Автор: Щербак И.Г.
Теги: материальные основы жизни биохимия молекулярная биология биофизика биофизика, биохимия и физиология животных и человека медицина химия биологические науки
ISBN: 5-88999-052-7
Год: 2005
Текст
И. Г. Щербак
БИОЛОГИЧЕСКАЯ
ХИМИЯ
Учебник для медицинских вузов
Создан по поручению Учебно-методической комиссии по преподаванию
химических дисциплин Минздрава РФ и рекомендован Комиссией
(председатель — академик РАО профессор В. А. Попков)
в качестве учебника для студентов медицинских вузов
отсканировал
Санкт-Петербург
Издательство СПбГМУ
2005
УДК 577.1(075.8)
ББК 28.902
Щ 61
Автор И. Г. Щербак
Рецензенты:
профессор Д. М. Зуба и ров. д.м.н„ зав. кафедрой биологической хи-
мии Казанского государственного медицинского университета, За-
служенный деятель науки ТАССР и РФ:
профессор А. И. Карпищенко, д.м.н., начальник кафедры клиниче-
ской биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской
академии;
профессор В. В. Поступаев, д.м.н., зав. кафедрой биологической хи-
мии Дальневосточного государственного медицинского университета;
профессор Е. Г. Скворцевич, д.б.н., зав. кафедрой биологической хи-
мии Санкт-Петербургского государственного университета
Редактор
профессор Л. В. Галебская, д.м.н., зав. кафедрой биологической хи-
мии Санкт-Петербургского государственного медицинского универси-
тета имени акад. И.П.Павлова
Щербак, И. Г.
Щ61 Биологическая химия : Учебник. - СПб. : Издательство
СПбГМУ, 2005. - 480 с.
ISBN 5-88999-052-7
Современный учебник, отражающий новейшие достижения в области фундамен-
тальной медицины. Акцент сделан на изложении основополагающих закономерностей
биологической химии в их логической взаимосвязи и в такой последовательности, ко-
торая, по опыту автора, оптимальна для понимания и усвоения наиболее значимых
основ этой науки.
Учебник предназначен для студентов медицинских вузов, а также факультетов
медико-биологического профиля. Он может быть полезен для аспирантов и препода-
вателей смежных кафедр.
УДК 577.1(075.8)
ББК 28.902
Напечатано в Российской Федерации
Все права защищены. Воспроизведение и распространение в каком бы то ни было виде части
или целого издания не могут быть осуществлены без письменного разрешения автора.
ISBN 5-88999-052-7
© И. Г. Щербак, 2005
© Издательство СПбГМУ, 2005
Истинная наука не может развиваться иначе
как в небрежении к собственной пользе.
И. П. Павлов,
Нобелевский лауреат 1904 года
ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРА
Современная биохимия - чрезвычайно разросшаяся, стремительно развивающаяся область
знания. Ее достижения все более становятся составной частью других медико-биологических на-
ук, таких как физиология и патофизиология, фармакология, медицинская генетика и т.д., не говоря
уже о клинических дисциплинах. Поэтому особую остроту приобретает проблема отбора учебного
материала. С одной стороны, он должен быть достаточным для полноценного изложения наиболее
значимых закономерностей биохимической науки, представляемых в их логической взаимосвязи.
С другой стороны, желательно избегать чрезмерной детализации, ибо частности и отвлечения на
смежные вопросы затрудняют усвоение главной сути описываемого явления.
Структура и содержание предлагаемого учебника отражают многолетний опыт моей препода-
вательской и научной работы на кафедре биологической химии Санкт-Петербургского государст-
венного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова.
Последовательность изложения отличается от традиционной для многих руководств. В част-
ности, нет специальных разделов по гормонам и витаминам. Основные биохимические механизмы
их участия в метаболизме и его регуляции включены в соответствующие главы учебника, а все
остальное - это область физиологии, патофизиологии, гигиены питания.
Впервые введена специальная глава «Протеолиз», отсутствующая в других учебниках в каче-
стве самостоятельного раздела. Целесообразность этого акцента проистекает из того, что послед-
ние достижения биохимии позволяют сформулировать представления о комплексе систем ограни-
ченного протеолиза, которые на основе общих закономерностей реализуют такие частные, хотя и
очень важные процессы, как гемокоагуляция и фибринолиз, регуляция сосудистого тонуса и за-
щита от чуждого материала.
Считаю своим долгом выразить благодарность коллегам по кафедре за деятельное сотрудни-
чество в совершенствовании той методологии преподавания, которая положена в основу настоя-
щего учебника. Кроме того, Е. В. Рюмина, И. Л. Соловцова, Т. Ф. Субботина и Ю. В. Тарасова
взяли на себя труд по критичному просмотру отдельных глав рукописи и дали ценные советы,
способствовавшие улучшению качества изложения, а П. П. Бельтюков, Ю. А. Борисов, Л. А. Ан-
дреева и В. П. Фаенкова оказали немалую помощь в подборе литературы и оформлении иллюстра-
тивного материала.
Особенная моя признательность — профессору Людвиге Вячеславовне Галебской, ныне воз-
главляющей кафедру. Она приняла активное участие в работе над учебником уже на ранних ее
этапах, а в заключение любезно согласилась на непростой труд редактора, который нередко со-
провождался дискуссиями, позволившими четче сформулировать излагаемые вопросы.
Невозможно переоценить личный вклад ректора Университета, академика РАМН профессора
Н. А. Яицкого, которому я обязан заботливым вниманием и неизменной поддержкой на протяже-
нии всего процесса создания книги.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АД — артериальное давление (крови)
АДГ — антидиуретический гормон
о2“ АП — а2-антиплазмин
агАТ — агантитрипсин
АКТГ — адренокортикотропный гормон (кортикотропин)
АЛТ — аланин-аминотрансфераза
АМФ, АДФ и АТФ — аденозинмоио-, ди- и трифосфат
АО — аминокислотный остаток (остатки)
АОЗ — антиоксидантная защита
АПБ - ацилпереносящий белок
АПК — альтернативный путь (активации) комплемента
АПФ — ангиотензинпревращающий фермент
ACT — аспаргат-амииотрансфераза
АТФаза — аденозинтрифосфатаза
АФК — активные формы кислорода
АХЭ — ацетилхолииэстераза
вкм — внеклеточный матрикс
вмк - высокомолекулярный кинииоген
ГАП — гидроксиапатит
ГБФ-пугь - гексозобисфосфатный путь (распада глюкозы)
ГК — гексокиназа
ГлбФ глюкозо-6-фосфат
ГлбФаза — глюкозо-6-фосфатаза
ГМГ-КоА - Р-гидрокси-0-метилгдутарил-КоА
ГМФ, ГДФ иГТФ — гуанозинмоио-, ди- и трифосфат
ГМФ-путь - гексозомоиофосфатный путь (распада глюкозы)
ГФДГ — глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа
ДГАФ - дигидроксиацетоифосфат
ДГБП - дигидробиоптерин
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота (кислоты)
ДОФА - ди(гидр)оксифенилаланин
ИК — . иммунный комплекс (комплексы)
ИМФ - инозинмонофосфат
ИЭТ — изоэлектрическая точка
а-КГ - a-кетоглутаровая кислота (а-кетоглутарат)
КК — калликреин
KoQ кофермент Q (убихинои)
КоА - кофермент А (кофермент ацилирования)
КПК — классический путь (активации) комплемента
ЛВП - липопротеин(ы) высокой плотности
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
5
ЛДГ - лактатдегидрогеназа
Л.к. — липоевая кислота (липоат)
ЛНП - липопротеии(ы) низкой плотности
ЛОНП — липопротеин(ы) очень низкой плотности
ЛПЛ - липопротеинлипаза
ЛПП - липопротеин(ы) промежуточной плотности
ЛТГ - липотропный гормон (липотропин)
ЛХАТ - лецитии:холестерол-ацилтрансфераза
МАК - мембраноатакующий комплекс
МАО - моноамииоксидаза
а2-МГ
ММП
МСГ
МтО
ОДК
пвк
ПА
ПАИ
П.о.
ПОЛ
преКК
РНК
сод
То,5
Т3
Т4
тг
ТГБП
ТГФ
ТМФ, ТДФ и ТТФ
УМФ, УДФ и УТФ
фн
ФАФС
ФВ
ФГА
ФГДГ
ФЕП
ФЛ
ФРПФ
ФС
фф
ФФК
ФХ
ФЭ
ХМ
хс
ЦМФ, ЦДФ и ЦТФ
эзк
ЭР
ЭТФ
FeS-P
Gia
Hb
IGF-1
RGD
- а2-макроглобулин
- матриксные металлопротеиназы
- 'меланоцитстимулирующий гормон (меланотропин)
митохондриальное окисление
- окислительное декарбоксилирование а-кетокислот
- пировиноградная кислота (пируват)
— плазмииогеи-активатор - тканевый (тПА) или урокиназного типа (уПА)
- плазмииогеи-активаториый ингибитор(ы)
- пары (азотистых) оснований [в ДНК]
- перекисное окисление липидов
- прекалликреин
— рибонуклеиновая кислота (кислоты)
— супероксидднсмутаза
- период полусуществования
- 3.5,3-трийодтироиин
- тироксин (3,5,3',5'-тетрайодтироиин)
- триглицерид(ы)
— тетрагидробиоптерин
— тетрагидрофолиевая кислота
— дезокситимидинмоно-, ди- и трифосфат
- уридинмоио-, ди- к трифосфат
— неорганический фосфат (Н3РО4)
— 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат
- фон Виллебранда (фактор)
- фосфоглицеральдегид (глицеральдегидфосфат)
- 6-фосфоглюкоиатдегидрогеиаза
— фосфое иол пируват
- ’ фосфолипид (ы)
— 5-фосфорибозил-1-пирофосфат
- фосфатидилсернн(ы)
— пирофосфат (Н4Р2О7)
— фосфофруктокииаза
- фосфатидилхолин(ы)
- фосфатид и лэтаноламин(ы) - "
- хиломикрои(ы)
- холестерол (свободный)
- цитидинмоио-, ди- и трифосфат
- энергетический заряд клетки (см. уравнение [5-2])
- эндоплазматический ретикулум (эндоплазматическая сеть)
- электронтранспортирующий флавопротеин
- железо-сериый протеин(ы)
- у-карбоксиглутамииовая кислота
— гемоглобин
- иисулиноподобиый ростовый фактор 1 (insulin-like growth factor-1)
- последовательность ...-арг-гли-асп-... (центр клеточной адгезии)
ВВЕДЕНИЕ
Биологическая химия (биохимия) — это наука о тех
химических и физико-химических процессах, которые про-
текают в живом организме и лежат в основе буквально
всех проявлений жизнедеятельности.
История становления и развития биологи-
ческой химии охватывает более полутора ве-
ков. Возникла она на стыке органической хи-
мии и физиологии. Органическая химия как
наука о химическом строении и свойствах мо-
лекул, образующихся в живых организмах, до-
вольно скоро стала развиваться преимущест-
венно как химия соединений углерода, уделяя
основное внимание синтезу, изучению свойств
и систематизации все новых веществ, особенно
таких, которые представляли интерес для про-
мышленного производства. Те направления
органической химии, в рамках которых про-
должалось выяснение строения молекул живой
природы, постепенно дополнялись изучением
вообще химического состава живых объектов,
исследованием путей превращения различных
веществ и их роли в процессах жизнедеятель-
ности, особенно у человека. Все это и состави-
ло предмет новой науки, которая поначалу обо-
значалась как «физиологическая химия» либо
«медицинская химия». Лишь в первые десяти-
летия XX века утвердилось современное на-
звание - «биологическая химия» - как резуль-
тат осознания того, что химизм всех объектов
живой природы в основе своей удивительно
единообразен.
На начальном этапе становления биохи-
мии усилия исследователей были сосредоточе-
ны в основном на выделении, расшифровке
строения и изучении свойств различных ве-
ществ, входящих в состав живых организмов.
Эта задача почти полностью решена, в основ-
ном к середине XX века. Попутно исследовате-
лей занимала и другая проблема - выяснение
количественного содержания тех или иных ве-
ществ в живых объектах и их выделениях. Она
также в значительной мере решена, но - на
«макроуровне», в том числе на уровне органов
и тканей в норме и при патологии. Однако ко-
личественная оценка концентраций различных
метаболитов в клетке того или иного типа (тем
более - в субклеточных структурах) до сих пор
остается в большинстве случаев очень трудной
задачей. Особенно это относится к «минор-
ным» компонентам клетки, в том числе имею-
щим белково-пептидную природу. Важность
этой задачи велика, ибо, как известно из общей
химии, направление реакции, характер взаимо-
действия различных молекул и сама его воз-
можность зависят прежде всего от концентра-
ций взаимодействующих веществ.
С начала XX века биохимия постепенно
переходит на качественно новый этап развития
- изучение последовательностей превращения
различных веществ в организме, т.е. исследо-
вание процессов метаболизма. Это стало воз-
можным на основе достижений предыдущего
этапа («статической биохимии») и использова-
ния возможностей параллельно развивавшихся
наук, прежде всего органической химии. Этот
этап («динамическая биохимия»), сильно за-
держанный II мировой войной, привел к выяс-
нению химизма основных путей распада (ка-
таболизма) углеводов, липидов, белков.
Особенно важные успехи были достигнуты
ВВЕДЕНИЕ
7
в 20-30-е годы, когда удалось выяснить глав-
ные пути катаболизма глюкозы, процесс
[3-окисления жирных кислот, последователь-
ность реакций в дыхательной цепи (митохонд-
риальное окисление), реакции цикла трикарбо-
новых кислот и образования мочевины. Гораз-
до позже обозначились первые успехи в изуче-
нии химизма биосинтетических процессов, т.е.
реакций анаболизма. Постепенно стало ясным,
что некоторые метаболические пути легко об-
ратимы и могут функционировать как в на-
правлении распада определенных веществ, так
и в направлении биосинтеза. Такие пути стали
называть амфиболическими.
По мере продвижения в изучении путей
метаболизма стали предприниматься попытки
выяснить, каким образом биохимические про-
цессы обеспечивают ту или иную физиологи-
ческую функцию. Это направление принято
обозначать термином «функциональная био-
химия». Путь этот оказался очень трудным,
тернистым. Несмотря на ряд серьезных дости-
жений, задача выяснения молекулярных основ
той или иной физиологической функции до сих
пор остается одной из центральных проблем
биохимии.
С завершением изучения химизма важ-
нейших метаболических превращений в орга-
низме все большее внимание исследователей
стали привлекать вопросы их регулирования на
молекулярном уровне. Прежде всего - вопросы
о том, как осуществляется согласование про-
цессов распада тех или иных веществ и их био-
синтеза в тех же клетках; как обеспечивается
контроль за соответствием интенсивности ме-
таболических процессов реальным потребно-
стям клетки в разных функциональных состоя-
ниях. Первые серьезные успехи в изучении ме-
ханизмов регуляции были достигнуты при изу-
чении ферментов. Оказалось, что многие из
них чувствительны к воздействию эндогенных
регуляторов, - таких как гормоны, нейроме-
диаторы, другие биологически активные моле-
кулы. Накопление конкретных фактов привело
к принципиально важному обобщению, значе-
ние которого трудно переоценить. Оно заклю-
чается в осознании того, что молекулы многих
ферментов способны не только выполнять
свою функцию (катализировать соответствую-
щую химическую реакцию), но и регулировать
интенсивность выполнения этой функции в
зависимости от достигаемых результатов. Так
возникло понятие о саморегуляции фермента-
тивных процессов, сложившееся примерно к
началу 70-х годов. Довольно скоро стало яс-
ным, что не только ферменты, но и многие
другие белки обладают свойством саморегуля-
ции. Выявление контролирующих (ключевых)
звеньев метаболизма и конкретных механизмов
их саморегуляции стало одним из важнейших
направлений современной биохимии. Продви-
жение в этой области имеет не только познава-
тельное значение. Оно открывает возможности
целенаправленного синтеза новых лекарствен-
ных средств с заранее запланированным меха-
низмом действия. На этом пути уже есть яркие
достижения, используемые в практической ме-
дицине. Например, обратимые ингибиторы ан-
гиотензинпревращающего фермента, широко
применяемые при лечении гипертонической
болезни.
Начало современному этапу исключитель-
но бурного развития биохимической науки по-
ложило открытие двойной спирали ДНК
(Д. Уотсон, Ф. Крик, 1953 г.). Это достижение
не только выявило принцип построения моле-
кул, являющихся материальным носителем на-
следственности. Оно стало еще и мощным
стимулом к разработке новых методических
приемов, к развитию лабораторной техники,
основанной на регистрации ряда физических и
физико-химических параметров сложных био-
логических объектов, в том числе громадных
молекул белков и нуклеиновых кислот. В ре-
зультате в короткие сроки было доказано, что
наследственность есть передача потомкам спо-
собности синтезировать определенный набор
строго специфичных белков. Был расшифрован
генетический код; разработаны эффективные
методы анализа структуры индивидуальных
белков; выяснены молекулярные механизмы
биосинтеза белковых молекул; успешно разви-
ваются исследования механизмов регуляции
биосинтеза белка, лежащие в основе, в частно-
сти, клеточной дифференцировки. Все это со-
ставляет важную часть нового направления -
оно обозначается термином «молекулярная
биология». Формально это - синоним термина
«биологическая химия», поскольку изучением
строения и свойств молекул занимается именно
8
ВВЕДЕНИЕ
химия. Фактически же это - довольно само-
стоятельная область исследований, в рамках
которой разработаны своеобразные методиче-
ские приемы, позволяющие, в частности, выяв-
лять и идентифицировать минорные белковые
компоненты, изучать их роль в функциониро-
вании клетки и организма в целом.
В последние десятилетия стало очевид-
ным. что задачи биохимии не могут быть све-
дены к изучению только химических про-
цессов, т.е. реакций разрыва ковалентных свя-
зей или возникновения новых. Оказалось, что
гораздо более важными, буквально универ-
сальными являются физико-химические
взаимодействия, реализующиеся в виде так на-
зываемых слабых типов связей (например,
ионных связей - взаимном притяжении проти-
воположно заряженных атомов или групп ато-
мов). Любая химическая реакция, протекающая
с участием фермента, осуществляется путем
серии последовательных событий физико-хи-
мического уровня, приводящих в конечном
счете к ковалентным преобразованиям. Более
того, пространственная организация макромо-
лекул (прежде всего, белковых) обеспечивается
в основном именно слабыми физико-химичес-
кими взаимодействиями между разными участ-
ками такой молекулы. Обратимые изменения
этой организации в ходе функционирования
такой макромолекулы, включая ее взаимодей-
ствие с другими молекулами или надмолеку-
лярными структурами, тоже в основе своей
имеют физико-химическую природу. Появи-
лись даже специальные направления в науке -
«физико-химическая биохимия», «физическая
биохимия». Все это делает необходимым обо-
значать теперь биохимию как науку не только
о химических, но и о физико-химических про-
цессах в живом организме.
Современная биохимия - это целый ком-
плекс более или менее самостоятельных на-
правлений. Помимо упомянутой молекулярной
биологии, можно назвать медицинскую биохи-
мию, иммунохимию, биохимическую фармако-
логию, молекулярную генетику, биотехноло-
гию, молекулярные основы конструирования
новых лекарственных веществ и т.д. Четкие
границы между ними вряд ли можно обозна-
чить - настолько все они тесно взаимосвязаны,
взаимно переплетены. В сущности, их можно
рассматривать как специализированные разде-
лы общей биохимии, главнейшие закономерно-
сти каковой являются универсальными. Неуди-
вительно, что среди всех медико-биологичес-
ких наук биохимия идет впереди, причем, с
большим отрывом. Это видно и по темпам раз-
вития, и по числу научных журналов (и публи-
каций в целом), и по весомости достижений, их
значимости для построения фундаментальных
основ практической медицины.
Далеко не на все вопросы, интересующие
врача, может ответить современная биохимия.
Но уже на довольно многие вопросы она спо-
собна дать однозначный ответ, тем самым су-
жая поле для некорректных, ошибочных трак-
товок и представлений. Одной из важнейших
целей преподавания (и изучения) биохимии
является формирование иммунитета к произ-
вольным суждениям, псевдонаучным гипоте-
зам, еще бытующим в такой чрезвычайно
сложной и ответственной сфере деятельности,
как медицина.
Глава 1
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
Представления о первенствующей роли
белков в явлениях жизни, возникшие еще в
XIX веке, окончательно утвердились лишь во
второй половине XX века. Главное же - эти
представления наполнились гораздо более бо-
гатым содержанием, чем просто констатация
их правильности. Теперь мы знаем, что любое
проявление жизнедеятельности, любая физио-
логическая функция в основе своей имеет
вполне определенные (и притом обратимые!)
изменения в пространственной организации
конкретных белков. Эти изменения отражают
отшлифованную эволюцией способность бел-
ковых структур так или иначе реагировать на
малейшие изменения условий среды, а также
передавать возникающий таким образом «сиг-
нал» другим макромолекулам. Цепочка таких
элементарных актов составляет молекулярную
основу любой функции - от восприятия света
или вкуса до мускульной работы или элемен-
тарных актов нервной деятельности. Конкрети-
зация этого общего принципа требует прежде
всего знания главных закономерностей строе-
ния и пространственной организации белковых
молекул. Лаконичное определение этого класса
веществ можно сформулировать так:
Белки (протеины) - это высокомолекуляр-
ные азотсодержащие органические вещества,
структурным элементом которых являются
аминокислоты.
Для понимания особенностей строения
белков и уникальности их свойств целесооб-
разно рассмотреть важнейшие качества амино-
кислот как биологических молекул.
1.1. СТРОЕНИЕ ПРИРОДНЫХ
АМИНОКИСЛОТ
В живой природе обнаружены сотни раз-
нообразных аминокислот. Однако только 20 из
них используются при построении любого бел-
ка. Их объединяют термином «кодируемые»: в
генетическом коде свое обозначение имеет ка-
ждая аминокислота из этого набора, причем
только из него.
Две структурные особенности присущи
кодируемым аминокислотам:
а) все они являются а-аминокислотами, то
есть, аминогруппа присоединена в них к угле-
родному атому, соседнему с карбоксильной
группой;
б) по стереохимической конфигурации а-
углеродного атома все они относятся к L-ряду
(исключение составляет простейшая из них -
глицин, который не имеет стереоизомеров, ибо
содержит два атома водорода при а-углерод-
ном атоме).
Из этих особенностей следует, что все ко-
дируемые аминокислоты имеют совершенно
одинаковый фрагмент молекулы (на рис. 1-1 он
обведен прямоугольником) и различаются
только строением радикала R, присоединенно-
го к Ct-углеродному атому этого стандартного
для них фрагмента.
10
Глава 1
R
, I
!h-c-nh2
I
I COOH
Рис. 1-1. Общая формула кодируемых аминокислот
(прямоугольником выделен фрагмент, который можно
назвать «стандартным», поскольку он одинаков
у всех этих аминокислот).
Формулы всех 20 кодируемых аминокислот
приведены в табл. 1-1. Строго говоря, в белках
встречаются и некоторые другие а-аминокис-
лоты L-ряда. Однако появляются они в резуль-
тате постсинтетической модификации белка,
т.е., преобразования радикалов аминокислот,
уже включенных в состав белковой молекулы.
К числу таких преобразований относятся гидро-
ксилирование пролина и лизина, у-карбокси-
лирование глутаминовой кислоты и ряд других;
они будут рассмотрены в дальнейших разделах.
1.2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
АМИНОКИСЛОТ
Входя в состав белковой молекулы, ами-
нокислоты придают ей многие из своих
свойств. Две характерные черты аминокислот
наиболее важны для белка: растворимость в
воде и способность к ионизации (электролити-
ческой диссоциации).
1.2.1. РАСТВОРИМОСТЬ
Хорошая растворимость в воде обусловле-
на полярными свойствами аминокислот. Во-
обще полярными называют такие молекулы
или фрагменты молекул, у которых «центр тя-
жести» отрицательных зарядов (т.е., электро-
нов) не совпадает с «центром тяжести» поло-
жительных зарядов (т.е., ядер атомов).
Типичным полярным веществом является
молекула воды. В этом смысле ее правильнее
изображать не симметрично (Н-О-Н), а при-
мерно так:
Асимметричность молекулы обусловлена
тем, что атом кислорода гораздо сильнее при-
тягивает к себе обобществленные электроны,
чем соединенный с ним атом водорода. Поэто-
му электронное облако, формирующее кова-
лентную связь, заметно смещено в сторону ки-
слорода, который приобретает некоторую из-
быточность отрицательных зарядов. Она
меньше заряда одного электрона и потому по-
лучила название «частичный отрицательный
заряд» и обозначается символом «5-». Соот-
ветственно на атомах водорода возникает яв-
ный дефицит электронной плотности — частич-
ный положительный заряд (5+). Таким обра-
зом, в целом молекула воды представляет со-
бой диполь, т.е. частицу с некоторым преобла-
данием электронной плотности на одном по-
люсе и соответствующей избыточностью по-
ложительного заряда - на другом:
Выраженность поляризации зависит от аб-
солютного значения частичных зарядов и от
расстояния между их центрами. Произведение
этих величин обозначается термином диполь-
ный момент и является мерой полярности дан-
ной молекулы (или полярного фрагмента
крупной молекулы).
Молекулы воды обладают высоким ди-
польным моментом (1,84 Дебай). Очевидна
поэтому их склонность к межмолекулярным
взаимодействиям. Электростатическое притя-
жение одного полюса молекулы воды к проти-
воположно заряженному полюсу другой моле-
кулы может привести к формированию, на-
пример. линейных цепочек из множества ди-
полей воды; такие цепочки могут замыкаться
сами на себя, образуя кольцо.
Экспериментально установлено, что, дей-
ствительно. даже в жидком состоянии вода яв-
но структурирована. Расчеты показали, однако,
что сила межмолекулярного притяжения в та-
ких структурах значительно больше (соответ-
ственно. межмолекулярные расстояния мень-
ше), чем это можно объяснить только притя-
жением противоположных зарядов разных ди-
полей. Как оказалось, значительная поляриза-
ция ковалентной связи между водородом и ки-
слородом в молекуле воды приводит к тому,
что появившийся вблизи атом кислорода дру-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
11
гой молекулы начинает притязать на «чужой»
для него водород. Реализации притязаний бла-
гоприятствуют малые размеры атома водорода,
которые позволяют ему сблизиться с кислоро-
дом другой молекулы воды, «подтянуться» к
нему. Такого рода притяжение обозначается
термином водородная связь. Она во много раз
слабее простой ковалентной связи и обознача-
ется обычно пунктирной линией.
В жидком состоянии на каждую молекулу
воды приходится обычно от 3 до 4 (в среднем
около 3,4) соседних молекул, связанных с нею
водородными связями. Если диполь-дипольные
взаимодействия легко обеспечивают двумер-
ную структуру (например, замкнутую в кольцо
линейную последовательность молекул-дн-
полей), то способность молекулы воды образо-
вывать более двух водородных связей со свои-
ми соседями создает предпосылки для форми-
рования более сложных структур - трехмер-
ных. В жидкой воде возникают упорядоченные
скопления молекул, - так называемые класте-
ры (рис. 1-2).
Кластеры находятся в динамическом рав-
новесии с окружающей их свободной (неструк-
турированной) водой. Средняя продолжитель-
ность жизни кластера меньше миллиардной
доли секунды (порядка 10'1О-10'п с). Однако
молекулы каждого распадающегося кластера
сразу же реорганизуются в новые кластеры,
взаимодействуя с молекулами свободной воды
и других распавшихся кластеров. При этом
очень важную роль играет кооперативный ха-
рактер образования водородных связей: воз-
никновение одного такого межмолекулярного
«мостика» способствует появлению второго,
гретьего и т.д. Таким образом, размеры класте-
ров весьма непостоянны, а границы - довольно
расплывчаты (другое их обозначение - «мер-
цающие гроздья»). Подсчитано, что каждый
кластер содержит в среднем 57 молекул воды.
Несмотря на крайнюю нестабильность каждого
отдельного кластера, само по себе кластерное
структурирование жидкой воды существует
постоянно. При этом обычно около 70% всех
молекул воды структурировано, и лишь при-
мерно 30% пребывает в составе «свободной»
воды. По другим данным, только 15% воды
структурировано при 37°С. Очевидно, наличие
микропримесей, температура и ряд других
факторов могут очень сильно влиять на кла-
стерную организацию жидкой воды.
Схема на рис. 1-2 позволяет убедиться, что
в структуру кластеров могут встраиваться
только такие молекулы, которые сами поляр-
ны. Более того, молекула полярного вещества
хорошо взаимодействует и с неструктурирован-
ной водой, а нередко способна даже стать цен-
тром, вокруг которого формируется структура,
подобная кластеру. Только ее уже не называют
кластером, а обозначают термином «гидратная
оболочка» молекулы полярного вещества.
Рис. 1-2. Схема кластерного структурирования жидкой воды (модель Франка-Уэно)
(затененные пятна - кластеры, остальное - окружающая их свободная вода).
12
Глава 1
Понятным становится, почему именно поляр-
ные вещества хорошо растворимы в воде, т.е.
обладают свойством гидрофильности. Напро-
тив, гидрофобность («неприязнь» к воде, неспо-
собность в ней растворяться) присуща тем орга-
ническим молекулам (или фрагментам крупных
молекул), которые неполярны. Самый яркий
пример этому - углеводороды и их смеси
(нефть, бензин, керосин и т.п.). В молекулах та-
ких веществ атомы водорода очень симметрич-
но расположены вокруг атомов углерода, так
что центр тяжести всех электронов молекулы
совпадает с центром тяжести всех протонов
(дипольный момент равен или очень близок ну-
лю). Такие соединения растворяются только в
себе подобных (неполярных) растворителях, но
не в аоде. Более того, в силу поверхностного
натяжения на границе фаз, они стремятся мак-
симально уменьшить поверхность своего сопри-
косновения с водой. В качестве простой иллю-
страции; если в пробирке встряхнуть смесь рас-
тительного масла с водой, то образовавшиеся
капли масла (имеющие большую площадь со-
прикосновения с водой) будут довольно быстро
сливаться (уменьшается площадь контакта с
водной фазой) и в конечном счете смесь рассло-
ится на воду и масло с минимально возможной
поверхностью их соприкосновения.
Полярными являются все те молекулы или
фрагменты молекул, в которых есть так назы-
ваемые электроотрицательные атомы. Так обо-
значают атом, который сильнее, чем его парт-
нер по химической связи, притягивает к себе
обобществленные электроны, формирующие
эту связь. В аминокислотах (и белках) электро-
отрицательными являются атомы О, N и, в го-
раздо меньшей степени, S. Обладая полярно-
стью, аминокислоты (а, следовательно, и бел-
ки) гидрофильны, т.е. способны растворяться в
воде. Аминокислотам это качество присуще
уже хотя бы в силу высокой полярности их
стандартного фрагмента молекулы (см. рис.
1-1), содержащего два атома кислорода и один
атом азота. Нередко и в составе радикала R
тоже имеются электроотрицательные атомы,
которые усиливают гидрофильность молекулы.
Однако есть и такие аминокислоты, у ко-
торых радикал R построен только из атомов
углерода и водорода. Это делает молекулу ам-
фифильной, т.е., сочетающей в себе участки с
противоположными свойствами: стандартный
фрагмент гидрофилен, а ковалентно соединен-
ный с ним радикал R гидрофобен (растворим в
жирах). Такая двойственность физико-хими-
ческих свойств одной и той же молекулы (её
«двуличие») сильно расширяет диапазон воз-
можностей и играет очень важную роль в ме-
ханизмах её функционирования в живых объ-
ектах. Особенно это относится к белкам, в мо-
лекуле которых причудливо чередуются гид-
рофильные фрагменты и гидрофобные радика-
лы аминокислот.
В сущности, двойственность свойств лю-
бого белка (и иных биологических молекул)
относится к числу фундаментальных принци-
пов, лежащих в основе явлений жизни.
1.2.2. ЭЛЕКТРОЛИТИЧЕСКАЯ ДИССОЦИАЦИЯ
Другим из упомянутых важнейших физи-
ко-химических свойств аминокислот является
способность к электролитической диссоциации
(ионизации). Благодаря наличию карбоксиль-
ной группы происходит диссоциация по типу
кислоты с образованием аниона и освобожде-
нием протона в среду. Аминогруппа диссоции-
рует по типу основания, - путем присоедине-
ния протона из водной среды с образованием
катиона (положительный заряд на атоме азота).
Вещества, способные диссоциировать и по ти-
пу кислоты, и по типу основания, обозначают-
ся как амфотерные вещества. Продукты пол-
ной диссоциации таких молекул называются
амфотерными ионами, или амфионами (рис.
1-3). Способность аминокислот к ионизации
выражена настолько сильно, что они полно-
стью диссоциированы и пребывают в форме
амфионов не только в физиологических усло-
виях (в живом организме), но даже в кристал-
лическом состоянии.
Таким образом, и по второму из важней-
ших физико-химических свойств - по склонно-
сти к ионизации - каждая аминокислота тоже
проявляет двойственность, будучи способной
диссоциировать и по типу кислоты, и по типу
основания. Естественно, это распространяется
и на белки.
Схема на рис. 1-3 показывает, что диссо-
циация аминокислот, содержащих одну кар-
боксильную и одну аминогруппу, не сопрово-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
13
h-c-nh2 н
А
О он
R
I +
H-C-NН3
катион Н R
H-C-N+H3
С
R °Х Х°"
| амфион
н-с- nh2
Рис. 1-5. Подавление ионизации карбоксильных групп
аспартата постепенным добавлением сильной кислоты
(А - анионная, Б - электронейтральная, В - катионная
формы аминокислоты).
анион
Рис. 1-3. Электролитическая диссоциация
моноаминомонокарбоновой кислоты.
ждается изменением уровня водородных ионов
в среде. Иными словами, при растворении та-
ких аминокислот в воде pH раствора остается
нейтральным, т.е. близким 7. Образующийся
амфион обладает положительным и отрица-
тельным зарядами, которые взаимно уравно-
вешиваются, так что в целом молекула амино-
кислоты электронейтральна.
Однако некоторые аминокислоты имеют
ионизирующиеся группы не только в стандарт-
ном фрагменте молекулы, но и в составе ради-
кала R. Так, аспарагиновая кислота содержит в
нем карбоксильную группу, а лизин - амино-
группу. Эти группы тоже легко диссоциируют.
В результате при растворении, например, аспа-
рагиновой кислоты в воде происходит подкис-
ление среды (отсюда и название этого вещест-
ва), а сама аминокислота находится в растворе
в форме аниона, в котором из двух отрицатель-
ных зарядов только один уравновешен поло-
жительным зарядом на атоме азота (рис. 1-4).
Добавление сильной кислоты к раствору
аспартата подавляет диссоциацию карбоксиль-
ных групп (равновесие реакции, приведенной
на рис. 1-4, сдвигается влево). Постепенным
подкислением можно добиться того, что дис-
социация карбоксильных групп будет подавле-
на ровно наполовину. При этом амфион аспа-
рагиновой кислоты станет электронейтраль-
ным (рис. 1-5, Б), т.к. один оставшийся отрица-
тельный заряд компенсируется положитель-
ным зарядом на атоме азота. В данном случае
это произойдет при значении pH среды, равном
2,77. Если же продолжать добавление сильной
кислоты, то в конце концов можно подавить
диссоциацию и второй карбоксильной группы,
и тогда молекула аспарагиновой кислоты пред-
станет в форме катиона (рис. 1-5, В).
В противоположность аспарагиновой ки-
слоте, лизин при растворении в аоде подщела-
чивает среду, забирая из нее два протона (для
ионизации аминогрупп) взамен одного, осво-
бождаемого при диссоциации карбоксильной
группы. Соответственно, сама аминокислота
пребывает в катионной форме (рис. 1-6).
О ^ОН
хс
I
сн2
h-c-nh2
с
сА хон
°х /°"
с
+ н+
Н—С—N+H3
с
О ХО"
H2C-NH2
сн2
сн2
I +
СН2
h-c-nh2
Н2О
Н2с-Ы*Нз
СН2
СН2
। + НО’
им2
Н-С-ГГНз
Рис. 1-4. Ионизация аспарагиновой кислоты.
Рис. 1-6. Ионизация лизина.
14
Глава 1
Н2С-N Нз
I
СН2
СН2
сн2
H-C-N*H3
С
О Х ХО'
НО~ Jj2O
НО" н2о
Н2С—ЬГНз Н2С—Nh2
•гн’ но- н2о
сн2 А сн2
Ун2 *но^н2о ^Н2
H-C-NH? H-C-NH2
с ХС
tf ХО_ О ХО"
Рис. 1-7. Подавление ионизации аминогрупп лизина
постепенным добавлением щелочи
(А - катионная, Б - электронейтральная, В - анионная
формы аминокислоты).
Диссоциацию аминогрупп лизина можно
подавлять добавлением щелочи, которое ведет к
повышению концентрации гидроксильных ио-
нов НО- в среде. Они «отнимают» протоны от
ионизированных аминогрупп, превращаясь в
воду. При определенной концентрации гидро-
ксильных групп установится такое равновесное
состояние, когда половина аминогрупп будет
пребывать в депротонированном состоянии, так
что молекулы аминокислоты станут элекгро-
нейтральными (рис. 1-7, Б). В растворах лизина
этот момент наступает при pH среды, равном
9,82. Если продолжать добавление щелочи, то
можно достичь практически полного подавле-
ния диссоциации аминогрупп; молекулы лизина
превратятся при этом в свою анионную форму
(рис. 1-7, В).
Итак, каждая аминокислота всегда несет
на себе хотя бы один электрический заряд,
равный по величине заряду электрона или про-
тона. Обычно же имеются и отрицательные, и
положительные заряды в одной молекуле.
Иногда они уравновешивают друг друга, и то-
гда молекула находится в электронейтральном
состоянии, т.е. ведет себя в электрическом по-
ле как незаряженная частица. Наличие (и ха-
рактер) заряда или его отсутствие зависят, с
одной стороны, от соотношения кислотных и
основных групп в молекуле и, с другой сторо-
ны, от pH среды.
Изоэлектрическая точка (ИЭТ) - это то
значение pH среды, при котором молекула ам-
фотерного вещества находится в электроней-
тральном состоянии (т.е., число группировок,
диссоциированных по типу основания, в точно-
сти равно числу групп, диссоциированных по
типу кислоты). По аналогии с pH, значения ИЭТ
выражают отрицательным логарифмом соответ-
ствующей концентрации водородных ионов в
среде и обозначают символом pl.
Из приведенных выше примеров видно,
что для аминокислот, у которых в составе ра-
дикала R имеется кислотная групппа (обычно -
карбоксильная), ИЭТ находится в кислой сре-
де. Если же в составе радикала есть группа,
диссоциирующая по типу основания (напри-
мер, группа -NH2 в молекуле лизина), то ИЭТ
находится в щелочной среде. Наконец, моно-
аминомонокарбоновые кислоты (см. рис. 1-3)
должны иметь р! в нейтральной среде (факти-
чески же ИЭТ таких аминокислот находится в
слабокислой среде - при pH около 6,0 - из-за
того, что способность а-аминогрупп диссоции-
ровать по типу основания выражена заметно
слабее, чем кислотные свойства у карбоксиль-
ных групп).
Таким образом, с помощью параметра сре-
ды (pH раствора в изоэлектрической точке)
можно получить представление о соотношении
кислотных и основных групп в молекуле амфо-
терного вещества. Особенно важно это для
белков, в молекуле которых имеется множест-
во (нередко - десятки) тех и других группиро-
вок. Более того: изменяя pH среды, можно пе-
реводить любые амфионы в электронейтраль-
ное состояние или придавать молекуле в целом
отрицательный либо положительный заряд.
Как видно из приведенных схем, при pH ниже
изоэлектрической точки молекулы амфотерных
веществ (в том числе аминокислот) переходят
в катионную форму, а в среде, более щелочной,
чем pl, — в анионную форму. И чем дальше pH
среды отстоит от ИЭТ, тем большая доля мо-
лекул находится в виде заряженной частицы.
Так, все молекулы лизина электронейтральны
при pH = р! = 9,82. Подкисление среды на
1 или 2 единицы pH (т.е. до значений 8,82 или
7,82) переводит в катионную форму соответст-
венно 75 и 95% молекул этой аминокислоты.
Напротив, подщелачивание среды на 1 или
2 единицы pH переводит соответственно 75
и 95% молекул лизина в форму аниона. Даже
очень незначительный сдвиг pH вблизи р! ока-
зывает существенное влияние. Так, сдвиг отно-
сительно ИЭТ всего на 0,1 единицы pH пере-
водит примерно 6% молекул аминокислоты в
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
15
форму катиона или аниона (в зависимости от
направления сдвига, разумеется).
Электролитическая диссоциация амино-
кислот (и белков) относится к числу наиболее
простых и наглядных проявлений одного из
фундаментальных свойств живой материи -
способности реагировать на изменения усло-
вий среды и отвечать на них вполне однознач-
ным, предсказуемым образом. В частности,
влияние pH среды на степень зараженности
радикалов аминокислот, входящих в состав
белка, отражается прежде всего на суммарном
заряде всей белковой молекулы в целом. Это
важно само по себе. Однако, несравненно ве-
сомее изменения степени диссоциации радика-
ла той аминокислоты, которая играет главную
роль в функционировании данного белка. На-
пример, не случайно в состав каталитического
центра многих ферментов входит гистидин,
имидазольный радикал которого имеет кон-
станту ионизации (рК=6,0), гораздо более
близкую к физиологическим значениям pH
среды, чем у любой другой из кодируемых
аминокислот. Поэтому даже небольшие изме-
нения pH в микроокружении имидазольного
радикала, наступающие, например, под влия-
нием приближающейся молекулы субстрата,
заметно влияют на ионизацию этого радикала
и тем самым позволяют ему участвовать в
осуществлении ферментативного катализа.
1.3. КЛАССИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ
В первых попытках систематизации амино-
кислот исходили из химического строения мо-
лекул (соотношение амино- и карбоксильных
групп, наличие разветвленных или циклических
структур и т.д.). Однако, современная биохимия
отдает предпочтение классификации, основан-
ной на физико-химических свойствах радикалов
аминокислот. Тем самым ставится акцент на
том, что для функционирования белковых моле-
кул первостепенное значение имеют изложен-
ные выше физико-химические свойства амино-
кислот, входящих в состав белка, а не спектр их
химической реактивности.
По физико-химической классификации
аминокислоты подразделяются на 4 группы, в
зависимости от полярности или неполярности
радикала и наличия в нем группировки, диссо-
циирующей по типу кислоты или основания.
Эта классификация приведена в таблице 1-1
вместе с формулами всех 20 аминокислот, их
общепринятыми названиями и обозначениями,
а также величинами р! и данными о раствори-
мости в воде.
Физико-химическая классификация кодируемых аминокислот
Таблица 1-1
Название аминокислоты Формула Краткое обозначе- ние Символ Значение ИЭТ (pl) Растворимость в воде (г/100мл)
1 2 3 4 5 6
1. Аминокислоты с неполярным радикалом R
Глицин Н 1 Н-С-А/+Н3 СОО" Гл и (Gly) G 5,97 25,0
Аланин н 1 НзС-С-Л/*Н3 ООО' Ала (Ala) А 6,01 16,6
Валин Н,с / сн-с-л/*н, / 1 НзС СОО' Вал (Vai) V 5,96 8,8
Лейцин HSC н сн-сн2-с-л/*н, Н3с СОО- Лей (Leu) L 5,98 2,4
16
Глава 1
Продолжение таблицы 1-1
1 2 3 4 5 6
Изолейцин НзС—CHz сн—< НзС ч ~/гн3 ;оо" Иле (Не) I 5,44 4,1
Метионин н H3C-S-CH2-CH2-C-W*H3 СОО’ Мет (Mei) М 5,74 3,5
Пролин н2с- Н2С с с сн2 Ж QQ- Про (Pro) Р 6,30 162,3
Фенилаланин н /==х I %. >-СН2-С-Л/ н3 СОО" Фен (Phe) [Фал] F 5,48 2,9
Триптофан Ч '-N*H3 ;оо- Трп(Тгр) W 5,89 1,1
II. Аминокислоты с полярным незаряженным радикалом R
Серин он I сн2-< ч ?оо_ Сер (Ser) S 5,68 5,0
Цистеин SH н I ’ сн2-с-л/н3 СОО’ Цис (Cys) с 5,02 хорошо растворим
Треонин он I НзС— СН— ( ч '.-N*H3 ЮО~ Тре (Th г) т 5,64 20,5
Тирозин н HQ-^^^-CHz-С—N*H3 СОО' Тир (Туг) Y 5,66 0,05
Аспарагин о н С-СНг-С-ЛГН, Н2М СОО' Асн (Asn) N 5,41 3,0
Глутамин О V Т-СН2-СН2-С-Л/*Н3 h2n СОО' Глн (Gin) Q 5,65 4,2
III. Аминокислоты с карбоксильной группой в радикале R
Аспарагино- вая кислота (аспартат) °, " . С-СНг-С-Л/*Н3 ‘° СОО' Acn (Asp) D 2,77 0,5’
Глутаминовая кислота (глутамат) °, " . С-СНг-СН,- C-N H3 'О 4 СОО' Глу (Glu) Е 3,24 0,9*
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
17
Окончание таблицы 1-1
1 1 2 3 1 4 | 5 6
IV. Аминокислоты с основной группой в радикале R
Лизин н + 1 H3N -сн2-сн2-сн2-сн2-с-лГн3 СОО~ Лиз (Lys) К 9,59 хорошо растворим
Аргинин h2n* н У 1 c-nh-ch2-ch2-ch2-c-/v*h3 H2N ООО’ Apr (Arg) R 11,15 15,0
Г истидин НС NH Н СН СОО" Гис (His) Н 7.47 4,2
* - хорошо растворим при нейтрализации раствора до pH 7,0.
1.4. ТИПЫ СВЯЗЕЙ МЕЖДУ
АМИНОКИСЛОТАМИ В МОЛЕКУЛЕ БЕЛКА
Все типы связей, которые возникают между
аминокислотами в ходе биогенеза белковой
молекулы, можно разделить на две группы:
ковалентные связи и нековалентные (слабые
типы связей). К пераой из них относятся пеп-
тидная и дисульфидная связи. Ко второй - во-
дородная связь, ионная связь и гидрофобное
взаимодействие.
1.4.1. ПЕПТИДНАЯ СВЯЗЬ
Пептидная (кислотоамидная) связь соеди-
няет две аминокислоты — одинаковых или раз-
ных. Ее можно представить как результат вы-
деления молекулы воды за счет карбоксильной
группы одной аминокислоты и аминогруппы
другой. В итоге углерод бывшей карбоксиль-
ной группы соединяется ковалентной связью с
азотом бывшей аминогруппы другой амино-
кислоты. Образуемую молекулу обозначают
как ди пептид.
В качестве примера на рис. 1-8 представ-
лено строение одного из дипептидов, которые
могут быть получены при соединении аланина
с глицином. Естественно, на одном конце ди-
пептида остается свободной аминогруппа, на
другом - карбоксильная группа. К любой из
них можно аналогичным образом присоеди-
нить еще одну аминокислоту, и тогда появятся
молекулы двух разных трипептидов (см. рис.
1-8).
Рис. 1-6. Строение дипептида аланил-глицина и продуктов присоединения к нему цистеина.
18
Глава 1
Трипептид можно наращивать далее, по-
лучая последовательно тетрапептиды, пента-
пептиды, гексапептиды и вообще любые поли-
пептиды. Следует, однако, подчеркнуть, что в
живых системах наращивание идет в одном
направлении — путем присоединения новой
аминокислоты к карбоксильной группе преды-
дущей.
Как видно на рис. 1-8, названия пептидов
составляются из названий аминокислот, начи-
ная с той, у которой сохранена свободная а-
аминогруппа. При этом в названиях всех ами-
нокислот окончание изменяется на «-ил». Ис-
ключение составляет последняя по счету ами-
нокислота, название которой не изменяется,
так как ее карбоксильная группа остается сво-
бодной (не вовлеченной в образование пептид-
ной связи).
Лишь в 50-е годы XX века были разрабо-
таны методы, которые позволяют устанавли-
вать последовательность соединения амино-
кислот в любом полипептиде. Применение их к
изучению самых разных белков, а также осу-
ществленный тогда же прорыв в области био-
химической генетики, — все это позволило
окончательно и абсолютно однозначно устано-
вить, что любая белковая молекула всегда пред-
ставляет собой прежде всего длинную поли-
пептидную цепь, насчитывающую десятки,
сотни, а иногда и тысячи аминокислотных ос-
татков. Соответственно, молекулярная масса
таких полипептидов может достигать десятков
и даже сотен килодальтон.
Две определяющих закономерности лежат
в основе структурных особенностей любого
природного полипептида: неразветвленность
полимерной цепи и ее гибкость.
Неразветвленность полипептидной цепи
обусловлена тем, что в образовании пептидной
связи аминокислоты участвуют только своим
стандартным фрагментом, который, как уже
отмечалось, одинаков у всех кодируемых ами-
нокислот. Если же в составе радикала R имеет-
ся еще и «своя» карбоксильная или аминогруп-
па, то она никогда не участвует в построении
природных полипептидных цепей. Эта законо-
мерность гарантируется теми молекулярными
механизмами, которые осуществляют биосин-
тез полипептидных цепей в клетке.
Для иллюстрации на рис. 1-9 приведено
строение небольшой полипептидной цепи, на-
считывающей всего 6 аминокислотных остат-
ков. В их числе - остатки лизина и аспартата, в
боковых радикалах которых содержатся соот-
ветственно аминогруппа и карбоксильная
группа. Эти группы в принципе тоже способны
формировать пептидные связи. Однако систе-
мы биосинтеза белка полностью исключают
такую возможность. Значит, при написании
формулы любого (поли)пептида аминокислот-
ные остатки следует соединять только их стан-
дартными фрагментами.
Рис. 1-9. Строение гексапептида ввлил-лизил-лейцил-гистидил-аспарагил-тирозина
(Затенением выделен остов («стержень») молекулы, абсолютно одинаковый у всех природных полипептидов.
В представленном изображении все пептидные группы и а-углеродные атомы находятся в одной плоскости
(в плоскости рисунка), а радикалы R попеременно либо выступают нед этой плоскостью
(в данном примере - валин, лейцин и аспартат), либо расположены позади нее (лизин, гистидин и тирозин);
водород при а-углеродных атомах направлен в сторону, противоположную направлению радикала R]
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
19
Итак, природные (поли)пептиды пред-
ставляют собой линейную последовательность
аминокислотных остатков, соединенных пеп-
тидными связями, прочно фиксирующими ме-
сто (очередность) каждой аминокислоты в дан-
ной цепи. При этом на одном конце цепи име-
ется свободная а-аминогруппа, а на другом —
свободная карбоксильная группа. Они обозна-
чаются соответственно как N-конец и С-конец,
а расположенные здесь аминокислоты - как
N-концевая и С-концевая. Именно с N-концевой
аминокислоты решили начинать отсчет после-
довательности (нумерацию) аминокислотных
остатков в полипептидной цепи (много позже
выяснилось, что биосинтез таких цепей дейст-
вительно начинается с N-концевой аминокисло-
ты и происходит путем наращивания С-конца).
Неразветвленность полипептидной цепи -
не единственное следствие использования
стандартного фрагмента аминокислот для ее
построения. Не менее важно и то, что в резуль-
тате возникает некий остов («стержень»), оди-
наковый у всех белковых молекул (на рис 1-9
он выделен затенением). Этот «стержень»
представляет собой многократное повторение
последовательности ...-N(H)-C(H)-C(O)-..., в
которой группа -С(Н)- является а-углеродным
атомом соответствующего аминокислотного
звена. Именно на этих группах «стержневой»
части молекулы сидят как боковые веточки,
радикалы 20 разных аминокислот, т.е., 20 ва-
риантов боковой цепи.
Стандартность «стержня» открывает воз-
можность использования единого механизма
для синтеза любых полипептидов. Сопряжение
его с системой отбора очередной аминокисло-
ты для включения ее в состав полимера позво-
ляет разнообразить чередование боковых це-
пей, т.е., обеспечивать специфику синтезируе-
мого полипептида.
Таким образом, несмотря на структурную
однотипность всех природных полипептидов,
имеются неисчерпаемые возможности для по-
строения самых разнообразных молекул. При
этом разные полипептиды могут различаться,
во-первых, общим числом боковых цепей, т.е.,
длиной полипептидной цепи (а, следовательно,
и величиной молекулярной массы). Во-вторых,
даже при одинаковой длине полипептидные
цепи могут различаться соотношением разных
боковых цепей (разных аминокислот). Нако-
нец, даже при совпадении и величины молеку-
лы, и соотношения разных аминокислот в ней,
полипептиды могут различаться последова-
тельностью чередования 20 разных аминокис-
лотных остатков.
Легко сосчитать, что из двух разных ами-
нокислот можно построить 4 различных дипеп-
тида. Аналогично, из трех аминокислот можно
создать 27 разных трипептидов, из четырех —
256 тетрапептидов и т.д. Известен такой под-
счет: при использовании всего лишь 12 амино-
кислот для построения полипептидов с молеку-
лярной массой 34000 Да число теоретически
возможных вариантов составит 1О300! Эту цифру
трудно даже представить. Если взять только по
одной молекуле каждого варианта, то совокуп-
ная масса их достигнет примерно 1О280 г, тогда
как масса всей нашей планеты составляет «все-
го» 1027 г! Иными словами, даже этот масштаб
слишком мал: чтобы построить по одной моле-
куле каждого из возможных вариантов, необхо-
димое количество материала эквивалентно мас-
се 10253 таких планет, как Земля!
Становится очевидным, что живая приро-
да реализует лишь ничтожно малую долю из
возможного разнообразия полипептидных це-
пей. Лишь некоторые, наиболее «удачные» по-
следовательности отобраны и «отшлифованы»
эволюцией в качестве пригодных для выпол-
нения какой-нибудь конкретной функции
(ферментативный катализ, мышечное сокра-
щение, «захват» фотона и преобразование за-
ключенной в нем энергии в иную форму и т.д.).
Нередко природа использует удачно найденное
сочетание конкретных аминокислот в качестве
однотипного фрагмента при создании белко-
вых молекул с совершенно различными биоло-
гическими функциями. Бывает и так, что неко-
торые конструкции повторяются (и неодно-
кратно!) в пределах одной полипептидной цепи
(их так и называют: «повторяющиеся последо-
вательности» или, короче, «повторы»).
Гибкость полипептидной цепи про-
истекает из того, что простая («одинарная»)
ковалентная связь подобна оси, допускающей
свободное вращение соединяемых ею фраг-
ментов молекулы. Поскольку в «стержневой»
части полипептида ковалентные связи направ-
лены под углом друг к другу, вращение вокруг
20
Глава 1
одной из них изменяет направление дальней-
шего хода «стержня», т.е., обеспечивает его
изгиб. Накопление таких изгибов приводит к
тому, что весь «стержень» может принимать
причудливую форму, которая к тому же легко
меняется. В этом и проявляется гибкость поли-
пептидной цепи.
Есть, однако, определенные ограничения
этой гибкости. Главное из них - сами пептид-
ные связи. Они заметно короче простой кова-
лентной связи (например, такой, как связь
...-N(H)-C(H)-... в той же полипептидной цепи),
но длиннее обычной двойной связи. Кроме то-
го, и связь между кислородом и углеродом в
пептидной группе не является чисто двойной:
она заметно длиннее аналогичной связи в альде-
гидах или кетонах, т.е., несколько ближе к про-
стой («одинарной») связи. Такой характер связи,
промежуточный между простой и двойной, по-
казывают пунктиром рядом с черточками, обо-
значающими простую связь (рис. 1-10, Б).
Частично двойной характер пептидной
связи делает невозможным вращение вокруг
нее как вокруг оси. Поэтому все 4 атома пеп-
тидной группы ...-C(O)-N(H)-... лежат в одной
плоскости, т.е., обладают жесткой планарной
(плоской) структурой. В той же плоскости
лежат и оба а-углеродных атома, расположен-
ные по обе стороны от пептидной связи. Одна-
ко их связи с пептидной группой (связи
...-N(H)-C(H)-... и ...-С(Н)-С(О)-...) относятся к
числу простых («одинарных»), т.е., допускаю-
щих вращение вокруг себя как вокруг оси. Зна-
чит, в «стержне» полипептида две из каждых
трех подряд связей допускают осевое вращение.
При этом а-углеродный атом каждой аминокис-
лоты, находясь на стыке соседних планарных
структур, представляет собой как бы шарнир,
вокруг которого примыкающие плоскости могут
поворачиваться относительно друг друга.
Рис. 1-10. Две предельные мезомерные формы (А и В)
пептидной связи и ве гибридная структура (Б);
пептидная связь указана стрелкой.
Рис. 1-11. Структура тетралептида:
линейный вариант (А) и изгиб «стержня» (Б)
вследствие осевого поворота по одной
из связей ...С(Н)-С(О)..-
Для иллюстрации на рис. 1-11 приведен
тетрапептидный фрагмент, в котором жесткие
планарные структуры пептидных групп выделе-
ны затенением. Здесь показано осевое вращение
вокруг той связи, которая соединяет а-угле-
родный атом и карбонильный углерод во втором
(с N-конца) аминокислотном звене. Можно ви-
деть, что такой поворот ведет к изменению на-
правления хода полипептидной цепи: из вытя-
нутой в одну линию она стала несколько изо-
гнутой в пространстве.
Поворот соседних планарных структур от-
носительно друг друга обычно не беспределен:
этому препятствует чрезмерное сближение
аминокислотных радикалов R. Однако сравни-
тельно небольшие повороты не только возмож-
ны, но и осуществляются в действительности.
Если они разнонаправленны и чередуются без
явной регулярности, то в целом ход полипеп-
тидной цепи в пространстве приобретает при-
чудливый характер, создавая впечатление не-
упорядоченности, хаотичности («случайный
клубок», «хаотичный клубок»). Если же в каж-
дом звене поворот осуществляется в одну и ту
же сторону, то становится возможной спирале-
образная форма довольно протяженных участ-
ков полипептидной цепи. В более коротких
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
21
участках накопление небольших поворотов
плоскости каждой пептидной группы относи-
тельно предшествующей планарной структуры
может привести к такому перегибу цепи, в ре-
зультате которого она меняет свое направление
на противоположное. В частности, стандартная
группа одного аминокислотного фрагмента
может сблизиться с аналогичной группой чет-
вертого от нее (по ходу цепи) аминокислотного
остатка, как это изображено (в проекции на
плоскость) на рис. 1-12. Между сближенными
группами >С=О и Н—N< легко образуются во-
дородные связи (см. раздел 1.4.3), которые,
появившись, обеспечивают стабилизацию воз-
никшего изгиба полипептидной цепи в обрат-
ном направлении. Такой способ изменения хо-
да полипептидной цепи на 180°, обнаруженный
при изучении строения белков, получил назва-
ние «p-поворот» (полипептидной цепи); по
внешнему сходству его сравнивают со шпиль-
кой для волос.
Таким образом, закономерность, обуслов-
ленная частично двойным характером пептид-
ной связи, делает структуру полипептидной
цепи полужесткой, позволяет «лепить» из нее
разные «фигуры». Эта полужесткость обеспе-
чивает возможность многообразия вариантов
пространственной организации белковой моле-
кулы. Более того, она обусловливает и доста-
точную стабильность сложившейся структуры,
и, вместе с тем, ее некоторую подвижность в
определенных рамках.
Рис.1-12. «0-Поворот» полипептидной цепи
(«шпилька») в проекции на плоскость.
Аланил-глицин-валил-серин
Аланил-глицил-пролил-серин
Рис. 1-13. Нарушение регулярности «стержня»
полипептидной цепи в зоне пролина
(«пролиновый излом»).
Рассмотренная регулярность структуры
«стержня» полипептидной цепи существенно
искажается в тех местах молекулы, где содер-
жится остаток пролина. Это объясняется тем,
что пролин, строго говоря, является не амино-
кислотой, а иминокислотой, ибо в его общей
части содержится иминоазот. Иными словами,
в молекуле пролина присущий аминокислотам
радикал R своим «дальним» концом замкнут
на атом азота, который в обычных аминокис-
лотах входит в состав а-аминогруппы. Из-за
этого невозможно осевое вращение вокруг свя-
зи ... >N-C(H)-... (указана стрелкой на рис.
1-13, Б). Следовательно, нарушается подвиж-
ность «стержня» полипептидной цепи в этом
месте. Кроме того, жесткость циклического
радикала пролина ведет к искажению обычной
регулярности структуры «стержня», вызывая
его изгиб с некоторым осевым поворотом (см.
рис. 1-13). Особым образом изменяя направле-
ние полипептидной цепи, этот жестко фикси-
рованный изгиб получил название «пролино-
вый излом».
1.4.2. ДИСУЛЬФИДНАЯ СВЯЗЬ
Одна из 20 аминокислот — цистеин — имеет
в составе радикала R сульфгидрильную группу
(-SH). Если две такие группы окажутся доста-
точно сближенными в пространстве, то они мо-
22
Глава 1
Рис.1-14. Образование и разрыв дисульфидной связи
(соответственно окислительный и восстановительный процессы).
гут провзаимодействовагь между собой с вы-
делением двух атомов водорода и образовани-
ем дисульфидной связи ...-S-S-... (рис. 1-14).
Дисульфидная связь может возникнуть за
счет двух остатков цистеина, расположенных в
разных местах одной и той же полипептидной
цепи, но сближенных за счет изгибов этой це-
пи. Такую дисульфидную связь называют
внутрицепочечной. Но она может образоваться
и за счет остатков цистеина, принадлежащих
разным полипептидам. Тогда ее называют
межцепочечной. Нередко дисульфидную связь
обозначают термином «дисульфидный мос-
тик», подчеркивая тот факт, что она соединяет
разные полипептиды или разные участки од-
ной полипептидной цепи, причем, не соседние,
а достаточно удаленные по ходу этой цепи.
Дисульфидный мостик - это обычная ко-
валентная связь, т.е., достаточно прочное хи-
мическое соединение соответствующих фраг-
ментов полипептидной цепи (или двух цепей).
Однако биологически она менее устойчива,
чем пептидная связь. Это объясняется высокой
интенсивностью окислительно-восстановитель-
ных процессов в клетке. От редокс-потенциала
микросреды сильно зависит как возникновение
дисульфидной связи (окисление групп -SH),
так и ее расщепление (восстановление мос-
тиков -S-S-).
1.4.3. НЕКОВАЛЕНТНЫЕ СВЯЗИ
(СЛАБЫЕ ТИПЫ СВЯЗЕЙ)
Сила нековалентных связей — в их слабо-
сти! Это — не преувеличение. Будучи в десятки
раз менее прочными, чем обычная ковалентная
связь, слабые взаимодействия очень чувстви-
тельны к физическим и физико-химическим
параметрам среды. А это качество играет ис-
ключительно важную роль в живых системах с
их способностью (и «обязанностью») реа-
гировать на изменения внешних условий.
Еще одно важное качество слабых типов
связей — ограниченная степень их избиратель-
ности. Ковалентные связи, как известно, воз-
никают между строго определенными химиче-
скими группировками (та же пептидная связь
или дисульфидная). В противоположность
этому, слабые связи соединяют почти любые
химические структуры — лишь бы они облада-
ли определенным физико-химическим свойст-
вом. Например, гидрофобностью. Или заряда-
ми противоположного знака. Иными словами,
нековалентные связи - это, в сущности, не хи-
мические соединения атомов, а некие физико-
химические взаимодействия, возникающие на
основе взаимного влечения (притяжения) в
чем-то родственных структур. Эта невзыска-
тельность влечет за собой высокую чувстви-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
23
тельность слабых типов связей к появлению в
среде «посторонних» веществ, способных к об-
разованию таких же связей.
Водородная связь может быть опре-
делена как связь, осуществляемая атомом во-
дорода между двумя электроотрицательными
атомами, с одним из которых этот водород
соединен обычной ковалентной связью. Как
уже отмечалось (раздел 1.2.1), в белках такими
атомами являются главным образом О и N. По-
этому водородная связь в белковых молекулах
чаще всего возникает между пептидными груп-
пами (рис. 1-15).
Хотя водородная связь в 10-20 раз слабее
обычной ковалентной связи, многократное ее
повторение между двумя полипептидами до-
вольно прочно удерживает их вместе. Точно
так же водородные связи могут прочно соеди-
нять расположенные рядом участки одной и
той же полипептидной цепи, соответственно
изогнутой в пространстве.
В образовании водородных связей могут
участвовать и радикалы R аминокислот, имею-
щие группу -ОН (серин, треонин, тирозин) или
атомы азота (например, гистидин).
Водородные связи очень чувствительны к
нагреванию (усиливающему тепловое движе-
ние молекул), а также к присутствию веществ,
которые сами легко образуют водородные свя-
зи, а потому способны «вмешиваться» и ослаб-
лять, разрушать аналогичные связи в белковой
молекуле. К числу таких веществ относится,
например, мочевина [H2N-C(O)-NH2] - глав-
ный конечный продукт распада аминокислот у
человека.
Ионная связь — это взаимное притя-
жение разноименно заряженных молекул или
Рис. 1-15. Водородная связь (обозначена пунктиром)
между кислородом одной пептидной группы и азотом
другой, пространственно сближенной.
частей одной большой молекулы, достаточно
сближенных в пространстве.
Почти в любой полипептидной цепи мно-
гие из аминокислотных радикалов R содержат
ионизируемые группы, несущие положитель-
ный или отрицательный заряд. В результате
изгибов такой цепи некоторые разноименно
заряженные группы могут оказаться на дис-
танции, достаточно короткой для образования
ионной связи, которая, возникнув, начинает
удерживать цепь в таком изогнутом состоянии.
Встречаются в белке и другие варианты элек-
тростатических взаимодействий (полярных
связей). Они обозначаются как ион-дипольное
и диполь-дипольное взаимодействия.
Ионные связи очень чувствительны к со-
левому фону среды. Катионы (Na+, К+ и др.)
склонны к экранированию отрицательно заря-
женных групп в молекуле полипептида, а анио-
ны (например, СГ или НСОз ) стремятся бло-
кировать положительные заряды. В результате
ослабляются и разрушаются полярные связи
между белковыми фрагментами.
Гидрофобное взаимодействие от-
личается тем, что возникает между неполяр-
ными структурами. Как известно, неспецифи-
ческое взаимное притяжение любых молекул
называют силами Ван дер Ваальса. Такое при-
тяжение может возникать и между фрагмента-
ми одной крупной молекулы, если они оказы-
ваются достаточно сближенными в простран-
стве. В частности, из-за изгибов полипептид-
ной цепи могут оказаться в достаточной близо-
сти аминокислотные радикалы R, расположен-
ные в разных участках «стержня» этой цепи.
Если же эти радикалы окажутся еще и непо-
лярными, то окружающая вода будет способст-
вовать их сближению и более тесному взаимо-
действию. Иными словами — содействовать
слиянию таких структур, которое сопровожда-
ется вытеснением молекул воды из простран-
ства между неполярными радикалами и, следо-
вательно, уменьшением площади соприкосно-
вения воды с неполярной фазой.
Итак, гидрофобное взаимодействие - это
силы Ван дер Ваальса, дополненные выталки-
вающей силой воды. В водном окружении не-
полярным структурам не остается ничего ино-
го, как тесно сблизиться друг с другом, закре-
пив свое единение явственным взаимным при-
24
Глава 1
Рис. 1-16. Схема гидрофобного взаимодействия
(обозначено затенением) с участием радикалов
фенилаланина и лейцина.
тяжением. В этом им существенно помогает
окружающая вода, «выдавливающая» из себя
чуждые ей гидрофобные структуры.
В полипептидной цепи обычно имеется
довольно много неполярных радикалов амино-
кислот. Из-за их гидрофобности становятся
энергетически выгодными такие изгибы этой
цепи, которые способствовали бы сближению
неполярных радикалов, «слиянию» их в гидро-
фобные конгломераты, внутри которых нет
молекул воды. При этом взаимодействие непо-
лярных структур будет особенно эффективным
в случаях их стерического (пространственного)
соответствия друг другу, - например, при
сближении радикалов фенилаланина и лейцина
(рис. 1-16).
Гидрофобные взаимодействия, естествен-
но, очень чувствительны к присутствию орга-
нических растворителей (н детергентов). В ча-
стности, некоторые проявления алкогольного
опьянения, возможно, обусловлены наруше-
ниями гидрофобных взаимодействий в белко-
вых структурах под действием этанола.
1.5. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ
Длинная полипептидная цепь представляет
собой линейную последовательность очень
большого числа планарных пептидных фраг-
ментов, которые, как уже отмечалось, соедине-
ны между собой шарнирно. Осевая подвиж-
ность этих соединений обеспечивает (теорети-
чески) почти неограниченную возможность
вариаций пространственного взаиморасполо-
жения различных частей молекулы. Однако в
действительности реализуется небольшое чис-
ло типовых вариаций, часть из которых сочета-
ется в одной и той же белковой молекуле. Что-
бы прояснить иерархию таких вариаций, было
введено понятие о четырех уровнях простран-
ственной организации белковой молекулы. Их
обозначают как первичную, вторичную, тре-
тичную н четвертичную структуру белка.
1.5.1. ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА
Первичная структура — так называют
последовательность аминокислотных остат-
ков в полипептидной цепи, прочно закреплен-
ную пептидными связями. Прочно - ибо эти
связи являются ковалентными, и разорваны
они могут быть только при сильном нагрева-
нии с крепкой кислотой (илн щелочью) либо
под действием специальных ферментов. Ины-
ми словами, первичная структура сохраняется
до тех пор, пока существует данная молекула.
Разрыв хотя бы одной из десятков или сотен
пептидных связей в белковой молекуле ведет к
ее исчезновению и появлению совсем других
молекул - обломков исходной. Продолжитель-
ность существования белковых молекул со-
ставляет в среднем 2-3 недели, хотя для инди-
видуальных белков она варьирует в широком
диапазоне; от нескольких минут (например,
гормон инсулин) до нескольких месяцев (в ча-
стности, гемоглобин или некоторые белки
мышц).
Характер чередования аминокислотных
остатков является решающим фактором, пре-
допределяющим возможный характер структур
более высокого порядка. Действительно, фик-
сируя положение, например, остатков цистеина
в полипептидной цепи, первичная структура в
значительной мере предопределяет характер
возможных изгибов этой цепи, которые могут
привести к сближению цистеиновых остатков и
возникновению дисульфидных мостиков (ко-
торые, естественно, и стабилизируют сложив-
шуюся пространственную форму молекулы).
Фиксируя положение гидрофобных радикалов
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
25
в цепи, аминокислотная последовательность
дает информацию о том, как должна быть изо-
гнута эта цепь в пространстве, чтобы неполяр-
ные группы могли сблизиться и вступить в
гидрофобные взаимодействия. То же самое
можно сказать и о роли положения заряженных
радикалов в полипептидной цепи, гидрофиль-
ных радикалов, а также группировок, пригод-
ных для образования водородных связей.
Таким образом, аминокислотная последо-
вательность полипептидной цепи, детермини-
рованная генетически, несет, в свою очередь,
информацию о том, какой может быть вторич-
ная и последующие структуры данного белка.
На основе знания первичной структуры белка
удается даже предсказать возможный характер
высших структур.
1.5.2. ВТОРИЧНАЯ СТРУКТУРА
Вторичная структура — это пространст-
венная организация «стержня» полипептидной
цепи. Различают 4 главных варианта вторичной
структуры: а-спираль, коллагеновая спираль,
структура складчатого листа и нерегулярная
цепь.
А. а-Спираль
Установлено, что «стержень» полипептид-
ной цепи обычно не просто вытянут в про-
странстве, а имеет тенденцию приобретать
спиралеобразную форму. Чаще всего встреча-
ется очень плотная укладка атомов «стержня»,
без пустот внутри спирали. Из-за единообразия
самого «стержня» такая спираль однотипна у
самых разных полипептидов. Она имеет пра-
вую закрученность (по часовой стрелке, если
смотреть с N-концевого торца спирали). На 5
полных ее витков приходится 18 аминокислот-
ных остатков. Диаметр спирали равен 0,50 нм,
а расстояние между соседними витками (шаг
спирали) составляет 0,54 нм. Аминокислотные
радикалы R, присоединенные к а-углеродным
атомам (Са), располагаются не внутри спирали,
а направлены кнаружи от нее, образуя спира-
леобразный ряд боковых «выростов». Поли-
пептидная цепь с такими стандартными харак-
теристиками получила название «а-спираль».
Ее структуру предсказали Л.Полинг и Р.Кори в
1951 г., за 6 лет до того, как были получены
Рис. 1-17. Схематическое изображение а-спирали.
экспериментальные подтверждения (осуществ-
ленные благодаря развитию метода рентгено-
структурного анализа). Схематически а-спи-
раль изображена на рис. 1-17.
Фиксируется структура а-спирали посред-
ством водородных связей, возникающих между
фрагментами «стержня», а именно: между
группой >С=О одного витка и группой H-N<
соседнего витка спирали. Они проходят прак-
тически параллельно оси спирали. Повторяясь
многократно, эти слабые связи достаточно на-
дежно закрепляют спиралеобразную форму
«стержня». Более того, они удерживают а-спи-
26
Глава 1
раль в несколько напряженном состоянии, на-
поминающем немного сжатую пружину.
Б. Коллагеновая спираль
Как отмечено в разделе 1.4.1, наличие ос-
татка пролина нарушает регулярность хода
«стержня» полипептидной цепи. Поэтому в
участках, где есть эта аминокислота, формиро-
вание а-спиралн невозможно. Вместе с тем,
регулярное повторение «пролиновых изломов»
(см. рис. 1-13) способствует возникновению
спиралеобразной структуры с совсем иными
характеристиками. Ее обозначили термином
«коллагеновая спираль», - по названию глав-
ного белка внеклеточного вещества. Полипеп-
тидная цепь коллагена состоит из примерно
1000 аминокислотных остатков, и каждый тре-
тий из них представлен глицином, а каждый
пятый — пролином (еще около 11% приходится
на долю аланина).
В отличие от а-спирали, коллагеновая
спираль имеет не правую, а левую закручен-
ность. А главное — шаг этой спирали (0,95 нм)
почти вдвое больше свойственного а-спирали
(0,54 нм). Иными словами, коллагеновая
спираль растянута гораздо сильнее (рис. 1-18).
Рис. 1-18. Сопоставление а-спирали (А)
и коллагеновой спирали (Б).
Это препятствует формированию водородных
связей между соседними витками. Фиксируется
же вытянутая структура коллагеновой спирали
за счет водородных связей с соседними поли-
пептидными цепями такого же строения. Есте-
ственно, направлены эти связи поперек оси спи-
рали. Формируются они за счет группы >N=H
остатков глицина одной цепи и групп О=С< в
смежных полипептидах.
В. Складчатый лист.
Наряду с а-спиралью, Л.Полинг и Р.Кори
предсказали в 1951 г. и 0-структуру белковой
молекулы. Она подтверждена эксперименталь-
но и получила названия «структура складчато-
го листа», «0-складчатый слой», «0-слой».
Главная особенность этой структуры заключа-
ется в том, что «стержень» полипептидной це-
пи не закручен в спираль, а почти полностью
растянут. При этом он имеет зигзагообразный
вид. Структуру 0-слоя проще всего можно
представить в виде длинной полоски бумаги,
сложенной в виде гармошки (рис. 1-19). Рас-
стояние между соседними сгибами гофриро-
ванной полоски (ребрами «гармошки») состав-
ляет 0,35 нм. В плоскости листа, находящейся
между двумя ребрами, располагается одна пеп-
тидная группа (все ее четыре атома). На каж-
дой линии сгиба находится очередной
а-углеродный атом. Присоединенный к нему
радикал R всегда направлен в сторону от «гар-
мошки» (т.е., находится вне пространства,
ограниченного «верхними» и «нижними» реб-
рами складчатого листа). Водород при а-угле-
родном атоме находится в пределах «гармош-
ки» (между ее ребрами).
Фиксируется 0-слой водородными связя-
ми, образуемыми группой >С=О одного фраг-
мента полипептидной цепи и группой H-N<
другого аналогичного фрагмента, находящего-
ся в той же плоскости. Упомянутые группы
могут принадлежать разным полипептидным
цепям, расположенным по соседству. Но очень
часто они принадлежат достаточно протяжен-
ным фрагментам одной и той же полипептид-
ной цепи, разделенным нерегулярным участ-
ком молекулы, в пределах которого осуществ-
ляется поворот цепи в обратную сторону.
Фрагменты полипептидной цепи, объединен-
ные водородными связями в 0-складчатую
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
27
Рис. 1-19. Структура складчатого листа (Р-складчатый слой).
структуру, могут иметь одинаковое направление
(от N-конца к С-концу), и тогда их именуют па-
раллельными 0-слоями (цепи А и Б на рис.
1-19). Антипараллельными называют такие
р-складчатые структуры, в которых полипеп-
тидные цепи имеют взаимно противоположное
направление (фрагменты Б и В на рис. 1-19).
Из приведенных количественных характе-
ристик видно, что в р-складчатой структуре
полипептидная цепь еще более растянута, чем
в коллагеновой спирали. В последней а-угле-
родные атомы отстоят друг от друга на 0,29 нм
(по оси спирали), тогда как в p-слое аналогич-
ное расстояние составляет 0,35 нм, т.е., на 20%
больше. В сравнении же с а-спиралью протя-
женность p-слоя в 2,3 раза больше, если сопос-
тавлять отрезки цепи, одинаковые по числу
аминокислотных звеньев.
Г. Нерегулярная цепь.
И спиралеобразные, и Р-складчатые фраг-
менты полипептидной цепи представляют со-
бой примеры периодичной структуры, т.е.,
многократного повторения одного и того же
варианта пространственной укладки «стерж-
ня». Эта упорядоченность довольно жестко за-
креплена водородными связями, расположен-
ными регулярно внутри цепи или между сосед-
ними полипептидами. Вместе с тем, в белковой
молекуле встречаются и такие участки, в пре-
делах которых отсутствует какое-либо едино-
образие в характере взаиморасположения пеп-
тидных фрагментов.
В общем, линейная вытянутость цепи энер-
гетически невыгодна. Прежде всего этому ме-
шают гидрофобные радикалы аминокислотных
фрагментов, ковалентно закрепленные в разных
местах по ходу цепи. Водное окружение стре-
мится уменьшить площадь соприкосновения с
такими неполярными структурами. Этим созда-
ется главная движущая сила, заставляющая по-
липептидную цепь изгибаться в пространстве
так. чтобы многие (если не все) неполярные ра-
дикалы оказались сближенными между собой и
объединились силами гидрофобного взаимодей-
ствия (вытесняя тем самым воду из промежут-
ков между собой). Сложившаяся форма цепи до-
полнительно закрепляется водородными и ион-
ными связями, возникающими в подходящих
для этого участках, а иногда S-S-мостиками.
В итоге ход полипептидной цепи в про-
странстве принимает энергетически наиболее
выгодный вариант. В нем нет каких-либо регу-
28
Глава 1
ляриых повторов. Он различен в разных ами-
нокислотных последовательностях, но всегда
содержит осевые повороты и изгибы полипеп-
тидной цепи, среди которых нередки повороты
типа «шпильки» (см. рис. 1-12). Все это вместе
дает основание для обозначения описанного
варианта вторичной структуры как «нерегу-
лярная цепь». Менее удачны синонимы «хао-
тичный клубок», «аморфный участок», «беспо-
рядочный клубок», хотя и они встречаются в
литературе.
1.5.3. ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА
Третичная структура - это пространст-
венное взаиморасположение спиралеобразных,
^-складчатых и нерегулярных участков поли-
пептидной цепи. Иными словами — простран-
ственная организация полипептидной цепи в
целом, ее архитектура.
Фиксируется третичная структура всеми
типами слабых связей, а нередко - и дисуль-
фидными мостиками. Естественно, у каждого
белка формируется свой, неповторимый облик
третичной структуры (в значительной степени
предопределенный спецификой первичной
структуры).
Можно выделить два главных типа тре-
тичной структуры. Одному из них присуща
плотная укладка полипептидной цепи в малом
объеме пространства. Поэтому молекула в це-
лом приобретает вид округлой частицы - глобу-
лы. Хотя чаще эти частицы имеют довольно вы-
тянутую (эллипсоидную) форму, такие белки,
тем не менее, называют глобулярными (шаро-
образными). Другому типу третичной структуры
свойственна сильная растянутость полипептид-
ной цепи: она приобретает вид нити или волок-
на. Соответственно белки, построенные из таких
цепей, называют фибриллярными.
1.5.4. ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА
У многих белков молекула построена не из
одной, а из нескольких полипептидных цепей.
Каждую из них называют субъединицей данно-
го белка (реже — протомером). Термином «чет-
вертичная структура» обозначают и сам
факт наличия несколъкиих субъединиц в моле-
куле, и особенности пространственной орга-
низации всей молекулы, включая характер вза-
имного расположения субъединиц и способы их
взаимодействия. Число субъединиц в молеку-
ле, как правило, четное, — обычно 2, 4, 6 или 8,
но иногда достигает 16 или даже 24. У некото-
рых белков молекула построена из совершенно
одинаковых субъединиц, у других — из разных
протомеров. Белки, молекула которых по-
строена из нескольких полипептидных цепей,
называют для краткости олигомерными.
Решающую роль в объединении субъеди-
ниц играет пространственное соответствие со-
прикасающихся поверхностей. Оно обозначает-
ся термином комплементарность (взаимодо-
полнение частей целого). Будучи генетически
запрограммированной в структуре субъединиц,
их комплементарность друг другу обеспечивает
и строгую определенность взаимной укладки
протомеров, и фиксацию возникающей четвер-
тичной структуры слабыми типами связи, а ино-
гда - еще и дисульфидными мостиками. По-
рознь субъединицы не обладают функцио-
нальной активностью, свойственной олигомеру.
В этом - коренное отличие четвертичной струк-
туры от простой ассоциации белковых молекул,
которая тоже встречается нередко и носит
обычно неспецифический характер.
Глобулярные и фибриллярные белки на-
столько различаются по особенностям третич-
ной и четвертичной структур (да и в функцио-
нальном отношении тоже), что можно говорить
о двух типах пространственной организации
белка, точнее - высших структур белковой мо-
лекулы. Их целесообразно рассмотреть по-
отдельности.
1.6. ВЫСШИЕ СТРУКТУРЫ
ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ
К глобулярным относится большинство
белков. Только в первом приближении их
можно называть шарообразными. На самом
деле поверхность белковых молекул не бывает
ровной и гладкой. Обычным является наличие
более или менее обширных выступов, значи-
тельно видоизменяющих равномерную округ-
лость молекулы. Часто наблюдаются также
различные углубления, впадины («щели»,
«ниши», «карманы»), что ограничивает доступ
внешних объектов к этим зонам и имеет, как
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
29
правило, важное функциональное значение.
Тем не менее, общие контуры молекулы тако-
вы, что ее размеры в разных направлениях раз-
личаются не очень сильно, - обычно не более
чем в несколько раз. Это возможно лишь при
наличии многочисленных изгибов полипеп-
тидной цепи, ход которой в пространстве вы-
глядит поэтому сложным и запутанным; неред-
ко встречаются p-повороты (см. рис. 1-12).
При всей сложности пространственной ор-
ганизации глобулярного белка, его третичная
структура не сводится только к варианту хао-
тичного клубка. Обычно «стержень» полипеп-
тидной цепи формирует короткие отрезки
а-спирали (как правило, не более нескольких
витков) и р-складчатые структуры примерно
такой же протяженности. Концы этих жестких
фрагментов (их «торцы») соединяются не-
регулярными участками единой полипептид-
ной цепи. Благодаря своим изгибам и поворо-
там вспять, эти нерегулярные участки обеспе-
чивают плотную укладку спирализованных и
складчатых фрагментов в округлую форму
глобулярного белка.
1.6.1. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
МИОГЛОБИНА
Расшифровка трехмерной конфигурации
белковых молекул стала возможной благодаря
разработке метода рентгеноструктурного ана-
лиза кристаллов белка. Первым белком, тре-
тичная структура которого была выяснена, ока-
зался миоглобин (рис. 1-20). Он состоит из
С-конец
1
Рис. 1-20. Схема третичной структуры миоглобина.
одной полипептидной цепи, уложенной на-
столько компактно, что внутри образовавшейся
глобулы почти нет «пустот». Почти 80% ами-
нокислотных остатков (118 из 153) участвуют в
формировании 8 а-спирализованных участков
протяженностью от 7 до 24 звеньев каждый.
Остальные 35 аминокислотных остатков обра-
зуют короткие отрезки нерегулярной струк-
туры между концами последовательных спира-
лей. Спирализованные фрагменты уложены
под разными углами друг к другу в трехмерном
пространстве, так что в целом размеры молеку-
лы составляют 4,5x3,5x2,5 нм (если бы вся
цепь была вытянута в виде а-спирали, то ее
длина составила бы 23 нм).
Важно отметить, что на поверхность гло-
булы миоглобина выступают в основном по-
лярные радикалы аминокислот, обеспечивая
гидрофильные свойства всей молекулы в це-
лом. Глубинные же участки заполнены почти
исключительно неполярными радикалами лей-
цина, валина, метионина, фенилаланина и не
содержат заряженных группировок, а также
аспарагина и глутамина. Такое сочетание гид-
рофильной «внешности» макромолекулы с
гидрофобной сущностью спрятанных в глубине
структур очень типично для глобулярных бел-
ков. В этом — еще одно проявление упоминав-
шейся выше даойственности, столь характерной
для молекул живых систем. В обычных услови-
ях глобулярные белки очень хорошо раствори-
мы в воде и ведут себя как вполне гидрофиль-
ные частицы. Однако определенные воздействия
способны нарушать их третичную структуру, и
тогда неполярные радикалы могут выступить на
поверхность, резко изменяя свойства белка, в
том числе — его растворимость.
Удаленные от окружающей воды непо-
лярные радикалы аминокислот не только уча-
ствуют в фиксации индивидуальных черт тре-
тичной структуры. Нередко они важны и для
функционирования белка. Это относится и к
миоглобину, главным предназначением кото-
рого является обратимое связывание О2 с це-
лью его накопления в клетках (наиболее богаты
этим белком мышцы китов, тюленей и дру-
гих млекопитающих, способных долго нахо-
диться под водой). Происходит это связывание
в строго определенном участке поверхности
белка. Здесь имеется впадина (ниша), выстлан-
30
Глава 1
пая неполярными радикалами. В глубине этой
гидрофобной ниши находится молекула небел-
ковой природы — плоская полициклическая
структура гема, в центре которой расположен
атом Fe2+. Четырьмя связями он соединен с
азотом каждого из пиррольных колец гема
(рис. 1-26), а пятой — с азотом гистидинового
радикала полипептидной цепи. Таким образом,
одна из 6 координационных сфер атома железа
остается свободной, и обращена она ко входу в
нишу. Именно в этом месте к Fe2+ обратимо
присоединяется О2- Из-за тесноты ниши моле-
кула кислорода может приблизиться к гему
только одним своим концом и потому неспо-
собна окислять Fe2+ до Fe3+. Воде, содейст-
вующей такому окислению, нет доступа в ни-
шу из-за гидрофобности ее стенок. Отсюда —
устойчивость восстановленного состояния же-
леза миоглобина даже при высоком содержа-
нии кислорода в окружающей жидкости.
1.6.2. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
ГЕМОГЛОБИНА
Многие глобулярные белки обладают чет-
вертичной структурой. При этом каждая субъ-
единица сохраняет основные черты своей тре-
тичной структуры. Соединяются они между
собой слабыми связями, а иногда — и дисуль-
фидными. Как правило, сохраняется и глобу-
лярный характер укрупненной молекулы, т.е.,
ее шарообразная или эллипсоидная форма.
В качестве примера может служить гемогло-
бин. Его молекула построена из четырех субъ-
единиц. Каждая из них очень напоминает мо-
лекулу миоглобина и по характеру третичной
структуры, и по наличию в ней железосодер-
жащего гема. Вместе с тем, есть и существен-
ные различия в первичной структуре. В соот-
ветствии с ними, разные варианты субъединиц
обозначают буквами греческого алфавита а, р,
у и т.д. У взрослого человека гемоглобин эрит-
роцитов представлен почти исключительно
гемоглобином A] (HbAi), который состоит из
двух a-цепей и двух P-цепей. Характер взаим-
ной комплементарности обеспечивает укладку
4 субъединиц относительно друг друга таким
образом, что их центры находятся приблизи-
тельно в вершинах тетраэдра. В целом образу-
ется сферическая структура диаметром около
5,5 нм. При этом между а- и p-цепями возника-
ет множество нековалентных связей. Четыре
гема расположены на расстояниях около 2,5 нм
друг от друга. Как и в миоглобине, железо гема
способно обратимо связывать молекулу О2
(степень окисления железа не изменяется!).
Однако из-за особенностей четвертичной
структуры гемоглобина его сродство к кисло-
роду гораздо меньше, чем у миоглобина. Ины-
ми словами, доступность железа кислороду у
гемоглобина хуже, чем у миоглобина. Поэтому
молекулы О2, присоединившиеся к гемоглоби-
ну при прохождении кровью капилляров лег-
ких (где кислорода много), легко переходят от
гемоглобина к миоглобину, когда кровь прохо-
дит по капиллярам мышц.
Но самое примечательное заключается не
в этом, а в способности субъединиц гемогло-
бина функционировать кооперативно. Коопе-
ративность проявляется в том, что присоеди-
нение кислорода к одной субъединице гемо-
глобина сильно облегчает его связывание с
другими. В цифрах это выглядит так: в резуль-
тате присоединения первой молекулы О2 срод-
ство остальных субъединиц к кислороду воз-
растает в 500 раз! В данном случае имеет место
положительная кооперативность. Она проявля-
ется сигмоидным характером зависимости сте-
пени оксигенации гемоглобина от концентра-
ции кислорода (от его парциального давления в
среде). Миоглобин, не имеющий четвертичной
структуры, этого качества лишен, как это вид-
но на рис. 1-21.
Приведенный пример свидетельствует, что
субъединицы олигомерного белка способны
сильно влиять на функциональные свойства
друг друга. В этом и заключается кооператив-
ное взаимодействие. Оно присуше только оли-
гомерным белкам: изменения конформации
одной цепи, вызванные связыванием подходя-
щей молекулы, однозначно отражаются на
конформационном состоянии других субъеди-
ниц. Эта закономерность распространяется и
на обратный процесс. Так, в случае полностью
оксигенированного гемоглобина потеря одной
молекулы кислорода при снижении рО2 сильно
облегчает отдачу второй и третьей. Кооператив-
тивность проявляется значительным увеличе-
нием наклона в средней части кривой оксиге-
нации гемоглобина (рис. 1-21, Б), которое по-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
31
Парциальное давление Ог, мм рт.ст.
Рис. 1-21. Зависимость степени оксигенации
миоглобина (А) и гемоглобина (Б) от парциального
давления кислорода (рОг) в окружающем растворе.
называет, что в этом диапазоне резко усилива-
ется присоединение (отдача) кислорода гемо-
глобином в расчете на единицу изменения рО2-
Вследствие этого гемоглобин, почти полно-
стью насыщаясь кислородом в легких (где рО2
составляет около 100 мм рт. ст.), способен от-
давать его в других тканях тем интенсивнее,
чем больше они его расходуют. Лишь четверть
своего кислорода отдает оксигемоглобин при
снижении рО2 наполовину (точнее, до уровня в
40 мм рт. ст., обычного для почти всех тканей),
тогда как дальнейшее уменьшение рО2 всего на
30 мм рт.ст. (типичное для интенсивно рабо-
тающей мышцы) освобождает еще М50% ки-
слорода, заключенного в оксигемоглобине!
Сравнение кислородсвязывающих белков -
миоглобина и гемоглобина — показывает, что
четвертичная структура придает белку новые
функции, не свойственные его субъединицам. В
случае гемоглобина это, прежде всего, транс-
порт кислорода от легких к тканям, — функция,
которую не могут выполнять ни его субъедини-
цы порознь, ни аналогичный им миоглобин (из-
за его слишком высокого сродства к кислороду).
Кроме того, гемоглобин очень чувствителен к
различным влияниям среды. В частности, даже
небольшое (не выходящее за физиологические
пределы) снижение pH или увеличение концен-
трации СО2 сдвигает кривую оксигенации гемо-
глобина вправо, т.е., уменьшает сродство к ки-
слороду, облегчая тем самым его отдачу тканям.
Таким образом, благодаря феномену коо-
перативности олигомерный белок гораздо чув-
ствительнее к внешним влияниям и эффектив-
нее реагирует на них. Обладание четвертичной
структурой усиливает регуляторные возможно-
сти глобулярных белков, повышая их роль в
регуляции и биохимических процессов (моле-
кулярный уровень), и физиологических функ-
ций (на уровне клеток, тканей и всего организ-
ма в целом).
1.7. ВЫСШИЕ СТРУКТУРЫ
ФИБРИЛЛЯРНЫХ БЕЛКОВ
Фибриллярными называют белки, длина
молекулы которых в десятки и сотни раз боль-
ше поперечных размеров. Сильно вытянутая
форма, очевидно, не может поддерживаться за
счет связей внутри полипептидной цепи, как
это имеет место при формировании а-спирали
(продольные водородные связи) или нерегу-
лярной пепи (слабые типы связей и дисуль-
фидные мостики между достаточно сближен-
ными участками изгибающейся полипептидной
цепи). Отсюда ясно, что нитевидная форма фи-
бриллярных белков может удерживаться толь-
ко посредством поперечных связей с соседни-
ми полипептидами, тоже вытянутыми. Следо-
вательно, в фибриллярных белках третичная
структура приобретает устойчивость лишь бла-
годаря наличию четвертичной структуры. Чаще
всего такие белки являются объединениями
коллагеновых спиралей (коллагены), протяжен-
ных а-спиралей (кератины, тропомиозин) или
р-складчатых полипептидных цепей (фиброин).
Коллагены - семейство белков, фор-
мирующих основу волокнистых структур меж-
клеточного вещества у позвоночных. В сово-
купности они образуют внеклеточный каркас
тела и составляют около 30% от общего коли-
чества белков (примерно 6% всей массы тела
человека). Особенно много их в коже, сухожи-
лиях, хрящевой и костной тканях, в твердых
тканях зуба (кроме эмали).
Структурной единицей коллагеновых во-
локон является молекула тропоколлагена, син-
тезируемого специализированными клетками
соединительной ткани. Она состоит из трех
очень сходных (или даже одинаковых) поли-
пептидных цепей, издавна обозначаемых как
32
Глава 1
a-цепи. Их первичная структура характеризу-
ется многократным повторением тримера
...-гли-про-Х-... почти по всей длине молекулы,
которая может достигать 300 нм. Поэтому, в
отличие от а-спирали (и несмотря на созвучие),
a-цепь складывается в совсем иную спираль -
коллагеновую (см. рис. 1-18, Б). Как отмечено
выше (раздел 1.5.2, Б), удерживается этот ва-
риант вторичной структуры за счет слабых свя-
зей со смежными цепями аналогичного строе-
ния, примыкающих сбоку. Все три левозакру-
ченные коллагеновые спирали, составляющие
молекулу тропоколлагена, имеют параллель-
ную направленность (от N-конпа к С-концу).
Они обвивают друг друга вокруг общей оси,
образуя правозакрученную тройную суперспи-
раль, расстояние между витками которой со-
ставляет 10 нм (рис. 1-22). Вот эта правая за-
крученность коллагеновой спирали с шагом в
10 нм, формируемая в составе суперспирали, и
характеризует третичную структуру каждой от-
дельной a-цепи. И фиксируется она тоже (как и
сама коллагеновая спираль) благодаря наличию
четвертичной структуры.
Толщина суперспирали составляет всего
1,5 нм. Столь высокая плотность укладки обу-
словлена большей растянутостью коллагено-
Рис. 1-22. Тройная суперспираль тропоколлагена
(схема).
вой спирали (в сравнении с а-спиралью),
а главное — изобилием глицина в коллагенах.
Минимальность размеров радикала у этой ами-
нокислоты (состоящего только из атома водо-
рода) и направленность этого радикала к оси
суперспирали позволяет осуществить очень
тесное сближение всех трех субъединиц вдоль
их общей оси. Таким образом, в тесном про-
странстве внутри суперспирали располагаются
только остатки глицина, а кнаружи обращены
громоздкие радикалы остальных аминокислот,
включая пролин, гидроксипролин и лизин.
Плотная скрученность тройной спирали и оби-
лие поперечных связей между субъединицами
делает молекулу тропоколлагена практически
нерастяжимой и очень упругой.
Кератины - это группа внутриклеточных
белков, синтезируемых клетками эпидермиса.
Молекула такого белка тоже состоит из трех
субъединиц. Однако, в отличие от коллагена,
каждая из них являет собой правозакрученную
а-спираль типичного строения, а три таких
спирали закручены влево вокруг общей оси,
образуя суперспирализованную структуру про-
тяженностью порядка 100 нм. Такая суперспи-
ральная укладка каждой единичной а-спирали
может рассматриваться как ее третичная струк-
тура в составе кератина.
Фиксируется четвертичная структура ке-
ратина посредством дисульфидных мостиков
между соседними субъединицами. Этому спо-
собствует обилие радикалов цистеина в иих. Ко-
валентный характер дисульфидных связей и
многократное повторение их по ходу суперспи-
рали делает молекулу кератина очень прочной.
Помимо цистеина каждая а-спираль кера-
тина очень богата такими аминокислотами, как
фенилаланин, валин, аланин, лейцин, метио-
нин. Их неполярные радикалы сосредоточены
на наружной стороне обвивающих друг друга
субъединиц, обеспечивая гидрофобность всей
суперспирали в целом. Поэтому кератин со-
вершенно нерастворим в воде. Очевидно био-
логическое значение этого свойства (как и
прочности), если вспомнить, что молекулы ке-
ратина являются главным (по количеству) ком-
понентом эпидермиса и его производных (во-
лосы, ногти и пр.).
Перечисленные структурные характери-
стики присущи всем а-кератинам. Однако каж-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
33
дый конкретный белок этой группы имеет свои
особенности, проистекающие прежде всего из
специфики аминокислотного состава молеку-
лы. Например, кератины панциря черепахи
особенно богаты цистеином, составляющим
почти 20% всех аминокислотных остатков. По-
этому здесь особенно много межцепочечных
дисульфидных мостиков, что обеспечивает
особую прочность и жесткость панциря. В ке-
ратинах эпидермиса содержание цистеина го-
раздо меньше, но достаточно для крепкого свя-
зывания субъединиц. Скопления кератиновых
молекул образуют нерегулярную сеть пучков,
контактирующих на уровне десмосом с анало-
гичными сетями соседних клеток. По мере со-
зревания и отмирания клеток эпидермиса
остаются только их кератиновые скелеты, ко-
торые и обеспечивают прочность и водонепро-
ницаемость защитного слоя на поверхности
кожи, а также образование тонкой жировой
пленки, придающей коже водоотталкивающие
свойства. Иначе выглядит пространственная
организация кератинов, составляющих основ-
ную массу волоса. Здесь каждая трехжильная
суперспираль кератина (обозначаемая терми-
ном «протофибрилла») толщиной 2 нм плотно
упакована с десятью такими же молекулами в
длинное цилиндрическое образование - мик-
рофибриллу, диаметр которой составляет 8 нм.
Пучок из сотен параллельных микрофибрилл
формирует более толстую нить - макрофиб-
риллу, множество которых уложено по длине
волоса и составляет почти всю его структуру.
Тропомиозин относится к мышечным
белкам. Он отличается от кератинов, во-
первых, почти полным отсутствием цистеина
и, во-вторых, наличием не трех, а только двух
субъединиц в молекуле. Каждая из них по всей
длине полностью сложена в обычную правую
а-спираль. Обе спирали параллельной направ-
ленности обвивают друг друга, формируя лево-
закрученную суперспираль, которая имеет вид
стержня диаметром 2 нм и длиной 40 нм. Су-
перспираль сильно вытянута: расстояние меж-
ду соседними витками составляет 14 нм (в 26
раз больше, чем в а-спирали). Фиксируется
четвертичная структура тропомиозина только
слабыми типами связи; из-за отсутствия ди-
сульфидных мостиков она не столь жесткая,
как в кератинах.
Двухцепочечная суперспираль, аналогич-
ная тропомиозиновой, содержится и в одном из
важнейших сократительных белков мышц -
миозине. Здесь ее длина достигает 134 нм.
Однако суперспирализация не распространяет-
ся на короткую (немногим более 10 нм)
N-концевую часть молекулы миозина. Более
того, каждая из расплетенных нитей этого кон-
ца нековалентно соединена с двумя небольши-
ми (около 20 кДа) пептидами, формируя вме-
сте с ними глобулярное образование. Таким
образом, четвертичная структура миозина фик-
сирует необычную форму молекулы, в которой
длинная нить («хвост») сочетается с двумя не-
большими глобулярными головками на одном
ее конце. Необычное строение открывает уни-
кальную возможность совмещения в одной мо-
лекуле совершенно разных функций, — в дан-
ном случае структурной и каталитической.
Фибриллярная часть обеспечивает объедине-
ние множества молекул миозина в особые
внутриклеточные структуры, — так называемые
толстые нити мышечного волокна. А глобуляр-
ная головка является ферментом, катализирую-
щим гидролиз молекулы АТФ до АДФ и фосфа-
та. При этом энергия разрыва макроэргической
связи в молекуле АТФ прямо трансформируется
в механическую энергию мышечного сокраще-
ния. В этой трансформации участвуют и другие
мышечные белки (тропомиозин и два глобуляр-
ных белка - актин и тропонин).
Фиброин - это белок, из которого по-
строены нити шелка и паутины. Каждая его
субъединица организована как P-слой, склад-
чатая форма которого фиксируется водород-
ными связями с соседними такими же цепями
(см. рис. 1-19). Вся молекула фиброина почти
целиком состоит из «штабелей» р-складчатых
полипептидов, имеющих преимущественно ан-
типараллельную направленность. Расстояние
между соседними цепями составляет 0,27 нм
(т.е., длину водородной связи >С=О H-N<).
Столь плотная укладка требует, чтобы боковые
радикалы R в каждой цепи имели не слишком
крупные размеры. Так оно и есть: молекула
фиброина на 50% состоит из глицина, а среди
остальных аминокислот цепи сильно преобла-
дают аланин и серин: цистеин и метионин от-
сутствуют полностью. В первичной структуре
каждой субъединицы регулярно повторяется
34
Глава 1
последовательность ...-гли-сер-гли-ала-гли~
ала-..., причем, остатки глицина выступают с
одной стороны складчатого листа, а радикалы
аланина и серина - с другой. Гидрофобным
характером обращенных кнаружи аминокис-
лотных радикалов обеспечивается нераствори-
мость нитей шелка и паутины в воде. Вместе с
тем, минимальность размеров большинства
радикалов R придает этим нитям довольно вы-
сокую гибкость. Наконец, максимальная рас-
тянутость остова полипептидной цепи, свойст-
венная p-слоям, делает нити шелка и паутины
нерастяжимыми.
Таким образом, во всех фибриллярных
белках именно четвертичная структура обеспе-
чивает саму возможность формирования тре-
тичной структуры своих субъединиц, а иногда
необходима и для фиксации их вторичной
структуры (коллагеновая спираль).
1.8. КОНФОРМАЦИЯ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ
В органической химии широко использу-
ется понятие о конфигурации молекул. Ее
можно определить как пространственное взаи-
морасположение отдельных частей молекулы,
жестко закрепленное ковалентными связями.
В частности, если при атоме углерода имеются
4 различающихся радикала, то взаимное их
расположение в пространстве может иметь
лишь два разных варианта, каждый из которых
является зеркальным отражением другого. Они
не могут переходить друг в друга самопроиз-
вольно, т.к. для этого необходим разрыв одних
ковалентных связей и формирование новых.
Будучи совершенно идентичными по химиче-
ским свойствам, стереоизомеры сходны и по
большинству физико-химических параметров.
Но они могут быть едва ли не антиподами по
своим биологическим качествам.
В отличие от конфигурации, конформация
- это вполне определенное, но не неизменное
(не зафиксированное ковалентно) простран-
ственное взаиморасположение различных
частей молекулы. Четкое понимание этого
особенно важно применительно к белкам. Как
уже отмечалось, две из каждых трех подряд
ковалентных связей в стержне полипептидной
цепи допускают осевое вращение. Это реально
может происходить в нерегулярных участках
цепи. Поэтому любой полипептид теоретиче-
ски может принимать самую различную фор-
му. Ограничений, в общем-то, немного. Во-
первых, при любых изгибах какая-то часть мо-
лекулы не может совмещаться в пространстве с
другой частью («натыкаться» на нее). Во-
вторых, возникновение слабых типов связи
между достаточно сблизившимися частями по-
липептидной цепи будет способствовать фик-
сации всей цепи в соответствующей форме.
Естественно, более устойчивой будет такая
конформация, которая закрепляется наиболь-
шим числом слабых взаимодействий. В соот-
ветствии с конкретным окружением, сущест-
вующим в клетке, полипептидная цепь по мере
ее биосинтеза принимает энергетически наибо-
лее выгодную конформацию, - ту, которая
обеспечивается максимально возможным чис-
лом нековалентных связей (а иногда - и ди-
сульфидных мостиков) при наиболее «удоб-
ной» для этого укладке стержня полипептид-
ной цепи. В другой среде оптимальной может
оказаться иная конформация. Но даже в диапа-
зоне физиологических условий взаимораспо-
ложение частей белковой молекулы может за-
метно варьировать, - уже хотя бы в силу теп-
лового движения. Эта «колеблемость» затраги-
вает преимущественно четвертичную и в ка-
кой-то степени третичную структуру. Подвиж-
ки в конформационном состоянии белка могут
быть вызваны локальными колебаниями pH,
ионной силы и других факторов, влияющих на
слабые типы связи, как это описано в разделе
1.4.3.
Обобщая, можно сказать, что в физиоло-
гических условиях белковая молекула сущест-
вует в нескольких, энергетически наиболее
предпочтительных конформационных состоя-
ниях, между которыми поддерживается дина-
мическое равновесие. Даже очень небольшие
изменения состава среды способны вызвать
определенный сдвиг этого равновесия в сторо-
ну одной из естественных конформаций, при-
чем этот сдвиг легко обратим. Именно обрати-
мые переходы из одного конформационного
состояния в другое составляют механизм
функционирования белковой молекулы (и ши-
ре - молекулярную основу любой физиологи-
ческой функции организма).
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
35
1.9. УЗНАВАНИЕ И РЕАГИРОВАНИЕ -
ДВЕ ГЕНЕРАЛЬНЫЕ ФУНКЦИИ
БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ
Из предыдущего изложения следует, что не
только рельеф, но физико-химические свойства
поверхности белковой молекулы очень нерав-
номерны. Обычно здесь доминируют полярные
радикалы аминокислот, в большинстве своем
незаряженные. Вместе с тем, на общем фоне
гидрофильной поверхности местами встречают-
ся положительно или отрицательно заряженные
группы, а в некоторых участках (особенно в уг-
лублениях) — неполярные фрагменты или их
скопления. В этом смысле глобулярный белок
напоминает округлое образование, причудливо
раскрашенное четырьмя красками, каждая из
которых, условно говоря, соответствует катион-
ным или анионным группам, гидрофильным или
гидрофобным зонам. Ясно, что белки могут раз-
личаться по размерам, форме и взаиморасполо-
жению «пятен» разного цвета.
Эта важная особенность лежит в основе
избирательности физико-химического взаи-
модействия белка с другими молекулами.
Иными словами, она обеспечивает одну из
наиболее универсальных функций любого бел-
ка: его способность распознавать другие мо-
лекулы. Реализуется эта способность путем
связывания лишь со строго определенными из
них (именуемыми поэтому лигандами данного
белка).
Пояснить это можно так. Любая отрица-
тельно заряженная молекула, оказавшись в
достаточной близости, может образовать ион-
ную связь с одной из положительно заряжен-
ных группировок огромной поверхности белка.
Это взаимодействие очень слабое и легко исче-
зает даже под влиянием кинетической энергии
теплового движения молекул. Кроме того, оно
неспецифично, так как в белке обычно имеется
множество положительно заряженных атомов, а
в окружающей среде встречаются самые разно-
образные вещества с отрицательным зарядом.
Но если в приблизившейся молекуле есть две
заряженные группировки с расстоянием между
ними, равным дистанции между двумя противо-
положными им зарядами на поверхности белка,
то межмолекулярное взаимодействие может
осуществляться уже в двух точках. Поэтому оно
будет и более устойчивым (хотя и ненамного), и
несколько более специфичным. Если же в ли-
ганде окажется еще и, например, гидрофобный
фрагмент в определенном положении относи-
тельно заряженных групп, а в белке - неполяр-
ная зона в аналогичной позиции к заряженным
участкам, то молекула лиганда может связаться
с белком уже тремя своими участками. Такое
соединение будет существенно более устойчи-
вым (но обратимым, как это следует из слабо-
сти нековалентных связей). А главное - оно
приобретает отчетливый характер избиратель-
ности: белок может объединяться только с та-
ким лигандом, в котором взаиморасположение
«опознаваемых» признаков достаточно строго
соответствует рисунку физико-химических ха-
рактеристик в некоторой зоне белковой поверх-
ности. Эту зону называют участком связывания
(сорбции). Он-то и выполняет функцию узна-
вания определенного лиганда. В основе этой ге-
неральной функции - пространственное соот-
ветствие между объединяющимися структура-
ми, их комплементарность (рис. 1-23).
Ясно, что для реализации функции узнава-
ния необходимо достаточное число «опознава-
тельных знаков». Выше упоминалось, что по
качеству их всего четыре: положительный или
отрицательный заряд, гидрофильные или гид-
рофобные «пятна». Для большей точности сле-
2. взаимодействие сильное, специфическое
Рис. 1-23. Соответствие лиганда структуре участка
его связывания (узнавания):
гидрофобные зоны; | | - гидрофильные
зоны (незаряженные); Ф - положительно заряженные
зоны; Q- отрицательно заряженные зоны.
36
Глава 1
дует добавить еще электроотрицательные ато-
мы (О, N), пригодные для образования водо-
родной связи (см. рис. 1-15). Но важнее даже не
разнообразие набора «маяков» (впрочем, до-
вольно небогатого), а изобилие возможных ва-
риантов их взаимного расположения. Чем об-
ширнее зона комплементарности и чем уни-
кальнее рисунок из разных «опознаваемых
признаков», тем точнее узнавание белком
именно данного лиганда. В качестве аналогии:
знакомое лицо мы легко распознаем даже сре-
ди множества похожих людей (но если часть
лица прикрыта, то узнавание затруднено или
даже невозможно).
Участки, наиболее точно приспособленные
к структуре определенного лиганда, обладают
и наибольшей избирательностью, т.е., правиль-
ностью опознания нужной молекулы. Их назы-
вают поэтому центрами связывания (узнава-
ния). В ходе эволюции природа специально от-
бирала и «шлифовала» такие структуры. Так
появились, например, рецепторы на клеточных
мембранах. Каждый тип рецепторов представля-
ет собой специализированный белок, который из
всего разнообразия окружающих клетку ве-
ществ узнает (и связывает) только молекулы
определенного, например, гормона.
Как правило, в белковой макромолекуле
имеется только один центр узнавания либо не-
сколько, но разных. С другой стороны, такие
центры занимают лишь очень небольшую долю
поверхности белка. Остальной части тоже при-
сущи и особенности рельефа, и причудливое
чередование функциональных группировок.
Выяснив тонкую структуру любого фрагмента,
в принципе возможно синтезировать молекулу,
комплементарную ему и потому способную
сорбироваться здесь. И тогда этот фрагмент
можно назвать участком связывания искусст-
венно синтезированного лиганда.
Детальное изучение функции узнавания
выявило неожиданный факт: между центром
узнавания и лигандом обычно не бывает зара-
нее готового пространственного соответствия,
- такого, какое существует, например, между
замком и ключом к нему. Парадокс был разре-
шен. когда установили, что обычно центр свя-
зывания сформирован радикалами аминокислот,
расположенных в разных участках полипептид-
ной цепи, но пространственно сближенных ме-
жду собой за счет изгибов этой цепи. Стало по-
нятным, что такая организация не случайна. Она
открывает возможность заметных конфор-
мационных подвижек упомянутых радикалов
относительно друг друга, ибо угол каждого из-
гиба (поворота) цепи может изменяться в замет-
ных пределах.
Таким образом, достаточно точное соот-
ветствие центра связывания строению лиганда
формируется лишь в процессе взаимодействия
между ними. Складывается оно по мере их
сближения и реализуется путем постепенного
приспособления центра узнавания к структур-
ным особенностям лиганда. Как показывает
схема на рис. 1-24, в процессе сближения моле-
кула лиганда индуцирует соответствующую
конформационную перестройку центра своего
связывания. Представления о наведенном (инду-
цированном) соответствии подтверждены экс-
периментально и стали общепризнанными. Сле-
дует отметить, что при этом и молекула лиганда
в определенных случаях тоже претерпевает
конформационные изменения (если она на это
способна). Некоторой аналогией феномену на-
веденного соответствия может быть, например,
процедура надевания перчатки: двигая пальца-
ми, мы постепенно натягиваем ее на руку, при-
давая ей форму нашей кисти.
Рис. 1-24. Индуцированное соответствие центра
связывания в белке (Б) структуре лиганда (Л)
[черными прямоугольниками обозначены
гидрофобные зоны].
Пространственные сдвиги в центре узна-
вания — это необходимая, но не единственная
реакция белка на сближение с лигандом. Ока-
залось, что конформационные подвижки рас-
пространяются и на другие части белковой мо-
лекулы. В каждом случае характер такой пере-
стройки различен, но всегда строго закономе-
рен. Его предсказуемость предопределена
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
37
структурами лиганда и центра узнавания, но
главное - особенностями строения всей белко-
вой молекулы. Очень часто изменение конфор-
мации сопровождается «деблокированием» оп-
ределенных фрагментов белка, т.е., переходом
их из скрытого («латентного») состояния в ак-
тивную форму, которая начинает реализацию
своего предназначения. Именно в этом заключа-
ется вторая из генеральных функций белковых
молекул - функция реагирования. Лиганд, свя-
зывание которого приводит к ее осуществле-
нию, часто обозначают термином эффектор.
Таким образом, природа функции реаги-
рования - физико-химический процесс перехо-
да белковой молекулы из одной конформации
в другую. Важно, однако, подчеркнуть строгую
детерминированность ответа: белковая моле-
кула не может (и не должна!) по-разному реа-
гировать на один и тот же внешний сигнал-
команду. И еще один важный аспект — это об-
ратимость процесса реагирования: после де-
сорбции лиганда белок возвращается в исход-
ное состояние и готов к связыванию новой мо-
лекулы эффектора.
В качестве примера можно привести кле-
точные рецепторы. Каждый из них является
белком, пронизывающим плазматическую
мембрану. Внешняя его часть, выступающая на
поверхность клетки, выполняет собственно
рецепторную функцию. Это значит, что она
содержит центр узнавания определенного ве-
щества, — например, гормона. Обратимое свя-
зывание этого лиганда вызывает такую кон-
формационную перестройку, которая охваты-
вает не только трансмембранную часть белка,
но и внутриклеточный фрагмент, переводя его
в функционально активное состояние. Нередко
эта активность сводится к ускорению опреде-
ленной химической реакции, продукт которой
{вторичный посредник) инициирует дальней-
шую цепочку внутриклеточных последствий,
т.е., обеспечивает реакцию клетки на воздейст-
вие гормона (первичного посредника). Таким
образом, происходит не только передача гормо-
нального сигнала в клетку, но и его преобразо-
вание (трансдукция). Прекращение воздействия
гормона (его удаление или разрушение) приво-
дит к возвращению рецептора в исходную фор-
му, в том числе - к переходу внутриклеточного
фрагмента в неактивную конформацию.
Итак, в основе функций и узнавания, и
реагирования лежат физико-химические взаи-
модействия, которые ведут к определенной
конформационной перестройке макромолеку-
лы. В этом смысле они являются наиболее об-
щими, универсальными функциями, присущи-
ми каждому белку (хотя и в различной степе-
ни). Поэтому их удобно называть генеральны-
ми функциями белковой молекулы. Конкрет-
ные проявления функции реагирования вообще
очень многообразны, но они строго однознач-
ны, жестко регламентированы для каждого
данного белка. У фермента это - ускорение
химических превращений определенного ве-
щества (субстрата), у иммуноглобулинов - ко-
манда на уничтожение конкретного чужерод-
ного вещества, у клеточных рецепторов - пе-
редача внешнего сигнала внутрь клетки, у фо-
торецептора - преобразование энергии фотона
в энергию нервного импульса, у сократитель-
ных белков - укорочение либо расслабление
мышечного волокна, и так далее. Все эти кон-
кретные ответы называют обычно биологиче-
скими функциями соответствующих белков.
1.10. НАТИВНОСТЬ БЕЛКА
И ЕГО ДЕНАТУРАЦИЯ
Нативность - это тот уникальный
комплекс физических, физико-химических и
биологических свойств, который присущ бел-
ковой молекуле в ее естественном, природном
(нативном) состоянии. Например, для белков
хрусталика глаза (кристаллинов) понятие на-
тивности включает высокую прозрачность об-
разуемых ими структур.
Денатурация - это необратимая ут-
рата белком его нативных свойств. В основе
ее лежит грубое и необратимое изменение чет-
вертичной, третичной, а иногда и вторичной
структуры. Важно подчеркнуть: первичная
структура при этом остается неизменной. Дру-
гими словами, химически белковая молекула
остается прежней. Но пространственная органи-
зация ее нарушена настолько, что резко изме-
няются многие физико-химические свойства, а
главное - полностью утрачиваются биологиче-
ские качества. Например, сильно прогретые
зерна не могут прорасти, сваренное яйцо тоже
бесполезно класть в инкубатор, а яичный белок
38
Глава 1
при этом из прозрачной тягучей жидкости пре-
вращается в плотную белую массу. Хотя хими-
ческий состав остается прежним, включая со-
хранность первичной структуры всех белков
(при разрыве хотя бы одной пептидной связи
белковая молекула исчезает, превращаясь в две
другие, а это уже выходит за рамки понятия
«денатурация»).
Здесь необходимо одно уточнение. Оно
связано с тем, что денатурация - это не одномо-
ментный «перескок» из нативной формы белка в
денатурированную- Обычно она представляет
собой более или менее плавный переход из од-
ного состояния в другое. Начальные стадии та-
кого процесса могут быть обратимыми. Если на
этих стадиях прекратить денатурирующее воз-
действие, то молекула белка может самопроиз-
вольно вернуться в нативное состояние. В таких
случаях часто употребляют термин «ренатура-
ция». Удобный из-за своей краткости, этот тер-
мин, тем не менее, не вполне точен, ибо создает
впечатление обратимости полной денатурации.
На самом деле обращение возможно лишь в
случаях незавершенной денатурации, — пока
процесс не перешел грань необратимости изме-
нений высших структур белковой молекулы.
1.11. КОЛЛОИДНОЕ СОСТОЯНИЕ БЕЛКА
Водные растворы некрупных молекул
(глюкоза, аминокислоты и т.п.) обычно про-
зрачны (даже если они имеют окраску, как, на-
пример. растворы перманганата или йода). Та-
кие растворы называют истинными, или опти-
чески пустыми, так как они не рассеивают про-
ходящий через них свет. Если же частицы
(молекулы) растворенного вещества имеют
размеры, сопоставимые с длиной волны види-
мого света, то они мешают беспрепятственно-
му прохождению лучей через раствор, отражая
в стороны часть фотонов. Такой раствор назы-
вается коллоидным- В проходящем свете он
выглядит мутным. Если в затемненной комнате
пропустить солнечный луч через сосуд с кол-
лоидным раствором, то ход луча в нем можно
наблюдать со стороны в виде расширяющегося
конуса (явление Тиндаля). Феномен светорас-
сеяния используют в целях определения кон-
центрации коллоидных частиц в растворе. Для
этого с помощью фотоэлемента регистрируют,
какая доля пропускаемого через коллоидный
раствор света рассеивается в стороны, - на-
пример, в направлении, перпендикулярном хо-
ду луча (метод нефелометрии).
Размеры белковых молекул составляют
чаще всего от 2-5 до 100 нм, а иногда и боль-
ше. Поэтому белки неспособны давать истин-
ных растворов, а могут формировать только
коллоидные. Однако, чтобы эта возможность
стала реальностью, необходимы какие-то фак-
торы, которые удерживали бы белок в колло-
идном состоянии, препятствуя выпадению
столь крупных частиц в осадок.
1.11.1. ФАКТОРЫ СТАБИЛИЗАЦИИ БЕЛКА
В КОЛЛОИДНОМ СОСТОЯНИИ
Среди факторов, способ ньгх препятство-
вать чрезмерному сближению белковых моле-
кул, их «слипанию», наиболее универсальными
являются два: гидратная оболочка и электро-
статический заряд. Оба они обусловлены при-
родными свойствами белков.
Гидратная оболочка представляет со-
бой слой молекул воды, определенным обра-
зом ориентированных вокруг молекулы белка.
Толщина слоя зависит от степени гидрофиль-
ности белковой поверхности. Иными словами,
белки являются- гидрофильными коллоидами.
Вода гидратных оболочек находится в динами-
ческом равновесии с окружающей их свобод-
ной водой. Несмотря на постоянный обмен мо-
лекулами между ними, гидратная оболочка как
таковая существует постоянно. Она как бы
принадлежит белку, а входящая в нее вода об-
ладает особыми свойствами. В частности, она
отличается пониженной температурой замер-
зания, в ней не растворяются соли и другие
хорошо растворимые вещества.
Заряд белковой молекулы проистекает из
ее свойств амфотерного полиэлектролита (см.
раздел 1.2.2). В зависимости от соотношения
ионизируемых групп, изоэлектрическая точка
(pl) у разных белков находится обычно в пре-
делах pH от 4 до 8, но иногда выходит за эти
рамки (табл. 1-2).
Чаще всего преобладают карбоксильные
группы, и поэтому у таких белков pl < 7. К ним
относятся, в частности, белки плазмы крови.
Поскольку pH плазмы обычно составляет при-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
39
Таблица t-2
Изоэлектрическая точка (pl) некоторых белков
Наименование белка Pl
Тропоэластин -13
Салмин - 12
Цитохром с 10.6
Рибонуклеаза 7,В
Миоглобин 7,0
Гемоглобин 6.9
у-Глобулин 6,3
Карбоксипептидаза 6,0
Альбумин плазмы крови 5,6
Фибриноген 5,5
Уреаза 5,1
Яичный альбумин 4,6
Статерин слюны 4,2
Дентинный фосфофорин 1.1
Пепсин < 1
мерно 7,36 (т.е., выше, чем pl этих белков), то в
каждой белковой молекуле число отрицатель-
ных зарядов весомо преобладает над числом
положительно заряженных групп. Следова-
тельно, в целом белковая молекула ведет себя
как отрицательно заряженная частица. Одно-
именные заряды, как известно, взаимно оттал-
киваются. Это препятствует слиянию белковых
частиц и тем самым способствует поддержа-
нию коллоидного состояния. При подведении
pH среды к значению pl растворенного белка
устойчивость коллоидного раствора станет ми-
нимальной и будет определяться только степе-
нью выраженности гидратной оболочки. Если
же каким-либо воздействием удалить еще и
гидратную оболочку, то произойдет осаждение
белка из коллоидного раствора.
1.11.2. СПОСОБЫ НЕОБРАТИМОГО
ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКА
Необратимое осаждение белка всегда яв-
ляется следствием его денатурации. Наиболее
распространенным способом денатурации яв-
ляется нагревание (кипячение). При этом уси-
ливается тепловое движение молекул, в том
числе - подвижность отдельных частей белка
относительно друг друга. Происходящее ослаб-
ление и даже разрыв слабых типов связей при-
водит к увеличению масштабов этих сдвигов. В
результате нарушаются высшие структуры бел-
ка - четвертичная, третичная и даже вторичная.
Легче всего это происходит с глобулярными
белками. Полипептидная цепь теряет свою упо-
рядоченность, ее клубок разворачивается. Как
следствие, на поверхность начинают выступать
и гидрофобные структуры, ранее «замаскиро-
ванные» в глубине молекулы. Это ведет к тому,
что белковая молекула теряет свою безусловную
гидрофильность и лишается гидратной оболоч-
ки. Поскольку нагревают белковый раствор
обычно вблизи изоэлектрической точки, то и
заряд белковой молекулы при этом отсутствует
или не очень значителен. В отсутствие обоих
факторов стабилизации белковые молекулы мо-
гут сближаться друг с другом, формируя круп-
ные конгломераты (хлопья), видимые глазом.
Их образованию способствует и неупорядочен-
ное, хаотичное замыкание слабых типов связи,
уже не только внутри молекулы, но и между
развернутыми полипептидными цепями. Поя-
вившиеся хлопья укрупняются и оседают, осо-
бенно при последующем охлаждении раствора.
Достаточное прогревание растворов белка
всегда ведет к денатурации. Однако осадок об-
разуется не всегда. Если нагревание проводить
в щелочной или в сильно кислой среде, то бе-
лок все равно денатурируется и утрачивает
гидратную облочку, но сохраняет свой заряд
(очень значительный в среде, далекой от pl).
Поэтому выпадения белка в осадок не проис-
ходит даже после охлаждения раствора. Но это
будет уже коллоидный раствор денатуриро-
ванного белка, стабилизированный только
электрическим зарядом каждой частицы. Убе-
диться в этом легко: при добавлении к охлаж-
денному раствору соответственно кислоты или
щелочи наступает образование осадка, усили-
вающееся по мере приближения pH раствора к
pl растворенного белка.
Устойчивость к нагреванию очень различ-
на у разных белков. Некоторые из них денату-
рируются уже при 50-60°С, другие — только
при более высокой температуре (например, при
80°С), а есть и такие, которые устойчивы даже
в кипятке. Все зависит от стабильности внут-
римолекулярной организации белка, особенно
от плотности его пространственной упаковки,
характера и обилия нековалентных связей. Эти
различия иногда используют в эксперимен-
тальной практике. Например, при 56°С в тече-
ние 30 мин полностью денатурируется компо-
40
Глава 1
нент Clq - один из белков системы компле-
мента, сосредоточенных в плазме крови и иг-
рающих незаменимую роль в механизмах им-
мунохимической защиты организма. Два дру-
гих белка этой системы — фактор В и компо-
нент С2 - денатурируются и тоже полностью
теряют биологическую активность в результате
20-мин. прогревания при 50°С. Прогрев сыво-
ротку крови в том или ином режиме, можно
получить реагент, лишенный нативной формы
соответствующего компонента комлемента и
не способный осуществлять иммунный лизис
клеток. Если к такому реагенту добавить пор-
цию интересующей исследователя сыворотки,
то литическая активность вновь станет прояв-
ляться. По количеству исследуемой сыворотки,
необходимому для этого, можно судить о со-
держании в ней того компонента, активность
которого отсутствует в использованном реа-
генте. Описанный способ широко применяется
в биохимии и иммунологии: несмотря на тех-
нические трудности, он несравненно проще и
доступнее любого другого метода количест-
венного определения индивидуального белка в
столь сложной белковой смеси, каковой явля-
ется любой биологический объект.
Дифференцированная денатурация белков
прогреваниием используется и в одном из
способов консервирования пищевых продуктов
- пастеризации. Предложенный Л.Пастером,
он заключается в кратковременном (15-30 мин)
выдерживании, например, молока при темпе-
ратуре 60-70°С. В таких условиях главный бе-
лок молока (казеиноген) сохраняет свою на-
тивность, тогда как некоторые белки микробов
денатурируются, что препятствует размноже-
нию микрофлоры и удлиняет сроки сохранно-
сти пищевого продукта (в стерильных, разуме-
ется, условиях).
Помимо тепловой обработки, известны и
другие способы необратимого осаждения бел-
ка. Нередко они сопряжены с химическим пре-
образованием белковых молекул, что уже вы-
ходит за рамки понятия «денатурация». Обыч-
но речь идет о сильно действующих реагентах:
крепкие растворы серной и других сильных
кислот, щелочей, ряда органических веществ
(пикриновая и сульфосалициловая кислоты,
фенол, некоторые алкалоидные реактивы). Од-
нако один из таких способов следует рассмот-
реть подробнее. Это - осаждение белков соля-
ми тяжелых металлов (Hg, Pb, Си и другие).
Они легко образуют прочные связи с некото-
рыми функциональными группами белковых
молекул, особенно с группами -SH. В результа-
те происходит грубая и необратимая деформа-
ция белка — его денатурация. Важно подчерк-
нуть, что эффект наступает даже при очень
низких концентрациях таких солей. Поэтому-
то они и ядовиты. Особенно сулема - хорошо
растворимый хлорид ртути. Острое отравление
ими угрожает самой жизни. При попадании
таких ядов через рот обычное промывание же-
лудка нежелательно, т.к. создает условия для
лучшего их всасывания в пищеварительном
тракте. Лучше всего быстро ввести в желудок
раствор какого-нибудь белка (нативного!): мо-
локо, белок сырого яйца, сыворотку или плаз-
му крови, наконец. Катионы тяжелых металлов
окажутся прочно связанными с белками, после
чего можно промывать желудок. При хрониче-
ском отравлении малыми дозами денатуриро-
ванные белки быстро расщепляются фермента-
ми клеток, а освободившиеся катионы тяжелых
металлов оказывают свое денатурирующее воз-
действие на новые белковые молекулы. И эта
последовательность повторяется снова и снова.
Отсюда - длительная задержка катионов тяже-
лых металлов в организме, трудность их выве-
дения и кумулятивный эффект повторных доз.
1.11.3. СПОСОБЫ ОБРАТИМОГО
ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКА
Обратимость осаждения достигается при-
менением «мягких» воздействий. Обычно ис-
пользуют водоотнимающие средства, - веще-
ства с выраженной гидрофильностью, способ-
ные «притязать» на воду гидратной оболочки.
Если это осуществлять в среде, не очень дале-
кой от pl осаждаемого белка, то удается устра-
нить оба фактора стабилизации коллоидного
состояния и получить осадок, в котором белок
сохраняет свои нативные свойства. В качестве
водоотнимающих средств можно применять,
например, этанол или ацетон. Осаждающее
действие они проявляют в концентрациях,
достаточных для их растворения не только в
свободной воде, но и в воде гидратных оболо-
чек. Образующийся осадок белка следует быст-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
41
ро отделить от надосадочной жидкости. Это не-
обходимо для предотвращения денатурирующе-
го действия органических растворителей: оно
развивается несколько медленнее, чем водоот-
нимающее, и обусловлено их внедрением в гид-
рофобные структуры белковых молекул.
Указанного недостатка органических рас-
творителей лишены способы высаливания бел-
ка. Так называют осаждение его под действием
высоких концентраций нейтральных солей ще-
лочных или щелочноземельных металлов, -
таких как NaCl, Na2SO4 или подобный им
(NH4)^O4. Они очень хорошо растворимы в
воде, но при этом не влияют существенно на
pH среды и, следовательно, на заряд белковых
молекул. В коллоидной системе добавляемые
соли растворяются прежде всего в свободной
воде. Когда концентрация соли в ней становит-
ся достаточно высокой, между белком и солью
начинается конкуренция за обладание водой
гидратных оболочек. Исход этого состязания
зависит, с одной стороны, от степени гидро-
фильности осаждаемого белка и, с другой сто-
роны, от степени гидрофильности и от концен-
трации используемой соли. Чем меньше срод-
ство данной соли к воде, тем более высокая
концентрация ее необходима для осаждения
белка. Например, осаждение глобулинов сыво-
ротки крови происходит при полунасыщении
раствора сульфатом аммония, но лишь при
полном насыщении хлоридом натрия. Альбу-
мины, составляющие (по массе) более полови-
ны всех белков сыворотки, осаждаются лишь
при полном насыщении раствора сульфатом
аммония (и не осаждаются хлоридом натрия).
Это свидетельствует об очень высокой гидро-
фильности альбуминов.
Убедиться в обратимости высаливания
легко. Достаточно уменьшить концентрацию
соли в растворе. Этого можно достичь, напри-
мер, путем диализа или добавлением воды.
Осадок белка при этом вновь перейдет в рас-
твор. А главное - белок сохранит свои натив-
ные свойства, в том числе присущую ему био-
логическую активность (ферментативную, гор-
мональную и т.д.).
Важная особенность высаливания заклю-
чается в том, что по достижении критичной
концентрации соли в осадок переходят «вдруг»
сразу все молекулы соответствующего белка.
Если в растворе содержатся и другие белки (бо-
лее гидрофильные), то они остаются в коллоид-
ном состоянии. Для их осаждения необходимо
повысить концентрацию соли в растворе. Мож-
но осуществить это после отделения предыду-
щего осадка (например, центрифугированием).
Отсюда становится очевидной возможность
дробного осаждения белков. Имеется в виду
осаждение и отделение сначала наименее гид-
рофильных белков, затем все более и более гид-
рофильных. Так можно разделить сложную
смесь белков на ряд порций (фракций). Каждая
из них представляет собой обычно группу инди-
видуальных белков, сходных по выраженности
гидрофильных свойств. Для дальнейшего разде-
ления белков любой из фракций можно исполь-
зовать не гидрофильность, а какое-либо из дру-
гих физико-химических свойств макромолекул.
Одно из ранних применений метода выса-
ливания в медицине - очистка лечебных сыво-
роток (антисывороток). Получают антисыво-
ротку путем иммунизации животных опреде-
ленным инфекционным агентом (например,
дифтерийным токсином). Полученная сыворот-
ка крови иммунизированного животного со-
держит антитела к этому агенту (антигену).
Парентеральное введение ее человеку оказыва-
ет лечебный эффект при соответствующем за-
болевании (в приведенном примере - при диф-
терии). Однако лечебная сыворотка помимо
антител содержит большое количество других
белков. В ответ на эти чужеродные белки у че-
ловека развиваются иммунные реакции, кото-
рые могут обесценить лечебный эффект анти-
сыворотки. Поскольку все антитела содержатся
во фракции глобулинов, то отделение их путем
высаливания хотя бы от альбуминов дает воз-
можность наиболее простого получения очи-
щенной антисыворотки. Позднее было уста-
новлено, что глобулины - это тоже смесь раз-
нородных белков, а антитела сосредоточены
только в сравнительно небольшой фракции у-
глобулинов. Были разработаны более сложные
приемы очистки, которые позволяют получать
именно эту фракцию, наиболее безопасную в
плане побочных эффектов.
Высаливание пригодно не только для раз-
деления белковых смесей. Его применяют и
для осаждения индивидуальных белков, пред-
варительно отделенных от всех других. Опре-
42
Глава 1
деленный режим высаливания очищенного
белка позволяет осадить его из раствора в кри-
сталлической форме, которая свидетельствует
о максимальной степени очистки. К тому же,
именно кристаллы необходимы для проведе-
ния рентгеноструктурного анализа, открывше-
го возможность изучения пространственной
организации белковой молекулы, включая
оценку количественных параметров вторичной
и более высоких структур.
Достижения техники позволили разрабо-
тать еще один способ обратимого осаждения
белков. Он заключается в вымораживании бел-
ковых растворов в условиях вакуума. При этом
осуществляется замораживание раствора, а за-
тем сухое испарение (возгонка) льда. По суще-
ству, это уже не осаждение белка, а его высу-
шивание («лиофильная сушка»). Многие белки
полностью сохраняют при этом свои нативные
свойства. Растворением сухого порошка можно
восстановить его исходное коллоидное состоя-
ние. В сухом виде препараты белка сохраняются
гораздо дольше (особенно, на холоде и при со-
блюдении стерильности). Из-за хорошей рас-
творимости в воде их часто называют лиофили-
зированными препаратами. В таком виде вы-
пускаются теперь различные белковые вещест-
ва, применяемые в медицине (гормоны белко-
вой природы; многие ферментные препараты;
фибриноген и другие белки плазмы крови).
1.12. РАЗДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА БЕЛКОВ
Почти любой биологический объект - от
слюны и плазмы крови до цитозоля и над-
молекулярных структур - представляет собой
сложную, многоликую смесь разнообразных
белков. Все они обладают практически одина-
ковым набором химических свойств. Поэтому
традиционные методы химии (например, хи-
мическая реакция со специфическим реаген-
том) непригодны для выделения и очистки ин-
дивидуального белка. Они позволяют лишь
обнаружить наличие некоторых химических
группировок (аминогруппа, дисульфидная
связь и т.д.), каковые, как оказалось, есть прак-
тически у всех белков. Невозможность получе-
ния достаточно очищенных препаратов разных
белков длительное время сдерживала изучение
их строения и индивидуальных свойств. Про-
блема эта постепенно решалась по мере разви-
тия методов (и соответствующей аппаратуры),
которые позволили использовать даже не-
большие различия в физико-химических и фи-
зических особенностях разных белков. Однако
и до сих пор не существует какого-либо уни-
версального метода, который позволял бы в
один прием получать любой белок в высоко-
очищенном состоянии. Необходимо проводить
разделение и очистку в несколько последова-
тельных этапов. На каждом из них использует-
ся наиболее подходящий из известных методи-
ческих приемов. Принципиальные основы не-
которых из них изложены выше (избиратель-
ная денатурация, дробное фракционирование
высаливанием или путем использования неко-
торых органических растворителей). Осталь-
ные методы можно свести в 3 группы: ультра-
центрифугирование; электрофорез; хромато-
графия.
1.12.1. УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ
Первую высокоскоростную центрифугу
создал в 1923 г. шведский ученый Т. Сведберг.
С ее помощью он установил молекулярную
массу гемоглобина (68 кДа). За эти работы
ученый был удостоен Нобелевской премии
1926 г. Конструкция прибора постепенно со-
вершенствовалась, и современные ультрацен-
трифуги обеспечивают скорость вращения ро-
тора до 80 000 об/мин. Центробежная сила при
этом в сотни тысяч раз превышает силу земно-
го тяготения. В этих условиях белковые моле-
кулы (вместе со своими гидратными оболоч-
ками) постепенно оседают на дно центрифуж-
ной пробирки. Естественно, скорость оседания
тем выше, чем крупнее частицы белка. По этой
зависимости можно рассчитать молекулярную
массу белка. Кроме того, смесь белков можно
разделить на фракции: во время центрифугиро-
вания постепенно формируется зона наиболее
крупных частиц (самая удаленная от оси враще-
ния центрифуги), тогда как менее крупные бел-
ки образуют зоны, продвигающиеся медленнее.
Разработаны и иные варианты метода
ультрацентрифугирования. Например, седи-
ментационное равновесие. В этом случае ско-
рость вращения ротора должна быть сравни-
тельно небольшой, а продолжительность про-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
43
цедуры измеряется обычно не часами, а днями.
В конечном счете устанавливается равновесие
между оседанием белковых частиц и процес-
сом их диффузии, которая противодействует
оседанию. По скорости достижения равновесия
можно рассчитать молекулярную массу белка.
Преимуществом этого способа является неза-
висимость результатов от степени гидратации
белка (т.е., «толщины» гидратной оболочки).
Еще один вариант — центрифугирование в гра-
диенте плотности. В этом случае в центрифуж-
ную пробирку помещают слои раствора с раз-
ной плотностью (например, растворы сахарозы
разной концентрации). Наибольшей она долж-
на быть у дна пробирки, наименьшей - в верх-
ней части. Затем сверху осторожно наслаивают
исследуемый белковый раствор. При ультра-
центрифугировании белки распределяются по
слоям в соответствии с плотностью частиц
(белковая молекула плюс гидратная оболочка).
Сыграв важную роль в истории науки,
ультрацентрифугирование теперь имеет огра-
ниченное применение. В основном оно исполь-
зуется для исследования очищенных препара-
тов индивидуальных белков с целью изучения
размеров, формы и степени гидратации натив-
ных белков. Для разделения смесей применя-
ются другие способы, более простые и эконо-
мичные, а главное - с большей разрешающей
способностью.
1.12.2. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Методы электрофореза основаны на реги-
страции движения заряженных частиц в элек-
трическом поле к аноду (анионы) или к катоду
(катионы). Скорость продвижения прямо зави-
сит от величины заряда частицы и от напряжен-
ности электрического поля, но обратно пропор-
циональна сопротивлению трения. Электрофо-
рез оказался очень эффективным средством раз-
деления белков. Во-первых, потому, что сум-
марный заряд молекулы различен у разных бел-
ков, ибо зависит от соотношения катионных и
анионных групп (которое характеризуется вели-
чиной pl, - см. табл. 1-2). Во-вторых, этот заряд
можно изменять в широких пределах, применяя
буфер с заданным значением pH.
Первым применил электрофорез для раз-
деления белков А. Тизелиус (1937 г.), удосто-
енный в 1948 г. Нобелевской премии. С тех пор
было разработано множество модификаций
метода, в том числе - для применения в клини-
ческих лабораториях.
Технология метода обычно состоит в том,
что небольшую порцию исследуемой белковой
смеси наносят на подходящую подложку (но-
ситель), пропитанную буферным раствором, и
пропускают через нее постоянный электриче-
ский ток. Проще всего в качестве подложки
использовать полоску бумаги. Концы ее опус-
кают в сосуды с тем же буферным раствором, в
один из которых помещают катод, а в другой —
анод электрической цепи. Во избежание пере-
грева и денатурации белка следует обеспечить
достаточное охлаждение системы. После за-
вершения процедуры разгонки носитель высу-
шивают и обрабатывают подходящим красите-
лем на белок. Белковые фракции обнаружива-
ются в виде окрашенных полос, если анализи-
руемая проба была нанесена на подложку в
виде поперечной полоски. Направление и дли-
на пробега от старта зависят от характера и
величины заряда белков каждой фракции, а
также от pH буфера.
Высокая разрешающая способность мето-
да электрофореза ярко проявилась в работах
Л. Полинга и его сотрудников. В 1949 г. они
обнаружили, что при одном из наследственных
заболеваний — серповидноклеточной анемии —
гемоглобин отличается по своей электрофоре-
тической подвижности от гемоглобина здоро-
вых людей. Выявление особой формы белка
при врожденной патологии породило новый
термин - «молекулярная болезнь». Дальней-
шими исследованиями установлена суть гене-
тического дефекта. Оказалось, что в каждой из
одинаковых половин молекулы гемоглобина,
состоящих из 287 аминокислотных остатков,
имеет место одна-единственная замена (вслед-
ствие точечной мутации соответствующего ге-
на): глутаминовая кислота в положении 6 р-це-
пи гемоглобина заменена валином. Следова-
тельно, вся молекула аномального белка со-
держит не 60, а только 58 кислотных групп
(при сохранении всех 92 группировок, способ-
ных диссоциировать по типу основания). Этого
очень небольшого различия оказалось доста-
точно для выявления его методом электрофо-
реза! Успехи в изучении молекулярных основ
44
Глава 1
серповидноклеточной анемии стимулировали
бурное развитие нового направления - молеку-
лярной патологии. К настоящему времени
только для гемоглобина человека обнаружено
более 150 аномальных вариантов. К счастью,
лишь несколько из них вызывают болезнь.
Развитие техники электрофореза привело к
разработке более совершенных модификаций.
Важной вехой явилось создание нового препа-
рата - полиакриламидного геля (ПААГ). Варь-
ируя условия его синтеза, легко регулировать
размеры пор этого геля и даже создавать гра-
диент пористости. Тем самымгеоздана основа
для проведения электрофореза не только на
поверхности носителя, но и в его толще (в мас-
се пористого геля). Это увеличивает влияние
размеров молекул белка на скорость их про-
движения. Стало возможным ие только разде-
лять белковые смеси, но и определять молеку-
лярную массу белков каждой фракции.
Следующим важным шагом оказалась раз-
работка серий специальных амфолитов (их на-
звали амфолинами). Они представляют собой
близкие по строению низкомолекулярные ве-
щества, различающиеся по величине изоэлек-
трической точки. При электрофорезе каждое из
них занимает то место в пространстве между
электродами, которое строго соответствует ве-
личине его pl (так как именно в этом участке
амфолин электронейтрален). Тем самым созда-
ется градиент pH. Каждый белок концентриру-
ется при электрофорезе в той зоне градиента,
pH которой совпадает с величиной pl данного
белка. В результате достигается очень четкое
распределение белков в соответствии со значе-
ниями их изоэлектрических точек. Отсюда и
название метода - изоэлектрофокусирование.
Наиболее высокой разрешающей способ-
ностью при разделении природных белковых
смесей обладает метод двумерного электрофо-
реза, разработанный в 1975 г. В данном вари-
анте процедуру электрофореза осуществляют
сначала в одном направлении, а затем - в на-
правлении, перпендикулярном первому. При
этом стремятся сочетать разные модификации
электрофореза. Например, сначала производят
изоэлектрофокусирование, а затем - разделе-
ние по величине молекул в пористом ПААГ.
В качестве второй стадии можно использовать
и иммуноэлектрофорез, который осуществля-
ется в геле, содержащем поливалентную анти-
сыворотку (смесь антител к разделяемым бел-
кам). Эффективность двумерного электрофоре-
за видна из следующего сопоставления. В сы-
воротке крови содержится более 100 белков.
При электрофорезе на бумаге их удается раз-
делить на 5, а в ПААГ - примерно на 20 фрак-
ций. Применение же двумерного электрофоре-
за позволяет получить свыше 30 фракций.
Аналогичным методом полипептидные цепи
клеточных белков кишечной палочки удалось
разделить почти на 2 000 фракций!
1.12.3. ХРОМАТОГРАФИЯ
В самом начале XX века М.С.Цвет, рабо-
тавший тогда в Санкт-Петербурге, установил,
что зеленый цвет листьев растений обусловлен
наличием не одного, а нескольких разных пиг-
ментов. Выявить это удалось путем разделения
красящих веществ, оказавшихся очень близки-
ми по строению и свойствам. Исследователь
применил разработанный им совершенно не-
обычный метод. В длинную стеклянную труб-
ку с фильтром у нижнего отверстия помещает-
ся взвесь порошка мела в водной фазе. После
оседания частиц излишек жидкости следует
аккуратно удалить через нижнее отверстие,
т.е., пропуская ее через всю колонку до тех
пор, пока над осадком не останется очень тон-
кий водный слой. Затем в верхнюю часть труб-
ки аккуратно наслаивается раствор, получен-
ный при экстрагировании зеленых листьев
петролейным эфиром. При открывании нижне-
го отверстия жидкость из колонки вновь начи-
нает вытекать. По мере ее убыли следует по-
стоянно доливать растворитель (или иную под-
ходящую жидкость), не давая обнажиться
верхнему слою мела. Окрашенный экстракт,
проходя по колонке с током пропускаемой
жидкости (элюента), постепенно разделяется
на несколько окрашенных полос. В описанном
опыте М.С.Цвета быстрее всего продвигалась
полоса желтой окраски (обусловленной нали-
чием каротина). Затем, все более отставая, сле-
довала еще одна зона желтой окраски (прису-
щей содержащимся здесь ксантофиллам). На-
конец, медленнее всего перемещались зеленый
и желто-зеленый участки, которые содержали
два разных варианта хлорофиллов. Каждый из
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
45
разделенных слоев можно изолировать и из-
влечь содержащиеся в нем компоненты (в дан-
ном случае - окрашенные) для дальнейшего
изучения их структуры и свойств.
Поскольку изначально метод М.С. Цвета
был применен для разделения окрашенных ве-
ществ, ему дали название хроматография (от
греческого «хромое» — цвет). Почти полвека
понадобилось, чтобы он оказался востребован-
ным. Мощный стимул этому дали успехи в раз-
работке способов определения первичной
структуры белка. Для их реализации надо было
уметь получать очищенные препараты индиви-
дуальных белков. Принцип хроматографии
оказался для этого наиболее подходящим, тем
более что он обеспечивает нативность полу-
чаемых белковых препаратов. Быстро было
разработано множество модификаций. Главные
из них различаются характером используемого
носителя (неподвижной фазы). Благодаря это-
му теперь можно фракционировать сложную
смесь молекул по их величине (гель-фильт-
рация, или метод молекулярных сит), соотно-
шению ионогенных групп (ионообменная хро-
матография), способности удерживаться на
тех или иных адсорбентах (адсорбционная хро-
матография), распределению в несмешиваю-
щихся жидкостях (распределительная хро-
матография).
Хроматографическое разделение можно
осуществлять не только в колонках, но и на
полосках бумаги или тонкого слоя иного носи-
теля (тонкослойная хроматография).
Самой высокой избирательностью от-
личается аффинная хроматография (хромато-
графия по сродству). Для ее проведения ис-
пользуют носитель, к которому прочно (кова-
лентно) присоединен лиганд белка, подлежа-
щего очистке. Например, аналог субстрата при
выделении соответствующего фермента. Или
антиген - при выделении специфичных к нему
антител. Важным преимуществом этого спосо-
ба является возможность за один прием выде-
лить из сложной смеси нужный белок: пропус-
тив белковый раствор через колонку и отмыв
ее подходящим элюентом от неспецифически
связавшихся примесей, снимают затем избира-
тельно задержанный белок с помощью ве-
ществ, влияющих на слабые связи между ним и
фиксированным на колонке лигандом.
1.13. НОМЕНКЛАТУРА И КЛАССИФИКАЦИЯ
БЕЛКОВ
Разделение белков и их изучение началось
за много десятилетий до того, как были уста-
новлены полипептидная природа этих молекул и
другие детали их устройства. Поэтому названия
вновь открываемых белковых веществ склады-
вались произвольно, по усмотрению первых ис-
следователей: амилаза, пепсин, трипсин, катала-
за, бычий альбумин, овальбумин (альбумин ку-
риного яйца), глобулин, миозин и т.д.
Отсутствие номенклатурной системы в
обозначении белков сохраняется до сих пор,
несмотря на колоссальные успехи и изобилие
возможностей в изучении строения этих мак-
ромолекул. По-прежнему учитываются обычно
лишь источник получения выделенного белка и
свойство, по которому он обнаружен; иногда
принимают во внимание самые яркие струк-
турные особенности. Поэтому очень часто воз-
никают разные названия для одного и того же
белка, и все они аккуратно перечисляются в
справочной литературе (правда, обычно отме-
чается наиболее предпочтительное). Бывают и
попытки переименования. Так, лет 40 тому на-
зад была обнаружена способность сыворотки
крови подавлять ферментативную активность
очищенного трипсина. Действующим началом
оказался белок из фракции сц-глобулинов. По-
этому новому ингибитору дали название аг
антитрипсин. Позднее было установлено, что
он угнетает активность и многих других проте-
олитических ферментов, но особенно эффекти-
вен в отношении эластазы нейтрофилов. Кон-
центрации, в которых он присутствует в крови,
достаточны для инактивации именно эластазы,
но не других протеиназ. Поэтому некоторое
время его называли антиэластазой. Поскольку
такое название сильно сужало действительный
спектр эффектов этого белка, его стали имено-
вать di-протеиназным ингибитором. Однако и
этот термин не стал общепринятым, ибо дан-
ный ингибитор отнюдь не универсален, а угне-
тает только протеиназы трипсиноподобного
действия. В итоге предпочтительным осталось
исходное наименование - оц-антитрипсин.
Трудности в создании рациональной сис-
темы обозначения (номенклатуры) различных
белков имеют объективную основу. Они обу-
46
Глава 1
словлены громадным разнообразием их строе-
ния. С одной стороны, все белки - это поли-
пептиды, обладающие абсолютно одинаковым
строением ковалентного стержня молекулы.
С другой стороны, необозримые вариации со-
отношения и порядка чередования боковых
аминокислотных радикалов R делают практи-
чески невозможной систематизацию по этому
признаку. Тем более, что небольшие различия
в аминокислотной последовательности зачас-
тую почти не сказываются на пространствен-
ной организации макромолекулы, но могут вы-
звать нарушение ее функционирования.
Все это затрудняет не только разработку
общих правил наименования белков, но и со-
здание научно обоснованной классификации
белковых молекул. Тем не менее, усилия в
этом направлении продолжаются. Нацелены
они на поиск структурных особенностей, кото-
рые помогли бы объективно подразделять бел-
ки на определенные группы или классы.
В поисках таких «знаковых» примет было
установлено, что нередко часть полипептидной
цепи (насчитывающая обычно от 50 до 150
аминокислот) состоит из нескольких коротких
участков а-спирали и/или ^-складок, форми-
рующих компактное образование глобулярного
характера. Плотность упаковки обеспечивается
изгибами нерегулярных отрезков цепи (пере-
мычек). Существует немного устойчивых ти-
пов таких образований (модулей), которые по-
вторяются, с некоторыми вариациями, в самых
разных белках. Для обозначения такого обо-
собленного элемента структуры используют
термин домен (в буквальном переводе - некая
область, участок). Он представляет собой ти-
повую укладку жестких элементов (спирапизо-
ванных и/или складчатых), соединенных ко-
роткими перемычками нерегулярного характе-
ра. Иными словами, это уже не вторичная
структура, но еще не третичная (поскольку
охватывает только часть молекулы). Поэтому
домены относят к числу вариантов так назы-
ваемой надвторичной структуры.
Вообще-то, домен - это термин, который и
исходно не отличался однозначностью. Со
временем он стал еще менее определенным,
более «размытым», в том числе из-за употреб-
ления в иных смысловых значениях, понятных
только в контексте. В частности, многие белки
содержат коллагеноподобный домен. Он не
складывается в компактную глобулу, но и на
коллагеновую a-цепь похож довольно отда-
ленно - главным образом, изобилием радика-
лов глицина и пролина. Поэтому его иногда
называют не доменом, а коллагеноподобным
регионом. Примером может служить фермент
ацетилхолинэстераза, в которой коллагенопо-
добный фрагмент «привязывает» каталитиче-
ские субъединицы к базальной мембране си-
напсов. Со временем термин «связывающий
домен» стали применять даже в тех случаях,
когда структурные основы избирательности
связывания еще не ясны. Так возникли назва-
ния гепарин-связываюгфцй домен, фибрин-
связывающий и т.д.
Одинаковые домены могут встречаться в
пределах одной полипептидной цепи, будучи
разделенными достаточно длинными участка-
ми нерегулярной структуры. Такие белки на-
зывают мультидоменными. Нередко в белке
имеются разные домены (модули); это находит
отражение в терминах «модульное строение
белка» и «мозаичный белок».
Существует и другой подход к системати-
зации белков. Он основан на выявлении общ-
ности их происхождения в ходе развития жи-
вой материи.
Семейство — это группа родственных бел-
ков, появившихся в результате эволюции об-
щего прародительского гена. Нередко эволю-
ционное расхождение достигает такой степени,
что возникает серия обособившихся семейств,
составляющих суперсемейство.
Хорошим примером является суперсемей-
ство глобинов. Оно объединяет большую груп-
пу гем-содержащих белков, которые обеспечи-
вают связывание и/или транспорт Ог. Часть из
них свойственна животным (например, гемо-
глобины и миоглобины позвоночных), тогда
как другие встречаются только в растениях или
у бактерий.
Другой пример - суперсемейство лекти-
нов. Так называют белки, имеющие центр свя-
зывания строго определенных углеводных ком-
понентов, в том числе - ковалентно включенных
в другие белки (например, в рецепторы). Откры-
тые поначалу в семенах бобовых, лектины ока-
зались широко распространенными и в растени-
ях, и в животном мире. По характеру центра
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
47
распознавания и связывания углеводов выделя-
ют 2 главные группы: семейство лектинов
С-типа и семейство лектинов S-типа. Последние
называют еще галектинами - из-за высокой из-
бирательности к р-галактозцдным структурам.
Их углевод-связывающий центр обязательно
содержит гексапептцдную последовательность
...-трп-гли-арг-глу-глу-арг-..., в которой арги-
нин в третьей позиции нередко заменен на се-
рин, глутамат или пролин, а в шестой - на ли-
зин или аспарагин. Недавно установлено, что
одни из галектинов (LEG8) специфичен для ра-
ковой опухоли предстательной железы (увели-
чения его в сыворотке не наблюдается при доб-
рокачественной гиперплазии).
Несмотря на общее свойство лектинов -
высокое сродство к определенным углеводам -
конкретные функции у индивидуальных бел-
ков этого суперсемейства очень различны.
Многие из них выполняют роль клеточных ре-
цепторов, иные участвуют в обеспечении про-
цессов экзоцитоза или фагоцитоза. Встречают-
ся и такие, которые обладают ферментативной
активностью (в частности, протеолитической).
Уникальную группу составляют аквапорины.
Эти лектины формируют в клеточной мембра-
не особые каналы, избирательно пропускаю-
щие воду (по градиенту осмотического давле-
ния). В таком белке сочетаются внеклеточные,
трансмембранные и цитоплазматические до-
мены (поэтому аквапорины нередко относят к
семейству трансмембранных белков).
Исследование структурно-функционал ь-
ных признаков сходства и различия белковых
молекул пока еще не привело к созданию чет-
ких и ясных основ классификации белков. Од-
нако оно показало неубедительность система-
тизации их по биологическим функциям (белки
ферментные, регуляторные, транспортные, за-
щитные, токсические, рецепторные и т.д.), по-
скольку такое деление совсем не совпадает с
распределением белков по семействам или по
специфике их доменов. Например, некоторые
белки осуществляют ферментативную деток-
сикацию опасных продуктов, тогда как другие
защитные белки не только не являются фер-
ментами. но и сильно различаются между со-
бой по строению и механизмам действия.
