Автор: Артюхов B.Г. Наквасина М.А.
Теги: материальные основы жизни биохимия молекулярная биология биофизика медицина биология микробиология биология клетки
ISBN: 5-7455-1162-1
Год: 2000
В. r. АРТЮХОВ, М. А. НАКВАСИНА БиолоrИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ: структурная орrанизация, фунции,моДификация физико",химическими аrентами Допущено lvfинuсmерсmвом образования Российской Федерации в качестве учеБНО20 1Z0собtlЯ для студе1lтов высиLИХ учебных заведеиuй, обучаlOщихся по спецuалыюстu "БUОЛО2ия" Издательство Воронежскоrо rосударственноrо университета 2000
УДК 577.15:577.353 Артюхов B.r., Наквасииа М.А. БИОЛОI'ические мембраны: структурная орrанизация, фУНКЦИИ, модификация Физикохими ческими аrентами: Учеб. пособие. Воронеж: Издательство Bo ронежскоI'О rосударственноrо университета, 2000. 296 с. ISBN 5745511621 в учебном пособии, IlOдrотовленном на базе спецкурсов "Биофизика мембран" и "Молекулнрная фО1'обиолоrия", представлр.нJ>I cOBpeMeн:нъre воззреШ1Я о составе и c'rpyк. турно.функциональной ОРr!lННзации биомембран, путях передачи информации в клетке, роли :vrембрuнных КОМJlонеН1'ОВ в осущеС1'влении и реrулированни метаболических Пlюцессов. Обсуждаются молекулярные механизмы фУНКЦИОНИРО,вания биомембран в норме и в условиях воздействия модифицирующих ментов (Уф. и ионизирующих излучений, химических соединений), а также вопросы разВИ1'ИЯ naтолоrических со- c-rояниЙ ОрI'анизма, связанных с накоплением активных форм КИCJlорода. Издание предназначено для ,студентов, мarистров и аспирантов БИОЛOJ'ичес. ких фдкули'етов университетов, а также может быть использовано студентами медицинских, фармацев'rических и сельскоховяйственных вузов. Ил. 62. Табл. 21. I3иблиоrр., 29' IUU'fB. Рецензенты: кафедра биофизики биолоrическоrо факультета OCKoBCKoro rосударственноrо университета (зав. ЮlфедроЙ дp биол. наук, членкор. РАН, проф. А. Б. Рубин), дp биол. наук, проф. В. Л 3uolпa (Киевский rосударственный унивеРСИ'l'ет) A:rtyukhov V.G., Nakvasina М.А. Вiological membranes: structur'al orgallization, functions, modificatio!l Ьу physical and chemical agellts. Voronezh: Voronezh University Press, 2000. 296 р. This textbook focIlses оп tlle Пlоdеrn views concerning comp08ition, structuraJ I\nd fIlnctional organizatioll of biological тетЬтnеа, the ways of infоrшаtiОIl transIllission iIl t!le сеН, D,nd ro!e of шеIl1ЬrUllе components ill realization and regu!atioll о! tlle шеtaЬо1isПl. Other aspects described illcl ude шо!есu!аr шесhanisП1S о! ЫОll1ешЬrаllеs fIlnctioning in the nornla! state and under the infllJence of u nUll1ber о! Illodifyl!lg agents (UV. and ionlzing radiation, сllешiсal substances). Particu!ar attentio!l is given to t!le ro]e of actlve fоrшs о! oxygen in deve!oping о! sоше human pat!lo!ogies. Fig. 62. ТаЫ.21. BibI.: 89. ISBN 5745511621 @ АртIOХОВ B.r., Наквасила М.А., 20UlJ @ Издательство Воронежсн:оrо roсударственлоrо университета, 2000
оrЛАВЛЕНИЕ Предисловие............' .......... ................. ......, ......... ................7 rлапа 1. Состав и СТРУК'l'урв:оФуш\:циопальпая орrапи" зация молекуляриых КОМlIонев:тов био:мембраи ........... 11 1.1. Липиды биомембран: классификация, состав, структура, физико-химические и динамические свойства, функции'......'..... 11 1.1.1. Классифюсация, состав и структура ЛШIидов мембран ...........11 1.1.2. Физико-химические и динамические свойства и функции ЛИПИДDВ мембран.......... ............... ........................... 19 1,2. Мембранные белки ................... ....................... ....................... 26 1.2.1. Классификация, CTPYI<Typa и функции мембранных белков.. .......... .............. ....... ." .... ..... . .. .. .............. .... .. ..,.... .. .. 26 1.2.2. Цитоскелет (мембранный каркас) .................................... 31 1.2.3. Интеrральные белки биомембран..................................... 34 1.2.4. Структура, Фу:н:кциональные и неКО'l'Орые физико- химические свойства Na+, К+ -АТФазы ......... ....... ................'35 1.2.5. Структура, функциональные и некоторые физико- химические свойства ацетилхоли:нэстеразы .......................... 5 О 1.3. 'Уrлеводы мембран .......... ......... .................... .......... ................ &6 1.4. 'rипы взаимодействий мембранных компонентов и их роль в функционировании биомембран .............................. 58 Контрольные вопросы ................................................................... 62 rлапа 2. Участие I\:омпонептов био:ме:мбрав: в осуществлс" иии и реryлировапии метаБОЛП1Jеских процессоп ......... 64 2.1. Общая характеристика процессов передачи информации в клетке.................................................................................. 64 2.1.1. Особенности структуры и функций мембранных рецеп'l'ОрОВ ....,.................................,.................................. 65 2.1.2. Аденила'fЦиклазный путь передачи сиrнала ..................... 71 2.1.3. Фосфоинозитидный путь передаIИ информации ............... 72 2.2. Роль ионов в осуществлении метаболических процессоВ с участием мембран " .................. ....... ... .........., ........................ 74 2.3. Молекулярные механизмы интеrрации l<леточноrо метаболизма.... .... .. .... ........,... ........ ...... .................. .. ....... .. ....... 18 2.3.1. Механизмы реrулирования функциональной аК'J.'ИВНОСТИ ферментов и ферментных сис'!'ем в кле'rке ........................... 78 2.3.2. Адсорбционный механизм реryляции метаболи.зма: понятие ометаболоне, ero струк'!'ура, физио.лоrическое значение образования.......................................................... 82 2.3.3. Пути реrулирования активноти векторных фЕ'рмен'fОВ биомембран .............,......................... 91 2.3.4. Молекуллрные механизмы нейроrуморальной реrу.JIЯЦИ:И функций кле.rок............................................;..................... 97 3
Контрольные вопросы.....................'.. ................................ ......... 100 rлава 3. Механизмы модификации JlЮМlIонентов биомембран при патолоrических состояниях: роль кислородных метаболитов .....................................102 3.1. Пероксидное окисление липидов IaK один из ключевых механизмов модификации структурнофункциональноrо состояния биомембран ....................................... .................... 102 3.2. Роль активных форм кислорода в рryлировании метаболи ческих процессов в биосистемах .............................................107 3.3. Пути реrулирования уровня свободнорадикальных продук- тов и активных кислородных метаболитов ..............................114 Контрольные вопросы... ................................ .............. ................ 124 rлава 4. Структурно-фувкциональ:иы:е модификации молекулярных КОМIIоне:итов биомембран под воздействием физико-химических areHTOB ...................126 4.1. Фотохимические и радиационнох:имические превращения компонентов биомембран в условиях различноrо микроокружения .... ....... ............... ............ .............. ............... 126 4.1.1. Структурно-функциональные модификации молекуляр ных компонентов биомембран под действием УФ-излучения. 126 4.1.2. Радиационнохимические превращения CTPYK'I'YPHblX компонентов биомембран ...............................142 4.2. УФ-индуцированные изменения CTPYKTYPHO-ФУНIЩИОНальноro состояния мембраносвязанных ацетилхолинэстеразы и Na+, K+ АТФазы в присутствии некоторых химических МОДИфИКаторов ... 149 4.2.1. Функциональная активность мембраносвязанной аце'rилхолинэстеразы после УФоблучения в присутствии бензиловоrо спирта и конканавалина А.............................. 149 4.2.2. Фоточувствительность ацетилхолинэстеразы эри'rроци тарных мембран в присутствии фосфолипа:3Ы D и аскорби- новой кислоты....................................... .............. ............. 157 4.2.3. УФ. индуцированные изменения функционалЬНЫХ свойств мембраносвязанной Na+, К+.АТФазы в присутствии фосфолипRзы D......................... ................................ ........ 169 4.3. Функциональные свойства лактатдеrидроreназы в комплек, се с эритроцитарными мембранами и их компонентами в интактном состоянии и после УФоблучения ........................172 4.4. Исследование роли активных форм кислорода в процессах УФмодификации лактатдеrидроrеназы .................................. 184 Контрольные вопросы...............................'..........' ................... ... 200 rлапа 5. Характеристика некоторых методов изуч:еlШЯ биолоrкческ:в:х мембран ..................................................202 5.1. Краткий обзор rpупп методов исследования биомембран ........ 202 5.2. Выделение и разделение мембран ......................................... 217 4
5.3. Оценка чистоты мембранных фракций .................................. 222 5.4. Выделение и очистка мембранных белков .............................223 5.5. Выделение и фрющионирование ЛИl1ИДОВ мембран ................. 227 Контрольные вопросы..... ..... ......................... .............................. 228 rлава 6. ИсслеДОВQllие cTpyKTypIlo-фyImц:иоIIQлыlrоo СОСТОIOIИЯ отдельв:ых I\:о:мп:оиеитов биомембраи в в:орме и при ВОЗДействии раз.пи.ш:ых физико-хими- ческих факторов .... ........ ..... ........... ........... ...... ................. 230 6.1. Выделение эритроцитарных мембран ....................................230 Лабораторная работа М2 1. Выделение эритроцитарных мембран из крови доноров ................................................. 231 Лабораторная работа М2 2. Определение концентрации белка плазматических мембран по методу Лоури ......................... 232 Лабораторная работа М2 3. Количественное опреДелеНие белка по биуретовой реаЕ.ЦИИ ...................................................... 235 6.2. Исследование функциональной активности мембраносвязан ных ферментов в норме и при Боздействии ФИЗИRо-химических факторов............................................................................... 236 Лабораторная работа N2 4. Определение функциональной а1"ТИВ ости ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мембран ............. 237 Лабораторная работа NQ 5. Исследование 'УФиндуцированных изменений функциональной активности ацетилхолинэсте- разы эритроцитарных мембран ..........................................238 Лабораторная работа N2 6. Исследование ферментативной активности свободной и мембраносвязанной ацетилхолин- эстеразы в интактном состоянии и после УФ-облучения ..... 240 Лабораторная работа N'2 7. Определение функциональной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарных мембран после индукции пероr"сидноrо окисления: липидов .............. 240 Лабораторная работа N2 8. Исследование функциональной активности мембраносвя:занной Na+, К+.АТФазы ................. 241 Лабораторная работа N'2 9. Изучение 'Уфиндуцированных изменений функциональных свойств Na+, Е+.АТФазы эритроцитарных мембран ................. .................. ............... 243 Лабораторная работа N2 10. Определение ферментативной активности Na+, К+.АТФазы эритроцитарных мембраfI после индукции пероксидноrо окисления: липидов .............. 245 6.3. Исследование интенсивности протекания: процесса цероксид Horo окисления: липидов мембран ........................................... 245 Лабораторная работа М! 11. Определение уровня продуктов пероксидноro окисления: липидов мембран с использова- нием тиобарбитуровой кислоты ......................................... 246 6.4. Изучение изменений CTPYKTYPHoro состояния биолоrических мембран методом флуоресцентных зондов ................ .............. 248 5
Лабораторная работа N2 12. Исследование фотоиндуцированныx изменений CTPYETypHoro состояния ЭрИ'I'роцитарных мембран методом флуоресцентных зОндОв....................................... 250 6.5. Исследование устойчивости эритроцитарных мембран Е действию различных химическИХ areHToB при помощи метода реrистрации осмотичеСI<.ИХ и ЕИСЛОТНЫХ эритроrрамм... 252 Лабораторная работа N2 13. АвтоматичеСIЩЙ метод реrистра. ции осмотичеСЕИХ и кислотных эритроrpамм .....................253 6.6. Количественное определение липидноrо состава эритроцитов ...256 Лабораторная работа N2 14. Определение фосфолипидов эрИТрО ци:тарных мембран методом ТОНЕОСЛОЙНОЙ хроматоrрафии.... 257 6.7. Определение функциональной аЕТИВНОСТИ некоторых антиоксидантных ферментов крови......................................... 260 Лабораторная работа N2 15. Исследование н.аталитичеСI<ОЙ активности супероксиддисмутазы в эритроцитах крови доноров ..... ................. ......... ....... ......................... ............. 260 Лабораторная работа М 16. Определение активности каталазы в эритроцитах крови человека спектрофотометрическим методом ................................................,...... ........ ............. 262 Лабораторная работа N2 17. Исследование функциональной ан,тивноети rлутатионредуктазы эритроцитов .....................264 6.8. Изучение участия аЕТИВНЫХ форм кислорода в процессах 'Уфмодификации беЛI<,ОВЫХ молеЕУЛ ......................................265 Лабораторная работа N2 18. Исследование каталитической активности лактатдеrидроrеназы спеЕтрофотометрическим методом.. ........................................................ .................. 267 Лабораторная работа N2 19. Выделение лактатдеrидроrеназы из сердца свиньи.... ...... ...... '" ............. ............. .................. 269 Лабораторная работа М 20. Исследование изоферментноro спектра лактатдеrидроrеназы методом электрофореза в полиакриламидном rеле.................................. ...... ......... 271 Лабораторная работа N2 21. Исследование 'УФЧУВСТВИ'I'ель. ности лактатдеrидроrеназы в присутствии некоторых модифицирующих areHTOB................................................. 273 Iонтрольные вопросы......... ....................,................... ...........,.... 274 Спи СОЕ основной литературы .. .................................................... 276 СПИСОЕ дополнительной литературы................. ........,...... ............ 277 Проrрамма спецкурса «Биофизика мембран» ...............................282 ПРИЛОЖЕНИЯ.................................................. ... ......... ........... 285 Rачественный и количественный соетав липидов различных орrанизмов ............................ ........................................... 285 Приrотовление буферных растворов......... ............................... 288 Предметный УI<азатель. ........................ ....................... ........... 290
ПРЕДИСЛОВИЕ Мембранолоrия современная, стремительно развивающа яся междисциплинарная область ещ'ественных наук, находяща яся на стыке биофизики, биохимии, молекулярной биоло1'ИИ, иммунолоrии, физиолоrии, rенетики, физической и Н:ОЛЛОИДJ:IOЙ химии и др. Она изучает состав, структуру, свойства, функции, локализацию I'.:омпонентов БИОЛО1'ических мембран, их молеку лярную и динамическую орrанизацию, особенности межмоле кулярных взаимодействий и фазовые переходы липидов и бел ков в мембране, транспорт веществ через мембраны, участие био мембран в осуществлении и ре1'улировании метаболических про цессов в клет:ке, механизмы действия различных физикохими ческих факторов на мембранные системы и ДРУ1'ие вопросы, свя занные с исследованием состояния :компонентов биомембран и от дельных :клеток. Одним из центральных разделов мембранолоrии является биофизика мембран, котора,я: рассматривает, прежде Bcero, фи зико-химические механизмы их функционирования в норме и в условиях воздействия разнообразных модифицирующих a:reH тов, а та:кже при развитии nаТОЛО1'ичес:ких состояний отдель- ных систем ОР1'анизма человека. Спецкурс "Биофизика мемб ран" в объеме 24 ч читается студентам 4-1'0 и 5-1'0 курсов I'.:a- федры биофизИI'.:И и биотехнолоrии дневно1'О и вечерне1'О OTдe лений биолоrопочвенно1'О факультета Воронежскоrо rосудар- CTBeHH01'O университета. Одна:ко невозможно освоить npo1'paM- му этоrо курса без 1'лубоко1'О изучения друrих разделов мемб- ранолоrии. Оrраниченный объем учебных часов не позволяет подробно рассмотреть МНО1'ие аспекты мембранолоrии как меж- дисциплинарной области знаний. МНО1'ие вопросы проrраммы курса мембранолоrии отражены в ряде МОНО1'рафий, учебни- ков, научных обзоров ведущих отечественных и зарубежных специалистов (В. r. Ивков, r. н. Берестовекий, 1981; 1982; В. Ф. Антонов, 1982; Я. KaraBa, 1985; В. А. Твердислов и со- авт., 1986; С. В. I\:OHeB, 1987; А. А. Болдырев, 1985, 1998; В. П. Скулачев, 1989; 3. И. Rрутецкая, А. В. Лонский, 1994; Р. rеннис, 1997, и др.), которые заложили фундаМI?НТ препо- давания в вузах этой важнейшей научной дисциплины. BMec те с тем ряд учебников и учебных пособий по биофизи:ке и мембранолоrии не содержит разделов, посвященных пробле- 7
мам, l{асающимся выявления ключевой роли БИОЛО1'ических мембран в осуществлении и ре1'улировании различных MeTa болических процессов в норме и в условиях воздействия раз личных физикохимических факторов, в развитии патолоrи ческих состояний орrанизма человека, а также проявлении Te рапевтическо1'О действия эффективных методов лечения аутотрансфузии "УФоблученной крови (АУФОК) и эндоваску л.ярноrо лазерноrо облучения крови (ЭЛОК), широко использу емых в современной медицинской практике. Следует отметить, что библиотеки мноrих, в том числе и известных в стране BЫC тих учебных заведений (университетов), не MorYT обеспечить возрастающие научные потребности аспирантов, маrистров, студентовбиофизиков и биохимиков, обучающихс.я на ДHeB ном, вечернем и заочном отделениях и выполняющих KYpco вые и дипломные работы, направленные на выявление молеку лярных механизмов функционирования биополимеров и их надмолекулярных комплексов. Кроме Toro, проведение "Боль moro практикума" в рамках учебноrо плана ПОДI'отовки био ЛО1'абиофизика предусматривает выполнение ряда лаборатор ных работ, связанных с изучением мембранных структур, что требует не только знания принципов современных физикохи мических методов анализа биосистем, но и теоретических oc нов той или иной научной проблемы мембранолоrии. Настоящее учебное пособие является дальнейшим разви тием и существенным дополнением к разделу "Мембраноло rия" учебника по биофизике, наnисанноrо коллективом aBTO ров кафедры биофизики и биотехноло1'ИИ Воронежскоrо rocy дарствен:в:оrо университета (В. r. Артюхов, Т. А. :Ковалева, В. П. Шмелев, 1994). В нем более детально изложены вопро сы, касающиеся структурнофункциональной орrанизации MO лекулярных компонентов биомембран, в том числе и с точки зрения участия последних в осуществлении процессов клеточ Horo метаболизма (rлава 1), Большое внимание уделено pac смотрению проблем передачи информации в клетке и роли биомембран в реrулировании активности важнейших фермен тов и ферментных систем (на примере адсорбционно1'О Mexa низма реrуляции 1'ликолитическо1'О комплекса). Представле ны современные воззрения о взаимосвязи механизмов интеrра ции метаболических процессов, нейроrуморальной реrуляции функций клеток, путях реrулирования векторных ферментов 8
биомембран (rлава 2). rлава 3 посвящена проблеме выяснения молекулярных механизмов модификации компонентов биомем бран при патолоrических состо,яниях ОР1'анизма: рассмотрена ведуща,я роль пероксидно1'О окисления мембранных липидов; подробно охарактеризованы активные формы кислорода, их свойства, БИОЛО1'ическос действие, процессы образования и пути их утилизации, значение в реализации ВНУТРИltлеточноrо Me ханизма редоксре1'УЛЯЦИИ метаболизма; описаны классифика ци,я, свойства и механизмы функционирования антиоксидант ных систем ОР1'анизма как реrуляторов уровня свободноради кальных продуктов и активных кислородных метаболитов. В rлаве 4 ИЗложены вопросы, касающиес,я исследования законо мерностей функционирования биомембран и их компонентов в условиях воздействия различных физикохимических фак. торов (Уф и ионизирующей радиации, химических areHTOB). Пособие содержит и материалы собственных исследований авто. ров, посвященных изучению фотоиндуцированных изменений структурно.функциональноrо состояния компонентов биомемб ран (ацетилхолинэстеразы, Na+, к'+.АТФазЬ1 эритроцитарных MeM бран, лактатдеrИДРОI'еназы в комплексе с эритроцитарными мембранами и их компонентами) в норме и после воздействи,я: УФизлучения в условиях различно1'О микроокружения. rла ва 5 включает обзор методов изучения биомембран, а в rлаве 6 представлено описание 21 лабораторной работы, которые про вод,ятс,я: в рамках "Большоrо практикума" и предусматривают не только решение задач учебноrо плана (т.е. освоение CTyдeH тами методов и методик), но и обсуждение ряда научно.иссле довательских проблем, связанных с ин'rерпретацией получен ных результатов, установлением причинно.следственных .свя зей, выдвижением рабочих rипотез. В конце каждой rлавы приведены контрольные вопросы, а в конце учебно1'О пособия список основной и дополнительной литературы, учебная проrрамма спецкурса "Биофизика мембран". В приложении даны таблицы, материал которых дополняет све. дения rлавы 1. о качественном и количественном' составах липи- дов биомембран различных орrанизмов. Авторы надеются, что настоящее учебное ПО.собие расширит объем обязательноrо учебно1'О материала, предназначенноrо дл,я изучения студентами в рамках спецкурсов "Биофизика мемб. ран" и "Фотобиолоrия", "Больmо1'О практикума" и общеrо кур- 9
са биофизики, поможет студентам, маrистрам и аспирантам био лоrических, химических, медицинских специальностей l'лубже освоить теоретические основы мембранолоrии, получить преk ставление о' современном уровне исследований в данной облас ти. ознакомиться с ее фундаментальными проблемами, MeToдa ми их разработ:ки, источниками современной учебнонаучной литературы, а та:кже приобрести навыки работы с мембранны ми препаратами. Авторы выражают rлубо:кую бла1'одарнось зав. кафедрой био- физи:ки биолоrическоrо факультета MOCKOBCKOl'O I'осударствен Ho1'o университета, члену-корреспонденту РАН, профессору А. Б. Рубину и профессору кафедры биофизи:ки Rиевскоl'О rocy- дарственноrо университета В. Л. Зиме за труд по рецензирова нию учебноI'О пособия и ценные замечания, а также сотруднику :кафедры биофизИ:RИ и биотехнолоrии Воронежскоrо rосударствен Horo уни:верситета К. П. Пенс:кому за большую помощь в ПОД1'о- товке рукописи к изданию.
rJIaBa 1 СОСТАВ И СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ оРrАНИ3АЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПОНЕНТОВ БИОМЕМБРАН 1.1. ЛИП ИДЫ БИОМЕМБРАН: IСЛАССИФИКАЦИЯ, СОСТАВ, СТРУКТУР А, ФИ3ИКОХИМИЧЕСКИЕ И ДИНАМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ФУНКЦИИ 1.1.1. lCлассuфuкацu.я, состав u структура лuпui308 мембран Липиды обширный класс химических соединений, содержа- щих алифатические или ароматические yrлеводородные 1'руппы, плохо растворимых в воде в мономерной форме. Липиды ПОдРазде- ляют на 3 класса: нейтральные, амфифильные или дифильные, жирорастворимые витамины. R нейтральным относятся жиры (ди- и триацИЛ1'лицериды), воска (смесь длинноцепочечныХ парафи нов, спиртов и эфиров спиртов и жирных кислот), каротиноиды и стероиды. Они хорошо растворимы в неполярных растворителях, таких, как налканы и бензол; в обычных условиях не способны к образованию в Боде ламеллярных структур. Амфифильные (дифиль- ные) липиды малорастворимы и в неполярных растворителях (нал- канах, бензоле, четыреххлористом yrлероде). При небольших I\:OH- центрациях они формируют мицеллы и бислойные структуры. R ним относят фосфолипиды и rликолиnиды, жирные кислоты и их соли, моноаЦИЛ1'лицерИДЫ, длинноцепочечные амиды. В состав клеточных мембран прокариотических и эукарио тических орrанизмов в основном входят амфифильные фосфо и I'ликолипиды, В плазматичеСI\:ИХ мембранах эукариот содержат ся в значительных количествах стероиды. Большинство нейт ральных липидов присутствует в мембранах в качестве продук тов метаболизма и, по-видимому, слабо влияет на структур НО- функциональную Ор1'анизацию клеточных мембран. Жирораство римые витамины А, Д, Е и R блaroдаря небольшой полярной 1'руппе и протяженной У1'леводородной части хорошо встраиваются в мембрану, однако их роль в функционировании мембранных структур изучена далеко не полностью. Известно, что витамины rруппы Е (токоферолы) представляют собой антиоксиданты (rла ва 3) и тем самым стабили:шруют липидный бислой. Фосфоли- пиды, r ликолипиды и стероиды, составляющие основную часть липидноrо компонента мембран различных ОР1'анизмов, Ha3ыв ют структурообразующими (рис. 1). 11
a'9H2 a .../C{i I U CH2...()...--O'""'\....::::: О О ...... о ФОСфОЛИПИД . 'сН 2 О I O /C{i I НО CH 2 ...()...P--о....... N + ..... 11 О ...... о ЛИ30фОСфОЛИПИД . 'СН 2 О I O I C! CH 2 ..-Оi'=О О О I СН 2 I СНА Н O'CH 6Н 2 О I 2 1 .../C{i 9 U CH2OF=a о a Кардиолипин O 'СН 2 I a СН I vvvvvvv,./:f" 'cH2..-ОN::::: о ..... ПЛ6змалоrен pH СН I O /C{i I vvvvvvvy NH CH2..-ОfN::::: о О ..... Сфинrомиелин ?" T"'H Ну уН ?Н2 ен NH ОН 11 I "! r Ц'р'бро,,,, pH СН I qi /V'V"v'\./VVN'H CH2--о---GlсGаl---GlсN Ac--Gal 11 I I О NeuNAc NeuNAc rанrлиозид Холестерин Ситостерин Стиrмастерин Рие. I. Структурные формулы соединений некоторых классов мем. браниых липидов ОбоЗНllчениSl: Gal rалактоза; Glc rтокоза; NeuNAc Nацетил нейраминовая кислота (сиалОВ8S1 кислОО'а); GlcNAc . N 'ацетилI'ЛЮКоза:мин 12
O I + ""OPOCH2....cH 2N н з 11 О Фосфатидилэтаноламин O 1 OPOCHCOO 11 1 О +NН з Фосфатидилсерин о сн з I 1+ ""O.P""OC н 2....с н 2N....c н з 11 I о сн з Фосфатидилхолин O I OP""()C н 2CH....cH20 Н 11 I О он Фосфатидилrлицерин он он [1 О CHCH I / " ""OP""OCH сн....он 11 " / о сн....сн I I ОН ОН Фосфатидилинозитол Рис. 2, C'rpYKTypa полярных rОЛОВО:Е\ наиболее распространенных rлицерофосфолипидов ФОСфО.1luпuаы подразделяют на 1'J1ицерофосфолипиды и сфин 1'ОфОСфОJ1ИПИДЫ (рис. 1, 2). В rлицерофосфолипидах две первич ные I'идроксильные rруппы I'J1ицерина этерифицированы жир ными кислотами, а третья ОНI'руппа образует сложную эфир ную связь С фосфорной кислотой: о 1 11 О CH2...() 11 21 c""()--CH O 31 I с H2...()P"'()X 11 О в положении 2 остатка rлицерина находитс-я ненасыщенная жирная кислота. Х спиртовая 1'ру,ппа азотистое (холин, эта ноламин) или безазотистое (инозит, 1'лицерин) основание, этери фицированное фосфорной кисло'rой. Номенклатура 1'лицерофос- фоли:пидов основана на системе стереоспецифической нумерации (sп-система) и связана с наличием асимметрическоI'О атома уrле 13
рода (хиральноrо центра) в 1'лицериновом остатке, что приводит к появлению L и Dстереоизомеров: 1 CH2OH 21 НО....С.....Н 31 СН2ОРОзН2 sпrлицерил3фосфаТ (L r лиц ерил3фосфат, D-rлицерил 1-фосфат) yHt-ОРОзН r УН2РОЗН2 J Н.....С.....ОН НО....с.....Н I I cH2OH СН 2 ОН sпrлицерил 1 фосфат "У1'леродный атом на вершине проекции Фишера обознача ется Cl, если уrлеводородная цепь или ОН-rруппа, присоеди ненная к С-2, направлены влево. У большинства 1'лицерофосфо- липидов фосфатная rруппа находится в sп3-положении rлице рина. Производные 1'лицерофосфолиuидов, утратившие в резуль тате rидролиза одну из двух ацильных 1'рупп, получили назва ние ЛИЗ0фОрМ или лизофосфолипидов. rлицерофосфолипиды широко представлены в мембранах зу- и прокариотических кле ток, за исключением архебактерий. Фосфатидилхолин OCHOB ной компонент мембран животных клеток, фосфатидилэтанола мин часто входит в состав бактериальных мембран. К rлицеро фосфолипидам относятся также кардиолипины димерные формы фосфолипидов. В большом количестве они содержатся во внутренней мембране митохондрий, в мембране хлоропластов и некоторых бактериальных мембранах. rлицерофосфолипиды, у которых одна из У1'леводородных цепей представляет собой виниловый эфир, называются плазмалоrенами. Этаноламиновые плазмаЛО1'ены содержатся в м:и:елине и саркоплазматическом ретикулуме сердца, СфИН1'офосфолипиды построены на основе ДЛИННОЦепочечно 1'0 ненасыщенно1'О аминоспирта сфинrозина. Наиболее распрост- раненный сфинrофосфолипид плазматических мембран живот- ных клеток (особенно клеток МОЗ1'а) СфИН1'омиелин. В мемб ранах растительных и бактериальных клеток СфИН1'офосфоли- пиды встречаются редко. Fлщсолuпui3ы содержат MOHO или ОЛИ1'осахаридный остаток, соединенный с липидной частью rликозидной связью без учас ти;я фосфата. Они локализованы, как правило, на наружной по верхности плазматической мембраны и определяют ее антиrен ные, рецепторные и, возможно, механические свойства. rлико 14
липиды делятся на цереброзиды и 1'анrлиозиды. rоловку моле- кулы цереброзидов образует полярная rидрофильная yrлеводная rруппа, чаще Bce1'o 1'алактоза, а неполярная часть представлена остатками СфИНl'озина и э'rерифицированной жирной кИСлотой. Это нейтральные липиды, в значительных количествах содержа щиеся в миелиновых оболочках нервных стволов, Сульфоэфиры цереброзидов, образованные при участии ОН-1'руппы уrлеводно- ro компонента, называют сульфоцереброзидами или сульфатида- ми. rан1'ЛИОЗИДЫ представляют собой сиалО1'ликосфинrолипиды, которые включают в свой состав один или несколько остатков сиаловой КИСЛО'l'ы (Nаце'rилнейраминовой кислоты). Они coдep жатся преимущественно в мембранах нервных клеток и являют- ся кислыми липидами. rликосфинrолипиды мембран эритроцитов несут аНТИ1'ены rpупп крови. В клетках аденокарциномы накапливаются фукози лированные rликосфинrолипиды, l<оторые можно использовать дл,я обнаружени,я этих l<леток и контроля за развитием опухоли. Стероиоы ПРИСУТС'l'вуют во мноrих мембранах растений, жи вотных, МИКРООР1'анизмов. Широко распространен среди них xo лестерин. Ero молекула состоит из четырех колец (rидрофобное ядро), одно из r,оторых соединено с 1'идроксильной 1'руппой, вы- полняющей роль полярной rоловки, а пя:rичленное кольцо свя- зано с разветвленной У1'леводородной цепочкой из восьми атомов уrлерода. Холестерин содержится в плазматических мембранах животных кле'l'ОК (составляет около 30 % массы мембранных липидов), лизосомах, аппарате rольджи. Нарушение содержания холестерина в ТI<анях может приводить к развитию ряда патоло- rических состояний человека (желчнокаменной болезни, a'repo склероза). В высших растениях обнаружены ДРУ1'ие стероиды, чаще Bce1'o ситостерин и СТИ1'мастерин. Как правило, при нейтральных значениях рН молекулы ли пидов электронейтральны или заряжены отрицательно. Поэто- му удобно классифицировать липиды по заряду полярной rруп- пы, что особенно важно дл,я изучения функционирования био мембран, так как зарядовое состо,яние поверхностных участков мембраны влияет на ar<тивность мембранных белковферментов. В связи с этим выделяют; нейтральные липиды, пол,ярные 1'o ловки которых не несут зар,яда (ТРИ1'лицериды, холестерин, цe реброзиды); цвиттерионные липиды, в полярных rоловках кото- рых положительный и отрицательный заряды нейтрализуют дру1' 15
дрУ1'а (СфИН1'омиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин); кислые липиды с отрицательно заряженными rоловками (фосфа тидилсерин, фосфаТИДИЛ1'лицерин, фосфатидилинозитол, кардио- ЛИIIИН, rанrлиозиды). Жирные кислоты, входящие в состав мембранных липидов, представлены насыщенными стеариновой (18:0), IIальмитино вой (16:0), миристиновой (14:0) и ненасыщенными олеиновой (18:1), линолевой (18:2), линоленовой (18:3), арахидоновой (20:4) жирными кислотами. Почти все IIриродные жирные кислоты ха- рактеризуются цисконфиrурацией двойных связей. Уrлеводо- родная цепь в такой конфиrурации имеет излом, что нарушает упаковку липидных молекул в бислое. O1'poMHoe разнообразие фосфолипидов и различия в их физико,химических свойствах обусловлены возможностью комбинирования полярных l'оловок с различными кислотами. Лизоформы липидов, имеющие одну уrлеводородную цепь, при высоких концентрациях действуют по добно детерrентам и способны разрушать клеточные мембраны. Примером является лизолецитин (1- или 2-ацилrлицерофосфо ХОЛИН), образующийся из фосфатидилхолина (лецитина) под дей ствием фОСфОЛИIIаз А! и А 2 . В e1'o присутствии происходит рас- пад клеточных мембран, что может служить одной из причин смерти при укусе змей. В молекулах одно цепочечных диольных липидов вместо l'лицерина содержатся более простые спирты этиленrликоль или пропандиол. Предпола1'ают, что они способ ны выполнять ре1'УЛЯТОРНУЮ роль в функционировании биомем бран. Синтез этих липидов резко усиливается в случае возраста- ния функциональной активности клеток (например, в созреваIO щих семенах и клетках ре1'енерируIOЩИХ тканей). Общее содержание ЛИIIИДОВ в биомембранах варьирует от He скольких процентов у IIpOкариот (например, 69 % у Bacillus mega terium) до 6080 % в мембранах миелина эукариот. В среднем липиды составляют 1550 % от сухой массы мембраны (табл. 1). Причем среди них преобладают амфифильные фосфолипиды. Oд ним из основных структурообразующих липидов на всех уровнях биолоrической ОР1'анизации является фосфатидилэтаноламин. В состав липидов бактерий в значительных количествах BXO дЯТ фосфатидилэтаноламин, фосфатидилrлицерин, кардиолипин, а в небольших фосфатидная кислота, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидилхолин. К специфическим "бакте- риальным" липидам относят ами:ноацилфосфолипиды у rpампо- 16
'l'аблица 1 СоiJержанuе дипиоов в раздuч-ных мембра1lах Общие ФОсфОЛИПИДЫ, Стероиды, Вид мембраны липиды, % от сухой % 0'1' общих % от сухой массы массы липидов Плазматическая: печени :крысы 50,0 67,5 13 скелетной мъuuцыкролцка 15,8 48,5 32,5 аксода моз'а быка 13,5 52,2 20,1 СИН8П'l'осом мозrа крысы 50 71 16 эритроцита кролика 40 65,8 28,9 амебы А. castellani 42 59 29 бактерии Е. соН 45,3 96 Вдутренняя мембрана мито хондрий печени крысы 17 87 1,5 СаРl<.опдазматичеСl{ИЙ рети. кулум скелетной МЪПliцы к роли:к а 25 90 10 ФО'l'орецеП'l'орная мембрана сетча'l'КИ кальмара 25 74 17 ЛО"кительных бактерий, липид А ЛИПОПОJIисахарида у rpaMOT рицательных и "rибридные" фОСфО1'ликолипиды у МИl{оплазм и молочнокислых бактерий. Особенностью липидноrо состава эукариотических клеток .является наличие фосфатидилхолина и стероидов. Фосфатидил холин обладает исключительной способностью существовать в виде бимолекулярных слоев в широком диапазоне ионных KOHцeHTpa ций и температур. :Кроме Toro, он формирует стабильные ламел лярные структуры при смешивании с ДРУ1'ими липидами, которые не МОl'УТ образовывать бислои при данных условиях. В мембранах эукариот суммарное содержание цвиттерионных липидов (фосфа ТИДИЛХОJIИн + фосфатидилэтаноламин + сфинrомиелин) составля е'l' 7590 % от общеI'O количества фосфолипидов (табл. 2). Мембраны вирусов содержат практически те же классы ли пидов, что И мембраны клеткихозяина, однако их соотношение может быть друrим. В состав вирусных фосфолипидов входит значительно больше насыщенных жирнокислотных остатков, чем 2. Заказ 3788 17
Таблица 2 Липионыu состав мембран высших животных Содержание фосфолипидов, Содержание Тип мембраны мол. % от суммы ХС, ФХ ФЭ СМ ФС КЛ ФИ лизо- моль/моль ФЛ формы Плазматическая 39 23 16 9 1 8 2,3 0,37 Митохондриальная 40 34 1 17 7 1 0,03 Ядерная 44 3 16 4 1 6 1 Аппарат rольджи 50 20 8 6 1 12 3 0,21 Саркоплазматиче 68 15 8 3 2 3 0,21 ский ретикулум Обозначения: ФЛ фОСфОЛШ1иды, ФХ фосфатидилхолин, ФЭ фосфатидилэтанолам:ин, СМ СфИН1'омиелин, ФС фосфатидилсерин, КЛ кардиолШ1ИН, ФИ фосфатидилиноз:итол, ХС холестерин. В состав липидов клеток хозяина, в основном, за счет BblcoKoro содержания СфИН1'омиелина. Кроме тоro, молярное отношение xo лестерин/фосфолипид в вирусных мембранах обычно близко к единице, а в клетках хозяина составляет O,2O,4. Эти особенно сти липидно1'О состава вирусов обеспечивают плотную упаковку липидных молекул и способствуют более эффективной защите вирусных частиц. Липидный состав клеточных мембран, скорость обмена мемб ранных ЛИI1ИДОВ существенно изменяются в ходе развития и транс- формации клеток. Изменения в функционировании мембран, про исходящие на разных этапах развития клеток, обусловливают из менения в относительном содержании липидов, вязкости yrлево- дородной части бислоя. Так, например, в растущих и делящихся клетках содержится больше ненасыщенных жирных кислот и ли пидов В целом. При созревании эритроцитов по мере уменьшения функциональной активности их мембран происходит возрастание микровязкости последних. Увеличение вязкости У1'леводородной части мембран может происходить за счет повышения содержа- ния холестерина. Акклиматизация различных ОРl'анизмов к хо- лоду неизменно сВязана с увеличением степени ненасыщенности жирнокислотных остатков фосфолипидов, что находит отражение в повышении содержания полиненасыщенных жирных кислот. Фосфолипидный состав мембран изменяется также в зависимости от сезона и режима питания живых РР1'анизмов. 18
1.1.2. ФЩJUlCо-хuJ/tuчеСlCuе ц аипами",еские свойства u фуltlCЦUU лuпuiJов .м.е.м.бран. В водной среде мембранные лип иды ведут себя как анизо- тропные жидкости, обладающие свойствами жидких кристаллов. В жидком кристалле сочетаются особенности кристалла (даль- ний порядок орrанизации, двулучепреломление) и жидкости (об- разование капель и текучесть). Всем жидким кри:сталлам свой ствен полиморфизм, т. е. они MorYT существовать в нескольких жидкокристаллических фазах. Даже индивидуальные очищен- ные липиды в rидратированном состоянии Moryт находиться в нескольких структурных модификациях. Преобладание '1'01'0. или: иноro типа структуры определяется целым рядом факторов: кон- центрацией липида, температурой, величиной рН, ионной силой, давлением. Формирование мезоморфных структур фосфолипи- дов мембран зависит от соотношения липид/вода (Jluотропный меао.м.орфuам) и от температуры (тepMbтpoтtblU .м.езоморфuз.м.). Сочетание в молекуле липида полярноrо и неполярноro KOM понентов, т. е. дифильность, обусловливает ее амфицатические свойства и, следовательно, способность к образованию мембран. Наиболее энерrетически ВЫ1'одным положением для молекул JIИ пидов является формирование мономолекул.ярно1'О слоя на по- верхности раздела масло вода или вода воздух (рис. 3). При достижении определенной концентрации липида крИТИ1:rес- кой концентрации мицеллобразования (КЕМ) ero молекулы объе- диняются в замкнутые аrреrаты мицеллы, в которых поляр- ные rоловки обращены к воде, а 1'идрофобные хвосты напраgле ны внутрь. Для большинства липидов КЕМ составляет менее 1 %. При более высокой концентрации формируется бимолекулярный липидный слой (ламеллярная структура). Для ламеллярной жйд кокристаллической фазы (L,,) характерно упорядоченное распо- ложение слоистых структур при значительной неупорядоченно- сти ацильных цепей. Считают, что именно в этой фазе находится основная масса липидов биомембран. Ламеллярная rелевая фаза (Lp) образуется при низкой температуре теми ЛИDидами, которые формируют слоистые структуры. В этой фазе молекулы упакова ны более плотно (на молекулу приходится меньшая ПЛОЩадь по- верхности), а У1'леводородные цепи более упорядочены и Haxo дятся преимущественно в транс-конфиrурации. Так как цепи Maк симально вытянуты, толщина бислоя в фазе rел.я: выше, чем в жидкокристаллической фазе. В случае образования rl;JКсаrональ 2* 19
А , , Б . 1 ''',,1 J .J ТУ"" . ....1. 4 't. ...., '""'" --=.. er;Vj- --=.. 2 ',.P 7,'\: :J-t.. "\.1,1" .rJ..... J,.9 7'\: 7{ '.;. ,.P <l"J..... ......1,1" 7',>::;: 7','\: Ф 5 Jllt 1 f 1. з ;::.o.....: 1"': - r ;;r '-"" y -1" " -=- J) t'" '1e? : '\. .f'- ::.&:. K 6 , -- Рис, 3, Типы СТРУRТУРНОЙ ОРI'ани:зации ВОДlIОЛИПИДНЫХ систем: А ВОЗДУХ; Б вода; 1 монослой липидов; 2 мицелды фосфодипидов в воде; 3 ламеллярная ЖИД:КОltристаллическая фаза L,,; " ламел- лярная: rелевая: фаза L; 5 rеRсаrональная фаза типа 1; 6 reRcaro- нальная фаза ТИТIа II ной фазы 1 (Н Х ) лип:и:дные молекулы формируют цил:и:ндриче- сн:ие структуры, поверхность которых образована полярными ro ловками :и: контактируе'l' с водой. Цилиндры упаковываются с образованием rе:ксarональной решетки. Липиды в 1'екса1'ональ ной фазе П (НН) также образуют цилиндры, но полярные 1'руппы обращены внутрь цилиндра и формируют водный канал. Следу- ет отметить, что некоторые липиды (ненасыщенные фосфати- ДИЛЭ'L'аноламины, моноrалактозилдиацилrлицерол) не образуют стабильные бислои, а находятся в rексarоналыюй фазе Н п . Для изучения ти:пов структурной орrанизации воднолипидных сис тем исполъзуют метод дифракции рентrеновс:ких лучей, а также дифференциальную сканирующую ::калориметрию, электронную микроскопию и метод ямр. Термотропный мезоморфизм это зависимос'l'Ь состояния липидных молекул от температуры. В твердой или rелеобразной фазе уrлеводородные цепи ориентированы cTpo1'o параллельны- ми зиrзarами. После фазово1'О перехода в жидкокристалличес- кое состояние, который определяется температурой и ав:ало1'И чен процессу плавления, yrлеводородные цепи становятся под вижными. "Жидкое" состояние мембранных липидов необходи 20
МО для нормалыюrо функционирования всех биомембран, при чем степень вязкости зависит от функциональных особенностей мембраны. В среднем вязкость нормальной мембраны COOTBeT ствует примерно вязкости ОЛИВI\,ОВО1'О масла. Термотропный ме- зоморфизм существенно зависит от природы жирных ltислот И полярной 1'оловltи липидов. Так, увеличение числа двойных свя- зей И укорочение уrлеводородных цепей при ВОДЯТ к снижению температуры фазовоrо перехода. Вышеописанные свойства липидов взаимосвязаны дру!' с др у- rOM. Температура фазово1'О перехода зависит от содержания ВОДЫ в анализируемой СИС'l'еме. Различные липиды способны к формированию разных мезо морфных структур, что обусловлено особенностями строения MO лекул и соотношения объемов полярных rоловок и У1'леводород- ных хвостов. Липиды С электронейтралыroй 1'оловкой (фосфати- дилхолин, фосфатидилэтаноламин, сфннrомиелин) образуют ла меллярв:ую фазу. Лип иды с отрицательно заряженными 1'олов ками вследствие действия электростатичесltих сил отталкивания формируют мицеллярные или rексаrональные структуры. В слу чае равенства объемов, занимаемых полярными rоловками и yr леводородными хвостами, молекулы липида имеют цилиндри ческую форму и образуют бислой (фосфатидилхолин). Если объем полярной rоловки болъше объема УI'леводородных цепей (лизо фосфолипиды), то молекула имеет форму перевернутоrо конуса и в водном растворе находится в мицеллярной фазе. Если объем полярной rоловки меньше объема У1'леводородных цепей (HeHa сыщенный фосфатидилэтаноламин, ltардиолипин в ПРИСУ'fСТВИИ ионов Са 2 +, фосфатидная ltислота), то молекула липида имеет фор му конуса и образует 1'ен:саrоналъную фазу типа П. В целом crro собы упаКОБIШ различных липидов с учетом 1'еометрической формы их молекулы определяются следующими параметрами: молекулярным объемом неполярной части молекулы V, макси- мальной длиной это1'О участltа 1, оптимальной площадью поверх ности, занимаемой полярной rоловкой 80' :Критический пара метр упаковки липидов представляеТ собой величину V /180' Фазовые перехооы липидов сопровождаются значительным повышением ионной проницаемости мембран. Повидимому, ми целлярная и 1'еltса1'ональная фазы, способные формировать сltвоз- ные поры, более проницаемы для ионов и воды, чем бислойная ламеллярная структура. Способность мембранных фосфолипидов 21
к образованию в ВОДНОЙ среде мезоморфных структур в физиоло rическом оптимуме температур обусловливает ион-реryляторную функцию мембранных липидов. Так, для заряженных фосфоли пидов, фосфатидилэтаноламина и лизолецитина возможны фазо- вые переходы из бислоя в мицеллярную и 1'ексаroнальную фазы. Для фосфатидилхолина характерен вид бислойной ламеллы с фа- зовыми переходами термотропно1'О характера из жидкокристал лическо1'О состояния в 1'ель и обратно. В связи с этим выяснение молекулярных механизмов полиморфных переходов в липидной фазе необходимо для изучения процессов транспорта веществ че- рез биомембраны. Динамическое состояние липидно1'О бислоя, являющееся ос- новой функционирования мембраны, определяется целым рядом факторов: вращательной и латеральной диффузией отдельных молекул фосфолипидов, ПОДВИЖНОСТЬЮ их уrлеводородных цe пей, транс-rош-изомеризацией остатков жирных кислот. Лабиль ность мембранных беЛI<ОВ, в свою очередь, зависит от фазово1'О состояния и вязкости ЛИПИДНО1'о матрикса мембраны. С помо- щью метода ЭПР показано, что для молекул фосфолипидов в MeM бранах характерны движения двух типов: 1) латеральная диффузия перемещение в пределах одноro слоя липидной фазы параллельно поверхности мембраны; 2) трансбислойный переход типа "фЛ}1ПфЛОП" перемеще- ние из ОДНО1'О монослоя ЛИПИДНО1'О матрикса в ДРУ1'ой. E1'o час- тота в везикулах яичноrо лецитина около 2'10-5 c- I , ОН происхо дит на 12 порядков медленнее, чем латеральная диффузия. "Флипфлоп"переходы молекул фосфолипидов характеризуются высокими значениями энер1'ИИ активации (= 80 КДЖ/МОЛЬ), а обмен в пределах одноrо монослоя липидов более низкими (= 21 кДж/моль). Движение У1'леводородных цепей состоит из торсионныx (вра- щательных, крутильных) колебаний с относительно малой амп- литудой « 200) BOKpyr каждой из связей (время корреляции вра- щев;ия =10-14 с) и tpaHC-1'ошизомеризации отдельных звеньев (= 10-10 с). Минимальной энерrией обладает TpaHC, а максималь- ной цис-конформация У1'леводородных цепей. Уrлеводород- ные цепи в полной трансконформации представляют собой ли- нейные структуры. rош-конформации (1'ош "+" и roш ""; пово- рот на :t:120 Q относительно трансконформации) мало превыша- ют по уровню энерr:ии трансконформацию (на 23 кДж/моль), 22
но эти состояния разделяет энеР1'етический барьер высотой при мерно 1217 кДж. Появление одиночной rошконформации при водит к искривлению пространетвенной конформации уrлеводо родной цепи примерно на 1200, что затрудняет появление оди- ночных rошконформаций. При последовательном повороте цепи на +120 и 1200, т. е. при образовании двух 1'ошконформаций ("+" и "") пространственная структура цепи сохраняется пря молинейной. Участок цепи, на.ходящийся в 1'ош "+" транс-1'ОШ ""конформации, формирует в У1'леводородной цепи петлю, на- зываемую КИllКО.llt. Образование кинка сопровождается уменьше- нием эффективной длины уrлеводородной цепи примерно на 0,127 нм, а объем, занимаемый молекулой липида, увеличивает ся (рис. 4). Формирование кинков кооперативный процесс, приводящий к возрастанию разупорядоченности уrлеводородной зоны и ее плавлению. Этот процесс стимулируют двойные (ЦИс-) связи в ненасыщенных цепях мембран. Для образования кинка в таких участках необходимо появление лишь одной 1'оmконфор мации при искривлении цепи на 800. Поэтому высока'я текучесть уrлеводородной зоны мембран в жидкокристаллическом состоя нии объясняется возрастанием амплитуды крутильных осцил ляций BOKpyr ССсвязей, появлением rош-конформаций. С текучестью мембран тесно связаны функциональная актив ность мембраносвязанных ферментов, а TaKe фун:кционирова- ние систем пассивно1'О транспорта. Формирование кинков, обус ловленное появлением в липидном бислое флуктуирующих объе мов, является одним из возможных механизмов трансмембран j 0,127 нм { < транс 1 rош транс, rош rош..................... I ЦИ.У [ l !.. 0,15 нм : 1 2 3 Рис. 4. Конформация УI'леводородных цепей липидов в мембране: 1 полная 'l'рансконформация; 2 I'оштранСI'Ol!н\:онформация; 3 цистранс-I'ОШКОНфОРМация 23
Ho1'o переноса воды и ионов. Вопросы, касающиеся выяснения роли мембранных липидов в процессах транспорта ионов и Mexa низмов образования ионных каналов при фазовых превращени ях липидов, подробно изложены в МОНО1'рафии В. Ф. Антонова "Липиды и ионная проницаемость мембран" (1982). Динамическая модель липидно1'О бислоя показана на рис. 5. Липидный матрикс состоит из области полярных 1'рупп Р И облас ти У1'леводородных цепей Н. Уrлеводородная часть представлена как бы тремя слоями: двумя упорядоченными толщиной 0,8 нм, приле1'ающими к полярной области, и центральным "изотропным" , подобным короткоцепочечному жидкому У1'леводороду. Толщина этоI'O центральноro слоя для бислоев ДИIIальмитоил, димиристоил и дилауроиллецитина составляет соответственно 0,85 и 0,2 им. По видимому, существование "изотропной" области необходимо для Т01'o, чтобы бислой был непроницаем для ионов и малых молекул. Повышение проницаемости липидноrо матрикса связано с образо ванием кластеров и динамических дефектов. Кластеры это обла сти с сохраняющимся ближним порядком молекул, упаковка ко- торых близка к кристаллической. :Кластеры представляют собой динамические (M1'HoBeHHble) образования с временем жизни 107 С, включающие 4060 уrлеводородных цепей (2030 молекул фос- фолипидов). В них ближайшие к полярным rоловкам учас'l'КИ Y1' леводородных цепей имеют несколько более плотную упаКОВ:RУ, чем в "твердом" бислое. По направлению к центру бислоя плот ность упаковки уменьшается, как и на rpаницах кластеров, KOТO Н,О ***1*Jp , fr / ff 11 f ;7 i 1 ! f f t н ]}JJj} } а }Р Рис. 5. Динамическая орrанизация ЛШIидноrо бислоя: Р области полярных rрупп; Н области уrлеводородных цепей; а упорядочен ная "анизотропная" область; i "изотропная" область; J, динамиче СRие дефеRТЫ 24
рые непрерывно распадаются и образуются, перемещаясь вдоль бислоя. При этом rраничные области между кластерами представ ляют собой динамические дефекты в бислое. Последние также но- сят динамический характер, поэтому степень проницаемости ли пидной мембраны должна зависеть от времени жизни дефектов. Увеличение времени их жизни путем фиксации части кластеров при отвердевании бислоя приводит к резкому (на 12 порядка) возрастанию npoницаемости мембраны. Необходимо отметить, что на ориентацию и динамику поляр ных rоловок липидов влияет образование межмолекулярных во- дородных связей на поверхности мембраны. Донорами и акцеп торами при образовании этих связей M01'Y'l' служить фосфати дилсерин, фосфатидилэтаноламин, 1'ликолипиды. Однако не ясно, каким образом водородные связи воздействуют на структуру MeM браны. С точки зрения термодинамики, основной силой, стаби лизирующей rидратированные ЛlШидные a1'peraTbl, являются 1'ид рофобные взаимодействия. К друrим стабилизирующим факто рам относятся водородные связи и вандер-ваальсовы силы (ко- роткодействующие слабые силы притяжения между соседними rидрофобными цепями). Важнейшим свойством ЛИПИДноrо бислоя мембран является стРУlCтУРJlа.я асu.мJ/otетрu.я различное распределение липидов между внутренним и наружным монослоями. Анализ распреде- ления фосфолипидов в мембранах микросом, аппарата rольджи, ЛИЗ0СОМ, Ядер, митохондрий показывает, что фосфатидилзтано лам:ин и фосфатидилсерин расположены преимущественно на ци топлазматической стороне, СфИН1'омиелин, кардиолипин и фос Фатидил:инозитол на внутренней, тополоrичной наружной сто- роне плазматических мембран, а фосфатидилхолин более или Me нее равномерно распределен между обеими сторонами. В наруж ном монослое липидов мембран эритроцитов человека содержится 44 % фосфатидилхолина, 44 % СфИН1'омиелина и 12 % фосфати дилэтаноламина, во внутреннем 48 % фосфатидилэтаноламина, 28 % фосфатидилсерина, 10 % сфинrомиелина и 14 % фосфати дилхолина. Уrлеводородные цепи, входящие в состав фосфатидилхолина и СфИН1'омиелина, более насыщены по сравнению с теми, I{OTOpble находятся в составе фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсери- на. В связи с этим асимметрия в распределении полярных rоло вок сопровождается асимметрией распределения жирно кислот- 25
ных XBOC'l'OB. Это может привести к тому, что текучесть BHyтpeH He1'O монослоя будет несколько больше, чем внешнеrо. Известно также, что отрицательно заряженный фосфатидилсерин локали ЗОБан во внутреннем монослое, следовательно, две стороны бис Лоя существенно различаются и по заряду. Феномен асимметрич Horo распределения липидов необходим для проявления функ циональной активности МНО1'их мембраносвязанных ферментов. Так, при активации протеинкиназы С она связывается с цитоп лазматической стороной плазматической мембраны, rде KOHцeHT рируется фосфатидилсерин, необходимый для работы фермента. Асимметрия распределения ЛИПИДОБ определяется не только ли пидбелковым взаимодействием, но и асимметрией липидно1'О синтеза, различиями ионноrо состава BHe и внутриклеточной cpe ды. Асимметрия бислоя обеспечивается ферментами липидноro обмена и липидпереносящими белками (липазами, системами об мена холестерина, метилазами фосфатидилэтаноламина). Липиды в биомембранах выполняют множество функций. Bo первых, они обеспечивают структурную орrанизацию и стабиль ность клеточных мембран. BOBTOpЫX, выполняют барьерную и транспортную функции. Втретьих, иrрают фундаментальную роль в передаче информации и ре1'улировании метаболических процессов в клетке. Последняя функция мембранных липидов включает участие их в реакциях биосинтеза; поддержании опти мальной активности белковферментов мембран; выполнении ре- цепторных функций, обеспечивающих про.явление иммунолоrи- ческих свойств и ответственных за взаимодействие клеток; а TaK же в процессах накопления, передачи и хранения энерrии. Ли- пиды участвуют в механизмах кратковременной и ДОЛ1'овремен- ной памяти. В дальнейшем вопрос о выполнении липидами ре- ryляторной роли в различных процессах метаболизма будет pac смотрен более подробно в 1'лавах 2, 3. 1.2. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ 1.2.1. Клаесифшсацил, структура и ФУJlкции .ме.lltбраJlJlЫХ белков Белки обеспечивают выполнение мембранами их специфичес ких функций. Поэтому содержание и типы бел:ков в различных мембранах значительно варьируют. Так, в миелиновой мембране, выполняющей функцию изолятора, белки составляют около 20 % массы мембраны. Цитоплазматическая мембрана животных 26
клеток на 50 % состоит из белка, во внутренней мембране мито хондрий на ero долю приходится около 75 % (табл. 3). Плотность мембран прямо пропорциональна содержанию в них белка. Обычно мембранные белки подразделяют на наружные (пери ферические) и внутренние (интеrральные). При этом критерием служит степень жесткости обработки, необходимой для извлече ния этих белков из мембраны. Перuферu'tескuе беЛ/си высвобож даются при промывании мембран буферными растворами с низ кой ионной силой, с низким или высоким значением рН, в при сутствии растворов хелатирующих a1'p.HToB (ЭДТА), связывающих двухвалентные катионы. Такие белки контактируют с поверх ностью мембраны в основном за счет слабых электростатических взаимодействий с полярными 1'оловками тшидных молекул либо с молекулами дРуrих белков. В определенных условиях с биомем бранами MOryт взаимодействовать некоторые водорастворимые ци топлазматические белки. Поэтому возникла необходимость в Дo полнительной классификации периферических белков, которые делятся на две 1'руппы: собственно периферические и поверхност ные. Собственно периферические белки, как правило, связаны с мембраной электростатическими силами и MOryT быть частично поrpужены в ее rидрофобную область. Поверхностные белки при I{репл.яются I{ мембране только за счет электростатических взаи модействий. К периферическим белкам относят 1'ексокиназу, свя занную с белком порином, локализованным во внешней мембране митохондрий; цитохром С, который образует комплекс с мембран ным белком цитохромоксидазой; креатинфосфокиназу, взаимо действующую с кардиолипином внутренней мембраны митохонд рий. В rруппу периферических :включают и белки цитоскелета: актин и миозин, ассоциированные с внутренней поверхностью MeM браны в клетках эукариот, а таlCже спектрин эритроцитов. 'у эука риот к числу периферических белков относят коллаrен, фибро нектин, ламинин, расположенные на внешней поверхности мемб раны, входящие в состав экстраклеточноrо матрикса. Это rлико протеины, выполняющие сиrнальную и структурные функции. По функциям периферические белки делятся на следующие 1'руппы: 1) реryЛЯТОРНОСИ1'нальные (белки экстраклеточноrо матрикса); 2) CTPYKTypHOKapKaCHыe (актинспектривовые комплексы); 3) белки, обеспечивающие подвижность клеток и субклетоq ных структур (белки микротрубочек и микрофиламентов). 27
Таблица 3 Белковый u лuпuiJныu состав некоторых .lИе.мбраи ЖU80тиых u бактерuалъиых !Слеток Отношение Мембраны Основные белки Основные липиды липид/белок по массе су- XOI'O вещества) Миелин Основный ФХ 10 %, 34 человек белок ФЭ20 %, липофилин ФС8,5%, протеолипид CM8,5%, rанrлиозиды 26 %, холестерин 27 % Мембраны Родопсин ФХ 41 %, 1 дисков бык ФЭ39%, ФС 13 %, следы холестерина Эритроциты Белок полосы 3, ФХ 25 %, 0,75 человек rликофорин, ФЭ 22 %, спектрин, ФС10 %, rлицеральде- CM17 %, rид.3-фосфат холестерин 25 % деI'llдроrеНRза Мембраны АцетиJIXОЛИНО' ФХ 24 %, 0,50, 7 ХОЛИНерrиЧе вый рецептор ФЭ23%, CKOro рецеп- ФС 9,6 %, тора Torpedo холестерин 40 % marmorata Саркоплазма. Ca 2 +-АТФаза ФХ 66 %, 0,660, 70 тический ФЭ 12,6 %, ретикулум ФИ8,1%, кролик холестерин 10 % ПУРПУРНая Бактериородоп- Фосфатидилrлицерол 0,2 мембрана СИН фосфат 52 %, Halobacterium rликолипиды 30 %, llalobium нейтральные лили. ды6% Для высвобождения из мембраны интеrpальных белков необ ходимо использовать детерrенты или ОР1'анические растворите- ли. Детерrенты разрушают липидный бислай И связываются с неполярными участками мембранных белков, контактирующи- ми с 1'идрофобной областью бислоя. Ин.теzральн.ые белJCU пред ставляют собой rлобулярные амфифильные макромолекулы, Бза имодействующие и с 1'идрофобными, И С rидрофильными компо 28
нентами мембраны. Ос()бенностью их структуры ЯDЛJIe'l'Сl НЫСО'" кое содержание аспиральных учас'l'КОВ и учас'rков с кон:ф()рrvrа цией статистическо1'О клубка. Степень поrружени,я ИН'l'er'раЛl,'" ных белков в липидный матрикс определяется их аМИlЮl<:ИСJ!О'['" ным составом (количеством аминокислотных остаткОВ с IltПО лярными боковыми радикалами) и трехмерной прос'rранс'l'Нt.Ш: ной С'l'руктурой. Эти белки выполняют в мембране 'rранспОР'1'- ную, рецепторную и ферментативную функции. К ним 0'1'110<':>1'1' rликофорины, А'l'Фазы, цитохром Ь 5 , родопсин, бaI<:'l'ериоро,дон., син и др. Следуе'l' O'l'ме'I'ИТЬ, что с высоким разрешением yc'ra. новлена CTpYК'I'ypa 'I'ОЛЬ:КО бактериородопсина, однако и 11 ,УХ'ОМ случае положение белка относительно липидно1'О БИСJIОЯ не он, ределено однозначно. Детальное исследование и:нтю'раЛЬJ:10I'О мембранноrо белка должно включать эксперимеН'l'аЛЫIое иаУЧt,. ние ero ТОПО1'рафии. Для ЭТО1'о используют целый арсеиал ме'I'О.. дов: протеолиз, ИММУНОЛО1'ические методы (применение мОНtll<:ЛО- нальных и поликлональных антител про'rив пептидов, COO'l'Ht'1'" ствующих определенным областям беЛI<а), химическую модифн.. кацию (например, солями диазония), 1'енетические подходы. Различия периферических и интеrральных беш<.оn оnредеДJ-I" ют степень связывания их с мембраной, но не способ их nРИ1(.Р(11- ления к бислою. На рис. 6 показаны способы прикрепле:ния БСJI- ков к мембране: 1 связывание с "якорными" белками, поrруженными в би слой. Примеры: FlqaCTb Н+А'I'Фазы связана с F о .час'1'ЬЮ, lЮI'РУ. женной в мембрану; сукцинатдеrидроrеназа, неl<:оторые 6СJп."и ци'rоскел:ета; 2 связывание с поверхностью бислоя. Эти взаимодеЙ:с'l'ВИ,Н имеют либо электростатичеСI{УЮ природу (а), например. миелIХ- новый основный белок, либо l'идрофобную, но практи:чеСI<:И бtЗ поrpужения в бислой (6), например, пируватоксидаза, фОСфС>.1IИ. пазы; 3 связывание с помощью 1'идрофобноро "якоря". Ци'rо.. хром Ь 5 имеет короткий концевой сеl'мент из неполярных амино кислотных OC'I'aTKOB (а). Некоторые белки использую'r 13 качо.. стве "якоря" ковалентно связанные с ними жирные :КИслО'!'Ы или фОСфОЛИIlИДЫ, например, щелочная фосфатаза эукариот (б); -1 пересечение мембраны 'I'рансмембранными бел:ками. I'ли кофорин имеет одиночный трансмембранный cerMeHT (а), а лаI<:.. топермеаза и бактериородопсин нескодько (6). 2Н
{f .. 1 а б а б r f 3 а б 4 Рис. 6. Способы прикрепления белков к мембране. Объяснения в тексте Мембранные беЛЕИ эукариот MorYT быть ковалентно связаны с липидами. Их подразделяют на три rруппы: белки, связанные с миристиновой кислотой (14:0): катали тическая субъединица сАМРзависимой протеинкиназы, NADPH цитохром Ь5редуктаза; белки, связанные с пальмитиновой кислотой (16:0): poдo псин, анкирин; белки, связанные с rликозилфосфатидилинозитолом: аце- тилхолинзстераза, 5'-нуЕлеотидаза, щелочная фосфатаза. Белки, связанные с жирными кислотами, по-видимому, лока лизован:ы в основном на цитоплазматической поверхности плаз матической мембраны, а беЛЕИ, взаимодействующие с фосфатиди линозитолом, на наружной. Миристиновая кислота присоеди няется к белку через амидную связь с N-концевым rлицииом, паль митиповая: путем образо:ван:и:я тиоэфирной связи с цистеином ИЛИ mдроксиэфирной СВЯЗИ с серином и треонином. Эти амипо кислотные остатки расположены внутри основной части полипеп- тида вблизи трансмембранных участков, как правило, на цито плазматической стороне. Связь белков с производными фосфати дилинозитола локализована на С-концевом участке аминокисло ты. Липиды присоедин:.яются к белку либо посттрансляционно, либо одновременно с трансляцией на рибосомах (котрансляционно ). Поверхностные белки клеток млекопитающих, а также боль- шинство рецепторов и транспортных белков почти все1'да rликози 30
лированы. ОлиТ'осахаридные остатки Moryт защищать белки от npо теолиза или участвовать в узнавании и адrезии. Выделяют две rруп пы олиrосахаридных структур мембранных rликопротеи:нов: Nrликозидные ОЛИ1'осахариды, связанные с белками через амидную Т'руппу аспарarина; О1'ликозидные олиrосахариды, связанные через rидро ксильные 1'руппы серина или треонина. rликофорин А мембраны эритроцитов rликозилирован пу тем присоединения одно1'О Nrликозидноrо олиrосахарида и 15 ce рин/треонинсвязанных олиrосахаридов. Наиболее детально исследован белковый состав эритроцитов млекопитающих (табл. 4). Классической работой по электрофоретическому разделению белков мембран эритроцитов человека является исследование Фейрбанкса и соавт. (1971), в котором предложена номенклату ра rrолипептидных полос, выявляемых в солюбилизирова:нной с помощью додецилсульфата натрия (ДСН) мембране. Этой HOMeH клатурой пользуется в настоящее время большинство ученых. Наличие сетчатой структуры, выстилающей внутреннюю повер хн ость мембраны эритроцита, было обнаружено непосредственно с помощью электронной МИКРОСI<.ОПИИ после обработки клеток неионным детерrентом тритоном XlOO. При определенных эксперимен'rальных условиях (в среде с высокой ионной силой и при низкой температуре) применение ЭТОТ'О детерrента позволя ет полностью солюбилизировать липидный бислой и интеrраль ные белки. При э'l'ом остается сеть белков, сохраняющая ИСХОk ную форму клетки, которая представляет собой me-мбраltliЫЙ СICе. лет (lcapICac) эритроцита. Он 'l'естируется в виде двухмерной сети филаментов, длина которых зависит от особенностей приrотов- ления препарата для микроскопии. Необходимо отметить, что белки, близкородственные компонентам цитоскелета эритроци тов, обнаружены в ряде неэритроидных клеток. В связи с уни версальностыо данной системы следует более подробно paCCMOT реть структуру и свойства некоторых цитоскелетных белков. 1.2.2. ЦuтОСICе.лет (-ме-мбранпый ICарICас) Основными компонентами мембранноrо скелета эритроцита являются спектрин, актин, анкирин, а также белки полосы 4.1 и 4.9. Мембранный скелет содержит около 50 % всех белков, npи СУТСТВУ1ОЩИХ в мембране. 31
