Д. к. ШАПИРО
Практикум по биологической
химии
э
>1
Под редакцией академика АН БССР А. С. В е ч е р а	’’
Издание второе, переработанное и дополненное
Допущено Министерством просвещения БССР в качестве учебного пособия для биологических специальностей пединститутов
е
Я
I-Р
г, iT
МИНСК «ВЫШЭЙШАЯ ШКОЛА» 1976
.1: э-э-т, э-
3
57.04
Ш23
УДК 577.1 (0,75.8)
Рецензент: кафедра химии Горьковского государственного педагогического института им. А. М. Горького.
... 21005—135
ШМ 304(05)—76 46—76
© Издательство «Вышэйшая школа», 1976
Ра здел I
ХИМИЯ АМИНОКИСЛОТ, ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ
АМИНОКИСЛОТЫ, ПЕПТИДЫ И ПРОСТЫЕ БЕЛКИ (ПРОТЕИНЫ)
Белки — высокомолекулярные органические соединения. Они играют огромную роль в жизнедеятельности клеток и тканей, являются важнейшей составной частью всего живого. «Повсюду, где мы встречаем жизнь, мы находим, что она связана с каким-либо белковым телом, и повсюду, где мы встречаем какое-либо белковое тело, не находящееся в процессе разложения, мы без исключения встречаем и явления жизни» (Маркс К-, Э н-гельс Ф. Соч., т. 20, с. 83). С белками в живом организме связаны важнейшие функции: рост и развитие клеток, пищеварение, размножение, передача наследственных признаков, раздражимость, мышечные сокращения, образование антигенов и антител, обратимое связывание и перенос жизненно важных веществ и др. Биологические катализаторы — ферменты являются белковыми веществами.
Белки—основной материал, из которого строится структура живой, клетки.
В состав белков входят (в процентах): углерод (50,6— 54,5), кислород (21,5—23,5), азот (15,0—17,6, в среднем 16), водород (6,5—7,3), сера (0,3—2,5), фосфор (0,5—0,6).
Суммарное количество белков в тканях определяют, умножая общее содержание в них азота на коэффициент 6,25.
Все белковые вещества разделяют на две группы: простые (протеины) и сложные белки (протеиды). Простые белки при гидролизе распадаются только на аминокислоты. В состав сложных белков, кроме аминокислот, входят также вещества небелковой природы — нуклеино
1*
з
вые кислоты, углеводы, липиды, пигменты, фосфорная кислота, металлы и т. д.
В построении молекул различных белков участвуют более 20 аминокислот, которые могут быть разделены на две большие группы: ациклические и циклические. В зависимости от числа аминогрупп и карбоксильных групп в молекуле ациклические аминокислоты делят на: а) мо-ноаминомонокарбоновые, содержащие по одной амино-и карбоксильной группе; б) моноаминодикарбоновые, в состав молекулы которых входят одна амино- и две карбоксильные группы; в) диаминомонокарбоновые, для которых характерно наличие в молекуле двух аминогрупп и одной карбоксильной. Циклические аминокислоты разделяют на карбоциклические и гетероциклические. В группу циклических включают также и иминокислоты.
В белковой молекуле аминокислоты соединены между собой пептидными связями. При образовании пептидной связи карбоксильная группа одной аминокислоты взаимодействует с аминной группой другой, при этом выделяется молекула воды:
СН3	,Нз
Н2И ~СНг —СО{ОН+HIHN-СН-СООН —► Н2и —СНг—С —N -СН-СООН+ н2 о о н
Лминоуксусная кислота ос - аминопропи-
(глицин) сноВая кислота
(аланин)
Изучение распределения электронов в пептидной .связи показало, что здесь имеет место явление мезомерии, или резонанса. Поэтому пептидная связь не является строго ни двойной, ни простой, занимая промежуточное положение, и схематически может быть представлена так:
н
Это подтверждают также данные, характеризующие расстояние между атомами углерода и азота для разных типов связи. Для двойной связи оно составляет 1,28А, простой — 1,48А, тогда как для пептидной —1,32А.
4
Резонанс является фактором, повышающим устойчивость химических соединений, и его наличием объясняется прочность пептидной связи.
Соединение из двух аминокислот носит название дипептид (например, глицил-аланин), из трех — трипептид, из четырех — тетрапептид и т. п., а из многих аминокислот — полипептид.
В образовании пептидной связи у моноаминодикарбоновых и диаминомонокарбоновых кислот принимают участие только аминогруппы и карбоксильные группы, связанные с а-углеродным атомом.
В пространственной конфигурации белковой молекулы имеют место различные типы связей. Чаще всего это водородные связи, но большую роль играют также дисульфидные, эфирные (ортофосфатные, пирофосфатные), фосфоамидные, ионные и др.
Аминокислоты и белки обладают амфотерным характером. При диссоциации как свободных аминогрупп, так и свободных карбоксильных групп они приобретают заряды: в кислой среде — положительный, в щелочной —отрицательный.
Регулируя pH среды, можно достигнуть такого состояния, когда диссоциация аминогрупп и карбоксильных групп будет одинаковой, т. е. уравняется количество положительных и отрицательных зарядов, следовательно, общий заряд частицы окажется равным нулю. Значение pH, при котором сумма положительных зарядов равна сумме отрицательных зарядов белковой частицы, называется изоэлектрической точкой. В изоэлектрической точке растворы белка весьма неустойчивы, белок из них легко выпадает в осадок. Значение изоэлектрической точки характерно для каждого белка и зависит ют аминокислотного состава. Таким образом, меняя концентрацию водородных ионов, можно изменить заряд белковых частиц.
Белки отличаются различной растворимостью.
При растворении белков в воде происходит гидратация их молекул. Вокруг каждой из них образуется водная оболочка (гидросфера). Наличие оболочек, состоящих из ориентированных в пространстве молекул воды, является наряду с зарядом белковых частиц фактором устойчивости белковых растворов. Под действием факторов, уменьшающих гидратацию белковых частиц (например, водоотнимающих средств) и нейтрализующих их заряд, рас
5

творимость белков понижается и они могут выпасть в осадок.
Качественные реакции на аминокислоты, пептиды и белки можно разделить на две группы: а) цветные реакции, обусловленные аминокислотами и пептидами; б) реакции осаждения, в основе которых лежат изменения физико-химических свойств белковых молекул.
Приготовление растворов белка
Раствор яичного белка для цветных реакций и реакций осаждения. Белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 15—20-кратном объеме дистиллированной воды. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3—4 слоя. Хранят в холодильнике.
Раствор яичного белка для реакций высаливания и диализа. Белки трех куриных яиц отделяют от желтков и растворяют в 700 мл дистиллированной воды, к которой прибавляют 300 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3—4 слоя. Хранят в холодильнике.
Раствор молочных альбуминов. К 200 мл снятого молока добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония, перемешивают и оставляют на 10— 15 мин., после чего фильтруют через складчатый бумажный фильтр. В растворе — альбумины, в осадке — глобулины и казеин.
Раствор растительных белков. К 40 г пшеничной муки прибавляют 160 мл дистиллированной воды, перемешивают и колбу переносят в холодильник (1—2° С) на сутки, затем снова перемешивают и фильтруют вначале через гигроскопическую вату, а потом через складчатый бумажный фильтр. Раствор содержит главным образом альбумины. Хранят в холодильнике.
Цветные реакции
Биуретовая реакция (реакция Пиотровского). В щелочной среде белки, а также продукты их гидролиза — полипептиды дают фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание с солями меди. Реакция обусловлена наличием пептидных связей. Положительная биуретовая реакция проявляется у соединений, содержащих не менее двух
6
пептидных групп. Интенсивность окраски зависит от длины пептида и варьирует от сине-фиолетовой до краснофиолетовой и красной.
Биуретовую реакцию дают также аспарагин (амид аспарагиновой кислоты) и аминокислоты гистидин, треонин и серин.
Свое название реакция получила от биурета — соединения, которое образуется при нагревании мочевины. Эта реакция сопровождается отщеплением молекулы аммиака
с=о I nhJhI
с=о I AW*
№3+
с=о
I
NH
I
с=о
I
№fz Биурет
Комплексной медно-натриевой соли пептидов и белков приписывают следующее строение:
/?2 0	~\2~
I II
...-NH~CH~C=N~CH-C~N~CH~C-
1 1 \ / I II "
Rj 0	\ / о
Си	-2Na+
Ч	/ \ Р'е 0
I II / \ | ||
...—NH-CH-C-N— CH-C=N-CH-C-
। I
Rs о~ J
он
— C=N~CH—
Ено/ыая форма пептидной связи
fy, Rz- R3.  —остатки аминокислот
7
Реактивы; а) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); б) раствор растительного белка (приготовление — см. с. 6); в) едкий натр, Ю^-ный раствор; г) сернокислая медь, 1%-ный раствор.
В одну пробирку наливают 2 мл раствора яичного белка, в другую — столько же растительного, затем в каждую из них прибавляют равный объем раствора едкого натра и по 1—2 капли раствора сернокислой меди. Появляется красно-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание.
Нингидриновая реакция. Нингидриновая реакция обусловлена наличием аминокислот, имеющих аминогруппы в a-положении. Белки, полипептиды и аминокислоты образуют с нингидрином соединение синего или сине-фиолетового цвета (при нагревании). Нингидриновая реакция является одной из наиболее чувствительных для обнаружения а-аминогрупп.
Сущность реакции заключается в том, что «-аминокислоты и пептиды, реагируя с нингидрином, подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию:
Восстановленный нингидрин взаимодействует с аммиаком и второй молекулой нингидрина, в результате чего образуется окрашенное соединение (пурпурный Руэ-манна)
Реактивы: а) раствор белка (без хлористого натрия). Приготовление — см. с. 6; б) глицин, 0,1%-ный водный раствор; в) нингидрин, 0,1%-ный спиртовой раствор.	'
В одну пробирку наливают 1—2 мл раствора глицина, в другую — столько же раствора белка. В обе пробирки добавляют раствор нингидрина (в первую 5—6 капель, во вторую — 10—12), нагревают около минуты. В пробирке с глицином быстро появляется фиолетово-синее или фиолетовое окрашивание, в пробирке с белком окрашивание развивается медленно и имеет красновато-фиолетовый оттенок (или даже желтовато-фиолетовый в случае наличия иминокислоты пролина).
Реакция «Поури. Это одна из наиболее чувствительных реакций на белки. Ее дают циклические аминокислоты. Реагируя с реактивом Фолина, они образуют комплексы, окрашенные в синий цвет. Интенсивность окраски зависит от концентрации белков, поэтому реакция Лоури может быть использована и для количественного определения.
Реактивы: а) раствор яичного белка для цветных реакций и реакций осаждения (см. с. 6), разведенный дистиллированной водой в 100 раз; б) глицин, 0,02%-ный раствор; в) фенилаланин, 0,02%-ный раствор; г) реактив А: 2%-ный раствор углекислого натрия (Ыа2СОз) в 0,1 н растворе едкого натра; д) реактив В: 0,5%-ный раствор сернокислой меди (CuSO4-5H2O) в 1%-ном растворе двузамещенного виннокислого калия (К2С4Н4О6 • 5Н2О) или натрия (Па2С4Н4О6’5Н2О); е)реактив С: к 50 мл реактива А пипеткой приливают 1 мл реактива В; ж) реактив Фолина: в колбе из термоустойчивого стекла в 700 мл дистиллированной воды растворяют 100 г вольфрамовокислого натрия (вольфрамата натрия, Na2WO4-2H2O) и 25 г молибденовокислого натрия (молибдата натрия, Na2MoO4-2H2O). К раствору приливают 50 мл концентрированной ортофосфорной кислоты (85%-ной) и 100 мл
9
концентрированной соляной кислоты (р 20—1,1885 — 1,1933), после чего к колбе присоединяют обратный холодильник, переносят ее в вытяжной шкаф и кипятят 10 ч, не допуская бурного кипения жидкости. Затем в
колбу добавляют 150 г сернокислого лития (Li2SO4-H2O), 50 мл дистиллированной воды, 5 капель брома и кипятят (без холодильника) в течение 15 мин. для освобождения от избытка брома. После того как раствор остынет до комнатной температуры, его доводят дистиллированной водой до объема 1 л, фильтруют и хранят в склянке темного стекла с притертой пробкой. Реактив ярко-желтого цвета, устойчив при хранении. Перед употреблением готовят рабочий раствор реактива, разводя его дистиллированной водой в отношении 1:1. Концентрация кислоты в растворе должна составлять 1 г-экв. Ее проверяют титрованием 1 н раствором едкого натра (индикатор — фенолфталеин).
В три пробирки вносят соответственно растворы яичного белка, глицина и фенилаланина (по 2,5 мл), добавляют по 5 мл раствора С и оставляют на 10 мин., после чего приливают по 0,5 мл рабочего раствора реактива Фолина. Через 30 мин. наблюдают окрашивание жидкости: в пробирках с белком и фенилаланином развивается интенсивная синяя окраска, в пробирке с глицином сохраняется желтый цвет реактива.
Ксантопротеиновая реакция. Характерна для некоторых ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана). При нагревании белков и полипептидов с концентрированной азотной кислотой образуется нитросоединение желтого цвета.
Реакция протекает в две стадии. На протяжении первой аминокислота, например тирозин, взаимодействуя с концентрированной азотной кислотой, подвергается нитрованию. При этом образуется динитротирозин (желтого цвета).
сн2—сн—соон
nh2 +2Н^
Примечание. В зависимости от количества прибавленной азотной кислоты может образоваться и смесь динитро- и нитротиро • зина.
10
Во второй стадии продукты нитрования тирозина (динитро- и нитротирозин) реагируют с едким натром или гидроокисью аммония с образованием натриевой или аммонийной соли, имеющей желто-оранжевое окрашивание.
лн ° ¥ЫЦ0Н ______
>—CH—COOti
Хиноидная форма	Аммонийная соль
динитротирозина	динитротирозина
Ксантопротеиновую реакцию, кроме белков, пептидов и циклических аминокислот, дают также многие простые ароматические соединения (бензол, фенол и др.).
Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка (приготовление — см. с. 6); б) раствор желатина, 1°/0-ный; в) азотная кислота, концентрированная; г) натрий едкий, 2О°/о-ный раствор, или аммиак, концентрированный раствор (20—25°/0-ный); д) фенол, 0,Р/о-ный раствор.
К 2—3 мл раствора фенола осторожно (по стенке пробирки) приливают 1—2 мл концентрированной азотной кислоты. Осторожно нагревают, появляется желтое окрашивание.
В другую пробирку наливают 1—2 мл раствора яичного или растительного белка, прибавляют 8—10 капель концентрированной азотной кислоты и осторожно нагревают. Выпадает осадок, который окрашивается в желтый цвет.
После охлаждения в пробирку осторожно (по стенке) приливают избыток концентрированного раствора аммиака или едкого натра — жидкость принимает оранжевое или желто-оранжевое окрашивание.
Реакцию следует проводить под тягой!
Те же реакции проводят с раствором желатина: желтого окрашивания не наступает, так как желатин не содержит ароматических аминокислот (иногда может появиться очень слабое желтоватое окрашивание, обусловленное примесью других белков).
11
Реакция Миллона. С помощью реакции Миллона открывают наличие аминокислоты тирозина. Тирозин образует с реактивом Миллона ртутную соль нитротирозина красного цвета. Эта реакция характерна также почти для всех фенолов.
Ртутная соль нитротирозина
Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка (см. с. 6); б) раствор желатина, 1%-ный; в) фенол, 0,1%-ный раствор; г) реактив Миллона: 40 г ртути растворяют в 57 мл концентрированной азотной кислоты вначале при комнатной температуре, затем слабо подогревая на водяной бане. Раствор разбавляют двумя объемами воды и после отстаивания сливают с осадка.
Все работы производят под тягой!
К 1 мл раствора фенола в пробирке приливают 0,5 мл реактива Миллона И осторожно нагревают. Появляется розовое окрашивание.
В пробирку наливают 1—2 мл раствора яичного или растительного белка и 5—6 капель реактива Миллона, осторожно нагревают.
Жидкость окрашивается в красный цвет, и затем выпадает осадок кирпично-красного цвета.
То же проделывают и с раствором желатина: красного окрашивания не наступает или оно проявляется очень слабо (если желатин не очищен от примеси других белков)«
Реакции на триптофан. Триптофан, реагируя в кислой среде с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению
12
По аналогичной схеме протекает также реакция триптофана с оксиметилфурфуролом или формальдегидом.
В указанных реакциях принимает участие серная кислота, являющаяся водоотнимающим средством.
Реакция Адамкевича. Реактивы: а) свежий яичный белок (неразбавленный); б) желатин, /%-ный раствор; в) уксусная кислота, концентрированная; г) серная кислота, концентрированная.
В пробирку наливают несколько капель неразбавленного яичного белка, прибавляют 1—2 мл концентрированной уксусной кислоты (лучше ледяной) и осторожно нагревают до растворения выпавшего осадка, после чего охлаждают и (осторожно!) по стенке пробирки, наклонив ее, наслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты, следя, чтобы не произошло смешения жидкостей. На границе двух слоев через некоторое время появляется красно-фиолетовое кольцо.
Эту же реакцию проделывают с раствором желатина -— окрашивания не наступает, так как триптофан не входит в состав желатина.
Реакция с оксиметилфурфуролом (Ш у л ь-це — Распайля). От фруктозы в присутствии концентрированной серной кислоты отщепляется три молекулы воды, она превращается в оксиметилфурфурол, который образует с триптофаном окрашенные продукты конденсации. Реакцию можно производить как с фруктозой, так
13
и с сахарозой, при гидролитическом расщеплении которой освобождаются равные количества глюкозы и фруктозы.
Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка (приготовление — см. с. 6); б) сахароза, 5%-ный раствор; в) серная кислота, концентрированная.
К 1—2 мл раствора белка добавляют 2—4 капли раствора сахарозы и по стенке пробирки осторожно наслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе жидкостей появляется кольцо темно-красного (вишневого) цвета.
Реакция с формальдегидом. Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка; б) формалин, 5°/о-ный раствор; в) серная кислота, концентрированная.
К 1 мл раствора белка в пробирке добавляют 2 капли раствора формалина и затем осторожно (по стенке пробирки) наслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты, следя, чтобы жидкости не перемешивались. На границе соприкосновения жидкостей появляется кольцо фиолетового или фиолетово-красноватого цвета.
Реакция на аргинин (Сакагучи). Производные гуанидина, как, например, аминокислота аргинин (гуанидина-миновалериановая кислота), метилгуанидин, гликоциамин (гуанидинуксусная кислота), реагируя с гипоброми-том натрия (NaBrO) и а-нафтолом, образуют продукт конденсации кирпично-красного или малинового цвета. Метилгуанидин и гликоциамин не входят в состав белковых веществ, и поэтому реакцию Сакагучи можно использовать для открытия аминокислоты аргинина.
Гипобромит является окислителем. Окисленный арги-
СООН
Аргинин
Продукт конденсации окисленного аргинина соС-насртолом
2NH}+3NaBrO -*-Nz +ЗРаВг+ЗН20
14
нин, потеряв одну иминогруппу ( = NH), реагирует с а-нафтолом с образованием окрашенного соединения.
Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка; б) а-нафтол. Готовят 1%-ный раствор в 96%-ном этиловом спирте. Перед употреблением 10 мл раствора разбавляют спиртом в мерной колбе емкостью 100 мл; в) натр едкий, 15°)о-ный раствор; г) раствор гипобромита натрия. 150 г едкого натра добавляют небольшими порциями к 500 мл воды, перемешивают до полного растворения (осторожно: растворение сопровождается обильным выделением теплоты!). К остывшему раствору осторожно (под тягой!) прибавляют при постоянном перемешивании 8 мл чистого брома. Раствор сохраняют в темной склянке с притертой пробкой (в вытяжном шкафу). Срок годности до трех месяцев.
Примечание. Раствор гипобромита натрия готовится лаборантом.
К 1 мл раствора белка прибавляют 2—3 капли раствора едкого натра, 1—2 капли раствора а-нафтола и хорошо перемешивают, после чего в пробирку добавляют 1—2 капли раствора гипобромита. Появляется малиновокрасное окрашивание.
Реакция на аминокислоты, содержащие серу (цистеин, цистин). Известны три серусодержащие аминокислоты: цистеин, цистин и метионин.
CH2--SH	Cli2—S—S—CH2	сн2-$-сн3
СННН2	chnh2	chnhz	сн2 1
соон	соон	соон	chnh2
цистеин	Цистин	1 соон
		метионин
В молекулах цистеина и цистина сера связана относительно слабо и легко отщепляется при щелочном гидролизе в виде сероводорода, который реагирует со щелочью, образуя сульфиды натрия или калия. Сульфиды взаимодействуют с уксуснокислым свинцом (вернее, с плюмбитом) с образованием осадка сернистого свинца черного или буро-черного цвета. Реакции протекают по следующим уравнениям:
15
t	CH2— SH	CHZ-OH
CH-NH2 +2NO.0H—*- CH—NH2 + Nazs + H20
COOH	COOH
Цистеин	серин
2-	Pb(CH1C0o)2 + 2NaOH —*~Pb(OH)z + 2CH3C00Na Pb(0H)2+2Na0H —*- Na2PbO2 + 2HZO
П/нонбит
3.	Na23 + NazPbO2 + 2Нг0 —*-I PbS + 4NaOH
Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка (см. с. 6); б) желатин, 1%-ный раствор; в) едкий натр, 15—20%-ны.й раствор; г) уксуснокислый свинец, 1%-ный раствор.
В одну пробирку наливают 2 мл раствора яичного или растительного белка, в другую — столько же раствора желатина. В обе пробирки добавляют по 1—1,5 мл раствора щелочи и осторожно нагревают до кипения, кипятят 1—2 мин., после чего в каждую пробирку прибавляют по 2—3 капли раствора уксуснокислого свинца.
В пробирке с яичным (или растительным) белком появляется буровато-черное или черное окрашивание, интенсивность которого'зависит от концентрации раствора белка и содержания в нем цистеина и цистина. Раствор желатина окрашивания не дает. Это свидетельствует о том, что в состав желатина не входят серусодержащие аминокислоты.
Исследование физико-химических свойств белковых веществ
Диализ. С помощью диализа очищают высокомолекулярные растворы белковых веществ от примеси низкомолекулярных соединений (солей, сахаров и др.).
Реактивы: а) раствор яичного белка с хлористым натрием (приготовление — см. с. 6); б) азотнокислое серебро, 0,5%-ный раствор (в склянке темного стекла); в) азотная кислота, 10%-ный раствор; г) едкий натр, 10%-ный раствор-, д) сернокислая медь, 1%-ный раствор.
16
Рис. 1. Простейший диализатор.
В мешочек из целлофана или коллодия (или в высушенный пузырь теленка, поросенка) наливают до половины раствор яичного белка (с хлористым натрием). Мешочек подвешивают на стеклянной палочке и погружают в стакан с дистиллированной водой (рис. 1). Диализ проводят при комнатной температуре. Через 40—60 мин. из стакана берут в две пробирки по 2 мл воды. В одной пробирке проводят реакцию на ионы хлора, для чего воду подкисляют несколькими каплями 10%-него раствора азотной кислоты и добавляют 2—3 капли раствора азотнокислого серебра, выпадает белый осадок хлористого серебра. С пробой во второй пробирке производят биуретовую реакцию. Если диализ проводится правильно, биуретовая реакция будет отрицательной.
Диализ можно ускорить, периодически меняя воду в стакане (через каждые 15—20 мин.) или же используя проточный диализатор.
Диализ проводят до получения отрицательной реак
ции на ионы хлора.
Примечания: 1. Для приготовления мешочков рекомендуется разрезать целлофан па куски размером 12,5 X 12,5 см.
2. Для приготовления мембраны из коллодия в чисто вымытую и высушенную крутлодонную колбу емкостью 50 мл или большую пробирку наливают коллодий (4%-ный раствор нитроклетчатки в смеси эфира со спиртом) и почти сразу же выливают обратно в склянку.
Медленно вращая колбу или пробирку, равномерно распределяют остатки коллодия по ее стенкам. Сосуд оставляют на несколько минут до исчезновения запаха эфира, после чего 2—3 раза ополаскивают небольшими порциями дистиллированной воды (по 5—8 мл) для удаления следов спирта.
Во время ополаскивания пленка начинает отслаиваться от стенок сосуда, тогда ее осторожно отделяют пинцетом. Чтобы ускорить отделение, осторожно наливают воду между отслоившейся пленкой и стенкой сосуда.
Определение изоэлектрической точки белка. В изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы. Молекулы белка с одинаковым количеством положительных и отрицательных зарядов легко выпадают в осадок. Зна
17
чение pH, соответствующее изоэлектрической точке, является характерным для каждого белка. Например, для казеина pH равно 4,7, для яичного альбумина — 4,8, желатина — 4,9, зеина (кукурузного белка) — 6,2; у протаминов и гистонов изоэлектрическая точка лежит в слабощелочной среде.
Выпадение белка в осадок в изоэлектрической точке можно ускорить добавлением водоотнимающих веществ (спирта, ацетона, эфира) или танина. Одни из них (органические растворители) уменьшают степень гидратации белковых макромолекул, разрушают их водные оболочки, другие, как, например, танин, образуют нерастворимые в воде соединения с азотистыми гетероциклическими группировками.
Реактивы: а) желатин, 0,5^1а-ный раствор; б) уксусная кислота, 0,1 н раствор; в) уксуснокислый натрий, 0,1 н раствор; г) этиловый спирт, 96%-ный; д) танин, 0,1%-ный раствор.
В пять пробирок наливают растворы уксусной кислоты и уксуснокислого натрия в количествах, указанных в табл. 1, после чего в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора желатина и хорошо перемешивают, затем прибавляют по 4 мл этилового спирта (или по 1 мл раствора танина) и снова перемешивают. Через 5—10 мин. просматривают все пробирки и оценивают степень мутности смеси в каждой из них. pH наиболее мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатина. Результаты опыта записывают в таблицу, которую составляют по образцу табл. 1.
Табл. 1. Определение изоэлектрической точки белка
№ пробирки	Состав буферной смеси, мл		pH смеси	0,5%-ный раствор желатина, мл	Этиловый спирт, мл	Степень мутности (по пятибалльной системе)
	0.1 н сн„соон	0,1 н CHjCOONa				
1	1.8	0,2	3,8	1	4	1
2	1.4	0,6	4,4	1	4	3
3	1.0	1.0	4,7	1	4	5
•4	. 0,6	1.4	5,1	1	4	4
5	0,2	1,8	5,7	1	4	3
18
Реакции осаждения белков. Многие факторы влияют на физико-химические свойства белковых веществ, вызывают изменения структуры макромолекул. Данный процесс известен как денатурация. При денатурации нарушается активная конформация белковой макромолекулы. Эти изменения касаются в первую очередь вторичной и третичной структуры без нарушения при этом ковалентных (пептидных) связей.
Факторы, вызывающие денатурацию, можно разделить на две группы: физические и химические. К физическим относятся высокая температура, механические воздействия, обработка ультразвуком, действие ионизирующих излучений; к химическим — осаждение ионами тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, нейтральными солями аммония, щелочных и щелочноземельных металлов; органическими растворителями, алкалоидными реактивами. Аналогичное по результатам действие оказывают детергенты, мочевина, некоторые красители.
Механизм действия некоторых физических факторов следует рассматривать как комбинированный, например, воздействие ультразвуковых волн и ионизирующих излучений приводит также к химическим изменениям белковых макромолекул.
Реакции осаждения белков бывают обратимыми и необратимыми.
При обратимом осаждении макромолекулы белка в основном не подвергаются глубокой денатурации, а осадки могут быть снова растворены в первоначальном растворителе (например, воде). Обратимое осаждение вызывается действием нейтральных солей аммония, щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание), спирта, ацетона, эфира и некоторых других органических растворителей.
При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация белка, он теряет свойства гидрофильности и становится гидрофобным. Денатурированный белок неспособен к восстановлению своих первоначальных физико-химических и биологических свойств. Необратимое осаждение вызывается высокой температурой, действием концентрированных минеральных и некоторых органических кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидных реактивов, детергентов, красителей.
19
Осаждение белков солями щелочных и щелочноземельных металлов (высаливание). Соли нейтральные аммония, щелочных и щелочноземельных металлов — Na2SO4 (NH4)2 SO4, NaCl, MgSO4 и другие нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию, что ведет к выпадению в осадок. Этот способ осаждения белков называют высаливанием. Высаливание — обратимый процесс. Осадки можно снова растворить в воде, при этом наблюдается значительная степень восстановления свойств белков (например, ферментативной активности, антигенных свойств и т. д.). Высаливанием пользуются для разделения белковых фракций, очистки белков, получения их в кристаллическом виде.
Реактивы: а) раствор яичного белка с хлористым натрием (приготовление — см. с. 6); б) хлористый натрий, кристаллический, тонко растертый порошок (в виде пудры); в) сернокислый аммоний, кристаллический, тонко растертый порошок; г) сернокислый аммоний, насыщенный раствор; д) сернокислый магний, кристаллический, тонко растертый порошок; е) уксусная кислота, 1%-ный раствор; ж) едкий натр, 1О°/о-ный раствор; з) сернокислая медь, 1%-ный раствор.
Осаждение сернокислым аммонием. В пробирку наливают 2—3 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов, альбумины остаются в "растворе. Осадок отфильтровывают через бумажный фильтр.
К фильтрату добавляют тонко растертый порошок сернокислого аммония до получения насыщенного раствора (последняя порция соли уже не растворяется). Выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают.
С фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Если произошло полное осаждение белков, она должна быть отрицательной.
Осаждение сернокислым магнием или хлористым натрием. В 2 пробирки наливают по 2—3 мл раствора яичного белка и добавляют (до получения насыщенного раствора) в одну пробирку порошок хлористого натрия, в другую — сернокислого магния. Через 5—6 мин. в пробирках замечается выпадение осадков
20
(глобулины). Альбумины в нейтральных растворах солей щелочных и щелочноземельных металлов не осаждаются.
Содержимое пробирок отфильтровывают через бумажные фильтры. В фильтратах — альбумины. Фильтраты подкисляют 1%-ным раствором уксусной кислоты — появляются осадки альбуминов. Их отфильтровывают, а в фильтратах с помощью биуретовой реакции доказывают отсутствие белка. Осаждение белков путем высаливания применяется в промышленности.
Осаждение белков органическими растворителями. Органические растворители (спирт, эфир, ацетон и др.) вызывают дегидратацию белковых макромолекул, разрушают их водные оболочки (гидросферы), что понижает устойчивость белков в растворе и ведет к выпадению в осадок. Лучше всего происходит осаждение белков из нейтрального или слабокислого раствора, в щелочных растворах осаждение органическими растворителями затормаживается. Способствует осаждению также присутствие электролитов (например, хлористого натрия) в растворе.
Осаждение белков спиртом обратимо при условии, если процесс проводили без нагревания и воздействие реагента было кратковременным. Продолжительный контакт белка со спиртом ведет к необратимому осаждению, денатурации.
Реактивы: а) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); б) этиловый спирт (или ацетон); в) хлористый натрий, кристаллический.
В пробирку наливают 1—2 мл раствора яичного белка, добавляют немного порошка хлористого натрия (на кончике шпателя) и взбалтывают до растворения. По каплям приливают 4—6 мл этилового спирта, сильно взбалтывают. Через 5—8 мин. выпадает осадок белка.
Сразу же после появления осадка отливают часть содержимого пробирки (с осадком) в другую, добавляют несколько миллилитров дистиллированной воды. Концентрация спирта падает, а белок снова переходит в раствор.
Тепловая денатурация б ел ко в. Свертывание большинства белков начинается уже при температуре 50—55°. Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой про
21
исходят необратимые изменения физико-химических и биологических свойств макромолекул. Нагревание вызывает разрыв дисульфидных связей между полипептид-ными цепями, что приводит к их раскручиванию и изменению конформации макромолекул. При кратковременном нагревании (при относительно невысоких температурах) денатурация может и не произойти или проявиться в слабой степени, дальнейшее же повышение температуры (а особенно при кипячении) ведет к быстрому свертыванию белка.
На скорость и интенсивность процесса тепловой денатурации оказывают большое влияние pH раствора и добавление электролитов. Быстро и наиболее полно белки свертываются в изоэлектрической точке. Сдвиги pH в кислую и щелочную стороны затормаживают процесс осаждения белков. В сильно кислых и сильно щелочных растворах осаждения белков при кипячении практически не происходит. При добавлении кислот молекулы белка заряжаются положительно, в щелочных растворах они приобретают отрицательные заряды.
Прибавление электролитов (например, хлористого натрия) ускоряет процесс коагуляции даже в кислой среде.
Реактивы: а) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); б) раствор растительных белков; в) уксусная кислота, 1%-ный раствор; г) уксусная кислота, 10%-ный раствор; д) едкий натр, 10%-ный раствор; е) хлористый натрий, насыщенный раствор.
В пять пробирок наливают по 1—2 мл раствора яичного или растительного белка. Белок в первой пробирке нагревают до кипения: раствор мутнеет (разрушаются гидратные оболочки вокруг белковых частиц), но осадок не выпадает, так как мицеллы сохраняют одноименные заряды, что препятствует их коагуляции.
К раствору белка во второй пробирке добавляют одну каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают: осадок белка выпадает быстро, поскольку заряд мицелл нейтрализован и белок близок к изоэлектрическому состоянию.
К раствору белка в третьей пробирке прибавляют 5— 8 капель 10 %-него раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения: осадок не образуется, так как мицеллы
22
белка приобрели положительные заряды, что является стабилизирующим фактором и препятствует коагуляции.
В четвертую пробирку добавляют 5—8 капель 10% -ного раствора едкого натра и нагревают до кипения: осадок не выпадает, поскольку мицеллы заряжены отрицательно.
В пятую пробирку прибавляют 4—5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты и 5—6 капель насыщенного раствора хлористого натрия, нагревают до кипения — белок выпадает в осадок.
Осаждение белков минеральными кислотами. Концентрированные минеральные кислоты (азотная, серная, соляная) вызывают резкую дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию их заряда, при этом происходит образование комплексных соединений. Все это ведет к необратимой денатурации белка. Ортофосфорная кислота не образует осадков с белками.
Осадки, вызванные действием минеральных кислот, растворяются в избытке серной и соляной кислот, но не растворяются в азотной.
Реактивы: а) раствор яичного белка; б) раствор растительного белка; в) серная кислота, концентрированная; г) азотная кислота, концентрированная; д) соляная кислота, концентрированная.
В три пробирки наливают по 1 мл кислот: в первую — серной, во вторую — азотной, в третью — соляной. Пробирки наклоняют под углом 45° и осторожно (из пипетки) наслаивают по стенке раствор белка ( пробирку держат отверстием от себя). На границе белка и кислоты появляется белое кольцо.
Пробирки осторожно встряхивают и добавляют в первую — избыток серной, во вторую — азотной, в третью— соляной кислоты. Осадки белка растворяются в серной и соляной кислотах, но не растворяются в азотной.
Реакция находит применение для быстрого ориентировочного определения белка в биологических жидкостях (например, в1 моче).
Осаждение белков органическими кислотами. Органические кислоты необратимо осаждают белок из растворов. Различные кислоты отличаются по силе действия.
23
Наиболее эффективно и специфично действие сульфосалициловой и трихлоруксусной кислот.
СС13~~С00Н
Триморуксусная кислота
Сульфосалициловая кислота
Под действием трихлоруксусной кислоты осаждаются только белки, сульфосалициловая же кислота, кроме белков, осаждает также высокомолекулярные продукты их распада — пептоны и полипептиды.
Реактивы: а) раствор яичного белка; б) раствор растительного белка; в) сульфосалициловая кислота, KPIo-ный раствор-, г) трихлоруксусная кислота, 1Оо1о-ный раствор.
В две пробирки наливают по 2 мл раствора белка и добавляют в первую 5—8 капель раствора сульфосалициловой, а во вторую — столько же раствора трихлоруксусной кислоты. В обеих пробирках белок выпадает в осадок.
Осаждение белков солями тяжелых металлов. Белки осаждаются солями меди, свинца, ртути, цинка, серебра и других тяжелых металлов.
Характер взаимодействия белков с ионами тяжелых металлов сложен и многогранен. Это прежде всего образование комплексных соединений, нерастворимых в воде, но растворяющихся в избытке соли (кроме AgNOg и HgCl2); соли тяжелых металлов, адсорбируясь на белковых мицеллах, изменяют их электрический заряд (вплоть до полной нейтрализации). Денатурация белков солями тяжелых металлов вызывается глубокими нарушениями вторичной и третичной структур макромолекул белка, изменением положения пептидных цепей, которое обусловливается в основном разрывом связей между ними (главным образом дисульфидных). Дисульфидным связям принадлежит видная роль в поддержании вторичной и третичной структур белка. Разрыв их влечет за со
24
бой изменение структур — необратимую денатурацию белка.
Растворение осадка белков в избытке соли объясняется явлением адсорбционной пептизации. Ионы металла, адсорбируясь на поверхности белковых мицелл, придают им положительные заряды. Одноименно заряженные мицеллы отталкиваются, что способствует их переходу из осадка в раствор.
Реактивы: а) раствор яичного белка; б) раствор растительного белка; в) уксуснокислый свинец, 5%-ный раствор; г) азотнокислое серебро, 2,5%-ный раствор; д) хлорное железо, 5%-ный раствор, е) сернокислая медь, 5%-ный раствор.
В четыре пробирки наливают по 1—2 мл раствора белка и по каплям добавляют растворы солей: в первую — уксуснокислого свинца, во вторую — сернокислой меди, в третью — хлорного железа, в четвертую — азотнокислого серебра (до выпадения осадков). Затем прибавляют избыток указанных реактивов и наблюдают растворение осадков в первых трех пробирках. Осадок, вызванный прибавлением азотнокислого серебра, не растворяется в избытке соли.
Свойство белков связывать ионы тяжелых металлов используется в медицине при оказании первой помощи пострадавшим от отравления солями меди, свинца, ртути и др.
Осаждение белков реактивами на алкалоиды. Алкалоиды — азотсодержащие вещества основного характера, обладающие сильным физиологическим действием. В большинстве своем являются гетероциклическими соединениями, производными пиридина, пиррола, пирролидина, хинолина, индола, пурина и др. К алкалоидам относятся, например, морфин, папаверин, атропин, кофеин, эфедрин и ряд других соединений, которые находят широкое применение в лечебной практике.
Многие так называемые общие реактивы на алкалоиды вызывают также осаждение белковых веществ. К ним относятся: танин, раствор иода в иодистом калии (реактив Бушарда), раствор йодистого висмута в иодистом калии (реактив Драгендорфа), пикриновая кислота и др.
Осаждение белковых веществ общими реактивами на алкалоиды обусловлено тем, что в состав аминокислот
25
и алкалоидов входят сходные гетероциклические группировки (индольные, имидазольные, пирролидиновые и др.).
Алкалоидные реактивы образуют нерастворимые соединения с белками. Слабое подкисление органической кислотой (например, уксусной) благоприятствует реакции и, наоборот, добавление сильных минеральных кислот затормаживает этот процесс. Осадки растворяются в щелочной среде.
Реактивы: а) раствор яичного (или растительного белка; б) пикриновая кислота, 1%-ный раствор; в) танин, свежеприготовленный 10^-ный раствор; г) реактив Бушарда: 1 г иода, 2 г йодистого калия, 50 мл воды. Йодистый калий (иодид калия) растворяют в нескольких миллилитрах воды. В концентрированном растворе соли растворяют иод и затем доливают остальное количество воды; д) реактив Драгендорфа (раствор йодистого висмута в иодистом калии). 13,5 г йодистого калия (иодида калия) растворяют в 20 мл воды. Отдельно готовят раствор 2,5 г основного азотнокислого висмута в 10 мл азотной кислоты (р2о=1,182О). Смешивают оба раствора и оставляют (в склянке темного стекла) на 2—3 дня. На дно сосуда выпадают кристаллы азотнокислого калия. Прозрачный раствор осторожно сливают с осадка и доводят его объем водой до 50 мл. Хранят в склянке темного стекла; е) уксусная кислота, 1%-ный раствор.
В четыре пробирки наливают по 1—2 мл раствора белка. В каждую пробирку добавляют по 3 капли 1 %-него раствора уксусной кислоты, после чего в первую пробирку приливают 4—5 капель раствора пикриновой кислоты, во вторую — 2—3 капли раствора танина, в третью — 2—3 капли реактива Бушарда, в четвертую — столько же реактива Драгендорфа.
Наблюдают выпадение осадков.
Образование хелатов. Ионы тяжелых металлов (Си2+, Мп2+) образуют с аминокислотами внутрикомплек-сные соединения, так называемые хелаты.
При образовании хелатов ионы металла вступают в связи с молекулой аминокислоты, в состав которой входят две группы, способные соединяться с металлами (карбоксильная и аминогруппа). Эти связи являются частично ионными и частично ковалентными, так как одна из реакционноспособных групп аминокислоты образует с металлом ионную связь, а другая вступает в комплекс-
26
ную, ковалентную связь, при которой свободная пара электронов дополняет незавершенную структуру внешней электронной оболочки металла. В растворах хелатов металлы не образуют положительно заряженных ионов.	i
Строение внутрикомплексного соединения аминокислоты глицина (гликоколла) с ионами меди может быть представлено следующей формулой:
I	|
н2с-/1нг н2н—снг
Реактивы: а) глицин (гликоколл), 2%-ный раствор; б) углекислая основная медь (СиСОз-Си(ОН)2), в порошке.
К 2—3 мл раствора глицина добавляют (на кончике шпателя) немного основной углекислой меди, нагревают до кипения и кипятят 1 мин. Горячий ярко-синий раствор фильтруют. В фильтрате через некоторое время заметны тонкие игольчатые кристаллы глицин-медного внутрикомплексного (хелатного) соединения.
Распределительная хроматография аминокислот на бумаге
Общие сведения. Хроматографический метод анализа открыт русским ученым М. С. Цветом в 1903 г. В настоящее время многочисленные виды хроматографического анализа широко используются в различных областях химии и биологии.
В зависимости от физико-химических факторов, определяющих основной механизм процесса, методы хроматографического анализа делят на четыре основных вида: адсорбционные, распределительные, ионообменные и осадочные.
Для разделения смеси аминокислот чаще всего применяют метод распределительной хроматографии на бумаге. Он основан на различной степени распределения компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами (неподвижной водной фазой и подвижной фазой органического растворителя).
27
Органический растворитель (например, фенол, насыщенный водой, или смесь н-бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и воды), проходя через полоску фильтровальной бумаги, увлекает за собой аминокислоты, раствор которых был нанесен на бумагу. Различные аминокислоты передвигаются по бумаге с неодинаковой скоростью. Скорость перемещения аминокислот зависит от многих факторов: строения молекулы аминокислот, их способности легче растворяться в органическом растворителе или воде, избирательной адсорбции на бумаге, типа бумаги, условий проведения анализа и т. д. Чем лучше растворяется аминокислота в органическом растворителе, тем больший путь она пройдет с ним по бумаге.
Приняты два способа хроматографического разделения аминокислот на бумаге — восходящий и нисходящий. При восходящем способе растворитель поднимается по бумаге снизу вверх, при нисходящем — сверху вниз. Положение отдельных аминокислот обнаруживают путем проявления — обработки высушенной бумаги раствором нингидрина и последующего нагревания ее при 100° С. На полоске бумаги (хроматограмме) отчетливо видны пятна фиолетового, синего, голубого, желтого, оранжевого, коричневого цвета.
Положение аминокислот на бумаге можно установить и без проявления, рассматривая хроматограмму в ультрафиолетовых лучах. Пятна отчетливо флуоресцируют в ультрафиолете.
Для каждой аминокислоты характерна скорость перемещения, которую выражают с помощью коэффициента Rf. Коэффициентом Rf называют отношение пути, пройденного аминокислотой (от места ее нанесения на бумагу до середины пятна на хроматограмме), к расстоянию от места нанесения смеси аминокислот до фронта растворителя:
где а — расстояние от места нанесения раствора смеси аминокислот до середины пятна данной аминокислоты, мм; b — путь, пройденный растворителем, мм.
28
Каждая аминокислота имеет определенное значение коэффициента Rf, которое может меняться в зависимости от вида применяемой бумаги, растворителя, температуры, pH среды и некоторых других факторов (табл. 2).
Табл. 2. Значения Rf отдельных аминокислот (бумага ватман № 1),
Аминокислоты	Растворители	
	фенол, насыщенный водой	к-бутиловый спирт — ледяная уксусная кислота—вода (4 : 1 :1)
Фенилаланин	0.87	0,66
Лизин	0,82	0,16
Аргинин	0,90	0,18
Гиствдин	0,69	0,17
Серин	0,36	0,32
Треонин	0,47	0,36
Глицин	0,41	0,34
Аспарагиновая кислота	0,15	0,33
Глютаминовая кислота	0,25	0,37
Тирозин	0,63	0,53
а-аланин	0,56	0,39
Метионин	0,83	0,58
Триптофан	0,75	0,62
Пролин	0,89	0,50
Лейцин	0,87	0,72
Валин	0,76	0,56
Цистин	0,03	0,13
Для разделения аминокислот применяют специальную хроматографическую фильтровальную бумагу высокого качества (она должна быть строго равномерной по толщине и одинаковой по плотности, характеризоваться незначительным содержанием примесей), например ленинградскую № 1 или 2 и импортную ватман № 1, 2, 3, а также FN-11 (ГДР).
Реактивы: а) раствор смеси аминокислот: в 10 мл воды растворяют 60 мг аспарагиновой (или глютаминовой) кислоты, 40 мг глицина (или аланина) и 50 мг лей
29
миллиметры;

42-— Пробка
цина; б) фенол, насыщенный водой: к 100 г перегнанного фенола добавляют 35 мл воды и перемешивают, для ускорения растворения фенола смесь можно слегка подогреть; в) смесь н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды (4:1:1 по объему): реактивы смешивают в указанном соотношении. Для того чтобы смесь не расслаивалась, рекомендуется дополнительно прибавить несколько капель уксусной кислоты; г) нингидрин, 0,2%-ный раствор в этиловом или бутиловом спирте.
Оборудование: а) термостат, отрегулированный на температуру 37—38° С; б) сушильный шкаф, отрегулированный на 100—105° С; в) пробирки стеклянные большого размера (длина 18—20 см, диаметр 2—2,5 см) с подобранными пробками; г) линейка с делениями на эпипетки; е) пульверизатор; ж) ножницы; з) игла с ниткой; и) штатив для пробирок.
Материалы:	Бумага
фильтровальная хорошего качества (лучше пользоваться специальной хроматографической бумагой).
Вырезают полоску фильтровальной бумаги шириной 1,2 см, длиной 12—15 см (рис. 2). Один из концов полоски прокалывают иглой, протягивая нитку, которую завязывают петлей. На противоположном конце полоски, отступив на 1—1,5 см от ее края, графитовым карандашом очерчивают небольшой кружок (диаметром 3—5 мм), в который с помощью микропипетки вносят каплю раствора смеси аминокис
лот. Место нанесения раствора подсушивают на воздухе.
В сухую пробирку наливают около 1 мл насыщенного водой фенола или смеси н-бутанола, уксусной кислоты и воды, следя, чтобы при этом не смочить стенки. В пробирку осторожно (за нитку) опускают полоску бумаги, погружая ее нижний конец в растворитель на 2—3 мм (не более!), и закрепляют в висячем положении с по
J— Нитка
---- прокол
-I— Фронт растворителя (фенола)
J—- Полоска бумаги

Фенол
Рис. 2. Упрощенный при бор для распределительной хроматографии аминокислот.
Место нанесения раствора, очерченное карандашом
30
мощью нитки и пробки. Полоска не должна касаться стенок пробирки. Пробирку ставят в термостат (при температуре 37—38°) на 1,5 ч, затем вынимают полоску и переносят ее на 10—12 мин. в сушильный шкаф, нагретый до 100—105°. В сушильном шкафу полоску подвеши-
вают за нитяную петлю на
стеклянную палочку. После испарения растворителя полоску вынимают из шкафа, опрыскивают раствором нингидрина (с помощью пульверизатора) и снова вносят в тот же сушильный шкаф на несколько минут. На хроматограмме появляются окрашенные пятна аминокислот (рис. 3). Линейкой измеряют расстояния: а) от места нанесения капли раствора смеси аминокислот до середины данной кислоты; б) от места нанесения капли раствора аминокислот до фронта растворителя. Рассчитывают R/ каждой аминокислоты.
Прокол
манин
Глютаминовая кислота место нанесения растдора

Распределительная круго- Рис. 3. Хроматограмма ами-вая хроматография аминокис-	нокислот.
лот. При круговой хроматографии вместо пятен аминокислот на бумаге получают кон-
центрически расположенные кольца. В принципе метод остается таким же, как и в предыдущей работе. Хроматографирование проводят в эксикаторах небольшого
размера.
Реактивы: см. «Распределительная хроматография аминокислот на бумаге».
Оборудование: а) эксикатор малого размера с хорошо притертой крышкой; б) термостат (37—88° С); в) сушильный шкаф (100—105° С).
Из хорошей фильтровальной бумаги (лучше — специальной хроматографической) вырезают круг соответствующего диаметра (на 2—3 см больше диаметра узкой части эксикатора). Для того чтобы поступал растворитель, из круга вырезают «фитиль» — полоску, шириной 2— 3 мм (рис. 4).
31
На расстоянии 0,5—0,6 см от центра круга наносят каплю раствора смеси аминокислот и высушивают на воздухе.
Растворитель наливают в стеклянный стаканчик или фарфоровую чашечку или же прямо на дно эксикатора.
Бумажный круг кладут на выступ над узкой частью эксикатора. «Фитиль» отгибают и опускают в раствори
Рис. 4. Распределительная круговая хроматограмма аминокислот:
1 —• бумажный фильтр; 2 — фитиль; 3 — растворитель.
тель. Эксикатор плотно закрывают и ставят в термостат (37—38° С) на 1,5—2 ч, после чего с хроматограммой проделывают все те же операции, что и при хроматографировании на полосках бумаги.
Разделение белка и низкомолекулярных примесей методом гельфильтрации на сефадексе G 25 (пб'С. Р. Мардашеву, А. А. Покровскому, Н. А. Павловой, с дополнениями)
Общие сведения. Метод гельфильтрации (гельхрома-тографии) широко используется в биохимии и биохимической технологии для фракционирования и очистки высокомолекулярных веществ, концентрирования их в растворах, обессоливания биологических субстратов, определения молекулярного веса и т. д. Он основан на способности низкомолекулярных веществ проникать внутрь частиц наполнителя. В то же время большие частицы высокомолекулярных соединений проходят мимо частиц геля, вследствие чего скорость прохождения веществ через колонку с наполнителем будет различной: высокомолекулярные соединения фильтруются быстрее, а низкомолекулярные задерживаются на колонке.
32
При гельфильтрации широко применяются сефадек-сы. Сефадексы — высокополимерные поперечносшитые полисахариды (декстраны), обладающие сильно гидрофильными свойствами. Они устойчивы, к действию органических растворителей, растворов щелочей и разбавленных кислот, разрушаются сильными кислотами (например, ОД н раствором соляной кислоты) и сильными окислителями..
Сефадексы различаются размерами частиц, а также количеством поперечных связей («сшивок»), что в свою очередь определяет степень набухания высокополимера. Различные марки сефадекса отличаются способностью к набуханию, на которую указывает номер геля. Номер определяет десятикратное количество воды, которое может удержать 1 г сухого сефадекса. Так, например, 1 г сефадекса G-15 способен поглотить 1,5 мл воды, сефадекса G-25—2,5 мл.
Для расчета количества сефадекса, необходимого для заполнения колонки, надо знать его удельный объем, который будет занимать 1 г сухого полисахарида после набухания. Для сефадекса G-25 эта величина составляет 4—6 см3/г (в среднем 5). Объем колонки следует разделить на удельный объем сефадекса. Полученная величина укажет требующееся количество граммов сухого сефадекса.
Рекомендуемые размеры колонки 1,8X20 см, объем — 50,8 см3. Чтобы ее заполнить, потребуется 50,8 : 5 = 10,16 г сефадекса.
Подготовка сефадекса и заполнение колонки. Сухой сефадекс суспендируется в большом объеме дистиллированной воды. После осаждения основной массы сефадекса надосадочную жидкость с мельчайшими частицами геля декантируют. Эту-операцию отмывки повторяют несколько раз, пока надосадочная жидкость не будет содержать мельчайших частиц. Для отмывки и набухания сефадекса требуется 3 часа.
Колонка представляет собой цилиндрический стеклянный сосуд высотой 20—25 см и диаметром 1,8 см, с краном внизу. В качестве колонки можно использовать широкую бюретку со стеклянным краном. Ее укрепляют строго вертикально в штативе. На дно колонки кладут кусочек стеклянной ваты, на него кружок фильтровальной бумаги, вырезанный по диаметру колонки, и за-
2 Д. К. Шапиро
33
тем на 1/3 объема колонки наливают фосфатный буфер (pH 6,8). Открывают кран и заполняют узкую нижнюю часть колонки буфером, далее через воронку, по палочке наливают небольшими порциями суспензию сефадекса и заполняют колонку гелем приблизительно на 70% высоты. Показателем правильного заполнения колонки является строго горизонтальная поверхность геля в ней. После заполнения колонки ее уравновешивают фосфатным буфером (pH 6,8) так, чтобы pH раствора на входе и выходе из колонки был одинаковым.
Гельфильтрация. Для гельфильтрации берут смесь гемоглобина крови с раствором рибофлавина (витамин В2).
Реактивы: а) рибофлавин, 0,02%-ный раствор на дистиллированной воде; б) раствор гемоглобина. Берут кровь из ушной вены кролика. Дистиллированной водой ее разводят в отношении 1:9; в) фосфатный буфер (pH 6,8).
Смешивают по 2 мл обоих растворов, полученную смесь вводят в колонку, не нарушая поверхности сефадекса. После того как основная масса смеси заполнит колонку, сверху над колонкой укрепляют стеклянную воронку в пробке, подобранной по диаметру колонки, и через гель пропускают фосфатный буфер для элюции со скоростью вытекания жидкости через колонку 0,5 мл/мин. Фракции элюата собирают по 5 мл в мерные пробирки с помощью коллектора или вручную.
Вначале будут всходить фракции, содержащие гемоглобин (3—6 фракций), затем окраска последующих фракций изменится на желтую в связи с элюцией рибофлавина.
После разделения с помощью гельфильтрации смеси высокомолекулярного вещества гемоглобина и низкомолекулярного рибофлавина колонка снова уравновешивается фосфатным буфером и может быть использована для дальнейшей работы.
Электрофорез белков и аминокислот на бумаге
Общие сведения. Электрофорезом называют движение заряженных коллоидных частиц в постоянном электрическом поле к противоположно заряженному электро
34
ду. Явление электрофореза было открыто профессором Московского университета Ф. Ф. Рейссом в 1807 г.
В молекулах белковых веществ возникновение электрических зарядов зависит от группировок, обладающих кислотными и основными свойствами. Кислотные свойства обусловлены карбоксильными и сульфгидрильными группами, а также фенольными гидроксилами. Основные свойства характерны для амино-, имино- и гуанидиновых групп.
Как известно, белки и аминокислоты являются биполярными ионами.
—- ^w//3+ ^СООН*-- 'С00~
Процесс диссоциации белков во многом зависит от их изоэлектрической точки. Чем дальше будет отстоять значение pH среды от изоэлектрической точки, тем макромолекулы белка будут обладать большим зарядом и с большей скоростью передвигаться к положительному или отрицательному полюсу. Если в растворе находятся несколько белков, которые различаются своими изоэлектрическими точками, то скорость их перемещения в электрическом поле будет неодинаковой. Это явление положено в основу метода электрофоретического исследования биологических жидкостей, который находит широкое применение при анализе свойств белков и аминокислот, а также для диагностических целей.
Для практических работ используют различные варианты метода электрофореза на бумаге.
Аппарат для электрофореза на бумаге. Основу аппарата составляет ванна из толстого стекла, в которую помещены две кюветы (анодная и катодная) с электродами, приспособления для размещения и закрепления полосок хроматографической бумаги (рамка, лабиринт, пружины) и некоторые вспомогательные части (рис. 5). Применяются платиновые или угольные электроды. Кюветы разделяются перегородками на два отделения — наружное и внутреннее, чтобы предотвратить попадание продуктов электролиза (что связано с изменением pH) на полоски бумаги. В наружных отделениях кювет располагаются электроды, во внутренние погружаются концы полосок бумаги, на которые наносится исследуемая
2*
35
жидкость. Внутреннее и наружное отделения каждой кюветы соединяются посредством кусочков фильтровальной бумаги, которые кладутся на перегородки. Кюветы заполняются буферным раствором (боратным, фосфатным, вероналовым) с определенным значением pH и ионной силы. Одинаковый уровень жидкости в кюветах поддерживают с помощью сифона.
Рис. 5. Камера аппарата для электрофореза на бумаге (по В. И. Добрыниной и Е. Я. Свешниковой):
1 — ванна из толстого стекла; 2 —- стеклянная крышка, пришлифованная к ванне; 3 — электродные кюветы (свободно вынимаются); 4 — продольная перегородка, разделяющая кювету пополам; 5 —* угольные электроды; 6 — бумажные полосы, концы их опускаются во внутреннее отделение кюветы; — съемные пластинки, на которых укрепляются электроды (присоединяются К ванне при помощи двух пружинок); 8— рамка, на которой укрепляются и натягиваются бумажные полосы; 9 — лабиринт для укрепления бумажных полос; 10 — пружины для натягивания бумажных полос; 11___подставка для
ванны; /2 —уровень на подставке; 13 установочные винты.
Для предотвращения испарения жидкости камеру (ванну) закрывают пришлифованной стеклянной крышкой.
В комплект аппарата входит также стабилизатор и выпрямитель.
В Советском Союзе аппараты для электрофореза на бумаге выпускает фрунзенский завод «Физприбор».
Разделение глютамина и глютаминовой кислоты с помощью электрофореза на бумаге (по прописи В. И. Добрыниной и Е. Я. Свешниковой). Если на полоску фильтровальной бумаги нанести раствор смеси глютамина и глютаминовой кислоты, то после электрофореза при pH 8,0 в течение 1,5—2 ч и последующей окраски электрофореграммы можно наблюдать, что глютамин остается на месте нанесения капли раствора, а глютаминовая кислота передвигаетя к аноду на 3—4 см. Это обусловлено
36
тем, что молекулы глютамина при pH 8,0 электронейт-ральны и не передвигаются в электрическом поле, а молекулы глютаминовой кислоты при указанном pH имеют преобладающую диссоциацию карбоксильных групп, несут отрицательные заряды и поэтому передвигаются к аноду.
Реактивы: а) раствор глютаминовой кислоты: в 10 мл воды растворяют 50 мг глютаминовой кислоты; б) раствор глютамина: в 10 мл воды растворяют 50 мг глютамина; в) фосфатная буферная система. Готовят два раствора: I—8,9 г Na2HPO4 в 1 л, II—6,8 г КН2РО4 в 1 л. Для получения фосфатного буфера pH 8,0 смешивают 945 мл I раствора с 55 мл II раствора; г) нингидрин, 0,2%-ный раствор в этиловом или бутиловом спирте.
В обе кюветы аппарата наливают фосфатный буфер (pH 8,0, ионная сила 0,05). На перегородки между наружным и внутренним отделениями кюветы кладут по кусочку фильтровальной бумаги для установления электрической связи. Одинаковый уровень жидкости в обеих кюветах устанавливают при помощи резинового или стеклянного сифона, наполненного тем же буферным раствором. Полоску фильтровальной бумаги (лучше брать ватман № 2 или хроматографическую ленинградскую) размером 1,5—2X25 см берут двумя пинцетами (во избежание загрязнения), помещают на лист бумаги и в центре проводят карандашом поперечную линию, вдоль которой штриховыми движениями наносят из микропипетки 0,02 мл смеси растворов глютамина и глютаминовой кислоты. Каждую новую порцию наносят после того, как подсохнет предыдущая. На другую полоску наносят 0,02 мл раствора глютаминовой кислоты, на третью — столько же раствора глютамина. Полоски поочередно смачивают буферным раствором (в чашечке). Избыток влаги удаляют, раскладывая полоски на листе фильтровальной бумаги. Полоски переносят в прибор и концы их погружают в кюветы. В камеру можно уложить 6 полосок. Они должны лежать горизонтально и не провисать.
Камеру для электрофореза закрывают крышкой, и зажимы электродов фиксируют на выпрямителе — стабилизаторе тока. Выпрямитель подключают к электросети и постепенно увеличивают напряжение. Электрофорез проводят при напряжении 200—300 В и силе тока 1,5—2 мА
37
в течение 1,5—2 ч, после чего снижают напряжение до нуля и выключают прибор.
