Автор: Лобанок А.Г.
Теги: микробиологические производства биохимия микробиология
ISBN: 5-343-00283-8
Год: 1988
Текст
АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛОРУССКОЙ ССР
институт микговиологии
А.Г Аобанок В. Г. Бабицкая
Ж. Н. БогАановская
МИКРОБНЫЙ
СИНТЕЗ
НА ОСНОВЕ
ЦЕААЮАОЗЫ
БЕ/\ОК
И АРУГИЕ ЦЕННЫЕ
ПРОАУКТЫ
ОГЛАВЛЕНИЕ
МИН
«НАУКА И Т НИКА»
1988
УДК 663.1
Лобанок А. Г.‚ Бабицкая В. Г.‚ Богданов-
с к а я Ж. Н. Микробный синтез на основе целлюлозы: Белок
и другие ценные продукть1.— Мн.: Наука и техника,
1988.— 261 с.— ISBN 5-343-00283-8.
Рассматривается проблема получения белка, этанола, органиче-
ских кислот, метана и других ценных продуктов на основе микробной
трансформации лигноцеллюлозных и целлюлозных отходов сельского
хозяйства и промышленности. Приведены данные о составе и свойст-
вах целлюлозы и ряда природных лигноцеллюлозных материалов, спо-
собы их предварительной модификации с целью повышения эффектив-
ности биоконверсии этих материалов. Рассматриваются механизмы
ферментативного расщепления целлюлозы и родственных полисахари-
дов, а также вопросы биосинтеза и некоторые аспекты применения
целлюлолитических ферментов. На основании обобщения и анализа ис-
пользованных в работе данных делаются выводы о возможности прак-
тической реализации процессов биоконверсии.
Рассчитана на микробиологов, биохимиков, работников микробио-
логической промышленности, специалистов сельского хозяйства, аспи-
рантов и студентов биологических п технологических вузов.
Табл. 38. Ил. 6. Библиогр.: с. 235-258.
Рецензенты.
д-р биол. наук М. В. 3 ал ашко,
д-р биол. наук Н. И. Федоров
2910000000-141
M316(03)—88
100-88
© Издательство
ISBN 5-343-00283-8 «Наука и техника», 1988,
ПРЕДИСЛОВИЕ
В настоящее время ни у кого не вызывает сомнений тот факт,
что в деле осуществления Продовольственной программы важная
роль принадлежит микробному синтезу с использованием дешевых
природных ресурсов органического вещества и отходов про-
мышленного и сельскохозяйственного производства. Микроорга-
низмы растут в сотни раз быстрее, чем самые урожайные сельско-
хозяйственные культуры, и в тысячи раз быстрее самых продук-
тивных животных. Если же учесть то обстоятельство, что для их
питания пригодны самые разнообразные субстраты, то преиму-
щества использования микроорганизмов для получения белка,
этанола, метанола и некоторых ДрУГих продуктов биосинтеза оче-
видны.
Проблема ограничения ископаемых видов топлива и стрем-
ление многих стран уменьшить свою зависимость от поставок им-
портной нефти стимулировали возрастающий в мире интерес к
продуктам фотосинтеза как возобновляемому и практически не-
исчерпаемому источнику энергии, перспективному сырью для
получения продуктов кормового назначения и других пенных хи-
мичсских соединений. Отсюда возникает необходимость разра-
ботки прогрессивных технологий использования этого сырья.
Целлюлоза является основным по массе органическим вещест-
вом биосферы. Вместе с тем она не годится для корма животных
без специальной дополнительной предобработки. Основная проб-
лема, связанная с утилизацией’: целлюлозы, состоит в том, что в
отличие от крахмала она не является резервным углеводом, кото-
рый по мере надобности может превращаться в глюкозу. Напро-
тив, иеллЮл03а——устоЙчивЫй к различным воздействиям струк-
турный компонент растений. Устойчивость ее обеспечивается дру-
гим структурным компонентомилигнином. Поэтому одна из
основных задач современной биотехнологии —— научиться исполь-
зовать это труднометаболизируемое, но широко распространен-
ное в природе органическое соединение более эффективным спо-
собом, чем сжигание.
Из целлюлозосодержащего сырья наиболее приемлемыми для
этой цели являются отходы сельского хозяйства — солома, листья
и стебли различных растений, кукурузная кочерыжка, подсол-
нечная лузга, багасса, отходы пищевых производств——кожура
фруктов, отходы картофелеперерабатывающей промышленности,
нссортовал древесина, опилки, отходы бумажных производств,
верховой торф и др.
Большинство известных способов получения микробного белка
из иеллюлозосодержащих субстратов базируется на их кислот-
ном или щелочном гидролизе и высвобождении при этом простых
сахаров. Гидролиз, особенно кислотный, имеет ряд недостатков,
связанных с большим расходом кислоты, потребностью в кислото-
устойчивой аппаратуре, образованием нежелательных продуктов
гидролиза и т. п. Все это оказывает известное отрицательное
влияние на стоимость производства продуктов микробного син-
теза и их качество. Поэтому перспективным представляется за-
мена кислотного гидролиза ферментативным, B основе биологи-
ческой утилизации целлюлозы лежит ее ферментативное рас-
Щекление до глюкозы.
При рассмотрении экономической целесообразности биокон-
всрсии лигноцеятлжюлозных материалов важным является вопрос
о стоимости ферментных препаратов, которая все еще остается
весьма высокой. При прямом культивировании микроорганизмов
на лигноцеллюлозных субстратах с целью получения белковых
и белково-углеводных кормовых препаратов стоимость послед-
них будет зависеть как от содержания в них белка, так и от кор-
мовой ценности продукта в целом.
ELM решения социальных и экономических проблем представ-
ляется целесообразной комплексная переработка растительного
сырья в разнообразные продукты, необходимые народному хо-
зяйству, по безотходной технологии. В последние годы интен-
сивно развиваются исследования в области биоконверсии целлю-
лозосодержащих субстратов микроорганизмами для получения
не только белковых веществ, но и этанола, глюкозы, органических
кислот и метана. Этанол и метан, образуемые из растительной
биомассы, представляют значительный интерес как энергетиче-
cane ИСТОЧНИКИ уже в настоящее время.
В монографии обобщены результаты исследований отечест-
венных и зарубежных ученых, а также материалы собственных
наблюдений авторов по рассматриваемым вопросам. Разработка
различных технологий биокопвсрсии целлшолозосодержащих суб-
стратов с целью получения продуктов кормового назначения,
биотоплива и сырья для микробиологической промышленности
связана с использованием микроорганизмов, способных дегради-
ровать ЦеЛЛЮЛОЗУ. В связи с этим изучение физиологии и биохи-
мии таких микроорганизмов имеет определенное практическое
значение.
По мнению авторов, данная книга может оказаться полезной
микробиологам, биохимикам, биотехнологам и специалистам
АГР0Прома‚ студентам и аспирантам соответствующих специаль-
НОСТЕЙ И“ будет способствовать быстрейшему использованию до-
стшкснии науки в практике,
Глава 1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МАТЕРИАЛОВ
Зеленые растения -— источник жизни на нашей планете. Они
являются посредниками между Солнцем и всеми живыми орга-
низмами, Световая энергия Солнца поглощается зеленым расте-
нием и в процессе фотосинтеза превращается в химическую энер-
гию органических веществ. Благодаря фотосинтетической дея-
тельности в мире ежегодно улавливается 102‘ кал солнечной
энергии и образуется 150-109 т сухой растительной массы (био-
массы), а ежегодный круговорот углерода составляет 33-109 т.
Не менее трети фиксируемого при этом углерода используется на
синтез целлюлозы, основное количество которой, синтезируемое
в процессе аккумуляции энергии Солнца, находится в древесине.
Ее среднегодовая продукция 5- 10‘° T, а общая биомасса древес-
иых растений на земном шаре в пересчете иа углерод равна
50- I0” T.
Таким образом, в качестве органического полимера Целлюлоза
занимает доминирующее положение в наземном и морском ра-
стительном мире. В свою очередь по истечении известного вре-
мени биомасса расщепляется и окисленная до CO2 возвращается
в атмосферу. Таков цикл углерода. Полученная в процессе фото-
синтеза энергия может быть использована живыми организмами
для роста и поддержания метаболизма. Деградаиия целлюлозы ——
исключительно микробиологический процесс. Большая часть Цел-
люлозы в природе окисляется аэробными микроорганизмами до
СО2 в соответствии с реакцией
C,,H12O,.,+6O,—>6CO2+6H2O.
Около 55-10% целлюлозы конвертируется в метан и углекис-
лый газ (C5H12O;~»3CH4+3CO2). B анаэробных экосистемах из
целлюлозы образуется около (0,55——1‚2) ‹ 109 т метана в год. В ат-
мосфере метан окисляется озоном до СО2 и воды. Количество
целлюлозы практически не ограничено, так как при рациональ-
ном ведении хозяйства она полностью восполняется.
Целлюлоза содержится не только в древесине, но и в травах,
льие, конопле, в оболочке семян плодов, в морских водорослях.
В хлопковых и лубяных волокнах китайской крапивы имеется
до 95—98 % чистой целлюлозы, в соломе и древесине —- 40—60°/0.
В природе встречается также внеклеточная бактериальная (Асе-
5
Т абл и ца 1. Полисахариды клеточной стенки высших растений
(Whitaker, 1984)
Полисахариды Структурная классификация
Целлюлоза В-В-Глюкан (связь в положении 4)
Пектиновые вещества Г алактоуронаньт и рамногалактоуронаны, арабаны,
галактаньт и арабиногалактаньт
Гемицеллюлозы Ксилан (включая арабиноксиланьт и (4-О-метил)
глюкуроноксиланы)
Г алактоманнаны и глюкоманнаны
В-П-Глюканы (связь в положении З и 4)
В-В-Гдгюкан-каллоза (связь в положении 3)
Ксилоглюканы (связанные в положении 4
В-В-Глюканы с боковыми цепями)
Другие полисахариды Арабиногалактаньт и глюк; рономаннаны
tobacter xi/linum И А. acetigenum) И животная целлюлоза (в орга-
низмах некоторых ракообразных и улиток). В наиболее чистом
виде целлюлоза содержится в хлопковом волокне и продуциру-
ется бактериями рода Acatobacter, особенно А. xylinum. Имеется
также мнение о возможности использования Acetobacter xylinum
для получения чистой целлюлозы биотехнологическими методами.
Молекулярная структура целлюлозы хлопка и древесины
сходна, однако морфологически древесина организована более
сложно, чем хлопок, и представляет собой сочетание раститель-
ных клеток разнообразной формы.
Растения содержат множество полисахаридов; крахмал (ами-
лоза п амилопектин), целлюлозу, гемицеллюлозу, пектиновые
вещества и др. (табл. 1). Существует много гликопротеинов, где
гликоцепи, содержащие маннозу, ксилозу, фукозу и М-ацетилглю-
козамин, играют важную роль. Крахмал, являясь запасным угле-
водом, часто наряду с лигнином выполняет структурную функцию
в растительной ткани. Пектиновые вещества в иптактной ткани
нерастворимы, их обычно называют протопектииами. Нераство-
римость может быть обусловлена величиной полимера и присут-
ствием двухвалентных катионов, таких, как Сад.
Как известно, основной структурной и функциональной едини-
цей растения является клетка. Она состоит из стенки, протоплас-
та и вакуоли. Отличительный признак растительной клетки—
целлюлозная стенка. Она хорошо оформлена, очень прочна и
сохраняется после отмирания протопласта. Из рис. 1 видно, что
клеточная стенка включает тонкий внутренний выстилающий
слой (третичную стенку), содержащую целлюлозу и гемицеллю-
лозу, широкую Вторичную стенку, состоящую из целлюлозы,
лигнина и гемицеллюлоз, и первичную стенку. Первичные стенки
соседних клеток (волокон) соединены между собой когезивным
межклеточным веществом, или срединной пластинкой. Имеются
6
указания на содержание в ней метилового эфира полигалактуро-
новои кислоты, гемицеллюлоз и белка. В период роста клетки
срединная пластинка на 2/3 состоит из пектиновых веществ. За-
тем происходит сильная лигнификация межклеточного вещества,
и оно приобретает большую устойчивость к различным механи-
ческим, химическим и энзиматическим воздействиям (Бейнарт,
Чедерников, 1972).
В первичной стенке, имеющей толщину около 0.1 МКМ, микро-
Пектиновые вещества
стенка
Лигнин
Центральный канал
к;
а-Цеппюпоза 430 Too
Гемицеплюпоза 9/, ед
к; д’?
м?
О
Иду ‘он ‘а,
су д,
Непрерывное
межклеточное веществе
(аморфная фаза)
и межклеточное вещество,
или срединная пластинка
I I l.ll\ д l
д. ‚1 с bub 1 d с
Рис. 1. Строение растительной клетки‘ 1 —общий вид клетки по Тоуагпа; Н ——
строение древесной клеточной стенки по Ротовину; а—— межклеточное вещест-
во; 17—стенки двух смежных клеток; с, d— вторичная стенка; е— внутренняя
(третичная) стенка
фибриллы целлюлозы занимают менее 1/3 объема. Они перепле-
таются между собой, образуя сетчатую систему. Микрофибриллы
погружены в аморфный матрикс, который составляет основную
массу этой оболочки. В период роста клетки он состоит из геми-
Целлюлоз и пектиновых веществ. Позднее основная часть вещест-
ва матрикса (до 70%) замещается находящимся в аморфном
состоянии лигнином. Далее следует целлюлоза, гемицеллюлоза
и пектиновые вещества. В аморфном участке микрофибриллы,
лигнин и гемицеллюлозы могут проникать между макромолеку-
лами целлюлозы.
Компоненты, входящие в состав первичной клеточной стенки,
можно уСЛОВНО разделить на четыре группы (Салматова‚ 1983):
структурные, представленные целлхолозой; компоненты матрикса
стенки—гсмицеллюлозы, иектины, белки, липиды; инкрустиру-
ющие стенку — лигнин и суберин; откладывающиеся на ее поверх-
ности——кутин и Воска. Кроме того, клеточные стенки могут CO‘
держать значительное количество минеральных веществ: сили-
катов и карбонатов кальция.
Вторичная клеточная стенка хлопкового и древесного волок-
на, основным компонентом которой является целлюлоза, состоит
из множества концентрических слоев, которые в результате опре-
деленных химических и физических воздействий распадаются на
микрофибриллы. Вторичный слой определяет форму клетки, мс-
ханические свойства ткани, и микрофнбриллы в нем расположены
параллельно.
Толщина третичной стенки (включая внутренние слои вторич-
ной стенки) не более 7О—80 нм. Лигнина в ней больше, чем во
вторичной стенке, и химически она более устойчива. Микрофиб-
рпллы ЦеЛЛЮЛОЗЫ здесь расположены под углом друг к другу в
виде пучков диаметром 2~—3 HM (Бейнарт, Ведерников, 1972).
Состав и строение древесины различных пород разнятся вслед-
ствие морфологической неоднородности структур. Так. хвойная
древесина отличается от древесины лиственных пород. Генети-
чески обусловленный состав полисахаридов клеточной стенки
постоянен внутри одного вида.
Целлюлоза и ее производные характеризуются повышенной
скелетной жесткостью. На структуру и реакционную способность
целлюлозы большое влияние оказывают водородные связи. Спе-
цифика морфологической структуры целлюлозы определяется
в первую очередь ее функцией в клеточной стенке. Мембраной
растительной клетки целлюлоза выделяется в виде плотно упа-
кованных фибрилл, образующих подобие кристаллической решет-
ки. Фибриллы, обеспечивающие прочностные свойства клетки,
находятся в сложном взаимодействии с аморфным матрпксотч
других полисахаридов и веществами белковой природы. В резуль-
тате создается мощная структурная упаковка (Тарчевский, Мар-
ченко, 1985).
Целлюлоза — очень прочное соеддтнение, способное сохранять-
ся без изменения очень долго. Она не растворяется в воде даже
при кипячении, не переваривается в желудке многих животных.
Однако у лошадей, крупного рогатого скота находящиеся в же-
лудке бактерии выделяют целлюлолитические ферменты, pac-
щепляющие клетчатку, и способствуют ее перевариванию. Целлю-
лоза нерастворима во многих кислотах и щелочах. Она растворя-
ется лишь в аммиачных растворах солей меди.
Природная целлюлоза характеризуется неодинаковой реакци-
онной способностью и устойчивостью к действию химических pea.
FEHTOB. Вследствие высокой степени организации целлюлозы ее
8
структура малодоступна даже для воды, не говоря о макромо-
лекулах ферментов. В то же время она при определенных усло-
виях способна поглощать большое количество воды. Так, очи›
щенный хлопок впитывает до 0,4 г воды на 1 г целлюлозы. Воз-
можность проникновения полимера в структуру целлюлозы завп-
сит от его молекулярнои массы (ММ), так как диаметр пор,
например у хлопкового волокна, равен 0,5—1‚0 нм, у делигнпфи-
цированных волокон древесины он несколько больше (Ranby,
1969).
РИС. p�y� ХИМИЧЕСКОЕ crpoexme fl{).'IJIIO.'I0%hI
При действии на целлюлозу концентрированных растворов
щелочи изменяются ее химические, физико-химические и струк-
турные свойства: отмечается интенсивное набухание, изменяется
степень кристалличности. Высокомолекулярная фракция целлю-
лозы, Нерастворимая в 17,50/0-Hofx NaOH, называется огцеллюло-
зой, Хлопок состоит из ос-Целчюлозы, а другие растения и древе-
сина содержат главным образом [З-пеллюлозы, растворимые в
концентрированном растворе щелочи,
На ранних стадиях роста растения целлюлоза имеет наиболее
низкую степень полимеризации, более пориста и обладает более
высокой сорбционной способностью, чем целлюлоза созревших
растений. В природных пеллюлозосодержащих субстратах ей
обычно сопутствуют гемицеллюлозы, лигнин, танин, крахмал, а
также воска, жиры, белки (от 2 до 10%), смолы, терпены и ДРУ‘
гие органические соединения. Различные примеси не только проч-
но адсорбируются на поверхности микрофибрилл иеллтюглозьх, но
и могут быть включены внутрь.
Из-за выраженной межмолекулярной когезии и водородных
связей разделение микрофибрилл на отдельные молекулы за-
труднптельно. Выделение чистой и относительно нензмененной
целлюлозы с применением различных химических реагентов
(спирта, эфира, едкого натрия) рекомендуется вести в атмосфе-
ре инертного газа.
Целлюлоза представляет собой наиболее высокомолекуляр-
ный полисахарид, линейный в-1,4‹глюкан с видовой специфич-
ностью степени полимеризации (СП). Так, для целлюлозы волос-
ков семян хлопчатника СП первичной клеточной стенки равна
9
2-—6 тыс., вторичной- 13—14 тыс‚‚ для целлюлозы Acetobacter
xylinum -— 2,0—5‚7 тыс., для древесины — около 8,3 тыс. Несмот-
ря на то что целлюлоза состоит лишь из остатков глюкозы, на-
личие В-1,4-свя3ей между этими остатками заставляет считать,
что основным повторяющимся структурным элементом полисаха-
рида является дисахарид целлобиоза. В клеточных стенках моле-
кулярные цепи целлюлозы входят в состав надмолекулярных
структур — микрофибрилл, состоящих из 60—70 целлюлозных
нитей. Полагают, что в обычных условиях микрофибриллы целлю-
лозы не имеют окончаний. Они непрерывны в отличие от состав-
ляющих их индивидуальных молекул целлюлозы, которые имеют
перекрывающиеся концы цепей внутри микрофибрилл (Тарчев-
ский, Марченко, 1985).
Химический состав целлюлозы соответствует формуле
(C6H,0O5)n. Элементарным звеном макромолекулы является ан-
гидро-Б-глюкоза, которая содержит три гидроксильные группы у
2, 3 и 6-го атомов углерода. Однако, по данным инфракрасного и
рентгеноструктурного анализа, элементарной единицей целлюло-
зы является ангидроцеллобиоза‚ а не ангидроглюкоза (Blackwell,
1982; Atalla, 1983). Таким образом, хотя в химическом отношении
целлюлоза представляет собой линейный полимер в-Б-глюкопи-
ранозы (рис. 2), интересно отметить, что целлобиоза является
главным промежуточным продуктом расщепления целлюлозы
целлюлолитическими и бактериальными ферментными системами.
СП целлюлозы около 10000 соответствует ММ 1,5 млн. В этом
случае длина ангидроглюкозной единицы 0,515 нм, а общая дли-
на целлюлозной молекулы больше 5 мкм. Целлобиоза, целлотрио-
за и целлотетраоза растворимы в воде. Целлюлозные молекулы
с СП более 0000 считаются нерастворимыми, что, по мнению ис-
следователей, обусловлено наличием водородных связей между
целлюлозными молекулами. Такие водородные связи в целлю-
лозе имеются между глюкозными остатками в самой цепи глю-
кана и между цепями. Гидрофобные взаимодействия между цепя-
ми также имеют место.
Элементарные звенья макромолекул целлюлозы (ангидро-Б-
глюкопираноза) соединены между собой в-гликозидной связью.
Участок макромолекулы, отмеченный на рис. 2 скобкамиг- цел-
лобиоза. Это продукт неполного гидролитического расщепления
макромолекул. В гидролизатах могут быть также обнаружены
Целлотриоза и целлотетраоза. При полном гидролизе целлюлозы
образуется В-(+)-глюкоза. Элементарные волокна целлюлозы
состоят из множества линейных макромолекул с поперечным
сечением 0‚6—0‚7 нм. Размеры молекул целлюлозы льна и хлоп-
чатника более однородны, чем размеры молекул целлюлозы трав
вянистых растений (Йиргенсонс, 1964; Роговин, 1972).
Ввиду регулярности строения полимерной цепи и строго опре-
деленной конфигурации асимметрических углеродных атомов
целлюлозу относят к стереорегулярным полимерам. Наличие в
10
пиранозном цикле атома кислорода делает возможными две кон—
формации кресла и шесть конформаций ванны. В зависимости от
конформации пиранозного звена при том же строении в цикле
изменяется пространственная ориентация заместителей (ОН-
групп). Гидроксильные группы могут располагаться экватори-
ально и аксиально, т. е. перпендикулярно плоскости кольца.
Полагают, что макромолекула целлюлозы состоит из большоч
го числа остатков Бтлюкопиранозы в конформации кресла, со‹
единенных в‹1‚4‹гликозидньтми связями. Различные химические
и физические воздействия, однако, способствуют переходу звень-
ев в другую конформацию. Особенности конформации молекулы
целлюлозы определяют ее ригидность и наклонность к агрегации.
ЦЭЛЛтЮЛОЗНЫЭ молекулы не имеют определенной длины, число
глюкозных остатков (СП) варьирует от 15 до 14000 со средним
значением около 3000 (Роговин, 1972). У целлюлозы хлопка СП
может достигать 1500, у целлюлозы древесины——8000——10 000.
Максимальная экспериментально установленная ММ цешгюлозьг
составляет 6 000 000 (у льна). В настоящее время исследователи
ОТКЭЗЭЛИСЬ ОТ ПрСДСТаВЛСНИЯ О ТОМ, ЧТО МЗКРОМОЛЕКУЛЫ ЦеЛЛ1О<
лозы являются линейно вытянутыми жесткими структурами. По‹
лагатют, что макромолекулы целлюлозы сложены в свернутые в
спираль ленты. Тем не менее имеются расхождения между этой
моделью и теми, что описаны другими исследователями (Роговин,
1972).
Участки целлюлозы с высокой степенью упорядоченности на-
зывают кристаллическими, а участки с беспорядочной ориента‹
иией- аморфными. Аморфная целлюлоза имеет более рыхлую
структуру и поэтому более доступна для кислоты или ферментов.
По Мнеииго В. И. Шаркова (1967), наличие в целлтолозе двух фаз
не обязательно предполагает существование четкой границы меж‹
ду ними и более обосновано представление о целлюлозе как об
однофазной системе с различной степенью упорядоченности и не
прерывным переходом уплотнений и разрыхлений в пределах
отдельных флуктуаций мнкрофибрилл.
Целлюлоза полнморфна и благодаря водородным связям обра‹
зует кристаллические структуры, по крайней Мере четырех типов
(Blackwell. 1982). CyLI_[€CTByllOT различные мнения относительно
числа целлюлозных молекул в кристаллических участках и спо‹
соба их организации. Целлюлозные молекулы образуют элемен-
тарные фибриллы посредством водородных связей. Эти фибриллы
в свою очередь образуют микрофибриллы и затем волокна. Во‹
локнистую структуру целлюлозы можно наблюдать в микроскоп.
Целлюлозная молекула благодаря своей длине может проходить
и через аморфные и через кристаллические участки. Целлюлоз-
ные волокна легко Поглощают влагу и набухают, но набухание
ограничено аморфной частью волокна.
Таким образом, целлюлазы и другие молекулы, сходные по
размеру, не могут проникать во внутренние структуры фибрилл
11
нативной целлюлозы. Они действуют только на поверхности мик-
рофибрилл или элементарных фибрилл. Число гликозндньхх свя-
зей, доступных действию ферментов, в большой степени зависит
от степени набухания целлюлозы. Увеличение степени набухания
достигается за счет механической или физической предобработки,
такой, как пропаривание, размалывание, обработка ультразву-
ком. Минеральные кислоты и щелочи в высоких концентрациях
увеличивают набухание всего волокна, так как они способны
разрывать водородные связи и проникать в кристаллические
участки (Blackwell, l982).
Вопрос о фазовом соотношении природной и регенерированной
целлюлозы сложный и в настоящее время окончательно не
решен. Тем не менее целлюлоза может быть получена как в упо-
рядоченном‚таки в крайне неупорядоченном, практически аморф-
ном состоянии. Фазовый переход аморфной фазы в кристалличе-
скую происходит скачкообразно. В результате размола природ-
ной целлюлозы ее прочность и кристалличность снижаются и
Соответственно возрастает ее аморфность.
Интересно, что при обработке целлюлозы водой даже при низ-
ких температурах происходит повышение ее плотности. Присут-
ствие воды обеспечивает кристаллизацию целлюлозы благодаря
перераспределению водородных связей. Повышение температуры
также ускоряет процесс повышения плотности и степени упоря-
доченности.
По З. А. Роговину (1972), целлюлозу следует рассматривать
как стереорегулярный высокоориентированный кристаллический
полимер, обладающий значительной неоднородностью структуры
с наличием упорядоченных областей. Между линейными макро-
молекулами целлюлозы существуют связи, осуществляемые си-
лами межмолекулярного взаимодействия, и химические, Так,
цепи целлюлозы главным образом связаны водородными связями
между гидроксильными группами и атомами кислорода. Наличие
в препаратах целлюлозы водородных связей обусловливает ряд
таких важных ее свойств, как скорость растворения, гигроскопич-
ность, реакционная способность. Из-за высокой прочности водо-
родных связей молекулярные ассоциации целлюлозы в воде не-
растворимы. Замещение полярных групп, например карбоксиме-
тилом, ведет к нарушению молекулярной регулярности, способ-
ствует возникновению множества водородных связей с водой
и делает целлюлозу растворимой.
Одним из основных факторов, определяющих свойства целлю-
лозы и других высокомолекулярных полисахаридов, является
надмолекулярная структура. Цепи молекул целлюлозы объеди-
няются в пучки и мицеллы. Максимальный диаметр одной моле-
кулы целлюлозы 0,8 нм. Эти молекулы образуют элементарные
мицеллы с максимальным диаметром 10 им. Элементарные ми-
целльт объединяются в пучки, называемые микрофибритлами,
Тяжи последних имеют ширину 25 нм и содержат до 2000 моле-
12
Kym целлюлозы. микрофибриллы объединяются в волокна — мак-
рофибрилльт шириной 0,4 мкм, они содержат 500 000 моле-
кул целлюлозы. В волокнах вторичной оболочки 200 млн молекул
целлюлозы. Стенки клеток различаются главным образом распо-
ложением микрофибрилл. Различают параллельную ориентацию
микрофибрилл по отношению к оси клетки и продольно-попереч-
ную, или беспорядочную, ориентацию (Тутаюк, 1980).
Свойства целлюлозы определяются не столько взаимным по-
ложением макромолекул, сколько строением и взаимным распо-
ложением элементов надмолекулярной структуры, Так, полага-
ют, что надмолекулярная структура целлюлозы хлопка очень
отличается от структуры целлюлозы льна, древесины или бакте-
риальной целлюлозы.
Рентгеноструктурный анализ и инфракрасная спектроскопия
указывают на существование различных структурных кристалли-
ческих модификаций целлюлозы. Например, одна из них (гид-
ратцеллюлоза) образуется при размоле целлюлозы, выделении
ее из растворов (Роговин, 1972). В плотные участки структуры
с максимальным взаимодействием между макромолекулами не-
которые химические реагенты не проникают. Структурные участ-
ки целлюлозы, доступные для диффузии реагентов, иногда назы-
вают аморфными, что не связано с фазовым состоянием целлю-
лозы. Модифицированная (в том числе кислотами и щелочами)
целлюлоза имеет более открытую структуру и поэтому более до-
ступна действию фермента.
Природный хлопок, который подвергается незначительной хи-
мической и механической обработке, образован очень длинными,
неразветвленными цепями [3-1,4-глюкана с СП около 3000, плотно
упакованными Преимущественно в кристаллические структуры.
В результате обработки водой аморфной целлюлозы, выделен-
ной из нераскрывшейся коробочки хлопка и высушенной в от-
сутствие влаги, повышается степень ее кристалличности. Содер-
жание легкогидролизуемой фракции в размолотой хлопковой
целлюлозе даже при обработке водой при 20 °С уменьшается
с 68 до 43% (Роговин, 1972).
B соответствии с общепринятой в настоящее время модельжю
элементарной фибриллы молекулярные цепи целлюлозы образу-
ют кристаллическое ядро с высокой степенью упорядоченности.
В области, прилегающей к ядру, ётепень упорядоченности макро-
молекулярных цепей существенно уменьшается, Элементарные
микрофибриллы всегда ассоциированы в агрегаты из достаточно
большого числа элементарных фибрилл, составляющих микро-
фибриллы. В межфибриллярной области располагаются значи-
тельно менее упорядоченные макромолекулярные цепи. Получен-
ные к настоящему времени данные позволяют рассматривать
Природную и высокоориентированную целлюлозу как линейный
полимер, в котором определениым образом чередуются зоны
с высокой и низкой степенью ориентации. Надмолекулярная ор-
13
ганизация целлюлозы характеризуется формами, присущими
кристаллическим полимерам, и включает участки как с высоким,
так и C малым уровнем ориентационного упорядочения, гиикро-
фибрилла, подобно свае в мягком пластичном грунте, рассматри-
вается как армирующий элемент системы (Тарчевский, Марчен-
ко, 1985).
Другие углеводы (пектиновые вещества и гсмицеллюлозы),
входящие в состав клеточной стенки, образуют гель, пронизанный
субмикроскопическими целлюлозными микрофибрижхлами.
Одним из неотъемлемых компонентов клеточной стенки ра-
стений являются гемицеллюлозы. В противоположность целлю-
лозе они включают полисахариды с меньшим размером молекул
(СП 50-200, ММ 10 000—40 000), извлекаемые из растительных
материалов растворами щелочи и легкогидролизуемые до гексоз
и пентоз (Степаненко, 1968). Основные компоненты гемицеллю-
лоз-ксиланы, уроновые кислоты (например, ПОЛИГШЮКурОНО-
вая), маннаны, арабогалактаньг Наиболее распространены кси-
ланы. Кукурузная кочерыжка и овсяная шелуха содержат до
28——34 % ксилана. Маннан представляет собой стереоизомер цел-
люлозы, в цепи которого связаны ангидроманнопиранозные остат-
ки. Маннаны не волокнисты, что указывает на малую степень их
полимеризации. Ни одна из гемицеллюлоз не Охарактеризована
достаточно полно.
В клеточной стенке гемицеллюлозы находятся между микро-
фибриллами целлюлозы в виде кристаллических или аморфных
гранулированных веществ или даже образуют собственные мик-
рофибриллы (Степаненко, 1968). Легко гидролизуются, по-види-
мому, те гемипеллюлозы, которые не связаны с целлюлозой либо
связаны с аморфной ее частью. Трудногидролизуемые гемипел-
люлозы состоят из коротких цепей, совместно ориентированных
аналогично длинным цепям целлюлозы.
Особенности организации древесной целлюлозы, обусловлен-
ные наличием водородных связей между целлюлозой и гемицел-
люлозой, делают ее менее доступной для целлиюлолитическгтх
ферментов (Ranby, 1969). Гемицеллюлозы выполняют структур-
ные функции, участвуя в формировании скелета растений, играют
роль запасных веществ, используемых в процессе обмена, и в ко-
личестве 15—40% содержатся во всех растительных тканях. Осо-
бенно много гемицеллюлоз в семенах, косточках, соломе, подсол-
нечной лузге, в шелухе хлопковых семян, в кукурузных кочерыж-
ках. В среднем 25% (по массе) органического вещества растений
представлено гемицеллюлозами. Лиственные породы дсрсвьев
содержат гемииеллюло3 в 1,5 раза больше, чем хвойные (Шар-
ков, Куйбина, 1972).
Гемипеллюлозы в растительной клетке обычно находятся в
виде гомо- или гетсрополисахаридов. Чаще гемИЦЭЛЛЮЛОЗЫ —
это гетсрополисахариды, содержащие остатки различных гексоз,
пентоз или их производных с СП от 50 до 200. ПослеДНИе разде-
I4
ляют на неразветвленные гетерополисахариды с регулярной
структурой и разветвленные с нерегулярным или регулярным
строением, которые настолько сложны по составу и характеру
последовательности входящих в них моносахаридов, что опреде-
лить их строение Весьма затруднительно. Они растворяются го-
раздо легче, чем целлюлоза, что объясняется более «рыхлым»
строением их молекул. Большинство гемицеллюлоз нерастворнмо
в воде, лишь некоторые переходят в воду с образованием колло-
идного раствора.
В зависимости от состава основной цепи полисахарида и со-
отношения моноз, составляющих полисахарид, гемицеллюлозы
разделяют на группы, характеризующиеся одинаковым составом
и строением основной неразветвленной наиболее длинной цепи
полимера или большей части этой Цепи: арабаны, ксиланы, глю-
каны, галактаны, маннаны, фруктозаны, галактуронаны, манну-
ронаны. В подгруппы объединяются полимеры в зависимости от
состава и строения разветвленной части молекулы или от коли-
чества углеводных остатков, ВХОДЯЩИХ в состав основной нераз-
ветвленной части полимерной цепи (Дудкин, 1969; Тарчевский,
Марченко, 1985).
Во вторичных клеточных стенках гемицеллюлозы представле-
ны ксиланами и маннанами. В зависимости от сахаров, находя-
щихся в боковых цепях, они называются арабиноксиланом, глю-
команнаном, галактоманнаном и т. д. K гемицеллюлозам отно-
сится также каллоза -— полиглюкан, состоящий из молекул
Б-глюкозы, соединенных В-ДЗ-связями. Цепи каллозы могут
замыкаться или быть линейными (Салматова, 1983).
Ксиланьъ-основной компонент гемицеллюлоз лиственной
древесины и однолетних растений. Макромолекулы ксиланов
сравнительно невелики. Основную неразветвленнутю часть моле-
кулы составляют остатки В-Б-ксилопираноз, соединенных по ме-
сту 1~>4 углеродных атомов. А с основной цепью посредством
1—›2 и 1—>3 связи соединяются разнообразные в большинстве слу-
чаев одноединичные остатки [З-В-ксилопираноз, Ь-арабофураноз,
Б-глюкуроновой кислоты и 4-О-метилглюкуроновой кислоты. Ряд
остатков моноз ацетилирован. Из ксиланов наиболее распростра-
нены и изучены арабоксиланы, глюкуроноксиланы и арабоглюку-
роноксиланы. Арабоксиланы обнаружены в зернах риса и ржи,
в сое и в оболочках гороха.
Глюкуроноксиланы содержат в боковых цепях остатки В-глю-
куроновой кислоты и ее 4-О-метилового эфира и характерны для
лиственной древесины, стеблей злаков и трав. Арабоглюкуроно-
ксиланы характеризуются одновременным присутствием в боко-
вых цепях макромолекулы остатков Ь-арабофураноз, В-ксилопи-
раноз, Б-ГЛжЮКУрОНОВОЙ кислоты и ее 4-О-метильного производ-
ного. Арабоглюкуроноксиланы выделены из древесины хвойных
пород, стеблей злаков, тростника и поверхностных слоев зерна.
Маннаны найдены в различных растительных тканях. Это по-
15
лимерные углеводы, в которых остатки Б-маниопиранозьт соеди-
нены [3-1,4-гликозидными связями. По Моносахаридному составу
эти полисахариды можно разделить на три основные группы: ман-
наны, глюкоманнаны и галактоманнаньт. Глюкоманнаньх хвойной
древесины составляют около половины количества гемнцеллюло-
зы древесины. Глюкоманнаны различных хвойных пород имеют
сходное строение и состоят из Б-маннозных и В-глюкозных ос-
татков. Предположительно древесный глюкоманнан имеет линей-
ную структуру, в которой остатки В-маннопиранозы и В-глюко-
пиранозы соединены В-1,4-гликозидными связями (Фнрантас,
1985).
Галактаны построены из остатков В-галактопираноз. В моле-
куле могут быть остатки Ь-арабинозы, В-глюкозы, В-галактуро-
новой кислоты и Ь-рамнозы. Арабогалактан, FJI\}0KO21p36OF3JIE1K-
тан, галактуроногалактан также входят в эту группу. Ь-Арабино-
за—основная единица макромолекул полисахаридов группы
арабанов. В макромолекуле могут присутствовать остатки других
моносахаридов и уроновых кислот (Шарков, Куйбина, 1972).
Пектиновые вещества — высокомолекулярные соединения
углеводной природы, содержатся в большом количестве в стон-
ках молодых растений и связывают не только волокна стенки, но
и соседние клетки. Состоят они главным образом из линейных
полимеров В-галактуроновой кислоты, соединенных оь-1‚4-глико-
зидными связями (Тутаюк, 1980). Пектиновые вещества обычно
сосредоточены в срединной пластинке и образуют группу гетеро-
генных полисахаридов, основная биологическая роль которых
сводится к цементированию клеточных компонентов. Они обла-
дают коллоидными свойствами и могут связывать большое коли-
чество воды. В свежих фруктах обнаруживается от 0,2 до 4‚0°/о
пектиновых веществ, а в растительных тканях — от 0,7 до 16,0%
(Fogarty, Ward, 1972). Средняя молекулярная масса пектииов
20О0О—400О00.
Полагают, что пектины включают Ь-арабан, [3-1‚4-галактан,
а Ь-рамноза, Ь-арабиноза и В-галактоза являются составными
частями молекулы пектина. Основа структуры пектиновых ве-
ществ — это оь-1,4-0-галактоуронан‚ частично этерифицнрованньтй
метанолом. С главной цепью галактоуронана связано различное
число остатков Ь-рамнозы, боковые цепи геминеллъолозы могут
быть связаны либо с остатками рамнозы, либо с галактоурона-
ном. Некоторые гидроксильные группы (С2 и C3) пектина ацети-
лированы.
Таким образом, пектиновые вещества —это группа сложных
коллоидных веществ, содержащих главным образом иолигалак-
туроновую кислоту, этерифицированную метильными группами
в той или иной степени и частично или полностью нейтрализован-
ную основаниями. Протопектином обычно называют водонераст-
воримоо, родственное пектину вещество. Одной из причин нераст-
в‹›римости протопектина является связь с другими компонентами
16
клетки, особенно с гемицеллюлозами, присутствие катионов, в
частности кальция, что ведет к нерастворимости малоэтерифици-
рованных пектиновых веществ и уменьшению способности к на-
буханию высокоэтерифицированного пектинового материала, и,
наконец, Механическое переплетение пектина С ДРУГИМИ компо—
нентами клетки (Fogarty, Ward, 1972) (рис. 3).
Хотя детально строение срединной пластинки не исследовано,
известно, что целлюлозные волокна первичной клеточной стенки
out
c...
...
...
can
Рис. 3 Характер ассоциации
пектина И дръгих компонен-
><
гов стенки растительной 3
клетки ПО Fogarty и Ward‘ Д": ‚т ;,_ ": .
а — центральный канал; б, {К :3 Мёд: P��� -
в -— соответственно вто ич- 3. ‘J. 2 . - -
\ . . . . . . . - - 8
пая и первичная стенки, e—— д ���� - ; ‘В? ‚д‘ зги
срединная пластинка; 1— : ��� : . ' P��� I у .2
лигнин. 2 —— пектин, J ш 4 '.' д‘ '.: ‘.2 а’ Ь -
I I I I I I О 5 ‘
целлюлоза, 4 —— гемицеллю- / 3 и о - о 3 о - ~ ; ; ; : ;
H033 ::::::::: .. ����
. д о о и а д я о I ' ‘ ' ‘
в о II о с I I а д I ‘ ‘ '
Ь:
связаны гемицеллюлозой и пектиновымгг веществами в более или
менее ригидные структуры. Содержание пектиновых веществ
в растительном материале не превышает 1%, тем не менее они
обеспечивают цеЛОСТНОСТЬ растительной ткани. Деградация пек-
тина срединной пластинки ведет к дезинтеграции ткани, т. е. к ее
мацерации (Rombouts, ринги, 1980). Пектовые кислоты-это
полигалактуроновые кислоты с небольшим количеством мето-
ксильных групп. В природных субстратах до 75% карбоксильных
остатков в пектине этерифицироваиьт метанолом. Расщепление
эфирных связей ведет к образованию пектовой кислоты.
По Rombouts и Pilnik (1980), пектиновые вещества -—это
гетерополисахариды (с ММ от 30 000 до 300 000), состоящие из
основной цепи частично метилэтерифицированного oL~1,4-D-ra-
лактоуронаиа. Значительное количество Ь-рамнопиранозных ос-
татков связано через С‚- и С2-атомы с главной цепью галактуро-
нана. Большее или меньшее число галактуроновых остатков
может быть аиетилировано в положении C2 И C3. Боковые остат-
ки нейтральных сахаров, преимущественно галактозы, арабино-
зы и ксилозы, ковалентно связаны с галактуроновыми остатками
2. Зак 966 17
в положении C2 И C3, для рамнозных остатков — C4. Пектины при
определенных условиях образуют гели с сахарами и кислотами.
Пектипы найдены в стенках клеток высших растений, Если
целлюлоза, подобно стальному каркасу, составляет основную
структурную решетку, то фибрпллярные пектины служат мате-
риалом для структурных деталей. Пектины, возможно, также име-
ют некоторое функциональное значение, хотя главная их роль ——
сохранение структурной целостности растительной клетки.
Как уже отмечалось, взаимодействие целлюлозных молекул
друг с другом в микрофибрилле обеспечивается за счет множест-
ва водородных связей. Предполагается, что на поверхности всех
микрофибрилл целлюлозы имеется ксилоглюкановый монослой,
формирующийся за счет водородных связей. Обнаружены и ко-
валентные связи между ксилоглюкановыми цепями и пектиновы-
ми полисахаридами, Пектиновые вещества связаны друг с дру-
гом преимущественно ковалентными связями. В ходе развития
клетки при переходе от первичной клеточной стенки к вторичной
и в процессе ее формирования состав полисахаридов закономерно
изменяется. У древесных пород при формировании вторичных
сильно утолщенных клеточных стенок происходит отложение
гемицеллюлоз, особенно целлюлозы. При одревеснении клеточ-
ных стенок наблюдаются значительное накопление лигнина и
импрегнация им полисахаридов, Предполагают ковалентное свя-
зывание лигнина с гемицеллюлозами (Тарчевский и др., 1985).
Из других природных полисахаридов растительного происхож-
дения можно назвать гуммиарабик, трагакант, карайю, агар, дск-
страны, лихенин- резервный полисахарид исландского мха. яв-
ляющийся линейным полимером [З-Б-глюкопиранозы, содержа-
щий 30% 1а3-и 70% 1—›4-связей. Еще одпим сопутствующим
целлюлозе полисахаридом с ос-1,4-гликозидными связями явля-
ется крахмал, содержащийся в клубнях, например, картофеля,
корнях и сердцевине стеблей растений. В семенах имеется до
70% крахмала, а в других частях растений—— 4——25% (Иирген-
cone, 1964). Крахмал обычно хорошо усваивается животными,
человеком и большинством микроорганизмов.
Компонентом растительной клетки наряду с целлюлозой яв-
ляется лигнин. Этот инкрустирующий групповой полимер с трех-
мерной структурой построен в основном из фенилпропановых
структурных звеньев и вклтючает большую часть метоксильных
групп древесины. В естественных условиях лигнин как таковой
не существует и структурно связан с полисахаридами. Он «оку-
тывает» целлюлозные микрофибриллы и проникает между кри-
сталлическими мицеллами.
Лигнин -— наиболее важный компонент растительной биомас-
сы после целлюлозы и наиболее важный возобновляемый источ-
ник ароматических соединений углерода на Земле. Так как лиг-
нин и целлюлоза вместе с гемицеллюлозой являются структур-
ными компонентами высших растений, биодеградация их тканей
18
служит источником возобновления биосинтетического углерода
на Земле. Однако лигнин, являющийся гетерогенным аромати-
ческим полимером, содержащим различные биологически ста-
бильные углерод—углерод и другие связи, погружен в гемицедх-
люлозу, окружающую целлюлозные микрофибритльх, резуль-
татом чего является органический композитный материал,
защищенный от деградирующего действия ферментов микроор-
ганизмов. Таким образом, проблема биодеградации целлюлозы
тесно связана с деградацией лигнина (Higushi, 1982).
Лигнин — это сложный природный полимер растительных ма-
териалов (древесины, соломы и др). Его запасы на Земле зани-
мают второе место после целлюлозы. Лигнин —— основной компо-
нент срединной пластинки, но его большая часть содержится во
вторичной клеточной стенке, где он перемежается и ковалентно
связан с гемицеллюлозой. Целлюлозные фибриллы погружены
в лигнингемицеллюлозный матрикс. Лигнин—это полимер из
фенилпропаиовых единиц, соединенных более чем десятью раз-
личными С—С- и С—О-—С-связями, и, следовательно, один из
наиболее сложных гетерогенных комплексных полимеров. Бла-
годаря своим химическим и физическим свойствам и „локализа-
ции лигнин служит основным компонентом, обусловливающим
СВОЙСТВЗ „ЧИГНОЦЁЛЛЮЛОЗНЫХ Материалов. ЛИГНИН ДСЛЗЁТ ЦЕЛЛЮ-
лозу и гемииеллюлозу плохо псревариваемыми (Kirk, 1985).
Работами последних лет показано, что содержание лигнина
в сложной срединной пластинкс Хвойных и лиственных растений
составляет соответственно 23 и 19%, а остальное количество на-
ходится во вторичной клеточной стенке. По одним данным, лиг-
нин в аморфном состоянии заключен между фибриллами целлю-
лозы и Ориентирован в соответствии с ориентацией микрофиб-
рилл целлюлозы, по другим —упорядочен в клеточной оболочке
в виде тяжей, граиул или пластинок. По сравнению с древесиной
ели лигнин березы менее упорядочен (Озолиня, 1975). Это свое-
образное иолиароматическое соединение в обмене растительной
ткани участия не принимает, а служит связующим материалом.
Нет единой точки зрения относительно молекулярной массы
лигнина. Лигнин представляет собой желтое или коричневое
аморфное вещество и содержит до 65% углерода (Йиргенсоис,
1964). При его гидролизе получают эвгенол, катехин, фенол и др.
Вопрос о природе лигнинполисахаридного комплекса неясен,
хотя предполагается наличие химической связи в этом комплек-
се. Доказательством наличия лигноуглеводных связей считают
возможность выделения лигноуглеводных комплексов при обра-
ботке древесины. При выделении лигнина различными методами
получены лигноксилановые комплексы. В кислой среде гидроли-
зуются гликозидные связи внутри молекул ксилана, связи между
лигнином и ксиланом не нарушаются, Полагают, что в создании
лигногемииеллюлозного комплекса важную роль играют кова-
лентные и водородные связи.
2‘ 19
Одним из способов делигнификации растительного материала
является обработка его растворами сильных щелочей. Несмотря
на химическую стойкость лигнина, имеются микроорганизмы
(дереворазрушающие грибы), способные вызывать деструкцию
лигнина. Последняя связана с действием комплекса экзофермен-
тов лигнинразрушающих грибов. Под влиянием этих и некоторых
других ферментов лигнин подвергается окислению и деметокси-
лированию. Микробиологическое расщепление связанного или
выделенного лигнина — процесс весьма длительный. Лигнпн пре-
пятствует проникновению целлюлаз и гемицеллюлаз в структу-
ры целлюлозы и осуществлению ферментативного гидролиза.
Очень своеобразным целлюлозосодержащим природным суб-
стратом является верховой торф. В последнее время верховому
торфу уделяется большое внимание как высокополимерному
органическому технологическому сырью для производства кор-
мовых дрожжей. Природные экологические условия, обусловли-
вающие разнообразие растительных группировок, а также по-
следующее воздействие биологических, химических и других фак-
торов привелп к образованию торфа с различным ботаническим
составом и физико-химическими свойствами. Тем не менее торф
во многом сохраняет особенности химического состава растений,
из которых он образовался. Сфагновый торф со степенью разло-
жения 20% содержит до 80% углеводов и, таким образом, прак-
тически не отличается от древесного и растительного сырья. Уг-
леводы торфа состоят из легко- и трудногидролизуемых полиса-
харидов —- пентозанов и гексозанов. Отличительной чертой
верхового торфа является наличие в нем воска, битумных, гуми-
новых веществ и фенольных соединений, что препятствует раз-
ложению его в природных условиях микроорганизмами.
Помимо соединений полисахаридной природы и лигнина ра-
стительные ткани обычно содержат эфиры, белки, могут также
ВКЛЮЧЭТЬ смолы, Воск, терпены и ДРУГИе органические соедине-
ния, которые адсорбируются как на поверхности целлюлозных
микрофибрилл, так и включаются внутрь. Несмотря на всю слож-
ность и низку›ю реактивность целлюлозосодержащих материалов,
в природных условиях макромолекулы, входящие в состав
растительной клеточной стенки, расщепляются благодаря дей-
ствию специфических ферментов Микроорганизмов, главными
из которых являются целлюлолитические и лигнолитическпе.
При рассмотрении вопросов биоконверсии лигноцеллюлозных
растительных субстратов в белок и другие продукты, а также
энзиматического осахаривания целлюлозы не всегда в должной
мере принимаются во внимание особенности строения того или
иного субстрата, наличие нежелательных компонентов не только
в виде лигнина, но и в виде гемицсллюлозы, пектиновых и других
веществ. Однако особенности строения и наличие сопутствующих
компонентов тех или других лигноцеллюлозных материалов су-
щественно влияют на эффективность биотрансформации.
20
Глава 2
МЕХАНИЗМЫ МИКРОБНОЙ ДЕГРАДАЦИИ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛО3Ь|
Целлюлоза разрушается в природе с участием большого
числа различных микроорганизмов——эукариотов и прокариотов,
аэробов и анаэробов, мезофилов и термофилов. Их Целлюлоли-
тические системы так же разнообразны, как и сами организмы.
Хотя большая часть целлюлозы в природе разлагается аэробны-
ми микроорганизмами, анаэробные процессы имеют большое
экологическое значение. Эффективное разложение целлюлозы в
природе происходит в результате симбиотического взаимодей-
ствия различных типов микроорганизмов и их сложных целлюло-
литических систем.
Ущерб, наносимый каждый год целлюлолитическими микро-
организмами древесине, изделиям из дерева и текстиля, огромен.
В США в 1924 г. он составил 800 млн долларов. В 1929 г. здесь
было использовано 25 млн галлонов консервантов только для за-
щиты древесины (Augustine, 1976). Ранний период изучения раз-
ложения целлюлозы микроорганизмами связан с именами де Ба-
pm, OMeJmHcKoro, Фареуса, ван Итерсона, а позднее Виноград-
ского, Имшенецкого и др. Этот, по образному выражению Феник-
совой, «микробиологический период исследования разложения
целлюлозы закончился установлением факта, что разложение
целлюлозы происходит под действием внеклеточных ферментов
микроорганизмов, и позволил перейти к изучению действия на
целлюлозу бесклеточных ферментных препаратов» (Фениксова,
1967).
Толчком к началу современных исследований целлюлаз послу-
жило плесневение и порча армейского обмундирования и обору-
дования (США) в годы второй мировой воины в джунглях ост-
ровов южной части Тихого океана. В 1950 г. Reese et al. на осно-
вании того, что одни микроорганизмы растут на средах, содер-
жащих в качестве единственного источника углерода нативную
целлюлозу, а другие —— только на глюкозе или растворимом про-
изводном целлюлозы (натрийкарбоксиметилцеллюлозе)‚ выдви-
нули концепцию Cr И Сх-Целлюлолитических ферментов. Они
предположили, что первая группа микроорганизмов в дополнение
к целлюлолитическим ферментам Сх-типа, продуцируемых микро-
организмами, способными к росту на дсриватах целлюлозы, обра-
зует Срфермент, обусловливающий расщепление высокооргани-
зованной целлюлозы, действие которого направлено на надмоле-
кулярную структуру субстрата. Были высказаны предположения,
что возможными точками приложения Сд-фермеъгта могут быть
21
водородные связи между полимерными птепями целлюлозы или
он воздействует на кристаллическую структуру. Допускалось, что
действие С1-компонента имеет негидролитическую природу. Одна-
ко ферментов с указанными свойствами выделено не было.
Reese et а1. предложили Сг-Сх-концепиию как гипотетиче-
скую модель без всяких доказательств предгидролитического эта-
па. Основной вывод из их работы, который имеет значение еще
и сегодня, заключается в том, что целлюлоза расщепляется в ре—
зультате 2—3-ступенчатых реакций. Сегодня еще невозможно
сделать обобщение, касающееся целлюлолитических систем всех
групп микроорганизмов. В определенной степени такие обобще-
ния могут быть сделаны лишь для отдельных трупп микроорга-
низмов.
Ферментативные механизмы, связанные с расщеплением пел-
люлозы, наиболее детально были Изучены у гриба—--во3будите.тя
белой гнили Sporotrichum pulverulenfzmz H микромипета Tric/10-
derma viride QM 6а (позднее названного Т. reesei). Целлюлоли-
тические системы у обоих организмов сходны, Помимо гидроли-
тических ферментов в последнее время у этих организмов обна-
ружена способность образовывать окислительные ферменты
(Ayers et а1., 1978; Vaheri, 1982). Eriksson e1 а1. (1986) охарак-
теризован фермент, выделяемый Phanerochaete Chrys0sp0rimn,
который окисляет глюкозу и образует H202.
ЦЭЛЛЮЦОЛИТИЧССКИЭ микроорганизмы широко распространены
в природе. Они включают аэробные и анаэробные грибы и бакте-
рии. Многие из них растут при экстремальных условиях темпера-
туры и рН. Таким образом, иеллюлолитические микроорганизмы
можно обнаружить в различных условиях обитания. Наиболее
важным потенциальным источником целлюлаз с точки зрения их
промышленного использования являются грибы следующих родов:
Agaricus, Aspergillus, Botryodiplodia, Chaetomium, Cladosporium,
Coriolus, Eupenicillium, Fomes, Fusarium, Humicola, Hypocopa,
Irpex, Myceliophtora, Myriococcum, Myrothecium, Neocallimaslix,
Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Pestalopsis, Phanerochaele,
Phialophora, Phoma, Physarium, Pleurolus, Podospora, Polyporus,
Рода, Poronia, Saccobolus, Schizophyllum, Sclerotinia, Sordaria,
Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thraustotheca, Torula,
Trichoderma, Trichurus, Verticillium H др. (Ljungdahl, Eriksson,
1985).
По данным Stevens H Payne (1977), дрожжи TriCh0s/Joron
culaneum H T. pullulans обладают такой же способностью к раз-
ложению бумаги, как и грибы Trichoderma штабе и My;-ozhecium
verrucaria. KyJIbTypaJ1bHaH жидкость дрожжей обладает также
высокой ксиланазной активностью. Основными продуктами раз-
ложения Целлюлозы являются целлобиоза и глюкоза. Дрожжи
Cryptococcws albidus образуют внеклеточную эндо-В-1А-ксилана-
зу, природным индуктором ксиланазы служит ксилобиоза (Biely
et а1., 1980).
22
Наиболее активными продуцентами целлюцгоягитических фер-
ментов являются грибы рода Trichoderma, особенно Т. viride QM
ба, выделенный из гниющего патронташа в Новой Гвинее во
время второй мировой воины и более тридцати лет изучавшийся
в Нэтике (США) доктором Ризом и сотр. В 1977 г. было дока-
зано, что Trichoderma viride QM 6а имест специфические видо-
вые признаки, и в честь доктора Риза он был переименован в
Т. reesei. За последние 20 лет из этого организма был получен ряд
перспективных мутантов, обладающих способностью к сверхсин-
тезу целлюлаз.
В природе непрерывное разложение растительных остатков
происходит под действием сапрофитных микроорганизмов. Наи-
более важными деградаторами древесины являются грибы белой
И бурой гнили. Однако разложение древесины в естественных
условиях редко происходит под действием Монокультуры, но име-
ет место сукцессия микроорганизмов, КОЛОНИЗИрУчЮЩИХ лигноцел-
люлозный субстрат в виде древесных остатков. Обычно такая
сукцессия предполагает три стадии; 1—— колонизацию лигноцел-
люлозных остатков сапрофитными грибами, которые метаболи-
зируют легкоусвояемые соединения (сахара и др.); 2 -— преобла-
дание грибов, разлагающих целлюлозу; 3—— преобладание
деструкторов лигнина. Однако эта схема условна, и в реальной
ситуации характер разложения растительных остатков И сукцес-
сии Микроорганизмов подвержены влиянию многих факторов.
Установлено также, что дрожжи и бактерии влияют на раз-
ложение лигноцеллюлозы базидиомицетами, ускоряя этот про-
цесс. С другой стороны, Раггу и Slater (1984) показано, что
целлгололитическое сообщество, выделенное из почвы и состоя-
щее из 8 грибных и 2 бактериальных штаммов, не является более
эффективным в деградации целлюлозосодержащих материалов
по сравнению с чистыми культурами.
При исследовании компостируемой соломы Atkey И Wood
(1984) УСТЗНОВИЛИ экологическую сукцессию при микробной ата-
ке. Вначале доминировала бактериальная микрофлора, позднее
стали появляться актиномицеты. Микробные колонии связыва-
лись с полисахаридами клеточных стенок растений. В процессе
компостирования многие растительные волокна оказались полно-
стью разрушенными.
На установке для микробиологического разложения соломы
показана трехстадийность этого процесса. Состав микрофлоры в
первые 14-35 дней определяется наличием в среде легкоусвояе-
мых веществ, главным образом сахаров. К 85-му дню образова-
ние кислот замедляется и кислотность стабилизируется, что свя-
зано с потреблением сахаров. С 90-го по 120-й день активно раз-
вивастся целлюлолитическая микрофлора. После 134-r0 дня
активность целлюлолитической микрофлоры падает (Antunes et
al., 1986).
Все грибы белой гнили обладают способностью продуцировать
23
внеклеточную ФеНОЛОКСИДазу. Онн являются единственной груп-
пой микроорганизмов, разлагающей все компоненты древесины,
включая лигнин. Грибы белой гнили в противоположность грибам
бурой гнили деполимеризуют полисахариды до простых сахаров,
и продукты расщепления немедленно утилизируются. Это указы-
вает иа то, что энергия для расщепления лигнина должна быть
nonyucna H3 более доступных источников. С другой стороны, са-
xapa Могут быть необходимы как субстрат для образования Н2О2‚
которая образуется, например, когда глтюкоза окисляется до глю-
коновой кислоты глюкозооксидазой (Ljungdahl, Eriksson, 1985).
Грибы бурой гнили атакуют главным образом древесные по-
лисахариды и практически не затрагивают лигнин. На ранних
стадиях деградации целлюлозы грибы бурой гнили разрушают
целлюлозу быстрее, чем усваиваются продукты деполимеризации.
Полагают, что грибы бурой гнили до начала деполимеризации
целлюлозы должны иметь доступ к легкоусвояемым сахарам.
Эти сахара окисляются с образованием Н2О2, которая необходи-
ма для расщепления кристаллической целлюлозы.
Грибы мягкой гнили используют в основном углеводы древе-
сины и очень ограниченно модифицируют лигнин. Это в основном
виды Ascomycetes H Fungi imperfecti. B процессе роста этих гри-
бов в древесине возникают цилиндрические полости и происходит
эрозия клеточной стенки. Так, базидиомииет Conioplzora cerebel-
[а вызывает бурую гниль Древесины, продуцирует внеклеточную
целлюлазу, главным образом эндоглюканазу. Культуральная
жидкость имеет низкую активность по отношению к нативной
целлюлозе. Аскомииет Cha£’tomium the;-mophilla — тсрмофил,
продуцирует экзо- и эндоглюканазы и В-глюкозидазу. Гриб Thie-
[арго terrestris продуцирует внутри- и внеклеточные эндоглюка-
назы, (З-глюкозидазу и ферменты, расщепляющие фильтроваль-
ную бумагу (Breuil et а1., 1986).
Способностью разлагать целлюлозу обладают некоторые ана-
эробные грибы рубца: Neocallimastix frontalis, Sphaeromonas
commzmis H Piromonas comrmmis. Разложение целлюлозы ана-
эробными грибами рубца ведет к образованию уксусной кисло-
ты, СО2‚ этанола, молочной кислоты и водорода. Эти грибы мо-
гут культивироваться совместно с рубцовыми метаногенами
(Вапсйор, Mountfort, 1981). За счет целлюлолтттитлескоёт активно-
сти анаэробные грибы рубца способны глубоко проникать в
растительные ткани при росте мицелия. Эти грибы, по Данным
ВапсЬор (1981), напоминают примитивные водные фикомицеты.
Три морфологически отличных изолята анаэробных фикоми-
цетов были выделены из содержимого слепой кишки лошади. При
культивировании in Vitro два из них усваивают ста-целлюлозу,
ксилан, интенсивно разлагают растительные ткани (Огрйп, 1981).
Методами световой и сканирующей электронной микроскопии
обнаружено, что на волокнах растительных остатков в рубце
жвачных развиваются большие популяции анаэробных грибов.
24
Один из видов классифицирован как Neocallinlctstix fr0nl‘al1's.
Грибы растут in vitro на полосках фильтровальной бумаги и
образуют уксусную, молочную и муравьиную КНСЛОТЬд ЭТЗПШЪ
CO2 и 112. Таким образом, целлюлолитиггеские грибы являются
компонентом рубцовой микрофлоры и развиваются в анаэробных
условиях (ВаисЬор, 1982). Следует отметить, что РЗЗЛИЧНЫе ТИПЫ
микроорганизмов, включая бактерии, простейших и грибы, в про-
цессе разложения растительных субстратов в рубце Воздействуют
на клеточные стенки. Между микроорганизмами рубцовой микро-
флоры происходит сложное взаимодействие (Akin, Barton, 1983).
Бактерии часто прочно адгезированы на растительной клеточной
стенке в процессе ее деградации. Это в основном кокки и ОРГЗНИЗ‘
мы типа Bacteroides succinogerws. Определенные тииы бактерий
характерны для тех или ДРУГИХ кормов. ДелигтпгфИкацИя грубых
кормов способствует улучшению их перевариваемости в рубце.
Установлено, что метанобразующие бактерии Используют
продукты, полученные в происссе ферментации целлюлозы ана-
эробными грибами, для образования метана. Так, уксусная кисло-
та превращается в CO2 И CH4 Meflzanosarcina bar/Geri. Это указы-
вает на то, что целлюлолтттические анаэробные грибы МОГуТ
играть важную роль в разложении целлюлозы В рубце. В этой
связи возникает вопрос о возможной роли анаэробных грибов В
других экологических средах: почве, грязях.
Принято считать, что грибы бурой гнили, интенСИВн0 РЗЗЛЗГН‘
ющие целлюлозу, продуцируют только эндоглюканазу и нс
Продуцируют экзоглюканазу (Koenigs, 1974). Эти грибы В ПРО‘
цессе роста на древесине «атакуют» целлюлозу на значительном
расстоянии от грибной клеточной стенки, что послужило поводом
для предположения о том, что первоначальная атака ЦЭЛЛЮЛОЗЫ
осуществляется низкомолскулярным веществом, леГКО ДШЁФУНДИ‘
рующим на расстоянии. Однако и сегодня мехаНИЗМ ДеГРЗДЗЦИИ
целлюлозы грибами бурой гнили нельзя считать УСТЗНОВЛСННЫМ-
Хотя грибы, вызывающие мягкую гниль, способны раСЩеП-
лять кристаллическую целлюлозу, только некоторые ИЗ НИХ ПРО-
дуцируют полные внеклеточные целлюлолитИЧССКИе оИСТеМЫ
(эндо- и экзоглюканазы и В-глюкозидазу). Среди НИХ TrtCh0der-
ma viride, T. reesei, T. /eoningii, Penicillium funiculosltm, Fttsarium
solam‘ И др. Для культуральной жидкости большинства других
грибов этой группы характерно отсутствие экзоглюканазы. Эти
грибы, следовательно, могут деградировать более аморфные фор-
мы целлюлозы.
Деградация высокоупорядоченной формы целлюлозы осу-
ществляется благодаря синергическому действию комплекса
целлюлолитических ферментов. При любой комбинации экзо- и
эндоглюканаз Trichoderma koningii, Fusarium solani и Penz'Cz'lIz'um
funiculosum отмечается выраженный синергизм. Однако Синер-
гизм между экзоглюканазами этих грибов и ЭНДОГЛЮКЭНЗЗЗМИ
грибов, не продуцирующих экзоглюканазу (МуГОГ/ЮСГЫт Неписа-
25
ria), He выявлен. Нет также синергизма между экзоглюканазами
грибов п эндоглюканазами рубцовых бактерий. Последнее указы-
вает на существенное различие целлюлолитических систем грибов
и бактерий (Ljungdahl, Eriksson, 1985).
Разложение целлюлозы бактериями осуществляется в аэроб-
ных и анаэробных условиях. В естественной среде значительная
часть растительной биомассы превращается анаэробными бакте-
риями в метан и углекислый газ. Такие процессы происходят в
болотах, почве, реках, озерах и компостах. Особый интерес пред-
ставляет разложение целлюлозы в организмах травоядных жи-
вотных и насекомых. Из содержимого задней кишки термитов
были выделены Bacillus cereus, Serratia sp., а также 20 штаммов
актиномицетов, обладающих целлюлолитической активностью
(Pasti, Belli, 1985). Bacillus sereus хорошо растет на ое-целлю-
лозе и карбоксиметилцеллюлозе, а виды Serratia — на всех видах
целлюлозы (Тпауег, 1976). Симбиотическое расщепление цел-
люлозы бактериями отмечено также в кишечном тракте зеленой
черепахи (Panchel et a1., 1979).
Как уже отмечалось, цедтлтололитттческтте системы бактерий
отличны от таковых у грибов. Так, у многих целлюлолитических
бактерий нет целлобиазы, а если и есть, то и в этом случае они
могут усваивать целлодекстриньт и целлобиозу с помощью фос-
форилаз. В природе целлюлозные волокна, возможно, являются
для целлюлолитическпх бактерий лучшим субстратом, чем про-
дукты разложения. Это создает для бактерий ряд экологических
преимуществ. Бактерии, адсорбированные на целлюлозных во-
локнах, способны лучше потреблять продукты деградации суб-
страта.
Анаэробная бактерия Acet£vz'brz'o cellulolyticus продуцирует
внеклеточную целлюлазу, сопоставимую по активности с препа-
ратами из Aspergillus niger И Trichoderma viride (Khan, 1980).
Это облигатный анаэроб, растет при рН 6,5—7,7 и температуре
20—40 °С‚ ферментирует целлюлозу, целлобиозу и глюкозид са-
лицин с образованием водорода, углекислого газа, уксусной кис-
лоты, этанола, пропанола и бутанола. Асепигдгёо cellulolyticus
продуцирует индуцируемую внеклеточную эндоглюканазу. Син-
тез эндоглюканазы репрессируется глюкозой, хотя последняя не
метаболизируется Acetivibrio cellulolyticus (Mac Kenzie, Bilous,
1982). Основная масса клеток /lcetivibrio cellulolyticus
не агрегирует вокруг целлюлозных частиц. Полагают, что
Acetivibrio cellulolyticus может быть хорошим объектом для
изучения деградации целлюлозы прокариотами (Мас Kenzie,
Bilous, 1982).
Целлюлолитгтческтте организмы встречаются и среди клостри-
дий. Среди них известны Clostrzdium cellobioparum, выделенный
из рубца, С. papgrosolvens, C. thermocellum, выделенные из на-
воза, С. stercorarium, выделенный из компоста. Установлено, что
Clostridium acetobutilicum образует Целлюлазу и целлобиазу.
26
Главный продукт деградации целлюлозы Clostridium therm0cel-
1и2п—иеллобиоза и целлодекстрины. Полагают, что эти продук-
ты проникают в клетку, где они метаболизируются с участием
специфических фосфорилаз с образованием глюкозо-1-фосфата и
свободной глюкозы. Образование глюкозо-1-фосфата является
преимуществом для этого организма, так как при этом сохраняет-
ся энергия гликозидной связи. Конечными продуктами метабо-
лизма являются H2, CO2, этанол, уксусная и молочная кислоты
и др.
Преобладающими целлюлолитическими бактериями рубца
являются Bacleroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ru-
minococcus albus, Eubacterium cellulosolvens, Micromonospora
rmninantium, MiCrOm0n0Sp0ra propionici (Ljungdahl, Eriksson,
1985), Bacteroides succinogenes ферментирует целлюлозу, целло-
биозу‚ глюкозу, крахмал и другие углеводы, фиксирует СО2, про-
дуцирует внеклеточную эндоглюканазу. Целлюлазная активность
у этого организма также связана с мембранной фракцией клетки
и растворимой белковой фракцией, целлобиаза ассоциирована с
клеткой и является конститутивной.
Bactero£de5 succzmgenes способны использовать целлюлозу в
качестве единственного источника углерода. Бактерии полностью
покрывают волокна целлюлозы, плотно прилипая к нитям. Бес-
клеточные экстракты, а также культуральная жидкость плохо
гпдролизуют фильтровальную бумагу или микрокристаллическую
целлюлозу (Groleau, Forsberg, 1981). Bacteroides succinogerzes
S 85 продуцирует на среде с микрокристаллической целлюлозой
Множественные формы 6-1,4-эндог„люканаз (Schellhom, Fors-
berg, 1984). Семь дискретных целлюлаз, разделенные хромато-
графически, делились на две группы в зависимости от величины
отношения их деполимеризуюшей активности к сахаролитической
активности и от характера седиментаиии. Не осаждаемые при
центрифугировании фракции проявляли активность, более харак-
терную для экзоглюканаз. Предполагается, что целлюлазы этой
фракции играют определенную роль при гидролизе нераствори-
мой целлюлозы бактериями in situ. Глюканазы из этой фракции
имеют более выраженную тенденцию сорбироваться на нераство-
римых полимерах.
Некоторые штаммы Butyrivibrio fibrisolvens, особенно выде-
ленные из рубца овцы, разлагают целлюлозу и ксилан. Основны-
ми продуктами распада при этом являются H2, CO2, масляная
и молочная кислоты. Ruminococcus flavefaciens И R. albus актив-
но деградируют целлюлозу в рубце травоядных животных. Боль-
шинство штаммов усваивает целлюлозу и ксилан. Основные про-
дукты метаболизма целлобиозы — органические кислоты, этанол,
H2. Целлюлазы рубцовой бактерии Ruminococcus albus, как вне-
клеточные, так и связанные с клетками, являются эндоглюка-
назами. Степень агрегации субъединиц препаратов целлюлаз,
полученных из клеток, значительно варьирует.
27
Отмечен синергизм между целлюлазами Ruminococczzs albus
И целлобиогидролазой Trichoderma /eoningii при действии на
авицель (Wood, Wilson, 1984). Целлюлолитическая активность
у этих организмов имеет конститутивный характер. Основными
продуктами являются целлобиоза, целлотриоза и глюкоза. Пред-
полагается, что эти бактерии образуют большой ферментный
комплекс, связанный с клеточной поверхностью посредством
глюкопротеиновой оболочки, последняя способствует адгезии
клетки к целлюлозному субстрату. Ruminococcus albus, так же
как Clostridium thermocellum H Ruminococcus flavefaciens, про-
дуцирует фактор аффинитета, который связывает целлюлазу
или бактериальную клетку с субстратом. Eubacterium cellulo-
solvens весьма специфична по отношению к целлюлозным Суб-
стратам, хотя ее роль в рубце жвачных животных считается не-
существенной.
Род Cellulomonas представлен целлюлолитическими бакте-
риями, не образующими спор, растущими в аэробных и анаэроб-
ных условиях и способными деградировать целлюлозу из разных
источников. Целлюлазная система Cellulomonas сложна и, как
полагают, сходна с таковой у Closlridium thermocellum. Фер-
менты, продуцируемьте Cellulomonas sp., тесно связываются с
субстратом и появляются в культуральной жидкости только в
стационарной фазе (Ljungdahl, Eriksson, 1985). У одних видов
Cellulomonas конечным продуктом действия целлюлаз является
глюкоза, у других, как у Closfrfdillm tlzermocellum, образуется
целлобиозофосфорилаза, расщепляющая Целлобиозу с образо-
ванием глюкозы и глюкозо-1-фосфата. Так, по данным C110ud-
hury (1982-1984), осахаривающая багассу способность культу-
ры Cellulomonas sp. BbILLI€, чем разделенные центрифугировани-
ем супернатант и биомасса. В гидролизатах содержится более
высокий процент целлобиозы, чем глюкозы. Общая целлюлолтт-
тическая активность Cellulomonas эр. уступает Trichoderma
reesei.
Большой интерес представляет сообщение Calloway H Turner
(1983) о том, что из древесных червей выделена новая уникаль-
ная бактерия, которая может усваивать целлюлозу и фиксиро-
вать молекулярный азот. Бактерия является аэробньтм хемоге-
теротрофом. При сильной аэрации она нуждается в источнике
сложного азота, в микроаэрофильных условиях она связывает
атмосферный азот. Halsall H Gibson (1985) установили, что сме-
Шанные культуры Cellulomonas gelida H Azospirillum lipoferum
ИЛИ А. brasilense H C. денди, а также Bacillus macerans дегра-
дируют целлюлозу и солому и используют энергию продуктов
расщепления для фиксации атмосферного азота. В теченпе
30 дней кооперативного процесса целлюлоза расщепляется на
20%, а солома—на 28~30%, при этом связывается от 12 до
14,6 мг N/r целлюлозы и от 17 до 19 мг N/r СОЛОМЫ. Штаммы
Cellulomonas B отличие от грибов расщепляют целлюлозу при
28
низкой концентрации кислорода, что способствует тесной
ассоциации целлюлозоразрушаюших п микроаэрофильных диазо-
трофных микроорганизмов. В культурах, инокулированных пер-
воначально бактериями в различных пропорциях, устанавлива-
ется стабильное соотношение клеток Azospirillum 11 Cellulomo-
nus — I : 3.
Целлюлолитические бактерии представлены также многими
видами спорообразующих аэробов или факультативных анаэро-
бов. Целлюлолитигтеские ферменты этих бактерий плохо изуЧС-
ны. Конечными продуктами расщепления целлюлозы этими бак-
териями может быть целлобиоза и глюкоза. Выделены (Sharrock,
1983) анаэробные термофильные целлюлолитические бактерИИ‚
растущие при 75 °С. Время полуинактивации эндоглюкаиазы ИЗ
этих бактерий составляет 5 ч при 85 °С. Получен также штамМ
алкалофильной Bacillus sp., продуцирующий целлюлазу с опти-
мумом действия при рН 9,0, целлюлаза стабильна при рН 6-41
и температуре 40 °С, но быстро инактивируется при 60 °С. Фер-
мент характеризуется высоким содержанием аспарагиновой кис-
лоты, не содержит цистеина и предположительно обладает транс-
глюкозидазной активностью (Fukumori et а1., 1985). Sashihara
et а1. (1984) описали Bacillus sp., продуцирующий две карбо-
ксиметилцеллюлазы, активные при рН 5—10‚9 и стабильные ПрИ
75 °С. Гены двух ферментов были клонпрованы в кишечной Ha-
лочке, ферменты синтезировались и выделялись в периплазмати-
ческое пространство.
Из горячих источников выделен новый род термофильных
ацидофильных целлюлолитических бактерий Acidot/zermus cellu-
lolyticus. Это облигатные аэробы, прототрофы, термофилы с
диапазоном температур для роста 37—70 °С, ацидофилы с 11113‘
пазоном рН 4,5——7‚0 (Mohagheghi et а1., 1986). Некоторые вИдЫ
бактерий рода Pseudomonas Целлюлолитические. Наиболее изу-
чен Р. fluorescens var. cellulosa, продуцирующий сложную Цед‘
люлолитическую систему. Установлено, что Rhizobium trifolii
при росте на среде с целлюлозой и гемицеллюлозой продуцирует
целлюлазу, способную разрушать клеточные стенки корней
растений.
Среди видов Cellovibrio наиболее изучен С. gilvus, которЫЙ
конститутивно продуцирует несколько эндо-В-1,4-гл1оканаз, pac-
щепляющих целлюлозу до целлобиозы или Целлотриозы и даль-
ше метаболизирующихся с участием целлобиозофосфорилазЫ.
В отличие от С. gilcus целлюлаза С. fulvus репрессируется глю-
козой, п ее локализация зависит от источника углерода (Berg,
Petterson, 1972). На легкоусвояемых источниках углерода (глю-
козе, целлобиозе) эндоглюкаиазная активность связана с клет-
кой, а на целлюлозных субстратах — с субстратом.
Ряд видов бактерий родов Cytophaga, Herpetosiphon И $190-
rocytoplzaga, относящихся к семейству Cytophagaceae, расЩеП-
ляет некоторые полисахариды, в том числе целлюлозу. ОНИ
29
обитают в почве, морской и пресной воде. Sporocytophaga тухо-
coccoides растет в тесном контакте с целлюлозным волокном.
Sporocytophaga myxococcoides продуцируют экзо- и эндоглюка-
назы с образованием глюкозы при действии на растворимые 11
нерастворимые олигосахариды. Однако эти бактерии не дегра-
дируют кристаллическую целлюлозу. Некоторые виды Cytophaga
продуцируют целлюлазы, действующие на кристаллическую
целлюлозу и ее производные. Их целлюлазы отличаются низкой
молекулярной массой и локализованы в периплазме (Ljungdahl,
Eriksson, 1985).
Целлюлолитические штаммы также обнаружены среди видов
Streplomyces, Thermoactinomyces H Thermomonospora. Так, Strep-
tomyces flavogriseus продуцирует внеклеточную [3-1,4-глюканглю-
каногидролазу, действующую на фильтровальную бумагу и хло-
пок. Виды Thermoactinomyces H Thermomonospora H0 своей
внеклеточной целлюлюлитической активности сравнимы с Trich0-
derma стае. Оптимум рН для целлюлаз Thermoactinomyces 5,5
H 6,5, оптимум температуры 65 °С. Синтез целлюлаз подвержен
катаболитной репрессии.
У термофильного актиномицета Microbispora bispora, отлича-
ющегося высокой активностью и способного расти при 55°С,
оптимум активности целлюлаз Широкий (рН 5‚5——7,2), целлю-
лазы характеризуются стабильностью. Основным продуктом рас-
Щепления целлюлозы целлюлазой является глюкоза (Wa1dr0r1
et a1., 1986).
B природе в процессе фотосинтеза производится большое
количество целлюлозы. Неудивительно поэтому, что возникли
многие виды целлюлолитических микроорганизмов, и функцио-
нируют 011H весьма эффективно. В почве целлюлозная и геми-
целлюлозная части биомассы разлагаются интенсивнее, чем
лигнин, и быстро метаболизируются почвенными микроорганиз-
мами. Показано (Sarkar, 1984), что целлюлаза из Tric/zoderma
viride образует с гуминовой кислотой комплекс, стабильный
даже в почвенных условиях. При внесении азота в почву разло-
жение лигнина и целлюлозы ускоряется. Добавление глюкозы
вызывает обратный эффект. Окончательный продукт деградации
целлюлозы-СОЪ но если процесс протекает в анаэробной
среде, образуется также метан.
целлюлолитические организмы снабжают легкоусвояемым
источником углерода (глюкозой и целлобиозой) популяции дру-
гих почвенных микроорганизмов. Последние потребляют из среды
свободные сахара, которые ингибируют деградацию целлюлозы.
Такой «симбиоз» стимулирует процесс деструкции этого поли-
сахарида. Так, ассоциация, содержащая целлюлолитические
Sporocytophaga sp. H не деградирующую целлюлозу Flav0bacte-
rium sp., более эффективно разлагает целлюлозу, чем Sp0r0cy-
tophaga sp. Таким образом, участие ассоциации бактерий в раз-
ложении целлюлозы — обычное явление.
30
Значительная часть целлюлозы разлагается в анаэробных
условиях. В рубце разложение идет, скорее, с образованием
органических кислот. Следовательно (Ljungdahl, Eriksson, 1985),
разложение целлюлозы в анаэробных условиях состоит из двух
взаимосвязанных процессов. Первый—это окисление целлюло-
зы до CO2 И восстановление протонов до Н2, второй — окисление
Н? и восстановление CO2 до уксусной кнслоты и метана, сульфа-
та —— до Н25 или нитрата — до аммиака. Это указывает на важ-
ную роль H2 в анаэробном разложении целлюлозы. На первом
этапе бактерии образуют H2, a Ha втором они его потребляют.
Другими словами, Н2 переносится от Н2-продуцирующих к H2-
потребляющим бактериям. Концепция межвидового переноса
водорода оказала огромное влияние на понимание механизмов
генерации энергии у анаэробных Микроорганизмов и фермента-
ции с участием смещаннь1х культур (Peck, Odom, 1984; Ljur1g-
dahl, Eriksson, 1985).
Знание физиологии бактерий в ассоциациях, превращающих
целлюлозу в CO2 И метан, позволило понять, что эта конверсия
происходит через стадии, которые обеспечиваются определенной
метаболической группой бактерий. Если, например, в ассоциации
целлюлолитическая бактерия представлена Clostridium thermo-
сенат, то она гидролизует целлюлозу до целлобиозы и глюкозы
с помощью внеклеточных целлюлолитических ферментов. Clos-
lridium thermocellum сбраживает часть сахаров до молочной и
уксусной кислот, этанола, CO2 и H2. Однако, если Clostridium
thermocellum не имеет спутников, глюкоза и целлобиоза накап-
ливаются в среде и, наконец, достигают концентрации, когда они
ингибируют целлюлолитическую систему. Если в среде имеется
другая бактерия, способная метаболизировать глюкозу и целло-
биозу, она потребляет эти сахара и продуцирует соответствую-
щие метаболиты.
Если целлюлолитическая бактерия представлена Clostridium
thermohydrosulfuricum, то она из глюкозы и целлобиозы обра-
зует те же продукты, что и С. thermocellum. При совместном
культивировании эти бактерии более эффективно разлагают
целлюлозу, чем одна Closlridium thermocellum, при этом тип
метаболизма бактерии-спутника определяет, какими будут про-
дукты в среде. В смешанной культуре Clostridfum thermocellum
И Thermoanaerobacter ethanolicus, продуцирующей этанол и СО2‚
основными продуктами разложения целлюлозы являются этанол
и СО2 (Ljur1gdah1,Erikssor1, 1985).
Бактериальные целлюлазы термофильных и мезофильных
организмов представляют интерес с точки зрения применения их
для получения этанола из целлюлозы. С этой целью Целесооб-
разно использование культуры видов Clostridium. Целлюлазы,
секретируемые этими микроорганизмами,-— это эндо- и экзоглю-
каназы с оптимумом рН 5,2 и 5,4, температуры —- 65 и 67 °С со-
ответственно. Внеклеточная целлобиаза у Ciostridium thermo-
31
celltmz отсутствует. И хотя целлюлазы этого организма слабо
ингибируются глюкозой и целлобиозой‚ скорость осахаривания
целлюлозы вдвое меньше, чем для целлюлаз Trio/zoderma reesei.
Установлено, что на поверхности Clostridium thermocellum об-
разуются сложно организованные многоферментные комплек-
сы—целлюлосомы‚ которые ответственны за Прикрепление
клетки к целлюлозе и выделение ферментов в среду. Внекле-
точные и связанные на клеточной стенке целлюлозосвязующие
факторы (ЦСФ) идентичны по молекулярной массе, строению и
составу субъединиц, а также иммунологически (Lamed et 211.,
1983а).
ЦСФ, выделенный из культуры Clostridium thermocellum,
представляет собой комплекс субъединиц с ММ 2100000 и раз-
мером молекулы 18 нм. Субъединицы имеют сложную четвертич-
ную структуру. Комплекс разделяется на 14 полипептидных
цепочек. По крайней мере 8 полипептидных компонентов ЦСФ
обладают целлюлолитической активностью. Предполагается, что
ЦСФ-это многокомпонентный комплекс или группа комплек-
сов с индивидуальной антигенностью, множественной целлюлаз-
ной активностью и способностью связываться на целлюлозе.
ЦСФ не только ответствен за плотное сцепление клеток с целлю-
лозой, но также представляет собой основную часть целлюлоли-
тического аппарата этого организма (Вауег et а1.‚ 1983).
У мутантов, потерявших способность к адгезии, этот фактор
отсутствует. Полагают, что в процессе адгезии взаимодействие
субстрата с антигенным фактором, который является высоко-
молекулярным полипептидом‚ может индуцировать синтез цел-
люлаз. Частичная денатурация внеклеточного фактора додецил-
сульфатом натрия вызывает распад комплекса на соответству-
ющие субъединицы. Полученные данные, по мнению авторов,
указывают на определенную организацию эндо- и экзоцеллюлаз
в родственные мультиэнзнмные комплексы, названные целлю-
лосомами. Видимо (Lamed et а1., 1983а), целлюлазы образуют
на поверхности субстрата тонкую сложную структуру. Это муль-
тиэнзимная высокоорганизованная структура, ответственная как
за клеточную адгезию, так и за эффективность ферментативного
гидролиза вследствие создания пространственной близости раз-
личных комплиментарных ферментов. Такая структура на кле-
точной поверхности, как целлюлосома, может быть важным
фактором эффективной деградации целлюлозы анаэробными
бактериями.
y мутанта Clogtridium 2‘/zermocellum, потерявшего способность
образовывать компонент ЦСФ, ответственный за сцепление с
клеткой, при росте на среде с целлюлозой происходит восстанов-
ление способности к образованию полноценного ЦСФ (Вауег et
a1., 1983).
Clostridium lhermocellum ЛИ 20 в процессе роста на среде с
целлюлозогт также продуцирует целлюлолитические ферменты,
32
которые на ранних стадиях ферментации связаны с субстратом.
Ферменты выделяются в культуральную жидкость после потреб-
ления целлюлозы в виде трех основных комплексов, качественно
схожих по содержанию 20 различных полипептидов, из которых
около десяти являются основными компонентами (Ноп-папи
ей а1., 1986).
Условия роста (среда с целлюлозой или среда с целлобио-
зой) критически влияют на распределение целлюлосом у мутан-
тов Clostridium thermocellum (Bayer et а1.‚ 1985). У них (в про-
тивоположность диким типам) целлюлосомы на поверхности
клеток отсутствуют, а незначительное образование внеклеточ-
ных целлюлосом сопровождается продуиированием других низ-
комолекулярных целлюлаз. Полииептидный состав соответству-
ющих очищенных целллолосом у мутантов и диких типов Cl0sz‘ri-
diam thermocelltmz сходен. У диких типов бактерий на клеточной
поверхности выявлены полицеллюлосомные протуберанцы, ко-
торые отсутствуют у Мутантов. Примечательным свойством Цел-
люлосом является их стабильность. Предполагается, что орга-
низация множественных форм Целлюлолитических ферментов
(каждый из которых обладает сродством к субстрату) в боль-
шой комплекс способствует увеличению аффинитета всего комп-
лекса к субстрату.
Связанная с поверхностью целлюлазная активность отмечена
также у капсульных структур Ruminococcus albus (Stack, Hun-
gate, 1984). Секреция фермента коррелирует с появлением боль-
ших везикул, У другой бактерии рубца — Bacteroides succL'n0ge-
nes (Groleau, Forsberg, 1981) ысекретируемый фермент связан
с мембранными фрагментами. Таким образом, прослеживается
общая закономерность специализации ферментсодержащих по-
верхностных структур клетки анаэробных целяиодголитпческих
бактерий, обеспечивающих адгезию клетки на субстрате и его
гидролиз.
целлюлолитическая система Clostridzum thermocellum, свя-
занная на целлюлозе в течение начальных стадий роста, была
разделена на два комплекса, представляющих собой сферичес-
кие частицы с ММ 4,2-105 И 102-105 (Coughlan ей а1.‚ 1985).
Предполагается, что целлюлолитическая система Clostridium
thermocellum вначале функционирует в виде больших комплек-
сов, при их диссоциации образуются комплексы, которые обна-
руживаются в культуральной жидкости и, если не деградиру-
ются, могут повторно связываться с целлюлозой.
При росте дикого штамма Clostridium thermocellum на среде
с Целлобиозой на поверхности клеток выявляются многочислен-
ные полусферические выступы размером 130——200 нм><60——
100 нм. Эти образования являются полицеллюлосомами, объ-
единяющими несколько сотен целлюлосом. В процессе роста
бактерий на целлюлозе происходит резкое изменение этих вы-
ступов с образованием аморфной или фиброзной сетчатой струк-
З. Зак. 966 33
туры, которая соединяет поверхности клетки и целлюлозы, об-
разуя «контактный коридор». Однако за непосредственное свя-
зывание с клеткой ответственны целлюлосомы (Lamed, Bayer,
1986).
Ljungdahl et al. (1983) обнаружили, что Closlridium thermo-
сенат выделяет в культуральную жидкость желтое вещество
(ММ 1500) с высоким сродством к целлюлозе, что приводит к
ее окрашиванию. Конъюгат целлюлозы и желтого вещества
имеет большее сродство к эндоглюканазе, чем одна целлюлоза.
Также показано, что внеклеточная целлюлазная активность тер-
мофильного анаэроба Clostridium thermocellum зависит от на-
личия Ca2+ И тиолвосстанавливающих агентов. Максимум актив-
ности целлюлаз из Clostridium наблюдается при 70 °С и рН
5,7—6,1. По-видимому, Clostridium t/zermocellum помимо эндо-
глюканазы продуцирует также экзоглюканазу и целлобиогидро-
лазу (Johnson et a1., 1982).
При совместном культивировании бактерий Cellulomonas И
Clostridium в анаэробных условиях расщепление целлюлозы
происходит более интенсивно и с образованием большего коли-
чества сахаров, чем при выращивании чистых культур (Andria-
narisoa et а1.‚ 1984). Таким образом, видно, что целлюлолити-
ческие системы бактерий и грибов различны. Основное
отличие —- это высокая величина отношения эндоактивность——
экзоактивность у бактерий по сравнению с грибами.
Принято считать, что термофильные целлюлолитические мик-
роорганизмы являются потенциально более перспективными про-
дуцентами целлюлаз. Один из HHx——Microbispora bispora—-
продуцирует целлюлолитический комплекс, стабильный при 60-
65 “С, включает эндоглюканазу, целлобиогидролазу и в-глюко-
зидазу. Последняя не выделяется в среду и связана с клеточной
стенкой (ВагНеу et а1., 1984). В-1,4-Эндоглюканаза Myceliopht/zo-
ra thermophila по величине периода полуинактивации при 65” С
(3 сут) в 200 раз превосходит эндоглюканазу из Trichoderma
reesei (22 МИН в тех же условиях) (Клесов и др.‚ 1986). Однако
высказываются и сомнения по этому поводу, например то, что
оптимумы и максимумы температурной активности целлюлаз из
термофильных грибов немногим выше, чем у целлюлаз мезо-
фильных штаммов. Это неудивительно, так как Целлюлазы ме-
зофильных организмов способны выдерживать температуры, при
которых растут термофильные грибы.
В течение ряда лет исследование механизма действия цел-
люлолитических ферментов шло медленно, так как не были из-
вестны микроорганизмы, продуцирующие внеклеточные фермент-
‘Hue комплексы, способные осахаривать такие высокоорганизо-
ванные формы целлюлозы, как хлопок.
Способность бесклеточных препаратов Целлюлолитических
ферментов расщеплять целлюлозу одним из первых продемон-
стрировал Halliwelt (1966). В его опытах отмечены три стадии
34
расщепления хлопка внеклеточной целлюлазой Trichoderma ko-
ningi: фрагментация хлопкового волокна, образование раство-
римых продуктов целлюлолизиса и, наконец, образование глю-
козы. Причем образование коротких нитей и глюкозы происходит
одновременно (Halliwell, 1966).
При инкубировании неочищенного препарата культуральной
жидкости Tric/zoderma /eoningi с обезвошенным волокном хлопка
при рН 5,0 Marsh (1957) также наблюдал выраженную фрагмен-
тацию. Образование коротких нитей происходило только при
сильном встряхивании. Присутствие кислорода на фрагмента-
цию не влияло. Она сопровождалась незначительным выделени-
ем растворимых сахаров. По мнению Marsh (1957), фрагмента-
ция нитей хлопка——явление неспецифическое и обусловлено
повышенной хрупкостью хлопкового волокна вследствие воздей-
ствия фермента и появления поперечных трещин.
Berg et al. (1972) с помощью световой и сканирующей элект-
ронной микроскопии обнаружили разрушение целлюлозы бак-
терияМи Cellvibrio fulvus И Sporocytophaga myxococcoides.
B кристаллические участки микрофибриллы х.лопка бактерии
проникали с трудом, и его расщепление шло медленно. Фильт-
ровальная бумага и целлюлозная пудра разрушались быстрее.
Cellvibrio fulvus образовывала скопления между микрофибрил-
ламп и разрушала целлюлозное волокно. Древесные волокна
быстро разрушались бактериями обоих родов после удаления
лигнина, Структура этих волокон не столь плотная, как у хлоп-
ка, поэтому бактерии легко проникали в полость волокна. Ki1ber-
tus её а]. (1973) при Электронномикроскопическом исследовании
наблюдали, как на поверхности волокон целлюлозы под дейст-
вием внеклеточной целлюлазы Trichoderma стае появлялись
трещины и разрывы.
Предполагается зависимость между размерами поверхности
субстрата и скоростью ферментативного гидрдлггза целлюлозы.