Таблица 4 Свойства, степень ассоциации и ФУJtlщии Jtшсоторых эритро- цuтарJtых мембранных беЛlCов Число Пептидю:ur Молекуляр. моле. Степень Связь с н 11Я масса кул на Функция белками фрroщия субъединицы клетку, ассоциации х 105 Полоса 1 240000 2,2 Димеры Участвует в Полоса 3 (спектрин) 260000 (а) полос 1 и 2 формировании (сдолосоi1: 1), Полоса 2 220000 () образуют м:ембранноrо анкирин (с (спектрин) те1'рамеры и скелета полосой 2), ОШ1rомеры полоса 4.1 Полоса 2.1 215000 1,1 Мономер Связывает спек. Спектрин, 165000 трин с мембра. полоса 3 ной через белок (анки рин) полосы 3 Полоса 3 8900095000 12 Тетрамер в Транспорт не. Анкирин, равновесии орrанических полосы 4.1 и с димерами анионов, вза:и. 4.2, rликоли, мосвязъ с мем- тические бранным ске. ферменты летом Полоса 4.1 7800080000 2,3 Димер Связывает СпеКТРЩI, мембранный rликофорин скелет с инте. rральными бел. ками; стабили. зирует спект. рин .актин овые взаимодействия Полоса 4.5 5200059000 О, 71,4 ? Системы '1 транспорта моносахарИДОJl и нуклеозидов Полоса 4.9 4500048000 1 ? Связывание Актин актина Полоса 5 43000 5,1 ОЛИI'Омеры Участвует ]! Спектрин, (актин) из 1217 формировании полоса 4.1 субъединиц мембранноrо скелета Полоса 6 35000 4,1 Те1'рамер rлицералъде. Полоса 3 I'Ид-з.фосфаТде- rидроreназа rликофо- 2900031000 2 Димер Место Полоса 4.1 ринА прикрепления rликофо 23000 мембранноrо рин В скелета rликофо- 2500029000 рин С 32
Спектрин (рис.7), по данным электронной микроскопии, .я:в л.я:ется 1'ибкой молекулой в виде тяжа длиной 100 нм И пред ставляет собой rетеродимер, составленный из двух полипептид Hыx цепей а. и , уложенных антипараллельно, Однако в эритро ци'rах in situ основной формой спектрина является тетрамер, об разованный путем самоассоциации rетеродимеров конец в :кo нец. На обоих хвостовых концах тетрамера имеются центры свя зывания актина и белка полосы 4.1. Путем латеральной ассоци ации тетрамер спектрина прикреплен к актину, ПрИСУ'l'ствующе му винтактной клет:ке в виде олиrомеров из 1217 субъеди ниц. Каждый такой протофиламент а:ктина соединен в среднем с 6 тетрамерами спектрина, :которые друrим концом связаны с co седними протофиламентами актина. Предполаrают, что белок полосы 4.1 облеrчае'r ассоциацию спе:ктрина с актином. Спе:ктрин имеет также центры связывания анкирина, Haxo дящиеся на субъединице и расположенные на расстоянии 20 нм от центра тетрамера. С помощью этоrо якорно1'О белка актин спектриновая сеть прикреплена I мембране через цитоплазмати ческий участок белка полосы 3. Повидимому, это основной Me ханизм прикрепления каркаса к мембране. Цепь бело:к полосы 3 анкирин спеrтрин представляет собой путь, св.я:зываю щий наружную и внутреннюю поверхнос'I'И мембраны эритроци та, позволяющий осуществлять контроль за протеrсанием BHYТ риrшеточных событий на уровне ОР1'анизма (см. 1'лаву 2), Ycтa новлено, что поддержание нормальной структуры мембранно1'О каркаса эритроцита возможно при определенном оптимальном содержании АТР и двухвалентных катионов (прежде Bcero Са 2 +) внутри клеток. По-видимому, степень фосфорилирования KOM 4 Ри,,', 7. Схема орrанизации спектринаК'l'ИНОБОЙ сети: 1 липидный бислой; 2 интеI'pальные белки; S актин; 4 'reтpaмep спек'rрина 3. Заказ 3788 33
понентов мембранноrо скелета определяет сродство Ca 2t к мемб рапным белкам. В свою очередь, ионы Са2\- обусловливают проч- ность связи отдельных компонентов мембранноrо каркаса. В связи с этим реrулирование свойств последне1'О, а, значит, и целой клет ки, может осуществляться за счет изменения соотношения [АТР]/[Са 2 +]. Мембранный скелет эритроцита наиболее полно охарю,те ризованная разновидность цитоскелета эукариотической клет ки. В прокариотических клетках наличие цитоскелета не выяв лено. В целом цитоскелет эукариот представляет собой слож- ную сеть волокон, обеспечивающих механическую опору для плаз матической мембраны, определЯIOЩИХ форму клетки, местополо жение клеточных орrанелл и их перемещение при делении клет ки. Цитоскелет образуют три типа волокон: 1) микрофиламенты (диаметр около 6 нм), состоящие из aK тина 11 связанных с ним белков; 2) промежуточные филаменты (диаметр 810 пм), состоящие из кератинов; 3) микротрубочки (диаметр 23 нм), состоящие из тубулина. Повидимому, микрофиламенты участвуют в таких мембран- ных процессах, как рецепторзависимый эндоцитоз, пэтчиНl' и кэп- пин1' аНТИ1'енов на клеточной поверхности, цитокинез, клеточная подвижность. Микротрубочки образуют цитоплазма'l'ическую сеть, связывающую плазматическую мембрану с различными суб кле'l'ОЧНЫМИ н:омпонентами. Следует отметить,что одной из за,цач мембранолоrии является выявление молекулярных механизмов взаимодействия отдельных компонентов цитоскелета клетки и путей ето реryлирования, KOTO рые обеспечивают нормальное функционирование биосистем. 1.2.3. Ннтеtра-ЛЫlые белlCИ био.меhlбраll в: настоящему времени накоплены сведения о структуре, BHYT римембранной орrанизации, структурной динамике и механиз- мах функционирования некоторых ключевых интеrральных бел ков, 'l'аких как rликофорин, цитохром b s , родопсин, бактериоро допсин, а,ценилатцю;:лаза, транспортные АТФазы и др. OxapaKTe ризуем некоторые из них. rликофорин А является rлавным сиалоrликопротеином плаз матической мембраны эритроцита, определяющим ряд антиrе- нов rрупп крови. Концевые участки ero молекулы выступают по 34
обеим сторонам липидноrо бислоя. На наружной поверхности клетки rликофорин имеет центры, связывающие лектины и ви русы. На долю белка полосы 3 приходите.!! около 25 % обще1'О KO личества мембранных белков ЭрИ'l'роцитов человека. Этот белок имеет два высокоспециализированных домена. С-концевой дo мен встроен в липидный бислой мембраны и отвечает за перенос ХЛОРИk, бикарбонат, фоефатаиионов, поэтому белок полосы 3 называют анионным обмеНRИКОМ. Ero цитоплазматический N-концевой участок представляет собой полипептид с молеку лярной массой 43 кДа, который может быть отщеплен от мемб раны протеолитическими ферментами. Эта область белка поло сы 3 способна связывать аикирин, белки полос 4.1 и "1.2, rемоI'ЛО бин, некоторые rликолитические ферменты. К нему MOryT при- соединяться и дрyrие внутриклеточные белки и ферменты, Ha пример, аденилатци:клаза. Мембраносвязанные ферменты катализируют реакции, как правило, полностью протекающие по одну сторону биомембра- ны. Интеrральные белки-ферменты присоединяют субстраты на одной стороне мембраны и выделяют продукты на ПРО'l'ивопо- ложной C'I'OpoHe. Поэтому каталитическая реакция носит BeK торный (направленный) характер, а сами мембраносв.язанные ферменты называю'l' eelCтOpllbtMU. При этом О1'раниченная про ницаемость мембран обеспечивает разделение Itомпонентов ре- акции и образование концентрационных 1'радиентов. I вектор- ным фермеН'I'ам биомембран относят аденилатциклазу (см. раз дел 2.1.2), продуктом каталитической реакции которой являет ся сАМР универсальный реrул.!!тор важнейших метаболичес- ких процессов в клетке, а также транспортные АТФазы. В табл. 5 преДС'I'авлены сведения о классификации, виде транспортируе мых ионов и локализации различных типов АТФаз. 1.2.4. Струюпура, фуlllcцuою2Jlыlеe U llюсоторые фU3UlСО' хuмuч.еСlCuе свойства Na+, K'/'-АТФазы В 1957 1'. J. Skou' k обнаружил в rOMoreHaTe периферических нервов краба АТФазу, активируемую ионами Na+ и К+ И инrиби- руемую специфическим блока'l'ОРОМ активноrо транспорта одно- * Б 1997 I'. ему была присуждена НобелевскаJI Пр\JМИЯ совместно с П. Войе ром, д. Уолкером за изучеlIИе бещtoц-ферментов, обеспечивающих преобраэование химической и электрической энерrии в Rлетке. 3* 35
Таблица 5 Некоторые АТФазы, уztаствующuе в транспорте UOftOB Тип АТФаз и транспортируемые ИСТОЧНИК Мембрана ионы 1. Е 1 Е 2 -тип Н+ Нкзшие эукариоты Плазматическая дрожжи и rрибы Н+ Высшие эукариоты Плазматическая Растения Животные К+ Прокариоты Е. соН Цитоплазмати. ческая Высшие эукариоты животные Плазматическая Na+/K+ « « Са 2 + « « Са 2 + « Саркоплазмати ческая 2. F1Fотип Н+ Большинство бактерий Цитоплазматиче ская Н+ Эукариоты Внутренняя ми. животные и растения тохондриальная Н+ Растения 'l'ИЛI!КОИДЫ хлоропластов 3. Ва.куолярный тип Н+ Низшие эукариоты ДРОЖЖИ и Вакуоли rpибы Н+ Высшие эукариоты растения Тонопласты Н+ Высшие эукариоты животные ЛИЗ0СОМЫ Н+ « Секреторные rpанулы Н+ « Запасающие I'lнш:улы Н+ « Окаймленные везикулы валентных катионов уабаином. В 70e rr. L. Е. Hokin было по казано, что Na+, К+АТФаза, очищенная до 1'OMoreHHoro состояния, при встраивании в лецитиновые липосомы способна обеспечить сопряжение 1'идролиза АТР с активным переносом (навстречу дру1' друry) ионов Na+ и К+ со стехиометрией Na+/K+/ATP == 3/2/1, Т.е. той же, что обнаружена и для нативных мембран (эритроцитов). Основной функцией Na+, К+АТФазы (Na+Hacoca), присутствую 36
щей в мембранах БОЛЬШИНС'l'ва эукариотических клеток, является установление rpадиентов ионов Na+ и К+, что служит необходи мым условием ре1'УЛЯЦИИ объема клетки, внутриклеточноrо зна ченил рН, процессов дыхания и 1'ликолиза, трансмембранно1'О пе реноса сахаров, аминокислот и нейротрансмиттеров. В возбуди мых клетках rpадиент N а+ составляет движущую силу для быст po1'o e1'o тока внутрь клетки при возбуждении (потенциал дей ствия), для контроля за внутриклеточным содержанием Са 2 + че рез N а + /Са 2 + обменный механизм. Na+, К+АТФаза локализована в различных op1'aHax и тканях. Особенно велико ее содержание в opraHax, осуществляющих BЫ делительную функцию (почки, солевые железы) или выполняю щих электрическую работу (мозr, электрические opraHbl). Na+, К+АТФаза все1'да обнаруживается в наружных плазма тических мембранах клеток и является их маркерным фермен том. Она представляет собой интеrральный белок, пересекающий мембрану насквозь, контактируя как с внеклеточной средой, так и с цитоплазмой. rидролитический центр фермента "обращен" внутрь клетки. Изнутри осуществляется также и активация фер мента натрием. Присутствие калия требуется снаружи. Как 1'Иk ролитический центр, так и участки ионной активации распола 1'аются в 1'идрофильном окружении в тех частях молекулы, KO торые выступают из фОСфОЛИПИДНО1'о бислоя (рис. 8). Молекула фермента состоит из двух субъединиц: <х (липопро теидной природы), содержащей rидролитический центр, способ ный фосфорилироваться в присутствии АТР, и. (rликопротеин). <хсубъединица (каталитическая) "прошивает" липидный матрикс и несет на себе каталитический центр, центры связывания и пе реноса ионов натрия и калия, уабаина и ДРУ1'их сердечных rли козидов (ДИ1'италисрецептор), ионов ма1'НИЯ, ДРУ1'их функцио нально важных продуктов. рсубъединица обеспечивает правиль Бую ориентацию Na+, К.j.АТФазы, отвечает за ее антиrенные свой ства, участвует в ре1'УЛЯЦИИ связывания ионов калия с фермен том. Сиалоrликопротеидный компонент обнаружен и в асубъеди нице Na+, K+-АТФазы почек кролика, электрическоrо opraHa рыб и наплиуса креветок. Считают, что асубъединица, судя по ами но кислотному составу, более rидрофобна, хотя рсубъединица свя зывает большее количество фосфолипидов (табл. 6). Методом амперометрическо1'О титрования нитратом серебра установлено наличие в Na+, К+А'l'Фазе почек свиньи пяти дисульфидных свя 37
Цитоплазма с Iзсубъединица а.субъединица Центр связывания А тр Петля между второй и третьей колоннами участвует в связывании ионов Рис. 8. Схема расположения Na+, R+.АТФазы в клеточной мембране (А. А. Болдырев, 1998) зей и 20 свободных остатков цистеина, большинство из которых относится к разряду замаскированных. Анализ профиля rидрофобности показывает, что в полипеп тИдной цепи а-субъединицы содержится от 6 до 10 потенциаль ных трансмембранных фрarментов (колонн), состоящих из 17 25 3МJiнокислот, уложенных в аспираль (см. рис. 8). N- и CKOH цевыв фраrменты асубъединицы располarаются в цитоплазме. N- концевая часть полипептидной цепи представляет собой rибкий неспирализованный участок, обоrащенный остатками лизина, 1{0 торый принимает участие в конформационных переходах и, воз можно, реrулирует чувствительность фермента к катионам. В N-концевой половине асубъединицы присутствует 4 трансмемб- ранных фра1'мента (M1M4), а в Сконцевой половине, повиди мому, еще 6 (M4Ml0). Между трансмембранными фраrментами М2 и М3 располarается малая цитоплазматическая петля, а между М4 и Мб большой цитоплазматический домен, в состав которо- 38
Таблица 6 ФОСфО.lluпuiJJtыЙ u У2левоi}JlЫй состав uзолuроваllllЫХ а. u {З.суtJ'ОеiJUllUЦ Na+, К+:АТФаЗbl (А. А. ВО.llаырев, 1985) ФОСфОЛИl1ИДЫ, - % с/'.Субъедиюща j3Субъединица Сфинrомиелин 23::1: 6 17 ::1: 4 Фосфатидилхолин 31::1: 5 37::1: 2 Фосфатидилсерин 11::1: 2 11::1: 2,5 Фосфа'l'ИДИЛИН 03ИТОJI 1::1:1 1::1:1 ФосфатидилэтШlОЛамин 33::1: 7 33::!: 4,5 Уrлеводы, :моль/100 :молей а.субъединицu Р.субъединица аминокислот Манноза 0,3 :!: 0,1 2,5 :!: 0,1 rалar{тоза 0,9::1: 0,1 5,5 ::!: 0,4 r JIЮКОЗ!l 0,9::1: 0,2 2,0::1: 0,5 r JIЮI{ОЗU:МИН 2,0 ::1: 0,2 10,1::1: 0,5 rалю{тозамин Отсутствует 0,3::1: 0,1 СиаJIовые I{ИСЛОТЫ 0,35::1: 0,05 3,2 ::1: 0,2 1'0 входит более 400 аминокислотных остатков (Хсубъединицы. Большой цитоплазмаТИ'tIeСКИЙ домен состоит из чередующихся (X спиральных и складчатых участков. Характерной ero особев:но стью является наличие центральноrо ядра, представленно1'О cтpyк турой, которое окружено. о:спиральными участками, соединенны ми rибкими петлями. АТРсвязывающий центр расположен, Bepo юно, в Сконцевой части CTPYKTYPЫ. В большом цитоплазмати ческом домене о:субъединицы находится фосфорилируемый oc таток аспара1'ИНОВОЙ кислоты (Asp 369). Полиnептидная цепь субъединицы уложена в антипараллельные CTPYKTYPЫ. Все изо формы субъеДиницы содержат три дисульфидные связи (Cys121 Cys150, Cys160Cys176, Cys215Cys278 в lизоформе). Молекулярная масса белковых субъединиц в среднем составля ет 90130 (а.) и 3557 () кДа. В очищенных nрепаратах Na+, К+ АТФазы рядом исследователей отмечено присутствие низкомо лекулярно1'О протеолипида с молекулярной массой 1000015000 выраженной 1'идрофобной природы. Ero называют усубъединицей Na+Hacoca. Предполаrают, что подобные протеолипиды способству ют образованию трансмембранных ионных кав:алов в мембране или обеспечивают взаимодействие ОЛИI'омерных белков с бислоем. 39
Основной формой Na+, К+АТФазы, встречающейся у млеко питающих, является изофермент «llтипа. В 1986 {'. G. Е. Shll11 et al. опубликовали данные о полной последовательности трех клонов кДНЕ из мозrа крысы, соответствующих трем различ ным изоформам I<аталитической субъединицы белка «(1, «2, аЗ) и npедставляющих собой продукты трех неодинаковых reHoB. У различных видов животных обнаружено пять изоформ субъ единицы, входящих в состав Na+, К+АТФазы и Н+, К+Аrl'Фазы (1, 2, 3, Н, E и Ы). Деление протомера фермента на « и I)субъединицы услов но: под электронным микроскопом «-протомер выrлядит как цилиндр с диаметром 5,4 нм и высотой 8,0 нм. Для проявления функциональной активности фермента необходим по меньшей мере димер с молекулярной массой 265 000. Однако в последнее время получены активные препараты Na+, К+АТФазы, находя- щиеся в мономерном состоянии. Na+, K+-АТФаза представляет собой векторную систему пер- вично-активноrо транспорта, обеспечивающую сопряжение энер- 1'ии ферментативноrо rидролиза А ТР с трансмембранным проти воrрадиентным переносом Na+ и К+; АТР + HP ----7 ЛDР + Р п' 3Na+ + 2К+ + АТР н 3Na+ + 2Е+ + ЛDР + Р . Dll СП СП DII n Свободная энерrия rидролиза АТР составляет в условиях клет ки "'" 55 кДж/моль, а для транспорта указанных ионов требуется == 46 кДж/моль, Т.е. коэффициент полезноrо действия натриево- 1'0 насоса равен 84 %. Натриевый насос работает в элеКТРО1'ен- ном режиме: за каждый транспортный цикл из клетки "BЫHO сится" один положительный заряд. В результа'l'е на внутренней стороне плазматической мембраны создается отрицательный по тенциал порядка 90 мВ. Используя технику миллипоровоrо фильтрования, У. Топо- mura (1979) обнаружил в ферменте, выделенном в чистом виде из почек свиньи, участки специфическоrо связывания Na+ (3 MO ля/моль фермента) и К+ (2 моля/моль фермента), что СО1'ласуется как со стехиометрией транспорта ионов в оптимальных услови ях (Na+ /К+ I АТР == 3/2/1), так и с результатами определения KO эффициентов кооперативности для ионов, рассчитываемых по aK тивации калием и натрием АТФазной реакции. Еоэффициенты Хилла по ионам равны: п н по К+ 1,7; по Na+ 2,3. Кд для Na+ 40
в Nа'центрах составляе'l' O,20,8 ммоль/л, а в K+цeHTpe 2,2 ммоль/л. Ион К+ обнаруживает высокое сродство не только к собственным центрам (K d "" 0,04 ммоль/л), но и к Nа'центрам. Каждый протомер Na+, К+АТФазы содержит ОЩIН НУl<леотид связывающий центр, локализованный на асубъединице. В при сутствии N а +, M g 21 , АТР он может фосфорилироваться, образуя ацилфосфат на карбоксиле аспара1'ИНОВОЙ кислоты. Образование фосфофермента одна из стадий 1'идролиза субстрата Na', К+ АТФазой, а К I обеспечивает ero быстрое дефосфорилирование (K d для АТФ 0,1+1,0 мкмоль/л). Показано существование двух типов АТРсвязывающих цен'rров, что позволяет получить ДBYX фазную кривую субстратной зависимости фермента. Предложены три rипотезы функционирования фермента (R. W. Albers R. IJ. Post, 1969; J. D. RоЫпsоIl, 1975; К. R. Н. Rep ke, 1979), основанные на результатах как экспериментальных ис. следований, так и теоретическоrо анализа. В основу реакционной схемы (А. G. 8ен, R. W. Albers, R. L. Post, 1969), включающей стадию, протекание которой Tpe бует наличия ВЫСОl\.ОЙ концентрации Mg2+ , положен тот факт, что для ПрОцесса фосфорилировани,н требуе'l'СЯ присутствие 1'o раздо меньшеrо количества Mg 2 + , чем для полноrо 1'ИДРОЛИ'l'И ческоrо цикла: Nя+ M g 2t К:' A'rp + Е 1 -----7 Е 1 Р -----7 Е 2 Р -----7 Е 2 + Р n' Однако этой 1'ипотезе противоречили некоторые эксперименталь ные данные: одновременная, а не последовательная активация Атфазы ионами Na+ и К+ (J. D. RоЫпsоп, 1983); образование в реакционном цикле фосфофермента EIP дО фосфофермента Е 2 Р в отсутствие К+ (У. Tonomura, 1973). В соответствии со схемой J, D. RоЬinsоп (1975) Е Р м едлен: о Е + Р 1 cnOH'raHHO 1 " Mg2+ К+ Е 2 Р .. Е 2 + Рn быстро существуют две 1'руппы субстратов, 1'идролизующихся фермен том разными путями: "калиевые субстраты" (82) должны взаи модействовать с конформацией фермента Е2' "натриевые субстра 81 + El Na+ t 82 + Е 2 41
ты" с конформацией EJ' АТР проходит путь, включающий обе н.онформации фермента и стадии активации обоими ионами. Переход Е 2 н Е] сопряжен с отщеплением ADP и изменением сродства к Na+ и К". Эта схема соrласуется с представлениями о функционирова нии Na+, К+АТФазы в виде димера, протомеры Koтoporo работа ют соrласованно, но находятся на разных стадиях ферментатив Horo цикла: активация натрием одноrо протомера совпадает по времени с активацией калием друrоro. Соrласно rипотезе К. R. Н. Repke (1979) Na+, К+АТФазная активность осуществляется мономерной формой фермента. Присутствие К+ пере водит фермент в димерную форму. В этих условиях присоедив:ение А ТР к центру с низким сродством к субстрату индуцирует "сбрасывание" ADP с соседнеrо цeHT ра, обладающеrо высоким сродством. Это синхронизирует ра- боту димера в противофазе так, что эндерrоническая стадия ферментативной реакции у одно1'О протомера совпадает по Bpe мени с экзерrонической стадией реакции, осуществляемой дpy rим протомером. В пользу этой 1'ипотезы служат результаты исследовав:ий, свидетельствующие о существовании rеометри, ческих различий между нуклеотидсвязывающими центрами двух типов, соответствующих двум значениям КМ для АТР. Однако различные модификации схемы R. W. Albers R. L. Post не имеют принципиальной разницы и основаны на воз- зрениях, соrласно которым каталитический цикл Na+, К' -АТФа зы представляет собой чередование двух основных конформаций фермента (Е] и Е 2 ) в фосфорилировавном и дефосфорилирован- ном состояниях: 3Na+,ATP Е "- 1 1 " 3Na+' E1'ATP " [3Na+]E] Р 2 2K+ 6 2К+ 3 3Na+ [2К+]Е 2 .. 2К+' Е 2 Н 2 О ./ 4 Е 2 Р 5 Катализ начинается, КО1'да фермент находится в конформа ции El' Эта конформация обладает высоким сродством к АТР и 42
ионам натрия с цитоплаrзматической стороны мембраны. Связы вание ионов натрия активирует фосфорилироnание фермента по остатку аспара1'ИНОВОЙ кислоты. Добавление ионов калия к фос фоферменту активирует rидролиз ацилфосфатной связи и при водит к освобождению неОР1'аническо1'О фосфата, причем ион К' действует с внен:леточной стороны мембраны. В формировании представлений о механизме переноса ионов через мембрану cbI1' рало свою роль открытие в середине 80x 1'1'. окклюдированных (поrлощенных) катипНОR. Было установлено, что на определен ных стадиях катали'rическо1'О цикла ионы натрия и калия ока. зываются недоступными с обеих сторон мембраны, Т.е. он:клюди рованы внутри последней. Открытие окклюдированных ионов явилось дополнительным apryMeHToM в пользу модели транспорта катионов Na+, К+АТФа зой, описывающей перенос катионов через мембрану как их пepe мещение через канал с калиткой (Р. Lallgel', 1991). СО1'ласно этой модели (рис. 9) l<атионы перемещаются через канал, образуемый полипептидной цепью асубъединицы фермента. При этом BOKpy1' катиона происходит формирование энерrетическо1'О барьера (Ka литки), которая О'l'крывается и закрывается при фосфорилирова нии дефосфорилировании белка. Собственно перемещение ИОНОВ представляет собой серию ДИСlсретных стадий, КО1'да катион, co еДИБИВШИЙСЯ с l<атионсвязывающим центром (при этом канал открыт только с одной стороны), переходит в окклюдированвое состояние внутри канала (lСанал ОТКРЫТ.с обеих сторон), а затем освобождаетс.!-I с противоположной стороны мембраны (канал OT крыт с противоположной стороны мембраны). Т. НеХllт et 1'1.1. (1970), изучая влияние рН на КМ и v шах мемб paHOCB.!-Iзанной Na', К+АТФазы из ткани МОЗ1'а крысы, показали наличие в ферментсубстратном комплексе ионизирующихся 1'рупп со значениями рК: 7,1; 7,5; 7,6, которые соответствуют величинам рК для амино1'РУПП rистидина, цистина и аамино кислот соответственно. А. В. Кравцовым (1978) при исследовании солюбилизирован ной ДИ1'итонином Na+, К+АТФазы из ткани МОЗ1'а быка было по казано, что в ферментсубстратном комплексе выявляются две ионизирующиеся 1'руппы со значениями рК 7,25 и 7,70 (т.е. близ кими к приведенным выше значениям для мембраНОСВ.!-Iзанноro фермента) рис. 10, а. Величины рК этих 1'рупп соответствуют значениям для аNН21'РУПП аминокислот и аNН21'РУППЫ цис 43
Среда Рис. 9. Схема реalЩИОННОI'О цикла Na+, К+.А'l'Фазы (А. А. Болдырев, 1998) Примечание. Шесть основных последовательных реющий вклю, чают связывание ионов натрия Е1,конформером, eI'O взаимодействие с А'l'Р и образование фосфорилированноI'О ИН'l'ермедиата (стадия 1), ОК' клюзию ионов Na+ конформацией EIP (стадия 2), активируемый иона. ми MgZ+ переход EIP ---+ Е 2 Р, приводящий к высвобождению ионов Na+ во внеклеточную среду и связыванию с ионным центром внеклеточно. I'O калия (стадия 3), окклюдирование ионов К+ (стадия 4.), дефосфори. лирование фермента, вследствие KO'l'OpoI'O ионы н:+ высвобождаются во внутриклеточное пространство (стаДИJi 5), и переход конформации Ez в конформацию Ер обусловливающий начало HOBOI'O цикла (стадия 6). тина. :Км,АТР для солюбилизированной Na+, :К+АТФазы зависит от рН среды: при переходе от фИЗИОЛО1'ических значений рН в ще лочную область КМ существенно уменьшается (рис. 10, 6). Кри вая зависимости Р:К М от величины рН представляет собой BOCXO дящую ветвь, что свидетельствует о присутствии в ферментсуб стратном комплексе ионизирующейся rруппы с р:К 7,60. Таким образом, и в случае rидролиза субстрата солюбилизированным ферментом процесс контролируется аминоrруппами со значени ями р:К в узком интервале рН: 7,25 7,70. :Ее моменту создания модели активно1'О центра Na+, K-1АТФа ЗЫ, реконструированной с помощью методов ЯМР и ЭПРспект роскопии, не была установлена природа rруппы, высвобождаю щей протон при переходе из Кформы В Nаформу (или акцепти рующей erO при превращении). Ею может быть NН2rруппа ли 44
2,5 2,0' / 1,5 , , 1,0 1,0 6 7 8 9 6 7 8 рН а б Рис. 10. 3ависимоC'lЪ Щ<ТИВНОС'I'И солюБИJIИЗИРОВанной Na+, К'АТФа. зы от рIl: а рII.заВИСИМО<'lЪ Nа',К+.АТФаэы (lg v f(pH)); 6 записи. мос'1Ъ KJA'I'P) Na+, К'.АТФазы от рН зина (J. 8koll, 1983) или ОНrруппа тироаина, имеющая близкое значение рК (8,0). Обе rруппы идентифицированы Б активном центре Na+, КtАТФазы. Для N а 1, К' Аrl'Фазы обнаружена нелинейная зависимость фер ментативной активности от температуры 13 I<оордина'l'ах Аррениуса (рис. 11). В температурном интервале 10 . 35 "С наблюдается "пе ре1'иб" на rpафике Аррениуса в области 20 "С, при этом энер1'ИЯ активации каталитичеСI\ОЙ реакции повышается с 18 Iщал/моль при температурах выше 20 "С дО 30 юшл/моль при более низких темпе ратурах (А. А. Болдырев, 1988). На основании результатов сравни тельноro изучения темпера'I'УР ной зависимости активности v, МI<МОЛЬ Pn/Mr В Ч Na", К'А'l'Фазы и исследования ме'родом ЭПР параметров, xa рактеризующих струн:турное co G'Тояние мембранных липи,цов, автором сделано заключение о том, что коиформационный пе реход молекул фермента при из менени:и температуры в состоя иие с более высокоЙ энеР1'ией aK тивщии обусловлен фазовыми rrерестройками липи,цноro OIёpy жения при условии взаимодей ствия белковых молекул с ли пи,цным матриксом с участием rидрофобныx и элеК'l'ростати ческих сил. Примеча'I'ельным 19v 2,0 I I I I о, 1,5 r-.., ., r-.., r 1 I I РК м 200 20 ос 100 50 20 10 I 3,З 3,4 3,5 10ЗIТ,к1 Рис. 11. ТеМIIера'l'урная зависи мость начальной CI<орости I'идроли. за АТР Na+, К+.АТФазоЙ МОЗI'а 15
является тот факт, что нелинейный характер rpафиков Аррениуса для Na+, К+АТФазы наблюдается лишь в случае использования Б качестве субстрата Arrp, что свидетельствует о выполнении после дним не только функции субстрата, но и МОДИфИI:Cатора. Na+, К+АТФаза способна 1'идролизовать большое количество субстратов: нуклеозидтрифосфаты, ацетилфосфат, умбеллиферон фосфат, карбамоилфосфат, динитрофенилфосфа'r, фурилакри лоилфосфат. Сложная кинетика ферментативной реакции, харак- теризующаяся наличием двух значений К м ' проявляется только при 1'идролизе АТР и СТР; превращения друrих субстратов под чиняются кинетике Михаэлиса. Na+, К+АТФаза активируется при одновременном присутствии ионов Na+ и К. в среде. Вид зависи- мости активности фермента от соотношения Na+/K+ определяет ся природой субстрата реакции. Считают, что струн:турной единицей Na+, Kf-АТФазы являеТСJI димер (a)2' а минимальной функциональной единицей (а)протомер (или а-субъединица). Олиrомерный ансамбль ((а)2димер) АТФазы подцерживается в основном за счет взаимо- действий асубъединиц с цитоплазматической стороны в "районе" АТР-св.язывающих центров, что обеспечивает стабильность четвер тичной структуры, необходимой для проявления функциональной активности белка. Вместе с тем с фунн:циональной точки зреНИJI каждаJI асубъединица в стабилизированном состоянии обладает полной rидролитической и транспортной активностью. Однако воп, рос о биоло1'ИЧеской роли олиrомеров фермента, образуемых в MeM бране, изучен далеко не полностью. Повидимому, наличие оли1'о- мерной структуры Na+, K+-АТФазы обеспечивает возможность pea лизации "rибких механизмов", контролирующих активность MeM браносвязанно1'О фермента (см. раздел 2.3.3). Данные, касающиеся кооперативных взаимодействий междУ ионными центрами и 1'идролизующими субстрат участками, слу жат основой для пред ставлен ий о том, что Na+, К+А'l'Фаза не только структурно орrанизована, но и использует взаимодеЙстви,н между протомерами для реrуляции их активности. При этом величины коэффициента Хиюrа пн по ионам-активаторам отра- жают взаимодействие между ионными центрами, локализован.. ными на каждом протомере, а по субстрату взаимодействие между протомерами. Чувствительность n H по АТР к фазовому состоянию мембранных ЛИПИДОБ подтверждает, что эта величина отражает взаимодействие разных протомеров АТФазно1'О комп- 46
лекса. Напротив, независимость величин 1111 по ионамактивато, рам от фазовоrо состояния мембраны свидетельствует о том, что взаимодействующие ионные центры находятся на одном и том же протомере . Характеризуя натрпевый насос эритроцитов, I. М. GlYnll и 8. J. Karlisll указали на существование четырех "дискретных pe жимов" e1'o работы, соответствующих определенным частным биохимическим реакциям АТр.фосфоrидролазной последователь. ности: 1) N а" /К '-обмена; 2) нес()пряженно1'О выхода из клетки Na+; 3) Nаl/Nа"-обмена; 4) IC+/IC.обмена. При отклонении от оптимальных условий насосная функция Nat, К+АТФазы существенно изменяется. В ОТСУТС'l'вие К+ во внеш- ней среде и в присутствии Na' с обеих сторон мембраны система осуществляет эквимолярный обмен ионов Na+ через мембрану, измеряемый с помощью изотопов Na+. Для этоrо процесса требу- ется присутствие АТР и ADP. Неrидролиауемые анало1'И А1'Р, в том числе P,y-NН-А'l'Р, заменить аденозинтр:ифосфат не Mo1'YT (1. М. Karlish, S. У. GlYnll, 1975). Na" /Nа+обмен сопровождается АТР / ADРобменом: АТР, MgZ+, NIl' Е . . EP ADP, Mg2" , NI" Аналоrичным образом в отсутствие ВI3:у'l'рикле-fочноrо N а 1, но В ПРИСУ'!'ствии К I С обеих сторон мембраны N al-Hacoc осущеСТDЛЯет неэлеКТРО1'енный обмен К' через мембрану, не ПрИБОДЯЩИЙ к со- зданию калиевоrо rpадиента. При э'!'ом требуется присутстnие внут- риклетОЧНОl'О Р" или АТР. Кt/КI-обмен осуществляется OДHOBpe менно с реакцией; К' EP _........... Е 2 + Р Н Р,К' В отсутствие К. и Na+ во внешней среде Na'-Hacoc может обес печивать несопря:женный выброс Na+, осуществляющИйся в про- цессе 1'идролиза АТР. Стехиометрия работы насоса в этом режи ме составляет 23 иона Na+ на 1 моль АТР. Nа+.А'rФазная реакция отличается по ряду свойств от Na+, К+- АТФазной реакции: она подчиняется кинетике Михаэлиса, :имеет линейный rра.фик Аррениуса, требует меньшей концентрации MgC1 2 и инrибируется высокими I\Онцентрациями А'!'Р, хотя почти He 47
чувствительна к Рп' Разница между несопряженным и сопряжен ным выбросами Na+ состоит в чувствительности к АТР. Несопр.я: .iI}енныЙ выброс N а + ДОСТИ1'ает максимальной скорости уже при 1 мкмоль/л A'l'P, а Nа+/К+обмен требует миллимолярных KOHцeH траций субстрата. Следовательно, два типа функционирования Na+Hacoca, как и два способа работы А'l'Фазы, отличаются функ ционированием лишь субстратных центров с высоким сродством (Na+, К+АТФаза) или обоих типов субстратных центров. Чувствительность Na+, K-IАТФазы и Na+Hacoca к одновалент ным катионам одинакова. Этот факт можно рассматривать как доказательство идентичности центров активации Na+, К+АТФа зы натрием и калием и центров, обеспечивающих их транслока. цию. Об этом же свидетельствует соответствие стехиометрии транспорта ионов (Na+/K+ == 3/2) количеству ионсвязывающих участков на одной молекуле фермента. Процесс переноса ионов через мембрану с помощью натриево ro насоса не требует затрат энерrии, если исключить работу по переносу нескомпенсированно1'О заряда Na+ против трансмемб ранноro потенциала при электроrенном транспорте. На Э'l'0 YKa зывает существование в схеме натриевоrо насоса Na+ /Na+ и К+ /К+обменов, для которых АТР требуется лишь кюс Iщфактор, но не источник энерrии. Можно предпола1'ать, что энеРl'ИЯ A'l'P при работе Na+, К+АТФазы затрачивается на "узнавание" ионов Na+ и К+, Т.е. на связывание и сбрасывание ионов с "нужной" стороны мебраны. В норме катионы связываются с той ее CTOpO ны, 1'де их мало, а сбрасываются туда, rде их концентрация вели ка. Такие изменения сродства ионсвязывающих центров сопря жены с конформационными изменениями фермента, которые и ЯВЛJIЮТСЯ rлавными энер1'оакцепторными стадиями реакцИИ. Ионы Na+ и К+ транспортируются Na+HacocoM в частично деrидратированном состоянии. Модификаторы rидрофобных вза имодействий влияют в первую очередь на калиевую активацию, а вещества, разрушающие водородные связи, на натриевую. Из ЭТО1'о можно сделать вывод, что связывание Na+ опосредовано "жесткими" структурами белка, стабилизированными BOДOPOД ными связями наподобие ИОRОфОрНЫХ структур. Ионы Na+ дe rидрируются при переходе из водной фазы в полярную полость молекулы фермента. Ионы К+ де1'ИДРИРУЮТСЯ при переходе в rидрофобную область молен:улы. Следовательно, Na+, К+АТФаза "различает" ионы Na+ И К+, ис[юльзуя различные пути их rидра 48
тации. При отсутствии внеклеточно1'О К+ Nа+/К+насосы Mo1'YТ .осуществлять элеКТРО1'енный транспорт протонов, и этот TpaHC порт осуществляется, повидимому, конформацией Е 2 насосов. К инrибиторам Na+, К+АТФазы относятся олиrомицин, уаба ин, диметилсульфоксид, уксусный альдеrид, ДИ1'итонин, Тимеро зал, этилмеркуриат. Вместе с тем необходимо отметить, что дей ствие этих соединений на N а+, К+ АТФазную активность может быть различным. Механизм деЙСТВИJI модификаторов трудно поддается клас сификации: здесь есть areHTbl направленно1'О действия (8Hpea reHTbl: тимерозал, этилмеркуриат, уксусный ан1'ИДРИД), веще ства, модифицирующие rидрофобные взаимодействия (диметил сульфоксид, ОЛИ1'омицин, диrитонин), специфический инrиби тор Na+, К+ /АТФазы уабаин ( строфантин G), препятствующий rидролизу фосфорилированно1'О фермента. rидролиз одним и тем же ферментом разных субстратов в различных условиях неодинаково чувствителен к модификаторам, что можно объяс нить тем, что исследуемые "частные" реакции ферментативной активности осуществляются разными олиrомерными состояни ями Na+, К+АТФазы. Таким образом, на современном уровне знаний Na+, К+АТФаза представляется олиrомером, в котором взаимодействие между протомерами выражено сильнее, чем между rлобулами белка и e1'o липидным окружением. Количество протомеров в таком KOM плексе определяется, повидимому, той конформацией белка, KO торую ему диктует ЛИПИДное микроокружение. Сами взаимодей ствия между протомерами контролируются липидами. Показа но, что взаимодействия между протомерами фермента в nроцессе rидролиза АТР не остаются постоянными: доля крупных ассоци атов АТФазы возрастает на стадии взаимодействия ее с ионами калия, а подвижность этих ассоциатов в мембране резко увели чивается при связывании АТР. Особый интерес представляет проблема вовлечеНИJI N а + , К+АТФазы в общие пути передачи СИ1'нала в клетке, а также ее фосфорилирование протеинкиназами и взаимодействие с BHYT риклеточными белками (см. 1'лаву 2). 'Установлено, что асубъ единица фермента является мишенью для сАМРзависимой' про теинкиназы (протеинкиназы А) и фосфолипидзависимой проте инкИназы С н ионов кальция. Противоречивые данные (инrиби рование, активация, отсутствие эффекта) о характере влияния 4. 3аказ 3788 49
фосфорилирования: Na+, K-1.АrrФазы протеинкиназой А связыва ют с зависимостью "ответной реакции" белка от e1'o конформа ционноrо состояния, измен,яющеrося в результате взаимодей ствия фермента с белками цитоскелета, в частности, аJ:\ТИНОМ. Однако более детальные исследования по этому вопросу пока отсутствуют. 1.2.5. Структура, функциональные и некоторые физико, ХИlftи<tеСlCце свойства ацетЦЛХОJlUllэстеразы Один из важнейших биохимических механизмов, лежащих в основе деятельности нервной системы, это химический про цесс, связанный с биосинтезом, выделением и распадом ацетил холина. Скорость ферментативно1'О rидролиза последнеrо И1'рает ключевую роль в функционировании нервной системы. Измене ния в кинетике ферментативно1'О разрушения ацетилхолина при водят к серьезным нарушениям функций этой системы. Одна из областей фармаколо1'ИИ разрабатывает способы лечения заболе ваний нервной системы путем применения лекарственных средств, влияющих на кинетические параметры rидролиза aцe тилхолина холинэстеразами. После обнаружения Дейлом в 1914 1'. в крови фермента, ка. тализирующе1'О процесс расщепления ацетилхолина, было пока зано ШИрОJ:\ое распространение это1'о фермента в различных TKa нях животных. В 40e 1'1'. было высказано предположение о cy ществовании двух основных типов ферментов, 1'идролизующих эфиры холина, "истинных холинэстераз" и "псевдохолинэсте раз". Эти ферменты относятся к сериновым 1'идролазам и COOT ветствуют двум rpуrшам БИОЛО1'ичеСJ:\ИХ катализаторов: ацетил холинэстеразе (ацетилrидролаза ацетилхолина, ЕФ 3.1.1.7) и xo линэстеразе (аЦИЛ1'идролаза ацилхолинов, КФ 3.1.1.8). Холин эстер азы наряду с 1'идролизом ацетилхолина Mo1'YT участвовать также в межклеточных взаимодействиях. С этим связана специ фическая экспрессия холинэстераз в эмбриоrенезе в определен- ных структурах до формирования ХОЛИНЭР1'ичеСJ:\ИХ синапсов, а также обнаружение их в нехолинэрrических тканях. Ферментативное расщепление ацетилхолина преДС1'авляет co бой реакцию 1'идролиза, протекающую с образованием уксусной кислоты и холина: (СН)зN+СН2СНРС(О)СНЗ + Н 2 О (СНз)зN+СН2СНРН + СНзСООН 50
Основное наЗI:lачение холинэстеразы нервной ткани быст рый rидролиз выделяюще1'ОСЯ ацетилхолина, без KOToporo невоз можна передача нервных импульсов. Обнаружено, что фермента тивный I'ИДРОЛИЗ ацетилхолина может осуществляться не толь ко нервной, но и дРУ1'ими тканями: присутствие холинэстеразы было выявлено в сыворотке и эритроцитах крови, в мышечной ткани, печени, поджелудочной железе. Считают, что холинэсте раза эритроцитов И1'рает важную роль Б клеточной проницаемо сти. Холинэстераза крови и тканей рассматривается как своеоб разный защитный (<<аварийный") фермент на случай знач:итель ных выходов в кровяное русло ацетилхолина при перевозбужде нии нервной системы. К ацетилхолинэстеразам относятся ферменты нервной ткани и эритроцитов, а к холинэстеразам ферменты сыворотки KpO ви, печени, поджелудочной железы и ДРУ1'их opraHoB. Ацетилхо линэстераза катализирует rидролиз ацетилхолина и ацетил метилхолина и не вли,я:ет на rидролиз бензоилхолина и бути рилхолина. ХОJIинэстераза катализирует rидролиз БУТИРИЛХОJIИ на, ацетилхолина, беНЗ0илхол:ина и пропионилхолина, но не дей ствует на ацетилметилхолин. Активность ацетилхолинэстера зы характеризуется отчетливым максимумом при концентра- ции ацеТИЛХОJIина 2'lO4 моль/л и тормозится при ее увеличе нии, в то время как на активность ХОJIинэстеразы не влияет из- бы'rок ацетилхолина. Оптимум pH-действия составляет для aцe тилхолинэстеразы 7 ,58,O, а для холинэстеразы 8,5 (рис. 12). В каталитическом действии холинэстераз обоеrо типа при- нимает непосредственное участие 1'идроксильна,я: rруппа ОДНО1'о из остатков серина, раСПОJIоженноrо на активной поверх:в:ости фермента. Однако такой rидроксил должен быть специфически активирован, чтобы приобрести способ:а:ость к участию в катали- тическом действии. Эта активация может быть осуществлена пу- тем взаимодействия с rруппировкой белковой молекулы, харак- теризующейся величиной рК 5,87,O. Предпола1'ают, что такой 1'руппировкой является остаток 1'истидива. Доказано наличие в холинэстеразах обое1'О типа аниОнной rpуппировки, несущей еди ничный отрицательный заряд и взаимодействующей с катион- ной rруппировкой субстрата ацетилхоли:в:а, а также катион- содержаЩИХ инrибиторов. В активном центре холинэстеразы вблизи серина находитс,я: остаток rлутаминовой кислотЫ. Прове дены расчеты электростатическо1'О потенциала и электрическо1'О 4' к 51
поля BOKpyr наиболее важноro в Ka талитическом отношении "roрла" ацетилхолинэстеразы, включаю щеrо серив, rистидин и I'лутэ.мат. Из результатов исследования рНзависимости действия холин эстераз следует, что их активность связана с функциями rpуппиров ки, рК которой составляет 8,5 10,0. К таким rpуппировкам MO 2 жет быть отнесен I'идроксил тиро зина. В образовании фермеЕ:тсуб 10 cTpaTHoro комплекса ацетилхолин эстеразы участвует в качестве обя зательных не менее трех связей. Во всех современных схемах Me ханизма действия холинэстераз фИ1'урируют: 1'идроксил серина, связанный с и:м:идазолом I'истиди Ha t в качестве постулированной "Уилсоном нуклеофильной 1'руп пировки эстеразноro центра; ионизированная карбоксильная 1'руп па в качестве анионно1'О центра; 1'идроксил тирозина в каче стве кислотной rруппы эстеразно1'О центра. Считают, что каталитический процесс (рис. 13) начинается с образования электростатической связи между катионом субстрата и анионной 1'руппировкой фермента. Нейтрализация отрицатель H01'O заряда одной из 1'рупп белковой молекулы в сочетании с взаимодействием трех метильных 1'рупп при атоме азота aцe тилхолина с окружающими анионный центр rpуппами приводит к существенным изменениям конформации фермента. В резуль тате это1'О 1'руппировки эстеразно1'О центра и соответствующие rруппы субстрата занимают положение, обеспечивающее YCTaHOB ление "наилучшей" комплементарности, а затем образуются свя зи между У1'леродом поляризованной карбонильной 1'руппы и кислородом 1'идроксильной rруппы серина и, возможно, между эфирным кислородом и водородом КИСЛОТНОЙ 1'руппировки (OCTa ток тирозина). Далее происходит переход протона к холину с образованием ацетилированно1'О по I'идроксилу фермента и про тонированно1'О имидазола. Следующий элементарный акт с учас тием воды осуществляется после TOro, как молекула холи на по v, % 100 80 60 40 20 о 5 8 рН Рис. 12. Зависимость CKOpO сти I'идролиза ацетилхол:ина от рН для ацетилхолинэстеразы Torpedo marnlOrato (1) и холин эстеразы сыворотки крови (2) 6 7 9 52
кинет анионный центр фер мента и восстановится отри цательный заряд анионной rpуппировки. Молекула BO дЫ образует связи с карбо нильным кислородом и кис лородом тирозина, в резуль тате че1'О происходит пере ход протона к I"идроксилу ce рина. При этом выделяется второй продукт реакции уксусная кислота и pe1'e нерируется фермент В исход ной конформации. Эксперименты Е. Krejci и соавт. (1991) с направлен ным :м:ута1'енезом показали, что консервативный для эс тераз и липаз остаток аспа раI"ИНОВОЙ кислоты необхо дим для осуществления ими каталитических функций. Повидимо:м:у, электростати ческие особенности поверх ности молекулы ацетилхо линэстеразы не влияют на скорость катализа, которая не зависит от диффузии MO лекул субстрата, а стабили зация переходных состояний в катаЛИТIIческом центре He чувствительна к электроста тическим взаимодействиям. Для выделения ацетилхо линэстеразы из эритроцитов используют метод экстрак ции фермента из стромы ще лочным буфером В присут- ствии нейтрально1'О дeTep reHTa :rвин20 с последую- CHz N:1 \..... NH I CH z COO 1 I ОН I , + "..COCHzCHzN (СНз)з НзС 11 HO тир О I I CH z СН k'Gн i9 2 I H I I I + ';:OCHzCHzN (СНз)з НзС I I Н (Ь I t CHz HNrI '\.....NH I COO 1+ N (СНз)з I 9Н2 o 9Нz он I I СН 2 f1 СН HNt>.t 2 НзС"""'(IН О Н 1 1 I 1 O I Рис. 13. Схема механизма дей. ствия холинэстераз 53
щим фракционированием сульфатом аммония и отделением 1'e моrлобина с помощью кальцийфосфатноrо rеля. Молекулярная активность (т.е. число молекул субстрата, претерпевающих пре вращение на одном активном (каталитическом) центре фермен та в 1 мин в условиях насыщения фермента субстратом) ацетил холинэстеразы составляет (33,5)'105 минl И превышает в 4 5 раз таковую для холинэстеразы сыворотки крови. Зависимость 19 v от l/Т для фермевтативно1'О 1'идролиза эфи ров холи на холинэстеразой сыворотки крови лоmади (1'рафик Ap рениуса) в интервале температур lO25 'с является линейной (рис. 14). В случае 1'идролиза ацетилметилхолина константа Михаэлиса не зависит от температуры, для ацетилхолина и бен зоилхолина не значительно растет по мере ее повышения, а для бутирилхолина суще ственно увеличивается. Ацетилхолинэстераза эри троцита расположена на ввеш ней поверхности мембраны и составляет O,2O,3 % от Bce 1'0 мембранно1'О белка. Она яв ляется rликопротеином, в co став KOToporo входят 1'ликано вые компоненты, содержащие последовательность: этанола мин фосфатманноза l'лю козамин инозитол. Фермент может быть экстраrирован в форме активноrо липопротеи 3 на при обработке мембраны растворами высокой ионной силы, Nадезоксихолатом или 3,5 1/Т.10 З тритоном X100. Удаление липида приводит к полной по тере активности фермента, а последующее добавление фос фатидилсерина (липида, с KO торым он выделяется из MeM браны) к восстановлению ее функциональных свойств. Ig(v max ' 1 0--8) 2 4 2,4 1,6 0,8 3,3 3,4 Рис. 14, 38БИСИМОСТЬ 19v от 1fТ для ферментативноrо rидролиза эфиров холина при действии холин эстеразы сыворотки крови лошади: 1 ацеТИЛХQЛИН; 2 бутирилхо лин; 3 ацетил,Рметилхолин; 4 бензоилхолин 54
Ацетилхолинэстераза состоит из двух одинаковых субъединиц с молекулярной массой, равной 7090 кДа. Каждая субъединица имеет два центра связываНИJI: активный и аллостерический. Aк тивность фермента зависит от ионно1'О состава среды и специфи чески инrибируется ионами тетраметиламмония, производными карбаминовой кислоты и фосфоорrаническими соединениями. Показано, что хлорпирофосметил (ХПМ) являеТся сильным HeKOH курентным инrибитором ацетилхолинэстеразы из эритроцитов че ловека. При растворении ацетилхолинэстеразы в тритоне X100 ее активность и кинетические свойства не изменяются, а также co храняется чувствительность к ХПМ. Предполarают, что на участ ки связывания ацетилхолинэстеразы и ХПМ не влияет 1'идрофоб ное окружение мембран эритроцитов. Ацетилхолинэстераза явля ется aJtлотопньt.М фер.JИентом: каталитические свойства ее суще ственно различаются в растворе и в составе биомембран. Каталитическая активность мембранной ацетилхолинэсте разы находится под контролем CTPYKTYPHoro состояния ли ПИДIЮЙ фазы эритроцитарной мембраны. Фосфолипазы (А 2 , С и D) оказывают на мембраны близкое модифицирующее дей ствие, хотя они характеризуются не только различной специ фИЧНОСТЬЮ (природой разрываемых в ЛИI!идах связей), но и пространственной асимметрией действия. Панкреатическая фосфолипаза А 2 и фОСфОЛИIIаза D 1'идролизуют липиды, pac положенные на обеих сторонах эритроцитарной мембраны, а фосфолипаза С rидролизует фосфолипиды, расположенные на внутренней ее стороне. Модификация ЛИПИДНОI'О бислая с внут- ренней стороны мембраны приводит к изменеFj:ИЮ CTPYKTYP Horo состояния липидов, а затем и белков, расположенных снаружи. Косвенным свидетельством возможности такой трансмембранной передачи CTPYKTypH01'o сиrнала может слу. жить отрыв ацетилхолинэстеразы от мембраны под влиянием фосфолипазы С (И. Д. Волотовский И соавт., 1987). Обработка любыми фосфолипазами как бы превращает мембраносвязан ный фермент в квазисвободный. Следует отметить, что поскольку функциональные свойства ацетилхолинэстеразы существенно зависят от CTPYKTypHoro co стояния мембраны, то определение уровня ее активности исполь зуют в качестве конформационноrо маркера для оценки различ HOI'O рода модификаций мембранных компонентов под влияни ем физикохимических факторов (см. 1'лаву 4). 55
Кроме To1'o, активность холинэстераз изменяется при МНО1'их патолоrических процессах: заболеваниях печени, почек, остром инфаркте миокарда, онкозаболевавиях, в послеоперационном пе риоде, при интоксикации фосфорорrаническими соединения:м:и, поэтому эта характеристика белковой молекулы может быть ис пользована в энзимодиа1'ностике. 1.3. уrЛЕВОДЫ МЕМБРАН Уrлеводные компоненты биомембран входят в состав rлико липидов, rликопротеинов и мукополисахаридов. В табл. 7 CYM мированы сведения о составе, локализации и функциях выше- названных структурных элементов мембран. Таблица 7 У'zлееоiJные компоненты 6иомем6ран Соединения Уrлеводные Друrие ЛО1Сализация Функции 1Сомпоненты компоненты r ликолипиды rлюкозз., rаЛaRтоза, Цервмид. Плазматиче- Участие в (т ликосфинrо- проиэводные эми- N.ацилъное ская: мембра- меж:клеточных липиды) носахаров rлю1СОЗ- производное нз.,мембрана взаимодей- амин а и rалактоз- сфинrозина митохоид- ствиях, обеспе- вмина, ФУRоза, сиа. рий и эндо- чение антиrен- ловые Itислоты плазматиче- ных свойств ской сети мембран rликопро- 48 OCTaTRoB БеЛRИ Плазматичес- Обеспечение теины сахз.ров: rлюкоза, (rликозиль, :кие мембра- антиrенных rалактоза, манноза, ную связь ны, ме-мбра. свойств ме-м- производные rлю- образуют ас- ны зндопла.з- брав, участие в Rозэмнна и парarиноJШЯ мз.тической иммунолоrиче- rалактозамина и rлутамино-- се')'и с:ких реакци- вая RИСЛОТъr, ях; в процес- серии, трео- синrе пост- ннн) трансляцион- ном формиро- вании слож. ных молеltул со специфиче- скими Фун:к- циями; в ста- билизации бел- :ковых молекул Му:кополисаха- IIлaзматиче- Участие в фор- риды ская: мембра- мировании по- rиалуроно:ва.я Мономер дисаха- иа верхностиоro кислота рид (rлю:куроноJШЯ потенциала, в 1<.ислота + ацетил- осуществлении rлюкозамин) межклеточных Хондроитин, r люкуроновая: Сульфат контактов и сульфат кислота + ацетил- транспорте rалактозамин веществ 56
В состав клеточных мембран некоторых орrанизмов входит хитин rомополимер ацеТИЛ1'люкозамина (у беспозвоночных животных). муреин или пеПТИДО1'ликан (у бактерий), мономером KOToporo является дисахарид муропептид (ацеТИЛ1'люкозамин + + ацетилмурамовая: кислота). В плазматической мембране количество уrлеводов невелико по сравнению с белками и липидами и составляет от 2 до 10 % сухой массы мембран. В распределении уrлеводов также, как бел ков и липидов, наблюдается асимметрия: они локализованы на той стороне мембраны, котора.я: не контактирует с цитозолем. В качестве биохимическоrо маркера для изучения локализации и выделения локусов плазматической мембраны, содержащих y1' леводы, используют лектины белки растительноrо и животно 1"0 происхождения, специфически связывающие сахара. Их Ha зывают уrлеводраспознающими белками, отличающимися от фер ментов и антител и не вызываЮЩIJМИ ХIJмические превращения в распознаваемом ЛИ1'анде. К классу лектинов (фитоreмar1'ЛЮТИНИНОВ), которые способны а1'1'лютинировать клеТIJ,;И млеКОI!ИТающих, относится KOHKaHaBa лин А. Он является 1"ликопротеином, С9СТОJIЩИМ из двух субъеди ниц (изолектинов) с молекул.я:рной массой 260 кДа; каждая coдep жит 237 аМИНОКIJСЛОТНЫХ остатков; при рН > 7,0 представляет собой тетрамер. Этот rликопротеин имеет два центра связывания Са 2 + , два центра связывания ДРУ1'их металлов, два центра связыва ния сахаров. Кон канав алин А способен к взаимодеЙСТВIJЮ со спе цифическими уrлеводными rруппами на поверхности клеток, а именно с D1"ЛЮКОЗОЙ и Dманнозой интеrpальных белков и, в час тностц, 1'ликофоринов. Образует нерастворцмые комплексы с био полимерами, содержащими множественные аD1'люкошrранозиль ные, аDманнопираноз:ильные и Dфруктофуранозильные OCTaT ки в качестве невосстанавливающих :r:сонцов. Лектины IJмеют важное практическое значение для медиц:й: ны, связанное с их способностью "различать" эритроциты трех rpупп крови (А, В, О) по структуре ОЛИ1'осахаридных компонен тов rликофорина. Специфические 1'ликопротеИБЫ обнаружива ются на поверхности не только эритроцитов. но IJ ДРУ1'их клеток живых тканей. Именно вследствие валичия этих 1'ликопротеи нов при трансплантации op1'aHoB неоБХОДIJма идентичность TKa ней донора и реципиента. Кроме тoro. установлено, что HeKOTO рые лектины вызывают избирательную а1'rлютинацию злокаче 57
ственных опухолевых клеток, указывающую на различия в CTPYК туре их поверхности по сравнению с нормальными клетками. Связывание лектинов с поверхностью плазматической мембраны может индуцировать изменения в расположении поверхностных беЛ1<ОВ и rликопротеинов, физическом состоянии липидов мемб ран, проницаемости их для различных веществ и активности MeM бранных ферментов. Выявлены основные типы взаимодействий, приводящих к об разованию уrлевод-белковых комплексов с участием лектинов: rидрофобные взаимодействия боковых радикалов аминокислот с пиранозными циклами сахаридов; водородные связи между ато- мами боковых радикалов Asn, Asp, Arg, амидных и карбониль- ных rрупп уrлеводраспознающе1'О саша и rидроксилами caxa ридных остатков; ван-дерваальсовые взаимодействия; участие молекул воды в образовании водородных связей; участие ионов двухвалентных металлов в комплексообразовании (О. С. Мирош- ниченко, 1999). Установлено, что в распознавании лектинами остатков Gal, в отличие от остатков Glu и Мап, большую роль И1'рает положение в rексозах rидроксила 4OH. "Уrлеводраспоз нающие сайты Mo1'YТ быть сформированы различными участка- ми полипептидной цепи. Получены доказательства способности лектинов распознавать помимо уrлеводных функционально по- добные пептидные ЛИ1'анды (по карбоrидратнезависимому пути). Были идентифицированы пептиды, имитирующие связывание метилаDм:аннозида и аDманнозы с кон:канавалином. Счита ют, что лектины и ле:ктиноподобные белки, которые представля- ют собой мулътидоменные молекулы, вовлекаются в различные типы взаимодействий с разными веществами при участии отлич ных от У1'леводраспознающих доменов. Критическим парамет ром лиrанда для успешноrо распознавания леl(тинами является e1'o конформация. В заключение следует подчеркнуть, что лек тины способны участвовать в широком спектре реrуляторных процессов: эмбриоrенезе, иммунолоrических реакциях, oHKore- незе, белковом синтезе и др. 1.4. ТИПЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ МЕМБРАННЫХ КОМПОНЕНТОВ И ИХ РОЛЬ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ БИОМЕМБР АН в природной мембране взаимосвязь белковой молекулы с ли- пидным бислоем определяется, по всей вероятности, балансом 58
водородных связей, электростатических и вандерваальсовых вза имодействий между липидом, водой и "соседними" белковыми молекулами. Липидбелковые взаимодействия условно подраз деЛЯIOТ на взаимодействия типа белоклипидный монослой, бе- локлипидный бислой, а также липидбеЛIi.овые взаимодействия, включающие липид-зависимые ферменты. Термин "поrраничный липидный слой" был введен в связи с появлением и развитием концепции о существовании особоrо "стационарно1'О" слоя липидов, связанно1'О с поверхностью бел ковой молекулы, в котором физикохимические параметры ли пидов отличаются от таковых в основной части бислоя. Под "CTa ционарностью" понимают отсутствие липидноrо обмена за Bpe мя, сравнимое с временем оборота фермента (",10З с). ПО1'ранич ные лип иды называют также aJtJiY.1LflpllblMU. В то же времн нет убедительных экспериментальных доказательств различноrо по ведения ПО1'раничных липидов и липидов основной части бислоя. Это связано с использованием разных методов исследования, для которых характерны неодинаковые временные интервалы изу чения динамики липидных молекул. В 70-е 1'1'. первым исследованием упаковки липидов вблизи мембранно1'О белка в небольших временных интервалах (:::; 108 с) было определение подвижности спинмеченной жирной кислоты в реконструированной системе цитохромоксидаза ЭНДО1'енные митохондриальные фосфолипиды методом ЭПР. в дальнейшем подобные эксперименты проводились с использованием цито- хромоксидазы и цитохрома Ь 5 и липидных бислоев, содержащих 1'рамицидин А, а также мембраны микросом печени крысы, эрит- роцитов, вирусов Синдбис и везикулярноrо стоматита. Было по- казано, что значительная часть липидов в этих мембранах иммо- билизована за счет белок-липидных взаимодействий. Количество иммобилизованных липидов при температурах 2040 'с COCTaB ляет примерно 0,2 м!' на 1 м!' беЛI<а (47 молекул фосфолипидов на белковый комплекс) цитохромоксидазы, что соответствует при близительно одному слою липидов BOKpy1' белковой rлобулы. При- мерно такое же количество (4590) молекул иммобилизуется за счет взаимодействия с Са2+АТФазой саркоплазматическо1'О ре- тикулума. Понижение температуры может приводить к возрас танию количества иммобилизованных липидов в 23 раза. Существование участков липидно1'О бислоя (аннулы липидов) с более плотной упаковкой и меньшей подвижностью У1'леводо 59
родных цепей в модельных и природных биомембранах. было по казано также и с помощью ДРУ1'их физикохимических метоДОВ (ямр, комбинационное рассеяние света, метод флуоресцентных зондов). Однако впоследствии концепция "поrранично1'О липи да" была подверrнута критике. Результаты, полученные с помо- щью метода 2НЯ:М:р, свидетельствуют о том, что поrpаничные липиды быстро обмениваются с основной массой липидов в бис лое (скорость обмена весьма велика 107 Cl). Кроме Toro, в присутствии белков упорядоченность связанных липидов (т.е. трансrom-конформации ацильных цепей) почти не изменяется, а скорость переориентации У1'леводородных цепей слабо YMeHЬ шаетсн (= на 20 %) в частотном диапазоне 109 Cl. По данным яМР, трансмембранные белки весьма незначительно влияют на ориентацию и динамику липидных молекул и их полярных ro- ловок. Эти результаты были подтверждены и некоторыми дpy rими методами, например, инфракрасной спектрофотометрией с фурьепреобразованием. Противоречивые данные получены также при исследовании избирательности связывания белков с различными фосфолипи дами. Так, селективность взаимодействия фосфолипидов, несу- щих определенные полярные rруппы, была выявлена для родоп сина, Na+, К+АТФазы из Squalus acantus, цитохромсоксидазы, Са2+АТФазы. Вместе с тем мноroчисленные эксперименты по ре- активации выделенных мембранных ферментов путем добавле ния ЭКЗО1'енных липидов и детер1'ентов показали, что в больmин стве случаев не существует специфических белок-липидных вза- имодействий, обеспечивающих ферментативную активность; раз ные типы липидов Mo1'YT одинаково влиять на функционирова ние мембраносвязанных белков. Несмотря на то, что взаимодей- ствие липидов с инте1'Ральными белками носит в основном 1'ид рофобный характер, электростатические силы связывания заря женной 1'идрофильной части белковой молекулы и полярных rрупп окружающих липидов MorYT существенно влиять на xa рактер липидноrо микроокружения белка. Кроме TOro, для акти- вирующеro действия липидов по отношению к некоторым мемб равным ферментам важны такие факторы, как степень подвиж ности ацильных цепей и способность липидов образовывать ми- целлы. Повидимо:м:у, сродство разных липидных молекул к бел кам мембраны определяется не спецификой белков, а специфи- кой липидных молекул. 60
В последнее время внимание МНО1'их исследователей cocpeдo точено на изучении связывания с липидным бислоем перифери ческих мембранных белков. Ряд периферических белков взаи модействует с мембраной путем связывания с интеrралъными бел ками. В то же время значительное количество белков связывает ся непосредственно с поверхностью липидноrо бислоя, причем некоторые из них способны к взаимодействию 'l'олько в опреде ленных условиях и на непродолжителъное время. Иноrда такое взаимодействие является необходимым условием проявления функциональной активности мембранно1'О фермента (протеинки наза С, пируватоксидаза, фю,торы свертывания крови). Повидимому, типы взаимодействия между периферически ми мембранными белками и фосфолицидным бислоем весьма разнообразны: связывание с участием амфифильных о;сцираль ных участков, электростатичеСI<ИХ сил, 1'идрофобных взаимодей ствий, ионов Са 2 +. Для изучения связывания цериферических белков с фосфолицидами используют следующие методы: ЯМР, ИЕсцектрофотометрию, люминесценцию, светорассеяние и др. В настоящее время активно исследуется роль цроцессов адсорб ции и десорбции ферментов важнейших метаболических путей в реrулировании их функциональной ак'l'ИВНОСТИ (раздел 2.3.2). Белокбелковые взаимодействия в мембранах характеризуют ся высокой специфичностью и ПРОЯВЛЯIOтся В виде обратимой внутримембранной аrреrации мембранных белков, которая co провождается изменением функциональной активности всей си стемы. При температурах ниже температуры фазовых переходов липидов белки находятся в аrреrированном состоянии, а при TeM пературах выше фазовых переходов в диспеР1'ированном co стоянии. Считают, что это происходит вследствие "выталкива ния" белковых молекул из упорядоченной rелевой фазы. CTe пень дисперrированности белков в мембране контролируется фазовым состоянием липидов. Имеются данные, свидетельству ющие о том, что при частичном удалении липидов из мембраны цроисходит усиленная а1'реrация белков, а при введении в мемб рану небольших количеств детер1'евта наблюдается диссоциация олиrомерных молекул, например, Са 2 + АТФазы. Степень аrреrированности белков определяется несКОJ[ЬКИМИ факторами: энтропией смешивания "раствора" белков :в липиде; прямыми белокбелковыми взаимодействиями, включающими ковалентные, водородные, солевые связи, электростатические и 61
дисперсионные силы притяжения, способствующие в целом об разованию белковых arperaToB; равновесием в системе ПО1'ранич ный липид общая липидная фаза с учетом количества моле кул ПО1'раничных (аннулярных) липидов. Процессы аrре1'ации дезаrpе1'ациИ мембранных белков проявляются при пиноцитозе, взаимодействии и слиянии мембран, на разных стадиях клеточ Ho1'o цикла. Необходимо подчеркнуть, что для инте1'ральных белков MeM бран, по-видимому, характерно формирование иммобилизован Horo кольца (аннулы) ПО1'раничных липидов с нарушенной упа ковкой ацильных цепей, контактирующих с 1'идрофобной час тью молекулы белка. Однако комплекс белка с поrраничным липидом представляет собой динамическое образование, Bpe мя существования KOTopo1'o исчисляется микросекундами. Ли пидное кольцо является более "твердым" по сравнению с ос- тальной частью бислоя, если последний находится в жидком состоянии. но более "жидкое", если бислой нахор;ится в 1'елеоб разном состоянии. По всей вероятности, состав и фазовое со- стояние (а именно жидко кристаллическое) липидов аннулы важ.ны, прежде Bce1'o, для функционирования мембранных бел ковферментов . КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Дайте характеристику основных rpynn лиnидов мембран про. и эукариотических орrанизмов. 2. Какие особенности структуры мембранных ЛИIIидов обеспечива- ют выполнение ими различных функций? 3. Опишите основные свойства ЛШlидов биомембран и типы связей меж.ду ними. 4. Что представляют собой фазовое состояние и фазовые переходы липидов в мембране? Какие факторы влияю'!' на фазовое СОС,!'ОЯНИе MeM бранных липидов? 5. Обоснуйте утверждение: "Фазовые переходы липидов обуслов ливают функциональное состояние мембраны". 6. Что такое аннулярные липиды, в чем состоят особенности их структурно-функциональноrо состояния и значение для Функциониро вания мембран? 7. На ка.кие rpynnbI подразделяют мембранные белки? 8. Каковы особенности строения молекул интеrральных белков MeM бран в связи с выполняемыми ими функциями? 9. Что ТаЕое асимметрия компонентов мембран, каковы ее причины и значение для нормальноrо функционирования биомембран? 62
10. Какова роль периферических белков в С'l'абилизации биомемб. ран? 11. Какие функции выполняют мембранные АТФазы? Раскройте механизм фующионирования Na+, К+АТФазы плазматических мемб. ран. 12. Каковы особенности структуры мембранных yrлеводов в связи с выполняемыми ими функциями? 13. Что представляют собой 6елоклипидные взаимодействил в мем, бранах? Какие типы связей участвуют в их поддержании? 14. Используя ма.териал rлавы 1 и приложения, ОПИIШIте С'rроение и функции эритрОцитарных мембран. 15., Что понимают под терминами "кинки" и "динамические дефек, ты", какова их роль в функционировании биомембран? 16. Используя материал rлав 1 и 5 (раздел 5.1), ОIIИIIШте методы (с указанием их принципов, ДОС'l'оинств И недостатков), :которые исполь. зуются длл: а) изучения белоклипидных взаимодействий в мембранах; 6) изученил фазовых переходов в липи,цном бислое; в) исследования особенностей :конформационноrо состояния мемб. ранных белков. 17. Какова роль мембранных липидов в осущеС'l'влении важнейших метаболических процессов в клетке?