Полоски электрофореграмм вынимают чистыми пинцетами и с концов, погруженных в буферный раствор, удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой. Полоски накалывают в горизонтальном положении на гвоздики рамы и помещают для фиксации в сушильный шкаф при температуре 100—105° С в течение 10—15 мин. Сухие полоски вынимают из шкафа и опрыскивают раствором нингидрина, после чего для проявления пятен снова помещают в тот же сушильный шкаф на 3—5 мин.
Кроме электрофореза на бумаге, в последнее время широкое распространение получили методы электрофоретического разделения веществ на полиакриламидном, " агаровом.геле, крахмале и т. д.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле (по В. Бжескому и 3. Канюга, с дополнениями)
Общие сведения. Электрофорез в полиакриламидном геле, как и другие виды аналогичных исследований, основан на использовании неодинаковой электрофоретической подвижности различных белковых фракций. Кроме того, гель играет роль молекулярного сита: вещества, имеющие размеры молекул большие, чем диаметр пор геля, проходят через гель, не проникая внутрь его частиц; соединения же, характеризующиеся размерами молекул меньшими диаметра пор геля, будут проходить гель по порам, и поэтому их движение окажется замедленным. Благодаря способности избирательно адсорбировать более мелкие молекулы молекулярное сито позволяет разделить фракции с различным молекулярным весом.
Акриламид, употребляемый для электрофореза, представляет собой смесь двух веществ — собственно акриламида Н2С = СН—СО—NH2 и М.М'-метилен-бис-акрила-мида Н2С = CH—СО—NH—СН2—NH—СО—СН = СН2. В зависимости от сочетания этих соединений получают полимеры с различной частотой и размерами пор. Размеры пор определяются количеством Ь1,М'-метилен-бис-акри-ламида в реакционной смеси, поскольку он содержит так называемые поперечные метиленовые мостики, от количества которых зависит в конечном счете и диаметр пор
38
геля. Полимеризация происходит при участии надсернокислого аммония и катализатора Й.М.М'.М'-тетраметил-этилендиамина (ТЕМЕД). В результате реакции образуется полимер, имеющий следующее примерное строение:
I снг
NH I СО
—сн2—сн—\сн2
со I nh2
снг—сн —
со
I
NH
I сн2
со
nh2
сн2—
NH I со
-сн2—сн—|с%-СН -]х
СО	СО
NH	м2
снг
сн2—
сн2
NH
СН2 — СН —^2— С//—] со
I
NH
сн2-
Полимеризацию полиакриламидного геля чаще всего производят в стеклянных трубках под слоем воды, так как кислород воздуха замедляет этот процесс (рис. 6).
Разделение белковых фракций сыворотки крови с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Этим методом можно разделить сывороточный белок на 18— 25 фракций, которые располагаются на столбике геля в следующей последовательности:
39
1)	находящаяся в авангарде фракция преальбуми-нов;
2)	альбумины (очень широкие полосы);
3)	сц-глобулины (4 полосы);
4)	2-0-глобулины;
5)	1-р-глобулины (фракции 4 и 5 образуют широкие,
Рис. 6. Прибор для элсктрофо-
реза в полиакриламидном геле (схема):
/ — крышка аппарата; 2—'верхняя часть; 3 нижняя часть; 4____трубка с гелем; 5 — электрод; 6_уро-
вень буферной смеси; 7 — уплотняющая резиновая муфта.
интенсивно окрашенные полосы) ;
6) аг-глобулины (16 тонких полос, расположенных близко друг к Другу);
7) Yi-глобулины (остаются на старте).
Реактивы, материалы, аппаратура: а) сыворотка крови. Свежую кровь крупного рогатого скота взбалтывают со стеклянными бусами в тече-
ние 10—12 мин., после чего
сыворотку сливают и цент-рифугируют 15 мин. со скоростью 3000 об/мин. Осветленную сыворотку снимают с осадка пипеткой и хранят
при температуре — 20° (в морозильной камере холодильника, установив регулятор
термостата на «холод»). Для электрофореза смешивают 0,04 мл сыворотки с 0,1 мл 25%-него раствора сахарозы; б) сахароза, 40%-ный раствор-, в) раствор акриламида и N.N'-метилен-бис-акриламида: 3 г акриламида и 0,1 г метилен-бис-акриламида растворяют в 12,3 мл дистиллированной воды (соблюдать меры предо
сторожности — акриламид ядовит!); г) N, N, N', N'-тет-
раметилэтилендиамин, 0,28%-ный раствор (по объему). Сохраняют в холодильнике; д) надсернокислый аммоний, 0,14%-ный раствор (весо-объемный). Перед употреблением готовят 5 мл раствора; е) трис-глициновая буферная смесь для приготовления геля: 0,29 г глицина (гликокол-ла) и 0,06 г трис-(гидроксиметил)-аминометана растворяют в 9,8 мл воды. Хранят в холодильнике; ж) трис-глициновая буферная смесь pH 8,1 :2,9 г глицина, 0,6 г трис-(гидроксиметил)-аминометана и 0,5 мл 1 н соляной
40
кислоты растворяют в 97,5 мл воды. pH раствора проверяют с помощью pH-метра. Перед употреблением разбавляют дистиллированной водой в 10 раз. К каждым
Рис. 7. Пипетка с соской и ниткой, протянутой через ее канал.
100 мл разведенного буфера, которые вливают в верхнюю часть аппарата, прибавляют 0,05 мл 0,5 %-него водного раствора красителя бромфенолового синего; з) амидочерный 10 В: 0,1%-ный раствор на 7%-ной уксусной кислоте; и) уксусная кислота, 7%-ный раствор; к) капиллярная пипетка. Ее готовят из стеклянной трубки, которую вытягивают в капилляр длиной 8 см и диаметром 2 мм; л) пипетка с соской и ниткой, протянутой через ее канал (рис. 7); м) аппарат для электрофореза (см. рис. 6)
; н) микропипетка с делениями на 0,005 мл; о) плоская кювета (из фаянса или пластмассы); п) препаровальная игла; р) стеклянные трубки длиной 75 мм и диаметром 5 мм, имеющие «воротнички» на одном из концов (см. рис. 6); с) резиновые пробки от пенициллиновых склянок.
Подготовка трубок. Четыре стеклянные трубки закрепляют «воротничками» в пробках от пенициллиновых склянок. На расстоянии 18 мм от верхнего конца трубок карандашом «стеклограф» наносят риски. Трубки ставят в штатив. С помощью капиллярной пипетки наливают раствор сахарозы на 2 мм выше верхнего края пробок, не касаясь пробки кончиком пипетки.
Приготовление геля. 2 мл раствора акриламида и метилен-бис-акриламида смешивают с 1 мл раствора тетраметилэтилендиамина, 4 мл раствора надсернокислого аммония и 1 мл трис-глицинового буфера. Полученной смесью (с помощью капиллярной пипетки) осторожно наполняют трубки до рисок, нанесенных ранее. Кончик пипетки при этом упирают в стенку трубки над самой поверхностью раствора сахарозы. Поверх слоя смеси вносят (пипеткой с ниткой) слой воды в 0,5—1 см, касаясь ниткой стенки трубки у самой поверхности смеси. При этом следят, чтобы сохранялась четкая граница между водой и полимеризующейся смесью. По мере полимеризации эта граница смазывается, и лишь через 1 ч пос
41
ле завершения процесса она снова становится четко различимой.
Чтобы поверхность геля была идеально гладкой, трубки во время, полимеризации нельзя сдвигать с места. После окончания реакции воду осторожно отсасывают с помощью тонкой пипетки, трубки вынимают из пробок и устанавливают в верхней части аппарата для электрофореза (см. рис. 6).
Электрофорез. Нижнюю часть аппарата наполняют буфером, pH которого равен 8,1. Верхнюю часть переворачивают дном кверху и в трубки с гелем осторожно вводят буфер так, чтобы, не было пузырьков воздуха. После этого ее снова устанавливают на нижней, следя, чтобы в нижние концы трубок не проник воздух. Затем наливают буфер в верхнюю часть прибора. Слой жидкости должен быть на 1 см выше верхнего края трубок. Пользуясь тонкой пипеткой, удаляют пузырьки воздуха из верхней части трубок. Микропипеткой вносят в каждую трубку по 15 мкл разведенной сыворотки, касаясь кончиком пипетки стенки трубки над самой поверхностью геля. Сыворотку вводят в трубку очень медленно и осторожно, следя за тем, чтобы не произошло ее смешения с буфером.
В верхнюю часть аппарата осторожно доливают еще немного буферной смеси и закрывают крышкой. Аппарат присоединяют к источнику питания (положительный электрод — в нижней части аппарата, отрицательный — в верхней) и устанавливают такое напряжение, чтобы на каждую трубку с гелем приходилось 1—2 мА. Когда буфер проникнет в гель на 1—2 мм (о чем будет свидетельствовать окрашенное кольцо), увеличивают напряжение так, чтобы сила тока составляла 4 мА на трубку. Ток пропускают до тех пор, пока окрашенное кольцо буфера не достигнет уровня, отстоящего на 5 мм от нижнего конца геля.
Окрашивание белковых фракций. В пластмассовую или фаянсовую кювету наливают воду. Держа трубки под водой, вынимают столбики геля, осторожно продвигая препаровальную иглу между гелем и стенкой трубки, и сразу же переносят их на 30—60 мин. в пробирки с раствором амидочерного. Окрашенные столбики ополаскивают водопроводной водой, избыток красителя удаляют с помощью раствора уксусной кислоты,
42
свежие порции которого все время подливают в пробирки. Окрашенные столбики хранят в 7%-ном растворе уксусной кислоты. Положение отдельных фракций белков устанавливают, руководствуясь данными, приведенными на с. 40.
СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ (ПРОТЕИДЫ)
В состав макромолекул сложных белков, кроме аминокислот, входят также соединения небелкового характера (называемые простетическими группами). В зависимости от химической природы простетических групп сложные белки делят на нуклеопротеиды, хромопротеи -ды, гликопротеиды, фосфопротеиды, липопротеиды, ме-таллопротеиды и т. д.
Хромопротеиды
Общие сведения. Хромопротеиды — это сложные белки, простетическими группами которых являются окрашенные соединения. Одни из них содержат железо, другие — медь, магний, третьи металла не содержат (фла-винпротеиды, родопсин). К хромопротеидам относятся белки, играющие очень важную роль в процессах обмена веществ. Красящее вещество крови — гемоглобин, хромопротеид мышц — миоглобин, ферменты — каталаза, цитохромпероксидаза, пероксидаза являются железосодержащими белками. К протеидам, содержащим медь, относятся растительные ферменты о-дифенолоксидаза (полифенолоксидаза) и аскорбинатоксидаза, а также протеид гемоцианин, который находится в крови и гемолимфе головоногих моллюсков и некоторых других беспозвоночных животных. Флавинпротеидам принадлежат важные ферментативные функции. Они катализируют реакции дегидрогенизации, т. е. отщепления водорода от молекул органических веществ, подвергающихся окислению непосредственно или же при участии других промежуточных переносчиков электронов. Велика роль родопсина (зрительного пурпура) в восприятии света.
Гемоглобин состоит из белка глобина, который относится к группе гистонов и простетической группы — гема. Гемоглобины различных видов животных различаются между собой, причем эти различия касаются лишь амино-
43
кислотного состава белковой части, структура же гема одинакова у всех позвоночных животных.
Основу молекулы гема составляет ядро порфирина — четыре производных пиррола, соединенных метиковыми группами ( = СН —), и атом двухвалентного железа, связанный основными валентными связями с двумя пиррольными кольцами:
Пунктирные линии обозначают добавочные связи атома железа. Строго говоря, в молекуле гема связи с атомом двухвалентного железа осциллируют в системе сопряженных связей в порфириновом ядре.
В состав макромолекулы гемоглобина входят четыре молекулы гема (и, следовательно, четыре атома железа). При воздействии на гемоглобин уксусной кислоты (в присутствии хлористого натрия) гем превращается в окисленную форму — гемин. В молекуле гемина железо трехвалентно (третья валентная связь соединяет железо с атомом хлора).
При воздействии слабых растворов щелочей гем превращается в гематин, который является также окисленной формой гема (третья валентная связь соединена с гидроксильной группой).
Огромную роль в процессе фотосинтеза играет магнийсодержащий растительный пигмент хлорофилл, образующий комплексные соединения с белками и липидами хлоропластов. Хлорофилл весьма близок по строению к гему. Показано, что и пути образования этих соединений принципиально одинаковы.
Бензидиновая проба на гемин. Гемоглобин катализирует процесс разложения перекиси водорода на атомар-44
ный кислород, которым бензидин окисляется в парахино-индиимид, имеющий синюю и сине-зеленую окраску. Реакция очень чувствительна и применяется для открытия примеси следов крови.
Реактивы: а) дефибринированная кровь. Из ушной вены кролика в колбу Эрленмейера (на 50 мл) берут 10 мл крови. Колбу укупоривают ватой со стеклянной палочкой, к нижнему концу которой припаяны кусочки стеклянных капилляров. Колбу держат за горловину и вращают в руке. Через 4—5 мин. на палочке собирается комок фибрина. Дефибринированная кровь не свертывается; б) бензидин основной, раствор в 50%1-ной уксусной кислоте: перед употреблением немного бензидина (на кончике ножа) растворяют в 5 мл 50%.-ной уксусной кислоты. Употребляют только свежеприготовленный реактив; в) перекись водорода 3%-ная или раствор пергидрола (1:10), приготовленный непосредственно перед употреблением.
В пробирку вносят пипеткой 1 мл сильно разведенной дефибринированной крови, добавляют столько же раствора бензидина и несколько В течение первых двух минут должно появиться синее или сине-зеленое окрашивание.
водорода можно заменить перекисью бария.
Амидопириновая проба на гемин. Реактивы: а) дефибринированная кровь; б) амидопирин (пирамидон), 5%-ный спиртовой раствор; в) уксусная кислота, 30%-ный раствор; г) перекись водорода, 3%-ная, или раствор пергидрола
(1 : 10), приготовленный перед употреблением.
В пробирку вносят пипеткой 1—2 мл сильно разведенной дефибринированной крови и столько же спиртового раствора амидопирина (пирамидона), прибавляют по 10—15 капель раствора уксусной кислоты и перекиси водорода. Появляется сине-фиолетовое окрашивание.
капель перекиси водорода.
Рис. 8. Кристаллы гемина.
45
Образование кристаллов гемина (проба Тейхмана). Реактивы: а) дефибринированная кровь-, б) уксусная кислота, ледяная-, в) натрий хлористый, кристаллический.
На предметное стекло наносят каплю дефибриниро-ванной крови, размазывают ее по стеклу и осторожно подсушивают над пламенем, не допуская сильного нагревания (температура не выше 60°С). К подсушенному мазку добавляют несколько кристалликов хлористого натрия и 2—3 капли ледяной уксусной кислоты, смесь перемешивают, накрывают покровным стеклом и осторожно нагревают до начала кипения.
После охлаждения препарат рассматривают под микроскопом при большом увеличении. Зарисовывают коричневато-бурые кристаллы гемина, имеющие форму ромбовидных пластинок, табличек, палочек, иногда собранных в звезды (рис. 8).
Гликопротеиды
Общие сведения. Гликопротеиды — сложные белки, простетическими группами которых являются углеводы и их производные. В состав небелковой части гликопротеидов входят моносахариды — глюкоза, галактоза, фукоза, аминосахара — глюкозамин, галактозамин, ацетил-глюкозамин, кислоты — глюкуроновая, уксусная, нейраминовая, серная и др.
Гликопротеиды широко распространены в организме животных. Они содержатся почти во всех тканях. Одни из них выполняют Чисто механические функции (например, гликопротеиды синовиальной жидкости суставов),
С----
С —ОН с—н с—он
с----
/У —
но —
У —
н —
соон
Глюкуроновая кислота
СНОП
I
СН20Н
не Ураниновая кислота
46
н—с—нн2
но —с—н о
I но —с—н
I н— с------
I
СН2ОН
D-галактозамин
н—с—нн2
I но—с—н о
но—с—н
н—с----
I
СНз
D-глюксзамин
D-Фукозами.н
другие облегчают передвижение и переваривание пищи (муцин слюны, желудочный и кишечный муцины). К гликопротеидам относятся также некоторые вещества групп крови, ферменты (например, холинэстераза) и т. д. Гликопротеиды содержатся и в семенах некоторых растений (ячменя, пшеницы и др.).
Многочисленные гликопротеиды часто объединяют под общим названием муцинов и мукоидов. Муцины входят в состав секрета слизистых желез. Мукоиды встречаются в хрящах (хондромукоиды), костях (оссеомукои-ды), соединительной ткани и т. д.
У некоторых муцинов и мукоидов простетические группы легко отделяются и встречаются в свободном виде в тканях. Они получили название мукополисахаридов. Некоторые мукополисахариды (гиалуроновая кислота, хондроитинсерная кислота, гепарин) являются веществами, которые играют весьма важную роль в организме.
Выделение муцина из слюны. Реактивы: а) слюна, свежесобранная-, б) уксусная кислота, концентрированная.
В пробирку наливают 2—3 мл слюны и по каплям прибавляют уксусную кислоту. Выпадает осадок муцина.
Реакция Подобедова — Молиша на углеводный компонент муцина. Углеводные остатки гликопротеидов образуют окрашенные соединения с тимолом или a-нафтолом в присутствии концентрированной серной или соляной кислоты.
Это окрашивание вызвано образованием фурфурола и оксиметилфурфурола в результате дегидратации моносахаридов под воздействием минеральных кислот.
47
нс-----сн	нс-----CH
Фурфурол	Оксинетилфурфуро/i
Реактивы: а) осадок муцина слюны (см. предыдущую работу); б) тимол, 1%-ный раствор в этиловом спирте; в) а-нафтол, 0,2%,-ный раствор в этиловом спирте; г) серная кислота, концентрированная.
Осадок муцина осторожно промывают дистиллированной водой и затем делят на две части. К одной части добавляют 5—6 капель раствора а-нафтола и перемешивают, к другой — столько же раствора тимола. Затем в обе пробирки осторожно (по стенке) наслаивают 1—2 мл концентрированной серной кислоты. На границе слоев в первой пробирке появляется фиолетово-красное, а во второй — красное окрашивание.
Фосфопротеиды
Общие сведения. В состав фосфопротеидов входит фосфорная кислота (0,40—0,88%), соединенная эфирной связью с оксиаминокислотами (серином, треонином).
UH
сн2—он н—с—нн2 соон Серин (еС~анино-рЗ-окси-пропионовая кислота) сн3 1 н—с—он 1 H—C—NHi 1 СООН Треонин (d. -анино-рз-окси-насляная кислота) 48	снг—о—р=о 1 Н—С—ННг 1 соон Серинфосфорная кислота СН3 1 н—с—о—р=о 1 h—c—nh2 соон Треонинфосфорная кислота
К фосфопротеидам относятся многие весьма важные по своей биологической роли белки: казеиноген (казеин) молока, белки яичных желтков — вителлин, вителленин и витин, белки икры, ферменты — пепсин, фосфорилаза, фосфоглюкомутаза и др.
Фосфопротеиды выпадают в осадок при подкислении раствора, в воде нерастворимы, но растворяются в разбавленных щелочах.
Выделение казеиногена из молока и исследование его свойств. Казеиноген — важнейший белок молока. Остатки фосфорной кислоты в молекуле казеиногена связаны с остатками серина. В молоке казеиноген находится в виде растворимых в воде анионов кальцината. При подкислении до pH 4,7 (изоэлектрическая точка казеиногена) белок выпадает в осадок. Добавление избытка кислоты вызывает перезарядку белковых молекул и переход их снова в раствор.
Казеиноген высаливается нейтральными солями (хлористым натрием, сернокислым аммонием и др.).
Под действием пищеварительных ферментов (пепсина, химозина) казеиноген превращается в казеин, кальциевая соль которого в отличие от казеиногена нерастворима в воде.
Реактивы: а) молоко, цельное или (лучше) снятое; б) уксусная или молочная кислота, 10%-ный раствор; в) едкий натр, 1%-ный раствор.
В пробирку пипеткой вносят 2 мл молока, прибавляют столько же дистиллированной воды и по каплям — 10%-ный раствор уксусной или молочной кислоты до выпадения осадка (избегать избытка кислоты!). Осадок отфильтровывают на бумажном фильтре и несколько раз промывают дистиллированной водой (на фильтре), после чего растворяют в 1 %.-ном растворе едкого натра. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, смоченный водой. С фильтратом производят цветные реакции на белки и отдельные аминокислоты (биуретовую, нингидриновую, ксантопротеиновую, Адамкевича, Шульце — Распайля, Миллона и др.).
Получение препарата казеиногена (по Д. Л. Фердма-ну и Е. Ф. Сопину, с изменениями). Р е а к т и в ы: а) молоко (снятое); б) соляная кислота, 0,5 н раствор; в) диэтиловый эфир. Препарат используют для аналитических работ.
49
К 1,4 л снятого молока медленно, в течение 25— 30 мин., добавляют 0,5 н раствор соляной кислоты до достижения pH 4,7—4,8 (расходуют приблизительно 145— 150 мл). Содержимое сосуда перемешивают 10 мин., затем оставляют на 1 ч для отстаивания осадка. Жидкость над осадком отсасывают с помощью сифона. В воронку Бюхнера кладут два слоя фильтровальной бумаги. Отфильтровывают осадок, потом его промывают дистиллированной водой 15—20 раз, расходуя на каждое промывание 100—150 мл воды. Для очистки от примеси молочного жира промытый осадок обрабатывают 3—4 раза диэтиловым эфиром, которого берут каждый раз по 80— 100 мл (при этом надо выключить все нагревательные приборы!), после чего распределяют тонким слоем на стекле для удаления остатков эфира и оставляют на 3— 4 часа. Выход препарата — 30—35 г.
Гидролиз казеиногена и открытие в нем фосфорной кислоты. Реактивы-, а) препарат казеиногена (см. предыдущую работу); б) едкий натр, 5%тный раствор-, в) азотная кислота, концентрированная-, г) молибденовый реактив (приготовление — см. «Гидролиз нуклеопротеидов») .
0,25 г препарата казеиногена гидролизуют с 5%-ным раствором едкого натра в колбе, закрытой пробкой с воздушным холодильником. Раствора щелочи берут 15— 20 мл.
Колбу устанавливают на асбестовую сетку и нагревают на небольшом огне до кипения. Кипение поддерживают в течение часа, после чего колбу снимают с нагревательного прибора, дают ей остыть на воздухе и жидкость нейтрализуют концентрированной азотной кислотой, добавляя ее по каплям до слабокислой реакции (по лакмусу) . При добавлении кислоты выпадает осадок пептонов, который отфильтровывают на бумажном фильтре. С частью фильтрата (1—2 мл) производят реакцию на фосфорную кислоту с молибденовым реактивом (см. с. 56).
Раздел II
НУКЛЕОПРОТЕИДЫ. НУКЛЕИНОВЫЕ кислоты
Нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды играют огромную и разностороннюю роль в сохранении и передаче генетической информации и регулировании важнейших биосинтетических процессов в организме. Нуклеопротеиды — сложные белки, молекулы которых построены из простых белков (гистонов, протаминов, реже альбуминов и глобулинов), связанных с нуклеиновыми кислотами.
Нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды) — полимеры, построенные из нуклеотидов. В состав нуклеотидов входят азотистые основания (производные пурина или пиримидина), углеводный компонент — пентоза (рибоза или дезоксирибоза) и остатки фосфорной кислоты. В зависимости от пентозы, входящей в их состав, нуклеиновые кислоты делят на две большие группы: рибонуклеиновые (РНК) и дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК) • Молекулы РНК содержат рибозу, в состав молекул ДНК входит дезоксирибоза.
Структурными звеньями нуклеиновых кислот являются нуклеотиды. При гидролизе нуклеотидов освобождаются: азотистые основания пуринового или пиримидинового ряда, пентоза и фосфорная кислота.
Пуриновые основания
Авенин	Гуанин
(6-аминопурин)	(2 -амино -6-оксипуршу
51
Пиримидиновые основания
/^2
N	СН
I	И
но-с^ СИ "''N цитозин (2-окси 6-аминопиримидин)
Урацил (2,6-диоксипиримидин)
тимин (2,6-диокси-5-метил-пиримиВин или 5-метил-урацил)
В состав РНК входят аденин, гуанин, цитозин и урацил, в молекулах ДНК находим те же азотистые основания, но место урацила занимает тимин. У ДНК молярная сумма пуриновых оснований равна молярной сумме пиримидиновых
Гуаиии + адении _ ।
Цитозин 4- тимин
У РНК нет такой отчетливой закономерности, и отношение пуриновых и пиримидиновых оснований в значительной степени изменчиво.
Для молекул ДНК характерен коэффициент видовой специфичности, который определяется соотношением азотистых оснований
Гуанин 4- цитозин
Аденин -р тимин
Молекулы ДНК отличаются отчетливо выраженной видовой специфичностью, тогда как у РНК это свойство выражено значительно слабее.
Названия нуклеотидов образуются по азотистым основаниям, которые входят в их состав. Так, нуклеотиды, содержащие аденин, называются адениловыми кислотами, гуанин — гуаниловыми, цитозин — цитидиловыми, тимин — тимидиловыми, урацил — уридиловыми. Например, адениловая (аденозин-монофосфорная кислота)
52
Остаток рибозы
РНК преимущественно содержатся в органоидах клеток (митохондриях, рибосомах и т. д.), меньше — в ядре и ядрышке. ДНК главным образом находятся в ядре. ДНК является основным веществом, из которого состоят гены.
Нуклеотиды соединены между собой в линейном порядке через фосфорные и пентозные группировки.
Основу строения молекул ДНК и РНК составляют полинуклеотидные цепи. Различают первичную, вторичную и третичную структуры нуклеиновых кислот.
Под первичной структурой понимают порядок чередования нуклеотидных остатков в полинуклеотидных цепях.
Вторичной структурой нуклеиновых кислот называют конфигурацию полинуклеотидных цепей, т. е. их спира-лизацию. Вторичная структура молекулы ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из двух поли-дезоксирибонуклеотидных цепей, одновременно спира-лизованных друг около друга. В молекулах РНК спирализация происходит в пределах одной полирибо-нуклеотидной цепи, причем свернуто в спираль лишь около 40—60% ее.
Устойчивость вторичной структуры нуклеиновых кислот обеспечивается главным образом водородными связями, образующимися между двумя парами азотистых оснований: в молекулах ДНК—аденин — тимин и гуанин— цитозин, в молекулах РНК — аденин — урацил и гуанин — цитозин. Такие пары азотистых оснований, в которых они соединены водородными связями, называют комплементарными.
Третичной структурой считают конфигурации, которые могут принимать спирализованные полинуклеотид-
53
ные цепи в пространстве. Особенно полиморфна третичная структура РНК (развернутая полирибонуклеотидная цепь, компактная структура-палочка, клубок и т. д.). Третичная структура ДНК проявляется в виде спирализации второго порядка (например, в хромосомах) либо клубков двойных спиралей.
ВЫДЕЛЕНИЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОПРОТЕИДОВ ИЗ ПЕЧЕНИ ИЛИ СЕЛЕЗЕНКИ
Нуклеопротеидами богаты печень, селезенка, поджелудочная железа, почки, дрожжи. Они растворяются в разбавленных растворах щелочей и выпадают в осадок при подкислении раствора. Дезоксирибонуклеопротеиды хорошо растворяются также в солевых растворах.
Реактивы и материалы: а) печень или селезенка крупного рогатого скота или свиньи, свежие или замороженные-, б) хлористый натрий, 5%-ный раствор; в) деревянная палочка с насечками.
2—2,5 г печени или селезенки разрезают на маленькие кусочки и затем растирают в ступке с 5%,-ным раствором хлористого натрия, добавив немного стеклянного порошка. Раствор соли добавляют небольшими порциями (по 10—15 мл), всего расходуют его около 80 мл.
Растирают 12—15 мин. до получения гомогенной массы. Содержимое ступки разливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10—15 мин. (при 2500 оборотах в минуту), после чего измеряют объем центрифугата (сливая его в стеклянный цилиндр).
В стакан наливают дистиллированную воду (объем которой должен быть в шесть раз больше объема центрифугата) и, медленно помешивая в стакане деревянной палочкой, вливают в воду центрифугат. Дезоксирибонуклеопротеиды выпадают в виде нитей, которые наматывают на палочку.
КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ДНК
Наличие ДНК определяют по цветным реакциям, характерным для дезоксирибозы. Часто применяют реакцию с дифениламином (С6Н5—NH—С6Н5). Дифениламин с дезоксирибозой или ДНК образует соединение синего
54
цвета. Рибоза и РНК дают с дифениламином зеленое окрашивание.
Реактивы и материалы: а) осадок дезоксирибонуклеопротеида (см. предыдущую работу); б) дифениламиновый реактив: 1 г дифениламина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты. К раствору добавляют 2,75 г концентрированной серной кислоты (Рго= 1,836); в) едкий натр, 0,4с/^ный раствор.
Часть осадка дезоксирибонуклеопротеида переносят в пробирку и добавляют 0,5—1 мл раствора едкого натра (до растворения). К раствору приливают равный объем дифениламинового реактива. Осадок, выпадающий вначале, растворится в последующих порциях реактива, после чего его нагревают в течение 15—20 мин. в кипящей водяной бане. Появляется синее окрашивание.
ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ ИЗ ДРОЖЖЕЙ
Реактивы и материалы: а) дрожжи пекарские, прессованные; б) диэтиловый эфир; в) едкий натр, 0,4%-ный раствор; г) уксусная кислота, 5°10-ный раствор; д) стеклянный порошок или речной песок, тщательно промытый и прокаленный.
5 г дрожжей увлажняют в ступке 1 мл диэтилового эфира и 1 мл воды, добавляют немного стеклянного порошка или песка и растирают с 0,4%-ным раствором едкого натра, приливая его небольшими порциями (по 5—10 мл). Всего расходуют до 50 мл раствора щелочи; растирание продолжают в течение 15—20 мин. Содержимое ступки фильтруют через складчатый фильтр или центрифугируют в течение 10 мин. (при 2500 оборотах в минуту). Фильтрат или центрифугат переливают в стакан и к нему по каплям добавляют 5%гный раствор уксусной кислоты до полного осаждения нуклеопротеида (обычно расходуют 10—15 мл раствора).
Осадок отделяют центрифугированием.
ГИДРОЛИЗ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ
Гидролиз нуклеопротеидов происходит при кипячении с разбавленной серной кислотой. Этот процесс можно представить следующей схемой:
55
Белки
Полипептиды
Аминокислоты
нуклеопротеиды
нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды)
Мононуклеотиды
нуклеозиды
Фосфорная кислота
Пуриновые или пиримидиновые основания
Пентоза
Реактивы и материалы: а) осадок нуклеопротеидов (см. предыдущую работу); б) серная кислота, 5%-ный раствор-, в) серная кислота, концентрированная-, г) едкий натр, 10%гный раствор; д) аммиак, концентрированный раствор (20—25%-ный); е) сернокислая медь, 1%-ный раствор; ж) тимол, 1%-ный спиртовой раствор; з) аммиачный раствор окиси серебра: к 1—2 % -ному раствору азотнокислого серебра добавляют концентрированный раствор аммиака до растворения образующегося вначале осадка; и) молибденовый реактив: 3,75 г молибденовокислого аммония растворяют в 50 мл воды и добавляют 50 мл 32%-ной азотной кислоты (р2о= 1,200). Полное растворение соли происходит только после прибавления азотной кислоты.
Осадок нуклеопротеидов переносят в круглодонную колбу, смывая его 5%-ной серной кислотой. Остаток кислоты вливают в колбу с осадком. Всего расходуют не более 20—25 мл раствора. Колбу закрывают пробкой с обратным холодильником, ставят на асбестовую сетку, нагревают на малом огне до кипения и кипятят 1—1,5 ч, после чего охлаждают и гидролизат фильтруют через бумажный фильтр. С фильтратом проделывают реакции на полипептиды, пуриновые основания, пентозы и фосфорную кислоту.
Пр имечание. Гидролитическое расщепление нуклеопротеидов можно производить и без выделения их из дрожжей.
Отвешивают 1 г прессованных дрожжей, переносят навеску в круглодонную колбу, вливают 30—40 мл
56
5%-ного раствора серной кислоты, закрывают колбу пробкой с воздушным холодильником, нагревают на малом огне до кипения, подложив под колбу асбестовую сетку. Кипятят 1—1,5 ч, после чего колбу охлаждают, содержимое ее фильтруют через бумажный фильтр. С фильтратом проделывают перечисленные ниже реакции.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИЗА НУКЛЕОПРОТЕИДОВ
Открытие полипептидов. С частью фильтрата (1— 2 мл) проделывают биуретовую реакцию.
Открытие пуриновых оснований. К 2 мл фильтрата добавляют концентрированный раствор аммиака до щелочной реакции на лакмус и приливают 1 мл аммиачного раствора окиси серебра. Через несколько минут выпадают хлопья осадка серебряных солей пуриновых оснований.
Открытие пентоз. Открытие пентоз основано на реакции с тимолом и концентрированной серной кислотой (см. с. 47). Серная кислота вызывает дегидратацию пентоз и образование фурфурола, который с тимолом дает соединения красного цвета (продукты конденсации).
(ИСОН},
РиЗоза СНг0Н
концентрированная цг$04
-зн2о
Соединение красного цвета
Тимол н3с—с—сн} н
57
К 1 мл фильтрата добавляют 2—3 капли 1%-ного спиртового раствора тимола и по стенке пробирки осторожно наслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты. Жидкость окрашивается в красный цвет. Окраска более выражена на границе раздела слоев.
Пентозы можно обнаружить также с помощью реакций с орцином, или флороглюцином, или фелинговой жидкостью (см. раздел VII).
Открытие фосфорной кислоты. Фосфорная кислота образует с молибденовым реактивом желтый кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония:
Н3РО4 +12 (NH4) 2МоО4+21 HNO3-> (NH4)3PO4- 12MoO3+21NH4NO3+ 12Н2О-
К 1—2 мл фильтрата приливают равный объем молибденового реактива, нагревают до кипения и кипятят 2— 3 мин. Появляется желтое окрашивание, обусловленное образованием фосфорномолибденовокислого аммония. При стоянии выпадает желтый осадок.
ОЧИСТКА И РАЗДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ* (по Шмидту и Таннгаузеру, в прописи Г. П. Георгиева)
Реактивы и материалы: а) селезенка, печень, почки; б) трихлоруксусная кислота, 5—10—50%-ные растворы-, в) кали едкое (КОН), 0,5 н раствор-, г) этиловый спирт, 95%-ный; д) диэтиловый эфир-, е) смесь этилового спирта с диэтиловым эфиром (3:1)-, ж) смесь этилового спирта с хлороформом (3:1); з) хлорная кислота (НС1О4), 5 н раствор. Раствор готовить осторожно, так как хлорная кислота нестойка и может взорваться при хранении (особенно при повышенной температуре), а также при соприкосновении с органическими веществами.
Процесс выделения, очистки и разделения нуклеиновых кислот состоит из ряда последовательных этапов.
1.	1 г ткани (сырой вес) измельчают в стеклянном гомогенизаторе с 5%,-ным раствором трихлоруксусной кислоты на холоду до получения однородной тонкой ка
* Для студенческого научно-исследовательского кружка.
58
шицы (гомогенизатор охлаждают льдом), которую, количественно смывая со стенок гомогенизатора 5 мл 10%-ного холодного раствора уксусной кислоты, переносят в центрифужную пробирку. Центрифугируют 7 мин. (3000—4000 об/мин) в центрифуге с охлаждением или низкотемпературной комнате. Жидкость над осадком сливают, к осадку вновь приливают 5—10 мл 10%-него холодного раствора трихлоруксусной кислоты и снова центрифугируют. Операцию повторяют в третий раз. Промывные воды соединяют.
В осадке остаются нуклеиновые кислоты, белки и липиды, в промывные воды переходят низкомолекулярные производные азотистых оснований (в том числе нуклеотиды) и неорганические фосфорные соединения.
Примечание. Все операции необходимо проводить при низкой температуре во избежание отщепления пуринов (апуринизации) и последующего разрыва цепей ДНК при щелочном гидролизе.
2.	Осадок освобождают от липидов путем экстракции органическими растворителями, для чего его растирают стеклянной палочкой и последовательно центрифугируют с этиловым спиртом, два раза со смесью спирта с хлороформом (3: 1), затем со смесью спирта с эфиром (3:1) и наконец с эфиром. Каждый раз берут по 10 мл растворителя. Промытый осадок высушивают на воздухе; для ускорения сушки его растирают стеклянной палочкой.
В осадке остаются нуклеиновые кислоты и белки.
3.	Производят разделение РНК и ДНК.
При мягком щелочном гидролизе РНК расщепляется до нуклеотидов, тогда как ДНК остается полимерной и выпадает в осадок при добавлении кислоты (хлорной или трихлоруксусной).
К высушенному на воздухе и растертому в порошок осадку добавляют 5—10 мл 0,5 н раствора КОН и ставят на 15—18 ч в термостат при 37° С, после чего охлаждают до 0—2° и добавляют холодный 5 н раствор хлорной кислоты (НС1О4) из расчета 0,2 мл раствора на каждый миллилитр гидролизата.
Примечание. Вместо взрывоопасной концентрированной хлорной кислоты лучше использовать 50%-ный раствор трихлоруксусной, который добавляют к гидролизату с таким расчетом, чтобы довести концентрацию кислоты в нем (после нейтрализации КОН) до 5%.
59
После добавления кислоты гидролизат в течение 5 мин. выдерживают в холодильнике при 0° С и затем центрифугируют.
В надосадочной жидкости содержатся нуклеотиды, которые освободились при гидролитическом расщеплении РНК. Надосадочную жидкость сливают, соединяют ее с промывными водами, полученными в первом этапе. В жидкой фракции определяют содержание РНК.
В осадке остаются ДНК и белки.
4.	Осадок растворяют в 0,5 н растворе КОН при 37° С, затем охлаждают до 0° С. Раствор сливают и в нем определяют содержание ДНК. Осадок нерастворимых веществ выбрасывают.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДНК (по Дише)
При нагревании дезоксирибозы с раствором дифениламина в смеси ледяной уксусной и серной кислот развивается синее окрашивание, имеющее максимум поглощения при 595 нм.
Механизм реакции заключается в образовании окси-левулинового альдегида и конденсации последнего с дифениламином с образованием окрашенного соединения.
Реактивы-, а) раствор или суспензия ДНК, 50— 500 мкг/мл (приготовление — см. предыдущую работу); б) реактив Дише-. 1 г дифениламина растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты. К раствору прибавляют 2,75 мл концентрированной серной кислоты.
Примечание. Для приготовления реактива Дише рекомендуется брать дифениламин, дважды перекристаллизованный из 70%-иого этилового спирта.
К 1—2 мл раствора (или суспензии) ДНК приливают двойной объем реактива Дише, нагревают 10 мин. на кипящей водяной бане, затем охлаждают. Жидкость окрашивается в синий или сине-фиолетовый цвет. Измеряют поглощение раствора в фотоэлектроколориметре с красным (лучше оранжевым) светофильтром (595 нм) против контроля (реактив Дише).
Содержание ДНК в исследуемом растворе рассчитывают по калибровочной кривой, составленной по стандартному раствору натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты с известным содержанием фосфора (9,89—10,0%! в пересчете на чистую ДНК).
60
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РНК (по Мейбаум)
В основу метода положена известная реакция пентоз с орцином (см. раздел «Химия и обмен углеводов»).
Реактивы: а) хлорное железо (FeCl3 • 6Н2О), О,1°1о-ный раствор в концентрированной соляной кислоте; б) орцин (5-метилрезорцин): раствор (10 мг/мл) готовят перед употреблением на солянокислом растворе хлорного железа (см. выше); в) раствор РНК, 10—15 мг!мл (приготовление — см. «Очистка и разделение нуклеиновых кислот»),
К 2 мл раствора РНК прибавляют столько же раствора орцина, нагревают 20 мин. на кипящей водяной бане и охлаждают под краном. Жидкость окрашивается в зеленый или синевато-зеленый цвет.
Измеряют поглощение раствора в фотоэлектроколориметре с красным фильтром (670 нм). Содержание РНК вычисляют по калибровочной кривой, составленной по стандартным растворам РНК или рибозы. Предложена модификация метода Мейбаум, повышающая точность определения: после охлаждения окрашенный продукт экстрагируют изоамиловым спиртом, центрифугируют. Измеряют поглощение спиртовой фракции при 670 нм. против контроля (раствор орцина), обработанного таким же образом, как и испытуемая проба.
Содержание РНК рассчитывают по калибровочной кривой.
ХРОМАТОГРАФИЯ НА БУМАГЕ ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ, НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ*
Общие сведения. В биологическом материале свободные пуриновые и пиримидиновые основания встречаются в небольших количествах. Они, как известно, являются компонентами дезоксирибонуклеиновых и нуклеиновых кислот и освобождаются при их гидролитическом расщеплении. Подвергая гидролизу ДНК действием концентрированных растворов минеральных кислот (например, 6 н соляной кислоты или 12 н хлорной) при 100° С, можно добиться почти количественного освобождения пу-
Для студенческого научно-исследовательского кружка.
61
риновых и пиримидиновых оснований. Для высвобождения нуклеозидов и нуклеотидов следует применять более мягкий метод — энзиматический.
Значительно легче гидролизуются рибонуклеиновые кислоты. Уже 1н раствор серной или соляной кислот расщепляют РНК до пуриновых оснований и пиримидиновых нуклеотидов. Этот способ гидролиза позволяет установить неодинаковую прочность гликозидных связей в пуриновых и пиримидиновых нуклеотидах, так как последние в описанных условиях почти не подвергаются дальнейшему расщеплению. Пиримидиновые основания освобождаются лишь при гидролизе РНК 12 н раствором хлорной кислоты (1ч при 100°С).
Для того чтобы выделить свободные мононуклеотиды, проводят гидролитическое расщепление РНК 0,3 н раствором едкого натра в течение 18 ч при температуре 37° С.
Стандартные растворы. Готовят раствор свободных пуриновых и пиримидиновых оснований (2 мг/мл) в 10%-ном растворе изопропанола, к которому добавляют 10% уксусной кислоты.
Гуанин растворяют (в количестве 1 мг/мл) в 0,1 н растворе соляной кислоты.
Нуклеозиды и нуклеотиды (в концентрации 4 мг/мл) растворяют в 10 %-ном растворе изопропанола. Их стандартные растворы сохраняют в морозильной камере холодильника при температуре —15° С.
На хроматограммы наносят по 5—10 мкл растворов.
Системы растворителей. Употребляют следующие системы растворителей.
I. Смесь бутанола, уксусной кислоты и воды (12:3: : 5). Применяют для разделения смеси оснований, а также пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов и нуклеотидов.
II. Смесь изопропанола, концентрированной соляной кислоты и воды (130 : 33 : 37). Используют для разделения свободных пуриновых и пиримидиновых оснований. В этой смеси разделение происходит медленно. Хроматограммы высушивают на воздухе при комнатной температуре. Для того чтобы удалить следы соляной кислоты, высушенную хроматограмму выдерживают несколько минут над кипящей водяной баней, а затем снова сушат на воздухе.
В табл. 3 представлены данные, характеризующие
62
Табл. 3. Значение пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов н нуклеотидов (бумага ватман № 1)
Соединения	Системы растворителей	
	I	II
Аденин	0,60	0,33
Гуанин	0,40	0,20
Цитозин	0,45	0,47
Урацил	0,52	0,70
Тимин	0,70	0,81
Аденозин	0,49	0,37
Гуанозин	0,39	0,32
Цитцдин	0,39	0,45
Уридин	0,40	0,67
Тимидин	—	0,88
Аденозин—31— монофосфат	0,20	0,48
Гуанозин—З1— монофосфат	0,15	0,43
Цитидин—З1— монофосфат	0,21	0,58
Уридин—З1— монофосфат	0,16	0,82
значения Rf пуриновых и пиримидиновых оснований, а также нуклеозидов и нуклеотидов в описанных системах растворителей.
Проявители. Проявители реагируют с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, пентозами и остатками фосфорной кислоты.
Ультрафиолетовые лучи. Пуриновые и пиримидиновые основания, а также нуклеозиды и нуклеотиды, в состав которых они входят, поглощают ультрафиолетовые лучи в границах 250—280 нм. При просмотре хроматограмм в ультрафиолетовых лучах они становятся заметными в виде темных пятен на светло-голубом флуоресцирующем фоне бумаги. Границы пятен очерчивают графитовым карандашом.
Азотнокислое серебро — двухромовокислый натрий. Является реактивом на пуриновые основания. В состав проявителя входят: а) азотнокислое серебро, 2%-ный раствор; б) двухромовокислый натрий (бихромат натрия), 0,5%;-ный раствор; в) азотная кислота, 0,5 н раствор.
63
Хроматограмму опрыскивают раствором азотнокислого серебра, после чего погружают в раствор бихромата натрия. Выпадает красный осадок хромата серебра. Затем хроматограмму переносят в раствор азотной кислоты, в котором происходит медленное растворение осадка. Красная окраска остается лишь в местах комплекса хромата серебра с аденином и гуанином. Если при этом фон хроматограммы сохраняет еще розовую окраску, бумагу следует перенести в сосуд с водой и несколько раз прополоскать.
Ртутный проявитель. С его помощью можно открыть пиримидиновые основания — урацил, цитозин, тимин.
Хроматограмму погружают на 30 секунд в раствор, состоящий из 1 части 0,1 М. раствора уксуснокислой ртути, 3 частей 1 М раствора уксуснокислого натрия и 6 частей воды. Затем хроматограмму перекладывают на 20 секунд в кювету с проточной водой, после чего сразу же погружают в 2%,-ный раствор сернокислого аммония до появления черных пятен.
Проявитель на фосфорную кислоту. Состоит из четырех компонентов: а) раствор молибденовокислого аммония (1 г соли в 8 мл воды); б) соляная кислота, концентрированная; в) хлорная кислота, 12н раствор; г) ацетон. Перечисленные компоненты смешивают в отношении 8:3:3:86 (перед употреблением). Указанной смесью опрыскивают хроматограмму, которую затем высушивают при комнатной температуре и освещают ультрафиолетовыми лучами (кварцевой лампой) в течение 30 мин. Соединения, в состав которых входят фосфатные группы, дают голубые пятна. Голубой оттенок фона можно снять парами аммиака.
Хроматографическая идентификация продуктов гидролиза ДНК- Реактивы и материалы: а) препарат ДНК', б) соляная кислота, 6 н раствор-, в) соляная кислота, 0,1 н раствор-, г) хроматографическая бумага ватман № 1 или FN1; д) стандартные растворы пуриновых и пиримидиновых оснований (см. с. 62); е) системы растворителей I и Н (см. с. 62); ж) проявитель азотнокислое серебро — двухромовокислый натрий; з) ртутный проявитель.
Гидролиз. 5—20 мг препарата ДНК вносят в пробирку, туда же прибавляют 3 мл 6 н раствора соляной
64
кислоты. Пробирку запаивают и помещают в сушильный шкаф при 100° С на 3 ч. Полученный гидролизат досуха испаряют в вакуумном эксикаторе (над твердым КОН). Остаток растворяют в таком количестве 0,1 н раствора соляной кислоты, чтобы получить 4°/огпый раствор (учитывая количество ДНК, взятой для гидролиза).
Хроматография. Берут четыре листа хроматографической бумаги размерами 12X40 см. На середину линии старта наносят по 5 мкл исследуемого гидролизата, а по сторонам — стандартные растворы пуриновых и пиримидиновых оснований. Раствор гуанина наносят только на лист № 4.
Хроматограммы № 1 и 2 ставят в сосуды с системой растворителей I, а № 3 и 4 — в сосуды с системой II. Хроматографию продолжают до тех пор, пока фронт растворителя не поднимется хотя бы на 20 см (в системе I это продолжается около 3 ч, в системе II — 22—24 ч).
Хроматограммы высушивают (см. выше) и просматривают в ультрафиолетовых лучах. Пятна азотистых оснований очерчивают графитовым карандашом, после чего хроматограммы № 1 и 2 обрабатывают ртутным проявителем, а листы № 3 и 4 — проявителем азотнокислое серебро —двухромовокислый натрий. Определяют Rf соединений и с помощью табл. 3 производят их идентификацию.
Хроматографическая идентификация продуктов гидролиза РНК. Реактивы и материалы-, а) препарат РНК-, б) соляная кислота, 1 н раствор-, ^хроматографическая бумага ватман № 1 или FN1; г) стандартные растворы пуриновых и пиримидиновых оснований; д) система растворителей II (см. с. 62); е) проявитель азотнокислое серебро — двухромовокислый натрий; ж) проявитель на фосфорную кислоту (см. с. 64); з) проявитель на а-диоловую группу: 1) иоднокислый калий (перйодат калия, КЮ4), насыщенный раствор (около 1%); 2) бензидин, 0,1 М раствор в 50°/о-ном метаноле. Раствор бензидина смешивают с ацетоном и 0,2 н раствором соляной кислоты в отношении 10 : 2 : 1; 3) бензидин, 0,1 М раствор в 50%,-ном метаноле, смешанный с 0,8 н раствором соляной кислоты в отношении 1: 1.
Хроматограмму опрыскивают раствором 1, а через 6 мин.— раствором 2. Соединения, имеющие а-диоловую группу, дают белые пятна на голубом фоне.
3 Д. К. Шапиро
65
С помощью этого же проявителя можно отличить кетозы и аминосахара от других соединений с а-диоловой группой. Для этого проявленную хроматограмму дополнительно опрыскивают раствором 3 и прогревают 1 мин. при 110°. Пятна кетоз и аминосахаров остаются белыми, тогда как остальных соединений принимают голубое окрашивание.
Гидролиз. 10 мг исследуемого препарата РНК вносят в пробирку с 1 мл 1 н раствора соляной кислоты. Пробирку запаивают и выдерживают 1 ч в сушильном шкафу при 100° С. Гидролизат охлаждают.
Хроматография. На листе хроматографической бумаги линию старта делят на три отрезка по 8 см. В каждом из них отмечают три точки. Отрезок А предназначен для идентификации пуриновых оснований гидролизата, В и С — для пиримидиновых оснований.
В среднюю точку каждого отрезка наносят по 5 мкл гидролизата, а в крайние — соответствующие стандартные растворы. Хроматографию проводят в системе II в течение 22—24 ч. За это время растворитель должен подняться по бумаге не менее чем на 20 см.
Хроматограмму высушивают на воздухе, просматривают в ультрафиолетовых лучах, пятна очерчивают графитовым карандашом, после чего бумагу разрезают на полоски, соответствующие отрезкам А, В и С. Отрезок А проявляют проявителем азотнокислое серебро — двухромовокислый натрий, В — проявителем на фосфорную кислоту, а отрезок С — проявителем на а-диолы.
Раздел III
ВИТАМИНЫ
Витамины — низкомолекулярные вещества, относящиеся к различным классам органических соединений. Они условно объединены в одну группу по признаку жизненной необходимости для организма. Витамины — непременные участники важнейших физиологических и биохимических процессов у животных, растений и микроорганизмов. Многие из них входят в состав простети-ческих групп двухкомпонентных ферментов или являются веществами, служащими для синтеза указанных соединений, активируют некоторые ферментные системы.
В основном витамины синтезируются растениями, с которыми главным образом и поступают в организм человека и животных. Некоторые из них образуются симбиотической микрофлорой пищеварительного тракта.
Недостаточное содержание витаминов в пище и кормах, а также нарушение их всасывания в организме ведут к развитию тяжелых нарушений обмена веществ, известных под названием гиповитаминозов и авитаминозов. Заболевание, возникающее в результате отсутствия того или иного витамина в пище, называют авитаминозом. При относительной недостаточности какого-нибудь витамина наблюдается гиповитаминоз.
Функции витаминов тесно связаны между собой, поэтому обычно наблюдаются полиавитаминозы или полигиповитаминозы. Авитаминозы встречаются весьма редко, чаще же наблюдаются гиповитаминозы как результат нерационального питания или перенесенных заболеваний. Гиповитаминозы могут иметь место и вследствие длительного приема некоторых лекарственных препаратов (сульфонамидов, антибиотиков).
з*
67
Избыточный прием ряда витаминов ведет к нарушениям обменных функций, известных под названием гипер-витаминозов.
В основу классификации витаминов положена их растворимость. По этому признаку витамины делят на две группы: а) витамины, растворимые в жирах и органических растворителях; б) витамины, растворимые в воде.
Растворимыми в жирах и органических растворителях являются: I) витамины группы А; 2) витамины группы D; 3) витамины группы Е; 4) витамины группы К; 5) непредельные (полиненасыщенные) жирные кислоты, имеющие две и больше двойных связей.
Растворимыми в воде являются: 1) витамины группы В: Bi—тиамин, В2 — рибофлавин, РР — никотинамид, В6 — пиридоксин, Н — биотин, пантотеновая и параами-нобензойная кислоты, холин, инозит, фолиевая кислота, В12 — цианкобаламин, В^ — пангамовая кислота; 2) витамин С (аскорбиновая кислота); 3) витамин Р (биофлавоноиды) .
ВИТАМИНЫ ГРУППЫ А
Общие сведения. К группе витаминов А относятся несколько веществ, близких по строению и физиологическим функциям.
Витамин А[ (ретинол) образуется при расщеплении желто-оранжевых w пигментов растений — каротиноидов — в печени и слизистой оболочке тонких кишок при участии фермента каротиназы
^СН3	сн	СНз
I I
дгс / \с-СН=СН-С=СН-СН^СН-С=СН-СН2ОН
|	Витамин (ретинол)
нгс\ус—сн3
сн2
Таким образом, каротиноиды являются провитаминами А. В вита!мин Ai превращаются а-, р- и у-каротины, криптоксантин и некоторые другие каротиноиды. Наиболее активен p-каротин, в состав молекулы которого входят два кольца р-ионона:
68
Н3С^С^СН3
с~сн=снс^снсн=снс=снсн=снсн=ссн=снсн=ссн=сн-с
CHj
С'
н2с
снг
В2('\1^/С~СН3 сн2
сн3
CHj
СН3
/3-каротин
н3с-с\уснг сн2
При расщеплении симметричной молекулы р-кароти-на освобождаются две молекулы витамина Аь
Молекула а-каротина состоит из одного 0-иононового кольца и одного кольца а-ионона. В состав молекулы у-каротина входят кольца р-ионона и псевдоионона. Вот почему при расщеплении а- и у-каротина образуется лишь одна молекула витамина Аь
Витамин А] содержится в печени и почках животных, печеночных жирах морских рыб (морского окуня, тунца, лосося, трески, камбалы и др.), мясе рыб (сельди, карпа и т. д.), молоке и молочных продуктах, яйцах.
Витамин Ai — циклический высокомолекулярный спирт. В его молекуле содержится кольцо р-ионона и боковая цепь, в состав которой входят два остатка изопрена и метоксильная группировка. По новейшим данным, наряду с алкоголем ретинолом обнаружены витамин Ai — альдегид, называемый ретиналем, и витамин Ai — ретиновая кислота.
Витамин А2 (дегидроретинол) найден в печени пресноводных рыб. Он отличается от витамина Ai наличием добавочной двойной связи в кольце р-ионона:
Н3(К „СН3	сн3	СН3
/\	।	।
\с-сн=-сн-с=сн-сн=сн~с=ск-сн2он
|	Витании Д2 (дегидроретинол)
нс\)с-сн3
сн
Провитамин А2 неизвестен. Как и у витамина Аь известны три формы витамина А2: спирт — дегидроретинол, альдегид — дегидроретиналь и дегидроретиновая кислота.
69
В печени млекопитающих найдено вещество, названное витамином А3. Соединения, характеризующиеся свойствами витамина А, выделены также из печени кита (китол), жира акулы и т. д.
Суточные нормы потребности человека в витамине А составляют: 1) для взрослых—1,5 мг; 2) для беременных и кормящих женщин — 2 мг; 3) для детей: до 1 года — 0,5 мг, от 1 до 3 лет — 1мг, от 4 до 6 лет — 1 мг, от 7 до 15 лет—1,5 мг; 4) для юношей и девушек (от 16 до 22 лет) — 1,5 мг.
При потреблении каротина норма повышается в два раза.
Качественные реакции на витамины группы А. Р е а к-ция с треххлористой сурьмой (Карр — Прайса). При взаимодействии витамина А с треххлористой сурьмой образуются соединения, обладающие синей окраской. Предполагают, что при протекании этой реакции имеет место водоотнимающее действие треххлористой сурьмы и образование окрашенных продуктов конденсации.
Реактивы-, а) треххлористая сурьма (SbCl3), 21— 23%-ный раствор в хлороформе. Хлороформ промывают 2—3 раза равными объемами дистиллированной воды, воду сливают и хлороформ для высушивания взбалтывают с прокаленным сернокислым натрием или углекислым калием, затем отделяют от соли и перегоняют (в затененном месте, избегая прямого действия света). Первые 10—15 мл дистиллята отбрасывают. Перегнанный хлороформ хранят в склянке оранжевого стекла с притертой пробкой, на дно которой насыпают немного прокаленного сернокислого натрия или углекислого калия (для поглощения следов воды). Кристаллы треххлористой сурьмы промывают перегнанным хлороформом до тех пор, пока растворитель не перестанет окрашиваться, после чего готовят насыщенный при комнатной температуре (20° С) раствор. Хлороформный раствор треххлористой сурьмы хранят в склянке оранжевого стекла с притертой пробкой. Он пригоден к употреблению через 6—8 ч после приготовления. Срок годности — две недели; б) рыбий жир, медицинский. Берут только свежий препарат, так как старый или прокипяченный рыбий жир практически лишены витамина А; в) масляный раствор ретинола-аце-тата (витамина Ai)-, г) хлороформ.
70
Несколько капель рыбьего жира или одну каплю масляного раствора ретинола-ацетата растворяют в 1 мл хлороформа (в тщательно высушенной пробирке). К 1 капле раствора прибавляют 5 капель хлороформного раствора треххлористой сурьмы. Появляется неустойчивое голубое или синее окрашивание (в зависимости от концентрации ретинола в растворе).
Реакция с серной кислотой. Под воздействием концентрированной серной кислоты растворы витамина А приобретают сине-фиолетовую окраску, возникновение которой связано с водоотнимающим действием реактива. Окраска является нестойкой и быстро сменяется буроватой, вследствие образования липохрома.
Реактивы-, а) рыбий жир, медицинский. Употребляют только свежий препарат (см. предыдущую работу); б) серная кислота, концентрированная (р2о= 1,836); в) хлороформ.
1 каплю рыбьего жира растворяют в 20—25 каплях хлороформа, к раствору добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты и встряхивают. Появляется сине-фиолетовое окрашивание, которое вскоре переходит в красновато-бурое и бурое.
Определение содержания каротинов в растительных объектах (по прописи Всесоюзного научно-исследовательского института растениеводства). Каротины экстрагируют ацетоном или этиловым спиртом и выделяют из смеси пигментов на хроматографической бумаге. Каротины элюируют из хроматограммы петролейным эфиром или низкокипящим бензином и их содержание определяют путем колориметрирования.
Реактивы и материалы: а) петролейный эфир (температура кипения 60—70° С) или бензин (температура кипения 70—80° С); б) ацетон или этиловый спирт, 95—96%-ный; в) хроматографическая бумага марки «быстрая» Ленинградской бумажной фабрики им. Володарского (вес 1 дм2=0,85 г); г) углекислый натрий или углекислый кальций-, д) азобензол, перекристаллизованный из спирта и высушенный. 145 мг препарата растворяют в 100 мл 96%-ного этилового спирта (в мерной колбе). Из указанного основного раствора готовят рабочий, разбавляя его спиртом в 10 раз (также в мерной колбе на 100 мл). 1 мл рабочего раствора азобензола соответствует 0,00235 мг каротина. Растворы (основной
71
и рабочий) хранят в темном месте; е) стеклянный или кварцевый песок.
Приборы и посуда-, а) концентрационный колориметр или колориметр-нефелометр; б) стеклянные сосуды цилиндрической формы, высота 25—30 см, диаметр 13—15 см, с притертыми пробками или крышками, или батарейные стаканы с притертыми стеклянными пластинками; в) ступки фарфоровые-, г) мерные цилиндры на 100 мл с притертыми пробками.
Навеску растительного материала (1—10 г в зависимости от предполагаемого содержания каротинов) растирают в ступке с ацетоном или 95—96%гным спиртом, добавив немного стеклянного или кварцевого песка и щепотку углекислого натрия или химически чистого мела (углекислого кальция) для нейтрализации кислот. Ацетон или спирт приливают небольшими порциями (по 10— 15 мл). Экстрагирование повторяют несколько раз. Вытяжки сливают в мерный цилиндр на 100 мл. Извлечение продолжают до получения бесцветного экстракта. Раствор в мерном цилиндре доводят ацетоном или спиртом до определенного объема (50—60—75—100 мл).
Хроматографическую бумагу нарезают на полоски длиной 25 см и шириной 15 см.