При Действии частично очищенной целлюлазы Trichoderma vi-
пае на кристаллическую гидроцеллюлозу King (1966) наряду с
поверхностной эрозией субстрата зафиксировал фрагментацию
субстрата, которая по образующимся фрагментам отличалась
от фрагментации хлопкового волокна, наблюдаемой Halliwell
(1966). Из микрокристаллических частиц гидроцеллюлозы диа-
метром 6 мкм B опытах King образовывалось до 1500 частиц
меньшсго размера.
Целлюлоза является высокоупорядоченным полимером, и ее
способность к набуханию или растворению предопределяет гид-
ролитическое действие целлЮлазЫ. Такая подготовка субстрата
может осуществляться в результате физико-химической обра-
ботки, действия солнечной радиации, а также под влиянием
малых количеств перекиси водорода, Перекись водорода в при-
сутствии солей железа в кислой среде вызывает каталитическое
расщепление хлопка, травы, соломы, сена и опилок. Halliwell
3* 35
(1966) полагает, что таким может быть альтернативный, или
дополнительный, наряду с гидролитическим действием целлю-
лазы механизм дезинтеграции целлюлозы. Микроорганизмы, об-
ладающие способностью образовывать перекись водорода, бла-
ГОДЗрЯ НЗЛИЧИЮ ГЛЮКОЗООКСИДЗЗЫ осуществляют ЛОКЗЛИЗОВЗН-
ную атаку на природную целлюлозу. Подобного рода реакции
имеют большое значение при действии некоторых дереворазру-
шающих грибов, например Sporotrichum pulverulenlum (Eriks-
son et а1.‚ 1974). Аналогичные окислительные ферменты выявле-
ны и у других микроорганизмов, разлагающих целлюлозу: P0-
lyporus adustus, Myrothecium verrucaria, Trichoderma viride.
Для фрагментации нитей хлопка под действием культураль-
ной жидкости Trichoderma reesei требуется также присутствие
кислорода (Vaheri, 1982). Предполагается, что в начальной ста-
дии расщепления хлопка окислительные реакции вызывают из-
менения в целлюлозе, которые хотя и не приводят к образова-
нию растворимых продуктов, но повышают чувствительность
субстрата к эндо-В-глюканазе. Выявлено, что в процессе рас-
щеплеиия целлюлозы ферментами Trichoderma reesei Образуют-
ся альдоновые кислоты, продукты окисления углеводов. В отсут-
ствие кислорода не происходит фрагментации хлопка на корот-
кие нити. Видимо, в ранних стадиях деградации целлюлозы
определенную роль играют окислительные процессы. При индук-
ции целлюлаз окислительные ферменты обнаруживаются в среде
культивирования, тогда как у неиндуцированной культуры окис-
лительные ферменты связаны с клетками. Так как эти ферменты
обнаруживаются у гриба, выращенного на среде с глицерином,
предполагается различная регуляция образования целлюлаз и
окислительных ферментов (Vaheri, 1985).
Важным фактором, определяющим расщепление высокоорга-
низованных субстратов, таких, как, например, хлопок, является
их надмолекуляриая структура. Еще в 1961 г. Selby (1961) отме-
чал, что по сравнению с кислотным гидролизом деиствие целлю-
лаз на хлопок при одинаковом образовании редуцирующих групп
в нерастворимом остатке сопровождается большими потерями
массы субстрата. Воздействие ферментов имеет более сильный
эрозирующий эффект.
Методом малоуглового рентгеновского рассеяния установлено,
что молекула целлобиогидролазы Trichoderma reesei имеет (pop-
My клина с изотропной головкой и длинным хвостом (Schmuck
et а1.‚ 1986). Grethlein (1985) удалось установить корреляцию
между начальной скоростью гидролиза и количеством Пор дед.
люлозного субстрата, доступных по размерам для молекул цел-
люлаз. Показано, что субстраты, имеющие больше пор, чувстви-
тельнее к действию целлюлаз. В то же время не выявлено зави-
симости между степенью кристалличности и скоростью гидро-
лиза.
Получены также данные о том, что лимитирующие скорость
36
гидролиза целлюлозы компоненты бактериальных и грибных
целлюлазных комплексов одинаковы по размеру. Последний зна-
чительно меньше максимального размера пор в нативных Цел-
люлозных субстратах (Weimer, Weston, 1985).
Микроорганизмы, расщепляющие природную целлюлозу, оби-
тают или на поверхности целлюлозного, например хлопкового,
волокна, или во внутреннем его отверстии, например у древеси-
ны. Внеклеточные целлтололитические ферменты могут быть
связаны на поверхности микробной клетки, и тогда необходим
непосредственный контакт микроорганизма с субстратом. Если
Целлюлазы выделяются в окружающую среду, то они проникают
в тонкие клеточные структуры и воздействуют на микрофибрил-
ляриую и тонкую капиллярную или молекулярную структуры
волокна. Микроскопическая картина повреждения цеттлтолозньтх
структур целлюлолитическими ферментами весьма специфична
для определенных групп микроорганизмов (Cowling, Brown,
1969).
Для того чтобы целлюлозные микрофибрттлльт с очень слож-
ной структурной организацией деполттмеризовались цедтлюлаза-
ми до образования растворимых легкоусвояемых продуктов, не-
обходимы условия, обеспечивающие диффузию ферментов в
структурный матрикс целлюлозы, и возникновение комплекса
фермент-субстрат. Целлюлаза должна не только проникнуть в
целлюлозную структуру, но, чтобы расщепить определенные
р-гликозидные связи, прийти в стерическое соответствие с суб-
стратом. При воздействии на целлюлозу в отличие от других ти-
пов ферментативных реакций, протекающих в растворе, действие
фермента осуществляется на разделе фаз раствора фермента и
нерастворимой поверхности субстрата.
Полагают, что на скорость ферментативного гидролиза влияет
величина реакционной поверхности субстрата (Fan et а1., 1981).
Так, отмечена определенная зависимость между начальной ско-
ростью ферментативной реакции и поверхностью целлюлозных
гелей, доступных молекулам целлюлаз (Stone et а1., 1969).
Сложность и гетерогенность лигноцеллюлозных субстратов тре-
буют последовательного воздействия на них весьма большого
количества ферментов. Поэтому химический состав и физические
особенности субстратов, ограниченные возможности одного ми-
кроорганизма продуцировать весь необходимый набор ферментов
определяют устойчивость целлюлозной микрофибрилльт к воз-
действию ферментов данного микроорганизма.
Под влиянием целлюлолитических ферментов природная
Целлюлоза изменяет свои физические свойства еще до появления
редуцирующих сахаров. Это выражается в появлении попереч-
ных трещин и потере прочности, снижении степени полимериза-
ции, повышенной адсорбции влаги и щелочи и, наконец. во
фрагментации целлюлозного волокна. Подробно факторы, опре-
деляющие чувствительность целлюлозных структур к фермента-
37
тивному гидролизу (содержание влаги, форма и диффузионные
свойства молекул фермента, размеры и свойства Поверхности
капилляров, пространства между микрофибриллами и макромо-
лекулами целлюлозы в аморфных участках, степень кристаллич-
ности и полимеризации цедхлюлозы, конформация и стерическая
ригидность ангидроглюкозных единиц и др.), рассматриваются в
обзоре Cowling И Brown (1969).
K HCJIJIIOJIOJII/ITYHCCKHM относят ферменты, которые расщеп-
ляют [5-1‚4-гликозидные связи целлюлозы между остатками D-
ГЛЮКОЗЫ целлюлозы и ее растворимых Производных. Наиболее
распространенная целлюлаза——эндоглюканаза‚ или [5—1,4-D-
глюканглюканогидролаза‚ способная гидролизовать любую гли-
козидную связь в молекуле целлюлозы. Однако при высокой сте-
пени полимеризации субстрата вероятность атаки эндоглюкана-
зой внутренних его связей значительно выше, чем крайних. Поэ-
тому в результате такого неупорядоченного действия образуются
фрагменты молекулы целлюлозы различной длины (Рабинович,
1987).
Так как зндоглюканазы расщепляют целлюлозные цепи по-
середине, образуются в значительном количестве невосстанавли-
вающиеся концы. От последних целлобиогидролазы и глюкогид-
ролазы отщепляют целлобиозу и глюкозу. Целлобиаза, которую
не всегда считают целлюлазой, гидролизует целхлобиозу до глю-
козы. В деградации упорядоченных форм целлюлозы могут
принимать участие окислительно-восстановительные ферменты——
целлобиозооксидаза и целлобиозохиноноксиредуктаза‚ которые
окисляют целлобиозу и целлоолигосахариды до целлобиозолак-
тона или до целлобионовой кислоты. Целлюлолитические фер-
менты при очень высоких концентрациях конечных продуктов в
системе могут катализировать реакцию синтеза [з-1,4-гликозид-
ной связи, а также реакцию трансгликозилирования, в результа-
те чего к Примежуточному фермент-субстратному соединению
присоединяется дополнительная молекула субстрата, при этом
тип связи изменяется с [5-1,4 Ha [5-1,6 или [5—1,2. Эти реакции
осуществляются в основном эндоглюканазами и целлобиазой и,
как полагают, играют определенную роль в образовании индук-
тора синтеза целлюлаз (Рабинович, 1987).
По современным представлениям, гидролиз целлюлозы про-
исходит под действием полиферментной системы или целлюлаз-
ного комплекса и конечным продуктом гидролитического рас-
щепления целлюлозы является глюкоза. Различают четыре ос-
новных индивидуальных компонента целхлюлазньтх комплексов:
эндоглюканаза (КФ 3.2.1.4), целлхобиогидролаза (КФ 3.2.1.91),
ЭКЗОГЛЮКОГИДрОЛЗЗЗ (КФ 3.2.1.74) и целлобиаза (КФ 3.2.1.21).
Число индивидуальных целлхюлолитических ферментов и их раз-
нообразных форм, входящих в состав целлюлазного комплекса,
различно и зависит от источника целлюлазы (Клесов и др‚,
1985а).
38
Имеются данные, что эндоглюканаза Trichoderma reesei Не-
посредственно действует на исходную нерастворимую целлюлозу
с образованием глюкозы и Целлобиозы. Целлобиогидролаза об-
разует целлобиозу непосредственным действием на исходную цел-
люлозу и на промежуточные нерастворимые целлоолигосахаридьт
(продукты действия эндоглюканазьт). Полагают, что целлобио-
гидролазе принадлежит ключевая роль при гидролизе микрокри-
сталлической целлтолтозьт (МКЦ) (Клесов и др., 1985). Целлобио-
Рис. 4. Общая схема фермен-
тативного гидролиза карбокси-
метттлцеллюлозьт (Клесов и др.,
1985а; Рабинович, 1987): 5-
исходная молекула субстрата,
Gn —— целлодекстриньт, G2 -
целлобиоза, G -— глюкоза, E1——
E4 — соответственно эндоглю-
канава, целлобиогидрогтаза, цел-
лобиаза, экзоглюкогидролаза
гидролаза, по мнению Клесова и др. (1985), в процессе гидролиза
многих видов нерастворимой целлюлозы образует до 80% глтоко-
зы и 80—90% иеллобиозы. В тех целлюлазных комплексах, где
целлобиогидролаза отсутствует (например, у микроскопических
грибов рода Aspergillus), ee каталитическую роль выполняет
эндоглюканаза‚ что приводит к существенно меньтпему образова-
нию глюкозы и в целом к заметному снижению эффективности
ферментативного гидролиза целлюлозы.
Общая схема ферментативного гидролиза растворимой кар-
боксиметилиеллюлозы, по Клесову и др. (1985а) и Рабиновичу
(1987), представляется в виде серии последовательно-параллель-
ных реакций, в каждой из которых может работать несколько
ферментов (рис. 4).
Рабиновичем (1987) выявлена доминирующая роль нецелло-
биазного пути образования глюкозы при ферментативном гидро-
лизе растворимых производных целлюлазными компонентами ря-
да грибов, Обнаружено специфическое свойство сорбирующихся
целлюлаз диспергировать целлюлозные частицы. На основании
этого сделан вывод о существовании у прочно сорбирующихся
частиц некаталитических функций поверхностно-активных ве-
ществ, способствующих диспергированию целлюлозы. Автор
предполагает, что деградация высокоупорядоченной целлюлозы
есть результат совместного действия прочно и слабо сорбирую-
щихся целлюлаз, причем основная роль принадлежит первым.
Прочно сорбирующиеся эндоглюканазы разрушают наибольшее
число внешних аморфных областей, соединяющих отдельные
микрокристаллиты, и образуют дефекты, заполняемые сильно
сорбирующимися целлобиогидролазами
39
Под действием прочно сорбирующихся ферментов, концентри-
рующихся и диффундирующих в глубь дефектов, расширяемых
как за счет гидролиза, так и механическим путем, происходит
диспергирование, расслаивание микрокристаллитов с понижением
их поперечной упорядоченности и высвобождением внутренних
неупорядоченных областей. Слабо сорбирующиеся эндоглюканазы
И Целлобиогидролазы активно работают на вновь образующейся
поверхности. При этом эндоглюканазы Действуют на аморфные
области либо вблизи концов молекул, уложенных в микрокри-
сталлиты. По мнению Рабиновича, в противоположность уста-
новившейся точке зрения воздействие эндоглюканаз на глико-
зцдные связи, лежащие в кристаллических областях, невозможно.
Мо1опеу‚ Coughlau (1983) показано, что адсорбция целлю-
лазных компонентов Talaromyces emersonii на целлюлозе воз-
растает при увеличении температуры (от 4 до 45 или 60 °C)
И рН (от 3,8 до 5,8). Скорость десорбции всех компонентов воз-
растает при повышении температуры от 60 до 65 “С. Фермента-
тивная деструкция субстрата способствует переходу компонен-
тов из комплекса в жидкую фазу.
Получены доказательства существования двух форм
эндоцеллюлазной активности у Agaricus bisporus (Manning,
-Wood, 1983). Одна из них сильно сорбируется на целлюлозе и
преобладает в культурах с низким содержанием целлюлозы, а в
культурах с высоким содержанием целлюлозы преобладает
форма цемюлозьл, которая не адсорбируется.
При исследовании очищенных ферментов Eupenicillium
java/zicum установлен различный характер сорбции целлюлаз.
Matsuno е‘: а1. (1986) пришли к заключению, что стадия быстрой
адсорбции соответствует связыванию целлюлаз на наружной
поверхности пучков микрофибрилл целлюлозы, а на стадии
медленной адсорбции происходит проникновение целлголаз во
внутренней области пучков микрофибрилл
Hiroshi et a1. (1986) установили, что неионные амфотерные
и катионные поверхностно-активные вещества усиливают осаха-
ривание целлюлозы целлюлазами Trichoderma viride. Наиболее
эффективное из них Твин 20, по мнению авторов, действует глав-
ным образом на гидролиз кристаллической целлюлозы 11 наруша-
ет адсорбцию эндоглюканазы на Целлюлозе, что выражается в
увеличении скорости гидролиза субстрата. Гусаковым и др. (1986)
обнаружен эффект обратимой инактивации целлюлолитических
ферментов, образующих Целлобиозу. при их сорбции на поверх-
ность субстрата. Предполагается, что путем устранения диффу-
зии целлюлаз в целлюлозные фибриллы, где каталитическое
действие целлюлоз ингибируется, можно сохранить скорость
гидролиза на высоком уровне (Тапака е’: а1.‚ 1986).
Показано, что основная причина неодинаковой кинетики цел-
люлазных препаратов из различных источников по отношению
к природной целлюлозе заключается в числе стадий, лимити-
40
рующих скорость ферментативного гидролиза целлюлозы. По-
следние в свою очередь обусловлены качественным и количест-
венным составом целглюлазных комплексов. Величину скорости
образования глюкозы определяет, как правило, действие двух
или трех целлюлолитических компонентов комплекса. Видимо,
существует единый механизм гидролиза целлюлозы для всех
целлюлазньлх комплексов независимо от их состава и происхож-
дения (Клесов, Григораш, 1981). Ингибирование продуктами
реакций в ходе ферментативного гидролиза целлюлозы может
бЫТЬ ПрИНЦИПИаЛЬНО РЗЗЛИЧНЫМ ДЛЯ РЗЗНЫХ КОМПОНЕНТОВ Цел-
люлазного комплекса, и роль отдельных компонентов изменяет-
ся по мере увеличения глубины ферментативного гидролиза
нерастворимого субстрата (Синицын и др.‚ 1985).
Тиуновой‚ Кобзевой (1985) выделены две эндо-В-1,4-глюка-
Ha3b1,rnLLpoJm3yIoH1He (Cf) и негидролизующие (Cf) хлопковое
волокно в сочетании с шеллобиогидролазой. В отличие от C‘; С: -
глюканаза не сорбируется на микрокристаллической целлюлозе.
По мнению авторов, Сгглюканаза, не имеющая адсорбционного
центра, не принимает активного участия в гидролизе аморфных
участков природной целлюлозы. Кривые биосинтеза этих двух
форм эндоглюканаз неодинаковы, что свидетельствует о незави-
симом образовании этих ферментов. Поскольку Сг-фермент не
принимает участия в гидролизе природной целлюлозы, он отне-
сен к В-глюканазам, а не к целлюлазам.
Имеются сведения (ВагНеу et а1., 1984) о том, что синергизм
между целлобиогидролазой и эндоглюканазой проявляется и в
прокариотных системах, в частности у Microbispora bispora, про-
дуцирующей целлюлазный комплекс, стабильный при 60——65 °С.
Исследования по фракционированию целлюлаз грибов Peni-
cillium, Trichoderma и Fusarium показали, что для растворения
кристаллической целлюлозы необходима смесь эндо-В-1,4-г„чюка-
назы, целлобиогидролазы и В-глюкозидазы, однако еще недоста-
точно ясно. какие факторы влияют на взаимодействие этих
ферментов. Определенная последовательность действия эндо-{З-
1,4-глюканазы и целлобиогидролазьъ-наиболее вероятная особен-
ность этих целлюлазных систем. Отмечено, что целлобиогидрола-
за одного гриба действует в синергизме с эндо-В-1,4-глюканазой
другого на высокоупорядоченную целлюлозу. Однако. когда
грибная целлобиогидролаза добавляется к эндо-В-1,4-глюканазе
бактерий рубца (Ruminococcus albus, R. flave/‘aciens 11BaCter0z'-
des succinogenes), синергизма не наблюдается. Одним из объяс-
нений может быть то, что механизм действия целлюлаз бактерий
и грибов различен (Wood et а1., 1984).
Родиопова и др. (1985) предлагают следующую схему фер-
ментативного расщепления целлюлозы: одни эндоглюканазы
расщепляют нативную целлюлозу в ее аморфных участках, дей-
ствуя более или менее упорядоченно и гидролизуя ее до целло-
41
биозы, целлотриозы, целлотетраозы и глюкозы. Другие эндоглю-
каназы гидролизуют лишь водно-растворимые производные цел-
люлозы и целлоолигосахариды. Эндоглюканазы, сорбированные
на поверхности кристаллитов, ослабляют водородные связи меж-
ду молекулой кристаллита, лежащей на поверхности, и соседней
с ней молекулой. В результате молекула, лежащая на поверхно-
сти кристаллита, приобретает способность к набуханию и ата-
куется совместно эндоглюканазой и экзоцеллобиогидролазой, при
этом образуются водно-растворимые олигосахариды.
Целлюлазы Trichoderma содержат N- И О-связанные олиго-
сахариды. М-связанные олигосахариды не играют решающей ро-
ли в секреции и энзиматической активности целлюлаз Trich0der—
ma reesei (Merivuori et а1., 1985), но повышают их термостабиль-
ность и устойчивость к действию протеаз. Эти результаты, по
мнению авторов, согласуются с предположением о том, что цел-
люлазы образуют комплексы, которые удерживаются вместе (по
крайней мере частично) вследствие взаимодействия между поли-
сахаридами.
Для осахаривания кристаллической и аморфной целлюлозы в
случае целлюлолитической системы$с1его1йит rolfsiiaeoéxogmmo
совместное действие эндо-[З-глюканаз и [З-глюкозидаз (Sadaha,
Patil, 1985). Предполагается, что целлобиогидролаза иниции-
рует атаку на кристаллическую целлюлозу, а эндо-В-Б-глюкана-
за дсйствуст на аморфную целлюлозу. Возможно, что для эффск-
тивного гидролиза целлюлозы необходимо образование комплек-
са трех типов ферментов, которые адсорбируются на целлюлозе
благодаря аффинитету целлобиогидролазы к кристаллической
целлюлозе. По-видимому, во время роста Sclerotium rolfsii Ha
J1HI‘HOI1€J1.IIIO.HO3HbIX субстратах окислительные ферменты играют
Важную роль в расщеплении как целлюлозы, так и лигнина, как
это было ранее показано для Sporolrichum pulverulerztum (Wes-
termak, Eriksson, 1975).
Две иммунологически отличные целлобиогидролазы, образуе-
мые Penicillium pinophilum, проявляют синергизм при действии
на микрокристаллическую целлюлозу. Wood и МсСгае (1986)
считают, что эти ферменты являются стереоспецифическими и
осуществляют расщепление двух различных конфигураций не-
редуцирующих концевых групп целлюлозы.
В экспериментах Macris et а1. (1985) значительное количест-
во целлюлазы и [З-глюкозидазы, способных осахаривать хлопко-
вое волокно и целлюлозу пшеничной соломы, секретировались
мутантами Aspergillus ustus И Trichoderma harziamem Ha среде
с целлюлозными материалами, в том числе на соломе. При сме-
шивании культуральных жидкостей отмечался выраженный си-
нергизм при действии на хлопковое волокно.
Szakacs—Dobozi ей а1. (1985) сравнили по эффективности гид-
ролиза очищенной целлюлозы и целлюлозосодержащих отходов
супернатанты культуральных жидкостей шести целлюлолитиче-
42
ских грибов и их смешанных ферментных систем. Оказалось, что
скорость гидролиза целлюлозы увеличивается в случае, когда
целлюлазные комплексы Trfchoderma, Aspergillus или Penicillium
действуют совместно.
По данным Клесова и Рабиновича (1978), добавление целло-
биазы к ферментным препаратам, лимитированным по этому
ферменту, приводит к ускорению ферментативного гидролиза и
увеличению выхода конечного продукта —— глюкозы. Однако, учи-
тывая степень гидролиза фильтровальной бумаги внеклеточными
препаратами целлюлаз Trichoderma reesei и его мутантов с по-
ниженным уровнем В-глюкозидазы и повышенным уровнем эн-
доглтоканазы, Chaudhary et al. (I985) сделали вывод о том, что
способность расщепления целлюлозы лимитируется содержанисм
эндоглюканазы, а не В-птюкозттдазьт. В литературе большинство
авторов отмечают особое значение синергизма между отдельными
компонентами целлюлазного комплекса. По мнению же Клесова
и Рабиновича (1978), речь идет не о подлинном, а о кажущемся
синергизме, когда один фермент поставляет субстрат для друго-
го, а он в свою очередь снимает ингибирующее действие продук-
та на предыдущий фермент в цепи.
Enari, Niku—Paavo1a (1987) полагают, что гидролиз нативной
целлюлозы осуществляется в результате синергического действия
целлобиогидролаз I И II. При гидролизе хлопка целлобиогидро-
лаза 1 фрагментирует его и образует растворимые сахара, при
действии на кристаллическую целлюлозу образуется целлобиоза.
Для этого фермента предлагается название В-1,4-г„пюканцелло-
биогидролаза. Целлобиогидрогтаза 11 по механизму действия
сходна с экзоферментами, однако не во всем, иммунологически
она вполне индивидуальна. Эндоглюканазы участвуют в более
поздних стадиях гидролиза, когда гидролизуются растворимые
декстрины, следовательно, эндоглюканазы сопоставимы с Б-глю-
козидазой, которая атакует только целлобиозу.
По современным представлениям, гидролиз нативной целлю-
лозы является результатом синергического действия эндо- и экзо-
глюканаз, которые либо образуют мультиэнзимный комплекс на
поверхности молекулы субстрата, либо действуют последова-
тельпо-паралцхельно.
Трудности выяснения механизма ферментативного гидролиза
целлюлозы связаны с комплексом свойств белков Целлюлолитиче-
ских ферментов и сложностью анализа различных нерастворимых
продуктов гидролиза целлюлозы. Результат ы экспериментов с ис-
пользованием различных производных целлюлозы, в том числе
низкомолекулярных соединений, необязательно справедливы для
нерастворимой целлюлозы. Целлюлолитические ферменты, по-
лученные в разных условиях культивирования, выделения и хра-
нения и подвергнутые различным процедурам очистки, прояв-
ляют неодинаковые свойства. Сравнить активность ферментов
можно только при использовании идентичных субстратов. Чем
43
дольше гидролиз, тем лучше проявляется эффект всех фермен-
тов, присутствующих в целлюлолитическом комплексе, Оценка
специфичности целлюлолитических ферментов в целом затрудне-
на из-за отсутствия специфических субстратов и стандартизации
методов определения активности. Имеющиеся данные позволяют
полагать, что множественные компоненты отдельных целлюлаз
не являются истинными изоферментами.
Прогресс, достигнутый за последнее десятилетие в области
изучения механизма ферментативного расщепления целлюлозы,
очевиден. Установлено, что целлюлолитические ферменты, вхо-
дящие в состав целлюлазных комплексов, характеризуются суб-
стратной специфичностью, определенными кинетическими пара-
метрами, изотермами адсорбции на водно-растворимых произ-
водных целлюлозы, термостабильностью, их активность и
адсорбционная способность зависят от рН, температуры и величи-
ны рК ионогенных групп активного центра.
Концепция о том, что Су-фермент является экзо-В-1А-глюка-
назой, не подтверждается. Сам автор гипотезы (цит. по Mandels,
1984) пришел к мнению, что гипотетический Сгфермент может
быть эндо-Б-ггдюканазой очень неупорядоченного действия. Во
всяком случае этот фермент никогда не был выделен и его актив-
ность не была определена сколько-нибудь рациональным спосо-
бом. Лимитирующий фактор всех известных целлюлазных
комплексов —— их низкая удельная активность. Проблема оконча-
тельного выяснения механизмов многоступенчатого расщепле-
ния природной целлюлозы с учетом ее надмолекулярной струк-
туры и реальных субстратов пока не решена.
Существенным недостатком исследований свойств целлю-
лолитических ферментов и механизма их действия является то,
что они проводятся без учета условий их получения, особенно
условий культивирования микроорганизмов-продуцентов. При-
менение сред различного состава, поверхностного и глубинного
культивирования, неодинаковые условия и сроки культивирова-
ния даже в случае использования одного и того же продуцента
приводят к гетерогенности состава и свойств пеллюлазного
комплекса, первично связанных с условиями биосинтеза и реали-
зации генетической информации и вторично—с модификацией
компонентов в среде культивирования. Помимо Trichoderma
reesei, гетерогенность и модификация ферментов отмечены и для
ряда других целлюлолитических микроорганизмов
С совершенствованием методов фракционирования целлюло-
литических ферментов появилось много данных, свидетельствую-
щих о множественности молекулярных форм компонентов, вхо-
дящих в состав целлюлазного комплекса,—— эндоглюканаз,
целлобиогидролаз и целлобиаз. Эти формы отличаются изоэлект-
рическими точками, молекулярной массой, содержанием углево-
дов, специфичностью действия и другими свойствами. Так, Черно-
глазовым и др. (1985) показано, что молекулярные формы
44
эндоглюканазы Trfchoderma viride обладают одинаковой и до-
статочно узкой субстратной специфичностью как к природе Mo-
номерного звена растворимого полисахарида, так и к типу гидро-
лизуемой связи,
Внеклеточные кислые протеазы могут действовать на целлю-
лазу в процессе ферментации, если условия роста (рН и темпе-
ратура) недостаточно контролируются. Из результатов, получен-
ных Dunne (1982), следует, что кислая протеаза из Trichoderma
reese1'— не единственный фактор, ответственный за существова-
ние Множественных форм целлюлаз. Во-первых, целлюлазный
спектр одинаков у штаммов гриба с высоким и низким уровнями
образования протеаз, во-вторых, целлюлазы в естественной кон-
формации (рН 4) устойчивы к действию протеаз. По мнению ав-
тора, роль кислых протеаз в секреции целлюлазы еще неясна.
Имеются указания на то, что в активации эндоглюканаз у
Sporotric/mm pulverulentum И других грибов определенную роль
играют кислые протеазы, которые разрушают ингибитор эндо-
глюканазы белковой природы (Eriksson, Pettersson, 1982).
Мутация Trichoderma reesei приводит к изменению спектра
секретируемых внеклеточных белков, хотя в меньшей степени это
затрагивает число и индивидуальную активность компонентов
целлюлазного комплекса (Farkas et а1.‚ 1982). Было установле-
но, что Trichoderma reesei секретирует множественные формы
целлполхаз с самого начала культивирования. Существует мнение,
что целлюлоза Trichoderma reesei — сложная система, состоящая
из множественных целлюлазных компонентов, которые, по край—
ней мере частично, генетически детерминированы. Теоретически
возможны посттрансляционная модификация компонентов под
воздействием физических факторов или в результате гликозили-
рования‚ а также высвобождение целлюлазных компонентов с
остатков целлюлозы в конце культивирования (Labudova, Far-
kas, 1983).
Гомогенность внеклеточных белков Trichoderma reesei после
изоэлектрофокусирования свидетельствует скорее о чистоте муль-
тиферментного комплекса, чем о чистоте одного Выделенного фер-
мента. Наличие гетерогенности уже на самых ранних стадиях
культивирования исключает объяснение этого явления постсек-
реционной модификацией ферментов. Зргеу, Lambert (1984) пола-
гают, что макрогетерогенность является общим свойством вне-
клеточных экзогидролаз, характерным для многих грибов. Это
подтверждается наблюдениями и других исследователей.
Willick et а1. (1984) с помощью иммунопреципитации фермен-
тов специфическими антителами обнаружили, что за секрецию
В-глюкозидазы, авицеллазы и карбоксиметилцеллюлазы ответ-
ственны три гена. Другие молекулярные формы ферментов об-
разуются в результате гликозилирования или под действием про-
теолитнческих ферментов в процессе секреции или после нее.
Известно, что грибы образуют много внеклеточных глюканаз.
45
Trichoderma reesei B молодой культуре или при индукции софо-
розой образует только три или четыре глюканазы.
Множественность форм целлюлолитических ферментов была
описана Okada et а1. (1968) и Gong et а1. (1979). Ко1аг е’: а1.
(1985), используя протопласты Trichoderma reesei, ДОКЗЗЭЛН, что
множественные формы целлюлаз имеются уже в фазе секреции.
Результаты Ко1аг et а1. (1985) показывают, что некоторые из
множественных компонентов целлюлазного комплекса проявляют
и карбоксиметилцеллюлазную и В-гликозидазную активность в
одной фракции, что как бы подтверждает предположение о том,
что множественные компоненты являются многоферментными
агрегатами (Зргеу, Lambert, 1983, 1984).
Kolar et а1. (1985) отмечают, что совпадение изоэлектричес-
ких точек и соответствующие проявления карбоксиметилцеллю-
лазной и глюкозидазной активности менее очевидны в культурах
гриба на среде с целлюлозой. Возможны образование в периплаз-
матическом пространстве многоферментных агрегатов вследствие
их высокого сродства к полимерам клеточной стенки и после-
дующая «фильтрация» ферментов из агрегатов через клеточную
стенку в окружающую среду. Белецкая и др. (1985) полагают,
что у Aspcrgillus terreus I‘JI}0KaHa3bI секретируются в виде одного
или более ферментов, из которых посредством последовательного
гидролиза образуются низкомолекулярные гидролазы с изменен-
ной специфичностью. Предполагается протеолитическая природа
такой модификации ферментов.
Эндоглюканазы Trichoderma reesei представлены рядом им-
мунологически родственных компонентов, Было показано, что
это Один и тот же фермент, Модифицированный во Взаимодейст-
вии с другими компонентами культуральной жидкости. Эти эн-
доглюканазные компоненты, по мнению Niku—PaaVo1a et а1.
(1985), соответствуют ранее описанным изоферментным формам
эндоглюканазы, так как их молекулярные свойства идентичны.
Получены данные о том, что другие белки могут взаимодейство-
вать с ферментами. Изученные глюканазы не проявляют актив-
ности по отношению к нерастворимым субстратам, поэтому их
роль сводится к гидролизу растворимых форм целлюлозы. По-
скольку очищенные целлюлазные компоненты взаимодействуют
с другими белками культуральной жидкости, интерпретация ре-
зультатов механизма действия целлюлаз, даже в случае исполь-
зования только целлюлолитической системы грибов Trichoderma,
часто затруднена из-за различия методов очистки и характери-
стик отдельных целлюлазных компонентов (Niku-Paavola, 1986).
Присутствие множественных форм целлюлаз в культураль-
ной жидкости Trichoderma reesei И других организмов наблюда-
ли и многие дРУгие исследователи, однако происхождение этих
форм не нашло удовлетворительного Объяснения. Точка зрения
о том, что множественность форм целлюлаз объясняется моди-
(рикацией основных ферментов протеазами культуральной жид-
46
кости, не разделялась всеми исследователями. Теоретически
множественность молекулярных форм ферментов может быть
следствием ряда событий (Кагпгпе1, Kubicek, 1985): недостаточ-
ной точностн трансляции или гликозилирования, модификации
в течение или после транспорта через цитоплазматическую мем-
брану‚ постсекреционной модификации белковой или углеводной
структуры, образования фермент-субстратных или фермент-фер-
ментных агрегатов или даже комбинации их. Кроме того, не ис-
ключено существование истинных изоферментов,закодированных
различными структурными генами. В исследовании Kammel И
Kubicek (1985) выявлено, что множественные формы целлюлаз
появляются очень рано при глубинном культивировании Trich0-
derma reesei, НО некоторые из них инактивируются в процессе
длительного культивирования.
Методом изоэлектрического фокусирования и окрашивания
белков и гликопротеинов было показано, что внеклеточные белки
состоят из ряда компонентов, идентичных на всех стадиях куль-
тивирования. Аналогичные результаты получены и для глико-
протеинов. Состояние гликозилирования Б-глюкозидазы в про-
Цессе культивирования также не изменяется. Инкубация in vitro
культуральной жидкости Trichoderma reesei без добавления и с
добавлением изолированных клеточных стенок гриба выявила
только минорные изменения в профиле белков при изоэлектро-
фокусировании. Авторы на основании полученных данных сдела-
ли заключение о том, что протеины и гликопротеины из Tri-
choderma reesei, растущего на целлюлозе‚ секретированные в
культуральную жидкость, не подвержены постсекреторной моди-
фикации.
Таким образом, различные химические и физические воздей-
ствия, ведущие к возникновению новых молекулярных форм,
должны, по-видимому, осуществляться на более ранних стадиях
секреции. Среди возможных причин образования множественных
форм целлюлаз——наличие подлинных изоферментов, кодируе-
мых отдельными генами и выполняющих различные функции,
неодинаковые способы сплайсинга МРНК, транскрибируемых с
одного гена, комплексирование с индивидуальными углеводными
компонентами, ассоциация белков и диссоциация надмолекуляр-
ных образований, модификация ферментного белка протеолити-
ческимп ферментами и, наконец, воздействие физико-химических
факторов среды при соответствующих условиях культивирова-
ния микроорганизма-продуцента. Множественность компонентов,
кроме того, может выступать как артефакт в процессе выделения
ферментов (Рабинович, 1987).
Большинство сообщений относительно ингибирования целлю-
лаз касается ингибирования тяжелыми металлами, избытком
субстрата, конечным продуктом, физическими и химическими
факторами. Природными ингибиторами целлюлаз являются фе-
нольные соединения, танины.
47
В литературе отмечается стимулирующее (защитное) дейст-
вие на целлюлазы некоторых белков и красителей, цистеина и
аскорбиновой кислоты. Мочевина увеличивает скорость инакти-
вации фермента, однако B кислой среде отрицательный эффект
в основном компенсируется за счет стимуляции фермента путем
уменьшения ингибирования (Datta et а1., 1961). Ингибирующее
действие некоторых реагентов объясняют связыванием тиоловых
групп активного центра молекул фермента (Sison et а1., 1952;
Bull, 1967; Pathak, Ghose, 1973) Бутанол, этанол и глюкоза
являются сильными ингибиторами целлтогтазьт, органические кис-
лоты целлюлазу Trichoderma reesei практически не ингибируют.
Ацетат и бутанол необратимо инактивпруют целлюлазу (Takagi,
I984).
Гемицеллюлазная и пектолитическая активность в меньшей
степени лимитируют способность ферментных препаратов рас-
щеплять лигноцеллюлозные субстраты. На среде с целлюлозой
или ксиланом Trichoderma reesei продуцируют внеклеточные
ферменты, которые могут гидролизовать и целлюлозу и ксилан.
При низком насыщении среды кислородом образование В-глюко-
зидазы подавляется на среде с целлюлозой. но не на ксилане
(Robinson, 1984). Poutanen et а1. (1986) показано, что гемицел-
люлазы Tric/zoderma reesei более активны, чем гемицелгхюхгазьт
Aspergillus awamori. Авторы полагают, что гидролиз гетерокси-
ланов различного происхождения представляет собой результат
действия нескольких ферментов с неодинаковой активностью.
С использованием электрофореза установлено, что культураль-
ная жидкость Trichoderma reesei (Lappalainen, 1986) содержит
три ксиланазы и две В-ксилозидазы. Основными продуктами де-
градации кснлана являются ксилобиоза п ксилооытттгомеры. До-
бавление (З-ксилозидазы усиливает образование ксилозьт, но не
влияет на общий гидролиз ксилана. Однако гидролиз ксилана
усиливается при добавлении ос-глюкуронидазьт из Agaricus
bisporus (Puls et а1., 1986). Гемицеллюлазы Trichoderma reesei
обладают большей дезапелируюшей активностью, чем гемицел-
лтолазьт Aspergillus awamori. Предполагается, что триходермы
в отличие от аспергиллов образуют ос-ЪЗ-глтокуронидазу (Роща-
пеп et а1., 1986). Показано также, что полиферментный комплекс
Trichoclerma reesei гидролизует В-1‚4-маннози‚1ньке связи в поли-
сахаридах (Власенко и др.‚ 1985).
Наиболее изучены В-маннаназы микроорганизмов, в том
числе грибов Aspergillus, Penicillium, Triclzoderma, бактерий
Xanthomonas campestris, Bacillus subfilis и др. Обнаружена
В-маннаназа и у представителей рода Streptomyces. Отмечено,
что в присутствии маннана в среде образование В-маннаназ уве-
личивается в 100 раз. Однако индукци1о синтеза фермента вы-
зывают полисахариды, на которые В-маннаназы не действуют.
Некоторые авторы считают (З-маннаназьт конститутивными фер-
ментами. В-Маннаназа—преимущественно внеклеточный фер-
48
мент, хотя у Xarzthomonas campestris она связана с мембраной
или клеточной стенкой (Фирантас, 1985).
Один из Наиболее важных биологических процессов в приро-
де——деградация лигноцеллюлозных материалов до CO2, воды
и гуминовых веществ, Только грибы белой гнили могут атаковать
все компоненты древесины. Мутанты этих грибов, не продуциру-
ющие целлюлазу, не осуществляют специфическую деструкцию.
Для осуществления эффективного разложения лигнина необхо-
димо наличие сахара в качестве источника энергии для роста и
метаболизма и частично для образования перекиси водорода,
которая Нужна для деградации лигнина. Таким образом, Воз-
можна специфическая биоделигнифнкация дтигноцелыхюлозных
материалов, что позволяет, например, Экономить энергию при
механическом пульпировании древесины, а в случае делигнифи-
кации соломы получать легко перевариваемый корм для жвач-
ных животных, Для разложения лигнина грибами белой гнили
необходима фенолоксидаза.
Eriksson (1985) получил мутанты, которые являются не толь-
ко целш-мутантами, но и обладают повышенным уровнем образо-
вания фенолоксидазы и ксиланазы. В этом случае продукты
расщепления ксилана служат источником Энергии для метабо-
лизма гриба. Позднее были получены целтдмутанты с более вы-
сокой способностью к разложению лигнина, чем исходные дикие
варианты. Полученные результаты, по мнению Егткззоп (1986),
свидетельствуют о возможности делигнттфикаттиьт древес-
ной щепы с целью получения механической и химической
пульпы.
Многие виды базидиомипетов быстро метаболизируют лиг-
нин. Один из наиболее изученных деструкторов лигнина — Pha-
nerochaere chrysosporium (Sporotrichum pulverulenzum), Процесс
деградации лигнина связан преимущественно с действием вне-
клеточных окислительных ферментов. Действие ферментов не-
специфнчно. Грибы не растут на лигнине, как на субстрате, для
ЭТОГО ИМ НЕОбХОДИМЗ ЦСЛЛЮЛОЗЗ ИЛИ ДРУГОЙ ИСТОЧНИК углерода В
качестве косубстрата. Деградация лигнина протекает лучше при
лимитапии роста организма, а Перемешивание культуры Plume-
rohaete chrysosporium. тормозит деструкцию. Деградация ammu-
на требует участия Н2О2. Деполимеризания лигнина осуществля-
ется ферментом лигниназой. В культуральнон жидкости содер-
жатся множественные формы лигниназьх
Вератриловый спирт усиливает образование лигниназы. До-
бавление вератрилового спирта в культуру базидиомицетов, раз-
рушающих лигнин, сильно стимулирует их лигнолитическую
активность (Leisola et a1., 1985). Однако неясно. стимулирует ли
лигниназную активность сам вератриловый спирт или продукты
его распада. Синтез и выделение внеклеточных белков до появ-
ления лигниназнои активности при С-лимитации и различный
спектр белков при С- и М-„чимитаттии культуры Phanerochaete
1 Зак. 966 49
chrysosporium указывают, по мнению авторов, на сложный ме-
ханизм регуляции биосинтеза лигниназы.
Культура Phanerochaete chrysosporium, индуцированная ве-
ратриловым спиртом, приобретает способность разлагать лигнин
в условиях перемешивания (Leisola, Fiechter, 1985). Кроме лиг-
ниназы, в культуральную жидкость выделяются и другие фер-
менты, роль которых еще не ясна. Установлено, что лигниназы
являются особыми пероксидазами (Kirk, 1985).
Биодеградацпя лигнина имеет выраженно окислительный ха-
рактер. Она происходит в боковых цепях, которые окисляются
с образованием ос-карбонильных и ос-карбоксильньхх групп, и в
ароматическом ядре, которое окисляется в результате деметили-
рования и введения гидроксильных групп в фенольные остатки с
образованием 2,3- и (или) ЗА-дигидроксифенильных остатков
(Higushi, 1982). Различные структуры лигнина деградируются
внеклеточными ферментами, которые атакуют низкомолекуляр-
ные и полимерные субстраты.
Показано, что в деградации лигнина могут участвовать бак-
терии Nocardia, Bacillus, Pseudomonas, a также актиномицеты
Strptomyces. Полученные Pometto И Crawford (1986) данные
свидетельствуют о том, что оптимальной для минерализации
лигнина актиномицетами является нейтральная или слабокислая
среда, а для деградации лигноцеллюлозы с солюбилизацией лиг-
нина и образованием полимерного лигнина—щелочная. Воз-
можно, что в нейтральных и щелочных почвах в отличие от гри-
бов актиномицеты играют важную роль в разложении лигнина.
Так, Thermomonospora rnesophila деградирует лигнин лигноцел-
люлозы пшеницы с образованием высокомолекулярных водно-
растворимых продуктов и незначительного количества CO2. Со-
любилизация лигнина не совпадает по времени с образованием
ксиланазы или целлюлазы. Вероятно, деструкция лигнина осу-
ществляется в результате окислительных и других реакций
(МсСагШу et а1., 1986). Однако грибы — более активные дегра-
даторы лигнина.
При разложении лигнина культурой Phanerochaete chrysospo-
rium метанол образуется в процессе вторичного метаболизма
непосредственно из лигнина и продуктов его деградации. Иссле-
дователи считают, что накопление метанола происходит в ре-
зультате снижения потребления глюкозы в слабо аэрированных
культурах и последующей катаболитной инактивации метано-
локсидазы (Апс1ег, Eriksson, 1985). Деметоксилирующими фер-
ментами являются пероксидаза и ферменты типа пероксидазы
(Ander et а1., 1985). Кислород стимулирует образование H202
грибов Phanerochaete chrysosporium, динамика продукции H202
коррелирует во времени с лигнолитической активностью гриба.
Гриб продуцирует фермент, зависимый от Н2О2-генерирующей
системы. Не исключено, что этот фермент принимает участие в
деградации лигнина (Maltseva et а1., 1985).
50
В опытах с гниющей соломой установлено, что лигнин раз-
лагается в атмосфере кислорода быстрее, чем в атмосфере воз-
духа. Использование гриба Palms conchalus вызывает макси-
мальное разложение лигнина с образованием 24,7% водно-раст-
воримого лигнина, высвобожденного из соломы (Hui-Shung Yu.,
Eriksson, 1985).
У штаммов Phanerochaete Chrysosporium скорость окисления
лигнина до CO2 повышается после добавления глюкозооксидазы.
Возможно (Kirk et а1., 1986), скорость окисления лигнина ли-
митируется внеклеточной H202. Увеличение лигнолитической
активности этих грибов в пять раз при добавлении вератрило-
вого спирта или смеси микроэлементов связано с возрастанием
количества всех форм лигниназ. Kirk et а1. (1986) не смогли об-
наружить связи между лигниназой и общей лигнолитической
активностью штаммов Phanerohaete chrysosporium. Добавление
к культурам глюкозооксидазы у большинства штаммов усилива-
ло окисление лигнина до CO2, ЭТО указывает на зависимость
активности лигниназы от внесения внеклеточной H202.
Предложен механизм окислительной бнодеградации природ-
ного лигнина (Schoemaker ей а1., 1985) и описана новая редокс-
система‚ в которой энзиматически генерируемые и регенерируе-
мые радикальные катионы, действуя как переносчики электро-
нов, влияют на окисление модельных соединений лигнина. По
мнению Harvey et а1. (1986), вератриловый спирт—вторичный
метаболит гриба Phanerochaete chrysosporium и опосредует окис-
ление лигнина вне связи с активным Центром лигниназы.
Определенный интерес представляет сравнительный анализ
лигнолитической активности грибов в работе Milsteirl et а1.
(1983), Aspergillus japonicus —— эффективный деструктор фенолов
и углеводов в растворимом лигноуглеводном комплексе, экстра-
гированном из пшеничной соломы. Грибы рода Trichoderma раз-
лагают только углеводный компонент. Гриб Polyporus versicola
оказывает комплексный эффект: полимеризация низкомолеку-
лярных фенолов сопровождается деградацией ароматических и
углеводных полимеров. Добавление ксилозы в среду ускоряет
деполимеризацию лигнина испытанными грибами и предотвра-
Щает полимеризацию низкомолекулярных фенольных фракций
лигноуглеводного комплекса грибом Polyporus versicola. B ОТ-
личие от других испытанных организмов этот гриб секретирует
в среду значительное количество лакказы, но только в отсутст-
вие углеводов. Milstein ей а1. (1983) полагают, что лакказа во-
влечена у этого организма, скорее, в Процессы полимеризации,
чем деполимеризации. Aspergillus japonicus как активный лигно-
литический организм может быть использован как продуцент
для ферментации соломы с целью получения белкового корма.
Грибы рода Aspergillus (A. fumigatus, А. japonicus, А. niger,
A. terreus) активно растут на соломе, усваивая лигнин и некото-
рые углеводы и превращая оставшиеся полисахариды в более
4* 51
доступные для ферментов соединения (Milstein et а1.‚ 1984).
Аспергиллы более энергично, чем грибы белой гнили, расщеп-
ляют ароматические и углеводные компоненты растворимых в
воде лигноуглеводных комплексов. Лучше других расщепляет
лигноуглеводные комплексы, экстрагированные из соломы, и
накапливает биомассу гриб Aspergillus japonfcus. OH разлагает
фенольные соединения и их высокомолекулярные фракции бо-
лее активно, чем виды Trichoderma. Добавление в среду ксилозы
способствует усилению деградации лигнина грибами (Milstein
её а1.‚ 1984).
Исследования Kadam И Dreut (1986) расщепления крафт-
лигнина различными культурами грибов выявили превосходство
Aspergillus fumigatus над эталонной культурой Coriolus versi-
color. Отмечено, что трудномстаболизирусмые углеводы, как и
микрокристаллическая целлюлоза, лучше, чем легкометаболизи-
руемые, способствуют проявлению лигнолитической активности
грибов. В отличие от Coriolus versicolor Aspergillus fumigatus
вызывают значительное деметоксилирование и дегидроксилиро-
вание крафт-лигнина.
Предполагается, что вначале грибы белой гнили атакуют
лигноуглеводный комплекс, а затем разлагают лигнин и геми-
целлюлозу (Fukuzumi, Shimada, 1984). С использованием
сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии пока-
зано, что грибы Cerrena mucolor, Ganoderma applantum, G. tsu-
gae, Isc/moderma resinosum И Perermifora medulla-panis — возбу-
дители белой гнили——вызывают избирательную (до 98%) де-
лигнификацию древесины (Blachette, 1984). Установлено также,
что грибы——возбудители бурой гнили растут равномерно на
поверхности волокон, не проникая внутрь волокна. Однако цел-
люлоза внутри волокна интенсивно расщепляется диффундиру-
ющей целлюлазой во всех случаях независимо от того, ирони-
кают гифы гриба или нет (Highley et а1.‚ 1983).
Грибы белой гнили вызывают два типа разрушения древе-
сины. В первом случае разрушаются в основном компоненты
средней перегородки, а вторичная стенка существенно не затра-
гивается. При таком повреждении древесины удаляется 95-
98% ЛИГНИНЗ, а также гемицеллюлоза. Во втором случае раз-
рушению подвергаются все слои клеточной стенки, при этом
лигнин, целлюлоза и гемицеллюлоза разрушаются в одинаковой
степени, а само разрушение происходит вблизи грибных гиф
(Blanchette, I984).
Лигнин ингибирует энзиматическое расщепление целлюлозы,
влияя на активность целлюлаз (Hidaka et а1.‚ 1984). Обнаружено,
что адсорбция всех форм эндоглюканаз на целлюлозе и лиг-
нине сходна, но существенно отличается от адсорбции на ксила-
не. Инкубация целлюлаз с лигнином приводит к быстрой инак-
тивации ферментов, а добавление лигнина в реакционную систе-
му существенно уменьшает скорость и глубину ферментативного
.52
превращения микрокристаллической целлюлозы (Клесов и др.,
19856).
На модели целлюлазы Penicillium janthinellum показано, что
вследствие сорбции фермента на соломе и после контакта с
лигнином, выделенным из соломы, происходит инактивация цел-
люлазы (Schulz et а1., 1986). Лигнин ингибирует также актив-
ность целлобиазы Trichoderma штабе (Hidaka, 1984). Этот фе-
номен указывает на то, что лигнин ингибирует энзиматическое
разложение целлобиозы. Накопление целлобиозы в свою очередь
ингибирует разложение целлюлозы.
Глава 3
ОБРАЗОВАНИЕ МИКРОБНЫХ ДЕПОЛИМЕРА3
Целлюлозоразрушаютцие микроорганизмы—важный компо-
нент биогеоценоза —Встреча1отся в растительном опаде, в воде
и ПОЧВе и являются основными деструкторами целлюлозы в при-
роде. Имеются, однако, сведения о том, что отдельные виды во-
дорослей также принимают участие в этом процессе. Продуци-
руют целлюлазу некоторые насекомые, моллюски и простейшие.
Целлюлаза может быть животного и растительного происхож-
дения.
Большинство гидролитических ферментов микроорганизтлов
относят к индуцированным, т. е. предполагается, что образова-
ние этих ферментов возможно только в присутствии в среде
(чаще всего) субстрата или того или иного специфического ин-
дуктора. Если большинство микроскопических грибов выделяет
целлюлазу в окружающую среду, то у бактерии фермент очень
часто связан со структурами клеточной стенки, и для его выде-
ления клетка должна быть разрушена.
У бактерии Cellulomonas Sp. глтокоза репрессирует не только
образование целлтолазы, но также и рост в присутствии целлю-
лозы. При этом подавляется прикрепление растущих бактерий к
целлюлозным волокнам. На среде с Целлюлозой бактерии обра-
зуют толстый наружный слой, который, по-видимому, способст-
вует их адгезии к целлюлозным волокнам (V1adut—Ta1or е’: а1.,
1986). Культуры Aspergillus fumigatus продуцируют больше
внеклеточной ксиланазы и целлтолазы, когда растут на сене или
соломе, чем На очищенной целлюлозе. На среде с очищенным
ксиланом образование целлюлаз уменьшается. Химическая де-
лигнификация сена и соломы ведет к снижению уровня образо-
вания внеклеточных ферментов (Stewart et a1., 1983). Термо-
фильный гриб Rhizopus rhizopodiformis лучше продуцирует цел-
люлазу на среде с пшеничной соломой, а наибольшее количество
сахаров накапливается в среде, содержащей рисовую солому
(Johri, Paudey, 1982). Kvachadze et al. (1985) показано, что
термофильные грибы, способные продуцировать целлюлазу при
40-50 °С‚ при более высоких температурах (50—-60 °С) исполь-
зуют только легкометаболизируемые источники углерода. Цел-
люлазы при этом не образуются.
В отличие от других продуцентов ферментов термофильный
гриб Thielavia terrestris продуцирует максимальное количество
54
ферментов к 30-му часу культивирования. Температурный опти-
мум действия целлюлаз при этом находится между 60-70 °С.
Под влиянием целлюлаз T/zielavia terrestris 26% пшеничной со-
ломы гидролизуется за 8 ч при 64°С (Margaritis, Merchant,
1983).
Логинова с сотр. (1986) выделили из рубца крупного рогато-
го скота перспективный продуцент целлюлаз термофильный
гриб Myceliopht/10ra thermophila, отличающийся большей ско-
ростьто роста при низких значениях рН и способностью к глу-
бокому расщеплению целлюлозного компонента соломы. В от-
личие от других продуцентов целлюлаз Myceliophthora thermo-
plzila не синтезирует целлюлазы на среде с лактозой (Свистова
и др.‚ 1986).
Получение целлюлаз с Помощью термофильных организмов
имеет ряд преимуществ по сравнению с использованием мезо-
филов. К ним относятся более высокая скорость рдста этих мик-
роорганизмов (что снижает вероятность инфекции), отсутствие
затрат на Охлаждение ферментеров, более высокая термостой-
кость целлюлаз и проявление активности при высоких темпера-
турах. Однако в случае применения целлюлолитических термо-
филов возможны некоторые технологические трудности: выход
из строя датчиков при повышенных температурах, поддержание
постоянной концентрации кислорода, а также более высокая
чувствительность целлюлолитических термофилов к ингибирова-
нию этанолом. По имеющимся данным (Margaritis, Merchant,
1986), максимальная активность целлюлолитических ферментов
термофильных грибов значительно ниже, чем у мезофила Tricho-
derma reesei.
Образование целлюлаз у бактерий и грибов существенно за-
висит от источника углерода и условий культивирования микро-
организмов. Berg et а1. (1972) установили, что ферментативная
активность Celluibrio fulvus изменяется при изменении времени
культивирования и источника углерода. Следы целлюлазы всегда
присутствуют в среде в стационарной фазе. При росте бактерий
на среде с глюкозой Сх-целлюлаза в фильтратах появляется в
стационарной фазе. Одновременно целлюлазная активность свя-
занная с клеткой, уменьшается. Высокая активность целлюлаз
отмечается при использовании в качестве источника углерода
производных целлюлозы. Рост бактерий при этом сильно замед-
ляется. Большие концентрации глюкозы подавляют синтез цел-
люлаз. Обнаружено, что целлюлаза также локализована в пери-
плазматической и мембранной фракциях клетки. При росте на
среде с целлюлозой фермент выделяется в среду. При росте на
среде с целлобиозой и амилозой фермент продуцируется с мень-
шей скоростью, чем на среде с целлюлозой (Berg, 1975).
Hulme, Stranks (1974) полагают, что целлюлаза Myrothecium
verrucaria КОНСТИТУТИВНЗ и ее образование определяется «мета-
болическим состоянием» клетки, а целлюлозный субстрат явля-
55
ется «естественным источником углеводов», выделяемых в среду
с некоторой скоростью. Достигнуть необходимого для образова-
ния фермента «метаболического состояния» клетки при лимите
глюкозы или глицерина авторам не удалось из-за меняющейся,
по их мнению, скорости прироста биомассы гриба.
Нами (Лобанок, 1977) была исследована зависимость специ-
фической и дифференциальной скорости синтеза ферментов от
скорости роста Triclzoderma lignorum на среде с лактозой (мо-
лочной сывороткой). Установлено. что Максимум синтеза фер-
ментов отмечается при замедлении или даже полном прекраще-
нии роста гриба. Синтез целлюлаз и рост гриба не совпадают по
Времени. Лактоза—хороший индуктор целлюлазы у многих
видов грибов рода Trichoderma, От целлобиозы лактоза отлича-
ется конфигурацией у четвертого углеродного атома. Окисление
редуцирующей группы лактозы лишает ее индуцирующих
свойств.
По мнению Reese (1972, 1971), любой метод, который спо-
собствует медленному поступлению «индуктора» синтеза целлю-
лазы целлобиозы в растущую культуру микроорганизма-проду-
цента, уменьшая катаболитную репрессию (КР), способствует
образованию фермента. Желаемый результат может быть до-
стигнут различными способами ингибирования роста, например
использованием субоптимальной для роста продуцента темпера-
туры, некоторых соединений в концентрациях, слегка токсичных
для данного микроорганизма, а также лимитацией одного из
компонентов среды, необходимых для роста.
Нами (Лобанок, 1977) было высказано предположение, что
образование целлюлазы у Trichoderma lignorum, так же как и
пектолитических ферментов у Sclerotinia sclerotiorum, на среде
с лактозой обусловлено медленным потреблением этого дисаха-
рида. Скорость потребления продуктов расщепления лактозы
(глюкозы и галактозы) выше, чем скорость их образования из
лактозы, роз-тому не происходит репрессии биосинтеза. Макси-
мум активности {з-галактозидазы совпадает со снижением коли-
чества лактозы в среде и увеличением активности синтеза пек-
тиназ, целлюлазы, амилазы и целлобиазы. Использование для
получения целлюлазы или пектиназы среды, содержащей такой
растворимый индуктор, как лактоза, делает более реальным по-
лучение этих ферментов в протоке.
Было установлено, что при лимите источника углерода amu-
вация синтеза целлюлазы у Trichoderma lignormn находится в
обратной зависимости от накопления биомассы и скорости по-
ступления того или иного источника углерода в питательную
среду и специфически не связана с тем или иным соединением.
Ограничение потребления источника углерода замедляет рост
гриба и, снижая катаболитную репрессию в 10--200 раз (в зави-
симости от источника углерода), увеличивает продуцирующую
способность мицелия. Добавление в среду с простыми источни-
56
ками углерода динитрофенола и малоната, тормозящих их окис-
ление, также активирует синтез фермента. Эти данные корре-
лируют с фактом реверсии малоновой кислотой катаболитной
репрессии глюкозой и сукцинатом синтеза целлюлазы у Tric/10-
derma lignorum на среде с целлюлозой. Аналогичные данные
были получены по стимуляции синтеза пектиназ путем лимита-
ции роста SCler0tz'm'a sclerotiorum различными факторами среды.
Хотя роль катаболитной репрессии и скорости роста в регу-
ляции синтеза целлюлаз и пектиназ и других гидролаз у ряда
птикроскопических грибов очевидна, вопрос о природе индуктора
и механизма индукции до конца не ясен. Большой интерес пред-
ставляет, например, возможная «Самоиндукция» целлюлазы ди-,
три- и полисахаридами с [3-1—>2, f5—1—>3 и [5-1—›6-связями, вклю-
чая софорозу, которые образуются вследствие трансгликозилаз-
ной активности грибов. В этой связи небезынтересны данные о
метаболической индукции {З-галактозидаз у кишечной палочки
путем образования из лактозы истинного индуктора аллолакто-
зы трансгликозплированием.
По мнению Reese et а1. (1971), имеется реальная возмож-
ность активного синтеза целлюлазы с высоким выходом при
культивировании грибов на среде, содержащей целлобиозу. При
добавлении некоторых поверхностно-активных веществ в культу-
ры, растущие на среде с целлобиозой, образование целлюлазы
увеличивается стократно. В фазе образования фермента в при-
сутствии олеата продуцирующая способность мицелия возрас-
тает. Олеат замедляет потребление целлобиозы, действуя, как
полагают, на клеточную мембрану, и способствует выходу цел-
люлазы в среду. Однако главный эффект олеата, очевидно,
связан с превращением целлобиозы в более активный индуктор.
B опытах с отмытым мицелием олеат оказывал ингибирую-
щее действие, что, по-видимому, связано с его превращением в
нерастворимую олеиновую кислоту. Некоторые поверхностно-
активные вещества (Твин 80 и Твин 40) в этом случае оказыва-
ют стимулирующий эффект. Последний проявляется в усилении
образования целлюлазы даже при использовании в качестве
растворимого индуктора аналога целлобиозьт—лактозы. Nisi-
zawa et а1. (1972) в опытах с Trichoderma стае доказали, что
индуцирующий эффект софорозы связан с образованием целлю-
лазы с1е поуо. Ингибирующий эффект больших концентраций
софорозы авторы объясняют возможным расщеплением софоро-
зы до глюкозы, что ведет к репрессии. Репрессия глюкозой и ее
метаболитами индукции синтеза целлюлазы у Tric/zoderma viri-
de происходит преимущественно на уровне трансляции (Nisiza-
ша et а1., 1972).
По данным Loewenberg И Chapman (1977), софороза быстро
катаболизируется до CO2 И H20 грибом Trichoderma стае. При-
сутствие софорозы в среде необходимо для непрерывного обра-
зования целлюлазы. Уровень синтеза целлюлазы в среде с со-
57
форозой в 10 раз меньше, чем на среде с целлюлозой. Причину
Низкого индуцпрующего эффекта авторы видят в том, что софо-
роза не стабильна как индуктор, она метаболизируется, а про-
дукты ее расщепления вызывают репрессию синтеза целлюлазы.
Sternberg и Mandels (1979) отмечают, что у Trichoderma reesei
софороза не индуцирует полный комплекс целлюлаз. Она инду-
цпрует образование карбоксиметилцеллюлозы и В-глюкозидазы
у протопластов Triclzoderma reesei, при этом продуцируются
множественные формы этих ферментов (Ко1аг et а1., 1985). Од-
нако имеются данные, что В-глюкозидаза у этого организма син-
тезируется конститутивно (Mandels, 1984).
Продемонстрирована возможность Получения целлюлазы
Trichoderma стае в хемостатной культуре на глюкозе при ли-
митации источника углерода. Установлено, что в состав коммер-
ческой глюкозы входит софороза, индуцирующая образование
фермента. На химически чистой глюкозе продуцируется только
карбоксиметилцеллюлаза и амилаза. На среде с глицерином и
лактозой образуется Целлюлаза и амилаза. Для образования
ферментов необходим низкий рН среды. Влияние Н+ на скорость
метаболизма объясняется лимитацией скорости переноса комп-
лекса субстрат——пермеаза (Brown, 1976). Установлено, что
штаммы Clostridium acetobutyricum B условиях непрерывного
культивирования при лимите целлобиозы или ксилозы образуют
наибольшее количество ксиланазы (Lee et а1., 1985).
Исполгьзуя новый метод непрерывного протока питательной
среды с целлобиозой (8—12 мг/(ч-г мицелия) в качестве ин-
дуктора через плотную суспензию мицелия Tric/zoderma reesei,
Tanigushi et а1. (1983) полтучили резкое увеличение уровня об-
разования целлюлазы и В-глюкозидазы по сравнению с периоди-
ческим культивированием.
Trichoderma reesei QM 9114 в проточной культуре на среде с
целлобиозой при лимитации последней продуцировала внекле-
точную целлюлазу так же, как на среде с целлюлозой (Vaheri
et а1., 1979). Webb et а1. (1986) осуществлен непрерывный про-
цесс получения целлюлаз на основе иммобилизованных клеток
Trio/zoderma стае в 10-литровом ферментере с использованием
в качестве основного источника углерода глюкозы и софорозы в
качестве индуктора.
Allen И Mortensen (1981) получены результаты, которые по-
казывают, что целлобиоза не является естественным индуктором
синтеза целлюлазы, так как целлобиоза одна или в смеси с
глюкозой, ксилозой и гентиобиозой синтез не индуцирует. Гидро-
лизаты целлюлозы и сиропы, обработанные в-глюкозидазой и
содержащие В-димеры и тримеры глюкозы, индуцируют синтез
целлюлаз. Предполагается, что наиболее вероятный индуктор——
софороза. С другой стороны, Нггпоуа и Biely (1983) показано,
что при действии На софорозу коммерческими препаратами цел-
люлаз или культуральнокй жидкостью Trichoderma reesei, полу-
58
ченной на среде с целлюлозой, образуется серия олигосахаридов
с молекулярной массой, превышающей таковую для софорозы.
В полученных продуктах отсутствуют |3-1,2-гликозидные связи.
Установлено, что софороза Накапливается в клетках TrL'ch0der-
ma reesei И, возможно, служит «долгоживущим» предшественни-
ком олигосахаридов с |3-1,4-связями. По мнению авторов, софо-
роза может быть предшественником целлобиозы или другого
вещества, являющегося индуктором синтеза целлюлаз. Эти дан-
ньте не подтверждают более ранние результаты Loewenberg и
Chapman (1977) о том, что софороза быстро метаболизируется
ДО СО2 И �"*�
Исследуя образование целлюлазы Triclloderma reesei при
двухстадийном непрерывном культивировании на синтетической
среде с лактозой, Ryu et а1. (1979) выявили, что синтез фермен-
тов происходит только во второй стадии при оптимальной ско-
рости разбавления 0,026—0,028 ч“. Отмечен активный синтез
целлюлаз в проточной культуре Tric/zoderma reesei Ha 5%-Hofi
лактозе и на среде с подпиткой (Allen, Andreotti, 1982). При
росте мутанта Trichoderma reesei Ha среде с лактозой макси-
мальное количество АТФ регистрируется к 60 ч культивирова-
ния, что соответствует началу образования эндоглюканазы. При
культивировании на среде с подпиткой при каждом добавлении
лактозы отмечается быстрый подъем уровня АТФ, сопровожда-
ющийся ускорением синтеза эндоглюканазы (Farkas et а1., 1986).
Farkas et а1. (1986) на модели мутанта Тггс/юаегхпа reesei CC
11 показали, что, поддерживая концентрацию лактозы в среде
на определенном уровне, можно обеспечить продолжительную
непрерывную секрецию целлюлазы в среду без заметного роста
биомассы. Оценивая результаты опытов с лактозой, следует
иметь в виду, что в условиях паровой стерилизации лактоза раз-
рушается, причем степень разрушения возрастает при щелочных
значениях рН среды, при больших исходных концентрациях
лактозы, выдерживании среды перед стерилизацией, а также в
присутствии карбонатных и фосфатных анионов. Первичным
продуктом разрушения лактозы является лактулоза, которая,
как и другие производные лактозы, не метаболизируется.
По данным Уагпапе (1970), высокополимерные целлюлозные
субстраты индуцируют образование целлюлазы у аэробной мезо-
фильной бактерии Pseudomonas fluorescens var. cellulosae, и
более 90% фермента выделяется в культуральную жидкость.
Софороза обладает сходным индуцирующим эффектом. На про-
стых сахарах Pseudomonas fluorescens синтезирует конститутив-
но незначительное количество внутри- и внеклеточной целлюла-
зы. Лимитация легкоусвояемых источников углерода замедляет
рост и значительно усиливает образование целлюлазы, главным
образом внеклеточной. Гентиобиоза оказывает очень незначи-
тельный индуцирующий эффект на образование внеклеточной
целлюлазы. Лимитация галактозы не активирует синтез целлю-
59
лазы, а самым плохим индуктором, как отмечалось, является
лактоза. Манноза——плохой источник углерода, но хорошо сти-
мулирует синтез внеклеточной целлюлазы.
Целлобиоза индуцирует синтез целлюлолитической системы
у Therrnomonospora sp., однако удельная активность образова-
ния целлюлаз выше на среде с целлюлозой (Могетга et а1., 1981).
У актпномицетов Micromonospora Chalcae И Pseudonocardia ther-
mophila [5-1,4-глюкозидазы связаны преимущественно с клеткой,
а карбоксиметилцеллюлазы равномерно распределены между
клеточной фракцией и средой. Глюкоза репрессирует синтез, а
карбоксиметилцеллюлоза и целлобиоза действуют как индукто-
ры (Ma1faiteta1., 1984).
У гриба Sporotrichum thermophfla. (Canevascini et а1., 1979)
синтез карбоксиметилцелцтюлазы индуцируется целлюлозой, глю-
команнаном, целтлобиозой, а также в меньшей степени ламина-
рабиозой и целлобионовой кислотой. Предполагается, что есте-
ственным индуктором синтеза целлюлазы является целлобиоза.
В отличие от других организмов синтез целлюлазы на среде с
целлобиозой отмечается в фазе активного роста гриба, репрес-
сия глюкозой осуществляется на уровне трансляции.
Термофильный гриб Talaromyces emersonii при культивиро-
вании на среде с Целлюлозой продуцирует множественные фор-
мы экзо- и эндоглюканаз и |3-глюкозидазы‚ Индуцированный
синтез репрессируется лактозой, целлобиозой и глюкозой, а со-
фороза не влияет на образование ферментов. Вероятно, внутри-
клеточная [З-глюкозидаза, обладая трансферазной активностью,
удаляет репрессор и образует индуктор биосинтеза (Coughlan
et а1., 1984).
По данным Kawamori et а1. (1986), синтез целлюлаз у мутан-
тов Trichoderma reesei индуцирует Ь-сорбоза—ингибитор син-
теза |3-1,3-глюкана. Индуцирующая активность сравнима с тако-
вой у софорозы. Добавление 1—5% сорбозы к культуре Trisha-
derma reesei Ha среде с 1% глюкозы стимулирует образование
целлюлолитических ферментов. Эффект Ь-сорбозы связан с ре-
гуляцией потребления глюкозы. При добавлении в среду другого
источника углерода скорость поглощения Ь-сорбозы и глюкозы
падает (Закоо е’: а1., 1986).
У всех штаммов Trichoderma reesei синтез Целтлюлаз индуци-
руется целлюлозой, лактозой или софорозой и репрессируется
глюкозой и неллобиозой. Истинный индуктор синтеза целлюлаз
не найден. По мнению Mandels (1984), такой индуктор образует-
ся из целлюлозы в результате первичной атаки на субстрат цел-
люлазы, синтезирующейся конститутивно в следовых количест-
вах. В качестве потенциальных индукторов рассматриваются
целлобиоза и софороза (2-0-{З-В-глъокопиронозил-В-глюкоза).
В основе последнего соображения лежит также факт, что софо-
роза обнаруживается в ферментативных (Trichoderma reesei)
гидролизатах целлюлозы. В отличие от целлобиозы софороза ин-
60
дуцирует синтез ферментов у отмытого мицелия Trio/10derma
reesei, она поглощается мицелием и метаболнзируется. Софороза
гидролизуется с образованием продуктов, которые вызывают ка-
таболитную репрессию. Ее индуцируюший эффект проявляется
при низких концентрациях, поэтому его трудно разграничить с
катаболитной репрессией. Уровень софорозы для индукции син-
теза Trichoderma reesei ниже, чем оптимум для ктоглошения этогО
дисахарида и роста гриба (Mandels, 1984).
Целлобиаза у Trichoderma reesei преимущественно внутри-
клеточная. Внутри- и внеклеточные иеллобиазы Trichoderma
reesei не идентичны. Видимо, [З-глюкозидаза выполняет опреде-
ленную роль в поглощении софорозы клетками Tric/zoderma
reesei. Софороза гидролизуется В-глюкозидазой, связанной с
мицелием. Репрессия синтеза В-глюкозидазы софорозой способ-
ствует индуцирующему действию софорозы на синтез целлюлазы.
В больших концентрациях софороза репрессирует и синтез цел-
лтолаз. Софороза индуцирует синтез целлюлазы не у всех грибов.
Это может быть обусловлено неспособностью софорозы проник-
нуть в клетку, превратиться в истинный индуктор и, наконец,
слишком быстрым ее метаболизмом. Синтез целлюлаз Trz'choder-
ma reesei меньше, если используется среда с лактозой. Примене-
ние лактозы как растворимого источника углерода имеет свои
преимущества как для изучения физиологии организма, так и
для регуляции синтеза целлюлаз. Среда с лактозой наиболее
пригодна для осуществления непрерывного культивирования.
Оптимизация условий культивирования Tr1'ch0derma reesei Ha
среде с лактозой выявила две основные стадии (Mandels, 1984).
Первая оптимальна для роста, вторая при скорости роста, близ-
кой к нулю‚—- для синтеза целлюлазы. При лимитации поступле-
ния сахаров в питательную среду Trichoderma, reesei продуцирует
целлюлазы, если в качестве источника углерода используется
ферментативный гидролизат целлюлозы. Индуктором в этом слу-
чае считают продукты превращения глюкозы или целлобиозы.
Тем не менее наибольший выход Целлтолаз (2% внеклеточного
белка, продуктивность 150 мг/(л-ч) ферментного белка) дости-
гается при периодическом культивировании. Выход фермента
пропорционален начальной концентрации целлюлозы в среде,
которая по техническим причинам не может превышать 6% из-
за сложности перемешивания среды. Рециклирование и подпитка
среды представляются перспективными для увеличения выхода
цедтлюлаз (Mandels, 1984).
Целлобиоза играет важную роль в регуляции иелттюлтаз у
многих грибов. Микроскопический гриб Fusarium эр. 27 на среде
с целлюлозой синтезирует полный комплекс целлюлтолититтеских
ферментов. Целлобиаза образуется также на среде с глюкозой.
После потребления глюкозы накопление целлобиазы в среде и
на поверхности мицелия продолжается до 120 ч. Независимо от
источника углерода активность Целлобиазьг, связанной с мице-
61
лием, значительно выше, чем ее активность в культуральной жид-
кости. В присутствии мицелия в культуральной жидкости обра-
зование редуцирующих сахаров из фильтровальной бумаги воз-
растает на 25% (Targofiski, 1984). У Trichoderma pseudo/aoningi
[5-rmoxosnnasbl продуцируются на различных источниках углеро-
да (глюкозе, лактозе, целлюлозе, крахмале, мальтозе‚ целлобио-
зе). Наибольшая активность фермента в культуральной жидко-
сти наблюдается на источниках углерода, способствующих мед-
ленному росту. Выделение (Ёэ-глюкозидазы в среду коррелирует с
активностью связанной с клеточной стенкой (З-ДЗ-глюканазы
(Kubicek, 1982).
Дрожжи Candida wickerhamii B аэробных условиях консти-
тутивно продуцируют (з-глюкозидазу, большие концентрации глю-
козы подавляют этот процесс. В анаэробных условиях экспрессия
В-глюкозидазы дерепрессируется и более глюкозой не подавляет-
ся. Результаты Freer, Detroy (1985) показали, что Candida
wic/eerhamii способны утилизировать целлобиозу в присут-
ствии 95 г/л глюкозы. У Penicillium janthinellum (3-1‚4-глюкози-
дазы продуцируются конститутивно, а эндо-(з-1,4-глюканазьт ин-
дуцируются целлобиозой (Карр е’: а1., 1981).
Horikoshi е’: а1. (1984) и Fukumori et а1. (1985) выделены
Bacillus sp., продуцирующие щелочную целлюлазу с оптимумом
активности при рН 9, половина активности сохраняется при рН
11. B ЗЗВИСИМОСТИ от видовой принадлежности синтез фермента
конститутивный или индуцированный Молекулярная масса ще-
лочной целлюлазы несколько выше, чем целлюлазы других ор-
ганизмов‚ и приближается к молекулярной массе целлюлазы
Closfridimn.
Аэробная мезофильная бактерия Sporogytophaga myxococ—
отдав продуцирует внеклеточную целлюлазу на среде с глюкозой,
что Vance е’: а1. (1980) считают результатом попадания целлю-
лозных продуктов с посевным материалом, а не следствием
конститутивного синтеза.
Rummococcus flavefaciens KOHCTI/ITyTI/IBHO продуцирует карбок-
симетилцехтлюлазу и ксиланазу (Pettipher, Lathaen, 1979). Фер-
менты связаны с поверхностью бактериальной клетки и выде-
ляются в среду при ее лизисе. Бактерии Rzmzinococcus стоят в
начале пищевой цепочки в рубце. При их лизисе высвобождаются
углтеводы, которые служат субстратом ферментации для других
бактерий.
Образование карбоксиметилцеллюлазы у Clostridium ther-
mocellum не подвержено сильной катаболитной репрессии. В то
же время у клеток, выращенных на целлобиозе и перенесенных
в среду с фруктозой или сорбитом, целлюлазная активность
заметно дерепрессируется, на среде с глюкозой дерепрессии не
отмечается (Johnson et а1., 1985). По данным Головченко (1986),
целлюлолитические ферменты Clostridium thermocellum, как и
начальные ферменты катаболизма глюкозы, конститутивны.
62
Bacillus polymyxa конститутивно синтезирует целлюлазу на
среде с сахарозой, крахмалом, арабинозой и другими источника-
ми углерода (Иванова и др, 1977). Показано, что некоторые ви-
ды бактерий Erwiizia также конститутивно продуцируют целлю-
лазу (Е1-Не1а1у et а1., 1979). У Trichosporon cutaneum ксилаНа3Ы
индуцируются только ксилосахаридами, целлюлаза продуцирует-
ся в незначительном количестве и не индуцируется целл1олОЗ0И
(Biely е’: а1., 1984).
Культуры дереворазрушатощих грибов Lampteromyces japa-
nicus И Fomitopsis cystisina B условиях глубинного или поверх-
ностного культивирования на среде, содержащей сахарозу, глю-
козу, галактозу и другие источники углерода, активно синтези-
руют целлюлолитический комплекс ферментов (Ма5апоЬц‚ 1972).
Имеются данные о конститутивном синтезе целлтюлаз у микро-
мицета Cliocladium penicilloides (Альперович, 1986).
Ortega (1980) выделил из почвы грибы пяти родов и семи ВИ-
дов, в том числе Fusarium episphaerie, Cfzaetomium globosum,
Alternaria humicola, Aspergillus niger, Mucor sp., А terreus и
Fusarfum s0lam', которые образуют внеклеточную целлюлазу при
культивировании на среде с глюкозой. Ряд примеров конститутив-
ного синтеза микробных деполимераз рассмотрен в обзорах (ЛО-
банок, Бабицкая, 1976; Лобанок, Михайлова, 1982; Павловская‚
1982). Целлюлолитическая активность у бактерии чаще связана
с клеткой, чем у грибов.
По данным Ramasamy, Verachtert (1980), Pseudomonas sp.
продуцирует две внеклеточные эндоглюканазы. Часть эндоглю-
каназной активности связана с клеткой. Установлено, что источ-
ник углерода влияет на локализацию эндоглюканазы, при
росте бактерий на среде сцеллюлозой клеточносвязанная эндо-
глюканаза локализована ближе к наружной поверхности клеточ-
ной стенки, чем на среде с целлюлозой. Обнаружена цитоплаз-
матическая эндоглюканаза, которая отличается от периплазма-
тической эндоглтоканазы.
Ghosh е’: а1. (1982) сообщают, что у двух мутантов Trich0der-
ma гее$е[—сверхпродуцентов целлюлаз, устойчивых к катабо-
литной репрессии, в стадии активной секреции целлюлазы эндо-
плазматический ретикулум более развит, чем у исходного штам-
Ma. Авторы Полагают, что Мутации дезактивирутот регулЯЦИЮ
биогенеза эндоплазматического ретикулума и создают таким об-
разом потеНЦИал для усиления синтеза и секреции внеклеточных
целлюлаз. Получены прямые доказательства ассоциации целлю-
лаз с эндомембранной системой Trichoderma reesei. Локализация
целлюлаз внутри органелл, ответственных за синтез ферментов,
GPO модификацию И Секрецию, указывает на то, что целлюлазныи
комплекс является акитивно секретируемым ферментом. После
секреции целлюлазныи комплекс может ассоциироваться с Kne-
точной стенкой (Chapman е’: а1., 1983).
ИММУН0Цит0химическими И цитохимическими методами ПОКа-
63
зано, что целлобиогидролаза и [5-1‚4-глюканаза Tric/zoderma
reesei локализуются в цистернах эндоплазматического ретикулу-
ма и в мембранных комплексах гиф гриба, растущего на целлю-
лозе. Оба фермента обнаруживаются также в культуральной сре-
де. В гифах, выращенных на среде с глюкозой, специфические
реакции на фермент отсутствуют (Chapman е’: а1.‚ 1983). На ос-
новании результатов фракционирования в градиенте Плотности
сахарозы мицелия гиперпродуцента целлюлазы Trichoderma
reesei Rut 30 сделан вывод о том, что в отличие от легких ве-
зикул значительная часть карбоксиметилцеллтолазы в тяжелых
везикулах находится в неактивной форме (Glenn е’: а1.‚ 1985).
Aspergillug terreus 17р —— продуцент целлюлаз при росте на
твердом нерастворимом субстрате (соломе)—секретирует вещест-
во полисахаридной природы, образующее на поверхности густую
фибриллярную сеть. Методом электронномикроскопической цито-
химии выявлена связь целлюлаз с внеклеточными полисахари-
дами (Агабекян и др., 1982).
Отмечается, что секреция зндоглюканазы у гриба Aspergillus
terreus ПрОИСХОДИТ вследствие ее активного транспорта в культу-
ральную жидкость и она является истинным зкзоферментом.
Морфофизиологические особенности продуцента зависят от при-
роды целлюлозного субстрата (Иванова, 1984).
Результаты, полученные Kubicek И Pitt (1982), показывают,
что значительное усиление секреции [З-глюканазы у Trichoderma
aureoviride обусловлено выраженными изменениями метаболиз-
ма клеточной стенки гриба. В зависимости от скорости разбав-
ления изменяется состав клеточной стенки. Предполагается, что
повышение секреции В-глюкозидазы вызвано увеличением актив-
ности литических ферментов, связанных с клеточной стенкой.
Клеточные стенки гиф, полученных при низких скоростях разбав-
ления, имеют более высокую литическую активность.
Грибные глюканазы разнообразны не только по свойствам и
механизму действия, но и различны по регуляции. Так, образова-
ние [5-1‚3-г.чюканазы не репрессируется глтокозой. Такой тип ре-
гуляции, возможно, является отражением функции глюканаз в
процессе морфогенеза, выражающейся в ограничении гидролиза
компонентов клеточной стенки (Delrey et а1.‚ 1979). Сравнение
секреции В-глюкозидазы и В-ДЗ-глюканазнойт активности трех
различных штаммов Trichoderma подтверждает гипотезу о том,
что появление В-глюкозидазы в культуральной жидкости вызва-
но увеличением активности [З-ДЗ-глюканазьт, связанной с клеточ-
ной стенкой (Kubicek, 1983).
Ha среде с целлюлозой (но не глюкозой), глицерином или
лактозой в культуральную жидкость Pem‘cz‘llium funiculosum
выделяется фактор, стимулирующий секрецию целлюлолитиче-
ских ферментов у Pem'cz'llz'um ja/zthinellum, выращенного также в
присутствии целлюлозы. По-видимому, этот фактор (Rao е’: а1.,
1986) является специфической протеазой. Отмечено значительное
64
увеличение синтеза внеклеточных целлюлаз и гемицеллюлаз в
смешанной культуре Tric/zoderma reesei D 1-6 и Aspergillus
wenzii Pt 2804. Маннаназа Aspergillus wentii влияет на продук-
цию целлюлозы Trichoderma reesei в смешанной культуре. С од-
ной стороны, маннаназа необходима для высвобождения целлю-
лазы из мицелия, с другой — она оказывает ингибирующее дейст-
вие на целлюлазу, но не на ксиланазу и В-глюкозидазу. Скорее
всего, маннаназа инактивирует целлюлазу, действуя на маннаны
полисахаридного остатка и изменяя таким образом специфиче-
скую конформацию, необходимую для проявления активности
(Ghose et а1., 1985).
Многие грибы, особенно рода Trichoderma, выделяют внекле-
точные целлюлазы в значительных количествах. Вероятно, специ-
фические протеазы влияют на выделение и активность целлюлазы.
Eriksson И Petterson (1982) отмечают значительное увеличе-
ние целлюлазной активности Sporotrichum pulverulentum при ин-
кубации с протеазами и предполагают существование этого фер-
мента в зимогенной форме. Альтернативным объяснением являет-
ся посттрансляционная Модификация целлюлаз. Deshpande е’: а1.
(1984) установили, что эндо-р-1‚4-глюканазная активность в
фильтратах двухдневной культуры Pem'cilliLm1 janthinellum уве-
личивается в 4 раза после инкубации с фильтратом 10-дневной
культуры этого гриба на той же среде. Неактивный белок, выде-
ленный из двухдневной культуры Pemcillium janthinellum, после
инкубации с фильтратом старой культуры гриба проявляет зна-
чительную целлюлазную активность. Он был назван процеллю-
лазой.
Синтез и выделение целлюлаз стимулируются рядом факто-
ров. По наблюдениям Zamost И МсС1агу (1983),регуляторы роста
растений индол-З-уксусная и гибберелиноваЯ кислоты в малых
количествах стимулируют образование целлюлазы у штаммов
Trichoderma reesei, a 13 больших подавляют прорастание спор и
синтез целлюлаз. Интересно, что стимуляция синтеза целлюлазы
стимуляторами роста растений происходит и в условиях катабо-
литной репрессии синтеза. Индолил-З-уксуспая и гиббсрелиповая
кислоты не влиятот на накопление биомассы Trichoderma reesei,
НО B два раза увеличивают выход целлюлаз. Zamost и МсС1агу
(1983) полагают, что в присутствии регулятора роста растений
повышается проницаемость клеточных стенок гриба, вследствие
чего усиливается выделение ферментов в среду. Следовательно,
регуляторы роста растений могут быть использованы в условиях
промышленной ферментации.
Холин стимулирует синтез внеклеточных белков у Tr1'c/zoder-
ma reesei. Твин 80, который тоже стимулирует секрецию белков
у Тгёсподегта reesei, предотвращает стимуляцию секреции цел-
люлолитических ферментов холином. Возможно, холин стимули-
рует синтез экзопротеинов, увеличивая содержание эндоплазма-
тического ретпкулума (Schreiber е’: а1., 1986).
5 Зак 966 65
Перспективным подходом к изучению Регуляции образования
целлюлаз является получение мутантов целлюлолитических
микроорганизмов. Peiris е’: а1. (1982) установили, что мутация,
вызвавшая Повышение целлюлолитической активности у штамма
Cellulomonas, сопровождается возрастанием активности образо-
вания ксиланазь1. В опытах по индукции выявлено различие
целлюлолитической и ксиланазной активности, хотя перекрест-
ная активность двух систем не исключается. Предполагается,
что мутация происходит в одном гене, контролирующем образо-
вание обоих ферментов.
Mishra е’: а1. (1982) получили конститутивный мутант Trz'Ch0-
derma reesei C-5, который продуцирует целлюлазу на среде с
глюкозой или сахарозой с активностью, как у исходного штамма
Trichoderma reesei QM 9414. Профиль образования ферментов
у мутанта С-5, по мнению авторов, указывает на то, что все три
целлюлозных компонента контролируются одним главным регу-
‚ЛЯТОРНЫМ геном. ЭТО предположение ПОДТВЭРЖДЭЭТСЯ КОНСТИТУ-
тивнь1м синтезом трех целлюлазных ферментов в результате
одной мутации. Получены мутанты Trichoderma гее5е[—сверхпро-
дуценты целлюлаз, у которых отсутствует катаболитная репрес-
сия. На пилотной установке на среде с лактозой концентрация
внеклеточного белка достигала 40 г/л. Durand et а1. (1985) пред-
полагают наличие у этого штамма отдельных, но тесно связан-
ных регуляторных генов целлюлазы, Б-глгокозидазы и ксиланазы
с высокой частотой двойных мутаций.
Из сверхсинтезирующего штамма Trichoderma reesei получе-
ны мутанты, плохо секретирующие целлюлазы при 37 °С. Види-
мо, эта мутация нарушает регуляцию экспрессии целлюлазы или
нарушение происходит в гене, регулирующем секрецию только
целлюлазы (Suh Duck е’: а1., 1986). У цел‘-мутантов Trz'C/mderma
стае мапнаназная и ксиланазная активность также отсутствует.
Это указывает на то, что в мутацию вовлечен общий регулятор-
ный механизм образования этих ферментов (Nevalainen, Palva.
1978).
Создание новых микроорганизмов—продуцентов целлюлаз ме-
тодами генетической инженерии развивается в трех направле-
ниях. Это перенос целлюлазных генов анаэробных термофильных
бактерий или грибов в легко культивируемые аэробные бактерии
типа кишечной палочки, увеличение числа целлюлазных генов и
получение конститутивных мутантов —— продуцентов целлюлаз и,
наконец, создание с помощью техники рекДНК штаммов дрож-
жей или бактерий, способных продуцировать целл1олазь1 и сбра-
живать продукты гидролиза целлюлозы до этанола. На основе
использования генов бактериальных целлюлаз в эксперименте
удается их экспрессия у бактерий и даже дрожжей. Однако об-
разующиеся ферментные белки в отличие от донорских микро-
организмов связаны с клеткой. Из этого обстоятельства вытекает
целесообразность проведения работ по повышению эффективно-
66
сти экспрессии генов целлюлаз в клетках организма-реципиента.
Хотя донорские и реципиентные организмы окончательно не по-
добраны и пока нет явных достижений практического характера,
генетическая инженерия целлюлаз очень перспективна.
Пектолитические ферменты продуцируются очень многими
бактериями, главным образом родов Pseudomonas, Xanthomonas,
Египта, Bacillus, Clostridium. Фитопатогенные и сапрофитнь1е
бактерии выделяют один или несколько пектолитических фер-
ментов. Синтез пектолитических ферментов может быть как ин-
дуцированным, так и конститутивным.
Грибы являются наиболее мощными продуцентами комплек-
сов пектолитических ферментов. Их состав варьирует в зависи-
мости от свойств организма-продуцента и условий образования
ферментов. Секреция пектолитических ферментов происходит
уже на ранних стадиях роста грибов. В процессе роста возможна
последовательная индукция ферментов этого комплекса (Rom-
bouts, Pilnik, 1980). Выраженной пектолитической активностью
обладают многие дрожжи; Kluyveromyces fragilis (Saccharomy-
сев fragilis), Candida pseua'oiropicaZ[s u др. Продуцируется в ос-
новном эндополигалактуроназа.
Пектолитические ферменты не только вовлечены в патогенез
растения, часто ими инициируется атака патогена. В небольших
количествах они продуцируются Rhizobium H некоторыми други-
мп спмбиотическими микроорганизмами. Значительные потери
свежпх фруктов и овощей наблюдаются во время их транспор-
тировки и хранения в результате грибных и бактериальных ин-
фекций. Получение текстильного волокна из льна и джута свя-
зано с действием пектолитических микроорганизмов. Они участ-
вуют в разложении и минерализации растительных остатков,
играют важную роль в процессе пищеварения у жвачных жи-
вотных. В значительном количестве пектолитические бактерии
обнаруживаются в рубце этих животных. Нельзя рассматривать
вопросы разложения растительных материалов без учета роли
пектолитических ферментов микроорганизмов.
Из приведенных в этой главе данных видно, что в настоящее
время имеется возможность активного синтеза целлюлолитиче-
ских ферментов микроорганизмами на средах, не содержащих
специфических индукторов, однако для промышленного получе-
mm этих ферментов используются среды, содержащие в качестве
индукторов соответствующие субстраты.
Регуляция катаболитрепрессируемых ферментов у бактерий
осуществляется через дополнительный контроль уровня цикличе-
ского 3’, 5’-адено3инмонофосфата (цАМФ) в клетке. Таким об-
разом, экспрессия катаболитрепрессируемых ферментов у бак-
терий является результатом метаболической активности клетки
и генетических регуляторных механизмов.
Регуляция образования грибных экзо- и эндоглюканаз может
также реализовываться на уровне секреции этих ферментов.
5‘ 67
Внеклеточные ферменты синтезируются На связанных с мембра-
ной рибосомах. Они распознаются как внеклеточные по специфи—
ческой сигнальной последовательности в мРНК. Этап процессин-
га включают гликозилирование, упаковку в секреторные везику-
лы, передвижение к месту экспортации и высвобождение в
окружающую среду.
Существует мнение, что синтез целлюлаз, в частности у ГрИбыВ
рода Trichoderma, индуцирован. Видимо, синтез вызывается цел-
люлозой, лактозой, целлобиозой и софорозой‚ Но не ясно, как та-
кои «естественный» индуктор, как целлюлоза, не проникающая в
клетку, может повлиять на экспрессию генов. Не исключено, что
индукция является результатом физического контакта субстрата
и клетки. В этом случае на поверхности клетки должны быть
сайты узнавания, которые активируют механизм синтеза целлю-
лазы. Считается, что базальный синтез целлюлазы происходит
конститутивно. В результате действия базальной целлюлазы вы-
свобождается истинный индуктор, каким может быть, например,
софороза, образующаяся из целлобиозы путем трансгликозили-
рования. Однако если софороза является активным индуктором
целлтолаз у грибов, то бактерии. а также грибы Phanerochaete не
реагируют на софорозу как на индуктор.
Хорошо известно, что синтез целлюлаз подвержен катаболит-
ной репрессии, тем не менее механизм КР y грибов точно не уста-
новлен. Montenecourt е1 а1. (1981) не выявили очевидной корре
ляции между уровнем цАМФ в мицелии и образованием целло-
биозы у Trichoderma reesei. Синтез эндоглюканазы, одного из
катаболитрепрессируемых ферментов этого гриба, также не свя-
зан с внутриклеточным уровнем цАМФ. Видимо, эффект КР про-
является в процессе трансляции. Это обстоятельство, по мнению
Мопйепесоыг’: е’: а1. (1981), не исключает возможности того, что
какое-то другое соединение взаимодействует с сенсорным геном
и регулирует изменение уровня цАМФ.