I'ла:ва 2 УЧАСТИЕ КОМПОНЕНТОВ БИОМЕМБРАН В ОСУЩЕСТВЛЕНИИ И РЕI'УЛИРОВАНИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ в настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что биоло 1'и:ческие мембраны иrpают ключевую роль в процесс ах приема, переработки и передачи информации в клетке, обеспечивающих СО1'ласованное протекание множества биохимических реакций ц&- лостноrо орrанизма. Изучение молекулярных механизмов реryля. ции клеточноrо метаболизма с помощью внешних (перви:чных) и внутриклеточных (вторичных) СИ1'налов (проблемы клеточной сиr нализации) является предметом пристальноI'О внимания биофи зиков, биохимиков, молекулярных биолоI'ОВ, иммунолоrов. Эта стре- мительно развивающаяся область мембранолоI'ИИ как комплеКС. ной научной дисциплины начала развиваться во второй половине хх века после открытия Е. Сазерлендом (Нобелевский лауреат, 1971) циклическоI'О аденозин3,5.монофосфата (сАМР) и создания концепции вторичных сиrналов (мессенджеров). Рассмотрим бо лее подробно основные принципы функционирования систем по- лучения и переработки информации в клетке. 2.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОЦЕССОВ ПЕРЕДАЧИ ИНФОРМАЦИИ В IЛЕТКЕ Внешний СИ1'нальный a1'eHT, называемый lzервu't/;н.ы.м .мессе",- джером, как правило, не проникает внутрь клетки, а специфи чески взаимодействует с рецепторами наружной клеточ:вой мем- браны. В качестве первичных мессенджеров выступают различ ные химические соединения (1'opMoHbl, нейромедиаторы) или фи зические факторы (квант света). Однако I'идрофобные стероид- ные и тиреоидные I'ормоны способны диффундировать через ли пидный бислой внутрь клетки и связываться с растворимыми рецепторными белками. Если внешняя СИ1'нальная молекула воз действует на рецепторы клеточной мембраны и активирует их, то последние передают полученную информацию на систему бел ковых компонентов мембраны, называемую каскадом передачи сиrнала. Мембранные белки каскада передачи СИI'нала подразде- ляют на белкипреобразователи, связанные с рецепторами, и фер менты-усилители, связанные с белками-nреобразователями и ак- тивирующие вторичные внутриклеточные мессенджеры, перено 64
с,ящие информацию ВНУТРЬ клетки. В роли вториl/ЛЫХ .мессе но- жеров выступают малые молекулы и ионы: сАМР, циклический I'уанозин3, 5монофосфат (cGMP), инозитолl ,4,5трифосфат (IP з)' диацилrлицерол (DG), арахидоновая кислота, ионы кальция. BTO ричные мессенджеры характеризуются следующими свойствами; имеют небольmую молекулярную массу и с высокой СКОрОС'l'Ью диффундируют В цитоплазме; быстро расщепляются и быстро yдa ляются из цитоплазмы (например, ионы кальция выкачиваются во внешнюю среду или поступают во внутриклеточные депо с помощью Са2+А'l'Фаз). В противном случае система передачи ин формации будет функционировать в ОТСУТС'fвие первичноrо Mec сенджера, что приведет к нарушению протекания :м:етаболичес ких реакций в клетке и возникновению патолоrических состоя ний орrанизма. rrаким образом, процесс передачи внешнеrо сиr- нала с помощью внутримембранных :компонентов каскада пред ставляет собой совотупность последовательных стадий измене- ния конформационноrо состояния и функциональной активнос ти белков, связанных друr с дPY1'oM непосредственно или опосре дованно с участием ДРУ1'их стру:ктурных элементов мембран. 2.1.1. Особенности структуры и функций .lftе.мбраШtых рецепторов В плазматических мембранах про- и эукариотических кле- ток локализованы различные специализированные рецепторн:ые системы, процессы функционирования которых включают реа- лизацию следующих стадий: связывание первичноrо мессенджера с рецептором; передачу информации о связывании внешнеrо сиrнала с рецептором на мембранные беJIковые компоненты каскада; формирование первичноrо и вторичноrо клеточноrо ответа. Обнаружены суперсемейства рецепторных белков со сходной первичной структурой, но различными фующиями, взаимодей ствующих с определенным типом лиrандов и вызывающих раз витие специфическоrо клеточно1'О ответа (табл. 8). Большинство рецепторов представлены олиrомерны::м:и мемб- ранными белками rЛИI(.опротеинами. Функции рецепторов мо- ryт выполнять И мембранные rан1'ЛИОЗИДЫ. Взаимодействие pe цепторов с ЛИ1'андами специфично: молекулы инициаторы трансмембранной передачи сиrнала активируют рецепторы, воз действу,я на последние в :концентрациях 10-8 моль/л и менее. 5. Заказ 3788 G5
Таблица 8 Некоторые суперсе.мейства структурно роосmвеЮlЫХ рецепторов .ме.ll'lбран эукарuот м Суперсемейство рецепторов Функции п/п 1 Иммуноrлобулиновое суперсемейство: Развитие иммуно- Тклеточный рецептор лоrических реакций r ла:вный комплекс rистосовместимости класса II IgА/IgМрецепторы Поверхностные иммуноr лобулины 2 Интеrрины: Связывание с :КОМПО- Фибронектиновые рецепторы нентами внекле- rликопротеиновый комплекс точноrо матрикса и: тромбоцитов белками адrезии ЛеЙl<оцитарные беЛl<И адrезии 3 Рецепторы митоrенов факторов роста, Стимуляция обладающие ТИРОЗИНl<иназной аl<ТИВ- l<леточноrо роста ностью: Рецептор фактора роста эпидермиса Рецептор фактора роста производных тромбоцитов J1нсулиновый рецептор 4 Рецепторьt нейромедиаторов ионные ка- Каналы, налы: функционирующие Никотиновый ацетилхолиновый как рецепторы рецептор Рецептор 'У-аминомасляной l<ИСЛОТЫ r лициновый рецептор 5 Рецепторы, активирующие GбеЛЮ1: Участвуют в f3-АдренерrичеСl<ие рецепторы а!,тивации G -беЛl<ОВ а-Адренерrические рецепторы Опсины родопсин Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы Для обеспечения рецепторной функции молекулы белков дол- жны отвечать ряду требований: а) обладать высокой избирательностью к ЛИ1'анду; б) :кинетика связывания ЛИ1'анда должна описываться кривой с насыщением, соответствующим состоянию полной заня'rости всех молекул peцeIIТOpoB, число которых на мембране О1'раничено; в) рецепторы должны обладать тканевой специфичностью, отражающей наличие или отсутствие данных функций в р;лет ках орТ'анамишени; r) связывание лиТ'анда и e1'o клеточный (фИЗИОЛО1'ический) эффект должны быть обратимы, параметры сродства должны co ответствовать фИЗИОЛО1'ическим концентрациям лиТ'анда. 66
ЛИ1'андрецепторные взаимодействия реализуются при помо щи слабых нековалентных сил: эле:КТРОСТ8.'fических, иондиполь ных, вандерв8.альсовых и 1'идрофобных взаимодействий, BOДO родных связей. Рассмотрим основные СВОЙС'l'ва рецепторов плазматической мембраны клетки и формирование первично1'О ответа. 1. Рецепторы, сопряжщшые с G-белкам:к Эти рецепторы образуют KOMnJIeI(C с мембранными GТРсвя зывающими белками (G-белн:ами). Первичными сиrналами для этих рецепторов служат низкомолекулярные 1'ормоны и нейро трансмиттеры(адреналин,норадреналин,ацетилхолин,серотонин, rистамин), пептидные и беш(овые ropMoHbI (адреНОI(()РТИКОТРОП ный ropMoH, соматостатин, вазопрессин, 1'онадотропные ropMo- ны). Один и тот же первичный мессенджер может инициировать передачу сиrнала с участием последовательности разных рецеп 'Х'оров G-бел:ков. Эти рецеП'I'ОРЫ ПрЕ)ДС'l'авляют собой моно мерные интеrраЛЫlые мембранные бещ(и, lюлипеП'l'идная цепь которых семь раз lIересеl(ает клеточную мембрану. При связывании ли rанда с рецептором измеJ:шется I:tонформационное состояние ком- плекса рецептор Gбелка GбеЛ(щ. В результате облеrчается обмен связанноrо с GбеЛl(ОМ GDP на G'rp (рис. 15). Аюивиро- Лиrанд ---+ беЛОК 6 мишень ..........,.. сАМР Вторичный ответ Рис. 1.7. Схема эффеI'rов, индуцируеМ"IХ присоединением лиrан,ца :к рецетору (R), COl1p-яжеш-IOМУ с: G-бел:кпм (РI1зви'rие первичноrо OTBe'l'a) АТР \lIGDP 1 .......... +Рп 5'" 67
ванный таким образом Gбелок, связанный с GTP, может OTдe литься от рецептора, а e1'o субъединица а взаимодействует в pe зультате это1'о с мембранными белками мишенями (аденила'r циклазой, ионными каналами, фосфолипазой С). Обнаружено около 20 типов различных Gбелков*. Они явля ются 1'етеротримерами, которые состоят из субъединиц трех ти пов: а, р, 'У. В норме две последние субъединицы функционируют как единый Р'Укомплекс. На асубъединице локализован центр связывания 1'уаниловых нуклеотидов. В табл. 9 представлены характеристики некоторых Gбелков. Все Gбелки прочно связаны с плазматическими мембрана ми, за исключением трансдуцина, который in vitro ле1'КО OTcoe диняется от мембраны. Ни одна из субъединиц не является TpaHC мембранным белком. Однако асубъединица может быть ацили рована и при соединяется к мембране с помощью ковалентно свя занной жирной кислоты. При переходе СИ1'нала в каскаде: рецептор Gбелок эффекторный белок исходный внешний СИ1'нал способен к MHO 1'ократному усилению (амплификации). Это связано с тем, что одна молекула рецептора, находясь в активированном состоя нии В результате присоединения ЛИ1'анда, переводит в активи рованную форму несколько молекул Gбелка. При Э'l'ом коэф фициент усиления внешнеrо сиrнала может составлять 102 103, так как на каждую молекулу рецептора приходится He сколько сотен или тысяч образующихся молекул Gбелка. На следующей стадии каскада (Gбелок ----+ эффекторный белок) каждая молекула активированно1'О Gбелка взаимодействует только с одной молекулой эффекторно1'О белка, но в ответ на это в цитоплазме образуется (распадается) большое количество молекул вторичноrо мессенджера. В результате суммирования процессов амплификации внешнеrо сиrнала в каскаде: рецеп тор ----+ Gбелок ----+ эффекторный белок коэффициент усиления может составлять 105100. "Выключение" каскада передачи внешнеrо СИ1'нала осуще ствляется различными способами: путем диссоциации СИ1'наль ной молекулы из комплекса с рецептором; путем фосфорилиро вания реце пторов с участием протеинкиназ; в результате rид '" За открытие Gбелков и изучение их роли в трансдукции сиrнала в клетке А. fuлману иМ. Родбеллу в 1994 r. присуждена НобелеВСltая премия. 68
Таблица 9 Свойства и функции некоторых G-tJеЛКО8 Моле!(улярна.я: Рецепторпый Бело!( масса субъеди- Чувстви. G-беЛОR беЛОI( (беЛRИ) (беЛIШ)- ФУННЦИЯ ниц, нДа тельность мишень а. у ,( тО!(сину Gs (очищен -Адреп()рrиче- Адепилат- Стиму- 4552 3536 8 Холерный до I'OMOl'eH- СI(ие рецепторы цит,лаза ля:ция токсин HOI'O со- ([31 И ,) СТОЯНИЯ) Gi (очищен а.Адренерrиче- Аденилuт ИПl'иби 41 3536 8 КОRJПОШ- ДО rOMoreH СIШИ рецептор цюшаза ровапис ВЫЙ поl'О co Мускариновый токсин стояния) холинерrичесний рецеп'ор Аlадспозиповыи рецептор Д2-дофаМИIIОВЫИ рецептор Опиатпыи рецептор Gt (трапе- Родопсин cGMP-спе- Стиму 39 36 8 Коклюш дудин, цифичная Jt5ЩИЯ ныи И очищен до фосфоди- холерпый l'oMoronno- ОC'I'ераза токсипы 1'0 состоя Фосфоли- ПИЯ) паза А." Go (очи- ОПИ!\ТIIЫЙ Потеп- 3Ш,РЫШI- 39 3536 8 КО!<JДОШ щен до I'o рецептор (Мозr) цимзапи !пre ный MOronnOI'O симыи !(ав: ала ТОI,СИН (1) СОСТОЯНИЯ) Са 2".I<uнал Gp МУСI(ариновыи Фосфати- Стимуля. холиперrи'Iесн:ии ДИJIИнози ция рецептор толеl1еци Вазопрессиновый фичпая рецептор фосфоJIИ АнrиотеII3ИВIIЫИ паза С рецептор rgE-рецептор с высоким cpoд ством Gk МУСI(ариповый К' I(Uнал OTI(pLIBa 1 холиверrичесн:ий (?) ние рецептор I<анала Дофаминовый рецептор rистамиповый рецептор ролиза связанноrо с G-белками GTP дО G DP, а также восстанов- ления исходноrо уровня внутриклеточноrо вторичноrо мессенд- жера в цитоплазме. 69
2. Ионные каналы, фуmtциопярующие Italt реIJ;епторЫ Они представляют собой интеl'ральные мембранные белки, полипеПТИДные цепи которых несколько раз пронизывают ли пидный бислой. Связывание аrониста с рецептором при водит к открыванию канала и селективному изменению ионной прони- цаемости мембраны. К таким рецепторам ионным каналам относят лиrандуправляемые ионные каналы, ЯВЛЯIощиеся рецеп торами нейротрансмиттеров (см. табл. 8). Наиболее I'лубоко изучены никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (холинорецепторы) в скелетных мышцах и электри- ческих opraHax ската и Уl'ря. Холинорецептор состоит из четы рех Т'ликозилированных субъединиц ()', (50 кДа), [3 (54 кДа), у(56 кДа) и 0(58 кДа) с молярным соотношением 2:1:1:1, имеет "rрибовидную" форму и ориентирован перпендикулярrrо поверх- ности мембраны. Катионпый канал холинорецептора открывает- ся при взаимодействии двух молекул а1'ониста (ацетилхолин, Kap бамилхолин, суберилхолин) с участками связывания двух ()',-субъ- единиц рецептора. Малоселективные катиоrmые каналы нико- ТИНОВОl'о ацетилхолиновоТ'о рецептора неnpоницаемы для ионов. 3. Рецепторы, обладаIOщие ферментативв:ой: активностыо Представляют собой моно- или ОЛИl'омерные белки, имеющие центр связывания первичноrо мессенджера, локализованный на внешней поверхности мембраны. На внутреннюю (цитоплазма тическую) сторону мембраны обращен каталитическй участок, активируемый в результате воздействия на молекулу рецептора внешнеrо сиrнала. К рецепторам, обладающим ферментативной активностью, относят рецепторные протеинкиназы, способные аутофосфорилироваться и фосфорилировать беЛIщ-мишени по ти- розиновым остаткам, а также протеинтирозинфосфатазы, дефос форилирующие фосфотирозиновые остатки беЛЕ.ов-мишеней. Опи участвуют в реryлировании процессов деления клетю-r, их диф- ференцировании, развитии ИММУННОl'о ответа. Рецепторные rya- нилатциклазы, катализирующие синтез cGMP из GTP, необходи мы для реryляции водно-солевоl'О обмена и тонуса сосудов. Развитие вторичноrо (н:леточноrо) ответа в результате фУНЪ:- ционирования компонентов каскада передачи внешнеl'О сиrнала реализуется на разных уровнях: транскрипции, трансляции и на уровне изменения ctpyktypho-фун:кциопалыIOI'О состояния I<ЛIO чевых внутрин:леточных белков. Последний мехапизм ВI<лrочает обратимую ковалентную модификациIO белков (фосфорилирова 70
ние, метилирование, ацилирование), изменение функциональных свойств белков непосредственно или опосредован но под действи ем вторичных мессенджеров, модуляцию свойств олиrомерных белков посредством ассоциации ДИссоциации субъединиц, об ратимые переходы белков из свободно1'О состояния в связанное (изменение компартментализации)*. Более подробно некоторые из вышеназванных способов реrулирования метаболических про цессов описаны в разделе 2.3. 2.1.2. А;;еНUJlатЦI.tJслаЗIiЫй путь переоач.u CUZfla.1la Наиболее полно охарактеризованы два основных пути пере дачи информации в клетке, I{OTOpbIe различаются природой и свойствами вторичных мессевджеров. В аденилатциклазном пути в качестве внутриклеточноI'О посредника выступает цикличес кий аденозинмонофосфат. В фосфоинозитидном пути действует rруппа мессенджерОБ: ионы кальция и образующиеся из мемб равных фосфолипидов инозитолтрифосфат и диацилrли:церол. Схема аденилатциклазно1'О пути передачи информации в клет ке представлена на рис. 16. Стимулирующий внешний сиrнап ... Инrибирующий внешний сиrнал t белок е Выкпючение r ( )} t неактивныи АТР сАМР + Акиназа:(2: КсАМР + С Р I белок-Р 4- (активный) + клеточный ответ Рис. 16. АденилаТЦИIла3IIЫЙ: ПУТ!, передачи информации: R. и R, соответственно стимулирующие и инrиБНРУIOщне рецепторы; G. и G 1 соответственно стимулирующие и Юlrибирующие G-бещи; АС aдe нилаТЦlшлаза; Аюшаза протеИШШ:Н<lЗ8 А; R и С реrУЛЯТОРП8Я и r<RталитичеСI<. ая субъедипицы протеинRиназы А : За ОТIрытие обратимо!'о фосфорилировав:ия: бещюв IЩ БИQлоrи чес]иТ'о реТ'УЛЯТОрIIО!'О механизма Э. Фишеру и Э. Кребсу в 1992 1'. ПрИСУЖД6па НобелеВСI<.ая Пр6МИЯ. 71
.Стимулирующие Gsбелки взаимодействуют со стимулиру ющими рецепторами Gбелков (Rs), а ИН1'ибирующие Giбелки с инrибирующими рецепторами (Ri). Связывание внешней СИ1' нальной молекулы с рецептором индуцирует конформационные изменения последнеrо, которые передаются на Gбелки. В OT вет на это Gбелок приобретает способность присоеДИБЯТЬ GTP и воздействовать на функциональную активность адеНИJIатцик лазы ('f.e. "усилительноrо" фермента). Gsбелок активирует aдe нилатциклазу, а Giбелок инrибирует ее (см. табл. 9), Актив ность комплекса GsGTP подавляется в результате rидролиза GTP дО GDP, катализируемоrо 1'уаНОЗИН'J.'рифосфатазой. Инrи бирование этоrо фермента холерным токсином приводит к YBe личению времени жизни комплекса Gбелок GTP. Клетка начинает вырабатывать сАМР независимо от действия внешне ro сиrнала. В клетках кишечника сАМР вызывает сильную сек- рецИЮ жидкости, что приводит К тяжелой диарее, которой CTpa дают больные холерой. Конечные стадии передачи сиrнала осуществляются с участи- ем сАМРзависимых протеинкиназ (АIщназ). сАМР специфи- чески связывается с ре1'УЛЯТОРНОЙ субъединицей протеинкина- зы. Это приводит К активации каталитической субъединицы белка и ее отделению от реI'УЛЯТОРНОЙ. IСаталитическа-я: субъединица в свободном состоянии может фосфорилировать определенный бе лок, активация KOToporo и обусловливает ответ клетки на воз- действие внешнеrо сиrнала. 2.1.3. ФосфоultозuтuiJный путь nepeiJartu uнформациu В этом механизме передачи СИ1'нала в клетку активное учас тие принимают мембранные фосфолипиды, в частности, фосфа тидилинозитол, на долю KOTopo1'o приходится от 2 до 8 % фосфо- липидов клеточных мембран. Внешний СИ1'нал после взаимодействия с рецептором акти- вирует Gрбелок (рис. 17), а затем "усилительный" фермент фосфодиэстеразу (фосфолипазу С), которая расщепляет фосфа- тидилинозитол-4,5дифосфат (PIP 2) на водорастворимый инози- тол-l,4,5-трифосфат (IР з ) и липидораСТБОрИМЫЙ диацилrлице рол (DG). Инозитолтрифосфат и диаЦИЛ1'лицерол являютс-я: вто- ричными мессенджерами. rидрофильный инозитолтрифосфат диффундирует в цитоплазму и вызывает освобождение ионов Са 2 + из внутриклеточных депо (ЭНДОIJлазматический ретикулум, 72
Мембрана белок J IP3 (не::t::IЙ) ...... Клеточный (активный) ответ е t Са 2 + -4 Ca2' СаМ -4 киназа t белок Эндоплазмвтический (неактивный) ретикулум Рис. 17. ФосфоинозитидныЙ ЛY'lЪ лередачи сиrнала: PIP 2 фосфа. ТИДИЛИlIози:тол-4.,5дифосфа'r; ФлС фОСфОЛИП8З8 С; IР з ИНОЗИ'l'ол 1,4.,5трифосфа'l'j DG диацилrлицерОЛj С-киназа лротеинкинаЗ8 С; РВ фосфатидилсеРИНj СаМ калъмодулив: митохондрии). Ионы кальция образуют I(.омплекс с Са2свя зывающим белком кальмодулином (СаМ), ar<тивируIOЩИМ ки- назу, катализирующую фосфорилирование неак'!'ивноrо белка. Активация фосфорилированноrо белка обусловливает развитие клеточноrо ответа. Оставшийся в мембране диаЦИЛ1'лицерол активирует проте инкиназу С (Скиназу). Протеинкиназа С в присутствии кислоrо фосфолипида фосфатидилсерина и ионов кальция катализи рует присоединение фосфата к неактивному белку. В результа'rе фосфорилирования белка развивается ответная реакция клетки. ДиаЦИЛ1'лицерол может подвеР1'аться дальнейшим превраще ниям. Диацилrлицеролкиназа в присутствии А'!'Р фосфорилиру ет диаЦИЛ1'лицерол с образованием фосфатидной кислоты. Пред пола1'ают, что последняя способна выполнять роль ионофора (под вижно1'О переносчика) для ионов кальция. При переносе этих ионов через плазматическую мембрану образуются участки с не- бислойной структурой, Т.е. каналы для проникновения ионов Са 2 +. Кроме Toro, под действием диаЦИЛ1'лицероллипазы из диацил- 1'лицерола образуется арахидоновая кислота, окисляющаяся за тем до БИОЛО1'ически активных метаболитов эйкозаноидов, KO торые сами являются эффективными модуляторами разнообраз 78
ных реакций в клетке. Фосфоинозитиды реrулируют процессы деления клеток, секреции ropMoHoB, транспорта ионов. Структурные аналоrи диацилrлицерола форболовые эфи ры способствуют развитию злокачественных опухолей. Они имитируют действие диаЦИЛ1'лицерола и обеспечивают передачу пролиферативно1'О сиrнала, однако в орrанизме не расщепляют ся:. Вследствие этоrо каскад передачи сиrнала функционирует непрерывно и способствует активации процессов клеточноrо дe ления. Изучение действия токсинов и химических a1'eHToB, спе цифически взаимодействующих с компонентами системы пере дачи сиrнала, необходимо для выявления молекул.ярныIx Mexa низмов внутриклеточной СИ1'нализации, а также развития пато лоrических состояний орrанизма человека. Необходимо отметить, что вышеописанные механизмы пере дачи информации имеют MHoro общих черт и включают реализа ЦИIO трех основных этапов: взаимодействие рецептора с первичным мессенджером; изменение конформации и функциональных свойств MeM бранных белковпосредников (белка "преобразователя" и фермен Ta "усилителя"); активацию вторичных мессенджеров, взаимодействие ко- торых с определенными структурными компонентами клетки ин- дуцирует быстрое распространение сиrнала по всей клетке. 2.2. РОЛЬ ИОНОВ В ОСУЩЕСТВЛЕНИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ С УЧАСТИЕМ МЕМБРАН Ионная ре1'УЛЯЦИЯ является одним из важных механизмов управления внутриклеточными процессами. Изменения ионной силы или ионноrо состава в клетке влияют на arpe1'aTHoe состоя- ние и характер движения протоплазмы, функциональное COCTO яние орrанелл, конформацию и взаимодействие биомакромоле кул, изменяют активность и специфичность ферментов и муль тиферментных систем и Т.д. В осуществлении и реrулировании различных метаболических процеССQБ в клетке активное учас тие принимают, прежде Bcero, ионы металлов. Одновалентные катионы участвуют в реrуляции внутриклеточноI'О рН, являют- ся кофакторами МНО1'их ферментов, обеспечивают электрические свойства мембран клеток. Установлено, что они контролируют активность и специфичность более 100 ферментов. Большинство 74
белков активируется калием; функциональная активность HeKO торых подавляется натрием, Например, 1'ликолитические фер менты стимулируются ионами калия цитоплазмы. Эксперимен тальные данные, свидетельствующие о взаимосвязи активноrо транспорта одновалентных катионов с уровнем клеточноrо ды хания, леrли в основу создания концепций ионной ре1'УЛЯЦИИ температуры тела теплокровных животных, соrласно которым скорость метаболических процессов и соответственно теплопро дукции ре1'улируется концентрацией ионов в клетках и среде. Ионь'I Na+ и К! широко распространены в неживой природе. В клетке эти ионы распределены неравномерно: ионы натрия выбрасываются из клетки, ионы калия накапливаются в ней. В результате создается разность концентраций одновалентных ионов на клеточной мембране, необходимая для rенерации возбужде ния в нервных и мышечных кдетках. Первичноютивный тpaHC порт ионов, осуществляющийся с использованием энерrии АТР или окислитеЛЫIOвосстановительных реакций, происходит с уча стием транспортных АТФаз (см. раздел 1.2.4). ОднаlО 1'радиент концентрации одновалентных ионов необходим и для функцио нирования систем вторичноаlТИВНО1'О транспорта (в том числе сахаров и аминокислот). В клетке ионы :калия являются актива торами МНО1'их ферментативных процессов, та:ких как синтез aцe тилхолина, синтез белка на рибосомах, дыхание митохондрий, ДНКполимеразная и РНКполимеразная реакции, фосфо фруктокиназная реакция. В противоположность ионам калия ионы натрия aI<ТИВИРУ ют лишь синтез липидов и являются инrибиторами МНО1'их кле точных реакций. Кроме Toro, одновалентные катионы участвуют в реrулировании осмотическоrо баланса орrанизма, а та:кже мо- дифицируют конформационное состояние молекул белков и HYK леиновых кислот. Важную роль в жизнедеятельности клетки иrрают ДBYXBa лентные катионы Са 2 + и Mg2+. Ионы кальция представляют собой единственный универ сальный вторичный мессенджер животных и растительных кле ток. Различают три состояния кальция в клетке: Са2+, локализованный внутри клеточных ОР1'анелл (эндо плазматическоrо ретикулума, митохондрий); хелатированный кальций, связанный с анионами и белка ми цитозоля; 75
свободный или ионизированный Са 2 +, находящийся в paB новесии с хелатированным кальцием. Внутриклеточные процессы реrулирует свободный или иони зированный кальций. В состоянии покоя концентрация кальция в цитоплазме поддерживается на уровне 106107 моль/л. Низ кий уровень этих ионов в состоянии покоя связан с функциониро ванием специализированных мембранных систем: Ca 21 -АТФазы плазматических мембран, вьшачивающей Са 21 против концентра- ционноrо 1'радиента из клетки во внешнюю среду; Na+ /Са2+обмен- ника, осуществляющеrо в зависимости от условий обмен внутри клеточноrо Са 2 + на внеклеточный Na'; Ca 21 -АТФазы мембран эн- доплазматическоrо ретикулума, откачивающей кальций из цито плазмы и накапливающей e1'o внутри замкнутых цистерн ретику лума; транспортной системы митохондриальных мембран, перека чивающей Са 2 + из цитоплазмы в матрикс митохондрий (рис. 18). Стимуляция клетки путем воздействия ropMoHoB на специ- фические рецепторы плазматической мембраны и активация вто- ричных мессенджеров приводит к резкому кратковременному YBe личению концентрации Са 2 + в клетке до 10-5 моль/л. Ионы каль- ция взаимодействуют с особыми кальцийсвязыающимии белка- ми и тем самым влияют на разнообразные метаболические про- цeccы. К таким белкам относят кальмодулин, тропонин С сер- дечных и скелетных мышц, кальбиндин кишечника, кальрети- нин нейронов, онкомодулин плаценты и опухолей и др. Са 2 + -связывающие белки ре1'улируют в клетке транспорт каль- ция, активируют ферменты, реrулируют состояние цитоскелета клетки и клеточный цикл, способны контролировать процессы транскрипции и апоптоз (ПРО1'раммируемую 1'ибель клетки). Са2+-связывающие белки, секретированные во внеклеточное про- странство, Moryт выступать в качестве факторов роста, влияют на хемотаксисы, взаимодействуют с компонентами внеклеточно- 1'0 матрикса. В эритроцитах действие ионов Са 2 + опосредуется кальмоду- лином. Наиболее вероятными мишенями для кальмодулина cpe ди белков цитоскелета эритроцита являются спектрин, белок по- лосы 4.1, аддуцин (белок цитоскелета, обеспечивающий взаимо- действие спектрина с актином). Кальмодулин инrибирует взаи- модействие в цепи спектрин актин белок полосы 4.1. YBe личение I<онцентрации Са 2 + в цитоплазме приводит к изменению формы, снижению деформабильности, уменьшению продолжи 76
Реrуляция метаболизма Са" Na' Са2+ АТР Са 2 > 'СВ>l3ЫВi:lющие белки 1 Реryляция метаболизма Са 2 > Рис. 18. СхеМllтичес!{ое изображение неКО'l'ОРЫХ мембранных си. стем клетки, учаС'fВУЮЩИХ в 'l'ранеПОР'l'е ионов Са 2 +: 1 Ca2'I-каналы плазМa'rическоЙ мембрнны; 2 Сн 21 .АТФнза плазма'l'ическоЙ мембра. НЫ; 3 Na+/Ch 2t -оБМfiННИК; i фосфоипозитидныЙ ПУ'fЬ передачи ин формации В кле'rку (Н рецеП'l'Ор, G GбелOI{, ФлС фосфолипазаС, PIP 2 фосфаТИДИЛИНОЗИ'fол4,5дифосфа'l'; lРз ИНОЗИ'l'0J[1,4)5три фосфат); 5 Са2+-каналы эндоплазматичесн:оro ретикулума (ЭР); (j Са 2 +.АТФаза эндоплнзматическоrо ре'l'и!;:улума тельности жизни эритроцитов. Кальций и каЛЬМОДУJtин вызыва ют обратимое снижение стабильности мембран эритроцитов. Инкубация эритроцитов с подвижными переносчиками (ионофо рами) Са 21 " при МИЛЛИМОЛЯРНЫХ eI:'o I<онцентрациях индуцирует сфероцитоз и уменьшение площади кле'I'ОЧНОЙ поверхности. KOH центрация Са 2 + в эритроцитах определяется балансом между ero активным транспортом из цитоплазмы в плазму крови и пас сивным потоком в обратном направлении, который лимитиру ется активностью рецептор и потенциалуправляемых кальцие Bыx каналов мембраны. Следовательно, в клетке осуществляется тесная взаимосвязь между состоянием мембранно1'О скелета, ypOB 77
нем протекания метаболических процессов и функционирова нием систем пассивно1'О и активно1'О транспорта. Ионы Mg2+ способны модифицировать конформационное co с'rояние молекул белков, выступать в качестве субстра'rсвязыва ющих ионов и переносчиков электронов. Mg2.' необходим в Ka чеС'l'ве кофактора для более чем сотни ферментов, входит в co став фотосинтетическо1'О ПИ1'мента растительных клеток хло. рофилла. В табл. 1 О приведена сравнительная характеристика KOHцeH траций ионов внутри и снаружи типичной животной клетки. Анализ приведенных в ней данных дает возможность констати ровать, что значительные различия в ионном составе цитозоля и внеклеточной жидкости позволяют клеточным мембранам aK кумулировать потенциальную энерrию в виде 1'радиентов KOH центраций ионов, используемую для осуществления различных процессов клеточноrо метаболизма. Таблица 10 Концентрации ионов внутри и снаружи животной lCлетlCИ Компонент Катионы: Na+ К+ Mg2+ Са+ Н+ Анионы: CI Внутриклеточная концентрация, ммоль Внеклеточная концентрация, ммоль 515 140 0,5 104 8'105 107.1 моль или рН 7,1 145 5 12 12 4-105 101.4 моль или рН 7,4) 515 110 2.3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИНТЕrРАЦИИ КЛЕточноrо МЕТАБОЛИЗМА 2.3.1. Механизмы реzулирования фующион.алыiйй щстИ81wсти ферментов и ферментн.ых систем в lC.летlCе Биомембраны не только представляют собой места локализа ции МНО1'их важнейших ферментов и ферментных систем клет ки, но и принимают непосредственное участие в их осуществле нии и реrулировании. Р. Б. rеннисом (1997) предложена услов ная классификация типов ферментов, функцио:нирование KOTO рых тесно связано с мембранами: 78
1. Трансмембранные ферменты, ка'rализирующие сопряжен ные реакции на противоположных сторонах мембраны. Они име ют несколько активных центров, сопряжение между которыми осуществляется с помощью потока электронов, rенерирующих трансмембранный элеКТI)ический потенциал. К ним относятся фотосинтетические реакционные центры растений и бак'rерий, цитохром Соксидаза митохондрий, рецепторы, обладающие про теинкиназной активностью. 2. Трансмембранные ферменты, учаС'fВyIOщие в транспорте Be ществ, Это транспортные АТФазы, охарактеризованные в l'лаве 1. 3. БеЛIШ, являющиеся компонентами электронтранспортных цепей. Наиболее типичные ферменты ЭТО1'о класса компонен ты дыхательной цепи митохондрий, ферменты системы элект pOHHo1'o транспорта микросом, элементы фотосинтетической элек тронтранспортной цепи в тилакоидах (в частности, различные цитохромы). Остается открытым вопрос об образовании устой чивых комплексов ферментов названных CTPYI<TYP и длительно сти их жизни. 4. Ферменты, способные использовать мембраносвязанные суб страты. Это ферменты, участвующие в метаболизме :компонентов мембран: фосфолипидов, rликолипидов, стероидов; в процессин 1'e мембранных и секреторных белков; их примером являются ра:шичные фосфолипазы, 5. Ферменты, использующие водорастворимые субстраты. 'raK, ацетилхолинэстераза, каталиэирующая 1'идролиз ацетилхолина, фиксируется, по-видимому, в постсинаптичеСI<ОЙ мембране с по мощью IФвалентной сшивки с фосфатидилинозитольным f'лико липидом. 6. Ферменты, способные обраэовывать мембраносвязанный комплекс. Мембрана при этом служит своеобразным орrанизу ющим каркасом, с которым св,я:зываются rrериферичеСlше фер менты с образованием мультиферментно1'О комплекса. Это фер менты 1'ликолиза и цикла триr<арбоновых кислот. 7. Ферменты, совершающие челночные перемещения между цитозолем и мембраной, активность которых модулируетс,я: пу тем связывания с мембраной. Такие ферменты способны взаимо действовать либо с поверхностью фОСфОЛИПИДЕоrо бислоя, либо со специфическими беЛlСОВЫМИ рецепторами. К ним следует OT нести пируватоксидазу из Е. соН, протеинкиназу С, некоторые ферменты касн:ада свертывания I<РОВИ, 7Н
В целом механизмы реrулирования функциональной актив ности ферментов и ферментных систем клетки подразделяют на две 1'руппы (Б. И. KypraHoB, 1986): реrуляторные механизмы, направленные на поддержание концентраций ключевых метабо литов на постоянном уровне (механизмы поддержания клеточ Horo rомеостаза), и ре1'уляторные механизмы "слежения" ("MO ниторинrа") за сиrналами, поступающими от нервной, 1'ормональ ной и иммунной систем, реализующиеся с участием вторичных посредников (рис. 19). Механизмы поддержания rомеостаза и "сле жения" за состоянием биосистем реализуются на различных ypOB нях их Ор1'анизации. В частности, механизмы "слежения" зани мают более высокое положение в иерархической системе ypOB ней контроля клеточноrо метаболизма по сравнению с м:еханиз м:ами поддержания rомеостаза. Для низкомолекулярных катализаторов основными механизма ми контроля являются механизмы uзосmерUlf.есlCОЙ реzул.я.цuu, pea лизующиеся в результате прямоrо воздейC'l'ВИЯ модификатора. При переходе к высокомолекулярным катализаторам возможность ocy ществления изостерических механизмов сохраняется. Однако в дей ствии модификаторов изостер:и:ческоI'O типа (например, KOHKypeHT Механизмы реl)'ЛИрО8ЭНИЯ ферментных комплеКСО8 Механизмы поддержания rомеостаза Механизмы "слежения" с участием 8ТОРИЧНЫХ мессенджеров Anлостерическая реryляция ферментных комплексов Адсорбционная реryляция ферментных комплеКСО8 Изостерическая реl)'ЛЯЦИЯ ферментных комплексов Рис. J 9. Схема механизмов реrулирования активности ферментов 11: ферментных систем в клетке 80
ных инrибиторов) появляется аллостеричеСI<ая составляющая в том случае, если фермент олиrомерный и имеет несколько активных центров. Модификатор, связывающийся в районе а1<ТИВНОro цент- ра, действует как модификатор изостерическоrо типа на уровне субъединицы и при этом может по аллостерическому механизму влиять на функционирование активных центров, локализованных на друrих субъединицах фермента (т.е. действует как аллостери ческий эффектор на уровне ферментноrо олиroмера). Механизм аллоетеРUllеСJCО20 ре2улuрова1iU.я процесса функ ционирования ферментов обеспечивается узнаванием и связыва нием метаболитареrулятора в аллостерическом цеН'l'ре. В pe зультате происходит изменение конформационноrо состояния и каталитических свойств активно1'О центра белковой молекулы. Конечный этап заключается в воздействии по принципу обрат ной связи на источник возникновения ре1'улирующе1'О СИ1'нала: изменение скорости образования продуктов ферментативной pe акции, ПОС'I'упающих в цепь последовательных метаболических реакций, приводит к изменению функционирования фермента, продуцирующе1'О метаболитреrулятор. АiJcорt5ЦUО1i1iЫЙ мехаllИ.1М ре2улuроеания активности фермен тов и ферментных комплексов реализуется при соблюдении сле дующих условий: существуе'l' обратимое равновесие между свободной фор мой фермента и адсорбированным ферментом; каталитические характеристики фермента изменяются при ero адсорбции; обратимое равновесие между свободной и связанной фор мами фермента является чувствительным к воздейс'rвию кле точных метаболитов. Физиолоrическая важность обратимо1'О связывания фермен тов субклеточными структурами рассматривается в следующих аспектах: адсорбция ферментов может приводить к изменению их каталитических и реrуляторных свойств и, следовательно, явля ется фактором, реryлирующим активность ферментов; адсорбция ферментов может обеспечивать компартмента лизацию метаболитов у поверхности, на которой адсорбированы эти ферменты; адсорбированные ферменты способны образовывать упо рядоченные мультиферментные СТРУl<ТурЫ (метаболоны), блаrо в. Заказ 3788 81
даря чему появляется возможность реryлировать метаболичес кий процесс как единое целое; ферменты, адсорбированные на белковых порах мембран, Mo1'YТ участвовать в активном транспорте метаболитов через мем, брану; адсорбированные ферменты более стабильны, чем свобод ные ферменты. Таким образом, адсорбция может служить фак тором, снижающим скорость деrрадации ферментов в клетке. Рассмотрим адсорбционный механизм реrулирования функ циональной активности ферментов важнейших метаболических путей более подробно, так как он реализуется с участием различ ных мембранных структур клетки. 2.3.2. АiJеорбцuонный .механиз.м реzул.яцuи .метаболиз.ма: понлтuе о .метаболоне, ею структура,. ФU3UОЛОZUlfДСlCое значение образованUJl В последние 1'оды наряду с "классической" энзимолоrией, pac сматривающей ферментные системы как rомоrенный раствор со свободно плавающими ферментами: и метаболи:тами, выделилось направление, основанное на пространственной и структурной opra низации ферментных систем. В рамках этоrо направления разра ботаны разли:чные методические подходы для решения пробле мы надмолекулярной орrанизации метаболических процессов в клетке. Так, целый ряд работ посвящен экспериментальному ис следованию. взаимодействия различных структурных компонен тов клетки с ферментами важнейших метаболических путе,Й, в частности, 1'ликоли:за. Впервые взаимодействие rликолитических ферментов со cтpyк турными белками мышц было описано Н. Arl101d, D. Pette (1968), которые установили, что на долю Fактина приходится больще свя занных ферментов 1'ликолиза, чем на долю миозина, актомиозина и белков стромы. Из ферментов наибольшим сродством к F акти:ну обладает альдолаза, несколько меньшим 1'ли:церальдеrид-3фос фатдеrидроrеназа. Определенную способность к взаимодействию ПРОЯВЛЯIот также фрсфофруктокиназа, 3фосфоrлицераткиназа, пи руваткиназа и лактатдеrидРОI'еназа. F. М. Claxke, С. J. Masters (1975) изучили способность ферментов rликолиза образовывать фермен- тативно-активные комплексы с Fактином и Fактинтропомио- ЗИНтpQпонином из мышц быка. Они показали, что такие фермен ты, как фосфофруктокиназа, альдолаза, пируваткиназа, лактатде- 82
rидроrеназа, rлю:ко:зо6ф()сфатизом:ерааа, леrко ассоциируют с F актином и нативным тонким филв-м:е:атом. Причем наибольшее сродство эти ферменты проявляют к I'tомплексу FаЕТИНтропоми озинтропонин. 'l'риозофосфа'l'изомераза, фосфоrлицераткиназа, фосфоrлицератмутаза, енолаза и reКСО:Киназа связываются roраздо медленнее. Наилучшие условия ассоциации наблюдались при фи ЗИОJIоrическОЙ концентрации солей ". 5,0 мм:оль/л KCl и высокой концентрации МИО1'ена 35 М1'/мл. Это взаимодействие чувстви тельно к изменению ИОЕШОЙ силы; :КС1 в :концентрации 150 ммоль/л предотвращает образование КОМПJlе:ксов. В опытах по экстра:кции ферментов из I'рудной мышцы КурИ цы также была показана специфичес:кая адсорбция 1'ликолити ческих ферментов, особенно I'лицеральдеI'ид3-фосфатде1'идроrена зы и лактатдеl'ИДРО1'еназы (J. D. El1rrlann, Н. О. Hu1tin, 1973; R. L. Me1rlick, Н. О. Hu1tin, 1973), Кив:етические параметры обоих ферментов при связывавии измен.я:лисъ: максимальная скорость и КОIхстанта Михаэлиса выше для свободной rлицеральдеI'Иk3 фосфатдеI'идроrеназы; при переходе лю,татдеI'идроrеназы в свя занную форму предотвращается ее инrибирование пируватом:. Предположение о существо1Ц'\НИИ на мембране эритроцитов CTPYK'rypHo УllорядоченrюI'О IЩМПЩН'tса rликолитических фермен тов было ВЫCl,азан:о еще в 1965 1:'. D. Е. Green et al. Позднее с использованием ме'rода седиментации на препарате МИОI'ена было обнаружено увеличение кажущихс.н молекулярных масс альдола зы, лактатде1'идроrеназы, lIИруваткинаэы и фосфофруктокиназы (F. М. C1arke, С. ,Т. Masters, 1973). IIолученные результаты подтвер дИJIИ наличие полиферментных комплеI"сов rликолитических KOM понен.тов при физиолоrичеСIШХ условиях рН и ионной силы. На основе анализа данных по ВНУТРИl'tлеточном:у распределе нию фермен'l'ОВ rликолиза в мышечных :клетках D. Pette (1975) пришел :к заключению о существовании упорядоченно1'О мульти фермеIlТНOI'О компле:кса rЛИI<Qлитических ферментов, адсорбирован ных на СТРУI<ТУРНЫХ беJII\ах мышц. rис'rохимичес:кими исследова ниями подобный комплекс ферментов был выявлен в изотропной зоне миофибрилл мышечных ВОЛОI<ОН (Р. 8ige1, D. Pette, 1969). J. Mowbray, У. Моэеэ (1976) обl:!аружили мультиферментный комплекс, обладающиЙ аI,ТИlШОСТЯМИ всех ферментов 1'ли:коли за, в растворимой фрarш;ии разрушенных механическим путем сферопластов Esc1lericl1ia соН. F. Е. Opperdoes и Р. Borst (1977) выявили, что полный набор ферментов 1'ликолиза африканской в.. 83
трипаносомы Trypanosoma brucei упакован в примембранной opra нелле, названной ими "rЛИКОСQМОЙ". При изучении обратимо1'О связывания ферментов 1'лико лиза в скелетных мышцах было высказано предположение о том, что ассоциация диссоциация э'rих ферментов с сократительным аппаратом является ре1'УЛЯТОРОМ rликоли тическоrо пути (Т. Р. Walsll et al., 1981). В ряде работ обсждается ВОЗМОЖНЫЙ характер прос'rрыrС'l'вен ной орrанизации комплекса ферментов rликолиза. П. Фридрих предложил rипотетическую схему расположения ферментов в мембране эритроцитов (рис. 20). Идея схемы состоит в наложе нии последовательно расположе:нных ферментов центральной ча- сти 1'ликолиза на пучок "хвостов" белка полосы 3, имеющих весьма специфичные участки для связывания каждоrо фермента. Схема учитывает 'l'!j.Кже возможное участие белков цитоскелета (а:Еt'l'И на) в процессе связывания отдельных ферментов. Б. И. KypraнoB и соавт. (1986, 1988) ВЫДВШ'IУЛИ rипотетичес кую модель структур комплекса 1'ликолитических ферментов в CKe летных мышцах, а также на. внутренней поверхности мембраны эритроцитов. Возможность объединения 1'ликолитических фермен- тов в комплекс предопределена тем, что их молекулы имеют цeHT ры узнавания своих "соседей", а однозначность сборки ДОСТИ1'ается тем, что в ней принимает участие якорный белок подложки, на N N N N N N Рис. 20. rипотетическая cxelVIa расположения ферlVIентов в lVIеlVIбране эритроцитов (П. Фридрих, 1986). Димеры B3P (белка полосы 3) nOI'PY- жениые в мембрану reIсaroнальНЫе структуры. Их NК9НЦЫ формируют В ЛИ1IИДНОIVI бислое каналы для анионов и выступают в цитоплазму. фrк 3фосфоrлицераткиназа; нь rемоrлобин; rАФД rJПщеральдеrид3 фосфатдеrидроreназа; Альд. альдолаза; ФФК фОСQюфруктокиназа Мембрана Внутри 84
которой формируется комплекс. Комплексы отдельных 1'ликоли тических ферментов непрочны, что затрудн,я:ет их изучение в pa створе. :Кооперативность процесса ассоциации при:водит к тому, что ассоциация должна протекать по принцилу "все или ничеro". KOM плекс 1'ликолитичесн:их ферментов формируется на тонких нитях изотропной зоны миофибрилл мышечных волокон, образованных F -актином и реryляторными белками тропомиозином и тропо- вином, или на димерах бета полосы 3, поrруж.енных в мембрану эритроцитов. ФИЗИОЛО1'ический смысл формирован:ия комплекса ферментов, участвующих в общем метаболическом пути, на под- ложке биолоrической природы состоит в том, что клетка получает возможность pery лировать метаболичеСIУЮ систему как единое целое с помощью химических СИ1'налов, воздействующих на "якор- ный" белок подложки (Б. И. KypraнOB, 1986). ПредполаrаIOТ, что в скелетных мышцах rликолитическая система стимулируетс,я: ионами Са 2 + , связывающимися с "якор ным" белком подложки тропонином С. Первый этап сборки комплекса это, по всей веро,я'l'НОСТИ, посадка фосфофруктоки назы на "якорный" белок. Остов "ядра" комплекса, так называе мое "ядрыmко". образуют в мышечной ткани, кроме фосфофрук 'roкиназы, альдолаза и rлицеральде1'идфосфатдеrидроrеназа. В со- став "ядра" входят rлюкозофосфатизомераза, пируваткиназа, лактатдеrидроrеназа и фОСфО1'лицераткииаза. Остальные компо ненты комплекса (фосфоrлицеромутаза, еиолаза, триозофосфати- зомераза, rлицеролЗ.фосфатде1'ИДРО1'еназа) занимают, очевидно, положения на периферии комплекса (рис. 21). 11 CD Q Q Q Q I (1) 11 (5) 111 (13) IV (21) зародыш ядрышко ядро комплекс Рис. 21. Этапы сБОРI<И I<омплекса ферментов I'ликолиза: n ,я:кор ный белок подлож:ки; 2 I'ЛЮI<озофосфатизомеразаj 3 фосфоФрук токиназа; 4 альдолаза; 5 I'лицеральдеrидфосфатдеI'ИДрОI'еназа; 6 фосфоrлицеРa'I'I<иназа; 7 фОСфОI'лицеромутаза; 8 енолаза, 9 пи руваТЮIназа, 10 лактатдеI'ИДрОI'еназа; 11 триозофосфатизомераза; 12 rлицеРОJI-3-фосфатдеI'ИДРОI'еназа. В СI<обках указаs:о число моле- кул ферментов в состояниях IIV КОМlшекса 85
. Сборка rликолитическо1'О метаболона на внутренней поверх ности мембраны эритроцитов происходит на reKcaMepax (триме- рах димеров) белка полосы 3, имеющих ось симметрии TpeTbero порядка, перПеНдикулярно к плоскости мембраны. Первым эта пом сборки комплекса rликолитических ферментов является ад- сорбция 6фосфофруктокиназы (ей принадлежит ключевая роль) на олиrомерах белка полосы 3 (В. И. Kyp1'aHoB, А. Е. Любарев, 1988). Метаболон содержит тройной набор ферментов, ero моле кулярная масса составляет 4,5'106 Да (рис. 22). Метаболон явля ется мобильной структурой и находится в подвижном paBHOBe сии со свободными ферментами, которое контролируется клеточ ными метаболитами (В. И. KypraHOB и соавт., 1986). Микроком- 10 нм 11 Рис. 22. I1шотетич:еская структура комплекса ферментов rликоли за, формирующеrося на внутренней поверхности мембраны эритроци- тов (три проекции) (В. и. KYPl'aнOB, А. Е. Любарев, 1988): Q димер белка полосы 3; 1 rлюкозофосфатизомераза; 2 6-фосфофруктоки- наза; 3 фруктозобисфосфатальдолаза; -4 rлицеральдеrидфосфатде rидроrеназаj 5 фосфоrлицератжиназа; б мультифунжциональный фермент, обладающий фосфоrлицеромутазной, бис-фосфоrлицеромутаз- ной и БИС-фОСфОl'шщератфосфатазной акТИБностями; 7 еНОЛ83аj 8 пир'уваткиназа; 9 лактатдеl'идроrеназа; 10 триозофосфатизомера- за; 11 rлицерол-3-фосфатдеrидроrеназа 86
партмент имеет вход(ы) для поступления исходных субстратов и выход(ы) конечных продуктов метаболическо1'О пути. "Места" выхода АТР продукта rли:колитическоrо пути в комплексе ферментов 1'ликолиза находятся вблизи фосфоrлицераткиназы и пируваткиназы. Повидимому, АТР, продуцируемый фОСфО1'ли цераткиназой, утилизируется Na+, Kt-АТФазой. Таким образом, комплекс rликолитических ферментов, aд сорбированный на димерах белка полосы 3, может находиться в контакте с Na+, К+АТФазной системой и обеспечивать потреб- ности последней в А ТР. Взаимодействия ферментов, входящих в состав мультиферментно1'О комплекса, обеспечивают вовм:ож ность ре1'улирования функциональной активности комплекса как единоrо цело1'О. Роль фаr{торов контроля отводится в дaв: ном: случае не интермедиатам метаболическоrо процесса, а BHe mни:м факторам вторичным посредникам, с помощью KOTO рых осуществляется оптимальное функционирование мульти" ферм:ентноrо комплекса в рамках системы более BbIcoKoro ypOB вя сложности, Т.е. в клетке. Рассмотрим это на следующем примере. Димер белка полосы 3 эритроцитарных мембран спо со бен взаимодействовать с ионами кальция. Концентрация ионов кальция в эритроцитах составляет 1020 мкмольfл. Внутри- клеточная концентрация кальция может повышаться в ответ на связывание ropMoHoB и нейромедиаторов соответствующими рецепторами, встроенными в мембрану эритроцитов (см. раз дел 2.1.). Изменение степени насыщения якорноrо белка иона м:и кальция будет приводить к конформационным изменениям: якорноrо белка и, следовательно, молекул ферментов комплек са, находящихся в непосредственном контакте с якорным бел- ком:. В результате изменяются каталитические свойства всех ферментов rликолиза. Кроме '1'01'0, происходит снятие стеричес ких затруднений для входа субстратов в микрокомпартм:ент и дальнейшей химической трансформации в микрокомпартмен те. Якорный белок центр управления rликолитическим: KOM плексом может фосфорилироваться с участием протеинки- ваз, которые активируются сАМР вторичным мессенджером. Следовательно, сборка ферментов, участвующих в общем MeTa болическом пути, ПРИВОДИТ I ослаблению изостерических и алло- стерических м:еханизмов и обеспечивает возможность реализации иерархически более "BblcoKoro" реryляторно1'О механизма, осуще ствляющеrо контроль функционирования метаболической систе- 87
мы как целою. Этот механизм контроля реализуется с участием вторичных мессенджеров, Т.е. является механизмом слежения, переключающим функционирование метаболической системы в новый режим в соответствии с СИ1'налами, поступающими от более высоких уровней контроля метаболизма. Механизм контроля фун- кционирования мультиферментно1'О комплекса как цело1'О осуще- ствляется с более высокой скоростью в сравнении с изостерически ми и аллостерическими механизмами ре1'УЛЯЦИИ. Мультиферментные комплексы, формирующиеся на подлож ках БИОЛО1'ической природы, являются мобильными образовани- ями, которые находятся в равновесии со свободными фермента- ми. Это обстоятельство определяет возможность эффективноrо осуществления и взаимодействия в клетке и механизмов 1'OMeo стаза, и механизмов слежения. Ферменты, связанные общими ме'l'аболитами или кофермен тами, находятся в метаболоне рядом дрyr с дрУ1'ом. Это обеспечи вает эффективное продвижение интермедиатов по конвейеру ак- тивных центров в микрокомпартменте, образующемся при сбор- ке метаболона (В. И. KypraнoB, А. Е. Любарев, 1988). На основе данных о пространетвенной орrанизации метаболи- ческих процессов в цитоплазме эукариотической клетки А. r. Ря занов и А. С. Спирин (1989) построили эстафе'l'нyIO модель работы ферментов в клетке, которая объясняет молен:улярный механизм компартментализации. Модель основана на трех постулатах: ассо- циации ферментов с субклеточными структурами, передачи мета- болитов междУ ферментами без диффузии в растворе идесорбции ферментов с поверхностей внутриклеточных структур в процессе К8ЖДоro акта катализа (рис. 23). Важным преимуществом Mexa низма "эстафеты у поверхности" является то, что он приводит К Е(Ф Е(1ф . o \ V Е 2 \"\ Е,( 1Cif! Е 2 / 11 E2 .... О ......... Ф ......... Ф ......... . ...... Рис. 23. Схема эстафетной передачи метаболитов между фермента ми у поверхности внутриклеточной cTpyITypы 88
концентрированию и компартментализации ферментов данно1'О метаболическоro пути вблизи места ПO'l'ребления конечно1'О про- дукта. Те или иные МОДИфИIации ферме1I'l'ОВ или поверхности, изменяющие их взаимное сродство, создают возможности HOBoro механизма ре1'УЛЯЦИИ метаболических процессов за счет простран- cTBeHHoro перераспределения ферментов в клетке, Концепция метаболической ре1'УЛЯЦИИ посредством динами. чесн:ой сборки и разборки ферментных комплексов обсуждается также в работе J. Ovadi (1988). J. Batke (1989) предложена схема процессов взаимодействия между ферментами rликолиза в мышцах (рис. 24). На основании анализа результатов исследования взаимодей- ствия ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), связанно- ro со множеством анаболических и катаболических процессов, с внутренней мембраной митохондрий, а также белок-белковых вза- имодействий А. Е. Любаревым и Б. И. Кур1'ановым (1987) раз работана модель, описывающая пространственную структуру KOM плекса ферментов ЭТО1'о центральноrо метаболическоrо пути. ПреДПОЛCiжение о существовании комплекса ферментов ЦТК ими было высказано с учетом следующих экспериментальных дан- Рис. 24. Схема взаимодействия между ферментами r.JXиколиза в мыш- цах: ФФI'I: фосфофруктокиназа; фдф фруктозо-l,6дифосфатаза; rАФД rлицеральдеrидфосфа1'дех'идроrеназа; фrI'I: фосфоrлицера1'- киназа; ПI'I: пируваткиназа; лдr лаятатдеrидроrеназа; ТФИ три озофосфатизомераза; fФД rлицерол3-фосфатдеrидроrеназа; СаМ кальмоду.JXИН. Линиями обозначена возможность комплен:сирования in vitro, цифрами представлены значения Rd в микромол.ях 89
ных И теоретических расчетов: концентрация белка в матриксе митохондрий, rде локализованы ферменты ЦТК, составляет 40 вес. %; в этих условиях затруднена диффузия молекул фер- ментов и их кофакторов; среднее расстояние между внутренни ми поверхностями внутренней мембраны митохондрий сердца со- ставляет 1530 нм. Авторы считают, что комплекс ферментов ЦТК представляет собой 1'ексамер из шести идентичных асимметричных субъеди ниц, каждая из которых содержит тетрамер транссукцинилазы, по одной молекуле остальных ферментов и "якорный" белок. Ком- плекс "зажат" между противоположными поверхностями BHYT ренней мембраны митохондрий, причем с мембранами контакти руют все ферменты, за исключением а.кеТО1'лутаратдеrидроrе назы и аспарта'l'аминотрансферазы. В качестве "якорных" бел ков выступают интеrральные белки внутренней митохондриаль- ной мембраны, в том числе сукцинатдеrИДРО1'еназа. Они обеспе чивают сборку комплекса ферментов ЦТК на мембране, высота KOToporo вдоль оси симметрии TpeTbero порядка составляет 20 нм, а диаметр 50 им. Молекулярная масса (без учета сукцинатде- 1'ИДРО1'еназъr) равна 8 мДа. Структура предложенной модели до- пускает возможность взаимодействия это1'о комплекса с ДРУ1'ими ферментами и мультиферментными ансамблями, с которыми он связан общими метаболитами, и, прежде Bcero, с комплексами цепи переноса элеl<ТРОНОВ внутренней мембраны митохондрий. Кроме To1'o, метаболон ЦТК должен взаимодействовать с ДРУ1'и- ми ферментами матрикса. Для митохондрий сердца в качестве таких беЛl<ОВ выступают nируватдеrидроrеназный l<омплекс и фер менты -окисления жирных кислот, поставляющие в ЦТК aцe тилкофермент А. Комплекс фермен'rов ЦТК мобильная СТРУЕ тура, находя щаяся в равновесии со свободными ферментами матрикса. Обра тимое равновесие между свободными и связанными ферментами контролируется целым рядом факторов: концентрациями опре деленных метаболитов в матриксе митохондрий (цитрата, OKca лоацетата, кофермента А, ацетилкофермента А, Mg2+-ATP и др.), концентрацией белка, энерrетическим состоянием митохондрий. Взаимодействия ферментов, входящих в состав метаболона ЦТК, обеспечивают функционирование ЭТО1'о надмолекулярноrо l<ОМП- лекса ферментов как целостной, кооперативно действующей сис темы. 90
В то же время нет убедительных доказательств существова- ния надмолекулярноrо комплекса kaK01'o-либо метаболическоrо пути или e1'o фраrмента. Прямым подтверждением существова- ния .метаболона (надмолеI<,улярноrо I<.омплекса ферментов, ката- лизирующих последовательные стадии ферментной системы) мо- жет быть либо ero выделение, либо реконструкция in vitro и эк- спериментальное доказательство туннелирования между фермен тами-соседями (r. л. Ермаков, 1993). Такие попытки предприни маются, например, для ферментов rликолиза, цикла :Кребса и цикла мочевины. Та:ким образом, в настоящее время широко обсуждается про- блема пространствеюlОСТРУКТУРНОЙ орrанизации ферментных систем. Вместе с тем отсутствуют исчерпывающие данные, Kaca ющиеся изучения ферментферментных, ферментмембранных взаимодействий, взаимосвязи физико-химических хараI<:теристик белков с их способностью образовывать надмолекулярные KOM плексы, выяснения роли цитоскелета клетки в ОР1'анизации кле точноrо метаболизма. Кроме '1'01'0, схемы надмолекулярной op1'a- низации компонентов метаболических систем 'l'ребуют экспери- ментальных доказа'l'елъств. 2.3.3. Пути ре3УЛllровани'я aJстибности векторных фер.ментов 6'ио.ме.м6'ран Одним из наиболее ан:туальных вопросов современной мем- бранолоrии является выяснение принципов и механизмов ре- rуляции векторных ферментов биомембран (в том числе Na, :K+-АТФазы), выполняющих разнообразные "жизненно важные" функции не только для отдельных мембранных структур, но и для клетки в целом. Полифункциональный характер Na+, :К+АТФа зы (см. раздел 1.2.4) , Т.е. сочетание в ней метаболической, транс- портной и рецепторной функций, определяет существование до- статочно сложных механизмов ее реryляции. :Кроме тo1'o, изуче ние механизмов функционирования и реrулирования транспорт- ных АТФаз на уровне отдельных Iлеток и субклеточных компо нентов актуально не только в теоретическом, но и в практичес ком аспекте для оценки степени и характера нарушений этих механизмов при некоторых паТОЛО1'ических состояниях, связан- J:Iыx с изменением ионноrо состава среды и накоплением актив ных форм кислорода (см. rлаву 3). Рассмотрим основные пути реrулирования функциональной активности одно1'О из ключевых 91
векторных ферментов плазматических мембран Iлеток Na+, K+ АТФазы. По современным представлени.ям, Na+, К+АТФаза является типичным липидзависимым ферментом: для формирования e1'o функциональноак'rивной конформации необходимы кислые ли пиды. Показано, что мембранные rликолипиды, локализованные преимущественно в наружной половине бислоя, обеспечивают правильную ориентацию Na+, К+АТФазноJ:'О комплекса относи тельно плоскости мембраны (т.е. они отвечают за проявление BeK торных свойств фермента). Вместе с тем остается неясным, KaKO ва специфическая роль мембранных фосфолипидов в обеспече нии транспортной функции Na+, К+АТФазы. Повидимому, фун кционирование центров связывания нуклеотидов и катионов на молекуле фермента не зависит от ЛИПИДов, тоrда как для осуще ствления конформационных церестроек в ферментном беЛIе важ на ero связь с мембранными липидами. Кривые, описывающие зависимость ферментативной активности от концентрации ли пида, имеют сиrмоидиую форму, что свидетельствует о I<.оопера тивном характере связывания ЛИl1ИДОВ с белком. Однако абсо лютная потребность фермента в тех или иных фосфолипидах (или их полярных rоловках) экспериментально не дон:азана. Так, опыты по ферментативному превращению одних фосфолипидов в дру- 1'ие (например, фосфатидилсерина в фосфатидилэтаноламин) в препаратах мембраносвязанной Na+, IC+АТФазы показали, что фермент может функционировать без отрицательно заряженных фосфолипидов, но с уменьшением молекулярной активности. Получены данные, свидетельствующие о том, что липиды, создающие микроокружение Na+, IC+АТФазы в биомембранах, характеризуются сравнительно низкими энерrиями взаимодей ствия с ферментом. Существует мнение, что Na+, IC+АТФаза не имеет аннулюса в традиционном понимании этоrо термина. BMe сте с тем исследования с использованием ЭПРспеКТРОСI<'ОПИИ спинмеченных фосфолипидов показали, что фермен'l' оказывает существенное влияние на фосфолипидный состав ближайше1'О микроокружения в мембране, преИМyJЦественно связывая отри- цательно заряженные фосфолипиды. Оказалось, что сродство Na+, IC+АТФазы к отрицательно заряженным фосфолипидам в cpeд нем в 4 раза больше, чем к положительно заряженным, и "" в 2,5 раза больше, чем к нейтральным. Эта избирательность фер мента по отношению к заряду молекул фосфолипидов может 92
быть связана с наличием положительно заряженных боковых цепей аминокислотных остатков во внутримембранном домене Na+, К+АТФазы, взаимодействующем с полярными 1'ОЛОВl(8МИ фосфолипидов из ближайщеrо мин:роокружения. Для ряда ин теrральных мембранных беЛl(ОВ обнаружены такие боковые цепи остатки ар1'инина и лизина, преимущественно взаимо действующие с о'!'рицательно заряженными фосфолипидами би слоя. Получены доказа'rельс'rва To1'o, что изменение физическоrо СОС'!'ОЯЮIЯ липидноrо окружения Na', K АТФазы под влиянием температуры, содержания в нем холестерина, длины цепи и c're пени ненасыщенности жирных кислот, входящих в СОС'!'8В фос фолипидов, може'!' влиять на активность ЭТОI'О фермен'rа. 1. J. De POIlt et а1. (1978) ПОIазали, ч'ro rидролиз различных фосфолипидов, содержащихся в высокоочищенном препарате Na+, IC+.АТФазы из '!'КaIШ почек крокодила с помощью фосфолипа зы С, существенно не влияе'!' на активность фермента. С друrой стороны, удаление 60 % фосфолипидов из 'l'aKorO же npelIapa'l'a белка с помощью фосфолипазы А приводило l( nO'l'epe 70 % А'l'Фазной активности, в то время как число уабаинсвязываю щих центров оставалось неизменным. 'l'акой разброс данных о липидной "по'rребности" Na, К+АТФазы объясняется тем, что снижение ферментативной активности обусловлено не толы(o уменьшением содержания фосфолипидов, но и инrибирующим действием жирных кисло'!', образующихся при rидролизе фос фолипидов фосфолипазами. Все вышеизложенное свидетеЛЬС'l'вует о 'l'OM, что целыЙ ряд воп росов, Iасающихся детальноrо выяснения роли ЛИПИДИО1'О маТрИl( са в функционировании мембранОСDЯЗ8ННОЙ Na+, КАТФазы, OC'l'a етс.я недос'rаточно изученным. По всей вероя'1'НОСТИ, Na+, К+.АТФаза нахОДИ'l'ся в 'rеСJ:IОЙ про странственной и функциональной взаимосвязи не только с липи дами, но и с мембранными белками. Были получены доказатель ства взаимодействия этоrо фермента с периферическим белком мембраннOI'О скелета анкирином, УС'l'ановлена ero связь с ани- онным переносчиком белком полосы 3, выявлено ре1'УЛЯТОР ное влиm:-Iие на ar<'l'ивнос'rь АТФазы спектрин-а.ктиново1'О комп- лекса. Имеются данные, указывающие на возможность образо вания за счет белокбелковых взаимодействий в мембране эрит рОЦИ'l'Oв сложных мультиферментных комплексов, состоящих из rлицеральдеrид 3 фосфат деrидроrеназы, фОСфО1'лицераткиназы, 93
фОСфО1'лицератмутазы и Na+, КIАТФазы. Между указанными фер ментами существует функциональное сопряжение, за счет ];cOTO poro субстраты 1,3-дифосфоrлицерат и АТФ непосредствен но транспортирую'rся от ОДНО1'о компонента системы ];с дрУ1'ому. Известно, что Na+, K+-АТФаза может быть функционально связана с такими мембранными системами как, N а+ jCa 2 ' -обмен- ник, рецептор инсулина, адренорецепторы, cAMP-зависимая протеинкиназа, аденилатциклаза. Обсуждается вопрос о существовании in vivo пространствен ной и функциональной взаимосвязи между мембраносвязанны- ми Na', К'АrrФазой и ацетилхолинэстеразой. Субстрат ацетил- холинэстеразной реакции ацетилхолин был одним из первых соединений, идентифицированных как нейротрансмиттеры. Он принадлежит к 1'руппе нейропередатчиков, вызывающих депо ляризацию постсинаптических мембран, которая приводит к воз никновению ПИКОВО1'о потенциала и торможению активности Na+, К+А'I'Фазы. Действие ацетилхолина в основном устраняется пу тем e1'o энзиматическо1'О расщепления ацеТИЛХОЛИНэс'rеразой. Ре1'уляторные механизмы, в реализации которых, очевидно, участвуют вторичные мессенджеры (например, СаН и сАМР), 1'ор- моны, БИОI'енные амины, нейротрансмиттеры и друrие факторы, наименее изучены. Однако не вызывает сомнений, что именно блаrодаря им происходит более тесное сопряжение натриевоrо насоса с важнейшими процессами клеточноrо метаболизма. Существенное значение для проявления: функциональной ак- тивности N а+, К+ A ТФазы и ДРУ1'их векторных ферментов (Ca 2 +-АТФаза, аденилатциклаза, цитохромоксидаза), состоящих из нескольких субъединиц, имеют степень олиrомеризации и коо- перативные взаимодействия субъединиц или доменов в составе олиrомерных молекул, которые находятся под контролем BHYТ ренних и внешних факторов. Все вышеперечисленные ре1'УЛЯ- торные звенья, а именно: взаимодействие фИЗИОЛО1'ических ли 1'андов со специфическими центрами связывания; индуцируемые ЛИ1'андами взаимодействия доменов внутри субъединиц, отдель- ных субъединиц, протомеров, ОЛИ1'омерных комплексов; модуля- торные эффекты липидноrо матрикса лежат в основе KpaTKO срочной (быстрой) или "оперативной" реryляции активности век- торных ферментов биомембран при изменении Функционально- 1'0 состояния клетки. Этот механизм реализуе'l'СЯ за счет элект- ростатических, rидрфобных, ван-дерваальсовых взаимодействий, 94
водородных, ковалентных связей, участвующих в поддержании липидбелковых, белок-белковых, липидлипидных взаимодей- ствий (раздел 1.4). "Долrосрочный" механизм реrул:ирования активности мемб ранных ферментов реализуется за счет белоксинтезирующей си стемы клетки и заключается в поддержании оптимальноrо соот- ношения между скоростью биосинтеза и распада этих фермен тов. Он направлен на обеспечение б:ИО1'енеза необходимOI'О коли- чества функционально активных молекул и олиrомерных комп лексов векторных ферментов, приходящихся на единицу площа- ди поверхности мембраны. "Долrосрочный" механизм связан с действием различных 1'ормонов, вторичных мессенджеров и дpy rих факторов на плазматическую мембрану клетки. Биосинтез векторных ферментов биомембран на начальных стадиях происходит анало1'ИЧНО синтезу бодылинства белков эука риотических клеток, однако имеет и ряд особеннос'rей. Так, MeM бранные белки синтезируются, как правило, в виде неактивных форм (проферментов), которые с помощью селективно1'О протео- лиза превращаются в активные формы в ходе пос'rтрансляцион- ной МОДИфИI'(ации. Вероятно, биосинтез различных субъединиц олиrомерных молекул мембранных беЛl{ОВ происходит на раз ных мРНК в шерохова'rой (rранулярной) эндоплазматической сети. Полаl'ают, что эффективность синтеза мембранных беЛI'(ОВ знаЧИ'l'еJIЬНО повышается за счет объединения отдельных рибо- сом в полисомы. Однако более детальные исследования, касаю щиеся выявления важных аспектов БИО1'енеза мембранных бел- ков, остаются не выясненными до настоящеrо времени. "Краткосрочный" и "ДОЛ1'осрочный" механизмы реl'улирова ния активности мембранных ферментов в реальных условиях ill vivo дополняются мноrочисленными компонентами: функцио нальным "сопряжением" одноrо фермента с дрyrими, наличием каскадных механизмов реrуляции, "модуляцией" активности белков мембран в результате воздействия физических a1'eHTOB. В целом процесс реrулирования функционирования векторных белковферментов биомембран рассматривается как сложноевза имодействие "подсистем" универсальноrо реrуляторноrо механиз ма, обеспечивающее CTPYIi.typho-функциональную 'интеrрацию компонентов мембран и поддержание клеточноrо rомеос'rаза (рис. 25). Универсальность основных реrуляторн:ых механизмов векторных ферментов биомембран обусловлена сходством их 05
Физиолоrические лиrанды Аллостерич еская реryляция Мембранные липиды и холестерин Белок-белковые взаимодействия rормональный контроль Действие физиоло- rически активных соединений ЭндоrеННЬ1е инrибиторы и активаторы ? Конформа ционные переходы Изменение количества "копий" фермента Каталитический цикл и сопряженная с ним функция Рис. 25. Схема процессов реrуляции активности векторных фермен тов биомембран (А. В. Кравцов, И. Р. Алексеенко, 1990) структурной ОР1'анизации и трансмембранным характером BЫ полняемых ими функций. Вместе с тем остается ОТRрытым воп- рос О npиоритетности To1'o или ШЮ1'О реrуляторно1'О механизма и об их взаимодействии в процессе функционирования каждоrо KOHKpeTHoro фермента. Таким образом, разрабатываемая в Ha стоящее время концепция общности принципов ре1'УЛЯЦИИ ак- тивности ферментов, БЫПОЛНЯЮЩИХ трансмембранные функции, требует новых экспериментальных доказательств. 96
2.3.4. Молекулярные MexaHU3J1tbl нейроzу.;и;оральной реzуляцuи ФУНlCций lCлетOlС Функционирование клеток раЗЛИ<J:НЫХ 'rканей в составе цело CTHoro орrанизма обеспечивается взаимосвязанными механизма ми неЙРО1'уморалъной реrуляции с участием нейромедиаторов и ropMoHoB, синтезируемых соответственно нервными клетками и железами внутренней секреции. Следуе'l' подчеркнуть, что OCHOB ные механизмы (рис. 26) такой реrуляции реал:изуются при He посредственном участии различных молекулярных Iомпонентов биомембран. Охарактеризуем более подробно представленные на этом рисунке пу'1'И ре1'УЛИрОl!ания функций Iлеток. Первый механизм осуществляется с участием нейромедиато ров, взаимодействующих с мембранными рецеП'1'орами клеток,' КО'1'орые представляют собой ионные каналы, Напомним, что ион ные каналы Э'1'о ин'rеrральные беJ1IИ (1'ЛИКОl1ротеины), прони зывающие липидный бислой мембраны и С110собиъrе в результа те внешних воздействий (изменение мембранноI'O потенциала, дей ствие медиатора или ropMOHa.) избирательно изменять проницае мость мембраны для определенных ионов. Ионным каналам свой I Нейроryморальная реryляция Нейромедиатор С меМбранные рецепторы каналоформеры Белковопептидные ropMOHbI, катехолами ны, простаrландины идр. Биолоrический эффект (миллисекунды) Изменение мембран НОСО потен циала Химическая моди фикация белков Биолоrический эффект (минуты) Стероидные и тиреоидные ropMOHbI Внутриклеточные рецепторы Ядро мРНК Синтез белка Биолоrический эффект (часы) Рис. 26'. Схема основных путей неЙРОl'уморальной реrуляции функ- ций кле'l'ОК (В. А, Ткачук, 1998) 7. 3акаа 3788 97
ственны избирательная проницаемость для ионов (селективность) и способность открываться и закрываться при различных воз действиях на мембрану (воротная функция). Воротный механизм работы каналов реryлируется сенсором внешнеrо стимула. В за висимости от локализации сенсора ионные каналы подразделя ют на две rруппы. К первой rруппе относятся каналы, имеющие собственный сенсор внешне1'О СТИмула (первичноrо посредника), Т.е. внешний сиrнал воздействует непосредственно на MaKpOMO лекулу ионноrо канала. Эта rруппа включает два семейства ион ных каналов: потенциал и ЛИ1'андуправляемые. Потенциал управляемые ионные каналы (Na+, К+, Са 2 +, Cl' каналы) OTKpЫ ваются и закрываются при изменении электрическоrо потенциа ла на мембране. Лиrандуправляемые ионные :каналы обеспечи- вают быструю передачу СИ1'налов в химических синапсах. Они открываются при связывании с рецептором специфических aro нистов (ацетИJIXолина, rлутамата, уаминомасляной кислоты). В каналах второй 1'руппы сенсор внешнеrо сиrнала (рецептор пер вичноrо посредника) пространственно разобщен с каналом. Взаи- модействие сенсора и канала осуществляется с помощью paCTBO римых внутриклеточных посредников (мессенджеров). Это ре- цепторуправляемые ионные каналы; каналы, опосредованно уп- равляемые химическими сиrналами. R ним относятся каналы, управляемые О-белками, которые активируются при связывании лиrанда с рецептором (см. раздел 2.1.1). В результате взаимодействия ЛИ1'анда нейромедиатора (на- пример, ацетилхолина) с холинерrическим рецептором никоти- HOB01'O типа, формирующим ионный канал, происходят измене ние конформации белка ионноrо канала и переход ero в активи- рованное состояние. Через устье канала, в формировании KOTO fk>ro участвуют субъединицы олиrомерноrо комплекса, внутрь клетки поступают ионы натрия. Происходит деполяризация, а затем rиперполяризация мембраны. Возникающий на постсинап тической мембране потенциал действия, вызываемый ацетилхо- лином, возникает и 1'асится за 12 млс, при этом синапс спосо- бен проводить от аксона на иннервируемую клетку до 500 имп/с. Быстрое развитие и rашение сиrнала возможны блarодаря BЫCO кой скорости связывания ацетилхолина (полумаксимальное насы- щение рецепторов наблюдается в присутствии ацетилхолина в KOH центрации 10'" моль/л) с рецептором и разрушения ero ацетилхо линэстеразой, локализованной на мембране вблизи холинорецеп 98
тора. Возвращение ИОННО1'о канала в закрытое состояние происхо дит в результате диссоциации rормонрецепторно1'О комплекса. Второй механизм реrулирования функций клеток реализу ется с участием ropMoHoB, действующих через мембранные pe цепторы и системы вторичных посредников, стимулирующих хи мическую модификацию белков (см. раздел 2.1). В качестве при мера можно привести функционирование муска.РИНОВОI'О холи неРI'ическо1'О рецептора, локализованно1'О преимущественно вне синапса. Он активируется ацетилхолином и алкалоидом MYCKa рином. Четыре типа близких по структуре мускариновых рецеп торов сопряжены с различными Gбелками. Так, Мхолинорецеп торы способны стимулировать фосфолипазу С, I'идроли:зующую фосфоинозитиды, И Mo1'YT ИН1'ибировать аденилатциклазу, синте зирующую сАМР и активирующую К+I):аналы. БИОЛОI'ический эффект при этом развивается и I'асится в течение десятков ми нут. Это связано с кинетическими особенностями связывания ли rандов с рецепторами, последовательным развитием этапов Kac кадной передачи СИI'налов через мембрану в цитозоль, медленно протекающими химическими реакциями СИН'l'еза, вторичных Mec сенджеров, фосфорилироваюrя и дефосфорилирования внутри клеточных белков. В каждой клетке имеются 710 различных типов рецепто ров, взаимодействующих со специфическими ре1'уляторами (ней ромедиаторами, 1'ормонами, проста1'ландинами, факторами poc та). Для каждоI'О реrулятора характерны определенные пара метры: продолжительность и аМПлитуда сиrнала, соотношение аКТИБностей компонентов систем вторичных мессенджеров и др. Третий механизм реrулирования функционирования клеток реализуется в том случае, если секретируемые эндокринными железами С'l'ероидные и тиреоидные ropMOHbl, имеющие липо фильную природу , взаимодействуют с цитозольными или ядер ными рецепторами. Эти рецепторы характеризуются высоким сродством к указанным 1'ормонам (полумаксимальное насыще ние рецепторов происходи:т в присутствии ropMoHa в KOHцeHTpa ции 1O910lO моль/л). Образующийся rОрМонрецепторн:pIЙ KOM плекс, стабильный в течение 13 ч, связы1аетсяя с дик и белка ми хроматина и Блияе'l' на экспрессию определенных 1'енов. TpaHC ляция синтезируемой мРНК на рибосомах приводит к появле- нию 37 новых белков, опосредующих биолоrический эффект стероидных и тиреоидных ropMoHOB. Этот тип ре1'УЛЯЦИИ осуще 7* 99
ствляется в течение 36 ч после поступления рормона в pOBЬ, а прекращается через 612 ч. Не исключается возможность и реп рессирования отдельных ренов, что rrриводит к уменьшению KOH центрации определенных белков в клетке. rOpMOHbI контролируют синтез не только различных фер ментов, участвующих в процессах анаболизма и катаболизма кле'l'КИ, но и протеинкиназ, фосфопротеинфосфатаз, рецепторов каналоформеров, реrулЯ'l'ОРНЫХ белков и ферментов, участвую щих в функционировании систем передачи информации в клет ке с участием вторичных посредников. Это один из путей ин те1'рации и взаимовлияния отдельных механизмов нейроrумо ральной реrуляцИИ функций клеток в составе целостно1'О opPa низма. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1, Что представляют собоЙ вторичные мессенджеры? 2. Какими свойствами характеризуютс,я мембранные бещ,и-рецеп- торы? 3. Что понимают под "каскадом" передачи внешнеrо сиrнала через клеточнУ1О мембрану? 4. Назовите основные типы мембранных рецеп'rоров, охарактери- ЗУЙ1'е их свойства и функции. 5. Каковы функции Gбелков? 6. Что 'rю<ое амплификация внешнеrо СИI'нала.? 7. Охарaz<теризуйте этапы передачи информации в клетку по аде- иилаТЦИI{лазному пути. 8. Какие внутриклеточные мессенджеры учаС'l'вую'r в передаче сиr- нала через клеточную мембрану по фосфоинозитидному пути? 9. Какова роль мембранных фосфолипидов в реализац= фосфоино- зитидноrо механизма передачи информации? 10. Какова роль ионов кальция в реализации различных процессов клеточноrо метаболизма? 11. КаЕие мембранные Tpaнcnop'rIIbIe системы ПРИНИМ810Т участие в реrулировании УРОВНЯ кальция внутри Iетки? 12. Какие факторы обеспечивают асимме'l'ричное распределение Ok новалентных ионов ВНY'l'ри и вне клетки? 13. Охарактеризуйте основные мехаIIИЗМЫ реrулирования: функци- ональной активности ферментов и ферментных систем в клетке. 14. Какова рОЛЬ мембран в интеrрации процессов кле'l'очноrо мета" болизма? 15. Ч'l'О понимают под адсорбционным механизмом рerулирования: ферментативной активности? 16. Что называют мета.болоном? 100
17. Какие теоретические 1.[ экспери:меН'I'альные предпосылки послу- жили основой для создани.я концепции о пространс'rвеННО-СТРYR'rурной орrанизации важнейших метаболичеСIИХ систем клетки? 18. Каково физиолоrическое значение образования rликолитичес- Koro мета.болона.? 19. Какие факторы Оказывают вли.яние на функционирование ком- понентов мета болона? 20. ОхарактеРИЗУIЪ'е сущность эстафетной модели функционирова- ния ферментов в клетке. 21. Что понимают под "краткосрочной" и "долrосрочной" реrул.я цией активности векторных ферментов биомембран? 22. Предложите план проnедения экспеРИМЕ'.Н'I'ОВ по вы.явлению роли отдельных компонен'rов биоме:мбран в функционировании ключевоrо фермента ионноrо rо:меостаза клетки Na+, K+-АТФазы. 23. В чем заключается взаимосвязь трех основных механизмов ней- роryморальной реrул.яции функций клеток?