0,5—1 мл ацетонового (или спиртового) раствора пигментов наносят (в виде полосы) на полоску хроматографической бумаги на расстоянии 4 см от ее нижнего края. Бумагу подсушивают на воздухе (лучше всего с помощью фена) в затененном .месте и затем сворачивают в однослойную трубку, верхний конец которой сшивают или скрепляют пластмассовой скрепкой. Трубку ставят на дно стеклянного сосуда, куда заранее был налит петролейный эфир или низкокипящий бензин слоем в 2—3 см (он должен быть ниже места нанесения раствора пигментов на бумагу). Через 20—30 мин. бумажную трубку вынимают из сосуда. Вырезают полоску бумаги, окрашенную в желто-оранжевый цвет (она находится сразу же за фронтом подъема растворителя), измельчают ее (нарезают) в стеклянный бюкс или стаканчик и извлекают каротины небольшими порциями (по 1—2 мл) петролейного эфира или бензина, повторяя экстрагирование до получения бесцветного раствора. Раствор каротинов доводят этими же растворителями до определенного объема (например, 10—20 мл) и колориметрируют, употребляя в качестве
72
стандартного рабочий раствор азобензола (14,5 мг в 100 мл). Содержание каротина (в миллиграммах на 100 г продукта) х рассчитывают по формуле
_ 0,00235 • lOOt»!^ v2nh2 ’
где Vi — объем ацетонового (или спиртового) экстракта пигментов в мерном цилиндре, мл; и2 — объем ацетонового (или спиртового) экстракта, нанесенный на бумагу, мл; и3— объем раствора каротинов в петролейном эфире или бензине, взятый для колориметрирования, мл; hi — показания шкалы колориметра для стандартного раствора; h2 — показания шкалы колориметра для исследуемого раствора (среднее из 5—6 определений) ; п — навеска растительного материала, г.
При колориметрировании каротинов пользуются синим светофильтром.
Спектрофотометрический метод определения содержания витамина Ai (ретинола) в рыбьем жире (по Государственной Фармакопее СССР, изд. 10-е, 1968). Реактивы и материалы-, а) рыбий жир тресковый (медицинский)-, б) едкое кали, 50%гНый водный раствор-, в) этиловый спирт, 95%-ный, не содержащий альдегидов. Для проверки на альдегиды к 10 мл спирта добавляют 10 мл воды, 1 мл 2%-ного раствора азотнокислого серебра и (по каплям) раствор аммиака до исчезновения образующегося вначале осадка. Смесь ставят в темное место на 12 часов. Она должна оставаться бесцветной и прозрачной: г) этиловый спирт абсолютный, 99,8%<-ный (по объему). Для получения его к 95%,-ному спирту-ректифи-кату прибавляют негашеную известь в таком количестве, чтобы куски ее выступали над поверхностью жидкости в колбе. Соединяют колбу с обратным холодильником, снабженным хлоркальциевой трубкой с негашеной известью, осторожно нагревают на водяной бане (при температуре не выше 75° С) в течение часа и затем оставляют стоять на два дня. Через два дня отгоняют спирт в колбу Бунзена, которую плотно соединяют с холодильником. Отводную трубку колбы соединяют с хлоркальциевой трубкой. Концентрация такого спирта составляет около 99,5%. Для более полного удаления влаги к 99,5 %-ному спирту добавляют твердый едкий натр или едкое кали (10 г на 1 л) и перегоняют, отбрасывая на
73
чальную и конечную фракции; д) диэтиловый эфир; е) сернокислый натрий, прокаленный. Сохраняют в сосуде с притертой пробкой.
Приборы, аппаратура и по с у д а: а) спектрофотометр СФ-4 или СФ-16; б) делительные воронки; в) колбы конические емкостью 100 мл; г) колбы для отгонки; л) баня водяная; е) баллон с азотом.
В конической колбе емкостью 100 мл отвешивают на аналитических весах около 1 г жира, прибавляют 30 мл этилового спирта, не содержащего альдегидов, и 3 мл 50%-ного раствора едкого кали. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и ставят на 30 мин. в горячую водяную баню (85—90° С). После омыления колбу охлаждают, добавляют 50 мл воды и содержимое переносят в делительную воронку. Неомыляемую фракцию три раза экстрагируют диэтиловым эфиром, при этом первый раз берут 50 мл его, а во второй и третий — по 30 мл. Все эфирные вытяжки сливают в другую делительную воронку и несколько раз промывают водой до полного удаления остатков щелочи (проба с фенолфталеином). Для обезвоживания к промытой эфирной вытяжке добавляют 8 г прокаленного сернокислого натра и ставят на 30 мин. в темное место, время от времени встряхивая, после чего фильтруют через сухой бумажный фильтр в колбу для перегонки. Сернокислый натрий на фильтре несколько раз промывают диэтиловым эфиром (берут каждый раз по 10 мл), который фильтруют в ту же колбу. Эфир отгоняют на водяной бане при температуре до 40° С (если отгонку ведут в токе азота, температуру бани можно повысить до 47—50°С).
Примечание. Отгонку эфира рекомендуется вести в токе азота, учитывая легкую окисляемость ретинола; в студенческой ра боте, рассчитанной на ознакомление с методом, отгонку допускается проводить на воздухе (под тягой!), соблюдая противопожарные мероприятия.
После отгонки эфира неомыляемый остаток растворяют в абсолютном этиловом спирте до получения раствора, содержащего в 1 мл 8 международных единиц (ME) витамина А (при изготовлении раствора учитывают, что в 1 г невитаминизированного рыбьего жира должно содержаться не менее 350 ME витамина А; в 1 г витаминизированного рыбьего жира содержится 1000 ME
74
ретинола). Изменяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длинах волн 311, 324,5 и 334 нм.
Содержание витамина А в международных единицах х в 1 г жира вычисляют по формуле
£>испрУ _ _ <2100 ' 185°’
где £>Испр=7£>з24,5—2,912Дзц—4,088£>зз4; £>324,5—оптиче ская плотность раствора при длине волны 324,5 нм; £>3ц, £>334 — то же при длинах волн 311 и 334 нм; V — разведение, мл; Q — навеска жира, г; 1850 — коэффициент перевода в международные единицы.
Примечание. Одна международная единица витамина А равна 0,3 мкг.
ВИТАМИНЫ ГРУППЫ D (КАЛЬЦИФЕРОЛЫ)
Общие сведения. Витамины группы D являются веществами стероидной природы. Наибольшее практическое значение имеют витамины D2 (эргокальциферол) и D3 (холекальциферол).
Витамин D2 образуется из эргостерина при облучении ультрафиолетовыми лучами. Значительные количества эргостерина найдены в дрожжах и спорынье (содержится также в зеленых растениях). Процесс превращения эргостерина в эргокальциферол требует затраты тепловой энергии и протекает при температуре около 80° С:
С/А
сн—сн=сн—сн—сн—сн3
I сн3 сн3 сн3
СН3
\ )----- Эргостерин
сн-сн=сн-сн-сн-сн3
сн3 СН3 сн3
Витании D2 (эргокальциферол)
75
Витамин D3 образуется при облучении ультрафиолетовыми лучами 7-дегидрохолестерина, содержащегося в подкожной жировой клетчатке. Таким образом, эргостерин и 7-дегидрохолестерин — провитамины D2 и D3.
CHj
<---СН-СН2-СНг-СНг-СН-СН3
СП3
7 - Оегидрохолестерин
Ctij
— сп—сн2-сн2—сн2-сн-сн3
СН,
СПз
Bumai-IUHDj (х охвкахьцисрерол)
Провитаминами D4, D3 и D6 являются 22, 23-дигидро-эргостерин, 7, 8-дегидроситостерин и 7, 8-дегидростигма-стерин. Они содержатся в дрожжах, масле пшеничных зародышей, соевом масле.
Витамины D2 и D3 характеризуются примерно одинаковой биологической активностью, у других витаминов группы D она значительно слабее (особенно у облученного 7, 8-дегидростигмастерина).
Источниками витамина D в питании человека являются молоко и молочные продукты (особенно сливочное масло), яичный желток, печеночный рыбий жир. Особенно богаты витамином яйца, полученные от кур, находящихся на пастбищном содержании.
Норму потребности в витамине D для детей до 1 года принимают в среднем в 800 ME, старше 1 года — 400 ME, беременных и кормящих женщин — 400—800 ME. Одна международная единица равна 0,025 микрограмма эргокальциферола или холекальциферола.
Качественные реакции на витамины группы D. Р е а к-ция с анилином. Реактивы: а) рыбий жир, витаминизированный-, б) анилин; в) соляная кислота, концентрированная.
76
К 1 мл витаминизированного рыбьего жира прибавляют 4—5 мл анилина и 0,5 мл концентрированной соляной кислоты. Содержимое пробирки нагревают до кипения и кипятят 20—30 с. Жидкость принимает красную окраску.
Реакция с треххлористой сурьмой. Реактивы-, а) треххлористая сурьма, 21—23%-ный раствор в хлороформе (приготовление — см. «Качественные реакции на витамины группы А»); б) уксусный ангидрид; в) рыбий жир, витаминизированный, 10%-ный раствор в хлороформе.
В сухую пробирку вносят 3—5 мл хлороформного раствора рыбьего жира, добавляют 8—10 капель уксусного ангидрида и столько же хлороформного раствора треххлористой сурьмы. Жидкость окрашивается в желтый или желто-оранжевый цвет.
Реакция с бромом. Реактивы: а) рыбий жир, витаминизированный; б) раствор брома в хлороформе (1:60).
На часовом стекле смешивают 2—3 капли рыбьего жира и 3—4 капли хлороформного раствора брома. Через некоторое время появляется зеленое или зеленовато-голубое окрашивание.
ВИТАМИНЫ ГРУППЫ Е (ТОКОФЕРОЛЫ)
Общие сведения. К группе витаминов Е относятся несколько соединений, в основе строения которых лежит бициклическое ядро хромана, связанное с остатком спирта фитола.
Хронан
Как видно, хроман состоит из бензольного и пиранового циклов. В зависимости от количества метильных групп и их расположения различают а-, 0-, у-, 0-. е-, g- и тртокофе-ролы. Наибольшей витаминной активностью обладает
77
ct-токоферол, у которого бензольное кольцо является полностью замещенным:
Токоферолы — вещества, довольно устойчивые к действию высокой температуры и кислорода, но легко окисляемые азотной кислотой и другими энергичными окислителями. Разрушаются они также под действием ультрафиолетовых лучей. Токоферолы обладают ценным свойством предохранять от окисления витамин А, каротиноиды и ряд других веществ, они являются антиоксидантами.
Токоферолами богаты растительные масла, например соевое, подсолнечное, кунжутное, пшеничных зародышей, сафлоровое, арахисовое, хлопковое, льняное, рапсовое. Содержатся они также во многих продуктах растительного и животного происхождения: яйцах, печеночном жире трески, молоке и сливочном масле, печени, говядине, кочанном салате, шпинате, семенах арахиса, плодах шиповника, белой смородиньгй др. Суточная потребность человека в витаминеЕ составляет от 10 до 30 мг а-токо-ферола.
Качественные реакции на токоферолы. Реакция с азотной кислотой. Реагируя с сильными окислителями, например с концентрированной азотной кислотой, а-токоферол превращается в о-токоферилхинон, который затем образует соединение, окрашенное в красный или желтовато-красный цвет.
78
Реактивы: а) масляный концентрат витамина Е, 0,15%-ный раствор в абсолютном этиловом или бутиловом спирте-, б) азотная кислота, концентрированная.
К нескольким каплям спиртового раствора витамина Е осторожно добавляют 8—10 капель концентрированной азотной кислоты и пробирку слегка встряхивают. Через 1—2 мин. содержимое пробирки приобретает красное или желтовато-красное окрашивание.
Реакция протекает бурно, поэтому рекомендуется азотную кислоту прибавлять медленно, по стенке пробирки и проводить реакцию в вытяжном шкафу.
Реакция с хлорным железом. Токоферолы окисляются хлорным железом, которое при этом восстанавливается до FeCl2. Ион Fe2+, реагируя с ортофенантролином, образует комплексный ион Fe (C12H8N2)32+, благодаря которому раствор окрашивается в красный цвет.
При окислении токоферолов хлорным железом происходит разрыв пиранового кольца с образованием у-оксиалкилхинона:
СН}	(И,
сС-тоыюерм	Г-оксиалкилхинон
Реактивы-, а) масляный концентрат витамина Е, 0,15%-ный раствор в абсолютном этиловом спирте; б) хлорное железо, 0,2%-ный спиртовой раствор (хранят в темном месте); в) ортофенантролин, 0,5%-ный спиртовой раствор.
К 1—2 мл спиртового раствора концентрата витамина Е добавляют 1 мл раствора ортофенантролина и по каплям раствор хлорного железа до появления красного окрашивания.
ВИТАМИНЫ ГРУППЫ к (ФИЛЛОХИНОНЫ)
Общие сведения. Факторы свертывания крови — витамины группы К — являются производными 2-метил-1,4-нафтохинона:
79

2 метил --1, 4-»aipmoxunott
Витамин Ki синтезируется в хлоропластах зеленых растений. Составные части его молекулы — 2-метил-1,4-нафтохинон и остаток спирта фитола:
сн3	CHj	СН}
I	I	।
—сн2-сн=с-(сн2)3- cn- (сн2)}-сн-сн}
Витамин Kt
Много витамина Ki содержится в белокочанной и цветной капусте, томатах (особенно зеленых), шпинате, тыкве, плодах шиповника, листьях крапивы, люцерне, петрушке, хвое сосны и ели, листьях каштана, моркови. Витамин Ki найден и в животных продуктах — телятине, говядине, свинине, почках, печени.
Витамин Кг синтезируется микроорганизмами — симбионтами, находящимися в кишечнике. Выделен он также из гниющей рыбной муки. По химическому строению представляет собой 2-метил-3-дифарнезил-1,4-нафто-хинон:
Витамин К2
Витаминная ценность витамина Кг ниже, чем витамина Кь и составляет примерно 50%> активности последнего.
5»
*
1
I
у
1
80
Многие производные 2-метил-1,4-нафтохинона характеризуются антигеморрагической активностью. Считают, что производные 2-метил-1,4-нафтохинона входят в состав простатической группы ферментной системы, катализирующей процессы биосинтеза протромбина и тромбопластина, играющих большую роль в процессе свертывания крови.
Получен ряд синтетических аналогов витамина К, обладающих отчетливо выраженным антигеморрагическим действием. Таким, например, является водорастворимое бисульфитное соединение викасол, синтезированное А. В. Палладиным и нашедшее широкое применение в медицине:

NaHS03-5Hz0
Викасол
Викасол представляет собой бисульфитное производное метинона — 2-метил-1,4-нафтохинона.
Качественные реакции на 2-метил-1,4-нафтохинон.
Реакция с анилином. 2-метил-1,4-нафтохинон (метинон) с анилином образует 2-метил-З-фениламино-1,4-нафтохинон, обладающий красной окраской:
^СП}
I +
СНЛ
метанон
Ш12
Анилин
2-нетил-J-фениламино -1,4- нафтохинон
I— CHj
Продукт восстановления 2-метил-- 1,4-нафтохинона
Реактивы: а) викасол, 0,1%-ный водный раствор, или метинон, 0,2%-ный раствор в этиловом спирте; б) анилин.
К 1 мл раствора викасола или метинона добавляют 6—8 капель анилина и взбалтывают. Содержимое пробирки приобретает красную окраску.
Реакция с цистеином. Реактивы: а) викасол, 0,1%-ный водный раствор; б) цистеин, О,ОЗ°/о-ный раствор; в) едкий натр, 5%-ный раствор.
К 1 мл раствора викасола добавляют столько же раствора цистеина и 5—6 капель раствора едкого натра. Развивается желтое или лимонно-желтое окрашивание.
ВИТАМИН С (АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА)
Общие сведения. Антицинготный витамин С — аскорбиновая кислота — по химическому составу является лактоном 2,3-диенол-гулоновой кислоты. Аскорбиновая кислота — окисленное производное шестиатомного спирта сорби-
I I
та — характерна наличием диенольной группы —С—С—, которая обусловливает способность витамина С легко подвергаться окислению с одновременным восстановлением других соединений.
ин	он
I	I
-.-с
ноне-НС	с—о
Варианты структурной формулы аскорбиновой кислоты
Витаминной активностью обладает лишь /.-аскорбиновая кислота; Д-аскорбиновая кислота физиологически инертна.
/.-аскорбиновая кислота — бесцветные кристаллы, легко растворимые в воде, сильно кислого вкуса. Нерастворима в бензоле, хлороформе, диэтиловом эфире, жирах. Водные растворы аскорбиновой кислоты имеют кислую реакцию. Аскорбиновая кислота легко окисляется, образуя дегидроаскорбиновую кислоту, сохраняющую витаминную ценность:
-2Н ---*-
+2Н
С
О
о—с I О о==с
НС
носи
сн2он
^-аскорбиМая £-Оегиброаскорби.~ кислота	новая кис/юта.
Дегидроаскорбиновая кислота — соединение весьма неустойчивое и при восстановлении снова переходит в L-аскорбиновую кислоту. Это свойство витамина С определяет его активное участие в окислительно-восстановительных процессах. Аскорбиновая и дегидроаскорбиновая кислоты — активные компоненты процессов переноса электронов. При pH 7 (и выше) дегидроаскорбиновая кислота необратимо окисляется в /.-дикетогулоновую кислоту, которая уже не обладает свойствами витамина С. Витамин С принимает участие во многих ферментативных реакциях, являясь активатором или ингибитором ряда энзиматических систем.
83
HOCH
снгон
IC-OesuBpoacKopDii-новая кислота
неон I HOCH
снгон
И-дикетогумно-Вая кис/юта
Окисление аскорбиновой кислоты легко происходит в нейтральной и щелочной среде, оно катализируется ионами тяжелых металлов (меди, железа, серебра). Глюкоза, глютаминовая кислота, флавоноиды, креатинин, тиомочевина стабилизируют аскорбиновую кислоту в растворах. Аскорбиновая кислота обладает сильными восстанавливающими свойствами: соли окислов металлов восстанавливаются ею в соли закиси, а в щелочной среде-соли меди, ртути, серебра, золота—до металлов. Нитраты восстанавливаются в нитриты, арсенаты — в арсениты, метиленовая синь и 2,6-дихлорфенолиндофе-нол — в бесцветные соединения (лейкоформы). В кислой среде восстанавливающие свойства аскорбиновой кислоты выражены значительно слабее.
Следует подчеркнуть, что кислоты стабилизируют аскорбиновую кислоту в растворах.
Суточная потребность человека в витамине С зависит от возраста, физиологического состояния и тяжести выполняемой работы и составляет 70—120 мг для взрослых и 30—70 мг для детей.
Исследование восстанавливающих свойств аскорбиновой кислоты. Легко вступая в окислительно-восстановительные реакции, аскорбиновая кислота восстанавливает метиленовую синь, 2,6-дихлорфенолиндофенол, железосинеродистый калий, азотнокислое серебро и другие вещества. Это свойство положено в основу качественных реакций на витамин С.
84
Реакция с метиленовой синью. Аскорбиновая кислота на свету восстанавливает метиленовую синь в бесцветное соединение (лейкоформу), окисляясь в дегидроаскорбиновую кислоту
Реактивы: а) сок картофеля или капусты. Клубень картофеля или часть кочана капусты натирают на терке из нержавеющей стали. Растертую массу отжимают через марлю, сложенную в два слоя; б) метиленовая синь, О,О1°1о-ный раствор; в) натрий углекислый, 5°10-ный раствор.
К 1 мл свежеотжатого сока картофеля или капусты добавляют 1—2 капли раствора метиленовой сини и 2 — 3 капли раствора соды. Пробирку слегка подогревают. Наблюдают обесцвечивание синей окраски.
Реакция с 2,6 - дихлорфенол и ндофено-л о м. Аскорбиновая кислота окисляется 2,6-дихлорфено-линдофенолом в дегидроаскорбиновую кислоту, а сам ре
85
актив восстанавливается при этом в бесцветное соединение (лейкоформу):
2.6 --Оих/1орфеьолинвофено/1 (синяя окраска)
Реактивы: а) сок капусты, или картофеля (приготовление — см. предыдущую работу); б) 2,6-дихлорфе-нолиндофенол, натриевая соль, 0,001 н раствор (см. «Количественное определение витамина С в растительном сырье»); в) соляная кислота, 2°/0-ный раствор.
В пробирку наливают 1 мл сока капусты или картофеля, прибавляют 3—4 капли 2%-ного раствора соляной кислоты и по каплям раствор 2,6-дихлорфенолиндофено-ла. Реактив будет обесцвечиваться до тех пор, пока вся аскорбиновая кислота не окислится в дегидроаскорбино-вую, после чего первая же капля раствора окрасит жидкость в розовый цвет, так как 2,6-дихлорфенолиндофенол уже не восстанавливается.
Реакция с железосинеродистым калием. Аскорбиновая кислота, окисляясь, восстанавли-
86
вает железосинеродистый калий КзРе(СМ)б до железистосинеродистого K4Fe(CN)6, который с ионом трехвалентного железа образует в кислой среде берлинскую лазурь Ре4[Ре(СМ)6]з:
+ 2K}Fe(CN)6+2KUH^*~
+ 2K4Fe(CN)6+2H2l}
3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 ~^Fe4[Fe(CN)b]3 + 12KCI
Берлинская лазурь
Реактивы: а) сок капусты или картофеля (см. выше); б) железосинеродистый калий, 5°/0-ный раствор; в) едкое кали, 5%-ный раствор; г) соляная кислота, 10%-ный раствор; д) хлорное железо, 1%-ный раствор.
К 1 мл сока капусты или картофеля прибавляют 2 капли раствора едкого кали, столько же раствора железосинеродистого калия и встряхивают пробирку, после чего добавляют 6—8 капель 10%-ного раствора соляной кислоты и 1—2 капли раствора хлорного железа. Выпадает синий или зеленовато-синий осадок берлинской лазури.
Количественное определение витамина С в растительном сырье (по методике Всесоюзного научно-исследовательского института растениеводства). Определение со
87
держания витамина С основано на способности аскорбиновой кислоты к окислению в дегидроаскорбиновую. 2,6-Дихлорфенолиндофенол, окисляя аскорбиновую кислоту, восстанавливается в бесцветное соединение (лейко-форму). (Уравнение реакции см. в работе «Исследование восстанавливающих свойств аскорбиновой кислоты».)
Раствор натриевой соли 2,6-дихлорфенолиндофенола (реактив Тильманса) в нейтральной и щелочной среде обладает синей окраской, в кислой среде принимает розовое окрашивание.
Реактивы: а) соляная кислота, 1^-ный раствор; б) щавелевая кислота, 1°1о-ный раствор; в) серная кислота, 2°/0-ный раствор; г) аскорбиновая кислота, кристаллическая; д) иодистый калий (KI), кристаллический. Пожелтевший препарат непригоден; е) крахмал растворимый, 1°10-ный раствор; ж) иодноватокислый калий (KJO3), 0,001 н раствор. Химически чистую соль высушивают 2 ч при 100—102°. Навеску 3,568 г высушенной соли растворяют в мерной колбе емкостью 1 л. Из полученного децинормального раствора готовят миллинор-мальный: 10 мл раствора пипеткой переносят в мерную колбу на 1 л и доводят водой до метки. 0,001 н раствор готовят по мере надобности; з) 2,6-дихлорфенолиндофенол, натриевая соль (краска Тильманса), 0,001 н раствор. 60—65 мг сухой краски (навеска на технических весах) переносят в мерную колбу емкостью 200 мл, добавляют 100—125 мл дистиллированной воды и 4—5 капель 0,01 н раствора едкого натра, взбалтывают в течение 10— 15 мин. и оставляют на 6—8 ч (можно на ночь), после чего раствор доводят водой до метки и фильтруют через бумагу в склянку из темного стекла. Хранят в темном и прохладном месте (лучше всего — в холодильнике). Раствор годен 6—7 дней, титр его проверяют ежедневно.
Аппаратура и посуда: а) микробюретки емкостью 1 и 5 мл; б) пипетки Мора емкостью 5 и 10 мл; в) мерные колбы емкостью 100, 200 и 1000 мл; г) конические колбы емкостью 50—100 мл; д) фарфоровые чашки; е) ступка фарфоровая с пестиком; ж) ножи из нержавеющей стали или хромированные; з) воронки; и) весы технохимические на 200 г.
Установка титра раствора 2,6- дихлорфенол индофенола по аскорбиновой к и с
88
лоте (по С. М. Прокошеву). В 50 мл 2%-ного раствора серной кислоты растворяют несколько кристаллов аскорбиновой кислоты (примерно 1—1,5 мг, взвешивать не надо). 5 мл раствора титруют из микробюретки приготовленным (приблизительно 0,001 н) раствором 2,6-дихлор-фенолиндофенола до появления розового окрашивания. Снова берут той же пипеткой в другую колбочку 5 мл раствора аскорбиновой кислоты, добавляют несколько кристалликов йодистого калия (КД), 2—3 капли 1 Ясного раствора крахмала и титруют 0,001 н раствором иодноватокислого калия (KJO3) до появления голубого окрашивания.
Титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола х вычисляют (при расчетах принимают во внимание, что 1 мл 0,001 н раствора КЮ3 эквивалентен 0,088 мг аскорбиновой кислоты) по формуле
0,0884 X— в ,
где А — количество миллилитров 0,001 н раствора иодноватокислого калия, израсходованное на титрование раствора аскорбиновой кислоты; В — количество миллилитров раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшее на титрование.
Таким образом узнают, скольким миллиграммам аскорбиновой кислоты соответствует 1 мл приготовленного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола.
Титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола проверяют перед самым определением содержания витамина С в растительном материале.
Подготовка материала к исследова-н и ю. При исследовании картофеля из каждого клубня вырезают сектор наподобие лимонной дольки, чтобы захватить все слои клубня. При анализе кочанной капусты срез делают через все слои кочана. Томаты и другие сочные плоды разрезают по вертикальной оси на 4—6 частей и для исследования берут одну часть.
Пробы, взятые из нескольких клубней, кочанов, плодов, составляют среднюю пробу.
Среднюю пробу плодов, овощей, листьев быстро разрезают ножом из нержавеющей стали или хромированным (на стеклянной пластинке или в фарфоровой чашке).
89
Мелкие плоды и ягоды растирают в ступке. При исследовании вишен, черешен, слив удаляют косточки. Листья разрезают на кусочки. Из измельченного (разрезанного или растертого) и тщательно перемешанного материала берут две параллельные навески на технических весах в стаканчики или на часовые стекла. В навесках определяют содержание аскорбиновой кислоты.
В зависимости от предполагаемого содержания витамина С навески должны составлять 5—2Q г.
Ход анализа. Навеску в ступке сразу же заливают 20 мл 1%-ного раствора соляной кислоты и быстро растирают до образования однородной кашицеобразной массы. Для облегчения процесса растирания можно добавить немного хорошо промытого и высушенного стеклянного порошка.
Растертую гомогенную массу при помощи воронки и стеклянной палочки переводят в мерную колбу на 100 мл. Ступку и пестик несколько раз ополаскивают 1%-ным раствором щавелевой кислоты, который вливают в ту же мерную колбу. Содержимое колбы доводят до метки той же 1%-ной щавелевой кислотой. Колбу закрывают пробкой, тщательно взбалтывают в течение 1—2 мин. и оставляют на 8—10 мин., после чего ее содержимое фильтруют через сухой бумажный фильтр или центрифугируют.
Смесь соляной и щавелевой кислот не только извлекает из тканей аскорбиновую кислоту, но и повышает ее устойчивость в вытяжке.
В 2—3 конические колбы на 50—100 мл пипеткой вносят по 10 мл фильтрата, который титруют из микробюретки раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розовой окраски, удерживающейся в течение 0,5— 1 мин. Параллельно проводят не менее двух-трех титрований.
Одновременно проводят контрольный опыт для проверки восстанавливающих свойств растворов соляной и щавелевой кислот, которые применялись для извлечения витамина С. В мерную колбу на 100 мл вносят 20 мл 1%-ного раствора соляной кислоты и доводят до метки 1%-ным раствором щавелевой кислоты. Содержимое колбы перемешивают и пипеткой берут для титрования две пробы по 10 мл, которые титруют тем же раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розового окра
90
шивания. Полученную поправку (так называемую поправку на реактивы) вычитают из результатов титрования опытного раствора. Величина ее обычно составляет 0,05—0,1 мл.
Содержание витамина С (в миллиграммах на 100 г растительного материала) х рассчитывают по формуле
___(Л — а)Т100В нм ’
где А — количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованное на титрование опытного раствора (среднее из 2—3 титрований), мл; а — количество раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованное в контрольном опыте (поправка на реактивы), мл; Т — титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола по аскорбиновой кислоте, мг; В — общий объем вытяжки (100 мл); н — навеска растительного материала, г; м — количество фильтрата, взятое для титрования, мл.
Определение витамина С в окрашенных объектах. Титрование раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола вытяжек из окрашенных плодов и овощей (например, вишен, черной смородины, свеклы и т. д.) связано со значительными трудностями, так как зачастую невозможно проследить за изменением окраски экстракта и определить конец титрования.
Вытяжки из окрашенных плодов и овощей рекомендуется титровать в присутствии хлороформа или дихлорэтана. Метод неприменим в случае наличия в сырье хлорофилла, ксантофиллов и других зеленых и желтых пигментов.
Экстрагирование витамина С из растительного материала производят, как было указано в предыдущей работе.
В 2—3 большие пробирки (длина 150 мм, диаметр 20—25 мм) пипеткой вносят по 5—10 мл окрашенной вытяжки, добавляют по 5—6 мл чистого хлороформа или дихлорэтана, после чего титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола, перемешивая жидкость стеклянной палочкой с загнутым концом. Титрование заканчивают при появлении розового окрашивания слоя органического растворителя.
91
Параллельно проводят контрольный опыт, титруя раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола смесь 1%-ных растворов соляной и щавелевой кислот (1 : 4).
Содержание витамина С рассчитывают по формуле, приведенной в предыдущей работе.
БИОФЛАВОНОИДЫ (ВЕЩЕСТВА Р-ВИТАМИННОГО ДЕЙСТВИЯ)
Общие сведения. К веществам Р-витаминного действия относится ряд соединений фенольной природы, основное физиологическое действие которых заключается в уменьшении проницаемости и повышении прочности стенок кровеносных капилляров. Они способствуют усвояемости аскорбиновой кислоты в организме человека и животных. Биофлавоноиды принимают активное участие в окислительно-восстановительных процессах, обладают антиокислительными свойствами, задерживая, в частности, окисление гормона мозгового слоя надпочечников адреналина. Вещества Р-витаминного действия инактивируют фермент гиалуронидазу, которая катализирует процесс распада гетерополисахарида — гиалуроновой кислоты. Гиалуроновая кислота входит в состав основного вещества соединительной ткани.
Биофлавоноиды угнетают также активность холинэстеразы, сукциноксидазы и некоторых других ферментов. Считают, что в основе тормозящего действия флавоноидов на ферментативную активность лежат реакции их с белковыми компонентами биологических катализаторов.
В основе строения веществ Р-витаминного действия лежит ядро 2-фенилхромана — флавана
Флаван
В растениях встречаются многочисленные производные 2-фенилхромана, например флавоны—производные 2,3-дегидрофлавана.
92
о
Флавон
Флавонолы — оксизамещенные флавонов.
II
О Флавонол
Флаваноны — производные 4-оксо-2-фенилхромана.
Флаванол
Катехины — оксипроизйодные 2-фенилхромана.
Катехин
93
Установлено, что витаминными свойствами обладает ряд флавонолов (рутин, кверцетин), флаванонов (эрио-диктин и его метиловый эфир гесперидии), катехинов (/-эпикатехин, эпикатехингаллат и др.), кумаринов (эску-лин и др.), галловая кислота и ее производные, антоцианы (красящие вещества плодов, ягод и цветов).
Многие вещества Р-витаминного действия представляют собой гликозиды флавонолов и флаванонов или агликоны (несахаристые компоненты гликозидов). Например, рутин является гликозидом, состоящим из агликона — флавонола кверцетина и дисахарида — рутинозы:
При гидролизе рутинозы освобождаются глюкоза и рамноза.
кверцетин
Биологической так и рутин.
активностью обладают как кверцетин,
94
К группе веществ Р-витаминного действия следует также отнести агликоны ряда растительных пигментов — антоцианидины (например, цианидин — агликон цианина, пигмента, весьма распространенного в цветках и плодах ряда высших растений) и лейкоантоцианы.
Биофлавоноиды широко распространены в растительном мире. Ими богаты многие плоды и ягоды (цитрусовые, черная смородина, шиповник, голубика, черника, брусника, рябина, клюква и др.), листья чайного растения, гречиха (особенно в период цветения), рута и др.
Качественные реакции на рутин и кверцетин. Реакция с хлорным ж ел е з о м. Хлорное железо образует с рутином комплексное соединение, окрашенное в изумрудно-зеленый цвет. Реакция характерна для многих полифенолов. Обычно зеленую окраску дают соединения, содержащие ортодиоксифенольные группы. Окрашенный комплексный ион, образующийся при реакции рутина или кверцетина с хлорным железом, имеет следующее строение:
Реактивы: а) рутин, насыщенный водный раствор; б) хлорное железо, 1 % -ный раствор.
К 1—2 мл насыщенного водного раствора рутина прибавляют несколько капель раствора хлорного железа (FeCls • 6Н2О). Появляется зеленое окрашивание.
Реакция с концентрированной серной кислотой. Концентрированная серная кислота образует с флавонами и флавонолами (например, рутином) оксониевые (флавилиевые) соли, растворы которых характерны ярко-желтой окраской. Флаваноны (например, гесперидии) дают с серной кислотой малиновое окрашивание.
95
Реактивы: а) рутин, насыщенный водный раствор; б) серная кислота, концентрированная (Рго= 1,836).
К 1—2 мл насыщенного водного раствора рутина осторожно, по стенке пробирки, добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки окрашивается в желтый цвет.
Реакция с магнием и концентрированной соляной кислотой. Флавоноиды (флавоны, флавонолы, флаваноны), реагируя с металлическим магнием и концентрированной соляной кислотой, легко восстанавливаются, давая окрашенные соединения. Окраска зависит от строения флавоноида. Флавонолы (например, кверцетин) образуют соединения, характеризующиеся красно-розовой или фиолетово-красной окраской (в зависимости от концентрации вещества). При восстановлении кверцетина образуется цианидин

ОН
—ОН
+Мд+знс1
ОН О Кверцетин
+МдС12+Н20
он
Цианидин
Реактивы: а) кверцетин, насыщенный раствор в этиловом спирте; б) магний металлический (лента или порошок); в) соляная кислота, концентрированная (р20= 1,188).
К 1 мл насыщенного спиртового раствора кверцетина добавляют кусочек магниевой ленты или немного (на кончике скальпеля) порошка металлического магния и 3—4 капли концентрированной соляной кислоты. Жидкость вначале окрашивается в розовый цвет, но при стоянии интенсивность окраски усиливается, доходя до малиновой и фиолетово-красной.
Реакция рутина с фелинговой жидкостью. При кислотном гидролизе вначале отщепляется молекула рутинозы, которая затем распадается на глюкозу и рамнозу, обладающие восстанавливающими свойствами.
96
Реактивы: а) рутин, в порошке; б) растворы Фелинга I и II (приготовление — см. с. 202); в) соляная кислота, О,5°/о-ный раствор; г) едкий натр, 1О°/о-ный раствор.
К 0,5 г рутина добавляют 50 мл 0,5%-ного раствора соляной кислоты, нагревают до кипения, кипятят 1 мин., затем фильтруют. К 5 мл фильтрата приливают 3 мл 10%-ного раствора едкого натра и 3 мл фелинговой жидкости (которую готовят непосредственно перед употреблением, смешивая равные объемы I и II растворов Фелинга) и снова нагревают до кипения. Выпадает красный осадок закиси меди.
Капельный метод определения катехинов в яблоках и грушах (по Л. И. Вигорову). Катехины, реагируя с солянокислым раствором ванилина, образуют соединения, окрашенные в розовый или красный цвет. Используя указанную реакцию, можно очень быстро определить приблизительное содержание катехинов в яблоках или грушах.
Реактивы: а) солянокислый раствор ванилина: 10 мг ванилина растворяют в 10 мл концентрированной соляной кислоты. Раствор должен быть бесцветным. Хранят в склянке из оранжевого стекла. Реактив, который приобрел розовую окраску, непригоден к употреблению; б) сернистокислый натрий (сульфит натрия, NajSOs), 1 °1о-ный водный раствор.
Куски хроматографической бумаги (10X10 см) пропитывают 1%-ным раствором сернистокислого натрия и высушивают. Через всю толщу мякоти плодов вырезают полулунные ломтики, доходящие до семенных камер. Из ломтиков отжимают сок (между двумя алюминиевыми пластинками или же на прессе от полевого рефрактометра). Каплю сока наносят на хроматографическую бумагу и место нанесения нумеруют графитовым карандашом (на один кусок бумаги наносят 8—10 образцов сока). Бумагу высушивают на воздухе (высушивание можно ускорить комнатным вентилятором или феном). Высушенную бумагу опрыскивают солянокислым раствором ванилина. В зависимости от содержания катехинов в плодах места нанесения капель на бумагу принимают розовое, светло-красное или красное окрашивание.
Определение суммарного количества Р-витаминных веществ в чае. В листьях растения витамин Р в основном
4 Д. К. Шапиро
97
представлен катехинами и их производными (чайным танином). В числе суммы катехинов чайного листа почти 9/ю составляют £-эпикатехин, эпикатехингаллат, эпигал-локатехин и эпигаллокатехингаллат.
В основу метода количественного определения витамина Р в чае положена способность бесцветных катехинов окисляться марганцовокислым калием с образованием окрашенных соединений.
Реактивы и материалы: а) чай, черный или зеленый; б) марганцовокислый калий (перманганат калия), 0,1 н раствор: 3,16 г (навеска на аналитических весах) растворяют в прокипяченной и остуженной дистиллированной воде в мерной колбе емкостью 1 л, раствор доводят до метки той же водой. Поправку на титр раствора КМпО^ устанавливают по химически чистому щавелевокислому натрию или аммонию; в) раствор индигокармина: 1 г индигокармина растирают в фарфоровой ступке и растворяют в 50 мл концентрированной серной кислоты. Раствор переносят в мерную колбу емкостью 1 л и доводят водой до метки, затем фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Хранят в холодном месте в склянке из темного стекла; срок годности раствора — не более 10 дней.
Навеску чая (0,5—0,6 г) переносят в коническую колбу, заливают 200 мл кипящей воды, колбу закрывают пробкой с воздушным холодильником и продолжают кипячение в течение 5 мин., после чего охлаждают. Измеряют общий объем-водного экстракта.
В большую фарфоровую чашку наливают 500 мл дистиллированной воды, 25 мл-раствора индигокармина и 10 мл водного экстракта из листьев чая (пипеткой). Раствор в чашке, окрашенный в синий цвет, титруют 0,1 н раствором марганцовокислого калия до появления желтого окрашивания. Раствор марганцовокислого калия прибавляют небольшими порциями, все время перемешивая жидкость в чашке стеклянной палочкой.
Одновременно проводят контрольный опыт: в чашку наливают 500 мл дистиллированной воды, 25 мл раствора индигокармина и титруют 0,1 н раствором перманганата. Опытное и контрольное титрования повторяют 3—4 раза.
Суммарное содержание веществ Р-витаминного действия в чае (в процентах) х вычисляют по формуле:
98
_ (a — b) /<0,0064^100
X ~~	dv2	’
где a — количество 0,1 н раствора KM11O4, израсходованное на титрование опытного раствора, мл; b — то же для контрольного опыта; К — поправка на титр 0,1 н раствора марганцовокислого калия; 0,0064 — количество чайного танина, окисляемое 1 мл 0,1 н раствора КМГ1О4, г; Wi — объем водного экстракта из листьев чая, мл; v2 — количество водного экстракта, взятое для титрования, мл; d — навеска чая, г.
ВИТАМИН В! (ТИАМИН)
Общие сведения. В состав молекулы витамина Bi входят два гетероцикла — пиримидиновый и тиазоловый, связанные метиленовой группой. Кроме того, в молекуле тиамина содержатся гидроксильная и аминная группы.
СН2
4РЛ
1 JC-CHi-CtizOH s'
Витамин В1 (тиамин солянокислый)
В тканях организма животных тиамин превращается в пирофосфорный эфир — тиаминпирофосфат, являющийся коферментом одного из важнейших ферментов углеводного обмена — карбоксилазы.
-----N--------C-Ctij	0 ОН
II II II /
НС С-СН2-СНг-0-Р-0-Р-0
'г"	I \
№	0/1
ТианштирйфйСфат (кокарбоксилаза)
Витамин Bi хорошо растворяется в воде, плохо — в этиловом спирте, нерастворим в хлороформе, диэтиловом эфире и других органических растворителях.
4*
99
Наиболее активна в молекуле тиамина его тиазоловая часть. Азот тиазолового кольца способен к образованию четвертичных аммониевых солей. Спиртовая группа сравнительно легко вступает с кислотами в реакцию этерификации. Тиамин устойчив в кислой среде (pH 3,0), разрушается в нейтральной и щелочной. При сильнощелочной реакции происходит разрыв тиазолового кольца и превращение тиамина в тиольную форму, не обладающую витаминными свойствами. Окислители (например, железосинеродистый калий) приводят (в присутствии щелочи) также к образованию тиольной формы (тиохрома).
Витамин Bi распространен в растительных и животных продуктах. Особенно богаты им зерновые продукты, дрожжи, орехи; содержится он также в печени, почках, сердце, нежирном мясе и мясных продуктах.
Суточная потребность взрослого человека в тиамине составляет 2—3 мг (в зависимости от затраты труда и физиологического состояния организма), детей — 1—2 мг, грудных детей (до 1 года) — 0,5 мг.
Недостаток витамина Bi в организме вызывает глубокие нарушения углеводного обмена, что ведет к тяжелому заболеванию периферической нервной системы (полиневриту), расстройствам функций сердечно-сосудистой системы и органов! пищеварения.
Качественные реакции на витамин Bb Тиохром-ная реакция. Тиамин в щелочной среде окисляется железосинеродистые калием в тиохром, обладающий голубой флуоресценцией в ультрафиолетовом свете
С-Сн3
||	K3Fe(CN)^
с—сн2-снгон
3'
100
тиохром
Реактивы: а) тиаминбромид, в порошке; б) железосинеродистый калий (феррицианид калия — КзРе (CN)6), 5%-ный раствор; в) едкий натр, 10%~ный раствор; г) бутиловый или изоамиловый спирт.
Немного порошка тиаминбромида (приблизительно 10 мг) растворяют в 5 мл воды, прибавляют 1 мл 5Ясного раствора железосинеродистого калия, 1 мл 10%-ного раствора едкого натра, 5 мл бутилового (или изоамилового) спирта. Пробирку (или стаканчик) хорошо встряхивают и оставляют на несколько минут. Верхний, спиртовой слой осторожно сливают в пробирку из нефлуоресцирующего стекла и рассматривают в лучах ртутно-кварцевой лампы (в темном помещении). Хорошо заметна голубая или синяя флуоресценция.
Диазореакция на витамин Вь Тиамин, реагируя с диазобензолсульфоновой кислотой, образует соединение, окрашенное в розовый или красный цвет.
Реактивы: а) тиаминбромид, в порошке; б) диазореактив: 0,9 г сульфаниловой кислоты растворяют в 9 мл концентрированной соляной кислоты (в мерной колбе на 100 мл) и раствор доливают водой до метки. Солянокислый раствор сульфаниловой кислоты довольно устойчив. Его хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой. Непосредственно перед анализом готовят диазореактив, для чего 1,5 мл основного раствора переносят в мерную колбу на 50 мл (установленную в сосуде со льдом или снегом, или в холодильнике) и добавляют 1,5 мл только что приготовленного 5%-ного раствора азотистокислого натрия (NaNO2). Через 5 мин. прибавляют еще 6 мл раствора азотистокислого натрия и через 1—2 мин. доливают до метки охлажденной водой. Колбу взбалтывают и оставляют в ледяной ванне или холодильнике еще в течение 15—20 мин. Диазореактив можно сохранять в холодильнике или на льду (не более одних суток!); в) карбонатно-щелочной раствор: пе
101
ред употреблением смешивают равные объемы 4%-ного раствора едкого натра и 5,76%-ного раствора двууглекислого натрия.
К 2 мл карбонатно-щелочного раствора добавляют 1 мл диазореактива и 1—2 мг порошка тиаминбромида (на кончике скальпеля). Вначале появляется желтое окрашивание, которое через 1—2 мин. переходит в розовое или красное.
ВИТАМИН В2 (РИБОФЛАВИН)
Общие сведения. Витамин В2 — один из важнейших участников окислительно-восстановительных процессов в организме. Он входит в состав активной группы основных окислительно-восстановительных ферментов, участвующих в переносе водорода; очень тесно связан с обменом белковых веществ.
Рибофлавин — игольчатые кристаллы оранжево-желтого цвета. Плохо растворяется в воде, этиловом спирте, пиридине, циклогексане. Нерастворим в хлороформе, ацетоне, бензоле. Нейтральные растворы рибофлавина характеризуются желто-зеленой флуоресценцией, которая ослабевает при сдвиге pH в кислую и щелочную стороны. Рибофлавин устойчив к высокой температуре.
Основу молекулы витамина В2 составляет диметили-зоаллоксазин, связанный с остатком спирта рибитола, поэтому рибофлавин рациональнее можно назвать 6,7-диметил-9- (1-б/-рибитил)-изоаллоксазином.
।---(CH0H)j— СНгОН
сн2
Ch L	N
CH N С=0
РиВофлавин (витамин В2)
Рибофлавин распространен в растительных и животных продуктах.
102
Потребность организма в витамине Вг зависит от расхода энергии и содержания белка в пище. Нормы суточной потребности взрослого человека в рибофлавине составляют 2,5—3,5 мг (в зависимости от тяжести труда и физиологического состояния организма), детей—1,0— 3,0 мг, юношей и девушек (16—22 лет) — 3,5 мг.
Качественные реакции на рибофлавин. Восстановление рибофлавина. Рибофлавин легко окисляется и восстанавливается. При восстановлении его водородом образуется бесцветное соединение — лейкофла-вин, которое, окисляясь, превращается в рибофлавин.
Cti2 ~(снон)3-сн2он
НС N N
HjC-C
HjC~C
c=o ti3C~C
—/.П
4	>	„,U	-2H
NyrNzcx/
HC N C=0 Рибофлавин
aiz—(Ctl0tl)3—CH?0ti
Ntt
НС NH C=0 Лейкофлавин
Реактивы: а) рибофлавин, 0,015%-ный раствор (хранят в склянке из темного стекла); б) соляная кислота, концентрированная; в) цинк, металлический.
К 1 мл раствора рибофлавина добавляют 10 капель концентрированной соляной кислоты и кусочек металлического цинка.' Под влиянием выделяющегося водорода окраска раствЬра постепенно меняется: из желтой превращается сначала в зеленую, затем в малиновую, розовую, и, наконец, наступает обесцвечивание. Через несколько минут верхний слой жидкости в пробирке снова принимает желтое окрашивание (окисление лейкофлави-на в рибофлавин).
Реакция с азотнокислым серебром. Нейтральные или слабокислые растворы рибофлавина (pH 6,5—7,2), реагируя с азотнокислым серебром, дают соединение, окрашенное в розовый и красный цвет.
Реактивы: а) рибофлавин, 0,015%-ный раствор (хранят в склянке из темного стекла); б) азотнокислое
103
серебро, 0,1%-ный раствор (хранят в склянке из темного стекла).
К 1 мл раствора рибофлавина добавляют 0,5 мл раствора азотнокислого серебра. Появляется розовое или красное окрашивание (интенсивность окраски зависит от концентрации рибофлавина в растворе).
ВИТАМИН РР (В5, НИКОТИНОВАЯ КИСЛОТА, НИКОТИНАМИД)
Общие сведения. Витамин РР по своей химической природе является никотиновой кислотой и ее амидом — никотинамидом:
никотинамид
Никотиновая (fi -пиридинкарйоновая) кислота
Биологическая активность никотиновой кислоты и ее амида в общем одинакова, но в организме встречается преимущественно никотинамид, так как никотиновая кислота легко подвергается амидированию. Это дало основание некоторым исследователям считать никотиновую кислоту провитамином РР, а ее амид — витамином. Амид никотиновой кислоты — важнейший участник процессов биологического окисления. Он входит в состав анаэробных дегидрогеназ, коферментами которых являются ни-котинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидаде-ниндинуклеотидфосфат (НАДФ).
Авитаминоз РР (пеллагра) есть результат нарушения окислительно-восстановительных процессов в организме вследствие недостатка никотинамида, необходимого для синтеза кодегидрогеназ.
Витамин РР довольно широко распространен в продуктах животного и растительного происхождения.
Суточная потребность •человека составляет (в зависимости от возраста, тяжести труда и состояния организма) 15—25 мг.
104
Качественные реакции на никотиновую кислоту. Реакция с уксуснокислой медью. Никотиновая кислота, реагируя с солями меди в уксуснокислой среде, образует медную соль никотиновой кислоты (никотинат меди) синего цвета
Никотинат меди
Реактивы: а) никотиновая кислота, 0,75°^-ный раствор (в горячей воде); б) уксусная кислота, 15°1ъ-ный раствор; в) уксуснокислая медь, 5%-ный раствор.
К 2 мл раствора никотиновой кислоты добавляют 1 мл 15%-ного раствора уксусной кислоты и нагревают до начала кипения, после чего приливают 1—1,5 мл раствора уксуснокислой меди. В пробирке сначала появляется голубоватая муть, а затем выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.
Реакция с углекислым натрием. При нагревании никотиновой кислоты с безводным углекислым натрием появляется специфический неприятный запах пиридина.
Реактивы: а) никотиновая кислота, в порошке; б) углекислый натрий, безводный.
В небольшом фарфоровом тигле смешивают 0,05 г никотиновой кислоты с 0,1—0,15 г безводного углекислого натрия и подогревают. Появляется резкий запах пиридина.
Отличие никотинамида от никотиновой кислоты. При нагревании никотинамида с едким натром выделяется аммиак.
105
Реактивы: а) никотинамид, в порошке; б) никотиновая кислота, в порошке; в) едкий натр, 40%-ный раствор.
Немного порошка никотинамида (на кончике шпателя) всыпают в пробирку, добавляют 2 мл воды, половину объема 40 %-ного раствора едкого натра и подогревают 5 мин. на кипящей водяной бане. Появляется запах аммиака. К отверстию пробирки подносят красную лакмусовую бумажку, смоченную водой. Она синеет.
Проделывают ту же реакцию с никотиновой кислотой — выделения аммика не наблюдается.
Определение содержания никотиновой кислоты в пищевых продуктах (по В. М. Иосиковой) *. Никотиновая кислота, реагируя с бромроданом и анилином (или другими ароматическими аминами, например метолом), образует соединение, окрашенное в желтый цвет (производное глютаконового альдегида).
Реактивы: а) стандартный раствор никотиновой кислоты. Вначале готовят основной раствор. 25 мг кристаллической никотиновой кислоты растворяют в мерной колбе емкостью 50 мл в 96%-ном этиловом спирте. 1 мл основного раствора пипеткой переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки 96%-ным этиловым спиртом, получая стандартный раствор, в 1 мл которого содержится 10 мкг никотиновой кислоты; б) раствор ро-данбромида (готовится лаборантом!). В 10 мл 0,1 н раствора роданистого калия (KCNS) или роданистого аммония (NH4CNS) растворяют 1 г бромистого калия (КВг), к раствору прибавляют 1 мл раствора соляной кислоты (1:1) и (под тягой!) по каплям (из автоматической пипетки) 2 мл брома. Не давая раствору остыть, тотчас же используют его для реакции; в) раствор анилина. Анилин перегоняют над цинковой пылью. Один объем свеже-перегнанного анилина растворяют в шести объемах 96%-ного этилового спирта. Раствор должен быть бесцветным. Храпят в холодильнике в склянке из темного стекла; г) этиловый спирт, 95—96%-ный; д) асканит (бентонит), активированный. Асканит заливают 7%-ным раствором соляной кислоты, настаивают 20 мин., нагревают до кипения, затем охлаждают, отфильтровывают, многократно промывают дистиллированной водой до от-
Для студенческого научно-исследовательского кружка.
106
рицательной реакции промывных вод на хлор-ион (проба с азотнокислым серебром), высушивают в сушильном шкафу при 120° С, после чего растирают в сухой ступке и всыпают в банку с притертой пробкой; е) едкий натр, 20%-ный раствор; ж) едкий натр, 1 н раствор; з) универсальный индикатор; и) сернокислый цинк, насыщенный раствор; к) марганцовокислый калий, 1 н раствор; л) трифосфат калия (калий фосфорнокислый трехзаме-щеный, К3РО4), кристаллический; м) соляная кислота (1:1); н) соляная кислота, 1 н раствор.
Навеску растертого исследуемого продукта (1—20 г) берут в зависимости от примерного содержания витамина РР. В ней должно содержаться 100—150 мкг никотиновой кислоты. Навеску заливают 100 мл нормальной соляной кислоты и подвергают гидролизу в течение часа на кипящей водяной бане. Солянокислую вытяжку охлаждают, затем нейтрализуют 20%-ным раствором едкого натра до pH 6,5 (под контролем универсального индикатора), после чего к; ней добавляют 100 мл 95—96 % -ного этилового спирта и хорошо перемешивают. Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера, а к прозрачному фильтрату прибавляют 2 г асканита и взбалтывают с адсорбентом в течение 3 мин. Асканит отфильтровывают на маленькой воронке Бюхнера. Фильтр с асканитом переносят в ту же колбу, в которой обрабатывали вытяжку адсорбентом, добавляют 25 мл нормального раствора едкого натра и встряхивают колбу в течение 3 мин. для элюирования никотиновой кислоты. Взвесь переносят в центрифужную пробирку или стаканчик и центрифугируют. Объем центрифугата измеряют тем же цилиндром, которым отмеривали раствор едкого натра, потом его без потерь переливают в стакан и прибавляют раствор сернокислого цинка до pH 6,5 (по универсальному индикатору). Образовавшуюся в стакане густую массу фильтруют (на воронке Бюхнера). Фильтрат нагревают на электрической плитке и к нему по каплям добавляют нормальный раствор марганцовокислого калия до получения прозрачного раствора (окисление посторонних примесей). Расходуют обычно 4—6 капель раствора.
После охлаждения содержимое колбы центрифугируют. Центрифугат обрабатывают кристаллическим К3РО4 (индикатор — спиртовой раствор фенолфталеина), после
107
чего добавляют раствор соляной кислоты (1:1) до pH 6,5 и фильтруют на воронке Бюхнера.
5 мл испытуемой вытяжки и 5 мл стандартного раствора никотиновой кислоты прогревают 5 мин. на кипящей водяной бане (в отдельных стаканчиках), затем к ним одновременно прибавляют по 2 мл роданбромид-ного раствора и 7 мл спиртового раствора анилина. Смеси оставляют на 30—40 мин., потом фильтруют через бумажные фильтры и колориметрируют в колориметре или фотоэлектрофотоколориметре (со светофильтром 440 нм). В фотоколориметре в качестве контроля применяют водный раствор этилового спирта (1 : 1).
Содержание никотиновой кислоты (в миллиграммах на 100 г веса продукта) х рассчитывают:
а)	при пользовании колориметром типа Дюбоска по формуле
_ 25^10 • 100 Х “ avbhiWOO ’
где 25 — количество нормального раствора NaOH, взятое для элюирования никотиновой кислоты, мл; а — навеска продукта, г; v — объем элюата после извлечения никотиновой кислоты нормальным раствором NaOH и центрифугирования, мл; Vi — объем элюата после обработки раствором сернокислого цинка, мл; h — показания шкалы колориметра для стандартного раствора, мм; h\ — то же для испытуемого раствора, мм; 5 — объем вытяжки, взятой для реакции, мл; 10 — содержание никотиновой кислоты в 1' мл стандартного раствора, мкг; 100 — коэффициент пересчета, мг%; 1000 — пересчет в миллиграммы;
б)	при пользовании фотоэлектроколориметром по формуле
__ 25и1п110 • 100 (ю5п21000	’
где П\ и «2 — оптическая плотность соответственно испытуемого и стандартного растворов.
ВИТАМИН В6 (ПИРИДОКСИН)
Общие сведения. Известны три вещества, обладающие свойствами витамина Вб: ппрпдоксол (пиридоксин), пиридоксаль и пиридоксамин. Все они являются производ-
108
Пиридоксаль
Пиридоксамин
ними пиридина. Эти вещества устойчивы к высокой температуре, действию кислот и щелочей, разрушаются солнечным светом.
Пиридоксаль и пиридоксамин играют важную роль в обмене аминокислот. Их фосфорилированные производные (фосфопиридоксаль и фосфопиридоксамин) обладают коферментными функциями и катализируют реакции переаминирования (трансаминирования), декарбоксилирования, рацемизации и элиминации аминокислот (см. раздел V «Обмен аминокислот, пептидов и белков»). Имеются данные, свидетельствующие о коферментной функции фосфопирндоксаля в реакциях синтеза никотиновой кислоты из триптофана, образования триптофана из аминокислоты серина и индола, а также обмена метионина, цистеина, глютаминовой и других аминокислот. Витамин В6 участвует также в обмене липидов.
Пиридоксол, пиридоксаль и пиридоксамин широко распространены в пищевых продуктах животного и растительного происхождения. Богаты витамином Вб печень, почки, мышечная ткань, яйца, дрожжи, рисовые отруби, бобы,горох и др.
Суточная потребность взрослых в пиридоксине составляет 2 мг.
Качественные реакции на витамин В6. Реакция витамина В6 с хлорным железом. Витамин В6 образует с хлорным железом комплекс, окрашенный в красный цвет.
Реактивы: а) пиридоксин, 0,5%-ный раствор; б) хлорное железо, 1%-ный раствор.
К 4—5 мл раствора пиридоксина приливают 1 мл раствора хлорного железа и перемешивают. Развивается красная окраска.
109
Отличие пиридоксола (пиридоксина) от пиридоксаля и пир и докса мин а. Пиридоксол, реагируя с 2,6-дихлорхинонхлоримидом, образует соединение, окрашенное сначала в синий, а затем в красный цвет. Реакция характерна для фенолов со свободным параположением, поэтому ее не дают пиридоксаль и пири-доксамин.
Реактивы: а) пиридоксин, 0,01 % -ный раствор, б) уксуснокислый натрий (ацетат натрия), 2О°/о-ный раствор; в) 2,6-дихлорхинонхлоримид, 0,5 %-ный спиртовой раствор; г) борная кислота, 4%.-ный раствор.
В две пробирки вносят по 1 мл раствора пиридоксина и 2 мл раствора уксуснокислого натрия, затем в первую пробирку прибавляют 1 мл дистиллированной воды, а во вторую — 1 мл раствора борной кислоты и перемешивают. Когда пробирки остынут до комнатной температуры, быстро прибавляют в каждую из них по 1 мл раствора 2,6-дихлорхинонхлоримида. В первой пробирке жидкость принимает вначале синее окрашивание, сменяющееся вскоре красным, во второй — синее окрашивание не появляется.
Осаждение пиридоксина фосфорновольфрамовой кислотой. Пиридоксин, являясь производным пиридина, обладает основными его свойствами и осаждается некоторыми реактивами на алкалоиды (см. с. 25—26), в том числе фосфорно-вольфрамовой кислотой.
Реактивы: z( фосфорно-вольфрамовая кислота, 1 %-ный раствор в разведенной соляной кислоте (1:10); б) пиридоксин, 5°1о~ный раствор.
К 1 мл раствора пиридоксина добавляют 1 мл раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты. Наблюдают выпадение осадка. Можно провести микрохимическую реакцию на часовом стекле, соответственно уменьшив объемы растворов.
Раздел IV
ФЕРМЕНТЫ (ЭНЗИМЫ)
Ферменты (энзимы) — биологические катализаторы процессов обмена веществ. Они представляют собой высокомолекулярные соединения и относятся к простым или сложным белкам. По характеру своего действия ферментативный катализ чаще всего является гетерогенным (мпкрогетерогенным).
Обладая многими свойствами, сходными со свойствами неорганических катализаторов, ферменты характеризуются рядом особенностей, к которым следует отнести термолабильность, большую зависимость их активности от pH среды, высокую специфичность (как групповую, так и индивидуальную, включая стереохимическую), огромную эффективность каталитического действия и др. Протекает ферментативный катализ с большой скоростью и в мягких условиях.
Активность ферментов в значительной мере зависит от состава среды. Многие химические вещества способны усиливать (активаторы) или затормаживать (ингибиторы) каталитическую активность ферментов.