И самое важное: многие белки можно назвать
мультифункциональными, т.е., имеющими не
единственное предназначение. Так, амилаза
слюны не очень-то и нужна в своем качестве
фермента (гидролизующего крахмал), но игра-
ет важную роль в неспецифическом связыва-
нии микроорганизмов, а также в формировании
защитной пленки на зубной поверхности.
Вследствие описанных сложностей, до на-
стоящего времени находит применение доволь-
но несовершенная систематизация белков, воз-
никшая век тому назад. В соответствии с нею
все белки подразделяют на простые (построен-
ные только из аминокислот) и сложные (содер-
жащие еще и другие компоненты). Первые
группируют на основе их' физико-химических
свойств (иногда - с указанием на локализацию в
клетке или организме). 'Сложные белки разли-
чают по строению небелкового компонента.
1.13.1. ПРОСТЫЕ БЕЛКИ (ПРОТЕИНЫ)
В течение многих десятилетий простые
белки подразделяли на «спаренные» группы:
альбумины и глобулины; гистоны и протами-
ны; проламины и глютелины. Причиной тому
были не только черты сходства, но и совпаде-
ние природной локализации белков каждой
пары. И еще: все эти белки являются глобуляр-
ными. Остальные белки долго не поддавались
изучению известными методами. Поэтому их
относили к отдельной группе, которую обозна-
чали как «протеиноиды» («белковоподобные»)
или «склеропротеиды» (белки соединительной
ткани). Теперь эти названия стали анахрониз-
мом и заменены более однозначным термином
- фибриллярные белки. Характеристика их
приведена в разделе 1.7, и поэтому здесь пой-
дет речь только о глобулярных белках.
Альбумины н глобулины - широко рас-
пространенные белки, нередко сопутствующие
друг другу. Так, в плазме крови человека
содержится обычно 35-55 г/л альбумина,
а остальные 25-40 г/л представлены глобули-
нами.
Альбумины составляют довольно немного-
численную группу очень сходных белков. Мо-
лекула их состоит из одной полипептидной
цепи небольших размеров (до 70 кДа), содер-
жащей мало триптофана и метионина, но бога-
той цистеином и заряженными радикалами,
особенно анионными. Обилием дисульфидных
48
Глава 1
мостиков обеспечивается стабильность белка,
включая устойчивость к нагреванию до почти
80°С. Альбумины обладают высокой гидро-
фильностью (их гидратная оболочка составля-
ет 30% от массы белка) и потому трудно под-
даются высаливанию (см. раздел 1.11.3). Они
легко связывают ионы кальция, магния, меди,
никеля, ртути и им подобные, а также различ-
ные органические вещества. В частности, выс-
шие жирные кислоты способны сорбироваться
на катионных группах белка. Наступающие
при этом конформационные изменения сопро-
вождаются раскрытием гидрофобных карма-
нов, в каждом из которых довольно прочно
фиксируется углеводородная часть жирной ки-
слоты. Молекула альбумина может удерживать
до 6 молекул жирных кислот. В результате бе-
лок становится более кислым (р! достигает
значения 4,8 вместо р! = 5,6 у обезжиренного
альбумина). Связывание жирных кислот спо-
собствует сорбции и других неполярных со-
единений (стероидные гормоны, билирубин,
многие лекарственные препараты). Тем самым
альбумины выполняют роль резервуара для
сорбируемых веществ и участвуют в их пере-
носе с током крови.
Будучи низкомолекулярным белком, аль-
бумин довольно легко проникает в ткани
(а затем и обратно), так что общее количество
этого белка вне сосудов даже больше, чем в
крови (у взрослого человека - соответственно
230 и 150 г). За время существования молекулы
(в среднем 27 дней) она успевает примерно
15 раз «посетить» межклеточные пространства.
Синтезируется альбумин плазмы клетками пе-
чени (около 14 г в сутки).
Белки, сходные с альбумином плазмы кро-
ви, обнаружены также в молоке (лактальбу-
мин) и птичьих яйцах (овальбумин). Первый из
них синтезируется в молочной железе как ре-
гуляторная субъединица фермента, обеспечи-
вающего синтез лактозы, а в составе молока
выполняет роль Са2+-связывающего белка.
Второй является главным протеином яичного
белка и способен подавлять активность проте-
олитических ферментов.
Глобулины, в отличие от альбуминов,
представляют собой обширную группу очень
разнообразных белков, молекулярная масса
которых превышает 150-200 кДа, а у некото-
рых достигает 700 кДа (макроглобулины). Их
неоднородность выявляется уже при дробном
высаливании. Методы электрофореза, приня-
тые в клинико-биохимических лабораториях,
позволяют разделять белки сыворотки крови на
альбумины и 4 фракции глобулинов, которые
обозначаются как аг, а2-, р- и у-глобулины.
Самой крупной и наиболее гетерогенной явля-
ется последняя фракция: в ней сосредоточены
фибриноген, многие факторы свертывания
крови, а также почти все разнообразие раства-___ -
римых антител, которые теперь обозначают
как иммуноглобулины. В семенах растений то-
же выявляются отдельные глобулины, но они
сильно отличаются от глобулинов животного
мира и выполняют, судя по всему, роль пита-
тельного резерва.
Гистоны и протамины - это белки, со-
средоточенные почти исключительно в ядрах
клеток. Они содержат много аргинина и лизина
(до 25% в гистонах и около 70% в протами-
нах). Поэтому самой яркой чертой этих белков
является щелочной характер (высокое значение
pl), придающий им способность довольно
прочно связываться с полианионами, - такими,
как молекулы дезоксирибонуклеиновой кисло-
ты (ДНК).
Гистоны различаются по величине моле-
кул (от 11 до 21 кДа), по степени преобладания
катионных аминокислот над анионными (в
2-6 раз), по другим особенностям состава. В
наиболее крупных гистонах (Н1) лизин резко
преобладает над аргинином и содержится мно-
го аланина, хотя в целом доля неполярных
аминокислот минимальна (около 10%). Преоб-
ладание лизина невелико в гистонах Н2А и
Н2В, первые из которых богаты лейцином,
а вторые - серином и совокупностью неполяр-
ных радикалов (24%). Наконец, «аргининовые»
гистоны, в которых этой аминокислоты на
20-40% больше, чем лизина, различаются по
обилию глутамата (Н3) или глицина (Н4). Со-
всем не содержат гистоны триптофана и, как
правило, цистеина. Вообще, эти белки чрезвы-
чайно консервативны: по первичной структуре
большинства из них даже растения почти не
отличаются от животных.
Общей чертой гистонов является поляри-
зация первичной структуры: преобладание ка-
тионных радикалов в N-концевой части моле-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
49
кулы и неполярных - в С-концевой (в группе
Н1 - наоборот). Молекулы гистонов (кроме Н1)
легко взаимодействуют друг с другом, образуя
димеры, которые объединяются в октамеры.
Протамины — ограниченная группа очень
небольших белков (< 5 кДа), выявленных впер-
вые в зрелой сперме некоторых рыб. В ядрах
клеток они замещают собой гистоны во время
гаплоидной фазы сперматогенеза. Наиболее
изученные представители (салмин и клупеин
из молок соответственно семги и сельди) со-
держат в своей молекуле 30-32 аминокислоты,
из которых 20-21 приходятся на долю аргини-
на. Домен подобия салмину выявлен в некото-
рых крупных белках, включая ряд ферментов
митохондрий. В последнее время ряд протами-
нов идентифицирован и у млекопитающих,
включая человека, причем, не только в ядре, но
и в полирибосомах.
Проламины н глутелины - белки расти-
тельного происхождения. Больше всего их со-
держится в зернах злаков, где они выполняют
роль запаса питательных веществ, используе-
мых при прорастании семян. От других белков
отличаются растворимостью в присутствии
70-80% этанола. Различные проламины содер-
жат много глутамина (до 30%) и пролина
(10-15%), а также цистеина, за счет которого
образуются внутрицепочечные дисульфидные
связи. Типичным для глутелинов является мно-
гократное повторение последовательности
...-про-про-про-гис-вал-лей-..., а иногда - еще
и наличие домена, состоящего из двух подряд
последовательностей .. .-гл н-про-гис-про-цис-
про-цис-глн-... (глутелин из зерен кукурузы).
В заключение следует отметить, что по
мере изучения простых белков выяснялось, что
многие из них содержат и небелковые компо-
ненты. Так, большинство глобулинов (если не
все) содержит углеводный или липидный
фрагмент. То же установлено и для некотороых
проламинов и глутелинов.
Наконец, гистоны и протамины, как прави-
ло, существуют в виде комплексов с нуклеино-
выми кислотами. Тем не менее, традиция разли-
чать перечисленные группы белков сохраняется
до сих пор, особенно в целях обозначения физи-
ко-химических свойств белковой части сложных
белков.
1.13.2. СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ
(УСТАРЕЛОЕ НАЗВАНИЕ - ПРОТЕИДЫ)
Для обозначения небелковой части моле-
кулы сложного белка принят термин просте-
тическая группа. Если соединение с белком
осуществляется не ковалентными, а слабыми
типами связей, то ее обычно называют кофак-
тором. Белковую часть молекулы сложного
белка обозначают как апопротеин. В зависи-
мости от строения простетической группы,
принято различать следующие группы слож-
ных белков:
- фосфопротеины;
— гликопротеины;
— липопротеины;
- нуклеопротеины;
- хромопротеины;
- металлопротеины.
Фосфопротеины несут в себе остатки
фосфорной кислоты (Н3РО4). С белком она со-
единяется ковалентно, образуя сложноэфир-
ную связь с радикалом серина, треонина, реже
- тирозина. В физиологических условиях обе
свободные гидроксильные группы фосфата
почти полностью диссоциированы, придавая
белковой молекуле сильный отрицательный
заряд. Этот новый «опознавательный знак»
может оказаться необходимым для узнавания
определенного лиганда или, напротив, «отпу-
гивать» его. Но наиболее важным эффектом
является изменение конформации белковой
молекулы, которое может сильно повлиять на
интенсивность ее функционирования. Поэтому
природа широко использует такую простую ре-
акцию - фосфорилирование (или дефосфорили-
рование) - для управления активностью фер-
ментов, преобразования (трансдукции) внешних
сигналов внутри клетки и вообще для регулиро-
вания многих функций. Конкретные примеры
будут рассмотрены в дальнейшем изложении.
Иногда в молекуле белка имеется множе-
ство фосфатных остатков. Это относится, в ча-
стности, к казеину - главному белковому ком-
поненту молока. С фосфатными группами лег-
ко связываются ионы Са2+. Поэтому казеин не-
редко рассматривают как транспортную форму
кальций-фосфата. Аналогичную роль играет
фосвитин яичного желтка, который содержит
50
Глава 1
до 10% фосфора. В костной ткани и зубах
фосфопротеины участвуют в процессе отложе-
ния кристаллов фосфорнокальциевых солей.
Гликопротеины названы так по наличию в
их молекуле хотя бы одного углеводного фраг-
мента. Присоединяется он к белку за счет своего
полуацетального гидроксила. Иными словами,
формируется не сложноэфирная (как в фосфо-
протеинах), а гликозидная связь. Для ее образо-
вания апопротеин «предоставляет» обычно гид-
роксильную группу серина или треонина
(О-гликозидное соединение), но нередко - амид-
ную группу радикала аспарагина (N-гликозид-
ное связывание). Изобилуя кислородом, угле-
водные компоненты усиливают гидрофильные
свойства поверхности белковой молекулы.
Простетическая группа редко бывает
представлена одним моносахаридом (обычно
это L-фукоза, D-глюкоза или N-ацетил-В-
глюкозамин, присоединяемые О-гликозидной
связью). Как правило же, апопротеин несет на
себе одну или несколько олигосахаридных це-
почек, насчитывающих до 20 моносахаридных
звеньев. Концы этих цепочек могут быть раз-
ветвлены, образуя «усики» («антенны»). Ино-
гда на этих «усиках» бывают фосфатные груп-
пы. В состав гликопротеина часто входят раз-
ные как О-, так и N-олигосахариды.
Хотя в природе обнаружено около 200 мо-
носахаридов, практически только 8 из них ис-
пользуются для построения олигосахаридных
цепочек гликопротеинов (рис. 1-25). Этого, од-
нако, вполне хватает, чтобы обеспечить огром-
ное разнообразие гликановых фрагментов. Оно
используется при построении клеточных рецеп-
торов, а также для обеспечения избирательности
белок-белковых взаимодействий и специфично-
сти контактов клеток между собой и с внекле-
точными белками. Еще одна важная функция
углеводных цепочек заключается в защите сво-
их апопротеинов от разрушения ферментами
протеолиза на путях миграции этих белков
внутри клетки, их сортировки и секреции, пре-
бывания вне клеток. Именно поэтому гликопро-
теинами являются почти все внеклеточные бел-
ки, включая глобулины плазмы крови.
В гликопротеинах белковая часть молеку-
лы обычно сильно преобладает над углевод-
ной. Гораздо позже были обнаружены макро-
молекулы с обратным соотношением этих
компонентов. Их назвали протеогликанами.
Углеводы здесь представлены неразветвлен-
ными полисахаридными цепями длиной в де-
сятки и даже сотни моносахаридных звеньев.
Как и в гликопротеинах, одним своим концом
гликановая цепь присоединена к апопротеину
О-гликозидной связью (иногда - N-гликозид-
ной). Обычно в молекуле протеогликана со-
держится от 50 до 200 полисахаридных цепей,
а нередко — еще и множество олигосахаридных
НОСНг НОСНг НОСНг
D-Глюкоза D-Галактоза D-Манноза
НОСНг
н NH2
Глюкозамин
(2-амино-О-глюкоза)
(М-Ацетил)галактозамин
L-Фукоза
(6-дезокси-1_-галактоза)
R= Н-С-ОН
н-с-он
I
СНгОН
(М-Аиетил)нейраминовая
кислота
Рис. 1-25. Моносахариды и их производные, обнаруживаемые в олигосахаридных цепочках гликопротеинов.
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
51
фрагментов. В итоге совокупная масса глика-
нов превышает (иногда - очень значительно)
массу белкового компонента. Это и стало кри-
терием для разграничения гликопротеинов и
протеогликанов.
Со временем, однако, этот критерий утра-
тил свою однозначность. С одной стороны,
оказалось, что ряд протеогликанов содержат
лишь несколько полисахаридных цепей, так
что белковая часть в них сильно преобладает.
С другой стороны, недавно установлено, что
муцин (главный белок слизистых выделений),
хотя и содержит до 90% углеводов, не имеет в
своем составе полисахаридных цепей: вся его
небелковая часть представлена только олиго-
сахаридами. Стало ясным, что принадлежность
к протеогликанам определяется наличием по-
лисахаридных цепей, а не долей углеводов в
молекуле. Почти все протеогликаны сосредо-
точены в межклеточном веществе, поэтому де-
тали их строения будут рассмотрены в главе
«Соединительная ткань» (раздел 10.3.3.).
В настоящее время все чаще употребляют
термин «гликоконъюгаты» для общего обозна-
чения и гликопротеинов, и протеогликанов.
Липопротеины резко выделяются среди
всех других белков. Причиной тому является
высокая гидрофобность небелкового компо-
нента. Иногда он представлен нейтральными
жирами (триацилглицеролами), но чаше - бо-
лее сложно устроенными липидами, в составе
которых, впрочем, тоже преобладают неполяр-
ные структуры.
Подробно строение липидов будет рас-
смотрено в главе 3. А пока отметим лишь одну
особенность: нековалентный характер соеди-
нения липидов со своими белками (их теперь
часто обозначают как аполипопротеины).
Определенный вклад в такое объединение мо-
гут вносить ионные и водородные связи, фор-
мируемые с участием полярного фрагмента
липидных молекул. Но главную роль играют
гидрофобные взаимодействия липида с непо-
лярными зонами белка. Остальной (гидрофиль-
ной) частью молекулы аполипопротеин «мас-
кирует» гидрофобную природу ассоциирован-
ного липида, создавая для него возможность
существования в водной среде. Амфифиль-
ность липопротеинов позволяет им соединять-
ся в надмолекулярные образования, под гид-
рофильной поверхностью которых складиро-
вано значительное количество липидов. Благо-
даря этому, липопротеины обеспечивают транс-
порт липидов от мест их образования (печень)
или поступления в организм (кишечник) к мес-
там депонирования (жировые клетки) или ути-
лизации. При электрофорезе большинство
транспортных липопротеинов плазмы крови об-
наруживается во фракциях а- и р-глобулинов.
Еще более значимую роль играют липо-
протеины в качестве исполнителей многих из
важнейших функций биологических мембран,
обязательным компонентом которых они яв- l
ляюгся (раздел 3.2.2).
Нуклеопротеины представляют собой не-
ковалентные комплексы нуклеиновых кислот с
гистонами (реже - с протаминами). В каждом
таком комплексе множество белковых молекул,
прочно соединяясь с длинной цепью нуклеино-
вой кислоты, вносит решающий вклад в про-
странственную организацию «своей» простеги-
ческой группы. Учитывая уникальность биоло-
гической роли нуклеиновых кислот, их строе-
нию и механизмам функционирования специ-
ально посвящена следующая глава.
Хромопротеины («цветные белки») своей
окраской обязаны простетической группе.
В зависимости от ее строения, различают ге-
мопротеины и флавопротеины.
Гемопротеины содержат конструкцию из
4 пиррольных колец, лежащих в одной плоско-
сти и объединенных метенильными мостиками
в большое порфириновое кольцо (рис. 1-26),
внешний контур которого представляет собой
систему сопряженных двойных связей. Цен-
тральное место в нем занимает атом металла,
соединенный со всеми четырьмя азотами пир-
рольных колец. В молекулах гема (которому
кровь обязана своим красным цветом) таким
атомом является железо. Хлорофиллы содер-
жат магний и различаются боковыми радика-
лами порфиринового кольца; эти зеленые пиг-
менты участвуют в поглощении света и ис-
пользовании его энергии для проведения реак-
ций фотосинтеза.
В гемопротеинах животного организма
чаще всего встречается гем b (именно его фор-
мула показана на рис. 1-26). Он входит в состав
упоминавшихся гемоглобина и миоглобина,
обеспечивающих перенос кислорода кровью и
52
Глава 1
Рис. 1-26. Строение гема Ь.
Примечание: в молекуле формилпорфирина (гем а)
вместо метильной и винильной групп в положениях 8 и 2
находятся соответственно формильный остаток -С(О)Н
и изопреноидная цепь -СН(ОН)-[СН2-СН2-СН-С(СН3)]з-СНз
накопление его миоцитами (раздел 1.6). В этих
молекулах железо всегда двухвалентно. Введе-
ние в кровь даже «мягких» окислителей чрева-
то опасностью появления метгемоглобина, ко-
торый отличается от гемоглобина только сте-
пенью окисления железа гема (Fe3+), но, тем не
менее, непригоден для транспорта кислорода.
С другой стороны, в некоторых белках
особенности строения апопротеина и его со-
единения с гемом обеспечивают поддержание
окисленного состояния железа. От этого зави-
сит активность таких ферментов, как каталаза
и пероксидаза. Оба они разрушают пероксид
водорода, обезвреживая тем самым этот опас-
ный метаболит (см. раздел 5.5.2).
Наконец, гем b входит в состав и некото-
рых цитохромов - внутриклеточных фермен-
тов, участвующих в переносе электронов от
окисляемых веществ в конечном счете на ки-
слород. Впрочем, другие цитохромы содержат
гем о, немного отличающийся от гема b строе-
нием боковых радикалов порфиринового коль-
ца. Несмотря на эти различия, специфика всех
цитохромов заключается в переменной валент-
ности железа гема: принимая электрон, оно
восстанавливается до Fe2+, а отдавая его затем
на очередной цитохром (или на молекулу ки-
слорода), вновь переходит в окисленное со-
стояние (Fe3+).
Все эти примеры показывают, что именно
белковая часть молекулы гемопротеинов «дик-
тует», как именно использовать возможности
простатической группы: либо просто для
транспорта и накопления молекул кислорода,
либо для вовлечения в различные окислитель-
но-восстановительные реакции, связанные с
переносом электронов.
Растительные магнийпорфирины, несмот-
ря на заметные отличия от гема, тоже участву-
ют в метаболических превращениях кислорода.
В самых общих чертах это выглядит так: вме-
сте со своими апопротеинами хлорофиллы
обеспечивают захват фотонов и утилизацию их
энергии для расщепления воды до О2 и атомов
водорода; последние, в свою очередь, исполь-
зуются в сложных системах хлоропластов для
восстановления молекул СО2 до моносахари-
дов (например, глюкозы).
Здесь уместно отметить, что порфирины
пищевых продуктов не могут всасываться в
кишечнике. Поэтому в ходе биогенеза гемо-
протеинов в нашем организме необходимые
для иих простатические группы должны синте-
зироваться из более простых веществ. При
этом атом железа включается лишь на заклю-
чительной стадии, после завершения биосинте-
за порфиринового кольца.
На молекулу гема очень похож витамин
В12 (кобаламин). Фактически это группа ве-
ществ, однотипность которых обусловлена на-
личием частично восстановленного порфири-
нового кольца с атомом кобальта в его центре
(лиганды при этом атоме бывают разными).
Такого рода структура содержится в небелко-
вой части ряда ферментов (их называют коба-
мидными). Несмотря на значительное сходство
с гемопротеинами, ферменты этой группы уча-
ствуют не в процессах биологического окисле-
ния, а преимущественно в реакциях внутри- и
межмолекулярного переноса метильных и не-
которых других группировок. Всасывание ви-
тамина В12 в кишечнике обеспечивается осо-
бым гликопротеином желудочного сока, име-
нуемым внутренним фактором.
Флавопротеины содержат в составе про-
статической группы рибофлавин (витамин В2).
На рис. 1-27 показана фосфорилированная фор-
ма этого витамина, который представляет собой
полициклическое азотистое основание флавин с
присоединенным к нему пятиатомным спиртом
рибитолом (продукт восстановления моносаха-
рида рибозы в положении 1). Этот рибофлавин-
БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
53
Рис. 1-27. Строение флавин моно нуклеотид а
(рибофлави н-5’-фосфат)
5'-фосфат чаще обозначается как флавинмоно-
нуклеотид (ФМН) и является простейшим вари-
антом простатических групп флавопротеинов.
Во всех таких группах роль реактивного центра
выполняет азотистый гетероцикл изоаллоксази-
на. Желтая окраска присуща ему в окисленном
состоянии (рис. 1-27), но исчезает в результате
присоединения двух атомов водорода к атомам
азота, выделенным жирным шрифтом.
Именно из-за способности легко восста-
навливаться (присоединяя два атома водорода)
и снова окисляться (передавая их на подходя-
щий акцептор) рибофлавин используется в ка-
честве простатической группы многих фермен-
тов, которые так и называют - флавиновые
ферменты. Нередко они содержат еще и моле-
кулу гема (флавогемопротеины) либо ионы
некоторых металлов (металлофлавопротеины).
Металлопротеииы очень разнообразны и
по содержащимся в них ионам металлов, и по
способу их связывания с апопротеином, и по
функциональному предназначению макромоле-
кулы.
Некоторые из них являются транспортной
формой соответствующего минерала. Наиболее
известен трансферрин. Этот гликопротеин вы-
рабатывается клетками печени и секретируется
в кровь, где составляет главную долю фракции
Р-глобулинов плазмы. Он имеет два центра
связывания, способных прочно удерживать по
атому Fe3+ в сочетании с присоединением анио-
на (обычно НСОз-) в расположенном по сосед-
ству участке. Трансферрин захватывает ионы
железа, всасываемые в кишечнике или освобо-
ждаемые в местах деградации гема, и осущест-
вляет их перенос к местам депонирования и
утилизации. Аналогичный белок фракции
аг-глобулинов — церулоплазмин — обладает
8 участками связывания меди и обеспечивает
транспорт этих ионов в организме.
Другая группа металлопротеинов предна-
значена для накопления («складирования») то-
го или иного металлоиона в клетках. Наиболее
ярким примером является ферритин. В его со-
ставе Fe3+ депонируется в селезенке, клетках
костного мозга, слизистой оболочки кишечни-
ка. Но богаче всего этим белком печень, где с
его участием может накапливаться до 700 мг
железа (для сравнения: в гемоглобине крови
взрослого человека содержится около 3 г желе-
за, что составляет 60-70% от общего количества
его в организме). По мере надобности оно ис-
пользуется для синтеза гема. Это осуществляет
специальный фермент митохондрий (гемсинте-
таза), который принимает Fe3+ от ферритина и
включает его восстановленную форму (Fe2+) в
молекулу готового порфиринового кольца.
Наконец, самую разнообразную группу
металлопротеинов составляют ферментные
белки. Во многих случаях они очень прочно
связывают ион металла, который не может
быть заменен аналогами и непосредственно
участвует в акте катализа. Особенно это отно-
сится к атомам железа, меди, цинка, магния,
кальция, кобальта, молибдена, марганца.
Неорганические компоненты сложных
белков могут быть представлены не только ио-
нами металлов, но и другими элементами. Так.
йодтироглобулин (предшественник гормонов
щитовидной железы) содержит атомы йода,
ковалентно соединенные с радикалами тирози-
на. Другой пример: гпутатионпероксидаза
имеет в своем составе остаток цистеина, в ко-
тором атом серы заменен на селен, причем,
селеноцистеин прямо участвует в реакции раз-
ложения Н2О2, катализируемой этим защитным
ферментом. Есть и ряд других ферментов, яв-
ляющихся селенопротеинами.
Представленные сведения о сложных бел-
ках указывают на несовершенство традицион-
ной их классификации. Тем не менее, принци-
пиальные ее основы используются до сих пор.
Помимо «смешанных» названий вроде фосфо-
гликопротеинов и других, упомянутых выше,
появляюгся и совсем новые группы (например,
сульфопротеины, в которых эфирные связи с апо-
протеином образуют остатки серной кислоты).
Глава 2
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Впервые нуклеиновые кислоты были вы-
делены из ядер клеток (1869 г) в виде соедине-
ния с белком, названным нуклеином. Они ока-
зались крупными полимерами, содержащими
много фосфатных групп (более 20% по массе).
Этим обусловлен полианионный характер та-
ких макромолекул, чем и объясняется проч-
ность их связывания с катионными белками
(представленными, как теперь известно, в ос-
новном гистонами). Потребовалась разработка
жестких методов воздействия (вплоть до дена-
турации апопротеинов), чтобы из нуклеопро-
теинов выделять очищенные препараты нук-
леиновых кислот, сохраняющих ковалентную
структуру молекулы.
Исследованиями последних десятилетий
установлено, что нуклеиновые кислоты очень
разнообразны. Размер их молекулы может со-
ставлять от нескольких десятков до десятков
тысяч килодальтон. Тем не менее, все они по-
строены по единому плану, представляя собой
полимеры (полинуклеотиды), составленные из
небольшого набора структурных единиц - мо-
нонуклеотидов.
2.1. СТРОЕНИЕ МОНОНУКЛЕОТИДОВ
Каждый мононуклеотид состоит из трех
компонентов: азотистого основания, углевода
(конкретнее - пентозы) и фосфорной кислоты.
Набор используемых оснований невелик.
Он включает два производных пурина (аденин
и гуанин) и три пиримидиновых структуры
(цитозин, урацил, тимин). Они часто обозна-
чаются первыми буквами названий — соответ-
ственно А, Г, Ц, У, Т. Их формулы приведены
на рис. 2-1.
Другие производные пурина или пирими-
дина встречаются в нуклеиновых кислотах не
всегда и в малых количествах («минорные»
основания); они появляются только в результа-
те модификации «главных» оснований в соста-
ве уже готовых полимеров.
Пентозным фрагментом мононуклеотида
бывает либо D-рибоза, либо ее производное —
2-дезокси-й-рибоза (рис. 2-2). Они соединяют-
ся р-гликозидной связью с азотом в положении
1 пиримидинового кольца или в положении 9
пуринового ядра. Образуемые продукты обо-
Рис. 2-1. Строение пуриновых и пиримидиновых
оснований
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
55
Рис. 2-2. Строение р-форм D-рибозы (I)
и 2-дезокси-О-рибозы (II).
значают общим термином нуклеозиды (рис.
2-3). Конкретные названия формируются в со-
ответствии с содержащимися в них основания-
ми А, Г, Ц, У, Т:
аденозин цитидин
гуанозин уридин
тимидин
Фосфорная кислота присоединена всегда к
углеводной части нуклеозида, образуя сложно-
эфирную связь, как правило, с 5-м углеродным
атомом пентозы (5-фосфат). Это приводит
к превращению нуклеозидов в соответствую-
щие мононуклеотиды (рис. 2-4). Их наимено-
вания составляются прибавлением окончания
«-монофосфат» к названию соответствующего
нуклеозида:
аденозинмонофосфат (АМФ); [адениловая к-та]
гуанозинмонофосфат (ГМФ); [гуаниловая к-та]
цитидинмонофосфат (ЦМФ); [цитидиловая к-та]
уридинмонофосфат (УМФ); [уридиловая к-та]
тимидинмонофосфат (ТМФ); [тимидиловая к-та]
Рис. 2-4. Строение аденозин-5’-монофосфата (АМФ)
Все приведенные обозначения применимы
только к тем нуклеозидам и нуклеотидам, уг-
леводный фрагмент которых представлен ри-
бозой. Если же вместо нее содержится дезок-
сирибоза, то к перечисленным названиям до-
бавляется приставка «дезокси-» или ее сокра-
щение «d-» (например: дезоксиаденозинмоно-
фосфат, d-АМФ). Следует, однако, оговорить-
ся, что тимидиновые нуклеотиды содержат
всегда только дезоксирибозу. Имея это в виду,
для удобства обозначают их нередко без при-
ставки «дезокси-» или «d-».
Таким образом, есть два ряда мононуклео-
тидов. Их так и называют: рибонуклеотиды и
дезоксирибонуклеотиды. Последние гораздо
стабильнее. Они не синтезируются из более
простых веществ, а образуются из уже готовых
рибонуклеотидов путем восстановления рибо-
зы в положении 2 специальными ферментными
системами.
НО ОН
I
Рис. 2-3. Строение пуриновых и пиримидиновых
нуклеозидов на примере соответственно аденозина (I)
и уридина (II).
2.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ
МОНОНУКЛЕОТИДОВ
Природное предназначение мононуклео-
тидов не сводится только к тому, чтобы быть
строительным материалом для создания нук-
леиновых кислот. Не менее фундаментальной
функцией является их участие в процессах пре-
образования энергии, без которых жизнь
невозможна. Кроме того, некоторые из них ис-
пользуются в системах передачи внешних сиг-
налов на исполнительные структуры клетки.
Наконец, нуклеотидные компоненты включены
и в состав небелковой части ряда важных фер-
ментов.
56
Глава 2
2.2.1. НУКЛЕОТИДНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
ФЕРМЕНТОВ
Очень многие ферменты являются не про-
стыми, а сложными белками. Небелковая часть
бывает разной. Нередко она содержит мононук-
леотидный фрагмент. Примером может слу-
жить кофермент А (КоА). Как видно на рис. 2-5,
нуклеотидным его компонентом является АМФ,
дополнительно фосфорилированный в позиции
3 рибозы (З'-фосфо-АМФ). Остальная часть ко-
фермента А представлена фосфопантотеином,
который своей фосфатной группой соединен с
5'-фосфатом в молекуле З'-фосфо-АМФ. Ои со-
держит пантотеновую кислоту (витамин Вз),
которую можно представить как р-аланин, со-
единенный пептидной связью с диметилмасля-
иой кислотой, гидроксилированной в положе-
ниях 2 и 4. Последний из этих гидроксилов не-
сет фосфатную группу (через которую осущест-
вляется связь фосфопантотеина с З'-фосфо-
АМФ), а кислотный радикал пантотеновой ки-
слоты соединен пептидной связью с тиоэтано-
ламином (продукт декарбоксилирования цис-
теина). Его тиольная группа (-SH) и является
реактивным центром кофермента А, присоеди-
няющим органические кислоты на время пере-
носа их с одних веществ на другие (КоА - это
сокращение от слов «кофермент ацилирова-
ния»). Такую же функцию выполняет и сам фос-
фопантотеии, входя в состав некоторых фер-
ментов (речь об этом пойдет в разделе 7.4.3).
У ряда других ферментов небелковая часть
представляет собой соединение АМФ с очень
похожей на него структурой. Одна из таких
остаток
никотинамидного
мононуклеотида
остаток
адениловой
кислоты (АМФ)
Рис. 2-6. Строение никотинамидадениндинуклеотида
(НАД). Примечание: в молекуле НАДФ атом водорода,
указанный стрелкой, замещен фосфатной группой -РОзН2
надстроек отличается только тем, что в качест-
ве пиримидинового основания содержит амид
никотиновой кислоты, который (как и сама ни-
котиновая кислота) является витамином РР.
Поэтому такую структуру можно назвать нико-
тинамидным мононуклеотидом. При соедине-
нии его с АМФ образуется никоптинамид-
адениндинуклеотид (НАД, рис. 2-6). Он выпол-
няет роль кофермента никотинамидных дегид-
рогеназ, названных так по способности отни-
мать атомы водорода от окисляемых веществ.
К адениловому фрагменту молекулы НАД мо-
жет быть присоединена дополнительная фос-
фатная группа (в положении 2 рибозы); такой
кофермент обозначается как никотинамидаде-
ниндинуклеотидфосфат (НАДФ).
Еще один пример - молекула флавинаде-
ниндинуклеотида (ФАД). Как показано на рис.
2-7, он является соединением адениловой кис-
лоты с флавинмононуклеотидом (ФМН), пред-
ОН
ОН
HS—CH2—СН2—N—С—СН2—CH2—N—С
сн3
сн—с—сн2—о—р—о—р—о—сн2
I
о
ОН СНз
Остаток тиоэтаноламина
Остаток пантотеновой кислоты
Остаток фосфолантотеина
|з-
НО.
О=Р—6
НО^
ОН
о
о
н
Н
I
о
Остаток З'-фосфо-АМФ
Рис. 2-5. Строение кофермента А (КоА; HS-KoA)
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
57
Рис. 2-7. Флавинадениндинуклеотид (ФАД)-
ставленным на рис. 1-27. Во многих флавино-
вых ферментах именно ФАД (а не ФМН) вы-
полняет функцию простетической группы, спо-
собной временно присоединять 2 атома водо-
рода в ходе переноса их от одного вещества к
другому.
Заслуживает внимания тот факт, что и в
ФАД, и в НАД мономеры соединены своими
фосфатными «хвостами», а совсем не так, как
мононуклеотиды в нуклеиновых кислотах (см.
раздел 2.3). Из этого следует, в частности, что
такого рода динуклеотиды не могут входить в
состав природных полинуклеотидов (и появ-
ляться при их расщеплении).
2.2.2. РОЛЬ МОНОНУКЛЕОТИДОВ
В ЭНЕРГЕТИЧЕСКОМ МЕТАБОЛИЗМЕ
К фосфатной группе любого нуклеозидмо-
нофосфата может присоединяться остаток еще
одной, а к нему — и третьей молекулы фосфор-
ной кислоты. Так образуются соответствующие
нуклеозиддифосфаты и нуклеозидтрифосфаты:
аденозиндифосфат (АДФ),
аденозинтрифосфат (АТФ);
гуанозин дифосфат (ГДФ),
гуанозинтрифосфат (ГТФ);
цитидиндифосфат (ЦДФ),
цитидинтрифосфат (ЦТФ);
уридиндифосфат (УДФ),
уридинтрифосфат (УТФ);
тимидиндифосфат (ТДФ),
тимидинтрифосфат (ТТФ).
Все перечисленные нуклеозидфосфаты от-
носятся к числу мононуклеотидов, вне зависи-
мости от количества фосфатных групп. Однако
есть одна очень существенная деталь. Она вид-
на на примере молекулы АТФ, формула кото-
рого приведена на рис. 2-8. Здесь только пер-
вый фосфатный остаток присоединен (к рибо-
зе) сложноэфирной связью (обозначенной, как
и обычно, черточкой). А вот соединение вто-
рой фосфатной группы с первой (а также
третьего фосфата со вторым) представлено в
виде волнистой линии (~). Так принято обо-
значать макроэргические связи, то есть такие
связи, при гидролизе которых выделение сво-
бодной энергии превышает 30 кДж/моль (в рас-
чете на стандартные условия). Для сравнения:
при расщеплении обычной фосфоэфирной связи
в различных молекулах этот параметр составля-
ет от 9 до 20 кДж/моль, а конкретно в молекуле
АМФ (связь между фосфатом и рибозой) - око-
ло 12 кДж/моль.
Таким образом, макроэргической называ-
ют связь, обладающую значительно повышен-
ным запасом свободной энергии, пригодной
для выполнения полезной работы. В молекуле
АТФ (и ее аналогов) такой потенциал полезной
энергии сосредоточен в кислотоангидридных
связях, возникающих при соединении двух ос-
татков фосфорной кислоты. Энергетически эк-
вивалентны им макроэргическая связь в моле-
куле пирофосфата (Н4Р2О7) и тиоэфирные свя-
зи органических кислот с коферментом А. Еще
выше потенциал в молекулах фосфоамидов,
смешанных ангидридов фосфорной и карбоно-
вых кислот (40-50 кДж/моль), а также енол-
фосфатов (более 60 кДж/моль).
Каждое из макроэргических веществ пере-
численных групп занимает свое место в био-
химических процессах. И только АТФ причас-
тен к самым разным реакциям, идущим с боль-
шими перепадами свободной энергии (и пото-
Рис. 2-8. Строение аденозинтрифосфата (АТФ).
58
Глава 2
му практически необратимым). Обычная кон-
центрация этого макроэрга в клетках млекопи-
тающих составляет около 1 ммоль/л.
Как правило, именно АТФ возникает за
счет энергии, выделяемой в экзэргонических
реакциях катаболизма^ т.е., расщепления пи-
щевых веществ до более простых соединений
(в конечном счете - до СО2 и Н2О). При этом
почти вся энергия, заключенная в химических
связях органических молекул пищи, освобож-
дается на окислительных этапах их разложе-
ния. Более половины ее используется клетками
для синтеза АТФ из АДФ и неорганического
фосфата (Фн)- Механизмы трансформации
энергии биологического окисления в энергию
макроэргических связей АТФ будут рассмот-
рены в главе 5. Здесь лишь отметим, что пря-
мое преобразование освобождаемой энергии в
энергию молекул АТФ обладает исключитель-
но важными преимуществами.
Во-первых, преобладающая доля энергии,
выделяемой в реакциях катаболизма, уберега-
ется от рассеивания в виде тепла, которое «бес-
полезно» для организма (в том смысле, что не
может быть использовано для совершения по-
лезной работы из-за изотермичности живых
существ). Во-вторых, молекулы АТФ доста-
точно устойчивы, чтобы быть средством нако-
пления (депонирования) химически связанной
полезной энергии и даже переноса ее к участ-
кам потребления. Наконец, именно макро-
эргические связи АТФ почти всегда служат
клетке наиболее доступным поставщиком
энергии для осуществления эндэргонических
процессов (т.е., требующих затраты энергии).
Все разнообразие таких процессов можно све-
сти в три группы:
— синтез сложных органических молекул
из более простых предшественников (процессы
анаболизма);
- механическая работа, в том числе со-
кращение и расслабление мышц, движение
внутриклеточных органелл;
- трансмембранный перенос веществ,
включая активный транспорт ионов и молекул
против градиента концентрации (создание ко-
торого для ионов Na+ и К+ лежит в основе
электрических явлений, — таких как возникно-
вение и распространение нервного импульса).
Важно подчеркнуть, что во всех этих энер-
гоемких процессах происходит прямая переда-
ча энергии от АТФ, не требующая реакции
гидролиза макроэргической связи за счет воды.
Для пояснения можно привести в общем
виде реакцию синтеза вещества С-D из более
простых предшественников:
I: С-ОЯ + С-Я —С-Б + Я2О
Она явно относится к эндэргоническим.
Если затраты энергии на ее реализацию со-
ставляют. например, 12 кДж/моль, то спонтан-
но она протекать не может. Однако возможно
образование С-D путем двух последовательных
реакций:
Па: С-ОН + АТФ -> С-О-РО3Н2 + АДФ
ПЬ: С-О-РО3Я2+ D-Я -> С-D + Н3РО4
Па + ПЬ: С-ОН + D-Я + АТФ -*
—»C-D + АДФ + Н3РО4
Приведенный пример показывает, что син-
тез молекул С-D (расход 12 кДж/моль) легко
осуществим за счет сопряжения его с распадом
АТФ до АДФ и Фн (освобождающим примерно
32 кДж/моль): суммарный итог процесса сво-
дится к выделению около 20 кДж энергии на
моль синтезированного С-D (в расчете на стан-
дартные условия). Такой уровень экзэргонич-
ности практически полностью смещает равно-
весие сопряженных реакций в сторону синтеза
вещества С-D за счет энергии распада АТФ до
АДФ и Н3РО4-
Очень важно обратить внимание, что вода,
необходимая для такого распада, отсутствует в
левой части итогового уравнения. И действи-
тельно, утилизация макроэргической связи для
обеспечения энергоемких процессов происхо-
дит не путем гидролиза (освобождающего всю
полезную энергию в виде тепла), а совсем ина-
че. В данном случае концевая фосфатная груп-
па АТФ сначала (реакция Па) переносится на
один из субстратов (такого рода реакции ката-
лизирует масса ферментов, обозначаемых тер-
мином киназа с добавлением названия фосфо-
рилируемого субстрата). Затем, на стадии ПЬ,
фосфорилированный субстрат соединяется с
другим предшественником (D-Я), освобождая
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
59
молекулу фосфорной кислоты (Фн). Получает-
ся, что для превращения АТФ в АДФ и Ф1( ис-
пользуется «скрытая» вода, - та, элементы ко-
торой {-ОН и -Н) находились в составе мо-
лекул-предшественников и «изымались» из них
в состав АДФ и Н3РО4.
Нередко использование АТФ в целях
энергообеспечения реакций синтеза осуществ-
ляется иным способом. А именно: к одному из
исходных веществ присоединяется не фосфат-
ная группа, а аденозильная часть макроэрга.
Тем самым резко повышается реакционная
способность этого вещества. Иными словами,
оно преобразуется в «активную форму», спо-
собную легко реагировать с другим веществом.
В частности, путем передачи ему определенно-
го фрагмента своей молекулы.
В качестве примера на рис. 2-9 приведена
реакция активации метионина. Точнее, в дан-
ном случае повышенную реакционную способ-
ность приобретает не вся аминокислота, а
только ее метильная группа, ковалентно при-
соединенная к атому серы.
Уникальность этой реакции заключается в
том, что ей сопутствует отщепление от АТФ не
одного и даже не двух, а всех трех фосфатных
остатков: два из них освобождаются в форме
пирофосфата (ФФ). а третий — в виде Фн (реак-
ция 1). В результате аденозильный фрагмент
молекулы АТФ оказывается присоединенным к
атому серы метионина, делая весьма неста-
бильной связь этого атома с метильной груп-
пой. Катализирует весь этот процесс специаль-
ный фермент — метионин-аденозиптрансфера-
за. Образующийся S-аденозил метионин явля-
ется главнейшим донором метильных фрагмен-
тов, переносимых различными метилтрансфе-
разими на соответствующие акцепторы (А-Н на
рис. 2-9). Теряя метильную группу, S-аденозил-
метионин превращается в S-аденозилгомоцис-
L-Метионпн
СНз
с
| АТФ+HzO ФФ+Фн
сНз \ 7
?Нг ф
hc-nh2
соон
(.-Гомоцистеин
SH
L, Аденозин HzO
СГ12 Ц- ,
СН, <.V-------V
HC-NH, (3)
СООН
Рис. 2-9. Активация метионина (1), его использование в реакциях метилирования (2)
и последующий гидролиз с освобождением гомоцистеина (3).
60
Глава 2
теин (реакция 2). Гидролиз этого метаболита
(реакция 3) ведет к освобождению гомоцистеи-
на (который может быть использован для реге-
нерации метионина специальными фермент-
ными системами).
Аналогично приведенным примерам про-
исходит преобразование потенциала макроэр-
гической связи АТФ и в другие формы энергии
(механическую, осмотическую): и в этих слу-
чаях АТФ расщепляется до АДФ и Фн, но не
путем простого гидролиза водой.
Таким образом, в энергетическом мета-
болизме АТФ выполняет роль своеобразного
аккумулятора полезной энергии: АТФ образу-
ется в клетках из АДФ и Фн за счет окисления
органических молекул пищи (зарядка «аккуму-
лятора») и распадается вновь до АДФ и Фн,
отдавая свою энергию на все виды работы (раз-
рядка «аккумулятора»).
Более того, АТФ является универсальным
накопителем энергии. Его аналоги (ГТФ, УТФ
и др.) образуются лишь в ограниченных объе-
мах и утилизируются в довольно редких реак-
циях. Вместе с тем, все мононуклеотидные
макроэрги тесно взаимосвязаны.
Специальные ферменты (нуклеозидмоно-
фосфаткг/нязы) катализируют обратимый пере-
нос фосфатной группы (вместе с ее макроэрги-
ческой связью) с АТФ на ГМФ, ЦМФ и т.д.,
превращая их в соответствующие дифосфаты.
Последние, в свою очередь, за счет еще одной
молекулы АТФ могут превращаться в свои
трифосфатные формы (под действием нуклео-
зиддифосфаткдиш). Можно сказать, существу-
ет целый «клуб» мононуклеотидов, члены ко-
торого легко обмениваются макроэргическими
фосфатными группами.
И здесь снова приходится отметить осо-
бую роль АТФ. Как уже отмечалось, его обра-
зование, обеспечиваемое реакциями окисли-
тельного катаболизма, происходит путем фос-
форилирования молекул АДФ. Молекулы
АМФ, образуемые во многих реакциях утили-
зации АТФ, непригодны для такого способа
регенерации АТФ. Поэтому из всех нуклео-
зидмонофосфаткиназ наиболее востребована
аденилаткиназа, которая есть почти в любой
клетке и катализирует обратимую реакцию об-
разования двух молекул АДФ из АМФ и АТФ:
АМФ + АТФ <--------> 2 АДФ [2-1]
Представленная уравнением [2-1] аде-
нилаткиназная реакция обеспечивает, по суще-
ству, регенерацию АДФ из АМФ. Иными сло-
вами, она необходима для возврата АМФ в
энергетический кругооборот. Но есть у нее еще
одна смысловая нагрузка: устранение мощного
активирующего (или угнетающего) влияния,
которое АМФ оказывает на ряд ключевых фер-
ментов энергетического метаболизма (см. раз-
делы 6.5.3 и 6.7.2).
2.2.3. ЦИКЛИЧЕСКИЕ ФОРМЫ
МОНОНУКЛЕОТИДОВ
Крупным достижением биохимии явилось
открытие аденилатциклазы (1960). Этот фер-
мент, встроенный в плазматическую мембрану
с ее внутренней (цитоплазматической) сторо-
ны, катализирует отщепление пирофосфатного
остатка (ФФ) от молекулы АТФ. Реакция эта,
показанная на рис. 2-10, требует присутствия
ионов Mg2+. Необычность ее в том, что осуще-
ствляется она без участия воды или еще каких-
либо молекул: фосфатная группа, остающаяся
в 5-м положении рибозы, замыкается (после
отделения ФФ) еще и на 3-ий углеродный атом
той же рибозы (но уже не кислотоангидридной,
АТФ цАМФ АМФ
Рис. 2-10. Образование и гидролиз циклического аденозин-3',б’-монофосфата (цАМФ)
лод действием аденилатииклазы (I) и цАМФ-фосфодиэстеразы (II) соответственно.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
61
как было, а сложноэфирной связью). Значит,
появляется не моноэфир аденозина (как в
обычном АМФ), а диэфирное соединение фос-
фатной группы и с 5-м, и с 3-м углеродными
атомами его рибозы. В результате этого, наря-
ду с тремя циклическими структурами обыч-
ной («линейной») молекулы АМФ, появляется
еще один гетероцикл - шестичленный, вклю-
чающий атом фосфора, два атома кислорода и
трехуглеродный фрагмент рибозы (на рис. 2-10
атомы этого цикла выделены курсивом). Пол-
ное название этого необычного продукта - цик-
лический аденозин-3',.5'-монофосфат. Обычно
употребляют сокращенное название (цикло-
АМФ) или краткое обозначение (цАМФ). Кон-
центрация цАМФ в клетках на 3 порядка ниже
уровня АТФ и составляет около 1 мкмоль/л.
Позднее был открыт аналогичный фермент
(гуанилатциклаза), превращающий ГТФ в пи-
рофосфат и циклический гуанозин-3'^'-моно-
фосфат (цГМФ).
Для нуклеозидтрифосфата отщепление
ФФ означает потерю двух макроэргических
связей (одна из них сохраняется в молекуле
пирофосфата Н4Р2О5). Это указывает на высо-
кую экзэргоничность процесса, обеспечиваю-
щую необратимое течение реакции в сторону
образования цАМФ (или цГМФ). Отмеченная
необратимость усиливается гидролизом ФФ до
двух молекул Н3РО4, осуществляемым пиро-
фосфатазой.
Тем не менее, циклические формы нуклео-
зидмонофосфатов недолговечны- Будучи диэфи-
рами, они легко гидролизуются до обычной
(«линейной») формы АМФ (ГМФ) под действи-
ем фосфодиэстеразы (см. рис. 2-10), эффект
которой тоже необратим. Известен ряд вариан-
тов этого фермента, различающихся по пред-
почтению к цАМФ или к цГМФ, а также по
чувствительности к регуляторным влияниям (в
том числе - со стороны ионов Са2+).
Биологическое предназначение цикличес-
ких нуклеотидов - выполнять роль вторичного
посредника (см. раздел 1.9) в системах переда-
чи внешнего сигнала от возбужденного им ре-
цептора на те внутриклеточные макромолеку-
лы, которые реализуют ответную реакцию
клетки. Набор таких сигнальных путей относи-
тельно невелик.
Аденнлатцнклазная система - один из
наиболее распространенных путей сигнальной
трансдукции. Через нее осуществляют свое
влияние многие гормоны, воздействующие на
клеточные рецепторы. К их числу относятся ад-
реналин (для которого известна серия разных
адренорецепторов), глюкагон, соматостатин,
паратгормон, вазопрессин, ряд тропных гормо-
нов. Из-за сложности этой системы целесооб-
разно подразделить ее работу на три последова-
тельных этапа: организация выработки цАМФ;
регулирование его концентрации в клетке; реа-
лизация конечных эффектов гормона.
Выработку цАМФ инициирует распо-
знание рецептором соответствующей сигналь-
ной молекулы. Сорбция ее на центре узнава-
ния, имеющемся во внеклеточном участке ре-
цептора, вызывает конформационную пере-
стройку, которая охватывает и его внутримем-
бранную часть, а также внутриклеточный до-
мен. Более того, она вовлекает еще и особый
регуляторный белок, примыкающий к рецепто-
ру со стороны цитоплазмы. Он состоит из трех
разных мономеров (а. р и у) и обозначается как
G-протеин, поскольку в его а-субъединице
есть центр связывания молекулы гуанозинди-
фосфата (ГДФ).
Изменение конформации G-протеина при-
водит, во-первых, к «отказу» от ГДФ с заменой
его на ГТФ (имеющийся в цитозоле, как и дру-
гие мононуклеотиды). Во-вторых, комплекс
а-субъединицы с ГТФ отделяется от остальной
части G-протеина, получая возможность сво-
бодной миграции. Встретившись с одной из
ближайших молекул аденилатциклазы, ком-
плекс объединяется с нею, в результате чего
фермент переходит в активную форму. Так
осуществляется запуск ферментативной реак-
ции превращения АТФ в цАМФ в ответ на
стимуляцию рецептора. Интенсивность выра-
ботки цАМФ зависит от числа вовлеченных
молекул аденилатциклазы и от уровня их ак-
тивности, которая зачастую чувствительна к
регуляторным влияниям таких факторов, как
аденозин, Mg2+, Мп2+, Са24.
Регулирование концентрации цАМФ
осуществляется двумя независимыми механиз-
мами.
Один из них предотвращает бесконечную
продукцию цАМФ в ответ на однократную
62
Глава 2
(«мимолетную») стимуляцию рецептора. Он
обеспечивается способностью а-субъединицы
G-протеина не только присоединять к себе мо-
лекулу ГТФ, но и гидролизовать ее до ГДФ и
Фн. Эта ферментативная активность а-субъеди-
ницы очень невелика. Поэтому комплекс ее с
ГТФ продолжает некоторое время пребывать в
объединении с аденилатциклазой и поддержи-
вать ее в активном состоянии, стимулируя вы-
работку все новых порций цАМФ. Но как
только гидролиз ГТФ свершится, а-субъеди-
ница оказывается в комплексе не с ним, а
с ГДФ. В такой форме она не может сохранять
контакт с аденилатциклазой и покидает ее,
В итоге фермент возвращается в неактивную
форму и прекращает выработку цАМФ. Следо-
вательно, комплекс а-субъединицы с ГТФ дей-
ствует как своеобразный таймер: длительность
стимулирующего действия на аденилатциклазу
предопределена сроком, требуемым комплексу
для самоинактивации (реализуемой путем гид-
ролиза ГТФ).
Но и это еще не все. Расщепив ГТФ и
удерживая возникший ГДФ, а-субъединица
может теперь воссоединиться с покинутыми
ею р- и у-мономерами, а реставрированный в
итоге G-протеин способен вновь примкнуть к
рецептору. Если тот уже успел освободиться от
гормона, то на этом все и завершится: рецептор
останется в готовности в очередной раз выпол-
нить свою функцию распознания лиганда (при
его новом появлении). Если же сигнальная мо-
лекула еще не успела покинуть рецептор, то
«возвратившийся» к нему G-протеин сразу же
подвергиется конформационной перестройке с
заменой ГДФ на ГТФ, — и все повторится сна-
чала, Значит, пока рецептор «занят» первич-
ным посредником, а-субъединица будет снова
и снова перемещаться от него к аденилатцик-
лазе и обратно, обеспечивая продолжение вы-
работки вторичного посредника (в данном слу-
чае - цАМФ),
Совершенно иной механизм контроля
осуществляет фосфодиэстераза, которая, как
уже отмечалось, гидролизует цАМФ до обыч-
ной («линейной») формы АМФ (см. рис, 2-10).
Этим обеспечивается довольно быстрое сни-
жение уровня цАМФ, накапливаемого в ходе
гормональной стимуляции аденилатциклазной
системы. Вместе с тем, различные формы фос-
фодиэстеразы тоже являются объектами кон-
троля со стороны ряда гормонов, включая те,
что регулируют концентрацию ионов Са2+ в
цитозоле (от которой сильно зависит фермента-
тивная активность некоторых фосфодиэстераз).
Влияют на этот фермент и отдельные экзоген-
ные вещества. В частности, такие производные
пурина, как кофеин и теофиллин, вызывают
обратимое угнетение фосфодиэстераз. Тем са-
мым они тормозят убыль цАМФ, имитируя со-
стояние возбуждения соответствующих кле-
точных рецепторов.
Реализация внутриклеточных эф-
фектов происходит путем влияния цАМФ на
конформационное состояние определенных
белков. Едва ли не единственной способностью
этого вторичного посредника является его ак-
тивирующее воздействие на протеинкиназу А.
Так обозначают группу ферментов, каждый из
которых катализирует перенос фосфатного ос-
татка с АТФ на тот или иной белок (точнее, на
гидроксильную группу серина или треонина в
составе этого белка-«мишени»), В итоге обра-
зуется фосфорилированная форма «атакован-
ной» макромолекулы:
АТФ АДФ
БЕЛОК-ОН > БЕЛОК-ОРО3Н2 [2-2]
Протеип-
киназа
Реакция эта протекает за счет энергии
макроэргической связи АТФ и потому необра-
тима. Гидролитическое расщепление образо-
вавшейся в белке фосфоэфирной связи воз-
можно под действием другого фермента -
фосфопротеинфосфатазы. Эта реакция тоже
необратима. Она осуществляет обратный пере-
ход фосфорилированного белка в его дефосфо-
рилированную форму:
Н2О Н3РО
БЕЛОК-ОРО3Н2 > БЕЛОК-ОН [2-3]
Фосфопротеин-
фосфатаза
Смысл этих довольно простых преобразо-
ваний в том, что они вызывают такую конфор-
мационную перестройку белка, которая карди-
нально изменяет его функциональную актив-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
63
ность. Очень часто в роли избирательной «ми-
шени» выступает определенный фермент, ра-
ботоспособность которого усиливается (или
тормозится) в результате фосфорилирования;
отщепление фосфатной группы фосфопротеин-
фосфатазой восстанавливает исходную актив-
ность. Нередко протеинкиназа фосфорилирует
не сам фермент, а белок, являющийся его акти-
ватором или ингибитором. Наконец, некоторые
цАМФ-зависимые протеинкиназы катализиру-
ют фосфорилирование так называемых факто-
ров транскрипции, — особых белков, чья функ-
ция состоит в том, чтобы «открывать» либо
«приостанавливать» доступ к информации, за-
ключенной в определенных генах.
Описанный вариант вклада аденилатцик-
лазной системы в преобразование внешних
сигналов реализуется с участием р2-адрено-
рецепторов (типичных для печеночных клеток
и скелетных мышц). Другой вариант сопряжен
с а2-адренорецепторами. Они находятся в кон-
такте с G-протеином иного строения, - таким,
а-субъединица которого (в комплексе с ГТФ)
оказывает не активирующее, а подавляющее
действие на аденилатциклазу (следовательно,
возбуждение а2-адренорецепторов не повыша-
ет, а снижает концентрацию цАМФ в клетке).
В этом контексте уместно упомянуть и про
oil-адренорецепторы, хотя связанный с ними
G-протеин вообще не взаимодействует с аде-
нилатциклазой: они инициируют совсем иной
путь преобразования сигнала, а именно - фос-
фоинозитидный каскад (раздел 3.3.4). Вторич-
ными посредниками в нем выступают не цикли-
ческие нуклеотиды, а совсем другие молекулы.
Однако и здесь необходимым соучастником яв-
ляются специфические протеинкиназы, группо-
вое название которых - протеинкиназа С.
Гуаннлатцнклазная система необычна
разнообразием своих воплощений. Вариант,
наиболее близкий аденилатциклазному пути,
оказался независимым от G-протеина. Ибо
здесь сам клеточный рецептор (точнее, его ци-
топлазматический фрагмент) является фермен-
том - гуанилатциклазой. Она становится ак-
тивной в результате конформационной пере-
стройки рецептора, вызываемой первичным
посредником. Молекулы цГМФ, генерируемые
возбужденным рецептором, оказывают активи-
рующее действие на протеинкиназу G. От про-
теинкиназ А и С она отличается своей «клиен-
турой», - спектром белков, приемлемых для
нее в качестве объекта фосфорилирования.
К ним относятся, в частности, белки, обеспечи-
вающие секрецию Na в почечных канальцах,
а также сократительные белки гладких мышц.
Через эти исполнительные молекулы реализу-
ются главные рецептор-опосредуемые эффекты
натрийуретического фактора предсердий
(группа небольших пептидов, выделяемых при
увеличении объема крови). Они сводятся к уси-
лению почечной экскреции Na (а с ним - и
воды), расширению сосудов вследствие рас-
слабления мышечных клеток их стенки и сни-
жению артериального давления крови.
Совсем иначе функционирует гуанилат-
циклазная система фоторецепторных клеток
сетчатки глаза. Начать с того, что рецептор
здесь локализован не в плазматической мем-
бране, как обычно, а в стопке уплощенных
мембранных мешочков (дисков), погруженных
в цитозоль. В ней и сосредоточены молекулы
трансмембранного белка родопсина (зритель-
ный пурпур). Этот светочувствительный пиг-
мент состоит из небольшого белка опсина и
витамина А (ретинол), — точнее, одной из его
альдегидных форм, обозначаемой как 11-цис-
ретиналь (рис. 2-11). Именно простетическая
группа, обладая системой сопряженных двой-
ных связей, поглощает квант света, который
превращает ее в алло-тиртс-ретинаиь, отде-
ляющийся от опсина из-за несоответствия его
центру связывания. Сопоставление изомеров
на рис. 2-11 показывает, что поглощенный фо-
тон фактически преобразуется в движение
концевого фрагмента полиеновой цепочки от-
носительно остальной части молекулы.
Такое изменение геометрии ретиналя при-
водит к быстрому (~ 1 мс) освобождению
а-субъединиц из ~ 500 молекул трансдуцина
(специальный G-белок). Как и обычно, они свя-
зываются с ГТФ и выполняют роль биологиче-
ского таймера. Однако эти субъединицы со-
вершенно уникальны тем, что в комплексе с
ГТФ активируют не протеинкиназу, а цГМФ-
фосфодиэстеразу! Следовательно, возбуждение
фоторецепторов ведет не к приросту молекул
цГМФ, а к быстрому падению их концентрации
в цитозоле. Это, в свою очередь, изменяет кон-
формацию белков, образующих натриевые ка-
64
Глава 2
Ретинол
алло-гдз/с-Ретиналь
Рис. 2-11. Ретинол (витамин А) и его альдегидные формы.
налы в плазматической мембране. Наступаю-
щее уменьшение потока Na+ в клетку приводит
к увеличению электроотрицательности внут-
ренней поверхности этой мембраны (относи-
тельно наружной), что воспринимается окон-
чаниями зрительного нерва как сигнал к гене-
рированию нервного импульса, который затем
передается в мозг.
Гуанилатциклазная система фоторецепто-
ров не только улавливает и преобразует свето-
вые сигналы, но и действует как очень эффек-
тивный фотоумножитель: поглощения единст-
венного фотона достаточно для возбуждения
всей светочувствительной клетки и возникно-
вения нервного импульса. Готовность рецепто-
ра к восприятию нового фотона обеспечивается
регенерацией 11-г/ис-ретиналя в серии фер-
ментативных реакций. При этом алло-транс-
ретиналь сначала подвергается восстановле-
нию до алло-/ирянс-ретинола, который затем
изомеризуется в И-цис-ретинол с последую-
щим окислением его спиртовой группы до аль-
дегидной.
Наконец, еще один вариант гуанила-щик-
лазной системы. Его реализует свободная фор-
ма фермента, растворенная в цитозоле. Не бу-
дучи связанной с мембранами, эта форма гуа-
нилатциклазы функционирует сама по себе,
вне зависимости от клеточных рецепторов. Она
реагирует на простейшую из всех известных
сигнальных молекул — оксид азота (NO), вы-
рабатываемый многими типами клеток с по-
мощью специальной ферментной системы (см.
главу 5, рис. 5-47). Благодаря хорошей раство-
римости в липидах, оксид азота легко проника-
ет через мембраны. Вместе с тем, он быстро (в
течение секунд) окисляется до NO2 и NO3. По-
этому в качестве медиатора NO успевает по-
влиять только на клетки, близкие к месту его
выработки. Простетической группой раствори-
мой гуанилатциклазы является гем (см. рис.
1-26), который очень легко улавливает молеку-
лу NO, благодаря чему активность фермента
может возрастать в сотни раз. Образующийся
при этом цГМФ способствует расслаблению
гладких мышц, снижению сосудистого тонуса.
Впрочем, растворимая аденилатциклаза явля-
ется, по-видимому, далеко не единственной
мишенью оксида азота.
Тирозин киназная система заслуживает
краткого описания в ряду других путей сиг-
нальной трансдукции, хотя и обходится без
привлечения циклических нуклеотидов. Она
располагает рецепторами для большинства так
называемых факторов роста и для некоторых
гормонов, таких как инсулин. Каждый рецептор
этой системы представляет собой трансмем-
бранный белок, внешняя часть которого содер-
жит центр распознавания сигнальной молекулы,
а обращенный к цитоплазме фрагмент функ-
ционирует как фермент тирозинкиназа. В отли-
чие от других протеин киназ, она переносит
фосфатную группу с АТФ на радикал тирозина,
а не серина или треонина. Более того, модифи-
цируемые ею остатки тирозина принадлежат не
каким-либо белкам, а самому рецептору (его
цитоплазматическому фрагменту). Иными сло-
вами, тирозинкиназа осуществляет аутофосфо-
рилирование. Происходит оно в условиях акти-
вации фермента, вызываемой димеризацией ре-
цептора (сближением соседних молекул), кото-
рая наступает под влиянием соответствующего
гормона или иной сигнальной молекулы.
Множественное самофосфорилирование
димерной тирозинкиназы стимулирует ее про-
теинкиназную активность в отношении опре-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
65
деленных белков цитоплазмы. Часть из них
относится к ферментам, фосфорилирование
которых изменяет их каталитическую актив-
ность и, следовательно, скорость соответст-
вующего пути метаболизма. Результатом про-
теинкиназного фосфорилирования других бел-
ков-мишеней становится «включение» того
направления сигнального пути, которое ведет
от мембранного рецептора к ядру клетки и за-
вершается активацией определенного фактора
транскрипции- Это сложный, зачастую много-
ступенчатый процесс, изученный пока не во
всех деталях. Установлено, однако, что здесь
нет вторичных посредников малого размера:
все его звенья являются белками. Среди них -
небольшой мономерный Ras-белок. Он анало-
гичен а-субъединице G-протеина других сиг-
нальных систем, в том числе — по исполнению
таймерной функции. Объединяясь с рядом дру-
гих цитоплазматических белков (один из кото-
рых сначала сорбируется на фосфорилирован-
ном рецепторе), Ras-белок (в комплексе с ГТФ)
инициирует активацию каскада протеинкиназ
серин/треонинового типа. Конечным звеном
каскада становится фосфорилирование белка,
контролирующего тот или иной участок моле-
кулы ДНК. Такая нацеленность тирозинкиназ-
ного пути на регуляцию генетического аппарата
делает неудивительным тот факт, что аномалии
белковых звеньев этого пути часто бывают он-
когенными, приводя к неуправляемому делению
клеток.
2.3. СТРОЕНИЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ
Нуклеиновые кислоты представляют собой
линейные (неразветвленные) полимеры нуклео-
зидмонофосфатов. Любой полинуклеотид по-
строен либо из рибонуклеотидных мономеров,
либо из дезоксирибонуклеотидных. Этому соот-
ветствуют и названия: рибонуклеиновые кисло-
ты (РНК) и дезоксирибонуклеиновые кислоты
(ДНК). Последние сосредоточены в ядрах кле-
ток (если не считать митохондрии, которые, как
и хлоропласты, обладают специальными моле-
кулами ДНК для собственных нужд).
2.3.1. РИБОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
При биосинтезе рибонуклеиновых кислот
в их состав включаются 4 рибонуклеотида, а
именно: АМФ, ГМФ, ЦМФ и УМФ. Исходным
материалом при этом служат трифосфатные
формы мономеров. Создание полинуклеотид-
ной цепи осуществляет РНК-полимераза. Этот
фермент, отщепив ФФ от нуклеозидтрифосфата,
соединяет фосфатный конец оставшегося нук-
леозидмонофосфата с 3-м углеродным атомом
рибозы другого мононуклеотида (рис. 2-12). Та-
ким образом, пентозные фрагменты мономеров
АТФ
Рис. 2-12. Образование межнукпеотидной 5'—►З'-фосфодиэфирной связи.
66
Глава 2
оказываются соединенными через фосфатную
группу, которая образует две эфирные связи: с
5-м углеродным атомом рибозы (5*) одного мо-
нонуклетотида и 3-м атомом рибозы (3') друго-
го. Первая существовала в бывшем нуклеозид-
трифосфате, а вторая возникла заново (под
действием фермента). Иными словами, РНК-
пол имераза формирует 5 —>3 -фосфодиэфирное
соединение соседних мононуклеотидов. Быст-
рый гидролиз выделившегося ФФ, реализуе-
мый пирофосфатазой, закрепляет необрати-
мость образования такого соединения.
Аналогичным образом РНК-полимераза
может присоединять к полученной молекуле
третью мононуклеотидную единицу, к ней -
Рис. 2-13. Схема первичном структуры фрагмента
молекулы РНК.
четвертую, затем пятую и т.д. Каждый раз оче-
редное звено фиксируется своей 5-фосфатной
группой на 3-м углеродном атоме рибозы пре-
дыдущего мононуклеотида. Пока оно остается
концевым, это звено обозначается как 3'-конец
полимера. Именно с этой стороны «дозволено»
наращивание полинуклеотидной цепи, по-
скольку расположенная здесь рибоза имеет
свободную группу -ОН в положении 3. На дру-
гом конце, обозначаемом как 5'-конец, рост
цепи невозможен, т.к. З'-гидроксильная группа
здесь уже вовлечена в межнуклеотидную связь.
Эту часть молекулы обозначают как начало по-
линуклеотидной цепи. Трифосфатный «хвост»,
показанный в положении 5' на рис. 2-12, отще-
пляется после завершения биосинтеза полиме-
ра, так что в готовых молекулах полинуклеоти-
дов в позиции 5' обычно тоже находится сво-
бодная гидроксильная группа.
Молекула РНК может насчитывать от
многих десятков до нескольких тысяч моно-
нуклеотидных единиц. И всегда она содержит
длинную цепь чередующихся остатков рибозы
и фосфата, составляющую единообразный
стержень (остов) любой РНК (рис 2-13). С каж-
дым из рибозных фрагментов этого остова со-
единен остаток того или иного из 4 азотистых
оснований. Если не считать величину молекул,
то различаются РНК лишь тем, в какой после-
довательности 4 разных основания чередуются
по длине стандартного остова. Порядок чере-
дования и обозначается как первичная струк-
тура молекулы РНК.
2.3.2. ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
По общему плану устройства первичной
структуры молекулы ДНК не имеют принци-
пиальных отличий от РНК. Есть лишь две осо-
бенности. Во-первых, вместо рибозы в молеку-
лах ДНК содержится дезоксирибоза. Во-вто-
рых, в них отсутствует урацил, но есть 5-ме-
тилурацил, именуемый обычно тимином (см.
рис. 2-1).
С учетом этих нюансов, все изложенное
про структуру РНК полностью распространя-
ется и на ДНК. Это касается и способа соеди-
нения мономеров, которое тоже происходит в
направлении 5'—>3' (хотя ферментом в данном
случае является ДНК-полимераза}.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
67
Главные различия начинаются с простран-
ственной организации макромолекул. Если
РНК представляет собой единственную поли-
мерную цепь, то молекула ДНК всегда (за ис-
ключением ДНК некоторых вирусов) состоит
из двух полинуклеотидных цепей, располо-
женных параллельно- Они не одинаковы по
строению и даже не являются зеркальным от-
ражением одна другой. Вместе с тем, эти цепи
строго соответствуют друг другу. Высокую
точность их взаимной комплементарное™
обеспечивает одна структурная закономер-
ность: против крупного (бициклического) ос-
нования одной цепи всегда находится менее
объемное пиримидиновое основание, принад-
лежащее смежной цепи. Точнее, пуриновые
основания образуют с пиримидиновыми только
такие пары: А..Т и Г..Ц (рис. 2-14). Именно
в этих парах основания комплементарны друг
другу и, будучи соединены водородными свя-
зями, точно укладываются в расстояние между
двумя параллельными пентозофосфатными
«стержнями» молекулы ДНК (дистанция меж
глиикозидными связями их пентоз составляет
около 1,1 нм).
Таким образом, молекулу ДНК можно
представить как две-нити. Обе формируются
н
Аденин
...Чх /СНа
---Na еС-Н
У2 ’kiZ
С — |
Д Пентоза
I
ТИМ4Н Фосфат
Н
N—Н..О
: v.c:
Н
с—С
//5 4 \>
Н — Св 3N.Н—N’
>’~Ч >
о..н—N
N- /
?N
'Пентоза
Фосфат
Пентоза
Н
Фосфат
I Цитозин
Гуанин
Рис. 2-14. Комплементарные пары азотистых
оснований в молекуле ДНК
(А соединяется с T двумя водородными связями,
а Г с Ц - тремя).
5‘-конец 3-конец
/Ч А А Ут . п"
Ф. ________ Я>
п|Д~- I fin
Хч г
ф _________________ ф
ХП-| Т /•••/ А |-П^
Хч г п"0
ф _________________ ф
ХПЧ А \-\ Т 1-П
ф^ ________
,п 1~Ц rLn
З'-конец 5-конец
Рис. 2-15. Фрагмент двухцепочечной молекулы ДНК
(схема).
чередованием остатков фосфата и дезоксири-
бозы и имеют боковые «веточки» в виде А, Г,
Ц или Т на каждом пентозном звене (рис.
2-15). Благодаря комплементарности в парах
А.Т и Г.Ц комплементарными между со-
бой оказываются и сами цепи: порядок чередо-
вания азотистых оснований в одной из них
строго соответствует последовательности их в
другой (но не тождественен ей!). Важно отме-
тить, что эти цепи антипараллельны: если в
одной из них направление 5'—>3' обращено, на-
пример, сверху вниз (как на рис. 2-15, слева),
то в другой (изображенной справа) оно ориен-
тировано наоборот - снизу вверх.
Двухцепочечное строение молекулы ДНК
постулировали в 1953 г. Джеймс Уотсон и
Френсис Крик. Под впечатлением только что
опубликованных гипотез о возможных вариан-
тах вторичной структуры белка они подвергли
анализу ставшие известными картины дифрак-
ции рентгеновских лучей на нити ДНК. На
этой основе ученые предложили структурную
модель, согласно которой молекула ДНК со-
стоит из двух полинуклеотидных цепей, закру-
ченных вокруг общей оси (рис. 2-16). Самым
3 -конец
Рис. 2-16. Схема двойной спирали ДНК
по Дж. Уотсону и Ф. Крику.
68
Глава 2
ценным в этой модели двойной спирали
ДНК явилось обоснование комплементарное™
цепей как результата комплементарное™ пар
азотистых оснований, сидящих на спирализо-
ванном пентозофосфатном остове каждой из
них. При этом пуриновые и пиримидиновые
основания находятся внутри спирали, а высоко
гидрофильные пеитозофосфатные цепи обви-
вают их снаружи. Имея плоскую, преимущест-
венно неполярную структуру, каждое азоти-
стое основание одной цепи соединено водо-
родными связями с парным ему основанием
другой цепи, находящимся в той же плоскости,
перпендикулярной оси спирали. Поэтому про-
странственная организация молекулы ДНК
фиксируется не только водородными связями
(А с Т, Г с Ц), направленными поперек цепей,
но и гидрофобными взаимодействиями, кото-
рые возникают между плоскостями азотистых
оснований, уложенных стопкой внутри двой-
ной спирали.
Правильность модели, предложенной Дж.
Уотсоном и Ф. Криком, вскоре получила экс-
периментальные подтверждения. Дальнейшие
исследования позволили значительно развить
представления о пространственной организа-
ции молекул ДНК. В частности, была установ-
лена вариабельность конформации двойной
спирали. Вариант правозакрученной спирали,
описанный первооткрывателями, насчитывает
10 пар оснований (п.о.) в одном витке, а шаг ее
составляет 3,4 нм при толщине 2 нм. Эта форма
считается доминирующей в физиологических
условиях и теперь обозначается как В-форма.
Другой из известных теперь вариантов
(A-форма) имеет несколько меньший диаметр и
содержит 11 п.о. в каждом витке протяженно-
стью 2,8 нм (по оси спирали). Выявлен и лево-
закрученный вариант спирали (Z-форма): при
толщине 1,7 нм она содержит 12 п.о. на каж-
дый виток.
Даже будучи скрученной в двойную спи-
раль, молекула ДНК остается чрезвычайно
длинной, достигая 8 см (в хромосоме 2 челове-
ка). При поперечнике 2 нм это делает ее крайне
уязвимой. Поэтому важное значение имеют
высшие структуры ДНК, призванные обеспе-
чить компактную укладку. Начальным элемен-
том упаковки являются нуклеосомы. Сердцеви-
ну каждой из них составляет октамер, образуе-
мый четырьмя димерами гистонов Н2А, Н2В,
НЗ и Н4. Вокруг такого белкового комплекса,
богатого положительными зарядами, участок
двойной спирали длиной около 150 п.о. делает
почти два оборота. Начало и конец этих оборо-
тов фиксируются на нуклеосоме гистоном Н1.
В результате каждая нуклеосома почти в 7 раз
укорачивает «свой» фрагмент ДНК и, кроме
того, защищает его от воздействия ферментов.
Участки двойной спирали (длиной в десятки
п.о.), расположенные между соседними нук-
леосомами, называют линкерными.
Образованная структура похожа на цепь
бусинок толщиной около 10 нм. Она затем
складывается (возможно, спиралеобразно) в
более толстую нить (диаметром до 30 нм), ко-
торая образует сильно вытянутые боковые пет-
ли (500-1000 п.о. каждая). Основания этих тес-
но уложенных петель закреплены на централь-
ном остове из негистоновых белков, пока еще
почти не изученных. Перечисленные уровни
конденсации ДНК позволяют сократить линей-
ные размеры молекулы на 4 порядка, уместив
ее пределах хромосомы.
2.4. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ
МОЛЕКУЛ ДНК
Длительное время считалось, что носите-
лем наследственности являются хромосомные
белки. Такому пониманию способствовали и
успехи иммунологии, демонстрировавшей не
только видовые различия этих макромолекул,
но и специфику белков каждого индивидуума.
Лишь в 1944 г. было показано, что с помощью
ДНК, выделенной из патогенных пневмокок-
ков, можно передавать наследуемые признаки
(вирулентность, способность синтезировать
капсулу) непатогенному, бескапсульному му-
танту этих бактерий. Более того, оказалось, что
перенесенные вместе с ДНК качества закреп-
ляются в потомстве. Через 8 лет определяю-
щую роль ДНК в наследственности подтверди-
ли и опыты с мечеными атомами - 32Р (для
ДНК) и 35S (для белков). Когда Дж. Уотсон и
Ф. Крик предложили модель двойной спирали
ДНК, сразу же стала очевидной ее пригодность
для объяснения механизма точного копирова-
ния этих молекул, наступающего при делении
клеток. Они постулировали, что двойная спи-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
69
раль может расплетаться, позволяя полинук-
леотидным нитям расходиться так, чтобы на
каждой из них, как на шаблоне (матрице), мог-
ла синтезироваться новая нить, полностью ком-
плементарная своей матрице (рис. 2-17). В ре-
зультате появляются две новые двухцепочеч-
ные молекулы, являющиеся точными копиями
исходной (родительской) ДНК. При этом каж-
дая из копий содержит одну родительскую
нить, а вторую — вновь синтезированную, точ-
но повторяющую ту цепь, которая оказалась в
другой дочерней молекуле ДНК.
Среди атрибутов подлинной науки — ее
предсказательная сила. Модель двойной спи-
З'-конвц 5-конец з-конец 5-конец
Рис. 2-17. Принцип удвоения (репликации) молекулы ДНК:
А - расхождение полинуклеотидных цепей родительской
ДНК (выделены затенением); Б - построение новых цепей,
комплементарных каждой из исходных «половинок».
рали ДНК открыла путь к разработке немыс-
лимых ранее методов, многие из которых ис-
пользуют принцип комплементарности. Уси-
лиями мирового научного сообщества вскоре
были не только раскрыты молекулярные осно-
вы наследственности и механизмы биосинтеза
белка, но и обеспечено бурное развитие всего
комплекса биологических наук, включая соз-
дание различных направлений современной
биотехнологии.
Теперь мы знаем, что наследственность -
это способность передавать потомству ин-
формацию о строении белковых молекул, спе-
цифичных для данного организма.
Материальным носителем этой информа-
ции являются молекулы ДНК (у некоторых ви-
русов - молекулы РНК). Она закодирована в
них характером чередования четырех азоти-
стых оснований на стандартном пентозофос-
фатном остове. Совокупность .всех молекул
ДНК клеточного ядра обозначается как геном.
Собственной ДНК (довольно скромных разме-
ров) обладают также митохондрии (и хлоро-
пласты).
Полностью расшифровать геном человека
удалось уже к 2001 году. Оказалось, что он со-
держит почти 3 млрд пар азотистых оснований
(в эухроматических участках ДНК хромосом)
и несет информацию о структуре примерно
26,5 тысяч белков. Для записи этой информа-
ции используется лишь 25% общей протяжен-
ности всех ядерных ДНК.
Роль любой молекулы ДНК двуедина. Во-
первых - хранение наследственной информа-
ции и безошибочная передача ее при смене по-
колений. Это обеспечивается дублированием
информации в комплементарных цепях ДНК.
Оно открывает возможность самовоспроизвод-
ства (репликации) каждой молекулы ДНК при
делении клетки (см. рис. 2-17).
Другой аспект функционального пред-
назначения ДНК - передача генетической ин-
формации системам, строящим белковые моле-
кулы. Она реализуется путем синтеза молекулы
РНК, комплементарной тому или иному участ-
ку одной из цепей молекулы ДНК. У эукариот
каждый такой участок — ген — несет информа-
цию о структуре одной полипептидной цепи и
является минимальной единицей наследствен-
ной информации. Сам процесс считывания ука-
70
Глава 2
заний, заключенных в структуре гена, обозна-
чается термином транскрипция (переписыва-
ние), а образующийся продукт {транскрипт)
получил название информационной РНК
(иРНК), поскольку она переносит информацию
от ДНК к месту синтеза белка. Чаще ее обозна-
чают как мРНК, производя это сокращение от
распространенного термина мессенджер-РНК
{messenger — связной, посыльный, курьер) либо
от названия матричная РНК, принятого в рус-
ской литературе и отражающего тот факт, что
мРНК синтезируется на ДНК как на матрице и,
в свою очередь, служит матрицей для наработ-
ки молекул соответствующего белка.
2.4.1. РЕПЛИКАЦИЯ (СИНТЕЗ ДНК)
Удвоение наследственного материала, ко-
торое предшествует делению клеточного ядра,
а затем и всей клетки, осуществляется путем
репликации каждой молекулы ДНК. Процесс
этот очень сложный и обеспечивается большой
группой ферментов и других белков. Он требу-
ет расхождения двух нитей ДНК с тем, чтобы
на каждой из них можно было синтезировать
комплементарную ей половину.
Инициирование репликации ДНК на-
ступает в S-фазе клеточного цикла. Оно проис-
ходит путем локального разделения полинук-
леотидных цепей в пункте, именуемом точкой
начала репликации. Здесь имеется специфиче-
ская последовательность оснований с повы-
шенной долей пар А.....Т, обеспечивающая
возможность сорбции особых белков, которые
способствуют расхождению цепей. Один из
них - фермент хеликаза — расплетает двойную
спираль, используя для этого энергию расщеп-
ления АТФ. Другие белковые молекулы (SSB-
белки - Single Strand Binding Proteins) связы-
ваются с каждой одиночной цепью, препятст-
вуя реставрации двойной спирали.
От точки начала репликации процесс рас-
плетения постепенно продвигается вдоль моле-
кулы ДНК в обе стороны. В каждой из них на-
чальный участок, где двуспиральная ДНК раз-
деляется на одиночные нити, обозначается как
репликативная вилка (рис. 2-18). Именно здесь
располагается хеликаза. Она продолжает рас-
кручивать двойную спираль со скоростью око-
ло 50 п.о. в секунду (у эукариот).
Обе репликативных вилки, удаляясь друг
от друга, проходят не всю молекулу ДНК, а
лишь расстояние до таких же вилок, движу-
щихся навстречу от соседних точек начала ре-
пликации. Полагают, что в молекуле эукарио-
тической ДНК более тысячи таких точек, и все
они включаются в процесс одновременно. По-
этому полная репликация генома млекопитаю-
щих завершается довольно быстро (8-9 ч), не-
смотря на медленное продвижение реплика-
тивных вилок.
Хеликаза не может вращать всю громад-
ную молекулу ДНК, особенно если учесть и
высшие структуры полимера. Поэтому ее про-
движение не только ведет к разделению цепей,
но и порождает тенденцию к усилению скру-
ченности впереди хеликазы. Проблему снимает
топоизомераза. Этот фермент способен разры-
Рис. 2-16. Синтез дочерних цепей ДНК на расплетенном участке родительской ДНК
[вертикальными прерывистыми стрелками отмечено положение репликативных вилок,
горизонтальными - направление их продвижения вдоль оси двойной спирели;
затенением выделены РнК-праймеры лидирующих цепей (А) и фрагментов Оказаки (Б)].
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
71
вать фосфатную перемычку в одной из цепей
ДНК. Тем самым создается возможность сво-
бодного вращения вокруг фосфоэфирной связи,
находящейся на таком же уровне в другой це-
пи. Это помогает дальнейшему раскручиванию
двойной спирали под действием приближаю-
щейся хеликазы.
Важно, что топоизомераза разрывает по-
линуклеотидную цепь не путем гидролиза, а
посредством «переключения» З'-фосфоэфир-
ной связи с дезоксирибозы на группу -ОН ра-
дикала тирозина в молекуле самого фермента.
Поэтому реакция легко обратима: после завер-
шения проворачивания фосфодиэфирный мос-
тик восстанавливается (без затраты энергии),
а освободившаяся топоизомераза может повто-
рять свою акцию в других участках двойной
спирали. Известна и такая топоизомераза, ко-
торая разрывает обе полинуклеотидные цепи,
а после «проворачивания» двойной спирали
вновь сшивает их.
Синтез новой цепи ДНК на одноце-
почечной матрице требует наличия всех четы-
рех субстратов - d-АТФ, d-ГТФ, d-ЦТФ и
d-ТТФ. Осуществляется он под действием
ДНК-полимераз. Их известно несколько типов.
Как и РНК-полимераза, все они образуют фос-
фодиэфирные связи только в направлении
5'—>3’ (см. раздел 2.3.1). Однако, в отличие от
нее, ДНК-полимеразы не могут соединить два
мононуклеотида (т.е., инициировать синтез но-
вой цепи), а способны лишь удлинять уже су-
ществующую цепь, даже если она является ри-
бонуклеотидной. Такая начальная цепь, обозна-
чаемая термином праймер (затравка), синтези-
руется с участием особой РНК-полимеразы,
которую именуют праймазой. Субстратами ее
являются, естественно, рибонуклеотиды в их
трифосфатной форме. Они фиксируются водо-
родными связями на родительской (дезокси-
рибонуклеотидной!) цепи, образуя комплемен-
тарные пары оснований (против Г оказывается
Ц будущего праймера, против Ц - Г, против
Т - А, но против А размещается У, а не Т, по-
скольку ТМФ не включается в состав РНК). По
мере выстраивания рибонуклеотидов на дезок-
сирибонуклеотидной матрице праймаза осуще-
ствляет замыкание фосфоэфирных связей
5'—>3' (как это было показано на рис. 2-12).
И только после завершения синтеза праймера
(длиной от 2 до 10 рибонуклеотидных звеньев)
дальнейший рост начинает осуществлять
ДНК-полимераза. Она продолжает наращива-
ние 3-конца новообразуемой цепи, но уже де-
зоксирибонуклеотидными мономерами, кото-
рые поочередно выстраиваются на одноцепо-
чечной нити родительской ДНК.
Синтез дочерней полинуклеотидной цепи
начинается в репликативной вилке сразу после
ее возникновения и продолжается по мере ее
продвижения. - сначала в форме затравочной
РНК (праймера), а затем в виде ДНК, копи-
рующей родительскую нить. Эта копия форми-
руется в антипараллельном направлении, как
это и свойственно двойной спирали ДНК.
Иными словами, синтез дочерней цепи в на-
правлении 5'—>3' происходит вдоль направле-
ния 3'—>5' одиночной нити материнской ДНК,
как это показано на рис. 2-18. Образующаяся
дочерняя копия этой нити обозначается терми-
ном лидирующая цепь. Другая нить материн-
ской ДНК не может удваиваться таким спосо-
бом, ибо ее расплетение протекает в направле-
нии 5'—>3' и, следовательно, синтез дочерней
ДНК на ней возможен только в направлении,
обратном движению репликативной вилки (см.
рис. 2-18). Создание этой дочерней нити (обо-
значаемой как запаздывающая цепь) начинает-
ся в виде отдельных отрезков, которые затем
соединяются между собой (не покидая матри-
цу). Эти отрезки называются фрагментами
Оказаки (в честь открывшего их ученого); их
длина составляет от 100 до 200 мононуклео-
тидных звеньев. Именно с таким интервалом
появляется (по мере продвижения репликатив-
ной вилки) каждый новый праймер запазды-
вающей цепи (см. рис. 2-18). По завершении
синтеза праймера дальнейшее наращивание
этой цепи осуществляет уже ДНК-полимераза
(тоже в направлении 5'—>3'), продолжая это
почти вплоть до достижения праймера преды-
дущего фрагмента Оказаки (возникшего ранее).
Оставшуюся небольшую брешь достраивает
ДНК-полимераза другого типа. Достигнув пре-
дыдущего праймера, она поочередно отщепля-
ет от него рибонуклеотидные звенья, заменяя
их соответствующими дезоксирибонуклеотид-
ными. Когда весь праймер будет заменен, осо-
бый фермент - ДНК-лигаза - соединяет
З'-конец вновь образованного отрезка с 5'-кон-
72
Глава 2
цом предыдущего фрагмента Оказаки (эта ре-
акция несвойственна полимеразам нуклеино-
вых кислот и требует затраты энергии в виде
расщепления АТФ до АМФ и ФФ).
Как отмечалось, от каждой точки начала
репликации расходятся две репликативных
вилки, движущихся в противоположных на-
правлениях. Поэтому дочерняя цепь ДНК, ко-
торая синтезируется как лидирующая вслед за
движением одной вилки, со стороны другой
репликативной вилки формируется (на той же
родительской цепи) как запаздывающая цепь
(т.е., прерывисто), и самый ранний из ее фра-
гментов Оказаки стыкуется с лидирующей ча-
стью цепи тоже ДНК-лигазой (см. рис. 2-18).
В ходе репликации ДНК расплетение
двойной спирали является окончательным: воз-
врата одиночных цепей родительской ДНК в
исходное состояние невозможно, т.к. на каж-
дой из них возникает новая цепь, которая вме-
сте с родительской образует дочернюю двой-
ную спираль, совершенно идентичную роди-
тельской. Это совершенство обеспечивается
многими механизмами контроля. Одни из них
реализуют упомянутые выше ДНК-поли мера-
зы. Как оказалось, эти ферменты не только на-
ращивают полинуклеотидную цепь, но и спо-
собны исправлять свои ошибки. Если послед-
ний из включенных в цепь мононуклеотидов
окажется почему-либо некоплементарным мат-
рице, то ДНК-полимераза сразу же замечает
свою ошибку и отщепляет (путем гидролиза)
неверно вставленный фрагмент, а потом заме-
няет его «правильным» мономером, и только
после этого способна продолжать наращивание
цепи. Механизм коррекции неточного спа-
ривания оснований дополняется системами
репарации повреждений ДНК, вызываемых
УФ-излучением, ионизирующей радиацией,
химическими мутагенами и другими фактора-
ми. Эти системы осуществляют распознавание
неправильностей в структуре любой из цепей
двойной спирали, после чего вырезают более
или менее длинный участок, содержащий по-
вреждение, а затем (с участием ДНК-полиме-
разы и ДНК-лигазы) заполнять возникшую
брешь, используя неповрежденную цепь в ка-
честве матрицы.
Регуляция репликации тесно связана
с контролем клеточного цикла. Недавно в этой
области достигнут значительный прогресс.
У эукариотов выявлено целое семейство бел-
ков - циклинов, которые участвуют в регуляции
деления ядерной клетки. Одни из них (Gi/S)
обеспечивают начало перехода фазы Gj в син-
тетическую (S) фазу клеточного цикла, во вре-
мя которой и осуществляется синтез ДНК (ре-
пликация). Белки другой группы - циклины
G2/M - необходимы для инициирования мито-
за; они постепенно накапливаются на протяже-
нии фазы G2 и резко исчезают (разрушаются) в
конце М-фазы (в регуляции мейоза участвует
особый вариант - циклин АД
Все циклины действуют не в одиночку, а в
виде комплексов с другими белками, среди ко-
торых наиболее изучены цикли н-зависимые
протеинкиназы. По существу, циклины явля-
ются регуляторными субъединицами этих фер-
ментов, переводя их в активное состояние.
Чаще всего протеинкиназы, образующие ком-
плексы с циклинами Gi/S, катализируют
фосфорилирование определенных участков
РНК-полимеразы, тем самым позволяя ей при-
ступить к синтезу праймеров. Но есть и такие,
которые аналогичным образом активируют ту
или иную ДНК-полимеразу, обеспечивая даль-
нейшее развитие процесса репликации. Нако-
нец, некоторые циклиновые комплексы не ак-
тивируют, а подавляют полимеразу, - путем
либо ее дефосфорилирования, либо фосфори-
лирования в «неудобном» месте.
Циклины группы G2/M тоже взаимодей-
ствуют с определенными протеинкиназами, об-
разуя белок-белковые комплексы, которые
стимулируют переход в фазу митоза. Каждый
такой комплекс обозначают как фактор, спо-
собствующий созреванию.
Все приведенные сведения отражают лишь
начальный этап выяснения регуляторных ме-
ханизмов репликации. Исследования по их
уточнению ведутся очень интенсивно.
2.4.2. ТРАНСКРИПЦИЯ (СИНТЕЗ мРНК)
Сама ДНК непосредственно в синтезе бел-
ков не участвует. Возможно лишь снятие с нее
копий, которые и отправляются в цитоплазму,
доставляя к рибосомам генетическую инфор-
мацию, считанную с ДНК. Каждая такая копия
представляет собой молекулу мРНК. Копире-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
73
вание - транскрипцию гена - ведет одна из
ДНК-зависимых РНК-полимераз (у эукариот ее
называют РНК-полимеразой II), а сам процесс
совершенно аналогичен процедуре описанного
выше синтеза праймера. Только размеры син-
тезируемой мРНК несравненно больше: ее цепь
может насчитывать многие тысячи мономер-
ных звеньев.
Инициация копирования происходит в
стартовой точке транскрипции, которая со-
ответствует началу гена (5'-концу формируемой
молекулы мРНК). РНК-полимераза II почти сра-
зу же обозначает этот 5'-концевой нуклеозидтри-
фосфат особой меткой. Она создается путем от-
щепления от него последней (по счету) фосфат-
ной группы, которую заменяет остаток ГМФ,
присоединяемый своей фосфатной частью. По-
является редкостная структура — 5'-5 -трифос-
фатная связь между двумя мононуклеотидами
(рис. 2-19). Далее следует метилирование при-
соединенного гуанина в положении 7, а также
рибозы бывшего 5'-концевого нуклеозидтри-
фосфата в положении 2 (нередко и рибоза сле-
дующего звена тоже подвергается аналогичному
о сн,
1Т">
цепь мРНК
Рис. 2-19. Строение «кэпа» на 5'-конце молекулы мРНК.
метилированию). Возникшую метку называют
кэп (от англ, cap - шапка, кепка); она обозначает
начало синтезируемой цепи мРНК.
Каждый акт транскрипции представляет
собой снятие копии лишь с одного гена. Поэто-
му, в отличие от репликации, разделение цепей
ДНК в ходе такого копирования является вре-
менным и не требует участия дополнительных
белков: сама РНК-полимераза II расплетает
двойную спираль (примерно на полтора витка) и
начинает здесь синтез мРНК на одной из оди-
ночных цепей ДНК. По мере продвижения фер-
мента к 5'-концу матрицы, двойная спираль рас-
плетается перед ним, но вновь закручивается
позади полимеразы, освобождаясь при этом от
готовой цепи мРНК на расстоянии 12 оснований
от ее наращиваемого 3'-конца (рис. 2-20). Таким
образом, зона расхождения нитей ДНК переме-
щается вместе с РНК-полимеразой, удерживая в
виде комплекса с цепью ДНК лишь короткий
головной (растущий) отрезок мРНК.
Завершается синтез молекулы мРНК в
терминаторной области, которая у прокариот
имеет типовые особенности строения. У эука-
риот сигналы прекращения транскрипции не
столь однотипны, но вполне узнаваемы для
факторов терминации транскрипции. Эти
белки способствуют отделению (от ДНК) син-
тезированного транскрипта, который затем
подвергается полиаденилированию. Оно осу-
ществляется независимым от матрицы фермен-
том, который поочередно присоединяет до
200 остатков АМФ со стороны З'-конца моле-
кулы мРНК. Полагают, что возникший
полиА-«хвост» нужен для ее зашиты от расще-
пления ферментами и, кроме того, участвует в
образовании комплексов с белками.
Ту цепь ДНК, на которой формируется
мРНК, называют обычно матричной цепью.
Синтезируемая молекула рибонуклеиновой
кислоты комплементарна ей, а потому иден-
тична другой, нематричной цепи ДНК, повто-
ряя ее и по последовательности чередования
азотистых оснований (если «смириться» с за-
меной Т—>У), и по положению концов 5' и 3'.
Поэтому именно нематричную цепь часто на-
зывают кодирующей (или смысловой) цепью.
Следует подчеркнуть, что цепь, являющаяся
матричной для одних мРНК, может оказаться
нематричной при копировании других генов.
14
Глава 2
кодирующая
(смысловая)
3’
Рис, 2-20. Схема синтеза мРНК. осуществляемого ДНК-зависимой РНК-полимеразой.
У эукариот молекула мРНК, синтезирован-
ная на матричной цепи ДНК, как правило, не
является окончательной. Участки, кодирующие
структуру определенного фрагмента будущей
полипептидной цепи (они именуются экзонами),
чередуются в ией с так называемыми интрона-
ми. Последние представляют собой довольно
протяженные последовательности (иногда до
многих тысяч мономерных звеньев), которые не
нужны при синтезе белка. Теперь установлено,
что в геноме человека из тех 25% общей протя-
женности ДНК, которые кодируют более 26 ты-
сяч белков, лишь 1,1% приходится на долю эк-
зонов; остальные 24% занимают интроны.
Еще до выхода мРНК из ядра клетки спе-
циальные нуклеопротеиновые комплексы, в
которых содержатся малые ядерные РНК
(мяРНК), вырезают все интроны (роль которых
пока еще так и неясна) и сшивают между собой
оставшиеся экзоны. Механизм этого процесса
сводится к реакции трансэстерификации (пере-
носа фосфоэфирной связи с одной пентозы на
другую в той же цепи), не требующей затрат
энергии. Распознавание интронов обеспечива-
ется тем, что каждый из них начинается с ди-
мера ГУ, а завершается фрагментом АГ (при-
мыкающие к ним нуклеотиды тоже довольно
консервативны). В целом этот процесс дозре-
вания {процессинга) синтезированной молеку-
лы мРНК получил специальное название
сплайсинг (сращивание, - имеется в виду
«склеивание» экзонов). И только после его за-
вершения молекула зрелой мРНК в виде ком-
плекса с определенными белками транспорти-
руется через поры ядерной оболочки в цито-
плазму. Нередко экзоны сшиваются не все
и/или ие только в том порядке, в каком они
следуют в исходной молекуле мРНК. Это явле-
ние обозначается как альтернативный сплай-
синг. Есть гены, мРНК-копии которых реали-
зуют его регулярно. Тогда ген (как и синтези-
рованная на нем мРНК) является источником
информации для построения не одной, а раз-
ных полипептидных цепей, хотя и близких по
строению и функциональной роли.
Период полужизни зрелой мРНК составля-
ет у эукариот десятки или сотни минут. После
прекращения транскрипции гена остановка
синтеза соответствующего белка происходит
поэтому ие сразу, а спустя время, требуемое
для деградации молекул мРНК.
Регуляция транскрипции исключи-
тельно важна в связи с тем, что гены (у эукари-
от) подвергаются транскрипции не все сразу, а
каждый в своем режиме. Для многих {консти-
тутивные гены) копирование в виде мРНК
протекает постоянно (хотя и в разном темпе) и
мало зависит от функционального состояния
клетки. Другие проявляют себя только в спе-
циализированных тканях или только на опре-
деленной стадии клеточной дифференциации.
Но есть еще и индуцируемые гены, — те, транс-
крипция которых запускается (или прекраща-
ется) под действием некоторых гормонов или
других ре1уляторных факторов (включая экзо-
генные).
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
75
Ведущую роль в регулировании транскрип-
ции играет промотор. Так называют отрезок
двойной спирали ДНК длиной в 100-200 п.о.,
примыкающий к контролируемому им гену,
т.е., к стартовой точке его транскрипции (она
соответствует 5'-коицу будущей мРНК). Наря-
ду со специфическими последовательностями
нуклеотидов, в разных его местах имеются
сайты (от англ, site - местоположение, участок
для чего-либо), обязательные для почти любого
промотора. Чаще всего такой сайт представлен
последовательностью -Т-А-Т-А- (и парным
ему фрагментом -А-Т-А-Т-). На нем сорбиру-
ется ТАТА-связывающий белок, к которому
присоединяется целая серия так называемых
общих факторов транскрипции (имеющихся
во всех клетках). В этот комплекс встраи-
ваются РНК-полимераза II и еще ряд белков,
завершая формирование инициаторного фак-
тора. Главная его задача - распаковывание
нуклеосомы, ибо она блокирует область ини-
циации любого промотора, удерживая гены в
«выключенном» (репрессированном) состоя-
нии. И еще одна задача: она заключается в том,
чтобы создать возможность сорбции специфи-
ческих факторов транскрипции. Каждый из
них имеет не менее двух центров распознава-
ния, один из которых взаимодействует с ком-
понентами инициаторного фактора, а другой -
с определенным участком ДНК.
Как правило, специфические факторы
транскрипции находятся в неактивном состоя-
нии. Связывание с инициаторным фактором
требует поэтому их предварительной активации,
- например, посредством взаимодействия с оп-
ределенным гормоном. Кроме того, это должно
сопровождаться локальным изгибом молекулы
ДНК (формированием петли), тем более что на
инициаторном факторе могут одновременно
сорбироваться несколько разных специфиче-
ских факторов транскрипции. Есть основания
считать, что между ними возможна конкурен-
ция, а некоторые из сорбируемых здесь белков
(их называют репрессорами) способны не ини-
циировать, а блокировать транскрипцию гена.
2.4.3. ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ
Многие вирусы не содержат ДНК, а в ка-
честве генетического материала имеют лишь
РНК, нередко представленную одиночной це-
пью. В зараженной клетке такая РНК либо не-
посредственно выполняет роль мРНК (исполь-
зуемой рибосомами клетки для наработки бел-
ков, необходимых для репродукции вируса),
либо предварительно подвергается транскрип-
ции под действием РНК-зависимой РНК-поли-
меразы, привнесенной вирусом. Смысл такой
транскрипции - получение копии, которая не
только комплементарна молекуле вирусной
РНК, но и приемлема для рибосом клетки в
качестве мРНК.
Есть, однако, особый класс РНК-вирусов -
ретровирусы (к ним относится и вирус имму-
нодефицита человека, вызывающий СПИД).
Наряду с РНК, они содержат еще и уникальный
белок - РНК-зависимую ДНК-полимеразу. Ча-
ще его называют обратной транскриптазой,
т.к. этот фермент использует вирусную РНК
для синтеза двухцепочечной ДНК (которая
способна встраиваться в геиом инфицирован-
ной вирусом клетки). Поначалу признанию
возможности обратной транскрипции мешал
авторитет авторов модели двойной спирали
ДНК, провозгласивших в качестве «централь-
ной догмы молекулярной биологии» свое убе-
ждение в том, что информация идет только в
одном направлении: от ДНК к РНК и далее к
белку. И лишь лет через 10 после опубликова-
ния гипотезы о существовании обратной транс-
криптазы значимость открытия американских
исследователей Г.М. Темина и Д. Балтимора
была отмечена присуждением Нобелевской
премии (1975 г.).
Ретровирусы обычно не убивают заражен-
ную ими клетку. Более того, ретровирусная
ДНК, встроенная в геном благодаря обратной
транскриптазе, не только участвует в наработке
новых вирусных частиц, но и вовлекается в
процесс репликации (в составе клеточной
ДНК), а потому сохраняется и в клетках-по-
томках.
2.5. УЧАСТИЕ РНК В БИОСИНТЕЗЕ
БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ
Помимо мРНК еще две группы рибонук-
леиновых кислот непосредственно вовлечены в
реакции белкового синтеза. Их обозначают как
рибосомные РНК (рРНК) и транспортные
76
Глава 2
РНК (тРНК)- Подобно мРНК, все они синтези-
руются на матричной ДНК, но на других ее
участках. Функциональное их предназначение
различно.
Молекулы рРНК являются важной частью
белок-синтезирующей системы. На них прихо-
дится более 50% состава рибосом-, остальное
представлено белками массой от 6 до 75 кДа.
Именно эти органеллы служат местом синтеза
белков. Число рибосом в клетке эукариот мо-
жет достигать 100 000, а размеры - около
20 нм. Каждая из них представлена двумя суб-
частицам н. одна из которых вдвое крупнее
другой. Малая - это комплекс более 30 белков
с молекулой РНК, насчитывающей 1900 моно-
мерных звеньев. Большая построена из 3 моле-
кул РНК (длиной в 120. 160 и 4700 мононук-
леотидов) и почти 50 белковых молекул. Все
рРНК образуются из общего предшественника,
синтез которого на ДНК происходит под дей-
ствием специальной ДНК-зависимой РНК-по-
лимеразы (ее называют РНК-полимеразой I).
Гены рибосомных РНК имеются в ДНК в сот-
нях копий. В ходе посттранскрипционного про-
цессинга происходит интенсивное метилиро-
вание пентоз и азотистых оснований в опреде-
ленных зонах цепи, после чего почти половина
молекулы подвергается деградации (в неме-
тилированных участках). Нетронутыми оста-
ются только 4 отдельных фрагмента, т.е., упо-
мянутые выше 4 варианта зрелой рРНК. Каж-
дый образует комплексы с белками, посту-
пающими из цитоплазмы. Так возникают рибо-
сомные субчастицы, которые через поры в
ядерной мембране переходят в цитоплазму.
В целом молекулы рРНК составляют около
80% от общего количества РНК в клетке.
Молекулы тРНК невелики по размерам.
Они состоят из 80-90 мононуклеотидных зве-
ньев, последовательность которых кодируется
специальными участками ДНК. Здешней экзо-
тикой является внутригенное расположение
промотора, который к тому же подлежит
транскрипции. Более того, он сохраняется и в
зрелой молекуле тРНК, участвуя в формирова-
нии ее третичной структуры. Синтез всех тРНК
ведет РНК-полимераза III. Как и обычно, пер-
вичный транскрипт избыточен. Последующий
процессинг включает удаление излишних фраг-
ментов и модификацию ряда оснований (в ча-
стности, их метилирование). Завершает созда-
ние зрелой тРНК специальный фермент, кото-
рый наращивает З'-конец молекулы последова-
тельностью ЦЦА, так что у всех тРНК этот
участок одинаков. На долю тРНК приходится
10-15% всей РНК клетки.
Несмотря на название тРНК, данное им
при открытии, выполняют они не только
транспортную функцию. Собственно, в этом
нет и необходимости, ибо любая аминокислота
есть в окружающей среде - в цитозоле. Главная
их задача - преобразовать информацию, дос-
тавленную к рибосоме молекулой мРНК, в
строгую инструкцию об очередности соедине-
ния аминокислот, т.е., о первичной структуре
будущего белка. Иными словами - обеспечить
перевод генетической информации с четырех-
буквенного языка нуклеиновых кислот на
20-буквенный алфавит полипептидных цепей.
Это действительно центральный момент фено-
мена наследственности. Поэтому весь сложный
процесс биосинтеза белков в рибосомах полу-
чил название трансляция, что в оригинале
имеет оттенки перевод (с языка на язык), тол-
кование (смысла), претворение (в жизнь).
Таким образом, тРНК должна обладать,
как минимум, двумя функциями. С одной сто-
роны, она должна уметь читать генетический
код, т.е. узнавать тот участок в цепи мРНК, ко-
торый соответствует месту каждой аминокис-
лоты в первичной структуре синтезируемого
белка. С другой стороны, каждая молекула
тРНК распознает только одну из 20 кодируе-
мых аминокислот. Связываясь с нею, тРНК за-
одно осуществляет и ее активацию, вследствие
чего доставляет к рибосомам активированную
аминокислоту (т.е. уже подготовленную к
включению в синтезируемую полипептидную
цепь).
2.5.1. РАСПОЗНАВАНИЕ И АКТИВАЦИЯ
АМИНОКИСЛОТ
Аминокислоту идентифицирует, строго
говоря, не сама тРНК, а специальный фермент
- аминоацил-тРНК-синтетаза. Именно он
«узнает» аминокислоту, фиксируя ее на своем
активном центре (рис. 2-21, 1а). Рядом сорби-
руется и молекула АТФ (рис. 2-21, 16), адени-
ловый фрагмент которой (АМФ) переносится
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
77
аа-тРНК-синтаза
комплекс фермента
с аминоацил-аденилатом
Рис. 2-21. Механизм действия аминоацил-тРНК-синтетазы (аа-тРНК-синтаза): активация аминокислоты (1а,б,в)
и перенос ее на молекулу тРНК (На,б,в).
затем иа карбоксильную группу аминокислоты,
присоединяясь к ией своим фосфатным концом
(рис. 2-21, 1в). При этом одна из макро-
эргических связей бывшей молекулы АТФ со-
храняется в возникшем аминоациладенилате.
Другая остается в отщепившемся пирофосфате
(ФФ), который, как обычно, гидролизуется пи-
рофосфатазой, что делает всю реакцию необра-
тимой. Так происходит активация аминокисло-
ты, остающейся пока в соединении с активным
центром фермента (рис. 2-21, 1в). На второй
стадии процесса другой активный центр фер-
мента распознает молекулу нужной тРНК и
тоже фиксирует ее (рис. 2-21, Па). Это способ-
ствует ие только вытеснению АМФ из амино-
ациладенилата, но и «переброске» аминоа-
цильного фрагмента на З'-концевой аденозил
молекулы тРНК (рис. 2-21, Пб). Точнее, иа
3'-гидроксигруппу его пентозы (с сохранением
макроэргической связи при карбоксильной
группе аминокислоты, т.е., активированного
состояния этой кислоты). Возникшая молекула
аминоацил-тРНК отделяется от фермента (рис.
2-21, Пв) и поступает к рибосомам.
Известно более 60 разных тРНК. Это озна-
чает, что некоторые аминокислоты могут транс-
78
Глава 2
портироваться к рибосомам не одной, а несколь-
кими тРНК (т.е. располагают двумя или более
персональными «каретами»). Вместе с тем, раз-
ных аминоацил-тРНК-синтетаз только 20, - по
числу кодируемых аминокислот. Специфич-
ность трансляции во многом обусловлена тем,
что каждая аминоацил-тРНК-синтетаза очень
точно распознает только одну из кодируемых
аминокислот и присоединяет ее только к той
(или тем) из молекул тРНК, которые предназна-
чены исключительно для этой аминокислоты.
2.5.2. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД
Проблема расшифровки генетического ко-
да была принципиально решена уже в первое
десятилетие после открытия комплементарно-
сти цепей в двухспиральной структуре ДНК.
В основе лежало простое соображение: одной
буквой четырехбуквенного алфавита нуклеи-
новых кислот можно обозначить только 4 раз-
ных аминокислоты, двумя буквами - 4-4=16
аминокислот, и лишь трехбуквенных слов дос-
таточно (4-4-4=64), чтобы каждую из 20 амино-
кислот назвать своим именем (или даже не-
сколькими именами). Это было подтверждено
разнообразными экспериментами, которые по-
зволили расшифровать смысл каждого три-
плета (последовательность трех подряд азоти-
стых оснований в полинуклеотиде). Такой
фрагмент в кодирующей цепи ДНК (или в эк-
вивалентном ей участке мРНК), читаемый в
направлении 5'—>3', стали обозначать термином
кодов. Перечень всех 64 кодонов с указанием
смыслового значения каждого из них получил
название генетический код. Он приведен в табл.
2.1 в том виде, какой имеет в молекулах мРНК
(в ДНК вместо У всегда находится Т). Можно
видеть, что только для метионина и триптофана
имеется по одному кодовому слову, а почти по-
ловина аминокислот шифруется двумя кодона-
ми каждая. Еще пять аминокислот имеют по 4, а
аргинин, лейцин и серин - даже по 6 кодонов.
Вместе с тем, есть триплеты (УАА, УДГ и
УГА), которые не обозначают никакой амино-
кислоты, а играют роль стоп-сигналов: любой из
них вызывает терминацию полипептидной цепи
(т.е., дает «команду» о завершении ее синтеза).
Генетический код
Таблица 2-1
ААА - лизин АГА - аргинин АЦА - треонин АУА - изо лейцин
ААГ -лизин АГГ - аргинин АЦГ -треонин АУГ - метионин*
ААЦ - аспарагин АГЦ - серин АЦЦ - треонин АУЦ - изолейцин
ААУ - аспарагин АГУ - серин АЦУ - треонин АУУ - изолейцин
ГАА- глутамат ГГА - глицин ГЦА - аланин ГУ А - валин
ГАГ - глутамат ГГГ - глицин ГЦГ - аланин ГУГ - валин
ГАЦ- аспартат ГГЦ - глицин ГЦЦ - аланин ГУЦ - валин
ГАУ - аспартат ГГУ - глицин ГЦУ - аланин ГУУ - валин
ЦАА - глутамин ЦГА-аргинин ЦЦА - пролин ЦУА - лейцин
ЦАГ - глутамин ЦГГ - аргинин ЦЦГ - пролин ЦУГ -лейцин
ЦАЦ - гистидин ЦГЦ - аргинин ЦЦЦ - пролин ЦУУ - лейцин
ЦАУ - гистидин ЦГУ - аргинин ЦЦУ - пролин ЦУЦ - лейцин
УАА - стоп** УГА-стоп** УЦА - серин УУА - лейцин
УАГ - стоп** УГГ - триптофан УЦГ - серин УУГ - лейцин
УАЦ - тирозин УГЦ - цистеин УЦЦ - серин УУЦ - фенилаланин
УАУ - тирозин УГУ - цистеин УЦУ - серин УУУ - фенилаланин
Примечание: * - у прокариот в начале транслируемой цепи мРНК кодирует молекулу формилметионина,
отмечающую инициацию трансляции; ** - стоп-триплет не кодирует аминокислот, а указывает на завершение
(остановку) синтеза создаваемой полипептидной цепи.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
79
Кодоны, символизирующие одну и ту же
аминокислоту, называют синонимами. Как вид-
но из табл. 2.1, в большинстве своем они раз-
личаются лишь последним (З'-концевым) осно-
ванием триплета (поэтому синонимы почти
всегда располагаются в одной клетке таблицы).
Изобилие синонимов при однозначиом смысле
каждого из них позволяет в значительной мере
преодолевать негативные последствия точеч-
ных мутаций.
Твердо установлено, что генетический код
универсален (одинаков у всех живых существ)
и непрерывен (кодоны следуют один за другим
без каких-либо интервалов или «знаков препи-
нания»). Кроме того, он является неперекры-
вающимся. Это означает, что каждый новый
кодон не наслаивается на предыдущий, а «всту-
пает в силу» только после полного считывания
предшествующего триплета. Например, чере-
дованием оснований ААГЦУГЦАЦ кодируется
трипептид лизил(ААГ)-лейцил(ЦУГ)-гисти-
дин(ЦАЦ), но не тетрапептид лизил(ААГ)-
аланил(ГЦУ)-цистеил(УГЦ)-гистидин(ЦАЦ) и
не октапептид лизил-серил-аланил-лейцил-
цистеил-аланил-гистидил-треонин (отражаю-
щий считывание кодонов ААГ-АГЦ-ГЦУ-ЦУГ-
УГЦ-ГЦА-ЦАЦ-АЦх).
Из-за неперекрываемости генетического
кода добавление (вставка) или выпадение (деле-
ния) одного-двух оснований кодона (вследствие,
например, мутации) приводит к сбою, который
обозначают как сдвиг рамки считывания. Так,
если в приведенной выше последовательности
ААГЦУГЦАЦ исчезнет основание Ц в позиции
4 или появится добавочное А после первого ко-
дона, то вместо трипептида лизил-лейцил-гисти-
дин окажутся закодированными соответственно
лизил-цистеил-треонин (ААГ-УГЦ-АЦх) или
лизил-треонил-аланин (ААГ -ЛЦУ-ГЦА-Ц...).
Иными словами, окажется ошибочной вся ами-
нокислотная последовательность, синтезируе-
мая после точки сбоя рамки считывания.
2.5.3. АДАПТОРНАЯ РОЛЬ тРНК
Внешний вид молекулы тРНК очень свое-
образен. Она как бы сложена пополам и вдоба-
вок несколько скручена. Поэтому в некоторых
участках происходит спаривание комплемен-
тарных оснований с образованием двухспи-
ральной структуры. Между ними остаются пет-
ли одиночной цепи. В целом получается подо-
бие «стебля», согнутого в верхней части в
форме буквы Г. Как показано на рис. 2-22, го-
ризонтальную часть этой «буквы» образуют
оба конца полинуклеотидной цепи молекулы
тРНК. При этом 5'-конец короче, чем высту-
пающий З'-конеи, последние звенья которого
всегда представлены стандартным триплетом
-ЦЦА. К его завершающему (адениловому)
звену и присоединяется активированная форма
аминокислоты (как это описано выше).
Петля, наиболее удаленная от обоих кон-
цов молекулы тРНК, содержит триплет, специ-
фический для каждой тРНК. Его обозначают
общим термином антикодон (рис. 2-22), т.к. он
комплементарен тому кодону, который соот-
ветствует аминокислоте, переносимой молеку-
лами данной тРНК.
Если распознавание «своей» аминокис-
лоты молекула тРНК осуществляет с участием
специальной аминоацил-тРНК-синтетазы, то
соответствующий кодон она узнает вполне са-
мостоятельно, имея в своей структуре антико-
дон. Благодаря такому сочетанию, молекула
тРНК способна говорить на аминокислотном
«языке» белковых молекул (с помощью ами-
ноацил-тРНК-синтетазы) и, вместе с тем, точ-
но «понимает» указания генетического кода,
безошибочно объединяя оба информационных
потока. Эту функцию «переводчика» принято
называть адапторной ролью молекул тРНК.
Рис. 2-22. Схематическое изображение
структуры молекул тРНК.
80
Глава 2
2.5.4. МЕХАНИЗМ ТРАНСЛЯЦИИ
Рибосомы не просто являются тем местом,
где происходит белковый синтез, но и вносят
важный вклад в его осуществление. В частно-
сти, они содержат специальные центры связы-
вания, предназначенные для точной взаимной
ориентации молекул мРНК, аминоацил-тРНК и
точки роста созидаемой белковой цепи. Один
из них (А-участок) фиксирует молекулу ами-
ноацил-тРНК в таком положении, чтобы стало
возможным возникновение водородных связей
между ее антикодоном и очередным кодоном
молекулы мРНК, расположенной рядом. Дру-
гой центр связывания — пептидилъный (П-учас-
ток) — «держит» аналогичным образом моле-
кулу пептидил-уРНК., т.е., такую тРНК, амино-
кислота которой соединена с уже построенным
фрагментом будущего белка.
Наиболее ответственным моментом транс-
ляции является точное узнавание самого пер-
вого кодоиа (соответствующего N-коицевой
аминокислоте будущего белка). Только от без-
ошибочности этого узнавания зависит пра-
вильность установки рамки считывания и, сле-
довательно, строгое соответствие строящегося
белка структуре зрелой мРНК. Между тем, оба
конца мРНК имеют нетранслируемые участки.
Более того, в генетическом коде нет специаль-
ного триплета, который отмечал бы начало
трансляции. Выяснилось, что стартовой точкой
трансляции является АУТ, - единственный ко-
дон для обозначения метионина. Значит, синтез
любой полипептидной цепи начинается с ме-
тионина (у эукариот). Чтобы отличить его от
других молекул метионина, встраиваемых в бе-
лок, клетки «обзавелись» двумя совершенно
разными тРНК, обладающими антикодоном для
метионина (ЦАУ. если читать в антипараллель-
ном кодону направлении 5'—>3'). Лишь одну из
них распознает специальный белок — инициа-
торный фактор 2 (ИФ-2), и только в комплексе
с ним молекулу инициаторной метионил-тРНК
способен принять свободный П-участок (когда в
нем окажется кодон АУГ), при условии, однако,
незагруженное™ и A-участка (другая из метио-
ниновых тРНК пригодна только для свободного
A-участка, даже если П-участок тоже свободен).
Соединению инициаторной метионил-
тРНК с рибосомой предшествует фиксация
мРНК на малой субчастице рибосомы, реали-
зуемая благодаря группе специальных белков
(включая кэп-связывающие). Они образуют
комплекс, который обеспечивает правильное
положение 5'-конца молекулы мРНК на малой
субчастице и способствует связыванию ини-
циаторной метионил-тРНК (вместе с ИФ-2)
этой органеллой (рис. 2-23, А). В результате
малая субчастица, объединенная с метионил-
тРНК, получает возможность продвигаться
вдоль мРНК к ее 3'-концу. Перемещение про-
исходит с помощью АТФ-зависимого меха-
низма и продолжается до встречи с первым же
кодоном АУГ. Связывание с ним антикодона,
инициаторной метионил-тРНК служит сигна-
лом к объединению малой субчастицы рибосо-
мы с большой (одновременно с вытеснением в
цитоплазму ИФ-3, ИФ-2 и других белков, вы-
полнивших свою роль). Так завершается ини-
циация трансляции - сборка рибосомы, еоеди-
H.N-CH
сн.
I
снг
S-CH
S-CH3
Рис. 2-23. Инициация трансляции
[А - фиксация мРНК и инициаторной метионил-тРНК на
малой субчастице рибосомы с участием кэп-связывающих
белков и других инициаторных факторов (ИФ);
Б - полная сборка рибосомы на инициаторном комплексе
у первого кодона АУГ]-
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
8J
ненной с мРНК и несущей инициаторную ме-
тионил-тРНК на своем П-участке (рис. 2-23, Б).
Следующая фаза трансляции - образова-
ние пептидных связей между аминокислотами,
доставляемыми в составе тРНК. Иными слова-
ми, происходит ступенчатое удлинение синте-
зируемой полипептидной цепи {элонгация). В
начале процесса свободный A-участок рибосо-
мы занимает молекула той аминоацил-тРНК,
антикодон которой комплементарен кодону в
зоне этого участка (в примере на рис. 2-24,1
здесь находится аланил-тРНК). Теперь очередь
за пептидилтрансферазой, которая является
компонентом большой субчастицы. Она разры-
вает сложноэфирную связь аминокислоты с
т-РНК в пептидильном участке и переносит
«изъятый» аминоацильный фрагмент (в данном
случае - метионильный) на A-участок. И не
просто переносит, а присоединяет его к «-ами-
ногруппе находящейся здесь молекулы ами-
ноацил-тРНК, превращая ее в дипептидил-
тРНК (на рис. 2-24,11 — в метионил-ал анил-
тРНК). После этого специальный белок -
транслоказа - производит перемещение рибо-
сомы на один кодон вдоль цепи мРНК (в на-
правлении 5'—>3')- Это не нарушает связи ко-
дона мРНК с антикодоном молекулы дипепти-
дил-тРНК, которая поэтому оказывается уже в
зоне П-участка (вытесняя отсюда тРНК, остав-
шуюся от инициаторной метионил-тРНК). В
примере на рис. 2-24,111 это отражено перехо-
дом метионил-аланил-тРНК из A-участка в
пептид ильный центр рибосомы. Благодаря это-
му в зоне освободившегося A-участка оказыва-
ется очередной кодон, готовый принять новую
аминоацил-тРНК (на рис. 2-24JV таковым яв-
ляется кодон серина - УЦА).
Следующий раунд элонгации сводится к
повторению таких же актов: фиксация молеку-
лы очередной аминоацил-тРНК на А-участке;
превращение ее в трипептидил-тРНК за счет
переноса дипептидильного фрагмента из
П-участка; смещение трипептидил-тРНК в
П-участок с освобождением A-участка для сле-
дующего кодона и соответствующей ему ами-
ноацил-тРНК. Аналогично трипептид превра-
щается затем в тетра-, пента-, гексапептид и
так далее, вплоть до полного синтеза полимера,
отвечающего структуре зрелой мРНК. В при-
веденном на рис. 2-24 примере третье, четвер-
тое и пятое место от начала цепи должны за-
нять серин, аргинин и валин (в соответствии с
обозначенными на рисунке кодонами).
В чередовании перечисленных актов уча-
ствуют не только структурные компоненты
рибосом, но и специальные белки цитоплазмы.
Из них наиболее изучены факторы элонгации
(ЭФ). Они являются регуляторными молекула-
ми из семейства G-протеинов. Как уже отмеча-
лось (раздел 2.2.3), так обозначают белки, спо-
собные в ассоциации с ГТФ объединяться с бел-
ками-мишенями, активируя их (или блокируя).
При этом G-протеины и сами претерпевают
конформационную перестройку, усиливающую
их способность расщеплять ГТФ до ГДФ и
фосфата. Так реализуется таймерная функция
G-протеинов: в ассоциации с ГДФ они выходят
из комплекса с белками-мишенями, которые из-
за этого возвращаются в исходное состояние (а
факторы элонгации освобождаются в цитоплаз-
ме от ГДФ и могут вновь соединяться с ГТФ).
Один из факторов элонгации (ЭФ-1), свя-
завшись с ГТФ, образует комплекс с молекулой
аминоацил-тРНК, помогая ей соединиться с
рибосомой и расположиться на соответствую-
щем кодоне. Когда фиксация в А-участке
свершится, ЭФ-1 гидролизует «свою» молеку-
лу ГТФ и с оставшимся ГДФ покидает рибосо-
му. Только тогда становится возможным пере-
нос пептидильного остатка и образование но-
вой пептидной связи.
Другой фактор - ЭФ-2 - содействует акту
транслокации. В ассоциации с ГТФ он необхо-
дим при перемещении удлинившейся молеку-
лы пептидил-тРНК (вместе с удерживаемым ею
кодоном) из A-участка в пептидильный центр.
После этого ЭФ-2 расщепляет молекулу ГТФ и
в связанном с ГДФ виде тоже покидает рибо-
сому. Таким образом, оба фактора элонгации
не могут одновременно фиксироваться на ри-
босоме. Выполняя свою таймерную роль, они
соединяются с нею только попеременно, чере-
дуя тем самым акты транслокации и связыва-
ния следующей молекулы аминоацил-тРНК.
Если суммировать затраты АТФ на обра-
зование молекулы аминоацил-тРНК и расход 2
молекул ГТФ в рибосомах, то становится яс-
ным, что энергоемкость процесса образования
одной пептидной связи эквивалентна гидроли-
зу 4 макроэргических связей.
82
Глава 2
Рис. 2-24. Синтез пептидной связи на приме-
ре обрезования метионил-аланил-тРНК:
I - связывание аланил-тРНК со своим кодоном
ГЦА в А-участке рибосомы;
II - результат переноса метионильного остатке
на аминогруппу аланина в А-участке;
III - сдвиг метионил-аланил-тРНК в П-участок
при движении рибосомы вдоль мРНК;
IV - связывание серил-тРНК с очередным кодо-
ном УЦА в освобожденном А-участке.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
83
Процесс наращивания белковой молекулы
(и продвижения рибосомы вдоль мРНК) про-
должается до тех пор, пока в районе А-участка
не окажется один из стоп-кодонов (УАА, УАГ
или У ГА). Для них нет подходящего антико-
дона в молекулах существующих тРНК. Из-за
незаполненности A-участка происходит оста-
новка синтеза полипептидной цепи. Кроме то-
го, возникшая на нем «пустота» служит сигна-
лом для привлечения особого цитоплазматиче-
ского белка - фактора освобождения (фактор
терминации трансляции). Связываясь с пепти-
дилтрансферазой, этот белок «побуждает» ее
гидролизовать эфирную связь между концевой
группой -СООН полипептидной цепи и 3'-кон-
цом молекулы тРНК, доставившей к рибосоме
последнюю аминокислоту построенного поли-
мера. Рибосома отделяется от мРНК (и тРНК).
после чего диссоциирует на свои субчастицы
(раздельное их существование поддерживается
фиксацией ИФ-3 на малой субчастице).
Таким образом, все рибосомы функциони-
руют однотипно. Каждая из них является уни-
версальной машиной для синтеза любого бел-
ка, - в зависимости от строения используемой
мРНК. Нередко еще задолго до завершения
элонгации на освободившемся 5'-конце моле-
кулы мРНК снова образуется инициаторный
комплекс. В результате на одной мРНК оказы-
вается две рибосомы, продвигающиеся на не-
котором расстоянии друг от друга. Вторая из
них тоже синтезирует полипептидную цепь, -
независимо от первой и с небольшим отстава-
нием от нее. В зависимости от длины мРНК, на
ней может находиться до десятка рибосом. Та-
кой комплекс обозначают термином полисома.
Этот механизм призван обеспечить интенсифи-
кацию белкового синтеза на молекуле мРНК.
Молекулы конкретного белка нередко на-
зывают генным продуктом. Их появление (на-
работка) является свидетельством экспрессии
гена, содержащего информацию о структуре
данного белка. В этом смысле говорят о высо-
ком (или низком) уровне проявления гена (ли-
бо вовсе об отсутствии экспрессии). Если ген
экспрессируется — значит, успешно протекают
все этапы биосинтеза соответствующего белка,
от трвнскрипции до выхода полипептида из
рибосом. Обычно бывает и постсинтетическая
доработка белка.
2.6. ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ
МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКА
Многие из синтезированных белков осво-
бождаются прямо в цитоплазму. Другие пред-
назначены для встраивания в различные мем-
браны, включения в некоторые субклеточные
образования (например, в лизосомы) или сек-
реции во внеклеточную среду. Большинство из
таких белков вырабатывается не свободными
рибосомами, а фиксированными на мембране
эндоплазматического ретикулума (ЭР). Обыч-
но они образуют локальные скопления на
внешней (цитоплазматической) стороне мем-
браны, формируя участки шероховатого ЭР
(шЭР). Существуют механизмы, направляю-
щие растущую полипептидную цепь через
мембрану во внутреннее пространство шЭР. И
есть специальные системы, которые произво-
дят посттрансляционную модификацию белка,
а также доставку готовых молекул к конечным
пунктам назначения. Посттрансляционные пре-
образования (нередко их называют постсинте-
тическими) очень разнообразны. Наиболее уни-
версальны процессы, которые обеспечивают
правильное складывание (фолдинг) полипеп-
тидной цепи в индивидуальный облик трехмер-
ной конфигурации. Почти со всеми белками
происходит также протеолитическая доработка
(процессинг), т.е., дозревание молекулы. Нако-
нец, реакции ковалентной модификации амино-
кислотного радикала: они разнообразны, но ка-
ждая касается лишь части белков. Совокупность
всех постсинтетических преобразований пре-
вращает полипептидную цепь в окончательный
(зрелый) белок, готовый к исполнению своего
функционального предназначения.
2.6.1. ФОЛДИНГ
Среди постсинтетических преобразований
молекулы белка важную роль играют некова-
лентные видоизменения. Они составляют ос-
новное содержание процессов, обеспечивающих
правильную укладку длинной полипептидной
цепи в элементы вторичной и третичной струк-
тур. Конечно, оптимальные варианты вторичной
структуры и характер их взаиморасположения в
значительной мере предопределены особенно-
стями аминокислотной последовательности. Од-
84
Глава 2
нако, поскольку цепь строится постепенно, на-
чальным ее отрезкам непросто дождаться пол-
ного завершения процесса, чтобы иметь воз-
можность взаимодействовать и с конечными ее
фрагментами (а не создавать локальные «фигу-
ры», каких нет в нативном белке). Препятство-
вать «рискованным» контактам фрагментов в
пределах еще недостроенной цепи призваны
молекулярные шапероны (в очень вольном пере-
воде - молекулы-наставницы). Так называют се-
мейство особых клеточных белков, которые,
образуя нековалентный комплекс с растущей
полипептидной цепью, как бы «предостерега-
ют» от ошибочных вариантов ее сворачивания,
особенно тех, что могли бы зафиксироваться
слабыми типами связи или дисульфидными
мостиками. Удерживая незавершенный белок от
неудачных случайностей, шапероны обеспечи-
вают более легкое и быстрое складывание выс-
ших структур сразу же в правильном виде (а не
методом проб и ошибок). Они ускоряют фол-
динг, но не влияют на конечный результат, ибо
общая архитектура молекулы уже предопреде-
лена характером первичной структуры.
Нередко третичная структура белка фик-
сируется не только слабыми типами связи, но и
дисульфидными мостиками. В таких случаях
эффект шаперонов дополняется действием
протеиндисулъфид-изомеразы. Этот фермент
осуществляет перегруппировку дисульфидных
связей, устанавливая их в позиции, свойствен-
ные нативному белку.
Важность шаперонной функции стала оче-
видной при изучении прионов (белковые моле-
кулы, которые при попадании в организм с
пищей вызывают заболевания, подобные ин-
фекциям, — такие как «болезнь коровьего бе-
шенства», куру у человека, почесуха у овец и
мышей). Хотя механизм инфекционности при-
онов не вполне ясен, уже установлено, что они
могут отличаться от своих нормальных эквива-
лентов всего лишь (!) необычностью простран-
ственной организации полипептидной цепи.
Аномальность высших структур не только ста-
бильна, но и препятствует ферментативному
расщеплению пептидных связей. Так, у одного
из прионов обнаружена высокая доля (3-скла-
док, которых вовсе нет в нормальной молекуле
с абсолютно такой же первичной структурой.
Более того, при совместной инкубации моле-
кулы нормального белка тоже приобретают
аномальную конфигурацию приона. Эти факты
позволяют предполагать, что именно шаперо-
ны защищают от спонтанного возникновения
прионных модификаций нормального белка.
Участие в фолдинге - не единственная
функция шаперонов. Установлено, что они мо-
гут содействовать и восстановлению нативно-
сти клеточных белков, находящихся на началь-
ных (обратимых) стадиях денатурации (см.
раздел 1.10). Ее вызывают, в частности, тепло-
вые воздействия. Было замечено, что быстрый
нагрев культуры Е. coli до 42 °C сопровождает-
ся всплеском синтеза клеточных белков. Их
назвали белками теплового шока. Выяснилось,
что они являются шаперонами. Временное
усиление их биосинтеза вызывают и иные не-
благоприятные воздействия (такие как ультра-
фиолет, ионизирующая радиация, азотистое
голодание). Поэтому возник более широкий
синоним - белки стресса.
Помимо перечисленного, шапероны участ-
вуют также в мечении состарившихся белков
(для последующей их деградации); в формиро-
вании четвертичной структуры («состыковка»
субъединиц); в трансмембранной проводке ряда
белковых молекул; в контроле конформацион-
ных переходов активная/неактивная форма бел-
ка. Такому многообразию функций соответ-
ствует специализация разных групп шаперонов.
2.6.2. ПРОЦЕССИНГ
Первым белком, выделенным в очищен-
ном виде (1922 г.) и даже в форме кристаллов
(1926 г.), стал инсулин, гормон поджелудочной
железы. Через 30 лет он оказался первым бел-
ком, для которого удалось полностью расшиф-
ровать строение, а затем и осуществить хими-
ческий синтез. Выяснилось, что этот белок со-
стоит из двух полипептидных цепей (21 и 30
АО), соединенных двумя дисульфидными мос-
тиками. Лишь с развитием новых технологий
было установлено (1967 г.), что изначально ин-
сулин синтезируется в виде одной полипептид-
ной цепи, вдвое более длинной (у человека —
110 АО). Более того, такая избыточность ока-
залась обшим правилом: многие белковые мо-
лекулы синтезируются не сразу в окончатель-
ном виде, а как более крупный предшественник
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
85
(пре-белок). Термином лидерная последова-
тельность принято обозначать его начальный
(N-концевой) фрагмент, насчитывающий чаще
всего от 15 до 35 аминокислотных остатков.
Нередко его называют сигнальным пептидом,
т.к. он содержит информацию о пункте назна-
чения создаваемого полимера. Ее «понимают»
определенные белки, которые и начинают це-
левое перемещение (транслокацию) полипеп-
тидной цепи.
Лидерную последовательность белков,
подлежащих, подобно предшественнику инсу-
лина, отправке в просвет ЭР, распознают осо-
бые рибонуклеопротеины цитоплазмы. И не
только распознают, но и «доставляют» ее к
мембране ЭР и даже связывают с трансмем-
бранным белком, формирующим сквозную по-
ру для проводки полипептидов. Все это проис-
ходит задолго до завершения трансляции, а
потому прикрепленной к мембране оказывает-
ся не только полипептидная цепь (своим сиг-
нальным пептидом), но и сама рибосома, из
которой эта цепь в виде петли продвигается
сквозь пору в просвет ЭР. Еще до окончания
синтеза полипептида специальный фермент —
сигнальная пептидаза — расщепляет связь меж-
ду ненужным уже сигнальным пептидом и ос-
тальной частью молекулы, облегчая ей даль-
нейшее складывание (фолдииг) с участием ша-
перонов.
Сходным образом реализуется транспорт
белков в митохондрии, в которых, как извест-
но, менее 5% необходимых им протеинов вы-
рабатывается в собственных рибосомах (по
информации, поступающей в виде мРНК от
молекулы митохондриальной ДНК). Основная
же масса их синтезируется на свободных рибо-
сомах цитоплазмы с участием ядерных мРНК.
Лидерная последовательность в этих случаях
отличается своеобразием, представляя собой
а-спираль. одна сторона которой гндрофобна,
а другая несет положительные заряды. Такая
амфипатическая структура легко фиксируется
на рецепторах наружной мембраны митохонд-
рий. направляя остальную часть белковой мо-
лекулы внутрь органеллы через пору, располо-
женную в участке контакта обеих мембран.
Лишь после этого происходит ферментативное
отщепление сигнального пептида. Предшест-
венники белков межмембранной зоны мито-
хондрий содержат 2 сигнальных пептида. Уда-
ление первого (обеспечившего обычное посту-
пление пре-белка в матрикс) ведет к раскры-
тию второго, который через внутреннюю мем-
брану митохондрий направляет полипептид-
ную цепь в межмембранное пространство (где
и подвергается затем отщеплению).
На свободных рибосомах цитоплазмы син-
тезируются также все белки клеточного ядра.
Для прохождения через поры ядерной оболочки
лишь небольшие молекулы гистонов не нужда-
ются в лидерной последовательности. В осталь-
ных ядерных пре-белках она обычно очень ко-
ротка, а в предшественниках белковых факторов
транскрипции расположена не с N-конца, а
внутри полипептидной цепи.
Рис. 2-25. Процессинг препроинсулина человека
[затенением выделены сигнальная последовательность
(24 АО) и связующий пептид (35 АО);
светлыми кружками обозначены цепь А (21 АО)
и цепь В (30 АО) зрелого инсулина].
86
Глава 2
Отщепление сигнального пептида - не
единственное проявление процессинга белков.
Зачастую необходимо гидролизовать еще одну
или несколько пептидных связей, чтобы пе-
ревести белок в функционирующее состояние.
Например, упомянутый предшественник инсу-
лина превращается после удаления сигнально-
го пептида не в готовый гормон, а в неактив-
ный проинсулин. В просвете ЭР эта молекула
сначала подвергается складыванию (с участием
шаперонов и протеиндисульфид-изомеразы).
Затем, уже в аппарате Гольджи, происходит
«прицельное» расщепление определенных пеп-
тидных связей (они указаны стрелками на рис.
2-25), в результате чего вычленяется срединная
часть молекулы («связующий пептид» — С-пеп-
тид) протяженностью более 30 АО. Столь вы-
борочный гидролиз пептидной связи из множе-
ства имеющихся в молекуле белка обозначают
термином «ограниченный протеолиз». Его осу-
ществляют высокоспецифичные протеиназы (к
их числу относятся и сигнальные пептидазы).
Ограниченный протеолиз проинсулина
превращает его в готовую молекулу гормона.
Она-то и состоит из двух полипептидов, соеди-
ненных двумя S-S-мостиками (см. рис. 2-25) и
обозначенных как A-цепь и В-цепь в 1955 г.,
еще до выявления того, что они являются
фрагментами одной исходной молекулы - пре-
проннсулина. Зрелый инсулин накапливается в
секреторных пузырьках, откуда выделяется в
кровь по мере надобности.
Бывает и так, что одна полипептидная
цепь разделяется в ходе процессинга на не-
сколько самостоятельных белков, выполняю-
щих совершенно разные функции. Наиболее
яркий пример - препроопиомеланокортин,
синтезируемый в передней и промежуточной
долях гипофиза. У человека этот предшествен-
ник состоит из 267 аминокислотных звеньев.
После удаления сигнального пептида (26 АО)
возникший проопиомеланокортин становится
мишенью для ряда высокоизбирательных про-
теиназ. Набор их и очередность действия раз-
т-мсг
Рис. 2-26. Биоактивные продукты процессинга препроопиомеланокортина человека
(цифрами дана нумерация аминокислотных остатков в исходной цепи) [пояснения приведены в тексте].
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
87
личны в клетках разного типа. Как показывает
схема на рис. 2-26, на определенном этапе ог-
раниченный протеолиз может привести к рас-
членению предшественника на три самостоя-
тельных полипептида. Один из них (N-кон-
цевой) составляет половину исходной молеку-
лы, другой является адренокортикотропным
гормоном (АКТГ; кортикотропин), а третий
обозначают как липотропный гормон (ЛПГ;
липотропин). Каждый из этих «обломков» про-
опиомеланокортина содержит фрагмент, обла-
дающий активностью меланоцитстимулирую-
щего гормона (МСГ; меланотропин). На рис.
2-26 эти фрагменты выделены горизонтальной
штриховкой. Они заметно различаются по пер-
вичной структуре, из-за чего введено дополни-
тельное обозначение буквой греческого алфа-
вита (а-, Р- и у-).
Продукты начальной серии реакций огра-
ниченного протеолиза подвергаются затем воз-
действию других протеиназ, тоже высокоизби-
рательных. При этом из N-концевой половины
предшественника вычленяется молекула
у-МСГ, а также три довольно крупных пептида,
предназначение которых пока неясно (они по-
мечены вопросительным знаком). Из молекулы
АКТГ удалению подвергается срединный пен-
тапептид, в результате чего освобождаются
а-МСГ и пептид, в определенной степени со-
храняющий активность кортикотропина и по-
тому обозначаемый как кортикотропиноподоб-
ный промежуточный пептид (КПП; часто ис-
пользуется англоязычное сокращение CLIP).
Наконец, на этом этапе происходит аналогич-
ное расчленение ^-липотропина на у-ЛПГ и
Р-эндорфин (как это показано в третьей сверху
строке на рис. 2-26). В свою очередь, у-ЛПГ
подвергается укорочению до Р-МСГ, а моле-
кула Р-эндорфина — до у-эндорфина. Последние
два продукта (как и чуть более короткий их
аналог а-эндорфин) по своему болеутоляюще-
му эффекту в десятки раз сильнее морфина (от-
сюда и название эндогенные морфины). Близ-
кими нейромедиаторными свойствами обладают
и энкефалины, которые возникают в виде пен-
тапептидов, отщепляемых от N-конца эндорфи-
нов (на рис. 2-26 энкефалиновый фрагмент вы-
делен затенением).
Очень часто про-белки не подвергаются
заключительному протеолизу в клетке, а секре-
тируются в среду. Иными словами, они превра-
щаются в активную форму не заранее, а непо-
средственно в том месте, где и должны функ-
ционировать. Ранее всего это было установлено
для ферментов пищеварительных соков. Многие
из них выделяются в виде проферментов {зимо-
генов)-. пепсиноген, трипсиноген, химотрипси-
ноген, проэластаза, прокарбоксипептидаза. Ак-
тивация их происходит путем ограниченного
протеолиза, благодаря которому удаляется
фрагмент (рропеппгид), прикрывающий («мас-
кирующий») активный центр фермента. В част-
ности, трипсиноген активируется энтерокиназой
кишечного сока, обеспечивающей отщепление
N-концевого гексапептида. Аналогичным обра-
зом образовавшийся трипсин катализирует уда-
ление пропептидов из молекул остальных упо-
мянутых зимогенов (кроме пепсиногена). Вме-
сте с тем, трипсин способен отщеплять гекса-
пептид от молекул трипсиногена. .Этот феномен
присущ и пепсиногену, первые порции которого
активируются неферментативно (под воздейст-
вием соляной кислоты желудочного сока).
2.6.3. КОВАЛЕНТНОЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЕ
РАДИКАЛОВ АМИНОКИСЛОТ
Большая группа реакций постсинтетиче-
ской модификации белка связана не с разрывом
полипептидной цепи (процессинг), а с преобра-
зованием аминокислотных радикалов R.
Обычно оно протекает по мере продвижения
белковой молекулы по трубочкам и цистернам
ЭР и в аппарате Гольджи. Именно в мембранах
этих структур локализованы ферменты, распо-
знающие нужные локусы в молекуле белка и
катализирующие соответствующее преобразо-
вание строго определенных аминокислот.
Чаще всего наблюдается присоединение
углеводных фрагментов, которое превращает
простые белки в гликопротеины или протео-
гликаны (см. раздел 1.13.2). Нередко присое-
диняется фосфатный остаток (чаще к радика-
лам серина или треонина). В некоторых белках
костной ткани происходит фиксация сульфат-
ных групп на радикалах тирозина.
Строго говоря, перечисленные (и им по-
добные) реакции не отражаются на структуре
самого радикала аминокислоты, а заключаются
лишь в обратимом присоединении к нему того
88
Глава 2
или иного фрагмента. Имеются ферменты, ко-
торые легко удаляют такую «добавку» (обычно
- путем гидролиза), возвращая аминокислот-
ный радикал в исходное состояние.
В подлинном смысле слова ковалентное
преобразование аминокислоты состоит в транс-
формации ее в совсем другую, причем, не от-
носящуюся к числу кодируемых. Так, в ходе
биогенеза коллагеновых волокон обязательным
является предварительное окисление части ра-
дикалов лизина и пролина до 5-гидроксилизина
и 3- или 4-гидроксипролина. Детали этого про-
цесса (идущего с участием витамина С) будут
рассмотрены в разделе 5.4.3 на примере гидро-
ксилирования лизильных звеньев (см. рис.
5-50). Совершенно аналогичные ферментные
системы внедряют гидроксигруппу в положе-
ние 3 или 4 радикалов пролина (рис. 2-27).
Важно еще раз подчеркнуть, что перечислен-
ные аминокислоты подвергаются гидроксили-
рованию не в свободном виде, а только в со-
ставе белковой молекулы. Более того, даже
весьма стабильные молекулы гидроксипроли-
нов, появляющиеся при распаде собственных
или пищевых белков, никогда не включаются в
синтезируемую полипептидную цепь (ибо для
них нет специальных кодонов).
Многие белки становятся функционально
полноценными только после превращения
определенных глутамильных звеньев их моле-
кулы в радикалы у-карбоксигпутаминовой ки-
слоты (Gia). Оно заключается в присоедине-
нии молекулы СОг к у-углеродному атому ата-
куемого радикала глутамата. Итоговое уравне-
ние этой реакции приведено на рис. 2-28.
В действительности же механизм такого кар-
боксилирования очень сложен. Оно сопряжено
Рис. 2-27. Гидроксилированные формы радикалов
пролина в составе белковой молекулы.
с утилизацией молекулы кислорода, вовлекае-
мой в реакции монооксигеназного типа (раздел
5.4.3), но требующих участия витамина К (см.
формулу на рис. 5-4). Поэтому белки, содер-
жащие радикалы Gia, часто называют витамин-
К-зависимыми протеинами. Внедрение второй
карбоксильной группы в у-положение глута-
мильного радикала приводит к резкому усиле-
нию его способности связывать ионы Са +. Не-
удивительно, что скопление множества остат-
ков Gia в небольшом участке макромолекулы
типично для ряда белков, участвующих в про-
цессе минерализации костной ткани. Многие
компоненты системы свертывания крови также
обладают функционально важными зонами
изобилия радикалов Gia, которые располагают-
ся вплотную или разделены одним-двумя ос-
татками иных аминокислот.
Но самое необычное происходит в ходе
биогенеза тироидных гормонов. Они форми-
руются в составе тироглобулина — специально-
го гликопротеина щитовидной железы, со-
стоящего из двух одинаковых субъединиц мас-
сой более 300 кДа, в каждой из которых насчи-
тывается свыше 60 остатков тирозина. Иодиро-
вание некоторых из них кладет начало конст-
руированию гормональных молекул. Особый
фермент — йодидпероксидаза - внедряет атом
йода в положение 3 фенильного кольца ради-
калов тирозина, а зачастую еще и в положение
5 (механизм реакции предстаален на рис. 5-55).
Этот же фермент переносит затем цикличе-
скую структуру с одного из йодированных ра-
дикалов на гидроксильную группу другого. Так
возникают йодтиронины, пока еще входящие в
состав тироглобулина. В основном они пред-
ставлены тироксином. Формула на рис. 2-29
ОН но ОН
I I I
(р=о О=С\ /С=О
сн2 +СОг сн
сн? сн2
сн ... сн
N С N С
I II I II
но но
Глу Gia
Рис. 2-28. Преобразование глутамильного фрагмента
(Глу) в радикал у-карбоксиглутаминовой кислоты (Gia).
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
89
НС—nh2
СООН
Рис. 2-28. Строение тироксина
(3,5.3',5'-тетрайодтиронин; Т4).
показывает, что он является продуктом кон-
денсации двух радикалов дийодтирозина, т.е.,
является 3,5,3',5'-тетрайодтиронином (краткое
обозначение — Т4).
Установлено, что все дийодтирозильные
звенья, которые становятся акцепторами фе-
нильного ядра йодированного тирозина, лока-
лизованы в строго определенных местах каж-
дой субъединицы йодтироглобулина, а именно
в положениях 24, 1310, 2573, 2587 и 2766 бел-
ка-предшественника. Лишь первые 4 из них
превращаются в тироксин (Т4), тогда как по-
следнее принимает на себя не дийодтирозиль-
ный фрагмент, а 3-монойодированный аналог.
В итоге димерная молекула зрелого йодтиро-
глобулина несет в себе 8 остатков тироксина
и 2 остатка З^З'чприйодтиронина (Т3).
Синтезируемый клетками тироглобулин
секретируется во внеклеточный коллоид. В мо-
лекулах этого белка, примыкающих к люми-
нальной поверхности тироцитов, происходит
йодирование и конденсация тирозильных ра-
дикалов. Эти процессы реализует упомянутая
йодидпероксидаза, встроенная в апикальную
мембрану клеток. Зрелый йодтироглобулин
накапливается в фолликулярном коллоиде же-
лезы. По мере надобности он захватывается
тироидными клетками, где в составе фаголизо-
сом подвергается полному протеолизу до ами-
нокислот. Освобожденные при этом тироидные
гормоны Т4 и Тз выводятся через базальную
мембрану клеток и переносятся кровью почти
исключительно в виде комплексов с белками
(главным образом, с тироксинсвязывающим
глобулином).
Со временем было установлено, что
тироксин является фактически прогормоном,
т.к. все гормональные эффекты наиболее энер-
гично реализует трийодтиронин (Тз). Превра-
щение предшественника (Т4) в гораздо более
активную форму Т3 происходит путем восста-
новительного отщепления йодида Г под дей-
ствием специальной дейодиназы, зависимой от
НАДФ-Нг- Она фиксирована на мембране ЭР и
сосредоточена в основном в печени и почках.
Нервная ткань обладает своим вариантом этого
фермента, продукция которым трийодтиронина
особенно важна в критичные периоды развития
мозга.
Дейодирование молекул Т3 осуществляют
другие дейодиназы (в печени, почках, самой
ЩЖ). Образующиеся ди- и монойодтиронины
полностью лишены гормональной активности
и подвергаются дальнейшей метаболической
деградации.
Итак, стандартную процедуру синтеза
белковых молекул на рибосомах природа до-
полнила механизмом ковалентной модифика-
ции аминокислот, уже включенных в полипеп-
тидную цепь. Это позволяет сузить круг «из-
бранных» макромолекул и обеспечить выпол-
нение ими нетривиальных функций, будь то
надмолекулярное структурирование коллагено-
подобных белков, локальное накопление свя-
занного кальция (Gla-протеины) или создание и
депонирование тироидных гормонов (йодтиро-
глобулин).
В заключение следует отметить, что пост-
синтетическая модификация белка — это столь
же необходимый этап его биогенеза, как и все
предыдущие. Ее нарушения (например, из-за
генетических дефектов соответствующих фер-
ментов) так же чреваты появлением неполно-
ценного белка, как и сбои на уровне транс-
крипции или трансляции.
Глава 3
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
Главные макромолекулы клетки — белки и
нуклеиновые кислоты - ведут себя как гидро-
фильные частицы. Еще лучше растворимы в
воде углеводы, особенно мономерные. Поэто-
му для обособления от окружающей среды (как
правило, водной) клетки должны обладать по-
верхностным слоем, разграничивающим обе
водные фазы — внутреннюю и внешнюю. Не-
удивительно, что для его построения природа
избрала вещества, совершенно нерастворимые
в воде. Ими являются липиды. Сооружаемые из
них пограничные слои обозначают как биоло-
гические мембраны. Они обособляют не только
клетку (плазматическая мембрана), но и почти
каждое субклеточное образование (клеточное
ядро, митохондрии, лизосомы и ряд других).
Разделяя внутриклеточное пространство на
отсеки (компартменты), биомембраны обеспе-
чивают при этом строго контролируемое
трансмембранное перемещение нужных ве-
ществ, а также передачу внешних сигналов.
3.1. СТРОЕНИЕ ЛИПИДОВ
Липиды - это класс органических ве-
ществ, которые нерастворимы в воде (но рас-
творимы в неполярных жидкостях) и по
своему строению являются, как правило,
сложными эфирами высших жирных кислот и
какого-либо из немногих спиртов.
В этом определении главенствуют жирные
кислоты. Так обозначают длинные алифатиче-
ские цепи с карбоксильной группой на одном
из концов. В природных липидах эти цепи поч-
ти всегда линейны и содержат четное число
углеродных атомов. Чаще всего оно составляет
16, 18 или 20 (табл. 3-1). Более длинные цепи
встречаются в основном в липидах нервной
ткани, а также в рыбьем жире (получаемом из
печени трески).
Двойные связи, встречающиеся в составе
некоторых жирных кислот, имеют, как прави-
ло, г/дс-конфигурацию, которая обусловливает
Таблица 3-1
Наиболее распространенные высшие жирные кислоты
Число атомов С и двойных связей Название кислоты Формула
С (16):0 Пальмитиновая СНз-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-(СН2)7-СООН
С (16):1 Пальмитолеиновая СН3-СН2-СН2СН2-СНг-СН2-СН=СН-(СНг)7-СООН
С (18):0 Стеариновая СНз-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-(СН2)7-СООН
С (18):1 Олеиновая СНз-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН2-СН=СН-(СН2)7-СООН
С (18):2 Линолевая СНз-СН2-СН2-СН2-(СН2-СН=СН)2-(СН2)7-СООН
С (18):3 а-Линоленовая С Нз- (СН2-С Н=СН )з- (СН2)7-СООН
С (20):0 Арахиновая СНз-СНг-СН2-СН2-(СН2-СН2-СН2)4-(СН2)з-СООН
С (20):4 Арахидоновая СН3-СН2-СН2-СН2-(СН2-СН=СН)4-(СН2)з-СООН
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
91
н2с-он
нс-он
н2с-он
Глицерол (глицерин)
СН3-(СН2)12-СН=СН-СН-ОН
HC~NH2
н2с-он
Сфингозин
сн3-(сн2)п--сн2он
Алифатический спирт
(п = 14,16.18 и более)
Холестерол
(пространственное представление)
Рис. 3-1. Главнейшие спирты, входящие в состав липидов
изгиб углеродной цепи под углом 120°. В поли-
еновых кислотах такие изгибы повторяются,
делая молекулу более объемистой (ио и более
короткой). Поэтому растительные масла, в со-
ставе которых преобладают моно- и полиено-
вые кислоты, имеют более низкую температуру
плавления, чем жиры животного происхожде-
ния, в которых ненасыщенных жирных кислот
гораздо меньше. Как показано в табл. 3-1,
двойные связи в жирных кислотах не бывают
сопряженными, т.к. они всегда разделены ме-
тиленовой группой -СН2-
В качестве спиртовой части молекулы ли-
пиды содержат обычно трехатомиый спирт гли-
церол (глицерин), реже — двухатомный амино-
спирт сфингозин или полициклический одно-
атомный спирт стерол и совсем редко - алифа-
тический спирт с длинной цепью (рис. 3-1). По
этому признаку липиды разделяют на ряд
групп. Дальнейшую детализацию производят с
учетом иных структурных элементов, имею-
щихся в некоторых липидах.
3.1.1. ВОСКА
Молекула воска представляет собой слож-
ный эфир высшей жирной кислоты (длиной до
36 атомов углерода) и высшего жирного спир-
та, содержащего от 16 до 30 углеродных ато-
мов (см. рис. 3-1). Например, одним из главных
компонентов пчелиного воска является эфир
мирицилового спирта и пальмитиновой кисло-
ты: СзоНб1-0-С(0)-С15Нз1- Иными словами, мо-
лекула воска является линейной цепью из 30-50
метиленовых звеньев, которая где-то посереди-
не прерывается сложноэфирной группой. Такие
липиды наиболее трудно растворимы даже в
органических растворителях. Это относится и к
тем воскам, спиртовый фрагмент которых со-
держит еще одну гидроксильную группу (по
соседству с первой) и потому может соединять-
ся с двумя молекулами жирных кислот.