rлава 3 МЕХАНИЗМЫ МОДИФИКАЦИИ КОМПОНЕНТОВ БИОМЕМБР АН ПРИ ПАтолоrИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ: РОЛЬ АКТИВНЫХ КИСЛОРОДНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В основе мноrих патолоrических состояний орrанизма чело века лежат изменения структурнофункциональных свойств MO лекул.ярных компонентов биомембран, индуцированные воздей ствием внешних факторов среды (фармаколоrические аrенты, яды, токсины, аллеР1'ены, ионизирующее и УФизлучение и др.) или внутренними функциональными расстройствами. К заболевани ям подобно1'О рода следует отнести rипертонию, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, стрессорные заболевания сердца, бронхоле1'очные заболевания, различные воспаления, злокаче ственный рост клеток. В связи с этим всесторонние исследова ния механизмов функционирования биомембран в норме и при патолоrии необходимы как для разработки методов лечения и профилактики вышеназванных заболеваний, так и для создания высокоэффективных лекарственных препаратов. 3.1. ПЕРОКСИДНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ КАК ОДИН ИЗ КЛЮЧЕВЫХ МЕХАНИ3МОВ МОДИФИКАЦИИ СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЫiоrо СОСТОЯНИЯ БИОМЕМБР АН Ведущую роль в развитии МНО1'их патоло1'ИЧеских состояний орrанизма иrрает свободнорадикальное пеРOJссианое окисление липшJов (ПОЛ). Наиболее вероятным субстратом ПОЛ в opra низме являются полиеновые лип иды биомембран. В roMoreHHbIX системах процесс ПОЛ протекает по свободнорадикальному цеп ному механизму. Первичные свободные радикалы появляются в ходе реакции инициирования цепи или катализа, которую счи тают начальным этапом ПОЛ. Инициирующими факторами ПОЛ в мембранах выступают ферментные системы природных мемб ранных структур (например, NADРНзависимая система), иони зирующее и УФизлучение, различные активные формы кисло рода (АФК). Последние способны индуцировать ПОЛ как в TeM новых процессах (например, при фа1'оцитозе), так и при воздей ствии УФсвета, фото повреждении сетчатки 1'лаза и др. 102
Реакция инициирования цепи имеет вид х' + RH ХН + R" , rде Х' свободный радикал, инициирующий цепь; RH HeHa сыщенная жирная кислота липида; R' алкилъный свободный радикал липида. Затем следуют реакции продолжения цепи: k R' + 02 RO"2' k RO + RIH .3> ROOH + R' l , (2) rде RO' 2 пероксидный раДИI:\ал липида; ROOH 1'идроперок сид липида. Константа СI:\ОрОСТИ k 1 реакции составляет l07l08 л/моль' с, а энер1'ИЯ аI:\тивации практически равна нулю. Следовательно, при обычных концентрациях кислорода (>106 моль/л) все pa дик алы R' превращаются в RO' 2 . Реакция (2) также имеет низ кую энер1'ИЮ аI:\тивации и высокую I-юнстанту скорости k 2 , вели чина которой зависит от типа окисляющеrося соединения. Разветвление цепи осуществляется в соответствии с реакцией (1) k ROOH a RO' + ОН', (3) rде RO' алкоксильный радикал; ОН' 1'идроксильный ради кал. С реакциями продолжения конкурируют реакции, приводя щие к обрыву цепи. Возможны следующие варианты спонтанно ro обрыва цепи: k R' + R" 4 RR, (4) k RO' 2 + R' ROOR, (5) k RO' 2 + RO' 2 молекулярные продукты. (6) Сущность цепно1'О процесса окисления состоит в чередовании двух реакций образования пероксидноrо радикала липида RO' 2 , а также 1'идропероксида ROOH и noBOro радикала липида R'; RH RH R' i RO' 2 f R' i R0 2 } R' --+ RO'z ROOH ROOH 103
Таким образом, в процесс вовлекаются все новые молекулы липида (RH) и кислорода, при этом накапливаются 1'идроперок сиды, а число радикалов R. и RO' 2 не изменяется в соответствии с принципом неуничтожимости свободной валентности. rенерирование липопероксидов в ОР1'анизме сопряжено с HOp мальными метаболическими реакциями, осуществляемы:м:и специ ализированными ферментными системами: NADРНзависимыми микросомальными оксиrеназами, ЦИКЛООКСИ1'еназами и лиnоокси 1'еназами, и служит источником биосинтеза внутриклеточных Me диаторов ПР()СТaI'ландинов, тромбоксанов, простациклина, лей. котриенов и липоксинов. Свободная полиненасыщенная жирная кислота, в частности арахидоновая. образовавшаяся в результате ферментативноrо 1'идролиза -ацилов лецитинов фосфолипазой А2' может окисляться по двум альтернативным: путям цикло или лиnооксиrеназному. При ЦИКЛООКСИ1'еназном окислении арахидо ната образуются цикличеСI<.ие эндопероксиды простarландины П2 и Н 2 . служащие универсальными метаболическими предшествен- никами различных ПрОСТaI'Л8НДIllЮВ (РПЕ 2 , РПЕ/, PGD 2 ), тромбок санов (ТХА 2 , ТХВ 2 ) и простациклина (PGI 2 ). Продуктами липоок СИ1'еназноrо окисления арахидоната являются алифатические 1'ид ропероксиды 1'идропероксиэйкозатетраеновые кислоты (НРЕТЕ) промежуточные продукты биосинтеза HOB01'o класса био ЛО1'ически аЕТИВНЫХ веществ лейкотриенов (LTA 4 , LTB4' LTC 4 , LTD,j) рис. 27. Производные С20полиненасыщенных жирных кислот типа арахидоновой, ТаЕ называемые эйкозаноиды, участВУ ют в осуществлении защитных реаЕЦИЙ клеток желудка, сердца и дрyrих opraнoB от повреждений, способствуют развитию воспале- ния, стимулируют сокращение 1'ладкой мускулатуры. Циклоокси- 1'еназные системы обнаружены в большинстве тканей животных, липооксиrеназные в различных животных клетках и тканях: лейкоцитах, тромбоцитах, ретикулоцитах; ле1'КИХ, селезенке, ce менниках. Между лиnооксиrеназным и циклооксиrеназным ny тями окисления полиненасыщенных жирных кислот в Ор1'анизме существует тесная взаимосвязь. ИН1'ибирование циклооксиrеназ H01'o пути окисления этих клеток in vivo сопровождается аЕтива цией их ЛИПООКСИ1'еназноro окисления, Т.е. Jllшооксиreназный путь окисления может использоваться для быстрой утилизации избы точноro субстрата биосинтеза простarлэндинов. Ре1'УЛЯЦИЯ процессов ПОЛ в Ор1'анизме ТаЕже осуществляет- ся ферментативным путем. В микросомах наряду с фермента- 104
OOH Арахидоноваякислота NАDРНэависимая диоксиrеназа МИКрОGОМ ""'Д Ji '" ro :r: ф !s: () '" о о :s: ::r ?'7'/COOH 6-. ... ООН PGG2 ?'7'/COOH 6-. ОН PGH2 ЛеЙI(ОЦИТЫ (o Н) ООН C OOH ООН (....QH) (5,12DIHPETE) (5,12-L ТВ) ООН r1Дроперокси- фосфолипид Липоксиrенаэа ЛеrКИе : OOH &;'н (11HPETE) (....QH) (11 HEТE) ТромБОЦИТ!:>1 OOH ОН (12-НРЕТЕ) (....QH) (12-НЕТЕ) Рис. 27. Основные пути ферментативноrо биосинтеза перо:ксидов липидов в тканях млекопитаюЩИХ (В. 3. Ланкин, 1984): НЕТЕ - rид- ро:кси:козатетраеновые :кислоты; НРЕТЕ rидропероксиэй:козатетра- еновые :кислоты; DIHPETE диrидроперо:ксиэйкозатетраенова.я кисло- та; LTB лейкотриены; PGG 2 , PGH 2 - простаrландины тивным синтезом пероксидов липидов происходит и их фермен тативная утилизация, так как терминальная оксида за цепи пере носа электронов в микросомах цитохром Р 450 может функ ционировать как активная пероксидаза. В цитозоле клеток со- держатся восстанавливающие перОЕСИДЫ липидов 1'лутатионпер- оксидазные и rлутатионSтрансферазные системы, одной из фун- IЩИЙ которых является О1'раничение распространения нефер ментативных реакций ПОЛ в случае "утеЧЕИ" свободнорадикаль- ных продуктов ферментативноrо ПОЛ. Существование специа- лизированных ферментных систем синтеза и утилизации актив- ных форм кислорода и пероксидов липидов делает маловероят- ным (если не невозможным) протекание в нормальных ТЕ анях животных неспецифическоrо процесса неферментативноrо ПОЛ с фИЗИОЛО1'ически значимой интенсивностью. 105
Необходимо отметИ'l'ь, что в клетке существует несколько пус ковых и защитных систем, которые рассматриваются как факто ры, влияющие на скорость окисления липидов на разных стадиях (зарождение и продолжение цепи; разветвление; обрыв цепи): системы, ответственные за cTpo1'o определенную CTPYKTYP ную ОР1'анизацию липидов и влияющие на скорость окисления липидов на разных стадиях (зарождение и продолжение цепи; разветвление; обрыв цепи); системы ферментов, ответственных за образование и rи бель активных форм кислорода и свободных радикалов или уча ствующих в разложении пероксидов нерадикальным путем; системы, ре1'улирующие обмен фосфолипидов мембран и влияющие на скорость инициирования и продолжения цепей пу тем изменения состава ненасыщенных жирных кислот фосфо липидов; системы низко молекулярных реrуляторов, выполняющих роль инициаторов, ИН1'ибиторов и влияющих на стадию иниции рования, разветвления и обрыва цепи. ПОЛ представляет собой один из важнейших универсальных процессов повреждения мембранных систем, изменяющий хими ческий состав, физические параметры, ультраструктурную ОР1'ани зацию и функциональные характеристики биомембран. ПОЛ BЫ зывает обновление липидноrо состава мембран вследствие удале ния леrко окисляющихся ЛИIIидов фосфатидилсерина, фосфати дилэтаноламина, фосфатидилинозитола. При пол возрастает CKO рость процессов "флип-флоп" переходов. ПОЛ приводит к увели чению вязкости мембран в результате уменьшения содержания жид- ких липц.цов В бислойных участках, появления поперечных меж- молекулярных сшивок и возрастания доли упорядоченных липи дов с оrраниченной подвижностью. Отрицательный заряд на по- верхности мембран увеличивается, что обусловлено вторичными ПРОдУктами ПОЛ (эпоксиды, кетоны, малоновый диальдеrид и др.), содержащими карбонильные и карбоксильные rруппы. Мембраны эритроцитов, митохондрий, саркоплазматическоrо ретикулума, ли зосом становятся проницаемыми для различных ионов, неэлект ролитов, макромолекул. Изменяются свойства мембранных белков: Са 2 + АТФазы, N а+, К+ АТФазы, родопсина, фоСфОЛИIIазы. Эти фун кциональные проявления ПОЛ определяют формирование мноrих паТОЛО1'ических состояний орrа.низма, возникающих при неблаrо- приятных условиях и повреждающих воздействиях. 106
Как уже было отмечено выше, в I-сачестве инициаторов ПОЛ выступают alстUШlые Фор)/tbl lCuслороijа или активные кислород ные метаболиты. Рассмотрим более подробно механизмы их об разования и пути утилизации, функциональное значение и роль в развитии патолоrических состояний ОР1'анизма человека. 3.2. РОЛЬ АI\:ТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В РЕI'УЛИРОВАНИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В БИОСИСТЕМАХ в дыхательной цепи митохондрий аэробных клеток (помимо ПОЛНО1'о четырехэлектронно1'О восстановления молекулы кисло рода до воды) всеrда происходит OДHO И трехэлектронное BOCCTa новление с последовательным образованием различных АФК: +4ё + 4Н+ I +е +е +е .j,. +е. ,J-. 02 ---+ 02 t Н 2 О 2 ---+ ОН t 2Н 2 О, +2Н+ +2Н+ {'де O супероксидный анионрадикал; НР2 пероксид BOДO рода; ОН' rидроксильный радикал. К активным формам КИCJIорода, кроме O, Н 2 О 2 , ОН', относятся также СИН1'летный молекулярный кислород 102' перrидроксилъный радикал НО;, 1'иrю1'алоиды, пероксидный радикал RO;, алкоксилъ ный радикал ЕО', Они M01'YТ 1'енерироваться в разнообразных фер ментативных и неферментативных реакциях во всех частях клет ки. Наибольший вклад в их образование вносит дыхательная цепь митохондрий, а также система цитохрома Р 450' локализованная в эндоплазматической сети. АФК возникают как спонтанно, так и ферментативно (например, с участием NАDРНоксидазы дыхатель Ho1'o "взрыва" в плазматической мембране и ксантиноксидазы в 1'иалоплазме). Они вызывают образование ОР1'анических rидропер оксидов ROOH при взаимодействии с биоJ;:О1'ическими молекулами (ДНК, белками, липидами), Совокупность реакций, индуцируемых АФК и приводящих к формированию 1'идропероксидов и затем вторичных окисленных продуктов (спиртов, алъдеrидов, эпокси дов), называют оксидативной модификацией молекул. В табл. 11 представлены данные, хараК1'еризующие механиз мы образования, свойства, биолоrическое действие и пути утили зации АФк' 107
Таблица 11 АlCтивирова"'/tые lCuслороiJ",ые .метаболuты (АКМ) в орtа",uз- .ме .млеlCопuтающuх: образовш/.uе, свойства, утuлuзаЦUJl (по Е. В. МеньщltJсовой, Н. К. 3еюсову, 1993) Форма АКМ, 'Механизмы время жизни, образования в живых Биолоrическое Инrибиторы радиус действие действия сиc-rемах 1 2 3 4 Супероксид- ОДНО[lлектронное вос- Образованио перокси- Супероксиддисму- ный анион становление кислоро- да водорода, rидрок- таза, аскорбиновая радикал o; да ксантнноксидазой, СИJlьноrо, перrндрок кнслота, церуло- 10-6 с; NADРН-оксидазой сильноrо радикалов и плазмнн, rлута- 0,3 мкм фаroцитов, оксидаза- синrлетноrо кислоро- тион ми аминокислот; об- да, индукция ПОЛ, разование в цепи разрушение мембран транспорта [Iлектро- эритроцитов, усиление нов митохондрий и пролиферации лимфо- микросом; при окис- цитов, внутрю<леточ- лении оксиreмоrло- нан реryляция, вазомо- бина торное действие Перrидрок- Присоединение Н. к Индукци.я: ПОЛ, цито- Аскорбиновая еильный O в кислой среде токсическое действие, кислота, мочевая радикал HO; (рКа 4,8); реакция образование пероксида кислота, убихи- 10-3 с; Н.О. с орrаннчеСIЩМИ водорода и супе рок- нон, о:-токоферол 10 мкм пероксидами; проме- СИдноro анион-радика- жуточный продуl'Т в ла при взаимодейС1'- реакциях восстано- вии с орrаническими влени.я: флавинов сО. молекулами Пероксид Двухэлектронное ВОС- Цитотоксическое де1\:- Внутриr<леточные водорода становление кислоро- ствие, образование l'аталаза и н 2 о 2 , да ксантиноксидазой rИдРОКСИЛЬНОro ради- rлутаТИОlшер стабилен и флавиновыми окси- кала в реакциях типа оксид азы, дазами; реl!-КЦИЯ: дис- Фентоновской, ЛОI<аль- церу лоплазмин мутации о; с учаc-rи ное закисление среды, ем или без участия сосудосуживающее супероксиддисмутазы действие, инrnбирова- ние пролиферации лимфоцитов rидрокCRЛЬ- Разложение перокси- Сильный окислит.ель, Одно- и MHOro ный радикал да водорода ионами юrдуцирующий раз- атомные спирты, ОН; 10.. с; металлов переменной рыв СН-связей; индук аскорбиновая < 10 нм валентности (ре8.IЩИЯ ция ПОЛ; вызывает I<ИСЛ01'в., мочевая Фентона); дейc-rвие довреждени.я: молекул кислота, тиомоче- ИОНЩЩ:РУЮIЦИх иалу- белков и нуклеиновых вина, урацил, ди чений на воду; обра- кислот; оказывает метилсульфоксид зование при микросо- сильное цитотоксиче- мальном окислении; ское, мутэreнное и при взаимодействии с канцероreнное 0-'- действи.я: 3 108
Окончание табл. 11 1 2 3 4 Сию'летный ФОТОИНДУЦированные ИНДУIЩИSl ПОЛ, вызы- AIщеII1'ОРЫ и 'I'Y- кислород 102; рсar,ции, СОПУ'l'с'rВУIО- вщ'r IIовреждени.я: мо- ши'rели: кароти- 10B с; щий продукт в реак, лекул лков и ну- иоиды, азидЫ, 0,3 мкм ЦНЯХ с пероксидаза- кдеиновых кисдот; амиДЫ, а-токофе- МИ; образуется при оказывает цитотокси рол, !UIКeHbl, про- спонтанной дисмута- чеСIСое и МУ'l'аrеиное НЗВОДJilые фУР!lпа, ции суперor,сидноrо действие ароматичсские yr. анион-радиrЦlЛа леводороды, ходе- стерии, r'JoIC'I'ИДЮI, аскорБИIlОВD.Я: и мочевая ItИСЛОТЫ rипоrзлоиды Реакция пероксида Индукция: и инrибиро- Церулоплазмюr, OC1- н HOCl водорода смиелопер- вание ПОЛ, ЮI8R1'ива- мочевая кислота. OBr- н НОВ!' ОКСИД8ЗОЙ лейкоци- ция инrибиторов про- альбумин, амино- OJ- н HOJ тон И пероксидазой теаз; цитотоксическое кислоты (1UIаюIН, эозинофилоп деЙствае ССрЮI, валии, rлицин) Пероксид- ВзаимодеЙствис Itис- Образование !UIКиль- a-ТОRоферол, ИЫЙ радикал лорода с ОРl'!lНичеСIШ- Hыx радикалов ЛИПН- уБНХЮIОИ, RO; 10 с ми радикалами; peart Дов и rИДРОIIерor,сидов аскорбиновая ции супероксидноrо КИСЛО1'а, мочuвм юшон-радикала, сип- кислота rлетноrо кислор()да, rидроксильиоl'О ради- кала, алкоксилы!ro радикала с неиасы- Щенными ЖИРНЫМИ кислотами ЛИIIИДОВ Алltоксидь- Разложение орrани ИНДУIЩЮI ПОЛ; ЦИТО- Аскорбиновая ный радикал ческих ПСрО!tсидов токсичеСI,ое и Шlнце- кислота, убихи- RO'; 10" с ионами Me'l'IUUIOB пере- роreпное деЙствия нои, а'1'ОIЩфСРОЛ, меиной В1JЛснтности мочевая ю!сло'rа Супероксидны:й анионрадикал образуе'l'СЯ путем одноэлект pOHHo1'o восстановления кислорода иди одноэлеК'l'рщшоrо ОКИс ления пероксида водорода. Мембраны фarоцитирующих клеток 'rканевых макрофа1'О:В, моноцитов и rранулоци'rов крови со- держат ферментный комплеlСС NADPH-OIссидазу, которая ОКИС- ляет NADPH дО NAD+, rrри э'rом происходит ОДIIоэлектро:нное восстановление молекулярно1'О кислорода до супероксид-радика ла. Супероксидный анион-радикал является важным фактором токсическоrо действия КИСJIорода, обладает высокой реакцион ной способностью по отношению к различным компонентам био- систем. Предполаrают, что 02::" либо атакует днк непосреДС'l'вен- но, либо при водит к образованию вторичных радикалов, 109
воздействующих на дик. Супероксидный радикал может вызы вать деполимеризацию кислых полисахаридов, а также иниции ровать ПОЛ. При нормальном протекании метаболических про цессов 02:' не накапливается в клетках в результате ero обезвре живания супероксиддисмутазой:. Однако он плохо проникает че рез клеточную мембрану и оказывает токсическое действие в yc ловиях интенсивноrо образования свободных радикалов и сни жения активности антиоксидантпых систем клетки. Пероксид водорода наиболее стабильный интермедиат BOC становления кислорода способен покидать клетку как более rидрофобное соединение по сравнению с 02:" Он наименее peaK ционноспособен и наиболее леrко определяется. Н 2 О 2 можно по- лучить прямым двухэлектронным восстановлением 02 с после дующей дисмутацией 02:" Пероксид водорода токсичен, вызыва ет окисление сульфrИДРИЛЫIЫХ соединений и метионильиых ос- TaTIOB белков, а также пероксидное окисление полиненасыщен ных жирных кислот. СупероксиТ\ный аrrиоирадикал и пероксид водорода способ ны 1'енерировать чрезвычаЙно активный окислитель 1'ИДрОI- сильный радикал в слеДYIощей цепной реакции: Fe 2 + + НР2 ---+ Fe8+ + ОН- + ОН', ОН' + Н 2 О 2 ----7 ир + Н+ + 02\ 02:' + НР2 ----7 02 + ОН' + ОН- (Реакция rаберВейса), Fе З + + Н О ---+ Fe 2 + + 2If+ + О :. 2 2 2 ' Fе З + + 02:' ----7 Fe 2 + + 02' Смесь солей железа с пероксидом водорода называется реакти- вом Фентона и широко используется 'Как 1'идроксилирующий areHT. I'идРОКСИЛЫIЫЙ радикал образуется и при радиолизе воды, что ле- жит в основе повреждающеrо деЙствия ионизирующе1'О излуче- ния на биосистемы. I'идроксильный радикал повреждает нуклеи новые кислоты, оказывая как мутационное, так и летальное дей- ствие на клетку, инициирует реarщии ПОЛ, инактивирует фермен- ты, Т.е. обладает сильнейшим цитотоксичес'Ким деЙствием. Супероксидный анионрадикал, перОIСИД водорода и пеР1'Иk роксильныЙ радикал способны rенерировать СИН1'летный кисло- род. Он отличается от друrих активных форм rщслорода тем, что для e1'o получения требуется лишь поrлощение энерrии без 110
химической модификации кислородных молекул. Следует под черкнуть, что основное состояние молекул 02 является триплет ным, однако при поrлощении энерrии молекулы кислорода спо собны заселять относительно низколежащие СИН1'летные уровни lI. g + И l6. g . Для заселения lI. g + необходима энер1'ИЯ, соответствуIO щая фотонам с л == 760 нм, для заселения 16. с л == 1270 нм. В g состоянии lI. g + неспаренные электроны находятся на различных орбиталях и пространственно раздt'.лены: (и). в 16. состоянии занята одна и та же орбиталь: (и ). g Таким образом, СИП1'леТIIЫМ кислородом называют электрон }1Овозбужденпое состояние молекулы 02' паходящейся на одном из указанных синrле'ПIЫХ уровней. Одним из самых эффективных механизмов образования 102 является, по-видимому, процесс e1'o 1'енерации в результате перепоса ::шер1'ИИ на кислород от триплет- пых молекул различных соединений. Э'l'от механизм определяет фотосенсибилизированпое образование синrлетноrо кислорода в ра- створах разнообразных сенсибилизаторов в аэробных условиях. В ходе миелопероксидазной реакции пероксид водорода фер ментативно превращается н rипохлоританиоп, R,оторый является активной формой хлора и представляет собой МОIЦНЫЙ окисли- тель. В присутствии ионов железа он способен превращатъся в ОН'. Миелопероксидазная реакция осуществляется в макрофа1'ах и не- обходима для борьбы с инфекциями и устранения повреждепия клеток. Макрофаrи миrрируют в очаr воспаления, rAe reперируют супероксидный IНIИон-радикал и сипrлетный кислород за счет NADРН-оксидазной реакции, пероксид водорода с помощью супер- ОI(сиддисмутазы и rипохлорит-анион OCI (рис. 28). NО-радикал (NO') вырабатывается фермептативно NОСИН'l'а зой фаrоцитов и 1'ладкомъпuечпых клеток сосудов и выполняет роль расслаБЛЯIOще1'О фактора дЛЯ: 1'Л8ДI<.ИХ мышц вследствие aK тивации rуанилаТЦИR,лазы. Это соединение рассматривают кан; вторичный мессепдж.ер вследствие R,онтролируемо1'О способа об разовапия, высокой скорости ПРОНИКIIовения через клеточную мембрану и длительною времени жизни (несколько секуНд);.... В клетке NO' взаимодействует с пизкомолекулярными тиолами, об- разуя мопо и ДИНИТРОЗИЛЫIые I(ОМПЛeIСЫ, ТОIсичные для J{лет ки. МОНОПИТРОЗО1'лутатион мож.ет вызывать проrраммируемую 1'ибель клет ки апоптоз. ," За ОТI",рытие роли ОI",сида азота ШI< сиrнаЛЫIОЙ МОJIЫ",УЛЫ в сер- деЧI-IOСОСУДИСТОЙ системе Р. Фурчrотту, Л. Иrнарро и Ф. Мыорэду в 1998 r. rrрИСУЖДена НuбелеВСI<aJ=I премия. 11]
a: "'" $;,,;('(1[ N О ('(1b « 8('(1 OQ)IDc:;O:x: :а t::; i:i r:::I: р. b(J,Q) (т] о t1I:S: :J: ''0 :S;>Ф !I: C:+:I:t::; ('(10 L", :S: :S:'-.... 2:8 .,,,, Е M N ,О :S: ' ::r с:; .........:;;: () , О ro :I: О (т] :S: ('(10 t::; X:S:!I: tirJ + ,u.g :х: -& О ('(1 "'':r.t '" :s: z о з: N О (u !;;: g С: 8 9.+ lU g-t:!: t--- «-& !ii 'N :J: r:: :S;<-- О 5- :::r О t::; !I: Х т ""' / /' g- :iIQ) glD LL 8.2:a +:S; о o:s; О r:: ф r::+ g-Jj:;;::2 @() cOC:;c:[\Dj: roi:L 'f? ...-/0 3-:I: Ф k" + x LLC";,,; (U1Xl <=Ф t:::r8!З"'8 :!:а. Ф 8 N "'Ф03('(1 +ф g 5 !!1 LL L::;:s:@:=if :r.LI '--' [ c\ij N Х О :f' :r ::;; .:s; <" о + а. tf .0+::;;+ .LI :J: с:; ::s: ::r о о.. .... ::s: о.. (т) t N + Ф U. ('(1 '" ('(1 N ...,.. 9. .....'0 '" :J: q: 8. О () 112 ']: ot::; !s! о с:; с t 'f + '" Ф :!: '" (т] ('(1 (J '" о а. Q) r:: i о :s; t-- [ С ,--.. C"I Ф м J I "'" lЗ:i "-"' a:I t:( О g< i<: 111 р< to:: р< ffi '-' a:J t:r о З Ж
АКМ называют 'rакже пРОOlссuоаиталtu, Т.е. веществами, усиливающими разветвление цепи окисления в результате вза имодействия с 1'идроксипероксидами биомолекул. Постоянное образование прооксидантов в ЖИJIых ОР1'анизмах находится в равновесии с их дезактивацией антиоксидантами, что лежит в основе внутриклеточно1'О механизма реrуляции метаболических процессов реООlCс,ре2УЛ.fU./ult. Сдви1' баланса антиоксидантов и прооксидантов в тканях в сторону прооксидан'l'OВ называют окис- литеЛЫlЫМ стрессом. Следствием окислительно1'О (оксидатив Horo) стресса является окислительное повреждение тканей, KO торое сопровождае'r различные па'!'ОЛО1'ические состояния (бо лее 60 болезней) различные воспаления, ревматоидный apT рит, 1'ас'rрит, язва, колит, цистит, бронхолеrочные заболевания, канцероrенез, сахарный диабет, атеросклероз, старение, нейро де1'енеративные процессы (паркинсонизм, болезнь Альцrейме ра) и др. Однако до недавнеI'О времени рассматривалась пре имущественно патоrенная функция АФR, реализующаяся по средством активации ПОЛ в мембранах. Иеследования после дних лет выявили участие АКМ в реrуляции тонуса сосудов, клеточной пролиферации, синтезе проста1'ландинов, микроби цидном действии фа1'ОЦИТОВ, ре1'УЛЛЦИИ метаболических про цессов в качестве внутриклетопных мессенджеров, индукции иммунных реакций. Поэтому сейчас весьма актуальным явля ется вопрос о соотношении IIOложи'!'ельной и о'rрицательной роли АФR в осуществлении и ре1'улировании клеточно:rо мета60ЛИЗ ма, а также о ре1'улировании динамическоrо равновесия про и антиоксидантов и О целесообразности ИВ1'ибирования синтеза АФК в определенных условиях. ПаТОЛО1'ические состоя нил возникаю'!' при чрезмерном накоп лении AI'l:M и ИН'l'еНСИфИl,:ации оксидативной модификации Maк ромолекул. В качестве факторов, индуцирующих оксида'l'ИВНЫ:Й стресс, выделяют избыток 02 (особенно при rипербарической OK СИ1'енации и реперфузии), сильные воспалительные процессы с акт.rвацией неЙтрофилов и МaJ:<.рофа1'ОВ, ионизирующее и УФиз лучение, избыток 1'ема, Fe2+, действие ксенобиотиков, больших доз витаминов А и D. АФК в высоких концентрациях вызывают мутации, ИН1'ибирование синтеза ДНК и деления клеток, способ ны аI<.ТИВИРОllать аПОIIТОЗ. В результате оксидативной модифи кации белков происходят нарушение их C'l'PYK'l'ypHo1'o состояния и функциональных свойств, аrpе1'ация и денатурация их моле 8. Наказ 3788 113
кул. Продукты ПОЛ проявллют мута1'енный и цитотоксический эффекты. Кроме TOro, избыток некоторых эйкозаноидов индуци- рует тромбоз и 1'ипертонию (тромбоксаны), rиперчувствительность, участие в развитии инфаркта JVl:иокарда, язвы желудка, бронхи- альной астмы (лейкотриены). 3.3. ПУТИ PEry ЛИРОВАНИЯ УРОВНЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬПЫХ ПРОДУКТОВ И АКТИВНЫХ КИСЛОРОДНЫХ МЕТАБОЛИТОВ Реrулирование уровня активных кислородных метаболитов и свободнорадикальных продуктов ПОЛ осуществляется анти- OlCCUOa1lтHbtMU системами, снижающими активность радикаль ных окислительных процессов. В настоящее время под антиок- сидантами понимают широкий класс соединений, инrибирующих окислительные процессы по одному или нескольким механиз- мам: 11 lV Уl III V VH . RH 02 RH Me n + ROH, .:.. ,(. R ,(. Щ)2 t Rбон R==O, RC::' 02' НО 2 , 102 ---+ ---+ ---+ OH,RO t 1 t IP' Me(n+1)+ Различают превентивные антиоксиданты (пути: П измене- ние структурной Ор1'анизации субстрата, замеДЛЯIOщее окисле- ние; IV снижение концентрации 02; VI связывание или окис ление ионов металлов переменной валентности, индуцирующих разложение пероксидов и образование радикалов; УН перевод пероксидов в стабильные продукты окисления: спирты, альде1'И- ды, кетоны) и ИН1'ибиторы .АКМ (пути: 1 инrибирование ради кальных форм .АКМ, способных инициировать образование op1'a- нических радикалов; ПI и V прерывание окислительной цепи посредством взаимодействия с ОР1'аническими радикалами). Дей ствие инrибиторов .АКМ является специфичным. Часто антиоксиданты классифицируют в соответствии с ве- личинами их молекулярных масс. К 1'руп:ае высокомолекуляр ных соединений ферментов антиоксидантной защиты и бел ков, связывающих катализаторы свободнорадикальных процес- сов ИОВЫ Fe и Cu, относят соответственно суПероксиддисмута зу (СОД), церулоплазмин, пероксидазу, каталазу, rлутатионзави- 114
симые ферменты и альбумин крови, трансферрин, ферритин. rруп пу низкомолекулярных ан'rиоксидантов составляют атокоферол, аскорбат, rлутатион, мочевая кислота, мочевина, билирубин, He которые аминокислоты. Ферментативные антиоксиданты (АО) хара.ктеризуются BЫ сокой специфичностыo действия, а также клеточной и ОР1'анной локализации, использованием в качестве катализаторов HeKOTO рых металлов (Си, Zn, Fe, Se). Уровень внутриклеточных фер ментативных АО находится под rенетическим контролем. У жи вотных В условиях 1'ипоксии И 1'ипероксии, усиливающих обра зование ММ, повышается уровень внутриклеточных фермента тивных АО, что связано с механизмами поддержания устойчиво- сти орrанизмов к окислительному стрессу. Супероксиддисмутаза (I{Ф 1.15.1.11, СОД) катализирует peaK цию дисмутации суперо:ксидно1'О анионрадикала: 200:' + 2Н+ ---+ Н 2 О 2 + 02' Обнаружено НеСКОЛЬКО изоферментов этоrо" белка, раз личающихся локализацией, строением активно1'О центра и He которыми физикохимическими свойствами. Си, Zпсодержащая СОД чувствительна к циан иду и содержится в цитозоле и в меж мембранном пространстве клеток эукарио'r. Цианидрезистент ная Мl1СОД (железосодержащий изофермент) локализована в митохондрилх эукариот и найдена у прокариот. В пла.зме coдep жится цианидчувствительнал экстрацеллюлярная СОД, представ ляющая собой Cu, Zпсодержащую тетрамерную молекулу (Mr 120135 кДа) из четырех 1'ЛИКОПРО'l'еиновых субъединиц. Предпола1'ают, что экстрацеЛЛIOлярная СОД выполняет функцию защиты клеток эндотелия во всем ОР1'анизме. Однако активность СОД в плазме крови HaMHo:ro ниже, чем для цитозольно1'О фер мента. По-видимому, это связано с накоплением н:онечноrо про дукта реакции пероксида водорода, являюще1'ОСЯ ИН1'ибито ром фермента. В клетн:ах перОI{СИД водорода быстро разрушает ся внутриклеточными каталазой и 1'лутатионпероксидазой. Несмотря на высокую специфичность фермента, в определен ных условиях СuСОД может взаимодействовать спероксидом водорода и выступа'rь в качестве прооксиданта, инициируя обра зование радикалов 02 и ОН': Сu2+СОД + НР2 СulСОД + 02 + 2Н+, Cи+COД + НР2 н Си 2 +.СОД + ОК + OH. В настоящее время исследуются ВОЗМО.жности клиническо1'О применения СОД, обладающей выраженным защитным эффе:к 8* 115
том при воспалительных, ишемических и стрессовых поражени ях. С целью повышения стабильности фермента и предотвраще ния ero быстро1'О разрушения во внеклеточном пространстве ис польауют IIрепараты фермента, ковалентно связаННОI'О с иммуно rлобулинами, СЫВОРО'1'очным альбумином, полиэтилеН1'ликолем. Катала за (I-CФ 1.11.1.6) ускоряет процесс двухэлектронно1'О восстановления пероксида водорода до воды, используя Н 2 О2 как донор электрона. Молекула каталазы состои'1' из четырех иден 'rичных субъединиц и четырех 1'рупп 1'ематина. Молекулярная масса фермента из различных источни:ков составляет 225 250 кДа. Каталаза ЛОI<ализована преимущественно в пероксисо мах Iшеток, {'де ее концентрация ДОСТИ1'ает lOO моль/л. Макси мальное содержание фермента обнаружено в эритроцитах, пече ни и почках. Разложение пероксида водорода каталазой осуще ствляетсн в два этапа: J!"е3+каталаза + 2Н 2 О2 н окисленная каталаза + Н 2 О2 н Н Fе3+I<аталаза + 2НР + 02' В окисленном состоянии каталаза работает и кан: пероксида за, ка.тализируя реакции окисления спиртов или альде1'ИДОВ: окисленная каталаза + АН 2 -..+ Fе3+каталаза + 2НР + А, {'де АН 2 ДОБОр элеК'rрОБОВ. Церулоплазмин один из основных антиоксидантов плаз мы, проявляющий как специфическую, так инеспецифическую антиоксидантную активность. Специфическая ю<тивность, свя занная со снижением уровня АКМ, обусловлена реализацией трех возможных механизмов; 1) церулоплазмин обладает феррокси ДRЗНОЙ активностью, окисЛяя ионы Fe 2 + без образования супе рОКСИДНОI'о анионрадикала; 2) он способен вызывать дисмута цию супероксидных радикалов, которая имеет не ферментатив ный, а стехиометрический характер (это обусловливает ИН1'иби рование цеРУЛОПJrазмином ПОЛ в липопротеинах); 3) церулоп: лазмин ина1<тивирует АФК, 1'енерируемые миелопероксидазой, и тем самым защищает аН'fипротеиназу от окислительно1'О повреж дения 1'И110хлори'rом. Неспецифическая антиоксидантна.я: активность церулоплаз мина связана с образованием комплексных соединений с медью, Ч'1'Q препя:тствует возможности их участия в реакциях Фентона и rаберВейса. Антиоксидантной активностью обла.дает также трансферрии 116
плазмы. E1'o действие носит в основном неспецифичеCIСИЙ xa раК'l'ер, обусловленный связыванием ионов железа. При Hacы щении железом белка до 100 % трансферрин может проявлять прооксидантное действие, связанное с rенерацией rидроксильных радикалов. Избыток железа при полном насыщении трансфер рина связывается неспецифически с поверхностью бел:ка и в Ta кой форме может участвовать в реакции rаберВейса. К rpуппе высокомолекулярных антиокси:дантов ОТНОсятся 1'лу- татионзависимые ферменты rлутатионпероксидаза, rлутати онредуктаза, rлутатионтрансфераза. rлута тионперо:кидаза (КФ 1.11.1.9) эффективно утилизирует токсичные липопероксиды в орrанизме при помощи фермента тивной реакции ROOH + 2 G8H ----7 ROH + GSSG + нр. в тканях млекопитающих обнаружены по крайней мере два фермента, способные ле1'КО восстанавливать орrанические rидро пеРОl<с.иды. Селенсодержащая 1'лутатионпероксидаза с высокой скоростью утилизирует как пероксид водорода, так и орrаничес кие 1'идроперОl<СИДЫ, в том числе липопероксиды пероксиды жирных кислот, аЦИЛ1'лицеридов, стероидов и простаrландинов. Неселеновая rлутатионпероксидаза II, напротив, актИВНО BOCCTa навливает исключительно ОР1'анические rидропероксиды. Seco держащая 1'лутатионпероксидаза локализована в цитозоле (70 %) и митохондриях (2030 %) :клеток млекопИтаЮЩИХ. В ре1'УЛЯЦИИ обмена липопероксидов (рис. 29) важную роль И1'рае1' сопряженное действие rлутатионпероксидазы и 1'лутати онредуктазы (КФ 1.6.4.1), приводящее к инактивации перокси- дов жирных кислот И превращению их в соответствующие ОI<СИ кислоты. rлутатионредуктаза катализирует восстановление окис ленно1'О 1'лутатиона: GS8G + NADPH + н+ ----7 2 G8H + NADP+. rлутатионтрансферазы (КФ 2.5.1.18) представляют собой 1'руп пу ферментов, катализирующих начальную стадию биосинтеза меркаптуратов конъюrацию 1'лутатиона с ксенобиотиками (RX), содерЖащими электрофильвый атом: RX + G8H ----7 R8G + ИХ. Однако продуктом ферментативно1'О nревращения неI<ОТОрых субс'rратов, в том числе орrанических 1'идропероксидов, являет ся не тиоэфир (R8G), а окисленный rлутатион. Образование GSSG 117
е\,о"СИ Д <1За (, <Qy.:>...&j NADP(H) + Н+ NADP+ / . "\\,,nOnepOkCtt " / " ,<>y..-i'J.;"', У RO' ОН' , " / ;.r"4 НОХ НХ 2 GSH GSG RO/ / ROOH ............ GS8рер.э."''3./ 2Н 2 О Fе З + (R0 2 )' Fe 2 + ROH ЗОН S р,окисление ROH + Н 2 О 1 { Н О каталаза 202 + Q ОН' OH Н2 0 2+ 0 2 H. e'" 02'дисмутаза Fе З + Х О2 ",,"Р'М Р,., Х NADP(H) --+ ФП Fe2+ O Микросомальная диоксиrеназа фосфолипидов Рис. 29. Детоксикация супероксидноrо радикала, пеРОКСИДR водоро- да и дипопероксидов в тканях млекопитающих при действии G8Нтрансферазы на орrанические 1'идроперокси ды объясняется взаимодействием электрофильно1'О кислорода с тиолатным анионом (G8'), что приводит к возникновению He стабильно1'О сульфеново1'О ПРОИЗВОДНО1'о rлутатиона: ROOH + GSH -..+ ROH + [GSOH], которое затем неферментативно реа1'ирует с еще одной молеку- лой GSH: [GSOH] + GSH -..+ G8SG + Н 2 О. rлутатионтрансферазы локализованы преимущественно в ци- тозоле клеток; в печени человека они составляют 24 % от обще1'О количества ЦИТОЗОЛЬНО1'о белка. rлутатионтрансферазы эффективно восстанавливают 1'идрофобные rидропероксиды с большим объемом молекулы (1'идропероксиды линолевой и ара- хидоновой полиненасыщенных жирных кислот, фосфолипидов), а также 1'идропероксиды мононуклеотидов и ДНК, участвуя тем самым в их репарации, Считают, что при окислительном стрессе ферментативная ан- тиоксидантная защита оказывается малоэффективной по срав- нению с действием низкомолекулярных соединений. Это связа. 118
но с тем, что ферментыантиоксиданты локализованы внутри :Клеток, а в БИОЛО1'ических жидкостях обнаруживаются лишь следовые их количества. Кроме Toro, при оксидативном повреж дении происходит быстрая ИНа&тивация КОНСТИТУТИВНО1'о пула ферментов свободными радикалами. Поэтому необходимо значи- тельное время для индукции их синтеза. В этих условиях повы шается роль низкомолен:улярных антиоксидантов, не только сни жающих интенсивность свободнорадикальных процессов, но и выполняющих важные метаболические функции. Эффективными перехватчиками свободных радикалов явля- ются фенольные аНТИОI<сиданты, СОДержащие ароматическое коль- цо, связанное с одной или несколькими 1'идроксильными 1'руппа- ми. Блаrодаря наличию в структуре ароматическоrо кольца обоб- щенной системы 1t-электронов происходит смещение отрицатель- HOro заряда на кислород, в результате KOTOpOl'O осуществляется достаточно ле1'КИЙ отрыв атома водорода ОН-1'руппы с образо- ванием разных изо мерных форм феноксирадикала. Такие co единения вытупают в качестве перехватчиков пероксидных и алкоксильных радикалов в следующих реакциях: RO' + АтОН ----7 ROH + АтО', RO + АтОН ----7 ROOH + ArO', 1'де ArOH ароматичесrще кольцо фенольно1'О антиоксиданта, связанное с rидроксильной 1'руппой. Взаимодействие фенольных аНТИОI<.сидантов с ОР1'анически ми радикалами приводит 1< образованию феноксильных радика лов (АтО'), которые Mo1'YT участвовать в реакциях диспропорци онирования с образованием хинолидных пероксидов: ЛrО' + RO ----7 R0 2 ArO; АтО' + АтО' ----7 Ar 2 0 2 . Распад хинолидных перOI<СИДОВ приводит к образованию хи- нонных форм молекул, которые в нормальных условиях не обла дают антиоксидантными свойствами, однако при дефиците кис лорода Mo1'YT тормозить окисление путем взаимодействия с ал- килъными радикалами: OAтO + R' ----7 'OArOR. в: фенольным соединениям, обладающим выраженной анти- оксидантной активностью, относят витамИны Е (атокоферол) и К, триптофан, тирозин, фенилаланин, убихиноны, каротиноиды, 119
флавоноиды, фенокарбоксильные кислоты и др. Они инrибир- ют супероксидный анионрадикал кислорода., СИН1'летный моле кулярный кислород, 1'идроксильный радикал и индуцированные ими процессы ПОЛ. Вместе с тем бла1'одаря способности ле1'КО отдавать и захва- тывать электроны фенольные АО MorYT выступать и в качестве восетановителей. Например, в условиях 1'ипоксии при действии ряда дыхательных ядов в митохондриях убихинон окисляется кислородом с образованием супероксидно1'О анионрадикала, т. е. проявляет прооксидантные свойства. а,- Токоферол способен BOC станавливать ионы металлов переменной валентности и действо вать как прооксидант, в частности, при индуцированном ионами железа окислении липосом:. Взаимодействие фенольных АО с пе роке идами приводит к образованию алкоксильных радикалов, которые Moryт индуцировать окислительные реакции: АтОН + ROOH ---+ RO' + HP + АУО', Аскорбиновая кислота способна выступа'rь 'в качестве донора и акцептора водорода бла1'одаря наличию в ее структуре двух енольных rрупп. Аскорбат образуется у животных в виде конеч- Ho1'o продукта из разветвлений 1'люкуронатноro пути обмена rлю- козы. При окислении витамина С в тканях животных и челове ка образуется де1'идроаскорбат, превращающийся затем в дике- тоrулонат. При расщеплении последнеrо образуется щавелевая кислота, а при декарбоксилировании ксилулоза, превращаlO щаяся в 1'люкозу. У растений окисление аскорбата с образовани ем деrидроаскорбата катализирует медьсодержащая аскорбат- оксидаза. Эту же функцию выполняют и дрyrие терминальные оксидазы растительных и животных тканей цитохромоксида- за, фенолоксидаза, некоторые металлы. Одновременно с окисле НИ-еМ аскорбата в орrанизме происходит ферментативное и не- ферментативное восстановление де1'идроаскорбата до аскорбата, осуществляющееся при участии восстановленно1'О 1'лутатиона. Второй путь быстро1'О образования аскорбата в Ор1'анизме вос- становление моноде1'идроаскорбата при участии NADH. Способность аскорбата и де1'идроаскорбата ле1'КО подверrать ся окислительновосстановительным превращениям лежит в основе широкоrо участия витамина С в обмене веществ: дыxa нии и фотосинтетической активности, транспорте электронов, окислении и восстановлении никотинамидных коферментов. 120
Аскорба'r необходим для нормальноrо развития орrанизма, по вышает эффективность адаптации к воздействию факторов внеш ней среды, участвует в обмене беЛI>.ов, липидов, У1'леводов, yCKO ряет процессы реrенерации, стимулирует деятельность желез BНYT ренней секреции. Окисленная и восстановленная формы аскорбата способны провикать через мембранные структуры животных клеток. Бла rодаря большей липофильности деrидроаскорбат ЛeI'КО диффун дирует через биомембраны, чем существенно отличается от ac корбата. Де1'идроаскорбат как транспортная форма витамина С проникает в биолоrические структуры посредством простой или обле1'ченной диффузии. В нормальных фИЗИОЛО1'ических услови ях основную роль в процессах трансмембранноrо переноса и nOk держания фИЗИОЛО1'ическо1'О уровня аскорбата в клетках иrpает механизм активно1'О транспорта, опосредованный участием спе цифических белков и зависящий от наличия энер1'ИИ. Аскорбиновая кислота обладает чреавычайно широким спект ром антиоксидантных свойств: обезвреживает rипоrалоиды, супер оксидный анионрадикал кислорода, перrидроксильный радикал, пероксидный радикал, СИН1'летный кислород, rидроксильный pa дикал, восстанавливает (),токоферильный радикал, возвращая атокоферолу антиоксидантные свойства, а также тиильный (CS") и тиопероксильный (GSO) радикалы. Витамин С превосходит дpy rие антиоксиданты плазмы крови в защите липидов от пероr"сид Horo окисления, так как 'l'олько это соединение достаточно реакци онноспособно для эффективноrо ИН1'ибирования ПОЛ. Анти:окси дантные свойства аскорбата основаны на функционировании OДHO электронных циклических переходов между ДИ1'идро, семидиrид po и деrидроаскорбатными формами. Скорость этих npевращений зависит от присутствия металлов переменной валентности, дРуrих пар окислительвосстаНОвитель и величины рН. Способностью He посредственно взаимодействовать с АФЕ характеризуется BOCCTa новленная форма аСI>,орбиновой кислоты. Витамины С, А, D и F, при окислении и аутоокислении KOTO рых образуются промежуточные радикальные формы, Mo1'YT BЫ полнять роль инициаторов окисления и ускорять ПОЛ, увеличи вая скорость зарождения цепей реакций в мембранах. Кроме Toro, в присутствии ионов железа и меди аскорбиновая кислота CTaHO витс,Я мощным прооксидантом, что УI"азывает на необходимость in vivo надежной секвестрации свободных ионов металлов Пере 121
менной валентности. Проявление аскорбатом анти- или проок сидантных свойств зависит также от концентрации субстрата и условий протекания окислительных реакций. Такая ее функци ональная пластичность необходима для осуществления в биосис- темах механизма редоксреrуляции. Антиоксидантные свойства 1'лутатиона (G8H) трипептида, образованноrо цистеином, 1'лутаминовой кислотой и rлицином, определяются как непосредственным взаимодействием с АФЕ и обменныъш реaJ:ЩИЯМИ с дисульфидными связями, так и функцио- нированием rлутатионзависимых ферментов (см. выше). Mexa низм защитноrо эффекта 1'лутатиона связан с инактивацией BЫ сокореакционных кислородных и орrанических свободных ра- дикалов вследствие переноса атомов водорода с молекулы тиола. Образующиеся активные частицы обладают меньшим повреж дающим эффектом по сравнению с радикалом, у KOTopo1'o неспа- ренный электрон локализован на атоме уrлерода: G8H + ОН' G8' + ОН-, GSH + 02"'- GS' + HO, GS' + GS' GSSG. Ти:и:льные радикалы эффективно удаляются из реакционной среды вследствие образования дисульфидов 1'лутатиона. rлутатион необходим для нормально1'О функционирования эритроцитов и кроветворной ткани, в норме он практически весь ассоциирован с форменными элементами крови и находится в восстановленной форме (до 96 %). GSH участвует в восстановле- нии метrеМО1'лобина. Ферменты синтеза rлутатиона находятся в эритроцитах. Процесс восстановления ero происходит с участи ем rлутатионредуктазы, а также NADPH и зависит от активнос ти пентозофосфатно1'О пути. Клеточный rлутатион участвует в поддержании пула восстановленно1'О аскорбата: перенос BOCCTa новленных эквивалентов с GSH на аскорбат осуществляется 1'лу татионде1'идроаскорбатредуктазой. Мочевая кислота по своим свойствам близка к енольным антиоксидантам и может выступать синер1':И:СТОМ с радикалами а,токоферола и аскорбиновой кислоты. Она способна инактиви ровать синrлетный кислород, 1'идроксильный радикал, связывать ионы железа с участием аминоrpупп, инrибировать ПОЛ и BOC станавливать метreмоrлобин с образованием радикала урата. Разные 1'руппы антиоксидантов функционируют в тесной вза- 122
имосвязи: снижение концентрации или активности одних KOM понентов антиокислительных систем приводит к изменению ypOB ня друrих, что обеспечивает поддержание окислительно-восста- новительноrо rомеостаза клеток. Антиоксидантные ферменты и низкомолекулярные соединения катализируют последовательные этапы превращения АФВ:, например: СОД каталаза, rлутатионпероксидаза 02 ----+ Н 2 О 2 ) Н 2 О RO ----+ (токоферол) ----+ (асКорбиновая) . ----+ мочевая )" кислота кислота NADPH Х Деrидроаскорбиновая Х Мочевая GSH кислота кислота NADP Аскорбиновая Радикал GSSG кислота мочевой кислоты Высказано представление об антиоксидантных цепях переноса электронов, эффективность функционирования которых обеспечи вается работой всех компонентов антиш\Ислительных систем. Автиоксиданты, модифицируя структуру и функциональную активность мембран, оказывают воздействие на клеточный метабо- лизм различными способами: в результате взаимодействия со сво- бодными радикалами, рецепторами, путем инrибирования и акти вирования ферментов, непосредственноrо встраивания в мембрану, взаимодействия с reнетическим аппаратом клетки (рис. 30). Необходимо отметить, что выяснение множественных Mexa низмов действия антиоксидантов в орrанизме, включающих и воздействие их на скорость ПОЛ, и влияние :на различные про- цессы клеточноrо метаболизма, представляет сложную научную задачу. Это связано с проявлением ими активности в широком интервале концентраций (10lB102 моль/л) и реализацией в каж- дом интервале концентраций различных механизмов: протеканием реакций инrибиторов со свободными ради калами; взаимодействием с клеточными рецеПТОР8;МИ; изменением текучести липидов мембран и мезофазных переходов в них; 123
Активность ферментов перОКСИДНоrо окисления Активность мембрано- связанныx ферментов Вязкость мембран Активность липоли'i'ических ферментов Рис. 30. Схема процессов реrушщии клеточноrо метаболизма с уча- стием окислительных реакций в ЛШIидах мембран (К. Е. l:Cруrлякова, Л. Н. ШИШ:ЕСина, 1992) непосредственным влиянием на активность ферментов; влиянием на лиrаНkбелковые отношения через парамет- рический резонанс. Переход от одноrо механизма к дPyroмy обусловливает слож ную немонотонную, полимодальную зависимость "дозаэффект" (Е. Б. Бурлакова, 1998). КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. ОПИIШrте основные механизмы МОДИфИI<ации белковых и ЛШIИД ных ROMnoHeHToB биомембран при воздействии экстремальных факто- ров внешней среды и развитии патолоrических состояний орrанизма. 2. Что такое перОRсидное окисление липидов, какие факторы ини- циируют этот процесс, RaR.OBa последовательность стадий ero развития? 3. В чем состоит сущность цепноrо окисления липидов? 4. В чем разница между ферментативным инеферментативным перОRСИДНЫМ окислением липидов? 124
5. Что 'l'a}<.oe ак'l'ивные формы кислорода, какова их роль в развИ'l'ИИ различных патолоrических состояниЙ орr8Низма? 6. Каковы мех8НИЗМЫ образования различных ак'rИ:Е!.ных форм кис лорода? 7. Опишите свойства и пути утилизации сynероксидноrо анион-ра дик ала и перОКСИД!l водорода. 8. В чем отличие синrлети:оrо молекулярноrо кислорода от др'Тих активных I<'ИСJIОрОДНЫХ метаболи'rОВ? 9. Какова роль NОрадикала в реrУЛИРОВ81IИИ ДРОЦессоВ кле'l'ОЧRОro ме'rаболизма? 10. Что называю'r оксида'rивной модификацией макромолекул и OlШСЛИ'rельным стрессом? 11. Дайте определение ПОНЯ'l'ия "антиоксид8НТЫ". 12, Каковы основные механизмы инrибирования ан'l'ИОКСИД8Нтами ОКИСЛИ'l'ельных процессов? 13. ОхараI<.теризуй'rе основные компоненты системы ВЫСОI<.Омоле- кулярныlx антиоксидан'l'ОВ. 14. Какова роль rлутатионзависимых ферментов в реrулиров8НИИ уровня свободнорадикальных продуктов ПОЛ и активных I<.ИСЛОРОД ных ме'l'аболитов? 15. В чем отличия ПРООКСИД8Нтов от 8Нтиоксидан'l'ов? 16. Опишите СВОЙС'l'ва, механизмы дейс'rвия и метаболические функ ции основных НИЗI<.омолеКУЮlРНЫХ I<.омпонентов антиоксидан'rНОЙ сис темы. 17. 060снуЙ'rе утверждение: "Биомембраны непременные уч:аст- НИI<.И совокупности процессов возникновения и развития ряда патолО rических СОС'rояний орrанизма человека".
fлапз 4 СТРУКТУРНОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МОДИФИКАЦИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПОНЕНТОВ БИОМЕМБРАН ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ АfЕНТОВ 4.1. ФОТОХИМИЧЕСКИЕ И РАДИАЦИОНПО- ХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВР АЩЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ БИОМЕМБР АН В УСЛОВИЯХ Р Азличноrо МИКРООКРУ:/КЕНИЯ 4.1.1. СтруктУРНО-ФУНlСЦUОllальные .м.оiJuфuкацuu .м.олекуЛJlРн.ых ко.м.пОllен.тов tfuо.ме.мбран поа аеuствие.м УФ-U3JlУ'lеНUJl БИОЛО1'ически значимое УФ-излучение занимает участок спектра от 200 до 400 нм И подразделяется на три области: ко- ротковолновую (200280 нм), средневолновую (280315 нм) и длинноволновую (315400 нм). Поверхности Земли достиrает УФ-свет в диапазоне длин волн 287400 нм с энеР1'ией квантов 34 эВ. Коротковолновая часть спектра УФизлучения Солнца полностью ПО1'лощается озоновым слоем атмосферы. В биосистемах УФ-свет индуцирует 1'лавным образом фото- деструктивные реакции, связанные с фотохимическими превра- щениями белков и нуклеиновых кислот, относящихся к основ- ным акцепторам УФизлучения в клетке. Однако в биомембра- нах и ДРУ1'их липидных системах под действием УФизлучения эффективно протекает процесс пероксидноrо фотоокисления (ПФО) ненасыщенных жирных кислот липидов, который приво- дит К значительным изменениям структурнофункциональноrо состояния всех мембранных компонентов. Таким образом, био- мембраны содержат различные хромофорные rpYnnbl, ПО1'лоща- ющие энерrию УФизлучения в разных диапазонах длин волн, ароматические и серо содержащие аминокислоты мембраносвя занных белков, полиненасыщенные жирные кислоты липидов, а также коферменты, включающие пиридиннуклеотиды, флавины, кофермент Q, железопорфирины, витамины. Результаты исследования фотохимическо1'О действия опти ческоI'O излучения на биомембраны клеток показывают, что наи- более эффективным является "УФизлучение с длинами волн ко- 126
роче 300 нм. rлавный пу'l'Ь фотолиза мембранных липидов фо тоокисление цепей полиненасыщенных жирных кислот фосфо липидов. Следует отметить, что липиды ПО1'лощают УФ-свет в корот:коволновой области спектра (1.< 240 нм), а максимумы по rлощения ненасыщенных жирных I{ИСЛО'l' находятся в области < 220 нм. Однако фотоокисление липидов развивается при воз действии на мембраны более длинноволново1'О излучения, что обус- ловлено ПО1'лощением УФ-света rидропероксидами липидов, при сутствующими В норме в липидных системах вследствие проте кания ферментативных процессов ПОЛ (см. rлаву 3). Диеновые rидропероксиды жирных :кислот имеют максимум светопо1'ЛО щения при 233 нм, а триеновые I'идропероксиды при 270 нм. Процесс ПФО липидов можно представить в общей форме в виде сово:купности элементарных реа:кций: (а) ko ROOH ROO.; l1v k 2 (6) ROO. +RH ROO. + ROOH; 02 (в) k6 ROO. +ROO. Pl +Р2; k7 (1') k7 ROO. +InHROOH+ln.; k 10 In. +RH ROO. +InH; 02 (д) k", (е) InH Pa. hv В этой схеме RH, ROOH, ROO' ,I!lH и In' обозначают COOTBeT ственно окисляющийся липид, eI'o 1'идропероксид, пероксидный свободный радикал липида, антиоксидант и свободный радикал антиоксиданта; Рl' Р 2 , Ра некоторые продукты реа:кций; k o ' k 2 и др. I{OHCTaнTbI СI{оростей рею{ций. Реа:кции (а) и (е) фото химические, реа:кции (б)(д) темновые. Реакция (а) носит Ha звание реа:кции фотоинициирования, если ROOH предсуще 127
ствующие 1'идропероксиды, или разветвление цепей окисления, (б), (в), (r), (д) соответственно продолжение цепи, "квадратич ный" обрыв цепи (диспропорционирование радикалов ROO'), "ли нейный" обрыв цепи на антиоксидаН'l'е, инициирование цепи окис ления свободным радикалом антиоксиданта. УФоблучение MeM бран и дру1'их ЛИПИДных систем индуцирует темно вое пероксид ное окисление ненасыщенных жирных кислот липидов. Процесс автоокисления в облученных мембранах протекает rораздо Meд леннее фотоокисления, но за длительный темновой период он может приводить даже к более сильному OIшслению мембран ных липидов, чем фотоокисление. Темновое автоокисление ли пидов в облученных мембранах блокируется антиоксидантами в низких конценТрациях. Под действи€м УФИЗЛУЧ6НИЯ в HeKo'ro рых :клетках стимулируется темновое ферментативное перо:ксид ное окисление липидов с участием ЦИI{ЛОСКСИ1'еназы, в результа те KOTopo1'o образуются проста1'ландины. &1'0 явление обнаруже но в коже и иrрает важную роль в развитии эритемной рею{ции в ответ на УФоблучение. Следует подчеркнуть, что процесс пероксидноrо фотоокисле ния липидов (ПФОЛ) является двухквантовым и протекает по сложному механизму. Первая фотохимическая стадия e1'o re нерация rидропероксидов в результа'l'е присоединения кислоро да; вторая стадия, не зависящая от присутствия :кислорода, фотолиз 1'ИДрОIIероксидов до вторичных проду:ктов (аЛЬД61'ИДОВ и кетонов), ПО1'лощающих УФизлучение в диапазоне длин волн 260280 нм. При воздействии видимо1'О света и длинноволново ro УФизлучения процесс за:канчивается в основном на стадии образования rидропероксидов, а при облучении липидных сис тем более :коротковолновым светом (л 233 нм) накапливается большое :количес'rво вторичных продуктов. Один ИЗ вторичных продуктов ПОЛ малоновый диальде1'ИД при взаимодействии с тиобарбитуровой IШСЛОТСЙ (ТЕК) дает OI{ рашенное соединение, ПОl'лощающее свет с длиной волны 533 нм. эту реакцию используют для определения уровня интенсивности протекания ПФОЛ. Второй подход, ПОЗВОЛЯЮЩИЙ судить об эф фе:ктивности пероксидноrо окисления липидов, связан с реrистра. цией хемилюминесценции, являющейся следствием реакции дис пропорционирования перо:ксидных радюшлов липидов. Ка:ково же значение пероксидно1'О окисления липидов в фо топовреждении биолоrических мембран? Фотолиз липидQв MO 128
жет приводить прежде Bce1'o к существенным нарушениям CTPYK турной орrанизации компонентов биомембран. Продукты фото окисления липидов обладают ДОС'l'аточно выраженными токси ческими свойствами. Пероксиды липидов и продукты их даль нейших превращений (альде1'ИДЫ и Ke'l'OHbI) морут ИНдУЦировать повреждение белковых молекул, в частности, их СУЛЬф1'идриль ных rрупп. Повреждение белков может быть обусловлено как их окислением, так и образованием стабильных ковалентных свя зей между молекулами белков и прОДУI{тами пероксидно1'О фо'rо- окисления липидов. Последние способны инактивировать MHO 1'ие мембраносвязанные ферменты. IpoMe '1'01'0, вышеуказанные продукты окисляют также такие биолоrически важные соедине ния, как цистеин, 1'лутатион, нуклеотиды, витамины А и Д, липо евую кислоту и др. Таким образом, действие УФизлучения приводит к значи- тельным модификациям структурнофункциональною состоя ния компонентов различных мембранных структур и их взаим:о действий: изменяется пассивная проницаемость липидноrо бис- лоя для ионов, разобщается окислительное фосфорилирование, изменяются конформация и каталитическая активность мембра носвязанных ферментов, нарушаются межклеточные взаимодей ствия, происходит набухание и лизис клеток и их ОРl'анелл. Ряд исследователей считает, что мембранные эффекты УФ. облучения в основном индуцированы ПФОЛ и лишь частично обусловлены фотохимическими превращениями белков. Напом ним, что происходящие в белках под воздействием УФизлуче ния нарушения их структурно-функциональноrо состояния ин дуцируютс.я: в основном ПО1'лощением энер1'ИИ 'УФ-света остат- ками ароматических аминокислот: триптофана, тирозина, фенил- аланина, а также остатками серосодержащи:х аминокислот цис теина и цистина. Под влиянием УФ-света происходит фото ионизация остатков аминокислот с образованием сольватирован ною электрона и катион-радикала аминокисло'l'Ы: АН ----t АН* ---7 A'Hf + е. . ICатион-радикал сильная кислота и при 77140 IC диссо- циирует на протон и нейтральный радикал: АН-' ---7 А' + H f . Нейтральные радикалы являются неустойчивыми соеДинени .я:ми и при температуре выше 200 К вступают в дальнейшие пре- 9. 3аказ 3788 129
вращения. Взаимодействуя с соседними 1'руппами полипептид ной цепи, они м:o1'YT образовывать межмолекулярную сшивку, являющуюся стабильным фотопродуктом: А'Н+ ---7 А' + Н+ ---7 AB (сшивка). В присутствии кислорода происходит фотоокисление трипто фана, тирозина и фенилаланина. Большое значение в фотохимии белков имеют фотосенсибилизированные реакции с участием сольватированноrо электрона. Наибольшим сродством к электро ну обладают цистин и цистеин, Они быстро разрушаются в резуль тате взаимодействия с сольватированными электронами ез, выби тыми из ароматическоrо кольца: R---CН2SS---CН2R + e. ---7 (R---СН2S---ЩR) ---7 R---CH2S + 'SCН2R ЦИСТИН радикал цистина цистеин радикал цистеина Если фотолизу подвеР1'ается остаток аминокислоты, Henocpeд ст:венно входящей в состав активно1'О центра фермента, уже это ro может быть достаточно, чтобы белок потерял ферментатив- ную активность. Если сшивка находится вне активно1'О центра фермента, то. она способна изменить баланс водородных, 1'идро фобных и друrих слабых связей (множественные разрывы свя зей), поддерживающих нативную конформацию макромолекулы. В большинстве случаев конечным результатом действия УФсвета на белки является их инактивация, Т.е. потеря ферментативной, реrуляторв:ой, транспортной, 1'ормональнсй, ИММУНОЛО1'ической и друrих видов активности. Вместе с тем для ряда белков (Kap боксипептидаза А, супероксиддисмутаза, цитохром С, 1'ем:оrло бив:) выявлена их активация под влиянием УФизлучения. Необходимо отметить, что фоточувствительв:ость мембрано- связанноrо белка может существенно отличаться от таковой для это1'О же биополимера в свободном состоянии (в растворе), что обусловлено особенностями микроокружения белковых молекул в мембране, их взаимодействием с ДРУ1'им:и: компонентами Haд молекулярноrо комплекса. Иными словами, уровень фоточувствительности мембранных белковферментов будет эффективно контролироваться CTPYKTYP ным состоянием их микроокружения. Доказательства мембранно1'О контроля УФ-чувствительности ферментов были получены С. В. Коневым и И. Д. Волотовским: (1979) на основании анализа изменений величины поперечно1'О 130
сечения инактивации ацетилхолинэстеразы в свободном состоя нии, в составе интактной мембраны, в мембране, обработанной фосфслипазами А2' С и D, в мембране, обедненной по холестери ну. Под поперечным сечением инактивации (а) понимают про изведение поперечноrо сечения поrлощения (8) активноrо света и KBaHToBo1'o выхода инактивации (<(», т. е. cr '=' S . «>. Квантовый выход фотохимической реаIЩИИ это отношение числа проре аrировавших (химически измененных) молекул к числу моле кул, поrлстивших фотоны. Следовательно, поперечное сечение поrлощения представляет вероятность поrлощения кванта света при про хождении e1'o через молекулу. Физический смысл фото чувствительности вероятность, с которой фотон вызывает хи мическую реакцию превращения молекулы, В ходе проведения экспериментов было выявлено, что попе речное сечение инактивации мембраносвязанной ЭрИТрОЦитар ной ацеТИЛХОJIинэстеразы больше, чем у своБОДЕ!О1'О фермента. Нарушение CTPYKTYPHOro состояния эритроцитарной мембраны с помощью фосфолипаз приводит к уменьшению фоточувствитель- ности ацетилхолинэстеразы. Такой же эффект вызывает и yдa ление из мембраны значительно1'О количества холестерина, опре деляюще1'О текучесть липидной фазы мембраны. Влияние мемб paHHo1'o окружения на УФ-чувствительность ацетилхолинэсте разы реализуется, по крайней мере, двумя путями: посредством изменения конформационноrо СОС'l'ояния фермента за счет меж- молекулярных взаимодействий и посредством повреждения бел ковой молекулы ПРОДУI{тами фотохимических превращений ли пидов. То есть состояние мембранно1'О фермента зависит не толь ко от эффективности протекания фотохимических процессов в самом белке, но и от фотохимических реакций в "соседних" KOM понентах, инициирующих структурные перестройки мембраны. При сравнении кинетики УФ-инактивации свободной и мем- браносвязанной ацетилхолинэстеразы обнаружено, что при изу чении мембранноrо фермента наблюдается отклонение от кине тики реакции первоrо порядка, проявляющееся в искажении ли нейной зависимости остаточной активности от дозы облучения. Одновременно изменяются и каталитические параметры остаточ- ною фермента. Необходимо подчеркнуть, что при УФоблучении свободных ферментов в растворе представлены только активные (немоди фицированные) и полностью ин активированные молекулы бел 0* 131
ка. Это значит, что при ИНlштивации ферментов в растворе УФсвет выступает в роли необратимо1'О HeKoHKypeHTHo1'o ин rибитора: по мере облучения снижается только максимальная скорость ферментативной реакции, а величина константы Ми хаэлиса остается неизменной. В отличие O'f растворимой формы ацетилхолинэстеразы мембраносвязанный фермент фотоинак. тивируется по типу смешанноrо ИН1'ибирования с OДHOBpeMeH ным изменением значений максимальной скорости реакции и константы Михаэлиса. Е одной из 1'лавных особенностей УФповреждения белков в составе биомембран относится так называемый феномен фотохи мической аллотопии. Под ним понимают эффект изменения структурно.функционально1'О состояния фермента в составе био мембраны, обусловленный стерическим возмущением ero KOH Формации вследствие фотомодификации друrих структурных компонентов мембраны. Проявление феномена фотохимической аллотопии связывают преимущественно с фотохимическими по вреждениями белков, способных под влиянием УФсвета взаи модействовать с соседними мембранными компонентами за счет образования межмолекулярных ковалентных сшивок. Модификация структуры биомембран с помощью ферментов (например, фосфолипаз, трипсина, неЙраминидаз) или в резуль. тате дезинтеrрации мембраны ультразвуком вызывает исчезно вение названноrо феномена. Следовательно, феномен фотохими. ческой аллотопии характерен только для интактных мембран. В целом УФ-индуцированные изменения С'l'руктурнофунк ционалъноrо состояния мембранных беЛКQВ MOryT быть обуслов. лены реализацией несколысих возможных процессов: собственными фотопревращениями белка в реЗУJlьта'rе по 1'лощения энерrии УФ.излучения e1'o ароматическими и cepoco держащими аминокислотными остатками; интенсификацией ПФОJI, накоплением e1'o продуктов (пер вичных и вторичных), влияющих на конформационное состоя. ние мембраносвязанно1'О белка и e1'o "ближайшеrо" липидноrо окружения или способных непосредственно повреждать белко вую rлобулу; ПО1'лощением квантов длинноволново1'О УФизлучения BOC становленными пиридиннуклеотидами, флавинам:и, железоrюр. фиринами, фотосенсибилизацией ими процессов ПОЛ, а также влиянием их фотохимических продуктов на структуру молеку 132
лы белка (фермента), e1'o активноrо центра и ближайших "coce дей" биополимера в мембране. Рассмотрим совокупность фотопроцессов, связанных с ПО1'ло щением УФсвета хромофорными rруппами 6иомембран TpeTьe 1'0 типа, Т.е. различными кофакторами мембранных ферментов. В некоторых случаях в качестве первичных акцепторов энерrии излучения выступают вещества, которые передают эту энер1'ИЮ на друrие молекулы, а сами при этом обычно не претерпевают химических превращений. Такие вещества называют фотоееlt- сut!uлuзаторамu, а процессы, в которых они участвуют, фото- сенсut!uлuзuроваIlIlЫ,М,U. Фотосенсибилизаторы индуцируют хи мические реакции, которые в их отсутствие не происходят. Они имеют две системы электронновозбужденных состояний син rлетную ев) и триплетную (38). Отметим, что пероксидное фотоокисление полиненасыщенных жирных кислот фосфолипидов мембран может происходить при ПО1'лощении квантов света как липидо:м:, так и друrи:м:и молеку лами фотосенсибилизаторами. Фотосенсибилизирующим дей ствием обладают триптофановые и тирозиновые хромофоры бел ков, порфирины, флавины, пиридиннуклеотиды. Следовательно, ПОЛ может инициироваться не только УФизлучение:м:, но и ви димым светом. Как правило, фотосенсибилизировавное окисление происхо дит с участием сенсибилизатора в триплетном состоянии, так как оно является более длительным (lO4lO с). Поэтому наибо- лее эффективными являются сенсибилизаторы, образующие дол rоживущие триплетные состояния с высоким квантовым BЫXO дом. К ним относятся мноrие синтетические красители (метиле новый rолубой, бенrальский розовый, эозин), природные пиrмен- ты (хлорофилл, 1'ематопорфирин, флавины) и ароматические yr леводороды (рубрен, нюоторые антрацены). Большинство из них ПО1'лощает видимый и длинноволновый УФсвет, поэтому эти ди- апазоны длин волн наиболее эффективны при фотосенсибилизи рованном окислении. Молекулы сенсибилизатора в триплетном состоянии MorYT химически взаимодействовать с молекулами субстрата в реакци- ях переноса электронов или атомов водорода. При переносе элек трона на 02 образуется супероксидный анионрадИRал кислоро да. При переносе электрона или атома водорода на друrие суб C'l'paTbI кислород взаи:м:одействует с короткоживущими проме 133
жуточными соединениями, образуя продукты фотоокисления. Друrой путь фото сенсибилизированных реакций КОСRенный: молекула сенсибилизатора в триплетном состоянии химически не участвует в реакции, а передает энер1'ИЮ возбуждения на MO лекулярный кислород, образуя электронновозбужденное состоя ние кислорода СИН1'летный кислород 102' Активность послед Hero в окислительных реакциях в 100 раз выше, чем невозбуж денноrо кислорода. Фотопроцессы с участием 102 настолько pac пространены, что их часто выделяют в особый тип реакций, Ha зываемый фотореакциями типа П: 80 ---7 18* ---7 38' ---7 80 + 102 (lA g или 1 L:g) , 102 + D ---7 Dox. Все остальные реакции по этой классификации относятся к типу 1. Оба типа реакций широко распространены. Кроме окис ления ОР1'анических соединений в химических системах, они оп ределяют фОТОИН1'ибирование фотосинтеза и фотодеструкцию фо тосинтетическоrо аппарата при высоких интенсивностях осве- щения, участвуют в фотоповреждении сетчатки и хрусталика 1'лаза, определяют фототоксичность некоторых лекарственных препаратов, обусловливают фотодеструктивное действие порфи- ринов при их избыточном накоплении в клетках растений и животных, используются для "разрезания" ДНЕ, уничтожения вирусов, в фотодинамической терапии раковых заболеваний. Основная часть изученных фотосенсибилизированных процес сов осуществляется с участием кислорода. Фотоповреждение био систем в присутствии сенсибилизаторов с участием молекулярно ro кислорода называют фотодинамическим действием. Ero paCCMaT ривают как частный случай фотосенсибилизированных процессов. Еислороднезависимых фотосенсибилизированных реакций известно сравнительно мало. В качестве примера можно привес- ти фотолиз цист ина в макромолекулах белков при действии Уф излучения с длинами волн более 280 нм. Фотосенсибилизатора ми в этом случае служат ароматические аминокислоты трипто фан и тирозин. Е кислороднезависимым фотосенсибилизирован- ным процессам относят и фотоприсоединение псораленов к пи- римидиновым основаниям ДИК. ТИП фотосенсибилизированной реакции зависит также от I1Pи роды сенсибилизатора и субстрата, в частности, от их способнос ти вступать в окислительновосстановительные реакции. 134
Биомембраны являются основной мишенью повреждающе 1'0 действия света в присутствии порфириновых соединений, OT носящихся к ЭНДО1'енным сенсибилизаторам. Изучение Mexa низмов направленно1'О сенсибилизированноrо фотоповре)Кдения опухолевых клеток с участием порфиринов, избирательно Ha каПЛивающихся в них, леrло в ОСНОВУ метода фоторадиацион ной терапии злокачественных новообразований. С друrой CTO роны, в настоящее время необходимо разрабатывать защитные меры от сенсибилизированнс1'О фотоповреждения биосистем в присутствии ЭКЗО1'енных соединений (красителей, ароматических У1'леводородов). Особенности фотосенсибилизированных процессов, протека ющих в мембранных системах, определяются ЧУЕствительностью липидов и белков к сенсибилизированным фОТОПОЕреждениям. Сенсибилизированному фотоокислению наиболее эффе:ктив но подверrаются не насыщенные жирные :кислоты, а также холе стер ин. Процессы их фотоокисления сходны с таковыми, проте :кающими при пероксидном окислении липидов. Сенсибилизи рованное фотоокисление липидов может осуществляться и по pe а:кциям типа II и типа 1. Тип реа:кции фотоокисления различ ных мембранных структур зависит от соотношения KOHцeHTpa ций сенсибилизатор ЛИПИД и от способности МОЛ8:КУЛ сенсиби лизатора образовывать arpe1'aTbI. Более подробно изучены фотосенсибилизированные повреж дения белковых макромолекул с участием синrлетнО1'О кислоро да. Следует подчер:кнуть, что 102' с одной стороны, является уча стником МНО1'их фотосенсибилизированных реакций, а с дрyrой степень ero участия в фотопроцессах служит I<ритерием для вы- явления механизма их протекания. К настоящему времени установлено, что процесс rенерации 102 в результате переноса энерrии на кислород от трицлетных молекул различных соединений является одним из самых эф фе:ктивных механизмов образования этой а:ктивной формы кис лорода. Он определяет фото сенсибилизированное образование 102 в растворах сенсибилизаторов в аэробных условиях, приводит к появлению СИН1'летноrо :кислорода в темновых химических и био- химических реакциях, если они сопровождаются образованием возбужденных молекул ОР1'анических соединений в СИН1'летном и триплетном состояниях. Кроме Toro, суперокс:ИДНЫЙ анион- радикал, пероксид водорода, перrидроксильный радикал, образу- 135
ющиеся в разнообразных ферментативных инеферментативных реакциях, способны 1'енерировать СИН1'JIетный кислород (см. rлаву 3). Вероятность фотоиндуцированноrо образования 102 особенно велика в клетках, содержащих значительное количество поrло щающих свет пиrментов. Тю<, эффективными фотосенсибилиза торами образования СИН1'летно1'О молекулярно1'О кислорода яв ляются основные ПИ1'ментЫ фотосинтеза (хлорофиллы, бактсрио хлорофиллы, феофитины), основной ПИ1'мент зрения ретиналь, флавины, порфирины. Наиболее разработаны в методическом отношении способы обнаружения СИН1'летноrо кислорода в 1'азовой фазе. Наличие в системе 102 можно зареrистрировать методом эмиссионной спек троскопии. Важным преимуществом 3'1'01'0 метода является то, что он позволяет обнаружить lL1 и 1}:; + состояния СИН1'летноro g g молекулярно1'О кислорода в широком диапазоне давления, ТО1'да как методом ЭПР можно определить lL1 состояние СИН1'летноrо g кислорода при давлениях в несколько мм рт. ст. Потенциалы ионизации молекул 102 в состояниях lL1g и l}:;g+ ниже, чем для OCHoBHo1'o состояния З}:;. На этом базируется фотоионизацион ный метод обнаружения возбужденно1'О кислорода. Широкое pac пространение имеет метод активации реакций путем замены Н 2 О тяжелой водой. Эффект связан с тем, что время жизни 102 в D 2 0 значительно больше, чем в Нр, и поэтому активность СИН1'лет Horo кислорода в D 2 0 также значительно выше. Современная Tex ника люминесцентных измерений позволяет наблюдать и иссле довать инфракрасную люминесценцию СИН1'леТIIО1'О кислорода практически в любых растворителях в ходе фотосенсибилизиро BaнIIbIx или темновых процессов. Однако реrистрация образова ния синrлетноrо кислорода прямыми методами осложняется из за ниЗкой e1'o стационарной концентрации вследствие взаимо действия 102 с различными акцепторами и тушителями. Поэтому широкое распространение получили методы обнаружения син1' летноrо кислорода, основанные на применении акцепторов и TY шителей, способных эффективно и более или менее избиратель но взаимодействовать с СИН1'летным кислородом, приводя к ero физической дезактивации или образованию специфических про дуктов окисления. В качестве акцепторов 102 применяются алке ны, производные фурана, ароматические У1'леводороды, холесте рин; в качестве тушителей каротиноиды, азиды, амиды, (),TO коферол. Возможно самотушение СИН1'летно1'О CL1) кислорода g 136