Ферменты можно разделить на две большие группы: ферменты-протеины (простые белки) и ферменты-протеиды (сложные белки). К протеинам относятся многочисленные ферменты, катализирующие процессы гидролитического расщепления сложных соединений на более простые (например, пепсин, амилазы, уреаза и др.).
Ферменты-протеиды состоят из белковой части — апофермента и термостабильной небелковой — кофермента, или простетической группы. В большинстве своем коферменты— это сопряженные (резонансные) органические молекулы.
111
Многие простатические группы представляют собой производные витаминов (главным образом группы В). Часто роль кофермента играют металлы (железо, магний, медь, кобальт, цинк, марганец, молибден). Существуют, наконец, ферменты, у которых имеются две или несколько простетических групп. Например, у карбоксилазы, фермента, катализирующего реакцию декарбоксилирования пировиноградной кислоты, простатическими трупами являются производное витамина Bi (тиаминпирофосфат) и металл магний, который служит связующим звеном между белковой частью фермента и тиаминпирофосфатом (кокарбоксилазой). Схему строения фермента можно представить следующим образом:
тиаминпирофосфат — Mg — белок.
В названиях ферментов отражается не только характеристика катализируемой реакции, но и наименование субстрата, который подвергается превращению. Как правило, они составляются из двух частей. Первая указывает название субстрата или (при бимолекулярных реакциях) двух субстратов. Вторая часть названия с окончанием «аза» характеризует природу реакции. Например, ферменты, катализирующие реакцию отщепления атомов водорода в молекулах органических соединений и их перенос на молекулы других веществ, называются дегидрогеназами (дегидрогенизация — отщепление водорода). Фермент, катализирующий указанный процесс у первичных и вторичных спиртов, носит название алкогольдегидрогеназы.
Наряду с рациональными названиями для ряда ферментов сохранились старые исторически сложившиеся названия, например пепсин, трипсин, папаин и др.
В соответствии с рекомендациями Международного биологического союза (1961 г.) все ферменты разделены на 6 классов.
1.	Оксидоредуктазы. Катализируют окислительно-восстановительные реакции. Оксидоредуктазы подразделяются на две большие группы: а) дегидрогеназы, катализирующие процесс окисления органических веществ путем отнятия водорода и переноса его на другой субстрат; б) оксидазы, катализирующие перенос водорода с субстрата, подвергающегося окислению, на кислород.
112
2.	Трансферазы. Эти ферменты катализируют реакции переноса атомных групп (аминогрупп, остатков фосфорной кислоты, метильных групп и т. д.),
3.	Гидролазы. Катализируют реакции гидролитического распада сложных соединений на более простые. К этому классу относятся многочисленные ферменты, действующие на сложно-эфирные связи (эстеразы, например, липазы, катализирующие процесс гидролитического расщепления липидов), гликозильные соединения (например, гликозидазы, катализирующие гидролитический распад поли- и олигосахаридов), пептидные связи (пептидазы или пептидгидролазы), кислотноангидридные (полифосфатазы) и др.
4.	Лиазы. Катализируют негидролитическое отщепление от субстратов определенных групп с образованием двойной связи.
5.	Изомеразы. Ферменты, отнесенные к этому классу, катализируют разнообразные реакции изомеризации, например превращение цисформы в трансформу, взаимопревращение альдоз и кетоз, внутримолекулярный перенос групп (в последнем случае ферменты называют мутазами) и т. д.
6.	Лигазы (синтетазы). Катализируют присоединение друг к другу двух молекул, сопряженное с разрывом пирофосфорной связи в молекуле АТФ (или аналогичных трифосфатов). Сюда относятся ферменты, образующие связи между молекулами углерода и кислорода, серы, азота или между двумя молекулами углерода.
ИССЛЕДОВАНИЕ ОБЩИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ
Ферментативный гидролиз крахмала. Ферментативный гидролиз крахмала протекает под влиянием ферментов амилаз, которые содержатся в слюне, соке поджелудочной железы, крови, печени, мозге. Источниками амилаз в промышленности служат проросшие зерна злаков (солод) и культуры плесневых грибов.
Известны а- и р-амилазы, которые несколько различаются по характеру действия. Под влиянием а-амила-зы процесс гидролитического расщепления крахмала задерживается главным образом на стадии декстринов, а мальтозы образуется немного, тогда как под действием Р-амилазы расщепление идет в сторону преимуществен
113
ного образования мальтозы. Последовательно этот процесс можно представить следующим образом.
Крахмал
I
Растворимый крахмал
я J
Амилодекстрины (фиолетово-синее окрашивание с иодом)
I
Эритродекстрины (буровато-красное окрашивание с иодом)
Ахроодекстрины (желтое или буровато-желтое окрашивание с иодом)
Мальтодекстрины (с иодом не дают окрашивания)
I
Мальтоза
Мальтоза под действием фермента мальтазы (а-глю-козидазы) распадается на две молекулы a-D-глюкозы. Встречается также фермент глюкоамилаза, катализирующий распад крахмала до глюкозы.
Ход процесса гидролитического расщепления крахмала можно проследить с помощью реакций Троммера, Бенедикта или Ниландера (см. раздел VII), характеризующих восстанавливающие свойства углеводов.
При ферментативном гидролизе крахмала увеличивается количество свободных гликозидных гидроксилов, обусловливающих восстанавливающие свойства, и поэтому мальтоза и глюкоза способны восстанавливать окись меди до закиси, гидрат окиси висмута или окись серебра до металлов.
Реактивы: а) слюна. Свежую слюну разводят в 10 раз дистиллированной водой: б) крахмал, 1°/0-ный раствор; в) раствор иода в иодистом калии (раствор Лю-голя): в нескольких миллилитрах воды растворяют 1 г йодистого калия, в концентрированном растворе соли растворяют 1 г иода и доливают водой до 300 мл; г) едкий натр, 5°/0-ный раствор; д) сернокислая медь (CuSO4 • 5Н2О), 5°/0-ный раствор.
В две пробирки наливают по 2 мл 1°/о-ного раствора крахмала, в одну из них добавляют 1 мл разведенной слюны (1 : 10), в другую •— 1 мл воды и ставят на 10 мин.
114
в водяную баню, нагретую до 37—38° (внимательно следят за температурой, не допуская ее повышения), или, еще лучше, в ультратермостат, после чего охлаждают пробирки пол краном. Проделывают реакции Троммера и с иодом, для чего содержимое каждой пробирки делят пополам.
Инактивация ферментов высокой температурой. Являясь белковыми веществами, ферменты весьма чувствительны к температуре, при которой протекает реакция. Температурный оптимум действия ферментов теплокровных животных составляет 37—38° С. При небольшом повышении температуры (например, 40—45° С) скорость ферментативных реакций вначале повышается, но уже при дальнейшем нагревании (выше 50° С) падает, а при 70—80° утрачивается. Кипячение влечет за собой полную потерю каталитической активности ферментов вследствие денатурации их белковой части (апоферментов). При температурах ниже нуля скорость ферментативных реакций значительно понижается, но сами ферменты не разрушаются и при осторожном оттаивании восстанавливают свою активность.
Реактивы: а) слюна, разведенная в 5 раз дистиллированной водой; б) крахмал, 1%-ный раствор; в) раствор иода в иодистом калии (см. предыдущую работу); г) реактивы для реакции Троммера (см. предыдущую работу).
В две пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны. Содержимое одной из них нагревают до кипения и кипятят 2—3 мин. Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл раствора крахмала и ставят на 10 мин. в водяную баню, нагретую до 38° С, после чего проделывают реакции Троммера и с иодом. Убеждаются, что в пробирке, в которой фермент был инактивирован кипячением, расщепления крахмала не произошло.
Специфичность действия ферментов. Это одно из важнейших свойств ферментов. Каждый фермент воздействует лишь на определенное вещество или группу веществ, близких по своей структуре. Различают следующие виды специфичности: а) абсолютную, когда ферменты катализируют лишь одну реакцию превращения какого-либо вещества. Например, уреаза (карбамид — амидогидролаза) катализирует только реакцию гидролитического расщепления мочевины до аммиака и двуокиси
115
углерода; б) групповую, когда ферментом катализируются реакции превращения близких по своей структуре веществ, построенных по одному типу. Так, сахараза (p-фруктофуранозидаза) катализирует реакцию гидролитического расщепления сахарозы с освобождением молекул глюкозы и фруктозы, но тот же фермент катализирует также реакцию частичного гидролиза трисахарида рафинозы (а-галактозидо-а-глюкозидо-р-фруктози-да), при которой освобождается лишь молекула фруктозы, а связь между галактозой и глюкозой остается ненарушенной; в) стереохимическую, которая проявляется в том, что фермент катализирует реакцию расщепления или синтеза только одного из стереоизомеров, не воздействуя на другой. Окисление £-молочной кислоты до пировиноградной катализируется ферментом лактатдегидрогеназой, тогда как тот же процесс у £>-молочной кислоты катализируется другим ферментом — 7)-лактатде-гидрогеназой.
Р е а к т и в ы: а) слюна, разведенная в 10 раз дистиллированной водой; б) сахароза, 1°/0-ный раствор; в) крахмал, 1°/0-ный раствор; г) реактивы для реакции Троммера.
iB две пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны, затем в одну из них добавляют 1 мл раствора сахарозы, а в другую — столько же раствора крахмала. Обе пробирки прогревают 10 мин. в водяной бане при температуре 38° С, после чего охлаждают и с содержимым каждой из них проделывают реакцию Троммера. Убеждаются, что амилаза катализировала лишь процесс гидролитического расщепления крахмала и не оказала действия на сахарозу.
Влияние pH среды на активность амилазы слюны. Каждый фермент проявляет максимум своего каталитического действия при строго определенном pH среды. Наивысшую активность многие ферменты проявляют в изоэлектрической точке.
Оптимальное значение pH для пепсина составляет 1,5—2,0, амилазы слюны—6,8—7,0, трипсина—7,8, липазы поджелудочной железы — 7,0—7,8. Было, однако, показано, что ферменты, катализирующие одни и те же реакции, но выделенные из различных субстратов, проявляют оптимум действия при неодинаковых значениях pH. Так, оптимум действия кишечной сахаразы наблю
116
дается при pH 6,2, а сахаразы, выделенной из дрожжей,— при pH 4,6—5,0. Оптимум pH амилазы слюны составляет 6,8—7,0, а амилаза солода проявляет максимум каталитической активности при pH 4,4—4,5.
Реактивы: а) слюна, разведенная дистиллированной водой в 100 раз; б) крахмал, 0,5%-ный раствор; в) лимонная кислота, 0,1 М раствор (19,212 г кислоты в 1 л); г) фосфорнокислый натрий двузамещенный (Na2HPO4 • 2Н2О), 0,2 М раствор (содержит 36,62 г соли в 1 л); д) раствор Люголя (раствор иода в иодистом калии); е) хлористый натрий, 1%-ный раствор.
В 7 однотипных пробирок пипетками наливают растворы лимонной кислоты и фосфорнокислого натрия в количествах, указанных в табл. 4, получая таким образом буферные смеси со значениями pH от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 1 %-ного раствора хлористого натрия, 0,5%;-ного раствора крахмала, разведенной в 100 раз слюны и перемешивают.
Табл. 4. Фосфатно-цитратные буферные смеси
Номер пробирки	Количество 0,2 М раствора двузаме-щениого фосфата натрия, мл	Количество 0,1 М раствора лимонной кислоты, мл	pH буферной смеси
1	0,58	0,42	5,6
2	0,63	0,37	6,0
3	0,69	0,31	6,4
4	0,77	0,23	6,8
5	0,87	0,13	7,2
6	0,94	0,06	7,6
1	0,97	0,03	8,0
Пробирки ставят на 10 мин. в водяную баню при температуре 38° С, после чего быстро охлаждают, добавляют во все пробирки по 1 капле раствора Люголя, перемешивают и наблюдают окраску. Устанавливают, при каком pH произошло наиболее полное расщепление крахмала (желтая или буровато-желтая окраска с иодом). Реакция весьма специфична и показательна.
117
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (ГИДРОЛАЗ)
Определение активности амилазы слюны (по Вольге-муту). Определяют предельное разведение фермента, при котором наблюдается полное расщепление крахмала. Метод находит применение в клинической лабораторной практике.
Реактивы: а) слюна. Свежую слюну разводят в 10 раз; б) раствор Люголя (см. с. 114); в) крахмал, 0,1%-ный раствор, свежеприготовленный.
Нумеруют 10 пробирок. В каждую из них наливают из пипетки по 1 мл дистиллированной воды. В первую пипеткой вносят 1 мл разведенной слюны. Содержимое пробирки перемешивают, три раза втягивая в пипетку и выпуская. 1 мл раствора из первой пробирки переносят во вторую, повторяют те же операции, затем 1 мл раствора из второй пробирки переносят в третью и т. д. Таким образом, концентрация амилазы в каждой из пробирок в два раза ниже, чем в предыдущей. Из десятой пробирки 1 мл раствора выливают.
Во все пробирки добавляют еще по 1 мл дистиллированной воды и, начиная с десятой,— по 2 мл раствора крахмала, перемешивая при этом содержимое каждой пробирки. Все 10 пробирок одновременно ставят на 30 мин. в водяную баню, нагретую до 37-—38 ° С (внимательно следят за температурой, не допуская ее повышения).
Через 30 мин. пробирки охлаждают под краном и в каждую из них прибавляют по 2 капли раствора Люголя. Наблюдают окрашивание жидкости. При полном расщеплении крахмала амилазой жидкость в пробирке будет бесцветной или слабо желтоватой, если расщепления не произошло — жидкость окрашена в синий цвет. В промежуточных пробирках наблюдается гамма переходных оттенков цвета — от синевато-фиолетового до буроватожелтого. Результаты опыта записывают по образцу табл. 5.
Для расчета количества амилазы в слюне учитывают ту пробирку, в которой уже нет синего оттенка (т. е. ту, после которой жидкость во всех остальных пробирках окрашена в синий цвет). Пусть это будет, например, четвертая. В четвертой пробирке неразведенной слюны со-
118
Табл. 5. Исследование активности амилазы
Номер пробирки	Отношение разведения слюны	Окраска содержимого пробирки после добавления раствора Люголя
1	1 :20	Синего окрашивания нет
2	1 :40	»
3	1 :80	»
4	1: 160	»
5	1 : 320	Светло-синяя
6	I : 640	Синяя
7	1 : 1280	»
8	1 : 1560	»
9	1 :3120	»
10	1 :6240	»
держится мл. Это количество слюны расщепляет 2 мл 0,1 %-кого раствора крахмала, а 1 мл неразведенной слюны способен расщепить 320 мл 0,1 %-кого раствора крахмала (х = 2 ~	= 320 мл). Активность амилазы слюны
(амилокластическую силу) выражают количеством миллилитров 0,1 % -ного раствора крахмала, который способен расщепить 1 мл неразведенной слюны в течение 30 мин. при 37—38° С. Амилокластическая сила слюны человека составляет в норме 260—320 ед.
Определение активности липазы. Липазы катализируют реакцию гидролитического расщепления сложно-эфирных связей в молекулах жира, в результате которой освобождаются глицерин и жирные кислоты:
Щ-О-ОСС^з	с"гт
CH-0-OCC„HJ3	+ЗНг0	С"он	+ЗС17НззС00Н
CHz-0-0CC„HJ3	снгон
119
Гидролитическую активность липазы можно определить с помощью различных методов: тетраметрического, сталагмометрического, колориметрического и ряда других.
Реактивы: а) растительное масло; б) препарат липазы: 10—12 г семян льна, конопли, пшеницы тщательно растирают с кварцевым песком до образования гомогенной массы, которую обрабатывают в ступке пятикратным количеством ацетона в течение 10 мин., растирая пестиком. Кашицеобразную массу центрифугируют. Остаток два раза обрабатывают диэтиловым эфиром, после чего высушивают над серной кислотой в вакуум-экси-каторе в течение 12 ч и растирают в ступке. Перед опытом ферментный препарат растирают с водой в отношении 1 : 10. Для анализа берут 0,1—0,5 мл суспензии; в) едкое кали, 0,1 н раствор; г) ацетатный буфер, pH 4,7. Смешивают равные объемы нормальных растворов уксусной кислоты и уксуснокислого натрия (оптимум действия большинства растительных липаз лежит при pH 4,6—4,9); д) смесь этилового спирта с диэтиловым эфиром (1:1) (готовится перед употреблением); е) фенолфталеин, 1 % -ный спиртовой раствор.
В коническую колбу на 50 мл отвешивают на техно-химических весах 2,0—2,5 г растительного масла, к навеске добавляют 2 мл ацетатной буферной смеси, тщательно встряхивают и приливают 0,1—0,5 мл суспензии ферментного препарата, смешанной с 3 мл воды. Смесь в колбе доливают водой до общего объема 8 мл, энергично встряхивают и переносят в аппарат для взбалтывания. Колбу закрывают пробкой и взбалтывают в течение 1 ч при температуре 20° С, затем ее содержимое (с помощью 60 мл нейтрализованной спирто-эфпрной смеси) количественно переносят в сухую коническую колбу большего объема. Свободные жирные кислоты, образовавшиеся при гидролитическом расщеплении масла, от-титровывают 0,1 н раствором едкого кали (индикатор — раствор фенолфталеина). Одновременно проводят контрольный опыт с прокипяченной суспензией ферментного препарата.
Активность липазы х выражают количеством миллилитров 0,1 н раствора щелочи, израсходованных для нейтрализации свободных жирных кислот, образующихся при гидролитическом расщеплении 1 г масла:
120
x (a — b)k н ’
где а — количество 0,1 н раствора едкого кали, израсходованное на титрование опытного образца, мл; b — то же для контрольного образца; k — поправочный коэффициент 0,1 н раствора едкого кали; н — навеска масла, г.
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ (ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ)
Общие сведения. К классу оксидоредуктаз относятся многочисленные ферменты, катализирующие реакции биологического окисления. Это — сложные белки (протеиды), в состав простетических групп которых входят витамины группы В (рибофлавин, амид никотиновой кислоты и др.), металлы (железо, медь), нуклеотиды.
Роль коферментов в процессах биологического окисления заключается главным образом в переносе электронов от вещества, подвергающегося окислению (донора электронов), к восстанавливаемому соединению (акцептору электронов). Совокупность промежуточных переносчиков электронов образует окислительно-восстановительную (или дыхательную) цепь, особенностью которой является то, что каждый из коферментов попеременно выступает то как акцептор электронов (по отношению к субстрату — донору), то как донор (по отношению к последующему веществу или кислороду, которые служат акцепторами).
К числу важнейших коферментов процессов биологического окисления следует отнести кодегидрогеназы I и II (активной группой которых является амид никотиновой кислоты), а также флавинмононуклсотид и флави-надениндинуклеотид (производные витамина В2— рибофлавина).
Кодегидрогеназа I (никотинамидадсниндинуклеотид, НАД) находится в тканях преимущественно в окисленной форме. Является акцептором водорода, который отнимается от субстрата, подвергающегося окислению.
Кодегидрогеназа II (никотинамидадениндинуклео-
121
Анид никотиновой кислоты
РиБоза
^С"\ АОенин |	|| сн
W |
н—с------------
I
н-с-он
Рибоза | О пирофосфат	н—с—он
о	о	н-с--------
II	II I
снг—о---Р—О----Р—о—СИ,
I	I
он	он
КодегидрдгёНаза! (никотинамидадениндинумеотид, НАД)
тид — фосфат, НАДФ) отличается от НАД наличием еще одного остатка фосфорной кислоты, присоединенного к третьему углеродному атому рибозы аденпннуклео-тида.
В обратимых окислительно-восстановительных реакциях участвует не вся молекула кофермента, а лишь ее отдельные части. Так, у кодегидрогеназ (НАД и НАДФ) обратимому восстановлению — окислению подвергается амид никотиновой кислоты.
122
+2^
'-2Н
С-СОННг
+ Н+
У флавиновых коферментов активной группой является изоаллоксазин
R
I
N NH
"’С^ААА=<’
^2Н
н,с—
я
N
нСЛ^\ЛУт
NH ||
О
К классу оксидоредуктаз относятся также гемсодер-жащие ферменты, в состав коферментов которых входит железопорфириновый комплекс — гем (каталаза, пероксидаза).
Качественные реакции на ферменты биологического окисления. Открытие о-д ифенолоксидазы в картофеле. О-дифенолоксидаза (полифенолоксида-за, тирозиназа) содержит медь. Катализируют реакцию окисления ортодифенолов и монофенолов (в том числе и аминокислоты тирозина) молекулярным кислородом с образованием хинонов. Реакция протекает по схеме
Ортодифевол + О2-»Ортохинон ф- 2Н2О.
Реактивы: а) экстракт из клубней картофеля: навеску мякоти клубней (3—5 г) быстро растирают с несколькими миллилитрами дистиллированной воды; б) гваяковая смола, 1°/0-ный спиртовой раствор.
В пробирку наливают 10—12 капель экстракта из клубней картофеля, добавляют 5—8 капель спиртового
123
раствора гваяковой смолы и наблюдают изменение окраски. Повторяют реакцию, беря воду вместо экстракта из картофеля.
Реакции на пероксидазу. Пероксидаза широко распространена в тканях животных и растений. По химической природе является гемопротеидом: в состав ее простетической группы входит железопорфирин.
Фермент катализирует реакцию окисления некоторых органических соединений (фенолов, полифенолов, ароматических аминов) в присутствии перекиси водорода, с которой пероксидаза образует комплексное соединение. Активированная перекись становится акцептором водорода, отщепляемого от соединения, которое подвергается окислению (донора).
Общая схема реакции такова:
окисленный донор +2Н20
Донор+н20г Например,
Пирокатехин	Хинон
В лаборатории в качестве источников пероксидазы обычно используют корни хрена, листья капусты, свежий мясной фарш, корнеплоды брюквы, репы.
Реакция с гваяковой смолой. Гваяковая смоляная кислота окисляется перекисью водорода (при участии пероксидазы) в озонид — соединение синего цвета.
Реактивы: а) экстракт из корней хрена: 100 г свежих корней хрена натирают на терке, заливают 100 мл 0,05%-ного раствора углекислого натрия и настаивают 2—3 ч, после чего фильтруют. Готовят в день анализа; б) гваяковая смола, 1%-ный спиртовой раствор, или 1°/0-ный раствор гваякола; в) перекись водорода, 2%-ный раствор, свежеприготовленный.
К 2—3 мл раствора перекиси водорода добавляют 5—8 капель спиртового раствора гваяковой смолы, 10 капель экстракта из хрена и встряхивают пробирку. Появляется синее окрашивание, обусловленное окисле
124
нием гваяковой смолы. Повторяют ту же реакцию с прокипяченным экстрактом из хрена — синее окрашивание не появляется, фермент инактивирован.
Пурпурогаллиновая реакция. При участии пероксидазы пирогаллол окисляется перекисью водорода до пурпурогаллина (красный осадок)
Реактивы: а) экстракт из корней хрена (см. выше); б) пирогаллол, 2%-ный водный раствор; б) перекись водорода, 2%-ный раствор, свежеприготовленный.
В две пробирки наливают по 2 мл экстракта из корней хрена. Одну из них нагревают до кипения и охлаждают. В обе пробирки добавляют по 1 мл раствора пирогаллола и 1—2 капли раствора перекиси водорода.
Осадок пурпурогаллина выпадает только в той пробирке, в которой фермент не был инактивирован кипячением.
Реакция с бензидином. Пероксидаза катализирует реакцию окисления бензидина в дифенохинондиимин.
Белок мышечной ткани миоглобин обладает пероксидазной активностью. Для свежего мяса характерна положительная реакция на пероксидазу, в несвежем мясе она не проявляется или запаздывает.
Реактивы: а) вытяжка из мяса: 10 г фарша свежего мяса заливают 40 мл дистиллированной воды, настаивают 10 мин. и фильтруют: б) бензидин, 0,25%-ный спиртовой раствор; в)перекись водорода, 2%-ный раствор, свежеприготовленный.
К 2—3 мл вытяжки из мяса добавляют 3—5 капель спиртового раствора бензидина и 2—3 капли раствора перекиси водорода. Если мясо свежее, содержимое про
125
бирки почти тотчас же принимает зеленовато-синее окрашивание.
Определение активности пероксидазы в мышцах или крови. В основу метода положена описанная выше реакция окисления бензидина в дифенохинондиимин, катализируемая пероксидазой:
СН СН СИ сн
сн сн сн сн
Бензидин
Дишенохинондиимин
Молекула дифенохинондиимина конденсируется с молекулой бензидина с образованием окрашенного соединения (бензидинового синего)
Бензидиновый синий
Реактивы: а) свежая кровь кролика, разведенная 1:1000, или вытяжка из мышечной ткани: 1 г измельченной свежей мышечной ткани заливают 4—5 мл дистиллированной воды и экстрагируют в течение 30 мин., после чего фильтруют; б) бензидин, 1%-ный раствор в ледяной уксусной кислоте; в) перекись водорода, 3%ный раствор, свежеприготовленный; г) едкий натр, 30%-ный раствор; д) этиловый спирт, абсолютный; е) марганцовокислый калий, 0,01 н раствор; ж) стандартный раствор: в мерную колбу емкостью 25 мл вносят 2 мл 1 %-ного раствора бен
126
зидина (пипеткой с резиновой грушей!), добавляют 3 мг 0,01 н раствора марганцовокислого калия и оставляют на 10 мин., чтобы жидкость приобрела интенсивнокрасное окрашивание, затем прибавляют 10 мл 30 %-кого раствора едкого натра и доливают до метки абсолютным спиртом. Готовят перед самым определением.
В мерную колбу на 25 мл вносят 2 мл раствора бензидина, 2 мл 3%-ного раствора перекиси водорода и 1 мл вытяжки из мышечной ткани или разведенной крови (1:1000). Колбу встряхивают и ставят точно на 3 мин., после чего в нее приливают 10 мл 30%-ного раствора едкого натра и снова встряхивают. Выпадает окрашенный осадок, который растворяют в абсолютном спирте. Им же доводят содержимое колбы до метки.
Интенсивность окраски испытуемого и стандартного растворов сравнивают в колориметре.
За единицу активности фермента принята активность пероксидазы, при которой в данной реакционной смеси развивается окрашивание, равное по интенсивности окраске стандартного раствора.
Активность фермента (в условных единицах на 1 г ткани) рассчитывают по формуле
fti25
х = --,1 g-, л25
где h[ — высота столба стандартного раствора, мм; Л2— высота столба испытуемого раствора, мм; 25-—объем раствора в мерной колбе, мл; 5 — суммарный объем реагирующих растворов (бензидина, перекиси водорода и вытяжки из мышечной ткани) в колбе, мл.
Определение активности пероксидазы в растительном материале (по А. Н. Бояркину). Определяют скорость катализируемой пероксидазой реакции окисления бензидина в дифенохинондиимин с образованием синеокрашенного продукта конденсации последнего с молекулой бензидина (бензидинового синего). Химизм реакции — см. с. 126.
Реактивы и приборы: а) ацетатная буферная смесь pH 4,7 (см. прил. 12); б) раствор бензидина на ацетатном буфере pH 4,7: в мерную колбу емкостью 200 мл наливают 60—80 мл дистиллированной воды, приливают 2,3 мл ледяной уксусной кислоты, после чего всыпают 0,184 г бензидина. Колбу ставят на водяную
127
баню (60°) и, взбалтывая, подогревают до полного растворения бензидина, затем прибавляют 5,45 г уксуснокислого натрия, взбалтывают до его растворения. Колбу охлаждают до 20° С и доводят до метки дистиллированной водой; в) перекись водорода, 3%-ная; г) фотоэлектроколориметр ФЭК-М, ФЭК-Н-57 или ФЭК-60; д) секундомер; е) центрифуга.
Из средней пробы растительного материала берут навеску 0,2—0,5 г (в зависимости от предполагаемой активности фермента), тщательно растирают ее в ступке с ацетатным буфером. Растертую массу переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки, после чего центрифугируют при 4000—5000 об/мин (или фильтруют). В две кварцевые кюветы фотоэлектроколоримстра (толщина слоя 2 см) вносят по 2 мл центрифугата (или фильтрата), 2 мл раствора бензидина и 2 мл дистиллированной воды. Измерения ведут при красном светофильтре (Х=625—700 нм). Устанавливают нулевую точку прибора, затем с помощью правого барабана отводят стрелку гальванометра в крайнее правое положение (£=0,125). В левую кювету быстро добавляют 2 мл воды, а в правую — 2 мл перекиси водорода (с помощью пипетки с широким отверстием). Вливая первую каплю перекиси, включают секундомер, поскольку начинается реакция окисления бензидина, катализируемая пероксидазой. Стрелка гальванометра двигается к нулевому делению шкалы. Как только она достигнет нулевого деления, отсчет времени прекращают. Подбирают такую навеску материала и разведение вытяжки, чтобы изменение окраски происходило за 30—50 с, для чего вытяжку после центрифугирования дополнительно разводят ацетатной буферной смесью.
Активность фермента (А) рассчитывают по формуле
.  Е (а • б • в) с • t ’
где £— экстинкция, равная 0,125; а — отношение количества буферной смеси, взятой для экстрагирования фермента (мл), к навеске растительной ткани (г); б — степень дополнительного разведения вытяжки после центрифугирования; в-—степень постоянного разведения вытяжки в кювете; с — толщина слоя в кювете фотоэлектроколориметра (2 см); t — время, с.
128
Определение активности полифенолок-сид азы (о-дифено л оксидазы, тирозиназы, катехол оксид а зы) (по А. Н. Бояркину). Фенольные соединения — важные компоненты окислительно-восстановительных процессов. Окисляясь кислородом воздуха, они превращаются в хиноны. Реакция катализируется ферментом полифенолоксидазой (о-дифенолок-сидазой, тирозиназой, катехолоксидазой). Схематически эта реакция может быть представлена так:
фенол + О2=хинон + Н2О.
Хиноны подвергаются восстановлению водородом дыхательного субстрата до фенолов, которые снова включаются в реакцию окисления, протекающую при участии фермента.
Полифенолоксидаза действует на полифенолы, о-ди-фенолы, монофенолы, дубильные вещества. Фермент катализирует также окисление аминокислоты тирозина с образованием темноокрашенных продуктов меланинов.
Система «полифенол^хинон» играет видную роль в дыхании растений, являясь промежуточным звеном при окислении многочисленных органических соединений (в том числе аскорбиновой кислоты).
При количественном определении активности поли-фенолоксидазы измеряют скорость реакции окисления диметилпарафенилендиамина с образованием продукта, окрашенного в сине-фиолетовый цвет.
Реактивы и приборы: а) диметил-парафени-лендиамин, О,О2°/о-ный раствор на 0,01 н растворе щавелевой кислоты; б) щавелевая кислота, 0,01 н раствор; в) пирокатехин, 1°10-ный раствор на 0,01 н растворе щавелевой кислоты; г) фосфатная буферная смесь, pH 7,4 (см. прил. 12); д) фотоэлектроколориметр, ФЭК-М или ФЭК-Н-57; с) секундомер; ж) центрифуга.
Навеску растительной ткани (0,5—1 г) берут на аналитических весах. Ее тщательно растирают в ступе с фосфатной буферной смесью, затем количественно переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят буфером до метки. Взвесь центрифугируют (4000 об/мин) или фильтруют.
В две кварцевые кюветы фотоэлектроколориметра (толщина слоя 2 см) вносят по 2 мл центрифугата (или фильтрата), 2 мл дистиллированной воды и 2 мл раствора диметил-парафенилендиамина. Нулевую точку при-
5 Д. К. Шапиро
129
бора устанавливают при красном или оранжевом светофильтре (7v=590—625 нм), после чего правым барабаном отводят стрелку гальванометра в крайнее правое положение (£=0,125). В контрольную левую кювету прибавляют 2 мл раствора щавелевой кислоты, а в опытную (правую) кювету — 2 мл раствора пирокатехина и тотчас же включают секундомер. В остальном поступают, как при определении пероксидазы.
Активность полифенолоксидазы выражают в условных единицах на 1 г растительного материала. Вычисление ведут по формуле, приведенной в работе «Определение активности пероксидазы в растительном материале».
Спектрофотометрическое определение активности аскорбпнатоксидазы (по Арригони, в прописи Н. П. Ярош, А. И. Ермакова и В. В. Ара-симович). Аскорбинатоксидаза (аскорбиноксидаза) катализирует реакцию окисления аскорбиновой кислоты кислородом воздуха (химизм реакции см. с. 83). Фермент аскорбинатоксидаза широко распространен в растительном мире. Высокой активностью фермента характеризуются капуста, огурцы, тыква, кабачки. Активность аскорбинатоксидазы обычно определяют по количеству аскорбиновой кислоты, превращенной в дегидроформу 1 г ткани за единицу времени.
Аскорбиновая кислота обладает максимумом поглощения света при длине волны ^=265 нм. Под действием фермента она окисляется. Степень окисления аскорбиновой кислоты пропорциональна активности фермента, ее можно определить по уменьшению оптической плотности раствора.
Реактивы и приборы: а) фосфатная буферная смесь, pH 7,38 (см. прил. 12); б) хлористый калий (КС1), 0,005 М раствор; в) сернокислый магний (MgSO-THaO), 0,005 М раствор; г) аскорбиновая кислота, 0,005 М раствор; д) спектрофотометр СФ-4, СФ-16, VSU-2P.
Навеску растительной ткани (1 г) берут на аналитических весах. Ее тщательно растирают в ступке с фосфатной буферной смесью, после чего количественно переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят буфером до метки. Затем центрифугируют или фильтруют.
В одну из кювет спектрофотометра (опытную) вносят 0,1 мл ферментной вытяжки (центрифугата или
130
фильтрата), 0,1 мл раствора хлористого калия, 0,1 мл раствора сернокислого магния, 0,7 мл раствора аскорбиновой кислоты и 2 мл фосфатной буферной смеси, во вторую (контрольную) —2,3 мл буферной смеси и 0,7 мл раствора аскорбиновой кислоты. Сразу же после внесения растворов измеряют оптическую плотность опытной кюветы, потом измерения повторяют через 1, 2, 3, 4, 5 мин. Активность аскорбпнатоксидазы определяют в единицах оптической плотности на 1 г ткани за 1 мин.
Раздел V
ОБМЕН АМИНОКИСЛОТ, ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ
КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА АЗОТА
Среднее содержание азота в белках составляет 16%. Для пересчета общего количества азота на белок нужно найденное количество общего азота умножить на коэффициент 6,25. При исследовании зерна и продуктов его переработки принят пересчетный коэффициент 5,70, молока и молочных продуктов — 6,38.
При определении содержания общего азота в биологическом материале получают величину, которая характеризует общее количество азотсодержащих соединений (белков, нуклеиновых кислот, амидов, аминокислот, креатинина, креатина, мочевой кислоты, аммонийных солей, аммиака, солей азотной и азотистой кислот и др.) в исследуемом объекте. Умножая ее на пересчетный коэффициент, получают представление о содержании не чистого белка в продукте, а. так называемого «сырого протеина», поэтому при более точных исследованиях наряду с определением количества общего азота следует также изучить содержание белкового азота, азота аминокислот и амидов и т. д.
Для определения общего азота продукт минерализуют нагреванием с концентрированной серной кислотой при участии катализаторов (сернокислой меди, ртути, селена и др.) и окислителей (пергидроля, марганцовокислого калия). При этом углерод и водород окисляются до двуокиси углерода и воды, а азот отщепляется в виде аммиака
R—CHNH2—СООН + H2SO4^CO2 + NH3 + Н2О + SO2.
Аммиак далее реагирует с серной кислотой
2NH3 + H2SO4= (NH4)2SO4.
132
Аммонийные соли (или аммиак) взаимодействуют с реактивом Несслера, образуя иодид меркураммония, окрашенный в желто-бурый цвет.
Ntij + 2Kz[HgjJ+JK0H =	г+ 7KJ+ZHz°
Реактив	иоОид
несслера	меркураммония
Интенсивность окраски пропорциональна содержанию аммиака в растворе, что позволяет применить эту реакцию для количественного определения содержания общего азота в биологическом материале.
Реактивы: а) реактив Несслера (двойная соль иодистой ртути и йодистого калия в растворе едкого кали или натра). Используется готовый или приготавливается лаборантом по такой прописи: в 20 мл воды растворяют 10 г двуиодистой ртути (Hgl2) и 8 г йодистого калия. Образуется комплексное соединение. В 80 мл воды отдельно растворяют 20 г едкого натра. Оба раствора после остывания сливают в один сосуд и фильтруют через стеклянную вату; б) серная кислота, концентрированная (р>2о= 1,836); в) пергидроль; г) едкий натр, 0,25 н раствор; д) стандартный раствор: навеску 0,7643 г химически чистого хлористого аммония (NH4C1) или 0,9429 г химически чистого сернокислого аммония ((NH^SCh) вносят в мерную колбу на 1 л, растворяют в 20—30 мл дистиллированной воды, свободной от аммиака, и той же водой доводят до метки. Получают так называемый основной раствор. 10 мл основного раствора пипеткой вливают в литровую мерную колбу и доводят до метки дистиллированной водой, свободной от аммиака. Получают рабочий стандартный раствор, 1 мл которого соответствует 0,002 мг азота; е) дистиллированная вода, освобожденная от аммиака: дистиллированную воду слабо подкисляют серной кислотой и вторично перегоняют, отбрасывая первую и последнюю порции.
Продукт, подлежащий исследованию, тщательно, измельчают. Навеску измельченного продукта в 0,03—0,08 г вносят в пробирку из термоустойчивого стекла (диаметром 15 мм), куда добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты и 1—2 капли пергидроля. Удерживая в
133
наклонном положении (с помощью держателя), пробирку нагревают на слабом огне. В течение 2—3 мин. обычно происходит обесцвечивание жидкости. При дальнейшем нагревании бесцветная и прозрачная жидкость не должна желтеть. Если же она принимает желтое окрашивание, то это свидетельствует о неполном сожжении органических веществ. В этом случае содержимое пробирки охлаждают, добавляют еще 1—2 капли пергидроля и снова нагревают на медленном огне. Всего расходуют не более 4—5 капель пергидроля.
При минерализации органических веществ избегают бурного кипения жидкости.
После того как все органические вещества окислились, на что указывает устойчивое обесцвечивание жидкости, содержимое пробирки количественно переносят в мерную колбу на 100 мл, на дно которой заранее наливают 10—15 мл воды, освобожденной от аммиака. После охлаждения мерную колбу доводят до метки той же водой.
Пипеткой отбирают из мерной колбы 10 мл раствора, добавляют 3 капли раствора фенолфталеина и оттитро-вывают 0,25 н раствором едкого натра до появления устойчивого слаборозового окрашивания. Затем той же пипеткой снова отбирают из мерной колбы 10 мл раствора, вносят в другую мерную колбу на 100 мл и добавляют столько же 0,25 н раствора едкого натра, сколько было израсходовано на нейтрализацию кислоты при предварительном титровании (фенолфталеин не прибавляют), после чего раствор в колбе доводят водой до метки и тщательно перемешивают. Раствор используется для определения содержания общего азота.
Берут две мерные колбы на 100 мл. В одну из них пипеткой вносят 10 мл испытуемого раствора, в другую — 10 мл рабочего стандартного раствора. В обе колбы приливают по 50 мл воды, 4 мл реактива Несслера, доводят водой до метки и перемешивают.
Интенсивность окраски обоих растворов уравнивают в колориметре КОЛ-IM или другого типа, фотометре ФМ-58 или ФМ-58И.
Расчет производится следующим образом. Навеска продукта 0,05 г. После сжигания раствор доводится до 100 мл, 10 мл полученного раствора после нейтрализации вновь разводится до объема 100 мл.
134
К Ю мл указанного раствора было добавлено 4 мл реактива Несслера и воды до объема 100 мл. В другую мерную колбу внесли 10 мл рабочего стандартного раствора (1 мл которого содержит 0,002 мг азота) и также прибавили 4 мл реактива Несслера и воды до общего объема 100 мл.
При уравнивании интенсивности окрасок испытуемого и стандартного раствора в колориметре высота столба стандартного раствора составила 25 мм, испытуемого — 20 мм.
Общее количество азота xt в продукте следующее: 0,002 • 10 • 20 • 10 • 10 • 100% _о9о/ —	25 • 1000 • 0,05	— 6,2 /о'
Содержание «сырого протеина» X2=Xi-6,25= = 3,2-6,25 = 20%.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО АЗОТА ПО КЪЕЛЬДАЛЮ (МИКРОМЕТОД)
Метод определения общего содержания азота в биологических объектах по Къельдалю считается одним из наиболее точных. В своей классической прописи определение, однако, является продолжительным по времени и относительно трудоемким, поэтому в последнее время, особенно при массовых анализах, расширилась область применения других методов (колориметрических, тптри-метрическнх, адсорбционных и др.). Но в тех случаях, когда требуется высокая точность анализа (например, в научно-исследовательских работах, арбитражных исследованиях), метод Къельдаля по-прежнему остается основным.
При определении общего количества азота органическое вещество минерализуют кипячением с концентрированной серной кислотой (см. «Колориметрическое определение общего количества азота»). Освобождающийся аммиак связывается серной кислотой, при этом образуется сернокислый аммоний. Добавлением концентрированного раствора едкого натра вытесняют аммиак. Аммиак поглощается титрованным раствором серной кислоты, который заведомо берут в избытке. Отгонку аммиака ускоряют пропусканием водяного пара. Избыток раствора серной кислоты, не вошедший в реакцию, оттитро-вывают едким натром.
135
По разности между количествами миллилитров раствора серной кислоты, взятыми для поглощения аммиака и оставшимися затем в излишке после окончания реакции, определяют число миллилитров, израсходованное для нейтрализации аммиака,
1 мл 0,01 н раствора серной кислоты соответствует 0,000142 г азота.
Реактивы: а) серная кислота, концентрированная (Р 20= 1,836), проверенная на содержание азота; б) пер-
Рис. 9. Аппарат для микроопределения азота (по К. П. Петрову),
гидроль; в) сернокислая медь, х. ч.; г) сернокислый калий, х. ч.; д) едкий натр, 33°10-ный раствор. Для освобождения от аммиака рекомендуется нагреть раствор до кипения, кипятить 1—2 мин., затем охладить; е) едкий натр, 0,01 н раствор; ж) метиловый красный (метил-рот): 0,05 г порошка индикатора растворяют в 15 мл 95%-ного этилового спирта. К раствору добавляют 10 мл дистиллированной воды и перемешивают.
Посуда и аппаратура: а) колбы Къельдаля емкостью 50—100 мл; б) аппарат для макроопределения азота (рис. 9).
136
Органическое вещество сжигают так, как описано в работе «Колориметрическое определение общего количества азота». В качестве катализатора пользуются смесью сернокислой меди и сернокислого калия (1 :3). Для ускорения сжигания можно добавить пергидроль. Сжигание производят в колбах Къельдаля из тугоплавкого стекла.
После окончания сжигания колбу охлаждают, к прозрачной и бесцветной жидкости осторожно (по стенке!) добавляют 15 мл дистиллированной воды (заранее проверенной с помощью реактива Несслера на отсутствие аммиака), 2 капли раствора метилового красного и присоединяют к аппарату для микроопределений азота.
Аппарат для микроопределений азота состоит из парообразователя 1, предохранительного сосуда 3, колбы Къельдаля 5, каплеуловителя 11, холодильника 10 и приемника — конической колбы 12. Парообразователем служит обычная плоскодонная колба, в которую наливают дистиллированную воду, подкисленную серной или фосфорной кислотой. Колбу-парообразователь снабжают предохранительной стеклянной трубкой, которая доходит до дна. Для равномерного кипения на дно колбы кладут несколько кусочков пемзы или стеклянных капилляров.
В приемную колбу 12 пипеткой вносят 20 мл 0,01 н раствора серной кислоты. Колбу устанавливают так, чтобы форштосс был погружен в кислоту на 2—3 мм (во избежание потерь аммиака).
В колбу Къельдаля через воронку 7 наливают 33 %',-ный раствор едкого натра (из расчета 5—6 мл раствора щелочи на 1 мл концентрированной серной кислоты, взятой для сжигания) до изменения окраски индикатора в желтую, после чего тотчас же закрывают зажим на воронке 7. Открывают зажим 13 (одновременно закрывая зажим 4 на предохранительном сосуде) и начинают про-пускать пар. Отгонку аммиака продолжают 10—15 мин. В последние минуты отгонки конец форштосса вынимают из раствора кислоты (чтобы избежать засасывания жидкости). Окончив отгонку, смывают форштосс 2—3 мл дистиллированной воды, присоединяя их к раствору в приемной колбе.
В приемник добавляют 2—3 капли раствора метилового красного и оттитровывают избыток кислоты, не вошедшей в реакцию, 0,01 н раствором едкого натра до
137
появления желтого окрашивания. Общее процентное содержание азота в исследуемом материале xt рассчитывают по формуле
ЛО,000142 • 100 х, -------------,
1	н
где А — количество 0,01 н раствора серной кислоты, связавшейся с аммиаком, мл; н — навеска продукта, г.
Для перевода на «сырой протеин» найденное количество общего азота умножают на коэффициент 6,25.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВОГО И НЕБЕЛКОВОГО АЗОТА
Белки осаждают гидратом окиси меди (или основным уксуснокислым свинцом). Осадок белковых веществ отфильтровывают. В осадке определяют азот белков, в фильтрате — небелковый. Если известно содержание общего азота в исследуемом объекте, можно ограничиться определением или белкового или небелкового азота и по разности рассчитать значение второго показателя.
Реактивы: а) сернокислая медь (CuSO4 • 5Н2О), 6°1о-ный раствор; б) едкий натр, 1,25°10-ный раствор; в) едкий натр, 0,25 н раствор; г) хлористый барий, 5%-ный раствор; д) реактив Несслера (см. с. 133); е) серная кислота, концентрированная (р2о= 1,836); ж) пергидроль; з) стандартный раствор хлористого или сернокислого аммония (см. с. 133); и) дистиллированная вода, освобожденная от аммиака.
Продукт, подлежащий исследованию, тщательно измельчают. Навеску 1—2 г тонко измельченного продукта (взвешивают на аналитических весах) вносят в химический стакан или коническую колбу емкостью 100— 150 мл, прибавляют 50 мл горячей дистиллированной воды и нагревают до кипения. Если исследованию подвергаются зерновые продукты, богатые крахмалом, то к навеске добавляют теплую воду (40—45° С) и нагревают 10 мин. на водяной бане при температуре не выше 50° С. Для осаждения белков прибавляют 25 мл 6%-ного раствора сернокислой меди, перемешивают стеклянной палочкой и приливают (все время помешивая) 25 мл 1,25%-ного раствора едкого натра, после чего оставляют на 30—60 мин. для более полного осаждения белков.
После отстаивания осадка жидкость осторожно сливают через фильтр, стараясь не взмутить осадка. Осадок
138
несколько раз промывают горячей водой (вначале декантацией, а затем переводят на фильтр) до отрицательной реакции на ионы SO|”~ (реакция с раствором хлористого бария). Фильтр с осадком подсушивают и минерализуют, как при определении общего азота. В дальнейшем поступают, как описано выше (см. работы «Колориметрическое определение общего количества азота» или «Определение общего азота по Къельдалю»).
Найденное количество азота (за вычетом его содержания в фильтре) умножают на пересчетный коэффициент (6,25; 6,38 или 5,7, в зависимости от продукта, который подвергается исследованию), получая таким образом содержание белковых веществ.
Метод определения белкового азота трудоемок: промывание осадка требует продолжительного времени, минерализация фильтра с осадком протекает медленно, жидкость при сжигании вспенивается. Осадок белка поэтому не отфильтровывают, а вместе с надосадочной жидкостью количественно переводят в мерную колбу на 100 мл. Содержимое колбы доводят водой до метки. Прозрачную жидкость отделяют фильтрованием (или центрифугированием), аликвотную часть фильтрата подвергают минерализации и в ней определяют содержание небелкового азота.
Зная содержание общего и небелкового азота в продукте, можно по разности рассчитать количество белкового азота (и, следовательно, белков).
БЫСТРЫЙ МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ
Метод основан на способности белков количественно адсорбировать краситель оранж Ж. Он предложен для определения содержания белков в молоке (У. С. Ашворт, Р. Силс, Р. Э. Эрб, Д. С. Жебровский, Р. Тейнберг), картофельном соке (А. С. Вечер и О. К. Василькевич). Этот быстрый и удобный метод позволяет достигнуть удовлетворительной точности.
Реактивы и материалы: а) молоко; б) лимоннокислый раствор красителя оранж Ж: 1 г красителя оранж Ж и 21 г лимонной кислоты растворяют в 400— 500 мл дистиллированной воды в мерной колбе емкостью 1 л. К раствору добавляют 2,5 мл 10%-ного раствора
139
тимола в 95 %-ном этиловом спирте и доливают водой до метки. Раствор хранят в темном месте.
Посуда и приборы: а) мерные цилиндры или конические колбы на 50 мл с притертыми пробками; б) градуированные пипетки на 2 мл; в) бюретка на 50 мл со стеклянным краном; г) воронки стеклянные; д) пробирки 13X120 мм; е) фотоэлектроколориметр ФЭК-М, ФЭК-56 или ФЭК-Н-57.
В два мерных цилиндра или конические колбы с притертыми пробками одной и той же пипеткой вносят по 1 мл молока. Из пипетки в каждый сосуд прибавляют, перемешивая, по 25 мл лимоннокислого раствора краски оранж Ж, закрывают пробками и взбалтывают 30— 40 с, затем ставят в затененное место на полчаса, после чего снова тщательно взбалтывают и фильтруют в пробирки.
Оптическую плотность фильтрата каждой пробы исследуют на фотоэлектроколориметре ФЭК-М, ФЭК-56 или ФЭК-Н-57. В качестве стандартного раствора употребляют лимоннокислый раствор красителя оранж Ж, разведенный дистиллированной водой в сочетании 25 : 20.
Пользуются правой шкалой прибора. Светофильтр синий с областью максимального пропускания 453 нм. Рабочая длина кювет 1,070 или 1,065 мм. Процентное содержание белка в молоке у рассчитывают по формуле ^=2,4542+3,6049 х,
где х—показатель*"шкалы оптической плотности прибора.
Заранее составляют калибровочную кривую, градуируя шкалу оптической плотности фотоэлектроколориметра в процентах белка, для чего проводят не менее 50—60 параллельных анализов проб молока по колориметрическому методу (или методу Къельдаля) и по адсорбции красителя. Калибровочную кривую составляет обычно лаборант для каждого прибора (в начале учебного года).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТА АМИНОКИСЛОТ
Основные понятия. При количественном определении азота аминокислот применяют различные методы (газометрические, например по Ван-Слайку или Д. А. Цувер-
140
калову, титриметрические, колориметрические, фотометрические). Благодаря своей простоте и вполне удовлетворительной точности наибольшее распространение получили метод формольного титрования и различные варианты медного способа — по Попе и Стивенсу, Вой-вуду и др.
Определение азота аминокислот методом формольного титрования. Аминные группы аминокислот вступают в реакцию с формальдегидом с образованием метиленовых соединений (метиленамипокислот)
Н
R-C-CO0H+H-C
н
R—C—COOH+НгО
I
н=снг
Метиленаминокислоты обладают более сильными кислотными свойствами, чем аминокислоты, и легко от-титровываются щелочью
R—C-COOH+NaOH------*- R — C — COONa +Н20
I	I
N=Cffz	N=Ctii
По количеству раствора щелочи (мл), израсходованному на титрование, можно рассчитать содержание азота аминогрупп. При этом принимают, что количество карбоксильных групп, оттитрованных щелочью, эквивалентно количеству аминогрупп, прореагировавших с формальдегидом. Это справедливо лишь для моноаминомонокарбоновых аминокислот. Диаминомонокарбоновая кислота аргинин не реагирует с формальдегидом, поэтому не участвует в реакции. При титровании тирозина взаимодействуют со щелочью не только карбоксильная, но и фенольная группа.
Достоинствами метода формольного титрования являются быстрота и удобство определения. Это — основная причина его широкого распространения в практике, несмотря на относительно невысокую точность.
Реактивы: а) глицин, 0,02 М раствор; б) формалин, 40%-ный; в) этиловый спирт, 95—96%-ный; г) тимолфталеин: 0,05 г индикатора растворяют в 100 мл
141
96%-ного этилового спирта; д) метиловый красный: 0,2 г индикатора растворяют в 100 мл 60%-ного этилового спирта; е) фенолфталеин: 0,5 г фенолфталеина растворяют в 100 мл 90%-ного этилового спирта; ж) едкий натр, растворы 0,2 н и 0,05 н концентрации.
В стаканчик или коническую колбу наливают 20 мл раствора глицина. В другой такой же сосуд вливают 20 мл воды, заранее прокипяченной (для освобождения от СО2) и охлажденной, которая служит контролем.
В оба сосуда добавляют по 3 капли индикатора метилового красного и титруют 0,05 н раствором едкого натра до появления отчетливого желтого окрашивания. После этого в сосуды доливают по 10 мл формольной смеси.
Для приготовления формольной смеси к 50 мл 40%-него формалина добавляют 2 мл 0,5%-ного раствора фенолфталеина и оттитровывают 0,2 н раствором едкого натра до слаборозового окрашивания (обычно расходуют не больше 5 капель раствора щелочи).
После добавления формольной смеси опытную и контрольную пробы титруют 0,2 н раствором едкого натра до появления интенсивной красной окраски (pH 9,1). Сначала титруют одну из проб, затем вторую дотитровы-вают до той же окраски.
При расчетах содержания аминного азота х (мг) в 20 мл испытуемого раствора принимают во внимание, что 1 мл 0,2 н раствора NaOH соответствует 2,8 мг азота:
'х = (А—В) £2,8,
где А — количество 0,2 н раствора едкого натра, израсходованное на титрование опытного образца, мл; В — количество 0,2 н раствора едкого натра, израсходованное на титрование контрольного образца, мл; k — поправочный коэффициент 0,2 н раствора едкого натра.
Полученный результат пересчитывают затем на 100 г исследуемого вещества.
При формольном титровании вместо индикатора фенолфталеина часто рекомендуют пользоваться раствором тимолфталеина, у которого синее окрашивание проявляется, если pH равно 9,5—9,7. Доказано, что при применении фенолфталеина титрование идет не совсем до конца, при добавлении же тимолфталеина карбоксильные группы аминокислот оттитровываются более полно.
142
С тимолфталеином анализ проводят так же, как и при добавлении фенолфталеина, но формольную смесь готовят несколько иначе: к 50 мл 40%-ного формалина приливают 25 мл 95—96%-ного этилового спирта, 5 мл раствора тимолфталеина и добавляют (по каплям) 0,2 н раствор едкого натра до появления зеленоватого или зеленовато-голубого окрашивания. Опытный и контрольный образцы оттитровывают 0,2 н раствором едкого натра до появления интенсивного синего окрашивания.
Определение азота аминокислот медным способом. Описано ниже, в работе «Гидролитическое расщепление белка ферментами поджелудочной железы» (см. с. 146).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (по Г. В. Колоболотскому)
Общие сведения — см. работу «Разделение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии».
Разделение аминокислот в тонком слое силикагеля продолжается 1,5—2 ч, т. е. происходит в несколько раз быстрее, чем при хроматографии на бумаге. Чувствительность тонкослойной хроматографии в 5—10 раз выше бумажной.
Разделение аминокислот мышечной ткани проводят методом двухмерной восходящей хроматографии во взаимно перпендикулярных направлениях.
Реактивы и оборудование: а) хроматографические пластинки со слоем силикагеля «КСК» с добавлением 5—10% гипса. Подготовка силикагеля: силикагель «КСК» измельчают в течение 4—5 ч в шаровой мельнице, отбирают однородную фракцию с частицами 2,5—7,5 мкм и высушивают при 105° С до постоянного веса. Подготовка гипса: порошок гипса просеивают через капроновое сито № 64, после чего выдерживают 1 — 2 суток в сухожаровом шкафу при температуре 180° С; хранят в банке с притертой пробкой. Подготовка хроматографических пластин: в ступке тщательно растирают 0,3 г силикагеля, 0,03 г гипса с 3 мл дистиллированной воды; суспензию выливают на гладкую обезжиренную стеклянную пластинку длиной и шириной по 6 см, толщиной 2 мм. Пластинку кладут на строго горизонтальную поверхность и высушивают на воздухе в течение
143
12—14 ч, предохраняя от пыли; б) хроматографические сосуды. Берут батарейные стаканы высотой 13 см, диаметром 7 см и плоским дном внутри, с Пришлифованной стеклянной крышкой (пластиной); внутреннюю поверхность стаканов на 75% по окружности покрывают фильтровальной бумагой; в) градуированные стеклянные капилляры на 0,001 мл; г) стеклянный горизонтальный столик для хроматографических сосудов; д) хлороформ, перегнанный при 6Г С; е) метанол, перегнанный при 67° С; ж) аммиак, 25%-ный раствор; з) фенол, перегнанный при 182,7° С; и) нингидрин, 0,5%-ный ацетоновый раствор; к) система растворителей I: хлороформ — метанол — 25%.-ный водный аммиак, 5:3:1; л) система растворителей II: фенол — вода, 3:1.
Приготовление вытяжки из мышечной ткани. 1 г мяса тщательно растирают в ступке. Гомогенат переносят в центрифужную пробирку. Ступку ополаскивают несколькими миллилитрами 90%-ного этанола и вливают в ту же пробирку, общий объем жидкости в которой доводят этанолом до 10 мл. Содержимое пробирки перемешивают, после чего ее ставят в штатив на 10—20 мин., затем центрифугируют в течение 15 мин. при 3000 об/мин. Центрифугат сливают в небольшую выпарительную чашку, к осадку в пробирке добавляют 10 мл 96%-ного этанола, снова центрифугируют 10—12 мин. и сливают в ту же чашку.
Объединенный центрифугат выпаривают досуха на водяной бане. К остатку добавляют 3 мл воды, переносят в пробирку и для освобождения от липидов взбалтывают 2—3 раза с диэтиловым эфиром. Эфирный слой осторожно отсасывают с помощью капилляра и водоструйного насоса. Водный слой выпаривают на водяной бане. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл воды.
Хроматография. На пластинку со слоем адсорбента на расстоянии 1 см от края наносят с помощью капилляра каплю вытяжки.
Хроматографические сосуды ставят на горизонтальный стеклянный столик или другую строго горизонтальную поверхность и наливают систему растворителей I на высоту 0,5 см, потом вертикально устанавливают хроматографическую пластинку, чтобы часть ее ниже нанесенного пятна находилась в жидкости. Сосуд закрывают пришлифованной крышкой.
144
После того как растворитель поднимется по пластинке на 5 см, ее вынимают и переносят на 2—4 мин. в сушильный шкаф при температуре 105—110°. Высушенную пластинку снова ставят в тот же растворитель, затем высушивают. Описанную операцию повторяют три раза, после чего через слой адсорбента однократно пропускают систему II: пластинку переносят во второй сосуд и устанавливают в положение, перпендикулярное к тому, при котором производилось разделение аминокислот в системе растворителей I. Воздух в сосуде насыщают парами аммиака. Для этой цели на дно его ставят фарфоровый тигель или чашечку с 2%-ным раствором аммиака.
При разделении аминокислот во втором направлении хроматографию также ведут до тех пор, пока растворитель не поднимется по пластинке на 5 см, тогда ее вынимают, высушивают при 105° С до полного исчезновения запаха фенола (под тягой!). Высушенную пластинку опрыскивают раствором нингидрина и снова прогревают в течение нескольких минут в сушильном шкафу при 100—105° С. На пластинке появляются пятна аминокислот красновато-фиолетового или сине-фиолетового цвета.
Идентификация аминокислот. Для идентификации сопоставляют расположение пятен аминокислот на хроматограмме испытуемого раствора с пятнами, которые получаются в результате нанесения на адсорбент раство-
Табл. 6. Количество аминокислот (мг), необходимое для приготовления 1 мл 0,01 М раствора
Аминокислоты	Навеска	Аминокислоты	Навеска
Аланин	0,89	Лизии	0,82
Аспарагиновая кислота	1,33	Метионин	0,50
Аргинин	2,10	Серин	1,05
Валин	1.17	Тирозин (0,005 М)	0,90
Гистидин	2,20	Треонин	1,20
Глиции	0,75	Триптофан	2,04
Глютаминовая кис-	1,47	Цистин	2,40
лота		Фенилаланин	1,65
Лейцин	1,31	Пролин	1,15
145
ров заведомо известных аминокислот («свидетелей» или «метчиков»). С этой целью готовят 0,01 М растворы аминокислот (раствор тирозина — 0,005 М). В табл. 6 указаны навески аминокислот (в миллиграммах на 1 мл воды), необходимые для приготовления растворов.