Мутанты Trichoderma B опытах Montenecourt е’: а1. (1981) на-
ряду с выходом целлюлазы увеличивали также выход внеклеточ-
ных белков в целом. Это обстоятельство, как считают авторы, а
также регуляция синтеза белка у прокариотов (модель Дэвид-
сона—Бриттена) свидетельствуют о том, что синтез всех внекле-
точных белков контролируется общим регуляторным фактором —~
избытком рецепторных сайтов.
Wood et а1. (1984) сопоставили удельную скорость синтеза
целлюлазы с внутриклеточным уровнем цАМФ у термофильного
актиномицета Trichomonaspora выплат на среде с различными
источниками углерода. Отмечен более активный синтез целлюла-
зы и цАМФ в клетках на среде с целлюлозой, чем в клетках на
среде с глюкозой. Целлобиоза снижает уровень образования фер-
мента. В целом же нет прямой зависимости между уровнем
цАМФ в клетке и скоростью синтеза целЛЮЛа3Ы- СКОРЭЭ ВСЭГО,
цАМФ участвует в механизме регуляции синтеза целлюлазы Не-
68
прямым путем. Manning И Wood (1983) считают, что одним из
механизмов регуляции внеклеточной целлюлазы у Agaricus bis-
porus является катабо.питная инактивация фермента.
макромолекулы ферментов, продуцируемые микробной клет-
кой, могут находиться в цитоплазме, периплазменном пространст-
ве, быть связанными на клеточной стенке и, наконец, выделены в
окружающую среду. Соответственно ферменты подразделяются
на внутри-‚ внеклеточные и связанные с клеточной стенкой. В на-
стоящее время белок считают внеклеточным, если он выходит за
пределы цитоплазматической мембраны (Безбородов, Астапович,
1984). Ферменты способны накапливаться в периплазматическом
пространстве между клеточной мембраной и клеточной стенкой.
Так, у бактерий периплазматические ферменты могут связывать-
ся со структурными элементами клетки.
С проблемой локализации ферментов непосредственно связан
вопрос о существовании на поверхности клеток особых участков,
где происходит экспрессия белка в окружающую среду. У мице-
лиальных грибов секреция осуществляется преимущественно в
апикальном участке гиф, т. е. в участке активного роста. Фермен-
ты секретируются через определенные поры в стенке клетки.
Для локализации катаболических ферментов, какими являются
целлюлазы, Пектиназы и другие, характерна некоторая вариа-
бельность, вызванная специфическими функциями клеток, усло-
виями их обитания. Так, условия существования целлюлолптиче-
ских бактерий рубца жвачных и почвенных мицелиальных цел-
люлозоразрушающих грибов существенно отличны. Особенности
образования, локализации и выделения таких ферментов пред-
ставляются экологически целесообразной адаптацией микроорга-
низмов к данным условиям среды. Полагают, что внеклеточные
ферменты синтезируются на рибосомах (или мезосомах), свя-
занных с мембраной (Безбородов, Астапович, 1984).
Согласно «сигнальной» гипотезе Блобеля (цит. по Безбородо-
ву, Астапович, 1984), секретируемый белок несет в себе сигнал в
виде определенной аминокислотной Последовательности, по ко-
торому он распознается мембранами, происходит локальное ос-
лабление связи между мембранными белками, в результате чего
в мембране образуется туннель. Последний не является постоян-
ной структурой, после прохождения белка он исчезает. Образова-
ние туннеля совпадает по времени с трансляцией, и процесс син-
теза Н секреции фермента оказывается скоординированным.
Большинство известных белков первоначально синтезируется
в виде предшествеников, которые затем подвергаются модифика-
ции. Процессинг включает весь цикл изменений от образования
структур молекул до их функционирования. В процессинге белка
при образовании функционально активных продуктов могут
участвовать протеазы. Посттрансляционные модификации белка
могут осуществляться также за счет гликозилирования‚ присое-
динения углеводного компонента.
69
Возможно также внеклеточное формирование четвертичной
структуры ферментов (Безбородов, Астапович, 1984). Внеклеточ-
ные белки проходят через особые поры в клеточной стенке. До-
пускается, что через клеточную стенку проходит предшественник,
который приобретает сво1о окончательную конформацию на кле-
точной стенке. Механизм секреции белка через цитоплазматиче-
скую мембрану существенным образом не отличается у прока-
риот и эукариот. Рост микроорганизмов и синтез ферментов
могут быть связаны определенной зависимостью. Многие внутри-
клеточные ферменты образуются в определенных фазах разви-
тия клетки. Например, экзоферменты синтезируются премущест-
венно в постэкспоненциальной фазе роста, т. е. при его замедле-
нии.
Имеется ряд гипотез, объясняющих это явление (Безбородов,
Астапович, 1984). Хотя секреция ферментов является активной
функцией клетки, накопление ферментов в среде культивирова-
ния микроорганизмов в значительной степени зависит от раз-
личных физико-химических факторов, и прежде всего от состава
питательной среды: источника углерода, азота, других компонен-
тов, их количества и соотношения, кислотности среды, температу-
ры, аэрации и других факторов.
Индукция экзогенным низкомолекулярным соединением — не
единственный механизм активации синтеза ферментов у микро-
организмов, особенно в тех случаях, когда субстрат является
полимерным соединением (целлюлоза). Инициация и значитель-
ное ускорение синтеза многих микробных ферментов могут быть
достигнуты в результате воздействия на физиологическое состоя-
ние микробной клетки целого ряда факторов (изменение темпов
роста микробной популяции в результате лимита одного из ком-
понентов среды или действия ингибиторов и антиметаболитов,
присутствие субстрата фермента, продукта его действия или их
аналогов, образование продуктов трансгликолизирования и не-
которых Эндогенных метаболитов).
Существенным моментом, обусловливающим инициацию син-
теза и секреции экзоферментов, являются «метаболизируемость»
источника углерода и скорость роста микроорганизма-проду-
цента.
В заключение следует сказать, что исследование проблемы
получения целлюлаз достигло такого уровня, когда можно рас-
сматривать вопрос об их широком промышленном производстве.
Высокая стоимость целлюлолитических ферментов ограничивает
их применение в промышленности для осахаривания целлюлозы.
Такая стоимость обусловлена низкими выходом и удельной ак-
тивностыо имеющихся сегодня микробных ферментов.
Глава 4
ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОБНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗ
Использование Лигноцеллюлазного сырья в сельском хозяй-
стве и промышленности приводит к накоплению значительного
количества целлюлозных отходов. Важным источником целлю-
лозосодержащих материалов являются городские и бытовые от-
ходы, животный навоз, а также некоторые отходы пищевой про-
мышленности. Их гидролиз до легкоусвояемых сахаров позво-
ляет получить сырье для ферментации в микробиологической
промышленности. С этой целью могут быть использованы целлю-
лолитические ферменты.
Целлюлазы получают путем глубинного или чаще поверхно-
стного культивирования микроорганизмов на средах с различны-
ми целлюлозосодерх<ащими субстратами (отрубями, жомом,
опилками, соломой, древесной пульпой, бумажной и вискозной
массой), очищенной целлюлозой, а также мелассой и простыми
сахарами. Применяется способ получения целлюлазы на среде,
содержащей в качестве источника углерода только глюкозу. На
образование ферментного комплекса влияют состав и соотноше-
ние компонентов, кислотность и аэрация среды. Из известных в
настоящее время продуцентов целлюлазы наиболее активными
продуцентами ферментов, способными осахаривать природные
целлюлозосодержащие субстраты, являются различные штаммы
грибов рода Trichoderma. Trichoderma viride широко использует-
ся для получения целлюлаз в Японии, США, Германии, а также
в нашей стране.
Преимущество грибов Trio/zoderma как источников целлюлаз
в том, что они продуцируют достаточно полный комплекс Целлю-
лаз с очень большим выходом. K недостаткам следует отнести
низкую удельную активность целлтолаз, незначительный уровень
образования [З-глгокозидазы и неспособность грибов атаковать
лигнины (Mandels, 1984). Поэтому продолжаются поиски новых
продуцентов целлюлаз.
Как деструктор лигнина (но нс продуцент целлюлаз) продол-
жает вызывать интерес Sporotrichum pulverulentum (Ljungdahl,
Eriksson, 1985). Целлюлаза lrpex lacteus коммерчески произво-
дится в Японии. Активно используются целлюлазы из термофиль-
ных актиномицетов Streptomyces thermodiasticus, T/1erm0m0rz0-
spora выплат и Т. fusca, однако их целлюлолитические системы
плохо действуют на нерастворимую целлюлозу. Культуральные
71
фильтраты Этих организмов не содержат (З-глюкозидазу, которая
связана с клеткой, а целлюлазный комплекс сильно ингибирует-
ся целлобиозой. Из-за высокотемпературного оптимума целлю-
лаз термофильных актиномицетов дополнение их целлюлазного
комплекса (З-глюкозидазой грибов нецелесообразно. По-прежне-
My исследователи изучают бактериальные деллюлазы.
Сегодня лучшим продуЦентом Целлюлаз является Tric/zoder-
ma reesei. Ha основе этого организма в разных странах получено
Множество Перспективных мутантов. Работы, выполненные аме-
риканекими исследователями с использованием этого организ-
ма, обобщены Mandels (1984). Гриб хорошо растет на синтети-
ческих средах, удельная скорость роста его на среде с глюкозой
О,12—0‚24 г/(г-ч), оптимум рН 4,0, температуры —- 35 °С. Выход
биомассы 0‚4—0‚5 г/г глюкозы. .
Ряд мутантов, полученных из Trichoderma reesei, имеет раз-
личия только количественного характера: мутанты продуцируют
больше целлюлаз, чем исходный штамм, но состав, свойства
Целлюлазного комплекса одинаковы. Все штаммы Trichoderma
reesei продуцируют малое количество конститутивной целлюла-
зы. Для достижения высокого уровня синтеза необходима индук-
ция, синтез Подвержен катаболитной репрессии. Получены му-
танты с частично дерепрессированным синтезом, а также с повы-
шенным уровнем конститутивного синтеза
Принято считать, что фермент целесообразно получать на
том же субстрате, на который он будет действовать. Это, по-ви-
димому, справедливо для тех случаев, когда культуральная жид-
кость применяется непосредственно как источник целлюлазы.
Если же фермент производится в больших количествах или для
специальных целей, отказ от чистой целлюлозы, если она может
увеличить выход фермента, выигрыша не дает‚
Одна из проблем крупномасштабного получения целлюла-
зы — продолжительность ферментации при глубинном культиви-
ровании. В Японии пеллюлазу получают с помощью поверхност-
ного культивирования Tric/zoderma virfde на отрубях. Этот про-
Цесс обеспечивает высокий выход целлюлаз, но весьма трудо-
емок. В последнее время метод поверхностного культивирования
вновь привлекает внимание исследователей (Kim, 1985). Система
твердофазной ферментации создает более естественные условия
для микроорганизмов и в определенных условиях может доста-
точно эффективно применяться для получения продуктов фер-
ментадии.
Результаты экспериментов (Deschamps е’: а1., 1985), которые
проводились с Trichoderma harziazzum, указывают на то, что цел-
люлолитические ферменты можно получать методом твердофаз-
ной ферментации в нестерильных условиях. Особенно эффектив-
на твердофазная ферментация с перемешиванием. По мнению
авторов, этот метод проще и дешевле: проще оборудование для
культивирования, меньше сточных вод, ниже затраты на произ-
72
водство, так как процесс менее энергоемкий. дорогостоящих
этапов Выделения и очистки ферментов можно избежать, так как
обогащенный ЦСЛЛЮЛЗЗОЙ субстрат после подсушивания при
40 °С может быть использован непосредственно для осахари-
вания.
Показана возможность получения высокоактивных препара-
тов целлюлаз путем твердофазного культивирования мутантного
штамма Tric/zoderma reesei на обработанных щелочью лигно-
целлюлозных субстратах. В процессе ферментации гриб потреб-
ляет вначале гемицеллюлозную фракцию субстрата, а затем men-
люлозу. Полученный таким образом целлюлазный комплекс
эффективно гидролизует делигнифииированную пшеничную со-
лому (Chahal, 1985).
В нашей лаборатории (Лобанок, 1977) впервые из молочной
сыворотки были получены пеллюлолитические ферменты. Су-
Щественной особенностью сыворотки как питательной среды
является наличие в ней лактозы, молочной кислоты, аминокис-
лот, витаминов, фосфолипидов, стеринов и других физиологиче-
ски активных веществ. На разведенной в 2 раза сыворотке с до-
бавлением в нее 0,3% NaNO3 И 0‚05% MgSO4 Tric/zoderma lt'gno-
rum 534 продуцирует комплекс целлюлолитических ферментов,
как и при культивировании его на среде со специфическим суб-
стратом—целлюло3ой Интенсивный рост гриба на молочной
сыворотке отмечается уже в первые сутки, а максимум целлюло-
литической активности—на третьи-четвертые сутки. Одновре-
менно с целлюлазой Trichoderma lignorum продуцирует иелло-
биазу, амилазу и [З-галактозидазу.
В опытах с мутантным штаммом Tric/zoderma reesei (Pourouie,
Vandecasteele, 1985) установлено, что уровень образования Цел-
люлаз на среде с лактозой и уровень их синтеза на чистой целлю-
лозе практически одинаковы. На среде с подпиткой активность
синтеза целлюлаз возрастает более чем в три раза. Warzywoda
et a1. (1983) исследовали образование целлюлазы Trichoderma
reesei на различных источниках углерода и также пришли к вы-
воду, что молочная сыворотка может быть перспективной средой
для получения Целлюлаз в промышленном масштабе.
Существует мнение, что максимальный эффект оптимизации
условий ферментации для получения целлюлазы достигается при
периодической глубинной культуре с подпиткой, Это исключает
проблемы, связанные с высокой исходной концентрацией целлю-
лозы в среде, при сохранении преимуществ общей высокой кон-
центрации субстрата (Watson, 1984). McLean И Podruzny (1985)
полагают, что при периодической культуре с подпиткой можно
одновременно добиться высокой продуктивности (производитель-
ности, высоких концентрации и выхода фермента).
Показана возможность активного биосинтеза целлюлаз клет-
ками Trichoderma reesei, ИММОбИЛИЗОВЗННЫМИ в пористых сфери-
ческих гранулах на среде с порошкообразной целлюлозой и в
73
композитах пористого полимерного матрикса (Катакыга et а1.,
1984; Катакнга, Kaetsu, 1984). Иммобилизованные в альгинате
кальция клетки Sclerotium rolfsii при инкубировании с целлюло-
зой продуцируют эндоглюканазу и В-глюкозидазу (Deshpande е’:
а1., 1987). Такие системы аналогичны твердофазной ферментации
и создают преимущества для получения ферментов в маленьких
компактных системах.
Смешанное культивирование двух культур Trichoderma reesei
И Aspergillus phoenicus (продуцента [З-глюкозидазы) повышает
гидролитический потенциал целлюлазного комплекса, что выра-
жается в увеличении выхода продуктов и скорости гидролиза
при более высокой концентрации ферментов (Dutt, 1985).
Известно, что целлюлазы облагораживают корма, служат
кормовой добавкой в рационы домашней птицы, повышают вы-
ход белков, жиров, крахмала, сахаров, эфирных масел, стерои-
дов при разрушении растительных клеточных стенок. В медици-
не целлюлазы могут быть использованы для улучшения перева-
риваемости пищи. Препараты целлюлаз нашли применение в
препаративной цитологии и молекулярной биологии для получе-
ния протопластов. В ближайшем будущем целлюлазы будут при-
меняться для получения глюкозы и этанола из целлюлозосодер-
жащего растительного сырья (Гернет, 1985). Целлюлаза Tricho-
derma reesei снижает количество глюканов, уменьшает вязкость
и повышает фильтруемость на стадиях приготовления сусла и
первичной ферментации пива (Ойзапеч е’: а1., 1985).
В целлюлозно-бумажной промышленности Целлюлазу можно
использовать для придания древесине новых технологических
свойств. Ферментативные препараты при определенных услови-
ях ускоряют процесс размола целлюлозной Массы и отходов дре-
весины. Механические свойства бумаги при этом улучшаются.
Многие авторы указывают на возможность применения пре-
паратов целлюлолитических ферментов гриба при силосовании.
Сахара, образующиеся при действии целлюлолитических фермен-
тов, способствуют развитию бактерий. В результате силос кои-
сервируется, обогащается белком, органическими кислотами и
другими питательными веществами (Henderson, McDonald, 1977;
Vaisto е’: а1., 1978; Ташпулатов, 1980).
Ферментативный гидролиз лигпоцеллюлозы может интенсив-
но протекать только после ее предварительной предобработки.
Предобработка нативной целлюлозы растворителями нарушает
кристаллическую структуру целлюлозы, образуется аморфная
целлюлоза, которая гораздо более чувствительна к действию
целлюлаз (Sasaki et а1., 1979). Измельчение субстрата само по
себе мало влияет на его гидролиз, однако в сочетании с прогре-
ванием оно эффективно повышает чувствительность субстрата к
гидролизу. Прогретая, затем измельченная целлюлозная пульпа
быстрее гидролизуется, чем размолотая, а затем прогретая.
Предобработка багассы паром (перед осахариванием целлю-
74
лазой) имеет, по данным Rao е: а1. (1983), преимущество перед
Щелочной обработкой, так как в среде Не накапливается NaC1,
поэтому возможны более высокие концентрации целлюлозы и по-
лучение соответственно более высоких концентраций глюкозы.
Автоклавирование пшеничной соломы в течение 45 МИН в режиме
180 °С в 4 раза повышает чувствительность к последующему
ферментативному гидролизу, Особенно эффективно последующее
удаление растворимых компонентов лигнина и гемицеллюлозы
экстракцией водой или водным раствором этанола при повышен-
ной температуре. После такой обработки гидролизуется 80% цел-
люлозы в соломе (Linden et а1., 1981). Обработка древесины па-
ром при 170—210°С повышает солюбилизацию гемицеллюлоз,
чувствительность целлюлоз к последующему ферментативному
гидролизу и увеличивает выход этанола (Poutanen е’: а1., 1985).
Для улучшения осахаривания свекловичного жома целлюла-
зами Trichoderma reesei предлагают автоклавирование, химиче-
скую предобработку кислотой или щелочью и энзиматическую
предобработку пектиназой. Наиболее эффективным методом
предобработки целлюлозных субстратов Mandels (1984) считает
паровой взрыв, который представляется экономически выгодным
при обработке древесины и сельскохозяйственных отходов.
Каткевичем и др. (1981) показано, что лигнин, не удаленный
из соломы щелочной обработкой, ингибирует целлюлолитические
ферменты. Наибольшие глубина и скорость гидролиза и наимень-
шая степень ингибирования фермента наблюдаются у целлюлоз,
содержащих менее 3% лигнина. Поэтому необходима предобра-
ботка субстрата и удаление лигнина. Возможна биологическая
делигнификация. Предобработка щелочами эффективна, но доро-
гостояща. Осуществить ее без затрат можно, если материал ис-
пользовать в каком-либо процессе до гидролиза целлюлозы, на-
пример для получения фурфурола или ксилита. Однако потреб-
ность в этих соединениях ограничена, Предполагается, что
тонкая структура целлюлозы в большей степени влияет на фер-
ментативныи гидролиз, чем просто площадь поверхности взаимо-
действия с субстратом (Fan et a1., 1980). Поэтому наиболее эф-
фективным методом предобработки следует считать тот, при
котором воздействие направлено на структуру целлюлозы.
Выявлена линейная зависимость между степенью фермента-
тивного гидролиза отходов целлголозно-бумажной промышлен-
ности и Степенью кристаллизации. Для повышения эффективно-
сти процесса рекомендуется предобработка 1°/‚-ныь4 МаОН (Dan
et а1., 1979). Но, по мнению дРУгих авторов, состояние кристалли-
ческой решетки целлюлозы не оказывает заметного влияния на
степень ферментативного гидролиза. Различные виды предобра-
ботки усиливают набухание волокон целлюлозы, а при их набу-
хании доступ целлюлаз к молекулам целлюлозы облегчается
(Dan е’: а1., 1981).
Для Целлюлозно-бумажной и деревообрабатывающей про-
75
мышленности большое значение имеет разработка микробиоло-
гических и ферментативных методов делигнификации древесины,
в частности создание мутантов, потребляющих исключительно
лигнин, а также применение микроорганизмов и ферментных
препаратов для очистки сточных вод. Биологическая делигнифи-
кация соломы в большей степени, чем щелочная предобработка‚
улучшает энзиматическую сахарификацию субстрата (Hatakka,
1984). Удаление лигнина и гемицеллюлозы в процессе предобра-
боток способствует более быстрой и полной утилизации оставше-
гося материала в течение ферментации (Lin et а1., 1985).
Разложение лигнина активизируется в случае использования
ассоциации микроорганизмов Pemcilliuin waksmani И Candida
Sp. B отличие от монокультуры (Ward, 1984). Применение сме-
шанных культур лигнолитических (Nocardia autotrophica) И
целлюлолитических (Cellulomonas Sp.) микроорганизмов повь1-
шает уровень деградации пшеничной соломы, лигнина и выход
биомассы (Haider, 1980).
С целью улучшения энзиматической сахарификации соломы
на ней выращивают вешенку обыкновенную. Этот гриб избира-
тельно деградирует лпгнин и гемицеллюлозы. Через 30 дней со-
держание доступной целлюлозы в соломе удваивается и обработ-
ка целлюлазой Приводит к превращению 72% целлюлозы в глю-
козу (Detroy et а1., 1980).
Факторами, влияющими на гидролиз целлюлозных материа-
лов, являются тип и концентрация субстрата, его предобработка,
возможность повторного использования фермента, температура
и рН реакционной среды, продолжительность воздействия препа-
рата и тип реактора. Многие из этих факторов взаимозависимы,
и это делает весь процесс довольно сложным. В оптимальном
случае реакция должна быть быстрой и полной, с образованием
больших концентраций глюкозы без существенной потери актив-
ности фермента.
В настоящее время целлюлазы мало используются в гзчёст-
ве промышленных ферментов. Существует мнение, что в ближай-
шие пять лет они не найдут широкого промышленного примене-
ния из-за высокой стоимости целлюлаз и сырья, необходимости
его предобработки, повторного использования целлюлаз, низкой
стоимости этанола — основного конечного продукта и др‚
В перспективе, по-видимому, резко возрастет потребность в цел-
люлазах, гемицеллголазах и лигнииазах для получения этанола,
обработки древесной пульпы, обработки стоков, В определенных
условиях энзиматический гидролиз целлюлозы может быть эко-
номически выгодным: при получении дополнительных и более
дорогих продуктов, чем этанол, а также при сочетании обработ-
ки стоков или других отходов с получением целевого продукта,
например глюкозы, Однако и в этом случае критическим момен-
том является стоимость целлюлаз. Так как для полного гидроли-
за целлюлозы необходимы несколько иеллюлазных компонентов,
76
можно полагать, что в последующем для получения необходимо-
го комплекса целлюлаз будут использоваться два или более ор-
ганизма.
Уже сегодня экономически целесообразно применение целлю-
лаз при получении спирта из зерна, при переработке фруктов и
овощей c Целью получения соков, ряда диетических продуктов и
протопластов. Ферментативные гидролизаты целлюлозы содер-
жат большее количество глюкозы, чем других продуктов расщеп-
ления. В кислотных гидролизатах ее количественное преоблада-
ние менее значительно, что особенно важно при получении глю-
козы для пищевых целей или для последующей изомеризации
глюкозы во фруктозу.
Несмотря на изобилие целлюлозы, трудно найти подходящий
целлюлозный субстрат, который не требовал бы больших эконо-
мическнх затрат на его сбор, транспортировку и хранение. Вь1-
бор соответствующего сырья диктуется местными условиями.
Проблема осложняется тем, что в большинстве случаев это сырье
может служить также топливом. Следовательно, стоимость ма-
териала для гидролиза соответствует стоимости его как топлива,
Примером отрицательной стоимости субстрата могут быть суль-
фптньте щелока, которые требуют соответствующей обработки,
чтобы избежать загрязнения окружающей среды. В этой связи
Целесообразно производство белка одноклеточных, пекарских
дрожжей, этанола или концентрирование и сжигание.
Ферментативное осахаривание целлюлозы может осуществ-
ляться в виде периодического или непрерывного процесса. Ис-
пользование техники иммобилизованных ферментов, непрерь1в-
ной подпитки раствора субстратом и удаление конечного продук-
та -— глюкозы, ингибирующей гидролиз, с помощью ультрафильт-
рации повышают производительность процесса.
По мнению Рабиновнча (1987), несмотря на значительные
усилия, направленные на реализацию опытно-промышленного
процесса ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих ма-
териалов, стоимость получаемых гидролизатов еще очень высока
и не окупает затрат на получение фермента 11 осуществление
процесса. Одной из причин низкой эффективности этой техноло-
гии является малоэффективность существующих реакторов пере-
мешивания, применяемых для процесса гидролиза. Низкая эф-
фективность процесса, большие затраты на делигнификацию и
предобработку субстрата делают его нерентабельным. Глубокий
гидролиз лигноцеллюлозы автор считает бесперспективным. Бо-
лее целесообразен процесс неглубокого гидролиза, который по-
зволяет сочетать одновременно процесс получения сахаров и
Целлюлаз.
Экономичность конверсии в значительной мере определяется
эффективностью систем осахаривания 11еллюлозь1 (Х/аага, 1985).
В ряде стран уже имеются опытные установки для энзиматиче-
ского осахаривания целлюлозы и получения этанола. Подробно
77
работа этих установок рассмотрена в обзоре Клесова (1985).
Осахаривание целлюлозосодержащих отходов коммерческими
препаратами целлюлаз—процесс дорогостоящий, следователь-
но, превращение целлюлозы с помощью ферментов для после-
дующего получения этанола экономически невыгодно. Возможно,
энзиматическии гидролиз гемицеллюлоз окажется экономически
выгодным для переработки целлюлозных материалов с Целью
получения ферментируемых сахаров.
Несмотря на очевидную эффективность Применения целлюло—
литических ферментов для получения легкоусвояемых сахаров
из целлюлозы, в ближайшем будущем для получения белковых
веществ и некоторых других продуктов биосинтеза микробиоло-
гическим путем экономически более целесообразным следует
считать непосредственное культивирование на целлюлозосодер-
жащем сырье определенных штаммов микроорганизмов, способ-
ных к усвоению целлюлозы.
Глава 5
МИКРООРГАНИЗМЫ — ПРОДУЦЕНТЫ БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ
Наиболее острым аспектом проблемы питания является де-
фицит белка, особая роль которого объясняется многообразием
его биологических функций. Белок-г основа тканей человека и
животных. Ферменты и многие гормоны, обеспечивающие жиз-
ненно важные процессы в организме человека,—— это также бел-
ковые вещества.
В настоящее время население земного шара составляет 4 млрд
человек, к 2000 г., по прогнозам ООН, оно достигнет 5,8%
6,4 млрд, а к 2500 г. — 11 млрд человек. Мировая потребность в
белке возрастет с 42 млн т в 1980 г. до 65 млн т в 2000 г. Но уже
сегодня более половины населения испытывает недостаток в
белке. Это в первую очередь относится к населению развиваю-
щихся стран, которое получает в 2 раза меньше растительного
белка и в 5 раз меньше белков животного происхождения, чем
население высокоразвитых стран, что приводит к снижению сред-
ней продолжительности жизни людей.
Растения и сельскохозяйственные животные — надежные, ис-
пытанные временем источники получения белка. Однако они уже
не удовлетворяют растущие потребности человечества. Совер-
шенно очевидно, что наряду c интенсификацией сельскохозяйст-
венного производства и освоением ресурсов Мирового океана ре-
альной необходимостью становится производство новых видов
пищи.
Всем Известно, что наиболее ценны молочные и яичные белки,
несколько менее—белки мяса и еще меньше-растительный
белок. В последнем меньше незаменимых аминокислот. Сравни-
вая, например, белки говядины, муки и картофеля с белком мо-
лока, следует отметить, что в муке мало лизина, в картофеле——
лейцина, Как правило, суммарный белок растений не сбаланси-
рован по ряду незаменимых аминокислот. Так, белки злаков де-
фицитны почти по всем незаменимым аминокислотам, лимити-
рующая аминокислота—лизин. Белки бобовых дефицитны по
лейцину, метионину, валину, триптофану и другим, лимитирую-
щая аминокислота — лейцин или метионин.
Питательная ценность белков зерновых культур не превыша-
ет 35-—50% питательной Ценности эталона (белка куриного яй-
Ца). Чтобы продукты были питательны, следует добавлять в них
Недостающие аминокислоты. Улучшение кормов недостающими
79
аминокислотами называется балансированием. Балансировать
можно любую растительную пищу,
Балансирование растительных продуктов позволяет получать
белок, аналогичный животному. Однако этот путь требует интен-
сификации сельскохозяйственного производства. В нашей стране
обеспечение сельского хозяйства высокоценным белком (соевый
шрот, рыбная, мясо-костная мука и др) ограничено. Общий объ-
ем производства этих белковых добавок в 1990 г. может покрыть
не более 6% потребности в нем.
Дефицит высокоценного белка исчисляется миллионами тонн
в год. Покрытие его наряду с увеличением производства продук-
тов растительного происхождения, рыбной муки и некоторых
других возможно за счет микробиологического синтеза. При этом
не требуются посевные площади, промышленное производство не
зависит от климатических условий, поддается точному планиро-
ванию и регулированию.
Микроорганизмы как продуценты белка имеют ряд преиму-
ществ по сравнению с высокоурожайными сельскохозяйственны-
ми растениями и животными, а главное имеют высокую скорость
роста. Кормом для них могут быть меласса (побочный продукт
получения сахара), продукты осахаривания древесины, а для
многих — ТОЛЬКО п-алканы нефти, солома злаковых культур и др.
Большое разнообразие микроорганизмов-продуцентов белко-
вых веществ и типов их питания позволяет использовать самые
различные виды сырья.
Преимущество микробиологического синтеза заключается в
возможности увеличения белковых запасов не путем экстенсив-
ного ведения сельского хозяйства, а промышленным способом.
Микробиологический синтез, таким образом, является новым ре-
гулируемым и управляемым промышленным процессом получе-
ния продуктов питания для человека. В качестве продуцентов
белка могут использоваться дрожжи, бактерии, грибы и водо-
росли.
Для оценки пригодности микроорганизмов в качестве проду-
центов протеина существует несколько критериев.
1. Качественный состав биомассы:
-— аминокислотный состав, содержание витаминов, липидов,
минеральных веществ;
— содержание нуклеиновых кислот. В быстрорастущих клет-
ках микроорганизмов этот показатель высок: 12-18% сухого
веществ а, что в несколько раз превышает нормы, рекомендуемые
Организацией По вопросам продовольствия и сельского хозяйства
при ООН (ФАО);
—— l'IepeBapI/IMOCTb——yCBO${eMOCTb азота протеина микробной
массы в пищевом тракте;
— содержание мико- и эндотоксинов‚ Высокое содержание
микотоксинов делает проблематичным использование целого ря-
да мицелиальных грибов в производстве. То же относится и к не-
80
Т аблица 2, Потребность человека в некоторых аминокислотах и
содержание их в микроорганизмах, мясе и зерне пшеницы (Лобанок,
Бабицкая, 1976)
Суточная Содержание аминокислот, % сух. массы —
потреб- Эталон
АМШЮКИСЛОТЗ ность че- дрож- бакте- мясо (го- зерио ФАО
ловека, г жн рии О Грибы вяднны) пшеницы
Лейцин 9,1 7,0 5,7 7,2 12,1 13,0 4,8
Изолейцин 3,3 5,3 2,9 3,6 3,4 4,0 4,2
Валин 3,8 6,3 3,9 5,8 3,4 3,5 4,2
Лизин 5,2 6,7 4,4 7,0 8,1 2,7 4,2
Цистин 3,8** — —- 3,5 1,1 4,3** 2,0
Метионин —— 1,2 1,4 2,8 3,3 —— 2,2
Фенилаланин 4,4 4,3 2,5 3,9 4,5 9,3* 2,8
Треонин 3,5 5,5 2,6 4,3 5,2 3,3 2,8
Тирозин 3,9 — — 3,4 3,1 —- 2,8
Триптофан 1,1 1,2 0,56 1,4 1,2 1,0 1,4
* Количество феннлаланина и тирозина.
** Количество цистина и метионина.
которым бактериям, липополисахаридные оболочки которых со-
держат эндотоксины.
2. Технологичность микроорганизма: резистентность к повы-
шению температуры и экстремальным значениям рН, особенно в
крупномасштабных процессах.
3. Отношение величины выхода продукта к количеству ис-
Пользованного источника углеродного субстрата.
4. Продуктивность — скорость синтеза микробной массы.
5. Способность использовать поликомпонентные субстраты
(um. no Виестуру и др.‚ 1986).
Аминокислотный состав белка микроорганизмов близок к со-
ставу, необходимому для питания человека. В табл. 2 представ-
лены сравнительные данные анализа аминокислотного состава
некоторых микроорганизмов, выращенных на углеводах.
Из приведенных данных видно, что почти все микроорганиз-
мы синтезируют большое количество лизина, относящегося к чис-
лу наиболее дефицитных аминокислот. Однако содержание Ме-
тионина и триптофана у дрожжей и бактерий невысоко. Поэтому
большой интерес представляют исследования, направленные на
выделение штаммов, в состав которых входят все три дефицит
ные аминокислоты в необходимых количествах.
Кроме белков, микроорганизмы богаты витаминами, особен-
но витаминами группы В, количество которых колеблется в за-
висимости от вида микроорганизма, питательной среды и усло-
вий культивирования. Некоторые авторы отмечают наличие в
микроорганизмах до 8 мг% витамина 8,2, до 60 мг% параами-
нобензойной кислоты, следы витамина Е. Такое количество ви-
таминов позволяет применять микроорганизмы также в лечебном
6 Зак. 966 81
Таблица 3. Состав микробной биомассы и традиционных белковых
продуктов (Межиня и др.‚ I982), %
Показатель Бактерии Дрожжи Грибы Водоросли Соя ‘ РЪЁЁБЁЁЯ
Азот 11,5—12,5 7,5—9,5 5,О—8,0 7,5—10‚О 6,5—7,2 ‘9,0—I0,2
Жир l,5~—8,0 2,0—9,0 2,0—8,0 7,0—15,0 1,О—2‚О 7,О—9
Нуклеиновые 8‚О——16‚О 6,0—12,0 l,6—-2,5 3,0—~8,0 — —
КИСЛОТЫ
лизин 4,1-s,4 4,2—9,0 2,0—7,9 2,0~2,4 2,5—2,s 4,5—4,7
Метионин+ 2,3—3‚8 1,7—2,2 О,8—2‚2 1,5—1‚7 1,З—1,5 2,8—3,О
+цистин
питании, в фармацевтической промышленности в качестве сырья
для получения витаминов группы В и витамина D. Более того,
витамины, в частности группы В, положительно влияют на белко-
вый обмен, причем естественные витамины значительно активнее
синтетических препаратов (Андреев, Брызгалов, 1986).
Присутствие в биомассе микроорганизмов аминокислот и дру-
гих биологически активных веществ наряду с высоким содержа-
нием белка делает возможным их использование не только в
корм ЖИВОТНЫМ, но и в пищу человека (Складнев, 1982).
Итак, высокопродуктивными продуцентами белка являются
микроорганизмы различных таксономических групп: бактерии,
дрожжи, мицелиальные грибы, актиномицеты. Отличительная
особенность микроорганизмов — высокая скорость удвоения био-
массы. Микроорганизмы способны генерировать каждые 1—6 ч,
в то время как растения и животные требуют для этого в 30—
700 раз больше времени (Межиня и др.‚ 1982). Наивысшим со-
держанием белковых веществ обладают бактерии (табл. 3).
У некоторых из них белок составляет 70% биомассы. Бактерии
размножаются быстрее других микроорганизмов. Аминокислот-
ный состав их белка более разнообразен и сбалансирован. Среди
бактерий встречаются виды с высоким содержанием таких дефи-
цитных аминокислот, как метионин и триптофан.
Недостаток бактерий как продуцентов белка усматривается
в высоком содержании в них нуклеиновых кислот (до 16%). Од-
нако, как считает Воробьева (1985), в биомассе, употребляемой
на корм животным, нет необходимости снижать содержание ну-
клеиновых кислот. Дело в том, что мочевая кислота, возникаю-
щая при деградации нуклеиновых кислот, у всех млекопитаю-
щих, кроме человека и некоторых приматов, превращается под
деиствием уратоксидазы в алантоин, который хорошо растворим
и легко переходит в мочу.
К недостаткам бактерий можно отнести малый размер кле-
ток, а следовательно, и сложный процесс выделения биомассы из
культурной среды. Для производства бактериальной биомассы
82
необходимо совершенствование технологии ее отделения. Уже
сейчас начинают применять более эффективные способы отделе-
ния биомассы бактерий. Так, Метод флотации с применением
тонкого диспергирования воздуха и флотируюЩих агентов дает
возможность получать на выходе из флотатора концентрирован-
ную массу, содержащую около 50 г/л сухого вещества. Для уско-
рения оседания бактерий успешно используются агглютинирую-
щие воздействия на суспензии бактерий. Предложен также спо-
соб осаждения бактерий путем добавления к ним соответствую-
Щей дрожжевой культуры (Коваленко, 1980).
Высокое содержание белков в биомассе, физиологически пол-
НОЦеННЫй ИХ аМИНокислотный состав, способность расти на раз-
личных питательных средах — вот основные критерии, позволяю-
щие считать бактерии перспективным объектом для микробиоло-
гической промышленности.
С технологической точки зрения более перспективными для
получения белка принято считать дрожжи. В производстве кор-
мовых дрожжей чаще всего применяются дрожжевые культуры
родов Candida, Trichosporon, Rhodotorula, Saccharomyces, Toru-
lopsis, Hansemtla И др. (Залашко, Залашко, 1967; Бекер, Бекер,
1982; Олешко и др.‚ 1986).
Основным сырьем для производства кормовых дрожжей явля-
ется барда гидролизных и сульфИтно-спиртовых заводов, щело-
ки Целлюлозно-бумажных комбинатов, гидролизаты древесины,
растительных сельскохозяйственных отходов и малоразложившс-
гося торфа, отходы крахмало-паточного, капролактамового про-
изводства, свеклосахарная меласса и дРУгие отходы сахарных за-
водов, мелассная и зернокартофельная барда спиртовых заводов,
барда ацетоно-бутиловых предприятий, отходы молочной про-
мышленности. Широкие возможности имеет микробный синтез
протеина из углеводородов нефти, продуктов ее переработки и
сопутствующих ей природных газов (Картуш, Мирзоянова, 1982).
Биомасса дрожжевых клеток состоит из 20—22% сухих ве-
ществ и 75-80 % ВОДЫ. Состав сухих веществ: углерод (45-
50%), азот (7—10°/0), водород (5—7%)‚ кислород (25-30%),
неорганические элементы (5—10%). 95-97% золы составляют
фосфор и калий, 3—5% —соедипения кальция, магния, серы,
хлора, железа, кремния. В небольших количествах в дрожжах
представлены такие Микроэлементы, как Марганец, цинк, молиб-
ден и др. (Забродский, 1972). Наиболее Ценный компонент дрож-
жей — протеин. По составу аминокислот дрожжевой белок пре-
восходит белок зерна пшеницы и других злаков, мало отличается
от белка сухого молока и рыбной муки.
В целом ценность дрожжевой биомассы определяется содер-
жанисм в ней не только белка, витаминов, микроэлементов, но и
некоторых уникальных питательных факторов. По данным Во-
робьевой (1985), пекарские дрожжи, например, —— лучший источ-
ник хромсодержащего органического фактора устойчивости к
5* 83
глюкозе. Он выступает посредником в действии инсулина. В по-
жилом возрасте способность людей к синтезу этого фактора сни-
жается. Сейчас при получении биологического белка в качестве
продуцентов чаще всего традиционно используются дрожжи и
бактерии. Мицелиальным же грибам не уделяется достаточного
внимания. Вместе с тем в ряде стран применение микроскопи-
ческих грибов издавна является основой МНОГИХ национальных
способов приготовления пищи (Steinkraus, 1985; Paredes-Lopes
ей а1., 1987).
Промышленное культивирование мицелиальных грибов нача-
лось задолго до появления антибиотиков. Так, сыр рокфор изго-
товляли на юге Франции из молока овец еще тысячу лет назад.
Другие виды «голубых» сыров также имеют древнюю историю, и
лишь сравнительно недавно была выяснена роль микроскопиче-
ских грибов в процессах приготовления сыров. Из них наиболее
распространенными оказались Pe/2ict'llium roqueforli, P. Camem-
berti, P. швед.
На Востоке мицелиальные грибы применяют с той же целью,
что и солод на Западе. Они высоко ценятся За способность повы-
шать усвояемость и вкусовые качества довольно пресных и Не-
усвояемых продуктов, являющихся важными источниками бел-
ков в вегетарианской или иолувегетарианской диете.
В Азии для приготовления пищевых продуктов используют
плесневые грибы родов R/zizopus, Mucor, Actinomucor И Amyla-
myces, ИЗ рода Aspergillus — А. oryzae И А. sojae. Грибы же рода
Penicillium (P. c/zrysogenum, Р. dierc/exii, P. gladioli, P. album)
ускоряют процесс созревания салями (Grazia ей а1., 1986).
В Европе микромицеты чаще всего используются для производ-
ства сыров, сухих колбас и сырых окороков. Они представлены
почти исключительно грибами рода Penicillium (Lcisiner, 1986).
Существует порядка 73 способов ферментации и более 80 их раз-
новидностей с участием грибов и дрожжей. Многие из них под-
ходят для промышленного изготовления с дальнейшей реализа-
цией в качестве деликатесов.
С помощью микроскопических грибов получают кислоты: гал-
ловую, лимонную, глюконовую, фумаровую.
Говоря о роли микрогрибов, нельзя не вспомнить о пеницил-
mane, открытие которого связано с именем Флемминга. Вслед за
пенициллином появились и другие антибиотики. Открытие пени-
циллина явилось мощным толчком для быстрого развития гриб-
ной ферментационной промышленности.
Микроскопические грибы способны также синтезировать на
простых средах белок, который может быть использован для по-
лучения некоторых аминокислот, приготовления белковых гид-
ролизатов. Аналогичное применение могут найти и жиры, про-
дуцируемые грибами. Другая возможность использования микро-
скопических грибов—выделение из них фармакологически ак-
тивных соединений, которые могут оказаться менее токсичными и
«84
в то же время более эффективными по сравнению с синтетиче-
скпми препаратами, стимулирующими сердечную деятельность,
регулирующими кровяное давление, усиливающими обмен ве-
Ществ и дыхание. Практическое значение веществ, получаемых с
помощью микроскопических грибов, совершенно очевидно.
Интерес к микроскопическим грибам как продуцентам белка
возник еще в прошлом веке. Уже в 1896 г. сотрудниками Харь-
ковского ветеринарного института сделана попытка использовать
способность некоторых грибов фиксировать атмосферный азот
для получения кормового протеина. В 1950—1960 гг. рядом авто-
ров изучалась Возможность накопления полноценной биомассы
микроскопическими грибами различных таксономических групп
на таких субстратах, как барда сульфитных и гидролизных спир-
товых и паточных заводов, а также на субстратах, содержащих
целлюлозу и гемицеллюлозу.
С биологической точки зрения вездесущая роль грибов была
оценена лишь сравнительно недавно. В последние годы в связи с
проблемой белкового дефицита микроскопические грибы рас-
сматриваются как продуценты белковой биомассы (Горленко,
1983). По ряду показателей они имеют преимущества перед дру-
гими микроорганизмами. Как известно, людям свойственны
привычки, укоренившиеся традиции. Человек ест пищу, которая
ему нравится. Представления же о питательной ценности ее сто-
ят, как правило, на втором месте. Опыт показал, что ввести но-
вый вид пищи, даже очень хорошей, в рацион людей, привыкших
к пище с другими свойствами, очень трудно. Что же касается
грибов, то они как пищевой продукт общепризнаны и в ряде
стран являются деликатесом.
Преимущества грибов как продуцентов белка обусловлены и
рядом других, более ценных свойств. Ввиду высокого содержа-
ния и особенностей нуклеиновых кислот дрожжей и бактерий
только до 10% белка в рационе можно заменить дрожжевым или
бактериальным. Грибной же белок может употребляться в пищу
в любых количествах, вплоть до полного замещения животного
белка. Немаловажное преимущество грибов —легкое и дешевое
отделение мицелия. Их мицелиальная структура — ценное свой-
ство при получении структурированных пищевых продуктов.
Грибной белок легко подвергается кулинарной обработке, его
нитчатая структура позволяет имитировать общепринятые впдьт
пищи.
Микроскопические грибы синтезируют большой набор фер-
ментов, что позволяет им превращать в съедобный белок отходы
производства бумаги, текстильной промышленности, пищевого
производства и др. (Бабипкая, 1977; Стахеев, Бабицкая, 1978;
Lobanok, Babitskaya 1986).
Особое внпмание стали уделять грибному белку в 60—70-е
годы. На 111 Мевкдународпом конгрессе по пищевой промышлен-
ности, проходившем в 1970 г. в Вашингтоне, обсуждались вопро-
85
сы изыскания новых источников питания, повышения питатель-
ности пищи и обогащения ее белком. В докладах ученых из мно-
гих стран наряду с возможностью промышленной выработки
пищевого белка из семян сои, риса, хлопка, листьев некоторых
растений отмечалась перспективность получения и использова-
ния белков грибного происхождения.
Для многих регионов мира, в которых наблюдается дефицит
белка, характерно наличие избытка углеводов (особенно в форме
крахмалосодержащих продуктов). Превращение части таких
крахмальных субстратов в белки с помощью микроорганизмов
позволит улучшить белково-калорийный баланс (Roger et а1.‚
1976; Gregori, Reade, 1977; Sukatsch et а1.‚ 1983; Hang, Woodams,
1983; Solak, 1986).
С помощью микроскопических грибов можно обогатить бел-
ком и отходы Целлюлозно-бумажного производства, молочной
промышленности (Kehagias, Macris, 1984; Ощепкова, 1986). На-
ми (Бабицкая и др., 1976; Бабицкая, Лобанок, 1976; Лобанок и
др., 1977; Лобанок, Бабицкая, 1977) проверена способность бо-
лее 500 культур мицелиальных грибов трансформировать в белок
отходы картофеле- и крахмалоперерабатывающей промышлен-
ности, Лучшими продуцентами белка оказались грибы рода Ре-
nicillium, B частности Р. digitatum, P. notatum, P. claviforme,
P. terli/aows/aii. Грибы хорошо растут на нестандартном картофе-
ле, картофельной мезге, картофельном соке, соковой воде и др.
Использование таких отходов для получения белка исключает
опасность отрицательного действия самих субстратов.
Наряду с полноценной биомассой отобранные продуценты
синтезируют комплекс гидролитических ферментов — пектиназу,
амилазу и целлюлазу, что позволяет при приготовлении пита-
тельных сред для микробного синтеза белка исключить предва-
рительный кислотный гидролиз субстратов, а культуральную
жидкость применять для мацерации растительных тканей либо
для ДРУГИХ целей. Урожай биомассы рекомендуемых продуцен-
тов достигает 20 г/л. Грибная биомасса содержит до 50% протеи-
на, 4‚5—5‚0 % жира, витамины группы В. Истинный белок в пре-
паратах составляет 30~40%, нуклеиновые кислоты——0‚6—2°/о.
Многие микроскопические грибы способны расти на средах с
углеводородами. K ИХ числу относятся грибы родов Aspergillus,
Botrytis, Penicillium, Rhizopus, Monilia (Редчиц, 1976).
Особый интерес как сырье для микробиологической промыш-
ленности представляют спирты — этиловый и метиловый. Сравни-
тельно недавно в литературе появились сообщения о способности
микрогрибов к метилотрофному росту. Из почв, окружающих
петролейные тэнки, выделено несколько штаммов мицелиальных
грибов, растущих на среде с метанолом. Один вид идентифици-
рован как Triclzoderma lignorum. Однако полагают, что его ис-
пользование в качестве продуцента белка на среде с метанолом
пока невыгодно из-за невысокого экономического коэффициента
86
(8,45 %) И низкой удельной скорости роста (Тау, Willets, 1977).
Весьма энергично растут минелиальные грибы на средах с
этанолом в качестве источника углерода. Родионова с сотр.
(1975), изучая грибы родов Penicillium, Aspergillus, Spicaria, Fu-
sarium, наряду с другими источниками углерода применяли эти-
ловый спирт. Выход абсолютно сухой биомассы составлял 40,0-
72,0%. Содержание сырого протеина в биомассе колебалось в
пределах 50—58%. По составу аминокислот биомасса мицели-
альных грибов не уступала биомассе кормовых дрожжей, Одна-
ко скорость роста грибов на этаноле была ниже, чем у дрожжей.
Большая работа по изучению особенностей культивирования
грибов, в частности базидиальных, на этаноле проведена в Япо-
нии (Sugimori et а1., 1972). Установлено, что урожай биомассы,
содержание в ней протеина у гриба Lensites edodes И некоторых
других грибов на среде со спиртом выше, чем на среде с глюко-
зой. При культивировании грибов на среде с этанолом мицелий
имеет более приятный запах.
Лобанком с сотр. (1976) и Гончаровой с сотр. (1977) исследо-
вана способность более 300 культур мицелиальных грибов накап-
ливать биомассу с высоким содержанием белковых веществ на
средах с этиловым и метиловым спиртами. На среде с этанолом
урожай биомассы у большинства проверенных культур не пре-
вышал 5——7 г/л и лишь у небольшой части достигал 11—12 г/л.
На этой среде хорошо росли грибы родов Penicillium И Fusarium,
накапливающие 10—12 г/л биомассы с содержанием протеина до
60%, слабее развивались грибы рода Aspergillus, хотя урожай
биомассы одной из выделенных культур составил 10,5 г/л.
На средах с метанолом грибы росли намного медленнее: на
5-е сутки культивирования урожай биомассы не превышал 5 г/л.
Более половины исследованных культур давали до 3 г/л биомас-
cm. Лучше Других на метаноле развивались грибы родов Воггу-
tis И Trichoderma. Урожай биомассы этих культур достигал 5 г/л,
количество протеина в ней — 60%.
Особое место среди потенциальных продуцентов белка зани-
мают съедобные базидиальные грибы, плодовые тела которых
издавна употребляются человеком в пищу (Гарибова‚ 1987). Но-
вый этап в исследовании по культивированию базидиомицетов
связан с именем американского ученого Хумфельда. Им впервые
был разработан способ выращивания в глубинной культуре шам-
пиньонов. Работы Хумфельда явились толчком для дальнейших
исследований по культивированито съедобных макромицетов в
глубинной культуре. Высшие съедобные грибы стали привлекать
внимание исследователей как продуценты биологически актив-
ных метаболитов и как продуценты кормового и пищевого бел-
ка. В середине 50-х годов проведены широкие исследования по
культнвированию некоторых представителей рода Morchella.
B конце 50-х—начале 60-х годов появились сообщения о
культивировании других видов макромицетов в глубинной куль-
87
туре, в частности Hypholoma /zidrophila И Stereum пилит. Сле-
дует упомянуть также работы финских ученых, которые выявили
наиболее перспективные виды съедобных грибов для культивиро-
вания в глубинной культуре. Быстрым ростом и высоким урожа-
ем биомассы отличались Suillus bovinus, S. variegatus, Arrm'lla-
пена mellea и др. При выращивании на комплексных средах мак-
симальный выход биомассы наблюдался у грибов Pleurotus
cormwopiae (20,9 I‘/J1) И Morchella esculenta (23‚6 г/„ч). Из 15 изу-
ченных видов грибов Boletus sp., Дерюга ргосега отличались наи-
большей продуктивностью. Экономический коэффициент состав-
лял 44—45%. Дальнейшая оптимизация условий культивирова-
ния позволила увеличить урожай биомассы у Во1е’ш$ эр. до
20 г/л за 32 ч инкубации (Лобанок, Бабицкая, 1981).
Работы по изучению макромицетов с Целью получения бел-
ковых веществ интенсивно ведутся в нашей стране. Так, в Ле-
нинградском ботаническом институте АН СССР Низковская
(1972) исследовала рост представителей различных физиологи-
ческих групп базидиомицетов в глубинной культуре. Лучшими
продуцентами оказались грибы, вызывающие белую гниль дре-
весины. Flammulina velutipes, Pholiota mutabilis И Pleurotus ost-
reazus рекомендованы автором для получения грибного мицелия
В ПИЩЕВЫХ ИЛИ КОрМОВЫХ ЦЕЛЯХ.
Центром исследований по культивированию съедобных гри-
бов в глубинной культуре является Институт ботаники АН УССР
(Дудка и др.‚ 1978), где с 60-х годов ведутся интенсивные рабо-
ты в этом направлении. Установлено, что глубинное культивиро-
вание значительно ускоряет процесс роста высших грибов. Из
агариковых грибов быстрым ростом и урожаем биомассы ——от
15 до 27 г/л — характеризовались грибы родов Agaricus, Capri-
nus, Кызыла, а также Lactarius helvus, Clitopilus prurnilis, Pleu-
rotus ostrealus, Flammulina velutipes, Panus tigrinus, Pholiota
adiposa, Suillus bow’/ms. Среди агариковых грибов хороший рост
продемонстрировали как дереворазрушаюшие, так и представи-
тели микоризообразоватслей, почвенных и подстилочных сапро-
фитов. Из афиллофоровых наибольший интерес представлял
Sparassis crispa, дающий выход мицелия до 22 г/л и обладаю-
щий сильным грибным ароматом (Бухало, 1973, 1978; Бухало и
др.‚ 1972; Дудка и др.‚ 1978).
Основными объектами исследований стали три гриба: Pleu-
rotus ostreatus, Flammulina velutipes И Panus tigrinus. По мн"-
нию украинских исследователей, первое промышленное произ-
водство мицелия в СССР следует основывать на базе различных
штаммов гриба Pleurotus osireatus (Бухало, 1983). Характерной
особенностью одного из этих штаммов (UMBF-1300) является
высокая (0‚14 г‘) удельная скорость роста в глубинной культу-
ре, а также большой урожай биомассы.
Промышленное культивирование высших грибов связано с
наличием дешевых субстратов. На 1 Всесоюзном совещании ‹<Со-
88
стояние и перспективы производства высших съедобных грибов
в СССР», которое состоялось в Киеве в 1977 г.‚ указывалось на
Целесообразность использования для выращивания съедобного
мицелия богатых сахаром отходов переработки фруктов, овощей,
картофеля, сахарной свеклы, кукурузы, МОЛОЧНОЙ сыворотки, а
также других отходов сельскохозяйственного производства и де-
ревообрабатывающей промышленности. Особенно часто для по-
лучения биомассы базидиомицетов применяют мелассу. Хоро-
Шие результаты по культивированию некоторых МаКрОМИцетоВ
на мелассе получил болгарский исследователь Торев (1973).
В опытах Морозовой и сотр. (1978) гриб Pleurofus ostreatus при
выращивании на мелассе образовывал до 12 г/л мицелия, содер-
жащего 38-400/0 протеина. Сравнительное изучение биохимиче-
ского состава мицелия Pleurotus ostreatus, выращенного на сре-
де со свекловичной мелассой, и плодовых тел выявило, что по
содержанию белка и нуклеиновых кислот они практически не
отличались (Морозова и др‚, 1982, 1985).
Соломко и сотр. (1978) выращивали на среде с мелассой 72
штамма грибов и установили, что 46 из них способны активно
развиваться. Лучшим ростом обладали Flarnmulina velutipes,
Panus tigrinus, Pleurotus ostreatus. При этом мицелий, выращен-
ный глубинно, сохранял основные химические свойства естествен-
ных плодовых тел. Авторы считают, что качественный состав и
количественное содержание важнейших компонентов клеток за-
висят от условий культивирования, состава среды и возраста
биомассы. Перспективным продуцентом биомассы на средах с
мелассой оказался штамм Flammulina velutipes I/IBK-112. OH от-
личался более активным ростом по сравнению с Pleurotus 0strea—
tus UMBF-1300 (СОЛОМКО, 1978). Об активном росте этого гриба
(зимний опенок) на среде с мелассой сообщалось Неустроевой
(1981).
Капичем и сотр. (1980, 1984) также показано, что на среде с
мелассой в качестве единственного источника питания способны
развиваться многие дереворазрушающие грибы. При выращива-
нии одного из них — Daedaleopsis confragosa —— в ферментере че-
рез 72 ч культивирования концентрация биомассы равнялась
7 г/л при содержании сырого протеина 48%. Интенсивный рост
штамма на средах с мелассой обусловлен способностью его
активно использовать сахарозу-—основнои углеводныи компо-
нент мелассы.
Для получения грибной биомассы используют и такие суб-
страты, как соевую сыворотку, отходы деревообрабатывающей и
консервной промышленности (Rensser et а1.‚ 1985). В последнее
время появились сообщения об успешном применении для глубин-
НОЙ культуры базидиальных грибов таких источников углерода,
как п-алканы, органические кислоты, алифатические спирты (Ма-
rjorie, 1985).
Большой интерес для выращивания базидиомицетов пред-
89
ставляют также крахмалосодержашие субстраты. Известно
(Шиврина и др.‚ 1969; Капич, 1981), что крахмал является опти-
мальным источником углеродного питания для многих видов ба-
зидиомицетов. Так, при замене в среде глюкозы крахмалом уро-
жай биомассы гриба Lensitcs edodes почти утраивается. Большое
количество крахмала содержится в отходах переработки расти-
тельного сырья, особенно в отходах переработки картофеля, ко-
торые могут служить сырьем для получения не только биомассы
дрожжей, но и мицелиальных грибов.
Капичем и сотр. (1979, 1986) обнаружено, что многие виды
дереворазрушающих базидиомиЦетов, вызывающих белую гниль
древесины, активно накапливают биомассу с высоким содержа-
нием белка на средах с нестандартной клубневой фракцией кар-
тофеля. При выращивании 24 быстрорастущих культур базидио-
мицетов на среде с 10% такого субстрата выход биомассы грибов
достигал 5,2—9,4 г/л, содержание протеина в ней ~ 35,8——43,5 %.
Наиболее продуктивным по белку был штамм Palms tigrinus.
Перспективным субстратом для культивирования мицелиаль-
ных грибов считается отход переработки картофеля—карто-
фельная Мезга. Ранее сообщалось (Алексеева, 1965), что при вы-
ращивании базидиальных грибов на средах с картофельной мез-
гой (20 г/л) выход биомассы колеблется от 6,8 до 16,4 г/л, содер-
жание протеина — от 15,4 до 34%. Низкое содержание протеина
в биомассе (21,6—20,4°/д) отмечено и другими авторами (Капич
и др.‚ 1983) при выращивании на картофельной мезге гриба Ра-
nus tigrinus. По мнению исследователей, это объясняется непол-
ным усвоением субстрата грибом. Присутствие в биомассе неути-
лизированного субстрата позволяет применять ее только в ка-
честве кормовой добавки.
Для культивирования мицелия может быть использован кле-
точный сок картофеля. Объем его доходит до 50% массы пере-
рабатываемого картофеля. В качестве основных составных ча-
стей в клеточный сок картофеля входят аминокислоты: лизин,
аланин, глутамин и др. Минеральная часть сока включает окси-
дат калия, фосфорную кислоту, соединения кальция и магния.
При выращивании Panus tigrinus Ha клеточном соке картофеля
получали мицелий с содержанием протеина до 51%. Концентра-
ция биомассы при этом была незначительной (Капич и др.‚ 1983).
Поскольку клеточный сок картофеля является ценным источни-
ком углерода, биофакторов роста и органического азота, многие
(Краузе и др.‚ 1974; Межиня и др.‚ 1978) рекомендуют его как
заменитель кукурузного экстракта.
Для глубинного культивирования йазидиомицетов благопри-
ятна среда с водными экстрактами овсяной муки, пшеничных
отрубей, тапиока, шелухи гороха и рисовых отрубей. Так, при
выращивании гриба Pleurotus flabcllatus максимальную концент-
рацию биомассы получали на средах с экстрактом овсяной муки
и пшеничных отрубей —- 5,4 и 4,6 г/л соответственно. Содержание
90
протеина ограничивалось лишь 13,1 и 15,0%. Самой низкой
(2,2 г/л) была концентрация биомассы на средах с тапиоком. Оп-
тимальными субстратами для получения полноценной биомассы
не только Pleurotus flabellatus, НО и Sporotrichum pulverulem
tum — несовершенной стадии базидиального дереворазрушающе-
го гриба Phanerochaete chysosporium-— явились мука злаковых
и пшеничные отруби (Hofsten, Ryden, 1975).
Морозова и сотр. (1978), а также Таратунина и сотр. (1987)
считают возможными субстратами для получения белковых ве-
ществ гидролизаты растительных тканей, сульфитные щелока,
отходы молочной промышленности и др.
Хорошие результаты при выращивании гриба Phanerochaete
chrysosporium получены на винассе (отход производства спирта
из сахарного тростника). После 30 ч культивирования в фермен-
‘re концентрация мицелия достигала 11 г/л, количество протеи-
на — 23% (Cardoso, Nicoli, 1981). Для получения мицелия гриба
может быть использован и сок из белкового экстракта листьев
маниоки (Femandes, Nicoli, 1981). В качестве питательной среды
для выращивания Sporotriclzum pulverulentunz употребляют и от-
ходы переработки апельсинов (кожуру, отходы мякоти и семена).
Выход грибной биомассы при этом равен 34 г на 100 г отходов,
протеина — 30% (Karapir1ar,Okuyar1, 1982).
Перспективным субстратом для получения пищевой биомас-
сы высших съедобных грибов, по мнению многих авторов (Моро-
зова и др., 1978; Бухало и др., 1983), является молочная сыво-
ротка. работ, связанных с разработкой способов получения ми-
целия дереворазрушающих грибов на этом ценном субстрате,
сравнительно мало. Известно, что при выращивании на разбав-
ленной (1 :2) водой молочной сыворотке Trametes versicolor И
Tyromyces albellus урожай биомассы достигает 10—-11 г/л, коли-
чество протеина—32—38°/о. Оба гриба обладают [З-галактози-
дазной активностью.
В Польше разработан способ получения биомассы гриба Ino-
„от obliquis. 3a 68 ч его культивирования образуется 7 г/л био-
массы с содержанием протеина 41% (Капич И др., 1984). По
данным Капича, Стахеева (1983), молочная сыворотка может
быть использована для получения белковой биомассы Sp0r0tri-
chum pulverulentum, обладающей хорошим аминокислотным со-
ставом, в том числе высоким содержанием лизина. Авторами изу-
чен рост 24 штаммов дереворазрушающих грибов на молочной
сыворотке. Установлено, что неразведенная сыворотка обеспе-
чивает более активный рост грибов. Свыше 10 г/л мицелия на-
капливают Daedaleopsis confragosa, Panellus stypticus, Palms
tigrinus, Phlebia gigarztea, Schizophyllum Commune. Эти же
грибы оказались активными продуцентами протеина. Макси-
мальное содержание протеина (42,0%) отмечено в мицелии Hirs-
cfzioprus pergarnenus, однако наиболее продуктивным по белку
(4,1 г/л) был Daedaleopsis co/zfragosa.
91
Вместе с тем следует отметить, что биомасса, полученная при
выращивании грибов на молочной сыворотке, обладала более
низким содержанием сырого протеина по сравнению с биомассой,
полученной при выращивании этих же грибов на средах с отхо-
дами переработки картофеля. Исследования роста Daedaleopsis
confragosa ПОЗВОЛИЛИ оптимизировать условия его культивиро-
вания: гриб активно развивался на молочной сыворотке без до-
бавления дополнительных компонентов питания. Лучший его
рост и более полная утилизация лактозы достигались на неосвет-
ленной сыворотке, что свидетельствует о способности гриба
усваивать сывороточные белки. Разведение сыворотки водой
(1 : 1) способствовало более экономному использованию ее угле-
водов. Внесение в неосветленную и разведенную сыворотку до-
полнительных источников азотного питания увеличило содержа-
ние протеина до 40-500/0 и ускорило рост гриба. Максимальная
удельная скорость роста Daedaleopsts confragosa достигала
0,11 ч".
Известен технологический процесс, позволяющий трансфор-
мировать жидкие лигноцеллюлозные отходы деревообрабаты-
вающей промышленности B биомассу Sporotrichum pulverulem
tum (Mats, Eriksson, 1980). Инокулированием сточных вод, в
состав которых входят моно- и олигосахариды, а также лигноцел-
люлоза, мицелием гриба получен продукт, содержащий 40% СЫ-
рого протеина. Биомасса характеризовалась высокой усвояе-
мостью. При выращивании на гидролизатах древесины 25 штам-
мов базидиомицетов отобрано три активно растущих штамма
(Гусарова и др.‚ 1983). Выход сухого мицелия по отношению к
углеводам среды составил: у Trametes sp,—— 34—35%, y Pleura-
tus sp.— 22-26, у Schizophylluzn CO:‘7l:‘7lLH’l€—230/0. Содержание
сырого протеина в грибном МИцеЛиИ колебалось от 37 до 39%.
Субстратом для выращивания базидиомицетов может быть гид-
ролизат твердой фракции свиного навоза (Davey, Bruce, 1983).
Концентрация Sporotrichum pulverulentum на этой среде в опти-
мальных условиях достигала 20 г/л.
Некоторые дереворазрушающие базидиомицеты усваивают
лигносульфоновые кислоты и фенольные продукты разложения
лигнина, а также гидролизный лигнин (Озолиня и др.‚ 1982).
При выращивании предварительно адаптированного гриба Ро-
gonomyces hydnoides на жидкой среде, содержащей 20 г/л гидро-
лизного лигнина и Минеральные соли, выход биомассы равен
24% используемого субстрата при содержании протеина 17,50/0.
Биомасса рекомендована в качестве белково-витаминной добав-
ки к рациону цыплят.
Выращивание мицелия высших базидиальных грибов для
пищевых или кормовых целей в искусственных условиях требу-
ет изучения отношения этих грибов к основным источникам пита-
ния и некоторым другим факторам, регулирующим Накопление
биомассы или желаемых продуктов метаболизма. При изучении
92
влияния наиболее существенных компонентов питательной сре-
ды— источников азотного и углеродного питания— на рост ми-
целия некоторых съедобных грибов из порядков Agaricales,
Aphyllophorales, Gasteromycetales установлено, что испытанные
виды базидиомицетов на разных источниках углерода развива-
ются индивидуально. Многие грибы лучше росли на (‘реде с крах-
малом, другие — на среде с мальтозой. На средах с сахарозой и
рафинозой испытанные виды (более 33%} образовывали мице-
лия в 5—10 раз меньше, чем на средак с глюкозой. Все испытан-
ные виды, кроме Agaricus bisporus, усваивали как нитратный,
так и аммонийный азот. Одни виды предпочитали нитритные,
другие аммонийные соли (Бухало и др.‚ 1975).
При изучении влияния различных источников углерода и азота
на рост некоторых видов грибов рода Coprinus обнаружены су-
щественные различия в физиологии питания, на основании чего
они были подразделены на виды, обладающие малой избира-
тельностью к источникам углерода и азота, и виды, использую-
щие только строго определенные соединения, Утилизация гриба-
ми источников питания, витаминов, ростовых веществ зависит от
ряда факторов среды: рН, температуры, отношения С : N B среде
и др. При выращивании Agaricus bisporus B жидкой минеральной
среде сырой протеин составлял 38%, а на среде с молочной сы-
вороткой-около 58%. Для Coprinus conchazfus эти значения
равнялись 39,2 и 52% соответственно. Гриб Lensites edodes на
глюкозе продуцировал биомассу, содержащую 32% сырого про-
теина, а на среде с этанолом — 55%, для мицелия Schizophyllum
эр. этот показатель достигал соответственно 32 и 62,8% (Заруд-
ная, 1971).
Дереворазрушающие базидиомицеты способны развиваться
на средах относительно простого состава. Ранее было показа-
но, что единственным витамином, необходимым для роста этих
грибов на синтетических средах, является тиамин. Вместе с тем
внесение в культуральные среды дополнительных факторов ро-
ста (аминокислот и витаминов) значительно интенсифицирует
процессы образования биомассы и белка. Использование субст-
ратов растительного и животного происхождения во многом спо-
собствует решению проблемы обеспечения мицелия факторами
роста. Такие субстраты, как меласса, отходы переработки карто-
феля, отвары и экстракты растений, молочная сыворотка и дру-
гие, сами по себе являются источниками таких факторов. Одна-
ко во многих случаях требуется внесение дополнительных стиму-
ляторов. Наиболее часто с этой целью применяется кукурузный
экстракт, который в более высоких концентрациях может слу-
жить источником органического азота, так же как дрожжевой
экстракт, пептон и гидролизат казеина. Стимулирующее влияние
на рост мицелия дереворазрушающих базидиомицетов оказыва-
ют липиды. При выращивании Pleurotus „Чардаш на средах с
тростниковой мелассой, вытяжкой из соевых бобов или соком
93
из люцерны, во всех трех случаях рост гриба стимулируется до-
бавлением кукурузного масла в концентрации 1%: в наибольшей
мере— на вытяжке из соевых бобов, в наименьшей —— на мелас-
се. Было установлено, что растительное масло стимулирует обра-
зование биомассы и у других грибов рода Pleurotus: P. ostreatus,
P. Osfreatus sp. florida и Р. cornucopiae (Капич и др.‚ 1984).
В целом дереворазрушающие базидиомицеты как продуценты
белка уступают другим микроорганизмам по таким показателям,
как удельная скорость роста, содержание белка.
По данным Капича и сотр. (1984), себестоимость белковой
биомассы дереворазрушающих базидиомицетов относительно вы-
сока ~3—4 руб/кг, что в 2—1О раз выше себестоимости белковой
биомассы дрожжей. Цена на дрожжи пищевого назначения в
1982 г. составляла 1,9——2‚3 долларов/кг, а на кормовые дрож-
жи — 0‚5—О‚7 долларов/кг (Litchfield, 1983). По данным Межн-
ни и сотр. (1982), стоимость дрожжевого белка в СССР равня-
лась 1,0—-1,2 руб/кг.
Цифры говорят о том, что дереворазрушающие грибы вряд ли
смогут конкурировать в ближайшее время с дрожжами как про-
дуценты кормового белка. Учитывая традиционность потребле-
ния грибов, хорошие органолептические качества их мицелия,
есть все основания полагать, что в ближайшее время он найдет
применение лишь в качестве источника пищевого белка.
В известной нам литературе нет сообщений о существовании
налаженного производства мицелия дереворазрушающих бази-
диомицетов на основе глубинного культивирования, хотя опыт
промышленного выращивания мицелия съедобных грибов в неко-
торых странах имеется (в США, Финляндии). Капичем и сотр.
(1984), а также украинскими ученьлми показана принципиальная
возможность получения мицелия дереворазрушающих базидио-
мицетов Panus zigrinus, Daedaleopsis confragosa и Pleurotus
osrreatus UMBF-1300 Ha базе предприятий микробиологической
промышленности. Для опытного выращивания мицелия пило-
лпстника тигрового и даедалеопсиса бугристого использована
молочная сыворотка, для выращивания вешенки обыкновенной —
глюкозо-пептонная среда, а также среда с осахаренным карто-
фельным крахмалом (Бисько и др.‚ 1983). Авторы отмечают, что
при культивировании грибов в производственных условиях на-
копление мицелия происходит более интенсивно, чем в лабора-
торных.
Ценность мицёлиальных грибов еще и в том, что кроме бел-
ков они способны накапливать значительное количество ве-
ществ липидной фракции, которая состоит из восков и углеводо-
родов, эфиров стеринов, триглицеридов‚ жирных кислот, стери-
нов, моно- и диглицеридов, т. е. компонентов, аналогичных со-
ставу растительных масел. Как считают Морозова и сотр. (1985),
по содержанию и характеристике жирных кислот липиды грибов
близки к облепиховому и подсолнечному маслам. Характерным
94
является высокое количество в мицелии многих микро- и макро-
мицетов полиненасыщенных линоленовой и линолевой кислот.
Линолевая кислота относится к незаменимым жирным кислотам.
При ее недостатке снижается интенсивность роста, угнетается
репродуктивная функция, понижается сопротивляемость к инфек-
циям, возникают поражения кожных покровов и другие наруше-
ния. Именно поэтому уделяется внимание получению не столько
белковой, сколько белково-липидной биомассы, которая с успе-
хом может быть использована в качестве высокоэнергетической
добавки в корм животным.
До 20-38 % линолевой кислоты содержится в составе липи-
дов биомассы микромицетов рода Aspergillus (Дарган-Сущова
и др., 1987), до 40——60% — B белково-липидной биомассе грибов
Aspergillus alliaceus, Curminghamella echinulafa и Plzanerochaete
chrisosporium (Капич и др., 1987). Методом многоступенчатой
обработки мукорового гриба Curminghamella japonica ультра-
фиолетовыми лучами получены мутанты с измененным жирно-
кислотным составом. Увеличение ненасыщенности липидов на-
блюдалось за счет повышения доли линолевой и уменьшения со-
держания олеиновой кислот (Полотебнова, 1987; Полотебнова и
др., 1987). Имеются сообщения ( Капич и др., 1984) о том, что
значительное содержание по отношению к сумме липидов гриба
Polyporus Squamosus составляют фосфолипиды, в которых обна-
ружена арахидоновая кислота, обладающая ранозаживляющими
свойствами, Ценными фармацевтическими свойствами обладают
и некоторые полисахариды, синтезируемые грибами.
Мицелий грибов содержит разнообразные витамины, в том
числе тиамин, рибофлавин, биотин, пиридоксин, эргостерин, пан-
тотеновую, фолиевую и аскорбиновую кислоты (Соломко и др.,
1987). При этом большинство мицелиальных грибов способны на-
капливать витамины в количествах, превышающих их содержа-
ние в <<витаминном депо>>-—печени крупного рогатого скота
(Морозова и др., 1985). Положительное качество мицелиальных
грибов — низкое содержание нуклеиновых кислот (0,9——2,0%).
Анализ литературных данных дает основание полагать, что
мицелиальные грибы продуцируют белки с той же эффектив-
ностью, что и другие микроорганизмы. Оптимизация условий
культивирования, а также разработка технологии непрерывного
культивирования будут способствовать значительному снижению
стоимости получаемых препаратов.
Обогащение белком лигноцеллюлозных субстратов
Производство микробного белка характеризуется высоким
уровнем энергетических затрат, как прямых (приготовление
среды, аэрация, отделение и обезвоживание биомассы), так и
косвенных (производство сырья, его энергетическая ценность)
(Айказян и др., 1985). При производстве дрожжей на основе
95
нефтяного сырья расход энергии на 1 кг белка в три раза боль.
ше, чем при производстве говядины (Чернов, 1982). Высокий
уровень прямых и косвенных энергетических затрат является
одной из основных причин, препятствующих организации произ-
водства белково-витаминного кормового концентрата за рубе-
жом.
Как отмечает Воробьева (1985, 1987), для экономики произ-
водства очень важна способность микроорганизмов использо-
вать дешевый субстрат с высоким экономическим коэффициен-
том, показывающим, какое количество субстрата пошло на обра-
зование клеточной массы. Производство микробной биомассы
характеризуется высокими ценами на сырье и энергетическое
обеспечение и низкими ценами на ТРУД. Самое Дешевое сырье —
багасса (выжимки сахарного тростника), самое дорогое——ме-
танол. Однако энергетические затраты при применении метанола
почти в три раза ниже, чем при использовании багассы. Идеаль-
ным можно назвать субстрат с низкой стоимостью и высоким со-
держанием углерода. Воробьева (1985) приводит интересные
цифры: если принять содержание углерода в молекуле глюкозы
за 100%, для метанола эта величина составит (по отношению к
глюкозе) 95%, для метана —-188‚ для этанола ~— 130, для п-алка-
нов— 213%. Значит, п-алканы—— благоприятный субстрат. Его
утилизируют многие микроорганизмы, особенно же активно
дрожжи рода Candida. Из 1 т углеводородов можно получить
0,5 т белков. Менее 1% перерабатываемой в настоящее время
нефти хватило бы для компенсации недостатка белка на всей
планете. Вместе с тем п-алканы—побочный продукт нефтяной
промышленности. Цены же на нефть растут, запасы ее истоща-
ются.
В ряде стран в последнее десятилетие применяются другие
виды сырья: метан, метанол. Метан используют только бактерии,
метанол—бактерии и дрожжи, иногда мицелиальные грибы.
Хорошим субстратом для выращивания бактерий и дрожжей яв-
ляется п этанол. Его ресурсы высвобождаются вследствие пере-
вода производства каучука (главного потребителя этанола) на
другие виды сырья. На этаноле растут дрожжи, бактерии, неко-
торые мицелиальные грибы.
В связи с энергетическим кризисом внимание исследователей
обращено на разработку технологических процессов, обеспечи-
вающих экономию энергетических ресурсов. Радикальным реше-
нием этой проблемы может быть использование в производстве
микробного бслка сырья, получение и применение которого не
затрагивали бы энергетический потенциал страны (Чернов,
1982). Таким сырьем являются солома, стебли И стержни почат-
ков кукурузы, стебли хлопчатника. древесные и другие целлюло-
зосодержащие отходы.
Ежегодные ресурсы только соломы в СССР составляют
200——250 млн т. Ферментативный гидролиз ее с последующим
96
дрожжеванием позволяет получить кормовую массу, включаю-
Щую 10~12°/0 белка. Переработка только 1/5 части ресурсов со-
ломы может дать 50 млн т Ценных кормов либо 5 млн т белка.
Эти данные наглядно показывают, что дефицит кормового белка
в СССР можно полностью устранить за счет переработки сель-
скохозяйственных отходов. Следовательно, решение многих энер-
гетических и продовольственных проблем определяется в значи-
тельной мере возможностью эффективного использования энер-
гии солнечной редиации, аккумулированной в химических связях
полимеров растений в процессе фотосинтеза. И это естест-
венно. Ведь в результате фиксации 1021 кал солнечной энергии
на земном шаре ежегодно образуется 5-101” т биомассы расте-
ний и дррвесины. Такой возобновляемый источник энергии не
может не привлекать внимания (Огарков и др.‚ 1985).
Основными источниками органических отходов, требующих
утилизации, являются отходы Сельского хозяйства, лесо- и дере-
вообрабатывающей промышленности, твердые и жидкие быто-
вые отходы. Всего в СССР, по данным Панихавы и Березина
(1986), в различных отраслях народного хозяйства образуется
более 500 млгн т органических отходов: в сельском хозяйстве--
360 млн т (в животноводстве — 230 млн т, в растениеводстве —
130 млн т); в лесной и деревообрабатывающей промышленно-
сти —70 млн т; в быту— 70 млн т (60 млн т жидких и 10 млн т
твердых отходов).
Основной путь использования растительного сырья —- его гид-
ролиз с последующим выращиванием дрожжей. Однако широкое
внедрение методов гидролиза сдерживается некоторыми недо‹
статками этого процесса: низким выходом моносахаридов и об-
разованием значительного количества продуктов вторичных пре-
вращений, технологическими и экономическими трудностями.
K гидролизным процессам нредьявляются следующие требова-
ния: уменьшение энергозатрат, безотходность производства, уве-
личение выхода и повышение качества промежуточных продук-
тов гидролиза, простота аппаратурного оснащения и возмож-
ность автоматизации (Огарков и др.‚ 1985).
Определенный прогресс достигнут в ферментативном гидро-
лизе лигноцеллюлозного сырья, хотя практическую его реализа-
цию тормозят как трудности, связанные с поликомпонентностью
химического состава самих субстратов‚ так и высокие затраты на
получение и выделение ферментных препаратов (Холькин, 1985).
В последнее время появилось новое направление использова-
ния растительного сырья—биологическая конверсия его в бе-
лок и другие органические соединения (51оЬо(1ап‚ 1984; Wood et
al., 1984; Hccht ей а1., 1985; Квеситадзе и др.‚ 1986; Скрябин и др.‚
1986; Билай и др.‚ 1987).
Эффективность применения лигноцеллтолозы в качестве
сырья для получения протеина микробной массы обусловлена
множеством факторов. Некоторые физические характеристики
7. Зак. 966 97
такого сырья— влажность, низкая плотность и другие — ослож-
няют процессы его транспортировки и хранения. Химические
свойства — высокая степень полимеризации углеводов, кристал-
личность целлюлозы, а также наличие лигнина —— в большинстве
СЛУЧЭЭВ делают невозможной Прямую конверсию этих субстратов
(Виестур и др., 1986). Основной углеводный компонент субстра-
тов растительного происхождения — целлюлоза — трудногидро-
лизуемый полимер. Целлюлозе обычно сопутствуют гемицеллю-
лозы, лигнин, танин, крахмал, а также воска, жиры, белки, смо-
лы, терпены и другие органические соединения. Разгличные
примеси не только прочно адсорбируются на поверхности микро-
фибрилл целлюлозы, но и могут быть включены внутрь. Это в
значительной степени препятствует микробиологической конвер-
сии лигноцеллюлозного сырья, которое требует предварительной
обработки (Madam, Bisaria, 1984; Hidaka et а1., 1984; Уассагйпо
ет а1., 1987; Ragg, Fields, 1987).
Основными типами деструкции, представляющими наиболь-
ший практический интерес, являются механическая, термическая,
фотохимическая, химическая и ферментативная, деструкция под
действием ионизирующих излучений. Все перечисленные методы
предобработки изменяют физико-химические и механические
свойства целлюлозы, в результате чего происходит более или ме-
нее значительное снижение степени полимеризации. Для увели-
чения реакционной способности сырья предварительная обработ-
ка должна приводить к деблокации лигнина, способствовать сни-
жению индекса кристалличности целлюлозы, увеличивать ее
удельную поверхность, доступную для молекул белка (Жуков и
др., 1985).
При переработке и обогащении целлюлозосодержащего сырья
белком и другими необходимыми питательными компонентами
предъявляются повышенные требования к механической дест-
рукции исходного растительного материала. В результате размо-
ла целлюлозы степень ее упорядоченности и кристалличности по-
нижается‚ соответственно повышается доступность волокна дей-
ствию микроорганизмов. Предварительная механическая дест-
рукция лигноцеллюлозы позволяет существенно повысить выход
редуцирующих веществ, а также уменьшить их возможные по-
тери.
Исследования, проведенные во Всесоюзном научно-исследова-
тельском институте биосинтеза белковых веществ, показали, что
тонкое измельчение соломы улучшает работу аппаратов за счет
исключения «забивания» и наматывания субстрата на транспор-
терные ленты передающих устройств (Ксенофонтов и др., 1982).
Авторы рекомендуют при микробиологической переработке соло-
мы и другого растительного сырья ввести стадию тонкого из-
мельчения (размер частиц 0,5——0‚6 мм). От степени измельчения
субстрата зависят скорость роста мицелиальных грибов, а также
содержание протеина в конечном продукте. Выращивание про-
98
дуцентов на соломе мелкого помола обеспечивает не только бо-
лее активный синтез протеина, но и более высокую (в 2 раза) ак-
тивность ферментов (Douglas, George, 1987).
Однако в процессе Механической деструкции степень полиме-
ризации целлюлозы снижается до определенных пределов. По-
этому измельчение —это только первая ступень предобработки
лигноцеллюлозных субстратов, за которой следует вторая: хими-
ческая, ферментативная обработка, радиолиз и др. Так как лиг-
нин— основное препятствие на пути широкой утилизации угле-
водов огромного числа лигноцеллюлозньтх отходов, решением
проблемы является делигнификация. Техника делигнификации
сельскохозяйственных отходов, в том числе и соломы, 1°/д-ътьтм
раствором NaOH была разработана в Японии (Лобанок и др.‚
1981). Обработка лигноцеллтолозных материалов 1—4°/д-ным
NaOH B течение 24 ч приводит к повышению Их усвояемости.
Щелочная делигнификация субстратов активизирует рост микро-
организмов. Так, утилизация углеводов рисовой соломы и багас-
сы сахарного тростника бактериями Cellulomonas увеличилась с
29 до 73% после 15-минутного воздействия на субстраты 4% -ной
гидроокисью натрия при 100 ‘С.
Изучая влияние разных методов предварительной обработки
соломы на синтез белка грибами Тгбс/тосгеггпа lignorum, T. leanin-
дн, Т. reesei, Aspergillus glaucus B условиях глубинного культи-
вирования, многие авторы получили лучшие результаты (высо-
кое содержание белка в продукте, Высокая утилизация целлюло-
зы и лигнина субстрата) при использовании щелочной (Molina
et а1.‚ 1984; Srinivasan et а1.‚ 1983; Rao et а1.‚ 1983, 1986; Иконо-
мова, Димитрова, 1986; Гагоик et а1.‚ 1984) или кислотно-Щелоч-
ной (Апсите и др.‚ 1982) обработки Эффективной оказалась
предобработка субстратов растительного происхождения хлори-
том натрия (Chahal ей а1., 1979, 1981; Hecht е: а1.‚ 1983; Chahal,
1984).
Однако следует иметь в виду, что наличие в реакционной сме-
си продуктов делигнификации значительно ингибирует актив-
ность целлюлолитических ферментов. По мнению Каткевича и
сотр. (1980), а также Синицына и сотр. (1984), этот факт объ-
ясняется тем, что продукты деструкции лигнина щелочью —— фе-
нол, ванилиновый спирт, п-оксибензойнпя кислота, ацетованилин,
гваякол и ванилиновая кислота —— подавляют действие целлю-
лаз.
Традиционная химическая обработка растительного сырья
также не лишена недостатков. t\ ним можно отнести следующие:
необходимость применения щелочи или дРУгих реагентов для
проведения предварительной делигътификации субстрата, а так-
же осуществление этого процесса при высокой температуре;
Использование щелочи для предобработки субстратов требует
большого количества кислоты для нейтрализации среды, что
Приводит к коррозии и уменьшению сроков службы оборудова-
W‘ 99
ния; многостадийность процесса при больших Энергетических за-
тратах на нагревание и охлаждение.
Все это побудило к поиску и разработке более совершенных
методов предварительной обработки лигноцелатюлозного сырья.
Исследования ряда авторов (Ветров и др., 1984) показали, что
щелочной или кислотный гидролиз целлюлозосодержащих мате-
риалов может быть заменен радиационной обработкой. Эффек-
тивность и универсальность действия ионизирующих излучений
делают Перспективным применение радиолиза для решения проб-
лемы получения кормовых продуктов из отходов (Ветров и др.,
1984). Ионизирующее излучение способно разрушать структуру
древесины, соломы, в результате чего их составные части стано-
вятся водно-растворимыми и доступными для микроорганизмов
пищеварительного тракта животных (Скворцов, 1986). Напри-
мер, облучение сосновых опилок (2‚5 МГр) повышает их перева-
римость с 6 до 45%, обработка древесины осины —— с 53 до 78%.
Облученные отходы различаются не только общим количест-
вом сахаров, но и их качественным составом. Так, сахара облу-
ченной соломы и кукурузных стержней содержат в 1,5——2,0 раза
больше хорошо усвояемых галактозы и глюкозы. Характерной
особенностью радиационной обработки является и то, что облу-
чению подвергается сухое сырье, не требующее смачивания и
добавки химикатов, в итоге чего образующиеся водно-раствори-
мые углеводы в дальнейшем не вымываются водой, что имеет ме-
сто при других способах обработки.
Облучение целлюлозосодержащих материалов снижает их
гидролитическую устойчивость и увеличивает ферментируемость.
Например, обработка соломы у-излучением при поглощенной до-
зе 0,2—0,3 МГр приводит к тому, что масса синтезируемого на
ней продукта увеличивается в два раза по сравнению с необра-
ботанной соломой, продолжительность культивирования микро-
организмов, а следовательно, и время получения конечного про-
дукта сокращаются. Радиационная предобработка целлюлозосо-
держащего сырья позволяет существенно повысить эффектив-
ность его последующего механического измельчения. Эффект
радиационной обработки еще более усиливается при сочетании
радиолиза с последующим химическим воздействием (Ветров и
др., 1984).
ВНИИГидролиз с участием ряда организаций разработал на-
учные основы радиационно-химического способа обработки
растительного сырья, который по сравнению с традиционными
способами химического и ферментативного гидролиза имеет ре-
альные преимущества:
— технология соответствует основным направлениям разви-
тия отечественной энергетики;
—— радиационно-химическое аппаратостроение в настоящее
время позволяет создавать крупномасштабные производства с
применением машинных и изотопных источников ионизирующей
100
радиацип по переработке древесины и отходов сельскохозяйст-
венного производства;
-— радиолиз некормового сырья превращает его в Ценный,
имеющий реальную кормовую ценность продукт, который при
применении микробиологической конверсии может быть превра-
men B высококачественный, сбалансированный по содержанию
углеводов, жиров и белков корм;
—- метод позволяет получать целлолигнин и гемицеллюлозы
с более низкой СП при одновременном разрушении лигноугле-
водных связей, частичной декристаллизации целлюлозы и обра-
зовании в лигнине окисленных структур, сравнительно легко
расщепляемых различными микроорганизмами (Цит. по Климен-
тову и др., 1985).
Технико-экономическая оценка радиационного и радиацион-
но-биологического способов обработки отходов лесоперерабаты-
вающей промышленности и сельского хозяйства подтверждает
перспективность этого пути интенсификации производства кор-
мов. Себестоимость радиационной обработки 1 т целлюлозосо-
держащих отходов ускоренными электронами в дозе 10 кГр не
превышает 2,5 руб. Добавление в облучаемую биомассу соответ-
ствующих катализаторов позволит снизить дозу и соответствен-
но стоимость облучения без уменьшения химического эффекта.
Следует ожидать дальнейшего снижения стоимости ускорителей
электронов, что указывает на экономическую оправданность иро-
цесса предварительной радиационной обработки (Ветров и др.,
1984).
Подводя итог вышеизложенному, можно констатировать, что
высокоэффективный процесс комплексного использования расти-
тельного сырья может быть достигнут при сочетании методов фи-
зигко-хидтическотй предобработки „тиггноцегглюлозных Субстратов С
микробиологической их конверсией (lean-Jacques ы а1.‚ 1985;
Marsden, Grey, 1986).
Интерес Исследователей к лигноцслптолозньтм субстратам как
сырью для микробиологической проьиьппленности вполне объяс-
ним. Известно, что одним из факторов, лимитирующих развитие
производства белка микробного происхождения, кроме значи-
тельности капиталовложений в строительство заводов, является
высокая стоимость сырья. При производстве такого белка из
сельскохозяйственных и древесных отходов она составляет 14%
общей стоимости продукции, тогда как при производстве белка
из других видов сырья, например из меганола и этанола‚— бо-
лее 50% (Litchfild, 1983).
По данным Головлева, Скрябина (1984) и других (Detroy е‘:
а1., 1982; \/111о5‚ 1983; Bisaxia, Madam, 1983), растительное сырье
В будущем может стать основным видом сырья для микробиоло-
гической промышленности. Растительные материалы будут осно-
вой для получения не только белка кормового или пищевого на-
значения, но и других ценных продуктов: углеводов, органиче-
101
ских растворителей, жидкого и газообразного топлива, витами-
нов, жиров, антибиотиков.
Целлюлозосодержащие отходы сельского хозяйства и про-
мышленности можно разделить на три группы: хорошо транспор-
тируемые, локализованные в одном регионе, трудно транспорти-
руемые и отходы сельского хозяйства. Исходя из этого, И разра-
батываются различные способы утилизации этих субстратов
(Складнев, 1982).
Наибольшее количество отходов (сырье растительного проис-
хождения) в нашей стране и за рубежом образуется на пред-
приятиях лесоперерабатывающей, пищевой промышленности, в
сельскохозяйственном производстве, Как известно, в СССР еже-
годно отходы древесины достигают 30——35 млн т. Рациональное
применение находят только 10% из них. Для производства кор-
мового белка используют в основном побочные продукты лесопи-
ления и деревообработки — опилки и щепу. Отличительная осо-
бенность древесного сырья — его воспроизводимость. Как в бли-
жайшее время, так и в перспективе, это Сырье будет составлять
значительную долю сырьевых ресурсов для производства белка
микробного происхождения (Лебедев, 1982; Александров и др.‚
1982).
Перспективно для производства кормового белка сельскохо-
зяйственное сырье. Возможность его использования определяется
концентрированием в определенных географических точках.
В значительных количествах (10% общего объема) находят при-
менение такие побочные Продукты предприятий первичной пере-
работки сельскохозяйственного сырья, как подсолнечная лузга,
хлопковая шелуха. Из имеющихся почти 500 тыс. т лузги в гид-
ролизной промышленности применяется 150 тыс. т, на корм скоту
идет 60 тыс. т, 250 тыс. т сжигается в топках и 50 тыс. т прак-
тически не реализуется. Количество хлопковой шелухи достига-
ет 1300—1500 тыс. т. Из них 250—300 тыс. т идет на нужды гид-
ролизной промышленности и 1000—1250 тыс. т — на корм скоту.
Кормовая ценность корма из подсолнечной лузги и хлопковой
шелухи невелика. Он наполовину состоит из труднопереваримой
клетчатки. Переваримый протеин в нем составляет O,1—O,2%
(Лебедев, 1982). Более рационально, на наш взгляд, было бы
обогащать это сырье белком для получения ценного кормового
Продукта.
Сырьем для получения белка могут стать стержни початков
кукурузы, рисовая лузга, По кормовой ценности перемолотые
стержни приравниваются к сену или яровой соломе. Однако ис-
Пользование их нежелательно из-за низкого содержания белка,
минеральных веществ, витаминов.
В последнее время внимание исследователей привлекает
костра льна и конопли— отходы первичной обработки лубяных
культур. По данным Александрова Н сотр. (1982), только в УССР
более 200 тыс. т костры ежегодно выбрасывается и сжигается.
102
В БССР накапливается в год 350 тыс. т костры льна-долгунца и
более 30 тыс. т конопляной костры (Скриган, 1960).
Нельзя не вспомнить н о таком ценном целлхолозосодержа-
шем субстрате, как жом——побочный продукт предприятий са-
харной промышленности, запасы которого также огромны, ибо
при переработке только 1 т сахарной свеклы образуется около
500 кг свежего жома (примерно 35 кг сухого вещества).
Из побочных продуктов предприятий пищевой промышлен-
ности, перерабатывающих сельскохозяйственное сырье, следует
выделить нестандартную клубневую фракцию картофеля, побоч-
ные продукты картофелекрахмального (картофельная мезга‚
клеточный сок картофеля, соковые воды) и пивоваренного произ-
водства, плодовоовощной и консервной промышленности. Отхо-
ды картофеле- и крахмалоперерабатывающей промышленности
целесообразно использовать не на корм, а для выработки гриб-
ной биомассы (Стахеев, 1978). В БССР применение только не-
стандартной клубневой фракции позволило бы получать около
80 тыс. т такой биомассы. В южных районах не находят рацио-
нального применения стебли хлопчатника и виноградная лоза
(около 3 млн т в год).