триплетным еЕ) КИСЛОРОДОМ в растворах. Физическое тушение g Il:gt во MHoroM определяется возможностью перехода ll:g Ib. g в колебательном движении молекул тушителя. Обсуждаются два механизма тушения синrлетно1'О кислоро да. Вопервых, тушение осуществляется через образование комп лекса с пере носом заряда, в котором 102 выступает в роли акцеп тора электрона. Этот комплекс формируется лишь в момент co ударения и не находится в равновесии с реа1'ентами, BOBTOpЫX, тушение 102 происходит путем переноса энер1'ИИ от синrлетноrо кислорода на электронный уровень тушитеJIЯ при условии He посредственно1'О KOHTaK'ra электронных оболочек 102 и акцепто ра энерrии. При физическом тушении не происходит дeCTpYK ции тушителя. Химическое тушение приводит к окислению TY шителя, накоплению 1'идроперОI{СИДОВ, образованию свободных радикалов и развитию; свободнорадикальных процессов окисле ния. В нефотосинтези:рующих клеТI{ах самыми сильными туши телями 102 являются аминокислоты и белки. Среди амИНОКИСJIОТ наиболее эффективны триптофан, rистидин, метионин :и: цисте ин (табл. 12). Для оценки способности соединений взаимодейство вать с 102 используют константу скорости тушения, I{ОТОрую pac считывают по уравнению ШтернаФольмера на основе измере ний тушения люминесценции 102 или ИН1'иби:рования фотодест рукции акцепторов СИН1'летноrо кислорода: (СРох}) (СР")Ч == (CP1)j(q>I)'l == ('СА}of('С д \ == 1 + kq('CA).,[Q], rде СРох квантовые выходы (или СI{ОРОСТИ) ОКИСJIения акцепто ров 102; <Р! квантовые выходы (или интенсивности) люминес ценции 102 ; 'СА время жизни 102; [Q] концентрация тymите ля; параметры, измеренные в отсутствие тушителя, обозначают ся индексом "о", а в присутствии тушителя "q". Вклэд химическоrо тушения в активность аминокислот MO жет составлять от 10 до 100 %. Оно приводит К существенным изменениям структурнофункциональноrо состояния белков. Фи зическое тушение 102 аминокислотами и белками определяется образованием комплексов с переносом заряда. Липиды существенно более слабые тушители 102 по cpaB нению с белками. Активность фосфолипидов в ОР1'анических pa створителях практически равна сумме активностей составляю щих жирных кислот. Ненасыщенные жирные кислоты и холес терин тушат 102 преимущественно по химическому механизму 137
Таблица 12 КОJl.станты ClCOpOCmU тушенuл СUН2летН020 lCuслоро(}а HelCoтopblMU 6UОЛОZU'lесlCU.мu .молеlCула.мu Тущитель Условия проведения k q , мольI.с-1 эксперимента Триптофан D 2 0, рН 78, метод 3,25,6 '107 тушения фосфоресценции fистидин « 4,04,6 '107 Метионин « 1,3'107 L-цистеин « 0,95 '107 Тирозин « 25 '106 DL-фенилаланин « 7'105 rлиц:ин « < 105 Сывороточный альбумин « 2,6'108 быка Сывороточный альбумин « 1, 77,8 .108 человека r люкоза « 1,4'10' Сахароза « 2,5'10' Аскорбинова.я: кислота « 0,516 '107 fуанозин « 46 '106 АМР « 4'10' A'l'P « 35 '101 а-то:коферол Растворитель СС!., метод 17 '108 тушени.я: фосфоресценции Хлорофилл а « 17 '108 Ба:ктериохлорофилл а « 109 каротин « 78 .109 Яичный « 510 '10' фосфатидилхоJПIН Фосфатидилхолин « 105 сетчатки Фосфатидилэтаноламин « 105 сетчатки Вода « 2,8'103 с образованием rидропероксидов и далее свободных радикалов, инициирующих ПОЛ. Примечательно, что хлорофиллы, бакте риохлорофиллы и порфирины сочетают способность 1'енериро вать и тушить 102 по физическому механизму. Это позволяет указанным пиrментам ВЫПОлнять роль протекторов фотосинте тических мембран от 1"енерируемоrо ими же синrлетноI'O IШСЛО рода. 138
Фотосенсибилизированное окисление аминокислотных OCTaT ков белков биомембран является первичным световым процес сом. Оно приводит К образованию сшивок полипептидБыx цепей биополимеров, т. е. к вторичному процессу, не требующему дo полнительной световой активации. Различные типы сшивок MO 1'УТ формироваться между ФОТООI<.исленными аминокислотными остатками ( в основном 1'истидина) и функциональными rруппа ми белков (NH2' SH). Фотосенсибилизированные изменения CTPYKTYPHoro состоя ния липидов И белков биомембран приводят к существенным нарушениям их функционирования: изменению проницаемос ти, процессов транспорта, катали'rической активности мембран ных ферментов (их инrибированию). Степень фотоповреждения мембран зависит от цело1'О ряда факторов: коэффициента pac пределения сенсибилизатора между мембранной фазой и paCTBO рителем, KBaHToBo1'o выхода триплетно1'О состояния красителя, e1'o заряда, присутствия про и антиоксидантов. В целом совокупность фИ3Иl<охимических процессов, инду цированных воздействием УФизлучения и при ВОДЯЩИХ к Hapy шениям ctpyktypho-функционально1'О состояния компонентов мембраны и, в конечном итоrе, к изменению протекания метабо лических процессов в клетке, может быть представлена в виде следующей схемы (рис. 31). Изучение молекулярных механизмов действия УФизлучения на БИОllOлимеры, их надмолеl<,улярные комплексы и биомембра ны представляет собой одну из актуальных проблем биофизики, биохимии и мембранолоrии в связи с особой значимостью реше ния задач в рамках важнейших разделов медицины и ЭRолоrии. Так, в настоящее время в ХИРУР1'ических, акушерско-rинеколо rических и терапевтических Rлиниках широко используется метод аутотрансфузии УФоблученной RрОВИ (АУФОR). Целесо образность rлубокой разраБОТI<.И вопроса оприменении это1'о :мe тода и выявлении механи;змов e1'o положительноI'О ("тераП6ВТИ- чеСRОro") действия была убедительно показана при лечении боль ных с rнойновоспалительными и кожными заболеваниями, в случае острых инфекций, заболеваний, связанных с иммунопато ЛО1'ией. Доказана высокая эффеRТИВНОСТЬ АУФОК при лечении сосудистых заболеваний нижних конечностей и ишемической болезни сердца. Терапевтический эффект этоrо метода связыва ют с усилением оксиrенации крови, купированием rИПОI<.сичес 139
hv (240---290 нм) Интеrральные белки Пиридиннуклеотиды, железопорфирины, флавины, витамины Ароматv.ческие и серосодерЖащие аминокислотные остатки Фотоионизация ароматических аминокислотных остатков, фотолиз SS- и СSсвязей Образование 102 или радикальных интер медиатое Фотосенсибилизиро ванное окисление аминокислотных OCTaT ков иненасыщенных жирных кислот липидов + Образование белковых сшивок Изменение функцио нальных свойств мембранных белков (инактивация или активация) I I I I I I I I I I I I I I I I , I I I I ....................................... Нарушение транспортных свойств мембран Нарушение рецепторных свойств мембран Нарушение фУНКЦИонирова ния ферментных комплексов hv (220---290 нм) Липиды rидроr.ероксиды не насыщенных жирных кислот Накопление вторичных продуктов ПОЛ Нарушение белоклипидных взаимодействий Изменение барьер ных и транспортных свойств мемб аны Изменение метаболических Процессов в клет!(е Рис. 31. Схема физико-химических процеССОБ, индуцированных B03 действием УФ-излучени.я: и приводящих R нарушениям CTPYKTYPHO ФУНRциональноrо состояния компонентов биомем5ран 140
ких сос'rояний, с повышением бактерицидных и нормализацией реолоrических СВОЙС'l'В УФоблученной крови, а 'l'акже с'rимуля цией факторов клеточноrо и rуморальноrо иммунитета. Вместе с тем молекулярные основы формирования клиническоrо эффеI\: та указанноrо метода исследованы ДIеко не полностью. Прак- тически не обсуждался вопрос о механизме протекания первич- ных фотохимических процессов в Itрови под уrлом зрения их роли в лечебно-оздоровительном дейс'l'ВИИ АУФОк. В 1969 r. В. r. Ар'rюховым был O'l'крыт эффект усиления оксиrенации молеItул rеМО1'лобина мышей под воздействием УФ-света. Последующие исследования клиницистов подтверди- ли сильнейшее оксиrенирующее действие УФизлучени.я на кровь. Природа этоrо явления изучена недоста'rочно: мноrие аспекты e1'o нуждаются в детализации, уточнении и КQнкретизации. Од- ним ИЗ подходов к решению данной задачи является выяснение механизмов деЙС'l'ВИЯ УФ-излучения на с'rруктурнофункциональ ные свойства важнейших белковых компонентов транспортной, иммунолоrичесн:ой, антиоксидантной и окисли'rельной систем крови орrанизма человека и животных. На кафедре биофизики и биотехнолоrии Воронежскоrо 1'ocy дарствеННОI'О унинеРСИ'l'ета в 'l'ечение длителыrorо времени прово- дя'rся систематические исследования по изучению влияния УФ-ра диации на структуру и фУНКЦIШ молекул OДHO и двухкомпонент ных белков (rеМО1'лобина человека и некоторых животных, CЫBO роточноrо альбумина, к,аталазы, пероксидазы, цитохрома с, лак татде1'ИДРО1'еН8ЗЫ, белков системы комплемента) и их н:омпле:ксов, иммобилизованных ферментов и биомембран в условиях различ- Horo МИКрООItружения, в широком диапазоне рН и 'l'емператур, в присутствии модифицирующих areH'l'OB (серотонина, NAD(H) , ac корбиновой кислоты, тре'rичноro бута нола, манНИ'l'а, а-токоферола и др.). Определены величины I\:вантовых выходов, констант CKO рост ей , энер1'ИИ активации и термодинамических параметров pe акции фотомодификации белковых молекул. Установлено, что 1'лавной особенностью действи.я: УФ-света на rемопротеиды явл.яе'rся фотосенсибилизаци.я: ОС'l'атками apo матических аминокислот простетических rpупп (1'eMoB) и ини циация путем фотомодификации последних локальных I\:ОНфОр мационных изменений апобелков. Воздействие УФ-света на растворы супероксиддисмутазы (СОД) индуцирует повышение ее фу:ющиональной ак'l'ИВНОСТИ. 141
Эффект фотоак'rивации СОД наиболее выражен при экстремаль ных для проявления ее ферментативной активности значениях рН и определяется конформационным состоянием белковой 1'ло булы. Ин активация молекул лактатде1'идроrеназы (лдr) под влия нием УФсвета обусловлена разворачиванием ее ОЛИ1'омерных молекул. Важную роль в процессах фотопревращений отдель ных изоферментов лдr иrрают активные формы кислорода (син rлетный молекулярный кислород, 1'идроксильный радикал). Pe инфузия УФоблученной крови больным бронхиальной астмой приводит к снижению функциональной активности лдr, что сви детельствует об уменьшении интенсивности окислительных про цессов, протекающих в крови пациентов. Определяющая роль в УФиндуцированных изменениях 1'e молитической активности системы комплемента принадлежит оrюсредованному через продукты радикальной природы (преиму щественно продукты пероксидноro окисления липидов) действию УФсвета. Отмечено корре1'ирующее дейС'rвие АУФОЕтерапии на структурно-функциональное состояние эритроцитарных MeM бран и систему комплемента крови больных бронхиальной aCT мой и язвой желудка. Исследование уровня функциональных свойств и CTPYKTYP Horo состояния важнейших ферментов транспортной, иммуноло 1'ической, антиоксидантной и окислительной систем крови боль Ных С различной этиолоrией и паТО1'енезом до и после проведе ния сеансов АУФОК и ЭЛОI{терапии, сопоставление результа тов биофизическоrо и биохимическоrо анализов изучаемых по- I,<азателей с клинической картиной развития паТОЛО1'ических co стояний позволит осуществить математическое и физическое моделирование динамики развития заболеваний на различных стадиях ero лечения, разработать рекомендации индивидуально дифференцированноrо подхода к использованию АУФОК и ЭЛОК при лечении конкретных патолоrий и внедрить прикладные про rpaмMbI использования фотоrемо и лазеротерапии в медицине. 4.1.2. Раf}цаЦlLоюю-хuмurtескuе прееращенUJl структурных lCO.1ItlZOHellmoe бцоме.мбран Процесс свободнораДИlCllЛЬНО1'О пероксидноrо окисления ли пидов мембран рассматривают в настоящее время как один из механизмов "биохимическоrо усиления" эффекта ионизирующей 142
радиации, который иrрает важную роль в развитии лучево1'О по ражения живых систем. При первичном взаимодействии (физическая стадия) ионизи рующе1'О излучения электромаrнитной или корпускулярной при роды с атомами вещества образуются положительно и отрицатель но заряженные ионы, а также возбужденные электронные состоя ния атомов и молекул. В элементарном акте ионизации pacxoдy ется около lO12 эВ энер1'ИИ ионизирующей радиации (IJотенци ал ионизации). Если передаваемая элы{трону энерrия больше этой величины, то он сам становится источником ионизации дРУ1'их атомов; если меньше потенциала ионизации, имеет меб'О возбуж- дение атома (молекулы). Физикохимическая стадия воздействия радиации на биообъеI{ТЫ существенно зависит от особенностей их структурно-функциональной Ор1'анизации. При этом большое зна- чение имеет процесс радиолиза воды: н 2 о возбуждсние н 2 о ИОlI1шu.ЦИrI » HzO* » н'+ он, » н 2 о + + ё t Н,О H20""""""'" + 1:1" н' + OH н + И,О еrи.цр Молекулярный кислород, растворенный в биолоrическнх жид костях, вступая в реакцию с продуктами первичноro радиолиза, является источником образования супероксидно1'О анион-ради- кала, 1'идропероксидов, орrан:ических пероксидов, эпоксидов: н 2 о ----7 н' + он' + ё rидр + Н 2 + Н 2 О 2 + НзО+; ё rидр + 02 ----7 O н' + 02 ----7 HO. Все последующие реакции, развивающиеся в живых систе мах под влиянием вышеуказанных продуктов взаимодействия ионизирующей радиации с веществом, носят свободнорадикаль ный характер (см. 1'лаву 3). Вклад KOCBeHH01'O действия (т. е. с участием воды) ионизирующеrо излучения на БИОJIО1'ические молекулы СОС'l'авляет 8590 %. АФЕ, образующиеся при луче- вом воздействии, индуцируют окислительные реакции в MaKpo молекулах по ОI{сидазному или ОКСИ1'еназному пути. В реЗУЛЬ'l'а те ферментативноrо или неферментативноrо оксиrеназноJ'O окис 143
ления образуются перOIссидные ПРОДУК'l'ы, способные к повреж дению биомаКРОМОЛeIСУЛ и су6клеточных структур. Сравнительный анализ величин ради:ационнохи:мичеСlсоrо выхода G (paBHo1'o числу изменившuхся или вновь образован ных молекул на 100 эВ поrлощенной энерrии), используемоrо для хараК'l'еристики радиочувс'rвительности молекул, показал, что наиболее радиочувствительным компонентом клеТIСИ .я:в ляются фосфолипиды (G> 1), выступающие в качестве ИС'l'очни ка образования первичных продуктов радиолиза орrаничес ких радикалов и пероксидов, участвующих в реакциях иници ации, продолжения и разветвления цепей свободнорадикально 1'0 окисления. Активные радикальные ме'fаболиты (0,\ ОН', н0 2 ', Н', е ) и rnдp продукты радиолиза липидов мембран индуцируют в белках про цессы окисления т:иоловых и аминоrрупп, образования вну'rри и межмолеКУJIЯРНЫХ СШИБОК, сопровождающиеся их инактива цией. В нуклеиновых кислотах и нуклеотидах происходят OДHO и двутяжевые разрывы, модификация азо'l'ИСТЫХ оснований, об разование сшивок ДHKДHE и ДНКбелок. Таким образом, в результате воздействия ионизирующей pa диации на биомембраны происходи'l' нарушение с'rpуктурной op1'a низации всех ее компонентов, изменяется про'rекание транспорт ныx и метаболических процессов, становится возможным выход ллзосомальных ферментов (в частности, протеаз и нуклеаз), раз рушение вJIy'l'риклеточныx структур и rибелъ lслетки, Важную роль в инактивацин токсичных продуктов ПОЛ иr рают фосфолиnазы, особенно фосфолипазы А2' В процесс е фосфо липазноI'О rидролиза происходит удаление из мембран наиболее I'лубоко де1'радированных фраrментов ненасыщенных жирных кислот липидов. В результате токсичные прОДУК'fЫ ПОЛ пере ходят в rидрофильное окружение и подверrаютс,я ипактивации с участием монооксиrеназной системы (в том числе цитохрома P450) ЭRДоплазматичеCIсоrо реТИ1сулума. В 60x rr. было показано, что ион-изирующее излучение инrи бирует работу на'rpиевоrо насоса эритроцитов человека. TOPMO жение активноrо оттока Na+ наблюдается уже после облуqени,я в дозах 8,989 тр. При повышении дозы радиациц до 200 rp транс- порт Na+ и К+ В эрИ'rроцитах полностью инактивируется. После облучения эритроцитов крысы в дозе 7 I'p также выявлено cy щественное торможение активности Na+, Е+АТФазы. 144
Результаты исследования влияния обще1'О рент:rеиов'Скоrо об лучения на фую:щиональные свойства Na\ IС+АТФазы мембран клеток печени крысы показали, что торможение удельноii aI< тивности фермента отмечается в течение длительноrо времеIlИ (1 ч 60 сут) после прекращения воздействия радиации. Чс рез 1 ч потеря активности фермента составляла 87 %. Через 30 и 60 сут У выживших животных наблюдалась полная ИlIаI<.ТI1 вация фермента. Следовательно, инrи6ирование акТИВНО1'о мембранноrо TpaHC порта под действием ионизирующе1'О излучения происходит в клетках различных типов, в разных условиях облучения :в l11И роком диапазоне доз. ПреДIюлаrаIOТ, что сохранение ЖИЗIlедея тельности клеток при деЗ81ТИВации натриевOI'О насоса связано с включением компенсаторных механизмов поддержания roMeo M С'rаза. Например, в мембранах эритроцитов при торможении ан,;м тивности Na+, К+АТФазы активность са2+.Атфазы превы:w:аст контрольный уровень, а в плазматических мембранах печени увеличиваетсз Мg2iАТФазная активность. Известно, что Са 21 11 Мg2+ способствуют связыванию белков, в том числе АТФаз, с MCM браной. В ЛИlIИДНЫХ бислоях Са 2 + обеспечивает образование мо- стиков между фосфатидами, в реЗУЛЬ'l'зте KOToporo упаковка ли пидной фазы с'rановится более плотной и уменьmается прО,Н:И цаем ость мембраны. Кроме Toro, после рентrеиовскоrо облуче иия животных в дозе 5 rp обнаруживается повышение аI<ТИ:В ности щелочной фосфатазы, свззанной с плазматическими MeM бранэми клеток печени мышей. Щелочная фосфатаза И"I1:тех'м ралъный фермент плазматических мембран некоторых клеток участвует в а!(ТИВНОМ транспорте ионов Na+ и К+. Воздействие ионизирующеrо излучения приводит к сущес'l'ВСНм ному подавлению аКТИВJюс'rи друrоrо 'I'ранспортноrо белка НСОзАТФазы плазматических мембран клеток печени и ЭрИТ роцитов, В результате KOToporo возможно нарушение КИСЛОТlХО щелочноro равновесия в клетке л орrанизме. Торможение функциональной активности АТФаз, участ:вую щих в активных транспортных процессах, коррелируе'r с Hapy шепием баланса элек'rролитов в облученной клетке, а 'l'a:f(.же с изменением прОНлцаемости плазматических и внутриклеточных мембран, вслеДС'I'вие чеrо реrистрируется выход внутриклеточ- HOro калия, подавление окислительноrо фосфорилирования, Y'I'еч- ка К+ из МИ'l'охондрий. 10. ЗакlIЗ 3788 141i
Функциональная активность мембраносвязанной 5' нуклео тидазы печени крыс значительно возрастает при действии иони зирующей радиации как в ранние, так и в поздние сроки после облучения. Считают, что повышение активности ЭТО1'о фермента не связано с синтезом фермента de novo, а обусловлено перерас npеделением белка в растворе и в составе мембран. Повидимому, механизмы пострадиационной вариабильнос ти активности мембранных белков предусматривают реализацию реrуляторных эффектов целоrо ряда факторов: например, влия ния нейроэндокринной системы на функционирование фермен тов в облученном ОР1'анизме, биолоrически активных веществ, продуктов пероксидноrо окисления липидов, изменений зарядо Boro состояния поверхностных участков мембраны и др. Ионизирующее излучение ИНдУцирует снижение общеrо YPOB ня мембранных фосфолипидов и повышение содержания холе стерина, что сопровождается возрастанием коэффициента холе стерин/фосфолипиды до 1,05 при норме 0,60. Однако уровень индивидуальных фосфолипидов изменяется разнонаправленно: происходит накопление сфинrомиелина и фосфатидилсерина и снижение содержания фосфатидилхолина, фосфатидилэтанол амина и особенно фосфатидилинозитола. В целом коэффициент насыщенности мембранных липидов повышается. Все это приво дит К значительным нарушениям текучести мембраны, увели чению ее ВЯЗlСОСТИ, изменениЮ функциональных свойств мемб ранных белков. Предполаrают, что механизм пострадиационной модификации состава и содержания структурных липидов в плаз матических мембранах животной клетки связан с изменением npоцессов синтеза и распада липидпереносящих белков, фермен тов липидно1'О обмена, нарушением внутримембранной динами 'ки липидных компонентов. Вместе с тем необходимо отметить, что липиды клеточных мембран животных защищены от процесса ПОЛ при воздей ствии ионизирующей радиации по сравнению с искусственны ми мембранными структурами, в частности, липосомами. Ha копление холестерина может препятствовать приросту уровня пероксидов липидов и приводить К торможению ДРУ1'их про цессов в мембране, связанных с развитием лучевой патоло1'ИИ. Кроме To1'o, в мембранах локализованы собственные низкомо лекуля:рные антиоксиданты (например, олокоферол) и защит ные антиокислительные ферментные системы. Так, результаты 146
модельных исследований свидетельствуют о том, что витамин Е образует комплексы с мембранными фосфолипидами, содержа щими остатки арахидоновой кислоты. Формирование этих KOM плексов способствует стабилизации и снижению проницаемос ти клеточных мембран с высоким содержанием полиненасы щенных жирных кислот. При изучении влияния минимальных летальных доз (154,8 мКлjкr) peHT1'eHoBcKoro излучения на активность HeKO 'l'OpbIX фермен'l'ОВ У1'леводно1'О обмена клеток KocTHoro мозrа крыс выявлено, что после облучения в популяциях миелокариоцитов активность лактат, малат- и rлюкозо6-фосфатдеrидроrеназ зна чителъно уrнетается в течение 72 ч после облучения и ДОСТИ1'а ет минимальноrо значения на 3-и сутки эксперимента. На 10e сутки наблюдается увеличение значений скорости реющий, Ka 'l'ализируемых, малат- и лактатде1'ИДРО1'еназой, при снижении активности rлюкозо6фосфатдеrидроrеназы. Следовательно, в ранние сроки после воздействия ионизирующей радиации на орrанизм животных происходит усиление интенсивности анаэ робных процессов и ослабление дыхания и пентозофосфатно1'О пути. Облучение животных ионизирующей радиацией вызывает не только изменения активности МНОl'ИХ ферментов, реrулирующих процессы клеточно1'О метаболизма, но и относительноrо содержа ния изоферментов. Так, в ряде работ показано, что у-облучение влияет на активность изоферментов лактатде1'идроrеназы, lИС- лой фосфатазы, неспецифической эстер азы. Причем при более низких дозах облучения величина изменений в относительном содержании изоформ может быть больше, чем при высохих. При анализе относительноrо содержания фракций изоферментов вы- шеуказанных белков в различные сроки после у-облучения в дозе 1 rp установлено, что воздействие радиации вызывает существен ные изменения в относительном содержании изоформ изучен ных ферментов, которые имеют, повидимому, фазовый харак- тер. Считают, что эти результаты связаны с интенсивной пере стройкой 1'енетическоrо аппарата клетки в период до 7 суток после облучения. Новому структурнофункциональному состоя- ниlO rенетическоro аппарата соответствует иной уровень процес сов метаболизма, происходит запуск адаптивных систем, нивели- руlOщих нарушения, возникающие в результате воздействия иони зирующе1'О излучения на орrанизм. 10'" 1-17
А. И. Дворецким (1986) предложена 1'ипотеза вероятной пос ледовательности процеССОБ нарушения энеР1'етичеСRИХ и ре1'УЛЯ торнотранспортных функций мембран в условиях воздействия ионизирующей радиации. Инициирующим процессом при действии лучевоrо фактора является аRтивация пероксидноrо окисления липидов в клетке, происходящая на фоне резко1'О усиления эндоrенноrо фосфоли пазноrо rидролиза. В результате накопления продуктов пол про исходит изменение баланса между эндоrенными радиопротекто рами и радиосенсибилизаторами в пользу последних. Окисление мембранных липидов и повышенный эндоrенный фосфолипазный rидролиз приводят к нарушению проницаемос ти биомембран для катионов. Это вызывает уменьшение уровня калия, увеличение содержания натрия и возрастание KOHцeнтpa ции кальция в цитозоле, поэтому происходи'r насосзависимое увеличение объема клетки, нарушение структурнофункциональ Ho1'O состоя:ния Na+, К+АТФазы за счет конформационных изме нений молекул фермента на фоне липидбелковых перестроек в мембране. В ответ на изменение ионноrо rомеостаза возможно компенсаторное увеличение количества молекул Na+, К+АТФазы за сче'l' "резервных". Однако вследствие деэнерrизации клетки, индуцированной нарушением окислительноrо фосфорилирова ния и дефицита АТР, функционирование Na+, К+АТФазы оказы вается затрудненным. Изменяется и активность Са 2 + АТФазы. Все это, наря:ду с нарушением пассивной проницаемости, вызывает резкое увеличение уровня внутриклеточноrо кальци.я:. В резуль тате выявляются необратимые последствия, связанные с модифи кацией мембранно1'О скелета и изменением формы клетки. Cy щественным моментом в патофизиолоrии клеточной 1'ибели яв ляется вторичная активация фосфолипаз кальцием. Это приво дит К фосфолипазному истощению мембран клеток и внутрикле точных ОР1'анелл и возрастанию их проницаемости. Нарушения в функционировании всех клеточных систем способны индуци ровать необратимые изменения в процессе жизнедеятельности клеток. Необходимо отметить, что компоненты биолоrических мемб ран иrрают ключевую роль в развитии свободнорадикальных pe акций в клетках и тканях, индуцируемых воздействием ионизи рующе1'О излучения, и патоrенезе лучево1'О поражения живых орrанизмов. Процессы нарушения липидноrо состава, текучести 148
липидных компонентов, подвижности ЛИПИДБЫХ и белковых MO лекул, липидбелковых взаимодействий, изменения активности мембраносвязанных фермеи:тов, собственных систем антиради кальной защиты представляют собой комплексный и взаимосвя занный механизм, индуцирующий пострадиационные cтpyKTyp но-функциональные перестройки биомембран и обеспечивающий переход клеток и орrанизма на новый метаболический уровень функционирования. 4.2. уфиIIдуцировАнныE ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРНОФУПКЦИОНАЛЫIоrо СОСТОЯНИЯ МЕМБР АНОСВЯЗАПНЫХ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕР АЗЫ И NA+, К+АТФА3Ы В ПРИСУТСТВИИ НЕКОТОРЫХ ХИМИЧЕСI<:ИХ МОДИФИКАТОРОВ 4.2.1. ФУIl,кциОliальна.Jl активность мем{fраносв.Jl.юшюй ацетилхолинэстерааы после УФ-облу'"енU.Jl в присутствии {fензuловоzо спирта и КOllкаllаеаЛltна А Значительный вклад в решение проблемы, касающейся изу- чения CTPYKTypHoro состояния, локализации, особенностей функ- ционирования отдельных компонентов в составе Бадмолекуляр Ho1'o комплекса, характера их взаимодействия с ближайшим молекулярным окружением, Moryт внести методичеСI<ие подхо- ды, связанные с модификацией тех или иных структурных эле ментов мембран. В :качестве модиФицирующих a1'eHToB, приме няемых как для исследования свойств интактных мембран, так и для реryляции метаболических процессов, осуществляющихся с их участием, активно используются разнообразные естественные и синтетические соединения, ферменты, физические факторы УФизлучение и температура. Информативным тестом для оценки нативно1'О состояния эритроцитарной мембраны, а также исследования структурных перестрое:к и изменений в функционировании ее основных :КOM понентов липидов и белков, индуцированных воздействием целоrо ряда физикохимических areHToB, является определение фун:кциональной активности конформационноrо маркера мемб- раны ацетилхолинэстеразы (см. раздел 1.2.5). На рис. 32 показаны изменения функциональной активности мембран ос вязанной P.LКЭ после облучения мембран эритроцитов челове:ка УФсветом в интервалах длин волн 240390 нм и зоо 400 нм. Видно, что при воздействии УФизлучения (240390 им) 149
А,% 100 2 Рис. 32. ФУН1щионмьнал aк ТИВНОСТЬ ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека, модифицированных воздействи- ем УФ-излучения: 1 I{ОНТРОЛЬ; 2 УФоблучение в ин'rервале ДЛИН ВОЛН 300400 нм; 3 УФоблучение в ИН'I'ервале длин волн 240390 нм. Каталитиче скую активность реrистрировали по методу Хестрина, йС:а:ован:аому на колориметрическом оnpеделе нии концентрации ацеТИJIXолина 80 60 40 20 о 3 на суспензию эритроцитарных мембран активность исследуемо ro фермента статистически достоверно возрастает на 12 %. Облу чение мембран длинноволновым 'УФсветом приводит к СНИ.же нию функциональной активности АХЭ на 50 %. Таким образом, фоточувствительность мембранной АХЭ сутцественно зависит от спектральноrо состава УФсвета, а значит, она определяется po лью различных хромофоров мембран при их облучении в YKa занных диапазонах длин волн. УФизлучение в интервале длин волн 240390 нм эффективно поrлощается такими структурными компонентами эритроцитарной мембраны, как полиненасыщенные жирные кислоты фосфолипидов, а также ароматические и серо содержащие остатки интеrpальных белков. Необходимо отметить, что мембранные эффекты УФоблу- чени.я: в значительной степени вызываются пероксидным окисле нием липидов и лишь частично обусловлены фотохимическими превращениями белков. Следовательно, поrлощение 'УФизлучения в интервале длин волн 240390 нм указанными выше хромофора ми эритроцитарных мембран индуцирует такие структурные пере- стройки липидноrо бислоя и интеrpальных белков, которые, в свою очередь, затрarивают конформационное состояние АХЭ и приводят К увеличению ее функциональной активности. И. д. Волотовским: И соавт. (1978), С. В. Коневым и И. Д. Во- ЛОТОвским (1979) при изучении влияния CTPYKTypHoro состоя- ния липидной фазы мембран эритроцитов на эффективность фо- 150
тохимичеСRОЙ МОДИфИI{ации АХЭ, связанной с мембраной, обра ботанной фосфолипазами, а 'l'акже обедненной холестерином, cдe лано заключение о важной нефотохимической роли липидной фазы мембран в определении характера и эффективности дей- ствия УФ-света на активность фермента, Учитывая эти данные, можно констатировать, что ПФОЛ, индуцированное УФизлучением в интервале длин волн 240 390 нм, не приводит к фотодеструкции мембранной А.ХЭ, а по- средством изменения контролирующих конформацию фермента белок-белковых и белок-липидных взаимодействий способствует более эффективному протеканию каталитической реакции. На наш взrляд, интересным представляется тот фаRТ, что облучение мембран эритроцитов длинноволновым 'УФ-светом индуцирует резкое снижение каталитической активности А.ХЭ. Хромофорами УФ-света в данных условиях эксперимента являются различные (восстановленные) пиридиннуклеотиды, флавины, железопорфи- рины. Итак, инrибирование мембранноl'О фермента в указанном случае может быть обусловлено фотохимическими превращени ями вышеназванных хромофоров 'УФ-излучения. Не исключена вероятность локализации этих акцепторов УФсвета на мембра не в непосредственной близости I{ исследуемому белку. Вместе с тем учитывая то обстоя:тельство, что хромофорные 1'руппы мем- бран (порфирины, флавины, нуклеотиды) выступают в Rачестве сенсибилизаторов ПФОЛ, можно предположить, что в процессы модификации А.ХЭ вносят ВRлад преимущественно фотохимичес кие превращения указанных Rомпонентов биомембран, а таRже фотосенсибилизированное ими пероксидное окисление липидов. На рис. 33 представлены результаты исследования фермента тивной активности мембранной А.ХЭ в присутствии ROHRaHaBa- лина А из канавалии мечевидной (Concanavalia ensiformis) в Rонцентрациях 0,4 и 0,8 моль/л. Конканавалии А относится к классу лектинов, связывание которых с поверхностью плазмати ческой мембраны клеток имеет самые разнообразные последствия, например, вызывает изменение в расположении поверхностных белков и l'ликопротеинов, физическом состоянии липидов мемб ран, проницаемости их для различных веществ и активности мем- бранных ферментов (см. раздел 1.3). Rонканавалин А, избира тельно модифицируя CTPYRtyp.ho-функциональное состояние ин теrpальных мембранных белков, способен изменять и фоточув ствительность AJ{Э. 151
А,% о Рис_ 33. Ка'rалитическая актив- ность ацетилхолинэстеразы мемб- ран эритроцитов человека в при СУТСТБИИ кон:канавалина: 1 KOH троль; 2 конканавалин Б KOH центрации 0,4 моль/л, соотноше ние суспензии :мембран и KOHKa навалина 1:0,05; 3 KOHKaнaвa ЛИН Б концентрации 0,4 моль/л, со- отношение 1:0,2; {/ KOHKaнaвa ЛИН Б концентрации 0,4 моль/л, со- отношение 1:1; 5 конканавалин в концентрации 0,8 моль/л, COOT ношение 1: 1 100 80 60 40 20 2 3 4 5 Из рис. 33 видно, что обработка мембран эритроцитов YKa занным модифицирующим areHToM вызывает снижение функ- циональной активности фермента. При использовании объемных соотношений суспензии мембран иконканавалина 1:0,05 не за реrистрированы статистиqески достоверные различия величин активности мембранной АХЭ в нативном состоянии и в присут ствии лектина. С увеличением этих соотношений до 1:0,2 и 1:1 активность фермента статистически достоверно снижается по сравнению с контролем на 16 и 42 % соответственно. Примене ние конканавалина в концентрации 0,8 моль/л и соотношении суспензии мембран и экзоrенноrо модификатора 1:1 вызывает инrибирование мембранной АХЭ на 75 %. Основные структурные особенности биолоrической мембра ны и, следовательно, ее функциональная динамичность опреде ляются свойствами липидноrо бислоя, существенно влияющеrо на подвижность белковых молекул и их ассоциацию в мембране. Известно, что бензиловый спирт, взаимодействул преиму щественно с rидрофобными участками липидной фазы, увеличи вает аодвижность последней, а также изменяет подвижность ее отдельных компонентов. На рис. 34 показаны изменеНl1Я функциональной активности мембраносвлзанной АХЭ в присутствии бензиловоrо спирта. Ин кубирование суспензии мембран с этим модификатором ариво- 152
дит К снижению каталитической активности исследуемо1'О фер- мента на 1618 % по сравнению с контролем. Увеличение объе- ма добавляемоro спирта до 1 мл не вызывает усиления ero ИН1'и бирующеrо действия по отношению к активности молекул АХЭ. Таким образом, увеличение подвижности ЛИПИД:ЕОЙ фазы с по мощью бензиловоrо спирта и, тем самым, модификация БЛИж'ай- ше1'О окружения мембраносвязанной АХЭ фосфатидилсерина индуцирует снижение ее ферментативной активности. На рис. 35 пред ставлены данные, полученные при исследова- нии функциональной активности АХЭ мембран эритроцитов, УФ облученных в интервале длин волн 300400 нм в присутствии конканавалина А. УФоблучение интактных мембран эритроци- тов индуцирует снижение каталитической активности АХЭ на 50 %, обусловленное, по всей вероятности, поrлощением энер1'ИИ 'УФсвета ПИРИДИН:Еуклеотидами, флаВИRами, ЖeJrезопорфири нами, витаминами, входящими в состав мембраны. При воздей- А, % А,% 100 100 80 80 60 - 60 40 40 20 20 О 2 3 4 о 2 3 4 Рис. 34, Функциональная актив ность ацетилхолинэстера.зы мембран ЭРИТРОЦИТОВ человека, модиф- ванных 2 % -ным раствором бензи- ловом спирта: 1 контроль; 2 соотношение суспензии мембран и беНЭИJIОБоrо спирта 1:0,05; 3 со- отношение эти:х Компонентов 1:0,2; {/. соотноше:ние 1: 1 P. 35. Ферментативная актив ность ацетилхолинэстеразы мембран Эр:И'J.'роцитов челове}(а., облученных УФ-светом в области 300400 нм в присутствии }(ОНR8Н8В8лина А: 1 контроль; 2 активность УФ облученной АХэ; ,'9 активность АХЭ в присутствии }(он}(анавалина; '4 активностъ УФ-облучеmюй АХЭ в присутствии конканавалина 153
ствии УФизлучения на суспензию мембран эритроцитов в при сутствии конканавалина А функциональная активность мембра носвязанной АХЭ возрастает на 45 % по отношению к исследуе мому параметру при облучении нативных мембран. KOHKaHaBa лин А характеризуется спектром ПО1'лощения с Л Il18Х при 280 нм, что обусловлено свеТОПО1'лощением остатков ароматических ами нокислот, входящих в состав ero молекулы. Следовательно, из менение фоточувствительности мембранной PLКЭ в присутствии лектина может быть связано с влиянием на ее структурное coc тояние продуктов фотохимических превращений нуклеотидов, коферментов, железопорфиринов и витаминов, интенсивно по 1'лощающих свет в данной области спектра. На рис. 36 показаны изменения ферментативной активности АХ.Э, модифицированной воздействием УФ-излучения (зоо 400 нм) в присутствии бензилово1'О спирта. Из анализа рисунка следует, что облучение суспензии эритроцитарных мембран в при сутствии указанноrо химическо1'О areHTa индуцирует резкое воз растание каталитической активности белка: 210 % по cpaBHe нию с ее уровнем при УФоблучении интактных мембран (50 %). Наблюдаемый эффект активации мембранной АХЭ может быть связан, по всей вероятности, со структурными перестройками MO лекул ближайшеro липидноrо окружения фермента, обусловлен- ными воздействием на Hero бензиловоrо СIIирта и, прежде Bce1'o, ero фотохимических продуктов. Вследствие разрыхления липид ной фазы мембраны, модифицированной бензиловым спиртом, и увеличения подвижности ее отдельных компонентов возможно ослабление связей АХ.Э с молекулами, находящимися в Heaocpeд ственном контакте с ней, а именно фосфатидилсерина. Результа том этих процессов, по-видимому, являются конформационные превращени.я всей молекулы АХЭ и демаскирование ее активноro центра на поверхности эритроцитарной мембраны, проявляющи еся в резком возрастании функциональной активности фермента. При УФоблучении мембран в диапазоне длин волн 240 390 нм в присутствии указанных экзоrенных модификаторов Ha блюдаются противоположные по направлению изменения функ ционирования P.L[Э. На рис. 37 пред ставлены результаты исследования катали тической активности мембраносвязанной АХЭ при воздействии УФизлучения (240390 нм) на суспензию мембран эритроци тов В присутствии канканавалина А (фИТО1'емаrrлютинина). Из 154
А,% А,% 200 100 80 150 60 100 40 50 20 о о 2 3 4 Рис. .16. Каталюическал акТИБ насть ацетилхолинэстеразы мембран эрюроцитов человека, облученных 'УФсветом в области 300400 нм в присутствии 2 % Horo бензилово 1'0 спирта: 1 контроль; 2 aк ТИБность 'УФоблученной АХэ; 3 активность АХэ в присутствии бен зиловоrо спирта; 4 активность УФ-облученной АХЭ в присутствии бензиловоrо спирта 1 2 3 Рис. 37. Фующио:в:альнал aк тивность аце'l'ИЛХОЛИНЭС'l'еразы мембран эритроцитов человека, об лученных УФ-светом в области 240390 нм в присутствии кон- канавалина: 1 I-tон'l'рОЛЬ; 2 активность УФоблученной АХЭ; 3 аК'l'ИВНОСТЬ АХЭ :в присут- ствии конкана:валина; 4 актив- ность УФоблученной АХэ в при- сутствии конканавалина анализа рисунка вытекает, что УФоблучение мембран эритроци тов в e1'o присутствии индуцирует значительное снижение aK тивности этоrо фермента до 12 % (против 112 % при облучении интактных мембран). Вероятно, инrибирование мембраносвя:зан ной АХЭ в данном случае происходит за счет конформационных изменений молекул фермента, обусловленных воздействием на последние, а также на молекулы интеrpальных белков продуктов фотолиза конканавалина и приводящих, по-видимому, К стери ческому экранированию активноrо центра. Необходимо отметить, что УФоблучение буферноrо раствора (рН 7,6) конканавалинаА вызывает статистически достоверное снижение величины опти- ческой плотности в максимуме ПО1'лощения при 280 нм, связан ное либо с разрушением части хромофоров УФ-света лектина ароматических аминокислотных остатков, либо с их экранирова 155
А,% 100 80 60 40 20 О 1 Рис. 38. Фермен'rатИБНал aк тивность ацетилхолинэстеразы мембран эритроцитов человека, облученных УФ-светом в облас ти 240390 нм в присутствии 2 % -НОl'О бензиловоl'О спирта: 1 КОНТрОЛЬ; 2 акТИВНОСТЬ УФоблученной АХЭ; 3 актив НОСТЬ JLКЭ в ПРИСУТСТВИИ бензи ЛОВОl'О спирта; -1 акТИВНОСТЬ УФоблученной АХЭ в присут ствии бензиловоro СПИРТа" 2 3 4 нием на поверхности белковой rлобулы. Однако не исключена веро.я:тность и прямоrо воздействия 'УФизлучения на АХЭ. При УФоблучении (240390 нм) эритроцитарных мембран в присутствии бензиловоrо спирта обнаруживается практически полное инrибирование мембранной АХЭ (рис. 38). Повидимому, наблюдаемый эффеI{Т может быть обусловлен реализацией He скольких параллельно протекающих процессов, индуцированных воздействием УФизлучения на эритроцитарные мембраны и при- водящих к экранированию аКТИВНОl'О центра: 1) возможная интенсификация ПФОЛ вследствие увеличе ния подвижности липидной фазы мембран под влиянием бензи ловоrо спирта, образование продуктов ПФОЛ, влияющих на KOH формацию АХЭ и ее активноrо центра непосредственно или опос- рер';ованно через взаимодействие с интеrральными белками; 2) фотоrrревращения инте1'Ральных белков мембраны, поrло щающих свет в данной области спектра, в том числе и caMoro фермента (однако в незначительной степени); 3) поrлощение квантов УФ-излучения с длинами волн ззо 370 нм пирИдиннуклеотидами, флавинами, коферментами, же- лезопорфиринами; фотосенсибилизация ими процессов ПФОЛ; непосредственное влияние их фотохимических продуктов на структурное состояние АХЭ и ее активноrо центра. Таким образом, путем модификации отдельных структурных компонентов эритроцитарных мембран различными химически- 156
ми аrентами и выбора условий их УФ-облучения в завис:имОС'l'И от природы и содержания хромоФорных 1'рупп можно существен но изменять фО'fОЧУВСТБительность мембранных белков, в том: числе АХ.Э. 4.2.2. ФотОЧУ6с:nzвиnzе.JllJнос:ть ацетиJlХОJlUllЭс:теразы эритроцuтаРIiЫХ мембран в пpиcyтncтnвии фОСфО.lluпазы D U аСlCорБUltовой жиС.llоты Е rpynne естественных модиф:vща'fОРОВ, изменяющих лип:ид ный состав мембран в на'fИВНОЙ кле'fке, относятся липидперено сящие белки, фермен'l'Ы обмена фосфолипидов фосфолипазы, диметилазы и др., а также системы обмена холестерина. Всдед- ствие их деятельности осуществляются выраженное изменение содержания лизоформ отдельных липидов, накопление в бисдое жирных кислот, обладающих детерrентным деЙС'fвием, измене- ние соотношения фосфатидилхолип/фосфатидилэтав:олам:ин :и фОСфОЛИПИДЫ/ХОJIестерин. Все э'rИ факторы управляют м:икрО- вязкостью мембраны и оказывают влияние на ПОДВИЖIIОСТЬ ее компонентов, ФОСфОJIипазы обширный класс ЛИПОЛИ'l'ических фермен- тов, имеющих пер во степенное значение ДЛя реl'улирования: раз- нообразных процессов жизнедеятельности всех живых ОрI'аниз мов. Это СВ5IЗано с МНО1'ообразием их функций. Вопервых, они участвуют в обновлении мембранных фосфолипидов, что опреде- ляет стаБИJIЬНОС'l'Ь и биохимическую активность мембран и в lCO- нечном :ИТОI'е функциоюшьное состояние целой клетки. Bo:в'('o- рых, продукты фосфолипазной реакции (жирные кислоты, .лжю фосфа'l'ИДИЛХОЛИН, холин, ДИ1'лицерид, фосфОРИJIXолин и др.) ЯН-. ляются мощными эффекторами мембранных процессов. Втре'l'Ь их, фосфолипазам принадлежит :ключевая роль в биосинтезе про- С'l'а1'ландинов, леЙКО'l'риенов и друrих продуктов превращенИЯ араХИДОНОБОЙ кислоты. Так, реющию 1'идролиза фосфолипидов, приводящую к образованию свободной арахидоновой кислоты, I{атализирует фосфолипаза А 2 . Эта реакция является лимитиру- ющей стадией в "каскаде" ферментативных реакций биосинтеза фИЗИОЛО1'ически активных эйкозаноидов. Вместе с тем всестороннее изучение с'rруктурно-функциональ- ных свойств фосфолипаз имеет важное не толы{О теоретическое, но и пра:ктическое значение для медицины и фармаколо1'ИИ. Мао- rие паТОЛО1'ические процессы, в том числе ишемия и воспаление, 157
сопровождаются увеличением активности внутриклеточных фос- фолипаз. Предполаrают, что продукты метаболизма арахидоно- вой кислоты участвуют в защитной реакции ОР1'анизма при об- лучении, а также комбинированном радиационно-термическом поражении e1'O отдельных систем. Фосфолипазы (фосфатидацилrидролазы, ЕФ 3.1) фермен- ты, катализирующие rидролитическое расщепление сложноэфир- ных связей в различных фосфолипидах. Фосфолипазы А[, А2' В, С, D различают в зависимости от Toro, какая из четырех эфир ных связей, имеющихся в молекулах фосфатидов, rидролизуется ферментом. Существует также цифровая номенклатура фосфо липаз соответственно положению расщепляемой сложноэфирной связи: 1,2,3,4 (рис. 39). Фосфолипазы различноrо происхождения способны также катализировать реакции ферментативноrо трансалкилирования (фосфолипаза D) и трансацилирования (ДРУ1'ие фосфолипазы). Липолитические ферменты 1'ИдРолизуют водонерастворимые субстраты, следовательно, они должны функционировать на rpa- нице раздела фаз. Обычно их молекулы состоят из трех участ ков: rидрофобноrо, который создает необходимую ориентацию фермента на поверхности субстрата, и активноrо центра, находя- А 1 (1) О 1I О H2CRI 11 I R2 C ! OC I H О СН З 11 I А 2 (2) СН2......().......Р"""О......с;Н2СН2N......с;Нз (Х) /,)fl, I С(З) ОН 0(4) СН З О О H2COH 11 11 I H2C----OCR2 RO......c;H О I /'" I 11 HOCH О / H2cOPOx I 11 в I H2cOPOx О I O Рис. 39_ Схема действия и номенклатура фосфолипзз 158
щеrося вблизи rоловки, но не идентично1'О ей, и l'идрофильноrо хвоста, стабилизирующеl'О ориентацию белковых молекул. По анало1'ИИ с ДРУ1'ими rидролитическими ферментами для фос фолипаз предполarаroт наличие различных типов активных цeHT ров: сеРИН1'истидиновоrо, карбоксилкарбоксилатноrо, Zll21 карбо ксилатноrо, цистеин1'ИСТИДИНОВОro. Именно с участием этих rрупп происходит осуществление каталитическо1'О акта 1'идролитически ми ферментами. Фосфолипаза D (фосфатидилхолин-фосфатидатrидролаза, фос фолипаза 4) 1'идролизует эфирную связь между фосфатной rpуп- пой и rидрофильным спиртом в фОСфО1'лицеридах и соответству- ющую связь в сфинrомиелинах. Фермент был впервые обнаружен в корнеплоде моркови и листьях шпината, он содержится таК.же и в ДРУ1'их растениях: свекле, брюссельской и савойской Iапусте. Субстра1'ами фосфолипазы D являются фосфолипиды и их лизо- производные. Ле1'КОСТЬ rидролиза уменьшается в ПОСJIедователь ности: фосфатидилrлицерин, лизофосфатидилхолин, дифос фаТИДилrлицерин. Ферментативные процессы с участием paCТBO римых фосфолипаз и нерастворимых субстратов протекают на 1'ра- нице раздела фаз: лип ид вода. Эти процессы предпола1'ают пер- воначально реакцию иммобилизации водорастворимоrо фермента на поверхности субстрата. Поэтому фосфолипаза D может исполь- зова'lЪСЯ в качестве модели для исследования reTeporeHHoro фер- ментативноrо катализа и изучения примем6ранных ферментов. А,% 120 100 Рис. 40. Фермента'rивная актив" ность ацетилхолинэс'rеразы ЭрI1'I'РО" ци'rарных мембран, модифициро- ванных фОСфОЛШIaЗОЙ D, после УФ. облучения Б дозе 1,5 :кДж/м 2 : 1 контроль (НWI'ИВНЫЙ фермент); 2 УФ-облучение; 3 моДификация фосqюлиnазоЙ D; 4 УФ-облуче- ние модифицированных фосфоли- пазоЙ D мембран 80 60 40 20 о ;2 з 4 159
На рис. 40 показаны УФ-индуцированные изменения функ- циональной ативности АХЭ мембран эритроцитов, модифици рованных фосфолипазой D, в интактном состоянии и после УФ облучения в дозе 1,5 кДж/м 2 . Предварительная обработка эрит роцитарных мембран раствором фосфолипазы D в концентра- ции 106 молъ/л (рН 5,6; 0,03 моль/л CaCl) с последующим yдa лением модифицирующеrо .a1'eHTa путем центриФУ1'ирования практически не влияет на величину каталитической активности мембранной АХэ: уровень изучаемоrо параметра 105 % по отношению к таковому для нативных мембран (100 %). Однако УФоблучение эритроцитарных мембран, обработанных фосфо- липазой D, индуцирует резое снижение функциональной актив нос'rи АХЭ дО 8 %. Следовательно, воздейс'rвие УФсвета на мем- браносвязанный фермент после модификации липидной фазы MeM бран вызывает ero инактивацию, т. е. выявляется эффект, проти- воположный наблюдаемым изменениям (активация) исследуе- Moro параметра при облучении интактных мембран. Таким об- разом, в случае химической модификации липидноrо компонен- та мембраны путем 1'идролиза фосфоrлицеридов и сфинrомиели на как на внешней, так и на внутренней поверхности мембраны фоточувствительность эритроцитарной АХЭ существенно изме- няется. Аналоrичные результаты были получены и при исследова- нии функциональной активности АХЭ мембран эритроцитов, мо- дифици:рованных фосфолипазой, в нативном состоянии и rюсле УФоблучения в дозе 3,0 кДж/м 2 (рис. 41). Воздействие УФиз- лучения в дозе 3,0 IДж/м2 на эритроцитарные мембраны, обра ботанные фосфолипазой D, приводит к практически полному ин- rибировавию фермента. Следовательно, и в этом случае модифи- ация липидной фазы мембран вызывает инактивацию АХЭ эффект, противоположный изменениям активности белка, реrи- стрируемым при облучении интактных мембран. На рис. 42 показаны изменения ферментативной активности мембраносвязанной JLКЭ после обработки мембран фосфолипа- зой D и воздействия УФ-света в дозе 4,5 кДж/м 2 . Видно, что В результате УФоблучения модифицированных мембран фоточув- ствителъность фермента изменяется незначительно. Активность АХЭ в интактных мембранах после облучения снижается на 44 %, а в обработанных фосфолипазой на 52 % по отношению к контрольному образцу. 160
А,% А,% 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 20 О 2 3 4 О 2 3 4 Рис. 41. КаталИ'l'ичес:кая а:ктив ность ацетилхолинэстеразы ЭРИ'l' роцитарных мембран, модифициро- ванных фосфолипазой D, после УФ- облучения в дозе 3,0 кДж/м 2 : 1 контроль (нэ.'l'ивный фермент); 2 УФоблучение; 3 модификаци.я: фосфолидазой D; 4 УФ-облуче- ние модифицированных фосфоли- дазой D мембран Рис. 43. ФОТОЧУВС'l'витель- насть ацетилхолинэстерэ.зы ИН'l'актных и модифицирован- ных фОСфОJIида:юй D ЭРИ'l'РО- цитарных мембран: 1 ин- TaK'l'HbIe мембраны; 2 мо- дифицированные мембраны 11. 3аказ 3788 Рис. 42, Функциональная ilКТИВ- ность ацетилхолИ1tэС'rеразЫ 9РИ'1'f)О цитарных. мембран, модифицирован- ных фОСфОЛИl1азо:й D, после УФоб- лучения в дозе 4,5 кДж/м 2 : 1 :контроль (наТИВIiЫЙ фермент); 2 УФ-облучение; 3 модифиющил фосфолипазой D; 4 УФ-облуче- ние модифици:рованных фосфолипа- зой D мембран А,% 20 1,5 3 4,5 КДЖ/М" lбl
На рис. 43 представлены данные, характеризующие зависи м()сть функциональных свойств мембранной АХ.Э от дозы облу чения для интактных и обработанных фосфолипазой D эритро цитарных мембран. Полученные результа'rы свидетельствуют о том, что Фчувствительность мембраносвязанной ацетилхолин эстер азы существенным образом зависит от CTPY!<TypHoro COCTO яния фосфолипидных компонентов биомембраны. Фосфолипаза D катализирует отщепление I'идрофильноrо спирта от фОСфО1'лицеридов и сфинrомиелинов. В результате отщеплен ия полярных rоловок от молекул фосфолипидов MO 1'ут нарушаться электростатические взаимодействия фермента с молекулами окружающих ero фосфолипидов, в частности, кис лоrо липида фосфатидилсерина, являюще1'ОСЯ, повидимому, аннулярным липидом для ацетилхолинэстеразы. Фосфатидил серин, а также фосфатидилэтаноламин локализованы преиму щественно во внутренней половине ЛИПИДНОI'О бислоя. Можно предположить, что 1'идролиз фосфолипидов И фосфатидилсери на не вызывает конформационных изменений молекул фермен: та, затраI'ивающих ero активный центр, поэтому активность АХЭ при обработке мембран фосфолипазой практически не изменя- ется. Необходимо отметить, что обработка мембран фосфолипа зой индуцирует изменения упаковки и подвижности фосфоли пидов, вязкости И асимметрии липидной фазы, белок-липидных взаимодействий. Воздействие УФизлучения на модифицирован ные мембраны приводит к нарушениям в фунr-щионировании мембраносвязанной АХ.Э, отличающимся по направленности от таковых при облучении интактных мембран. Эти нарушения являются результатом изменения конформационво1'О состояния продуктов rидролиза фосфолипидов в мембране при воздействии Фсвета. Е. А. Лапшина, И. Б. 3аводник (1995) установили, что взаи модействие свободных жирных кислот (пальмитиновой, лаури новой, каприловой) и их производных С эритроцитарной мембра ной вызывает ИН1'ибирование АХ.Э целыlхx эритроцитов и изо лированныx эритроцитарных мембран. Авторы считают, что воз действие жирных кислот и их ПРОИЗВОДных на мембрану приво дит к изменению белодлипидных контактов, возмущению Ha ТИВНО1'о липидно1'О окружения фермента, нарушению максималь ной комплементарности между rидрофобной поверхностью мем- бранных белков и их липидным окружением. Обработка эритро 162
цитов малоновым диальдеrидом, способным модифицировать амино и сульфrидрильные rруппы белков, образуя ряд стабиль- ных инестабильных аддуктов, внутри и межбелковые сшивки, приводила к инrибированию активности АХЭ по бесконкурент ному механизму. Таким образом, выявляется различная УФ-чувствительность АХЭ интактных и модифицированных фосфолипазой D эритро цитарных мембран, обусловленная нарушением нативной KOH формации фермента вследствие воздействия на He1'o фотохими- ческих продуктов rидролиза фосфолипидов. Большой интерес в настоящее время представляют вопросы, касающиеся BcecTopoHHe1'o изучения процессов фото модификации отдельных компонентов биомембран в присутствии химических соединений с различным механизмом действия, способных ини- циировать, усиливать или ослаблять фотохимичеCI{ие реакцИИ. Од- ним из факторов системы низкомолекулярных ре1'УЛЯТОроВ, вы- полняющих роль инициаторов, катализаторов, ИН1'ибиторов и влияющих на стадию инициирования, разветвления и обрыва цепи свободнорадикальных реакций, лвляются низкомолекулярrrые ком- поненты антиоксидан'fНОЙ системы (ем. раздел 3.3). Содержание аскорбиновой кислоты, обладающей чрезвычайно широким спектром антиоксидантных свойств, составляет в плаз- ме крови 50200 мкмоль/л. Вместе с тем известно, что низкомо лекулярные антиоксиданты способны проявля').'ь свои защитные А,"/о 200 150 100 Рис, 44. ФермеН'l'ативна,я акТИВ- ность ацетилхолинэстеразы ЭРИТРОЦИ- тарных мембран В ПРИСУТСТБИИ аскор- 50 биновой кислоты В различ:ных KOH центрациях (моль/л): 1 :контрою> (на'l'ИБнъrе мембраны); 2 0,5'10..:1; 3 10-4; 4 10-5; 5 10-6; 6 10- R 11* о 2 3 4 5 6 163
функции в широком интервале концентраций: от 102 до 10!8 моль/л. На рис. 44 локазаны изменения функциональной актив ности АХЭ эритроцитарных мембран в присутствии аскорбата в различных концентрациях. Из анализа данных, представленных на этом рисунке, следует, что добавление к суспензии эритроци- тарных мембран аскорбиновой кислоты в концентрациях O,5'103, 10\ lO5, 106 моль/л индуцирует статистически достоверное сни жение уровня каталитической активности АХЭ. Использование экзоrенноrо areHTa в минимальной концентрации (108 моль/л) приводит к активации фермента на 93 % по отношению к KOHT рольному образцу (100 %). Витамины А,С, D и F, при окислении и аУ'l'Oокис.лении кото- рых образуются промежуточные радикальные формы (например, пероксид водорода), Mo1'YT выполнять роль инициаторов окисле ния и ускорять ПОЛ, увеличивая скорость зарождения цепей в мембранах. Кроме тоro, в присутствии ионов железа и меди, со- держащихся в эритроцитарной мембране, аскорбиновая кислота становится мощным прооксидантом, что указывае'l' на необходи мость iil vivo надежной секвестрации свободных ионов металлов переменной валентности. Проявление аскорбатом анти и про- оксидантных свойств зависит также от концентрации субстра'rа и условий протекания ОКИСЛИ'1'ельных реакций. Следовательно, в интервале используемых концентраций О,5'1О310--в моль/л аскорбиновая кислота проявляет проокси- дантные свойства, что находит отражение в снижении функцио нальной активности мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы. Про- межуточные радикальные формы, образующиеся при окислении аскорбата, усиливают и ускоряют ПОЛ, в результате котороro на- капливаются пероксидные продукты. Ацетилхолинэстераза при- надлежит к числу ферментов мембран, леrко инактивируемых при пероксидном окислении ненасыщенных жирных кислот. Наибо- лее важные изменения в белковых молекулах, вьшываемые окис- ленными липидами, заключаются в образовании комплекса окис ленный липид белок, ассоциации белковых молекул и разруше- нии аминокислот, в частности, содержащих 8H-r'РУППЫ. На рис. 45 представлены данные, полученные при исследова- нии уровня функциональной активности АХЭ эритроцитарных мембран, УФоблученных в дозе 4,5 кДж/м 2 в присутствии ас- корбиновой кислоты. УФоблучение интактных мембран вызы вает снижение активности фермента на 44 %. COBMec'rHoe дей- 164
А,% А,% 100 100- 75 75 50 50 ,.............. 25 25 о о 2 3 А,% а А,% 2 б 3 100 300 75 200 50 25 100 о 2 3 о 2 3 8 r Рис. 45. Изменения каталитической активности мембраносвлзан- ной аце'rИЛХОJ1ИНЭС'l'еразы, УФ-облученной в присутствии аскорбата: 1 контроль (нативные мембраны); 2 в присутствии ас кор ба та; 3 УФоб лучение в ПРИСY'l'ствии аскорбаоrа. Концентрация аскорбата, моль/л: а 10-4; б 10б; в 106; z 108 ствие УФ.излучения и аскорбата в концентрациях 10\ lОб, lO6 моль/л индуцирует полное ИН1'ибирование мембранной АХЭ. УФ-облyrlение мембран эритроцитов в комплексе с моДифициру ющим a1'eHTOM (10-8 моль/л) приводит к резкому повышению функциональной активности белковой молекулы. При изучении ПОЛ в мембранах митохондрий и микросом было установлено, что существенное усиление накопления перок- 165
сидных продуктов может быть вызвано добавлением солей ДBYX валентноrо железа, аскорбиновой кислоты и соединений, coдep жащих СУЛЬф1'идрильные rруппы, например, цисте ина или rлу татиона. В 1959 1'. Оттолен1'И обнаружил, что накопление перок сидов связано с наличием в изучаемой среде двухвалентноrо железа. Он предположил, что ионы Fe 2 + оказывают каталитичес кое действие на образование пероксидов. При этом Fe 2 + окисля ется до Fe3+, а функция аскорбиновой кислоты заключается в реrенерации ионов за счет обратно1'О восстановления Fea+ до Fe 2 +. Ведущую роль ионов Fe 2 + в процессе ПОЛ в биомембранах опре- деляет совокупность следующих реакций: ROOH + Fe 2 + ---7 RO' + OH + Fe 3 +, Fe 2 + + 02 + Н+ ---7 Fe 3 + + НО;, Fe 2 + + RO; ---7 Молекулярные продукты, Fe 2 + + R' ---7 Молекулярные продукты. Следует подчеркнуть, что скорость ПОЛ определяется COOT ношением Iшнцентраций ионов Fe 2 +, 1'идропероксидов, свобод ных радикалов R0 2 '. Ионы железа И1'рают одновременно функ цию про И антиоксидантов. Их антиокислитель ное действие IIpоявляется только при достаточно высоких концентрациях Fe 2 + (>lОБlО4 моль/л), По всей вероятности, инrибирование мембраносвязанной АХЭ при ее УФоблучении в присутствии аскорбата (104106 моль/л) представляет собой результат параллельноrо протекания перок сидноrо фотоокисления ненасыщенных жирных кислот фосфоли пидов И аскорбатзависимоrо ПОЛ с участием ионов Fe 2 +. Причем эти процессы взаимоусилива.ют друр друра. Антиоксидантный и активирующий эффекты аскорбата по отношению к уровню фун кциональной активности мембраносвязанной АХЭ зареrистриро ваны только в присутствии ЭКЗО1'енноrо a1'eHTa в концентрации lO8 моль/л. В данном случае реализуются процессы обезврежи вания аскорбиновой кислотой активных форм кислорода (супе роксидно1'О анионрадикала, синrлетно1'О кислорода, rидроперок сидноro радикала, rидрокси:льноrо радикала, пероксидных ради калов липидов), восстановления атокоферильноrо радикала. Изучение фоточувствительности мембраносвязанной АХЭ в присутствии химических арентов, модифицирующих липидную фазу мембраны, позволяет расширить современные представле ния о молекулярных механизмах реrулирования активности важ нейших компонентов биомембран. На основании собственных эк 166
Мембрана АХЭ Интеrральные белки Липиды Серосодержащие и ароматические аминокислотные остатки hv (240З90 HM Ароматические серОСОДерЖаЩие НЖК липидов аминокислотные остатки Фотоионизация ароматических аминокислотных остатков, фотолиз Ss и СSсвязей Накопление пер вичных и вторич- ных продуктов ПОЛ Изменение CTPYKTypHoro состояния липидов Нарушение белокли пидных взаимодей- ствий hv (240З90 нм) Пиридиннуклеотиды, железопорфи ри ны, флавины Возбужденные состояния Образование 102 или раДИКаль ных интермедиатов Окисление аминокислотных остатков мембран- ных белков, в том числе /J.Y..Э Образование белковых сшивок Изменение конформации АХЭ и ее активноrо центра Изменение функциональных своЙств АХЭ (активация или ИНактивация) Рис. 46. Схема процеССОБ, ПрИБОДЯЩИ:Х 1< фОТОМОДИфИЕации мемб. ранной ацетилхолинэстеразы 167
спериментальных и литературных данных предложена схема про- цессов, приводящих к фотомодификации мембранной АХЭ, учи тывающая вклад УФпревращений caMo1'o фермента, а также OT дельных структурных компонентов мембран (рис. 46). Кроме TOro, Изменение состава фосфолипидов мембраны, микровязкости и текучести липидной фазы Изменение интенсивности ПФО вследствие влияния на ско- рость инициирования и продол жения цепи окисления липидов -t Накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ Нарушение белоклипидных вза имодействий Прооксидантное Де йстви е -t Влияние на стадию инициирования, разветвления и обрыва цепи ПОЛ Ан тиоксидантное действие -t Взаимодействие с АФК: О;, НО;;, Н 2 О 2 , ОН', 102' RO;, RO' Аскорбат Предотвращение (полное) фотолиза или снижение cтe пени фотолиза мембранных анти- оксидантов Изменение конформации АХЭ и ее активноrо центра Изменение УФчувствительности мембраносвязанной АХЭ Рис. 47. МОДУЛЯЦИЯ фоточувствителъности мембраносвязанной аце- тилхолинэстеразы разработана схема модуляции фоточувствительности ацетилхо- линэстеразы путем модификации CTPYKTYPHo1'o состояния липид ной фазы эритроцитарной мембраны в присутствии фосфолипа- зы D и аскорбиновой кислоты (рис. 47). Выявлены важная роль микроокружения в процессах фую, ционирования АХЭ и возможность целенаправленноrо реrули рования степени ее УФ-чувствительности путем введения в изу чаемую систему ЭКЗО1'енных areHToB, модифицирующих конфор- 168
мацию ближайших "соседей" фермента в биомембране. Исследо вания подобноrо рода полезны при обсуждении вопросов, касаю- щихся выяснения механизмов влияния УФизлучепия на струк- турнофункциональное состояние эритроцитарных мембран в HOp ме и в присутствии ряда химических соединений. Они расширя: ют современные представления об особенностях фотохимических превращений белковферментов в составе мембран клеток и МО- ryт быть использованы для разработки новых физико-химичес- ких подходов к мембранному скрининrу разнообразных по своей природе и механизмам действия химических соединений, а так- же к выявлению структурных нарушений компонентов мембран, обусловленных действием указанных внешних факторов. 4.2.3. УФUltfjуцирО8аltltые иЗ.JItен.еltUJl фуюсциОJtальных свойств .lItе.м.ffраносв.я.:ШJtlюй Na+, B:+-АТФазы 8 присутствии фОСфОJlипазы D На рис. 48 представлены данные по исследованию фоточув ствительности мембря.носвязанной N а+, Е+ -АТФазы при возде]}'r ствии УФизлучения (240390 нм) в дозах 1,5 и 3,0 кДж/м 2 на интактные мембраны эритроцитов человека. Из анализа рисун ка следует, что при облучении мембран происходит статистичес ки достоверное снижение уровня каталитичес:кой активности ис следуемоrо фермента. А,% Рис. 48. УФ-индуциро- ванные изменения функци- ональной аКтивнос'rи Na+, K+-АТФазы ЭрИТрОЦИ'l'арных мембран, модифицирован- ных фосфолипазой D: 1 УФ-облучение интактных мембран; 2 УФ-облучение модифицированных фосфо липазой мембран о 1,5 3,0 кДж/м2 169
В состав активноro центра Na+, К+АТФазы входят BЫCOKO реакционноспособные остатки тирозина и цистина, ПОl'лощение "УФСJ3ета которыми оБУСЛОJ3Jшвает процесс фотомодификации фермента. Воздействие длинноволновоrо "УФсвета в интервале длин волн 320390 нм (л'mnx == 365 нм) в течение 30 мин приводит К полному инrибированию ферментативной активности N а +, К+ АТФазы. Xpo мофорами УФсвета в этом диапазоне длин волн являются различ ные (восстановленные) пиридиннуклеотиды, флавины, железопор фирины. Таким образом, инактивация мембраносвязанноrо фер мента в данном случае может быть обусловлена фотохимическими превращениями вышеназванных хромофоров. Не исключена веро- ятность локализации этих акцепторов УФизлуч:ения на мембране в нецосредственной близости к исследуемому белку. Вместе с тем, учитывая то обстоятельство, что хромофорные rруппы мембран (порфирины, флавины, нуклеотиды) выступают в качестве сенсиби лизаторов пероксидноro окисления липидов, можно предположить, что в процесс модификации Na!, К+АТФазы вносят вклад преиму- щественно вышеуказанные компоненты эритроцитарных мембран, а ты,же фотосенсибилизированное ими пероксидное окисление ли пидов. При УФоблучении выделенных микросом МОЗ1'а крыс обна- руживается корреляция между снижением а:ктивности N а +, R+АТФазы и пероксидным окислением липидов, оцениваемым по содержанию полине насыщенных жирных кислот и накоплению малоново1'О диальде1'ида (J. Jamme et а1., 1995). Подавление актив ности Na+, К+АТФазы при облучении микросом УФсветом сни жалось тушителем свободных ради:калов тиомочевиной и не из менялось в присутствии "защитника" тиолов дитиотреитола. Aв торы считают, что эффект ПОЛ опосредуетс.я нарушением целост ности мембран, а не структурными изменениями саморо фермента. В 1967 р. Liberman показал, что УФ-излучение (255285 нм) ИН1'ибирует Na+, К+АТФазную активность нервных волокон кра- ба. Видимый свет инrибировал Na+, К+АТФазу различных типов клеток, сенсибилизируемых метиленовым синим, бенrальским розовым или протопорфирином, блаrодаря фотодинамическому эффекту. Однако чувствительность Na " , КI'АТФазы к видимому свету в отсутствие экзоrенных фотосенсибилизаторов не показа на. Воздействие излучения арроноворо лазера (488 нм, 0,1 Вт/см 2 ) индуцировало ИН1'ибирование Na+, R+.АТФазы из мозrа крыс дo зозависимым образом. 170
в состав a (более 1'идрофобна) И Всубъединиц молеlСУЛ этоro белка входят некоторые фОСфОЛИПИДЫ, среди которых преобла- дают фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, СфИНl'омиелип. Вероятно, модификация ЛИПИДНОl'О бислоя при облучении мемб- ран затраrивает конформационное состояние не только поrра- ничных (аннулярных) липидов АТФазы, но и непосредственно фосфолипидных компонентов ее а-субъединицы, что ПрИБОДИТ К изменению структуры активноЮ центра фермента и нарушению ero функциональных свойств. При изучении УФиндуцированных изменений ферментатив ной активности Na+, К+АТФазы ЭРИ'l'РОЦИ'l'арных мембран, мо- дифицированных фосфолипазой D, было установлено, что пред- варительная обработка мембран фосфолипазой (lOE! моль/л, рН 5,6; 0,3 моль/л CaC1 2 ) приводит к увеличению уровня это1'О параметра на 33 % по сравнению с контрольным образцом (100 %). Фосфолипаза D, как уже отмечалось, катализирует 0'1'- щепление rидрофильно1'О спирта от фОСфО1'лицеридов и сфинro миелинов. В результа'l'е О'l'щеIlJlения полярных 1'оловок от моле кул фосфолипидов Mo1'YT нарушаться электростатичесн:ие взаи модействия мембраносвязанных ферментов с молекулами окру- жающих их фосфолипидов. А. Johannsson et al. (1981) показали, что увеличение или уменьшение толщины липидноrо бислоя может влиять на активность Na+, КАТФазы за счет перемеще ния полярных 1'оловок фосфолипидов, обращенных к фермент ному белку. Повидимому, rидролиз фосфолипидов мембраны, в том числе и аннулярных для Na+, К-А'l'Фазы, вызывает конфор мационные изменения молекул фермента, затрarивающие e1'o активный центр, что находит отражение в увеличении уровня ан:тивности исследуемоrо белка. На рис. 48 показаны УФ-индуцированные изменения функ циональной активности Na+, К+АТФазы эритроцитарных MeM бран, обработанных фосфолипазой D. После модификации фос- фолипидов мембраны фото чувствительность связанноrо фермен- та существенно изменяется. Воздействие УФсвета. на обрабо- танные фосфолипазой мембраны приводит к нарушениям в фун кционировании Na+, K+'-АТФазы, отличающимся по направлен ности от 'l'aKOBbIx при облучении ИНТaIСТНЫХ мембран, т. е. про- исходит фотоактивация модифицированноrо фермента. Следо вательно, обработка липидной фазы фосфолипазой нивелирует протекание процессов, обусловливающих фотоинактивацию N а+, 171
К+ АТФазы в Фоблученных интактных мембранах, и повы ПIает фотостабильность фермента. Изменения в функционировании мембраносвязанной Na+, К+АТФазы в "УФоблученных мембранах, предварительно моди фицированных фосфолипазой D, являются, повидимому, резуль татом изменения конформационно1'О состояния аннулярных ли пидов, нарушения белоклипидных взаимодействий, OTBeTCTBeH H:ыx за проявление каталитической активности фермента. Обобщая результаты вышеописанных исследований по изу- чению УФиндуцированных изменений функциональной актив ности Na+, КtАТФазы и АХЭ эритроцитарных мембран, обрабо танных фОСфоЛИIIазой D, можно заключить, что в присутствии последней проявляется различная фоточувствительность этих фер ментов, обусловленная нарушениями их нативной конформации вследствие модификации бело:клипидных взаимодействий, а TaK же влияния фотохимических продуктов молекул мембранных фосфолипидов. Такие различия в "ответной реакции" двух мембранных бел ков на воздействие физикохимических факторов (-УФизлуче ние, действие фосфолипаз) связаны с различиями в их локализа ции на мембране, в расположении их а:ктивн:ыx центров, в xapaK тере взаимодействия с "ближайшими" липидными молекулами и их химическим строением. Однако экспериментальные дaH ные, касающиеся возможности модуляции фоточувствительнос ти мембранных ферментов, Na+, К+АrrФазы и ацетилхолинэс термы, возможно, взаимореryлируемых субстратами их реакций, свидетельствуют в пользу представлений об общности основных реrуляторных механизмов функционирования для мноrих BeK торных ферментов биоме:м:бран. 4.3. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЛАКТАТДЕrИДРОI'ЕВА3Ы В IЮМПЛЕКСЕ С ЭРИТРОЦИТАРНЫМИ МЕМБР АВАМИ И их IЮМПОНЕВТАМИ В ИНТАкmом СОСТОЯНИИ И ПОСЛЕ УФ.ОБЛУЧЕНИЯ в настоящее время считается общепризнанным, что "классическое" исследование ферментов in vitr'o без учета их вза имодействия с различными суб:клеточными структурами не MO жет дать aдeEBaTHoro представления о закономерностях и Mexa низмах их функционирования в составе целой :клетки. Поэтому 172
широко обсуждаются вопросы, связанные с локализациеЙ 1'ЛИI(О литических ферментов в клетке (см. раздел 2.3.2) и, в чаС'l'БОСТИ:, лактатде1'ИДРО1'еназы, L.лактатдеrИДРО1'еназа (Lлыи'а'r:N AD+ -оксидореДУl<таз а, КФ 1.1.1.27) 1'ликолитический фермент, относящийся к I,Jlac су оксидоредуктаз. Он катализирует обратимое оки:сленин Lлактата до пирувата с использованием в качестве кофермен та NAD+. Лактатдеrидроrеназа (ЛДr) принадлежи'l' к наиболее ИН'I'е:н сивно изучаемым белкам, тю, как она является ключевыМ фер ментом, функционирующим на «развилке» пу'rей аэробноI'О и анаэробноro превращения уrлеводов в тканях. Молекула лдr представляет собой Te'rpaMep, состоящий из субъединиц двух типов Н и М (от анrл. heart сердце и muscle мышца). Молекулярные массы Te'l'paMepa и !:\аждой субъединицы составляют 140 и 35 кДа соответственно, РЕ:!комби нация двух типов субъединиц дает различные изоформ:ы фщ) мента: rOMOTeTpaMepbl Н! и М4 И 1'ибридные Te'l'paMepbl (re'repo тетрамеры) НзМ, Н 2 М 2 и: НМ з . Это количество изоферментов обус ловлено наличием двух rенетических локусов, которые кодиру ют синтез субъединиц М и Н . Субъединица М синтезируе'rся 1'лавным образом в т'КаН:>1:Х с анаэробным метаболизмом, в то время как субъединица Н присY'I' ствует в тканях с преобладанием аэробных процессов. В цитозоле rерминативных клеток, в частности в сперматозоидах, ПРИСУТС'l'ву ет лдr.х, составляющая 80 % активности лдr. Показано, '1'1'0 лдrх также является тетрамером и состоит из субъединиц ЛДI'Х, которые по аминокислотному составу отличаются от Н и М. Изоферментам лдr при:сущи разные lшнетические xapaKT(O! ристики, величины рН, при которых они проявляют маН.сим:аЛ:F)" ную активнос'l'Ь, сродс'rво 1, субстра'l'ам и I<офакторам. Для опре деления относи'rельноrо содержания изоферментов ИСПОЛЬЗУЮТ ряд физикохимических методов: электрофорез, ионообменную хроматоrрафию, различия в кинетичеСIШХ пара.метрах отдель ных изоферментов, дифференцированную чувствительцос'l'Ь 'к су б.. стратам и ИН1'ибиторам, иммунохимические методы. lIолипеп'rидная цепь обеих субъединиц содержит 330 ам:ино кислотных остатков; различия в их последовательности в еубr:Е)е диницах обнаружены на протяжеции более чем 25 % длины по. липептидной цепи. 17:-1