На пластинку наносят каплю раствора одной из аминокислот и хроматографируют так же, как и испытуемый раствор. После прояв
Рис. 10. Двухмерные хроматограммы аминокислот в тонком слое силикагеля (по Г. В. Ко-лоболотскому):
Л — аминокислот-«свидетелей»; Б — вытяжки из свежего мяса: / — фенилаланин; 2 — лейцин; 3—метионин; 4 — тирозин; 5_валин; 6 —
аланин; 7 — пролин; 8 — глицин; 9 — серин; 10 - гистидин; 11 — глютаминовая кислота; 12 — аспарагиновая кислота; /3 — аргинин+лизин.
испытуемого раствора, определяя его аминокислотный состав.
Существует и другой вариант: на пластинку с силикагелем наносят смесь растворов перечисленных аминокислот. Расположение пятен аминокислот на хроматограмме переносят на кальку, которая служит эталоном для расшифровки хроматограммы вытяжки из мышечной ткани (рис. 10).
ления хроматограммы находят Rs аминокислоты. Так поступают и с растворами других аминокислот, получая 13—14 пластинок, на каждой из которых имеется пятно одной определенной аминокислоты.
На листе кальки вычерчивают квадрат со стороной 6 см. Квадрат накладывают на пластинки с пятнами аминокислот и на кальке отмечают расположение их пятен. Таким образом получают эталон, который накладывают на хроматограмму
ГИДРОЛИТИЧЕСКОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ БЕЛКА ФЕРМЕНТАМИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Пептоны, образовавшиеся при переваривании белков в желудке, а также белки, поступившие в двенадцатиперстную кишку в непереваренном виде, подвергаются воздействию протеолитических ферментов, выделяющихся главным образом поджелудочной железой и частично клетками слизистой оболочки тонкого кишечника.
146
В соке поджелудочной железы содержатся трипсин, химотрипсин и карбоксипептидаза.
Трипсин — один из важнейших протеолитических ферментов. Он выделяется в виде неактивного профермента трипсиногена. Под влиянием фермента энтерокиназы, содержащегося в кишечном соке, трипсиноген превращается в активную форму — трипсин. Трипсин катализирует гидролитическое расщепление не только полипептидов, образовавшихся при распаде белков в желудке, но и тех белков, которые поступили в кишечник в непереваренном виде. Оптимум действия трипсина лежит при pH 7,8. Под влиянием трипсина происходит гидролитический распад пептидных связей с образованием низкомолекулярных полипептидов со значительно меньшей величиной молекулы, чем у исходных веществ, а также небольшого количества свободных аминокислот.
Химотрипсиноген тоже выделяется в неактивном виде и активируется трипсином. Химотрипсин, как и трипсин, катализирует процесс гидролиза пептидных связей полипептидов и белков. Трипсин с наибольшей скоростью расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильными группами лизина и аргинина, тогда как химотрипсин действует главным образом на пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана.
Дальнейшее расщепление полипептидов происходит под действием пептидаз — карбоксипептидазы, аминопептидазы и дипептидаз. Карбоксипептидаза катализирует процесс гидролиза полипептида со стороны свободной карбоксильной группы. Аминопептидаза и дипептидазы содержатся в соке тонких кишок. Аминопептидаза катализирует гидролитическое расщепление полипептида со стороны свободной аминогруппы. Дипептиды, образовавшиеся в результате действия перечисленных ферментов, расщепляются (при участии дипептидаз) на свободные аминокислоты. Таким образом, конечными продуктами гидролитического расщепления белков в желудочно-кишечном тракте являются аминокислоты, которые и усваиваются организмом.
Определив содержание азота а-аминокислот в белке до его контакта с ферментом и затем через некоторое время, в процессе расщепления, можно установить интенсивность процесса гидролиза.
147
Содержание азота аминокислот (аминного азота) определяют с помощью метода, основанного на том, что а-аминокислоты и пептиды образуют внутрикомплексные соединения с ионами двухвалентной меди. Указанные соединения реагируют с подпетым калием в кислой среде, при этом выделяется иод, который оттитровывают серноватистокислым натрием (гипосульфитом, тиосульфатом).
Реакции протекают по следующим уравнениям:
... —гн	/с00к
т-а,	''о—а>
12 + 2 Na2S2 03 = 2NaJ + Уаг5^06
1 мл 0,01 н раствора гипосульфита соответствует 0,28 мг азота аминокислот.
Реактивы: а) желатин, 1%-ный раствор; б) панкреатин (препарат поджелудочной железы): 2 г препарата растворяют в 20 мл 1%-ного раствора двууглекислого натрия (гидрокарбоната натрия). Раствор фильтруют; в) хлорная медь: 27,3 г соли растворяют в мерной колбе на 1 л и доводят водой до метки; г) натрий фосфорнокислый трехзамещенный (Na3PO4-12Н2О) : 68,5 г соли растворяют в мерной колбе на 1 л и доводят водой до метки. Раствор можно готовить также из двухзамещенного фосфорнокислого натрия. В этом случае 64,5 г Na2HPO4’12Н2О растворяют в 500 мл дистиллированной воды (предварительно прокипяченной для освобождения от СО2 и остуженной), раствор количественно переносят в мерную колбу на 1 л, добавляют 7,2 г едкого натра, после растворения которого раствор доводят водой до метки; д) боратный буфер (pH 8,8): 28,6 г буры (тетра-борнокислого натрия) растворяют в 750 мл воды (в мерной колбе на 1 л), прибавляют 50 мл нормального раствора соляной кислоты и доводят водой до метки; е) суспензия фосфорнокислой меди в боратном буфере: 100 мл раствора хлорной меди смешивают с 200 мл раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия и добавляют 200 мл боратного буферного раствора. Суспензию готовят не более чем на один день, лучше
148
всего перед употреблением; ж) тимолфталеин: 0,25 г индикатора растворяют в 100 мл 50%гного этилового спирта; з) тиосульфат натрия, гипосульфит (Na2S2O3X Х5Н2О), 0,1 н раствор. Перед употреблением из него готовят 0,01 н раствор; и) крахмал, 0,5%-ный раствор; к) иодистый калий (KJ), 10%-ный раствор. Готовят перед употреблением; л) уксусная кислота, концентрированная; м) трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; н) едкий натр, 1 н раствор.
Нумеруют четыре конические колбы емкостью по 50 мл. Во все колбы вносят по 2 мл раствора панкреатина. В колбах 3 и 4 нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин. разрушают ферменты, в колбах 1 и 2 остаются активные ферменты.
В колбы 1 и 3 пипеткой вносят по 20 мл раствора желатина, в колбы 2 и 4 — по 20 мл дистиллированной воды. Растворы во всех колбах перемешивают и немедленно отбирают из каждой колбы по 2—5 мл смеси в мерные колбы на 25 мл для определения азота аминокислот.
В каждую мерную колбу еще до внесения смеси наливают по 2 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для инактивирования ферментов. В первую очередь добавляют трихлоруксусную кислоту в колбу 1.
В растворах, внесенных в мерные колбы, определяют содержание азота аминокислот.
Все исходные смеси (в конических колбах) ставят на 1 ч в термостат при температуре 38° С.
Для определения азота аминокислот в каждую мерную колбу прибавляют 2 капли раствора тимолфталеина и по каплям 1 н раствор едкого натра до светло-голубого окрашивания (pH 10,2). К нейтрализованным растворам доливают по 10 мл суспензии фосфорнокислой меди и тщательно перемешивают. Если весь объем суспензии прореагировал, добавляют еще 5 мл.
Колбы доводят водой до метки, хорошо перемешивают и смесь фильтруют (через фильтр из плотной бумаги) или центрифугируют. Фильтрат (или центрифугат) должен быть совершенно прозрачным.
Примечание. В случае необходимости фильтрат (цеитри-фугат) можно оставить на следующий день (в темном и холодном месте).
В две конические колбы пипеткой вносят по 10 мл фильтрата, прибавляют по 0,5 мл уксусной кислоты и
149
5 мл раствора йодистого калия (или 0,5 г порошка KJ), выделившийся иод тотчас же оттитровывают 0,01 н раствором тиосульфата натрия (гипосульфита). Раствор тиосульфата добавляют до тех пор, пока окраска жидкости в колбе не станет светло-желтой, после чего приливают 5—6 капель раствора крахмала и дотитровывают тиосульфатом до обеспечивания синей окраски.
На основании результатов титрований вычисляют содержание азота аминокислот во всем объеме каждого из исходных растворов (в конических колбах). Данные, характеризующие содержание аминного азота в колбах 2 или 4, будут указывать на количество свободного азота аминокислот в 2 мл ферментного препарата (раствора панкреатина). Разность в содержании азота аминокислот в колбах 3 и 4 указывает на количество азота свободных аминогрупп в 20 мл раствора желатина. Разность в содержании аминного азота в колбах 1 и 2 (1—2) должна быть практически такой же, как и в колбах 3 и 4 (3-4).
После часа инкубации колбы вынимают из термостата и повторяют определения аминного азота. Данные анализа пересчитывают на исходный объем смеси — 22 мл (2 мл раствора панкреатина + 20 мл раствора желатина или воды).
Разность между содержанием аминного азота в колбах 3 и 4 должна быть такой же, как и до инкубации, разность же между колбами 1 и 2 должна возрасти после инкубации по сравнению с той же величиной в начале опыта.
Иногда наблюдаются случаи, когда содержание азота аминокислот в колбе 2 после инкубации оказывается более высоким, чем в колбе 4. Это свидетельствует о само-переваривании (автолизе) ферментного препарата.
Рассмотрим следующий пример расчета.
В коническую колбу внесли 2 мл раствора панкреатина и 20 мл раствора желатина; оттуда в мерную колбу для определения аминного азота отобрали 2 мл смеси. После фильтрования были отобраны две пробы по 10 мл прозрачного фильтрата, на титрование которых израсходовали соответственно 1,92 и 1,96 мл 0,01 н раствора тиосульфата натрия (среднее—1,94 мл).
1 мл 0,01 н раствора тиосульфата натрия (гипосульфита) соответствует 0,28 мг азота аминокислот.
150
Количество азота аминокислот х{ (мг) в объеме мерной колбы (25 мл)
1,94 - 0,28 • 25
X. =-------.
Содержание азота аминокислот х2 (мг) в исходном растворе (22 мл)
1,94  0,28 - 25 - 22
х« =-------.
ДЕЗАМИНИРОВАНИЕ АМИНОКИСЛОТ
Общие сведения. Дезаминирование — один из путей дальнейшего превращения аминокислот в организме. В результате этого процесса аминокислоты отщепляют аммиак и превращаются в безазотистые соединения. Возможны несколько типов дезаминирования:
а) окислительное
ОН—СООН + j02 R—С—СООН + NH} ‘
NH2	J
б) восстановительное
R—CH—COOH +2Н
I -----------*
ин2
р—сн2—С00Н + ин3;
в) гидролитическое
R—-CH—COOH +Н20 R—CH—C00H + NH3. нн2	он
Окислительное дезаминирование превалирует у животных, растений и многих видов микроорганизмов, другие типы дезаминирования встречаются главным образом у некоторых анаэробных микробов. Окислительное дезаминирование протекает в два этапа.
151
Первый этап
Я	R
I	+уОг |
СН~ NHZ —-—* C—NH + нг0.
СООН	СООН
Иминокислота
Промежуточными акцепторами водорода являются НАД или ФМН, которые восстанавливаются до НАД • Н2 или ФМН • Н2. В дальнейшем водород восстановленных форм коферментов переносится на кислород с образованием воды.
Второй этап. Иминокислота присоединяет воду и распадается на кетокислоту и аммиак:
R	Ч
I +Нг0 I C=NH --------*- 0=0 + NH3.
соон	соон
Аминокислота Кетокислота
Второй этап проходит спонтанно, без участия ферментов.
Окислительное дезаминирование D-, Л-аланина. D-, L-аланин под действием фермента оксидазы-Д-аминокис-лот окисляется в пировиноградную кислоту. При этом отщепляется аммиак, который можно определить с помощью реактива Несслера.
СН3	4- /л
I	+	I
CH—NH2 —------------------------0=0	-I-	NH3
I Оксидаза-Д-аминокислот I
СООН .	СООН
ПироЬиноградная
кислота
Реактивы: а) ферментный препарат оксидазы-Д-аминокислот. Освобожденные от капсулы почки крысы на холоду тщательно разрезают ножницами на мелкие кусочки, которые затем растирают в ступке в кашицу. Кашицу дйажды экстрагируют 10-кратным объемом охлажденного ацетона. Ацетон отсасывают на воронке Бюхнера, а осадок два раза промывают диэтиловым эфи
152
ром. Эфир испаряют на воздухе (в вытяжном шкафу), выключив в лаборатории нагревательные приборы. Порошок ферментного препарата хранят в холодильнике. Он сохраняет свою активность в течение 5—7 дней. Перед употреблением порошок экстрагируют 20 мин. фосфатной буферной смесью (pH 7,6) в отношении 1 : 20, после чего центрифугируют 10 мин. при 3000 об/мин.; б) D-, L-аланин, 2,5^-ный раствор на фосфатной буферной смеси (pH 7,6); в) фосфатная буферная смесь pH 7,6 (приготовление см. прил. 12); г) серная кислота, 10 % -ный раствор; д) реактив Несслера (см. работу «Колориметрическое определение общего количества азота»).
Опыт проводят в трех пробирках. В первую вносят 1 мл ферментного препарата (центрифугата) и 1 мл фосфатного буфера, во вторую — 1 мл раствора аланина и 1 мл буферной смеси, в третью — 1 мл ферментного препарата и 1 мл раствора аланина. Все пробы тщательно перемешивают, плотно закрывают заранее подобранными пробками и помещают в водяную баню 37—38° С на 1 ч (лучше пользоваться ультратермостатом). Во время инкубации тщательно следят за температурой воды в бане, не допуская ее повышения. По истечении указанного срока во все пробирки приливают по 1 мл 10%-ного раствора серной кислоты и 3—4 мл реактива Несслера и наблюдают за окраской жидкости. В опытной пробе (третья пробирка) появляется интенсивное желто-оранжевое окрашивание (до желто-бурого), вызванное продуктом взаимодействия аммиака с реактивом Несслера (иодидом меркураммония). Жидкость в первой и второй пробирках, которые служили контролем, примет бледно-желтую окраску.
ПЕРЕАМИНИРОВАНИЕ (ТРАНСАМИНИРОВАНИЕ) АМИНОКИСЛОТ
Общие сведения. Трансаминирование играет важную роль в процессах биологического распада и синтеза аминокислот. Реакция переаминирования, открытая советскими учеными А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман, заключается в переносе аминогруппы с аминокислоты на кетокислоту, которая таким образом преобразуется в аминокислоту. Аминокислота — донатор аминогруппы, кетокислота — ее акцептор. Реакция катализируется
153
ферментами трансаминазами, простатической группой которых служит фосфопиридоксаль, являющийся промежуточным переносчиком аминогруппы. Присоединив аминогруппу, фосфопиридоксаль превращается в фосфо-пиридоксамин, с которого уже аминогруппу принимает кетокислота.
Принцип работы. Аланин и а-кетоглютаровая кислота подвергаются переаминированию с образованием пировиноградной и глютаминовой кислот:
соон
СЩ	СНг	СН3
I	| __________I
CH—NHz + СН2 ______________ С—О +
I	I	1
СООН	0—0	соон
Лианин соон Пировиноградная
соон
снг
I
сн2
ch—nh2
соон
ОтКетоглютаробая кислота. рЛ1Отшт2НоВая кислота	кислота
Образование пировиноградной кислоты можно доказать реакцией с салициловым альдегидом (оранжевая окраска). Для того чтобы задержать процесс на стадии образования пировиноградной кислоты и предотвратить ее восстановление в молочную, к реакционной смеси добавляют монобромуксусную кислоту.
Реактивы: а) L-аланин, 0,1 М раствор, приготовленный на 0,1 М растворе двууглекислого натрия; б) а-кетоглютаровая кислота, 0,1 М раствор, приготовленный на 0,1 М растворе двууглекислого натрия. Раствор предварительно нейтрализуют 2%,-ным раствором двууглекислого натрия или 0,2 М раствором едкого натра, добавляя рассчитанное его количество; в) двууглекислый натрий (бикарбонат натрия), 0,1 М раствор; г) монобромуксусная кислота (СН2ВгСООН), 0,002 М раствор, нейтрализованный щелочью; д) трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; е) салициловый альдегид, 2%-ный спиртовой раствор; ж) кали едкое, концентрированный раствор (100 г КОН растворяют в 60 мл дистиллированной воды).
Животное (мышь, крысу, кролика) быстро обезглавливают. На холоду быстро готовят кашицу из скелетных
154
мышц. Из мышечной кашицы берут навески по 1 г (на маленьких часовых стеклах или кусочках плотной бумаги), которые до начала опыта хранят в холодильнике.
Опыт проводят в трех больших пробирках: первая и вторая — контрольные, третья — опытная. В первую пробирку вносят по 2 мл растворов аланина и двууглекислого натрия и 1 мл раствора монобромуксусной кислоты; во вторую — то же, но вместо аланина приливают 2 мл раствора а-кетоглютаровой кислоты; в третью — по 2 мл растворов аланина и а-кетоглютаровой кислоты и 1 мл раствора монобромуксусной кислоты. Затем быстро во все три пробирки одновременно вносят мышечную кашицу, перемешивают, пробирки закрывают пробками и помещают в термостат при 37—38° на 1 ч, все время встряхивая пробы (удобно пользоваться ультратермостатом или, еще лучше, аппаратом для встряхивания пробирок с термостатной ванной).
Через час пробы вынимают, в пробирки для осаждения белков приливают по 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, встряхивают для перемешивания и через 3— 5 мин. фильтруют.
К 2 мл фильтрата из каждой пробирки добавляют по 2 мл раствора едкого кали и 1 мл раствора салицилового альдегида, пробирки встряхивают и ставят на 10— 12 мин. в водяную баню или ультратермостат при температуре 37—38°.
Жидкость в опытной пробирке принимает интенсивное оранжевое окрашивание, свидетельствующее о наличии пировиноградной кислоты, в контрольных пробирках окраска жидкости остается светло-желтой.
Раздел VI
ХИМИЯ И ОБМЕН ЛИПИДОВ
Под общим названием «липиды» объединяют большую группу нейтральных жиров и жироподобных веществ (или липоидов). Свойством, общим для всех этих соединений, является их растворимость в органических растворителях (бензоле, петролейном эфире, бензине, хлороформе, ацетоне, диэтиловом эфире, сероуглероде и др.) и нерастворимость в воде.
По химической природе липиды делят на следующие группы: а) жиры (нейтральные жиры), или триглицериды; б) высокомолекулярные жирные кислоты; в) фосфатиды (или фосфолипиды); г) цереброзиды; д) стерины и стериды; е) ганглиозиды; ж) воска и воскоподобные вещества.
Жиры и липоиды играют огромную роль в жизнедеятельности человека и животных.
Жиры — важный энергетический резерв организма (так называемый запасной или резервный жир). Они входят также в состав протоплазмы клеток, являясь структурными компонентами. Содержание резервного жира в организме зависит от уровня и характера питания, количество же протоплазматического (или структурного) жира не убывает даже при сильном голодании и не увеличивается при патологическом ожирении.
Липоидам принадлежит весьма важная роль в процессах жизнедеятельности. Они встречаются во всех клетках и тканях организма, обычно сопутствуя жирам; особенно много их в нервной системе. Липоиды концентрируются на периферии клеток, образуя полупроницае-
156
мне мембраны, избирательно регулирующие поступление веществ в клетку и их отток.
Липиды в организме животных образуют комплексные соединения с белками — липопротеиды.
Стерины входят в состав белого вещества головного мозга, участвуют в образовании ряда биологически активных веществ — витаминов, гормонов, желчных кислот и т. д.
ЖИРЫ (НЕЙТРАЛЬНЫЕ ЖИРЫ)
Общие понятия. Жиры — сложные эфиры глицерина и высокомолекулярных жирных кислот.
В состав жиров входят многочисленные предельные (или насыщенные) и непредельные (или ненасыщенные) жирные кислоты. Среди предельных кислот чаще встречаются стеариновая (Ci7H35COOH) и пальмитиновая (С15Н31СООН). Из непредельных жирных кислот основная роль принадлежит олеиновой (Ci7H33COOH), линолевой (Ci7H3iCOOH) и линоленовой (С17Н2дСООН), большое физиологическое значение имеет также арахидоновая (C]9H3iCOOH) кислота. Непредельные жирные кислоты характеризуются наличием двойных связей: в молекуле олеиновой кислоты содержится одна двойная связь, в молекуле линолевой — две, линоленовой — три, арахидоновой — четыре. Благодаря наличию двойных связей непредельные кислоты отличаются высокой реакционной способностью. Линолевая, линоленовая и арахидоновая (так называемые полиненасыщенные) кислоты не синтезируются в организме человека и должны поступать с пищей. Недостаток этих кислот в пище вызывает серьезные нарушения обмена веществ, исчезающие при потреблении продуктов, в состав которых входят непредельные жирные кислоты. Поэтому указанные соединения относят к веществам, обладающим витаминным действием (витамин F). Линолевая и линоленовая кислоты содержатся в растительных маслах (льняном, подсолнечном и др.), арахидоновая кислота — в печеночных жирах рыб, сливочном масле и некоторых видах маргарина.
В состав масел некоторых тропических растений входят также циклические жирные кислоты (хаульмугро-вая, гиднокарповая и др.).
157
Качественные реакции на жиры. Образование масляного пятна. Каплю масла наносят стеклянной палочкой на кусочек бумаги. Образуется пятно, не исчезающее при нагревании.
Растворимость ж и р о в. Р е а к т и в ы: а) растительное масло (подсолнечное, льняное, хлопковое или другое); б) твердый жир (бараний, говяжий); в) диэтиловый эфир; г) ацетон; д) этиловый спирт; е) дистиллированная вода.
Ставят два ряда пробирок по 4 в каждом. В пробирки первого ряда вносят по нескольку капель растительного масла, в пробирки второго ряда— по кусочку твердого жира. В первую пробирку каждого ряда наливают 2 мл дистиллированной воды, во вторую — столько же диэтилового эфира, в третью — ацетона, четвертую — спирта. Все пробирки взбалтывают и наблюдают растворимость жиров в различных растворителях. Пробирки со спиртом рекомендуется подогреть на водяной бане. Записывают результаты опыта.
Эмульгирование жирных масел. Реак-ти в ы: а) растительное масло; б) углекислый натрий, 2%-ный раствор; в) мыло, 2°/0-ный раствор; г) желчь; д) дистиллированная вода.
В четыре пробирки вносят по 5 капель масла. В первую пробирку добавляют 2 мл дистиллированной воды, во вторую — 2 мл 2%-ного раствора углекислого натрия (соды), в третью — столько же 2%-ного раствора мыла, в четвертую — 2 мд. воды и несколько капель желчи. Все пробирки взбалтывают и наблюдают образование в первой пробирке неустойчивой эмульсии масла в воде, быстро расслаивающейся при стоянии, а в остальных — устойчивой эмульсии благодаря действию добавленных эмульгаторов, которые адсорбируются в наружном слое жировых капель и понижают их поверхностное натяжение.
Акролеиновая реакция. С помощью пробы на акролеин определяют наличие глицерина в жирах. При нагревании жира с кислым сернокислым калием (KHSO4), натрием (NaHSO4) или борной кислотой (Н3ВО3) происходит отщепление от молекулы глицерина двух молекул воды и образование акрилового альдегида, или акролеина, обладающего резким раздражающим запахом (пригоревшего сала):
158
CH20H 	CHz
I —2Н20 II
CHOP -----------*" CH
I	1^0
снгон	c
^H
Глицерин	Акролеин
Реактивы: а) растительное масло или животный жир; б) воск пчелиный; в) кислый сернокислый калий или натрий, кристаллический; г) борная кислота, кристаллическая.
В сухую пробирку вносят несколько капель растительного масла или кусочек животного жира, добавляют немного порошка кислого сернокислого калия (или натрия) или борной кислоты и осторожно подогревают. Появляются белые пары акролеина, обладающие резким запахом. Повторяют реакцию с воском — акролеин не образуется, так как глицерин не входит в состав восков.
Омыление жира. При взаимодействии жиров со щелочами происходит их гидролиз с образованием солей высших жирных кислот (мыла) и глицерина. Натриевые соли представляют собой твердые мыла, калийные — жидкие. Реакция идет по уравнению
сн2 0 С Ci7H35
1
сн—o—c—ei7HjS +jkoh—*-
।
CH2—O—C—C„HjS
CHt-OH сн—он сн2—он
+3Ci7HJSC00K
Реактивы: а) растительное масло или животный жир; б) кали едкое, 30010\-ный спиртовой раствор; в) дистиллированная вода.
В широкую пробирку вносят 0,5 мл растительного масла или около 0,5 г животного жира и добавляют 10 мл спиртового раствора едкого кали. Пробирку закрывают пробкой с воздушным холодильником и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин., после чего в пробирку наливают горячую воду и растворяют в ней мыло.
159
Выделение свободных жирных кислот. Реактивы: а) раствор мыла (см. предыдущую работу); б) соляная кислота (1:1 по объему).
К 5 мл раствора мыла добавляют 1—2 мл раствора соляной кислоты. При взаимодействии сильной кислоты с мылом выделяются свободные жирные кислоты, которые всплывают на поверхность жидкости. Реакция идет по следующему уравнению:
С17Н35СООК+НС1^С17Н35СООН + КС1.
Образование нерастворимых мыл. Кальциевые и магниевые соли жирных кислот нерастворимы в воде.
Реактивы: а) раствор мыла (см. работу «Омыление жира»); б) хлористый кальций, 5—10%-ный раствор.
К 2—3 мл раствора калийного мыла добавляют 1 мл раствора хлористого кальция. Выпадает нерастворимый в воде осадок стеарата кальция
2C17HS5COOK+СаС12-> (С17Н35СОО)2 Са + 2КС1.
Проба на непредельные жирные кислоты. Непредельные жирные кислоты способны присоединять галоиды по месту двойных связей:
—С=С— +Вг2---------с—-С—
1 I
Вг вг
Реактивы: а) растительное масло; б) бромная вода (хранят под тягой!); в) диэтиловый эфир или хлороформ.
В пробирку наливают 1—2 мл масла, растворяют его в 2—3 мл диэтилового эфира или хлороформа, прибавляют 1—2 капли бромной воды и взбалтывают. Буроватожелтая окраска бромной воды исчезает, что указывает на присутствие непредельных кислот.
Количественное определение жира. В основу многочисленных методов определения содержания жира в биологическом материале положена способность липидов растворяться в органических растворителях (диэтиловом и петролейном эфире, четыреххлори
160
стом углероде, дихлорэтане, хлороформе и др.). При экстрагировании органическими растворителями в раствор переходят не только жиры, но также свободные жирные кислоты, фосфолипиды, стерпны, воска, эфирные масла, пигменты (например, хлорофилл) и ряд других веществ, поэтому продукт, получаемый в результате анализа, называют «сырым жиром» пли «суммой липидов». Для практических целей этот показатель обычно является достаточным, в случае же необходимости более точного определения «истинного жира» приходится в отдельных пробах материала исследовать содержание фосфолипидов (по фосфору), эфирных масел (перегонкой с водяным паром), свободных жирных кислот (тит-риметрическим методом) и т. д. и вносить соответствующие поправки в результаты анализа.
Приводим метод определения «сырого жира» в семенах масличных культур (по С. В. Рушковскому), нашедший широкое применение в лабораторной практике.
Реактивы и материалы:^ диэтиловый эфир. Для экстракции жира употребляют безводный эфир. В склянку с продажным эфиром прибавляют прокаленный хлористый кальций или негашеную известь (окись кальция). Сосуд укупоривают корковой пробкой, в которую вставляют трубку с прокаленным хлористым кальцием. По истечении 1—2 суток эфир сливают и к нему прибавляют новую порцию негашеной йзвести или хлористого кальция. Через 6—8 ч эфир сливают в сосуд, на дно которого кладут кусочки металлического натрия. Эфир должен быть также свободным от перекисей. Для этого к 1 л эфира добавляют 100 мл 4%гного раствора марганцовокислого калия и 10 мл 40%-ного раствора едкого кали или едкого натра, смесь осторожно взбалтывают и ставят в темное место на 20— 24 ч, после чего разделяют в делительной воронке. Нижний слой, водный, отделяют, а верхний, эфирный, несколько раз промывают дистиллированной водой и затем обезвоживают, как описано выше. Внимание! Диэтиловый эфир легко воспламеняется, его пары образуют с воздухом взрывоопасные смеси, поэтому все работы надо проводить при строжайшем соблюдении противопожарных мероприятий. Целесообразно заменять диэтиловый эфир невоспламеняющимся растворителем, например четыреххлористым углеродом или хлорофор-
6 Д. К. Шапиро
161
mom; б) фосфорнокислый натрий двузамещенный, безводный, или сернокислый натрий, безводный. Кристаллическую соль Na2HPO4 • 12Н2О высушивают в течение 6—8 ч при 100—105° С. Сернокислый натрий Na2SO4X Х10Н2О поокаливают в муфельной печи в течение 3—
Рис. 11. Экстракционный аппарат Сокслета.
4 ч; в) семена льна, конопли, подсолнуха, рапса, кунжута.
Аппаратура: а) экстракционный аппарат Сокслета (рис. 11). Состоит из трех частей, пришлифованных друг к другу: холодильника шарикового или спирального 1, экстрактора 2 и приемной колбы 3.
Берут 2—3 навески семян по 2—5 г (в зависимости от предполагаемого содержания масла). Навеску переносят в сухую фарфоровую ступку и растирают с безводным сернокислым натрием или фосфорнокислым натрием двузамещен-ным до получения однородной порошковидной массы. Соли берут в три раза больше по отношению к навеске.
Тщательно растертую массу количественно переносят в пакетик из фильтровальной бумаги, высушенной до постоянного веса. Пакетик заворачива-
ют, как порошок в аптеке, взвешивают на аналитических весах, и переносят в экстрактор аппарата Сокслета.
Примечание. В экстрактор можно поместить 4—6 пакетиков.
В приемную колбу наливают эфир (или другой растворитель) на */з емкости, после чего ее соединяют с экстрактором. В экстрактор наливают столько эфира, чтобы его уровень покрывал пакетики и почти доходил до верхней части сифона, затем с помощью шлифа соединяют его с холодильником и аппарат ставят на холодную водяную баню. Материал настаивают в растворите-
162
"ле не менее 3—4 ч и лишь после этого включают источник нагрева.
Примечание. Аппараты Сокслета следует установить в вытяжном шкафу. Еще раз подчеркиваем необходимость тщательного соблюдения всех противопожарных мероприятий. Во время заливки эфира выключают все электроприборы в лаборатории.
Пары эфира из приемной колбы по широкой трубке поступают в холодильник, где они конденсируются, и капли растворителя стекают в экстрактор, извлекая жир из растертых семян. Как только уровень эфира достигнет верхнего края сифонной трубки, он тотчас же начнет переливаться в приемную колбу. Таким образом, процесс экстракции продолжается непрерывно. Диэтиловый эфир кипит при температуре 34—35° С, поэтому надо так отрегулировать нагрев, чтобы в течение часа происходило не более 8—10 сливаний растворителя через сифонную трубку.
Экстракцию жира продолжают 5—6 ч (не считая времени настаивания), после чего пакетики с обезжиренным материалом вынимают из экстрактора, подсушивают на стекле в вытяжном шкафу (до испарения эфира) и высушивают (во взвешенных бюксах) при 100—105° С до постоянного веса. Содержание масла в семенах (в процентах на сухое вещество) рассчитывают, зная вес пакетика до и после экстракции, а также вес пустого пакетика. Берут среднее из 3—4 определений.
Определение химических показателей жиров. По своему составу природные жиры весьма неоднородны,. Они состоят из смеси триглицеридов различных предельных и непредельных жирных кислот. Кроме того, в их состав входят также моно- и диглицериды, свободные жирные кислоты, пигменты, жирорастворимые витамины, некоторая примесь белковых веществ. Нейтральным жирам обычно сопутствуют липоиды (фосфатиды, стери-ны, стериды и т. д.).
Растительные жиры (называемые обычно маслами) характеризуются жидкой консистенцией. В их состав входят главным образом непредельные кислоты. Масло какао и кокосовое — твердые.
Жиры животного происхождения — преимущественно твердые, так как состоят в основном из глицеридов предельных жирных кислот. Животные жиры жидкой кон
6*
163
систенции содержатся в тканях рыб и морских млекопитающих, копытах и костях наземных животных.
Жиры характеризуются рядом химических показателей. Основные из них: кислотное число, число омыления, эфирное число, иодное число.
Примечание. Для более подробной характеристики химических свойств жнров определяют также содержание летучих кислот (растворимых и нерастворимых в воде), окснкислот (ацетильное число), родановое и гексабромное числа и некоторые другие показатели, рассмотрение которых не входит в задачи нашего практикума.
При хранении жира под влиянием кислорода воздуха, влаги и солнечного света, при участии органических катализаторов-ферментов происходит его порча, прогоркание. Растительные масла, богатые непредельными кислотами, прогоркают быстрее, чем твердые жиры. Степень устойчивости жиров при хранении характеризуют перекисное число и содержание альдегидов. В значительной мере об этом свидетельствует и кислотное число, так как при порче происходит гидролитический распад триглицеридов и высвобождение свободных жирных кислот.
Кислотное число. Кислотным числом называется количество миллиграммов едкого кали, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира.
Реактивы: а) едкое кали, 0,1 н спиртовой раствор; б) смесь этилового спирта с диэтиловым эфиром (1:1); в) фенолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор; г) тимолфталеин, 1%-ный спиртовой раствор.
В сухую коническую колбу (емкостью 250 мл) отвешивают 3—5 г жира. Навеску растворяют в 50 мл предварительно нейтрализованной смеси спирта с эфиром.
Примечание. Смесь спирта с эфиром нейтрализуют 0,1 н спиртовым раствором едкого калн (в присутствии 3—4 капель раствора фенолфталеина) до слаборозового окрашивания н лишь после этого вливают в колбу с навеской жира.
Раствор жира титруют 0,1 н спиртовым раствором едкого кали (индикатор — фенолфталеин) до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 0,5—1 мин.
При определении кислотного числа темноокрашенных жиров вместо фенолфталеина пользуются 1°/о'-ным спир
164
товым раствором тимолфталеина (в кислой среде — бесцветен, в щелочной — голубое окрашивание).
Кислотное число к. ч. вычисляют по формуле вк5,611 к. ч. =----------------------,
где в — количество 0,1 н спиртового раствора едкого кали, израсходованное на титрование навески жира, мл; к — поправочный коэффициент к титру 0,1 н раствора КОН; 5,611 —титр точно 0,1 н раствора КОН; н — навеска жира, г.
Для характеристики кислотности растительных масел, кроме кислотного числа, часто рассчитывают процентное содержание свободной олеиновой кислоты О по формуле
О=к. ч. 0,53,
где к. ч. — кислотное число масла, мг.
Число омыления. Число омыления показывает, сколько миллиграммов едкого кали надо израсходовать для нейтрализации как свободных, так и связанных (в эфиры) кислот, содержащихся в 1 г жира.
Реактивы: а) растительное масло или животный жир; б) едкое кали, 0,5 н спиртовой раствор: 29—30 г гранулированного едкого кали растворяют в 25—30 мл воды, после чего для осаждения карбонатов прибавляют несколько миллилитров 35—40%-ного раствора хлористого бария и раствор в литровой мерной колбе доводят этиловым спиртом — ректификатом до метки. Хранят в хорошо укупоренной склянке оранжевого стекла. Для защиты от проникновения углекислоты воздуха склянку снабжают хлоркальциевой трубкой с натронной известью; в) соляная кислота, 0,5 н раствор; г) фенолфталеин, 1%гвый спиртовой раствор.
Коническую колбу (емкостью 250 мл) взвешивают на аналитических весах, затем в нее вносят около 2 г растительного масла или животного жира и снова взвешивают. По разности устанавливают навеску жира. В колбу с помощью пипетки с резиновой грушей вливают 25 мл 0,5 н спиртового раствора КОН, укупоривают пробкой с обратным холодильником и нагревают на водяной бане 35—40 мин., время от времени взбалтывая содержимое колбы. При омылении жира не следует допускать бурного
165
кипения воды в бане, которое может явиться причиной вспенивания жидкости в колбе и попадания ее на пробку. К концу процесса омыления раствор в колбе становится однородным, прозрачным, без капелек жира.
Горячий мыльный раствор в колбе оттитровывают 0,5 н соляной кислотой (индикатор — фенолфталеин) до обесцвечивания розовой окраски. Параллельно проводят контрольный опыт с тем же количеством 0,5 н спиртового раствора КОН, но без добавления жира. Контрольный опыт необходим для проверки титра раствора КОН, так как вследствие частичного проникновения углекислоты воздуха и окисления этилового спирта титр может меняться.
Число омыления ч. о. рассчитывают по формуле
(с — о) к28,055 ч. о. = —----------,
н
где с — количество 0,5 н раствора соляной кислоты, израсходованное на титрование контрольного («слепого») опыта, мл; о — количество 0,5 н раствора соляной кислоты, израсходованное на титрование испытуемого образца, мл; к —- поправочный коэффициент к титру приблизительно 0,5 н спиртового раствора КОН; 28,055 — титр точного 0,5 н раствора КОН (1 мл раствора содержит 28,055 мг КОН); н — навеска жира, г.
Эфирное число. Эфирным числом называют количество миллиграммов едкого кали, которое требуется для нейтрализации жирных кислот, связанных в виде эфиров в 1 г жира.'*
Эфирное число э. ч. определяют расчетным путем, вычитая кислотное число из числа омыления:
э. ч. = ч. о— к. ч.
Таким образом, число омыления является суммой кислотного и эфирного чисел.
Определение количества глицерина в жире. Химическое определение содержания глицерина в жирах является довольно трудоемким и продолжительным. Сравнительно неплохие результаты дает расчетный метод. Зная эфирное число жира, можно вычислить содержание глицерина, приняв во внимание, что для высвобождения одной молекулы глицерина надо израсходовать три молекулы едкого кали
166
СН2 О С Cfftys
I	л
сн—о—с-спн35
I	/
СН% О С Си Н33
СИ2—он
+3K0H—- сн—он
СН2-ОН
+ЗСпН35С00К-
Процентное содержание глицерина в жире г рассчитывают по формуле
__ 92,Оба. ч. 100 г~ 56,11 • 3 • 1000 ’
где 92,06 — молекулярный вес глицерина; э. ч. — эфирное число жира; 56,11 — молекулярный вес едкого кали.
Иодное число. Общие сведения. Иодное число показывает количество граммов иода, которое присоединяется к 100 г жира. Оно свидетельствует о количественном содержании непредельных кислот в жире, что позволяет судить о его устойчивости к окислению, полимеризации и другим превращениям. Иодное число является показателем, характерным для каждого вида свежего жира.
Химизм процесса присоединения галоидов описан выше (см. «Проба на непредельные жирные кислоты»). Следует подчеркнуть, что иод присоединяется главным образом к двойным связям, тогда как более реакционноспособные галоиды — хлор и бром — могут также замещать атомы водорода в углеводородном радикале кислоты.
Наиболее точным является определение иодного числа по Гюблю, однако оно связано с применением весьма ядовитого реактива — сулемы (HgCb) и поэтому не может быть рекомендовано для студенческого практикума. Описываем более простой и быстрый метод определения иодного числа, применение которого не связано с использованием сулемы. Метод обладает вполне удовлетворительной точностью.
Определение иодного числа с бромистым иодом (по Ганусу). Бромистый иод образуется при взаимодействии иода с бромом в уксуснокислой среде.
Бромистый иод количественно присоединяется к непредельным жирным кислотам по месту двойных связей.
167
Избыток бромистого иода, не вошедший в реакцию, реагирует с иодистым калием но уравнению
BrI + KI = KBr + I2.
Выделившийся иод оттитровывают тиосульфатом
I2+Na2S20s=2NaI + Na2S<06.
Реактивы: а) растительное масло; б) реактив Гану са: 13 г кристаллического иода растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты (в мерной колбе емкостью 1 л). К раствору добавляют 8,2 г брома и доводят ледяной уксусной кислотой до 1 л. Хранят в склянке оранжевого стекла с притертой пробкой. Раствор готовится лаборантом (в вытяжном шкафу!); в) иодистый калий, 20%-ный раствор. Готовится непосредственно перед определением; г) тиосульфат натрия (гипосульфит, серноватистокислый натрий), 0,1 н раствор; д) крахмал, 1%-ный раствор; е) хлороформ.
В сухую коническую колбу или склянку с притертой пробкой емкостью 250—300 мл отвешивают на аналитических весах 0,2—0,3 г масла и растворяют его в 10 мл хлороформа. В другую такую же колбу или склянку вносят 10 мл хлороформа без масла («слепой опыт»), В обе колбы из бюретки (со стеклянным краном) добавляют по 25 мл реактива Гануса. Сосуды плотно закрывают пробками, смоченными в растворе йодистого калия. Содержимое сосудов осторожно взбалтывают, после чего сосуды ставят в темное место на 1—1,5 ч. По истечении указанного времени в оба сосуда добавляют по 10 мл 20%-ного раствора йодистого калия и 50 мл воды и выделившийся иод оттитровывают 0,1 н раствором тиосульфата натрия до слабо-желтой окраски, потом добавляют 10—12 капель раствора крахмала и продолжают титрование до полного обесцвечивания раствора.
При расчетах принимают во внимание, что 1 мл 0,1 н раствора тиосульфата натрия соответствует 1 мл 0,1 н раствора иода. Иодное число и. ч. вычисляют по формуле
ч _ (с —о) кО,01269 • 100 ‘	н	’
где с—количество 0,1 н раствора тиосульфата, израсходованное на титрование контрольной пробы («слепой опыт»), мл; о — количество 0,1 н раствора тиосульфата,
168
израсходованное при титровании опытного образца, мл; к — поправочный коэффициент к титру приблизительно 0,1 н раствора тиосульфата; 0,01269 — титр раствора тиосульфата по иоду; н — навеска масла, г.
Перекисное число. Общие сведения. Непредельные жирные кислоты легко подвержены окислению. Этот процесс протекает под воздействием кислорода воздуха, влаги, света и катализируется ферментом липоксигеназой (липооксидазой).
Перекиси — неустойчивые соединения. Они легко распадаются с образованием окисей и освобождением атомарного кислорода. Атомарный кислород в свою очередь служит источником образования озона и перекиси водорода.
В дальнейшем перекиси и окиси превращаются в оксикислоты.
Выделившийся озон окисляет новые молекулы непредельных кислот. Образуются нестойкие соединения, озониды, которые гидролитически расщепляются, превращаясь в альдегиды.
Вот почему определение содержания перекисей и альдегидов может оказать большую помощь при суждении о качестве растительного масла.
Определение перекисного числа. Количественное определение перекисей в растительном масле основано на реакции выделения иода перекисями из йодистого калия в кислой среде
Л-СН~СН~к'~СООН+2К1+Н20~^~СН-а/~И'-СООН+1г+2'Ш
i—4	V
Иод оттитровывают раствором тиосульфата.
Реактивы: а) растительное масло (лучше прогорклое); б) уксусная кислота, ледяная; в) хлороформ, химический чистый (лучше — для наркоза); г) калий иодистый, насыщенный раствор. Готовится перед употреблением; д) тиосульфат натрия (гипосульфит, серноватистокислый натрий), 0,002 н раствор. Готовят перед употреблением из 0,1 н раствора: в мерную колбу на 250 мл с помощью пипетки вносят 5 мл 0,1 н раствора и
169
доводят до метки прокипяченной (и затем охлажденной до 20° С) дистиллированной водой; е) крахмал, 0,5%-ный раствор.
В конической колбе или склянке с притертой пробкой емкостью 200 мл отвешивают (на аналитических весах) около 2 г масла. Навеску растворяют в 20 мл смеси ледяной уксусной кислоты и хлороформа (2:1 по объему), прибавляют 5 мл насыщенного раствора йодистого калия, сосуд укупоривают пробкой и ставят в темное место на 10 мин., после чего доливают 50 мл дистиллированной воды и оттитровывают выделившийся иод 0,002 н раствором тиосульфата (индикатор — крахмал). Одновременно проводят также контрольное определение (без масла).
Перекисное число п. ч. (количество граммов иода, выделенное перекисями, содержащимися в 100 г масла) рассчитывают по формуле
(с —о) «0,0002538 • 100
П. Ч. = -----—-----------,
н	’
где с — количество 0,002 н раствора тиосульфата, израсходованное при контрольном определении, мл; о — количество 0,002 н раствора тиосульфата, израсходованное при титровании опытного образца, мл; к — поправочный коэффициент раствора тиосульфата; 0,0002538 — титр 0,002 н раствора тиосульфата по иоду (1 мл раствора соответствует 0,0002538 г иода); н — навеска масла, г.
Качественная реакция на альдегиды (с реактивом Шиффа). Одной из наиболее специфичных является реакция альдегидов с фуксинсернистой кислотой (реактивом Шиффа). Бесцветный раствор фуксинсернистой кислоты под влиянием альдегидов принимает красно-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание.
Реакция протекает по следующей схеме:
170
Реактивы. Реактив Шиффа; можно готовить двумя способами: а) 0,5 г фуксина растворяют в 500 мл воды и фильтруют. 500 мл воды насыщают сернистым ангидридом. Оба раствора сливают вместе и оставляют на 10—12 ч. Хранят в темном месте; б) в мерную колбу емкостью 250 мл вливают 30 мл 0,1%-ного спиртового раствора фуксина, добавляют 15 мл 32%-ного водного раствора сернистокислого натрия (Na2SOs • 7Н2О) и 30 мл воды. Содержимое колбы осторожно перемешивают и оставляют на 1 ч, после чего прибавляют 16 мл разведенной серной кислоты (1:3) и доливают до метки 50%-ным этиловым спиртом. Хранят в склянке темного стекла или темном месте. При исследовании масел предпочтительнее пользоваться реактивом, приготовленным по второму способу.
В пробирку наливают 5—6 мл масла, добавляют 2—3 мл реактива Шиффа и взбалтывают. В случае наличия альдегидов жидкость окрасится в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет. Максимум окрашивания развивается через 15—16 мин. Если окраска не появляется через 20 мин. после начала опыта, то это свидетельствует об отсутствии альдегидов в масле.
Разделение и идентификация высших предельных жирных кислот с помощью хроматографии на бумаге. Общие сведения. С помощью описываемого мето
171
да можно разделить и идентифицировать высшие предельные (насыщенные) жирные кислоты, в состав которых входит от 12 до 24 атомов углерода.
Общая методика разделения органических веществ на бумаге описана выше (см. «Распределительная хроматография аминокислот на бумаге»).
Для хроматографирования жирных кислот применяют специально подготовленную гидрофобную бумагу. Высшие жирные кислоты являются гидрофобными веществами, поэтому при хроматографировании исключается применение воды в качестве неподвижной фазы. Роль подвижной фазы обычно выполняет ледяная уксусная кислота или смесь уксусной кислоты с муравьиной и водой (30: 10: 1).
Реактивы и материалы: а) животный жир; б) хроматографическая бумага «быстрая» Ленинградской бумажной фабрики или ватман № 3; в) уксусная кислота, ледяная, или смесь 98%-ной уксусной кислоты, 85%-ной муравьиной и воды в соотношении 30 :10:1 (по объему); г) вазелиновое масло (10°/с-ный раствор в бензоле) или керосин (температура кипения 190—210°); д) основной азотнокислый висмут, насыщенный раствор: 1 г соли тщательно взбалтывают с 1 л дистиллированной воды в течение 5—8 мин. Используют мутноватый раствор; е) раствор сульфгидрата аммония: раствор аммиака (р20=0,969) насыщают сероводородом или готовят 1О°/о-ный раствор сернистого натрия (NasS) в растворе аммиака указанной, плотности; ж) соляная кислота, 0,5%гный раствор; з) серная кислота (1:3 по объему); и) кали едкое, 25%-ный спиртовой раствор. Можно использовать 0,5 н раствор, применяемый при определении числа омыления жира; к) толуол, хлороформ, ацетон, метиловый или этиловый спирт, диэтиловый эфир; л) метчики: пальмитиновая, стеариновая и другие высшие предельные жирные кислоты.
Подготовка хроматографической бумаги. Бумагу промывают 0,5%-ным раствором соляной кислоты в течение 3 мин., после чего 5—6 раз дистиллированной водой, 3 раза этиловым спиртом и 4—5 раз диэтиловым эфиром, затем высушивают на воздухе (работу проводят под тягой, при выключенных нагревательных приборах, соблюдая при этом противопожарные мероприятия) .
172
Промытую и высушенную бумагу разрезают на полоски шириной 1—2 см и длиной 30—35 см. Один край каждой полоски прокалывают иголкой с ниткой, образуя петлю. Для гидрофобизации полоски опускают в цилиндр с притертой пробкой, на дно которого (слоем высотой в 4—6 см) налит бензольный раствор вазелинового масла. Нитяные петли подводят под пробку и сосуд плотно укупоривают. Полоски вынимают, когда раствор дойдет до верхнего края бумаги (на 1 см до петли), и высушивают при комнатной температуре (в вытджном шкафу). При обработке керосином полоски погружают в жидкость на 1 мин., потом вынимают, отжимают роликом между двумя листами фильтровальной бумаги и высушивают в висячем положении при комнатной температуре (в вытяжном шкафу).
Выделение смеси жирных кислот. В коническую колбу вносят 2—3 г жира и добавляют 20— 25 мл 25%-ного спиртового раствора едкого кали. Колбу плотно закрывают пробкой с обратным холодильником, ставят на кипящую водяную баню и проводят омыление жира в течение 35—40 мин. К раствору мыла в колбе прибавляют 25—30 мл горячей воды и перемешивают. Раствор переливают в выпарительную чашку и нагревают на горячей водяной бане (температура воды не выше 85° С) до полного исчезновения запаха спирта. К жидкости в чашке добавляют несколько миллилитров раствора серной кислоты (1:3) до полного выделения слоя жирных кислот. Содержимое чашки осторожно переливают в делительную воронку. Отделяют водно-кислотный слой, а слой жирных кислот несколько раз промывают теплой водой до нейтральной реакции промывных вод по метилоранжу. Промытый слой жирных кислот фильтруют через сухую фильтровальную бумагу в темную склянку с притертой пробкой и хранят в холодильнике.
Для хроматографирования готовят раствор жирных кислот в толуоле или ацетоне, или метиловом спирте, или смеси этилового спирта с диэтиловым эфиром. Отдельно готовят раствор метчиков (в том же растворителе). Концентрацию кислот в растворах подбирают так, чтобы в капле, нанесенной микропипеткой на бумагу, содержалось 10—25 мкг каждой кислоты.
Хроматографирование. На расстоянии 1— 1,5 см от нижнего края бумажной полоски графитовым
173
карандашом вычерчивают прямую линию, на которую с йомощью микропипетки наносят каплю испытуемого раствора. На другую такую же полоску наносят каплю раствора метчиков. Капли высушивают на воздухе.
Разделение произво
дят в стеклянных цилиндрах с притертыми пробками при комнатной температуре. На дно цилиндра наливают ледяную уксусную кислоту или смесь уксусной кислоты, муравьиной кислоты и воды (30: 10: 1). Полоску подвешивают за нитяную петлю, которую подводят под пробку так, чтобы нижний край бумаги был погружен в жидкость на 3— 5 мм.
После того как растворитель поднялся по бумаге на 26—28 см, полоски вынимают и высушивают при комнатной температуре, затем промывают в дистиллированной воде и снова высушивают.
В фотографическую ванночку наливают раствор основного азотнокислого висмута, в который кладут хроматограммы на 10—15 мин., затем их перекладывают в другую
Рис. 12. Хроматограмма жир- ванночку с дистиллиро-ных кислот.	ванной водой, которую ме-
няют 10—12 раз. Хорошо промытые полоски опрыскивают раствором сульфгидрата аммония (или кладут в ванночку с раствором): появляются черные пятна жирных кислот (рис. 12). Хроматограммы 5—6 раз промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Рассчитывают R/ каждой кис
174
лоты на опытной и контрольной хроматограммах (с метчиками) и по совпадению их мест устанавливают состав кислот испытуемого жира.
ФОСФАТИДЫ, ИЛИ ФОСФОЛИПИДЫ
Общие сведения. Одной из наиболее распространенных групп жироподобных веществ, или липоидов, являются фосфолипиды, или фосфатиды. Различают три группы фосфолипидов: а) фосфоглицериды, в состав которых входят глицерин, жирные кислоты, фосфорная кислота и азотистые основания (холин, коламин, оксиаминокислота серин); б) инозитфосфатиды (фосфатиди-линозитиды), содержащие вместо азотистого основания циклический шестиатомный спирт инозит; в) сфингоми-элины (сфингофосфолипиды), молекулы которых состоят из высокомолекулярного двухатомного ненасыщенного аминоспирта сфингозина, остатков жирной и фосфорной кислот и азотистого основания холина. В молекулах сфингомиэлинов жирная кислота соединена пептидной связью с аминогруппой сфингозина.
Выделение лецитинов из желтка куриного яйца. П о-нятие о лецитинах. Лецитины относятся к фосфоглицеридам (фосфатидилхолинам). При гидролизе лецитинов освобождается молекула глицерина, две молекулы жирных кислот (из которых одна является непредельной), молекулы фосфорной кислоты и азотистого основания холина.
Фосфорная кислота в молекуле лецитина соединена сложноэфирной связью со спиртовой группой холина
ЛН
Н0~СНг—СН2—П^-СН3 или
+
0Н~
\^СН3 CHS
Ctij

Холин
В зависимости от того, к какому углеродному атому глицерина присоединен остаток холинфосфорной кислоты, выделяют а- и р-лецитины. Лецитины различаются также пр жирным кислотам, входящим в их состав
175
Cfi2—0—0CRt
I
CH — 0—OCP2
I
CH2—0-T P—0— СНг— СНг	Cti3
/ \ I
0 on ctij
ос-лецитн
Cflz—O—OCRt
I
CH — 0 -P—O—CHz—CHz—H^-CHj
fl—лецитин
OH
ctb
CH2 — 0—0CRz
R,, R2 -остатки жирных кислот
0
Реактивы: а) желток куриного яйца; б) этиловый спирт; в) ацетон; г) хлористый кадмий, насыщенный спиртовой раствор.
В небольшой стаканчик вносят около *Д—7б желтка куриного яйца и, помешивая стеклянной палочкой, добавляют 10 мл горячего спирта. После остывания содержимое стаканчика фильтруют в сухую пробирку. Фильтрат должен быть прозрачным. Если в нем появляется муть, фильтрование повторяют до получения прозрачного фильтрата.
Со спиртовым раствором лецитинов проделывают ряд реакций.
Осаждение ацетоном. В сухую пробирку наливают 2—3 мл ацетона и по каплям прибавляют спиртовой раствор лецитинов. Выпадает осадок, так как лецитины в ацетоне не растворяются.
Получение эмульсии лецитинов. Для получения эмульсии к 2—3 мл спиртового раствора лецитинов добавляют (по каплям) дистиллированную воду. Образуется устойчивая эмульсия лецитинов в воде.
Осаждение хлористым кадмием. В сухой пробирке к 1 мл спиртового раствора лецитинов добавляют по каплям насыщенный раствор хлористого кадмия. Выпадает белый осадок соединения лецитинов с хлористым кадмием.
Гидролиз лецитинов и исследование их состава. Р е а к т и в ы: а) спиртовой раствор лецитинов (см. выше); б) едкое кали или едкий натр,
176
10%-ный раствор; в) хлорная платина, 10%-ный спиртовой раствор; г) кислый сернокислый калий или натрий (KHSO4 или NaHSO4), кристаллический, или борная кислота (Н3ВО3), кристаллическая; д) ацетон; е) азотнокислый калий (KNO3), кристаллический; ж) углекислый натрий (NazCOs), кристаллический; з) азотная кислота, концентрированная; и) молибденовый реактив (см. «Гидролиз нуклеопротеидов»).
К спиртовому раствору лецитинов прибавляют ацетон до выпадения осадка, с которым производят дальнейшие реакции. Для выполнения работы можно также использовать фармацевтический препарат «лецитин-церебро» в драже (перед проведением реакций драже очищают от оболочки).
Часть осадка лецитинов нагревают с несколькими миллилитрами 10%-ного раствора едкого натра или едкого кали. Лецитины гидролизуются на свои компоненты. При гидролизе происходит частичный распад холина с отщеплением триметиламина, обладающего селедочным запахом.
С гидролизатом производят реакции на жирные кислоты, холин, глицерин и фосфат-ион.
Проба на жирные кислоты. К части гидролизата добавляют по каплям 10%-ный раствор серной кислоты — выделяются свободные жирные кислоты. Содержимое пробирки фильтруют через бумажный фильтр, на котором задерживаются жирные кислоты.
К фильтрату прибавляют раствор едкого кали или едкого натра до нейтральной реакции на лакмус, после чего выпаривают досуха на водяной бане. Сухой остаток делят на три части.
Проба на глицерин. Часть сухого остатка сплавляют с порошком кислого сернокислого калия или натрия, или борной кислоты. Образуется акролеин, который обнаруживается по резкому специфическому запаху.
Проба на холин. Кроме образования триметиламина (см. выше), наличие холина определяют с помощью реакции с хлорной платиной. Другую часть сухого остатка растворяют в этиловом спирте и к раствору добавляют по каплям 10%-ный спиртовый раствор хлорной платины. Выпадает осадок хлороплатината холина. Осадок отделяют фильтрованием, растворяют его в нескольких каплях горячей воды. При медленном охлажде
177
нии раствора выделяются кристаллы хлороплатината холина оранжево-красного цвета.
Проба на фосфат-ион. Часть сухого остатка переносят в небольшой тигель, прибавляют немного азотнокислого калия и углекислого натрия в порошке, перемешивают с сухим остатком и сплавляют на небольшом огне. Сплав растворяют в 2 мл азотной кислоты, растирая палочкой. К раствору добавляют 2 мл молибденового реактива и нагревают. Выпадет желтый осадок фосфорномолибденовокислого аммония.
Разделение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии (по прописи М. И. Прохоровой и 3. Н. Тупиковой). В последние годы широкое распространение получил метод распределительной хроматографии в тонком слое адсорбента на стеклянных пластинках, названный тонкослойной хроматографией. Этот метод, предложенный советскими исследователями Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбером в 1938 г., отличается быстротой выполнения и простотой, не требует сложной аппаратуры.
Применяют два варианта метода: с закрепленным (с помощью фиксатора) и незакрепленным слоем адсорбента на пластинке. Адсорбентом служит силикагель отечественного производства (марки КСК), к которому в качестве фиксатора добавляют медицинский гипс, рисовый или маисовый крахмал и воду.
Для качественного разделения фосфолипидов применяют стекло с гладкой поверхностью (зеркальное; стекла от фотопластинок; предметные). Размеры стекол: 3X9 см или 4X18 см.
Готовят смесь силикагеля с гипсом и водой. На 1 см2 пластинки берут 12,5—15 мг силикагеля, 1—1,2 мг гипса и 0,03—0,04 мл воды. Силикагель измельчают на шаровой мельнице и просеивают через сито с отверстиями в 60 мкм. К адсорбенту добавляют также раствор родамина G-6, с которым фосфолипиды образуют комплексные соединения, флуоресцирующие в ультрафиолетовых лучах. К 54 мл в'оды прибавляют 0,0011 г родамина G-6.
Силикагель, гипс и воду (в указанных соотношениях) тщательно смешивают в ступке (лучше агатовой) и однородную массу шпателем наносят на стеклянные пластинки, следя, чтобы слой адсорбента был равномерным, без пузырьков. Пластинки оставляют (в строго горизонтальном положении) на воздухе (при 20—28°С) на 20 —
178
25 мин., после чего для активирования адсорбента нагревают при 105° С в' течение 30 мин. или при 80° — 45— 60 мин.
Хроматографическая камера представляет собой стеклянный сосуд любой формы (удобнее всего — четырехугольный) с плоским дном и пришлифованной крышкой.
Фосфолипиды растворяют в смеси хлороформа с бутиловым спиртом (2 : 1). На расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки намечают стартовую линию, на которую с помощью микропипетки (объемом 0,1 мл) или капилляра наносят раствор липидов в виде точек, отстоящих друг от друга на 1 см. Раствор наносят осторожно, стараясь не нарушить слоя адсорбента. Лучшие результаты получаются, если нанести на пластинку не более 1 мг фосфолипидов'.
Пластинку ставят в вертикальном положении. На дно камеры наливают растворитель в таком количестве, чтобы нижний край пластинки был погружен в жидкость на 5 мм.