По сравнению с другими липидами, воска
играют довольно ограниченную роль. У позво-
ночных они секретируются кожными железами
и покрывают водозащитной пленкой кожу, во-
лосы, шерсть, перья. Листья, плоды многих
растений тоже имеют восковый налет. Будучи
пластичными при температуре ниже точки их
плавления, воска выполняют также роль сма-
зывающего и смягчающего покрытия. В каче-
стве источника энергии эти вещества выраба-
тываются и используются только морскими
организмами, особенно планктонными.
3.1.2. АЦИЛ ГЛИЦЕРОЛЫ (НЕЙТРАЛЬНЫЕ ЖИРЫ)
Будучи трехатомным спиртом, глицерол
(см. рис. 3-1) может присоединять одну, две
или три молекулы жирных кислот (одинаковых
или разных). Образуемые сложные эфиры обо-
значаются как моно-, ди- и триацилглицеролы.
Для последних применяют и прежние термины:
триглицериды^ жиры., нейтральные жиры.
В простых триглицеридах все три ацильных
92
Глава 3
11 1 П
СН3-(СНг)к-С-О-СН2 СН3-(СН2),,-С-О-СН2
сн3-(сн2)и-с-о-сн сн3-(сн2)7-сн=сн-(сн2)7 -с-о-сн
о н^-о-с-(сн2)к-сн3 & Нгс-о-счсн^-снз
О о
Т ристеармн 1 -Пальмито-2-олео-З-стеарин
Рис. 3-2. Строение триацил глицеролов (триглицеридов).
остатка одинаковы. Отсюда и названия: паль-
митоилглицерол, олеоилглицерол, стеароилг-
лицерол и т.д. Чаще используют более краткие
обозначения - трипальмитин, триолеин, три-
стеарин. Смешанными триацилглицеролами
называют такие, которые имеют разные ациль-
ные остатки, как, например, пальмитодистеа-
рин или пальмитоолеостеарин. При этом сред-
ний углеродный атом глицерола становится
оптически асимметричным, а ферменты распо-
знают иеидентичиость крайних, даже если те
соединены с остатками одной и той же жирной
кислоты. Поэтому углеродные атомы глице-
рольного фрагмента обозначают цифрами (в
обычном изображении нумерацию ведут свер-
ху вниз, — рис. 3-2).
Природные жиры (сливочное масло, рас-
тительные жиры, свиное или говяжье сало и
пр.) являются обычно смесью различных, пре-
имущественно смешанных триглицеридов,
ацильные фрагменты которых варьируют и по
длине цепи, и по числу двойных связей.
Ацилглицеролы составляют самую рас-
пространенную группу липидов. Главнейшая
их роль - участие в энергетическом метабо-
лизме. На пищевые жиры приходится весомая
часть калорийности суточного рациона. Кроме
того, эти вещества легко синтезируются в ор-
ганизме человека и животных (в основном, из
углеводов). Избыток глицеридов легко накап-
ливается в жировых депо. Здесь они служат не
только энергетическим резервом, ио и попутно
защищают от механических воздействий и теп-
лопотерь (подкожная жировая клетчатка), вы-
полняют опорную функцию (например, око-
лопочечная клетчатка).
3.1.3. ФОСФОЛИПИДЫ
В отличие от нейтральных жиров, фосфо-
липиды (фосфатиды) содержат заряженные
группы, среди которых обязательно имеются
остатки фосфорной кислоты. В качестве спир-
товой части молекулы выступает либо глице-
рол, либо сфингозин (см. рис. 3-1). Соответст-
венно этому, фосфолипиды разделяют на
2 подгруппы.
Глицерофосфолипиды являются про-
изводными фосфатидной кислоты (рис. 3-3).
Она представляет собой 1,2-диацилглицерол,
образующий сложноэфирную связь с фосфор-
ной кислотой, которая, в свою очередь, соеди-
нена (тоже сложноэфирной связью) с амино-
кислотой серином, продуктом ее декарбокси-
лирования этаноламином либо трижды N-ме-
тилированным производным последнего - хо-
лином (см. рис. 3-3). Иногда их заменяет шес-
тиатомиый циклический спирт инозитол. Со-
ответствующие глицерофосфатиды обознача-
ются как фосфагидилсерины, фосфатидилэта-
ноламины, фосфатидилхолины и фосфатиди-
линозитолы (фосфоинозитиды). Множествен-
ным числом каждого названия подчеркивается
вариабельность состава жирных кислот в этих
группах молекул.
Иногда в положении 1 глицерола вместо
жирной кислоты содержится остаток альдегида
с длинной цепью. Такие аналоги именуют
плазмалогенами (см. рис. 7-24).
Не совсем обычную структуру имеет кар-
диолипин (см. рис. 7-21). Он представляет со-
бой глицерол, крайние спиртовые группы ко-
торого соединены с фосфатными остатками
двух молекул фосфатидной кислоты. Этот ди-
фосфатидилглицерол характерен для внутрен-
ней мембраны митохондрий и впервые был
выделен из сердечной мышцы.
Сфингофосфолипиды являются про-
изводными длиниоцепочечного двухатомного
аминоспирта сфингозина. Обе спиртовые груп-
пы и аминогруппа между ними находятся на
одном из концов линейной цепи из 18 углерод-
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
93
О
II
R'—С—О—СН2
R’’-С-О-СН
II I
О Н2С-О-Р-Х
II
о
Общая формула
глицерофосфолипидов
(R’ - остаток насыщенной
жирной кислоты,
Я" - ненасыщенной)
Строение фрагмента -X Названия фосфоглицеридов
-ОН Фосфатидная кислота
-O-CH2-CH-N+H3 1 COO Фосфатидилсерины
- o-chz-ch2-n*h3 Фосфатидил этанол амины (кефалины)
СНз 1 - O-CHz-CH2-N+-CH3 1 СНз Фосфатидилхолины (лецитины)
ОН он 21.он -о\дн у он Фосфатидилинозитолы
Рис. 3-3. Структурные компоненты глицерофосфолипидов (фосфоглицеридов).
ных атомов. Если ее представить в таком виде,
как на рис. 3-1, то станет очевидным сходство с
глицеролом, точнее - с моноацилглицеролами.
Подобно им, здесь имеется алифатическая цепь
из 15 углеродных атомов, присоединенная в
позиции, аналогичной первому углеродному
атому глицерола. Присоединена она, однако, не
эфирной связью, а непосредственно к этому
углероду (спиртовая группа при нем остается
незанятой). Еще одно отличие заключается в
том, что в положении, соответствующем атому
2 глицерола, сфингозин имеет ие спиртовую, а
аминогруппу. Именно к ней во всех сфинголи-
пидах присоединяется жирная кислота, форми-
руя кислотоамидную связь. Это - первое ис-
ключение из общего правила о сложноэф ирном
строении липидов. Впрочем, оно не очень су-
щественное, ибо оба типа связи близки по сво-
ей природе, да и многие ферменты успешно
гидролизуют ту и другую.
Соедииеиие сфингозина с жирной кислотой
(содержащей обычно L8-26 углеродных атомов)
обозначают термином церамид (рис. 3-4). Фос-
форилирование его концевой спиртовой груп-
пы (которая аналогична такой же группе в по-
ложении 3 глицерола) ведет к образованию
продукта, очень сходного с фосфатидной ки-
слотой. Подобно ей, он может соединяться сво-
им фосфатным остатком с холином, превраща-
ясь в сфингомиелин. На рис. 3-4 такая молекула
представлена в форме, наиболее приближенной
к реальности: две длинные гидрофобные цепи
вытянуты параллельно друг другу в сторону от
высокополярной «головки», содержащей к тому
же и заряженные группировки. Аналогичную
форму имеют в природных условиях и молеку-
лы глицерофосфолипидов: объемная полярная
«головка» и длинный гидрофобный «хвост».
Пространственное разделение полярного и
гидрофобного фрагментов придает молекуле
амфипатические свойства и тем самым обес-
печивает фосфолипидам ведущую роль в по-
строении биологических мембран. Кроме
структурной они выполняют и регуляторную
роль, содействуя селективности функций этих
мембран. А вот в качестве источника энергии
фосфатиды почти не используются (в противо-
положность жирам).
94
Глава 3
СН3-(СН2)12-СН=СН-СН-ОН
CH3-(CH2)n-C-NH-CH
о Н2С-ОН
Церамид
СН3-(СН2)12-СН=СН-СН-ОН
CH3-(CH2)n-C-NH-CH О
О НгС-О-р-ОН
он
Фосфорилированный церамид
(аналог фосфатидной кислоты)
СН3-(СН2)12-СН=СН-СН-ОН
СНз-(СНг)„-С-МН-СН О
О Н2С—О—Р—О-СН2- СНг-N*
ОН (СН3)3
Сфингомиелин
Рис. 3-4. Строение сфмнгофосфолипидов
(сфингофосфатидов).
3.1.4. ГЛИКОЛИПИДЫ
Вместе с фосфолипидами, гликолипиды
относят к сложным липидам, т.е., таким, кото-
рые содержат еще какой-либо компонент кроме
спирта и жирной кислоты.
По строению гликолипиды близки сфин-
гомиелинам и тоже являются мембранными
липидами. Только вместо фосфатной группы
здесь содержится углеводный фрагмент, при-
соединенный к церамиду гликозидной связью.
Для цереброзидов характерно наличие остатка
глюкозы или галактозы (рис. 3-5). Их ацильный
остаток чаше представлен цепью С(24). Галак-
тозилцерамидами богаты мембраны миелина.
Включение сульфатной группы в галактозу
превращает их в сульфамиды (они типичны
для белого вещества мозга).
Олигосахаридные аналоги цереброзидов
называются ганглиозидами. Их углеводный
фрагмент нередко содержит остатки N-ацетил-
галактозамина и N-ацетил нейраминовой ки-
HO-CH-CH=CH-(CH2)i2-CH3
он
Рис. 3-5. Строение галактозилцерамида.
слоты (см. рис. 1-25). Сосредоточены ганглио-
зиды в плазматической мембране нейронов
(6% ее липидов), но встречаются и в клетках
иного типа.
3.1.5. СТЕРОЛЫ И СТЕРИДЫ
У животных преобладающим стеролом яв-
ляется холестперол (холестерин). Он представ-
ляет собой четыре сконденсированных кольца,
первое из которых содержит гидроксильную
группу (в положении 3), а последнее (в поло-
жении 17) - боковую цепь из 8 углеродных
атомов. На рис. 3-1 холестерол представлен и в
общепринятом плоскостном изображении, и в
той вытянутой пространственной конфигура-
ции, какую он принимает в своем естественном
окружении. Таковым обычно являются другие
мембранные липиды, так что жесткая форма
растянутого блока кольчатых структур легко
смыкается с неполярными «хвостами» фосфо-
и гликолипидов, объединяясь с ними гидро-
фобными взаимодействиями (объединению
способствует и гибкость боковой цепи в поло-
жении 17).
В растительном мире преобладают стеро-
лы несколько иного строения; животные не-
способны усваивать их.
Стериды - это сложные эфиры стерола с
какой-либо жирной кислотой. В организме они
легко возникают и столь же легко гидролизуют-
ся ферментами. Свойства стеролов и их эфиров
очень близки. Соотношение тех и других, а так-
же суммарное содержание их довольно сильно
варьирует в разных биологических структурах,
соответствуя их функциональной специфике.
Все это служит основанием относить стеролы
(наравне со стеридами) к числу липидов, хотя
они и не являются эфирами. Модификация бо-
ковых радикалов холестерола лежит в основе
биогенеза гормонов коры надпочечника и поло-
вых желез, а также желчных кислот. Витамин D
тоже относится к числу стеролов.
3.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
Основу биологической мембраны состав-
ляет липидный бислой. Непроницаемый для во-
ды и гидрофильных молекул, он выполняет
барьерную функцию, поддерживая различия в
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
95
химическом составе разделяемых водных фаз.
С мембранными липидами ассоциированы спе-
циализированные белки, часть из которых спо-
собна формировать каналы (поры), пронизы-
вающие мембрану и избирательно проницае-
мые для гидрофильных молекул. Рецепторные
белки тоже пересекают липидный бислой, но
ие образуют пор, а являются своеобразными
проводниками, передающими внешний сигнал
внутрь клетки. Наконец, многие белки, встро-
енные в мембрану, являются ферментами. Их
мембранная фиксация необходима для про-
странственного разграничения метаболических
процессов, в том числе разнонаправленных. До-
ля белковых компонентов сильно варьирует.
Так, в миелиновых оболочках нервов она со-
ставляет меиее 20%, в эритроцитах человека -
около 50%, тогда как во внутренней мембране
митохондрий - более 75%. Толщина биомем-
браны составляет обычно от 5 до 10 нм.
3.2.1. ЛИПИДНЫЙ БИСЛОЙ
У животных преобладающими липидами
биомембран являются глицерофосфатиды, доля
которых варьирует от 35-40% в плазматиче-
ских мембранах до более чем 70% в мембранах
митохондрий. Сфингофосфолипиды составля-
ют почти 20% в плазматических мембранах и
ие обнаруживаются в митохондриях. Гликоли-
пиды, типичные для мембран миелиновой обо-
лочки нервов (до 30% их липидного состава),
слабо представлены (или почти отсутствуют) в
других мембранах. Доля холестерола достигает
20-25% в плазматических мембранах и миели-
не, но не превышает нескольких процентов в
митохондриях и ЭР.
В водной среде амфипатическая природа
перечисленных липидов вынуждает их объеди-
няться своими гидрофобными фрагментами,
оставляя в контакте с водой лишь полярные
«головки» молекул. Даже в искусственной сре-
де (вне клеток) можно создать условия, при
которых амфипатические липиды совершенно
самостоятельно образуют два слоя молекул,
обращенных друг к другу своими углеводород-
ными «хвостами», а к водной фазе — гидро-
фильными «головками» (рис. 3-6). В каждом
моиомолекулярном слое неполярные участки
молекул объединяются между собой силами
гидрофобного взаимодействия. Эти же силы
связывают воедино неполярные «хвосты» одно-
го слоя с такими же структурами другого. Кро-
ме того, в пределах своего монослоя все поляр-
ные «головки» взаимодействуют с соседними
посредством ионных и водородных связей.
Таким образом, липидный бислой пред-
ставляет собой нековалентное объединение
множества молекул, упорядоченность которого
предопределена их амфипатичностью. Струк-
турное сходство мембранных липидов и неспе-
цифичный характер соединяющих их слабых
типов связи, - все это позволяет каждой моле-
куле легко меняться местами со своими сосе-
дями по моиослою (до 10 млн раз ежесекунд-
но). В результате такой латеральной диффузии
скорость перемещения липидных молекул
вдоль монослоя может превышать 0,1 мм/мин.
Высока и интенсивность их вращения вокруг
своей продольной оси. Вместе с тем, перескок
липидов из одного монослоя в другой (флип-
флоп) в зрелой мембране — крайне редкое со-
бытие (меиее 2 молекул в месяц), ибо требует
прохождения полярной «головки» через зону
гидрофобных «хвостов».
а)
Рис. 3-6. Схема строения липидного бислоя:
а - поперечный срез; б - фрегмент бислоя в трехмерном изображении.
96
Глава 3
Рис. 3-7. Правильное (а) и «вывернутое» (6) замыкание обрывка биомембраны
(на примера мембраны эндоплазматического ретикулума).
Состав липидного бислоя асимметричен.
Так, в плазматической мембране эритроцитов и
других клеток холестерол и холиновые фосфо-
липиды содержатся преимущественно в на-
ружном монослое, тогда как во внутреннем
сильно преобладают этаноламиновые и несу-
щие отрицательный заряд сериновые фосфати-
ды. Гликолипиды же вообще локализованы
только во внешнем моиослое клеточной мем-
браны.
Естественным атрибутом биологической
мембраны является ее непрерывность: липид-
ный бислой не может иметь «краев», он замы-
кается сам на себя, в виде бимолекулярной
пленки окружая ограничиваемое им простран-
ство. Нарушение целости биомембраны ведет к
спонтанному слиянию мест разрыва, которое
реставрирует безусловную непрерывность ли-
пидного бислоя (рис. 3-7). Во времена изуче-
ния органелл клетки, разделяемых ультрацен-
трифугированием, была обнаружена фракция
мелких пузырьков (везикул), названных микро-
сомами. Впоследствии оказалось, что в натив-
ной клетке микросом не существует, а образу-
ются они самопроизвольно, из обрывков мем-
браны эндоплазматического ретикулума (ЭР),
возникающих при механическом разрушении
клеток. Как показано на рис. 3-7, ориентация
мембраны в «микросомах» может быть «пра-
вильной» (такой, как в нативном ЭР) либо вы-
вернутой наизнанку (когда цитоплазматическая
сторона мембраны ЭР оказывается внутри мик-
росомной везикулы, а снаружи находится то,
что в нативной мембране обращено в просвет
ЭР). Изучение «вывернутых» пузырьков ие
только подтвердило представления о даижущих
силах самосборки биомембран, но и помогло
выявить структурные различия между их внеш-
ней поверхностью и внутренней. И хотя микро-
сомы в клетках не существуют, их название со-
хранилось в таких устойчивых терминах, как,
например, микросомальное окисление.
К числу функционально важных свойств
биомембраны относится способность к отпоч-
ковыванию своих фрагментов в виде мембран-
ных везикул. Как показано на схеме (рис. 3-8),
процесс начинается с появления выпячивания,
края которого затем смыкаются, образуя пере-
мычку. Она состоит из двух липидных бисло-
ев, слияние которых завершается восстановле-
нием непрерывности исходной мембраны и
замыканием самостоятельного бислоя отшну-
ровавшейся везикулы. Внутреннее ее содержи-
мое отвечает составу среды с той стороны
мембраны, которая противоположна направле-
нию ее выпячивания. Если везикула формиру-
ется с внутренней стороны плазматической
(клеточной) мембраны, то этот процесс обо-
значают термином эндоцитоз (или фагоцитоз,
если из среды захватываются крупные частицы
или даже целые клетки). Таким способом в
клетку переносятся извне объекты, для кото-
рых нет иного механизма проникновения через
биомембрану. Принципиально тот же процесс,
ио протекающий в обратном направлении, на-
зывается экзоцитозом. Ои обеспечивает выде-
ление компонентов клетки в окружающую сре-
ду. Обычно в экзоцитозе участвуют специаль-
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
97
Рис. 3-8. Схема отпочковывания фрагмента биомембраны
ные внутриклеточные пузырьки. К ним отно-
сятся, в частности, секреторные везикулы., кото-
рые возникают путем отпочкования от аппарата
Гольджи и заключают в себе белки, подлежа-
щие отправке в межклеточную среду (например,
проколлаген). Сливаясь затем с оболочкой клет-
ки, везикулы отдают свое содержимое во вне-
клеточную среду, а их мембрана становится ча-
стью плазматической мембраны. Здесь есть од-
на тонкость: при отпочковании везикул внут-
ренняя сторона цистерн Гольджи остается об-
ращенной внутрь пузырька, а при его слиянии с
клеточной оболочкой она становится наружным
моиослоем плазматической мембраны.
Помимо плазматической мембраны, окру-
жающей клетку, собственную бислойную мем-
брану имеют и некоторые внутриклеточные ор-
ганеллы. К ним относятся, в частности, лизосо-
мы, богатые ферментами внутриклеточного пи-
щеварения (которые подвергают гидролизу и
содержимое фагосом, сливающихся с лизосо-
мами). Образуются лизосомы отпочкованием
участков мембраны аппарата Гольджи. Из глад-
ких участков ЭР таким же способом возникают
пероксисомы, несущие в себе ферменты окисли-
тельной деградации органических молекул. Од-
нако есть в клетке н такие органеллы, которые
окружены двойной мембраной, т.е., двумя само-
98
Глава 3
стоятельными (замкнутыми на себя) липидными
бислоями. К ним относятся ядра клеток и мито-
хондрии (в растениях - еще и хлоропласты).
В митохондриях наружная мембрана име-
ет довольно ровную поверхность и нигде ие
смыкается с внутренней: оба бислоя разделяет
межмебранное пространство. Внутренняя мем-
брана не просто окружает содержимое мито-
хондрии (матрикс), а направляет в него мно-
жество глубоких складок, которые обознача-
ются как кристы. Они почти в 5 раз увеличи-
вают площадь этой мембраны (в сравнении с
наружной), но уменьшают объем матрикса.
Тем не меиее, именно в нем сосредоточено до
70% белков митохондрии.
В отличие от митохондрий, наружная
мембрана клеточного ядра местами сливается с
внутренним бислоем, образуя ядерные поры.
Размеры их достаточны для прохождения мо-
лекул РНК (в виде нуклеопротеиновых ком-
плексов) из ядра в цитоплазму, а гистонов и
других ядериых белков — в обратном направле-
нии (см. раздел 2.4.2). Но самое уникальное за-
ключается в том, что наружная ядерная мембра-
на формирует обширные, сильно ветвящиеся
тупиковые выросты в виде чередующихся тру-
бочек и уплощенных расширений (цистерн).
Совокупность их обозначается как ЭР. Понятно,
что мембрана этой сети представлена одиноч-
ным бислоем. Несмотря на обилие складок и
изгибов, он образует непрерывную поверхность,
которая ограничивает единое пространство (по-
лость ЭР), продолженное в межмембранную
часть ядерной оболочки. Эта полость ненамного
превышает 10% клеточного объема, тогда как
мембрана ЭР составляет более половины пло-
щади всех мембран клетки (доля внутренней
мембраны митохондрий — от 20 до 30%).
Гладкие участки ЭР являются источником
формирования аппарата Гольджи. Его упло-
щенные дисковидные цистерны образуются в
результате слияния транспортных везикул,
отделяющихся от ЭР.
3.2.2. МЕМБРАННЫЕ БЕЛКИ
Биологическая мембрана - это не только
липидный бислой, ио и ассоциированные с иим
белковые молекулы. Как показано на рис. 3-9,
некоторые из иих фиксируются ионными и во-
Рис. 3-9. Способы ассоциации мембранных белков
с липидным бислоем: а - поверхностный белок;
б - интегральные белки, не пронизывающие весь бислой;
в - трансмембранный белок; г - поверхностный белок,
фиксированный на трансмембранном; д - белок,
ковалентно связанный с якорной молекулой.
дородными связями на полярных «головках»
мембранных липидов. Другие обладают непо-
лярным участком, способным проникать в гид-
рофобную внутренность бислоя. Известен ряд
белков, амфипатические свойства которых по-
зволяют им ие только проникать в липидный
бислой, но и создавать в нем сквозные’отвер-
стия (поры). Обычно они формируются множе-
ством сомкнувшихся молекул белка, одна сто-
рона которых (неполярная) взаимодействует с
гидрофобными «хвостами» внутри бислоя, а
другая (полярная) обращена в просвет поры.
Есть и такие трансмембранные (интегральные)
белки, молекула которых, пронизывая бислой,
концами своими выступает из него, обычно по
обе стороны мембраны. Некоторые из поверх-
ностных мембранных белков ассоциированы
не с липидами, а с внемем бранной частью ин-
тегрального белка. Иногда фиксация белка
осуществляется ковалентным соединением со
специальной якорной молекулой, другим кон-
цом погруженной в бислой или закрепленной в
нем ковалентно.
Трансмембранный участок белков имеет
довольно жесткую структуру а-спирали или р-
складок, которая фиксирована внутренними
водородными связями и экспонирует свои не-
полярные радикалы аминокислот в сторону
гидрофобной зоны бислоя. Такие участки не
имеют изгибов и по протяженности равны тол-
щине этой зоны. У многих рецепторных белков
срединная часть полипептидной цепи прони-
зывает мембрану многократно, делая изгибы
(повороты) за пределами бислоя.
Как и липидные молекулы бислоя, мем-
бранные белки могут вращаться вокруг оси,
перпендикулярной его поверхности, хотя и го-
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
99
раздо медленнее. Их латеральная диффузия
варьирует в очень широких пределах, но всегда
сильно уступает подвижности липидов. Диф-
фузия белков плазматической мембраны резко
тормозится, если они ассоциированы с фила-
ментами цитоскелета или с белками соседних
клеток, и вовсе прекращается в зоне межкле-
точных плотных контактов. Эта зона отделяет
апикальную область клеточной мембраны от
базальной и препятствует диффузии белков из
одной области в другую. Тем самым обеспечи-
вается своеобразие белкового спектра разных
частей клеточной мембраны.
Мембраны, ограничивающие клеточные
органеллы, гарантируют пространственное
обособление тех или иных биохимических про-
цессов. При этом специализация каждого
отсека клетки обусловлена, прежде всего, спе-
цификой набора ферментов и других белков.
Так, синтез жирных кислот из активированной
формы уксусной кислоты (ацетил-КоА) проис-
ходит в цитозоле, тогда как окислительная де-
градация их до ацетил-КоА и далее до СОг и
Н2О осуществляется в матриксе митохондрий,
где в процесс вовлечены не только раствори-
мые ферменты, но и встроенные во внутрен-
нюю мембрану этих органелл.
В качестве другого примера можно при-
вести синтез мембранных липидов. Этот про-
цесс реализуется комплектом ферментов, каж-
дый из которых насквозь пронизывает мембра-
ну ЭР, но своим активным центром ориентиро-
ван в сторону цитоплазмы. Черпая из нее
«строительный материал» в виде фосфоглице-
рола, жирных кислот (предварительно активи-
рованных) и проч., эти ферменты уже с самого
начала синтеза внедряют образуемые продукты
(фосфатидная кислота, церамид) в структуру
наружного монослоя мембраны, а затем посте-
пенно достраивают липидную молекулу (пере-
вод таких молекул во внутренний монослой
осуществляется избирательно и только в пери-
од построения мембраны ЭР; механизм этой
процедуры пока неясен). На внутренней сторо-
не мембраны ЭР локализованы фермеиты вне-
митохоидриального (микросомального) окис-
ления, в том числе те, которые участвуют в
биосинтезе холестерола и его производных.
Еще одно проявление трансмембранной
асимметрии заключается в том, что ферменты
постсинтетической модификации белков лока-
лизованы в просвете ЭР и обычно встроены в
мембрану. Среди них наиболее многочисленны
гликозилтрансферазы, осуществляющие по-
строение разнообразных углеводных фрагмен-
тов на молекулах большинства белков (и неко-
торых липидов). Подробнее эти реакции глико-
зилирования будут изложены в разделе 10.3.4.
А пока важно подчеркнуть, что протекают они
только на внутренней стороне мембраны ЭР и
аппарата Гольджи. Поэтому в любых мембра-
нах углеводные цепочки сосредоточены лишь
на той стороне, которая не прилежит к цитозо-
лю. В ходе экзоцитоза секреторных везикул их
содержимое (включая гликоконъюгаты) посту-
пает в межклеточную среду, а мембрана
встраивается в плазматическую мембрану. При
этом углеводные фрагменты гликопротеинов и
гликолипидов оказываются на внешней сторо-
не клеточной оболочки, составляя от 2 до 10%
ее массы. Нейраминовая кислота в их составе в
основном и ответственна за наличие отрица-
тельных зарядов на поверхности клеток.
3.3.3. ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНУ
Липидный бислой практически непрони-
цаем для полярных молекул. Исключение сос-
тавляют вода и газы (О2, N2, СОг и т.д.), а так-
же нейтральные органические вещества, моле-
кулярная масса которых не превышает 100 Да
(мочевина, этанол, глицерол и им подобные).
Макромолекулы и надмолекулярные образова-
ния преодолевают мембрану посредством от-
почковывания везикул и их слияния (эндоци-
тоз, экзоцитоз, образование лизосом, фаголизо-
сом и т.п.). Некоторые из них (включая транс-
феррин, липопротеины плазмы крови, ком-
плексы антиген-антитело, многие вирусные
частицы и токсины) попадают в клетку путем
рецептор-опосредованного эндоцитоза.
Для всех остальных веществ проникнове-
ние через липидный бислой возможно только с
участием особых белков. Часть из них способ-
на формировать в нем упомянутые выше поры
(каналы), пригодные для прохождения тех или
иных молекул или иоиов. Но чаще перенос
реализуется гораздо более сложными механиз-
мами, не требующими создания канала. Иногда
они сопряжены с перемещениями белка-пере-
100
Глава 3
носчика относительно бислоя. В других случа-
ях белок, образовав комплекс с переносимым
веществом по одну сторону мембраны, претер-
певает такую конформационную перестройку,
благодаря которой освобождается от него по
другую сторону бислоя (возвращаясь при этом
в исходное конформационное состояние). Но
всегда именно мембранные транспортные бел-
ки обеспечивают избирательность процесса и
часто снабжены специальными механизмами
контроля, регулирующими интенсивность
трансмембранного потока.
Перенос какого-либо вещества бывает од-
нонаправленным (унипорт) либо возможным в
обоих направлениях. Некоторые белки-пере-
носчики осуществляют котранспорт, при ко-
тором перемещение одного вещества сопряже-
но с одновременным (или поочередным) пере-
носом другого либо в том же направлении
(симпорт), либо во встречном (антипорт).
Во многих случаях трансмембранное про-
движение молекул и ионов осуществляется пу-
тем простой диффузии. Происходит она по гра-
диенту концентраций, а для заряженных частиц
- по электрохимическому градиенту, который
определяется еще и разностью потенциалов по
обе стороны мембраны. Участие транспортных
белков позволяет ускорять физическую диффу-
зию веществ (механизм облегченной диффузии).
От перечисленных способов пассивного
транспорта принципиально отличаются сис-
темы, обеспечивающие перенос веществ про-
тив их электрохимического градиента. Работа
по преодолению концентрационного (и элек-
трического) барьера требует затраты энергии.
Отсюда и название — активный транспорт.
Источником энергии для него чаще всего слу-
жит попутное расщепление АТФ до АДФ и
фосфата. Фермент, обеспечивающий такой
процесс, обозначается как транспортная аде-
нозинтрифосфатаза (АТФаза).
К наиболее распространенным относится
натрий-калиевая АТФаза (Na+,K+-АТФаза).
Этот трансмембранный белок широко пред-
ставлен в плазматической мембране животных
клеток и очень чувствителен к концентрациям
ионов Na’’ и К+. Внеклеточный его фрагмент
имеет центр связывания для К+, а на цитоплаз-
матической стороне находятся участки, специ-
фичные для Na+ и АТФ. Связывание внутри-
клеточного Na+ стимулирует АТФазную актив-
ность, в результате чего освобождается моле-
кула АДФ, а фосфатный остаток остается со-
единенным с ферментом. Наступающие при
этом конформационные изменения белка вы-
зывают выброс Na+ из клетки наружу, за чем
следует присоединение внеклеточного К+. Это,
в свою очередь, ведет к отщеплению фосфат-
ной группы (во внеклеточную среду), которое
способствует «переброске» К+ внутрь клетки с
возвратом №+,К+-АТФазы в исходное конфор-
мационное состояние. В каждом цикле пере-
численных событий гидролиз одной молекулы
АТФ сопряжен с выбросом трех ионов Na+ из
клетки и «накачиванием» в нее двух ионов К+.
Эта неэквивалентность обмена - главная при-
чина дефицита катионов внутри клетки. Иными
словами, плазматическая мембрана оказывает-
ся поляризованной', цитоплазматическая сторо-
на ее заряжена отрицательно по отношению к
наружной. Благодаря непрерывной работе
Ыа+,К+-АТФазы, трансмембранная разность
электрических зарядов (потенциал покоя) под-
держивается на постоянном уровне, вопреки
неизбежным «утечкам» Na+ и, особенно, К+,
происходящим путем простой диффузии.
Содержание Na+ во внеклеточных средах в
десятки раз превышает концентрацию ионов
К+, а внутри клеток наблюдается обратное со-
отношение. Системы, которые создают такой
градиент, нередко называют насосами. В дан-
ном случае - натрий-калиевый насос (Na+,K+-
насос). Значение его видно уже из того, что на
перекачивание ионов Na+ и К+ расходуется бо-
лее 30% АТФ, утилизируемого клеткой на свои
нужды в состоянии покоя.
В нейронах трансмембранный градиент
концентраций этих ионов необходим для реа-
лизации элементарного акта нервной деятель-
ности, каковым является возникновение и рас-
пространение нервного импульса. Роль пуско-
вого фактора играют чаще всего особые на-
триевые каналы, которые в покое непроницае-
мы для ионов, но мгновенно раскрываются в
ответ на воздействие нейромедиатора или ино-
го раздражителя. Локальный прорыв в клетку
даже малой порции катионов (несколько тысяч
ионов Na+ за одну миллисекунду) вызывает
скачкообразную деполяризацию мембраны,
означающую смену потенциала покоя потен-
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
101
циалом действия. Очевидно, в таких каналах
должны быть некие «ворота», которые быстро
распахиваются под действием раздражителя,
но почти сразу же вновь захлопываются, оста-
навливая поток ионов. В данном случае закры-
тие «воротных каналов» происходит под влия-
нием развивающегося потенциала действия.
Тем самым обеспечивается предельная кратко-
временность нервного импульса.
Изменение трансмембранного электриче-
ского потенциала в зоне возникновения им-
пульса создает соответствующую разность за-
рядов вдоль мембраны, т.е., относительно
смежных ее участков. В них из-за этого тоже
раскрываются «ворота» для Na+ и происходит
скачок трансмембранного потенциала (с неко-
торой, естественно, задержкой относительно
локуса начальной деполяризации). Таким спо-
собом потенциал действия постепенно охваты-
вает всю остальную поверхность клетки (и ее
отростков), пробегая по ней в виде волны элек-
трического тока (ибо ионный поток - это род
электрического тока). Аналогией может слу-
жить движение огня по бикфордову шнуру.
Однако шнур при этом сгорает, а в био мембра-
не локальный сдвиг мембранного потенциала
сразу же компенсируются работой Na+,K+-Ha-
соса, возвращающего состояние готовности к
возникновению и проведению новых импуль-
сов. На эту работу нейроны расходуют до 70%
синтезируемого ими АТФ.
Система Na+,K+-Hacoca и воротных кана-
лов действует не только в нервной, но и в дру-
гих возбудимых тканях, включая мышечную.
Вместе с тем, градиент концентраций, созда-
ваемый №т,К+-АТФазой, многие клетки не
применяют для генерирования волны возбуж-
дения, а используют в качестве движущей силы
(вместо АТФ) для активного транспорта неко-
торых веществ. Так, всасывание глюкозы эпи-
телиальными клетками тонкой кишки осущест-
вляется не только путем пассивной диффузии,
но и в значительной степени благодаря сопря-
жению с транспортом ионов Na+, устремляю-
щихся в клетку по градиенту их концентрации.
Как полагают, белок-переносчик имеет разные
участки для связывания Na+ и глюкозы. Чем
больше различие в содержании Na+ внутри и
вне клетки, тем интенсивнее поступает в нее
глюкоза (и натрий, естественно). Подобный
механизм активного транспорта за счет гради-
ента концентрации Na+ осуществляется также
при реабсорбции глюкозы в почечных каналь-
цах. Во всех этих случаях дальнейший переход
моносахарида из клетки в кровь происходит
путем пассивной диффузии по градиенту его
концентрации. Известны Ыа+-зависимые пере-
носчики и для других сахаров, а также для
аминокислот. Надо заметить, однако, что в ко-
нечном счете источником энергии для таких
систем является выкачивание Na+ из клетки,
обеспечиваемое работой На+,К+-АТФазы.
Среди других ионных насосов наиболее
важную роль играет кальций-зависимая
АТФаза (Са2+-АТФаза, Са2+-насос). Встроен-
ный в плазматическую мембрану, фермент на-
столько энергично выкачивает Са2+, что его
концентрация в цитозоле эукариотических кле-
ток на 3-4 порядка ниже, чем во внеклеточных
средах (где она находится обычно на уровне
1-2 мМ). Быстрый поток ионов Са2+, устрем-
ляющийся в клетку при определенных воздей-
ствиях, служит одним из важных способов
трансмембранной передачи сигналов.
Скелетная мышца демонстрирует наиболее
выразительный пример управления клеткой
посредством ионов Са2+. Крайне низкий уро-
вень их в цитозоле поддерживается работой не
только Са2+-АТФазы плазматической мембра-
ны (сарколеммы). Значительный вклад вносит
также фермент, встроенный в мембрану сарко-
плазматического ретикулума (СР) и состав-
ляющий до 90% всего белка этой мембраны. За
каждый цикл работы этот Са2+-насос, гидроли-
зуя со стороны цитоплазмы молекулу АТФ,
перекачивает два иона Са2+ внутрь цистерн СР,
делая из них своеобразное хранилище внут-
риклеточного Са2+ (10*3 М). Потенциал дейст-
вия, возникающий при возбуждении мышечной
клетки, распространяется по сарколемме и об-
разуемым ею Т-трубочкам, достигая участков
их контакта с мембраной СР. Здесь электриче-
ский импульс вызывает быстрое раскрытие
«воротных» каналов, через которые поток на-
копленного в цистернах Са2+ устремляется в
цитозоль. Это служит сигналом для укороче-
ния миофибрилл, ибо достаточный уровень ио-
нов Са2+ (1О'б-1О'5 М) стимулирует АТФазную
активность комплекса сократительных белков
мышцы. Иными словами, только в присутствии
102
Глава 3
указанных концентраций Са2+ эти белки спо-
собны превращать энергию расщепления мак-
роэргической связи АТФ в механическую ра-
боту укорочения мышечного волокна. Расслаб-
ление мышцы, как оказалось, тоже требует за-
траты энергии АТФ: она нужна для обратного
откачивания ионов Са2+ в цистерны СР. Осуще-
ствляет этот обратный процесс Са2+-ЛТФаза,
которая сильно активируется избытком Са24 в
цитозоле и поэтому быстро снижает уровень
этого иона в нем до 10'7 М или еще ниже (что и
приводит к расслаблению миофибрилл).
Приведенные примеры показывают, что
системы трансмембранного переноса вешеств
очень разнообразны. Они различаются и своей
избирательностью, и способами функциониро-
вания, и механизмами регулирования. Их со-
гласованная работа обеспечивает специфику
состава и соотношения растворимых веществ в
различных отсеках клетки.
3.3.4. ТРАНСМЕМБРАННАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ
От мембранных белков, реализующих
прохождение определенных молекул (ионов)
сквозь липидный бислой, отличаются те, кото-
рые осуществляют трансмембранную передачу
не веществ, а информации. Источником ее ча-
ще всего являются сигнальные молекулы (гор-
моны и другие химические медиаторы), по-
средством которых одни клетки могут воздей-
ствовать на поведение других, - тех, что обла-
дают соответствующими рецепторами. Являясь
трансмембранными белками клеточной обо-
лочки, рецепторы, тем не менее, не образуют
каналов в липидном бислое. Как уже отмеча-
лось (раздел 1.9), свою роль «проводника» они
выполняют путем конформационной пере-
стройки, которая наступает под действием
внешнего сигнала и распространяется на внут-
риклеточную часть белка-рецептора, сущест-
венно изменяя ее свойства. Следствием этого
становится цепочка преобразований внутри-
клеточных «партнеров» данного рецептора,
ведущая в конечном счете к кратковременной
стимуляции (или угнетению) соответствующей
функции клетки.
В большинстве своем системы трансдук-
ции (внутриклеточного преобразования внеш-
него сигнала) используют в качестве вторично-
го посредника циклическую форму нуклеоти-
дов - цАМФ или цГМФ. Главные аспекты их
функционирования изложены в разделе 2.2.3.
Здесь уместно рассмотреть еще одну важную
систему - фосфоинозитидную. Она использует
компонент липидного бислоя, причем, только
одну группу мембранных липидов - фосфати-
дилинозитолы (см. рис. 3-3). Предварительно
молекула такого липида должна превратиться в
фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат (рис.3-10).
Этот процесс протекает путем переноса фос-
фатного остатка с АТФ на спиртовые группы
инозитола в положениях 4 и 5. Есть данные,
что его «организует» внутриклеточный домен
рецепторов, распознающих некоторые факторы
роста или гормоны белковой природы.
Из трансмембранных белков, реализую-
щих фосфоинозитидный путь, наиболее изуче-
ны di-адренорецепторы и гладкомышечные
рецепторы антидиуретического гормона (вазо-
прессина). Их возбуждение вызывает актива-
цию особого G-протеина, который, наряду с
обычной таймерной функцией аллостерически
активирует фосфолипазу С. Этот фермент,
встроенный в плазматическую мембрану с ее
внутренней стороны, катализирует гидролиз
фосфатидилинозитол-4,5 -бисфосфата до ино-
зитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерола (см.
рис. 3-10). Каждый из продуктов реакции вы-
полняет роль вторичного посредника, демонст-
рируя еще одну особенность фосфоинозитид-
ной системы. Кратковременность действия
обоих посредников обеспечивают ферменты их
гидролитического расщепления.
Гидрофобный диацилглицерол остается в
липидном бислое и способен активировать
встроенную в него протеинкиназу С. Фактиче-
ски это группа близких ферментов, которые
фосфорилируют (за счет АТФ) определенные
белки и тем самым изменяют их активность.
К мишеням протеинкиназы С относятся, в ча-
стности, некоторые факторы роста.
Другой из вторичных посредников - ино-
зитолтрифосфат - гидрофилен и поэтому легко
переходит в цитозоль, где и выполняет свое
предназначение. Оно заключается в том, чтобы
открывать воротные механизмы кальциевых
каналов, пронизывающих бислойные структу-
ры плазматической мембраны, ЭР, митохонд-
рий. Это приводит к быстрому снижению
ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ
103
II
R'-C-O-CH2
R"—с-О-СН
II I
о н2с-о
Фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат
Инозитол-1,4.5-трифосфат
II
R'-C-O-CH2
I
R"-С- О-СН
II I
О Н2С-ОН
Диацил глицерол
Рис. 3-10. Гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата фосфолипазой С.
трансмембранного градиента ионов Са2+ за
счет увеличения их содержания в цитозоле.
Такой скачок концентрации вызывает самые
разнообразные последствия (за что Са2+ иногда
называют третьим посредником фосфоинози-
тидного пути). Некоторые из них обусловлены
собственно кальцием (в частности, сорбция его
протеинкиназой С усиливает активацию этого
фермента диацилглицеролом). Однако боль-
шинство эффектов кальций вызывает не сам по
себе, а в виде комплексов с кальций-связываю-
щими белками.
Наиболее распространенным из белков,
обладающих строгой избирательностью к каль-
цию, является кальмодулин (на его долю при-
ходится до 1% суммарного содержания белков
в клетке). При сравнительно небольших разме-
рах (около 17 кДа), он содержит 4 центра, каж-
дый из которых состоит из 12 АО и обладает
высоким сродством к ионам Са2+. Сорбируя их,
белок претерпевает существенные конформа-
ционные изменения, становясь способным ви-
доизменять (модулировать) функциональную
активность ряда ферментов и иных белков. В
частности, именно кальций-кальмодулин вы-
зывает упомянутую выше активацию некото-
рых мембранных Са2+-АТФаз, наступающую
при повышении уровня Са2+ в цитозоле. Анало-
гичный регуляторный эффект, аллостериче-
ский по механизму действия, кальмодулин мо-
жет проявлять и в отношении аденилат- и гуа-
нилатциклаз, фосфодиэстеразы циклических
мононуклеотидов, ряда ферментов метаболиз-
ма углеводов. В гладких мышцах комплекс Са2
с кальмодулином активирует киназу легких це-
пей миозина, которая, фосфорилируя эти цепи,
инициирует процесс сокращения (аналогично
регулируется и сократительная активность ак-
томиозиновых систем немышечных клеток).
Иногда кальмодулин вообще является посто-
янным компонентом фермента, входя в его со-
став в качестве регуляторной субъединицы
(пример - киназа фосфорилазы).
В заключение следует отметить, что не все
внешние сигналы воздействуют именно на
внеклеточный сегмент трансмембранного бел-
ка-рецептора. Некоторые из них в силу своей
гидрофобности и небольших размеров способ-
ны проникать через липидный бислой и лишь
затем избирательно связываться с белком-
мишенью. Известные данные об одной из та-
ких сигнальных молекул - оксиде азота - при-
104
Глава 3
ведены в конце раздела 2.2.4. К числу осталь-
ных относятся стероидные гормоны, йодтиро-
нины и ряд других органических веществ, вы-
полняющих сигнальную функцию. Как прави-
ло, их эффекты реализуются посредством не-
ковалентного объединения со специфичным
белком (внутриклеточным рецептором), кото-
рый вследствие этого обретает (или теряет)
способность связываться с определенным уча-
стком ДНК и тем самым регулирует инициа-
цию транскрипции соответствующего гена.
Рецепторы для гормонов внутриклеточного
действия находятся в цитозоле или непосред-
ственно в ядре клетки. Каждый из них сущест-
вует обычно в форме комплекса с белками-
шаперонами, которые поддерживают опреде-
ленную конформацию рецепторного белка. Ее
изменения вызываются связыванием рецептора
с сигнальной молекулой и, в свою очередь,
приводят к отделению шаперонов. В результа-
те становится открытым тот участок рецептора,
который предназначен для взаимодействия с
фрагментом молекулы ДНК, контролирующим
экспрессию определенного гена.
Глава 4
ФЕРМЕНТЫ
Белковые молекулы выполняют в живом
организме самые разнообразные функции. Ка-
ким образом они это делают - эта проблема
впервые стала успешно решаться при изучении
ферментов. Со временем были разработаны
разнообразные способы и методы количест-
венного анализа ферментативных процессов.
Теперь они позволяют не только регистриро-
вать конечный итог «работы» фермента, но и
получать количественную оценку ряда качест-
венных характеристик такой деятельности.
Эти достижения способствовали успехам и* в
изучении других белков, — тех, которые не яв-
ляются ферментами. Выяснилось, что меха-
низмы и параметры функционирования таких
белков очень часто тоже могут быть количест-
венно оценены с помощью приемов, разрабо-
танных применительно к ферментам. Особенно
большую роль сыграло открытие феномена
саморегуляции ферментов, который, как оказа-
лось, свойственен и многим другим белкам.
Ферменты (энзимы) - это высокоспеци-
фичные белки, выполняющие функции биологи-
ческих катализаторов.
Как известно, катализатором называют
вещество, которое ускоряет химическую реак-
цию, но само в результате реакции не расходу-
ется.
Чтобы представить себе механизм такого
ускорения, целесообразно рассмотреть природу
химического катализа вообще.
4.1. СУЩНОСТЬ ЯВЛЕНИЯ КАТАЛИЗА
Любые химические превращения пред-
полагают прежде всего сближение (столкнове-
ние) реагирующих молекул. Но не всякое их
соударение будет эффективным, т.е., завер-
шится химическим преобразованием. Прежде
всего, в момент контакта молекулы должны
обладать таким энергетическим потенциалом
(энергия столкновения), который достато-
чен для обеспечения химических превраще-
ний. Конкретная величина этого потенциала
зависит от природы реагирующих молекул и
характера их преобразования. Поэтому ее мож-
но обозначить как энергетический уровень ре-
акции. Этот параметр является константой,
т.е., внутренней характеристикой, свойствен-
ной от природы каждой данной химической
реакции. Естественно, что для разных реакций
эта константа в общем случае различна.
С другой стороны, эффективность химиче-
ской реакции зависит от того запаса энергии,
которым фактически обладают молекулы в
момент соударения. Однако эта характеристика
— энергетический уровень молекул — не являет-
ся неизменной, а относится к разряду величин
вероятностных (статистических). Действитель-
но, уже хотя бы в силу теплового движения
молекул потенциал каждой из них непостоянен
во времени (наглядный пример - броуновское
движение частиц). Сталкиваясь с другими, от-
дельная молекула «летит» то быстрее, то мед-
леннее, а то и вовсе на мгновение почти «зам-
106
Глава 4
рет» на месте. Тем не менее, ее энергетический
потенциал колеблется около определенного
значения, которое обозначается как средний
энергетический уровень молекул (Еср). Этот па-
раметр характеризует достаточно большую со-
вокупность данных молекул в данных конкрет-
ных условиях (температура, концентрация мо-
лекул и т.д.). С течением времени каждая из
них чаще всего оказывается именно в состоя-
нии, близком к среднему значению энергетиче-
ского потенциала всех молекул данной сово-
купности. И чем дальше от этого среднего зна-
чения (в любую сторону), тем реже каждая
конкретная молекула обладает таким потен-
циалом. Отсюда следует, что в любой момент
времени наибольшая доля молекул несет в себе
именно тот запас энергии, который обозначен
как средний. И чем дальше от него, тем меньше
доля молекул, пребывающих на таком энерге-
тическом уровне. Эта зависимость выражается
законом распределения Максвелла-Больцмана.
Графически она представлена на рис. 4-1.
Таким образом, несмотря на непостоянст-
во судьбы каждой отдельной молекулы, в дос-
таточно большой их совокупности постоян-
ная доля молекул обладает тем или иным
энергетическим потенциалом. В том числе -
таким, который не ниже, чем энергетический
уровень данной реакции. Соударения именно
таких молекул - достаточно энергичных в дан-
ный момент могут завершиться химическим
их преобразованием, т.е., стать «эффектив-
ными» (с позиций химической реакции). Раз-
ность между энергетическим уровнем реакции
Рис. 4-1. Кривая Максвелла-Больцмана (распределение молекул по их энергетическому потенциалу)
в «обычных» условиях (А) и после некоторого повышения температуры (Б).
Каждая точка кривой представляет долю молекул N, (ордината), обладающих соответствующим энергетическим
уровнем Е> (абсцисса). Площадь, ограниченная кривой и абсциссой, отражает общее число молекул данной совокупности.
Доля реакционноспособных молекул обозначена штриховкой.
ФЕРМЕНТЫ
107
и средним энергетическим уровнем молекул
составляет энергию активации (Еакт), или энер-
гетический барьер данной реакции. Если эта
разность велика (рис. 4-1, А), то лишь неболь-
шая часть молекул будет обладать энергией,
достаточной для реализации химических пре-
вращений (на рисунке она обозначена штри-
ховкой). Соответственно, из всего множества
случайных столкновений молекул «эффектив-
ными» окажутся сравнительно немногие. Зна-
чит, химическая реакция будет протекать до-
вольно медленно. Напротив, чем меньше вели-
чина энергии активации, тем больше будет до-
ля достаточно «энергичных» молекул и тем
выше станет скорость химической реакции.
Важно подчеркнуть, что преобразования
наиболее «энергичных» частиц в ходе реакции
не приводят к полному исчезновению только
активных молекул, т.е., к «обрыву» кривой рас-
пределения по линии энергетического уровня
реакции. Ибо по мере уменьшения общего
количества непрореагировавших молекул вся
кривая распределения снижается по высоте, но
в целом сохраняет свой вид. Иными словами,
определенная доля молекул всегда будет
обладать энергией, достаточной для химиче-
ского взаимодействия. И это - несмотря на
уменьшение (в процессе реакции) абсолютной
величины как общего числа молекул, так и ко-
личества достаточно «энергичных» молекул.
Естественно, это сопровождается постепенным
уменьшением скорости реакции, - в соответст-
вии с законом действующих масс.
Из изложенного ясно, что для ускорения
химической реакции необходимо уменьшить
величину энергии активации. Один путь к это-
му очевиден: следует повысить энергетический
потенциал молекул. Это можно сделать, на-
пример, нагреванием. Тогда вся кривая распре-
деления сместится вправо, в сторону более вы-
соких уровней энергии (рис. 4-1. Б). Соответ-
ственно повысится значение среднего энерге-
тического уровня молекул (Еср). В результате
гораздо большая часть их окажется в числе тех,
чей энергетический потенциал выше энергети-
ческого уровня данной реакции (отмечено
штриховкой на рис. 4-1, Б). Следовательно,
возрастет доля «эффективных» соударений мо-
лекул, и скорость реакции станет более высо-
кой, чем до нагревания (или воздействия дру-
гих факторов, - например, облучения). Такой
способ ускорения реакции широко применяет-
ся на практике. Однако он неприемлем для жи-
вых организмов, способных существовать
лишь в довольно узком диапазоне температу-
ры, давления и т.д.
Казалось бы, есть и другой путь к умень-
шению энергии активации: снижение энерге-
тического уровня реакции. Однако такой путь
принципиально невозможен, ибо этот пара-
метр, как отмечалось выше, является констан-
той, характеризующей внутреннюю сущность
каждой данной химической реакции.
Природа, однако, нашла нетривиальный
путь ускорения реакций, - такой, который не
требует высоких температур или других жест-
ких воздействий. Суть его поясняют реакции,
уравнения которых в общем виде представле-
ны на рис. 4-2.
Уравнение I показывает, что некие моле-
кулы А и В способны вступать в химическую
реакцию, превращаясь в соединение АВ.
В принципе возможно подобрать определенное
вещество К, образующее с молекулой А про-
межуточный продукт АК (уравнение Па), кото-
рый под действием В превращается в АВ с ос-
вобождением вещества К в его исходном виде
(уравнение ПЬ). Суммарный итог двух послед-
них реакций такой же, как и в реакции I, но
образование молекул АВ происходит здесь в
присутствии (и при участии!) вещества К, ко-
торое, однако, остается в итоге неизменным.
I. А + В—Е‘кт- >АВ
Па. А+К—>АК
ПЬ. АК+В >АВ+К
Итоговое уравнение реакции П: А + В ———> АВ
Рис. 4-2. Химические реакции между веществами А и В: прямая (I) и опосредованная веществом К (II).
108
Глава 4
Значения энергии активации всех трех
упомянутых реакций в общем случае различ-
ны. И все возможные соотношения между ни-
ми можно свести в две группы:
1. Величины энергии активации реакций Па
или ПЬ (либо обеих) больше, чем Е^.
В соответствии с этим, реакция Па или ре-
акция ПЬ (либо обе) будут протекать мед-
леннее, чем реакция I. Значит, в любом из
таких вариантов суммарная реакция П бу-
дет осуществляться медленнее, чем прямая
реакция между А и В без участия вещества
К. В таком случае вещество К следует на-
звать (и называют) ингибитором данной
химической реакции. Будучи добавленным
в систему, оно отвлекает на себя какое-то
количество молекул А и/или В и тем са-
мым уменьшает возможности их прямого
взаимодействия между собой, - т.е., за-
медляет и собственно реакцию I.
2. Величины и Е'1^ и Е^(т.е., каждая из
них) меньше, чем величина Е’^.. В такой
ситуации и реакция Па, и реакция ПЬ бу-
дут протекать быстрее, чем реакция I. Зна-
чит, возникновение продукта АВ с участи-
ем вещества К (суммарная реакция II) ста-
нет происходить эффективнее, чем при
прямом взаимодействии А и В (реакция I).
А посредник К, облегчающий образование
конечного продукта АВ, обозначается как
катализатор (ускоритель) данной хими-
ческой реакции.
Итак, катализатор — это вещество, ко-
торое направляет химическую реакцию по об-
ходному пути, причем такому, на котором
энергетические барьеры ниже.
Для наглядности на рис. 4-3 приведена
схема, поясняющая суть явления катализа. Она
не только иллюстрирует то, что изложено вы-
ше. Здесь ясно видно также, что энергия акти-
вации - это как бы временный кредит, который
молекулы полностью возвращают в процессе
реакции. А энергетический итог реакции пред-
ставляет собой разницу между величинами
среднего энергетического уровня исходных
молекул и конечных продуктов. Он не зависит
от величины энергии активации и, следова-
тельно, от участия катализатора.
Общие законы термодинамики, включая
понятие о свободной (полезной) энергии, пред-
сказывают принципиальную возможность (или
невозможность) самопроизвольного протека-
ния того или иного процесса (например, скаты-
вания частиц по склону вулкана либо спон-
танного возвращения их назад). Кинетические
же параметры (в том числе энергия активации)
определяют, с какой скоростью может проте-
кать термодинамически возможный процесс.
Следовательно, энергетические барьеры - это
те препятствия, которые стоят на пути ко все-
общему термодинамическому выравниванию,
усреднению всего и вся. Ограждая энергетиче-
ские «ловушки», эти барьеры на какой-то срок
«сохраняют» их содержимое, препятствуя рос-
ту энтропии - степени неупорядоченности.
Именно благодаря энергетическим барьерам
возможно существование даже такого уни-
кального отклонения от абсолютной хаотично-
сти. каким является живой организм.
Изложенные представления об энергии ак-
тивации и сущности катализа несколько упро-
щены ради наглядности. В частности, при хи-
мическом взаимодействии (в том числе с уча-
стием катализатора) происходит не просто со-
ударение молекул, но и формирование проме-
жуточного комплекса (обычно его называют
«активированным комплексом»). Энергетиче-
ские характеристики молекул тоже не сводятся
только к кинетической энергии теплового дви-
жения. Тем не менее, суть явлений изложена
достаточно верно, в том числе и применитель-
но к формированию и распаду промежуточных
комплексов. Строго она выражается уравнени-
ем Аррениуса, которое может быть представ-
лено в следующем виде:
V = А • е RT ,
где: v - скорость химической реакции; А - пре-
дэкспоненциальный множитель; е - основание
натуральных логарифмов; R - универсальная
газовая постоянная; Т - температура в абсо-
лютной шкале.
Предэкспоненциальный множитель А
включает в себя концентрации реагирующих
веществ и ряд других сомножителей. В их чис-
ле - «стерический фактор», отражающий веро-
ФЕРМЕНТЫ
109
ятность «оптимальной» ориентации молекул в
момент их сближения (особенно важен он для
крупных молекул, в том числе - для фермен-
тов). Еще одни сомножитель учитывает изме-
нения энтропии в ходе реакции. Он показыва-
ет, почему иные реакции с малой Еакт осущест-
вляются медленно (энтропийный фактор очень
велик) или ряд реакций с высоким значением
ЕаКт протекает довольно быстро (энтропийный
фактор очень мал).
В уравнении Аррениуса значение ЕаКт вхо-
дит в показатель степени. Значит, даже очень
небольшим различиям в величине Еакт соответ-
ствуют значительные различия в скорости ре-
акции. Далее: перед показателем степени стоит
знак «минус». Следовательно, чем больше ве-
личина Еа1СТ, тем медленнее течет реакция (что
и отмечалось выше). Наконец, в уравнении Ар-
рениуса значение энергии активации дано в
расчете на произведение универсальной газо-
вой постоянной R и температуры в абсолютной
шкале Т. Иными словами, значение Еакт следу-
ет рассчитывать относительно неких стандарт-
ных условий. Действительно, в общепринятом
Рис. 4-3. Схема, иллюстрирующая природу каталитического эффекта.
На схеме условно изображен срез вулкана, проходящий вертикально через его кратер. Слева - шкала энергети-
ческих уровней (Е). Высота лавы в кратере условно обозначает средний энергетический уровень исходных моле-
кул, а уровень подножья горы — средний энергетический уровень продуктов реакции. Крея кратера неровные. Их
высота символизирует энергетический уровень реакции в отсутствие катализатора (справа) или в его присутствии
(слева). Ясно, что лишь некоторые из частиц, выбресываемых кипящей лавой, имают шанс преодолеть край кре-
тере и скатиться к подножью. Слева таких частиц окажется гораздо больше, чем спрева. Поэтому реакция с уча-
стием катализатора идет быстрее, чем без него. На схеме видно также, что энергия, затраченная на подъем час-
тиц над краем кратере, полностью компенсируется при самопроизвольном их скатывании по склону вулкана до
уровня лавы в нем. Остальная часть энергии, освобождаемой при скатывании к подножью, обозначается как
энергетический итог реакции. Видно, что он не зависит ни от величины энергии активации, ни от пути, по кото-
рому прошла реакция.
Можно отметить, что в принципе частицы вновь могут быть заброшены в кратер. Для этого необходим, однако,
внешний (для системы) источник энергии. На схеме видно, что энергетический итог обратного процесса оказыва-
ется точно таким же, как и в прямой реакции, но с обретным знаком (что указывает на необходимость расходова-
ния внешней энергии). Попав снова в кратер, частицы не могут просто так опять покинуть его. Они будут пребы-
вать в этой энергетической «яме» («ловушке»), пока не получат импульс, соответствующий величине энергии ак-
тивации. Понятно, что длительность их пребывания здесь зависит от высоты энергетических барьеров.
но
Глава 4
понимании Еакт является не просто разностью
между энергетическим уровнем реакции и
средним энергетическим уровнем молекул (как
это было сформулировано выше), а этой разно-
стью, отнесенной к стандартному значению
среднего энергетического уровня молекул. Та-
кое стандартизованное значение энергии акти-
вации тоже является (как и энергетический
уровень реакции) постоянной величиной (кон-
стантой), характеризующей каждую конкрет-
ную химическую реакцию.
4.2. ОБЩИЕ СВОЙСТВА КАТАЛИЗАТОРОВ
Изучение катализа позволило выявить ряд
общих принципов каталитического действия.
Установлено, что любой катализатор (в том
числе фермент):
1) не ВЫЗЫВАЕТ химическую реакцию,
а лишь УСКОРЯЕТ реакцию, которая в прин-
ципе возможна и без катализатора (хотя иногда
протекает настолько медленно, что ее практи-
чески не удается зарегистрировать); иными
словами, невозможно создать такой катализа-
тор, который осуществил бы реакцию, не соот-
ветствующую законам термодинамики;
2) не влияет на энергетический итог реак-
ции;
3) в обратимых реакциях ускоряет и пря-
мую, и обратную реакцию, причем - в
ОДИНАКОВОЙ степени; из этого следует, что
катализатор:
а) не влияет на направление обратимой ре-
акции (оно определяется лишь соотношением
концентраций исходных и конечных продук-
тов); следовательно, направление реакции не
зависит от концентрации катализатора-,
б) не влияет на положение равновесия об-
ратимой реакции, а лишь ускоряет достижение
этого равновесия {степень этого ускорения
возрастает с увеличением концентрации ка-
тализатора).
4.3. ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТОВ
КАК БИОЛОГИЧЕСКИХ КАТАЛИЗАТОРОВ
Развитие энзимологии подтвердило, что
ферменты обладают всеми свойствами, прису-
щими катализаторам вообще. Вместе с тем,
ферменты - это белки, т.е., громадные, высо-
коорганизованные молекулы, очень чувстви-
тельные к условиям среды. Отсюда проистека-
ет ряд особенностей, свойственных именно
ферментам. К их числу относятся:
- чрезвычайная эффективность катали-
тического действия;
- высокая чувствительность к неспеци-
фичным физическим и физико-химическим
факторам, - таким, как температура, pH среды,
ионная сила окружения и т. п.;
- исключительная «требовательность»
как к строению субстрата (субстратная спе-
цифичность), так и к типу катализируемого
превращения этого субстрата (специфичность
действия)',
— высокая и очень избирательная чувстви-
тельность к физико-химическим влияниям тех
или иных веществ (лигандов), способных неко-
валентно влиять на конформацию белка-фер-
мента, повышая его эффективность (актива-
тор) или уменьшая ее (ингибитор фермента).
4.3.1. ЭФФЕКТИВНОСТЬ
ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА
Ферменты могут ускорять катализируе-
мую ими реакцию в миллионы, миллиарды и
даже в триллионы раз (106-1014 раз). Далеко не
каждый фермент столь высоко эффективен. Но
всегда фермент ускоряет реакцию несравненно
значительнее, чем любой из простых (небелко-
вых) катализаторов. Например, в водном рас-
творе без примесей пероксид водорода подвер-
гается спонтанному разложению очень мед-
ленно (константа скорости реакции составляет
10'6 с'1) и потому может храниться длительное
время. При добавлении солей двухвалентного
железа скорость распада Н2О2 возрастает в 60
тысяч раз. Такое же (по молярности) количест-
во каталазы из эритроцитов ускоряет эту ре-
акцию примерно в 7 миллиардов раз. Легко
подсчитать, что этот фермент «работает» более
чем в 100 тысяч раз эффективнее неорганиче-
ского катализатора. Такой размах скоростей
просто огромен на фоне умеренных различий в
величинах энергии активации: стандартное ее
значение составляет для этих трех реакций со-
ответственно 75, 40 и 7 кДж/моль.
Еще один пример - мочевина. Это очень
простое вещество (рис. 4-4) является одним из
ФЕРМЕНТЫ
111
nh2
O=c( + H2O уреа3а >СО; + 2 NH3
NH.
Рис. 4-4. Реакция расщепления мочевины
под действием уреазы.
конечных продуктов метаболизма и выводится с
мочой в количестве примерно 30 г в сутки (у
взрослого человека). Оно очень стабильно и не
разлагается заметно в процессе формирования
мочи и ее накопления в мочевом пузыре. Одна-
ко, некоторые микроорганизмы обладают уреа-
зой — ферментом, который в 1013 раз (!) ускоряет
реакцию спонтанного разложения мочевины до
СОг и аммиака. Поэтому при инфицировании
мочевых путей такими микробами моча приоб-
ретает резкий аммиачный запах. То же бывает и
при хранении мочи в нестерильных условиях.
4.3.2. ВЛИЯНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ
ФАКТОРОВ СРЕДЫ
Как уже отмечалось (раздел 1.8), конфор-
мационное состояние белка очень чувстви-
тельно к физическим и физико-химическим
условиям среды, - температуре, pH, ионной
силе и т.д. Все эти неспецифические факторы
так или иначе влияют на пространственную
организацию макромолекулы и могут даже
способствовать развитию денатурационных
процессов. Поэтому для любого белка (в том
числе — фермента) существует оптимальный
диапазон каждого из перечисленных парамет-
ров среды, в рамках которого молекула сохра-
няет нагивность и наилучшим образом выпол-
Рис. 4-5. Типичная кривая зависимости скорости
ферментативной реакции (v) от температуры среды.
няет свое функциональное предназначение
(для ферментов - функцию катализа).
Влияние температуры на скорость
ферментативной реакции характеризуется
куполообразным графиком (рис- 4-5). Вершина
купола соответствует диапазону температур,
оптимальному для данного фермента. У тепло-
кровных животных температурный оптимум
большинства ферментов находится в пределах
35-45°С. Для ферментов растений он обычно
смещен в зону 25-20°С или даже ниже. Шири-
на купола бывает разной. Она зависит от
устойчивости фермента к тепловой денатура-
ции. При повышении температуры за пределы
оптимальной происходит более или менее
плавное снижение скорости ферментативной
реакции, а в определенной зоне (разной для
разных ферментов) наступает полная денату-
рация белка и, следовательно, необратимая ут-
рата каталитической функции. Снижение тем-
пературы от оптимальной до нулевой также
сопровождается постепенным замедлением
ферментативной реакции, но оно носит об-
ратимый характер: последующее согревание
ведет к полному восстановлению свойств фер-
мента. Поэтому все процедуры по выделению и
очистке ферментных препаратов проводят
обычно на холоду (от 0° до +4°С); это относит-
ся и к хранению очищенных белков.
Влияние pH на функционирование фер-
ментов очень значительно. Подкисление или
подщелачивание среды усиливает диссоциацию
соответственно основных или кислотных групп
белковой молекулы, вызывая более или менее
значительные изменения ее конформационного
состояния. В случае фермента это приводит
сначала к плавному, а затем все более резкому
уменьшению каталитической эффективности. В
некотором диапазоне аблизи оптимума pH эти
изменения обратимы. Однако чрезмерные сдви-
ги pH приводят к необратимой потере активно-
сти фермента вследствие его денатурации.
Многие ферменты сильно различаются и
по значению оптимума pH, и по характеру рН-
зависимости (примеры приведены на рис. 4-6).
Очень часто ионизирующиеся группировки
входят в состав активного центра фермента,
т.е., непосредственно участвуют в акте катали-
за. Степень их диссоциации гораздо сильнее
сказывается на каталитической эффективности.
112
Глава 4
Относительная
Рис. 4-6. Влияние pH среды на скорость ферментативной
реакции: 1 - пепсин; 2 - лизоцим; 3 - амилаза слюны;
4 - аргиназа.
чем изменения общего заряда всей белковой
молекулы в целом. Поэтому пик оптимума pH
у таких ферментов гораздо более узок, чем у
остальных.
Ионная сила раствора также небезраз-
лична для функционирования фермента, по-
скольку уровень концентрации электролитов
существенно отражается на слабых взаимодей-
ствиях в молекуле белка, - особенно на ионных
связях. В целом, зависимость здесь тоже имеет
куполообразный характер, подобный показан-
ным на рис. 4-5 и 4-6. Иначе говоря, для каж-
дого фермента есть свой диапазон оптималь-
ных значений ионной силы среды, и по мере
удаления от этого оптимума скорость фер-
ментативной реакции все больше уменьшается.
В некоторых пределах эти изменения обрати-
мы, но при слишком больших отклонениях мо-
гут стать и необратимыми.
Подводя итог, следует отметить, что каж-
дый из ферментов успешно функционирует в
довольно узком диапазоне физических и физи-
ко-химических параметров среды. Оптималь-
ное их сочетание необходимо для обеспечения
такого конформационного состояния нативно-
го белка, которое наиболее благоприятно для
проявления его каталитических свойств.
4.3.3. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ
ФЕРМЕНТОВ
Каждый фермент способен ускорять хи-
мические превращения далеко не любых ве-
ществ, а только вполне определенных. Их на-
зывают субстратами данного фермента. Из-
бирательность к субстратам может быть очень
высокой. Например, упомянутый выше фер-
мент уреаза распознает только одно-единствен-
ное вещество — мочевину, катализируя ее рас-
щепление до СО2 и аммиака (см. рис. 4-4). Этот
фермент совершенно не влияет на превращения
каких-либо других веществ, даже если они
очень похожи на мочевину. У млекопитающих
к числу столь высокоизбирательных ферментов
относится аденилатциклаза (см. раздел 2.2.3),
для которой АТФ в качестве субстрата не мо-
гут заменить даже ближайшие ему по строе-
нию нуклеозидтрифосфаты. Такого рода мак-
симально строгая «требовательность» фермен-
та к структуре своего субстрата называется аб-
солютной субстратной специфичностью. Од-
нако встречается она редко.
Обычно же субстратная специфичность
бывает относительной (групповой). Это озна-
чает, что фермент способен ускорять однотип-
ную реакцию у группы веществ, сходных по
строению. Такой способностью обладают, в ча-
стности, пищеварительные ферменты. Напри-
мер, трипсин катализирует гидролиз пептидных
связей, образуемых карбоксильной группой ли-
зина или аргинина с аминогруппой почти любой
другой аминокислоты. Более того, он может
гидролизовать связи этих карбоксильных групп
не только с аминокислотами, но и со многими
аминами. Вместе с тем, фермент не способен
расщеплять пептидные связи, образованные
аминогруппой лизина или аргинина.
Следует отметить, что ферменты с груп-
повой специфичностью все-таки делают опре-
деленные различия между своими субстратами.
Так, глюкозооксидаза — фермент, содержащийся
в некоторых грибках, — оказывает явное пред-
почтение D-глюкозе, обеспечивая ее окисление
(за счет кислорода) до глюконовой кислоты.
Такие же превращения 2-дезокси-D-глюкозы,
2-дезокси-6-фторО-глюкозы и 6-метил-В-глю-
козы этот фермент катализирует со скоростью,
соответственно в 4, 33 и 54 раза меньшей. Окис-
ление ряда сходных веществ глюкозооксидаза
катализирует в 100-1000 раз медленнее, а мно-
гие десятки других исследованных изомеров
или аналогов глюкозы совершенно нечувстви-
тельны к присутствию этого фермента.
К ферментам с наиболее широкой суб-
стратной специфичностью относятся, например,
фосфатазы. Те из них, которые проводят гидро-
ФЕРМЕНТЫ
113
лиз эфиров фосфорной кислоты с простыми ор-
ганическими веществами, как правило, не очень
требовательны к структуре спиртовой части
субстрата. Их обычно и обозначают такими тер-
минами, как щелочная фосфатаза, кислая
фосфатаза, т.е. без указания на предпочтитель-
ный субстрат (хотя им и свойственно заметное
предпочтение к эфирам некоторых спиртов).
Выделяют также стереохимическую спе-
цифичность ферментов. Она проявляется в тех
случаях, когда субстрат может существовать в
форме разных пространственных изомеров. Как
правило, фермент «признает» только один из
них. Важно отметить, что стереохимическая из-
бирательность - это не только предельный ва-
риант абсолютной субстратной специфичности.
Она типична и для ферментов с групповой спе-
цифичностью. В частности, некоторые клетки
содержат два разных фермента - оксидазу
L-аминокислот и оксидазу D-аминокислот. Каж-
дый из них катализирует окислительное отщеп-
ление аминогруппы от почти любой аминокис-
лоты, но только в пределах либо L-, либо D-ряда.
4.3.4. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ
ФЕРМЕНТОВ
Если субстратная специфичность разных
ферментов варьирует в очень широких преде-
лах, то специфичность действия всегда со-
блюдается очень строго. Она проявляется в
том, что фермент способен ускорять только
одну из всех реакций, в которые может всту-
пать его субстрат. Примером такого субстрата
является глюкозо-6-фосфат. В одной и той же
клетке эта молекула может подвергаться раз-
личным превращениям. И каждое из них тре-
бует участия специального фермента. В част-
ности, гидролиз глюкозо-6-фосфата до глюко-
зы и фосфата осуществляет глюкозо-6-фос-
фатаза. Перенос фосфатной группы из 6-го в
1-е положение реализует совсем другой фер-
мент - фосфоглюкомутаза. Изомеризацию во
фруктозо-6-фосфат производит фосфогексои-
зомераза. Наконец, окисление альдегидной
группы глюкозо-6-фосфата для превращения
его в 6-фосфоглюконовую кислоту протекает
благодаря глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназе.
Приведенный пример - лишь иллюстрация
общей закономерности: разные типы реакций с
одним и тем же субстратом катализируют со-
вершенно различные ферменты.
4.3.5. ОБРАТИМЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
ФЕРМЕНТА С ЛИГАНДАМИ
Функциональные группировки на поверх-
ности белковой молекулы фермента способны
нековалентно взаимодействовать с веществами
самого различного строения, лишь бы те обла-
дали подходящими физико-химическими харак-
теристиками (гидрофильность-гидрофобность,
способность формировать водородную связь,
наличие заряда и его знак). Обычно это никак не
отражается на эффективности ферментативного
катализа. Однако иногда такое взаимодействие
происходит в «стратегически важных» участ-
ках фермента, вызывая существенную конфор-
мационную перестройку белковой молекулы.
Это может привести к усилению-или ослабле-
нию его каталитического действия. Вещества,
вызывающие такие эффекты, называются соот-
ветственно активаторами и ингибиторами
данного фермента. Их действие является обра-
тимым. поскольку осуществляется (для рас-
сматриваемых здесь веществ) только за счет
слабых типов связи. Поэтому удаление таких
лигандов (например, путем диализа) ведет к
полному восстановлению исходной каталити-
ческой способности фермента (об эффекторах
необратимого типа речь пойдет отдельно).
Избирательность обратимых активаторов
и ингибиторов бывает очень высокой. Она от-
носится к самым наглядным проявлениям
генеральных функций белка - способности
к узнаванию и реагированию (см. раздел 1.9).
4.4. НОМЕНКЛАТУРА, КЛАССИФИКАЦИЯ
И ИНДЕКСАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
Во времена становления энзимологии от-
крываемые ферменты именовались обычно по
названию субстрата, к которому добавляли
окончание «-аза». Многие из таких терминов
сохранились до сих пор. Например, амилаза (от
amylum - крахмал) - фермент, катализирующий
гидролиз крахмала; фосфатаза (гидролизует
эфиры фосфорной кислоты); уреаза (расщепляет
мочевину); протеиназа (осуществляет гидролиз
белков). С приумножением выявляемых фер-
114
Глава 4
ментов стали возникать названия, ничего не го-
ворящие ни о субстрате, ни о природе катализи-
руемой реакции. Так появились обозначения
«каталаза», «диафораза», «промежуточный фер-
мент», «желтый фермент Варбурга» (который
пришлось обозначать как «старый желтый фер-
мент» после открытия нового «желтого фермен-
та») и т. д. Постепенно эти не очень внятные
термины заменялись более точными. И все же,
нередко какой-либо фермент получал разные
имена или, напротив, одинаковое название да-
вали разным ферментам.
В 1956 г. Международный биохимический
союз учредил Комиссию по ферментам. Она
составила список более 700 известных тогда
ферментов и разработала принципы их систе-
матизации и рационального обозначения. Соз-
данная на этой основе Классификация и но-
менклатура ферментов утверждена на V Меж-
дународном биохимическом конгрессе (Моск-
ва, 1961 г.). Она действует поныне, постоянно
пополняясь вновь открываемыми энзимами (за
40 лет общее их число возросло пятикратно,
достигнув почти 3,5 тысяч).
По новой номенклатуре наименование
фермента должно состоять из названия его суб-
страта и обозначения типа катализируемой ре-
акции, которое завершается окончанием «-аза».
Если в реакции участвуют два субстрата, то
приводятся названия обоих (разделенные двое-
точием). Отсюда - громоздкость систематиче-
ских наименований. Поэтому было решено
«узаконить» употребление и многих традицион-
ных (рабочих) названий, которые привычнее, а
главное - гораздо короче. В самом деле, удобнее
пользоваться краткими терминами «глюкозо-
оксидаза» или «аденилатциклаза» вместо их на-
званий в систематической номенклатуре:
«p-D-глюкоза: кислород-1 -оксидоредуктаза» и
«АТФ-пирофосфатлиаза (циклизирующая)».
В отличие от принятой в химии система-
тизации веществ по строению (составу) их мо-
лекул, рациональная классификация ферментов
может быть построена только на основе их
функции. Действительно, катализируемая ре-
акция - это тот всеобщий признак, по которому
один фермент отличается от других. При этом
учитывают только суммарное химическое пре-
вращение, выражаемое формальным итоговым
уравнением.
В соответствии с международной Класси-
фикацией ферментов (КФ), по типу катализи-
руемой реакции все ферменты подразделяются
на 6 классов, за каждым из которых закреплен
свой порядковый номер:
1. Оксидоредуктазы — катализируют реакции
окисления-восстановления.
2. Трансферазы - реализуют межмолекуляр-
ный перенос групп атомов (метильных, гли-
козильных, фосфатных, аминогрупп и т.д.).
3. Гидролазы — катализируют гидролитическое
расщепление сложноэфирных, пептидных,
гликозидных и ряда других связей.
4. Лиазы — обеспечивают расщепление связи
углерода с кислородом, азотом, серой или
другим углеродом без участия воды.
5. Изомеразы — проводят реакции внутримоле-
кулярного переноса (рацемазы, мутазы,
внутримолекулярные оксидоредуктазы и
ряд других).
6. Лигазы (синтазы) - допустимо название
синтетазы’, проводят реакции синтеза за
счет энергии расщепления макроэргиче-
ской связи (в АТФ или его аналогах).
Первые три класса содержат почти по ты-
сяче ферментов каждый, последние - от одной
до нескольких сотен. Разнообразие ферментов в
каждой из этих крупных групп потребовало
дальнейшей градации классов на подклассы, а
тех - на подподклассы. Главными критериями
при этом служат характер атакуемой связи или
функциональной группировки в молекуле суб-
страта, наличие второго субстрата, природа ак-
цептора (если он есть), строение переносимой
группы и т. д. Наконец, каждый подподкласс
состоит из перечня индивидуальных ферментов
с закрепленным для каждого из них порядковым
номером. Вновь открываемые ферменты зано-
сятся в соответствующий подподкласс под оче-
редным номером (т.е., последовательность их
носит чисто хронологический характер).
К числу преимуществ КФ относится воз-
можность обозначать каждый фермент инди-
видуальным шифром (индексом). Он состоит
из четырех чисел, первое из которых обознача-
ет номер класса, второе - номер подкласса,
третье — номер подподкласса и, наконец, чет-
вертое - порядковый номер фермента в его
подподклассе. Эти числа отделяются друг от
ФЕРМЕНТЫ
115
друга точкой. Например, индекс глюкозоокси-
дазы (КФ 1.1.3.4) указывает, что этот фермент
относится к подклассу 1 класса оксидоредуктаз
(т.е., действует на группу СН-ОН в молекуле
окисляемого вещества); что акцептором двух
атомов водорода, отнимаемых от субстрата,
является молекула кислорода (такие ферменты
в подклассе 1 оксидоредуктаз составляют под-
подкласс 3) и, наконец, что в этом подподклас-
се глюкозооксидаза имеет порядковый номер 4.
Таким образом, индекс фермента не толь-
ко точно обозначает его (а также указывает на
официальное признание этого энзима), но и
дает представление о типе катализируемой ре-
акции и характере атакуемых связей (отсюда —
и о возможных продуктах реакции).
Современная Классификация ферментов
«помехоустойчива»: любой вновь открытый
фермент можно вставить в соответствующий
подподкласс под очередным номером. Если
понадобится - можно ввести в нее новый под-
подкласс или даже подкласс. По мере углубле-
ния знаний некоторые ферменты приходится
исключать из общего списка либо переносить в
другой разряд. Естественно, при этом индекс
фермента изменяется. Во избежание путаницы,
прежний индекс сохраняется в перечне фер-
ментов, но с пометкой «исключен» (deleted).
Все новшества оперативно отражаются на спе-
циальных сайтах в Интернете, посвященных
ферментам, - таких как Enzyme Nomenclature
или ExPASY-ENZYME, содержание которых
контролируется Комитетом по номенклатуре
Международного союза по биохимии и моле-
кулярной биологии.
4.5. СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ
Макромолекула белка может взаимодейст-
вовать с молекулой субстрата, естественно, не
всей своей поверхностью, а только относитель-
но небольшим ее участком. И не любым, а
вполне определенным. Он обозначается как ак-
тивный центр фермента. В его пределах выде-
ляют две функционально различные зоны - ад-
сорбционный центр (участок) и каталитичес-
кий центр (участок). Кроме того, вне пределов
активного центра может быть один или несколь-
ко так называемых аллостерических центров.
4.5.1. КАТАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР
Каталитическим центром фермента обозна-
чают совокупность тех фрагментов белковой
молекулы, которые непосредственно участвуют
в химических преобразованиях субстрата. Фор-
мируется он радикалами обычно двух или трех
аминокислот, расположенных в разных местах
полипептидной цепи, но пространственно
сближенных между собой благодаря изгибам
этой цепи (т.е., благодаря особенностям третич-
ной структуры белка). Непосредственное уча-
стие в акте катализа принимают чаще всего гид-
роксильная группа серина, имидазольное коль-
цо гистидина, группа -SH цистеина, карбок-
сильная группа аспартата (глутамата). Приме-
ром может служить ацетилхолинэстераза
(АХЭ), - фермент, способный гидролитически
расщеплять сложноэфирную связь между ук-
сусной кислотой и спиртом холином. Каталити-
ческий участок этого фермента представлен ра-
дикалами серина, гистидина и глутамата, кото-
рые у человека занимают в полипептидной цепи
положения 203, 447 и 334 соответственно (рис.
4-7, А). Под влиянием субстрата происходит
перераспределение слабых взаимодействий в
этой «каталитической триаде», которое способ-
ствует «переброске» ацетильного остатка с хо-
лина на радикал серина-203 (рис. 4-7, Б и В).
Затем место холина, покидающего ацил-фер-
мент, занимает молекула воды, вызывая новую
череду перемещений нековалентных и кова-
лентных связей (рис. 4-7, Г). Она завершается
гидролитическим отщеплением уксусной ки-
слоты от серина-203 и возвращением каталити-
ческого центра в изначальное состояние (рис.
4-7, Д). Иными словами, элементы каталитиче-
ского участка АХЭ сначала вытесняют из суб-
страта спиртовую «половину», ковалентно со-
единяясь с ацильным его фрагментом, а потом
с участием воды отщепляют временно захва-
ченную кислоту (в данном случае - уксусную).
Ферменты, сходные с АХЭ по строению
каталитического центра (а, значит, и по меха-
низму его функционирования), часто называют
серин-гистидиновыми или, более кратко, сери-
новыми. К ним относятся не только различные
эстеразы, но и многие протеиназы, — фермен-
ты, гидролизующие пептидную связь (которая
по своей природе очень близка сложноэфир-
116
Глава 4
HC=N*...н-о-сн2
Глузз4-сн2-СН2-С-О"..Н-N >Н Сер203
О I
Гис447-СН?
н,с\
H,C-W-CH2-CH.-0-C-0
nsc' ) (,
HC-N-H.....0-CH2
ГЛУ334-СН2-СН2-С-О-Н..N* >н Сер2И
О |
Гис447-СН2
«13V' «V L/ П /->< <
H>C HC=N’ I 3
I x C=0
Глузз-СН2-СН2-С-СГ....H-N /Н £
°
CH3
H-0....C-0
: I
HC-N-H.....O-CH2
ГлУэз4-СН2-СН2-С-О-Н....A; >H Cep203
О T
Гис447-СН2
Д-
CH,
H*O’-C-0
HC=hQ-..Н-О-СНг
ГлуззГсН2-СН2-С-О-..H- A>H Cep203
О I
Гис^-СНг
Рис. 4-7. Ацетилхолинэстераза (АХЭ): схема строения каталитического центра (А) и основные стадии акта катализа (Б-Д).
Каталитический центр АХЭ человека состоит из радикалов сер-203, гис-447 и глу-334, расположенных на вершинах
трех петель полипептидной цепи, но пространственно сближенных между собой за счет особенностей третичной струк-
туры белковой молекулы фермента. Такая ориентация делает возможным нековалентное притяжение одного азота
имидазольного кольца гистидина к карбоксильной группе глутамата, а другого - к гидроксилу серина. Благодаря этому,
«каталитическая триада»> формирует систему переноса заряда (А), которая резко повышает реакционную способность
серина-203. Приближение молекулы субстрата (ацетилхолин, - на рисунке он выделен курсивом) вадет к перераспре-
делению заряда в этой системе, что провоцирует перегруппировку нековалентных и ковалентных связей в пределах
фермент-субстратного комплекса (Б). Как следствие, облегчается передача водорода гидроксильной группы серина-203
на кислород спиртовой части субстрата, вызывающая разрыв сложноэфирной связи в молекуле ацетилхолина. В ре-
зультате спирт (холин) отделяется в качестве одного из продуктов холинэстеразной реакции, а ацетильный фрагмент
оказывается ковалентно связанным с серином-203, образуя с ним сложноэфирную связь (В). Затем место освободив-
шегося холина занимает молекула воды (выделена жирным шрифтом), заполняя собой просвет между гис-447 и аце-
тилсерином (О. Это опять-таки ведет к перераспределению заряда, которое теперь уже «возвращает» водород гидро-
ксильной группе серина-203 с передачей остальной части молекулы воды ацетильному остатку, удаляемому в виде ук-
сусной кислоты в качестве второго продукта реакции (Д). В конечном итоге гидролиз субстрата до холина и ацетата за-
вершается переходом активного центра в исходное конформационное состояние, обеспечивающее готовность взаимо-
действовать с новой молекулой субстрата.
ФЕРМЕНТЫ
117
ной). В частности, каталитический центр хи-
мотрипсина состоит из радикалов серина-195,
гистидина-57 и аспартата-102 (нумерация дана
по их положению в цепи предшественника -
химотрипсиногена). Аналогичной триадой об-
ладают трипсин, эластаза, ферменты свертыва-
ния крови и т.д. Помимо сериновых протеиназ,
существуют и протеолитические ферменты с
иной структурой каталитического центра. На-
пример, в молекуле пепсина его роль выполня-
ет тандем аспартата-94 и аспартата-277. Такого
рода ферменты называют аспартатными (или
карбоксильными) протеиназами.
Непосредственно участвуя в ковалентных
превращениях субстрата, именно каталити-
ческий центр предопределяет специфичность
действия фермента.
Нередко фермент является не простым, а
сложным белком. В таких случаях небелковая
часть молекулы (простетическая группа) обыч-
но тоже участвует в работе каталитического
центра и, следовательно, в обеспечении специ-
фичности действия фермента. Если такая груп-
па соединена с белком не ковалентными связя-
ми, а слабыми физико-химическими взаимо-
действиями, то она легко диссоциирует и мо-
жет быть полностью отделена от белка (напри-
мер, путем диализа). Такую нековалентно при-
соединенную простетическую группу стали
обозначать термином кофермент. Было уста-
новлено, что ни белковая часть фермента (апо-
фермент), ни кофермент порознь не обладают
способностью ускорять химическую реакцию.
Это может делать только их объединение -
«полный» фермент (холофермент). Постепен-
но противопоставление терминов «простетиче-
ская группа фермента» и «кофермент» утрати-
ло новизну открытия, и теперь коферментом
часто называют любую небелковую часть фер-
мента, независимо от прочности ее связи с бел-
ком (если по контексту нет необходимости
привлечь внимание к характеру связи белка с
небелковой группой фермента).
Для многих ферментов роль кофермента
выполняет один из витаминов или его произ-
водное (нередко обозначаемое как «активная»
форма этого витамина).
Витамины — это органические вещества
разнообразного строения, которые не синте-
зируются в организме, но жизненно необходи-
мы ему, а потому должны обязательно посту-
пать с пищей, хотя и в очень малых количест-
вах.
Главной (если не единственной) биологи-
ческой функцией почти всех витаминов являет-
ся выполнение коферментной роли. Этим и объ-
ясняется минимальная потребность в них. ко-
торая у человека не превышает, как правило,
2-5 мг в сутки.
Из приведенного определения явствует,
что перечень витаминов не универсален и мо-
жет иметь видовые особенности. Так оно и есть.
Например, аскорбиновая кислота является ви-
тамином только для человека, обезьян, морской
свинки и индийского крылана, тогда как все
другие животные способны синтезировать ви-
тамин С (из глюкозы) и не нуждаются в поступ-
лении его с пищей. Теперь окончательно уста-
новлено, что человек нуждается в 13 витаминах.
Четыре из них обозначают как жирораствори-
мые витамины (A, D, Е, К). Еще 9 составляют
группу витаминов, растворимых в воде. К ним
относятся витамины В| (тиамин), В2 (рибофла-
вин), РР (никотинамид), С, В3 (пантотеновая
кислота), В(, (пиридоксин), биотин (вит. Н), В12
(кобаламин) и фолиевая кислота (вит. Вс). Све-
дения о некоторых витаминах даны в разделе
2.2.1. Коферментная роль других будет изложе-
на в последующих главах при описании соот-
ветствующих биохимических процессов.
4.5.2. АДСОРБЦИОННЫЙ ЦЕНТР
Как видно из его названия, адсорбционный
центр предназначен для формирования слабых
типов связей с молекулой субстрата. Тем са-
мым реализуется функция распознавания суб-
страта - то, с чего начинается действие любого
фермента.
Формируется адсорбционный участок за
счет радикалов одной или нескольких амино-
кислот, непосредственно примыкающих к ка-
талитическому центру, а иногда еще и тех, ко-
торые расположены на некотором удалении от
него. Даже «непосредственно примыкающие»
не обязательно являются соседями по стержню
полипептидной цепи. Напротив, - обычно они
встроены в отдаленные звенья этой цепи, но
118
Глава 4
благодаря третичной структуре приближены к
элементам каталитического центра.
Например, в адсорбционном участке АХЭ
главную роль играет так называемый анионный
центр. По современным данным, он представ-
лен радикалом триптофана-86, ароматическое
ядро которого несет частичный отрицательный
заряд (диффузно распределенный по индоль-
ному кольцу) и окружено гидрофобными ради-
калами соседних аминокислот. В целом такая
структура комплементарна триметиламмоние-
вой группе («катионной головке») ацетилхоли-
на (см. рис 4-7, б). Кроме того, по другую сто-
рону серина-203 находится небольшое гидро-
фобное углубление, по размерам соответст-
вующее метильной группе ацетильного остат-
ка. Оно тоже способствует притяжению суб-
страта, но главное - совместно с анионным
участком обеспечивает правильную ориента-
цию ацетилхолина относительно каталитиче-
ского центра фермента.
Многие из сериновых эстераз не имеют
анионного участка в активном центре. Поэтому
подходящим для них субстратом является ие
ацетилхолин, а молекула эфира, не несущая
заряда. Например, гидролиз эфиров холестерола
с высшими жирными кислотами катализирует
холестеролэстераза. Ее адсорбционный центр
представлен обширными гидрофобными зона-
ми, одна из которых фиксирует полицикличе-
скую структуру холестерола, а другая сорбирует
углеводородный «хвост» жирной кислоты.
У ряда сериновых протеиназ главную
часть адсорбционного центра составляет осо-
бое углубление («ниша», «карман»), стенки
которого выстланы неполярными радикалами
аминокислот. Проникать в такую полость спо-
собны только гидрофобные фрагменты суб-
страта. В активном центре химотрипсина раз-
меры «ниши» таковы, что размещаться в ней (и
удерживаться силами гидрофобного взаимо-
действия) могут достаточно крупные радикалы
таких аминокислот, как, например, фенилала-
нин (рис. 4-8). При этом пептидная связь, обра-
зуемая его карбоксильной группой, оказывает-
ся в зоне каталитической триады (такой.ориен-
тации способствуют и другие элементы ад-
сорбционного центра, влияние которых обо-
значено пунктирными линиями). Наступающий
затем гидролиз этой связи (на рис. 4-8 она ука-
зана зигзагом) приводит к расщеплению моле-
кулы белка-субстрата на два полипептидных
Рис. 4-8. Схема фиксации белкового субстрата на активном центре химотрипсина.
Впадина («ниша»), примыкающая к каталитическому центру, выстлана неполярными радикалами аминокислот
(условно обозначено затенением) и приспособлена для сорбции радикала фенилаланина (показан на схеме) ли-
бо тирозина, триптофана или лейцина. Превильному расположению их на активном центре способствуют слабые
связи (показаны пунктиром) белка-субстрата с другими элементами адсорбционного центра. В итоге каталитиче-
ской триаде «преподносится» пептидная связь (отмечена зигзагом), обрезованная карбоксильной группой амино-
кислоты, попавшей в «нишу». Расщепление этой связи достигается обычным для сериновых эстераз способом
(см. рис. 4-7). Сначала происходит вытеснение аминогруппы (в качестве N-конца того из продуктов реакции, ко-
торый на схеме выделен жирным шрифтом). Этому сопутствует передача серину-195 той карбонильной группы,
которая принадлежит аминокислоте, фиксированной в «нише». На следующей стадии эта группа покидает серин
(путем гидролиза сложноэфирной связи, только что образованной им), т.е., освобождается второй продукт реак-
ции, - в виде полипептида, у которого С-концевой аминокислотой является в приведенном примере фенилала-
нин (а в других случаях может оказаться тирозин, триптофан или лейцин). Следует еще отметить, что химотрип-
сину, в общем-то, безразлично, какая аминокислота выступает в качестве R' (т.е., станет N-концевой в первом из
двух продуктов расщепления пептидной связи в молекуле белка).
ФЕРМЕНТЫ
119
фрагмента, в одном из которых С-концевое по-
ложение занимает (в данном примере) фенил-
аланин. Таким образом, химотрипсин способен
расщеплять молекулу белка во всех тех местах,
где имеются остатки фенилаланина (а также
тирозина, триптофана или лейцина, обладаю-
щих столь же крупными неполярными радика-
лами, приемлемыми для гидрофобной «ни-
ши»).
В активном центре трипсина тоже имеется
аналогичная «ниша», примыкающая к катали-
тическому центру, но на дне ее расположена
карбоксильная группа аспартата, несущая от-
рицательный заряд. В таком адсорбционном
центре могут размещаться лишь радикалы ли-
зина или аргинина, полиметиленовые цепочки
которых оканчиваются положительным заря-
дом на атомах азота. Следовательно, в белко-
вой молекуле субстрата трипсин будет гидро-
лизовать только те пептидные связи, которые
образованы с участием группы -СООН лизина
или аргинина. Этот фермент, как и химотрип-
син, безразличен к структуре другого участни-
ка атакуемой пептидной связи (R' на рис. 4-8).
Таким образом, именно адсорбционный
центр предопределяет субстратную специ-
фичность фермента. Иначе говоря, своеобра-
зием своей структуры этот участок формули-
рует на языке физико-химических свойств пе-
речень тех требований, которым должна отве-
чать молекула субстрата. Но это еще не все. Он
не только «узнает» молекулу, пригодную в ка-
честве субстрата, но и ориентированно связы-
вает ее, — как бы «преподносит» каталитиче-
скому центру в наиболее удобном для него по-
ложении.
Сорбция субстрата на адсорбционном цен-
тре фермента - процесс обратимый, ибо осу-
ществляется за счет только нековалентных свя-
зей. По мере их возникновения (в одной точке,
другой и т.д.) происходит правильное разме-
щение субстрата на активном центре, которое
стимулирует вполне определенную конформа-
ционную подвижку элементов активного цен-
тра (включая его каталитический участок). Это
приводит к обеспечению более точного соот-
ветствия между пространственными структу-
рами субстрата и активного центра. Следова-
тельно, - и к более успешной работе каталити-
ческого центра.
Вещества, похожие на субстрат, тоже могут
связываться с адсорбционным центром. Однако
затем такая подмена обнаруживает себя. На-
пример, если фермент катализирует гидролиз
какого-либо сложного эфира R'-C(O)-O-R", то
молекула простого эфира аналогичного строе-
ния (R'-CH2-O-R") имеет высокие шансы неко-
валентного связывания с адсорбционным цен-
тром этого фермента. Однако тогда в зоне ката-
литического участка окажется не сложноэфир-
ная группировка «истинного» субстрата, а про-
стая эфирная связь, не поддающаяся расщепле-
нию данным ферментом. Занимая адсорбцион-
ный центр, такой аналог препятствует взаимо-
действию фермента с настоящим субстратом.
Тем самым он затрудняет работу всего активно-
го центра, т.е. является ингибитором данного
фермента. Причем, обратимым ингибитором
(т.е., соединяющимся с ферментом нековалент-
но). Такого рода обратимые ингибиторы назы-
вают конкурентными, ибо они «соперничают» с
субстратом за обладание активным центром. До-
бавление субстрата способствует вытеснению
им молекул ингибитора из активного центра и,
следовательно, ослаблению угнетающего эф-
фекта. В конечном счете все большим повыше-
нием концентрации субстрата можно совсем
вытеснить ингибитор из активного центра и
восстановить изначальную работоспособность
фермента.
4.5.3. АЛЛОСТЕРИЧЕСКИЕ ЦЕНТРЫ
В свое время было замечено, что многие
обратимые ингибиторы вовсе непохожи на
субстрат. Их назвали аллостерическими инги-
биторами. имея в виду совсем иную простран-
ственную организацию таких молекул в срав-
нении с субстратом данного фермента. Несоот-
ветствие структур (отсутствие комплементар-
ности) препятствует формированию стойких
физико-химических взаимодействий между
ними и активным центром. Угнетающее дейст-
вие таких ингибиторов не удается ослабить по-
вышением концентрации субстрата. Следова-
тельно, они являются неконкурентными инги-
биторами. Очевидно, они должны связываться
не с адсорбционным участком, а где-то в ином
месте, вне активного центра фермента. Эти
места (сайты, — от английского site) стали на-
120
Глава 4
зывать аллостерическими центрами. Сорбиру-
ясь на определенном сайте, неконкурентный
ингибитор вызывает такие конформационные
изменения белка, которые вовлекают и актив-
ный центр фермента, затрудняя его функцио-
нирование- Степень угнетения в данном случае
не зависит от количества субстрата и определя-
ется только концентрацией ингибитора и сте-
пенью его сродства к данному ферменту.
Бывает и так, что взаимодействие какого-
то лиганда с соответствующим ему аллостери-
ческим участком не затрудняет, а, напротив,
облегчает работу активного центра, вызывая,
можно сказать, «благоприятные» конформаци-
онные подвижки в молекуле фермента. Оче-
видно, такое вещество следует называть акти-
ватором. Важно подчеркнуть, что многие ак-
тиваторы ферментов оказывают свое влияние
именно через аллостерические воздействия и,
следовательно, относятся к эффекторам некон-
курентного типа.
От термина «аллостерический центр» не
стали отказываться даже после того, как выяс-
нилось, что иногда его структура очень близка
строению адсорбционного участка. Не обладая
элементами каталитического центра, такой не
совсем обычный аллостерический участок спо-
собен связывать субстрат, но не подвергает его
химическим превращениям. При достаточном
избытке субстрата могут произойти конформа-
ционные изменения фермента, отражающиеся
на его работоспособности. Обычно она снижа-
ется. Тогда говорят об угнетении фермента из-
бытком субстрата. Это - своеобразный вариант
аллостерического угнетения. У некоторых
ферментов наблюдается обратный эффект — не
затруднение, а улучшение работы активного
центра. Такой феномен называют аллостериче-
ской активацией фермента собственным суб-
стратом.
К числу ферментов, угнетаемых избытком
субстрата, относится уже упоминавшаяся аце-
тилхолинэстераза Помимо анионного центра в
адсорбционном участке, она имеет еще и пе-
риферический анионный центр (ПАЦ), кото-
рый находится за пределами активного центра,
но тесно примыкает к нему. Решающими
компонентами ПАЦ являются радикалы трп-
286 и асп-74, а также трех остатков тирозина (в
положениях 72, 124 и 341). Фиксация ацетил-
холина на ПАЦ несколько изменяет ориента-
цию трп-86 адсорбционного участка, тем са-
мым затрудняя работу всего активного центра.
Однако по сродству к ацетилхолину ПАЦ су-
щественно уступает адсорбционному участку
АХЭ. Поэтому замедление гидролиза ацетил-
холина начинается лишь при высоких концен-
трациях этого субстрата.
Аллостерические центры бывают (точнее —
известны) далеко не у каждого фермента.
Обычно они присущи достаточно сложно уст-
роенным белковым молекулам, особенно тем,
которые обладают четвертичной структурой (и
потому легче поддаются весомым конформа-
ционным перестройкам). В молекуле может
быть один, а может быть и несколько аллосте-
рических центров, обычно очень разных. Бла-
годаря их избирательности, активность фер-
мента по-разному меняется под действием раз-
личных эффекторов, в роли которых могут вы-
ступать те или иные метаболиты, вторичные
посредники, лекарственные препараты и т.д.
При этом принципиально важна обратимость
вызываемого эффекта. Ферменты, способные
обратимо изменять интенсивность своей функ-
ции под действием определенных метаболитов,
называются регуляторными.
Можно заключить, что природа в ходе эво-
люции специально «отбирала» и «шлифовала»
удачные фрагменты белковой молекулы, кото-
рые мы теперь называем аллостерическими
центрами. Шлифовала их (и не только у фер-
ментов!) именно как инструмент для реали-
зации посреднической миссии молекул-«ин-
форматоров». В этом смысле вполне оправдан
термин «центр» - то есть, участок, специально
созданный для выполнения какой-то конкрет-
ной функции (в данном случае - узнавание
строго определенного вещества и жестко за-
данный характер реагирования на его воздей-
ствие). Вместе с тем, сложность и разнообразие
рельефа белковой молекулы делают возмож-
ным синтез какого-либо вещества, комплемен-
тарного достаточно протяженному участку по-
верхности фермента. Его взаимодействие с
этим участком может вызвать конформацион-
ные сдвиги, отражающиеся на эффективности
ферментативного катализа. Именно так дейст-
вуют многие искусственно синтезированные
лекарственные препараты. Соответствующие
ФЕРМЕНТЫ
121
участки фермента тоже называют аллостериче-
скими центрами, хотя в данном случае природа
не «придумывала» их специально, а просто
удалось создать комплементарное им вещест-
во-эффектор. Детальное выяснение устройства
поверхности белковой молекулы, ее третичной
и четвертичной структуры позволяет предска-
зывать строение веществ, которые могут ока-
заться эффективными лигандами. Целенаправ-
ленный синтез веществ с заданными физико-
химическими характеристиками (и последую-
щее испытание серии таких веществ) является
наиболее перспективным направлением в раз-
работке лекарств новых поколений. Оно уже
дает свои плоды: десятки препаратов, создан-
ных таким путем, применяются в практической
медицине.
В заключение раздела важно подчеркнуть,
что активному и всем аллостерическим цен-
трам вместе принадлежит ничтожная доля мо-
лекулы фермента. Неверно, однако, было бы
расценивать остальную ее часть просто в каче-
стве инертного носителя этих функционирую-
щих группировок. Эти остальные структуры
тоже существенны для работы фермента. В ча-
стности, именно их особенностями предопре-
деляется характер возможных конформацион-
ных подвижек как в ходе ферментативного ка-
тализа, так и в реализации регуляторных воз-
действий активаторов и ингибиторов, особенно
аллостерических.
4.6. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ
ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА
Любая ферментативная реакция протекает
через серию промежуточных стадий - так на-
зываемых элементарных актов. Но все они мо-
гут быть сведены к трем основным, принципи-
ально различным этапам (рис. 4-9).
Этап I - сорбция субстрата (S) на активном
центре фермента (Е) с образованием фермент-
субстратного комплекса (Е-S). Реализуется пу-
тем формирования слабых типов связи, а пото-
му протекает легко и полностью обратим. Кон-
формационные подвижки в процессе сорбции
усиливают пространственное соответствие ак-
тивного центра структуре субстрата. Приспо-
собление («подгонка») их друг другу обеспечи-
вается в основном адсорбционным центром и
характеризует эффективность его работы.
Этап II - ковалентные преобразования суб-
страта в составе фермент-субстратного ком-
плекса, в результате чего появляется комплекс
фермента с химически измененным субстратом
(Е • S’), т.е. с почти готовым продуктом (Р).
В этом этапе участвует каталитический центр.
Он обеспечивает разрыв одних ковалентных
связей, формирование других. Поэтому данный
этап необратим (за исключением тех реакций,
которые по природе своей обратимы, - для них
в схеме на рис. 4-9 обозначены пунктиром
стрелки в обратном направлении). Необходи-
мость ковалентных превращений субстрата
делает этот этап, как правило, гораздо более
трудным и медленным, чем этап I (да и чем
этап III тоже). Поэтому константа скорости
этого этапа (к+2) обычно гораздо меньше всех
остальных частных констант скорости (к+ь к.ь
к+3). Иными словами, именно этап II определя-
ет (лимитирует) скорость всей реакции в це-
лом, а величина к+2 дает количественное пред-
ставление об эффективности работы каталити-
ческого центра.
Этап III - десорбция готового продукта ре-
акции (Р) из комплекса Е S’, которая сопро-
вождается освобождением фермента в его
исходном виде. Чаще всего этот этап протекает
легче предыдущего, но, как и этап И, является
необратимым (опять же, за исключением слу-
чаев катализа обратимой химической реакции).
Здесь уместно отметить, что многие бел-
ковые молекулы связываются со своим специ-
фическим лигандом примерно так же. как фер-
мент сорбирует молекулу субстрата на этапе I.
E + S ktl > Е S k« > E S k” > Е+Р
к, " '
<-- I —»!<— п —> <— ш —>|
Рис. 4-9- Основные этапы ферментативного катализа.
122
Глава 4
Отличаются же они неспособностью хи-
мически преобразовывать молекулы связанно-
го лиганда. К наиболее известным представи-
телям таких белков относятся гемоглобин, ко-
торый нековалентно присоединяет кислород в
легких и разносит его по организму. Другой
пример — клеточные рецепторы, которые обра-
тимо связывают определенный гормон или ме-
диатор, а наступающей при этом своей кон-
формационной перестройкой передают соот-
ветствующий сигнал внутриклеточным струк-
турам. Все белки такого рода являются как бы
ферментами, реализующими этап I, но неспо-
собными осуществлять каталитическую функ-
цию (т.е., этапы II и III). Поэтому к ним приме-
нимы те методы кинетической характеристики,
которые разработаны для количественной
оценки функциональных возможностей этапа I
ферментативной реакции.
4.7. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОГО
КАТАЛИЗА
Кинетика вообще - это учение о скоростях
процессов. В химических реакциях скорость
измеряется по убыли субстрата в единицу вре-
мени или, что то же самое, по приросту про-
дукта реакции во времени. Здесь необходимы
два уточнения. Во-первых, регистрировать
следует так называемую начальную скорость
реакции, т.е., за тот отрезок времени, пока кон-
центрация субстрата снизится не настолько,
чтобы это привело к заметному замедлению
реакции в соответствии с законом действую-
щих масс (обычно скорость практически неиз-
менна до расщепления не более 20% субстра-
та). Во-вторых, для ферментативных реакций
всегда нужна поправка на скорость спонтанно-
го процесса. Иными словами, работа фермента
характеризуется скоростью реакции в присут-
ствии фермента за вычетом ее скорости без
фермента (при прочих равных условиях).
В дальнейшем изложении под скоростью фер-
ментативной реакции будет подразумеваться
именно начальная скорость с поправкой на не-
ферментативные превращения (которая иногда
бывает весьма существенной).
Единицы измерения скорости реакции мо-
гут быть разными. Количество превращаемого
вещества лучше всего выражать в молярных
единицах, а время - в секундах или минутах.
Соответственно в качестве единиц скорости
можно использовать такие, как ммоль/мин или
мкмоль/с и т.п. Непосредственные измерения
хода реакции удобно проводить путем регист-
рации изменений какого-либо физического па-
раметра, свойственного субстразу или обра-
зующемуся продукту. Например, если один из
них имеет окраску, то скорость процесса удоб-
но измерять по динамике светопоглощения
раствора, в котором протекает реакция (при
этом единицы светопоглощения при желании
можно перевести в молярную концентрацию
анализируемого вещества, воспользовавшись
соответствующей калибровочной кривой).
Как известно, скорость любой химической
реакции определяется законом действующих
масс: она пропорциональна произведению кон-
центраций реагирующих веществ. Фермента-
тивные реакции отличаются в этом плане неко-
торыми особенностями. Во-первых, одно из
реагирующих веществ - это фермент, концен-
трация которого, как правило, на много поряд-
ков меньше, чем концентрация субстрата. Во-
вторых, фермент, как и всякий катализатор, не
расходуется в ходе реакции, а потому его ко-
личество в ходе реакции остается неизменным
(точнее, постоянной пребывает совокупная
концентрация свободного фермента и связан-
ного в комплексах с субстратом и продуктом).
Рассмотрим выражение закона действую-
щих масс применительно к простейшей (одно-
субстратной) ферментативной реакции:
r = k+2- [Е] [S]
Анализ этого уравнения позволяет вскрыть
своеобразие кинетики ферментативного ката-
лиза.
4.7.1. ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ
ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТА
Эксперименты in vitro позволяют изучать
ферментативную реакцию в стандартных усло-
виях, варьируя тот или иной параметр при со-
блюдении постоянства остальных. В частности,
можно варьировать количество фермента,
обеспечив постоянную (но достаточно высо-
кую) концентрацию субстрата. Такие опыты
показывают, что скорость превращений суб-
ФЕРМЕНТЫ
123
страта прямо пропорциональна концентрации
фермента (его количеству в инкубационной
смеси стандартного объема). Это проявляется
линейностью графика зависимости v от [Е] в
довольно большом диапазоне концентраций
фермента (рис. 4-10).
При очень высоких значениях [Е] нередко
наблюдается отклонение от линейности. Не
вдаваясь в причины этого, следует отметить
главное: для получения воспроизводимых ре-
зультатов измерять скорость реакции следует
только при таких концентрациях фермента,
которые не выходят за рамки линейной зави-
симости. Поэтому, начиная работу с каким-
либо ферментом (или биопробой, содержащей
фермент, - например, с сывороткой крови),
всегда предварительно следует эксперимен-
тально установить тот диапазон, в пределах
которого скорость реакции пропорциональна
концентрации данного фермента. Это позволя-
ет в дальнейшем измерять скорость реакции
только при одной, произвольно взятой концен-
трации фермента (желательно - в средней час-
ти линейного диапазона). Разделив измерен-
ную при этом скорость на количество (концен-
трацию) фермента, получают параметр, име-
нуемый активностью фермента. По сути, это -
тангенс угла наклона линейного участка к абс-
циссе (тангенс угла а на рис. 4-10): он одно-
значно характеризует положение всего линей-
ного участка на таком графике.
Рис. 4-10. Зависимость скорости ферментативной
реакции (и) от концентрации фермента ([Е])
при достаточно высокой концентрации субстрата.
Итак, активность фермента - это ско-
рость ферментативной реакции в расчете на
единицу количества фермента (в стандарт-
ном объеме инкубационной смеси)
Измерять активность фермента можно
в разных единицах, в зависимости от того, в
каких единицах представлены убыль субстрата,
время и количество фермента. Очень часто ко-
личество фермента выражают в миллиграммах
белка. Тогда единица активности может выгля-
деть, например, так: мкмоль/(мин.мг). Это
означает: мкмоли субстрата, превращаемого за
1 минуту в расчете на 1 мг белкового препара-
та, содержащего данный фермент. По мере
фракционирования биопробы с целью удаления
«посторонних» белков регистрируемые вели-
чины такой удельной активности фермента
будут возрастать. Это позволяет судить об эф-
фективности каждой из процедур очистки изу-
чаемого фермента.
Оптимальной единицей является молеку-
лярная активность фермента. Она означает
количество молекул субстрата, превращаемых
одной молекулой фермента за 1 мин при 30 °C
в условиях, наиболее благоприятных для дан-
ного фермента (включая оптимальную концен-
трацию субстрата). Естественно, в таких еди-
ницах можно выражать активность лишь тех
ферментов, для которых известна молекуляр-
ная масса. Зато становится возможным не
только сравнивать активность одного и того же
фермента из разных источников, но и сопос-
тавлять каталитическую эффективность со-
вершенно разных ферментов. Так, молекуляр-
ная активность (прежнее обозначение - число
оборотов) каталазы эритроцитов человека со-
ставляет 1 200 000. Это значит, что одна моле-
кула этого фермента за 1 мин при 30 °C расще-
пляет 1,2 млн молекул пероксида водорода (до
воды и молекулярного кислорода). Среди дру-
гих наиболее активных ферментов можно на-
звать уже упоминавшуюся ацетилхолинэстера-
зу (1 500 000), а также карбоангидразу, которая
катализирует обратимую реакцию превраще-
ния углекислого газа и воды в угольную кисло-
ту (ее молекулярная активность достигает
60 000000!).
Многие десятилетия понятие «активность
фермента» использовали как синоним термина
124
Глава 4
«количество фермента» (или его концентрация)
в исследуемом биологическом объекте. Дейст-
вительно, если активность какого-то фермента
в расчете на 1 мл исследуемой сыворотки кро-
ви у одного человека вдвое ниже, чем у друго-
го, то из линейности графика на рис. 4-10 сле-
дует, что у первого из них сыворотка содержит
вдвое меньше фермента, чем у второго. Строго
говоря, трактовка не вполне корректна, ибо
активность - это показатель не количества
фермента, а его эффективности (которая может
меняться). Хотя и до сих пор нередко (даже в
учебниках) пишут «активность повышена»,
имея в виду повышение концентрации фермен-
та (например, в сыворотке крови).
Чтобы обеспечить однозначность терми-
нов, было решено ввести понятие «количество
фермента» и измерять его скоростью катализи-
руемой реакции, измеренной при 30°С и про-
чих оптимальных значениях pH и других пара-
метров среды. Международная система единиц
(СИ) рекомендует в качестве такой единицы
катал (кат).
Катал - это то количество фермента,
которое преобразует 1 моль субстрата за 1
секунду.
Для биологических объектов эта единица
измерения чрезмерно велика. Поэтому исполь-
зуют в миллиард раз меньшую мерку — нано-
катал. Однако, обычно применяют более удоб-
ную единицу — юнит (в зарубежной литературе
- unit, что в английском и означает «единица»).
Юнит - это то количество фермента,
которое преобразует 1 мкмоль субстрата за
1 мин.
Таким образом, если в расчете на 1 мл ис-
следуемой сыворотки крови некая фермента-
тивная реакция протекает со скоростью 1,
2 или 5 мкмоль/мин, то это означает, что в 1 мл
этой сыворотки содержится 1, 2 или 5 юнит
данного фермента, а его концентрация состав-
ляет соответственно 1, 2 и 5 юнит/мл.
Легко подсчитать соотношение разных
единиц:
1 юнит = 16,67 нанокатал;
1 нанокатал = 0,06 юнит.
Очевидно: чем больше молярная масса
фермента (при сходстве чисел оборотов), тем
больше весовых единиц его (например, милли-
граммов) приходится на 1 юнит (или 1 кат).
Итак, измерение скорости ферментативной
реакции позволяет количественно оценить со-
держание соответствующего фермента в анали-
зируемом биологическом материале. Такие из-
мерения невозможно произвести в живом объ-
екте, - они осуществимы только в опытах in
vitro. При этом регистрируется функционально
полноценный фермент, но не его генетически
дефектные формы, не обладающие полноцен-
ной ферментативной активностью. Они могут
быть определены иммунологическими метода-
ми. которые, однако, обычно не позволяют
оценить функциональную активность фермента
(да и других белков тоже).
4.7.2. ЗАВИСИМОСТЬ СКОРОСТИ РЕАКЦИИ
ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ СУБСТРАТА
Влияние концентрации субстрата можно
исследовать путем измерения скоростей реак-
ции в серии пробирок, содержащих одинако-
вую порцию фермента, но возрастающие коли-
чества субстрата. Естественно, с увеличением
концентрации субстрата скорость реакции ста-
новится все выше. Однако эта зависимость не
является линейной. Соответствующий график
(рис. 4-11) представляет собой часть равнобоч-
ной гиперболы и описывается уравнением Ми-
хаэлиса-Ментен:
где:
[S] - концентрация субстрата в отдельном
эксперименте;
v - скорость реакции при данной конкрет-
ной концентрации субстрата;
и Км - главные кинетические кон-
станты, характеризующие фермент в его реак-
ции с данным субстратом.
График в координатах Михаэлиса-Ментен
представляет собой типичную кривую насы-
щения (в данном случае - фермента субстра-
том): с увеличением значений абсциссы значе-
ния ординаты постепенно приближаются к не-
которому пределу (насыщению).
ФЕРМЕНТЫ
125
Рис. 4-11. Влияние концентрации субстрата ([S])
на скорость ферментативной раакции (*>)
[черными кружочками показаны результаты измераний
в эксперименте in vitro].
Vmax - это то предельное значение, к ко-
торому стремится скорость реакции при бес-
конечно большом увеличении концентрации
субстрата (см. рис. 4-11). Этот кинетический
параметр характеризует максимально возмож-
ную работоспособность данного фермента и
называется максимальной скоростью данной
ферментативной реакции.
Как уже отмечалось, скорость фермента-
тивной реакции лимитируется, как правило,
константой скорости ее этапа II, т.е., величи-
ной к+2- Следовательно, Vmax характеризует со-
бой эффективность именно этого этапа (чаще
всего). Вместе с тем, Vmax — это не то же самое,
что к+2 . Последняя отражает скорость реакции
в расчете на стандартные условия (включая
требование 1 М концентрации каждого из уча-
стников реакции). Величина же VniHX - это мак-
симально возможная скорость, оцениваемая в
опытах с каким-то определенным количеством
фермента. Иными словами, она пропорцио-
нальна концентрации фермента:
V„.=k42-[E] [4-2]
Экспериментально найденная величина
Vmax может быть пересчитана на единицу коли-
чества фермента, и тогда она представляет со-
бой его максимальную активность. Она может
быть рассчитана на единицу количества иссле-
дуемого объекта, — например, на 1 мл плазмы
крови, на 1 г анализируемой ткани, на I клетку.
Тогда Vmax характеризует максимально возмож-
ную скорость данной ферментативной реакции
в соответствующем объеме биологического
объекта (1 мл, 1 г, одиночная клетка). Если при
этом скорость представлена в мкмоль/мин, то
получаем выраженное в юнитах содержание
данного фермента в проанализированной био-
пробе, т.е., его концентрацию в ней.
Другая из главнейших кинетических ха-
рактеристик любого фермента - это константа
Михаэлиса (Км).
Численно Км равна той концентрации
субстрата, при которой скорость реакции
составляет половину от максимально возмож-
ной (см. рис. 4-11). Это легко проверить, под-
ставив в уравнение [4-1] значение и = 0,5 Vmax.
Физический смысл Км заключается в том,
что она представляет собой константу равнове-
сия между реакцией образования фермент-
субстратного комплекса Е S и двумя реакция-
ми, ведущими к его распаду (см. рис. 4-9):
к-, + к.2
k.i
Как отмечалось выше, к+2 обычно много
меньше, чем k+i (или другие частные констан-
ты скорости). Следовательно, величина Км, как
правило, очень близка отношению kj/k+i. Это
отношение является константой равновесия эта-
па I ферментативного катализа и называется
субстратной константой (Ks). Ее величина ха-
рактеризует положение равновесия обратимой
реакции, составляющей этот этап (см. рис. 4-9):
Чем больше величина к+1 преобладает над
значением к.[ , тем больше равновесие этапа I
сдвинуто вправо, в сторону образования ком-
плекса Е S. Значит, чем меньше величина суб-
стратной константы, тем более значительная
доля фермента пребывает в составе фермент-
субстратного комплекса, или, как часто гово-
рят, — тем выше сродство между данными фер-
ментом и субстратом. В свою очередь, чем
большая часть фермента связана с субстратом,
тем выше концентрация комплекса Е S и, сле-
довательно, быстрее протекает самый трудный
этап II, а, значит, и вся ферментативная реак-
ция в целом.
Верно и обратное: если субстратная кон-
станта велика, то это свидетельствует, что ком-
плексы Е S, образующиеся на этапе 1, гораздо
126
Глава 4
легче распадаются на исходный субстрат и сво-
бодный фермент, чем вступают в химические
преобразования, знаменующие этап II. Это и
означает низкое сродство фермента к данному
субстрату: молекулы фермента предпочитают
«уклоняться» от работы в составе комплекса
Е • S, и поэтому этап II и реакция в целом осу-
ществляются сравнительно медленно.
В стационарном режиме протекания фер-
ментативной реакции очень быстро устанавли-
вается постоянная концентрация комплекса
Е • S. Это обеспечивается высокой скоростью
достижения равновесия на этапе I при гораздо
более медлительном процессе химических пре-
образований на этапе II. Поэтому величины Км
и Ks обычно практически совпадают или очень
близки, что позволяет сделать следующие за-
ключения.
Чем ниже величина Км, тем меньшие кон-
центрации субстрата достаточны для эф-
фективного протекания реакции, в том числе
— для достижения максимально возможной
скорости реакции (Vnax).
И еще; чем меньшие концентрации суб-
страта «замечает» (и «перерабатывает»)
фермент, тем более высоким является его
сродство к данному субстрату.
Таким образом, Км и Vinax - это наиболее
важные кинетические константы. Они дают ко-
личественную оценку таким фундаментальным
качествам фермента, как его сродство к данному
субстрату и максимально возможная работоспо-
собность (соответственно - эффективность эта-
пов I и II ферментативного катализа).
Сопоставление значения Км с реальной
концентрацией субстрата в клетке открывает
уникальную возможность: по параметрам, из-
меренным in vitro, судить о том, в какой степе-
ни фермент реализует свою работоспособность
в реальных условиях in vivo.
4.8. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ГЛАВНЫХ КИНЕТИЧЕСКИХ КОНСТАНТ
Для расчета субстратной константы Ks не-
обходимо уствновить частные константы ско-
рости к+1 и к.1, что требует очень сложных экс-
периментов. Величину Км определить несрав-
ненно легче, - достаточно измерить скорость
реакции при разных концентрациях субстрата.
Поэтому предпочитают пользоваться именно
константой Михаэлиса, тем более что она
обычно почти совпадает по величине с суб-
стратной константой.
Вместе с тем, как видно на рис. 4-11, точ-
ность определения Vnwx (а отсюда и Км) срав-
нительно невелика. Во-первых, из-за экспери-
ментальных погрешностей, присущих любым
измерениям, нет уверенности, что проведенная
кривая действительно достигла предела. Во-
вторых, не всегда удается создать достаточно
высокие концентрации субстрата (например,
из-за плохой его растворимости). Преодолеть
эти затруднения можно путем преобразования
графика Михаэлиса-Ментен в линейную фор-
му. Одну из таких возможностей реализовали
Г. Лайнуивер и Д. Берк. Предложенный ими
способ двойных обратных величин основан на
известном правиле: если две величины равны
между собой, то равны и обратные им величи-
ны. Следовательно, уравнение [4-1] может
быть представлено в таком виде:
1, Км
Это соотношение удобнее переписать в
несколько иной форме:
Этим преобразованием достигается линеа-
ризация кривой Михаэлиса-Ментен, повы-
шающая надежность усреднения эксперимен-
тальных измерений, а тем самым — и точность
экстраполяции их к высоким концентрациям
субстрата, которая необходима для определе-
ния значений и V^, и Км.
Итак, график зависимости 1/t? от 1/[SJ
представляет собой прямую линию (рис. 4-12).
Ее продолжение пересекает ординату в точке,
равной 1/Vmix (она соответствует нулевому зна-
чению абсциссы 1/[S], т.е., бесконечно боль-
шой концентрации субстрата, которую вообще
невозможно создать в эксперименте). Абсциссу
же экстраполяция этой линии пересекает при
(1/f) = 0, т.е. в точке, отвечающей значению
(-1/Км), как это следует из уравнения [4-3].
ФЕРМЕНТЫ
127
Экспериментальное определение главных
кинетических констант в присутствии эффек-
торов дает возможность количественно оце-
нить их способность к нековалентному взаи-
модействию с ферментом. В частности, оно
позволяет довольно просто устанавливать тип
угнетающего действия обратимых ингибиторов
и определять константу угнетения.
4.9. КИНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ОБРАТИМЫХ
ИНГИБИТОРОВ
Эффект обратимого ингибитора может
ослабевать с повышением концентрации суб-
страта. Такой тип угнетения называют конку-
рентным. Его отличает то, что в присутствии
ингибитора график Михаэлиса-Ментен (рис.
4-13, а) стремится к тому же пределу (Vmax),
который наблюдается без ингибитора (кривая
1). Однако достигается этот предел при гораздо
более высоких концентрациях субстрата. Соот-
ветственно, увеличивается значение константы
Михаэлиса, определяемой в присутствии инги-
битора (так называемая «кажущаяся» констан-
та Михаэлиса, - Км.каж)- Степень увеличения
легко определить, применив способ Лайнуиве-
ра-Берка (рис. 4-13, б). Она зависит от концен-
трации ингибитора ([!]) в среде и от его срод-
ства к данному ферменту, которое оценивается
ингибиторной константой К,:
Км.„,=Км(1 + ^)
IV,
Из этого соотношения можно рассчитать
значение К, (зная использованную в опыте кон-
центрацию ингибитора):
К
К,=[1]--------[4'4]
К- М,каж К- М
В примере, приведенном на рис. 4-13, зна-
чения Км и Км.каж (при расчете их способом
Лайнуивера-Берка) равны соответственно
-(-1/0,05) = 20 и -(-1/0.28) ~ 36 мМ (округлен-
но). Поскольку ингибитор в этом эксперименте
был использован в концентрации 0,4 мМ, его
ингибиторная константа К, составляет 0,5 мМ
(расчет приведен на рис. 4-13, б).
Очевидно, что при конкурентном угнете-
нии константа К; характеризует легкость взаи-
модействия ингибитора не вообще с фер-
ментом. а с его активным центром.
В отличие от конкурентных, ингибиторы
неконкурентного типа проявляют свое действие
вне зависимости от концентрации субстрата.
Поэтому максимально возможная скорость ре-
акции в присутствии обратимого ингибитора
(Vmanja») никогда не достигает уровня, наблю-
даемого без ингибитора. Вместе с тем, на вели-
чине Км неконкурентный ингибитор не сказы-
128
Глава 4
Рис 4-13. Графики Михаэлиса-Ментен (а) и Лайнуивера-Берка (б) для ферментативной реакции без эффекторов (1)
и в присутствии 0,4 мМ конкурентного обратимого ингибитора (2).
а) б)
Рис 4-14. Графики Михаэлиса-Ментен (а) и Лайнуивера-Берка (б) для ферментативной реакции без эффекторов (1)
и в присутствии 0,4 мМ неконкурентного обратимого ингибитора (2).
вается (как это видно на рис. 4-14, а). Иными
словами, он не влияет на сродство фермента к
субстрату, а лишь снижает его каталитическую
эффективность. Поэтому в координатах Лай-
нуивера-Берка (см. рис. 4-14, б) экстраполяция
обеих линий приводит на абсциссе к одной и
той же точке (отражающей значение -1/Км),
а ординату на более высоком уровне пересекает
та прямая, которая проведена по результатам
измерений в присутствии ингибитора. Это по-
вышение в обратных координатах свидетель-
ствует, что сама величина Утах.каж меньше, чем
Vmax. Расчеты показывают, что значения этих
величин (в данном эксперименте) составляют
соответственно 1:0,02 = 50 и 1:0,125 =
80 мкмоль/мии. Зависимость степени этого
уменьшения от концентрации неконкурентного
ингибитора выражается довольно простым со-
отношением:
V =V •
тах.каж max
Для расчета величины К, используют
обычно уравнение:
V
тах.каж
К, =[1]
V -V
max тах.каж
[4-5]
В конкретном примере, приведенном на
рис. 4-14, она составляет около 0,67 мМ. Это
заметно выше, чем величина К> для конкурент-
ного ингибитора, результаты опытов с которым
ФЕРМЕНТЫ
129
были показаны на рис. 4-13. Значит, из двух
исследованных ингибиторов неконкурентный
обладает меньшим сродством к изученному
ферменту, чем конкурентный.
Таким образом, константа неконкурентно-
го обратимого ингибитора тоже характеризует
степень сродства ингибитора к соответствую-
щему ферменту, но уже не к его активному
(адсорбционному) центру, а к тому аллостери-
ческому участку, с которым взаимодействует
неконкурентный ингибитор.
Далеко не всегда действие обратимых ин-
гибиторов бывает чисто конкурентным или
строго неконкурентным. Зачастую их действие
носит более сложный («смешанный») характер.
При этом в присутствии ингибитора изменяют-
ся величины и Км, и VinM. Определение степе-
ни этих изменений позволяет оценить вклад
конкурентного и неконкурентного компонен-
тов в итоговое угнетение фермента.
В сущности, константа обратимого угне-
тения характеризует положение равновесия в
реакции фермента с ингибитором. Выражают
ее обычно как константу диссоциации возни-
кающего комплекса Е I, т.е., как отношение
произведения концентраций свободных Е и I к
концентрации E.I в состоянии равновесия меж-
ду участниками реакции:
К, =-
[В] [I]
[EI]
[4-6]
Знание величины К; позволяет сопостав-
лять эффективность различных веществ. В ча-
стности, среди обратимых ингибиторов данно-
го фермента наиболее эффективными («силь-
ными») окажутся те, у которых ингибиторная
константа меньше, чем у остальных. С другой
стороны, обратимый ингибитор, способный
угнетать разные ферменты, будет отдавать
предпочтение тому из них, для которого значе-
ние Kj наименьшее (если для остальных значе-
ния этой константы во много раз больше, то та-
кие ферменты вообще не будут угнетаться в ре-
альных физиологических условиях организма).
Определение значений К, дает еще и воз-
можность по результатам опытов in vitro про-
гнозировать возможную эффективность испы-
туемого вещества при введении его в организм
(in vivo). Именно такого рода «пробирочные»
исследования различных, специально синтези-
рованных веществ совершенно необходимы на
ранних этапах работы по созданию любого ле-
карства нового поколения.
Теперь уже известно, что эффекты лекар-
ственного вещества, как правило, обусловлены
его воздействием на ферменты (или на белки,
функционально сходные с ними, - например,
на клеточные рецепторы). В большинстве слу-
чаев это воздействие обратимо. Но самое при-
мечательное заключается в том, что лечебные
средства почти всегда являются не активатора-
ми, а ингибиторами ферментов (применитель-
но к рецепторам их обычно называют блокато-
рами, невзирая на обратимость действия). Этот
парадокс нашел простое объяснение: замедляя
некий биохимический процесс, ингибитор спо-
собствует более значительному проявлению
противоположно направленных реакций. Наи-
более яркий пример - кофеин и.близкие ему
вещества, содержащиеся в чае, кофе и ряде дру-
гих растительных экстрактов. Давно замечено,
что их прием вызывает состояние, подобное
легкому эмоциональному возбуждению, кото-
рое, как теперь известно, вызывается «выбро-
сом» в кровь адреналина. Оказалось, что кофеин
и подобные ему «тонизирующие» вещества об-
ратимо угнетают фосфодиэстеразу (см. раздел
2.2.3). Замедляя действие этого фермента, такие
ингибиторы способствуют более длительному
сохранению молекул цАМФ. Тем самым они
имитируют действие адреналина (точнее, обес-
печивают более стойкий эффект обычных кон-
центраций адреналина в крови).
4.10, НЕОБРАТИМЫЕ ИНГИБИТОРЫ
ФЕРМЕНТОВ
Далеко не все вещества взаимодействуют с
молекулой фермента нековалентно. Многие со-
единения способны химически реагировать с
белком. Если вызываемая ими ковалентная мо-
дификация фермента ведет к потере каталитиче-
ской активности, то такие вещества относятся к
ингибиторам необратимого типа. Некоторые
из них вызывают денатурацию белка, т.е. инак-
тивируют практически любой фермент. Поэто-
му их называют неспецифическими ингибито-
рами. К таким относятся, в частности, катионы
тяжелых металлов (ртуть, свинец, медь и др.).
130
Глава 4
Есть, однако, и такие необратимые инги-
биторы, которые в большей или меньшей сте-
пени обладают избирательностью действия.
Она обусловлена способностью таких эффек-
торов реагировать не с любыми белками, а
только с вполне определенными группировка-
ми в активном центре или в других участках
молекулы конкретного фермента (или группы
близких по строению ферментов).
Взаимодействие фермента с необратимым
ингибитором представляет собой односторон-
нюю бимолекулярную реакцию:
E+I—>Е-1
Поскольку концентрация ингибитора
обычно значительно превышает концентрацию
фермента, рано или поздно весь фермент пре-
вратится в неактивное производное Е-I. В та-
кой ситуации разные ингибиторы, взятые в
одинаковых концентрациях, различаются лишь
временем, необходимым для достижения пол-
ного угнетения фермента: более сильные дела-
ют это быстрее. Измеряя ферментативную ак-
тивность через разные сроки от начала инкуба-
ции фермента с определеиной концентрацией
такого ингибитора, можно рассчитать констан-
ту скорости необратимого угнетения:
к, =-Е- In А, [4-7]
[I]•t V,
где: [I] — концентрация ингибитора в инкуба-
ционной смеси; t - время от начала инкубации
(обычно - в минутах); го - скорость фермента-
тивной реакции в отсутствие ингибитора; ц -
скорость реакции после инкубации с ингибито-
ром в течение времени t; In - натуральный
логарифм.
Чем меньше ингибитора и/или времени
требуется для развития его действия, тем он
эффективнее и, значит, тем больше величина
константы необратимого угнетения (в отличие
от обратимых ингибиторов, она является кон-
стантой скорости, а не равновесия).
Избирательность некоторых необратимых
ингибиторов обусловлена их сходством с суб-
стратом соответствующего фермента. Однако в
отличие от субстрата, такие ингибиторы обра-
зуют прочную ковалентную связь с радикалом
той или иной аминокислоты в составе активно-
го центра и тем самым блокируют его работу.
При этом, как и в случае обратимого угнетения
конкурентного типа, высокие концентрации
субстрата затрудняют доступ ингибитора к ак-
тивному центру и, как следствие, ослабляют
его угнетающее действие («защищают» свой
фермент).
Своеобразным механизмом действия обла-
дают фосфорорганические ингибиторы (ФОИ).
Некоторые из них были специально синтезиро-
ваны в качестве боевых отравляющих веществ
нервно-паралитического действия (табун, за-
рин), инсектицидов (дихлофос, карбофос и др.),
а некоторые - и как хорошие смазки в различ-
ных мехаиизмах. Многие из них являются
сильными ингибиторами ацетилхолинэстеразы
(АХЭ), поскольку обладают сходством с ее
субстратом - ацетилхолином (формула его по-
казана на рис. 4-7). Только вместо ацетильного
остатка они содержат фосфорильную группу,
соединенную сложноэфирной связью с холи-
ном или каким-либо другим спиртом (Х-ОН):
R
/
Х-О-Р = О [4-8]
\
R"
Радикалы R фосфорильной группы (она
выделена жирным шрифтом) могут быть пред-
ставлены алкилами, алкоксилами, алкиламина-
ми, которые легко сорбируются вблизи серина-
203 активного центра, где, как выяснилось,
имеются достаточно обширные гидрофобные
зоны. Это способствует «правильной» ориен-
тации сложноэфирной группы ингибитора на
каталитическом участке фермента. Как и в слу-
чае истинного субстрата (ацетилхолина), на-
чальная стадия акта катализа (см. рис. 4-7)
приводит к отщеплению спирта (Х-ОН) и ко-
валентному присоединению кислотного фраг-
мента к серину-203. И только теперь обнару-
живается «подмена» истинного субстрата: вме-
сто остатка уксусной кислоты ковалентно свя-
занным с серином-203 оказывается производ-
ное гораздо более сильной кислоты - фосфор-
ной. Этот фосфорильный фрагмент почти со-
всем не поддается удалению с активного цен-
тра и тем самым прекращает его работу. Ана-
логично действуют и такие ФОИ (обычно еще
ФЕРМЕНТЫ
131
более токсичные), которые вместо сложно-
эфирной связи с Х-ОН содержат кислотоан-
гидридную связь фосфорильного фрагмента с
HF или HCN.
Как известно, холинэргическая передача
нервного импульса осуществляется путем вы-
броса нервным окончанием порции ацетилхо-
лина. Этот медиатор обратимо воздействует на
холинорецепторы клетки-мишени, но одновре-
менно подвергается гидролизу под действием
АХЭ. Высокой активностью мембранной АХЭ
обеспечивается быстрое разложение ацетилхо-
лина (ведущее к удалению его с рецепторов) и,
следовательно, гарантируется кратковремен-
ность передачи импульса. Угнетение АХЭ под
действием яда приводит сначала к усилению
возбужденности клеток-мишеней, а затем - к
полной дезорганизации работы холинэргиче-
ских структур. К этому сводятся главные эф-
фекты ФОИ в организме. Однако многие из
таких ядов могут воздействовать и на другие
белки, в том числе — на сериновые протеиназы.
Во всех этих случаях молекула ФОИ рас-
щепляется ферментом точно так же, как и мо-
лекула настоящего субстрата, но один из обра-
зующихся продуктов остается ковалентно свя-
занным с ферментом и полностью блокирует
его работу. Такого рода ингибиторы называют
«ложными» субстратами (псевдосубстратами)
Ингибиторами псевдосубстратного дейст-
вия бывают не только искусственные соедине-
ния, как ФОИ. Не так давно выяснилось, что и в
живой природе вырабатываются вещества, на-
званные эндогенными ингибиторами за их спо-
собность угнетать тот или иной фермент собст-
венного организма (или попавший извне). По
своему строению они обычно являются белками
(или пептидами). Многие из них обладают вы-
раженным предпочтением к протеолитическим
ферментам, что обычно зафиксировано в назва-
ниях соответствующих белков плазмы крови:
сц-антитрипсин, агантихимотрипсин, антитром-
бин, а2-антиплазмин, а2-макроглобулин. Оказа-
лось, что по механизму угнетающего действия
они относятся к «плохим» субстратам. Осуще-
ствив расщепление одной из пептидных связей
в молекуле такого белка-ингибитора, протеина-
за не может затем избавиться от «обломков»
расщепленного псевдосубстрата и остается
блокированной. Эндогенные ингибиторы вно-
сят очень важный вклад в регуляцию различ-
ных процессов.
4.11. АКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ
Термином «активация фермента» обозна-
чают повышение каталитической эффективно-
сти и без того активного энзима. Типичный
пример - активация амилазы слюны ионами
СТ. Часто активаторами выступают ионы ме-
таллов (Са2+, Mg2+, Мп2+, К* и другие). Очень
важно, что некоторые метаболиты обладают
способностью обратимо активировать тот или
иной фермент собственного организма, стано-
вясь участниками регуляции биохимических
процессов. Важнейшие из конкретных приме-
ров будут рассмотрены в последующих главах
при изложении основных путей метаболизма.
Действие активирующих веществ обычно
обратимо, и для их оценки используют в прин-
ципе те же приемы, которые описаны выше
применительно к обратимым ингибиторам.
Только вместо равновесных констант угнете-
ния (Ю обратимые активаторы характеризу-
ются аналогичными константами активации
(Ка). Следует, однако, отметить, что кинетика
Михаэлиса-Ментен не всегда применима к ак-
тиваторам ферментов, и тогда требуются иные,
более сложные подходы.
Не так давно установлено, что ковалент-
ные преобразования фермента тоже могут вы-
зывать его активацию. Например, внедрение
фосфатной группы, осуществляемое протеин-
киназой, или удаление таковой из ранее фос-
форилированного фермента под действием со-
ответствующей фосфатазы (см. раздел 2.2.3).
Природа широко использует такие реакции для
управления интенсивностью и направлением
метаболических процессов. В частности, рас-
пвд гликогена в клетках катализирует глико-
генфосфорилаза. Димерная форма этого фер-
мента (фосфорилаза Ь) малоактивна. Присо-
единение фосфатной группы к каждой из субъ-
единиц (катализируемое киназой фосфорила-
зы) вызывает их ассоциацию с образованием
тетрамера (фосфорилаза а), обладающего го-
раздо более высокой активностью (обратный
процесс - возврат к малоактивной форме фос-
форилазы Ъ - происходит под действием фос-
фатазы фосфорилазы, гидролитически отщеп-
132
Глава 4
ляющей фосфатные группы). Напротив, глико-
генсинтетаза, которая катализирует необра-
тимую стадию процесса биосинтеза гликогена,
становится малоактивной после присоединения
фосфатной группы (осуществляемого киназой
гликогенсинтетазы), но возвращается в более
активную форму при удалении этой группы
фосфатазой гликогенсинтетазы. Самое инте-
ресное заключается в том, что обе протеинки-
назы активируются аденилатциклазной систе-
мой, управляемой через Рг-адренорецепторы
(см. раздел 2.2.3). Значит, возбуждение этих
рецепторов (например, адреналином) не только
ведет к усилению распада гликогена в клетках,
но и попутно тормозит его биосинтез. Тем са-
мым обеспечивается настолько резкое смеще-
ние баланса этих процессов, что возникает эф-
фект «переключения» с одной направленности
метаболизма (биосинтетические процессы, —
анаболизм) на противоположную (процессы
распада веществ — катаболизм).
В последнее время термин «активация
фермента» стали применять и в совсем ином
смысле, обозначая им образование активной
формы энзима из неактивного предшественни-
ка. Обычно речь идет о превращении профер-
мента (зимогена) в «готовый» фермент, кото-
рое осуществляется путем ограниченного про-
теолиза (см. раздел 2.6.2). По существу, оно
является последней «ступенькой» процессинга
- заключительного этапа в биогенезе белковой
молекулы фермента. Об «активации» при этом
можно говорить, чтобы подчеркнуть факт по-
явления зрелого фермента не в месте его био-
синтеза в клетке, а в зоне применения (для пи-
щеварительных ферментов - просвет желудоч-
но-кишечного тракта) либо в период востребо-
вания (для ферментов свертывания крови -
момент его инициации).
4.12. АВТОНОМНАЯ САМОРЕГУЛЯЦИЯ
ФЕРМЕНТОВ
К числу уникальных особенностей белков
относится их способность не только выполнять
какую-то конкретную функцию, но и регули-
ровать интенсивность ее исполнения в зависи-
мости от складывающихся условий. Иными
слоаами, белковым молекулам изначально
присуще свойство саморегуляции.
В общем смысле саморегуляция - это ре-
гуляция, осуществляемая за счет самих участ-
ников процесса. Применительно к ферментам
это означает регуляцию за счет только самого
фермента, его субстрата (субстратов) и его
продукта (продуктов). Она автономна, так как
реализуется даже в отсутствие внешних воз-
действий со стороны, например, гормонов и
других биологически активных веществ. Это
не означает полной независимости от механиз-
мов других уровней. Напротив, гормональные
факторы, сигнальные молекулы межклеточного
общения, а также регуляция на генетическом
уровне (изменения скорости биосинтеза фер-
ментного белка и/или протеиназ, его разру-
шающих), — все это может налагаться на само-
регуляцию ферментов, «настраивая» ее на бо-
лее точное соответствие текущим потребно-
стям клетки и организма в целом. И не только
может, но и действительно имеет место. Более
того, многие эффекты гормонов реализуются
именно через их избирательное воздействие на
регуляторные звенья ферментных систем.
С другой стороны, многим молекулярным ме-
ханизмам в регуляции биогенеза белка (генети-
ческий уровень), выработки гормонов и иных
медиаторов (нейро-гормональный уровень)
присущи черты автономной саморегуляции.
Конкретные проявления автономной само-
регуляции ферментных систем очень многооб-
разны. Но в основе их лежат два основопола-
гающих качества ферментов.
Это, во-первых, кинетические свойства
фермента, количественно характеризуемые ве-
личинами главных кинетических констант -
Км и Vrriax. Механизмы кинетического типа в той
или иной степени присущи каждому ферменту.
Во-вторых, это аллостерические свойства
фермента, точнее - его чувствительность к
аллостерическим эффектам своего собственно-
го субстрата и/или продукта. Механизмы алло-
стерического типа свойственны далеко не лю-
бому ферменту. Но если они есть, то создается
возможность «корректировки» механизмов ки-
нетического типа. Зачастую это придает регу-
ляторным возможностям фермента очень свое-
образные черты.
Разнообразие проявлений автономной са-
морегуляции ферментов целесообразно рас-
смотреть на примерах общего плана.
ФЕРМЕНТЫ
133
4.12.1. ПРОСТЕЙШАЯ ФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА
Минимальный состав ферментной сис-
темы — сам фермент (Е), его субстрат (обозна-
чим его символом А) и продукт преобразова-
ния этого субстрата (В):
A—>В
Обычно кинетика такой реакции описыва-
ется уравнением Михаэлиса-Ментен и соответ-
ствующей ему кинетической кривой. Характер
этой кривой (см. рис. 4-11) показывает, что
фермент как бы сопротивляется как повыше-
нию концентрации субстрата, так и его полно-
му истощению. Действительно, усиленное об-
разование субстрата (или приток в клетку) не-
избежно ведет к повышению скорости его ути-
лизации. т.е., вызывает противодействие его
накоплению. При остановке выработки (или
доставки) субстрата концентрация этого мета-
болита в клетке постепенно уменьшается, но
соответственно замедляется и скорость его
превращений; в конечном счете, субстрат ути-
лизируется все медленнее, но никогда не исче-
зает полностью. В итоге даже при больших ко-
лебаниях интенсивности появления метаболита
концентрация его в клетке автоматически под-
держивается на уровне, более или менее близ-
ком значению Км.
На этот механизм кинетического типа мо-
гут «наслаиваться» аллостерические эффекты.
Например, нередко субстрат является аллосте-
рическим ингибитором своего фермента. Тогда
наблюдается эффект торможения избытком
субстрата, и кинетическая кривая приобретает
куполообразный характер (рис. 4-15). Это
означает, что после достижения некоторого
Рис. 4-15. Эффект угнетения фермента
высокими концентрациями субстрата.
уровня концентрации субстрата дальнейшее ее
нарастание сопровождается все большим за-
медлением реакции. Концентрация субстрата,
при которой скорость реакции достигает мак-
симума (пик кривой на рис. 4-15), называется
оптимальной. Очевидно, такой способ саморе-
гуляции выработан для тех ситуаций, когда
чрезмерное накопление продукта реакции бо-
лее нежелательно, чем избыток субстрата.
Аналогичный куполообразный характер
кинетическая кривая приобретает и тогда, ко-
гда аллостерическим ингибитором фермента
является не субстрат, а продукт реакции. Такая
система тоже эффективно сопротивляется
чрезмерному накоплению продукта реакции.
Но здесь эффект «защиты от избытка продук-
та» достигается более прямым путем, т.е., ал-
лостерическим влиянием самого продукта.
Этот вариант обладает тем преимуществом,
что угнетения фермента не наступает даже при
высоких концентрациях субстрата, если обра-
зующийся продукт достаточно быстро утили-
зируется последующими реакциями. Иными
словами, такая система реагирует не просто на
скорость образования продукта, а на баланс
реакций его возникновения и дальнейшего
преобразования.
Иные соотношения наблюдаются, если
субстрат является аллостерическим активато-
ром своего фермента. Тогда кинетическая кри-
вая приобретает S-образный вид, т.е., имеет
2 перегиба (рис. 4-16). Это означает, что с при-
бавлением субстрата скорость реакции возрас-
тает поначалу плавно, в соответствии с кине-
тикой Михаэлиса-Ментен. Однако на каком-то
этапе начинает проявляться активирующий эф-
фект, в результате чего все более значитель-
ным становится прирост скорости реакции в
ответ на увеличение концентрации субстрата.
Это выражается первым перегибом на кинети-
ческой кривой и последующим более крутым
наклоном ее. После достижения наибольшей
крутизны (максимального эффекта активации)
плавно наступает второй перегиб кинетической
кривой, означающий переход ее в форму, ха-
рактерную для заключительного отрезка обыч-
ной кривой Михаэлиса-Ментен. Таким обра-
зом, в целом система весьма успешно сопро-
тивляется как накоплению субстрата, так и его
чрезмерному истощению. В диапазоне между
134
Глава 4
Рис. 4-16. Аллостерическая активация фермента
субстратом.
перегибами фермент гораздо энергичнее обыч-
ного реагирует на малейшие изменения кон-
центрации субстрата. Это позволяет стабили-
зировать ее гораздо эффективнее и в более уз-
ком интервале (между двумя перегибами), чем
в отсутствие аллостерической активации суб-
стратом (ср. рис. 4-11).
Наконец, аллостерическим активатором
своего фермента может оказаться не субстрат,
а продукт реакции. В таком случае с увеличе-
нием концентрации субстрата скорость реак-
ции возрастает сначала постепенно, а по мере
достаточного накопления продукта начинает
сказываться его активирующее воздействие на
фермент. Этот эффект не безграничен, а пото-
му кинетическая кривая в целом имеет такой
же характер, как и при активации фермента
субстратом (см. рис. 4-16).
4.12.2. СИСТЕМА ДВУХ ФЕРМЕНТОВ
ДЛЯ ОДНОГО СУБСТРАТА
Если один и тот же субстрат А может пре-
вращаться в два разных продукта (В и С), то,
естественно, катализировать эти реакции долж-
ны разные ферменты (Е( и Е2):
[4-9]
В общем случае кинетические константы
ферментов Ei и Е2 будут разными. Следова-
тельно, не совпадут и соответствующие им ки-
нетические кривые. Они могут оказаться, на-
пример, такими, какие показаны на рис. 4-17.
Тогда в диапазоне малых концентраций суб-
страта А будет преобладать первая реакция,
т.е., образование продукта В. По мере увеличе-
ния [А] доля превращения его в вещество С
будет нарастать. Когда концентрация субстрата
достигнет значения N (соответствующего точке
пересечения кривых), скорости обеих реакций
сравняются: половина реагирующих молекул
будет превращаться в продукт В, другая —
в продукт С. Если концентрация субстрата ста-
нет и далее нарастать, то его превращение в С
будет становиться все более преобладающим.
Такая система особенно важна в тех слу-
чаях, когда нежелательно накопление не толь-
ко продукта В, но и субстрата А. Решение про-
блемы природа нашла в том, чтобы направлять
избыток субстрата на образование вещества,
безопасного даже в больших количествах (про-
дукт С на рис. 4-17). Поэтому путь превраще-
ния А в С стали называть резервным путем ме-
таболизма, а не просто одним из альтернатив-
ных направлений. Хотя нередко такая «резерв-
ная» возможность выступает в более весомой
роли, а именно — как способ накопления запас-
ных питательных веществ (гликоген, жиры и
другие).
Рис. 4-17. Графики зависимости скорости превращения
субстрата А в продукт В (ферментом Е,) или в продукт С
(ферментом Е2) [в приведенном примере кинетические
константы для Е! и Е2 составляют соответственно:
Км - 4 и 50 мМ, Vmax - 30 и 80 мкмоль/мин].
ФЕРМЕНТЫ
135
Описанный механизм кинетического типа
нередко дополняется аллостерическими влия-
ниями. Они могут сделать более надежной за-
щиту от чрезмерного повышения концентра-
ций и субстрата, и продукта В. Такой эффект
достигается, если, например, продукт В являет-
ся аллостерическим активатором фермента Ег
либо ингибитором «своего» фермента Ер Оба
варианта ведут к повышению эффективности
переключения метаболизма на альтернативный
путь (образование продукта С). Более того,
может оказаться сдвинутым положение точки
«переключения», — например, в сторону более
низких концентраций субстрата, чем значение
N на рис. 4-17. Тогда переход на резервный
путь станет наступать раньше, а концентрация
продукта В будет лимитироваться строже.
4.12.3. ИЗОФЕРМЕНТЫ
Нередко бывает и так, что одну и ту же
реакцию катализируют два разных фермента:
Такие ферменты стали называть изофер-
ментами. Следует подчеркнуть, что это — не
изомеры в обычном для химии понимании, а
разные молекулярные формы одного и того же
фермента. Обычно они несколько различаются
по аминокислотному составу. Этих небольших
отклонений достаточно для появления разли-
чий и в ИЭТ, и в оптимуме pH, и в спектре суб-
стратной избирательности. Как правило, раз-
ными оказываются и кинетические константы в
отношении одного и того же субстрата. Поэто-
му кинетические кривые для него могут разли-
чаться так же значительно, как и в примере,
приведенном на рис. 4-17.
Суть изложенного не меняется от того, что
нередко изоферменты различаются не амино-
кислотным составом, а соотношением субъе-
диниц разного типа. Так, креатинкиназа ске-
летных мышц состоит из двух субъединиц типа
М (от англ, muscle - мышца). Ее изофермент,
содержащийся в мозгу, построен тоже из двух
субъединиц, но несколько других - типа В (от
англ, brain - мозг); он обладает гораздо боль-
шей подвижностью при электрофорезе (этот
изофермент обнаружен также в яичниках, мо-
лочной и предстательной железах). Наконец,
третий изофермент - креатинкиназа МВ - со-
держит субъединицы разного типа (и потому
обладает промежуточной электрофоретической
подвижностью). Этот изофермент типичен для
клеток миокарда. Он практически отсутствует в
плазме (и сыворотке) крови здоровых людей, но
обнаруживается в первые часы после острого
инфаркта миокарда (что используется в диагно-
стических целях).
Для лактатдегидрогеназы (ЛДГ) обнару-
жено 5 изоформ. Их принято обозначать циф-
рами - от ЛДГ-1 до ЛДГ-5 (по результатам
электрофореза). Все они построены из 4 субъе-
диниц двух типов — Н и М. В миокарде и эрит-
роцитах преобладает ЛДГ-1, .состоящая из
субъединиц типа Н (Н4), а в скелетной мышце -
ЛДГ-5, построенная только из субъединиц типа
М (М4). Остальные изоферменты (Н3М1, Н2М2
и Н[Мз), обладающие промежуточной элек-
трофоретической подвижностью, встречаются
в самых разных тканях, причем, в разнообраз-
ных соотношениях. Например, печеночные
клетки, наряду с ЛДГ-5, содержат значитель-
ное количество ЛДГ-4.
Если изоферменты распределены по клет-
кам разного типа, то они обеспечивают специ-
фику метаболизма своих клеток (или особен-
ности метаболических процессов в тех субкле-
точных структурах, где они локализованы).
Если же разные изоферменты находятся в
одной и той же клетке, то их кинетические
кривые становятся неразличимыми, ибо и суб-
страт для них один и тот же, и продукт тоже.
Общий итог зависимости скорости реакции от
концентрации субстрата таков, как будто инди-
видуальные кинетические кривые, суммируясь,
слились в единую, более сложную. Она харак-
теризуется двумя крутыми подъемами (в диа-
пазоне Км каждого из изоферментов) с более
пологим участком между ними (особенно яв-
ным он становится при очень большом разли-
чии между величинами Км)- Такой тандем изо-
ферментов природа «изобрела» для ситуаций,
когда клетке приходится работать в условиях
колоссально широкого диапазона колебаний
136
Глава 4
притока субстрата. Описанная система успеш-
но перерабатывает субстрат и при довольно
малых, и при чрезвычайно высоких концентра-
циях субстрата.
Наиболее яркий пример сочетания двух
изоферментов представляют печеночные клет-
ки. В них, как и во всех других клетках, есть
фермент гексокиназа. Она катализирует пер-
вую реакцию утилизации глюкозы, превращая
ее (за счет АТФ) в глюкозо-6-фосфат. Сродство
гексокиназы к глюкозе очень велико: значение
Км составляет около 0,01 мМ. Это примерно в
500 раз меньше реальной концентрации глюко-
зы в клетках. Отсюда следует, что гексокиназа
любых клеток (пока они живы) всегда рабо-
тает со свойственной ей Vmax, т.е., на пределе
своих возможностей.
Однако, в печеночных клетках (и только в
них!) есть еще один фермент, катализирующий
ту же реакцию, - глюкокиназа. Фактически он
является изоферментом гексокиназы (во време-
на их открытия еще не было понятия об изо-
ферментах, поэтому и названия этих киназ ока-
зались разными). Глюкокиназа отличается по
ряду свойств, в том числе - по спектру суб-
стратной специфичности в отношении разных
моносахаридов. Однако самое важное отличие
заключается в несравненно меньшем сродстве к
субстрату: значение Км для глюкозы на три по-
рядка выше и достигает 20 мМ! Это более чем в
4 раза превышает обычную концентрацию глю-
козы в клетках. Поэтому в обычных условиях
глюкокиназа работает не более чем на 1/8 (12%)
от своих максимальных возможностей (а собст-
венные потребности гепатоцитов удовлетворя-
ются в основном гексокиназой).