в субъединицах фермента выделяют два домена: каталити ческий и центр связывания кофер:м:ента. Аминокислоты, образу lOщие NAD+связывающий домен, расположены в середине моле кулы лдr. Структура названно1'О домена состоит из шести склад чатых слоев (AF), соединенных между собой о:спиралями. Лактатде1'ИДРО1'еназа связывает лактат или пируват только в присутствии кофермента, причем первым связывается кофер мент. NAD+ (NADH) находятся в 1'идрофобной полости В ИЗО1'ну Той конформации молекулы лдr. в каталитичесн:ом центре лдr находятся полярные 1'руппы, участвующие в связывании кофермента и субстратов и катализе: остатки Arg 109, Arg 171, Arg 101, Glu 102, Asn 140, а также существенный остаток His 195, способный И1'рать роль ДOHopa акцептора Ht в ходе реакции. Кроме To1'o, для проявления активности фермента необходима сульфrидрильная rруппа, одна на субъединицу. Оптимум рН для реакции восстановления пирувата в лак тат 6,57,5, а для обратной реакции 8,59,O. ИН1'ибируют фермент высокие концентрации NAD, фторпируват (необрати мо), о:меркаптокислоты (конкурентно по отношению клактату), СУЛЬф1'идрильные peareHTbI. В последнем случае инrибирование предотвращается коферментом и снимается цистином и 1'лута тионом. Получены сведения о взаимодействии лдr со структурными белками мышц и миофибриллами, субклеточными частицами, искусственными подложками, :м:икросомами и мембранами cap коплазматическоrо ретикулума. Установлено, что взаимодействие лдr с Fактином и натив ным тонким филаментом приводит к уменьшению каталити ческой активности фермента. При связывании с Fактином про исходит увеличение значения константы Михаэлиса дЛЯ NADH и уменьшение максимальной скорости реакции. Для свободной и связанной форм ЛДr выполняется уравнение Михаэлиса MeH тен. Предпола1'ают, что обратимое взаимодействие изофермента М4 лдr с Fактином является специфическим и обусловлено об разованием белокбелковоrо комплекса. ИсследоваIiие кинетических параметров лдr в растворе и в суспензии 1'OMoreHaTa субклеточных частиц скелетных мышц цыпленка позволило выявить, что изофермент лдr Н4 не связы вается субклеточными чаС'l'ИЦaIVIИ, ЛДr М 2 полностью и лдr Н 2 М 2 174
частично находя'l'СЯ в связанном состоянии. Связывание изо фермен'rов М4 и Н 2 М 2 приводит К значительному снижению Be личины максимальной скорости реакции, а также KOHc'raHTbI Ми хаэлиса для пирувата. При взаимодействии ЛДr с митохондриальной фраlщией и митохондриальным ИН1'ибитором из скелетных мышц кролика отмечено снижение активности фермента. Причем зависимость скорости реакции от концентрации субстра'l'ОВ для связанной ЛДr была не1'иперболическоЙ, а зависимость 1/у от 1/[пируват]1/2 или 1/[NADH]3/2 была линейной. Описано связывание лдr М4 с ИСКУСС'l'венными подложками, карбоксиметилцеллюлозой и декстрансульфа'rом. Взаимодействие лдr из мышц свиньи с декстрансульфатом приводит к появле- нию положительной кооперативности по концентрации NADH, не характерной для фермента в растворе. В. И. Лущак (1991) изучил физикохимические своЙства лдr, свяэанной с микросомальными мембранами из белых мышц ши- повато1'О ската. Исследование l{ине'l'ических хараК'l'еристик для мембраносвязанноrо и изолированно1'О ферментов показало, что константа Михаэлиса для данных форм (состояний) ЛДr прак- тически одинакова. В то же время данный показатель дЛЯ NADH у связанноrо фермента в 4 раза ниже, чем у изолированноrо. Цитозольная форма лдr из белых мышц шиповато1'О ската ин rибируется наполовину при н:онцентрации пируната 14 ммоль/л, а связанная проявляет в этих условиях полную активность. Свя занная ЛДI' обладает более высокой стабильностью, чем свобод ная: перевод фермента в раствор в 2,53,0 раза ускоряет про цесс e1'o инактивации трипсином. 'l'акие факторы, как рН, ион- ная сила, субстраты и коферменты, влияют на процесс экстрак ции лдr из микросом. При щелочных значениях рН удается солюбилизировать 48 (% активности фермента, но не менее 20 % лдr остается в мембраносвязанном виде. Степень экстра1'ируе- мости фермента из микросом возрас'rает по мере увеличения ионной силы раствора. При ней'rральных значениях рН среды NADH экстра1'ИРУет 68 % лдr. Повидимому, с микросомами из белых мышц шиповатоrо ската связано два пула лдr. Фермент одноrо пула взаимодействует с мембраной за счет электростати ческих сил, фермент дрУ1'оrо пула за сче'l' 1'идрофобных взаи модействий. Наличие двух пулов ЛДI' приводит к дополнитель- ной возможности реrуляции свойств фермента путем el'O пере 175
распределения между разными клеточными компартментами. Т. В. Есаковой иМ. В. Ивановым (1992) показано, что связы вание лдr с мембранами саркоплазма'rическоrо ретикулума Be дет к снижению удельной активности фермента на 6070 %. Высказано предположение о '!'Ом, что взаимодействие фермента с мембранами происходит в участках с высоким и низким cpoд СТВОМ. Добавление NADH, NAD+, а также повышение ионной силы pac'rBopa вызывает солюбилизацию связанноrо фермента. Сни жение активнос'l'И лдr в связанном состоянии можно объяснить как маскировкой некоторых субъединиц, диффузионными за труднениями при связывании субстратов, конформационными пе рестройками молекулы лдr, так и изменениями физикохими ч:еских свойств среды при переходе фермента из раствора в при мембранный слой. Взаимодействие мембран эритроци'rов с лдr приводит к сни- жению ее ка'l'алитичеС1ЮЙ активности. На рис. 49 представлена зависимость фермента'rивной активности мембраносвязанной ЛДI' оТ величины рН среды инкубирования. В условиях оптимума рН 7,4 активнос'l'Ь ее снижается на 25 %; при значениях рН 6,0 и 4,0 соответственно на 33 и 46 %. Сдви1' рН в щелочную область приводит к уменьшению эффекта инrибирования лдr. При рН 9,0 активности свободноrо и связанно1'О ферментов статисти чески достоверно не отличаются. Повидимому, с увеличением отрицателъноrо заряда молеку лы белка веРОЛ'l'НОСТЪ образования e1'o комплекса с мембраной уменьшается. Можно предположить, что участки связывания фер- мента на мембране несут отрицательный заряд. Эти данные коррелируют с результатами исследования А, % 100 80 60 Рис. 49. Зависимость фер ментативной ruктивности Л8Е Т8тдеI'ИДроl'еН!lЗЫ, связанной с мембранами ЭрИ'l'роцитов (2'10B моль/л, 0,15 МI'/МЛ бел ка мембран), от величины рН (З8 100 % прин.ята aIСТИВНОСТЬ СБободноrо фермента при тех же значениях рН) 40 контроль 4,0 0,0 7,4 8,5 9,0 рН 176
В. И. Лущака (1991,1992), который изучил влияние рН среды на экстракцию лдr из микросом плавательных мышц шипо ваторо ската и показал, что степень экстраrируемости ферм:е:н та из микросомаль:ных мембран увеличивается при щелочных значениях рН. Т. В. Есакова, и М. В. Иванов (1992) считаЮТ, что для взаимодействия лдr из скелетных мышц свиньи с м:eм: бранами саркоплазматическо1'О ретикулума важен отрица тельный заряд мембраны. Кроме TOI'O, на поверхности мембра ны существует положительный заряд, затрудняющий связы вание лдr. Падение активности фермента в связанном состоянии может быть обусловлено следующими причинами (Б. И. Kyp1'aHoB, Н. И. Лобода, 1977; Б. И. 1{YPl'aHOB, 1984): а) стерическим экранированием активных центров при aд сорбции; б) изменением конформациоююI'О СОСТОЯНИЯ белковой моле кулы (или преимущественной адсорбцией одной из конформаци онных форм фермента, находящеrося в растворе); в) изменением микроокружения фермента при переходе из раствора в примембранный слой (концентрации водородных ионов и субстратов в растворе и на поверхности Mo1'YT различаться вслед ствие их взаимодействия с подложкой). Однако убедительных доказательств в пользу КaIЮ1'олибо oд HOro из этих предположений не получено. Таким образом, процесс ассоциации ЛДr с эритроцитарной мембраной можно ре1'улировать путем варьирования значений рН среды. Следовательно, важную роль в образовании компле:к сов фермента с различными клеточными структурами иrрают электростатические взаимодействия. При взаимодействии лдr с тенями эритроцитов, обработан:н:ы ми тритоном X100, наблюдалось снижение каталитической a:к тивности лдr, однако степень инактивации фермента была выше, чем в случае ero ассоциации с препЭ,ратами нативных мембран. Так, связывание Лдr с эритроцитарными мембранами и их "три тоновыми" тенями при рН 7,4 ПрИВОДИJIО к снижению ее аКТИВЕО сти на 25 и 82 % соответственно (рис. 50). При рН 9,0 катаЛИ'rи ческая активность ЛДr в присутствии нативных и ТРИТОНОВ:ЫХ теней статистически достоверно не отличалась от таковой дЛЯ CBO боДНОI'о фермента. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ЛДr эффективнее взаимодействует со спектринаКТИЕО 12. Заказ 3788 177
А, % 100 80 60 40 20 О 7.4 9,0 рН Рис. 50. I'i:аталитическая активность лактатдеrидроrе- назы в комплексе с эритроци- тарными мембранами и трито новыми тенями эритроцитов (2'10B моль/л, 0,15 мr/мл бел ка мембран): D изолиро ванные мембраны; b.SJ три- тоновые тени вой сетью, представляющей основу мембранно1'О каркаса клетки. Можно предположить, что преобладающий вклад в образование комплекса фермента с эритроцитарной мембраной вносит ero ассо- циация с элементами цитоскелета, прежде Bcero актином и спектри ном. Это соответствует ко'Нцепции о центральной роли актина как белкакоординатора в реryл.яции обменных процессов в клетке, предложенной Б. Ф. ПО1'лазовым и соавт. (1983). При взаимодействии эритроцитарной лдr с нативными и мо- дифицированными тритоном Х-100 мембранами ЭрИ'l'роцитов aK тивность связанНО1'о фермента снижается при рН 7,4 на 21 и 30 %, а при рН 5,4 на 35 и 41 % coo'rBeTCTBeHHO. Следователь но, изменения каталитической активности фермента из скеле'l' ных мышц и ЭРИТРОЦИ'l'ов В ассоциированном с эритроцитарными мембранами состоянии имеют идентичный характер и указывают на единый механизм ассоциации мембран эритроцитов с лдr из названных источников. В ПРИСY'l:ствии восстановленно1'О кофермента в среде ИН1\:уби- рования: лдr и мембран ее активность статистически достоверно не отличается от таковой для свободно1'О фермента. Итак, получен ные результаты можно объяснить тем, что NADH, соединяясь с апоферментом, вызьшает ero конформационные изменения, KOTO рые затрудняют адсорбцию- фермента на подложке биолоrической природы. Эти данные соrласуются с результатами ряда работ 178
(R. L. Melnick, Н. О. Hultin, 1973; r. Л. Ермаков, 1993; А. Dabrowska et а1., 1989), в которых было показано, что NADH способствует дe сорбции фермента, связанноrо с мышечными ВОЛОRНами лосося, липосомами и мембранами саркоплазматическоrо ретикулума. ИН1'ибирование лдr, ассоциированной с субклеточн:ыми части- цaMи' происходит за счет увеличения константы Михаэлиса для пирувата, а не изменения максимальной скорости реакции (А. Dabrowska et al., 1989). Н. П. Сyrробовой И соавт. (1983) показа- но, что связывание лдr с Fактином не изменяет характера зави- симости скорос'rи реакции от концен'l'Рации суБС'l'рата aKeTO 1'лутарата. В результате взаимодействия лдr с Fактином макси мальна.я скорость реакции снижается в 1,6 раза, а константа Миха- элиса увеличивается в 2,5 раза. Друrие результаты получены при исследовании лдr, ассоциированной с митохондриальной фР9.1щи ей печени цыпленка (М. L. Sagrista, J. Bosa1, 1987). Зависимость каталитической активности связанноrо фермента от концентра:ции пирувата О'l'клоняется от 1'ипербол:ической формы, а при измене- нии концентрации NADH описывается в paMI,ax l<инетики Ми хаэлисаМентен. Считают, Ч'l'О имеющиеся в литературе противоречивые дан- ные по этому вопросу можно оБЪЯСНИ'l'Ь двумя причинами: осо- беННОС'l'ЯМИ природы биолоrической ПОДЛОЖRИ и природой само- уо фермеН'l'а. На рис. 51 показаны результаты исследования зависимости скорости фермеН'l'ативной реакции лдr, связанной с мембрана- ми эритроцитов, от концентрации пирувата натрия при рН 7,4. КинетичеСRие кривые для свободно1'О фермеН'l'а и комплекса фер- ментмембрана подчиняются уравнению МихаэлисаМентен. Величина константы Михаэлиса для лдr в растворе равна 0,25::1:0,02 ммоль/л пирува'l'а, а для мембран ос вязанной 0,60::1:0,04 ммоль/л. Максимальная СЕОростЬ ферментативной ре- акции при взаимодействии лдr с мембраной эритроцитов сни жается в 1,2 раза. Значит, инrибирование фермента происходит за счет увеличения в 2,4 раза KOHCTaH'rbl Михаэлиса для пиру вата натрия. Суммируя результаты проведенных эх,спериментов, можно констатировать, Ч'l'О ассоциация лдr с эритроцитарным:И мемб ранами и их белковыми компонентами, представляющими собой мембранный каркас клетки, при различных значениях рН среды приводит к снижению каталитической активности фермента, KO 12* 179
v (!,15 0,,10 J,иc. 51, 811I1ИСИМОСТI. тш рщ"rl! ф!РМЮ!ТtlТИIIНОЙ реtlIщии ЛI\I<'J'!IТДI)['ИДРО!'LШI\ЗЫ n t:!()бt)д 110М СЩ:'fЩIlНШ (1) и ТI !(ОМI!JlЮ{- Cl' е >\JИ1'(ЮЦИТ!'РIlЫМИ M(JMflp!I 1IIIMI1 (2) ОТ !tOlЩШI'rрIЩЮ! ни- JlУШI'['!\ ШIТ(\ЮI 0,05 (J () 2 3 4 5 [пирумтj, ММОЛЬ/Л '1'орtЮ ПРЩН:ХОДИТ ан ече'I' УВСЛПЧ(ШИЛ KOHt1TfiHTbl Мшcnэлиса для 1I11(1YIII\'1'1l 1П1'I'(НШ. ЭффeltТ Iш{'ибироlЩПИЛ JIдr усиливается при СДНИ!'!) р11 11 юtСJlУЮ оБJЩС:'1't., что СllиrЦj'rеШ,С'l'вует об элеКТроста- '1'ичш'коtf щш{!оде В:НtIIМ(JДСЙС1'l:IИЙ между ферментом и мембра- !lОЙ. СJНЩОII/l'l'ОЛЫIO, процесс обрааоnaни.я I,oMnJleI{CIJ. лдr с био- JlЩ'lfческоЙ ШIДЛОЖКОЙ можно реl'УJШIЮJ3аТI. путем nаРЬИроВа- шш Щ)JЩСII'rрtЩI1Н ВОДОрОдНЫХ ИUllOtl, а твлже добавлепия n ре- !IIЩНШШУЮ срtЩУ ItоферМ<НI'rt\ NАШ:I. ОБРI\ТI1М<Н! IШIIИМtщеЙе'I'ЮЩ БНЛRо,g.ферментов с различными <:'I'РУН:'l'У[НIЫМИ I,ОМПОIНШ'ЩМИ Юfl.!Т1<И нреДСТt\IIJшет собой ОДИН на ЭФФЩ<"fIIННЫХ МtJХ!!JшаМОtr реl'УJlJПЩИ Ю1.ТIlJlитической актцв- ШН:'I'И ROMllOllell'1'OH меТt\БЩП'lЧN:КИХ СИС'N:М. В соответствии с a'I'IIM фУIIIЩИОIIИIЮШШIН! ферМtШ"С!II 11 ItJIC'1'I<e можно рассмат- [НllIIt'I'I. Ш1К СОllUltУfПlOС'n lI:шим()(тпзанпых процессов перехода их 11:1 еllоБОДIIО1'О еОСТОШШJI 11 СnШI!lll'ное, ко'rорые рсrулируютса IIY'fCM lIоаД('ЙС'I'НИ'н рfl:lJlИЧIlЫХ физика-химических факторов 11 СШ(lНJIНlЖl(l\ю'rI:Н Нlм(!неllием фУШЩИОШ\ЛЫJЫХ свойств этихфер- MI'[l'l'l/lI, 11, следощtтелыlO, и И:JМtJнением жизиеДелтелыхости це. J10ii 1<:J1("I'ЮI. 1 111 pт, ;):;" tI ПР(ЩС'I'IШJltты !,<::JУЛЬ'I'fiТЫ ищтедоnапия Еft.Талити. 'II'('КОЙ I\к'rИНIIIЮ'I'И Jl)I" Уф.(){jлученшоЙ 11 дозе 1,5 кДж/м 2 и Ш!('ОI(lIщщт\!шоЙ r. ;)IН1'rРОЦИ'I'I'tрНЫМИ мембрюшми при рН 7,4, ЛI{'!'ИН1!Щ:'!'t. феРМОП'fа н свободном с()(:'rо.ннии после ero облуче. IIIШ ('()I"['H)l.'tН{T H: 'Х, по о'rЮIIШНlИЮ к КШI'1'IЮJlЫIОМУ обращу. IHII
Д, % д, % Д, % 100 100 100 85 85 85 70 70 70 55 55 55 40 40 40 2 3 2 3 2 а 6 8 Рис. 52. АКТИnJlOстr> .7Iактатдеrидроrепазыt УФоблученной в дозе 1,5 кДж/мИ, в комплексе с :Jритроцитарными мембранами при рН 7,4 (а), 5,4 (15), 4,5 (в): 1 активность УФоб.7Iученной ЛДr; 2 активность лдr в ПРИСУТСТВИИ :JРИТРОЦИ'I:'арных мембран; 3 ан:тиюroстъ ЛДr. УФ.облученной в дозе 1,5 н:Дж/м 2 и ассоциированной с эритроцитар ными мембранами 3 Rатали'rичеСIая ютивность УФмод:ифицированной лдr, acco циированной с эритроци'rарными мембранами, статистически дo стоверно уменьшается па 8 'Уо по сравнению с активн:остыo CBO бодноrо УФ.облученноrо фермента. Таким образом, степень инактивации УФ-модифицированной лдr при рН 7,4 n связанном с эритроцитарными мембранами состоянии выше, чем в свободном состоянии (табл. 13). На рис. 52, б приведены результаты исследования катали- тической активности JIдr, модифицированной УФизлучением и ассоциированной с эритроцитарными мембранами при рН 5,4. Активность фермента в свободном состоянии после ero 'УФ-облу чения составляет 65 'Уо по отношению к контрольному образцу. Каталитическая активн ость УФоблуч:енной лдr и ассоцииро ванной с эритроцитарными мембранами увеличивается на 21 % по сравнению с каталИТИчеСJОЙ активностыо УФ-облученн:оrо CBO бодно1'О фермента. Друrими словами, степень инактивации лдr, УФ-облученной и связанной с эритроцитарныии мембранами, при рН 5,4 ниже, чем п'ри облучении свободно1'О фермента (см. табл. 13), 181
Таблица 13 СтеnеllЬ UllаJCтuвацuu ЛДF, УФ-облуч-еllllОЙ при рН 7,4/ 5,4; 4,5 в свободllОМ состОЯllии ц. в lCо;nnлеlCсе с эритроцитпар- llыми .ме;nбрана;nи рН Степень инактивации АА =' Ан.. А об ", % в связанном с эритроци тарными мембранами состо.янии в свободном состо.янии 7,4. 17 21 5,4 35 6 4,5 14 2 Пр и: м е ч а н И е. АВА. каталитическая активность JЩI' в натив- ном состоянии; А обх каталитическая а:ктивность УФоблученной лдr; АА разность величин каталитической активности лдr в наТИБНОМ и УФ.облученном состояниях. На рис. 52, в II01<a3aнbl результаты исследования каталитической активности лдr, УФоблученной и ассоциированной с эритро цитарными мембранами при рН 4,5. Каталитическая а1<ТИВНОСТЬ УФоблученной лдr в комплексе с эр:итроцитарными мембранами при этом значении рН статистически достоверно увеличивается на 12 % по сравнению с активностью свободноrо УФоблученно1'О фермента. Степень инактивации лдr, модифицированНОЙ УФсве том и связанной с эритроцитарными мембранами, 01<азывается ниже, чем при облучении свободно1'О фермента (см. табл. 13). Следовательно, степень инактивации лдr, УФоблученной и ассоциированной с эритроцитарными мембранами, при рН 4,5 и 5,4 уменьшаетсд по сравнению с та1<ОВОЙ для УФмодифициро BaHHoro свобо,ЦНО1'О фермента при тех же значениях рН. Можно предположить, что такое изменение функциональной активности лдr, модифицированной воздействием УФсвета и ассоциированной с эритроцитарными мембранами, может быть связано с изменением м:икроокружения активноrо центра УФ облученноrо фермента при ero адсорбции на мембране. Веродтно, УФмодификация и ассоциация лдr с эритроци тарной мембраной при рН 7,4 приводит 1< стерическому экра нированию активных центров лдr, а при рН 5,4 и 4,5 создают сд более оптимальные условия для катализа. Но нельзя исклю чить и то обстоятельство, что при УФоблучении и последую щей иммобилизации фермента на мембране происходит изме 182
нение участков ero локализации на подложке биолоrической природы. С целью проверки справедливости высказанных преДIIоложе ний были исследованы флуоресцентные свойства lанилинона фталин8сульфоната в комплексе с мембранами эритроцитов и лдr, УФоблученной при значениях рН 7,4; 5,4 и 4,5. На рис. 53 представлены результаты исследования значений интенсивности в максимуме флуоресценции АНС (479 нм) в при сутствии мембран эритроцитов и лдr, модифицированной воз действием УФоблучения при рН 7,4; 5,4 и 4,5. Из анализа рисунка следует, что при взаимодействии эритроцитарных мембран с лдr, облученной УФсветом при YKa занных значениях рН, не выявляются статистически достовер- ные отличия значений интенсивности флуоресценции зонда в комплексе "мембраны лдr в нативном состоянии" и в комп- лексе "мембраны УФоблученный фермент". Полученные данные, вероятно, указывают на то, что при УФ облучении фермента не происходит модификация тех ero участ- ков, которые ответственны за связывание с эритроцитарными мем- бранами. Iфл Iфл Iфl1 0,3 0,3 0,3 0,2 0,2 0,2 0,1 0,1 0,1 О О О 2 2 2 8 б в Рис. 53_ Интенсивность флуоресценции зонда 1,8-АНС в компле:ксе с эритроцитарными мембранами и лдr, модифицированноЙ "УФ-излуче- нием, при рН 7,4 (а), 5,4 (О), 4,5 (8): 1 интенсивность флуоресценции АНС Б комплеЕсе с эритроцитарными мембранами и лдr Б нати:вном состоянии; 2 интенсивность флуоресценции АНС в Еомплексе с эрит- роцитарными мембранами и "УФоблученным ферментом 183
4.4. ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ПРОЦЕССАХ УФМОДИФИКАЦИИ ЛАКТАТДЕrидроrЕНА3Ы* в настоящее время возрос интерес исследователей к проблеме окислительноrо стресса. Ключевую роль в развитии окисл:итель Horo повреждения И1'рают активные формы кислорода (АФК): синrлетНЫЙ молекулярный кислород 102' супероксидный анион радикал, пероксид водорода Н 2 О 2 , rидроксильный радикал ОН', перrидроксильный радикал, rИПО1'алоиды (см. разделы 3.2, 3.3). Образование АФЕ и оксидативная модификация макромолекул нормальные и важные реryляторные процессы, участвующие в синтезе эйкозаноидных ropMOHOB (простаноидов и лешштриенов) и иодтиронинов, в воспалительных и иммунолоrических peaK циях. В норме ОР1'анизм имеет мощную аптиоксидантную (за щитную) систему, но при различных патолоrических состояниях и действии экстремальных факторов (избыток 02' активация ней- трофилов и фarоцитов, избыток 1'ема, ионов Fe 2 + и Си 2 +, ионизи рующее и УФи:злучение, некоторые ксенобиотики) необходимо предусматривать дополнительные меры, повышающие устойчи вость макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) 1< ОКСИДа тивной модификации и, в частности, фотоокислению. Существенную роль в процессах: TeMHoBoro и фотоокисления биолоrических структур И1'рают СИН1'летный кислород и ради кал 1'идроксила, обладающие наибольшим модифицирующим эф фектом. Одним из широко используемых методов исследования роли тех или иных активных интермедиатов в процессе УФмо- дификации белка является элиминирование их при помощи спе цифических акцепторов и тушителей. Рассмотрим более подробно результаты исследования фото индуцированных изменений структурно-Функциональных свойств изоферментов лактатде1'идроrеназы из различных источников в интактном состоянии и в присутствии ряда химических соеди- нений, способных взаимодействовать с активными формами кис лорода. Каталитическая активность растворов изофермента М4 лдr (0,2-10-8 моль/л) из скелетных мыщц свиньи при действии УФ- света (240390 нм) в дозах O,154,53 кДж/м 2 снижается с poc ТОМ дозы облучения (В. r. Артюхов и соавт., 1997, В. r. Артю- * Раздел написан с участием Ю. А, Лысенко и Н. В. А!'ишевой. 184
хон, М. А. Накнасина, 1991). NADH (2,4'107 моль/л) оказывает фотосенсибилизирующее действие по отношению к молекулам фермента при УФ.облучении их смеси. Падение каталитичеСI<ОЙ активности лдr происходит под влиянием УФ-излучения, по- rлощаемо1'О как anоферментом (Л- 280 нм), та:к и :коферментом (1-.2260 нм). По-видимому, Н IIроцесс фотоинактивации лдr HHO сят в:клад преимущественно фотохимические превращения апо- белка, связанные с ПО1'лощением энер1'ИИ УФ-света остатками apo матических (триптофана, тирозина входит н активный центр лдr, фенилаланина) и серосодержащих аминокислот белка. При сутствие указанных аминокислотных OC'l'aTKOB в молекуле MЫ шечной изоформы фермента было продемонстрировано IIрИ иссле- довании ее аминокислотноrо состава (табл. 14). Таблица 14 Соf}ержанuе отf}елыtых а.мU7f.Olсuслот в .lItо.леJCу.ле лаJCтатf}еzuf}РО2еJl.аЗbl АмИНОКИСЛОТЫ Количество, % на Аминокислоты Количество, % на 100 r белка 100 r белка Авр 7,820 Met 3,693 Thr 4,250 Не 4,819 Ser 3,294 Lel! 10,579 Glu 9,640 Tyr 3,793 Pro 6,273 Phe 4,078 Gly 4,006 НiB 2,937 Ala 4,092 Trp 2,068 "Полуцисти}! " 1,141 Lys 9,610 Val 8,626 Arg 6,388 Наблюдаемые IIрИ ВОЗДействиИ УФсвета нарушения струк. TypHo1'o состоянид и функциональной 'активности лдr являются результатом разворачивания белковой 1'лобулы, что находит от- ражение в изменении оптических и 1'ельхромаТОl'рафических свойств УФ.облученно1'О фермента. Продуктом фотоде1'радации остатков ТРИIIтофана являют- ся кинуренины и формилкинуренины. Показано, что IIрОИЗ- водные ТРИIIтофана СIIособны выполнять функцию фотодина- мических сенсибилизаторов, в частности, 1'енерировать СИНl'- летный кислород. В качестве источника 102 рассматриваю'!' процессы тушения кислородом ТРИIIлетных состояний apOMa тических или карбонильных соединений, которые входят в 185
состав МЮ,ёромолекул или присутствуют в них В виде приме сей. На потенциальную возможность I'енерации 102 в реакции триплетных возбужденных состояний белков указывает И. И. Сапежинский (1979). Образование СИНI'леТlIOI'О I,ёислорода может происходитъ в короткоживущих Iщмплексах с перено сом зарЯда: ароматический уrлеводород (аминокислотный oc таток) кислород. С целью получения дополнительной информации о механиз ме фотопревращений лдr необходимо исследовать УФ-индуци рованные изменения с'rРУКТУрIIофункционалЫIЫХ свойств и I,ёИ нетики фотоинактивации различных изофермептов лдr в ши роком спектральном диапазоне У<Ризлучения для выяснения возможно1'О участия модифицированных триптофанилов в каче стве (.внутримолекулярных аутосенсибилизаторов». Для изуче ния роли активных кислородных метаболитов в процессах 'Уф превращений белка используют их специфические акцепторы и тушители: азид натрия, Dманнит, Ркаротин, I'истидин, cepOTO нин. Применяемые концентрации вышеНазванных соединений не должны оказьmать заметноI'О влияния на уровень активности иативноI'О фермента. Распространепным тушителем синrлетноrо кислорода явля ется азид натрия, защитное действие KOTopo1'o было продемонст рировапо по отношению к сенсибилизированному окислению раз личных ОР1'анических субстратов. 1C0нстанта скорости e1'o peax<, ции с 102 2'108 л,(моль.с)l, 2.109 л,(моль.с)l. Азид натрия TY шит триплетные состояния возбужденных молекул, но KOHCTaH та скорости данной реакции в последнем случае на 2 порядка ниже. Для подбора концентрации N aN 8 можно использовать пред- положение о простом конкурентном перехвате СИНI'леТIIоrо кис лорода в исследуемой модельной системе и в соответствии с изве стными- :константами скорости взаимодействия 102 с компонента- ми этой системы. Для ЛДr такая константа не определена, но в первом приближении можно принять ее значения равными 109 1010 л,(моль.с)1 (И. И. Сапежинский, 1988). Суммируя известные литературные данные (В. Рэнби, Я. Рабек, 1978, В. Я. Шляпин тох, 1979, Х. Фут, 1979, Н. А. Шинкаренко, В. В. АлеСКОВСI<.ИЙ, 1981, Ю. А. Владимиров, А. Я. Потапенко, 1989), взаимодействие СИН1'летноrо кислорода. с возможными субстратами реакции MO жет быть представлено с помощью следующей упрощенной фор- мальнокинетической схемы: 186
kd За;! k К, G 102 А0 2 +02 +Д k q 302 + Q +0 )- ОО 2 {'де G источник, rенерирующий 102; k'i константа дезактива ции 102 растворителем; k r константа скорости реакции 102 с акцептором (окисляемым веществом); k константа скорости '1 тушения (или химическоrо взаимоде;i:IСТВИЯ) с потенциальным протек't'ором. В присутствии двух l'\:ОНКурИрУЮЩИХ за 102 соединениЙ (А и Q) квантовыЙ выход окисления акцеп't'ора определяется по ypaB нению = [ I+ kd+kчIQ] } . CfJЛО 2 <P 1 02 Реакционная способность орrапическоrо соединения и туши- теля характеризуется параМетрамИ: f3 А ::: kd f k r и PQ::: kd f kq . Эф- фективная защита молекулы от повреЖдающеrо действия 102 в присутствии тушителя возможна при соблюдении условия k L1 [Q]» kd + kJA]. Следовательно, [Q]»Si+!..r..[A] и [Q]» f3 Q +- [А] k ч kq k L1 Время жизни 102 в Н 2 О составляет 3,1+3,2 мкс, значит, kd == 1/1: == (3,2+3,1)'105 CI" Если принять k для азида натрия 2'108+2'109 л,(моль.с)I, k r (Лдr) 10 U +10 1 'b л,(моль.с)1, то полу чаем: (N aN 3)== 1,6'1 O3(---4), r- ] З(-4) 109(10) r ] lNaN J »1,6,10 + 2.lо 8 (9) :t!ЩI. Величина ВТОРОI'O сла1'аемоrо в правой части неравенства бу дет пренебрижимо мала по сравнению с первым до значений кон- центраций фермента 10б моль/л. Следовательно, в этом случае 187
А,% 100 90 80 70 60 50 ,........... ,........... А,% А,% АI 100 А1 100 А1 90 90 80 80 А2 70 А2 70 А2 60 60 5С1 50 2 3 2 3 2 3 а б liI Рис. 54. Изменение ФОТОЧУВСТБительности лдr в присутствии азида натрия (а), каротина и Dманнита (6), rи:стидина (6). По оси абсцисс КOIщентрации модификаторов, моль/л; по оси ординат ферментатив нм 8RТИВНОСТЬ, % . Аl 8RТИВНОСТЬ наТ!iШНОro фермента, Az УФоблу ченноrо фермента. Концентрации модификаторов: 8) 1 6,6'10б моль/л; 2 6,6'104 моль/л; 3 3,2'10З моль/л; б) ,[ 3,3'10-6 моль/л фкаротин); 2 5,5'105 молъ/л (Dманнит); 3 -каротин + Dманнит; в) 1 1,3'10З моль/л; 2 1,3'10Z моль/л; 3 3,3'102 моль/л концентрация азида натрия для проявления фотопротекторноrо эффекта должна превышать 1,6'103(4) моль/л. Эти теоретические расчеты были подтверждены результа тами экспериментов по изучению УФчувствительности (доза облучения 2,27 кДж/м 2 ) изофермента М4 лдr (2'108 моль/л) в присутствии азида натрия в концептрациях 6,6'105; 6,6'104; 3,2'103 моль/л (рис. 54,а). Из анализа рисунка следует, что NаN з в концентрации 3,2'103 моль/л практически полностью восстанавливает ферментативную активность исследуемоrо бел ка. При изучении спектральнолюминесцентных характерис тик лдr (lO6 моль/л) после ее облучения в свободном COCTO янии и В присутствии азида натрия (3,2'103 моль/л) выявле но, что воздействие УФсвета на смесь ферментазид натрия при водит к восстановлению до уровня контрольноrо образца величин интенсивности люминесценции модифицированноrо белка в e1'o максимуме (340 нм) и светопоrлощения в миниму ме (250 нм) и в более длинноволновой области (>290 нм), что связано, вероятно, с защитой хромофорных rpупп лдr от дей ствия 'УФизлучения. На рис. 55, а показаны кривые зависимости остаточной ферментативной активности мышечной изоформы лдr от Bpe мени облучения. Для количественною описания данно1'О процес 188
In(A/Ao) t, мин In(A/Ao) t, мин О 10 20 30 40 50 60 О 10 20 30 40 50 60 0,2 ...0,1 0,6 ...0,2 1,0 2 0,3 ...0,4 1,4 0,5 1 ,8 Q ...0,6 Q а Q Рис. 55. Кинетические кривые фОТОИНаЕТИВации ЛаЕТ8.тдеrидроre Н8.зы из мышц (а) и сердца (6) свиньи в присутствии некоторых фото протекторов: а) 1 на'ивная лдr; JIдr, УФоблученная: в присутствии модификаторов: 2 азида натрия (з,2'103 моль/л); 3 Dманнита (5,5'10-5 моль/л); 4 серО'l'онина (1'1O5 моль/л); б) 1 нативная ЛДr; 2 ЛДl', УФ-облученная в присутствии азида натрия (3,2'10-3 моль/л) са мы использовали константы фотоинактивации (k f ), рассчитан- ные по TaHreHcy уrла наклона линейной анаморфозы исходной кривой «доза эффект!) в координа'l'ЮС [ln(A/ Ао); t]. Для натив ной ЛДr k f оказалась равной 5,39'10-4 c- 1 . Эн:споненциальный характер кривой фотоинактивации свидетельствует об отсутствии процессов реактивации УФмодифицированно1'О белка и позво- ляет отнести rюследовательность фотохимических реакцИЙ Лдr к катеrории мономолекуля:рныХ реакций перво1'О порядка. Bpe мя полупревращени:я лдr (период, в течение KOТOPOI'O каталити ческая активность белка уменьшается на 50 %) в этом случае составит: t 1 !2== ln 2/k == 0,693/k == 1286 с == 21 мин. При KOHцe:в: трации фермента 0,2'10-8 моль/л (щреддиссоциационной,» фор ма кинетической кривой фотоинаК'l'ивации не изменяется, однако k, существенно увеличивается и становится равной 3,05'10-3 c- 1 , а t 1 !2 == 227,2 с == 3,8 мин. Следовательнd, уф-чувствительность ЛДr возрастаеТ при разведении ее растворов. Добавление азида натрия (3,2'10-3 моль/л) при облучении paCT вора изоформы М4 ЛДr (2'108 !j10ЛЬ/Л) вызывает частичное восстановление каталитической активности фермента. Однако 189
дозовая зависимость описывается прямой, а в IIOЛУЛО1'арифми чес:ких :координатах :квадратичной функцией (см. рис.55, а). Это свидетельствует о постоянстве скорости ина:ктивации лдr в изучаемом диапазоне. Та:ким образом, протекторный эффект NaN з на разных стадиях фотомодификации фермента неОДИна ков. Защитное действие азида натрия может быть обусловлено тушением 102' а 'I'акже ero комплексированием с белковой макромоле:кулой и, возможно, образованием внутримолекуляр ных сшивок некоторых функциональных 1'рупп лдr, Ч'rо индуци рует повышение фоторезистен'l'НОСТИ зафиксированной конформа ции биополимера. Не исключено также тушение азидом натрия возбужденных состояний белка и e1'o взаимодействие со свобод ными радикалами, обра:зующимися Б процессе УФмодификации молекул фермента. На рис. 55, б представлена зависимость «доза эффект» для: изоформы лдr из сердца свиньи в ПОЛУЛО1'арифмичес:ких координатах. Эта зависимость удовлетворительно описывается прямой. Константа скорости инактивации фермента составляет 1,41'104 cl и t 1 / 2 ==1690 с == 28 мин, что позволяет сделать вывод о меньшей фоточувствительности изофермента Н4 по cpaBHe нию с М4' При добавлении :к раствору лдr до облучения азида натрия остаточная ферментативная активность оказалась выше таковой для облученной в соответствующих дозах свободной ИЗ0фОРМЫ (см. рис. 55, 6). A1A2, % 30 10 25 20 15 5 о 1,51 3,02 4,53 6,04 7,55 9,06 кДж/м2 190 Рис. 5б. Сравнение протекторно ro эффекта азида натрия по отноше- нию к сердечной и мышечной изо формам лдr при различных дозах УФоблучения: 1 протекторный эффект NaN 3 для мышечной изофор мы; 2 для сердечной изоформы. По оси ординат отложена разнос'l'Ъ между уровнями ферментативной aк тивности ЛДI', УФ-облученной в CMe си с азидом натрия (A l ) и Б СБобод ной форме (А 2 )
На рис. 56 представлена зависимость протекторноrо эффекта азида натрия от дозы УФоблучения по отношению к мышечной и сердечной изоформам лдr. Анализ полученных данных по зволяет сделать заключение о неоднонаправленном характере дей ствия модификатора: максимальное защитное действие азида Ha трия наблюдается для лдr (M,j) при дозах облучения з,О26,О4 кДж/м 2 , а по отношению к ЛДr (Н) 6,049,06 кДж/м 2 . Если предположить, что основной вклад в фотопротекторный эффект NaN a вносит процесс тушения 102' то э'rот активный интермедиат оказывает влияние на изменение ферментативной активносТИ изо форм лдr при вышеун:азанных дозах облучения. Наиболее широко распространено пред(:та13ление о том, rro дезак тивация 102 каротином, взаимодействующим с ним IIреимуще ственно по физическому механизму, связана с переносом энерrии от СИН1'летноrо кислорода на низколежащий триплетный уровен!> каротина. Обсуждается вопрос о вкладе в рассматриваемый процесс комплекса с переносом заряда между 102 и каротином. Константа скорости дезактивации синrлетно1'О КИCJIорода близка к диффузи онной И составляет для CC1 4 7'109 л,(моль.с)I. rисти:дин относят к типу акцепторов 102: ero дезактивация осуществляется химичес- ким путем. Константа скорости k для Э'l'ой аминокислоты COCTaB cj ляет 5.107 л,(моль,с)1 В метаноле; в D 2 0 108 л,(моль.с)l. В реаК- цию с 102 вступает только неIIротонированная форма rИС'l'идипа. Из анализа рис. 54, б следует, что Ркаротин в концентрации 3,3'105 моль/л оказывает защитное действие по отношению 1':С молекулам лдr (М): активнос'l'Ь УФ-облученноrо в дозе 2,27 кДж/м 2 белка восстанавливается на 18 % по сравнению с таковой в отсутствие протектора. rистидин в концеН'l'рarJ;ИИ 3,3'10-2 моль/л снижает степень инак'rивации лдr на 19 % (см. рис. 54, в), что СО1'ласуется с данными, полученными при исполь зовании Ркаротина. Облучение лдr в присутствии D-маннита, являющеrося aK цептором ОНрадикалов, сопровождается снижением ее фото чувствительности: константа ин активации составила 4,0'10-4 c 1 , а t 1 / 2 "'" 1732 с == 29 мин (рис. 55, а). Дозовая кривая имеет экспо ненциальный характер. При изучении сочетанно1'О воздейс'rВИ,fI Ркаротина и D-маннита на уровень активности УФоблученн()й лдr выявлен четко выраженный эффект аддитивнос'rи дейс'l'ВИЯ этих areHToB (рис. 54, в). Полученные результаты свидетельству ют о том, что их протекторное действие связано с реализацией 1IП
различных каналов защиты белка от УФповреждения: элими нированием 102 и ОНрадикалов. При 'УФоблучении лдr (М 4 ) из скелетных мышц свиньи в присутствии серотонина установлено e1'o фотопротекторное дей ствие по отношению к молекулам этой изоформы: k f =:3,5'lO4 c1 И t 1 / 2 == 1980 с=: 33 мин (см. рис. 55, а). На рис. 57 показаны фотоиндуцированные изменения функ циональных свойств лдr (изоферменты Н4' НзМ, Н 2 М 2 ) эритро цитов крови человека после УФоблучения в присутствии cepo тонина. Введение в облучаемую систему экзоrенноrо a1'eHTa в KOH центрации 108 моль/л приводит к проявлению ero защитно1'О действид только при использовании максимальной дозы 'УФсве та (4,53 кДж/м 2 ), вызывающей наиболее rлубокие изменения в структуре молекулы фермента и приводящей к падению ero aк тивности на 35 % по сравнению с контрольным образцом. 'YBe личение концентрации серотонина до 107 моль/л индуцирует резкое усиление e1'o фотопротекторно1'О эффекта, наиболее ярко проявляющеrося при облучении лдr в дозах 1,51 и 4,53 кДж/м 2 , При использовании биоrенно1'О амина в концентрации 106 моль/л отмечаетсд снижение ero защитноrо действия при воздействии УФизлучения в дозах 1,51 и 4,53 кДж/м 2 по отношению к ЭТО му показателю при концентрации серотонина lO7 моль/л. Про текторный эффект 5окситриптамина может быть связан либо с акцепцией различных активных интермедиатов, в том числе и 102' либо С образованием комплекса фермент БИО1'енный амин, более фоторезистентноrо, чем свободный белок. А,'Уо 80 70 60 О з 4 2 192 кДжJм2 Рис, 57. Зависимость ypOB ня каталитической тивности лта'rдеrидроrеназы эритроци тов челове:ка в свободном COCTO .янин и в присутствии серотони- на от дозы УФ-облучения: 1 УФ-облучение без модификато ра; УФ-облучение в присутствии серотонина: 2 в концентрации 106 моJIЬ/Л, 3 107 моль/л, 4 108 моль/л
С целью детализации IIредставлений, касающихся выяснения механизма защитно1'О действия серотонина по отношению к MO лекулам лдr, при помощи метода И:К:спектрофотометрии были исследованы особенности вторичной структуры изофермента М4 из скелетных мышц свиньи в нативном состоянии и в присут ствии БИО1'евно1'О амина. Анализ соотношения интенсивностей ПО1'лощения в полосах амид 1 и амид II на частотах, являющихся характеристическими для отдельных элементов вторичной структуры, свидетельствует о том, что присутствие БИО1'енно1'О амина индуцирует увеличение доли беспорядочной структуры в молекуле _фермента (табл. 15). При этом отмечаемый прирост ее реализуется за счет как <Х.СIIИ ральных участков, так и складчатых слоев. Б случае соотноше Н;liЯ молекул лдr и экзоreнноrо модификатора 1: 1 наблюдаемый эффект в большей стеIIени обусловлен участием <Х.СIIиралей, BXO дящих в состав белка. Таблица 15 Соотllошенuе полос поzлощенu.а., харшстерuаующuх основные типы вторштой cтpYlCтypbt tJеЛlCовой молекулы, O.1lJl лаJCтшпое8UОРО8енааы в свобооном состОЛlши u в присутствuи серотонина Соотношение Исследуемые образцы интенсивностей полос лдr + серотовин лдr + серотонин поrлощения НаТИ1l:НЫЙ беЛОЕ 11 соотноще:нии 11 соотвощении моле'Кул 1:1 :МОJЩ'КУЛ 1:10 1656 (беспорядочная 1,423 :!: 0,092 1,406:1: 0,021 1,596 :!: 0,107 структура): 1650 (а.-спираль) c:м' 1535 (беспорядочная 1,488 :!: 0,092 2,297 :!: 0,078* 1,658:1: 0,109 структура): 1516 (а-спираль) CMl 1685 ф-С'КЛIJД'Ки): 0,926':1: 0,007 0,932:1: 0,028 0,752:!: 0,040* 1656 (беспорядочная CTPYRтypa) cм' 1550 ([3-СRЛIJДRИ) : 1535 1,342 :!: 0,058 1,072:1: 0,029* 1,160 :!: 0,033* (беспорядочная CTPYRTypa) см-' 1650 (а-спираль): 0,746:1: 0,050 0,756:!: 0,029 0,764 :!: О, 046 1685 (I3-СRЛIJДКИ) c:м' 1516 (а.-спираль): 0,538:1: 0,029 0,407:!: 0,009* 0,535 :1: 0,019 1550 (I)-СRЛIJДКИ) CM' * Отличие от контроля статистичес:ки достоверно. 13, 3!lRаз 3788 193
Изменение спектральных характеристик фермента удается обнаружить и на ДРУ1'их участках спектра. При соотношении молекул ЛДr и серотонина 1:1 статистичес!\и достоверно YMeHЬ шается интенсивность поrлощения образцов на частотах 1468, 1420 CMl по сравнению с нативным белком; отмечается появле ние HOBo1'o максимума на частоте 1502 CMl. Повышение концентрации ЭКЗО1'енноrо модификатора в 10 раз сопровождается снижением интенсивности поrлощения на час- тоте 1432 CMl. Вместе с тем в области 14401380 CMl реrистри руется выраженный пик с максимумом при 1404 CMl. Для Ha тивно1'О белка ПО1'лощение в этом участке незначительно, а при соотношении компонентов изучаемой системы 1:1 практически отсутствует. ИКспектр свободноrо фермента характеризуется Ha личием широкой полосы поrлощения в области 13701180 CMl Добавление к e1'o раствору серотонина приводит к ее С1'лажива- нию и при соотношении молекул Лдr БИО1'енный амин 1:10 в данном диапазоне отмечается практически монотонное убыва- ние светопропус!\ания образца. Таким образом, выявлен выраженный фотопротекторный эф фект серотонина по отношению к молекулам изоферментов Н4' НзМ, Н 2 М 2 ЛДr эритроцитов человека, обусловленный образова ни ем комплекса ЛДr серотонин, формирование KOToporo зат раrивает вторичную структуру белка. Возможно, комплексиро- вание биоrенно1'О амина с молекулами фермента происходит и в . растворе. Однако полученные результаты не исключают и Bepo ятность дезактивации серотонином АФЕ, в том числе 102' Динамический комплекс с молекулами ЛДr способен образо- вывать и ero кофактор NADH, что может существенно изменять фоточувствительность фермента. С целью расширения представле- ний, касающихся выдвления механизма УФ-модификаций лдr в присутствии кофермента, были проведены эксперименты по изуче НИI0 фотостабильности молекул лдr (М 4 ) из скелетных мышц сви ньи В условиях различной занятости ее а!\тивных центров этим кофактором. Степень занятости активных центров фермента NADH рассчитывали по формуле (Ч. Кантор, П. Шиммел, 1985): у = [NADH] K dis +[NАDН]' rде у степеЕЪ насыщения белка лиrандом; [NADH] концен- трация кофактора; Kdi. !\онстанта диссоциации комплекса бе 194
лок ЛИI'анд (в качестве Кш. использовали значение константы Михаэлиса 2,5'105 моль/л для NADH по отношению к изоформе М 4 ) (С. Е. Северин, r. А. Соловьева, 1989) . Установлено, что предварительное добавление NADH (4'10-8 моль/л) к лдr (108 моль/л), УФоблучаемой в дозе 3,02 кДж/м 2 , не вызывает статистически достоверных изменений степени инактивации свободноI'О белка (32 %). У в данном слу чае 0,16 %. При концентрации NADH 4'107 моль/л (У == 1,57 %) обнаруживается эффект сенсибилизации (13 %). Фотомодифика ция лдr в присутствии кофермента в КОНцентрациях 4'10в (У == 13,8 %) и 2,5'105 моль/л (У==50 %) приводит К ре1'ИСТРации llpOTeKTopHOI'O эффекта NADH по отношению к ферменту: степень УФинактивации белка в этом случае соответст!3еННО на 9,3 и 16,0 % ниже уровня активности лдr, облученной без кофактора. Путем одноэлектронноI'О окисления NADH и при BOCCTaHOB лении NAD+ может образовываться радикал NAD', взаимодей ствующий с кислородом С образованием супероксидноI'О анион радикала 0/, поражающеI'О белковую 1'лобулу. Вместе с тем BOC становленная форма кофактора обладает способностью дезакти- вировать 102: константа скорости тушения СИН1'летноI'О кислоро да в системе СНзСN : DP (4:1) 7,5'107 л,(моль.с)l; В DP 2,1'107 л,(моль.с)-l. Следовательно, значение ее дЛЯ NADH COCTaB ляет 1,7'104 1,5'10-2 моль/л. NADH способен взаимодейство вать с 02\ причем выявлено, что e1'o окисление супероксидом идет быстрее, если кофактор образует ,комплекс с лдr: констан- та скорости окисления NADH в последнем случае по меньшей мере на 4 порядка выше таковой для свободноI'О ЛИ1'анда. Окис ление NADH в активном центре фермента, по-видимому, должно происходить по цепному механизму и существенным образом изменять химические свойства кофактора. Спектр ПОI'лощения комплекса лдr (2'10в моль/л) NADH (2'10-8 моль/л) характеризуется двумя полосами ПО1'лощения с "'шах при 268 и 340 нм. Присутствие полосы с "'шах 268 нм В спек- тре ПО1'лощения изучаемой системы можно объяснить индукци ей структурных изменений молекулы апофермента путем при соединения'кофактора. D. Scherr и соавт. (1973) исследовали спек тральные свойства двойных комплексов, образующихся при вза- имодействии аналО1'ов или фра1'ментов NADH с лдr из сердца свиньи. Комплексообразование вызывало спектральные измене. ния в области 280 нм, что указывает на участие в этом Процессе 13* 195
ароматических аминокислот. Авторы постулировали rидрофоб НЫЙ характер взаимодействия адениновой части коэнзима с апо- белком. Таким образом, суммарный реrистрируемый эффект измене- ния :каталитической активности лдr при ее УФ-облучении бу дет зависеть от соотношения процессов сенсибилизации и проте:к TopHoro эффе:кта NADH. Защитное действие :кофермента (У == 13,8 и 50 %) может быть обусловлено реализацией следующих воз- можных процессоВ: 1) формированием более фоторезнстентиой конформации лдr в :комплексе с NADH по сравнению с апоферментом; 2) миrрацией энерrии с возбужденных амино:кислотных ос- тат:ков белка (в частности, триптофана) на :кофермент; 3) а:кцептированием АФК е02 и 02); 4) экранирующим эффектом NADH в областн длин волн 240 280 нм. Фотосенсибилизирующий эффект NADH по отношению к ЛДТ, по-видимому, объясняется образованием при УФ-облучении бел- :ка сольватироваиноrо электрона, акцептируемоrо NAD+, в резуль- тате чеrо в присутствии 02 возможен циклический процесс пере- хода NAD+ NAD' с 1'енерированием 02:' и друrих а:ктивных интермедиатов (NAD', НР2)' Кроме TOro, вследствие конформа- ционных переходов протомеров лдr при фотоокислении NADH Moryт формироваться субъединицы, занятые одновременно вос- становленной и о:кисленной формой :кофактора, что существенно изменяет характер УФ-превращений, индуцнруемых в системе фермент :кофермент . Изучение роли АФК в процессах фотомодифи:кации белка cy щественно дополняют исследования фотосенсибилизированно1'О метиленовым rолубым (мr) фотоокисления изофермента М4 ЛДТ. Механизм действия красителя связан с 1'енерацией 102 или непосредственным взаимодействием возбужденной моле:кулы Mr с молекулой бел:ка. Преобладание в системе тех или иных про цессов зависит от соотношения :концентраций биополимера и :кpa сителя в облучаемой Системе. Из аналнза данных, представленных на рис. 58, а, следует, что облучение :красным светом изофермента М4 (10--8 моль/л) в тече ние 15 мин с Mr (10-7 моль/л) не вызывает статистически досто- верных изменений функциональных свойств лдr по сравнению с уровнем активности белка, облученноrо в отсутствие красителя. 196
А,% 100 .:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: до 90 2 1 а 80 70 60 107 А,% 120 110 100 б /1 10...б 105 10--4 cMr, молЬ!л 2 1 Ао 60 107 А,% 10...б /1 10-..5 10--4 CMr, молЬ!л 100 80 Ао в 70 /1 107 10...б 105 10--4 CMr, моль/л Рис, 58. Зависимость ферментативной активности лдr (М 4 ), облу- ченной красным светом в присутствии азида натрия (3,2'10-3 моль/л), от концентрации метиленовоrо rолубоrо: а концентрация фермен та 10-8 МОЛЬ/Л; б 106 МОЛЬ/Л; в 10-7 МОЛЬ/Л; Ао активность фермента, облученноrо в течение 15 мин красным светом без модифи- каторов; 1 лдr; 2 лдr+Nа.N з 197
Добавление Mr в концентрациях 1041, 10"" и 10--4 моль/л сопровож далось эффектом сенсибилизации: активность лдr снижалась на 26,7::!::6,0; 11,0::!::1,8 и 17,4::!::2,6% соответственно. В присутствии NaN g остаточная активность фермента после ero облучения с Mr (106 моль/л) составляет 87 , 8::f::3 ,6% , что свидетельствует об учас тии 102 В процессе фотоинактивации лдr (10--8 моль/л). При использовании растворов фермента (106 моль/л) максимальный сенсибилизирующий эффект мr обнаруживается при ero концентрации 1041 моль/л и составляет 30,0::!::4,0 %, а OCTa точная активность белка, облученноrо в присутствии азида натрия, равна 90,3::f::2,4% (рис. 58, 6). АналО1'ичные результаты были полу чены при исследовании фотосенсибилизированноrо окисления cep дечной изо формы лдr с участием мr (1041 моль/л). Для JЩr (1O1 моль/л) в присутствии Mr характер изменения функциональных свойств лдr от концентрации красителя при об лучении их смеси оказался иным: активность фермента убывает с ростом концентрации Mr, а степень ин активации ДОСТИ1'ает Maк симальной величины (23,2::!::4,5%) при концентрации сенсибили затора 104 моль/л (рис. 58, в), При добавлении в систему азида натрия значения исследуемоro параметра не отличались от TaKO ВЫХ: для лд:r, фотомодифицированной в свободном состоянии. Взаимодействие фермента с синrлетным кислородом может ocy ществляться при относительно высоких концентрациях белка, так как 102 характеризуется малым временем жизни. Этим, вероятно, объясняется отсутствие протекторноro действия NaN з для низких концентраций фермента. При определенных концентрациях Mr (lОб и 104 моль/л) возможно тушение ero триrrлетноro состояния своими же молекулами или взаимодействие их с 102; этот поража ющий areHT не достиrает активно1'О центра белка. Кроме тoro, фо тоинактивация лдr может быть связана с комплексированием MO лекул красителя с поверхностными участками белковой 1'лобулы, что блаroприятствует протеканию реакций по типу !, Т.е. обуслов лена непосредственным химическим взаимодействием триплет ных состояний сенсибилизатора с аминокислотными остатками фермента. Суммируя результаты исследования УФИНдУцированных из менений структурноФункциональноrо состояния изоферментов лдr в условиях их различно1'О микроокружения, можно заклю чить, что основной тип УФмодификации каталитической актив ности ИЗ0фОрМ лдr (мышечно1'О и сердечноrо типов) фото 198
инактивация ее молекул. На основании определения величин KOH станты скорости инактивации и времени полупревращения изо ферментов лдr показано, что сердечная форма фермента (Н 1 ) бо лее фотостабильна по сравнению с мышечной (М 1 ). Использова- ние широкоrо спектра ЭКЗО1'енных соединений (азида натрия, - каротина, D-маннита, rистидина, серотонина, NADH), способных акцептировать АФК и проявлять в определенных концентраци- ях фото протекторное действие по отношению к молекулам лдr, позволило выявить существенную роль СИН1'летно1'О моле кулярноrо кислорода в процесс е фотоинактивации лдr. При исследовании сенсибилизированноro Mr фотоокисления изоформ hv (о; 280 нм) + ОН+ Конечные стабильные фото продукты Первичные и вторичные продукты фотоокисления аминокислотных остатков (His, Trp, Tyr, Met, Cys---Cys) Нарушение конформации лдr (в том числе разворачивание белковой rлобулы) и ее активноro центра Фотоинактивация лдr Рис. 59. Схема возможных фИЗИкохи:м:ических процессов, приводя ЩИХ :к фотоинактивации молекулы лактатдеrидроrеназы 199
фермента по:казана возможность о:кисления лдr (М,,) СИН1'лет ным :кислородом при ero экзоrенной 1'енерации. На рис. 59 представлена схема возможных процессов, способ ных приводить :к фотоинактивации лдr. Результаты проведенных исследований У1'лубляют современ- ные представления об особенностях фотохимических превраще ний и фун:кциональных нарушений отдельных изоферментов лдr, индуцированных воздействием УФизлучения. Их необходимо учитывать при изучении первичных и начальных процессов УФ изменений сложных белков с доменной структурой. Кинетичес :кие исследования фотоокисления лдr в присутствии протекто- ров, акцептирующих активные промежуточные продукты фото- превращений белка, позволят оценить реальный вклад каждой элементарной стадии (реакции) в сложный процесс УФмодифи- кации субъединич:в:ой молекулы ЭТО1'о фермента. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Какие компоненты биомембран являются акцепторами УФ-излу- чения? 2. Что понимают под термином "пеРО1<сидное фото окисление ли пидов" мембран? 3. Каковы механизмы протекания процесса пероксидноrо фотоокис- ления ЛШIидов мембран? 4. Чем обусловлены изменения стрУктурнофункциональноrо состо- яния простых и сложных белкоВ ПОД влиянием УФизлучения? 5. В чем заключаются особенности фотохимических превращений мембраносвязанных белков по сравнению со свободными? 6. Что представляет собой эффект фотохимической аллотолии? Ка- ковы условия проявления и исчезновения феномена фотохимической аллотопии? 7. Что называют фотосенсибилизаторами? 8. Каковы механизмы протекания фотосенсибилизированных реак- ций? 9. В чем состоит роль синrлетноrо молекулярноrо кислорода В pea лизации фото сенсибилизированных лроцессов? 10. Охарактеризуйте методы выявления и оцешш роли синrлетноro кислорода в различных фотосенсибmrnзированных и темповых реакциях. 11. Что называют акцепторами и тушителями синrлетноrо молеку лярноro кислорода? Как оценивают способность этих соединений взаи- модействовать с 10 з ? 12. Какие биолоrические молекулы являются наиболее эффектив ными тymителями синrлетноrо кислорода, а какие малоэффектив ными? 200
13. В чем заключаютс.я различия химическоrо и физическоro меха- низмов тушения 102 биомакромолекулами? 14. Каковы "последствия" фотосенсибилизированноrо повреждения молекулярных компонентов биомем6ран? 15. Опишите последовательность реакций, индуцированных воздей ствием УФсвета на отдельные мембранные компоненты и npи:водящих к нарymенШIМ структурно-функциональноro состояния биомембран. 16. Какое теоретическое и практическое значение для медицины имеют исследования, направленные на изучение закономерностей фо тохимических превращений биополимеров, их надмолекулярных KOМn лексов и биомембран?
I'лава 5 ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ МЕТОДОВ И3УЧЕНИЯ БИОЛОI'ИЧЕСКИХ МЕМБРАН 5.1. КРАТКИЙ ОБЗОР rрупп МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОМЕМБРАН Методы исследования биолоrических мембран весьма разно образны и условно объединены в 5 rрупп: биохимические, физио ЛО1'ические, иммунолоrические, rенетические, биофизические. Биохимические методы позволяют разделять, выделять и анализировать в чистом виде липидные и белковые компоненты, изучать их физикохимические свойства в свободном состоянии и в составе надмолекулярных комплексов в условиях воздействия различных внешних факторов (температуры, концентрации BOДO родных ионов И др.), исследовать их время «жизни», пути биосин теза и распада этих компонентов. К ним относят методы выделе ния (недеструктивные и включающие разрушение клеТОI<); разде ления субклеточных фраrментов (хроматоrрафия, электрофорез, центрифyrирование, иммуноаффинные методы); идентификации и оценки чистоты субклеточных фракций; выделения орrанелл и мембранных систем; экстракции липидов и разделения их по клас сам; количественноrо определения фосфолипидов; исследования трансмембранно1'О распределения липидов; солюбилизации мемб ранных белков, их реконструкции и определения функциональ ной активности реконструированных мембран, выделения и MO дификации мембранных белков. ФИЗИОJIОl'ические методы используют для изучения функ ционирования естественных и искусственных мембран, Они по зволяют исследовать пропицаемость мембран, процессы возбуж дения, торможения, проведения HepBHo1'o импульса, распределе пия и выведения ио13:0в и молекул из клеток и тканей, измене нил фИЗИОЛО1'ических функций клеток. Им:мунОJIОl'ические методы широко используются для иден- тификации мембранных компонентов, их локализации, оценки количества, выделения. Это методы получения поликлональных и моноклональных антител к компонентам мембран, иммуно блоттин1' (электрофорез в полиакриламидном rеле в присутствии додецилсульфата нрия с перенесением разделенных белков на нитроцеллюлозные фильтры для последующеrо выявления с по 202
мощью антител), иммунолоrическая очистка субклеточных фраl< ций, иммунолоrическое выделение мембранных компонентов, использование антител для отбора комплементарных ДИК, IO дирующих мембранные белки. rеиетические методы основаны на использовании мутанто!!, дефектных по синтезу определенных мембранных белков. ОНИ позволяют исследовать функции мембранных белков, их роль в функционировании мембран, проблемы саМООР1'анизации мемб ран. Биофизические ме'l'ОДЫ позволяют изучать динамичеСI<УЮ орrанизацию биомембран, получить представления об ynal<OBl(! и движении липидных молеr<ул в природных и модельных MeM бранах, их взаимодействии дРУХ' с дрУ1'ом и молекулами белкОв, исследовать фазовые переходы и друrие процессы. I{ ним OTHO сятся дифракционные методы (рентrеновская дифракция, ди:ф ракция нейтронов), резонансные методы, метод электронноЙ мик роскопии, оптические методы (круroвой дихроизм, дисперсия ()Il тическоrо вращения, абсорбционная спектроскопия, люминесцев ция, метод флуоресцентных зондов), метод дифференциальноЙ сканирующей микрокалориметрии, метод моделирования и иo лучения искусственных мембран и др. Дифракционные .методы основаны на взаимодействии элеl<'.rро маrнитноrо излучения или частиц с длиной волны, соизмеримой с межатомным расстоянием, и компонентов мембраны. Их ис пользуют для определения reометрических параметров CTpYl<TY ры: типа липидной мезофазы и ее периодичности, толщины би слоя, среднеrо расстояния между уrлеводородными цепями. К этим методам относятся реНТ1'еновская дифракция (peHTreHO структурный анализ) и дифракция нейтронов. В основе peHTreHocTpYKTypHoro анализа лежит вааи модействие peHTreHoBcKoro излучения с электронами вещества, в результате KOToporo возникает дифракция рентrеновских лучей с длиной волны 0,1 нм. Последние рассеиваются на элеl<ТРОН ных оболочках атомов. Интерференция волн, рассеянных веrде ством, приводит к возникновению дифракционной картины, что позволяет зареrистрировать peHT1'eHorpaMMY. При рассеянии :на кристалле можно рассматривать дифрarщию как отражение peH тrеновских лучей плоскостями кристаллической решеТl'\:И. Ди фракция наблюдается, если рассеянные волны находятся в фазе, Т.е. разность хода лучей равна целому числу волн n. 20а
Условие дифракции (отражения) описывает формула Брэ1' rаВульфа: nЛ- == 2 d sin 0, rде л. длина волны; d расстояние межДУ кристаллическими плоскостями; 0 уrол между направлением па,цающеrо луча и кристаллической плоскостью. На основании дифракционной картины, получаемой для peHT 1'еновских лучей с известной длиной волны, определяют пара метр d. Дифракционная картина зависит от длины волны peHT rеновских лучей и строения объекта. Анализ дифракционных максимумов позволяет установить распределение электронной плотности в кристалле. РеНТl'еноструктурный анализ дает ин формацию о расположении атомов в молекулах и кристаллах. Для построения профилей электронной плотности, а также для изучения ориентации и характера упаковки уrлеводороД ных цепей используют мультислои липидов или смесей липидов и белков, ориентированные на твердой подложке. Их получают путем постепенноrо нанесения липидов при MHorOKpaTHoM про хождении стеклянной пластины сквозь моно слой ЛИПИДа на rpa нице раздела вода воздух или путем спонта:нноrо образования мультислоев, параллельных подложке, при испарении орrаничес- Koro растворителя из капли липидноro раствора. Метод реНТl'еновской дифракции позволяет установить нали чие бислойной структуры в природных И модельных мембранах и определить параметры бислоя. На основании анализа дифрак- ционной картины можно исследовать состояние уrлеводородных цепей мембранных липидов и зареrистрировать фазовый пере- ход из rелеобразноrо в жидкокристаллическое состояние. Одна- ко из-за высокой лабильности и сравнительно малой упорядо- ченности структуры биомембран метод peHTreHocTpYKTypHoro анализа не позволяет изучить локализацию мембранных белков. Лишь в мембранах, СОДержащих упорядоченные белковые комп лексы, удается выявить наличие и ориентацию а-спиральных участков интеrpальных белков. С помощью метода дифракции нейтронов, дополня- юще1'О реНТ1'еноструктурный анализ, определяют расположение молекул и их частей в бислое путем изотопно1'О замещения водо- рода на дейтерий. В отличие от peHT1'eHoBcKoro излучения, неЙт роны практически одинаr<,ово эффективно рассеиваются леl'КИ- 204
Mf1 И тяжелыми атомами. Взаимодействие с некоторыми ядрами, имеющими соответствующие резонансные уровни энерrии, при водит к изменению знака амплитуды рассеяния. Амплитуда KO repeHTHoro рассеяния ядром (Ь) связана с эффективным сечени ем (О') соотношением: Ь = .JO' 147& . Различие в рассеянии нейтро- нов атомами водорода и дейтерия позволяет широко использо- вать эффекты изотопноrо замещения для изучения биомембран. Резонансные .метоаы анализа веществ подразделяют на ме- тод ядерноrо маrнитноrо резонанса (ЯМР) и метод электронноrо парамаrнитноrо резонанса (ЭПР). М е т о Д Я М Р основан на резонансном по1' лощении в силь- ном внешнем маrнитном поле знерrии электрома:rнитноrора- диочастотно1'О поля системой атомных ядер, обладающих Ma1' нитным моментом. Он позволяет получать сведения о подвиж- ности молекул липидов биомембран, об упаковке фосфолипид ных молекул в бислое, используется для реrистрации изменений значения р:Н в частицах малО1'о размера (искусственные мемб- раны, митохондрии), изучать процессы латеральной диффузии липидов и трансбислойноrо движения ("флипфлоп" переходы) молекул. Положение спектральной линии ЯМР относительно некото- рой эталонной линии называют химическим СДВИ1'ом. Химичес кий сдвиl' (о) это отношение СДВИ1'а частоты поля (Д(О) к эта лонному значению «(00)' умноженное на 106: О (д<о!<оо) . 106 ДНjН о ' 106, 1'де Но напряженность постоянноrо маl'нитноrо поля. Величина О для в.лифатических протонов варьирует от O,5 дО 2,0, ароматических протонов от 6,0 до 8,5. В качестве эталона для протонноrо резонанса орrанических соединений ис пользуют тетраме'1'илсилан (СНЗ)4Si, а для водных растворов био- полимеров 2,2-диметил-2-силанпев:тан-5-сульфоновую кисло- ту (дсс). При высоком разрешении наблюдается сверхтонкая (мультиплетная) структура линий ЯМР, возникающая вследствие маrнитно:rо взаимодействия между ядрами, передаваемоrо через электроны связи (непрямое спин-спиновое взаимодействие). К недостаткам метода ЯМР следует отнести низкую чувстви тельность (концентрация образца должна быть не менее 10-3 моль/л), а также малую эффективность в изучении крупных молекул, Т.е. мембранных белков. 205
Метод ЭПР это резонансное поrлощение энерrии элеRТРО маrнитных колебаний в сантиметровом или миллиметровом ди апазоне длин волн веществами, содержащими парамаrнитные ча стицы (молеRУЛЫ, атомы, ионы, свободные радикалы, слабо свя занные с атомом электроны). Условие резонанса, при соблюде нии KOTopo1'o образец поrлощает электрома1'НИТНУЮ энер1'ИЮ, опи сывают уравнением hv '= E == gPH, 1'де h постоянная Планка; v частота переменно1'О электро- ма1'НИТНОI'О поля; E разность энерrий между маrнитными под уровнями, которые образуются в результате расщепления ypOB ней энер1'ИИ парамаrнитной частицы в постоянном ма1'НИТНОМ поле Н; g фаЕТОР расщепления (отношение маrнитноI'О MO мента парамаrнитной частицы к ее механическому моменту (спи ну); /3 ммнетон Бора. Метод ЭПР основан на введении в липидный бислой napaMa1' НИТНЫХ меток и зондов. Основу спиновых меток и зондов COCTaB ляет стабильный свободный иминоксильный (нитроксильный) радикал с неспаренным электроном, локализованным преиму- щественно у атома азота: н в () ()НЗ NO НзС СНЗ Если производное TaKOI'O радИRала присоединя:ется к бел.ку или липиду ковалентной связью, то такое npоизводное называют спиновой меткой, а если с помощ;ью электростатических сил и rидрофобных взаимодействий . o спиновым зондом. Выбор спиновоrо зонда или метки определяется задачами ис следоваEi:ИЯ:. Так, для иq:учения характера движения липидных молекул используют липофильные спинмеченные жирные кис лоты, rЛИRО и фосфолипиды. Последние применяют также для исследования латеральноrо фазовоrо разделения липидов и ли- пидбелковых взаимодействий. Некоторые амфифильные зонды, в частности 2,2,6,6.TeTpa метилпиперидинN-оксил (ТЕМРО), растворяются частично в yr- леводородной зоне мембраны, а частично в ее полярной облас ти. Поэтому ИХ спектры зависят от полярности окружения. Рас- 206
пределение TaKoro зонда в мембране опреде.тrется фазовым co стоянием липидов и "чувствительно" к их фазовым переходам. rидрофильные спиновые зонды, представляющие собой MO дификацию зонда ТЕМРО и изменяющие свой заряд в зависимо сти от величины рН, способны связываться с различными участ ками ПОЛЯРНЫХ rруrш мембраны за счет электростатических вза имодействий. Их используют для исследования поверхностноrо потенциала и плотности заряда мембранной поверхности. Более предпочтительным для изучения биомембран являет ся одновременное применение нескольких зондов, поразному вза имодействующих с компонентами мембран, что позволяет иссле довать цитоплазматическую и наружную поверхности мембран клеток и клеточных орrанелл. Таким образом, метод ЭПР применяют для изучения фазо вых переходов в липидном бислое, микровязкости мембран, под вижности У1'леводородных цепей, латеральной диффузии и "флип флоп"переходов. Недостаток этоrо метода заключается в том, что введение зонда изменяе'r структуру БИСJIОЯ и свойства мемб раны. Метод ЭIIP более чувствителен по сравнению с методом ЯМР, так как маrнитный момент электрона в 1000 раз выше, чем ядра. С помощью .lltето(}а Э.1lelстJю1tftой .lltикроскопии (разрешающая способность электронноrо микроскопа нахОДИТСJI в диапазоне 2 4 нм И превышает таковую для оптическоrо микроскопа более чем в 500 раз) исследуют МОРфОЛО1'ию внутренних поверхностей двух монослоев, распределение фаз в мембране, трехмерную моле кулярную структуру мембранных белков, форму и размеры солIO билизированных мембранных белков. Однако необходимость про ведения обезвоживания, фиксации и кон'rрастирования объекта солями тяжелых металлов приводит к существенной модифика ции cTpyKTypHoro состояния компонентов мембран. Разновидность метода эле:ктронно:й: микроскопии "замора живаниескалывание". Ero применяют для изучения хара:ктера связывания белков с мембранами. Для это1'о образец; не требую щий химической фи:ксации, замораживают в жидком азоте, а затем раскалывают в плоскости наименьшеrо сопротивления xo лодным ножом в вакууме. Плоскость наименьшеrо сопротивле ния проходит между двумя слоями липидной фазы мембраны. Далее поверхность образца покрывается платиной и уrлероДОМ, e1'o растворяют и отпечато:к (реплику) рассматривают в элек'l' 207
ронный микроскоп. Если лед возrоняют с поверхности образца, то модификацию метода называют "замораживаниетравление". Onmu'teC1Cue .иетоiJы позволяют получить информацию о Me ханизме фотосинтеза, электронном транспорте, транспорте кис лорода в тканях, транспорте ионов, взаимодействии )3еществ раз- личной природы с мембранами, белок-липидных взаимодействи- ях и друrих процессах. Они основаны на присутствии в изучае мой системе эндоrенных или экзоrенных (вносимых в систему экспериментатором) хромофорных rpупп. К эндоrеннЬJМ XPOMO форам относятся порфирины, флавины', каротиноиды, пиридин нуклеотиды, цитохромы, rемоrлобин, миоrлобин, которые поrло- щают свет в видимой области спектра. Акридины, нафталин- сулъфонаты, цианины являются ЭКЗО1'енными хромофорами. К оптическим методам относят абсорбционную спектрофотомет рию, люминесценцию, метод флуоресцентны:х. зондов, а также кру- rовой дихроизм, дисперсию оптическоro вращения. Последние наряду с ИК-спектроскопией и спектроскопией комбинационно 1'0 рассеяния используются для определения содержания различ ных элементов вторичной структуры молекулы белка, позволя- ют изучать ее конформационные переходы. Л ю м и н е с Ц е н Ц и я наблюдается в результате поrлощения веществом энер1'ИИ возбуждения, пере:х.ода ero частиц из OCHOB HOro в возбужденное электронное состояние и обратно. Она пред- ставляет собой свечение атомов, ионов, молекул и их комплек- сов, возникающее в результате электронно1'О перехода из возбуж денноrо состояния в основное. Все известные виды люминесценции подразделяют на два больших класса: флуоресценцию и фосфоресценцию. Под флу оресценцией понимают свечение, MrHOBeHHO (10-0 с) затухаю- щее после прекращения возбуждения. Квант флуоресценции испускается при переходе из синrлетноrо возбужденноrо со- стояния 81 (с ero нижнеrо колебательно1'О подуровня) в синr- летное основное состояние 80: 81" ----? 80 + hv фл' Фосфоресцен- ция свечение, продолжающееся в течение длительно1'О про межутка времени (>10-0 с) после прекращения возбуждения. Квант фосфоресценции высвечивается при переходе (с обра- щением спина) электрона из триплетноrо возбужденноrо co стояния Т 1 В основное состояние: Т 1 ----? 80 + hv фас' Есть и друrие виды классификации люминесценции: по типу возбуждения свечения и кинетике процесса люминесценции. Так, 208
в случае возбуждения вещества световыми квантами возникаю щее при этом свечение называется фотолюминесценцией. В зависимости от кинетических характеристик свечения вы- деляют резонансную, спон'rанную, вынужденную и рекомбина ционную люминесценцию. Резонансная флуоресценция основа процесса атомной лю- минесценции представляет собой излучение фотонов той же энерrии, что и у поrлощенных фотонов возбуждающеro света; наблюдается в rазах и кристаллах. При спонтанной люминесценции после возбуждения молеку- ла сначала переходит на высокий возбужденный электронный уровень 82' а затем путем безызлучательноrо перехода на бо лее низкий возбужденный уровень 81' Квант люминесценции BЫ свечивается при перех.оде 81 ---7 80' поэтому e1'o величина оказыва ется меньше, чем у ПОI'лощенноrо кванта. Спонтанная люминес ценция наблюдается у паров. растворов сложных молекул, моле- кулярных кристаллов. Вынужденная люминесценция характерна для сложных opra- нических молекул, находящихся: при низкой температуре или в жестких средах. В этом случае при возбуждении молекула пере ходит из состояния 80 в возбужденные состояния 82" и 81"' затем безызлуч:ательным путем в Т (триплетное), переход из KOTO poro в 80 запрещен правилами отбора. За счет внутренней коле- бательной энерrии или сообщенной извне тепловой энерrии ocy ществляется перех.од в основное состояние с испусканием кванта люминесценции. Спонтанный и вынужденный типы излучения наиболее xa рактерны для молекулярных систем и поэтому их называют мо- лекулярной люминесценцией. Рекомбинационная люминесценция наблюдается у rазов и сложных неорrанических кристаллов в случае рекомбинации ра- дикалов или ионов с образованием их возбужденных молекул. Спектром люминесценции вещества называют зависимость интенсивности люминесценции от длины волны (частоты) изме ряемо1'О света. Спектр возбуждения люминесценции это зави- симость интенсивности люминесценции от длины волны воз- БУЖД81Ощеrо света. Теоретически спектры возбуждения люминесценции молекул должны быть идентичны по форме их спектрам поrлощения и не зависеть от длины волны измерения флуоресценции. Однако 14. Заказ 3788 209,
чаще Bce1'o на практике эти спектры о'rличаются вследствие раз личий физикохимических свойств молекул в основном и воз бужденном состояниях. Например, в возбужденном состоянии Moryт изменяться rеометрические параметры, межатомные pac стояни.я: и, следовательно, дипольные моменты молекул, степень диссоциации последних. Для устранения кажущихся различий между спектрами поrлощения и возбуждения необходимо соблю дение следующих условий: а) одинаковой интенсивности возбуж дающе1'О света во всем диапазоне частот; б) отсутствие вторично ro ПО1'лощения исследуемо1'О излучения. Форма спектра люминесценции (правило Каши) и квантовый выход (закон Вавилова) не зависят от длины волны возбуждаю щеrо света. Это обусловлено тем, что при ПО1'лощении больших квантов возбуждающеro света происходит переход молекул из O.cHoBHoro состояния 80 в возбужденные 82"' 8З-, однако излуча 'тельный переход осуществл.я:ется только из состояния 81' (люми несценция), а переходы 82' ---+ S/, 8З- ---+ 8/ происходят безызлуча тельно. Соrласно правилу Стокса частоты возБУЖДaIOще1'О света Bce 1'да больше или равны частотам люминесценции: V.о.б>V. юм , т. е. одна часть ПО1'лощаемой молекулой энер1'ИИ Идет на возбужде ние люминесценции, а друrая расходуется на увеличение ее KO лебательной энерrии и развитие безызлучательных переходов. Однако cTporoe выполнение правила Сток са наблюдается у aTO мов и простых молекул в rазовой фазе. Спектры поrлощения и люминесценции молекул MOI'YТ перекрываться, Т.е. значения ча стот переходов между электронными уровнями при поrлощении Moryт быть меньше, чем при испускании. Следовательно, наблю дается нарушение правила Стокса. Часть спектра люминесцен ции, rде выполняется правило Стокса, называетс.я: стоксовой об ластью, а 1'де оно нарушается антистоксовой. Поэтому это пра вило характеризует одиноЧ:'Ный акт поrлощения и испускания света молекулой. В соответствии с законом СтоксаЛоммеJLЯ спектр излуче ния и ero максимум всеrда сдвинуты по сравнению со спектром ПО1'лощения и ero максимумом в сторону более длинных волн: hv люм < hv доrл. КD..ICC ыnш Э-rот закон носит статистический характер и описывает по rлощательные и излучательные свойства совокупности молекул 210