При тонкослойной хроматографии фосфолипидов чаще всего употребляют следующие растворители: а) хлороформ— метиловый спирт — 7 н аммиак (60:35:5 по объему); б) хлороформ — метиловый спирт — уксусная кислота — вода (50 : 25 : 8 : 4); в) хлороформ — метиловый спирт — вода (65:25:4). Для насыщения воздуха камеры парами растворителя внутри сосуда укрепляют куски фильтровальной бумаги, смоченной растворителем. Камеру закрывают пришлифованной крышкой (в роли крышки может выступать хорошо пришлифованная к стенкам стеклянная пластинка). Разделение фосфолипидов производят до тех пор, пока жидкость не поднимется на высоту 7—8 см (на пластинках 3x9 см) или 10—12 см (на пластинках 4\18 см). Обычно оно продолжается около 20—25 мин. По истечении указанного времени пластинку вынимают из камеры и просматривают в ультрафиолетовых лучах (в ультрахимископе): фосфолипиды, содержащие серин и инозит, проявляются в виде пятен лилового или синего цвета; пятна фосфатидов, в состав молекул которых входят холин и этаноламин (коламин), дают желтую или желто-оранжевую флуоресценцию.
Если при формировании массы адсорбента не был добавлен родамин G-6, то еще влажные пластинки, вынутые из камеры, можно опрыскивать 0,03%-ным раствором
179
родамина G-6 или родамина В в 95%-ном этиловом спирте и просматривать в ультрафиолете.
Кроме родамина, применяют также следующие проявители:
а)	Пары иода. Высушенную при комнатной температуре пластинку помещают на 1 мин. в герметически закрываемый сосуд с парами иода.
б)	Железо-сульфосалициловый реактив. В 25 мл воды растворяют 7 г сульфосалициловой кислоты и 0,1 г хлорного железа, после чего раствор доливают до 100 мл 95%-ным этиловым спиртом. Он является реагентом на фосфатные группы.
в)	Молибденовую кислоту. 3 г молибденовокислого аммония растворяют в 50 мл воды, добавляют 5 мл 6 н соляной кислоты и 13 мл 70%-ной перхлорной кислоты.
Пластинки, вынутые из камеры, высушивают при комнатной температуре, опрыскивают раствором проявителя и прогревают 10 мин. при 80° С. Фосфатиды проявляются в виде синих или серовато-синих пятен.
Пользуются также частными проявителями, с помощью которых можно обнаружить отдельные компоненты молекулы фосфолипидов.
а)	Раствор нингидрина. Сухие пластинки опрыскивают раствором нингидрина (приготовление см. с. 8) и высушивают при комнатной температуре. На белом фоне пластинки появляются красные или красно-фиолетовые пятна, обусловленные свободными аминогруппами.
б)	Аммиачный раствор окиси серебра. Сухие пластинки опрыскивают аммиачным раствором окиси серебра (см. работу «Гидролиз нуклеопротеидов») и прогревают при 110° С до появления коричневых пятен, обусловленных глицерином и инозитом.
в)	Реактив Драгендорфа (см. работу «Осаждение белков реактивами на алкалоиды»). Сухие пластинки опрыскивают реактивом Драгендорфа и высушивают при комнатной температуре. Появляются пурпурные или оранжевые пятна холина и холинсодержащих соединений.
г)	Реактив Шиффа. Для проявления фосфолипидов реактив готовят по следующей прописи: 4 г основного фуксина растворяют в 17 мл горячей воды (90—95° С), добавляют воду до 1 л и перемешивают до тех пор, пока температура раствора не снизится до 40°. После этого добавляют 8 г пиросернистокислого калия (пиросульфи
180
та) K2S2O5 и 10 мл концентрированной соляной кислоты и оставляют стоять 16—18 ч, затем к раствору прибавляют 2 г активированного угля, перемешивают и фильтруют на воронке Бюхнера. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным. Хранят в холодильнике (до 1 месяца). Для проявления фосфолипидов смешивают 1 мл реактива Шиффа, 1 мл 0,05 М раствора двухлорной ртути (сулемы) и 10 мл 0,05 М раствора серной кислоты, после чего доводят водой до 100 мл.
Сухие пластинки опрыскивают проявляющим раствором: на бледно-фиолетовом фоне появляются фиолетовые пятна. Проявитель реагирует со всеми фосфолипидами.
Рассчитывают значение Rf для каждой фракции фосфолипидов сравнивая их со следующими данными (по А. А. Липской):
Фосфолипиды	Rj
Фосфатидиновые кислоты	0,73
Фосфатидилэтаноламин (кефалин)	0,58
Фосфатидилхолин (лецитин)	0,35
Ф осфа тиди линозитиды	0,31
Сфингомиелин	0,23
Фосфатидилсерин	0,19
Лизофосфатидилхолин	0,11
Примечание. Растворитель хлороформ-:летанол-7н аммиак.
СТЕРИНЫ
Общие сведения. Стерины — высокомолекулярные циклические спирты, в основе строения которых лежит ядро циклопентанпергидрофенантрена. Стериды — сложные эфиры стерипов с высокомолекулярными жирными кислотами (чаще всего — пальмитиновой, стеариновой и олеиновой).
Циклопентанпергидрофепантрен
181
Одним из наиболее распространенных стеринов является холестерин, вторичный высокомолекулярный циклический спирт.
н2с
сн3
г/^н— сн—сн—сн2—сн2—сн—сн3
( Y }сн2 |	|
Н2С
СН3 н2с \нс /ЦЛ/сн ( сн
сн2
сн3
сн3
Холестерин
Ut1 сн2 НС
Холестерин — типичный представитель стеринов животного организма (зоостеринов). При дегидрировании молекулы холестерина образуется провитамин D3 (7-де-гидр охолестер ин). Из холестерина образуются желчные кислоты, стероидные гормоны.
Стерины, встречающиеся в растениях, называют фитостеринами. В дрожжах содержится эргостерин, который при облучении ультрафиолетовыми лучами превращается в витамин D2. В растительных маслах содержатся стигмастерин и p-ситостерин, в бурых водорослях — фукостерин. p-СитОстерин найден в плодах малины, ежевики, грейпфрута.
К производным циклопентанпергидрофенантрена относятся также некоторые алкалоиды, гликозиды и сапонины — вещества, содержащиеся в растениях и обладающие активным физиологическим действием.
Так, агликонами гликозидов наперстянки, горицвета, ландыша и некоторых других растений, употребляющихся для лечения заболеваний сердца, являются стероиды. Имеются также данные, что гормон цветения растений относится к производным циклопентанпергидрофенантрена.
Реакция Сальковского на холестерин. Под действием концентрированной серной кислоты происходит дегидратация молекулы холестерина с образованием холестери-лена — соединения, окрашенного в красный цвет.
182
Н2С
C»3
1	---CH~(CH2),—ch—ch3
Z\C/\ I	|
CH3
w /6С
ю к ____]гн
/^ЛУсн^ сн
СНг I cn3
— Н20
\Ж/Снг сн2 сн ----
СН3 н2с I /\С/ Н2СС
Нзс н2с Iwe zvA/w сн
СН----сн— (CH2)j—CH—CH3
\сн2
сн3
сн3
сн2
Холестерилен
hC\K^ сн сн
Реактивы: а) холестерин, 1 %-ный хлороформный раствор, или растительное масло, хлороформный раствор; б) серная кислота, концентрированная (Рго= 1,836).
К 2—3 мл хлороформного раствора холестерина (или растительного масла) в пробирке осторожно, наслаивая по стенке, добавляют 1—2 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку легко встряхивают. Вначале верхний слой, а затем и вся жидкость в пробирке принимает красную, оранжевую или красно-фиолетовую окраску.
Реакция Либермана — Бурхарда на холестерин. При реакции холестерина с уксусным ангидридом и серной кислотой образуются сульфокислоты холестерилена, обладающие сине-зеленой или зеленой окраской.
Реактивы: а) холестерин, 1 %-ный хлороформный раствор, или растительное масло, хлороформный раствор; б) уксусный ангидрид; в) серная кислота, концентрированная (Р2о= 1,836).
В пробирку наливают 2—3 мл хлороформного раствора холестерина или растительного масла, прибавляют 10 капель уксусного ангидрида и наслаивают по стенке 2—3 капли концентрированной серной кислоты. Через 5—8 мин. появляется вначале красное, затем сине-зеленое и зеленое окрашивание.
183
Реакция Витби на наличие стеринов в растительных маслах. Реактивы: а) подсолнечное или другое растительное масло; б) хлороформ; в) смесь концентрированной серной кислоты с формалином (50 :1).
В сухую пробирку наливают 1 мл хлороформа, добавляют 2—3 капли растительного масла и легко встряхивают для растворения масла. К хлороформному раствору масла прибавляют 20 капель смеси концентрированной серной кислоты с формалином (50:1) и встряхивают. Хлороформный слой окрашивается в яркий вишневокрасный цвет, кислотный — в тусклый красно-коричневый с зеленой флуоресценцией. Из хлороформного слоя можно отобрать пипеткой несколько капель, перенести в другую пробирку (сухую!) и добавить 2 капли уксусного ангидрида — появляется сине-зеленое окрашивание.
ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ЛИПИДОВ
Общие сведения. Жиры и липоиды подвергаются гидролитическому расщеплению в пищеварительном тракте. Нейтральные жиры распадаются на глицерин и жирные кислоты; фосфатиды (лецитины, кефалины, серинфос-фатиды и др.) расщепляются на глицерин, жирные кислоты, фосфорную кислоту и азотистые основания — холин, коламин (этаноламин), серин и т. д. При гидролизе стеридов освобождаются холестерин или эргостерин и жирные кислоты.
Гидролитический распад жиров катализируется ферментами липазами, которые содержатся в соке желудка, поджелудочной железы и тонкого кишечника. Роль желудочной липазы у взрослого человека весьма невелика, так как фермент катализирует расщепление лишь тонко-диспергированных, предварительно эмульгированных жиров (например, молочного). Значительная роль в переваривании жиров принадлежит липазе поджелудочной железы. Расщепление жиров происходит главным образом в тонком кишечнике.
Липаза поджелудочной железы выделяется в малоактивной форме и активируется желчными кислотами. Значение желчных кислот в переваривании жира очень велико. Они являются не только активаторами липазы. Будучи поверхностно-активными веществами, желчные кислоты способствуют эмульгированию жиров, что уве
184
личивает во много раз их поверхность соприкосновения с водным раствором липазы.
Липазы содержатся также в растительных объектах (семенах злаков, масличных растений) и микроорганизмах. При их участии происходит порча круп, муки и других продуктов при хранении.
Гидролитическое расщепление жиров протекает в несколько стадий. Липаза действует главным образом на внешние (а) эфирные связи молекулы триглицерида. Вначале отщепляются жирные кислоты, связанные с глицерином в a-положении, и образуется глицерин-2-жирная кислота, которая затем изомеризуется в глицерин-1-жирную кислоту, подвергающуюся уже окончательному расщеплению.
а. CHz—0—OCRt
СИ—О—OCR, I
CH^—O—OCRj
Триглицерид
;н2-он
I
CH—0—OCR,
I
CHz—OH
+2H20
Липаза
ch2—dh
CH—0—0CR2 + Rr-COOH+Rj—COOH свободные жирные кислоты
CH20H
Глииерин-2-жир-ная кислота
ch,-o—ocr;
изомеризация | к сн—ОН
I
сн2—он
Глицерин ~1—жирная кислота
в. ch2-o—ocr2
сн—он
I
сн2—он
+Н20 липаза
сн2—он
I
СН—0Н+ R2—C00H
сн2—он
Продукты. гидролитического расщепления жиров всасываются в тонком кишечнике. Глицерин растворим в воде и всасывается легко. Жирные кислоты образуют растворимые комплексные соединения с желчными кислотами (так называемые холеиновые кислоты), которые также всасываются в кишечнике. Холеиновые кислоты затем
185
расщепляются на свои компоненты в клетках эпителия кишечных ворсинок.
Освободившиеся желчные кислоты всасываются в кровь и через систему воротной вены снова поступают в печень. Жирные же кислоты вступают в сложноэфирную связь с глицерином, образуя жир, свойственный уже данному виду животного.
Гидролиз фосфолипидов катализируется ферментами фосфолипазами (А, В, С, D), расщепление холестерилов происходит под влиянием холестеролэстеразы.
Качественная реакция на желчные кислоты. Желчные кислоты по своему строению близки к холестерину и являются производными холановой кислоты.
Холановая кислота
н,с-сн-снг-снг—СООН
Желчные кислоты (холевая, дезоксихолевая, литохо-левая) входят в состав желчи как в чистом виде, так и в виде парных соединений с гликоколлом (глицином) и таурином (с которыми они соединяются посредством пептидной ковалентной связи).
Для открытия желчных кислот используют их способность давать красное окрашивание с оксиметилфурфуро-лом (реакция Петтенкофера). Оксиметилфурфурол образуется при реакции фруктозы с концентрированной соляной или серной кислотой.
Реактивы: а) желчь, водный раствор (1:2); б) сахароза, 5%-ный раствор, или фруктоза, 3%-ный раствор; в) серная кислота, концентрированная.
В сухую пробирку наливают 10 капель разведенной желчи, добавляют 1—2 капли раствора сахарозы (или фруктозы) и, наклонив пробирку, осторожно (по стенке)
186
наслаивают равный объем концентрированной серной кислоты. На границе слоев образуется пурпурное кольцо, которое затем принимает красно-фиолетовое окрашивание.
Исследование действия эмульгаторов на жир. В тонком кишечнике гидролизу подвергаются только эмульгированные жиры. Основной эмульгатор — желчные кислоты, но определенными эмульгирующими свойствами обладают и бикарбонаты кишечного и панкреатического соков, белковые вещества и в сравнительно небольшой степени мыла, содержащиеся в полости кишечника.
Реактивы: а) желчь; б) мыло, 2%-ный раствор; в) яичный белок, 2%-ный раствор; г) двууглекислый натрий, 2%-ный раствор; д) растительное масло.
В штатив ставят 5 пробирок. В первую из них наливают 20 капель желчи, во вторую — 20 капель раствора мыла, в третью, четвертую и пятую соответственно по 20 капель раствора яичного белка, двууглекислого натрия и дистиллированной воды. Затем во все пробирки вносят по 3 капли растительного масла, содержимое взбалтывают. Через 5 мин. учитывают результаты опыта.
Исследование кинетики гидролитического действия липазы поджелудочной железы. Общие сведения. Скорость химической реакции определяется количеством субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени. Единицей действия фермента называют то количество его, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту при оптимальных условиях — соответствующей температуре, pH, концентрациях реагирующих веществ и фермента и т. д.
Скорость ферментативной реакции зависит также от химической природы субстрата, присутствия активаторов или ингибиторов и некоторых других факторов.
Одним из важнейших факторов, определяющих скорость ферментативной реакции, является концентрация субстратов.
Фермент Е образует с субстратом S промежуточный комплекс ES, который затем распадается. При этом образуется продукт реакции Р, а фермент регенерирует
^-Н	^+2
E + S'^EST^E + P,
*-i X-г
187
где /Сц — константа скорости прямой реакции; К-\ — константа скорости обратной реакции; /С+2 — константа скорости реакции расщепления фермент-субстратного комплекса; К-г— константа скорости обратной реакции. Принимая, что фермент-субстратный комплекс способен к диссоциации, можем написать
K-i
Ks-
K+i
т. е. константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна отношению констант скоростей обратной и прямой реакций.
Если велико значение константы скорости обратной реакции K-i и мало значение К+ь то константа диссоциации фермент-субстратного комплекса является высокой и комплекс легко подвергается распаду на исходные вещества. В этом случае реакция протекает с малой скоростью. Если же, наоборот, значение E+i велико, а К-\ мало, то реакция идет с большой скоростью.
В соответствии с законом действия масс можно написать
[S]	([Ео] - [ES]) = Ks [£S],	(I)
где [Eq] — общая концентрация фермента в начале реакции; [FS] — концентрация фермент-субстратного комплексного соединения; ([Ео]—[ES]) — концентрация свободного фермента за вычетом той части, которая связана с субстратом.
Преобразуя данн'ое уравнение, получим
(И)
или
[ES] [3]
[fiol ~KS -НЗГ
Чем больше значение [£5], тем выше скорость ферментативной реакции. Наибольшая скорость реакции будет достигнута при [ES] = [Ео], т. е. когда весь фермент соединится с субстратом.
Таким образом,
——=-^г’	(Ш)
Гмакс [£о]
где v — скорость данной реакции; Омаке — максимальная скорость реакции.
188
Но
[ES] _	[S]
[Eo] Xs + [S] •
Тогда уравнение (III) примет следующий вид:
v =	[S]
Цлакс KS "Ь [S] откуда
V = Омаке 77—L I оу»	(IV)
As т LoJ
Уравнение (IV) называют уравнением Михаэлиса—Ментен.
При более точных расчетах кинетики ферментативных реакций вместо константы диссоциации KS применяют так называемую константу Михаэлиса Км-
Лм “ *+1 '
В этом случае уравнение (IV)можно написать
v — v ___1^1 	(V)
макскм + [5]’	' '
Уравнение (V) известно как уравнение Холдейна — Бриггса. Константа Михаэлиса соответствует той концентрации субстрата (в молях на литр), при которой скорость реакции равна половине максимальной.
Кинетика реакции гидролитического расщепления жира. Исследуют скорость реакции расщепления молочного жира, катализируемой липазой поджелудочной железы.
Реактивы: а) вытяжка из поджелудочной железы. Свежую поджелудочную железу (крупного рогатого скота, свиньи) тщательно очищают от жира, измельчают на мясорубке и растирают в ступке с водой до получения гомогенной массы (соотношение железы и воды 1:3), которую процеживают через марлю, сложенную в 2—3 слоя; б) молоко. Свежее молоко нагревают до кипения и охлаждают до 37—38° С; в) фенолфталеин, 0,1%-ный спиртовой раствор; г) едкий натр, 0,1 н раствор; д) желчь.
В две конические колбы на 100 мл отмеривают по 50 мл кипяченого молока, после чего добавляют по 2 мл
189
вытяжки из поджелудочной железы, содержащей липазу. В первую колбу прибавляют еще 5 капель желчи, которая является активатором липазы.
Содержимое обеих колб быстро перемешивают и тотчас же из каждой отбирают (пипетками) по 10 мл жид-
Вреня В минутах.
Рис. 13. Кривые процесса гидролитического расщепления жира:
1—липаза, активированная желчью; 2 — липаза без желчи.
кости (для титрования), а колбы с реакционной смесью переносят в термостат, нагретый до 37° С.
К отобранным 10 мл жидкости добавляют 10 мл дистиллированной воды, 2—3 капли раствора фенолфталеина и титруют 0,1 н раствором едкого натра до слабо-розового окрашивания. Отдельно титруют пробы, взятые из первой и второй колб. Результаты титрования записывают. Из колб, помещенных в термостат, через 15—30—45 мин. отбирают пробы по 10 мл, которые также оттитровывают раствором едкого натра, как описано выше.
Под влиянием липазы происходит гидролитическое расщепление молочного жира и со временем нарастает содержание свободных жирных кислот. Гидролиз проходит энергичнее в колбе, в которую была добавлена
желчь.
Результаты исследования отражены на графике (рис. 13). На оси абсцисс откладывают время протекания реакции (в минутах), на оси ординат — количество 0,1 н раствора щелочи (в миллилитрах), израсходованное на титрование, и вычерчивают кривые, характеризующие кинетику реакций гидролитического расщепления жира, катализируемых как самой липазой, так и активированным ферментом (с добавлением желчи).
КЕТОНОВЫЕ ТЕЛА
Общие сведения. При нарушениях обмена жиров и углеводов в моче появляются 0-окснмасляная, ацетоуксусная кислоты и ацетон, которые получили название кетоновых или ацетоновых тел.
190
р-Оксимасляная и ацетоуксусная кислоты — нормальные продукты обмена высших жирных кислот. В норме они окисляются в тканях до СО2 и Н2О, поэтому у здоровых людей в моче находят лишь следы кетоновых тел (около 40 мг в сутки).
р-Оксимасляная кислота, окисляясь, переходит в ацетоуксусную, а последняя подвергается декарбоксилированию и превращается в ацетон
сн3
I
СИОН -2Н
сн2
I
соон
/3-оксиносляная кислота
Ch3 с=о
СНг
СООН
СН3
С=0
СН3
Ацетоуксусная кислота
Ацетон
Содержание кетоновых тел в крови (и моче) резко увеличивается при голодании и особенно при заболевании сахарным диабетом. Обеднение печени гликогеном при диабете способствует накоплению больших количеств р-оксимасляной и ацетоуксусной кислот, а также ацетона. Образования кетоновых тел не происходит при нормальном количестве гликогена в печени.
Значительное увеличение содержания кетоновых тел в крови нарушает ее буферные свойства, сдвигает pH в кислую сторону (ацидоз). Кетоновые тела выделяются из организма не только с мочой (которая приобретает при этом фруктовый запах), но также с потом и выдыхаемым воздухом.
Йодоформная реакция на ацетон. Наличие ацетона в моче определяют по реакции образования йодоформа:
С=0 +312+Ыа0Н —СН^+ЗНаТ+ЗНгО
СН3
Ацетон
Реактивы: а) ацетон; б) моча; в) едкий натр, 10%-ный раствор; г) раствор иода в иодистом калии: в 10 мл воды растворяют 20 г йодистого калия, в полу-
191
ченном растворе, перемешивая, растворяют 10 г иода и постепенно добавляют 90 мл воды.
К 1 мл ацетона приливают 1 мл 10%-кого раствора едкого натра и несколько капель раствора иода в иодистом калии. Выпадает желтый кристаллический осадок йодоформа. Наличие йодоформа определяют также по характерному запаху. Проделывают ту ж реакцию с мочой, к которой добавлен ацетон.
Реакция с нитропруссидом натрия на ацетон и ацетоуксусную кислоту. Ацетон и ацетоуксусная кислота образуют с нитропруссидом натрия в щелочной среде комплексный анион, характеризующийся красно-бурой окраской.
Реактивы: а) моча. К 10—15 мл мочи добавляют 1 каплю ацетона; б) сернокислый аммоний, кристаллический; в) аммиак, 20—30%-ный раствор; г) нитропруссид натрия [Na2Fe(CN)5 ’ NO • 5Н2О], 5%-ный раствор. Готовят перед употреблением.
В пробирку наливают 5 мл мочи и добавляют сернокислый аммоний до насыщения, после чего приливают 2—3 капли раствора аммиака, 4—5 капель раствора нитропруссида натрия и встряхивают. Жидкость окрашивается в красновато-фиолетовый или буровато-красный цвет.
Реакция с хлорным железом (на ацетоуксусную кислоту). Енольная форма ацетоуксусной кислоты (или ацетоуксусного эфира) образует с ионами трехвалентного железа ацетоуксусный енолят железа — соединение, обладающее вишнево-красной окраской.
СН3
I с=о
3 I
СНг
I
СООН
Ацетоуксусная кислота
СН3
I
с-он
3 II + FeCl3
СН
I
соон
Енольная форт ацетоуксусной кислоты'
Ееззнсг
Реактивы: а) ацетоуксусный эфир; б) моча; в) хлорное железо, 5°1о-ный раствор.
192
К 1 мл ацетоуксусного эфира приливают 5 капель 5 %-ного раствора хлорного железа. Жидкость окрашивается в вишнево-красный цвет.
Аналогичную реакцию проделывают также с мочой, к которой прибавляют 1 каплю ацетоуксусного эфира.
Моча, которая не содержит примеси ацетоуксусной кислоты, окрашивается хлорным железом в красновато-желтый цвет.
7 Д. К. Шапиро
Р а з дел VII
ХИМИЯ И ОБМЕН УГЛЕВОДОВ
Значение углеводов в жизни животных и растений весьма велико. Оно сводится не только к энергетической и структурным функциям.
Углеводы выполняют в живых организмах и ряд специализированных ролей. Так, пентозы рибоза и дезоксирибоза входят в состав важнейших биологически активных веществ —- нуклеиновых кислот, нуклеотидов и нуклеозидов. Углеводы являются важными составными частями молекул многих антибиотиков (стрептомицинов, неомицинов, линкомицина, новобноцина и др.). Они играют большую роль в явлениях иммунитета: многие микробные антигены, вызывающие образование антител, относятся к углеводам (полисахаридам). В качестве антител выступают г'ликопротеиды — комплексные соединения углеводов с белками.
Наличие групп крови также связано с гликопротеидами, особенно с их углеводными (олигосахаридными) остатками. Наконец следует подчеркнуть, что вещества, обладающие исключительно важным физиологическим значением, как антикоагулянт гепарин, гиалуроновая кислота, играющая значительную роль в защите от проникновения болезнетворных микроорганизмов, и другие, также относятся к углеводам.
Некоторые производные углеводов обладают витаминным действием, например витамин С (аскорбиновая кислота), витамин В15 (пангамовая кислота).
Углеводы классифицируют по их способности к гидролизу. Простые углеводы — моносахариды или монозы —
194
гидролизу не подвергаются. Сложные углеводы способны гидролитически расщепляться до моносахаридов.
Углеводы делят на три группы: 1) моносахариды, или монозы; 2) олигосахариды, или кристаллические полисахариды, молекулы которых состоят из 2—10 остатков мо-ноз; 3) высшие, или коллоидные, полисахариды (полно-зы), в состав которых входят более 10 остатков моносахаридов. Моно- и олигосахариды образуют в воде истинные растворы, из которых способны кристаллизоваться. Они обладают сладким вкусом. Высшие полисахариды относятся к высокомолекулярным веществам. В отличие от моно- и олигосахаридов их называют коллоидными или некристаллизующимися углеводами.
Моносахариды — альдегиды или кетоны многоатомных спиртов с числом углеродных атомов от 2 до 9. В соответствии с характером функциональных групп моносахариды делят на альдегидоспирты, или альдозы, и кето-носпирты, или кетозы.
В зависимости от числа атомов углерода в молекуле моносахариды подразделяют на биозы (2 атома углерода), триозы (3), тетрозы (4). пентозы (5), гексозы (6), гептозы (7), октозы (8), нонозы (9 атомов углерода).
Из олигосахаридов наибольшее значение имеют дисахариды — сахароза, лактоза и мальтоза. Молекула сахарозы (свекловичный сахар) при гидролизе распадается на молекулу глюкозы и молекулу фруктозы. При расщеплении лактозы (молочного сахара) освобождаются молекула глюкозы и молекула галактозы, а при гидролитическом распаде молекулы мальтозы образуются две молекулы глюкозы.
Функции полисахаридов весьма разнообразны. Некоторые из них (крахмал, гликоген, инулин) являются энергетическими резервами организма, другие же (клетчатка, гемицеллюлоза, хитин) имеют структурные, опорные функции.
Свойства углеводов связаны с их строением. Представления о строении углеводов со временем претерпели ряд изменений, Так, наиболее распространенная форму; ла глюкозы, по Фишеру, не объясняет многообразия ее свойств, прежде всего явления мутаротации, т, е. постепенного изменения угла вращения поляризованного луча света свежеприготовленными растворами,, обусловлено1
7*
го наличием двух аномеров — а-глюкозы и 0-глюко-зы. Более рациональными оказались формулы, отражающие полуацетальную циклическую структуру молекул моносахаридов.
Формулы глюкозы: I — по Фишеру; II — по Колли и Толленсу; III — по Хеуорсу:
^0
н—с—он I но—с—н
I
н—с-он
I
н-с-он
но—с—н О
н—с-он
и—с
СН20Н Глюкофураноза
снгон	снгон
Глюкопираноза
Глнжпираиоза
глюмсрураноза
В последнее время уделяется большое внимание изучению конформаций моносахаридов, т. е. тех форм, которые возникают в результате изменения взаимного положения отдельных частей молекулы. При конформациях не нарушаются связи, соединяющие атомы, чем образование конформационных форм (конформеров) отличается от процесса изомеризации.
В конформационных формах различают два вида расположения связанных с углеродами атомов — экваториальные и аксиальные. Экваториальные атомы распола-196
гаются в одной, «усредненном», плоскости шестичленного углеродного кольца, а аксиальные занимают перпендикулярное положение к плоскости молекулы (рис. 14). Преобладание экваториальных атомов наблюдается у
глюкозы, в молекуле которой все основные объемные группы занимают экваториальные положения. У других гексоз не менее одной объемной группы находится в аксиальном положении. Вот почему глюкоза является наиболее стабильным по структуре моносахаридом.
Рис. 14. Трехмерная структура Д-глюкозы.
КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА МОНОСАХАРИДЫ
Реакция с а-нафтолом или тимолом. Является одной из наиболее чувствительных общих реакций на углеводы и углеводные компоненты в сложных соединениях. Углеводы при взаимодействии с концентрированной серной кислотой разлагаются с образованием фурфурола и 5-ок-симетилфурфурола, которые конденсируются с а-нафтолом или тимолом, образуя триарилметановый хромоген, а последний, окисляясь в серной кислоте, дает окрашенное хиноидное соединение.
Реактивы: а) глюкоза, 0,5°/о-ный раствор; б) тимол, 1°10-ный спиртовой раствор; в) а-нафтол, 0,2^/о-ный спиртовой раствор; г) серная кислота, концентрированная.
Тимол
197
В две пробирки наливают по 2 мл раствора глюкозы и добавляют: в первую — 3—4 капли раствора тимола, во вторую — столько же раствора а-нафтола и встряхивают, после чего осторожно наслаивают в обе пробирки по 1—2 мл концентрированной серной кислоты. Жидкость в первой пробирке принимает красное, а во второй — фиолетово-красное окрашивание, более выраженное на границе слоев.
Реакция с антроном. При воздействии концентрированной серной кислоты на углеводы образуются фурфурол, метилфурфурол или оксиметилфурфурол, которые, конденсируясь с антроном, дают соединения зеленого, голубого или синего цвета.
Реактивы: а) глюкоза, О,5°1уный раствор; б) фруктоза, 0,5°^-ный раствор; в) антроновый реактив: 0,2 г антрона растворяют в 100 мл концентрированной серной кислоты.
К 4—5 каплям раствора гексозы прибавляют 2 мл антронового реактива. Пробирку встряхивают и отставляют на 30 мин. Образуются продукты конденсации зеленого или голубого (синего) цвета. С антроном реагируют все углеводы.
Реакция Селиванова на фруктозу. При нагревании фруктозы (и других кетогексэз) с соляной кислотой образуется оксиметилфурфурол, который с резорцином дает соединение (ксантеновый краситель), окрашенное в вишнево-красный цвет. С альдогексозами реакция протекает очень медленно, на основании чего можно считать реакцию Селиванова специфичной для кетогексоз.
198
но—
Резорцин
-ОН НО— [н__о_н\
нс—с I нс=с
^с-н ")0 '''СН20Н
R - остаток
Оксиметилфурфурола
Реактивы: а) фруктоза, 0,5с[й-ный раствор; б) реактив Селиванова: 0,05 г резорцина растворяют в 100 мл 20°/о-ной соляной кислоты.
К 1 мл реактива Селиванова прибавляют 1—2 капли раствора фруктозы и нагревают в кипящей водяной бане не более 1 мин. Появляется вишнево-красное окрашивание.
Реакция считается положительной, если окрашивание появляется через 30—60 сек. При более длительном нагревании возможна изомеризация альдоз в кетозы.
Реакция с карбазолом на кетозы. Как и предыдущая, реакция является весьма чувствительной и специфичной для кетоз.
Реактивы: а) фруктоза, 0,2%-ный раствор; б) L-цистеин солянокислый (моногидрат), 2,4°la-ный раствор; в) карбазол, 0,1°/0-ный спиртовой раствор; г) серная кислота, 75°/0-ный раствор (по объему).
К 0,1 мл раствора фруктозы добавляют 0,2 мл 2,4°/о-ного раствора цистеина и 6 мл 75°/0-ной серной кислоты. Содержимое пробирки встряхивают и тотчас же прибавляют 0,2 мл 0,1°/о-ного спиртового раствора карбазола. Через несколько минут появляется красное или фиолетовое окрашивание.
Реакция с мочевиной на фруктозу. Р е акт ивы: а) фруктоза, 2й!0-ный раствор; б) мочевина, в порошке; в) соляная кислота, концентрированная.
199
В фарфоровую выпарительную чашку всыпают 0,5— 1 г мочевины, добавляют 5—6 капель концентрированной соляной кислоты и 2—3 капли раствора фруктозы. Осторожно покачивают чашку до растворения мочевины, затем переносят ее на кипящую водяную баню. Через 10— 15 мин. появляется бирюзово-синее кольцо. Альдогексозы дают красную окраску, а рибоза и другие альдопентозы — желтую.
Реакции восстановления металлов. Моносахариды, окисляясь в щелочной среде, восстанавливают соли окиси меди в закись, соли окиси висмута—до металлического висмута, соли серебра — до металлического серебра. Эти реакции используются для количественного определения так называемых восстанавливающих (или редуцирующих) моносахаридов, молекула которых содержит карбонильную группу. Восстанавливающими свойствами обладают также некоторые дисахариды — мальтоза, лактоза и целлобиоза, молекулы которых имеют по одной свободной карбонильной группе.
Реакция Троммера. Глюкоза в щелочной среде восстанавливает окись меди в закись, сама окисляясь до глюконовой кислоты.
неон
носн
| +2CllSO4+5NaOH неон
неон
СН20Н
соона
неон
I
10 СН
|	+ 2Cu0H+2Ha2S04+2Н20
неон
I
СН20Н
При более глубоком окислении глюкозы образуются соли сахарной кислоты и ряд других соединений.
Реактивы: а) глюкоза, 1°/0-ный раствор; б) едкий натр, 5°/0-ный раствор; в) сернокислая медь (C11SO4X Х5Н2О), 5°/(-ный раствор.
К 3—4 мл раствора глюкозы прибавляют 1—2 мл 5°/о-ного раствора едкого натра и по каплям 5%-ный раствор сернокислой меди.
200
Раствор окрашивается в синий цвет. Пробирку осторожно (на малом огне) нагревают до кипения. Выпадает вначале желтый осадок гидрата закиси меди СиОН, который затем переходит в красный осадок закиси CuaO.
Реакция с реактивом Бенедикта. Является наиболее чувствительной реакцией на восстанавливающие сахара.
Реактивы: а) глюкоза, 1°/0-ный раствор; б) реактив Бенедикта. Отдельно готовят два раствора: I —-в 600 мл теплой воды растворяют 100 г безводного лимоннокислого натрия и 90 г безводного углекислого натрия. Нагревают до полного растворения солей; II — в 100 мл воды растворяют 17,3 г сернокислой меди (CuSC>4 • 5НгО). Оба раствора сливают вместе и доливают водой до 1 л. Реактив весьма устойчив.
К 5 мл реактива Бенедикта добавляют 7—8 капель раствора глюкозы. Пробирку ставят в кипящую водяную баню на 5 мин., после чего охлаждают под краном. Раствор приобретает зеленое, желтое, апельсиновое или красное окрашивание, в дальнейшем выпадает зеленовато-желтый или желтовато-красный осадок.
Реакция с гидратом окиси висмута (Ниландера). Глюкоза в щелочной среде восстанавливает гидрат окиси висмута до металлического Bi или его закиси.
Bi(0H)2 NOj+NaOH-----*~ВЬ(ОН)з + Na"°3
неон
HOCH I 2Bl(0H),----------*-
неон
I неон снгон
соон
I
неон
носн
I +2Вс+ЗНг0к неон
неон
I
СН20Н
Реактивы: а) глюкоза, 1—1,5°/$-ный раствор; б) реактив Ниландера: в 100 мл Ю°/0-ного раствора едкого натра растворяют 2 г основного азотнокислого висму
201
та и 4 г сегнетовой соли (калия-натрия виннокислого). Для улучшения растворимости соли висмута рекомендуется подогреть на кипящей водяной бане. После охлаждения раствор фильтруют.
К 2 мл раствора глюкозы приливают 1 мл реактива Ниландера, нагревают до кипения и кипятят 1—2 мин. Жидкость в пробирке окрашивается сначала в коричневый, а затем в черный цвет. При стоянии выпадает черный осадок металлического висмута.
Реакция неприменима в присутствии белков, в состав которых входят серусодержащие аминокислоты. При кипячении со щелочью происходит отрыв слабо связанных сульфгидрильных (тиоловых) групп, которые с реактивом Ниландера дают буровато-черный осадок сернистого висмута.
Реакция с реактивом Фелинга. Реактив Фелинга является медным алкоголятом сегнетовой соли. Моносахариды при кипячении с фелинговым реактивом восстанавливают его до закиси меди, окисляясь до глюконовой кислоты.
неон
носи
I +2 неон неон
I
СН20Н
СООН.
I
сно\
I /Си
СПО*'
I
COONa
соон неон
I носн +2Н20----* I +Си20 +
неон
I
неон
СН20Н
COOK
I
снон
I
снон
I
COONa
Реактивы: а) глюкоза, или фруктоза, 1\-ный раствор; б) реактив Фелинга. Готовят два раствора: I — в мерной колбе емкостью 500 мл растворяют 34,64 г сернокислой меди (CuSO4-5H2O) и доводят водой до метки; II — в 200—250 мл воды растворяют 173 г сегнетовой соли (COOK — СНОН — СНОН — COONa-4H2O). Раствор количественно переносят в мерную колбу на 500 мл. Сюда же вливают раствор 50 г едкого натра в 100 мл воды и доводят водой до метки. Растворы хранят
202
раздельно. Непосредственно в момент употребления смешивают равные объемы первого и второго растворов.
К 3—4 мл 1°/о-ного раствора глюкозы (или фруктозы) добавляют равный объем реактива (2 мл I раствора и 2 мл II раствора) и нагревают до начала кипения. Выпадает красный осадок закиси меди.
Реакция с реактивом Фелинга широко используется при количественном определении содержания редуцирующих сахаров в животных и растительных тканях.
Реакция восстановления окиси сереб-р а (реакция «серебряного зеркала»). Карбонильные группы моносахаридов восстанавливают аммиачный раствор окиси серебра до металлического Ag:
AgNOj+SNH+UH
—* [дд(иНз)^ОН+нн^о3+2нго;
^0
(У	COONHi
I
неон	неон
I	I
носн	7 HOCH
|	+2figfNHA, он—*-	|	+2/1д+знн3+н2о
неон L J неон
I	I
неон	неон
снгон	сн2он
Реактивы: а) азотнокислое серебро, 5°/0-ный раствор (сохраняют в темном месте); б) аммиак, КР/^-ный раствор; в) глюкоза (или фруктоза), 1°10-ный раствор.
В пробирку наливают 1 мл 5%-ного раствора азотнокислого серебра и добавляют по каплям раствор аммиака. Вначале образуется серый осадок, который растворяется в избытке аммиака. К аммиачному раствору окиси серебра прибавляют 2—3 мл раствора глюкозы (или фруктозы). Пробирку ставят в горячую (80°С) воду на 5—10 мин. На стенках пробирки образуется зеркальный налет металлического серебра.
Реакция образования озазона. Карбонильные группы углеводов реагируют с фенилгидразином с образованием вначале гидразона, а затем озазона. Реакция весьма чувствительна. Озазоны глюкозы, фруктозы и маннозы
203
характеризуются одинаковой структурой и свойствами кристаллов, у других же сахаров они отличаются формой кристаллов, их структурой, точкой плавления.
Реакция образования озазонов используется для идентификации моносахаридов. Она протекает в три стадии.
1)	При взаимодействии карбонильной группы моно-зы с фенилгидразином образуется растворимый в воде гидразон
Л с-н неон I носн |	+ Н2Н НН СеН} *
№0// сренилгидразин неон
I
снгон
Н\ ''С=ц—нн-сен5
неон
I
носн
I +нго неон
I неон
I
СНгОН
2)	Гидразон реагирует еще с одной молекулой фенил-гидразина. В результате образуется промежуточное соединение, содержащее карбонильную группу у второго атома углерода, и выделяются аммиак и анилин
С =/Y~NH-C6HS
| л:н~~ hh2: с.
1^--^
НОСИ	C6HS
неон I
неон
СН20Н
C=H—NH-C6HS
I
С=0
носн
|	+нн3+С6Н5-ННг
неон
неон
I
СНг0Н
3)	Промежуточное соединение взаимодействует с третьей молекулой фенилгидразина. Результатом реак
204
ции является образование характерных кристаллов глюкоозазона, трудно растворимых в воде
W\
C=N—NH—CeHs
I
с=о
I
НОСН
|	+h2n—NH— CeHs
HCOH
I
HCOH
' снгон
\ =^N—NH—CeHs
c=n—nh-—c6h5
HOCH
|	+H20
HCOH
I
HCOH
|	глюко озазон
CHzOH
Рис. 15. Кристаллы глюкоозазона.
Реактивы: а) глюкоза, 5°1о~ный раствор; б) фе-нилгидразин или фенилгидразин солянокислый; в) уксусная кислота, ледяная; г) уксуснокислый натрий, кристаллический.
В пробирку наливают 4—5 мл 5°/о-ного раствора глюкозы, подкисляют 5—6 каплями ледяной уксусной кислоты и добавляют 5 капель фенил гидр азина или 0,25—0,3 г фенилгидразина солянокислого (в последнем случае требуется также прибавить равное весовое количество уксуснокислого натрия, при взаимодействии которого с фенилгидразином солянокислым выделяется фенилгидразин — основание).
Пробирку ставят в кипящую водяную баню на 25—35 мин. Выделяется желтый кристаллический осадок глюкоозазона. После остывания кристаллы рассматривают под микроскопом и зарисовывают. Кристаллы глюкоозазона имеют игольчатую форму, они часто собраны в пучки, «букеты», «снопы» (рис. 15).
Реакцию образования озазонов, кроме моноз, дают также дисахарнды, имеющие свободную карбонильную группу (гликозидный гидроксил),— лактоза, мальтоза, целлобиоза.
Реакции на пентозы. Пентозы содержатся в тканях растительных и животных организмов. Рибоза и дезокси
205
рибоза являются составными частями нуклёиновых кислот и важнейших коферментов (НАД, НАДФ, ФАД). Ксилоза и арабиноза входят в состав полисахаридов пентозанов, которые содержатся в оболочках растительных клеток. Обычно пентозы в отличие от гексоз находятся в связанном состоянии, но при исследовании процесса фотосинтеза были найдены и свободные пентозы (например, кетопентоза-рибулоза).
V			СН20Н	н^°
н—с—он 1	н— 1	?— н	0=0	н—с—он
1 н—с—он	н—(	?—он	н—с—он	но-с —н
н—с—он	н—с—он		н—с—он	н—с—он 1
СН20Н D-рибоза	сн2он	снгон D-дезоксирибоза D-puDy/юза			1 СН20Н ^-арабиноза
В отличие от гексоз пентозы не сбраживаются дрожжами. Озазоны восстанавливают металлы из окисей.
Характерные реакции на пентозы основаны на их способности превращаться в фурфурол при нагревании с соляной или серной кислотой. Фурфурол дает с анилином и флороглюцином продукты конденсации красного, с орцином — зеленого цвета.
Реакция с анилином. Реактивы: а) рибоза, арабиноза или ксилоза, 1—2^/^-ный раствор; б) анилин (С6Н5МН2); в) уксусная кислота, ледяная; г) соляная кислота, концентрированная.
В пробирку наливают 2 мл раствора пентозы, прибавляют равный объем концентрированной соляной кислоты и нагревают до кипения. Содержимому пробирки дают остыть и к нему добавляют по 1 мл анилина и уксусной кислоты. Жидкость окрашивается в интенсивно красный цвет.
Реакция с флороглюцином. Реактив ы: а) флороглюцин — С6Н3(ОН)3, 0,2й/й-ный раствор в 30°/о-ной соляной кислоте; б) рибоза, арабиноза или ксилоза, 1—2°/0-ный раствор.
206
К 1 мл раствора флороглюцина прибавляют 4—5 капель раствора пентозы и нагревают до кипения. Появляется вишнево-красное окрашивание.
Реакция с орцином. Реактивы: а) раствор пентозы, 1—2\-ный; б) орциновый реактив: 0,25 г орцина растворяют в 125 мл 30%-ной соляной кислоты (Рго= 1,149). К раствору добавляют 1 мл 10%-ного раствора хлорного железа. Хранят в склянке оранжевого стекла, плотно укупоренной.
1—2 мл орцинового реактива нагревают до кипения. К горячему реактиву добавляют 4—5 капель раствора пентозы. Появляется зеленое окрашивание.
Реакция альдопентоз с р-нафтолом и серной кислотой. Р е акт ивы: а) рибоза, арабиноза или ксилоза, 1°/0-ный раствор; б) нафтол, 0,3°/о-ный раствор в концентрированной серной кислоте.
К 3—4 мл раствора 0-нафтола в серной кислоте осторожно (по стенке пробирки) добавляют 1 мл раствора альдопентозы так, чтобы слои не смешивались. На границе раздела появляется темно-синее кольцо. Гексозы дают желто-зеленое или коричневое окрашивание.
ОБЩИЕ РЕАКЦИИ ДИСАХАРИДОВ
Строение дисахаридов. Молекулы дисахаридов состоят из остатков двух молекул моносахаридов, соединенных гликозидной связью. К дисахаридам относятся: сахароза (свекловичный или тростниковый сахар), мальтоза (солодовый сахар), лактоза (молочный сахар), трегалоза (грибной сахар, микоза), целлобиоза (дисахарид, освобождающийся при гидролитическом расщеплении клетчатки), генцйобиоза и др.
207
По типу связи между молекулами моноз дисахариды можно разделить на две группы: 1) построенные по типу мальтозы; 2) типа трегалозы.
Дисахариды мальтозного типа состоят из двух остатков моноз, соединенных в положении 1,4, т. е. кислородный мостик связывает первый атом углерода одной молекулы моносахарида с четвертым атомом углерода другой.
Н ОН	Н ОН
Мальтоза (оС-глюкозид-1,4-гаюкоза)
У мальтозы остается свободным один гликозидный гидроксил (карбонильная группа), поэтому дисахариды, построенные по типу мальтозы, сохраняют все реакции, свойственные карбонильной группе (Троммера, Бенедикта, Ниландера, с фелинговой жидкостью и т. д.).
По мальтозному тйпу построены также лактоза и целлобиоза. При гидролизе лактозы освобождаются молекула а-глюкозы и молекула галактозы
Лактоза (1,4 -галоктозибоглюмза)
208
Молекула целлобиозы гидролитически расщепляется на две молекулы р-глюкозы. Следовательно, целлобиоза-р-глюкозид-1,4-глюкоза.
В молекулах дисахаридов, построенных по типу трегалозы, моносахариды соединены кислородным мостиком между двумя гликозидными гидроксилами (карбонильными группами). Поэтому дисахариды трегалозного типа лишены восстанавливающих свойств. К дисахаридам указанного типа относятся сахароза и трегалоза. Сахароза легко гидролизуется с образованием смеси равных количеств глюкозы и фруктозы, называемой инвертным сахаром. Инвертный ч_ахар дает все реакции, характерные для моноз
СНг0Н
II	1<
Н ОН	ОН Н
Сахароза
(I2 -глюкозидофруктозиВ)
Трегалоза состоит из остатков двух молекул «-глюкозы, соединенных в положении 1,1, т. е. кислородный мостик связывает оба гликозидных гидроксила. Трегалоза также не обладает восстанавливающими свойствами.
Трегалоза
(1,7 -oL -глюкозивоглюкозид)
209
Исследование восстанавливающих свойств дисахаридов. Реактивы: а) мальтоза, 2°/о-ный раствор: б) лактоза, 2°Io-ный раствор; в) сахароза, 2° fa-ный раствор; г) реактивы Бенедикта, Ниландера, фелингова жидкость; реактивы для реакции Троммера.
В пробирки вносят по 3—4 мл растворов мальтозы, лактозы, сахарозы и производят с ними реакции Бенедикта, Ниландера, Троммера, с фелинговой жидкостью. Мальтоза и лактоза обладают восстанавливающими свойствами, сахароза, как уже было указано, лишена этой способности.
Инверсия сахарозы. Ре а кт ив ы: а) сахароза, 1—2°1о-ный раствор; б) соляная кислота, концентрированная; в) едкий натр, 10—15°fa-ный раствор; г) реактивы для реакций Троммера, Бенедикта, Ниландера, Селиванова.
В пробирку наливают 3—4 мл раствора сахарозы, добавляют 2—3 капли соляной кислоты и нагревают в кипящей водяной бане в течение 10—15 мин., после чего содержимое пробирки охлаждают и нейтрализуют раствором едкого натра (под контролем лакм/совой бумажки). С нейтрализованной пробой (инвертом) производят реакции Троммера, Ниландера или Бенедикта. Продукты инверсии сахарозы — глюкоза и фруктоза — обладают восстанавливающими свойствами. С частью ипверта проделывают реакцию Селиванова на фруктозу.
Реакция сахарозы с солями кобальта. Сахароза в щелочной среде дает фиолетовое окрашивание с ионом Со2+.
Р е а к т и в ы: а) сахароза, 1—2°10-ный раствор; б) азотнокислый или сернокислый кобальт, 2° fa-ный раствор; в) едкий натр или едкое кали, 5°/о-ный раствор.
К 2 мл раствора сахарозы добавляют 1 мл раствора щелочи и несколько капель раствора соли кобальта. Появляется фиолетовое окрашивание.
Реакция Барфеда (в модификации Таубера — Клейнера). Реакция Барфеда позволяет быстро отличить моносахариды от дисахаридов мальтозного типа, обладающих, как известно, восстанавливающими свойствами (лактозы, мальтозы, целлобиозы). Она основана на том, что восстанавливающие свойства моносахаридов сохраняются также в кислой среде, тогда как дисахариды восстанавливают металлы только при щелочной реакции. При взаимодействии дисахаридов с реактивом Барфеда
210
красный осадок закйСи меди появляется не сразу, а лишь спустя некоторое время (15—20 мин.), когда произойдет их гидролитический распад, который катализируется кислотами.
Реактивы: а) глюкоза, 1°/о-ный раствор; б) лактоза или мальтоза, 1°/о-ный раствор; в) реактив Барфеда (в модификации Таубера и Клейнера): в 450 мл горячей воды растворяют 24 г уксуснокислой меди, прибавляют 25 мл 8,5°/о-ной молочной кислоты и перемешивают до растворения осадка. После охлаждения доливают водой до 500 мл и фильтруют. Реактив Барфеда можно готовить и по следующей прописи: в 200 мл горячей воды растворяют 13,3 г уксуснокислой меди. Помешивают до растворения соли, фильтруют. К фильтрату прибавляют 1,9 мл ледяной уксусной кислоты.
В две пробирки наливают по 1 мл реактива Барфеда. В первую пробирку добавляют 1 мл раствора глюкозы, во вторую — столько же раствора лактозы или мальтозы. Пробирки встряхивают и ставят в кипящую водяную баню. В пробирке с глюкозой через 2—3 мин. появляется красный осадок закиси меди, тогда как в пробирке с дисахаридом реакция восстановления наблюдается лишь после 15—20-минутной выдержки в водяной бане.
Ферментативный гидролиз сахарозы. Фермент р-фрук-тофуранозидаза (инвертаза, сахараза) катализирует процесс расщепления сахарозы до глюкозы и фруктозы. Он содержится в пекарских дрожжах.
Реактивы: а) пекарские дрожжи (прессованные); б) сахароза, 2°/0-ный раствор; в) реактив Бенедикта или реактивы для реакции Троммера (см. выше).
1—1,5 г пекарских дрожжей растирают в ступке с 10—12 мл воды до получения однородной взвеси. К 2 мл взвеси прибавляют 2 мл воды и производят реакцию Троммера или Бенедикта (проверка восстанавливающей способности дрожжей).
В две пробирки наливают по 3 мл взвеси дрожжей; одну из них ставят на 10 мин. в кипящую водяную баню (для тепловой инактивации фермента) и потом охлаждают под краном, вторую не нагревают. В обе пробирки добавляют по 3 мл раствора сахарозы и оставляют на 5—8 мин., после чего фильтруют. С фильтратами проделывают реакцию Троммера или Бенедикта. Записывают результаты опыта.
211
Распределительная хроматография сахаров на бумаге. Теоретические основы метода и общие положения методики были описаны на с. 27.
Для хроматографического разделения сахаров употребляют бумагу № 1 и 2 Ленинградской фабрики им. Володарского, фабрики «Маяк революции» (I сорт), а также ватман № 1 и 2.
Восходящую хроматографию проводят в цилиндрах с притертыми пробками или больших пробирках (25Х Х200 мл) с подобранными резиновыми пробками. Для круговой хроматографии используют эксикаторы небольшого размера или чашки Петри.
Реактивы: а) стандартные растворы сахаров (глюкозы, мальтозы, фруктозы, лактозы, сахарозы, пентоз): готовят из расчета 10 мг углевода в 1 мл раствора; б) смесь н-бутилового спирта, пиридина и воды в соотношении 6:4:1 (по объему); в) бензидин: 0,5 г препарата растворяют в 20 мл ледяной уксусной кислоты и 80 мл абсолютного этилового спирта; г) флороглюцин: 0,2 г препарата растворяют в 80 мл 90%-ного этилового спирта, доводят до объема 100 мл 25%-ным раствором трихлоруксусной кислоты; д) динитросалициловая кислота, О,5°1о-ный раствор в 4й!а-ном растворе едкого натра; е) анилинфталат: 1,66 г фталевой кислоты и 0,93 г перегнанного анилина растворяют в 100 мл этилового спирта, насыщенного водой; ж) резорцин, 1°/0-ный раствор в этиловом спирте. К 10 мл раствора резорцина добавляют 90 мл 2 н соляной кислоты.
Хроматографическую бумагу нарезают на полоски длиной 17 см, шириной с одного конца 1,8 см, а с другого— 1,3 см. На расстоянии 1,5—2 см от узкого конца полоски графитовым карандашом очерчивают круг диаметром 0,5 см. Широкий конец полоски прокалывают иглой, протягивают нитку, которую завязывают петлей. Смешивают по 1 мл стандартных растворов сахаров. Одновременно ставят 7—8 хроматограмм (каждую в отдельной пробирке или цилиндре): на две полоски с помощью микропипеток наносят по капле смеси растворов сахаров, на другие — по капле стандартного раствора одного из сахаров. Объем капли — 5 мкл. Капли высушивают на воздухе.
В пробирки (или цилиндры) наливают растворитель (н-бутиловый спирт — пиридин — вода) в таком объ
212
еме, чтобы толщина его слоя на дне сосуда составляла около 1,5—1,6 см. Наливая растворитель, надо следить за тем, чтобы не смочить им стенки пробирки. Полоски бумаги осторожно опускают в пробирки и погружают в жидкость на 2—3 мм, затем с помощью нитки и пробки закрепляют их в вертикальном положении (они не должны прикасаться к стенкам пробирки).
Хроматограммы выдерживают в сосудах 2—3 ч. Их вынимают, когда фронт растворителя приблизится к верхнему краю бумаги на 5—6 мм. Карандашом очерчивают уровень фронта растворителя и высушивают бумагу в течение 10 мин. при 100—105° С, после чего хроматограммы опрыскивают проявителями: одну из полосок, на которую была нанесена смесь сахаров, обрабатывают раствором бензидина или динитросалициловой кислоты, другую — раствором флороглюцина. Контрольные полоски, на которые был нанесен раствор только одного сахара, опрыскивают одним из проявителей, зная, что бензидин и динитросалициловая кислота реагируют только с восстанавливающими сахарами, а флороглюцин — с сахарозой и фруктозой. Полоски, обработанные проявителями, переносят в сушильный шкаф и прогревают 10 мин. при 100—105° С. Пятна пентоз окрашиваются в буровато-шоколадный цвет (окраска возникает быстро, ее можно заметить уже после 5-минутного нагрева), бурые пятна остальных восстанавливающих сахаров появляются через 8—10 мин. Пятна фруктозы и сахарозы окрашиваются флороглюцином в желто-оранжевый цвет.
Рассчитывают Rf сахаров на опытных и контрольных хроматограммах.
Примечание. Вместо указанных проявителей можно пользоваться растворами анилинфталата и резорцина. Лнилинфталат более чувствителен к альдозам, чем к кетозам, которые проявляются раствором резорцина. На хроматограммах, обработанных анилинфталатом, желто-коричневые цвета глюкозы и галактозы проявляются при 100—105° С через 5 мин., пентозы окрашиваются в вишневый цвет. Мальтоза и лактоза проявляются после 20-минутного нагревания при 100—105° С. Полоски, увлажненные раствором резорцина, сушат 10 мин. при 85—90° С. Фруктоза дает пятна красного цвета, ксилоза и арабиноза — синего.
Если разделяют сахара на круговой хроматограмме, то смесь углеводов наносят на два сектора круга, а стандартные растворы — на остальные секторы.
213
ВЫСШИЕ ПОЛИСАХАРИДЫ
Общие сведения. Высшие полисахариды — полимеры, состоящие из множества структурных звеньев — остатков моносахаридов. По принятой классификации углеводов к высшим полисахаридам относят соединения, в состав молекул которых входит более 10 остатков моноз. Они не обладают сладким вкусом, не кристаллизуются из водных растворов, большинство из них образует коллоидные растворы. При гидролитическом расщеплении, катализируемом кислотами или ферментами, полисахариды распадаются на олиго- и моносахариды. Остатки моноз в молекулах полисахаридов соединены гликозидными связями в длинные, часто разветвленные цепи. В зависимости от вида моноз, образующих молекулу полисахарида, различают гомо- и гетерополисахариды. Молекулы гомополисахаридов состоят из многочисленных остатков одного моносахарида (глюкозы, фруктозы, галактозы, маннозы и т. д.). В состав молекул гетерополисахаридов входят разнообразные монозы, причем они часто связаны с неуглеводными компонентами (липидами, белками, аминокислотами и т. д.).
За основу классификации гомополисахаридов принята природа монозы, остатки которой образуют молекулу полимера. Так, различают: а) глюканы (крахмал, гликоген, клетчатка, декстран, лихенин), состоящие из глюкозных остатков; б) полифруктознды или полифруктозаны (инулин, фруктозаны злаковых трав, бактериальные леваны), в состав которых входят остатки фруктозы; в) маннаны, состоящие из остатков маннозы; г) галактаны, в состав молекул которых входят только остатки галактозы; д) арабаны, ксиланы и т. д.
Гетерополисахариды также делятся на ряд групп: гемицеллюлозы, мукополисахариды, камеди, слизи.
Крахмал. Это — основной резервный углевод высших растений. Является первым видимым продуктом фотосинтеза. В клетках растений находится в виде зерен, форма и размеры которых специфичны для каждого рода растений (картофеля, пшеницы, риса, овса, ячменя ит. д.).
Растения, богатые крахмалом, представляют собой ценные продукты питания и сырье для производства пищевых продуктов.
214
Крахмальные зерна состоят из двух компонентов — амилозы и амилопектина. Амилоза растворяется в горячей воде, амилопектин же образует в ней клейстер. Амилоза дает с иодом синее окрашивание, амилопектин — красно-фиолетовое. В состав амилозы входят остатки a-D- глюкозы, соединенные гликозидной связью (в положении 1,4) в неразветвленную цепь. Амилопектин состоит из тех же остатков а-£)-глюкозы, но они образуют сильно разветвленные цепи. Остатки глюкозы в цепи амилопектина также соединены в положении 1,4, но в местах ветвления наблюдается другой тип связи — 1,6.
В крахмальных зернах количественно преобладает амилопектин, среднее содержание которого составляет 70—80% и более.
Под действием кислот или фермента амилазы крахмал расщепляется, давая в конечном итоге а-£>-глюкозу
(C6H10Os)„ ф- пН2О —»/гС6Н12О6.
Промежуточными продуктами гидролиза являются декстрины. При кислотном гидролизе крахмала процесс идет до образования глюкозы, при ферментативном же расщеплении конечным продуктом является дисахарид мальтоза, которая уже при участии фермента а-глюкози-дазы (мальтазы) гидролитически распадается с освобождением двух молекул глюкозы.
Крахмал восстанавливающими свойствами не обладает, они появляются лишь у декстринов.
Реакция крахмала с иодом. Наиболее специфическая реакция на крахмал — появление синего окрашивания с иодом. Окраска обусловлена амилозой. Хотя содержание амилопектина в зернах крахмала в несколько раз превышает количество амилозы, тем не менее синее окрашивание, возникающее при действии иода на амилозу, перекрывает красно-фиолетовую окраску амилопектина. Окраска исчезает при нагревании и восстанавливается при охлаждении крахмального клейстера.
Реактивы: а) крахмал (лучше всего растворимый), 0,5%-ный раствор; б) раствор Люголя: в нескольких миллилитрах холодной воды растворяют 2 г йодистого калия (KJ). В концентрированном растворе йодистого калия растворяют 1 г иода и добавляют воды до объема 100 мл.
215
В пробирку наливают 1—2 мл раствора крахмала и добавляют 1—2 капли раствора Люголя. Появляется насыщенное синее окрашивание. При нагревании синяя окраска исчезает, при охлаждении — восстанавливается.
Проверка восстанавливающих свойств крахмала. Реактивы: а) крахмал, 1%-ный раствор; б) соляная кислота, концентрированная; в) реактивы для реакции Троммера (см. выше).