Однако реализация всех перечисленных растительных отходов
для производства продуктов кормового назначения сопряжена с
рядом трудностей. Главная из них — сложность транспортировки
сырья от многочисленных мелких предприятий предприятиям,
производящим кормовой Микробный белок.
Пожалуй, самое перспективное сырье для производства бел-
ка микробного происхождения—солома злаковых. Ежегодно в
нашей стране накапливается свыше 300 млн т соломы. 70—
80 млн т идет на корм скоту, более 30 млн т— на предприятия
гидролизной промышленности. Около 50% соломы может быть
использовано для получения кормового белка грибного проис-
хождения. Солома — самый дешевый и высокоэнергетический
грубый корм для жвачных животных. По энергетической ценно-
сти она приближается к зерну, по питательности же уступает ему
из-за низкого количества протеина и высокого содержания клет-
чатки.
Усвояемость энергии органических веществ соломы—30—
35%. Это связано с тем, что органическое вещество ее на 80—
90% состоит из сложных нерастворимых полисахаридов (пекти-
на, гемицсллюлоз, целлюлоз) и инкрустирующих веществ (лиг-
нина‚ кутина, кремниевой кислоты). Низкая переваримость пита-
тельных веществ соломы связана с тем, что углеводы и белки
более высокого качества по мере созревания растения переходят
в зерно, а белки и углеводы низкого качества остаются в солоМе
(Айбазов‚ 1984). Для повышения питательности соломы, улуч-
шения запаха, вкуса, поедаемости животными разработаны раз-
личные способы подготовки ее к скармливанию: физические,
химические и биологические.
303
Об огромном интересе к проблеме биотрансформации расти-
тельных субстратов в белок свидетельствуют многочисленные
симпозиумы и семинары, которые Проходят как за рубежом, так
и в нашей стране. Работы, направленные на получение продук-
тов кормового назначения из лигноцеллюлозы, активно прово-
дятся в США, Канаде, Финляндии, Швеции И других странах
(Прошина, Селифонтова, 1985). Большое внимание таким иссле-
дованиям уделяется и в нашей стране (Бекер, 1982; Микеладзе,
1982; Закордонец, 1983; Головлева, Головлев, 1983; Билай, 1986).
Однако до сих пор практически отсутствуют сведения о широ-
комасштабном производстве белков грибного происхождения,
что объясняется как длительностью проведения токсикологиче-
ских и зоотехнических испытаний продуктов ферментации, так и
дороговизной разрабатываемых процессов.
Из способов получения белка на основе лигноцеллюлоз наибо-
лее известным, дошедшим до стадии внедрения является способ
Waterloo, разработанный в Канаде (Moo-Young, 1979). По имею-
щимся данным, Канада может ежегодно получать из сельскохо-
зяйственных отходов около 45 млн т белка микроорганизмов.
Финской фирмой <<Тагпре11а>> на основе сульфитных щело-
ков —— отходов Целлюлозно-бумажного производства — выраба-
тывается белковый продукт «некило». Авторы считают этот про-
цесс конкурентоспособным с производством соевой муки (Про-
шина, Селифонтова, 1985). Сырьем могут служить отходы сахар-
ной и картофельной промышленности. Продукт содержит до
60% протеина с хорошим аминокислотным составом и большим
количеством таких витаминов, как тиамин, рибофлавин, Impu-
ILOKCHH, ПЭНТОТСНОВЭЯ кислота, биотин, фолиевая кислота.
Более ранние литературные данные о биоконверсии лигноцел-
люлозных субстратов достаточно полно изложены в ряде моно-
графий и обзоров (Лобанок, Бабицкая, 1976, 1981; Межиня и др‚,
1982; Морозова и др., 1978; Lobanok е’: а1., 1984). Анализируя
результаты зарубежных и советских исследователей, можно ска-
зать, что они касаются биотрансформации в белок большого кру-
га целлюлозосодержащих отходов. Это свекловичный жом, жом
сахарного тросника, маниок, рисовая, пшеничная либо ржаная
солома, некондиционные овощи н фрукты, целлюлоза хлопка, от-
ходы древесины, картофелеперерабатывающей промышленности.
При разработке технологии не только подбираются высокопро-
дуктивные продуценты, но и отрабатываются подходящие с эко-
номической и технологической сторон условия предварительной
модификации субстратов.
При выращивании гриба Aspergillus terreus Ha среде, приго-
товлснной из жома сахарного тростника (1%), подвергнутого го-
рячей щелочной обработке, наибольшая скорость накопления
белка наблюдается в течение первых трех дней. Максимальное
содержание белка в биомассе составляет 32,9 %, выход—
22 г/100 г багассы, переваримость белка in vitro — 68,8 %. Содер-
104
жание аминокислот в биомассе сравнимо со стандартом ФАО
(Garg, Neelakantan, 1982). Дешевым источником белка может
служить биомасса, полученная путем выращивания грибов рода
Aspergillus Ha средах из недоброкачественных овощей и фруктов
(Ali, Laidi, 1984; Odunfa, Shasore, 1987).
Хорошие результаты получены при выращивании мицелиаль-
ных грибов рода Basisporium H Chaetomium Ha свекловичном
жоме (Стахеев и др., 1983; Батурина‚ 1985). По сравнению с суб-
стратом в грибном продукте количество белка увеличивается в
8—1О раз, пектин утилизируется на 26—40°/о, целлю.тоза—на
30-45%. При изучении способности 317 штаммов термофильных
микромицетов к накоплению биомассы и белка на свекловичном
жоме лучшими оказались грибы, принадлежащие к родам Chry-
sosporium H Thielavia (Шабунина и др., 1985). На 38—48 % уве-
личивали содержание белка в свекловичной пульне за 3 сут вы-
ращивания Trichoderma reesei, Sporomcfzmrz thermophile, Chaeto-
mium cellulolyticunz, Morclzella esculenta (Bajon, 1985).
Более подробно следует остановиться на разработанном в
Канаде процессе Waterloo (Moo-Young, 1979). В качестве сырья
используются отходы сельского хозяйства, продуцентом является
гриб C/zaelomium cellulolytiwm. При этом предпочтительнее ба-
гасса‚ солома злаковых культур, кукурузная кочерыжка, а так-
же отходы животноводческих ферм. Процесс апробирован в 200-
H 1О00-литровых ферментерах. Он предполагает три этапа: хими-
ческую или термическую обработку целлюлозосодержащих мате-
риалов, аэробную ферментаиию, отделение биомассы от культу-
ральной жидкости. Получаемый продукт хорошо переварим, не
токсичен, может быть применен в качестве кормовой добавки
вместо рыбной И соевой муки, которые в свою очередь можно вы-
свободить для других целей. Биологическая ценность получаемой
биомассы испытана па крысах, цыплятах и овцах. Продукт име-
ет гранулированную структуру, грибной запах, по составу и ко-
личеству важнейших компонентов грибной белок ближе к мясно-
My, а не к соевому, содержит меньше, чем дрожжи, нуклеиновых
кислот и больше серусодержащих кислот.
Из данных литературы известно, что технология Waterloo
применяется тремя фирмами: в Канаде, Франции и Югославии.
По мнению авторов, она экономически выгодна как для разви-
тых, так и для развивающихся стран (Moo-Young, 1983). Препа-
рат может использоваться и как Добавка к кормам, содержащим
растительный белок, ч в определенном количестве в качестве
единственного белоксодержатцего компонента комбикормов. Из
обследованных свыше 500 образцов почв, компостов этими же
авторами выделено пять культур грибов, способных расти на
среде, содержащей целлюлозу как единственный источник угле-
РОда, и накапливать значительную биомассу не более чем за
трое суток. Среди них два штамма отнесены к роду Aspergillus,
дВа — к роду Triclzoderma, один не был идентифицирован.
105
Аналогичные результаты по биосинтезу белка с помощью гри-
ба C/zaetomium cellulolyticum получены в ФРГ (Hecht ей а1.,
1982), Индии (Стасеёа е’: а1., 1985). Максимальная производи-
тельность по биомассе и белку достигается при pH 5,0 и темпе-
ратуре 37 “C. Наилучшим способом предобработки субстрата
оказалась обработка паром при 180 °С. Для обогащения белком
пшеничной соломы используют гриб Chaetomium globosum (Be-
éarevic et а1., 1985). Наивысший уровень белка (34,9%) регист-
рируется после 72 ч культивирования продуцента. Оптимальный
его рост отмечен на питательной среде, содержащей 2,5% соло-
мы. Применение Chaetomium megalocarpum позволило повысить
содержание белка в опилках осины в 8—10 раз. Технология по-
лучения кормового продукта апробирована в производственных
условиях (Стахеев, Здор, 1982; Здор, 1985).
Известен способ получения кормового продукта из соломы
путем глубинного культивирования грибов рода Penicillium, B
частности Р. verruculosum (Бабицкая, 1986; Бабицкая, Стахеев‚
1981; ЬоЬапо1< е’: а1., 1983, 1985). Из грибов этого же рода для
обогащения лигноцеллюлозньхх субстратов чаще всего исполь-
зуются Penicillium ja/it/zinellum И Р. funiculosum (Bhatowdekar,
1983; Refai et а1., 1984). Белковые продукты из различных отхо-
дов сельского хозяйства и пищевой промышленности можно по-
лучить с помощью грибов родов Fusarium, Trichoderma, Clado—
sporium, Myrothccium H др. (Micami ct а1., 1982; Rogana, Lindari,
1983; Экспресс инф. ...‚ 1986; Закордонец и др.‚ 1986; Kassim,
Ghazi, 1987). Так, селекционированные штаммы фузариев обо-
гащали белком отруби, фуражное зерно, отходы чайной промыш-
ленности в 2——3‚ виноградные стебли в 3—4 раза, солому, свек-
ловичный жом, хлопковую шелуху—в 4-5 раз (Закордонец,
1983).
Исследование продуцирующей способности грибов родов Cla-
dosporium, Alternaria, Aspergillus позволило выявить наиболее
перспективные штаммы, которые при росте на соломе увеличива-
ют содержание протеина в пей в 1‚5—8,0 раза. Аналогичные ре-
зультаты получены при выращивании на соломе грибов родов
Penicilliurn, Trio/zoderma. СКрИНИНГОМ по способности синтезиро-
вать на соломе белковую биомассу и целлюлазу установлено, что
содержание протеина в биомассе грибов Aspergillus flavus (4
штамма) составляет 16—24°/0, А. niger (9 штаммов) — 7‚5—25‚8,
А. terreus (2 штамма) ——22—41, Penicillizmz chrysogenum (3
штамма) —13—40,5%. Лучшими продуцентами оказались As-
pergillus terreus H Penicillium chrysogenum (Kremar, 1975-,
Geathadevi et а1., 1978).
Болгарскими исследователями (Кожухарова и др.‚ 1986) раз-
работана технология глубинного процесса биоконверсии соломы
мицелиальными грибами. Технология связана с решением вопро-
са предварительной подготовки соломы, подбора и селекции про-
дуктивных штаммов грибов. Лучшим из исследованных оказал-
106
ся штамм Cephalosporium sp. 78, при выращивании которого на
делигнифицированной соломе получен продукт с содержанием
белка 23—30%. Переваримость его in vitro ДОСТИГЭЕТ 78%.
На высокую продуцирующую способность грибов родов Cla-
dosporium и Penicillimn указывают и другие авторы (Lucio et а1.,
1986). Значительное обогащение пшеничной соломы белком и по-
лисахаридами наблюдалось при выращивании на ней Aspergillus
japonicus. Содержание белка увеличилось с 2,6 до 11,2% (Mil-
stein et а1.‚ 1983, 1986).
Большой интерес представляют совместные исследования
Института микробиологии АН УССР и Инстптута микробиологии
АН Латвийской ССР (Билай, 1982; Закордонец и др., 1982).
Отобраны атоксичные относительно быстрорастущие штаммы
мезофильных и термофильных грибов, достигнуто обогащение не-
которых целлюлозосодержатцих субсгратов (соломы, хлопковой
шелухи) протеином в зависимости от вида и штамма гриба с
З—4 до 18—25%. Авторами разрабатываются технология полу-
производственного и Промышленного полученпя обогащенных
грибами растительных субстратов и способы их применения.
Получением микробного белка на основе биоконверсии цел-
люлозы активно занимаются в НПО биотехнологии (Бравова и
др., 1985; Алексеева, Булгакова, 1986). Разработаны технологи-
ческие процессы получения белковых кормовых продуктов на
таких целлюлозосодержащих субстратах, как хлопковая шелу-
ха, свекловичный жом, виноградные выжимки, льняная костра,
пивная дробина.
Белковые кормовые добавки содержат 25-50% протеина,
ферменты целлюлолптического действия, витамины, липиды. Сте-
пень конверсии целлюлозы достигает 35—50%. Особый интерес
представляет разработанный авторами способ получсния белко-
во-ферментного комплекса путем культивирования гриба Мусе-
liophtora thermophila 214Д на льняной костре. Количество суб-
страта в среде 2—10%, В качестве источника микроэлементов и
органических веществ используются стоки мочки льна. Содержа-
ние протеина в продукте ферментации 25%.
Позже было предложено три способа получения белковой
кормовой добавки: культивирование термофильных дрожжей
Sacc/zaromyces ‚чадам на ферментативных гидролизатах льняной
костры, прямая биотрансформапия субстрата термофильным
микроскопическим грибом Myceliophtora t/zermophila H совмест-
ное культивирование М. the/mophila H S. fragilis. Изучен химиче-
ский состав белковых кормовых добавок, их токсикологические
свойства.
В последние годы внимание исследователей обращено на ис-
пользование отходов производства бумаги для получения белка.
И это вполне естественно, ибо за последние 30 лет количество
отходов бумаги значительно увеличилось и составляет 50% об-
щих бытовых отходов.
107
Отходы бумажного производства, древесины и растительные
отходы применяют для получения белка японские исследовате-
ли, которые разработали способ выращивания грибов, идущих в
пищу. Аналогичный способ превращения газетной бумаги в корм
для домашних животных предложен учеными из Астонского уни-
верситета. Метод заключается в намачивании газетной бумаги
до образования мягкой массы и инокулировании ее грибом, Обо-
гащенный белком и витаминами продукт получают через 24 ч
культивирования. Испытания на животных показали, что этот
продукт легко переваривается, нетоксичен и питателен. Разраба-
тываются также методы превращения в подобный продукт су-
хого навоза домашних животных. Получение продукта осуществ-
ляется на основе культивирования термофильных микроскопиче-
ских грибов, обладающих целлюлоли-гической активностью
(Fang е‘: а1., 1986).
Более подробно следует остановится на биоконверсии отходов
плодоовощной продукции. Особую значимость это приобретает
в связи с тем, что они образуются в больших объемах. По дан-
ным Двойченковой, Кантере (1985), в целом но стране их коли-
чество составляет около 2/3 объема продуктов переработки неф-
тц, используемых в производстве кормового белка, 1/6—1/4
объема всего сырья для микробиологической промышленности.
Однако из всех отходов плодоовощного сырья применяется около
50%. Большая часть безвозвратно теряется. Вместе с тем эти
отходы содержат такие ценные компоненты, как белки, углеводы,
минеральные вещества и др.
По своему составу плодоовощные отходы представляют собой
сбалансированную питательную среду для микроорганизмов.
Наиболее рациональным для нужд сельского хозяйства является
получение из отходов плодов и овощей белковых препаратов в
виде жидких и сухих микробиологических концентратов. Авторы
разработали схему биоконверсии отходов плодоовощного сырья,
которая является безотходным производством, конечный продукт
имеет большую кормовую ценность и за счет органического со-
става небелковой части. Продукт, получаемый на основе плодов
и овощей, абсолютно безвреден. Следовательно, в условиях
сырьевого и белкового дефицита плодоовощные отходы можно
рассматривать как важный резерв полноценных субстратов для
микробиологической промышленности.
Биоконверсия сырья растительного происхождения может
активно осуществляться не только микромицетами, но и бази-
диальными грибами (Vaillant et а1., 1986; Smith ct а1., 1987,
Rolz ct а1., 1987). Как известно, наиболее активными деструкто-
рами лигноцеллюлозных субстратов являются грибы рода Pleu-
rotus.
Для превращения различных растительных отходов в кору
используют и разлагающие лигнин грибы Stropharia rugosoamm-
юга, Pleurotus sp. florida (zadrazil, 1980), Phanerochaete Chry-
108
sosporium (zatelaki-Horvath, 1984), Ph. sordida (Hattaka, 198.3),
Chrysonia sitophila (Nelson et а1., 1987). Ферментация стебля
кукурузы, пшеничных отрубей, лигноцеллюлозных остатков ука-
занными грибами снижает содержание лигнина на 50‚2°/о‚ целлю-
лозы — на 6,9 %. Положительным фактором, по мнению некото-
рых исследователей, является низкая потеря в субстратах Цел-
люлозы — источника энергии для жвачных животных.
В качестве корма во многих странах применяется разложен-
ная микроорганизмами древссина. Изучение разложения и обо-
гащения белком древесины показало, что в этом процессе прини-
мают участие грибы, относящиеся к базидиомицетам —- возбуди-
телям белой гнили, в частности Ganoderma applanatum H Armilla—
пена sp. Так, до действия микроорганизмов древесина содержит
26% лигнина, переваримость ее in что составляет около 3%.
В процессе же деструкции древесины грибами повышается ее
влажность, содержание растворимых в воде соединений. Резко
снижается количество лигнина (с 26 до 1%), переваримость про-
дукта равна 77,7 0/0. По мнению авторов, резкое повышение пере-
варимости связано со снижением содержания лигнина (Zadrazil
е’: а1.‚ 1982). В результате обработки осиновых опилок парами
аммиака при температуре 100 и 120 °С в течение 1 ч и последую-
щего выращивания двух штаммов дереворазрушающих грибов
содержание белка в них повышается до 7,5°/о. Разработана про-
мышленная технология и создана аппаратура для глубинного и
поверхностного выращивания культур (Сивочуб, 1983).
Бухало (1975) изучено влияние источников питания на выра-
щивание грибницы, длительность культивирования мицелия при
различных температурах и кислотности среды, морфологические
особенности мицелиальных форм грибов в условиях микробиоло-
гической культуры. Установлено, что из многочисленных испы-
танных углеводов большинство изученных грибов усваивают
преимущественно крахмал и мальтозу. Многие грибы используют
целлюлозу и лигнин и не только расгут, но и накапливают пол-
ноценную биомассу на таких субстратах, как солома, опилки, от-
руби и измельченные кукурузные кочерыжки.
Исследование роста и образования белка Sporofrichum pulve-
rulemfum на лигнинсодержащих отходах бумажного производст-
ва выявило, что с увеличением степени кристалличности целлю-
лозы содержание белка в мицелии уменьшается. Авторами обна-
ружена обратная связь между содержанием белка в мицелии и
количеством целлюлолитических ферментов в среде. Значитель-
ному увеличению выхода белка в мицелии способствует совмест-
ное выращивание гриба и дрожжей Candida utilis (Eriksson,
Larsson, 1975). Расщепление субстрата при выращивании дере-
воразрушающих базидиомипетов на средах, содержащих в ка-
честве источника углерода лигноцеллюлозу, осуществляется за
WET Действия внеклеточных ферментов. Освободившиеся моно-
сахара используются грибами для метаболических процессов.
109
Phcmerochaete chrysosporium И Polyporus anceps способны
усваивать обработанную гидроокисью натрия кору деревьев.
Максимальный выход белка (113 мг/г коры) у Phanerochaete
chrysosporium и Polyporus anceps (116 мг/г) получен на 4-е сут-
ки роста (Daugulis, Bone, 1978). Обе культуры активно синтези-
руют целлюлазы, но не разлагают лигнин. Ро1урогц$ sapidus
продуцирует лакказу, но слабо растет на средах с корой,
Переваримость растительного сырья и усвояемость его жи-
вотными резко ухудшаются присутствием лигнина. Лишь незна-
чительная часть микроорганизмов способна разлагать его в лиг-
ноцеллюлозном комплексе. Положительное влияние в этом случае
играет предварительная обработка, которая уменьшает со-
держание лигнина и увеличивает площадь поверхности, что при-
водит к более полной биоконверсии растительного сырья микро-
организмами, а Следовательно, и к лучшему усвоению его живот-
ными (Головлева и Др.‚ 1986).
Исследованиями Бабицкой, Стахеева (1981) и Капича (1983)
показано, что многие дереворазрушающие базидиомицеты спо-
собны развиваться на средах с соломой ржи и пшеницы, пред-
варительно обработанной щелочью (NaOH). Наиболее активным
продуцентом протеина из 23 изученных штаммов дереворазру-
шающих базидиомицетов оказался Pleurotus ostreatus STF-1.
B результате глубинного культивирования этого гриба на средах
с 1,5% соломы было достигнуто увеличение сырого протеина с
6,1 в субстрате до 23,9% в продукге, обогащенном мицелием.
Гриб Fomitopsis pinicola 0130, вызывающий бурую гниль древе-
сины, наиболее слабо развивается на средах с соломой, что, по-
видимому‚ связано с его неспособностью синтезировать лигно-
литическис ферменты. Сырого протеина в продукте, полученном
в результате его выращивания, было всего 9,2 0/0.
Виестур и сотр. (1986) разработали способ получения белко-
вого продукта из гидротермически и механохимически обрабо-
танной соломы озимой пшеницы. В результате обработки из 1 т
соломы получают примерно 280 кг редуцирующих веществ (жид-
кая фракция) и 740 кг гетерогенного субстрата, включающего
трудногидролизуемую гемицеллюлозу, целлюлозу, олигосахари-
ды и в небольшом количестве легкогидролизуемую гемицеллюло-
зу и моносахара. После гидролиза и фракционирования получен-
ная жидкая фракция применяется для глубинной ферментации
мицелиального гриба Polyporus squamosus. Из 280 кг жидкой
фракции получают 150 кг белкового продукта с содержанием сы-
рого протеина 55,6°/0_ После инактивации он используется на
скармливание моногастричным животным.
В последнее время появилось много работ зарубежных иссле-
дователей о разработке и внедрении так называемой «подходя-
щей>> биотехнологии для развивающихся стран (Tagychi, 1982).
Внедрение биотехнологических процессов позволит решить ряд
социальных проблем, в частности проблему дбеспечения продук-
110
тами питания, а также задачи, связанные с получением энергии,
биологически активных веществ, утилизацией отходов сельского
хозяйства и органических веществ сточных вод. Основное вни-
мание здесь сосредоточено на микробиологических способах ути-
лизацип навоза животных, биомассы водорослей, некоторых
видов кустарников. С целью снижения расхода энергии планирует-
ся для высушивания биомассы и других продуктов микробиоло-
гического синтеза Использование Солнечной энергии.
Важнейшие материалы по биотрансформации растительного
сырья, перспективы применения микробиологической технологии
в животноводстве и сельском хозяйстве были подробно изложены
на Всесоюзном симпозиуме <<Биоконверсия растительного сырья»,
проходившем в 1982 г. в г. Риге, на Всесоюзной конференции
«Мицелиальньхе грибы» (Пущино, 1983 г.), а также на советско-
финских семинарах (1983-1986 гг.). Показана значимость про-
цессов биоконверсии в решении задач использования раститель-
ного сырья для получения различных продуктов кормового и
пищевого назначения, рассмотрены особенности реализации про-
цессов, вопросы их аппаратурного оформления (Матвеев и др.‚
1982; Viestirs et а1., 1983). Расширяется фронт работ по био-
трансформации ресурсов леса, огромным потенциальным источ-
ником протеина могут служить активный ил, а также органиче-
ские вещества торфа и сапропеля (Эрнст, 1982; Martin, Bailey,
1985).
При обогащении белком растительных отходов сельского хо-
зяйства предпочтение часто отдается комплексной обработке суб-
стратов (Taniguchi et а1., 1982; Pou e1 а1., 1985). Так, при полу-
чении белка из рисовой соломы ее обрабатывают целлюлазными
препаратами из Pellicularia filamentosa И Trichoderma reesei.
Полученный гидролизат применяют при выращивании дрожжей.
При этом усвоение сахара и выход биомассы составляют соответ-
ственно 70% и 6,8 г/л для Candida tropicalis, 56% И 6,4 г/л —- для
Tcrulopsis xylinus И 74% и 7,6 г/л —— для Trichosporon cutaneum.
Наибольшее потребление сахаров (80%) И наилучший выход
биомассы отмечены для культуры Candida guilliermondii.
Институтом ВНИИБиотехника (Ахмедов, Ездаков, 1983) раз-
работан способ приготовления высокопитательного корма (соло-
моконцентрат) на основе ферментно-дрожжевой обработки ма-
лоценных отходов полеводства. Сущность способа заключается
в том, что под действием целлюлолитических и пектолитических
ферментов растительные полисахариды расщепляются до про-
стых сахаров, которые являются легкодоступным источником пи-
тания для дрожжей. Содержание прогеина в соломе за счет фер-
ментации повышается с 3-5 до 11—13%, белка ——с 2,0——2‚5 до
9,0——11,0%. Соответственно снижается уровень клетчатки с 35—-
45 до 25-30%. Стоимость 1 т кормосмеси с применением фер-
ментов и дрожжей 22 руб., в то время как затраты на приготов-
ление 1 т соломенной кормосмеси с употреблением зерна равны
111
27 руб., т. с. затраты на 1 т продукции снижаются на 19% (Ай-
базов, 1984).
В настоящее время заводы микробиологической промышлен-
ности выпускают пектолитические и целлюлозолитические фер-
ментные препараты пектофоетидин ГЗх и целловиридин ГЗх,
которые служат гидролизующимп агентами при производстве
из соломы и других отходов растениеводства углеводно-белко-
вого корма (Ахмедов‚ Ицыгин, 1986).
Ферментные препараты гидролизуют растительные nonma-
хариды (целлюлоза, гемицеллюлозы, пектиновые вещества) до
пенто3‚ гексоз и др. На полученных гидролизатах выращива-
ются дрожжи, обогащающие корм полноценным по аминокис-
лотному составу белком. В условиях производства получение
углеводно-белкового корма Оказалось экономически выгодным.
В 1 кг его (в расчете на воздушно-сухое вещество) содержится
113—114 г протеина, 18—22 г жира, 480-490 г безазотистых
экстрактивных веществ (БЭВ). Годовой экономический эффект
от производства и использования углеводно-белкового корма с
применением ферментных препаратов в хозяйствах составляет
180 тыс. руб.
Для обработки растительных субстратов (свекловичного
жома, клевера, соломы, кукурузного силоса) применяют фер-
ментный препарат целлобранин ГЗх (Грачева и др., 1986).
С целью повышения питательности соломы предложен спо-
соб, основанный на частичном ферментативном гидролизе слож-
ных полисахаридов с последующим выращиванием молочнокис-
лых бактерий (Удалова, Рыженок, 1986). Экономический эф-
фект от внедрения разработки составил 16 тыс. руб.
Некоторые авторы (Межиня и др., 1982) считают наиболее
целесообразным проведение предварительной щелочной делиг-
нификации субстрата, затем осахаривание его коммерческим
ферментом, полученным из гриба Trichoderma шпаг, и, нако-
неЦ, выращивание на растворимой фракции дрожжей Candida
utilis.
Большой интерес проявляют исслсдоватсли и к смешанному
культивированию, что объясняется его исключительно важным
практическим значением. Изучение параметров управления про-
цессом выращивания ассоциаций культур позволяет более ра-
ционально реализовывать отходы сельского хозяйства и пище-
вой промышленности. В качестве продуцентов, разлагающих
целлюлозу, чаще используют грибы родов Trichoderma, Sporotri—
chum, B качестве культур, ассимилирующих продукты ее разло-
жения,— бактерии (род Brevibaclerium), дрожжи (род Candi-
da), грибы родов Penicillium, Aspergillus И Slreptomyces (Veal,
Lynch, 1984; Hours et а1‚‚ 1985; Trivedi, Ray, 1985; Lo, Moreau,
1986; Suha, Bassam, 1985).
В последнее время внимание исследователей все чаще обра-
щается к твердофазной ферментации. Связано это с тем, что
112
экономический анализ глубинного культивирования микроорга-
низмов—продуцентов белка—показал выгодность его лишь
в случае создания непрерывных технологических процессов, что
в свою очередь ставит перед Исследователями ряд сложных
задач.
Как считают Межиня и сотр. (1982), при твердофазной фер-
ментации расходы на электроэнергию уменьшаются в 10 раз,
а на тепловую энергию——в 3 раза по сравнению с глубинным
культивированием, По мнению Головлева и Скрябина (1984),
твердофазная ферментация как метод улучшения питательных
качеств грубых растительных кормов имеет широкие перспек-
ТИВЫ ДЛЯ СОЗДЗНИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПрОИЗВОДСТВЗ КОРМОВЫХ ПРЕПЯ-
ратов совхозного или межсовхозного уровня. Эта технология,
ориентируясь на дешевое местное сырье (солома, отходы мест-
ной промышленности и сельского хозяйства), может стать од-
ним из основных путей производства белка для животноводства.
Использование для этих целей установок, созданных на базе
типовых кормосмесителей, позволяет уменьшить объемы фер-
ментационного оборудования по сравнению с объемом обору-
дования для глубинного культивирования (Бекер, 1985).
Твердофазная ферментация — процесс достаточно известный.
Он применялся для получения ферментов, органических кислот,
антибиотиков и других микробных продуктов, Особенно широко
реализуется твердофазная ферментация на Востоке и в некото-
рых развивающихся странах для производства различных ти-
пов ферментированных продуктов, грибных метаболитов и био-
конверсии растительных отходов и животных (Aidoo е’: а1.‚ 1982).
Из более ранних процессов следует отметить сыроделие, процесс
койи, получение уксуса, галловой кислоты. Несколько позже
(1900—1920 гг.) процесс использовался для получения грибных
и других микробных ферментов. Новым способом ферментации
явилось производство глюконовой кислоты, появившейся в
1920~1940 гг. И что особенно важно, этот процесс осуществлял-
ся во вращающемся барабанном ферментере, который приме-
няется и сейчас. 1940—1950 гг. отличались бурным развитием
промышленности микробиологического синтеза в связи с откры-
тием антибиотиков. Хотя и не долго, твердофазный метод ис-
пользовался для производства первых партий коммерческого
ПЕНИЦИЛЛИНЗ.
Процессы твердофазной ферментации, применяемые с дав-
них пор, можно объединить в три группы: 1—микробное пре-
вращение пищевых продуктов (содержащих крахмал, белки);
2—получение сыров с плесенью; 3— компостирование (Бекер,
1984).
После 1960 г. появились новые процессы твердофазной фер-
ментации, Это производство микотоксинов и получение продук-
тов микробного синтеза путем биотрансформации растительных
сельскохозяйственных и животных отходов. Круг работ по био-
8. Зак 966 113
конверсии продуктов фотосинтеза расширился вместе с ростом
сельскохозяйственных отходов—багассы, опилок, соломы, ше-
лухи, початков, отрубей и других, которые могут быть превра-
щены в кормовой продукт. Предпринятая в 1969 г. попытка
обогащения протеином маниока не принесла успеха, что, по-ви-
димому, объясняется отсутствием в тот период времени соответ-
ствующего метода для изучения роста грибов на твердом суб-
страте.
Такой метод был разработан несколько позже французскими
исследователями. Первые эксперименты проведены с использо-
ванием штамма Aspergillus „где; и маниока в качестве субстра-
та. Лабораторный метод заключался в приготовлении гомоген-
ного мелкозернистого продукта из сырого крахмалистого мате-
риала. Вместе с достаточным объемом воды добавлялось
определенное количество солей и спор. Гранулированный и по-
ристый продукт обеспечивал удовлетворительную диффузию
кислорода на протяжении всего периода инкубации, Применя-
лись и другие субстраты—зерно злаковых, мука из зерновых,
отходы зерноперерабатывающей промышленности, батат, рис,
маниок, бананы. Продуцентами служили грибы родов Aspergil-
т, Rhizopus, Penicillium, Mucor (Лобанок, Бабицкая, 1981).
При твердофазной ферментации банановых отходов грибом
Aspergillus niger хорошим субстратом явились высушенные на
солнце и размельченные зеленые бананы, содержащие 6% бел-
ка, После выращивания гриба количество белка в субстрате
повышалось до 18%. Продукт, содержащий 50% общих саха-
ров‚ 13% редуцирующих и 18% белка, был рекомендован как
корм для крупного рогатого скота (Baldeusperger et а1., 1985;
Deschmps, Heut, 1985).
Твердофазная ферментация сушеной кожуры цитрусовых с
помощью Aspergillus niger HO3BOJIHJIa получить продукт с со-
держанием белка 10% и более (Rodrigues е’: а1.‚ 1985). Ценные
продукты кормового назначения были получены и при фермен-
тации грибами рода Aspergillus таких субстратов, как карто-
фельная или маниоковая мука, банановая или картофельная
пульпа.
Для Повышения питательной ценности струлков акации ре-
комендуют гриб Rhizopus oligosporus, отходов сельского хозяй-
ства и лесной промышленности——Спаеготёи/п cellulolyticum,
рисовой conoMb1——Myrolhecium verrucaria, крахмалосодержа-
щих растений тропических стран —— Cephalosporium eichhorniae,
Rhizopus chi/zensis (Kenneth, 1982). Лучшими для твердофазной
ферментации содержащих лигноцеллюлозу растительных остат-
ков оказались Trichoderma harzianum, Sporotrichum pulverulem
tum И Dichomitus squale/zs (Zadrazil, Brurmert, 1982; Roussos,
Raimbau11., 1982; Karapinar, Okuyan, 1982; Головлев и Др.‚ 1983;
Platt et al., 1983).
Стрпкауска и сотр. (1985) сравнили два способа получения
114
белоксодержащего кормового препарата из целлюлозолнгнино-
вых материалов при культивировании гриба Trichoderma стае.
Выяснилось, что по выходу белка, продуктивности и некоторым
другим параметрам наиболее перспективен твердофазный спо-
соб в колонном ферментере с протоком жидкости.
Грибы родов Trichoderma И Pem'cillium—J1yqu1ne продуцен-
ты белка и на таких субстратах, как солома, пшеничные отруби,
пивная дробина, солодовые ростки, сенная мука. В процессе
микробиологического синтеза количество белка в исходном
сырье возрастает в 2-5 раз в зависимости от вида и штамма
микроорганизма. Заметно повышается усвояемость корма, рас-
ход его на единицу привеса уменьшается до 20% (Межиня и
др_‚ 1983; Богдан и др.‚ 1985). Для гвердофазной ферментации
целлюлозосодержащего сельскохозяйственного сырья ученые
Болгарии используют селектированный штамм Theromoascus
aurantiacus AC23 (БЗХЧЕВЗНСКЗ, 1986).
Для микробной конверсии пригодны виноградная лоза, кор-
зинки и стебли подсолнечника, лесная древесная масса, в каче-
стве продуцентов—грибы родов Fusarium И Tric/zoderma (Том-
чук‚ Альман, 1983; Томчук, 1985). После микробной трансфор-
мации происходит обогащение исходного сырья в 1,5—2,0 раза
при уменьшении количества клетчатки на 10—25°/о.
По данным Закордонец н сотр. (1986), сегтекционированньте
штаммы фузариев обогащают грибным белком отруби, фураж-
ное зерно, отходы переработки лекарственного сырья, цитрусо-
вых и чая в 2—3 раза, виноградные стебли—-в 3-—4‚ солому,
свекловичный жом, хлопковую шелуху— в 4——5 раз. Поскольку
перспективной остается конверсия растительного сырья, вни-
мание исследователей привлечено не только к получению продук-
тов, но и к изучснию их компонентного состава, в частности
содержания в продуктах ферментации хитина. Обнаружено,
что количество его у различных видов фузариев непостоянно
и колеблется (13,6—29,0%) B зависимости от вида сырья, штам-
мовой специфичности и возраста культуры. Путем физиологиче-
ской регуляции количество хитина удавалось снизить в 1,5—
2,5 раза. Хорошей продуцирующей способностью при выращи-
вании на промышленных отходах из грибов рода Fusarium
обладают F. gibbosum и F. lateritium (Стефанов и др.‚ 1986).
Для обогащения белком рисовой соломы, отрубей и гузапаи
используют гриб Trichoderma sp. 52. При развитии его на лигно-
целлюлозном субстрате помимо белка и целлюлозы накапли-
ваются аминокислоты, витамины и другие вещества, что дает
право авторам рекомендовать грибную биомассу животновод-
ству (Ташпулатов, Хамидова, 1985).
При твердофазной ферментации лигноцеллюлозных субстра-
тов грибами рода Fusarium и Trichoderma наблюдается значи-
тельное увеличение не только белка, но и редуцирующих саха-
ров (Сиверс, Богдан, 1983). Так, через 5 сут ферментации их
8* 115
количество возрастает на 29,3—95,1%, Ha 10-е сутки увеличива-
ется в 1‚4—2,8 раза, на 14-е сутки—— в 2,4—3,9 раза по сравне-
нию с контролем. Изучение химического состава исходного
сырья и обогащенных грибным белком кормов показало, что
в результате проведенной обработки в них значительно увели-
чивается содержание жира, фосфора, уменьшается количество
клетчатки и лигнина. По химическому составу такие корма при-
ближаются к гранулированной травяной муке из 3лаково-бобо-
вых культур (Лизак и др., 1983).
Большую работу по применению целлюлозолитических гри-
бов для обработки и обогащения грубых кормов и отходов
сельского хозяйства провели Билай, Сиверс (1971) и ряд дру-
гпх исследователей (Сиверс и др., 1971). Начиная с 1969 г. ими
изучено более двух тысяч грибов, отобраны активныс целлюло-
зо- и гемицеллюлозолитические штаммы, способные расщеплять
субстраты с образованием редуцирующих сахаров и обильно
накапливать биомассу.
Позже Билай и сотр. (1981), а также Закордонец и сотр.
(1983) изучили способность 12 штаммов плесневых грибов обо-
гащать кормовые отходы протеином, целлюлолитическими фер-
ментами, витаминами группы В, жиром и другими питательны-
ми веществами. Грибы выращивали на указанных субстратах
на протяжении двух—восьми суток. При этом синтезировались
ксиланаза и другие ферменты, Содержание витамина 132 при
культивировании грибов рода Pem'cz'llium Ha среде с кукурузной
кочерыжкой составляло 12-31 мг/кг.
Проведенные Бакай (1971) биопробы с целью выяснения,
возможно ли добавление биомассы грибов в рационы животных
(подсвинков) трех-‚ семимесячного возраста, дали положитель-
ные результаты. При двукратном в сутки кормлении с добавка-
ми от 20 до 300 г сухой биомассы на голову отрицательных яв-
лений не обнаружено. По мнению исследователей, выращивание
микроскопических грибов——один из путей повышения усвояе-
мости грубых кормов, а также увеличения кормовых ресурсов
развивающегося животноводства.
В 1975—1984 гг. Билай и сотр. провели селекцию активных
штаммов из 4000 изолятов микромипетов разных экологических
ниш и таксономического положения, обладающих высокой спо-
собностью трансформировать растительные полимеры в белок,
витамины И другие физиологически активные вещества. Уста-
новлена возможность трансформации в белок широкого спектра
субстратов: фуражного зерна, отрубей, свекловичного жома,
соломы хлебных злаков, стержней и стеблей кукурузы, хлопко-
вой шелухи, виноградных обрезков и выжимок, отходов чайной,
плодоовощной промышленности. Поскольку некоторые субстра-
ты малопригодны для роста грибов, применялись различные
комбинации и соотношения субстратов, что обеспечивало хоро-
шую аэрацию среды, удовлетворяло потребности грибов в раз-
116
личных компонентах, способствовало образованию белка повы-
шенной биологической ценности.
Билай с сотр. (1985) путем трансформации целлюлозо- и
крахмалосодержащих кормовых субстратов, а также раститель-
ных отходов селекционированными штаммами получили также
принципиально новый вид кормового продукта—микорм. Он
содержит мицелий гриба и внеклеточные метаболиты: белок с
полным набором незаменимых аминокислот, витамины, поли-
сахариды, фермснтьг и др. Многолетние опыты на разных видах
сельскохозяйственных животных (свиньях, крупном рогатом
скоте, птицах, пушных зверях) выявили безвредность, высокую
эффективность полученного препарата при замене им до 12—
15% концентрированных кормов в рационе животных.
Огромная работа по изучению условий переработки сельско-
хозяйственного сырья (зеленой массы растений, фуражной
муки, пшеничных отрубей, соломы) при помощи различных
культур и ассоциаций микроорганизмов проведена в Институте
микробиологии им. А. Кирхенштейна АН ЛатвССР (Бекер,
1984; Лиепиньш, Дунце, 1986). Изучены не только параметры
глубинного и твердофазного культивирования ПрОДуцеНТОВ, но
и их физиологические особенности при росте на целлолигнино-
вых материалах, разработаны технические средства реализации
процессов биоконверсии. В ходе многолетних экспериментов
установлено, что при твердофазном культивировании отобран-
ные культуры способны конвертировать термообработанную с
добавлением 10% отрубей солому в препарат с содержанием
не менее 12% белка за 5 сут.
Показана значимость перемешивания субстрата: любое пере-
мешивание его приводит к ухудшению показателей фермента-
ЦИИ. Вместе с тем оно необходимо для обеспечения теплоотвода,
ибо в отличие от глубинных процессов при твердофазном куль-
тивировании недопустима технически приемлемая разница тем-
ператур ферментации и теилоотводящего агента. Именно поэто-
му для каждого ферментируемого материала и используемого
микроорганизма нужен специальный подбор режимов и аппара-
туры. Из-за больших объемов перерабатываемого сырья и слож-
ности его стерилизации вряд ли можно рассчитывать на воз-
можность осуществления биоконверсии растительных отходов
в стерильных условиях. Целесообразно обеспечивать стериль-
ность только на стадии размножения посевного материала.
И, пожалуй, самая сложная проблема твердофазной фермента-
ции — спорообразование ряда продуцентов.
Большое внимание при изучении биологической конверсии
целлюлоз и лигноцеллюлоз уделяется изучению механизма рас-
щепления субстратов. Исследования с помощью электронного
Микроскопа позволили установить, что мицелий микромицетов,
в частности Trichoderrna reesei И Т. lignorum, находится в очень
тесном контакте с частицами соломы. Чаще мицелий просто об-
117
волакивает их, т. е. наблюдается тенденция к образованию наи-
большей поверхности непосредственного контакта мицелия с
частицами соломы. Авторы полагают, что такой контакт способ-
ствует более активной деструкции целлюлозы. Выделенные
грибами ферменты диффундируют из клеток в субстрат, частич-
но разрушают его, затем образовавшиеся растворенные про-
дукты микромицеты реализуют в своих же обменных процессах
(Бекер, 1984).
При биоконверсии продуктов фотосинтеза в белок предпочте-
ние отдают совместному культивированию микроорганизмов
(Бекер, 1984). Связано это с тем, что в естественных условиях
один вид микроорганизмов потребляет продукты обмена ве-
ществ микроорганизмов Другого вида. При выращивании же
монокультуры микромицетов продукты обмена скапливаются
в большом количестве, ингибируя тем самым рост данного про-
дуцента. Рижские исследователи Пошли по пути подсева к
микромицетам дрожжей Candida lypolytia, Endomycopsis fibulzl
ger, Trichosporon curaneunz. B этих условиях получен более вы-
сокий выход белка как при глубинном, так и при твердофазном
культивировании.
На базе ферментационной установки ФУ-8 Лейте и сотр.
(1986) создали два варианта ферментационных систем. Для
микромипетов рода Trich0derma——3To исследовательский био-
реактор, представляющий собой комбинированную твердофаз-
но-глубинную систему с протоком жидкости, для базидиомице-
тов—колонный ферментер стационарного слоя с коррекцией
газового состава аэрирующего воздуха. Полная колонизация
субстрата, по данным Виестура и сотр. (1986), может быть до-
стигнута при использовании большого количества инокулюма
и различных углеродных косубстратов. На первых этапах (48—
72 ч) конверсию субстрата следует вести в ферментерах, затем
скорость роста продуцентов снижается, процесс становится ме-
нее экзотермичным, не так остра борьба с посторонней микро-
флорой. Дальнейшую конверсию можно осуществлять не в фер-
ментере, а в полиэтиленовых мешках в термокамере.
Несмотря на столь широкий интерес к твердофазной фер-
ментации, с помощью которой можно получать кроме кормового
белка этанол, метан, ферменты, некоторые химические соедине-
ния, до настоящего времени нет четкого представления о таких
процессах, как потребление субстрата, перенос кислорода. Не-
ясно также, как в условиях поверхностного культивирования
оценивать рост, контролировать системы для поддержания ряда
параметров, какие использовать математические модели и кон-
струкции ферментеров и как автоматизировать сами процессы
ферментации (Tengerdy, 1985; Ьопзапе et а1., 1985).
По мнению Виестура и сотр. (1986), итоговая оценка состоя-
ния и перспектив внедрения способа биоконверсии соломы в бе-
лок представляется следующей: решающими являются технико-
118
экономические показатели, которые могут быть определены в
ходе длительной эксплуатации опытно-производственных уста-
новок‚ а также результаты широких зоотехнических испытаний
продуктов ферментации.
Интересные данные получены рядом авторов при изучении
биоконверсии в белок таких субстратов, как виноградные вы-
жимки, отходы виноделия, ботва овощных культур и др. (Мике-
ладзе и др., 1985; Касимадзе, 1985; Перадзе и др., 1985; Соп-
sidine et а1.‚ 1987). Продукты биоконверсии характеризуются
приятным грибным запахом, достаточно высоким содержанием
белка и наличием биологически активных веществ. Путем вы-
ращивания микроскопических грибов на различных видах отхо-
дов получают и белково-ферментные комплексы, в которых вме-
сте с белком содержатся целлюлолитические ферменты. При
одновременном употреблении их и грубых кормов повышается
пищевая Ценность последних и их усвояемость (Микеладзе,
1982).
Только в Грузии при полной утилизации отходов и вторич-
ного сырья путем микробиологического синтеза может быть
ежегодно получено свыше 800 тыс. т белково-ферментного комп-
лекса, что дает возможность полностью покрыть белковый де-
фицит в республике. Подобраны микроорганизмы и разработана
технология производства белковых продуктов на таких видах
отходов, как виноградные выжимки, отходы эфиромасличного
производства и консервной промышленности, стебли, листья,
початки кукурузы. Из более чем 250 видов мицелиальных гри-
бов и дрожжей выделено 20 перспективных штаммов (Мике-
ладзе, 1984). Среди них дрожжи Candida tropicalis, МИЦеЛИаЛЬ-
ные грибы Sporotrichum pulverulentum, Fusarium semizfectum,
Allescheria lhermophila.
Проведенные эксперименты (Микеладзе и др., 1985) came-
тельствуют о том, что более эффективно совместное культиви-
рование двух микроорганизмов, чем раздельное выращивание
этих культур. Белково-ферментный комплекс, образующийся
при биотрансформации целлюлозосодержащего сырья, оказался
нетоксичным продуктом, содержащим не более 2,0~—2,5% ну-
клеиновых кислот, 30% белка и до 19% клетчатки. Биодегра-
дации подвергается 60——70% клетчатки исходного сырья. Из
белково-ферментного комплекса возможно выделение белкового
концентрата пищевого назначения.
Итак, в процессе твердофазной ферментации растительного
сырья в большинстве случаев используются мицелиальные гри-
бы (Бабицкая, 1985; Бекер, 1985). Однако, поскольку несовер-
шенные грибы слабо расщепляют ЛИГНОЦеЛЛЮЛОЗНЫЙ комплекс,
возможности их применения для твердофазной ферментации
субстратов без предварительной обработки последних ограни-
чены. Кроме того, серьезным недостатком продуктов твердофаз-
ного культивирования несовершенных грибов является, как уже
119
отмечалось, наличие в них спор (Бекер, 1984; Апсите и др.‚
1983).
Дереворазрушающие базидиальные грибы, вызывающие бе-
лую гниль древесины,— наиболее активные разрушители лигно-
целлюлозы в природе (Бисько и др.‚ 1983; Гаврилова, Григорье-
ва, 1983; Абрамович и др.‚ 1987). Грибы этой группы без участия
других деструкторов способны разлагать древесину, солому, так
как они синтезируют комплекс ферментов, расщепляющих ра-
стительные полисахариды и лигнин. Как правило, дереворазру-
шающие базидиомицеты не образуют конидиальных спороноше-
ний, в связи с чем представляют большой интерес как микроор-
ганизмы, осуществляющие процессы твердофазной ферментации
(Капич и др.‚ 1984; Бисько, Дудка, 1987; Somasundaram et а1.,
1987).
Основная масса работ по вопросам твердофазного культиви-
рования дереворазрушающих базидиальных грибов посвящена
проблеме увеличения кормовой ценности лигноцеллюлозных ма-
териалов (Reid, Jan, 1985; Nicolini е’: а1., 1987). Вместе с тем
широкораспространенными отходами промышленности явля-
ются разнообразные жмыхи, остающиеся от переработки расти-
тельного сырья, например жмыхи плодов, получаемые при
отжимании соков, картофельные и кукурузные жмыхи —— отходы
производства крахмала, соевые жмыхи, остающиеся после при-
готовления соевого молока, твердые отходы свеклосахарного
производства и др. Жмыхи реализуются в сыром виде в корм
скоту, но их кормовое значение невелико, так как они содержат
в основном углеводы (клетчатку и пектин) и при недостатке
белков в рационе не дают заметного эффекта в привесе или в
приросте. Ценность жмыхов как корма может быть значительно
повышена при обогащении их белком.
В Японии запатентован способ, позволяющий превратить
разнообразные жмыхи в пищевой продукт. Согласно этому спо-
собу, на увлажненных жмыхах в течение шести дней при тем-
пературе 20 °С выращивают гриб Cortinellus c/ziftake (или дру-
гой съедобный гриб). Полученный продукт измельчают, сушат
и снова измельчают в порошок, который обладает грибным вку-
сом и применяется в качестве приправы при приготовлении раз-
личных кулинарных изделий. Мицелиальная масса деревораз-
рушающих грибов Coriolus versicolor H Phellinus limfeus может
быть получена на твердых питательных средах, включающих
жмыхи семян капусты пак-хой, хлопчатника.
Твердофазная ферментация может быть использована для
обогащения субстратов, содержащих в большом количестве
легкодоступные углеводы, но лимитированных по содержанию
белка.
В США разработан метод обогащения белком кормовых и
пищевых продуктов. Исходными субстратами служат зерновые
(кукуруза, рожь, ячмень, овес, рис), соя, маниок‚ бататы и их
120
смеси. После стерилизации и охлаждения субстрата его под-
вергают твердофазной ферментации одной из грибных культур
рода Pleuroms (P. ostreafus, P. ulmarizzs, P. sapidus, P. Попал).
Содержание белка в продукте после 21-35 дней культивирова-
ния повышается на 30—-65%. ОН имеет улучшенный аминокис-
лотный состав. Для обогащения белком зерна кукурузы рекомен-
дуется выращивать на нем в течение 14-24 сут гриб Pleurotus
ostreatus (Капич и др., 1984). По данным Торева (1982), бази-
диальные грибы способны значительно обогащать белком и дру-
гими биологически активными веществами кормовую муку ку-
курузы, ячменя и пшеничные отруби или их смеси даже в тече-
ние 36-60 ч.
Существует два пути улучшения кормовых качеств лигно-
целлюлозных и крахмалосодержащих субстратов за счет выра-
щивания на них макромицетов: увеличение переваримости и
обогащение белком и витаминами. Увеличение переваримости
таких материалов достигается путем расщепления лигиоцеллю-
лозного комплекса, уменьшения содержания лигнина и увели-
чения количества свободных углеводов. Известно несколько не-
обычных видов грибов белой гнили, которые способны разлагать
3/4 первоначального количества лигнина, мало затрагивая цел-
люлозу. Некоторые виды грибов локально расщепляют лигнин,
обогащая древесину целлюлозой. Например, при развитии гриба
Cyat/zus stercorcus на соломе в течение 62 дней при 25 °С содер-
жание лигнина в ней уменьшается почти в 2 раза, а содержание
целлюлозы-только на 17——20%. Обработанная таким обра-
зом солома риса и пшеницы содержит в основном свободную от
лигнина целлюлозу, легко подвергающуюся ферментативиому
гидролизу с образованием глюкозы, и относительно легко пере-
варивается животными (Капич и др.‚ 1984). Такой избиратель-
ной способностью обладают многие представители рода Polypo-
rus (Levonen—Munoz, Bone, 1985).
Лигнинразрушающие грибы повышают переваримость и со-
ломы ячменя. Наиболее выраженное действие при этом оказы-
вают культуры капрофильных и дереворазрушающих грибов:
Coprinus cinereus, C. comalus, Schizophyllum commune И Xylaria
hypoxylon. Все испытанные грибы обладают фенолоксидазной
активностью и повышают переваримость субстрата на 109-—
111%. Применение Coprinus cinereus позволило вести процесс
обогащения соломы в нестерильных условиях.
Дереворазрушающие базидиальные грибы стали объектом
обширных исследований, проводимых в ФРГ под руководством
Zadrazil. Уже в первых работах (Zadrazil, 1975, 1977) было по-
казано, что грибы рода Pleurotus (P. ostreatus, P. эр. florida,
P. corrzucopiae), вызывающие белую гниль древесины, разру-
шают лигпоцедтлтолозньтт? комплекс соломы и увеличивают ее
кормовую ценность. Переваримость соломы, ферментированной
грибами, достигает переваримости сена и составляет 60—70%.
121
Увеличение переваримости коррелирует с возрастанием концент-
рации легко растворимых веществ. Кроме соломы грибы Pleura-
tus эр. florida И Stropharia rugosoannulata разрушают лигнин
и повышают переваримость отходов древесины, камыша, куку-
рузы, Исключением является обильно инкрустированная рисо-
вая шелуха.
При выращивании на соломе разных видов грибов перевари-
мость ее может либо увеличиваться, либо уменьшаться. В зави-
симости от степени действия базидиальных грибов на перевари-
мость соломы они разделены на три группы. K первой группе
принадлежат грибы, увеличивающие переваримость. K НИМ от-
несены некоторые виды рода Pleurotus, Stropharia rugosoarmu-
Хат. Грибы второй группы (виды рода Pholiota, Coprinus coma-
tus, Kluyveromyces нападёт) практически не изменяют перева-
римость соломы. Грибы третьей группы, в частности Volvaria
volvacea, Agrocybe aegerila, Flammulina velutipes, хунта poly-
morpha, снижают переваримость соломы (Zadrazil, 1978).
B качестве грибов, осуществляющих процессы твердофазной
ферментации лигноцеллюлозных субстратов, могут быть исполь-
зованы также Sporotrichum pulverulentum И Dichomifus squa-
lerzs. Последний хотя и разлагает такие субстраты медленнее
первого, однако более активно расщепляет лигнин, вследствие
чего в большей степени увеличивает их переваримость. При
культивировании Sporotric/mm pulverulentum максимальная
переваримость соломы (40-500/0) отмечается после 20 сут фер-
ментаЦии‚ а при культивировании Dichomitus squalerzs—nocne
30 сут (около 60%). Внесение дополнительных источников азот-
ного питания в субстрат приводит к более активной утилизации
грибами легкоусвояемых компонентов (особенно целлюлозы) и
ингибированию расщепления лигнина, что вызывает снижение
переваримости. Аналогичные результаты получены и для других
культур дереворазрушающих базидиальных грибов. Таким об-
разом, добавление дополнительных источников азота K лигно-
целлюлозным субстратам является нежелательным при прове-
дении твердофазной ферментации, когда ее целью является по-
лучение продукта с повышенной переваримостью (цит. по
Капичу и др‚, 1984).
Для повышения переваримости пшеничной соломы путем
модификации ее лигноцеллюлозного комплекса применяется
гриб Pleurotus ostreaz/‘us NRRL 2366. После его культивирования
в течение 36 дней содержание лигнина и целлюлозы в субстра-
те снижается соответственно на 10—45 и I5—55%. После 90 дней
инкубации соломы с грибом переваримость ее составляет 50%.
Чувствительность пшеничной соломы к фермептативному оса-
хариванию кроме грибов рода Plcurotus способны повышать
грибы Pycnoporus cimzabarinus И Isc/moder/na benzoinum (На-
takka, 1983, 1984).
Хороший субстрат для выращивания макромицетов, в част-
122
ности Pleurotus ostreatus sp. florc‘da,— хлопковая солома. При
твердофазном культивировании на ней гриба за 21 день содер-
жание лигнина в субстрате снижается на 65%. Предполагается,
что интенсивный рост Pleurotus ostreatus обусловлен присут-
ствием в хлопковой соломе соединений флавоноидного типа.
При добавлении водного экстракта хлопковой соломы, содер-
жащего флавоноидные соединения, удалось значительно акти-
визировать рост данного гриба и на пшеничной соломе, степень
деградации которой увеличилась на 33 %.
Хороший корм для сельскохозяйственных животных—фер-
ментированная дереворазрушающими базидиомицетами овсяная
солома (Levonen-Munoz et а1., 1983). Наибольшей продуциру-
ющей способностью обладает гриб Phanerochaete chrysosporium,
за 2 нед инкубации которого деградации подвергается 27%, а
за 4 нед——47% субстрата. При добавлении в солому минераль-
ного источника азота лигнолитическая активность гриба пол-
ностью подавляется. Такой эффект у гриба Pharzerochaete chry-
sosporium наблюдали и другие исследователи (Leatham, Kirk,
1983). Известны также грибы, лигнолитическая активность ко-
торых не ингибируется, а повышается при высоких концентра-
циях азота в среде (1гепе, Nelson, 1987). Увеличение соотноше-
ния С : N вследствие добавления в среду с овсяной соломой
глюкозы приводит к преимущественному разложению макроми-
цетами лигнина. Такого же мнения придерживаются и другие
исследователи, сообщающие, что косубстраты углеводной при-
роды во многих случаях значительно стимулируют процессы
деградации лигнина (Головлева и др., 1982, 1983; Ulmer et а1.,
1983; Mfiller, Txbsch, 1986).
Исследования возможности использования дереворазруша-
ющих базидиомицетов с целью обогащения белком субстратов
различного происхождения широко проводятся у нас в стране.
Для повышения питательной Ценности измельченной и предва-
рительно обработанной аммиаком древесины предложен гриб
Coriolus pubcsccns. C помощью этого гриба выпущен продукт
с содержанием белка 7,0——7,5% (Борзаковская и др., 1980).
О получении растительно-белковых продуктов при применении
грибов родов Coriolus, Pleurotus, Stereum, Schizophyllum сооб-
щают Кузубова с соавт. (1982). При выращивании Pleurotus
ostreatus на субстрате, состоящем из осиновых опилок и пше-
ничньтх отрубей (9:1), содержание азота возрастает на 22—
32%. Штамм утилизирует из субстрата 31-—33% целлюлозы и
21-26% лигнина (Бисько и др., 1986).
В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН
СССР проведен отбор культур грибов, способных разрушать
лигноцеллюлозный комплекс березовых опилок и пшеничной
соломы и обогащать эти субстраты белком (Черменский и др.,
1983; Сто1оу1еуа et а1., 1983, 1985; Maltseva et а1., 1985). Среди
дереворазрушающих базидиальных грибов наиболее активными
123
продуцентами белка названы Sporotrichum puluerulentum, Pa-
низ tigrinus, Pholiota fuberculosa H др. Расщепляя лигноцел-
люлозный комплекс, лучшие культуры утилизируют 20——40%
целлюлозы и 30-500/0 лигнина.
Изучение твердофазной ферментации пшеничной соломы и
березовых опилок в тонком и толстом слоях с помощью гриб-
ных культур Parzus ligrinus 144 и 8/18 и Myceliopht/10ra thermop-
Рта 214 показало, что при культивировании в тонком слое ма-
ксимальное обогащение субстратов наблюдается на 6—7-е сут-
ки. K этому же периоду отмечается и максимальное потребление
целлюлозы и лигнина, влажность субстратов повышается от 60
до 80%, рН снижается с 5,5 до 4,0. При культивировании в тол-
стом слое „пимитируюшими факторами, по мнению исследова-
телей (Грекова и др., 1985), могут быть не рН, влажность или
транспорт растворимых питательных веществ, а, скорее, неудов-
летворительный транспорт O2, CO2 H распределение тепла внут-
ри рабочего объема. С повышением слоя субстрата уменьша-
ется содержание белка в продукте. Следовательно, на процесс
биоконверсии „лигноцеллюлозных субстратов твердофазной фер-
ментации в толстом слое определяющее влияние оказывают
интенсивность и способ аэрации.
Грековой и сотр. (1985) проведена большая работа по срав-
нительной оценке физических и химических методов предобра-
ботки растительного сырья. Исследование влияния различных
видов механического измельчения соломы на рост грибов Parzus
tigrinus 144 и 8/18 обнаружило, что наилучшие рост и обогаще-
ние белком, максимальное усвоение лигнина и целлюлозы про-
исходят при ферментации грибов на соломе, измельченной с
помощью зернодробилки, соломорезки и дисковой металлорез-
ки. Оптимальной оказалась величина частиц З0—5О и 1,5 мм.
Содержание белка в соломопродукте увеличивается в 2-3 раза
и достигает 4——7°/д‚ количество лигнина и целлюлозы снижается
на 14-18 и 30~55°/0 соответственно. Уменьшение размера ча-
стиц соломы до 0,5 мм ведет к ухудшению роста грибов и паде-
нию содержания белка в продукте.
Оценены два вида ферментации-поверхностная и глубин-
ная с объемным способом аэрации. Сравнительный анализ сви-
детельствует в пользу глубинного процесса: больше как глубина
биоконверсии лигноцеллюлозы, так и обогащение ее белком.
Анализ продукта, взятого из разных слоев ферментера, показал,
что рост гриба и деградация субстрата одинаковы по всему объ-
ему ферментера. Показателем интенсивного роста Panus agri-
nus H потребления им компонентов субстрата служили содержа-
ние углекислоты в выходящем воздухе и температура в центре
ферментера (Черменский и др., 1985). Для более активной
биоделигнификации лигноцеллюлозных субстратов используется
совместное культивирование (Иванова, 1987). Отсутствие анта-
гонизма позволило подобрать перспективные пары грибов
124
(используя Panus Наплыв, Coriolus versicolor, Poria нашили‘:
и неидентифицированный Штамм 39), осуществляющие более
глубокую биоконверсию по сравнению с монокультурами: убыль
лигнина и целлюлозы составила 2О—3О%, вдвое увеличилось
содержание белка в соломопродукте.
Активными деструкторами лигноцеллюлозных субстратов
являются и грибы Coriolus versicolor, Tyromyces lacteus, Stereum
hirsutum (Brown, I985; Стахеев и др.‚ 1985; Бабицкая и др.‚
1986), при выращивании которых на соломе (с добавлением
1О—ЗО% массы сухого субстрата свекловичного жома или кар-
тофельной мезги) содержание белка увеличивается с 2,8 до
9,0—10,0%. B продуктах по сравнению с субстратом возросло
количество всех аминокислот, за исключением серусодержаших.
При твердофазном обогащении грибным белком раститель-
ных отходов к субстрату, как правило, добавляют дополнитель-
ные источники азотного питания, чтобы обеспечить необходимый
уровень синтеза протеина. Однако, как уже упоминалось, по-
вышенные концентрации азота во многих случаях вызывают
преимущественную утилизацию клетчатки и ингибируют дегра-
дацию лигнина, что снижает переваримость конечного продук-
та. Таким образом, появляется возможность получения продук-
та с достаточно высоким содержанием белка, но обладающего
низкой переваримостью. K сожалению, в большинстве работ,
посвященных обогащению грибным белком лигноцеллюлозных
субстратов, результаты определения переваримости конечного
продукта не приводятся. Вместе с тем многие исследователи
отмечают приблизительно пропорциональное снижение концент-
рации клетчатки и лигнина в конечном продукте и увеличение
содержания в нем свободных углеводов, что косвенно свидетель-
ствует об увеличении его переваримости (Капич и др.‚ 1984).
В связи с возросшим вниманием исследователей к биотехно-
логическим процессам, основанным на утилизации лигноцеллю-
лозных субстратов, необходимо изучение механизма разложе-
ния компонентов растительных отходов, особенно лигнина.
Предполагают, что начальные этапы разложения лигнина долж-
ны осуществлять диффундирующие атакующие агенты, так как
полимерный лигнин не может поступать внутрь клетки. Такими
диффундирующими агентами могут быть внеклеточные фер-
менты и (или) активированные формы кислорода, образуемые
грибным мицелием (цит. по Скрябину и др.‚ 1985).
Первыми в отечественной литературе, кто попытался обоб-
щить данные по проблеме микробиологической деградации лиг-
нина, были Грушников и Антропова (1975). Авторы отмечают,
что еще в 1928 г. Бавендамм обнаружил способность грибов
белой гнили при культивировании на агаровой среде, содержа-
щей галловую или танниновую кислоты, образовывать темно-
окрашенную зону вокруг мицелиальных пленок. Бавендамм
связывал способность грибов расщеплять лигнин с продуциро-
125
ванием фенолоксидазы. Однако позже было показано, что неспо-
собность дереворазрушающих грибов окислять фенолы в агаро-
вой среде нельзя считать доказательством невозможности ути-
лизировать лигнин.
До сих пор роль фенолоксидаз в биодеградации лигнина
остается невыясненной, ибо, по данным ряда авторов, как де-
структирующие лигнин грибы белой гнили, так и неразруша-
ющие лигнин грибы бурой гнили продуцируют фенолокисляю-
Щие ферменты, причем некоторые грибы бурой гнили выделяют
больше фенолоксидаз, чем некоторые грибы белой гнили. Все
это указывает на то, что в процессе деградации лигнина прини-
мают участие и другие энзиматические системы. Установлено,
что деструкция лигнина грибами приводит к уменьшению коли-
чества метоксильных групп и увеличению содержания общих и
фенольных гидроксильных, карбонильных и карбоксильных
групп.
Низкомолекулярными продуктами микробиологической дегра-
дации лигнина могут быть ванилиновая, пара-оксибензойная,
феруловая, 4-окси-3-метоксифенилпировиноградная, пара-окси-
коричная кислоты, гваяцилглицерин, ванилин, дегидродивани-
лин, конифериловый и сиреневый альдегиды, нара-оксикориттньтйт
альдегид, гваяцилглицерин-{З-конифериловый эфир. Наблюда-
ется некоторая специфичность в действии грибов на лигнин.
Так, продуктами метаболизма грибов рода Мисог оказались
альдегиды и некоторые кислоты, рода Trich0derma—KeToHb1,
бензойная и ванилиновая кислоты, рода Азрегуб11из——ионифе-
рштовьтй альдегид, пара-оксибензальдегид, детидродиванилин,
кетоны и кислоты. Продуктами деградации лигнина грибами
рода Peniccillium И Fusarium ЯВИЛИСЬ спирты, отсутствующие
в случае грибов родов Mucor, Trichoderma И Aspergillus, а так-
же фенолы, некоторые альдегиды, кетоны и кислоты.
С целью выяснения роли пероксидазы и лакказы в деграда-
ЦИИ лигнина было исследовано действие этих ферментов на
мономерные (гваякол, 2,6-диметоксифенол, глицерилариловые
эфиры) и димерные (1-гваяцил-2-сирингилэтанол, пинорезинол
и дегидродиизоэвгенол) фенольные соединения, структурно
родственные лигнину. Ферментативное воздействие приводит
к образованию продуктов более высокой молекулярной массы
в результате углерод-углеродного и углерод-кислородного соче-
тания. Нефенольные модельные соединения не затрагиваются
обеими ферментными системами, что говорит о том, что их ка-
талитический эффект по своей природе окислительный, а не гид-
ролитический (Dart et а1., 1987).
Анализируя литературные данные о роли лакказы при био-
деградации лигнина и его модельных соединений, Озолиня и
Сергеева (1987) отмечают, что мнения исследователей по этому
вопросу расходятся. Одни считают, что при действии лакказы
на лигнин наблюдается незначительная потеря метоксильных
126
групп и преобладают процессы полимеризации за счет ради-
кальных процессов. Другие указывают на процессы деметокси-
лирования и окисления. Разноречивость во взглядах авторов
объясняется тем, что препараты лакказы, Выделенные из раз-
личных грибов, обладают разными свойствами, более того, по-
разному действуют на лигнин и его модельные соединения даже
изоэнзимы лакказы одного и того же гриба.
По мнению Грушникова и Антроповой (1975), наиболее обос-
нованной представляется выдвинутая Кирком <<фенолоксидаз-
ная гипотеза», согласно которой фенолокисляющие ферменты
дереворазрушающих грибов катализируют окисление феноль-
ных ОН-групп макромолекулы лигнина, в результате чего обра-
зуются нестабильные свободные радикалы, которые затем ста-
билизируются в ходе реакций, приводящих к конденсации неко-
торых лигнинных структур и одновременному расщеплению
углерод-углеродных связей между боковыми цепями и кольцами
других окисленных фенолпропановых звеньев. Деструкция лиг-
нина происходит в результате серии одноэлектронных перено-
сов, приводящих в конечном итоге к отщеплению боковых це-
пей. Вследствие разнообразия связей между мономерными
звеньями в лигнине полное разрушение может не включать пря-
мую атаку на каждую из этих связей с освобождением низко-
молекулярных фенольных соединений. Скорее, имеет место пря-
мая атака на общие структурные элементы полимера, такие,
как ароматические ядра, а разрыв связей между фенилпропа-
новыми звеньями протекает косвенным путем. Однако имеющие-
ся в литературе данные пока не позволяют сделать однознач-
ный вывод как о ферментных системах, так и о механизме ми-
кробиологической деградации лигнина.
Предполагается, что анаэробные микроорганизмы не спо-
собны разрушать лигнин. Аскомицеты и некоторые несовершен-
ные грибы разлагают его частично. В большей степени способ-
ны метаболизировать лигнин базидиомицеты, к числу которых
относятся общеизвестные грибы, вызывающие белую гниль дре-
весины (Kirk, 1985). Классическим объектом в исследованиях
по утилизации лигнина стал представитель базидиомицетов
Sporotric/mm pulverulenlum. Установлено (McDonald et а1.‚
1984), что в процессе появления лигнолитической активности у
Sporotrichum pztlverulerzium происходят физиологические изме-
нения.
Так как определение лигнина обычными методами затрудни-
тельно вследствие его гетерогенности, используют лигнин, ме-
ченный по углероду‚ либо модельные соединения лигнина (Eriks—
son, 1984, 1987; Согпгпапаау, Maeg, 1985). При исследовании
механизма микробиологического разложения лигнина основное
внимание было обращено на расщепление связи СО„—СВ в боко-
вых цепях молекулы этого полимера. Выяснилось, что для рас-
пада связи Со„——С‚д, необходимо присутствие катализаторов.
127
Первым, кто высказал гипотезу об участии в процессе разложе-
ния лигнина восстановленных форм кислорода — перекиси водо-
рода (H202), перекисного аниона (04), гидроксильного ради-
кала ('ОН) и синглетного кислорода ('02), был На] (Экспресс-
инф...., 1985). Его предположение подтвердилось. На примере
Sporotriclmm pulverulentum показано, что под действием синте-
зируемых грибом ферментов в среде образуется I-I202, которая
необходима для деградации лигнина. Поскольку H202 не явля-
ется сильным окислителем, предполагают, что она выполняет
роль кофактора при разложении лигнина.
В 1982 г. в модельных опытах был выявлен фермент, расщеп-
ляющий С‚‚„——Сд-связи. Его активность проявлялась только в
присутствии H202. Фермент был назван лигниназой. Синтез
лигниназ грибом Sporotrichum pulverulentum стимулировался
добавлением в среду вератрилового спирта. Позже выяснилось,
что этот гриб синтезирует Шесть лигниназ. Установлено, что в
разложении лигнина кроме лигниназ участвуют и другие фер-
менты, осуществляющие, например, деметоксилирование арома-
тических метоксильных групп, гицроксилированпе ароматических
ядер, расщепление их и т. д. (Reid et а1., 1985; Катга, Zadrazil,
1985; Meyer, Hartig, 1987; Roy, 1987).
Лигииназы представляют собой гемопротеин. В основе их
Действия на субстрат лежит реакция окисления ароматических
ядер с образованием нестабильных соединений——катионовых
радикалов, которые претерпевают дальнейшие изменения (Kirk,
1983, 1985; Schoemaker е‘: а1., 1985).
Большая работа по изучению механизма разложения лигни-
на проводится в Институте биохимии и физиологии микроорга-
низмов АН СССР (Скрябин и др.‚ 1985; Головлева, Мальцева,
1986). Исследована динамика разложения лигнина, выделен-
ного из березовой древесины, грибом Phanerochaete chrysospo-
rium 1764. Установлено, что деградация лигнина начинается
после завершения фазы активного роста гриба. Авторы пола-
гают, что процесс потребления целлюлозы и активный рост гри-
ба происходят в течение первых 3 сут культивирования. Свя-
зано это с исчерпанием источников азота из среды. Наиболее
активно процесс деградации лигнина протекает в течение пер-
вых двух недель выращивания продуцента. Выявлено стимули-
рующее влияние 02 на лигнолитическую активность культуры,
а также участие в Процессе деструкции лигнина грибом Pharm-
rochaete chrysosporium 1764 активированных форм кислорода
(H202, ‘0H), По данным Скрябина и соавт. (1985), для пол-
ного разложения лигнина необходима не только его деполиме-
ризация, но и расщепление образующихся ароматических струк-
тур.
Высказывается предположение об участии в деградации
лигнина грибом Phanerochaete chrysosporium 1764 внеклеточно-
го перекисьзависимого фермента, а в расщеплении образующих-
128
ся при деполимеризации лигнина ароматических соединений——
гомогентизатдиоксигеназы. Гриб Pharzerochaete chrysosporium
He образует лакказы, целлобиозохиноноксидоредуктазы и пе-
роксидазы, обладает слабой активностью глюкозооксидазы, из
пяти диоксигеназ он синтезирует только гомогентизатдиокси-
геназу.
Исследование факторов, контролирующих лигнолитическую
активность у базидиомицетов Lentinus edodes И Phanerochaete
chrysosporium, позволило установить, что лигнолитическая
активность у Plzanerochaete chrysosporium появляется после
прекращения вегетативного роста гриба при наличии 02 и экзо-
генного источника углерода (фруктозы, глюкозы или ксилозы).
Стимулируют лигнолитнческую активность у этого гриба ионы
Ред, Са2+ и M05+. У гриба же Le/ztirms edodes лигнолитическая
активность наблюдается только в период вегетативного роста
и не стимулируется ионами Ca2+, НО возрастает при добавлении
Мп9+ (Leatham, 1986). Аналогичные данные получены другими
исследователями (Kirk et а1.‚ 1986; Harvey, 1986), которые
наблюдали, что добавление в среду культивирования смеси
микроэлементов или вератрилового спирта в конечной концент-
рации 0,4 мМ приводит к 5-кратному увеличению активности
лигниназ. Скорость окисления лигнина до CO2 повышается у
большинства штаммов Phanerochaete chrysosporium и после до-
бавлення глюкозооксттдазьт (Kirk et а1.‚ 1986).
Имеются сообщения об усилении деградации лигнина при
внесении в субстрат (древесные опилки) солодового Экстракта,
галловой или дубильной кислоты или орсина (Агога, Sandhu,
1986). Деградация лигнина зависит от активности лигнолити-
ческих ферментов и не коррелирует с гемицельлюлазной и кар-
боксиметилтцеллюлазной активностью (McCarthy et а1.‚ 1986).
По данным Капича и сотр. (1984), деструкцию лигнина и
целлюлозы соломы с Одновременным обогащением ее белком
вызывают кроме грибов родов Coriolus, Parms, Tyromyces, Spo-
гематит, Le/zfinus ГрИбЫ рода Schizophyllum. Для ускорения
роста макромицетов и увеличения степени расщепления лигно-
целлюлозного комплекса соломы Целесообразно дополнительное
внесение легкоусвояемых и дешевых источников углеродного
питания, например свекловичного жома или картофельной
мезги.
Деградацию лигнина в лигноиеллтюгхозных материалах вы-
зывают актиномииеты (McCarthy et а1.‚ 1984). Принято считать,
что регуляция лигнолитической активности у актиномицетов
осуществляется иным путем, чем у грибов белой гнили. Опыты
с применением акцепторов кислорода выявили, что восстанов-
ленные формы кислорода не участвуют в процессе разложения
лигнина Streptomyces viridosporus (Commanday, Maeg, 1985).
Если лигнолитические ферменты Sporotrichum pulverulem
tum—3To BH€K.fI€TO‘{HbI€, неспецифические пероксидазы и окси-
9 Зак. 966 129
геназы, которые обладают оксигеназной и пероксидазной актив-
ностью, и, кроме того, способны расщеплять связи Сад-Св в
боковых цепях молекулы лигнина, то Streptomyces viridosporus
продуцирует ферментный комплекс, участвующий в демитили-
ровании ароматических колец молекулы лигнина, окислении
боковых цепей и расщеплении р-эфирньтх связей. По-видимому,
актиномицеты, в частности Streptomyces viridosporus, играют
важную роль в деградации лигнина в нейтральной и щелочной
зонах (почвах), в которых лигнолитические грибы не могут
составить им конкуренцию (Pometto, Crawford, 1986).
Активными деструкторами лигнина оказались и некоторые
виды Aspergillus (Milstein е‘г а1.‚ 1984; Каоат, Dreut, 1986).
Показано, что все исследованные грибы (Aspergillus fumigafus,
A. {артистах А. niger, A. terreus) расщепляют ароматические и
углеводные компоненты растворимых в воде лигноуглеводных
комплексов, выделяемых из пшеничной соломы. Ароматические
и родственные лигнину соединения не влияют на образование
грибами гемииеллюлаз. Все виды Aspergillus, особенно A. fumi-
дат, активно растут на соломе, утилизируя лигнин и некото-
рые углеводы. Гриб в одинаковой степени вызывает значитель-
ное д‹еметоксилирование и дегидроксилирование лигнина.
По мнению Огаркова и сотр. (1985), при осуществлении раз-
ложения компонентов лигноцелттюлозных субстратов существует
тесное взаимодействие циклов деструкции и утилизации целлю-
лозы и лигнина. В этот цикл вовлечено более десяти ферментов.
Среди промежуточных продуктов распада целлюлозы и лигнина
обнаружены Н2О, H202, O2, О‘, иелцтобиоза, глюкоза, Цел-
лобионовая кислота, феноксильные радикалы.
Цикл разложения целлюлозы тесно связан с циклом конвер-
сии лигнина и его мономеров. В Этих циклах есть две точки со-
пряжения через превращения целлобиозы и глюкозы (Огарков
и др.‚ 1985). Особенно важна вторая точка сопряжения. Глю-
козо-2-оксидаза, превращая глюкозу в глюконолактон, генери-
рует H202, которая является катализатором при разложении
лигнина и необходима для проявления активности недавно вы-
деленного фермента лигниназы (фермент деградации лигнина).
До сих пор еще остается неясным, каковы различия лигнииаз
и известных лакказ. Следовательно, накопление глюкозы в сре-
де стимулирует ее превращение в глюконолактон, а выделяю-
щаяся H202 запускает реакции окислительной деструкции лиг-
нина и его мономеров.
Как указывают Огарков и сотр. (1985), разложение целлю-
лозы -— процесс известный, осуществляется с помощью целлю-
лазного комплекса микроорганизмов. Его можно проследить на
примере гриба Trichoderma reesei. Ферментативный комплекс
этого гриба состоит из {3-1‚ФЕ-глюканцеллобиогидролазы (КФ
3.2.1.91), которая специфически отщепляет целлобиозильные
единицы с невосстановленното конца цепи целлюлозы, из эндо-
130
[3-1,4-Б-глюканазь1 (КФ 3.2.1.4), расшепляющей внутренние
связи в целлюлозных цепях, И В-1‚4-Б-глюкозидазы (КФ 3.2.1.21),
отщепляютцей глюкозильные остатки от невосстановленного
конца целлоолигосахаридов. Комплекс ферментов действует
кооперативно, катализируя образование олигосахаридов, цел-
лобиозы и глюкозы. Конечным продуктом распада является
глюкоза. Первичная атака целлюлозы осуществляется по аморф-
ным зонам цепей, затем по мере разрыхления структуры крис-
таллических участков волокон ферменты диффундируют в эти
участки.
Анализируя данные литературы о механизме разложения
лигноцеллюлозных субстратов, следует отметить, что если про-
цесс деградации целлюлозы довольно ясен (Клесов, 1987), то
все предполагаемые схемы утилизации лигнина носят пока еще
гипотетический характер.
В качестве субстрата для твердофазиого культивирования
дереворазрушающих базидиомицетов могут быть использованы
гребни винограда-отходы виноделия и виноградарства (Гра-
дова и др.‚ 1982). За счет выращивания на них гриба Pleurotus
oszreatus содержание белка увеличивается с 6 до 18%. Полу-
ченный продукт обладает приятным грибным ароматом. Биокон-
версию обрезков виноградной лозы проводят с помощью грибов
Coriolus versicolor, Bfer/eandcra adusta, B. fumosa И др, (Ганба-
ров и др, 1987).
Источником пополнения кормовой базы может служить вер-
ховой сггаборазлтоживгциися торф, содержащий большое количе-
ство клетчатки и мало лигнина. Под воздействием грибов в
торфе увеличивается содержание белковых веществ. Частичное
разложение торфа дереворазрушаюшими грибами способствует
обогащению его и легкогидролизуемыми соединениями.
Некоторые способы обогащения белком макромицетов лигно-
целлюлозных субстратов дошли до стадии внедрения. Так, со-
трудниками ВНИИГидролиз разработан способ получения бел-
кового кормового продукта на основе культивирования дерево-
разрушагошего базидиомицета белой гнили Coriolus pubescens
на измельченной древесине. Древесину осины измельчают до
размера 3~5 мм и обрабатывают газообразным аммиаком в ко-
личестве, равном 1,5—3‚0°/о массы абсолютно сухой древесины.
В подготовленное таким образом сырье вносят питательные соли
с содержанием фосфора 0,05—1 %, калия — 0‚05——1 и магния ———
0,01——1 % массы сухого сырья.
Смесь перемешивают и пропаривают острым паром в течение
20 мин. После охлаждения в субстрат вносят засевную культуру
гриба Coriolus pubescezzs B виде суспензии, вновь тщательно пе-
ремешивают и выращивают при температуре 24—26 °С. Через
семь дней полученный продукт высушивают, измельчают и ис-
пользуют как концентрированную добавку к кормам животных.
B продукте, выход которого составляет 90% массы исходного
9* 131
абсолютно сухого сырья, содержится 12% белка. Он не токси-
‘ten, хорошо усваивается животными и стимулирует некоторые
биологические процессы, например повышает привес кроликов.
Сообщается о разработке полупромышленной технологии и
аппаратуры для глубинного и поверхностного выращивания
культур дереворазрушающих базидпомицетов. На Киришском
биохимическом заводе создана опытно-промышленная установка
для получения растительно-бегтковой кормовой добавки. Выход
продукта достигает в среднем 88% массы исходного сырья. Со-
держание белка в продукте, погтученном на опилках осины, до-
стигает 7‚5°/0, на соломе — 10,0% (Копытова и др., 1983).
Известен способ получения корма из хвои, предусматриваю-
щий последовательную экстракцию ее водой и органическими
растворителями, пропаривание с дальнейшим выращиванием на
экстрагированием осадке мицелиального гриба Рагшэ figrinus.
Содержание протеина в хвое, подвергнутой твердофазной фер-
ментации, достигает 11%, ее переваримость увеличивается на
16—66°/о. Суммарный экономический эффект от внедрения спо-
соба составляет 100—150 руб/т перерабатываемого сырья. Кроме
того, способ позволяет более полно использовать в народном
хозяйстве древесную зелень (Капич и др‚, 1984).
Широкораспространенными отходами Промышленности яв-
ляются разнообразные жмыхи, остающиеся от переработки рас-
тительного сырья. Это жмыхи плодов, картофельные, кукуруз-
ные и соевые жмыхи, свекловичный жом и др. Основными угле-
водными компонентами их являются клетчатка и пектиновые
вещества. Применение макромицетов и метода твердофазной
ферментации позволяет превратить эти отходы в пенные кормо-
вые или Пищевые продукты.
Исследования Капича и сотр_ (1984) показали, что некоторые
дереворазрушающие базидиальные грибы способны в 2—3 раза
обогащать белком картофельную мезгу и свекловичный жом.
Развитие этих грибов может происходить в слое субстрата высо-
той до 20 см без перемешивания и дополнительной аэрации. По-
видимому, для биотрансформации этих более доступных суб-
стратов дереворазрушающими базидиомицетами кислород
нужен в значительно меньших количествах, чем для биодеграда-
ции лигноцеллгюлозы. Используя твердофазную ферментацию
растительного сырья, можно получать комплексные кормовые
добавки, биоорганические удобрения (Межиня и др., 1982;
Алексеева и др., 1986).
Говоря о твердофазной ферментации, следует указать на ряд
присущих ей особенностей:
—— относительную простоту среды, ибо возможна утилизация
широкого круга субстратов;
—— ферментационное оборудование не требует много места;
—~ аэрация легко достижима, поскольку имеются капилляры
между частицами субстрата;
132
— ниже по сравнению с глубинным способом потребление
энергии;
— вследствие относительной сухости субстрата заметно
уменьшается возможность инфицирования посторонней микро-
флорой.
Вместе с тем в мировой практике до настоящего времени не
найдено технического решения культивирования микроорганиз-
мов механизированным поверхностным способом, хотя первые
установки в виде вращающихся барабанов для выращивания
микрогрибов на твердых субстратах были разработаны еще в
30-х годах в США. Позже для этих целей стали применять фер-
ментеры типа бродильных чанов.
Существовал и метод выращивания микрогрибов на лотках
(древняя технология «кодзи>>). Первая механизированная техно-
логия этого типа для получения ферментов была создана в сере-
дине 40-х годов. В конце 50-х сконструированы Инкубационные
камеры, в которых осуществляли автоматическую инокуляцию
твердых субстратов‚ контроль за условиями культивирования,
переворачивание субстрата и сбор конечного продукта Такие
автоматические Инкубационные камеры трех видов применяются
до сих пор на многих заводах Японии.
Одной из современных конструкций для твердофазното вы-
ращивания грибов является механизированная растительная
установка фирмы <<VaIersteI'n>> (США). Установка представляет
собой горизонтальный барабан диаметром 2100 мм и длиной
5200 мм. В барабан загружают 2000 кг засеянной стерильной
питательной среды. Культивирование проводят при частоте вра-
Щения барабана 1 мин” в аэробных условиях. Высота слоя вы-
ращивания 200 мм и более. Известны попытки использовать для
выращивания грибов серийные сушилки различных типов (на-
пример, ВИС-42-Д СПК).
Все описанные установки копируют в известной мере процесс
выращивания грибов в лотках по традиционной схеме. Не-
смотря на элементы Механизации, эти установки не лишены не-
достатков. Главные из них —— низкая производительность при
Достаточно высокой металлоемкости и значительных рабочих
площадях, занятых технологическим оборудованием, низкий
уровень механизации и автоматизации основных операций (um.
по Новикову и др.‚ 1985).
Предстоит решить ряд проблем, прежде чем твердофазная
ферментация будет внедрена в промышленность (регулирование
температуры, применение контрольных приборов для измерения
Влажности и других важнейших показателей процесса, соответ-
ствуюЩая подготовка субстрата и др.).
Одна из главных задач исследователей, занимающихся
твердофазным культивированием, ~— выяснение причин, лимити-
РУЮЩИХ рост микроорганизмов —- продуцентов белка. Высказы-
вается мнение, что основным лимитирующим фактором является
133
газообмен в ферментируемой массе. На примере гриба Pha-
neroclzaete chrysosporium показано, что частичное лимитирова-
ние по кислороду обусловливает низкую степень деградации
лигнина. В проЦессе твердофазной ферментации в аппаратах
большого объема активная деструкция лигноцеллюлозного
комплекса и обогащение белком наблюдаются в пристеночном
и поверхностном слоях, но не в глубине слоя. Дополнительная
аэрация обеспечивает активный рост мицелия в местах контакта
с подаваемым воздухом, в результате чего здесь образовывается
плотная мицелиальная плеика.
Однако рост мицелия в толще субстрата распределяется не-
равномерно в связи с неравномерностью распределения воздуха
в субстрате. Механическое перемешивание тормозит рост мице-
лия и деградацию субстрата. Считается, что наиболее перспек-
тивным вариантом твердофазной ферментации грубого расти-
тельного сырья является равномерно аэрируемая перемешивае-
мая масса субстрата (Черменский и др., 1983).
B лабораторных и полупроизводственных экспериментах изу-
чалось влияние на процесс твердофазной ферментации соломы
дереворазрушаюшими базидиомицетами белой гнили Aborfz‘po—
rus biemzis, Pleurotus ostreatus, Garzoderma appla/zatum И других
факторов — влажности, температуры и продолжительности
культивирования. Лучшие результаты бьтлтт получены при до-
бавлении воды в среду из расчета 75 мл на 25 гсубстрата. Вместе
с тем большинство испытанных грибов могло активно раз-
виваться на соломе при колебаниях влажности в широких
пределах (от 50 до 125 мл воды на 25 г субстрата). Влияние коли-
чества воды в субстрате на процесс ферментации носит опосре-
дованный характер. С увеличением содержания воды уменьша-
ется объем газовой фазы в субстрате и, таким образом, затруд-
няется газообмен, Важное значение имеет также геометрия
субстрата (размер частиц, размер пор между частицами суб-
страта и их распределение).
Продолжительность культивирования свыше 60 сут и темпе-
ратура более 22 °С приводят к снижению переваримости конеч-
ного продукта, при этом гриб Ganoderma applarzatum образует
продукт, переваримость которого ниже, чем у необработанной
грибами соломы. Авторы отмечают, что переваримость продукта,
полученного в полупроизводственных условиях, находится на
более низком уровне, чем в лабораторных, так как невозможно
обеспечить гомогенное развитие культуры, Переваримость соло-
мы при ферментации ее грибом Abortiporus bie/mis B лабора-
торных условиях возрастает на 25%, в то время как в полупроиз-
водственных — всего на 9%. В связи с этим указывается на
необходимость проведения детальных производственных испыта-
ний, прежде чем разработка будет внедрена в промышленном
масштабе (цит. по Капичу и др., 1984).
Более важным фактором твердофазной ферментации явля-
134
ется влажность среды (Бекер, 1984; Kahlon, 1985). Количество
влаги в среде должно быть достаточным для обеспечения роста
микроорганизмов. От влажности зависит осмотическое давление,
подходящее для того или иного процесса, а также условия
переноса кислорода к среде ферментации и внутри нее.
Сравнение технико-экономических показателей производства
белковых продуктов на основе целлюлозосодержащих отходов
при твердофазном и глубинном способах культивирования вы-
явило преимущества твердофазного способа. Себестоимость
продукта, полученного на основе поверхностных культур, в 1,5—
3,0 раза ниже (Складнев, 1982; Zadrazil, Реега11у, 1986; Abdul-
lah ей а1.‚ 1985). Мнение дРУгих исследователей (Viesturs е’: а1.‚
1985) иное: сравнивая способы прямого культивирования микро-
организмов на растительных отходах, они считают, что твердо-
фазная ферментация не имеет существенных преимуществ пе-
ред глубинной.
По мнению Головлева и Скрябина (1984), твердофазная фер-
ментация как метод улучшения питательных качеств грубых
растительных кормов может стать основой создания технологии
производства кормовых продуктов совхозного и межсовхозного
уровня.
Итак, несмотря На столь широкий интерес исследователей к
проблеме биотрансформации „тигноцеллюлозньтх субстратов,
она далека от решения. На сегодняшний день известны только
работы, касающиеся дрожжевания и силосования растительных
субстратов_ Технология же биоконверсии целлюлозосодержащих
отходов путем глубинного либо твердофазного выращивания
мицелиальных грибов не Внедрена в широких масштабах в усло-
виях производства. Не разработан до сих пор и более экономич-
ный процесс непрерывной ферментации лигноцеллюлоз.
Проблема биоконверсии растительного сырья требует также
решения следующих вопросов:
— поиска культур микроорганизмов с повышенной физиоло-
гической активностью;
— конструирования супермутантов целлюлаз и гемицеллюлаз
для прямой биоконверсии полисахаридов растений;
— получения и конструирования микроорганизмов, активных
в деструкции лигнина и интермедиатов его разложения (Огарков
и др.‚ 1985);
— повышения концентрации субстрата и массообмена в
ферментерах;
— проблемы предварительной обработки субстрата (механи-
ческое измельчение, щелочная, кислотная обработка, радиолиз
И дн);
— проведения серьезных биологических и зоотехнических
испытаний продуктов микробного синтеза (на канцерогенность,
тератогенность, мутагенность);
— экономической оценки целесообразности производства
135
микробной биомассы в сравнении с традиционными белковыми
продуктами.
Предполагается, что в период 1986—1996 гг. в мире в про-
мышленном масштабе будут реализованы такие процессы, как
ферментативное получение из целлюлозосодержащих материа-
лов глюкозы с последующим превращением ее в фрукто3у‚ эта-
нол, этилен, жидкое топливо, Медицинские препараты и т. д.
Соответствующих промышленных или опытно-промышленных
технологий в мире нет. Эта задача может быть решена путем
поиска целлюлаз в природе с помощью «молекулярного скри-
пинта», создания целлтолаз с заданными свойствами методами
генетической или белковой инженерии, разработки оригинально-
го аппарата для ферментативного гидролиза, способного в 5-
10 раз увеличить скорость и степень конверсии целлюлозы в
глюкозу (Клесов, 1987). K 1990—2000 гг. возможно осуществле-
ние процесса деструкции растительной биомассы с целью повы-
шения ее питательной цениости для сельскохозяйственных жи-
вотных (в первую очередь для крупного рогатого скота).
Эффективность реализации этих технологических процессов
будет в решающей степени зависеть от фундаментальных иссле-
дований в области ферментативной конверсии растительных ма-
териалов (цит. по Виестуру и др., 1985),
Глава 6
БИОТЕХНОЛОГИЯ БЕЛКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ КОРМОВЫХ ЦЕЛЕЙ
Субстраты и продуценты, используемые для получения
белково-углеводных продуктов
Солома. Основным питательным веществом, входящим в
состав соломы, является клетчатка (26~—45°/0). B состав соломы
входят БЭВ: сахар, крахмал, гемицеллюлозы, пектиновые ве-
щества‚ пигменты, смолы, танины, органические кислоты. На их
долю приходится 27——43% массы соломы. Среди них могут
оказаться также вещества из группы сырой клетчатки: целлю-
лозы, пентозаны, лигнин, способные частично растворяться в
ходе определения (табл. 4, 5).