На первый план роль глюкокиназы высту-
пает в период пищеварения, когда с током кро-
ви в печень поступают очень большие количе-
ства глюкозы (а гексокиназа не может усилить
свою работу, всегда исполняемую на уровне
Vmax). Если концентрация глюкозы в крови во-
ротной вены (и, следовательно, в гепатоцитах)
возрастет в 4 раза, достигнув значения Км для
глюкокиназы (20 мМ), — даже в этих условиях
глюкокиназа будет работать лишь вполовину
от свойственной ей Vmax- И у нее останется
значительный резерв мощности на случай еще
большего поступления глюкозы в печень. Пе-
рерабатываемый при этом избыток глюкозы
гепатоциты превращают в основном в глико-
ген, который откладывается в них про запас
(резервный путь метаболизма!). По мере за-
вершения пищеварения (снижения содержания
глюкозы в крови воротной вены) работа глю-
кокиназы соответственно замедляется, — и так
до нового приема пищи.
Таким образом, благодаря наличию такого
изофермента, как глюкокиназа, печень не толь-
ко оказывается в готовности к резким перепадам
концентрации глюкозы в крови воротной вены,
но и задерживает (в виде гликогена) основную
массу всасываемой в кишечнике глюкозы, пре-
дотвращая ее прорыв в общий кровоток.
Пример глюкокиназы примечателен де-
монстрацией того, что в живых системах есть и
такие резервы мощности, которые не требуют
усиления функции уже работающего механиз-
ма, а сводятся к вовлечению в общий труд но-
вых исполнителей, находящихся обычно как
бы в «дремлющем» состоянии. И - самое глав-
ное — это включение резервного механизма
происходит не по какой-то специальной ко-
манде, а совершенно автоматически, в силу
природных свойств и «обычных», и «добавоч-
ных» исполнителей.
4.12.4. НЕРАЗВЕТВЛЕННАЯ
МУЛЬТИФЕРМЕНТНАЯ СИСТЕМА
Почти любой метаболический процесс
протекает через множество промежуточных
стадий. Каждая из них катализируется своим
ферментом. Совокупность таких ферментов,
действующих последовательно один за другим,
называется мультиферментной системой.
На рис. 4-18 представлен простейший из
таких вариантов — неразветвленная (линейная)
мультиферментная система.
А Е' >В Е» >С Ё> >D—Е|->F—М Ед—>N
Рис. 4-18. Схема неразветвленной мультиферментной системы.
ФЕРМЕНТЫ
137
Две очень важные особенности присущи
любой такой системе.
1. Концентрация каждого промежуточного
метаболита (от В до М включительно) будет
поддерживаться довольно постоянной даже в
условиях очень больших колебаний скорости
всего процесса в целом. Действительно, уско-
рение реакции на первой стадии (например, из-
за повышения концентрации метаболита А)
должно привести к увеличению концентрации
метаболита В, которое автоматически «заста-
вит» работать быстрее и фермент Е2; накопле-
ние вещества В будет, таким образом, преодо-
леваться. И так - по всей цепочке. Отсюда яс-
но, что концентрация любого промежуточного
метаболита не зависит от скорости всего про-
цесса. Она предопределена только соотноше-
нием кинетических констант двух ферментов —
того, который ведет к образованию данного
метаболита, и того, который обеспечивает его
дальнейшее превращение. Например, кон-
центрация метаболита В обусловлена соотно-
шением кинетических констант ферментов,
обозначенных на схеме как Е] и Е2. Оба они,
как вся цепочка в целом, могут работать быст-
рее или медленнее, но концентрация метаболи-
та В останется практически неизменной. Эта
особенность, обусловленная только природны-
ми качествами ферментов, лежит в основе фе-
номена гомеостаза — постоянства состава внут-
ренней среды организма.
2. Значения кинетических констант у всех
ферментов метаболической цепи в общем слу-
чае различны. Очевидно, у какого-то из них
величина окажется наименьшей среди
партнеров. Следовательно, именно этот фер-
мент (точнее, его V^) определяет максималь-
но возможную скорость всего процесса в це-
лом. Поэтому его называют лимитирующим
ферментом данной мультиферментной систе-
мы. Такой фермент катализирует всегда необ-
ратимую реакцию (для простоты в схеме на
рис. 4-18 не обозначено, что большинство ста-
дий метаболической цепи являются обратимы-
ми). Как правило, лимитирующим является тот
фермент, который находится в начале цепи.
Обычно это либо Еь либо Е2 (в приведенной
схеме). И еще одна закономерность: именно на
лимитирующее звено нацелены регуляторные
влияния (чаще всего - аллостерические). Они
могут быть «внешними» (для данной системы),
— например, гормоны, лекарства и т.д. Но бы-
вают они и «внутренними», т.е., метаболитами
самой системы, начиная от исходного субстра-
та А и кончая конечным продуктом N. Понят-
но, что только второй вариант относится к сфе-
ре автономной саморегуляции мультифермент-
ной системы. Хотя аллостерическое воздейст-
вие оказывается только на один фермент, из-за
лимитирующей его роли регулируется факти-
чески работа всей мультиферментной системы
в целом. Объединяя и лимитирующую роль, и
регуляторную функцию такого фермента, его
называют ключевым ферментом данной мета-
болической цепи. Именно через такие решаю-
щие звенья осуществляется метаболический
контроль (получается — самоконтроль!) за ин-
тенсивностью биохимических процессов.
Нередко аллостерическим эффектором вы-
ступает не субстрат или непосредственный
продукт ключевого фермента, а более отдален-
ный метаболит, зачастую — конечный продукт
цепи (метаболит N в приведенной схеме). Если
он является ингибитором ключевого фермента,
то имеет место саморегуляция по механизму
отрицательной обратной связи: на каком-то
уровне накопления конечного продукта начи-
нается торможение всех реакций метаболиче-
ской цепи, начиная с лимитирующего звена.
В этом случае функционирование всей систе-
мы характеризуется такого же вида графиком,
как и кривая для простейшей системы на рис.
4-15. Если же конечный продукт оказывается
аллостерическим активатором ключевого фер-
мента. то говорят о саморегуляции по принци-
пу положительной обратной связи. Такой сис-
теме свойственна готовность к самовозбужде-
нию: при накоплении некоторой критичной
массы продукта начинается лавинообразное
ускорение работы всей мультиферментной це-
пи в целом.
4.12.5. РАЗВЕТВЛЕННАЯ МУЛЬТИФЕРМ БИТНАЯ
СИСТЕМА
Линейная метаболическая цепь чаще бы-
вает всего лишь фрагментом более сложных
биохимических «блоков», среди которых пре-
валируют разветвленные мультиферментные
системы. Особенности саморегуляции таких
138
Глава 4
А
-Ь—>D—F -4... -> М > N
>S- Е' >Т->...->Х—> >Y
Рис. 4-19. Схема разветаленной мультиферментной системы.
систем видны уже на примере простейшей из
них, имеющей только одну точку ветвления
(хотя их может быть несколько).
В такой системе (рис. 4-19) ключевой
фермент (Ei) находится, как обычно, в самом
начале, т.е., до точки ветвления. В этом поло-
жении он контролирует совокупную скорость
превращений исходного метаболита А всеми
существующими путями.
Главной особенностью разветвленных це-
пей является наличие «дополнительных» клю-
чевых ферментов. Как правило, они располо-
жены сразу или вскоре после точки ветвления
(в приведенной схеме это могут быть, напри-
мер, Ез и Eq). Такие ключевые звенья называют
пунктами вторичного контроля. Каждый из
них лимитирует скорость только своей ветви
метаболизма (и обеспечивает ее регуляцию).
Нельзя сказать, чтобы пункты вторичного
контроля были совсем независимыми друг от
друга и не влияли бы на состояние начального
фрагмента, общего для всех путей. Напротив.
Например, торможение Е3 приведет к накопле-
нию его предшественников. Наступающее при
этом повышение концентрации метаболита В
чревато ускорением его превращений по аль-
тернативному пути, контролируемому фер-
ментом Еч. Если же вещество В окажется еще и
аллостерическим ингибитором фермента Е[, то
накопление В, вызванное угнетением фермента
Ез, приведет к замедлению суммарной скоро-
сти превращений субстрата А всеми путями
(при этом утилизируемое все же количество
вещества А станет направляться преимущест-
венно по пути образования конечного продукта
Y. Конкретные примеры изложенных взаимо-
отношений будут представлены, в частности,
при рассмотрении главных путей метаболизма
глюкозы (раздел 6.8).
В заключение необходимо подчеркнуть,
что все изложенные механизмы автономной
саморегуляции строго детерминированы. Не-
возможно «отменять» их или произвольно «за-
ставлять» работать иначе; недопустимо припи-
сывать им несвойственные параметры функ-
ций. Ибо обусловлены они самой природой
конкретных белковых молекул, трансформация
свойств которых возможна только путем соот-
ветствующих изменений на генетическом
уровне. Описанные «модели поведения» явля-
ются теми элементами, из которых слагается
сложная и чувствительная к внешним воздей-
ствиям система регуляции всего метаболизма и
любых физиологических функций клеток, тка-
ней, организма в целом.
Глава 5
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
В научном понимании биоэнергетика
означает совокупность знаний о превращениях
энергии в живом организме. В той или иной
степени энергетические преобразования сопро-
вождают практически любую функцию живой
системы - от ферментативного катализа или
восприятия фотонов до таких сложных, как
процессы возникновения, распространения и
передачи нервных импульсов или сокращение
и расслабление мышц.
Однако обычно термин «биоэнергетика»
употребляют в гораздо более узком смысле,
обозначая им лишь те наиболее универсаль-
ные процессы, которые поставляют энергию,
необходимую для жизнедеятельности. У жи-
вотных ее источником служат органические
вещества (углеводы, липиды, в гораздо мень-
шей степени - белки). Все они поэтапно пре-
образуются ферментами в небольшой набор
более простых молекул, подвергаемых затем
биологическому окислению. Почти вся энер-
гия, освобождаемая при расщеплении пита-
тельных веществ, выделяется именно на окис-
лительных стадиях. А весь комплекс реакций
распада сложных молекул до конечных про-
дуктов (в основном до СО2 и Н2О) получил на-
звание «.энергетический метаболизм» (углево-
дов, жиров, аминокислот).
Термином «биологическое окисление» объ-
единяют все те окислительные процессы, ко-
торые протекают в живом организме с уча-
стием кислорода. Они осуществляются внутри
клеток, во всех тканях. Отсюда - давний сино-
ним: «тканевое дыхание» (в отличие от «легоч-
ного»).
Как известно, окисление одних веществ
невозможно без сопутствующего восстановле-
ния других. Эта абсолютная сопряженность на-
шла отражение в более точном термине — окис-
лительно-восстановительные процессы. В жи-
вом организме они изобильны и очень разнооб-
разны. Однако в понятие «биоокисление» целе-
сообразно включать только ту часть этих про-
цессов, которая требует вовлечения кислорода.
5.1. ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ
УЧЕНИЯ О БИООКИСЛЕНИИ
Сущность биологического окисления ста-
ла проясняться к концу XVIII в., благодаря ра-
ботам великого французского ученого Антуана
Лавуазье. Он установил, что дыхание живот-
ных сопровождается потреблением кислорода
воздуха, которому сопутствует образование
СО2 и воды. Так возникло представление о то-
ждественности процессов дыхания горению
веществ вне организма. Позднее это подтвер-
дили и опыты со срезами живых тканей. Одна-
ко очевидными были и «странности»: тканевое
дыхание протекало в водной среде и не вело к
воспламенению. Его назвали поэтому «мед-
ленным горением».
Более века прошло до первых попыток
раскрыть механизм необычного «горения».
140
Глава5
Выдающуюся роль в этом сыграл Алексей Ни-
колаевич Бах (1857-1946).
В молодости А.Н.Бах увлекся идеями борьбы с
самодержавием. За участие в революционном
движении был отчислен нз Киевского универ-
ситета, отбыл ссылку, затем стал народоволь-
цем (подпольная кличка — «Кащей бессмерт-
ный»). Автор знаменитой брошюры «Царь-
голод» (1883). Вынужденный эмигрировать,
занимался в химической лаборатории в Пари-
же, затем трудился в США. В почти 40-летнем
возрасте поселился в Женеве, где занялся
экспериментами в созданной им домашней ла-
боратории. На их основе разработал ориги-
нальную концепцию, получившую название
перекисной теории А.Н.Баха. В канун 60-летия
ему был вручен диплом почетного доктора Ло-
заннского университета. Вскоре он вернулся в
Россию, где продолжил активную деятель-
ность, стал академиком, основал ряд научных
учреждений. Имя А.Н. Баха носят два круп-
нейших института биохимии (в Москве и Кие-
ве), а также организованный им журнал «Био-
химия», один из ведущих в России.
Учитывая изрядную инертность моле-
кулярного кислорода, А.Н.Бах исходил из те-
зиса о необходимости его предварительной
активации. Он предположил, что в живых объ-
ектах есть особые легкоокисляемые вещества —
оксигеназы. В их структуре содержится нена-
сыщенная связь, по месту которой сравнитель-
но легко присоединяется молекула Ог:
Образовавшаяся перекись высокореактив-
на и способна окислять другие, более стойкие
вещества. Иными словами, образование пере-
киси рассматривается как явление активации
кислорода. С участием особых ферментов -
пероксидаз — он передается затем окисляемым
субстратам, которые сами по себе неспособны
окисляться молекулярным кислородом в усло-
виях живой клетки.
Концепция А.Н.Баха получала подтвер-
ждения и в работах других исследователей.
Особенно значительными были результаты,
которых достиг выдающийся немецкий ученый
Отто Варбург (1883-1970). В 1926 г. он открыл
особый фермент, участвующий непосредст-
венно в активации кислорода. За открытие это-
го «железосодержащего дыхательного фермен-
та» О.Варбург был удостоен Нобелевской пре-
мии 1931 г. Одновременно английский иссле-
дователь Дэвид Кейлин (1887-1963) показал,
что такого рода ферментов много разных и что
они по строению простетической группы сход-
ны с гемоглобином (и потому тоже имеют ок-
раску). Он предложил называть их цитохрома-
ми; этот термин общепринят до настоящего
времени.
Почти сразу же после публикаций А.Н.Баха
возникли и альтернативные взгляды. Первым их
сформулировал и обосновал Владимир Ивано-
вич Палладии (1859-1922).
Выпускник Московского университета
В.И. Палладии работал под руководством
К.А. Тимирязева, изучая разные аспекты роли
кислорода в растениях. После защиты доктор-
ской диссертации возглавлял кафедры физио-
логии растений в Харьковском, затем в Вар-
шавском ис 1901 г. - в Петербургском универ-
ситете, где и разработал концепцию, обозна-
ченную как «теория активации водорода». Ака-
демик с 1914 г.
В.И. Палладии экспериментально проде-
монстрировал, что процессы биологического
окисления могут заключаться не в присоеди-
нении кислорода, а в отнятии водорода от
окисляемого вещества. Соответствующие фер-
менты он назвал редуктазами. Водород, отни-
маемый от субстрата, они способны передавать
не только на кислород, но и на другие вещест-
ва. Их он назвал «дыхательными хромогена-
ми». Эти пигменты после восстановления (при-
соединения водорода) становятся бесцветны-
ми, что позволяет визуально оценивать их уча-
стие в процессах биоокисления. В отсутствие
кислорода восстановленные пигменты так и
остаются неокрашенными. Если же открыть
доступ кислороду, то дыхательные хромогены
вновь перейдут в окрашенную форму. Отсюда
следовало, что при тканевом дыхании кисло-
род не присоединяется к окисляемым органи-
ческим веществам, а служит лишь конечным
акцептором для отнимаемого от них водорода.
Если в систему ввести другой акцептор, то
окисление субстратов может протекать в от-
сутствие кислорода (в анаэробных условиях).
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
141
Среди наиболее известных сторонников
теории активации водорода был крупный не-
мецкий ученый Генрих Виланд (1877-1957).
Еще в начале XX века он выполнил выдающие--
ся работы по исследованию желчных кислот, за
что в 1927 г. был удостоен Нобелевской премии.
Однако к этому времени он уже перешел на
изучение механизмов тканевого дыхания и по-
лучил новые свидетельства того, что процессы
биоокисления начинаются с отнятия водорода
от окисляемого вещества. Ученый дал более
точное название соответствующим ферментам -
дегидрогеназы. Он экспериментально доказал,
что обогащение субстрата кислородом может
происходить не путем внедрения этого окисли-
теля, а путем присоединения молекулы воды с
последующим отнятием двух атомов водорода.
Так спирт и альдегид могут превращаться в кар-
боновую кислоту (рис. 5-1).
Дискуссии между сторонниками двух на-
правлений в изучении тканевого дыхания были
очень острыми. Кульминации они достигли в
начале ЗО-х годов. Отто Варбург, внесший
крупный вклад в обоснование теории актива-
ции кислорода и именно за эти работы удосто-
енный Нобелевской премии (1931 г.), уже в
1932 г. обнаружил (вместе с В. Христианом)
новый фермент, названный «желтым дыха-
тельным ферментом Варбурга» {«флавиновый
фермент», по современной терминологии). Но
самое главное - оказалось, что этот белок яв-
ляется переносчиком атомов водорода! Откры-
тие было «ужасным»: оно опровергало преж-
ние взгляды ученого и доказывало правоту его
оппонентов. Одно время авторы даже считали
его артефактом. Однако вскоре О. Варбург вы-
явил еще одну группу ферментов - никотина-
мидные дегидрогеназы. Более того, именно
они первыми отнимают водород от ряда суб-
стратов и передают его затем на флавиновые
ферменты.
он о<—п он о
Н-С-Н Н-MbH Н-С-ОН -2Н с—он
сн2 —А сн2 —» сн2 —4 СН2
R R R R
Спирт Алъаегид Гидратированный Карбоновая
альдегид кислота
Рис. 5-1. Окисление спирта до кислоты путем
последовательных реакций дегидрогенирования
с промежуточным присоединением молекулы воды.
Постепенно стало окончательно ясным,
что реакции биологического окисления проте-
кают, как правило, путем отнятия водорода от
субстрата и постепенного переноса его через
серию посредников в конечном счете на
кислород с образованием воды. Соответствую-
щие ферменты сосредоточены во внутренней
мембране митохондрий. Поэтому процесс в
целом стали обозначать терминами «дыха-
тельная цепь» и «митохондриальное окисле-
ние» (МтО). Освобождаемая при этом энергия
используется для преобразования АДФ в АТФ.
Заключительную стадию - перенос водорода
непосредственно на молекулу кислорода - не-
которое время еще называли «активацией ки-
слорода», но это было скорее лишь данью ува-
жения к приверженцам перекисной теории.
Эта «дань» оказалась нелишней. Со вре-
менем было установлено, что в митохондриях
утилизируется примерно 90-95% кислорода,
потребляемого организмом. Остальная часть
используется в процессах внемитохондриалъ-
ного окисления. Их называют обычно «микро-
сомальным окислением», поскольку многие из
них сосредоточены в ЭР (обрывки которого и
составляют фракцию микросом, см. раздел
3.2.1). Соответствующие реакции не высвобо-
ждают нужную организму энергию в виде АТФ
или других макроэргов. Они используются в
иных целях. В основном - для крайне необхо-
димых преобразований очень устойчивых ве-
ществ, именуемых трудноокисляемыми. К их
числу относятся превращение пролина в окси-
пролин (необходимый этап биосинтеза колла-
гена), образование или инактивация некоторых
гормонов, разрушение чужеродных веществ (в
том числе — многих лекарственных препара-
тов). Очень часто микросомальное окисление
сводится именно к внедрению кислорода в мо-
лекулу окисляемого вещества. Это - прямое
подтверждение обоснованности воззрений
А.Н. Баха и его последователей. Более того, во
многих таких реакциях образуется или исполь-
зуется перекись водорода, для регистрации ко-
торой ученый разработал специальный метод.
Значит, представления, зародившиеся под на-
званием «перекисной теории», и в современной
науке сохраняют свою особую нишу, претер-
пев, естественно, соответствующее развитие. В
настоящее время очень много исследований
142
Глава 5
посвящено так называемому перекисному
окислению липидов.
Таким образом, в животном мире можно
выделить два типа процессов биологического
окисления. Один из них — митохондриальное
окисление - сильно преобладает и может быть
назван энергетическим типом окисления, т.к.
поставляет почти всю энергию, необходимую
для процессов жизнедеятельности (энергию в
форме АТФ и его аналогов). Другой тип - вне-
митохондриальное («микросомальное») окисле-
ние - не может служить источником энергии и
используется во множестве разнообразнейших
реакций, которые в совокупности потребляют,
однако, лишь 5-10% кислорода, утилизируемого
клетками. Эти реакции имеют либо биосинтети-
ческую направленность (включая образование
биологически активных веществ), либо разру-
шающую, катаболическую (деградация, в част-
ности, чужеродных соединений).
5.2. МИТОХОНДРИАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ
Все ферменты дыхательной цепи мито-
хондрий являются сложными белками. Их не-
белковые фрагменты способны принимать элек-
троны, а затем отдавать следующему партнеру.
Благодаря этому возможно возникновение пото-
ка электронов от окисляемого субстрата к моле-
куле кислорода Он направлен в сторону воз-
растания редокс-потенциала участников процес-
са (стандартный окислительно-восстановитель-
ный потенциал пары окислитель/восстанови-
тель). Именно в такой последовательности целе-
сообразно рассмотреть главные звенья системы
митохондриального окисления (МтО): никоти-
намидные дегидрогеназы, флавиновые фермен-
ты, убихинон, цитохромы. Многие из этих ком-
понентов образуют прочные комплексы с осо-
быми белками — «железо-серными».
5.2.1. ФЕРМЕНТЫ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО
ОКИСЛЕНИЯ
Никотинамидные дегидрогеназы (НД).
Составляют большую группу ферментов, полу-
чивших название по своей главной функции -
отнимать водород от окисляемого метаболита.
Обладают высокой субстратной избирательно-
н
I
НС С—с; +(2Н,2ё)--------->
I II knh2
НЧ+/СН
N
I
R
НАД
(или НАДФ)
Н Н
X
НС с—с'
II II , xnh2
нс он
R
НАД-Нг
(или НАДФ-Н?)
Рис. 5-2. Никотинамидные фрагменты окисленной
и восстановленной форм никотинамидных коферментов.
стью, диктуемой спецификой строения адсорб-
ционного центра. Но в качестве кофермента
всегда используют либо НАД, либо НАДФ,
хотя некоторые НД способны функциониро-
вать с любым из них.
Описание обоих коферментов дано в раз-
деле 2.2.1. Там же показано строение этих мо-
лекул (см. рис. 2-6). Ведущую роль в них игра-
ет никотинамидная группа (витамин РР).
Именно к ней присоединяются отнимаемые от
субстрата два атома водорода, т.е., два элек-
трона и два протона. Точнее, оба электрона
переходят к азоту гетероцикла, восстанавливая
его из пятивалентного до трехвалентного со-
стояния (рис. 5-2), тогда как лишь один из про-
тонов фиксируется коферментом (присоединя-
ясь в пара-положении относительно этого азо-
та, с перераспределением двойных связей в
кольце), а другой остается в растворе (среда
при этом подкисляется). Тем не менее, для
краткости удобнее обозначать восстановлен-
ные формы НАД и НАДФ в виде НАД-Я2 и
НАДФ-йз соответственно.
Если обозначить окисляемый субстрат как
А-/72, то реакцию, катализируемую никотин-
амидными дегидрогеназами, можно предста-
вить в виде общей схемы:
НД
Л-Н2 + НАД(Ф) ----=--> А + НАД(Ф)-Я2
В этой схеме использован частый прием:
сокращения НАД(Ф) и НАД(Ф)-/72 применяют
тогда, когда имеют в виду любой из этих ко-
ферментов (без конкретизации их).
Почти все клетки содержат больше НАД,
чем НАДФ. Внутриклеточное распределение их
(и соответствующих дегидрогеназ) очень нерав-
номерно. НАД сосредоточен главным образом в
матриксе митохондрий, в НАДФ - в цитоплазме.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
143
ФМН (или ФАД)
ФМН Н2(или ФАД-Н2)
Рис. 5-3. Окисленная и восстановленная формы редокс-центра флавиновых дегидрогеназ.
Флавиновые ферменты {флавопротеины -
ФП). Сложные белки, простатическая группа
которых прочно связана с апоферментом и со-
держит производное рибофлавина (вит. В2).
У одних ферментов ею является флавинмоио-
нуклеотид (ФМН), изображенный иа рис. 1-27,
у других — флавинадениндинуклеотид (ФАД),
который показан на рис. 2-7.
По своей функции ФП относятся к дегид-
рогеназам {флавиновые дегидрогеназы). Они
отнимают два атома водорода от субстрата и
присоединяют их к своему редокс-центру
(представленному атомами азота изоаллокса-
зинового гетероцикла); это сопровождается
перегруппировкой в нем системы двойных свя-
зей, как показано на рис. 5-3.
К числу важнейших ФП относится
НАД-Н2-дегидрогеназа, содержащая ФМН в ка-
честве простетической группы. Субстратом
этого фермента является восстановленная фор-
ма НАД, образующаяся в матриксе митохонд-
рий при окислении ряда метаболитов:
НАД-Я2 + ФМН -------> ФМН-Я2 + НАД.
Молекулы ФП имеют крупные размеры и
обычно встроены во внутреннюю мембрану
митохондрий. Нередко они содержат не ФМН,
а ФАД и используют в качестве субстрата не
НАД-Я2> совсем другие молекулы. В мембра-
ны ЭР (и его производных) также включены
специфические ФП, в том числе ФАД-содер-
жащие флавиновые ферменты, которые суб-
стратом «признают» не НАД-Т/г» а НАД(Ф)-//2
и принимают участие во многих реакциях мик-
росомального окисления.
Убихинон. Так называют повсеместно рас-
пространенный бензохинон с четырьмя боко-
выми радикалами (рис. 5-4). Один из них -
очень длинная полииенасыщенная цепь, кото-
рая состоит из повторяющихся изопреноидных
единиц. Аналогичная цепь встречается и в
структуре витаминов группы К, а также в ви-
тамине А (см. рис. 2-11) и иных каротиноидах.
Рис. 5-4. Строение убихинона (KoQ) и витаминов группы К.
Изопреновая группировка в боковой цепи повторяется в молекуле KoQ, как правило, 10 раз (л = 10), а в витаминах К2
- от 6 до 9 раз. Несмотря на очень большое сходство с KoQ, эти витамины вовсе не вовлекаются в дыхательную
цепь. Они локализованы не в митохондриях, а в мембранах ЭР (где выполняют роль кофермента при карбоксили-
ровании глутамильных радикалов в процессе постсинтетической модификации ряда белков, как это показано на рис.
2-28)
144
Глава 5
о он
II I
/сх /Ч
Н,СО— С С—СНз Н3СО—С С —СН3
ФП нг + II II ---------» | II + ФП
н3со—с с—R н3со—с с—R
Убихинон (KoQ)
Убихинол (KoQ Нг)
Рис. 5-5. Восстановление убихинона флавиновым ферментом.
Убихинон - единственный компонент сис-
темы МтО, не имеющий собственного апофер-
мента. Тем не менее, ои сохраняет изначальное
название кофермент Q (по первой букве слова
«quinone»). Гидрофобность и малые размеры
обеспечивают ему мобильность в неполярной
среде. Поэтому кофермент Q (KoQ) способен,
мигрируя в пределах мембраны, принимать
восстановительные эквиваленты (атомы водо-
рода) от одних участников дыхательной цепи и
передавать их другим сложным протеинам, -
обладающим более высоким значением редокс-
потенциала («оправдывая» тем самым звание
кофермента).
Обычным «поставщиком» водорода для
убихинона являются восстановленные формы
флавиновых ферментов (ФП’/б)- Принимая
от них два электрона и два протона, хинонная
структура кофермента Q превращается в гидро-
хинонную (убгошнол), как это показано на
рис. 5-5.
Цитохромы. Так обозначают сравнительно
небольшие белки (обычно 15-45 кДа), простети-
ческая группа которых почти или совсем иден-
тична гему Ь, содержащемуся в гемоглобине
(см. рис. 1-26). Нередко их называют белками,
содержащими гемовое железо.
По мере открытия цитохромов, их обозна-
чали латинскими буквами. Выявление все но-
вых аналогов потребовало добавления цифро-
вых символов к уже принятым буквенным.
В дыхательной цепи МтО функционируют
цитохромы b. Ci, с и аа3. Первый из них коор-
динационно связывает 2 молекулы гема Ь. Ци-
тохромы Ci и с обладают таким же гемом, но
фиксированным ковалентно, тиоэфирными свя-
зями. А вот цитохром аа3 содержит две молеку-
лы гема а, который немного отличается от гема
b (см. подпись к рис. 1-26). Эти молекулы в нем
обозначаются как гем а и гем с3 из-за неравно-
ценности их свойств, обусловленной, похоже,
разным расстоянием от атома меди (Cu2+/Cu+),
связанного с этим гемопротеином через радика-
лы цистеина и гистидина.
Главным функциональным центром цито-
хромов является железо гема. В отличие от ге-
моглобина, здесь оно довольно легко может
менять свою валентность. Принимая электрон,
окисленное железо феррицитохрома (Fe3+) пе-
реходит в восстановленную форму (Fe2+). От-
давая затем электрон подходящему акцептору,
возникший ферроцитохром вновь превращает-
ся в ферри-форму:
Вариации в строении гема, в способах его
связывания с белком, а также в структуре при-
легающих фрагментов апопротеина, - все это
заметно отражается на степени сродства желе-
за цитохромов к электронам. Приведенный
выше перечень цитохромов дан в порядке воз-
растания их редокс-потенциала. Поэтому
именно в такой последовательности компонен-
ты системы цитохромов транспортируют элек-
троны от убихинола в конечном счете на
молекулярный кислород (рис. 5-6).
KoQ-H2 Дит. Ъ —* цит. cj —> цит.с —*
—> цит. аа3 —» О2
Рис. 5-6. Путь электрона по системе цитохромов.
Железо-серные белки (FeS-протеины;
FeS-P). Так называют небольшие белки (по-
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
145
Рис. 5-7. Схема строения железо-серного кластера
типа 2Fe-2S.
рядка 20 кДа), содержащие негемовое железо и
неорганическую серу. Обычно в молекуле име-
ется один железо-серный центр, включающий
по два атома железа и серы (2Ре-28-протеины).
Как показано на рис. 5-7, каждый атом железа
в нем. помимо связей с сульфидной серой, ком-
плексирован еще и с группами -SH двух ради-
калов цистеина (вместо одной из них возможен
радикал гистидина). Вся эта структура локали-
зована в петле, выступающей на поверхность
бочкообразной молекулы 2Ре-2в-протеина. Не-
редко встречаются и белки с двумя такими
кластерами (4Ре-48-протеины) либо с непол-
ным удвоением их.
Подобно цитохромам, железо-серные белки
тоже осуществляют одноэлектронный транс-
порт. Одиако делают это они не самостоятельно,
а в составе неразрывных комплексов с другими
компонентами дыхательной цепи - флавопро-
теинами или цитохромами. Влияние партнера в
таком комплексе, как и специфика собственного
апопротеина, - все это сильно отражается на
величине редокс-потенциала железо-серного
центра: в разных FeS-белках он составляет
обычно от -0,30 до -0,15 В. Неудивительно, что
FeS-P со столь различающимися характеристи-
ками «встроены» в совершенно разные звенья
дыхательной цепи.
5.2.2. ПОЛНАЯ ЦЕПЬ СИСТЕМЫ
МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
Систему, в которой участвуют все пере-
численные компоненты митохондриального
окисления, целесообразно назвать полной ды-
хательной цепью. В виде общей схемы она
изображена на рис. 5-8. Эта давняя схема
удобна своей наглядностью. Во-первых, она
демонстрирует, что окисление одного компо-
нента цепи невозможно без одновременного
восстановления другого (это отражено обяза-
тельным соприкосновением полукруглых стре-
лок). Во-вторых, здесь виден (светлые стрелки)
путь электронов (и протонов) от исходного
субстрата (PcHi) в конечном счете на молеку-
лу О2. Приведенные на схеме цифры показы-
вают, что этот путь пролегает в направлении
постепенного увеличения редокс-потенциала -
от -0,32 В для пары НАД / НАД- Н2 до +0,82 В
для пары ИО2/ О .
Наконец, схема отражает эксперименталь-
ные данные о том, что в трех участках цепи
перенос пары электронов с одного звена на
другое сопряжен с синтезом молекулы АТФ.
Это сопряжение происходит лишь на уровне
тех звеньев, где перепад редокс-потенциала
наиболее значителен (порядка 0,2 В): именно в
этих пунктах освобождаемая порция энергии
достаточна для обеспечения синтеза одной мо-
лекулы АТФ из АДФ и фосфата.
Таким образом, митохондриальное окис-
ление представляет собой по существу реак-
цию гремучего газа:
Н2 + Vz О2 = H2O + 230 кДж/моль.
Разница заключается в том, что в мито-
хондриях используется не молекула газообраз-
ного водорода, а даа атома водорода, изымае-
мые у окисляемого субстрата. Но самое глав-
ное отличие - в том, что дыхательная цепь рас-
членяет реакцию гремучего газа на множество
промежуточных стадий. Из-за этого энергия
выделяется не мгновенно (как при взрыве гре-
мучей смеси) и не столь интенсивно, как при
горении струи водорода в воздухе, а - посте-
пенно, небольшими порциями. Некоторые из
них достаточны для трансформации в энергию
макроэргических связей АТФ. Она составляет
—30 кДж/моль в стандартных условиях (в ре-
альной среде митохондрий - и того больше:
до 42 кДж/моль). Следовательно, при окисле-
нии субстрата полной дыхательной цепью из
230 кДж/моль освобождаемой энергии не ме-
нее 3x30 = 90 кДж/моль концентрируется в мо-
лекулах АТФ. Это очень высокий коэффициент
полезного действия - более 40%! Остальная
энергии рассеивается в форме теплоты (хотя и
146
Глава 5
Рис. 5-8. Полная цепь митохондриального окисления (схема).
она небесполезна, ибо пригодна для терморе-
гуляции организма).
Синтез АТФ из АДФ и Фн кратко обозна-
чают как реакцию фосфорилирования (подра-
зумевая фосфорилирование молекулы АДФ
неорганическим фосфатом).
Окислительным фосфорилированием
называют образование АТФ, сопряженное с
работой дыхательной цепи (т.е., за счет энер-
гии, освобождаемой в процессах митохондри-
ального окисления).
Критерием эффективности окислитель-
ного фосфорилирования служит количество
АТФ, вырабатываемое на единицу утилизи-
руемого О2. Как показывает схема (см. рис. 5-
8), на пути двух атомов водорода от субстрата
до кислорода образуются 3 молекулы АТФ
(т.е., используется 3 молекулы Фн в расчете на
каждый атом потребляемого кислорода). Этот
критерий - отношение фосфор/кислород (ко-
эффициент Р к О) — предложили в 1939 г. В.Н.
Белицер и Е.Т. Цибакова. Экспериментальные
измерения in vitro поначалу подтверждали, что
в полной дыхательной цепи коэффициент Р/О
равен 3.
В митохондриях содержатся никотинамид-
ные дегидрогеназы для многих веществ. Однако
преобладающими субстратами полной дыха-
тельной цепи являются всего только 5 метабо-
литов, - те, которые в организме человека окис-
ляются сотнями граммов (первые три из приве-
денного списка) или десятками граммов в сутки:
- изолимонная кислота (изоцитрат);
— яблочная кислота (малат);
- 0-гидроксиацил-КоА ф-гидроксипроиз-
водное активированных жирных кислот);
- 0-гидроксимасляная кислота ф-гид~
роксибутират);
- глутаминовая кислота (глутамат)..
Митохондриальное окисление именно
этих веществ поставляет клеткам основную
массу АТФ. Соответствующие дегидрогеназы
локализованы в митохондриальном матриксе.
По существу, вырабатываемый всеми ими
НАД7/2 оказывается единым субстратом для
полной цепи МтО. И даже если в митохондри-
ях появляются молекулы НАДФ-//2, которые
возникают в отдельных реакциях, они легко
отдают водород молекулам НАД благодаря
имеющейся здесь НАД(Ф)-трансгидрогеназе:
НАДФ-Яг + НАД <-> НАДФ + НАД-Я2- [5-1]
Со временем было установлено, что мем-
бранные белки, переносящие электроны (часть
из них - и протоны), организованы в блоки,
каждый из которых сохраняет свою функцию
даже после выделения из митохондрий. Блоки
оказались устроенными гораздо сложнее, чем
это показано на рис. 5-8, и были названы ком-
плексами МтО. Современные данные о них
обобщены в табл. 5-1. В работе полной дыха-
тельной цепи участвуют, однако, не все элек-
трои-транспортные белки мембраны, а только
комплексы 1, III и IV. Рисунок 5-9 в самом
общем виде показывает очередность их вовле-
чения в процесс переноса электронов (и прото-
нов). Детальнее роль каждого звена представ-
лена на рис. 5-10.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
147
Таблица 5-1
Блоки электрон-транспортных белков внутренней мембраны митохондрий
Название Локализация, состав, функции Редокс- центры Транс- локация
А. НАЧАЛЬНЫЕ (альтернативные) звенья митохондриального окисления
Комплекс 1 (НАД-Н2- убихинон- оксидоредуктаза) Трансмембранный комплекс из десятков субъединиц. Предна- значен для окисления молекул НАД-Н2, продуцируемых рас- творимыми (внемембранными) никотинамидными дегидрогена- зами 1 ФМН 4 FeS- белка 2 KoQ 4 Н*
Комплекс II (сукцинат- дегидрогеназа) Состоит из серии субъединиц, внедренных во внутреннюю мембрану со стороны матрикса; переносит 2 ё и 2 Н+от янтар- ной кислоты (сукцинат) на мобильный убихинон липидного бислоя 1 ФАД 3 FeS- белка 1 гем b 0
ЭТФ-дегидро- геназа ФАД-содержащий железо-серный белок, обладающий транс- мембранным участком. Генерирует убихинол за счет окисления ЭТФ (электронтранспортирующий флавопротеин), восста- навливаемого различными ФАД-зависимыми дегидрогеназами митохондрий 1 ФАД 4 FeS- центра 0
Б. ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ (общие) звенья системы митохондриального окисления
Комплекс III (цитохром Ьсг, убихинол-цито- хром-с-редуктаза) Трансмембранный белок из 11 субъединиц, включая цитохром Ь (с двумя молекулами гема Ь), цитохром Ci (с ковалентно свя- занным гемом Ь) и FeS-белок. Они образуют цепочку пооче- редного транспорта каждого электрона от KoQ-H2 на цитохром с межмембранного пространства, примыкающий к мембране 3 гема b 1 FeS- белок 2 Н+
Комплекс IV (цитохром- оксидаза) Ансамбль из 6 субъединиц. Из них каталитическая богата трансмембранными доменами (12) и содержит не только два гема, но и атом меди (медь В). С привлечением «иной» меди (медь А) другой субъединицы, она обеспечивает поток элек- тронов от цитохрома с снаружи мембраны на молекулу О2 в матриксе 1 гем а 1 гем аз 1 медь «А» 1 медь «В» 4 Н+
Комплекс I является начальным из мем-
бранных звеньев полной дыхательной цепи,
выполняя роль посредника между никотина-
мидными дегидрогеназами матрикса и мобиль-
ным KoQ мембраны. Он обозначается как
НАД-Нг-дегидрогеназа и представляет собой
крупное (до 900 кДа) объединение десятков
разных субъединиц, семь из которых кодиру-
ются митохондриальной ДНК. Многие субъе-
диницы гидрофобны и организованы в транс-
мембранные а-спирали. На весь комплекс при-
ходится одна молекула ФМН, которая иекова-
лентно, но прочно связана с гидрофильным
фрагментом фермента, выступающим в мат-
рикс, и является первичным акцептором элек-
тронов от НАД-Я2 (см. рис. 5-10). Следующее
затем поочередное восстановление FeS-центров
соответствующих субъединиц, сопряжено с
протонированием определенных группировок
апопротеина. Обладая редокс-погенциалом от
-0,37 до -0,15 В, эти центры образуют цепочку
одноэлектронного транспорта в конечном счете
на две молекулы убихинона, связанных с белка-
ми комплекса прочно, но по-разному (а потому
различаются и их свойства). Возникший убихи-
иол передает потом атомы водорода тем моле-
кулам KoQ, которые свободно мигрируют в
мембране (см. рис. 5-10).
Комплекс Ш, тоже трансмембранный, яв-
ляется следующим звеном системы МтО. Он
состоит из серии субъединиц общей массой
около 250 кДа. Главную роль играют 3 из них:
железо-серный белок 2Fe-2S, цитохром b (со-
держащий два близких по свойствам гема Ь) и
цитохром Ci (отсюда другое название комплек-
са - цитохром b-Су). Как показано на рис. 5-10,
все они образуют цепочку редокс-центров, ко-
торая реализует перенос электронов от
Субстрат НД —> Комплекс I KoQ —> Комплекс III —> Цит. с —> Комплекс IV -> О2
Рис. 5-9. Последовательность включения дыхательных комплексов в работу полной цепи системы МтО.
Рис. 5-10. Мембранные дыхательные комплексы и участки выброса протонов из матрикса.
[ОДК - мультиферментный комплекс окислительного декарбоксилирования а-кетокислот].
Глава 5
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
149
KoQ-Яг» мигрирующего в пределах внутренней
мембраны митохондрий, на молекулы цито-
хрома с, примыкающие к ее внешней стороне
(протоны при этом остаются в среде). Ос-
тальные субъединицы комплекса III нужны
для его структурирования, а также для обеспе-
чения контакта цитохрома Ъ с донором элек-
тронов (KoQ-Яг) или цитохрома С\ с цитохро-
мом с (их акцептором). Последний представля-
ет собой небольшой белок, способный пере-
мещаться в межмембранном пространстве,
контактируя с внутренней мембраной мито-
хондрий. По существу, он является внемем-
бранным связующим звеном между комплек-
сами III и IV.
Комплекс IV (цитохром-с-оксидаза) — это
конечное звеио в цепи электронного транспорта
от исходно окисляемого метаболита на молеку-
лярный кислород. Состоит из нескольких субъ-
единиц, одна из которых (25 кДа) содержит
атом меди, связанный с двумя радикалами гис-
тидина и двумя - цистеина. Этот атом (медь А)
участвует в переносе электрона с цитохрома с
на гем а трансмембранной субъединицы. Буду-
чи самой крупной (57 кДа), она имеет еще один
редокс-центр, который включает а себя гем а3 и
атом меди (медь В), и осуществляет передачу
электрона непосредственно на кислород. Не-
смотря на одноэлектронный механизм транс-
порта по системе цитохромов, комплекс IV
обеспечивает единовременную передачу сразу
4 электронов на молекулу кислорода, восста-
навливая ее до воды (чтобы не усложнять схему,
на рис. 5-8 показан единичный акт отнятия пары
атомов водорода от субстрата, - с переносом
двух электронов на «половинку» молекулы О2).
Важно отметить, что последнее звено -
цитохром оксидаза — обладает чрезвычайно вы-
соким сродством к кислороду. Поэтому дыха-
тельная цепь функционирует со свойственной
ей максимальной скоростью (Vtrax) вплоть до
почти полного исчерпания О2 в митохондриях.
Схема иа рис. 5-10 ясно показывает функ-
циональные связи между звеньями дыхатель-
ной цепи. Следует, однако, подчеркнуть, что эти
связи не закреплены структурно: даже крупные
комплексы свободно перемещаются в липидном
бислое (в среднем - на расстояние не менее соб-
ственного диаметра за 1 мс). На порядок выше
скорость диффузии молекул убихинона и цито-
хрома с, которые в ходе хаотичных контактов с
крупными комплексами обеспечивают, тем не
менее, продвижение по дыхательной цепи от 50
до 200 электронов в секунду.
На пространственную обособленность ком-
понентов дыхательной цепи указывает и факт
неэквивалентности их соотношения. По некото-
рым данным, в расчете на комплекс I внутрен-
няя мембрана содержит 3 комплекса III. но 7
комплексов IV, и все они разделены значитель-
ными промежутками, для преодоления которых
электронами предназначены 9 молекул цито-
хрома с и 50 молекул KoQ (в расчете тоже на
каждый комплекс I).
5.2.3. УКОРОЧЕННАЯ ЦЕПЬ
МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
У ряда веществ, окисляемых в митохонд-
риях, редокс-потенциал существенно выше
значения -0,32 В, присущего никотинамидным
коферментам. Например, у янтарной кислоты
его уровень (+0,03 В) почти такой же, как и у
KoQ. Следовательно, эта кислота (сукцинат) не
может быть субстратом полной дыхательной
цепи. Установлено, что она окисляется непо-
средственно флавиновым ферментом, - анало-
гичным тому, который показан как второе зве-
но в схеме на рис. 5-8. Иными словами, здесь
отсутствует никотинамидный компонент. Од-
нако это не просто «укорочение» полной цепи:
сукцинат окисляется не частью комплекса I,
а вполне самостоятельным ансамблем, кото-
рый содержит ФАД (а не ФМН!) и обозначен
как комплекс П (см. табл. 5-1). Поскольку он
тоже переносит два атома водорода от субстра-
та (но своего1) на мобильный KoQ мембраны,
комплекс II следует считать особым - альтер-
нативным комплексу I - вариантом начально-
го участка дыхательной цепи. Тем не менее,
термин укороченная дыхательная цепь целесо-
образно сохранить. Хотя бы потому, что в ней
действительно нет никотинамидного звена.
И, как следствие, величина коэффициента Р/О,
установленная экспериментально, оказалась
равной 2, а не 3 (то есть, эффективность окис-
лительного фосфорилирования на треть мень-
ше, чем в полной цепи). Наконец, комплекс II
строго избирателен к сукцинату, а для ряда
150
Глава 5
других субстратов существуют свои флавопро-
теиновые системы, но - совсем иной структуры
(см. табл. 5-1). Термин «укороченная дыха-
тельная цепь» позволяет объединить все эти
варианты общим названием, отражающим их
однотипность. Наиболее значимыми субстра-
тами такой цепи являются 3 метаболита (пер-
вые два из которых окисляются сотнями грам-
мов в сутки):
- янтарная кислота (сукцинат);
- ацил-КоА (активированная форма жир-
ных кислот);
- глицерол-3-фосфат (фосфоглицерол).
Комплекс II {сукцинатдегидрогеназа),
как упомянуто выше, способен окислять толь-
ко янтарную кислоту (уравнение реакции при-
ведено на рис. 5-22). У эукариот ои представ-
ляет собой объединение нескольких белков,
встроенное во внутреннюю мембрану мито-
хондрий, но не пронизывающее ее (см. рис.
5-10). Самый крупный из иих (60-70 кДа) вы-
ступает в матрикс и содержит молекулу ФАД,
ковалентно соединенную с радикалом гистиди-
на. Другую часть комплекса составляют субъе-
диницы, несущие три FeS-кластера и гем Ь.
Именно "в такой последовательности эти ре-
докс-центры участвуют в передаче двух элек-
тронов от сукцината на мобильный убихинон
(чему сопутствует перенос на него и двух про-
тонов).
Апил-КоА-дегидрогеназа представляет
собой другой вариант начала укороченной це-
пи. Этот фермент локализован в матриксе и
катализирует отщепление двух атомов водоро-
да от жирной кислоты в составе ацил-КоА
(рис. 7-6). Их он присоединяет к собственной
молекуле ФАД, а затем передает на особый
электронтранспортирующий флавопротеин
(ЭТФ). Этот белок играет роль специального
акцептора восстановительных эквивалентов от
ряда флавиновых дегидрогеназ митохондрий.
Реоксидацию его ФАД осуществляет еще один
флавопротеин - ЭТФ-дегидрогеназа внутрен-
ней мембраны (см. табл. 5-1). Помимо ФАД,
она обладает тремя FeS-центрами, которые по-
могают ей использовать восстановленную
форму ЭТФ для превращения KoQ липидного
бислоя в KoQ-Яг-
Фосфоглицеролдегидрогеназа производит
окисление третьего из перечисленных субстра-
тов укороченной цепи — глицерол-3-фосфата -
до фосфоглицеральдегида (ФГА) или изомерно-
го ему дегидроксиацетон-фосфата (ДГАФ).
Уравнение этой обратимой реакции, показанное
на рис. 5-33, характеризует НАД-зависимую
форму фермента, которая сосредоточена в цито-
плазме. Митохондриальная же фосфоглицерол-
дегидрогеназа является флавиновым фермен-
том: ту же самую реакцию она реализует с уча-
стием не НАД, а ФАД. Этот фермент встроен во
внутреннюю мембрану митохондрий с внешней
ее стороны и состоит из трех субъединиц. Одна
из них иековалентно связывает молекулу ФАД,
другая содержит два FeS-центра. Последние
способствуют восстановлению мобильного
KoQ, которое осуществляется, вероятнее всего,
с участием ЭТФ и ЭТФ-дегидрогеназы (как и в
случае ацил-КоА-дегидрогеназы).
Таким образом, все три названных вариан-
та начала укороченной цепи обеспечивают (как
и комплекс I) восстановление мобильного KoQ
(см. рис. 5-10). Но энергетический баланс этого
процесса недостаточен для синтеза АТФ.
Дальнейший путь электронов от K0Q7/2 до Oi
протекает так же, как и в полной дыхательной
цепи, с использованием заключительных зве-
ньев системы МтО (комплекс III, цитохром с и
комплекс IV). Именно на этом отрезке пути
происходит освобождение всей той энергии,
которая может быть использована для синтеза
АТФ (две молекулы АТФ на каждый акт окис-
ления субстрата).
Помимо перечисленных метаболитов, уко-
роченными путями окисляются также минорные
субстраты (в данном контексте имеются в виду
вещества, суточная утилизация каждого из кото-
рых составляет около 1 г). В основном это про-
дукты частичной деградации таких аминокис-
лот, как лейцин, лизин, триптофан. Их окисление
не дает ощутимого вклада в общую выработку
АТФ, но является составной частью нормального
катаболизма названных аминокислот.
5.2.4. МЕХАНИЗМ СОПРЯЖЕНИЯ ОКИСЛЕНИЯ
С ФОСФОРИЛИРОВАНИЕМ
Долгое время оставалось загадкой, каким
образом энергия, освобождаемая при биологи-
ческом окислении, трансформируется в энер-
гию макроэргических связей АТФ. Многие вы-
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
151
дающиеся биохимики пытались обнаружить и
выделить «сопрягающие» ферменты или обра-
зующиеся с их участием промежуточные про-
дукты. Прорыв наступил в 1961 г., когда анг-
лийский исследователь Питер Митчел опубли-
ковал короткую статью «Сопряжение окисле-
ния и фосфорилирования механизмом хемиос-
мотического типа».
Судьба П. Митчела сложилась так, что ос-
новные эксперименты он выполнил в своей
домашней лаборатории (как в свое время
А.Н. Бах), в оборудовании которой едва ли не
самым главным прибором был обычный
pH-метр. Ученый сумел перевести проблему
в совсем другую, совершенно неожиданную
плоскость. Его публикации вызвали очень
острую и длительную полемику. Большую
роль в доказательстве правоты П. Митчела
сыграли эксперименты группы московских
ученых во главе с В.П. Скулачевым (ныне
академиком РАН, председателем Российско-
го биохимического общества). В 1978 г.
П. Митчел был удостоен высшей научной на-
грады - Нобелевской премии.
Суть хемиосмогической теории сводится к
тому, что в местах сопряжения (отмеченных на
рис. 5-8) происходит не фосфорилирование как
таковое, а просто выброс протонов из матрикса
в межмембранное пространство. В результате
создается трансмембранный градиент концен-
трации протонов: снаружи их в 10 раз больше
(pH =^7), чем в матриксе (pH ~8). Возникающий
градиент электрохимического потенциала
(Ар.Н+ ) является движущей силой, стремящейся
вернуть протоны в матрикс, т.е., устранить рез-
кий перепад их концентрации. Однако возврат-
ное движение ионов Н+ возможно только через
специальные трансмембранные каналы. Энер-
гия «прорыва» протонов по ним используется
для синтеза АТФ (как поток воды по каналам в
теле плотины - для выработки электроэнер-
гии). Важно подчеркнуть, что это - поток
«обезличенных» протонов, т.к. невозможно
определить, на каком участке дыхательной це-
пи выброшена из матрикса та или иная пара
ионов Н+ (все они образуют совокупный пул
протонного градиента).
Преодоление П.Митчелом рамок традици-
онной научной парадигмы привело к быстрому
прогрессу в раскрытии механизмов окисли-
тельного фосфорилирования. Теперь уже точно
известно, что оно осуществляется не в тех трех
участках, которые отмечены в схеме на рис.
5-8, а в других местах - с внутренней (мат-
риксной) стороны протонных каналов. Указан-
ные же на этой схеме участки сопряжения яв-
ляются лишь пунктами выкачивания протонов
из матрикса. Ими становятся один за другим
трансмембранные комплексы I, III и IV сис-
темы МтО (как это отмечено на рис. 5-10). В
каждом из них передача электронов по редокс-
центрам обеспечивает транслокацию протонов
из матрикса наружу. И хотя детали этого про-
цесса еще не вполне ясны, можно считать ус-
тановленным количество ионов Н+, удаляемых
из матрикса при прохождении комплекса па-
рой электронов. Как показано в последней
графе табл. 5-1, для комплекса I оно составляет
4 протона, для комплекса III — 2 протона и для
комплекса IV - снова 4 протона.
Комплекс V - так обозначен крупный (поч-
ти 500 кДа) надмолекулярный ансамбль, фор-
мирующий в мембране особый канал, в котором
поток протонов по градиенту концентрации
обеспечивает реакцию синтеза АТФ из АДФ и
Фн. Полное название комплекса - протон-
транспортирующая двухсекторная АТФ-аза.
Фактически это и есть фактор сопряжения.
Часть его — сектор Fo — состоит из более чем де-
сятка субъединиц (почти все они одинаковы),
образующих цилиндрической формы трансмем-
бранный канал для прогонов. На нем, как на
оси, фиксирован сектор Fj, который выдается в
матрикс в виде округлого расширения («шляпка
гриба»). По окружности этой «шляпки» равно-
мерно распределены три одинаковых гетероди-
мера, состоящих из а- и р-субъединиц (55 и
50 кДа соответственно). Каждая из них содер-
жит нуклеотид-связывающий центр для АТФ и
АДФ. В центре этой трехсекционной «шляпки»
находятся три меньшие субъединицы, некова-
лентно соединяющие ее с Fo.
Функционально субкомплекс Fi представ-
ляет собой фермент, катализирующий реакцию
фосфорилирования молекулы АДФ (т.е., пре-
вращение ее в АТФ). Обычно его обозначают
термином протонная АТФ-синтетаза, ибо
энергию, необходимую для синтеза АТФ, по-
ставляет здесь поток ионов Н+ через протон-
ный канал Fo (рис. 5-11).
152
Глава 5
Межмембранное пространство
ЗН+ Матрикс митохондрии
(рН»6)
Рис. 5-11. Схема функционирования протонной
АТФ-синтетазы (слева) и АТФ/АДФ-транслоказы (справа).
По современным представлениям, веду-
щую роль в механизме синтеза АТФ играет
вращательное движение комплекса FoFi вокруг
продольной оси. Движущей силой является по-
ток протонов через Fo, вызывающий его рота-
цию, которая увлекает за собой и сектор Fb
Вращение последнего происходит ступенчато,
с «длительными» (~1 мс) остановками после
каждого поворота на 120° (т.е., на протяжен-
ность димера ар). В итоге за один оборот ди-
мер трижды претерпевает конформационную
перестройку (вызываемую сменой «обстанов-
ки», т.е., ближайшего окружения). В одном из
конформационных состояний димер сорбирует
молекулы АДФ и Фн, в следующем формирует
макроэргическую связь между ними (образуя
молекулу АТФ с выделением Н2О) и, наконец,
в третьем — освобождается от синтезированной
молекулы АТФ, переходя в состояние готовно-
сти снова повторить весь этот цикл. Таким об-
разом, в любой момент времени все три димера
ар, расположенные по окружности субком-
плекса Fi, находятся в разных конформацион-
ных состояниях, а синтез АТФ идет непрерыв-
но, пока достаточен протонный градиент по
обе стороны мембраны. Максимальная ско-
рость процесса может достигать —600 молекул
АТФ за 1 секунду.
Сравнительно недавно стало очевидно, что
через протонные каналы проходят далеко не
все ионы Н+, удаляемые из матрикса транс-
мембранными комплексами I, III и IV. Ибо в
живой клетке энергия ДцН+ частично исполь-
зуется и на другие нужды. В частности, на дос-
тавку в матрикс анионов фосфата, требуемых
(вместе с АДФ) для материального обеспечения
биосинтеза АТФ (см. рис. 5-11). Иными слова-
ми, соотношение между «выбросом» протонов
из митохондрий и «прорывом» их обратно по
протонным каналам отнюдь не является сте-
хиометрическим (т.е. таким, которое выражается
коэффициентами уравнения химической реак-
ции). Оно заметно варьирует в разных типах
клеток и в зависимости от их функционального
состояния. Современные исследователи пришли
к согласию в том, что прежние значения коэф-
фициента P/О (упомянутые в разделах 5.2.2 и
5.2.3) явно завышены, а более реальными явля-
ются Р/О = 2,5 для полной дыхательной цепи
(окисление НАД7/2) и Р/О = 1,5 - для укоро-
ченной (окисление ФАД772). Эти «консенсусные
величины» приняты теперь (взамен ранее уста-
новленных 3 и 2 соответственно) для расчета
энергетической эффективности процессов ката-
болизма (таких как распад глюкозы или высших
жирных кислот).
В заключение следует отметить обрати-
мость механизма синтеза АТФ за счет энергии
протонного потенциала. Процесс может пойти
вспять при накоплении АТФ на стороне распо-
ложения Fj. В этих условиях синтез АТФ сменя-
ется его гидролизом, из-за чего наступает рота-
ция всего комплекса FoFi в обратном направле-
нии и, как следствие, градиент протонов не
уменьшается, а нарастает. Такое «обратное со-
пряжение» фосфорилирования с наработкой
протонного градиента действительно реализует-
ся в ряде живых объектов. В частности, так ра-
ботает протонная АТФ-синтетаза в плазматиче-
ской мембране бактерий, способных подкислять
среду, а также в мембране везикул с кислым со-
держимым (таких как лизосомы). Таким обра-
зом, комплекс V объединяет в себе два двигате-
ля: мотор Fo, движимый потоком протонов по
градиенту их концентрации, и мотор Fj, вра-
щаемый в обратную сторону гидролизом АТФ,
что ведет к увеличению этого градиента.
5.2.5. ДЫХАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ
У животных митохондрии являются глав-
ным производителем молекул АТФ, а почти
все потребители энергии АТФ (см. раздел
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
153
2.2.2) находятся в других участках клетки.
Следовательно, этот макроэрг, синтезируемый
в матриксе, должен перемещаться в межмем-
бранное пространство, откуда ему легко диф-
фундировать в цитозоль. Преодоление внут-
ренней мембраны облегчает специальная
АТФ/АДФ-л2/?«нсу/окш«, которая «выпускает»
из матрикса АТФ строго в обмен на АДФ. По-
путно в матрикс переходит эквивалентное ко-
личество Фн (см. рис. 5-11), сопровождаемого
протоном. Тем самым компенсируется дефи-
цит отрицательных зарядов в молекуле АДФ (в
сравнении с АТФ), а также обеспечивается ма-
териальный баланс: в матрикс поступает
столько (АДФ + Фн), сколько необходимо для
синтеза выводимого АТФ. Благодаря слажен-
ности АТФ-синтетазного и транслоказного ме-
ханизмов соотношение [АТФ] / [АДФ] в цито-
золе в 10 раз больше, чем в матриксе.
Но самое главное заключается в том, что
осуществляемое транслоказой поступление
АДФ в матрикс является непременным услови-
ем для поддержания не только реакции фосфо-
рилирования, но и работы самой дыхательной
цепи. Действительно, в отсутствие АДФ синте-
зировать АТФ не из чего. Поэтому трансмем-
бранный градиент [Н1 [, создаваемый дыха-
тельной цепью, не «разряжается» через протон-
ные каналы, а нарастает, все более затрудняя
дальнейшую «перекачку» протонов из матрикса
(вплоть до ее остановки). В результате тормо-
зится поток электронов (и протонов) по дыха-
тельным цепям, т.е., прекращается утилизация
кислорода (тканевое дыхание). Однако и фос-
форилирование, и дыхание возобновляются, ес-
ли добавить в систему АДФ (и Фи) либо обеспе-
чить распад внемитохондриального АТФ до
АДФ и фосфата (которые станут поступать в
матрикс в обмен на синтезируемый там АТФ).
Не только в этих опытах на модельных
системах in vitro, но и в физиологических
условиях показано, что расходование АТФ в
процессах жизнедеятельности, приводя к обра-
зованию АДФ, тем самым автоматически сти-
мулирует выработку АТФ и утилизацию кис-
лорода в митохондриях. Эта зависимость ско-
рости клеточного дыхания от скорости образо-
вания АДФ получила название дыхательный
контроль. Благодаря ему интенсивность про-
цессов митохондриального окисления и фосфо-
рилирования диктуется фактическими затратами
АТФ в каждый данный момент. Потребление
клеткой энергии (в виде АТФ) нередко изменя-
ется в десятки раз, но соответственно этому ме-
няется и скорость утилизации кислорода, гак
что соотношение концентраций АТФ и АДФ
остается почти постоянным, колеблясь в очень
узких пределах. Это соотношение принято вы-
ражать коэффициентом, обозначаемым как
энергетический заряд клетки (ЭЗК):
[АТФ] 10^-[АДФ] |521
[АТФ] + [АДФ]+[АМФ]
Введенный в числитель коэффициент 0,5
перед обозначением концентрации АДФ ука-
зывает на то, что две молекулы АДФ (с одной
макроэргической связью в каждой) эквива-
лентны одной молекуле АТФ (с ее двумя мак-
роэргическими фосфатными группами). Их
взаимопревращения катализирует аденилатки-
наза (см. уравнение [2-1]).
Фактически ЭЗК отражает степень «на-
полнения» адениннуклеотидной системы мак-
роэргическими связями. В случае полного ис-
черпания таких связей вся система окажется
представленной только молекулами аденило-
вой кислоты (АМФ), а значение ЭЗК упадет до
нуля. Если же, напротив, полностью профос-
форилировать адениннуклеотидный фонд
(превратив все его компоненты в АТФ), то
ЭЗК станет равным единице. Обычное значе-
ние ЭЗК варьирует в разных клетках от 0,85 до
0,95 (в состоянии покоя). Это свидетельствует
о почти полном насыщении адениннуклеотид-
ной системы энергией макроэргических связей.
5.2.6. РАЗОБЩЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО
ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ
Концепция П.Митчела позволила объяс-
нить давно известный феномен нарушения со-
пряженности фосфорилирования с окислением.
Он заключается в том. что в присутствии неко-
торых веществ, не препятствующих процессам
окисления, выработка АТФ в митохондриях
ослабевает (уменьшается коэффициент Р/О).
Такие вещества назвали разобщающими аген-
тами. К ним относятся, в частности, динитро-
фенол, салициловая кислота, дикумарол. Рас-
стройство сопряжения процессов окисления и
154
Глава 5
фосфорилирования наступает также при избы-
точности тироидных гормонов - тироксина и
трийодтиронина (структурно похожих на ди-
нитрофенол).
Эффектом разобщения объясним ряд ведущих
проявлений гиперфункции щитовидной желе-
зы (базедова болезнь; тиротоксикоз: болезнь
Грейвса). Из-за снижения коэффициента Р/О
при этой патологии образуется меньше АТФ и
больше теплоты, чем обычно (в расчете на
единицу окисляемых продуктов). Как следст-
вие, развивается повышенный аппетит и насту-
пает усиленное потребление кислорода. Тем не
менее, такие больные очень худощавы, если не
сказать - истощены. Увеличение общего коли-
чества потребляемой пищи н повышение доли
энергии, рассеиваемой в виде тепла, приводит
к избыточной теплопродукции: таким больным
все время жарко («симптом простыни»), а тем-
пература тела постоянно держится на слегка
повышенном уровне (субфебрилитет). Объек-
тивным критерием диагностики служит повы-
шение основного обмена (количество кислоро-
да. потребляемого натощак в состоянии покоя
в расчете на единицу поверхности тела).
Несмотря на большие различия в строении
известных разобщающих агентов, все они об-
ладают двумя особенностями. Во-первых, они
относятся к числу слабых кислот, а потому
степень их диссоциации растет с увеличением
pH среды. Во-вторых, им присущи гидрофоб-
ные свойства (из-за наличия крупных неполяр-
ных структур), благодаря чему такие молекулы
довольно легко проникают сквозь липидный
бислой, причем, даже в ионизированной (ани-
онной) форме. Попадая в матрикс (pH ~8), та-
кая кислота диссоциирует сильнее, чем по дру-
гую сторону мембраны (pH ~7), а это значит -
отдает часть своих протонов. Смещение равно-
весия в пользу анионной формы способствует
диффузии последней из матрикса в межмем-
браниое пространство, где эти анионы, прини-
мая избыточные здесь протоны, снова перехо-
дят в форму неионизированной кислоты, кото-
рая вновь диффундирует в матрикс, и все по-
вторяется опять (рис. 5-12). Иными словами,
слабая кислота оказывается в роли переносчика
протонов извне в матрикс. Этот перенос не при-
вязан к каким-либо особым участкам внутрен-
ней мембраны и ведет к тотальному уравнива-
нию концентрации ионов Н+ по обе ее сторо-
н+
Н++НО~---->НяО
Межмембранное
пространство
Внутренняя мембрана
митохондрий
Матрикс
Рис. 5-12. Механизм разобщающего действия
слабых органических кислот.
ны, т.е., к устранению протонного потенциала. В
результате ослабевает поток ионов 1Г через
каналы Fo, из-за чего субкомплекс Fi лишается
источника энергии, необходимой для синтеза
АТФ. Таким образом, реакция фосфорилирова-
ния АДФ замедляется, тогда как окисление суб-
стратов и потребление кислорода не только не
уменьшаются, но даже возрастают (благодаря
стимуляции накапливающимися АДФ и Фн).
Этот эффект пытались было использовать для
лечения ожирения. Применение динитрофенола
действительно приводило к снижению избыточ-
ного веса (благодаря непродуктивному «сгора-
нию» жира). Одиако вскоре стали появляться
сообщения о тяжелых нарушениях и даже ле-
тальных исходах, и «быстрое лекарство» было
запрещено. Для тех, кто занимается разработкой
новых лекарственных препаратов, эта история
послужила серьезным уроком на будущее.
Разобщающий эффект оказывают не толь-
ко чужеродные вещества типа салицилата. Он
достигается и собственными регуляторами,
контролирующими теплопродукцию. Наиболее
ярким примером служат клетки бурого жира.
Во внутренней мембране митохондрий, кото-
рыми они особенно богаты, есть специальный
белок - тпермогенин (содержащий, как и
АТФ/АДФ-транслоказа, много глицина и про-
лина). Функционирует этот белок как димер,
способный создавать трансмембранные каналы,
которые позволяют протонам проникать извне в
матрикс. Тем самым «обесценивается» работа
дыхательной цепи по созданию протонного гра-
диента: его энергетический потенциал использу-
ется не для синтеза АТФ, а рассеивается виде
тепла. В сущности, бурая жировая ткань реали-
зует механизм прямой генерации тепла, выпол-
няя роль своеобразной печки, которая защищает
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
155
организм от переохлаждения. Особенно важна
она у новорожденных с их несовершенной сис-
темой физиологической терморегуляции, а так-
же у зимнеспящих животных.
5.2.7. УДЛИНЕННАЯ ЦЕПЬ
МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
Помимо ряда уже упоминавшихся суб-
стратов МтО, сотнями граммов в сутки обра-
зуются в организме человека и такие метабо-
литы. как пировиноградная кислота (ПВК) и
а-кетоглутарат (а-КГ). Редокс-потенциал каж-
дой из этих а-кетокислот (-0,7 В) намного ни-
же, чем у никотинамидных коферментов (-0,32
В). Такая разница создает большой энергетиче-
ский ресурс, которым природа не могла не
воспользоваться. Если обычные субстраты
полной цепи поставляют НАД7/2 комплексу I
с помощью простых («одноступенчатых»)
Н АД-дегидрогеназ, то для а-кетокислот в мат-
риксе митохондрий существуют специальные
надмолекулярные ансамбли. Каждый из них
производит НАД’Яг -лишь после предваритель-
ного декарбоксилирования а-кето кислоты (от-
щепление СО2). Отсюда и название - мульти-
ферментный комплекс окислительного декар-
боксилирования а-кетокислот (на рис. 5-10 он
обозначен как ОДК). Реализуя многостадий-
ный процесс, этот комплекс, по существу, уд-
линяет начальное звено полной дыхательной
цепи, а главное - использует освобождаемую
при этом энергию для образования макроэрги-
ческих соединений. Поэтому всю систему
окисления а-кетокислот (включая мембранные
комплексы I, III и IV) удобно обозначать тер-
мином удлиненная цепь митохондриального
окисления (имея в виду, что путь пары атомов
водорода к комплексу I длиннее, чем в полной
дыхательной цепи).
Комплекс окислительного декарбоксили-
рования объединяет три разных фермента, ка-
ждый из которых содержит свою простетиче-
скую группу. Кроме того, в его работу вовле-
чены еще и два кофермента - НАД и КоА,
строение которого показано на рис. 2-5. Там же
отмечено, что реактивным центром КоА (ко-
фермент ацилирования) является группа -SH.
Поэтому в уравнениях реакций его обычно
представляют как HS-KoA.
Простетическая группа одного из фер-
ментов (Ei) представлена тиаминдифосфатом
(ТДФ) - фосфорилированной формой витами-
на В] (рис. 5-13). В этой молекуле углерод,
заключенный между атомами азота и серы тиа-
золового кольца, обладает высокой реакцион-
ной способностью. Именно к нему присоеди-
няется субстрат в ходе ферментативной реак-
ции. Поэтому тиаминдифосфат кратко обозна-
чают как ЯС=ТДФ (как это сделано на рис.
5-15).
Другой фермент комплекса (Е2) имеет в
качестве простетической группы липоевую ки-
слоту (рис. 5-14), которая соединена кислото-
амидной (пептидной) связью с одним из ли-
зильных радикалов апофермента. Функцио-
нально активной частью липоевой кислоты
(Л.к.) является дисульфидная группа, способ-
ная легко восстанавливаться, присоединяя два
атома водорода (см. рис. 5-14).
Наконец, третий фермент комплекса (Е3) в
качестве простетической группы содержит
молекулу ФАД (см. рис. 2-7).
Объединение ферментов в стабильный
комплекс является залогом быстрого и у поря-
Витамин В t (тиамин)
Рис. 5-13. Строение тиаминдифосфата (активная
форма витамина Bi) [жирным шрифтом выделен высоко-
реактивный атом углерода тиазолового кольца].
s—сн2
I xCHa
S—сн
СН2 СН2 СООН
сн2 сн2
А
HS—сн2
^сн2
HS—сн
Хн2 сн2 соон
XXX/
сн2 сн2
Б
Рис. 5-14. Окисленная (А) и восстановленная (Б) формы
липоевой кислоты (Л.к.) и их сокращенные обозначения
(В и Г).
156
Глава 5
доченного течения последовательных стадий
катализируемого процесса. При этом продукт
действия одного фермента сразу же поступает
на активный центр следующего, чем предот-
вращается рассеяние промежуточных метабо-
литов в окружающей среде.
Известны два комплекса окислительного
декарбоксилирования а-кетокислот, а именно:
пируват-дегидрогеназный и а-кетоглутарат-
дегидрогеназный. Они различаются строением
белковой части двух из трех своих ферментов
(Ei и Е2), ио не коферментами или простетиче-
скими группами. Механизм их функциониро-
вания представлен на рис. 5-15 на примере
окислительного декарбоксилирования ПВК.
Первой на субстрат воздействует пируват-
декарбоксилаза (Ei), которая производит от-
щепление СО2. Как показано на рис. 5-15
(стадия 1), сначала ПВК углеродом своей кар-
бонильной группы присоединяется к ферменту
(точнее — к активному углероду его тиаминди-
фосфата), а затем теряет карбоксильную груп-
пу в виде углекислоты, превращаясь в гидро-
ксиэтильный фрагмент, ковалентно связанный
сТДФ.
СН3 л
I «
соон
ОН
СН3 ОН
V_______
нх
ПВК
Гидроксиэтил-ТДФ-Ei
сн3/°н
2 -->
Из
->s—< _
Липоил-Е2
СН3
-> хс'
НООСХ
Ацети л-дигидро липои л - Е2
СН3 ____________ СН3
С^9-"' _+_«S-KoA -------> с^° +
HS ^Л]к^Д| Ацетил-КоА
Дигидро липои л - Е2
Дигидрол ипоил- Е2
5 + НАД ----> НАД • н2 + gwi
Липоил-Е2
Итоговое 9нз СН3
уравнение: с=О + Hg_KoA + НАД ----------> с02 + + НАД Н2
СООН —КоА
ПВК
Рис. 5-15. Окислительное декарбоксилирование ПВК: стадии процесса и итоговое уравнение.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
157
Вторую стадию процесса можно считать
самой важной. Как видно на схеме, гидрокси-
этил ьный остаток теряет два атома водорода.
Один из них переходит к углероду тиаминди-
фосфата, а другой - к одному из атомов серы
липоевой кислоты (второй атом серы соединя-
ется с тем, что осталось от бывшего гидрокси-
этил ьного фрагмента, занимая место, принад-
лежавшее тиаминдифосфату). Фактически на
этой стадии происходит окисление гидрокси-
этильного остатка до остатка уксусной кисло-
ты, который сразу же передается на Л.к. (про-
стетическую группу второго фермента ком-
плекса). Принятое обозначение Е2 - дигидро-
липоил-трансацетияаза — обусловлено тем,
что этот фермент катализирует и стадию 3 про-
цесса, осуществляя дальнейший перенос аце-
тильного остатка (см. ниже). Но все же именно
дегидрогеназное действие (стадия 2, рис. 5-15)
является самым важным эффектом фермента
Е2. Окисляя продукт стадии 1 за счет восста-
новления собственной липоевой кислоты, ди-
гидролипоил-трансацетилаза заодно переносит
на нее возникающий остаток уксусной кисло-
ты, вытесняя при этом пируватдекарбоксилазу
(Et) в ее исходной форме (ЛСгТДФ-Ei). Энер-
гия этого окисления концентрируется в виде
макроэргической связи между ацетильным ос-
татком и атомом серы липоевой кислоты.
На стадии 3 этот ацетильный фрагмент
вместе с макроэргической связью передается
на кофермент А (образуя ацетил-КоА), а сама
трансацетилаза освобождается в восстановлен-
ной форме (точнее, восстановленной оказыва-
ется простетическая группа фермента, превра-
тившаяся в остаток дигидролипоевой кислоты).
Третий фермент комплекса (Е3) завершает
процесс, возвращая дигидролипоевую кислоту
дигидролипоил-трансацетилазы в окисленную
(дисульфидную) форму. Отсюда и название
фермента - дигидролипоилдегидрогеназа. От-
нимая два атома водорода у дигидроли по-
ильной группы трансацетилазы, он сначала
присоединяет их к собственной простатиче-
ской группе, каковой является ФАД (стадия 4),
а затем, на стадии 5, передает на молекулу
НАД, превращая ее в НАД-//2, - субстрат ком-
плекса I системы МтО.
Таким образом, суммарный итог работы
пируват-дегидрогеназного комплекса сводится
к тому, что субстрат (ПВК) превращается в
активную форму уксусной кислоты (ацетил-
КоА), подвергшись сначала декарбоксилиро-
ванию, а затем - окислению путем отнятия во-
дорода, который в конечном счете оказывается
в составе НАД-772 (см. итоговое уравнение на
рис. 5-15). Здесь важно подчеркнуть, что обра-
зование СО2 не связано непосредственно
с окислительными процессами и, уж тем более,
не является следствием присоединения кисло-
рода к углероду окисляемого вещества: такого
процесса в митохондриях попросту нет.
В этом - еще одно отличие митохондриального
окисления от обычного горения.
Аналогичным образом работает и а-кето-
глутарат-дегидрогеназный комплекс. От ПВК
молекула а-кетоглутаровой кислоты отличает-
ся тем, что вместо группы —СНч несет на кар-
бонильном углероде более крупный радикал
-СН2-СН2-СООН. Теряя СО2, эта молекула пре-
вращается в янтарную кислоту (сукцинат):
НООС-СН2-СН2-СООН.
Понятно, что лишь первые два фермента
а-КГ-дегидрогеназного комплекса обладают
иной субстратной специфичностью, чем в ком-
плексе для ПВК. Соответственно их называют
а-КГ-декарбоксилазой и дигидролипоат-транс-
сухцинилазой. С поправкой на специфику ра-
дикала, все уравнения процесса окислительно-
го декарбоксилирования а-КГ выглядят точно
так же, как это показано на рис. 5-15 для ПВК.
Итоговое же уравнение этого процесса приве-
дено на рис. 5-16. Можно видеть, что конеч-
ным продуктом окислительного декарбо-
ксилирования а-КГ является активная форма
янтарной кислоты - сукцинил-КоА (наряду с
обычными для такого процесса молекулами
СО2 и НАД-7А).
Есть данные, что комплексы окислитель-
ного декарбоксилирования а-кетокислот при-
мыкают к внутренней мембране митохондрий
(со стороны матрикса). Это облегчает передачу
митохондриальному комплексу I атомов водо-
рода от НАД-Я2, генерируемого в ходе декар-
боксилирующего окисления а-кетокислот.
Дальнейший транспорт электронов и протонов
по полной дыхательной цепи приводит к обра-
зованию 2,5 молекул АТФ в расчете на каждую
молекулу окисленного пирувата или а-КГ.
158
Г лава 5
соон
сн2
СН2 + HS-КоА+НАД
соон
а-Кетоглугарат
(а-КГ)
СООН
сн2
----> СН2 + СО2 + НАД -н2
if
LS—КоА
Сукцинил-КоА
Рис. 5-16. Итоговое уравнение процесса окислительного
декарбоксилирования о-кГ.
Но этим количеством АТФ не исчерпыва-
ется энергетическая эффективность удлинен-
ной цепи МтО. Ибо еще одним из конечных
продуктов здесь является молекула ацетил-
КоА либо сукцинил-КоА. В каждой из них
ацильный остаток соединен с атомом серы ко-
фермента А не обычной, а макроэргической
связью (как это показано на рисунках 5-15 и
5-16). Она легко трансформируется в макроэр-
гическую связь молекулы АТФ (или ее анало-
гов - других нуклеозидтрифосфатов). Именно
такова судьба основной массы молекул сукци-
нил-КоА. Механизм трансформации показан на
рис. 5-17.
Процесс, катализируемый сукцинат-тио-
киназой, протекает в две стадии. Сначала ко-
фермент А «вытесняется» неорганическим
фосфатом, но с сохранением макроэргической
связи в составе образующегося сукцинил-
фосфата. Затем остаток фосфата вместе с мак-
роэргической связью переносится на ГДФ,
превращая его в ГТФ, а янтарная кислота (сук-
цинат) выделяется в свободном виде. По суще-
ству, это реакция фосфорилирования нуклео-
зиддифосфата (в данном случае — молекулы
ГДФ). Однако оно не может быть названо
соон соон
сн2 сн2
1 СН2 + но—РОзН2 ---------> сн2 + HS— КоА
с=”° с«'°
"i-S-KoA 'О-РО..Н,
Сукцинил-КоА Сукцинилфосфат
СООН СООН
2 f
сн2 + гДф -------------> сн2 + ГТФ
с^° соон
""О-РОэНг
Сукцинилфосфат
Сукцинат
Рис. 5-17. Фосфорилирование гуанозиндифосфата
за счет макроэргической связи молекулы сукцинил-КоА.
окислительным, ибо энергетическая «подпит-
ка» обеспечивается здесь не трансмембранным
градиентом протонов и вообще не зависит от
работы дыхательной цепи. Это - так называе-
мое фосфорилирование на уровне субстрата,
что означает: внедрение фосфата в нуклеозид-
дифосфат путем использования готовой макро-
эргической связи, возникшей в каком-либо
субстрате. В данном случае им является сукци-
нил-КоА. В дальнейшем изложении будут
встречаться и другие метаболиты такого рода.
Субстратным фосфорилированием назы-
вают феномен синтеза АТФ (и его анало-
гов), осуществляемого за счет энергии
макроэргических связей, появляющихся в
каком-либо субстрате в ходе его метабо-
лических превращений.
В приведенном примере специфика фер-
мента такова, что фосфатный остаток перено-
сится не на АДФ (как чаше и бывает), а на
ГДФ, превращающийся в молекулу ГТФ. Од-
нако в клетках есть активные нуклеозидди-
фосфаткиназы (раздел 2.2.2), которые легко
осуществляют взаимообмен фосфатными ос-
татками между различными мононуклеотида-
ми, богатыми энергией. Поэтому и образую-
щийся ГТФ находится в равновесии с АТФ:
ГТФ + АДФ <=» ГДФ + АТФ [5-3]
При подсчете энергетических балансов за-
пас «полезной» энергии выражают обычно
числом молекул именно АТФ. Так удобнее,
тем более что АТФ количественно преобладает
над своими аналогами и участвует в подав-
ляющем большинстве энергоемких процессов.
Поэтому не будет ошибкой считать, что пре-
вращение сукцинил-КоА в молекулу янтарной
кислоты может быть использовано для образо-
вания молекулы АТФ из АДФ и фосфата.
Итак, в удлиненной дыхательной цепи
энергетический итог может достигать 3,5 мо-
лекул АТФ на молекулу окисленного субстра-
та. Из них 2,5 молекулы АТФ образуются пу-
тем нестехиометрического процесса окисли-
тельного фосфорилирования, а еще одна - по-
средством субстратного. Поэтому удлиненная
цепь энергетически выгоднее других вариантов
системы МтО.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
159
Независимость субстратного фосфорили-
рования от митохондриального окисления
важна, по меньшей мере, в двух отношениях.
Во-первых, становится возможной вы-
работка АТФ вне митохондрий, за счет только
тех метаболических реакций, которые проте-
кают в цитоплазме. Благодаря этому источни-
ку энергии многие клетки могут оставаться
жизнедеятельными даже при недостатке ки-
слорода (или полной его недоступности). Под-
робнее этот аспект будет рассмотрен в разделе
6.7.4, посвященном бескислородному распаду
углеводов (гликолиз).
Во-вторых, появление макроэргической
связи в молекуле какого-либо вещества вовсе
не обязательно должно завершаться субстрат-
ным фосфорилированием. Такая связь зачастую
непосредственно используется для энергетиче-
ского обеспечения химического соединения это-
го вещества с другим. Иными словами - для ре-
акции синтеза сложной молекулы из более прос-
тых. Самое важное заключается в том, что такой
биосинтез не требует затраты АТФ. Происходит
прямая утилизация макроэргической связи, без
предварительной наработки АТФ, необходимо-
го для почти всякого биосинтеза. Причем, ути-
лизация целевая, приспособленная для данных
конкретных участников процесса.
В частности, сукцинил-КоА может напря-
мую использоваться в биосинтетических реак-
циях. Например, для синтеза гема. Это очень
сложный, многоступенчатый процесс. Но на-
чинается он с реакции между сукцинил-КоА и
глицином (рис. 5-18). Продукт их конденсации
служит материалом для построения пятичлен-
ных пиррольных колец, входящих в состав
порфириновой структуры гема и гемоподоб-
ных веществ.
Лишь малая доля возникающего сукцинил-
КоА идет на биосинтез более сложных моле-
соон
I
сн2
H2C-NH2 -----> CH2 + HS—КОД
соон с=о
I
Глицин НС МН2
СООН
а-амино-р-кего-
адипиновая кислота
Рис. 5-18. Первая стадия биосинтеза гема.
соон
I
сн2
сн2
к°
S—КоА
Сукцинил-КоА
кул. Основная же его масса утилизируется ре-
акцией субстратного фосфорилирования.
Напротив, ацетил-КоА - продукт другого
комплекса окислительного декарбоксилирова-
ния - практически весь используется не для
прямого получения АТФ, а в биосинтетических
процессах. Главнейшими из них являются:
- синтез лимонной кислоты;
- синтез кетоновых тел;
- синтез жирных кислот;
- синтез холестерола и других стеролов.
Значительно преобладает первая из пере-
численных реакций. Именно с нее начинается
так называемый цикл трикарбоновых кислот.
Остальные три процесса будут рассмотрены в
главе 7, посвященной метаболизму липидов
(разделы 7.3.4, 7.4 и 7.7.1).
5.3. ЦИКЛ ТРИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
Уксусная кислота, входящая в состав аце-
тил-КоА, - самое простое из всех перечислен-
ных выше органических веществ, воз-
никающих при митохондриальном окислении.
Вместе с тем, эта двухуглеродная молекула
чрезвычайно стабильна и не может быть раз-
рушена без применения жестких воздействий,
несовместимых с жизнью. Природа смогла,
однако, «изобрести» особый прием для пре-
одоления этой трудности. Он заключается в
том, что ацетильный фрагмент сначала перено-
сится с ацетил-КоА на щавелевоуксусную ки-
слоту (оксалоацетат) с образованием шестиуг-
леродной лимонной кислоты. Последняя со-
держит три карбоксильные группы и одну гид-
роксильную, а потому вполне «удобоварима»
для декарбоксилаз и дегидрогеназ. Их пооче-
редное воздействие приводит в итоге к появле-
нию молекулы воды и двух молекул СО2, что
по числу углеродных атомов эквивалентно со-
ставу ацетильного фрагмента. В конечном сче-
те, лимонная кислота (цитрат) вновь превра-
щается в щавелевоуксусную (ЩУК), готовую
принимать очередной ацетильный фрагмент и
снова повторять весь путь.
Этот циклический процесс, в ходе которо-
го ацетильные фрагменты расщепляются до
СО2 и И2О, обозначают как цикл трикарбоно-
вых кислот или цикл лимонной кислоты.
160
Глава 5
Ферменты цикла трикарбоновых кислот
(ЦТК) локализованы в митохондриях. Некото-
рые из его промежуточных метаболитов стано-
вятся субстратами дыхательных цепей - пол-
ной, укороченной или удлиненной. Это значит,
что каждая дегидрогеназа, выполняя свою роль
в реакциях собственно цикла, вместе с тем «да-
ет старт» транспорту пары атомов водорода по
соответствующей дыхательной цепи от суб-
страта (метаболита цикла) до кислорода с об-
разованием молекулы воды. Именно таким об-
разом окислительное превращение (дегидроге-
нирование) одного метаболита цикла в другой
оказывается «состыкованным» с процессами
митохондриального окисления, с которыми, в
свою очередь, сопряжен механизм биосинтеза
АТФ (окислительное фосфорилирование). Из
всего этого следует, в частности, что ЦТК яв-
ляется строго аэробным процессом, т.е., может
протекать только в присутствии кислорода и
обязательно с его привлечением (абсолютная
зависимость от кислорода).
5.3.1. ХИМИЗМ РЕАКЦИЙ ЦТК
Собственно ЦТК состоит из 8 последо-
вательных стадий, каждую из которых реали-
зует свой фермент или ферментный комплекс.
На первой стадии в цикл вводится двух-
углеродный фрагмент. Механизмом альдоль-
ной конденсации цитратсинтетаза (1 на рис.
5-19) присоединяет к карбонильному углероду
ЩУК (оксалоацетата) метильную группу аце-
тильного фрагмента молекулы ацетил-КоА
(оба углеродных атома этого фрагмента отме-
чены звездочками здесь и в последующих ре-
акциях ЦТК). Попутно фермент гидролизует
макроэргическую связь (с освобождением
HS-KoA), благодаря чему реакция синтеза ли-
монной кислоты становится практически необ-
ратимой.
Вторая стадия ЦТК заключается в изо-
меризации лимонной кислоты до изол именной.
Эту реакцию катализирует аконитаза (2 на
рис. 5-19), которая легко отнимает от субстрата
молекулу воды (с образованием z/z/c-аконито-
вой кислоты), а затем вновь присоединяет ее,
но уже с переменой позиции гидроксильной
группы. Реакция обратима, и в состоянии рав-
новесия на долю изоцитрата приходится менее
10% смеси обеих кислот. Однако поскольку в
дальнейшем используется именно изоцитрат,
вторая стадия ЦТК протекает фактически
в одном направлении - в сторону образования
изолимонной кислоты.
Третью стадию ЦТК обеспечивает изо-
цитратдегидрогеназа, катализирующая пре-
вращение изоцитрата в а-кетоглутаровую ки-
слоту (а-КГ). Как показано на рис. 5-20, снача-
ла фермент отнимает от изоцитрата два атома
водорода и передает их на свой кофермент,
восстанавливая его до НАД-ГД. При этом гид-
роксильная группа изоцитрата превращается в
кетогруппу, знаменуя возникновение щавеле-
воянтарной кислоты. — промежуточного про-
дукта, который быстро преобразуется в а-КГ
путем отщепления СО2 за счет одной из трех
карбоксильных групп (выделенной курсивом
на рис. 5-20).
Следует заметить, что происходящее на
третьей стадии образование СО2 не является
окислительно-восстановительным процессом:
просто окисление (дегидрогенирование) изо-
цитрата делает молекулу очень нестабильной,
легко и необратимо теряющей карбоксильную
группу.
о / нон
.и/ /
C~ S—КоА
Ннг
Ацетил-КоА
О=С—СООН
I
СН2
СООН
ЩУК
(Оксалоацетат)
‘СООН
.1
СНг
но-с—СООН
I
СНг
СООН
Лимонная кислота
(цитрат)
Цис-Аконитат Изоцитрат
‘соон
*1
сн2
С—СООН+Н2О
сн
I
СООН
‘СООН
|нг
н-с-соон
но-с—н
соон
Рис. 5-19. Синтез лимонной кислоты и ее изомеризация: 1 - Цитретсинтетзза; 2 - Аконитаза.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
161
‘соон
,1
сн2
н-с-соон
I
но-с-н
I
соон
НАД НАД-Н2
Изоцитрат
‘СООН
J
сн2
нс—соон
I
с=о
I
соон
‘соон
J
I
соон
а-Кетоглутарат
(а-КГ)
Оксалосукцинат
Рис. 5-20. Превращения изолимонной кислоты под действием изоцитратдегидрогеназы (3).
Четвертую стадию — окислительное де-
карбоксилирование а-КГ - реализует мульти-
ферментный комплекс, являющийся одним из
вариантов начального звена удлиненной дыха-
тельной цепи. Детально механизм работы та-
ких комплексов рассмотрен в разделе 5.2.7, а
на рис. 5-16 было приведено суммарное урав-
нение а-КГ-дегидрогеназной реакции. Здесь же
оно дано немного подробнее, чтобы напомнить
главные моменты процесса, осуществляемого
а-кетоглутарат-дегидрогеназным комплексом
(4 на рис. 5-21).
Как и третья стадия, четвертая протекает с
выделением СО2, - и тоже независимо от окис-
лительных процессов: в данном случае оно да-
же предшествует дегидрогеназной реакции (но
«спровоцировано» созданием кето-группы на
предыдущей стадии). Кроме того, продуктами
этой стадии являются НАД-Н2 и сукцииил-КоА.
На пятой стадии молекула сукцинил-
КоА используется для субстратного фосфори-
лирования, реализуемого в данном случае сук-
цинаtn-тиокиназ ой (5 на рис. 5-21). Его меха-
низм рассмотрен ранее (см. рис. 5-17). Теперь
же показан только суммарный итог процесса, в
ходе которого макроэргическая связь сукци-
нил-КоА строго стехиометрически обеспечива-
ет реакцию синтеза ГТФ из ГДФ и фосфата
(что равнозначно образованию молекулы АТФ,
- см. уравнение [5-3]).
Шестая стадия ЦТК сводится к окисле-
нию янтарной кислоты до фумаровой, которое
катализирует флавиновый фермент - сукци-
натдегидрогеназа (6 на рис 5-22). Ее обозна-
чают еще как мембранный комплекс II систе-
мы МтО. Как отмечалось в разделе 5.2.3, он
является одним из вариантов начального звена
укороченной дыхательной цепи.
На седьмой стадии фумсратгидратаза
(7 на рис 5-23), часто именуемая для краткости
фумаразой, обеспечивает присоединение воды
по месту двойной связи в молекуле фумарата.
Тем самым происходит превращение его в
L-изомер яблочной кислоты (L-малат), являю-
щейся, как отмечалось в разделе 5.2.2, одним
из субстратов полной дыхательной цепи.
Последняя - восьмая - стадия заключа-
ется в окислении яблочной кислоты под дейст-
вием НАД-зависимая малатдегидрогеназы
(8 на рис. 5-23). Лишая свой субстрат пары во-
дородных атомов, этот фермент преобразует
его в ЩУК (оксалоацетат).
Возникновение ЩУК на восьмой стадии -
это не только завершение цикла, но и возмож-
ность его повторения, которое начинается
с «посадки» очередного ацетильного фрагмен-
‘СООН
J
сн2
сн2
с=о
I
соон
HS-КоА НАД НАД Н2
‘СООН
*СН2
СН2
с-°
%—КоА
Н3РО4 HS-KbA
ГДФ ГТФ
(АДФ) (АТФ)
а-КГ
Сукцинил-КоА
‘СООН
J
сн2
сн2
СООН
Янтарная
кислота
(сукцинат)
Рис. 5-21. Реакции, катализируемые a-W-дегидрогеназным комплексом (4) и сукцинат-тиокиназой (5).
162
Глава 5
‘СООН
J
н-с-н
I
н-с-н
I
СООН
‘соон
*с-н
---->фад-н2 + II
(Г Н-С
соон
Сукцинат
Фумарат
Рис. 5-22. Реакция, катализируемая сукцинатдегидрогеназой (6).
‘СООН
+ НОН
Н-С*------У
I
СООН
Фумарат
‘СООН
J
сн?
н-с-он
I
СООН
НАД НАД-Н2
L-Яблочная кислота
(L-Малат)
‘соон
J
сн2
с-о
I
соон
ЩУК
(Оксалоацетат)
Рис. 5-23. Обратимые реакции, катализируемые фумаратгидратазой (7) и малатдегидрогеназой (В).
та на высвободившуюся молекулу ЩУК. Ин-
тенсивность оборотов циклического процесса
такова, что реальная концентрация ЩУК
в клетке очень низка (менее 1 мкМ), несмотря
на огромное количество метаболитов, перера-
батываемых в ЦТК ежесуточно.
5.3.2. ИТОГОВОЕ УРАВНЕНИЕ ЦТК
Совокупность всех 8 стадий, рассмотрен-
ных в предыдущем разделе, представлена на
рис. 5-24 в виде обобщающей схемы, которая
помогает подвести общий баланс каждого обо-
рота цикла лимонной кислоты.
С самого начала в ЦТК внедряется аце-
тильный фрагмент молекулы ацетил-КоА (сам
КоА при этом освобождается). Кроме того, в
цикл вступают 3 молекулы воды: на стадиях 1
и 7 явно (видны на схеме), а на 5-й стадии - в
неявной форме (как вода, которая должна была
бы выделиться при соединении Н3РО4 с ГДФ,
но на самом деле ее атом водорода оказывается
в составе КоА, а гидроксил - в карбоксильной
группе сукцината).
С другой стороны, образуются в реакциях
цикла («выходят» из него) 2 молекулы СО2 и 4
пары атомов водорода, которые оказываются
на коферментах соответствующих дегидроге-
наз (стадии 3, 4, 6 и 8). Если все эти кофермен-
ты, независимо от их строения, обозначить
общим сокращением {Ко}, то предварительно
итоговое уравнение ЦТК можно записать так:
CH3-C(O)~S-KoA + 3 Н2О + 4 (Ко) —
-> HS-KoA + 2СО2 + 4{Ко} Н2 t5’4!
В такой форме итоговое уравнение ясно
показывает, что за один оборот цикла ацетиль-
ный остаток исчезает, но возникают две моле-
кулы СО2 (по числу углеродных атомов в ук-
сусной кислоте). Исчезают и 3 молекулы воды,
утилизируемой в реакциях ЦТК. Следователь-
но, именно из этой воды происходят три из че-
тырех атомов кислорода в образующейся угле-
кислоте.
Однако анализ уравнений на рис. 5-20 и
5-21 показывает, что это вовсе не прямое
включение компонентов Н2О в декарбоксили-
руемые группы. Просто ее присоединение с по-
следующим отнятием атомов водорода обога-
щает соответствующий метаболит кислородом
и делает возможным отщепление подходящей
карбоксильной группы в виде СО2. Кстати,
опыты с меченым углеродом выявили совер-
шенно неожиданный факт. Оказалось, что де-
карбоксилированию всегда подвергается не
ацетильная «надстройка», а тот фрагмент цит-
рата, который принадлежал только что вклю-
ченной в него молекуле ЩУК ! Поэтому угле-
родные атомы только что внедренного аце-
тильного остатка (на рисунках с 5-19 по 5-23
они помечены звездочкой) попадают в состав
образуемой СО2 лишь при последующих обо-
ротах цикла (когда этот остаток стал частью
регенерированной молекулы оксалоацетата).
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
163
Рис. 5-24. Общая схема реакций ЦТК.
а-Кетоглутарат
Сукцинил-КоА
Возвращаясь к общему балансу ЦТК, не-
обходимо отметить, что восстановленные фор-
мы дегидрогеназных коферментов могут за-
блокировать цикл, если не будут отдавать во-
дород на мембранные комплексы митохонд-
рий. Иначе говоря, существует абсолютная за-
висимость ЦТК от системы МтО. Результат их
«состыковки» выражает уравнение:
4 {Ко}Н2 + 2 О2 -> 4 {Ко} + 4 Н2О [5-5)
Сложение этого уравнения с предыдущим
([5-4]) позволяет исключить коферменты, а
также 3 молекулы воды в левой части равенст-
ва, оставив справа только одну из четырех.
Следовательно, окончательная форма итогово-
го уравнения собственно ЦТК выглядит так:
CH3-C(O)~S-KoA + 2 О2 -»
— 2 СО2 + Н2О + HS-KoA [5-6]
Таким образом, хотя в цикле «сгорает» не
сам вступивший ацетильный фрагмент, вне-
дрение его приводит к образованию метаболи-
тов, окислительная деградация которых экви-
валентна полному разложению ацетила (до
Н2О и 2СО2) в сочетании с образованием новой
молекулы ЩУК, - содержащей теперь ранее
принятый ацетильный фрагмент. Все эти уточ-
нения не отменяют правильности формулиро-
вок и уравнений, описывающих итоги ЦТК, но
показывают «изощренность» природы в пре-
одолении невозможности прямого «сжигания»
самой по себе уксусной кислоты в условиях
живой клетки.
5.3.3. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ИТОГ РЕАКЦИЙ ЦТК
Схема на рис. 5-24 показывает, что про-
межуточными метаболитами ЦТК являются
4 из 10 главных субстратов митохондриального
окисления (перечисленных в разделах 5.2.2,
5.2.3 и 5.2.7), а именно: изопитрат, а-КГ, сук-
цинат и малат. Окисление каждого из них
(стадии 3, 4, 6 и 8) является одновременно и
начальной реакцией соответствующей дыха-
164
Глава 5
_u 9(АДФ*ФМ) 9(АТФ+Н2О)
имэ 1
С^° + 2О2 ----------------> 2CCh + Н2О + HS-KoA
^'S-КоА
ГДФ+ФН ГТФ
(АДФ) (АТФ)
Рис. 5-25. Полное итоговое уравнение реакций ЦТК.
тельной цепи. Именно на этих стадиях проис-
ходит сопряжение ЦТК с системой МтО.
Два метаболита цикла (изоцитрат и малат)
относятся к субстратам полной дыхательной
цепи. Следовательно, их окисление дает в со-
вокупности 2 2,5 = 5 молекул АТФ.
Один из метаболитов - сукцинат — окисля-
ется комплексом II (открывающим укорочен-
ную дыхательную цепь), что ведет к образова-
нию еще 1,5 молекулы АТФ.
Наконец, а-кетоглутарат преобразуется на-
чальным звеном удлиненной дыхательной це-
пи, продуцирующим не только НАД-Н2 для
комплекса 1 (что ведет к синтезу 2,5 молекул
АТФ), но и сукцинил-КоА, который на 5-й ста-
дии используется для выработки еще одной
молекулы АТФ, но уже строго стехиометриче-
ской реакцией фосфорилирования на уровне
субстрата.
Таким образом, энергетический итог одно-
го оборота ЦТК составляет в общей сложности
5 + 1,5 + 2,5 + 1 = 10 молекул АТФ. Схема на
рис. 5-25 подчеркивает, что 9 из них возникает
в реакциях окислительного, а еще одна - по-
средством субстратного фосфорилирования.
И все это обеспечивается энергией разложения
до СО2 и Н2О молекулы уксусной кислоты (вхо-
дящей в состав ацетил-КоА).
5.3.4. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЦТК
Функциональная роль ЦТК заключается
прежде всего в выработке АТФ (точнее - в его
регенерации из АДФ и фосфата, которые обра-
зуются при непрерывном распаде АТФ. необ-
ходимом для энергообеспечения жизнедея-
тельности). Более того, именно реакции ЦТК,
сопряженные с митохондриальным окислени-
ем, составляют основной источник АТФ у жи-
вотных. Они производят не менее 70% всего
АТФ, образуемого в клетках, т.к. именно аце-
тил-КоА оказывается тем общим (универсаль-
ным) метаболитом, который возникает при
распаде и углеводов, и липидов, и белков
(аминокислот), как это показывает схема на
рис. 5-26. На путях этого «предварительного»
разложения органических веществ появляется
остальная часть АТФ — до 30% от общей выра-
ботки.
Таким образом, ЦТК являет собой некую
заключительную «топку», в которой ради по-
лучения АТФ «сжигаются» ацетильные фраг-
менты универсального полуфабриката (ацетил-
КоА), возникающего при распаде более круп-
ных органических молекул. Помимо АТФ этот
цикл генерирует также примерно 2/3 всего СО2,
образуемого в организме в качестве одного из
конечных продуктов метаболизма.
5.3.5. АВТОНОМНАЯ САМОРЕГУЛЯЦИЯ ЦТК
Механизм дыхательного контроля
(раздел 5.2.5) составляет наиболее общую ос-
нову для регулирования интенсивности реак-
NH3
Белки ____________> Аминокислоты _____S , Органические
КИСЛОТЫ
Рис. 5-26. Общая схема путей катаболизма питательных веществ в животном организме.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
165
ций ЦТК, ибо 4 из 8 его стадий «состыкованы»
с митохондриальным окислением. Однако этот
механизм контролирует в основном работу
собственно системы МтО (включая протонную
АТФ-синтетазу) и только опосредованно затра-
гивает функционирование ЦТК, который «все-
го лишь» поставляет восстановительные экви-
валенты (атомы водорода) для дыхательных
цепей. Поэтому ЦТК наделен и своими собст-
венными возможностями саморегуляции.
Ключевым звеном ЦТК является изоцит-
ратдегидрогеназа. Этот НАД-зависимый фер-
мент 3-й стадии цикла сосредоточен только в
митохондриях и сочетает в себе как лимити-
рующую роль, так и регуляторные функции.
Он угнетается (конкурентно) избытком своего
собственного продукта - НАД Н2 (который
вырабатывают к тому же еще и две другие де-
гидрогеназы цикла), а также повышенными
концентрациями АТФ. Напротив, АДФ (суб-
страт протонной АТФ-синтетазы) обладает
мощным активирующим действием на изоцит-
ратдегидрогеназу, значительно повышая ее
сродство к субстратам (изоцитрату и НАД).
Этот аллостерический эффект настолько зна-
чителен, что в отсутствие АДФ фермент почти
полностью теряет свою активность.
Регуляторными свойствами обладает так-
же цитратсинтетаза, начальный фермент ЦТК.
Она чувствительна к аллостерическому воз-
действию АТФ. накопление которого увеличи-
вает значение Км в отношении ацетил-КоА
(т.е., снижает сродство фермента к своему суб-
страту). Поэтому синтез цитрата замедляется с
повышением уровня АТФ, точнее - с нараста-
нием величины энергетического заряда клетки
(см. уравнение [5-2]). Аналогичный угнетаю-
щий эффект вызывает и прирост содержания
сукцинил-КоА (продукт 4-й стадии ЦГК) или
каких-либо жирных кислот в их активированной
форме (ацил-КоА), в которой они используются
для образования больших количеств ацетил-
КоА в митохондриях (детали процесса будут
рассмотрены в главе 7). Таким образом, само-
регуляция цитратсинтетазной стадии направле-
на в одну сторону: она уменьшает поступление в
ЦТК его исходного субстрата - молекул ацетил-
КоА (в том числе тех, что образуются из жир-
ных кислот). Реализуется этот эффект в услови-
ях насыщенности клеток макроэргами.
Наконец, еще одним регуляторным звеном
ЦТК является а-КГ-дегидрогеназный комплекс
(4-я стадия). Его активность тоже снижается с
повышением ЭЗК и при избытке собственных
продуктов - НАД-Н2 или сукцинил-КоА. Важ-
ность этих эффектов обусловлена тем, что
а-КГ образуется не только в реакциях ЦТК.
В частности, он возникает и ходе катаболизма
большинства аминокислот (об этом - в разделе
9.2).
Таким образом, автономная саморегуляция
ЦТК нацелена на полную (и быструю!) компен-
сацию расходов АТФ в клетке, зачастую сильно
варьирующих во времени. Ведущую роль в ус-
пешном поддержании физиологических значе-
ний ЭЗК играет ключевой фермент ЦТК - изо-
цитратдегидрогеназа, высоко чувствительная к
стимулирующему действию АДФ и угнетаемая
избытком НАД7/2 и повышением уровня ЭЗК.
Дополнительные пункты контроля регулируют
поступление в цикл его начального субстрата -
ацетил-КоА - из разных источников (цитратсин-
тетаза), а также «внешних» метаболитов
(а-кетоглутаратдегидрогеназа).
5.3.6. ВОСПОЛНЕНИЕ ФОНДА ЩУК
Как уже отмечалось, для бесперебойной
работы ЦТК на каждую молекулу вступившего
в него ацетил-КоА необходимо регенерировать
(на 8-й стадии) молекулу ЩУК: она принимает
очередную ацетильную группу и тем самым
дает начало новому обороту цикла. Однако
полнота такой регенерации в реальности не-
возможна. Ибо часть метаболитов цикла клетке
приходится использовать для иных целей, -
вне ЦТК. Например, 0,03-0,04% сукцинил-КоА,
образующегося на 4-й стадии, расходуется для
биосинтеза гема (см. рис. 5-18) и тем самым
«отчуждается» от регенерации ЩУК. Есть и
другие пути «утечки» отдельных метаболитов
цикла. И хотя они тоже очень невелики, долж-
ны существовать способы восполнения этих
потерь (во избежание постепенного исчерпа-
ния ЩУК). Такие реакции существуют. Их на-
зывают анапчеротическими («восполняющи-
ми»). Одна из них протекает в митохондриях,
другая - в цитоплазме.
Митохондриальная выработка ЩУК
типична для клеток печени и почек. Ее реа-
166
Глава 5
I
о нс-
II I
НО- С-(СН>)4—сн
NH
I
— сн
I
сн2
S7
Б. Карбоксибиотин
(в составе фермента)
А. Биотин
Рис. 5-27. Строение биотина (А) и его карбоксилированной формы (Б).
лизует пируваткарбоксилаза, Каждая субъеди-
ница этого гомотетрамера содержит прочно
связанный Мп"*, а также биотин (рис. 5-27, А),
ковалентно соединенный (пептидной связью) с
определенным лизильным радикалом апофер-
мента. Именно биотин (прежнее название -
витамин Н) входит в состав каталитического
центра ряда ферментов, обеспечивающих вне-
дрение СОг в органические молекулы или пе-
ренос карбоксильной группы с одного вещест-
ва на другое.
Пируваткарбоксилазная реакция начинает-
ся с превращения биотина (в составе фермента)
в его карбоксилированную форму (рис. 5-27, Б).
Процесс включения СО2 в простетическую
группу происходит за счет использования мо-
лекулы угольной кислоты. Он требует затраты
энергии, а потому протекает сопряженно с ре-
акцией расщепления АТФ до АДФ и Фн (рис.
5-28, I). При этом углерод возникшей карбо-
ксильной группы присоединяется к азоту био-
тина макроэргической связью (отмеченной еще
на рис. 5-27, Б). Поэтому не нуждается в до-
полнительной энергии вторая стадия фермен-
тативного процесса, - передача группы -СООН
на пируват, превращающая его в ЩУК (рис.
5-28, И).
Обычная активность пируваткарбоксилазы
очень невелика. Однако, накопление ацетил-
КоА сильно повышает ее. Биологический
смысл этого аллостерического эффекта очеви-
ден. Утилизация избыточного ацетил-КоА тре-
бует ускорения реакций ЦТК, а для этого не-
обходимо повышенное количество ЩУК. При-
рост ацетил-КоА в митохондриях, активируя
пируваткарбоксилазу, содействует переводу
части ПВК в щавелевоуксусную кислоту, с
участием которой быстро ликвидируется избы-
точность ацетил-КоА. А это, в свою очередь,
ведет и к прекращению активации пируваткар-
боксилазы, т.е., к падению наработки ЩУК.
В результате интенсивность ЦТК постепенно
снижается, возвращаясь к исходному («базаль-
ному») уровню. Этот механизм автономной
саморегуляции постоянно поддерживает тре-
буемую концентрацию ЩУК, эффективно
обеспечивая контролируемое восполнение
убыли («утечки») любого из промежуточных
метаболитов ЦТК.
Цитоплазматический путь регене-
рации ЩУК доминирует в мышечной ткани
(включая миокард). При этом используется не
пируват, а предшествующий ему метаболит -
фосфоенолпируват (ФЕП), образующийся в
о
II
I. Фермент-биотип + НО—С—ОН
II. Фермент-биотин—СООН +
О—С—ОН
I
СН3
АТФ АДФ+Фн
Фермент-биотин ~ СООН
О=С—ОН
I
—> сн2
соон
ЩУК
Фермент-биотин
ПВК
Рис. 5-28. Схема пируеаткарбоксилазной реакции
(жирным шрифтом выделены атомы COO, происходящие из угольной кислоты)
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
167
СООН
сн2 1
II с—0~РОзН2 + СО2 ГДФ ГТФ ?Нг > со
соон соон
ФЕП ЩУК
Рис. 5-29. Карбоксилирование фосфоенолпируеата (ФЕП) под действием фосфоенолпируеат-карбоксикиназы
цитоплазме при распаде углеводов (как это по-
казано на рис. 6-25, IX). Обычная его судьба —
превращение в пируват, который с участием
специального трансмембранного переносчика
(пируват-транслоказы) поступает в митохонд-
рии, где и превращается в ацетил-КоА (см. рис.
5-15). Однако часть ФЕП может подвергаться в
цитоплазме карбоксилированию. Эту обрати-
мую реакцию превращения ФЕП в ЩУК (рис.
5-29) катализирует фосфоенолпируват-карб-
оксикиназа.
Образуемые в цитоплазме молекулы ЩУК
сами по себе не в состоянии проникать в мито-
хондрии, - из-за отсутствия соответствующей
транслоказы. Однако под действием цитоплаз-
матического изофермента малатдегидрогеназы
они легко превращаются в малат. Эта обрати-
мая реакция идентична 8-й стадии ЦТК (см.
рис. 5-23) и использует имеющийся в цито-
плазме НДД-Я2- Появляющиеся молекулы яб-
лочной кислоты без затруднений попадают в
матрикс митохондрий с участием дикарбокси-
лат-транслоказы, которая специализирована
на трансмембранном переносе ионов дикарбо-
новых кислот, - таких как малат и сукцииат.
После этого малатдегидрогеназа (но уже мито-
хондриальная) может обратно превращать ма-
лат в ЩУК и НАД-Я2 (рис. 5-30).
Таким образом, источником компенсации
убыли ЩУК в митохондриях могут стать те
молекулы этого метаболита, которые образу-
ются в цитоплазме, но проникают в матрикс в
форме малата.
Рис. 5-30. Восполнение митохондриального фонда ЩУК за счет цитоплазматического
(цифрой 1 обозначен трансмембранный переносчик дикарбоновых кислот).
168
Глава 5
К середине XX в. был сформулирован те-
зис: «Жиры сгорают в пламени углеводов». Он
отражал наблюдения о нарушениях обмена ве-
ществ при резком преобладании жиров в пита-
нии и о благоприятном эффекте увеличения
доли продуктов, богатых углеводами. С разви-
тием науки стали понятными молекулярные
основы негативных последствий однобокости
пищевого рациона. Теперь известно, что фонд
ЩУК необходимо пополнять и что в мышцах
это требует использования предшественника
пирувата - ФЕП. Он образуется при распаде
глюкозы - практически единственного источ-
ника этого метаболита. Схема на рис. 5-26 по-
казывает, что жирные кислоты превращаются в
молекулы ацетил-КоА без промежуточного об-
разования пирувата (и ФЕП). Поэтому пре-
имущественно жировое питание чревато не-
достаточным восполнением ЩУК и, следова-
тельно, ограничением возможностей ЦТК. А
без него невозможно полноценное расщеп-
ление жиров (т.е.. происходящего из них аце-
тил-КоА), — с вытекаюшнми из этого неблаго-
приятными последствиями. Нечто подобное на-
ступает и при алкоголизме, когда спирт стано-
вится чуть ли не главным энергетическим ресур-
сом: этанол превращается в уксусный альдегид и
далее в ацетил-КоА, а потому не может быть ис-
точником восполнения убыли ЩУК. Это вносит
свой вклад в развивающуюся патологию, хотя и
отнюдь не исчерпывает вредных последствий
злоупотребления алкоголем.
5.3.7. ЧЕЛНОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ
Как видно из схемы, приведенной на рис.
5-30, в составе малата в митохондрии переда-
ется не только ЩУК, но и атомы водорода от
цитоплазматического НАД-/А- Такое вовлече-
ние внемитохондриального источника в работу
системы МтО очень невелико: оно ограничено
тем количеством ЩУК, которое необходимо
для восполнения убыли этого метаболита. Од-
нако поток внешних атомов водорода в мат-
рикс может усилиться, если молекулы ЩУК
станут выполнять роль «челнока», снующего
сквозь внутреннюю мембрану митохондрий и
за каждый оборот переносящего на себе по два
атома водорода. Для этого необходимо, чтобы
«челнок» (в данном случае — молекула ЩУК)
мог возвращаться в цитоплазму за новой пор-
цией водорода от НАД(Ф)-//2- Иными словами,
схема на рис. 5-30 должна быть дополнена ме-
соон
I
сн2
сн2
hc-nh2
I
соон
Глутамат
соон
соон сн2 соон
сн2 , х сн2 ♦ сн2
1 v с=о 7 1 с=о hc-nh2
соон соон соон
ЩУК О--КГ Аспартат
Рис. 5-31. Реакция, катализируемая глутаминово-
щавелевоуксусной трансаминазой.
ханизмом, обеспечивающим возврат ЩУК из
митохондрий в цитоплазму.
Такой механизм существует. Он реализу-
ется благодаря, во-первых, реакции переами-
нирования (рис. 5-31) и, во-вторых, наличию
белков, осуществляющих трансмембранный
перенос трех из ее участников — глутамата и
аспартата (перемещаются глутомат-трансло-
казой), а также а-кетоглутарата (дикарбокси-
лат-транслоказой).
Реакция переаминирования легко обрати-
ма. Ее катализирует глутаминово-щавелево-
уксусная трансаминаза (ГЩТ), которую назы-
вают также аспартат-аминотрансферазой
(ACT). Возникающие в матриксе молекулы
ЩУК фермент превращает в аспартат за счет
аминогруппы глутамата, который при этом
трансформируется в а-кетоглутарат (см. рис.
5-31). Появившиеся молекулы аспартата и а-КГ
легко выходят из митохондрий с помощью
упомянутых транслоказ. Попав в цитоплазму,
они могут снова вступать в реакцию переами-
нирования, но уже с участием цитоплазматиче-
ского изофермента ГЩТ. В итоге здесь возни-
кают молекула ЩУК (исчезнувшая в митохон-
дриях) и молекула глутамата, которую глута-
мат-транслоказа возвращает в митохондрии в
обмен на аспартат.
Изложенные механизмы «окольного» воз-
вращения ЩУК в цитоплазму, в сочетании с
процессами, отраженными на рис. 5-30, фор-
мируют малат-аспартатную систему челноч-
ного транспорта НАД-Д», как она представле-
на на рис. 5-32. Тот ее фрагмент, который изо-
бражен на рис. 5-30, пригоден для восполнения
ЩУК (т.е., для компенсации «утечек» метабо-
литов ЦТК). Кроме того, он необходим для
поддержания необходимого уровня «челноч-
ных» молекул ЩУК, - тех, что обслуживают
работу малат-аспартатной системы транспорта.
В полном же «комплекте» вся эта система ре-
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
169
Рис. 5-32. Малат-аспартатная система челночного транспорта водорода НАД-/-/2
Белки-пераносчики: 1 - дикарбоксилат-транслоказа; 2 - глутамат-транслоказа (переносчик аминокислот).
Ферменты: малат-дегидрогеназа - цитоплазматическая (А) и митохондриальная (Б) аспартат-аминотрансфераза —
цитоплазматическая (В) и митохондриальная (Г).
шает задачу переброски в митохондрии тех мо-
лекул НАД-2?2, которые производятся внемито-
хондриальными дегидрогеназами. Точнее, пе-
редаются только восстановительные эквива-
ленты (атомы водорода), ибо сами никотин-
амидные коферменты не могут проходить
сквозь мембрану: они формируют четко разде-
ленные фонды (пулы) — внутримитохондри-
альный и цитоплазматический.
Таким образом, малат-аспартатная система
челночного транспорта НАД-Т^ служит тому,
чтобы система МтО могла использовать не
только «местные» молекулы НАД-//2, но и те,
которые образуются в цитоплазме. Направлен-
ность их потока (из цитоплазмы в митохонд-
рии) обеспечивается отмеченной выше необра-
тимостью заключительной стадии дыхательной
цепи. Все же остальные звенья челночного
процесса вполне обратимы, а потому могут
быть использованы еще и для поддержания
равновесных концентраций участвующих в нем
метаболитов в случае убыли любого из них
(или его притока извне).
Малат-аспартатная система характерна для
клеток миокарда, печени и почек. В скелетных
мышцах и мозге функционирует альтернативная
система, которую обозначают как глицеро-
фосфатный механизм челночного транспор-
та. В нем используется дигидроксиацетон-
фосфат (ДГАФ), который, как и изомерный ему
фосфоглицеральдегид (ФГА), возникает при
распаде глюкозы (как будет показано на рис.
6-22).
Как показано на рис. 5-33, цитоплазмати-
ческая фосфоглицеролдегидрогеназа способна
восстанавливать ДГАФ до глицерол-3-фосфата
(за счет НАД-//2). Оба метаболита легко прони-
кают через наружную мембрану митохондрий,
не нуждаясь в каких-либо посредниках. Здесь
глицерол-3-фосфат может подвергаться обрат-
ному превращению, но уже под действием ми-
тохондриальной фосфоглицеролдегидрогеназы,
которая, в отличие от цитоплазматического ана-
лога, относится к числу флавиновых ферментов.
В разделе 5.2.3 уже отмечалось, что эта дегидро-
геназа встроена во внутреннюю мембрану с ее
внешней стороны и является одним из вариан-
тов начального звена укороченной дыхательной
СНгОН
С-О
I
Н2С-О-РО3Н2
СН2ОН
н-с-он
Н2С-О-Р03Н2
ДГАФ
Глицерол-З-фосфат
Рис. 5-33. Обратимое восстановление дигидроксиацетон-
фосфата (ДГАФ) НАД-зависимой фосфоглицеролдегидро-
геназой цитоплазмы.
170
Глава 5
Межмембранное
пространство
Внутренняя
мембрана.
Матрикс
Рис. 5-34. Глицерофосфатный механизм челночного
транспорта с участием цитоплазматической (1)
и митохондриальной (2) фосфоглицеролдегидрогеназ
цепи. Окисляя фосфоглицерол до ДГАФ, она
инициирует мембранный транспорт электронов
(и протонов) с коэффициентом P/О, равным 1,5.
Образуемый при этом ДГАФ возвращается в
цитоплазму в готовности захватывать новые
порции водорода от возникающего здесь
НАД-Я2 (рис. 5-34). Общую направленность
процесса - передачу водорода от НАД-//2 цито-
плазмы на дыхательную цепь - диктует отме-
чавшаяся выше необратимость конечного звена
системы МтО.
Таким образом, в отличие от малат-
аспартатной системы, глицерофосфатный ме-
ханизм переброски в митохондрии водорода от
цитоплазматического НАД7/2 дает возмож-
ность получить не 2.5 молекулы АТФ, а толь-
ко 1,5 (на каждую пару атомов водорода). Но
есть в этом и очень важное преимущество. Оно
заключается в возможности транспорта атомов
водорода против градиента НАД7У2, на что не
способна малат-аспартатная система. Своеоб-
разной «платой» за это преимущество и явля-
ется «недополучаемая» молекула АТФ.
5.4. ВНЕМИТОХОНДРИАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ
Многие реакции, требующие использова-
ния кислорода, протекают без участия дыха-
тельной цепи. Соответствующие ферменты ло-
кализованы чаше всего в мембране ЭР (фрак-
ция микросом). Отсюда и возник термин «мик-
росомальное окисление». Оказалось, однако,
что аналогичные процессы встречаются и в
других субклеточных структурах. Поэтому
предпочтительнее выглядит более общее обо-
значение - «внемитохондриальное окисление».
Но и оно небезупречно. Ибо даже в митохонд-
риях есть ферменты, использующие кислород
вне зависимости от дыхательной цепи. В част-
ности, моноаминоксидаза - маркерный фер-
мент наружной мембраны. Во внутренней мем-
бране также встречаются ферменты иного спо-
соба биоокисления. Наиболее известен пример
с цитохром(Р^оу-монооксигеназоми. В пече-
ночных клетках они действительно сосредото-
чены в мембранах ЭР. Однако в других тканях,
особенно в коре надпочечников, некоторые из
таких ферментов локализованы во внутренней
мембране митохондрий.
Недавно предложен еще один синоним
«свободное окисление» (подразумевающий от-
сутствие сопряженности с реакциями фосфо-
рилирования, т.е., с накоплением энергии в ви-
де АТФ). Этот термин, однако, совсем неодно-
значен; в частности, он не позволяет отличить
это «свободное окисление» от работы дыха-
тельной цепи в режиме разобщения.
Учитывая изложенное, термин «внемито-
хондриалъное окисление» можно принять (за
неимением лучшего) для наиболее приемлемо-
го обозначения тех кислород-зависимых про-
цессов, которые протекают без участия дыха-
тельных цепей митохондрий.
По способу использования кислорода фер-
менты внемитохондриального окисления раз-
личаются очень сильно. Одни из них - оксида-
зы и десатуразы - отнимают водород от суб-
страта и передают его прямо на кислород. Дру-
гие внедряют кислород в молекулу органиче-
ского вещества, - процесс, совершенно несвой-
ственный системе МтО (но близкий изначаль-
ным представлениям сторонников теории акти-
вации кислорода). Такие ферменты называют
оксигеназами. Их подразделяют на моноокси-
геназы и диоксигеназы. Среди последних выде-
ляются своеобразием действия и биологиче-
ской значимостью липоксигеназы и циклоокси-
геназы. Именно в такой очередности удобно
рассмотреть все основные группы ферментов
внемитохондриального окисления.
5.4.1. ОКСИДАЗЫ
Оксидазы - сравнительно немногочис-
ленная группа ферментов. По строению они
являются металлопротеинами, т.к. содержат
прочно связанные ионы меди, молибдена или
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
171
железа (иногда - в составе гема), которые при-
нимают непосредственное участие в катализе.
Нередко в качестве простетической группы
включены также ФАД илн ФМН.
Своеобразие оксидаз состоит в том, что
осуществляемый имн перенос водорода от суб-
страта на кислород приводит к образованию не
воды (как в дыхательной цепи), а перекиси во-
дорода:
АН2 + О2 -----> А + Н2О2
Иными словами, эти ферменты осуществ-
ляют лишь двухэлектронное (т.е., неполное)
восстановление молекулы кислорода, превра-
щая ее в пероксидный ион О2 , который обла-
дает свойствами сильного окислителя.
У приматов наиболее значимыми оксида-
зами являются те, что воздействуют на вещест-
ва, содержащие аминогруппу (аминокислоты,
амины, пуриновые основания). Количество ка-
ждого нз них, окисляемое у взрослого человека
за сутки, не достигает и 1 г. Так что совокуп-
ное потребление кислорода в оксидазных ре-
акциях очень невелико.
Примером могут служить преобразования,
катализируемые моноаминоксидазой (МАО).
Встроенная в наружную мембрану митохонд-
рий, она содержит ковалентно связанный ФАД
н обладает довольно широкой субстратной
специфичностью. Как показано на рис. 5-35,
фермент производит отщепление двух атомов
водорода, которые передает прямо на молекулу
О2 с образованием водородпероксида. Один из
Рис. 5-35. Моноаминоксидазная реакция (I)
и спонтанный гидролиз возникающего имина (II)
[для простоты указан аммиак, хотя в водной среде он су-
ществует как ион аммония].
них изымается у азота аминогруппы, другой -
у соседнего с нею углерода. Это ведет к воз-
никновению двойной связи, т.е., к превраще-
нию аминогруппы -NH2 в иминогруппу =NH.
Такая связь очень неустойчива и спонтанно
(без участия фермента) реагирует с водой. Оба
ее водородных атома «уходят» в составе отще-
пляемой молекулы аммиака, а атом кислорода
замещает собой иминогруппу. В результате
ферментативной стадии и последующего само-
произвольного включения воды исходный амин
превращается в соответствующий ему альдегид,
а бывшая аминогруппа освобождается в виде
аммиака. Именно такую процедуру природа
сделала главным способом удаления аминог-
рупп из разных молекул. Его обозначают как
окислительное дезаминирование. Ферменты
группы МАО очень активны и обладают высо-
ким сродством к своим субстратам (Км 0,1 мМ и
ниже). В их числе не только собственные мета-
болиты организма, но и содержащие аминоазот
ксенобиотики и лекарственные препараты.
Высокой субстратной специфичностью
отличиется протеин-Ъ-лизил-^-оксидаза. Она
содержит атом Си2+, фиксированный гистиди-
новыми радикалами. Необычным является то,
что этот фермент отщепляет концевую амино-
группу лизина (e-NH2) в составе белков, но не
влияет на свободную аминокислоту. И еще од-
на особенность: фермент действует в меж-
клеточном пространстве. В молекулах колла-
гена и эластина он преобразует часть радика-
лов лизина в его альдегидный аналог, обозна-
чаемый как аллизин (рис. 5-36). Фермент спосо-
бен окислять и радикалы 5-гидроксилизина,
также переводя нх в альдегидную форму
(5-гидроксиачлизин). Обе реакции совершенно
необходимы для формирования полноценной
структуры волокон соединительной ткани (см.
раздел 10.2.2).
В растительном мире и у микробов окси-
дазы представлены гораздо шире, чем у жи-
вотных. Можно упомянуть глюкозооксидазу
(окисляет D-глюкозу до глюко новой кислоты),
лактатоксидазу (превращает лактат в ацетат с
выделением углекислоты), пируватоксидазу,
оксалатоксидазу (расщепляет щавелевую ки-
слоту до двух молекул углекислоты за счет
превращения кислорода в Н2О2).
172
Глава 5
НС=О
I
сн2
сн2
сна
сн
H2c-NH2
СН2
СН2
сн2
сн
Лизин
(в составе белка)
О2 Н2О2
Н2О NH3
Аллизин
(в составе белка)
Рис.5-36. Окислительное дезаминирование лизильных
рад и кал о в npomeuH-L-пизил-б-оксидазой.
5.4.2. ДЕСАТУРАЗЫ
Название свое ферменты этой группы по-
лучили по способности превращать насыщен-
ные жирные кислоты в ненасыщенные (и далее
- в полиненасыщенные). Образование двойной
связи они обеспечивают путем отнятия двух
атомов водорода у соседних углеродных ато-
мов. При этом отнимаемый водород передается
прямо на кислород. Но, в отлнчие от оксидаз-
ных реакций, здесь происходит не двухэлек-
тронное восстановление молекулы кислорода,
а четырехэлектронное. Поэтому образуется не
перекись водорода, а две молекулы воды. Не-
достающую пару электронов (и протонов) де-
сатуразы получают от НАД(Ф)-/4- Схематиче-
ски реакция представлена на рис. 5-37 (с уче-
том того, что формируемая двойная связь име-
ет, как правило, гд/с-конфигурацию).
Полнота восстановления О2 обеспечива-
ется тем, что десатураза (несущая 1 атом неге-
мового железа) - это не одиночный белок, а
составная часть комплексов, встроенных в
мембрану ЭР. В такой комплекс входят также
цитохром £>5 и цитохром(Ь$)-редуктаза, кото-
рая содержит ФАД и использует НАД(Ф)-Л2
для восстановления железа цитохрома Ь5
Важная роль десатураз обусловлена тем,
что биосинтез любой жирной кислоты проте-
кает путем поэтапной конденсации двухугле-
родных фрагментов (происходящих из ацетил-
КоА), приводя к образованию полностью на-
сыщенной углеводородной цепи (с группой
-СООН на одном из концов). И только затем
возможно внедрение двойных связей, что и
осуществляют десатуразы. Жирные кислоты
вступают в реакцию только в активированном
состоянии, т.е., в форме соединения с
коферментом А (ацил-КоА).
В отличие от растений клетки животного
организма имеют очень ограниченную способ-
ность формировать двойную связь в молекулах
жирных кислот. В отношении насыщенных
известен только один фермент - стеароил-
КоА-десатураза, открытая в печени как инте-
гральный белок мембраны ЭР. Она относится к
Д9-десатуразам, ибо внедряет двойную связь в
положении 9 (т.е., между 9-м и 10-м атомами
углерода, считая от карбоксильной группы).
При этом стеариновая кислота С(18):0 превра-
щается в олеиновую С(18): 1 (рис. 5-38). Анало-
Н 1 _1 н 1
* О2 * НДД(Ф)-Н2 I /с~с\ I + 2Н2О + НАД(Ф)
с с I
I I н
Н Н
Рис. 5-37. Внедрение двойной связи в углеводородную цепь жирной кислоты.
Олеоил-КоА
Рис. 5-36. Образование олеиновой кислоты под действием стеароил-КоА-десатуразы.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
173
гичным образом стеароил-КоА-десатураза дей-
ствует и на ряд других насыщенных жирных
кислот, преобразуя их в моноеновые. В частно-
сти, она превращает пальмитиновую кислоту
С(16):0 в пальмитолеиновую С(16): 1 (см. табл.
3.1).
Полиеновые кислоты должны поступать в
организм животных извне. Точнее, из всех
жирных кислот незаменимыми компонентами
пищн являются линолевая и а-линоленовая
(содержащие по 18 углеродных атомов). Как
отмечено в табл. 3.1, первая содержит две
двойных связи (в позициях 9 и 12), а вторая -
три (в положениях 9, 12 и 15). Обе они служат
материалом для создания еще более ненасы-
щенных жирных кислот, которые необходимы
для построения липидов биологических мем-
бран и, кроме того, для образования сигналь-
ных молекул из группы эйкозаноидов.
Как показывает схема на рис. 5-39, снача-
ла линолевая и а-линоленовая кислоты под-
вергаются десатурации в положении 6, что
превращает их соответственно в триеновую
у-линоленовую кислоту и в ее тетраеновый
аналог. В обоих случаях процесс катализирует
линопеоил-КоА-десатпураза. По строению, ло-
кализации и механизму действия она очень
близка стеароил-КоА-десатуразе, но специа-
лизирована на внедрении двойной связи в по-
зиции 6 (т.е., является А6-десатуразой). Обра-
зовавшиеся продукты могут подвергаться уд-
линению специальной системой ЭР, обозна-
чаемой как элонгаза. Как и при биосинтезе на-
сыщенных жирных кислот, это происходит
путем наращивания карбоксильного конца
молекулы двухуглеродным фрагментом, про-
исходящим из ацетил-КоА. Такое удлинение
отодвигает от группы -СООН (на два номера)
у- Линоленоил-КоА
6.9.12.15-Октадекатетраеноил-КоА
Рис. 5-39. Роль десатураз в биогенезе полиеновых производных эйкозановой кислоты.
174
Глава 5
положение тех двойных связей, которые уже
имелись в молекуле. В итоге С 18-кислоты
преобразуются в 20-углеродные (эйкозано-
вые), а двойные связи смещаются из положе-
ний 6, 9, 12... в позиции 8, 11, 14..., соответст-
венно. Последующая десатурация по 5-му уг-
леродному атому приводит к превращению
исходной линолевой кислоты в 5,8,11,14-эйко-
затетраеновую (арахидоновую кислоту), а
а-линоленовой - в 5,8,11,14,17-эйкозапента-
еновую. Пути превращения последних в био-
логически активные молекулы будут рассмот-
рены в разделах 5.4.5 н 5.4.6.
5.4.3. МОНООКСИГЕНАЗЫ
Ферменты этого типа катализируют вклю-
чение одного атома кислорода в молекулу
окисляемого вещества, а для второго атома мо-
лекулы О2 необходим еще какой-нибудь вос-
становитель. Нередко в таком качестве высту-
пает НАДФ-Я2, водород которого используется
при этом для образования воды:
I
-С-Н + 0=0
I
I
-С-ОН + НгО
I
Как видно из этой схемы, посредством мо-
нооксигеназной реакции в окисляемый суб-
страт внедряется кислород с образованием
гидроксильной группы. Поэтому такие фер-
менты часто называют гидроксилазами. Они
типичны для мембраны ЭР. Следует, однако,
отметить, что редкие из них проводят реакцию
по типу простого одноступенчатого процесса,
как он изображен на приведенной схеме.
Обычно реакция гидроксилирования нуждает-
ся в привлечении и других факторов, включая
дополнительные ферменты. Чтобы подчерк-
нуть это, нередко употребляют термин «моно-
оксигеназная система».
Все монооксигеназы являются сложными
белками. В зависимости от строения небелко-
вых компонентов, различают:
— цитохром(Р45о)-монооксигеназы;
- биоптериновые ферменты;
— медь-содержащие гидроксилазы, зави-
симые от аскорбиновой кислоты;
— монооксигеназы, сопряженные с окис-
лением а-кетокислот (тоже аксорбат—
зависимые).
Цитохром^^-монооксигеназы - это са-
мая многочисленная группа гидроксилаз. Их
небелковый фрагмент всегда представлен
гемом. Но железо здесь необычно тем, что од-
ной из координационных связей соединено с
радикалом цистеина в молекуле апофермента
(гем-тиолатная связь). Индекс «Р45оу> отража-
ет специфику некоторых свойств, обусловлен-
ную таким способом фиксации гема.
Цитохром Р45о функционирует в составе
прочного комплекса белков, встроенных в мем-
брану ЭР. В нем есть также флавиновая цито-
хром(Р45о)-редуктазаь а нередко - еще и
цитохром Ь5 и/или железо-серный белок
(2Ре-28-протеин). При этом сам цитохром Р450
гидроксилирует субстрат и, кроме того, вос-
станавливает второй атом кислорода, отдавая
ему два электрона. Окисленное железо (Fe3+)
цитохрома Р450 восстанавливается затем цито-
хром(Р45о)-редуктазой. Она переносит атомы
водорода от восстановленного НАДФ (редко -
НАД) на собственную флавиновую группу
(обычно ФАД). а затем отдает электроны на Р450,
- непосредственно либо с участием добавочных
переносчиков, упомянутых выше. Таким обра-
зом, цитохром(Р450)-монооксигеназный ком-
плекс является микросомальной системой
транспорта электронов от НАДФ-Я2 (иногда -
от НАД Яг) на О2 с образованием молекулы
воды и появлением гидроксильной группы в
составе окисленного субстрата. Из-за вовлече-
ния FeS-белков и/или цитохрома число про-
межуточных электронтранспортирующих звень-
ев в этих гидроксилазах бывает разным. Но ми-
нимальный их набор составляют цитохром Р450 и
его редуктаза (рис. 5-40).
Субстратами цитохром(Р450)-моноокси-
геназ являются, как правило, гидрофобные мо-
лекулы. Гепатоциты особенно богаты этими
ферментами, зачастую обладающими широкой
субстратной специфичностью, спектр которой
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
175
Рис. 5-40. Схема окисления субстрата (R-H)
цитохром(Р45о)-монооксигеназной системой;
1 - цитохром(Р4ы)~монсюксигеназа;
2- цитохром{Р45о)~редуктаза.
к тому же сильно перекрывается. Поэтому де-
сятки таких гидроксилаз объединены единым
термином неспецифическая монооксигеназа. Ее
устаревшее название - оксидаза смешанной
функции (ОСФ) - не вполне точное, но до сих
пор встречающееся в литературе, особенно ме-
дицинской.
Наиболее универсальным последствием
гидроксилирования гидрофобных молекул яв-
ляется внедрение в них полярной группировки.
Более того, открывается возможность образо-
вания, в частности, эфиров с серной или глю-
куроновой кислотой. Такие конъюгаты приоб-
ретают еще большее сродство к воде, что об-
легчает их удаление из организма (в том числе
почками). Особенно важно это для инактива-
ции и выведения гидрофобных ксенобиотиков
и синтетических лекарств. Однако в ряде слу-
чаев гидроксилирование приводит не к инакти-
вации, а, наоборот, к превращению не очень
опасного вещества в токсичный продукт (иногда
- в канцерогенный). Такое отмечено при моно-
оксигеназном окислении афлатоксинов, поли-
циклических углеводородов типа фенантрена,
бензпирена и других. В этих случаях выполне-
ние биологического предназначения - повысить
растворимость подлежащих выведению веществ
- дает опасный «побочный» эффект.
Для изоферментов неспецифической мо-
нооксигеназы характерно явление индукции
собственными субстратами (хотя и не каждым
из них). Давно установлено, что систематиче-
ский прием, например, фенобарбитала уже
вскоре приводит к многократному усилению
биосинтеза и, как следствие, к увеличению
количества соответствующей монооксигеназы
в ЭР печени. Более того, ускоряется гидрокси-
лирование не только самого фенобарбитала, но
и других барбитуратов, а также веществ друго-
го строения и иной биологической активности
(в данном случае - антикоагулянтов группы
4-оксикумарина). Это свидетельствует о широ-
те субстратной специфичности конкретного
изофермента и позволяет не только оценить ее,
но и различать разные монооксигеназы.
Описанное явление индукции следует учн-
тыветь при проведении химиотерапии. В част-
ности, на фоне приема барбитуратов производ-
ные 4-оксикумарина эффективны лишь в по-
вышенных дозах. Да и к самим барбитуратам
развивается привыкание: при длительном упо-
треблении их снотворное действие сильно ос-
лабевает, что вынуждает увеличивать дозиров-
ку. Развитие привыкания (повышение толе-
рантности) наблюдается с различными ксе-
нобиотиками. Но наиболее известно оно для
наркотиков: регулярное употребление многих
из них быстро индуцирует систему детоксика-
ции настолько, что для достижения наркотиче-
ского эффекта дозировка должна быть увели-
чена в 10-20 раз!
Из эндогенных веществ цитохром(Р45о)-гид-
роксипазы окисляют в основном холестерол и
его производные. В отличие от неспецифиче-
ской монооксигеназы эти ферменты обладают,
как правило, высокой субстратной специфич-
ностью. Многие из них содержатся в ЭР гепа-
тоцитов. Однако значительная часть сосредо-
точена в таких стероидогенных тканях, как ко-
ра надпочечников и половые железы. Именно
здесь некоторые монооксигеназы локализова-
ны не в ЭР, а встроены во внутреннюю мем-
брану митохондрий (со стороны матрикса). В
клетках коры надпочечников митохондриаль-
ный цитохром Р450 даже преобладает над ге-
мопротеинамн дыхательной цепи, составляя
более 80% всех цитохромов внутренней мем-
браны.
Реакции цитохром(Р450)-зависимого окис-
ления известны на всех путях метаболизма хо-
лестерола, включая такой минорный, как акти-
вация витамина D (около 10 мкг в сутки).
Этот витамин был открыт как жирораствори-
мый компонент пищи, который не только изле-
чивает, но и предупреждает развитие рахита -
тяжелого заболевания детей, проявляющегося
нарушением остеогенеза с деформацией кос-
тей. Хороший эффект давало и УФ-облучение
кожи. Как оказалось, оно вызывает внутримо-
лекулярную перестройку 7-дегидрохолестеро-
ла, который образуется в клетках кожи под
176
Глава 5
действием соответствующей дегидрогеназы
(реакция 1 на рис. 5-41). Перестройка протека-
ет в мальпигиевом слое эпидермиса без уча-
стия ферментов и приводит к раскрытию коль-
ца В с переходом гидроксильной группы из
Зр- в За-положение (этап 2 на рис. 5-41). Так
образуется холекальциферол, который назван
витамином D3. При дефиците солнечных лучей
необходимым становится поступление витами-
нов группы D с пищей. Помимо холекальцифе-
рола, к ним относится эргокальциферол из рас-
тений (витамин D2), который отличается от D3
двойной связью между С22 и С23, а также ме-
тильной группой при С2д.
Сами витамины D2 и D3 не обладают био-
логической активностью. Они обретают ее под
действием двух специфических цнтохром(Р450)-
монооксигеназ (реакции 3 и 4 на рис. 5-41).
Одна из них находится в ЭР гепатоцитов н
внедряет гидроксильную группу в положение
С25- Возникший 25-гидроксивитамнн D3 (каль-
цидиол) подвергается второму окислению в
клетках извитых почечных канальцев. Оно
реализуется митохондриальной la-гидроксила-
зой (выявленной также в костной ткани и пла-
центе), которая преобразует кальцидиол в наи-
более активную форму витамина - 1,25-дигид-
рокснвитамин D3 (кальцитриол). Нарушение
биогенеза этого фермента чревато развитием
D-витаминной недостаточности, преодолимой
только приемом готового кальцитриола (а не
D3 или D2).
В тысячи раз больше холестерола - десят-
ки миллиграммов в сутки — используется в ор-
ганизме человека для выработки стероидных
гормонов, протекающей тоже с участием спе-
циальных цитохром(Р450)-гидроксилаз (см. раз-
дел 7.7.3). Основная же масса этого вещества
подлежит экскреции, которую затрудняет его
гидрофобность. Поэтому сперва происходит
создание в нем полярных фрагментов. Оно
реализуется путем окислительной деградации
боковых групп (ибо сам полициклический ске-
7-Дегидрохолестерол
1а,25-Дигидроксихолекальциферол
(кальцитриол)
Рис. 5-41. Биогенез витамина D3 и его преобразование в активную форму (кальцитриол):
1 - ферментативное превращение холестерола в 7-дегидрохолестерол в клетках кожи
(формирование двойной связи в кольце В); 2 - неферментативное лреобрезование под действием
УФ-лучей (фотолиз); 3 - цитохром(Р45о)-монооксигеназное окисление по Сг5 (мембрена ЭР гепатоцитов);
4 - цитохром(Р45о)~монооксигеназное окисление в позиции Ci (митохондрии почек;
осуществляется также в костной ткани и в плаценте).
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
177
лет холестерола исключительно устойчив к
метаболическим воздействиям). В результате
возникают продукты, наиболее значимые из
которых называют желчными кислотами (по
месту их обнаружения).
Гидрофилизация холестерола (и ряда его
производных) происходит в гепатоцитах, с
участием цитохром(Р45о)-монооксигеназ мем-
браны ЭР (рис. 5-42). Лимитирует скорость об-
разования желчных кислот 7а-гидроксилаза
(реакция 1). Этот ключевой фермент чувствите-
лен к угнетающему эффекту холевой кислоты,
преобладающей среди конечных продуктов.
Следующие стадии обеспечивают эпи-
меризацию Зр-гидроксильной группы и вос-
становление двойной связи в кольце В (этап 2
Рис. 5-42. Пути обрезования желчных кислот.
178
Глава 5
на рис. 5-42). Так появляется дигидроксилиро-
ванный предшественник желчных кислот.
Преобладающая часть его под действием
12а-монооксигеназы приобретает еще одну
гидроксильную группу (реакция 3). Затем в
молекулах обоих предшественников происхо-
дит окислительное укорочение боковой цепи и
формирование карбоксильной группы на ее
С24-конце. В итоге образуются холевая н хено-
дезоксихолевая кислоты (этапы 4 и 5). Име-
нуемые первичными желчными кислотами,
они составляют 0,5-1.5% состава желчи. Ки-
шечная микрофлора лишает их гидроксильной
группы при С? (реакции 6 и 7 на рис. 5-42),
превращая соответственно в дезоксихолевую н
питохолевую кислоты (их относят к вторич-
ным желчным кислотам).
Внедрение карбоксильной группы придает
холестеролу амфипатические свойства. Они
усиливаются тем, что этн производные пребы-
вают в желчи главным образом не в свободном
виде, а будучи связанными пептидной связью с
аминогруппой глицина илн таурина (продукт
декарбоксилирования метионина и окисления
его серы до сульфатной группы). Такне конъю-
гаты называют парными желчными кислота-
ми'. гликохолевая кислота (преобладает у чело-
века), таурохолевая (обе показаны на рис.
5-43), глико- и таурохенодезоксихолевые ки-
слоты. Преобразуясь в кишечнике во вторич-
ные желчные кислоты, онн обычно сохраняют
свою связь с глицином или таурином (стано-
вясь глико- и тауропроизводными дезоксихо-
левой и литохолевой кислот). Снижая поверх-
ностное натяжение, все эти детергенты под-
держивают в растворенном состоянии и холе-
стерол, значительная доля которого выводится
с желчью в неизменном виде. Более того, их
эмульгирующие свойства востребованы и в
процессах пищеварения.
Биоптериновые монооксигеназы содержат
атом Fe2+, связанный с двумя радикалами гис-
тидина. Кроме того, в качестве кофермента им
нужен тетрагидробиоптерин (ТГБП). Внедряя
один атом кислорода в молекулу субстрата, для
восстановления другого атома эти ферменты
используют ТГБП (рис. 5-44), превращая его в
дигидробиоптерин (ДГБП). В исходную форму
кофермент возвращается, получая водород от
НАДФ-/72- Элу реакцию осуществляет флави-
новый фермент дигидробиоптеринредуктаза
(ДГБП-редуктаза).
Таким образом, окисление субстрата гид-
роксилазами бноптериновой группы требует
участия не менее двух разных ферментов (сход-
ство с цитохромными монооксигеназами). Один
из них — собственно монооксигеназа, которая
обеспечивает субстратную специфичность и для
восстановления кислорода использует водород
своего кофермента (ТГБП). Другой фермент -
ДГБП-редуктаза, необходимая для регенерации
ТГБП за счет окисления НАДФ-//2.
Двухстадийность процесса показана на
рис. 5-45 на примере гидроксилирования трип-
он Н ОН
I I и I
/Н 2Н /Сх
У |[ ?-СН(ОН)-СН(ОН) ^4 f f усН(ОН)-СН(ОН)
/ЧЯ/Н, I AAA СН,
W N NH СНз Н;Ь/ 'N NfT
Тетрагидробиоптерин (ТГБП) Дигидробиоптерин (ДГБП)
Рис. 5-44. Коферментная функция биоптерина (выделены атомы водорода, участвующие в восстановлении кислорода).
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
179
5-Гидрокси- L-трилтофан
Рис. 5-45. Гидроксилирование триптофана биоптериновой монооксигеназой:
1 - Триптофан-5-монооксигеназа (гидроксилаза); 2 — Дигидробиоптерин-редуктаза.
тофана. Образующийся 5-гидрокси-Ь-трнпто-
фан становится предшественником серотони-
на, который выполняет ряд важных функций,
включая роль медиатора в некоторых отделах
мозга. Именно триптофан-5-монооксигеназа
является лимитирующим звеном биогенеза
этого высокоактивного амина.
Аналогичную реакцию катализирует гид-
роксилаза фенилаланина (рис. 5-46), которая
является ключевым звеном, т. к. лимитирует
I
сн2
нс—nh2
соон
NH2
соон
L-Фенилаланин
L-Тирозин
(4-Гцдроксч-1.- фенилаланин)
хс
нс'' "с-он
I II
НС СИ
с
сн2
нс—нн2
Дофамин
(3,4-Дигид рокси-
-фени лэти лам ин)
I II
Н-С. с-н
с
I
сн2
I
нс—nh2
соон
ДОФА
(3,4-Дигидрокси-
-L-фенилаланин)
Рис. 5-46. Реакции гидроксилирования фенилаланина и тирозина:
1 - Фенилаланин-4-гидроксилаза; 2 - Тирозин-3-гидрокси лаза:
3 - Дигидробиоптерин-редуктаза; 4 -Декарбоксилаза ароматических L-аминокислот.
180
Глава 5
совокупную скорость всех дальнейших путей
преобразования этой аминокислоты и, кроме
того, угнетается избытком собственного суб-
страта. Последнее обусловлено тем, что в С-
концевой стороне фермента есть участок свя-
зывания фенилаланина, именуемый «ингиби-
торным» доменом (каталитический центр на-
ходится в N-концевой части).
Гидроксилирование фенилаланина является
в норме практически единственным путем его
катаболизма. А вот образующийся при этом ти-
розин может подвергаться различным превра-
щениям. Среди важнейших - монооксигеназное
гидроксилирование до дигидроксифенилалани-
на (ДОФАу - сокращение старого названия «ди-
оксифенилаланин»). Он используется затем в
разных реакциях. В частности, отщепление кар-
боксильной группы (в виде СО2) преобразует
молекулу ДОФА в дофамин (рис. 5-46, 4), кото-
рый, как будет показано на рис. 5-49, является
предшественником норадреналина и адреналина
(часто объединяемых общим названием катехо-
ламины}. Биоптериновая тирозин-3-гидрокси-
лаза составляет то звено, которое лимитирует
скорость биогенеза этих гормонов.
Совершенно необычна реакция гидрокси-
лирования аргинина, которая приводит к обра-
зованию оксида азота. При открытии (в конце
80-х годов) фермент получил название NO-cuh-
пгетаза, хотя по механизму действия он ока-
зался монооксигеназой. Катализируемая им
реакция заключается в окислении L-аргинина
по азоту гуанидиновой группы (No), в резуль-
тате чего этот азот отщепляется в виде молеку-
лы NO (рис. 5-47).
Чрезвычайный интерес к ферменту возник
сразу же. ибо выяснилось, что вырабатываемое
им простейшее вещество — оксид азота - явля-
ется сигнальной молекулой, опосредующей ряд
важных функций нервной, иммунной и сердеч-
но-сосудистой систем.
Уникальность NO-синтетазы еще и в том,
что она является и биоптериновон гидроксила-
зой, и цитохром(Р45о)-монооксигеназой. Это
обусловлено строением фермента, обладающе-
го рекордным набором простетических групп и
кофакторов (ФМН, ФАД, ТГБП, гем и кальмо-
дулин - небольшой белок, имеющий 4 центра
связывания ионов Са2+).
Активностью обладает только димерная
форма фермента, состоящая из одинаковых
субъединиц. В каждой различают 3 функцио-
нально разных фрагмента. Ближе к С-концу
апофермента находится редуктазный домен.
По первичной структуре он очень похож на
цитохром(Р45о)-редуктазу, а в качестве просте-
тических групп содержит по одной молекуле
ФАД и ФМН. Другой домен называется окси-
геназным. Его гем-тиолатная группа находится
поблизости от центра связывания молекулы
ТГБП. Между этими доменами расположен
кальмодулин-связывающий участок. Сорбция
на нем кальмодулина (вместе с Са2+ ) вызыва-
ет конформационные сдвиги, необходимые для
обеспечения внутреннего транспорта электро-
нов в цепи ФАД-^ ФМН гем. Внешними
потребителями этих электронов служат молеку-
NH2
C=NH
I
NH
i надф-н2 наДФ
YH2 X Z4
CH2
£h2 °2 H2O
hc-nh2
1
COOH
NHz
I
C=N-OH
I
NH
НС-NHz
L-Аргинин
I
CH2
CH2
<рн2
N u- Г ид рокси- L- аргинин
NH2
I
c=o
I
NH
CH2
(fH2
HC-NH2
COOH
L-Цитруллин
Рис. 5-47. Монооксигеназное окисление L-аргинина под действием NO-синтетазы.
Фермент обеспечивает двухэлектронное окисление на первом этапе и трехэлектронное - на втором, когда утилизи-
руется «половинка» молекулы НАДФ-Нг (точнее, одной молекулы НАДФ-Нг здесь достаточно для того, чтобы из
двух молекул N^-гидрокси-L-аргинина и двух молекул О2образовалось по две молекулы L-цитруллина, оксида азота
и воды).
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
181
лы кислорода, а поставщиками - НАДФ-/72 и
атом N© аргинина (меняющий при этом степень
окисления от -3 до +2).
В лаконичной форме весь этот процесс
представлен на рис. 5-47 в виде двух главных
этапов. На каждом утилизируется по одной мо-
лекуле кислорода. Первая из этих молекул по-
ставляет атом кислорода для гидроксилирова-
ния азота, другая передает один из своих ато-
мов углероду гуанидиновой группы. В обоих
случаях второй атом молекулы кислорода вос-
станавливается до воды, для чего привлекается
необходимое количество НАДФ-/72.
Локализована NO-синтетаза в цитозоле (в
отличие от других нитохромов(Р45о), которые
связаны с мембранами). Образуемая молекула
оксида азота очень нестабильна и существует в
биосистемах не более нескольких секунд. За это
время она может путем диффузии преодолеть
расстояние, лишь в несколько раз превышаю-
щее средний диаметр клетки. Поэтому NO на-
зывают диффузионной сигнальной молекулой.
Биологические эффекты ее многообразны.
В частности, именно ей принадлежит функцио-
нальная активность эндотелиального фактора
релаксации, который играет важную роль в ре-
гуляции кровотока, оказывая сосудорасширяю-
щее действие. Кроме того, NO подавляет агре-
гацию тромбоцитов. В макрофагах эта молекула
опосредует бактерицидную и туморицидную
активность. В некоторых типах клеток мозга NO
играет роль медиатора. В отличие от других
нейромедиаторов, оксид азота не резервируется
в каких-либо везикулах и потому выделяется из
нервного окончания не посредством экзоцитоза,
а путем простой диффузии. Следовательно, ин-
тенсивность потока молекул этого посредника
определяется активностью NO-синтетазы, кото-
рая, очевидно, должна находиться под контро-
лем. В ее регулировании важную роль играет
угнетение фермента продуктом реакции - ок-
сидом азота. Установлена также зависимость
ферментативной активности от концентрации
Са2+ в микроокружении. Появились данные и
о белковых регуляторах NO-синтетазы.
На молекулярном уровне первичными
«мишенями» оксида азота часто оказываются
железо-содержащие компоненты разных белков,
включая циклооксигеназу (см. ниже) и раство-
римую гуанилатциклазу. Оба фермента сильно
активируются оксидом азота (активность гуани-
латцикпазы может возрасти в сотни раз). С вы-
соким сродством NO связывается с гемом цито-
хрома Р450. В данном случае это приводит, одна-
ко, не к активации, а к угнетению фермента. Та-
кое действие установлено, в частности, для не-
специфической монооксигеназы, гемопротеи-
новой триптофан-2,3-диоксигеназы и железосо-
держащей липоксигеназы (см. ниже). Измене-
ние активности перечисленных (или других)
ферментов влечет за собой серию молекулярных
событий, завершающуюся реализацией конкрет-
ной физиологической функции (например, ги-
потензивный эффект).
Среди других молекулярных «мишеней»
оксида азота важное место занимают вещества,
содержащие группы -SH. Нитрозирование та-
кой группы в ключевых точках белка часто
влияет на функциональное состояние молеку-
лы. Например, ферментативная активность при
этом обычно подавляется. С другой стороны,
обратимое связывание с низкомолекулярными
тиолами может способствовать сохранности
молекул NO. В частности, S-нитрозоцистеин
считают резервной и транспортной формой
оксида азота, которая при одноэлектронном
восстановлении распадается на NO и цистеин.
Особую сферу биологических эффектов
составляет участие NO (и его производных) в
регуляции биосинтеза многих белков. К ним
относятся, в частности, белки стресса; ферри-
тин и его рецепторы; белки антиоксидантной
защиты; гемоксигеназа; ядерный белок р53,
подавляющий рост злокачественных опухолей.
Конкретные механизмы вовлечения NO разно-
образны; они реализуются на этапах и транс-
крипции, и трансляции.