В две пробирки наливают по 4—5 мл раствора крахмала. В одну пробирку добавляют 3 капли концентрированной соляной кислоты, во вторую — столько же дистиллированной воды (контроль). Обе пробирки ставят на 10—15 мин. в кипящую водяную баню. После охлаждения производят реакцию Троммера. В первой пробирке выпадает красный осадок закиси меди, что свидетельствует о гидролитическом расщеплении крахмала и освобождении веществ, обладающих восстанавливающими свойствами, во второй пробирке — реакция отрицательная.
Гликоген (животный крахмал). Содержится в печени (2—10%, в среднем 5%), скелетных и гладких мышцах, головном мозге. Значительные количества гликогена найдены у грибов — аскомицетов, фикомицетов, базидиоми-цетов. Гликоген в горячей воде образует коллоидные растворы, которые с иодом дают красно-бурое или красновато-фиолетовое окрашивание.
Кислотный гидролиз-гликогена, а также ферментативное расщепление (под действием глюкоамилазы и глико-генфосфорилазы) приводят в конечном итоге к освобождению а-глюкозы (а-£>-глюкопиранозы). Под влиянием фермента амилазы гликоген расщепляется только до мальтозы.
Гликоген по своему строению и свойствам очень близок к компоненту крахмала — амилопектину. Он состоит из остатков a-D-глюкозы, связанных в положении 1,4, а в местах разветвления — 1,6.
Выделение гликогена из печени. Реактивы: а) печень лягушки; б) едкое кали, 30%-ный раствор; в) этиловый спирт, 50-, 75- и 96%-ный; г) диэтиловый эфир.
Свежую печень лягушки, (взятую от только что убитого животного) опускают в центрифужную пробирку
216
или стаканчик, прибавляют 10-кратный объем горячего 30%,-ного раствора КОН и выдерживают 15 мин. в кипящей водяной бане, после чего охлаждают (на воздухе) и центрифугируют 10—15 мин. при 3000 об/мин. Жидкость над осадком сливают и прибавляют к ней (по каплям) 96%-ный этиловый спирт для осаждения гликогена. Осадок отделяют центрифугированием, промывают его по очереди 50-, 75- и 96%-ным спиртом и затем диэтиловым эфиром. Высушивание производят на воздухе (на часовом стекле).
Реакция гликогена с иодом. Реактивы: а) осадок гликогена (см. предыдущую работу); б) раствор Люголя (см. работу «Реакция крахмала с иодом») .
Часть осадка гликогена растворяют в горячей воде. После остывания к содержимому пробирки добавляют 2 капли раствора Люголя. Появляется красновато- бурое (иногда с фиолетовым оттенком) окрашивание.
Кислотный гидролиз гликогена. Реактивы: а) осадок гликогена; б) соляная кислота, 3°1&-ный раствор; в) едкий натр, 15°/0-ный раствор; г) реактивы для реакции Троммера.
Часть осадка кипятят 12—15 мин. с несколькими миллилитрами 3%-ного раствора соляной кислоты. После остывания содержимое пробирки нейтрализуют 15%-ным раствором едкого натра (по лакмусу) и производят реакцию Троммера.
Инулин. Инулин содержится в корнях одуванчика, кок-сагыза, цикория, клубнях топинамбура (земляной груши), георгина, а также в некоторых водорослях. Состоит из остатков р-£)-фруктозы, соединенных гликозидной связью в положении 1,2. В корнях и листьях ржи, пшеницы и некоторых других злаков найдены полисахариды, построенные также из остатков фруктозы и называемые инулидами, однако в их молекулах фруктозные остатки соединены не только в положении 1,2, но и 2,6. Инулин и инулиды хорошо растворяются в теплой воде, давая коллоидные растворы. Растворы инулина не окрашиваются иодом. При нагревании с кислотами или под действием фермента инулазы молекула инулина гидролитически распадается с освобождением р-£>-фрук-тозы.
217
Выделение инулина из клубней георгина или корней одуванчика. Реактивы: а) клубни георгина или корни одуванчика; б) известковая вода (0,15%-ный раствор гидроокиси кальция Са(ОН)2); в) щавелевая кислота, 1%-ный раствор; г) активированный уголь.
100 г измельченных клубней георгина или корней одуванчика заливают 250 мл горячей воды (60°). Настаивание продолжают в течение 1,5 ч, все время поддерживая температуру воды и помешивая настой. Фильтруют. К фильтрату добавляют известковую воду до щелочной реакции на лакмус (избегать избытка реактива). Выделившийся осадок отделяют фильтрованием. Фильтрат нагревают до 60—65° С и нейтрализуют щавелевой кислотой до pH 7, прибавляют немного активированного угля, перемешивают и фильтруют. Фильтрат охлаждают до температуры +2—3° С: выделяется аморфная масса инулина, которую отфильтровывают и выдерживают в ацетоне 12—16 ч, а потом высушивают на воздухе. Инулин используют для аналитических целей.
Гидролиз инулина и обнаружение фруктозы. Р е а к т и в ы: а) инулин, 0,25%-ный раствор; б) соляная кислота, 10%-ный раствор; в) реактив Селиванова (см. «Реакция Селиванова на фруктозу»),
К 2—3 мл раствора инулина добавляют 2 мл 10%-но-го раствора соляной кислоты и нагревают 8—10 мин. на горячей водяной бане, после чего прибавляют 8—10 капель реактива Селиванова (или несколько кристалликов резорцина). Появляется вишнево-красное окрашивание, характерное для фруктозы.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕДУЦИРУЮЩИХ (ВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ) САХАРОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ
Общие сведения. Сахара, содержащие свободную карбонильную группу, количественно окисляются реактивом Фелинга, представляющим собой медный алкого^ лят сегнетовой соли. При окислении глюкозы образуется одноосновная глюконовая кислота, под действием более сильных окислителей процесс может идти до образования двухосновной сахарной.
218
/7°
c-ti	соон
I	I
неон неон
HOCH 0 HOCH +20
неон	HCOH
неон	HCOH
I	I
CH20H	CH2OH
глюкановая кислота
СООн
HCOH
носн
|	+H20
HCOH
HCOH
I
COOH
Сахарная кислота
Фруктоза, окисляясь, образует одноосновную арабоновую кислоту и формальдегид, которые при дальнейшем окислении дают соответственно триоксиглутаровую и муравьиную кислоты. При взаимодействии реактива Фелинга с редуцирующими сахарами (при нагревании) происходит разложение медного алкоголята сегнетовой соли:
COOK
I
СНО<
I >Си+Н,0-------
ено7
I
COONa
COOK ’
I
СНОН
I + CuO снон
I
COONa
Освобождающаяся окись меди быстро восстанавливается в закись
2СиО = Си2О+О.
Выделяющийся при этой реакции кислород окисляет сахара. Следовательно, по количеству образовавшейся закиси меди можно рассчитать содержание редуцирующих сахаров в исследуемом материале.
219
Реактивы: а) реактив Фелинга (приготовление см. с. 202). 1 мл реактива должен соответствовать 0,05 г инвертного сахара (смеси равных количеств глюкозы и фруктозы). Методика установки титра реактива Фелинга описана ниже (см. с. 224); б) метиленовая синь (метиленовая голубая), 1%-ный раствор; в) натрий углекислый, 15%-ный раствор; г) уксуснокислый свинец (средний) — (СН3СОО)гРЬ • ЗН2О, 30%-ный раствор; д) фосфорнокислый натрий двузамещенный—Na2HPO4X' Х12Н2О, насыщенный раствор; е) соляная кислота, концентрированная (р 20 =1,188); ж) едкий натр, 15— 20%-ный раствор.
Приготовление вытяжки. Из средней пробы продукта берут навеску, величина которой зависит от предполагаемого содержания сахаров в материале. При исследовании фруктов или ягод навеска составляет 15—50 г мезги (материала, измельченного на терке или мясорубке), варенья, повидла, джема — 7—8 г. Навеску количественно переносят в мерную колбу на 250 мл, смывая ее дистиллированной водой. Объем навески и воды в колбе не должен превышать 130—150 мл. Колбу встряхивают, затем определяют реакцию содержимого (с помощью нейтральной лакмусовой бумаги или универсального индикатора). При исследовании фруктов и ягод реакция вытяжки обычно бывает кислой, поэтому ее доводят до нейтральной (pH 7) осторожным добавлением 15 %-кого раствора углекислого натрия (под контролем лакмуса или универсального индикатора), после чего колбу нагревают в течение 15—20 мин. на горячей водяной бане (80°С), часто встряхивая для перемешивания содержимого.
Примечание. При исследовании продуктов, содержащих крахмал (например, клубней картофеля, незрелых яблок и груш), водную вытяжку не нагревают на водяной бане, а сахара извлекают холодной водой в течение 1 ч, часто взбалтывая колбу.
Колбу охлаждают и к вытяжке добавляют 7—15 мл раствора уксуснокислого свинца, взбалтывают и ставят на 5—10 мин. (для осаждения белков, пигментов, дубильных веществ, также обладающих восстанавливающими свойствами). Появление прозрачного слоя жидкости над осадком свидетельствует о полноте осаждения. Если пол-220
нота осаждения не была достигнута, в колбу добавляют (каплями) еще 1—5 мл раствора уксуснокислого свинца и взбалтывают. Для осаждения избытка уксуснокислого свинца в колбу приливают 18—20 мл насыщенного раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия, взбалтывают и оставляют на 10—12 мин. для отстаивания. Проверяют полноту осаждения свинца, для чего по стенке колбы осторожно приливают 1—2 капли раствора фосфорнокислого натрия. Если в прозрачном слое жидкости над осадком уже не образуется мути, считают, что полнота осаждения достигнута. Колбу доливают до метки водой, взбалтывают и содержимое ее фильтруют через бумажный складчатый фильтр. В фильтрате (его называют «фильтрат А») определяют содержание редуцирующих сахаров. Надо так подобрать навеску продукта и разведение, чтобы концентрация сахаров в фильтрате А составляла 0,1—0,2%.
Примечание. Быстрого осаждения белковых, красящих и дубильных веществ (так называемых органических несахаров) можно достигнуть обработкой вытяжки основным азотнокислым свинцом. К 100 мл вытяжки прибавляют 3—4 мл раствора едкого натра, взбалтывают и добавляют 4—6 мл раствора азотнокислого свинца. Осветление раствора происходит в течение 5—7 мин. Для освобождения от избытка свинца к вытяжке, нагретой до температуры 60° С, приливают 3—4 мл насыщенного раствора сернокислого натрия и нагревают на водяной бане при той же температуре 10 мин.
Определение редуцирующих сахаров (по Лэну и Эй-нону). В фильтрате А содержатся редуцирующие сахара (глюкоза, фруктоза и другие монозы, а также дисахариды, обладающие восстанавливающими свойствами,— мальтоза, лактоза и др.). Хотя сахароза тоже переходит в фильтрат, но для количественного определения ее необходимо подвергнуть гидролитическому расщеплению, инверсии (см. с. 222).
Метод определения редуцирующих сахаров основан на титровании реактива Фелинга сахарным раствором (фильтратом Л) в присутствии метиленовой сини. Сахара, оставшиеся в небольшом избытке после восстановления окиси меди в закись, реагируют с метиленовой синью, восстанавливая ее в лейкосоединение.
В бюретку емкостью 50 мл (со стеклянным краном) наливают фильтрат А. В коническую колбу специальны-
221
ми пипетками вносят по 5 мл растворов Фелинга I и II и вливают из бюретки 15—20 мл фильтрата А. Колбу ставят на электрическую плитку и нагревают (на асбестовой сетке) так, чтобы довести до кипения за 2 мин., после чего прибавляют 4—5 капель раствора метиленовой сини и кипятят точно 2 мин.
Примечание. Могут наблюдаться случаи, когда от прибавления метиленовой сини раствор в колбе не посинеет. Это свидетельствует о высокой концентрации редуцирующих сахаров в фильтрате А, и тогда надо его разбавить в два-три раза. Содержание сахаров в испытуемом растворе должно составлять примерно 0,1—0,25%.
Продолжая кипячение жидкости, ее титруют из бюретки фильтратом А до исчезновения синего окрашивания и появления оранжевого осадка закиси меди.
Титровать надо быстро, чтобы в сумме жидкость кипела не более 3 мин. На дотитровывание следует расходовать не более 2—3 мл испытуемого раствора. Если при этом расходуется более 3 мл фильтрата А, рекомендуется повторить определение, прибавив в колбу не 15, а 20 мл испытуемого раствора.
Первое титрование является ориентировочным. Приблизительно установив, сколько миллилитров фильтрата А расходуется на титрование 10 мл реактива Фелинга, проводят два-три точных определения.
Содержание редуцирующих сахаров Х\ вычисляют по формуле
TWO
где Т — титр реактива Фелинга (по инвертному сахару); н — навеска растительного материала в объеме испытуемого раствора, израсходованном на титрование 10 мл реактива Фелинга (суммируют количество миллилитров фильтрата А, прибавленных в колбу в самом начале определения и затем затраченных на дотитровывание).
Определение сахарозы. Для определения содержания сахарозы в отдельной порции фильтрата А производят ее гидролитическое расщепление (инверсию). Условия инверсии подобраны так, что гидролизуется только одна сахароза.
222
CHzOti
сахароза
снгон
Глюкоза	Фруктоза
В мерную колбу на 100 мл вносят 50 мл фильтрата А (см. с. 221), добавляют 5 мл концентрированной соляной кислоты (Р2о= 1,188) и нагревают, часто взбалтывая, в течение 8 мин. на водяной бане, следя за тем, чтобы жидкость в колбе имела температуру 68—70° С (шарик термометра опущен в колбу). Затем колбу быстро охлаждают (под краном) до 20° С. Охлажденную жидкость нейтрализуют углекислым натрием или 15— 20%-ным раствором едкого натра, контролируя этот процесс лакмусовой бумажкой, опущенной в колбу. Нейтрализованную жидкость доводят водой до метки и в случае необходимости фильтруют. Получают фильтрат Б, в котором содержится так называемый инвертный сахар — смесь равных частей глюкозы и фруктозы, освободившихся в результате гидролитического расщепления сахарозы. Содержание редуцирующих сахаров в фильтрате определяют по методу, описанному выше.	।
Содержание сахарозы (в процентах) х2 рассчитывают по формуле
х2=(В—Л) 0,95,
223
где В — содержание редуцирующих сахаров после инверсии; А — то же до инверсии (в процентах); 0,95 — коэффициент перевода инвертного сахара в сахарозу.
Суммарное содержание сахаров (в процентах) с в испытуемом растительном материале рассчитывают по формуле
С=Х\ + Л'2,
где Xi, л'2 — содержание соответственно редуцирующих сахаров и сахарозы.
Определение титра реактива Фелинга. Титр реактива Фелинга определяют по химически чистой сахарозе.
Примечание. Для установки титра реактива можно также пользоваться сахаром-рафинадом, который предварительно выдерживают в эксикаторе (над хлористым кальцием) в течение 4—5 суток.
На аналитических весах (с точностью до 0,0001 г) отвешивают 0,55 г сахарозы. Навеску переносят в мерную колбу на 250 мл и растворяют в 75 мл теплой воды. К раствору прибавляют 4 мл концентрированной соляной кислоты и производят инверсию сахарозы. Все последующие операции описаны выше (см. «Определение сахарозы»). Определяют содержание редуцирующих сахаров в растворе.
Пример расчета. Навеска сахарозы — 0,55 г. Объем раствора инвертного сахара — 250 мл. На титрование 10 мл реактива Фелинга израсходовано 21,2 мл испытуемого раствора.
Титр реактива Фелинга (по инвертному сахару) рассчитывают по формуле
у,__ «51,053
v ’
где н — навеска сахарозы, г; В — объем раствора инвертного сахара, израсходованный на титрование 10 мл реактива Фелинга (в нашем примере — 21,2 мл); v — объем раствора инвертного сахара в мерной колбе (250 мл); 1,053 — коэффициент перевода сахарозы в инвертный сахар;
Т = 0.55 • 21 2 • 1,053 = 0 О401 г_
224
ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕДУЦИРУЮЩИХ САХАРОВ
Количественное определение сахаров по антроновому методу. Химизм реакции — см. с. 198.
Реактивы и приборы: а) антроновый реактив: 0,2 г перекристаллизованного антрона растворяют в 100 мл 96%-ной серной кислоты (рго= 1,835). Употребляют только свежеприготовленный реактив. Продажный препарат антрона надо дважды перекристаллизовать из бензола или ледяной уксусной кислоты; б) стандартный раствор глюкозы: в 1 л кипящей воды растворяют 2,5 г бензойной кислоты. На аналитических весах отвешивают 1 г глюкозы. Навеску переносят в мерную колбу на 100 мл с помощью раствора бензойной кислоты, охлажденного до 20° С. Этим же раствором и доводят до метки. Стандартный раствор глюкозы хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой. Для приготовления калибровочной кривой стандартный раствор разбавляют, получая рабочие растворы с содержанием 20, 40, 60, 80 и 100 мкг глюкозы в 2 мл; в) фотоэлектроколориметр ФЭК-60, ФЭК-Н-57 или ФЭК-56, либо спектроколори-метр «Спекал» (ГДР).
Экстракцию сахаров из материала и осаждение белков, пигментов, дубильных веществ производят, как описано в работе «Определение редуцирующих (восстанавливающих) сахаров в растительном материале».
В две пробирки вносят по 4 мл антронового реактива. Пробирки ставят в сосуд с проточной холодной водой и затем в одну из них, помешивая стеклянной палочкой, осторожно наливают 2 мл испытуемого раствора (в которых должно содержаться не более 100 мкг сахара). В другую пробирку добавляют 2 мл воды (контроль). Обе пробирки ставят на 14 мин. в баню с горячей водой (90°С), после чего охлаждают под краном и колориметрируют в фотоэлектроколориметре с красным светофильтром (Л=625 нм) против контрольного раствора, установленного на нуль. Толщина слоя жидкости в кюветах 0,5 см.
Содержание сахара в испытуемом растворе рассчитывают по калибровочной кривой, составленной по стандартным (рабочим) растворам глюкозы. На оси абсцисс откладывают величины, характеризующие со
8 Д. К. Шапиро
225
держание сахара (мкг), а на оси ординат — оптическую плотность. Калибровочную кривую для каждого прибора проверяют 1—2 раза в год.
Количественное определение сахаров по реакции с пикриновой кислотой. При взаимодействии редуцирующих сахаров с пикриновой кислотой они окисляются до соответствующих кислот, а пикриновая кислота восстанавливается в пикраминовую, обладающую красной или буровато-красной окраской:
Пикриновая
Глюкоза кислота
Пикраминовая ГлюконоВая
кислота
кислота
Реактивы и приборы: а) пикриновая кислота, насыщенный раствор; б) углекислый натрий (карбонат натрия), 20%-ный .раствор; в) спектрофотометр, фотоэлектроколориметр ФЭК-60, ФЭК-Н-57, ФЭК-56 или спектроколориметр «Спекал» (ГДР).
К 1 мл испытуемого раствора (в котором должно содержаться не более 3 мг редуцирующих сахаров) прибавляют 2 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 1 мл раствора углекислого натрия, после чего пробирку переносят на 30 мин. в кипящую водяную баню. Охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до объема 10 мл.
Оптическую плотность раствора определяют при 455 нм (синий светофильтр).
Содержание редуцирующих сахаров рассчитывают по калибровочной кривой, составленной по стандартным растворам глюкозы (см. в работе «Количественное определение сахаров по антроновому методу»).
226
Метод пригоден для количественного определения глюкозы, галактозы, арабинозы, фруктозы, рамнозы, ксилозы, мальтозы, лактозы и крахмала.
Определение редуцирующих сахаров по реакции с 3,5-динитросалициловой кислотой. При взаимодействии сахаров с 3,5-динитросалициловой кислотой последняя восстанавливается в З-амино-5-нитросалициловую. В остальном реакция протекает так же, как и с пикриновой кислотой.
Реактивы и приборы: а) динитросалициловый реактив: в мерной колбе на 1 л растворяют в дистиллированной воде 10 г 3,5-динитросалициловой кислоты, 300 г сегнетовой соли, 16 г едкого натра и доводят водой до метки. Раствор выдерживают два дня в темном месте, затем фильтруют в склянку оранжевого стекла и хранят в темноте; б) спектрофотометр, фотоэлектроколориметр ФЭК-60, ФЭК-Н-57, ФЭК-56 или спектроколори-метр «Спекол» (ГДР).
К 1 мл испытуемого раствора (с содержанием не более 2 мг редуцирующих сахаров) прибавляют 2 мл динитросалицилового реактива, нагревают 5 мин. в кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры, после чего доводят до объема 25 мл.
Оптическую плотность раствора определяют при 530 нм (зеленый светофильтр).
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ САХАРОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ С ПОМОЩЬЮ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ* (по О. А. Павлиновой)
Количественное определение сахаров с применением хроматографии на бумаге включает в себя следующие основные операции: а) фиксацию растительного материала; б) экстракцию сахаров и очистку вытяжки от белков и других примесей; в) распределительную хроматографию сахаров на бумаге; г) элюцию сахаров с бумаги; д) определение их содержания в элюатах.
Реактивы и материалы: а) хроматографическая бумага Ленинградская «быстрая» № 1; «Filtrak» FN-4; ватман № 1 и 2; б) этанол, 96%-ный и 80%-ный; в) уксуснокислый свинец (средний) (СН3СОО)2РЬХ
* Для студенческого научно-исследовательского кружка.
8*
227
X ЗН2О, 10%-ный раствор; г) сернокислый натрий, насыщенный раствор; д) смесь-н-бутанола, пиридина и воды в соотношении 6:4:3 (по объему), или е) смесь н-бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5 (по объему). Если смеси растворителей разделяются на два слоя, то берут верхний; ж) проявители на кетозы: I — резорцинфосфат. 0,2 г резорцина растворяют в 100 мл 96%-ного этанола. Перед проявлением хроматограммы смешивают 10 объемов спиртового раствора резорцина С ОДНИМ объемом ОрТОфосфорНОЙ КИСЛОТЫ Н3РО4 (плотность 1,75—1,82); II — мочевина. 5 г мочевины растворяют в 100 мл 96%-ного спирта и добавляют 20 мл 2 н раствора соляной кислоты; з) проявители на альдозы: I — анилинфталат (см. с. 212); II — анилиноксалат: 0,93 г перегнанного анилина растворяют в 50 мл 96%-кого этанола, после чего смешивают с равным объемом 0,2 М раствора щавелевой кислоты в этаноле (можно также брать водный 0,2 М раствор щавелевой кислоты); и) глюкоза, фруктоза, сахароза и другие сахара, 2%-ные растворы; к) реактивы для количественного определения сахаров по антроновому методу (см. с. 225).
Навеску свежего растительного материала (10—30 г) заливают (для фиксации) десятикратным объемом кипящего 96%-ного этанола, нагревают 2—3 мин., добавляя небольшое количество углекислого кальция или натрия в порошке для нейтрализации кислот (под контролем лакмуса или универсального индикатора). Зафиксированная навеска (в' колбе или склянке с притертой пробкой) может храниться в течение нескольких месяцев (в темном и прохладном месте). Фиксация спиртом является и началом экстракции сахаров, которые частично переходят в раствор.
Сахара экстрагируют горячим (70—80°) 80%1-ным этанолом 3 раза по 30 мин. Перед началом экстракции рекомендуется дополнительно растереть материал в ступке. Спирт, который служил для фиксации навески, объединяют со спиртовыми вытяжками.
После каждой экстракции охлажденную спиртовую вытяжку центрифугируют. Объединенные спиртовые вытяжки сгущают в вакууме до небольшого объема (2— 3 мл). Если материал богат хлорофиллом и каротиноидами, то сгущенную вытяжку несколько раз взбалтывают с петролейным эфиром. Эфирный раствор пигментов
228
сливают, а остатки растворителя удаляют на водяной бане при 50—60°.
Сгущенную вытяжку количественно переводят в мерную колбу на 5 или 10 мл. Для осаждения белков и других примесей прибавляют по каплям раствор уксуснокислого свинца. Проверив полноту осаждения, раствор в колбе доводят до метки, затем
фильтруют или, еще лучше, центрифугируют. Для осаждения избытки свинца, не вошедшего в реакцию, добавляют одну каплю насыщенного раствора сернокислого натрия и снова центрифугируют или фильтруют.
Нарезают полосы хроматографической бумаги длиной 50—55 см и шириной 13—19 см или другого размера (в зависимости от диаметра хроматографической камеры). Бумагу разлиновывают графитовым карандашом, оставляя с одной стороны листа одну, а с другой — две контрольные полосы шириной 2— 2,5 см (рис. 16).
Низ хроматограммы вырезают зубцами, что способствует равно-
Рис. 16. Схема разделения сахаров на хроматограмме и определение положения пятен на основ-
ной, непроявленной части (по О. А. Павликовой): а и б — опрыскивание резорцинфосфатом, а' — опрыскивание анилинфталатом;
в —. непроявленная основная часть хроматограммы. С — сахароза; Г — глюкоза; Ф — фруктоза; /, 2, 3 — олигосахариды.
мерному скапыванию растворителя и предотвращает наблюдающийся иногда перекос пятен. Затем на линию старта отдельными пятнами по одному на основной части хроматограммы и на каждой из контрольных полос наносят
с помощью микропипетки или
капилляра определенный точный объем испытуемого раствора (например, по 0,01; 0,02 или 0,03 мл в пятно). Количество экстракта, наносимого в пятно, должно соответствовать примерно 30—50 мг сырого веса исследуемого материала в том случае, если в нем содержится 5—7 мг глюкозы, фруктозы и сахарозы на 1 г сырого веса ткани. Для установления оптимальной концентрации сахаров, вносимых в пятно, ставят отдельно две
229
контрольные хроматограммы с нанесением различных объемов опытного экстракта (0,01—0,04 мл в пятно). На те же полосы наносят также и метчики — растворы сахаров (по 0,004 мл 2%-ных растворов).
После нанесения растворов на бумагу приступают к разделению сахаров в соответствующей смеси растворителей (н-бутанол — пиридин — вода, 6:4:3; «-бутанол— уксусная кислота — вода, 4:1:5). Хроматография нисходящая. Продолжительность разделения 2—3 суток.
После разделения хроматограммы высушивают в токе воздуха (в вытяжном шкафу) до полного удаления следов растворителя. Следующей задачей является определение положения пятен на основной части хроматограммы, так как сахара элюируют из непроявленной части бумаги. Для этого от основной хроматограммы отрезают контрольные полосы а, а' и б и опрыскивают две из них, например а и б, проявителями на кетозы (резорцинфосфатом или раствором мочевины), а полосу а' — проявителем на альдозы (анилинфталатом или анилиноксалатом).
Полосу, опрыснутую резорцинфосфатом, прогревают 3—4 мин. в сушильном шкафу при температуре 85—95°. Пятна фруктозы, сахарозы, раффинозы и олигосахаридов, содержащих фруктозу, окрашиваются в интенсивно розовый цвет.
При нагревании хроматограммы, опрыснутой раствором мочевины, в течение 5 мин. при 105° пятна кетоз принимают синее окрашивание.
Полосу, обработанную раствором анилинфталата или анилиноксалата, нагревают при 105—110°. При обработке хроматограммы анилинфталатом глюкоза и галактоза проявляются в течение 5 мин. при 105° в виде желтовато-коричневых пятен; пятна пентоз вишнево-красного цвета. Мальтоза и лактоза дают желто-коричневые пятна при нагревании в течение 20 мин. при 105°. При проявлении анилиноксалатом (110°, 5—6 мин.) пятна альдоз имеют коричневое окрашивание.
Проявленные контрольные полосы а, а' и б прикладывают к основной части хроматограммы (в ) и таким образом определяют положение пятен отдельных сахаров на полосе в, не проявляя ее. Участки бумаги, содержащие непроявленные пятна глюкозы, фруктозы, саха
230
розы и олигосахаридов, вырезают, разрезают на маленькие кусочки («лапшу») и элюируют сахара водой три раза по 30 мин. при 60—70°. Элюаты фильтруют через маленькие бумажные фильтры, выпаривают на водяной бане до небольшого объема, снова фильтруют и доводят до определенного объема.
В растворе определяют содержание сахара с помощью антронового реактива.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ (по Хагедорну — Иеисеиу)
Общее содержание сахаров в крови здорового человека составляет 0,08—0,12% (в том числе глюкозы 0,06— 0,1%).
Для количественного определения глюкозы в крови чаще всего пользуются микрометодом Хагедорна — Йенсена. Суть его состоит в том, что глюкоза окисляется железосинеродистым калием (красной кровяной солью) в щелочной среде до глюконовой кислоты, при этом красная кровяная соль восстанавливается до желтой (железистосинеродистого калия).
ЮСИ	Н0СН
I +2K3Fe(ctye+2K0H	I +2K4Fe(Cfy + Hz0
ИСОН	неон
ЮН	ИСОН
сЦон	сн2он
С/1юконоВая кислота
Реакция доходит до конца лишь в присутствии ионов Zn2+. Образуется нерастворимый цинк — железистосинеродистый калий
2K4Fe(CN)6+3ZnSO4=K2Zn3[Fe(CN)6]2+3K2SO4.
Избыток железистосинеродистого калия, не израсходованный на окисление глюкозы, определяется йодометрическим путем
231
2K3Fe (CN) 6+2K1+8CH3COOH = = 2K4Fe (CN) 6 +12+8CH3COOK.
Выделившийся иод оттитровывают тиосульфатом натрия (гипосульфитом):
I2 + 2Na2S2O3=2NaI + Na2S40e.
Реактивы: а) оксалатная кровь. Кровь берут из ушной вены кролика. Чтобы предупредить ее свертывание, к 10 мл крови добавляют 0,01 г щавелевокислого натрия. Можно также брать кровь из пальца; б) содовый раствор железосинеродистого калия: 1,65 г КзРе (CN)e и 10,6 г безводного углекислого натрия растворяют в мерной колбе на 1 л. Раствор хранят в склянке из темного стекла; в) тиосульфат натрия (гипосульфит, серноватистокислый натрий), 0,005 н раствор; г) едкое кали, 0,1 н раствор; д) сернокислый цинк. Готовят 45°/о-ный раствор сернокислого цинка (ZnSO4 • 7Н2О); перед употреблением его разводят в 100 раз, получая 0,45%-ный раствор; е) хлорцинковый раствор: 10 г сернокислого цинка и 50 г хлористого натрия растворяют в 100 мл воды в мерной колбе на 200 мл, раствор доводят водой до метки и фильтруют; ж) иодистый калий: 5 г соли (не содержащей свободного иода) растворяют в 25 мл воды. Раствор готовят перед употреблением; з) уксусная кислота, 3{'[й-ный раствор; и) крахмал, 1°10-ный раствор.
В четыре пробирки наливают по 1 мл 0,1 н раствора едкого натра и 5 мл 0,45%-ного раствора сернокислого цинка. Выпадает" студенистый осадок гидрата окиси цинка. В две пробирки сухой микронипеткой вносят по 0,1 мл крови. Пипетку погружают в раствор гидрата окиси цинка почти до дна пробирки, осторожно выпускают кровь и хорошо перемешивают ее с содержимым пробирки, 2—3 раза втягивая и выпуская жидкость. В две другие пробирки вносят по 0,1 мл дистиллированной воды (контроль). Все пробирки ставят в кипящую водяную баню точно на 3 мин. Белки крови выпадают в виде бурых сгустков. Содержимое четырех пробирок фильтруют через вату в четыре сухих пронумерованных стаканчика. Кусочки ваты в воронках до фильтрования промывают горячей дистиллированной водой (по 2 мл). Пробирки, в которых осаждали белок, ополаскивают 2 раза горячей водой (по 2—3 мл), присоединяя
232
промывные воды к основным фильтратам (через те же воронки с ватой). Фильтрат должен быть прозрачным.
Во все четыре стаканчика добавляют точно по 2 мл содового раствора железосинеродистого калия, а затем нагревают на кипящей водяной бане 15 мин. После охлаждения в каждый стаканчик доливают по 2,6 мл хлор-цинкового раствора, 0,4 мл раствора йодистого калия и 2 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты. Выделившийся иод оттитровывают из микробюретки 0,005 н раствором тиосульфата натрия (индикатор — раствор крахмала).
На титрование контрольной пробы должно быть израсходовано около 2 мл 0,005 н раствора тиосульфата. В опытных образцах объем раствора тиосульфата, израсходованный на титрование, обратно пропорционален содержанию глюкозы в крови.
Для расчета содержания глюкозы пользуются табл. 7.
Пример расчета. На титрование исследуемого образца израсходовано 1,29 мл 0,005 н раствора тиосульфата, контрольного — 1,92 мл. По табл. 7 находим, что 1,29 мл раствора тиосульфата соответствуют 0,125 мг глюкозы, а 1,92 мл того же раствора — 0,014 мг.
Содержание глюкозы в 0,1 мл крови равно 0,125—0,014=1,111 мг, а в 100 мл 0,111-1000=111 мг.
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КРАХМАЛА
Содержание крахмала в растениях варьирует, составляя, например, в зернах злаков до 80%, в клубнях картофеля — до 20—25% (на сырое вещество).
Крахмал -— один из основных продуктов фотосинтеза. Процесс биосинтеза крахмала зависит от многих факторов: вида растения, условий выращивания, стадии зрелости семян и др. Форма и размеры крахмальных зерен характерны для каждого вида растений.
Крахмал представляет собой полимерную систему, структурными звеньями которой являются остатки а-глюкозы. В состав крахмального зерна входят два полимерных компонента — амилоза и амилопектин, различающиеся по форме и степени ветвления цепей, молекулярному весу, растворимости в горячей воде, окрашиванию с иодом и некоторым другим показателям. Молекула амилозы состоит из линейной неразветвлен-ной цепи, в состав которой входят 200—300 остатков
233
tJ‘OOc0CDCD('--OQOOCM’^<£o—«СОЮЬ-ОСМЮ ф	co	-'С^ьюсо^оооолс^-<	о	ь-	ю	co	см	о
CO	CO	CO CM CM см сч CM СЧ —_	- —«_ —	о	о	o^	о	о	о
о	о	о" о с5 о о” о о" о’ о ° с5 о	о	о	о	о	о	о
2=
s a о Q.
СОЮСОСЧСМСЧСОМ'ФСООСМ^^О) — со Ю N о Г^.’^СМОООСО'^СМОООГ^ЮСО—< СТ) ООО см -« СО СО СО со см см_ см_ см_ см —« —*	—« —• с о о_ о о_ о
о о’ o' o' о о’ о" о" о о" о~ о о’ о о о“ о’ о о’ о
ФЮЮ^М'^ЮФССССМ^ОС^^СОЮЬОСМ N'^(MOX'CDM4CMOC^b’LOCO^OCCCO^C'J’-• со со~ СО_ СО см_ см_ см~ см_ см_ ——« —< «—< о о о о о о о о' о о о~ о~ о о~ о о о" о о~ o' о" о" о’ о о“
СМСМООООООООО—«со ООЮСМОООО^СО—«о СОСОСОСОСМСМСМСМСМ—< о о" о о о“ о о" о о~ о
ЮГ^ОСМт}«ООООСМЮ ЬЮсОСМОХСЮсО-« « о о о о о о о" о" о“ о’ о’ о" о о о

S
S
ю о
см со Ttio о г- со о — о о~ о" о о” o' о о о	—«~
234
а-глюкозы. Амилопектин состоит из разветвленных полимерных цепей а-глюкозы. У большинства растений амилопектин преобладает над амилозой, составляя в среднем 70—80% крахмала. Методы количественного определения крахмала основаны на его гидролитическом расщеплении до глюкозы, содержание которой устанавливают с помощью описанных методов (см. с. 221—227). Для перевода в крахмал найденное количество глюкозы умножают на коэффициент 0,9.
Реактивы и мат е р и а лы: а) зерна злаков, мука или клубни картофеля; б) соляная кислота, 25°10-ная (р2о= 1,1239); в) едкий натр, 1(Р10-ный раствор; г) реактивы, необходимые для количественного определения редуцирующих сахаров в растительном материале (см. с. 220—227).
В зависимости от предполагаемого содержания крахмала в исследуемом материале навеска должна составлять 2—10 г.
Продукт (например, клубни картофеля, зерна злаков) предварительно измельчают и тщательно перемешивают, после чего берут навеску.
Навеску переносят в стакан, добавляют 100 мл дистиллированной воды комнатной температуры и, часто помешивая, оставляют на 45—60 мин., при этом редуцирующие сахара переходят в раствор. Содержимое стакана фильтруют через бумажный фильтр, остаток на фильтре промывают 8—10 раз холодной водой, которую берут каждый раз по 20—30 мл.
Воронку с фильтром, на котором находится отмытый остаток, ставят в коническую колбу на 500 мл. Тонкой стеклянной палочкой делают отверстие в бумаге и отмытый остаток смывают водой в колбу. Водой смывают также с кончика палочки приставшие кусочки навески. В колбу наливают 25 мл 25%-ной соляной кислоты, закрывают ее пробкой с обратным холодильником и ставят в кипящую водяную баню на 2,5—3 ч, периодически встряхивая. После окончания гидролиза колбу охлаждают, содержимое ее нейтрализуют 10%-ным раствором едкого натра (по лакмусу), стараясь не давать избытка щелочи. К нейтрализованному содержимому колбы добавляют 1—2 капли 25%-ной соляной кислоты до слабокислой реакции и количественно переводят в мерную колбу на 500 мл, доливая водой до метки, затем пере-
235
Мешивак>т и фильтруют. В 20—50 мл фильтрата определяют содержание глюкозы.
Содержание крахмала (в процентах) х рассчитывают по формуле
х=Г-0,9,
где Г — количество глюкозы, образовавшееся в результате гидролиза крахмала (в процентах); 0,9 — коэффициент пересчета глюкозы на крахмал.
ИССЛЕДОВАНИЕ АНАЭРОБНОГО РАСПАДА ГЛИКОГЕНА ИЛИ КРАХМАЛА
Анаэробный распад гликогена (гликогенолиз) или глюкозы (гликолиз) начинается с этапа образования глюкозофосфорных эфиров. При гликогенолизе вначале образуется глюкозо-1-фосфат, который затем под влиянием фермента фосфоглюкомутазы превращается в глю-козо-6-фосфат. При фосфорилировании глюкозы процесс начинается с образования глюкозо-6-фосфата.
Наряду с фосфорилитическим распадом гликогена в мышцах имеет место (правда, в значительно меньшей степени) и гидролитическое расщепление его под влиянием амилазы и мальтазы.
Схематически процесс анаэробного расщепления углеводов в мышцах можно представить следующим образом.
Г ликогенолиз
Гликоген + Н3РО4
Фосфорилаза | f	Гликолиз
Г люкозо-1 -фосфат	Г люкоза + АТФ
Глюкомутаза | t	I	1
Глюкозо-6-фосфат *-----------• АДФ
Фосфоизомераза | f
Фруктозо-6-фосфат -|- АТФ
Фосфофруктокиназа | f
Фруктозе-1,6-дифосфат -J- АДФ
Альдолаза	f |
Фосфоглицериновый альдегид фосфодиоксиацетон I t
2 молекулы фосфоглицеринового альдегида +
+ 2Н3РО4 + 2НАД
Дегидрогеназа фосфоглицеринового альдегида | f
236
2 молекулы 1,3-Дифосфоглицериновой кислоты 4-4- 2НАД-Н, 4- 2АДФ
Фосфоглицераткиназа j f
2 молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты 4- 2АТФ Фосфоглицеромутаза | |
2 молекулы 2-фосфоглицериновой кислоты Фосфопируватгидратаза 1 Т
2 молекулы фосфоенолпировиноградной кислоты 4-4-2АДФ
Киназа пировиноградной кислоты (пируваткиназа) | f
2 молекулы енолпировиноградной кислоты 4~ 2АТФ 1 t
1	молекула пировиноградной кислоты 4- 2НАД — Н2 Лактатдегидрогеназа | f
2	молекулы молочной кислоты 4- 2НАД
Таким образом, если к кашице мышечной ткани добавить раствор гликогена или крахмала и эту смесь поместить в анаэробные условия при температуре 36,5— 37° С, то через 1—2 ч можно наблюдать образование молочной кислоты, которую открывают реакцией с серной кислотой и гваяколом или с серной кислотой и спиртовым раствором тиофена в присутствии сернокислой меди.
Реактивы и материалы: а) кашица мышечной ткани. Мышцы только что убитого кролика, крысы или лягушки нарезают ножницами на маленькие кусочки (на холоду). Кашицу готовят непосредственно перед употреблением, растирая нарезанные мышцы с небольшим количеством дистиллированной воды; б) фосфатный буфер pH 8,04. Готовят два раствора: I — */is М раствор Na2HPO4.2H2O (11,876 г соли в 1 л); II —'As М раствор КН2РО4 (9,078 г соли в 1 л). Для получения буферной системы (pH 8,04) смешивают 95 мл первого раствора с 5 мл второго; в) метафосфорная кислота, 5<ф0-ный раствор; г) гликоген или крахмал, О,5°1о-ный раствор; д) вазелиновое масло; е) гидрат окиси кальция (Са(ОН)2. Н2О), в порошке; ж) сернокислая медь, 15°/0-ный раствор; з) серная кислота, концентрированная; и) гваякол (монометиловый эфир пирокатехина), О,2°1о-ный спиртовой раствор; к) тиофен, 10—20 капель препарата растворяют в 100 мл этилового спирта.
237
В две пробирки вносят по 0,5 г свежеприготовленной мышечной кашицы и 3 мл фосфатного буфера (pH 8,04). Первая пробирка служит контрольной, вторая — опытной. В контрольную пробирку для инактивации ферментов добавляют 2 мл 5°/0-ного раствора метафосфорной кислоты и 1 мл дистиллированной воды. Во вторую пробирку вливают 1 мл 0,5°/о-ного раствора крахмала или гликогена, затем в обе пробирки добавляют по 1 мл вазелинового масла (для защиты реагирующих веществ от кислорода воздуха) и ставят на 1 ч в термостат при температуре 36,5—37° С. После часа инкубации пробирки вынимают из термостата и во второй инактивируют ферменты добавлением 2 мл 5%-ного раствора метафосфорной кислоты. Контрольную и опытную пробы фильтруют через бумагу в сухие пронумерованные пробирки. Для осаждения углеводов к фильтратам прибавляют по 0,5 г гидрата окиси кальция и 1 мл 15°/о-ного раствора сернокислой меди, потом пробирки ставят на 10—15 мин., время от времени взбалтывая, после чего снова фильтруют.
С фильтратами проделывают реакции на молочную кислоту. Для этого в четыре пробирки наливают: в первые две — по 10 капель фильтрата контрольной пробы, в третью и четвертую — по 10 капель опытной. Пробирки ставят в сосуд со снегом и осторожно (по стенке) добавляют в каждую из них по 30—40 капель концентрированной серной кислоты, во вторую и четвертую приливают также по 1 капле раствора сернокислой меди. После этого все пробирки нагревают на кипящей водяной бане 2—3 мин. и быстро охлаждают. В первую и третью пробирки наливают по 3—4 капли 0,2%-ного спиртового раствора гваякола, во вторую и четвертую — столько же спиртового раствора тиофена. Через несколько минут в третьей пробирке появляется красное окрашивание, в четвертой — вишнево-красное, которое усиливается при нагревании на водяной бане. В первой и второй пробирках может появиться розоватая окраска, обусловленная наличием следов молочной кислоты в мышечной кашице.
Примечание. Опыт проводят в пробирках из термоустойчивого стекла, соблюдая все меры предосторожности, принятые при работе с концентрированной серной кислотой.
238
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ
Пировиноградная кислота — нормальная составная часть плазмы крови (0,8—1,5 мг%). При недостатке витамина Bi и вызванном вследствие этого нарушении процесса декарбоксилирования кетокислот значительно увеличивается содержание пировиноградной кислоты в крови, мозге и других тканях.
Пировиноградная кислота выделяется с мочой (у здоровых людей — до 200 мг в сутки). Исследуя содержание ее в суточном количестве мочи, можно судить о течении процессов углеводного обмена.
Пировиноградная кислота в кислой среде образует бисульфитное соединение с кислыми солями сернистой кислоты (бисульфитом калия или натрия):
СН3
1	I ^он
С=0 +KHS03 = | соон	СООН
Соль сернистой кислоты берут в некотором избытке, который затем связывают иодом
KHSO3+12+Н2О = KHSO4+2НI.
Бисульфитное соединение пировиноградной кислоты разрушается в щелочной среде, при этом освобождается бисульфит, количество которого эквивалентно содержанию пировиноградной кислоты. Количество освободившегося бисульфита определяют титрованием иодом.
Реактивы: а) моча; б) иод, 0,1 ни 0,01 н растворы; в) бисульфит калия или натрия, Р'^-ный раствор. Готовят перед употреблением; г) двууглекислый натрий (бикарбонат, гидрокарбонат), насыщенный раствор; д) тиосульфат натрия (гипосульфит), 0,1 н раствор; е) крахмал, 1°1й-ный раствор на насыщенном растворе хлористого натрия; ж) щавелевая кислота, 0,1 н раствор.
В коническую колбочку на 25 мл вносят пипеткой 1 мл мочи, добавляют 9 мл воды и 1 мл 0,1 н раствора щавелевой кислоты, при этом выпадают в осадок соли кальция. Приливают 10 капель раствора бисульфита калия или натрия, смесь взбалтывают и колбу ставят в
239
темное место на 15 мин. По истечении указанного времени избыток бисульфита связывают 0,1 н раствором иода, добавляя его каплями (в присутствии крахмала) до появления синего окрашивания. Для удаления избытка иода приливают по каплям 0,1 н раствор тиосульфата натрия (гипосульфита) до обесцвечивания содержимого колбы, после чего прибавляют (также по каплям) 0,01 н раствор иода (для связывания избытка тиосульфата) до появления синего окрашивания от последней капли раствора. Затем приливают 10 капель насыщенного раствора двууглекислого натрия (синяя окраска исчезает) и жидкость в колбе титруют (из микробюретки) 0,01 н раствором иода до восстановления синего окрашивания, сохраняющегося 20—30 с.
Содержание пировиноградной кислоты в суточном количестве мочи (мг) х рассчитывают по формуле
 ЭЛ 0,01 в
где Э — грамм-эквивалент пировиноградной кислоты; А—количество 0,01 н раствора иода, израсходованное на титрование, мл; 0,01 —нормальность раствора иода; В — суточное количество мочи, мл; 1 — количество мочи, взятое для исследования, мл.
Раздел VIII
ГОРМОНЫ
Гормоны — специфические регуляторы биохимических процессов в организме, вырабатываемые железами внутренней секреции. Они играют большую роль в обеспечении замечательной способности живых организмов — саморегулировании (авторегуляции) биохимических и физиологических процессов, поддержании их на относительно стабильном уровне.
В организме человека и животных гормоны выраба-бываются щитовидной и паращитовидными железами, надпочечниками, поджелудочной железой, гипофизом, половыми железами, эпифизом. Некоторые гормоны (или гормоноподобные вещества) вырабатываются в желудочно-кишечном тракте, системе кровообращения, околоушной слюнной железе, почках и других органах и тканях.
По химической природе гормоны можно разделить на три группы.
1.	Производные аминокислот (гормоны щитовидной железы и мозгового слоя надпочечников).
2.	Полипептиды и белки (гормоны гипофиза, поджелудочной железы).
3.	Стероидные соединения (гормоны коркового слоя надпочечников и половых желез).
Характер влияния гормонов на обмен веществ отличен от механизма действия ферментов и витаминов. Они не входят в состав молекул биологических катализаторов, ферментов, отличаясь этим от витаминов.
241
Гормоны в отличие от ферментов не принимают непосредственного, видимого участия в химических реакциях и их не удается включить в химические уравнения, выражающие основные процессы обмена белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, минеральных соединений. Считают, что роль гормонов сводится к так называемому аллостерическому регулированию, т. е. изменению пространственной конфигурации молекул.
Ряд гормонов, главным образом белковой и пептидной природы, влияет на проницаемость клеточных и субклеточных мембран, некоторым из них свойственны функции активаторов или ингибиторов ферментных систем (в первую очередь — окислительно-восстановительных), другие (в основном стероидные) принимают участие в процессах биосинтеза белковых веществ.
Роль ряда гормонов сводится к преимущественному регулированию процессов работы других желез внутренней секреции.
ОТКРЫТИЕ ИОДА В ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЕ
В щитовидной железе синтезируются несколько соединений, обладающих гормональным действием. В составе молекулы основного гормона — тироксина (тетра-иодтиронина) содержатся четыре атома иода
Гироксин
Кроме тироксина, в щитовидной железе вырабатываются еще три гормона, из которых наиболее активными являются 3, 5, З^трииодтиронин и 3, З’-дииодтиронин
242
Тироксин и трииодтиронин, окисляясь, образуют тетра- и трииодуксусную кислоты, которые играют каталитическую роль в окислительных процессах. Щитовидная железа вырабатывает также гормон тиреокальцитонин, снижающий уровень кальция в крови.
Реактивы: а) препарат тиреодин (представляет собой обезжиренную, высушенную и измельченную щитовидную железу убойного скота); б) углекислый натрий, в порошке; в) азотнокислый калий, в порошке; г) серная кислота, 15°10-ный раствор; д) хлороформ; е) хлорамин, 5°10-ный раствор, свежеприготовленный (или хлорная вода).
0,5 г порошка тиреодина тщательно смешивают в тигле с 2 г смеси азотнокислого натрия и углекислого натрия (5:7) и нагревают до обугливания. Остаток растворяют в 20 мл воды и фильтруют. Фильтрат подкисляют 15°/о-ным раствором серной кислоты до слабокислой реакции (по лакмусу), после чего к нему добавляют 5 мл хлороформа, 4—5 мл свежеприготовленного раствора хлорамина (или хлорной воды) и встряхивают. Хлороформный слой принимает красно-фиолетовое окрашивание.
243
ГОРМОНЫ МОЗГОВОГО СЛОЯ НАДПОЧЕЧНИКОВ
Общие сведения. В хромаффинных клетках мозгового слоя надпочечников образуются два гормона — адреналин и норадреналин. Они являются производными ортодиоксибензола (пирокатехина) и синтезируются в организме в результате ферментативных превращений аминокислоты тирозина (или фенилаланина) при участии метионина.
норадреналин
Адреналин
Адреналин и норадреналин образуются также в хромаффинных клетках ганглиозной ткани.
Адреналин — весьма неустойчивое вещество. Он легко окисляется и сам является хорошим восстановителем. Так, он способен восстанавливать металлическое серебро из раствора азотнокислого серебра, медь — из закиси меди и т. д. Особенно легко проходит окисление адреналина в нейтральной и щелочной среде. Продукты окисления адреналина (дегидроадреналин, адренохром и др.) принимают участие в окислительных процессах в организме.
Качественные реакции на адреналин. Реакция с хлорным железом. Растворы адреналина дают с хлорным железом изумрудно-зеленое окрашивание,
244
характерное для гидроксильных групп, расположенных в ортоположении.
Р е активы: а) адреналин, раствор 1: 1000; б) хлорное железо, 3°/0-ный раствор; в) аммиак, 1О°/о-ный раствор.
0,5 мл раствора адреналина смешивают с 2 мл воды и прибавляют 1 каплю раствора хлорного железа. Содержимое пробирки тотчас же окрашивается в изумрудно-зеленый цвет. От прибавления 1 капли раствора аммиака окраска переходит в вишнево-красную, а затем принимает коричневый оттенок.
Реакция с и о д н о в а т о к и с л ы м калием. Реактивы: а) адреналин, раствор 1:1000; б) иодноватокислый калий (иодат калия, КЮз), Р^-ный раствор; в) уксусная или ортофосфорная кислота, 10°1й-ный раствор.
К 0,5 раствора адреналина прибавляют 1 мл 1%-ного раствора йодата калия, 10 капель 10%-ного раствора уксусной или ортофосфорной кислоты и подогревают до температуры 60—65° С. Появляется интенсивное краснофиолетовое окрашивание.
ГОРМОНЫ коркового слоя НАДПОЧЕЧНИКОВ (КОРТИКОСТЕРОИДЫ)
Общие сведения. Гормоны коры надпочечников относятся к веществам стероидной природы. Основу их структуры составляет тетрациклическое ядро циклопентанпергидрофенантрена.
По строению все они близки к холестерину, который является их предшественником в организме.
По характеру преобладающего физиологического действия гормоны коры надпочечников (кортикостероиды) делят на две группы: минералокортикостероиды и глюкокортикостероиды. Минералокортикостероиды в основном влияют на обмен электролитов (главным образом ионов Na+, К+, С1~) и воды, глюкокортикостероиды преимущественно воздействуют на обмен углеводов и белков.
Важнейшие глюкокортикостероиды — кортизон, гидрокортизон (кортизол) и кортикостерон.
245
Основным минералокортикостероидом является дезоксикортикостерон
дезоксикортикостерон
Гормон альдостерон регулирует как обмен углеводов и белков, так и минеральный обмен
246
н
I о=с
Альдостерон
Качественные реакции на кортизон. Реакция с сернокислым фелилгидразином. Благодаря наличию карбонильных групп кортизон, реагируя с фе-нилгидразином, образует гидразон и озазон.
Реактивы: а) раствор сернокислого фенилгидра-зина: 0,1 г фенилгидразина растворяют в 100 мл охлажденной смеси из равных объемов концентрированной серной кислоты и воды. Раствор готовят перед употреблением; б) препарат «кортизон-ацетат»; в) метиловый спирт.
1 мг кортизона-ацетата растворяют в 1 мл метилового спирта, прибавляют 5 мл раствора сернокислого фенилгидразина и нагревают на водяной бане. Через несколько минут появляется желтое окрашивание.
Реакция с реактивом Фелинга. Кортизон способен восстанавливать закись меди из солей окиси.
Реактивы:	а) препарат «кортизон-ацетат»;
б) реактив Фелинга.
10 мг кортизона-ацетата растворяют в 1 мл метилового спирта, добавляют 1 мл реактива Фелинга и нагревают на водяной бане. Выпадает красно-оранжевый осадок закиси меди.
Реакция на дезокси кортикостерон. Ре-а к т и в ы: а) препарат «дезоксикортикостерон-ацетат»; б) серная кислота, концентрированная; в) хлороформ.
2 мг препарата растворяют в 2 мл концентрированной серной кислоты. К раствору прибавляют 1,5 мл воды и встряхивают, добавляют еще 1,5 мл воды и снова
247
встряхивают. Содержимое пробирки принимает вишневое окрашивание. Раствор охлаждают, прибавляют к нему 3 мл хлороформа и встряхивают: нижний слой окрашивается в желтый цвет, верхний — в зеленый.
ГОРМОНЫ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Общие сведения. В поджелудочной железе вырабатывается несколько веществ, обладающих гормональным действием.
0-Клетки островков Лангерганса синтезируют инсулин, являющийся одним из важнейших регуляторов обмена углеводов в организме. Роль островковых клеток в выработке инсулина была доказана Л. В. Соболевым.
В ct-клетках островков Лангерганса образуется гормон глюкагон. Он также влияет на углеводный обмен, но его действие оказывается противоположным инсулину.
Клетки эпителия мелких протоков железы вырабатывают гормон липокаин, участвующий в обмене жиров.
Гормон ваготонин повышает тонус парасимпатической нервной системы, а центропнеин влияет на дыхательный центр. Эти гормоны изучены еще недостаточно.
Инсулин — белковое вещество. Его синтез был осуществлен в 1963—1964 гг. Макромолекула инсулина состоит из мономеров, каждый из которых построен из двух полипептидных цепей: цепи А, состоящей из 21 остатка аминокислотой цепи В, в состав которой входят 30 аминокислотных остатков. Полипептидные цепи соединены между собой дисульфидными мостиками. Мономеры инсулина связываются в димеры посредством цинка, содержание которого составляет 0,3%. Димеры соединяются друг с другом с помощью сил Ван-дер-Ваальса и электростатических связей. Макромолекула инсулина состоит из четырех димеров. Физиологической активностью обладают не только макромолекулы, но и мономеры, димеры и соединения, состоящие из двух-четырех димеров.
Глюкагон — полипептид, состоит из 29 аминокислотных остатков.
Реакции на инсулин. Реакция с разбавленным раствором едкой щелочи. При добавлении к раствору инсулина очень разбавленного раство
ра едкого натра или едкого кали выпадает хлопьевидный осадок, растворяющийся при подкислении.
Реактивы: а) раствор инсулина (в ампулах); б) едкий натр или едкое кали, 0,1 %-ный раствор; в) уксусная кислота, О,5°1о-ный раствор.
К Ю—15 каплям раствора инсулина добавляют по каплям 0,1%-ный раствор едкой щелочи до выпадения хлопьевидного осадка (pH 5,0—5,2), который растворяется при подкислении 0,5%-ным раствором уксусной кислоты до pH 2,5—3,5.
Реакции, свидетельствующие о белковой природе инсулина. С раствором инсулина проделывают реакции, доказывающие его белковую природу,— биуретовую, Миллона и др. [см. раздел I «Химия аминокислот, пептидов и простых белков (протеинов) »].
248
Раздел IX
ОБМЕН МИНЕРАЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ
Минеральные вещества — непременная составная часть живого организма. Они играют важную роль в обмене веществ, построении тканевых и клеточных структур. Наличие устойчивой концентрации минеральных соединений в тканях и жидкостях организма (главным образом в ионизированном состоянии) способствует поддержанию постоянства концентрации водородных ионов.
Относительное постоянство содержания минеральных веществ является фактором, способствующим поддержанию стабильности осмотического давления крови, лимфы, клеточного сока, межклеточного содержимого и т. д. Соотношение ионов между собой в жидкостях организма влияет в значительной'мере на раздражимость клеток и тканевых структур. Показано, что в первую очередь свойства раздражимости определяются соотношением ионов
Na+ -р К+ Са2+ 4- Mg2+
= const.
Указанное отношение названо ионным коэффициентом. Преобладание одновалентных ионов, т. е. увеличение значения числителя, влечет за собой повышение раздражимости, и, наоборот, сдвиг в сторону двухвалентных ионов связан с тормозящим, угнетающим раздражимость действием. Устойчивость коллоидных систем (сохранение присущей им степени дисперсности, гидратиро-ванности, поддержание определенного электрокинетиче-ского потенциала и т. д) также связана с различными
250
ионами. Кроме того, многие минеральные вещества выполняют специфические коферментные функции (соединения меди, цинка, железа, кобальта, магния, марганца, молибдена), входят в состав молекул гормонов, активируют или тормозят активность ферментов. Металлы, служащие коферментами, часто играют роль связующего звена между белковой частью фермента и субстратом (особенно соединения магния и цинка).
Человек и животные получают минеральные вещества с пищей и кормом. Минеральные соединения должны постоянно поступать в организм, так как постепенно происходит их выделение (с мочой, калом, потом, слезами и т. д.).
Некоторые минеральные соли задерживаются в организме. Так, соединения кальция, магния и фосфора концентрируются главным образом в костной ткани, железо — в печени, хлористый натрий — в коже. В случае недостаточного поступления указанных веществ в организм с пищей они переходят из указанных депо в кровь.
Суточная потребность взрослого человека в минеральных веществах (мг) составляет:
Кальций — 700—800 Фосфор — 1500—2000
Натрий — 4000—8000
Калий — 2000—3000 Хлор — 2000—4000
Железо — 15—20
В зависимости от количественного содержания в организме и продуктах питания минеральные вещества разделяются на две группы: 1) макроэлементы; 2) микроэлементы.
К макроэлементам относятся кальций, фосфор, калий, сера, натрий, хлор, магний, железо, фтор. Среднее содержание микроэлементов в животном организме (%) следующее:
Кальций	2,00	Хлор	0,15
Фосфор	1,10	Магний	0,05
Калий	0,35	Железо	0,004
Натрий	0,15	Фтор	0,001
Сера	0,25		
Многие элементы обнаружены в очень небольших количествах (10-3—10-12 %), и поэтому их называют микроэлементами. К ним относят иод, кобальт, цинк, медь, стронций, марганец, молибден, никель, кадмий и др.
251
Микроэлементы принадлежат к биологически активным веществам. Они участвуют в процессах тканевого дыхания, являются непременными компонентами обмена белков, углеводов, липидов, витаминов, принимают участие в процессах деления клеток, кроветворения, образования костной ткани. Доказана роль микроэлементов в процессах фотосинтеза и усвоения атмосферного азота растениями.
Установлена тесная связь микроэлементов с ферментами, витаминами, гормонами. Микроэлементы весьма неравномерно распределены в организме животных. Так, иод концентрируется главным образом в щитовидной железе, стронций — в костях, медь — в печени и костном мозге, молибден — в почках, цинк — в поджелудочной железе, половых железах, гипофизе.
Потребность организма в минеральных веществах повышается при беременности, кормлении грудью, росте. Недостаточное поступление минеральных веществ в организм вызывает глубокие нарушения обмена веществ, важнейших физиологических функций.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Кальций, поступающий в организм, в основном концентрируется в костной ткани в виде двойных углекислых, фосфорнокислых и фтористых солей
[СаСО3 • nCa3(PO4l2; CaF2 • пСа3(РО4)2].