Солома характеризуется невысоким (3——8%) содержанием
протеина, бедна жиром (0,5—1,5%). Количество минеральных
элементов колеблется от 4 до 12%. Среди них преобладает окись
кремния. Такие же основные Макроэлементы, как Са, Р, Na И
другие, содержатся в небольших количествах. Практически от-
сутствуют в соломе и витамины. Невелик (около 10%) уровень
питателтьных веществ, растворяющихся в воде, слабой соляной
кислоте. Незначительная растворимость питательных ‘веществ,
инкрустация целлюлозът и гемнцеллюлоз лигнином обусловлива-
ют низкую переваримость органического вещества соломы жвач-
ными. Содержание растворимых углеводов крайне мало (0,5——
0,80/0).
KOpMOBy}O ценность соломы снижает целлюлоза, на долю ко-
торой приходится до 50% сухого вещества. Одним из неотъем-
лемых компонентов клеточной стенки соломы, как и других рас-
тений, являются гемицеллюлозы. Основные компоненты геми-
целлюлоз —— ксиланы, уроновые кислоты, маннаны, арабогалак-
таны.
Как компонент растительной стенки одновременно с целлю-
лозой присутствует лигнин. В естественных условиях лигнин как
таковой не существует, он структурно связан с полисахаридами,
окутывает целлюлозные микрофибриллы и проникает между
кристаллическими мицеллами. Вопрос о природе лигнополисаха-
ридного комплекса не ясен. хотя предполагается наличие в нем
химической связи.
ВСЕ ВИДЫ СОЛОМЫ ВСЛЕДСТВИЕ НИЗКОЙ ПЕРЕВЗРИМОСТИ ИМЕЮТ И
НИЗКУЮ ПНТЗТЕЛЬНОСТЬ.
Льняная костра. Древесная часть льняного стебля. Составля-
ет (Ь0—70% органической массы растения.
Несмотря на то что исследования химического состава стебля
и волокна льна были начаты еще в 30-е годы, уровень наших
137
Таблица 4. Химический состав соломы (Авров, Мороз, 1979), %
С - й - С
Солома КЁЁЁОЁЁ: Q/:06 OI})(I0aeH1;3I:?C r§>bcI>I;:- gtfigefifagfl K:"1l§’lE3-fl БЭВ Зола
ЩЕСТВО ЩЕСТВО ИН ТВИН ЧЗТКЗ
Пшеничная
озимая 0,20 84,6 78,2 3,7 0,5 36,4 36,8 6,4
Яровая 0,22 84,9 79,0 4,6 0,9 35,1 36,8 5,9
Ржаная
озимая 0,22 85,0 80,7 3,1 0,5 39,8 35,3 4,3
яровая 0,25 84,9 80,1 3,8 0,9 37 4 37 2 4,8
Таблица 5. Аминокислотный состав белка соломы, г/100 г субстрата
Аминокислота I Содержанне Аминокислота I Содержание
Лидин 0,05 Глицин 0, 1 1
Гистидин ч Аланин О, 25
Аргинин 0 , 59 Цистин 0, 29
Аспарагиновая 0, 10 Валин 0,59
Треонин 0,04 Метионин 0,05
Серин 0,06 Изолейцин 0,02
Глутаминовая 0, 27 Лейцин 0, 13
Пролин 0, 12 Тирозин —
Фенилаланин —
Всего
2 ,7 6
Т а б л и ц а 6. Качественная характеристика костры (Александров и др.‚ 1982)
Показатель % ��M� Показатель %
Влага 9,06 Пентозаны 25,35
Смолы и воска 4,84 Уроновые кислоты 5,37
Азот 1 ‚ 25 Полисахариды
Зола 1 ‚96 легкогидролизуемые 19,08
Целлюлоза 33, 85 трудногидролизуемые 34, 40
Лигнин 32,80 I
знаний далек от требований Практики. Данные о составе льня-
ныдх материалов разрозненны и противоречивы (табл. 6, 7).
Общим для соломы и льняной костры является высокое со-
держание в них лигнина и трудногидролизуемых полисахари-
дов.
продуценты. Использовали Микро- И макромицеты (свыше
500 культур), полученные из музеев чистых культур Института
микробиологии АН БССР, Института ботаники им. Н. Г. Холод-
пого АН УССР, Ботанического института им. В. Л. Комарова
АН СССР, Белорусского технологического института им, С. М.
138
Кирова. Часть культур макромицетов выделена из природных
источников п плодовых тел грибов, идентификация которых про-
водилась в лаборатории низших растений Института экперимен›
тальной ботаники им. В. Ф. Купревича АН БССР. В результате
Широкого скрининга отобраны следующие продуценты: Penicil-
T абли ца 7. Аминокислотный состав белка древесной части
льняного стебля, г/100 г субстрата
Аминокислота 1 Содержание Ч Аминокислота Содержание
Лизин 0, 1 1 Глицин 0,08
Гистидин 0, 03 Аланин 0 , 07
Аргинин 0, 03 Цистин —
Аспарагиновая 0, 12 Валин 0, 08
Треонин 0,07 Метионин 0, 01
Серин 0,08 Изолейцин 0, 05
Глутаминовая 0,20 Лейцин 0,08
Пролин 0,74 Тирозин 0,05
Фенилаланин 0 , 07
Всего 1 ,87
T аб л ица 8 Состав биомассы мицелиальных грибов, %
U „ с U
Нродуцент * ! IS 531%}; и C23?“ Зол а к .Ir’I1§'1-a-H ИЁЁЁЁЁЫ“ 5:02:33 ��n�
чатка Ка
Perziczllzum verruculo— 116,0—50,0 3,7 5,3 8,1 43,0—45,0 70,7
sum
Aspergzllus carbor2a- 41,0——48,0 5,6 4,4 7,6 36‚0—41,0 82,0
rium
Altemarta tenms 35,0—4-4,0 5,7 6,5 7,6 30,0—39,0 75,1
Tyromyces lacteus 35,0~40,0 5,0 6,4 10,7 30‚0—35,0 69,0
Coriolus Uersicolor 35,7~——40,0 3,8 6,7 9,0 32,0—36‚0 70,0
С. hfrsutus 36,0——45,0 3,4 5,3 6,5 29‚0—38,0 71,0
" Грибы выращены на глюкозо-пептснной среде и среде Чапека
Т аблица 9. Аминокислотный состав белка биомассы мицелиальных
грибов, г/100 г белка
0�r� “вага 11515,”:-i‘fru,;::z’:;§:iz;5’*’::,:::g"" ms: 5:22:75, T1;:';:z:“
Си osum
Лизин 4,2 6,3 6,1 5,3 4,2 2,5 3,7
Треонин 2,8 5,8 5,9 5,5 8,1 7,4 8,4
Валин 4,2 3,8 4,8 4,9 4,5 5,3 4,5
Метионин 2,2 1,6 1,1 2,0 1,3 1,6 1,4
Изолейцин 4,2 4,0 3,8 4,1 3,3 3,4 3,7
Лейцин 4,8 7,6 6,6 6,0 5,8 6,1 6,9
Тирозин 2,8 3,7 5,4 5,4 2,1 1,1 1,6
Фенилаланин 2,8 16,8 3,7 4,0 5,4 6,0 6,9
Цистин 2,0 1,1 0,6 1,0 0,8 0,9 1,0
139
Таблица 10. Жирнокислотный состав липидов биомассы, %
. ‚у и ‚ _ _ .
!M� ’1€£i:‘céiJ”:::*;;;%:£::: ’“::;:‘;;*“ ‚нага: Szrszéif ��g�
sum [or
Тридекановая (С1з.о) 0,19 — — — — —
Миристиновая (C14:o) 1,72 Следы Следы 0,32 0,54 —
Миристоленновая 0,48 0,42 » 0,86 1 ‚44 1 ‚00
(С14:1)
Пентадекановая 0,48 т -_ — W. —. „.
(C15 о)
Пальмнтиновая 21,62 17,98 21,27 21,36 24,52 21,96 ‘"
(C16:0)
ИЗОПЗЛЬМНТИНОВЗЯ 0,43 — —— — —— -
(Сито)
Ёёзльмитолеиновая 0, 56 6, 98 5 , 29 8, 09 5,95 6,22
16‘!
маргариновая (С17 о) 0,65 Следы Следы —— Следы 0,86
Стеариновая (C1s:o) 3,06 1,69 1,62 —— 2,27 2,68
OJIeHHOBa71(C181) 34,63 26,98 11,16 12,41 10,36 4,22
Линолевая (С18‚2) 34,93 43,23 56,88 56,96 53,73 63,06
Линоленовая (С18,з) 0,48 2,72 3,78 — 1,19 —
Арахиновая (С2о‚о) 0,77 —— — — -— —
Ненасыщенные 71,08 80,33 77,11 72,32 72,67 74,50
Насыщенные 28,92 19, 67 22,89 21 ‚68 27 ,33 25 ‚50
lium verruculosum, Aspergillus carbonarius, Alternaria texmis,
Coriolus /21'rsutus, Coriolus versicolor, Tyromyces lacteus. B табл.
8——10 приведен состав биомассы, полученной при выращивании
отобранных продуцентов на синтетических средах. Удельная
скорость роста грибов (p1)=0,08—0,15. Биомасса содержит до
45% истинного белка, 3,7——5,7% жира, в составе которого пре-
обладают непредельные жирные кислоты. Характерная особен-
ность мицелиальных грибов —— высокое содержание (35—63%)
B общей фракции липидов линолевой кислоты.
Получение 6елково—углеводных добавок на основе
биоконверсии соломы злаковых
Глубинная ферментация. Оценка мицелиальньтх грибов по
скорости накопления биомассы, содержанию в ней протеина и
стеьсни деструкции соломы позволила отобрать наиболее пер-
спективные продуценты. Ими оказались грибы родов Penicillium,
Chaetomium, Triclzoderma, Aspergillus. B связи с тем что про—
дукты ферментации рекомендуется использовать в сельском
хозяйстве, важнейшим критерием при выборе продуцента яви-
лись результаты токсикологических испытании культур и био-
массы мицелиальных грибов. За основу при изучении процессов
биоконверсии соломы был взят гриб Penicilltum verruculosum
(Бабицкая и др.‚ 1981; Lobanok et а1.‚ 1983, 1985).
Для исследования брали солому (размеры частиц 6——10 мм),
140
предварительно делигнифицированную 1°/о-ным раствором
NaOH. Как известно, щелочная обработка соломы сопровожда-
ется частичным растворением гемицеллюлоз и лигнина, что
приводит к уменьшению исходной массы субстрата. Такие поте-
ри затрудняют решение проблемы полной утилизации отходов
сельского хозяйства. В наших опытах потери массы субстрата
достигали 20—25 %.
Bo избежание таких потерь была разработана технология,
которая включает частичную Делигнификацию измельченной
соломы 1%—ным раствором щелочи при модуле 1: 10, приготов-
ление на основе полученной суспензии (после нейтрализации)
питательной среды, выращивание гриба, отделение биомассы,
сушку конечного продукта. Параметры культивирования: исход-
ный рН среды —— 5,0——7,0, температура — 28—30 °С, аэрация-
0,5 л/л среды в 1 мин.
При периодическом росте Penicillium verruculosum на соломе
лаг-фаза продолжалась 8——9 ч. В экспоненциальной фазе на-
блюдалась прямолинейная зависимость логарифмов концентра-
ции биомассы от времени культивирования. Максимальная
удельная скорость роста культуры достигала 0,12 ч“. Экспо-
ненциальный рост длился 8—10 ч, концентрация биомассы в
конце фазы составляла 4,0——4,2 г/л. Наибольший суммарный
прирост биомассы зарегистрирован в фазе замедления роста.
Стационарная фаза роста Penicillium verruculosum наступала
через 40 ч. Максимальная концентрация истинной биомассы к
этому времени равнялась 7,3 г/л, количество белка — 22%, ИЛИ
2,1 г/л, Продуктивность по истинной биомассе составила 0,18,
по белку — 0,04——0‚05 г/(л-ч).
Выращивание микроорганизмов на гетерогенных средах свя-
зано с рядом трудностей, особенно при определении истинного
урожая мицелия. Мы воспользовались известным методом (Wil-
libaldo, Масгыь, 1976), согласно которому существует линейная
зависимость между концентрацией микроорганизмов (Х, г сухо-
го вещества в 1 л культуральной среды) и концентрацией белка
(Р, г клеточного белка в 1 л культуральной среды). Такая про-
пориионагтьность была показана для культуры Aspergillus rziger
NRRU 337, Величина константы пропорциональности (отноше-
ние между концентрацией биомассы H белка) определялась в
конце культивирования, когда твердый субстрат практически
утилтизироватг.
Для примера приведем один из расчетов. Урожай биомассы-
6‚4 г/л, содержание истинного белка —— 21,9%. B 100 г биомассы
содержится 21,9 г белка, а в 6,4 г биомассы —— P. Таким образом,
содержание клеточного белка (Р) в 1 л культуральной среды
равно 1,4 г.
Из табл. 11 следует, что начиная с 72 ч концентрация белка
в 1 л культуральной жидкости, а также урожай биомассы отно-
сительно постоянны, В биомассе гриба этого возраста практиче-
141
ски отсутствовал субстрат. Константа Х/Р изменялась в преде-
лах З‚9——4‚5. Так как начиная с 81-го часа роста гриба данные
более стабильны, принимали константу, равной 4,0. Истинные
значения урожая биомассы рассчитывали по формуле X“:
=P- 4,0 г/л.
В соломе имеется 2,0—2,8% белка. Среда содержит 1%, или
10 г, субстрата. Значит, в Питательную среду вместе с субстра-
том вносится 0,20—0,28 I‘/JI белка. Эту величину следует вычи-
Таблица 11. Концентрация клеточного белка и истинная
биомасса гриба Penicillium verruculosum B среде с соломой, г/л
Время, ч Kg§',$,::T(p1§')'{"H Биомасса (X) Ko7(g);'¢;y1>l§HeHT I/1~IaCaxTcy:[::xH7‘§{:;IO-
3 0,02 8,0 — 0,08
12 0,35 8,2 —— 1,40
24 0,48 9,0 ~— 1,92
36 0,84 9,0 —— 3,36
48 0,77 8,0 ~— 3,08
60 0,99 7,8 —— 3,96
63 1,38 7,4 ——- 5,60
73 1,40 6,4 4,5 5,60
75 1,40 6,6 4,7 6,60
78 1,70 6,6 3,9 6,80
81 1,50 6,0 4,0 6,00
84 1,50 6,0 4,0 6,00
87 1,30 5,2 4,0 5.20
96 1,50 6,0 4,0 6,00
тать при определении концентрации белка в средах. При внесе-
нии большого количества твердого субстрата (когда он утилизи-
руется частично) расчет содержания мицелия в общеи биомассе
(мицелий гриба+ неусвоенный субстрат) можно проводить по
формуле
т (GPm — ОР5)
GPa — ОРЗ
где а — масса мицелия, г; т —— масса общей биомассы, г; GPm,
ОРЗ, GPa — соответственно количество белка в биомассе, соломе
и мицелии, %.
Безусловно, предполагаемые методы не лишены недостатков,
обладают большой погрешностью, тем не менее они могут при-
меняться при изучении кинетики роста любых мицелиальных
культур на твердых субстратах. Разработанная технология куль-
тивирования Penicillium verruculosum B среде с соломой апро-
бирована в производственных условиях. Культивирование осу-
ществлялось в ферментере объемом 16 м3.
Получен белково-углеводный препарат (грибдгнеутилизиро-
ванный субстрат), названный нами веррукулин. Продукт содер-
142
жал 28% протеина, 20% истинного белка, 1,21% нуклеиновых
кислот (1,14°/о РНК и 0,18% ДНК), 8,2% золы. Сырая клетчат-
ка в биомассе составляла 30%, ЛНГНИН — 13,0, жир —— 4,9%.
Количество белка за счет микробной конверсии соломы воз-
росло в 3,5 раза. Частичная делигнификация соломы и 30-часо-
вой глубинный рост культуры Penicillium verruculosum способ-
ствовали не только обогащению субстрата белком, но и умень-
шен11Ю в нем целлюлозы и лигнина, Качественный состав белка
улучшился за счет лизина, метионина, серина, пролина, глицина
и других аминокислот. Переваримость белка 61%.
B НЗТИВНОЙ соломе практически отсутствуют витамины.
Обогащенная за счет выращивания гриба солома содержала
рибофлавин, никотиновую кислоту, смесь линолевой и линолено-
вой жирных кислот в составе витамина F. Жира в биомассе было
в 3,8 раза больше, чем в соломе, а отношение ненасыщенных
жирных кислот к насыщенным равнялось 1,47.
Обогащение соломы протеином, жирами и витаминами,
снижение сырой клетчатки при одновременном уменьшении бал-
ластного лигнина способствовали улучшению усвоения ее в орга-
низме животных, более полноценному их белковому питанию, что
подтверждено испытаниями препарата на животных.
Несмотря иа хороший состав и высокую биологическую цен-
ность продукта, способ его получения не лишен недостатков.
Процесс обработки субстрата гидроокисью натрия с последую-
щей нейтрализацией кислотой сложен, особенно при осуществ-
лении его в производственных условиях. Кроме того, концентра-
ция субстрата в питательной среде не превышает 1,0—1,5%.
Для повышения производительности процесса мы исследова-
ли биотрансформацию соломы при повышенной концентрации
субстрата, а также влияние различных способов предваритель-
ной обработки соломы на образование углеводов и накопление
белка. При культивировании гриба в ферментерах мы выбрали
концентрацию соломы 3 и 5%. Следует, однако, отметить, что
уровень редуцирующих веществ в среде с соломой грубого по-
мола (размер частиц 6—10 мм) был довольно низким. Повыше-
ние концентрации субстрата ухудшало аэрацию и значительно
(с 30/36 до 70 ч) удлиняло сроки культивирования.
Аналогичные результаты получены и другими исследователя-
ми (Зелтиня и др.‚ 1985), которые также считают, что повыше-
ние концентрации субстрата является возможным решением
проблемы низкой продуктивности процессов глубинной фермен-
тации. Удлинение же сроков культивирования связано, по их
мнению, с существенным повышением вязкости культуральной
жидкости, что приводит к падению интенсивности процессов
массопередачн. В наших условиях повышение концентрации
субстрата оказалось экономически выгодным при использовании
соломы более мелкого помола. Это значительно усилило массо-
обмен, аэрацию среды и сократило сроки получения продукта.
143
Изучение влияния степени измельчения соломы на обогаще-
ние ее протеином позволило установить, что при размере частиц
соломы до 1 см протеин в биомассе составляет 8—-10%‚ а при
размере частиц 0,05—0,2 смь- 12——15°/о. Значительно Повыша-
ется в среде и содержание редуиирующих веществ, что сокраща-
ет сроки культивирования гриба —— продуцента белка при вь1-
ращивании его в колбах на качалке до 48-—60 ч, при выращива-
нии в ферментерах —— до 30——40 ч. В дальнейших испытаниях
Таблица 12. Влияние предварительной обработки соломы
на углеводный состав среды, мг/100 мл
Способ обработки
Углеводы ‘
B�� 1%-иый NaOH 0.3 Mrp
Рнбоза 0,83 0,90 Следы
Кснлоза Следы 0, 30 0, 66
Арабиноза ›> Следы Следы
Фруктоза 0,27 0,17 0,21
Галактоза Следы 0, 68 2 , 80
Глюкоза 5,80 0,58 21,50
Сахароза 0 , 24 2, 08 Следы
Целлобноза 0 ‚ 19 0, 81 »
Всего 7,33 5,52 25,07
использовалась солома с размером частиц не более 1 мм при ее
концентрации в среде 3%.
При глубинном культивировании в среде с 3% субстрата
наибольшей способностью к биотрансформации соломы в белок
кроме Pem'cL'llz’Lm1 verruculosum обладали микроминеты Р. p[sca—
rizzm, P. lanosum, Р. funiculosum, a из базидиомицетов —— Сита-
codon septentrionalis, Schizophyllurzz commune, Tyromyces lacteus.
Продукты, полученные при выращивании лучших продуцентов
на измельченной нативной соломе (при дополнительном внесе-
нии 0‚5°/о кукурузной или ржаной муки), содержали 17‚0——18‚0°/0
протеина и 13,0——14,5% истинного белка (Стахеев и др, 1985).
С целью усовершенствования способа предобработки суб-
страта (исключения щелочного или кислотного гидролиза) сов-
местно с НИИ физико-химических проблем Белгосуниверситета и
ЦНИИ МЭСХ изучено влияние некоторых режимов радиацион-
ной обработки. Поглощенные дозы ускоренных электронов 0‚10—
1,54 МГр. Выяснилось, что оптимальной дозой для модификации
соломы является интегральная доза 0,3 МГр.
От способа предварительной обработки субстрата зависел
количественный и качественный выход сахаров (табл. 12). Об-
щее содержание углеводов в среде с нативной и обработанной
щелочью соломой составляло 7,3 и 5,5 мг/100 мл, в то время как
на радиационно-модифицированной —— 25,1 M1‘/MJ1. Сравнительно
144
Т а б л и ц а 13. Влияние способа обработки соломы на
показатели ферментации
Выход Выход общего
Длительность
Способ обработки культивирования, Продукта белка
ч
г/г субстрата
Нативная солома 48 0,73 0,11
1%-ный паон 36 0,70 0,15
0,3 МГр 24 0,90 0,14
Таблица 14. Состав биомассы (средние показатели) гриба
Penicillium verruculosum, 03
Способ обработки ПЁЁЁЁЁ, Сырой жир Зола Кдёёцрааёда БЭВ ”°g§',‘,‘f,‘,‘Z""' He}:/:)1:;:EH‘
елка
1%-ный NaOH 25,0 2,2 6,2 27,5 39,1 16,7 60,2
0,3 МГр 20,8 2,5 3,8 26,0 46,9 14,5 64,6
Синтетическая 46,8 3,7 5,3 8,1 36,1 43,0 70,7
среда Чапека
невысокое содержание моносахаридов в среде с делигнифициро-
ванной соломой связано, очевидно, с тем, что при нагревании
углеводов с разбавленными щелочами происходит разрыв их
углеродной цепи с образованием большого числа разнообразных
продуктов, в том числе молочной и муравьиной кислот, а также
других продуктов с трехуглеродной цепью. Часть же моно- и
дисахаридов, вступая во взаимодействие с гидроокисью натрия,
образует сахариды, Таким образом, максимальное накопление
углеводов в легкодоступной для микроорганизмов форме обес-
печивала обработка целлюлозосодержашего субстрата ускорен-
ными электронами.
Более богатый в количественном и качественном отношении
углеводный состав питательной среды с радиационно-модифици-
рованной соломой, а также большая доступность субстрата фер-
ментативному гидролизу обеспечивали сокращение сроков куль-
тивирования гриба. Накопление продукта при выращивании
РетсЦЦи/п vurruculosum на необработанной соломе заканчива-
лось к 48——60 ч культивирования. На соломе, обработанной
щелочью, культура росла интенсивнее: продолжительность фер-
ментации сокращалась до 36—48 ч. При использовании радиа-
ционно-модифицированной соломы длительность культивирова-
ния уменьшалась до 24-36 ч (табл. 13). Получен наибольший
выход белково-углеводного продукта. Однако выход общего бел-
ка и на дслигнифицированной и на облученной соломе был
практически одинаков и превышал контроль (необработанная
солома) в 1,3 раза.
Обработка субстрата ускоренными электронами способство-
10. Зак. 906 145
вала сокращению продолжительности ферментационного про-
цесса, не вызывая ухудшения качественного состава конечного
продукта (табл. 14). Аминокислотный состав белков препара-
тов, полученных при выращивании Pem'cilliLm1 verruculosum B
среде с частично делигннфицированной и радиационно-модифи-
цированной соломой, был идентичен. Сумма незаменимых ами-
нокислот белка составляла 43,9 (деструкция соломы уск0реннь1-
ми электронами) и 46,4% (деструкция гидроокисью натрия), на
необработанной соломе — 38,6°/о.
Способ предобработки субстрата не оказывал существенного
влияния и на количество интрацеллюлярных липидов. При выра-
щивании Penicillimn U€I'rL£CL£l0Sm71 на нативной соломе содержа-
ние липидов в продукте равнялось 2‚3°/о‚ на обработанной
щелочью —— 2,2, ускоренными электронами — 2,5°/о. Особых изме-
нений в составе внутриклеточного жира в зависимости от спосо-
ба обработки субстрата также не наблюдалось. В ферментиро-
ваином грибом субстрате идентифицировано 18 кислот, в том
числе 57,5—64,2% ненасыщенных. Наибольший процент от сум-
мы жирных кислот приходился на ненасыщенные олеиновую
(Cm) и линолевую (Сдш) кислоты, из насыщенных — на паль-
митиновую (CW0). Отношение суммы ненасыщенных жирных
кислот к сумме насыщенных находилось в пределах 1,4——1,8
(Стахеев и др.‚ 1985).
Проведенные исследования позволяют сделать вывод, что
обработка целлюлозосодержащих субстратов, в частности соло-
мы, ускоренными электронами аналогична по конечному эффек-
ту (выходу общего белка) предобработке ее 1°/о-ным раствором
гидроокиси натрия. Деструкция целлюлозы под действием иони-
зирующих излучений способствует повышению почти в 5 раз
выхода общего количества углеводов по сравнению с деструкци-
ей под действием химического реагента и в 3,5 раза по сравне-
нию с нативной соломой. Это позволяет на 25—30% сократить
длительность процесса биоконверсии лигноцеллюлозы в белок.
На наш взгляд, замена кислотного либо щелочного гидролиза
лигноцеллюлозных субстратов радиационной деструкцией позво-
лит сделать процесс получения белково-углеводных концентра-
тов на основе растительного сырья более технологичным, сокра-
тить трудозатраты, расход химических реагентов и энергии.
Переход от лабораторной к опытно-промышленной техноло-
гии не может быть осуществлен без определения технологично-
сти штамма, т. с. без разработки стандартных условий культиви-
рования, обеспечивающих Максимальную Продуктивность куль-
туры. Перспективным вариантом технологии, осуществляющим
получение препарата с заданными свойствами при минимальных
затратах, является метод полу- и непрерывного культивирования,
который приобретает все ббльшую практическую ценность, так
как его применение в производстве позволяет получить гораздо
больший выход нужного продукта, лучше использовать оборудо-
I46
вание, полнее контролировать ход процесса по сравнению с пе-
риодическим выращиванием.
Представляло интерес сравнить данные периодической и по-
лунепрерывной ферментации гриба Penicillizmt uermculoszun на
делигнифицированной и радиолизованной соломе. Так как мак-
Симальная удельная скорость роста популяции при полунепре-
рывной ферментации не достигает максимума удельной скоро-
сти, отмечаемой при периодическом культивировании, процесс
начинали со скоростью разбавления 0,03 Ir‘, увеличивая ее до
0,1 ч“.
Периоды стабилизации процесса при периодическом и полу-
непрерывном культивировании различались в зависимости от
способа модификации субстрата: для делигнифицированной со-
ломы он составлял 12 ч, для радиолизованного субстрата удли-
нялся до 20 ч. При скорости разбавления 0‚03—0‚06 11-‘ кон-
центрации общего белка и редуцирующих веществ для обоих
субстратов после некоторых колебаний остались на прежнем
уровне, как и в периодическом процессе.
При более высокой скорости разбавления (0,08—~0,1 Ir‘)
гриб не полностью утилизировал редуцирующие вещества, по-
ступающие с питательной средой, и концентрация их резко воз-
растала. Одновременно снижался процент белка в продукте за
счет связи низкобелковых компонентов субстрата с грибной‘
биомассой, в конечном продукте увеличивалось содержание не-
утилизированного субстрата.
Для обоих способов обработки субстрата характерен наи-
больший выход белка при скорости разбавления О‚05—0‚06 Ir‘.
Расчетные данные свидетельствуют о преимуществе отъемно-
доливного способа ведения ферментации над периодическим.
Продуктивность по белку для делигнифицированнои соломы
возросла в 4,5 раза, для радиолизованной——в 4,4 раза.
Белково-углеводный препарат можно получать и в жидком
виде на основе измельченной нативной соломы. Культивиро-
вание ведется B стерильных условиях при аэрации 0,5 л воз-
духа на 1 л среды в минуту и перемешивании (150-200 об/мин).
Время культивирования 20-24 ч. По окончании процесса про-
дукт (суспензия грибного мицелия с остатками субстрата) из
ферментера перекачивается насосом в сборник и оттуда посту-
пает на скармливание животным.
Зоотехнические и токсикологические исследования кормового
продукта грибного происхождения, проведенные совместно с
Белорусским научио-исследовательским институтом экспери-
ментальной ветеринарии, показали:
—— скармливание препарата молодняку крупного рогатого
скота обеспечивает значительное увеличение среднесуточного
прироста при высокой переваримости всех компонентов рациона,
в том числе и клетчатки;
— продукт не изменяет состояние здоровья и не вызывает
10* I47
Таблиц а 15. Состав (средние показатели) ферментированной грибами
соломы (ТФФ), %
���� 93:2?“ c;;;;;;»:« зола 2512:? sea “:32? 32:52:;
теин Harm белок белка
Нативная солома 5,0 0,97 5,5 38,0 51,5 2,8 19,0
Солома с посевным — -— —- — —— 3,2 --
материалом
Panus figrinus 13,4 2,5 5,3 29,7 49,1 8,5 58,6
Tyromyces lacteus 15,0 3,3 6,1 27,6 48,0 9,0 57,5
Coriolus versicolor 15,7 2,9 5,8 28,0 47,6 8,2 57,0
Penicillium verruculosum 14,8 3,0 4,5 31,5 46,2 6,6 46,0
Р. notatmn 14,0 2,7 6,4 30,5 46,4 I 6,0 42,0
П р и м е ч а н и е. Здесь и далее в таблицах ТФФ — твердофазная фермен-
тация.
Таблица 16. Содержание незаменимых аминокислот
в белково-углеводных продуктах, %
Аминокислота Рекомендуемое} Полученное Pmicillmm Tyromyws Conic!“
no Билай и Др. (1981) шггисанозит ‘ lacieus verszcolor
Протеин 8,0—10,0 11,4—17,0 12,0—15,0 13,0——18‚0 13‚0—17›0
Лизин 0,45 0,00——0,80 0,33 0,40 0,46
Треонин 0,28 О, 10—0,2б 0,66 0,40 0,45
Валин 0,32 0,20——0,35 0,39 0,49 0,46
Метионин 0,22 0,13——0,20 0,22 0,11 0,09
Изолейцин 0,22 0,10—0,40 0,32 0,37 0,30
Лейцин 0,49 0,30—0,60 0,41 0,59 0,56
Фенилаланин 0 , 32 0 , 20-—0 , 26 0 ,39 0 ‚58 0 , 36
патоморфологических нарушений в органах и тканях, не upm-
водит к специфической микогенной сенсибилизации организма
животных, не оказывает отрицательного действия на органо-
лептические и физико-химические свойства мяса;
— количество препарата в суточном рационе животных
может составлять 10-15%.
Подводя итог вышеизложенному, следует рекомендовать по-
лучение кормовых белково-углеводных концентраторов из соло-
мы злаковых по трем схемам: получение жидкого и сухого
кормового продукта на основе нативной, делигнифицированной
(1о/о-ньтм NaOH) И радиолизованной (0‚2-—О‚3 МГр) соломы.
Твердофазная ферментация. Скрининг мицелиальных грибов
в условиях глубинного культивирования позволил отобрать наи-
более перспективные продуценты для твердофазной фермента-
ции. Из микромицетов ими оказались грибы родов Penicillium,
Trichoderma, C/uzetomiurn. Наибольшей продуцирующей способ-
ностью обладали грибы Penicillium verruculosum, Р. notanmz,
Chaetomium cellulolyticum, Ch. setosum. Хорошие результаты
были получены и при выращивании грибов рода Trichoderma,
148
однако обильное спороношение указанных микроорганизмов не
позволило использовать их при изучении условий биотрансфор-
мации соломы. Из макромицетов отобраны грибы Туготусе$
lacteus, Slcreum /iirsutum, Coriolus versicolor, PLZIILZS tigrirzus,
Сопоте lzirsutus.
B результате твердофазной ферментации соломы мицели-
альными грибами содержание сырого протеина в ней увеличи-
лось с 4——6 до 16‚0°/о, а количество клетчатки снизилось с 38
до 28% (табл. 15). Переваримость препарата in vitro варьиро-
вала в пределах 42—58%. При этом более высокая перевари-
мость и меньшее содержание целлюлозы отмечены в продук-
тах, полученных с использованием базидиомицетов (57,5—
58,6 против 42,0—46,0% y микромицетов),
Биологическая ценность белков-продуктов твердофазной
ферментации, определенная методом химического скора, свиде-
тельствует о том, что они лимитированы по сравнению со шка-
лой ФАО по серусодержащим аминокислотам, в то же время
количество других аминокислот превышает требуемый уровень,
что дает основание рекомендовать некоторые грибы в качестве
продуцентов для обогащения протеином растительных субстра-
тов. Содержание аминокислот в белках полученных нами бел-
КОВО-УГЛЁВОДНЫХ ПрОДуКТОВ согласуется С ЦЗННЫМН ДруГИХ
авторов (табл. 16).
Кроме аминокислотного состава белка биологическую цен-
ность биомассы микробного происхождения в значительной сте-
пени определяют липиды, в частности качественный и количе-
ственный состав их жирных кислот. Особый интерес к вопросу
о составе липидов мицелиальных грибов вполне обьясним. Жиз-
ненно необходимые жирные кислоты—линолевая, линоленовая
и арахидоновая——в достаточных количествах не синтезиру-
ются в животном организме и должны вноситься извне. При их
недостатке в организме повышается активность цитохромокси-
дазы в печени, повышается потребление воды. В тканях, осо-
бенно в сердечной мышце, резко уменьшается com ржание био-
логически активных иолиненасыщенньтх жирных кислот. У лю-
дей при такой недостаточности появляется акзематозное
повреждение кожи, в крови увеличивается концентрация холе-
стерина, иногда развивается липемия (Мережинский, 1959).
Значимость „тинолевой кислоты обусловлена еще и тем, что из
нее в присутствии необходимого количества пиридоксина обра-
зуется наиболее физиологически активная арахидоновая кисло-
та (Vinay е1а1., 1986).
Определение липидов в биомассе базидиальных грибов вы-
явило, что их количество равно 1,5—3,3°/о. Общее количество
интрацеллюлярных липидов в нативной соломе 0,97%. B общей
фракции липидов биомассы, полученной при твердофазной
ферментации базидиальных грибов, обнаружено 17-20 жирных
кислот (от C12 до C20), Среди которых доминировали пальмити-
ь
149
новая, олеиновая и линолевая. Липиды, синтезируемые изучен-
ными макромицетами, характеризовались преимущественным
содержанием ненасыщенных жирных кислот с 18 атомами угле-
рода, при этом концентрация преобладающих олеиновой и лино-
левой жирных кислот достигала 34-36%, a B некоторых слу-
qas1x——47,5%. Характерной особенностью липидов биомассы,
полученной в условиях твердофазной ферментации, являлось
присутствие в них арахиновой кислоты и оксикислоты (C20-o).
Сравнительное изучение жирных кислот липидов биомассы
микро- и макромицетов не обнаружило существенных различий
в качественном составе, тогда как количественное соотношение
их значительно изменялось. Однако во всех случаях преоблада-
ющими были ненасыщенные жирные кислоты, составляющие у
микромицетов 64—71%, а у макромицетов——53,5—66‚6°/о сум-
мы жирных кислот. Способ культивирования грибов существен-
но изменял качественный состав липидов. На примере гриба
Pem'cz'lliLmz verruculoszmz показано, что Твердофазная фермен-
тация способствует увеличению в составе инграцеллюлярных
липидов общего количества ненасыщенных жирных кислот. При
этом значительно повышается содержание линолевой кислоты.
Обогащение соломы белком стимулировалось дополнительным
внесением в среду картофельной мезги или свекловичного жома
в количестве 10-30 % массы субстрата.
На рост грибов и синтез ими белка большое влияние ока-
зывали такие факторы, как температура, реакция среды, влаж-
ность субстрата. Действие этих факторов изучено на примере
грибов Tyromyces lacteus И Coriolzzs versicolor. У Coriolus versi-
color оптимум рН для синтеза сырого протеина и истинного бел-
ка находился в пределах 4,0-—6‚0. Оптимальные значения
активной кислотности среды несколько сдвигались при выращи-
вании на соломе гриба Tyrornyces lacteus—5,0—7,0. Деграда-
um: органического вещества грибами повышалась при смеще-
нии рН в щелочную сторону.
Наиболее благоприятная температура для активной био-
трансформации соломы колебалась от 25 до 30 °С. При этом
более чувствительным к изменению температуры культивиро-
вания оказался гриб Tyromyces lacteus. Изменение температуры
сказывалось и на усвоении грибами целлюлозы. Если Coriolzzs
versicolor более интенсивно расщеплял субстрат при повыше-
mm температуры, то более активная деградация органического
вещества грибом Tyromyces lacteus наблюдалась при 25-30 °С.
При исходной влажности среды около 40% грибы росли
слабо, количество общего белка в биомассе (грибдгнеусвоенньтй
субстрат) составляло 8——10°/о‚ истинного—-4‚5°/о. Хороший
рост грибов и высокое содержание в биомассе белка наблюда-
лись при влажности субстрата 65—~75°/0 (сырой протеин — 12—
18%, истинный белок—— 7—9%). Дальнейшее повышение влаж-
ности соломы до 80——85% приводило к неполному прорастанию
150
субстрата грибами, а следовательно, и к снижению содержания
белка в обогащенной соломе. На протяжении роста грибов
влажность субстрата изменялась незначительно. Субстрат, име-
ющий в начале культивирования грибов низкое содержание
влаги (приблизительно 30%), высыхал, и рост грибов практи-
чески прекращался.
Аналогичная закономерность была установлена ДРУгими
исследователями для грибов Trichoderma reesei (Atev, 1986),
Aspergillus mger (Rodriquez ей а1.‚ 1986) и Sporotrichum pulve-
rulenfum (Smith её а1.‚ 1986). С увеличением исходной влаж-
ности субстрата от 40 до 70% выход белка возрастал. Опти-
мальное его содержание (около 15%) отмечалось при влаж-
ности субстрата 60%.
Активный рост обеих культур начинался через 2—3 сут после
посева, сопровождался синтезом ферментов и расщеплением
лигноцеллюлозного комплекса субстрата. Суммарная целлюлаз-
ная активность проявлялась уже на 4——5-е сутки. По мере роста
грибов уровень активности целлюлазы повышался, достигая
максимума на 7—8-е сутки культивирования. Наряду с целлю-
лазой грибы Tyromyces lacteus И Coriolus zrersicolor CHHTe3HpO-
вали ксиланазу, тирозиназу, лакказу, пероксидазу, глюкозоо-
ксидазу и каталазу. Рост базидиомицетов на соломе сопровож-
дался изменением количественного и качественного состава
углеводов субстрата.
Содержание белка в ферментированной соломе достигало
максимума при культивировании обоих грибов к 6—8-м суткам
и дальше практически не изменялось. Вместе с тем деградация
лигнина была заметной лишь после 10 сут культивирования, а
целлюлозы-после 5 сут для гриба Tyromyces lacteus H после
7 сут для Corfolus versicolor, хотя активный рост грибов на-
чался значительно раньше. Деструкция целлюлозы и лигнина
грибом Туготусез lacleus за 18—20 сут составила 40 и 19%,
а грибом Coriolus z2ersic0lor— 32 и 23% соответственно. Интен-
сивный рост грибов в первые сутки культивирования и активное
разрушение органического вещества субстрата в более поздние
сроки (10—20-е сутки) дают основание предполагать. что на-
копление биомассы грибов в начале культивирования идет в
основном за счет питательных веществ среды и гемицеллюлоз-
ного компонента соломы.
Переваримость продукта (определенная in vitro под действи-
ем пепсина), полученного при выращивании на соломе гриба
Tyromyces lacteus, равнялась 33%, а продукта, полученного при
выращивании Coriolus versic0l0r,— 36%, что согласуется с дан-
ными чешских исследователей (Zadrazil, Brunnert, 1982) о су-
Ществовании корреляции между разрушением лигнина и пере-
варимостью органического вещества. Coriolus versicolor более
активно разрушал лигнин (23 против 19% у Tyromyces lacteus),
переваримость ферментированной этим грибом соломы также
151
выше (36 против 33%). Переваримость нативной соломы, опре-
деленная этим же методом‚— 23%.
При исследовании динамики образования аминокислот в
белках Продуктов, Полученных при ферментации соломы макро-
мииетами, наибольшее содержание как суммы всех аминокис-
лот, так и незаменимых зарегистрировано к 6——8-м суткам
культивирования для Coriolus versicolor H к 8——10-м суткам для
Tyromyces lacteus. Сумма аминокислот в биомассе Туготусез
lacfeus составляла 9,3—9,15%, количество незаменимых амино-
кис„лот-—3,75—З‚52°/о. В биомассе Coriolus versicolor зти вели-
чины равнялись соответственно 8‚06——7‚8 и 2,82—2,76%. Коли-
чество липидов в соломе, ферментнрованной Туготусе$ lacfeus,
изменялось от 1,53 до 1,75%, ферментированной Coriolus versi-
col0r— от 1,23 до 1,69%. Сравнительное изучение состава жир-
ных кислот выявило наибольшую их полноценность для Туго-
myces lacteus к 5——10-м суткам, для Coriolus versic0l0r—— к 3——
5 суткам выращивания. Липиды полученной в зтот период
биомассы характеризовались наибольшим количеством иенасы-
щенных жирных кислот и максимальной величиной отношения
количества ненасыщенных жирных кислот к содержанию насы-
щенных.
В наших экспериментах, так же как и в исследованиях дру-
гих авторов (Скрябин и др.‚ 1986), активный рост грибов на
соломе отмечался при отсутствии перемешивания, особенно
в первые 2-3 сут. Для активного роста мицелия последний
должен иметь контакт с большим количеством частиц суб-
страта.
Состав белково-углеводных препаратов
Широкое использование лигноцеллюлозных материалов в Ka-
честве сырья для микробиологической промышленности требует
тщательного изучения биохимического состава как самих суб-
стратов, так и получаемых на их основе продуктов.
Большой интерес представляет состав углеводов, являющих-
ся источником углеродного питания и энергии. Углеводы лигно-
целлюлозного сырья разнообразны и подразделяются на не-
сколько групп. Первая группа включает свободные моио-, ди-
и трисахариды, которые извлекаются обработкой материала
82%-ным спиртом. При последующем извлечении углеводов во-
дой в раствор переходят коллоидные полисахариды, раствори-
мые в воде декстрины, инулин, слизи и часть пектиновых ве-
Ществ (вторая группа углеводов). Третья группа представлена
главным образом крахмалом. Довольно разнообразная четвер-
тая группа углеводов — пектиновые вещества и гемицеллюлозьт,
часть из которых легко растворима и извлекается горячеи во-
дой, другая часть экстрагируется щелочными растворами. Неко-
торое кодтичество гемииеллюлоз Прочно удерживается вещест-
152
Т а б л и ц а 17. Фракционный состав углеводов субстрата, 06
Гемицеллюлозь;
б обработки ?c"T'§§°1}- aE:;(T)1:11I1§)y1- Ё‘ ЛИГНО-
Спосгубстрата р напр р мая А Б всего ueflmonoga Пбдобная
фракция фракция фракция
Субстрат (кон- 0,20 0,86 14,5 16,3 30,8 38,9 17,5
трель)
1ОО-НЫЙ NaO1-1 0,10 1,18 12,5 11,0 23,5 35,6 13,0
0,3 МГР 0,29 0,60 10,7 10,4 27,1 33,8 20,2
TepMo06pa6oTaH— 0,19 2,00 14,8 14,1 28,9 37,8 16,9
ная солома с до-
бавлением 10%
картофельной
мезги (среда для
ТФФ)
вами клеточных стенок и обнаруживается в составе а-целлюло-
зы. После выделения первой-четвертой групп углеводов в
растительном материале остаются углеводы пятой груППы——эТо
в основном сс-целлюлоза.
С физиолого-биохимической точки зрения углеводы Первой
и второй групп наиболее доступны и для микроорганизмов, и для
высших животных. В связи с этим изучение углеводного соста-
ва растительных субстратов и полученных на их основе белково-
углеводных препаратов представляет определенный теоретиче-
ский и Практический интерес.
Обработка соломы ускоренными электронами (0‚З МГр) п
1°/д-ным раствором гидроокиси натрия приводила к нарушению
лигноцелятюжтозного комплекса. В большей степени деструкции
подвергалась целлюлоза, составляющая 35,6 и ЗЗ‚8°/о (в конт-
роле 38,9%) (ТабЛ. 17). Общее содержание гемицеллюлоз в на-
тивном субстрате равнялось 30,8%. Радиолиз соломы приводил
к снижению количества гемицеллюлоз до 27‚1°/о, а частичная
делигнификацгтя-до 23,5%. Изменялось количество углеводов
водно-растворимой и лигноиодобной фракции. В радиационно-
модифицированной соломе доля водно-растворимой фракции
уменьшалась, лигиоподобной же увеличивалась. За счет деструк-
ции целлюлозы и гемицеллюлоз при радиолизе происходило
увеличение спирторастворимой фракции, особенно олигосаха-
ридов.
В частично делигнифицированном субстрате незначительно
снижалась концентрация моносахаридов, что, очевидно, связа-
но с переходом их в жидкую фазу при обработке соломы ще-
лочью. Дополнительное внесение в измельченную солому карто-
фельной мезги (среда для твердофазной ферментации) с После-
дующей термической обработкой не вызывало существенных
Изменений в количественном составе гемицеллюлознои, целлю-
лозной и лигноподобной фракций, тогда как содержание водно-
153
Т а б л и ц а 18. Фракционный состав углеводов ферментированного
субстрата, %
б Спи pm _ водно _ Гемицеллюлозы людном
o6C::§:TKn pac1:1(:IpK- pac;I:i2lpH- Б всего целлюлоз а “0l1°5H‘d5l
фракция фракция Фракция
Глубинное культивирование
Penicillium verruculosum
1%-ный ЫаОН 0,25 1,99 14,3 6,0 20,3 18,9 I 8,2
0,3 МГр 0,31 I 0,67 17,3 6,6 23,9 17,6 10,0
Твердофазног культивирование
Penicillium verruculosum
Нативная солома ъ 0,63 3,34 I 15,7 2,6 18,3 19,7 9,0
0,3МГр 2,04 2,67 14,6 6,1 20,7 17,3 П 11,0
Tyromyces lacteus
Нативная солома I 3,03 6,38 20,0 2,6 l 22,6 ' 18,5 8,4
0,3 МГр 2,57 4,29 7,9 3,4 11,3 15,8 9,6
растворимых углеводов увеличивалось на 1,14°/о. В целом сле-
дует отметить, что любая обработка субстрата повышала в нем
количество легкоусвояемых углеводов, а общее их содержание
убывало. Особенно это заметно при проведении частичной де-
лигнификации субстрата.
Глубинное культивирование Petzicillium verruculosum СПО-
собствовало незначительному расщеплению гемицеллюлоз (на
3,2% по сравнению с контролем). Целлюлозы стало меньше на
16,7 (продукт, полученный на делигнифицированной соломе) и
16,2% (на радиолизованной соломе). Содержание лигнина
уменьшилось относительно контроля на 4,8 (обработка соломы
1о/о-ным NaOH) и 10,2% (0,3 МГр). Однако доля лигноподоб-
ной фракции в белково-углеводном продукте, полученном с ис-
пользованием радиолизованной соломы, стала несколько (10,0
против 8,2%) выше, чем при использовании частично делигни-
фицированного субстрата. Анализируя содержание спирто- и
водно-растворимых фракций, следует отметить большее их ко-
личество в биомассе (соломе, обогащенной грибами), чем в са-
мих субстратах. При этом более богатой оказалась биомасса,
полученная при выращивании Pem'cz'llium verruculosum на де-
лигнифицированной соломе.
Солома, обогащенная мицелием Penicilliurrz verruculosum
B условиях поверхностного культивирования, значительно бо-
гаче углеводами спирто- и водно-растворимых фракций, чем
солома, облагороженная путем глубинной ферментации
(табл. 18).
154
Существенно зависит углеводный состав ферментированных
субстратов и от вида гриба. Процент легкоусвояемых сахаров
в соломе, ферментированной макромицетом Tyromyces laczfeus,
I-IaMHO1‘O выше, чем в соломе, ферментированной микромицетом
Penicillium verruculosmn. Таким образом, выращивание грибов
на соломе сопровождается снижением общего содержания угле-
водов п значительным увеличением процента легкоусвояемых.
Наиболее богатой по количеству сахаров оказалась биомасса,
Полученная в условиях твердофазной ферментации (табл. 19).
Сравнение фракционного состава углеводов продуктов, полу-
ченных путем твердофазной ферментации, а также изучение
процесса роста грибов——продуцентов белка обнаружило, что
грибы активно растут, разрушая лигноцеллюлозный комплекс
п накапливая полноценную биомассу и на нативной соломе.
Прп этом во всех случаях водно-растворимая фракция в боль-
mm количествах присутствовала в биомассе, полученной при
ферментации пменно нативной соломы. Общее количество легко-
усвояемых углеводов также было выше при выращивании гри-
Т а б л иЦ а 19. Содержание легкоусвояемых углеводов
в ферментированном субстрате, %
KyJI”;7T3l’?3’,':Ij‘:)‘;5‘:xHIIe Твердофазное культивирование
Способ
обработки _
Penlcillium Penini [Нит Tyromyces
verruczz I osum I verrucu [свит l acteus
Субстрат (кон- 1,12 —— —
ТрОЛЬ)
Нативная солома — 4, 99 16, 98
1%-ный NaOH 2,10 —— -—
O,3 МГр 1,64 4,83 10,40
T a 6 JI и ц а 20. Качественный состав легкоусвояемых
углеводов, 00
Субстрат
Углеводы “Шинный фермёнёёрёогианный d)epn/17§e;{r'1(")1%3!:,)L;‘3eéiSnnbI15l
verruculasum lacteus
Cnupmopacrneopumcm фракция
Галактоза 47,09 29,23 14,68
Глюкоза 11,07 14 ,90 36, 46
Сахароза 10,66 26,86 14,68
Целлобиоза 9, 33 9,67 15,55
Водно-растворимая фракция
Галактоза 18,19 8,99 14,44
Глюкоза 57,07 65,37 81,87
155
бов на нативной соломе. Это указывает на то, что при твердо-
фазной ферментаци11 соломы мицелиальными грибами не требу-
ется предварительная модификация субстрата.
Учитывая то, что в последнее время твердофазная фермен-
тация считается наиболее перспективным способом обогащения
лигноцеллюлозных субстратов белком, нами Изучен качествен-
нь1й и количественный состав углеводов спирто-‚ водно-раство-
римых фракций, а также фракций гемицеллюлоз субстрата,
ферментированного грибами Penicilliurrz verruczzlosum H Tyro-
myces [адгезия
Основными компонентами спирторастворимых фракций фер-
ментированных масс оказались галактоза, глюкоза, сахароза,
целлобиоза. Эти же сахара преобладали и в нативном суб-
страте. Одиако за счет выращивания грибов количество галак-
то3ь1 в субстрате снизилось, одновременно увеличилось содер-
жание глюкозы, сахарозы и целлобиозы (табл. 20). Углеводы
водно-растворимой фракции были представлены преимуществен-
но глюкозой и галактозой. При этом в субстрате, ферментиро-
ванном Туготусез laczfeus, количество глюкозы намного превы-
шало таковое в субстрате, ферментированном Penicillium verm-
снизит.
На долю „тегкогидролизуемых углеводов (гемицеллюлоз)
ПрИХОДИЛОСЬ 28,9 % (субстрат из среды культивирования), 18,3%
(субстрат, ферментированный Pezzicillium verruculoszmz) и 22,6%
(субстрат, ферментированный Tyromyces lacteus). Качествен-
ный анализ состава гемицеллюлоз показал, что преобладала
в гемицеллюлозах группы A и группы Б ксилоза. Количество
ее в субстрате составило 50,84 (груииа А) и 69,77% (группа Б).
Ферментация соломы грибами увеличивала содержание ксило-
зы до 5632—5996 (груииа А) и 68,16—76,79% (группа Б).
Выращивание как микро-‚ так и макромицета на соломе вело
к возрастанию во фракции гемицеллюлоз группы А количества
рибозы и арабинозы и к снижению содержания глюкозы. Срав-
нительное определение сахаров в составе гемицеллюлоз группы
Б в субстрате, ферментированном двумя грибами (микро- и
макромицегом), выявило некоторые различия. Если в фермен-
тированной грибом Penicillium zwrruczdosum соломе увеличива-
лось (по сравнению с нативным субстратом) содержание рибо-
зы, фруктозы и галактозы, то в субстрате, ферментированном
Туготусез lacteus, эти углеводы либо отсутствовали, либо ко-
личество их резко уменьшалось.
Следовательно, солома, имеющая низкие кормовые свойства,
за счет биоконверсии ее тиицелиальньиии грибами может быть
превращена в ценный кормовой продукт. Сравнение результа-
тов по обогащению лигноцеллюлозного субстрата соломы легко-
усвояемыми углеводами Показало Преимущество твердофазной
ферментации. В качестве продуцентов более предпочтительны
базидиальные грибы (Стахеев и др.‚ 1986).
156
Та блина 21. Фракционный состав белков биомассы гриба
Penicillfum verruculosum (ГЛФ), 96
Способ обработки Альбумииы Глобулкны Проламииы ГЛЮТЫИНЫ
Субстрат (контроль) 15,8 17,1 12,8 54,3
Нативная соягома 36,9 18,0 11,9 33,2
1%-Hbxfi NaOH 38,5 16,5 11,0 34,0
0,3 МГр 37,1 17,9 10,5 34,5
П р и м е ч а н и е. Здесь и далее в таблицах ГЛФ-глубинная ферментация
Т абл ица 22. Фракционный состав белков биомассы
мицелиальных грибов (ТФФ), %
Способ обработки I Альбумины Глобулиньт I Проламины I Глютелины
Penz'cL'llL'1m1 verruculosum
Нативная солома 37,9 14,8 16,6 I 30,7
0.3 МГр I 41,3 I 14,6 14,3 29,8
Tyronzyces lacteus
Нативная солома 41,3 13,4 12,9 32,4
0,3 МГр 34,7 I 18,4 I 12,7 34,2
Использование в народном хозяйстве продуктов микробного
синтеза требует тщательного изучения их биологической цен-
ности. Питательная ценность белка микроорганизмов зависит
от содержания протеина, количественного и качественного со-
става аминокислот. Однако аминокислотный состав белка не
всегда отражает физиологическую доступность аминокислот.
Питательная цеННОСТЬ, переваримость белков в значительной
степени определяются соотношением протоплазменных и ре-
зервных белков. Наиболее сбалансированными по незаменимым
аминокислотах} считаются протоплазменные белки, включающие
структурные и ферментные, менее сбалансированными ——резерв-
ные. Путем фракционирования установлено, что в белках био-
массы грибов Penicillium verruculosum И Tyromyces lacteus
преобладают протоплазменные белки— 53—56% MaCCbI общего
белка. В субстрате их всего 32,9%, а резервных——67,1°/0 (табл.
21, 22). Определенное влияние на распределение белков по
фракциям оказывают условия культивирования. Имеются неко-
торые различия в распределении белков по фракциям и в зави-
спмости от вида продуцента.
Сравнение фракционного состава белков исследованных
нами грибов с фракционным составом других грибов (Костина,
Бабицкая, 1981), дрожжей, бактерий (Рябушко, 1986; Собо-
лева, 4986), мяса, клевера, зерна пшеницы выявило, что по со-
держанию альбуминов изученные белки богаче грибов и мы-
157
щечной ткани, по содержанию глобулинов аналогичны клеверу
и зерну пшеницы, по количеству проламинов——клеверу‚ а ио
содержанию глютелинов приближаются к белкам дрожжей.
Общее содержание легкорастворимых белков в продуктах, по-
лученных при ферментации соломы грибами Penicillium verm-
culosum и Tyromyces имена, составляет 53,0—56,0%. Сумма
альбуминов и глобулинов у грибов, взятых для сравнения, рав-
на 49,0—52,6%, y бактерпй——54‚0°/о‚ у дрожжей — 37,0, y пше-
ницы —42,0‚ у клевера —— 48,0, у говяжьего мяса—— 89,0°/о. Сле-
довательно, по содержанию растворимого белка изученные про-
дукты микробного синтеза аналогичны белкам бактерий и
белкам растительного происхождения (Ткаченко 11 др., 1971;
Злочевская, Галимова, 1976). Преобладание легкорастворимых
в воде и в слабых солевых растворах цитоплазматических бел-
ковых фракций, наиболее доступных для пищеварительных
ферментов, дает основание считать исследуемые виды биомас-
сы продуктами высокой биологической ценности.
Получение белково-углеводных добавок
на основе биоконверсии льняной костры
Глубинная ферментация. В связи с rev что в литературе
практически отсутству1от данные по биоконверсии льняной ко-
стры, представляло интерес изучить способность грибных куль-
тур использовать лигноцеллюлозньлй комплекс нативной и мо-
дифицированной костры с целью обогащения ее белком.
Испытывали свыше 100 культур мицелиальных грибов (мик-
ро- и макромицетов), в качестве субстрата брали льняную
костру (древесную часть льняного стебля), имеющую размеры
частиц 0,63 мм. Количество субстрата в среде 2%.
Лучшими продуцентами в условиях глубинной ферментации
оказались микромицеты Aspergillus niger, А. carbonarius, A. foe-
tidus, Alternaria altemazfa (lermis), Penicillium jenseniz‘, среди
макромицетов—Рпапегоспаые c/zrisosporium, Coriolus /zirsutus,
Climacodon septentrionalis, Tyromyces laczfeus, Stereum lzirsmfum.
Выращивание грибов на костре в течение 48—72 ч позволило
получить продукты (обогащенную белком льняную костру)
с содержанием протеина до 17—19%.
По сумме аминокислот ферментированный субстрат значи-
тельно превосходил нативную костру. Сумма аминокислот в на-
тивной костре— 1,87%, B костре, ферментированной микроми-
цетами,— 9,5——1 1,0, макромицетами —13,1—l3,8%.
Качественный состав белка ферментированного грибами
субстрата улучшился за счет лизина, треонина, валина, изолей-
цина, лейцина. Положительно повлияло на процесс биоконвер-
сии костры грибами дополнительное внесение в среду кукуруз-
ного экстракта, кукурузной или ржаной муки в количестве
0,25—0,5% (Бабицкая и др.‚ 1986).
158
Таб л ица 23. Углеводный состав среды в зависимости от способа
модификации субстрата, мг/100 мл
Способ обработки
Углеводы Натнвиая солома
1%-нЫй NaOH | 1%-Has! H380, 0,5 МГр
Рамноза — 0,31 1,90 Следы
Арабиноза Следы 0, 10 0, 69 0, 24
Ксилоза Следы 0,71 3, 66 0, 20
Фруктоза 0,06 0,24 0,72 0,73
Галактоза 0,37 1,18 1,60 0,75
Глюкоза 2, 66 0,32 7,13 4,06
Всего 3,09 2,86 15,70 5,98
Биодеградация целлюлозосодержащих материалов в значи-
тельной мере зависит от их реакционной способности, которая
в свою очередь определяется степенью кристалличности, пло-
щадью поверхности, доступной ферментам, наличием примесей.
Для увеличения реакционной способности „чигноцеллюлоз необ-
ходима их предварительная обработка, Однако, как отмечает
ряд авторов (Синицин и др.‚ 1984), до настоящего времени нет
универсальных методов предварительной обработки, пригодных
как для целлюлозных, так и для „чигноцеллюлозных материа-
лов. При применении льняной косары в гидролизно-Дрожжевом
производстве субстрат подвергают щелочной или кислотной об-
работке, которая Осуществляется в несколько этапов при высо-
ких температурах и давлении (Кулик и др.‚ 1982). Непрогидро-
лизованный же остаток не находит рационального применения.
Использование мицелиальных грибов в качестве продуцентов
белка позволяет заменить глубокий гидролиз растительных ма-
териалов предварительной обработкой их слабыми растворами
щелочей и кислот.
В наших исследованиях субстратмльняная костра—обра-
батывался 1%-ными растворами гидроокиси натрия, соляной и
серной кислот при модуле 1 : 10, а также ускоренными электро-
нами в дозе 0,05——0,85 МГр. На примере трех грибов (Coriolus
hirsutus, Aspergillus carbonarius, /llternaria tennis) показано,
что частичная делигнификация костры 1°/о-ной щелочью или
обработка соответствующими растворами кислот способствует
значительному——с 9‚6—-10,8 (выращивание на нативном суб-
страте) до 15,0—18‚1 0/0 —повышению общего белка в биомассе.
Щелочной или кислотный гидролиз костры может быть заме-
нен радиолизом. Однако заметное повышение содержания белка
в продукте вызывали относительно высокие дозы радиации——
0,40-—0,85 МГр. Эффект радиационной обработки субстрата
усиливался при сочетании ее со щелочной.
Полученные результаты подтверждаются данными об угле-
водном составе среды. Больше всего углеводов содержалось в
среде с кострой, обработанной 1°/о-ным раствором серной кис-
159
лоты, меньше всего в среде с частично делигнифицированным
субстратом (табл. 23). Однако, несмотря на низкое количество
сахаров в среде с кострой, обработанной 1%-ным ЫаОН, именно
такая ее модификация обеспечивала активный рост грибов и
высокое содержание белка в продукте. Связано это с тем, что
предварительная обработка лигноцеллюлоз 1%-ньгм NaOH спо-
собствует разрыву сложноэфирных связей между лигнином и
углеводами, Происходит деградация лигниновой сетки, что, оче-
видно, и способствует увеличению доступной поверхности непо-
средственно целлюлозного ядра без снижения степени его упо-
рядоченности (цит. по Синицину и др., 1984). Характер гидро-
лиза полисахаридов минеральными кислотами практически не
зависит от присутствия в субстрате лигнина. При гидролизе
растительных материалов кислотами низкой концентрации на-
ряду со свободными углеводами в среду выделяется большое
количество пеитозанов (Каткевич и др., 1984), ферментативное
расщепление которых уведтичгтвало концентрацию моносаха-
ридов.
Оказывая существенное влияние на количественный состав
углеводов среды, предварительная обработка субстрата не
влияла на его качественный состав. Во всех средах (за исклю-
чением среды с нативной кострой) присутствовали рамноза‚
арабиноза, ксилоза, фруктоза, галактоза и глюкоза. Наличие
легкодоступных для микро- и макромицетов углеводов, а также
повышение реакционной способности субстрата путем сочетания
механического (измельчение) и химического методов предобра-
ботки обеспечивали быстрый рост грибов, расщепление ими
компонентов субстрата и накопление полноценной биомассы.
По нашим данным, обработка субстрата ускоренными элект-
ронами едва ли экономически выгодна из-за высоких доз ра-
диации (0,5 МГр). Наиболее приемлемыми способами предва-
рительной обработки льняной костры с целью обогащения бел-
ком оказалась делигнификация 1%-ным раствором МаОН или
слабый гидролиз серной кислотой. На равноценность щелочной
или кислотной деструкции льняной костры указывает и то, что
белки биомассы, полученные при выращивании мицелиальных
грибов на модифицированном этими способами субстрате, прак-
тически не различались по качественному составу и количест-
венному содержанию аминокислот.
При выращивании Coriolus hirsutus B среде с 2% нативной
костры содержание белка в продукте к 48 ч культивирования
составляло 6,7% и дальше практически не изменялось. Дегра-
дация лигнина и целлюлозы субстрата происходила параллель-
но и достигала соответственно 18,2 и 14,7°/о. Внесение в среду
с 2% ННТИВНОЙ костры дополнительного источника углерода-
ржаной муки в количестве 0,5% —значительно активизировало
рост Coriolus hirsutus. Уже к 12 ч культивирования в продукте
было около 10% белка. Активнее расщеплялись компоненты
166
Т аблица 24. Изменение количественного состава углеводов среды при
глубинном культивировании Coriolus hirsutus, мг/100 мл
Способ ‘ Продолжительность культивирования, ч
°6p”6°m' 1 0 1 0* 1 12 | 24 | 36 | 48 I 60 I 72 I 84
Нативный 5,1 8,4 96,4 40,9 51,1 1,7 2,3 3,6 3,6
субстрат
196-НаЯ H2804 24,4 26,4 208,2 142,9 333,6 92,7 120,4 82,4 14,9
1%-Hbn"1NaOH 4,5 8,2 188,6 64,7 24,2 20,5 4,2 4,8 1,4
* Среда с гшокулюмюм, в которую внесено 0,5% ржаной муки.
субстрата. За 84 ч роста культуры деградации подвергалось
22‚5°/о целлюлозы и 28,8% лигнина.
Наибольшая активность всех ферментов как на среде без до-
бавления инициатора роста, так и с ним наблюдалась к 36—
60 ч, при этом активность Целлюлазы и ксиланазы была выше
в среде с 2% нативной костры льна, а активность лакказы и
глюкозооксидазы—при внесении ржаной муки. В обоих слу-
ЧЗЯХ обнаруживалась ЛИШЬ незначительная ЗКТИВНОСТЬ ПерОК-
сидазы, Продуктами ферментативного расщепления субстрата
являлись рамноза, арабиноза, ксилоза, фруктоза и галактоза.
Общее содержание углеводов в среде возрастало в основном за
счет рамнозы, ксилозы 11 фруктозы, входящих в состав геми-
целлюлоз.
Внесение в Питательную среду 0,5% ржаной муки повышало
количество углеводов в среде. Израсходование легкодоступ-
ных сахаров ржаной муки к 48 ч культивирования иницииро-
вало синтез ферментов, участвующих в деградации гемииеллю-
лоз и Целл10л03ь1 костры льна. Общее содержание сахара увели-
чивалось за счет пентоз и гексоз и к 84 ч роста достигало
3,6 мг/`10О мл (табл. 24). Таким образом, использование ржаной
муки в качестве дополнительного источника углеродного пита-
ния позволило повысить белок в продукте и степень деграда-
ции субстрата.
Увеличению выхода белка и усвоению субстрата способство-
вала предварительная модификация костры 1%-ными раство-
рами H2804 И NaOH. Количество белка в продукте, полученном
при выращивании Coriolus hirsutus в среде с предварительно
модифицированной льняной кострой, равнялось соответственно
9,8 и 9,1°/о, убыль целлюлозы и лигнина —— 20,6 и 25,4 (предоб-
работка 1°/о-ной H2804) И 22,0 и 28,2% (предобработка 1°/о—ным
NaOH). Внесение в среду с модифицированным субстратом
0,50/0 ржаной муки позволило получить продукт в более корот-
кие сроки. Содержание белка в ферментированном субстрате
составляло 13,0 и 13,9%, деструкция целлю.г1озь1——25,4, 29,0%,
лигнина -— 37,4 И З9,0°/о.
II. Зак. 955 @�O�
Как и при выращивании на нативной костре, наибольшая
ферментативная активность гриба в среде с обработанным суб-
стратом отмечена к 36-72 ч. О более активной деградации
модифицированного субстрата грибом Coriolus магнита можно
судить и по изменению углеводного состава среды (см. табл. 24).
Основным компонентом углеводов среды с кострой‚ обработан-
ной 1°/о-ной H2804, была ксилоза——77,5°/д всех углеводов. Вы-
сокое содержание пентоз, в частности ксилозы, можно объяснить
тем, что при кислотной обработке костры гидролизу подвергаются
в большей степени гемицеллюлозы, на долю которых, по дан-
ным Матусевича и др. (1982), приходится 14‚6°/0 всех веществ,
входящих в состав древесной части льняного стебля. Наряду
с ксилозой при кислотном гидролизе гемицеллюлоз образуются
и промежуточные продукты—-ксилоолигосахариды, которые в
дальнейшем под действием ксиланазы расщепляются до кси-
лозы.
Исследование углеводного состава питательной среды на
основе делигнифицированной костры льна выявило самое низкое
содержание углеводов в нулевой пробе по сравнению с нативной
кострой и кострой, подвергнутой кислотной обработке. Вместе
с тем предварительная обработка костры 1°/0-ной гидроокисью
натрия, как и при использовании соломы, способствовала рас-
щеплению лигноуглеводного комплекса, разрыхлению структу-
ры клеточных оболочек, что обеспечивало активный рост гриба
и самую высокую деградацию компонентов субстрата (Бабиц-
кая, Щерба, 1987).
При выращивании на нативной костре гриба Aspergillus
carbonarius максимальное содержание белка (7%) В продукте
отмечено к 36 ч культивирования. За 84 ч роста деградации
подвергалось до 10% лигнина и l2—~l3% 116ЛЛЮЛОЗЫ субстрата.
Активная Деструкция лигнина происходила в более поздние сро-
ки культивирования—в стационарной фазе роста гриба. Вне-
сение в Питательную среду дополнительного источника угле-
рода——ржаной муки——сокращало время накопления белка
в продукте. К 24 ч его содержание в ферментированном субстра-
те достигало 11%. Убыль целлюлозы составляла 18%, лигни-
на —- 15%. Наибольшая активность целлюлолитических фермен-
тов, ксиланазы и глюкозооксидазы на обеих средах отмечена
к 24—6О ч, лакказы — к 6О—-84 ч роста гриба, при этом актив-
ность лакказы была выше в среде с добавлением ржаной муки.
При культивировании Aspergillus carbonarius на нативной
костре не наблюдалось корреляции между ферментативной ак-
тивностью и степеньтю разложения клетчатки субстрата. Так,
активность целлюлаз была одинаковой как при внесении в среду
инициатора роста, так и без него, активность ксиланазы снижа-
лась при дополнительном внесении источника углеродного пита-
Hm, тем не менее деградация целлюлозы в среде с 0,5% ржаной
муки интенсифицировалась—18 против 12—13% В среде без
162
нее. Продуктами ферментативного расщепления полисахарид-
ного комплекса нативной костры являлись ксилоза, фруктоза,
манноза, галактоза, глюкоза. Однако увеличение общего содер-
жания угловодов в среде осуществлялось преимущественно за
счет глюкозы.
Количество белка в продукте при выращивании A{spergL'llus
carbonarius B течение 24——Зб ч на частично делигнифицирован-
ной щелочью или обработанной 1°/д-ной H2804 костре равнялось
12%, убЫЛЬ целлюлозы и лигнина—-26,0 и 22,0% (предобра-
ботка 1°/о-ным Na0H) И 22,0 и 20,0% (предобработка 1°/о-ной
H2804). Внесение в среду 0,5% ржаной муки способствовало
повышению содержания белка в конечном продукте до 13-
15% за те же сроки культивирования. Деструкция целлюлозы
составила соответственно 22,0 и 20‚0°/о, лигнина — 26,0 и 23,0°/о,
т. е. незначительно отличалась от результатов, полученных при
выращивании микромицета в отсутствие стимулятора роста.
Анализируя ферментативную активность гриба в средах с
модифицированным субстратом, следует отметить, что обработ-
ка костры 1о/д-ньтм раствором Н25О4 значительно (по сравне-
нию с необработанной и обработанной 1°/о-ным Na0H) снижа-
ла активность целлюлаз и ксиланаз и в некоторых случаях при-
водила к полному отсутствию лакказы и пероксидазы. Самая
высокая целлюлолитическая активность гриба наблюдалась в
среде с кострой, модифицированной щелочью. Высокая newne-
лазная активность сопровождалась более низкой (по сравнению
с нативным субстратом) активностью лакказы, хотя именно
такая его обработка обеспечивала наибольшее разложение лиг-
нина_
Отсутствие корреляции между активностью лакказы и усво-
ением лигнина служит основанием для предположения об учас-
тии в процессе деградации этого компонента дРУгих лигнолити-
ческих ферментов. Как отмечают Скрябин и сотр. (1985), а
также Головлева и сотр. (1983, 1986), начальные этапы разло-
жения лигнина должны осуществлять диффундирующие атаку-
ющие агенты (внеклеточные ферменты и активированные фор-
мы кислорода, образуемые грибным мицелием), так как поли-
мерный лигнин не может поступать внутрь клетки. Ранее пред-
полагалось, что важную роль в разложении лигнина играют
экстрацеллюлярные фенолоксидазы—пероксидаза, особенно
лакказа (Соловьев и др., 1985). Однако, учитывая то, что дей-
ствие препарата лакказы не вызывает в структуре лигнина
глубоких изменений, многие исследователи пришли к выводу,
что лакказа необходима не столько для разрушения лигнина,
сколько для процессов окисления образующихся при деполи-
МерНЗацИИ лигнина ароматических соединений. Очевидно, в
условиях нашего эксперимента кроме лакказы и пероксидазы
участие в разложении лигнина принимали И другие синтезируе-
мые грибами внеклеточные оксигеназы.
И‘ 163
Т аблица 25, Состав ферментированной грибами льняной костры, %
Субстрат лёг-Рейн ИЁЁЁЁЁЪЛЁ КлЁЁЁЁЁна СЁЁЗЁаЯ Сжорй “Чигнин
1
Костра (контроль) 5‚0—6,0‘1‚8—2,01 40,0 12,0—3,01 2,3 I 26,0
Aspergillus carbomzrius
Нативная 13,1 10,4 32,5 2,7 2,8 21,4
Обработанная 19,1 14,5 30,6 3,0 3,2 18,0
1%-HI>IM NaOH
Обработанная 20,4 13,0 30,9 2 ,6 3 ,0 20,1
1%-ной H2504
/llfernaria Zemzis
Натнвная 15,9 1 9,6 32,8 I 4,5 3,0 22,0
Обработанная 21,6 1 15,0 31,5 4,4 3,6 18,6
19{,—ным ЫаОН 1
Обработанная 21,3 13,5 32,0 3,9 3,4 20,4
19641012 11,50, 1 ,
I
Coriolus hirsufus
Нативная 17,8 11,6 30,0 2,8 3,1 20,7
Обработанная 22,0 16,2 29,0 3,6 3,4 16,9
1%-ным NaOH
Обработанная 23,7 14,6 28,5 2,7 3,7 17,4
19д-ной H3804
Аналогичная Закономерность в образовании биологически
активных веществ прослеживалась при выращивании на костре
льна микроскопического гриба Alternaria tennis. Содержание
белка в ферментированном этим грибом субстрате достигало
12——13%, деградация целл1юло3ы——20‚0—22,0‚ лигнина——23,0——
24,00/0. Дополнительное внесение в среду источника углерода
(ржаной муки) также повышало активность лакказы и дегра-
дацию лигнина субстрата. Утилизация же целлюлозы в некото-
рых случаях была выше в среде без инициатора. В отличие от
Aspergillus carbonarius гриб Alternaria tenuis синтезировал
Меньший по активности комплекс целлюлолитических фермен-
тов. Отсутствовала в культуральной жидкости и активность
пероксидазы.
Для повышения продуктивности процесса была изучена воз-
можность обогащения белком костры льна полунепрерывным
способом. Исследования проводили с грибом Aspergillus Carbo-
rzariws. Tax как его удельная скорость роста достигала О,1З——
0,15 г‘, процесс осуществляли при скоростях разбавления (D),
равных 0,05——0,08 И 0,10 ч". С возрастанием скорости разбав-
164
ления продуктивность культуры увеличивалась. Оптимальные
условия для роста создавались при D=0,06——0,08 ч“. При дан-
ном режиме продуктивность по обшей биомассе и белку пре-
восходила аналогичные показатели, полученные при периоди-
ческом культивировании, в 5,3 и 3,0 раза соответственно.
Из табл. 25 видно, что при глубинной ферментации льняной
костры мицелиальными грибами содержание белка в получен-
ных препаратах достигало 9,6——15‚О°/д, что в 4‚2—6‚5 раза выше,
чем в самом субстрате. Значительно снизилось количество лиг-
нина и целлюлозы. Общее количество липидов в нативной кос-
тре равнялось 2,3°/о, в ферментированной грибами—— 2,8——3,7%_
B связи с тем что липиды принимают активное участие не
только в дыхании и регулировании клеточной проницаемости,
но и в биосинтезе многих компонентов клетки, в том числе и
белка (Залашко, Пидопличко, 1979), представляло интерес
определить не только количественный, но и качественный состав
липидов субстрата и ферментированных масс. Особенно важно
наличие ненасыщенных жирных кислот, которые делают слож-
ные липиды не только химически, но и биологически высокоре-
акционными веществами, поскольку способны легко окисляться
кислородом воздуха, полимеризоваться, восстанавливаться, т. е.
активно участвовать в различных процессах физиологического
обмена (Залашко, 1971; Закордонец и др., 1986; Evans et а1.,
1986).
Качественный состав липидов субстрата и полученных про-
дуктов оказался практически аналогичным. Насыщенные жир-
ные кислоты представлены в Основном пальмитиновой (CW0) И
стеариновой (Сдж), ненасыщенные-олеиновой (Сшд) и лино-
левой (Сшд). Характерная особенность грибов Alternaria tenuis
И Coriolus 1Ь[г5ц2ц5—способность синтезировать оксикислоты
(C20-_o) B количестве 8,7——15‚1 и 7,1—l3,7% соответственно.
Несмотря на некоторые изменения в процентном соотношении
индивидуальных жирных кислот, общим для всех продуктов
являлось преобладание в липидах суммы ненасыщенных кислот.
Величина отношения количества ненасыщенных кислот к на-
сыщенным варьировала в пределах 1,2——3,5 (грибная биомас-
са), в субстрате ~ B пределах 0,5З——0,90.
Твердофазная ферментация. В условиях твердофазной фер-
ментации наиболее продуктивными оказались микромицеты
Alternaria alternata (tennis), Penicillium verruculosum И Р. jen-
senii, среди макромицетов—В[гг/гапа’ега adusta, Panellus stip-
ticus, Tyromyces lacteus, Coriolus штатив. Однако если глубин-
ное культивирование позволило повысить содержание общего
белка в субстрате более чем в 2 раза, то твердОфазное—лишь
в 1,2—1,4 раза. В продуктах твердофазной ферментации истин-
ный белок по сумме аминокислот составлял всего лишь 4‚5—
5.6%.
Оптимизация питательной среды и условий культивирова-
165
ння позволила повысить количество протеина в продукте до
12%, белка—до 6—7%. Максимальное накопление белка на-
блю 1алось при исходном рН среды 4‚О—8‚О, температуре куль-
тпвирования 25—35 °C, влажности субстрата 60-650/0. Более
чувствительным к изменению температуры и реакции среды
оказался гриб Tyromyces lacteus. Как и при выращивании на
соломе, указанные параметры влияли на деградацию грибами
целлюлозы и лигнина. Для всех продуцентов было характер-
ным увеличение степени деструкции целлюлозы при смещении
рН в щелочную зону. Наибольшее разложение лигнина отмеча-
лось при рН 4,О—6,О (Tyromyces Кавказ), 4‚О—7,О (Coriolus
/zfrsutus) и 6,О——8,О (Bjerkandera adusta). Оптимальной темпе-
ратурой для деградации лигноцеллюлозного комплекса льняной
костры оказалась температура соответственно 25—3О, 25——З5 и
2О—35 °С.
Активный рост лучшего продуцента—гриба Coriolus hirsu-
tus— начинался на 3-5-е сутки, сопровождался синтезом фер-
ментов, изменением содержания редуцирующих веществ, рас-
щеплением компонентов субстрата. Количество белка в (pep-
Ментированном субстрате достигало максимума на 8—12-е сутки.
Наибольшая активность как лакказы, каталазы, тирозиназы,
глюкозооксидазы, так и пероксидазы, ферментов, принимающих
участие в расщеплении лигнина, отмечалась на 6-е сутки, далее
уровень активности Этих ферментов снижался и к концу выра-
щивания обнаруживались лишь следы активности. Суммарная
целлюлазная и ксиланазная активность проявлялась уже на
4—5-е сутки, достигая максимума на 9—12-е сутки. С синтезом
ферментов связано, очевидно, и накопление в субстрате реду-
цируЮщИХ веществ, наибольшее количество которых соответст-
вовало 1О—12 сут выращивания Coriolus hirsutus.
Заметная деградация компонентов субстрата наблюдалась
Т а б л и ц а 26. Состав белково-углеводных продуктов, %
Продудент ПЁЁЁЁЁн ИЁЁЁЁЁ” mCe‘}’5§§§<a C3333” C3‘,-3%” Лигнин
Нативная 5‚0——6‚0 1‚8——2‚0 40,0 2,0—3,0 2,3 26,0
костра
Костра с —— 2 ,2——2,8 — — — —
посевным
материалом
Tyromyces 10‚0—-12,0 5,5—7,0 28,5 5,7 5,0 18,5
lacteus
Coriolus 9,5—11,0 5‚3—-6‚5 30,0 5,5 4,8 19,0
hirsutus
Aspergillus 7,5—8,9 3,0~3,7 33,0 4,0 3,7 24,3
carbonarius
Alferruzria 8,0—-10,0 3,5-4,5 31,3 4,4 3,9 23.0
tenuis
166
Т аблица 27. Жирнокислотный состав липидов биомассы
мицелиальных грибов, %
Кислота “E33332” T%§’7§5§“ ЁЁЁЁЁЁЁЁ ЁЁЁЁЁЁЗЁЁЁЁ A”tiZ'Z?s”“
Лауриновая (C1210) 1,38 0,35 0,40 — Следы
Тридекановая (C1310) Следы 0,20 Следы — »
Миристиновая (C1410) 0,55 1,09 1,21 0,55 0,51
Пентадекановая (C1510) 2,20 0,70 0,61 1,60 1,61
пальмитиновая (C1610) 32,47 19,50 18,28 32,97 18,78
ПаЛЬМИТОЛеИНОВаЯ (C1511) Следы 5,90 4,84 Следы Следы
маргариновая (C1710) 0,92 0,38 0,27 >> 0,59
Гептадеценовая (C1711) 1,10 1,70 2,69 0,82 0,59
Стеариновая (C1810) 9,75 9,35 9,29 3,28 5,13
Олеиновая (C1811) 13,26 15,98 10,97 9,85 14,72
Линолевая (C1812) 14,63 38,70 41,47 47,61 39,01
Линоленовая (C1813) 5,52 5,07 4,04 3,42 2,35
Неидентифицированная 18,22 т — -- 16,71
окси (C1810)
Неидентифицированная — 1,08 5,93 —— ——
ОКСИ (C2o:o)
Ненасыщенные 34,51 67 ‚35 64,01 61,70 56,67
Насыщенные 65,49 32,65 35,99 38,30 43,33
уже через З сут. При этом более активно разрушался лигнин.
K КОНЦУ ферментации деструкция целлюлозы и лигнина льня-
ной костры составляла соответственно 16,0 и 27,00/0. Рост гриба
на костре льна сопровождался изменением как количественно-
го, так и качественного состава углеводов. Общее содержание
их в среде, инокулированной грибом, равнялось 5,86 мг/г суб-
страта. Преобладали глюкоза, галактоза, фруктоза. С ростом
гриба количество углеводов снижалось с 5,86 до 0,57 мг/г суб-
страта, затем, начиная с 10-х суток, концентрация углеводов
возрастала за счет галактозы и глюкозы и к концу фермента-
mm достигала 3,03 мг/г субстрата.
При твердофазном культивировании грибов Alternaria tenu-
is и Aspergillus carbonarius содержание белка в ферментиро-
ванной костре увеличивалось по сравнению с самим субстратом
только в 1‚6—2,О раза (4‚5 и 3,70/0), активность целлюлазы и кси-
ланазы у исследованных грибов была довольно высокой. Ак-
тивность же лакказы у Aspergillus carbonarius оказалась не-
значительной. При росте микромицетов обнаружена лишь слс-
довая активность Пероксидазы.
Деградация лигнина субстрата находилась на уровне 9—
167
10% (Alternaria tenuis) И около 5% (Aspergillus tarbonarius).
Оба гриба мало использовали целлюлозу (12—13%~/llternaria
teams И 8% —А$регд[11и5 carborzarius).
Полученные данные (табл. 26, 27) говорят о преимуществе
использования макромицетов для биоконверсии костры льна в
условиях твердофазной ферментации.
Состав белково-углеводных препаратов
Изучались препараты, полученные при выращивании проду-
центов на костре, модифицированной 1°/о-ной H2804. Обработ-
ка льняной костры H2804 снижала содержание углеводов всех
фракций, и в первую очередь гемицеллюлоз и целлюлозы, поте-
ри которых по отношению к нативному субстрату составляли
8,33 и 5,70% соответственно. Наибольшей деградации подвер-
галась фракция гемицеллюлоз А, количество которой уменьша-
лось на 52,800/0. Дополнительное внесение O,5% ржаной муки
существенно не изменяло количественный состав фракций.
В ферментированной Coriolus hirsutus и Alzernaria tenuis
костре значительно возросло количество спирторастворимых
фракций (с 1,22 до 3,38 и 3,51% - на среде без дополнительно-
го источника углерода и до 2,07 и 1,8О°/о—на с еде с 0,5% ржа-
ной муки). В субстрате, ферментированном spergillzzs carbo-
rzarizzs, на долю этой фракции приходилось 0,87 и 1,17%. Содер-
жание водно-растворимых углеводов в белково-углеводных пре-
паратах, полученных путем культивирования исследованных
грибов на среде без инициатора роста, уменьшалось до 0,41—
0,44 и 0,51%, B то время как внесение в питательную среду ржа-
ной муки способствовало увеличению количества данной фрак-
ции в субстрате, ферментированном грибами Coriolus hirsutus
И Alterrzaria ze/zuis.
Внесение дополнительного источника углеродного питания
приводило к более активному расщеплению лигнина костры
льна. Практически во всех ферментированных субстратах
снизилось содержание пектиновых веществ, гемицеллюлоз, Цел-
люлозы и лигнина (табл. 28). Деградация гемицеллюлоз проис-
ходила в основном за счет фракции Б, в то время как содержа-
ние гемицеллюлоз А увеличивалось. Данная закономерность
была показана и для грибов Penicillium verruculosum И Tyro-
m_L/C95 тотеме, выращенных на среде с соломой. Полученные ре-
зультаты позволяют предположить, что способность расщеп-
лять преимущественно гемицеллюлозы Б и синтезировать de
novo фракцию гемицеллюлоз А—это одно из свойств исследо-
ванных грибов, которое не зависит от природы субстрата.
В ферментированной массе снижалось общее количество
углеводов и повышался (за исключением Aspergillus Carbona-
rius) процент легкоусвояемых сахаров. По отношению к суб-
стратам деградация полисахаридного комплекса ферментиро-
158
Табл ица 28. Фракционный состав углеводов ферментированной
грибами костры льна, %
. , э з:
ё E Гемицеллюлозы Ё ‘в Ё ‘Ё;
Вариант Ё‘: Е Е‘: Ё &_._ g “д г: Ё?
“Ed oz: :5 9 сё
§=: §=§ И = Е
дгд egg A B всего за 5 д:
Опа-Э два-э Cm CT Ё:
Костра 1,22 0,78 6,74 10,84 17,58 1,62 36,70 27,25
Костра, обработанная 1,09 0,70 3,25 6,00 9,25 1,20 31,00 27,60
190-Hm"! H2804
Кострас инициатором 1,15 0,73 3,69 6,68 10,37 1,29 31,20 27,70
роста, обработанные
1%-ной H2804
Глубинная ферментация
Alfernaria fenuis
Среда без инициатора ’3,51 0,44 5,29 2,86 8,15 0,74 24,70 22,00
роста
Синициатором 1,80 1,24 5,96 2,82 8,78 0,59 25,20 21,30
Aspergillus carbonarius
роста
С инициатором
Среда без инициатора ’0,87 0,41 6,19 3,8410,08 0,13 23,00 21,90
1,17 0,58 4,71 3,37 8,08 0,63 24,20 20,80
Coriolus /tirsufus
Среда без инициатора 3,38 0,51 4,70 3,63 8,33 0,55 23,50 20,40
роста
С инициатором
2,07 1,50 4,51 3,15 7,66 0,37 21,80 18,00
Твердофазная г/Эерлленпжпцич
Coriolus /tirsufus
Костра 12,84 | 1,70 1 5,19 | 2,40 | 7,59 | 0,47 |24,30| 21,00
ванной костры составляла 16,10 и 23,70%, при этом содержание
лсгкоусвояемых углеводов в продуктах увеличивалось почти в
два раза. В отличие от костры, фсрментированиой Alternaria
tennis, где 13,18~13,37% полисахаридного комплекса подверга-
лось деградации при двукратном обогащении легкоусвояемыми
углеводами, в биомассе Aspergillus carbonarius утилизация по-
лисахаридов достигала 20,35—22,5З°/о‚ а содержание легкоус-
вояемых углеводов — 1,28——1,75 %.
Для сравнения был изучен фракционный состав костры, фер-
ментированной грибом Coriolus hirsutus при твердофазном
культивировании. Общее содержание углеводов в продукте рав-
нялось 36‚40°/о, в то время как в нативном субстратеы 57,90°/о.
Количество легкоусвояемых сахаров возросло с 2,0 до 4‚54°/о,
169
при этом углеводов спирторастворимой фракции было 2‚84%‚
водно-растворимой-1,70°/о. Количество пектина в продукте
снизилось с 1,62 до 0,47%, целлюлоза составила 24,З°/д, лигно-
подобная фракция- 21,0% (см. табл. 28).
Спирто- и водно-растворимая фракция ферментированной
грибами костры включали арабинозу, ксилозу, фруктозу, ман-
нозу‚ галакто3у‚ глюкозу и в некоторых случаях целлобиозу.
Существенные различия отмечены в основном в содержании кси-
лозы, галактозы, глюкозы (табл. 29). Значительным повыше-
Т а б л и ц а 29. Качественный состав легкоусвояемых углеводов, %
ферментированный субстрат
углеводы Чистый Cgrialus 1 Altermzria Aspergi Нив
субстрат hlrsutus terzuis carbomzrius
глф 1 тфф 1 ГЛ Ф
Спирторасгпворимал
Ксил оза 5,34 5 , 25 8,72 — —
Галактоза 8,73 15,31 2,75 3,38 12,89
Глюкоза 71,93 75,14 83,94 87,08 64,94
Водно- растворимая
Ксилоза 19,25 26,51 43,56 27,04 29,41
Галактоза 10,15 17,11 11,36 25,74 16,31
Глюкоза 9,73 44,04 33,71 30,10 31,67
Таблиц а 30. Фракционный состав белков ферментированной
грибами льняной костры, %
Продуцент Альбумины 1 ГЛОбУЛИНЫ Проламины i Глютелины
Субстрат 6,11 28 ‚ 53 4,86 60,50
Coriolus hirsulus 21,97 47,95 2,35 27,73
Aspergillus carbonarius 11,63 41,39 3,13 43,85
Altemaria tenuis 14,62 45,10 3,42 38,86
нием содержания глюкозы характеризовались не только спирто-
и водно-растворимые фракции, но и другие (пектиновая, геми-
целлюлозы) фракции белково-углсводных продуктов.
Сравнительное изучение фракционного состава белков no-
казало, что как и в биомассе, полученной при выращивании
мицелиальных грибов на соломе, в ферментированной костре
преобладают протоплазменные (альбумины, глобулины) бел-
ки—-53‚02—69‚92°/д (табл. 30). В самом субстрате этих белков
всего лишь 34‚64°/д_ Отличительная особенность белков фермен-
тированной костры-низкое содержание фракции проламинов
и высокое -— глобулинов.
170
Получение кормовых продуктов в виде
белково-углеводных комплексов
Требования экономики, с одной стороны, и экологии — с дру-
гой, диктуют необходимость полной утилизации сельскохозяй-
ственных и промышленных отходов. Переработка ЛИГНОЦеЛЛгЮ-
лозных материалов наиболее рациональна и целесообразна при
условии максимального приближения производства к источни-
кам сырья и животноводческим объектам, использующим его
продукцию. Организация переработки растительного сырья в
белково-углеводный корм в рамках агропромышленных ком-
плексов позволила бььмаксимально снизить затраты на транс-
портировку, хранение сырья и получаемых продуктов. Наиболее
перспективный путь экономии сырьевых и других материальных
ресурсов-внедрение безотходных и малоотходных технологи-
ческих процессов (Клейнер и др.‚ 1986).
Безотходные технологии, исключающие сепарацию и обез-
воживание кормовых продуктов, дают возможность получать
концентраты, обогащенные не только белком и растворенными
в культуральной жидкости свободными углеводами, но и вто-
ричными метаболитами (аминокислотами, пептидами, низко-
молекулярными полисахаридами и др‚) (Тогеу, 1986).
Белково-углеводные комплексы получены путем выращива-
ния мипелиальных грибов на соломе злаковых и льняной кост-
ре. Содержание протеина в них 28,6—33,8%, однако количество
истинного белка во всех случаях не превышает 13,0——15.0%. По
сравнению с субстратами в продуктах значительно ниже кон-
пентраппя клетчатки (38%——в соломе, 2О%—в продукте;
40% —в костре, I8—22% —в продукте) и лигнина (17% —в
соломе, 9,6% —в продукте; 26% —в костре, 13——I5%—B про-
дукте). Количество жира 4,6°/д, переваримость белка in „то
80.О—87,0% (табл. 31).
Спектр жирных кислот липидов белково-углеводных комп-
лексов представлен в основном теми же кислотами, что и у суб-
стратов. Особенностьъю грибных продуктов является высокое
содержание (ЗО——41 %) B НИХ линолевой кислоты, которая наря-
ду с линоленовой служит показателем степени ненасыщенности
липидов. Соотношение ненасыщенных кислот в продуктах
грибного происхождения к насыщенным равно 2,7 (на соломе)
и 1.96—2,З (на костре) (табл. 32).