Инактивируется оксид азота путем спон-
танного или ферментативного окисления, пре-
вращаясь в нитрит и далее - в нитрат, который
необратимо выходит из обращения (и выво-
дится из организма).
Медь-содержащие монооксигеназы, зави-
симые от аскорбиновой кислоты, особенны
тем, что, гидроксилируя субстрат, в качестве
восстановителя второго атома молекулы О2
используют аскорбиновую кислоту (витамин
С). Она подвергается при этом лишь частично-
му (одноэлектронному) окислению, превраща-
ясь в свою свободнорадикальную форму - мо-
182
Глава 5
нс—он
I
н2с—он
L-Аскорбиновая
кислота
(Витамин С)
О
О
Монодегидро -
аскорбиновая
кислота
Дегидро-
аскорбиновая
кислота
Рис. 5-48. Аскорбиновая кислота и продукты ее
одно- и двухэлектронного окисления.
нодегидроаскорбат (рис. 5-48). Поэтому в ре-
акции участвуют 2 молекулы аскорбата, чтобы
превратить атом кислорода в молекулу воды.
Типичным ферментом этой группы явля-
ется дофамин~$~гидроксилаза. Она содержит
атом Си2+, соединенный с радикалом гисти-
дина. Субстратом служит дофамин, который
образуется, как отмечалось выше, при декар-
боксилировании молекулы ДОФА. Как показа-
но на рис. 5-49, дофамин-р-гидроксилаза, вне-
дряя кислород в молекулу своего субстрата,
превращает его в норадреналин, а используе-
мая при этом аскорбиновая кислота возвраща-
ется затем в восстановленную форму под дей-
ствием специальной редуктазы. Следователь-
но, аскорбат в данном случае является не вто-
рым субстратом (наряду с дофамином), а фак-
тически коферментом и для гидроксилазы, и
для редуктазы, объединяющим их в единую
систему. Эта монодегидроаскорбат-редуктаза
содержит ФАД и утилизирует НАД-/А в каче-
стве донора электронов (и протонов). Она
встроена в мембрану митохондрий (со стороны
матрикса), тогда как дофамин-р-гидроксилаза
локализована в хромаффинных гранулах. Со-
пряженность между окислением витамина С в
этих гранулах и его регенерацией в митохонд-
риях обеспечивается специальной системой
челночного транспорта (аскорбатный челнок).
Монооксигеназы, сопряженные с окисле-
нием а-кетокислот, очень необычны. В от-
личие от гидроксилаз, рассмотренных выше,
они не нуждаются в НАД-Н2 или НАДФ-//2.
Более того, они аообще не образуют воду.
Вместо этого в качестве акцептора одного из
атомов кислорода они используют а-кето-
кислоту, - как правило, а-кетоглутарат (а-КГ).
Принимая кислород, а-КГ теряет СО2 и пре-
вращается в сукцинат (рис. 5-50).
Дофамин
Рис. 5-49. Биогенез норадреналина и адреналина: 1 - Дофамин-$-гидроксилаза (медь-содержащая).
2 — Монодегидроаскорбат-редуктаза. 3 - Фенилэтиламин-Ы-метилтрансфераза.
Сокращения: Аск- аскорбиновая кислота (восстановленная форма); ДгАск— монодегидроаскорбат
(свободнорадикальная форма); R-S-CHg — S-аденозил метионин; R-S - S-аденозил гомоцистеин.
h2c-nh2
н-с-н
СН2 * 0=0 +
сн2
сн ..
Ч / X /
соон
СН2
сн2
с=о
I
соон
а-КГ
h2c-nh2
/ « х н-с-он
(аскорбат) |
--------> СН2
сн2
сн
'"X / X /"
N С
Лизильный
фрагмент
проколлагена
5-Г идроксилизильный
фрегмент
проколлагена
соон
СН2
+ со2 + сн2
с=о
ОН
Янтарная
кислота
(Сукцинат)
Рис. 5-50. Гидроксилирование радикала лизина в составе белка.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
183
Ферменты этой группы содержат Fe2+.
Поэтому их функционирование зависит от при-
сутствия аскорбиновой кислоты, необходимой
для поддержания ионов железа в восстанов-
ленном состоянии (здесь уместно отметить, что
внутри клеток концентрация витамина С в 100
раз выше, чем в плазме крови, и достигает при-
мерно 10 мМ).
Монооксигеназы, функционирующие со-
пряженно с окислением а-кетокислоты, ти-
пичны для шероховатого ЭР, где участвуют в
постсинтетической модификации белков (см.
раздел 2.6.3). В качестве примера на рис. 5-50
представлена реакция, катализируемая прокол-
паген-лизил-5-гидроксилазой.
Исключительно важны еще два фермента,
зависимые от а-КГ и аскорбата. Эти протеин-
пролил-гидроксилазы включают атом кислоро-
да в строго определенные радикалы пролина в
составе ряда белков (но не в свободную амино-
кислоту!). Одна из них гидроксилирует пролин
по 3-му углеродному атому, другая — по 4-му
(формулы обоих гидроксипролиновых произ-
водных были показаны на рис. 2-27).
5.4.4. ДИОКСИГЕНАЗЫ
В общем названии ферментов этой груп-
пы, являющихся гемопротеинами, отражена их
способность включать весь дикислород в мо-
лекулу окисляемого субстрата. В ароматиче-
ских структурах каждый атом молекулы ди-
кислорода присоединяется обычно к одному из
соседних углеродных атомов, разрывая двой-
ную связь между ними.
На рис. 5-51 показана реакция диоксиге-
назного расщепления гомогентизиновои ки-
слоты. Этот метаболит возникает из тирозина
путем укорочения и внутримолекулярной ми-
грации его боковой цепочки с попутным гид-
роксилированием фенольного кольца. Осуще-
ствляемое гомогентизатдиоксигеназой вне-
дрение молекулы кислорода приводит к разры-
ву цикла с образованием линейной цепи ди-
карбоновой кислоты, содержащей еще и две
кето-группы. Эта 8-углеродная цепь легко под-
дается ферментативному гидролизу до фумара-
та и ацетоуксусной кислоты, превращаемой
затем в две молекулы ацетил-КоА.
Сходным образом осуществляется дегра-
дация ароматических колец триптофана. Для
полного расщепления диоксигеназной атаке
должно подвергнуться каждое из колец его би-
циклической структуры. Сначала происходит
разрыв пятичленного цикла, реализуемый
Ъ-триппюфаи-2.,3-диоксигеназой (рис. 5-52, 1).
Затем, после серии реакций, приводящих к
укорочению боковых цепочек, наступает рас-
щепление бензольного кольца, производимое
З-гидроксиантранилатдиоксигеназо й (реакция
2 на рис. 5-52). Возникший нециклический
продукт постепенно преобразуется в молекулы
ацетил-КоА.
У многих животных (собаки, свиньи, различ-
ные грызуны) часть триптофана может транс-
формироваться в никотинамидный фрагмент
молекулы НАД. Следовательно, для них нико-
тиновая кислота не является витамином.
У человека способность образования НАД из
триптофана очень ограниченна, и поэтому да-
же избыток этой аминокислоты не исключает
потребности в никотинамиде (витамин РР), а
лишь несколько уменьшает ее. Следует также
отметить, что одну из реакций между двумя
диоксигеназными стадиями катализирует фер-
мент, в простетическую которого входит вит.
В(г Недостаток этого витамина препятствует
превращению триптофана в витамин РР.
Итак, главное биологическое предназна-
чение диоксигеназ сводится к разрушению
очень устойчивых циклических структур (в том
он
к------------------1
с"----------* а
НС С—СН2—СООН + 0 = 0 ------>
II I
НСХ /СНг
Гомогентизиновая
кислота
4-Малеил-ацетоуксусная
кислота
Рис. 5-51. Расщепление ароматического кольца гомогентизатдиоксигеназой.
184
Глава 5
СИ соон
нс хсх
I II
нс.. с
Г NHz
1 I
|_он
СН СООН
НС С
Нх1 II
.С С
О ХС NH?
ох хон
0=0
3-Г идрсжсиантраниловая
кислота
2-Акролеил-З-аминофумаровая
кислота
Рис. 5-52. Диоксигеназная деградация бициклической структуры триптофана.
числе - и гетероциклов), недоступных другим
способам ферментативной деградации. В итоге
циклические структуры превращаются в ли-
нейные цепи, которые трансформируются в
субстраты ЦТК (фумарат, ацетил-КоА и дру-
гие) и могут окисляться в нем до конечных
продуктов (СО2 и Н2О).
5.4.5. ЛИПОКСИГЕНАЗЫ
Липоксигеназами называют ферменты,
включающие оба атома дикислорода в молеку-
лу ненасыщенной жирной кислоты (некоторые
- по месту двойной связи в стеролах). В отли-
чие от рассмотренных выше диоксигеназных
реакций, в данном случае не происходит раз-
рыва межуглеродных связей. Вместо этого вся
молекула О2 присоединяется к одному из ато-
мов углерода, внедряясь между ним и соеди-
ненным с ним водородом. В итоге формирует-
ся гидропероксидная группа - отличительный
признак липоксигеназного действия. Эти фер-
менты локализованы в цитоплазме и содержат
атом железа, связанный с четырьмя лигандами
в апоферменте (три из них - радикалы гисти-
дина). Для проявления активности они нужда-
ются в присутствии Са2+ и АТФ.
К самым важным субстратам липоксигеназ
относятся арахидоновая кислота (эйкозатет-
раеновая), а также ее три- и пентаеновые ана-
логи (см. рис. 5-39). Их перекисное окисление
становится начальным этапом на путях биоге-
неза лейкотриенов, многие из которых выпол-
няют функции сигнальных молекул.
Эти пути демонстрирует рис. 5-53 на при-
мере биогенеза производных арахидоната. Об-
разуемый 5-липоксигеназой гидропероксид (ре-
акция 1) очень нестабилен и быстро теряет мо-
лекулу воды (реакция 2), превращаясь в соот-
ветствующий 5,6-эпоксид, который обозначают
как лейкотриен А4. Из него образуются лейкот-
риены других серий, но уже без участия окисли-
тельных реакций. В частности, связывание с
трипептидом глутатионом (см. рис. 5-56) ведет
к образованию лейкотриена С4 (реакция 4), ко-
торый модифицируется затем частичным рас-
щеплением глутатионового фрагмента.
Та же 5-липоксигеназа аналогичным обра-
зом превращает эйкозатриеновую и эйкозапен-
таеновую кислоты соответственно в лейко-
триены АЗ и А5, позволяя расширить набор
молекул такого рода.
Лейкотриенам присущ широкий спектр
биологических эффектов, своеобразный для
каждого из них. Некоторые являются мощны-
ми стимуляторами сокращения гладких мышц
и вызывают, в частности, спазм бронхов. Дру-
гие обеспечивают хемотаксис определенных
клеток (в том числе макрофагов); способству-
ют фагоцитозу, модулируют клеточные отве-
ты. В совокупности лейкотриены, как считает-
ся, опосредуют иммунную гиперчувствитель-
ность и усиливают процессы воспаления.
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
185
У-глутамил-цистеил-глицин
(глутатион)
Лейкотриен С4
Рис. 5-53. Липоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты:
1 - образование гидропероксида арахидоновой кислоты под действием 5-липоксигеназы;
2 — вторая стадия 5-липоксигеназного катализа: дегидратация 5-ГПЭТЕ;
3 - формирование лейкотриена В4 под действием высокоспецифичной гидролазы;
4 - присоединение глутатиона (Г-SH) к лейкотриену А4 лейкотриен^Сд-синтетазой;
5 - восстановление гидропероксидной группы с участием глутатионпероксидазы.
Примечание: В лейкотриенах D4 и F4 отсутствуют соответственно у-глутамильный
и глициновый фрагменты глутатиона, а в лейкотриене Е4 - оба эти компонента.
Помимо 5-липоксигеназы в некоторых
клетках есть ферменты, которые формируют
гидропероксидную группу не в 5-м, а в 12-м или
15-м положении арахидоновой кислоты. Обра-
зующиеся вещества тоже могут подвергаться
действию 5-липоксигеназы, благодаря чему по-
являются продукты с двумя (и даже тремя) гид-
ропероксидными группами. В конечном счете
таким путем возникают полиоксипроизводные
ненасыщенных жирных кислот. Поскольку все
липоксигеназы способны окислять не только
арахидоновую, но и другие полиеновые кисло-
ты, становится возможной генерация разнооб-
разных продуктов перекисного окисления жир-
ных кислот. Биологическая роль их пока не
вполне ясна.
5.4.6. ЦИКЛООКСИГЕНАЗЫ
Подобно липоксигеназам, циклооксиге-
назы действуют предпочтительно на арахидо-
новую кислоту. Сходство еще и в том, что цик-
лооксигеназный тип окисления тоже ведет к
появлению высокоактивных сигнальных моле-
кул, которые в данном случае обозначаются
как простаноиды. Структурно они отличаются
от лейкотриенов, а с учетом специфики биоло-
гического действия подразделяются на про-
186
Глава 5
стагландины, простациклины и тромбоксаны.
Липоксигеназный и циклооксигеназный пути
превращений конкурируют за арахидоновую
кислоту как главный исходный продукт. В це-
лом метаболиты обоих путей обозначают тер-
мином эйкозаноиды. Те из них, которые обла-
дают высокой биологической активностью,
очень нестойки: продолжительность их суще-
ствования измеряется секундами или минута-
ми. Поэтому в качестве сигнальных молекул
они успевают оказать воздействие лишь на
близлежащие клетки-мишени (паракринная
регуляция) или на рецепторы своей собствен-
ной клетки (аутокринный механизм).
Принципиальная особенность циклоок-
сигеназ, фиксированных на внутренней стороне
мембраны ЭР, заключается в их способности
внедрять не одну, а две молекулы кислорода в
цепочку полиеновой кислоты. При этом одна из
них используется для формирования эндоперок-
Простагландин Р2а(ПГ-Я2а)
Рис. 5-54. Циклооксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты: 1 - циклооксигеназа (КФ 1.14.99.1):
эндо- и гидропероксидное действие; 2 - циклооксигеназа (КФ 1.14.99.1): пероксидазное действие;
3 - простагландин-О-синтетаза (изомераза, КФ 5.3.99.2); 4 - простагландин-Е-синтетаза
(изомераза, КФ 5.3.99.3); 5 - просгпациклинсинтетаза (изомераза, КФ 5.3.99.4); 5 - тромбоксансинтетаза
(изомераза. КФ 5.3.99.5); 7- гидратация тромбоксана А2; 8 - простагландин-Е-синтетаза (редуктаза, КФ 1.1.1.188).
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
187
сидной структуры, а другая - для образования
гидропероксидной группы. В случае арахидоно-
вой кислоты эндопероксид возникает в резуль-
тате соединения молекулы дикислорода с двумя
атомами углерода - в позициях 9 и 11. Как пока-
зано на рис. 5-54, это сопровождается замыкани-
ем связи между 8-м и 12-м углеродными ато-
мами, что ведет к появлению пятичленного
кольца (отсюда и возник термин циклооксигена-
за). Попутно другая молекула О2 воздействует
на углерод Со, образуя гидропероксидную груп-
пу (та же реакция 1 на рис. 5-54). В результате
арахидоновая кислота превращается в простаг-
ландин G2 (ПГ-О2). Отсюда происходит офици-
альное название фермента - простагландин-
зндопероксид-синтетаза.
Еще одно своеобразие фермента обуслов-
лено тем, что, наряду с циклооксигеназной, он
обладает и пероксидазной активностью. По-
этому на второй стадии процесса (реакция 2 на
рис. 5-54) гидропероксидная группа проста-
гландина G2 выступает как окислитель подхо-
дящего вещества, отнимая у него два атома
водорода, которые образуют воду с одним из
атомов кислорода бывшей гидропероксидной
группы. В итоге ПГ-С2 превращается в более
стабильную молекулу ПГ-Н2.
Формирование остальных простаноидов
происходит без участия оксигеназных реакций.
Как видно на рис. 5-54, главнейшие из них об-
разуются из ПГ-Н2 под действием специфиче-
ских изомераз, иногда — с последующей «дора-
боткой» другими ферментами. Установлено,
что каждая линия клеток вырабатывает только
один вариант простаноидов.
Известны и другие продукты циклооксиге-
назного пути метаболизма полиеновых кислот.
Несмотря на сходство строения, далеко не все из
них обладают заметной биологической актив-
ностью. Часть таких веществ образуется в про-
цессе инактивации простаноидов, протекающей
главным образом путем окислительных преоб-
разований.
Биологические эффекты простаноидов за-
висят не только от их строения, но еще и от
типа клетки-мишени. Многие простагландины
стимулируют сокращение гладких мышц (в
том числе - в стенке кровеносных сосудов),
участвуют в реализации воспалительных реак-
ций, модулируют действие ряда гормонов.
Вместе с тем, ПГ-А2 и ПГ-Е2 снижают тонус
сосудистой стенки. Наиболее мощным вазо-
прессорным действием обладают тромбоксаны,
которые, кроме того, стимулируют агрегацию
тромбоцитов, способствуя свертыванию крови.
Антагонистами тромбоксанов часто выступают
простациклины. Они оказывают сосудорасши-
ряющее действие, предотвращают агрегацию
тромбоцитов и обладают противосвертываю-
щим действием. Эффекты простаноидов сильно
зависят также от их концентрации, а особенно -
от общего фона различных биологически актив-
ных веществ- Соотношением всех перечислен-
ных факторов и определяются возможные эф-
фекты сигнальных молекул-посредников вооб-
ще и эйкозаноидов - в том числе.
5.5. АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА
Будучи конечным акцептором электронов
в процессах биологического окисления, моле-
кулярный кислород почти всегда восстанавли-
вается полностью, до воды, принимая 4 элек-
трона. Однако, как уже отмечалось, в некото-
рых ферментативных реакциях возникают про-
дукты неполного восстановления О2. Они гото-
вы захватывать «недополученные» электроны
и потому обладают свойствами сильных окис-
лителей. В целом эту группу веществ называют
активными формами кислорода (АФК). Неко-
торые из них имеют неспаренный электрон(ы)
на внешней (валентной) орбитали. Такие моле-
кулы (или атомы) именуют свободными ради-
калами. Они отличаются особенно высокой
химической активностью и энергично реаги-
руют с различными веществами.
Молекула кислорода содержит два неспа-
ренных электрона на внешних орбиталях, т.е.,
представляет собой бирадикал. В качестве
символа принадлежности к свободным радика-
лам, наличие такого электрона принято отме-
чать надстрочной точкой. Ее ставят около того
атома, где локализован неспаренный электрон.
Поэтому бирадикальную природу молекулы
кислорода обозначают так:
*ОО* или '0=0'
Неспаренные электроны молекулы ди-
кислорода обладают параллельными спинами и
потому находятся на разных орбиталях. Введе-
188
Глава 5
ние пары электронов в эти орбитали невоз-
можно без инверсии (обращения) спина одного
из них, что затрудняет восстановление О2 ве-
ществами, все электроны которых спарены.
Таким образом, «спиновый запрет» делает О2
стабильным соединением, химически довольно
инертным. Он. однако, не препятствует пооче-
редному присоединению одиночных электро-
нов. Поэтому реакции одноэлектронного вос-
становления кислорода легко протекают при
взаимодействии с такими веществами, которые
содержат неспаренные электроны.
Присоединив один электрон, молекула ди-
кислорода превращается в супероксидный ани-
он-радикал *ОО“, который для краткости обо-
значают как О2'“ и лаконично называют супер-
оксидом. Захватывая протон, он преобразуется
в гидропероксидныйрадикал НО2*:
О2 + е~ —> О2*~;
О2’~ + Н+ НО2*
Принимая еще один электрон, бывший су-
пероксидный анион-радикаЛ становится перок-
сидным анионом О22", полное протонирование
которого ведет к образованию Н2О2:
О2*~ + е -----> О22" ;
+ Н+ > НО2~;
НО2~ + Н+ ----> Н2О2
В водородпероксиде ковалентная связь
между атомами кислорода довольно непрочна.
Она может разрываться при ионизирующем или
ультрафиолетовом облучении. В результате мо-
лекула Н2О2 превращается в свободные радика-
лы НО*, которые называют гидроксиднымира-
дикалами (или короче, - гидроксилам^}'.
Н2О2 hv > НО’ + НО’
В биологических системах образование
гидроксидного радикала из Н2О2 происходит в
основном путем одноэлектронного восстанов-
ления. Донором электрона при этом чаще всего
выступают ионы железа, меди, марганца или
других металлов переменной валентности. Ре-
акцию с участием, например, железа, можно
записать так:
Н2О2 + Fe2+ ----> НО* + НО" + Fe3+ [5-7]
Заслуживает внимания, что в такой реак-
ции, наряду с гидроксидным радикалом НО',
образуется также гидроксильный ион НО", т.е.,
депротонированная форма молекулы воды
(иными словами, один из продуктов ее диссо-
циации).
Таким образом, к числу активных форм
кислорода, возникающих при неполном вос-
становлении О2, относятся свободные радика-
лы О2‘~, НО* и НО2', а также устойчивый моле-
кулярный продукт Н2О2, являющийся окисли-
телем умеренной силы.
5.5.1. ПУТИ ОБРАЗОВАНИЯ АФК
И ИХ ПРЕВРАЩЕНИЯ
Первоисточником АФК являются некото-
рые ферментативные реакции. Полагают, что
доминирует в этом система митохондриально-
го окисления. Обычно она почти идеально реа-
лизует практически одновременную передачу
4 электронов на молекулу О2. Однако из-за то-
го, что дыхательные ансамбли содержат редокс-
центры одноэлектронного транспорта, возмож-
ны «утечки» отдельных электронов, приводя-
щие к появлению продуктов неполного восста-
новления кислорода. Многие монооксигеназные
комплексы тоже обладают звеньями одноэлек-
тронного переноса, случайные нарушения «ад-
ресности» которого могут привести к возникно-
вению супероксидного анион-радикала.
Более специфичными источниками (хотя
далеко не столь масштабными) являются те
ферменты, которые производят АФК в качест-
ве непременного продукта реакции. К ним от-
носятся оксидазы (раздел 5.4.1), действие ко-
торых сопровождается выработкой Н2О2, а
также липоксигеназы, которые создают высо-
кореактивные молекулы гидропероксидов (см.
рис. 5-53), способные генерировать свободные
радикалы жирных кислот.
Наконец, следует упомянуть NO-синтетазу
(см. рис. 5-47). Образуемый ею оксид азота и
сам обладает высокой химической реактивно-
стью. Но при низких концентрациях субстрата
(аргинин) и кофермента (ТГБП) она способна
вместо NO производить супероксидный анион-
радикал (О2'"). В некотором (и довольно обыч-
ном) диапазоне условий NO-синтетаза выраба-
тывает одновременно и NO, и супероксид. Они
легко и быстро взаимодействуют, образуя го-
раздо более реактивный пероксинитрит
(ONOO-):
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
189
NO + О2" ------> O=N-O-O~
Активные формы кислорода могут само-
произвольно (без участия ферментов) реагиро-
вать с себе подобными. Так, молекула супер-
оксидного анион-радикапа способна отдавать
электрон другой такой же молекуле, окисляясь
тем самым до бирадикального кислорода О2.
Молекула же, принявшая этот электрон, вос-
станавливается до пероксидного аниона О22“,
который легко протонируется в водородперок-
сид Н2О2:
О2- + О2- + 2 Н+ -> ’о2 + Н2О2 [5-8]
Иными словами, два супероксидных ради-
кала могут превращаться в молекулу кислоро-
да и молекулу перекиси водорода (с участием
двух протонов). Эту реакцию диспропорцио-
нирования супероксида чаще называют дисму-
тпацией (супероксидных радикалов). Нюанс
заключается в том, что при спонтанном тече-
нии процесса возникают молекулы синглетно-
го кислорода (’Ог). От обычного (триплетного)
О2 он отличается антипараллельностью спинов
неспаренных электронов. Поэтому О2 облада-
ет высокой реактивностью («возбужденный»
кислород) и, следовательно, тоже относится к
АФК.
Супероксидный анион-радикал может реа-
гировать и с пероксидом водорода. Теряя элек-
трон, он окисляется в этой реакции до обычно-
го кислорода О2. В свою очередь, водородпе-
роксид, принимая электрон, распадается на
гидроксидный радикал НО" и гидроксильный
ион НО (как и в приведенном выше примере
восстановления Н2О2 двухвалентным железом).
В целом реакцию можно представить следую-
щим уравнением:
О2" + Н2О2 -> О2 + НО" + НО“ [5-9]
Таким образом, перечисленные активные
формы кислорода представляют собой единую
систему родственных соединений, легко пере-
ходящих друг в друга. Все они в большей или
меньшей степени способны оказывать повреж-
дающее действие на биомолекулы. В белках
наиболее уязвимыми оказываются боковые
радикалы цистеина, гистидина и триптофана,
химические изменения которых могут привес-
ти к нарушению функциональной способности
пораженного фермента или иного белка. В
нуклеиновых кислотах окислительной моди-
фикации подвергаются главным образом азо-
тистые основания, что лежит в основе мута-
генного действия АФК. Установлена способ-
ность этих активных молекул разрушать неко-
торые полисахариды. В липидах к окислитель-
ной атаке наиболее чувствительны полинена-
сыщенные жирные кислоты, деградация кото-
рых приводит к образованию продуктов так
называемого перекисного окисления липидов
(ПОЛ). В данном случае оно протекает спон-
танно, и потому его называют нефермента-
тивным ПОЛ (в отличие от окислительных
преобразований полиеновых кислот липокси-
геназами и циклооксигеназами). Главная опас-
ность окислительного повреждения липидов
связана с наступающими изменениями физико-
химических свойств липидного бислоя, кото-
рые приводят к нарушениям проницаемости,
рецепторной и иных функций биомембраны,
работы связанных с нею ферментов.
Среди всех АФК наиболее агрессивным
является гидроксидный радикал (НО"), спо-
собный атаковать практически любое вещество
клетки, включая ДНК. Фактически он пред-
ставляет собой продукт протонирования О'- -
анион-радикапа атома кислорода. Жизнь его
настолько скоротечна, что за время своего су-
ществования НО" может сместиться (путем
диффузии) на расстояние не более 0,1 мкм.
Значит, химические воздействия гидроксид-
ного радикала реализуются почти в самом мес-
те его возникновения.
Энергии гидроксидного радикала НО"
достаточно даже для того, чтобы отрывать
атом водорода от углерода в различных орга-
нических соединениях. Например:
НО" + СН3ОН -------> СН2ОН + Н2О
Восстанавливаясь при этом до воды, гид-
роксил превращает атакованную им молекулу в
новый радикал, что в конечном счете может
привести к разрыву межуглеродных связей.
Так, если объектом атаки становятся пентозы
нуклеиновых кислот, то возможен разрыв нук-
леотидной цепи со всеми неблагоприятными
последствиями, вплоть до гибели клетки.
Чаще мишенью радикалов НО" бывают
полиненасыщенные жирные кислоты, в том
190
Глава 5
числе в составе фосфолипидов биомембран.
Обычно атакуется метиленовая группа, нахо-
дящаяся между непредельными углеродами.
Отнятие атома водорода приводит к появлению
неспаренного электрона, локализованного на
углероде этой группы:
Н-С-Н ’С-Н
\ /\ Г /’
с=с С=С + НО’ -> Н2О + с=с с=с
Illi II I I
нннн нннн
Если липид обозначить буквой L и отме-
тить факт отнятия у него атома водорода, то
переход этой органической молекулы в со-
стояние радикала можно представить так:
НО’ + L-H ------> L + Н2О.
Возникший свободный радикал жирной
кислоты (липида) - ’L - способен положить
начало целой цепочке последовательных реак-
ций образования все новых АФК. Например, в
реакции с О2 он может переходить в липопе-
роксидный радикал L-OO’, который, в свою
очередь, готов отнимать атом водорода у по-
лиеновой структуры другой молекулы, делая
из нее новый радикал ’L, а сам превращаясь в
гидропероксидное производное L-OOH:
’Ь' + О2 -----> L'-OO'
L'-OO’ +L"-H -----> L-OOH + ’L"
Легко заметить, что во всех приведенных
реакциях исчезновение одного свободного ра-
дикала сопровождается возникновением друго-
го, так что в целом процесс идет в самопод-
держивающемся режиме. Это и есть отличи-
тельный признак цепной реакции линейного
типа. В данном случае наряду с постоянным
воспроизводством свободных радикалов она
вовлекает все новые молекулы липидов, пре-
образуя их в гидропероксиды, эндопероксиды
и т.д., вплоть до расщепления (фрагментации)
жирнокислотных цепочек.
Описанный линейный процесс может пе-
реходить в разветвленную цепную реакцию со
свойственным ей «размножением» активных
частиц. Например, упомянутый липопероксид-
ный радикал L -ОО’, генерируя новый радикал
’L (из L"-H), одновременно превращается в
гидропероксид L-ООН, который тоже спосо-
бен производить свободные радикалы, т.е.,
инициировать новые веточки цепного процес-
са. Это может произойти либо путем одноэлек-
тронного восстановления с участием металлов
переменной валентности:
L-OOH + Fe2*-----эЕ-О’+НО +Fe3+,
либо под действием УФ-лучей или ионизи-
рующей радиации, когда LOOH образует не
одну, а две радикальных частицы, что позволя-
ет усилить степень ветвления цепной реакции:
L -ООН '"'-> L -О’ + НО
Безудержное развитие цепной реакции в ка-
кой-то мере сдерживается вероятностью реакции
между двумя свободными радикалами. Объеди-
няя свои неспаренные электроны, они переста-
ют быть радикалами и оказываются скреплен-
ными ковалентной связью. Так возникают раз-
нообразные межмолекулярные сшивки:
L’ + ’R ----> L-R
l' + l"-----> l-l"
l'-OO’ + L" ----> l'-O-O-L" и т.п.
Таким образом, взаимодействия между ра-
дикалами тормозят цепную реакцию, вызывая
«обрыв» цепи. Однако это не устраняет уже
возникших повреждений молекул.
Ориентировочные подсчеты показывают,
что всего за одну секунду в клетке может обра-
зоваться более 30 частиц НО’. Это совсем нема-
ло, если учесть, что воздействие даже одной из
них на молекулу ДНК может привести к фа-
тальным последствиям.
Агрессивное поведение АФК, тяжесть и
необратимость вызываемых ими изменений
побудили называть их токсичными формами
кислорода. Однако возникают они не в резуль-
тате какой-то патологии, а как продукты обыч-
ных ферментативных процессов или как след-
ствие вполне естественных «утечек» электро-
нов в ходе некоторых из них. Очевидно, живая
природа в ходе эволюции не могла не обернуть
себе на пользу высокую химическую реактив-
ность и потенциальную опасность АФК.
Есть основания считать, что это действи-
тельно так. В частности, химическая модифи-
кация радикалов аминокислот нарушает про-
странственную организацию белковой молеку-
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
191
лы. Поэтому протеолитические ферменты бы-
стрее расщепляют окисленный белок, чем на-
тивный. Следовательно, свободнорадикальное
повреждение становится фактором, который
сокращает продолжительность существования
белковой молекулы и тем самым стимулирует
замену ее вновь синтезированной. Аналогич-
ным образом окислительные преобразования
фосфолипидов в процессе неферментативного
ПОЛ играют важную роль в обеспечении де-
градации и обновления этих компонентов био-
мембран.
Однако помимо обшедеструктивного дей-
ствия -АФК выполняют и ряд специальных
функций. В частности, упомянутый выше пе-
роксинитрит активирует проколлагеназу (ме-
таллопротеиназа-8) и вызывает инактивацию
тканевого ингибитора этого фермента, а также
ai-антитрипсина (главного из эндогенных ин-
гибиторов эластазы). Накапливаются свиде-
тельства того, что в низких (нетоксичных)
концентрациях АФК выполняют роль сигналь-
ных молекул, с помощью которых регулирует-
ся скорость многих метаболических процессов,
включая мембранный транспорт ионов Са2+,
фосфорилирование ряда белков, экспрессию
определенных генов, инициацию пролифера-
тивных процессов и т.д.
Особую роль играют АФК в механизмах
антимикробной защиты, осуществляемой фа-
гоцитирующими клетками. Наиболее эффек-
тивны в этом отношении нейтрофилы, которые
обладают специальной системой генерации
АФК. Важным ее компонентом является мем-
бранный комплекс НАДФ-/72-оксидазы, вклю-
чающий ФАД и цитохром Ь, а также ряд цито-
зольных белков. Перемещение последних к
мембране и сборка комплекса происходят в
момент активации нейтрофилов, в частности,
при контакте с микробными клетками. Актив-
ный комплекс утилизирует нарабатываемые в
цитоплазме молекулы НАДФ-//2 для восста-
новления молекул Ог по механизму одноэлек-
тронного переноса:
НАДФ-Я2 + 2 О2 -> 2 О2'~ + 2 Н* + НАДФ
В состоянии функциональной активности
фагоциты претерпевают так называемый «дыха-
тельный взрыв» («оксидативный стресс»). Он
проявляется в скачке потребления кислорода,
используемого НАДФ-772_оксидазой. Поставщи-
ком Н АДФ-ГД служит резко возрастающий при
этом распад глюкозы гексозомонофосфатным
путем (см. раздел 6.6.1). Всплеск поглощения
кислорода развивается в нейтрофилах очень бы-
стро, достигая максимума в течение 3 мин и
обеспечивая интенсивную генерацию суперок-
сидных радикалов, которые вместе с последую-
щими высокореактивными продуктами произ-
водят прямое разрушение чужеродных агентов.
Затухает «дыхательный взрыв» сравнительно
скоро: уже через 30-60 мин потребление кисло-
рода возвращается к исходному уровню.
5.5.2. МЕХАНИЗМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ
ЗАЩИТЫ
Основная масса АФК появляется как ре-
зультат «утечки» электронов и «сбоев» в рабо-
те систем биоокисления. Даже-для оксидаз,
продуцирующих Н2О2 в качестве одного из
продуктов катализируемой реакции, эти высо-
коактивная молекула является лишь побочным
результатом, ибо главное предназначение ок-
сидаз состоит в расщеплении минорных мета-
болитов, доступностью которых и определяет-
ся количество образуемых АФК. Если к этому
добавить еще возможность неферментативного
возникновения свободных радикалов, а также
их самовоспроизводство в цепных реакциях, то
можно заключить: создание АФК не является
специальной функцией каких-то ферментных
систем, способных регулировать интенсив-
ность выработки этих оксидантов.
Отсюда — опасность чрезмерного накопле-
ния АФК и их разрушительного действия. Ее
реальность подтверждается наличием эффек-
тивных механизмов ликвидации АФК, сово-
купность которых называют системой антиок-
сидантной защиты (АОЗ).
Наибольшим потенциалом обладают фер-
ментные звенья этой системы. К их числу от-
носятся супероксиддисмутаза, каталаза и пе-
роксидазы.
Супероксиддисмутаза катализирует реак-
цию дисмутации, т.е., переноса электрона с
одного супероксидного радикала О2‘" на дру-
гой. В результате первый окисляется до моле-
кулярного кислорода, а второй восстанавлива-
ется до Н2О2. Как показывает уравнение [5-8],
192
Глава 5
самопроизвольное течение такого процесса со-
провождается образованием синглетного кисло-
рода 1О2. В отличие от этого супероксид-
дисмугаза (СОД) генерирует обычную, доволь-
но инертную молекулу О2 (триплетный кисло-
род). Таким образом, фермент не только сильно
ускоряет ликвидацию радикалов супероксида,
но и «уводит» их от спонтанного перехода в вы-
сокореактивную форму синглетного кислорода.
Известны три совершенно разные формы
СОД. Две из них — цитоплазматическая и вне-
клеточная - содержат по одному атому Си2+ и
ZrT+B каждой субъединице. Третья локализует-
ся в матриксе митохондрий: вместо меди и
цинка в состав ее субъединицы входит атом
Мп2+ (или железа - у некоторых бактерий).
Молекулярная активность СОД исключительно
высока: фермент преобразует до 60 млн супер-
оксидных анион-радикалов за 1 мин.
Образующийся водородпероксид относи-
тельно стабилен и не несет электрического за-
ряда. Сочетание таких свойств позволяет ему
легко проникать через биомембраны, в отличие
от радикалов и ион-радикалов. Поэтому моле-
кулы Н2О2 способны оказывать свое действие
(или могут быть использованы) не только в
месте образования, но и внутри липидного бис-
лоя мембраны, а также по другую сторону ее.
Иными словами, Н2О2 можно считать транс-
портной формой АФК.
С другой стороны, Н2Ог представляет со-
бой опасность, поскольку может порождать
наиболее агрессивную из всех АФК частицу -
гидроксидный радикал НО'. Более того, в жи-
вом организме едва ли не единственным ис-
точником образования НО' служит именно пе-
роксид водорода, подвергаемый одноэлектрон-
ному восстановлению ионами металлов пере-
менной валентности (уравнение [5-7]) или су-
пероксидом (уравнение [5-9]).
Чтобы снизить возможность образования
НО’, существуют специальные ферменты, ко-
торые расщепляют Н2О2 до продуктов, не об-
ладающих высокой реактивностью.
Каталаза является главным из таких фер-
ментов. Она присутствует во всех аэробных
клетках, обладает очень высокой молекуляр-
ной активностью (порядка 1,2- 10б мин’1) и уни-
кальной способностью расщеплять Н2О2 до
воды и обычного (триплетного) кислорода:
2Н2О2 ------> 2 Н2О + О2 [5-10]
По строению каталаза напоминает гемогло-
бин. Она состоит из четырех одинаковых субъе-
диниц, содержащих гем, железо которого нахо-
дится, однако, в окисленной форме (Fe3+), - в
отличие от гемоглобина (Fe2+). Ликвидируя мо-
лекулы Н2О2, каталаза тем самым снимает угро-
зу превращения их в гидроксилы НО’. Кроме
того, действуя «по стопам» супероксид-дисму-
тазы, она помогает устранению и других АФК.
В эритроцитах каталаза содержится в ци-
тозоле, что облегчает ей задачу защиты железа
гемоглобина и HS-групп белковых и иных мо-
лекул от окисления пероксидом водорода.
В других клетках каталаза сосредоточена в пе-
роксисомах.
Пероксидазы в плане защиты от АФК
функционируют подобно каталазе, расщепляя
молекулы Н2О2. Главное отличие заключается
в том, что они восстанавливают молекулу Н2О2
(до воды) не за счет окисления другой молеку-
лы H2O2 (до молекулярного кислорода), а за
счет двух атомов водорода, отнимаемых у под-
ходящего субстрата:
АН2 + Н2О2 -----> А + 2 Н2О
Как правило, пероксидазы являются гемо-
протеинами и содержат окисленное железо
(Fe3+) в составе гема. В основном они харак-
терны для растений. В качестве субстрата,
окисляемого ими с использованием Н2О2, мо-
гут выступать разные соединения - фенолы,
гидрохиноны, гидроксибензоат, катехолы и т.д.
У животных такие ферменты сочетают расще-
пление Н2О2 с выполнением специализирован-
ных функций некоторых типов клеток.
Миелопероксидаза характерна для грану-
лоцитов и моноцитов. Она играет главную роль
в системе бактерицидной активности нейтро-
филов, составляющих первую линию неспеци-
фической защиты от инфекции. Лишь часть
этой активности объясняется обычным перок-
сидазным действием - реакцией окисления ор-
ганических молекул за счет Н2О2. Несравненно
важнее другое качество миелопероксидазы:
только она способна использовать водородпе-
роксид для окисления ионов хлора:
Н2О2 + СГ ------> ОСГ + Н2О
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
193
Образующийся в этой реакции ион гипо-
хлорита ОСГ по своей химической реактивно-
сти мало уступает гидроксилу НО". Помимо
обычного окислительного воздействия, гипо-
хлорит легко вступает в реакции хлорирования
аминокислот и иных веществ, давая начало хло-
раминам и серии других химически активных
продуктов, включая свободные радикалы. Ины-
ми словами, миелопероксидаза не просто раз-
рушает пероксид водорода, но и способна ис-
пользовать этот умеренный окислитель для вы-
работки гораздо более энергичных молекул, об-
ладающих высокой биоцидной активностью.
Относительно НО" гипохлорит гораздо ста-
бильнее, а потому обладает более протяжен-
ным радиусом действия. Этим в значительной
степени объясняется известный эффект: в борь-
бе с инфекцией погибают не только сами ней-
трофилы, но и соседние клетки здоровой тка-
ни, окружающей очаг воспаления («клетки-
свидетели»).
Таким образом, наряду с НАДФ-//2-окси~
дазой и ферментами наработки молекул
НАДФ-//2, миелопероксидаза является непре-
менным участником феномена «дыхательного
взрыва», использующего О2 для уничтожения
широкого спектра инфекционных агентов.
Лактопероксидаза вырабатывается клет-
ками слюнных и молочных желез и является
секреторным аналогом миелопероксидазы.
В слюне и молоке она способна использовать
Н2О2 для превращения тиоцианата (SCN ) в
слабый окислитель гипотиоцианит (OSCN),
обладающий бактериостатическим действием.
Иодидпероксидаза представляет собой
трансмембранный белок тироцитов (отсюда
другое название - тироидная пероксидаза).
Она катализирует окисление йодида до моле-
кулярного йода:
2 Ш + Н2О2------» J2 + 2 Н2О
Кроме этого, собственно пероксидазного
действия, фермент способен замещать водород
ароматического кольца тирозина одним из
атомов молекулы йода. Тем самым осуществ-
ляется органификация йода. На рис. 5-55 такая
реакция показана на примере внедрения атома
йода в положение 3 фенильной группы тирози-
на, в результате чего образуется 3-монойод-
тирозин. Однако реально субстратом служит не
Радикал
тирозина
Радикал
3-монойодтирозина
Рис. 5-55. Механизм йодирования тирозильных
радикалов в составе тироглобулина.
свободная аминокислота, а лишь особый бе-
лок - тироглобулин, изобилующий радикалами
тирозина (см. раздел 2.6.3). Часть из них пре-
образуется в 3-монойодтирозильные производ-
ные, а некоторые подвергаются повторному
йодированию, превращаясь в 3,5-дийодтиро-
зильные радикалы. На следующем этапе цик-
лический фрагмент одного из йодированных
звеньев переносится на гидроксильную группу
другого, что приводит к возникновению би-
циклической структуры йодтиронинов. Проце-
дуру такой конденсации осуществляет тоже ти-
роидная пероксидаза (это уже третья ее функ-
ция). Таким способом в составе белка форми-
руются предшественники тироидных гормонов.
Преобладает здесь тироксин (Т4), представляю-
щий собой 3.5,3',5'-тетрайодтиронин (его фор-
мула показана на рис. 2-29). В небольших коли-
чествах в йодтироглобулине содержится также
3,5,3 '-трийодтиронин (Т3), продукт конденсации
дийодтирозина и З'-монойодтирозина. Освобо-
ждение готовых молекул Т4 и Тз происходит
путем гидролитического вычленения их из мо-
лекулы йодтироглобулина (как это описано в
разделе 2.6.3).
Врожденные дефекты йодидпероксидазы,
а также недостаток йода в организме приводят
к разной степени гипофункции щитовидной
железы.
Глутатионпероксидаза сильно выделяется
среди всех пероксидаз. Это — один из тех ред-
ких белков, в состав которых входит селено-
194
Глава 5
цистеин. Будучи аналогом цистеина, сера ко-
торого заменена на селен, он включен в ката-
литический центр фермента. От каталазы глу-
татионпероксидаза отличается гораздо более
высоким сродством к Н2О2 и потому эффек-
тивна даже при низких концентрациях водо-
родпероксида. Особенность еще и в том, что в
качестве восстановителя для Н2О2 она всегда
использует только глутатион.
Глутатион - это трипептид у-глутамил-
цистеил-глицин (рис. 5-56). Он своеобразен
тем, что пептидная связь, образованная глута-
матом, сформирована с участием его «дальней»
карбоксильной группы, а не соседней с амино-
группой, как это присуще обычным пептидам.
Это придает глутатиону устойчивость к проте-
олитическим ферментам и позволяет находить-
ся во всех клетках, причем, в довольно высо-
ких концентрациях (до 10 мМ). Он легко про-
ходит через мембраны, в том числе во внекле-
точное пространство.
7-глутамил-цистеил-глицин
(глутатион)
(Г-SH, восстановленный глутатион)
Окисленный глутатион (fS—SQ
Рис. 5-56. Глутатион (Г-SH)
и его окисленная форма (FS-Sf).
Главной функциональной ценностью глу-
татиона является наличие сульфгидрильной
группы цистеина. Поэтому глутатион обозна-
чают сокращением Г-SH. Отдавая водород
своих HS-групп, две молекулы глутатиона со-
единяются дисульфидной связью -S-S-. Так
образуется окисленный глутатион, часто пред-
ставляемый как rS-ST (см. рис. 5-56). Реакция
обратима: многие восстановители легко пре-
вращают окисленный глутатион в две молеку-
лы глутатиона (иногда уточняют — «восстанов-
ленного глутатиона»).
Катализируемое глутатионпероксидазой
восстановление водородпероксида до воды
схематически можно представить уравнением:
Н2О2 + 2 Г-SH -----> 2 Н2О + TS-Sr [5-11]
Известен ряд ферментов, способных вос-
станавливать TS-Sr за счет различных ве-
ществ, включая аскорбиновую кислоту.. Одна-
ко главную роль в регенерации Г-SH играет
флавопротеиновый фермент глутатионредукта-
за, который для восстановления TS-SF исполь-
зует молекулы НАДФ'/Д, образующиеся в ходе
различных метаболических процессов (особен-
но в цитоплазме):
TS-Sr + НАДФ-Я2 <---> 2 Г-SH + НАДФ [5-12]
Равновесие данной реакции сильно сдви-
нуто вправо. Поэтому неудивительно, что в
обычных условиях около 90% глутатиона на-
ходится в тканях в восстановленной форме.
По существу, этот трипептид выполняет
роль переносчика восстановительных эквива-
лентов в клетке. В данном случае — от
НАДФ-Я2 на Н2О2 (сумма уравнений [5-11] и
[5-12]). Мощность переносящей системы весь-
ма велика, учитывая довольно высокое содер-
жание Г-SH в клетках и достаточно обильное
образование молекул НАДФ-Я> в процессах
метаболизма. Звенья этой системы имеются во
всех тканях. Особенно важную роль глутати-
онпероксидаза играет в хрусталике глаза, где
отсутствует каталаза — другой из главных «раз-
рушителей» водородпероксида.
Глутатионпероксидаза ликвидирует окис-
лительный потенциал не только перекиси во-
дорода. В частности, она может восстанавли-
вать гидропероксиды полиненасыщенных
жирных кислот, возникающие на первой ста-
БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
195
дии биогенеза лейкотриенов (см. рис. 5-53) и
способные генерировать свободные радикалы
L-OO*. При этом гидропероксидная группа, на-
пример, эйкозатетраеноата (5-ГПЭТЕ) превра-
щается в обычную спиртовую группу, как это
видно на рис. 5-53 (реакция 5). Возникающий
5-гидрокси-эйкозатетраеноат (5-ГЭТЕ) хими-
чески довольно безопасен, но и лишен биоло-
гической активности лейкотриенов. Более того,
он способен снижать активность 5-липокси-
геназы. Этот аллостерический эффект позво-
ляет осуществлять регуляцию выработки
5-ГПЭТЕ и следующего за ней биосинтеза
лейкотриенов.
Многие вещества способны взаимодейст-
вовать с активными формами кислорода даже
без участия ферментов. Их принято называть
антиоксидантами. Обычно, подвергшись окис-
лению, они затем легко регенерируются благо-
даря наличию соответствующих редуктаз. Наи-
более известными антиоксидантами являются
широко распространенные восстановители -
аскорбиновая кислота. Г-SH, цистеин и т.п.
Другие из неферментных факторов анти-
оксидантной защиты устраняют АФК благода-
ря тому, что в результате взаимодействия сами
переходят в свободнорадикальную форму. За-
частую вновь образованные радикалы химиче-
ски более инертны. Потому их появление обры-
вает цепную реакцию или, по крайней мере,
сильно замедляет ее. Таков механизм антиокси-
дантного действия многих естественных мета-
болитов - «ловушек» для свободных радикалов.
К ним относятся мочевая кислота, билирубин,
некоторые аминокислоты, одно- и многоатом-
ные спирты (включая моносахариды). Появив-
шись, их радикальные формы в дальнейшем ли-
бо уничтожаются путем взаимодействия между
собой, либо исчезают в ходе обычных метабо-
лических процессов, либо нейтрализуются вос-
становителями типа аскорбиновой кислоты или
сульфгидрильных соединений.
Перечисленные антиоксиданты относятся
к числу водорастворимых. В гидрофобной фазе
биомембран роль «ловушек» для свободных
радикалов выполняют главным образом вита-
мины группы Е, включая а-токоферол (рис.
5-57), а также витамин А (см. рис. 2-11) и дру-
гие каротиноиды. Сохраняя антиоксидантные
свойства даже при высоком парциальном давле-
СН3
I 1 СН2-(СН2-СН2-СН-СН2)3-Н
н/у'сАж,
СНз
Рис. 5-57. Строение а-токоферола (витамин Е).
нии кислорода, витамин. Е играет особенно
важную роль в мембранах эритроцитов и клеток
дыхательных путей. Образуемые им радикалы
малоактивны и не реагируют с ненасыщенными
жирными кислотами. Этим объясняется эффек-
тивность витамина Е в защите от перекисного
окисления липидов.
5.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Обобщая современные представления о
биологическом окислении в организме челове-
ка и животных, можно сформулировать 3 глав-
ных аспекта.
1. Почти весь потребляемый кислород
утилизируется митохондриями. Здесь он ис-
пользуется для окисления небольшого набора
органических молекул, в которые преобразу-
ются пищевые вещества на начальных этапах
метаболизма. Механизм этого окисления сво-
дится к отнятию пары атомов водорода от
окисляемого субстрата и передачи их по сис-
теме транспорта электронов (и протонов) в ко-
нечном счете на молекулярный кислород с об-
разованием воды. Освобождаемая энергия «сго-
рания» водорода трансформируется в макроэр-
гические связи молекул АТФ (окислительное
фосфорилирование), которые и обеспечивают
все энергетические потребности клетки. При
необходимости перед отнятием водорода к суб-
страту присоединяется молекула воды. Это обо-
гащает субстрат кислородом и позволяет созда-
вать карбоксильные группы. Последующее от-
щепление их в виде СОг происходит без участия
систем биоокисления и ведет к образованию
второго (наряду с НгО) из конечных продуктов
метаболизма. Специфичность ферментов дыха-
тельных цепей обеспечивает строгую последо-
вательность чередования реакций дегидрогени-
рования, гидратации и декарбоксилирования.
Она обозначается как цикл трикарбоновых ки-
слот - источник основной массы АТФ в клетке.
196
Глава 5
2. Все остальные окислительные процес-
сы, кратко обозначаемые термином «внемито-
хондриальное окисление», используют не бо-
лее 10% потребляемого кислорода. Они беспо-
лезны в качестве источника энергии, ибо не
генерируют молекул АТФ (более того: многие
из них утилизируют водород НАДФ-772, кото-
рый мог бы быть использован в митохондриях
для выработки АТФ). Тем не менее, эти про-
цессы являются неотъемлемой частью метабо-
лизма, т.к. обеспечивают биогенез различных
молекул, требуемых для выполнения тех или
иных функций. Конкретные реакции внемито-
хондриального окисления очень многообраз-
ны. Одни ферменты (оксидазы и десатуразы)
отнимают водород у субстрата и передают его
непосредственно на О2 с образованием водо-
родпероксида или воды соответственно. Дру-
гие (монооксигеназы и диоксигеназы) вклю-
чают один или оба атома молекулы кислорода
в окисляемый субстрат. Среди последних осо-
бое место занимают липоксигеназы и циклоок-
сигеназы, которые внедряют О2 в высокогид-
рофобные молекулы полиеновых жирных ки-
слот. В целом же специфика внемитохоидри-
ального окисления обусловлена необходимо-
стью преобразования трудноокисляемых
структур, особенно чисто углеводородных. Ре-
зультатом такого преобразования становится
либо появление молекул с высокой биологиче-
ской активностью (стероидные гормоны, кате-
холамины, лейкотриены, простаноиды и т.д.),
либо разрушение слишком устойчивых моле-
кул (включая ксенобиотики) для облегчения их
удаления из организма (образование желчных
кислот; разрушение ароматических радикалов
аминокислот; инактивация биогенных аминов;
гидрофилизация ксенобиотиков).
3. Побочным продуктом реакций био-
окисления являются активные формы кислоро-
да (АФК), включая Н2О2 и свободные радика-
лы О2‘~ и НО'. В низких концентрациях они
нередко используются в качестве сигнальных
молекул, участвующих (возможно, в качестве
«дублеров») в регуляции многих процессов на
молекулярном и клеточном уровнях. Более вы-
сокие концентрации АФК оказывают повреж-
дающее действие на молекулы белков, нуклеи-
новых кислот, липидов биомембран. В умерен-
ных масштабах это имеет позитивное значение,
инициируя деградацию поврежденных струк-
тур и тем самым способствуя их обновлению.
Чрезмерная продукция АФК опасна для жизни.
Она используется лишь в фагоцитирующих
клетках для обеспечения их бактерицидной
активности и осуществления поствоспалитель-
ной репарации. В целом же предотвращение
безудержной гиперпродукции АФК и блокиро-
вание вызываемых ими цепных реакций обес-
печивают специальные механизмы антиокси-
дантной защиты. Ведущую роль играют фер-
менты: супероксиддисмутаза, каталаза и глута-
тионредуктазная система. Заметный вклад вно-
сит также неферментативная защита, основан-
ная на антиоксидантных свойствах тех естест-
венных метаболитов (и витаминов), которые
могут действовать как «ловушки» свободных
радикалов, переводящие их в более инертную
форму.
Глава 6
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
Взрослый человек ежесуточно потребляет
400-600 г углеводов. При их расщеплении до
СО2 и воды освобождаемая энергия составляет
7-10 тысяч кДж (1600-2400 ккал). Это пример-
но на 2/з покрывает энергетические потребно-
сти организма. Иными словами, при обычном
рационе пищевые углеводы являются ведущим
источником энергии для человека.
Наряду с энергетической, углеводы вы-
полняют и важную структурную роль, входя в
состав гликопротеинов, протеогликанов и иных
компонентов биомембран, межклеточного ве-
щества и других образований. Иначе эту функ-
цию называют пластической.
Наконец, третья из наиболее общих биоло-
гических функций — регуляторная - почти ис-
ключительно является прерогативой белковых
молекул (с их способностью «узнавать и реаги-
ровать»). Углеводы же в этом отношении име-
ют лишь вспомогательное значение. Можно
отметить, в частности, их вклад в создание и
функционирование рецепторов, антигенных
детерминант, других регуляторов метаболизма
и физиологических процессов. К тому же, хотя
углеводы и являются заменимым компонентом
пищи, их метаболические превращения важны
для нормального обмена белков (аминокислот)
и, особенно, липидов.
6.1. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА УГЛЕВОДОВ
Само название этого класса веществ вос-
ходит к началу становления органической хи-
мии и биохимии. Оно отражает соотношение
углерода, водорода и кислорода в таких соеди-
нениях (1:2:1) и сохраняется даже после того,
как выяснились различные отклонения. В част-
ности, состав крахмала почти в точности вы-
ражается формулой (C6Hi0O5)n; в структуре ря-
да других полисахаридов часть атомов кисло-
рода заменена азотом, и т.д.
Современное определение углеводов мож-
но сформулировать следующим образом.
Углеводы (сахара) — это класс органиче-
ских молекул, включающий моносахариды
и вещества, гидролизуемые до моносаха-
ридов.
Моносахариды представляют собой аль-
дегиды или кетоны многоатомных спир-
тов. Их называют соответственно аль-
дозами и кетозами.
Формулы некоторых моносахаридов пока-
заны на рис. 6-1. Здесь приведены простейшие
моносахариды — триозы глицеральдегид и ди-
гидроксиацетон, а также гексозы глюкоза и
фруктоза.
В молекуле глицеральдегида предпослед-
ний атом углерода (счет ведут со стороны кар-
бонильной группы) оптически асимметричен.
То же относится ко всем остальным альдозам и
кетозам (кроме дигидроксиацетона). По сте-
реоконфигурации этого атома различают моно-
сахариды D-ряда и L-ряда.
198
Глава 6
н-’с=о
н-с-он
н-с-он
н
D-Глицеральдегид
Н
1
Н-С-ОН
I
с=о
н-с-он
н
Дигидроксиацетон
Н-С=О
н-с-он
но-<р-н
н-с-он
н-с-он
б!
н-с-он
I
н
н
н-с-он
НО-С-Н
н-с-он
н-с-он
н-с-он
н
Бывшая альдегидная группа превращается
в гидроксильную, которая пролучила специ-
альное обозначение — полуацетальный гидро-
ксил. Он тоже обладает повышенной реактив-
ностью. В частности, взаимодействие со спир-
том (происходящее с выделением молекулы
Н2О) приводит к превращению полуацеталя (I)
в полный ацеталь (II):
R"
I
ОН R" о-сн2
НС-О-СН2 + НО-СН2------НС-О-СН2 [6-2]
। । л । ।
R R' R R'
I II
D-Глюкоза
D-Фруктоза
Рис. 6-1. Строение некоторых моносахаридов.
С увеличением числа углеродных атомов в
молекуле моносахарида растет и количество
центров асимметрии. При этом в геометриче-
ской прогрессии нарастает число возможных
стереоизомеров. У альдогексоз (4 асимметрич-
ных углерода) их численность достигает 24=16
(половина из них относится к D-ряду). Кетозы
содержат на 1 центр асимметрии меньше, чем
их альдегидные аналоги. Поэтому для кетогек-
соз возможны 23=8 стереоизомеров, из которых
только один (D-фруктоза) довольно распро-
странен в живой природе. У альдогексоз тоже
далеко не все стереоизомеры используются
живыми организмами. Кроме глюкозы (сильно
преобладающей среди природных моносахари-
дов), широко представлены в животном мире
лишь манноза и галактоза (они отличаются от
глюкозы положением группы -ОН при 2-м и
4-м атоме углерода соответственно).
Кетонной и, особенно, альдегидной группе
присуща высокая химическая активность, спо-
собность спонтанно реагировать с подходящи-
ми веществами. В том числе - со спиртами,
при взаимодействии с которыми альдегид пре-
вращается в полуацеталь:
ОН
I
нс=о + но-сн2 — 1 1 > нс-о-сн2 1 1 [6-1]
R R' 1 1 R R
Важной особенностью моносахаридов с
пятью или более атомами углерода является то,
что их карбонильная группа может реагировать
не только с другими спиртами, но и с гидро-
ксильной группой собственной молекулы.
Этому способствует изогнутость углеродной
цепочки и ее подвижность. Например, у гексо-
зы вблизи альдегидной группы легко оказыва-
ется гидроксильная группа при 5-м углеродном
атоме. Взаимодействие между ними ведет к
образованию полуацеталя внутри молекулы -
внутреннего полуацеталя. В итоге альдегидная
(линейная) форма, например, глюкозы перехо-
дит в полуацетальную (циклическую) форму,
имеющую строение шестичленного кольца пи-
ранозы (рис. 6-2).
н-с-о
н-с-он
но-с-н
н-с-он
н-с-он
Н2С-ОН
D-Глюкоза (альдегидная форма)
H-CzpH
•I
н-с-он>
.1 I
НО-С-Н о
Н-С-ОН I
.1
н-с—
н2с-он
н2с-он
P-D-Глюкопираноза
a-D-Глюкопираноза
Рис. 6-2. Линейная и циклические (аномерные)
формы D-глюкозы.
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
199
При переходе альдоз в циклическую фор-
му химическая реактивность альдегидной
группы резко ослабевает и молекула становит-
ся гораздо более стабильной. Но возникший
полуацетальный гидроксил (в кетозах - полу-
кетальный) все же остается значительно более
активным, чем остальные спиртовые группы
той же молекулы. Поэтому в различных реак-
циях моносахариды участвуют прежде всего
своим полуацетальным гидроксилом.
Кроме того, превращение линейной формы
в циклическую приводит к появлению нового
центра оптической асимметрии, каковым ста-
новится углерод бывшей альдегидной (или ке-
тонной) группы. Возникают два аномера, кото-
рые обозначаются буквами а и р (в приведен-
ном примере - a-D-глюкопираноза и P-D-глю-
копираноза). Они легко переходят друг в Друга
через альдегидную форму (рис. 6-2).
Аномеры существенно различаются по
удельному вращению плоскости поляризован-
ного луча. Если растворить в воде кристаллы
одного из них, то угол вращения будет посте-
пенно изменяться, пока не установится (спустя
часы) постоянное значение, отражающее рав-
новесие между всеми формами моносахарида.
Это явление назвали муторотацией. В равно-
весных растворах D-глюкозы преобладает
p-форма (~63%) при ничтожной доле альдегида
(0,024%). Эта особенность имеет важное био-
логическое значение: она мешает проявлению
химической «агрессивности» альдегидной
группы, сильно ограничивает участие моноса-
харидов в процессах параметаболизма (так
с недавних пор стали обозначать совокупность
неферментативных реакций в организме, вно-
сящих своеобразный вклад в судьбу многих
органических веществ, особенно белков).
В названиях циклических форм альдогексоз
указание на их пиранозное строение обычно
опускают из-за неустойчивости (и почти полно-
го отсутствия) фуранозной формы, пятичленное
кольцо которой образуется в реакции альдегид-
ной группы с группой -ОН при 4-м атоме угле-
рода. Напротив, циклические формы кетогексоз,
включая D-фруктозу (рис. 6-3), а также всех
альдопентоз существуют в биологических
структурах только в виде фуранозных колец.
На рис. 6-2 аномеры глюкозы D-глюкозы
приведены (ради наглядности) в написании,
давно уже ставшем архаичным. Чаще всего те-
перь используют способ, который предложил
У.Хеуорс. При этом циклические структуры
моносахаридов даются в перспективном изо-
бражении в виде шести- и пятиугольников.
Подразумевается, что они лежат в плоскости,
перпендикулярной рисунку, а ближние к чита-
телю связи выделяют большей толщиной ли-
ний. Ниже плоскости кольца помещают замес-
тители, которые прежде располагали с правой
стороны (как на рис. 6-2), а выше - те, что
раньше показывали слева от вертикального ос-
това молекулы моносахарида. Исключение со-
ставляют лишь заместители при том углеродном
атоме, гидроксильная группа которого вовлече-
на в формирование внутреннего полуацеталя.
В частности, у гексоз D-ряда концевую группу -
СН2ОН (в положении 6) помещают выше плос-
кости кольца, а не ниже. Углеродные атомы
кольца обычно не прописывают, равно как и
принадлежащие им атомы водорода.
С учетом этих правил, формула a-D-глю-
козы в проекции Хеуорса выглядит так, как она
показана на рис. 1-25. Там же (и на рис. 2-2)
приведены и формулы ряда других моносаха-
ридов (но не D-фруктозы, — ее формулы по
Хеуорсу представлены на рис. 6-3).
Н2С-ОН
с=о
но-с-н
н-с-он
н-с-он
Н2С-ОН
D-Фруктоза
(кето-форма)
ноЪн, ,о 'сн2он
4| <
он
a-D-Фруктофураноза
ОН
P-D-Фруктофураноза
Рис. 6-3. Кето-форма D-фруктозы и проекционные
формулы (по Хеуорсу) ее фуранозных аномеров.
200
Глава 6
Полуацетальный (полукетальный) гидро-
ксил моносахарида легче других реагирует со
спиртовой группой какого-либо вещества (с
выделением молекулы воды). Образующийся
полный ацеталь (кеталь) обозначают термином
гликозид, а возникшую при этом связь назы-
вают гликозидной. Для конкретизации прореа-
гировавшего моносахарида используют его на-
звание, изменяя окончание на «-озид»: глюко-
зид, галактозид, фруктозид и т.д.
Если спиртовый фрагмент, вошедший в со-
став гликозида, не относится к углеводам, то его
называют агликоном. Такие вещества встре-
чаются среди лекарств растительного происхож-
дения. Например, уабаин (один из гликозидов,
влияющих на работу сердца) в качестве аглико-
на содержит стерол определенного строения.
Несопоставимо чаще гликозидная связь
возникает между молекулами углеводов. При
этом полуацетальный (полукетальный) гидро-
ксил одного моносахарида соединяется с таким
же, но обычно - с иным гидроксилом другой
молекулы моносахарида. Так образуются диса-
хариды и более крупные молекулы олиго- и
полисахаридов.
Одним из существенных последствий фор-
мирования гликозидной связи становится не-
возможность перехода циклической формы мо-
носахарида в альдегидную (кетонную). Иными
словами, это событие фиксирует молекулу в
виде а- либо p-аномера. Их строго различают
ферменты, катализирующие образование или
гидролиз таких связей. В качестве примера на
рис. 6-4 приведены формулы ряда дисахаридов.
Синтезируемая в молочной железе лактоза
представляет собой рТ)-галактозидо-(1—>4)-D-
глюкозу и потому может расщепляться
Р-галактозидазой (до галактозы и глюкозы), но
не а-галактозидазой. Мальтоза, в которой два
остатка D-глюкозы соединены а-(1—>4)-глико-
зидной связью, гидролизуется только под дей-
ствием а-глюкозидазы (мальтазы). Сахароза,
объединяющая a-D-глюкозид и p-D-фруктозид,
легко гидролизуется как мальтазой (КФ
3.2.1.20), так и p-фруктозидазой (инвертаза, КФ
3.2.1.26), встречающейся в растениях, грибах и
бактериях. Наконец, целлобиоза, в которой два
остатка D-глюкозы соединены р-(1—>4)-глико-
зидной связью, неподвластна ни одному из пе-
речисленных ферментов.
Названные дисахариды (кроме сахарозы)
сохраняют в одном из моносахаридных фраг-
ментов свободную полуацетальную группу.
Поскольку она обладает свойствами восстано-
вителя, такой фрагмент называют редуцирую-
щим (в отличие от нередуцирующего звена, по-
луацетальный гидроксил которого вовлечен в
гликозидную связь).
Углеводы, молекула которых содержит от
3 до 20 моносахаридных звеньев, принято на-
зывать олигосахаридами. В свободном виде
встречаются редкие из них (в основном триса-
хариды). Как правило, они являются составной
частью гликопротеинов (или гликолипидов), и
Сахароза
[а-( 1 ->2)-О-гпюкозидо-(3-О-фруктозид]
Лактоза
[р-( 1 ->4)-D-rana ктозидо-D-rr кжоза ]
Мальтоза
[а-(1->4)-0-ткжозидо-0-гл кжоза]
Целлобиоза
[(3-( 1 —>4)-D-rn юкозидо-D-rn кжоза]
Рис. 6-4. Строение важнейших дисахаридов.
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
201
потому краткая характеристика их дана в раз-
деле 1.13.2.
Высокополимерные углеводы могут быть
построены из одинаковых или различных мо-
носахаридных звеньев. Соответственно их обо-
значают как гомополисахариды и гете-
рополисахариды. Последние сосредоточе-
ны у животных преимущественно в межкле-
точном веществе и будут рассмотрены в главе
10 (раздел 10.3.2).
Гомополисахариды количественно преоб-
ладают в природе, особенно те, что построены
из D-глюкозы. К ним относятся крахмал, гли-
коген и целлюлоза (клетчатка).
Крахмал - это главный пищевой углевод
человека и многих животных. Будучи резерв-
ным (запасным) сахаром растений, он накапли-
вается преимущественно в семенах, включая
зерна злаков и клубни картофеля,-где его со-
держание доходит соответственно до 75 и 25%.
Природный крахмал неоднороден. Меньшая
доля (обычно 10-20%) приходится на раство-
римую в воде амилозу. Ее молекулы пред-
ставляют собой линейную цепь из сотен остат-
ков D-глюкозы, соединенных а-(1—^-глико-
зидными связями. Значит, концевые ее звенья
сохраняют свободным либо полуацетальный
гидроксил (редуцирующий конец цепи), либо
только остальные группы —ОН (нередуцирую-
щий конец). По пространственной конфигура-
ции молекула амилозы похожа на спираль.
Вся остальная часть крахмала представле-
на амилопектином. Его молекула, во-пер-
вых, в 10-100 раз крупнее амилозы и, во вто-
рых, сильно разветвлена. В линейных участках
глюкозные звенья соединяются так же, как и в
амилозе. А в точке ветвления остаток глюкозы,
соединенный а-(1,4)-связями с двумя соседни-
ми. «предоставляет» еще и 6-й атом углерода
(точнее, его группу -ОН) для взаимодействия с
полуацетальным гидроксилом той глюкозы,
которая становится началом «боковой» веточки
(рис. 6-5). Такие веточки появляются через ка-
ждые 25-30 мономерных звеньев. Более того,
каждая из них, в свою очередь, тоже разветвля-
ется (примерно с той же частотой). Этим обес-
печивается компактность огромной молекулы
полимерного углевода.
Амилопектин нерастворим в воде, но спо-
собен связывать ее, подвергаясь набуханию
(этим обусловлено образование клейстера по-
сле нагревания взвеси крахмала).
Гликоген содержится в основном в пе-
чени (до 5-10% сырого веса) и мышцах (обыч-
но 1-2%). Он выполняет роль резервного поли-
сахарида у животных («животный крахмал»).
По строению и молекулярной массе близок
амилопектину. Главное отличие заключается в
гораздо большей степени разветвленности: дли-
на линейных участков не превышает десятка —
полутора моносахаридных звеньев. Благодаря
этому усиливается компактность молекулы, а на
ее поверхности возрастает число концевых ве-
точек (которые, как и у амилопектина, являются
нередуцирующими). Такая структура позволяет,
в случае необходимости, освобождать сразу
много глюкозы (путем поочередного отщепле-
ния концевых мономеров), а при избытке моно-
сахарида — быстро наращивать длину поверхно-
стных «веточек» (и разветвлять их), отклады-
Рис. 6-5. Точка ветвления в молекулах амилопектина и гликогена.
202
Глава 6
вая углеводы про запас. О реальности этих
процессов свидетельствуют большие колеба-
ния величины молекул. Для животных интен-
сивность депонирования и, особенно, срочной
мобилизации энергетически значимых углево-
дов играет жизненно необходимую роль.
Целлюлоза является важнейшим струк-
турным полисахаридом растений. Будучи глав-
ным компонентом клеточных стенок, она со-
ставляет около 50% всей биомассы Земли (дре-
весина, листья, стебли растений и т.д.). Моле-
кулы этого совершенно нерастворимого поли-
сахарида подобны амилозе, но в десятки раз
крупнее. Они имеют вытянутую форму и со-
единяются бок о бок посредством водородных
связей, образуя длинные волокнистые структу-
ры. Однако принципиальные отличия обуслов-
лены тем. что мономеры соединены здесь не а-,
а 0-(1—*4)-глюкозидными связями. Это делает
целлюлозу недоступной для ферментов пище-
варительного тракта, - как и другие полисаха-
риды растительных волокон (гемицеллюлозы),
в которых р-гликозидными связями соединены
остатки арабинозы, галактозы, ксилозы, манно-
зы или иного моносахарида. Все эти полимеры
не усваиваются животными, кроме раститель-
ноядных (включая термитов, саранчу и т.п.). В
частности, у жвачных начальный отдел много-
камерного желудка (рубец) является средой
обитания целого симбиоза микробов, часть ко-
торых секретирует целлюлазу и целлобиазу. В
итоге клетчатка подвергается гидролизу до ди-
сахаридных фрагментов (целлобиозы), а затем
и до глюкозы. Последняя могла бы всасываться
в кишечнике. Однако реально микрофлора
расщепляет и ее (для обеспечения собственной
жизнедеятельности). Поэтому организм хозяи-
на получает (и усваивает) в основном продукты
более глубокой переработки углеводов, - глав-
ным образом, молочную, уксусную и иные ор-
ганические кислоты.
6.2. ПЕРЕВАРИВАНИЕ И ВСАСЫВАНИЕ
УГЛЕВОДОВ
Понятия «обмен веществ» и «метаболизм»
обычно отождествляют. Между ними, однако,
можно провести достаточно четкую грань. Ме-
таболизм - это совокупность химических пре-
вращений различных веществ внутри организ-
ма, осуществляемых при участии ферментов.
Обмен веществ - понятие, гораздо более широ-
кое. Оно включает еще и процессы поступления
веществ, их транспорта внутри организма, де-
понирования (если надо) и выведения наружу;
нередко все это вообще не сопровождается хи-
мическими преобразованиями (самый оче-
видный пример - судьба многих минеральных
солей). Не стоит относить к метаболизму и про-
цессы переваривания пищевых веществ, по-
скольку протекают они, хотя и с участием сек-
ретируемых организмом ферментов, но — в той
части внешней среды, которую составляет со-
держимое пищеварительного тракта (включаю-
щее, к тому же, и микрофлору со свойственны-
ми именно ей биохимическими процессами).
Пища человека (и животных) содержит
большое разнообразие органических веществ,
многие из которых обладают видовой специ-
фичностью (особенно белки). В основном они
построены из стандартного набора более про-
стых молекул (мономеров), одинаковых во
всей живой природе. Это - 20 а-аминокислот
L-ряда; моносахариды (многие из них изомер-
ны друг другу); наконец, глицерин, сфингозин,
холестерол и серия высших жирных кислот. Из
них формируются белки, полисахариды и ли-
пиды, в которых структурные единицы соеди-
нены соответственно пептидными, гликозид-
ными и эфирными связями. Гидролитическое
расщепление этих связей протекает сравни-
тельно легко и не сопровождается значитель-
ным перепадом энергии.
Отсюда становится ясным биологический
смысл процессов переваривания пищи: расще-
пить крупные молекулы до небольших струк-
турных единиц, способных всасываться (про-
никать в клетки), но лишенных видовой спе-
цифичности и сохраняющих практически весь
запас химически связанной энергии пищевых
веществ. Эта триединая задача и решается бла-
годаря тому, что все пищеварительные фер-
менты способны осуществлять только реакции
гидролиза. Иными словами, они могут (с уча-
стием воды) расщеплять только связи между
структурными мономерами в олиго- и поли-
мерных молекулах пищи.
Набор ферментов, осуществляющих пере-
варивание углеводов, невелик. Он включает
ряд амилаз и дисахаридаз.
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
203
В секрете слюнных желез содержится во-
обще только один из всех пищеварительных
ферментов. Это — а-амилаза слюны. Она гид-
ролизует а-(1—>4)-глюкозидные связи в глуби-
не молекул крахмала и гликогена, т.е., отно-
сится к зндогидролазам. Связи атакуются в
случайном порядке. Поэтому образуется смесь
более или менее крупных обломков, которые
издавна называют декстринами. Чем дольше
воздействие фермента, тем меньше размеры
образующихся декстринов. Самая маленькая
молекула, на которую еще может действовать
слюнная амилаза, должна содержать не менее
трех а-глюкозидных связей. Фермент может
расщепить ее на две молекулы мальтозы или
(реже) на глюкозу и трисахарид. Поэтому при
недолгом воздействии слюнной амилазы поли-
сахариды расщепляются в основном до декст-
ринов, а при длительном - преимущественно
до мальтозы (и небольшого количества глюко-
зы и мальтотриоз). Фермент активируется мно-
гими катионами и анионами, но наибольший
эффект оказывают ионы СГ.
Во рту пища находится недолго. Поэтому
действие слюнной амилазы (и различных мик-
робных гликозидаз) очень кратковременно. Оп-
тимум pH для нее - около 7. В желудке фер-
мент не только не может функционировать, но
и денатурируется сильнокислой средой; неко-
торое время действие его еще продолжается в
глубине пищевого комка.
Поскольку собственных гликозидаз в же-
лудочном соке нет, дальнейшее переваривание
углеводов происходит в тонкой кишке (содер-
жимое которой нейтрализует соляную кислоту
желудочного сока). Здесь панкреатическая
а-амилаза возобновляет гидролиз оставшихся
непереваренными полисахаридов и декстринов.
Имея возможность более длительного воздей-
ствия на пищевую кашицу, она расщепляет эти
полимеры в основном до мальтозы. Кроме то-
го, при гидролизе связей по соседству с точка-
ми ветвления образуются также молекулы а-
(1 —>6)-глюкозидо-глюкозы (именуемой изо-
мальтозой).
Действие амилаз продолжают и дополня-
ют гликозидазы, имеющиеся в кишечном соке
и на микроворсинках кишечного эпителия:
- амило-(1—>6)-глюкозидаза, обеспечиваю-
щая расщепление а-(1—»6)-глюкозидных связей
в точках ветвления молекул гликогена и ами-
лопектина (эту эндогидролазу называют еще
«отстригающая веточки»);
- олиго-(1—>6)-глюкозидаза (изомальтаза),
которая гидролизует а-(1—>6)-глюкозидную
связь в декстринах, происходящих из гликоге-
на и амилопектина, а также в изомальтозе (рас-
щепляемой до двух молекул глюкозы);
- а-глюкозидаза (мальтаза), избирательно
разрывающая а-(1—>4)-глюкозидную связь, са-
мую близкую к нередуцирующему концу оли-
госахаридов; последовательно отщепляя по
одному моносахариду, эта зкзогидролаза обес-
печивает полный распад неразветвленных уча-
стков внешних а-(1—>4)-цепей до глюкозы; в
соответствии со своей специфичностью фер-
мент гидролизует также дисахариды мальтозу
и сахарозу;
- сахараза; к природным субстратам этой
а-глюкозидазы относятся сахароза (расщеп-
ляемая на глюкозу и фруктозу) и мальтоза
(гидролизуемая до глюкозы);
- лактаза (^-галактозидаза), катализирую-
щая гидролиз р-гликозидной связи в лактозе (с
образованием галактозы и глюкозы) и в моле-
кулах многих других p-D-галактозидов и даже
P-D-глюкозидов (в частности, в целлобиозе);
- трегалаза, которая абсолютно специфич-
на в отношении трегалозы - необычного диса-
харида с гликозидной связью, образованной
полуацетальными гидроксилами обеих D-глю-
коз (в их a-форме); встречается у низших орга-
низмов (включая грибы и насекомых).
Хотя целлюлоза и ее аналоги не представ-
ляют питательной ценности для человека и
многих животных, роль их в пищеварении не-
маловажна. Эти балластные вещества, напол-
няя кишечник, стимулируют его перистальтику
и, следовательно, продвижение кишечного со-
держимого. Кроме того, они полезны в качест-
ве сорбента для различных токсичных продук-
тов, в том числе микробного происхождения, и
способствуют их выведению из организма. Со-
временная пищевая промышленность постав-
ляет все более рафинированные продукты пи-
тания, и поэтому появились специальные пре-
параты измельченной целлюлозы, предназна-
ченные для компенсации недостатка клетчатки
в рационе человека (иногда их рекламируют
как средства для «очищения» организма).
204
Глава 6
Совокупное воздействие всех упомянутых
гликозидаз пищеварительных соков приводит к
расщеплению усвояемых углеводов в конечном
счете до моносахаридов. Львиную долю их со-
ставляет глюкоза- Среди остальных преобла-
дают гексозы, представленные в основном
фруктозой и галактозой.
Процесс поступления продуктов перевари-
вания из кишечника во внутреннюю среду ор-
ганизма называется всасыванием. Осуществля-
ется оно главным образом в тонком кишечни-
ке. Из углеводов способны всасываться только
моносахариды. Многие из ннх преодолевают
барьер, каковым является слизистая оболочка,
путем простой диффузии. Для наиболее важ-
ных моносахаридов известны специальные пе-
реносчики в виде белковых молекул, которые
облегчают транспорт, связываясь с углеводом
на одной стороне мембраны энтероцитов и
освобождаясь от него на другой (происходит
это благодаря конформационным изменениям
переносчика, без формирования трансмем-
бранных пор). Механизм облегченного транс-
порта действует тоже по градиенту концентра-
ции, но заметно ускоряет процесс всасывания.
Наконец, существует и механизм активного
транспорта, который становится важным при
низкой концентрации моносахаров в химусе.
Наиболее изучен он для глюкозы, галактозы и
фруктозы. Поступление их в энтероцит из про-
света кишки против градиента концентрации
происходит за счет энергии движения ионов
Na+ в том же направлении, но по градиенту
концентрации. В свою очередь, ионный гради-
ент создается работой Иа+,К+-АТФазы, кото-
рая, гидролизуя АТФ, использует освобождае-
мую энергию для переноса Na+ в просвет киш-
ки (и ионов К+ - в обратном направлении).
Попавшие в энтероцит моносахара посту-
пают затем путем простой или облегченной
диффузии почти исключительно в кровь и по
системе воротной вены попадают прежде всего
в печень. Здесь значительная часть их превра-
щается в гликоген и откладывается про запас.
В состоянии натощак преобладает обратный
процесс: гликоген по мере надобности расщеп-
ляется до глюкозы, которая поступает в общий
кровоток и утилизируется всеми остальными
клетками. Благодаря тонкой регуляции метабо-
лизма углеводов, в плазме крови поддержива-
ется довольно стабильный уровень глюкозы
(3,8-6,1 мМ натощак, в покое), несмотря на ин-
тервалы в приеме пищи и резкие перепады в
энергозатратах организма.
Важно отметить, что в слизистой оболочке
кишки, в печени и других тканях есть фермен-
ты, обеспечивающее обратимые взаимопревра-
щения моносахаридов. В частности, фруктоза,
галактоза и манноза легко преобразуются в
глюкозу (подробности приведены в разделе
6.4.1). Поэтому не будет значимой погрешно-
стью утверждать, что во внутреннюю среду ор-
ганизма все углеводы поступают в виде глюко-
зы. А отсюда следует, что весь метаболизм уг-
леводов сводится, по существу, к различным
путям преобразования именно глюкозы. На-
чальную стадию каждого из них осуществляет
гексокиназа.
6.3. ГЕКСОКИНАЗНАЯ РЕАКЦИЯ
Практически единственное ферментатив-
ное превращение, которому подвергается глю-
коза в наших клетках, - это реакция фосфори-
лирования с участием АТФ (рис. 6-6, А). Ката-
лизирует ее гексокиназа, имеющаяся в любой
клетке. Она осуществляет перенос концевого
фосфата АТФ в положение 6 глюкозы. Таким
образом, образование первого метаболита глю-
козы - глюкозо-6-фосфата - происходит за
счет энергии разрыва макроэргической связи в
молекуле АТФ. Поэтому гексокиназная реак-
ция необратима.
Биологический смысл ее многозначен. Пре-
жде всего - «расшатать», расслабить довольно
симметричную и устойчивую структуру цикли-
ческой формы глюкозы; введением фосфатной
группы сделать молекулу более податливой к
новым воздействиям и тем самым облегчить
дальнейшие преобразования моносахарида.
Во-вторых - удержать, «запереть» глюкозу
внутри клетки, ибо, в отличие от самой глюко-
зы, глюкозо-6-фосфат (ГлбФ) не может прони-
кать через клеточные мембраны. Тем самым
создаются условия для дальнейшего метабо-
лизма глюкозы, поступившей в клетку.
Однако, некоторые ткани содержат актив-
ную глюкозо-Ь-фосфатазу (ГлбФаза), способ-
ную гидролитически отщеплять фосфат. Осво-
бождая глюкозу, фермент как бы преодолевает
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
205
D-глюкоза (в а-форме) D-глюкозо-б-фосфат (ГлбФ)
Рис. 6-6. Реакции, катализируемые гексокиназой (А)
и глюкозо-6-фосфатазой (Б).
необратимость гексокиназной реакции. Вместе
с тем, АТФ при этом не регенерируется! Сле-
довательно, ГлбФаза катализирует не реакцию,
обратную гексокиназной (да это и невозмож-
но), а совершенно другую реакцию, но приво-
дящую к реставрации глюкозы (рис. 6-6, Б).
Такого рода окольный процесс, нуждающийся
в участии отдельного фермента, принято обо-
значать термином обходной обратный
путь.
Способность «обходить» гексокиназную
реакцию наиболее важна в гепатоцитах. Как
уже отмечалось, в промежутках между прие-
мами пищи в печени преобладает распад гли-
когена. Молекулы ГлбФ, образующиеся при
этом (а также при биосинтезе из небольших
молекул типа ПВК), легко расщепляются
ГлбФазой, а образующаяся глюкоза поступает
в кровь для питания остальных клеток. Доста-
точно богаты этим ферментом также энтероци-
ты и клетки почек, которые тоже способны
синтезировать ГлбФ из более простых молекул,
а затем отдавать полученную глюкозу в кровь.
Вместе с тем, в мышцах, мозгу и жировой тка-
ни ГлбФаза отсутствует, и потому ГлбФ (обра-
зующийся здесь в основном из «внешней»
глюкозы) эти клетки утилизируют сами, не от-
давая сахар в кровь.
В-третьих, гексокиназная реакция, будучи
начальной, является к тому же ключевым зве-
ном всего метаболизма глюкозы, выполняя и
лимитирующую, и регуляторную роль.
Лимитирующая роль обусловлена кине-
тическими свойствами гексокиназы. Как уже
отмечалось (раздел 4.12.3), исключительно вы-
сокое сродство к глюкозе (Км порядка 0,01 мМ)
«вынуждает» гексокиназу функционировать с
максимально возможной для нее скоростью.
А этот параметр гораздо ниже, чем Vmax любого
другого фермента катаболизма глюкозы (в рас-
чете на их содержание в клетке). Отсюда
следует, что суммарная скорость всех даль-
нейших путей метаболизма глюкозы не может
превышать величину V^, присущую гексо-
киназе.
Единственное исключение - печеночные
клетки, где, наряду с гексокиназой (ГК), есть
еще ее изофермент глюкокиназа (см. раздел
4.12.3). Обладая в 1000 раз меньшим сродством
к глюкозе (Км ~ 20 мМ), он перерабатывает
дополнительные количества ее практически
только на высоте пищеварения, когда резко
возрастает содержание этого моносахарида в
притекающей к печени крови воротной вены.
Следует отметить, что глюкокиназа обнаруже-
на и в 0-клетках островков Лангерганса подже-
лудочной железы. Полагают, что здесь она уча-
ствует в модулировании секреции инсулина.
Регуляторная роль ГК реализуется по
принципу обратной связи. Аллостерические
свойства фермента таковы, что непосредствен-
ный продукт реакции (ГлбФ) является ингиби-
тором своего фермента. Если дальнейшая ути-
лизация этого продукта почему-либо уменьша-
ется, то накапливающийся избыток его тормо-
зит гексокиназу, т.е., замедляет использование
новых порций поступающей глюкозы (глюко-
киназа избытком ГлбФ не угнетается)
Итак, гексокиназная реакция является пер-
вым звеном утилизации пищевых углеводов
клетками. Затем происходит разветвление пу-
тей метаболизма. Часть из них направлена на
реализацию структурной роли сахаров. Неред-
ко они начинаются с модификации глюкозы (и
других моносахаридов) с тем, чтобы сформи-
ровать те варианты мономерных звеньев, кото-
рые необходимы для дальнейшего синтеза раз-
нообразных олиго- и полисахаридных струк-
тур. Однако основная масса глюкозо-6-фосфата
используется далее в энергетическом метабо-
лизме, подвергаясь распаду сразу же либо по-
сле дополнительного фосфорилирования. В не-
которых клетках часть глюкозо-6-фосфата
временно выводится в резерв, - для создания
запасов гликогена. Обобщая, можно выделить
4 разных направления дальнейшего метабо-
лизма глюкозо-6-фосфата:
- биогенез структурных углеводов;
— синтез гликогена (и его распад);
206
Глава 6
- гексозомонофосфатный пугъ (ГМФ-
путь);
- гексозобисфосфатный путь (ГБФ-путь).
Именно в такой очередности целесообраз-
но рассмотреть важнейшие аспекты всего угле-
водного обмена в целом.
6.4. РЕАКЦИИ БИОГЕНЕЗА
СТРУКТУРНЫХ УГЛЕВОДОВ
Олигосахариды и структурные полисаха-
риды позвоночных представляют собой гете-
рополимерные цепи. Для их биосинтеза необ-
ходим поэтому определенный набор разных
моносахаридов, а также ряда их производных.
Все они могут формироваться из единого ис-
точника - пищевой глюкозы. Ферменты легко
превращают ее в другие моносахара, часть ко-
торых (как и сама глюкоза) подвергается кова-
лентной модификации. При этом конечный
продукт, как правило, оказывает угнетающее
действие на один из ранних ферментов своего
биогенеза. Система таких обратных связей
обеспечивает эффективную саморегуляцию и
требуемого спектра мономерных единиц, и
поддержания их концентраций на уровне, не-
обходимом для построения структурных гли-
кополимеров.
6.4.1. ВЗАИМОПРЕВРАЩЕНИЯ МОНОСАХАРИДОВ
Преобразование глюкозы в иные моноса-
хариды является процессом обратимым. По-
этому оно может использоваться не только для
выработки ее аналогов, но и, наоборот, в целях
трансформации в глюкозу других сахаров, вса-
сываемых в кишечнике.
Взаимопревращения гексоз и пентоз тре-
буют множества промежуточных реакций, сре-
ди которых центральное место занимает пен-
тозофосфатный цикл. Он выполняет и другие
специфические функции, из-за чего логичнее
рассмотреть его отдельно (раздел 6.6).
Гораздо проще осуществляются взаимопе-
реходы гексоз: глюкозы, ее стереоизомеров
(галактоза, манноза) и изомерной ей фруктозы.
Один из способов таких преобразований -
изомеризация. Ей подвергается, однако, не са-
ма глюкоза, а ее фосфорилированные формы.
В частности, уже упоминавшийся ГлбФ под
действием фосфогексоизомеразы обратимо
превращается во фруктозо-6-фосфат. Послед-
ний с участием фосфоманноизомеразы преоб-
разуется в маннозо-6-фосфат (тоже обратимо).
Оба метаболита могут гидролизоваться с осво-
бождением фруктозы и маннозы, но в основ-
ном используются в других путях метаболизма,
включая синтез олигосахаридов.
Несколько сложнее протекает обратный
процесс - преобразование фруктозы и манно-
зы, всасываемых в кишечнике, в глюкозу. Его
начальной стадией является фосфорилирование
этих гексоз. С маннозой это осуществляет та
же гексокиназа, которая воздействует на глю-
козу (см. рис. 6-6, А). Образующийся маннозо-
6-фосфат может вступать в только что упомя-
нутые обратимые реакции, превращаясь во
фруктозо-6-фосфат и, далее, в ГлбФ, при необ-
ходимости гидролизуемый до глюкозы и фос-
фата (см. рис. 6-6, Б).
Свободная фруктоза может преобразовы-
ваться в глюкозу разными путями. Лишь в
мышцах и почках начальное превращение ее во
фруктозо-6-фосфат может осуществляться все
той же гексокиназой. Основная же масса пище-
вой фруктозы подвергается воздействию
фруктокиназы печени. Этот фермент совсем
неактивен в отношении глюкозы, но с высоким
сродством фосфорилирует фруктозу, причем, в
положении 1. Кроме того, в отличие от гексо-
киназы, фруктокиназа нечувствительна к из-
бытку своего продукта, а также к гормональ-
ной регуляции со стороны инсулина (поэтому
утилизация пищевой фруктозы не нарушается
при сахарном диабете).
Дальнейшие превращения фруктозе-1-фос-
фата подобны реакциям начального этапа ГБФ-
пути (они показаны на рис. 6-22). Сначала аль-
долаза печени расщепляет этот гексозофосфат
на 2 триозы, одна из которых сохраняет фос-
фатную группу, а другая подвергается фос-
форилированию триозокиназой. Затем обе
фосфотриозы конденсируются под действием
той же альдолазы, образуя фруктозо-1,6-бис-
фосфат. Он является промежуточным мета-
болитом ГБФ-пути распада глюкозы и может
либо расщепляться далее, либо превращаться в
глюкозо-6-фосфат, а затем в глюкозу (см. рис.
6-6, Б). Врожденная недостаточность фрукто-
киназы, триозокиназы или упомянутой альдо-
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
207
D-глюкозо-б-фосфат
D-глюкозсМ -фосфат
ба превращения глюкозы в галактозу). Для это-
го сначала соответствующая уридилтрансфе-
раза должна перенести УМФ-фрагмент из со-
става УДФ-галактозы на глюкозе-1-фосфат:
УДФ-глюкоза
УДФ-галактоза
глюкозе-1 -фосфат
[6-4]
галактозо-1 -фосфат
Рис. 6-7. Взаимопревращения глюкозо-6-фосфата
и глюкозо-1-фосфата.
лазы вызывает фруктоземию и прочие проявле-
ния непереносимости пищевой фруктозы.
Другой способ взаимопревращения гексоз
требует вовлечения нуклеозидтрифосфатов.
Как правило, в таких процессах участвует ури-
диндифосфат-глюкоза (УДФ-глюкоза), которая
является активированной формой этого моно-
сахарида. Образование ее требует предвари-
тельной изомеризации ГлбФ в глюкозе-1-
фосфат (рис. 6-7).
Последующая конденсация молекул УТФ
и глюкозо-1-фосфата (рис. 6-8) происходит с
выделением ФФ, быстрый гидролиз которого
пирофосфатазой делает реакцию синтеза УДФ-
глюкозы необратимой.
Молекула УДФ-глюкозы участвует во
многих процессах. В частности, под действием
эпимеразы глюкоза в составе этой молекулы
обратимо трансформируется в галактозу;
Освобожденный при этом галактозо-1-фосфат
может быть гидролизован до галактозы и Фн.
В норме, однако, УДФ-галактоза не про-
дуцирует свободную галактозу, а используется
в биогенезе гликополимеров. С помощью га-
пактозгшпрансферазы она может передавать
свой углеводный фрагмент на синтезируемую
молекулу многих олиго- и ряда полисахаридов,
присоединяя его галактозидной связью. Про-
стейшим примером служит синтез дисахарида
лактозы («молочный сахар»), осуществляемый
в молочной железе:
УДФ
У ДФ- галактоза
глюкоза
лактоза
[6-5]
УДФ-глюкоза <-----> УДФ-галактоза [6-3]
В принципе, галактозный фрагмент может
отделиться в виде свободной молекулы («де-
монстрируя» итоговый результат такого спосо-
Вообще-то обычной «мишенью» галакто-
зилтрансферазы в разных клетках служит кон-
цевой (нередуцирующий) остаток N-ацетил-
глюкозамина в растущей полимерной цепи. Но
в молочной железе к началу лактации суб-
стратная специфичность фермента совершенно
изменяется. Это обусловлено гормональной
перестройкой органа, приводящей к экспрессии
особого белка - а-лактальбумина. Оказалось,
что он представляет собой модулятор, в ком-
о о о
и II Т ।-1
+ НО-р~О-Р~О-Р-О- уридин
он он он
УТФ
он он
I I
Т о=р^о-р=о
I I
он он
Пирофосфат (ФФ)
Рис. 6-8. Реакция синтеза уридиндифосфат-глюкозы (УДФ-глюкоза).
208
Глава 6
плексе с которым галактозилтрансфераза обре-
тает новое качество - способность переносить
галактозу на D-глюкозу (т.е., становится фак-
тически лактозосинтетазой).
Обратимость показанных реакций (эпи-
меразной [6-3] и уридилтрансферазной [6-4])
имеет очень важное значение. Благодаря ей
возможно не только независимое от диеты об-
разование в клетках «собственноручной» га-
лактозы (из глюкозы), но, при необходимости,
и обратный процесс, - превращение пищевой
галактозы в глюкозу. Как и у других моносаха-
ридов, он начинается с реакции фосфорилиро-
вания, осуществляемой в данном случае га-
лактокиназой’.
Галактоза
Гапактозо-1 -фосфат
АТФ
АДФ
[6-6]
Затем в обратимых реакциях, катализи-
руемых упомянутыми уридилтрансферазой
([6-4]) и, далее, эпимеразой ([6-3]), возникший
галактозо-1-фосфат может преобразоваться в
глюкозо-1-фосфат, который либо используется
в процессах метаболизма, либо, если потребу-
ется, гидролизуется до глюкозы и фосфата (см.
рис. 6-6, Б).
6.4.2. МОДИФИКАЦИЯ МОНОСАХАРИДНЫХ
МОЛЕКУЛ
Среди всевозможных производных моно-
сахаридов чаще всего для синтеза структурных
углеводов нужны глюкуроновая кислота, гек-
созамины, их N-ацетилированные формы, а
также дезоксисахара (включая 2-дезоксиЛ)-ри-
бозу для синтеза ДНК). Все эти производные
ради краткости часто именуют тоже моносаха-
ридами, хотя их состав не отвечает обычному
для углеводов соотношению CnH2nOn, так как
они являются продуктами химической моди-
фикации «настоящих» моносахаридов.
Путь уроновых кислот начинает от-
личаться от других путей метаболизма сразу
после стадии образования УДФ-глюкозы (см.
рис. 6-8). В данном соединении остаток гексо-
зы подвергается окислению по 6-му углерод-
ному атому (группа -СН2ОН). Процесс этот
НАД-зависимая дегидрогеназа УДФ-глюкозы
осуществляет по общей схеме, показанной на
рис. 5-1. Двукратное отнятие атомов водорода
с промежуточным гидратированием преобразу-
ет группу -СН2ОН в карбоксильную -СООН
(рис. 6-9).
В реакции гидролиза образовавшийся
УДФ-глюкуронат может распадаться на УДФ и
свободную глюкуроновую кислоту. Она, в
свою очередь, может превращаться в аскорби-
новую кислоту (у приматов и морских свинок
этого не происходит из-за отсутствия одного из
необходимых ферментов) либо трансформиро-
ваться в некоторые пентозы (через реакцию
декарбоксилирования).
Однако основная масса УДФ-глюкуроната
используется в биосинтетических процессах, —
главным образом, для включения глюкуроно-
вой кислоты в строящиеся высокополимерные
цепи структурных полисахаридов соедини-
тельной ткани.
Заметные количества УДФ-глюкуроната
потребляются также в целях гидрофилизации
неполярных молекул, подлежащих удалению
из организма. К ним относятся билирубин, воз-
никающий при распаде гема (см. рис. 1-26);
продукты гниения белков в кишечнике (а том
числе фенол, крезол, а также индол и скатол
после их гидроксилирования в печени); многие
ксенобиотики; различные лекарственные пре-
параты. Если такие вещества обладают хотя бы
одной гидроксильной группой, то к ней и при-
соединяется (гликозидной связью) глюкуроно-
вая кислота, переносимая с УДФ-глюкуроната
под действием соответствующей УДФ-глю-
но-6сн2
Рис. 6-9. Превращение УДФ-глюкозы (I) в УДФ-глюкуронат (II).
6СООН
О-УДФ
II он
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
209
Рис. 6-10. Строение билирубин-диглюкуронида
[в билирубине глюкуронированию подвергаются не гидроксильные группы, как обычно, а карбоксильные].
куронилтрансферазы. Возникающие глюкуро-
ниды нередко менее токсичны и всегда - гораз-
до более водорастворимы, что облегчает их
экскрецию. Так, почти весь билирубин, обра-
зующийся в организме, превращается гепато-
цитами в моно-, а затем и в диглюкуронид (рис.
6-10), которые с желчью выводятся (почти не-
обратимо) в кишечник.
Образование аминосахаров осу-
ществляется благодаря использованию ами-
нокислоты глутамина. Как показано на рис.
6-11, первым на этом пути возникает один из
наиболее распространенных гексозаминов -
глюкозамин, более точно обозначаемый как
2-амино4)-глюкоза (см. рис. 1-25). Он появля-
ется в процессе переаминирования между глу-
тамином и фруктозо-6-фосфатом. Реакция эта
аналогична приведенной на рис. 5-31, но в дан-
ном случае аминокислота участвует в ней не
а-аминогруппой, а амидной группой -
C(O)NH2. В результате глутамин превращается
в глутамат, а фруктозо-6-фосфат трансформи-
руется в глюкозамин-6-фосфат. В ацилирова-
нии азота аминогруппы этого гексозамина уча-
ствует ацетил-КоА, что и приводит к образова-
нию молекулы Ы-ацетил-О-глюкозамин-6-фос-
фата (2-ацетиламино-О-глюкозо-6-фосфат). В
обоих аминопроизводных глюкозы фосфатная
группа легко (и обратимо) переносится из по-
ложения 6 в положение 1, после чего возможно
взаимодействие этих молекул с УТФ (анало-
гичное реакции на рис. 6-8). Так возникают
активированные формы ацетилглюкозамина и
N-ацетилглюкозамина. Последняя под действи-
ем эпимеразы превращается в УДФ-(М-ацетил)-
D-галактозамин. Аналогичным образом молеку-
ла N-ацетилглюкозамин-б-фосфата может под-
вергаться обратимой эпимеризации в N-ацетил-
маннозамин-6-фосфат (см. рис. 6-11). Конденса-
ция последнего с фосфоенолпируватом (ФЕП,
рис. 6-25) приводит к образованию N-ацетил-
нейраминовой кислоты, фосфорилированной в
положении 9. Гидролитическое отщепление
фосфата освобождает молекулу N-ацетилней-
рамината (см. рис. 1-25). Это - наиболее рас-
пространенный представитель сиаловых кислот,
различающихся лишь местом прикрепления
ацетильного остатка либо наличием вместо него
других ацильных фрагментов.
Дезоксипроизводные моносаха-
ридов очень немногочисленны и в свободном
виде почти не встречаются. К важнейшим из
них относится 2-дезокси4)-рибоза (см. рис.
2-2), - структурный элемент ДНК. Образуется
она единственным способом - путем восста-
новления D-рибозы, входящей в состав того
или иного рибонуклеозиддифосфата. Источни-
ком водорода служит особый белок - тиоре-
доксин. В восстановленной форме он содержит
расположенные по соседству две функцио-
нально значимые группы -SH, которые исполь-
зует рибонуклеотидредуктаза для передачи их
атомов водорода на кислород, отнимаемый у
D-рибозы (рис. 6-12, а).
Окисленный тиоредоксин восстанавлива-
ется затем флавиновым ферментом тиоредок-
синредуктазой за счет водорода НАДФ-Я2(рис.
6-12, б).
210
Глава 6
Фруктозо-6-фосфат
УТФ ФФ
Г люкозамин-1 -фосфат
УДФ-глкжозамин
САцетил-КоА
КоА
N-Ацетил-глюкоза мин-___>
6-фосфат <
N-Ацетил -глюкоза ми н-
1 -фосфат
УТФ
УДФ-(ЬГацетил)-
глюкозамин
эпимераза
N-Ацетил-маннозамин-
6-фосфат
эпимераза
УДФ-(ЬГацетил)-
галактозамин
9-фосфат
N-Ацетил ней рам и но вой
кислоты
N-Ацетилнейраминовая
кислота
Рис. 6-11. Схема биогенеза аминосахаров
[формулы глюкозамина, галактозамина, их N-ацетилированных форм,
а также N-a цетил нейраминовой кислоты приведены на рис. 1-25]
Эта не совсем обычная редокс-система
функционирует только в период активного
синтеза ДНК при делении клеток и обеспечи-
вает выработку всех дезоксирибонуклеотидов,
кроме тимидинового. Источником последнего
служит молекула d-УДФ, предварительно гид-
ролизуемая до d-УМФ, который и подвергается
метилированию, превращаясь в d-ТМФ (под-
робности будут представлены в разделе 9.5.1).
Другой распространенный дезоксисахар —
L-фукоза (см. рис. 1-25). Ее часто называют
метил пентозой. Однако в действительности
она образуется путем устранения атома кисло-
рода в позиции С6 маннозы. Процесс протекает
с участием двух ферментов. Один из них отни-
мает молекулу воды от гликозильного остатка
гуанозиндифосфат-Э-маннозы (за счет атомов
водорода при С4 и кислорода при С6). Затем
(а)
/SH
тиоредоксин
XSH
+ рибонуклеозид- ---->
дифосфат
Xs
дезоксирибонук- + тиоредоксин I + НгО
леозиддифосфат 4 S
SH
---> НАДФ + тиоредоксин^
XSH
Рис. 6-12. Схема образования дезоксирибонуклеотидов (а) и регенерации восстановленного тиоредоксина (б)
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
211
другой фермент, используя водород молекулы
НАДФ-Яг, восстанавливает кето-группу, воз-
никшую при С4, с одновременной эпимериза-
цией по С5. В результате ГДФО-манноза пре-
вращается в ГДФ-Ь-фукозу. В принципе воз-
можен гидролиз последней с образованием
Ь-фукозо-1-фосфата, а затем и свободной L-фу-
козы. Однако практически единственным пу-
тем использования молекул ГДФ-Ь-фукозы
является перенос гликозильного остатка на
синтезируемые цепи олигосахаридов (включая
антигенные детерминанты групп крови систе-
мы АВО).
6.4.3. БИОСИНТЕЗ СТРУКТУРНЫХ
ГЛИКОПОЛИМЕРОВ
Олиго- и полисахариды в свободном виде
обычно не встречаются. Единственное значи-
мое исключение у позвоночных - линейный
полимер глюкуроновой кислоты, именуемый
гиалуронаном. Все остальные входят либо в
состав протеогликанов межклеточного вещест-
ва, либо (олигосахариды) в мембранные и дру-
гие гликопротеины (а также в гликолипиды и
гликолипопротеины). Несмотря на многообра-
зие гликополимеров, биосинтез их осуществля-
ется по единой стратегии.
Во-первых, непосредственным источни-
ком мономерных звеньев служат их активиро-
ванные формы - нуклеозиддифосфат-сахара
(чаще всего - уридиндифосфатные).
Во-вторых, элементарным актом синтеза
является перенос моносахаридного фрагмента
с его активированной формы на наращиваемую
цепь полимера. Осуществляют такие переносы
специализированные гликозиптрансферазы (их
более 200).
В-третьих, все гликозилтрансферазные ре-
акции однотипны в том, что новый фрагмент
они присоединяют гликозидной связью к нере-
дуцирующему звену растущей цепи (из-за чего
он становится новым концевым звеном, тоже
нередуцирующим). Эта закономерность рас-
пространяется и на точки разветвления угле-
водных полимеров (см. рис. 6-5).
В большинстве своем гликозилтрансфера-
зы сосредоточены в мембране ЭР, где обеспе-
чивают построение олиго- или полисахарид-
ных цепей на молекуле того или иного белка в
процессе его постсинтетической модификации.
Одни из этих ферментов распознают белок и
тот локус(ы) в нем, где надлежит пристроить
первое углеводное звено. Другие достраивают
гликополимерную цепь, придавая ей черты
структурного своеобразия. Подробнее эти про-
цессы будут изложены в главе «Соединитель-
ная ткань» (см. раздел 3.4).
6.5. СИНТЕЗ И РАСПАД ГЛИКОГЕНА
Гликоген обнаруживается далеко не во всех
типах клеток. Наиболее интенсивно его метабо-
лизм протекает в гепатоцитах, мышечных клет-
ках и лейкоцитах, — т.е., там, где особенно важ-
но иметь запас легко мобилизуемого энергети-
ческого материала.
6.5.1. БИОГЕНЕЗ ГЛИКОГЕНА
Главным ресурсом для выработки глико-
гена служит глюкоза пищевого происхожде-
ния. Начальные стадии процесса идентичны
уже упоминавшимся реакциям других путей.
Это, во-первых, гексокиназная реакция (см.
рис. 6-6, А), затем изомеризация ГлбФ в глю-
козо-1-фосфат (см. рис. 6-7) и, наконец, обра-
зование УДФ-глюкозы (см. рис. 6-8).
И только следующая стадия оказывается
специфичной для биогенеза гликогена. Ее ка-
тализирует гликогенсинтетаза. По существу,
это глюкозилтрансфераза, так как производит
перенос глюкозного звена с УДФ-глюкозы на
молекулу уже имеющегося гликогена (его на-
зывают «затравочным»). Переносимая глюкоза
фиксируется а-(1—~>4)-глюкозидной связью на
иередуцирующем конце любой из веточек по-
лимера. Каждое такое событие увеличивает
молекулу гликогена на один остаток глюкозы
(рис. 6-13).
Освобождаемый при этом УДФ может за
счет АТФ опять превратиться в УТФ, который,
УДФ-глюкоза
УДФ
Х(СбНюОб)п
(СбНюО5)п+1
Рис. 6-13. Схема гликогенсинтетазной реакции
212
Глава 6
прореагировав с глюкозо-1-фосфатом (см. рис.
6-8), образует новую молекулу УДФ-глюкозы
(пригодную для переноса на гликоген очеред-
ного мономера).
Таким образом, на внедрение каждой мо-
лекулы глюкозы в гликоген расходуются 2 мо-
лекулы АТФ: одна в гексокиназной реакции,
другая - при регенерации УТФ.
Гликогеисинтетаза способна лишь удли-
нять концевые веточки гликогена в виде ли-
нейной цепочки мономеров, соединенных а-
(1—>4)-глюкозидными связями. Этот ее «недос-
таток» преодолевается благодаря наличию осо-
бой гликозилтрансферазы, именуемой разветв-
ляющим ферментом. Когда длина линейной
цепочки начинает превышать 10-15 глюкозных
остатков, этот фермент отщепляет с ее конца
небольшой фрагмент (6-7 звеньев) и переносит
его поближе к началу этой же (или близкой)
ветви, формируя здесь новую глюкозидную
связь, но уже а-(1—>6). В итоге возникает точка
ветвления (как она показана на рис. 6-5). После
этого гликогеисинтетаза получает возможность
снова наращивать и укоротившуюся цепь, и
появившееся боковое ответвление. Так про-
должается до тех пор, пока обе они не достиг-
нут длины, достаточной для очередного «вме-
шательства» ветвящего фермента.
Долгое время считалось, что гликоген
является чисто полисахаридной молекулой.
И лишь совсем недавно (1992 г.) удалось уста-
новить, что этот полимер иа самом деле явля-
ется протеогликаном (но не структурным, а
«накопителем глюкозы»). Белок, на котором
строится молекула гликогена, назвали гликоге-
нином. Удивительным оказалось, что это не
просто белок-носитель, но еще и фермент. Бо-
лее того: катализирует он реакцию самоглико-
зилирования! Отсюда другое его название: гли-
когенин-глюкозилтрансфераза. Она чувстви-
тельна к активирующему действию двухва-
лентных катионов, особен но Мп 2+.
Гликогенин состоит из двух одинаковых
субъединиц (по 40 или 55 кДа каждая, в зависи-
мости от ткани). Активный центр каждой субъ-
единицы содержит радикал лизина, участвую-
щий в передаче гексозного фрагмента с
УДФ-глюкозы на смежную субъединицу. Точ-
нее, иа определенный радикал тирозина в сред-
ней части полипептидной цепи. На его группе -
ОН передаваемый мономер фиксируется «-глю-
козидной связью. Далее фермент строит на нем
линейную цепочку из гексозных остатков, один
за другим переносимых с молекул УДФ-глю-
козы и присоединяемых каждый раз
а-(1—>4)-глкжозидной связью. Иными словами,
гликогенин катализирует ту же реакцию, кото-
рая показана на рис. 6-13, но в качестве субстра-
та использует собственную белковую молекулу,
наращивая на тирозиновом звене каждой субъе-
диницы линейную цепь полисахарида. Когда
длина цепи достигает примерно 10 мономерных
звеньев, гликогенин становится «затравочным»
гликогеном. Это означает, что дальнейшее на-
ращивание гликополимера производят глико-
генсинтетаза и ветвящий фермент (как это опи-
сано выше).
Таким образом, гликогенин, будучи и апо-
протеином, и ферментом, осуществляет ини-
циацию биосинтеза гликогена путем превра-
щения самого себя в праймер («затравку») для
построения огромной и сильно разветвленной
полисахаридной конструкции гликогена.
6.5.2. РАСПАД ГЛИКОГЕНА
В отличие от процессов гидролиза полиса-
харидов в пищеварительном тракте, для рас-
щепления гликогена в клетках используется не
вода, а неорганический фосфат (Фн). Такого
рода реакция обозначается термином фосфо-
ролиз. Фермент, катализирующий фосфоролиз
гликогена (рис. 6-14), обозначается как глико-
генфосфорилаза (для краткости ее часто на-
звают просто фосфорилазой, тем более что
иные фосфорилазы редки). Она постепенно
отщепляет по одному концевому мономеру,
освобождая его, однако, не в виде глюкозы (как
при гидролизе) а в форме глюкозо-1-фосфата.
Эта реакция необратима и составляет обходной
обратный путь для процесса, катализируемого
гликогенсинтетазой (рис. 6-15).
(CeHioOsIn -ч. Н3РО4
(СбНюО5)п-1 < глюкозе-1-фосфат
Рис. 6-14, Фосфоролиз гликогена
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
213
Рис. 6-15. Общая схема метаболизма гликогена. ГК - гексокиназа; ГМ - фосфоглюкомутаза;
ГФ - глюкозо-6-фосфатаза; ГПФ - УДФ-глюкозо-пирофосфорилаза.
Аллостерические эффекты: -активация; ........... > -угнетение.
В точках ветвления распад гликогена про-
текает иначе (рис. 6-16). Когда до основания
веточки остается не менее 4 мономерных
звеньев, специальная глюкан-трансфераза от-
щепляет ее почти всю целиком, - кроме един-
ственного звена, остающегося соединенным со
«стволом» связью а-(1—>6). И не только отще-
пляет, но и переносит на конец ближней ветви,
фиксируя на нем а~(1—*4)-глюкозидной связью.
Эта ветвь становится длиннее, но фосфорилаза
постепенно «отстригает» от нее по одному зве-
ну, пока не приблизится к следующему раз-
ветвлению на расстояние не менее 4 моносаха-
ридных остатков. После этого опять наступает
акт переноса почти всего фрагмента на конец
ближайшей ветви, и все повторяется снова. Ос-
таток глюкозы, каждый раз остающийся в точ-
ке ветвления, быстро отщепляется амило-
(1—>6)-глюкозидазой путем гидролиза (а не
фосфоролиза).
Рис. 6-16. Расщепление молекулы гликогена в точке разветвления:
1 - гликогенфосфорилаза, 2 - глюкантрансфераза, 3 - деветвящий фермент (гидролаза).
214
Глава 6
6.5.3. АВТОНОМНАЯ САМОРЕГУЛЯЦИЯ
МЕТАБОЛИЗМА ГЛИКОГЕНА
Ключевыми ферментами синтеза гликоге-
на и его распада являются соответственно гли-
когенсинтетаза и фосфорилаза. Каждая играет
роль лимитирующего звена своего направления
на отрезке между ГлбФ и гликогеном. И каж-
дой присущи аллостерические свойства, обес-
печивающие определенную автономность ре-
гуляторной функции.
Как показано на рис. 6-15, глюкозо-6-фос-
фат, будучи ингибитором «своего» фермента
(гексокиназы), вместе с тем является и алло-
стерическим активатором гликогенсинтетазы.
Следовательно, накопление ГлбФ приводит не
только к замедлению утилизации исходной
глюкозы клетками, но и к тому, что из потреб-
ляемого все-таки количества моносахарида бо-
лее высокая доля направляется на синтез гли-
когена. Напротив, усиление утилизации глюко-
зо-6-фосфата другими путями автоматически
ведет к замедлению биогенеза гликогена.
Автономная саморегуляция фосфорилазы
осуществляется иначе. Рис. 6-15 показывает ее
механизмы, реализуемые в мышцах. Высокий
уровень АТФ тормозит фосфорилазу, т.е. за-
медляет использование запасов гликогена для
выработки макроэргов. С другой стороны, ин-
тенсивная утилизация АТФ при мышечной ра-
боте чревата накоплением АДФ и АМФ, сти-
мулирующего распад гликогена до ГлбФ, ката-
болизм которого ГБФ-путем обеспечивает эф-
фективную регенерацию АТФ (как это будет
показано в разделе 6.7).
В гепатоцитах спектр аллостерических
эффектов иной. Здесь АМФ не активирует и
без того активную фосфорилазу, а угнетение ее
вызывают высокие концентрации глюкозы.
Контролируя уровень запасов гликогена,
гликогенсинтетаза и фосфорилаза становятся
удобным инструментом для регуляторного
воздействия со стороны гормонов.
6.6. ГЕКСОЗ ОМ ОНОФОСФАТНЫЙ ПУТЬ
Окислительный распад глюкозы может
начаться сразу после ее превращения в ГлбФ.
Отсюда и возник термин гексозомонофос-
фатный путь (ГМФ-путь). Один из ранних
его синонимов - анатомический путь — обу-
словлен тем, что при этом окислению подвер-
гается не вся молекула глюкозы, а только кар-
бонильный углерод (С-1), который в конечном
счете и отщепляется в виде СО2. В итоге гексо-
зо-6-фосфат трансформируется в пентозо-5-
фосфат. Этот фрагмент ГМФ-пути обозначает-
ся как окислительный этап.
На следующем этапе окислительных про-
цессов ие происходит. Доминируют здесь
трансферазные реакции. Они позволяют фос-
фопентозам обмениваться фрагментами своих
молекул, превращаясь в фосфосахара с иным
числом углеродных атомов. В том числе - в
молекулы ГлбФ, которые вновь могут вступать
в окислительный этап, расщепляясь в нем до
фосфопентоз. Поэтому второй этап (а иногда и
весь ГМФ-путь) обозначают еще как пентозо-
фосфатный цикл (шунт) или даже короче —
пентозный цикл.
Все реакции и первого этапа, и второго (не-
окислительного) протекают в цитоплазме, где
сосредоточены соответствующие ферменты.
6.6.1. ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ ЭТАП
Вступая в ГМФ-путь, молекулы ГлбФ
дважды подвергаются окислению с участием
НАДФ-зависимых дегидрогеназ. Сначала глю-
козо-6-фосфат-дегидрогеназа (ГФДГ) пре-
вращает ГлбФ в лактон 6-фосфоглюконовой
кислоты (рис. 6-17). После его гидратации на-
ступает второе окисление. Оно реализуется 6-
фосфоглюконат-дегидрогеназой (ФГДГ) и со-
провождается декарбоксилированием субстра-
та, превращаемого в рибулозо-5-фосфат (эта
кето-пентоза легко изомеризуется в свой альде-
гидный аналог - рибозо-5-фосфат).
Обе дегидрогеназные реакции являются
единственными необратимыми стадиями на
всем ГМФ-пути. Оии разделяют между собой
функцию пункта вторичного контроля этого
пути: лимитирующей стадией является ФГДГ,
а регуляторной - первая дегидрогеназа
(ГФДГ), которая чувствительна к угнетающему
действию избытка НАДФ-/^ и высоких значе-
ний ЭЗК. Поэтому при накоплении НАДФ Я2
или АТФ лимитирующая роль переходит от
второй дегидрогеназы (ФГДГ) к первой
(ГФДГ). Значит, тандем двух ферментов, вы-
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
215
НАДО ^АДФ-Н2
ФГДГ
соон
н-с-он
----> но-с-н
н-с-он
н-с-он
СН20Р03Н2
6-Фосфоглюконат
СН2ОН
Н-С-ОН
н-с-он
СНгОРОзН2
Рибулозо-5-фосфат
Рис. 6-17. Реакции окислительного этапа ГМФ-пути: ГФДГ - глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа;
ФГДГ - 6-фосфоглюконат-дееидрогеназа.
полняющий роль ключевого звена, осуществ-
ляет лишь одностороннюю регуляцию, а имен-
но - в сторону понижения от уровня, опреде-
ляемого количеством ФГДГ в клетке (а оно за-
программировано генетически).
Поскольку все реакции ГМФ-пути проте-
кают вне митохондрий, окислительный этап его
не требует участия кислорода и не сопровожда-
ется выработкой АТФ. Биологическое значение
этого этапа заключается в том, что он:
- осуществляет окисление глюкозы без
привлечения кислорода;
- продуцирует молекулы НАДФ-ТА;
- обеспечивает превращение гексозы в
пентозу;
- является одним из источников образо-
вания конечного метаболита СОг.
Образуемые в цитоплазме, они могли бы
отдавать свой водород в митохондрии посред-
ством механизмов челночного транспорта. Од-
нако в реальности эти восстановительные эк-
виваленты используются в основном для син-
теза жирных кислот и холестерола, а также в
монооксигеназных реакциях. Считается, что
дегидрогеназные реакции ГМФ-пути постав-
ляют клетке до 50% необходимого НАДФ-//2-
6.6.2. НЕОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ ЭТАП
Молекулы рибулозо-5-фосфата, образо-
вавшиеся в результате окислительного этапа
ГМФ-пути, легко подвергаются изомеризации
в рибозо-5-фосфат или эпимеризации в ксилу-
лозо-5-фосфат (отличный иным расположени-
ем группы -ОН при атоме С-3). Все три фосфо-
пентозы могут взаимодействовать между собой
(и с возникающими продуктами), обмениваясь
двух- и трехуглеродными фрагментами, содер-
жащими альдегидную или кетогруппу. Соот-
ветствующие ферменты обозначают как тран-
сальдолазы и транскетолазы. Например, при
взаимодействии рибозо-5-фосфата с ксилулозо-
5-фосфатом возникают триоза 3-фосфогли-
церальдегид (ФГА) и семиуглеродная кетоза -
седогептулозо-7-фосфат. Часть таких реакций
обмена ведет к появлению ГлбФ или фруктозо-
6-фосфата (который легко изомеризуется в
ГлбФ).
Все реакции второго этапа ГМФ-пути об-
ратимы. В определенных условиях итоговый
результат их может оказаться таким, как он
представлен на рис. 6-18 в виде краткой схемы.
Эта схема показывает, что 6 молекул пен-
тозофосфата могут трансформироваться в 5 мо-
лекул глюкозо-6-фосфата. В этом и заключает-
ся главное биологическое предназначение не-
окислительного этапа: из пентозных «облом-
ков» регенерировать возможно большее число
молекул ГлбФ, которые могли бы вновь всту-
пить в окислительный этап. Тем самым удается
предотвратить чрезмерное накопление «недо-
окисленной» глюкозы в виде пентозофосфатов,
т.е., обеспечивается завершенность начального
этапа.
216
Глава 6
Рис. 6-18. Возможный баланс реакций неокислительного
этапа ГМФ-пути.
Кроме того, неокислительный этап являет-
ся источником ряда моносахаридов, которые
нужны для биосинтетических процессов.
Наконец, некоторые из образующихся
продуктов (ФГА, фруктозо-6-фосфат и др.) яв-
ляются общими для разных ветвей метаболиз-
ма (т.е., возникают и утилизируются не только
в ГМФ-пути). Поэтому становится возможной
«состыковка» превращений веществ, исходно
совершенно различных. В каком бы из метабо-
лических путей ни возникла такая «стыковоч-
ная» молекула, дальнейшую «службу» она мо-
жет проходить (при необходимости) в совсем
другом направлении. Такие узловые точки со-
пряжения разных путей метаболизма (включая
метаболизм разных веществ) играют очень
важную роль в интеграции всего обмена ве-
ществ в единый комплекс.
6.6.3. ИТОГОВОЕ УРАВНЕНИЕ ГМФ-ПУТИ
Количественные соотношения между обо-
ими этапами ГМФ-пути позволяет оценить
схема иа рис. 6-19. Ее можно интерпретировать
следующим образом.
Каждая из 6 молекул ГлбФ, вступая в
окислительный этап, дважды передает по 2 ато-
ма водорода на НАДФ (с промежуточным при-
соединением НгО) и теряет один атом углерода
(в виде СОг). На неокислительном этапе воз-
никшие 6 пентозофосфатных молекул транс-
формируются в 5 молекул глюкозо-6-фосфата.
К ним добавляется еще одна, шестая молекула
ГлбФ (возникающая обычно в гексокиназной
реакции), и все повторяется снова.
Рис. 6-19. Общая схема реакций ГМФ-пути.
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
217
C6Hi2O6 + 6 Н2О + 12 НАДФ
АТФ + Н2О АДФ + Фк
Рис. 6-20. Итоговое уравнение ГМФ-пути распада глюкозы.
6 СОг + 12 НАДФ-Н2
Несмотря на вовлеченность множества
молекул, итоговое уравнение ГМФ-пути вы-
глядит довольно просто (рис. 6-20). Внешне
оно создает впечатление, будто за один оборот
пентозофосфатного цикла вступающая в него
молекула глюкозы, используя 6 молекул Н2О и
12 молекул НАДФ, полностью превращается в
6 СО2 и 12 11ЛДФ-772. И что на это расходуется
1 молекула АТФ. На самом же деле, столько
СО2 и НАДФ-/72 возникает за счет окислитель-
ного отщепления карбонильного углерода (в
виде СО2) от каждой из 6 молекул глюкозо-6-
фосфата, после чего 6 пентозных обломков
преобразуются в 5 молекул ГлбФ, вновь всту-
пающих в циклический процесс. Условно гово-
ря. молекуле глюкозы надо 6 раз «прокрутить-
ся» в пентозофосфатном цикле, чтобы полно-
стью превратиться в СО2 и водород НАДФ-/72.
И только однажды ей требуется молекула АТФ
(в первоначальной гексокиназной реакции).
Природа неспроста выработала столь не-
ординарный способ расщепления глюкозы.
Разнообразие и обратимый характер реакций
второго этапа позволяет не только обеспечи-
вать регенерацию ГлбФ, но и широко исполь-
зовать образующиеся при этом сахара для дру-
гих надобностей. Например, для синтеза моно-
нуклеотидов, который нуждается в рибозо-5-
фосфате, или для преобразования ФГА в гли-
церол-3-фосфат, необходимый в биосинтезе
ацилглицеролов и глицерофосфолипидов, и т.д.
ГМФ-путь вполне допускает такие «утечки»:
они легко компенсируются тем, что для реге-
нерации 5 молекул ГлбФ в цикл должно всту-
пить больше, чем 6 молекул глюкозы (в виде
ГлбФ).
И наоборот: метаболиты неокислительного
этапа могут пополняться за счет избытка их
«копий», возникающих на других путях мета-
болизма. В такой ситуации для регенерации
5 молекул ГлбФ требуется менее 6 молекул
глюкозы (фосфорилируемых гексокиназой).
Таким образом, ГМФ-путь, помимо оче-
видных функций (среди которых самые важ-
ные - выработка НАДФ-7А и пентоз), выполня-
ет и более широкие задачи, смягчая колебания
концентрации ряда фосфосахаров, возможные
при усилении (или замедлении) их потребле-
ния в различных путях метаболизма. Эта
демпферная (гасящая колебания) функция
ГМФ-пути является еще одним вариантом ме-
ханизмов автономной саморегуляции метабо-
лизма и вносит существенный вклад в поддер-
жание гомеостаза.
6.6.4. ДОЛЯ ГМФ-ПУТИ В ОБЩЕЙ УТИЛИЗАЦИИ
ГЛЮКОЗЫ КЛЕТКАМИ
Генетически ГМФ-путь предопределен
так, что он имеет место далеко не во всех типах
клеток. В частности, он невозможен в мышеч-
ной ткани, где практически отсутствуют обе
необходимые дегидрогеназы. Наиболее интен-
сивен этот путь в клетках с высокой потребно-
стью в НАДФ-/72 (эритроциты, клетки печени,
жировой ткани, надпочечников и половых же-
лез. л актирующей молочной железы). Но даже
н в них на долю ГМФ-пути приходится не бо-
лее 25-30% утилизируемой глюкозы.
В эритроцитах восстановительный потен-
циал НАДФ /72 нужен для защиты железа гема,
мембранных липидов и сульфгидрильных
групп белков (особенно ферментов) от окисле-
ния кислородом, которого здесь больше, чем
где бы то ни было. В печени, жировой ткани и
лактирующей молочной железе водород
НАДФ-/72 необходим для синтеза жирных ки-
слот, происходящего посредством конденсации
молекул ацетил-КоА с последующим восста-
новлением получаемых «полуфабрикатов» (в
сущности - удалением из них кислорода, как
это будет показано в следующей главе). В пе-
чени же, а также в клетках половых желез и
коры надпочечников существенные количества
НАДФ-Я2 используются для синтеза холесте-
рола и стероидных гормонов, который тоже
осуществляется из молекул ацетил-КоА и тоже
требует многократных повторов восстановле-
218
Глава 6
ния промежуточных продуктов. Кроме того,
биогенезу стероидных гормонов сопутствуют
монооксигеназные реакции, потребляющие
надф-//2.
6.7. ГЕКСОЗОБИСФОСФАТНЫЙ ПУТЬ
(ГБФ-ПУТЬ)
Биологическое значение ГБФ-пути обус-
ловлено, прежде всего, тем. что именно таким
способом до конечных продуктов — СО? и Н2О —
расщепляется основная масса глюкозы, а имен-
но: 70-75% в тех клетках, где существует еще и
ГМФ-путь, и практически 100% - в остальных
клетках (включая мышечные и нервные).
Еще важнее то, что из всех путей метабо-
лизма углеводов только ГБФ-путь сопровожда-
ется выработкой АТФ. Более того, именно этот
путь поставляет клетке преобладающую долю
АТФ - до 60-70% (при обычном пищевом ра-
ционе человека).
6.7.1. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ
ГЕКСОЗОБИСФОСФАТНОГО пути
К особенностям ГБФ-пути относится его
многостадийность, требующая участия десят-
ков различных ферментов. Поэтому удобно
разделить его на три последовательных этапа -
I. II и Ш. Это деление нельзя назвать услов-
ным, ибо оно отражает и особую роль каждого
этапа в общем метаболизме, и их пространст-
венное разграничение в клетке.
Этап I протекает в цитоплазме. Глюкозо-6-
фосфат, появляющийся в гексокиназной реак-
ции, почти сразу же подвергается повторному
фосфорилированию с образованием гексозо-
бисфосфата (отсюда и название - ГБФ-путь).
Такая атака способствует распаду молекулы на
две фосфотриозы, из-за чего возникло другое
обозначение - дихотомический путь окисле-
ния глюкозы. Затем каждая из фосфотриоз пре-
вращается в молекулу ПВК.
Этапы II и III реализуются в митохондри-
ях, и только в них. Более того, они сопряжены
с митохондриальным окислением, т.е. абсо-
лютно нуждаются в кислороде. Поэтому их
называют строго аэробными процессами, а
точнее - кислород-зависимыми. И, наконец,
оба эти этапа необратимы.
Этап II - это процесс окислительного де-
карбоксилирования ПВК, в результате которо-
го появляются ацетил-КоА, СО2 и НАД-//2 (см.
рис. 5-15). Как отмечено в разделе 5.2.7, утили-
зация водорода молекулы НАД-//2 в системе
МтО ведет к образованию 2,5 молекулы АТФ.
Этап III заключается в дальнейшей дегра-
дации только что возникшего ацетил-КоА. Она
осуществляется реакциями ЦТК, изложенными
в разделе 5.3.1. Как показывает уравнение
[5-6], в этом цикле ацетильный фрагмент рас-
щепляется до двух молекул СО2 и молекулы
Н2О за счет утилизации двух молекул О2.
Энергетический итог этого процесса составля-
ет 10 молекул АТФ (раздел 5.3.3).
Таким образом, окисление молекулы ПВК
на этапах II и III обеспечивает в совокупности
продукцию 12,5 молекул АТФ. В расчете на
исходную молекулу глюкозы это составляет 25
молекул АТФ (ибо в ходе этапа I гексоза пре-
вращается в 2 молекулы ПВК).
6.7.2. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЙ ЭТАП
ГБФ-ПУТИ
Если отсчет начинать с глюкозы, то этап I
гексозобисфосфатного пути включает в себя 10
последовательных стадий.
Первая стадия является общей для
всех путей метаболизма глюкозы: она заключа-
ется в фосфорилировании глюкозы под дейст-
вием гексокиназы (см. рис. 6-6, А).
Вторая стадия - обратимая изомериза-
ция ГлбФ во фруктозо-6-фосфат, катализируе-
мая фосфогексоизомеразой.
Третья стадия - повторное фосфо-
рилирование гексозы с участием теперь уже
фосфофруктокиназы (ФФК), в результате
чего образуется фруктозо-1,6-бисфосфат (рис.
6-21, А).
Подобно гексокиназной, эта реакция необ-
ратима, но имеет обходной обратный путь. Его
реализует фруктозобисфосфатаза (рис. 6-21, Б).
Сходство усиливается и тем, что ФФК тоже
обладает качествами регуляторного фермента.
В обычных условиях ее заметно выше,
чем у гексокиназы (ГК), и тогда именно ГК яв-
ляется лимитирующим звеном ГБФ-пути (как
доминирующего направления метаболизма
глюкозы). Однако повышение концентрации
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
219
Фруктозо-6-фосфат
Фруктозо-1,6-бисфосфат
Рис. 6-21. Реакции, катализируемые фосфофруктокиназой (А) и фруктозобисфосфатазой (Б).
АТФ. особенно в сочетании с подъемом уровня
цитрата, очень сильно тормозит фосфофрукто-
кииазу, из-за чего именно к ней переходит роль
лимитирующего звена ГБФ-пути. Напротив,
распад АТФ ведет к накоплению АДФ, сопро-
вождающемуся появлением АМФ, который
вызывает активацию фосфофруктокиназы, и
лимитирующая роль вновь возвращается к ГК.
На фруктозобисфосфатазу каждый из на-
званных метаболитов оказывает прямо проти-
воположное действие, благодаря чему резко
возрастает эффективность ФФК как пункта
вторичного контроля ГБФ-пути.
Происходящее на 3-й стадии повторное
фосфорилирование еще сильнее дестабилизи-
рует молекулу гексозы и тем самым облегчает
ее последующую деградацию.
Четвертая стадия заключается в рас-
щеплении фруктозо-1,6-бисфосфата ровно по-
полам, на две фосфотриозы (рис. 6-22, IV). Эту
обратимую реакцию катализирует альдолаза
фруктозобисфосфата. Возникающие продукты
- дигидроксиацетоифосфат (ДГАФ) и 3-фосфо-
глицеральдегид (ФГА) - изомерны друг другу.
Пятую стадию обеспечивает триозо-
фосфатизомераза, которая ускоряет взаимо-
превращения образовавшихся фосфотриоз
(рис. 6-22, V). В равновесном состоянии доля
ФГА невелика (не более 5%). Однако, в даль-
нейшем процессе используется именно этот
изомер. Поэтому фактически триозофосфати-
зомераза обеспечивает достаточно быстрое
восполнение ФГА по мере его убыли (т.е., ка-
тализирует реакцию, по существу, в одном на-
правлении). Следовательно, не будет преуве-
личением считать, что 5-я стадия сводится к
превращению всего ДГАФ в 3-фосфоглицер-
альдегид и что совокупным итогом 4-й и 5-й
стадий становится распад фруктозо-1,6-
бисфосфата на две молекулы ФГА.
Перечисленные 5 стадий составляют на-
чальную фазу цитоплазматического этапа ГБФ-
пути. Смысл ее сводится к расходованию 2 мо-
лекул АТФ с тем, чтобы стабильная молекула
гексозы распалась до ФГА, легче поддающего-
ся дальнейшим превращениям, в том числе
Фруктозо-1,6-бмсфосфат
'сн2оро3н2
2с-о
3СН2ОН
ДГАФ
II®
н-1с=о
J
н-Ъ-он
ЕСН2ОРО3Н2
ФГА
Рис. 6-22. Обратимые реакции, катализируемые фруктозобисфосфат-альдолазой (IV) и триозофосфатизомеразой (V)
[при атомах углерода в формулах фосфотриоз указаны те номера, которые они имели в составе фруктозе-1,6-бисфосфата].
220
Глава 6
О с-н I О С-О~РО3Н2 I
Н-С-ОН +НэРО41-НАД <=? Н-С-ОН + НАД-Н2
CH2OPO3H2 (уГ) СН2ОРО3Н2
ФГА 1,3-Бисфосфогпицерат
Рис. 6-23. Дегидроген аз ное окисление 3-фосфоглицеральдегида (ФГА).
окислительным. Блок этих превращений со-
ставляет вторую фазу этапа I.
Шестая стадия заключается в окисле-
нии карбонильной группы ФГА под действием
дегидрогеназы фосфоглицеральдегида.
Обычно окисление альдегидной группы
происходит путем присоединения молекулы
воды с последующим отнятием 2 атомов водо-
рода, вследствие чего карбонильная группа
превращается в карбоксильную (см. рис. 5-1 и
6-9). Однако при окислении ФГА специфика
НАД-зависимой дегидрогеназы обеспечивает
возможность использования не воды, а фосфор-
ной кислоты. В результате образуемая карбо-
ксильная группа сразу же оказывается связан-
ной с фосфатным остатком (рис. 6-23). Возник-
шая связь относится к числу кислотоангидрид-
ных, а потому является макроэргической. Тем
не менее, эта реакция образования 1,3-бисфос-
фоглицериновой кислоты вполне обратима.
Седьмая стадия представляет собой
реакцию субстратного фосфорилирования. Осу-
ществляемый фосфоглицераткиназой перенос
фосфорильной группы на АДФ с появлением
АТФ сопровождается превращением 1,3-бис-
фосфоглицерата в 3-фосфоглицериновую ки-
слоту (рис. 6-24, VII). Эта реакция обратима.
Восьмая стадия заключается в перено-
се фосфатной группы из положения 3 в поло-
жение 2, который осуществляет фосфоглице-
ратмутаза (рис. 6-24, VIII).
Девятая стадия - дегидратация 2-фос-
фоглицерата, образовавшегося на предыдущей
стадии. Эту обратимую реакцию катализирует
енолаза. В ее названии отражен факт превра-
щения фосфорилированного производного гли-
церата в такое же производное, но уже еноль-
ной формы пирувата (рис. 6-25, IX). Довольно
скромное событие - всего лишь потеря воды -
приводит к серьезному перераспределению
внутримолекулярной энергии, в результате ко-
торого возникает макроэргическая связь на
фосфорильной группе продукта реакции, обо-
значаемого как фосфоенолпируват (ФЕП).
Десятая стадия является, как и следо-
вало ожидать, реакцией субстратного фосфо-
рилирования (рис. 6-25, X), второго после
седьмой стадии. Осуществляет ее пируватки-
наза. Производимый ею перенос фосфатной
группы с молекулы ФЕП на АДФ (с образова-
нием АТФ) приводит, однако, к освобождению
не еиолпирувата, а его кето-изомера - ПВК.
О С-О~РОЭН2 АДФ АТФ СООН СООН ф т I I
<—-= >Н-С-ОН t > Н-С-ОРО3Н2
Н-С-ОН I СН2ОРО3Н2 @ СН2ОРО3Н2 ® СН2ОН
1,3-Бисфосфоглицерат З-Фосфоглицерат 2-Фосфоглицерат
Рис. 6-24. Обратимые реакции, катализируемые фосфоглицераткиназой (VII) и фосфоглицератмутазой (VIII).
СООН
I
Н-С-О-РО3Н2
I
СН2-ОН
2-Фосфоглицерат
СООН АДФ АТФ
t-O~PO3H2 >
сн2
* ®
Фосфоенол-
пируват (ФЕП)
СООН
с=о
I
СНз
Пируват
(ПВК)
Рис. 6-25. Енолазная (IX) и пируваткиназная (X) реакции первого этапа ГБФ-пути.
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
221
Эта трансформация енолпирувата в гораздо
более стабильный пируват делает пируватки-
назную реакцию необратимой, энергетически
подкрепляя ее.
Таким образом, если в первую фазу цито-
плазматического этапа идет расходование
энергии (в виде АТФ), то вторая фаза, напро-
тив, сопровождается выработкой АТФ.
6.7.3. ИТОГОВОЕ УРАВНЕНИЕ
ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ЭТАПА ГБФ-ПУТИ
Десять стадий первого этапа ГБФ-пути
превращают исходную глюкозу в 2 молекулы
ПВК. Решающим для выработки АТФ является
окисление ФГА до 1,3-бисфосфоглицерата (6-я
стадия): именно оно дает толчок реакциям суб-
стратного фосфорилирования на 7-й и 10-й ста-
диях, в результате чего появляются не только
2 молекулы ПВК, но и 4 молекулы АТФ. За
вычетом 2 молекул АТФ, использованных в
первой фазе процесса (стадии 1 и 3), энергети-
ческий баланс цитоплазматического этапа
ГБФ-пути составляет 2 молекулы АТФ, которые
образуются на каждую молекулу глюкозы, рас-
щепленной до ПВК без участия О2.
Структура энергетического баланса этапа I
показана на рис. 6-26. Процессы, идущие в са-
мой цитоплазме, выделены здесь жирным
шрифтом. Можно видеть, что энергетика этого
этапа не сводится только к субстратному фос-
форилированию и распаду глюкозы до ПВК.
Молекулы НАД-УД, возникающие на 6-й стадии,
тоже обладают большим потенциалом. Меха-
низмами челночного транспорта (раздел 5.3.7)
они передают свой водород на митохондриаль-
ный НАД, который переносит его далее на пол-
ную цепь МтО. Благодаря этому в расчете на
молекулу глюкозы (2 молекулы НАД-/Д) могут
появиться еще 5 молекул АТФ, но возникающих
уже механизмом окислительного фосфорилиро-
вания. Это соотношение отражено и в схеме на
рисунке 6-26, но оно относится только к гем
клеткам, где челночный транспорт осуществля-
ет малат-аспартатная система. Если же его реа-
лизует глицерофосфатный механизм, то прирост
АТФ за счет окислительного фосфорилирования
составляет не 5, а лишь 3 молекулы АТФ на ис-
ходную молекулы глюкозы.
Итак, полный энергетический баланс ци-
топлазматического этапа достигает 2 + 5 = 7
молекул АТФ, из которых только две образу-
ются путем субстратного фосфорилирования (в
случае глицерофосфатного механизма переноса
эти цифры составляют соответственно 2 + 3 = 5
молекул АТФ).
В самой лаконичной форме итоговое урав-
нение I этапа ГБФ-пути показано на рис. 6-27
(где учтена эффективность малат-аспартатной
системы). В целом же весь ГБФ-путь обеспе-
чивает выработку 7 + 25 = 32 молекулы АТФ
(в расчете на молекулу глюкозы, полностью
расщепленную до СО2 и воды). Это - макси-
мально возможная энергоотдача. В тканях же.
где доминирует глицерофосфатная челночная
система (мозг, скелетная мышца), энергетиче-
ский итог этапа I чуть ниже, а именно: 5 + 25 =
30 молекул АТФ на молекулу глюкозы, полно-
стью окисленную ГБФ-путем.
В заключение важно подчеркнуть, что ци-
топлазматическая локализация всех 10 стадий
первого этапа ГБФ-пути придает ему опреде-
ленную независимость от остальных, митохон-
дриальных этапов. Эта автономность позволяет
СбЬйгОб —
2Н?О <-
2(АДФ+ФН)
2(АТФ+Н2О)
► 2С3Н4О3
02
Рис. 6-26. Энергетический баланс цитоплазматического этапа ГБФ-пути
(при участии малат-аспартатного транспорта).
222
Глава 6
7(АДФ + Фн) 7(АТФ +Н2О)
СбГИгОб + О2
Глюкоза
2 С3Н4О3 + 2 Н2О
Пируват
Рис. 6-27. Итоговое уравнение I этапа ГБФ-пути катаболизма глюкозы.
ему не только выступать начальной частью
ГБФ-пути, но и выполнять свои особые функ-
ции, не замкнутые на работу МтО. Они стано-
вятся возможными благодаря двум особенно-
стям этапа I. Одна из них - отсутствие жесткой
зависимости от Ог, что позволяет расщеплять
глюкозу без участия кислорода, хотя и не до
конца (т.е., не до СО2 и Н2О) и с несравненно
меньшей продукцией АТФ. Такой процесс ста-
ли называть гликолизом (или гликогенолизом,
если он начинается с гликогена).
Другая особенность - полная обратимость
7 из 10 стадий при наличии обходных обрат-
ных путей для остальных трех стадий. Это соз-
дает возможность синтеза глюкозы (и гликоге-
на) из пирувата и близких ему метаболитов,
которые возникают при распаде многих амино-
кислот, а также глицерола липидов. Новообра-
зование углеводов из метаболитов неуглевод-
ного происхождения обозначают термином
гликонеогенез. Наиболее интенсивно этот про-
цесс осуществляется в печени, корковом слое
почек и в слизистой оболочке кишки. За сутки
у взрослого человека может синтезироваться
до 80 г глюкозы из неуглеводных источников,
главным образом, из аминокислот.
6.7.4. ГЛИКОЛИЗ
В отсутствие кислорода молекулы
НАД-/72, образующиеся на 6-й стадии этапа I,
не могут избавиться от своего водорода путем
передачи его на систему МтО. Поскольку со-
держание любого кофермента в клетке очень
мало, то окисление уже небольших количеств
ФГА могло бы превратить весь наличный НАД
в НАД-//2 и тем самым исчерпать свободный
НАД, необходимый для окисления новых пор-
ций ФГА. Как следствие, полностью останови-
лась бы утилизация глюкозы ГБФ-путем. Од-
нако и здесь природа нашла удачную альтерна-
тиву. Суть ее в том, что конечный продукт эта-
па I - молекула ПВК - является хорошим ак-
цептором атомов водорода. Перенос двух ато-
мов водорода с НАД-7/2 на кето-группу пирува-
та превращает его в молочную кислоту (лак-
тат). Реакция эта обратима (рис. 6-28). Равно-
весие ее сильно сдвинуто влево; отсюда и на-
звание фермента — лактпатдегидрогеназа
(ЛДГ).
Таким образом, при дефиците кислорода
появляется новая реакция, которую можно на-
звать стадией XI цитоплазматического этапа
ГБФ-пути, если не забывать, что она имеет ме-
сто не в обычных условиях, а лишь при чрез-
мерном накоплении молекул НАД-/72 и ПВК.
Эта стадия не только позволяет обойтись без О2,
но и обеспечивает в определенном смысле «без-
отходную технологию», а именно: сколько мо-
лекул НАД-7/2 образуется на 6-й стадии, столько
же ПВК возникает на 10-й стадии, и все они мо-
гут освобождать НАД-/72 от водорода. Иными
словами, происходит полная регенерация моле-
кул НАД, необходимая для окисления все новых
порций ФГА. Это сопряжение между 6-й стади-
ей (окисление ФГА) и 11-й стадией (восстанов-
ление пирувата) назвали гликолитической окси-
доредукцией. Она является, по существу, меха-
низмом «освобождения» цитоплазматического
этапа ГБФ-пути от кислородной зависимости.
А весь процесс распада глюкозы до лактата
(идущий без участия О2) обозначили термином
гликолиз. Его итоговое уравнение (рис. 6-29)
очень похоже на аналогичное уравнение I этапа
ГБФ-пути (см. рис. 6-27). Самое главное отли-
чие - гораздо меньшая продукция АТФ.
Биологический смысл гликолиза
заключается в том, чтобы обеспечивать распад
СН3 СНз
С-О + НАД-Н, < ‘ НАД + Н-С-ОН
I z 1
СООН Лактат- СООН
дегидрогеназа
Пируват Лактат
(ПВК)
Рис. 6-28. Обратимое восстановление пирувата в лактат.
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
223
CeHiaOe
Глюкоза
2 (АДФ + Фн)
4--->2(АТФ+Н2О)
2 СзНеОз
Лактат
Рис. 6-29. Итоговое уравнение гликолиза.
глюкозы даже в анаэробных условиях, — пусть
не до конца, а только до лактата, но получая
при этом хотя бы немного АТФ. Если при пол-
ном окислении глюкозы ГБФ-путем образуется
32 (или 30) молекул АТФ, то при гликолизе —
всего 2 молекулы АТФ, т.е. примерно в 15 раз
меньше. Зато эти 2 молекулы АТФ на каждую
глюкозу можно получить в полной независи-
мости от кислорода (и вообще от митохондри-
ального окисления).
Единственный критерий того, что происхо-
дит бескислородный распад углеводов ГБФ-пу-
тем, — это накопление недоокисленных продук-
тов. У молочнокислых бактерий таковым явля-
ется лактат (как и у животных). А вот пивные
дрожжи в отсутствие О2 образуют не лактат, а
этанол. Объясняется это тем, что они не имеют
лактатдегидрогеназы, но содержат в цитоплаз-
ме пируватдекарбоксилазу, способную, в отли-
чие от митохондриальной, отщеплять СОг от
пирувата без участия кислорода. Из-за этого
акцептором водорода от НАД*£4> становится не
пируват, а продукт его неокислительного де-
карбоксилирования — уксусный альдегид, вос-
станавливаемый до этанола (рис. 6-30).
Таким образом, у дрожжей в отсутствие
кислорода распад глюкозы ГБФ-путем насчи-
тывает не 10, и даже не 11, а 12 стадий. И ко-
нечный продукт — не лактат, а этанол. В прак-
тике виноделия этот процесс известен с глубо-
СН3
6=0
I
соон
НАД-Н2 НАД СНз
СН2ОН
(@|
Уксусный
альдегид
ПВК
Этанол
Рис. 6-30. Анаэробное декарбоксилирование ПВК (XI)
и восстановление уксусного альдегида (XII)
в цитоплазме дрожжевых клеток.
кой древности и обозначается как спиртовое
брожение. Брожение — из-за того, что интен-
сивное выделение СО2 ведет к образованию
пузырьков газа: жидкость как бы бурлит. По
мере выяснения химизма анаэробного распада
углеводов, становились известными и другие
виды брожения (маслянокислое, пропионово-
кислое и иные). Образование лактата в несте-
рильном молоке тоже назвали одним из видов
брожения - молочнокислым, хотя в этом слу-
чае никакой углекислоты не выделяется, т.е.,
нет «брожения» в физическом смысле. А глав-
ное — стало известно, что различия между ос-
новными вариантами брожения появляются
лишь на завершающих стадиях процесса. Точ-
нее, они сводятся к тому, какие именно моле-
кулы становятся конечными акцепторами во-
дорода от НАД-Нг , возникающего на 6-й ста-
дии. Вместе с тем, биологический смысл про-
цесса всегда одинаков: получение хотя бы ми-
нимума АТФ в условиях недоступности кисло-
рода. Спирт для дрожжей - это конечный про-
дукт, отброс, и накопление его препятствует
жизнедеятельности клеток (поэтому содержа-
ние этанола в некрепленом вине обычно не
превышает 11-12%).
Итак, несмотря на совпадение первых 10
стадий, процессы, обозначаемые как «глико-
лиз», «спиртовое брожение» и им подобные,
отнюдь не идентичны понятию «цитоплазма-
тический этап ГБФ-пути».
Гликолиз, как и другие виды брожения, -
тупиковый путь метаболизма, ибо лактат ни во
что дальше превращаться не может. Он может
лишь снова трансформироваться в ПВК (бла-
годаря обратимости лактатдегидрогеназной
реакции). Такое случается только при переходе
от анаэробных условий к аэробным. Полно-
ценное обеспечение клетки кислородом ведет к
прекращению прироста лактата. Первым это
отметил Л.Пастер, сформулировав тезис о том,
что с началом дыхания (т.е., потребления О2)
брожение останавливается. Он определял бро-
жение как жизнь без доступа кислорода.
Механизм эффекта Пастера (блокирование
брожения дыханием, сопровождаемое резким
падением скорости утилизации глюкозы) был
раскрыт гораздо позже. Теперь известно, что в
присутствии О2 нет условий для появления
лактата (или спирта и т.п.), ибо НАД7/2 и пи-
224
Глава 6
руват сразу же после их образования утилизи-
руются митохондриями. Более того, в живот-
ных тканях наблюдается убыль ранее накоп-
ленного лактата. Происходит это из-за того,
что молочная кислота отдает водород молеку-
лам НАД, превращаясь в пируват, который (как
и водород НАД-Д>) потребляется митохонд-
риями с использованием О2-
Утилизация лактата, накопившегося в пе-
риод нехватки кислорода, лежит в основе фе-
номена, которому физиологи дали название
ликвидация кислородной задолженности. Он
заключается в том, что после интенсивной
мышечной работы легочное дыхание не сразу
возвращается к норме, а остается усиленным
еще некоторое время. Избыточное потребление
О2 в этот период (в сравнении с состоянием
покоя) является отражением того, сколько лак-
тата накопилось во время работы, недостаточ-
но обеспеченной кислородом.
Итак, в отсутствие кислорода (или при его
нехватке) лактат не может не образоваться,
а при достаточном снабжении кислородом он,
напротив, не может образовываться.
Со временем, однако, выяснилось, что в
некоторых случаях выработка лактата проис-
ходит даже в аэробных условиях. Впервые это
выявлено в злокачественных опухолях, хотя и
до сих пор причины отсутствия эффекта Пас-
тера в раковых клетках остаются неясными.
Позднее обнаружили, что лактат в обычных,
аэробных условиях вырабатывают и совершен-
но нормальные эритроциты. Механизм этого
стал понятен после открытия митохондрий и
того факта, что в зрелых эритроцитах они от-
сутствуют. Значит, будучи не в состоянии осу-
ществлять II и III этапы ГБФ-пути, эти клетки
обеспечивают себя энергией только за счет тех
2 молекул АТФ, которые они получают суб-
стратным фосфорилированием по ходу рас-
щепления молекулы глюкозы до лактата (отда-
ваемого затем в плазму крови). Иными слова-
ми, нормальные зрелые эритроциты способны
осуществлять аэробный гликолиз, т.е. бес-
кислородный распад глюкозы до лактата в
аэробных условиях!
Здесь необходимо определиться с терминологией.
Уже в первых наблюдениях иа рубеже 19-20 вв. образо-
вание молочной кислоты при разложении глюкозы (гли-
когена) прямо связывали с недостатком О2 (в частности,
при мышечной работе). И даже строже: лактат возникает
только при недостатке кислорода, тогда как в аэробных
условиях глюкоза расщепляется до СО2 и Н2О. Полвека
спустя окончательно утвердилось понимание того, что
гликолиз - это процесс распада углеводов без потребле-
ния кислорода, оцениваемый по появлению лактата и про-
текающий в анаэробных условиях, ио иногда реализуе-
мый и в присутствии О2 (аэробный гликолиз). К сожале-
нию, в последние 15-20 лет без каких-либо обоснований,
«явочным» порядком возникла тенденция обозначать
термином «гликолиз» любое разложение глюкозы ГБФ-
путем. Это привело к явному смещению понятий. Собст-
венно гликолиз (распад до лактата) пришлось уточнять:
«анаэробный гликолиз» (хотя этот процесс на самом деле
случается иногда и в присутствии О2). А для обозначения
распада глюкозы (гликогена) до ПВК стали употреблять
термин «аэробный гликолиз» (игнорируя тем самым из-
вестные факты выработки в аэробных условиях не пиру-
вата, а именно лактата). Терминологическая нечеткость
особенно затрудняет тех, кто изучает медицинскую лите-
ратуру: в ней до сих пор часто используются понятия
«гликолиз» и «аэробный гликолиз», - как правило, в тра-
диционном смысле (образование лактата). Поэтому в на-
стоящем учебнике процесс превращения углеводов в лак-
тат всегда обозначается понятием «гликолиз», а в пируват
- терминами «этап I (цитоплазматический этап) ГБФ-
пути» (за неимением лучшего, - более краткого, но тоже
однозначного).
6.7.5. ГЛИКОНЕОГЕНЕЗ
Как уже отмечалось, только 3 из 10 стадий
цитоплазматического этапа ГБФ-пути являют-
ся необратимыми. При этом для двух из них
(1-я и 3-я стадии) есть обходные обратные ре-
акции, которые осуществляются легко и про-
сто, будучи одноступенчатыми.
Гораздо сложнее преодолевается однона-
правленность последней из необратимых ста-
дий - 10-й, катализируемой пируваткиназой
(см. рис. 6-25, X). Трудность заключается в
том, что обратный процесс протекает в не-
сколько стадий, а главное — требует вовлечения
митохондрий. Начинается он с присоединения
молекулы СО2 к пирувату. Оно осуществляется
под действием пируваткарбоксилазы митохон-
дрий и нуждается в АТФ (см. рис. 5-28). Про-
дукт этой реакции — молекулу ЩУК - митохон-
дриальная малатдегидрогеназа может вос-
станавливать до малата (см. рис. 5-24, стадия 8).
Последний, в отличие от ЩУК, легко проникает
через мембрану в цитозоль (благодаря наличию
в ней дикарбоксилат-транслоказы). Здесь мест-
ная малатдегидрогеназа вновь преобразует его в
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
225
ЩУК, которая затем подвергается декарбокси-
лированию с одновременным фосфорилирова-
нием за счет ГТФ (что эквивалентно использо-
ванию АТФ). В этой обратимой реакции, ката-
лизируемой фосфоенолпируват-карбоксикина-
зой, молекула ЩУК превращается в ФЕП (см.
рис. 5-29). Значит, для образования ФЕП из пи-
рувата нужны энергетические затраты, эквива-
лентные 2 молекулам АТФ.
Затем две молекулы ФЕП вступают в ре-
акции, последовательность которых обратна
стадиям I этапа ГБФ-пути. При этом в реакции,
обратной 7-й стадии данного этапа (субстрат-
ное фосфорилирование), расходуется еще мо-
лекула АТФ - третья по счету.
Обращение 6-й стадии не нуждается в АТФ,
но сопровождается использованием восстанови-
тельных эквивалентов молекулы НАД-/72.
Итак, обращение всех 5 реакций второй
фазы I этапа ГБФ-пути требует затраты 3 мо-
лекул АТФ и молекулы НАД-772 на каждую мо-
лекулу ФГА, регенерируемую из пирувата.