исследуемо1'О образца. Поэтому образование антистОКСОВОЙ об ласт и спектра люминесценции не противоречит за.кону coxpa нения энерrии: колебательная энерrия молекул частично пре образуется в энерrию их люминесценции, что удовлетворяет yc ловию: hv > hv . ЛЮМ поrл Закон СтоксаЛоммеля явл-яется качественным выражени ем правила зеркальной симметрии спектров поrлощения и лю минесценции Левшина, :которое rласит: спектры поrлощения и люминесценции зеркально симметричны относительно прямой, проходящей перпендикулярно Ее оси частот (длин волн) через точку пересечения спе.ктров. Эффективность процесса превращени-я энер1'ИИ возбуждаю щеrо света в энер1'ИЮ люминесценции характеризуется KBaHTO вым выходом люминесценции. Это отношение числа высвечен ных квантов люминесценции к числу поrлощенны:х квантов воз. буждающеrо света. Молекулы люминесцирующих веществ оптически аНИЗ0 тропны, поэтому люминесцентное излучение каждой молеку лы частично поляризовано. Если анизотропные молекулы ори- ентированы хаотично, то вещество в целом становится изо тропным, а ero люминесценция неполяризованной. При воз- буждении вещества линейнопол-яризованным светом e1'o по- rлощение осуществляется молекулами, у которых ПOl'JIощаю щий осциллятор параллелен электрическому вектору падаю щеrо света. Поэтому поrлощение полностью oTcyтcTBye'r у МО, лекул, поrлощающий осциллятор которых перпендикулярен электрическому вектору возбуждающеrо света. В этом случае измеряют поляризационные спектры флуоресценции зави- симость степени поляризации флуоресценции объекта от дли ны волны возбуждающеrо света (поляризационные спектры по поrлощению) или длины волны ре1'истрации при фиксиро ванной длине волны возбуждени-я (пол:яризационные спектры по испусканию). Для количественной оценки поляризованной люминесценции используют степень поляризации (Р) люминесценции: р == (I!l IJ/(I!l + 1), rде I п и IJ. соотве1'ственно параллельна.я и перпендикулярная электрическому вектору возбуждающе1'О света составляющие по ляризоваНЕОЙ люминесценции. 14* 211
Степень анизотропии (r ) излучения определяется по форму ле: r == (l п 1.L)j(l п + 21.L)' Использование этой характеристики для описания процессов поляризованной люминесценции более корректно, так как учи тывает третью составляющую, перпендикулярную электрическому вектору возбуждающе1'О света (т.е. в знаменателе уравнения для определения r находится величина, пропорциональная суммар- ному значению интенсивности). Связь междУ величинами Р и r отражает следующее уравне- ние: r == 2Р/(3 Р). Анизотропия оптической среды проявляется: каЕ при испус- кании, так и при ПО1'лощении света. Для характеристики ани- зотропии поrлощения света используют степень дихроизма d: d == (D п D.L)/(D Il + D}, 1'де DIl и D.L оптические плотности, измеренные при облучении исследУемоrо образца линейнополяризованным светом с коле баниями электрическоrо вектора, параллельными и перпендику- л.ярными 1'лавной оптической оси системы. Перреном и Яблонским установлена связь междУ Степенью поляризации (Р) флуоресценции и вязкостью среды (11): l/P 1/3 == (l/P o 1/3)' ('tRT/Vll + 1), rде РО предельное значение поляризации при T/ll ----? о; R универсальная rазовая постоянная; Т абсолютная температу- ра; V объем моля флуоресцирующих молекул; "с время жиз- ни возбужденноrо состояния. Этой формулой пользуются для рас- чета значений "С. Варьируя уrол направления поляризации флуоресценции, ус- танавливают нarrравление и степень ориентации молекул в ана- лизируемом образце. Исследование поляризации флуоресценции позволяет изучать МИrpацию энерrии в биосистемах, определять размеры биомакромолекул и время жизни их. возбужденно1'О co стояния. Поляризацию флуоресценции определяют для Toro, что- бы судить о МИЕРОВЯЗКОСТИ мембраны. Так, микровязкост:ь мембраны изучают путем измерения Р для флуоресцентноro зонда, введнноrо в исследуемую систему. Метод флуоресцентных зондов подробно рассмотрен в разделе 6.4. 212
в целом флуоресцентный метод анализа один из безынер- ционных, высокочувствительных методов исследования, приме- няемых для качественно1'О и количественноrо анализа смесей ве- ществ, изучения механизма фотофизических и фотохимических процессов в биосистемах и конформационных свойств биомакро- молекул. Ин фр а к расн ая (ИК) сп ектроск о п ия занимается анализом молекулярных спектров, так как в ИЕ-области спект- ра (10 000400 CMl) расположено большинство колебательных и вращательных спектров молекул. В ИRдиапазоне поrлощает ся свет тех частот, которые равны частотам колебаний атомов в молекуле. ИКспектр поrлощения, возникающий в результате по- l'лощения ИКизлучения при прохождении el'o через вещество, состоит из большоrо числа полос, причем часть полос поrлоще ния обусловлена колебаниями отдельных атомных rруппи:ровок, более или менее сохраняющих свои свойства в разных молеку- лах. Характеристики ИЕ-спектра (число полос ПО1'лощения, их положение, определяемое частотой v или длиной волны Л, шири- на и форма, интенсивность поrлощения в максимумах) определя ются структурой и химическим составом поrлощающеrо веще- ства и зависят от e1'o CTpYКTypHoro состояния, а также темпера- туры, давления и друrих факторов. Метод ИЕ-спектроскопии позволяет определять структуру молекул, их химический состав, моменты инерции, величины сил, действующих между атомами в молекуле, про водить качественный и количественный анализ смесей различных веществ. Сущность одноrо из видов метода ИКспектроскоnии ИК--ди хроизма заключается в измерении разности поrлощения CBe та, поляризованноrо вдоль оси ориентаци:и и перпендикул.я:рно этой оси ориентации молекулы. С помощью измерения ИК-дих- роизма можно установить, как направлены важнейшие rpуппы белка (> С == О и NH) по отношению к оси ero макромолекулы. Необходимыми для определения частотами пептидной связи бел ков явл.я:ются следующие: 3330 CM- l дл.я: валентноrо колебания NН-rруппы (колебание ядер вдоль линии связи между атомами в молекуле), 1660 CM- l для валентноrо колебания >СОrpуппы и 1550 CM- l для деформационноrо колебания (колебания, обуслов- ленные периодическими изменен:иями У1'ла межДУ связями от- дельных атомов в молеI<уле ) NН-rруппы. Анализ смещеlfИЯ этих полос поrлощения, изменения их ширины, формы, велич:ины по- 213
rлощения позволяет судить о состоянии вторичной структуры белков и полипептидов. Дисперсия оптическоrо вращения (оптической aK тивности) зависимость уrла вращения (поворота) плоскости поляризации света (с:р) или удельной оптической активности (удельноrо вращения [а]) от ДЛИНЫ волны л. оптическоro излуче ния, проходящеrо через среду: q> == [а] 'с, .rде 1 толщина слоя активноrо вещества или ero раствора; с концентрация этоrо вещества. IIOBOPOT плоскости поляризации В данной среде происходит либо по часовой стрелке (q»O), либо против часовой стрелки (с:р<О), если смотреть навстречу ХОДУ лучей. В связи с этим вещесТва, проявляющие естественную оптическую активность, не вызыва емую наличием внешних полей, разделяют на правовращающие (положительно вращающие d, <р>0) и левовращающие (отри цатеJj;ЬНО вращающие 1, <р<0). Ж. Вио (1815) установил, что в случае чистых ЖИДкостей, растворов и паров мноrих орrаничес ких веществ уrол вращения плоскости поляризации q> тем MeHЬ ше, чем больше л. (q> л.2). Такая дисперсия оптическоI'О враще ния (ДОВ) хаРalтерна для нормальной оптической плотности вдали от Длин воЗIН л. о ' на которых в оптически активном веще стве происходит резонансное поrлощение. Э. Коттон, изучавший оптическую активность для излучений с Л, близкими к Л О (212 нм), обнаружил аномальную оптическую активность увеличение q> с ростом л. IIри анализе оптической активности веществ, в том числе белков и полипептидов, наиболее удобной величиной является молярное вращение [М]).., связанное с удельным вращением [а]).. следующим уравнением: [М]).. == [а).: Mjl00. В качестве молекулярной массы М применяют среднюю Mac су :м: аминокислотноrо остатка из числа остатков, составляющих полипептидную цепь белковой макромолекулы. Кривые диспер сии оптическоrо вращения и KpyroBoro дихроизма в области эффекта Коттона, rде поrлощение обусловлено основной поли пептидной цепью, отражают вторичную структуру белковых MO лекул. Изучение и анализ кривых ДОВ и KpyroBoro дихроизма для таких конформаций, .как аспираль, CTpYKTypa, неупорядо 214
ченная конформация, проводятся на основании результатов ис следования синтетических полипептидов (полиrлутаминовой кислоты или полили зина), а также по экспериментальным дaE ным для белков, структура которых установлена методом peHT reHocTpYKTypHoro анализа. Круrовой дихроизм (эффект Кот тона) это разли чие поrлощения для света правой и левой KpyroBbIx поляриза ций. Эффект Коттона является одним из лучших современных методов х.арактеристики природы спиральных конформаций и оценки степени спиральности белковых молекул. Мuкрокалорu.метрuft информативный метод исследования термодинамических характеристик вещества, в частности, TeM пературноrо хода теплоемкости. Современные чувствитеЛЬЕые микрокалориметры используют для исследования фазовых пepe ходов (определения изменений энтальп:ии и энтропии этих про цессов) в воднолипидных суспензиях с использованием неболь ших (несколько Mr) количеств материала. Принцип метода диф ференциальной сканирующей калориметрии состоит в измере ЕИИ количества тепла, необходи:м:оI'О для увеличения температу ры объекта на очень малую величину в пределах узкоrо TeMпepa TypHoro интервала при постоянном давлении. Для изучения фазовых. переходов при плавлении фосфоли ПИДЕЫХ бислоев измеряют теплоемкость С суспензии фосфоли- р пидов при разных температурах в области фазовоrо перехода. Показано, что в этой .области происходит резкое возрастаЕие зна- чения С . Максиму:м: теплоемкости на кривой зависимости С от р р температуры соответствует температуре плавления. Площадь под пиком на указаНЕОЙ кривой соответствует общему количеству тепла, ПОI'лощаемому при переходе из твердо1'О состояния липид EOro слоя в жидкое (фазовый переход). Для чистых липидов Be личины изменения энтальпии и энтропии для перехода крис- талл жидкий кристалл линейно зависят от длины уrлеводо родных цепей. В целом те:м:пература плавления понижается в рядУ: холины этаноламины серины. Типичные зависимос- ти избыточной уДельной теплоемкости от температуры для ди пальмитоилфосфатидилхолина имеют два максимума. Максимум при более высокой температуре соответствует собственно пере ходу при температуре ТП (температуре плавления), друrой xapaK теризует так называемый предпереход, при котором происходит трансформация одномерной ламелляр:е:ой решетки в двумерную, 215
образованную искаженными слоями липида и нарушенную пе риодичеСRИМИ складками. Водные дисперсии, содержащие два или более липидных KOM понентов, проявляют rораздо более сложные термотропные свой ства. Метоо .мооелировон.uя и получения иС1Сусствеян.ых .ме.мб ран. основан на получении и исслеДовании MOHO и бимолеку лярных липидных слоев, везикул, липосом и протеолипосом. Существует два основных типа искусственных мембран: клас сические плоские и сферические мембраны различноrо разме ра. Для получения искусственных мембран используют различ ные фосфатиды, нейтральные rЛИЦериды, смеси липидов биоло 1'ическоrо происхождения, добавляя к ним холестерин, aTOKO ферол и ДРУ1'ие минорные добавRИ. Потенциальная ценность искусственных мембран для исследований зависит от возмож ности включения в них природных белков, в особенности тех, которые обладают транспортными свойствами. Липосом:ы, co стоящие из белков и липидов, стали получать в 60e rr.; термин "протеолипосомы" был введен В. П. Скулачевым. В настоящее время разработан целый ряд методов приrотовления различных типов липосом и протеолипосом, а также их стандартизации по размерам, структуре, rомоrенности, стабильности и друrим xa рактеристикам. Липосомы используют для достаВRИ в клетку лекарственных и химических соединений, стабилизации фер ментов в инженерной энзимолоrии, введения в клеточные мем- браны молекул зондов, модифицирующих и моделирующих их поверхность. Большой интерес для rенной инженерии и меди цины представляют работы по введению в клетки при помощи липосом нуклеиновых RИСЛОТ и вирусов. В липосомы включа ют митохондриальные компоненты и изучают на таких модель ных системах процессы rенерации энерrии в клетках. Ультра тонкие искусственные мембранные CTPYRTYPbl полислои Лен- 1'мюраБложе (ПЛБ) применяют для получения био- и им муносенсоров. Создаются ПЛБ с иммобилизованными фермен- тами и компонентами иммунолоrических систем. При исполь зовании смешанных липид-беЛКQВЫХ пленок ПЛБ получают информацию о функционировании белков и о липидбелковых взаимодействиях в мембране. Результаты изучения физичес ких характеристик, проводимости, проницаемости и друrих свойств искусственных липидных мембран имеют большое зна 216
чение для понимания структурно-функциональной орrанизации нативных БИОЛО1'ичес'Ких мембран. Необходимо отметить, что для решения определенной науч- ной задачи применяю'{' не один, а целый ряд методов, что позво ляет скомпенсировать недостаТl<И и оrраничения каждоrо из них за счет достоинств дру1'их методов. Так, например, для исследо- вания белоклипидных взаимодействий используют методы ЭПР, ЯМР, измерения флуоресценции, комбинационноrо рассеяния, ик- спектрофотометрии и др. 5.2. ВЫДЕЛЕНИЕ И Р А3ДЕЛЕНИЕ МЕМБРАН Выделению мембран предшествует этап разрушения клеток и тканей. Для этоrо подбирают методику, позволяющую не толь- ко эффективно разрушать клетки, но и сохранять нативную струк- туру мембран, подлежащих выделению. При выделении большин- ства мембран животных клеток используют I'Oмоreнизацию в I'O- моrенизаторах Даунса и Поттера со стеклянными стенками и теф- лоновым пестиком. Для разрушения клеток применяют также вращающиеся ножевые rомоrенизаторы. Предварительно свеже- выделенную ткань измельчают и промывают водой. В I'Oмоrени- заторе клетки разрушаются за счет СДВИ1'овых УСИЛИЙ, возника- ющих при продавливании суспензии через узкий зазор между тефлоновым пестиком и стеклянной стенкой. При rомоrениза- ции следует тщательно подбирать значение рН, ИОннуlO силу и состав буферноrо раствора. Часто в качестве суспендирующей среды используют раствор сахарозы в концентрации 0,25 моль/л с добавлением хлорида мarния, комnлексообразователей (напри- мер, ЭДТА) , восстановителей (дитиотреитол, -меркаптоэтанол). С целью облеrчения последующеrо разрушения растительных, rрибных и бактериальных .клеток их сначала обрабатывают фер ментами, расщепляющими компоненты 'Клеточной стенки (лизо- цим, целлюлаза). Более жесткая обработка клеток предусматри вает их растирание с помощью абразивных материалов (стеклян- ных. шариков, песка, оксида алюминия), разрушение ультразву- ком и путем экструзии (продавливание суспензии клеток через отверстия под давлением). Полученный 1'OMoreHaT кле'l'ОК проце- живают и используют дальше для получения мембран. Чаще Bcero для разделения мембран применяют .метод цент- рuфуzuроеанUJl. Мембранные частицЫ разделяют по скорости их седиментации (зональное центрифуrирование) или по плавучей 217
плотности (изопикническое центрифуrирование). Коэффициент седиментации (8) определяется по формуле: 8 =' vjw2r == т(1 Vp)jf, 1'де v скорость движения частицы; w уrловая скорость Bpa щения ротора; r расстояние до центра вращения; m масса часТИцы; f коэффициент трения; р плотность растворителя; V парциальный удельный объем частицы (равный увеличе нию объема, вызываемоrо прибавлением единицы массы paCTBO ряемо1'О вещества к раствору). Величина коэффициента седи:ментации зависит от несколь ких факторов: концентрации раствора, скорости движения час тиц, заряда, формы и массы частиц. Введено понятие CTaндapTHO ro значения константы седи:ментации, опредляемое в системе, имеющей вязкость и плотность воды при +20 ос (8o). Для выделения различных :мембранных структур из rOMore ната, имеющих разные величины коэффициента седиментации, применяют зональное центрифуrирование в rрадиенте плотнос ти определенных веществ. Исследуемый раствор наносят на пред варительно ПРИ1'отовленный в центрифужной пробирке rради ент плотности и центрифуrируют. I'pадиент создается путемпо следовательноrо наслоения растворов rрадиентной среды YMeHЬ шающейся концентрации (плотности) в центрифужной пробир ке. Субклеточные структуры разделяются на отдельные зоны в соответствии с их относительной плотностью. Для создания rpa" диента плотности необхоо подбирать вещества в чистом co стоянии, не взаимодействующие с компонентами суспензии и реarентами исследуемоrо раствора. Чаще Bce1'o для ЭТО1'о исполь- зуют сахарозу, однако ее растворы с высокой концентарцией имеют большую вязкость, вследствие чеrо происходит деrидра- тация орrанелл или их лизис. Кроме Toro, серьезным недостат- ком ЭТО1'о метода является проницаемость МЕО1'их ОР1'анелл для сахарозы, что вызывает их осмотическое разрушение и измене- ние эффективной плотности. Поэтому в настоящее время для создания rрадиента ПЛОТНОСТИ предпочитают применять друrие среды: фиколл, перколл и др, (табл. 16). Основные компоненты клетки осаждают в такой последова тельности: целые клетки и их фраrменты, ядра, митохондрии, лизосомы, микротельца, микросомы (фраrменты эндоплазмати ческой сети и плазматических мембран), отдельные типы мемб- ранных структур. 218
Таблица 16 Харщстерuстщса некоторых zpa(}ueJl.mHblX сре(} для вы(}елеltu.я .мембраН-ltых компонентов .мето(}ом цен-трuфузuрован-uя Кон- Плот- Вяз- Осмоляль Среда Структура цeHT ность, кость, ность, Преимущества или рация, r/мл сП мOcM/Rr неДОC'l'атки % Н 2 О Сахароза Дисахарид 20 1,06 30 700 rипертонические раство- С '2 Н 2 Рll ры способны вызывать ли- исорrанелл ФИКОЛЛ fидро- 30 1,10 49 130 Низкое осмотичеСRое дaв фильный ление позволяет создавать полимер растворы, изотоничные во (400 RДа) сем диапазоне Rонцент- сахарозы раций блa.roдаря допол- нительному в.ключению r:a.харозы или солей. Вы- оо:кая ВЛЗRQСТЬ растJlОрОВ и нелинейн8Я за;висимость ВSIЗROC'l'И И осмолярности от Rонцентрации Пер.колл Коллоид- 26 1,13 10 10 РаСТJlОрЫ имеют низкую н8Я суспен- ВSIЗROC'l'Ь и осмолярн ОСТЬ, зип сили- не проник!\Ют через мемб- кareля, рану. Большой размер частицы частиц при умеренных KOTOporo скорOC'l'ЯХ оборота ело- покрыты обствует формированию поливн- rрадиента. ПЛОТИОС1'И и нилпирро- быстрому разделению_ лндоном Среда разделения может быть изотоничиой блa.roдаря ВIслючению сахарозы или солей Необходимо отметить, что получаемые при разрушении кле ток мембранные фраrменты способны самопроизвольно образо вывать замкнутые пузырьки везикулы. К ним ОТНОСЯт мик росомы, субмитохондриальные частицы из внутренней митохон- дриальной мембраны, синаптосомы, образующиеся при отрыве нервных окончаний в области синаптических контактов. CKO рость оседания таких. частиц при центрифyrировании определя- ется их размерами, зависящими от метода разрушения клеток и состава среды. Для сохранения замкнутости мембранных opra нелл используют среду, изоосмотичную их внутреннему содер- жимому (сорбитол, маннитол, сахарозу). , Следует подчеркнуть, что препаративные типы центрифуr при- меняют для получения и очистки клеточных орrаиелл или Maкpo молекул, т. е. чистых фракций (препаратов). Аналитические цент- 219
рифуrи П03ВОJIЯЮТ анализировать распределение веществ в про бирке в течение вcero опыта. Поэтому они снабжены оптической системой (mлиреновской, :и:втерференционной, абсорбционной). Для выделения мембран из клеточных roMoreHaToB использу* ют и друrие методы: хроматоrрафию, электрофорез, адсорбцию. РаспреiJелuтеЛЫШJl ХрО.!ltаmоzрафия основана на различиях в распределении разделяемых веществ между двумя фазами: под* вижной (растворитель) и неподвижной (сорбент). Ее разновидно стями являются хроматоrpафия на бумаrе, тонкослойная, коло ночная, rазожидкостная. Большой разрешающей способностью характеризуется тонкослойная хром:атоrрафия: она ПОЗВОJIяет об наружить 1 нмоль вещества. Слой сорбента (толщина до 0,5 мм) rотовится из с:и:ликаrеля, оксида алюминия, целлюлозы. При этом обеспечивается низкое отношение массы pacTBopeHHo1'o вещества к массе сорбента (до 1/108) и большое отношение поверхности к объему. Разрешающая способность метода колоночной xpOMaTO rрафии на несколько порядков ниже, чем для тонкослоЙной, так как отношение массы растворенных веществ к массе сорбента равно 1/50. А(}сор(fЦUОН-1tая хро.!ltаm02рафuя основывается на различной способности молекул смеси адсорбироваться на поверхности HO сите.тr (силикаrель, окись алюминия, активированный уroль) при пропускании через Hero подвижной фазы. Принцип метода ионообменной хроматоrрафии разновидности адсорбционной хроматоrрафии заключается в способности ионообменника (OT рицательно заряженноrо катионита или положитеJIЬНО заряжен Horo анионита) обратимо адсорбировать заряженные молекулы при определенных значениях рН. Мембранные белки и уrлеводы разделяют на ионнообменниках на основе целлюлозы, декстрана, полиакриламида. FельпРОlluтсающaJ{, хро.!ltаm02рафUJl успешно применяется для разделения и очистки мембранных белковферментов, так как позволяет фракционировать вещества в широких диапазонах рН, температуры, ионной силы без адсорбции на носителе молекул разделяемых соединений. Метод основан на принципе обратноrо молекулярноro сита: более крупные молекулы быстрее проходят через слой мелких частиц носителя, а более мелкие (с диаметром меньше или равным диаметру пор в частице) медленнее, так как диффундируют через поры инертноrо материала. В качестве молекулярных сит используют декстрановые, а1'арозные и поли 220
акриламидные rели. Преимущество этоrо метода заключается в том, что он позволяет не только разделять, но и очищать и KOH центрировать макромолекулы (например, при добавлении к ис следуемому раствору сухих rpанул rеля с диаметром пор MeHЬ ше, чем диаМетр молекул). Для выделения различных мембранных структур использу ется и аффUllНДЯ хро.матоzрафuя.. Принциn этоrо метода заклю чается в способности выделяемоrо вещества специфически свя зываться с ЛИrандом, "пришитым" к нерастворимому носителю, при про пускании раствора через матрицу. В качестве последней применяют сефарозы (аrарозные rели), активируемые путем свя зывания различных ЛИ1'андов: кофакторов, инrибиторов, субстра тов мембранных белковферментов, лектинов в случае выделе ния: rликопротеинов; 1'ормонов, бромциана, конканавалина А соответственно при получении мембран, антител или целых Кле ток. Элюирование исследуемоro вещества осуществляют в усло виях диссоциации комплекса лиrанд вещество и сохранения нативной структуры выделяемо1'О соединения. Заряженные компоненты биомембран разделяют .lltетоао.м электрофореsа по скорости их движения в электрическом поле, которая зависит от величины заряда, молекулярной массы и фор мы молекул. Максимальное разделение макромолекул (в частно сти, мембранных белков) обеспечивается при использовании Me тода дискэлектрофореза в полиакриламидном rеле (ПAAI'). Ero название "диск" происходит от дискретноro напряжения элект рическоrо поля, что обусловлено прерывис'l'ЫМ rpадиентом рН в системе. Верхняя часть полимеризующе1'ОСЯ rеля: в стеклянной вертикальной трубке, на которую наносится исследуемый обра зец, имеет меньшую концентрацию, а нижняя часть (разделяю щий rель) большую. За счет большо1'О размера пор верхних слоев 1'ел.я и большоro rрадиента электрическоrо поля происхо дит быстрое движение и накопление вещества на верхней rpани це раздел.яющеl'О rеля, в котором в зависимости от подвижности разделяемых белков образуются различные зоны, I<:OTOpble иден тифицируют после удаления rеля из трубки. Для определения молекулярной массы мембранных белков используют SDS ПААrэлектрофорез с применением додецилсульфата натрия (ДСН, SDS), связываЮЩеrося с белком и вызываЮЩе1'О ero диссо циацию. Подвижность белка в комплексе с ДСН будет опреде 'Ляться только молекулярной массой биополимера, а заряд дo 221
децилсульфатом (при постоянстве количества связываемоro лю боrо типа белка додецилсульфатом: 1,41,5 r дсн на 1 r белка). Количественные измерения проводят оптическим методом с ис пользованием денситометра. Разновидность электрофореза изоэлектрическое фокуси рование. Метод основан на электрофоретическом разделении сме- си белков в rрадиенте рН с достижением изоэлеК'l'рической точ ки (ИЭТ) каждоrо белка и ero "фокусированием" в отдельной зоне и применяется для быстроrо и эффективноrо фракциониро- вания больших количеств (несколько rpaMMoB) образца на на- чальных стадиях ero очистки. 5.3. ОЦЕНКА ЧИСТОТЫ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ Наиболее часто для оценки чистоты выделенных мембран ных фракций используют методы исследования удельной актив ности ферментов, называемых маркерами. Маркерные ферменты должны быть локализованы в определенном типе мембранных структур и катализировать реакции, соответствующие специфи ческим функциям этих мембран. Ероме TOro, фермент можно использовать как маркер, если он прочно связан с мембраной и не подверrается активации или инrибированию при разделении мембранных фракций (табл. 17). Активность маркерных фермен Таблица 17 Биохu.мultеСJCuе .маркеры, uспользуе.мые ОЛJl контроЛJl 'щстоты .ме.мбранных фракций Мембранная фракция МаРRерный фермент ПлазматичеСRие мембраны 5"НУRлеотидаза (КФ 3.1.3.5) Щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) АденилатциклаЗIl (КФ 4.6.1.1) Na+, K+-АТФаза (КФ 3.6.1.3) Ядра NAD-ЛИРОфОСфОРИЛ8за (КФ 2.7.7.1) ЭндоллазматичеСRая сеть rЛЮRозо-6-фосфатаза (КФ 3.1.3.10) Мик})осомы NADрН.деrидроreназа (КФ 1.2.1.16) Пероксисомы Каталаза (КФ 1.11.1.6) Лизосомы Кислая РНКаза (КФ 3.1.4.8) Кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2) Саркоплазматическнй ретику лум Са 2 +АТФаза (КФ 3.6.3.з) Мптохондрии: наружная мембрана МоноаМИНООll:сидаза (КФ 1.4.3.4) внутрення:я: мембран Цитохромоксидаза (КФ 1.9.з.1) Цптохром-с-редуктаза (КФ 1.6.9.3) Цитозоль Лактатдеrндроreназа (КФ 1.1.1.27) 222
тов контролирую'r на каждом этапе выделения и разделения мембран в исходном rOMoreHaTe и в каждой фракции с целью определения стадии осаждения и выхода исследуемых мембран ных структур, а также потерь мембранных фракций. rOMoreH ность выделенноrо препарата мембран анализируют на OCHOBa нии увеличения активности MapKepHoro фермента (OB) в нем по сравнению с исходным 1'OMoreHaToM клеток. Часто используют не один, а дватри мембранных маркера. Однако необходимо по мнить, что и мембраны одноrо типа способны проявлять 1'eTepo reHHocTb, связанную с асимметрией белковоrо, липидноrо и уrле водноrо состава мембран, в результате чеrо фермент может Haxo диться в латентной форме изза нарушения ориентации мембра ны инедоступности активноrо центра для субстрата, например, в обращенных мембранных везикулах. Наиболее леrко из внутри клеточных орrанелл идентифицируют митохондрии и ядра, за тем лизосомы и пероксисомы, наиболее трудно плазмати ческие мембраны и мембраны эндоплазматической сети. Слож ность разделения последних обусловлена близостью величин ди апазона плотностей этих структур, поэтому разделение по CKOpO сти седиментации осуществляется в 'l'OM случае, если плазмати ческие мембраны представлены крупными фраrментами. С целью преодоления недостатков вышеуказанноrо метода для оценки чистоты мембранных фракций удобнее использовать не ферменты, а специфические рецепторы лектинов, ropMoHoB, aH тител. В том случае, если мембрана имеет четкие морфолоrичес кие признаки, в качестве критерия применяют метод ЭЛeI<ТРОН ной микроскопии. Если хорошо изучен химический состав опре деленноrо типа мембран, то для контроля чистоты мембранных структур используют анализ белковоI'О и липидноrо состава (Ha пример, методом электрофореза в ПAAI' в присутствии ДСН или путем определения содержания холестерина). 5.4. ВЫДЕЛЕНИЕ .и ОЧИСТКА МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ Исследование структурнофу:нкциональноrо состояния мемб ранных белков осуществляют после проведения двух важнейших этапов: выделения и очистки определенноrо белка; анализа полученной фракции для определения ее чистоты и исследования структуры чистоrо компонента. 223
в разделе 5.2. были охарактеризованы методы выделения MeM бранных структур, которые широко используются и для получе ния мембранных белков. Поэтому остановимся на некоторых воп росах, касающихся очистки интеrральных мембранных белков с применением детерrентов. Детерrенты это rруппа а:м:фифильных соединений, KOTO рые способны связываться с rидРофобными участками мембран ных белков, контактирующими с липидной фазой мембран, тем самым разрушая ее структуру. В ходе солюбилизации мембран детерrентами последние модифицируют бислой липидов, разрых ляя ero, затем образуют смешанные (белоклипиддетерrентные) мицеллы, а в конечном итоrе детерrентбелковые и лиnид детерrентные мицеллы. Для сохранения мембранных белков в растворимом состоянии необходимо постоянное присутствие дe TepreHTa. Ero удаление приводит к аrреrации и последующему осаждению молекул белка. Основной проблемой очистки белков является подбор дe TepreHTa и оптимальных условий солюбилизации их молекул. Детерrент не должен нарушать высшие типы пространствен ной орrанизации белков, а лишь замещать молекулы липидов, контактирующие с rидрофобными участками белковой rлобу лы. Критерий максимальной солюбилизации белка переход ero молекул в надосадочную жидкость после осаждения мемб ран. Причем важным требованием процедуры солюбилизации является сохранение функциональной активности биополиме ра и ero стабилизация. Для это1'О в исследуемую систему дo бавляют экзоrенные фосфолипиды, rлицерин, инrибиторы про теаз. Следует отметить, что получаемые при очистке белок детерrентные комплексы Moryт содержать значительные KO личества связанных фосфолипидов, что необходимо учитывать при дальнейшем разделении и характеристике получаемоrо препарата белка. При выборе детерrента необходимо учитывать: 1) критическую концентрацию мицеллообразования и размер мицелл детерrента; 2) заряд детерrента; 3) возможность осаждения при определенном значении рН; 4) возможность светопоrлощения в диапазоне длин волн, ис- пользуемом при определении концентрации белка оптическим методом (при 280 нм). 224
Если концентрация детерrента превышает критическую концентрацию мицеллообразования, то детер1'ен'l' полностью солюбилизирует мембранные структуры. В противоположном случае (концентрация меньше !{:КМ) детерrент :модифицирует мембрану, не разрушая полностью ЛИПИДFIЫЙ бислой. Кроме Toro, необходимо учитывать зависимость этоrо параметра от температуры и ионной силы среды. Детерrенты с низкой КЕМ, образующие крупные мицеллы, вследствие низкой KOHцeHT рации мономеров не способны полностью удаляться при диа лизе или ультрафильтрации, что может привести к дeHaTypa ции белка при накоплении молекул детер1'ента. Поэтому удоб нее пользоваться детерrентами с высокими значениями :К:КМ (цвиттерионные детерrенты, соли желчных кислот, ОI<тилrлю козид). Еще одной характеристикой детерrента является ero аrреrационное число. Это количество молекул, входящих в состав одной мицеллы. Детерrенты с высоким аrреrационным числом образуют выраженные :мицеллярные структуры, KO торые внедряются в липидный бислой и солюбилизируют ero. Детер1'енты с низким аrреrационным числом не способны образовывать собственные мицеллы и лишь встраиваются в бислой липидов. Выбор детерrента для выделения и очистки определенноrо мембранно1'О белка осуществляется методом проб и ошибок, oд нако исследователи стремятся к использованию минимальных концентраций детерrента с целью сохранения нативно1'О CTPYK турнофункциональноrо состояния изучаемоrо белка. Наиболее эффеr<тивными считают неионные детерrенты (тритон XlOO, OK тилrлюкозид), соли желчных кислот (холат, дезоксихолат), цвит терионные де'I'ер1'ентЫ. На рис. 60 приведены структурные формулы, а в табл. 18 описаны свойства некоторых детерrентов, используемых дЛЯ BЫ деления и очистки мембранных белков. Необходимо отметить, что свойства растворов солей желчных l<ИСЛОТ существенно за висят от температуры, рН, ионной силы. Эти соединения способ ны к образованию 1'елей при сдвиrе рН на единицу выше рЕа (для холата 5,2, для дезоксихолата 6,2). 15. Заказ 3788 225
Додецилсульфат натрия О 11 'V'V'VVVOSONa + 11 О Холат натрия О НО 11 .C'01<a' НО ОН Сульфобетаины (Цвиперrенты) СНз О 1 11 N+S",,() I 11 СНз О f)DОктилrлюкозид СН 2 ОН VVVVO ОН ОН Дезоксихолат натрия О 11 .C'O.Na' НО Лаурилдиметиламиноксид (Додецилам инNо ксид) СНз 1 N+O I СНз Эфиры жирных кислот полиоксиэтиленсорбитана (СхсорбитанЕп) серии Твин О (ОСН 2 СН 2 )с ОН 11 I 9 A/V'VV'V С(ОСН2СН2)W""ОСНт-СН I(OCH2CH2)yOH (OCH2CH2),OH n=w+x+y+z Полиоксиэтиленпаратретоктилфенолы (TpeTCe eJ Еп): Тритон X100, n = 910 ТритонХ114, п=78 .1. 1 Нонидет Р-40, n = 9 (ОСН2СН2)ПОН Рис. 60. Структурные формулы HeKO'l'OpbIX детерrентов, используе МЫХ Е мембранолоrии 226
Таблица 18 Свойства некоторых iJeтepzellll108 ККМ, Молеку- Размер Arpera- У дельный Детерreн'I'Ы ля:рная ЦИОllное объем, ММОJIЬ/Л масса мицеJIЛ число мл/r Додецилсульфа1' натрия 1,33 288 24500 85 0,864 (анионный AeTepreHT) Холат на1'рИЯ 3 408 2100 5 0,778 (0,15 ммоль/л NaCl, 20 'С, рН 9,0) ДеЗОКСИХОJIа'l' натрия 0,91 392 2300 55 0,771 (0,15 ммоль/л NaCJ, 20 'С, рН 9,0) Тритон Х-100 0,24 628 90000 1'10 0,908 (незаряженный детерrето)* Твин 80 0,012 1300 76000 60 0,896 (незаря:жеНllЫЙ детерrент)* [3-D-ОКТилrJJlОКОЗИД 25 293 8000 27 0,820 (незаряж.енный. детерrент) ЛаурилдиметилщvIИНОКСИД 2,2 229 17000 75 1,112 (ЦВИ'l'теРИОНllЫЙ детерreит) Цвнттерrент 312 3,6 335 0,957 (цвиттериоиный детерrент) * Полидисперсная смесь, приБедены средние ЗНllчения. 5.5. ВЫДЕЛЕНИЕ И фр AIСЦИОНИРОВАIIИЕ ЛИПИДОВ МЕМБРАН Выделение липидов мембран осуществляют сразу после по лучения мембранной фракции, которую необходимо защищать от деЙствия ПрО'l'ео и липолитических ферментов, аБтоокисле ния. Обычно все процедуры проводят при низкой температуре, поддерживая определенные значения рН и ионноЙ силы. Для экстракции липидов используют смесь хлороформметанол. Для одновременной экстракции белков и ЛИПИДОБ из теней эритро цитов их экстраrирую'r смесью БY'I'анолвода. При этом боль шая часть белков переходит в водный, а липида в бутаноль ный слой. Дальнейший анализ липидов ПрОБОДЯТ методами rидролиза и количественноrо определения компонеитов сложных смесеЙ фос- фолипидов. В результате избирательноrо rидролиза липидов MeM бран образуются продукты, которые можно разделить по поляр- ности или по остающимся неполярным 1'руппам. Описаны раз личные способы щелочноrо или кислотноrо rидролиза мембран- ных липидов. При использовании ферментативноrо rидролиза 15'< 227
(например, с помощью фосфолипаз) расщепляются только cTporo определенные связи при сохранении всех остальных, :Количественный анализ сложных смесей фосфолипидов про водят хроматоrрафически:ми методами. Для препаративных цe лей в основном используют хромаТО1'рафию на колонках. Для микроаналитических исследований успешно применяют TOHKO слойную хромато, rpафию с помощью которой можно разделить практически все классы липидов, локализовать и идентифици ровать их при использовании специальных реактивов. Для тонкослойной хромаТО1'рафии липидов применяют слои мелкозернистоrо силикаrеля (силикаrель Н). ДЛЯ аналитических целей используют слой сорбента толr:u;иной 0,25 мм, для препара тивных 0,5 мм. Размер стеклянной пластинки для разделения чаще Bce1'O 20х20 см. Для разделения различных классов JIИ пидов используют разные системы растворителей. Например, по лярные ФQСФОЛИПИДЫ и rликосфинrолипиды разделяют в смеси хлороформметанол, содержащей аммиак или разведенную YK сусную кислоту. Элюирующая способность смесей растворителей определяется полярностью ее составных компонентов. По элюирующей способности растворители распола1'аются в следующем возрастающем порядке: петролейный эфир, цикло reKcaH, четыреххлористый уrлерод, толуол, бензол, хлороформ, диэтиловый эфир, этилацетат, ацетон, нпропанол, этанол, Meтa нол, вода. После пропускания растворителей пластинку высуши вают на воздухе и идентифицируют липиды с помощью окраши вания специфическими реаrентами. Для количественноrо опре делеия фосфолипидов, разделенных тонкослойной xpoMaTorpa фией, используют спектрофотометрические методы. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. КaRие методы исследования биомембран относят к биохимичес- ким? 2. КЭЕовы особенности биофизических методов изучения биомемб- ран? 3. Дайте хаРaRтеристику оптических методов исследованил биомем- бран. 4. Охарактеризуйте основные этапы выделения и разделения био- мембран. 5. КaRие методы используют для выделения мембран из rOMoreHa- тов клеток и тканей? 228
6. Какие I<ритерии применяют для оценки чистоты мембранных фракций? 7, Какие требования предъявляют к маркерным ферментам? На- зовите маркерные ферменты различных мембранных структур клетки. 8. С какой целью в мембранолоrии применяют детерrенты? Что они представлНIОТ собой, каковы их свойства? 9. Почему критическую концентрацию мицеллообразования счита- ют важной характеристикой детерrентов? 10_ Опишите принципы, класси:фикациIO и области применения Me тодов хроматоrрафии и электрофореза для исследования биомембран. 11. Охарактеризуйте стадии выделения, разделения и количествен- HOro определения липидноrо состава мембран. 12. Какова физическая природа ЛIOми:несценции?
fла:ва 6 ИССЛЕДОВАНИЕ CTPYKTYPHO ФУНКЦИОНАЛЬНОfО СОСТОЯНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ БИОМЕМБРАН В НОРМЕ И ПРИ ВО3ДЕЙСТВИИ РА3ЛИЧНЫХ ФИ3ИКОХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ 6.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН Удобной моделью для изучения ctpyktypho-функциональны1x модификаций биомембран, индуцированных воздействием цело ro ряда физикохимических ментов, являются эритроцитарные мембраны и клетки, что обусловлено следующими причинами: однородностью мембранно1'О препарата, леrкостью e1'o по лучения с сохранением нативных свойств; выполнением эритроцитарными мембранами различных функций: барьерной, транспортной, рецепторной, механической, метаболической и др.; наличием в эритроцитарных мембранах и клетках фер ментных систем, реrулирующих энерrетические, ОIшслительные процессы, транспорт ионов, пероксидное окисление ЛИIIИДОВ; 1'e нерирующих и утилизирующих активные формы кислорода. Тени эритроцитов, полученные путем rипоосмотическо1'О re молиза и отмытые от rемоrлобина в изотоническом буфере, co держат около 50 % белков, 43 % липидов и 7 % уrлеводов. Белковые компоненты мембраны были идентифицированы Me тодом электрофореза в пr в присутствии додецилсульфата натрия. В соответствии с локализацией их подразделяют на пе риферические и интеrральные (см. 1'лаву 1). Периферические белки расположены на поверхности мембраны и им соответству- ют полипептидные полосы 1, 2, 4, 5 и 6, Интеrральные белки поrpужены Б липидный бислой и в некоторых случаях пронизы вают ero. Основным интеrральным белком является белок по лосы 3, осуществляющий транспорт анионов через мембрану. Ero Nконец находится с цитоплазматической стороны, а CKOHeц поrружен в бислой с наружной стороны мембраны. Перифери ческие белки взаимодействуют друr с дрУ1'ом, образуя двумерный каркас, выстилающий внутреннюю поверхность эритроцитарной мембраны, который называют мембранным скелетом. Он coдep 230
жит около 50 % общеrо количества белков эритроцитарной MeM браны. Ero основными компонентами являются спектрин (поло сы 1 и 2), актин (полоса 5), а также белки полосы 4.1. и 4.9. (см. раздел 1.2.1). Считают, что актинспектриновая сеть с помо- щью якорноrо белка анкирина связана с фосфолипидным мат- риксом через цитоплазматический участок белка полосы 3. Липиды в мембранах эритроцитов находятся почти исклю чительно в форме бислоя. По данным ЯМР, в эритроцитах чело века таких липидов не менее 97 %. Вязкость ЛИПИДНО1'о бислоя мембран эритроцитов выше, чем для дрyrих мембран. Это обус- ловлено высоким содержанием в них холестерина. В табл, 24 "Приложения" дана подробная количественная характеристика состава липидов и фосфолипидов мембран эритроцитов млеко питающих, а также жирнокислотноrо состава фосфолипидов в эритроцитах человека и быка. Лабораторн.ая работа .м 1 Выделение эритроцитариых мембран из IрОВИ доноров Материалы и оборуiJованuе: кровь доноров с антикоаrулян- том, хлорид натрия, трисrидроксиметиламинометан (трис), соля ная кислота, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), центрифужные upобирки, центрифужные весы, центрифуrа MPW360, центри фуrа ЦЛР-1.У 4.2, pH-метр, пастеровские пипетки, фильтроваль ная бума1'а. Ход работы Кровь с антикоаryлянтом (3,8 % ный раствор цитрата на- трия в соотношении кровь: цитрат 9:1) необходимо центри фуrировать при 3000 об/мин на центрифyrе MPW360 в течение 10 мин. Плазму и верхний слой лейкоцитов аккуратно отобрать пастеровской пипеткой и удалить. Эритроциты три раза промыть охлажденным раствором, содержащим 0,145 моль/л NaCl в 0,02 моль/л трисНСl буфере (рН 7,6 при 20 'С), каждый раз осаж дая клетки в том же режиме (при 3000 об/мин в течение 10 мин). Мембраны эритроцитов J:юлучают с помощью rипоосмотическо1'О rемолиза их раствором, содержащим 10 ммоль/л ЭДТА в 10 ммоль/л трисНСl буфере (рН 7,6 при 20 'С). ДЛЯ ЭТО1'о один объем отмытых эритроцитов быстро и энер1'ИЧНО перемешать с 20 объемами охлажденной до +4 'С 1'емолизирующей среды и выдержать при этой температуре в течение 15 мин. rемолизат 231
цеНТРиФУ1'ировать на центрифуrе ЦЛРl У4.2 при 18000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочиую жидкость удалить, а осадок мембран про мыть три раза 20 объемами 10 ммоль/л трисНСl буфера (рН 7,6 при 20 ОС), каждый раз осаждая мембраны в том же режиме. В экспериментах использовать свежеприrотовленную суспен зию мембран. Препараты мембран эритроцитов можно получить с помощью метода молекулярноrо сита. Для этоrо применяют rельхрома тоrрафию на сефарозе 4В ("Pharmacia", Швеция). Сефароза 4 В представляет собой rель а1'арозы, которая поставляется в набух тем состоянии. Преимущество этоrо 1'еля по сравнению с друrи ми носителями для хроматоrpафии З3Елючается в ero способнос ти разделять комплексы биополимеров, полисахариды, мембра ныI и фрarменты клеток. Для эффективно1'О отделения rемоrло бина от мембран необходимо лизировать эритроциты не менее, чем двумя объемами буфера. V станов лены оптимальные усло вия для разделения на сефарозе 4В: 4 ммоль/л фосфатный буфер (рН 7,5). На колонку размером 1,5x5,1 см МОЖЕ:О наносить до 1 мл rемолизата (rемолизат должен быть приrотовлен из расчета 1 объем эритроцитов: 1 объем rемолизирующей среды), при этом выход мембран составляет до 1 мл. Методом электрофоре- за в ПАAr в присутствии додецилсульфата натрия показано, что мембраны, выделенные rельхромаТО1'рафией, содержат тот же набор белков, что и мембраны, полученные методом промывания и цеНТРиФУ1'ирования. Лабораторная работа .м 2 Определение концентрации белка плазматических мембран по методу Лоури При выделении препарата мембран оценивают количествен ный выход белка. Метод Лоури (1951) наиболее распростра ненный и высокочувствительный метод определения KOHцeH трации белка, основанный на измерении интенсивности OK раски раствора, зависящей от концентрации белка. Принцип метода заключается в том, что при взаимодейс'l'ВИИ белка с реактивами, используемыми в определении, осуществляются по меньшей мере две цветные реакции на белок. Одна из них биуретовая реакция между пептидными 1'руппами и ионами меди. Возникающая синефиолетовая окраска обусловлена об 232
разованием КОМПЛeIСНО1'О соединения биуреТОБоrо MeДHO ro комплекса: O I С== NH HN/ О "6 == NH ,)' Си O I HN ==С i/ о " NH , HN == 6/ Такое комплексное соединение претерпевает в щелочной cpe де енолизацию по схеме: О Н О 11 1 11 H 2 N С N С NH 4 <=> HN"'" С NH.:... С "'" NH 1 I ОН ОН Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с I'Идроксидо:м: меди (П) и образуют комплексное соединение, в I<:O тором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота -иминных rрупп: R/I I СН С N / I / ......CHR", N............... О I 11 I с.....он COCu 11 R'H( / N CHR//1 11 '-. к- С ОН в цепь в цепь ТЭЕие медные комплексы обладают преимущественно фиоле товой и синей окраской. Вторая реакция это реакция реактива Фолина с ТИрОЗИНо выми И цистеиновыми радикалами молекулы белка. Это реак- ция восстановления ?меси фосфорновольфрамовой и фосфорно- молибденовой кисло'):' (реактив Фолина) с образованием комп лексноrо соединения синеrо цвета. Полarают, что в реакции вос- становления принимают участие комплексные соединения меди, возникающие при взаимодействии белка со щелочным paCTBO ром сульфата меди. Эта реакция не очень специфична, но BЫCO 233
кочувствительна. Преимущества метода Лоури состоит в возмож- ности определения белка в сильно разбавленных растворах (де- сятки мкr). Материалы и оборуiJованuе: вольфрамат натрия Na 2 WO 4'2НР, молибдат натрия Na 2 Mo0 4 '2H 2 0, 80 %ная фосфорная кислота, концентрированная соляная кислота, сульфат лития, бром, rид- роксид натрия, карбонат натрия, тартрат натрия, сульфат меди, бычий сывороточный альбумин, суспензия мембран, фотоэлект роколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46 , стеклянные кюветы для В:ФВ:, стеклянные пробирки, пипетки, фильтроваль- ная бумarа. ХОД работы Реактив Фол ина 1'отовят следующим образом: 100 l' вольфра мата натрия и 25 r молибдата натрия растворяют в 700 мл воды В круrлодонной колбе на 1 л, снабженной пришлифованным хо- лодильником Либиха. Прибавляют 50 мл 80 % -ной фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Поме щают в колбу несколько капилляров. Смесь кипятят в колбе с обратным холодильником в течение 10 ч. Далее прибавляют 150 r сульфата лития, 50 мл воды И несколько капель брома. Для удаления избытка брома кипятят содержимое колбы в течение 15 мин без обратноrо холодильника под ТЯ1'ой. Раствор охлажда ют, доводят водой до 1 л и IIропускают через стеклянный фильтр. Реактив Фолина хранят в химической посуде из TeMHoro стекла. На всех этапах приrотовления реактива цвет реакционной смеси должен быть желтым. Реактив Фолина титруют 1 н раствором щелочи и на основании полученных данных рассчитывают ero кислотность. Перед использованием реактив Фолина разбавля- ют водой до кислотности, соответствующей 1 н раствору соляной кислоты. Далее 1'отовят рабочий раствор: в цилиндр на 100 мл налива ют 50 мл 2 %Ho1'o раствора Nа 2 СО з , в отдельную пробирку 0,5 мл 2 %Horo тартрата натрия и 0,5 мл 1 %-Horo сульфата меди. Содержимое пробирки выливают в ЦИлиндр и образовав- mейся смесью ополаскивают проб ирку и опять выливают в ци л:индр. Смесь перемешивают и оставляют на 10 мин. В проб ирки разливают по 0,1 мл суспензии мембран, затем по 0,1 мл 0,4 н раствора NaOH (пробирки можно HarpeTb для лучmеrо Itастворения белка). Добавляют бидистиллированную 234
воду до 0,4 мл. Смешивают с 2 мл рабочеrо раствора, перемеши вают содержимое пробирок и оставляют при комнатной темпе ратуре на 10 мин. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина, перемешивают и оставляют на 3040 мин для развития OKpac ки. Измеряют оптическую плотность растворов при длине волны 750 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре. Co держание белка в пробах определяют по калибровочному 1'рафи ку, построенному с использованием бычье1'О СЫВОРОТОЧНО1'о аль бумина. Для этоrо rотовят серию paC'I'BOpOB белка с содержанием от 20 до 400 MKr в 1 мл. Определение ведут так же, как и для опытных растворов (см. выше), количество повторностей для каждой концентрации белка не менее 5. Строят калибровоч ный rрафик, откладывая по оси абсцисс содержание белка в про бе, а по оси ординат ее оптическую плотность при 750 нм. Лабораmорн.ая рабоmа .м 3 IСоличественное определение белка по биуретопой реаКЦИИ Материалы и 060руiJование: сульфат меди, rидроксид натрия, хлорид натрия, тартрат натрия-калия, йодид калия, бычий CЫBO роточ:ный альбумин, суспензия мембран, фотоэлектроколориметр В:ФК3 или спектрофотометр СФ46, стеклянные кюветы дЛЯ КФК, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумаrа. Ход работы Для приrотовления биуретово1'О реактива в мерную посуду на 250 мл вносят 0,375 r сульфата меди; 1,5 r тартрата натрия- калия и растворяют в 150 мл воды. При энерrичном перемеши вании добавляют 75 мл 10 %Horo раствора NaOH и 1 r йодида калия и доводят содержимое до 250 мл водой. Реактив хранят в полиэтиленовом сосуде, покрытом изнутри парафином, так как он не подлежит длительному хранению. В пробирки помещают по 0,2 мл исследуемоrо раствора, со- держащеrо белок, доводят бидистиллированной водой до 1 ил, добавляют 4 мл биуретовоrо реактива и перемешивают. В конт- рольную пробирку вместо белка наливают воду. Через 30 мин измеряют оптическую плотность проб (разви!3ается сине-фиоле- товое окрашивание за счет пептидных связей) при длинах волн 540650 нм против контроля (для более точноrо определения зареrистрировать спектр поrлощения проб и выявить л'mnx про тив контрольноrо раствора). 235
Содержимое белка в пробах определяют по калибровочному rрафику с использованием бычье1'О сывороточноrо альбумина. Стандартные растворы бычьеrо сывороточноro альбумина долж ны содержать от 1 до 10 Mr белка в 1 мл 1 %Horo раствора хло рида натрия. Определение ведут так же, как в случае опытных проб. 6.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АI'ТИВНОСТИ МЕМБР АНОСВЯЗАННЫХ ФЕРМЕНТОВ В НОРМЕ И ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ Для исследования отдельных свойств нативных мембран Кле ток, а также для изучения молекулярных механизмов реrулиро вания метаболических процессов, осуществляющихся с участи ем мембранных компонентов клетки, используются различные физикохимические методы модификации мембран. Химические способы модификации мембранных структур свя заны с использованием естественных и синтетических соедине ний. в: rруппе естественных модифицирующих areHToB, изменя ющих липидный состав мембран в нативной клетке, относятся липидпереносящие белки, ферменты обмена фосфолипидов фосфолипазы, диметилазы, системы обмена холестерина. Они реrулируют микровязкость и подвижность мембранных компо нентов, которые являются важнейшими факторами поддержа ния нормальной структурнофункциональной орrанизации и обес печения взаимодействия мембран. Синтетические БИОЛО1'ически активные вещества используют для индукции проницаемости природных и искусственных MeM бран. К ним относятся ионофоры (валиномицин, обеспечиваю щий проникновение ионов калия через мембрану; крауны MaK роциклические полиэфиры, обеспечивающие проницаемость MeM бран для ионов натрия, кальция, маrния) и каналообразователи (например, аламетицин, способствующий проникновению через мембрану АТР). К физическим методам модификации липидных и белковых компонентов биомембран относят ионизирующее и УФизлуче ние, температуру. 236
Лабораторuал работа .м 11 Определение функциональной активности ацетил:холипэстеразы эритроцитарпы:х мембран Метод Хестрина основан на колориметричеСI<ОМ определении ко:нцентрации ацетилхолина. Ero чувс'rвительность составляет 5 мк!' ацетилхолипа. Ошибка определения :J::1 %. Достоинство это- ro метода при определении а:ктивнос'rи АХЭ состоит в том, что 011 позволяет исследовать кинетику фермента'1'ИВНОЙ реакции при различных условиях, позволяет работа'rь в широком интервале :концентраций субстрата, производить массовые определения, удо- бен для ре1'истрации активности АХЭ различноrо происхожде- ния в стандартных условиях (определенные концентрэ.ции фер- мента и субстрата, стандартное время реакции при условии со- блюдения нулевоrо порядка). Принцип метода: при взаимодействии ацетилходина с ще лочным: раствором rидроксиламинхлорида образуется ацетил 1'идроксамовая кисдота, которая в кислом растворе дает с хлор ным железом цветную реакцию: (СН з )N+СН 2 СН 2 ОС(О)СН з + NHPH == (СНз)зN+СН2СН20Н + + СНзС(О)NНОН Материалы и об0руаование: 2 моль/л раствор солянокисло- ro rидроксиламина, 1 О % ный раствор хлорноrо железа, приro- товленный на 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор rидро:ксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кисло ты, ацетилхолинхлорид, фотоэле:ктроколориметр КФК3 или спектрофотометр СФ46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фИЛЬ'I'ровальная бумаrа. Ход работы Предварительно выделить мембраны эритроцитов из :крови соrласно ме'1'одике, описанной в лабораторной работе N2 1. Для ПОС'1'роения l<алибровочноrо rрафика необходимо приro товить растворы ацетилхолинхлорида с l\онцентрациями 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; :3,0; 3,5; 4,0 ммоль/л ацетилхолинхлорида. Оп- ределить оптическую плотность этих растворов против раствора сравнения (последовательность операций см. ниже), Построить :калибровочный 1'рафик, rде по оси ординат отложена оптичес кая плотность растворов ацетилхолинхлорида, а по оси абсцисс концентрация ЭТО1'о вещества. В пределах УI<азанных I<онцент 237
раций ацетилхолина калибровочная прямая должна подчинять- ся закону БуrераЛамбертаБера. Для приrотовления раствора сравнения в пробирку налить реактивы в такой последовательности: 2 мл раствора ХЛОРНО1'о железа, 2 мл соляной кислоты, 1 мл щелочно1'О rидроксиламина, 1 мл 2,5 ммольjл раствора ацетилхолинхлорида и 1 мл дистил лированной воды. Цвет смеси должен быть лимонножелтым. В контрольную и опытную проб ирки налить соответственно по 1 мл бидистиллированной воды и суспензии мембран эрит роцитов. Затем добавить в них по 2 ил 2,5 ммольjл раствора ацетилхолинхлорида и поместить проб ирки в термостат при 37.С на 15 мин. После термостатироваиия прилить по 1 мл раствора щелочноrо rидроксиламина (rотовят перед употреблением пу тем смешивания равных объемов раствора солянокислоrо rИk роксиламина и rидроксида натрия). Через 15 мин в опытную и контрольную пробы добавить. по 2 мл раствора соляной кисло ты И по 2 мл раствора хлорноrо железа. Через 20 мин оптиче скую плотность опытной и контрольной проб измерить на фо тоэлектроколориметре против раствора сравнения. Для расчета активности фермента из величины оптической плотности KOHT рольной пробы вычитают величину оптической плотности опыт- ной пробы. Активность ацетилхолинэстеразы выражают в ммольj л ацетилхолина с использованием калибровочноrо {'pa фика. ЛаБQраторн.ая работа М 5 Исследование УФ-индуцироваииых измеиеиий фуикционаJIЬПОЙ активности ацеТИJIХОJIииэстеразы эритроцитариьrx мембраи Материалы u 060руiJоваuие: 2 моль/л раствор солянокисло ro rидроксиламина, 10 %ный раствор хлорноrо железа, ПРИ1'о товленный на 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор rидроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кисло ты, ацетилхолинхлорид, фотоэлектроколориметр КФК3 или спектрофотометр СФ-46, установка для УФ-облучения, кровь до- норов, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумаrа. Ход рабо.ты Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови соrласно методике, описанной в лабораторной работе N9 1. 238
Один объем (3 мл) суспензии мембран эритроцитов использо вать в качестве контрольноrо образца и разлить по трем пробир- кам, второй (9 мл) разделить на три части (по 3 мл) И подвер rHYTb воздействию. УФ-света в дозах 0,75; 2,27; 3,78 кДж/м 2 при помощи УСТ8]IOвки для ультрафиолетово1'О облучения биоси стем, которая подробно описана в учебном пособии В. r.P.lртю хова, О. В. Путинцевой (1996). Облучение суспензии мембран эрит- роцитов в трисНСl буферном растворе (рИ 7,6) проводят в cTeI<- л.я:нной термостатируемой кювете (20:1:1 'С) при постоянном пе ремешчвании с помощью ма1'НИТНОЙ меmаЛI<И излучением лам пы типа ДPT400 через светофильтр УФСl (с полосой пропуска ния 240390 нм). Интенсивность облучения через этот CBeTO фильтр составляет 0,151 кДж/м 2 в 1 мин. Затем определить Ka талитическую активность ацеТИЛХОЛИнэстеразы в контрольных и опытных (при всех дозах облучения) пробирках по меТОДИI<е, описанной в лабораторной работе N!! 4. Полученные даЕные заЕе сти в табл. 19. Таблица 19 ФерментатUВНДJl ахтивность ацетuлхолuнэстераsы .lItембраll эритроцитов 'tеловеха 00 и rюсле УФ-оt5.llу'tеllи.я Активность ацеТИJIхолинэстеразы, ARтивность АХЭ, Обрааец ммодь/д ацетилхолина % от исходноro 1-е опреде- 2-е опреде- 3-е опреде- A:l:S A УРОВНЯ леНИе ленив ленив Контроль 100 % Доза 0,75 кДж/м 2 Доза 2,27 кДж/м' Доза 3,78 "Дж/м' Сделать вывод о степени и характере изменений функцио- нальной активности ацетилхолинэстеразы эритроцитарных MeM бран, модифицированных воздействием УФсвета в различных дозах. Какие процессы, протекающие при УФ-облучении эритро цитарных мембран, обусловливают изменения I<аталитической ак- тивности мембраносвязанной АХЭ? Какова зависимость фермен тативной активности P.lХЭ эритроцитарных мембран от дозы УФ облучения? 239
Лабораторная работа .м 6 Исследование фермеnтаТИВRОЙ активиости свободной и мембраиосвsзаппой ацеТИЛХОЛИRэстеразы в J!Jштактном состоянии и после УФоблучеrm:s Материалы и оборудование: 2 моль/л раствор солянокисло 1'0 1'идроксиламина, 10 %-ный раствор хлорноrо железа, приrо товленный на 0,1 моль/л растворе соляной :кислоты, 3,5 моль/л раствор rидроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кисло ты, ацетилхолинхлорид, фотоэлектроколориметр КФК-3 или спектрофотометр СФ-46, установка д.ця УФоблучеllИЯ, кровь дo норов, rотовый препарат ацетилхолинэстеразы из эритроцитов бы:ка, стеклянные IIробир:ки, пипетки, фильтровальная бумаrа. ХОД работы ПредваРИ'l'ельно выдели'l'Ь мембраны эритроцитов из крови соrласно методи:ке, описанной в лабораторной работе N2 1. Ис- пользуя описание методи:ки в лабораторной работе N2 5, провести определение каталитичес:кой активности JCКЭ эритроцитарных мембран в норме и при воздействии УФ-излучения в дозах 1,5; 3,0; 4,5 кДж/м 2 . Данные занести в таблицу, анало1'ИЧНУЮ табл. 19. Те же эксперименты провести с буферными растворами свобод- ной ацетилхолинэстеразы (10-8 моль/л). Оформить табл. 19 для фермента в свободном состоянии. Результаты представить в виде rрафи:ка, 1'Де по оси абсцисс отложены величины доз УФсвета, а по оси ординат значения активности АХЭ, выраженные в про- центах от уровня контрольноrо образца, для свободноrо (кривая 1) и мембраносвязанноrо (кривая 2) фермента. Сделать вывод об уровне фоточувствительности разных форм фермента. Чем МО- rYT быть обусловлены различия в характере УФ-индуцирован- ных изменений функциональной активности свободной и свя занной АХЭ? Лабораторная работа .м 7 Определение фуикциональной активности ацстилхолип- эстераз:ы: эритроцитарн:ы:х мембран ПОСJlе ИВ:ДУI'ЩИИ пероксидпоrо окисления JlИПИДОВ Мембранные ферменты изменяют свою активность под влия- нием продуктов ПОЛ, что может быть обусловлено образовани ем комплекса окисленный лип ид белок, ассоциаЦИей бел:ко- 240
вых молекул и разрушением аминOIШСЛОТ, в частности, coдep жащих 8Н1'РУППЫ. Цель работы выявление изменений функциональной aK тивности АХЭ эритроцитарных мембран после индукции aCKOp батзависимоrо пероксидноrо окисления липидов. Ионы Fe 2 + OKa зывают каталитическое действие на образование пероксидов. При этом Fe 2 + окисляется до Fe 3 +, а функция аскорбиновой кислоты заключается в реrенерации ионов за счет обратноrо восстановле ния Fe 3 + до Fe 2 +. Материалы u оf50ру80вание: 2 моль!л раствор солянокисло 1'0 1'идроксиламина, 10 % ный раствор хлорно1'О железа, приro товленный на 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 3,5 моль/л раствор 1'идроксида натрия, 0,1 моль/л раствор соляной кисло ты, ацетилхолинхлорид, сульфат железа Fe80 4 . аскорбиновая кис лота, фотоэде:ктроколориметр В:ФК-3 иди сnек'rрофотометр СФ- 46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фидьтрова.)'IЬ ная бума1'а. Ход работы Выделить эритроцитарные мембраны по методике, описанной в лабораторной работе М 1. К 1 мл суспензии эритроцитарных мембран д06ави'l'Ь 150 мкл смеси растворов FeS0 4 (100 мкмоль/л) и аскорбиновой кислоты (2 ммо,:н,!л) и инкубировать 5, 15,30.45 и 60 мин при 37 'С. Затем ПрОlести определение ферментативной активности АХЭ нативных и модифицированных мембран. Па- раллельно исследовать уровень ТБН:реактивных продуктов пе- рОКСИДНОl'о окисления липидов (см. лабораторную работу N2 11). После завершения экспериментов сопоставить динамику изме нений величин актИВНОСТИ АХЭ в процессе развития ПОЛ эрит- роцитарных мембран и уровня накопленных окисленных про- дуктов липидов. Лабораmорnа.я рабоmа М 8 Исследование функционалъной активности мембрав:освязав:ной Na\ I+-АТФазы Распространенные методы изучения функциональной актив ности Na+, К+АТФазы основаны на определении количества :e:e Qрrаническоrо фосфата, содержаще1'ОСЯ в исследуемом растворе. Существуют различные методы обнаружения фосфата в биообъ- ектах. Но все они основаны на том, что в кислой среде молибде- 16. Заказ 3788 241
новокислый аммоний и фосфорная кисло'rа (ее соли) взаимодей- ствуют между собой с образованием фосфомолибдата аммония, восстановление KOTopo1'o приводит к ,образованию смеси различ- ных оксидов молибдена, имеющих синий цвет. Появившаяся ок- раска устойчива в течение 12 ч. Для ее стабилизации применя- ют CuS0 4 . Различные методы отличаются природой восстанови- теля и кислотностью среды, что определяет скорость реакции и чувствительность метода. Материалы и оборуоован.uе: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид ма1'НИЯ, строфантин, ЭДТА, АТР, трис-НСl буфер (рН 7,4), трихлоруксусная кислота, термостат, аскорбиновая кислота, мо- либдат аммонии, однозамеЩеННЫЙ фосфат калия, фО'I'оэлектро- 'Колориметр КФК3 или спектрофотометр СФ-46, кровь доноров, стеклянные п.робирки, пипетки, фильтровальная бумarа. Ход работы Получить препарат мембран эритроцитов по методике, опи- Gанной в лабораторной работе N2 1. В пробирки для определения общей АТФа:зной и M g 2+-АТФазной активности внести по 1 мл суспензии мембран. В контрольные пробы вместо мембран вне- сти 1 мл трис-НСl буфера. Добавить в пробирки для определения M g 2+-АТФазной активности по 0,3 мл строфантина (0,025 %), в контрольные и опытные пробирки для определения общей АТФаз:ной активности по 0,3 мл буфера, перемешать и через 30 мин в каждую пробирку внести по 1 мл инкубационной сре- ды. Она содержит: 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л ECl, 3 ммоль/л MgCl2' 1 ммоль/л ЭДТА, 5 ммоль/л АТР, 50 ммоль/л трис-НСl буфер (рН 7,4). Далее термостатировать содерЖИмое пробирки в течение 1 ч при 37 "С. Реакцию остановить добавлением 0,5 мл 20 % ной трихлору:ксусной кислоты. Велок удалить центрифу- 1'ированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Количество образующеrося фосфата определяют по методу с применением аскорбиновой кисло'rой, который включает исполь- зование следующих реактивов: а) аскорбиновая кислота 10 % -ный раствор; б) молибдат аммония 0,42 %-НЫЙ раствор, ПРИ1'отовлен- ный на 1 н серной кислоте; в) смесь, состоящая из одноrо объема раствора (а) и шести объемов раствора (б). rотовится непосредственно перед работой и хранится в течение дня в ледяной бане. 242
Е 0,9 мл исследуемоrо раствора, содержащеrо 0,03 0,2 мкмоль неОР1'авическоrо фосфата, добавить 2,1 мл реактива (в). Перемешать и инкубировать 20 минут при 45 'с или 60 мин при 37 .С. После охлаждения измерить величину оптической плотности при 620 нм против контрольной пробы, содержащей вместо исследуемоI'О раствора бидистиллированную воду. По раз нице между полученными значениями общей АТФазной и Mg 2 + АТФазной активности найти активность Na+, К+АТФазы эрит роцитарных мембран с ПОМощью калибровочно1'О rрафика. Для построения :калибровочной прямой в пробирки налить по 0,15; 0,30; 0,50; 0,70 и 0,90 мл cTaндapтHo1'o раствора неорrани ческо1'О фосфата, содержащеro 0,23 м:кмоль/л фосфата (ЕН 2 РО 4 ) в 1 мл. Довести объем в каждой пробирке до 1 мл бидистиллиро ванной водой и далее обрабатывать, как указано выше. 3аре1'ИСТ рировать оптическую плотность проб и полученные данные изоб разить rpафически, откладывая по оси абсцисс содержание фосфа та в пробе, а по оси ординат оптическую плотность при 620 нм. . Активность фермента рассчитывают по формуле: А = (до общ ДD Мg ) . 106 K.j.t.31 '" I' д е D б == D б D разность величин оптической плотности ощ ощ к раствора для определения общей АТФазной активности и KOHT ролъно1'О раствора; DMg == D Mg D" разность величин оптичес кой плотности раствора для определения Mg2+ -АТФазной актив- ности и КОНТРОЛЪНО1'о раствора; К калибровочный :коэффици- D ент, определяемый по формуле: К = (D в абсототных величи- е нах для определенной концентрации, с значение концентра- ции); j количество белка в пробе; t время инкубации (мин); 31 молекулярная масса фосфора. Активность Na+, К+.АТФазы выражают в RМОЛЪ Pn/M1' (белка) в мин или в мкмоль/л Р)мл теней в час. Лабораторnая работа М 9 Изучение УФиидуцированных изменеиий фушщ:ионазп.- ных свойств Na+, K+-АТФазы эритроцитарных мембран Материалы и оборуiJованuе: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид маrния, строфантин, ЭДТА, АТР, трисНСl буфер (рИ 7,4), 16* 243
трихлоруксусная кислота, термостат, аскорбиновая кислота, MO либдат аммония, однозамещенный фосфат калия, сульфат желе за, фотоэлектроколориметр В:ФI.сз или спектрофотометр СФ46, установка для УФоблучения биообъектов, ЕрОВЬ доноров, c'reK лянные пробирки, пипетки, фильтровальная бумаrа. Ход работы Предварительно выделить мембраны эритроцитов из крови СО1'ласно методике, описанной в лабораторной работе М 1. Один объем (3 мл) суспензии мембран ЭРИТРОЦИТОВ использо вать в качестве КОНТРОЛЬНО1'о образца и разлить по трем пробир кам, второй (9 мл) разделить на три части (по 3 мл) И подвер I'HYTb воздействию УФсвета в дозах 0,75; 2,27; 3,78 кДж/м 2 при помощи установки для ультрафиолетовоI'О облучения биосистем. Облучение суспензии мембран эритроцитов в трисНСl буферном растворе (рН 7,6) проводят в стеклянной термостатируемой кю- вете (20:1:1 .С) при постоянном перемешивании с помощью MaI' нитной мешалки излучением лампы типа ДРТ 400 через CBeTO фильтр УФСl. Затем следует определить l\аталитическую ак- тивность Na+, К+АТФазы в контрольных и опытных (при всех дозах облучения) пробирках по методике, описанной в лабора торной работе N!! 8. Данные занести в табл. 20. Таблица 20 Фермен.тативна.я. шстивность Na+, C"-АТФазы мембран эритроцитов ItеловеJCа после УФ-облуltен.u.я. Активность Na+,K+-АТФазы, МКМОЛЬ/Л Активность Образец р /МЛ теней в час АТФазы, % от 1-е опреде- 2-е опреде- 3-е опреде- Ad:S А исходноrо УРОВЮI ление ление ление Контроль 100 % Доза 0,75 кДж/м' Доза 2,27 кДж/м' Доза 3,78 КДЖ/М' Сделать вывод о хараЕтере изменений функциональной aE тивности Na+, K'I-.АТФазы эритроцитарных ме:м:бран, модифици рованных. воздействием УФ-света в различных дозах.. Какие про цессы, протекающие при УФ-облучении эритроцитарных мемб 244
ран, обусловливают изменения каталитической активности MeM браносвязанной АТФазы? Какова зависимость ферментативной активности Na+, К'АТФазы эритроцитарныХ, мембран от дозы УФоблучеНИJ'I? Лабораторная. работа N 10 ОпределеlШе ферм:е:итативпой активпост:и Na+, :К+АТФазы: эритроцитар:иых м:ембра:и после и:идУКЦИИ пероксидноrо окисле:иия липидов Материалы и 060ру()ован-ие: хлорид натрия, хлорид калия, хлорид маrния, строфантин, ЭДТА, АТР, трисНСl буфер (рИ 7,4), трихлоруксусная кислота, термостат, аскорбиновая кислота, MO либдат аммония, однозамещенный фосфат калия, фотоэлектро колориметр КФК3 или спектрофотометр СФ46, кровь доноров, стеклянные пробирки, пипетки, фильтровальная бума1'а. ХОД работы Выделить эритроцитарные мембраны по методике, описан ной в лабораторной работе N2 1. К 1 мл суспензии эритроцитар ных мембран добавить 150 мкл смеси растворов FeS0 4 (100 мкмольjл) и аскорбиновой кислоты (2 ммольjл) и инкуби ровать 5, 15, 30, 45 и 60 мин при 37 'с. Затем провести определе ние ферментативной активности Na+, К+АТФазы нативных и MO дифицированных мембран. Параллельно исследовать уровень ТБКреактивных продуктов пероксидно1'О окисления липидов (см. лабораторную работу N2 11). После завершения экспериментов сопоставить дин амику изменений величин активности N а + , К+ АТФазы в процессе развития ПОЛ эритроцитарных мембран и уровня накопленных окисленных продуктов липидов. 6.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ПРОТЕIАНИ.я ПРОЦЕССА ПЕРОRсидноrо ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ МЕМБРАН в зависимости от конкретной цели исследований MorYT быть использованы различные физикохимические методы количе cTBeHHo1'o определения молекулярных продуктов ПОЛ мембран или общей оценки динамики протекания свободнорадин:альных процессов окисления. При количественном изучении первичных, промежуточных и конечных продуктов пероксид:аоrо окисле:аия определяют разность концентраций радикальных интермедиа 245
тов ДО И после процесса окисления с использованием оптических методов анализа, хроматоrрафии, поляроrpафии, амперометричес Koro титрования. При оценке интенсивности свободнорадикаль ных реакций ПОЛ получают информацию, суммарно характери зующую соотношение скоростей образования и разложения пер оксидов, изменения активности антиокислительных ферментов, уровня анти и прооксидантов в модифицированных мембранах. Так, например, йодометрический- (амперометрический) метод количественной оценки продуктов ПОЛ основан на определении концентрации свободноro йода или трийодина, образующихся при восстановлении пероксидных rpупп йодидионом. R оптическим методам количественно1'О анализа продуктов пероксидво1'О окисления липидов относят целый ряд методов: УФсцектрофотометрию для обнаружения rидроперО1<СИДОВ, ис следование уровня rидропероксидов с использованием тиоциа вата аммония, определение промежуточных продуктов ПОЛ по реакции с 2тиобарбитуровой J:ШСЛОТОЙ (ТБRтест), диеновых KOHЪ Ю1'атов ненасыщенных жирных кислот, флуоресцентный анализ шиффовых оснований конечных продуктов пол и др. Хемилюминесцентные методы, используемые для. инте1'Раль ной оценки процессов ПОЛ, основаны на ре1'истрации оптичес Koro излучения, возникающе1'О в результате спонтанных или ини циируемых в биолоrических пробах химических реакций. Лабораторная работа М 11 Определение уровня прОдyRтов nepORCJIДHoro окислении ЛRПИДОВ мембран с использованием тиобарбнтуровоi кислоты В основе метода лежит реаКЦИЯ 2тиобарбитуровой кислоты (ТБК) с промежуточными продуктами ПОЛ, в результате KOTO рой образуе'fСЯ окрашенный триметиновый комплекс с максиму мом поrлощения при 532 нм: ОН Н Н Н N N:Y "N 2 .Л + ---+ А л HS N ОН HS N ОН НО N S Считают, что 1'лавная роль при образовании этоrо окрашен HOro продукта принадлежит малоновому диальде1'ИДУ (МДА). 246