Изучение фракционного состава белково-углеводных комп-
лексов грибного происхождения выявило, что в них по сравне-
нию с субстратами значительно— с 0,26 до 5‚49% (солома) и с
1,22 до 4,15-—8‚18°/д (костра)-—возросло количество спирто-
растворимой фракции. В белково-углеводном комплексе, полу-
чснном при ферментации соломы, отмечено существенное увели-
чение водно-растворимой фракции (с 0,86 до 1,45%). B концент-
ратах же, образованных путем ферментации льняной костры,
171
Т а б л и Ц а 31_ Состав белково-углеводных комплексов
(средние показатели), “О
_ Пе ева‹
Продукт „Еёте- Жир Зола Л 5:5}; Лнгннн рикеость
белка
Солома (субстрат) 4,0 0,97 5,5 38,0 17,0 19,0
Солома, ферментированная грибом 28,6 4,6 12,1 20,0 9,6 80,0
Penicillum verruculosum
Костра (субстрат) 5,0 2,3 2,0 40,0 26,0 20,0
Костра, ферментированная
Coriolus lzirsutus 31,5 3,6 10,2 18,5 13,0 87,0
Aspergillus carbonarius 32,0 4,2 9,1 22,0 15,1 86,1
Al!err1arz'a галит 33,8 3,9 8,3 21,3 14,3 85,2
Т а б л и ц а 32. Жирнокислотный состав липидов
комплексов, %
белково -углеводных
Солома костра фермеитированиая
ферментн‹ Костра
Кнсдота натнв- P°’_3a_H”_a” натив’ Carialus Alternaria Aspergillus
ная Ретддшит “а” hirsutus tetzuis carbatzarius
Uerruculo-
I SHI71
Лаурнновая (C,2,0) —— 0,93 1,38 0,90 Следы —
Тридекановая (C,3,0) — 0,19 Следы Следы 0,63 —
Миристиновая (CNN) 1,10 1,92 0,55 1,99 1,29 0,46
Миристолеиновая (С, 4, 1) 0,62 __ — — — —
Пентадекановая (C15,0) 0,74 0,93 2,20 0,80 1,18 0,41
Изопальмитиновая (C16:0) 1 ‚38 Следы — ~- — 0,31
пальмитиновая (С,6,0) 29,27 21,39 32,47 24,68 16,59 19,15
Маргариновая (С„,0) 0,74 0,25 0,92 1,10 1,10 0,92
Гептадецеиовая (Сп, 1) 0,74 0,62 1,10 1,89 0,74 1,33
Стеариновая (C,8,0) 4,66 2,11 9,75 0,50 3,76 4,60
Олеиновая (С,8„) 27,61 24,18 13,26 29,91 27,19 22,49
Линолевая (C18,?) 25,99 41,29 14,63 36,14 35,17 37,57
Линоленовая (С,8,3) 1,47 6,19 5,52 2,49 4,06 4,29
Арахиновая (Сию) 1,72 -— — — —— -——
Неидентифицированная
окси (C,8,0) —— 18,22 — 8,29 7,96
Ненасыщенные 57,93 72,30 34,51 70,03 67,16 66,19
Насыщенные 42,07 27,70 65,49 29,97 32,84 33,81
наблюдалась несколько и11ая картина: водно-растворимая фрак-
ПНЯ увеличилась ЛИШЬ
в белковоуглеводном комплексе гриба
/lfiernaria Ienuis (C 0,78 до 1,42%), в других же (Coriolus Низы»
tus И Aspergillus carbonarius) количество ее снизилось до 0,74%.
172
Все белково-углеводные комплексы содержали намного
меньше пектиновых веществ, гемицеллюлоз, целлюлозы и лиг-
нина, чем субстрат (табл. 33). B целом в белково-углеводных
комплексах грибного происхождения уменьшалось (относитель-
но субстратов) общее содержание углеводов и повышалась кон-
центрация легкоусвояемых сахаров, что связано с деградацией
легко- и трудногидролизуемьтх полисахаридов соломы и костры.
Сравнительный анализ состава препаратов, полученных раз-
личными способами ферментации, обнаружил, что содержание
легкоусвояемых углеводов в продуктах глубинной ферментации
(биомасса, отделенная от культуральной жидкости) равно
2,95—З,89 %, в продуктах твердофазной —-4,54—4,99, В белково-
углеводных комплексах—6,94—8‚92°/0 (в самих субстратах —
1.12-2.00”/0), содержание общего белка 20—24, 12—-15, 29-
34% соответственно.
Результаты со всей очевидностью указывают на целесооб-
разность получения кормовых продуктов из растительного
сырья в виде «белково-углеводных комплексов». Возможно по-
лучение комплекса и в жидком виде. На наш взгляд, внедрение
такого безотходного технологического процесса-наиболее
перспективный путь снижения материалоемкости белково-угле-
водной Продукции.
Подводя итог вышеизложенному, можно сделать следующие
выводы:
~—* за счет ВЫрЭЩИВЗНИЯ отобранных НЗМИ мицелиальных ГрИ-
Табл ица 33. Фракционный состав субстратов и белково-углеводных
комплексов, %
Спир- Фрак- Фракции геми enme-
~ropacT~ B01010‘ ция лоз Ц лиги“
вор” раство- neK.m_ __ Цел- подоб-
Вариаит Мая римая новых ‘—“ “-'""""—‘ люло- нач
фраю фрак- Be_ общее за фрак-
дня ция ществ А В содер- цня
жаиие
Солома
Нативиая 0,26 0,86 1,2 14,52 16,25 30,77 38,90 17,50
Белково-углеводный 5,49 1,45 0,22 4,82 3,12 7,94 19,80 7,00
комплекс на основе
Penicillium verruculo«
sum
Костра
Нативная 1,22 0,78 1,62 6,74 10,84 17,58 36,70 27,25
Белково-углеводный
комплекс на основе
Coriolus hirsutus 8,18 0,74 0,75 2,90 1,36 4,26 17,37 13,70
Aspergillus сагЬопа- 4,15 0,74 0,80 3,80 2,24 6,04 20,35 15,40
nus
Allemaria lenuis 4,34 1,42 0,62 2,99 1,51 4,50 18,36 14,60
173
бов на лигноцеллаюлозных субстратах (солома и костра льна)
содержание белка в них повышается в 2,1-—8,0 раза. Изменя-
ется не только его количество, но и качественный состав. Преоб-
ладают в ферментированных субстратах протоплазменные (аль-
бумины, глобулины) белки—более 50%. Изменение количест-
венного и качественного состава белков продуктов способствует
значительному повышению их переваримости. Утилизация гри-
бами целлюлозы субстратов составляет 17‚5—З1,0 (глубинное)
и 12,0—29,0% (твердофазное культивирование), утилизация
лигнина——17,0——-З2,8 и 4,0——35,0% соответственно (табл. 34);
—ферментация растительных ОТХОДОВ мицелиальнымп гри-
бами способствует обогащению их не только белком, но и легко-
усвояемыми углеводами, ЧТО значительно повышает питатель-
ную ценность ферментированных субстратов. Использование
макромицетов позволяет получать продукт более высокого ка-
чества;
—-сравнение способа получения кормовых дрожжей на гпд-
ролизатах соломы со способом получения белково-углеводного
корма грибного происхождения на нативной соломе свидетель-
ствует о конкурентоспособности последнего (табл. 35).
Для оценки эффективности биоконверсии лигноцеллюлозных
субстратов мнцеллиальными грибами мы воспользовались ба-
лансовым методом, разработанным латвийскими исследователя-
ми (Бекср, 1984)_ Рассчитывали следующие показатели: пока-
затель, характеризующий прирост белка на единицу использо-
ванного субстрата:
УЗ: ВрР—В5$‚
s
T абл ица 34 Характеристика белково-углеводных продуктов, полученных
при ферментации лигноцеллюлозных субстратов, %
Процент увеличения белка,
Продукт утилизации компонентов
Показатель Субстрат __ СУбСТРЙТЗ
ГЛФ ТФФ ГЛФ ТФФ
Белок 2‚7—3,0 10,0——17,0 6,0—9,0 3,7—5,0 2,2—3,0
18—2 0 10‚0——16‚0 3‚7—7,0 5‚б—8‚0 2‚1—-—3‚5
Клетчатка 38,0 26,0—30,0 27 ‚0—32‚0 21 ‚0-31 ‚О 16,0—29 ,0
40,0 28,0~33,0 32,8—35,0 I7,5—30,0 12,0—I8,0
Гемицеллю- 30,8 20, 0—-24 , 0 11 ‚3—22‚ 6 22,0—55 ,0 27 ,0~64 , 0
Лоза 17,6 8,0——10,0 10,0—I1,0 43,0~54,0 37,0—43,0
Лигнин 17,0 12‚0—14‚5 11,0 —I4,0 20,6-—29,0 I7,6—35,0
25,3 17,0~—21,0 19,0———24,3 17,0—-32,8 4,0~25,0
П р и м е ч а н и е. Над чертой г данные для варианта, когда субстратом
является солома, под чертой-жостра.
174
Т аблица 35. Выход дрожжевого и грибного белка, г/кг соломы
Субстрат N Выход продукта I Выход белка
дрожжевой продукт
ферментированный гидролизат соломы* 180 73,8
Полный сернокислый гидролизат согтомы** 180‚0—190‚0 76,0—80‚0
Г рыбной продукт
Нативная солома { 700-800 I 70,0—80,0
* Данные по Каткевичу (1983).
** Данные по Андрееву (1986).
где Вр—содер›кание белка в продуктах ферментации, %; Bs—-
содержание белка в субстратах, %; Р—масса сухого вещества
продуктов, г; S —— масса сухого вещества субстрата, г;
показатель, характеризующий степень использования конвер-
тируемой доли субстрата:
AG + X
Us = ————.
I28
где А(Ё——н3менение массы сухих веществ среды ферментации
в результате ферментации, 0/0; Х——клеточная биомасса, г; 12-
содержание конвертируемых компонентов в субстрате, k=0,75;
коэффициент эффективности биоконверсии:
п ': nS'US9
где ц5—коэффициент эффективности образования клеточной
биомассы из конвертированной доли субстрата, %.
При определении показателей учитывалось содержание белка
в среде, а также количество белка, вносимое с посевным мате-
риалом.
В наших исследованиях (табл. 36) УБ составил 10,0~—20,0%
(глубинное культивирование) и 4,9—8,0% (твердофазное). Сте-
пень использования субстрата в условиях глубинной ферМента-
ции Ы5=42,0——87,0°/о‚ общая эффективность биоконверсии n=
=50,0—79,0%. По литературным данным (Бекер, 1984), Us
для лигноцеллюлозных субстратов различна——от 51 до 85%,
т; не превышает 80%, YB=8,0—I7,0%.
B условиях твердофазной ферментации степень утилизации
субстрата составила 34,4-—5З‚0°/о, п=1З‚О—46‚0°/о; в исследова-
ниях других авторов Us находилась в пределах 36——73%, п:
=15—59 0/0.
Приведенные многочисленные литературные данные, а так-
же результаты собственных исследований указывают на возра-
175
Таблица 36. Основные технологические показатели процессов
культивирования мицелиальных грибов на лигноцеллюлозных субстратах
Белок YB US T)
д,
U
xljilepc? Mlvmpooprakmam Субстрат
ГЛФ Penicitlium Солома 12,0*——22,0** 12,0~18,5 42,0——82,0 54,0——73 ,0
verr uculosum (3 04,)
ГЛФ Aspergillus Костра 13,0—24,0 10,0—16,5 65 ,0—74 ‚О 50,0—-77 ‚О
carbonari us (2 0/0)
ГЛФ Alternaria » 14,О——25,О 11,0~20,0 70,0——87,0 61,0—79,0
tenuis
ТФФ Туготусез Солома 9,0—15,0 4,8-8,0 42,0—53,0 13,0——46,0
lacteus
ТФФ То же Костра 6,0—13,5 4,9——6,0 34,4——42,024,0—30,0
* Истинный белок.
** Сырой протеин.
стающую роль микробиологии в перевооружении сельского хо-
зяйства, Неиолиоценность кормов, особенно дефицит белка, на-
носит животноводству огромный ущерб. Перерасход кормов
из-за их несбалансированности и недостатка высокоценного бел-
ка приводит к ежегодным непроизводительным потерям десят-
ков миллионов тонн зерна. Следствием этого является рост се-
бестоимости продукции (Хазин, 1987).
Существенную роль в ликвидации белкового дефицита долж-
ны сыграть препараты микробного синтеза, к числу которых от-
носятся п грибиые кормовые добавки. Достоинством продуцен-
тов грибного белка является их способность утилизировать ши-
рокий круг содержащих крахмал, целлюлозу, лигнин
субстратовнотходы сельского хозяйства и промышленности.
Есть все основания полагать, что белок, полученный на таком
сырье, может иметь самую низкую стоимость.
Интерес к возобновляемому сырью растет как в связи с со-
кращением природных ископаемых ресурсов (Бекер, 1985; Внес-
тур и др‚, 1986), так и вследствие выявления недостатка не толь-
ко иротеина и ряда других питательных веществ в рационах
животных, но и легкопереваримых углеводов. Углеводы же оп-
ределяют уровень энергетического Питания животных, от кото-
рого зависит их продуктивность. Эти вещества необходимы для
обменных процессов, связанных с окислением, переаминирова-
нием аминокислот, синтезом жира, минеральным обменом.
В ближайшем будущем ожидается более интенсивное ис-
пользование продуктов фотосинтеза в микробиологической и
химической промышленности (Виестур и др.‚ 1986). Расширит-
ся спектр сырья для получения продуктов микробного синтеза.
Предпочтение будет отдано отходам сельского хозяйства, лес-
ного, плодоовощного, хлопкового, пищевого п дРУгих произ-
водств. Поскольку на указанных отходах можно выращивать
различные грибы: культивируемые съедобные (высшие ба3идио-
176
мицеты) и микромицеты, грибная промышленность способна
решить задачу увеличения количества как продуктов питания,
так и продуктов кормового назначения (Гарибова и др.‚ 1982,
1985, 1987; Гарибова, 1987). Однако использование лигноцеллю-
лоз в качестве субстратов и мииелиальных грибов как проду-
центов связано с рядом трудностей, которые требуют своего ре-
шения. Это в первую очередь разработка рациональных спосо-
бов предварительной модификации лигноцеллюлоз и создание
соответствующего оборудования.
В результате интенсивного развития ядерной энергетики все
более актуальной становится проблема эффективного примене-
ния для обработки растительного сырья ионизирующего излу-
чения (СКВОрцОВ, Чурилов‚ 1987). По мнению многих исследова-
телей (Ковалеико и др.‚ 1982, 1987; Ковалев и др.‚ 1987), радиа-
ционный метод может составить конкуренцию таким методам,
как гидробаротермический, электрохимический и др. Экономи-
ческие показатели радиационного метода могут быть улучшены
путем снижения дозы ионизирующего излучения, чему способст-
Вует комбинирование радиационного метода с химическими спо-
собами обработки целлюлозосодержащих материалов.
Большая роль в процессах трансформации продуктов фото-
синтеза отводится микроорганизмам. Более приемлемыми из них
считаются те, которые способны использовать поликомпонент-
ные лигпопеяхлъоглозные субстраты при высоком уровне продук-
тивности, накапливая при этом легкоусвояемую биомассу. Усвоя-
емость грибного мицелия зависит от наличия в нем хитина и дру-
гих полисахаридов.
Много внимания в последнее время уделяется хитину (Ко-
валь и др.‚ 1987). Связано это пе только с тем. что этот поли-
аминосахарид широко распространен среди грибов (может со-
ставить четверть сухой массы мицелия). В клеточной стенке
грибов хитин связан иоиными и ковалентными связями с поли-
сахаридами, пигментами и белками. Способность образовывать
комплексы влияет на его физико-химические свойства и придает
этому биополимеру особую устойчивость к действию ферментов
(Феофилова и др, 1980; Феофилова, 1981, 1983). Это еще раз
указывает на то, что при скрипииге микроорганизмов выбирать
следует TC из них, в которых сочетается ряд важнейших свойств:
способность утилизировать с высокой эффективностью суб-
страт; устойчивость к токсическому действию продуктов мета-
болизма; способность синтезировать полноценный по аминокис-
лотному составу белок; содержание в клеточной стенке мини-
мального количества хитина и др.
Окончательный ответ на вопрос о целесообразности внедрения
технологий получения грибных белково-углеводных кормов из
лигноггеллтолозных субстратов может быть получен на основа-
нии технико-экономических показателей, а также зоотехничес-
кпх п медико-биологических испытаний получаемых продуктов.
12 Зак 966
Глава 7
БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ СУБСТРАТОВ
С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ СПИРТА
И ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ
Ограниченность запасов ископаемого топлива, зависимость
многих стран от импорта энергетических запасов активизируют
Поиск новых более доступных видов топливно-энергетического
сырья. Неисчерпаемым источником такого сырья является ра-
стительная биомасса, две трети которой составляет целлъюлоза.
В последнее десятилетие значительно возрос интерес к получе-
нию биотоплива (этанола) из растительной биомассы с по-
мощью микроорганизмов. Появилось большое число публика-
ций технологического и экономического характера, в которых
этиловый спирт рассматривается как горючее будущего.
Этанол, получаемый из растительной биомассы (биоэтанол),
может внести существенный вклад в восполнение энергетиче-
ских ресурсов. Для получения этанола используется недефицит-
ное сырье, в том числе целлюлозосодержащие отходы. Кроме
того, биоконверсия растительной биомассы в этанол энергети-
чески более выгодна, чем ее конверсия в микробную (белок)
биомассу.
Энергетический выход аэробной конверсии составляет около
0,60. При анаэробном процессе в конечные продукты—этанол
и микробную биомассу-— переходит около 0,95 энергии субстра-
та (Бекер, 1984; Минкевич, 1976).
Этиловый спирт как горючее и сырье для биосинтеза. Интерес
к получению спирта из растительных материалов для примене-
ния его в качестве жидкого топлива и химического сырья по-
стоянно растет, особенно в странах с недостатком нефти, но
обладающих сельскохозяйственными ресурсами. В конце
XIX B. у›ке были попытки использовать этиловый спирт в качест-
ве горючего для автомашин. В ряде стран применяли смеси, со-
держащие в горючем от 10 до 25% этанола (Bossong, 1980).
В последние годы создан международный центр по вопросам
микробиологического производства топливного спирта. Прове-
дены успешные испытания автомашин с двигателем, работаю-
щим на 95%-HQM этаноле: 1 л этого горючего достаточно для
5 км пробега, а 1 л бензина — для 7,5 км. Однако в выхлопных
газах автомобилей, работающих на этаноле, содержится в 60
раз меньше окиси углерода, чем при использовании бензина
(Копп, 1977; Hadley, 1979; Yand, 1979).
70-е годы ознаменовались новым повышением цен на нефть
178
и бензин, что опять вызвало необходимость добавления спирта
в горючее. В США в начале 1979 г. уже более 1000 станций
обслуживания заправляли автомашины смесью, содержащей
до 10% спирта (газохол). Ожидается, что эта тенденция будет
усиливаться, Причем не только в США, но и в других странах.
В 80-е годы в США было объявлено о 10-летней программе рас-
ширения производства этанола из растительного сырья. Будет
интенсифицироваться и производство спирта из древесины
(Покровская, 1980).
Этиловый спирт-перспективное сырье и для микробиоло-
гической промышленности. В отличие от метанола он не токси-
чен, менее летуч и более эффективно потребляется микроорганиз-
мами. Накоплено достаточно много сведений об использовании
этанола для получения белка. Способ получения дрожжей, ути-
лизиружющих этиловый спирт, запатентован в ряде стран. Выход
биомассы колеблется от 55 до 80% от внесенного этанола. Эта-
нол усваивают и многие бактерии. Наиболее перспективные
продуценты белка-бактерии рода Acinetobacter. Они хорошо
растут на среде с этанолом без добавления витаминов и накап-
ливают до 10 г/л биомассы, а в некоторых случаях——до 24 г/л
(Коваленко, 1980; Харатьян, 1975).
Этанол-сравнительно дешевое сырье для микробиологиче-
ского получения аминокислот. Он является хорошим источником
углерода для производства лизина и глутаминовой кислоты с
использованием Brevibacterium И Carynebacterium. Ha среде
с этанолом выход глутаминовой кислоты повышается на 50%
(Бекер‚ 1980). Имеется сообщение о том, что этанол может быть
источником уулерода и энергии при получении пенициллина. На
среде с 10 об.% этанола его образуется до 410 ед/мл, а без эта-
нола — только 200 ед/мл.
Таким образом, этиловый спирт можно рассматривать не
только как горючее будущего, но и как перспективное сырье для
различных отраслей микробиологической промышленности, раз-
витие которой увеличит потребность в этиловом спирте.
Способы получения этанола. Издавна сырьем для производ-
ства этилового спирта микробиологическим способом служили
различные сельскохозяйственные и дикорастущие растения, со-
держащие сахар или крахмал: зерно, картофель, сахарная свек-
ла, сахарный тростник, фрукты и др.
Синтетический этанол получают путем каталитической гид-
ратации этилена, который составляет основную часть крекинго-
вых и попутных газов, образующихся при переработке нефти.
Однако предполагают, что в течение 20 лет производство синте-
тического этанола полностью прекратится и его будут получать
исключительно путем ферментации (Экспресс-информ. ���� 1982).
Производство спирта на основе гидролиза целлюлозосодер-
жащих материалов минеральными кислотами разрабатывалось
в Германии, США, СССР в конце Х1Х—начале ХХ в. В нашей
12’ 179
стране большой размах гидролизная промышленность получила
благодаря работам Шаркова (1907).
Производство спирта из гидролизатов целлюлозосодержаще-
го сырья более энергоемко, чем из глюкозо- и крахмалсодержа-
щего, так как для получения сбраживаемого сахара необходимы
более высокие температура и затраты на выделение и очистку
спирта, содержание которого в бражке из целлюлозосодержащего
сырья на порядок ниже (1‚0—1‚5 об.°/о)‚ чем в бражке, перера-
батываемой на заводах спиртовой промышленности из крахмал-
содержащего сырья (6—12 об.°/о спирта). Несмотря на это,
в ряде стран сочли целесообразным продолжить усовершенство-
вание способов гидролиза древесины с целью получения этанола
(Bhatia, 1980; Mendelsohn, 1981).
Получение спирта ферментацией целлюлозы. В 1976 г. появи-
лось сообщение о новой комплексной технологии получения
спирта, обеспечивающей наиболее полную утилизацию газетной
бумаги. Технология заключается в получении ферментативным
путем из целлюлозы глюкозы с последующим ее сбраживанием
дрожжами до этанола. Схема предусматривает поэтапное оса-
харивание бумаги целлюлазой Trichoderma отдав QM 9414,
затем спиртовое брожение и выращивание кормовых дрожжей
на отходах.
Процесс, Предложенный Wilke et а1. (1976), состоит в том,
что целлюлозосодержащее сырье—древесину, хлопчатобумаж-
ные ткани, рисовую и пшеничную солому, бумагу —— измельчают,
а затем осахаривают целлюлазой или культуральной жидкостью
микроорганизмов Trichoderma стае или Т. reesei. Полученный
раствор глюкозы сбраживают до спирта, используя дрожжи
Sacclzarorrzyces cerevisiae, Pichia или микроскопические грибы
Rhizopus javam‘/eus. Этот способ значительно увеличивает выход
Целевого продукта по сравнению с известным двухступенчатым
методом получения этилового спирта.
Была создана соответствующая установка, рассчитанная на
переработку 885 т газетной бумаги в депь при выходе конечного
продукта (глюкозы) 238 т 4%-ного раствора в день. Проектная
производительность установки, работающей на сконцентрирован-
ных гидролизатах, содержащих не менее 14,З°/о сахаров, равня-
лась 81,5 т 95%-ного спирта в день, а ежедневное производство
кормовых дрожжей, потребляющих отходы спиртового броже-
ния‚—— 32,8 т. На основании показателей энергетического балан-
са производственных и эксплуатационных расходов, а также
затрат, необходимых для организации производственного комп-
лекса, этот способ утилизации газетной бумаги был признан
рентабельным (W1'1ke et a1., 1976).
По расчетам Linko (1977), стоимость глюкозы для рента-
бельного производства из нее этанола не должна превышать 8
центов за 1 кг. Себестоимость глюкозы, получаемой фермента-
тивным путем, составляет пока 20-50 центов за 1 кг. Дальней-
180
Lune исследования были направлены на разработку экономично-
го процесса: на поиск более активного продуцента целлюлаз и
подбор с помощью методов селекции микроорганизмов, сбражи-
Вающих глюкозу в этанол с максимальным выходом.
Изучение ферментативного осахаривания целлюлозы фильт-
ратом культуральной жидкости riCl1oa‘erma отдав QM 9414
показало, что процесс ферментативного гидролиза наиболее
активно протекает при 45-50 °С‚ следовательно, целесообразно
использование термофильных штаммов дрожжей. Было установ-
лено, что выход этанола зависит от концентрации ферментов,
активности отдельных компонентов целлюлазного комплекса и
концентрации глюкозы. Присутствие целлюлаз не подавляет
накопление этанола в ферментативной среде, а увеличение кон-
центрации ферментов повышает его выход. Подобный процесс
ферментации возможен при применении различных целлюлозо-
содержащих субстратов (Blotkamp е: а1., 1978).
Фирма <<Галф Ойл» (США) израсходовала около 9 млн дол-
ларов на разработку способов Получения этанола из целлюлозо-
содержащих отходов, таких, как твердые городские, сельскохо-
зяйственные отходы и отходы производства бумаги. После ус-
пешной работы опытной установки производительностью 1т/сут
фирма создала установку производительностью 50 т/сут, а нозд-
нее была пущена в эксплуатацию установка производитель-
ностью 2 тыс. т/сут. Процесс получения этанола по способу фир-
мы <<Галф Ойл» основан на обработке предварительно подготов-
ленной суспензии с содержанием целлюлозы 7,5—15,0%
ферментами Trichoderma reesei целлобиогидролазой и Б-глюкози-
дазой. Образовавшуюся при этом глюкозу сбраживают в этанол
дрожжи Sacc/zaromyces cerevtfisiae, S. bergensis и Candida brasSi—
саг. В качестве сырья испытаны древесные опилки, кора деревь-
ев и стоки Целлюлозно-бумажного производства (Humphrey,
1980; В1ас1‹, 1980).
Получение этанола на основе кислотного или ферментатив-
ного гидролиза сельскохозяйственных отходов считают перспек-
тивным. США, например, располагают большим количеством
(300 млн т/год) неиспользуемых сельскохозяйственных отходов.
Если учесть, что ежегодная потребность США в этаноле состав-
ляет 112,5 млн гал, то расход сырья для ее удовлетворения не пре-
высит 2% отходов. Таким образом, имеющиеся ресурсы расти-
тельного сырья позволяют практически неограниченно увеличи-
вать выработку спирта (Sitton, 1979).
Kim (1981) изучен процесс получения этанола из размельчен-
ной рисовой соломы путем одновременного гидролиза целлюло-
зосодержащих компонентов соломы и сбраживания образующих-
ся при этом сахаров B спирт. Процесс предусматривает исполь-
зование целлюлаз грибов рода Trichoderma п культивирование
термофильных дрожжей Saccharomyces cerevisiae NCYC 716.
В течение этого процесса в среде не накацгиваегсн Цедтлобиоза
181
и тем самым устраняется ингибирование образования целлюло-
литических ферментов.
Мез-Нагтгее (1984) разработал способ ферментативного гид-
ролиза пшеничной или ячменной соломы и сбраживания, который
позволяет получать этанол с выходом, равным 75% теоретиче-
ского. Показано, что выход этанола зависит от способа обработ-
ки соломы и способа экстракции целлюлозы, а также от концент-
рации ферментного препарата целлюлаз. Установлено, что при
использовании комплекса целлюлолитических ферментов гриба
Trichoderma harzia/mm выход этанола выше, чем при гидролизе
целлюлозы ферментами гриба Trichoderma reesei. Это объясня-
ется более высоким содержанием [З-глюкозидазы в культураль-
ной жидкости Trichoderma harrianum.
Заслуживает внимания новый способ превращения твердых
бытовых отходов в этанол. Процесс утилизации включает си-
стему разделения органических и неорганических отходов, гид-
ролиз целлюлозы до глюкозы, сбраживание глюкозы и отгонку
этанола. Авторы предлагают два способа гидролиза целллюло-
зы: кислотный и ферментативный с одновременным сбражива-
нием сахара. Оба позволяют получать этанол с выходом, пре-
вышающим 80% теоретического (Laughlin, 1984).
Городские домашние отходы также могут служить сырьем
для получения этанола. В этом случае гидролиз осуществляют
в колонном реакторе целлюлазами Trwlzoderma reesei. Даже
при низких концентрациях субстрата за 48 ч гидролиза выход
сахаров составляет 45-50 %. B гидролизатах преобладает глю-
коза (60%), присутствуют также ксилоза (8,5%) и целлобиоза
(7%). Полагают, что процесс может быть улучшен путем пов-
торного использования Целлюлаз (Qlanet, 1985).
При сравнении экономических показателей различных спо-
собов производства этанола на основе целлюлозосодержащих
материалов, кукурузного зерна и этилена, полученного синтети-
ческим путем, ВЫЯВЛСНО, ЧТО СПИрТ ИЗ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ МОЪКЗТ бЫТЬ
конкурентоспособным на рынке, поскольку его себестоимость
равна 18,5 Цента да 1 л, коммерческая стоимость—38 центов
за 1 л, а текущая цена на спирт на мировом рынке в 1983 г. со-
ставляла 44 Цента за 1 л. При этом чистая прибыль при продаже
этанола из целлюлозы в 2 раза выше, чем при продаже синте-
тического этанола, и в 1,5 раза выше, чем при продаже этанола
из зерна. Расчеты были проведены для соответствующих заво-
дов одинаковой мощности (200 млн л B год 95%-ного этанола,
учитывая затраты на производство и коммерческую стоимость
этанола, полученного ферментативным путем с последующим
сбраживанием из целлюлозосодержащих материалов, кукуруз-
ного зерна или синтетическим путем из этилена с учетом цен
1983 г.) (Emert, 1980).
Критический анализ (Keim Кагго1, 1983) всех существующих
технологий получения этанола из растительного сырья показал,
182
что для того, чтобы спирт из возобновляемых видов сырья мог
эффективно конкурировать с нефтыю, необходимо разработать
более Эффективные проекты, ориентированные на непрерывные
процессы микробной ферментации. Кроме того, нужны одно-
стадийная ферментация, т. е. совмещение нескольких стадий
процесса в одном биореакторе, предобработка исходного сырья,
поиск и селекция новых штаммов Микроорганизмов,
Прямая микробиологическая трансформация. Особое вни-
мание привлекает способ прямой микробиологической транс-
формации целлюлозосодержащих субстратов в этанол, органи-
ческие кислоты и другие ценные продукты без предварительно-
го химического или ферментативного гидролиза.
Впервые такие работы появились в 1923 г. Langwell (1923)
выяснил, что при сбраживании целлюлозы термофильными бак-
териями образуется большое количество продуктов, представ-
ляющих большой практический интерес. Бактерии хорошо
сбраживали многие растительные материалы и, следовательно,
Могли найти применение в промышленности. Были выделены
бактерии, разлагающие целлюлозу с образованием этилового
спирта. Они хорошо развивались без доступа воздуха при 60——
65 °С, энергично разлагали целлюлозу и утилизировали угле-
воды с образованием спирта, уксусной и молочной кислот, угле-
кислоты, водорода. При сбраживании отработанного сухого
хмеля (отход пивоваренного производства) из 1 т сырья полу-
чали 180 л смеси спирта и органических кислот, а при сбражи-
вании солодовой дробины—320 л. Однако чистые культуры
бактерий не были выделены.
Fred (1924) сообщил, что при использовании целлюлозы
термофильные бактерии в течение 11 сут при 62—66°С разла-
гали от 60 до 80% исходной целлюлозы. В продуктах брожения
содержалось 56,8% уксусной кислоты и 10% спирта. Позже
удалось выделить бактерию——возбудителя брожения в чистой
культуре, которую назвали Clostridium thermocellum (Viljoen,
1926). Однако исследователи, работавшие в более поздний пе-
риод, сомневались в чистоте этой культуры, так как количество
продуктов брожения сильно варьнровало: спирта ~— от 5 до 25%,
уксусной кислоты——от 19,6 до 56,8% исходной целлюлозы.
В результате тщательных исследований этой культуры удалось
выделить еще два cnyTHHKa——Bacillus cereus var. m_I/Coides И
В. starotlzermophilus (Первозванский, 1935; Oates, 1964).
Поиск анаэробных бактерий. С целью интенсификации про-
цессов получения этанола из целлюлозосодержащего сырья
проводился поиск, выделение и идентификация природных
штаммов термофильных анаэробных целлюлолитических мик-
роорганизмов. Ng et а1. (1977) из различных природных источ-
ников выделено три грамотрицательных штамма бактерий, ко-
торые оказались облигатными анаэробами, образовывали тер-
минальные споры и росли на целлюлозе, выделяя при этом
183
желтый пигмент. По этим свойствам, а также по содержанию
суммы гуанина и цитозина (38,1——39,5 мол.%) выделенные штам-
мы были идентифицированы как Clostridium l‘h9rm0€ell1tm.
Кроме целлюлозы, бактерии ферментировали и производные
целлюлозы, но были не способны использовать для роста глю-
козу, ксилозу и другие моносахара. При культивировании на
целлюлозе в среде накапливались H2, CO2, этанол, лактат и
ацетат. Оптимальной для роста была температура 60—64°С.
Выделенные штаммы с одинаковой скоростью росли на среде с
целлюлозой и целлобиозой (Ng е’: а1., 1977).
Guiliano (1983) выделил три анаэробные мезофильные цел-
люлолитнческие культуры и Clostridium thermocellum. Изучена
способность указанных бактерий расщеплять целлюлозу, накап-
ливать сахара и другие продукты при культивировании на
среде с целлюлозой. Все культуры разгдагали хлопковую
целлюлозу, делигнифицированную целлюлозную пульпуи обра-
ботанную паром древесину. Наибольшей способностью к деграда-
ции целлюлозы обладали Clostridium I/Lermocellum и мезофиль-
ная бактерия 138-25, которые разлагали около 80% обработан-
ной древесины. Степень конверсии субстрата снижалась при
повышении концентрации до 10 г/л.
Термофнльньтй штамм Clostridium tlzermocellum B отличие
от мезофильных бактерий продуцировал больше этанола при
росте на целлюлозе, кроме этанола образовывались масляная,
молгочная и уксусная кислоты. мезофильные анаэробные бак-
терии кроме этанола накапливали в среде небольшое количе-
ство масляной и молочной кислот. Оба типа анаэробов образо-
вывали H2 и СО2, степень разложения целлюлозы была ниже у
мезофильных бактерий, чем у термофильной культуры, однако
мезофильные бактерии в конце процесса аккумулировали боль-
ше сахаров‚ Для мезофильного штамма PB-25 выход сахаров
составлял 14,5 г/л, или 50% общего количества использованной
целлюлозы. Среди сахаров преобладала глюкоза и целлобиоза.
Bender (1985) выделил шесть штаммов Clostridium thermo-
cellum И проверил их способность образовывать сахара, этанол
и уксусную кислоту на средах, содержащих целлюлозу, а Tak-
Же ЭДЗПТИрОВЗТЬСЯ K IIOBbII1I€HHbI1\’I КОНЦСНТРЗЦНЯМ aranoma И К
росту ири температуре 45°С. Для сравнения использовался
Clostridzzmz tlvermocellmn, описанный в работе Ng е’: а1. (1977).
Пять из шести выделенных штаммов синтезировали этанола на
7——15% больше, а два штамма накапливали на 45% больше
редуиирующих сахаров, чем стандартный штамм. Лишь один
штамм (МС-6) бьтстрее других адаптировался к росту в среде,
содержащей 2% этанола (Bender, 1985).
Поиск анаэробных бактерий—иродуцентов спирта из цел-
шолозы бь1л начат в наше стране в 1930 г. во ВНИИ спиртовой
промышленности. Первозванский (1933) для экспериментов ис-
иользовал элективные культуры бактерий, выделенные из кон-
184
ского навоза, которые поддерживались регулярным пересевом
в жидкую питательную среду с фильтровальной бумагой, в те-
чение трех-шести дней при 50 °С на среде с 4%-ной целлюло-
зой. При этом сбраживалось до 90% целлюлозы, выход спирта
составлял 15——20%, a органических кислот—30——40°/о. Позднее
это направление получило развитие в работах но изучению
накопительных и чистых культур термофильных целлюлолити-
ческих анаэробных бактерий (Логинова и др., 1966; Имшенец-
кий, 1953; Ротмистров, 1939).
В последние годы интерес к таким исследованиям возобно-
вился. При изучении микрофлоры горячих источников Бурятии
с температурой воды 50—60 °С выявлено, что ил и вода содер-
жат анаэробные термофильные спорообразующие бактерии.
Накопительные культуры целлюлолитических бактерий полу-
чены из образцов, содержащих ил или растительные остатки.
Из накопительных культур выделена чистая культура ClosZri-
dium thermocellum. Выявлено, что вегетативные и снорулирую-
щие клетки бактерии в начале ферментации плотно прикрепля-
ются к целлюлозе. В процессе ферментации клетки освобожда-
ются от нее, переходят в культуральную жидкость. Изучены
цитологические особенности вегетативных клеток и спор Cl0siri-
diam thermocellum, Толщина кортекса спор значительно превы-
шает его толщину у мезофильных бактерий, что, по-виднмому,
обусловливает их термоустойчивость (Храпцова. 1986).
Поиск, выделение и идентификация природных штаммов
термофильных анаэробных целлюлолитических микроорганизмов
проведены также Чувильской (1986). Из почвы и ила выделено
пять штаммов Clostridium thermocellum. Они имеют сходные
морфологию и культуральные свойства, близки по суммарному
содержанию гуанина и Цитозина в ДНК (37-40 MOJL0/0), соста-
ву продуктов ферментации целлюлозы и целлобиозы. Штаммы
различаются но скорости роста, накоплению биомассы, актив-
ности целлюлаз, а также по количеству и соотношению накап-
ливаемых продуктов.
Физиолого-биохимические особенности. Новые методы куль-
тивирования анаэробов и определения активности ряда фермен-
тов способствовали успехам в выделении чистых культур тер-
мофильных целлюлозоразлагающих анаэробных бактерий и
изучении их физиологии и биохимии (Hungate 1969).
Термофильные анаэробные бактерии как в чистой, так и в
смешанной культурах активно разрушают целлюлозосодержа-
Lune субстраты. Однако в ранних исследованиях все попытки
обнаружить в фильтратах культуральной жидкости целлюлоли-
тические ферменты не увенчались успехом. Было высказано
предположение, что вокруг бактериальной клетки создается
активная зона с высокой концентрацией целлюлазы, но она на-
ходится в непосредственном контакте с клеточной стенкой (Им-
шенеикий, 1953).
185
ЕпеЬо (1951) в опытах с чистой культурой Clostridium ther-
mocellulaseum было показано, что в культуральной жидкости
целлюлаза накапливается в значительных количествах при фер-
ментации целлюлозы. Оптимальными для действия целлюлазы
являются температура 55—60 °С и рН 5,6. Внеклеточная цел-
люлаза адсорбируется на измельченной целлюлозе. Ионы тяже-
лых металлов ингибируют целлюлазу, ингибирующий Эффект
уменьшается при добавлении к субстрату пептона.
Образование внеклеточных целлюлолитических ферментов
изучено также и в опытахс накопительной культурой термофиль-
ных целлюлолитических бактерий. Установлено, что максимум
активности целлюлаз совпадает с оптимальной темпера-
турой развития бактерий——65 °С. Исследовано также образо-
вание целлюлолитических ферментов в зависимости от содер-
жания в среде целлюлозы, времени сбраживания субстрата и
температуры. Обнаружено, что целлюлолитическая активность
резко возрастает в течение первых 3 сут в условиях культиви-
рования бактерии на среде с целлюлозой при 60 °С (Верх0вце-
ва, 1965; Логинова, 1966).
При определении скорости роста и образования целлюлаз
Clostridium thermocellum ВЫЯВЛЕНО, что изучаемые штаммы с
одинаковой скоростью растут на среде с целлюлозой и целло-
биозой. При культивировании на среде с целлюлозой синтези-
руется внеклеточная целлюлаза. Образование внеклеточной
целлюлазы по времени совпадает с ростом и расщеплением
целлюлозы (Ng е’: а1., 1977).
Ait е’: а1. (1977) из фильтрата культуральной жидкости ана-
эробных бактерий Clostridium thermocellum посредством пре-
паративного электрофореза B полиакриламидном геле получен
частично очищенный целлюлазный комплекс. В аналитическом
диск-электрофорезе целлюлаза характеризуется одной белко-
вой полосой с MM 125 O00-:1000O. Однако при электрофорезе в
присутствии додецилсульфата целлюлаза диссоциирует по мень-
шей мере на пять белковых компонентов. Авторы предположи-
ли, что целлюлаза существует в виде мультиферментного комп-
лекса.
Другие авторы при изучении образования целлюлазы выя-
вили, что Clostridium thermocellum И мутантный штамм с боль-
шей продукцией целлюлазы образуют эндо-Б-глюканазу и экзо-
Б-глюканазу при культивировании на питательной среде с цел-
люлозой или целлобиозой в качестве источника углерода. Не
менее 95% целлюлазы накапливается в питательной среде. По-
добрана питательная среда, позволяжющая на 60% увеличить
образование эндо-[З-глюканазы (Garsia-Martines е’: а1., 1980).
Проведена очистка и изучены свойства эндоглюканазы
Clostridium thermocellum. Эндоглюканаза (КФ 3.2.1.4) была
очищена, оптимум ее активности наблюдался при рН 5,2 и тем-
пературе 62 °С‚ наибольшую активность она проявляла по от-
186
ношению к карбоксиметилцелл1олозе, наименьщую—к микро-
кристаллической целлюлозе (Ng е: а1‚, 1981),
На ранней стадии роста Clostridium therznocezlum на целлю-
лозе обнаруживается два основных целлюлолитических фер-
метных комплекса. При электронномикроскопическом иссле-
довании видны сферические частицы: большой комплекс (MM
102- 105) И Малый комплекс (ММ 4,2-105). На среде с целлтоло-
зой целлюлолитическая ферментная система на ранних этапах
роста связана с субстратом. После потребления целлюлозы свя-
занные компоненты системы переходят в культуральную
жидкость в виде свободных ферментов (Coughlan е: а1.‚ 1985;
Ноп-патй е: а1‚, 1986).
Сравнивая внеклеточные целлюлазы Clostridium thermoCel-
[urn LQRI И мутанта Trichoderma reesei QM 9414, Ng, Zeikus
(1981) выявили существенные различия между бактериальны-
ми и грибными целлюлазами. Бактериальные целлюлазы были
высокоактивными и солюбилизировали микрокристаллическую
целлюлозу со скоростью, составляющей 1/4 скорости солюбили-
зации для грибных целлюлаз. Бактериальные внеклеточные
целлюлазы не содержали целлобиазу или (Зь-ксилозидазу, имели
более высокие величины отношения активности эндоглюкана-
за-экзоглюканаза, при кратковременном гидролизе микро-
кристаллической целлюлозы отщспляли длинноцепочные олиго-
сахариды вместо короткоцепочных и проявляли высокую актив-
ность и стабильность при температуре 60—70 °C.
B среде с авнцелом и карбоксиметилцел1люлозой бактери-
альная целлюлаза проявляла максимум активности при темпе-
ратуре 70°C и рН 5‚7-—6,1. B отсутствие субстрата карбокси-
метплцеллюлаза оказалась менее стабильной при температуре
70 °С‚ чем ферменты, гидролизующие авицел. Предположили,
что препараты целлюлазы, помимо эндоглюканазы, содержат
также Экзоглюканазу или целлобиогидролазу (Johnson et а1‚,
1982).
Головченко с сотр. (1985), исследуя состав целлюлазного
комплекса Clostridium thermocellum, определили активность и
локализацию различных целлюлолитических ферментов. Вне-
клеточный целлюлазный комплекс состоит из эндоглюканазы,
экзоглюканазы и экзоглюкозидазы. От 80 до 90% активности
целлобиазы, целлобиозофосфорилазы и целлодекстринфосфори-
лазы связано с клеткой.
Lamed et а1‚ (1983) изучали субъединичный состав и фер-
ментативнуло активность целлюлозосвязывающего фактора,
связанного с поверхностью клеток Clostridium thermocellum.
Субъединицы, обладающие эндо- и экзоцеллюлазной актив-
ностью, находятся внутри белкового комплекса, отвечающего за
связывание с целлюлозой и эффективный ее гидролиз.
Изучено взаимодействие клеток и адгезия различных штам-
мов Clostridizmz thermocellum на волокнах целлюлозы различ-
187
ного происхождения и нерастворимых агрегатах гемицеллюло-
зы из древесины. Количество клеток, адсорбированных на ге-
мицеллюлозе, значительно меньше, чем на целлюлозе, адгезия
подавляется в присутствии смеси ксилозных олигомеров (выше
0,25%). Добавление к культурам, развивающимся на целлюло-
зе или гемицеллюлозе, 0,15% КСИЛОЗЬ}, 0,2°/о глюкозы или 0,10/0
целлобиозы ингибирует или полностью подавляет прикрепление
клеток к волокнам (Wiege1 et а1., 1984).
Вызывают интерес сведения о том, что Clostridiurrz thermo-
cellum наряду с целлюлазами способны образовывать пектина-
зы. Это расширяет возможности использования разнообразных
растительных субстратов и отходов.
При культивировании на свекловичном жоме в качестве ос-
новных продуктов Clostridium fhermocellum образует ацетат,
сукцинат, этанол, Нг и метанол. Образование метанола свиде-
тельствует о том, что бактерии продуцируют пектиназы (ОШ-
ver et а1., 1985). Изучена способность Clostridium thermocellum
АТСС 27405 использовать для роста и образования этанола мо-
дельные пектины, моно- и полигалактуроновые кислоты и свек-
ловичный жом, содержащий до 20% пектина. Бактерии утили-
зируют Полигалактуроновую кислоту (но не моногалактуроно-
вую), накапливая при этом главным образом уксусную кислоту
и незначителньое количество этанола. Хорошо они растут и на
среде с модельными пектинами, накапливая в ней метаиол
(1‚5 г/л) в качестве основного продукта ферментации. За 80 ч
ферментации расщепляется 70% пектинов. В процессе роста
клеток на питательной среде с пектином повышается активность
пектинолитических ферментов—пектингидролазы и пектинлиа-
зы (Spinnler е’: а1., 1986).
источники углеродного питания и накопления метаболитов.
Сведения об отношении чистых культур термофильных целлю-
лолитических бактерий Clostridium thermocellum к углеродно-
My источнику питания довольно противоречивы. Некоторые ав-
торы считают, что чистые культуры способны усваивать целлю-
лозу, гемицеллюлозу, целлобиозу, ксилозу (но не глюкозу) на
питательной среде с 0,05% дрожжевого экстракта (Мсвее,
1950). Другими исследователями выявлено, что эта же культу-
ра усваивает глюкозу и фруктозу при увеличении содержания
дрожжевого экстракта в питательной среде до 0,45% (Имше-
нецкий, 1953; Ратпй et а1., 1971). Высказывалось мнение и о
том, что термофильные Целлюлолитические бактерии, напоми-
нающие Clostridium tnermocellum по морфологии и усваиваю-
щие глюкозу, возможно, принадлежат к другим видам (Ng et
а1., 1977).
В 1981 г. появилось сообщение Gomez и сотр. о том, что клетки
Clostridium thermocellum используют глюкозу в качестве един-
ственного источника углерода только после длительного (12—
30 ч) лаг-периода. Адаптированные к глюкозе бактерии при
188
инкубации в среде с глюкозой и целлобиозой сначала утилизи-
руют глюкозу, а затем целлобиозу. Клетки, предварительно не
адаптированные к глюкозе, не могут ее использовать. Авторы
предположили, что процесс адаптации связан с индукцией сис-
темы транспорта глюкозы. Клетки Clostridium thermocellum не
растут на питательной среде, содержащей ксилан, хотя на сре-
де с целлобиозой обнаруживается ксиланазная активность
(Garsia—Martinez et а1., 1980). По наблюдениям Spinnler et а1.
(1986), Clostridium ihermocellum АТСС 27405 обладает целлю-
лолитической и ксиланолитической активностью.
При ферментации целлюлозосодержащих материалов Clo-
sfria'z'um thermocellum B среде накапливаются продукты гидро-
лиза целлюлозных и гемицеллюлозных компонентов. При этом
преобладают сахара, которые появляются в большом количест-
ве. При культивировании на среде с Целлголозой (начальная
концентрация 25 г/л) в условиях неконтролируемого рН обра-
зуется до 14 г/л сахаров. В смеси сахаров глюкозы—7 г/л,
целлобиозы —— 3,5, ксилобиозы —— 3, ксилозы —0,5 г/л (Gordon,
Сооиеу, 1981).
Имеются данные о том, что в среде без буфера выход этанола
снижается и удлиняется время его образования. При переме-
шивании культуральной жидкости выход этанола также пони-
жается, что авторы объясняют инактивацией ферментов, участ-
вующих в гидролизе целлюлозы (Zertuche, Zall, 1982).
Бактерии Clostridium thermocellurrz способны конвертиро-
вать целлюлозу в этанол в одностадийиом процессе. Однако в
отличие от дрожжей эти анаэробные бактерии сильно ингибиру-
ются сравнительно низкими концентрациями этанола (5 г/л).
Исследована толерантность к этанолу Clostridium thermocellum
АТСС 27405 и устойчивого к нему мутанта С9 при различных
концентрациях этанола и разной температуре. Показано, что
после добавления в среду повышенных концентраций этанола
рост Clos/ridium thermocellum продолжается с нормальной ско-
ростью в течение 1-—2 ч, после чего он прекращается. Длитель-
ность задержки роста зависит от инокулгома (Неггего, Gomez,
1980).
Методом серийных пассажей на среде с возрастающими
концентрациями этанола получен Clostridium flzermocellum
5-4, устойчивый к 40 г/л этанола. Этот штамм применяли для
прямой конверсии очищенной целлюлозы в этанол в периодиче-
ском режиме культивирования. Выявлено, что выход этанола
возрастает с увеличением температуры и составляет 0,08; 0,12;
0,20 г/г целлюлозы, если ферментация проводится соответствен-
но при 50, 55, 60 °С. Удельная скорость роста и время образова-
ния этанола в оптимальных условиях ферментации целлюлозы с
помощью мутантного штамма равны соответственно 0,13 кг‘ и
7,7 ч (при 60 °С и 1% иеллюлазного субстрата). При рН 7,2
(или в присутствии высоких концентраций этанола) происходит
189
ингибирование роста бактерий и образование спирта (Соопеу ей
а1., 1978; Zertuche, Zall, 1982).
Исследовано действие конечного продукта этанола на ана-
эробные бактерии Closlridium thermocellum при выращивании
на целлобиозе. В процессе адаптации к этанолу увеличивается
содержание фосфатсахаров. Эти данные свидетельствуют о
том, что ингибирование этанолом связано с подавлением глико-
лиза (Неггего ей а1., 1985).
Рост Clostridium thermocellurn ингибируется карбоновыми
КИСЛОТЗМН, В ОТЛИЧИЕ ОТ СПНрТОВ КИСЛОТЫ ВЫЗЫВЭЮТ СНИЖВНИС
скорости роста бактерий. Концентрация, при которой скорость
роста снижается на 50%, возрастает в ряду масляная——про-
пионовая—(3-оксимасляная—уксусная кислоты, Устойчивый к
спирту мутант Clostridium thermocellum 0Ka33JICH устойчивым
и к действию кислот (Неггего ей а1., 1985).
Вгепег, Johnson (1984) исследовали рост бактерий Closi-
ridium thermocellum И активность образования этанола в усло-
виях периодической ферментации при различной начальной
концентрации целлобиозы. Наилучшие показатели выхода эта-
нола отмечены при концентрации целлобиозы 0,8%. Если по-
следняя превышает 5%, рост бактерий прекращается.
Термофильное анаэробное разложение целлюлозы в приро-
де рассматривается как сложный процесс. Собственно целлю-
лолитические бактерии—-первое звено микробного ценоза.
Продукты разложения целлюлозы служат источником углерода
для других групп микроорганизмов. Поэтому на элективных
средах с целлюлозой выделяют не только целлюлолитические
бактерии, вызывающие ее осахаривание, но и ассоциации микро-
организмов.
Сахарова и др. (1983) показали, что из шести бактериаль-
ных штаммов, входящих в термофильную смешанную культуру,
только один, идентифицированный как Clostridium sp., эффек-
тивно деградирует микрокристаллическую целлюлозу. Опти-
мальное содержание целлюлозы находится в пределах 1—2%.
Скорость утилизации углеродного источника снижается при
более высоких концентрациях микрокристаллической целлюлозы
(3—10%). Образующиеся сахара (5—60 мг/л) ингибируют раз-
ложение целлюлозы.
Обнаружены бактериальные штаммы, продуцирующие эта-
нол и способные эффективно «работать» в анаэробных условиях
при высоких температурах. Это бактерии Thermoanaerobacter
81‘/zcmolicus, характеризующиеся исключительно широкой суб-
стратной специфичностью в отношении углеводов и сохраняю-
щие жизнедеятельность в широком диапазоне температур. Саг-
гейга ей а1. (1983) показали возможность получения этанола при
помощи Thermocmaerobacter ethcmolicus ИЗ отходов целлюлоз-
но-бумажной и пищевой промышленности, пищевых отбросов и
отходов сельскохозяйственного производства. Целлюлоза при
190
анаэробной ферментации трансформируется до Целлобиозы и
глюкозы, которые далее превращаются в этанол.
Из горячих источников Wiegel, Ljungdahl (1981) выделили
неспорулирующие термофильные анаэробные бактерии Тиегто-
anaerobacter ethcmolicus, которые растут при температуре 38——
78 °С, рН 4,4—9,9 и сбраживают рибозу, ксилозу, целлобиозу,
сахарозу, крахмал, образуя этанол и СО; с Небольшим количе-
ством лактата и ацетата. При этом наблюдается очень высокий
Выход этанола —— 1,8 M на 1 M использованной глюкозы. У дру-
гих этанолобразующих бактерий, кроме Zymomo/ms, этот по-
казатель составляет лишь 0,5—1,0 М.
Сагге1га и сотр. (1983) определили продукты, образуемые
Thermocmaerobacter ethanolicus ATCC 31550. Показано, что при
сбраживании различных источников углерода (глюкозы, ман-
нозы, галактозы, рибозы, ксилозы, целлобиозы, крахмала, пек-
тина) до этанола и (302 в небольших количествах образуются
лактат, ацетат и Нг. После УФ-обработки получен мутант, на-
капливающий до 2% этанола. Исходный же штамм накапливал
всего 0,5°/о. Эффективность трансформации целлюлозосодержа-
Щего сырья возрастает при применении для ферментации
Thermocmaerobacter ethcmolicus совместно с Clostridium ther-
mocellum. Поскольку бактерии, продуцирующие этанол, быстро
усваивают углеводы, то ингибирование целлюлолитических
ферментов продуктами расщепления целлюлозы заметно сни-
жается и скорость ферментативного гидролиза целлюлозы воз-
растает. Проведенные расчеты показали перспективность по-
лучения этанола из целлюлозного сырья и отстоя сточных вод
пищевых производств при помощи бактериальных штаммов,
продуцирующих этанол. По мнению Miller (1979), дрожжи ме-
нее пригодны для получения жидкого топлива из растительного
сырья, так как скорость процесса образования этанола из цел-
люлозосодержащих субстратов значительно ниже.
использование ассоциаций для биоконверсии целлюлозы.
Ряд авторов считают, что технологические процессы получения
различных видов жидкого топлива, включая этанол, из продук-
тов гидролиза целлюлозы и гемицелюлозы наиболее перспек-
тивны, так как ферментация углеводного сырья не требует
применения сложного оборудования, больших капитальных за-
трат и субстратами могут быть отходы целлюлозно-бумажной и
пищевой промышленности, а также нестандартные продукты
(овощи, фрукты, зерновые и целюллозосодерэкащие отходы
сельского хозяйства).
Гидролиз целлюлозы, гемицеллюлозы и предобработка ор-
ганическими растворителями требуют больших затрат. K тому
же возникает проблема удаления кислоты из продуктов гидро-
лиза и регенерации растворителей. Для прямого превращения
целлюлозы и гемицеллюлозы в этанол пригодны анаэробные
целлюлолитические бактерии Clostridium lhermocellum LQ 8.
191
Эффективность процесса значительно повышается, если для
усвоения пентозных сахаров дополнительно вводится Clostri—
dium lhermosaccharolyticum (Flickinger, 1980).
Avgerinos et a1. (1981) показали, что Clostridium thermocel—
[urn выделяет в среду целлюлазные и ксилазные ферментные
комплексы. Если штамм Clostridium thermocellum 5—7 выращи-
вать на среде с измельченным фуражным зерном, то образу-
ются гексозь1 и пентозы. Часть гексоз превращается в этанол и
органические кислоты, оставшиеся пентозы сбраживаготся до
этанола Cl0‘stridiLmz t/zermosacc/zarolyticum, И таким образом
повышается общий его выход. При ферментации зерна смешан-
ной культурой выход этанола составляет 50% теоретического.
Если для ферментации использовать целлюлозный субстрат,
лишенный лпгнина, то выход этанола повышается до 85% тео-
ретического.
Cl0stridium t/zerrnocellum LQRI не растет на среде с ксило-
зой и ксиланом, но сбраживает различные виды целлюлозы,
глюкозу, целлобиозу и образует этанол п ацетат в равных no-
ЛИЧССТВЭХ. При выращивании на среде с целлюлозои в культу-
ральной жидкости обнаруживаются также глюкоза. целлобио-
за, ксилоза и ксилобиоза.
Монокухгьтура Clostridium fhermo/zya’/'05ulfuricum 39E не
растет на средах с ксиланом или целлюлозой, но сбраживает
ксилозу, глюкозу, целлобиозу. При совместном культивировании
Cldsfridium thermocellum И Clostridium t/zermohydrosulfuricum
сбраживаются различные виды целлюлозы. Выход этанола в
3 раза увеличивается, а выход ацетата в 2 раза снижается по
сравнению с монокультурои Clostridium lhermocellum. При до-
бавлтении очищенной целлюлозы к культуре Clostridium tl1€r-
mo/zydrosulfuricum выход этанола из целлюлозы возрастает в
5—7 раз. Стабильная совместная культура, содержащая равное
количество клеток каждого вида, активно растет при 60°С.
Наибольший выход этанола наблюдается на среде с целлюло-
зой MN 300——l,8 M Z~)TaHOJIa на 1 M глюкозы (Ng е’: а1.‚ 1981).
Поскольку ксилаи является важным компонентом расти-
тельных субстратов, представляют интерес микроорганизмы,
утилизирующие ксилан. Выделена культура Clostridium BW,
которая не только гидролизует ксилан, но и сбраживает продук-
ты его гидролиза (Сгеигет е’: а1., 1983).
Мезофпльные анаэробные целлюлолитические бактерии раз-
лагают целлюлозу с образованием ацетата, этанола, СО2, H2 и
сахара. Бактерии отличаются от термофильного штамма Clo-
stridium llzermocellum не только по диапазону оптимальных
температур культивирования, но также и тем, что они утилизп—
руют продукты гидролиза растительных полисахаридов О-кси-
лозу и Ь-арабинозу. При 40°С целлюлоза разлагается мезо-
фильными бактериями так же, как Clostridium thermocellum
разлагает целлюлозу при 60°C. Следовательно, мезофильные
192
штаммы способствуют анаэробному разложению растительных
полимеров (Leschine et а1.‚ 1983).
Le Ruyet Pascale et а1. (1984) из накопительных культур
выделили строго анаэробные термофильные бактерии, облада-
юЩпе морфологическим сходством с родом Clostridium. Для
этих штаммов характерны наличие слабой целлъюлолитической
активности или полное ее отсутствие и вместе с тем способность
сбражпвать ксилан, крахмал и различные сахара. При этом
основным конечным продуктом является лактат. Описан Clo-
stridium cellulovorcms Sp. пои, использующий в качестве суб-
страта целлюлозу, ксилан, пектин, целлобиозу, глюкозу, галак-
тозу‚ сахарозу, лактозу, маннозу. При росте на целлюлозе обра-
зуется ацетат, бутират, формиат и лактат, а также H2 И СО2
(Sleat е’: а1., 1984).
Wiegel е’: а1. (1985) проанализированы различия в деграда-
ции ксилана у разных нецеллюлолитических термофильных
анаэробов и Clostridium thermocellum. C помощью специальной
предобработки, включающей паровой взрыв и экстракцию, из
древесины получили различные фракции гемицеллюлозы с пре-
имущественным содержанием ксилозы, ксилоолигомеров и кси-
лана. Культура Clostridium thermocellum вначале утилизирует
высокомолекулярные фракции ксилана со степенью полимери-
зации 15—40 ксилозных единиц. В процессе роста в среде на-
КЭПЛИВЗЮТСЯ КСИЛОЗЭ И КСИЛООЛНГОСЗХЭрИДЬК. Последние ИС-
пользуются клетками после длительной лаг-фазы (100 ч) тогда
как ксилоза утилизируется очень слабо.
В противоположность этому бактерии Cl0sl'rid1'umt/1ermo-
hydrosulfuricum (оптимальная температура 70 °С) и Thermo-
cmaerobium brockii (70 °C) утилизируют ксилозу в первую оче-
редь и только после этого начинают потреблять ксилоолигоса-
хариды со степенью полимеризации от 2 до 5. Эти бактерии
очень Медленно разлагают ксилоолигосахариды со степенью
полимеризации больше 6. Theymoanaerobacter ethcmolicus,
Thermobacteroides acetoethylicus и Clostridium t/1eymosaccha-
rolyticum предпочтительно утилизируют ксилозу и используют
ксилоолигосахариды со степенью полимеризации 2-6 и выше.
Нецеллюлолитпческие организмы на среде с ксилоолигосаха-
ридами образуют этанол, лактат, ацетат, CO2 И H2 (“деды е’:
а1., 1985).
Тапака и Shimomura (1986) выделены мезофильная и три
термофилгьные культуры Clostridium sp., разлагающие ксилан.
Продуктами сбраживания ксилана мезофильной культурой
Clostridium эр. являются этанол, уксусная кислота, Н2 и СО2.
Термофильные бактерии разлагают ксилан с образованием мас-
ляной кислоты в качестве основного продукта.
Ng И Zeikus (1982) исследованы различия метаболизма цел-
лобиозы и глюкозы у Clostridium thermocellum и Clostridium
thermohydrosulfuricum, образующих вместе устойчивую acco-
7
13 Зак. 966 193
Циацию. Clostridium thermohydrosulfuricum повышает выход
этанола при сбраживании целлюлозы в ассоциации, этот мик-
роорганизм предпочитает глюкозу целлобиозе в качестве энер-
гетического субстрата. Методом метки установлено, что ско—
рость поглощения клетками глюкозы выше, чем целлобиозы, а
урожаи клеток, выращенных на глюкозе и целлобиозе, близки.
Для Clostridium thermocellum, напротив, целлобиоза предпо-
чтительнее, чем глюкоза, но скорость роста на обоих субстратах
пижс, чем у Clostridium thermohydrosulfuricum. Скорость по-
глошения обоих субстратов одинакова, однако урожай клеток
на Целлобиозе почти вдвое выше, чем на глюкозе.
Изучено образование этанола алкогольтолерантным штам-
мом Clostridium thermohydrosulfuricum 39EA при изменении
температуры от 45 до 68 °С, который был получен в процессе
адаптации исходного штамма к повышаиюшимся концентрациям
спирта. Этот штамм превосходит исходный по скорости роста и
выходу этанола. При использовании мутанта в промышленных
условиях возможна биоконверсия ксилозы и глюкозы в этанол,
выход этанола составляет более 4% (Lovitt е’: а1., 1984).
С Целью повышения скорости ферментации целлюлозы и
устранения ингибирующего эффекта конечных продуктов на
целлюлазы были объединены процессы осахаривания целлюло-
зы культурой Thermomonospora И сбраживания образуемых про-
дуктов бактериями Clostridium thermocellum. Кроме того, ком-
бинированную ферментацию целлюлозы проводпли с ПОМОЩЬЮ
целлюлазы Thermomonospora эр. и целлюлолитических ксилозо-
усваивающих термофильных анаэробов. В обоих случаях полу-
чен высокий выход этанола. При добавлении нецеллюлолитиче-
ского организма, способного утилизировать ксилозу, система
может осуществлять ферментацию гемицеллюлозных и целлю›
лозных компонентов растительной массы в этанол (Alexander
et a1., 1981).
С целью оптимизации роста Clostridimn thermocellum на
Целлюлозе и предобработанных древесных субстратах после›
довательно культивировали Clostridium thermocellum И Zym0mo—
nus anaerobic: H добавляли целлобиазу, при этом выход этанола
составлял 1,8 мг/мл (Saddler, Chan, 1982).
Для получения этанола из гидролизатов древесины, содер—
жаЩих целлобиозу‚ глюкозу и ксилозу, Asther И Khan (1985) ис-
пользовали Zymomonas anaer0bia И устойчивыйкспирту штамм
Clostridium saccharozyticum. При культивировании исходного
штамма Clostridium saccharolyticum на среде с 7% этанола
отобран мутант, устойчивый к этанолу. Этот мутант утилизиру-
ет Целлобиозу с большей, а глюкозу с меньшей скорость‹ю, чем
исходный штамм. Смешанная культура на среде с 13% сахаров,
из которых 60% приходится на глюкозу, образует 5% этанола,
чистая культура Zymomonas апаего1ш2—только 3,70/0, a чистая
культура Clostridium saccharolyticum накапливает до 11 г/л
194
ацетата, который ингибирует рост. Преимуществом совместной
культуры для получения этанола из гидролизатов древесины
по сравнению C применяемыми в настоящее время дрожжами
является способность утилизировать целлобиозу и ксилозу.
Гидролиз целлюлозы можно интенсифицировать путем оп-
тимизации условий культивирования Clostridium thermocellum.
Так, снижение рН среды до 6,5 приводит к подавлению синтеза
уксусной кислоты (Volfova et а1., 1983). С целью повышения
скорости конверсии целлюлозы в этанол культивирование Clo-
тащит thermocellum ATCC 27405 проводили C подпиткой.
В этих условиях концентрацию этанола около 8 г/л удалось‘
получить за более короткий период, чем без подпитки. При
этом максимальная продуктивность равнялась 1,0 г этанола на
1 г целлюлозы (Spirmler, 1986).
Имеется сообщение о непрерывной ферментации термофиль-
ной смешанной культурой, содержащей Closfridium thermoce[—
шт, в реакторе с восходящим потоком при рН 6.8~—7,2 Н 02 °С.
Проводили сбраживание 3—‘%-Hofl суспензии волокон неис-
пользованной компьютерной бумаги (содержание целлюлозы
75%). Процесс продолжался 100 сут при ежедневном добавле-
нии 25—28 г субстрата. Концентрация спирта на выходе реак-
тора составляла 1——2 Г/Л, а уксусной кислоты ——3,4 г/л (Kleijn—
tjens et а1., 1986).
Получение органических кислот и растворителей. Представ-
ляет также практический интерес получение из целлюлозы ор-
ганнческих кислот: уксусной, масляной и др. Le Ruyet ct a1.
(1984) изучена способность к росту и ферментации целлюлозы
(ватман СС31) чистых культур Clostrirlium thermocellum и Ace-
fogenium кбит, а также ассоциации, составленной из этих мик-
роорганизмов. Ацетатобразутощие термофильные анаэробные
бактерии Acefogenium мои: сбраживают глюкозу и фруктозу,
но не целлюлозу и целлобиозу. Скорость ферментации целлю-
лозы чистой культурой Clostridium thermocellum зависит от рН
среды. При рН 7,4 бактерии полностью сбраживают целлюлозу
за два дня инкубации, при этом основными конечными продук-
тами являются этанол и ацетат. Максимальная скорость дегра-
дации целлюлозы в этих условиях 470 Mr/(J1-Ir‘). При такой
ферментации в среде не обнаруживаются редуцирующие саха-
ра. При рН 6,8 бактерии значительно медленнее разрушают
11елл-к‚.гтозу—48 мг/(л-ч“), в среде определяется большое ко-
личество редуцирующих сахаров.
При совместном культивировании двух культур (рН 6,8)
основным конечным продуктом является этанол. Культура не
накапливает в среде сахара. Это стабильный асеоциат, превра-
щающий 1 M целлюлозы в 2,7 M ацетата (Le Ruyet et al., 1984).
Khan (1986) исследовал причину образования бутирата
целлюлолитическими анаэробными бактериями, которые сами
не образуют эту кислоту. Обнаружено присутствие бактерий рода
13* 195
Clostridzum, образующих масляную кислоту. В чистой культуре
эти бактерии продуцируют этанол, ацетат, бутират, СО2 и Н;
при температуре 35 °С и рН 7-8. В совместной культуре с цел-
люлолитическими анаэробами они способствуют разложению
целлюлозы путем удаления глюкозы и целлобиозы, которые не
используются целлюлолитическими анаэробами и ингибируют
их рост. Отмечено, что при культивировании смешанной куль-
туры на среде, содержащей целлюлозу и глюкозу, деградация
целлюлозы и рост целлюлолитических анаэробов ингибируются
H2. Ha рост бутиратобразующих бактерий H2 не влияет.
Среди микроорганизмов, разрушающих целлюлозу с обра-
зованием уксусной кислоты, вызывает интерес Acetivibrio cel-
lulolyticum. Мезофильный организм выделен накопительным
методом из ила сточных вод при рН 6,5——7,7, температуре 20-
40 °С. При оптимальной температуре 35 °С и рН 7,0 этот микро-
организм утилизирует целлюлозу, целлобиозу и салиции с об-
разованием уксусной кислоты, водорода и углекислого газа
(Patel, 1982).
Метаболизм /lcetivibrio cellulolyticum изучен при оптималь-
ных условиях роста на глюкозе, целлобиозе и кристаллической
целлюлозе. Установлено, что глюкоза используется только пос-
ле адаптации и при концентрации ее в среде не менее О,15%.
Скорость сбраживания ЦОЛЛЮЛОЗЫ достигает 0,18 г/(л-ч-Ч, в
среде накапливается целлюлаза. Продуктами брожения клет-
чатки являются Н2, СО2, ацетат, этанол и сахара. Этанол в кон-
центрации 0,2 г/л снижает скорость роста указанных бактерий
(Patel, 1982).
Armstrong (1983) установил, что в условиях контролируе-
мого рН основным продуктом разложения целлюлозы культу-
рой Acetioibrio cellulolyticum СЛУЖИТ Этанол, а при неконтроли-
руемом рНм ацетат, Этанол в концентрации 0,3% и выше ин-
гибирует рост бактерий, неадаптированных предварительно к
Этаиолу. Адаптированные к этаполу клетки выдерживают в
T раз более высокие концентрации этанола, чем первоначаль-
ные. Снижение редокс-потснциала среды увеличивает образова-
ние этапо та.
Saddler и Khan (1979) исследовали, как влияют различные
условия культивирования на деградацию целлюлозы бактерией
Васгегойаез succinogenes. Оптимум рН для роста равен 7,0,
температуры — 37 °С. При культивировании в среде с целлюло-
зой образуются H2, СОЕ, уксусная кислота и редуцирующие са-
хара, главным образом глюкоза и целлобиоза. Глюкоза этими
бактериями не используется.
Целлюлолитические анаэробные бактерии, способные сбра-
живать только целлюлозу и целлобиозу, выделены из ила сточ-
ных вод. Эти бактерии отнесены к Bacteroides ccllulosolvens.
При росте их на целлюлозе или целлобиозе в среде обнаружи-
ваются уксусная кислота, этанол, следовые количества молоч-
196
ной кислоты, H2 и CO2. Эти бактерии не растут на среде с глю-
козой (Murray, 1984).
Однако Guiliano И Khan (1984), исследуя образование цел-
люлазы и сахаров Bacteroides cellulosolvens, отметили, что глю-
коза утилизируется, но клетки бактерий лишены В-глюкозидазной
активности. На среде с целлюлозой (5о11‹а Floc) накапли-
ваются целлобиоза‚ глюкоза и ксилоза. Позднее этими же авто-
рами установлено, что целлобиоза и глюкоза, а также (в мень-
шей степени) ксилоза оказывают ингибирующее действие на
образование сахаров целлюлолитическнми анаэробными бате.
риями Bacteroides cellulosolvens при культивировании на среде
с целлюлозой. Бактерии в стационарной фщс роста осущест-
вляют конверсию целлюлозы в сахара. При переходе с перио-
дического культивирования иа непрерывное выход сахаров со-
ставляет 32 г/л, Бактерии не снижают своей активности в тече-
ние 18 дней (Ciuiliano, Khan, 1985).
Murray (1986) исследована деградация бактериями Bacte-
roides cellulosolvens различных целлюлозосодержащих субстра-
тов: кристаллической целлюлозы, фильтровальной бумаги, хлоп-
ка, размолотой пульпы, Solka Floc И обработанной паровым
взрывом древесины, Эти бактерии способны к деградации Цел-
люлозы в количестве 20 г/л. Целлюлоза и гемицеллюлоза фер-
ментируются целлюлолитическим анаэробом до H2, CO2, уксус-
ной кислоты, этанола и молочной кислоты, Аккумуляция H2
приводит к замедлению скорости роста и изменяет метаболизм
в сторону образования этанола.
При изучении интенсивности ферментации целлюлозы чи-
стой культурой Bacteroicles cellulosolve/25 И в случае ассоциации
ее с культурой Clostridium saccharolyticum выявлено, что в ус-
ловиях смешанного культивирования целлюлозы ферментиру-
ется на 33% больше. Автор считаст, что связь культур основана
на взаимозависимости, при которой целлюлолитические бактерии
снабжают Clostridium sacs/zarolyticum питательными вещества-
ми, а последние в свою очередь удаляют из среды метаболиты,
ингибирующие рост Целлюлолитических анаэробов (Murray,
1986).
В связи с тем что в США стоки, образуемые при переработке
древесины, являются одним из основных отходов, содержащих
сахара, Согпреге (1983) сделана попытка выделить культуры,
способные превращать сахара этих отходов в нейтральные рас-
творители, главным образом в бутанол, ацетон, 2-пропанол, эта-
нол. Отходы деревообрабатывающей промышленности вклю-
чают щелока, гидролизаты и различные жидкости, применяе-
мые для промывки. Бактерии выделяли методом накопительных
культур. Всего выделено 240 штаммов, образующих бутанол,
29 из них образуют более 3% растворителей.
Hayashida И сотр. (1983) показали, что бактерии pom Cl0—
stridium при росте на среде с 1% целлюлозы синтезируют эта-
197
нол, н-бутанол, уксусную и масляную кислоты. Целлюлоза под-
вергается расщеплению на 80%.
Petidemange И сотр. (1983) описали одностадийный процесс
ферментации целлюлозы с использованием целлюлолитических
бактерий, усваивающих глюкозу. Монокультура Clostridium
H10 за девять дней инкубации расщепляет 34% внесенной цел-
люлозы Solka Floc И 25% целлюлозы MN 300. Через 48 ч после
подсева культуры Clostridium acetobutyricurn (при рН 7,0) сте-
пень расщепления целлюлозы достигает 85—100%. B среде
накапливаются масляная и уксусная кислоты, бутанол и этанол.
Yu (1985) исследовал образование бутандиола из лигноцел-
люлозных субстратов при последовательном культивировании
Clostridiurn Zhermocellum 2688 и Klebsiella pneumoniae. B pe-
зультате разложения целлюлозы и гемицеллюлозы культурой
Cl0srrz'diLzm tlzermocellum (при 60 °С в течение 3 сут) в среде
накапливается до 5% восстанавливающих сахаров и около
1% этанола. Последующая ферментация сахаров в течение
4 сут при 37 °С проводилась с помощью Klebsiella pneumorziae
АТСС 8724, при этом образовывался 2,3-бутандиол (до 1,5°/о).
Применение периодического процесса с подпиткой (добавление
по 1% опилок в момент инокуляции Klebsiella pneumozziae И че-
рез 2 сут ферментации) позволило повысить выход бутандиола
до 4%, этанола—до 2,5%. Этим же автором показано образо-
вание бутанола из целлюлозных материалов при последователь-
ном культивировании Closrridmnz thermocellzmz И Clostridium
acctobuZylz'cLm1. Клетки бактерий Closmdium thermocellum
NRCC 2688 выращивали на целлюлозе Solka Floc или на смеси
ее с ксиланом из осины при 60 “C B течение 3 сут. Затем добав-
ляли 5 об.% культуры Closzridmm acetobutylicum ATCC 824,
и дальнейшую ферментацию вели при 37 °С в течение 2-4 сут.
При подобном способе утилизации целлюлозных материалов
общий выход продуктов увеличивается более чем в 2 раза, при-
чем основными являются уксусная и масляная кислоты (но не
растворители). При ферментации глюкозы образование кислот
в смешанной культуре повышается, а при добавлении масляной
кислоты возрастает выход бутанола (Yu, 1985).
Первая попытка использовать анаэробные бактерии для био-
конверсии целлюлозосодержащнх материалов в производствен-
ных условиях осуществлена еще в 1932 г. Процесс проводили
в течение 7 сут при 60 °С, Броднлтьные чаны имели емкость
180 л, сырьем служили отруби. В анаэробных условиях наи-
большим был выход уксусной кислоты. Была сооружена также
опытная установка с бродильным чаном на 4,5 тыс. л, в ка-
Честве сырья использовали свекловичный жом, основным про-
дуктом производства была 40%-ная уксусная кислота (Lang-
well, 1932).
ЧельЦова и др. (1938, 1939) проводили полупроизводствен-
ные опыты по сбраживанию свекловичного жома и кукурузных
198
кочерыжек термофильными целлюлолитическими бактериями.
При сбраживании 3°/0-ного свекловичного жома за 36 ч 12%
целлюлозы субстрата было превращено в спирт. Наиболее вы-
сокий выход этанола был получен при сбраживании не расти-
тельного сырья, а технической Целлюлозы——3а 9—12 дней до
22% количества исходной целлюлозы.
Производственные опыты показали, что совместное исполь-
зование Closrridium thermocellum И Thermocmaerobacter ethano-
licus ATCC 3150 позволяет практически полностью исключить
стадию предобработки целлюлозы кислотами или щелочью.
Наряду с этанолом образуются H2, CO2, JIaKTaT И формиат,
Доказана возможность получения этанола из фильтровальной
бумаги, древесины щепы, кукурузной и пшеничной соломы, раз-
личных сельскохозяйственных остатков. Максимальный выход
этанола при ферментации целлюлозы смешанной культурой
достигается при рН 6,8——7,8 и температуре 45-70 °С. При вре-
мени ферментации 7—21 сут выход этанола равен 8,3—31,8%
общего количества целлюлозы.
Разработан способ избирательной делигнификации целлюло-
зосоцержащих материалов обработкой системой растворителей
МаОНшзтанол-вода в условиях, приводящих к минималь-
ной потере ферментируемых углеводов в целлюлозной биомассе.
Делигнифицированную целлюлозную массу отделяют центрифу-
гпрованием, промывают водным этаполом и высушивают при
50 °С. Полученная целлюлоза служит основным субстратом для
синтеза этанола с участием Clostridium thermoccllum ATCC
31924 и Clostridium thermosaccharolyticum HG-4. Скорость де-
градации делигнифицированной еловой древесины при последо-
вательном добавлении культур составляет 0,6 г/(л-ч) с выходом
этанола через 120 ч в концентрации 26 г/л. Заметно увеличива-
ется скорость деградации субстрата и образования спирта при
помощи двух культур, использующих делигнифицированные
кукурузную и пшеничную солому: в спирт Превращается 85%
субстрата (Avgerinos, Wang, 1983).
Щепу осины и пшеничную солому, а также эти же субстраты
после предобработки острым паром, водой и МаОН применяли
для культивирования Closlridium thermocellum B монокультуре
и сокультуре с Clostridium thermohydrosulfuricum. Скорость об-
разования этанола и конечная концентрация его заметно воз-
раста1от в ва ианте с предобработкой (Saddler et а1.‚ 1984).
Мутант loslridium thermosaccharolyticum образует незна-
чительные количества побочных продуктов брожения (молоч-
ну1о и уксусную кислоты). Он более устойчив к высоким кон-
центрациям этанола по сравнению с исходным штаммом. Выход
этанола равен 0,43 г/г ксилозы, максимальная концентрация
этанола——45 г/л, при этом концентрация уксусной кислоты не
превышает 4 г/л. Это хорошие показатели, особенно, если учесть,
что при получении спирта из гидролизатов целлюлозосодержа-
199
006
Различные отходы н (нлн) биоиасы
Целлюлоза
Гемицеллюлоза
P83.)'[ Н ЧН ые углеводы
Нецеллюлозные о: коды
(N -со.1ер;+‹а щне вещества.
Closmdxum thermocellum
(HCHTO3bI. FeKT03b!_ крахмал)
органические кислоты)
Thermoanaerobactcr ethanoluus
I
E]Io5s1tr:cji:un1 t§1ern1ohy(.r}<1)sul£ur1nun1. Адышеннью И другие
г - \-
о н шт {тегтоьац are ytzcurn Термофильные бактерии
Целлобнозах Манноза.
глюкоза L-——:i—-—~———‘ Fa.)13KTO33,
L.,__,__._____..
KC!/M033. v
арабнноза ъ
DesL1\i0t0111am\11n1 Methanobactermm
CO3+H;. CO;+ HZ.‘ -
mgrmcans H1ermoaut0troT1cL1m
JIBKTHT, лакгат. -
ацетат, ацетат. —‚——— -
этанол — этанол ъ
потмцм Метпапочагста
'
г Непрерывно удаляемыи азеотроп]
‹——-Цнстнлляцнн
I Этанол абсолютный Термофнльньле условия
Рис. 5. Схема получения этанола из целлюлозосодетлкапхнх отходов и биомассы с помощью термофильных анаэробных
бактерии (по Wiegel, 1982)
Щих материалов с помощью дрожжей ректификации подвергают
бражку с содержанием этанола 15 г/л (Цирлин, 1984).
Zeikus H сотр. (1981) при рассмотрении последних достиже-
ний в области этанольной ферментации с участием термофиль-
ных бактерий, а также результатов исследований физиолого-
биохимических свойств этанолобразующих термофильных бак-
терий, представляющих практический интерес с точки зрения
разработки непрерывных технологических схем получения эта-
нола прямой биоконверсией биомассы растительного происхож-
дения, пришли к заключению, что по сравнению с дрожжами и
мезофильными бактериями ферментация с участием термофиль-
ных бактерий позволяет более эффективно превращать в этанол
целлюлозные и гемицеллюлозные компоненты делигиифициро-
ванной биомассы. При этом исключается стадия предваритель-
ной деполимеризации этих субстратов, что значительно сни-
жает стоимость конечного продукта и упрощает технологию
спиртового производства.
Анализ получения этанола из цедтлюлозосодержащих суб-
стратов, крахмала и сахарных сиропов показывает, что исполь-
зование термофильных бактерий в процессе получения этанола
имеет следующие преимущества: термофильные культуры мень-
ше подвержены вытеснению, их ферменты термостабильны. Не
требуется жесткая стерилизация среды и оборудования, кроме
того, снижаются затраты на охлаждение. При 50-60 “C осуще-
ствляется самопроизвольная дистилляция этанола, следова-
тельно‚ снимается проблема ингибирования процесса его обра-
зования, Применение термофильных бактериальных культур
при промышленном получении этанола из сахаров и целлюлозо-
содержащих субстратов позволит снизить себестоимость эта-
нола примерно на 25% по сравнению с существующей (Payton,
1984).
В настоящее время более 2/3 расходов производства этанола
составляют затраты на сырье, поэтому в ряде стран наметились
тенденции к расширению переработки дешевых видов сырья,
в частности отходов деревообрабатывающей промышленности
и сельского хозяйства. Оригинальную схему получения этанола
из целлюлозы предложил Wiegel (1982) (рис. 5). Если учесть,
что только в США количество целлюлозосодержаших отходов
достигает 940-106 т в год, при этом на долю целлюлозы прихо-
дится 478-105 T, то получение этанола представляется вполне
реальным.
В США после 2-летнего изучения способов получения энер-
гии пришли к выводу, что к 2000 r. 20% производства энергии
будут получать за счет древесины и других видов растительного
сырья. Наиболее целесообразно, считают эксперты, использова-
ние для получения этанола лигноцеллюлозных материалов и
отходов сельского и лесного хозяйства. Процессы делигнифика-
ции и осахаривания, предшествующие получению этанола и
201
органических кислот, пока малоэффективны, поэтому широко-
масштабное получение этих продуктов еще экономически не вы-
годно (Уаага, 1985).
В связи с этим внимание исследователей сосредоточено на
разработке способов делигнификации целлюлозосодержащих
растительных субстратов. Особое внимание уделяется способу
обработки древесины острым паром с последующим резким
снижением давления. Такая обработка позволяет получить сво-
бодную целлюлозу, пентозаны и лигнин (Khan, 1984). Свобод-
ный от примесей лигнин обладает высокой реакционной способ—
ностью‚ низкой молекулярной массой и является источником
получения различных химических веществ, например полиме-
ров (Jotech, 1986). Деградация лигноцеллюлоз высокоэффектив-
ными микроорганизмами позволит рационально использовать
Целлюлозосодержащие источники. Сейчас стоимость биотоплива
из растительных материалов может быть определена с точностью
до 35%, поэтому окончательно дать оценку процессу с точки зре-
ния его экономичности пока не представляется возможным
(Douglas, 1985). Проводимые исследования в конечном счете
направлены на удешевление технологии получения биотоплива
из целлюлозосодержащих субстратов.
Глава 8
БИОКОНВЕРСИЯ БИОМАССЫ И ОТХОДОВ В МЕТАН
И ОРГАНИЧЕСКИЕ УДОБРЕНИЯ
Запасы природных источников энергии: нефти, газа, угля и
торфа ощутимо истощаются, Рост потребности в энергии, с од-
ной стороны, и уменьшение ресурсов ископаемого топлива — с
другой, побуждают ученых всех стран активнее вести поиск но-
вых источииков энергии. Одним из возможных путей решения
энергетической проблемы на длительный период является пре-
вращение возобновляющихся источников органического вещест-
ва, таких, как отходы и биомасса, в Продукты, которые могут
быть использованы в качестве топлива.
Успехи современной науки и практическая деятельность
человека свидетельствуют о том, что реальным источником до-
полнительной энергии может стать биологический метан. Он
образуется в результате разложения в анаэробных условиях
биомассы, основная часть которой состоит из целлюлозы, В
природе интенсивное образование метана постоянно происходит
в плохо аэрируемых условиях: в иле рек, озер, лиманов, в боло-
тах, в местах скопления различных органических отходов. Под-
считано, что из 1 кг сухих органических веществ образуется
200-600 л биогаза (метан+углекислый газ), содержащего до
60——85% чистого метана (Панцхава, 1978).
Основными положениями Энергетической программы СССР
предусмотрено на первом этапе ее реализации создать матери-
ально-техническую базу для широкого применения нетрадици-
онных источников энергии, в том числе биомассы. Особенно
важное значение утилизация биомассы имеет в сельском хозяй-
стве, где на различные технологические нужды ежегодно расхо-
дуется большое количество топлива и непрерывно растут по-
требности в удобрениях. При анаэробной ферментации отходов
и биомассы наряду с бпогазом получают остаток органического
вещества, представляющий собой обеззараженное, лишенное за-
паха удобрение более высокого качества, чем обычный навоз.
В нашей стране в 1990 г. планируется построить несколько
сотен комплексов по откорму свиней и крупного рогатого скота.
В связи с этим проблема реализации отходов становится очень
острой. Утилизация их позволила бы получать миллиарды кубо-
метров биогаза и миллионы тонн ценного удобрения. Кроме то-
го, возможно получение значительного количества энергии в ре-
зультате утилизации городских отходов. В Советском Союзе оно
ежегодно может составлять около 2 млрд M3. B соответствии с
203
Таблица 37. Теплотворная способность различных видов топлива
(Паицхава, Березин, 1986)
1 Теплотворная Теплотворная
Топливо Количество способность, Топливо Количество способность,
I ккал ккал
Биогаз 1 M3 5000 Уголь 1 кг 8000
Керосин 1 л 9100 Древесина » 4700
Бутан 1 кг 10900 Навоз (брикеты) » 2100
принятой Энергетической программой на длительный период в
СССР особое значение придается предотвращению загрязнения
окружающей среды, интенсификации сельского хозяйства путем
применения более эффективных и дешевых удобрений. Все вы-
шеприведенное свидетельствует о необходимости интенсифика-
ции теоретических и практических исследований для решения
проблемы биоконверсии биомассы и отходов в метан и органи-
ческие удобрения.
Приоритет в создании и развитии теории биологического ме-
тана в глобальных масштабах принадлежит ученым Омелянско-
My И Кузнецову, Эта теория открывает широкие перспективы в
плане направленного биосинтеза метана в недрах или в локаль-
ных искусственных емкостях. Омелянский считал, что выделе-
ние метана связано не только с термокатализом или вулканиче-
ской деятельностью. Этот процесс очень широко распространен
в природе- метан выделяется при анаэробном разложении
органических веществ. Считается, что 80% атмосферного метана
имеет современное биологическое происхождение, а 20% обра-
зовалось более 50 тыс. лет назад (цит. по Беляеву, 1979).
Биологический метан аккумулирует в себе часть солнечной
энергии, трансформированной в скрытую химическую энергию
органических соединений. Такую аккумуляцию осуществляют
зеленые растения в процессе фотосинтеза. В результате биологи-
ческой конверсии продуктов фотосинтеза -— растительной био-
массы — образуется биогаз. Он на 50——80% состоит из метана
и на 50——20% —~ из углекислого газа. При образовании метана
энергия солнца переходит в доступное для использования топли-
во и ценное удобрение.
Весьма высоки коэффициенты конверсии энергии в системах
получения метана из органического вещества с помощью микро-
организмов. На метан приходится примерно 90% энергии, со-
держащейся в субстрате (Соуфер, Заборский, 1985). Теплотвор-
ная способность чистого биометана составляет 104 ккал/мз, а
биогаза -— около 6-103 ккал/МЗ в зависимости от содержания
углекислого газа в нем (Чань Динь Тоай и др., 1983). Теплотвор-
ная способность биогаза и некоторых видов топлива приведена
в табл. 37.
Процесс метанообразования издавна привлекал внимание
ученых. Омелянский, исследуя процесс разложения клетчатки,
204
приписал этот процесс одному организму (Беляев‚ 1979). Иссле-
дования других авторов показали, что ферментация этанола,
которая, как ранее предполагалось, была обнаружена по нали-
чию Methcmobacillus 0melz'arzskL'L', на самом деле является резуль-
татом действия синтропического сообщества двух видов бакте-
рий, один из которых способствует образованию уксусной кис-
лоты и водорода только из этанола, а другой (метаноген) ис-
пользует образующийся водород. Было установлено, что ана-
Органическос вепиесизо
Ул ленольп
Про I еин
Л ипииы
Гидролиз и ферменгацИЯ (7) I
Жирные кислог ы
Адет огенная
‘/ дегидрогеннзация (2) \
Уксусная
/
muxowawx
H3+CO2
Ацетогенная
гидрогенизация (4)
декарбоксилирование Восстановительное
уксусной ‚шсдоты (3) образование метана (З)
CH4+CO2 CH4+H2O
Рис 6 Схема полного анаэробного расщепления органического вещества под
влиянием трех основных групп бактерий: 1 т ферментативных, 2 — облигат-
ных, производящих H2, ацетогенных; 3 — метаногенных. Уксусная, а иногда и
другие кислоты могут быть образованы в речульта ге участия бактерии 4-й груп-
пы (по Mxnnepnn, Браиант, 1985)
эробные целлтожхолнтические бактерии не образуют метан, они
лишь поставляют органические кислоты, спирты, H2 И CO2 дру-
гим микроорганизмам (Bryant et а1.‚ 1967).
В процессе анаэробного разложения биополимеров участву-
ют многие виды микроорганизмов, однако основными биологи-
ческими агентами, способствующими разрушению органического
вещества (субстрата) до метана, являются метаногены.
До недавнего времени разложение биомассы с образованием
205
метана рассматривали как процесс взаимодействия двух групп
бактерий, осуществляющих распад органических веществ, при
этом считалось, что процесс протекает в две стадии. На первой
(кислотообразующей) под действием бактерий происходит гид-
ролиз субстрата с образованием главным образом органических
кислот, спиртов, CO2 и 1-12. На второй (метанообразующей) про-
дукты гидролиза (кислоты и спирты) разлагаются в присутст-
вии СО2 и H2 с образованием CH4 И СО2 (цит. по Мкинерни,
Брайант, 1985).
Мкинерни и Брайант (1985) считают, что, поскольку не были
обнаружены чистые культуры метаногенов, разлагающих про-
пионовую и другие жирные кислоты с более длинной Цвпью,
двухстадийная система не дает полного Представления о процес-
се ферментации, т. е. катаболизм спиртов (кроме метанола) и
жирных кислот (кроме муравьиной и уксусной) вызван не ме-
таногенами как таковыми, а какой-то другой группой бактерий,
регулирующих обмен веществ (рис. 6). На первой стадии проис-
ходит накопление ферментов. По мнению авторов, возможно,
что пропионовая и другие жирные кислоты с более длинной
цепью, а также спирты разлагаются под действием промежуточ-
ной группы бактерий, так называемых облигатных апетогенных
бактерий, образующих H2. Другая группа бактерий образует из
Н2 и СО2 уксусную, а иногда и другие кислоты. Метаногены ис-
пользуют образованный бактериями водород, восстанавливая
CO; до CH4 и уксусную кислоту до CO2 и CH4. Последняя реак-
ция имеет важное значение, так как 70% метана, получаемого
ферментацией, образуется из метильной группы уксусной meno-
ТЫ.
Технологически метаиовое брожение проходит два этапа:
1 —— формирование метанового биоценоза; 2 — непрерывная или
периодическая ферментация. Первый этап называют кислотным,
так как метанообразующие бактерии растут медленнее, чем
ферментативные бактерии, поэтому перед началом образования
газа в среде накапливаются летучие жирные кислоты. Потом
скорости образования и потребления кислот выравниваются, и
далее идут параллельно разложение субстрата и образование
газа.
Микробиология кислотообразующего этапа изучена недоста-
точно. Исследования микроорганизмов, осуществляющих обра-
зование кислот в метантенке, свидетельствуют о том, что зна-
чительную их часть составляют облигатные анаэробы. Наличие
их не исключает одновременно присутствия большого количества
факультативных анаэробных бактерий, подобных стрептококкам
и кишечным бактериям.
Облигатные анаэробы мезофильного типа включают семей-
ства Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Lactobacillaceae, Strep-
tococcaceae. Важная роль в процессе анаэробного разложения
органических веществ принадлежит неспоровым облигатным
206
анаэробам родов Bacteroides И Bzztirivibrio (Ghosh, Conrad,
1975).