Последующее превращение 2 молекул ФГА
в глюкозу протекает без энергетических затрат:
все реакции начальной фазы этапа I либо обра-
тимы, либо (1-я и 3-я стадии) «снабжены» об-
ходным обратным путем, который реализуется
простым гидролизом.
Следовательно, весь процесс гликонеоге-
неза, начинающийся с двух молекул ПВК, со-
провождается расходованием 6 молекул АТФ и
2 молекул НАД7/2 (рис. 6-31).
Вспомним, что каждая молекула НАД-Н2
является потенциальным источником 2,5 моле-
кул АТФ. Значит, полную энергетическую
«стоимость» синтеза глюкозы из 2 молекул пи-
рувата составляют не только 6 молекул АТФ,
указанных в итоговом уравнении гликонеоге-
неза (см. рис. 6-31), но еще и те 5 молекул
АТФ, которые клетка могла бы получить при
утилизации двух молекул НАД-/Д в системе
МтО. В общей сложности это составляет 11
молекул АТФ, т.е., на 4 больше, чем дает рас-
пад глюкозы до ПВК.
Несколько иначе обстоит дело при обра-
щении гликолиза, т.е., ресинтезе глюкозы из
двух молекул лактата, образовавшихся ранее
при бескислородном распаде углеводов. В этом
случае молекулы НАД-/72 возникают с самого
начала, - при регенерации ПВК из лактата. По-
этому суммарное уравнение реакций обраще-
ния гликолиза (рис. 6-32) не содержит никоти-
намидных молекул.
Сопоставление с валовым уравнением са-
мого гликолиза (см. рис. 6-29) показывает, что
синтез глюкозы из лактата, как и новообразова-
ние ее из ПВК неуглеводного происхождения,
тоже требует на 4 молекулы АТФ больше, чем
их образуется при распаде до лактата (или
ПВК). Это - часть общего правила: при образо-
вании простых органических молекул из более
сложных возникает меньше АТФ, чем требуется
в обратном (биосинтетическом) процессе.
6(АТФ +Н2О) 6(АДФ + Фн)
2 СзНдОз + 2 НАД-Нг С6Н12ОБ + 2 НАД
ПВК Глюкоза
Рис. 6-31. Итоговое уравнение синтеза глюкозы из пирувата (гликонеогенез).
2 СзНбОз
Лактат
СбН12ОБ
Глюкоза
Рис. 6-32. Итоговое уравнение обращения гликолиза.
226
Глава 6
6.8. АВТОНОМНАЯ САМОРЕГУЛЯЦИЯ
ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА
УГЛЕВОДОВ
Все клетки животного организма нужда-
ются в непрерывном снабжении глюкозой, хотя
поступление ее с пищей происходит периоди-
чески (у человека — 3-4 раза в сутки). Для нерв-
ной ткани, эритроцитов, ряда других клеток
глюкоза вообще является практически единст-
венным энергетическим ресурсом. Например,
мозг взрослого человека потребляет более
120 г глюкозы в сутки (20-30% суточного ра-
циона углеводов), причем, скорость утилиза-
ции ее довольно постоянна, а запасами глико-
гена нервные клетки не обладают. В скелетной
мышце, напротив, скорость распада углеводов
сильно зависит от функционального состояния
и при очень интенсивной работе может возрас-
тать во многие десятки раз.
Все это требует тщательной урегулиро-
ванности углеводного метаболизма. Быстрее
всего (практически сразу) на изменения усло-
вий реагируют механизмы автономной саморе-
гуляции. Они не только контролируют ско-
рость потребления глюкозы на энергетические
нужды, но и согласуют ее с утилизацией дру-
гих источников энергии, - прежде всего, ней-
тральных жиров.
Реализуется автономная саморегуляция
через ключевые ферменты. Генетически запро-
граммированы как специфические свойства
каждого из них, так и количественное содер-
жание в клетке (которое и определяет величину
Vmax в клетках данного типа).
Ведущие ключевые звенья и их свойства
перечислены при изложении основных путей
метаболизма глюкозы; в виде обобщенной схе-
мы они представлены на рис. 6-33. Это, прежде
всего, ГК (раздел 6.3), которая лимитирует
Рис. 6-33. Механизмы автономной саморегуляции энергетического метаболизма.
Обозначения: 1 - цитратсинтетаза; 2 — изоцитратдегидрогеназа; 3 - пируватдегидрогеназный комплекс,
4 — пируваткарбоксилаза. Примечание: отмеченные на схеме аллостерические влияния АМФ и АТФ на гликоген-
фосфорилазу имеют место в мышцах, но не в печени.
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
227
совокупную скорость утилизации глюкозы все-
ми путями и заодно поддерживает определен-
ный уровень ГлбФ в клетке (обеспечивая, в
частности, потребности минорных путей мета-
болизма углеводов).
Дегидрогеназы ГлбФ и 6-фосфоглюконата
(раздел 6.6.1) контролируют уровень «оттока»
ГлбФ на ГМФ-путь. Как отмечено в разделе
6.5.3, скорость синтеза гликогена зависит от
гликогенсинтетазы, активируемой избытком
ГлбФ, а обратный процесс - распад гликогена
до ГлбФ - регулируется фосфорилазой, кото-
рую стимулируют низкие значения ЭЗК (появ-
ление АМФ) и подавляет увеличение этого по-
казателя (накопление АТФ).
В регуляцию ГБФ-пути — главного направ-
ления метаболизма углеводов — решающий
вклад вносит фосфофруктокиназа (ФФК), иг-
рающая роль пункта вторичного контроля
(раздел 6.7.2). Точнее, она управляет цито-
плазматическим этапом, завершающимся реак-
цией образования ПВК. Необратимость этой
реакции не играет регуляторной роли, но она
очень важна в качестве барьера на обратном
пути (раздел 6.7.5), ведущем к синтезу глюкозы
из ПВК или лактата. Начинает этот обратный
путь пируваткарбоксилаза митохондрий (фер-
мент 4 в схеме на рис. 6-33). Она является клю-
чевым звеном как всего гликонеогенеза, так и
процесса обращения гликолиза. Как уже упо-
миналось (раздел 5.3.6), этот фермент обычно
очень малоактивен, но его эффективность рез-
ко возрастает даже при небольшом повышении
содержания ацетил-КоА, который, по сущест-
ву, и является главным стимулятором синтеза
глюкозы (и гликогена) из пирувата или лактата.
Второй этап ГБФ-пути, хотя и является
необратимым, лимитирующей роли обычно не
играет. Биологический смысл этого очевиден:
окислительное декарбоксилирование ПВК до
ацетил-КоА востребовано не только в качестве
данного этапа распада глюкозы, но и для ути-
лизации тех молекул ПВК, которые возникают
при катаболизме многих аминокислот (см. рис.
5-26). Такое отсутствие ограничений служит
едва ли не «приглашением» пирувату любого
происхождения направляться в ЦТК (через
этап превращения в ацетил-КоА), а не на син-
тез глюкозы. Однако избыток ацетил-КоА (в
случае недостаточного вовлечения его в реак-
ции ЦТК) приводит к аллостерическому угне-
тению пируватдегидрогеназы (фермент 3 на
рис. 6-33). Следствием становится замедление
процесса декарбоксилирования ПВК, что спо-
собствует «переключению» невостребованного
пирувата на путь синтеза углеводов.
Заключительный этап ГБФ-пути - цикл
трикарбоновых кислот — обладает собственны-
ми регуляторными ферментами. Подробно они
охарактеризованы в разделе 5.3.5. Здесь важно
отметить лишь два момента. С одной стороны,
аллостерическая регуляция ключевых звеньев
ЦТК (ферменты 1 и 2 в схеме на рис. 6-33)
дублирует эффекты ЭЗК в отношении фосфо-
рилазы и ФФК (и даже дополняет их влиянием
цитрата на ФФК). С другой стороны,, чувстви-
тельность цитратсинтетазы к аллостерическим
эффектам ацетил-КоА и сукцинил-КоА вносит
весомый вклад в координацию процессов ис-
пользования молекул ацетил-КоА различного
происхождения (углеводного, жирового или
белкового).
Конкретные проявления автономной само-
регуляции углеводного обмена удобнее всего
рассмотреть на примере разных функциональ-
ных состояний скелетной мышцы, а также ор-
ганизма в целом.
6.8.1. ИНТЕНСИВНАЯ МЫШЕЧНАЯ РАБОТА
Значительных расходов АТФ требуют и
сократительные акты, и каждое расслабление
мышечных волокон. Обусловленная этим тен-
денция к снижению ЭЗК стимулирует работу
систем митохондриального окисления, ускоряя
реакции ЦТК, в том числе - утилизацию на-
чальных метаболитов цикла. Наступающим
уменьшением концентраций цитрата и АТФ
устраняется их угнетающее действие на ФФК,
а появление АМФ еще и активирует ее. В итоге
фосфофруктокиназная реакция начинает про-
текать быстрее, чем гексокиназная, а это чрева-
то снижением уровня глюкозо-6-фосфата и, как
следствие, снятием его угнетающего действия
на ГК и активирующего влияния на гликоген-
синтетазу. Следовательно, работающая мышца
не только усиленно потребляет глюкозу извне
(из сосудистого русла), но и более высокую
долю ее направляет на ГБФ-путь благодаря
ослаблению синтеза гликогена (ГМФ-путь в
228
Глава 6
мышцах отсутствует). Более того, в ГБФ-путь
вступают еще и молекулы глюкозо-6-фосфата,
возникающие при расщеплении гликогена (ко-
торое усиливается из-за активации фосфорила-
зы снижением ЭЗК).
Можно заключить: чем интенсивнее рабо-
тает мышца, тем больше глюкозы она потреб-
ляет и из крови, и из собственного гликогена,
накопленного ранее. И вся эта глюкоза исполь-
зуется ГБФ-путем, обеспечивая непрерывное
восполнение расходуемого АТФ. А главное -
все эти сдвиги происходят практически немед-
ленно и совершенно автоматически, без при-
влечения каких-либо внешних регуляторов или
сознательных команд.
Волевыми усилиями можно заставить
мышцу работать интенсивнее, чем это обеспе-
чено доставляемым к ней кислородом. Тогда
добавочная часть углеводов может расщеп-
ляться только до лактата. Прирост макроэргов
от этого невелик: всего 2 молекулы АТФ на
каждую молекулу глюкозы, расщепленную
сверх кислородного лимита. Однако он позво-
ляет хоть немного, но повысить эффективность
мышечной работы.
6.8.2. СОСТОЯНИЕ ПОКОЯ
В покоящейся мышце энергетические за-
траты нужны только для поддержания собст-
венной жизнеспособности («базальный уро-
вень»). В таких условиях расходы АТФ срав-
нительно невелики, и ЭЗК поддерживается на
относительно высоком уровне. Поэтому интен-
сивность реакций ЦТК снижается, что способ-
ствует увеличению концентраций начальных
метаболитов цикла. Накопление ацетил-КоА
вызывает активацию ключевого фермента гли-
конеогенеза (и обращения гликолиза) — пиру-
ваткарбоксилазы. Это способствует усилению
биосинтеза углеводов, в том числе и из лактата
(если он накопился во время предыдущей ра-
боты). Кроме того, повышение уровня цитрата
усиливает тормозящее действие АТФ на фос-
фофруктокиназу, переводя ее в ранг лимити-
рующего звена. Из-за этого создаются условия
для накопления предшествующих метаболитов,
в том числе глюкозо-6-фосфата. Избыток по-
следнего имеет двоякие последствия. С одной
стороны, он угнетает гексокиназу, тем самым
снижая общее потребление глюкозы клетками.
С другой стороны - активирует гликогенсинте-
тазу, из-за чего более высокая доля потребляе-
мой все же глюкозы направляется на синтез
гликогена. Накоплению этого резервного поли-
сахарида способствует и то, что распад его в
условиях покоя значительно замедляется бла-
годаря торможению фосфорилазы высоким
соотношением АТФ/АДФ.
Эффект накопления гликогена в благопри-
ятных («базальных») условиях присущ не
только мышечным, но и другим клеткам, спо-
собным депонировать этот углевод, - прежде
всего, гепатоцитам и лейкоцитам.
6.8.3. ГИПОДИНАМИЯ ПРИ ИЗБЫТОЧНОМ
УГЛЕВОДНОМ ПИТАНИИ
Малоподвижный образ жизни отражается
на состоянии не только мускулатуры, но и все-
го организма, особенно в условиях чрезмерно-
го потребления углеводов. Поначалу избыток
углеводов накапливается в виде гликогена,
главными депо которого являются мышцы и
печень. Однако их возможности не беспре-
дельны: у взрослого человека совокупный за-
пас полисахарида составляет примерно 400-
500 г. т.е., практически равен суточной потреб-
ности в глюкозе. Продолжающий поступать
избыток углеводов организм тоже использует
для накопления энергетических ресурсов, но
уже в иной форме, — в виде запасных жиров
(триацилглицеролов). И обеспечивают это те
же самые механизмы автономной саморегуля-
ции, которые уже неоднократно упоминались.
Специфика лишь в том, что теперь их потенци-
ал используется не только для обычных нужд
(восполнение расходов АТФ, синтез гликоге-
на), но еще и для переработки избыточной
глюкозы в триацилглицеролы.
Реализуется эта задача благодаря тому, что
часть ацетил-КоА, образующегося из глюкозы,
оказывается излишней для ЦТК (ибо этот цикл
тормозится высоким уровнем ЭЗК, типичным
для состояния покоя), но может быть исполь-
зована для синтеза жирных кислот (химизм
которого будет изложен в разделе 7.4). Этот
процесс наиболее интенсивно протекает в пе-
чени. Он не только изымает часть избыточной
глюкозы, но и стимулирует утилизацию другой
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
229
ее части ГБФ-путем (чтобы получить доста-
точное количество АТФ, необходимого для
такого синтеза). Наконец, существенная доля
«лишней» глюкозы подвергается деградации
ГМФ-путем с целью выработки НАДФ-//2, во-
дород которого интенсивно потребляется при
синтезе жирных кислот из ацетил-КоА.
Таким образом, все три источника биоге-
неза жирных кислот - ацетил-КоА, НАДФ-Я2 и
АТФ — имеют почти исключительно углевод-
ное происхождение (см. рис. 6-33). Кроме того,
и в ГБФ-пути, и в ГМФ-пути образуются моле-
кулы ФГА, кето-изомер которых (ДГАФ) легко
восстанавливается до глицерол-3-фосфата.
Взаимодействуя с ним, жирные кислоты пре-
вращаются в триглицериды, которые и откла-
дываются в жировых депо.
В отличие от углеводов триацилглицеролы
могут накапливаться в организме почти без-
гранично, увеличивая массу жировой ткани
(подкожная клетчатка, сальник и т.д.). По мере
надобности (особенно при голодании), они
легко мобилизуются в качестве энергетическо-
го материала, альтернативного углеводам.
Тесная взаимосвязь углеводного и жиро-
вого обмена очень выгодна организму. В част-
ности, она позволяет в широких пределах
варьировать соотношение углеводов и липидов
в ежесуточном рационе человека (и животных).
Есть, однако, и определенные опасности в
чрезмерном потреблении углеводов, не под-
крепленном достаточной мышечной активно-
стью. Главная из них связана с тем, что из тех
же источников - ацетил-КоА, АТФ и НАДФ-7У2
- в клетках (особенно, в гепатоцитах) синтези-
руются не только жирные кислоты, но и холе-
стерол. А этот синтез, как показывает схема на
рис. 6-33, необратим: в отличие от жиров, по-
лициклическая структура холестерола не мо-
жет расщепляться в наших клетках. Чрезмер-
ное накопление его в организме способствует
развитию атеросклероза. Давно установлено,
что избыточная масса тела является одним из
факторов риска в развитии данного заболева-
ния. Именно в этом заключаются опасные по-
следствия избыточного углеводного питания на
фоне слабой утилизации углеводов по их пря-
мому назначению: давать энергию для актив-
ного, подвижного, если не сказать - спортив-
ного - образа жизни.
6.9. ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ
ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА
УГЛЕВОДОВ
Как и механизмы автономной саморегуля-
ции, гормональный контроль энергетического
метаболизма углеводов направлен на поддер-
жание сбалансированности доминирующих пу-
тей утилизации глюкозы, а главное — на обес-
печение соответствия их интенсивности теку-
щим потребностям клетки (и организма в це-
лом). Благодаря этому внутриклеточная концен-
трация глюкозы остается довольно стабильной
(в пределах 2,6-4,9 ммоль/л), вопреки значи-
тельным колебаниям скорости ее утилизации.
Эта стабильность создает оптимальные условия
и для обеспечения глюкозой минорных путей ее
метаболизма (включая синтез гликоконъюга-
тов), регуляция которых осуществляется в ос-
новном на уровне экспрессии генов, кодирую-
щих соответствующие ферменты.
Концентрация глюкозы в плазме крови
обычно тоже довольно постоянна и несколько
выше, чем в клетках: натощак, в состоянии по-
коя она составляет 3,8-6,1 ммоль/л. Такой гра-
диент способствует потоку глюкозы извне в
клетки. При этом уровень ее в цельной крови
(3,3-5,6 ммоль/л) является объективным пока-
зателем состояния внутриклеточного метабо-
лизма углеводов во всем организме.
Типичной для гормонов является множе-
ственность эффектов, которые они вызывают.
Только часть наблюдаемых сдвигов оказывает-
ся результатом прямого воздействия на некую
«мишень»; большинство же отражает те или
иные последствия первичного эффекта, вызы-
ваемые обычно ответной реакцией механизмов
автономной саморегуляции.
Неудивительно поэтому, что изменения
уровня глюкозы в крови нередко становятся
лишь косвенным проявлением гормональных
сдвигов. Примером может быть один из самых
«разносторонних» регуляторов метаболизма —
соматотропин (СТГ), или гормон роста (ГР).
Этот небольшой белок (около 20 кДа) синтези-
руется гипофизом и выделяется в кровь пуль-
сирующим образом (через определенные ин-
тервалы времени), преимущественно во время
ночного сна. Главные его воздействия направ-
лены на регуляцию процессов роста и развития
230
Глава 6
организма, — прежде всего, на усиление био-
синтеза белков и замедление их распада. В ос-
новном эти эффекты опосредуются инсулино-
подобным ростовым фактором 1 (insulin-like
growth factor-1, - IGF-1). Вместе с тем, связы-
вание СТГ с рецепторами адипоцитов «вклю-
чает» аденилатциклазную систему (см. раздел
2.2.3), чья протеинкиназа А активирует гормон-
чувствительную триглицеридлипазу, — ключе-
вой фермент распада жиров. Поступление в
кровь свободных жирных кислот способствует
утилизации их (и образующегося из них аце-
тил-КоА) другими клетками. Этим вводится
(благодаря вовлечению механизмов автоном-
ной саморегуляции) своеобразный «режим
экономии» глюкозы на энергетических нуждах,
благоприятствующий ее использованию для
биогенеза структурных гликоконъюгатов.
Ограничение углеводной составляющей энер-
гетического метаболизма создает тенденцию к
повышению содержания сахара в крови, кото-
рую дополняет еще один эффект СТГ: стиму-
ляция им а-клеток поджелудочной железы
усиливает синтез и секрецию глюкагона, веду-
щего к распаду гликогена в печени и выходу
глюкозы в кровь (см. ниже). Наступающее из-
за всего этого повышение уровня глюкозы в
крови (гипергликемия) обычно невелико и чаще
наблюдается в юношеском возрасте.
Другим примером являются тироидные
гормоны (см. рис. 2-29), эффекты которых реа-
лизуются путем воздействия на рецепторы в
клеточном ядре (и митохондриях), куда йодти-
ронины проникают благодаря своей липофиль-
ности. По существу, эти рецепторы являются
гормон-чувствительными факторами транс-
крипции: кроме обычных центров связывания с
инициаторным фактором транскрипции (см.
раздел 2.4.2) и с промотором молекулы ДНК,
они имеют еще и третий центр, который спе-
цифичен для йодтаронинов. Модулируя экс-
прессию конкретных генов, эти гормоны ста-
новятся необходимым звеном в регуляции рос-
та и развития организма. Самый же необычный
их эффект связан с контролем выработки теп-
ла. Гиперпродукция йодтаронинов приводит к
разобщению окислительного фосфорилирова-
ния во всех тканях (кроме мозга и некоторых
специализированных клеток). И хотя в деталях
этот эффект не вполне ясен, последствия его
типичны (см. раздел 5.2.6): возникающий де-
фицит АТФ вынуждает механизмы автономной
саморегуляции усиливать мобилизацию всех
энергетических ресурсов. Какой-то вклад вно-
сит повышенный распад гликогена в печени с
поступлением глюкозы в кровь. Но главным
источником становятся жировые запасы (кото-
рые у взрослого человека составляют примерно
12 кг). Как уже отмечалось, избыток жирных
кислот и образуемого из них ацетил-КоА спо-
собствует гликонеогенезу, но мешает распаду
глюкозы ГБФ-путем, что и приводит к повы-
шению ее содержания в крови. Возникающая
гипергликемия невелика, но довольно стабиль-
на. Гипофункция щитовидной железы, напро-
тив, сопровождается заметной гипогликемией.
Глюкокортикостероиды (ГКС) представ-
лены у человека в основном кортизолом, в го-
раздо меньшей степени — кортикостероном
(формулы обоих представлены на рис. 7-32).
Будучи, как и йодтиронины, липофильными
веществами, они переносятся кровью в виде
комплекса с транскортином (кортакостероид-
связывающий глобулин). При этом около 10%
кортизола циркулирует в несвязанном виде.
Именно в свободной форме ГКС путем простой
диффузии проникают в клетку, где особые бел-
ки-переносчики доставляют стероид к ядру и
«передают» специальным рецепторам, которые
являются лиганд-зависимыми факторами
транскрипции и, следовательно, регулируют
экспрессию «опекаемых» ими генов. Среди
конечных эффектов ГКС доминируют усиле-
ние катаболизма белков и торможение их био-
генеза (включая синтез мышечных белков и
коллагенов межклеточного вещества). Тем са-
мым создаются условия для образования угле-
водов из продуктов распада аминокислот.
Кроме того, в гепатоцитах эти гормоны стиму-
лируют еще и выработку ключевых ферментов
гликонеогенеза (в том числе, пируваткарбокси-
лазы и ФЕП-карбоксикиназы). Все это ведет к
тому, что избыточность ГКС проявляется, сре-
ди прочего, некоторой гипергликемией.
Увеличение концентрации глюкозы в кро-
ви под влиянием перечисленных гормонов
очень невелико (обычно не более чем до
7-8 ммоль/л) и почти всегда является косвен-
ным последствием главных метаболических
эффектов. Гораздо более значимые возденет-
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
231
вия на углеводный обмен оказывают те гормо-
ны, главными «мишенями» которых становятся
ключевые ферменты метаболизма собственно
глюкозы. К этим гормонам прямого действия
относятся инсулин, глюкагон и катехоламины
(адренал ин/норадренал ин).
6.9.1. ИНСУЛИН
Вырабатываемый р-клетками островков
Лангерганса поджелудочной железы, инсулин
представляет собой небольшую белковую мо-
лекулу (~ 6 кДа), которая состоит из двух по-
липептидных цепей, соединенных двумя ди-
сульфидными связями. Синтезируется гормон
в виде предшественника, который в ходе про-
цессинга теряет около половины своего соста-
ва. Зрелый инсулин накапливается в секретор-
ных гранулах. Повышение уровня глюкозы в
крови - главный фактор, вызывающий секре-
цию гормона. Полагают, что данный рецеп-
тор-зав исимый эффект опосредован аденилат-
циклазной системой р-клеток. Он проявляется
при концентрации глюкозы в крови, состав-
ляющей 4,4-5.5 ммоль/л, и достигает максиму-
ма при ее повышении до 17-28 ммоль/л. Этот
ведущий механизм может корректироваться в
ту или другую сторону целым рядом других
гормональных факторов.
Описано множество метаболических и
функциональных изменений, вызываемых ин-
сулином и, особенно, его недостаточностью.
Однако до сих пор не стало правилом (как и
для других сигнальных молекул) отличать пря-
мые эффекты от тех последствий, которые воз-
никают в ответ на вызванные гормоном сдвиги
и непосредственно от него уже не зависят, а
реализуются в основном механизмами авто-
номной саморегуляции. Очевидно, что такое
разграничение способствует пониманию
иерархии регуляторных эффектов и, следо-
вательно. более точной оценке роли и весомо-
сти каждого из них.
Клеточные рецепторы инсулина относятся
к тирозинкиназному типу. Как отмечено в раз-
деле 2.2.3, связывание с гормоном приводит к
их аутофосфорилированию. Более того, перей-
дя в активную форму, такие рецепторы катали-
зируют также фосфорилирование строго опре-
деленных белков цитоплазмы, которые в ре-
зультате этого и становятся вторичными по-
средниками, обеспечивающими конечные эф-
фекты гормона. Точные механизмы реализации
не вполне выяснены, но сами эти эффекты из-
вестны давно. В регуляции углеводного обмена
решающую роль играют два из них.
Первый и самый быстрый эффект (секун-
ды) - обратимый процесс перемещения из ци-
топлазмы к плазматической мембране тех бел-
ков-переносчиков, которые осуществляют об-
легченный транспорт гексоз в клетку. А про-
ницаемость для глюкозы оказалась еще более
узким звеном, чем даже гексокиназы. По-
этому ускоренное поступление глюкозы ведет
к усилению ее утилизации клеткой. А вот на
каком пути станет использоваться «добавоч-
ная» глюкоза - это уже от инсулина не зависит.
Это контролируют механизмы автономной са-
морегуляции (как они представлены в разделе
6.8). В работающей мышце она будет утилизи-
роваться ГБФ-путем, в отдыхающей (а также в
печени) - превращаться в гликоген. При необ-
ходимости может усиливаться и ГМФ-путь (в
обладающих им клетках). В частности, при ги-
подинамии инсулин будет облегчать перера-
ботку избыточных углеводов в жиры клетками
печени и жировой ткани, а гепатоцитами - еще
и в холестерол (кстати, давно замечено, что
ожирение часто сопровождается желчнокамен-
ной болезнью). Лишь в клетки мозга, печени и
в эритроциты глюкоза проникает независимо
от инсулина, путем простой диффузии по гра-
диенту концентрации. Поэтому снижение со-
держания глюкозы в крови до 2,2 ммоль/л, ко-
гда начинает падать поглощение ее нервными
клетками, чревато нарушениями функций моз-
га, который нуждается в непрерывном притоке
глюкозы.
Второй из прямых эффектов развивается
гораздо медленнее (от минут до часов), т.к. за-
ключается в регулировании экспрессии опре-
деленных генов. Установлено, что инсулин
стимулирует биосинтез ключевых ферментов и
ГБФ-пути, и пентозофосфатного цикла, и гли-
конеогенеза (последнему способствует и со-
действие гормона транспорту аминокислот в
клетки, которое развивается тоже не сразу).
Иными словами, происходит «подкрепление»
быстрого эффекта более продолжительным, но
действующим в том же направлении (т.е., уве-
232
Глава 6
личивается не только активность ключевых
ферментов, но и их концентрация в клетке).
Таким образом, оба главных эффекта при-
водят к повышенной утилизации глюкозы клет-
ками. Этому способствует и третий эффект,
также сравнительно медленный: активируя одну
из протеинфосфатаз, инсулин способствует де-
фосфорилированию гормон-чувствительной
липазы адипоцитов, т.е., переводу ее в неактив-
ную форму. Как уже отмечалось, этот фермент
контролирует скорость распада жиров. При его
торможении замедляется поступление жирных
кислот в другие клетки, где они, расщепляясь до
ацетил-КоА, способны конкурировать с глюко-
зой, ограничивая ее утилизацию. Следователь-
но, и этот эффект, хотя и не напрямую (а через
«пороги» автономной саморегуляции), но все-
таки тоже настраивает клетку на предпочти-
тельное расщепление углеводов, а не жиров.
Итак, главное предназначение инсулина -
усиливать утилизацию глюкозы в клетках лю-
быми возможными путями. Из-за этого и на-
ступает снижение ее содержания в крови.
А оно ведет к уменьшению секреции инсулина
и замедлению потребления глюкозы клетками.
Иными словами, посредством инсулина обес-
печивается регуляция «в обе стороны».
Нарушения инсулинового контроля связа-
ны, как правило, с недостаточностью этого
гормона. Она приводит к развитию очень рас-
пространенного и тяжело протекающего забо-
левания, обозначаемого как сахарный диабет.
Лишь у 10-15% больных первопричиной слу-
жит недостаточная выработка гормона, - обыч-
но из-за аутоиммунной деструкции р-клеток
(инсулинзависимый сахарный диабет; диабет 1
типа). Чаще же в основе патологии лежат за-
держка и снижение секреции инсулина в ответ
на гипергликемию и/или ослабление эффектов
гормона в печени и скелетных мышцах, а также
(нередко) неадекватная реакция жировой ткани
на этот гормон (не-инсулинзависимый сахар-
ный диабет; диабет II типа; как правило, он
развивается у лиц старше 30 лет).
Несмотря на множество клинических ва-
риантов болезни, биохимические сдвиги, как
правило, однотипны и варьируют в основном
по степени выраженности. Обычный спектр их
составляют гипергликемия, глюкозурия, поли-
урия, жажда, кетоацидоз.
Гипергликемия наблюдается не только
при диабете, но и, например, после приема пи-
щи и при эмоциональном возбуждении. Эта
физиологическая гипергликемия (пищевая,
эмоциональная) преходяща и обычно не пре-
вышает 8-10 ммоль/л. В отличие от нее, пато-
логическая гипергликемия, наступающая при
сахарном диабете, если и не совсем, то почти
постоянна, а главное — может достигать очень
высоких значений. Во всяком случае, она регу-
лярно превышает 10-13 ммоль/л, но может воз-
растать до 20-40 ммоль/л, а в исключительных
случаях - до 50 ммоль/л и более.
Глюкозурия является прямым следст-
вием гипергликемии. В норме практически вся
глюкоза, попадающая в первичную мочу в ре-
зультате клубочковой фильтрации, подвергает-
ся обратному всасыванию в канальцах (вместе
с водой), так что в окончательной моче ее со-
держание становится почти таким же, как и в
плазме крови, т.е., не превышает 0.1%. Обыч-
ными методвми такие количества не выявля-
ются (поэтому в результатах лабораторного
анализа так и отмечают: «глюкозы в моче
нет»). При сахарном диабете содержание саха-
ра в моче часто составляет 0,5-3%, но может
достигать 8-10% и более. Это объясняется тем,
что обратное всасывание глюкозы в канальцах
эффективно до тех пор, пока ее концентрация в
плазме крови не превысит порогового значе-
ния, за пределами которого содержание глюко-
зы в конечной моче становится пропорцио-
нальным степени превышения этого порогово-
го уровня. Индивидуальные значения почечно-
го порога для глюкозы составляют у здоровых
людей от 10 до 13 ммоль/л. Поэтому в те пе-
риоды, когда ее концентрация в плазме крови
превышает этот уровень, начинаются потери
сахара с мочой. Они тем большие, чем выше
степень этого превышения. Таким образом,
глюкозурия при сахарном диабете по природе
своей является гипергликемической глюкозури-
ей. Этим она отличается от почечной глюкозу-
рии, которая развивается при нормальной (или
даже пониженной) концентрации глюкозы в
крови и свидетельствует о нарушении функций
самой почки (например, в результате воздейст-
вия нефротоксических агентов), приводящем к
ослаблению канальцевой реабсорбции (сниже-
нию почечного порога для глюкозы).
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
233
Полиурия при сахарном диабете отра-
жает степень выраженности глюкозурии. В ка-
честве осмотически активного вещества глю-
коза «удерживает» в окончательной моче опре-
деленное количество воды, препятствуя ее ре-
абсорбции. Суточный объем мочи часто со-
ставляет 3-5 л, а в доинсулиновую эпоху у
многих больных мог достигать 10-20 л.
Жажда возникает из-за потери жидкости
с выделяемой мочой. Часто именно полиурия и
повышенное потребление жидкости (полидип-
сия) становятся первыми признаками заболева-
ния, которые и побуждают пациента обратить-
ся к врачу.
Все перечисленные проявления сахарного
диабета, хотя и являются значительным откло-
нением от нормы, но сами по себе жизни не
угрожают. Подлинная опасность заключается в
нарушении поступления глюкозы в клетки и
утилизации ими этого энергетического ресурса.
Иными словами, клетки голодают (большин-
ство из них), хотя и окружены средой с повы-
шенным содержанием глюкозы. Выход из по-
ложения «предлагает» сам инсулин, точнее -
его недостаток. Как отмечалось выше, этот гор-
мон, способствуя потреблению глюкозы клет-
ками, в то же время тормозит мобилизацию
жировых запасов. Инсулиновая недостаточ-
ность ведет к снятию этого ограничения и вы-
зывает приток глицерола и жирных кислот в
кровь. Отсюда их черпают многие ткани (вклю-
чая мышечную), компенсируя недостаток глю-
козы (важное исключение составляют нервные
клетки, неспособные расщеплять жирные ки-
слоты). Однако мобилизация жира регулирует-
ся не так тщательно, не столь «многослойно»,
как углеводный обмен: по существу, ее кон-
тролирует только один фермент - гормон-
чувствительная триглицеридлипаза такой мас-
сивной ткани, как жировая. Поэтому невоз-
можно достичь того, чтобы поток жирных ки-
слот в кровь строго отвечал сиюминутной по-
требности в них (которая особенно переменчи-
ва в скелетных мышцах). Фактически создается
явная избыточность их («на всякий случай»).
В печени, как и в других органах (кроме мозга),
жирные кислоты легко расщепляются до аце-
тил-КоА. Поскольку нужды самих гепатоцитов
довольно невелики (и постоянны во времени),
«лишние» здесь молекулы ацетил-КоА конден-
сируются, образуя ацетоуксусную и р-гидрок-
симасляную кислоты (химизм этих реакций
представлен на рис. 7-8). Обе поступают в
кровь и легко проникают в другие ткани, где
вновь превращаются в ацетил-КоА, становясь
заменой недостающей глюкозе. Метаболиче-
ский дисбаланс приводит к резкому повыше-
нию в крови содержания обеих этих кислот, а
также к появлению в ней ацетона (этот лету-
чий продукт спонтанного декарбоксилирова-
ния ацетоацетата проявляет себя «запахом гни-
лых яблок» изо рта). Все три вещества в сово-
купности обозначаются с давних времен как
кетоновые тела.
Кетоацидоз при сахарном диабете ста-
новится самым тяжелым нарушением метабо-
лизма, наиболее опасным по своим последст-
виям. В крови концентрация кетоновых тел
(среди них преобладает р-гидроксибутират)
может возрастать в десятки раз, - с обычных
0,1-0,2 до 30-40 ммоль/л. Эти простые вещест-
ва легко выводятся, а потому вслед за кетоне-
мией возникает кетонурия: экскреция их с мо-
чой возрастает с неуловимых 20-40 мг в сутки
до 10-50 г. Накопление довольно сильных ор-
ганических кислот в крови ведет к сдвигу ки-
слотно-щелочного баланса в кислую сторону.
Метаболический ацидоз проявляется снижени-
ем содержания бикарбонатов в плазме крови, а
затем и величины pH. Выводимые с мочой ки-
слоты (ацетоуксусная и р-гидроксимасляная)
увлекают с собой ионы Na+ и К+, еще более
усиливая осмотический диурез и усугубляя со-
стояние дегидратации организма. Ацидоз,
утечка катионов и дегидратация особенно
опасны для мозга. В отсутствие надлежащего
лечения это вызывает гипергликемическую ко-
му. Она проявляется помутнением и потерей
сознания, расстройством дыхания, судорогами,
а потому чревата летальным исходом. Для спа-
сения больного нужны срочное вливание фи-
зиологического раствора (для преодоления
обезвоженности организма) и инъекция инсу-
лина.
Метод получения инсулина из поджелу-
дочной железы животных разработали в 1922 г
30-летний канадский ученый Фредерик Бан-
тинг и его студент Чарльз Бест. После испыта-
ний на экспериментальных животных они сра-
зу стали применять выделяемый препарат для
234
Глава 6
лечения безнадежно больных детей с тяжелой
формой сахарного диабета. Эффект был на-
столько разительным, что уже через год работа
была отмечена Нобелевской премией (а
Ф. Бантинг стал профессором). И поныне ин-
сулин, производимый современными методами
в промышленных масштабах, служит спасению
многих миллионов больных.
Гипогликемическая кома развивается
обычно при случайной передозировке инсули-
на. Чрезмерное падение уровня глюкозы в кро-
ви нарушает снабжение мозга единственным
питательным ресурсом. Поэтому внешние про-
явления такой комы почти неотличимы от ко-
мы гипергликемической. Вместе с тем, лечение
- прямо противоположное: надо срочно вво-
дить глюкозу (но ни в коем случае не инсу-
лин!). В принятии неотложного решения очень
важны результаты экспресс-анализов глюкозы
и кетоновых тел в крови и моче.
В целях ранней диагностики начальных
форм сахарного диабета применяется проба на
переносимость глюкозы. Ее проводят утром,
натощак, в спокойном состоянии пациента.
В положении сидя ему предлагают выпить рас-
твор 75 г глюкозы в стакане воды. В этот мо-
мент и через каждые 30 мин в течение после-
дующих двух часов у него берут из пальца
кровь для определения глюкозы. В современ-
ной трактовке результаты анализов («сахарная
кривая») расцениваются как свидетельство ин-
сулиновой недостаточности, если хотя бы в
одной из проб крови концентрация глюкозы
превышает 10,1 ммоль/л.
6.9.2. ГЛЮКАГОН
Инсулин является единственным гормо-
ном, снижающим уровень глюкозы в крови.
Все остальные гормоны повышают его. Наибо-
лее стабильный вклад вносит глюкагон. Этот
небольшой белок (менее 4 кДа) вырабатывает-
ся по соседству с инсулином - в а-клетках пан-
креатических островков. Синтезируется он в
виде препроглюкагона, который в ходе процес-
синга превращается в готовый гормон, депони-
руемый в специальных гранулах. Его секреция
в кровь происходит в ответ на снижение со-
держания глюкозы в крови и тормозится при
гипергликемии (механизмы этого контроля еще
требуют уточнения).
Главные эффекты реализуются через спе-
цифические глюкагоновые рецепторы, кото-
рыми обладают гепатоциты и адипоциты. Свя-
зывание с ними активирует аденилатциклаз-
ную систему (см. раздел 2.2.3), нарабатываю-
щую молекулы цАМФ, под действием которых
протеинкиназа А переходит в активную форму.
Ее мишенью в жировых клетках является упо-
минавшаяся выше гормон-чувствительная три-
глицеридлипаза. Протеинкиназное фосфорили-
рование этого ключевого фермента усиливает
мобилизацию жиров и тем самым благоприят-
ствует утилизиции освобождаемых жирных
кислот и глицерола другими тканями (что спо-
собствует уменьшению распада углеводов в
них).
Липолитическое действие глюкагона явля-
ется минорным. Гораздо значительнее пече-
ночные эффекты. Гепатоциты содержат совсем
другие субстраты для протеинкиназы А. Здесь
ими оказываются ключевые ферменты синтеза
и распада гликогена. Протеинкиназное фосфо-
рилирование гликогенсинтетазы угиетает ее, а
также снижает ее чувствительность к глюкозо-
6-фосфату. Противоположное действие оказы-
вает протеинкиназа А на активность фосфори-
лазы гликогена. Но делает это не сама, а через
еще одну ступеньку усилительного каскада
сигнальной трансдукции, - киназу фосфорила-
зы. Будучи фосфорилирован протеинкиназой А,
этот фермент становится активным и катализи-
рует превращение неактивной фосфорилазы b в
активную фосфорилазу а, как это показано на
рис. 6-34.
Вызываемые глюкагоном торможение
гликогенсинтетазы и активация фосфорилазы
ведут к преобладанию распада печеночного
гликогена над его синтезом. Образующийся
при этом глюкозе-1-фосфат легко изомеризу-
ется в ГлбФ, который в печени, как уже из-
вестно читателю, может не только утилизиро-
ваться разными путями, но и гидролизоваться
до свободной глюкозы под действием имею-
щейся здесь глюкозо-6-фосфатазой. Поступая в
кровь, она вызывает гипергликемию, тем са-
мым содействуя утилизации сахара другими
тканями.
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
235
Рис. 6-34. Активация гликогенфосфорилазы протеинкиназой А аденилатциклазной системы
Неактивная форма гликогенфосфорилазы {фосфорилаза Ь) состоит из двух субъединиц, каждая из которых содер-
жит по радикалу серина, способному присоединять фосфатную группу под действием киназы фосфорилазы Ь. Такое фос-
форилирование приводит к образованию активного тетрамера {фосфорилаза а), катализирующего постепенную деграда-
цию гликогена до глюкозо-1-фосфата. По прекращении гормонального стимула дефосфорилирование активных форм
фосфорилазы и ее киназы проводят фосфатазы этих белков.
6.9.3. АДРЕНАЛИН (НОРАДРЕНАЛИН)
Биогенез катехоламинов и их формулы
представлены на рис. 5-49. Эти вещества вы-
полняют роль не только гормонов, но и медиа-
торов симпатической нервной системы, по-
стганглионарными нейронами которой, по су-
ществу, и являются хромаффинные клетки
мозгового вещества надпочечников. Главные
различия сводятся к тому, что клетки надпо-
чечника продуцируют в основном адреналин и,
кроме того, накапливают его (и норадреналин)
в особых гранулах, откуда выделяют в кровь в
ответ на нервные стимулы.
По чувствительности к разнообразным эф-
фекторам рецепторы к обоим гормонам подраз-
деляют на «-адренергические и р-адренергичес-
кие, а их, в свою очередь, на аг и «2-, pi- и рг-ре-
цепторы. Адреналин обладает более широким
спектром действия, связываясь и с а-, н с р-ре-
цепторами, так что итоговый эффект определя-
ется сродством гормона к разным рецепторам, а
главное - их соотношением в клетках данного
типа. Норадреналин активирует в основном «-ре-
цепторы. Поэтому для краткости в дальнейшем
изложении будет упоминаться только адрена-
лин, имея в виду, что на энергетический метабо-
лизм норадреналин, если где и оказывает влия-
ние. то в принципе такое же, как и адреналин.
В печени адреналин, связываясь с р2-ре-
цепторами, активирует аденилатциклазную
систему, благодаря чему (с участием протеин-
киназы А) вызывает такие же последствия, что
и глюкагон. To-есть, замедляет синтез гликоге-
на и усиливает его распад, способствуя выходу
в кровь значительной части глюкозы, освобож-
даемой из гликогена. Эти эффекты подкрепля-
ются воздействием адреналина на «1-рецепто-
ры, которое, хотя и реализуется через фосфо-
инозитидный путь трансдукции и протеинки-
назу С (см. раздел 3.3.4), но обеспечивает дос-
тижение (причем, независимое) той же цели:
236
Глава 6
преобладание гликогенолиза над синтезом гли-
когена, ведущее к усилению выхода глюкозы в
кровь. Наступающая гипергликемия благопри-
ятствует повышенному потреблению глюкозы
всеми остальными клетками. Таким образом,
печень выступает как «орган-альтруист»: она
расщепляет собственный гликоген, чтобы обес-
печивать глюкозой другие ткани.
Подобно глюкагону адреналин действует и
на адипоциты. Но его липолитический эффект
выражен гораздо мощнее, тем более что он уси-
ливается влиянием медиаторов, выделяемых
окончаниями симпатических нервов, которыми
богата жировая ткань. Усиление распада жиров
катехоламины осуществляют путем связывания
с р!-рецепторами, которые через аденилатцик-
лазную систему тоже активируют гормон-
чувствительную липазу адипоцитов. Освобож-
даемые при этом жирные кислоты (и глицерол)
поступают в кровь и используются разными
тканями (но не мозгом) в качестве энергетиче-
ского материала. Следовательно, адреналин спо-
собствует снабжению клеток-потребителей как
глюкозой из печени, так и жирными кислотами
(и глицеролом) из жировых накоплений.
Не в пример глюкагону, адреналин спосо-
бен не только стимулировать мобилизацию
жиров в жировой ткани, но и угнетать этот
процесс. Обеспечивается торможение по дру-
гим каналам - через а2-рецепторы адипоцитов.
Как отмечалось в разделе 2.2.3, сопряженная с
ними система сигнальной трансдукции не по-
вышает, а уменьшает концентрацию цАМФ.
Поэтому связывание катехоламинов с аг-рецеп-
торами способствует не активации, а угнете-
нию гормон-чувствительной липазы и, соот-
ветственно, замедлению распада жиров.
Наличие противоположных тенденций во
влиянии адреналина на липолиз в жировой
ткани расширяет возможности управления ба-
лансом процессов отложения жира и его моби-
лизации (который зависит, в частности, от ди-
намики концентраций катехоламинов). Есть и
другой аспект. Он проистекает из того, что со-
отношение рецепторов и <х2 различно в ади-
поцитах разных жировых депо одного и того
же индивидуума. Этим объясняют разные ва-
рианты локального накопления жира: на живо-
те или в области ягодиц и бедер.
В отличие от глюкагона, катехоламины ре-
гулируют энергетический метаболизм не толь-
ко в печени и жировых депо, но и в других
тканях. Ведущее место среди них занимают
скелетные мышцы, - и не только из-за высокой
доли их в общей массе тела, но и в связи с рез-
ким увеличением энергетических трат во время
сократительной деятельности. Главный эффект
адреналина в мышечной ткани заключается в
значительной стимуляции распада гликогена,
которая осуществляется через (^-адренорецеп-
торы подобно тому, как это происходит в пече-
ни. Образующийся здесь глюкозо-6-фосфат не
может расщепляться ГМФ-путем, ибо в мыш-
цах нет соответствующих дегидрогеназ. Отсут-
ствует в них и глюкозо-6-фосфатаза, необходи-
мая для превращения ГлбФ в глюкозу, способ-
ную выходить в кровь. Следовательно, весь
ГлбФ, образующийся при распаде гликогена
мышцы, расщепляется ГБФ-путем, обеспечивая
восполнение расходуемого ею АТФ (в дополне-
ние к той глюкозе, которая продолжает посту-
пать из крови). Таким образом, в противопо-
ложность печени, скелетная мышца - это «ор-
ган-эгоист»: свои запасы гликогена она исполь-
зует исключительно для собственных нужд.
Спектр действия катехоламинов не огра-
ничивается перечисленными эффектами. На
физиологическом уровне адреналин вызывает
учащение и усиление сердечных сокращений;
сужение сосудов кожи и органов брюшной по-
лости; расширение кровеносных сосудов с уве-
личением кровоснабжения мускулатуры;
углубление и учащение дыхания. Все эти про-
явления имеют общий знаменатель. Более все-
го в них заинтересована работающая мышца.
Именно на обеспечение интенсивной мышечной
деятельности направлены главные эффекты ад-
реналина: и стимуляция распада собственного
гликогена мышц, и повышение выхода глюкозы
(и кетоновых тел) из печени и жирных кислот (и
глицерола) из жировых депо, и ускорение дос-
тавки этих питательных веществ к мышцам, и
- что, пожалуй, самое важное - резкое увеличе-
ние поступления кислорода из легких. К тому
же, усилением кровотока обеспечивается и ус-
пешное удаление из мышечной ткани конечных
продуктов метаболизма, а также недоокислен-
ных веществ (включая лактат).
Как известно, наибольший выброс адрена-
лина в кровь наблюдается во время сильных
МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ
237
эмоций. Простые наблюдения показывают, что
эмоциональный накал животные испытывают
тогда, когда им приходится догонять добычу
или спасаться бегством (либо вступать в дра-
ку). По существу, как теперь стало очевидным,
эмоции - это механизм быстрой мобилизации
всех ресурсов организма на энергетическое
обеспечение интенсивной мышечной работы.
Доставляемые питательные вещества рас-
щепляются в мышцах почти исключительно
реакциями митохондриального окисления,
обеспечивающими наибольший выход АТФ.
Поэтому предел возможного определяется ско-
ростью доставки кислорода. Однако и этот
предел может быть несколько превзойден. Во-
левыми усилиями можно заставить мышцу ра-
ботать интенсивнее, чем это обеспечено дос-
тавляемым к ней кислородом. Тогда некоторое
количество углеводов может расщепляться
только до лактата. Прибавка макроэргов от
этого очень невелика (см. рис. 6-29), составляя
всего 2 молекулы АТФ на каждую молекулу
глюкозы, расщепленную сверх кислородного
лимита. Однако именно она позволяет, хоть
немного, но повысить эффективность мышеч-
ных усилий и может оказаться решающей в
достижении конечного результата (догнать,
убежать, победить).
Есть и еще один ресурс. Лактат, образуе-
мый в работающей мышце, легко переходит в
кровь и достигает, в частности, печени. Здесь, в
отличие от мышц, дефицита кислорода не бы-
вает даже при энергичной мышечной работе.
Расщепление примерно 20% доставленного
лактата аэробным путем (до СО2 и Н2О) дает
столько АТФ, что его достаточно для превра-
щения остальных 80% в глюкозу. Новообразо-
ванный сахар переходит в кровь и может быть
использован мышцами (в том числе и для гли-
колиза). Этот кругооборот называют циклом
Кори (по имени открывших его супругов).
Фактически он позволяет мышцам использо-
вать не только «свой» кислород, но и часть О2,
поступающего в печень.
Таким образом, механизм эмоций жизнен-
но важен для животных. Получив его «по на-
следству», человек тоже обрел соответствую-
щие возможности и часто реализует их. Ти-
пичный пример - предстартовое волнение у
спортсменов. Но человек устроен гораздо
сложнее. В частности, он обладает второй сиг-
нальной системой. Поэтому нередко эмоции
возникают в ситуации, не позволяющей сразу
же разрядить их мышечной деятельностью.
Тогда мобилизованные энергетические ресур-
сы, не будучи утилизированными по прямому
назначению (синтез АТФ для мышечной рабо-
ты), переводятся механизмами автономной са-
морегуляции на синтез жиров и холестерола
(как это разъяснено в разделе 6.8.3). Давно за-
мечено, что атеросклероз с его осложнениями
(инфаркт миокарда, инсульт) и чрезмерное от-
ложение жира чаще развиваются у людей ум-
ственного труда, особенно в профессиях, свя-
занных с сильными эмоциями, не подкрепляе-
мыми сразу мышечной активностью.
Глава 7
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
Будучи гидрофобными, липиды оказыва-
ются единственным «оппонентом» полярным
белкам и углеводам и вносят особый вклад в
осуществление каждой из наиболее общих био-
логических функций — энергетической, струк-
турной (пластической) и регуляторной.
Энергетическую роль выполняют в основ-
ном нейтральные жиры, потребление которых
взрослым человеком достигает 60-80 г в сутки.
Калорийность их (9,3 ккал/г) более чем вдвое
превышает таковую белков или углеводов, при
полном сгорании которых теплопродукция со-
ставляет 4,1 ккал/г (17,2 кДж/г). Поэтому три-
глицериды жировых депо являются наиболее
компактной формой накопления энергетиче-
ских ресурсов.
Пластическая роль является главенст-
вующей для фосфо- и гликолипидов, поскольку
именно они (вместе с холестеролом) составля-
ют структурную основу липидного бислоя био-
логических мембран. Триглицериды вносят
далеко не столь фундаментальный вклад, но и
образуемые ими жировые отложения тоже не-
обходимы для выполнения некоторых частных
функций (таких как депонирование жирорас-
творимых витаминов А, Д, Е и К; опора для
почек и других внутренних органов; защита от
травм и теплопотерь).
Регуляторная роль липидов многопланева.
В значительной мере она обусловлена участи-
ем в осуществлении регуляторных функций
биомембран, в том числе - в реализации меха-
низмов сигнальной трансдукции (раздел 3.3.4).
Особые производные холестерола становятся
половыми или кортикоидными гормонами.
Широкий спектр специфических регуляторных
эффектов реализуют такие метаболиты поли-
еновых кислот, как лейкотриены и простанои-
ды (описанные в разделах 5.4.5 и 5.4.6). Нако-
нец, следует упомянуть и желчные кислоты
(см. рис. 5-42), необходимые, в частности, для
регулирования процессов пищеварения.
7.1. ПЕРЕВАРИВАНИЕ И ВСАСЫВАНИЕ
ЛИПИДОВ
Ферменты, гидролитически отщепляющие
жирные кислоты от ацилглицеролов, называ-
ются липазами. Будучи белками, они неспо-
собны проникать в неполярную фазу и потому
могут осуществлять свое действие лишь на
границе жира с водной средой.
Переваривание липидов начинают липаза
желудочного сока и язычная липаза, которая
выделяется железами фон Эбнера слизистой
оболочки языка. Оптимум pH для этих фермен-
тов составляет 4,0 и выше, а потому в желудке
взрослого человека они почти не работают из-
за сильно кислой среды (pH »1,5). У детей, од-
нако, кислотность желудочного сока гораздо
менее значительна. Кроме того, обе липазы
предпочитают отщеплять жирные кислоты с
короткой или средней длины цепью, каковыми
богаты жиры молока, к тому же, высокоэмуль-
гированные. Поэтому именно триглицериды
(ТГ) молока подвергаются существенному гид-
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
239
релизу в желудке, особенно у младенцев. Вы-
свобождаемые жирные кислоты с короткой це-
пью здесь же и всасываются, поступая затем с
кровью воротной вены непосредственно в пе-
чень. Остальные остаются растворенными в
жировых каплях.
В основном же переваривание липидов
происходит в тонкой кишке. Его осуществляет
липаза, содержащаяся в соке поджелудочной
железы. Бикарбонаты этого сока и желчи, тоже
изливающейся в 12-перстную кишку, создают
оптимальную среду для действия панкреатиче-
ской липазы, нейтрализуя соляную кислоту
поступающего сюда желудочного содержимо-
го. Кроме того, желчные кислоты, будучи де-
тергентами, способствуют эмульгированию жи-
ров и тем самым увеличивают площадь контак-
та липазы с жировыми каплями. Наконец, есть
еще один фактор - колипаза. Этот маленький
белок выделяется с панкреатическим соком в
виде проколипазы. Ограниченный протеолиз ее
трипсином облегчает сорбцию кофактора на
С-концевом (некаталитическом) домене пан-
креатической липазы. В итоге возрастает его
гидрофобность, обеспечивающая фиксацию
фермента на разделе фаз вода/жир. Это позволя-
ет сосредоточить здесь панкреатическую липазу
и обеспечить ей «фронт работы» на поверхности
жировых капель.
Предпочтительно эта липаза гидролизует
эфирные связи при концевых углеродных ато-
мах глицерола. Поэтому значительная доля ее
продуктов всасывается в кишечнике в виде
2-моноацилглицеролов. В некоторой степени
она способна гидролизовать также эфиры хо-
лестерола и фосфолипиды. Но есть в соке под-
желудочной железы и специальные ферменты
- холестеролэстераза и фосфолипаза А2 (выде-
ляемая в виде профермента и активируемая
трипсином). Имеются данные, что и кишечный
сок может осуществлять ферментативный гид-
ролиз фосфатидов.
Из продуктов переваривания липидов
труднее всего всасываются жирные кислоты.
Лишь те из них, карбоксильная группа которых
несет на себе не слишком длинный углеводо-
родный «хвост» (не более 10 углеродных ато-
мов), могут проникать через мембрану энтеро-
цитов и попадать затем в кровь и далее - в пе-
чень (как и все гидрофильные продукты пере-
варивания липидов - глицерол, инозитол, се-
рин, моносахариды и т.д.). Всасывание более
крупных жирных кислот возможно только бла-
годаря их взаимодействию с желчными кисло-
тами. Возникающие холеиновые комплексы ор-
ганизуются в мицеллы. Их гидрофобное ядро
состоит в основном из жирных кислот и моно-
глицеридов, а также холестерола (ХС) и его
эфиров. Поверхностный слой представлен по-
лярными фрагментами желчных кислот и, кро-
ме того, фосфолипидами, которые в неболь-
шом количестве содержатся в желчи, но могут
иметь и пищевое происхождение. По размерам
мицеллы на 2 порядка мельче частиц самой
тонкой жировой эмульсии, что способствует их
проникновению в энтероциты. Здесь мицеллы
распадаются, и освободившиеся желчные ки-
слоты поступают с током крови в печень, кото-
рая извлекает их и вновь выводит ₽ желчные
протоки. Эта печеночно-кишечная рециркуля-
ция позволяет до 10 раз использовать каждую
молекулу желчных кислот и поддерживать су-
точную выработку их в организме на уровне
всего лишь —0,5 г (для компенсации неизбеж-
ных потерь с экскрементами).
При расстройствах переваривания и вса-
сывания жира значительные количества его
выводятся с калом (стеаторея). Это ведет к на-
рушению всасывания жирорастворимых вита-
минов (A, D, Е, К). Кроме того, непереварен-
ный жир, обволакивая частицы пищи, затруд-
няет переваривание всех других пищевых ве-
ществ в просвете кишечника.
Жирные кислоты с длинной цепью, осво-
бождаемые в энтероцитах при распаде холеи-
новых комплексов, используются здесь же для
ресинтеза собственных ТГ (и фосфолипидов),
отличных по составу ст липидов пищи. К это-
му привлекаются не только моноглицериды, но
и всасываемый глицерол. Частично подверга-
ется эстерификации и ХС.
Синтезируемые в стенке кишки липиды
накапливаются в особых липопротеиновых
частицах диаметром 150-500 нм, именуемых
хиломикронами (ХМ). Они состоят в основном
из ТГ и содержат в 30 раз меньше фосфолипи-
дов и в 20 раз меньше ХС и его эфиров. Непо-
лярные молекулы ТГ и эфиров ХС погружены
вглубь частицы, образуя гидрофобное ядро,
которое окружено монослоем фосфолипидов
240
Глава 7
(ФЛ), свободного ХС и единичных молекул
особого белка, обозначаемого как апопротеин
В-48 (апоВ-48).
Белок апоВ-48 специфичен для ХМ и син-
тезируется только в энтероцитах. Недавно вы-
яснена необычность механизма постгрансля-
ционной регуляции его биогенеза. Как оказа-
лось, еще задолго до окончания синтеза поли-
пептидной цепи (более 2 000 АО) ее гидрофоб-
ный N-конец, проникнув в просвет ЭР, должен
связаться с липидными частицами (доставляе-
мыми сюда триглицерид-транспортным бел-
ком). Только в этом случае возможно заверше-
ние синтеза белка, его дальнейшее обогащение
липидами (в гладком ЭР) и последующее до-
зревание в аппарате Гольджи (включая его гли-
козилирование). Если же встреча с липидными
частицами в просвете ЭР не состоится, то рас-
щепление апоВ начинается (с N-конца) на фоне
еще продолжающегося в рибосомах синтеза его
С-концевой части. Следовательно, интенсив-
ность наработки ХМ (и подобных им печеноч-
ных ЛОНП) зависит не от уровня экспрессии
гена апоВ (она довольно постоянна), а от ско-
рости синтеза ТГ, которая, в свою очередь, ли-
митируется наличием жирных кислот.
В печени тоже синтезируется апоВ, но
вдвое более крупный (апоВ-100). На его основе
гепатоциты формируют липопротеины очень
низкой плотности (ЛОНП). От ХМ они отли-
чаются гораздо меньшими размерами (30-100
нм), более высоким содержанием белков (до
10%) и повышенной долей ФЛ, ХС и его эфи-
ров в общем липидном составе частицы. И по
способу регуляции биогенеза, и по функцио-
нальной роли ЛОНП подобны хиломикронам,
т.к. они тоже предназначены для выведения из
клеток синтезируемых в них ТГ со скоростью,
соответствующей интенсивности этого синтеза.
Печеночный апоВ-100 приведен здесь не
столько для сравнения двух транспортных ли-
попротеинов, сколько для демонстрации со-
вершенно необычного варианта регуляции на
генетическом уровне, открытого в 1987 г. Он
обозначен термином редактирование мРНК.
Оказалось, что энтероциты обладают специаль-
ным мультиферментным комплексом, который
вносит «исправление» в молекулу мРНК, копи-
рующую ген белка апоВ-100. Оно заключается
в изменении первого основания у одного из
кодонов ЦАА. В результате этот кодон, обо-
значающий глутамин в позиции 2153, превра-
щается в стоп-кодон УАА. Трансляция такой
«исправленной» мРНК приводит к синтезу
только N-концевой половины молекулы апоВ-
100. а это и есть апоВ-48! У человека (в отли-
чие от грызунов) ген редактирующего белка
экспрессируется только в слизистой кишечни-
ка, но никак не в печени.
Из энтероцитов ХМ поступают в межкле-
точное пространство, откуда они выносятся с
током лимфы и по грудному протоку попадают
в общий кровоток, минуя печень. Контактируя
с другими липопротеиновыми частицами кро-
ви, ХМ (как и ЛОНП) получают от них новые
для себя белковые молекулы - апоС-П и апоЕ.
В капиллярах многих органов и тканей (вклю-
чая жировую, мышечную, миокард, аорту, лег-
кие) содержится специальная липопротеинли-
паза (ЛПЛ), активатором которой является
апоС-П. В его присутствии ЛПЛ способна по-
очередно отщеплять все три ацильных остатка
в молекулах ТГ, но только входящих в состав
липопротеиновых комплексов. Этот гидролиз
происходит при непосредственном контакте
ХМ (и подобных им частиц) с ЛПЛ, которая
изначально фиксирована на эндотелии сосудов
полисахаридными цепями гепарансульфатов
(их структура будет рассмотрена в разделе
10.3.2). Освобождаемые при этом глицерол и
жирные кислоты частью поглощаются клетка-
ми данной ткани, а частью транспортируются
кровью к другим возможным потребителям
(жирные кислоты переносятся в виде комплек-
сов с альбумином плазмы). Обилие ЛПЛ на
эндотелии капилляров позволяет расщеплять
гораздо большие количества липопротеиновых
ТГ, чем их реально бывает в крови. Поэтому
время циркуляции ХМ в крови составляет все-
го несколько минут (для ЛОНП - часы). Поте-
ряв до 90% своих ТГ, сильно «похудевшие»
остаточные ХМ утилизируются гепатоцитами,
будучи поглощенными путем эндоцитоза, опо-
средуемого рецепторами к апоЕ.
7.2. МЕТАБОЛИЗМ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛОВ
Как и переваривание жиров в пищевари-
тельном тракте, метаболические превращения
триглицеридов в организме начинаются с их
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
241
гидролиза до глицерола и жирных кислот. Это
осуществляет не только ЛПЛ поверхности эн-
дотелия, но и внутриклеточные липазы, кото-
рые различаются избирательностью к моно-,
ди- и триацилглицеролам и локализованы
обычно на мембранах ЭР, а иногда (кислые ли-
пазы) в лизосомах. Выше уже упоминалась
гормон-чувствительная триглицеридлипаза ади-
поцитов, гидролизующая триацилглицеролы до
свободной жирной кислоты и диглицерида.
Последний теряет сначала одну, а затем и вто-
рую ацильную группу с участием других липаз,
несравненно более активных. Поэтому именно
эта (регулируемая) триглицеридлипаза играет
роль ключевого звена в расщеплении депониро-
ванных жиров, т.е., в мобилизации их для нужд
всего организма.
В отличие от гидролиза ацил глицеролов,
который не влияет на баланс макроэргов, ресин-
тез их из глицерола и жирных кислот требует
энергетических затрат, и достаточно ощутимых.
Они обусловлены необходимостью предвари-
тельной активации этих молекул.
Что касается глицерола, то перевод его в
активную форму (глицерол-3-фосфат) может
происходить за счет «присвоения» фосфатной
группы молекулы АТФ (рис. 7-1).
Глицеролкиназа, катализирующая эту ре-
акцию, хорошо представлена в энтероцитах и
клетках почек. В тканях с низким содержанием
этого фермента (мышцы, жировая ткань) глав-
ным источником глицерол-3-фосфата служит
ДГАФ, который образуется на I этапе ГБФ-
пути распада углеводов (см. рис. 6-22). Часть
этого метаболита может быть преобразована в
фосфорилированный глицерол под действием
глицерол-3-фосфатдегидрогеназы цитоплазмы
(реакция 1 на рис. 5-33). Обеспеченность угле-
водами позволяет адипоцитам создавать глице-
рол-3-фосфат и накапливать триглицериды за
счет связывания им жирных кислот, посту-
СНгОН
I
СНОН
I
СНгОН
Глицерол
АТФ АДФ
Глицеролкиназа
СН2ОН
I
СНОН
I
СНг~О—РО3Н2
ос-Гл и це рофосфат
(глицерол-3-фосфат)
Рис. 7-1. Фосфорилирование глицерола.
СН3
I
(СН2)п
о=с-он
Жирная кислота
АТФ
^♦фф
сн3
(СН2)п
О=С~АМФ
Ациладенилат
^-HS-KoA
^*АМФ
СН3
(СН2)П
O=C~S-KoA
Ацил-КоА
Рис. 7-2. Активация молекулы жирной кислоты,
пающих извне либо освобождаемых при липо-
лизе. Напротив, недостаточное снабжение жи-
ровой ткани углеводами ведет к снижению ре-
сурса глицерол-3-фосфата, из-за чего уменьша-
ется объем реутилизации жирных кислот и
усиливается выход их в кровь.
Печеночные клетки обладают возможно-
стью использования обоих способов генерации
глицерол-3-фосфата.
Активация жирных кислот, необходимая
для включения их в состав ацилглицеролов,
всегда однотипна и протекает под действием
ацил-КоА-синтетазы. Процесс сводится к «по-
садке» карбоксильной группы на серу кофер-
мента А. Общее название продуктов такой ре-
акции — ацилкоферменпг А (ацил-КоА). Возни-
кающая связь является высокоэргичной. Ее об-
разование требует разложения АТФ до АМФ и
пирофосфата (рис. 7-2). При этом сначала
фрагмент АМФ соединяется с жирной кисло-
той макроэргической связью, подобно тому,
как это происходит при активации аминокис-
лот (см. рис. 2-21, 1в), а освободившийся ФФ
быстро гидролизуется пирофосфатазой, что
делает реакцию необратимой. На второй ста-
дии процесса происходит замена АМФ в аци-
ладенилате на КоА. Макроэргическая связь
остается в конечном продукте — ацилкофер-
менте А. Она-то и служит непосредственным
242
Глава 7
R'
o=c~S-KoA HS-KoA
HOCH2 R'-C-O-CH2
HOCH HO(lH
I I
H2C-O-PO3H2 H2C-O-PO3H2
Глицерол-3-фосфат 1 -Ацилглицерол-3-фосфат
(лизофосфатидная кислота)
II
R-C-O-CH2
I
R-C-O-CH
II I
О H2c-O-PO3H2
Фосфатидная кислота
(фосфатидат)
Рис. 7-3. Синтез фосфатидной кислоты.
источником энергии для образования эфирной
связи между жирной кислотой и спиртом (в
данном случае — глицеролом). Надо отметить,
однако, что «стоимость» формирования такой
связи составляет 2 молекулы АТФ, расщепляе-
мых до АДФ и Фи. Значит, полный синтез мо-
лекулы триглицерида из свободных жирных
кислот и глицерола требует расходования
7 молекул АТФ (включая необходимую для
активации глицерола).
Собственно синтез ТГ происходит путем
переноса ацильных остатков с ацил-КоА на
гидроксигруппы глицерола. Производят это
О-ацилтрансферазы, фиксированные на мем-
бране ЭР. Одни из них ацилируют глицерол-3-
фосфат в положении 1. Другие внедряют жир-
ную кислоту (как правило, ненасыщенную) в
позицию 2 возникшего продукта. В итоге обра-
зуется 1,2-диацилглицерол-З-фосфат, именуе-
мый фосфатидной кислотой (рис. 7-3).
Уровень фосфатидата в тканях почти не-
уловим (лишь в печени он достигает 1% от со-
держания фосфолипидов). Это указывает на бы-
строту утилизации возникающего метаболита. К
главным его потребителям относится синтез ТГ.
При этом фосфатидная кислота теряет заряжен-
ную группу под действием фосфатидатфос-
фатазы (I на рис. 7-4), а образовавшийся 1,2-
диацилглицерол подвергается затем ацилирова-
нию в позиции 3 с участием диацилглицерол-
ацилтрансферазы (II на рис. 7-4).
С наибольшей интенсивностью синтез
триацилглицеролов протекает в жировой ткани
(где они и депонируются) и в печени, которая,
напротив, не накапливает их, а включает в со-
став ЛОНП, отправляемых затем в кровь.
В заключение раздела следует отметить,
что непосредственные участники метаболизма
триглицеридов - глицерол и жирные кислоты —
являются промежуточными метаболитами. Это
значит, что они не просто поступают с пищей,
но могут как синтезироваться в самом орга-
низме, так и расщепляться до конечных про-
дуктов, подлежащих удалению (в данном слу-
чае — ДО СОг и Н2О).
Метаболизм глицерола осуществляется в
основном путями, известными из углеводного
обмена. С одной стороны, как уже отмечалось,
он образуется (сразу в форме глицерол-3-
фосфата) посредством восстановления ДГАФ
(каковой возникает на обоих путях катаболиз-
ма глюкозы). С другой стороны, эта же обра-
тимая реакция позволяет превращать глицерол
(точнее, образуемый из него глицерол-3-фос-
фат) в молекулу ДГАФ и ее изомер ФГА, кото-
рый используется либо в пентозофосфатном
цикле (раздел 6.6.2), либо реакциями ГБФ-пути
для гликонеогенеза или для распада до СО2 и
Н2О. В последнем случае легко подсчитать
энергетический выход. Он достигает 20,5 моле-
кул АТФ в расчете на полное расщепление
1 молекулы глицерола: -1 в глицеролкиназной
О О
, II II
R-C-0-CH2 Н2О Н3РО4 R-C-0-CH2
R-C-O-CH * R’-C-O-CH
II I I II I
О Н2С-О-РО3Н2 О НгСОН
Фосфатидат 1,2-Диацилглицерол
О
II
R’-C-O-CHa
I
R-C-O-CH О
11 1 А .....
О H2C-0-C-R
Т ри глицерид
Рис. 7-4. Превращение фосфатидной кислоты в триацил глицерол.
I - фосфатидатфосфатаза, II— диацилглицерол-ацилтрансфераза.
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
243
R СНз R СП,
O=C~S-KoA + НО-СН-СН2-ГГ-СН3 < > О=С~О СН-СН2-ГТ СН3 + HS-KoA
Ацил-КоА СН2 СНз СН2 СН3
СООН СООН
Карнитин Ацилкарнитин
Рис. 7-5. Реакция, катализируемая карнитин-ацилтрансферазой.
Карнитин образуется путем переноса трех метильных групп с метионина на £-аминогруппу лизина, кото-
рый укорачивается затем на 2 атома углерода. Синтез происходит в клетках печени и почек, а в наибольших ко-
личествах карнитин обнаруживается в мышечной ткани (до 0,1% сухого остатка).
реакции; +2,5 в реакции окисления до ДГАФ;
+4,5 и +2,5 в ходе превращения ФГА в пируват
и далее в ацетил-КоА; наконец, +10 в реакциях
ЦТК (этот расчет приведен для случая малат-
аспартатного переноса атомов водорода с од-
ной из молекул НАД-Н2 изцитоплазмы в мито-
хондрии; если же вовлечен только глицеро-
фосфатный механизм утилизации этого водо-
рода, то прирост составит 19.5 молекул АТФ).
Метаболизм жирных кислот, несмотря на
их разнообразие, протекает по стандартным
схемам и обладает спецификой лишь на этапах
катаболизма до ацетил-КоА или синтеза из не-
го. Эти противоположные процессы не только
сильно различаются между собой, но и про-
странственно разделены в клетке.
7.3. КАТАБОЛИЗМ ВЫСШИХ
ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Распад жирных кислот в клетках происхо-
дит путем окислительного расщепления до
двухуглеродных фрагментов, освобождаемых в
виде ацетил-КоА. Оно локализовано в митохон-
дриях и сводится к чередованию реакций, сово-
купность которых обозначают термином ^-окис-
ление жирных кислот. Этому должна предшест-
вовать их доставка из цитоплазмы, ибо сами
жирные кислоты неспособны преодолевать внут-
реннюю мембрану митохондрий ни в свободной
форме, ни в активированной (ацил-КоА).
7.3.1. ПЕРЕНОС ЖИРНЫХ КИСЛОТ
В МАТРИКС МИТОХОНДРИЙ
Высшие жирные кислоты могут прони-
кать в митохондрии только после связывания
их с карнитином (рис. 7-5). В цитоплазме под
действием карнитин-ацилпгрансферазы он при-
нимает жирнокислотный фрагмент от ацил-
КоА, превращаясь в ацилкарнитин, который
легко проходит сквозь внутреннюю мембрану
митохондрий с помощью специальной трансло-
казы. В матриксе митохондриальная карнитин-
ацилтрансфераза катализирует противополож-
ный процесс, освобождая жирную кислоту (в
виде ацил-КоА) и карнитин. Важно, что кон-
станта равновесия этой обратимой реакции
близка 1, а мембрана легко проницаема и для
карнитина, и для его ацилированных форм. По-
этому баланс перехода различных ацил-КоА
определяется в основном соотношением кон-
центраций жирных кислот по обе стороны ми-
тохондриального барьера. В матриксе они под-
вергаются быстрому разложению, что и приво-
дит к преобладанию притока жирных кислот из
цитоплазмы, где они появляются из крови или
при распаде резервных ТГ.
7.3.2. ХИМИЗМ РЕАКЦИЙ
Р-ОКИСЛЕНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Окислительное разложение жирных кис-
лот происходит способом, который позволяет
обогащать углеводородные цепи кислородом
без прямого использования молекулы О2 (рис.
7-6). Суть его сводится к отнятию атомов водо-
рода с присоединением молекулы воды по мес-
ту возникшей двойной связи и повторному от-
нятию водорода, которое превращает образо-
вавшийся было спирт в кетон, чем сильно об-
легчается разрыв углеродной цепи в этом мес-
те. Начальному дегидрогенированию подвер-
гаются а- и Р-углеродные атомы, а кислород
присоединяемой затем воды оказывается в
P-положении. Отсюда и произошло название
этого способа, - в сущности, единствеиного
для почти всех жирных кислот.
На путь р-окисления жирные кислоты
вступают только в активированной форме, т.е.,
244
Глава 7
О
V /3 а II
CH3-(CH2>1D-CH2-CH2-CH2-CH2-C~S-КоА
Ацил-КоА
Ацил-КоА-
дегидрогеназа
р а II
СН3-(СН2)Ш—СН2— СН2-СН=СН-C~S-KoA
Еноил-КоА
ГН2О
CH3-(CH2)i0-CH2-CH2-CH-CH2-C~S-KoA
$-Гидроксиацил-КоА
J3- Гидрокси-
ацил-КоА-
дегидрогеназа
^-НАД
^НАДНз
о о
СНз-^НгЬо-СНг-СН-С-СНг-С'-З-КоА
|3-Кетоацил-КоА
fi-Кетотиолаза
^-HS-KoA
О
< 11
^*СН3-С~8-КоА
Ацетил-КоА
О
II
CH3-(CH2)w-CH2-CH2-C~S-KoA
Ацил-КоА
(укороченный на 2 атома С)
Рис. 7-5. р-Окисление жирных кислот
(курсивом выделены атомы водорода, переносимые
на коферменты дегидрогеназ).
в виде ацил-КоА. Схема на рис. 7-6 показывает
последовательность реакций, а также названия
участвующих ферментов и образуемых мета-
болитов. В качестве примера здесь приведена
пальмитиновая кислота (точнее, пальмитоил-
КоА), но обозначение ее дано в общем виде
(ацил-КоА), чтобы подчеркнуть универсаль-
ность процесса.
На последней стадии Р-окисления разрыва-
ется связь между карбонильным углеродом (в
P-положении) и соседним с ним а-углеродным
атомом. При этом карбоксиконцевой фрагмент
отделяется в виде ацетил-КоА, а оставшаяся
часть жирной кислоты переносится на свобод-
ный HS-КоА, образуя ацил-КоА с укороченной
на 2 углерода цепью. По сути, эта реакция явля-
ется трансферазной, хотя фермент предпочита-
ют обозначать давним (и более коротким) на-
званием - fl-кетотиолаза. Каждая из стадий
Р-окисления обратима, а общая направленность
процесса в сторону катаболизма (обозначенная
стрелками на рис. 7-6) обеспечивается тем, что
его дегидрогеназные стадии сопряжены с сис-
темами МтО.
Укороченный ацил-КоА вступает в новый
раунд Р-окисления, а затем еще и еще. Так про-
должается вплоть до полного распада жирной
кислоты на соответствующее число молекул
ацетил-КоА. При этом к конечному раунду
остается четырехуглеродный фрагмент в соста-
ве бутирил-КоА, окисляемого до р-гидроксибу-
тирил-КоА и Р-кетобутирил-КоА. Последний
чаще обозначают как ацепюацетил-КоА, ибо
при расщеплении р-кетотиолазой он превраща-
ется в две молекулы ацетил-КоА. Следователь-
но, при распаде жирной кислоты с четным чис-
лом углеродных атомов, равным N, процедура
Р-окисления должна повториться {(N:2)— 1} раз,
чтобы превратить ее в (N:2) молекул аиетил-
КоА. Например, 7-кратное р-окисление молеку-
лы пальмитоил-КоА дает 8 молекул ацетил-КоА.
Изложенный механизм Р-окисления пол-
ностью применим только к насыщенным жир-
ным кислотам с четным числом атомов уг-
лерода (каковые и преобладают у животных).
К числу необычных относятся жирные ки-
слоты с нечетным числом углеродных атомов,
содержащиеся в липидах многих растений и
некоторых морских организмов. Поступая с пи-
щей, они расщепляются в наших клетках тоже
реакциями Р-окисления. Но на последнем ра-
унде возникают не две молекулы ацетил-КоА,
а только одна. Вместо второй появляется трех-
углеродная кислота в виде пропионил-КоА.
Его утилизация начинается с карбоксилирова-
ния пропионильного фрагмента в реакции, ко-
торая аналогична пируваткарбоксилазной (по-
казанной на рис. 5-28). Появившаяся D-форма
метилмалонила (рис. 7-7) подвергается фер-
ментативной изомеризации сначала в L-ва-
риант, а затем - в свой сукцинильный аналог.
Последнюю из этих реакций катализирует
фермент, небелковой частью которого является
производное витамина В12 — дезоксиаденозил-
кобаламин. Образовавшийся в итоге сукци-
нил-КоА используется в реакциях ЦТК.
Гораздо более частым отклонением от
стандартной схемы является р-окисление йена-
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
245
СООН
I
нс-сн3
O=C~S-KoA
D-Мети л-
малонил-КоА
Метипмалонил-
эпимераза
СООН
I
НзС-СН
|
O=C~S-KoA
L-Метил-
малонил-КоА
Метипмалонил-КоА-
мутаза
СООН
сн2
I
сн2
O=C~S-KoA
Сукцинил-КоА
Рис. 7-7. Ферментативная изомеризация D-метил малой ил-Ко А в сукцинил-КоА
(курсивом выделены атомы, присоединенные к пролионил-КоА
под действием биотинового фермента пропионил-КоА-карбоксилазы).
сыщенных жирных кислот, на долю которых
приходится примерно половина от их общего
количества в животном организме. Особенно-
сти здесь обусловлены «неудобным» располо-
жением двойных связей: когда процесс Р-окис-
ления приближается к такой связи, она оказы-
вается не между а- и р-, а между р- и у-угле-
родными атомами ацильного фрагмента. Такое
положение делает ее недоступной для еноил-
КоА-гидратазы (см. рис. 7-6). Кроме того, такая
связь имеет г/г/с-конфигурацию, тогда как при
р-окислении возникает транс-изомер. Для пре-
одоления этих «нестыковок» существует спе-
циальная изомераза, которая в нужный момент
перемещает двойную связь в позицию между
а- и p-углеродами, а заодно и придает ей необ-
ходимую тряис-конфигурацию. Затем процесс
р-окисления продолжается, как обычно, —
вплоть до сближения со следующей двойной
связью (если она есть), которая тоже подверга-
ется описанной перегруппировке.
В клетках нервной ткани, богатых жирны-
ми кислотами с более чем 20 атомами углеро-
да, начальные шаги по их укорочению реали-
зуются посредством ^.-окисления. На этом ми-
норном пути в качестве субстрата используют-
ся свободные жирные кислоты (а не ацил-
КоА). Тем не менее, череда реакций здесь такая
же, как и при Р-окислении. С той лишь разни-
цей, что кето-группа внедряется не в Р-, а
a-позицию. Возникшая а-кетокислота подвер-
гается декарбоксилированию с образованием
новой жирной кислоты, укороченной на один
углеродный атом (удаленный в виде СО2).
7.3.3. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ИТОГ КАТАБОЛИЗМА
ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Первую из дегидрогеназных реакций
р-окисления проводит ацил-Кок-дегидрогена-
за. Как уже отмечалось (раздел 5.2.3), этот
фермент является начальным звеном укорочен-
ной дыхательной цепи, т.к. передает отнимае-
мые от субстрата атомы водорода на ЭТФ, ми-
нуя комплекс I. Поэтому энергетический итог
данной реакции составляет 1.5 молекулы АТФ.
Вторую окислительную реакцию реализу-
ет fl-гидроксиацгы-КоАгдегидрогеназа. Она
существует в разных вариантах, избирательных
в отношении длины ацильной цепи (короткая,
длинная, промежуточная). Будучи НАД-зави-
симыми, все они сопряжены с полной цепью
системы МтО, обеспечивая «консенсусное»
значение коэффициента Р/О = 2.5.
Таким образом, каждый проход молекулы
ацил-КоА через процедуру р-окисления позво-
ляет генерировать 1,5+2,5=4 молекулы АТФ.
Как уже отмечалось, общее число таких раун-
дов на единицу меньше числа атомов углерода
(N) в ацильной цепи, деленного на 2. Если
учесть еще выработку 10 молекул АТФ при
«сгорании» ацетил-КоА в ЦТК. а также расход
2 АТФ на активацию жирной кислоты (см. рис.
7-2), то прирост молекул АТФ (А) в итоге рас-
пада насыщенной жирной кислоты до СО2 и
Н2О выражается уравнением:
А = [4 • - 1) + 10 -у - 2].
Например, при распаде стеариновой ки-
слоты (N = 18) энергетический баланс равен
приросту 4-8 + 10-9 - 2 = 120 молекул АТФ.
Это гораздо больше прироста АТФ при окис-
лении 3 молекул глюкозы (равных стеариновой
кислоте по числу атомов углерода и водорода),
когда образуется не более чем 3-32 = 96 моле-
кул АТФ. Такая разница возникает из-за того,
что глюкоза является, в сущности, частично
окисленным углеводородом.
246
Глава 7
Можно рассчитать также энергетический
итог катаболизма триглицеридов. Поскольку
при их гидролизе нет значимого перепада энер-
гии, этот итог слагается из результативности
распада глицерола (максимум 20,5 молекулы
АТФ, см. раздел 7.2) и трех молекул жирных
кислот. Например, для тристеарина это состав-
ляет 20,5 + 3*120 = 380,5 молекул АТФ.
7.3.4. КЕТОНОВЫЕ ТЕЛА
Печень является главным координатором
метаболических путей в организме. В частно-
сти, именно она является единственным орга-
ном, вырабатывающим значительные количе-
ства кетоновых тел (исключение составляют
жвачные животные с их спецификой питания).
Выработка кетоновых тел резко усиливается
при углеводном голодании клеток (в том числе,
при сахарном диабете, как упомянуто в разделе
6.9.1), когда глюкозы недостает не только для
энергоснабжения, но и - главное — для воспол-
нения ЩУК (см. раздел 5.3.6).
Синтез кетоновых тел локализован в мито-
хондриях и происходит путем конденсации трех
молекул ацетил-КоА, лишь две из которых ока-
зываются представленными в конечном про-
дукте — ацетоуксусной или р-гидроксимасляной
кислоте (как это показано на рис. 7-8).
Первая реакция сводится к конденсации
двух молекул ацетил-КоА с образованием аце-
тоацетил-КоА и освобождением молекулы
HS-KoA. Можно заметить, что она обратна за-
ключительной стадии р-окисления и осуществ-
ляется тоже р-кетотиолазой.
Вторая реакция протекает с привлече-
нием еще одной молекулы ацетил-КоА. Своей
метильной группой она соединяется с карбо-
нильным углеродом ацетоацетильного фрагмен-
та и заодно теряет свой КоА (отщепляемый с
участием НгО). В итоге образуется р-гидрокси-
Р-метипглутарил-КоА (ГМГ-КоА). Фермент
этой стадии — митохондриальная ГМГ-КоА-смн-
тетаза - лимитирует скорость кетогенеза. Ее
1. СН3
О=С~ S-KoA
СН3
С=С~ S-KoA
СН3-С=б НСН2 - ”
I I *
СН2 + O=c~ S-KoA
О=С~ S-КоА
Ацетоацетил-КоА
СНз
с-с
I
СН2 + HS-KoA
О=С~ S-KoA
Ацетоацетил-КоА
СООН
СНг
+ НОН —-> СН3-С-ОН + HS-KoA
- Б I
сн2
О=С~ S-KoA
/3-гидрокси-
/3-метилглутарил-КоА
(ГМГ-КоА)
3. СООН
СН2
I г —,
СНг-С-ОН
....I— ;
: сн2
jo=C~ S-KoA
.. ГМГ-КоА
СНз
0=C~S-KoA
Ацетил-КоА
СООН
СН2
+ I
с=о
I
СНз
Ацетоацетат
СН3
I
с=о +
СН2
соон
Ацетоацетат
СНз
----------* НС-ОН
г I +
СНг
СООН
j3 -Гидроксибутират
НАД
Рис. 7-8. Последовательность реакций синтеза ацетоуксусной и p-гидрокси масляной кислот.
Ферменты. А - $-Кетотиолаза (ацетил-Кок-ацетилтрансфераза). Б - Гидроксиметилглутарил-Ко/\-синтетаза.
В - Гидроксиметилглутарил-Ко/\-лиаза. Г — р-Гидроксибутиратдегидрогеназа.
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
247
угнетают избыток свободного HS-КоА и накоп-
ление пальмитоил-КоА. Интенсификация р-
окисления жирных кислот требует повышенно-
го использования HS-КоА, из-за чего доля сво-
бодного кофермента уменьшается. Это ведет к
снятию его тормозящего действия на ГМГ-КоА-
синтетазу и усилению переработки образующе-
гося в избытке ацетил-КоА в кетоновые тела.
Третья реакция осуществляется под
действием ГМГ-КоА-ушшы. Она не требует
участия HS-КоА и заключается в отщеплении
от ГМГ-КоА одной из тех двух молекул аце-
тил-КоА. которые были вовлечены в первую
реакцию конденсации. То, что остается при
этом от молекулы ГМГ-КоА, и представляет
собой ацетоуксусную кислоту.
Четвертую реакцию катализирует осо-
бая гидроксибутиратдегидрогеназа, восстанав-
ливающая (за счет водорода НАД-//2) одно из
кетоновых тел (ацетоацетат) в другое - Р-гид-
роксибутират. Равновесие ее сдвинуто вправо,
чему способствует выработка НАД-/72 в про-
цессе р-окисления жирных кислот. Поэтому
преобладающей формой циркулирующих ке-
тоновых тел является именно р-гидроксимас-
ляная кислота.
Образуясь в митохондриях печени, кето-
новые тела без труда проходят через мембраны
и поступают в кровь, а потом в другие ткани,
где легко утилизируются в качестве источника
энергии, альтернативного глюкозе. Соответст-
вующая дегидрогеназа полной цепи системы
МтО (см. раздел 5.2.2) окисляет р-гидроксибу-
тират до ацетоацетата, активируемого затем за
счет макроэргической связи молекулы сукци-
нил-КоА (а не АТФ, как это бывает обычно):
Ацетоацетат Сукцинил-КоА
1 КоА-трансфераза
Ацетоацетил-КоА Сукцинат
В свою очередь, ацетоацетил-КоА подвер-
гается Р-кетотиолазному распаду до двух мо-
лекул ацетил-КоА, которые здесь же, в мито-
хондриях, могут расщепляться в ЦТК, давая
10 молекул АТФ (в расчете на каждую из них).
При дефиците углеводов даже клетки мозга
начинают интенсивно утилизировать кетоно-
вые тела (но не жирные кислоты!).
СНз СН3
С=О --------> С=О + СО2
СН2 СНз
СООН
Ацетоацетат Ацетон
Рис. 7-9. Спонтанное декарбоксилирование ацетоацетата.
Митохондрии миокарда наиболее богаты
КоА-трансферазой, активирующей ацетоаце-
тат. Затем следуют почки, мозг и мышцы.
В заметных количествах фермент обнаружива-
ется также в лейкоцитах и фибробластах, но
совершенно отсутствует в гепатоцитах. Поэто-
му печень неспособна утилизировать образуе-
мые ею кетоновые тела, и они целиком посту-
пают в кровоток. Их синтез необходим, чтобы
гепатоциты могли сохранять у себя кофер-
ментную часть избыточных молекул ацетил-
КоА, но заодно отправлять ацетильные фраг-
менты тканям-потребителям в легкоусвояемой
форме кетоновых тел. Следовательно, и при
дефиците углеводов в организме печень про-
должает выполнять роль всеобщего «кормиль-
ца». С той лишь разницей, что в этих условиях
переходит на снабжение других тканей уже не
глюкозой (образуемой из запасов гликогена
или из аминокислот путем гликонеогенеза), а
кетоновыми телами, создаваемыми при утили-
зации в гепатоцитах избытка жирных кислот,
мобилизованных из жировых депо.
В циркулирующей крови заметная часть
ацетоацетата успевает превратиться в ацетон,
причем, спонтанно, без участия ферментов
(рис. 7-9).
Ацетон, по давней традиции относимый к
кетоновым телам (их даже называли «ацетоно-
выми»), довольно токсичен, будучи и кетоном,
и органическим растворителем. В метаболизме
он не участвует и удаляется с потом, мочой,
выдыхаемым воздухом.
7.4. СИНТЕЗ ВЫСШИХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Многие типы клеток могут синтезировать
насыщенные жирные кислоты из молекул аце-
тил-КоА. Но наиболее интенсивно такой про-
цесс протекает в печени, а также в жировой тка-
ни и лактирующей молочной железе. Исходный
материал черпается в основном из той доли мо-
248
Глава 7
лекул ацетил-КоА, образуемых ГБФ-путем, ко-
торая остается избыточной для ЦТК.
Несмотря на сходство исходных и конеч-
ных продуктов, синтез жирных кислот - это не
обращение Р-окисления, а совсем иной, гораздо
более сложный процесс. Он слагается из трех
вполне самостоятельных этапов: перенос аце-
тил-КоА в цитоплазму; создание строительных
«заготовок» в виде малонил-КоА; построение
самой жирнокислотной цепи.
7.4.1. ТРАНСПОРТ АЦЕТИЛ-КоА В ЦИТОПЛАЗМУ
В отличне от Р-окисления, синтез жирных
кислот совершается в цитоплазме. Однако аце-
тил-КоА, возникающий только в митохондриях,
неспособен преодолевать их мембрану. В какой-
то степени выходу его в цитозоль содействует
карнитин, пригодный для переноса не только
крупных ацильных, но и небольших ацетильных
АТФ АДФ+Фн
Цитрат + HS-KoA —Ацетил-КоА + ЩУК
АТФ-цитрат-
пиаза
Рис. 7-10. Разложение цитрата.
фрагментов. Но гораздо весомее вклад транс-
порта в составе лимонной кислоты, для которой
имеется «своя» транслоказа. Цитрат, образуе-
мый при конденсации ацетил-КоА и ЩУК (1-я
реакция ЦТК), переносится ею в цитозоль, где
протекает обратный процесс, требующий, одна-
ко. затраты АТФ (рис. 7-10) и катализируемый
другим ферментом — цитрат-лиазой.
Молекулы ЩУК возвращаются в митохон-
дрии лишь после восстановления до яблочной
кислоты, производимого цитоплазматической
малатдегидрогеназой. Завершение транспорт-
ного цикла возможно двумя способами (см.
схему на рис. 7-11).
Рис. 7-11. Два варианта челночного транспорта ацетил-КоА из митохондрий в цитозоль
А - трикарбоксилат-транслоказа; Б - ди карбокси л ат-транслоказа; В - пируват-транслоказа.
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
249
Один из них осуществляется сразу же, -
благодаря дикарбоксилат-транслоказе, перено-
сящей малат в митохондрии, где он с участием
малатдегидрогеназы (теперь уже митохондри-
альной) превращается опять в оксалоацетат,
который может быть использован в новых ак-
тах челночного транспорта.
Другой способ возвращения ЩУК в мито-
хондрии отличается тем, что малат цитозоля
сначала атакуется яблочным ферментом (malic
enzyme). Это тоже малатдегидрогеназа, но не
обычная, а декарбоксилирующая. И в качестве
кофермента она использует не НАД, а НАДФ.
Одновременно с окислением малата яблочный
фермент осуществляет реакцию декарбоксили-
рования, из-за чего продуктом является не
ЩУК, а пируват (рис. 7-12).
Образовавшийся пируват поступает в ми-
тохондрии (см. рис. 7-11), где превращается в
ацетил-КоА путем окислительного декарбок-
силирования, показанного на рис. 5-15 (но во-
обще-то может использоваться и для воспол-
неиия фонда ЩУК, как это было отмечено в
разделе 5.3.6). Другой продукт яблочного фер-
мента - НАДФ-/72 ~ тоже оказывается очень
кстати: эта форма данного кофермента необхо-
дима для реализации восстановительных ста-
дий биогенеза жирных кислот.
7.4.2. СИНТЕЗ МАЛОНИЛ-КОА
Построение углеводородной цепи жирных
кислот осуществляется механизмом постепен-
ного наращивания ацетильного участка моле-
кулы ацетил-КоА новыми двухуглеродными
фрагментами. Источником их является, однако,
не ацетил-КоА, а трехуглеродный продукт его
карбоксилирования — малонил-КоА. Наработку
его проводит ацетил-КоА-карбоксилаза цитозо-
ля. Как и ряд других карбоксилаз, этот фермент
содержит биотин (см. рис. 5-27) в качестве про-
стетической группы. Энергозависимое карбок-
сссн
I
сн2
I
н-с-он
I
соон
L-Малат
НДДФ надф-н2
яблочный
фермент
СНз
С=О + СО2
СООН
ПВК
Рис. 7-12. Окислительное декарбоксилирование малата.
СНз
I
О=С~ S-KoA
Ацетил-КоА
^^Фермент-биотин—СООН
Фермент-биотин
СООН
I
СН?
I
О=С~ S-KoA
Малонил-КоА
Рис. 7-13. Образование малонил-КоА.
силирование биотина и составляет первую ста-
дию ферментативной реакции (см. рис.5-28,1).
На второй стадии этого необратимого
процесса возникшая карбоксильная группа пе-
реносится с карбоксибиотина на ацетил-КоА,
превращая его в малонил-КоА (рис. 7-13).
Синтез малонил-КоА существенен не
только созданием стандартных «заготовок» для
построения жирнокислотных цепей. Не менее
важно то, что он составляет начальную стадию,
через которую удобно управлять всем процес-
сом биогенеза жирных кислот. Действительно,
именно ацетил-КоА-карбоксилаза выполняет в
нем ключевую роль. Она чувствительна к угне-
тающему действию собственных продуктов —
как непосредственного (малонил-КоА), так и
конечного (пальмитоил-КоА). Кроме того, ее
подавляет АМФ, активируя ту протеинкиназу,
которая переводит ацетил-КоА-карбоксилазу в
фосфорилированную форму (неактивную). Час-
тичную активность эта форма проявляет в при-
сутствии цитрата, который вызывает некова-
лентную агрегацию фосфорилированных субъе-
диниц. В полном же объеме реактивацию фер-
мента реализует протеинфосфатаза 2А, угне-
таемая, однако, под влиянием цАМФ. Иными
словами, накопление этого посредника гормо-
нальных сигналов удерживает ацетил-КоА-
карбоксилазу в неактивном состоянии, возни-
кающем в условиях такого дефицита АТФ, ко-
торый приводит к появлению АМФ (нецикли-
ческого!). Выработку цАМФ стимулируют
глюкагон (см. раздел 6.9.2) и активация р2-ад-
ренорецепторов (см. раздел 6.9.3). Инсулин
оказывает противоположное влияние: активи-
руя протеинфосфатазу 2А, он усиливает дефос-
250
Глава 7
формирование (реактивацию) ацетил-КоА-
карбоксилазы и тем самым способствует син-
тезу жирных кислот.
Таким образом, соотношение глюка-
гон/инсулин, варьирующее в соответствии с
динамикой содержания глюкозы в крови, вно-
сит корректировки в итоговый баланс противо-
положных процессов. Один из них - мобилиза-
ция жиров из жировых депо для утилизации их
другими тканями (доминирует при дефиците
глюкозы). Другой - синтез жирных кислот (и
жиров) за счет избыточной глюкозы (и глюко-
генных аминокислот).
Есть и еще один контрольный механизм.
Он вступает в силу при неполной утилизации
создаваемого малонил-КоА. Избыток этого
продукта аллостерически угнетает цитоплазма-
тическую карнитин-ацилтрансферазу. То есть,
тормозит образование своего предшественника
(ацетил-КоА) еще на «дальних подступах» — на
стадии переноса жирных кислот в митохонд-
рии, где они могли бы превращаться в изоби-
лие молекул ацетил-КоА.
Целый спектр столь разноуровневых ме-
ханизмов регуляции подтверждает воистину
ключевую роль этапа выработки молекул ма-
лонил-КоА в биогенезе жирных кислот.
7.4.3. БИОГЕНЕЗ НАСЫЩЕННОЙ
ЖИРНОКИСЛОТНОЙ ЦЕПИ
Создание молекулы жирной кислоты про-
исходит путем удлинения ацильной цепи, пред-
варительно «посаженной» на специальный
белок-носитель. В клетках прокариот и расте-
ний он образует комплекс с 7 ферментами (по
числу катализируемых стадий). У высших жи-
вотных все эти компоненты являются фрагмен-
тами единой полипептидной цепи (-2500 АО),
обозначаемой как ацилсиюпепгаза (синтетаза
жирных кислот). И хотя функцию носителя в
ней выполняет лишь небольшой домен
(=60 АО), за ним сохранили прежнее название
- ацилпереносящий белок (АПБ). Активный
центр представлен здесь фосфопантотеином,
который присоединен своей фосфатной груп-
пой к серину-2151 в АПБ-домене. Эта просте-
тическая группа сродни коферменту А (см. рис.
2-5), отличаясь лишь отсутствием нуклеотид-
ного звена (З’-фосфо-АМФ). Отсюда и функ-
циональная близость: способность принимать
ацильный фрагмент на пантетеиновую
HS-группу, а затем передавать его подходяще-
му акцептору.
Остальные функционально значимые до-
мены синтетазы жирных кислот гораздо круп-
нее (от более чем 200 до 400 с небольшим АО),
и каждый из них катализирует «свою» стадию
удлинения ацильной цепи. Существует эта
синтетаза в виде гомодимера, а потому форми-
рует параллельно сразу две молекулы жирной
кислоты, — обычно пальмитиновой.
Решающую роль в наращивании жирно-
кислотной цепи играет самый крупный домен
ацилсинтетазы (N-концевой), ибо именно его
ферментативная активность обеспечивает
единственную необратимую стадию всего про-
цесса. По характеру катализируемой реакции
этот домен назван р-кетоацил-(АПБ)-синте-
тазой. В активном центре здесь наиболее ва-
жен радикал цистеина-161, на HS-группу кото-
рого передаются ацильные остатки. Такие пе-
ремещения осуществляет соседний домен,
именуемый {АПБ)-ацилтрансферазой.
Синтез жирной кислоты всегда начинается
с того, что эта трансфераза переносит кислот-
ный остаток с ацетил-КоА на HS-группу пан-
тетеиновой части АПБ-домена, как это показа-
но на рис. 7-14, А.
Вслед за этим ацетильный фрагмент пере-
мещается с АПБ на активный центр $-кето-
ацил-(АПБ)-синтеи1азЫу а точнее — на HS-rpyn-
пу ее цистеина-161 (см. рис. 7-14, Б).
Теперь (АПБ)-ацилтрансфераза получает
возможность перенести на освободившуюся
тиоловую группу АПБ-домена новый ациль-
ный фрагмент, но уже не ацетильный, а непре-
менно малонильный, который изымается у ма-
лонил-КоА (см. рис. 7-14, В).
В результате ацилсинтетаза оказывается за-
груженной ацетильным звеном (на цис^} и ма-
лонильным (на АПБ-домене), благодаря чему
переходит в состояние готовности к реализации
акта наращивания ацильной цепи. Его проводит
Р-кетоацил-(АПБ)-синтетаза (N-концевой домен
ацилсинтетазы), осуществляя реакцию конден-
сации ацетильного остатка (отнимаемого от
i/wci6i) с малонильным фрагментом, фиксиро-
ванным на АПБ. Эта реакция (рис. 7-14, Г) со-
провождается декарбоксилированием мало-
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
251
A. SH SH
ЦисЮ1-----АП Б
СНз
O=C~S-KoA --*
СНз
SH S~C=O
I I
quct61----АЛБ
+ HS-KoA
СНз
SH S~00
quc,e,-- АП Б
СНз
S~C=O SH
I I
quc16t--- АПБ
B- CH3
S~C=O SH
I I
quc,61----АПБ
COOH
COOH СНз СНэ
СНг ________S~C=O S~C=O
I I I
O=C~ S-КоА цис^-----АПБ
COOH
СНз CH2
s~c=o s~c=o
I I
quc,e,---АПБ
CH3
0=0
I
CH2
SH s-c-c
I I
4^Ciei---АПБ
Рис. 7-14. Механизм двухуглеродного наращивания ацильного фрагмента на АПБ-д омене ацил синтетазы.
нильного фрагмента, что делает ее необрати-
мой. Причем, отщепляются именно те атомы
СОз (они выделены жирным), которые были
внедрены в ацетил-КоА при превращении его в
малонил-КоА (см. рис. 7-13). Значит, и синтез
малонил-КоА «придуман» природой не в по-
следнюю очередь ради гарантии однонаправ-
ленности процесса удлинения жирных кислот.
Ацетильное звено (выделено курсивом),
переносимое с цис\ы, передается (взамен быв-
шей группы -СООН) на метиленовую группу
малонила, присоединяясь к ней своим карбо-
нильным углеродом и превращая малонильный
фрагмент в ацетоацетильный (т.е. в р-кето-
ацильное производное, отчего и фермент на-
зван Р-кетоацил-{АПБ)-синтетазоИ).
Вслед за созданием Р-кетоацильного произ-
водного, фиксированного на АПБ-домене, на-
ступает черед двух редуктазных реакций, разде-
ленных стадией дегидратации (рис. 7-15). Каж-
дый из ферментов этой серии (они поименованы
в подписи к рисунку) является особым доменом
ацилсинтетазы. Катализируемые ими превраще-
ния аналогичны первым реакциям р-окисления
жирных кислот (представленным на рис. 7-6),
но имеют противоположную направленность.
Это объясняется необратимостью р-кето-
ацил-(АПБ)-синтетазной реакции (и ацетил-
КоА-карбоксилазной тоже!), а также десяти-
кратным преобладанием НАДФ-Я2 в цитоплаз-
ме над его окисленным аналогом. Здесь умест-
но напомнить, что главными поставщиками
молекул НАДФ-Я2, необходимых для синтеза
жирных кислот, являются дегидрогеназы
ГМФ-пути (см. раздел 6.6.1), а также яблочный
фермент (см. рис. 7-12).
СН3
с==о
I
сн2
I
s~c=o
I
АПБ
СН3
НАДФ-Нг НАДФ НС-ОН
---> СН2
А S~C=O
I
АПБ
СН3
СН
II
СН
I
s~c=o
НАДФ-Н2 НАДФ
Ацето-
ацетил АП Б
/З-Гидрокси-
бутирил-АПБ
Кротонил-АПБ
СНз
СН2
I
сн2
I
s~c=o
I
АПБ
Бутирил-АПБ
Рис. 7-15. Восстановление р-кетоацильного фрагмента, фиксированного на АПБ-домене.
Ферменты: А - р-Кетоацал-(АПБ)-де<Зуктаза; Б - р-Гидроксиацил-(АГ\Б)-дегидрэтаза; В - Еноил-(АПБ)-редуктаза.
252
Глава 7
Восстановительные реакции (см. рис. 7-15)
затрагивают лишь р-кетоацильный фрагмент,
фиксированный на АПБ-домене, тогда как
HS-группа цистеина-161 продолжает оставать-
ся свободной. Следовательно, возникший про-
дукт (ацилсннтетаза с бутирильным остатком
на АПБ-домене) аналогичен результату реак-
ции А (см. рис. 7-14), когда именно на АПБ
был перенесен ацетильный остаток. Поэтому
нетрудно допустить, что и синтезированный
бутирильный фрагмент (подобно ацетильному
в уравнении А на рис. 7-14) может быть пере-
мещен с АПБ на пока еше свободную HS-
группу цистеина-161 (как на рис. 7-14, Б).
Установлено, что так оно и происходит.
Более того, повторяются и все последующие
реакции. С той лишь разницей, что вместо
двухуглеродного ацетильного фрагмента в но-
вом раунде участвует четырехуглеродный бу-
тирильный. Теперь именно он конденсируется
с малоновой кислотой, предварительно перене-
сенной на освобожденный им АПБ-домен (как
в уравнении на рис. 7-14, В). Конденсация эта
аналогична уравнению Г на рис. 7-14, но за-
вершается формированием на АПБ-домене не
четырехуглеродного, а теперь уже шестиугле-
родного р-кетоацильного фрагмента. Восста-
навливают его те же ферментные домены
ацилсинтетазы и точно так же, как это показа-
но на рис. 7-15. В итоге бутаноильная структу-
ра, возникая в первом раунде биогенеза ациль-
ной цепи, превращается в гексаноильную.
Аналогичным образом ацилсннтетаза
удлиняет возникшую гексаноильную цепь до
октаноильной, потом деканоильной, додекано-
ильной и т.д., для чего каждый раз привлекает
малонил-КоА как источник двух атомов угле-
рода, которыми наращивает карбоксильный
конец синтезируемой жирной кислоты, а также
две молекулы НАДФ7/2-
Конечным продуктом становится, как пра-
вило, пальмитиновая кислота. Для синтеза ее
16-углеродной цепи ацилсннтетаза 7 раз повто-
ряет комплекс реакций двухуглеродного удли-
нения ацильных радикалов, используя для это-
го сначала молекулу ацетил-КоА, а затем 7 мо-
лекул малонил-КоА и 7 пар молекул НАДФ-ТД-
В заключение тиоэстеразный домен фермента
гидролитически отделяет готовую пальмити-
новую кислоту от пальмитоил-АПБ. Легко
подсчитать, что, наряду с нею, в конечном ито-
ге образуются 7 молекул СОг и 6 Н2О, а также
освобождаются все участвовавшие кофермен-
ты (8 HS-KoA и 14 НАДФ).
Важным исключением являются клетки
лактирующей молочной железы. Здесь процесс
удлинения углеродной цепочки не всегда до-
ходит до образования пальмитиновой кислоты.
Нередко тиоэстеразному отщеплению подвер-
гаются ацильные фрагменты, состоящие всего
лишь из 8, 10 или 12 углеродных атомов. По-
этому триглицериды молока содержат значи-
тельную долю жирных кислот со сравнительно
короткой цепью.
Ацилсннтетаза неспособна продолжать
наращивание пальмитиновой кислоты. Это
осуществляют другие ферменты. Они локали-
зованы на внешней (цитоплазматической) сто-
роне мембраны ЭР и в качестве субстрата ис-
пользуют ацил-КоА (а не ацил-АПБ!). На его
карбонильную группу такая ацил-КоА-элонгаза
переносит двухуглеродный фрагмент с мало-
нил-КоА подобно тому, как это делает ацил-
синтетаза (рис. 7-14, Г). Восстановление воз-
никшего р-кетоацил-КоА с последующей де-
гидратацией и повторным восстановлением
(снова за счет НАДФ7/2) приводит к увеличе-
нию длины жнрнокислотной цепи (в составе
ацил-КоА) на 2 углеродных атома. Таким спо-
собом пальмитоил-КоА [С(16)] превращается в
стеароил-КоА [С(18)], который, в свою оче-
редь, удлиняется до эйкозанои л-Ко А (С(20)].
В нервных клетках интенсивно синтезируются
жирные кислоты с еще более длинной цепью
[С(22) н С(24)], необхродимые для синтеза
сфинголипидов.
Ненасыщенные жирные кислоты образуют-
ся путем внедрения двойной связи в уже синте-
зированные молекулы длинноцепочечных ацил-
КоА. Этот окислительный процесс осуществля-
ют ферменты из группы десатураз. Катализи-
руемые ими реакции представлены в разделе
5.4.2. У животных продуктами таких реакций
становятся мононенасыщенные олеиновая и
пальмитолеиновая кислоты, включаемые в со-
став как депонируемых ТГ. так и липидов мем-
бран. Полиеновые кислоты образуются только
из линолевой и а-линоленовой кислот пищевого
происхождения. Как показано на рис.5-39, имен-
но они реакциями десатурации (и элонгации)
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
253
могут превращаться в столь необходимые орга-
низму эйкозаполиеновые кислоты. Ведущую
роль среди этих метаболитов играет арахидоно-
вая кислота [С(20):4]. Она абсолютно необхо-
дима н как непременный компонент мембран-
ных липидов, и в качестве предшественника
таких сигнальных молекул, как эйкозаноиды.
7.5. МЕТАБОЛИЗМ
ГЛИЦЕРОФОСФОЛИПИДОВ
Будучи производными фосфатидной ки-
слоты, фосфглицериды по своему строению
очень похожи на триацилглнцеролы. Поэтому
и метаболизм тех и других во многом сходен.
Главные особенности связаны лишь с процес-
сами формирования и распада фосфорильного
фрагмента в составе глицерофосфатндов.
7.5.1. БИОГЕНЕЗ ГЛИЦЕРОФОСФОЛИПИДОВ
В формировании молекул фосфоглнцери-
дов главную роль играют трансферазы. В каче-
стве одной из «заготовок» они используют
1,2-диацилглицерол либо фосфатидную кисло-
ту (см. рис. 7-3). Другим субстратом часто яв-
ляются аминокислота серин, продукт ее декар-
боксилирования этаноламин или метилиро-
ванное производное последнего - холин (см.
рис. 3-3). Обычно азотсодержащий предшест-
венник предварительно подвергается активи-
рованию. Оно происходит путем фосфорили-
рования с участием соответствующей киназы и
последующего взаимодействия с молекулой
ЦТФ, как это показывает рис. 7-16 на примере
этаноламина. Ферментативный гидролиз осво-
бождаемого прн этом пирофосфата служит за-
логом необратимости процесса.
Под действием соответствующей трансфе-
разы фосфоэтаноламин переносится затем с
цитидиндифосфат-этанолам ина (ЦЦФ-этанол-
амин) на группу -ОН диацилглицерола, что
приводит к образованию фосфатндилэтанол-
амина (ФЭ) с освобождением ЦМФ (рис. 7-17).
Аналогичным образом может синтезиро-
ваться фосфатидилхолин (ФХ): киназное фос-
форилирование холина; образование ЦДФ-хо-
лина; перенос фосфохолина на диацилглице-
рол. Есть, однако, и альтернативный путь (рис.
7-18). Он заключается в присоединении трех
метильных остатков к азоту этаноламина в со-
ставе уже готовой молекулы ФЭ. Как н при
метилировании свободного этаноламина, ис-
точником метильных групп являются молеку-
лы активированной формы метионина - S-аде-
нозил метион ина.
ho-ch2-ch2~n+h3
Этаноламин
АТФ
^АДФ
О
НО-Р- О-СНз- сн2- N+H3
он
Фосфоэтаноламин
^-ЦТФ
^-»фф
о о
II II .
цитидин—О—Р~О—Р—О-СН2—СН2—N Н2
ОН ОН
ЦДФ-этаноламин
Рис. 7-16. Синтез ЦДФ-этаноламина.
О
R'-C~o-CH2
I
R-C-O-CH
II I
о н2с-он
1,2-Диаци л глицерол
ЦДФ-этаноламин
^ЦМФ
О
II
R-С-О-СНг
R-C-O-CH О
О НгС-О-Р-О-СНг-СНг-Л/^з
ОН
Фосфатидилэтаноламин
(ФЭ)
Рис. 7-17. Синтез фосфатид ил этанол амина
(курсивом выделен фрагмент фосфоэтаноламина,
переносимый на диацилглицерол).
254
Глава 7
о
О H2C-O-C-R'
II 1
R-C-O-CH О
H2C-O-P-O-CH2-CH2-N+H3
он
Фосфатидилэтаноламин
(ФЭ)
СНз
3HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-S4-CH2
S-аденозилметионин
ОН ОН
Аденин
3 НООС-CH{NH2>-СН2-СН2- S*-СНз
S-аденозмл гомоцистеин
ОН ОН
Аденин
О
СНз
О h2c-o-c-r*
II ।
R’-C-O-CH О
I И ..
Н2С-О-р-О-СН2-СН2-Н+-СНз
ОН СНз
Фосфатид и лхо л ин (ФХ)
Рис. 7-18. Преобразование фосфатидилэтаноламина (ФЭ) в фосфатид илхол ин (ФХ)
[жирным шрифтом выделены метильные группы, переносимые с S-аденозилметионина].
Биосинтез фосфатидилсерина (ФС) тоже
может осуществляться двумя путями. Одни из
них - обмен этаноламина на серии в уже гото-
вом фосфатидилэтаноламине (этаноламин прн
этом выделяется в свободном виде). Другой
путь специфичен тем, что изначально исполь-
зуется не диацилглицерол (как в описанных
выше синтезах), а фосфатидная кислота. И на-
чинается этот путь с ее активации посредством
взаимодействия с ЦТФ (рис. 7-19).
Специальный фермент производит затем
перенос фосфатидной кислоты непосредствен-
но на гидроксильную группу сернна (рис.
7-20). Аналогичный фермент передает фосфа-
тидатный фрагмент на другой акцептор - ино-
зитол, обеспечивая тем самым синтез фосфа-
тидилинозитолов (см. рис. 3-3). При фосфори-
лировании их спиртовой части (за счет АТФ)
образуется фосфатидилинозитол-4,5-бисфос-
фат (см. рис. 3-10), который играет ведущую
о
о НгС-О-С-R' Н2С-ОН
R"—С—О—СН О О +
Н2С~ О—р~О—Р-О-цитидин СООН
ОН ОН
ЦДФ-диглицерид L-серин
роль в фосфоинозитидной системе сигнальной
трансдукции (см. раздел 3.3.4).
о
R'-C-O-CH2
R"— С-О-ОН О
II I II
О н2с-о-р-он
I
он
Фосфатидная кислота
ЦТФ
фф
О
II
R’-C-O-CH2
R-C-O-CH О О
II I II II
О Н2с-О-р~о-Р-о-цитидин
ОН он
Цитидиндифосфат- диглицерид
Рис. 7-19. Синтез ЦДФ-диглицерид а.
О
II
о H2c-O-C-R'
— 4МФ + R"—с—о—сн о
I II
Н2С—О—Р—О—CHj—СН—л/н2
ОН соон
Фосфатидилсерин (ФС)
Рис. 7-20. Образование фосфатидилсерина (ФС).
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
255
Активация фосфатидной кислоты необхо-
дима и при синтезе кардиолипина, который ти-
пичен для мембраны митохондрий, а по струк-
туре является дифосфатидилглицеролом (рнс.
7-21). Его формирование начинается с перено-
са фосфатидатного фрагмента с молекулы
ЦДФ-диглицерида на глицерол-3-фосфат (точ-
нее, на его спиртовую группу в положении 1).
Продуктом этой реакции является фосфати-
дилглицеролфосфат (на рис. 7-21 он представ-
лен обычным шрифтом). После дефосфорили-
рования этого метаболита на него переносится
с ЦДФ-диглнцерида еще один фосфатидатный
остаток, который занимает место удаленной
фосфатной группы (на рис. 7-21 диглицеридная
часть этого остатка выделена курсивом).
Перечисленные пути биогенеза глицеро-
фосфолипидов суммированы в виде схемы на
рис. 7-22. Она демонстрирует центральное ме-
сто ФЭ в метаболизме азотсодержащих глице-
рофосфатидов. С одной стороны, фосфатиди-
лэтаноламины могут вырабатываться двумя
независимыми способами - непосредственно
из диацилглицеролов либо «окольным» путем,
О
R-С-О-СНг
I
R-C-O-CH
II I
О СН2
I
О
но-р=о
Н2С—О—С—R"
I
НС-О-С-R"
I II
н2с о
I
о
о=р-он
о-сн2-сн-сн2-о
он
Рис. 7-21. Строение кардиолипина.
начинающимся с фосфатидной кислоты и
включающим стадию образования фосфати-
дилсерина с последующим его декарбоксили-
рованием до ФЭ. С другой стороны, и молеку-
лы ФЭ могут быть превращены в ФС или в ФХ.
Разнообразие и взаимосвязи путей биогенеза
этих фосфолипидов благоприятствуют под-
держанию требуемого баланса.
Все три группы азотсодержащих глицеро-
фосфатидов в очень небольшой степени пред-
ставлены и такими аналогами, в которых вме-
сто жирнокислотного радикала в положении 1
глицерола содержится остаток первичного
НзРО4
Рис. 7-22. Пути биогенеза различных групп глицерофосфолипидов.
Сбозначения; Гл-З-Ф-глицерол-З-фосфат; Ц-ДГ -ЦДФ-диацилглицерол; S-CHs - S-аденозилметионин;
S-Г - S-аденозилгомоцистеин.
256
Глава 7
CH3-(CH2)n-CH2-O~CH2
сн3-с-о-сн
И I
о сн2
I
о
но—р=о сн3
O-CH2-CH2-N+-CH3
СНз
Рис. 7-23.Тромбоцитактиеирующий фактор.
спирта с длинной углеводородной цепью. Ины-
ми словами, алкильный радикал присоединен
здесь не сложноэфирной, а простой эфирной
связью. Примером может служать тромбоци-
тактивирующий фактор, еще одной особен-
ностью которого является наличие ацетильного
остатка вместо жирной кислоты в положении 2
глицерола (рис. 7-23).
Этот фактор содержится в клетках крови и
некоторых тканей. Обладая очень высокой ак-
тивностью, он даже в ничтожных концентра-
циях стимулирует агрегацию тромбоцитов,
способствуя тем самым свертыванию крови,
а также оказывает гипотензивное действие.
Биогенез 1-алкил-2-ацилглицерофосфоли-
пидов довольно специфичен. Он начинается с
ацилирования дигидроксиацетонфосфата (см.
рис. 6-22) по его спиртовой группе; после-
дующего замещения ацильного фрагмента на
длинноцепочечный спирт; восстановления ке-
то-группы ацетона до спиртовой и ее ацилиро-
вания за счет ацил-КоА. В результате образу-
ется 1-алкильный аналог фосфатидной кисло-
ты. Дальнейшие процессы подобны гем. что
происходят при биосинтезе всех глицерофос-
фатндов. Образующиеся 1-алкильные аналоги
молекул ФЭ, ФХ и ФС в основном подвергают-
ся десатурации с возникновением двойной связи
между 1-ми 2-м углеродными атомами алкила.
Так возникают плазмалогены - фосфатидаль-
этаноламины, фосфатидальхолины и фосфати-
дальсерины. Их устройство отражает формула
на рис. 7-24, где R - обозначает ацильную це-
СНз^СНг^-СН-СН-О-СНг
R-C-O-CH О
II I II
О Н2С-О-Р-О-Х
I
он
Рис. 7-24. Строение пл аз малоген ов.
почку, а X - остаток этаноламина, холина или
серина.
На долю плазмалогенов приходится значи-
тельная часть мембранных фосфолипидов в
митохондриях, а также в нервных клетках
(особенно в миелиновых оболочках).
7.5.2. КАТАБОЛИЗМ ГЛИЦЕРОФОСФОЛИПИДОВ
Распад фосфоглицеридов начинается с их
гидролиза до составных частей. Его осуществ-
ляют клеточные фосфолипазы, активность ко-
торых зависит от Са2+. Одни из них, как пока-
зано на рнс. 7-25, специализированы на осво-
бождении жирной кислоты, присоединенной в
положении 1 или 2 глицерола (соответственно
фосфолипазы Aj и Аз). Другие гидролизуют
эфирную связь фосфатной группы с глицеро-
лом (фосфолипаза С) или с полярной «голов-
кой» (фосфолипаза D).
Продукты гидролиза - жирные кислоты,
глицерол, фосфат, компоненты полярной «го-
ловки» — используются далее обычными для
них путями метаболизма, большинство нз ко-
торых рассмотрено выше. Следует лишь отме-
тить, что свободный холин в значительной сте-
пени подвергается реутилизации при синтезе
нуждающихся в нем липидов. Это обусловлено
тем, что для создания холина необходим ме-
тионин, а эта аминокислота относится к неза-
менимым (не синтезируется в организме чело-
века) и поступает с обычной пищей в довольно
ограниченном количестве (около 1 г в сутки).
Упоминания заслуживает еще одна особен-
ность: некоторые из продуктов гидролиза мем-
бранных глицерофосфатидов являются предше-
ственниками сигнальных молекул. Это относит-
ся прежде всего к продуктам гидролиза фосфа-
тидилинозитолов. Как отмечено в разделе 3.3.4,
гормональные воздействия на некоторые pe-
ll •
R’-C-O-CH2
R’-CtO-СН О
Il * I II
о: HsC-o-p-o-x
: ,* I *,
Аг : он \
C D
Рис. 7-25. Связи, атакуемые фосфолипазами
Ai,A2, CmD[R’ и R" - жирнокислотные цепи,
X - полярная «головка»].
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
257
цепторы ведут к аллостерической активации
фосфолипазы С, под действием которой появ-
ляются вторичные посредники фосфоинози-
тидной системы сигнальной трансдукции. Дру-
гой фермент - фосфолипаза Аг (ассоциирован-
ная с мембраной) - тоже активируется многи-
ми стимулами, включая гормональные влия-
ния, воздействие ряда биологически активных
молекул и даже контакт с такими структурами,
как комплексы антиген-антитело. Поступая в
цитоплазму, арахидонат и его аналоги стано-
вятся предшественниками эйкозаноидов (см.
рис. 5-53, 5-54). Спектр сигнальных молекул
этой группы различен в клетках разного типа, а
их пара- и аутокринные эффекты тоже зависят
от клеткн-мишени (разделы 5.4.5 н 5.4.6).
7.6. МЕТАБОЛИЗМ СФИНГОЛИПИДОВ
Будучи спиртовой частью сфинголипидов,
сфингозин не только внешне похож на моно-
ацилглицерол, как уже отмечалось в разделе
3.1.3, но и близок по биогенезу. Ибо начало
образованию этого ненасыщенного двухатом-
ного аминоспирта кладет конденсация молеку-
лы пальмитоил-КоА с серином. Процесс со-
провождается декарбоксилированием амино-
кислоты и освобождением КоА (рис. 7-26). За-
вершают формирование сфингозина восста-
новление кетогруппы (за счет НАДФ-Н2) и ре-
акция внедрения двойной связи (осуществляе-
мая ФАД-зависимым ферментом, аналогичным
ацил-КоА-дегндрогеназе).
Практически весь возникающий сфинго-
зин используется затем для синтеза церамида
(его структура показана на рис. 3-4). Происхо-
дит это путем переноса ацильного фрагмента с
молекулы ацил-КоА на группу -NH2 сфингози-
на. Именно N-ацилсфингозин является прямым
предшественником и сфингофосфатидов
(сфингомиелинов), и гликолипидов.
Сфингомиелины образуются в резуль-
тате переноса фосфохолина с молекулы
ЦДФ-холина на первичную спиртовую группу
церамида. Эта реакция аналогична протекаю-
щей при синтезе глицерофосфатидов (см. рис.
7-22). Возможна также передача фосфохолина
с молекулы фосфатидилхолнна.
Гликолипиды не имеют фосфорсодер-
жащего фрагмента. Вместо него при их синтезе
на первичную спиртовую группу церамида пе-
реносится моносахаридное звено. Соответст-
вующие гликозилтрансферазы используют для
этого молекулу УДФ-глюкозы или УДФ-галак-
тозы. Так появляются цереброзиды (см. рис.
3-5). Ганглиозиды создаются путем последова-
тельного наращивания глюкозы цереброзида
несколькими звеньями галактозы и N-ацетил-
галактозамина, а зачастую — еще и одним-тре-
мя остатками N-ацетилнейраминовой кислоты
(несущей отрицательный заряд). Многие олн-
госахаридные цепочки ганглиозидов обладают
антигенным потенциалом, благодаря чему иг-
рают важную роль в обозначении клеточной
индивидуальности и в межклеточных взаимо-
действиях.
О СООН
и I
CH3-(CH2)i4--C~S-KoA + h2n-сн
сн2он
Пальмитоил-КоА Серин
СО2
HS-KoA
CHs-(CH2)i4-C=O
H2N-CH
СН2ОН
Дегидросфинганин
НАДФ-Н2
^НАДФ
СНз-(СН2)12-СН=СН-СНОН
H2N-СН
СН2ОН
Сфингозин
е-фдд-н2
Е-ФАД
ОН
СНз- (СН2>14-сч н
h2n-ch
СН2ОН
Сфинганин
Рис. 7-26. Биогенез сфингозина.
258
Глава 7
Катаболизм сфинголипидов начинается с
гидролиза до составных компонентов, проте-
кающего в лизосомах. Каждая из специфиче-
ских гликозидаз и аминидаз отщепляет соот-
ветствующую гексозу или аминосахар (вклю-
чая N-ацетилнейраминовую кислоту), а в сфин-
гомиелинах полярная «головка» удаляется под
действием специальной фосфатазы. Совокуп-
ное действие всех этих ферментов ведет к
освобождению церамида, который, в свою оче-
редь, гидролизуется цераминидазой до жирной
кислоты и сфингозина. Последний подвергает-
ся дальнейшему разложению ферментами ЭР.
При этом сначала происходит фосфорилирова-
ние первичной спиртовой группы сфингозина и
восстановление двойной связи. Возникший
сфинганин-1-фосфат расщепляется затем спе-
циальной лиазой до фосфоэтаноламина и паль-
митинового альдегида (быстро превращаемого
в пальмитат).
Врожденный дефицит той или иной из
упомянутых гидролаз может стать причиной
накопления в клетках продуктов неполного
распада производных сфингозина. Такие со-
стояния относятся к группе лизосомных болез-
ней и объединяются термином сфинголипидо-
зы. Частота их невелика, но проявления очень
тяжелые (в том числе умственное отставание и
психические расстройства); смерть нередко
наступает в раннем возрасте. Разработаны ме-
тоды пренатальной диагностики некоторых
сфинголипидозов.
7.7. МЕТАБОЛИЗМ ХОЛЕСТЕРОЛА
При всем разнообразии природных стеро-
лов, основу их молекулы всегда составляет ха-
рактерная полициклическая структура стерана,
в одном из колец которого часто имеется двой-
ная связь (как правило, единичная). У высших
животных они представлены только одним ва-
риантом - холестеролом (см. рис. 3-1). Суточ-
ная потребность в нем составляет у взрослого
человека около 0,5 г. Еще примерно столько же
синтезируется в самом организме. Недостаточ-
ное поступление с пищей компенсируется уси-
лением эндогенного образования холестерола
(ХС). В целом лишь около 10% этого одно-
атомного спирта содержится в организме в ви-
де эфиров с жирными кислотами (стеридов).
Продукты преобразования боковых радикалов
ХС обозначаются общим терминов стероиды.
7.7.1. СИНТЕЗ ХОЛЕСТЕРОЛА
Как и жирные кислоты, ХС синтезируется
из ацетил-КоА, причем, тоже в цитоплазме. Но
ацилсинтетаза в стероидогенезе не участвует.
Есть иное совпадение: начальные реакции син-
теза ХС идентичны первым двум стадиям ми-
тохондриальной продукции кетоновых тел (см.
рис. 7-8). Однако, в отличие от ГМГ-КоА-
синтетазы митохондрий, ее цитоплазматиче-
ский изофермент сильно угнетается избытком
собственного продукта. Значит, замедление на
любом из последующих этапов построения ХС,
приводя к накоплению ГМГ-КоА, автоматиче-
ски снижает наработку этого метаболита
ГМГ-Ко А-синтетазой.
Первым ферментом, специфичным для пу-
ти биогенеза стеролов (н разнообразных изо-
преноидов), является ГМГ-КоА-редуктаза. Ее
N-концевая часть встроена в мембрану ЭР, а
активный центр обращен в цитоплазму и ката-
лизирует восстановление ГМГ-КоА до мевало-
новой кислоты, используя 2 молекулы
НАДФ-Н2 (рис. 7-27).
Будучи лимитирующим звеном стероидо-
генеза. ГМГ-КоА-редуктаза регулируется це-
лым рядом механизмов контроля. Среди них -
СООН
I
сн2
I
сн3- с-он
СН2
I
Q=C~S-KoA
ГМГ-КоА
2НАДФ-Н2
HS-KoA
соон
I
сн2
I
СНз-С-ОН
I
СНг
I
НО—СНг
Мевалонат
Рис. 7-27. Образование мевалоновой кислоты.
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
259
ее торможение путем фосфорилирования про-
теинкиназой, которую стимулирует АМФ. Как
н в случае ацетил-КоА-карбоксилазы (см. раз-
дел 7.4.2), опосредуемое рецепторами глюка-
гона угнетение протеинфосфатаз ведет к уси-
лению эффекта АМФ, а инсулин, напротив,
ускоряет синтез ХС, способствуя реактивации
ГМГ-КоА-редуктазы. Другой механизм - по-
давление экспрессии редуктазы. На уровне
транскрипции оно инициируется избытком ко-
нечных продуктов (ХС, желчные кислоты), а на
уровне трансляции — более ранними метаболи-
тами мевалоната. Наконец, известен еще один
эффект, довольно необычный. Он основан на
чувствительности внутрнмембранного домена
ГМГ-КоА-редуктазы к производным ХС и ме-
валоната, из-за чего их накопление ускоряет
деградацию фермента. Конструирование новых
лекарственных веществ путем целенаправлен-
ного синтеза соединений, сходных с мевалона-
том, позволило получить препараты, способ-
ные блокировать активный центр ГМГ-КоА-
редуктазы и тем самым препятствовать избы-
точной выработке ХС в организме.
Следующий этап биогенеза стеролов —
формирование изопентенильных структур,
пригодных в качестве «заготовок» для по-
строения полиизопреноидных цепей. Сначала
мевалонат подвергается двукратному фосфо-
рилированию по первичной спиртовой группе
(за счет молекул АТФ). Затем, как показано на
рис. 7-28, возникший мевалонатпирофосфат
лишается СО2, превращаясь в изопентенил пи-
рофосфат, который находится в равновесии с
изомерным ему диметилаллилпирофосфатом.
Источником энергии, необходимой для удале-
ния карбоксильной группы, становится сопря-
женный с этим распад АТФ до АДФ и Фн (для
чего используется «скрытая» вода, изымаемая
у соседних углеродных атомов мевалоната,
чтобы обратить связь между ними в двойную).
Очередной этап заключается в ступенча-
той конденсации пятиуглеродных звеньев. Де-
тали ее приведены на рис. 7-29. В общем плане
достаточно отметить, что энергетически про-
цесс обеспечивается отщеплением пирофос-
фатной группы, которую своим углеродным
«хвостом» замещает другая молекула изопен-
тенилпирофосфата. Возникший 10-углеродный
геранилпирофосфат точно так же реагирует с
СООН
I
сн2
I
CH3-C-OH
сн2 о о
I л tl II
СН2-О-Р-О--Р=О
I I
но он
Мевалонат-5-пирофсофат
СН2 н3С сн3
СН3—С с
I .___________ II
СНз *----------> СН
СНз—О СНз-О
РгО,Н, Р2О,Н,
Изопентенил- Диметилаллил-
пирофосфат пирофосфат
Рис. 7-28. Создание изопентенильных «заготовок».
еще одним изопентенилпирофосфатом. Это
приводит к образованию 15-углеродного фар-
незилпирофосфата, две молекулы которого то-
же стыкуются, но уже во «встречном» направ-
сн3
НзС-С“СН-СНг-О-Р2О6Нэ
дмп
снг
НзС-С-СНг-СНг-С-P^Hj
ипп
'Ч'*Н4Р2О,
СНз СНз
Н^-С=СН-СНг-СН2-С-СН-СН2-О-РгО6Нг
Герани л-ФФ
СНз СНз СНз
НзС,-С^С.Н-СН2~СН2-С-СН-СНз-СНз~С^СН-СН3-О-Р2О6Н}
Фарнезил-ФФ
Фарнезил-ФФ
2ФФ
Г СНз "I Г СНз .
н- СН2-ОСН-СН2 НСНг-СН“С-СНз
Сквален
Рис. 7-29. Формирование полиизопреноидной
цепи сквалена.
Сокращения: ДМП - диметилаллилпирофосфат;
ИПП - изопентенилпирофосфат; ФФ - пирофосфат.
260
Глава?
лении (т.е., теми концами, которые несли на се-
бе пирофосфат). В итоге появляется 30-угле-
родная цепь сквалена, которая состоит из
6 изопреноидных единиц.
Здесь уместно заметить, что сходные про-
цессы объединения изопреноидных единиц
лежат в основе биогенеза таких молекул с ко-
ферментными функциями, как убихинон (см.
рис. 5-4) и долихолфосфат (его строение пока-
зано на рис. 10-8). В растениях конденсацией
гераиилпирофосфата начинается синтез каро-
тинов (из которых в животном организме воз-
никает витамин А), а также боковых цепей ви-
таминов К и Е. Если вспомнить, что и витамин
D относится к стероидам (см. рис. 5-41), то
становится очевидным, что все 4 жирораство-
римых витамина имеют общее с холестеролом
происхождение.
Заключительный этап - трансформация
сквалена в ХС - протекает через множество ста-
дий, включая реакции микросомального окис-
ления. Для наглядности часть метаболитов этого
этапа показана на рис. 7-30. Уже сам характер
чередования двойных связей в молекуле сквале-
на способствует спонтанной укладке ее в такую
пространственную ориентацию, которая близка
конфигурации стеролов. Специальная моноок-
сигеназа внедряет затем кислород по месту
двойной связи между атомами С3 и С4 будущего
ХС. Появившаяся эпоксидная группа стимули-
рует перераспределение электронной плотности
в полиеновой системе сквалена, облегчая про-
цедуру замыкания трех шестичленных колеи и
одного пятичленного (с попутной переброской
метильной группы при С8 в положение Св).
В сформированном таким способом лано-
стероле происходит окисление трех метильных
групп (в позициях 14 и 4), приводящее к их
удалению в виде НСООН и 2СО2, а также вос-
становление обеих двойных связей и введение
новой (между С5 и Се). Так появляется конеч-
ная 27-углеродная молекула ХС. В растениях и
у многих животных «доводку» сквалена произ-
водят другие ферментные системы, благодаря
чему возникает не ланостерол, а несколько
иные молекулы - предшественники разнооб-
разных фито- и зоостеролов.
Рис. 7-30. Основные вехи на пути преобразования сквалена в холестерол.
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
261
7.7.2. ТРАНСПОРТ ХОЛЕСТЕРОЛА В ОРГАНИЗМЕ
Около половины эндогенного ХС образу-
ется в печени, а почти все остальное - в коже и
стенке кишки. Значительные количества его
циркулируют с током крови, гарантируя по-
требности любых клеток. Подобно молекулам
ТГ, холестерол переносится в составе липопро-
теиновых частиц. Каждая из них представляет
собой нековалентное объединение множества
молекул неполярных липидов (ТГ и эфиры
ХС), покрытое тонким слоем единичных бел-
ковых молекул и расположенных между ними
амфифильных фосфолипидов с включениями
холестерола (более полярного, чем его эфиры).
С ростом доли липидов крупнее становится
гидрофобное ядро частиц и снижается их плот-
ность. При ультрацентрифугировании они раз-
деляются на ряд фракций, усредненные данные
о составе которых приведены в табл. 7-1. На-
ряду с рассмотренными выше ХМ и ЛОНП, в
нее включены липопротеины промежуточной и
низкой плотности (ЛПП и ЛНП), не отличимые
от ЛОНП по размерам частиц (20-100 нм), а
также липопротеины высокой плотности
(ЛВП), наиболее бедные липидами и потому
самые мелкие из всех (7-15 нм).
В клинико-диагностических лабораториях
разделение липопротеинов сыворотки произ-
водят обычно не центрифугированием, а элек-
трофорезом. В условиях стандартной методики
ХМ остаются на старте, ЛОНП и ЛПП переме-
щаются с фракциями пре-p- и a2,pi-глобулинов,
а ЛНП и ЛВП - в составе р- и ai-глобулинов
(от этого происходят «дублирующие» обозна-
чения липопротеинов: пре-р-ЛП, а2,рг-ПП,
Р-ЛП и агЛП).
Как уже отмечалось, липиды пиши транс-
портируются в составе ХМ, которые, почти
полностью освобождаясь в тканях от ТГ (бла-
годаря липопротеинлипазе), в то же время со-
храняют имеющиеся в них ХС и его эфиры.
Истощенные и утратившие апоС частицы по-
глощаются гепатоцитами путем эндоцитоза,
опосредуемого рецепторами к молекулам апоЕ
на поверхности остаточных ХМ. Таким обра-
зом, именно печень становится конечным
пунктом назначения для экзогенного ХС, пере-
носимого в составе ХМ.
В отличие от этого, эндогенные ТГ, об-
разуемые гепатоцитами, переносятся кровью в
составе ЛОНП, в которых доля ХС (включая
синтезированный в печени) втрое выше, чем в
ХМ. Подобно хиломикронам, ЛОНП тоже от-
дают тканям (преимущественно жировой)
только ТГ, но не ХС. Поэтому доля общего ХС
в них постепенно нарастает, и ЛОНП довольно
быстро превращаются в ЛПП. Как и более лег-
кие частицы, ЛПП находятся в кровотоке ко-
роткое время. За этот срок половину из них
успевают поглотить гепатоциты (используя свои
рецепторы к апоВ-100 и апоЕ). Остальные ЛПП,
продолжая терять ТГ, превращаются в ЛНП,
которые циркулируют в крови несколько суток.
Многократно проходя при этом через капилляр-
ную сеть и тканевые жидкости тела, они обме-
ниваются липидами как с мембранами клеток,
так и с липопротеинами других фракций.
Как видно из табл. 7-1, ЛНП - это фрак-
ция, наиболее богатая холестеролом, который
представлен здесь в основном стеридами. По-
этому именно ЛНП являются главным постав-
щиком ХС для всех клеток, нуждающихся в
нем. Объем «предложения» сильно превышает
потребности периферийных тканей в стерои-
дах. Тем самым создаются предпосылки для
чрезмерной загрузки их клеток свободным ХС,
токсичность которого обусловлена его избы-
Таблица 7-1
Характеристика липопротеиновых фракций плазмы крови человека
Фракция Плотность (г/мл) Процентная доля главных компонентов Содержание в плазме (мг%)
Белки ФЛ ХС Эфиры ХС ТГ
ХМ <0,94 2 (В-48, С-Н, Е) 3 2 3 85 10-50
ЛОНП 0,96-1,00 10 (В-100, С-П, Е) 18 7 10 55 150-250
ЛПП 1,01-1,02 11 (В-100, Е) 23 8 30 26 50-ЮО
ЛНП 1,02-1,06 22 (В-100) 21 8 42 7 315-385
ЛВП 1,06-1,21 50 (А-1, С-ll, Е) 27 4 16 3 270-380
262
Глава 7
точностью в мембранах, чреватой нарушением
их функционального состояния. Один из спо-
собов преодоления этого опасного эффекта
клетки реализуют с помощью ацилтрансфераз,
передающих жирную кислоту с ацил-КоА на
ХС (образующиеся при этом эфиры «нейтрали-
зуются» путем депонирования в составе жиро-
вых капель).
Преобладающая часть ЛНП извлекается из
кровотока гепатоцитами, ЛНП-рецептор кото-
рых связывает апоВ-100 этих частиц (хотя и с
довольно слабым сродством). Избежавшие та-
кой участи ЛНП продолжают выполнять роль
донора ХС и его эфиров.
Среди липопротеинов, способных прини-
мать липидные молекулы от других надмоле-
кулярных структур, наиболее важную роль иг-
рают ЛВП. Образуются они в печени в виде
предшественников, которые не содержат апоВ,
но имеют в своем составе апоС-П, апоЕ и
апоА-I. Последний является активатором ле-
цитин:холестерол-ацилтрансферазы (ЛХАТ).
Этот фермент тоже имеется в ЛВП и, как видно
из названия, может переносить ацильный
фрагмент с глицерофосфатидов на спиртовую
группу ХС, превращая его в эфир.
Обмениваясь своими компонентами с дру-
гими липопротеинами, ЛВП снабжают их та-
кими белками, как апоС-П и апоЕ, а сами обо-
гащаются липидами. Но самое главное - их
способность «откачивать» из клеток избыточ-
ный ХС. Малые размеры ЛВП позволяют им
проникать через эндотелий сосудов. Поэтому в
межклеточной жидкости их концентрация в 3-4
раза выше, чем содержание ЛНП. Контакт ЛВП
с плазматической мембраной стимулирует
фосфоинозитидную сигнальную систему, вто-
ричные посредники которой активируют цито-
плазматическую гидролазу эфиров ХС и, с дру-
гой стороны, тормозят эстерификацию стерола.
Ясно, что оба эффекта способствуют выведе-
нию стеридов из внутриклеточных депо в виде
свободного ХС, который и поглощается части-
цами ЛВП (содержащими общего ХС в 2,5 раза
меньше, чем ЛНП). С участием ЛХАТ, распо-
ложенной на поверхности ЛВП, происходит
эстерификация поглощенного ХС, а образуе-
мые эфиры ХС мигрируют в гидрофобное ядро
частиц. Затем эти эфиры доставляются в пе-
чень как орган, который выводит ХС (с жел-
чью) в неизмененном виде или после преобра-
зования в желчные кислоты. Доставка произ-
водится либо в составе ЛВП, либо после пере-
дачи эфиров ХС (с помощью особого белка-
переносчика) на иные апоВ-содержащие липо-
протеины, поглощаемые гепатоцитами с по-
мощью соответствующих рецепторов.
Итак, главными транспортными формами
ХС в организме являются ЛНП и ЛВП. Веду-
щая функция первых заключается в доставке
ХС из печени к другим органам и тканям, тогда
как ЛВП обеспечивают обратный транспорт
ХС из периферических клеток в гепатоциты.
По существу, эти встречные потоки составляют
единственный способ, которым обеспечивается
обновление холестероловых компонентов био-
мембран, ибо многие клетки не способны к
достаточному синтезу ХС, а ферментативного
разрушения полициклической стерановой
структуры в организме вообще не происходит.
Нарушение функционального баланса меж-
ду фракциями ЛНП и ЛВП может приводить к
различной патологии. Наибольшую опасность
представляет «болезнь избыточности ХС» -
атеросклероз. Непосредственную роль в патоге-
незе этого заболевания играет модификация
ЛНП в период их довольно продолжительной
циркуляции в организме. Они могут подвер-
гаться воздействию свободных радикалов, раз-
личных ферментов, белковых комплексов; всту-
пать в реакции параметаболизма (например, с
глюкозой). Такие модификации апоВ способны
изменять сродство ЛНП к клеточным рецепто-
рам и даже приводить к формированию анти-
генных детерминант, на которые вырабатыва-
ются антитела. Нередко повреждения липопро-
теиновой частицы превращают ее в лиганд для
так называемого скевенджер-рецептора (от англ.
scavenger - уборщик мусора). Так обозначают
неспецифический и неконтролируемый рецеп-
тор, которым обладают макрофаги и ряд других
клеток Он обеспечивает захват и быстрое уда-
ление из крови всяких образований, необычных
для организма, включая достаточно модифи-
цированные ЛНП. Но если последние появля-
ются в местах, сравнительно бедных макрофа-
гами (например, в интиме артерий), то происхо-
дит перегрузка этих клеток устойчивым к де-
градации холестеролом. Это ведет к их гибели,
выпадению кристаллов ХС и локальному по-
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
263
вреждению эндотелия с образованием фиброз-
ной бляшки. Сужая просвет сосуда, атероскле-
ротические бляшки и, тем более, возникающие
на них тромбы часто приводят к острым нару-
шениям кровоснабжения, включая такое гроз-
ное, как инфаркт миокарда.
7.7.3. МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ
ХОЛЕСТЕРОЛА
Мембранотропные свойства молекулы ХС,
обусловленные особенностями строения и вы-
сокой стабильностью его полициклического
скелета, природа использовала для конструи-
рования широкого спектра сигнальных моле-
кул с высокой избирательностью действия.
Достигается это в значительной степени путем
внедрения кислорода в те или иные позиции
стеранового остова. Один из примеров рас-
смотрен выше (см. рис. 5-41): именно появле-
ние гидроксильных групп при С25, а затем при
Cj превращает стероидную структуру витамина
D в активный лиганд, воздействием которого
на определенные рецепторы реализуются био-
логические эффекты этого витамина (подробно
они будут рассмотрены в разделе 11.6, посвя-
щенном гормональной регуляции остеогенеза).
Холестерол является исходным веществом
для выработки большого разнообразия мужских
и женских половых гормонов, а также гормонов
коры надпочечника (кортикостероидов). Эти
процессы всегда начинаются с отщепления шес-
тиуглеродного фрагмента от 8-членной боковой
цепи при кольце D холестерола. Решающую
роль играет митохондриальная цитохром(Рд5о)-
монооксигеназа, обозначаемая как «отщепляю-
щая боковую цепь». Она гидроксилирует сосед-
ние атомы С22 и С2о (реакции 1 и 2 на рис. 7-31).
Затем (реакция 3) НАДФ-зависимый фермент
отнимает атомы водорода у возникших гидро-
ксильных групп, что приводит к разрыву боко-
вой цепи между С20 и С22. Фрагмент, остающий-
ся от бывшего ХС, насчитывает 21 атом углеро-
да и обозначается как прегненолон. Избыток его
угнетает упомянутую монооксигеназу, которая
является ключевым звеном в биогенезе корти-
костероидов.
Превращение прегненолона в те или иные
гормоны происходит путем серии отдельных
реакций. Последовательность их бывает различ-
ной. Один из возможных вариантов представлен
на рис. 7-32 в виде очень краткой схемы. Обяза-
тельным является дегидрогеназное окисление
по Сз и перемещение двойной связи в кольцо А
Холестерол
(фрагмент)
22(И)-Г идроксихолестерол
(фрагмент)
Прегненолон
(фрагмент)
4-Метилпенталь
20,22-Дигидроксихолестерол
(фрагмент)
Рис. 7-31. Окислительное укорочение боковой цели холестерола
(полная формула прегненолона приведена на рис. 7-32).
264
Глава 7
11 -Дезокси кортизол
Рис. 7-32. Пути биогенеза стероидных гормонов
(наследственные дефекты гидроксилаз, катализирующих этапы 2,3, 4 и 6. проявляются резкими сдвигами в коли-
чественных соотношениях синтезируемых гормонов с соответствующей клинической симптоматикой; дефицит же
дегидрогеназы этапа 1 нарушает выработку всех вообще стероидных гормонов и приводит к ранней смерти).
Кортизол (021}
(Гидрокортизон)
МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ
265
под влиянием изомеразы (этап 1 на рис. 7-32).
Под действием разных цитохром(РД5о)-моно-
оксигеназ возникший прогестерон подвергается
в клетках коры надпочечников поэтапному гид-
роксилированию в положениях 17, 21, 11 и 18.
Первые две являются типичными микросомаль-
ными ферментами, тогда как Пр- и 18-гидр-
оксилазы локализованы во внутренней мембра-
не митохондрий. Поэтому здесь превращения
прогестерона идут в направлении выработки
альдостерона (реакции 2-5 на рис. 7-32) - самого
мощного из минералкортикоидов. В более глу-
боких слоях коры надпочечника прогестерон
подвергается сначала воздействию 17а-гидрок-
силазы (реакция 6), продукт которой превраща-
ется в главный глюкокортикостероид - кортизол
(реакции 7 и 8) - под действием таких же 21- и
llp-гидроксилаз, какие участвуют и в «альдо-
стероновом» пути.
В семенниках 17а-гидроксипрогестерон
(продукт этапа 6) образуется из ХС так же, как
и в надпочечниках. Но здесь он подвергается
особым окислительным превращениям, кото-
рые ведут к полному удалению боковой цепоч-
ки при С]7 с переходом гидроксильной группы
из 17а- в 17р-положение (этап 9 на рис. 7-32).
Так появляется основной из мужских половых
гормонов - тестостерон. Заметим, что ликви-
дация боковой цепочки переключает биогенез
стероидов с выработки кортикоидов (С21-гор-
моны) на продукцию тестостерона и других
андрогенов (С19-гормоны), которые, в свою
очередь, являются предшественниками эстро-
генов (С18-гормоны). Наиболее эффективный
из них — эстрадиол - образуется в яичниках из
тестостерона (этап 10 на рис. 7-32) путем уда-
ления метильной группы С19 и внедрения доба-
вочных двойных связей в кольце А.
Подробнее этот этап показан на рис. 7-33.
Здесь видно, что он протекает через три подряд
цитохром(Р45о)-монооксигеназных реакции.
Первые два гидроксилирования с последую-
щим отнятием молекулы воды преобразуют
метильную группу С19 в альдегидную. Затем
еще одно окисление образует гидроксильную
группу при С2, благодаря чему быстро проис-
ходит самопроизвольная перегруппировка мо-
лекулы. При этом отшепление муравьиной ки-
слоты (за счет альдегидной группы С19 и гид-
роксила при С2) сопровождается возникнове-
нием сопряженных двойных связей в кольце А
(т.е., его ароматизацией). Именно третье гид-
роксилирование является стадией, которая ли-
митирует скорость преобразования андрогенов
в женские половые гормоны.
Инактивация стероидных гормонов (и
кальциферолов) происходит в основном в пе-
чени. Иногда при этом восстанавливаются
двойные связи. Однако ведущую роль играют
монооксигеназные реакции. Часть из них при-
водит к отщеплению боковой цепи при Ci7
с образованием 17-кетостероидов (ежесуточно
Тестостерон
(фрагмент)
ОН ОН
Эстрадиол
(фрагмент)
Рис. 7-33. Механизм трансформации андрогенов (тестостерон) в эстрогены (эстрадиол),
266
Глава 7
4-17 мг у женщин и 6-28 мг у мужчин). Другие
обеспечивают внедрение дополнительных гид-
роксильных групп, которые могут возникать в
положениях 1, 2, 6, 7, 11, 15, 16, 18 (а у каль-
циферолов - и по атомам С23 - С26 боковой це-
пи). Помимо инактивации стероидных регуля-
торов метаболизма, все это способствует по-
вышению их растворимости, - особенно при
образовании эфиров (конъюгатов) с серной или
глюкуроновой кислотой. В результате пример-
но три четверти образующихся неактивных
продуктов удаляется затем почками, а около
20% - с желчью (небольшая часть выводится
кожными железами).
Всем изложенным подтверждается устой-
чивость пяти- и шестичленных колец холесте-
рола. В процессах метаболизма его полицикли-
ческий скелет остается, по существу неизмен-
ным, не разрушаясь даже под действием мощ-
ных окислительных систем. Только боковые
цепи поддаются деградации и, кроме того, мо-
гут появляться (и исчезать) гидроксильные и
кето-группы, а также двойные связи в кольцах.
На нужды генерации стероидных гормонов
расходуется лишь пятая часть суточного пула
ХС. Основная же масса подлежит экскреции
печенью либо в неизменном виде, либо после
преобразования в более растворимые и (что
очень важно!) поверхностно-активные желч-
ные кислоты. Биогенез их рассмотрен в разделе
5.4.3 (см. рис. 5-42 и 5-43), а функциональное
значение - в разделе 7-1.
Глава 8
ПРОТЕОЛИЗ
Белковые молекулы составляют преобла-
дающий из органических компонентов клеток
и межклеточного вещества. Наряду с этой
структурной ролью, белки (в качестве фермен-
тов, гормонов, рецепторов) вносят решающий
вклад в осуществление регуляторной функции.
Напротив, энергетическая роль белков - дале-
ко не главная. Просто белки, как и все другие
вещества, со временем распадаются, освобож-
дая некоторое количество энергии.
Катаболизм белков начинается с их гидро-
литического расщепления до аминокислот.
Этот процесс, кратко обозначаемый термином
протеолиз, протекает вполне независимо от
гораздо более сложной и многоступенчатой
процедуры белкового синтеза, основные этапы
которого рассмотрены в разделах 2.5 и 2.6.
Объединяет эти два противоположных пути
метаболизма только набор аминокислот, яв-
ляющихся и исходным материалом для синтеза
белков, и конечным продуктом их гидролиза.
Следовательно, весь катаболизм белков четко
разделяется на два последовательных этапа:
протеолитическая деградация белковых моле-
кул и метаболические превращения собственно
аминокислот.
Здесь уместно остановиться на особой ро-
ли белков в питании. Будучи единственным
источником усвояемого азота, белки являются
незаменимым компонентом пищи. Среди дру-
гих органических веществ к незаменимым (для
человека) относятся лишь минорные количест-
ва каждого из 13 витаминов и двух жирных
кислот - линолевой и а-линоленовой (см. раз-
дел 5.4.2). Как ясно из предыдущих глав, угле-
воды и жиры вполне взаимозаменяемы. Более
того, они могут синтезироваться из аминокис-
лот (глава 9). Однако богатые белком продукты
стоят гораздо дороже «простой» пищи. Поэто-
му в плане экономическом весьма немаловажен
вопрос о необходимом уровне потребления
белка.
8.1. НОРМЫ БЕЛКА В ПИТАНИИ
Первым попытался количественно оценить
потребности человека в белках немецкий фи-
зиолог Карл Фойт (1881 г). Он провел система-
тический учет повседневного потребления раз-
личных продуктов большой группой людей
среднего достатка. Анализ полученных мате-
риалов показал, что взрослый здоровый горо-
жанин того времени потреблял в среднем 118 г
белков, 56 г жиров и 500 г углеводов в сутки.
Отсюда был сделан вывод, что столько и дол-
жен потреблять человек для поддержания сво-
ей жизнеспособности.
Такой подход к определению нормативов
питания сразу же встретил критику. В первую
очередь это касалось белков как самого доро-
гостоящего компонента пищи. Нашелся и бо-
лее объективный критерий. Им оказался азо-
тистый баланс — разница между потребляе-
мым азотом (поступающим практически только
в составе белков) и азотом, выводимым из ор-
ганизма. У взрослых людей она, естественно,
268
Глава 8
равна нулю. Иными словами, им свойственно
азотистое равновесие. При белковом голода-
нии и различных заболеваниях (в том числе
при раковой кахексии, ожоговой болезни, тя-
желых инфекциях) наблюдается отрицатель-
ный азотистый баланс (выведение азотистых
продуктов выше поступления азота в составе
пищи). Напротив, в растущем организме, у бе-
ременных женщин и в ходе реабилитации по-
сле периода белкового дефицита естественным
становится положительный азотистый баланс
(преобладание потребления азотистых веществ
над экскрецией азота).
Специальные исследования были проведе-
ны на добровольцах, пребывавших на безбел-
ковой, но достаточно калорийной диете. Экс-
креция азота у них быстро падала, а через не-
сколько дней стабилизировалась на уровне,
составляющем в среднем 53 мг за сутки в рас-
чете на 1 кг массы тела. Отсюда следует, что у
человека массой 70 кг ежесуточно подвергает-
ся полному распаду примерно 23 г собствен-
ных белков тела. Эту величину ученик К.Фойта
- Макс Рубнер - назвал «коэффициентом из-
нашивания» (термин неудачен, а в обыватель-
ском сознании даже породил популярную в
свое время «теорию экономии сил»: меньше
трудиться, меньше эмоций, больше покоя, -
чтобы меньше «изнашиваться»).
На этом фоне включение в суточный ра-
цион 23-25 г белка сопровождалось, как ни
странно, увеличением выведения азота (хотя и
не вдвое, а гораздо меньшим). Иначе говоря,
вместо ожидаемой нормализации азотистого
баланса происходило лишь уменьшение степе-
ни его отрицательности. Азотистое равновесие
наступало только тогда, когда потребление
белка достигало 35-45, а то и 50 г в сутки
(цифры варьируют у разных исследователей).
Отсюда возник термин «физиологический ми-
нимум белка». Так стали обозначать наимень-
шее количество белка в суточном рационе
(достаточно калорийном), которое необходимо
для обеспечения азотистого равновесия.
Оценке этого минимума был посвящен
ряд исследований. В частности, Р. Читтенден
(1909 г.) отмечал сохранение азотистого равно-
весия и обычного самочувствия у группы мо-
лодых испытуемых, на протяжении 200 дней
получавших по 50 г белка и полный достаток
остальных пищевых веществ. Так возникло
предложение более чем вдвое снизить нормы
белка в питании. Со временем возник даже ло-
зунг: «Человечество переедает белок».
Были, однако, и серьезные возражения.