Материалы и оборуаоеан:.ие: тиобарбитуровая кислота, три хлоруксусная кислота, буферный расТВОр с рН 7,4 (см. табл.7 Приложения), цеНТРиФУ1'а, водяная баня, фотоэлектроколориметр КФК3. ХОД работы Тканевой 1'OMo1'eHaT или суспензию мембран в буферном pa створе (рН 7,4) в объеме 2,5 мл поместить в центрифужные про бирки и добавить 1 мл 17 % Horo раствора 'fРИХЛОРУКСУСНОЙ кис лоты. Центрифуrировать 10 мин при 4000 об/мив. Отобра'fЬ Ha досадочную жидкость и 2 мл ее перенести в пробирку, в которую налить 1 мл 0,8 % Ho1'o раствора ТЕК, и закрыть ее. Пробирку поместить на водяную баню при 100 ос на 10 мин. Затем пробу охладить и зареrистрировать оптическую плотнос'I'Ь на фотоэлек троколориметре КФК3 при длине волны 532 нм. В качестве KOH троля использовать буферный раствор вместо супернатанта. Ko личество промежуточных продуктов ПОЛ (МДА) рассчитывают по формуле К == (A Q А,)/Е, rде К количество продуктов ПОЛ; AQ оптическая плотность ОП:ЫТНО1'о раствора; А" оптическая плотность контрольноrо раствора; Е молярный коэффициент экстинкции, равный в дaH ном случае 1,56'105 моль l'CMl. Образование комплекса ТЕI{МДА реrистрируют также флуо ресцентным методом. Для Э'1'О1'о к 0,1 мл 3%HOro раствора дoдe цилсульфата натрия добавляют 1,5 мл 2 моль/л ацетатноrо бу фера (рН 3,6) и 0,8%Horo раствора ТБК, доводят бидистиллиро ванной водой до 4 мл. Полученную смесь инкубируют при 95 ос в течение 60 мин. После охлаждения добавляют 1 мл 0,2 н соля ной кислоты и 5 мл смеси нбутанолпиридин в объемном COOT ношении 15:1 и перемешивают. Центрифу1'ИРУЮТ 15 мин при 3000 об/мин, отделяют надосадочную жидкость и реrистрируют ее спектр флуоресценции в области длин волн 450600 нм. За тем определяют интенсивность люминесценции в ее маl<симуме (",,515 нм). Чувствительность метода по стандарту МДА составля ет 0,5 нмоль при использовании чистых образцов ТВК. 247
6.4. ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ CТPYKTYPHOrO СОСТОЯНИЯ БиолоrИЧЕСКИХ МЕМБРАН МЕТОДОМ ФJIУОРЕСЦЕНТНЫХ зондов Современным биофизическим методом исследования, позво ляющим изу'Чать структурное состояние биомембран, транспорт ионов, трансмембранный потенциал, взаимодействие веществ раз личной природы с мембранами и ДРУ1'ие процессы, признан Me тод флуоресцентных зондов. "Универсальным" мембранным флуоресцентным зондом, pe аrирующим на самые разнообразные перестройки, которые MO 1'УТ происходить В мембранах, служит l-анилинонафталин8суль фонат (АНС): @ 00 АНС был первым зондом, который использовал Д. Лоуренс в 1952 1'. для исследования мембранных структур. Он является клас сическим примером зонда, распределяюще1'ОСЯ между водной и мембранной фазами в измеримой nропорции. АНС флуоресциру- ет практически только в связанном с мембраной состоянии. При чем флуоресценция связанноro с мембраной красителя заметно отличается по своим характеристикам от e1'o флуоресценции в водной фазе, что позволяет делать заключение о характере мик роо:кружения хромофорных rpупп молекул зонда. Исследователя, использующеrо флуоресцентные зонды, инте ресует положение максимумов их спектров ПО1'лощения и флуо ресценции не только в связи с необходимостью выбора правиль- ных условий возбуждения и измерения флуоресценции, но и по- тому, 'Что величина стоксова сдвиrа (длинноволновый сдви1' мак- симума флуоресценции по отношению к максимуму IIоrлощения) отражает такое важное свойство среды, как полярность. Величи- на стоксова сдвиrа определяется следующими условиями: а) изменением диполъноrо момента молекулы при переходе из OCHoBHoro в возбужденное состояние; б) электронной и ориентационной поляризуемостью окружа- ющих зонд молекул. 248
Спектр ПО1'лощения АНС в водном растворе имеет максимум в области длин волн 350360 нм, а спектр флуоресценции при 4 78480 нм. При СВЯЗывании данно1'О красителя мембранами или белками в определенной мере изменяются все параметры ПО1'лощения и флуоресценции, так как зонд оказывается в среде менее полярной и менее текучей, чем водный раствор. При взаимодействии АНС с различными мембранами происходит изменение положения MaK симумов поrлощения и флуоресценции, интенсивности и степени поляризации флуоресценции, анизотропии поляризованной флуо ресценции. Эти изменения позволяют количественно оценить CTe пень связывания зонда с мембранами. Вместе с тем следует учиты вать и тот факт, что характеристики связавшеrося зонда сильно зависят от состава исследуемых мембран (митохондриальных, фос фолипидных, плазматических). Еще более чувствительным пара метром является интенсивность флуорценции, так как она оп ределяется еще и количеством связавте1'ОСЯ зонда. Сейчас трудно однозначно ответить на вопрос о локализации АНС в белковолипидных мембранах. Предпола1'ают, что молеку ла зонда не может 1'лубоко поrpузитьс.я: в липидный бислой:, так как заряженная СУЛЬфо1'руппа должна оставаться на поверхности. Кроме Toro, rоризонтальная ориентация длинной оси eI'O молеку лы не позволяет поrрузить в бислой фенильное кольцо. Скорее всею, в плазматических мембранах часть АНС связана с беJIRЭМИ, а часть с липидами. В пользу это1'О представления привод.я:т данные о двух компонентах кривой затухания флуоресценции АНС в белковолипидных мембранах, из которых компонента с боль тим временем жизни преимущественно обусловлена молекула- ми зонда, связанными с белками, а вторая с липида:м:и. 1Диметиламино5нафталиносульфохлорид (DANS) способен ковалентно присоединяться к свободным аминоrруппам и явля ется хромофором МНО1'их флуоресцентных зондов. DAN81'ЛИЦИН имеет следующую структурную формулу: (;t!з УНз (х) o o=s=o '\ I PCH2NH О 249
Аминоrруппа DAN8rлицина, с ОДНОЙ стороны, сопряжена с 1tэлектронНОЙ системой нафталина, а 9 друroй взаимоде:й:ству ет с растворителями, полностью изменяя как спектр поrлощения нафталина, так и ero флуоресцентные свойства. При возбужде нии молекулы аМИНО1'руппа поворачивается в одну плоскость с кольцами нафталина, при этом дипольный момент молекулы YBe личивается. Появляется большой стоксов сдвиr спектра флуорес ценции, сильно зависящий от полярности растворителя. Взаимо действие аминоrруппы с протонодонорными растворителями (oco бенно водой) приводит к тушению флуоресценции, причем D р тушит флуоресценцию DAN8 в 23 раза слабее, чем нр. Если аминоrpуппа присоединяет протоны, то в процесс взаимодействия вступает электронная пара атома азота, ранее связанная с :коль цом. В результате сопряжение исчезает, а вместе с ним длин новолновая полоса поrлощения и связанная с ней флуоресцен ция. Предполаrают, что возбужденная молекула DAN8 может Ha ходиться в двух различных состояниях, различающихся степе нью чувствительности к полярности микроокружения. Лабораторная работа М 12 Исследование фотоицдуцироваииых изменений CTPYKтypHoro состояния ЭрИТрОЦRтарJlЫХ мембрап метоДОМ ф.луоресцентных зондов Материалы и оборуiJованuе: свежеприrотовленные препара ты мембран эритроцитов человека, 1анилинонафталин8суль фонат, DAN8rлицин, акридиновый желтый, флуоресцеин, NaOH, родамин 6Ж, акридиновый оранжевый, установка для реrистра ции спектров люминесценции. Ход работы Для ре1'ИСТРации спектров флуоресценции зондов 1,8AНC и DANSrлицина в комплексе с нативными и УФоблученными эрит роцитарными мембранами необходимо использовать установку, описанную в работе В. r. Артюхова, О. В. Путинцевой (1996). В ней в качестве источника света применяют ртутную лампу СВД120. Возбуждающий свет выделяется с помощью светофиль тра сзс 7 2 и падает на кювету с исследуемым образцом. Лю минесценцию растворов ЗОНДов измеряют при помощи MHo1'oxo довой кварцевой кюветы объемом 4 мл с зеркальными CTeHKa 250
ми. Ре1'истрируемый свет проходит через монохроматор спект рофотометра СФ4А и фиксируется фотоумножителем ФУЭ18А. Напряжение на ФЭУ составляет 1 кВ. Ширина щели 1 мм. СИI'нал с ФЗУ через входной блок подается на вход ПРQ1'рамм:и pyeMoro цифровоrо вольтметра В 743 и обрабатывается nq BCTpO енной проrpамме Р4 ("среднее арифметическое из n измерений"). С целью проверки правильности работы при бора про водят eI'o калибровку по стандартным растворам красителей: акридино Bo1'o желто1'О, флуоресцеина в 0,1 н растворе NaOH, родамина 6 Ж, акридиновоro оранжево1'О. Для работы необходимо приrотовить раствор АНС (препарат фирмы "8igma", СIПA) на бидистиллированной воде, имеющий исходную концентрацию 5'103 моль/л, и спиртовой раствор DAN8rлицина (содержание спирта не более 10 %) с исходной концентрацией 104 моль/л. Для исследования спектров флуоресценции 1,8AНC в комп лексе с суспензией нативных и УФ-облученных мембран указан ные растворы в объеме 1,5 мл надо проинкубировать с 1,5 мл 1'104 моль/л водноrо раствора АНС при 20 ОС в течение 15 :мин, затем смесь внести в !{ювету и заре1'истрировать спектр флуорес ценции в интервале длин волн 430500 нм. Для изучения спектров флуоресценции зонда DAN8-rлицина в комплексе с суспензией нативнцх и УФмодифицированных мембран эритроцитов указанные растворы в объеме 1 мл необхо димо смешать с 0,5 мл раствора зонда и 1,5 мл 10 ммоль/л трис-НСl буфера (рН 7,6 при 20 ОС) и инкубировать смесь в тече ние 15 мин, затем ре1'истрировать спектры флуоресценции в ин тервале длин волн 500550 нм. 1 вариант Предварительно заре1'истрировать спектры поrлощения и флу оресценции водноrо раствора зонда 1,8AНC (контроль). Затем снять спектры люминесценции зонда в присутствии суспензии эритроцитарных мембран с учетом эффекта разведения. Полу ченные данные изобразить rpафически, откладывая по оси абс цисс длину волны измеряемоrо света, а по оси ординат, интен- сивность флуоресценции опытных образцов. Сделать вывод о ха- рактере изменений люминесцентных свойств 1,8-АНС в присут ствии мембранноro препарата. Провести УФоблучение эритроцитарных мембран соrласно методике, описанной в лабораторной работе J\/'g 5, в дозах 0,76; 251
1,51; 3,02; 2,26; 4,53 кДжjм 2 и зареrистрировать спектры фJIУО ресценции зонда в присутствии модифицированных мембран. Построить rpафик зависимости средНих значений интенси:в:нос ти флуоресценции АНС в e1'o максимуме в присутствии н:а.т:и:в ных и УФ..облученных мембран от дозы УФ"света. Сделать Bыодд о причин ах изменений люминесценТНЫХ характеристик АН С в комплексе с модифицированными мембранами, индуцирова:в:В::ых воздействием УФизлучени.я в широком диапазоне длин во.л:в: а также о характере структурных нарушений облученных эритро цитарных мембран. II вариант В качестве зонда использовать DАNS1'ЛИЦИН, все опер ации npоводить анало1'ИЧНО описанным в варианте 1 этой раБОТЪ:J:.. 6.5. ИССЛЕДОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ МЕМБРАН К ДЕЙСТВИЮ' РАЗЛИЧНЫХ ХИМИЧЕСКИХ АI'ЕНТОБ ПРИ ПОМО:П:ЦИ МЕТОДА РЕrистРАЦИИ ОСМОТИЧЕСКИХ и КИСЛОТНЫХ эритроrРАММ* Осмотическая резистентность клеточных популяций крови являетс.я важным показателем, характеризующим проницае:rv.rостъ эритроцитарных мембран, белоклипидные взаимодействия13 м:eM бране, состояние белковых структур цитоскелета клетки. rемолиз эритроцитов под действием rемолитиков oCYJ:I.J;eCTB л.яется через ряд последовательных стадий: npедrемолитичес:кую, стадию осмотическоrо и химическоrо 1'еМО1'лобинолиза, CTpOMa топороза и строматолиза. rлавными показателями преД1'е1У.[ОЛИ.. тической стадии .являются выход ионов калия в окружа:к>щую среду и сферул.яци.я эритроцитов. Протекание 1'еМО1'лоб:инолиза зависит от физико..химических свойств rемолит:ика. Так, при ос.. мотическом rеМО1'лобинолизе набухание эритроцитов до крити ческоrо уровня приводит к повреждению мембраны, в резу .льта те чеrо свободная фракция внутриклеточноl'О rеМО1'лобив:а диф- фундирует наружу. Осмотический тип rемолиза не СОПрО:ВО:>Еда ется химическими изменениями состава эритроцитов, сох.раня" ются также и e1'o электрические свойства. Так как осмот:ичес кий rемлиз вызывает только частичный выход rеМО1'лоб:и:.на, то из этоrо следует, что часть rемоrлобина находится в связанной со "* Раздел написан С. r. Резваном:. 252
стромой форме в виде rемолипостроматиново1'О комплекса (co единение rеМО1'лобина с лип идами и холестерином). Реализация процесса освобождения связанной фракции происходит в стадии химическоrо rемоrлоБИЕолиза, осуществляющейся под действи ем поверхноствоактивных веществ (саrrонин, ДИ1'итонин и др.). При ЭТОМ наблюдается ВЫХОД связанноrо rемоrлобина вследствие распада rемолипостромативовоrо комплекса. Все вышеперечисленные стадии протекают без нарушевия МОРфОЛО1'ической целостности эритроцита. Стадия строматопо роза, характеризующаяся проводимостъю эритроцитами элект рическо1'О тока при сохранении МОРфОЛО1'ической целостности клетки. наступает при действии на эритроциты концентрирован ных растворов сапонина. Полная дезинте1'рация структуры н:летки (строматолиз) про исходит ПОД влиянием холево, дезон,сихолево и олеиновокис лоrо натрия. Принцип метода ре1'истрации осмотических и кислотных эрит- porpaMM заключается в фотоме'rрической реrистрации кинети ки распада эритроцитов под действием 1'емолитика в определен- ной дозе. Мерой стойкости эритроцитов является время, в тече- ние KOTopo1'o происходит их разрушение. Мноrостадийный про цесс вовлечения эритроцитов в rемолиз позволяет построить эрит porpaMMY зависимость их распределения по стойкости во Bpe мени. Лабораторnая работа М 13 Автоматический метод реrистрации осмотических и :кислотных эритроrрамм 'Установка для реrистрации эритроrрамм, разработанная С. r. Резваном на кафедре биофизики и биотехноло1'ИИ Воронеж- CKoro rосударственноrо университета, позволяет измерять степень повреждения мембран ЭрИТрОЦИ'l'ов по действием различных хи- мических areHToB. Оптический БЛОI{ установки состоит из фото- электрическоrо колориметра ФЭR-56 М со встроенным диффе ренциальным усилwrелем. Реrистрационный блок представлен двухкоординатным реrистратором ЛКД 4003, цифровым вольт метром В7.20. ДЛЯ термостатирования суспензии ЭрИтрОЦИТОВ применяют ультратеРМОС'l'ат UTU-6 и термостатируемые кюве 'l'ы. Электрическая схема предварительноrо усилителя позволя- ет получить линейную зависимость между истинным коэффи 253
циентом светопропускания (Т) и выходным СИI'налом YCTa новки. Темолиз эритроцитов ПрОБОДЯТ в кюветах с наружными раз мерами 20x40xlO мм и рабочим объемом 4 мл. Точность хода луча ФЭКа составляет 0,01 мм. Для увеличения точности хода лучей О1'раничивают диаметр центрально1'О о:кна кюветы до 0,8 см. Чувствительность ФЭКа при этом уменьшается, но результаты становятся более стабильными за счет уменьшения вклада CBeTO рассеяния. Измерение светопропускания про водят при длине волны 490 нм, так как в данном случае коэффициент молярной экстинкции ОКСИ1'еМОI'лобина минимален. Следовательно, при ис пользовании ЭТОI'О метода реI'истрации тестируется не сам reMo лиз (выход 1'еМО1'лобина в среду инкубирования), а повреждение мембран эритроцитов: светорассеяние исследуемых образцов из меняется за счет разрушения мембраны, в том числе ее цитоске лета. Выход rеМО1'лобина явление вторичное и при длине вол- ны 490 нм практически не влияет на ре1'истрируемый СИ1'нал. При проведении reмолиза эритроцитов в одной кювете YCTa новка ре1'истрирует Sобразную инте1'Ральную :кривую, форма ко- торой отражает суммарное изменение величины светорассеяния ('t) в исследуемом растворе во времени, т. е. 't == f(t) рис. 61. В процессе rемолиза с:корость расrщца эритроцитов Дj:}стиrает Maк симальноI'О значения примерно в середине кривой. При диффе- ренцировании СИI'нала интеrральной кривой, Т.е. зависимости dT /dt, в области максимальной скорости I'емолиза эритроцитов G,% 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 О 10 О 3 5 2 4 6 7 254 8 9 t, мин Рис. 61, Интеrральнва кри вая осмотическоrо (кислотноro) rемолиза эритроцитов: 1 фаза сфеРуЛЯ:ЦИИj 2 максимальная с:корость rемолиза (у МАХ); 3 Bpe ми 50 % rемолиза (t 50 ); -1 KO нечная: фаза rемолиза. ПО оси аб сцисс времн rемолиза; по оси ординат степень rе:м:олиза эритроцитов
появляется rлобальный максимум. :Кинетический метод реrист рации процесса раЗРУDIения эритроцитов позволяет оценивать следующие параметры: t лат время латентно1'О периода reмолиза, с; t G собственное время 1'емолиза; t 50 время половинноrо 1'емолиза, с; v ltUlX максимальная скорость rемолиза, ота. ед.; G sf , G степень сферуляции и rемолиза эритроцитов, %. ЛатентныЙ период (t""T) отражает время, ПрОDIедшее с MOMeH та введения rемолитика в кюве'rу до перво1'О появления 1'емоrло- бина вне эритроцита (участок "Ol"Ha рис. 61). Смещение ин- теrральной кривой вниз от нулевой линии вызвано повышением интенсивности рассеяния света суспензиеЙ эритроцитов в резуль тате их сферуляции. Истинный rемолиз, отраженный в виде 8-кривой, предстаВЛJ1ет собоЙ процесс последовательноro вовле чения всей массы эритроцитов (участок "14"); в первое время происходит разрушение самых старых эритроцитов, являющих- ся наименее стойкими (участок "12"). Появление 'И:зrиба на ин- те1'Ральной кривой перед выходом на плато (участок "34") ха- рактеризует кинетику разрушения молодых, наиболее стойких эритроцитов. Плато на кривой (точка "4") означает, ч'rо rемолиз окончен, Т.е. все эритроциты rемолизированы. Линейный участок Sобразной кривой отражает кинетику рас- пада основной массы эритроцитов. Но и в этой фракции есть 1'руппа клеток, rемолиз которых происходит со скоростью, пре ВЫDIающеЙ скорость распада любоЙ ДРУ1'ой rруппы данной по пуляции эритроцитов. Точка "2", расположенная примерно в се- редине кривой, соответствует времени распада эритроцитов, про исходящеrо с максимальной скоростью (у та)' Она соответствует положению максимума дифференциальной кривой. Промежуток времени до начала раЗРУDIения самых нестой ких клеток (точка "1") до :конца процесс а (точка "4") представ- ляет собственное время rемолиза. Время, ПрОDIедшее с момента введения rемолитика в кювету до выхода кривой на плато, общее время l'емолиза. ИНО1'да удобнее пользоваться временем ПОЛОВИННО1'о rемолиза t БО (точка "3"). Это время, за которое про- исходит распад 50 % эритроцитов. При исследовании кинетики rемолиза эритроцитов, индуцированноrо действием химических a1'eHToB, используются 1'ипоосмотические растворы этих соедине ний с различной концентрацией в 0,55 % NaCl. 255
6.6. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕIIИЕ липидноrо СОСТАВА ЭРИТРОЦИТОВ При изучении биомембран обычно имеют дело с относитель но небольшими количествами липидов, поэтому для их разделе ния чаще Bcero используют метод тонкослойной хроматоrрафии (ТСХ) на силикаrеле, позволяющий проводить и качественный, и количественный анализ липидов различных Классов. ТСХ ocy ществляют в тонком слое силикаrеля, нанесенном на подлож ку стеклянную, пластИIФВую или алюминиевую пластинку. В качестве адсорбентов можно применять и ДРУ1'ие вещества (OK сид алюминия, сефарозу, целлюлозу). Силикarель может быть с кальциевой связующей добавкой (силикаreль G) или без нее (си ликаrель Н). ДЛЯ разделения липидов используют xpoMaTo1'pa фические камеры, стенки которых выстилают изнутри фильтро- вальноЙ бумаrой для ускорения насыщения ее парами раствори теля. Камеру 1'отовят предварительно (примерно за 1 ч или более до эксперимента), залив в нее достаточное количество раствори теля на rлубину около 1,5 см. Фильтровальная бумаrа, выстила ющая стенки камеры, должна пропитаться растворителем. Необ ходимо плотно закрывать камеру крышкой (если необходимо использовать вазелиновую смазку). В камеру обычно помещают одновременно не более двух пластинок так, чтобы поверхность подложки была обращена в сторону выстилающей камеру бума rи, а слои адсорбента находились на максимальном удалении друr от друrа. Слой адсорбента не должен соприкаса'l'ЬСЯ с боковыми стенками камеры. Для лучше1'О разделения липидов рекомендуют активировать хроматоrрафические пластинки, ПРОI'pев их при 110 оС в тече ние 30 мин. Исследуемые образцы в полярном раС'l'ворителе Ha носят на расстоянии около 2,5 см от I<Рая пластинки в виде по лос или пятен при помощи микропипетки с тонким на.конечни ком. Прежде чем начинать разделение, необходимо убедиться, что растворитель полностью испарился из нанесенных образцов. Уровень растворителя в камере должен быть примерно на 1 см ниже уровня нанесенных образцов. Разделение заканчивают, коrда фронт растворителя доходит до уровня на 12 см ниже BepXHe 1'0 края пластины. Последнюю вынимают из камеры, осторож:в:о отмечают карандашом фронт растворителя и высушивают в BЫ тяжном шкафу. 256
При разделении смеси липидо:е сложноrо состава ПрО130ДЯТ двумерную хромаТО1'рафию с использованием двух систем paCT ворителей. Для этоrо образец наносят в одном уrлу пластинки и проводят разделение в первой системе растворителей, причем пятна ли:пидов располаrаются вдоль одноrо Ерая пластинки. Ее высушивают, поворачивают на 90" (пятна должны расцола1'аться внизу) и проводят разделение во второй системе растворите.n:ей. Все классы липидов нельзя разделить в одной системе раствори телей. Поэтому выбирают систему ра<;творителей для разделе ния определенноrо класса липидов. В случае полноrо анализа липидов используют неСН:ОЛЬЕО сис'rем растворителей. Лабораторная работа.м 14 Определение фОСфОДИПИДОВ эритроцитарВJdХ мембраи методом ТОИRОСДОЙИОЙ хроматоrрафии Материалы и оборуаован-ие: хлороформ, метанол, бензол, си ЛИЕаrель В:СК или Н, стеклянные IIлаСТИНЕИ 6х6 см (9х12 см), активированный 1'ипс (.или карбонат натрия). 25 % ный водный раствор аммиака, ацетон, ледяная УЕСУСНая: Еислота, серна.я: кис лота, бутанол, НИН1'идрин, раствор Драrендорфа, 42%ная хлор на.я: кислота, молибдат аммония, аскорбиновая Еислота, кровь доноров, стеЕлянные проБИРI{И, пипетки, центрифуrа, роторный испаритель, хроматоrpафическая Еl\мера, шаровая мельница, во'" дяна.я: баня, фотоэлектроколориметр КФR3. Ход paOTЫ Получить хорошо отмытые эритроциты по методике, описан ной в лабораторной работе N2 1. 5 мл отмытых эритроци'l'ОВ обра бо'rать 15 мл смеси хлороформме'l'анол (1:2). Смесь перемешать стеклянной палочкой и остить в холодильнике ва 1012 ч, затем отцентрифуrироватъ при 5000 об/мин и отделить супер натант и поместить ero в холодильник. Осадок реэкстра1'ИРОЕатъ 19 мл смеси хлороформметанолвода (1:2;0,8) и снова цeHT РиФУ1'ировать при тех же условиях. Супернатааты, цолученные в результа'l'е двух экстракций, разбавwrь 10 мл хлороформа и 10 мл воды. В результате образуется двухфазная СIюrема, ниж- ний слой которой состоит из хлороформа с растворенными в нем липидами, свободными от за1'рязнений, а верхний из смеси метанола и воды, содержащий водорастворимые нелипидные при меси. Отделить хлороформную фрarщию, разбавить ее равным 17. 3аказ 3788 257
по объему количеством бензола и упарить на роторном испари теле или под ТЯl'ой на водяной бане при 4050 'с. Липиды взве сить и растворить в нужном объеме хлороформа для получения концентрации 10 мl'/МЛ. Для ПРИl'отовления силикаrеля 220 r силика1'еля КСК, размо лотоrо на шаровой мельнице, залить 2 л дистиллированной воды, тщательно размешать и оставить для осаждения на 40 мин. За- тем надосадочную жидкость слить в друrой стакан и довести водой объем до 2 л. Осадок, накопившийся в течение 2 ч, пере мешать в минимальном количестве воды и оставить на ночь. Перед использованием к осадку добавить равное по объему ко- личество воды для приrотовлениЯ рабочей суспензии. При ис- пользовании силика1'еля Н 1,5 r носителЯ размешивают в 5 мл раствора безводноrо карбоната натрия (6,8 м!' на 100 мл воды). I Для анализа фосфолипидов используют стеклянные пластин ки размером 6х6 (9х12) см с закрепленным слоем силикаrеля. Для это1'О к 25 мл 50 %ной суспензии силикаrеля добавить 80 мr просеянно1'О и активированноrо rипса. 1 мл тщательно переме шанной смеси нанести на предварительно обезжиренную CTeK лянную пластинку и оставить влажную пластинку для Bыcыxa НИЯ на rоризонтальной поверхности. Пластинки можно хранить в эксикаторе над безводным хлористым кальцием. Раствор 100 мк!' липидной фракции в 10 мкл хлороформа нанести микрошприцем в уrол пластинки на расстоянии 1 см от края. Предварительно хроматоrрафическая камера дожна быть насыщена парами растворителей в течение 2030 мин. XpOMa тоrрафию провод.я:т сначала в вертикальном направлении в сис теме 1 (хлороформметанол25 % ный водный раствор аммиа ка в соотнОшении 13:7:1) до момента достижения BepXHero края пластинки фронтом растворителей. После извлечения из KaMe ры и просушивания пластинку поместить в друrую камеру с си стемой 2 (хлороформацетонметанолледяная уксусная кис лотавода в соотношении 10:4:2:2:1) и хроматоrрафировать ли пиды в перпендикулярном направлении. Затем необходимо вы- сушить пла:стинку, опрыснуть 10 %ной серной кислотой в мета- ноле и про.я:вить в течение 20 мин при 180 'с. В результате xpo матоrpафическоrо разделения каждый фосфолипид занимает оп ределенное место в виде пятна на пластинке (рис. 62). Индивиду альные пятна фосфолипидов идентифицируют с помощью ЦBeT ных реакций. Фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин опре- 258
\)4 ()З оО 2 5 О Рис. 62. Расположение индиви дуальных фосфолипидов после npo веденШI двумерной хроматоrрафJlli в тонком слое СИЛИК8rеЛJl (Н. Ю. Каль нова, 1992): 1 лизофосфатидилхо лин; 2 сфиШ'омиелин; 3 фосфа тидилхолин; {/ фосфатидилэтаноЛ а.мlШ; 5 фосфатидилсерин деляют с помощью НИНI'идрина. Для этоrо высушенные xpOMa TorpaMMbl опрыскивают раствором НИН1'идрина (0,3 моль/л) в бутан оле; после высушивания и наrревания пятна, соответствуIO щие этим липидам, окрашиваются в розовый цвет. Для об:аару жения холинсодержащих фосфолипидов пластинки опрыскива ют раствором Драrендорфа. При этом пятна, содержащие фос фатидилхолин, СфИН1'омиелин и лизофосфатидилхолин, окраш:и ваются в ЯрКОрОЗ0ВЫЙ цвет. Содержание фосфолипидов определяют по уровню неорrав:и ческоro фосфата по калибровочной прямой, полученной при по мощи однозамещенноro фосфорнокислоro калия СО1'ласно MeTO дике, описанной в лабораторной работе N2 8. Предварительно после высушивания на воздухе пластинок их проявдяют в парах йода. Затем пятна быстро и аккуратно "обкалывают" иrолкой, потом снимают специальной лопаточкой и переносят в пробирки. В каж дую пробирку добавляют 0,1 мл 42 % ной хлорной кислоты, Ha 1'ревают при высокой температуре до обесцвечивания силикаrе ля и испарения кислоты. После охлаждения добавляют 0,49 мл хлорной кислоты, 0,81 мл воды, 0,4 мл 1,25 %Horo раствора молибдата аммония и 0,4 мл 5 %ной аскорбиновой кислоты. выдерживают в кипящей водяной бане в течение 5 мин и фото метрируют. 17* 259
6.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФYJIIСЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ АНТИО!ССИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ КРОВИ* Лабораторная работа .м 15 Исследование каталитической активиости су:пеРОRсиддисм:утазы в ЭрИТрОЦИ'1'ах крови доноров Супероксиддисмутаза (СОД) .осуществляет защитную реакцию в отношении супероксидноrо радикала кислорода, катализируя реаJЩИЮ дисмутации 02 L с образованием пероксида водорода (см. раздел 3.1). Б ОР1'анизме человеI,а СОД найдена практически во всех op1'aHax и тканях; наиболее высокий уровень фермента об наружен в эритроцитах, мозrе, печени, щитовидной железе. Молекула СОД состоит ИЗ двух идентичных субъединиц с MO лекулярной массой 1'6300 Да, связанных между собой дисуль фидной связью. СОД является одним из быстродействующих ферментов: кон- станта скорости реаКЦИИ ферментативной дисмутации анионра дикаЛов составляет 2.1011 мольl. лl. СОД как один из основных ферментов антиоксидантной сис темы орrанизма участвует не только в реrуляции уровня высоко- реакционноспособных супероксидных анионрадикалов, но и KOH тролирует концентрацию продуктов ПОЛ на стадии иницииро вания цепей окисления. AI<.тивная 1'енерlЩИЯ 02 L при воспалительных процессах co пряжена с мобилизацией антиоксидантной системы, приводящей :к' ИЕrду:кции синтеза СОД. При увеличении длительности токси ческо1'О воздействия кислорода наблюдается истощение системы антио:кислитеЛъной защиты орrанизма, повышается скорость pe акций ПОЛ. Применение лекарственных форм СОД или ,СОДактивных соединений позволяет снижать :концентрацию 02 L . Таким обра зом, состояние антиоксидантной защиты и, в частности, уровень СОД, отражает компенсаторные возможности орrанизма при раз личных состояниях, связанных со своБОДЕ!ОРадикальной патоло rией. Материалы u otfopyiJosaltue: кровь доноров, хлорид натрия, хлороформ, этанол, 0,01 моль/л Nафосфатный буфер (рН 8,5), * Раздел написан с участием О. В. Вашариной. 260
этилендиаМИlIтетраацетат натрия (ЭД'l'А), тетраметилэтилендиа- мин ('l'ЭМЭД), нитросиний тетразолиевый (НСТ), рибофлавин, калий йодистый, цеНТРиФУ1'а MPW 340, центрифужные весы, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы для спектрофотомет- ра, стеклянные пипе'rки, проб ирки, фильтровальная бумаrа. Ход работ:ы Метод определения активности СОД основан на ее способно- сти конкурировать с красителем нитросиним тетразолиевым за супероксидные анионрадикалы, образующиеся при reнерации их в системе тетраметилэтилендиаминрибофлавин. В ходе реак- цИИ НСТ восстанавливается с образованием 1'идразинтетразолия, xapaI-i.теРИ3УlOщеrося максимумом ПОl'лощния при 540 нм. В присутствии СОД степень восстановления НСТ уменьшается. Выделить эритроциты из крови доноров СО1'ласно методике, описанной в лабораторной работе Nй. 500 мкл эритроцитов re- молизировать на холоде с равным объемом дис'rиллированной воды. Для удаления rеМО1'лобина эритроциты обработать 400 мкл хлороформ-этаноловой смеси (3: 5 ),добавить 100 мкл воды И ос- тавить на 30 мин при +4 'С. rемолизат центрифуrировать при 4000 об/мин в течение 10 мин, отобрать 50 мкл супернатанта и смешать с 600 мкл дистиллированной воды. Реакционная смесь содержит; 1. Фосфатный буфер 0,5 мл; 2. ТЭМЭД (0,05 моль/л) в 0,2 моль/л ЭДТА 0,5 мл; 3. НСТ (0,85 ммоль/л) 0,5 мл; 4. Вода дистиллированная 2,5 мл; 5. Раствор, содержащий СОД, 50 мкл; 6. Рибофлавин (0,034 ммоль/л) 1 мл. В контрольную пробу раствор фермента не добавлять. PeaK ция инициируется облучением лампой дневно1'О свет (мощность 20 Вт) на расстоянии 20 см в течение 5 мин. Для остановки реакции прилить 0,5 мл раствора KJ (1 %). Оптическую плот ность зареrистрировать на спектрофотометре СФ46 при 540 нм. За единицу активности фермента принимают такое e1'o количе ство, которое обеспечивает ИН1'ибирование восстановлени.я: НИТ- росине1'О тетразолиевоrо на 50 %. Активность СОД рассчитыва ют по формуле А'= (К O)/K'lOO %, 261
rде А активность фермента в усл. единицах; К оптическая плотность контрольной пробы; О оптическая плотность опыт- ной пробы. Лабораmорnая рабоmа ом 16 Определение активности катал:а3Ы в эритроцитах крови человека спектрофотометрическим методом Каталаза (пероксид водорода: пероксид водорода оксидоре дуктаза, 1.11.1.6) разрушает пероксид водорода, образующийся прямым путем при восстановлении кислорода или более слож. ным путем при дисмутации супероксидных радикалов. Этот фер мент катализирует двухэлектронное восстановление Н 2 О 2 дО Н 2 О, используя Н 2 О 2 как донор электрона. Каталаза в клетке локализо- вана в микротельцах (пероксисомах), входит в состав лизосом. Молекулярная масса каталазы из различных источников составляет 225251 кДа. Молекула каталазы состоит из 4 иден. тичных субъединиц и 4 l"рупп 1'ематина. Следует отметить, что каталаза проявляет и умеренную пероксидазную активность, Т.е. катализирует реакцию окисле ния ОР1'анических веществ пероксидом водорода. Считают, что каталаза все1'да присутствует в биосистемах, 1'де происходят процессы клеточноrо дыхания с участием цитохро мов, Т.е. там, rде в результате восстановления кислорода образу- ется пероксид водорода, который весьма токсичен для живой клет ки и поэтому должен быть удален. В связи с тем, что каталаза локализуется преимущественно в печени и эритроцитах, целесообразно определять ее активность в сыворотке крови при заболеваниях печени и 1'емолитических процессах. Материалы и оборуаование: кровь доноров, хлорид натрия, хлороформ, этанол, 0,01 моль/л Nа-фосфатный буфер (рН 6,7), этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА), пероксид водорода, 10 %ный раствор серной кислоты, ЦентриФУ1'а МPW.340, цент- рифужные весы, спектрофотометр СФ.46, кварцевые кюветы для спектрофотометра, стеклянные пипетки, пробирки, фильтроваль. ная бума1'а. Работа включает 3 этапа (а, б, в). а) Получение эритроцитов Эритроциты получают из цельной крови человека путем центрифуrирования на цеНТРиФУ1'е' MPW.340 при 1500 об/мин 262
в течение 15 мин. Сыворотку отбирают с помощью пастеровской пипетки, добавляют к эритроцитам равный объем 0,9 %Horo раствора NaCl и повторно центрифу1'ИРУЮТ в том же режиме. Эритроциты отмывают таким способом в растворе N aCl 3 раза. Затем 2 мл эритроцитов разводят 0,9 %HЫM раствором NaCl в соотношении 1:1000 до значений оптической плотности D==0,7 при 410 нм, что соответствует концентрации 1,5'108 кл/мл. б) Получение rемолизата эритроцитов, свободно1'О от rемо1'ЛО бина К 0,5 мл эритроцитов добавляют 0,5 мл бидистиллированной воды для нарушения целостности эритроцитарных мембран и oc тавляют на холоде в течение 1520 мин. rеМО1'лобин осаждают хлороформэтаноловой смесью (1 :5). Для ЭТО1'о к 1 мл 1'емолизата добавляют 200 мкл хлороформэтаноло вой смеси. Затем rемолизат центрифу1'ИРУЮТ в течение 10 мин при 3000 об/мин. Отбирают супернатант и в нем определяют активность ка.талазы, предварительно разбавив e1'o бидистилли рованной водой в соотношении 1:10. в) Определение функциональной активности каталазы Принцип метода. Опредsление активности каталазы OCHOBa но на ее способности БЫСОI<оэффективно катализировать peaK цию разложения перо:ксида водорода на воду и кислород. Реакционная смесь содержит следующие растворы: 1. Фосфатный буфер (0,01 моль/л), рН 6, 7' 0,5 мл. 2. Этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) (10-4 моль/л) 0,5 мл. 3. Пероксид водорода (0,015 моль/л) 2 мл. 4. Исследуемый образец 0,1 ил. ДЛЯ определения активности каталазы в контрольную и опыт Бую пробы, содержащие исследуемый ферментный раствор, дo бавляют фосфатный буфер, перо:ксид водорода и ЭДТА. Пр06ир ки оставляют на 10 мин при комнатной температуре, предвари тельно остановив реакцию в контрольной пробе добавлением '1 мл 10 % Horo раствора серной кислоты. 'l'акой же объем серной кислоты добавляют в опытную пробу после окончания инкуба ции. Каталазную активность определяют на спектрофотометре СФ46 при ДЛИне волны 250 нм. Холостая проба для учета спонтанной реакции разложения пероксида водорода отличается тем, ,Ч,то вместо образца, содержащеro каталазу , в нее добавляют такой жf4 объем фосфатноrо буфера. 263
За единицу активности (А) принимают такое количество (в MO лях) пероксида водорода, которое- раЗJfОЖИЛОСЬ при иrщубации в единицу времени: А = ДО . У[ . с[ . n (моль/мин на 1 MI:' беЛIа), Dx . У 2 . С 2 . t . rде D разность оптических плотностей опытной и контрольной проб; Dx оптическая плотность холостой пробы; V j общий объем инкубациоппой смеси; V 2 объем исследуемOf'О образца; С ! концентрация НР2; С 2 концентрация белка в пробе; n фактор разведения; t время инкубации. Лабораторная работа М 17 Исследование функциональной активцости rлутатионреДyIстазы эритроцитов rлутатионредуктаза (NAD(P)H: окисленный rлутатионоI<'.СИ- доредуктаза), фермент класса оксидоредyR'l'аз, катализирующий восстановление окисленноrо rлутатиона: GSSG + NADPH + Н+ 2GБН + NADP+, Т'де GS остаток rлутатиона; NADPH и NADP+ COOTBeTCTBeH но восстановленные и окисленные формы кофермента никотин- амидадениндинуклеотидфосфа та. rлутатионредуктаза состоит из двух одинаковых субъединиц с молекулярной массой каждоЙ 5055 тысяч: полость между ними в ходе реакции' занимае'l' 1'лутатион. Субъединицы содер- жа'l' но 4 структурных домена, на одном конце KOTopo1'O располо- жен остаток флавипадениндинуклеотида, на дрyroм NAD(Р)Нсвя зыающиеe участки. Наиболее полно изучено строение 1'лутати- овредуктазы эритроцитов человека, субъединица которой состо- ит из 478 аминокислотных остатков и содержит по 30 % а-сни- ралей и PCTPYITYP. Активность 1'лутатионредуктазы в сыворотке крови повыша- ется при инфаркте миокарда, онколоrичесн:,их заболевэ-ниях и 1'e- натитах, а в эритроцитах при наследственной неДОС'l'аТОЧНОС'fИ rлюкозо-6-фосфатде1'ИДРО1'еназы, что позволяет использовать оп- ределение уровня 1'лутатионредуктазы в диarностических целях. Материалы и оборуJоеаJiuе: кровь допоров, хлорид натрия, хлороформ, эта:нол, 0,067 моль/л Na-фосфа'I'НЫЙ буфер (рН 6,6), окисленный I'лутатион, NADPH, центрифyrа MPW-340, центри- фужные весы, спектрофотометр СФ-46, кварцевые юоветы для 264
спектрофотометра, стеклянные пипетки, пробирки, фильтроваль ная бумаrа. ХОД работы Получить отмытые эритроциты по методике, описав:ной в ла бораторной работе ;м 1. 0,5 мл эратроцитарной массы 1'емолизи ровать с 10 мл 0,067 моль/л фосфатноrо буфера (рН 6,6) и OTa- вить на холоде 15 мин. е целью осаждения 1'еМОl'лобина к 1 мл 1'емолизата добавить 0,2 мл хлороформ-этаноловой смеси (1:5), тщательно переме шать, выдержать на холоде 5 мин и цеНТРиФУ1'ировать при 5000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант использовать для определения активности 1'лутатионредуктазы. 0,1 мл супернатанта добавить в спектрофотометрическую КЮ вету, содержащую 2,9 мл 0,067 моль/л фосфатв:оro буфера (рН 6,6) с 0,027 ммоль/л окисленноro rлутатиона и 0,02 ммоль/л NADPH. Оптическую плотность раствора измерить при длине волны 340 нм на спектрофотометре СФ-46 сразу после добавления сynернатанта и через 5 мин после инкубации реакционной смеси. Активность 1'лутатиов:редУктазы (А) рассчитывают по формуле А= ДD З40 ,У lIр . q в . / . V СУl1ер . t ' rде .1D 840 "" D 1 D 2 изменение величкны оптической плотнос- ти реакционной смеси за 5 мин; V конечный объем пробы пр (3 мл); q фактор разведения эритроцитов; f молярный коэф- фициент ПО1'лощающеrо соединения (NADPH), равный 6,2'103 л (моль-l,смl); 1 длина оптическо1'О пути, см; V объем до- cynep бавленно1'О супернатанта (0,3 мл); t время инкубации реакци- онной смеси (5 мин). Каталитическую активность rлутатионредуктазы выражают в мкмолях превращенноrо NADPH в 1 мин на 1 мл эритроцитов. 6.8. ИЗУЧЕНИЕ УЧАСТИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ПРОЦЕССАХ УФ-МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ Для выявления участия активных форм кислорода в про- цессах фотомодификации белковых молекул проводят МОДель- ные ЭI<.сперименты с использованием растворов биополимеров (в частности, лактатде1'идроrеназы), а также акцепторов и тушите- лей активных r<.ислородных :метаболитов. 18. Заказ 3788 265
Одним из распространенных тушителей синrлетноrо молеку лярноrо кислорода является азид натрия NаN з . Это соединение обладает широким спектром действия, что обусловлено элеК'l' ронной конфиrурацией e1'O молекул. !'руппа N з линейна: N == N+== N: N N+ "" N: N N == N:+ Ее строение представляет собоЙ суперпозицию трех резонан сных структур с частичными зарядами у различных атомов азо та. ВероЯ'l'НО, это способствует взаимодействию иона азида с ком- плементарными участками аминокисло'rных остаТIЮВ беЛIЮВОЙ rлобулы. Азид натрия используе'l'СЯ КЮС эффективный ионофор, e1'o орrанические производные применяют в химической энзи- МОЛО1'ии в качестве фотореактивируемых поперечносшивающих a1'eElToB. Dманнит ШИрОlСО распространенное в природе вещес'l'ВО обладает сродством к ОН-радикалам. :Кроме To1'o, e1'o фотопро- текторное действие может быть связано с образованием комп лекса белокспирт, более резистентно1'О, чем свободный биопо лимер. Серотонин (5-1'идрокситриптамин) является БИОЛО1'ичеCIШ ак- тивным веществом из 1'руппы индолилалкиламинов: HOWCH'4CH'NH' N I Н Он принимает участие в различных фИЗИОЛО1'ических про цессах. E1'o рассматривают как химический медиатор нервных возбуждений, антидиуретический 1'ормон, 1'емостатичеСl':ИЙ a1'eH'r, фактор роста, медиа'rор аллерrических реакций и др. У становле- ЕЮ, что серотонин проявляет выраженный фотопро'rекторный эф- фект по отношению к молекулам rемопротеидов (феррицитох- рома С, каталазы и ОКСИ1'емоrлобина). По всей вероятности, за щитное действие это1'о биоrенноrо амина может быть обусловле- но как конкуренцией e1'o молеl':УЛ за активные частицы (первич ные и пероксидные радикальr) Уф..фо'roЛ>oJЗа водных растворов белков, так и образованием комплекса серотонин биополимер, более резистентноrо по сравнению со свободным белком. Лактатде1'идроrеназа rликолитический фермент, катали- зирующий обратимую реакцию окисления молочной кислоты с 266
образованием пировиноrрадной кислоты в присутствии I-,офер мента NAD (см. раздел 4.3). лдr обнаруживается во всех клетках и биолоrических жид- костях. Следует обратить внимание на 'l'OT фак').', что уровен:ь фер- мента в эритроцитах в 100 раз выше, чем в сыворотке. Поэтому при определении erO активности в сыворотке крови 1'емолиз эрит- роцитов должен быть полностью исключен. Также необходимо быстро отделять crycToK от сыворотки. Активность лдr моl'УТ подавлять rепарин и оксалат, Повышение активности лдr имеет место при некрозе TKa ней, особенно при остром поражении сердца, повреждении эрит роцитов, почек, скелетных мышц, печени, ле1'КИХ и кожи. Значи- тельное увеличение активности фермента сопровождает rемоли- тические анемии, связанные с дефици'roм витамина В 12 и фолие- вой кислоты, а также эритремию. Возрастание уровня лдr ха- рактерно для острой фазы и:в:фекционно1'О rеnа').'ита. Определение изоферментноrо CneI<Tpa лдr также использу- ют в диа1'ностических цеЛЯХ. Изоферменты сывороточной лдr выявляются после электрофореза при рН 8,6 на крахмальном, ю'аровом или полиакриламидном rелях. При инфаркте миокар да обнаруживается увеличение содержания лдr 1. Относитель ное повышение уровня лдr 4 и 5 наблюдае'rся при остром 1'епа ТИ'l'е, тяжелом мышечном повреждении, дерматомиозите, мышеч- ной дис'rрофии. Лабораторная работа М 18 Исследование каталитической аltтивпости лактатдеr:идроrе- пазы спектрофотометричес:ким метоДОМ Принцип метода. n основе даИНОl'О определения функциональ ной активности лдr лежит ме'I'ОД БерrМейера, сущность КОТО- poro заключается в оценке скорости окисления NADH, реrистри- руемой спектрофотометрически при длине волны 340 им. Материалы u оооруаование: 0,1 моль!л Nафосфатный бу фер (рН 7,4), пируват натрия, буферный раствор J):актатде1'ИДрО- 1'еназы из сердца свиньи или скелетных мышц свиньи, спектро фотометр СФ-46, кварцевые кюветы, стеКЛЯНБые пипетки и про- бирки, фильтровальная бума1'а, секундомер. 18* 267
Ход работы Если в работе используется коммерческий препарат лдr из мышц свиньи (кристаллическая суспензия в 2,2 моль/л сульфа те аммония), то он должен быть предварительно обессолен MeTO дом rельхромаТО1'рафии на колонке (15хl,5 см), упакованной сефадексом G25. Выделение лдr из сердца свиньи провод.ят по методике, описанной в лабораторной работе N2 17. Концентрацию растворов фермента определяют на cneKTpo фотометре СФ46 при длине волны 280 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции 1,96'105 Л (мольl. смЧ для мышечной и 0,196-105 л (мольl 'CMl) для сердечной изоформы. Реактивы (указаны конечные концентрации) а) для лдr из мышц свиньи: 1. Nафосфатный буфер 0,1 моль/л (рН 7,4). 2. лдr (буферный раствор) 108 моль/л. 3. Пируват натрия (буферный раствор) 1,5'103 мо:m./л. 4. NADH (буферный раствор 5,4'1O5 моль/л. б) для лдr из сердца свиньи: 1. Nафосфатный буфер 0,1 моль/л (рН 7,4). 2. лдr (буферный раствор) 108 моль/л. 3. Пируват натрия (буферный раствор) 0,15'103 моль/л. 4. NADH (буферный раствор 5,4'105 моль/л. В кварцевую кювету для спектрофотометра поместить 2,8 мл раствора фермента и 0,1 мл NADH. На спектрофотометре СФ46 при длине волны 340 нм измерить оптическую плотность Dl' Затем в кювету прилить 0,1 мл пирувата натрия и через 30 с зареrистрировать оптическую плотность D 2 . Каталитическую aK тивность лдr (А) рассчитывают по формуле А = ДD З40 . V llp е .f. t ' 1'де LJ)З40 == Dl D 2 изменение величины оптической плотности реакционной смеси при 340 нм; е молярный коэффициент по- 1'лощающе1'О соединения (NADH), равный 6,22'103 л (моль-l,.смl); 1 длина оптИческоrо пути (1 см); t время инкубации реакци- онной смеси (30 с); V np конечный объем реакционной смеси (3 мл). Активность лдr выражают в микромол.1IX превращенно- ro NADH в минуту. 268
Лабораторная работа .м 19 'Выделение лактатдеmдроrенаЗJld из сердца свиньи Материалы и оборуiJО8aJше: 0,2 моль/л Nафосфатны:й бу фер (рИ 7,2), 0,1 моль/л Nафосфатны:й буфер (рН 7,2),0,1 моль/л Nафосфатны:й буфер (рН 7,5), сульфат аммония мелкоизмель ченный, сульфат аммония (0,5 насыщения), ацетон, хлорид Ha трия"(лед), ХЛОРИД калЬЦИЯ, концентрированный раствор аммиа ка, 1'ОМО1'енизатор ("Honiogenizer type 302", Польша), маrнитная мешалка, цеНТРиФУ1'а MPW360, центрифужные npобирки, CTeK лянная посуда, фильтровальная бумаrа. Ход работы Для ПРИ1'отовления кал:ьцийфосфатноl"О 1'еля к 0,5 л 0,44 моль/л Na 2 HP0o\ при энерrичном перемешива:s:ии быстро дo бавить 0,5 л 0,66 МОJfЬ/л CaC1 2 . Концентрированным раствором аммиака довести рН раствора до значений 8,28,6. Полученную суспензию поместить в стеклянный цилиндр объемом 2 л, Ha лить бидистиллированную воду и перемешать. После оседания 1'еля жидкость декантировать. Оставшуюся суспензию вновь за лить водой, перемешать и отстаивать. Анало1'ИЧНУЮ процедУРу повторять до тех пор, пока в промывны:х. водах не исчезнут ионы хлора. После этоrо общий объем суспензии довести водой до 1 л. rель надо 1'отовить за 1 2 дня до использования и хранить в холодильнике. Все работы с растворами фермента необходимо проводить :в:а ледяной бане и в холодной комнате. ЭкстраlCЦlJ.Я,. Охлажденные свиные сердца освободить от жиро вой и соедииитеJfЬНОЙ ткани и l"омоreнизировать при 10090 об/мин ("Homogenizer type 302", Польша). Около 400 l' измельченной TKa ни залить 1,5 л холодной бидистиллирован:ной воды, перемешать в течеI;l:ие 20 мин при помощи маmитной меmалв:и, отжать через несколько слоев марли и фильтровать для удаления жира через стеклянную вату. Обработка lCальций-фосфатным zеле.м.. К экстракту при ne ремещивании добавить 0,3 л суспензии кальцийфосфатноro 1'еля. Пере.:мешивание продолжать еще 5 мин и. затем отстаивать. Че рез 30 мин прозрачную жидкость над осадком просифонировать и отбросить, а оставшуюся суспензию цеНТРиФУ1'ировать 15 мин при ;2000 g на рефрижераторной цеНТРиФУ1'е МPW-360 (Польша). 269
К осадку добавить 0,2 л 0,2 моль/л фосфатноrо буфера с рН 7,2, перемешать до получения однородной суспснзии и центрифу1'И- ровать 15 мин при' 2000 g. Надосадочв:ую жидкость слить, а к осадку добавить 0,15 л 0,2 моль/л фосфатноrо буфера (рН 7,2). Тщательно перемешать и центрифуrировать 15 мин при 2000 g. Первое осажrJенuе сульфатом ШИМOltltJl. К объединенным цен- ТРиФУ1'атам, полученным на предыдущей стадии, при перемеши вании отдельными порциями добавить сульфат аммония до 0,6 насыщения. Перемешивать еще 15 мин, затем центрифуrировать при 2600 g в течение 30 мин. Первое осажrJеlluе ацетоном. Осадок растворить в 40 мл 0,1 моль/л фосфатноrо буфера с рН 7,2 и к полученному pac'rBo ру добавить' предвари'rельно охлажденный до 15 'С ацетон в количестве 60,4 мл на каждые 100 мл ферментативно1'О раство- ра. Поднять температуру до 13 'С и инкубировать смесь 10 мин, затем центрифуrировать при 2600 g в течение 15 мин. К осадку добавить 20 мл сульфата аммония 0,3 насыения.. Пере мешать до получения однородной суспензии и через 30 мин центрифуrи ровать 40 мин при 2600 g. Второе осажоение сульфатом аММОНИJl. R центрифуrату до- бавить сульфат аммония до 0,5 насыщения. Перемешать в тече- ние 10 мин и оставить в холодильнике на 68 ч. Центрифуrиро вать 40 мин при 2600 g и осадок растворить в 5,5 мл холодной бидистиллированной воды. Второе осажоеJtuе ацетоном. К ферментному раствору, как и в первый раз, добавить ацетон, охлажденный до 15 'с. Темпе ратуру поднять до 18 'С, выдержать 10 мин, затем центрифуrи ровать 15 мин при 2600 g. Осадок суспендировать в 2 мл сульфа та аммония 0,3 насыщения. ICристаллuзаЦИJl. К ферментному раствору присыпать суль фат аммония до 0,5 насыщения. Перемешать и оставить в холо дильнике на ночь. ЦентриФУ1'ировать 20 мин при 2600 g и oca док растворить в сульфате аммония 0,3 насыщения. К суспензии добавить сульфат аммония до 0,5 насыщения. Описанную проце- дуру повторить три раза. Суспензию кристаллов фермента xpa нить в холодильнике. В процессе выделения лдr содержание белка на различных стадиях необходимо контролировать по методу Лоури (см. лабо раторную работу М 2). 270
Степень rомоrенности полученноrо препарата анализируют методом дискэлектрофореза в полиакрилаМИДRОМ rеле (см. ла- бораторную работу N2 20). Лабораторная работа М 20 Исследование изофермеитиоrо спектра лактатдеrидроrена зы методом электрофореза :в полиакриламидиом rелс Определение изофеРМI:JНТОВ ЛДr методом ДИСI<"электрофоре за в полиакриламидном rеле основано Шl различиях в зарядо вом СОСТОянии и электрофоретической подвижности молекул разных изоформ белка. Материалы u оборуiJоваltuе: соляная кислота, ТРИС1'идрокси метиламинометан (трис), ТЕМЕД, а:криламид, би:са:криламид (БИС), персульфат аммония, рибофлавин, сахароза, бромфеноловый си ний, феназинметасульфат, нитросиний тетразолиевый, хлорид ма1'НИЯ, хлорид натрия, фосфатный буфер (р:Н 7,4), NADH, лак тат натрия, уксусная кислота, парафин, установка для диск-элек трофореза, термостат, денситометр, РТУТlIOкварцевая лампа. Ход работы Для получении мелкопористоrо (5,5 %) rеля, в котором ocy Ществляется разделение веществ в соответствии с их зарядом и молекулярной массой, необходимо смешать 1 объем раствора А щ (48 мл 1 н HC1, 36,6 l' трис и 0,23 мл ТЕМЕД на 100 мл бидистил- лированной воды), 2 объема В (28 l' а:криламида и 0,735 l' БИС в щ 100 мл дистиллированной воды), 4 объема раствора 2 (0,14 %ный щ раствор пер сульфата аммония) и добавить 1 объем ДИСТИЛJIИро- ванной воды. Осторожно перемеrлав стеклянной палочкой полу ченную смесь, внести по 2 мл ее в каждую трубку (один :конец трубки заклеить и заrерметизировать расплавленным парафи- ном). Для предотвращения ИН1'ибирования молекулярным :кис лородом процесса полимеризации 1'еля и формирования ровной поверхности последне1'О сверху раствора наслоить бидистилли- рованную воду на высоту 57 мм. Процесс полимеризации за- канчивается через 3040 мин, о чем свидетельствует появление четкой rраницы раздела между rелем и водой и леrI{ое HarpeBa- ние трубок. На слой разделяющеrо I'еля нанести 0,2 МЗI I{онцентрирую щеrо крупнопористоrо 1'еля (7 %), который 1'отовят смешивани ем 1 объема Б щ (24 мл 1 н HC1, 2,99 l' трис и 0,23 мл ТЕМЕД на 271
50 мл бидистиллированной воды), 2 объемов раствора r (5 l' aK щ риламида и 1,25 l' БИС в 50 мл воды), 1 объема Дщ (0,004 % ный раствор рибофлавина) и 4 объемов раствора Е (40 % ный pa щ створ сахарозы). Полимеризация протекает за 1015 мин в yc ловиях облучения светом ртутно-кварцевой лампы. Для исклю- чеF.IИЯ контакта с кислородом воздуха на rель также аккуратно наслоить воду на высоту 35 мм. С поверхности заполимеризовавше1'ОСЯ концентрирующеrо 1'еля удалить воду и внести образец (смесь изоферментов лдr, разведенную 40 % -ным раствором сахарозы в отношении 1:1) в количестве 0,2 мл. Наслоить раствор лидирующею красителя (0,001 %ный раствор бромфенолово1'О СИF.Iе1'О). Эта часть колон ки непосредственно соприкасается с электродным буфером при электрофорезе, поэтому верхнее наслаивание заканчивается элек- тродным буфером. Наслаивание проводят очень осторожно, из беrая: перемешивания образца с буфером, во избежание потери вещества. Состав электродноrо буфера (рН 8,3): 6 r трис и 28,8 r 1'лици на на 1 л бидистиллированной воды. Перед использованием ero F.Iеобходимо разбавить в 10 раз. Собрать прибор для диск-электрофореза, поместить e1'o в xo ЛОДИЛЪF.Iик И подсоединить к соответствующим полюсам выпря мителя тока. Первые 1520 мин электрофореза сила тока не должна превышать 0,002 А на каждую трубочку. Такая низкая величина тормозит движение мелких частиц образца в раствор Bepxнero сосуда. По истечеmm этоrо срока силу тока увеличить дО O,0040,005 А на 1'ель. После окончания электрофореза извлечеНF.Iые столбики по местить в красящую смесь для проявления изоферментов лдr. в основе тетразолиевоrо метода выявления локализации ферментов в rелях лежит образование нерастворимых хромо- reHHыx веществ формазанов. Схематически их образование может быть представлено последовательностью реакций: NADH + феназинметасулъфат (ФМС) ФМС посет ФМС ВОССТ + нитросиний тетразолиевый (НСТ) НСТ во . ст (диформазан, окрашенный продукт) ФМС выступает в качестве переносчика электронов в цепи реакций. 272
В состав инкубационной средЫ входят 8 мл 1 моль! л раство- раЛllliтата натрия, 4 мл. раствора NADИ (10 мr/мл), 8 мл 0,1 моль/л раствора NaCl, 8 мл 0,005 молъ/л раствора MgC1 2 , 10 мл 0,05 моль! л фосфат:в:оrо буфера (рИ 7,4), 2 мл раствора ФМС (1 мr/мл) и 20 мл НСТ (1 М1'/мл). Каждый столбик ПAAr поместить в отдельную пробирку, за лить инкубационной смесью и поставить в термостат при 'rемпе ратуре 37 'с на 11,5 ч (или инкубировать при комнатной тем- пературе в тече:в:ие ночи). ПО истечении срока инкубации rели ополос:в:уть водой и перенести в пробирки, содержащие раствор уксусной кислоты (7 %). При температуре 5 'с и в темноте диск электрофореrраммы изоэнзимов лдr MorYT сохраняться не более 7 дней. В течение этоrо срока их денситометрируют, изобража- ют 1'рафически изоферментный спектр лдr (по оси абсцисс длина столбика 1'еля, по оси ррдинат оптическая плотность), затем определяют содержание каждоrо изофермента весовым методом. Лабораторная работа .м 21 ИССJIедование УФ-чувствитеJIЬИОСТИ JIактатдеrидроrев:азы в присутствии некоторых :модифицирующих areJITOB Материалы и оборуiJ08ание: 0,1 моль/л Nа-фосфатный бу- фер (рИ 7,4), пируват натрия, NADH, буферный раствор Лllliтат- де1'идроrеназы из сердца свиньи или скелетных мышц свиньи, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы, стеклянные пипет- ки и пробирки, фильтровальная бума1'а, секундомер, установка для УФоблучения биосистем. Ход работы 1 вариант Объектом исследования является roтовый препарат фермен та, обессоленный путем rель-хроматоrрафии на сефадексе G-25 (см. лабораторную работу N2 18). Преподаватель выбирает один из вариантов эксперимента. В качестве модифицирующе1'О ыeH та используется раствор: а) азида натрия (3,2'10-3 моль/л); б) D-маинита (5,5'10-5 моль/л); в) серотонина (1.10-.5 моль/л). Затем необходимо провести определение функциональной Illi тивности: 273
1) нативно1'О фермента (см. ла60ра'rорную работу NQ 18); 2) УФоблученно1'О в дозе 3,02 кДж/м 2 свободноrо фермента; 3) фермента в присутствии модифицирующеrо арента; 4) фермента, УФоблученноrо в той же дозе в присутствии модификатора. УФоблучение образцов проводи'l'Ь соrласно меТОДИIе, опи санноЙ в лабораторной работе N!! 5. Данные представить в виде табл. 21. Таблица 21 УФ-иноуцированные И:Jмененu.л ферментативноЙ aJстивности JlаJCmаmiJеi!иiJроzeна:Jbt в прuсутст6UИ .lIf.ооифuцuрующе20 а8ента Фсрментативнал АКТИВRОС1'Ь лдr, '% от Bap!IaHT опыта aIТИВНОСТЬ лдr, активности нативноrо МRМОЛЬ/МИН фермента Нативный фермент 100 %, лдr, УФ-облучеIШая в свободном состоянии лдr + модифицирующий ar'eHT лдr, УФ-облученная в прn:сутствии химичеСRОro RI'eHTa На основании полученных результатов сделать заключение о причинах и XapaRTepe изменений величин ферментативной Ю тивности ЛДr при УФ-облучении белка в свободном СОС'l'оянии и в присутствии модификатора. Какое действие может оказы вать модифицирующий арент (азид натрия, Dманнит, серотонин) на структурноФункциональное состояние белковой молекулы при УФоблучеF.IИИ растворов исследУемо1'О фермента? II вариант В качестве объекта исследоваF.IИЯ используют препарат фер мента, полученный из сердечной МЫШЦЫ свиньи по методике, описанной в лабораторной работе NQ 17. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ 1. Опишите методику выделения эритроцитарных мембран из IpO ви доноров. 2. Какие химические реакции лежат в основе определения содер- жания белка в мембранных стру:ктурах по методу Лоури? 274
3, Н:акие принципы лежат в основе определения ферментативной активности мембрнносвязuнных ацетилхолин:эстеразы и Na', I\.'-АТФа- зы? 4. Что предстаВЛЯЮ1' собой флуоресцентные зонды? Назовите пара- метры, используемые для харarтеристики флуоресцентных зондов. 5. Кarщвы направления использования флуоресцентных зондов в мембранолоrии? 6. Что предстаВ.'Iяет собой спеI'rр люминесценции вещества? 7. Почему люминесцентные свойства флуоресцентных зондов изме- няются при связывании их с рааJIИЧНЫМИ мембранными структурами? 8. Опишите фи:зикохимические методы модификarи:и биомембран. 9. Почему фосфолипазы относят к химическим модификаторам био мембран? 10. На каком основании Iщтuлазу относят к антиоксидантным фер- ментам? 11. Кarше фУНIщии в Iшетке выполняет rлутатионредуктаза? 12. Кarше методы используют для обнаружения и доказательства фактов участия aI<ТИВНЫХ форм кислорода в УФпревращения:х био- МaIромолеIУЛ? IaIЮВЫ их преимущества и недостатки?
список ОСНОВНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Алоертс В., Врей д., Льис Дж. и ар. Молекул.ярнал биолоrи.я клет ки: В 3x т. М.: Мир, 1994. Т. 1. 517 с, АllтоJЮВ В. Ф. Липиды и ионная проmщаемость мембран. М.: НауЕа, 1982. 151 с. Артюхов В. r., Вашарu1Ш О, В., Вашаllов Р. А., На1СваСИllа М. А., ПутUllцева О. В. ОЛИI'омерные белки: структурно-функциональные MO дификации и роль субъединичных контактов. Воронеж: Изд-во Bry, 1997. 264 с. Артюхов В. Р., Ковалева Т. А., Шмелев В. П. Биофизика: Учебное пособие. Воронеж: Изд-во BrY, 1994. 336 с. Артюхов В. Р., ЛутUllцева О. В. Оптические методы анализа ин- ТВЕТНЫХ И модифицированных биолоrических систем. Воронеж: Изд- во BrY, 1996. 240 с. Биолоrические мембраны. Методы! ПОД ред. ДЖ. Б. Финдле.я, У. r. Эванза. М.: Мир, 1990. 424 с. Биофизика: Учебник! Под ред. П. r. Костюка. Киев: Выща ШR., 1988. 504 с. Биохимическое исследование мембран! Под ред. Э. Мэдди. М.: Мир, 1979. 460 с. БолiJырев А. А. БИОЛО1'ические мембраны и транспорт ионов. М.: Издво мrY, 1985. 208 с. Введение в биомембраноло1'ИЮ: Учебное пособие ! Под ред. А. А. Болдырева. М.: ИЗk:ВО МI'Y, 1990. 208 с. ВлаiJuмuров Ю. А., Apv:a1CoB А. Н. Перекисное окисление ЛШIИ,Цов в БИОЛО1'ических мембранах. М,: Наука, 1972. 252 с. Влаоимиров Ю. А., Доорецов Р. Е. Флуоресцентные зонды в иссле довании биолоrических мембран. М.: Наука, 1980. 320 с. Влаоu.м.ирое Ю, А., Потапен.ко А. Л. Физико-хцмические основы фотобиолоrичеСRИХ процессов. М.: Высшая Школа, 1989. 199 с. rеllн.ш: Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции. М.: Мир, 1997. 624 с. Некое В. Р., Берестовский r. Н. Динамическая СТРуЕтура ЛШIидно- 1'0 бислон. М.: НауЕа, 1981. 293 с. Н еков В. Р., ВерестовС1Сий r. Н. Липидный бислой биолоrических мембран. М.: НауЕа, 1982. 224с. Кшаеа Л. Биомембраны. М.: Высш. шк, 1985. 303 с. Лонев С. В. Структурная лабильность БИОЛО1'ических мембран и ре- rул.яторные процессы. Минск: НауЕа и теХНИка, 1987, 240 с. ЛрутецкШl 3. н., Лонскuй А. В. Биофизика мембран: Учебное посо бие. СПб.: Изд:во СПб. YHTa, 1994. 288 с. Рощупкин Д. Н., Артюхов В. Р. Основы фотобиофизИRИ. ВОРО- неж: Bry, 1997. 116 с. 276
Рубuн. А. Б. Биофизика: В 2-х кн. Кн. 2: Биофизика клеточНЫХ процессов. М.: Высш. шк., 1987. 303 с. l'вердuслов В. А., Тихон.ов А. н., .fIlCовешсо Л. В. Физические меха- низмы функционирования биолоrически:х мембран. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986. 189 С. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекуляр ные комцлексы. М.: Мир, 1986. 374 с. Черн.ицlCUЙ Е. А., Воробей А. В. Структура и функции эритроци- тарных мембран. Минск: Наука и техника, 1981. 216 с, СПИСОК ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Ас/СО.ри А. Реryтщия Na-Hacoca липонуклеоти,цами: механизм и фи- зиолоrическое значение / / Биол. науки. 1990. N2 6. С. 715, Болдырев А. А. Возможные причины нешmейности rрафиков Арре- ниуса для Na, Кзависимой аденозинтрифосфатазы. 1. Роль мембран- ных лиnидов / / Биомакромолекулы в методе спиновых меток и зон дов. М.: Наука, 1988. С. 8092. Болды.рев А. А. Nа/ЕАТФаза свойства и БИОЛОI'ическая роль / / Соросовский образоват. журн. 1998. N2 4. С. 2 9. БРОlCерхоф Х., Джен.сен. Р. Липолитические ферменты. М.: Мир, 1978. 282 с. Владимиров Ю. А. Свободные радИRалы в первичных фотобиолоm- ческих ироцессах / / Биол. мембраны. 1998. Т. 15, М 5. C.517 529. ВолотОВСlCиu Н. д, ШейlCО Л. м., Кон.ев С. В. Вли,щше состояния липидной фазы мембраны на эффективность фотохимической модифи кации эритроцитарной ацетилхолинэстеразы / / Молек. биол. 1978. Т. 12, выи. 3. С. 533 538. Добрецов Р. Е, Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мем- бран и лиnопротеинов. М.: Наука, 1989. 277 с. Дубuн.uн.а Е. Е. Антиоксидантн8Я система плазмы крови / / Укр, биохим:. журн. 1992. Т. 64, N2 2. С. 3 15. Ep..J&alCOB r. Л. Надмолекулярная орr8НИЗация ферментных систем. 1. Структурный аспект проблемы / / Биохимия, 1993, Т, 58, вып. 5. С. 659 674. Есамова Т. В., Нван.ов М. В. Взаимодействие лактатдеrидроreназы и мембран саркоплазматическоrо ретикулума/ / Биохимия. 1992. Т. 57, вып. 2. С. 253266. 3ен.sбуш П. Молекулярная и клеточная биолоrия. М.: Мир, 1982. Т. 1. С. 263271, Исследование активности ферментов yrлеводноI'О обмена клеток KO CTHoro мозrа крыс в условиях лучевоI'О поражения/ Б. Ф. Сухомлинов, Ю. С. I'pИНЮк, Н. А. Сибирная и др.// Радиобиол. 1990. Т. 30, BЫn. 5. С. 619622. 277
f{азеннов А. М., Маслова М, Н. Структурнобиохимические своЙ- ства мембраны безъядерных эритроцитов 11 Физиол. журн. ИМ. И- М. Ce чеНQва. 1987. Т. 73, .N2 12. С. 1587 1598, КаЛЬНО8а Н. Ю. Количественное определение состава липидов эрит рОЦИ'I'ов и плазмы крови 11 Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и iп vivo: Сб. науч. ст. М.: Наука, 1992. С. 95 99. JCенu.я М. в., Лумош А. и., FYCbM08 Е. П, Роль низко:м:олекулярных антиоксидантов при окислительном c'rpecce 11 Успехи соврем. биол. 1993. Т.113, вып.4. С. 456470. Конев С. в., Волотовсмuй И. д. ФО'I'обиолоr'ИЯ. Минск: Изд-во Белорус. ун-та, 1979. 383 с. JCоШ!в С. в., ВолотовС1СUй И. Д. Действие УФсвета на белки в pa створе и в составе БИОЛОr'ических мембран 11 Фотобиолоr'ИЯ животной клетки. Л.: Наука, 1979. С. 2334. Коч.етов r. А. I1рактичес.:кое руководство по ЭНЗИМОЛОr'ии. М.: Высшая школа, 1980. С. 71. f{расновскuй А. А., .м.л. ФосфоресцеН'l'НЫИ анализ СИНI'летНОr'О 11010- лекулярноI'О кислорода в фотобиохимических системах 11 Виол. мембр. 1998. Т, 15, N2 5. С. 530 548. КраСllО8СКUЙ А. А., .м.л. Механизм образования и роль синrле'1'ноrо кислорода в фотоБИОЛОI'Ических лроцессах 11 Молекулярные механиз мы биолоrическоrо действия оптическоrо излученил. М.: Наука, 1988. С. 2341. Kp.ljzJlJllcoea К. Е., Ш иШКUllО Л. Н. Общие представленил о меха- низме действия антиоксидантов 11 Исследование синтетических и при родных антиоксиданто:в in vitro и in vivo: Сб. науч, ст. М.: Наука, 1992. С. 58. Кулuнский В. И. Активные фор:м:ы кислорода и оксида'.rИБная мо- дификация макро:м:олекул: польза, вред и защита 11 Соросовский обра зо:ват. журн. 1999. .N2 1. С. 27. Kypzaltoe Б. И'. Принципы интеrрации клеточноr'О метаболизмаll Малек. биол. 1986. Т. 20, вып. 2. С. 369377. Куреонов Б. Н. Роль МУЛЬ'l'иферментных комплексов Б интеrрации :клеточноrо метаболизмаll Молек. биол. 1986. т. 20, вып. 6. С. 15301538. НУРЮllов Б. и., люtfарев А. Е. I'ипотетическая. структура ферментов rликолиза (rЛИКОЛИ'1'ич:ескоrо мета60лона), формирующеrося на :мембране ЭРИТРОцитов11 Молек. биол. 1988. Т. 22, вью. 6. С. 16051613. KypzalloB Б. И. Физикохимические механизмы реrуляции актив- ности ферментов. 1\11.: Наука, 1992. 59 с. .f{ypzalioe Б. и., Люоарев А. Е. Принципы орrRlШЗации и функцио нирования микрокомпартмента метаболона 11 Биохим:ия:. 1989. Т. 54, вып. 5, С- 716718. 278
Jlактатдеrидроrеназа в диаrНОСТИI<е инфаркта миокарда: ди arностические и методические аспек'r:ыl В. П. 'l'И'l'О:В, В. А. Амелюшки- на, '1'. И. КО'l'КЮIa, А. В. Шапошников IIJlабор. дело. 1988. М 11. С. 3141. ЛОЮ(Ull В. 3, Ферментативное перекисное окисление липидо:в /1 Укр. биохим. журн. 1984. Т. 56, .N2 3. С. 317 331. Лuтвumсо Н. М, Кuсель М А. Эндоrенные фосфолиnазы А 2 : струк- тура и функции. МИ:НСI<: Наука и техника, 1991. 270 с. Лопuна О. Д'. Na+, К+АТРаза: cTpYK'rypa, механизм И реrуляция ак'rивности // Биол. мембр. 1999. Т. 16, .N'2 6. С. 584 603. Лущшс В. И. Взаимодействие ла:ктатдеrидроrеназы со структурными компонентами клетки: возмо:лrnое физиолоrическое значение/ 1 Био химия. 1992. Т. 57, вып. 8. С. 1142l154. Л.lJЩД/с В. И. Характеристика связанноЙ с микросомами лак та'rде!'идроrеназы из белых МЫШЦ cI<o'l'a/1 Биохимия. -, 1991. Т. 56, БЫП. 12. С. 21732180. МеllЬЩlшова Е. В., 3еll/Сов' Н. К. Ан'rИОКСИДЮ'I'l'Ы и инrибиторы pa дикмьных окислительных процессов 11 Успехи соврем. биол. 1993. Т. 113, вып. 1. С. 442 455. А:fuроuиш..tеmсо О. С, JIектины и распознавание белковых лиraii дов/I Укр. биохим. жури. 1999. Т. rl1, .N'2 5. С. 5.9. Норбu Й. Представлени.я об олиrомериой структуре и функции Na, K-АТФазы, основанные Шl реЗУЛЬ'I'атах изучения и связывания лиrан- дов и определении размеров молекулярноЙ мишени // Биол. науки. 1990. .N2 6. С. 120131. lIереки:сное окисление и радиация 1 В. А. Барабой, Н. Э, Орел, И. М. Карнаух 1/ OrB_ рад. I'pОДЗИRСI<ИЙ д. М. Киев: Наук. думка, 1991. 256 с. ПерМ.JtICО8 Е. А. Кальцийсвязывaroщие белки. М.: Наука, 1993, 192 С. ПОi!.IIа:JО8 Б. Ф. Ре!'удяторные функции ак'l'ЮIа в кле'l'кеll Известия АН СССР, Сер. биол. 1983.. N2 5. С. 66767'1. РеrУJI.яция ак'l'ИВНОСТИ фермен'l'ОВ в адсорбциоиных фермеН'l'НЫХ си стемах. lIl. Бзаимодействие ЛiШ'l'атдеТ'идр()!'еназы из :мышц свиньи с B' актииомl Н, П. Суrробова, Т, Б. Еронина, Н, А. Чеботарева И ДР./I Молекул. биолоrия. 1983. Т. 17, ВЬШ. 2. С. 430436. РощупlCUIl Д. И. Молекулярные механизмы фотоповреждения био лоrических мембран // ФотобиолоI'ИЯ животной клетки, Л.: Наука, 1979, С. 2334. РощупlCuft Д. и., Муриllа М А. Фотобиолоrические процессы в био мембранах при дейс'l'ВИИ: ультрафиолетовоrо излучения: на клетки, TH:a НИ и орrанизм животных 1/ Биофизика. 1993. Т. 38, ВЬШ. 6. C. 10531068. 279
Рыетсулова С. Т. Радиационная биолоrия плазматических мембран. М.: Энерrоатомиздат, 1986. 125 с. PJl3aItOS А r., Спирин А. С. Орrанизация ферментов на внутрикле точных структурах: эстафета у поверхности 1/ Биохимия. 1989. Т. 54, вып. 5. С. 709715, Сапежuн.стсuu И. И. Сенсибилизированное фОТООIOfсление белков и друrих веществ. Возможное значение этих процессов в фотобиолоrии / / Молекулярные механизмы биолоrическоro действия оптическоrо из лучения. М.: Наука, 1988. С. 92101. Tтca'iYТC В, А. Молекулярные механизмы нейроэндокринной реryля ции // Соросовский образоват. журн. 1998. N 6. С. 1б20. Фершт 9. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир, 1989. С. 344356. Фuлuппов П. П. Кro<: внешние сИrналы передаются внутрь клетки 11 Соросовский обраэоват. журн. 1998. N2 3. С. 2834. Фотопревращение мембранных липидов и ero роль в изменении фу:н КЦИЙ биомембран под действием УФизлученW1 1 д. И. Рощупкин и др. 11 Молекулярные механизмы биолоrическоrо действия оптическо ro излучения. М.: Наука, 1988, С. 7992. ФРUО08Uч. И. Радикалы кислорода, перо:r<си,ц водорода и токсичность кислорода 11 Свободные радикалы в биолоrии. М.: Мир, 1979. Т. 1. С. 272308. Фут Х. Фотосенсибилизированное окисление и синrлетный кисло род. Биолоrическое действие 11 Там же. Т. 2. С. 96143. ХОЛМОi?оров В. В., lCрылентсов Д А., Османов М. А. Первичные фо- топроцессы в крови и ее компонентах при действии оптическоrо излу чения 11 Молекулярные механизмы биолоrическоrо действия оптичес КОl"о излучения:. М.: Наука, 1988. С. 164177. Храпова Н. Ю. Перекисное окисление лиnидов и системы, реrули рующие ero интенсивность /1 БиохимW1 липидов И их роль в обмене веществ. М.: Наука, 1981. С. 147155. Ча.я:.ло П. П., Протас А. Ф. Изоферментный спектр лактатдеrидро- rеиазы, малат,цеrидроreназы, эстеразы и IOfслой фосфатазы клеток ro ловноrо мозrа крыс в ранние сроки после внешнеrо 'Уоблучения: в дозе 1 I'pll Радиобиол. 1992. Т, 32, вып. 6. С. 815819. ЧернuцlCUЙ В. А., Воробей А. В. Фотосенсибилизированное повреж- дение биолоrических мембран 11 Молекулярные механизмы БИОJIоrи- ческоro действия: оrrrическоrо излучения, М.: Наука, 1988, С, 102 111. ШuнтсаренlCО Н. А., .АлеСlCовсlCUй В. Б. Синrлетный кислород, мето- ды получения и обнаруженияll 'Успехи химии. 1981. Т. 50, вып. 3. С, 406428. Ш ляпuнтох В. Л. Фотохимические превращения и стабилизация полимеров. М.: Химия, 1979. 344 с. 280
Ш.1lлпин.тох В. .9., ИваltО6 В. Б. Тушение синrлетноrо кислорода// Успехи химии. 1976. 'f 45, вып. 2. С. 202223. Л,сов.1lев В. А. Кинетика ферментативноro катализа. М.: Наука, 1965. 247 с. Arпold н., Реие Р. Binding of glycolytic enzymes to structure proteins of the muscle// Eur. J. Biochem. 1968. Yol. 6, N 2. Р. 163171. Association of integrated metabolic pathways with membranes. 1. Glycolytic еnхутев of the red blood corpuscle and yeast/ D. Е. Green, Е. Murer, Н. О. НиШn et а1.// Arch. Biochem. Biophys. 1965. Vol.112. Р. 635647. Clarke Р. М, Masters С. J. Multienzyme aggregates: new evidence for IШ association of glycolytic сотроnеntз/I ВiocЫт. et Biophys. Acta. 1973. Vol. 327, М 1. Р. 223226. Clarke Р. М., Masters С. J. on the association о! glycolytic enzymes with structural proteins of skeletal muscle// Biochem et biophys. acta. 1975. Yol. 381, М 1. Р. 3746. Melпick Е. L., НиШп Н. О. Studies оп the nature о! the subceHular localization о! lactate dehydrogenare and glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase in chicken skeleta.1 muscle/ / J. СеН. Physiol. 1973. Vol. 81. Р. 139148. 19. З!llа:;l 3788
проrрАММА СПЕЦКУРСА «БИОФИЗИКА МЕМБРАН Введение в мембранолоrию. Краткая история мембраноло1'ИИ. Мембрана универсальный компонент биолоrических систем. Методы исследования биомембран: биохимические, физислоrи- ческие, иммунолоrические, rенетические, биофизичеСI{ие (ди- фракционные: ре;В:Т1'еновская дифракция, дифракция нейтронов; резонансные: ядерный маrнитный резонанс, электронный пара маrнитный резонанс; оптические: абсорбционная спектроскопия, флуоресценция и метод флуоресцентных зондов, дисперсия оп тическоrо вращения, круrовой дихроизм, инфракрасная спект рофотометрия; дифференциальная сканирующая микрокалори- метрия; метод радиоактив:е:ых меток; метод моделирования мем- бран). Состав и структурно-фу:е:кциональная орrанизация молекуляр- ных компонентов биомембран. Классификация, состав, структура, физикохимические и динамические свойства, фукции мембран- ных липидов. Особенности липидноrо состава мембран клеток про- кариот, эукариот и вирусов. ЛИОТРОIIНЫЙ И термотропный мезо- морфизм липидов биомембран. Кинки, механизм их образования. Динамическая модель ЛИIIИДНОro бислоя. Структурная асиммет- рия ЛИIIИДОВ. Фазовые IIереходы липидов в мембране. Связь меж ду фазовым состоянием ЛИIIИДОВ и функцией мембран. Классификация, структура, функции и локализация мембран- ных бl!лков. Структурнофункциональная орrанизация мембран- Horo каркаса эритроцитарной клетки. ХарактеРИСТИI{а основных белков ЭРИ'l'роцитарной мембраны: 'спектрина, актина, бедка IIO- лосы 3, rликофоринов и др. Понятие о векторных ферментах биомембран. Структура, функциональные и некоторые физико- химические свойства интеrральных мембранных белков на при- мере Na+, К+.АТФазы и ацетилхолинэстеразы. Хара:Ктеристика У1'леводных компонентов биомембран. Ис пользование уrлеводраСIIознающих белков лектинов в мемб- ранолоrии и медицине. Структура и функции плазматических мембран на примере мембран эритроцитов. Особенности межмолекулярных взаимодействий в мембранах. Физические основы внутримембранных взаимодействий. Лип ид- липидные, беЛОК-ЛИIIидные и бедок-белковые взаимодеЙС'l'ВИЯ в мембранах, их роль в функционировании биомембран. Понятие об аннулярных липидах, 282
Развитие представлений о стру