Кальций постоянно присутствует в плазме и сыворотке крови (среднее содержание в сыворотке 9—II мг%). В крови преобладающая часть кальция (около 60%) находится в ионном состоянии, а около 40% связано с альбуминами в виде комплексных соединений. Содержание ионов кальция в крови регулируется гормоном паращитовидных желез и тиреокальцитонином.
Кальций участвует в процессе свертывания крови; является активатором и ингибитором ряда ферментов (активирует лецитиназу, аденозинтрифосфатазу, угнетает действие енолазы, дипептидазы и других ферментов).
Содержание кальция в сыворотке крови определяют с помощью простого и быстрого метода де-Ваарда.
252
Кальций осаждают в виде щавелевокислой соли. Осадок растворяют в серной кислоте, при этом освобождается эквивалентное количество щавелевой кислоты, которое оттитровывают марганцовокислым калием.
Реакции протекают по следующим уравнениям:
COONHi coo.
CaCt2+\ =1 >ca+zw4cz COONHt coo7
coo.	соон
| yca+ HzS0i= |	+ CaS04
COO7	CO OH
COQH
\	+21W>4 +3H2S04—2MnS0i + K2SO4 +-8HzO+2Wz
Количество марганцовокислого калия, израсходованное на титрование, эквивалентно содержанию кальция во взятом для исследования объеме сыворотки. 1 мл 0,01 н раствора КМпО4 соответствует 0,2 мг кальция.
Реактивы и м ат е р иалы: а) сыворотка крови; б) щавелевокислый аммоний, 4°10-ный раствор; в) аммиак, ЯР/о-ный раствор; г) серная кислота, 1 н раствор; д) марганцовокислый калий, 0,01 н раствор.
В одну центрифужную пробирку пипеткой вносят 1 мл сыворотки крови, в другую — 1 мл дистиллированной воды (контроль). В обе пробирки добавляют по 1 мл 4%-ного раствора щавелевокислого аммония, перемешивают и оставляют на 30 мин., после чего центрифугируют 10—15 мин. (2500 оборотов в минуту). Прозрачную жидкость над осадком осторожно отсасывают с помощью стеклянного капилляра или декантируют, стараясь не взмутить осадка. В обе пробирки приливают по 4 мл 2°/о-ного раствора аммиака для отмывки от избытка щавелевокислого аммония и снова центрифугируют в течение 8—10 мин. Осадок щавелевокислого кальция нерастворим в щелочной среде, но хорошо растворяется в растворах минеральных кислот.
Промывку осадка производят два раза. Надосадочную жидкость тщательно отсасывают или декантируют, в обе пробирки прибавляют по 1 мл 1 н раствора серной
253
кислоты и размешивают тонкими стеклянными палочками, не вынимая их из пробирок, до полного растворения осадков. Затем пробирки (с палочками) ставят на 3—4 мин. в горячую водяную баню. Горячие растворы титруют (из микробюретки) 0,01 н раствором марганцовокислого калия, все время помешивая палочками, до появления слаборозового окрашивания, сохраняющегося в течение 1 мин.
Содержание кальция в сыворотке крови (мг%) х вычисляют по формуле
х=0,2(0—К) 100,
где О — количество 0,01 н раствора марганцовокислого калия, израсходованное на титрование опытной пробы, мл; К — то же при титровании контрольной пробы; 0,2— количество кальция, соответствующее 1 мл 0,01 н раствора марганцовокислого калия, мг.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ КАЛЬЦИЯ В МОЛОКЕ
Соединения кальция составляют приблизительно */s общего количества минеральных веществ молока. В женском молоке содержится в среднем 34 мг% кальция, коровьем — 140, кобыльем — 80—85.
Молоко — важный источник кальция и фосфора в питании не только детей, но и взрослых. 78% кальция молока представлено неорганическими солями, 22% соединено с белком казеином.
Содержание кальция в молоке определяют методом де-Ваарда (см. с. 252).
Реактивы и материалы: а) молоко; его разводят в 10 раз. В мерный цилиндр на 10—25 мл пипеткой вносят 1 мл молока, добавляют 9 мл воды и тщательно перемешивают; б) реактивы для определения кальция по методу де-Ваарда.
В одну центрифужную пробирку наливают 1 мл разведенного молока, в другую — 1 мл воды. В обе пробирки наливают по 0,5 мл 4%-ного раствора щавелевокислого аммония и в остальном поступают так же, как при определении кальция в сыворотке крови.
254
Содержание кальция в молоке (мг%) х вычисляют по формуле
0,2 {О — К) 100
Х~ 0,1
где 0,1—содержание молока в 1 мл разведенного, мл.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ ФОСФОРА В МОЛОКЕ
Соединения фосфора играют большую и разностороннюю роль в обмене веществ. Фосфор — один из важнейших структурных элементов; более 85% его общего количества в организме сосредоточено в скелете. Фосфорная кислота и ее соединения — непременные компоненты синтеза нуклеиновых кислот, нуклеопротеидов, фосфопротеидов, фосфатидов, ряда коферментов (НАД, НАДФ, ФМ.Н, ФАД, пиридоксальфосфата, ТПФ и др). Соединения фосфора — активные участники гликолиза, гликогенолиза, окислительного фосфорилирования и ряда других обменных процессов. Соли фосфорной кислоты входят в состав буферной системы, поддерживающей относительное постоянство pH крови.
Фосфор распространен в пищевых продуктах, много его в молоке, твороге, сыре, яйцах, мясе, горохе, фасоли, ржаной муке и хлебе. В женском молоке фосфора содержится в среднем 15 мг%, коровьем — 80, козьем — ПО мг%.
Содержание фосфора в молоке и других продуктах чаще всего определяют с помощью колориметрического метода Фиске — Суббароу (по образованию так называемой «молибденовой сини»). Сущность этого метода состоит в том, что неорганические фосфаты образуют комплексные соединения с молибденовокислым аммонием, которые затем восстанавливаются в продукты, окрашенные в синий цвет («молибденовая синь»). Интенсивность окраски пропорциональна содержанию фосфора в растворе. Органические соединения фосфора (например, фосфопротеиды, нуклеопротеиды, нуклеотиды, фосфатиды и др.) должны быть предварительно минерализованы.
Реактивы и материалы: а) молоко; б) серная кислота, концентрированная; в) молибденовокислый аммоний, 2,5%-ный раствор. В 300 мл воды растворяют 12,5 г молибденовокислого аммония. В отдельном сосуде
255
к 125 мл воды осторожно приливают 75 мл концентрированной серной кислоты. После остывания оба раствора сливают вместе; г) эйконоген, 0,25%-ный раствор. В мерной колбе на 250 мл растворяют 59,5 г NaHSO3 и 2 г безводного Na2SO3, раствор фильтруют. К 125 мл раствора добавляют 0,5 г эйконогена (1-амино-2-нафтол-4-сульфоновой кислоты) и доливают водой до 200 мл. Раствор не должен иметь щелочную реакцию. Хранят в плотно закрытой склянке темного стекла. Срок годности — до двух недель. Вместо эйконогена можно пользоваться свежеприготовленным 0,2%-ным водным раствором аскорбиновой кислоты; д) пергидроль; е) стандартный раствор: 4,394 г однозамещенного фосфорнокислого калия (промытого спиртом для удаления следов двузамещенного фосфата, перекристаллизованного и высушенного в эксикаторе над серной кислотой) растворяют в воде в мерной колбе на 1 л. Получают основной раствор, 1 мл которого содержит 1 мг фосфора. Из основного раствора готовят рабочий, разбавляя его водой в 20 раз. 1 мл рабочего раствора содержит 0,05 мг фосфора. Для повышения устойчивости к основному и рабочему растворам добавляют по 15—20 капель хлороформа.
В большую пробирку из тугоплавкого стекла наливают 0,5 мл молока и 2 мл концентрированной серной кислоты. Одновременно проводят контрольный опыт с 0,5 мл воды и 2 мл серной кислоты.
Обе пробирки закрывают маленькими воронками и ставят в наклонном положении на песчаную баню (под тягой!). Осторожно нагревают до обугливания, после чего охлаждают, прибавляют в каждую пробирку по 0,5 мл пергидроля и нагревают до кипения, кипятят несколько минут. Указанную операцию повторяют до полного обесцвечивания жидкости.
Бесцветные минерализаты (опытной и контрольной проб) количественно переносят в две мерные колбы на 100 мл и доводят водой до меток. Пипетками берут по 5 мл опытного и контрольного растворов и вносят в мерные колбы на 50 мл. В колбу с контрольным раствором добавляют 1 мл стандартного раствора КН2РО4. В обе колбы приливают по 1 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,5 мл раствора эйконогена (или 1 мл свежеприготовленного 0,2%-ного раствора аскорбиновой кислоты) и по 25 мл воды. Колбы ставят на 15—20 мин., потом
256
доводят водой до метки, перемешивают и колориметрируют.
Содержание фосфора (в миллиграммах на 100 мл молока) х рассчитывают по формуле
0,05 Hi 100 №= ---,,-----,
Hi-tn
где 0,05 — содержание фосфора в 1 мл стандартного раствора, мг; И — показания колориметра для контрольного раствора; Н2 — показания колориметра для опытного раствора; т — количество молока, содержащееся в 5 мл раствора минерализата, взятых для определения фосфора (т. е. в тех 5 мл раствора, которые были внесены в мерную колбу на 50 мл), мл.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖЕЛЕЗА В ПЛАЗМЕ ИЛИ СЫВОРОТКЕ КРОВИ (по прописи П. А. Розенберг и Н. К. Бялко)
Железо входит в состав соединений, принимающих участие в транспортировке кислорода (гемоглобин, миоглобин) и процессах тканевого дыхания (пероксидаза, каталаза, цитохромы).
Содержание железа в сыворотке крови человека составляет в среднем 0,198 мг%.
В тканях закисное железо преимущественно находится в виде ферритина — комплексного соединения с белком и фосфорной кислотой. Ферритин содержит до 25% железа. Наиболее им богаты селезенка, печень, слизистая оболочка кишечника.
Ионы закисного железа в плазме крови образуют с р-глобулинами подвижную транспортную форму — трансферритин, который поступает в костный мозг. В костном мозге трансферритин главным образом используется на образование гемоглобина, часть же его превращается в ферритин.
Железо в ферритине способно к окислительно-восстановительным реакциям. Восстановленный ферритин (Fe2+) диссоциирует на белковую часть — апоферритин и ионы двухвалентного железа. Окисленный ферритин (Fe3+)—довольно устойчивое соединение, в основном играет роль запасного вещества.
9 Д. К. Шапиро
257
Суть метода состоит в том, что окисные соли железа (Fe3+), реагируя с роданидами в кислой среде, образуют соединение, окрашенное в красный цвет
2FeCl3 + 6KCNS = 2Fe(CNS)3+6KCl.
Интенсивность окраски пропорциональна содержанию ионов окисного железа в растворе.
Реактивы и материалы: а) сыворотка крови или негемолизированная плазма; б) серная кислота, концентрированная; в) пергидроль; г) роданистый калий, 1,5 н раствор. 146 г роданистого калия растворяют в 300 мл воды в мерной колбе на 1 л. К раствору добавляют 20 мл ацетона, перемешивают и доводят водой до метки; д) калий надсернокислый (калий-персульфат) — KaSaOs, насыщенный раствор; е) стандартный раствор. Вначале готовят основной раствор: 0,0703 г аммонийсер-нокислого железа (соли Мора) (NH4)2SO4 • FeSO4 • 6Н2О растворяют в воде в мерной колбе на 100 мл. 1 мл основного раствора содержит 0,1 мг железа. Основной раствор разводят водой в 10 раз, получая рабочий, в 1 мл которого содержится 0,01 мг железа.
Органические соединения железа подвергают минерализации, для чего в пробирку из тугоплавкого стекла вносят 2 мл сыворотки или негемолизированной плазмы, добавляют 1,5 мл концентрированной серной кислоты и нагревают на песчаной бане, время от времени добавляя по 0,5 мл пергидроля (см. «Определение общего содержания фосфора в модоке»).
Охлажденную бесцветную жидкость количественно переносят в мерную колбу на 25 мл, несколько раз ополаскивают водой пробирку и сливают ополоски в мерную колбу.
В мерную колбу добавляют 1 мл насыщенного раствора надсернокислого калия, перемешивают (при этом закисные соли железа переходят в окисные), приливают 4 мл 1,5 н раствора роданистого калия, доливают водой до метки и хорошо перемешивают. Оптическую плотность раствора определяют на фотоэлектроколориметре ФЭК-М или ФЭК-Н-57 по левому барабану с зеленым светофильтром (Х=535 нм) в кювете с рабочей шириной 2 см против контрольного раствора. Для приготовления контрольного раствора в мерную колбу на 25 мл вливают 2 мл воды, 1 мл насыщенного раствора надсернокис-
258
лого калия, 4 мл раствора роданистого калия и доводят водой до метки.
Содержание железа в исследуемом растворе определяют по калибровочной кривой.
Калибровочную кривую строят следующим образом. В 11 мерных колб емкостью 25 мл вносят последовательно 0,05—0,1—0,2— 0,3—0,4—0,5—0,6—0,7—0,8—0,9—1,0 мл рабочего стандартного раствора. В каждую колбу вливают по 15 мл воды, 1 мл раствора надсернокислого калия и 4 мл раствора роданистого калия, доливают водой до метки и перемешивают. Получают серию растворов с содержанием 0,0005—0,001—0,002—0,003—0,004—0,005—0,006—0,007—0,008— 0,009—0,001 мг железа. Определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре (см. выше).
На оси абсцисс откладывают величины, показывающие содержание железа (мг) в каждом из растворов, а на оси ординат — оптическую плотность и, пользуясь указанными данными, вычерчивают калибровочную кривую.
Содержание железа (мг%) в плазме или сыворотке х вычисляют по формуле
а 100
где а — количество железа в испытуемом растворе, найденное по калибровочной кривой, мг; b — количество плазмы или сыворотки, взятое для исследования (обычно 2 мл); 100 — множитель для пересчета в миллиграмм-проценты.
Примечание. Калибровочную кривую готовит обычно лаборант один-два раза в семестр для каждого прибора, с которым работают студенты.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХЛОРИДОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ (по А. С. Вечеру и В. В. Малоян)
В основу метода положена реакция хлоридов с раствором азотнокислой закисной ртути с образованием осадка однохлористой ртути (каломели) HgaCK:
2NaCl + Hg2 (NO3)2 = 4 Hg2Cla +r2NaNO8.
Серовато-белый осадок однохлористой ртути практически нерастворим в воде (0,0001%), спиртах и диэтиловом эфире, очень слабо растворяется в соляной кислоте.
Конец реакции становится отчетливо заметным при добавлении к реагирующей смеси адсорбционного индикатора — бромфенолового синего.
9*
259
В начале титрования, пока в растворе содержатся в избытке свободные ионы хлора, они адсорбируются на осадке каломели, который благодаря этому приобретает отрицательный заряд и отталкивает окрашенные анионы индикатора. Чем ближе к точке эквивалентности, тем на осадке больше будут адсорбироваться ионы ртути. Заряд осадка становится положительным и начинает адсорбировать ионы индикатора. В точке эквивалентности адсорбция ионов индикатора максимальна, это вызывает изменение окраски осадка каломели — она становится сиреневой.
Лучшей коагуляции осадка способствует прибавление раствора азотнокислого свинца. Наиболее полная коагуляция наблюдается в точке эквивалентности.
Реактивы: а) азотнокислая закисная ртуть — Hg2(NO3)2 • 2Н2О, 0,1 н раствор. В мерной колбе на 1 л растворяют 30 г соли в 500—600 мл 0,05 н раствора азотной кислоты, после чего этим же раствором доводят до метки. Азотная кислота стабилизует раствор азотнокислой закисной ртути, повышает ее устойчивость к гидролизу. Титр раствора определяют по хлористому натрию. К титруемому раствору хлористого натрия добавляют 1 мл 10°/о-ного раствора азотнокислого свинца и 6—8 капель раствора бром фенолового синего; б) бромфеноловый синий, 0,1°/0-ный раствор. 0,1 г индикатора растирают с 1,5 мл 0,1 н раствора едкого натра и разбавляют водой до 100 мл; в) азотнокислый свинец — Pb(NO3)2, 10°1й-ный водный раствор.
Среднюю пробу продукта растирают в ступке. В зависимости от предполагаемого содержания хлоридов берут навеску в 10—25 г. Ее количественно переносят в мерную колбу на 250 мл, приливают 100 мл воды, взбалтывают 3—5 мин. и оставляют на 15 мин. Потом колбу доливают водой до метки и содержимое ее фильтруют через вату.
10 мл фильтрата пипеткой переносят в коническую колбу, прибавляют 1 мл 10°/0-ного раствора азотнокислого свинца, взбалтывают, приливают 6—8 капель раствора бром фенолового синего и титруют 0,1 н раствором азотнокислой закисной ртути, энергично взбалтывая содержимое колбы. Окраска жидкости во время титрования меняется: вначале она мутно-зеленоватая, затем серовато-белая и в точке эквивалентности становится сиреневой.
260
В связи с тем что цвет осадка может меняться под влиянием прямых солнечных лучей, титрование проводят в затененном месте.
Содержание хлоридов в продукте (в процентах хлористого натрия) х рассчитывают по формуле
Ак 0,005846 р 100 х =-----!----------,
н
где А — количество раствора азотнокислой закисной ртути, израсходованное на титрование 10 мл фильтрата, мл; к — поправочный коэффициент приблизительно 0,1 н раствора азотнокислой закисной ртути; р — разведение (например, навеска продукта 10 г, объем раствора в мерной колбе 250 мл, р=25); н — навеска продукта, г.
Метод удобен в работе и отличается точностью результатов.
ЛИТЕРАТУРА
Айвазов Б. В. Практическое руководство по хроматографии. М., 1968.
Алимова Е. К., Аствацатурьян А. Т. Исследование жирных кислот и липидов методом хроматографии. М., 1967.
Асатиани В. С. Ферментные методы анализа. М., 1968.
Ахрем А. А., Кузнецова А. И. Тонкослойная хроматография. М., 1964.
Бабко А. К. и др. Физико-химические методы анализа. М., 1968.
Белозерский А. И., Проскуряков Н. И. Практическое руководство по биохимии растений. М., 1951.
Березовский В. М. Химия витаминов. М., 1973.
Биохимические методы анализа растений. Перевод с нем. под ред. М. Н. Запрометова. М., 1960.
Биохимические методы исследования в клинике. Под ред. А. А. Покровского. М., 1969.
Биохимические методы в физиологии растений. М., 1971.
Биохимия фенольных соединений. Под ред. Дж. Харбориа. М., 1968.
Булатов М. И., Калинкин И. П. Практическое руководство по фо-токолориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа. М„ 1968.
Бурштейн А. И. Методы исследования пищевых продуктов. Киев, 1963.
Вечер А. С. Основы физической биохимии. Минск, 1966.
Витамины. Под ред. М. И. Смирнова. М., 1974.
Государственная фармакопея СССР, изд. 10-е. М., 1968.
Гребинский С. О. Биохимия растений. Львов, 1975.
Гродзинский А. М., Гродзинский Д. М. Краткий справочник по физиологии растений. Киев, 1973.
Девятнин В. А. Методы химического анализа в производстве витаминов. М., 1964.
Добрынина В. И., Свешникова Е. Я. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. М., 1967.
262
Ермаков А. И. (ред.) Методы биохимического исследования растений. Л., 1972.
Запрометов М. Н. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974.
Збарский Б. И., Иванов И. И., Мордашев С. Р. Биологическая химия. М., 1972
Збарский И. Б., Дебов С. С. (ред.) Химия и биохимия нуклеиновых кислот. Л., 1968.
Киреев В. А. Краткий курс физической химии. М., 1970.
Колоболотский Г. В. Физические и физико-химические методы в ветеринарно-санитарной экспертизе. М., 1971.
Коренман И. М. Фотометрический анализ. Анализ органических соединений. М„ 1974.
Кочетков Н. К. и др. Химия углеводов. М., 1967.
Кретович В. Л. Основы биохимии растений. М., 1971.
Кретович В. Л. (ред.) Техническая биохимия. М., 1973.
Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. Под ред. А. А. Покровского. М. 1974.
Ленинджер А. Биохимия. М., 1974.
Мардашев С. Р. и др. Демонстрации к лекциям по биологической химии. М., 1973.
Марх А. Т., Кржевова Р. В. Химико-технический контроль консервного производства. М., 1962.
Мелентьева Г. А. Фармацевтическая химия. М., 1968.
Методическое руководство по определению витаминов. Под ред. Б. А. Лаврова. М., 1960.
Методы химии углеводов. Перевод с англ, под ред. Н. К. Кочеткова. М., 1967.
Нестерова Е. А. Методы определения витаминов в кормах. М., 1967.
Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. Под ред. А. Нидервайзера и Г. Патакн. М.. 1974.
Номенклатура ферментов (Рекомендации международного биохимического союза). М., 1966.
Петров К- П. Практикум по биохимии пищевого растительного сырья. М.. 1965.
Плешков Б. П. Практикум по биохимии растений. М., 1968.
Розенберг П. А., Бялко Н. К- Химические методы исследования биологических субстратов в профпатологии. М., 1969.
Савронь Е. С. и др. Практикум по биохимии животных. М., 1967.
Смолин А. И. и др. Практикум по общей биохимии. М., 1969.
Степаненко Б. Н. Углеводы. Успехи в изучении строения и метаболизма. М., 1968.
Труфанов А. В. Биохимия витаминов и антивитаминов. М., 1972.
Филиппович Ю. Б. Основы биологической химии. М., 1969.
Филиппович Ю. Б. и др. Практикум по общей биохимии. М.. 1975.
Хефтман Э. Биохимия стероидов. М.. 1972.
Хохлов А. С., Овчинников Ю. А. Химические регуляторы жизненных процессов. М., 1969.
Хроматография в тонких слоях. Под ред. Э. Шталя. М„ 1965.
263
Шарпенак А. Э., Конышев В. А. Практикум по биологической химии. М„ 1969.
Яковлев Н. Н. (ред.). Биохимия. М., 1974.
Biochemia praktyczna. Pod red. W. Tysarowskicgo. Warszawa, 1968.
Brzeski W., Kaniuga Z. (red.). Praktykum z biochemii. Warszawa, 1972.
Graser H. Biochemisches Praktikum. Berlin, 1971.
Laboratoriumstechnik fur Biochemiker. Herausgegeben von B. Keil u. Z. Sormova. Leipzig, 1965.
Linskens H. F. (red.). Papierchromatographie in der Botanik . Berlin, 1959.
Mejbaum-Katzenellenbogen W., Mochnacka I- Kurs praktyczny z biochemii. Warszawa, 1968.
Ostrowski W. Elektroforeza w badaniach biochemicznych i klinicz-nych.Warszawa, 1970.
Rapoport S. M., Raderecht H.-I. Physiologischchemisches Praktikum. Berlin, 1967.
Rapoport S. M. Medizinische Biochemie. Berlin, 1969.
Smoczkewiczowa A. Melody chromatograficzne w badaniu witamin. Warszawa, 1965.
ПРИЛОЖЕНИЯ
1. Атомные массы элементов
Элементы и их символы	Атомная масса	Элементы и их символы	Атомная масса
Азот (N)	14,0067	Натрий (Na)	22,9898
Алюминий (А1)	26,9815	Никель (Ni)	58,71
Барий (Ва)	137,34	Олово (Sn)	118,69
Бор (В)	10,811	Палладий (Pd)	106,4
Бром (Вг)	79,909	Платина (Pt)	195,09
Ванадий (V)	50,942	Ртуть (Hg)	200,59
Висмут (Bi)	208,980	Свинец (РЬ)	207,19
Водород (Н)	1,00797	Селен (Se)	78,96
Вольфрам (W)	183,85	Сера (S)	32,064
Железо (Fe)	55,847	Серебро (Ag)	107,870
Золото (Au)	196,967	Стронций (Sr)	87,62
Иод (J)	126,9044	Сурьма (Sb)	121,75
Кадмий (Cd)	112,40	Таллий (TI)	204,37
Калий (К)	39,102	Теллур (Те)	127,60
Кальций (Са)	40,08	Титаи (Ti)	47,90
Кислород (О)	15,9994	Углерод (С)	12,01115
Кобальт (Со)	58,9332	Урай (U)	238,03
Кремний (Si)	28,086	Фосфор (Р)	30,9738
Литий (Li)	6,939	Фтор (F)	18,9984
Магний (Mg)	24,312	Хлор (С1)	35,453
Марганец (Мп)	54,9381	Хром (Сг)	51,996
Медь (Си)	63,54	Церий (Се)	140,12
Молибден (Мо)	95,94	Цинк (Zn)	65,37
Мышьяк (As)	74,9216		
265
2. Плотность растворов серной кислоты
H,S04, %	Р20	H„SO4, %	Р20	H„SO4, %	Р20
1,0	1,0051	34,0	1,2515	67.0	1,5760
2,0	1,0118	35,0	1,2599	68,0	1,5874
3,0	1,0184	36,0	1.2684	69,0	1,5989
4,0	1,0250	37,0	1,2769	70,0	1,6105
5,0	1,0317	38,0	1,2855	71,0	1,6221
6,0	1,0385	39,0	1,2941	72,0	1,6338
7.0	1,0453	40,0	1,3028	73,0	1,6456
8,0	1,0522	41,0	1,3116	74,0	1,6574
9,0	1,0591	42,0	1,3205	75,0	1,6692
10.0	1,0661.	43,0	1,3294	76,0	1,6810
11,0	1,0731	44,0	1,3384	77,0	1,6927
12,0	1,0802	45,0	1,3476	78,0	1,7042
13,0	1,0874	46,0	1,3569	79,0	1,7158
14,0	1,0947	47,0	1,3663	80,0	1,7272
15,0	1,1020	48,0	1,3758	81,0	1,7383
16,0	1,1094	49,0	1,3854	82,0	1,7491
17,0	1,1168	50,0	1,3951	83,0	1,7594
18,0	1,1243	51,0	1,4049	84,0	1,7693
19,0	1,1318	52.0	1,4148	85,0	1,7786
20,0	1,1394 '	53,0	1,4248	86,0	1,7872
21,0	1,1471	54,0	1,4350	87,0	1,7961
22,0	1,1548	55,0	1,4463	88,0	1,8022
23,0	1,1626	56,0	1,4557	89,0	1,8087
24,0	1,1704	57,0	1,4462	90,0	1,8144
25,0	1,1783	58,0	1,4768	91,0	1,8195
26,0	1,1862	59,0	1,4875	92,0	1,8240
27,0	1,1942	60,0	1,4983	93,0	1,8279
28,0	1,2023	61,0	1,5091	94,0	1,8312
				95,0	1,8337
29,0	1,2104	62,0	1,5200	96,0	1,8355
30,0	1,2185	63,0	1,5310	97,0	1,8364
31,0	1,2267	64,0	1,5421	98,0	1,8361
32,0	1,2349	65,0	1,5533	99,0	1,8342
33,0	1,2432	66,0	1,5646	100,0	1,8305
266
3. Плотность растворов азотной кислоты
HNOa, %	р20	UNO,, %	Pio	HNOS, %	Pio
1,о	1,0036	34,0	1,2071	67,0	1,4004
2,0	1,0091	35,0	1,2140	68,0	1,4048
3,0	1,0146	36,0	1,2205	69,0	1,4091
4,0	1,0201	37,0	1,2270	70,0	1,4134
5,0	1,0256	38,0	1,2335	71,0	1,4176
6,0	1,0312	39,0	1,2399	72,0	1,4218
7,0	1,0369	40,0	1,2463	73,0	1,4258
8,0	1,0427	41,0	1,2527	74,0	1,4298
9,0	1,0485	42,0	1,2591	75,0	1,4337
10,0	1,0543	43,0	1,2655	76,0	1,4375
11,0	1,0602	44,0	1,2719	77,0	1,4413
12,0	1,0661	45,0	1,2783	78,0	1,4450
13,0	1,0721	46,0	1,2847	79,0	1,4486
14,0	1,0781	47,0	1,2911	80,0	1,4521
15,0	1,0842	48,0	1,2975	81,0	1,4555
16,0	1,0903	49,0	1,3040	82,0	1,4589
17,0	1,0964	50,0	1,3100	83,0	1,4622
18,0	1,1026	51,0	1,3160	84,0	1,4655
19,0	1,1088	52,0	1,3219	85,0	1,4686
20,0	1,1150	53,0	1,3278	86,0	1.4716
21,0	1,1213	54,0	1,3336	87,0	1,4745
22,0	1,1276	55,0	1,3393	88,0	1,4773
23,0	1,1340	56,0	1,3449	89,0	1,4800
24,0	1,1404	57,0	1,3505	90,0	1,4826
25,0	1,1469	58,0	1,3560	91,0	1,4850
26,0	1,1534	59,0	1,3614	92,0	1,4873
				93,0	1,4892
27,0	1,1600	60,0	1,3667	94,0	1,4912
28,0	1,1666	61,0	1,3719	95,0	1,4932
29,0	1,1733	62,0	1,3769	96,0	1,4952
30,0	1,1800	63,0	1,3818	97,0	1,4974
31,0	1,1867	64,0	1,3866	98,0	1,5008
32,0	1,1934	65,0	1,3913	99,0	1,5056
33,0	1,2002	66,0	1,3959	100,0	1,5120
267
4. Плотность растворов соляной кислоты
НС1, %	Рго	НС1. %	Рго
1,0	1,0032	21,0	1,1031
2,0	1,0082	22,0	1,1083
3,0	1,0132	23,0	1,1135
4,0	1,0181	24,0	1,1187
5,0	1,0230	25,0	1,1239
6,0	1,0279	26,0	1,1290
7,0	1,0327	27,0	1,1342
8,0	1,0376	28,0	1,1392
9,0	1,0425	29,0	1,1443
10,0	1,0474	30,0	1,1493
11,0	1,0526	31,0	1,1544
12,0	1,0574	32,0	1,1593
13,0	1,0624	33,0	1,1643
14,0	1,0675	34,0	1,1691
15,0	1,0725	35,0	1,1741
16,0	1,0776	36,0	1,1789
17,0	1,0827	37,0	1,1837
18,0	1,0878	38,0	1,1885
19,0	1.0929	39,0	1,1933
20,0	1,0980	40,0	1,1980
5. Плотность растворов уксусной кислоты
сн8соон, %	Pzo	CHSCOOH, %	Р20	сн.соон, %	Р*о
1,0	0,9996	8.0	1,0097	15,0	1,0195
2,0	1,0012	9,0	1,0111	16,0	1,0109
3,0	1,0025	10,0	1,0125	17,0	1,0223
4.0	1,0040	Н.о	1,0139	18,0	1,0236
5,0	1,0055	12,0	1,0154	19,0	1,0250
6,0	1,0069	13,0	1,0168	20,0	1,0263
7,0	1,0083	14,0	1.0182	21,0	1,0276
268
Продолжение прил. 5
СН.СООН, %	Рго	СН.СООН, %	Рго	СН.СООН, %	Рго
22,0	1,0288	48,0	1,0559	75,0	1,0696
23,0	1,0301	49,0	1,0567	76,0	1,0698
24,0	1,0313	50,0	1,0575	77,0	1,0699
25,0	1,0326	51,0	1,0582	78,0	1,0700
26,0	1,0338	52,0	1,0590	79,0	1,0700
27,0	1,0349	53,0	1,0597	80,0	1,0700
28,0	1,0361	54,0	1,0604	81,0	1,0699
29,0	1,0372	55,0	1,0611	82,0	1,0698
30,0	1,0384	56,0	1,0618	83,0	1,0696
31,0	1,0395	57,0	1,0624	84,0	1,0693
32,0	1,0406	58,0	1,0631	85,0	1,0689
33,0	1,0417	59,0	1,0637	86,0	1,0685
34,0	1,0428	60,0	1,0642	87,0	1,0680
35,0	1,0438	61,0	1,0648	88,0	1,0675
36,0	1,0449	62,0	1,0653	89,0	1,0668
37,0	1,0459	63,0	1,0658	90,0	1,0661
38,0	1,0469	64,0	1,0662	91,0	1,0652
39,0	1,0479	65,0	1,0666	92,0	1,0643
40,0	1,0488	66,0	1,0671	93,0	1,0632
41,0	1,0498	67,0	1,0675	94,0	1.0619
42,0	1,0507	68,0	1,0678	95,0	1,0605
43,0	1,0516	69,0	1,0682	96,0	1,0588
44,0	1,0525	70,0	1,0685	97,0	1,0570
45,0	1,0534	71,0	1,0687	98,0	1,0549
46,0	1,0542	72,0	1,0690	99,0	1,0524
47,0	1,0551	73,0	1,0693	100,0	1,0498
		74.0	1,0694		
269
6. Плотность растворов едкого натра
NaOH, %	Рао	NaOH, %	Р20
1,0	1,0095	26,0	1,2848
2,0	1,0207	27,0	1,2956
3,0	1,0318	28,0	1,3064
. 4,0	1,0428	29,0	1,3172
5,0	1,0538	30,0	1,3279
6,0	1,0648	31,0	1,3385
7,0	1,0758	32,0	1,3490
8,0	1,0869	33,0	1,3594
9,0	1,0979	34,0	1,3696
10,0	1,1089	35,0	1,3799
11,0	1,1192	36,0	1,3900
12,0	1,1309	37,0	1,4001
13,0	1,1419	38,0	1,4101
14,0	1,1530	39,0	1,4201
15,0	1,1641	40,0	1,4300
16,0	1,1751	41,0	1,4398
17,0	1,1861	42,0	1,4494
18,0	1,1972	43,0	1,4590
19,0	1,2082	44,0	1,4685
20,0	1,2191	45,0	1,4779
21,0	1,2301	46,0	1,4873
22,0	1,2411	47,0	1,4970
23,0	1,2520	48,0	1,5065
24,0	1,2629	49,0	1,5159
25,0	1,2738	50,0	1,5253
7. Плотность растворов едкого кали			
КОН, %	Рао	КОН, %	Р2О
1,0	1,0073	4,0	1,0346
2,0	1,0164	5,0	1,0438
3,0	1,0255	6,0	1,0530
Продолжение прил. 7
КОН, %	Рао	।	КОН, %	Р20
7,0	1,0622	29,0	1,2771
8,0	1,0714	30,0	1,2876
9,0	1,0807	31,0	1,2981
10,0	1,0901	32,0	1,3087
11,0	1,0994	33,0	1,3193
12,0	1,1088	34,0	1,3300
13,0	1,1183	35,0	1,3408
14,0	1,1278	36,0	1,3516
15,0	1,1374	37,0	1,3625
16,0	1,1470	38,0	1,3735
17,0	1,1566	39,0	1,3845
18,0	1,1663	40,0	1,3956
19,0	1,1761	41,0	1,4068
20,0	1,1859	42,0	1,4180
21,0	1,1958	43,0	1,4293
1	22,0	1,2058	44,0	1,4407
|	23,0	1,2158	45,0	1,4521
I	24,0	1,2258	46,0	1,4635
1	25,0	1,2360	47,0	1,4750
»	26,0	1,2462	48,0	1,4866
J	27,0	1,2564	49,0	1,4983
j	28,0	1,2667	50,0	1,5099
| 8	Плотность раст!	зоров аммиака	
|	NHS, % i				Р20	NH„ %	Р2О
1	1,0	0,9939	6,0	0,9730
1	2,0	0,9895	7,0	0,9690
3,0	0,9852	8,0	0,9651
4,0	0,9811	9,0	0,9612
5,0	0,9770	10,0	0,9575
270
271
Продолжение прил. 8
NH„ %	Р20	NH„ %	Р20
11,0	0,9539	24,0	0,9101
12,0	0,9501	25,0	0,9070
13,0	0,9466	26,0	0,9040
14,0	0,9430	27,0	0,9010
15,0	0,9398	28,0	0,8980
16,0	0,9362	29,0	0,8950
17,0	0,9329	30,0	0,8920
18,0	0,9295	31,0	0,8890
19,0	0,9261	32,0	0,8860
20,1	0,9229	33,0	0,8828
21,0	0,9195	34,0	0,8799
22,0	0,9164	35,0	0,8765
23,0	0,9131		
9. Индикаторы
Наименование индикатора	Интервалы pH	Изменение окраски	Приготовление раствора
Метиловый фиолетовый	0,1—1,5	Желтая— зеленая	0,1 г индикатора в 100 мл воды
Тимоловый синий	1,2—2,8	Красная— желтая	0,1 г индикатора растирают с 4,3 мл 0,05 н NaOH и доливают водой до 200 мл
Бромфеноловый синий	3,0—4,6	Желтая— сине-фиолетовая	0,1 г индикатора в 100 мл 20%-кого этилового спирта
Метиловый оранжевый	3,0—4,4	Красная— желтая	0,1 г индикатора в 100 мл воды
Конго красный	3,0—5,2	Сине-фиолетовая— красная	0,1 г индикатора в 20 мл этилового спирта и доводят водой до 100 мл
Бромкрезоловый синий (зеленый)	3,8-5,4	Желтая— синяя	0,1 г индикатора растирают с 2,9 мл 0,05 н NaOH и доливают водой до 200 мл
272
Продолжение прил. 9
Наименование индикатора	Интервалы pH	Изменение окраски	Приготовление раствора
Метиловый красный	4,2—6,3	Красная— желтая	0,1 г индикатора в 100 мл этилового спирта
Лакмоид	4,0—6,4	Красная— синяя	0,1 г индикатора в 100 мл этилового спирта
Бромкрезоловый пурпуровый	5,2—6,8	Бледно-желтая— красно-фиолетовая	0,1 г индикатора растворяют в 20 мл теплого этилового спирта и доводят водой до 100 мл
Бромтимоловый синий	6,0—7,6	Желтая— синяя	Готовят так же, как и раствор бромкрезолового пурпурового
Азолитмин (лакмус)	5,0—8,0	Красная— синяя	0,5—1,0 г индикатора в 100 мл воды
Нейтральный красный	6,8-8,0	Красная— желтая	0,1 г индикатора в 100 мл воды
Феноловый красный	6,8—8,4	Желтая— красная	0,1 г индикатора растирают с 5,7 мл 0,05 и NaOH и доводят водой до 250 мл
Тимоловый синий Фенолфталеин	8,0—9.6 8,2—10,0	Желтая— синяя Бесцветная—красная	0,1 г индикатора растирают с 4,3 мл 0,05 н NaOH и доводят водой до 200 мл 0,5—1 г индикатора в 100 мл 60—90%-него этилового спирта
Тимолфталеин	9,3—10,6	Бесцветная — синяя	0,1 индикатора в 100 мл этилового спирта
10. Плотность водных растворов этилового спнрта
(по Государственной Фармакопее СССР, изд. 10-е)
Плотность р2о	Содержание безводного спирта в растворе, %		। Плотность Рю	Содержание безводного спирта в растворе, %	
	по массе	по объему 1		по массе	по объему
0,9962	1,09	1,38	0,9644	23,09	28,22
0.9944	2,07	2,62	0,9630	24,08	29,38
273
Продолжение прил. 10
Продолжение прил. 10
Плотность р20	Содержание безводного спирта в растворе, %		Плотность р2о	Содержание безводного спирта в растворе, %		Плотность р20	Содержание безводного спирта в растворе, %		ПЛОТНОСТЬ Рго	Содержание безводного спирта в растворе» %	
	по массе	по объему		по массе	| по объему		по массе |	по объему		по массе |	по объему
0,9926	3,09	3,89	0,9616	25,05	30,52	0,9248	44,98	52,69	0,8604	73,03	79,61
0,9910	4,02	5,05	0,9602	26,00	31,63	0,9226	46,00	53,77	0,8580	74,03	80,47
						0,9204	47,01	54,82	0,8556	75,02	81,33
0,9894	4,99	6,26	0,9586	27,04	32,84	0,9182	48,02	55,86	0,8532	76,01	82,17
0,9878	6,00	7,52	0,9570	28,06	34,03	0,9160	49,02	56,89	0,8508	77,00	83,01
0,9862	7,05	8,80	1	0,9554	29,05	35,16	0,9138	50,01	57,90	0,8484	77,99	83,83
0,9848	7,99	9,97	0,9538	» 30,01	36,26	0,9116	51,00	58,90	0,8458	79,05 80,03	84,71 85,51
						0,9094	51,98	59,89	0,8434		
0,9832	9,08	11,31	0,9520	31,07	37,47	0,9070	53,05	60,96	0,8410	81,00	86,31
0,9818	10,05	12,51	0,9504	31,99	38,51	0,9048	54,02	61,92	0,8384	82,04	87,15
0,9804	11,05	13,73	0,9486	33,00	39,66	0,9026	54,98	62,88	0,8360	83,00	87.92
						0,9002	56,03	63,91	0,8334	84,04	88,73
0,9790	12,07	14,97	0,9468	33,99	40,78	0,8980	57,00	64,85	0,8310	84,98	89,47
0,9778	12,96	16,06	0,9448	35,08	41,99	0,8956	58,04	65,86	0,8284	86,00	90,26
0,9764	14,02 -	17,35	0,9430	36,03	43,05	0,8934	59,00	66,77	0,8258	87,00	91,03
0,9752	14,96				1	0,8910	60,03	67,77	0,8232	88,01	91,79
		18,48	0,9410	37,07	44,19	0,8888	60,98	68,67	0,8206	89,00	92,53
0,9738	16,05	19,81	0,9392	37,98	45,20	0,8864	62,01	69,64	0,8180	89,98	93,25
0,9726	16,99					0,8840	63,04	70,61	0,8152	91,03	94,02
		20,93	0,9372	38,99	46,30	0,8818	63,99	71,49	0,8126	91,98	94,70
0,9712	18,07	22,23	0,9352	39,99	47,38	0,8794	65,01	72,44	0,8098	93,00	95,41
0,9700	18,98					0,8770	66,03	73,37	0,8070	94,01	96,12
		23,32	0,9332	40,98	48,44	0,8746	67,05	74,30	0,8042	95,00	96,79
0,9686	20,03	24,57	0,9310	42,04	49,58	0,8724	67,98	75,14	0,8014	95,98	97,44
0,9672						0,8700	69,00	76,06	0,7984	97,00	98,12
	21,07	25,81	0,9290	43,00	50,60	0,8676	70,01	76,96	0,7954	98,01	98,77
0,9658	22,09	27,03	0,9268	44,04	51,71	0,8652	71,02	77,85	0,7924	99,00	99,38
1						0,8628	72,03	78,73	0,7892	100,00	100,00
274											275
11. Объемные количества воды и этилового спирта, которые необходимо смешать, чтобы получить 1 л разведенного спирта (при 20° С), мл
(по Государственной Фармакопее СССР, изд. 10-е)
Желаемая крепость разведенного спирта, %	О СП	ntfog	co
		idHUQ	947
	LO со	r.tfOfi	CD CM —4 co
		ICfHtQ	895 944
	о СО	rVog	CD CM Ь- CM co
		•idHirj	CM CD —4 X? co co co cd
	ю	Btfog	CO CM b^ b^ CO 00 CM CD CM —* —*
		idHLig	CD CO CM OO 00 co 00 co N CO CO О
	о	etfog	oo о о	« 00 xj4 CD СО b- см см - -
		idHtrj	N	CO	Ю	CO CO	b-	CM	b-	co N	N	CO	CO	СП
	S	Btfog	CO	CD	CM	О	CD Tf	о	LO	Q	b CO	CM	CM	CM	—'
		idnng	xt	CM	1C	CM	b	CD 00	CM	CD	—*	CD	CM CD	b-	b^	00	00	CD
	о СО	ctfog	b-	b-	CO	Ю	—'	о	~4 CD	LQ	>—4	CD	—4	LD	00 CO	CO	CO	CM	CM	—'
		idHUQ	CM	b~	CD	о	о	b~	co CO	CD	о	ю	о	ю	CM CD	CD	b-	b-	OO	00	CD
	lO ш	Btfog	—«TpTFOOiO’-'b-. LQ—«b-CO00CMCD00 Tj* CO CO CM CM
		Jdnug	CD —« b- 00 CO CD CD CO Ь--,^СОСОСО'^-И LDCDCDcDbNOCC^
	о ю	BtTog	^O-^r^CDOOOCO'^ ONCOtD^Cn'tb-O Ю’^'^СОСОСМСМ^
		IfjHUQ	COOCOl.Ob'tC^COCD CMIDOOCMCD^CDCOO lOLOLQCDCDb-b-OOCD
	ю	Btfog-	CDCDCOb-b--^CDOOb-CO LQ CM CD LQ	b- —< LG 00 О LQ e Ю’^’^т^СОСОСМ— —i
		idling	О CD CM О CO CM О QO О b-OCMCOO'^CDLO»—-О xfl_Ql_Ol_f0CDCDCDb-00CT>
	о	Btfog	t^^-«~-<CDCOCOCOCOCD'^<CO O00LQ—^со^о-^ь^о—< СОЮЮЮ-^’^СОСОСМСМ’-*
		•LdHLT)	^^^~<ОСО^ЮЬ^Ь^ОО> СМтГЬ-OCOb^^CDCMOOO ^'^'^l_OLQLOCOCDb-OOCO
	ю со	Etfog	OO'^CD^CD'^COCD—« Ю Ю CD LQCOOOO-’F^b^CMb'.OCMCM CDCDCDIOLOIO-^TFCOCOCM^
		idHUg	OOCT>CMOOb^OOOCOcDOOOlO CDOO^COCDOCOOOCOOb-b-CO CO Tj* Tt* Xj* LQ LQ LQ co b~ b- 00
	о СО	Btfog	r^.b'.LQ~^xt<Tj«CDCJ>CM10cDCMCO CD 00 CD xt4 —MCOx^OcDOCOiDxt4 Ь-СОСОСОСОЮЬОЮх^х^сОСМ—4
		idHuj	CD	CO	CO	LQ	О	CD	CM	О	LQ	О	b^-	О Ю —MCOLQb^OCMCDO-^OcDLDb- CO	CO	CO	CO	xf	xj4	xj4	LQ	LD	CD	CD	b^ 00
% ‘ЕХЙИПЭ ОЛОИИ^ОЯЕЕЙ			юоюоюоюоюоюою CDCDoOOOb^b^cDCDLDtDxHxfcO
276
12. Буферные смеси
а)	Фосфатная буферная смесь:
А — М раствор двузамещенного
Na2HPO4 • 2Н2О (11,876 г соли в 1 л);
Б---^ М раствор однозамещенного КН2РО4 (9,078 г соли в 1 л).
фосфорнокислого
фосфорнокислого
натрия
калия
pH	Смешать, мл	
	раствора А	раствора Б
4,49	0,0	100,0
4,94	1,0	99,0
5,29	2,5	97,5
5,59	5,0	95,0
5,91	10,0	90,0
6,24	20,0	80,0
6,47	30,0	70,0
6,64	40,0	60,0
6,81	50,0	50,0
6,98	60,0	40,0
7,17	70,0	30,0
7,38	80,0	20,0
7,73	90,0	10,0
8,04	95,0	5,0
8,34	97,5	2,5
8,68	99,0	1,0
9,18	100,0	0,0
б)	Ацетатная буферная смесь:
А — нормальный раствор уксусной кислоты;
Б —- нормальный раствор уксуснокислого натрия.
pH	Смешать, мл	
	раствора А	раствора Б
3,19	32,0	1,0
3,30	16,0	1,0
3,80	8,0	1,0
4,10	4,0	1.0
4,40	2,0	1.0
4,70	1,0	1.0
5,00	1,0	2,0
5,30	1,0	3,0
5,60	1,0	8,0
5,90	1,2	16,0
6,22	1.0	32,0
277
в) Фосфатно-цнтратная буферная смесь:
А—0,2М раствор двузамещениого фосфорнокислого натрия Na2HPO4-2H2O (35,61 г соли в 1 л);
В—0,1М раствор лимонной кислоты (21,01 г в 1 л).
pH	Смешать, мл		pH	Смешать, мл	
	раствора А	раствора В		раствора А	раствора Б
2,2	0,40	19,60
2,4	1,24	18,76
2.6	2,18	17,82
2.8	3,17	16,83
3,0	4,11	15,89
3,2	4,94	15,06
3.4	5,70	14,30
3,6	6,44	13,56
3,8	7,10	12,90
4,0	7,71	12,29
4,2	8,28	11,72
4,4	8,82	11,18
4,6	9,35	10,65
4,8	9,86	10,14
5,0	10,30	9,70
5,2	10,72	9,28
5,4	11,15	8,85
5,6	11,60	8,40
5,8	12,09	7,91
6,0	12,63	7,37
6,2	13,22	6,78
6,4	13,85	6,15
6,6	14,55	5,45
6.8	15,45	4,55
7,0	16,47	3,53
7,2	17,39	2,61
7,4	18,17	1,83
7,6	18,73	1,27
7,8	19,15	0,85
8,0	19,45	0,55
г) Цитратная буферная смесь:
А—0,1М раствор лимонной кислоты (21,01 г СвН8О7-Н2О в 1 л);
Б—0,1М раствор трехзамещенного лимоннокислого натрия (29,4 г в 1 л);
pH	Смешать, мл		pH	Смешать, мл	
	раствора А|	раствора Б		раствора А |	раствора Б
3,0	18,6	1,4	5,0	8,2	Н,8
3.2	17,2	2,8	5,2	7,3	12,7
3,4	16,0	4,0	5,4	6,4	13,6
3,6	14,9	5,1	5,6	5,5	14,5
3,8	14,0	6,0	5,8	4,7	15,3
4,0	13,1	6,9	6,0	3,8	16,2
4,2	12,3	7,7	6,2	2,8	17,2
4,4	Н.4	8,6	6,4	2,0	18,0
4,6	10,3	9,7	6,6	1,4	18,6
4,8	9,2	10,8			
278
д) Na2HP04-NaH2P04 буферная смесь:
А—0,2М раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия (35,61 г Na2HPO4-2H2O или 71,64 г в Na2HPO4-12Н2О в 1 л);
Б—О 2М раствор однозамещенного фосфорнокислого натрия (27,6 г NaH2PO4-H2O илн 31,21 г NaH2P04-2H2O в 1 л).
pH	Смешать, мл		
	раствора А	| раствора Б	ВОДЫ
5,8	8,0	92,0	100,0
6,0	12,3	87,7	100,0
6,2	18,5	81,5	100,0
6,4	26,5	73,5	100,0
6,6	37,5	62,5	100,0
6,8	49,0	51,0	100,0
7,0	61,0	39,0	100,0
7,2	72,0	28,0	100,0
7,4	81,0	19,0	100,0
7,6	87,0	13,0	100,0
7,8	91,5	8,5	100,0
80	94,7	5,3	100,0
13. Окраска растворов и соответствующих нм светофильтров (по М. И. Булатову и И. П. Калинки ну)
Цвет раствора	Область максимального поглощения лучей раствором, им	Цвет светофильтра
Желто-зеленый	400450	Фиолетовый
Желтый	450—480	Синий
Оранжевый	480—490	Зелено-сииий
Красный	490—500	Сине-зеленый
Пурпурный	500—560	Зеленый
Фиолетовый	560—575	Желто-зеленый
Синий	575—590	Желтый
Зелено-сииий	590—625	Оранжевый
Сине-зеленый	625—700	Красный
279
14. Молекулярные массы некоторых биополимеров
Вещество	Молекулярная масса, тыс. дальтонов
Амилопектин	200-400
Амилоза	50—150
Целлюлоза	150—600
ДНК (дезоксирибонуклеиновые кислоты)	6000—120 000
Гистоны	57—84
Инулин	3—5
Пектиновая кислота	60—80
РНК (рибонуклеиновые кислоты)	10—2000
Ксилан	10—20
15. Свойства бумаг для хроматографии и электрофореза (по А. А. Лурье)
Стран а-изготовитель	Марка и номер бумаги	Плотность, мг/см2	Скорость впитывания воды, мм/1 Омни
СССР	Б (№ 1, 2)	—	быстрая
»	М (№ 3, 4)	8,5	медленная
ГДР	Filtrak	*	
	F N 1	8,5—9,0	140-160
	F N 2	12,0—12,5	140-160
	F N 3	8 5 9 0	90 100
	F N 4	12,0—12,5	90—100
	F N 5	8,5—9,0	60-70
	F N 7	14,5—15,0	140—160
	F N 8	27,0—28,0	170—190
	F N 11	8,5—9,0	140-160
	F N 12	12,0—12,5	140—160
Англия	Ватман		
	№ 1	8,5-9,0	140—220 мин/30 см
	№ 2	9,5—10,0	200—300 мин/30 см
	№ 3	18,5	150—250 мин/30 см
280
16. Температура кипения и вспышки органических растворителей
Растворитель	Температура кипения при 760 мм рт. ст.» °C	Температура вспышки» °C
Хлористый этил	12,27	—50,0
Диэтиловый эфир	34,5—35,6	—40,0
Сероуглерод	46,0	—20,0
Ацетон	56,1	—10,0
Этиловый спирт	78,32	+ 8,0
Хлороформ	61,1	Не горюч
Метиловый спирт	64.7	+ 6,5
Этилацетат	77,2	— 2,2
Четыреххлористый углерод	76,5	Не горюч
Бензол	80,1	— 8,0
Толуол	110,6	+ 4,4
Пиридин	115,3	+23,3
Уксусная кислота	118,5	+41,7
Изоамиловый спирт	132,1	+45,6
н-Бутанол	117,72	+27,8
Хлорбензол	131,68	+24,4
17. Охлаждающие смеси
Состав, весовые части		Температура
Соли	Снега	
СаС12-6Н2О, 41	100	— 9
Na2S2O3-5H2O, 67,5	100	—11
КС1, 30	100	—11
NH4C1, 25	100	—16
NaNOs, 59	100	—19
(NH4)2SO4, 62	100	—19
NaC!, 33	100	—21
CaCl2-6H2O, 82	100	—22
»	, 125	100	—40
»	. 143	100	—55
281
18.	Полезные рецепты
1.	Смазкн для шлифов. Приводим два рецепта:
а)	на водяной бане сплавляют 50 частей белого вазелина с 10 частями парафина, прибавляют 3 части натурального каучука и перемешивают. Хранят в банке с притертой пробкой.
б)	декстрин или бентонит смешивают с глицерином.
2.	Кислото- и щелочеупорная замазка для склеивания фарфора. Свинцовый глет нагревают на железной пластинке в течение нескольких минут до 300°С. После охлаждения 4 части глета смешивают с 1 частью глицерина до получения мягкой массы. Замазка выдерживает температуру до 250°С.
3.	Высокотемпературная лабораторная замазка. К 8 частям измельченного асбеста и 2 частям талька (или каолина) добавляют жидкое стекло до получения густого теста. Продолжительность затвердевания 6—8 часов. Замазка выдерживает температуру до 800°С.
4.	Меиделеевскаи замазка. Плавится при 45°С. Употребляется обычно для заливки пробок. Не трескается. Перед употреблением расплавляют на водяной бане.
Приводим две прописи замазки (в частях):
Вещества	Твердая замазка	Мягкая замазка
Канифоль	100	30
Воск пчелиный	25	8
Мумия или охра	40	10
Льняная олифа		0,1—1
или льняное масло		1
Воск расплавляют на слабом огне, после чего, непрерывно помешивая, прибавляют канифоль и смесь нагревают до исчезновения пены. Прибавляют прокаленную мумию или охру и размешивают до получения однородной массы, затем доливают олифу. Чем больше олифы, тем замазка мягче. Продолжают нагревание и перемешивание до получения жидкой однородной массы, потом ее снимают с огня и помешивают до полного остывания.
5.	Жидкость для очистки стеклянной лабораторной посуды. К концентрированной серной кислоте прибавляют 3—5% (от массы кислоты) измельченного двухромовокислого калия и осторожно нагревают до растворения (под тягой, в фарфоровом стакане).
6.	Быстро твердеющий цемент. Раствор хлористого магния (60%-ный) быстро замешивают с окисью магния до получения густого теста. Цемент затвердевает через 1 мии. В воде нерастворим, растворяется в кислотах. Вместо MgCl2 и MgO можно взять ZnCl2 и 7пО.
282
ОГЛАВЛЕНИЕ
Раздел I. Химия аминокислот, пептидов	и	белков	3
Аминокислоты, пептиды и простые белки	(протеины)	3
Приготовление растворов белка	6
Цветные реакции	6
Исследование физико-химических свойств белковых веществ	16
Распределительная хроматография аминокислот на бумаге	27
Разделение белка и низкомолекулярных примесей методом гельфильтрации иа сефадексе G-25 (по С. Р. Мар-дашеву, А. А. Покровскому, Н. А. Павловой, с дополнениями)	32
Электрофорез белков и аминокислот	на	бумаге	34
Электрофорез белков в полиакриламидном геле (по В. Бжескому и 3. Канюга, с	дополнениями)	38
Сложные белки (протеиды)	43
Хромопротеиды	43
Гликопротеиды	46
Фосфопротеиды	48
283
Раздел II. Нуклеопротеиды. Нуклеиновые кислоты	51
Выделение дезоксирибонуклеопротеидов из печени или селезенки	54
Качественная реакция на ДНК	54
Выделение нуклеопротеидов из дрожжей	55
Гидролиз нуклеопротеидов	55
Исследование продуктов гидролиза нуклеопротеидов	57
Очистка и разделение нуклеиновых кислот (по Шмидту и
Таннгаузеру, в прописи Г. П. Георгиева)	58
Количественное определение ДНК (по Дише)	60
Количественное определение РНК (по Мейбаум)	61
Хроматография на бумаге пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов	61
Раздел III. Витамины	67
Витамины группы	А	68
Витамины группы	Д	(кальциферолы)	75
Витамины группы	Е	(токоферолы)	77
Витамины группы	К	79
Витамин С (аскорбиновая кислота)	82
Биофлавоноиды (вещества Р-витаминного действия)	92
Витамин В] (тиамин)	99
Витамин В2 (рибофлавин)	102
Витамин РР (Bs, никотиновая кислота, никотинамид)	104
Витамин В6 (пиридоксин)	108
Раздел IV. Ферменты (энзимы)	111
Исследование общих свойств ферментов	113
Определение активности гидролитических ферментов (гидролаз)	118
Окислительно-восстановительные ферменты (оксидоредуктазы)	121
Раздел V. Обмен аминокислот, пептидов и белков	132
Колориметрическое определение общего количества азота 132
Определение общего азота по К'ьсльдалю (микрометод)	135
Определение белкового и небелкового азота	138
Быстрый метод количественного определения белков	139
Определение азота аминокислот	140
Определение свободных аминокислот в мышечной ткани методом тонкослойной хроматографии (по Г. В. Колобо-лотскому)	143
284
Гидролитическое расщепление белка ферментами поджелудочной железы	146
Дезаминирование аминокислот	151
Переаминирование (трансаминирование) аминокислот	153
Раздел VI, Химия и обмен липидов	156
Жиры (нейтральные жиры)	157
Фосфатиды, или фосфолипиды	175
Стерины	181
Ферментативный гидролиз липидов	184
Кетоновые тела	190
Раздел VII. Химия и обмен углеводов	194
Качественные реакции на моносахариды	197
Общие реакции дисахаридов	207
Высшие полисахариды	214
Определение редуцирующих (восстанавливающих) сахаров в растительном материале	218
Фотометрические методы количественного определения редуцирующих сахаров	225
Количественное определение сахаров в растительном материале с помощью хроматографии на бумаге (по
О. Л. Павликовой)	227
Количественное определение глюкозы в крови (по Хагедорну — Йенсену)	231
Количественное определение крахмала	233
Исследование анаэробного распада гликогена или крахмала	236
Определение пировиноградной кислоты в моче	239
Раздел VIII. Гормоны	241
Открытие иода в щитовидной железе	242
Гормоны мозгового слоя надпочечников	244
Гормоны коркового слоя надпочечников (кортикостероиды)	245
Гормоны поджелудочной железы	248
285
Раздел IX. Обмен минеральных веществ	250
Определение кальция в сыворотке крови	252
Определение общего содержания фосфора в молоке 254
Определение содержания кальция в молоке	255
Определение железа в плазме или сыворотке крови (по прописи П. Л. Розенберг и Н. К. Бялко)	257
Определение хлоридов в пищевых продуктах (по А. С. Вечеру и В. В. Малоян)	259
Литература	262
Приложения	265
Шапиро Д. К.
Ш23 Практикум по биологической химии. Под ред. академика АН БССР А. С. Вечера. Изд. 2-е, перераб. и доп. Минск, «Вышэйш. школа», 1976.
288 с. с ил.
Пособие составлено в соответствии с действующей программой по биохимии для педагогических институтов. В нем представлены лабораторные работы как по статической биохимии, так и по химии процессов обмена веществ.
В книге значительное место уделено применению хроматографических, электрофоретических, фотометрических (в том числе спектрофотометрических) и других современных методов анализа. Приведен ряд методик, которые могут оказаться полезными для студенческого научно-исследовательского кружка.
Второе издание книги дополнено рядом работ, отражающих современные достижения биологической химии.— Библ. с. 262.
2100—135
ШМ 304(05)—76 46—76
57.04