Одно из них сводилось к тому, что критерий
азотистого равновесия не абсолютен. Он по-
зволяет выявить нижнюю границу нормы, но
непригоден для оценки оптимума, ибо беспо-
мощен в установлении верхнего предела. Дей-
ствительно, чрезмерное потребление белковых
продуктов само по себе не нарушает баланса
азота, потому что избыточный белок подвер-
гается распаду, азотистые продукты которого
легко выводятся из организма (об отсутствии
мест и форм депонирования запасных белков у
животных еще в 1898 г. писал петербургский
профессор Б.И. Словцов). Кроме того, даже
обычный житейский опыт приучает не ограни-
чиваться единственным критерием. В конце
концов, вряд ли кого-нибудь вдохновит наблю-
дение за азотистым балансом собственного ор-
ганизма. Гораздо важнее для человека такие
критерии, как жизненный тонус, самочувствие,
полная реализация творческого потенциала,
устойчивость к простудным и иным заболева-
ниям, здоровье собственных детей, наконец. И
нет никаких свидетельств, что все это вполне
гарантируется питанием на уровне белкового
минимума.
После Второй мировой войны Институт
питания Академии медицинских наук СССР на
основе проведенных исследований предложил
(в 1951 г.) физиологические нормы пищевых
раскладок. В соответствии с ними, суточное
потребление белка в зрелом возрасте должно
составлять в среднем 100-110 г для лиц умст-
венного труда и повышаться у людей, занятых
физическим трудом, пропорционально росту
энергозатрат. Примерно такие же нормативы
были вскоре приняты и в США.
Дальнейшему продвижению помог учет
качества белковой пищи. Установлено, что из
всех 20 аминокислот только 8 являются неза-
менимыми, т.е., обязательно должны поступать
с пищей. Остальные, разумеется, тоже необхо-
димы. Но они взаимозаменяемы, так как ами-
ноазот любой аминокислоты (включая незаме-
нимые) может быть использован для создания
другой (но только из числа заменимых). Это
ПРОТЕОЛИЗ
269
обеспечивается переносом аминогруппы на
место карбонильного кислорода в а-кетокис-
лотах, возникающих в ходе катаболизма угле-
водов и жиров (подробнее такие процессы бу-
дут рассмотрены в разделе 9.2.2). Поэтому всю
совокупность заменимых аминокислот, посту-
пивших с пищей, обозначают термином «не-
дифференцированный азот». Это означает, что
соотношение заменимых аминокислот в пище-
вых белках может варьировать в широких пре-
делах, лишь бы совокупное их количество
(вместе с набором незаменимых) удовлетворя-
ло потребности организма. Ясно, что в отсут-
ствие хотя бы одной из полного набора 20 ко-
дируемых аминокислот совершенно невозмо-
жен синтез почти любой белковой молекулы.
Для незаменимых аминокислот самый же-
сткий минимум суточного потребления, необ-
ходимый для обеспечения азотистого равнове-
сия, составляет у взрослых людей примерно
0,25 г триптофана; 0,5 г треонина; по 0,7-0,8 г
лизина, валина и изолейцина; по 1,1 г лейцина,
метионина и фенилаланина (потребность в
двух последних снижается в 3-5 раз введением
в рацион таких же количеств цистеина и тиро-
зина соответственно). Следует заметить, что у
детей незаменимыми оказываются также арги-
нин и гистидин, т.к. скорость их эндогенного
синтеза отстает от нужд растущего организма.
По соотношению незаменимых аминокис-
лот наиболее близки потребностям человека
белки куриного яйца. Для поддержания азоти-
стого равновесия их достаточно получать всего
20 г в сутки, - меньше даже, чем «коэффициент
изнашивания»! В белках мяса и коровьего мо-
лока маловато метионина и фенилаланина, а
потому в качестве единственного источника
белка их требуется 26-28 г в сутки. Зерна пше-
ницы и других злаков особенно бедны трипто-
фаном и лизином, из-за чего почти 67 г белков
пшеничного хлеба пришлось бы съедать еже-
дневно для полного обеспечения всеми амино-
кислотами. Суточная порция хлеба должна бы-
ла бы составлять примерно 1 кг (как собствен-
но и было у трудового люда дореволюционно-
го Санкт-Петербурга).
Приведенные примеры показывают, что
биологическая ценность пищевых белков раз-
лична. Она определяется степенью соответст-
вия между содержанием незаменимых амино-
кислот в белке и потребностями в них орга-
низма человека. Ценность каждого раститель-
ного белка обычно значительно ниже, чем у
белков животного происхождения. Однако гра-
мотное сочетание пищевых продуктов из
разных растений позволяет преодолеть специ-
фику аминокислотного состава индивидуаль-
ных белков.
Итак, минимальный уровень белков в пи-
тании определяется той из незаменимых ами-
нокислот, которую пищевой рацион содержит в
наименьшем количестве (относительно по-
требности организма в ней). При этом осталь-
ные из незаменимых аминокислот окажутся в
избытке, равно как и значительная доля заме-
нимых (избыточная часть тех и других подвер-
гается распаду). Отсюда становится очевидной
причина расхождения данных о физиологиче-
ском минимуме белка: о стандартизации диеты
тогда еше не задумывались (кстати, расхожде-
ний относительно величины «коэффициента
изнашивания» не было).
За последние десятилетия официально ре-
комендуемые в США нормативы белков в су-
точном рационе претерпевали динамику в пре-
делах 50-58 г для женщин и 56-70 г для муж-
чин. Однако статистика показывает, что еже-
дневное потребление белков взрослым жите-
лем США реально составляет в среднем 101 г
(из них 30 г - растительные белки). С учетом
изменений качества питания за последние пол-
тора века, эта цифру можно считать совпадаю-
щей с рекомендациями К.Фойта. И это не слу-
чайно. Идеологию его изысканий можно сфор-
мулировать так: поверим инстинкту, ибо имен-
но он диктует человеку, сколько (и чего) надо
есть. Похоже, и до сих пор нормальный чело-
век больше всего доверяет «советам» собст-
венного инстинкта (т.е., руководствуется в ос-
новном аппетитом).
8.2. ТЕМПЫ ОБНОВЛЕНИЯ БЕЛКОВ ТЕЛА
Как и все компоненты живых систем, бел-
ковые молекулы непрерывно подвергаются
распаду с заменой вновь синтезированными.
Скорость этого процесса оценивают периодом
полусуществования (Тод), который указывает
время, требуемое для обновления половины
имеющихся молекул. У взрослого человека ве-
270
Глава 8
личина этого показателя для белков всего тела
составляет в среднем около 80 дней. В дейст-
вительности же темпы обновления разных бел-
ков варьируют в очень большом диапазоне.
Медленнее всего обновляются структурные
белки. В частности, для мышечных белков То.5
составляет около полугода. Гораздо выше ско-
рость обновления у большинства белков плаз-
мы крови и печени, для которых величина То,5
не превышает 10-14 дней. К наиболее коротко-
живущим относятся регуляторные белки. Так,
циркулирующий в крови инсулин обновляется
наполовину всего за 5 мин. Это значит, что за
30 мин исчезает (и заменяется новыми) более
98% молекул этого гормона.
Указанные цифры отражают не полный
распад белковых молекул, а лишь начальный
этап этого процесса - протеолиз. В результате
у взрослого человека ежесуточно появляется
порядка 300 г эндогенных аминокислот. Вместе
с продуктами переваривания пищевых белков
(80-100 г в сутки) они составляют общий фонд
(пул) свободных аминокислот. Из него при-
мерно 300 г аминокислот подвергается реути-
лизации, т.е., вовлечению в биосинтез необхо-
димых белковых молекул. Остальная часть
расщепляется до конечных метаболитов, выво-
димых из организма (СОг, НгО и ряд азотсо-
держащих веществ). Эта часть составляет «без-
возвратные потери», подлежащие восполнению
за счет пищи. Они возникают потому, что ами-
нокислоты используются не только в белковом
синтезе, но и для создания иных веществ. Та-
ких как гем, пуриновые и пиримидиновые ос-
нования, ряд гормонов (адреналин, норадрена-
лин, тироксин), креатин, оксид азота, биоген-
ные амины и т.д. (см. главу 9). Кроме того,
распаду подлежит невостребованная (избыточ-
ная) часть аминокислот. Параметрами всех по-
терь определяется желательный состав и до-
пустимый минимум пищевых белков.
8.3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ФЕРМЕНТОВ ПРОТЕОЛИЗА
Поскольку протеолитические ферменты
осуществляют гидролиз пептидной связи, их
объединяют термином «пептидазы». К экзо-
пептидазам относят те, что отщепляют по од-
ной аминокислоте с N- или С-конца полипеп-
тидной цепи (соответственно аминопептидазы
и карбоксипептидазы). Гораздо избирательнее
разнообразные эндопептидазы, которые воз-
действуют на пептидные связи в глубине бел-
ковой молекулы. Протеолитические ферменты
такого рода обозначают обычно термином про-
теиназы или протеазы.
Первыми были изучены наиболее доступ-
ные объекты - ферменты пищеварительных
соков (пепсин, трипсин и другие). Складыва-
лось даже впечатление, что и внутриклеточные
протеиназы нужны лишь для деградации «по-
старевших» или чуждых белков. Только в по-
следние десятилетия выяснилось, что функ-
циональная роль протеолиза гораздо шире.
Описанная в разделе 2.6.2 постсинтетическая
доработка белков (процессинг) - далеко не
единичное тому свидетельство. Молекулярной
основой таких фундаментальных явлений, как
свертывание крови, защита от чрезмерного
тромбообразования. регуляция сосудистого
тонуса и т.д., тоже являются протеолитические
процессы (контролируемый протеолиз).
По строению каталитического центра про-
теиназы могут быть разделены на 4 главные
группы:
- сериновые протеиназы, которые, как и
многие эстеразы (см. рис. 4.7), осуществляют
катализ с участием классической тривды: се-
рин-гистидин-аспартат (или глутамат);
- тиоловые (цистеиновые) протеиназы,
вместо серина содержащие радикал цистеина,
функционирующий в паре с гистидином;
- аспартатные (карбоксильные) протеи-
назы, каталитический центр которых состоит
из двух радикалов аспарагиновой кислоты (с
молекулой воды между ними);
- металлопротеиназы, получившие свое
название благодаря зависимости каталитиче-
ской активности от наличия иона металла (ча-
ще всего Zn2+), связанного с двумя или более
имидазольными циклами радикалов гистидина.
Различия между перечисленными груп-
пами протеиназ сводятся преимущественно к
особенностям механизма каталитического акта
и, как следствие, их чувствительности к тем
или иным факторам среды. Так, аспартатные
протеиназы активны только в кислой среде;
тиоловые ферменты теряют активность в усло-
виях, переводящих HS-группы цистеина в ди-
ПРОТЕОЛИЗ
271
сульфидную форму -S-S-; металлопротеиназы,
напротив, угнетаются ингибиторами, цистеи-
новые радикалы которых блокируют атом Zn2+
каталитического центра.
В прикладном аспекте гораздо важнее
дифференцировать протеиназы по структуре
их адсорбционного центра, которая предопре-
деляет спектр субстратной специфичности. В
целом, она варьирует в очень широком диапа-
зоне, не позволяя, в сущности, выделить четко
очерченные группы ферментов. Однако для
понимания функциональной роли различных
протеиназ целесообразно обозначить крайние
варианты: малоспецифичные протеиназы и
протеиназы с высокой избирательностью к
субстратам. Типичными представителями пер-
вых являются пищеварительные ферменты.
Гидролизуя пептидные связи в разных местах
одной и той же полипептидной цепи, они в
совокупности с себе подобными приводят к
полному расщеплению белковой молекулы до
соответствующего набора аминокислот. Ин-
ными словами, они обеспечивают тотальный
протеолиз атакуемой молекулы. Напротив,
протеиназы с высокой субстратной специфич-
ностью зачастую обладают способностью рас-
познавать и расщеплять одну-единственную
связь, причем, в точно обусловленном месте
громадной молекулы белка (или небольшой
группы сходных белков). Такую высокую
степень избирательности обозначают терми-
ном ограниченный протеолиз. Как правило,
продукт такого «разборчивого» действия об-
ладает особой биологической активностью
(нередко таким качеством обладают оба про-
дукта).
8.4. ТОТАЛЬНЫЙ ПРОТЕОЛИЗ
Адсорбционный центр малоспецифичных
протеиназ устроен относительно просто. Обыч-
но он предъявляет определенные требования к
структуре лишь одной из двух аминокислот,
соединенных той пептидной связью, которую
способен гидролизовать данный фермент. Это
означает, что такая протеиназа в принципе го-
това расщеплять столько связей в одном поли-
пептиде, сколько в нем содержится остатков
«избранной» аминокислоты (или двух-трех
«избранниц», что бывает гораздо чаще).
8.4.1. ПЕРЕВАРИВАНИЕ ПИЩЕВЫХ БЕЛКОВ
Для усвоения организмом пищевых белков
необходимо полное расщепление их до моно-
меров, ибо только свободные аминокислоты
легко всасываются в кишечнике, а главное -
совершенно лишены антигенных свойств.
Начинается оно в желудке, где пищеваре-
ние протекает в сильно кислой среде. Ее созда-
ет соляная кислота, вырабатываемая обкладоч-
ными клетками желудочных желез (рис. 8-1).
Молекулы СО2, поступающие путем диффузии
из плазмы крови, подвергаются здесь гидрата-
ции до Н2СО3 (эту реакцию сильно ускоряет
карбоангидраза). В ходе диссоциации возник-
шей угольной кислоты появляются ионы Н и
НСОз, устремляющиеся затем, соответствен-
но, в полость желудка и в плазму крови. При
этом бикарбонат транспортируется по анион-
ным каналам в обмен на имеющиеся в плазме
ионы хлора, которые далее через хлоридные
каналы поступают из клетки в просвет желуд-
ка. Протоны отправляются туда же, но другим
путем: мембранная Н+/К+-АТФаза выкачивает
из клетки ионы Н+, обменивая их на ионы ка-
лия, которые затем вместе с упомянутым пото-
ком С1 вновь возвращаются в просвет желуд-
ка. В итоге концентрация протонов в желудоч-
ном соке возрастает на 6 порядков, обеспечи-
вая его подкисление до pH 1,0-2,0.
Защиту слизистой оболочки от воздейст-
вия соляной кислоты (и протеиназ) осуществ-
ляют муцины, выделяемые добавочными клет-
Рис. 8-1. Выработка соляной кислоты обкладочными
клетками желудочных желез: 1 - карбоангидраза;
2 - Н7К*-АТФаза; 3 - анионный канал;
4 - хлоридный канал.
272
Глава 8
ками эпителия желудка. Описание этих высо-
кополимерных гликопротеинов будет приведе-
но в разделе 12.2.1. Здесь же достаточно отме-
тить, что они образуют сильно гидратирован-
ную, вязкую слизь, которая устойчива к фер-
ментам и покрывает защитным слоем поверх-
ность не только пищеварительного тракта, но и
дыхательных и мочеполовых путей.
Протеолитический компонент желудочно-
го сока вырабатывают главные клетки желез,
секретирующие его в виде пепсиногена. Это
небольшой одноцепочечный белок, в составе
которого активный центр карбоксильной про-
теиназы (асп.. .асп) вполне сформирован, но
прикрыт N-концевым фрагментом длиной бо-
лее 40 АО, содержащим почти все катионные
группы молекулы. Воздействие кислой среды
(pH ниже 5) стимулирует конформационную
перестройку, позволяющую разблокировать ак-
тивный центр настолько, что он оказывается в
состоянии отщеплять от собственной молеку-
лы весь «мешающий» N-концевой фрагмент.
Иными словами, реализуется внутримолеку-
лярный процесс аутокатализа (самоактива-
ции) протеиназы. Первые же появившиеся та-
ким способом молекулы готового пепсина ка-
тализируют превращение новых порций пеп-
синогена в активную форму.
В период вскармливания материнским мо-
локом в желудочном соке малышей выявляется
еще одна протеиназа — химозин (реннин). По
строению близкая пепсину, она удаляет корот-
кий гликопептид у одной из цепей главного
белка молока - казеиногена. С участием ионов
Са2+ измененный белок переходит в нераство-
римую форму и осаждается в виде хлопьев
(створаживание молока). Тем самым замедля-
ется прохождение жидкой пищи по желудочно-
кишечному тракту и обеспечивается более пол-
ное ее переваривание.
Соляная кислота желудочного сока не
только стимулирует активацию пепсиногена,
но и обеспечивает оптимальные для действия
пепсина значения pH (1,5-2,5). Вызывая дена-
турацию натнвных белков пищи, не подвергну-
той тепловой обработке, она помогает и их пе-
ревариванию (ибо денатурация облегчает дос-
туп ферментов к пептидным связям в глубине
белковой молекулы). Кроме того, сильно кис-
лая среда оказывает бактерицидное действие:
хотя мы принимаем далеко не стерильную пи-
щу, в содержимом двенадцатиперстной кишки
микрофлоры обычно не обнаруживается. На-
конец, соляная кислота играет важную роль в
регулировании поступления пищевой массы из
объемного желудка в довольно узкий просвет
кишки. Кислое содержимое желудка, попадая в
двенадцатиперстную кишку, вызывает рефлек-
торное закрытие привратника, и следующая
порция может поступить только после нейтра-
лизации предыдущей компонентами панкреа-
тического сока и желчи.
Биохимические методы оценки функцио-
нального состояния желудка сводятся в основ-
ном к анализу кислотности желудочного сока
(в том числе и потому, что в ответ на пищевые
стимулы секреция ферментов происходит все-
гда в большом избытке). Титрованием желу-
дочного сока, извлеченного с помощью зонда,
у мужчин натощак выявляется не более 10 мМ
свободной НС1, у женщин - менее 6 мМ (ба-
зальная свободная кислотность). После стиму-
ляции введением пентагастрина или гистамина
концентрация свободной соляной кислоты в
желудочном соке в норме резко возрастает, но
не превышает 45 мМ у мужчин и 35 мМ -
у женщин. Общая же кислотность стимулиро-
ванного сока (включающая еще и соляную ки-
слоту, связанную катионными группами бел-
ков, а также органические кислоты, соли фос-
фата и т.п.) обычно не выходит за пределы
40-60 мэкв/л.
В соответствии с субстратной специфично-
стью пепсина (см. ниже), желудочное перевари-
вание приводит не к полному распаду белковых
молекул, а лишь к фрагментации на более или
менее крупные обломки. В дальнейшем их рас-
щеплении ведущую роль играют панкреатиче-
ские ферменты: сериновые протеиназы трипсин,
химотрипсин, эластаза и Zn -содержащие кар-
боксипептидазы. Вырабатываемые поджелу-
дочной железой в виде зимогенов, они перехо-
дят в активную форму только в просвете двена-
дцатиперстной кишки. Инициирует активацию
энтерокиназа - крупный (300 кДа) гетероди-
мерный гликопротеин, своим трансмембранным
доменом фиксированный на энтероцитах. Ак-
тивный центр этой протеиназы серинового типа
обращен в просвет кишки и осуществляет уда-
ление короткого пептида с N-конца трипсиноге-
ПРОТЕОЛИЗ
273
на. Этим актом открывается возможность кон-
формационной перестройки, ведущей к форми-
рованию трехмерной структуры активного цен-
тра трипсина.
Энтерокиназа нечувствительна к панкреа-
тическому ингибитору трипсина. Этот не-
большой белок (~ 6 кДа) вырабатывается желе-
зой в качестве меры защиты на случай ано-
мальной активации трипсиногена по пути его в
просвет кишечника.
Будучи активирован энтерокиназой, трип-
син, в свою очередь, становится активатором
всех панкреатических проферментов. В том
числе и новых порций трипсиногена, посту-
пающих с соком поджелудочной железы. Их он
преобразует в трипсин так же, как и энтероки-
наза, - путем отщепления N-концевого пепти-
да. Аналогичным образом трипсин обеспечива-
ет активацию проэластазы (удаляя короткий
пептид) и прокарбоксипептидазы (у которой
отщепляемый N-конец составляет почти чет-
верть молекулы зимогена). Иначе происходит
трансформация химотрипсиногена. Серией
протеолитических атак его молекула (—250 АО)
почти без потерь расчленяется на 3 фрагмента,
удерживаемых вместе дисульфидными связя-
ми. Протеиназной активностью обладает не
только этот конечный продукт (наиболее ста-
бильный), но и все промежуточные, возникаю-
щие с первого же воздействия трипсина. Есть,
однако, и такой вариант профермента (химо-
трипсиноген С), для которого переход в актив-
ную форму требует гидролиза трипсином толь-
ко одной связи (-арг-вал-), приводящего к уда-
лению N-концевого экранирующего пептида
длиной 13 АО.
Как уже отмечалось в разделе 4.5.2, трип-
син гидролизует только те пептидные связи,
которые образованы группой -СООН лизина
или аргинина. Химотрипсин, в отличие от это-
го, избирателен к связям с участием карбо-
ксильной группы аминокислот, обладающих
крупным гидрофобным радикалом (см. рис.
4-8), а химотрипсин С «добавляет» к числу та-
ких предпочтений еще и метионин н даже глу-
тамин и аспарагин. Пепсин же расщепляет те
связи, в которых распознаваемая им аминокис-
лота участвует своей аминогруппой. Иначе го-
воря, он ориентируется на радикал, обозначен-
ный как R' на рис. 4-8. И в качестве обладателя
приемлемого радикала предпочитает лейцин,
фенилаланин или тирозин. Хотя фактически
его субстратная специфичность гораздо шире.
В частности, неожиданным выглядит, что он
атакует и связи, образованные группой -СООН
глутамата или глутамина.
Наконец, эластаза. Несмотря на структур-
ную близость трипсину и химотрипсину, она
единственная способна расшеплять главные
белки соединительной ткани - эластин и кол-
лаген. Это обусловлено небольшими особенно-
стями строения адсорбционного центра, благо-
даря которым доступ к каталитическому участ-
ку эластазы получают только аминокислоты с
минимальными размерами радикала - глицин,
аланин, серин. Ими особенно богаты белки
межклеточного вещества. Но и многие другие
белки содержат «малые» аминокислоты, а по-
тому тоже гидролизуются панкреатической
эластазой.
Таким образом, по своей субстратной спе-
цифичности пищеварительные эндопротеиназы
не столько дублируют, сколько дополняют друг
друга. Действуя на белковую молекулу в любой
очередности, они в конечном счете гидролизуют
ее до набора некрупных пептидов. Ступенчатое
их укорочение осуществляют затем экзопепти-
дазы.
Панкреатические экзопептидазы представ-
лены карбокснпептидазой В, удаляющей с
С-конца лизин или аргинин, и карбоксипепти-
дазой А, эффективной в отношении незаря-
женных аминокислот (своеобразная аналогия
паре трипсин - химотрипсин!). Сходным обра-
зом, но с N-конца действуют и аминопептида-
зы кишечного сока, обычно тоже содержащие
атом цинка (как и карбоксипептидазы). Одни
из них довольно избирательны, другие могут
отщеплять почти любую аминокислоту. Завер-
шают тотальный протеолиз в просвете кишки
три- и дипептидазы с различной субстратной
специфичностью.
Всасывание аминокислот в кишечнике
обеспечивается несколькими системами актив-
ного транспорта (включая Ыа+-зависимый сим-
порт). Они специализированы на переносе либо
аминокислот с катионным радикалом (или обя-
зательно анионным), либо обладающих незаря-
женным радикалом (в зависимости от его раз-
меров, а иногда и других особенностей). Час-
274
Глава 8
тично всасываемые аминокислоты поступают в
лимфу, а остальные - в кровь, с током которой
доставляются прежде всего в печень. Неболь-
шая часть продуктов протеолиза может прони-
кать в энтероциты в виде дипептидов и неболь-
ших олигопептидов, которые гидролизуются
внутриклеточными экзопептидазами различной
избирательности.
8.4.2. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ТОТАЛЬНЫЙ
ПРОТЕОЛИЗ
Расщеплению в клетках подлежат, прежде
всего, чужеродные белки, поглощенные путем
эндоцитоза. Процессы их деградации сосредо-
точены в лизосомах, среди эндопептидаз кото-
рых доминируют тиоловые ферменты (катепси-
ны В, L, Н и другие), а также аспартатная про-
теиназа катепсин D. Все они проявляют актив-
ность только в кислой среде (pH 4,5-6,0), а в
обычных условиях пребывают в «покоящемся»
состоянии (в виде проферментов, активация ко-
торых требует удаления экранирующего пепти-
да, обычно довольно протяженного). Каждая из
лизосомальных протеиназ обладает достаточно
широкой избирательностью к гидролизуемым
связям, а в совокупности они обеспечивают де-
градацию практически любого белка до набора
относительно коротких пептидов. Их дальней-
ший гидролиз до аминокислот завершают раз-
нообразные олигопептидазы, экзопептидазы и
дипептидазы, в большинстве своем локализо-
ванные в цитоплазме.
Вне лизосом деградацию белков осущест-
вляют особые мультикаталитические образова-
ния цитозоля - протеасомы (открытые в конце
XX века). Реализуемый ими протеолиз отлича-
ется от лизосомального высокой селективно-
стью. Она проявляется в том, что из всего оби-
лия внутриклеточных белков для деградации
отбираются только дефектные или поврежден-
ные молекулы. Однако этой деструктивной
функцией роль протеасом не исчерпывается.
Совершенно уникальна их способность изби-
рательно разрушать те белки, функциональный
эффект которых зависит только от их наличия
(или концентрации). Иными словами, такие
белкн должны быстро разрушаться вскоре по-
сле синтеза. Поэтому они именуются коротко-
живущими: их период полусуществования
(Тод) не превышает нескольких минут (к числу
таких белков относятся, например, регуляторы
транскрипции генов). Осуществляя распозна-
вание и деградацию таких белков, протеасомы
выполняют тем самым еще более весомую из
своих функций — регуляторную.
Протеолитический аспект обеих этих
функций однотипен. Его реализует эндопепти-
дазный комплекс, обозначаемый как протеасома
20S (по константе седиментации, которая соот-
ветствует молекулярной массе 700 кДа). А вот
распознавание белков, подлежащих деградации,
производят специальные регуляторные ком-
плексы. ассоциированные с протеасомой 20S и
именуемые активаторами протеасомы, меха-
низм распознавания у них различен, в зависимо-
сти от того, какую функцию протеасом он обес-
печивает-деструктивную или регуляторную.
Протеасома 20S состоит из 28 субъединиц
и похожа на цилиндр, образованный четырьмя
кольцами, положенными друг на друга. Каждое
- это укладка из 7 а-субъединиц (оба внешних
кольца) или из 7 р-субъединиц (срединные коль-
ца). На внутренней стороне каждого срединного
кольца создаются 3 активных центра, содержа-
щих по N-концевому треонину из состава
Р-субъединиц. Специфика центров различна:
каждый гидролизует только те связи, в которых
участвуют либо аминокислота с гидрофобным
радикалом, либо аргинин или лизин, либо, на-
конец, аспартат или глутамат. В отличие от
ферментов пищеварения, разлагающих белок на
все более мелкие фрагменты, протеасомы 20S
поочередно отщепляют от него пептиды длиной
от 3 до 22 АО (данные получены in vitro).
Регуляторные комплексы содержат около
20 субъединиц, т.е., тоже имеют довольно
крупные размеры (часто их называют регуля-
торными частицами). По одной такой частице
примыкает к торцам цилиндра, образуемого
протеасомой 20S. Они осуществляет контроль
за входом в «протеолитическую полость» этого
цилиндра. Пока неясно, есть ли какой-либо
общий механизм отбора поврежденных или
мутантных молекул белка. Легче было выявить
способ распознавания белков, подлежащих бы-
строму обновлению. Как оказалось, длитель-
ность существования белка в значительной сте-
пени запрограммирована строением его N-koh-
цевой аминокислоты. У стабильных молекул
ПРОТЕОЛИЗ
275
(Тол более 20 час) она представлена метиони-
ном, глицином, аланином, пролином или неко-
торыми другими. Для короткоживущих белков
(период полусуществования от 2 до 30 мин)
типичной N-концевой аминокислотой является
аргинин, лизин, гистидин, изолейцин, лейцин,
триптофан, фенилаланин или тирозин.
Распознав подлежащий деградации белок,
регуляторная частица обозначает его особым
«ярлыком». Им служит небольшой (76 АО) бе-
лок убиквитин, присоединяемый своим С-кон-
цевым глицином к е-аминогруппе одного из ос-
татков лизина в белке-мишени. Создает эту изо-
пептидную связь серия АТФ-зависимых субъ-
единиц регуляторного комплекса. Начинается
процесс с активации концевой карбоксильной
группы убиквитина путем переноса на нее ос-
татка АМФ с молекулы АТФ (реакция подобна
образованию аминоациладенилата, см. рис.
2-21,1). И только после этого убиквитинильный
компонент может быть передан на упомянутую
Е-аминогруппу белка-мишени. Таким образом,
модификация белка, отобранного для деграда-
ции в протеасоме, происходит за счет энергии
расщепления АТФ до АМФ и ФФ. Прикреплен-
ный при этом «ярлык» не только служит «про-
пуском» в полость протеасомы 20S, но и спо-
собствует развертыванию белковой глобулы,
что облегчает протеолитическую атаку на ее
внутренние пептидные связи.
Вполне обычным является формирование
более крупных «ярлыков». Особая группа уби-
квитин-протеин-лигаз способна аналогичным
образом (т.е., с затратой АТФ) присоединять
свободный убиквитин (его С-концевым глици-
ном) к лизину-48 в молекуле убиквитина, уже
фиксированного на белке. Повторение таких
актов приводит к формированию полиубикви-
тинильной цепи на молекуле белка-мишени,
который подвергается затем быстрой деграда-
ции. Следует отметить, что сами молекулы
убиквитина разрушению в протеасомах не под-
вергаются: они отщепляются специальной тио-
ловой протеиназой регуляторного комплекса,
гидролизующей изопептидную связь, и оста-
ются пригодными для реутилизации.
Таким образом, главной особенностью про-
теолитических реакций в протеасомах является
их энергозависимость. Расходы АТФ являются,
по существу, своеобразной платой за возмож-
ность прицельного отбора либо строго опреде-
ленных из множества молекул конкретного бел-
ка, либо только белков, синтезируемых для крат-
косрочной работы каждой их молекулы. Так
обеспечиваются и контроль качества белков, и
поддержание требуемого уровня их в клетке.
8.4.3. МЕХАНИЗМЫ ЗАЩИТЫ ОТ ИЗБЫТОЧНОГО
ПРОТЕОЛИЗА
Протеолитические ферменты потенциаль-
но опасны тем, что способны разрушать самые
разнообразные белки собственных клеток и
межклеточных пространств. Для предупрежде-
ния безудержного протеолиза существуют спе-
циальные механизмы контроля. Они разнооб-
разны и нацелены на ограничение ферментатив-
ной активности протеиназ. Известны разные
способы защиты от чрезмерного протеолиза.
Защита путем пространственного от-
граничения протеиназ. Наиболее очевидным
примером являются лизосомы, мембрана кото-
рых не позволяет содержащимся в них протео-
литическим ферментам воздействовать на белки
цитозоля. В протеасомах роль такого препятст-
вия выполняют регуляторные комплексы, про-
пускающие к каталитическим центрам лишь
строго определенные белковые молекулы.
Синтез протеиназ в виде неактивных
предшественников. Этот способ сдерживания
протеолитического потенциала ферментов обес-
печивает безопасную транспортировку их к
месту назначения (например, синтезируемые в
виде зимогенов протеиназы поджелудочной же-
лезы не вызывают повреждений этого органа,
становясь активными только после поступления
в полость кишки). А для протеиназ плазмы кро-
ви циркуляция их в форме проферментов позво-
ляет поддерживать постоянную готовность к
быстрому активированию, приводящему к
«включению» соответствующей функции (на-
пример, функции свертывания крови).
Защита белка от протеолитической ата-
ки. Наиболее распространенным способом, по-
зволяющим защитить белковую молекулу от
возможного воздействия протеиназ, является ее
гликозилирование. Олиго- и полисахаридные
цепи, присоединяемые к белку в ходе постсин-
тетической модификации, затрудняют доступ
протеолитических ферментов к его пептидным
276
Глава 8
связям. Недаром почти все белки плазмы крови
являются гликопротеинами (едва ли не единст-
венное исключение составляют альбумины).
Внеклеточный домен рецепторных белков то-
же, как правило, несет на себе олигосахарид-
ные цепочки. Участвуя в распознавании лиган-
да, они, кроме того, еще и защищают рецептор
от разрушения внеклеточными протеиназами.
Защита эндогенными ингибиторами про-
теиназ. В последние десятилетия выявлены
белки, способные подавлять действие протео-
литических ферментов в организме. Их назвали
эндогенными ингибиторами протеиназ (менее
удачное обозначение - антипротеиназы). Осо-
бенно много таких защитников вне клеток, -
прежде всего, в крови. Каждый из них может
блокировать разные протеиназы, но, как пра-
вило, в рамках лишь одной из 4 главных групп
этих ферментов. Поэтому различают эндоген-
ные ингибиторы сериновых, тиоловых, аспар-
татных протеиназ и металлопротеиназ. Для
плазмы крови типичны ингибиторы сериновых
протеиназ (серпины), на долю которых прихо-
дится ~ 2% от общего содержания белков в ней.
Примерно 70% их совокупного антипротеолити-
ческого потенциала принадлежит щ-антитрип-
сину (оц-АТ), который наибольшее предпочте-
ние отдает эластазе (из-за чего предлагалось на-
зывать его антиэластазой или d]-протеиназным
ингибитором; изначальное обозначение, тем не
менее, устояло). К числу других относятся ан-
титромбин III и а.2-антиплазмин, играющие
важную роль в регуляции свертывания крови и
фибринолиза. Угнетающий эффект серпинов
обусловлен их свойствами «плохого субстрата»:
протеиназа успешно расщепляет подходящую
пептидную связь в таком ингибиторе, но не мо-
жет освободиться от ацильного продукта реак-
ции, который остается ковалентно фиксирован-
ным на активном центре и блокирует его.
Отдельного описания заслуживает еще
один ингибитор - а2-макроглобулин (а2-МГ)-
Этот гетеротетрамерный гликопротеин плазмы
(® 700 кДа) способен инактивировать очень
многие протеиназы, причем, всех 4 групп. Та-
кая всеядность обеспечивается строением осо-
бой зоны (39 АО), которую назвали «прима-
ночной» из-за наличия в ней набора пептидных
связей, отвечающего «вкусам» самых разных
эндопептидаз. Расщепление любой из них вле-
чет за собой конформационную перестройку
этого ингибитора, благодаря которой атакую-
щая протеиназа «проваливается» в особую ни-
шу («ловушку») на поверхности а2-МГ. В ней
фермент фиксируется еще и ковалентно, ибо
поблизости есть так называемая тиол-эфирная
петля. Она представляет собой последователь-
ность ...-цис-гли-глу-глн-..., в которой за счет
радикалов цистеина и глутамина возникла тио-
эфирная связь —S-C(O)-. Эта «напряженная»
связь очень нестабильна, а потому легко гид-
ролизуется. Но чаще она расщепляется с осво-
бождением группы -SH и вовлечением карбо-
нильной группы в более устойчивое соедине-
ние с гидроксильной или аминогруппой како-
го-либо вещества. Протеиназа, захваченная аг-
макроглобул ином, обычно и оказывается таким
веществом. Каталитический центр фермента
остается при этом свободным, но способен
гидролизовать лишь небольшие пептиды, т.к.
крупным белковым молекулам доступ к нему
затруднен краями «ловушки».
Попадание протеиназы в «ловушку» вызы-
вает дальнейшие конформационные подвижки в
молекуле а2-МГ. В результате открывается за-
маскированный ранее участок, способный взаи-
модействовать со специфическим рецептором
на поверхности макрофагов и некоторых других
клеток. В итоге весь комплекс ингибитора с
протеиназой поглощается клеткой, где и под-
вергается тотальному протеолизу до аминокис-
лот. Следовательно, а2-МГ является не просто
универсальным ингибитором протеолитических
ферментов, но уникален еще и тем, что выпол-
няет роль своеобразного «чистильщика» крови
от всяких протеиназ, - как собственного орга-
низма, так и попавших извне. На интенсивность
этой функции указывает кратковременность его
существования: То,5 составляет от 3 до 7 мин.
Таким образом, в целом механизмы защи-
ты надежно контролируют деградацию белков.
При этом лимитируют они не только работу
малоспецифичных ферментов, но и процессы
ограниченного протеолиза, реализуемые про-
теиназами высокой избирательности.
8.5. ОГРАНИЧЕННЫЙ ПРОТЕОЛИЗ
Высокоспецифичные протеиназы характе-
ризуются усложненным строением адсорбци-
ПРОТЕОЛИЗ
277
онного центра. Как правило, он ориентирован
на особенности строения не одной, а обеих
аминокислот, образующих ту пептидную связь,
которую готов расщеплять данный фермент.
Более того, обычно предъявляются четкие тре-
бования к структуре еще и других аминокис-
лот. более или менее удаленных от атакуемой
связи, а также к пространственному взаиморас-
положению всех этих «опознавательных ори-
ентиров». В итоге из десятков или сотен пеп-
тидных связей в молекуле белка-мишени про-
теиназа распознает только одну и именно ее
подвергает гидролизу. Отсюда ясно, что в ходе
ограниченного протеолиза белковая молекула
субстрата расщепляется на два строго опреде-
ленных фрагмента.
Предельным примером высокой субстрат-
ной избирательности может служить одна из
протеиназ плазмы крови - фактор D системы
комплемента. Он способен расщеплять лишь
единственный из белков плазмы - фактор В
той же системы (см. раздел 8.6.3), причем,
только в одном, строго определенном месте (по
связи й/?ггз4 - ЛШ235).
Как правило, реакция ограниченного про-
теолиза зрелого (функционирующего) белка
является лишь первым шагом на пути, завер-
шающемся тотальным протеолизом. Иногда за
первой следует вторая, а то и третья реакция
такого рода, но рано или поздно это ведет к
появлению продуктов, быстро гидролизуемых
до соответствующего набора аминокислот.
Из сказанного ясно, что один и тот же ис-
ходный белок может быть мншенью для раз-
ных протеиназ высокой специфичности. И то-
гда встает вопрос об очередности их действия.
Для внутриклеточных процессов она в значи-
тельной степени предопределена пространст-
венной упорядоченностью этих ферментов.
Многие из них фиксированы в определенных
местах мембраны ЭР и аппарата Гольджи.
Синтезируемый в рибосомах белок своей
N-концевой частью попадает прежде всего в
просвет ЭР. Обычно именно здесь происходит
отщепление сигнального пептида (см. раздел
2.6.2). По мере продвижения по каналам ЭР
белок достигает той зоны, где есть фермент,
очень избирательно отщепляющей пропептид-
ный фрагмент молекулы. Этот простейший
пример дает представление о том, каким обра-
зом для каждого конкретного белка обеспечи-
вается нужная последовательность реакций
ограниченного протеолиза внутри клетки.
Совсем иное дело внеклеточные протеи-
назы. Для них нереальны и пространственное
разграничение между собой, и изоляция от
субстратов. Весь набор протеиназ, например,
плазмы крови (а их — не один десяток) равно-
мерно распределен в жидкости и перемешан с
остальными плазменными белками, т.е., со
своими потенциальными субстратами. В такой
ситуации упорядоченность реакций протеолиза
регламентирована двумя «правилами». Первое:
в плазму протеиназы поступают (и циркулиру-
ют в ней) только в форме зимогенов (исключе-
ние составляет упомянутый фактор D, концен-
трация которого, впрочем, предельно низка).
Второе «правило»: после активации очеред-
ность действия протеиназ предопределена
только их высокой субстратной специфично-
стью (именно она исключает возможность хао-
тичной работы этих ферментов). Отсюда следу-
ет, что плазма крови находится в постоянной
готовности осуществить тот или иной протео-
литический процесс. Однако запускается этот
процесс лишь под воздействием определенного
стимула, способного перевести соответствую-
щий зимоген в активную форму, которая и ста-
нет выполнять свое функциональное предназна-
чение, выборочно гидролизуя соответствующий
субстрат. Естественно, такая активация должна
находиться под жестким контролем, чтобы не
допустить случайного (несанкционированного)
эффекта либо его чрезмерности.
8.6. СИСТЕМЫ КАСКАДНОГО ПРОТЕОЛИЗА
Для почти каждой протеиназы плазмы суб-
стратом является предшественник другой
протеиназы. Ограниченный протеолиз перево-
дит его в активную форму, которая, в свою
очередь, активирует следующий зимоген, по-
сле чего наступает активация очередного про-
фермента. При этом каждая протеиназа, став
активной, из множества окружающих зимоге-
нов (и других белков) выбирает свою «жертву»
только в соответствии с собственной субстрат-
ной специфичностью. Возникающую череду
реакций ограниченного протеолиза называют
протеолитическим каскадом. Он непохож на
278
Глава 8
обычные метаболические цепи, в которых се-
рия реакций постепенно преобразует некое
исходное вещество в итоговый продукт(ы).
Уникальная особенность каскадного протеоли-
за в том, что лишь на завершающей его стадии
возникает такая протеиназа, которая превраща-
ет неферментный белок в продукт, реализую-
щий главное функциональное предназначение
всего каскада. Например, превращает фибри-
ноген в нерастворимый фибрин (система свер-
тывания крови). Или же нарабатывает актив-
ный плазмин, осуществляющий растворение
кровяного сгустка (система фибринолиза). Ли-
бо обеспечивает разрушение чужеродных кле-
ток (система комплемента). Хорошо изучена и
протеолитическая система регуляции сосуди-
стого тонуса посредством вазоактивных пепти-
дов (ангиотензина II и брадикинина).
Уже один перечень протеолитических кас-
кадных систем показывает, сколь кардинально
изменились представления полувековой давно-
сти, когда роль протеолиза сводили лишь к пе-
ревариванию пищевых белков и разрушению
«постаревших» белков собственного тела либо
проникших в него чужеродных молекул. Дос-
тижения последнего времени показали, что по
своему предназначению протеиназы выходят
далеко за эти рамки, участвуя в реализации
жизненно важных защитных и регуляторных
функций.
8.6.1. СИСТЕМА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
(ГЕМОКОАГУЛЯЦИИ)
Изучение механизмов гемокоагуляции на-
чалось на рубеже XIX - XX вв. Постепенно ста-
новилось очевидным, что в нем участвуют раз-
ные компоненты крови, о строении которых
приходилось только догадываться. Поэтому
сложилась традиция обозначать их термином
«фактор (свертывания)» с добавлением римской
цифры (или фамилии пациента, исследование
крови которого позволило заподозрить сущест-
вование фактора, неизвестного ранее). По этой
же традиции активную форму каждого фактора
указывают добавлением буквы «а» к соответст-
вующей римской цифре. Лишь за последние
десятилетия удалось установить, что все проте-
олитические компоненты каскада гемокоагуля-
ции являются протеиназами серинового типа,
которые поступают в плазму крови в виде про-
ферментов.
Обычно это некрупные белки (50-100 кДа),
относящиеся к числу гликопротеинов и обла-
дающие множеством S-S-мостиков (внутри-, а
в ряде случаев - и межцепочечных). В составе
факторов VII, IX, X и II есть радикалы у-карб-
оксиглутаминовой кислоты (Gia), формула ко-
торой представлена на рис. 2-28. Две карбок-
сильные группы при у-углеродном атоме тако-
го радикала легко связывают ион Са2+, оставляя
ему возможность взаимодействовать еще и с
другими лигандами. От 10 до 20 Gla-радика-
лов, располагаясь попарно или через одну-две
других аминокислоты, образуют особый уча-
сток (Gla-домен), придавая ему высокое срод-
ство к Са2+. Это имеет решающее значение для
функционирования витамин К-зависимых бел-
ков. Так их называют потому, что Gia возника-
ет в ходе постсинтетической модификации
белка (см. раздел 2.6.3) путем выборочного
карбоксилирования радикалов глутаминовой
кислоты, которое требует участия витамина К
(в качестве кофермента).
Как уже отмечалось, заключительной фазой
свертывания крови является превращение рас-
творимого фибриногена (фактор I) в нераство-
римый фибрин. Так возникает кровяной сгусток
(тромб), который предназначен для остановки
кровотечения из поврежденного сосуда. Выпа-
дающие нити фибрина захватывают в свою сеть
эритроциты (как и другие клетки), чем и объяс-
няется цвет сгустка («красный» тромб).
Фибриноген - довольно крупный белок
(почти 400 кДа). Он синтезируется в печени и
направляется в плазму крови, где его содержа-
ние составляет 1,5-3,6 г/л (4-10 мкМ). Построен
фибриноген из субъединиц трех типов. Самая
крупная (сс-цепь) насчитывает почти 850 АО,
две другие (0- и у-цепи) примерно вдвое коро-
че. Скрученные вместе и соединенные S-S-moc-
тиками, они образуют тример в форме стержня.
Один из его торцов представлен глобулярным
объединением С-концевых участков всех трех
цепей, а другой - взаимодействует со своим
аналогом в соседней молекуле. При этом, как
показывает схема на рис. 8-2, две стержневид-
ных молекулы, стыкуясь своими аминоконце-
выми фрагментами, образуют центральный
«узел». Выступающий из него N-конец а- или
ПРОТЕОЛИЗ
279
Рис. 8-2. Схема формирования «мягкого» тромба.
0-цепи именуют фибринопептидом А (16 АО)
или, соответственно, фибринопептидом В
(14 АО). Их способен отщеплять протеолити-
ческий фермент тромбин (фактор 11а), кото-
рый гидролизует единственную связь в каждой
из а- и 0- цепей, тем самым преобразуя
фибриноген в фибрин-мономер.
Удаление фибринопептидов раскрывает в
молекуле центры полимеризации, вследствие
чего центральный «узел» получает возмож-
ность нековалентного связывания с С-концевы-
ми глобулами соседних молекул фибрин-мо-
номера (см. рис. 8-2). Спонтанная агрегация
множества мономеров конец-в-конец и бок-в-
бок ведет к образованию фибриллярной струк-
туры растворимого фибрин-полимера. Он-то и
составляет сетевидную основу «мягкого» тром-
ба. Превращение его в плотный сгусток проис-
ходит путем формирования нерастворимого
фибрин-полимера, которое обеспечивается по-
явлением ковалентных связей между у- и а-
цепями соседних молекул фибрнн-мономера.
Эти межмолекулярные перемычки создает
трансглутаминаза - тиоловый фермент, кото-
рый в присутствии Са катализирует образо-
вание изопептидной связи за счет радикала
глутамина одной цепи и лизильного фрагмента
другой (рис. 8-3).
О=С о С=О
\ // ......... /
НС-(СНД-С •+ Л|-(СНг)4-СН -у
HN\ MV-'H NH NH3
: I П :
о=с о с=о
\ II /
► НС-(СН2)2-С-N-(СН2)4 -СН
HN / Н NH
Рис. 8-3. Трансглутаминазная реакция между радикалами глутамина (I) и лизина (II) соседних молекул фибрина
с образованием изопептидной связи (указана стрелкой).
280
Глава 8
Через довольно продолжительное время
(30-60 мин) наступает ретракция (сжатие)
плотного тромба. Ее производят сократитель-
ные белки тромбоцитарного происхождения
(актин и миозин). В результате ретракции кро-
вяной сгусток вчетверо уменьшается в объеме,
выдавливая из себя сыворотку. Этот эффект
необходим для преодоления полной закупорки
сосуда и возобновления кровотока.
Тромбин, вызывающий образование фиб-
рина, является, в свою очередь, последней про-
теиназой в каскаде свертывания крови. Приня-
то различать два способа активации его пред-
шественника - протромбина (фактор II). Один
из них обозначают обычно как внутренний
путь гемокоагуляции, т.к. для его реализации
достаточно участия белков самой плазмы. Дру-
гой требует вовлечения еще и тех компонентов,
которые поступают из поврежденных клеток
крови и сосудистой стенки; отсюда и его на-
звание - внешний путь гемокоагуляции. Они
различаются только начальными ступеньками
активационного каскада и совершенно одина-
ковы на заключительных стадиях. Поэтому це-
лесообразно рассмотреть сначала весь внут-
ренний путь, а затем - специфику внешнего.
Внутренний путь гемокоагуляции
осуществляется пятью протеиназами, циркули-
рующими в плазме в форме неактивных пред-
шественников. Краткое описание их структур-
ных особенностей приведено в табл. 8-1. В ней
же указан субстрат каждой протеиназы и обо-
значена гидролизуемая ею связь (связи). Из этих
данных следует, что факторы свертывания дей-
ствуют именно в той очередности, в какой онн
перечислены в таблице. Иными словами, суб-
стратная избирательность каждого фактора од-
нозначно «выстраивает» их в определенную по-
следовательность, формируя тем самым каскад
реакций протеолиза, как он показан на рис. 8-4.
В любом протеолитическом каскаде кри-
тичным моментом является активация началь-
ного звена. По смыслу, она не может быть
ферментативной (иначе другая протеиназа ста-
ла бы начальным звеном). Значит, природой
запрограммировано, что запуск каскадного
протеолиза должен осуществляться посредст-
вом нековалентной (конформационной) пере-
стройки начального профермента, призванной
способствовать экспонированию «замаскиро-
ванного» в нем активного центра.
Для внутреннего пути свертывания крови
начальным зимогеном является фактор XII
(фактор Хагемана). Конформационные сдвиги
он претерпевает уже при простом контакте кро-
ви (плазмы) с чуждым ей материалом, поверх-
ность которого обладает анионными свойствами
(стекло, древесина, кожа и т.п.). Этого доста-
точно, чтобы сам профермент в какой-то степе-
ни стал проявлять ферментативную активность.
В частности, расщеплять в других молекулах
того же фактора наиболее «ранимую» связь
tzpa372-e6w373 (нумерация здесь и далее приводит-
ся по первичному продукту трансляции). Тем
самым фактор XII ковалентно преобразуется в
активную форму (ХПа), в составе которой рас-
члененные фрагменты остаются связанными
между собой дисульфидной связью. Именно так
инициация внутреннего пути гемокоатуляции
отражена в схеме на рис. 8-4.
пептид (35 АО)
пептид (52 АО)
пептиды (155 и 129 АО)
(протромбин) (тромбин)'''''^-
Фибриноген Фибрин-
(фактор I) мономер
XIII
пептид (37 АО)
ХШа
Фибрин-полимер —Фибрин-полимер
(растворимый) (нерастворимый)
Рис. 8-4. Внутренний путь системы свертывания крови (схема).
ПРОТЕОЛИЗ
281
Таблица 8-1
Протеиназы системы свертывания крови (внутренний путь)
(число АО и их номера даны по первичному продукту трансляции)
Названия Функциональная роль
Фактор XII (Хагемана) При контвкте крови с анионной поверхностью (стекло, кожа, ввта и т.п.) фактор XII (615 АО) претерпевает конформационные изменения, которые могут облегчаться обра- зованием комплексов с другими белками плазмы - высокомолекулярным кининогеном (ВМК) и прокаппикреином (проКК). Эти нековалентные сдвиги «приоткрывают» активный центр фактора XII настолько, что он может не только катализировать активацию других молекул этого фактора, но и расщеплять связь аргзэо-илезм в молекуле проКК, разделяя ее на два S-S-связанных отрезка. Один из них сохраняет контакт с ВМК, а в другом ока- зывается деблокированным активный центр калликреина (КК). Он ускоряет спонтанный переход фактора XII в активную форму (ХНа), реализуя ферментативный гидролиз его (по араз72-валз7з) на две S-S-соединенных части, в одной из которых раскрывается протеи- назный центр. Фактор ХНа тоже расщепляет аргзгг-валзгз в факторе XII, активируя новые порции своего профермента.
Фактор XI Г омодимер. В каждом из мономеров (625 АО) фактор ХНа гидролизует единственную связь (аргзят-илеззз)- Этого достаточно для перехода фактора XI в активную форму Xia. Масса молекулы остается при этом прежней, т.к. сохраняются S-S-мостики, соединяющие каждую легкую цепь (несущую активный центр) с тяжелой (способной к ассоциации с ВМК).
Фактор IX (Кристмаса) Гликофосфосульфо протеин (461 АО), имеющий зону изобилия радикалов Gia. Фактор Х1а гидролизует в нем связи apaisi-anaw и арггге-еалгг? с вычленением «активационного пропептида» протяженностью в 35 АО, благодаря чему профермент трансформируется в активный фактор 1Ха.
Фактор X (Стюарта; Стюарта- Прауэра) В ходе процессинга первичный продукт (488 АО) разделяется на два S-S-связанных отрезка. Меньший (легкая цепь) содержит домен радикалов Gia. в сродстве которых к Са2+ нуждается активный центр, находящийся в тяжелой цепи. Фактор 1Ха «разрезает» ее по связи арггзд-илегзз, удаляя тем самым N-концевой фрагмент длиной 52 АО. Именно этим актом обеспечивается превращение фактора X в его активную форму (Ха).
Фактор II (Протромбин) Длинная цепь (622 АО) преобразуется в активный фактор Па (тромбин) под действием фактора Ха. Достигается это удалением с N-конца сначала одного пептида (155 АО), за- тем второго (129 АО) и, наконец, гидролизом оставшейся части по связи арезез-илезед (с сохранением S-S-мостика между возникшими фрагментами). Все 10 Gia-ради калов про- тромбина локализованы в первом из удаляемых пропептидов, который может быть от- делен и самим тромбином, еще до воздействия фактора Ха. Главной функцией тромбина является преобразование фибриногена в фибрин.
Фактор XIII (Трансглута- миназа) Тетрамер, в котором цепи А и В объединены с другой такой же парой. Каждая цепь А (731 АО) является предшественником тиолового фермента и подвержена гидролизу тромбином по связи аргзт~глиз8 (с удалением N-концевого пропептида). Возникшая ак- тивная трансглутаминаза (фактор ХШв) формирует изопептидные связи между нитями растворимого фибрин-полимера (рис. 8-3).
В реальных условиях этот процесс актива-
ции фактора XII значительно усиливается во-
влечением в него других белков плазмы - вы-
сокомолекулярного кининогена (ВМК) и про-
калликренна (проКК), до сих пор чаще обозна-
чаемого как /трекалликреин (рреКК). Краткая
характеристика этих белков приведена в таб-
лицах 8-4 и 8-5. Оба они тоже способны сорби-
роваться на анионной поверхности, образуя
при этом комплексы с фактором XII. Насту-
пающие изменения конформации позволяют
ему осуществлять гидролиз «стратегической»
связи аргзуо-илсзд] в молекуле проКК, превра-
щая его в активный калпикреин (КК). Послед-
ний, как и фактор ХПа, легко активирует фак-
тор XII путем гидролиза упомянутой выше
связи аргз72-валз7з. Таким образом, участие
ВКМ и проКК повышает эффективность кон-
282
Глава 8
тактной активации свертывания крови. Тем не
менее, и в этом, более сложном варианте ре-
шающим событием пусковой реакции остается
конформационная перестройка фактора XII.
После активации фактора Хагемана насту-
пает неудержимое развитие всего каскадного
процесса (см. рис. 8-4). Сначала фактор ХПа
гидролизует по одной связи в мономерах фак-
тора XI, «раскрепощая» его активные центры.
Затем фактор Х1а вычленяет «активационный
пропептид» (35 АО) из середины фактора IX,
превращая его в активную форму (1Ха), кото-
рая, в свой черед, отделяет N-концевой про-
пептид (52 АО) от «тяжелой» цепи фактора X,
раскрывая этим его активный центр. Наконец,
возникший фактор Ха удаляет крупные про-
пептиды (155 и 129 АО) с N-конца протромби-
на (фактор II) и расчленяет оставшуюся часть
на два отрезка (остающиеся соединенными
S-S-мостиком). Последняя акция деблокирует
каталитический центр фермента и открывает
возможность воздействия фактора Па {тром-
бина) на фибриноген. Попутно тромбин ката-
лизирует отщепление N-концевого пропептида
(37 АО) от A-цепей фактора XIII (см. табл.
8-1), превращая его в активную трансглутами-
назу, которая ковалентно «сшивает» нити рас-
творимого фибрин-полимера нзопептидными
связями (см. рис. 8-3). Свою ферментативную
активность Gla-белки (1Ха, Ха и Па), а также
трансглутаминаза способны проявлять только в
присутствии ионов Са2+.
На примере системы гемокоагуляции ста-
новится очевидным главное предназначение
протеолитических каскадов. Оно заключается в
усилении изначально слабого (и не очень спе-
цифичного) стимула, которое происходит на
каждой ступеньке каскада. Действительно, воз-
никшая молекула фактора ХПа способна в ко-
роткий срок проактивировать множество моле-
кул фактора XI. Каждая из них, став активной,
в свою очередь генерирует большое число мо-
лекул очередной протеиназы (фактора 1Ха).
И такое повторяется на каждой ступеньке кас-
када, обеспечивая усиление исходного стимула
в геометрической прогрессии. Это лавинооб-
разное нарастание числа активных молекул
продолжается до самого последнего звена кас-
када, когда быстро возникает огромное количе-
ство заключительной протеиназы (в данном
случае — тромбина). Этим и обеспечивается
почти моментальная реализация конечного ре-
зультата (в системе коагуляции он заключается
в массивном превращении фибриногена в фиб-
рин). Этот эффект легко наблюдать при контак-
те крови со стеклом (или кожей и т.п.): несколь-
ко минут она остается жидкой, а затем быстро, в
течение 2-5 секунд, «вдруг» сразу загустевает
(уплотнение возникшего кровяного сгустка на-
ступает позже и протекает гораздо медленнее).
Внешний путь гемокоагуляции
реализуется при взаимодействии плазмы с по-
врежденными мембранами тромбоцитов или
эндотелия. Точнее, стимулом являются анион-
ные фосфолипиды (ФЛ), свойственные внут-
ренней (цитоплазматической) стороне клеточ-
ных мембран (в основном это фосфатидилсе-
рины). Будучи экспонированными вовне, они
становятся центрами сорбции плазменных фак-
торов свертывания, которая требует участия
ионов Са2+. В образовании возникающих при
этом комплексов участвуют три гликопротеи-
на, специфичных для внешнего пути (рис. 8-5).
Один из них - синтезируемый в печени
фактор VII (проконвертин) - содержит Gla-
домен и может активироваться под действием
факторов ХПа, 1Ха, Ха или Па, каждый из ко-
торых обладает способностью расщеплять его
(по связи арг2\2-иле2\з) на две части, остающие-
ся соединенными S-S-мостиком. Возникший
таким путем фактор Vila способен атаковать
факторы IX и X, превращая их в 1Ха и Ха со-
ответственно.
Два других - факторы VIII и V - выделя-
ются печеночными клетками и эндотелием
(фактор V - еще и тромбоцитами). Они на ред-
кость близки по строению, включая наличие
нескольких сульфатных групп на радикалах
тирозина. Не обладая Gla-доменами, оба фак-
тора, тем не менее, проявляют высокое сродст-
во к ионам Са +, которые нужны и для связы-
вания с ФЛ, и для реализации прокоагулянтной
активности возникающих комплексов. В их
составе эти факторы активируются путем огра-
ниченного протеолиза тромбином. Однако и
после этого предшественники не становятся
ферментами. Фактор Villa, вовлекая в комплекс
фактор 1Ха, усиливает его активирующее дей-
ствие на фактор X. Тем самым фактор Villa вы-
полняет (в определенном смысле) роль ко-
ПРОТЕОЛИЗ
283
Рис. 8-5. Общая схема каскада гемокоагуляции
(факторы внешнего пути обведены кружками).
фактора в реакции протеолиза фактора X факто-
ром 1Ха. Белок, роль которого аналогична функ-
ции кофермента, часто обозначают термином
парафермент. Иначе говоря, фактор Villa яв-
ляется параферментом фактора 1Ха в его воз-
действии на фактор X. Аналогичным образом
фактор Va играет роль парафермента для фак-
тора Ха в катализируемой им активации про-
тромбина.
Как показывает схема на рис. 8-5, специ-
фичные для внешнего пути звенья стыкуются с
каскадом внутреннего пути на уровне факторов
IX и X, после чего процессы протекают совер-
шенно одинаково. Поскольку активная форма
фактора Хагемана преобразует проконвертин
(фактор VII) в протеиназу, складывается впе-
чатление, что внешний путь тоже инициирует-
ся фактором ХИа и вообще нужен лишь для
усиления трех ступенек, общих для обоих пу-
тей: IX —> IXa, X —> Ха и II —» На. Однако та-
кое суждение неверно, ибо дефицит фактора
XII не влечет за собой каких-либо клинических
проявлений и обнаруживает себя только неко-
торым замедлением свертывания крови, поме-
щенной в пробирку. Иначе говоря, для запуска
внешнего пути вовсе не является обязательной
активация пути внутреннего.
Что же в таком случае служит стимулом,
инициирующим внешний путь гемокоагуля-
ции? Для ответа на этот вопрос важно обратить
внимание на главную особенность этого пути:
наличие (более того — изобилие) положитель-
ных обратных связей. Действительно, как по-
казывает схема на рис. 8-5, все три его звена
активируются тромбином. Кроме того, самое
раннее звено (фактор VII) может превращаться
в активную протеиназу еще и факторами IXa и
Ха. Иными словами, протеолитический каскад
внешнего пути обладает высокой склонностью
к самовозбуждению: появление хотя бы
нескольких молекул одной из заключительных
протеиназ гемокоагуляции (факторов IXa, Ха
или 11а) быстро ведет к лавинообразному на-
растанию их количества (при наличии Са2+ и
мембранных ФЛ). Реализации этой склонности
способствует то, что в крови всегда имеются
(хотя и в ничтожных количествах) деформиро-
ванные фрагменты клеточных мембран (как
следствие естественного старения и поврежде-
ния клеток). При участии Са2+ на анионных
ФЛ, экспонированных в плазму, сорбируются
не только фактор VII, но и другие Gla-
протеины (факторы IX, X и П). Конформаци-
онная перестройка в составе формирующихся
284
Глава 8
комплексов делает возможной спонтанную ак-
тивацию этих факторов. Такой эффект уста-
новлен для протромбина (Д.М.Зубаиров,
В.Н.Тнмербаев и сотр.): будучи сорбирован-
ным на мембранных ФЛ, он подвергается не-
ферментативному гидролизу по тем же связям,
которые гидролизует и фактор Ха. Если возни-
кающего спонтанно тромбина достаточно для
преодоления противосвертывающего потен-
циала крови (о нем речь впереди), то первая же
молекула этой протеиназы, избежавшая инак-
тивации, способна на полную мощность запус-
тить реализацию положительных обратных
связей. Эффективность процесса -самовозбуж-
дения при этом такова, что «мягкий» тромб
появляется в десятки раз быстрее (примерно
через 15 с), чем при свертывании крови по
внутреннему пути.
Изложенные сведения о каскаде гемокоа-
гуляции (как и схема на рис. 8-5) охватывают
лишь наиболее значимые звенья этого процес-
са. В действительности же он протекает гораз-
до сложнее, в том числе из-за вовлечения и ря-
да других белковых факторов.
Среди наиболее важных следует выделить
фактор фон Виллебранда (фактор ФВ), кото-
рый вырабатывают и накапливают эндотели-
альные клетки и тромбоциты. Этот крупный
гликопротеин (~ 2800 АО) своеобразен муль-
тидоменным строением. Некоторые фрагменты
неоднократно повторяются в молекуле и, кро-
ме того, почти в таком же виде встречаются и в
других белках, а потому их называют домена-
ми фактора ФВ с буквенным и числовым обо-
значением домена каждого типа. К самым про-
тяженным относятся 3 домена А (170-180 АО в
каждом) и вдвое более крупные домены D (их
четыре).
Разнообразие структурных фрагментов
фактора ФВ придает ему многогранную поли-
функциональность. В частности, он обладает
особым участком для нековалентного связыва-
ния с фактором VIII. Более того, в плазме кро-
ви этот фактор циркулирует только в виде ком-
плекса с ФВ, выполняющим тем самым роль
белкового носителя, который мешает про-
теолитической деградации фактора VIII. Осво-
бождение последнего из комплекса обеспечи-
вает тромбин, постоянно генерируемый в цир-
кулирующей крови. Точнее, тромбин расщеп-
ляет одну из связей в факторе ФВ, открывая
возможность его конформационной перестрой-
ки. Она, в свою очередь, ведет к десорбции
фактора VIII (с возможностью последующего
превращения его в Villa, тоже под действием
тромбина).
Есть в факторе ФВ и другие участки неко-
валентного связывания. К ннм относится, в ча-
стности, универсальный центр клеточной адге-
зии RGD (...-арг-гли-асп-...), находящийся в
С-концевой части молекулы. Но в процессах
гемокоагуляции гораздо более важен протя-
женный домен А1, участвующий в сорбции
тромбоцитов, и столь же крупный домен АЗ,
обеспечивающий ассоциацию с волокнами
коллагенов типа I и типа III (табл. 10-2).
Наконец, еще одна важная особенность
молекул ФВ - это их чрезвычайная склонность
к нековалентной ассоциации между собой.
Только в плазме крови они циркулируют в мо-
номерной форме. При любом повреждении
слоя эндотелиальных клеток эти молекулы
сорбируются на коллагеновых волокнах субэн-
дотелия. Этим провоцируется агрегация факто-
ра ФВ с образованием мультимеров, насчиты-
вающих от 2 до 100 мономерных единиц.
Обычно фактор ФВ не связывается с тром-
боцитами. И тромбоциты не прилипают к стенке
неповрежденного сосуда: они циркулируют по
отдельности, как самостоятельные клеточные
элементы. Но в первые же секунды после по-
вреждения сосудистого эндотелия молекулы
ФВ образуют агрегаты на субэндотелии, а кро-
вяные пластинки «вдруг» фиксируются на им-
мобилизованном факторе ФВ. Скопление тром-
боцитов в локусе повреждения обусловлено и
обилием мест связывания на агрегатах фактора
ФВ, и высокой склонностью этих клеточных
элементов «приклеиваться» к уже фиксирован-
ным тромбоцитам. В результате циркулирую-
щие кровяные пластинки, оказываясь аблизи
зоны повреждения, быстро прилипают одна к
другой, образуя «пробку», закрывающую де-
фект.
Агрегация тромбоцитов ведет к так назы-
ваемой «реакции освобождения». Она проявля-
ется выбросом в среду тромбоцитарных компо-
нентов гемостаза (фибриноген, факторы V н
VIII, ВМК, фактор ФВ и др.), а также обрывков
цитоплазматической мембраны (фосфолипиды
ПРОТЕОЛИЗ
285
которых инициируют внешний путь гемоко-
агуляции).
Неудивительно, что недостаточность фак-
тора ФВ является самой частой из всех насле-
дуемых патологий, ведущих к повышенной
кровоточивости.
Следует отметить, что упомянутая «реак-
ция освобождения» может быть инициирована
не только контактом с тромбогенной поверхно-
стью, но и многими сигнальными молекулами,
включая белковые. Ибо на поверхности тром-
боцитов выявлено в общей сложности около 30
типов рецепторов. В том 'Числе и к такому
мощному медиатору воспаления, как тромбо-
цитактивируюший фактор (см. рис. 7-23). Он
вырабатывается многими клетками, в том чис-
ле клетками эндотелия, активированными
ишемией. Быстрой деградации в сосудистом
русле этот медиатор избегает благодаря сорб-
ции на альбумине, представляющем около по-
ловины общего содержания белка в плазме.
Активируя кровяные пластинки, тромбоцитак-
тивирующий фактор способен провоцировать
развитие гемокоагуляционного процесса и без
механического повреждения сосудов.
Итак, система свертывания крови, как и
всякий протеолитический каскад, предназначе-
на, прежде всего, для усиления слабого сигнала
до такой степени, чтобы стало возможным бы-
строе превращение сразу большой массы фиб-
риногена в фибрин. Вместе с тем, активация
каждой протеиназы означает исчезновение ее
предшественника. В этом проявляется еще од-
на уникальная особенность любой системы
каскадного протеолиза: в отлнчие от обычных
мультиферментных путей метаболизма, она
функционирует не иначе как посредством ис-
черпания составляющих ее зимогенов. Иными
словами, свое предназначение такая система
реализует в режиме саморазрушения. Очевид-
но, должны быть механизмы, сдерживающие
тенденцию чрезмерного развития каскадного
процесса, в том числе - и ради предотвращения
полного самоистощения протеолитической
системы.
Противосвертывающий потенци-
ал крови призван решать «триединую» зада-
чу. Во-первых, поддерживать жидкое состоя-
ние крови, предотвращая развитие фибринооб-
разования прн очень слабых («рутинных») сти-
мулах (например, повреждение единичных
клеток). Во-вторых, не препятствовать сверты-
ванию крови в ответ на достаточно значимые
сигналы (например, ушибы, царапины, другие
механические повреждения). Наконец, в-тре-
тьих, локализовать зону тромбообразования, не
допуская его распространения по всему крове-
носному руслу.
Среди антикоагулянтных возможностей
крови самым необычным является механизм
самоограничения гемокоагуляции. Ибо он за-
пускается самим тромбином, реализующим
создание фибриновой основы тромба. Цен-
тральным звеном этого механизма становится
протеин С (фактор XIV свертывания крови;
антикоагулянтный протеин С). Этот гликопро-
теин (>400 АО) синтезируется в печени как
единый полипептид, который затем расщепля-
ется на две части, удерживаемых вместе
S-S-mocthkom. Меньшая из них (легкая цепь)
содержит Gla-домен, тогда как в тяжелой цепи
«замаскирован» активный центр, типичный для
сериновых протеиназ. В таком виде профер-
мент пребывает в плазме.
Активацию протеина С осуществляет
тромбин (путем удаления небольшого пептида
с N-конца тяжелой цепи). Для этого необходим
еще один белок — тромбомодулин. Продуци-
руемый клетками эндотелия, он фиксируется
на их поверхности, выполняя роль не только
рецептора для тромбина, но и его парафермен-
та. Для распознавания комплекса тромбин-
тромбомодулин (и сорбции на нем) протеин С
обладает специальным участком, сродство ко-
торого к ионам Са2+ даже выше, чем у Gla-
домена.
Свою функциональную активность проте-
ин С проявляет с участием еще одного белка
плазмы — протеина S. Вырабатываемый клет-
ками печени, эндотелия и рядом других, он то-
же содержит Gla-домен и выполняет роль па-
рафермента в протеолитическом действии ак-
тивной формы протеина С на факторы Villa н
Va, приводящем к их деградации.
Таким образом, на определенном этапе на-
растания процесса гемокоагуляцни тромбин
начинает тормозить его, инициируя еще одну
серию реакций. Непосредственной мишенью
тромбина становится тогда профермент проте-
286
Глава 8
ин С (в комплексе с тромбомодулином и ФЛ),
активная форма которого (в комплексе с про-
теином S и ФЛ) разрушает два из трех факто-
ров внешнего пути (факторы Villa и Va). По-
лучается своеобразный «миникаскад», посред-
ством которого тромбин прерывает положи-
тельные обратные связи, предназначенные для
самоусиления внешнего пути. О весомости это-
го эффекта свидетельствует тот факт, что гете-
розиготы по протеину С или S (с 50%-ным
снижением уровня их в крови! страдают реци-
дивирующими тромбозами (гомозиготы часто
погибают от обширных тромбозов вскоре по-
сле рождения).
Совсем иначе функционируют компонен-
ты другого блока противосвертывающей сис-
темы крови. Они представлены эндогенными
ингибиторами протеиназ. Как уже отмечалось
(раздел 8.4.3), каждый из таких ингибиторов
обладает своим спектром предпочтений к раз-
личным протеиназам. В плазме крови представ-
лены в основном ингибиторы сериновых про-
теиназ (серпины). Среди них превалирует
си-АТ, обладающий, однако, довольно слабым
сродством к тромбину и другим протеиназам
гемокоагуляции. Тем не менее, высокое содер-
жание в плазме позволяет ему в какой-то степе-
ни блокировать протеолитическую активность
этих ферментов и тем самым препятствовать
распространению тромба за пределы зоны по-
вреждения сосудов.
Аналогичный эффект оказывает анти-
тромбин III. Будучи «специализирован» на уг-
нетении тромбина и предшествующих ему фак-
торов Ха и IXa, он вносит главный вклад в
предотвращение их попадания в общий крово-
ток. Кофактором антитромбина III служит ге-
парин, который переводит его из медленно
действующего в практически мгновенный ин-
гибитор перечисленных факторов свертывания.
Важно отметить, что полисахаридные цепи,
подобные гепарину, имеются на поверхности
эндотелия, обращенной в просвет сосуда. Уси-
ливая антикоагуляционный эффект циркули-
рующего антитромбина III, они обеспечивают
атромбогенные свойства этой поверхности.
Гетерознготы по дефициту антитромбина III
отличаются повышенной склонностью к тром-
бозам (гомозиготы не выявлены, - возможно,
потому, что они погибают in utero).
Антикоагулянтный эффект присущ еще
одному белку — аг-макроглобулину. Как отме-
чено в разделе 8.4.3, этот универсальный инги-
битор связывает (а затем и удаляет из плазмы)
самые различные протеиназы. В том числе -
активированные факторы гемокоагуляции.
И хотя молярная концентрация а2-МГ невели-
ка, высокая скорость обновления позволяет ему
выводить из плазмы весомые количества этих
факторов. Более того: эта скорость может воз-
растать соответственно появлению все новых
порций протеиназ, что позволяет повышать
эффективность данного ингибитора (в том чис-
ле и его антикоагулянтную результативность).
Таким образом, в отличие от механизма
самоограничения гемокоагуляции (реализуемо-
го путем избирательной инактивации факторов
Villa и Va) циркулирующие в плазме ингиби-
торы протеиназ нацелены в основном на пре-
дотвращение генерализации тромбообразова-
ния по всему сосудистому руслу. В определен-
ной мере участвуют в этом и тромбоциты,
а-гранулы которых содержат сц-АТ и а2-МГ.
В зависимости от обстоятельств, каждый из
компонентов общего противосвертывающего
потенциала вносит тот илн иной вклад в созда-
ние барьера, призванного предотвращать «не-
санкционированное» развитие каскадного про-
цесса свертывания крови.
8.6.2. СИСТЕМА ФИБРИНОЛИЗА
Осуществляя срочную защиту от кровопо-
тери, сформированный тромб не должен, одна-
ко, оставаться навсегда. Он подлежит разруше-
нию по мере репарации сосудистой стенки.
Осуществляет рассасывание фибринового сгу-
стка плазмин (фибринолизин). Эта трипсинопо-
добная протеиназа вырабатывается (преимуще-
ственно почками) в виде предшественника дли-
ной более 800 АО. Оставшийся после удаления
сигнального пептида плазминоген поступает в
плазму крови, где его содержание составляет
обычно 0,12-0,4 г/л (1,4-4,8 мкМ). Присутствует
он н почти во всех других жидкостях тела,
включая межклеточную. In vivo плазмин спосо-
бен расщеплять только фибрин и не действует
на его предшественник—фибриноген.
Активация плазминогена происходит по-
средством ограниченного протеолиза по связи
ПРОТЕОЛИЗ
287
фг58о-еол581. В результате предшественник раз-
деляется на две части, соединенные дисуль-
фидными мостиками. Меньшая из них содер-
жит протеолитический модуль, а более крупная
N-концевая богата петлеобразными изгибами
полипептидной цепи, которые закреплены свя-
зью -S-S- в основании каждой из них. Не-
обычным является то, что внутри крупных пе-
тель заключены петли меньшего размера. Та-
кая укладка «петель в петле» внешне напоми-
нает своеобразную завитушку (крендель) и бы-
ла обозначена английским словом kringle; оно
и стало общепринятым. Несмотря на внешнее
сходство, кринглы довольно разнообразны. В
тяжелой цепи плазмина их число достигает 5, а
главная функция заключается в обеспечении
сорбции плазминогена на поверхности фибри-
на в ходе его полимеризации.
Главная роль в активации плазминогена
принадлежит специализированному белку, ко-
торый вырабатывается эндотелием кровенос-
ных сосудов (в том числе и в опухолях) н сек-
ретируется не только в кровь, но и в другие
внеклеточные жидкости, включая слезную,
гингивальную и слюнную. Его так и обознача-
ют: тканевый активатор плазминогена, или
тканевый плазминоген-активатор (тПА). По-
добно плазминогену, полипептидная цепь это-
го активатора (~ 500 АО) содержит триаду се-
риновой протеиназы в С-концевой части моле-
кулы и два крингла - в более крупной N-koh-
цевой (где есть еще и иного рода участок неко-
валентного связывания с фибрином). Разделе-
ние этих фрагментов (удерживаемых вместе
дисульфидными мостиками) происходит путем
гидролиза связи лдаю-алезц, который могут
осуществлять сам плазмнн, а также плазмен-
ный КК и фактор Ха (рис. 8-6).
Редкостная особенность тПА состоит в
том, что его одноцепочечная форма (тПА-оц)
не является зимогеном. Ибо, вступая в контакт
с фибрином, она претерпевает такую конфор-
мационную перестройку, вследствие которой
резко повышается ее сродство к плазминогену
и почти в 1000 раз возрастает каталитическая
эффективность в отношении этого субстрата,
достигая уровня, свойственного двухцепочеч-
ной форме тПА (ее обозначают как тПА-дц).
Таким образом, появление фибрин-поли-
мера само по себе («автоматически») иниции-
рует сорбцию на нем молекул плазминогена и
тПА. Так формируются трехкомпонентные
комплексы. Именно в их составе тПА катали-
зирует превращение плазминогена в плазмнн,
который и осуществляет ступенчатое расщеп-
ление фибрина до всё менее крупных фрагмен-
тов (тем самым «растворяя» тромб). Иными
словами, сама полимеризация фибрина (осо-
Рис. 8-6. Общая схема системы фибринолиза (пояснения см. в тексте).
288
Глава 8
бенно переход его в нерастворимую форму) и
является пусковым фактором для реакций его
деградации (растворимые продукты которой
захватываются клетками, реализующими то-
тальный протеолиз поглощенных пептидов).
Помимо тПА, известен еще и урокиназный
тип активатора плазминогена (уПА), нередко
именуемый короче: урокиназа. Этот активатор
вырабатывается главным образом почками и
фибробластами, но и некоторыми другими
клетками тоже. Его полипептидная цепь еще
короче, чем у тПА, а в N-концевой части имеет
лишь один крингл. В отличие от тПА, одноце-
почечная урокиназа (уПА-оц) становится ак-
тивной протеиназой только после превращения
в двухцепочечную (уПА-дц). Происходит это
разделение на два фрагмента (удерживаемых
вместе дисульфидными мостиками) путем гид-
ролиза СВЯЗИ Z/ZZ3j78-W?ei79, который может быть
осуществлен плазменным КК либо уже проак-
тивированным плазмином. Как и другие проте-
олитические активаторы плазминогена (в том
числе фактор Х11а), уПА-дц гидролизует в
этом предшественнике «стратегическую» связь
^580-607/581.
Повышение уровня плазминоген-актива-
торов ведет к гнперфибринолизу и избыточной
кровоточивости. Одним из предупредительных
механизмов является элиминация тПА гепато-
цитами. В ней участвует белок, который по
строению подобен рецептору ЛНП и обладает
высоким сродством к N-концевому отрезку
данного активатора. Поэтому попавшие в кро-
воток молекулы тПА циркулируют не более
нескольких минут.
Совсем иной механизм предотвращения
избыточной активации плазминогена реализу-
ют специальные белки, предназначение кото-
рых - необратимо блокировать активную фор-
му как тПА, так и уПА. Эти белковые ингиби-
торы плазминоген-активаторов чаще обозна-
чаются как плазминоген-активаторные инги-
биторы (ПАИ). Они относятся к числу серпи-
нов, т.е., оказывают блокирующее действие
благодаря своей способности быть «плохими»
субстратами («псевдосубстратами») для ата-
кующего их фермента.
Существует несколько вариантов ПАИ,
различающихся, в частности, по месту преиму-
щественного синтеза. Все онн содержат уча-
сток, «привлекательный» для каталитического
центра активаторов плазминогена. В таком уча-
стке имеется пептидная связь, аналогичная
сайту б7?г58о-впл581 в плазминогене. Ее-то и ата-
кует активная форма тПА или уПА. В резуль-
тате один нз фрагментов расщепленной моле-
кулы ПАИ освобождается, а другой остается
ковалентно связанным с серином каталитиче-
ской триады тПА (или уПА). Например, доми-
нирующий в плазме крови ПАИ-1, выделяемый
эндотелием сосудов и тромбоцитами, в качест-
ве атакуемой связи имеет арг^-мет^. При ее
гидролизе появляется свободный пептид с
л/е/«з7о на N-конце, тогда как другой продукт
карбоксильной группой своего С-концевого
арг^э остается ковалентно связанным с сери-
ном-513 в каталитическом центре тПА (илн с
серином-376 в молекуле уПА). Естественно,
тем самым блокируется активный центр плаз-
миноген-актнватора, расщепившего данную
молекулу ПАИ-1.
Массивное освобождение ПАИ-1 тромбо-
цитами при их агрегации (а этим отличается
именно зона тромбообразования) ведет к ло-
кальному торможению фибринолиза. В этом и
заключается особая роль ПАИ-1: задержать на
время лизис формируемого в сосуде тромба,
чтобы надежно остановить кровотечение и об-
легчить начальную фазу заживления раны.
Аналогичным образом плазмнноген-акти-
ваторные ингибиторы оказывают блокирующее
действие и на ряд других протеиназ, спектр
которых различен для разных ПАИ, а в целом
включает плазмнн, тромбин, КК, факторы Ха и
Х1а, а также активную форму протеина С.
Взаимоотношения перечисленных звеньев
системы фибринолиза лаконично обобщает
схема на рис. 8-6. Можно видеть, что эта сис-
тема тоже формирует каскад реакций ограни-
ченного протеолиза. Он далеко не столь много-
ступенчат, как каскад гемокоагуляцин. И хотя
наиболее мощным стимулятором здесь высту-
пает нерастворимый фибрин-полимер, актива-
ция плазминогена может осуществляться и без
его участия. Решающее значение при этом
имеет соотношение активаторов плазминогена
(тПА н уПА), с одной стороны, и нх ингибито-
ров (ПАИ-1, ПАИ-2 и т.д.) — с другой. Свой
вклад могут вносить также факторы ХПа, Ха н
плазменный КК, способные переводить в ак-
ПРОТЕОЛИЗ
289
тнвную форму плазминоген и/или тПА. Нако-
нец, следует отметить и эффект самоактива-
ции: появившийся плазмин легко активирует
новые порции плазминогена, — как непосредст-
венно, так н путем воздействия на одноцепо-
чечные тПА и уПА (см. рис. 8-6).
Разнообразие и дублирование путей акти-
вации фибринолитического каскада повышает
его надежность, а, кроме того, отражает его
вовлеченность не только в деградацию фибри-
на. Действительно, это лишь в кровн фибрин-
полимер оказывается единственным субстра-
том плазмина. В тканях же протекают н другие
процессы, реализуемые с участием системы
фибринолиза. И хотя до полной ясности здесь
пока далеко, уже известно, что к ним относятся
эмбриогенез, ремоделирование тканей, ангио-
генез, опухолевая инвазия, рост аксонов нерв-
ных клеток, а также такие комплексные реак-
ции защиты, как воспаление и заживление ран.
Таким образом, система фибринолиза яв-
ляется самостоятельным протеолитическим
каскадом. Она имеет точки соприкосновения с
каскадом гемокоагуляцин (факторы ХПа, Ха и
КК), но отнюдь не является его продолжением.
Ибо на образовании фибрин-мономера коагу-
ляционный протеолиз завершается, н лишь по-
сле протекающей спонтанно полимеризации
фибрина подключается фибринолитический
процесс. Иными словами, система фибриноли-
за лежит вне каскада свертывания крови. Обе
системы «стыкуются» на уровне фибрина, но
для одной (свертывание крови) он является ко-
нечным продуктом, а для другой - главным
субстратом, деградация которого, к тому же,
усиливается с нарастанием тромбообразования.
Чрезмерная активация плазминогена ведет
к ускоренному расщеплению фибрина, которое
проявляется повышенной кровоточивостью.
Если наработку плазмина сдерживают ПАИ, то
главным предохранителем от избыточности
уже готового (активного) плазмина служит
а2-антиплазмин (а2-АП). Его источником яв-
ляются печеночные клетки и тромбоциты. Это
единственный из серпинов, который поступает
в кровь в виде предшественника и дозревает
(путем отщепления N-концевого пропептида)
уже во время циркуляции. Важно, что по со-
держанию в плазме крови (1,0-1,2 мкМ) он со-
поставим с плазминогеном.
В отличие от других серпинов, а2-АП имеет
участки связывания не только для плазминогена
(и плазмина), но и для фибрина. Однако связан-
ный с фибрином а2-АП действует на плазмин в
50 раз медленнее. Вместе с тем, плазмин, осво-
бождаемый из сгустков фибрина по мере их
рассасывания, сразу же выводится нз строя
«своим» ингибитором. Иными словами, а2~АП
эффективно взаимодействует лишь со свободно
циркулирующим плазмином (см. рис. 8-6). На-
ступающий прн этом гидролиз «уязвимой» пеп-
тидной связи в молекуле а2-АП приводит к не-
обратимому блокированию каталитического
центра плазмина ацильным продуктом этой ре-
акции. Ковалентно преобразованный плазмин
довольно быстро исчезает из кровотока.
При усиленной активации плазминогена
может произойти истощение имеющегося в
крови а2-АП, и тогда наступает очередь а2-МГ
как ингибитора, имеющего явно меньшее срод-
ство к плазмину. В еще меньшей степени, но
тоже обладают антиплазминовым эффектом
другие серпины крови (cq-AT, антитромбин Ш,
интер-сц-ингибитор трипсина, а также Cl-инги-
битор, о котором речь пойдет в следующем
разделе).
Долгое время считалось, что свертывание
кровн происходит только в участке ранения кро-
веносного сосуда, приводя к образованию тром-
ба (гемокоагуляция) с последующим его расса-
сыванием (фибринолиз). В 1961 г. Д.М. Зубаи-
ров (впоследствии возглавивший кафедру био-
химии Казанского медицинского института)
сформулировал и обосновал представления о
том, что образование фибрина в сосудистом
русле протекает постоянно, но столь же непре-
рывно осуществляются процессы фибринолиза,
которые предотвращают нарушение проходи-
мости сосудов и поддерживают жидкое со-
стояние крови. В наиболее развернутом виде
теория физиологического внутрисосудистого
микросвертывания крови представлена в не-
давней монографии Д.М. Зубаирова «Молеку-
лярные основы свертывания крови и тромбо-
образования» (Казань, 2000).
Теперь уже стало общепризнанным, что в
разных участках сосудистого русла постоянно
возникают ситуации, способствующие образо-
ванию фибрина. К ним относятся н функцио-
нальная травматизация сосудов, и микроразры-
290
Глава 8
вы мышечных волокон при интенсивной физи-
ческой работе, и гипоксия (ишемия), и повреж-
дение эндотелия некоторыми вирусами, бакте-
риальными токсинами или атеросклеротиче-
ским процессом, и локальный выброс ряда сиг-
нальных молекул (включая оксид азота NO), и
многое другое. Химическое повреждение эндо-
телия может быть вызвано и некоторыми на-
рушениями метаболизма (например, повыше-
нием уровня гомоцистеина в крови).
Об интенсивности частичного внутрисо-
судистого свертывания крови свидетельствует,
в частности, быстрое обновление факторов
коагуляции. Если для многих белков (включая
альбумин плазмы) Т015 лежит в пределах 2-4
недель, то период полусуществования фибри-
ногена, протромбина, фактора XI составляет
всего 2-4 дня, а у большинства остальных ком-
понентов каскада гемокоагуляции он и того
меньше (у фактора VII — всего от 4 до 6 ч). На
непрерывность функционирования системы
свертывания указывает и постоянное присутст-
вие в крови активных форм зимогенов каскада.
Так, у здоровых людей циркулирующий в кро-
ви фактор VII примерно на 0,5% представлен
активированной формой (Vila).
Прогрессированию физиологического ге-
мостаза, угрожающему нежелательным обра-
зованием тромбов, препятствуют две группы
механизмов противодействия. Одна из них -
противосвертывающий потенциал крови
(включая механизм самоограничения гемокоа-
гуляции), представленный в разделе 8.6.1. Дру-
гую составляет система фибринолиза в целом,
в том числе плазмин — ее конечный продукт и
главный разрушитель фибрина.
Фибринолитическую систему Д.М. Зубан-
ров образно назвал шомполом, который прочи-
щает просвет кровеносных сосудов (и межкле-
точные пространства) от отложений фибрина,
возникающих в процессе физиологического
свертывания крови.
Нарушения сбалансированности процессов
фибриногенеза и фибринолиза лежат в основе
крайне тяжелой патологии, которую обознача-
ют как синдром диссеминированного внутрисо-
судистого свертывания кровн (ДВС-синдром).
Он бывает осложнением самых различных па-
тологических состояний, общим знаменателем
которых оказывается дисбаланс в работе слож-
ных, многоступенчатых систем каскадного
протеолиза.
С недавних пор в медицинской практике
для лечения тромботических состояний стали
применять специфические белки микробного
происхождения - стрептокиназу (из гемолити-
ческих стрептококков) и стафилокиназу (из
стафилококков). Несмотря на «ферментное»
название, они не являются даже зимогенами.
Образуя своим С-концом эквимолярный ком-
плекс с плазминогеном, стрептокиназа (47 кДа)
индуцирует в нем конформационную пере-
стройку, ведущую к нековалентному раскры-
тию протеолитического модуля, который ста-
новится в состоянии катализировать гидролиз
«стратегической» связи <7/?e5g0-etz/z58i в другой
молекуле плазминогена, сорбированной на
ином (N-концевом) сайте стрептокиназы. В от-
личие от этого, стафилокнназа (втрое меньшая
по размерам), образовав комплекс с плазмино-
геном (тоже эквимолярный), не активирует
этот зимоген, а лишь облегчает его активацию
следовыми количествами плазмина, имею-
щимися в крови. Кроме того, стафилокиназа
способна освобождаться из комплекса и рецик-
лизироваться (т.е., объединяться с новой моле-
кулой плазминогена). Наконец, самое полезное
свойство этого лекарства обусловлено тем, что
в отсутствие фибрина плазмин, образовавший-
ся в составе комплекса со стафнлокиназой,
очень восприимчив к инактивирующему дей-
ствию а2-АП, а это позволяет избежать чрез-
мерного литического состояния при передози-
ровке препарата.
8.6.3. СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА
Более 100 лет тому назад было замечено,
что эффективность взаимодействия антигена с
антителами требует наличия еще какого-то
белкового фактора, имеющегося в нормальной
сыворотке крови. Этот дополнительный фактор
так и обозначили: комплемент. Лишь спустя
многие десятилетия новые способы выделения
н очистки белков, выяснения их первичной
структуры позволили установить, что компле-
мент — это не один, а множество индивидуаль-
ных белков. Большинство из них именуют
компонентами комплемента и кратко обозна-
чают латинской буквой «С» с добавлением
ПРОТЕОЛИЗ
291
арабской цифры: С1 (первый компонент ком-
племента), С2 (второй), СЗ (третий) и так да-
лее, вплоть до С9. Впоследствии были открыты
еще два белка, которые получили буквенные
обозначения: фактор В и фактор D. Все пере-
численные белки являются гликопротеинами и
функционируют в строго определенной после-
довательности, напоминая этим каскад гемо-
коагуляции. Совокупное количество их состав-
ляет около 10% от общего содержания белков в
сыворотке крови.
Теперь мы знаем, что единственное пред-
назначение каждого антитела заключается в
точном распознавании специфичного для него
(«своего») антигена. Это узнавание основано
на принципе комплементарности и завершается
формированием нековалентного комплекса ан-
тиген-антитело (Аг-Ат). Все дальнейшее уже
не зависит от собственно реакции иммуногло-
булина с антигеном: многообразие функцио-
нальных последствий реализуется не самим
комплексом Аг-Ат, а системой комплемента
(иногда — иными эффекторными системами).
Первый ее компонент (С1) распознает в молеку-
лах антител специальный участок, который стал
доступным из-за конформационной перестрой-
ки, наступающей при взаимодействии иммуно-
глобулинов с антигеном. И это служит началь-
ным стимулом для активации всей системы.
Иными словами, антитела обеспечивают
лишь верность распознавания «своего» антиге-
на, а весь спектр мер по его обезвреживанию
едва ли не всегда осуществляется с участием
системы комплемента.
Каскадный процесс, инициируемый им-
мунными комплексами, получил название
классический путь {активации) комплемента
(КПК). Ибо, как выяснилось много позднее,
нередко активация комплемента протекает без
участия антител, а главное - осуществляется
(на начальных стадиях) иными белковыми фак-
торами. Этот способ защиты, гораздо менее
специфичный, обозначили как альтернатив-
ный путь {активации) комплемента (АПК).
Основным местом выработки всех белков
комплемента являются гепатоциты. Полный
набор их продуцируют также моноциты и
клетки нейроглии. Во всех других местах син-
теза (полиморфноядерные лейкоциты, лимфо-
циты, фибробласты, миоциты) создаются лишь
отдельные компоненты системы. Как и другие
протеолитические каскады, комплемент функ-
ционирует в режиме самоистощения, что тре-
бует достаточно быстрого обновления его ком-
понентов. Поэтому скорость их синтеза до-
вольно высока.
Кроме прямых участников процесса акти-
вации, к системе комплемента относится и це-
лый ряд регуляторных белков (внекаскадные
факторы). Собственно каскадных белков ком-
племента насчитывается 12. Перечень их при-
веден в табл. 8-2.
Таблица 8-2
Краткая характеристика каскадных белков системы комплемента
Компонент Масса (кДа) Фракция глобулинов Ведущая функция Содержание в плазме (г/л) Пути активации
C1q 410 V Адгезия 0,08-1,15 КПК
С1 fgCls? 332 ₽ Зимогены (и С1г, и C1s) 0,13 КПК
С2 102 р Зимоген 0,015 КПК
СЗ 190 3 Компонент конвертаз 1,0-1,6 КПК, АПК
С4 206 р Компонент конвертаз 0,4 КПК
С5 190 ₽ Белок мембранной атаки 0,08 КПК, АПК
С6 128 а Белок мембранной атаки 0,075 КПК, АПК
С7 121 V Белок мембранной атаки 0,055 КПК, АПК
С8 151 р Белок мембранной атаки 0,08 КПК, АПК
С9 79 р Белок мембранной атаки 0,23 КПК, АПК
Фактор D 24 Y Сериновая протеиназа 0,002 АПК
Фактор В 90 р Зимоген 0,2 АПК
292
Глава 8
Важно подчеркнуть, что почти все протео-
литические звенья системы циркулируют в
проферментной (зимогенной) форме. Лишь по-
сле ограниченного протеолиза они превраща-
ются в сериновые ферменты (подобные трип-
сину, но с гораздо более узкой субстратной
специфичностью). Единственное исключение
составляет фактор D, поступающий в плазму в
виде уже активной протеиназы (не удивитель-
но поэтому, что его содержание в ней в десятки
и сотни раз ниже уровня любого другого ком-
понента).
И еще одна существенная деталь: протеи-
назы комплемента (кроме фактора D) функ-
ционируют не поодиночке, а только в составе
межмолекулярных комплексов. Этому способ-
ствует наличие во многих из них специальных
центров адгезии, включая модули так называе-
мых коротких согласованных повторов (SCR-
Short Consensus Repeats) . Кроме того, форми-
рование таких комплексов требует участия
двухвалентных катионов. При этом в протео-
литическом каскаде КПК участвуют ионы
кальция и магния, а в АПК - только магния.
В их отсутствие (например, при удалении диа-
лизом или связывании хелатирующими аген-
тами) белки комплемента неспособны форми-
ровать протеиназные комплексы, и активность
комплемента полностью блокируется
В компонентах СЗ и С4 важным элемен-
том является тиол-эфирная петля, идентичная
таковой в а2-МГ (см. раздел 8.4.3). Имеющаяся
в ней тиоэфирная группа высокореактивна, а
потому способна спонтанно реагировать с гид-
роксильными или аминогруппами, образуя бо-
лее стабильные связи (сложноэфирную или кис-
лотоамидную). Тем самым молекулы, обладав-
шие тиол-эфирной петлей, закрепляются ко-
валентной связью в составе формируемых ими
комплексов с другими белками, с поверхностью
клеток или с подходящими полисахаридами.
Классический путь начинается, как
уже упомянуто, с активации компонента С1.
Процесс этот довольно сложный, поскольку
сам С1 состоит из трех субкомпонентов. Сбор-
ка их требует участия Са2+ и осуществляется на
иммуноглобулиновых молекулах, образовав-
ших комплекс с антигеном. Обозначаются эти
субкомпоненты как Clq, Clr и Cis.
Сначала происходит сорбция Clq на рас-
крывшемся особом участке в константной час-
ти (Fc) тяжелой цепи иммуноглобулина (струк-
тура иммуноглобулинов будет представлена в
разделе 13.3.3). Наиболее крупный белок ком-
племента, Clq отличается и необычайностью
строения. Он состоит из 6 субъединиц, почти
наполовину' (с N-конца) представленных трой-
ной спиралью, типичной для коллагена. Напро-
тив, С-концевая часть каждой субъединицы
формирует глобулярную «головку». Именно в
ней находится центр связывания со специаль-
ным участком в области Fc иммуноглобулинов.
Кроме того, эти «головки» богаты аминокисло-
тами с положительно заряженным радикалом,
благодаря чему способны связываться с поли-
анионными макромолекулами (такими как ге-
парин или ДНК).
В целом Clq по форме напоминает букет
из 6 тюльпанов, как это показано на рис. 8-7.
Отсюда становится понятным, почему эффек-
тивную фиксацию Clq (и, как следствие, акти-
вацию всего С1) осуществляет не просто бимо-
лекулярное соединение Аг-Ат, а только муль-
тивалентный иммунный комплекс (ИК). При
этом взаимное расположение иммуноглобули-
нов в нем должно обеспечивать фиксацию не
менее двух из шести глобулярных головок мо-
лекулы Clq (в случае пентамерных иммуно-
глобулинов класса М достаточно одной моле-
кулы антитела для полноценного связывания
молекулы Clq; именно поэтому IgM активи-
руют комплемент эффективнее, чем иммуног-
лобулины класса G).
Глобулярные
головки
Коллагено-
подобные
стержни
Рис. 8-7. Пространственная организация молекулы
субкомпонента C1q.
ПРОТЕОЛИЗ
293
Взаимодействие Clq с ИК способствует
дальнейшему укрупнению возникшего надмо-
лекулярного агрегата. Оно происходит путем
вовлечения субкомпонентов С 1г и Cis. Эти
одноцепочечные зимогены очень близки по
строению и превращаются в активный фермент
путем гидролиза единственной связи в
центральной части молекулы (арг^-иле^м в
С 1г и «/>г4з7-гглв438 в Cis). В обоих случаях
сохраняется дисульфидная перемычка между
возникшими фрагментами, в одном из которых
становится раскрытым активный центр протеи-
назы, а в другом остаются зоны белок-
белковой адгезии (включая SCR-модули).
Два гетеродимера, содержащих по одному
субкомпоненту С 1г и Cis, сорбируются на мо-
лекуле Clq (объединенной с ИК), располагаясь
симметрично в пространстве между расходя-
щимися «стеблями», чуть ниже головок «буке-
та» (изображенного на рис. 8-7). Так формиру-
ется полный комплекс С1, состоящий из суб-
компонентов Clq, С 1г и Cis в молярном соот-
ношении 1:2:2 (комплекс Clqlr2ls2).
Несмотря на большое сходство С 1г и Cis,
активация этих зимогенов осуществляется по-
разному. Первый из них претерпевает спон-
танную самоактивацию. Она становится воз-
можной благодаря тем конформационным под-
вижкам, которые происходят в ходе формиро-
вания комплекса Clqlr2ls2 на ИК. Именно они
позволяют проферменту С 1г расщепить упомя-
нутую выше связь в своей собственной моле-
куле. Так зимоген С 1г становится активной
протеиназой С1г (надстрочной горизонтальной
линией принято отличать активные формы
компонентов комплемента). Она, в свою оче-
редь, производит ферментативный гидролиз
субкомпонентов Cis (в составе комплекса),
разделяя каждый из них на два фрагмента, ана-
логичных фрагментам С1г. Только здесь про-
теиназный фрагмент гораздо энергичнее гид-
ролизует свои белковые субстраты и, особенно,
эфиры _аргинина, лизина или тирозина (из-за
чего Cis часто именуют С1 -эстеразой).
Формированием активного комплекса
Clqlr2 ls2 (для краткости обозначаемого и как
С1) завершается этап инициации (запуска) сис-
темы комплемента.
Следующий этап - собственно протеоли-
тический каскад усиления. Как показано на
рис. 8-8, начинается он с двух реакций ограни-
ченного протеолиза, катализируемых комплек-
сом С1 (точнее, С1-эстеразой в его составе).
Одна из них заключается в расщеплении ком-
понента С4 (по связи арг-ы-ала-т) на две само-
стоятельные молекулы - С4а и С4Ь. Другая
сводится к разрыву единственной цепи белка
С2 (по связи ^/>г24з-лш244) с освобождением С2а
и С2Ь. В присутствии Mg2+ сериновая протеи-
наза С2а сразу же комбинируется с фрагмен-
294
Глава 8
том С4Ь, формируя новый комплекс — С4Ь2а.
Он обозначается как СЗ-конвертаза классиче-
ского пути, поскольку С2а в его составе спо-
собен расщеплять молекулу СЗ (по связи
срг^-сер^) на СЗа и СЗЬ. Появившийся СЗЬ
включается затем в породившую его конверта-
зу, изменяя ее субстратную специфичность.
А именно: возникший комплекс С4Ь2аЗЬ на-
чинает расщеплять уже не СЗ, а С5. То есть,
превращается в С5-конвертазу КПК, которая
гидролизует компонент С5 (по связи арг^\-
лей152) до фрагментов С5а и С5Ь.
Расщеплением циркулирующего в крови
компонента С5 завершается протеолитический
этап активации комплемента. Оба продукта -
С5а и С5Ь - остаются в жидкой фазе. Послед-
ний, однако, обладает высоким сродством к
компоненту С6 плазмы и образует с ним ком-
плекс. Этим облегчается вовлечение в него еще
и компонента С7, что вызывает перегруппи-
ровку, в результате которой на поверхности
надмолекулярного агрегата сосредоточиваются
неполярные фрагменты. Возникновение гид-
рофобной внешности придает комплексу мем-
бранотропные свойства, и он начинает погру-
жаться в липидную часть клеточной мембраны.
Погружение становится более полным, когда к
комплексу присоединяется компонент С8.
Конгломерат С5Ь-С8 внедряется в мембрану,
что приводит к медленному лизису клетки.
Процесс сильно ускоряется имеющимся в
плазме компонентом С9, который взаимодей-
ствует с С8 в составе С5Ь-С8. При этом сло-
женная вдвое молекула С9 разворачивается и
инициирует процедуру самоагрегации, которая
может вовлекать до 16 мономерных звеньев,
складывающихся в полый цилиндр. Так возни-
кает довольно широкий (11 нм) трансмембран-
ный канал, - сквозная «дырка», через которую
происходит утечка клеточного содержимого,
означающая гибель клетки (цитолиз).
Таким образом, третий этап активации
КПК является неферментативным процессом
дезорганизации мембраны. Он реализуется пу-
тем физико-химического комплексирования
конечных компонентов, протекающего в опре-
деленной очередности. Агрегаты С5Ь-С8 и их
объединения с поли-С9 называют мембранно-
атакующими комплексами (МАК). Мишенью
для них чаще всего становится та чуждая клет-
ка, на которой сформировался инициаторный
ПК. Но может стать и почти любая другая
клетка, оказавшаяся в пределах досягаемости
для жидкофазного С5Ь (даже если на ней вовсе
нет антител, - бывает и так!).
Здесь уместно отметить, что некоторые
полисахариды (например, дрожжевой маннан)
способны вызывать активацию КПК без уча-
стия иммуноглобулинов. Исследование этого
явления привело к открытию так называемого
маннан-связывающего белка, сокращенно МБР
(mannan-binding protein). Он оказался струк-
турным и функциональным аналогом компо-
нента Clq, содержащим и коллагеноподобные
«стебли», и глобулярные головки. Последние,
однако, не являются поликатионами, а имеют
сродство к углеводам (т.е., обладают свойства-
ми лектинов). Белки, сочетающие качества
коллагена и лектина, обозначили термином
коллектины. Образовав комплекс с полисаха-
ридом, МБР начинает взаимодействовать с
субкомпонентами С 1г и Cis, подобно тому, как
это делает Clq, фиксированный на ИК. Это и
приводит к инициации каскада КПК. Такой
вариант активации КПК обозначили термином
коллектиновый путь. Роль его неясна, ибо у
людей обычная концентрация МБР в плазме
крови на три порядка ниже уровня Clq (у неко-
торых он и вовсе не обнаруживается, и это не
отражается на их здоровье). Недавно установ-
лено, что МБР может взаимодействовать не
только с полисахаридами, но и с клетками, ин-
фицированными вирусами гриппа или ВИЧ.
При инфекционных заболеваниях концентра-
ция МБР возрастает, что позволяет отнести его
к белкам острой фазы.
Альтернативный путь комплемен-
та считают филогенетически более древним.
Этим и объясняют его низкую специфичность.
Действительно, стимулировать АПК способны
самые различные факторы, в том числе:
- полисахариды зимозан, декстран, ину-
лин и т.п. (само открытие АПК в 1954 г. со-
стоялось благодаря опытам с обработкой сыво-
ротки крови зимозаном - полисахаридом кле-
точных стенок дрожжей);
- клеточные мембраны (хорошим актива-
тором АПК человека является мембрана эрит-
роцитов кролика, некоторых опухолевых кле-
ток и клеток, трансформированных вирусами
ПРОТЕОЛИЗ
295
или убитых нагреванием; бараньи эритроциты
становятся активаторами АПК после фермен-
тативного удаления сиаловых кислот с их по-
верхности); "
- эндогенные кристаллы (осадок уратных
солей; кристаллы холестерола, особенно, его
окисленных производных);
- некоторые искусственные полимеры,
полученные в попытках создать материалы для
изготовления шовного материала, диализных
мембран, сосудистых протезов и т.п.
Однотипность эффектов, вызываемых
столь различными факторами, обусловлена
тем, что все они воздействуют на один и тот же
белок - компонент СЗ. Немаловажно, что в
плазме крови его во много раз больше, чем лю-
бого другого компонента комплемента (табл. 8-
2). Но для инициации АПК еще важнее нали-
чие в СЗ уже упоминавшейся тиол-эфирной
петли. Имеющаяся в ней тиоэфирная связь
подвержена медленному спонтанному гидро-
лизу, что ведет к появлению той формы ком-
понента СЗ, которую принято обозначать как
СЗ(Н2О). Конформационные подвижки в моле-
куле СЗ, вызываемые ее сорбцией на перечис-
ленных структурах, ведут к демаскировке тиол-
эфирной петли (которая в нативном белке
скрыта в в глубине гидрофобной ниши) и тем
самым облегчают гидролиз тиоэфирной связи.
Иначе говоря, все стимуляторы АПК являются,
по сути, факторами, существенно ускоряющи-
ми эту неферментативную реакцию.
После гидролиза тиоэфирной связи моле-
кула СЗ обретает сродство к фактору В ком-
племента. По строению и свойствам он очень
похож на компонент С2 классического пути:
оба являются одноцепочечными зимогенами;
оба содержат SCR-модули межбелковой адге-
зии; оба активируются путем расщепления на
две самостоятельные молекулы, одна из кото-
рых переходит в жидкую фазу, а другая «при-
вносит» свой активный центр в состав форми-
руемой комплексной протеиназы. Наконец, оба
белка отличаются от остальных компонентов
комплемента своей термолабильностью: про-
гревание при 50°С в течение 20 мин полностью
инактивирует их.
Последующие стадии процесса активации
АПК представлены в виде лаконичной схемы
на рис. 8-9.
Рис. 8-9. Альтернативный путь активации комплемента (АЛК).
296
Глава 8
Образовав прочный Mg^-зависимый ком-
плекс с СЗ(Н2О), молекула фактора В стано-
вится доступной для протеолитической атаки
фактором D. Его предшественник синтезирует-
ся как одна цепь (253 АО), которая по удале-
нии сигнального пептида (20 АО), а затем и
пропептида (5 АО с N-конца) поступает в
кровь в виде готовой сериновой протеиназы.
Отличаясь исключительно строгой субстратной
специфичностью, фактор D гидролизует един-
ственную СВЯЗЬ (OjD2259-^W326o) В ОДНОМ-еДИН-
ственном белке - факторе В. Более того: не в
свободном факторе В, а только в комплексиро-
ванном с СЗ(Н2О) или с очень похожим на него
белком, недавно обнаруженным в яде кобры
Naja naja и именуемым фактором яда кобры
(Cobra Venom Factor, - сокращенно CoVF).
В результате ограниченного протеолиза
фактора В один из продуктов (фрагмент Ва)
переходит в жидкую фазу, а в другом (фраг-
мент ВЬ), остающемся связанным с СЗ(Н2О)
через ион магния, раскрывается каталитическая
триада. Именно она осуществляет протеолити-
ческую функцию комплекса СЗ(Н2О)ВЬ, име-
нуемого начальной СЗ-конвертазой альтерна-
тивного пути. Название указывает, что эта
протеиназа расщепляет СЗ типичным образом
- на СЗа и СЗЬ. Фрагмент СЗЬ по своей кон-
формации очень похож на СЗ(Н2О). Поэтому он
тоже способен формировать магний-зависимый
комплекс с фактором В, делая его восприимчи-
вым к атаке фактором D. И снова в среду осво-
бождается Ва, а фрагмент ВЬ остается в составе
нового комплекса - СЗЬВЬ, или СЗ-конвертазы
АПК. Как и начальная, она тоже расщепляет СЗ
на СЗа и СЗЬ. В результате наступает быстрое
накопление СЗЬ, что способствует увеличению
его доли в составе СЗ-конвертазы АПК А это
ведет к изменению субстратной специфично-
сти: комплекс (СЗЬ)пВЬ, присоединивший не-
сколько молекул СЗЬ, предпочитает расщеп-
лять не СЗ, а С5. Иными словами, он становит-
ся С5-конвертазой АПК [с похожим на СЗ бел-
ком CoVF из яда кобры возникают аналогич-
ные СЗ-конвертаза CoVFBb и С5-конвертаза
CoVFC3bBb].
Молекулы С5Ь, вырабатываемые С5-кон-
вертазой альтернативного пути, индуцируют
точно такой же процесс спонтанной сборки
МАК, какой происходит и в КПК.
Следует, однако, заметить, что разные пути
комплемента совпадают не только по механизму
терминального этапа мембранной атаки и цито-
лиза. Общность обоих путей обусловлена еще и
тем, что в каждом из них обязательной стадией
является наработка молекул СЗЬ. Появившись
на одном из путей, в определенных условиях
они могут быть использованы и для построения
конвертаз другого, повышая эффективность его
последующих стадий. Так возникает феномен
амплификации, - усиления одного из путей
активации комплемента за счет молекул СЗЬ,
генерируемых другим путем.
Обеспечение лизиса чужеродных или
трансформированных собственных клеток -
это отнюдь не единственная функция компле-
мента. Во многих ситуациях дело вообще не
доходит до формирования комплексов мем-
бранной атаки.
Так бывает, если антигеном выступает не
клетка, а белковая макромолекула, на которой
и происходит построение иммунного комплек-
са. Тогда решающее значение приобретают те
его фрагменты, для которых есть рецепторы на
форменных элементах крови. В частности,
многие клетки, включая нейтрофилы и макро-
фаги, обладают рецепторами к СЗЬ (обозна-
чаемыми как CR1, CR2, CR3 и CR4). Связыва-
ясь с СЗЬ в составе ИК, рецепторы фагоцитов,
как правило, инициируют процесс поглощения
иммунных комплексов, завершающийся их
внутриклеточным перевариванием.
Сходным механизмом могут обезврежи-
ваться и клетки бактерий, которые не допускают
формирования полного ИК, но способны фик-
сировать молекулы СЗЬ неподалеку от уже при-
крепленных иммуноглобулинов класса G. Такой
способ фиксации компонентов комплемента
называют опсонизацией бактерий. Она повыша-
ет уязвимость чуждых клеток, т.к. помогает фа-
гоцитам, обладающим рецепторами и к СЗЬ, и к
Fc иммуноглобулинов, распознавать «маркиро-
ванную» опсонинами клетку, а затем и «обвола-
кивать» эту «жертву» с последующим поглоще-
нием и полным перевариванием ее в составе
фаголизосом. Установлено, что помимо СЗЬ
функцию опсонинов могут выполнять и моле-
кулы С4Ь.
Совершенно необычна роль тех фрагмен-
тов, которые появляются в ходе активации
ПРОТЕОЛИЗ
297
комплемента, но не участвуют в дальнейшем
развитии каскада (иа рис. 8-8 и 8-9 они выде-
лены прямоугольными рамками). Поначалу их
расценили как «побочные» пептиды. Название,
однако, продержалось недолго: оказалось, что
некоторые из них обладают высокой биологи-
ческой активностью и имеют прямое отноше-
ние к явлению анафилаксии. Этим термином
обозначили выявленный еще в XIX веке фено-
мен повышенной чувствительности к повтор-
ной инъекции чуждого белкового материала.
Эффект мог быть очень сильным - вплоть до
развития шокового состояния (анафилактиче-
ский шок) и даже гибели животного. Постепен-
но выяснилось, что главные проявления анафи-
лаксии опосредуются особыми веществами -
анафилатоксинами. И лишь специальное изу-
чение недавно открытых «побочных» молекул
показало, что свойствами анафилатоксинов об-
ладают фрагменты СЗа и, особенно, С5а (кото-
рый в 20 раз эффективнее). Связываясь со спе-
циальными рецепторами тучных клеток и базо-
филов, эти пептиды (размерами в 77 и 74 АО)
вызывают их дегрануляцию с выбросом гиста-
мина, который, в свою очередь, повышает сосу-
дистую проницаемость и стимулирует сокраще-
ние гладких мышц. Кроме того, С5а обладает
свойствами аттрактанта, обеспечивая хемотак-
сис лимфоцитов и их агрегацию. Воздействуя на
В-лимфоциты, С5а усиливает выработку анти-
тел, а СЗа тормозит ее. Пептид С4а по спектру
действия аналогичен анафилатоксину СЗа, но на
два порядка слабее его. Все перечисленные эф-
фекты являются элементами воспалительного
ответа на повреждение ткани. В реальности их
может быть больше, поскольку рецепторы к СЗа
и С5а имеются и на других клетках (нейтрофи-
лы, эозинофилы, моноциты, макрофаги).
Инактивация анафилатоксинов осущест-
вляется путем отщепления С-концевого арги-
нина, которым обладает каждый из трех пепти-
дов. Эту реакцию очень быстро (в течение се-
кунд) реализует фермент плазмы карбоксипеп-
тидаза N, иначе именуемая кининазой I (см.
табл. 8-5). Поэтому анафилатоксины очень не-
долговечны (как это и положено сигнальным
молекулам вообще).
Регуляторные механизмы в системе
комплемента призваны обеспечивать необхо-
димый н достаточный уровень защиты от чуж-
дого материала, появившегося в организме.
Как и во всяком протеолитическом каскаде,
здесь важно удерживаться на узкой грани меж-
ду эффективностью ответа и его чрезмерно-
стью (которая опасна появлением избытка ак-
тивных молекул, способного привести к неже-
лательным последствиям).
Ведущую роль в поддержании такого ба-
ланса играют специальные ре1уляторные бел-
ки, число которых даже превышает количество
компонентов самого каскада. Почти все они не
являются ферментами, а способны лишь к не-
ковалентным взаимодействиям с теми или
иными компонентами комплемента (либо про-
дуктами их активации). Очевидно, что эффект
таких регуляторов обусловлен их влиянием на
процессы ассоциации-диссоциации межбелко-
вых комплексов, формирование которых лежит
в основе функционирования комплемента.
Лишь два регуляторных белка нацелены на
ковалентное преобразование компонентов ком-
племента. Один из них именуется С1-ингиби-
тором, т.к. ои блокирует активную форму
комплекса С1. Другой представляет собой
протеиназу, способную расщеплять молекулы
СЗЬ и С4Ь, и потому обозначается как
СЗЬ/С4Ь-инактиватор (синоним: фактор I).
С 1-ингибитор (Cling) является главным
регулятором активированного С1. По строению
похож на другие серпины (а,-АТ, антитромбин
III и т.д.) и вызывает инактивацию ряда фер-
ментов, включая КК, плазмин, факторы ХНа и
Х1а. Но для активированной формы С1 он яв-
ляется единственным ингибитором. Точнее,
под его воздействием необратимо блокируются
субкомпоненты С1г и Cis в составе жидкофаз-
ного С1 и, особенно, в виде свободных моле-
кул. Однако они недоступны для Cling, когда
ассоциированы с С1, встроенным в полноцен-
ный иммунный комплекс. Следовательно, этот
ингибитор устраняет активные протеиназы на-
чального этапа КПК в тех случаях, когда они
появляются из-за случайной активации вне
иммунного комплекса либо при его распаде.
Вместе с тем, Cling не препятствует «правиль-
ному» течению инициации КПК.
Роль такого препятствия выполняет другой
белок, - CAq-ингибитор. По сути, он не является
ингибитором в обычном смысле слова. Обладая
298
Глава 8
адгезивными свойствами, этот белок затрудняет
ассоциацию Clq с иммуноглобулинами в соста-
ве комплексов Аг-Ат. Результат противостояния
зависит как от структуры иммунных комплексов
(степени их «полноценности»), так и от соотно-
шения локальных концентраций Clq и его ин-
гибитора. То же самое относится к так называе-
мому фактору J. Этот небольшой белок, обладая
катионными свойствами, затрудняет сборку ак-
тивированного комплекса С1.
О важности контроля за активацией ком-
понента С1 свидетельствует, в частности, тя-
жесть проявлений врожденной недостаточно-
сти С 1-ингибитора, описанной как ангионевро-
тический отек (отек Квинке). Заболевание со-
провождается эпизодическими отеками в ко-
нечностях, брюшной полости, области лица и
шеи. Приступы провоцируются стрессом или
травмой и длятся от 1 до 3 дней. Особенно опа-
сен отек гортани, который может привести к
летальному исходу. Причиной появления ло-
кальных отеков считают избыточность актива-
ции С1 и, как следствие, компонентов С4 и С2;
все вместе это усиливает выработку биологи-
чески активных пептидов, включая брадикинин
(см. табл. 8-3), который обладает сильным со-
судорасширяющим действием и повышает
проницаемость капилляров.
СЗЪ/САЪ-инактиватор (фактор I) играет
решающую роль в регуляции второго этапа
комплемента — этапа каскадного усиления. Бу-
дучи сериновой протеиназой, он содержится в
плазме крови в активной форме, т.е.. подобно
фактору D, является «протеиназой, ожидающей
появления своего субстрата». Однако, в отли-
чие от фактора D, ферментативную активность
фактор I проявляет только при поддержке спе-
циальных белковых кофакторов. В плазме кро-
ви существуют два таких белка. Каждый свя-
зывается не с ферментом, а с его субстратом
(СЗЬ или С4Ь), взаимодействуя с ним своей
SCR-зоной. Один из них - фактор Н - требует-
ся для реакций расщепления молекулы СЗЬ (до
неактивного iC3b и фрагментов C3f и C3dg).
Другой, обозначаемый как С4-связывающий
белок (С4Ьр), необходим для гидролиза факто-
ром I двух пептидных связей в С4Ь, приводя-
щего к появлению C4d и С4с.
Наряду с плазменными кофакторами фак-
тора 1 существуют и сходные с ними белки,
фиксированные на мембранах клеток хозяина
(гомологичные клетки). К ним относятся мем-
бранный кофакторный белок (МСР) и фактор,
ускоряющий распад (decay-accelerating factor,
DAF). В обоих есть область SCR-повторов, по-
средством которой они взаимодействуют с
фрагментами СЗЬ и С4Ь, ослабляя их связь с
партнерами в составе конвертаз, а именно - с
ВЬ и С2а, соответственно. Иными словами, оба
белка способствуют диссоциации комплексных
конвертаз КПК и АПК и тем самым снижают
их эффективность. В какой-то степени этому
противостоит фактор Р (пропердин), который,
подключаясь к конвертазам АПК, очень эф-
фективно способствует их стабилизации.
По сравнению с DAF, мембранный белок
МСР обладает более широким потенциалом,
ибо функционирует еще и как кофактор факто-
ра I. В этом плане ему подобен клеточный ре-
цептор комплемента типа 1 (CR1). Однако, в
отличие от МСР (и от DAF), этот рецептор
взаимодействует с теми молекулами СЗЬ и С4Ь,
которые ковалентно фиксированы не на своей
собственной, а на другой клетке или иммунном
комплексе. Кроме того, в качестве кофактора
рецептор CR1 обеспечивает несколько более
глубокое расщепление фактором I молекул СЗЬ
и С4Ь.
Заключительный этап активации компле-
мента контролируется белками, которые обла-
дают достаточно высоким сродством к компо-
нентам комплекса мембранной атаки. Вступая
с ними в нековалентное, но довольно стабиль-
ное объединение, регуляторные белки препят-
ствуют сборке МАК и способствуют его дезин-
теграции.
В плазме крови роль главного регулятора
терминального этапа принадлежит витронек-
тину, - белку, открытому как «фактор, вызы-
вающий распластывание клеток на стекле».
Подобно другим адгезивным макромолекулам
(включая фибронектин и фактор ФВ), он со-
держит центр связывания с клетками (последо-
вательность RGD). Будучи белком полифунк-
циональным, в системе комплемента витронек-
тин проявляет себя, прежде всего, высоким
сродством к С5Ь-7. При его связывании с этим
незавершенным комплексом мембранной атаки
образуется конгломерат, который неспособен к
внедрению в мембрану клетки-мишени, но со-
ПРОТЕОЛИЗ
299
храняет привлекательность для С8 и С9. Воз-
никающие объединения витронектина с С5Ь-8
и С5Ь-9 не обладают цитолитической активно-
стью и выводятся из кровотока. Кроме того,
этот регулятор еще и угнетает процедуру по-
лимеризации компонента С9, необходимую
при формировании трансмембранного канала.
Таким образом, все перечисленные эффекты
витронектина направлены на ограничение ком-
плементзависимого лизиса клеток.
Клеточные мембраны тоже обладают
структурами, контролирующими формирова-
ние МАК. Одной из них является С8-связы-
вающий белок (С8Ьр), который препятствует
включению С8 в комплекс С5Ь-7. При этом он
взаимодействует только с гомологичным С8 и
не влияет на сборку гетерологичного МАК.
Аналогичным действием, но только в от-
ношении С9, обладают гликофорин эритроци-
тов и протекший, присутствующий на мембра-
нах многих клеток разного типа. Связываясь с
С8 в составе комплекса С5Ъ-8, эти регуляторы
препятствуют правильной фиксации на нем
компонента С9. Детальный анализ показал, что
протектин при этом взаимодействует не только
с комплексированным 8, но и с С9. По сущест-
ву, его следовало бы назвать С8,9-связываю-
щим белком. Однако этого не позволяет его
полифункциональность: будучи лейкоцитар-
ным антигеном CD59, протектин участвует и в
других проявлениях активности обладающих
им клеток.
Некоторые из мембранных регуляторов
комплемента фиксируются на клетке гликофос-
фолипидным якорем. Мутации, приводящие к
нарушению биосинтеза якорного фрагмента
протектина, С8Ьр и DAF, проявляют себя пато-
логией, описанной ранее как пароксизмальная
ночная гемоглобинурия. Ведущая симптома-
тика этой болезни обусловлена недостаточной
защитой эритроцитов от собственного компле-
мента, из-за чего возникают приступы компле-
ментзависимого гемолиза. Генерализации про-
цесса не наступает потому, что только отдель-
ные клоны эритроцитов имеют такой дефект.
Известны также дефициты экспрессии
протектина в сперматозоидах (что приводит к
аспермии) и в меланоцитах (витилиго). Напро-
тив, для раковых клеток характерна избыточ-
ная выработка протектина. Поэтому такие
клетки, хотя и стимулируют активацию ком-
племента, сами, как правило, устойчивы к ком-
плементзависимому лизису.
Итак, можно выделить наиболее яркую от-
личительную особенность комплемента. Она
заключается в том, что на всех этапах и акти-
вации системы, и ее контроля едва ли не ре-
шающими элементами являются нефермента-
тивные процессы взаимного узнавания макро-
молекул и, как следствие, формирования неко-
валентных белок-белковых комплексов.
Как и другие системы каскадного протео-
лиза, комплемент принципиально отличается
от обычных мультиферментных цепей метабо-
лизма тем, что реализует свою функцию только
путем самоистощения. Поэтому к ним непри-
меним термин «ключевой фермент», которым
принято обозначать лимитирующее звено, чув-
ствительное к аллостерическим эффектам соб-
ственного продукта (субстрата), - ближайшего
либо отдаленного (благодаря чему обеспечива-
ется автономная саморегуляция всей метабо-
лической цепи). Очевидно, что саморегуляция
протеолитического каскада должна обеспечи-
ваться иным механизмом.
Пороговый принцип саморегуля-
ции - новое понятие, которое сформулирова-
но по результатам исследований комплемента,
выполненных сотрудниками кафедры биохи-
мии Санкт-Петербургского государственного
медицинского университета им. акад. И.П. Пав-
лова. Начальные эксперименты были проведе-
ны с очищеннными препаратами факторов В и
D, которые смешивали с сывороткой крови че-
ловека, избирательно лишенной того или дру-
гого. Оказалось, что малые количества фактора
В. добавленные к дефицитной по нему сыво-
ротке, не вызывали лизиса гетерологичных
клеток (эритроциты кролика). Иммунный лизис
наступал только тогда, когда добавляемое ко-
личество фактора В превышало некую критич-
ную величину. С дальнейшим увеличением
такой добавки скорость гемолиза закономерно
возрастала. Экстраполяция этой закономерно-
сти позволяла экспериментально определить ту
«пороговую» величину, превышение которой
необходимо для активации комплемента с дос-
тижением конечного эффекта (лизис клеток).
Аналогичные результаты были получены в
экспериментах с фактором D и дефицитной по
300
Глава 8
нему сывороткой, но не с компонентом СЗ,
оказавшимся эффективным даже в едва улови-
мых концентрациях (Л.В. Галебская, И.Г. Щер-
бак, П.П. Бельтюков, Е.В. Рюмина, И.Л. Солов-
цова, 1993). Позднее эффект «порога» был
установлен и для компонента С1.
Анализ экспериментальных данных пока-
зал, что величина пороговой концентрации ха-
рактеризует общий эффект всех внекаскадных
факторов (ингибиторы, инактиваторы), кото-
рые способны блокировать определенное ко-
личество соответствующей протеиназы (в ее
активной форме). Их совокупный потенциал
можно представить себе в виде барьера на пути
лавинообразного усиления каскадного процес-
са. Такого рода препятствие призвано «гасить»
процесс при умеренной степени его активации,
но пропускать достаточную часть лавины
дальше, если ее мощность превзойдет кон-
трольную отметку (высоту «порога»).
Каскадные протеолитические системы
уникальны в том, что их естественный катабо-
лизм и реализация их физиологической функ-
ции вплоть до конечного эффекта представля-
ют собой один и тот же процесс молекулярных
превращений. Разница лишь в интенсивности
этого процесса. Пороговый механизм разгра-
ничивает два уровня активации каскадного
протеолиза. При достаточно выраженном сиг-
нале со стороны инициирующего фактора сте-
пень активации превзойдет критичную отметку
мощности порога, благодаря чему становится
возможной реализация конечной функции, -
такой как лизис чужеродных клеток или гемо-
коагуляиия. Допороговый же уровень актива-
ции ведет к распаду предшествующих компо-
нентов каскада, компенсируемому их ресинте-
зом в рибосомах.
Такое непрерывное обновление макромо-
лекул протеолитической системы, очевидно,
необходимо для обеспечения ее постоянной
готовности к срочному срабатыванию с после-
дующим быстрым восполнением израсходо-
ванных белков. Однако отмеченная выше мно-
жественность порогов в рамках одного протео-
литического каскада приводит к заключению,
что допороговый режим нужен не только для
обновления звеньев системы и поддержания ее
в состоянии «свежей» готовности. Очевидно,
возможна фрагментарная активация системы
на участке между двумя порогами (Щер-
бак И.Г., 1997,1998).
Такое заключение подтверждают расчеты,
выполненные по результатам экспериментов в
условиях, достаточно близких физиологиче-
ским. А именно: для преодоления порога и дос-
тижения конечного эффекта (лизис клеток)
необходимо достаточно быстро проактивиро-
вать 10-20% имеющегося в сыворотке компо-
нента С1, но почти половину присутствующего
в ней фактора В. Что же касается фактора D, то
его пороговая концентрация вдвое выше ре-
ального содержания этой активной протеиназы
в крови. Следовательно, степень активации
АПК, достаточная для иммунного лизиса чуж-
дых клеток, может быть достигнута только по-
средством снижения тех порогов, которые
сдерживают эффекты протеиназ, формируемых
благодаря действию фактора D. К такому ре-
зультату может приводить, например, стабили-
зация конвертазных комплексов АПК.
Фрагментарная активация, осуществляемая
в допороговом режиме работы системы в целом,
не приводит к реализации конечной функции
всего каскада, но сопровождается появлением
биологически активных продуктов, в том числе
анафилатоксинов. Есть основания полагать, что
и другим продуктам «незавершенной» (межпо-
роговой) активации любого протеолитического
каскада присущи свои специальные функции.
8.6.4. ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА
РЕГУЛЯЦИИ СОСУДИСТОГО ТОНУСА
Долгое время основным регулятором арте-
риального давления (АД) считали симпатиче-
ский отдел центральной нервной системы, а
применение адреноблокаторов и других антиад-
ренергических средств было едва ли не единст-
венным способом лечения гипертонической бо-
лезни. Лишь в середине XX века, благодаря дос-
тижениям в области белковой химии, была ус-
тановлена важная роль небольших пептидов,
вызывающих сужение кровеносных сосудов (ан-
гиотензин П) либо их расширение (брадикинин).
Вообще-то история открытия вазоактив-
ных пептидов началась гораздо раньше. Еще на
излете XIX века были сделаны наблюдения о
том, что почки выделяют в кровоток некую
«прессорную субстанцию». Но только лет 40
ПРОТЕОЛИЗ
301
спустя удалось показать, что она является про-
теолитическим ферментом, который вырабаты-
вает прессорный пептид, названный ангиотен-
зином. Когда стала возможной расшифровка
его структуры, оказалось, что он является ок-
тапептидом, который обозначили как ангио-
тензин II. Его строение описано в табл. 8-3, как
и строение сосудорасширяющего нонапептида,
известного под названием брадикинин. Оба они
не синтезируются как таковые, а происходят из
крупных белковых молекул — ангиотензиноге-
на и кининогенов (табл. 8-4). Высвобождение
вазоактивных пептидов происходит путем
ограниченного протеолиза этих предшествен-
ников. Его реализуют соответственные про-
теиназы - ренин и калликреин (КК), описание
которых дано в табл. 8-5. Другие протеиназы
производят быструю деградацию возникающих
активных продуктов, обеспечивая им короткий
век (измеряемый всего лишь десятками се-
кунд). Это означает, что вазоактивные пептиды
фактически являются сигнальными молекула-
ми, успевающими оказать лишь краткосрочное
воздействие на соответствующие мишени.
Первоначальные представления о взаим-
ной независимости ренин-ангиотензиновой и
калликреин-кининовой систем были поколеб-
лены открытием нового фермента, который,
как оказалось, связывает их воедино.
В 1963 г. Ю.Е. Елисеева и академик
В.Н. Орехович из Института биологической и
медицинской химии (Москва) опубликовали
работу, в которой отметили способность обна-
руженной ими новой протеиназы отщеплять
дипептидные фрагменты с С-конца различных
олигопептидов. Выделив со временем высоко-
очищенный препарат, они показали, что этот
фермент (названный ими карбоксикатепсином)
катализирует такие реакции ограниченного
протеолиза, которые приводят к прямо проти-
воположным эффектам в отношении сосуди-
стого тонуса. Одна из них — образование
сосудосуживающего пептида (ангиотензин II)
из его непосредственного предшественника
(ангиотензин I). Другая — протеолитическая
инактивация брадикинина, обладающего силь-
ным депрессорным действием.
Таблица 8-3
Вазоактивные пептиды протеолитической системы регуляции сосудистого тонуса
Ангиотензин II Наиболее мощный из известных вазопрессорных агентов, ангиотензин II (октапептид асп-Ьрг-вал-тир-иле-гис-про-фен) образуется из неактивного ангиотензина 1 путем уда- ления С-концевого дипептида гис-лей. Гипертензивный эффект ангиотензина II вслед- ствие уменьшения просвета артериол дополняется стимулирующим действием его на реабсорбцию Na+ и воды в почечных канальцах, а также на секрецию альдостерона - самого активного гормона минералкортикоидной группы, обеспечивающего зедержку Na+ и воды в организме и выведение К*. Ангиотензин III, отличающийся от ангиотензина II отсутствием аспартата, сохраняет лишь способность усиливать выделение альдосте- рона. Появляясь, эти пептиды очень быстро инактивируются анеиотензиназами.
Брадикинин Представляет собой нонапептид арг-про-про-гли-фен-сер-про-фен-арг, путем огра- ниченного протеолиза вычленяемый из срединной части кининогенов. Снижая тонус гледкомышечного слоя сосудов, вызывает увеличение просвета периферических и ко- ронарных артерий (ведущее к снижению АД). Кроме того, бредикинин повышает прони- цаемость капилляров, усиливает выведение Na+ и воды, а также выполняет роль ме- диатора в некоторых реакциях воспаления. Тучные клетки освобождают его во время приступа астмы. Инактивация брадикинина реализуется удалением С-концевого аргини- на (кининвза 1) или дипептида фен-арг (кининаза II). Для введенного в кровь бредикини- на То,5 составляет 17-24 секунд в большом круге кровообращения, а в малом - и того меньше. Сходными свойствами обладают другие кинины, представляющие собой молекулу бредикинина, N-конец которой удлинен на молекулу лизина (лиз-брадикинин; каллидин) или на дипептид мет-лиз (меш-бредикинин).
302
Глава 8
Предшественники вазоактивных пептидов
Таблица 8-4
Ангиотензиноген Синтезируется гепатоцитами как гликопротеин, состоящий из почти 500 АО. По- сле удаления сигнального пептида (33 АО) поступает в кровь в виде одной поли- пептидной цепи, гидролиз которой по связи лещз-еал-ы осуществляет аспартатная протеиназа ренин. Отделяемый ею N-концевой декапептид асп-арг-вал-тир-иле- гис-про-фен-гис-пей известен как ангиотензин 1, который и является непосредст- венным предшественником ангиотензина II. Предназначение остальной части ан- гиотензиногена (состоящей из 442 АО) остается пока неясным.
Кининогены Кининогены являются мультифункциональными гликопротеинами плазмы, ограниченный протеолиз которых калликреином или фактором ХПа приводит к вы- членению активных кининов, - главным образом, бредикинина (аргзва-аргздо) либо лиз-бредикинина (лиззатаргзэо)- Высокомолекулярный к ин ин о ген (ВМК) состоит из почти 650 АО и синте- зируется гепатоцитами в виде гликопротеина. По удалении сигнального пептида (18 АО) он поступает в плазму крови, где содержится в концентрациях 65-30 мг/л (не уменьшаясь после свертывания крови). Извлечение кинина разделяет молекулу ВМК на две цепи, удерживаемых вместе дисульфидной связью. Меньшая по разме- рам (С-концевая) содержит участок ассоциации с анионными поверхностями (бога- тый гистидином и глицином), а также особую зону (58 АО) для связывания с факто- ром XI, центральная часть которой (30 АО) обладает высоким сродством к проКК. Именно через ВМК оба эти профермента сорбируются на анионных структурах. Со- всем иначе устроена тяжелая цепь (N-концевая). В ней есть локусы Zn +-зависимой фиксации на эндотелии, тромбоцитах и нейтрофилах, а также пептид, в свободном виде способный угнетать предсердный натрийуретический фактор, и, наконец, повторяющиеся сайты, подобные ингибиторам цистеиновых протеиназ (поэтому кининогены крови являются главным фактором системной защиты от этой группы ферментов лизосомного или микробного происхождения). Связывание ВМК с тром- боцитами подавляет их агрегацию и вообще функциональную активность (антиад- гезивный эффект распространяется и на нейтрофилы). Низкомолекулярный кининоген (НМК) появляется в результате альтерна- тивного сплайсинга и оказывается на треть короче (с С-конца), чем ВМК. Поэтому он не обладает центрами связывания, имеющимися в легкой цепи ВМК, и не участ- вует к контактной фазе гемокоагуляции (хотя в плазме его адвое больше, чем ВМК), но сохраняет способность угнетать агрегацию тромбоцитов. Помимо фактора ХПа и калликреина, расщеплять кининогены могут также (в разных местах) плазмин, нейтральная эластаза и фактор Xia, под действием кото- рого (в трех точках) в ВМК повреждается сайт для связывания с анионной поверх- ностью.
Почти одновременно аналогичные резуль-
таты опубликовали две другие группы иссле-
дователей (Yang H.Y.T., Erdos E.G., 1967-1972;
Skeggs L.T. et al., 1972-1974). Для новой про-
теиназы утвердилось название ангиотензин-
превращающий фермент (АПФ), а наименова-
ния «карбоксикатепсин» и «кининаза П» со-
хранились в качестве синонимов.
С открытием нового фермента стало оче-
видным, что ренин-ангиотензиновая и каллик-
реин-кининовая системы представляют собой
разные ветви единого протеолитического кас-
када, регулирующего сосудистый тонус путем
генерации вазоактивных пептидов разнона-
правленного действия. Последовала нарастаю-
щая волна работ, показавших, что АПФ играет
действительно главенствующую роль в регуля-
ции АД В рамках этих исследований были це-
ленаправленно синтезированы и испытаны раз-
личные препараты, способные угнетать АПФ.
Наиболее эффективные из них стали «средст-
вом номер один» в лечении гипертонической
болезни и ряда других сердечно-сосудистых
заболеваний. Синтез новых, все более избира-
тельных препаратов продолжается и в настоя-
щее время.
ПРОТЕОЛИЗ
303
Таблица 8-5
Протеиназы системы вазоактивных пептидов
Калликреины (КК) Плазменный КК синтезируется в печени как гликопротеин (>600 АО) и после уда- ления сигнального пептида (19 АО) поступает в кровь в виде проКК. Переход его в ак- тивную форму происходит путем гидролиза связи аргзэо-илезэт, реализуемого в основ- ном фактором ХНа, но в заметной степени и неферментативно, - благодаря конформа- ционной перестройке, вызываемой сорбцией проКК на молекуле ВМК, нековалентно связанной с эндотелием. Разделение на два фрагмента (удерживаемых вместе S-S-мостиком), ведет к раскрытию активного центра сериновой протеиназы в меньшем из них при сохранении в другом (N-концевом) участков связывания с ВМК, фактором XII и нейтрофилами. Помимо высвобождения брадикинина из кининогенов, КК плазмы спо- собен превращать проренин в ренин, а также активировать факторы XII и VII гемокоагу- ляции, плазминоген и тПА в системе фибринолиза, фактор В компонент С1 системы комплемента. Комплексирование с ВМК предохраняет молекулу КК от инактивации плазменными серпинами (С1-инактиватор, Ог-МГ, антитромбин III). Тканевые КК известны в разных вариантах, в зависимости от места синтеза. Со- держатся они в органах с экзокринной функцией и их секретах (почки, стенка кишки, поджелудочная, слюнные, половые, потовые железы), а также в сосудистой стенке, кар- диомиоцитах и в нервной ткани. По размеру они почти втрое уступают плазменной изо- форме, а активируются путем отщепления N-концевого гексапептида при гидролизе по связи арегл-илегъ трипсиноподобными протеиназами. Еще одно отличие заключается в том, что в кининогенах они вместо связи лиззво-аргзв! предпочитают гидролизо-вать связь меп?з79-лшз80 либо лейз73-метз7в, генерируя соответственно каллидин и мет- бредикинин.
Ренин Аспартатная протеиназа, вырабатываемая юкстагломерулярными клвтками а виде гликопротеина (» 400 АО), который после удаления сигнального пептида (23 АО) накап- ливается в плотных гранулах в форме зимогена. Опосредуемое рецепторами выделе- ние его в кровь происходит в ответ на понижение АД, потерю жидкости или снижение уровня Na+ в плазме. Активацию проренина осуществляет КК путем гидролиза связи аргвб-лейб7, ведущего к удалению N-концевого пропептида (43 АО). Единственная из- вестная функция ренина - гидролиз ангиотензиногена по связи лещз-еалм с высвобож- дением ангиотензина I (см. табл. 8-4).
Ангиотензин- превращающий фармент (АПФ) АПФ (карбоксикатепсин; кининаза II) является 7п2+-содержащей металлопротеина- зой, активируемой ионами СГ. Синтезируется в виде гликопротеина (1306 АО) практиче- ски всеми соматическими клетками (особенно - эндотелием легких) Основная масса АПФ представлена интегральным белком плазматической мембраны, почти вся молеку- ла которого (включая два неидентичных активных центра) находится вне клетки. Рас- творимая форма АПФ есть едва ли не во всех жидкостях тела, и не только из-за фер- ментативного отщепления от мембранной, но и благодаря синтезу белка, не имеющего трансмембранного фрагмента. Тестикулярный вариант фермента (продукт альтерна- тивного сплайсинга) почти вдвое короче и содержит только один активный центр. Отщепляя С-концевые дипептиды, АПФ превращает ангиотензин I в вазоконстрик- тор ангиотензин II и инактивирует сосудорасширяющий пептид брадикинин (и его гомо- логи).
Кининаза 1 Тетрамерный глобулин плазмы, состоящий из двух каталитических субъединиц и двух неактивных. Каждая кининазная цепь (> 400 АО) представляет собой Zn2+- содержащую карбоксипептидазу, способную удалять С-концевой лизин или аргинин, чем обеспечивается инактивация таких высокоактивных пептидов, как кинины и анафи- латоксины.
Ангиотен- зиназы Известно несколько фарментов, обеспечивающих быструю инактивацию ангиотен- зина II путем отщепления аминокислотных остатков, чаще всего с N-конца. Последова- тельность их воздействия определяется субстратной избирательностью к концевым аминокислотам.
304
Глава 8
На рис. 8-10 представлена структура ренин-
ангиотензиновой и калликреин-кининовой вет-
вей как составных частей объединенной протео-
литической системы регуляции сосудистого то-
нуса посредством вазоактивных пептидов.
Решающую роль в инициации выработки
ангиотензина II и кининов играют циркули-
рующие в крови высокомолекулярный кинино-
ген (ВМК) и прокалликреин (проКК). Точнее,
пусковым событием является сорбция проКК
на специальном участке молекулы ВМК, пред-
варительно фиксированной (нековалентно)
другим своим сайтом на поверхности эндоте-
лия. В возникшем комплексе проКК сохраняет
доступной свою зону связывания с фактором
ХПа. который и гидролизует в молекуле проКК
«стратегическую» связь аргзэо-илвзы- Образо-
вавшиеся фрагменты удерживаются вместе ди-
сульфидной связью, но в меньшем из них рас-
крывается протеолитический модуль сериново-
го типа. Такой путь превращения предшествен-
ника в активный КК считается доминирую-
щим.
Однако весомую роль играет и нефермен-
тативное активирование молекул проКК, реа-
лизуемое независимо от фактора ХПа. Оно
происходит благодаря тому, что сама по себе
сорбция проКК на молекуле ВМК, связанной с
эндотелием, вызывает такую конформацион-
ную перестройку этого зимогена, которая обес-
обеспечивает спонтанный гидролиз все той же
«ранимой» связи аргздо-илезы и, следовательно,
неферментативную продукцию активной фор-
мы фермента.
Из всех реакций, которые способен ката-
лизировать КК, две имеют прямое отношение к
регуляции сосудистого тонуса. Одна из них
заключается в избирательном «выщеплении»
брадикинина (либо каллидина или же?и-бра-
дикинина, - см. табл. 8-3) из белковых предше-
ственников — кининогенов (ВМК или НМК; их
описание приведено в табл. 8-4). Другая —
избирательное расщепление проренина по свя-
зи арг^-лейю, преобразующее его в активный
ренин. Эта аспартатная протеиназа (табл. 8-5),
в свою очередь, отщепляет от ангиотензиноге-
на N-концевой декапептид, названный ангио-
тензином 1. Высокую биологическую актив-
ность (включая мощный прессорный эффект)
он приобретает после превращения в ангиотен-
зин II, которое происходит путем удаления
С-концевого ди пептида гли-лей. Эту реакцию
осуществляет АПФ, который, вместе с тем, ка-
тализирует и реакцию отщепления дипептида
фен-арг с С-конца брадикинина и других ки-
нинов, что ведет к потере ими биологической
активности. Инактивацию ангиотензина II
обеспечивают несколько различающихся фер-
ментов, обозначаемых общим названием ан-
гиотемзиназы.
ПРОКАЛЛИКРЕИН
<----ВМК (спонтанно)
-*---XI 1а (ферментативно)
ПРОРЕНИН КИНИНОГЕН(Ы)
1«-----КАЛЛ И КРЕИ Н------------->1
I*-----РЕНИН БРАДИКИНИН(ы)
АНГИОТЕНЗИН I
АПФ
фен-арг •
КИНИНАЗА 1
арг
АНГИОТЕНЗИН II
Неактивные
ангиотензиназы
Неактивные
продукты
деградации
продукты
укорочения
С-конца
I
Продукты
полной
деградации
Рис. 8-10. Общая схема протеолитической системы вазоактивных пептидов.
ПРОТЕОЛИЗ
305
Таким образом, главное предназначение
объединенных ренин-ангиотензиновой и кал-
ликреин-кининовой систем сводится к выра-
ботке небольших пептидов, обладающих высо-
кой и очень избирательной биологической ак-
тивностью и подвергаемых вскоре полной
инактивации. В какой-то степени это напоми-
нает систему комплемента, активация которой
сопровождается появлением, по меньшей мере,
двух «побочных» пептидов, которые ранее
(еще до выяснения их структуры и генеза) бы-
ли известны по их высокой и очень своеобраз-
ной биологической активности (анафилатокси-
ны). Но только здесь выработка функциональ-
но активных пептидов является не попутным
результатом, а главным предназначением про-
теолитической системы.
Влияние вазоактивных пептидов на кровя-
ное давление обусловлено не только прямым
воздействием на тонус сосудистой стенки, но и
их участием в регуляции водно-солевого обме-
на. В частности, ангиотензин II вызывает уве-
личение объема циркулирующей крови, умень-
шая почечную экскрецию Na+ (а с ним - и во-
ды) и, кроме того, стимулируя поступление в
кровь альдостерона — самого эффективного из
минералкортикостероидных гормонов (он уси-
ливает канальцевую реабсорбцию Na+, а также
способствует выведению ионов К+ и NH/ поч-
ками, слизистой кишечника, слюнными и по-
товыми железами). Брадикинин же, помимо
сосудорасширяющего действия, стимулирует
выведение Na+ и воды почками и значительно
повышает проницаемость капилляров.
Системная регуляция кровообращения -
наиболее изученная, но не единственная роль
вазоактивных пептидов. В последние годы на-
капливаются данные о том, что на тканевом
уровне они могут участвовать в регулировании
таких сложных процессов, как морфогенез и
трансформация клеток, развитие воспаления,
процессы репарации, гипертрофия миокарда в
ответ на физические нагрузки и т.д. В этой свя-
зи примечателен тот факт, что молекулы всех
калликреинов содержат домены, идентичные
определенным факторам роста.
Недавно показано, что многие клетки (эн-
дотелий, кардиомиоциты, фибробласты) обла-
дают рецепторами, взаимодействие с которыми
ведет к интернализации почечного проренина с
активацией его внутри клеток (в частности,
калликреином). Наличие здесь диффундирую-
щего из крови ангиотензиногена и мембрано-
связанного АПФ создает возможность локаль-
ной генерации ангиотензинов I и II. Полагают,
что именно местная (тканевая) активация сис-
темы вазоактивных пептидов обеспечивает эф-
фекты (такие как ремоделирование тканей
сердца), выходящие за рамки регуляции сис-
темного кровообращения.
Обнаружением способности жировой тка-
ни человека синтезировать ангиотензиноген, а
также катепсины D и G, которые вырабатыва-
ют из него ангиотензин II, не только подтвер-
ждена необходимость местной продукции ва-
зоактивных пептидов, но и продемонстрирова-
на возможность нерениновой активации ренин-
ангиотензиновой системы.
Дальнейшие исследования, несомненно,
позволят полнее выявить значение тканевой
мобилизации протеолитической системы вазо-
активных пептидов и установить механизмы их
физиологических эффектов.
Глава 9
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
Запасы питательных веществ в животном
организме могут создаваться лишь в форме по-
лимеризованной глюкозы (гликоген) и водо-
нерастворимых триглицеридов (жировые де-
по). Природой не предусмотрено никакого на-
копления резервных белков и, тем более, ами-
нокислот. Поэтому в обычной ситуации у
взрослого человека ежесуточно расщепляется
столько же аминокислот, сколько поступает с
пищевыми белками, т.е., порядка 100 г.
Некоторые реакции распада а-аминокис-
лот затрагивают только общую для них часть
молекулы (т.е., содержащую -СООН и «-ами-
ногруппу')- Совсем иные ферменты реализуют
превращения того фрагмента (R), которым од-
на аминокислота отличается от всех других.
Соответственно этому различают общие для
них пути метаболизма и пути, специфичные
для каждой данной аминокислоты. Кроме того
целесообразно специально рассмотреть участие
аминокислот в биосинтезе важных небелковых
молекул. - таких как гем и азотистые компо-
ненты нуклеиновых кислот (пиримидиновые и
пуриновые основания).
9.1. ОБЩИЕ ПУТИ РАСПАДА АМИНОКИСЛОТ
Три типа преобразований являются универ-
сальными для всех а-аминокислот: реакции де-
карбоксилирования, дезаминирования и транс-
аминирования (переаминирования). Сущест-
вующий в клетках набор ферментов способен
вовлечь в каждую из этих реакций почти любую
из кодируемых аминокислот.
9.1.1. ДЕКАРБОКСИЛИРОВАНИЕ
Несмотря на созвучное название, реакция
декарбоксилирования аминокислот принципи-
ально отличается от окислительного декарбо-
ксилирования а-кетокислот, описанного в раз-
деле 5.2.7 (см. рис. 5-15). Будучи локализован-
ными не в митохондриях, а в цитоплазме, де-
карбоксилазы а-аминокислот не сопряжены с
биоокислением. В качестве небелкового ком-
понента они содержат витамин Вб, активно-
стью которого обладают три пищевых продук-
та, легко превращаемые друг в друга: пиридок-
сол, пиридоксаль и пиридоксамин (рис. 9-1).
Коферментную функцию выполняет фосфори-
лированное производное пиридоксаля - пири-
доксальфосфат. В реакциях он участвует своей
альдегидной группой, поэтому для краткости
его изображают так: О=С(Н)-ПФ.
В общем виде ферментативное декарбо-
ксилирование а-аминокислот представлено на
рис. 9-2.
Сначала альдегидная группа пиридоксаль-
фосфата реагирует с аминогруппой субстрата,
что приводит к образованию шиффова основа-
ния (так издавна называют вещества, которые
содержат фрагмент >НС—N=CH~, подобный
обозначенному на рис. 9-2). Затем к нему вновь
присоединяется вода, но происходящее при
этом освобождение пиридоксальфосфата со-
провождается теперь выделением СОг с пре-
вращением исходной аминокислоты в соответ-
ствующий ей амин.
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
307
Пиридоксол
(пиридоксин)
(I)
Пиридоксаль
(II)
Пиридоксамин
(III)
Пиридоксальфосфат Пиридоксаминфосфат
(IV) (V)
Рис. 8-1. Строение витамина В6 (I—III) и его коферментных форм (IV. V).
Степень субстратной специфичности де-
карбоксилаз очень различна. К наиболее изби-
рательным относятся глутаматдекарбоксилаза
и гистидиндекарбоксилаза (рис. 9-3). Первая
сосредоточена преимущественно в клетках го-
ловного мозга и катализирует превращение
глутамата в у-аминомасляную кислоту (ГАМК),
которая играет важную роль в качестве нейро-
медиатора: многие нервные клетки обладают
теми или иными вариантами ГАМК-рецеп-
торов. Вторая из упомянутых декарбоксилаз
распространена гораздо шире, да и продуци-
руемый ею медиатор - гистамин - обладает
гораздо более разнообразными эффектами (они
опосредуются гистаминовыми рецепторами Н(
и Н2). К их числу относятся: расширение ка-
пилляров и повышение их проницаемости;
снижение артериального давления; повышение
тонуса и даже спазм гладких мышц бронхов и
стенок пищеварительного тракта; усиление вы-
деления желудочного сока, слюны, бронхиаль-
ного секрета. Неудивительно, что антигиста-
минные препараты находят - разнообразное
применение в практической медицине.
Декарбоксилирование гистидина осущест-
вляет и другой фермент — декарбоксилаза аро-
матических L-аминокислот. К числу ее суб-
стратов относятся также незаменимая амино-
кислота триптофан и его производное — 5-гид-
рокситриптофан (см. рис. 5-45). При их декар-
боксилировании возникают биологически ак-
тивные метаболиты - соответственно трипта-
мин и 5-гидрокситриптамин, более известный
под названием серотонин. Особенно много-
плановы эффекты последнего, реализуемые с
участием группы серотониновых рецепторов,
обладателями которых являются, в частности,
многие центральные нейроны.
Еще одним субстратом декарбоксилазы
ароматических кислот является производное
фенилаланина - 3,4-дигидрокси-Ь-фенилала-
нин (ДОФА). Как было показано на рис. 5-46,
реакция его декарбоксилирования приводит к
образованию дофамина, который не только
। А.
H-C-NH2 + С-ПФ
I /
СООН Н
R Н
I I
HC-N-C-ПФ
I
СООН
R
I
+ НгС- NH2
Пирид-
оксаль-
фосфат
а-Амино-
кислота
Пирид-
оксаль-
фосфат
Шиффово
основание
Амин
Рис. 9-2. Схема реакции, катализируемой декарбоксилазами о-аминокислот.
308
Глава 9
СООН СООН
’сн2 со2 "iH2
Ссн2 » Ссн2
,.| I т1
hc-nh2 h2c-nh2
СООН
Y-Амино-
Глутаминовая масляная
кислота кислота
(ГАМК)
СН2
I
hc-nh2
соон
Гистидин
Гистамин
Рис. 9-3. Реакции, катализируемые глутаматдекарбоксилазой (I) и гистидиндекарбоксилазой (II).
выполняет роль нейромедиатора, но и исполь-
зуется в качестве предшественника при синтезе
норадреналина и адреналина (см. рис. 5-49).
Что касается самого фенилаланина и про-
дукта его гидроксилирования - тирозина - то
для декарбоксилирования каждой из этих ами-
нокислот существуют свои специальные де-
карбоксилазы, превращающие их в фенилэти-
ламин и тирамин соответственно.
При декарбоксилировании лизина и орни-
тина (один из метаболитов аргинина) образу-
ются не моноамины, а диамины, а именно: ка-
даверин и путресцин (рис. 9-4). Эти вещества
впервые были обнаружены среди продуктов
гниения белков (а потому их отнесли поначалу
к так называемым «трупным ядам», хотя позже
выяснилось, что в действительности их ток-
сичность невелика и что кадаверин образуют
только бактерии).
У млекопитающих путресцин, образую-
щийся в клетках, подвергается дальнейшим
преобразованиям. В них принимает участие
Б-аденозипметилтиопропиламиНу который ге-
нерирует декарбоксилаза S-аденозилметионина
(рис. 9-5, реакция 1). Выделенный рамкой ами-
но пропильный фрагмент этого продукта может
быть перенесен на одну из аминогрупп путрес-
цина с превращением его в спермидин (реакция
2 на рис. 9-5). Аналогичным образом и к дру-
гой аминогруппе путресцина может присоеди-
няться остаток пропиламина, в результате чего
образуется еще один полиамин - спермин (ре-
акция 3).
У взрослого человека в сутки образуется
примерно 100 мг полиаминов. Инъекция этих
веществ провоцирует гипотермию и снижение
артериального давления. Исследования на мо-
лекулярном уровне выявили ингибиторную
активность полиаминов в отношении ряда
ферментов, включая некоторые протеинкина-
зы, а также важную роль в регуляции биосинте-
за белка и в процессах пролиферации и роста
клеток.
Орнитиндекарбоксилаза - это первый
фермент на пути биогенеза полиаминов. Она
же является и лимитирующим звеном всего
процесса. Время ее полусуществования не пре-
вышает 10 мин. В культуре клеток млекопи-
тающих добавление гормона роста или некото-
рых стероидных гормонов в десятки и сотни
раз ускоряло биосинтез орнитиндекарбоксила-
зы, а добавление самих полиаминов стимули-
ровало выработку белка, который является ее
ингибитором.