В течение первого этапа метаногенеза развиваются анаэроб-
ные бактерии разнообразных физиологических групп: целлюло-
зоразрушающие, углеводсбраживающие (типа маслянокислых),
аммонифицирующие (разрушающие белки, пептиды и амино-
кислоты) и др. Благодаря такому сообществу бактерий первич-
ные анаэробы могут использовать разнообразные органические
вещества растительного и животного происхождения. В этом и
состоит одна из важнейших особенностей бактерий, осуществляю-
щих разложение органических веществ с образованием метана.
Тесная связь между указанными группами бактерий обеспечива-
ет достаточную стабильность процесса (Панцхава, 1978).
многоступенчатую цепь превращений органических веществ
в анаэробных условиях замыкают метаногены, Они представля-
ют собой уникальную группу бактерий, включающую более 20
видов с совершенно разной формой и структурой клеток. Эту
группу бактерий рассматривают как особую ветвь эволюции ор-
гапизмов и называют архебактериями (Ва1с11 et а1., 1979). Ме-
танообразующие организмы объединены в семейства: Methano-
bncieriaceae, Methanococcaceae, Met/1an0mL'cr0b/aceae, Methano-
sarwinaceae. Для роста метаногенов необходимы строго анаэроб-
ныс условия: микроорганизмы могут расти только при отсутствии
кислорода при окислительно-восстановительном потенциале ни-
же 300 MB.
Для метаногенов источником энергии может служить лишь
определенная часть субстратов, а некоторые виды способны
усваивать только одно-два соединения. Почти все виды метано-
генов потребляют для своего роста молекулярный водород и
углекислоту: 4Н2+СО2—>СН4+2Н2О+энергия. Реакция образо-
Harms; метана из углекислоты дает очень мало энергии. Поэтому
метанообразующие бактерии, производя большую химическую
работу, растут очень медленно и накапливают мало биомассы
(Бекер и др., 1984).
Хорошим субстратом для метаногенов является уксусная
кислота: примерно 65—70% метана, образующегося при пере-
гнивании органических веществ сточных вод и осадков озер, по-
лучается за счет метильной группы уксусной кислоты. Ацетат
используют некоторые виды метаносарцин, например Methano-
sarcma barleeri (Жилина, 1979; Pine, 1956; Ва1с11 е’: а1., 1979).
Помимо ацетата метанообразующие микроорганизмы могут раз-
лигать метанол и метилированные амины_ Метан из метанола
способна образовывать термофильная споровая палочка Metha-
nobacillus kusneceovii, причем промежуточным продуктом явля-
ется ацетат (Панцхава, 1963). Окись углерода и муравьиная
кислота для некоторых метаногенов также служат субстратом,
из которого образуется метан (Варфоломеев, 1981; Крепис,
1979; Vogels, 1979). Никакие другие соединения углерода, по
207
имеющимся да тным. рост метанообразующих бактерий не под-
держивают.
Требования к питательным веществам для этих микроорга-
низмов просты. Рост большинства видов происходит в среде с
минеральными солями, СО2, аммиаком и сульфидами, которые
являются основными источниками соответственно углерода, азо-
та и серы. Среди метанообразующих бактерий имеются организ-
мы, которые развиваются на минеральных средах, используя
Н; и СО2 не только для синтеза метана, но и для образования
всех компонентов клетки. Наряду с этим существуют виды, для
роста которых необходимы ацетат, валериат, 2-мети„човьтй эфир
масляной кислоты, отдельные аминокислоты, гидролизат казеи-
на, дрожжевой экстракт, кофермент М, витамин В.
Сведения о биосинтетических и энергетических процессах в
метанообразующих бактериях еще довольно ограниченны. Сов-
ременные представления о предполагаемом механизме образо-
вания энергии, особенностях строения цепи переноса электронов,
факторах, являющихся переносчиками электронов, об участии
гидрогеназы в ферментной системе этих бактерий, обнаружении
кофермента М и его роли в процессе метаболизма метанобак-
терий освещены в ряде работ советских и зарубежных авторов,
однако механизмы образования метана этими бактериями нель-
зя считать полностью изученными (Чань Динь Тоай н др, 1983;
Бекер и др.‚ 1984).
Чтобы метанообразующие бактерии могли осуществить ко-
нечный этап анаэробного разложения органического вещества—
образование метана, необходима предварительная подготовка
субстрата: сложные соединения нужно превратить в более прос-
тые, являющиеся непосредственными предшественниками мета-
на, т. е. в данной экосистеме должны присутствовать микроорга-
низмы тех ассоциаций, которые переводят первичные продукты
брожения в ацетат, Н2 и СО2.
В биотехнологии получения биогаза должны учитываться
особенности метанообразования с целью создания оптимальных
условий ведения процесса. Существенное влияние оказывают
температура, рН, состав среды и наличие в ней ингибиторов,
концентрация и размеры твердых частиц. гидродинамические
условия в ферментаиионной среде и другие факторы.
Активность и репродуктивная способность микроорганизмов
зависят от температуры. Метановое брожение протекает при
температурах от 10—15 до 55——60 и даже до 100 °С. Метан иолу-
чают в биореакторах в результате мезофильных (около 33 °С) и
термофильных (55-60 °С) процессов, которым соответствуют
наивысшие значения метаболической активности.
Использование анаэробного разложения для обеззаражива-
ния и утилизации навоза возможно при создании оптимального
температурного режима. При разлтичных технологических реше-
ниях применяют три температурных режима: 35, 37 и 60 °С. Во
208
многих случаях предпочитают более низкие температуры не
только из-за меньшего расхода энергии, необходимой для опти-
мизации температуры субстрата, но и потому, что при более
низких температурах культивируемые ассоциации микроорга-
низмов менее чувствительны к изменениям условий среды (Baik-
KOB, 1983).
Многие исследователи указывают, что с повышением темпе-
ратуры условия для образования газа улучшаются (Ма1у, 1971),
кроме того, температура влияет на качество газа: при ее повы-
шении снижается доля метана в общем обьеме выделяющегося
газа (Баадер и др., 1982).
Изучено превращение жирных кислот при анаэробном разло-
жении отходов крупного рогатого скота. Эксперименты прово-
дили в З-литровом ферментере при полунепрерывной подаче
субстрата и интенсивном перемешивании. При термофильном
сбраживании (60 °С, 6% сухих веществ, время пребывания в ап-
парате 10 сут) скорость превращения ацетата в метан уже че-
рез 2—5 ч после загрузки субстрата возрастает с 0,034—0,045
до 0,114—0,l38 мМ/мин, При той же нагрузке в мезофильных
условиях (40°С) образование метана и скорость превращения
жирных кислот на 30% ниже, чем при термофильном режиме
(Mackie, 1980). Зависимость образования биогаза от температу-
ры характеризуется следующими данными: при 47-55 °С на-
капливается 2,5 из биогаза в сутки, при 35—38 °С — 1,5—2,0,
при 15°С —- только 0,1 M3 (Холло, 1982).
В опытах по применению жидкого навоза с содержанием су-
хих веществ 1——3% B аппарате лабораторного типа достигнуто
выделение биогаза в количестве 0,315 и 0,564 л/(л-сут) при ме-
зофильном и термофильном процессах соответственно (Бекер и
др, 1984). Для нормального ведения процесса метанообразова-
ния в биореакторе необходимы рН в пределах 6,5-—7,5 и содер-
жаиие летучих кислот 600—1500 мг/л. Повышение концентрации
летучих кислот приводит к снижению выхода биогаза. Чтобы
уменьшить концентрацию летучих кислот, субстрат разбавляют
водой (Бекер, 1967; Kirsch. 1971).
Исследования проведенные болгарскими учеиьхми, показали,
что во многих случаях рН жидкого навоза отклоняется от опти-
мальных параметров метаногенеза, кроме того, р11 не является
константной величиной и зависит от состава кормов, которые
получали животные, применяемых лечебных препаратов и дезин-
фицирующих средств, способа и периодичности уборки навоза.
Например, при широком до сих пор использовании для дезин-
фекции средств, созданных на базе щелочных веществ, рН жид-
кого навоза достигает 8‚0—8‚5. Во многих случаях навоз со сви-
новодческих комплексов имеет рН ниже 7. Установлено, что для
эффективного получения биогаза субстрат должен содержать
50—500 MI‘/JI летучих кислот, при этом недопустимо, чтобы их
количество превышало 2000 мг/л (Байков, 1983). Сравнитель-
14 Зак 966 209
ные исследования свидетельствуют о том, что величина рН явля-
ется определяющей.
Развитие метанообразующих бактерий в большой степени
зависит от состава питательной среды. Наиболее благоприятное
соотношение углерода и азота для микробиологической конвер-
сии органических веществ в биогаз соответствует значениям
С :N=10—16. При нехватке в питательной среде азота и обилии
углеводов преобладает кислотообразование, ингибирующее ме-
таногенез. При избытке азота (белка) рН увеличивается до 8
и более, в результате чего процесс метанообразования ослабе-
вает. Состав сбраживаемых органических веществ в значитель-
ной степени влияет на выход метана. При сбраживании углево-
дов каждый килограмм субстрата дает около 0,8 M3 метана,
при сбраживании жиров-—— 1,5 M3, протеина——0,5 M3.
Присутствие лигнина в субстрате снижает образование био-
газа. Так, при содержании лигнина в навозе 10; 15 и 20% (по
сухому веществу) выход биогаза равен соответственно 420, 310
и 200 м3/т сухого вещества (Холло, 1982).
К веществам, которые препятствуют жизнедеятельности ме-
таногенов, относятся прежде всего тяжелые металлы и их соли,
аммиак, сульфиды, нитраты, органические растворители, анти-
биотики (McCarthy, 1964). Например, предельная концентрация
меди 10 мг/л, нитритов —— 50, сульфидов — 200, аммиака —
1500 мг/л, для свиного навоза и птичьего помета допускается
предел 3000—4000 мг/л. Метаногенез может осуществляться при
содержании ионов аммония до 3000 мг/л, натрия —— от 3500 до
5500, кальция -— от 2500 до 4500, магния — от 2500 до 4500 мг/л.
В последние годы исследовано воздействие различных лекарст-
венных и дезинфицирующих веществ На метаногенез.
Изучено получение метана при помощи смешанных культур,
адаптированных к навозу крупного рогатого скота, в корм кото-
рым были включены различные антибиотики. Антибиотики до-
бавляли в животные корма в количестве 29 (моненсин), 20 (ли-
залоиид) и 16,5 мг/кг (садтиномицин). Авопарцин вносили прямо
в навоз. Исследовали влияние этих антибиотиков на выход и
скорость образования метана. Обнаружено, что первые три ан-
тибиотика практически не влияют на скорость образования
метаиа при времени удержания 20 или 26,5 сут. После добавле-
ния авопарцина к навозу выход органических кислот возрастает
в 3 раза, однако в последующий период содержание органиче-
ских кислот снижается и скорость образования метана практи-
чески не изменяется (Valer ct а1.‚ 1982).
По данным других авторов, из проверенных антибиотиков
только флавомииин и лизалоцид не влияют на скорость образо-
вания биогаза, а моненсин ингибирует метаногенез при очень
низких концентрациях. Из группы синтетических лекарственных
препаратов скорость образования биогаза ие изменяют фуразо-
лидон, сульфаметазин и другие, только слахиндокс и арсаиило-
210
вая кислота оказались сильными ингибиторами метановой фер-
ментации. Инсектициды орбивет и инцидин в дозах, обычно ири-
меняемых в сельскохозяйственной практике, не являются инги-
биторами метаногенеза. С целью полного исключения ингиби-
рующих эффектов на выход биогаза, получаемого из навоза и
других сельскохозяйственных остатков, авторы рекомендовали
включить стадию предварительного разбавления исходного суб-
страта (Hi1perteta1., 1984).
В Бельгии в лабораторных условиях исследовано влияние
антимикробных веществ на образование биогаза из жидкого
свиного навоза. K навозу добавляли антигельминтные средства
тенак и Ь-нарпенол, химиотерапевтические средства сульфадиа›
зин и фуроксон и антибиотик руменсин в различных концентра-
циях. Продукция биогаза варьировала от 14 до 17 л/л навоза.
Даже 10-кратная (по сравнению с обычными) доза аитигель-
минтных и 20-кратная доза химиотерапевтических средств не
оказывали отрицательного влияния на продукцию биогаза. Ру-
менсин в дозе 0,4 мг/л также не влиял на образование биогаза,
однако 5-кратная его доза (2 мг/л) снижала продукцию биогаза
через 48- ч ферментации на 23%, а через 96 ч — на 55% (Van
Assche, 1984).
Этими же исследователями выявлено, что добавление анти-
биотиков (хлортетрациклина, эритромицина, хлорамфеникола,
бацитрацина, виргиниамицина) или коммерческих дезинфици-
рующих препаратов к свиному навозу при сбраживании послед-
него не влияет на скорость образования, состав биогаза и содер-
жание в нем летучих жирных кислот, если концентрации дезин-
фицирующих препаратов и антибиотиков не превышают доз,
рекомендованных ветеринарами для гигиенической обработки
животных и обеззараживания питьевой воды. Однако при более
высоких концентрациях антибиотики и дезинфицирующие веще-
ства снижают выход биогаза, сбраживание навоза сопровожда-
ется накоплением летучих жирных кислот и уменьшением кон-
центрации метана в биогазе (Poels et а1.‚ 1984).
Предпосылкой высокой интенсивности метанообразования
служит оптимальная концентрация взвешенных твердых час-
mu. Обычно микробиологическая переработка субстрата в ме-
тан осуществляется при концентрации водной суспензии, не
превышающей 5%. Если концентрация твердых частиц выше
10——12°/о, перемешивание среды затрудняется, и это приводит к
снижению газовыделения (Jewell, 1977). Однако имеется сооб-
щение о том, что выход метана при переработке навоза постоя-
нен при концентрации твердых веществ в пределах 7,7—l5% И
составляет 0,52—0,56 л/г твердых веществ. Переработка же сме-
си навоза и рисовой соломы (1 :2) с концентрацией твердых
веществ 15% дает выход метана и превращение тверцых веществ
в количествах, аналогичных таковым при переработке навоза
(Pathak ей а1.‚ 1985).
H" 211
Сконструирована установка для получения метана анаэроб-
ной ферментацией органических отходов с высоким содержани-
ем сухого вещества (более 25%). Она представляет собой фер-
ментер, который состоит из двух емкостей, соединенных в верх-
ней и нижней частях. Циркуляция содержимого в этих емкос-
тях может быть восходящей и нисходящей.
Проведены опыты, показавшие возможность эффективной
анаэробной ферментации соломы и навоза при концентрации их
в водной суспензии до 40%. При этом образуются метан и орга-
нические кислоты. Такая анаэробная ферментация указанных
субстратов позволяет значительно уменьшить расход воды и раз-
меры ферментационных установок для получения биогаза
(Wujcik et а1.‚ 1980).
Имеется сообтцение о том, что применение синтрофной ассо-
циации микроорганизмов позволяет ускорить процесс сбражива-
ния отходов сельского хозяйства, довести суточную загрузку
метантенка до 40-45% И увеличить его производительность в
3——4 раза (по сравнению со спонтанным сбраживанием). При
этом съем биогаза с 1 л реактора в сутки достигает 7‚0—7,5 л
при содержании в нем метана 59—72%, а распад органического
вещества в 1 л загружаемого навоза равен 16—18 г/сут. Факто-
ром, интенсифициругощим метанообразование, является увели-
чение концентрации биомассы микроорганизмов в реакторе. Это
Достигается возвратом биомассы или путем флокуляции и им-
мобилизации клеток.
Накопление и удержание бактерий в метантенке необходимы
для обеспечения высокой скорости процесса, сокращения време-
ни удержания субстратов в реакторе и уменьшения объемов
метантенков. В последние годы иммобилизованные метаноген-
ные ассоциации широко применяются для промышленного полу-
чения метана при переработке жидких отходов, Метаногенные
ассоциации активно функционируют в иммобилизованном со-
стоянии, и степень их активности во многом зависит от приро-
ды носителя (Панцхава и др.‚ 1985; Ножевникова, 1986). В
качестве носителей используют различные материалы: керами-
ку, кирпич, камни, стекло и полимеры. Способы Применения но-
сителей в реакторе также неодинаковы. Реакторы такого типа
получили название анаэробных фильтров.
В работе, выполненной в Технологическом институте г. Иоко-
гамь1 (Япония), метаногенная популяция бактерий была иммо-
билизована на агаровом полиакриламидном геле и на коллаге-
новой мембране. Микроорганизмы, иммобилизованные на ага-
ровом геле, имели наибольшую активность метаногенеза (Ка-
rube, 1980).
Исследуя анаэробную переработку отфильтрованного навоза
молочного скота, применяли обычный и с фиксированной плен-
кой реактор. Навоз разбавляли до содержания сухих веществ
7,5% и отфильтровывали через сита с диаметром пор 2 мм. Жид-
212
кая часть перерабатывалась при 35 °С в лабораторных реакто-
рах объемом 4 л. Биопленка фиксировалась насадкой из акрила,
закрепленной на расстоянии 6 см над дном реактора и на 3 см
ниже уровня жидкости.
Эксперименты, проводившиеся 13 мес, показали значитель-
ные преимущества реакторов с закрепленной пленкой по сравне-
нию с обычными реакторами. Нагрузка по сухим веществам из-
менялась от 2,34 до 25 и от 2,25 до 778 г/(л-сут) для обычного
реактора и реактора с фиксированной пленкой соответственно.
Максимальный выход метана в реакторах был 0,63 и 6,2 л/(л-
-сут) при времени удержания 6 и 0,125 сут соответственно (Lo,
Liao, 1984).
Годом позже эти же авторы получили метан в реакторах с
фиксированной пленкой, в которых для закрепления биопленки
использовали акриловые панели толщиной 3 MM или жесткий
шероховатый поливинилхлорид (ПВХ). Реактор с фиксирован-
ной пленкой позволил значительно, почти в 10 раз, интенсифици-
ровать процесс метанообразования (Liao et а1., 1985; Lo ей а1.,
1985).
На сахарном заводе испытана установка биогазовой конвер-
сии для очистки сточных вод, образующихся при суточной пере-
работке 5 тыс. т. свеклы. Применяли ферментер модели «Фло-
кор Р», который заполнен кольцами из ПВХ, фиксирующими
метанообразутощие бактерии. Таким образом, достигалось две
цели: очищение сточных вод при сокращении химического пока-
зателя кислорода (ХПК) на 90% (возможность сбрасывать их
непосредственно в природные водоемы) и производство биогаза
с повышенным содержанием метана (80% метана и 20% СО2 до
5600 мз/сут (Экспресс-информ. ‚.., 1985)).
В 1985 г. осуществлена анаэробная переработка кислой под-
сырной сыворотки в биогаз в реакторе, на 2/3 заполненном
бусинами (диаметр 1-—2 см) из пористой глины, предназначен-
ными для иммобилизации микрофлоры и удерживаемыми метал-
лическими сетками. Снижение ХПК достигало 95% при гидрав-
лическом времени удерживания 5 дней. Добавление в систему
свежей сыворотки или попадание в нее кислорода приводили
лишь к небольшим и быстро проходящим нарушениям продук-
ции метана (wildenauer, 1985).
Для увеличения концентрации биомассы микроорганизмов
использовали реактор объемом 5,5 л с погруженными враща-
ющимися дисками. Величина отношения поверхности для при-
крепления биопленки к объему реактора 100 м2/м3. Периодиче-
ски с помощью скребков удаляли избыток биопленки для под-
держания постоянного рабочего объема реактора. Навозную
жижу с 2,9——3,5°/о сухих веществ ферментировали при 35 °С.Мак-
симум образования метана —— 1,89 л/(л-сут) — достигался при
гидравлическом времени удержания 1 сут (Lo et aI., 1986).
Имеется сообщение о биометанизации уксусной кислоты в ре-
213
акторах со слоем песка с размером песчинок 0,6—-0,7 мм и обшей
поверхностью 4306 м2/м3 (Toldra, 1986).
В США разработан способ получения биогаза в анаэробных
условиях путем микробной ферментации органических отходов.
Он основан на применении особого вида микроорганизмов и
магнитного поля, создаваемого сильным электромагнитом для
удержания бактерий в реакторе. Последний состоит из двух
отдельных зон —— реакционной и зоны для сбора отработанного
осадка. В технологической схеме масштабированного получения
биогаза из различных отходов предусматривается непрерывное
выведение осадка. Применение магнитного поля практически
исключает вынос бактерий из реакционной зоны и позволяет
резко интенсифицировать скорость образования биогаза.
У нас в стране в Макеевском инженерпо-строительном ин-
ституте созданы и испытаны ферментеры, в которых носителями
служат ерши из стекловолокна, собранные в рамы. Микроб
ные клетки адсорбируются на поверхности ершей, и концентра-
mm биомассы (по сухому веществу) достигает 60 г/л. Это поз-
воляет увеличить суточную замену субстрата до 25—30, а иног-
да до 50% (Куликов, 1982).
Таким образом, несмотря на сложность метанового процесса,
существует ряд методов его интенсификации. Основные возмож-
ности интенсификации производства биогаза следует искать в
усовершенствовании технологии, в первую очередь в искусствен-
ном увеличении концентрации активной биомассы путем введе-
ния в аппарат плавающей или фиксированной насадки, в воз-
вращении биомассы в процесс, в секционировании аппаратов и
т. д. Немаловажную роль играют свойства перерабатываемых
отходов, которые отличаются большим разнообразием (Виестур
и др.‚ 1986). Аналогичное мнение высказано Frostell (1982).
Микробиологическое получение метана имеет ряд преиму-
ществ. Сырьем для получения метана могут быть разнообразные
органические остатки. Почти все они состоят из целлюлозы,
легко поддающейся анаэробному разложению с образованием
биогаза — метана. Источниками такого сырья могут быть отхо-
ды сельского хозяйства (солома, ботва, трава, листья, навоз
сельскохозяйственных животных), отходы текстильной, дерево-
обрабатывающей и пищевой промышленности, сточные воды и
отходы коммунального хозяйства. Отходы лесной и деревопере-
рабатывающей промышленности содержат лигнин, но при соот-
ветствующей предварительной обработке он разлагается с
образованием циклических продуктов, которые могут быть ис-
пользованы бактериями. Выход метана при этом увеличивается
на 40%, на 10% снижается количество твердых отходов.
По мнению Неа1у (1978), более половины углерода аромати-
ческих соединений, промежуточных продуктов гидролиза лигни-
на, может быть превращено в метан с помощью строго анаэроб-
ных бактерий. Установлено также, что гриб Pleurotus помад
214
способен полностью деградировать лигниновый компонент пше-
ничной соломы, при этом ускоряется и на 30% повышается выход
биогаза (Muller et а1., 1984).
Микробиологическое получение метана экономически выгод-
но даже в случае применения органического материала с малой
концентрацией его в воде. Результаты многолетних лаборатор-
ных исследований с помощью установки с объемом реактора
6 м3 и полупромышленных испытаний установки с объемом
200 M3 показали целесообразность сбраживания низкоконцен-
трированных отходов в метантенках, имеющих систему рецир-
куляции ила с жестким разделением в верхней части иловой и
газовой фаз (Lettinga et а1., 1980).
K преимуществам микробиологического Получения метана
следует отнести также и то, что полученный при метановом
процессе биогаз легко использовать. Он на две трети состоит
из метана и одну треть из углекислого газа, и его можно без
очистки от углекислого газа применять в народном хозяйстве.
Работающие на биогазе тракторы, автомашины и двигатели
электростанций не загрязняют окружающую среду. Сжатый до
200-250 атм биогаз пригоден в качестве горючего для тракто-
ров, автомашин, а при низком давлении (до 15% содержания
в смеси) — для любой газовой аппаратуры: печей, плиток, ко-
тельных и др. (Llama ДИНЬ Тоай, 1983).
Перспективность получения метана микробиологическим
способом состоит еще и в том, что источник топлива оказывает-
ся вблизи крупных производств, это сокращает расходы на
транспортировку топлива. Кроме того, при образовании биогаза
до 90% углерода субстрата превращается в газ, поэтому полу-
чение метана является наиболее радикальным и эффективным
способом очистки сточных вод.
Анаэробная переработка отходов животноводства, растение-
водства и активного ила помимо накопления биогаза приводит
к образованию шлама — органического удобрения. При этом
происходит минерализация соединений азота и фосфора главных
компонентов и их сохранение в отличие от традиционных спосо-
бов приготовления органических удобрений методами компости-
рования, при которых теряется до 30—40°/о азота. Проведен
микробиологический и химический анализ шлама из анаэроб-
ного реактора, перерабатывающего коровий навоз в биогаз. Ус-
тановлено, что анаэробная переработка навоза обогащает
микробную популяцию аэробных и анаэробных деструкторов
целлюлозы, кислотообразователей, аммонификаторов‚ азотфикса-
торов и разрушителей гуминовых и фульвокислот. Во время фер-
ментации минерализуется 26—43°/д органического вещества,
главным образом целлюлозы и гемицеллюлозы. Переработка
навоза повышает содержание общего и в 4 раза увеличивает
количество аммонийного азота, 20—40% азота навоза превра-
щается в аммонийный. Содержание усвояемого фосфора удваи-
215
вается и составляет 50% общего фосфора (Zondy et al., 1984).
При получении метана из органического вещества сточных
вод происходит эффективная их очистка (особенно животновод-
ческих и коммунально-бытовых вод), уничтожаются яйца гель-
минтов, патогенная микрофлора и семена сорняков, снижается
содержание органических веществ (в 10 раз), они превращают-
ся в топливо (Панцхава, 1986). Все это вносит существенный
вклад в решение крупнейшей современной экологической проб-
лемы—охраны окружающей среды и очистки воды, а также
энергетической проблемы — получения биогаза.
При исследовании метановой ферментации городских отхо-
дов при мезофильных и термофильных процессах было показано,
что основным преимуществом термофильного процесса являются
гибель большего количества патогенных микроорганизмов и
быстрое осаждение взвесей (Temper et aI., 1983).
Изучая экономические и экологические аспекты анаэробных
процессов утилизации животных отходов, органического веще-
ства сточных вод, отходов сельскохозяиственно:и производства,
лесной промышленности, установили, что анаэробная фермен-
тация является эффективным средством снижения уровня биоло-
гического показателя кислорода (ВПК) в сточных водах и по-
зволяет в значительнои мере уменьшить содержание патоген-
ных микроорганизмов и нерастворимых веществ. После метано-
вой ферментации навоза в анаэробных условиях не обнаружены
патогенные микроорганизмы (Leptospira sp., Salmonella Sp. и
др.) и были очень низкими концентрации мышьяка, марганца,
цинка, нитратов, фосфатов (Stack et а1.‚ 1982).
При исследовании выживаемости патоиснов во время ана-
эробного процесса выявлено, что уксусная, пропионовая, изо-
масляная, каприловая, гептаноевая (но не капроновая) кислоты
в концентрации 56 мМ оказывают бактерицидное действие на
кишечную палочку. В такой концентрации летучие жирные кис-
лоты образуются при росте анаэробов. Abdul (1985) считает,
что это один из основных механизмов обеззараживания отбро-
сов с ферм.
Проводимая в развивающихся странах ферментация сточных
вод позволяет одновременно очистить последние от патогенных
микроорганизмов, вызывающих холеру, тиф, дизентерию, шисто-
матоз и другие болезни (EI—Gohary, 1981).
В процессе днаэробной переработки навоза в биогазовом
реакторе непрерывного действия «Горизонталь 80», выпускае-
мом финской фирмой «Bio Energy OY», происходит обеззара-
живание. При этом гибнут 99% теплостойких колиформ и 97%
фекальных стрептококков. При переработке 2200 м3 свиного на-
воза получают биогаз в количестве, эквивалентном 357 тыс.
кВт-ч (Экспресс-информ. �=�� 1986).
Осуществлено исследование выживаемости семян сорной
травы в анаэробном ферментере при разложении навоза молоч-
216
ного скота. Обнаружено, что 20-суточная переработка сильнее
подавляет жизнеспособность семян, чем 15-суточная. Прораста-
ющие семена чувствительнее к разрушающему действию ана-
эробной переработки, чем покоящиеся. Периодический процесс
переработки навоза воздействует иа семена сильнее, чем непре-
рывный (Jeyanayagam, 1984).
В настоящее время микробиологическое получение метана
может стать дополнительным источником тоилива при решении
проблем энергетики. Однако производство метана требует изы-
скания новых крупномасштабных источников сырья. Одним из
таких источников является биомасса, из которой может быть по-
лучено жидкое и газообразное топливо.
Биомассой обычно называют возобновляющееея органиче-
ское вещество, генерируемое растениями путем фотосинтеза.
Первичным источником биомассы являются деревья, сельскохо-
зяйственные культуры, водные растения. После сбора и перера-
ботки биомассы в товарные продукты образуются отходы, кото-
рые вместе с городскими отходами могут оказаться источником
большого количества органического материала, пригодного для
получения дополнительной энергии.
На земном шаре ежегодно продуцируется более 100 млрд т
сухого вещества растительной биомассы (Семенов, 1973). Энер-
гия, запасаемая при фотосинтезе, составляет 3-102‘ Дж в год,
но эта величина в 10 раз превышает все энергетические затраты
человечества (Красновский, 1984).
По данным американских ученых, сегодня на долю биомассы
в США приходится 2,1 трлн МДж энергии, в то время как в
стране потребляется 82,3 трлн МДж. Доля энергии биомассы
незначительна по сравнению с долей энергии погребляемого неф-
тяного топлива (40,1 МДж) или природного газа (21‚9 трлн
МДж). K коицу ХХ в. количество энергии, получаемой в ре-
зультате переработки биомассы, может возрасти до 5,3——10,6
трлн МДж. Таким образом, биомассе, по мнению авторов, сле-
дует отвести существенную роль в энергетическом балансе стра-
ны (Мкинерни, 1985).
Ученые считают, что вклад в общую мировую энергетику
биомассы в ближайшие 50—100 лет не превысит 10——15%. Од-
нако для некоторых стран эта цифра будет значительно выше:
для Кенип—75°/0, Индии-ЗО, Бразилии——25%. Как уже го-
ворилось, биомасса является постоянно возобновляемым источ-
ником топлива, поэтому она вносит весомый вклад в обший
энергетический баланс, который можно сравнивать с вкладом
гидро- и атомной энергии (Вепте, 1981; Панцхава, Березин,
1986).
Около половины органического вещества биомассы, произво-
димой на Земле растениями, составляет целлюлоза. Значитель-
ная часть ее расходуется на топливо и строительные материалы.
Но главная часть фотосинтетически созданной целлюлозы всту-
217
пает в биологический круговорот, вовлекаясь в различные про-
цессы окисления и распада (Красновский, 1984).
Большое значение решению проблемы получения метана из
растительной биомассы придают в США, ФРГ и Франции.
В США Министерством энергетики разработана программа по
трансформации растительной биомассы в газообразное топливо.
Эта программа позволит в значительной степени уменьшить ввоз
сырой нефти и снизить потребление природного газа в качестве
горючего. В результате проведенного анализа сделан вывод, что
в недалеком будущем США и дРУгие страны будут уже не в
состоянии удовлетворять свои энергетические потребности в
топливе за счет невозобновляемых источников, следовательно,
необходимо активизировать работу по разработке и усовершен-
ствованию технологии использования возобновляемых источни-
ков энергии (Мооп, 1984). Для переработки в метан предпола-
гается утилизация неделовой древесины и отходов сельскохозяй-
ственного производства.
Доля энергии, получаемой из биомассы, в США составляет
лишь 2,5% в общем энергобалансе. Однако, по мнению амери-
канских ученых, к 2000 г. она может возрасти до l5—20°/0. Эти
прогнозы имеют под собой реальную основу. Биомасса страны
по теплотворной способности в 15 раз превышает то количество
энергии, которое США ежегодно импортирует в виде нефти, и
почти в 4 раза—совокупное количество потребляемой в год
энергии. В сельском хозяйстве США образуется большое коли-
чество разнообразных отходов, только пожнивных остатков на-
капливается около 400 млн т в год. Теплотворная способность
1 т сухих пожнивных остатков составляет примерно 142 млн Дж.
Таким образом, энергетический потенциал пожнивных остатков
Практически в 2 раза выше затрат энергии в сельском хозяйстве
и достигает почти 5% общего объема энергии в стране (Василь-
ев, 1981). Тем не менее американские ученые считают, что более
реально оценивать потенциал пожнивных остатков в 1—2% от
упомянутого объема, учитывая при этом, что пожнивные остатки
играют важную роль в сохранении продуктивности почвы.
Во Франции проведены исследования, показавшие, что при
переработке растительной биомассы, которая образуется в ми-
ровом масштабе из сельскохозяйственных и древесных отходов,
а также из степной и тундровой растительности, можно получать
ежегодно энергию, в 4—5 раз превышающую мировые потребнос-
ти в ней. При этом установлено, что производство биогаза из
растительной биомассы является более дешевым, чем из живот-
новодческих отходов, если только подобрать подходящие по
составу и урожайности растения. Для производства биогаза под-
ходят многие виды биоматериалов: растительная биомасса и
различные сельскохозяйственные и промышленные отходы.
Внедрение промышленных методов производства животновод-
ческих продуктов выдвинуло ряд новых гигиенических проблем.
218
Технология производства значительного поголовья животных на
ограниченной площади предусматривает бесподстилочное их
содержание. При такой технологии накапливается от 250 до
300 т/сут отходов (от 90 тыс. т до 1 млн т в год). Это может быть
приравнено к количеству отходов в крупном городе. Одной из
сложнейших, по мнению советских и зарубежных ученых, ока-
залась проблема уборки, хранения, переработки и утилизации
огромных масс бесподстилочного навоза животноводческих комп-
лексов (Ворошилов, 1979).
Энергетические расчеты показывают, что превращение отхо-
дов в биогаз не только экономически выгодно, но и позволяет
защитить окружающую среду от загрязнений. Так, аэробная
переработка 1 кг субстрата (по ХПК) требует 2 кВт энергии,
при этом получается 0,5 кг ила, а при анаэробной переработке
из 1 кг субстрата образуются 0,5 м3 биогаза (0,4 л жидкого топ-
лива) и 0,1 кг ила (Verstraete, 1983).
Изучая проблемы и перспективы получения биогаза в ряде
развитых европейских стран, Coombs (1983) оценил возможности
интенсификации процесса. Главный акцент при разработке этой
проблемы необходимо делать не на очистке сточных вод и пере-
работке отходов, а на получении энергии, так как возрастающая
стоимость нефти и газа усиливает энергетический кризис. Опре-
делены некоторые характеристики анаэробного сбраживания
при оптимальном режиме. Состав биогаза: MeTaHa—50—75%,
углекислоты — 25-459/0, сероводорода — следы. Выход газа со-
ставляет 0‚3——0,6 м3/кг сброженного вещества. Время пребыва-
ния загрузки в реакторе в случае высокого содержания взвесей
10—30 сут, при растворимой фракции—0‚5—5,О сут. Допусти-
мые нагрузки: для твердой фракции—1 кг/(м3-сут), для жид-
кой- 10 кг/(м3-сут). На энергию перемешивания и нагрев ис-
пользуется 30-40 % образующегося биогаза.
За последние годы производство сельскохозяйственной про-
дукции увеличилось в 2-3 раза, а расход энергии — в 10——15 раз
(Байков, 1983). Одно из перспективных направлений развития
сельскохозяйственной энергетики заключено в широкомасштаб-
ном производстве биогаза из навоза животноводческих комплек-
сов, так как навоз сельскохозяйственных животных и птицы име-
ет высокий энергетический потенциал и является возобновляе-
мым энергоносителем. Этот метод энергетического обеспечения
сельского хозяйства был исследован и применен еще в начале
50-х годов, но из-за несовершенства технологии и низкого тех-
нического уровня используемых средств был признан убыточ-
ным. На современном этапе проблема производства биогаза из
навозных стоков связана не только с энергетическими вопроса-
ми, но и с защитой окружающей среды (Хитров, 1980). Энерге-
тический потенциал навозных стоков, ежедневно образующихся
в животноводстве США, оценивается сейчас равным по теплоте
сгорания 51 млн т бензина. Однако реализация этого потенциала
219
ограничена в связи с недостаточной эффективностью применяе-
мых средств.
По сообщениям Экономической и социальной комиссии ООН
Азии и Дальнего Востока, уже в 70-е годы биогаз во многих
странах мира стал надежным источником энергии. В Индии к
этому времени работало 8 ТЫС. биоэнергетических установок
различной мощности, а к 1979 г. предполагалось, что число их
возрастет до 50 ть1с‚ Такие установки сооружались из местных
материалов, причем благодаря жаркому климату не требовалось
искусственного подогрева (до 30—32 °С) сбраживаемой массы.
Биогазовая установка состояла из бродильного чана с воронкой,
через которую поступал сбраживаемый материал. Таким мате-
риалом служили растительные отходы и экскременты живот-
ных. Для сбора газа сооружались газгольдеры (Листов, 1976).
Методы получения биогаза из целлюлозы, лигнина, навоза и
других органических соединений уже много лет являются пред-
метом исследований отдела Микробиологии Индийского сельско-
хозяйственного института. Анаэробная ферментация навоза про-
исходит в герметических емкостях, расположенных на молочных
фермах института. Образуется метан, который используется как
горточее для бытовых целей, а компостная масса— как удобре-
ние. Для ускорения процесса в некоторых случаях добавляют
мочевину. Индийские ученые Продолжают искать активные
штаммы микроорганизмов, разлагающих целлюлозу и лигннн,
так как получены результаты, свидетельствующие о том, что
эффективность образования метана резко повышается, если ком-
постирование навоза крупного рогатого скота проводится в при-
сутствии древесных опилок и рисовой шелухи (Neelakantan,
1980).
Сейчас в Индии функционируют десятки тысяч установок для
получения биогаза. Типичная индийская деревня, насчитываю-
щая 500 жителей, потребляет в день 500 кВт-ч электроэнергии.
Если в этой деревне имеется 250 голов крупного рогатого скота,
то, перерабатывая навоз и растительные отходы в биогазовых
установках, можно ежедневно получать такое количество элект-
роэнергии, которое почти полностью обеспечит дневную потреб-
ность жителей, С целью пополнения сырья для выработки био-
газа в азиатских странах засевают специальные «энергетичес-
кие» плантации, использующие солнечную энергию для ускорен-
ного роста трав, водорослей, водяного гиацинта и др. Собранная
с плантаций растительная масса измельчается и подается в био-
газовые камеры для сбраживания и получения метана (Листов,
1976).
Широко распространены заводь: по производству биогаза в
Китае. Здесь уже в 1977 г. действовали 4,7 млн предприятий, где
полученный метан применялся для сушки сельскохозяйственной
продукции, производства электроэнергии, для бытовых нужд
(приготовления пищи) и др. В провинции Сьтчуань биогазом для
220
освещения жилищ и приготовления пищи пользовались 17 млн
человек, в некоторых сельских районах 80% домов «биогазифи-
цированы>> (Васильев, 1981). В настоящее время там действует
7 млн установок (8—10 M3 каждая) с общим объемом около
63 млн M3 И 40 тыс. установок с реакторами большего объема.
При условии использования современной технологии получения
биогаза Китай в год может перерабатывать до 230 млн т от-
ходов (по сухому веществу) и получать до 110 млрд м3 биогаза,
что эквивалентно замещению органического топлива в объеме
110 млн т условного топлива.
K 2000 г. КНР планирует построить 30 млн таких установок,
что позволит этой стране перерабатывать в год до 1 млрд т от-
ходов и производить до 500 млрд M3 биогаза в год или заместить
ископаемое топливо в объеме 500 млн т условного топлива на
сумму около 50-4100 млрд долларов (Панцхава‚ 1985).
Комиссия, занимающаяся проблемами, связанными с полу-
чением биогаза и промышленным Производством соответствую-
щего биотехнологического оборудования, изучила ситуацию в
этой области в США. Производство установок для получения
бпогаза из различных видов отходов и биомассы растительного
происхождения началось в США в 1980 г. К 1984 г. общее коли-
чество таких установок достигло 50 (в Западной Европе -— 500).
Правительство США в 1972 г. открыло финансирование работ по
созданию специальных реакторных устройств для ферментации
различных отходов.
В США много так называемых неорганизованных установок
для масштабированного производства биогаза, В южной Kann-
форнии и других штатах успешно работают аппараты, утилизи-
рующие биомассу водорослей и органические вещества осадков
сточных вод. Кроме того, на многих фермах США установлены
небольшие установки для сбраживания навоза и сельскохозяй-
ственных остатков. Продажей установок для получения биогаза
занимаются 10—15 крупных компаний. Отмечается растущая
заинтересованность крупного капитала США в производстве
бнореакторов. Исследования по программе «Энергия из биомас-
cm» курируются Министерством энергетики США, финансирова-
ние из бюджета в 1982 г. составило около 20 млн долларов
(Demuynck, 1984).
Имеются сведения о том, что из 500 метанообразующих очи-
стных установок в странах Европейского экономического сооб-
щества 400 перерабатывают сельскохозяйственные стоки, 25—
городские и 75—-промышленные. 68% жидких сельскохозяйст-
венных стоков обрабатываются на непрерывных одноступенча-
тых реакторах полного смещения, 58% твердых отходов-на
реакторах периодического действия (Nyns, 1983),
По мнению ряда американских специалистов, для эффектив-
ной переработки навоза в биогаз необходима концентрация от-
кормочных предприятий, рассчитанных не менее чем на 300 тыс.
221
голов скота и расположенных в радиусе не более 80 км от завода
(Sauth, 1979). В конце 70-х годов в штате Канзас начали стро-
ить навозоперерабатывающий комплекс с ежесуточным выходом
очищенного метана 73 тыс. M3 (Purschwitz, 1979).
Данные об удельных капиталовложениях в строительство
цехов или предприятий по переработке навоза в биогаз свиде-
тельствугот о том, что при увеличении размера откормочного
предприятия с 1 тыс, голов до 100 тыс. капиталовложения на
одну голову снижаются с 371 до 66 долларов.
В перспективе с изменением исходных факторов изменится
и экономичность. В особенности следует считаться с растущей
стоимостью энергии. Чем дороже станет энергоноситель, с кото-
рым ведется сравнение — жидкое топливо (пли электроэнергия),
тем больше будет заинтересованность в биогазовых установках.
В настоящее время уже имеется возможность для внедрения
производства биогаза и в малых хозяйствах (различных инсти-
тутах, на предприятиях, в личных хозяйствах и пр‚). Например,
Пенсильванский университет разработал и испытал биогазовую
установку для животноводческих ферм с поголовьем до 150 ко-
ров. На опытном образце с реактором объемом 100 M3 за год был
получен биогаз в количестве, эквивалентном 72 тыс. кВт-ч элект-
роэнергии: коэффициент чистого выхода биогаза составил 0,75
(Person, 1978).
B 1979 г. в Индии действовало 65 тыс. установок для произ-
водства биогаза, при этом большинство из них предназначено
для утилизации навоза, получаемого от нескольких голов круп-
ного рогатого скота. Такие установки рассчитаны на призводст-
во 3 M3 биогаза, для них вместе с компостной ямой требуется
27 м? площади. Обслуживать такие установки может человек, не
имеющий специальной квалификации. Опасность возникновения
пожара минимальна (Байков, 1983).
На ярмарке в Вене была продемонстрирована установка для
получения биогаза из сухого коровьего навоза на фермах. Kam-
дый газовый генератор, использующий в качестве сырья навоз
от 20 коров, вырабатывает ежедневно 20 M3 биогаза. Было под-
считано, что эксплуатация в сельском хозяйстве подобных уста-
новок позволит сократить ежегодный импорт нефти в страну на
570 тыс. т, что в денежном выражении составляет 17,5 млн дол-
ларов (Васильев, 1981).
Подробно описана работа одной из установок по переработке
навоза в тепловую и электрическую энергию, действующей в
штате Миссури (США). Она обслуживает ферму на 60 голов
крупного рогатого скота и свиноферму на 300 голов. Навоз для
переработки поступает ежедневно в биореактор с рабочим объ-
емом 124 M3. Такой реактор дает ежедневно 280 M3 биогаза, со-
держащего 55% метана. Через 6 ч после загрузки образуется
40% дневной выработки биогаза. Часть его используется для
обеспечения работы реактора, в котором необходимо поддер-
222
живать температуру 35 °С‚ и для работы одновременно действую-
щей установки, в которой получают этанол из злаковой пульпы
(Fisher, 1983).
Финская фирма «Bio Energy OY>> создала реактор для пере-
работки навоза в биогаз на фермах крупного рогатого скота с
численностью животных до 90 голов, свинофермах с поголовьем
1000 свиней и птицефермах до 10 тыс. кур. Время переработки
навоза 10 сут при температуре 35 °С. Для контроля за работой
реактора требуется 15 МИН/СуТ. Техническая проверка необходи-
ма 1 раз в год при остановленном реакторе (Экспресс-информ.
...‚ 1986).
Значительный опыт по созданию и эксплуатации биогазовых
установок накоплен в социалистических странах. В 1969—1973 гг.
в ЧССР по проекту разработчиков из г. Праги была построена
станция совместной очистки городских сточных вод и свиных
экскрементов, что позволило организовать производство свини-
ны промышленным способом без угрозы загрязнения окружаю-
щей среды. Одновременно впервые в ЧССР была реализована
в крупном производственном масштабе технология прямой об-
работки свиных экскрементов анаэробным способом. Продук-
тами процесса сбраживания являются биогаз—6000 м3/сут‚
твердая фракция после обезвоживания—8 т/сут с 30% сухого
вещества и жидкая фракция—270 м3/сут. Биогаз используется
для отопления метантенков, нагрева воды, отопления трех сви-
нарников и в летнее время —- для сушки трав в передвижной су-
шилке. Выход биогаза —свыше 800 л из 1 кг органического ве-
Щества.
В ГДР в г. Дрездене производят установки для получения
биогаза из навоза. Биогаз используется преимущественно для
отопительных целей, но возможно его применение и в газовых
двигателях для производства механической и электрической
энергии. Выявлено, что при ферментации смешанного навоза
(свиного и коровьего) производится биогаза больше, чем из од-
нородного навоза. Производство биогаза из смешанного навоза
составляет 2,5 м3 на 1 M3 сбраживаемой массы при времени фер-
ментации 6-8 дней и температуре 35—36 °С.
B Венгрии в сельскохозяйственном кооперативе «Дожа» ра-
ботает биоустановка по переработке отходов. На установку по-
ступает около 12 тыс. т в год отработанной соломенной подстил-
ки, 8 тыс. т отходов от свинофермы, виноградарства, садоводства
и с полей. Собирается также мусор из окрестных сел, сухие
стебли кукурузы, ботва, опилки. Из 20 тыс. т биомассы получают
такое количество метана, которое по энергии равнозначно 440—
500 т нефти, кроме того, производится 18 тыс. т высококачествен-
ных удобрений. Анаэробная переработка отходов позволяет при-
готовить органические удобрения со значительным количеством
азота, фосфора, калия, Обслуживается такое производство лишь
несколькими работниками, а стоимость его окупается через 5 лет.
223
Уже разработаны проекты биозаводов‚ рассчитанных на по-
головье скота от 12 до 500 тыс.‚ а также работающих на речном
иле. Высокая отдача получается при использовании сточных вод
и побочных продуктов растениеводства, опилок. Ведутся экспе-
рименты по разработке установок для приусадебных и садовых
участков. Принята специальная программа, к реализации кото-
рой подключены 30 научно-исследовательских институтов и
25 предприятий республики (Бюл. иностр. ..., 1983).
В Болгарии создана и функционирует установка для произ-
водства биогаза из навоза, получаемого от 2500 свиней. За сутки
вырабатывается около 1000 M3 биогаза, что по энергии эквива-
лентно 600 л дизельного топлива (Жиц и др.‚ 1986).
Потенциальные возможности Советского Союза по производ-
ству биогаза из органических отходов разных отраслей народно-
го хозяйства достаточно велики. СССР в год производит более
500 млн т органических отходов, из них в животноводстве-
230 млн т, в растениеводстве—— 160 млн т (130 млн т соломы,
10 млн т гузапаи, 20 млн т ботвы), в процессе лесо- и деревооб-
работки — 70, городских отходов — 67 млн т (60 млн т твердых
отходов, 7 млн т сточных вод). Переработка значительной их
части в биогаз позволит получать до 200 млрд M3 биогаза в год,
или заместить органическое топливо в объеме до 150—200 млн т
условного топлива и получить до 20 млн т органических удобре-
ний. Для этого необходимо построить биоэнергетические уста-
новки с общим объемом реакторов 110 млн M3, или 110 тыс.
установок с реакторами объемом 1 тыс. M3.
Таким образом, только переработка отходов сельского хозяй-
ства в биогаз с учетом получения товарного газа по существую-
щим технологиям позволит полностью заместить использование
ископаемого топлива в этой отрасли. Но для этого необходимо в
течение ближайших лет создать соответствующие производствен-
ные Мощности по выпуску биоэнергетических установок (Панц-
хава‚ 1985). Если обеспечить биоэнергетическими установками
все животноводческие, свиноводческие комплексы и птицефабри-
ки нашей страны, то это позволит получить до 10-15 млрд M3
биогаза в год, т. е. заместить органическое топливо в объеме
10—15 млн т условного топлива.
Работы по аназробному сбраживанию навоза проводились
еще в 50-х годах. В Запорожском филиале ВИЭСХа (ныне
ЦНИПТИМЭЖ) в 1959 г. была сооружена опытная биоэнерге-
тическая установка, рассчитанная на использование отходов от
150 коров и 20 свиноматок с поросятами. Длительная эксплуата-
ция установки и осуществленные исследования показали, что
для получения метана пригодны любые растительные отходы
сельскохозяйственного производства. Было выявлено, что про-
цесс метанового брожения навоза крупного рогатого скота, а
также его смеси с навозом свиней в соотношении 1 : 2 при влаж-
ности 88——94°/д или с древесными опилками, применяемыми в
221
качестве подстилки вместо измельченной соломы, протекает
устойчиво. Метанообразование при использовании одного свино-
го навоза из-за кислой реакции среды происходит медленнее,
чем в случае смешивания его с растительными отходами (ботвой
картофеля, сорным разнотравьем).
Лучшая оргачическая масса для получения биогаза — навоз
крупного рогатого скота в смеси с растительными отходами при
соотношении этих компонентов 1 :2 ИЛИ 1 : 1. Удельный выход
биогаза при этом на 15-20 % выше, чем при применении одного
навоза. Переработка навоза от одной условной головы крупного
рогатого скота позволяет получать 900 кВт-ч электроэнергии в
год. Остальная энергия идет на оботрев животноводческих по-
мещений и поддержание температуры в биореакторе (Листов
и др., 1976).
В качестве побочного продукта метанового брожения получа-
ют витамин B12 B количестве 280—-300 мкг/л. Разработана Tex-
НОЛОГИЯ получения кормового концентрата витамина B12, заклю-
чающаяся в отделении от перебродившей массы остатков соломы,
получении осадка из очищенной жидкости, высушивании его при
65—70 °С и измельчении в муку, Это и есть кормовой концентрат
витамина B12. B 1 г такого концентрата содержится 8—10 мкг
витамина. При хранении качество концентрата сохраняется.
Было подсчитано, что при утилизации навоза от 150 голов круп-
ного рогатого скота в течение года можно получить около 150 т
витаминного концентрата и этим количеством обогатить более
50 тыс. т кормов. Добавка этого концентрата в корм птице и
свиньям повышает их продуктивность и сокращает отходы по-
головья (Листов и др., 1976).
В 60-х годах проведены эксплуатационные испытания опыт-
но-производственной биогазовой установки в экспериментальном
хозяйстве «Заречье» Белорусской ССР, Установка была рассчи-
тана на переработку навоза от 400 голов крупного рогатого ско-
та. Средний выход биогаза за период работы составил 600 м3/сут
(на 1 т навоза — 16,4 M3, а на 1 т сухого вещества — 205 м3). На
работу самой установки израсходовано 62% годового производ-
ства биогаза, избыток его для использования в сельском хозяй-
стве равнялся 32%. B настоящее время установка демонтирована
(Жиц и др., 1986).
В Латвийской ССР в совхозе <<Огре>> совместно с Институтом
микробиологии АН ЛатвССР в 1981—1982 гг. осуществлены ис-
пытания нескольких биогазовых установок. На свиноводческом
комплексе совхоза сначала работала установка емкостью 58 л,
изготовленная из оргстекла, затем была пущена вторая установ-
ка с метантенком емкостью 75 M3. Сейчас работают два метан-
тенка, рабочая емкость которых 100 M3. Получаемый биогаз
сжигается в котле, нагревающем воду, идущую на горячее водо-
снабжение фермы. Институт «Латгитгропром» разработал проект
первого в стране опытно-промышленного биоэнергетического
15. Зак, 966 225
комплекса, который запроектирован с учетом использования от-
ходов свинокомплекса от 24 тыс. голов. Здесь будет вырабаты-
ваться в год до 1540 тыс. м3 биогаза и около 98500 т высокока-
чественных удобрений. Биогаз Предполагается преобразовать в
3150 тыс. кВт/ч электрической энергии. Стоимость биоэнер-
гетического комплекса— 1700 тыс. руб.‚ полная окупаемость-
около четырех лет (Алимов, 1986).
Эстколхозпроект разработал проект реконструкции цеха пере-
работки жидкого навоза для Пярнуской межколхозной свино-
фермы на 30200 голов скота. Процесс переработки навоза в
мезофильном режиме рассчитан на 16-17 сут. При количестве
накапливаемого навоза 400 м3/сут с содержанием сухого веще-
ства, равным 4%, выход биогаза составляет 6210 м3/сут. Кроме
того, образуется осадок—6 тыс, т в год, он компостируется и
идет на удобрение. Из годовой выработки биогаза 61% расхо-
дуется на подогрев навоза, отопление и вентиляцию, 39% сжи-
гается на центральной котельной свинофермы. Экономия топлива
котельной достигает 500 т топливного мазута, или 15% годовой
потребности комплекса (Яра и др., 1982).
В подсобном хозяйстве Машиностроительного научно-произ-
водственного объединения г. Сумы (УССР) с 1984 г. эксплуа-
тируется биогазовая установка на свиноферме с 3000 свиней.
Среднесуточный выход биогаза 350—550 м3/сут, температура
сбраживания 40—41 °С‚ загрузка биореактора происходит 2 раза
в сутки по 15 м3 навоза. Установка обслуживается одним аппа-
ратчиком, биогаз используется только для получения пара для
нужд кормоприготовления.
В Белоруссии только в 1985 г. возобновились проектно-изыс-
кательные работы по созданию биоэнергетической установки (в
колхозе им. Дзержинского Речицкого р-на Гомельской обл.).
Ввод ее в действие намечен в 1989 г. На обслуживание самой
биогазовой установки будет расходоваться около 50% годового
объема получаемого биогаза. Однако, несмотря на значительные
потенциальные возможности сырьевой базы, способные удовлет-
ворить потребности республики в топливе и удобрениях, опыт по
получению и использованию биогаза из отходов сельского хо-
зяйства не нашел широкого применения, что ухудшает санитар-
ное состояние окружающей среды. Большинство эксплуатируе-
мых в республике систем обработки навоза на животноводчес-
ких комплексах, Включая подготовку, орошение и удобрение
сельскохозяйственных земель, не имеет систем очистки и обез-
зараживания, позволяющих надежно предотвращать загрязне-
ние почвы, поверхностных и грунтовых вод (Жид и др.‚ 1986).
Программа «Биотехнология» в области сельского хозяйства
главной задачей ставит создание прочной базы, обеспечивающей
население стран —членов СЭВ продуктами питания. При этом
основной целью является биотехнологическое производство цен-
ных органических удобрений. Микробиологическое получение
226
новых источников Энергии (биогаза) при утилизации сельскохо-
зяйственных отходов не только надежно обеззараживает навоз,
но и способствует накоплению органических удобрений, богатых
азотом и другими питательными веществами.
В западных странах с наступлением энергетического кризиса
минеральные удобрения стали дороже, так как производство их
чрезвычайно энергоемко. Это послужило причиной того, что по-
лучаемые в самом хозяйстве органические удобрения вновь об-
рели свою прежнюю ценность и усилилось стремление исполь-
зовать их оптимальным способом: исключить потери питательных
веществ и снизить объем складских емкостей.
Органическое удобрение, образуемое при метаногенезе, об-
ладает высоким удобрительным действием, обеспечивающим до-
полнительный прирост урожайности— в среднем около 20% на
1 т сухого органического остатка. Это дает экономию валютных
средств, затрачиваемых на систематическую закупку зерна за
границей по цене 200 долларов за 1 т. Эффективность примене-
ния такого удобрения равна 40 долларам на 1 т остатка.
Французская фирма выпускает новое органическое удобре-
ние——ферментированный навоз крупного рогатого скота. Удоб-
рение выпускается в виде гранул, из 10 кг навоза получается 1 кг
(85% сухого вещества). Оно содержит больше органического
вещества, фосфора, калия, кальция и магния, чем в обычном
навозе, и не имеет запаха. Внесенные в почву гранулы быстро
растворяются дождевой водой (Жид и др., 1986).
Советские ученые показали, что в течение года при штабель-
ном хранении навоза от одной коровы в почву поступает 12-
15 кг азота, причем в результате сбраживания навоза увеличи-
вается процент азота в аммиачной форме. При сравнении эффек-
тивности применения различных удобрений обнаружено, что
перебродивший навоз в метантенках способствует получению
самых высоких урожаев (табл. 38).
Площади земель, пригодных для возделывания сельскохозяй-
ственных культур, ограничены, поэтому особенно важно беречь
землю, охранять ее от истощения, повышать плодородие. Инду-
стриализация и химизация сельского хозяйства, перевод живот-
новодства на промышленную основу порождают новые сложные
проблемы оздоровления земли. Само сельское хозяйство оказы-
вается источником опасного загрязнения окружающей среды.
Отходы полей и крупных ферм, если их не обезвредить, стано-
вятся бедствием для природы. При плохо продуманном приме-
нении минеральных удобрений, пестицидов и гербицидов эти
средства превращаются в серьезную угрозу плодородию земель
и тем живым организмам, которые обеспечивают нормальный
круговорот веществ в почве. Вот почему традиционное земледе-
лие, пока существует, постоянно будет нуждаться в качественных
удобрениях, а биоконверсия сельскохозяйственных отходов в
компосты будет приобретать все большее значение.
15* 227
Таблица 38. Эффективность применения различных удобрений
(Листов и др.‚ 1976)
Урожайность
Вариант опыта картофеля 1 КЗПУСТЬ‘ l КУКУРУЗЫ
ц/га! % 1и/га1 % |u/ra| %
Без удобрений (контроль) 178,2 100 274,0 100 57,0 100
Навоз штабельного хранения 198,0 111,1 405,0 145,0 66,0 115,8
Минеральные удобрения (NPK) 193,5 108,6 386,5 141,0 67,0 117,5
Перебродивший навоз 211,4 119,3 432,0 157,6 71,6 125,4
Как известно, основная роль в превращении сельскохозяйст-
венных и других органических отходов в плодородный пахотный
слой принадлежит микроорганизмам. В Последние годы имеется
достаточно сообщений о применении отдельных микроорганиз-
мов или их ассоциаций для биоконверсии сельскохозяйственных
отходов в органические удобрения.
Японская фирма получила штамм бактерий, предназначен-
ный для эффективной переработки рисовой соломы в компост,
представляющий собой удобрение для сельскохозяйственных
растений. Фирма намечала провести производственные испыта-
ния 50 т препарата, получившего название «дайкомпо», который
предполагали получить в промышленных условиях в 1980 г. из
культуры выделенного штамма (Эксиресс-информ. �h�� 1979).
Ученые Токийского университета, исследуя возможные спосо-
бы утилизации навоза свиней, крупного рогатого скота и птиц,
показали, что для навоза крупного рогатого скота компостиро-
вание наиболее Эффективно. Оно Предусматривает внесение в
навоз микробного инокулята, брикетирование и выдерживание
в течение 9 мес. Куриный помет компостируется с использовани-
ем инокулята термофильных бактерий (0,025 объема). Процесс
включает два этапа: фермлентацию в иолуанаэробных условиях в
течение 65 ч, затем аэробную ферментадию с барботажем при
температуре 70 °С в течение почти 40 ч. Ведущая термофильная
культура — Thermomonospora viridis. Метод позволяет пол-
ностью уничтожить развитие патогенной микрофлоры и дает
значительную экономию энергии (Naito е1а1.‚ 1982).
Для компостирования соломы применяются смешанные ио-
пуляции микроорганизмов, в которых бактерии, не разлагающие
целлюлозу, растут на продуктах, образуемых Целлюлозолитичес-
кими грибами, дающими также подходящие субстраты для об-
разовапия бактериального полисахарида, улучшающего струк-
туру почв. В сообществе с целлюлозолитическими грибами Tri-
Choderma или Pem‘cilz‘um анаэробные бактерии Clostridium bu-
tyricum фиксируют атмосферный азот. При комиостировании
Целлюлоза и гемицеллюлоза соломы превращаются микроорга-
низмами в продукты питания растений (Lynch ей а1.‚ 1984).
228
В 1984 г. во Францииразработан новый способ биоконверсии
растительных, животных и хозяйственных отходов в гуминовые
удобрения. Гумификация целлюлозы и лигнина осуществляется
аэробными бактериями, действующими в симбиозе с грибами,
завершающими получение стабильного гумуса.
Размножение бактерий активизируется путем введения в
субстрат металлических электродов любой формы. Возникающий
электрический ток обеспечивает электролиз среды и снабжение
ее кислородом и водородом. Несколько часов спустя происходит
разогревание среды до 60 °С, что способствует быстрому разло-
жению субстрата.
Широкое распространение в последние годы получили дре-
весные отходы, которые используются при приготовлении ком-
постов (особенно в Японии). Так, для устранения неприятного
запаха при комиостировании свиного навоза его смешивают с
опилками и готовым сухим компостом в соотношении 5:8: 1,
оптимальная скорость аэрации при этом 86 мл/(мин-кг). Навоз
крупного рогатого скота компостируют с древесными опилками
в течение 23 нед. Через 5 нед от начала компостирования соот-
ношение С : N стабилизируется, что свидетельствует о готовнос-
ти компоста.
Исходным сырьем для приготовления искусственной почвы
также служат древесные опилки. Их насыпают в стойлах на
фермах крупного рогатого скота слоем 10 см. Чсрез 15 дней
опилки, пропитанные экскрементами и мочой животных, смеши-
вают с рыбными отходами и компостируют в ямах. При сниже-
нии температуры саморазогревающегося компоста до 30°C
(через 2 мес) в него вносят дождевых червей, и процесс компо-
стирования продолжается еще 16 мес. Полученный материал
переносят на птииеферму, где применяют одновременно в каче-
стве подстилки и корма для кур. На заключительном этапе при-
готовления искусственной почвы подстилку компостируют в
буртах и гомогенизируют.
Искусственная почва характеризуется прочной агрегатной
структурой, содержит 54% углерода, 2,7% азота и около 20%
водно-растворимых зольных веществ. В смеси с песком она мо-
жет быть использована как субстрат для выращивания растений
в вегетационных сосудах, при этом в отличие от других искусст-
венных субстратов на ней не происходит загнивания корней.
B полевом опыте показано, что искусственная почва является
высокоэффективным органическим удобрением (Тапака е’: а1.,
1983; Нагас1а е1а1.‚ 1983).
В европейских странах и США за последние 30 лет возросло
производство компоста из коры древесных пород, представляю-
щего собой пенное удобрение для сельскохозяйственных куль-
тур. Разработаны методы компостирования, которые позволяют
контролировать процесс микробиологического разложения исход-
ного сырья. В ФРГ, где ежегодно в отходы идет 1,5 млн т коры, ее
229
компостированием занимаются 33 специализированных пред-
приятия. Они производят 550 тыс. M3 компоста в год (Экспресс-
информ. ..., 1984).
В Италии исследуют вопросы утилизации сельскохозяйствен-
ных отходов в Институте лесного хозяйства и охраны природы.
Проведена оценка пригодности различных видов отходов для
выработки органических удобрений. В стране накапливается
около 410 Млн M3 отходов деревообрабатывающей промышлен-
пости, устранение которых связано с большими трудностями.
Создана технология переработки отходов в компост, по которой
работают три промышленные установки призводительностью
30 т органических удобрений в год. На специально оборудован-
ной площадке измельченную кору лиственных пород (55%)
смешивают с осадком сточных вод Целлюлозно-бумажных фаб-
рик (20%) Н формируют из них бурты, в которые в три приема
добавляют птичий помет (25%). Массу отходов за весь период
компостирования несколько раз перемешивают. Через 8 мес
компост готов, он богат гуминовыми кислотами и другими веще-
ствами, повышающими плодородие почв. Удобрение широко при-
меняется в садоводстве и овощеводстве, доза 100—200 ц/га.
В Италии вырабатывают более 4 млн Ц органических удобрений
с использованием коры. Внесение ее не только улучшает каче-
ство выращиваемых овощей, но и способствует более длитель-
ному сохранению товарного качества быстропортящихся овощей
при транспортировке.
В ЧССР ежегодно с примесью отходов древесины перераба-
тывают 160 тыс. M3 еловой коры. При компостировании на 1 т
коры добавляют 350 кг бесподстилочного навоза свиней и круп-
ного рогатого скота с содержанием сухого вещества 45%. Ком-
постируют в течение 6—8 нед, температура приготовления ком-
поста достигает 65 °С. Полученный компост содержит около 80%
органического вещества, 0,98% азота, 0,36% P205, 0,32% фосфо-
ра и 0‚32°/д калия в усвояемой форме. Специалисты считают, что
применение таких компостов особенно эффективно на почвах с
низким потенциальным плодородием (Экспресс-информ. � 1985).
Областное объединение «Архангельсксельхозхимия» рекомен-
довало приготовление лигно-пометных компостов (1 : 1) с влаж-
ностью 61——72°/0, содержанием азота 7 кг/т, фосфора—6, ка-
лия — 3, кальция — 10 кг/т. В полевых опытах в Архангельской
обл. внесение таких компостов значительно повысило урожай-
ность картофеля, белокочанной капусты, однолетних и многолет-
них трав. Лигнин эффективно использовали для приготовления
лигно-навозных, лигно-жижевых и лигио-фосфоритных компос-
тов. Птичий помет хорошо компостировался с древесной корой и
опилками (Страхов, 1985).
Во Франции разработан способ компостирования отходов
сельскохозяйственных животных с растительными остатками для
получения органического удобрения. Отходы (содержимое же-
230
лудка животных, обрезки кожи, жир, кровь, попадающие в сточ-
ные воды при мытье туш, и другие отходы, не нашедшие приме-
нения) смешивают с растительными остатками (кукурузными
стержнями, опилками) и измельчают. Соотношение С : N B ком-
постируемой массе должно составлять 1 : 10. Увлажнеиную смесь
помещают в ферментер и выдерживают при постоянном переме-
шиваиии и аэрировании Несколько часов, выгружают и компо-
стируют на открытых площадках. Через 3 мес компост готов.
По такой технологической схеме уже работает предприятие по
убою скота, оборудованное 7 биоферментерами. На нем ежегодно
вырабатывается 1200 т компоста, применяемого в овощеводстве
и садоводстве (Экспресс-информ. ` �� 1985).
У нас в стране проведена агроэкономическая оценка произ-
водства и применения пометно- и навозно-почвенных компостов,
рекомендуется готовить их в хозяйствах, малообеспеченных тор-
фом и другими влагоемкими материалами. Срок компостирова-
ния 1 мес, готовят компост в соотношении 1 часть помета или
навоза и 1,5 части почвы, полученную смесь штабелюют (1,5—
2 M). Затраты на Приготовление таких компостов окупаются
стоимостью дополнительной продукции растениеводства (Василь-
ев и др, 1981).
В БССР в колхозах проверяется эффективность компостов,
приготовленных на основе сапропеля. По методике, предложен-
ной сотрудниками Института торфа АН БССР, органическое
удобрение готовят на основе сапропеля оз. Червоное в сочетании
с навозом крупного рогатого скота и куриным пометом. Присут-
ствие в компостах сапропеля способствует сохранению биологи-
ческой активности органических удобрении более длительное
время.
Интересное сообщение опубликовали ученые Бельгии. Срав-
нивая теплообразование при компостировании с энергией, вы-
деляемой в процессе анаэробной очистки, они установили, что
при обработке одинаковых по составу сельскохозяйственных от-
ходов в одинаковых условиях при компостировании эпергии об-
разуется в 5ш10 раз больше, чем при метанообразовании в ана-
эробном ферментере (для сравнения использовали схему полу-
чения тепла, образующегося при компостировании, для нагрева
системы воздух-вода до 50щ55 °С). Следовательно, компости-
рование является наиболее экономичным и рентабельным мето-
дом получения энергии из сельскохозяйственных отходов (Ve-
rougstraete е’: а1.‚ 1985). В ФРГ создано устройство для получе-
ния тепла при микробном разложении органических веществ,
например соломы, древесной коры, зеленой массы.
Наращивание мощностей в растениеводстве и животноводст-
ве, которые определены Основными направлениями экономиче-
ского и социального развития на 1986—1990 гг‚, требует допол-
нительных поставок различных видов топлива и энергоносителей
в сельскую местность республики. Кроме того, выполнение по-
231
ставлепных задач предполагает немедленное решение природо-
охранительных Мероприятий, неразрывно связанных с объектами
сельскохозяйственного производства, в первую очередь с живот-
новодческими комплексами. Внедрение безотходных технологи-
ческих процессов как в производственных подотраслях Агропро-
Ma BCCP (пищевой, мясо-молочной промышленности), так и в
животноводстве и растениеводстве, где образуется достаточное
количество органических отходов, позволит методом биоконвер-
сии получить к 1990 г. 860,0 млн м3 биогаза в год и ценные орга-
нические удобрения (Жиц, Кузмич, 1986).
Анализ зарубежного и отечественного опыта Показывает, что
при биоконверсии сельскохозяйственных отходов возможно по-
лучение топлива (биогаза), высококачественных удобрений, ПО-
вышающих урожайность различных культур, обезвреживание
этих отходов, получение и использование топлива н удобрений
непосредственно на животноводческих комплексах и в сельских
населенных пунктах. При этом значительно сокращаются рас-
ходы на доставку.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В последнее десятилетие усилился интерес к использованию
растительной биомассы, основную часть которой составляет цел-
люлоза. Постоянный рост антропогенной нагрузки на биосферу
требует решения Проблемы утилизации лигноцеллюлозных от-
ходов сельского хозяйства, промышленности и переработки
стоков различных производств.
Существует несколько путей вовлечения этих Отходов в це-
левые процессы биоконверсии. Так, возможно более полное
усвоение жвачными животными грубых целлюлозосодержащих
кормов в результате их соответствующей физической или хими-
ческой предобработки. Получение легкоусвояемых сахаров, осо-
бенно глюкозы, из лигноцеллюлозных отходов путем фермента-
тивного гидролиза по экономическим соображениям пока проб-
лематично. Этот путь утилизации растительных полимеров
предполагает разработку эффективной технологии непрерывного
полугчения глюкозы из целлюлозы. В дальнейшем возможна кон-
версия глюкозы во фруктозу или использование ее в качестве
сырья для микробиологического синтеза различных целевых про-
дуктов. Особого внимания, по мнению специалистов, заслужи-
вает получение из ферментативных гидролизатов целлюлозы
этилового спирта.
Основной путь использования растительных субстратов —— по-
лучение на их основе белково-углеводных кормовых концентра-
тов Для удовлетворения потребностей сельского хозяйства. В свя-
зи с быстрым ростом народонаселения в мире возникла пробле-
ма обеспечения людей полноценным питанием. Эта проблема не
имеет однозначного решения. Обычные методы увеличения пищи
и кормов за счет сельского хозяйства в значительной степени
исчерпаны. Поэтому наряду с интенсификацией сельскохозяйст-
венного производства реальной необходимостью становится раз-
работка индустриальных способов получения кормовых и пище-
вых продуктов путем микробиологического синтеза.
Для превращения лигноцеллюлозных субстратов в ценные
продукты используют различные микроорганизмы, однако наи-
более целесообразно применение мицелиальных грибов. Вместе
с тем утилизация продуктов фотосинтеза в качестве субстратов
и мицелиальных грибов в качестве продуцентов белковой био-
массы требует решения таких задач, как расширение спектра
сырья, создание специального оборудования для культивирования,
проведение соответствующих медико-биологических и зоотехниче-
ских испытаний конечных продуктов. По стоимости и биологиче-
ской ценности грибной белок должен быть конкурентоспособным
с традиционными белковыми кормами, такими, как люцерна,сос-
вый шрот, рыбная мука и др. Переработка целлюлозосодержащих
233
сельскохозяйственных отходов и вторичного пищевого сырья в
кормовые продукты в энергосберегающих и безотходных техно-
логиях наиболее рентабельна при Максимальной близости про-
изводств как к сырьевым, так И к потребительским объектам,
так как это позволяет свести до минимума затраты на транспор-
тировку и хранение сырья и продукции, а также упростить про-
изводственные процессы.
Анализ имеющихся данных дает Основание полагать, что при
соблюдении определенных условий получение грибного белка
может быть экономически целесообразным. При равных затратах
на производство по биологической ценности Микробный белок
более полноценен, чем растительный. Возможна замена до 10%
рациона сельскохозяйственных животных кормовыми белковыми
препаратами из дрожжей и бактерий, а также грибным белком.
Таким образом, результаты исследования прямой конверсии
лигноцеллюлозньтх субстратов в микробную биомассу с повы-
шенным содержанием белка обнадеживают. В этом случае эко-
номически наиболее выгодными будут технологии, решающие од-
новременно две задачи: проблему получения целевого продукта,
например кормового белка, и проблему утилизации загрязняю-
щих среду отходов.
Существует еще один путь использования возобновляемого
сырья — непосредственное получение из него спирта, органичес-
ких кислот, биогаза, биоорганических удобрений. Получение
биогаза из различного рода сельскохозяйственных и бытовых
отходов уже сейчас является повседневной реальностью. Исполь-
зование ассоциаций анаэробных микроорганизмов, разлагающих
биомассу с образованием метана, весьма перспективно как для
пополнения энергетических ресурсов, так и для очистки окру-
жающей среды. Доказано, что метаногенез с участием много-
компонентной системы —— самый выгодный и экологически целе-
сообразный путь превращения органического вещества отходов
в топливо. Такие процессы осуществляются в закрытых резер-
вуарах‚ не требуют притока кислорода, установки занимают ма-
лую площадь. Применение различных отходов для получения
биогаза позволяет создать безотходные технологии. При этом
сельское хозяйство наряду с топливом сможет дополнительно
получать миллионы тонн полноценных органических удобрений.
Наконец, перспективным и целесообразным представляется
запахивание некоторых целлюлозосодержащих сельскохозяйст-
венных отходов, например соломы и др.‚ в почву с предваритель-
ной инокуляцией их ассоциацией целлюлолитических грибов и
азотфиксирующих бактерий, продуцирующих полисахариды,
Это позволяет использовать основную часть соломы непосредст-
венно B хозяйствах, улучшает структуру почвы, обеспечивая ее
дополнительным азотом, снижает заболеваемость растений.
Использование микроорганизмов при компостировании отходов,
содержащих целлюлозу, в настоящее время применяется для
234
получения ценного органического удобрения, например из дре-
весной коры.
В заключение следует подчеркнуть, что дальнейший прогресс
в Области микробной биоконверсии лигноцеллюлозы в Полезные
продукты связан с поиском новых, в том числе термофильных,
микроорганизмов, Методы генной инженерии позволят создать
более эффективные штаммы микроорганизмов, лучше приспособ-
ленные к определенным типам биоконверсий и обеспечивающие
больший выход целевого продукта. Разработка рациональных
способов предобработки лигноцеллюлозных субстратов и соот-
ветствующее аппаратурное оформление процессов также позво-
лят резко повысить их эффективность и конкурентоспособность.
ЛИТЕРАТУРА
Абрамович Ц. Л., Озолиня Н. Р., Сергеева В. Н. // Химия древесины, 1987.
N9 2, С. 88-94.
Авров О. E., Мороз 3. М. Использование соломы в сельском хозяйстве.
Л.‚ 1979.
Агабекян Э. Л., Дмитриев В. В.‚ Ратнер Е. H. и Др.//Микробиология.
1982. T. 51, М: 3. C. 472-476.
Айбазов О. А. Ферментативный способ обработки соломы. М., 1984.
Айказян А. П., Серегин В. 14., Калачев П. М. и др. Развитие новейшей
биотехнологии в капиталистических странах. М., 1985.
Александров Е. Н., Сгадлев Т. Ф., Кауфман Т. М. и др. Переработка
отходов различных отраслей народного хозяйства микробиологическими ме-
тодами. М., 1982.
Алексеева В. В.‚ Булгакова Е. И.//1\/ симпоз, соц, стран ио биотехноло-
гии: Тез. докл, Варна, 1986. С. 145.
Алексеева В. В.// Раст, ресурсы, 1965. Т, 1_ С, 122-127.
Альперович Е. Д. Получеиие целлюлазных ферментных препаратов на
основе грибных культур: Автореф. дис, `��� канд. биол, наук. М„ 1986.
Алимов Н. // M3BecT11s1. 1986. 28 окт. C. 3.
Андреев А. А.‚ Брызгалов Л. И. Производство кормовых дрожжей, М.,
1986.
Апсите А, Ф., Каткевич Ю. Ю.‚ Екабсоне М. A. // Биоконверсия расти-
тельного сырья: Тез. доки, Всесоюз. симиоз, Рига, 1982. T. 1. C. 35-36.
Апсите А. Ф.‚ Виестур У, Э.‚ Апине А. Я. и др. //1\/1ице„чиа„чьные грибы:
Физиология, биохимия, биотехнология: Тез. докл, Всесоюз, конф, Пущино,
1983, С. 166-167.
Ахмедов Г. A., Ездаков Н. В. // Мнкробиол. ирои-сть. 1983, N9 4. С, 12-14.
Ахмедов Г. A., Ицыгин Б. Б.// Биосинтез ферментов микроорганизмами:
Тез, докл, III Всесоюз, конф. Пущино, 1986. C. 7.
Баадер В.‚ Доие E., Брендечфер М.// Биогаз: Теория и практика, M.,
1982. C. 14-19.
Бабиикая В, Г. // Микробиол, Журн, 1977 Т. 39, М; 4. C. 497.
Бабицкая В. Г. // Достижения микробиологии——практике: Тез. докл. VII
съезда ВМО, Алма-Ата, 1985. Т. 7. С. 9.
Бабицкая В. Г. // Микол, и фитопатол. 1986, T, 20, N9 5. C. 377-385.
Бабицкая В. Г.‚ Лобанок А. Г.‚ Костина А. М.//Микробиол, пром-сть.
1976. N9 3. С. 9-13.
Бабицкая В. Г.‚ Лобанок А. Г. // Микробиол, пром-сть. 1976, N9 1, С.
26-28.
Бабицкая В. Г.‚ Стахеев и. В. // Микол, и фитопатол. 1981. T. 15, Не 1.
С. 22-27.
Бабицкая В. Г.‚ Костина А. М., Стахеев И. В. н др. // Микол, и фитопатол,
1981, Т. 15, Мг 6. С. 477-481.
Бабицкая В. Г.‚ Стахеев И. В.‚ Щерба В. В. и др.// Прикл. биохим. и
микробиол, 1986. T. 22, Мг 4. C. 531-539.
Бабицкая В, Г.‚ Стахеев и. В.‚ Щерба В. В. и др. /Микол. и фитопатол.
1986. Т. 20, Мг 2. C. 113-119.
Бабицкая В. Г.‚ Щерба В. B. // Микробиология. 1987. T. 55, М 4. C. 500-‘
607.
Байков Б. // междунар, с,-х, журн. 1983. N9 1. C. 64-68.
Бакай С. М. // Ферменты в народном хозяйстве и медицине: Респ. меж—
ведомств, сб, Киев, 1971. Т. 6. C. 155.
Батурина Т. Я. // Биотехнологические основы микробиологических синте-
зов; Те3_ докл, VII съезда ВМО, Алма-Ата, 1985. Т. 4, С. 11.
236
Бахчеванска С. //IV СИМПОЗ. соц, стран по биотехнологии: Тез. докл.
Варна, 1986, С. 142.
Безбородов А, М.‚ Астапович Н. И. Секреция ферментов у микроорганиз-
мов. М.‚ 1984.
Бейнар-г И. и., Ведерников Н. А. Клеточная стенка древесины и ее из-
менения при химическом воздействии. Рига, 1972.
Бекер М. Е.// Обезвоживание микробной биомассы и экстрацеллюлярных
метаболитов. Рига, 1967. С. 361-378.
Бекер М. Е.//2\’!икробио.чогический и энзиматический синтез. Пущино,
1980. C. 31-81.
Бекер М. Е.// Биоконверсия растительного сырья: Тез. докл, Всесоюз.
симпоз. Рига, 1982. T. 1. C. 2-4.
Бекер М. Е. Трансформация продуктов фотосинтеза. Рига, 1984,
Бекер М. Е. //Биотехиология. 1985. N9 6. C. 14-24.
Бекер М. Б., Бекер В. Ф. // Журн. Всесоюз, хим. о-ва им. Д. И. Менде-
леева, 1982, T. 37, Мг 6, С. 57-60.
Белецкая О. П.‚ Окунев О. Н., Кулаев И. С. Проблемы биохимии и фи-
зиологии микроорганизмов. Пущино, 1985. С. 61-71.
Беляев С, С. // Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М.‚
1979. C. 205-219.
Билай В. И.// Биоконверсия растительного сырья: Тез. докл. Всесоюз.
сиипоз, Рига, 1982. T. 1. C. 14.
Билай В. И.// Проблемы биоконверсии растительного сырья, М.‚ 1986, С.
6-29.
Билай В. И., Сиверс В. С. // Ферменты в народном хозяйстве и медицине:
Респ. межведомств. сб, Киев, 1971. T. 6, С. 149.
Билай В. И., Закордонец Л. А., Билай Т. И. и др. // Микробиол. Журн.
1981. T. 43, М: 3. С. 336-341.
Билай В. И.‚ Бакай С. М.‚ Томчук Р. И. и др. //1Иикробпол. Журн. 1985.
T. 47, М 6. С. 91-92.
Билай В. И., Курбацкая 3. А., Вязовкина И. В. и др. // Микробиол. журн.
1987. T. 19, Мг 3. С, 65-69.
БИСЬКО Н. А., Бухало А. С., Вассер С. П. и др. Высшие съедобные бази-
диомииеты в поверхностной и глубинной культуре. Киев, 1983.
Бисько Н. А., Фомина В. И.‚ Билай В. И.// Микол. и фитопатол. 1983.
T. 17, М; 3. С. 199-203.
Бисько Н. А., Фомина В. И., Володина Е. П. и др. // Микол. и фитопатол.
1986. Т. 20, N9 5. C. 392-395.
Бисько Н. А., Дудка И. А. Биология и культивирование съедобных грибов
рода Вешенка, Киев, 1987.
Богдан С. Д.‚ Сиверс В, С., Паришкура В. П. и др. // Сельскохозяйствен-
ная микробиология: Тез. докл. VII съезда ВМО. Алма-Ата, 1985. Т, 4. С_ 12.
Бонч-Осмоловская Е. А.//Успехи микробиол 1979, N9 14, С, 1О6—-123_
Борзаковская В. С., Сивочуб О. А., Болотова А. К. н др.// Превращения
древесииы при микробиологических и энзиматических воздействиях: Тез. докл.
науч. семинара. Рига, 1980. С. 45-47.
Бравова Г. Б., Ларина Л. Н.‚ Чумак Г. А. // Биотехнологические основы
¥1»IKpoC611;)é1or11uecKnx синтезов: Тез_ докл, V11 съезда ВМО. Алма-Ата, 1985.
. 4. . .
Бухало А. С. // Микол. и фитопатол, 1973. T. 7, Мг 4. С. 349-—353.
Бухало А. С. // Тр. IV съезда микробиологов Украины. Киев, 1975, C. 41.
Бухало А С. // Производство высших съедобных грибов в СССР: Сб‚ тр.
Киев, 1978. C. 24-29.
Бухало А. С. // Мицелиальные грибы: Физиология, биохимия, биотехноло-
гия: Тез. докл, Всесоюз. конф. Пущино, 1983. С. 99-100.
Бухало А. С., Пархоменко Л. П.‚ Мартыненко М. М. // Микол. и фитопа-
тол. 1972. Т. 6, N9 3, C. 241-244.
Бухало А. С., Пархоменко Л. П.‚ Мартыненко М. М. // Микробиол. жури.
1975. Т. 37, Ne 2. C. 181-184.
Бухало А. С., Соломка Э. Ф., Дудка И. A. // Мицелиальные грибы: Фи-
237
зиолоёия, биохимия, биотехнология: Тез. докл. Всесоюз. коиф, Пущино, 1983.
С 16 —169.
Бюллетень иностранной коммерческой информации/ Под ред. E. H. Чалых.
1983. W 62. С. 5483.
Варфоломеев С. Д. // Конверсия энергии биокаталитическимтт системами.
М. 1981. C. 28-35.
Васильев И. Г. // Механизация и электрификация сел, хоз-за, 1981, N9 7.
C. 57-62.
Верховцева М. И. // Микробиология, 1965. Т. 34, N9 3. C. 430-437.
Ветров В. С., Горбачев В, М.‚ Петряев E. П. и др. //П Всесоюз. конф, по
с.-х. радиологии: Тез, докл. Обнинск, 1984, Т, 3. С 36—37.
Ветров В. С., Высоцкая Н. А., Дмитриев А. М. и др. Радиационная об-
работка отходов для сельскохозяйственного использования. М‚, 1984.
С 1В1Ёстур У. Э„ Каитере В. М.‚ Шмите И. А.// Биотехнология. 1985. М: 4.
С 1B1»11e2c'ryp У. Э.‚ Лейте М. П., Саксе А, К. и др.// Биотехнология, 1986. N9 6.
Виестур У, Э., Кузнецов А, М., Савенков В. В. Снстемы ферментации,
Рига, 1986.
Власеико Е. Ю.‚ Синицын А. П., Щербухии В. Д. // Биотехнология. 1985.
N9 6. С, 76-83.
Воробьева Л, И. Промышленная микробиология, М.‚ 1985.
Воробьева Л. И. Техническая микробиология. М.‚ 1987.
Ворошилов Ю. И. Очистка, утилизация и влияние на Природную среду
сточных под животноводческих): кохшлексов: Обзор ВПИИТЭТТСХ. М.‚ 1979.
Гаврилова В. П., Григорьева Н, К. // Микол и фитонатол. 1983. Т. 17,
N9 2. С 127-131
Ганбаров Х. Г.‚ Мурадов П. 3.. Салидова Р. Ф. и др. // Химия древесины,
1987. .\1: 1. С, 61-64
Гарибова л, В., Чандра А., Дараков О, Б.//1\/1икол и фитопатол. 1982,
Т. 16. N9 3. C. 199-208.
Гарибова Л, 8., Дараков О. Б., Чандра А. // Микол, и фитоиатол. 1985.
Т, 19. N9 2. C. 113-119
Гарибова Л, 8., Решетникова И. А., Шумская Г, I".//M111<oJ1. 11 фитоиатол,
1987. T. 21, М 1. C. 19-26
Гарибова Л, В. Биология наших дней. 1987. Вып. 2. C. 115-135.
Гашкова М, 5l.// M1111e.'111a.'1b111a1e грибы. Физиология, биохимия, биотех-
нология Те; докл Всесоюз конф, Пущино, 1983, C 169’170.
Гернег M. В. // Биотехнология. 1985. Мг 4. C. 27-37.
Головлева Л. А., Ганбаров Х. Г., Скрябин Г. К.// Микробиология. 1982.
T. 51, .\9 4. С. 543-547.
Головлева Л. А., Ганбаров Х. Г. // Мицелиальиые грибы- Физнология,
биохимия. биотехнология: Тез, докл, Всесоюз, конф, Пущино, 1983 С. 45-46.
Головлева Л. А.. Головлев Е, Л.//Мицелиальные грибы: Физиология,
биохимия, биотехнология: Тез. докл. Всесоюз. конф Пущино, 1983, С.
157-159.
Головлева Л, А,_ Перцова P. H,, Федечкииа И. Е, и др. // Прикл. биохим.
и иикробиол, 1983. Т. 19, N9 6 C. 709-719.
Головлев E. Л., Чермеиский Д. H., Окуиев О. Н. и др. // Микробиология,
1983. T 52. М 1. С. 78-82.
Головлев E. Л., Скрябин Г. К. // Биотехнология, М,. 1984. С. 41-47.
Головлева Л. А., Грекова Г. А., Черменский Д. Н, и др. // Прикл. биохим.
и мнкробиол. 1986. Т. 22, N9 5. С. 715—72О.
Головлева Л. А., Мальцева О. В.// Проблемы биоконверсни растительного
сырья: Сб тр. М.‚ 1986. С. 272-293.
Головченко Н, П„ Чувильская Н, А., Акименко В. К. // Биохимия, 1985.
T. 50, М 1. С. 109-113.
Головченко Н. П., Чувильская Н. А., Акименко В. K. //Микробиология.
1986. Т. 55. N9 1. C 31-33.
Гончарова и. А., Бабицкая В. Г.‚ Лобаиок А. Г. // Рост мнкроорганнзмов
иа Са-соединениях: Тр. 11 Междунар снмиоз. Пущино, 1977. С. 189.
238
Горлеико М. В.// Микол. и фитопатол. 1983. T. 17, М; 3. С. 177——181.
Градова Н. Б., Касим-заде 14., Зобиииа В. П.// Биоконверсня раститель-
ного сырья: Тез докл. Всесотоз. симпоз. Рига, 1982. T. 2. C. 193—194.
Грачева И. М., Чегодаев Ф. Н., Иидисова Г. E. и др. // Биосинтез фер-
ментов микрооргаттизмтами: Тез. докл. 111 Всесоюз, конф. Пущино, 1986. C. 16.
Грекова Г. А., Долгов И. Л.‚ Гаврилов А. В. и др. // Превращение древе-
сины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях: Тез. докл.
науч. семинара. Рига, 1985. С. 62——67.
Грушников О. П.‚ Аитроиова О. Н.//Успехи химии. 1975. Т. 49, N9 5. C.
937—967.
Гусаков А, 8., Синнцын А. П.‚ Клесов А. А. // Прикл. биохим. и микро-
биол. 1986. Т. 22, же 1. С. 59—69.
Гусарова Л. А.‚ Низковская О, 11,, Семушииа Г. Н. и др. // Мицелиальные
грибы: Физиология, биохимия, биотехнология: Тез. докл. Пущино, 1983. C. 17.
Даргаи-Сущова М, 8., Волохова М. 8., Широкова E. А. //Совремеиные
проблемы биотехнологии микроорганизмов: Тез. докл. конф, Молодых ученых.
Рига, 1987. C. 22.
Двойчеикова Е. Ю.‚ Каитере В. М. // Биотехнология. 1985. N9 5. C. 59-63.
дудка И. A., Baccep С, П.‚ Бухало А. С. и др. // Промышленное культиви-
рование съедобных грибов. Киев, 1978. C. 213-240.
Дудка И. А.‚ Вассер C. 11., Щепа В. В. и др. // Производство высших
съедобных грибов в СССР: Сб. тр. Киев, 1978. C 50-;35.
Дудкии М. С. // Химия древесины 1969. N9 3. C. 19.
Жиц А. $1., Кузьмич В. В. //Производство и использование биогаза в
СССР и за рубежом: Обзор. информация Минск, 1986.
Жилина Т, Н., Заварзии Г. А. // Микробиология, 1979. Т, 48, 3\Г9 2. C.
279—285.
Жуков Н. А.‚ Синицыи А, П.‚ Пеикина В, Н, и др. // Превращения древе-
сины при энзиматттческом и микробиологическом воздействиях: Тез докл.
науч. семинара. Рига, 1985. С, 73-79.
Забродский А. Г. Производство кормовых дрожжей иа мелассно-спирто-
вых заводах. М, 1972
Закордонец Л. А.‚ Виестур У. Э.‚ Билай Т. И. и др. // Биоконверсня рас-
тительного сырья: Тез. докл. Всесоюз. симиоз. Рига, 1982. Т. 1. С. 63—64.
Закордонец Л. А.‚ Билай Т. И., Супруи С. М. и др. // Микробиол. жури.
1983. Т, 45, N.» 5. С. 55—6О.
Закордонец Л. А.// Мицелиальные грибы: Физиология, биохимия, био-
технология: Тез. докл. Пущино, 1983. C. 172—173.
Закордонец Л. А.‚ Васюреико 3. П.‚ Пустовалова Л. И. //Микробиол.
жури 1986. T. 48, же 5. C. 82-83.
Закордоиец Л, А‚‚ Пустовалова Л. Н., Харкевич Е. С.//1\/ симиоз, соц.
стран по биотехнологии; Тез. докл. Варна, 1986 С. 144.
Залашко М. В. Биосинтез липидов дрожжами Минск, 1971.
Залашко М. В., Залашко Л. С. Микробный синтез на молочной сыворотке.
Минск, 1967.
Залашко М. 8., Пидопличко Г. А. Экстрацеллюлярные продукты метабо-
лизма дрожжей, Минск, 1979.
Зарудиая Г. H. // Микол. и фитопатол. 1971. Т, 5, N9 2. C. 133—137.
Здор Н. А.// Биотехнологические основы микробиологических синтезов:
Тез. докл. \/11 съезда ВМО. Алма-Ата, 1985. Т, 4, С. 48.
Зелтиия М. 0., Берзииьш А. 51., Стрикауска С. В. и др. // Превращения
древесины при энзиматгтческом и микробиологическом воздействиях. Тез. докл.
науч. семинара. Рига, 1985. С. 150`155.
Злочевская И. В., Галимова Л. М. // Микол. н фигоиатол, 1976, Т. 10, N9 2,
C. 104~—107.
Иванова И. И.// Микробиология. 1984. T. 53, Не 4. C. 615-620.
Иваиова Н. П.‚ Ерохииа Л. Н., Морозова E. С. // Прикл. биохим. и mm-
робиол. 1977. Т. 13, N2 4 С. 552—558.
Иванова Т, А.// Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов:
Тез. докл. конф. молодых ученых. Рига, 1987. С. 39.
239
Икономова А., Димитрова М. // Животновод. науки. 1986. Т. 23, N9 8. C.
64 -71.
Имшенецкий А. А. Микробиология целлюлозы. М.‚ 1953.
Йиргенсонс Б. Природные органические макромолекулы. M.. 1964.
Капич А. Н.// Микроорганизмы-е продуцеиты биологически активных ве-
ществ: Сб. тр. Рига, 1981. С. 60—61,
Капич А. Н.//Микроорганизмы в сельском хозяйстве: Материалы рес-
публ. рабочего коордииац. совещ. Минск, 1983. C. 60-61.
Капич А. Н., Бабицкая В. Г.‚ Стахеев И. В. // Микроорганизмы в промыш-
ленности, сельском хозяйстве и медицине: Тез. докл. науч. конф. БМО. Минск,
1979. C. 33
Капйч А. М.‚ Бабйцкая В. Г.‚ СтахееУ I. В. // Becui AH BCCP. Cep. 6i;1J1.
иавук. 1980. N9 1. C. 88——92.
Капич А. Н., Бухало А. C., Стахеев И. B. //N11/IKp()6H()JI. иром-сть, 1983.
N9 11. C. 2-3
Капич А. Н., Стахеев И. В.// Мицелиальные грибы: Физиология, биохи-
мия, биотехнология: Тез, докл, Всесоюз. конф. Пущино, 1983. С. 98—99.
Капич А. Н., Стахеев И. 8., Бабицкая В. Г. Дереворазрушающне бази-
диомицеты-продуценты белка. Минск, 1984 (Препринт. Ин-т микробиологии
АН БССР: 63).
Капич А. Н., Стахеев И. 8., Важииская и. С.//Микол. и фитопатол.
1986. Т. 20, N9 13. C. 199—204.
Капич А. Н., Ромаиовец Е. С.‚ Войт C. П.//Современные проблемы био-
технологии микроорганизмов: Тез, докл. конф. молодых учеиых. Рига, 1987,
С. 44,
Картуш Р. В„ Мирзаянова Э. Г. // Журн. Всесоюз хим, о-ва им, Д, И.
Менделеева. 1982. T. 37. N9 6. С. 17—21.
Касимадзе И. Ф. // Биотехнологические основы микробиологических синте-
зов: Тсз. цокл. VII съезда ВМО. Алма-Ата, Т, 4, С. 55.
Каткевич Р. Г„ Каткевич Ю. Ю., Лиепиня Д. Э.//Хи\1ия древесины.
1980, .\"9 4 С. 47—56.
Кагкевич Ю. Ю.. Цируль П. 51., Букин А. B.//Ynwum древесины. 1981.
N9 3. C. 21~:26.
Каткевич Р. Г.‚ Гайлитис Ю. Н., Каткевич Ю. Ю. и др. // Химия древесины.
1983. N9 5, C. 88~89.
Каткевич Р. Г.. Громов В. C.. Пщане Д. Э. // Химия древесины. 1984, N9 5.
C. 51—59.
Квеситадзе Г, Н., Абесадзе Т. И.‚ Хочолава Р. И. и др. // Биотехнология.
1986. N9 3. C. 39——45.
Клейнер А. Б.. Парменова И. В.‚ Аляиская О. В. // Гидролиз. и лесохим.
пром-сть. 1986. N9 2. C. 1—3.
Клесов А. А. // Прикл. биохим. и микробиол. 1985. Т. 21, N9 2. C. 269.
Клесов А. А. // Изв. АН СССР. Сер. биол. наук. 1987. N9 1. C. 17—27.
Клесов А. А. // Биотехнология. 1987. Т. 3, N9 5. С. 549—552.
Клесов А. А., Рабинович М, Л.// Биол, химия. 1978, Т, 12. С. 49-91.
Клесов А. А.‚ Григораш С. Ю.// Биохимия. 1981, T. 46, N9 1. C. 110-
119.
Клесов А. А.‚ Черноглазов B. M.. Ермолова О. В. //Биотехиология. 1985.
N9 3, C. 206-212.
Клесов А, А.‚ Куде Е, Голдштейие Г. Х. // Биотехнология, 1985. N9 6, С.
59-69.
Клесов А. A.. Ермолова О. 8., Чериоглазов В. М. и др. // Прикл. биохнм.
и микробиол. 1986. T. 22, Мг 6. С. 714—719.
KJIHMCHTOB A. C., Борзаковская В. C., Кузубова И. А. и др.// Превраще-
ние древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях: Тез.
докл. науч. семинара, Рига, 1985. C. 108—112.
Ковалев Г. 8., Сииицын А. П.‚ Вольф Е. Г. и др. // Биотехнология. 1987.
Т. 3, N9 3. C. 380—385.
Коваленко С, П, Химические факторы в селекции Продуцеитов микробных
белков. Минск, 1980.
240
Коваленко С. П., Дуксина В. В., Петряев Е. П. и др. // Докл. АН БССР,
1982. Т. 27, N9 6. C. 559-561.
Коваленко С. 11-. ДУКСИНа В. 3., Петряев Е. П. и др. // Биотехнология,
1987. Т. З, N9 3. C. 376—379.
Коваль Э. 3., Харкевич Е, С.‚ Закордонец Л. A.//M11Kp0611o.'1_ жури. 1987.
Т, 49, N9 1. С. 93-96.
Копытова Т. И.‚ Бережной А. А.‚ Леванова В. П. и Др. // Мицелиальиьте
грибы: Физиология, биохимия, биотехнология: Тез. докл. Всесоюз. коиф. Пу-
Щипо, 1983. С. 173.
217 K2oOcImHa A. M., Бабицкая В. Г.//Микробиология. 1981. Т. 50, N9 2. C.
Кожухарова Н. P., Михайлова М. В.‚ Константинова Р. J1.//IV симпоз,
соц. стран по биотехнологии: Тез. докл. Варна, 1986. С. 151.
Красновский А. A. // Биоконверсткя солнечной энергии. Пущино, 1984. C,
3—22.
Краузе И. Я.‚ Лиепиньш Г. К.‚ Виестур У. Э. и др. // Ферментация: Сб,
тр. Рига. 1974. С. 91——95.
Крепис И. Б.//Изв. АН СССР. Сер. биол. наук. 1979. N9 1. С. 103—112.
Ксенофонтов Б. С., Шкоп Я. Я.‚ Гололобов А. Д. и др. // Биокоиверсия
растительного сырья: Докл. Всесоюз. сиипоз. Рига, 1982. T. 2. C. 227-228
Кузубова И. А.‚ Леванова В. П.‚ Пармасто Э. Х. и др. // Биокоътверсття
растительного сырья: Тез. докл. Всесоюз. симпоз. Рига, 1982_ T_ 2_ C. 228-229.
Кулик А. П.‚ Ломова Г. П.. Лисицкая С. М.// Гидролиз. и лесохихт,
пром-сть. 1982. N2 2. С. 12——14.
Куликов Н. И.‚ Нейзцойминов В. И.‚ Смагии В. В. // Анаэробиые микро‹
организмы. Пущино, 1982. C. 36~37.
J1e6e11c-3 E. И. Комплексное использование сырья в пищевой промышлен-
ности. .\1.. 1982.
Лейте м, IL, Стрикауска С. B., Зелтиня М. 0. и др.// IV симпоз. соц. стран
по биотехнологии: Тез. докл, Варна, 1986. С. 151.
Лиепиньш Г. K.. Дунце М. Э. Сырье и питательные субстраты для про-
мышленной биотехнологии. Рига. 1986.
Лизак Ю. В.‚ Козинец И. П.‚ Щеглова А. М. и др. // Мицелиальные гри-
бы: Физиология, биохимия, биотехнология: Тез. докл. Всесоюз. конф, Пущи-
но, 1983. C. 174.
Листов П. Н., Прищеп Л. Г.‚ Кучер 11. A.// Механизация и электрифика-
ция сои. сел. хо3›ва. 1976. N9 1. C. 21—22.
Лобанок А. Г. Бпогенез экзофериентов у микроскопических грибов: Авто-
реф, дис. `=�� п-ра биол. Наук. 1\1., 1977.
Лобанок А. Г.. Бабицкая В. Г. Микробиологический синтез белка на цел-
люлозе. Минск, 1976.
Лобанок А. Г.‚ Ганчарова 1. A., Bafiiuxafi B. P.//Becui AH BCCP. Cep.
61ml. HI1B)K. 1976. N9 4. C. 64—б7.
Лобанок А. Ii, Бабицкая В. Ii, Костииа А. M. // Прикл. биохим. и микро-
биол. 1977_ Т. 13, N9 3. C. 475—478.
Лобанок А. IT, Бабицкая В. Г. //Микол. и фитопатол. 1977. Т. 11, N9 4.
C. 311 —315.
Лобанок А. Г.. Бабицкая В. Г. Мицелиальньте грибы как продуценты бел-
ковых веществ. Минск, 1981.
Лобанок А. Ii, Бабицкая В. Г.‚ Богдановская Ж. Н. Переработка Целлю-
лозосодержатцих отходов в ценные продукты с помощью микроорганизмов. М.‚
1981.
лобанок А_ Ii, Михайлова Р. B. // Теоретические и прикладные аспекты
синтеза ферментов микроорганизмами. Минск, 1982. C. 77-106.
Логинова Л. Г., Головачева Р. С., Егорова Л. A. Микробиология. 1966.
Т. 35, N9 5. C. 796—799.
Логинова Л. Г., Иванова И. И.‚ Гужова Э. П. и Др. // Проблемы биокон-
версии растительного сырья. М.‚ 1986. С. 165~192.
Матвеев В. Е., Складнев А. A., Бравова Г. Б.// Биоконверсия растительного
сырья: Тет. цокл. Всесоюз. симпоз. Рига, 1982. T. 1. C. 5.
16. Зак. 966 241
Матусевич Л. Г., Селиверстова Т. С.‚ Званский Б. В. и др. // Химия древе-
сины. 1982. N9 1. C. 113~—114.
Матусевич Л. Г., Селиверстова Т. С., Кузнецова И. В. и др. // Химия дре-
весины. 1982. N9 2. C. 45—~49.
Межиня Г. Р.‚ Дунце М. Э. Новые виды сырья для микробиологических
производств. М.‚ 1978.
Межиня Г. Р.‚ Апсите А. Ф.‚ Осе В. П. и др. // Биоионверсия растительного
сырья: Тез. докл. Всесоюз. симпоз. Рига, 1982. T. 1. C. 87*88.
Межиня Г. Р.. Кристапсоне М, Ж.‚ Калныня Д. Э. Биотехнология белко-
вых препаратов для кормопроизводства, M., 1982.
Межиня Г. Р.‚ Муйжниекс И. 0., Мауриня Х. А. и др.// Биоконверсия рас-
тительного сырья: Тез. докл. Всесоюз. симпоз, Рига, 1982. T. 2. C. 234~235.
Межиня Г. Р.. Султанова Г. Т., Николаева В. Р. и др. // Мицелнальные
грибы: Физиология, биохимия, биотехнология: Тез_ докл, Всесоюз. конф. Пу-
щино, 1983. С. 163.
Мережинский М. Ф. Механизм действия и биологическая роль витаминов.
Минск, 1959.
Микеладзе Г. Г. // Биоконверсия растительного сырья: Тез. докл. Всесоюз.
симпоз. Рига, 1982, T. 1. C. 152—153.
Микеладзе Г. Г. //Материалы межфакультатив. конф. Тбилис. ун-та по
естести. наукам: Химия, биология, географ, геология. Тбилиси, 1984.
C. 162—165.
Микеладзе Г. Г., Кешелашвили Н. Г., Шарашенидзе Н. Н. // Использова-
mic биомассы микроорганизмов для пищевых целей: Сб. науч. докл. Пущино,
1985. С. 15/21.
Микеладзе Г. Г., Багашвили Л. 3., Шарашенидзе Н. Н.// Биотехнологиче-
ские основы микробиологических синтезов: Тез. докл. VII съезда ВМО. Алма-
Am, 1985. Т. 4. С. 77.
Минкевич И. Г., Ерошин В. К. // Успехи соврем. биологии. 1976. Т. 82, М! 1.
С. 103» -116.
Мкинерни М., Брайант М. // Биомасса как источник энергии. М., 1985. С.
2417—2636.
Морозова Г. P., Высоцкий В. Г., Сафонова Н. В. и др. Промышленное
получение мицелия высших грибов. М., 1978.
Морозова Г, P., Сафонова Н. B., Кинареевская Т. В. и др. // Производство
высших съедобных грибов в CCCP: C6. Tp. Киев, 1978. С. 87—~91.
Морозова Г. Р., Чопяк А. М.‚ Кинареевская Т. В. // Микробиол. пром-сть.
1982. Мат 5. C. 1~2.
Морозова Г. Р.„ Поправко С. А.‚ Макарова М. А. и др. // Использование
биомассы микроорганизмов для пищевых целей: Сб. пауч. тр. Пущино, 1985.
С. 21—38.
Наумснио 3. М., Ладинская С. И.// Химия древесины. 1987. N9 3. C. 3-9,
Неустрсева Л. М. //Лесоведение и лесн. хоз-во. 1981. N9 16. C. 109-112.
Hl43KOBCKafl 0. П.//Микол. и фитопатол. 1972. Т. 6, N9 6. C. 306—311.
Новиков Ю. Ф.. Рахимов М. М., Ахмаджонов Ш. Т.// Биотехнология.
1985. N2 4. C. 12-27.
HO)KeBHH}(0Ba A. H.// IV симпоз, соц. стран по биотехнолоэии. Варна, 1986.
С. 231.
Огарков В. И., Киселев О. И., Быков В. А.// Биотехнология. 1985. N9 3.
C. 1—~15.
Озолиня Н. Р. Изменение структуры клеточной оболочки трахеид ели и
волокон либриформа березы под действием грибов бурой гнили: Автореф.
дис. Ю�� канд. биол. наук. Рига, 1975.
Озолиня Н. Р.‚ Крейцберг 3. H.. Сергеева В. Н.//Биокоиверсия расти-
тельного сырья: Тез. докл, Всесоюз. симпоз. Рига, 1982. T. 1. C. 94-95.
Озолиня Н. Р.‚ Сергеева В. Н.// Изв. АН ЛатвССР. 1987. N9 4(477). C.
I26~——134.
Олешко В. С.‚ Стахеев И. В.‚ Батурина Т. Я.// Биотехнология. 1986. N9 3.
C. 24——28.
Ощепкова Е, П.// Микол. и фитопатол. 1986, Т. 20, М: 5. С, 430-434,
242
Павловская Ж. И.// Теоретические и прикладные аспекты синтеза фермен-
тов мгккрооргинткзхтамхг. Минск, 1982. С. 107—132.
Панцхава Е. С. //Витаминиьпе ресурсы и их использование. М., 1963. Т. 6.
С. 15~40.
Панцхава Е. С. // Теоретические и методические основы изучения ана-
эробных микроорганизмов. Пущино, 1978. С. 158-169.
Панцхава Е. С. // Биогаз—85: Пробл. и решения: Материалы совет-фин.
симпоз. V1.. 1985. C. 5—23.
Панцхава Е. С., Березин И. В. // Биотехнология. 1986. N9 2. C. 1—11,
Перадзе Г. Д.‚ Цулая Д. Г., Бегиашвили М. Д. // Биотехнологические oc-
новы микробиологическккх синтезов: Тез. докл, V11 съезда ВМО. ‚Алма-Ата,
1985. T. 4. C. 88.
Первозванский В. Б.‚ Чельцова Ю. С. // Микробиология. 1935. Т. 4, N9 2.
С. 262 314.
Первозванский В, Б.‚ Чельцова Ю. C. //’ Бродил, пром-сть. 1933. N9 3,
C. 7~12.
Покровская С. Ф.// Земледелие и растениеводство. 1980. N9 9. C. 9—16.
Полотебнова М. Ф.//Совремеиньхе проблемы биотехнологии микроорга-
низмов: Тез. докл. конф, молодых ученых. Рига, 1987. С. 205.
Полотебнова М. Б.‚ Терешина В. М.‚ Широкова Е. А. и др. // Микол. и фи-
топатол. 1987. Т. 21, N9 3. C. 246~252.
Прошина Н. Г.‚ Селифонтова В. C. Конъюнктура мирового рынка кормо-
вого белка. М, 1985.
Рабинович М. Л. Адсорбционные и кинетические закономерности фермен-
тативиото гидролиза иеллюлкозьт: flue. ...z1~pa XIIVI. наук. М., 1987.
Роговин З. А. Химия древесины. М., 1972.
Родионова Г. С., Бузург-заде Д. ‚П., Степаненко В. Г. и дри/Системдтика,
экология и физиология почвенных грибов: C6, Tp. Киев, 1975. С. 99—104.
Родионова Н. А., Мартинович Л. И., Смирнова Н. И. и др. // Прикл, био-
хим. и микробиол. 1985. Т. 21. N9 3. C. 309-317.
Редчиц Т, И. //MnKpo6m)J1. журн. 1976. Т. 38, N9 2. C. 244—251,
Ротмистров М. Н. // Микробиология. 1939. ‘Г. 8, N9 1. C. 56-63.
Рабушка Т. А.// Веси} АН BCCP. Сер. бйял, иавук, 1986. N9 1. C. 38—42.
Салматова Л. С. Физиология растительной клетки. Л.‚ 1983.
Сахарова 0., Вольфова 0., Крумфан 3. //III симпоз. соц. стран по био-
технололии: Сб. тез. Братислава, 1983. C. 322.
Свистова И. IL, Бравова Г. Б.‚ Жеребцов Н. А. и др.// Микробиология,
1986. T. 55, N9 1. C. 49—52.
Семенов Н. Н.// Наука и общество. 1973. С. 479.
Сиверс В. С., Щербакова В. M., Карнадская А. М. // Ферменты в народ-
ном хозяйстве и медицине: Респ. межведомств. сб. Киев, 1971, T. 6. C. 158.
Сиверс В. С., Богдан С. Д. // Мипелиальные трибы: Физиология, биохи-
мия, би‹›те\н0.101ия: Тез. докл. Всесоюз. конф. Пущино, 1983. C. 162.
Сивочуб О. A.//Muue.'IIIaJ1LHbIe трибы: Фидиологкая, биохимия, биотехно-
логия: Тез. доки, Всесоюз. конф. Пущино, 1983. C. 163.
Синицын А. П., Ковалев Г. 3., Меса-Манреса С. Р. и др. // Химия древеси-
ны. 1984. N9 4. C. 60—73.
Сииицын А. П., Ковалев Г. Б.‚ Меса-Манреса С. Р. и др. // Химия древе-
сины. 1984. N9 5. C. 60-71.
Синицын А. П., Наджеми Б.‚ Клесов А. А. // Прикл. биохим. и микробиол.
1985. Т. 21, N9 3. C. 324- 329.
Скворцов С, В. // Гидролиз. и лесохим. промЮТЬ. 1986. N9 4. C. 10—I4.
Скворцов С. Б.‚ Чурилова И. В. // Биотехнология. 1987. Т. 3, N9 3. C. 370——
375.
Складнев А. А.// Журн. Всесоюз, хим. о-ва им. Д. И. Менделеева. 1982.
T. 27, М 6. C. 682—~687.
Скриган А. И. // Ресурсы пентозансодержащего сырья в СССР: Сб. тр. Ри-
га, 1960. С. 73—82.
Скрябин Г. К., Головлева Л. А., Мальцева О. В. и др. // Изв. АН СССР.
Сер. биол. 1985. N9 3. C. 330——339.
I6‘ 243
Скрябин Г. К., Головлева Л. А.‚ Редикульцев Ю В. и др.// Микробиоло-
гия. 1986. T. 55, Мг б. С. 976-982.
Соболева Г. А. // Прикл. биохим. и микробиол. 1986. Т. 22, N9 3. C. 368—
872.
Соловьев В. А.‚ Яковлева Н. С.‚ юалышева О. Н. и др.// Превращение
древесины при Энзиматическом и Микробиологическом воздействиях: Тез, докл.
науч. сеиинара. Рига, 1985. C. 20~22.
Соломко Э. Ф.// Производство высших съедобных грибов в СССР: Сб. тр,
Киев, 1978. С. 98—1О4.
Соломко Э. Ф., Бухало А. С.‚ Пархоменко Л. П. и др.// Производство
съедобных грибов в СССР: Сб. тр. Киев, 1978. С. 105-108.
Соломко Э. Ф., Елисеева Г. С.‚ Рябчук В. А. и др.// Прикл, биохим. и
микробиол. 1987. Т. 23, N9 2. C. 230—~236.
Соуфер С.‚ Заборский О. М. // Биомасса как источник энергии. М.‚ 1985.
Стахеев И. В. Культивирование дрожжей и грибов—иродуцентов иро-
теина на отходах переработки картофеля, Минск, 1978.
Стахеев И. 3., Бабицкая В. Г. // Микол. и фитопатол. 1978. T. 12, М) 6,
C. 490~495.
CTaxee§I l. B., Bafiiuxan B. P., Капйч А. M. //Becui AH BCCP. Cep. б1ял.
навук. 1978. N9 1. C. 120.
Стахеев и. В., Здор Н. А. // Биоконверсия растительного сырья: Тез. докл.
Всесоюз. симпоз. Рига, 1982. T. 2. C. 264—265.
Стахеев и. В., Батурина Т. Я., Важинская И. С. // Мицслиальныс грибы:
Физиология, биохимия, биотехнология: Тез. докл, Всесоюз. конф. Пущино,
1983. С. 159.
Стахеев И. В., Бабицкая В. Г., Щерба В. В. и др.// Микол, и фитопатол,
1985. Т. 19, N9 3. C. 229 ~235.
Стахсев и. В., Латышева С. Г., Бабицкая В. Г. и др.// Микол и фитопатол.
1985 Т. 19, N9 4. C. 303-309.
Стахеев И. В.. Костина А. М.. Бабицкая В. Г. и др.// Микробиология.
1986. T. 55. N‘<_> 1. С. 531\569.
Страхов B. JI.// Химия в сел. хоз-ве. 1985. Т. 23, N9 9. С. 16——19.
Стрикауска С. B., Апсите А. Ф., Апине А. Я. // Биотехнологические основы
микробиологических синтезов: Тез, докл, VII съезда ВМО. Алма-Ата. 1985.
Т. 4. C. 109.
Степаненко Б. Н.// Итоги науки: Углеводы: Успехи в изучении строения
и метаболизма: Биохимия. М., 1968. С. 169.
Стефанов С.‚ Кузманова PL, Циркон И. и др. // IV симпоз. соц, стран по
биотехнологии: Тез. докл. Варна, 1986. С. 144.
Таратунина Л. B., Tapacona H. B., Манаков М. Н. и др.// Биотехнология.
1987. Т. 3, N9 4. C. 484-488.
Тарчевский И. А.. Марченко Г. и. Биосинтез Н структура целлюлозы. М.,
1985.
Ташпулатов Ж. // Микробиология. 1980, Т. 49, Мг 2. C. 342—346.
Ташпулатов Ж.. Хамидова С. // Биотехнологические основы микробиоло-
тических синтезов: Тез докл. VII съезда ВМО. Алма-Ата, 1985. Т. 4. C. 112.
Тиунова Н. А.. Кобзева Н. Я.// Прикл. биохим. и микробиол. 1985, Т. 21,
N9 3. C. 300~307.
Ткаченко В. В., Рылкин С. С.‚ Шкидченко А. Н. и др.// Микробиология,
1971. T. 40, М 4. C. 651-655.
Томчук Р. и.// Биотехнологические основы микробиологических синтезов:
Тез. докл. VII съезда ВМО. Алма-Ата, 1985. Т. 4. C. 11.
Томчук Р. I/L, Альман A. В. // Мицелиальные грибы: Физиология, биохи-
мия, биотехнология: Тез. докл, Всесоюз. конф. Пущино, 1983. С 176——177.
Торев A. A. Промишлена технология за производство на мицел от высшн
гъби. София, 1973.
Торев A. А. // Биоконверсия растительного сырья: Тез. докл. Всесоюз.
симпоз. Рига, 1982. T. 2. C. 268——269.
Тутаюк В. Х.// Анатомия и морфология растений. М.‚ 1980.
Удалова Э. В., Рыженок Л. В. // Биосинтез ферментов микроорганизмами:
244
Тез. докл. 111 Всесоюз. конф. Пущино, 1986. С. 25.
Фениксова Р. В. // Ферментативное расщепление целлюлозы, М.‚ 1967, С, 5,
Феофилова Е. П.‚ Терешина В. М.‚ Иванова Н. И. и др.// Прикл, биохим.
и микробиол. 1980. Т. 16, N9 2. C. 377-382.
Фсофилова Е. П. // Биол. науки. 1981. N9 6. С, 5~20.
Феофилова Е. П. // Биол. науки. 1981, N9 11. С, 5——26,
Феофилова Е. П. Клеточная стенка грибов, М.‚ 1983.
9 Фирантас С. Г. // Прикл, биохим. и микробиол. 1985. Т. 21, М! 3. С. 293——
2 7.
Холло Я.// Биоконверсия растительного сырья: Тез. докл. Всесоюз. сим-
поз. Рига, 1982. T. 1. С. 6-7.
Харатьян С. Г. // Прикл, биохим. и микробиол. 1975. Т. 11, N9 1. C. 35—43_
Хазин Д. А. Производство кормового микробного белка и его использо-
вание в кормлении сельскохозяйственных животных. М.‚ 1987.
Хитров А. Н. Механизация и электрификация сельского хозяйства. 1980.
N9 4. C. 57—61.
Холькин Ю. И. Новые методы гидролиза растительного сырья. М.‚ 1985.
Храпцова Г. И. // Микробиология. 1986. Т. 55, N9 3. C. 496——501.
Цирлин Ю. А. Этиловый спирт-добавка к моторному топливу: Обзор.
информация. М.‚ 1984.
Чан Динь Тоай, Хлудова М. C., Панцхава Е. С. // Итоги науки и техники:
Биотехнология, М.‚ 1983. Т. 1. С. 151—194.
Чельиова Ю. C., Логинова Л. Г.‚ Быкова Н. И.// Микробиология. 1938.
N9 7. C. 619-623.
Чельцова Ю. С. // Микробиология. 1939. N9 8. C. 481—490.
Черменский Д. Н., Окунев О. Н., Головлев Е, Д. // Мицелиальные грибы:
Физиология, биохимия, биотехнология: Тез. докл, Всесоюз, конф. Пущино,
1983. С. 159.
Черменский Д. Н.‚ Редикульцев Ю. 3., Головлев Е. Л. и др.// Превраще-
ние древесины при энзнматическом и микробиологическом воздействиях: Тез.
докл. науч. семинара. Рига, 1985. С. 140~146. ‚
Чернов Г. Н. //Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д. И. Менделеева, 1982.
Т. 37, Мг 6. С. 65-439.
Черноглазов В. М.‚ Ермолова О. B., Клесов А. А. // Биохимия. 1985. Т. 50,
N9 7. C. 1108—1119.
5 Чувильская Н. А. // Прикл. биохим. и микробнол, 1986. Т. 22, N9 6. C. 800~—
80 .
Шабунина Г. 14., Билай Т. и.‚ Слюсаренко Т. П. // Микробиол. журн. 1985.
Т. 47, N9 2. C. 63—~66.
Шарков В. П. Ферментативное расщепление целлюлозы. М.‚ 1967, С. 24.
Шарков В. П.‚ Куйбина Н. И. Химия гемицеллюлоз. М.‚ 1972.
Шиврина А. Н., Ннзковская О. П.‚ Филина Н. Н. и др. Биосиитетичестчая
деятельность высших грибов. П.‚ 1969.
Экспресс-информация/Под ред. Г. Н. Чернова, Г. Е. Москалева, M. и.
Верболовой. 1979. N9 16. С. 7.
Экспресс-информация/Под ред, Г. Н. Чернова, Г. Е. Москалева, М. и.
Верболовой, 1983. N9 2. C. 2.
Экспресс-информация: Зарубежный опыт/Под ред. М. И. Верболовой.
1984. N9 7. C. 12.
Экспрессмнформация: Науч-производст. опыт в сел, хоз-ве //Под ред.
Ю. Жиганова. 1985. N9 11. С. 40.
Экспресс-информация: Зарубежный опыт/Под ред, M. И. Верболовой,
Г. Е. Москалева, Г. Н. Чернова. 1985. N9 10. С. 1.
Экспресс-информация: Науч-производст, опыт в сел. хоз-ве/Под ред.
С. Покровской. 1985, N9 15. С. 30.
Экспрссоинформация/Под ред. В. Д. Антипиной. 1985. N9 11. С. 13-14.
Экспресс-информация: Науч,-производст. опыт в сел. хоз-ве/Под ред.
В. Фокиной. 1986. N9 20. C. 42.
Экспресс-информация: Зарубежный опыт/Под ред, М. В. Мещерякова.
1986. N9 15. С. 20——21.
245
Эрнст Л. K. // Биоконверсия растительного сырья: Тез. докл. Всесоюз. can-
поз. Piiia, 1982. T. 1. C. 8.
Эрнст Л. К., Науменко 3. М., Руденко Н. П. и др. Производство и исполь-
зование гидролизного сахара в животноводстве. М., 1982.
Яра K. X., Keca K. А. // Исследование, проектирование и строительство
систем сооружений метанового сбраживания навоза: Тез. докл. М_, 1982. С.
28-29.
Abdullah A., Tengerdy R., Murphy V.,'/ Biotechnol. Bioeng. 1985. Vol. 27,
N 1. P. 20-27.
Abdul P., Lloyd D.// Biotechnol. Lett. 1985. Vol. 7, М 2. P. 125-128.
Aidoo K., Mendry R., Wood B. /f Adv. Appl Microbiol. 1982. Vol. 28.
P. 201-237.
Ait N., Creuzet N., Forget P. //J. Gen. Microbiol. 1977. Vol. 113, N 2.
P. 399-402.
Akin D. N., Barton F. E.// Fed, Proceed. 1983. V01. 42, N 1. ‘P. 114-121.
Alexander J. K., Connors R., Ymamoto N.,’Adv. Biotechnol. ‘Proc. VI Int.
Ferment. Symp. (London (Canada), 20-25 July, 1980). Toronto e. a., 1981.
Vol. 2. P. 125-130.
Ali К, Laidi L. // Pakistan J. Sci. Res. 1984. Vol. 27, N 1. P. 47-50.
Allen A. L., Andreotti R. E.// Biotechnol. Bioeng. Symp. 1982. М 12.
P. 451-459.
5A1len A. L., Mortensen R. E. ‚1/вйотес11по1. Bioeng. 1981. Vol. 23. P. 2641-
264 .
Ander P., Eriksson M. Е., Eriksson K. E. Ph_xsio1. Plant. 1985. М 65.
P. 317-321.
Ander Р., Eriksson K. E./;1App1. Microbiol. Biotechnol. 1985. Vol. 21.
P. 96-102.
Andrianarisoa B., Bagnara C., Faure E. et al.’ Appl. Biochem. Biotechnol.
1984. V01. 9, N 4. P. 28-33.
Antunes L. A., Cereda M. P., Camargo R. 1/Agr. Biol. Techno]. 1986. Vol 29,
N 3. P. 533-543. _ `
Агога 1)., Sandhu D. '/Acta Biotechnol. 1986. Vol. 6, N 3. P. 293-297.
Armstrong D. “Д, Martin S. M./1Biotechnol. Bioeng. 1983. Vol. 25, N 11.
P. 2567-2575.
Asther M. Khan A. W. // Appl, Microbiol_ Biotechnol. 1985. Vol. 2l, N 3-4.
P. 234-237.
Atalla R. H.//'1'lic slructure of cellulose: Recent developments in Wood and
agricultural residues. М. Y., 1983. P. 59-77.
Atev A. //‘ Докл. Волг. АН. 1986. Vol. 39, N 5. ‘P. 109-l12.
Atkey P. T., Wood D. A./'Appl. Biochem. Biotechnol. 1984. Vol. 9, М 4.
P. 335-336.
Augustine N. R. // Biotechnol. Bioeng. Symp. 1976. М 6. Р. 1—8.
Avgerinos G. C. // Adv. Biotechnol. »Proc. Int. Ferment. Symp. ,(London (Ca-
nada), 20-25 July, 1980). Toronto e. a., 1981. Vol. 2. (P. 119- 124. .
Avgerinos G. C., Wang D. J.//Biotechnol. Bioeng. 1983. Vol. 25, М 1.
P. 67-83.
Ayers A. R., Ayers S. B., Eriksson K. E./’/ Eur. J. Biochem. 1978. V01. 90.
P. 171-181.
Вагон A. 1/ Biotechnol. Lett. 1985 V01. 7, М 3. LP. 203-206
Ba ch W. Е., Schoberth S., Tanner R. S. et al. //Microbiol. Rev. 1979. Vol. 49,
N 2. P 260-296.
Baldensperger J., Le Mer J., Hannibal L./ Biotechnol. Lctt. 1985. Vol. 7,
N 10,1P. 743-748.
Bartley T., Waldron С., Eveleigh D.//Appl. Biochem. Biotechnol. 1984.
V01. 9. P. 337.
Bauchop T. // Agr. Environ, 1981. Vol. 6, N 2-3. P. 339-348.
Bauchop T. // Bull. Roy. Soc. N. Z. 1982. N 2. P. 143-148.
Bauchop T., Mountfort D.//"Appl. Environ. Microbiol. 1981. Vol. 42.
Р. 1103-1110.
Bayer E., Kenig R., Lamed R. Н]. Bacteriol. 1983. V01. 156, N 2. «P. 818-
836.
246
Вауег Е., Setter E., Lamed R. 11/ J. Bacteriol. 1985. Vol. 163, IN 2. P. 552-
559.
Becarevic A., Skrinjar M., Petrovic S. et al.//‘Prehramb.-technol. Rev. 1985.
Vol. 23, N 4. P. 125-128.
Bender J. /,1App1. Environ. 1985. Vol. 49, N 3. P. 475-477.
Bente P. F. // Int. Bio-Energy Directory. Washington, 1981. Р. 11-17.
Berg В., Petterson G. //J. Appl. Bacteriol. 1972. N 2. P. 2.
Berg B. // Can J. Microbiol. 1975. N 21. P. 51.
Bhatia J. A. /1 Indian Chem. J. 1980. Vol. 15, N 6. ‘Р. 31——36,
Bhatowdekar S.//Indian J, Microbiol 1983. Vol. 23, N 2. P. 76-80.
Biely P., Kratky Z., Vrsfilnska M. et al.,4/ Wiss. Z. E. M. Arndt-Univ. Greifs-
Wald. Math-naturwiss. R. 1980. Vol. 29, М 4. P. 143-144.
Biely P., Vrsanska M., Petrakova E. //‘ Arch. Microbiol. 1984. V01. 138, N 4,
P. 371-376.
Blsaria 11., Madan M. //«Enzyme Microbiol. Technol. 1983. Vol. 5, М 4.
P. 251-259.
Black C. /’ Chem Eng. Progress. 1980. Vol. 76, М 9. Р, 78-85,
Blackwell J. ,1/The macromolecular organisation of cellulose and chitin, in
cellulose and other natural polymer systems N. Y., 1982. P. 403-428.
Blanchette R. A. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1984. V01. 9, N 4. ‘Р. 323-324.
Blotkamp P. J., Takagi М., Pzmberton M. S. et al.//‘Biochem. Eng. 1978.
Vol. 74, N 181. P. 85-90.
Bossong K. ‚О‘ Т11е energy consumer. L., 1980. P. 2-39.
Brener D., Johnson B. ’App1. Environ. Microbiol. 1984. V01. 47, N 5,
P. 1126-1129.
Breuil C., Wojtczak 0., Saddler J.//‘Biotechnol. Lett. 1986. Vol. 8, N 9.
P. 673-676.
Brown A. /,1 J. Appl. Biochem. 1985. Vol. 7, N 6. VP. 371-387.
Bull A. T. // Int. Biodetn. Bull. 1967. Vol. 3, N 1. IP. 3.
Bryant M. P., Wolin E. A., Wolin M. J. et a1.// Arch. Microbiol. 1967. N 59.
P. 20-31.
Calloway C. B., Turner R. D. /,‘ Science. 1983. Vol. 221. Р. 1401—1403.
Canevascini G.,Coudray M., Rey J. et а1. // J. Gen. Microblol. 1979. Vol. ll0.
P. 291-303.
Cardoso M., Nicoti мумии. Repts. Inta. 1981. Vol. 24, N 2. ‘Р. 237-247.
Carreira L. H., Ljung ан! L. 6., Bryant F. et a1.//lProc. IV lnt. Symp. Ge-
net. 1nd. Microorg. (Kyoto, 6-11 June, 1982). Tokyo, 1983. 1P. 351-355.
Chahal D.//‘ Bioenergy 84: vP1‘OC. Int. Conf. (Goteborg, 15-21 June, 1984).
L., 1985. Vol. 3. vP. 240-245.
Chahal D., Moo-Young М., Dhillon G.//1 Can. J. Microbiol. 1979. Vol. 25,
N 7. IP. 793—797.
Chahal D., Moo-Young M., Vlach 1).// Biotechnol. Bioeng. 1981, Vol. 23,
N 11. P. 2417-2420
Chaudhary K,, Mittal S., Tauro P. // Biotechnol, Lett. 1985. V01. 7, М 6.
P. 455-456.
Chapman C. M., Loewenberg J. R., Schaller M. J. et а1. М]. Histochem. Cy-
tochem. 1983. Vol. 31,1N 12. P. 1363-1366.
Choudhury Naiyyum /,‘Bang1adeSh J. Biol. Sci. 1984. N 13. «Р. 29-38.
Clanet M. // Bioenergy-84: Proc. Int. Conf. (Goteborg, l5-21 June, 1984).
L., 1985. Vol. 3. P. 167-172.
Commanday F., Maeg J.11/ Arch. Microbiol. 1985. Vol. 142, N l. P. 61-65.
Compere A. L. //‘ Dev. 1nd. Microbio1.: ‘Proc. XXXIV Gen. Meet. Sos. Ind.
Microbiol. (St. rPaul, 14-20 Aug, 1982). Arlington, 1983. Vol. 24. P 353-359.
Considine P., Hackett J., Coughlan M. // Biotechnol. Let. 1987. Vol. 9, М 2.
P. 131-134.
Coombs J./1/Biotechno1ogy—83: ~Proc. Int. Conf. Commer. Appl. and lmplicat.
Biotechnol. Northwood, 1983. P. 549-563.
Cooney C. L., Wang D. L., Wang S. et al.//lBiotechnol. Bioeng. Symp. 1978.
М 8. P. 103-114.
Coughlan M. P., Hon-Nami K., Hon-Nami H. et а1. //В1ос11ет. Biorphys.
Res. Commun. 1985. Vol. 130, М 2. P. 904-909.
247
Cowling E., Brown W. M Adv. Chem. Зет. 1969. N 95. ~P. 152—173.
Creuret N., Berenger J. Е‚ Fixon C. // FEMS Microbiol. Lett. 1983. Vol. 20.
Р. 347-4350.
Dan D. C., Fink H. P., Kasulke U. et al./, Acta Polym. 1981. Vol. 32, T\I 3.
P. 364—371.
Dart R., Betts W., Ball M. // Microbios. 1987. Vol. 49, N 200—201. P. 151-
159.
Datta Р, К.. Hanson K. К, Whitaker D. R. // Biochinr. Biophys. Acta, 1961.
N 50.'P. 113-118.
Daugulis A., Bone D.//Biotechnol. Bioeng_ 1978. Vol. 20, М 10. Р. 1639-
1649.
Davey 0., Вгцсе J. //«Biotechno1 Bioeng. 1983. V01. 25, N 3. P. 647-658.
P Delrey Е, Garcia-acha 1., Nombela C. Д J. Gen. Microbiol. 1979_ Vol. 110.
‹ . 83——89.
Demuynck M., Neveau H., Nyns 5. ‚‹/ J. Trends Biqtechnol. 1984. Vol. 2, .\1 1.
Р. 2—~5.
Deschamps F., Heut M. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. Vol. 22, N 3.
P. 177——180.
Deshpande V., Rao M., Keskar S. /,1 Enzy me Microb. Technol. 1984. Vol. 6,
N 8, KP. 3'/1~374.
Deshpande V., Balknishnan H., Ranjekar P. K. et al. // Biotechnol. Lett. 1987.
Vol. 9, N 1. P. 49——52.
Detroy R. “Д, Londenfelser L. A., Julian G. S. et a1.,1/ Biotechnol. Bioeng.
Symii). 1980 N 10 P. 135~148.
etroy R., Cunningham R., Bothast R. et al.//Biotechnol. Bioeng. 1982.
Vol. 24, N 5. 1P. 1105——1113.
Douglas R./1E1‘1erg_V Appl. Biomass; Proc. Nat. Meet. Biomass. (Arlington,
1~3 Oct, 1984). Ь; N. Y., 1985. Р. 219-—230.
Douglas R.. George E.//Biotechnol. Lett. 1987. Vol. 9, М 5. >Р. 365~368.
Dunne C. P. // Enzyme Eng; Proc. И Enzyme Eug. Conf. (Kashikojima,
20-25 Sept, 1981). N. Y.; Ь, 1982. Vol. 6. P. 355——356.
Dutt S. J. B. И] Adv. Ferment. 2: uPr0c. Conf. L., 1985. P. 152-157.
Durand H., Clauet M., Tiraby J. // Bioenergy-84: Proc. Int. Conf. (Géteborg,
15—~21 June. 1984). Ь, 1985. Vol. 3. P. 246-253.
E1-Helaly A. F., Abo-El—Dahab M. K., El-Goorani M. A. et al.//Zbl. Bakte—
riol.,1Parasitenk, Infektions. Krankh. und Ну; 1979. Abt. 2, vol. 134, М 2.
S. l87—~192.
El-Gohary F./1/Mazingira. 1981. ГМ 1. ‹Р. 80——84.
Emert 0.. Катает R. // Chem. Eng. Prog. 1980. N 9. P. 47~52.
Enari T. M., Niku—Paavola M. L. // CRL Rev. in Biotechnol. 1987. Vol. 5,
М 3. 1P. 67-87.
Enebo L. //‘Physiol. Plant. 1951. Vol. 4. Р. 652—-660.
Eriksson K. ,‘/Biotechnol. Adv. 1984. Vol. 2, N 2. ‘P. 149~—160.
Eriksson K. Н Phil. Trans. Roy. Soc. L., 1987. Vol. A321, N 1561. Р. 455-
459.
Eriksson К, Pettersson B., Westermark U. /,/‘FEES Lett, 1974. Vol. 49, N 2.
Р. 282~286.
Eriksson K., Larsson K. //' Biotechnol, Bioeng. 1975. N 17. Р 327.
Eriksson K..1/ New Horizons for Biotechnological utilization of the forest
resource: Lectures given at the 1985 Marcus Wallenberg Symposium in Falun.
Falun, 1985. P. 9~26.
Eriksson К, Pettersson B. ЛЕЩ. J. Biochem. 1982. Vol. 124. Р. 635~—642.
Eriksson K., Pettersson B., Vole J. et al. //lA.ppl. Microbiol, Biotechnol. 1986.
Vol. 23. P. 257-262.
Eriksson K. ‘И Tappi J. 1985. N 7. P. 46/ 55.
Evans8 J., Moclock M., Gealt M. Л/ Сап. J. Microbiol. 1986. Vol. 32, N 2.
P. 179-——1 l.
FarkasOV., Jalanko A., Kolarova N. //Biochim. Biophys. Acta. 1982. Vol. 706.
P. 105~ll .
Farouk H., El-Diwany A., Shaker H.//iMicr0bios_ Lett. 1984. Vol. 26,
N l03—~104. P. 129——l33.
248
Fan L. T., Lee G. H., David H.// Biochem. Bioeng. 1980. Vol. 22, N 1.
P. 17'/—199.
Fan L. T., Lee G. H., Beardmore D. R. // Biotechnol. Bioeng. 1981. Vol. 23,
N 2. P. 419~424.
Fernandes V., Nicoli J. //Rev. Microbiol. 1981. Vol. 12, N 4. P. l21~12-1.
Fischer J. R./,IBiotechnol. Bioeng. Symp. 1983. N 13. Р. 527——538.
Flickinger M. C. //' Biotechnol. Bioeng. 1980. Vol. 22, N 1. vP. 27—~48.
Fogarty W. M., Ward О. Р. // Proc. Biochem. 1972. Vol. 7, N 8. P. 13.
Fong J., Morrissette D., Vien R.;/Biotechnol. Lett. 1986. Vol. 8, N 4.
P. 299-302.
Frostell B. // -Proc. Biochem. 1982. Vol. 17, N б. Р. 37—40.
Fred E., Peterson W., Vildjoen J. //‘ Abstr. Bact. 1924. ‘N 8. P. 11—17.
ggreer S. N., Detroy R. W. /‘/ Appl. Environ. Microbiol. 1985. Vol. 50, N 1.
P.l ——159.
Fukumori F., Kudo T., Torikoshi K.//J. Gen. Microbiol. 1985. Vol. 131.
Р. 3339—3345.
Fukuzumi T., Shimada K./fApp1. Biochem. Biotechnol. 1984. Vol. 9.
Р. 357—3§8.
Gaéesa S., Skrinjar M., Robinson C., Mu—Jung 1.//"Hem. Ind. 1985. Vol. 39,
N 8. P. 179-182.
Garg S., Neelakantan C. ’/ Biotechnol. Bioeng. 1982. Vol. 24, N ll.
P. 2407—2417.
Garsia-Martinez D., Shinmyo A., Madia A. ст а1. ”J. App]. Microbiol. Bio-
technol. 1980. Vol. 9, N 3.113. 189——197.
Geathadevi B., Sitaram N., Monnamao K., Ramachandra R. /[Indian J.
Microbiol. 1978. Vol. 18. P. 85——87.
Ghose T. K., Panda T., Bisaria V. S. /, Biotechnol. Bioeng. 1985. Vol. 27.
P. 1353-1361.
Ghosh A., Conrad ‚МН. Water Pollution Control Federation. 1975. Vol. 17,
N 6. P. 1278/1305.
Ghosh A., Al-Rabiai S., Ghosh B. 7/ Enzyme Microbiol. Technol. 1982. Vol. 4.
1P. 1l1—113.
Glenn M., Ghosh A., Ghosh B. /,1 Appl. Environ. Microbiol. 1985. Vol. 50,
N 5. 'P. 1137-1143.
Golovleva L., Golovlev E., Chermensky D. et a1.;l/ Bioconversion of lant
raw material by microorganisms: (Proc. of the Finnish-Soviet Syrnpos. he d in
Tvarminee. Helsinki, 1983. P. 22-43.
Golovleva L., Redikultsev Y., Chermensky D. et al./1/Monitoring and cont-
rol of plant raw material bioconversion; VTT Symp. Espoo, 1985. N 60.
P. 54~—70.
Gomez R. Е, Hernandez P. /,’Adv. Biotechno1.: vProc. VI Int. Ferment.
Symp. (London (Canada), 20~—25 July, 1980). Toronto е. a., 1981. Vol. 2.
P. 131—136.
Gong C. 8., Ladish M. R., Tsa G. T. //‘Adv. Chem. Ser. 1979. Vol. 105.
P. 261—287.
Gordon J., Cooney C.’,/Adv. Biotechno1.'. Proc. VI Int. Ferment. Symp.
(London (Canada), 20—25 July, 1980). Toronto e. a., 1981. Vol. 2,1P. 15-20.
Grazia L., Romano P., Papa F. et al.//Ind. Alim. 1986. Vol. 25, N 11.
P. 859—~862.
Gregory K., Reade A. //Anim. Feed. Sci. Technol. 1977. Vol. 2, N 1.
P. 7——l2.
Grethlein H. E. Ц Biotechnol. 1985. Vol. 3, М 2. P. 155»—160.
Groleau D., Forsberg D. W. //' Can. J. Microbiol. 1981. Vol. 27. ‘P. 5l7——530.
Guiliano C. // Biotechnol. Lett. 1983. Vol. 5, N 6. ’Р. 395—398.
Guiliano C., Khan A. д/ Biotechnol. Bioeng. 1985. Vol. 27, N 7. P. 980——983.
Hadley B. // Chem. Age. 1979. Vol. 119. N 125. Р. 15-17.
Haider K. //l Ber. Kerniorschung Западе Jfilich. I980. N 35. КР. 70.
Halliweil G.//Biochem. J. 1966. М 100. P. 315~—~318.
Halsall D. M., Gibson А. H-/7/Appl. Environ. Microbiol. 1985. Vol. 50, N 4.
P. 1021~1026.
249
Hang Y., Woodams E. //Res. Food Sci. Nutr.: Proc. VI Int. Congr. Food
Sci Technol. Dublin, 1983. Vol. ‘2. P. 167-168.
Harada V., Haga K. //V World Coni. Anim. Prod. Tokio, 1983. Vol. 2.
P. 833-834.
Harvey P., Schoemaker H., Palmer J.// FEBS Lett. 1986. Vol. 195, N 1-2.
P. 242-246.
Harvey P. /‘/ J. Biol. Educ. 1986. Vol. 20, N 3.11). 169-174.
Hatakka A. H’ Appl. Biochem. Biotechnol. 1984. Vol. 9, N 4. ‘P. 363-364.
Hatakka A. //Bioconversion of plant raw material by microorganisms: Proc.
of ‘the Finnish»Soviet Sympos. held in Tvarminee. Helsinki, 1983. Р. 44-58.
Hatakka A.//Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1983. Vol. 18, N 6.
«Р. 350-357.
Hayashida S., Ahn 3., Yoshino S. et al.//J. Рас. Agr. Kyushu Univ. 1983.
Vol. 27, N 4. P. 99-107.
Healy J. В., Young L. Y. I’/Appl. Environ. Microbiol. 1978. Vol. 38, N 1.
Р. 84-89.
Hecht V., Schiigerl K., Scheiding W.//J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1982.
Vol. 16, жМ 14. P. 219-222.
Hecht V., Schiigerl K., Scheiding W. Н]. Chem. Technol. Biotechnol. 1983.
Vol. B 33, N 4. P. 231-240.
Hecht V., Rosen “А, Schiigerl K. »'/ Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985. Vol. 21,
N 3-4. P. 189-191.
Henderson A. R., McDonald P. 1‘; J. Sci. Food Agric. 1977. N 28. 117- 1186-490.
Herrero A. A., Gomez R. F.’ Appl. Environ. Microbiol. 1980. Vol. 40, N З.
P. 571-577.
Herrero A. A., Gomez R. F., Snedecor B. et а1.,;„/Арр1‚ Microbiol. Biotechnol.
1985. Vol. 22, N 1. 1P. 53-62.
Herrero A. A., Gomez R. F., Roberts M. F. /'/J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260,
N 12. P. 7442-7451.
Hidaka H., Takizawa T., Fujikawa H. et al. '/Appl. Biochem. Biotechnol.
1984. Vol. 9. N 4. P. 367.
Higushi '1"./.lExperientia. 1982. Vol. 38. P. 159-166.
Highley Т. L., Hurmani S. L., Palmer J. G.//Holzforschung. 1983 Vol. 37,
N 6. лР. 271-277.
Hilpert R., Winter J., Kandler О. //Agr. Wastes. 1984. Vol. 10, N 2
P. 103-116.
Hiroshi 0., Masani S., Yoshio H. //Biotcchnol. Biocng. 1986. Vol. 28, N 11.
Р. 1727-1734.
Hofsten В., Ryden AJ/Biotechnol. Bioeng. 1975. Vol. 17, N 8. P. 1183-
1197.
Hon-Nami K., Coughian M. P., Hon-Nami H. et al.// Arch. Microbiol. 1986.
Vol. 145, «N 1. P. 13-19.
Horikoshi K., Nakao M., Kurono Y. /‘fCan. J. Microbiol. 1984. Vol. 30.
P. 774-779.
Hours R. A., Massucco A., Ertola R. /_` Арр1. Microbiol. Biotechnol. 1985.
Vol. 23, М 1. P. 33-37.
Hrmova M, Biely P.//1II СИМПОЗ, соц. стран no биотехнологии. Братислава,
1983. С. 306
Hui-Sheng Yu., Eriksson K. E. // Svensk papperstidning. 1985. N 6. Р. 57-60.
Hulme M. A., Stranks D. W. 7/1. Biol. Sci. 1974. N 27. Р. 457-460.
Hymphrey A.//II int. Symp. Bioconversion and Biochemical Engineering.
Bere, 1980. Р. 5.
Hungate E. Methods in microbiology. 1969. Vol. 3B. Р. 117-132.
Irene F., Nalson D. /flBi0ter.hnol. Lett. 1987. Vol. 9, 1М 5. 113. 361-364.
Jean-Jacques В.‚ Gilbert G., Alain B.//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1985.
Vol. 22, N 3. P. 227-234.
Jewell W. J.// TID-27164. Ithaca (N. Y.), 1977. JP. 17-34.
Jeyanayagam S., Collins E. //Trans. ASAE. 1984. Vol. 27, М 5. Р. 1518—-
1523
Johri8 В. М.‚ Paudey A. R.//Indian J. Microbiol. 1982. Vol. 22, N l.
P. 76-7 .
250
Johnson E. A., Bouchot F., Demain A. l..,'/ J. Gen. Microbiol. 1985. Vol. 131,
N 9. P. 2303-2308.
Johnson E. A., Sakajoh M., Halliwell G. et al.// Appl. Environ, Microbial,
1982. Vol. 43, N 5. P. 1125—~1132.
Jotech B.//‘ Bioproc. тешит. 1986. Vol. 8, Х 3. P. 502~506,
Kadam K., Dreut S.//Biotechnol. Bioeng. 1986. Vol. 28, N З. P. 394-404.
Kahlon S. i'/ J. Res. Punjab Agr. Univ. 1985. Vol. 22, N 3. P. 527-533.
Kammel W. P., Kubicek S. P. ‘J. Appl Biochem. 1985. N 7. P. 138—144.
Kamra D., Zadrazil F. /,lBiotechnol. Lett. 1985. Vol. 7, N 5. P. 335-340.
Karube J. //Bioteclinol. Bioeng. 1980. Vol. 22, N 4. P. 847-857.
Karapinar M., Okuyan M. ‘/ Chem. Microbiol. Technol. Lebensm. 1982 Vol. 7,
N 5. P. 134~-136.
Karapinar M., Okuyan Мм J. Chem. Technol. Bioteclinol. 1982. Vol. 32,
N 12. P. 1055—1058.
Kassim E., Ghazi 1./ Zbl. Microbiol. 1987. Vol. 142, _\l 8. P. 257~261.
Kawamori M., Morikawa Ж, Takasawa S. /Appl. Microbiol. Biotechnol.
1986. Vol. 24, N 6. P. 449-—453.
Kehagias C., Macris B.// I11 Eur. Congr. Bioetchnol (Miinchen, 10~14 Sept.,
1984). Weinheim e. a., 1984. Vol. 2. P. 565~570.
Keim Carroll R. /, Enzyme Microbiol. Technol 1983. Vol. 5, N 2. P. 103~l14.
Kenneth G. //’Conserv. Recycl. 1982. Vol. 5, N 1. P. 33~—40.
Khan A. W. п‘ J. Gen. Microbiol. 1980. N 2. P. 499~—502.
Khan A. W. _f/ Can Res. 1984. Vol. 17, N 4. P. 2l—23.
Khan A. W. /,iBiomass 1986. Vol. 10, N 3. P. 165)174.
Kilbertus G., Mangenot F., Reisinger 0./ Ph3topathol. .‘/licol. Appl. 1973.
Vol ~19, N 1. P. l01—103.
Kim J. H. 1/ Biotechnol. Bioeng. 1985. Vol. 27. P. 1445—1450.
King K. W. и Biochem. Bioph_\s. Res. Comm. 1966. Vol. 24, N 3. P. 295—299.
Kirsch E. .l., Sykes R. ММ Progr. lnrlustr. Micrnbiol. 1971 Vol. 9. P. 155-
236.
Kirk T. /Biotechnol. 1983. Vol 21, N 8. P. 666«668.
Kirk T. ,4/lNew Horizons for Biotechnological Utilization of the Forest Re-
source: Lectures given at the 1985 Marcus Wallenbcrg Sympos. in Falun. Falun,
1985. P. 27-42.
Kirk Т., Сгоап 8., Tien M. et al. /"Enzyme Microbiol. T(3Cl'11'1\)i. 1986. Vol. 8,
N 1. P. 27~32.
Kirk T., Tien M., Johnsrud S. et al./, Enzyme Microbiol. Technol. 1986.
Vol. 8, N 2. P. 75——80.
Keeijntjens R, Н_, Boks P. A., Luyben K. Ch. // Biotechnol. Lett. 1986. Vol. 8,
N 9. P. 667—6'/'2.
Koenigs J. W. // Arch. Microbiol 1974. Vol. 99. P. 129-145.
Kohn Р. /’С11ет. Eng. 1977. Vol. 45, N 3. P. 58——63.
Kolar H., Mischak H., Kammel W. P. et al./‘.1. Gen. Microbiol. 1985.
Vol. 131, .\I 6. P. 1338——1347.
Kremar E. //Kvasny prum. 1975. Vol. 21, N 4. P. 83—90.
Kubicek C. P. l/ Arch Microbiol. 1982. Vol. 132, .\I 4. Р. 349~354.
Kubicek C. P., Pitt D. E./'/Eur. J. Appl. Biotechnol. 1982. Vol. 16, N 4.
P. 189~196.
Kubicek C. P. /, Can. J. Microbiol. 1983. Vol. 29. P. 163-169
Kumakura M., Kaetsu .l., Nisisava K.‘ Biotechnol. Bioeng. 1984 Vol. 26,
N 1. P. 17~21.
Kvachadze L, Kvesitadze 0., Hocholava R. />/ Monitoring and control of
plant raw material bioconversion: VTT Symp. Espoo, 1985. IN 60. >P. 156—165.
Labudova L, Farkas V. // Biochim. Biophys. Ania. 1983. Vol. 744. '-P. 135—~
140.
Lamed R., Bayer E. A. //lExperientia. 1986. Vol. 42, N 1. P. 72—’/'3.
Lamed R., Setter E., Kenig R. е: а1. Biotechnol. Bioeng. Symp. 1983a,
N 13. P. 163~18l.
Lamed R., Setter E., Bayer E. ,]/ J. Bacteriol. 1983b. Vol. 156, N 2. P. 828—
836
.Langwell H., Lloyd н. /,/J. Inst. Brewing. 1923. N 19. P 302-311.
251
Langwell H.//l Chem. Ind. 1932. N 51. P. 988-997.
Lappalainen A.//Biotechnol. Appl. Biochem. 1986. Vol. 8. P. 437-448.
Laughlin Tehomas J.//Biotechnol. Bioeng. Symp. 1984. N 14. P. 581-587.
Leatham 0. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986. Vol. 24, N 1. P. 51-58.
Leatham 0., Kirk T. /,' FEMS Microbiol. Lett. 1983. Vol. 16, N 1. P. 65-67.
Lee S. F., Forsberg C. W., 0ibbins L. N.//Appl. Environ. Microbiol. 1985.
Vol. 50, N 4. P. 1068-1076.
Leisola M., Fiechter A.//FEMS Microbiol. Lett. 1985. Vol. 29, N 1.
P. 33-36.
Leisola M., Thanei-Wyss U., Fiechter A. // J. Biotechnol. 1985. N 3. P. 97-
107.
Leistner L. //Fleischwirtschait. 1986. Vol. 66, N 9. S. 1385-1388.
Leschine S. В., Canale-Parola E. //Appl. Environ. Microbiol. 1983. Vol. 46,
N 3. P. 728-737.
Le Ruyet P., Dubourguier H. C., Albagnac 0. // Appl. Environ. Microbiol.
1984. Vol. 48, N 4, P. 893-894.
Le Ruyet P.. Dubourguier H., Albagnac 0. // Syst. Appl. Microbiol. 1984.
Vol. 5, N 2. P. 247-253.
Lettinga 0., VanVelsen А., НоЬта S. et a1.//Biotechnol. Bioeng. 1980.
Vol. 22, N 4. P. 699-734.
Levonen-Munoz E., Bone D., Daugulis A.//' Eur. J. Appl. Microbiol. Biotech-
nol. 1983. Vol. 18. N 2. P. 120-123.
Levonen—Munoz E., Bone D. ,‘/Biotechnol. Bioeng. 1985. Vol. 27, N 3.
P. 382-387.
Liao P. H., Lo K. V. // Biotechnol. Bioeng. 1985. Vol. 27, N 3. P. 266-272.
Lin K. W., Ladish M. R./'Biotechn. Bioeng. 1985. Vol. 27. P. 1427-1433.
Linden J. С., Murphy V. 0., Moreira A. R.// Adv. Biotechnol.: ‘Proc. VI Int.
Ferm. S mp. Toronto, 1981. P. 41-46.
Lin о M. /l/ Adv. Biochem. Engin. 1977. N 5. LP. 25-148.
Litchiild M. _// Food Can. 1983. Vol. 43, IN 4. P. 21-25.
Litchfild M. //1 Science. 1983. Vol. 219, N 4585. P. 740-746.
Ljungdahl L. 0., Eriksson K. E. НАШ’. Microbiol. Ecol. 1985. Vol. 8.
P. 237-299.
Ljungdahl L. 0., Petterson B., Eriksson K. E. et al. 1/ Curr. Microbiol. 1983.
Vol. 9, N 4. P. 195-200.
Lobanok A., Stakheev 1., Babitskaya V. // Bioconversion of lant raw mate-
rial by microorganisms: Proc. of the Finnish—Soviet Sympos. he d in Tvarminee.
Helsinki, 1983. Р. 3-12.
Lobanok A., Stakheev 1., Babitskaya V. /,’Soviet—Finland seminar on biocon-
version of plant raw materials by‘ microorganisms, Pushchino, 1984. P. 110-120.
Lobanok А., Stakheev 1., Babitskaja V. // Monitoring and control of plant
raw material bioconversion: VTT Symp. Espoo, 1985. N 60. P. 79-103.
Lobanok А., Babitskaya V. /l/ Biotechnology of Recycling: Leipzig Sympos.
on Biotechnol. 1986. Leipzig, 1986. S. 7.
Loewenberg J. к, Chapman C. M. // Arch. Microbiol. 1977. Vol. 113.
P. 61-64.
Lo K. V., Liao P. H., Chen W. Y. М Biomass. 1985. Vol. 7, N 1. P. 58-72.
Lo K. V., Liao P. H.//Energy Dev.: New Forms Renewables, Conserv.
Proc. ENERGEX’84, Global Energy Forum Regina. Toronto e. a., 1984. P. 231-
236.
Lonsane B,, 0hildya1 М, Budiatman S., Ramakrishna S. // Enzyme Micro-
biol. Technol. 1985. Vol. 7, IN 6. P. 258-265.
Lo 8,, Moreau Y, // Can. J. Chem. Eng. 1986. Vol. 64, N 4. P. 639-646.
Lovitt R. W., Longin R., Zeikus J. 0. et а]. М Арр1. Environ. Microbiol.
1984. Vol. 48, N 1. P. 171-177.
Lucio A., Marney С., Rodolphe C. // Agr. Biol. Technol. 1986. Vol. 29, N 3.
P. 533-543.
Lynch J. M., Harper S., Chapmen S. et al./1/Appl. Biochem. Biotechnol.
1984. Vol. 9, N 4. P. 379-380.
Mac Kenzie C., Bilous D./J‘ Can. J. Microbiol. 1982. Vol. 28. P. 1158-1164.
252
Macris B. .l., Paspaliari M., Kekos D. // Biotechnol. Lett. 1985. Vol. 7, N 5.
P. 369—379.
Madan M., Bisaria R. //Appl. Biochem. Biotechnol. 1984. Vol. 9, N 4. P. 395.
р Tglaggit M., Godden В., Penninckx M. J. /‘/ Ann. Microbiol. 1984. Vol. 135 B.
Maltseva 0., Myasoedova N., Go1ov1eva L. // Monitoring and control of plant
raw material bioconversion: VTT Symp. Espoo, 1985. N 60. P. 8—25.
Maly J. // Water Pollution Contro1 Federation. 1971. P. 641-654.
Mandels M. // Ann. Repots. Ferment. Processes. 1984. N 5. P. 35—78.
Manning K., Wood D. A. // J. Gen. Microbiol. 1983. Vol. 129. P. 1839—1847.
Margaritis A., Merchaut R. // Biotechnol. Bioeng. Symp. 1983. N 13.
P. 299—314.
Margaritis A., Merchaut R. f/ CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1986. Vol. 4, N 3.
P. 327~367.
Marjorie S. /’/ Science. 1985. Vol. 230, N 4727. P. 790~792.
Marsden W., Gray P. // CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1986. Vol. 3. P. 235~—276.
Martin A., Bailey V. // Appl. Environ. Microbiol. 1985. Vo1. 49, N 6.
Р. 1502—1506.
8 Mats Е, Eriksson K. /‘/ Biotechnol. Bioeng. 1980. Vol. 22, N 11. P. 2273—
22 4.
Matsuno R., Taniguchi M., Tanaka M. et а1. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1986.
Vol. 434. P. 158—160.
McBee R. H. // Bacterio1. Rev. 1950. V01. 14, N 1. P, 51——63.
McCarthy A. L. ,^/ Public Works. 1964. Vo1. 95. P. 91——98.
McCarthy A., Peace E., Paterson A., Broda P. // Appl. Biochem. Biotech-
nol. 1984. Vol. 9. N 4. P. 383.
McCarthy A., Paterson A., Broda P. ’ Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986.
Vol. 24, N 4. P. 347-352.
McDona1d M., Liwicli R., Broda P. ‘/ Арр1. Biochem. Biotechnol. 1984.
Vol. 9, N 4. P. 381~—382.
McLean D., Podruzny M. F. // Biotechnol. Lett. 1985. Vol. 7, N 9 P. 683—
688.
Mendelsohn H. R., Wettstein P. // Chem. Eng. 1981. V01. 88, N 12. P. 62~—65.
Merivuori M., Sands J. A., Montencourt B. S. '/‘ Appl. Microbiol. Biotech-
nol. 1985. Vol. 23. P. 60——66.
Mes-Hartree M. /‘/ Biotechnol. Bioeng. Symp. 1984. N 14. P. 397-405.
2 Meyer D., Hartig C. // Wiss_ Z. Techn. Hochscli. 1987. Vol, 29, N 2. S. 194——
03
Micami V., Gregory K_, Levadoux W. et а1. /,’ Appl. Environ. Microbiol.
1982. Vol. 43, N 2. P. 403-411.
Miller J. A. // Sci. (News. 1979. V01. 116, М 18. P. 317—323.
Milstein 0., Vered V., Sharma A. et a1. //’ Арр1. Environ. Microbiol. 1983.
Vol. 46, N 2. P. 55——61.
Milstein 0., Hards A., Sharma A. et a1. м Арр1. Biochem. Biotcchnol. 1984.
Vol. 9, N 4. P. 393—394.
Milstein 0., Vered V., Sharma A. et a1. f/ Biotechnol. Bioeng. 1986. Vol. 28.
N 3. P. 381—386.
Mishra 8., Gopalkrishnan K. S., Ghose T. K. // Biotechnol. Bioeng. 1982.
Vol. 24. P. 251-254.
Mohagheghi A., Grohmann K., Himmel M. е! а1. д,’ Int. J. Syst. Bacteriol.
1986. V01. 36, N 3. P. 435-443.
Molina 0., Galzev P., Frigerio C. et a1. //' Appl. Microbiol. Biotechnof.
1984. Vol. 90, N 5. P. 335—339.
253
Moloney А., СоиеЫап M. Р. // Biotechnol. Bioeng. 1983. Vol. 25. N‘ 1.
P. 271—280.
Montenecourt B. S., Nhlapo S. D., Trimino—Varquez H. et а1. ‚ Regulatory
controls in relation to overproduction of iungal cellulases. Trends Biol. Ferment.
Fuels and Chem. Proc. Symp. (Upton; Н. Y., 7~—11 Dec., 1980). N. Y.; L, 1981.
P. 33~53.
Moon 0., Katzen R. // Biotechnology-84: World Biotech. Rept. Proc Conf.
L, 1984 Vol. 2. P. 486—501.
Moo-Young M., Daugulis A., Chahal D. et al.//Pros. BiOchen1_ 1979.
Vol. 14, N 10. P. 38——40.
Moo-Young M. //' Colloq. Int. Protein org. unicellulaires (Paris, 28,30 Jan,
1981). Paris, 1983. P. 399-341.
Moreira A. R., Phillips V. A., Humphrey А. Е. Biochenol. Bioeng. 1981.
Vol. 23. P. 1339~1347.
Muller H., Troosch W., Kurube K. D. д Eur. Congr Biotechnol Munchen,
1984. Vol. 3. P. 89~94.
Miiller Н., Тгёэсп W. / Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986. Vol 21, ‘Ч 2.
P. 180—185.
Murray w. D. , Int. J. Syst. Bacteriol. 1984 V01. 34, N 2. P. 185-187,
Murray W. D. ,i/ Biomass. 1986. V01. 10, T\l 1 P. 47-57
Murray W. D. // Appl. Environ. Microbiol. 1986. Vol. 51, V’ 4. P. 710——714.
Naiio Hiroshi, Угнан Лпеа „1/ Res. Relut. UNESCO .’l1an. Biosphere Pro-
grain T()l\1(), 1982. P. 148——149.
Neelakantan S. Indian J. Microbiol 1980. Vol. 20. .\l 1. P 95~lO2.
Nelson D., Jaime R., Andre Е, Victoriano C. l Biotechnol. Lett. 1987.
Vol 9, N 5 P. 357-360.
Nevalainen K. M., Palva E. T. ‚ Арр1. Environ Microbiol 1978. Vol. 36,
(N 2. P. 11#16. -
Ng T. K., Weimer Р. 3., Zeikus J. G.//Aich. Microhiol. 1977. Vol. 114,
N l. P. 1-7.
Ng T. K., Ben-Bassat A., Zeikus J. G. et а1. Арр1. Enriron .\licrobi01.
1981 Vol. 41, У 6. P 133'/'——l343.
Ng T. K., Zeikus д. О. et а1. /, Biochem. J. 1981 Vol. 199, N 2. P. 3-11—350.
Ng T. K., Zeikus J. G. /' Appl. Environ. Microbial. 1981. Vol. 42, f\I 2.
P. 231 Q40.
Ng T. K., Zeikus .1. G. 1/ J. Bacteriol. 1982. Vol 150, Н 3 P. 139l«l399.
Nicolini L, Hunolstein C., Carilli А. 4/ Appl. Microbicrl Biotechnol 1987,
Vol. 26, N 1 P 95~98
1 Nisizawa Т.‚ Suzuki H., Nisizawa K. 1 J. Biochem. 1972. N 71. P 999-
002
Nyns E. J., Neveau H. P. //Energy Biomass Proc. lni. Conf. Biomass (Ber-
lin (West), 20—23 Sept, 1982). L.; N. Y, 1983 Р 363-369.
Oates R. ’ Diss. Abstr. 1964. T\I. 25 P. 2'/'09~27l4.
Odunfa S., Shasore S. /' Acta Biotechnol. 1987 Vol 7, .\I l. P. 23—29.
Okada 0., Nisizawa Т., Suzuki H. // J. Biochem. 1968. Vol 63. P. 591—607.
Oksanen 5., Anvenainen 1., Home S. l Eur Brewery. Cont. Proc. ХХ Congr.
Oxford, 1985. P. 4l9——425.
Olliver B., Smiti Н.‚ Garcia J. L. et al. 1 Biotechnol. Lett. 1985. Vol. 7,
N ll P. 847«~852.
Orpin C. G. / J. Gen Microbiol. 1981. Vol. 123, N 2 P. 287-296.
Ortega J. /’ Tex. J. Sci. 1980. Vol. 32, N 3. P. 241—246.
Panchel T. M., Mac Roy C. Е, Ogden .). C. et а1. /' Appl. Enxiron. Micro-
biol. 1979. Vol. 37, N 2. (P. 348-350.
254
Paredes-Lopes 0., Gwyneth 1., Montes-Rivera R. // Biotechnol. Lett. 1987.
Vol. 9, N 5. P. 333-338.
Parry J. B., Slater J. H. // Proc. Int. Symp. EEC Programme Recycl. Urban.
Ind. Waste. (Luxemburg, 8-10 May, 1984). L;. N. Y., 1984. P. 159-167.
Pasti M. P., Belli M. L. 11/ FEMS Microbiol. Lett. 1985. N 1. P. 107-112.
Patel G. B. // lnt. J. Syst. Bacteriol. 1980. Vol. 30, N 1. P. 179-185.
Patel G. B. // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1982. Vol. 16, N 4.
P. 212-218.
Pathak A. N., Ghose 1. K. ‚И Ргос. Biocem. 1973. Vol. 8, N 4. ‘P. 35.
Pathak A. N., Jain A. K., Dev D. S. /‘/ Авт. Wastes. 1985. V01. 13, N 4.
P. 251-259.
Pathi N. J., Alexander J. K. et al. // J. Bacteriol. 1971. Vol. 105, N 1.
P. 220-231.
Payton M. A. /‘/ Trends Biotechnol 1984. Vol. 2, N 6 Р. 153-158.
Peck J. H., Odom J. M. // Microbial Mats: Stromatolites. N. Y., 1984.
P. 215-243.
Peiris S. P., Rickard P. A., Dunn N. W. // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotech~
nol. 1982. N 14. P. 169-173.
Person S., Bartlett H. /,1 Energy in Agriculture. 1978. V01. 26, N 1 P. 13-17.
Petidemange E., Fond 0., Caillet F. et al. // Biotechnol. Lett. 1983. Vol. 5,
N 2. P 119-124.
Pettipher G. L., Lathaen M. J. N J. Gen. Microbiol. 1979. V01. 110. P. 29-38.
Pine M. J., Barker H. A. ,1,’ J. Bacteriol. 1956. V01. 71. P 644-648.
Platt M., Hadar Y., Henis Y. ей а1. // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.
I983. V01. 17, N 2 P. 140-142
Poels J., Van Assche P., Verstraete W. П‘ Agr. Wastes. 1984. Vol. 9, N 4.
P. 239-247.
Pometto A_, Crawford D.//Appl. Environ. Microbiol. 1986. V01. 52, N 2.
P. 246-250.
Pou J.. Figarella X., Fernandes M. et al. // Microblol Esp. 1985. Vol. 38,
N 3-4 P 81-88
Pourouie J., Vandecasteele J. P. // Bioenergy-84: Proc. Int Cont. (Gote-
borg. 1984). L, 1985 Vol. 3. P. 254-257.
Poutanen K.. Puls J., Linko M. /V Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986. Vol. 23,
N 6. P 487-490
Poutanen K., Puls J., Viikari L, // Monitoring and control of plant raw ma-
terial bioconversionz VTT Symp. Espoo, 1985. N 60. P. 139-145.
Puls J., Poutanen K., Schmidt О. ей а1. // The third international conference
on Biotechnology in the Pulp and Paper industry. Stockholm, 1986. ‘P. 93-95.
Purschwitz M. М Agr. Eng. 1979. Vol. 60, N 8. P. 6-8.
Ragg P., Fields P. // iPhi1. Trans. Roy. Soc. London. 1987 Vol. A321,
N 1561. P. 537-547.
Ramasamy K., Verachtert H. // J. Gen. Microbiol 1980. Vol 117. P. 181-
191.
Ranby B. Recent Progress on the Structure and Morphology of Cellulose. in
Cellulases and their Application. WashirLgt0n_ 1969.
Rao M., Mishra C., Gaikwad S. et a1. 1/ Bioteclmol. Bioeng. 1986. V01. 28,
N 1. P. 129-132
Rao M., Seeta R., Deshpande V. //‘ Biotechnol. Bioeng 1983. Vol. 25, N 7.
1P. 1863-1871
Rapp P., Grote E., Wagner F. // Appl. Environ. Microbiol. 1981. Vol. 41.
N 4. P 857-866.
Reese E. T., Siu R. G. H., Levinson H. S.//J. Bacteriol 1950. V01 59, N 4.
P. 485-488.
255
Reese E. T., Maguire A. // Dev. Industr. Microbiol. 1971. N 12. P. 212.
Reese E. T. // Biotechnol. Bioeng. Symp. 1972. Vol. 3. P. 43-45.
„З Refai A., Atalla M., E1-Safty H. ,1/Agr. Wastes. 1984. Vol. ll, N 2. P. 105-
Reid J., Jap D. //' Appl. Environ. Microbiol. 1985. Vol. 50, N 1. P. 133-139.
Reid .1., Chao E., Dawson P. // Can. .1. Microbiol. 1985. Vol. 31, N 1.
P. 88-90.
р 1кЪп55ег F., Spencer J., Sollans H. у)’ Арр1. Microbiol. 1985. Vol. 6, N 1.
Robinson P. D. // Biotechnol. Lett. 1984. Vol. 6, N 2. P. 119--122.
Rodrigues .l., Echevarria .l., Rodriguez F. et а1. // Biotechno1_ Lelt. 1985.
V01. 7, N 8. P. 577-580.
Rodriguez F., lstedt W., Echevarria .1. 1/ Acta Biotechnol. 1986. Vol. 6,
N 3. P. 253-258.
Rogana E., Lindari V. / Rev, Microbiol. 1983. V01. Н, N 1. P. 1-5.
Roger M., Vezinchet F., Myalzy P. et а1. //“ Rev. Ferment. Alim. 1976. Vol. 31,
N 5. P. 125-131.
Rolz C., Leon R., Arriola M., Cabrera S. ' Appl. Microbiol. Biotechnol.
1987. V01. 25, N 6. P. 535-541.
Rombouts F. M., Pilnik W. // Microbiol. Enzymes Bioconvers. L, e. a., 1980.
1P. 227-282.
Roussos S., Raimbault M. ;/ Ann. Microbiol. 1982. Vol. 133, N 3. P. 455-
464.
Roy A. 1’ Спгг. Sci. 1987. Vol. 56, N 8. P. 350-353.
Sadaha .1., Рай! R. V. //’ Carbohydrate Res. 1985. Vol. 140. P. 111-120.
Saddler .1. N., Chan M. K, ‚Т,‘ Еиг J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1982.
Vol. 16. N 2-3. P. 99-104.
Saddler J. М, Chan M. K. // Сап. J. Microbiol. 1979. Vol. 25, N 12. P. 1427-
1432.
Saddler .1. N. /f Can. J. Microbiol. 1984. Vol. 30, N 2. P. 212-220.
Sakoo D. K., Mishra S., Bisaria V. S. //J. Gen Microbiol. 1986. V01, 132,
N 10. P. 2761-2766.
Sarkar .1. M. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1984. Vol. 9, Ы 4. P. 411--416.
Sasaki T., Tanaka T., Nanbu W. et а1. // Biochem. Bioeng. 1979. Vol. 21,
N 6. P. 1031-1042.
Sashihara N., Kudo T., Horikoshi K. //1 J. Bacteriol. 1984. Vol. 158. P. 503-
506.
Sauth R. J. // .1. Anim. Sci. 1979. V01. 48, N 1. P. 202-217.
Schellhorn H. E., Forsberg C. W. П,’ Сап. .1. Microbiol. 1984. V01. 30.
P. 930-937.
Schmuck M., Pilk 1., Hayn M. et а1. /1/ Biotechnol. Бей. 1986. Vol. 8, Х 6.
P. 397-402.
Schoemaker H. E., Harvey P. .l., Bowen R. M. et а1. //' FEBS Lctt. 1985.
Vol. 183, N 1. P 7-12.
Schreiber 0., Kolar H., Foisner R. et а1. //' Arch. Microbial. 1986. Vol. 144.
P. 41-47.
Schulz 0., Mirte W., Jacopian V. et а1. /‚! Act-a Biotechnol. 1986. Vol. б, N 3.
P. 259-264.
Selby K. // Biochem. J. 1961. N 79. P. 562-567.
Sharrock K. R. ,”/ Chem. N. Zealand. 1983. Vol. 47, N 3. P. 62-64.
Sison B. S., Schubert W. .1., Nord F. F. ,1/‘ Arch. Виснет, Biophys. 1952,
Vol. 75. P. 260.
Sitton 0. C. ей а1. // Chem. Eng. Progress. 1979. Vol. 75, N 12. P. 52-57.
256
v01.Sz1l8ef=‘1:5\IRl-.plVl8a8l1‘lS§é.' Robinson R. е! а1. // Арр1. Environ. Microbiol. 1984.
Slobodan G. М Нет. Ind. 1984. Vol. 38, N 10. P. 301-306.
VOL%r,111r&h1.RI.).' 3<)1s_ogI:3§1lp Ch.. Bicho P., Gregory K. // Biotechnol. Lett. 1986_
Smith ., Anders ., ' ., ' _ . '_ _
don. 1987. '\}/201. A321, (I)\l11JE>61,Se1;]_‘%r07E-5j2\lli00 K Л PM Trans‘ Roy‘ з” L0“
Solak G. 1/V Acta Aliment. Pol. 1986. Vol. 12, N 3_4_ ›р_ 205_220_
Somasundaram . har ra‘ . ‚ -
I987. VOL 37, N 3' pl? .20g_2|:1: J W. Bane L // J. Chem. Technol. Biotechnol.
VOL 1:1-.43l:;=\_\:14g3t:3e 3., Blachere H. /1 Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986.
Spinnler H. /,1 Biotechnol. Lett. 1986. Vol. 8, N 3. P. 213-218.
Sprey 3.. Lambert c. // FEMS Microbiol. Lett. 1983. Vol. 18, N 2. P. 217-
Sprey 3., Lambert c. / FEMS Microbiol. Lett. 1984. Vol. 23, N 2-3.
P. 227-232.
Srinivasan M., Rao M., Seshmukh S. et al. А] Enzyme Microbiol. Technol.
1983. Vol. 5, N 4. P. 269-272.
Stack R. J., Hungate R. E. // Appl. Environ. Microbiol. 1984. Vol. 48.
P. 218-223
Stack C., Lichtenberger 0., Martin J. // int. Gas. Нее; Conf. Proc. (Los
Angeies. Ca1if., 28-1 Sepr.-Oct., 1981). Rockville (Md.), 1982. P. 824-832.
Steinkraus K. //1 Biotechnol. Adv. 1986. Vol. 4, N 2. P. 219-243.
Sternberg D., Mandels G. R. /'/ J. Bacteriol. 1979. Vol. 139, IN 3. P. 761-
769.
Stevens B., Payne J. // .1. Gen. Microbiol. 1977. Vol. 100, N 2. P. 381-393.
Stewart J., Lester A., Milburn B. et a1. /1/ Biotechnol. Lett. 1983. Vol. 5,
N 8. P. 543-548.
Stone .l., Sca11an A., Donefer E. et a1. // Cellulases and their Application.
Washington D. С.‚ 1969. P. 219-220.
Sugimori T., Ogata J., Omici T. // J. Ferment. Technol. 1972. Vol. 4, N 5.
P. 435-446.
Suha S., Bassam Y. //Adv. Ferment. Proc. Conf. (London, 23-25 Sept,
1985). Rickinansworth, 1985. P. 138-143.
Suh Duck H., Sauds J. A., Montenecourt B. S. // Appl. Microbiol. Biotech~
r-ol. 1986. Vol. 25, N 3. P. 277-284.
Sukatsch D., Prave P., Faust N. j/ C011oq. lnt. Protein org. unicelluiaires
(Paris, 28-30 Jan., 1981). Paris, 1983. ‘P. 193-201.
Szakacs-Dobozi M., Szakacs 6., Klappach G. ,1/Acta Biotechnol. 1985.
Vol. 5, N 1. P. 27-33.
Tagychi H.//Conserv. Recycl. 1982. Vol. 5, N 1. P. 71-74.
Takagi M. // Biotechnol. Bioeng. 1984. Vol. 26, ‚М 12. P. 1506-1507.
Tahaka T., Shimomura S. /I Agr. Biol. Chem. 1986. V01. 50, N 9. P. 2185-
2192.
Tanaka M., Haga K., Yanaga M. et a1. // V World Conf. Anim. ‘Prod. (14-
19 Аид, 1983). Tokio, 1983. Vol. 2. P. 835-836.
Tanaka M., Nakamura H., Taniguchi M. et al. 7/ Appl. Microbiol. Biotech-
nol. 1986. Vol. 23, N 3-4. P. 263-268.
Taniguchi M., Kometani V., Tanaka M. et al. /V Eur. J. Appl. Microbiol. Bio-
technol. 1982. Vol. 14. N 2. ‘P. 74-80.
Targonski Z. Л Acta Alim. Pol. 1984. Vol. 10, N 3-4. P. 301-309.
Тау R., Willets А. // Appl. Environ. Mierobiol. 1977. Vol. 33, N 4. P. 758-
761.
17. Зак. 966 257
Тетрег U., Winter .l., Kandler O. ‚д‘ Energy Biomass: 1Proc. Int. Cont. Bio-
mass (Berlin (West) 20-23 Sept, 1982). L.; N. Y., 1983. P. 521-525.
Tengerdy R. // Trends Biotechnol. 1985. Vol. 3, N 4. P. 96-99.
Toldra F. fl Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986. Vol. 23, N 5. P. 336-341.
Torev A. 1/ IV Sympos. of the Socialist Countries on teehno1.: Abstracts.
Varna, 1986. P. 129.
Trivedi 8., Ray R. ‚’/ J. Ferment. Technol. 1985. Vol. 63, N 3. P. 299-304.
Ulmer D., Leisola M., Schmidt B., Fiechter A. // Appl. Environ. Microbiol.
1983. Vol. 45, N 6. P. 1795-1801.
Vaara T. М Monitoring and control of plant raw material bioconversion:
VTT Symp. Espoo, 1985. N 60. P. 47-53.
Vaheri M. P., Vaheri M. E., Kauppinen V. S. // J. Appl. Microbiol. 1979.
N 8. P. 73-80.
Vaheri M. P. л J. Appl. Biochem. 1982. Vol. 4, N 2. P. 153-160.
Vaheri M. P. А/ .1. Appl. Biochem. 1982. Vol. 4, N 4. P. 356-363.
Vaheri M. /‘/ Monitoring and control of ,plant raw material bioconversion:
VTT Symp. Espoo, 1985. N 60. Р. 166-170.
Vaillant C., Gonzales V., Echevarria F. et ад. ff Cienc. Biol. 1986. .\I 16.
P. 17-27.
Vaisto T., Heikonen M., Kreula M. п’ J. of the scientific Agr. Society of
Finland 1978. N‘ 50. P. 332-397.
Valer V. H., Hashimoto A. О. ’ Арр1. Environ. Microbiol. 1982. Vol. 44,
N 6. P. 1415-1420.
Vance J., Topham C. M., Blayden S. L. et al. /‘/ J. Gen. Mlcrobiol. 1980.
N 117. P. 235-241.
Van Assche P., Poels .l., Verstraete W. ‚У Rev. Agr. (Belg.) 1984. Vol. 37,
N 1. P. 55-66.
Vaccarino С., Lo Curto к, Tripodo M. et al. //‘ Biol. Wastes. 1987, Vol. 20,
N 2. P. 79-88.
Veal D., Lynch .1. // Nature. 1984. Vol. 310, N 5979. P. 695-697.
Verougstraete A., Nyns E., Neveau H. М Compost. Agr. Waster. Oxford,
1985. P. I35-145.
Verstraete J. W. / Biotechnology-83: Proc. Int. Conf. Commer Appl. Impli-
cat. Biotechnol. Northwood, 1983. P. 725-742.
Viesturs U., Beker M., Apsite A., Laukevics Y. //’ Bioconversion of plant
raw material by microorganisms: Proc. of the Finnish-Soviet Sympos. held in
Tvarminee. Helsinki, 1983. P. 118-130.
Viesturs V., Leite M., Strlkauska S. ,1/‘ Monitoring and control of plant raw
material bioconversion: VTT Symp. Espoo, 1985. N 60. P. 103-I24.
Viljoen S.//J. Agr. Sci. 1926. N 16. P. 1-8.
Vinay Y., Purohit M., Shankhapal K. // Indian J. Technol. 1986. Vol. 24, N 3.
P. 165-166.
Vladut-Talor M., Kauri T., Kushner D. J. д? Arch. Microbiol. 1986. Vol. 144,
N 3. P. 191-195.
Vlitos A. // Post-Marvest Physiol. Crop. Preserv.; Proc. NATO Adv. Study
Inst. (Sounion, 28 Apr.-8 May, 1981). IN. Y.; Ь, I983. P. 537-546.
Vogels O. D. /l/ Antonie van Leeuwenhock. 1979. N 45. P. 347-352.
Voliova 0., Suchardova 0., Krumphanzl V. et a1. // III Симпоз. соц. стран
по биотехнологии, Братислава, 1983. С. 95.
Waldron C. к, Becker~\/allone C. A., Eveleigh D. E. //‘ Appl. Microbiol. Bio-
technol. 1986. V01. 24, N 6. P. 477-486.
Ward B./,“Bioenergy-84: Proc. Int. Conf. Goteborg. 1984. Vol. 3. P. 284-
288.
��u� даю „НЕЁ an
Warzywoda M., Ferre V., Pourquie J. /‘/ Biotechr1o1. Bioeng. 1983. V01. 28.
P. 3005-3010.
Watson T. G., Nelligan J., Lessing L. ‚// Biotechnol. Left. 1984. Vol. 6, N 10.
P. 667-672.
Webb C., Fukuda H., Atkinson B. ‚1/ Biotechnol. Bioeng. 1986. Vol. 28. N 1.
P. 41-50.
Weimer P. J., Weston W. M. // Biotechnol. Bioeng. 1985. Vol. 27, N 11.
P. 1540-1547.
Westermak U., Eriksson K. // Acta Снетка Scandinavica. 1975. Vol. 3,
N 29. P. 419-424.
Whitaker J. R. М Enzyme Microbiol. Technol. 1984. Vol. б, N 8. P. 341-
343.
Wiegel J., Mothershed C. P., Puls J. ей a1. // Appl. Environ. Microbiol. 1985.
Vol. 49, N 3. P. 656-659.
“Чаде! J. // Experientia. 1982. V01. 38, N 2. P. 151-156.
“деде! J., Ljungdahl L. C. А/ Arch. Microbiol. 1981. Vol. 128_1N 4. P. 343-
348.
“деде! J., Dykstra M. // Appl. Microbiol. Bioteehnol. 1984. V01. 20, N 1.
P. 59-65.
Wildenauer F., Winter J. // Appl. Mierobiol. Biotechnol. 1985. Vol. 25, М 5.
Р. 367-372.
шике C. R., Cysewski G. к, Yang R. D. et a1. /‘ Biotechnol. Bioeng. 1976.
Vol. 18, N 9. Р. 1315-1323.
Willibaldo 8., Marcus V. // J. Ferment. Technol. 1976. Vol. 54, -N 4. P. 115-
119
'Wi1|ick 0., Morosoli к, Seligy V. ей a1. V J. Bacteriol. 1984. Vol. 159, М 1.
Р. 29-1-299.
Wood T, M., Lynch J. M. Д, Арр1. Biochem. Biotechnol. 1984. Vol. 9.
Р. 307-312.
Wood T. M., McCrae S. 1., Wilson C. A. // Appl. Biochem. Bioetchnol. 1984.
Vol. 9. М 4. P. 313-314.
Wood T. M., Wilson C. А, // Сап. J. Microbiol. 1984. Vol. 30, N 3. P. 316-
321.
Wood T. М.‚ МеиЬаиег D. 0., Stutzenberger F. J. / J. Bacteriol. 1984.
V01. 100, N 3. P. 1047-1054.
Wood T. M., McCrae S. 1. // J. Biochem. 1986. V01. 234, N 1. P. 93-99.
Wujcik W. J., Jewell W. J. // Biotechnol. Bioeng. Symp. 1980. N 10
P. 43-65.
Yamane K., Suzuki H., Hirotani M. et al. ff J, Biochem 1970. V01. 67, М 1.
9
Маца V., Triudale S. /‘/ Chem. Eng. Progr. I979. V01. 75, М 4. P. 11-16.
Yu E. K. C. /1 App1. Microbiol. Biotechnol. 1985. Vol. 22, N 6. P. 399-404
Yu E. K. C., Deschatelets L, Louis-Seize G. ей а|. // Арр1. Environ. Micro-
bio1. 1985. V01. 50, N 4. P. 924-929.
Zadrazil F. '// Z. Pf1anzenern2'1'hr_ Bodenk. 1975. N 3. S. 263-278.
Шагай! F. 5// Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1977. Vol. 4, N 4
P. 273-281.
Zadrazil F. W Mushroom Sci. 1978. Vol. 10. 1P. 231-241.
Zadrazil F. // Eur. J. Appl. Microbiol. Bioteehnol. 1980. Vol. 9, N 3.
P. 243-248.
Zadrazil F., Brunnert H. // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1982. Vol. 16,
N 1. P. 45-51.
Zadrazil F., Grinbergs Y., Gonzales A. Л Eur. J. Appl. Microbiol. Biotech-
пой. 1982. V01. I5, N 3. P. 167-171.
17* 259
Zadrazil F., Peerally A. //Biotechnol, Lett. 1986, Vol. 8, N 9. Р. 663—666.
184 Zamost B. L., McClary D. O. М] Biotechnol. Lett. 1983. Vol. 5, N 3. P. 179-
Zatelaki-Horvath K. ‚4/ Biotechnol. Bioeng. 1984. Vol. 26, N 4. ‘P. 389.
Zeikus J. (1., Ng T., Ben-Bassat A. et al. // Trends Biol. Ferment. Fuels.
Chem. Proc. Symp. (Upton; 7-11 Dec., 1980). N. Y.; L., 1981. P. 441——46l.
Zertuche L., Zall R. // Biotechnol. Bioeng, 1982. V01. 24, N 1. P. 57-68.
Zertuche L., Zall R. ff J. Food Sci. 1982. Vol. 47, N 1. P. 328-329.
Zondy Ь, Bard E1-Din S., Khalafallah M. et al. // Egypt. .1. Microbiol. 1984.
V01. 19, N 1. P. 123-130.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие
Глав а 1. Общая характеристика лигноцешчюлозных материалов
(А. Г. Лобанок)
Г л а в а 2. Механизмы микробной „тигноцеллюлозы
деградации
(А. Г. Лобанок) . . ‚ . . .
Г л а в а 3. Образование микробных депопимераз (А. Г. Лобанок)
Глава 4. Получение и применение микробных целлюлаз (А 1`. Лоба-
нок)_.....‚.......
Гл а в а 5. Микроорганизмы — продуценты белковых веществ (В. 1`. Ба-
бицкая) `s��
Глава 6. Биотехнология белковых препаратов для кормовых целей
(B. Г. Бабицкая) . . . . . . . .
Глава 7. Биотрансформация цеплюлозосодержащих субстратов с
целью получения спирта и органических кислот (Ж. Н. Бог-
дановская) . . . . s . . . . .
Глава 8. Биоконверсия биомассы и отходов в метан и органические
удобрения (Ж. Н. Богдановская)
Заключение
Литератуира
21
54
71
79
137
178
203
233
236