Н2С—nh2 h2c-nh2 Н2С-МН2 H2C-NH2
сн2 c°z СН2 СН2 СО2 1 СН2
сн2 —сн2 сн2 У > сн2
СН2 1 сн2 hc-nh2 II h2c-nh2
hc-nh2 h2c-nh2 соон
СООН
Лизин Кадаверин Орнитин Путресцин
Рис. 9-4. Реакции, катализируемые лизиндекарбоксилазой (1) и орнитиндекарбоксилазой (II).
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
309
СН-СН2-СН2-СН2
сн2-сн-сн-сн2
nh2 nh2
Путресцин
CH2~CH3-CH2-CH2
ch2-ch2-ch-nh nh2
nh2
Спермидин
ch2-ch2-ch2-nh
nh2
nh-ch2-ch3-ch2
I
nh2
Спермин
Рис. 9-5. Декарбоксилирование аминокислоты в составе S-аденозил метионина (реакция 1)
и перенос аминопропильных фрагментов на путресцин и спермидин (реакции 2 и 3).
При злокачественных новообразованиях
резко усиливается биосинтез полиаминов и,
как следствие, их количество в суточной моче.
Предлагалось даже использовать этот тест в
целях диагностики раковых заболеваний.
Биологическое значение реакции де-
карбоксилирования аминокислот сводится к
следующим главным пунктам.
Во-первых - и это самое главное - почти
все образующиеся амины обладают высокой
биологической активностью, причем специали-
зированной для каждого из них. Поэтому их
объединяют общим термином: биогенные ами-
ны. Как и всякие сигнальные молекулы, они
существуют короткое время и должны быстро
разрушаться.
Во-вторых, эта реакция необратима, и если
происходит, то начинает необратимую дегра-
дацию данной аминокислоты (в случае незаме-
нимых аминокислот — триптофана, фенилала-
нина, лизина, метионина и других - их «расхо-
ды» на эту реакцию могут быть восполнены
только за счет пищевых источников).
В-третьих, декарбоксилирование амино-
кислот производит какую-то долю (хотя и не-
большую) одного из конечных продуктов ме-
таболизма — СОг.
Инактивация биогенных аминов может
осуществляться разными способами. Один из
них - метилирование активной молекулы. Ис-
точником метильных групп служит обычно
S-аденозилметионин (его формула приведена на
рис. 9-5), который превращается в S-аденозилго-
моцистеин. Соответствующие метилтрансфера-
зы переносят группу —СНз на азот инактивируе-
мого амина (например, гистамина) или на кис-
310
Глава 9
лород гидроксигруппы (она имеется в таких ами-
нах, как серотонин, адреналин и им подобные).
Однако для большинства биогенных ами-
нов доминирующим способом инактивации
является окислительное дезаминирование, ме-
ханизм которого был показан на рис. 5-35. Наи-
более распространена моноаминоксидаза (раз-
дел 5.4.1), которая эффективна в отношении
первичных аминов самого разного строения, но
способна расшеплять также вторичные и тре-
тичные амины. Медь-содержащая диаминокси-
даза инактивирует не только диамины, но и
иные субстраты такого рода, включая гистамин
(отсюда часто употребляемый синоним: гиста-
миназа}. Известны, наконец, и специальные
ферменты, катализирующие дезаминирование
полиаминов. Введением избирательных ингиби-
торов аминоксидаз можно замедлить деграда-
цию соответствующих аминов, т.е., пролонги-
ровать их действие. Некоторые из таких инги-
биторов применяются при лечении депрессии и
ряда других патологических состояний.
Интересно отметить одну деталь. Как уже
отмечалось в главе 5, декарбоксилирование а-
кетокислот осуществляется ферментным ком-
плексом, в составе которого субстрат сначала
теряет СОг и сразу же (не покидая комплекс!)
подвергается окислению (см. рис. 5-15). В слу-
чае же а-аминокислот декарбоксилирование
протекает в цитоплазме, а окисление образо-
вавшегося амина происходит под действием
аминоксидаз наружной мембраны митохонд-
рий. Иными словами, для а-аминокислот эти
два процесса разнесены в пространстве, а, зна-
чит, и во времени. Именно благодаря этой дис-
танции биогенные амины и могут существо-
вать в течение некоторого срока, когда они в
состоянии выполнить свое функциональное
предназначение, после чего разрушаются ами-
ноксидазами (вот уж, действительно: «жизнь -
это миг между прошлым и будущим»!).
9.1.2. ДЕЗАМИНИРОВАНИЕ
В природе обнаружены разные способы
дезаминирования а-аминокислот. Но у челове-
ка и высших животных реализуется фактиче-
ски единственный из них — окислительное де-
заминирование. Исключения буквально еди-
ничны. Одно касается серина и треонина и
обусловлено наличием в них (3-гидроксильной
группы. Благодаря этому возможно неокисли-
тельное дезаминирование. Его обеспечивают
ферменты, в активном центре которых содер-
жится пиридоксальфосфат. В качестве примера
на рис. 9-6, А представлена реакция, катализи-
руемая сериндегидрапгазой: сначала происхо-
дит отнятие молекулы воды с образованием
двойной связи, перегруппировка которой ведет
к появлению иминогруппы, спонтанно отщеп-
ляемой (с участием воды) в виде аммиака.
В итоге серин превращается в а-кетокислоту -
пируват. Точно таким же образом аналогичная
дегидратаза расщепляет треонин на аммиак и
а-кетобутират {цистеиндесулъфураза бактерий
способна расщеплять цистеин до аммиака и
пирувата, но на первой стадии процесса выде-
ляется не вода, a H2S).
А. сн2он
I
НС-НН2
I
соон
н2о сн2
/ > с-мн2
СООН
СНз
I
С—NH
I
СООН
СНз
I
с=о
I
соон
Серин
Пируват
Аминоакриловая
кислота
Б.
Гистидин
Рис. 9-5. Неокислительное дезаминирование а-аминокислот сериндегидратазои (А) и гистидазой (Б).
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
311
Второе исключение - удаление амино-
группы под действием гистидин-аммиак-лиазы
(рис. 9-6, Б). Здесь тоже имеет место неокисли-
тельное дезаминирование, ио оно происходит
путем внутримолекулярной перестройки гис-
тидина, без участия воды.
Окислительное дезаминирование а-амино-
кислот почти всегда осуществляется флавино-
выми ферментами оксидазного типа. Наиболее
универсальны два таких фермента. Каждый
расщепляет большинство а-аминокислот, но
только в пределах либо L-ряда, либо D-ряда.
Иными словами, широкую субстратную спе-
цифичность эти ферменты сочетают со строгой
стереоспецифичностью. Так они и называются:
оксидаза Ъ-аминокислот и оксидаза Хд-амино-
кислот. В качестве простетической группы
первая содержит ФМН. а вторая - ФАД.
Реакция, катализируемая такими оксида-
зами, аналогична окислительному дезаминиро-
ванию биогенных аминов. В качестве примера
на рис. 9-7 показан процесс, инициируемый
оксидазой L-аминокислот: два атома водорода,
отнимаемые ферментом от а-аминокислоты,
передаются непосредственно на молекулу О2 с
образованием Н2О2, а возникающая при этом
иминокислота подвергается спонтанному гид-
ролизу до аммиака и а-кетокислоты (которая
соответствует исходной аминокислоте). Точно
так же выглядит и реакция, проводимая окси-
дазой D-аминокислот, только вместо ФМН в
ней участвует ФАД.
Оба фермента выявлены в печени и почках
млекопитающих. Оказалось, однако, что окси-
даза L-аминокислот, и без того не очень актив-
ная, имеет оптимум при pH 10. а потому в фи-
зиологических условиях почти совсем не про-
являет своего действия. В отличие от этого,
оксидаза D-аминокислот обладает заметной
активностью в нейтральной среде. Остается
непонятным, зачем это нужно, ибо в теле мле-
копитающих содержатся только аминокислоты
L-ряда. Разве что для защиты от тех D-амино-
кислот, минорные количества которых могут
попадать с необычными компонентами пищи.
Единственная аминокислота — глутамино-
вая - подвергается окислительному дезамини-
рованию легко и «непринужденно». Ибо пред-
назначенный для нее фермент относится не к
оксидазам, а к никотинамидным дегидрогена-
зам. Более того, он входит в число тех немно-
гих дегидрогеназ (упомянутых в разделе 5.2.2),
каждая из которых является начальным звеном
полной дыхательной цепи. Как и все ферменты
этой группы, глутаматдегидрогеназа обладает
высокой активностью, а переносом атомов во-
дорода на систему митохондриального окисле-
ния обеспечивает синтез 2,5 молекул АТФ в
расчете на каждую молекулу окисленного глу-
тамата (что и отражено на рис. 9-8). Иными
словами, это единственный фермент, позво-
ляющий энергию окислительного дезаминиро-
вания аминокислот трансформировать в энер-
гию макроэргических связей молекул АТФ.
Непосредственным продуктом дегидроге-
назного действия является глутиминовая ки-
слота (см. рис. 9-8). Дальнейший распад ее на
аммиак и а-кетоглутаровую кислоту протекает
Рис. 9-7. Окислительное действие оксидазы L-аминокислот (I) и спонтанный гидролиз возникающей иминокислоты (II).
312
Глава 9
2,5(АТФ+Н2О) 2,5(АДФ+Ф)
НАД НАД-Н2
СООН ж СООН соон
СН2 \ J СН2 Н2° КИз сК2
СН2 --> СНз > сн2
| ' ] спонтанно ।
hc-nh2 c=nh c=o
I I I
соон соон соон
L-Глутаминовая
кислота
Глутиминовая
кислота
а -Кетогл утаровая
кислота
Рис. 9-8. Глутаматдегидрогеназная реакция (1) и ее сопряжение с системой окислительного фосфорилирования (2).
спонтанно, с участием молекулы воды. В це-
лом глутаматдегидрогеназная реакция у жи-
вотных практически необратима, т.к. фермент
обладает очень слабым сродством к аммиаку
(Км «1 мМ), а концентрация последнего в клет-
ках ничтожна.
Активная глутаматдегидрогеназа содер-
жится в митохондриях почти всех клеток (кро-
ме мышечных) и представляет собой олиго-
мерный белок, состоящий из 6 одинаковых
субъединиц общей массой более 300 кДа.
Для метаболизма аминокислот в целом
глутаматдегидрогеназа имеет ключевое значе-
ние. Это обусловлено ие только высокой ак-
тивностью фермента, но и его аллостерически-
ми свойствами, позволяющими «чувствовать»
уровень непосредственного продукта реакции
(НАД-//2) или отдаленных продуктов (АТФ,
ГТФ). Повышение концентрации любого из
них вызывает диссоциацию субъединиц, что
приводит к падению ферментативной активно-
сти. Напротив, накопление АДФ способствует
активации глутаматдегидрогеиазы (иногда
АДФ называют кофактором, - настолько он
необходим для проявления активности фер-
мента). Важные функциональные последствия
этих регуляторных эффектов будут рассмотре-
ны несколько позже.
Биологическое значение реакции де-
заминирования а-аминокислот многогранно.
Во-первых, эта реакция необратима, а по-
этому ее свершение означает первый шаг на
пути полного распада данной аминокислоты (и
сопровождается этот шаг потерей самого важ-
ного фрагмента молекулы — аминогруппы).
Во-вторых, именно дезаминирование ами-
нокислот является главным источником обра-
зования одного из конечных продуктов мета-
болизма — аммиака.
В-третьих, а-кетокислоты, возникающие
при дезаминировании аминокислот, использу-
ются в самых различных метаболических пу-
тях. При этом углеродные скелеты 14 из 20 ко-
дируемых аминокислот превращаются в про-
дукты (а-КГ, пируват, ЩУК, фумарат или сук-
цинил-КоА), которые могут быть использова-
ны для синтеза глюкозы (соответствующие
аминокислоты получили название глюкоген-
ных). Такие продукты не возникают при ката-
болизме лейцина и лизина. Эти две аминокис-
лоты называют кетогенными, поскольку их
безазотистые фрагменты превращаются в аце-
тил-КоА, ие пригодный для образования угле-
водов (ио легко используемый для синтеза ке-
тоновых тел, жирных кислот, холестерола).
В качестве и глюкогенных, и кетогенных вы-
ступают изолейцин, фенилаланин, тирозин и
триптофан, часть углеродного скелета которых
превращается в ацетил-КоА, а другая пригодна
для преобразования в глюкозу. В конечном же
счете углеродные компоненты всех аминокис-
лот, как показано на рис. 5-26, превращаются в
метаболиты, утилизируемые в ЦТК, где оии
окисляются до СО2 и ЩО, генерируя соответ-
ствующее количество АТФ.
В-четвертых, а-кетоглутаровая кислота, об-
разуемая при дезаминировании глутамата, игра-
ет центральную роль в катаболизме общего пула
аминокислот, и связана эта особая функция с
участием а-КГ в реакциях трансаминирования.
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
313
9.1.3. РЕАКЦИЯ ТРАНСАМИНИРОВАНИЯ
Структурное сходство между «-аминокис-
лотами и а-кетокислотами открывает для них
возможность взаимного обмена функциональ-
ными группами при а-углеродном атоме. В ре-
зультате исходная аминокислота превращается
в соответствующую ей кетокислоту, а бывшая
кетокислота становится становится аминокис-
лотой (сохраняя в прежнем виде остальную
часть своей молекулы).
Типичный пример был показан на рис.
5-31, где приведено итоговое уравнение реак-
ции, в ходе которой глутаминовая кислота пре-
образуется в а-кетоглутаровую (а-КГ) за счет
попутного превращения щавелевоуксусной ки-
слоты (ЩУК) в аспарагиновую. Такой взаимо-
обмен назвали реакцией трансаминирования
(переаминирования), а катализирующие его
ферменты — аминотрансферазами (их называ-
ют также трансаминазами).
Трансаминазы широко распространены в
организме; многие из них содержатся как в ци-
тозоле, так и в митохондриях. Наиболее богаты
этими ферментами печень, почки, мышцы и
мозг.
Коферментом трансаминаз всегда является
пиридоксапьфосфат. Механизм его участия в
реакции переаминирования представлен на
рис. 9-9, где показана стадийность процедуры
переноса аминогруппы с аланина на а-КГ под
действием аланин-аминотрансферазы (АЛТ),
которая именуется также глутаминово-пиро~
виноградной трансаминазой (ГПТ).
Промежуточными продуктами реакции
трансаминирования являются шиффовы осно-
вания. Одно из них возникает при взаимодейст-
вии альдегидной группы кофермента с амино-
группой аминокислоты (в данном случае - ала-
нина). Внутренняя перегруппировка этого осно-
вания с последующим его гидролизом приводит
к освобождению кофермента, но уже в форме
фосфопиридоксамина, из-за чего исходная ами-
нокислота выделяется в виде а-кетокислоты (в
данном случае - пировиноградной).
На второй стадии реакции фосфопиридок-
самин, взаимодействуя с а-КГ, образует новое
шиффово основание, которое после перегруп-
пировки гидролитически выделяет аминокис-
лоту (теперь уже глутаминовую) с одновре-
менным освобождением кофермента в его ис-
ходной форме фосфопиридоксаля.
Как видно на рис. 9-9, реакция трансами-
нирования представляет собой циклический
процесс. При этом сначала один субстрат пре-
вращается в соответствующий продукт (аланин
в ПВК), который освобождается в готовом ви-
де, и только после этого вовлекается другой
субстрат (в данном случае - а-КГ), постепенно
преобразуемый во второй продукт.
Важно отметить, что все стадии этого цик-
лического процесса легко обратимы. Чтобы не
усложнять схему, на рис. 9-9 не все они обо-
значены обратимыми стрелками. Из-за этого
СНз
НС-----n[h2;
СООН
Аланин
СНз
-» нс—N=c-
СООН Н
ПФ
СНз н
х I I
± C=N—С—ПФ
I I
соон н
Н
СООН
СН2
сн2
I
нс—nh2
соон
С-ПФ фосфо-
/ пиридоксаль
соон
I
сн2
сн2
НС—N=C~ПФ
соон н
фосфо- I г -,
лиридоксамин ФГ|—С------NH2i
I । 1 L
Н / 1--
соон
I
сн2
сн2 н
X I I
± С—N—С—ПФ <F—
I I ч/
соон н н2о
соон
I
сн2
I
СН2
c=io
I — •
соон
Глутамат
а-Кетоглутарет
Рис. 9-9. Механизм участия кофермента в катализе аланин-аминотрансферазной реакции.
314
Глава 9
создается впечатление, что реакция направлена
в одну сторону («по часовой стрелке»): в нее
вступают аланин и а-КГ, а образуются ПВК и
глутамат. В действительности же процесс лег-
ко протекает и в обратном направлении, т.е., в
сторону образования аланина и а-КГ за счет
утилизации пирувата и глутаминовой кислоты.
Фактическое направление реакции тран-
саминирования зависит от соотношения кон-
центраций всех четырех реагирующих веществ,
причем, константа равновесия обычно близка
единице. Для аланин-аминотрансферазной ре-
акции это можно выразить уравнением:
[ПВК] х [глутамат] j
[аланин] х [а - КГ]
Трансаминазы обладают высокой суб-
стратной специфичностью. Наиболее эффек-
тивны те из иих, которые переносят амино-
группу со «своей» аминокислоты иа одну из
дикарбоновых кетокислот, - а-кетоглутаровую
(как на рис. 9-9) или щавелевоуксусную (окса-
лоацетат). Вместе с тем, обе они являются уча-
стниками аспартат-аминотрансферазной реак-
ции (показанной на рис. 5-31). Значит, амино-
группа, полученная одной из упомянутых ке-
токислот, при необходимости легко транспор-
тируется затем на другую. Иными словами, вся
совокупность трансаминаз образует единую
систему, способную обеспечить свободный
обмен аминогруппами, изымаемыми у почти
любой аминокислоты.
Известные трансаминазы охватывают
большинство аминокислот. В остальных случа-
ях имеют место окольные метаболические пу-
ти. Например, лизин вступает в серию сложных
реакций конденсации и окисления, в результате
которых его аминогруппы попадают в состав
двух молекул глутамата.
Триптофан тоже сначала подвергается
частичной деградации, приводящей к удале-
нию боковой цепи в виде аланина, который и
участвует в переаминировании с а-КГ.
Более того, даже гетероциклический азот
таких аминокислот, как пролин и гистидин,
оказывается (после расщепления их пятичлен-
ных колец) в составе аминогруппы глутамата
(с возможностью последующего участия в ре-
акциях трансаминирования).
9.2. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
ПРОЦЕССОВ ТРАНСАМИНИРОВАНИЯ
В наиболее общем плане роль реакций
трансаминирования заключается в поддержа-
нии постоянного соотношения концентраций
разных аминокислот. В основе этой функции
лежит способность трансаминаз быстро дости-
гать равновесия реакции, константа которого
составляет примерно 1, как это показывает
уравнение [9-1]. Его можно переписать в более
наглядной форме:
[аланин] ___ [глутамат] _ const j 9^2]
[ПВК] ~ [ос —КГ] -COnS
Это означает, что в равновесных условиях
соотношение концентраций одной аминокис-
лоты и соответствующей ей а-кетокислоты
примерно равно такому же соотношению в
другой паре аналогичных партнеров. В данном
случае - отношение концентрации аланина к
уровню образующейся из него пировиноград-
ной кислоты практически равно такому же со-
отношению глутамата и продукта его дезами-
нирования (а-КГ). И так - для всех трансами-
наз, которые быстро восстанавливают равнове-
сие при любых его сдвигах.
Смысл этих заключений легко пояснить на
примере все той же реакции между аланином и
а-кетоглутаратом.
Допустим, что в клетке вдруг появится до-
полнительное количество аланина. Тогда бла-
годаря аланин-аминотрансферазе «лишняя»
аминокислота станет отдавать аминогруппу,
превращаясь в ПВК. Вследствие этого избыток
аланина несколько снизится, а молярная кон-
центрация ПВК на столько же возрастет. И это
будет происходить до того момента, когда со-
отношение [аланин]/[ПВК] вернется к равно-
весному значению. Хотя, естественно, концен-
трации и аланина, и ПВК окажутся при этом
несколько повышенными.
Теперь следует обратиться к правой части
уравнения [9-2].
Если аминогруппы с части поступившего в
клетку аланина будут перенесены на а-КГ, то
концентрация последнего снизится, а уровень
глутамата соответственно возрастет. Восстано-
вить нарушенное соотношение этих метаболи-
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
315
тов можно, теоретически рассуждая, двумя пу-
тями.
Один из них - повысить концентрацию а-
кетоглутарата в клетке. Например, притормо-
зив утилизацию его в ЦТК, где много а-КГ об-
разуется при распаде углеводов и жиров. Если
это станет осуществимым, то знаменатель в
правой части уравнения может возрасти вплоть
до достижения равновесного состояния данной
трансаминазной системы. Но в таком случае
равновесие достигается на более высоком
уровне концентраций всех 4 метаболитов, чем
это было до поступления избытка аланина.
Другой путь - устранение прироста глута-
мата. Этот путь гораздо реальнее, ибо, как от-
мечалось в разделе 9.1.2, дезаминирование глу-
таминовой кислоты протекает очень легко бла-
годаря наличию высокоактивной глутаматде-
гидрогеназы. Очень кстати оказывается и то,
что оно сопровождается появлением эквива-
лентных количеств а-кетоглутарата. Иными
словами, аминоазот, переносимый с избыточ-
ного аланина на а-КГ, освобождается в виде
аммиака благодаря дезаминированию возни-
кающего глутамата. Таким образом, вовлечени-
ем глутаматдегидрогеназы обеспечивается бы-
стрый возврат соотношения в правой части
уравнения [9-2] к исходному значению и, следо-
вательно, эффективное достижение равновесно-
го состояния всей трансаминазной реакции.
Аналогичные рассуждения можно привес-
ти и применительно к любой другой амино-
трансферазе.
Отсюда следует, что существующая сово-
купность трансаминазных реакций способствует
стабилизации отношения концентраций а-ами-
ноксилот к концентрациям соответствующих им
кетокислот. Обычно оно составляет примерно
4:1. Но это не означает равенства концентраций
самих аминокислот. В частности, если уровень
глутамата в клетке достигает 2 мМ, то аланина
может быть, например, 0,6 мМ, но концентра-
ции их кетоаналогов все равно будут вчетверо
меньшими (0,5 мМ а-кетоглутарата и 0,15 мМ
пирувата), что отвечает уравнению [9-1] равно-
весия аланин-аминотрансферазной реакции.
Таким образом, система трансаминазных
реакций вносит существенный вклад в поддер-
жание гомеостаза - постоянства состава внут-
ренней среды организма (в данном случае -
постоянства аминокислотного состава). Это
можно считать генеральной функцией транс-
аминаз в общей регуляции метаболизма. Но
есть и некоторые особые ее проявления, кото-
рые обеспечивают ряд важных процессов,
имеющих общебиологическое значение. К
главнейшим из них относятся:
- трансдезаминирование (косвенное де-
заминирование);
- синтез новых аминокислот из числа за-
менимых;
- биосинтез мочевины.
Каждый из этих процессов не только по-
вышает эффективность регуляторной роли сис-
темы трансаминаз, но и играет свою особую
роль в специальных аспектах метаболизма ами-
нокислот. Особенно это относится к синтезу
мочевины, предназначение которого заключа-
ется в обезвреживании аммиака, освобождае-
мого при распаде аминокислот.
9.2.1. ТРАНСДЕЗАМИНИРОВАНИЕ
Как уже отмечалось, оксидазы аминокис-
лот в нашем организме крайне малоактивны.
Поэтому прямое дезаминирование аминокис-
лот, если и происходит, то лишь с ничтожной
скоростью. Только единственная аминокислота
- глутаминовая - может дезаминироваться с
высокой скоростью.
С другой стороны, благодаря трансамина-
зам, почти любая аминокислота легко взаимо-
действует с а-кетоглутаратом (прямо или через
реакцию ЩУК <-> аспартат), превращая а-КГ в
глутамат (другие аминокислоты преобразуются
в глутамат иными путями, как это отмечено
выше).
Следовательно, создается возможность со-
пряжения реакций трансаминирования с по-
следующим дезаминированием образующегося
глутамата. Иными словами, через систему
а-кетоглутарат*->глутамат может происходить
опосредованное дезаминирование практически
всех кодируемых аминокислот, прямое деза-
минирование которых не всегда возможно.
Этот процесс косвенного дезаминирования а-
аминокислот стали обозначать термином
трансдезаминирование.
Схема на рис. 9-10 демонстрирует меха-
низм процесса трансдезаминирования. От глу-
316
Глава 9
R
hc-nh2
I
СООН
а-Аминокислота
NH3
R
I
C=O
I
COOH
2.5(АТФ+Н2О) 2,5(АДФ+Ф)
H2O
ct-Кетокислота
Рис. 9-10. Трансдезаминирование аминокислот:
1 — трансаминазная реакция; 2 - глутаматдегидрогеназа; 3 - дыхательная цепь митохондрий.
таматдегидрогеиазной реакции (см. рис. 9-8)
эта схема отличается только небольшим добав-
лением. Ойо расположено в левой части схемы
и показывает превращение аминокислоты в
соответствующую ей кетокислоту за счет тран-
саминазного переноса аминогруппы на а-КГ
(реакция 1). Появляющийся при этом глутамат
подвергается дегидрогеназному окислению
(реакция 2), которое приводит к образованию
2,5 молекул АТФ (реакция 3); регенерацию а-
КГ завершает спонтанная реакция гидролити-
ческого удаления аммиака.
Таким образом, глутаминовая кислота (в
паре с а-кетоглутаровой) выполняет роль кол-
лектора, который «вбирает» в себя аминоазот
прочих аминокислот, а затем с помощью глу-
таматдегидрогеназы освобождает его в виде
аммиака.
Преимущества трансдезаминирования за-
ключаются, прежде всего, в возможности обес-
печивать высокую скорость дезаминирования
практически всех аминокислот.
Второе очень важное преимущество за-
ключается в том, что при этом образуется ие
НгО2, а 2,5 молекулы АТФ (т.е., энергия окис-
ления сберегается для клетки в форме макроэр-
гических связей АТФ).
Наконец - и это самое главное - именно иа
пути трансдезаминирования находится ключе-
вое звено, контролирующее общую скорость
лишения аминокислот их аминоазота. Это
очень просто и надежно - через единственный
канал (в виде глутаматдегидрогеиазы) регули-
ровать интенсивность деградации всей сово-
купности аминокислотных молекул.
Как уже отмечалось, активацию глутамат-
дегидрогеназы вызывает накопление АДФ.
А оно наступает только при неполной компен-
сации расходов АТФ, вырабатываемого в ос-
новном в ходе катаболизма углеводов и жиров.
Значит, при недостаточном питании клетки
испытывают дефицит АТФ, который приводит
к накоплению АДФ и, как следствие, к актива-
ции глутаматдегидрогеиазы. Наступающая ин-
тенсификация процессов трансдезаминирова-
ния обеспечивает усиленное разложение ами-
нокислот, безазотистые продукты которого
окисляются затем до СО2 и Н2О (в основном,
реакциями ЦТК). Этому, естественно, сопутст-
вует выработка АТФ, дающая шанс к преодо-
лению его дефицита. Подсчитано, при обыч-
ном потреблении 100 г аминокислот в сутки
полная их деградация позволяет синтезировать
около 22 моль АТФ (т.е. примерно одну шес-
тую часть от общей выработки у взрослого че-
ловека). Отсюда следует, что при исключении
пищевых углеводов и жиров для поддержания
энергетического баланса необходимо в 6 раз
увеличить потребление белков, — до 600 г в су-
тки (это примерно 3-4 кг хорошего мяса!).
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
317
В условиях голодания в первую очередь ис-
тощаются запасы углеводов (гликоген). На го-
раздо больший срок хватает депонированных
жиров. Когда это приводит к повышению уров-
ня АДФ в клетках (из-за дефицита АТФ), начи-
нается усиление трансдезаминирования, прово-
цирующее мобилизацию белков. Причем,
структурных белков, ибо запасов белка в нашем
теле нет. В первую очередь используются белки
плазмы крови, печени, мышц. Надо понимать
так: они не специально утилизируются, а просто
в ходе естественного обновления расщепляются
до аминокислот, все большую долю которых
начинают «перехватывать» усилившиеся про-
цессы трансдезаминирования. Поэтому катабо-
лизм структурных белков не в полной мере
компенсируется их ресинтезом (из-за недостат-
ка свободных аминокислот). И в первую оче-
редь страдают быстрообновляемые макромоле-
кулы. При длительном голодании начальное
похудание (из-за уменьшения жировых отложе-
ний) постепенно переходит в дистрофию (с на-
рушением функций органов и тканей) и край-
нюю степень истощения - кахексию.
В противоположность голоданию, доста-
точное углеводно-жировое питание оказывает
сберегающее влияние на весь аминокислотный,
да и вообще белковый фонд. Ибо в этих усло-
виях поддерживаются достаточно высокие
концентрации и АТФ, и НАД-Т/г, которые по-
давляют глутаматдегидрогеназу и, благодаря
этому, тормозят трансдезаминирование, а, сле-
довательно, и вообще деградацию аминокис-
лот. Иными словами, создаются благоприятные
условия для использования аминокислот в дру-
гих целях, в том числе - для синтеза белков, а
также для корректировки качественного соста-
ва аминокислотного фонда.
9.2.2. СИНТЕЗ НОВЫХ АМИНОКИСЛОТ
ИЗ ЧИСЛА ЗАМЕНИМЫХ
Пищевые белки из разных источников раз-
личаются по аминокислотному составу иногда
очень значительно. Поэтому соотношение ами-
нокислот, поступающих в организм, непосто-
янно и не всегда отвечает потребностям. Реак-
ции трансаминирования позволяют устранять
такой дисбаланс.
Допустим, например, что организму необ-
ходимо ежесуточно 7 г аланина и 15 г глутамата
(цифры условные), а в какой-то из дней с пищей
поступило всего 5 г аланина, но 20 г глутамата.
Ясно, что дефицит первого легко устраняется
аланин-аминотрансферазой, которая способна
переносить аминогруппу с избыточного глута-
мата на молекулы пирувата (см. рис. 9-9).
Убыль нескольких граммов пирувата не наносит
ущерба, — хотя бы потому, что образуется он (из
углеводов) сотнями граммов ежесуточно. Зато
недостаток аланина устраняется полностью.
Аналогичные рассуждения можно привес-
ти и для многих других аминокислот, недоста-
ток которых в пище легко устраняется с уча-
стием соответствующих трансаминаз.
Необходимо, однако, отметить, что воз-
никновение «новых» аминокислот (имеется в
виду — недополученных с пищей) происходит
за счет использования аминогрупп других ами-
нокислот (тех, что поступили в относительном
избытке). Поэтому суммарная потребность в
пищевых белках остается неизменной. Значит,
правильнее говорить не о синтезе «новых»
аминокислот, а лишь о корректировке амино-
кислотного состава, которая позволяет преоб-
разовывать одни аминокислоты в другие. Ра-
зумеется, такое преобразование возможно
только с использованием соответствующих а-
кетокислот, возникающих в ходе метаболизма
углеводов и липидов. Следовательно, «новооб-
разованными» могут стать лишь те аминокис-
лоты, которые относятся к числу заменимых.
Теперь становится понятным, почему не-
которые аминокислоты являются незаменимы-
ми: именно потому, что соответствующие им
а-кетокислоты не могут появиться из углево-
дов или липидов. Действительно, ни углеводы,
ни липиды не содержат разветвленных угле-
родных цепочек, которые могли бы превра-
титься в кетоаналоги таких аминокислот, как
валин, лейцин или изолейцин. Не могут воз-
никнуть и соответствующие аналоги для ме-
тионина, треонина и лизина. Наконец, ни в уг-
леводах, ни в липидах нет готовых цикличе-
ских структур, тождественных радикалам фе-
нилаланина и триптофана. Поэтому-то все эти
8 аминокислот и оказываются незаменимыми
(для человека).
Чтобы не осталось неясностей, здесь уме-
стно отметить, что пролин с его гетероциклом
318
Глава 9
может возникать, как и аргинин, путем соот-
ветствующих преобразований глутамата; син-
тез гетероциклической структуры гистидина
тоже возможен у взрослых людей, хотя и осу-
ществляется довольно сложным путем.
9.3. ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ АММИАКА
У взрослого человека при суточном по-
треблении 100 г белков образуется около 20 г
аммиака, — в основном, реакциями трансдез-
аминирования. Это вещество очень токсично и
подлежит быстрому обезвреживанию.
Полную детоксикацию аммиака осуществ-
ляют гепатоциты, превращающие его в моче-
вину. Она вполне безвредна и очень хорошо
растворима в воде, а потому легко выводится
почками.
Однако образуется аммиак ие только в пе-
чени, но и в других клетках, включая нервные,
которые особенно чувствительны к его токси-
ческому действию. Поэтому существуют меха-
низмы временного связывания аммиака. С их
помощью он переводится в безопасную форму,
в которой доставляется в печень, где и подвер-
гается окончательному обезвреживанию.
9.3.1. ВРЕМЕННОЕ СВЯЗЫВАНИЕ АММИАКА
Основным способом быстрого изъятия
возникающего аммиака является перевод его в
амидную форму. Для этого используется
«дальняя» карбоксильная группа глутамата или
аспартата. Внедрение в нее аммиака (реакция
амидирования) требует затраты энергии.
В качестве субстрата для временного обез-
вреживания аммиака клетки предпочитают глу-
тамат. Его амидирование осуществляет глута-
минсинтетаза, локализованная в митохондриях.
Реакция требует расходования одной молекулы
АТФ (рис. 9-11,1) и протекает необратимо.
Освобождение аммиака из глутамина
происходит путем гидролиза. Эта реакция тоже
необратима, и катализирует ее совсем другой
фермент — глутаминаза (рис. 9-11, II). Один из
ее изоферментов специфичен для гепатоцитов,
другой - для почечных клеток. Оба они выяв-
ляются и в тканях мозга, тогда как в миокарде
и скелетных мышцах существует особый вари-
ант почечного изофермента.
Р р
с С с
Гон TNH* Гон
сн2 NH3 СН2 ЫНз сн2
1 \ ’ f' Ь п
hc-nh2 АТФ адф+ф нс—nh2 hc-nh2 1
соон соон соон
L-Глутамат L-Глутамин L-Глутамат
Рис. 9-11. Реакции, катализируемые глутаминсинтетазой (I)
и глутаминазой (II).
Аспарагиновая кислота, как и глутамат,
тоже может подвергаться амидированию за
счет неорганического аммиака. Однако этот
процесс более энергоемкий: молекула АТФ
расщепляется до АМФ и пирофосфата. У жи-
вотных активность аммиак-зависимой аспара-
гинсинтетазы невелика. Доминирует у них глу-
тамин-зависимая форма фермента, использую-
щая не аммиак, а амидную группу глутамина.
Тем не менее, эта реакция тоже требует повы-
шенного расходования энергии (рис. 9-12), а
потому по интенсивности значительно уступа-
ет образованию глутамина.
Синтезируемые молекулы глутамина и ас-
парагина относятся к числу кодируемых ами-
нокислот. Значит, они создаются не только для
обезвреживания аммиака, но и как «строитель-
ный материал», востребуемый при синтезе едва
ли не любого белка (а также нуклеотидов). Тем
не менее, основная масса этих амидированных
форм аминокислот образуется ради детоксика-
ции аммиака в местах его образования и (что
не менее важно) ради транспортировки безо-
пасной формы аммиака с кровью к местам его
окончательного обезвреживания. Неудивитель-
но, что аспарагин и, особенно, глутамин отно-
сятся к наиболее представительным аминокис-
лотам плазмы крови, а концентрация каждого
из них в 2-10 раз выше уровня своего предше-
ственника (т.е., аспартата или глутамата).
/Р Р
с с
pNH2 роН
сн2 СН2
fH2 + hc-nh2
hc-nh2 СООН
соон
L-Глутамин L-Аспартат
J)
сГ
АТФ АМФ+ФФ (LHNH2
> hc-nh2
соон
с
Гон
сн2
+ сн2
нс-nh2
соон
L-Аспарагин L-Глутамат
Рис. 9-12. Амидирование аспартата глутамин-зависимой
аспарагинсинтетазой.
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
319
Часть глутамина подвергается гидролити-
ческому дезамидинированию в почках, осуще-
ствляемому глутаминазой (реакция II на рис.
9-11). Этот процесс усиливается в ситуациях,
когда повышена экскреция кислых метаболитов.
Например, при кетоацидозе (раздел 6.9.1). По-
ступая в мочу в виде ионов аммония, аммиак
предупреждает чрезмерное подкисление мочи,
обеспечивая нейтрализацию выводимых кислот
(и заодно сберегая для организма ионы Na+ и
К+). О важности глутаминазной реакции в поч-
ках для поддержания кислотно-щелочного рав-
новесия организма свидетельствует довольно
высокий уровень экскреции аммиака, который
составляет обычно 35-70 ммоль в сутки.
Активная глутаминаза присутствует и в
клетках кишечной стенки. Образуемый ею ам-
миак частично попадает в просвет кишки, где
может быть использован бактериями, способ-
ными включать его в состав синтезируемых
аминокислот (вовлечение которых в биосинтез
белковых молекул обеспечивает рост и раз-
множение кишечной микрофлоры). Другая
часть поступает в систему воротной вены (по-
этому для иее типично повышенное содержа-
ние аммиака). В свою очередь, гепатоциты из-
влекают из проходящей крови практически
весь аммиак и полностью обезвреживают его,
превращая в мочевину.
9.3.2. БИОСИНТЕЗ МОЧЕВИНЫ
Аммиак в качестве конечного продукта
азотистого обмена выводят рыбы и многие
другие обитатели водной среды. Птицы и
наземные рептилии сначала превращают его в
мочевую кислоту, которая и подлежит экскре-
ции. И только млекопитающие способны син-
тезировать мочевину, которая составляет у них
основную массу азотсодержащих веществ, уда-
ляемых из организма (у человека - до 80-90%
выводимого азота).
Мочевина - довольно простое вещество,
представляющее собой диамид угольной кисло-
ты. Само строение молекулы (см. рис. 4-4) на-
водит на мысль о возможности ее синтеза из
углекислоты и аммиака. Это и было подтвер-
ждено уже в ранних экспериментальных иссле-
дованиях, показавших заодно, что такой про-
цесс протекает в печени (Салазкин С.С., 1897).
nh2
NH3 +СО2+ 2 АТФ +Н2О--> С=О + 2 АДФ + Фн
чо~ро3н2
Карбамоил-
фосфат
Рис. 9-13. Связывание аммиака вод действием
аммиак-зависимой карбамоилфосфет-синтетазы
митохондрий печени.
Потребовалось, однако, более 30 лет, чтобы вы-
яснить детали биогенеза мочевины. Решающий
вклад внесли немецкие исследователи Ганс
Кребс и Курт Гензеляйт, которые в 1932 г.
сформулировали представления о циклическом
характере процесса. В истории биохимии это
было первое описание метаболического цикла, и
состоялось оно за 5 лет до открытия цикла три-
карбоновых кислот, сделанного тоже Г. Креб-
сом.
Теперь твердо установлено, что первым
этапом в биогенезе мочевины является взаимо-
действие между углекислотой и аммиаком, до-
ставляемым в печень по системе воротной вены
или образующимся в ней из глутамина под дей-
ствием печеночной глутаминазы. Этот этап про-
текает в митохондриях и требует расходования
двух молекул АТФ (рис. 9-13), а потому являет-
ся необратимым. В результате образуется кар-
бамоилфосфат. Отсюда и название митохондри-
ального фермента - аммиак-зависимая карба-
моилфосфат-синтетаза.
Второй этап — собственно циклический
процесс, состоящий из 4 последовательных
стадий.
Сначала под действием орнитин-карбамо-
илтрансферазы происходит перенос карбамо-
ильной группы на «дальнюю» аминогруппу
аминокислоты орнитина (рис. 9-14,1),
Затем образовавшийся цитруллин транс-
портируется в цитоплазму, где под действием
аргининосукцинат-синтетазы вступает в реак-
цию конденсации с молекулой аспартата (рис.
9-14, 2), превращаясь в аргининоянтарную
кислоту (аргининосукцинат). Осуществляется
это за счет энергии расщепления АТФ до АМФ
и ФФ.
На третьей стадии продукт конденсации -
агрининосукцинат - разделяется соответст-
вующей лиазой на фумаровую кислоту и арги-
нин (рис. 9-14, 3). Протекает эта реакция тоже
в цитоплазме (как и последующая).
320
Глава 9
NH2
сн2
сн2
сн2
нс-nh2
соон
yNH2
с=о
О~РО3Н2
L-Орнитин Карбамоил-
фосфат
nh2
со
I
NH
(СН2)3
hc-nh2
СООН
L-Цитруллин
+ Н3РО4
nh2
C=icf “
I u----
NH
I
(СН2)з
hc-nh2
COOH
L-Цитруллин
COOH
,_t I
CH,
COOH
L-Аспартат
NH2 COOH
АТФ АМФ+ФФ c=N-ch
k T I I
—> NH CH2
(2) I I
(CH2)3 COOH
HC—nh2
COOH
Аргининосукцинат
NH2 COOH
C=N —CH
I I
NH CH2
(CH2)3 COOH
hc-nh2
COOH
Аргининосукцинат
NH2
C=NH
I
________NH
®_______(CH2)3
hc-nh2
COOH
L-Аргинин
COOH
I
CH
II
+ CH
I
COOH
Фумарат
NH2
C==NH
I
NH
I
(CH2)3
HC-NH2
COOH
L-Аргинин
H2O
NH2
c=o
xnh2
Мочевина
NH2
CH2
CH2
+ CH2
hc-nh2
COOH
L-Орнитин
Рис. 9-14. Стадии орнитинового цикла.
1 - орнитин-карбамоиптрансфераза митохондрий; 2 - аргининосукцинат-синтетаза цитоплазмы;
3 - аргининосукцинат-лиаза цитоплазмы; 4 - аргиназа цитоплазмы.
Наконец, четвертая стадия цикла - гидро-
литическое отщепление мочевины от аргинина
(рис. 9-14, 4). Соответствующий фермент ци-
топлазмы называют аргиназой. Второй продукт
реакции - это орнитнн. Специальный перенос-
чик доставляет его (в обмен на продукт первой
стадии - цитруллин) в матрикс митохондрий.
Здесь орнитин может взаимодействовать с но-
вой молекулой карбамоилфосфата, открывая
следующий оборот цикла (отсюда часто упо-
требляемое название: орнитиновый цикл Креб-
са-Гензеляйта).
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
321
Таким образом, один из двух атомов азота
в составе мочевины происходит из аммиака,
недостатка в котором клетки отнюдь не испы-
тывают (даже наоборот — им приходится из-
бавляться от него). А вот для включения второ-
го азота нужна аспарагиновая кислота, ресурсы
которой нельзя назвать безграничными.
Очевидно, необходим механизм регенера-
ции аспартата, отдающего свою аминогруппу
на синтез мочевины. Такой механизм сущест-
вует. Он сводится к тому, что фумарат, обра-
зующийся на третьей стадии орнитинового
цикла, может поступать в митохондрии, где
реакциями ЦТК превращаться в малат и далее
в щавелевоуксусную кислоту (см. рис. 5-23),
которая посредством трансаминирования легко
преобразуется в аспартат.
Отсюда следует, что орнитиновый цикл
просто обязан работать в сопряжении с еще
одним циклическим процессом, который мож-
но назвать циклом регенерации аспарагиновой
кислоты. Как показано на рис. 9-15, он включа-
ет в себя двухстадийное превращение фумара-
та в малат и затем в оксалоацетат (ЩУК), ко-
торый, вступая в реакции трансаминирования,
обеспечивает тем самым эффективную регене-
рацию аспартата.
Следовательно, второй атом азота мочеви-
ны происходит не просто из аспартата, а из
любой аминокислоты, способной передавать
свою аминогруппу на ЩУК (непосредственно
или через систему ct-КГ«-►глутамат). По суще-
ству, аспартат в паре с оксалоацетатом являет-
ся лишь переносчиком а-аминогрупп с различ-
ных аминокислот на цикл синтеза мочевины.
Решающее преимущество такого способа
транспортировки заключается в том, что он
позволяет обходиться без промежуточного по-
явления аммиака, т.е., вдвое снижает нагрузку
на системы временного обезвреживания этого
токсичного вещества.
Как видно из приведенных уравнений,
синтез молекулы мочевины потребляет 4 мак-
роэргических связи (две молекулы АТФ пре-
вращаются в АДФ на первом этапе и одна мо-
лекула АТФ расщепляется до АМФ и ФФ на
второй стадии второго этапа). Однако если
учесть образование 2,5 молекул АТФ в резуль-
тате малатдегидрогеназной стадии регенерации
аспартата, то итоговые расходы при синтезе
молекулы мочевины составляют лишь 1,5 мо-
лекулы АТФ, расщепляемые до АДФ и Фн.
И обеспечивает эту экономию энергозатрат
тоже цикл регенерации аспартата.
Регуляция мочевинообразования
призвана обеспечивать постоянное соответст-
вие скорости детоксикации аммиака перемен-
чивому темпу катаболизма всего многообразия
О
II
R-C-COOH
Рис. 9-15. Сопряжение орнитинового цикла с процессами регенерации аспартата.
322
Глава 9
СООН СООН
?Н2 ° сн2 1 о
СН2 + сн3—C~S-KoA — -> сн2 |[ + HS-KoA 1 С-СН3
НС—NH2 Ацетил-КоА Н<Г<Н
СООН соон
Глутамат
N-Ацети л глутамат
Рис. 9-16. Синтез N-ацети л глутамата.
аминокислот. Лимитирующим звеном биогене-
за мочевины является фермент начального эта-
па - аммиак-зависимая карбамоилфосфат-син-
тетаза. Аллостерические свойства ее уникаль-
ны в том, что она чувствительна не к субстра-
там или продуктам собственного метаболиче-
ского пути, как это бывает обычно, а к совсем
«постороннему» для нее веществу - N-ацетил-
глутамату (рис. 9-16). Этот метаболит не про-
сто является активатором карбамоилфосфат-
синтетазы, но и совершенно необходим для
проявления активности этого ключевого
фермента.
Образование N-ацетилглутамата (из глу-
тамата и ацетил-КоА) происходит в митохонд-
риях гепатоцитов. Катализирует эту реакцию
^-ацетилглутамат-синтетаза, которая тоже
находится под метаболическим контролем.
В частности, активирующее действие на нее
оказывает аргинин. Следовательно, повышение
его концентрации в гепатоцитах усиливает на-
работку N-ацетилглутамата, активация кото-
рым биогенеза мочевины способствует расще-
плению аргинина с освобождением орнитина,
необходимого для эффективной работы орни-
тинового цикла.
Но есть и еще один регуляторный меха-
низм. В нем участвует печеночная глутаминаза,
которая активируется своим непосредственным
продуктом - аммиаком. Это очень редкое для
ферментов качество. В данном случае положи-
тельная обратная связь означает, что малейшая
тенденция к повышению уровня свободного
аммиака вызывает взрывообразное ускорение
глутаминазной реакции. Как полагают, смысл
происходящего при этом почти мгновенного
расщепления имеющегося глутамина заключа-
ется в быстром освобождении глутамата для
N-ацетилглутамат-синтетазы. Тем самым соз-
даются условия для подъема внутримитохонд-
риальной концентрации N-ацетилглутамата,
а вызываемая им активация карбамоилфосфат-
синтетазы приводит к результирующему эф-
фекту удаления аммиака.
9.4. ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА
ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТ
Специфика метаболизма каждой конкрет-
ной аминокислоты обусловлена, главным обра-
зом. строением радикала R при а-углеродном
атоме. Вместе с тем, структурная близость не-
которых радикалов в какой-то степени сближа-
ет пути их метаболизма, а иногда делает воз-
можными их взаимопревращения. Это позво-
ляет выделить группы аминокислот, сходных
по метаболической судьбе, в том числе - по
способу вовлечения безазотистых фрагментов
в ЦТК. где они подвергаются заключительному
окислению до НгО и ССХ Из-за многообразия
путей превращения азотистых веществ такое
разделение является весьма условным, но оно
помогает более компактно изложить это мно-
гообразие. Отдельно будет рассмотрено уча-
стие некоторых аминокислот в биогенезе таких
сложных структур, как азотистые гетероциклы
нуклеотидов и порфириновое кольцо гема (раз-
делы 9.5 и 9.6).
9.4.1. АЛАНИН, ГЛИЦИН, СЕРИН, ТРЕОНИН
Помимо структурной близости, названные
аминокислоты сходны в том, что все они преоб-
разуются в пируват, который, как известно,
расщепляется до ацетил-КоА. непосредственно
передающего ацетильные остатки в ЦТК.
Аланин посредством реакции трансамини-
рования прямо превращается в ПВК и, наобо-
рот. образуется из пирувата. В свою очередь,
ПВК является тем метаболитом, который возни-
кает при распаде углеводов, а при необходимо-
сти может быть использован для гликонеогенеза
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
323
R R
I I
c-nh2 С=о
HzC-opcbHi н2с-оро3н2 (L00H (L00H
НС—ОН —?—> С-О ---->
I < V | ф
СООН НАД НАД-Н2 соон
З-Фосфо- Фосфогидрокси-
глицерат пируват
Н2С~ОРО3Н2
I
НС—NH2
I
соон
Фосфосерин
СН2ОН
(з) 1
HC-NH2
z ч, ।
Н2о Фн соон
L-Серин
Рис. 9-17. Образование серина из 3-фосфогл и церата путем последовательного воздействия
дегидрогеназы (1), трансаминазы (2) и фосфогидролазы (3).
(раздел 6.7). Следовательно, безазотистый ске-
лет аланина (как и остальных аминокислот этой
группы) тоже вполне пригоден для гликонеоге-
неза, а также для синтеза глицерола и (после
превращения в ацетил-КоА) - жирных кислот и
холестерола.
Серин превращается в пируват реакцией
неокислительного дезаминирования, катализи-
руемой серицдегидратазой (см. рис. 9-6, А).
Синтезируется же он преимущественно из
3-фосфоглицерата, возникающего при распаде
глюкозы (см. рис. 6-24). Благодаря дегидроге-
назному окислению гидроксильной группы это-
го предшественника и участию образовавшегося
фосфогидроксипирувата в реакции трансамини-
рования появляется фосфосерин, гидролити-
ческое расщепление которого по фосфоэфирной
связи освобождает молекулу новообразованного
серина (рис. 9-17).
В биосинтетических процессах серин ис-
пользуется для построения сфингозина (см. рис.
7-26) и серинфосфатидов (см. рис. 7-20), а после
декарбоксилирования до этаноламина (см. рис.
7-16) включается в состав фосфатидилэтанола-
минов (см. рис. 7-17).
Глицин тоже может создаваться в клет-
ках млекопитающих, причем, разными путями.
Доминирующим является образование глицина
из серина. Это требует укорочения последнего
на гидроксиметильную группу. На самом же
деле происходит эквивалентная этому процеду-
ра, а именно: отнятие молекулы воды с одно-
временным переносом метиленовой группы -
СНг- на подходящий акцептор. Им оказывается
тетрагидрофолат (ТГФ), — восстановленная
форма фолиевой кислоты (витамин Вс; витамин
В9). Именно ТГФ функционирует в качестве
кофермента различных энзимов, в том числе
трансфераз.
Как показывает формула на рис. 9-18, один
из фрагментов молекулы ТГФ почти идентичен
структуре тетрагидробиоптерина (рис. 5-44),
отличаясь лишь тем, что боковая цепочка в по^
ложении 6 укорочена до метильной группы.
Именно к ней в ТГФ присоединен другой ком-
понент - иа/ю-аминобензойная кислота, кар-
боксильная группа которой, в свою очередь,
образует пептидную связь с глутаматом, яв-
ляющимся еще одним фрагментом молекулы
ТГФ. Синтезировать фолиевую кислоту спо-
собны только микроорганизмы. Будучи анало-
гами иор«-аминобензоата, сульфаниламидные
препараты конкурентно тормозят его включе-
ние в состав фолиевой кислоты, а потому на-
Тетрагидрофолат (ТГФ)
Рис. 9-1 В. Коферментная форма фолиевой кислоты (витамина Вс).
324
Глава 9
шли применение в медицине (и ветеринарии) в
качестве эффективных средств антибактери-
альной терапии. У человека (и животных) эти
препараты не конкурируют с фолиевой кисло-
той, поскольку она должна поступать в орга-
низм в виде уже готового витамина.
В составе трансфераз ТГФ участвует в пе-
реносе не только метиленовой группы, но и
подобных ей одноуглеродных фрагментов,
объединяемых общим термином «активный
С]». К ним относятся и такие группировки, как
метильная (-СНз), метенильная (-НС=), фор-
мильная (-НС=О), формиминовая (-HC=NH).
В ходе трансферазной реакции одноуглеродная
единица временно присоединяется к акцеп-
торному участку в молекуле ТГФ (выделен-
ному жирным шрифтом на рис. 9-18). Так же
он обозначен и на рис. 9-19, который показы-
вает, что молекула ТГФ всегда фиксирует ак-
тивный С] на своем атоме азота в положении 5
или 10 (либо на обоих сразу). Здесь же изобра-
жены наиболее важные взаимопревращения
фрагментов, присоединенных к акцепторному
участку ТГФ. Такого рода перестройка одноуг-
леродных единиц в составе кофермента позво-
ляет разнообразить структуру тех молекул, ко-
торые оказываются конечными акцепторами
активного С].
Преобразование серина в глицин - реакция
обратимая. Иными словами, глицин может не
только возникать из серина, но и сам превра-
щаться в него. Осуществляется это путем на-
ращивания одноуглеродиой единицей, которая,
как показывает схема на рис. 9-19, может иметь
разное происхождение. В итоге для глицина
открываются новые метаболические перспек-
тивы, ибо образуемый из него серин легко ста-
новится пируватом (см. рис. 9-6, А), который
пригоден и для образования аланина (посред-
ством трансаминирования), и для синтеза глю-
козы (или, например, глицерола), и для распада
до СО2 и Н2О (реакциями ЦТК).
Другое из главных направлений метабо-
лизма глицина (а через него - и серина) заклю-
чается в окислительной деградации, которую
осуществляет мультиферментный комплекс,
локализованный в митохондриях гепатоцитов.
По механизму эта деградация очень близка
окислительному декарбоксилированию а-кето-
кислот (раздел 5.2.7), приводя к выделению
СО2 и превращению НАД в НАД-Нъ Главное
отличие заключается в том, что отщепление
карбоксильной группы (в виде СО2) сопровож-
дается здесь распадом остальной части моле-
кулы на NH3 и группу -СН2~, которая оказы-
вается в составе №’10-метилен-ТГФ (рис. 9-20).
но nh2
Н2С-СН-СООН
Серин
nh2
I + н2о
н2с-соон
Глицин
Рис. 9-19. Взаимопревращения одноуглеродных единиц на акцепторном участке ТГФ (выделен жирным шрифтом).
№-Метм л -ТГФ
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
325
NH2
СН2 + НАД + ТГФ <—> Метилен-ТГФ + НАД • Н2 + ССЬ + NH3
I
СООН
Рис. 9-20. Распад глицина под действием глицин-дегидрогеназь\ (декарбоксилирующей).
Среди особенностей метаболизма глицина
следует отметить и его участие в образовании
парных желчных кислот, - таких как гликохо-
левая (см. рис. 5-43).
Треонин не может синтезироваться в ор-
ганизме человека, из-за чего и относится к не-
заменимым аминокислотам (в отличие от пере-
численных выше). Катаболизм его необычен
тем, что начинается с альдолазного расщепле-
ния на два фрагмента (рис. 9-21). Один из них -
глицин (с его дальнейшими судьбами, включая
возможность преобразования в пируват). Дру-
гой фрагмент - уксусный альдегид. Он подвер-
гается окислению флавиновым ферментом до
ацетата, активируемого затем тиокиназой до
ацетил-КоА, который, в свою очередь, переда-
ет двухуглеродные звенья в ЦТК либо на син-
тез жирных кислот, холестерола и ряда других
веществ (но не углеводов!).
9.4.2. МЕТИОНИН, ЦИСТЕИН
Это единственные из кодируемых амино-
кислот, обладающие атомом серы. Метионин
является незаменимой аминокислотой, а цис-
теин становится незаменимым только при де-
фиците метионина (являющегося единственно
возможным поставщиком серы для формиро-
вания цистеина из серина).
Метионин наиболее важен тем, что вы-
полняет роль поставщика метильных групп во
многих метаболических процессах. Таковым он
оказывается в результате взаимодействия с
АТФ, приводящего к образованию S-аденозил-
метионина (см. рис. 2-9). В этой активирован-
ной форме метионин становится субстратом
для различных метилтрансфераз. Реализуемые
ими реакции обеспечивают превращение но-
радреналина в адреналин (см. рис. 5Л9), осу-
ществляют метилирование аминогруппы сери-
на для создания холина и ацетилхолина (его
формула показана на рис. 4-7), используются
при метилировании азота этаноламина в ходе
биогенеза холинфосфатидов (см. рис. 7-18),
участвуют в биогенезе карнитина (см. рис. 7-5),
креатина (см. ниже) и ряда других биологиче-
ски важных веществ.
Небольшая доля S-аденозилметионина не
становится донором метильных групп, а под-
вергается декарбоксилированию (реакция 1 на
рис. 9-5). Образовавшийся при этом продукт
(S-аденозилметилтиопропиламин) остается вы-
сокоактивным метаболитом. Используется он,
однако, в качестве источника не метильной, а
аминопропильной группы. Как показано на
рис. 9-5, перенос такой группы на один, а затем
и на другой аминоазот путресцина приводит к
появлению полиаминов, — спермидина и спер-
мина соответственно.
Таким образом, активная форма метиони-
на является генератором нейромедиаторов (ад-
реналин, ацетилхолин), упомянутых полиами-
нов, трансмембранного переносчика жирных
кислот (карнитин), макроэргического партнера
АТФ (креатин) и полярной «головки» многих
фосфолипидов биомембраны.
Отдавая метильную группу в реакциях
трансметилирования, S-аденозилметионин пре-
вращается в S-аденозилгомоцистеин, который
гидролитически распадается на аденозин и го-
Н2С-ОН
Сн2
I
нс—nh2
I
соон
Треонин
альдолаза
H2C-NH2
СООН
Глицин
НС=О
I
СНз
Ацет-
альдегид
ФАД ФАДН2
Н2О
О
II
С-ОН
I
СНз
Ацетат
О
II
АТФ АТФ+ФМ c~S-KoA
> СНз
HS-КоА Ацетил-КоА
Рис. 9-21. Катаболизм треонина.
326
Глава 9
Рис. 9-22. Строение витамина Bi2 (кобаламин).
[Коферментные формы витамина, содержащие 5'-дезоксиеденозильный фрегмент или метильную группу в качестве шесто-
го лиганда при атоме кобальта, обозначаются как дезоксиаденозилкобаламин и метилкобаламин соответственно].
мо цистеин (реакция 3 на рис. 2-9). Судьба по-
следнего двояка.
С одной стороны, гомоцистеин — это по-
следний рубеж, когда еще возможна регенера-
ция метионина. Она осуществляется путем
присоединения к гомоцистеину метильной
группы, переносимой с М5-метил-ТГФ (кото-
рый, в свою очередь, может получать ее из раз-
ных источников, как это было показано на рис.
9-19). В состав фермента, реализующего этот
перенос, входит метилкобаламин — одна из ко-
ферментных форм витамина В12 (кобаламина).
Этот витамин имеет очень громоздкую струк-
туру, показанную на рис. 9-22. Запоминать ее
нет никакой необходимости. Можно лишь от-
метить, что центральная часть этой молекулы
очень напоминает порфириновое кольцо гема
(приведенное на рис. 1-26), хотя и не вполне
идентична ему, а вместо железа содержит атом
кобальта (это единственный витамин, содер-
жащий атом металла). И еще: боковые цепочки
порфириноподобного цикла очень сильно от-
личаются от таковых у гема. Из-за отмеченных
структурных различий вит. В]2 способны син-
тезировать только микроорганизмы, тогда как
углеродный скелет гема легко формируют
клетки и животных, и растений.
Другой метаболический путь гомоцистеи-
на обусловлен его способностью «делегиро-
вать» свою серу для превращения серина в
цистеин. При этом, как показано на рис. 9-23,
сначала происходит взаимодействие гомоцис-
СНг —SH
НС-Ь1Н2
соон
1-Гомоцистеин
НО—СН?
HC-NH2
СООН
L-Серин
Н2О
Н2О
CH2-S-CH2
СН2 НС—NH2
HC-NH2 СООН
СООН
Цистатионин
НгО
Н2О
СН2~ОН
СН2
hc-nh2
СООН
L-Гомосерин
C^-SH
HC-NH2
СООН
L-Цистеин
Рис. 9-23. Обратимое преобразование серина в цистеин за счет SH-группы гомоцистеина.
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
327
теина с серином. Продукт их конденсации
(цистатионин) может расщепляться путем гид-
ролиза по связи, соседней с только что воз-
никшей, в результате чего образуются цистеин
и гомосерин. Процесс этот вполне обратим.
Неудивительно поэтому, что достаточное со-
держание цистеина в пище существенно сни-
жает потребность организма в метионине.
Образующийся гомосерин оказывается тем
промежуточным звеном, через которое прохо-
дит окончательная деградация углеродного
скелета метионина. Реакцией дезаминирования
гомосерин превращается в а-кетобутират, ко-
торый подвергается затем окислительному де-
карбоксилированию аналогично тому, как это
случается с молекулами пирувата и а-КГ (раз-
дел 5.2.7). Судьба возникающего продукта -
пропионил-КоА - была рассмотрена в разделе
7.3.2: биотин-зависимое карбоксилирование
преобразует его в метилмалонил-КоА, после-
дующая изомеризация которого протекает (см.
рис. 7-7) под действием фермента, функциони-
рующего с участием аденозилкобаламина (см.
рис. 9-22). В итоге гомосерин превращается в
сукцинил-КоА - один из субстратов ЦТК.
В этом цикле и происходит окончательное
расщепление сукцинильного фрагмента до СО?
иН2О.
Цистеин является тиоловым аналогом се-
рина и, как уже отмечалось, может синтезиро-
ваться из него путем замены гидроксильной
группы на группу -SH гомоцистеина (см. рис. 9-
23), происходящего из метионина (см. рис. 2-9).
Именно наличием тиоловой группы обу-
словлена функциональная уникальность цис-
теина. Наиболее универсальна роль его в фор-
мировании высших структур белковой молеку-
лы, ибо только присутствием цистеиновых ра-
дикалов создается возможность появления ди-
сульфидных мостиков между определенными
участками единой полипептидной цепи, а не-
редко - и между разными цепями. В составе
глутатиона (см. рис. 5-56) он становится участ-
ником различных метаболических процессов, в
том числе - направленных на поддержание
окислительно-восстановительного баланса кле-
ток. Нельзя, наконец, не отметить и то, что
цистеин (декарбоксилированный до тиоэтано-
ламина) выполняет своей тиоловой группой
роль акцепторного звена в таком распростра-
ненном коферменте, как HS-КоА (см. рис. 2-5).
Спепифика метаболических превращений
цистеина связана с судьбой его тиоловой груп-
пы. У млекопитающих окисление ее под дейст-
вием цистеин-диоксигеназы приводит к воз-
никновению 3-супьфиноаланина. Дальнейшие
преобразования могут протекать в разной по-
следовательности, но конечные итоги вполне
однозначны. В виде лаконичной схемы они
представлены на рис. 9-24. Можно видеть, что
сера цистеина освобождается при этом в виде
сульфата БОд2". Кроме того, возникает таурин,
который необходим для образования таурохо-
левой кислоты (см. рис. 5ЛЗ) и других парных
желчных кислот, аналогичных ей.
В организме человека и многих животных
цистеин является единственным источником
неорганического сульфата. Лишь небольшая
часть его выводится с мочой сразу. Главное же
предназначение сульфата - внедрение в состав
гликозаминогликанов (подробнее о них речь
пойдет в разделе 10.3.2), а также в молекулы
специальных белков, где сульфогруппы играют
функционально важную роль.
Рис. 9-24. Продукты окисления тиоловой серы цистеина
328
Глава 9
Органификация сульфата — очень энерго-
емкий процесс, требующий предварительной
активации, ради которой расходуется три мак-
роэргических связи АТФ на каждую молекулу
неорганического сульфата. Детально этот про-
цесс показан на рис. 10-10, а пока достаточно
отметить, что он завершается образованием
3-фосфоаденозин-5 '-фосфосульфата (ФАФС),
который и служит непосредственным донором
сульфатных групп для переноса их на струк-
турные полисахариды, некоторые белковые
молекулы и ряд других веществ. К числу по-
следних относятся различные ксенобиотики,
включая такие продукты гнилостного разложе-
ния тирозина кишечной микрофлорой, как фе-
нол и крезол, которые, попадая в печень, пре-
образуются в эфиры серной кислоты, гораздо
более растворимые и легко удаляемые с мочой
(продукты гниения триптофана - индол и ска-
тол - сначала подвергаются микросомальному
окислению до индоксила и скатоксила; только
после этого могут превращаться в сульфоэфи-
ры, выводимые почками).
9.4.3. ВАЛИН, ЛЕЙЦИН, ИЗОЛЕЙЦИН
Все три аминокислоты относятся к неза-
менимым, поскольку ни в углеводах, ни в ли-
пидах нет структур с разветвленной углерод-
ной цепью, которая могла бы превратиться в а-
кетоаналог валина, лейцина или изолейцина.
Начальные стадии катаболизма этих ами-
нокислот протекают по единому сценарию, как
это иллюстрирует схема на рис. 9-25. Реакция
трансдезаминирования (1) превращает их в со-
ответствующие а-кетокислоты, которые затем
подвергаются окислительному декарбоксили-
рованию (2) мультиферментным комплексом
митохондрий, подобным таким же комплексам
для пирувата и а-КГ (описанным в разделе
5.2.7). Потом флавиновая дегидрогеназа (3)
окисляет образовавшиеся ацил-КоА-тиоэфиры
Валин, изолейцин, лейцин
а-Кетокислоты
(а-кетоизовалерат, ct-кето-Р-метилвалерат, сс-кетоизокапроат)
Ацил-КоА-тиоэфиры
(Изобутирил-КоА. а-метмлбутирил-КоА, а-изовалерил-КоА
ФАД
ФАД
а,Р-Еноил-КоА-тиоэфиры
Рис. 9-25. Схема катаболизма аминокислот, обладающих разветвленным радикалом.
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
329
до соответствующих а,Р~ненасыщениых кислот
(остающихся в соединении с КоА). Эта реакция
вполне аналогична первой стадии процесса
0-окисления жирных кислот, показанного на
рис. 7’6.
Дальнейшие пути катаболизма несколько
расходятся в соответствии с особенностями
строения углеродной цепи каждой из амино-
кислот. При этом еноил-производное валина
постепенно превращается в метилмалонил-
КоА, который (как было показано на рис. 7-7)
изомеризуется в сукцинил-КоА, - один из ме-
таболитов ЦТК. Ненасыщенный продукт изо-
лейцина преобразуется в а-метилацетоацетил-
КоА, разлагаемый на ацетил-КоА и пропионил-
КоА (последний, как и образуемый при распаде
метионина, превращается в метилмалонил-КоА
и, далее, в сукцинил-КоА). Наконец, еноиль-
ный метаболит лейцина: он подвергается био-
тин-зависимому карбоксилированию с после-
дующей трансформацией в ГМГ-КоА, кото-
рый, как уже рассматривалось ранее (см. рис.
7-8), может распадаться на ацетил-КоА и аце-
тоацетат (непосредственный предшественник
кетоновых тел, способный, к тому же, превра-
щаться в 2 молекулы ацетил-КоА).
Таким образом, после дезаминирования
одна из разветвленных аминокислот (валин)
превращается в сукцинил-КоА, являющийся
промежуточным метаболитом ЦТК; другая
(лейцин) вступает в этот цикл в виде молекул
ацетил-КоА; третья (изолейцин) частью своей
молекулы образует сукцинил-КоА, а оставшей-
ся частью — ацетил-КоА.
Из врожденных дефектов метаболизма
аминокислот этой группы наиболее изучено
нарушение их окислительного декарбоксили-
рования. Это ведет к повышению содержания
в крови и моче не только всех трех аминокис-
лот, но и соответствующих им а-кетокислот
(кетонурия разветвленных кетокислот). При-
знаки заболевания обнаруживаются уже через
неделю после рождения. Главные из них - на-
рушение рефлексов, гипертонус, судороги, ко-
матозное состояние, характерный запах мочи и
пота (отсюда название: болезнь «кленового си-
ропа»). Летальный исход наступает к годова-
лому возрасту. Лечебный эффект дают специ-
альные питательные смеси с резко уменьшен-
ным содержанием разветвленных аминокислот,
позволяющие снизить концентрацию их в кро-
ви до нормального уровня.
9.4.4. ЛИЗИН
Метаболизм этой незаменимой аминокис-
лоты необычен тем, что ни одна из аминогрупп
самого лизина не участвует в реакциях транс-
аминирования. Распад молекулы начинается с
удаления «дальней» аминогруппы (e-NH2). Оно
осуществляется сложным путем: сначала при
участии этой группы образуется шиффово ос-
нование с молекулой а-КГ, затем следует серия
окислительно-восстановительных реакций, по-
сле чего продукт конденсации двух молекул
вновь распадается, но уже на глутамат и а-ами-
ноадипат (сохраняющий а-аминогруппу ис-
ходного лизина). Для наглядности этот процесс
и последующие стадии отражены на рис. 9-26 в
виде предельно лаконичной схемы. Трансдеза-
минирование а-аминоадипата превращает его в
кето-аналог, который реакцией окислительного
декарбоксилирования преобразуется в глута-
рил-КоА. Последний, в свою очередь подверга-
ется типичному р-окислению, а затем - удале-
нию 5-карбоксильной группы. Образующийся
кротонил-КоА может либо восстанавливаться
до бутирил-КоА, либо окисляться до ацетоаце-
тил-КоА (который эквивалентен двум молеку-
лам ацетил-КоА).
H2C-NH2 С ХЮН соон С ХЮН
СН2 1 СН2 I.. ( С J 1 у сн2 1 СОг СНг 4" С ( h 2Н гн= -А
СНг ( :н2 СНг > с :н2 '
НС—NHZ НС :-NHz НС=О
СООН с ХЮН 1 СООН "~S-KoA
L-Лизин а-Аминоадипат а- -Кетоадипат Глутарил-КоА
СНз
СО2 сН Н2О 2Н
НС
И
C~S-KOA
Рис. 9-26. Краткая схема катаболизма лизина.
СНз
I
с=о
I
сн2
р°
S-KoA
Кротонил-КоА Ацето-ацетил-КоА
330
Глава 9
В отличие от других аминокислот, лизин
не используется для создания биологически
активных веществ (если не считать биогенеза
карнитина — см. подпись к рис. 7-5). Главное
предназначение лизина - быть составной ча-
стью белковых молекул. В них он привносит
положительный заряд своего е-аминоазота. ко-
торый (что очень важно) локализован на конце
протяженной (а потому - подвижной) цепочки
из 4 метиленовых групп.
Известна врожденная непереносимость ли-
зина (тошнота, рвота, коматозное состояние);
она обусловлена недостаточностью фермент-
ной системы, обеспечивающей начальную ста-
дию его катаболизма (окислительное удаление
е-аминогруппы). Улучшение состояния боль-
ных наступает при уменьшении содержания
лизина в диете.
9.4.5. ФЕНИЛАЛАНИН, ТИРОЗИН, ТРИПТОФАН
Из этих трех аминокислот к числу замени-
мых относится только тирозин. Но единствен-
ный путь его образования - это необратимая
реакция гидроксилирования фенилаланина (см.
рис. 5-46, 1). Поэтому при недостатке фенила-
ланина тирозин становится незаменимым (но сам
не может восполнить дефицита фенилаланина).
У здорового человека примерно четверть
потребляемого фенилаланина используется для
биосинтеза белков, а остальная часть превра-
щается в тирозин. Дальнейшие пути метабо-
лизма одинаковы для обеих аминокислот. Са-
мые важные фрагменты этих путей осуществ-
ляются оксигеназными реакциями, которые
были рассмотрены в главе 5 (разделы 5.4.3 и
5.4.4). Поэтому здесь достаточно объединить
их в виде общей схемы (рис. 9-27).
Функционально наиболее значимым на-
правлением является окисление фенилаланина
до тирозина и ДОФА (эти реакции показаны на
рис. 5-46), последующее образование дофами-
на и гидроксилирование его в норадреналин,
который превращается в адреналин посредст-
вом реакции трансметилирования с участием
S-аденозил метионина (см. рис. 5-49). Этот путь
метаболизма реализуется в нейронах и клетках
мозгового слоя надпочечников.
Другое направление метаболических пре-
образований начинается с йодирования радика-
лов тирозина в составе специального белка -
тироглобулина. Механизм этой реакции показан
на рис. 5-55. Она протекает в щитовидной желе-
зе и обеспечивает возможность биогенеза ее
гормонов - йодтиронинов. к которым относятся
трийодтиронин и тироксин (см. рис. 2-29).
Особый путь метаболизма реализуется в
меланоцитах. Начинается он с окисления
ДОФА и замыкания его аминогруппы на имею-
щееся фенильное кольцо. Так возникает би-
циклический дофахром. Декарбоксилирование
превращает его в 5,6-дигидроксииндол, кото-
рый вступает в разнообразные и не до конца
изученные реакции конденсации (в том числе
со своими предшественниками). Известно
лишь, что в результате многоступенчатых про-
цессов образуются высокомолекулярные гете-
рополимеры, нерастворимые в воде. Точнее,
образуется смесь полимеров от желто-корич-
невого и красноватого до совершенно черного
цвета. От их количества и соотношения зави-
сит цвет кожи, волос, глаз.
Фенилаланин ---►Тирозин -----► ДОФА-------► Дофамин-----* Норадреналин-----► Адреналин
Йодтиронины
п-Гидрокси- Дофахром ------------> 5,6-Дигидроксииндол ----► Меланины
фенилпируват
I
Гомогентизинат ----» 4-Мал еил-ацето ацетат----► Фумарат + Ацетоацетат
Рис. 9-27. Схема главных путей метаболизма фенилаланина и тирозина.
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
331
Наконец, катаболизм «излишков» фенила-
ланина и тирозина до конечных продуктов, вы-
водимых из организма. Доминирует на этом
пути следующая последовательность реакций
(см. рис. 9-27): трансдезаминирование тирози-
на до n-гидроксифенилпирувата; окисление
последнего в гомогентизиновую кислоту; ди-
оксигеназное расщепление ее кольца (см. рис.
5-51) с появлением малеил-ацетоацетата. Ли-
нейная цепь последнего подвергается затем
ферментативному превращению в свой транс-
изомер - фумарил-ацетоацетат. Заключитель-
ной стадией становится гидролитический рас-
пад образовавшегося продукта на фумаровую
кислоту (интермедиат ЦТК) и ацетоацетат, ко-
торый может вступать в ЦТК после распада на
2 молекулы ацетил-КоА.
Разветвленность путей метаболизма фени-
лаланина и тирозина приводит к разнообразию
патологии, вызываемой недостаточностью того
или иного фермента.
Так, наследственные энзимопатии разных
стадий биогенеза йодтиронинов становятся при-
чиной очень редкого заболевания - гипотиреоза
новорожденных. Оно характеризуется множест-
венными расстройствами, включая необрати-
мую задержку умственного развития (вплоть до
кретинизма). Предотвратить или ослабить столь
тяжкие последствия возможно только посредст-
вом заместительной терапии тироидными гор-
монами, которая должна начинаться не позднее
недели-полутора после рождения.
Врожденное нарушение гидроксилазного
превращения тирозина в ДОФА проявляется
по-разному. В меланоцитах эту реакцию ката-
лизирует Си+-зависимая гидроксилаза, из-за
недостаточности которой блокируется весь
путь биогенеза меланинов. Внешние признаки
этого дефекта обозначают термином альби-
низм, крайняя степень которого проявляется
полным отсутствием пигментации кожи, волос,
радужной и пигментной оболочек глаза.
В нейронах и клетках надпочечника пре-
вращение тирозина в ДОФА осуществляется
совсем другой гидроксилазой, а именно - био-
птеринзависимой (см. рис. 5-46). Поэтому ге-
нетические дефекты ее возникают совершенно
независимо от тех, что проявляются альбиниз-
мом, и ведут к несравненно более тяжким по-
следствиям, поскольку препятствуют синтезу
катехоламинов, выполняющих роль гормонов и
нейромедиаторов.
Энзимопатии на пути распада тирозина до
фумарата и ацетоацетата тоже бывают разными
по степени тяжести вызываемой ими патоло-
гии. Наиболее доброкачественно протекает ал-
каптонурия («черная моча»), известная еще с
XVI века. Причиной ее является врожденная
недостаточность гомогентизатдиоксигеназы
(см. рис. 5-51). Накапливающаяся гомогенти-
зиновая кислота легко выводится почками и
под действием кислорода воздуха превращает-
ся в пигменты темно-коричневого цвета.
К числу других проявлений болезни относятся
охроноз (пигментация соединительной ткани) и
развитие артритов.
Некоторые из наследственных нарушений
катаболизма фенилаланина проявляются по-
вышением концентрации тирозина в плазме
крови. В частности, к тирозинемии приводит
нарушение трансдезаминирования тирозина до
и-гидроксифенилпирувата; недостаточность
диоксигеназы, превращающей последний в го-
могентизиновую кислоту; возможно, дефект
гидролазы, расщепляющей линейную цепочку
предшественника на фумарат и ацетоацетат.
Наконец, самой частой (1:16000 новорож-
денных) патологией аминокислотного метабо-
лизма является фенилкетонурия. Обычный ва-
риант ее возникает из-за врожденной недоста-
точности фенилаланингидроксилазы (см. рис.
5-46, 1). При этом концентрация фенилаланина
в крови возрастает в десятки раз, а в моче - ед-
ва ли не в сотни. Главные проявления наслед-
ственного дефекта - нарастающее слабоумие,
обильная неврологическая симптоматика, пси-
хозы, «мышиный» запах (из-за появления фе-
нилацетата в моче и поте), ранняя смерть (в
возрасте до 20-30 лет). Эти нарушения (кроме
запаха) объясняют негативным влиянием избы-
точного фенилаланина на клетки мозга, хотя
механизмы токсичности остаются неясными.
Единственный выход - перевод с первых дней
жизни на специальную диету с искусственно
сниженным содержанием фенилаланина (в
природных белках его доля составляет около
4%). Такое лечение дает вполне удовлетвори-
тельный результат, если проводить его под
контролем уровня фенилаланина в крови и
продолжать вплоть до завершения миелиниза-
332
Глава 9
ции мозга (в последнее время специалисты на-
стаивают на том, что ограничение потребления
фенилаланина должно быть пожизненным).
У больных фенилкетонурией становятся
явственными альтернативные пути катаболиз-
ма фенилаланина: его трансдезаминирование
до фенил пирувата, который затем может вос-
станавливаться до фенил лактата либо окис-
ляться (с декарбоксилированием) до фенилаце-
тата. Преобладающая часть последнего конъю-
гирует в печени с глутамином, образуя пептид-
ную связь с его а-аминогруппой. Все эти мета-
болиты отсутствуют в моче здоровых людей,
тогда как при нелеченной фенилкетонурии
достигают уровня 3-6 г/л.
Триптофан используется клетками в ос-
новном для включения в состав белковых мо-
лекул. Очень небольшая доля его достаточна
для синтеза необходимых количеств серотони-
на, который начинается биоптериновой моно-
оксигеназой (см. рис. 5Л5) и завершается реак-
цией декарбоксилирования (см. раздел 9.1.1).
Преобладающая часть свободного трипто-
фана распадается по так называемому кинуре-
ниновому пути, включающему множество ста-
дий. Две из них осуществляются диоксигена-
зами, которые расщепляют сначала одно, а за-
тем и другое кольцо исходной молекулы, как
это было показано на рис. 5-52. Теперь можно
добавить, что между этими событиями проис-
ходит удаление формильной группы, гидро-
ксилирование шестичленного кольца и укоро-
чение боковой цепи путем отщепления алани-
на. Линейная цепочка, возникшая после второй
из диоксигеназных реакций, подвергается де-
карбоксилированию, а затем двукратному вос-
становлению (с участием НАД(Ф) //2 и попут-
ным отщеплением аммиака). В итоге появляет-
ся а-кетоадипат, который трансформируется в
ацетоацетил-КоА через промежуточные стадии
образования глутарил-КоА и кротонил-КоА
(см. рис. 9-26).
Итак, в ходе катаболизма боковая цепь
триптофана отделяется в виде аланина, а его
радикал, подвергшись дециклизации и отдав по
молекуле формиата, СО2 и NH3, в итоге пре-
вращается в молекулу ацетоацетил-КоА.
От этого главного пути имеется ряд от-
ветвлений. Наиболее важное из них ведет к
биосинтезу амида никотиновой кислоты (вита-
мин РР). Реакции этого побочного направления
начинаются почти сразу после образования 3-
гидроксиантранилата и обеспечивают превра-
щение его не в линейную цепочку а-кетоадипа-
та, как отмечено выше, а в гетероциклическую
структуру хинолиновой кислоты (рис. 9-28). Ее
дальнейшие превращения наступают после
взаимодействия с 5-фосфорибозил-1-пирофос-
фатом (ФРПФ). Формула этого метаболита
представлена на рис. 9-34. Ясно, что образова-
ние его возможно реакцией переноса пирофос-
фатной группы с АтФ на полуацетальный гид-
роксил рибозо-5-фосфата, возникающего в хо-
де распада глюкозы ГМФ-путем (см. раздел
6.6.1).
Как показано на рис. 9-28, в молекуле
ФРПФ хинолиновая кислота замещает собой
пирофосфатный фрагмент. Затем в ней осуще-
ствляется удаление одной карбоксильной груп-
пы и амидирование другой (происходящее за
счет амидоазота глутамина). В итоге появляется
никотинамидный мононуклеотид. Легко заме-
тить, что он представляет собой половинку мо-
лекулы НАД (см. рис. 2-6) и может стать полно-
ценным НАД, соединившись с адениловым
фрагментом молекулы АТФ. Таким образом, не
имея возможности преобразования в свободную
молекулу собственно витамина РР, триптофан,
тем не менее, способен заменять его, трансфор-
мируясь прямо в коферментную форму этого
витамина — молекулу НАД(Ф).
У многих животных (включая крыс, кро-
ликов, собак, свиней) интенсивность генерации
никотинамидного кофермента из триптофана
достаточна для того, чтобы они не нуждались в
пищевых источниках никотиновой кислоты (и
ее амида). У других животных, а также у чело-
века триптофан лишь снижает потребность в
витамине РР, но не исключает ее полностью.
Гиповитаминоз РР, особенно на фоне низкого
уровня триптофана в пищевом рационе, приво-
дит к развитию пеллагры («шершавая кожа»).
Для нее характерны воспалительные пораже-
ния кожных покровов на открытых участках
тела, дисфункция кишечника, нервные рас-
стройства (три «д»: дерматит, диарея, демен-
ция). Тяжесть заболевания усиливается при
недостатке витамина Вб, т.к. он выполняет роль
кофермента на одной из стадий преобразования
триптофана в никотинамидные нуклеотиды.
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
333
Рибонуклеотид
хинолината
Рис. 9-28. Биогенез никотинамидного мононуклеотида из метаболитов триптофана.
9.4.6. АСПАРТАТ, АСПАРАГИН, ГЛУТАМАТ,
ГЛУТАМИН
Все эти аминокислоты играют особенно
важную роль в реализации общих путей мета-
болизма аминокислот, особенно в процессах
трансдезаминирования (раздел 9.2.1) и обезвре-
живания аммиака (раздел 9.3).
Для вовлечения аспартата и глутамата в
процессы катаболизма достаточно реакции де-
заминирования, чтобы их безазотистые фраг-
менты (ЩУК и а-КГ) стали промежуточными
метаболитами цикла трикарбоновых кислот
(см. рис. 5-24). Аналогично утилизируются в
ЦТК и углеродные скелеты аспарагина и глу-
тамина, предварительно лишенных амидного
азота (под действием, например, аспарагиназы
или глутаминазы).
9.4.7. ГИСТИДИН, ПРОЛИН, АРГИНИН
При всем разнообразии структуры назван-
ных аминокислот, их объединяет то, что в цикл
трикарбоновых аминокислот они поступают в
виде а-КГ. Естественно, пути предшествующей
трансформации их в глутамат существенно
различаются.
Гистидин в ходе катаболизма подверга-
ется, прежде всего, внутримолекулярному де-
заминированию, которое преобразует его в
уроканиновую кислоту (см. рис. 9-6, Б). Насту-
пающее затем двукратное присоединение к ней
воды приводит к разрыву гетероцикла с обра-
зованием N-формиминоглутамата (рис. 9-29).
К освобождению глутамата ведет затем пере-
нос формиминовой группы на азот N5 молеку-
лы тетрагидрофолата (см. рис. 9-19).
Можно заметить, что в образовавшейся
молекуле глутамата и а-углеродный атом, и
группы -СООН и -NH2 при нем, - все они вме-
сте являются фрагментом разорванного цикли-
ческого радикала гистидина (остальная часть
этого цикла передается в виде формиминовой
группы на ТГФ).
Наличие N-формиминоглутамата в моче,
особенно значительное после нагрузки гисти-
дином, служит диагностическим критерием
дефицита фолиевой кислоты в организме.
Наследственное нарушение катаболизма
гистидина часто сопровождается умственной
отсталостью и дефектами речи. При замедле-
нии превращения гистидина в уроканат наблю-
даются не только гистидинемия и гистидин-
урия, но и нарастает экскреция альтернативных
метаболитов. Прежде всего — продукта транс-
аминазного перехода гистидина в имидазолпи-
руват и образующихся из него имидазолацета-
та и имидазоллактата.
334
Глава 9
СООН СООН
I I
НС Н2О Н2О СН2
11 V к ч I
СН —СН2
А А
НС^ NH и NH
\ / НО^ /
N=CH HN=CH
Уроканат N-Формимино-
глугамат
ТГФ ТГФ
I
HN=CH
СООН
I
СН2
I
СН2
HC“NH2
СООН
L-Глутамат
Рис, 9-28. Превращение уроканиновой кислоты в L-глутамат.
Пролин, как показано на рис. 9-30, под-
вергается сначала дегидрогеназ ному окисле-
нию с образованием двойной связи в гетеро-
цикле. Гидролиз этой связи протекает спонтан-
но, преобразуя исходный пролин в линейную
цепочку глутамат-5-полуальдегида, который
затем окисляется до глутамата.
Все реакции, представленные на рис. 9-30,
вполне обратимы. Поэтому пролин относится
к числу заменимых аминокислот: он не только
распадается до глутамата и а-КГ, но и может син-
тезироваться из них в случае необходимости.
Аргинин начинает свой путь катаболиз-
ма с превращения в орнитин (см. рис. 9-14, 4).
Эта реакция удаления гуанидиновой группы
является важным звеном разных процессов, в
том числе - синтеза мочевины (см. рис. 9-14) и
биогенеза путресцина (см. рис. 9-4) и полиами-
нов (см. рис. 9-5). Излишний орнитин подле-
жит изъятию. Оно производится специальной
орнитин-аминотрансферазой^ реализующей
перенос «дальней» аминогруппы орнитина на
молекулу а-КГ, преобразуемую при этом в глу-
тамат (рис. 9-31,1). В результате этой реакции
сам орнитин становится глутамат-5-полуальде-
гидом, который окисляется до глутамата (рис.
9-31, 2) точно так же, как и образуемый при
распаде пролина (рис. 9-30, 2).
НгС— СН2 НАД НАДН2 Н2С—СН
/ \ \ Ф / \\
НгС NH А—H2Cx
СН ® СН
I I
СООН СООН
L-Пролин
Н2О
>
спонтанно
Таким образом, обе аминогруппы орнити-
на становятся а-аминогруппами двух молекул
глутамата (одна из которых происходит из
«внешнего» а-КГ, а другая - это несколько
«модернизированный» орнитин).
Обратимость обеих реакций, показанных
на рис. 9-31, свидетельствует о возможности
превращения молекул глутамата сначала в ор-
нитин, а затем (реакциями орнитинового цик-
ла, рис. 9-14) - в аргинин. В детском возрасте
такой путь биогенеза, по-видимому, недостато-
чен для растущего организма и потому должен
дополняться поступлением аргинина с пищей.
Уникальная особенность аргинина связана
с тем, что он является единственным источни-
ком оксида азота (механизм образования этой
необычной сигнальной молекулы показан на
рис. 5-47).
К числу специфических путей метаболиз-
ма аргинина относится также его участие в
биогенезе креатина, который во взаимодейст-
вии с АТФ превращается в креатинфосфат.
Осуществляется синтез креатина путем
двух подряд реакций переноса. Первая из них
лимитирует скорость всего процесса и реализу-
ется глицин-амидинотрансферазой, которая
чувствительна к угнетающему действию ко-
нечного продукта — креатина. Она катализиру-
НС=о СООН
СНг НАД НАД-Нг сн2
СНг ------> СНг
НС-ИНг Н’° ® НС—ИНг
I I
СООН СООН
L-Глутамат- L-Глутамат
5-полуальдегид
Рис. 9-30. Окислительное преобразование L-пролина в L-глутамат.
Ферменты: 1 - Пролиндегидрогеназа-, 2 -Дегидрогеназа глутамат-5-полуальдегида.
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
335
соон
I
сн2
СН2
НС-ННг
I
СООН
СООН
СН2
I
сн2
с=о
I
соон
h2c-nh2 НС=О
СН2 СН2 НДЦ ндц-н2
сн2 сн2
hc-nh2 hc-nh2 h2o
I I
соон соон
соон
I
сн2
I
сн2
hc-nh2
I
соон
L-Орнитин
L-Гпутамат-
-5-полуальдегид
L-Глутамат
Рис. 9-31. Катаболическая судьба L-орнитина.
Ферменты: 1 ~ Орнитин-аминотрансфераза; 2 - Дегидрогеназа глутамат-5-полуальдегида.
ет перемещение амидиновой группы с аргини-
на на глицин (рис. 9-32, 1). Возникший гуани-
доацетат взаимодействует в гепатоцитах
с S-аденозилметионином, принимая от него
метильную группу (рис. 9-32, 2). Далее образо-
вавшийся креатин поступает из печени в кровь
и накапливается в мышцах и мозгу. Здесь про-
текает еще одна (третья по счету) реакция пе-
реноса - фосфотрансферазная. Ее реализует
креатинкиназа, обратимо передающая фос-
фатную группу с АТФ на креатин (рис. 9-32,3).
Креатинкиназная реакция раскрывает био-
логический смысл синтеза креатина и его на-
копления именно в тех тканях, функциональ-
ная активность которых сопряжена с мощным
потреблением АТФ. В состоянии покоя изоби-
лие АТФ способствует депонированию части
макроэргических фосфатных групп в составе
креатинфосфата. Иными словами, создается
дополнительный резерв макроэргов, который
при необходимости легко мобилизуется для
срочного восполнения расходов АТФ.
Известно, например, что мышечная рабо-
та осуществляется непосредственно за счет
расщепления молекул АТФ. Вместе с тем, в
начале предельно интенсивной нагрузки уро-
вень АТФ в мышцах остается почти неизмен-
ным, тогда как содержание креатинфосфата
NH?
I
CH2
COOH
Аргинин Орнитин
Глицин
HN=C—NH2
NH
I
CH2
COOH
Гуанидоацетат
HN=C-
ch2-n
Н^С-
CH3-N
H OH
I I
HN=C-N~P=O
H2C
OH
Крезтинин
Крезтинфосфат
S-Аденозил-
гомоцистеин
HN-C-NHz
CH’-\ COOH
н'с'Х
Креатин
Рис. 9-32. Биосинтез креатина и краатинфосфата.
336
Глава 9
падает на 70-80% уже в первые 10 с (поэтому в
следующие 10 с невозможно поддерживать ту
же интенсивность мышечной деятельности).
Очень небольшая, но вполне постоянная
доля креатинфосфата тканей подвергается
спонтанному (неферментативному) распаду с
освобождением неорганического фосфата (ре-
акция 4 на рис. 9-32). Образующийся при этом
креатинин не участвует в метаболических про-
цессах, а поступает в кровь и выводится поч-
ками. Содержание его в моче довольно ста-
бильно и пропорционально объему мышечной
массы (поэтому у мужчин оно выше, чем у
женщин, а у тренированных спортсменов вы-
ше, чем у лиц умственного труда).
9.5. МЕТАБОЛИЗМ НУКЛЕОТИДОВ
Будучи структурными элементами моле-
кул РНК и ДНК, мононуклеотиды уже хотя бы
поэтому настолько важны для жизнедеятельно-
сти, что организм не может зависеть от их по-
ступления с пищей. Иными словами, клетка
должна уметь сама синтезировать необходи-
мые нуклеотиды- И прежде всего — их опреде-
ляющие компоненты, каковыми являются не-
сколько пиримидиновых и пуриновых гетеро-
циклов. Более того, для создания любого из
них достаточно всего трех аминокислот: гли-
цина, аспартата и глутамина (как поставщика
амидного азота). Такой синтез способны осу-
ществлять почти все позвоночные.
Что касается нуклеиновых кислот, посту-
пающих с пищей, то они практически не могут
стать материалом для построения собственных
нуклеотидов организма. Барьером служит, в
основном, кишечное пищеварение. Нуклеопро-
теины, потребляемые млекопитающими в до-
вольно заметных количествах, подвергаются
распаду протеиназами кишечного содержимо-
го. Освобождающиеся при этом молекулы РНК
и ДНК гидролизуются до своих мономерных
единиц под действием нуклеаз панкреатиче-
ского сока, а также кишечных полинуклеотидаз
и фосфодиэстераз. Фосфатазы и нуклеозидазы
завершают разделение свободных мононуклео-
тидов на фосфат, (фосфо)пентозу и азотистые
основания. Последние уже в стенке кишки на-
чинают подвергаться окислительной деграда-
ции. При этом пурины превращаются в моче-
вую кислоту, которая не пригодна для введения
в состав мононуклеотидов и удаляется из орга-
низма (в основном, почками). Пиримидиновые
гетероциклы претерпевают дециклизацию, что
лишает их возможности включаться в нуклео-
тиды, а затем вступают на путь полного разло-
жения до СО2 и NH3.
Есть и дополнительный барьер, мешаю-
щий использованию азотистых оснований пи-
щи для построения нуклеотидов, синтезируе-
мых в организме de novo. Он возникает из-за
того, что наши клетки постепенно строят пу-
риновое ядро сразу на молекуле фосфорибозы,
а пиримидиновые структуры тоже присоеди-
няются к фосфорибозе еще до завершения их
синтеза. Иными словами, происходит посте-
пенное созидание готовых нуклеотидов, а не
«посадка» полностью сформированных азоти-
стых оснований на фосфорибозу. Впрочем, не-
которая доля нуклеозидов и даже свободных
оснований (особенно пуриновых), возникаю-
щих в ходе деградации собственных нуклеино-
вых кислот клетки, все же не избегает повтор-
ного использования для- построения новых
нуклеотидных молекул (взамен только что рас-
павшихся). Такую реутилизацию азотистых
оснований обозначают термином «сберегаю-
щий ресинтез».
9.5.1. СИНТЕЗ ПИРИМИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ
Материалом для создания циклической
структуры пиримидинов служат СО2, молекула
аспартата и амидный азот глутамина. В этом
биосинтетическом процессе можно выделить
три последовательных этапа:
I. Синтез гетероциклического предшест-
венника - оротовой кислоты (рис. 9-33).
II. Фиксация ее на 5-фосфорибозе и синтез
пиримидиновых рибонуклеотидов (рис. 9-34).
III. Преобразование пиримидиновых
рибонуклеотидов в их дезокси-аналоги (рис.
9-35).
Первый этап начинается с образования
карбамоилфосфата, которое происходит в ци-
топлазме. В отличие от аналогичной реакции,
протекающей в митохондриях при синтезе мо-
чевины (см. рис. 9-13), цитоплазматическая
карбамоилфосфат-синтетаза использует в ка-
честве одного из субстратов не аммиак, а амид-
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
337
vC VOOH
CHt сн2
сн2 Ан2
с=о hc-nh2
соон соон
Глутамин Глутамат
АТФ+Н2О АДФ Карбомоил-
фосфат
О
NH СООН
Оротовая
кислота
н /\-н н=°
Н Г. СН2 -г
I I <-.S~
/:Ххрн @
о NH СООН
Дигидро-
сротовая
кислота
но-с
соон
Аспартат
о
НО-4Х
H2N СНз
О NH СООН
Карбамоил-
аспартат
Рис. 9-33. Синтез оротовой кислоты.
Рис. 9-34. Образование пиримидиновых рибонуклеотидов из оротовой кислоты.
338
Глава 9
ный азот глутамина (рис. 9-33, 1), из-за чего
реакция требует расщепления лишь одной мо-
лекулы АТФ, превращающейся в АДФ. Карба-
моилфосфат, возникающий в цитоплазме, не
участвует в синтезе мочевины, а конденсирует-
ся с молекулой аспартата (рис. 9-33, 2). Обра-
зовавшийся карбамоиласпартат, теряя молеку-
лу воды, превращается в циклическую струк-
туру дигидрооротата (рис. 9-33, 3). Все эти три
реакции осуществляет последовательно один и
тот же мультифункциональный фермент, обла-
дающий тремя доменами, каталитический
центр каждого из которых специализирован
лишь на одной из этих реакций.
Окисление дигидрооротовой кислоты (рис.
9-33, 4) осуществляется никотинамидной де-
гидрогеназой митохондрий, а возникший при
этом оротат поступает вновь в цитоплазму.
Здесь он под действием бифункционального
фермента — УМФ-синтетазы - сначала замеща-
ет собой пирофосфатную группу в молекуле
5-фосфорибозил-1-пирофосфата (рис. 9-34, 1),
а затем теряет карбоксильную группу, превра-
щаясь в готовую молекулу одного из рибонук-
леотидов, а именно - УМФ (рис. 9-34, 2). [От-
метим: первая из этих двух реакций совершен-
но аналогична «посадке» хинолината на 5-фос-
форибозу в ходе биосинтеза никотинамидного
нуклеотида из триптофана, как это было пока-
зано на рис. 9-28].
Двукратным фосфорилированием за счет
АТФ молекула УМФ легко превращается в
свою трифосфатную форму (УТФ), которая
преобразуется в ЦТФ путем энергозависимого
переноса амидной группы глутамина в пози-
цию 4 урацила (рис. 9-34,3).
Оба мононуклеотида — УТФ и ЦТФ — ис-
пользуются в различных метаболических про-
цессах в качестве макроэргических соедине-
ний. И оба служат необходимым материалом
для построения молекул РНК. Наконец, оба
они являются предшественниками пиримиди-
новых дезоксг/рибонуклеотидов, в которых ну-
ждается синтез ДНК.
Как отмечалось ранее (раздел 6.4.2), все
дезоксирибонуклеотиды возникают благодаря
восстановлению рибозы в составе предвари-
тельно синтезированных рибонуклеотидов,
причем, в их дифосфатной форме. В общем
виде механизм такой реакции представлен на
рис. 6-12. Соответственно этому, редуктазное
преобразование рибозы пиримидиновых нук-
леозидов - ЦДФ и УДФ - превращает их
в d-ЦДФ и d-УДФ (рис. 9-35, реакции 1 и 2).
Рис. 9-35. Биогенез пиримидиновых дезоксирибонуклеотидов.
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
339
Первый из них, перейдя в трифосфатную фор-
му (d-ЦТФ), непосредственно используется для
включения в синтезируемые ДНК. Что касается
второго, то, как известно, уридиловые нуклео-
тиды не включаются в состав ДНК. Тем не ме-
нее, выработка d-УДФ происходит, ибо обра-
зуемый из него d-УМФ необходим в качестве
предшественника тимидиловых молекул (кото-
рые, напомним, существуют только в виде де-
зоксмрибонуклеотидов). Однако и d-ЦДФ тоже
может превращаться в d-УМФ. Достигается это
путем дефосфорилирования d-ЦДФ до d-ЦМФ,
который затем под действием специального
фермента подвергается гидролитическому де-
заминированию (реакция 3 на рис. 9-35).
Поскольку тимин по своему строению яв-
ляется 5-метилурацилом (см. рис. 2-1), преоб-
разование d-УМФ в d-ТМФ требует внедрения
метильной группы в позицию 5 гетероцикла
(рис. 9-35, 4). Источником ее служит метилен-
ТГФ (см. рис. 9-19). В этой реакции утрата им
метиленового фрагмента сопряжена с окисле-
нием ТГФ до дигидрофолата, возвращение ко-
торого в исходную форму осуществляется
НАДФ-зависимой редуктазой.
9.5.2. КАТАБОЛИЗМ ПИРИМИДИНОВ
Как и при кишечном переваривании, соб-
ственные полинуклеотиды клеток в ходе ката-
болизма гидролизуются постепенно до моно-
нуклеотидов, дефосфорилирование которых
5'-нуклеотидазой приводит к появлению соот-
ветствующих нуклеозидов. Уже на этом этапе в
одном из них начинается трансформация азо-
тистого основания. А именно: гидролитическое
отщепление аминогруппы преобразует молеку-
лу цитидина в уридин (рис. 9-36). Следова-
тельно, дальнейшая деградация обоих этих
нуклеозидов полностью совпадает. Точно так
же осуществляется и распад тимидина, если не
считать того, что при этом во всех его метабо-
литах присутствует «лишняя» метильная груп-
па исходного тимина.
В целом процесс катаболизма пиримиди-
нов проиллюстрирован на рис. 9-36. Здесь вид-
но, что почти каждая реакция однотипна для
всех трех азотистых оснований. Более того, и
фермент на каждой стадии обычно один для
всех. Сами же реакции известны из предыду-
щих разделов. Краткое описание всего процес-
са можно свести к 4 пунктам:
- фосфорилазное (с привлечением Фн)
расщепление нуклеозида на свободное азоти-
стое основание и фосфопентозу (метаболиче-
ская судьба последней обсуждалась в разделе
6.6.2);
- насыщение двойной связи в цикле и
последующий разрыв кислотоамидной связи в
нем, из-за чего возникает линейная цепочка,
карбамоильный конец которой отщепляется в
виде молекул NH3 и СО2;
- трансдезаминирование возникших
р-аланина и его 2-метильного гомолога, де-
лающее из них 3-оксопропионат и 2-метил-З-
оксопропионат соответственно;
- окисление (с участием НАДФ и HS-
КоА) с попутным декарбоксилированием, бла-
годаря чему оксопроизводные переходят в ак-
тивную форму уксусной или пропионовой ки-
слоты.
Образовавшийся ацетил-КоА может прямо
вступать в ЦТК, а пропионил-КоА, как уже от-
мечалось в разделе 7.3.2, способен трансфор-
мироваться в метилмалонил-КоА, который пу-
тем ферментативной изомеризации (см. рис.
7-7) превращается в сукцинил-КоА, один из
метаболитов ЦТК.
Таким образом, катаболическая деграда-
ция пиримидинов полностью расщепляет их
гетероциклическую структуру до простейших
молекул: СО2 и NH3.
9.5.3. СИНТЕЗ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ
Для создания бициклической структуры
пуринов используется по одной молекуле СО2
и глицина, сс-аминогруппа аспартата, а также
амидный азот двух молекул глутамина и по
одноуглеродному фрагменту («активный С]»)
от двух молекул формил-ТГФ (рис. 9-37).
В отличие от пиримидинов, пуриновые ос-
нования с самого начала строятся на молекуле
5-фосфорибозил-1 -пирофосфата (ФРПФ). Ибо
первой же стадией биогенеза становится замена
пирофосфатного фрагмента молекулы ФРПФ на
аминогруппу, происходящую из амидного азота
глутамина (реакция 1 на рис. 9-38). Именно этот
азот в образовавшемся 5-фосфорибозиламине
становится атомом N-9 будущего пуринового
340
Глава 9
сн3
0=C~S-KoA
Ацетил-КоА
СН,
сн2
I
о—C~S-KoA
Пропионил-КоА
Рис. е-36. Распад пиримидиновых оснований.
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
341
Рис. 9-37. Схема биогенеза пуринового ядра инозинмонофосфата (ИМФ).
основания. Иными словами, именно на нем по-
степенно конструируется бициклическая струк-
тура синтезируемых нуклеотидов.
Процесс формирования пуриновых основа-
ний протекает через множество промежуточных
стадий. В наиболее сжатом виде он представлен
схемой на рис. 9-37. Здесь отмечено происхож-
дение всех атомов пуринового ядра, а цифры в
светлых кружочках обозначают очередность
реакций включения этих атомов в создаваемую
бициклическую структуру пуринов. Более под-
робно все эти реакции приведены на рис. 9-38,
где при желании можно обстоятельно рассмот-
реть каждую из них, хотя заучивать всю эту со-
вокупность нет особой необходимости.
Как показано на рис. 9-37, после фиксации
азота на 5-фосфорибозе к нему присоединяется
(своим карбоксильным углеродом) глицин, на
аминогруппу которого переносится затем од-
ноуглеродный остаток с молекулы формил-
ТГФ. Тем самым создается скелет будущего
пятичленного цикла пуринов. Очередными
точками роста (теперь уже шестичленного
кольца бицикла) становятся атомы бывшего
глицина: на его карбонильный углерод перехо-
дит амидоазот глутамина, а к о-углеродному
атому присоединяется молекула СО2. В проме-
жутке между этими двумя событиями осущест-
вляется замыкание пятичленного кольца буду-
щего пурина. Оно происходит путем отнятия
воды, «забирающей» атомы кислорода и водо-
рода у присоединенной ранее формильной
группы и у аминогруппы рибозиламина (ины-
ми словами, создается ковалентная связь меж-
ду атомами С-8 и N-9 создаваемого пурина).
Формирование шестичленного цикла пури-
новых оснований завершается благодаря трем
последовательным реакциям. Сначала один из
атомов кислорода в фиксированной ранее моле-
куле СО2 замещается а-аминогруппой аспартата
(реакция 6 на рис. 9-37). Затем происходит пе-
ренос формильного остатка с формил-ТГФ на
азот в позиции N-3 (реакция 7 на рис. 9-37). И, в
заключение, наступает замыкание 6-членного
кольца (отнятием воды за счет только что вклю-
ченных формильной группы и -NH2).
В результате перечисленной серии реак-
ций образуется молекула инозинмонофосфата
(ИМФ), который является общим предшествен-
ником и адениловых, и гуаниловых нуклеоти-
дов (формулы аденина и гуанина приведены на
рис. 2-1).
Превращение ИМФ в молекулу АМФ
осуществляется путем замены карбонильного
кислорода при атоме С-6 на а-аминогруппу
аспартата. Процесс этот требует затраты энер-
гии и протекает в две стадии, с освобождением
фумарата, подобно тому, как это происходит
при синтезе мочевины (реакции 2 и 3 на рис.
9-14).
Другое направление — трансформация
ИМФ в молекулу ГМФ - реализуется внедре-
нием аминогруппы в положение С-2 пуриново-
го бицикла. Достигается это посредством НАД-
зависимого окисления, приводящего к появле-
нию карбонильного кислорода в указанной по-
зиции, с последующей заменой этого кислоро-
да амидной группой глутамина (эта реакция
обеспечивается энергией распада АТФ до
АМФ и ФФ).
342
Глава 9
Инозинмонофосфат
(ИМФ)
Рис. 9-38. Последовательность реакций формирования бициклической структуры пуринов
(жирным шрифтом выделены атомы, встроенные в результате последней из свершенных стадий процесса).
Дезоксирибонуклеотидные аналоги пури-
новых нуклеотидов образуются посредством
рибонуклеотидредуктазной реакции. Этот уни-
версальный механизм восстановления рибозы
до 2-дезоксирибозы (показанный иа рис. 6-12)
охватывает только дифосфатные формы рибо-
нуклеотидов. Молекулу АДФ он преобразует в
d-АДФ, а молекулу ГДФ - в d-ГДФ. Трифос-
фатные формы дезоксирибонуклеотидов, необ-
ходимые для синтеза ДНК, возникают из ди-
фосфатных под действием нуклеозиддифос-
фаткиназ (см. раздел 2.2.2).
9.5.4. КАТАБОЛИЗМ ПУРИНОВ
В адениловых мононуклеотидах модифи-
кация пуринового ядра начинается после уда-
ления фосфатной группы. Образовавшийся
аденозин подвергается гидролитическому де-
заминированию, превращаясь в инозин (реак-
ция 1 на рис. 9-39). Тот, в свою очередь, пре-
терпевает фосфорилазное расщепление (с при-
влечением Ф„) на пентозо-1-фосфат и гипок-
сантин (реакция 2 на рис. 9-39). Дальнейшие
превращения последнего осуществляет ксан-
тиноксидаза гепатоцитов, которая содержит
ФАД, а также атомы Fe3+ и молибдена.
Подобно другим оксидазам (см. раздел
5.4.1), для окисления субстрата ксантиноксидаза
использует молекулу О2, а в качестве одного из
продуктов образует молекулу Н2О2- Но в отли-
чие от своих аналогов (рис. 5-35) она сначала
присоединяет молекулу воды по месту двойной
связи в гетероцикле и только после этого отнима-
ет два атома водорода, перенося их на молекулу
О2 (и оставляя пурину кислород бывшей воды).
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
343
Гипоксантин
Рис. 9-39. Катаболизм пуриновых оснований.
Следует отметить, что в некоторых (и не-
редких) условиях ксантиноксидаза реализует
не двухэлектронное, а одноэлектронное вос-
становление молекулы О2. В итоге образуется
не пероксидный иои О22-, а супероксидный
анион-радикал Ог'-, который является еще бо-
лее мощным окислителем, чем пероксид водо-
рода (см. раздел 5.5).
Ксантиноксидаза катализирует преобразо-
вание гипоксантина в ксантин, а также даль-
нейшее окисление ксантина до мочевой кисло-
ты (реакции 3 и 4 на рис. 9-39).
Почти точно так же протекает и катабо-
лизм гуаниловых нуклеозидов. Разница лишь в
том, что они сначала подвергаются фосфороли-
зу (с отщеплением фосфопентозы), а уже потом
освободившийся гуанин вступает в реакцию
гидролитического дезаминирования (см. рис.
9-39). При этом возникает сразу ксантин, пре-
образуемый далее в мочевую кислоту.
344
Глава 9
Таким образом, катаболизм пуриновых
нуклеотидов (в отличие от пиримидиновых) не
ведет к разрушению циклической структуры,
а заключается лишь в создании оксогрупп на
определенных атомах углерода пуринового
ядра.
У человека мочевая кислота является ко-
нечным продуктом катаболизма и аденина, и
гуанина. Будучи слабой кислотой, она при фи-
зиологических значениях pH отдает в среду
только один из трех своих протонов, переходя
в ионизированную форму урата (тоже показан-
ную на рис. 9-39). Константа диссоциации со-
ставляет 5,4. Это значит, что при таком значе-
нии pH среды половина молекул мочевой ки-
слоты находится в недиссоциированной форме,
очень плохо растворимой в воде, а другая по-
ловина - в виде урата, растворимость которого
на порядок выше. Поскольку выводится моче-
вая кислота в основном почками, подкисление
мочи создает угрозу выпадения мочекислого
осадка.
Суточное выведение мочевой кислоты
(считая и ураты) составляет у взрослых людей
0,4-0,6 г, а общее количество в водной фазе
тела - в среднем 1,2 г у мужчин и 0,6 г у жен-
щин.
Чрезмерное накопление мочевой кислоты
в организме наблюдается при подагре, клини-
ческие проявления которой обусловлены отло-
жением игольчатых кристаллов урата натрия
вблизи суставов, что сопровождается воспали-
тельной реакцией и приступами болей. Обу-
словлена гиперурикемия усилением биосинтеза
пуринов de novo, которое может быть спрово-
цировано, в частности, повышением уровня
5-фосфорибозил-1 -пирофосфата, наступающим
из-за разных причин (в том числе - вследствие
недостаточной реутилизации азотистых осно-
ваний). Величина «растворенного уратного пу-
ла» возрастает у больных многократно, а при
тяжелой форме подагры - в десятки раз (дости-
гая иногда 30 г).
Подагра, мочекаменная болезнь и другие
нарушения метаболизма пуринов в большой
степени связаны с отсутствием у человека (и
высших приматов) уратоксидазы, которая име-
ется у всех других млекопитающих. Этот медь-
содержащий фермент, используя кислород,
осуществляет разрыв шестичленного цикла
ла мочевой кислоты с удалением атома С-6 в
виде СО2 и появлением оксогруппы при С-5. В
противоположность самой мочевой кислоте
образовавшийся продукт (аллантоин) хорошо
растворим в воде и легко удаляется с мочой, не
угрожая выпадением нерастворимого осадка
(мочевых камней). К тому же, аллантоин легко
подвергается ферментативному гидролизу,
расщепляясь на две молекулы мочевины и гли-
оксиловую кислоту.
Для лечения избыточности мочевой ки-
слоты применяют аллопуринол - структурный
изомер гипоксантина, в котором «поменялись»
местами атомы N-7 и С-8. Это вещество оказа-
лось подходящим субстратом для ксантинок-
сидазы. Как и в гипоксантин, она внедряет в
него оксогруппу при С-2, в результате чего об-
разуется аллоксантин, — изомер ксантина.
В этот момент и обнаруживается «обман»: в от-
личие от истинного продукта (ксантина), аллок-
сантин с трудом покидает активный центр фер-
мента, оставаясь связанным с Мо4+ и мешая его
возвращению в состояние Мо6+, которое необ-
ходимо для завершения каталитического цикла.
Тем самым продукт преобразования ферментом
чуждого вещества препятствует работе этого
фермента с природными субстратами (т.е., пре-
вращению гипоксантина в ксантин и ксантина -
в мочевую кислоту). Метаболическая судьба
аллопуринола является типичным примером так
называемого суицидного синтеза.
Блокирование ксантиноксидазы способст-
вует уменьшению уровня мочевой кислоты в
крови и моче (при увеличении содержания
ксантина и гипоксантина, гораздо более рас-
творимых). На этом основано широкое приме-
нение аллопуринола в лечении подагры и осо-
бенно мочекаменной болезни. Эффект усили-
вается благодаря тому, что препарат заметно
уменьшает и общую скорость биогенеза пури-
нов de novo, ибо он отвлекает на себя часть
ФРПФ, образуя с ним рибонуклеотидное со-
единение. Более того, возникающий аллоксан-
тиновый рибонуклеотид является, как оказа-
лось, выраженным ингибитором первой стадии
биогенеза пуринов - реакции синтеза 5-фос-
форибозиламина (см. рис. 9-39,1).
Относительно недавно выяснилось, что
мочевая кислота не только является одним из
конечных продуктов метаболизма, но и способ-
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
345
на «гасить» активные формы кислорода, вклю-
чая супероксидный анион-радикал О2', гидро-
ксидный радикал НО', синглетный кислород
‘О2 (см. раздел 5.5). При этом ураты подверга-
ются неферментативной дециклизации, преоб-
разующей их в аллантоин.
По эффективности антиоксидантного дей-
ствия мочевая кислота не уступает витамину С.
Высказывалось даже мнение, что потеря спо-
собности синтезировать аскорбиновую кисло-
ту, наступившая в ходе эволюции, удачно ком-
пенсирована у приматов утратой уратоксидазы.
Ибо отсутствие этого фермента привело к воз-
никновению уратного пула, антиоксидантный
потенциал которого благоприятствует увели-
чению продолжительности жизни людей и сни-
жению частоты раковых заболеваний.
9.5.5. РЕГУЛЯЦИЯ БИОГЕНЕЗА НУКЛЕОТИДОВ
Хотя биосинтез пуриновых нуклеотидов
осуществляется совсем иначе, чем биогенез
пиримидиновых, оба эти пути протекают впол-
не согласованно, с примерно одинаковой ско-
ростью. В основе такой координации лежат
механизмы автономной саморегуляции.
Предшественником, общим для всех мо-
нонуклеотидов, является ФРПФ. Именно он ста-
новится донором рибозофосфатного фрагмента
для каждого из них (в том числе — для дезокси-
рибонуклеотидов). Синтезируется ФРПФ реак-
цией переноса пирофосфатного конца молекулы
АТФ на первый углеродный атом рибозо-5-
фосфата, генерируемого ГМФ-путем распада
глюкозы. Фермент, катализирующий эту реак-
цию, аллостерически угнетают мононуклеоти-
ды, особенно АМФ, ГМФ. АДФ, ГДФ и d-ТДФ.
Однако, будучи синтезированным, ФРПФ
ускоряет собственную утилизацию в биогенезе
пиримидинов, т.к. активирует карбамоилфос-
фат-синтетазу цитоплазмы, реализующую на-
чало этого пути (реакция 1 на рис. 9-33). Тем
самым создается ситуация постоянной дефи-
цитности ФРПФ. Несколько смягчает такую
опасность торможение этого фермента упомя-
нутыми пуриновыми нуклеотидами, а также
пиримидинами УТФ и ЦТФ.
Наряду с перечисленными эффектами, в
регуляции синтеза пуриновых нуклеотидов
важную роль играют:
— угнетающее действие ГМФ и АМФ на
фермент первой стадии биогенеза пуриновых
оснований (т.е., на реакцию образования
5-фосфорибозиламина, - см. 9-38,1);
- торможение преобразования ИМФ в
АМФ продуктом реакции (т.е., избытком
АМФ) и активация этого ферментативного
процесса повышением уровня ГТФ;
— угнетающее действие ГМФ на метабо-
лизм ИМФ по пути образования ГМФ и акти-
вация этого отрезка пути избытком АТФ.
Обилие факторов регуляции по принципу
обратной связи (чаще - отрицательной), «при-
вязка» их к разным уровням общего метаболи-
ческого процесса, наличие перекрестных алло-
стерических влияний между параллельными
путями, — все это обеспечивает надежную сба-
лансированность процессов биогенеза всех мо-
нонуклеотидов, ее устойчивость к любым ко-
лебаниям потребности в том или ином из них.
То же относится и к выработке дезоксирибо-
нуклеотидов. В трифосфатной форме они, как
правило, угнетают образование своего дифос-
фатного предшественника (из соответствующе-
го рибонуклеотида), но активируют такой же
путь биогенеза для почти любого другого де-
зокси-аналога.
9.6. СИНТЕЗ И РАСПАД ГЕМА
Гем входит в состав множества сложных
белков, которые так и объединяют общим на-
званием — гемопротеины. Именно железо гема
играет главную роль в обеспечении функцио-
нальной активности таких белков, будь то об-
ратимое связывание молекулы кислорода (ге-
моглобин, миоглобин), будь то транспорт элек-
тронов ферментами биологического окисления
(такими, как цитохромы и ряд других).
Как показывает формула на рис. 1-26, в
молекуле гема атом железа фиксирован в цен-
тре большого порфиринового кольца, которое
образуют 4 пиррольных гетероцикла, соеди-
ненных вместе метенильными мостиками.
Поступающие с пищей железопорфирины
и тем более магнийпорфирины растений (хло-
рофиллы) практически не всасываются в пище-
варительном тракте человека. Поэтому обнов-
ление гемопротеинов любой клетки требует не-
прерывного синтеза гемопорфиринов de novo.
346
Глава 9
Только для восполнения постоянной убыли
эритроцитов у взрослого человека синтезиру-
ется (в костном мозге) 250-300 мг гема ежесу-
точно.
8.8.1. БИОГЕНЕЗ ГЕМОПРОТЕИНОВ
При формировании молекулы гемопро-
теина акты включения железа и соединения с
белком происходят только после создания
порфиринового кольца. Синтез его начинается
с реакции менаду сукцинил-КоА и глицином,
представленной на рис. 5-18. Возникающая при
этом о-амино-р-кетоадипиновая кислота спон-
танно теряет карбоксильную группу бывшего
глицина, становясь 5-аминолевулиновой ки-
слотой (АЛК). Поэтому фермент, переносящий
сукцинильный фрагмент на глицин, получил
название 5-тааюлевулинат-синтетаза (АЛК-
синтетаза) Она локализована в митохондриях н
лимитирует скорость всего пути биогенеза пор-
фиринов.
Регуляцию лимитирующего звена контро-
лирует конечный продукт: избыток гема алло-
стерически угнетает АЛК-синтетазу. Этот ме-
ханизм быстрой регуляции дополняется эффек-
тами железа на уровне трансляции. Они обу-
словлены сродством ионов железа к специали-
зированному белку, способному фиксироваться
на инициаторном участке той молекулы мРНК,
которая несет информацию о структуре АЛК-
синтетазы. При недостатке железа этот регуля-
торный белок, связываясь с участком инициа-
ции трансляции в молекуле мРНК, препятству-
ет считыванию информации, т.е., наработке
АЛК-синтетазы. Избыток железа, образуя ком-
плекс с регуляторным белком, удаляет его с
инициаторного участка, а это значит - снимает
блокаду мРНК и тем самым способствует во-
соон
СООН СНг
СНг СНг
>4 "Ju,
НгС ftTWf
ГНг
5-Амино- 5-Амино-
левулинат левулинат
2НаО
S-Амонамеу-
лыМйт-двеифатада
СООН
НООС СНз
£н2
с—с
Порфобилиноген
Рис. 9-40. Образование порфобилиногена конденсацией
молекул 5-аминолевулината.
зобновлению выработки АЛК-синтетазы. Ко-
роче говоря, с увеличением концентрации дос-
тупного железа возрастает доля тех молекул
АЛК-синтетазной мРНК, которые открыты для
трансляции (т.е., для синтеза генного продук-
та), а со снижением уровня железа в клетке
часть таких молекул блокируется, что ведет к
замедлению выработки АЛК-синтетазы.
После перехода 5-аминолевулината в ци-
топлазму происходит реакция конденсации,
посредством которой две молекулы этого ме-
таболита объединяются в пятичленный цикл
порфобилиногена (рис. 9-40). Катализирующая
процесс 2п-зависимая дегидратаза очень чув-
ствительна к инактивирующему действию ио-
нов свинца. Поэтому при интоксикации этим
металлом повышается содержание 5-аминоле-
вулината в крови и моче.
Следующий этап - поочередное соедине-
ние 4 молекул порфобилиногена. Метиленовые
мостики между их гетероциклами появляются
благодаря выделению аммиака, образуемого за
счет аминогруппы одного кольца н водорода
при углероде другого пиррола, свободном от
боковой цепи (рис. 9-41, реакции 1-3). Возник-
шая линейная цепочка из 4 пиррольных колец
смыкается, своими концами, — тоже путем уда-
ления аммиака (рнс. 9-41, 4). Почти всегда
этому предшествует изомеризация кольца IV,
в результате которой ацетатная н пропионатная
цепочки меняются своими местами. В итоге
формируется порфириновая структура, обозна-
чаемая как уропорфириноген Ш.
Декарбоксилирование всех ацетатных це-
почек уропорфириногена III превращает их в
метильные группы, а возникший новый вари-
ант порфирина (копропорфириноген III) под-
вергается дальнейшим преобразованиям в ми-
тохондриях. Здесь происходит отщепление еще
двух молекул СОз (за счет даух пропионатных
радикалов), а главное - осуществляется сту-
пенчатое удаление 10 атомов водорода. Тем
самым реализуются реакции десатурации, при-
водящие к появлению в молекуле еще 5 нена-
сыщенных связей (включая преобразование
метиленовых мостиков в метенильные). Имен-
но процесс «изъятия» атомов водорода приво-
дит к тому, что в конечном продукте — прото-
порфирине IX - формируется система сопря-
женных двойных связей, которая играет важ-
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
347
^OOH
COOH CH2
CH2 CH2
(роон
l^OQH CH2
CH2 CH2
(jWH
COOH CH2
CH2 -
nri
СН2
COOH
1
(pOQH CH2
CH2 CH2
СНг NH
СН2 NH
NH
i /cx ^CH
CH2 XNH
&
NH3
NH3
NH3
Уропорфириноген Itl
Протопорфирин IX
Рис. 9-41. Формирование порфиринового кольца.
ную роль в функционировании гемопротеинов
(см. рис. 9-41). Попутно можно отметить, что
окраску порфириновые структуры обретают
только после обеспечения полной сопряженно-
сти двойных связей молекулы.
Синтез хлорофиллов в растениях протека-
ет с самого начала точно так же, как и синтез
гема. Лишь после образования протопорфири-
на IX происходит присоединение к нему атома
Mg2* (а не железа) и проявляются небольшие
особенности последующей модификации части
боковых группировок. Само же протопорфи-
риновое кольцо остается почти без изменений
(исчезает лишь одна из двойных связей, - в
пирроле IV).
В бактериях, способных синтезировать ви-
тамин В12, исходным материалом для этого
служат тоже 4 молекулы порфобилиногена (как
и при синтезе гема). Но в циклическую струк-
туру, подобную порфириновой, они объединя-
ются без участия аминогрупп (т.е., без удале-
ния аммиака), а совсем иными реакциями. Бо-
лее того: при замыкании этого кольца связь
между пирролами I и IV возникает напрямую,
без промежуточного метиленового мостика
(см. рис. 9-22). Из-за этого большой цикл коба-
ламина не имеет замкнутой системы сопря-
женных двойных связей, а потому вит. Bi2 не
способен участвовать в таких реакциях, кото-
рые типичны для гемопротеинов.
348
Глава 9
Порфирины и более ранние предшествен-
ники гема постоянно выявляются в моче, хотя
и в очень небольших количествах. Повышен-
ная экскреция этих метаболитов и, особенно,
изменения их обычного соотношения в моче
свидетельствуют о нарушении соответствую-
щей стадии биосинтетического процесса. Такие
состояния обозначаются гермином порфирии.
Они встречаются редко и бывают врожденны-
ми или приобретенными (интоксикационны-
ми). Частыми проявлениями болезни бывают
отложения порфиринов в коже (вызывающие
ее гиперчувствительность к свету, образование
трудно заживающих волдырей), а также невро-
логические расстройства. Нарушение главного
пути биогенеза порфиринов способствует уси-
лению побочных реакций, ведущих к синтезу
бесполезных пигментов (включая уропорфири-
ны I и III, копропорф ирины I и III), не пригод-
ных для преобразования в протопорфирин IX.
Некоторым вариантам порфирий сопутствует
отложение пигментов в зубах (его обнаружива-
ет красная флуоресценция в УФ-лучах). Био-
химический анализ мочи (и фекалий) помогает
не только в установлении нарушенного фер-
ментного звена, но и в выборе возможных ле-
чебных мероприятий.
Заключительная стадия биогенеза гема -
внедрение атома Fe2+ в молекулу протопорфи-
рина IX (формула гема показана на рис. 1-26).
Осуществляет эту реакцию феррохелатаза,
активный центр которой обращен в матрикс
митохондрий, а регулирование ее происходит
по принципу отрицательной обратной связи:
избыток образующегося гема угнетает ферро-
хелатазу.
Фиксация готового гема на молекулах со-
ответствующих апобелков завершает синтез
гемопротеинов: миоглобина, гемоглобина, раз-
личных цитохромов и ряда ферментов, вклю-
чая каталазу и пероксидазу.
Стимулирующее влияние гема на синтез а-
и 0-цепей глобина выявлено в эритроцитах (в
период их созревания). Этот эффект реализует-
ся на уровне трансляции.
В заключение следует подчеркнуть, что
важнейшим фактором, контролирующим ин-
тенсивность образования гемопротеинов, явля-
ется доступность железа. Как отмечалось вы-
ше, именно его уровень в клетке регулирует
трансляцию АЛК-синтетазы - ключевого фер-
мента биогенеза гема. Неудивительно поэтому,
что концентрация ионов железа находится под
строгим контролем. В его осуществлении
определяющую роль играют три белка: транс-
феррин, его рецептор и ферритин.
Трансферрин синтезируется в печени в ви-
де апопротеина (-80 кДа), молекула которого
способна связывать 1-2 атома Fe3+. В плазме
крови трансферрин содержится в концентраци-
ях 2-4 г/л (0,02-0,05 мМ) и насыщен железом
примерно на треть своей емкости. Поэтому он
легко захватывает ионы Fe3+ и доставляет их
клеткам-потребителям.
Организм человека усваивает всего 1-2 мг
железа из тех 15-20 мг, что содержатся в су-
точном рационе питания. Всасывается железо в
кишечнике только в восстановленной форме
(Fe2+). В трансферрин плазмы оно включается
благодаря ферментативному окислению до
Fe3+. В десятки раз большее количество Fe3+
трансферрин захватывает в ходе реутилизации
того железа, которое освобождается при распа-
де эритроцитов (и гемоглобина) в ретикуло-
эндотелиальных клетках селезенки, лимфати-
ческих узлов, костного мозга и печени.
Рецептор трансферрина — это белок, ко-
торый необходим для поступления железа
внутрь клеток, синтезирующих гем. Группа
рецепторов, связавшихся с внеклеточным
трансферрином, поглощается клеткой посред-
ством эндоцитоза. В образовавшейся эндосоме
протонный насос мембраны подкисляет ее со-
держимое (до pH 5-6). В такой среде сродство
апотрансферрина к Fe3+ падает на 3 порядка.
Иными словами, белок практически полностью
освобождается от ионов Fe3+ (которые легко
переходят в цитозоль). При этом сохраняется
ассоциация апотрансферрина со своим рецепто-
ром, - вплоть до той поры, пока «облегченная»
эндосома не сольется вновь с плазматической
мембраной. Здесь кислая среда эндосомы резко
сменяется нейтральным значением pH (—7,4)
внеклеточного пространства. Это стимулирует
быструю диссоциацию белок-рецепторного
комплекса, и освободившийся апотрансферрин
опять поступает в плазму в поисках новых пор-
ций Fe3+. Установлено, что весь цикл — от фик-
сации трансферрина на рецепторе до возвра-
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
349
щения его в среду в виде апотрансферрина -
занимает около 16 мин. Мощность транспорт-
ной системы такова, что за 1 мин гепатоцит
может поглотить до 20 000 атомов Fe3+.
Ферритин - внутриклеточный белок, наи-
более изобильный в гепатоцитах и клетках
эритроидного ряда. Локализованный в цитозо-
ле, он состоит из 24 субъединиц, содержащих
по 5-8 центров связывания железа (почти все
они представлены радикалами глутамата). Апо-
ферритин формирует шарообразную оболочку,
окружающую полимеризованные отложения
гидратированного ферри-оксида, в составе ко-
торых пребывает примерно 25% из тех 3-4 г
железа, что содержатся в организме взрослого
человека (в составе трансферрина — лишь
0,1%). Именно ферритин поглощает ионы Fe3+,
высвобождаемые в цитозоль трансферрином
эндосом. Так создается запас железа в раство-
римой, нетоксичной и, в то же время, легко
доступной форме. Перенос Fe3+ из этого резер-
ва на молекулу гема сопровождается восста-
новлением до Fe2+, которое происходит за счет
надФ-я2 под действием флавин-содержащей
редуктазы.
Регуляция синтеза апоферритина реали-
зуется на уровне трансляции, - подобно тому,
как это описано выше для АЛК-синтетазы.
Здесь также имеется специализированный бе-
лок. который при недостатке железа фиксиру-
ется на инициаторном участке апоферритино-
вой мРНК и блокирует ее считывание. Напро-
тив, высокие концентрации Fe3+ отвлекают этот
белок на себя, освобождая от него участок
инициации трансляции и способствуя тем са-
мым возобновлению синтеза апоферритина
(который, аккумулируя ионы Fe3+, снижает их
концентрацию в клетке).
Несколько иначе регулируется количество
рецепторов трансферрина, которое влияет на
интенсивность поглощения клеткой железа (в
составе трансферрина). Для мРНК, кодирую-
щей структуру этого рецептора, связывание со
специальным белком благоприятно тем, что
защищает ее от разрушения рибонуклеазой.
В чрезмерных концентрациях ионы Fe3+ обра-
зуют с этим белком комплексы, теряющие
сродство к мРНК, и тогда лишенная защиты
мРНК трансферринового рецептора становится
более уязвимой для рибонуклеазы. Иными сло-
вами, внутриклеточный дефицит ионов Fe3+
продлевает срок существования этой мРНК,
способствуя тем самым максимальной выра-
ботке молекул рецептора трансферрина, увели-
чению их числа и, как следствие, усилению
доставки Fe3+ в клетку. Избыток внутриклеточ-
ного Fe3+ провоцирует обратные эффекты.
Таким образом, ионы Fe3+ сами поддержи-
вают постоянство своей концентрации в цито-
золе, оказывая регулирующее влияние, с одной
стороны, на трансляцию молекул ферритина, а
с другой - на стабильность мРНК, кодирующей
рецептор трансферрина.
9.6.2 КАТАБОЛИЗМ ГЕМА
Распад гемопротеинов в ходе их обновле-
ния начинается, как правило, с отделения про-
стетической группы. Белковая часть молекулы
подвергается затем протеолизу, продукты ко-
торого поступают в общий аминокислотный
фонд организма и в значительной мере реути-
лизируются. Железо, освобождаемое при де-
градации гема, тоже подлежит реутилизации, —
в основном, после захвата его трансферрином и
депонирования в составе ферритина. И только
порфириновое кольцо гема претерпевает ката-
болические превращения, хотя и далеко не
полномасштабные.
Почти 70% гема, подлежащего катаболиз-
му, поставляют эритроциты. В крови они цир-
кулируют 110-120 дней и, постарев, поглоща-
ются затем ретикуло-эндотелиальными клет-
ками селезенки, костного мозга, печени, где
подвергаются полному разрушению. При этом
молекула гема, отделившаяся от глобина,
окисляется под действием микросомального
фермента — гемоксигеназы. Как показано на
рис. 9-42, окисление, сопровождаемое потреб-
лением 3 молекул Ог и водорода 3 молекул
НАДФ-7/2’ приводит к разрыву связи между
пиррольными кольцами I и II с удалением со-
единявшего их углерода в виде монооксида
(СО). Одновременно освобождается и железо,
- в окисленной форме (Fe3+). Таким способом
порфириновое кольцо гема преобразуется в
линейный тетрапиррол биливердин (имеющий
зеленую окраску). Его превращение в билиру-
бин осуществляется путем восстановления ме-
тенильного мостика между кольцами III и IV
350
Глава 9
ГЕМ
СООН соон
сн2 сн2 сн2 сн2
II I I II
СНз СН СНз СНз СН, СН, СНз сн
СН2 НООС-СНг н2С-СООН
СНз СН СНз СНз СН2 СНз
СНз
сн2
II
сн
о NH Сн NH "СН2 NH СН "NH
БИЛИРУБИН-ДИГЛЮКУРОНИД
(формула - на рис.6-10)
2 Глюку ронат
*
НООС соон
сн2 снь сн2 сн2
СНз СНз СНз СН2 СНг СНз СНз СН2
далц,--
Рис. 9-42. Судьба порфириновой структуры гема.
до метиленового (см. рис. 9-42). На этом, по
существу, и завершается катаболизм порфири-
нового цикла (и не только в упомянутых клет-
ках, но и в других, располагающих небольши-
ми количествами собственных гемопротеинов).
Билирубин обладает оранжевым цветом и
почти нерастворим в воде. Покидая клетку, он
транспортируется с током крови в виде ком-
плексов с альбумином плазмы, способным не-
ковалентно связывать 2-3 молекулы этого пиг-
мента. На поверхности гепатоцитов эти ком-
плексы диссоциируют и освободившийся би-
лирубин легко проникает в клетку путем об-
легченной диффузии, обеспечиваемой каким-
либо из двух белков-переносчиков.
В гладком ЭР паренхиматозных клеток
печени есть специальная трансфераза, которая
переносит остаток глюкуроновой кислоты с
УДФ-глюкуроната на карбоксильную группу
сначала одного, а затем и второго из пропио-
натных фрагментов билирубина. Образующий-
ся билирубин-диглюкуронид (его формула пока-
зана на рис. 6-10) часто называют конъюгиро-
ванным билирубином. Он гораздо лучше рас-
МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ
351
творим в воде и является главной формой вы-
ведения конечного пигмента из организма.
Секреция диглюкуронида в желчь осуществля-
ется механизмом активного транспорта, против
градиента концентрации.
Птицы и рептилии экскретируют не били-
рубин, а несколько лучше растворимый пред-
шественник - биливердин. Зачем млекопитаю-
щие превращают его в более гидрофобную мо-
лекулу билирубина, стало ясно лишь после вы-
явления антиоксидантных свойств последнего.
Оказалось, что именно в таком виде тетрапир-
рольная молекула эффективно «гасит» активные
формы кислорода. Захватывая два гидроперок-
сидных радикала, билирубин спонтанно окисля-
ется до биливердина, который быстро подверга-
ется затем ферментативному восстановлению до
билирубина (как это описано выше).
Таким образом, два из конечных продук-
тов метаболизма - мочевая кислота и билиру-
бин — создаются не только для выведения отра-
ботанных веществ из организма, но и попутно
используются для защиты от токсических эф-
фектов свободных радикалов. Однако, в отли-
чие от мочевой кислоты, которая разрушается
активными формами кислорода (см. раздел
9.5.4), билирубин в борьбе с ними «неисчерпа-
ем». Ибо действует подобно катализатору: уст-
ранив пару гидропероксидных радикалов и
превратившись из-за этого в биливердин, он
снова регенерируется (ферментативным вос-
становлением последнего).
Вместе с витамином С, мочевая кислота и
билирубин (связанный с альбумином) обеспе-
чивают преобладающую долю антиоксидант-
ного потенциала плазмы крови. Кроме того,
билирубин, будучи гидрофобным, вносит (вме-
сте с витамином Е) главный вклад в антиокси-
дантную защиту биомембран.
С выведением билирубин-диглюкуронида
в составе желчи преобразования этого пигмен-
та не заканчиваются. Ферменты кишечной
микрофлоры отщепляют глюкуроновую кисло-
ту и путем частичного восстановления двой-
ных связей превращают тетрапиррольную цепь
в разные формы уробилиногена и, наконец, в
стеркобилиноген (все они бесцветны). В выде-
ляемых фекалиях под действием кислорода
воздуха каждый из этих продуктов нефермен-
тативно лишается двух атомов водорода, вновь
превращаясь в окрашенные соединения - уро-
билин и, соответственно, стеркобилин (форму-
ла последнего приведена на рис. 9-42 для ил-
люстрации структурной близости линейных
тетрапирролов). В подвздошной и толстой
кишках часть уробилиногена всасывается в
кровь и, извлекаясь печенью, вновь экскрети-
руется в кишечник. Некоторая доля уробили-
ногена избегает печеночно-кишечной рецирку-
ляции и, попадая в общий кровоток, выводится
с мочой. Обычное содержание уробилиногена в
суточной моче не превышает 1-4 мг. Оно уве-
личивается при усиленном распаде эритроци-
тов, когда изобилие образующегося билируби-
на попадает в кишечник и способствует повы-
шению поступления уробилиногена в кровь.
Напротив, при полной закупорке желчных про-
токов уробилиноген в моче не обнаруживается
(но зато появляется билирубин).
9.7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выводы, к которым приводит содержание
данной главы, сводятся к тому, что исключи-
тельность аминокислот обусловлена не только
тем, что они необходимы для биосинтеза бел-
ковых молекул (причем, необходимы в полном
комплекте).
Невозможен без привлечения определен-
ных аминокислот и синтез таких важных
структур, как фосфолипиды биомембран; нук-
леотиды (в том числе используемые для по-
строения молекул РНК и ДНК); простетическая
группа гемоглобина и других гемопротеинов;
HS-KoA; карнитин (трансмембранный пере-
носчик жирных кислот); креатин (являющийся
партнером молекул АТФ при накоплении запа-
сов макроэргического фосфата в мозгу и мыш-
цах) и т.д. Аминокислоты, содержащие серу,
оказываются у животных единственным ис-
точником сульфатных групп, потребных для
включения в сульфопротеины и сульфатиро-
ванные гликозаминогликаны межклеточного
вещества и, кроме того, используемых для де-
токсикации и выведения некоторых ксенобио-
тиков.
Многие гормоны, нейромедиаторы, дру-
гие регуляторные и сигнальные молекулы тоже
являются метаболитами той или иной амино-
кислоты. Адреналин, норадреналин, тироидные
352
Глава 9
гормоны, ацетилхолин, гистамин, серотонин,
полиамины, оксид азота — все это далеко не
полный перечень жизненно необходимых ме-
таболитов аминокислот, обладающих высокой
и очень избирательной биологической актив-
ностью.
По соотношению аминокислот обычные
пищевые белки отличаются от оптимального
для нашего организма. В определенной степе-
ни (в рамках заменимых аминокислот) этот
дисбаланс компенсируется благодаря ами-
нотрансферазным реакциям. Однако, во избе-
жание возможного дефицита какой-либо из
незаменимых аминокислот, белковое питание
должно быть несколько избыточным. Невос-
требованные аминокислоты (т.е., оказавшиеся
«излишними») подвергаются трансдезамини-
рованию, общий темп которого контролирует
глутаматдегидрогеназа (раздел 9.2.1). Выде-
ляемый при этом аммиак обезвреживается,
превращаясь в безопасный конечный продукт -
мочевину. Оставшиеся безазотистые фрагмен-
ты аминокислот так или иначе преобразуются в
метаболиты ЦТК, в котором и расщепляются
до СО2 и Н2О, освобождая соответствующее
количество энергии в виде АТФ. Принципи-
ально сходным образом расщепляются и спе-
циализированные метаболиты аминокислот.
Едва ли не единственными исключениями яв-
ляются довольно крупные молекулы мочевой
кислоты и билирубина, которые удаляются без
дальнейшего расщепления (и уносят с собой
часть экскретируемого азота). Но и эти конеч-
ные продукты успевают до выведения выпол-
нить еще одну полезную функцию - антиокси-
дантную.
В общей сложности, за счет утилизации
избыточных аминокислот (оказавшихся «не у
дел») либо их метаболитов, выполнивших свою
миссию, в организме человека-образуется лишь
10-15% от общего количества АТФ, генери-
руемого при обычном рационе питания.
Глава 10
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
Соединительную ткань можно обозначить
как межклеточное вещество вместе с клетками,
которые его вырабатывают, а также клетками,
выполняющими функцию защиты.
Термин «межклеточное вещество» ставит
акцент на том, что соединительная ткань зани-
мает пространства между специализированны-
ми клетками печени, почек, мышц и других
органов. Однако кроме этого она формирует и
особые структуры (сухожилия, связки, Хрящ,
дерма и т.д.), состоящие только из внеклеточ-
ного вещества, созидающих его клеток и кле-
ток защиты. В костях и зубах структурные
клетки помимо выработки макромолекул вне-
клеточного пространства обеспечивают еще и
его минерализацию.
У позвоночных соединительная ткань яв-
ляется наиболее распространенной. При всем
разнообразии ее вариантов, главным объеди-
няющим признаком является общность проис-
хождения структурных клеток (из линии меха-
ноцитов мезенхимы), предопределяющая их
способность вырабатывать межклеточное ве-
щество.
Настоящая глава посвящена доминирую-
щему варианту соединительнотканных образо-
ваний, который обозначается как собственно
соединительная ткань. В качестве синонима
используют термин волокнистая соединитель-
ная ткань. Он возник на основе ранних наблю-
дений, обнаруживших, что ее межклеточное
вещество - внеклеточный матрикс (ВКМ) -
содержит не только «аморфные» компоненты
(основное вещество матрикса), но и множест-
во видимых под микроскопом волокон. Если
фибриллярные структуры преобладают над
основным веществом, то такую ткань обозна-
чают как плотную соединительную ткань (ее
вариантами являются, в частности, сетчатый
слой дермы, сухожилия, связки). Рыхлая со-
единительная ткань характеризуется обрат-
ным соотношением волокон и «аморфных»
компонентов ВКМ, гораздо большим количе-
ством и разнообразием клеток защиты. Она
является наиболее типичным и главным по
распространенности вариантом соединитель-
ной ткани, образуя строму различных органов,
собственную пластинку и подслизистую осно-
ву слизистых оболочек, сосочковый слой дер-
мы, пульпу зуба и т.д. Все это позволяет рас-
смотреть биохимические особенности именно
рыхлой соединительной ткани в качестве наи-
более представительного варианта, отмечая в
необходимых случаях специфику иных соеди-
нительнотканных образований.
10.1. КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ
Клетки, созидающие межклеточное веще-
ство, составляют лишь сотые доли от всего
объема ткани и обозначаются как структурные
клетки. Другое название - резидентные клет-
ки. Оно возникло, чтобы отличать их от так
называемых «пришлых» клеток («мигрантов»),
которые не участвуют в выработке структур-
ных элементов внеклеточного вещества, но
354
Глава 10
призваны защищать ткань от повреждений
(клетки защиты). В основном это потомки
стволовой клетки крови, проникающие в со-
единительную ткань из кровеносного русла.
Одни из них обладают механизмами неспеци-
фической (врожденной) защиты от почти лю-
бых повреждающих агентов. Другие осуществ-
ляют комплекс мер по распознаванию призна-
ков чужеродности (антигенов) и избиратель-
ному устранению обладателей таких признаков
(иммунная защита). Как правило, активизация
перечисленных функций сопровождается раз-
витием элементов цитоскелета, благодаря чему
возникает (или усиливается) подвижность за-
щищающих клеток.
10.1.1. СТРУКТУРНЫЕ КЛЕТКИ
Главными производителями структурных
элементов межклеточного вещества являются
фибробласты. Обеспечивая построение ВКМ,
они вместе с тем осуществляют и его обновле-
ние, используя для этого свою способность вы-
делять в среду гидролитические ферменты.
Сбалансированность процессов биосинтеза и
разрушения играет решающую роль в поддер-
жании постоянства состава ВКМ.
Строительная функция фибробластов регу-
лируется в основном с участием различных ре-
цепторов. Для некоторых стимулом являются
продукты внеклеточного распада коллагена и
иных компонентов ВКМ. Большинство же обла-
дает избирательной восприимчивостью к тем
или иным сигнальным молекулам, выделяемым
другими клетками. Так осуществляются дис-
тантные взаимодействия фибробластов между
собой и с клетками защиты. Важное значение
при этом имеет подвижность фибробластов
(обеспечиваемая наличием сократимых микро-
филаментов в цитоплазме), а также их способ-
ность обратимо прикрепляться к коллагеновым
волокнам матрикса посредством трансмембран-
ных адгезивных белков - интегринов, которые
внутри клетки соединяются с цитоскелетом.
Наряду с обычными фибробластами, со-
единительная ткань содержит в небольшом ко-
личестве и некоторые варианты этих клеток.
К ним относятся:
- фиброциты, которые представляют со-
бой постаревшие фибробласты: они уже не
столь энергичны, но могут, похоже, «давать
советы» молодым клеткам;
- фиброкласты, проявляющие себя как
однобоко развившиеся фибробласты: они слабо
синтезируют матрикс, но очень энергичны в
его разрушении; предпочитают скапливаться
там, где надо уничтожать поврежденный или
избыточный матрикс;
— миофибробласты, которые сочетают
способность активно синтезировать все эле-
менты ВКМ с высокой подвижностью, обу-
словленной сильно развитым (как у гладких
миоцитов) сократительным аппаратом; могут
быстро продвигаться к местам повреждения и
активно участвовать в процессах репарации
ткани;
- адипоциты, главным признаком кото-
рых является наличие крупной жировой капли,
занимающей почти весь объем клетки. Хотя
единичные адипоциты повсеместно распростра-
нены в рыхлой соединительной ткани, особая ее
разновидность, где они сильно преобладают,
именуется жировой тканью (гиподерма, саль-
ник и т.д.). Будучи результатом трансформации
фибробластов, сопровождающейся коренной
перестройкой биохимизма клетки, адипоциты
обладают уникальной способностью вновь пре-
вращаться в фибробласты после утраты жиро-
вых включений, вызванной голоданием.
10.1.2. КЛЕТКИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ
Ведущую роль в механизмах неспецифи-
ческой защиты от потенциально опасных аген-
тов исполняют макрофаги (гистиоциты), по
численности уступающие только фибробла-
стам, а также нейтрофилы. Многообразием
рецепторного аппарата этих клеток обеспечи-
вается узнавание и поглощение микробов,
трансформированных или поврежденных кле-
ток, деградирующих макромолекул и даже час-
тиц минерального состава.
Фагоцитоз сопровождается не только рез-
ким усилением функций лизосом, но и много-
кратным возрастанием общей метаболической
активности клеток. Благодаря этому включается
еще один механизм - «дыхательный взрыв»
(«оксидативный стресс»). Так обозначают рез-
кий скачок в утилизации глюкозы ГМФ-путем
(продукция НАДФ.ВД) и в потреблении кисло-
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
355
рода клетками. Вместе это ведет к интенсивной
выработке активных форм кислорода (раздел
5.5.1). Они используются для уничтожения
микроорганизмов и перерожденных клеток,
для разрушения различных органических мо-
лекул. В реализацию этого механизма важный
вклад вносит нейтрофильная миелопероксидаза
(раздел 5.5.2).
Еще одним способом неспецифической
защиты является эффект неферментной бакте-
рицидности. Ею обладают дефенсины {«за-
щитники») - небольшие (3-4 кДа) пептиды, со-
средоточенные в гранулах нейтрофилов и мак-
рофагов. Катионные свойства (р! > 9,0), обус-
ловленные наличием 4-10 остатков аргинина и
лизина, сочетаются в этих пептидах с изобили-
ем неполярных радикалов. Пространственное
разделение заряженного участка и гидрофоб-
ной зоны фиксировано тремя S-S-мостиками.
Такое амфипатическое устройство придает де-
фенсинам высокую мембранотропность, лежа-
щую в основе их бактерицидного действия.
При этом катионный фрагмент сорбируется на
клеточной оболочке микробов путем связыва-
ния с ее анионными компонентами (тейхоевые
кислоты, липополисахариды, кислые фосфоли-
пиды), а гидрофобная зона внедряется в непо-
лярную фазу бислойной мембраны бактерий и
грибов. В итоге наступает дезорганизация мем-
бран. вплоть до образования сквозных пор и
вытекания клеточного содержимого с после-
дующей гибелью микробной клетки. Бактери-
цидная активность дефенсинов столь высока,
что их обозначают еще как «антибиотические
пептиды животных».
Нейтрофилы - это клетки одноразового
действия. Внося свой вклад в защиту, они бы-
стро погибают, успев призвать смену в лице
макрофагов, живущих неделями и даже меся-
цами. Хемоаттрактантами при этом могут слу-
жить продукты распада обезвреженных микро-
организмов и компоненты самих погибших
нейтрофилов. Несравненно более избиратель-
ными являются хемокины, относящиеся к чис-
лу цитокинов (см. ниже).
10.1.3. КЛЕТКИ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ
Феномен специфического иммунитета
обеспечивают в основном лимфоциты. Как и
другие лейкоциты, в нормальной ткани они
очень немногочисленны, но, в отличие от них,
способны к рециркуляции, попадая с током
лимфы в кровь и другие ткани, а затем вновь
возвращаясь в соединительную. Такой круго-
оборот клеток, включающий прохождение ор-
ганов иммунной системы, - необходимый эле-
мент их жизненного цикла с его периодами со-
зревания и «обучения» некоторым функцио-
нальным обязанностям.
У взрослого человека все лимфоциты по-
стоянно образуются в костном мозге; общее
число их в организме составляет около 2x1012
клеток. Внешне одинаковые, они по своим фе-
нотипическим проявлениям (спектру синтези-
руемых белков) подразделяются на разные по-
пуляции, субпопуляции и даже «микропопуля-
ции» (клоны). Прежде всего - на клетки гумо-
рального иммунитета (В-лимфоциты, созре-
вающие в костном мозге) и клетки клеточного
иммунитета, обозначаемые как Т-лимфоциты,
поскольку их размножение и первичная про-
филизация происходят в вилочковой железе
(тимус).
Активацию тех и других инициирует
взаимодействие со специализированными ан-
тиген-представляющими клетками. Название
отражает функцию поглощения чуждого био-
логического материала, его избирательного
расщепления протеасомами и предъявления
(презентации) лимфоцитам результатов этой
работы в виде антигенных детерминант. Каж-
дая из них {эпитоп) представляет собой не-
большой фрагмент исходного антигена, по
размерам соответствующий примерно 10 ами-
нокислотным остаткам. Поэтому нередко в од-
ном объекте клетки антигенной презентации
«вычленяют» несколько различающихся эпи-
топов, специфические антитела к каждому из
которых синтезируются впоследствии разными
клонами плазматических клеток (о плазмоци-
тах см. ниже).
Обязательной для антиген-представляю-
щих клеток является также выработка глико-
протеинов главного комплекса гистосовме-
стимости (МНС, - от англ. Major Histocom-
patibility Complex), иначе именуемых антиге-
нами лейкоцитов человека (система EELA, - от
англ. Human Leukocyte Antigens). Различают
два главных класса МНС. Маркеры класса I
356
Глава 10
(МНС-I) синтезируются всеми типами клеток
(кроме спермиев) и представлены на их по-
верхности в виде комплексов с антигенными
детерминантами собственной клетки. Выраба-
тывать молекулы МНС класса II способны не-
которые Т-клетки и макрофаги, а также те
клетки, которые называют «профессиональны-
ми» клетками антигенной презентации. К ним
относятся дендритные антиген-представля-
ющие клетки (происходящие от общего с мак-
рофагами предшественника) и В-лимфоциты
(возможно, и сами макрофаги тоже). На по-
верхности таких клеток каждая молекула
МНС-П представлена в виде комплекса с той
или иной антигенной детерминантой (форми-
рование комплекса из уже готовых предшест-
венников осуществляется в эндосомах).
Выявление чуждых организму антигенов и
демонстрация их эпитопов (в комплексе с
МНС-П) на поверхности антиген-представля-
ющих клеток является необходимым этапом в
уничтожении микроорганизмов и видоизменен-
ных (в том числе опухолевых) клеток собст-
венного тела.
И тимус-зависимые клетки (Т-лимфо-
циты), и В-лимфоциты обладают рецепторами
для распознания эпитопов, предъявляемых
клетками презентации антигена. Эти рецепто-
ры обозначаются соответственно как Т-клеточ-
ные рецепторы (ТКР) и антиген-распозна-
toufue рецепторы (АРР). В каждой клетке они
строго комплементарны только одному эпито-
пу, но в целом набор как ТКР, так и АРР в по-
пуляциях Т- и В-лимфоцитов достаточен для
распознавания примерно миллиарда разных
антигенов. Эта «всеохватность» обеспечивает-
ся интенсивной перестройкой (реаранжиров-
кой) соответствующих генов в процессе есте-
ственной дифференциации клеток-предшест-
венниц, которая протекает еще в отсутствие
антигенной стимуляции и приводит к форми-
рованию по 109 клеточных клонов как Т-, так и
В-лимфоцитов.
Одно из кардинальных проявлений акти-
вирующего эффекта антиген-представляюших
клеток - резкое усиление пролиферации соот-
ветствующей группы лимфоцитов (наступает
экспансия клона).
Т-лимфоциты отличаются тем, что для
распознавания антиген-представляющих кле-
ток синтезируют не только ТКР, но и дополни-
тельные рецепторы (корецепторы). Это особые
белки, обозначаемые как CD-8 и CD-4. Ком-
плементарные белкам гистосовместимости (со-
ответственно МНС-I и МНС-П), они находятся
на клеточной поверхности в виде комплекса с
ТКР и в значительной мере предопределяют
профиль деятельности Т-лимфоцитов после их
активации, - быть ли им клетками-помощни-
ками, клетками цитотоксичности или угне-
тающими клетками.
Клетки-помощники (Т-хелперы, — Тк) об-
ладают корецептором CD-4. Поэтому они мо-
гут узнавать «свой» эпитоп антигена только на
«профессиональных» клетках антигенной пре-
зентации, у которых эта антигенная детерми-
нанта состоит в комплексе с МНС-П. Непо-
средственный контакт с такими клетками пере-
водит соответствующий клон хелперов в ак-
тивное состояние. Оно проявляется быстрой
пролиферацией клеток этого клона, а главное -
их участием в трансформации покоящихся
В-лимфоцитов в клетки, энергично вырабаты-
вающие антитела.
Цитотоксичные Т-лимфоциты (Т-киллеры,
- ТЭ синтезируют CD-8, в комплексе с кото-
рым ТКР распознает «свой» эпитоп антигена
на тех клетках, где он ассоциирован с МНС-1.
Обычно это клетки опухолей, трансплантата
либо клетки, инфицированные вирусами, гри-
бами, некоторыми бактериями. Вступив в кон-
такт с клеткой-мишенью, Тк оказывает на нее
летальное воздействие, после чего отсоединя-
ется от гибнущей клетки и отправляется на по-
иски очередной жертвы. Цитотоксический эф-
фект реализуется строго прицельно и без по-
вреждения соседних клеток, - по принципу
«смертельного поцелуя». В основе лежит целе-
направленный выброс из гранул Тк особых
белков - перфоринов. Встраиваясь в плазмо-
лемму мишени, эти белки быстро формируют в
ней агрегаты в виде трансмембранных пор,
приводящих к утечке клеточного содержимого.
Возможен также экзоцитоз ряда факторов, ко-
торые через перфориновые поры проникают в
клетку-мишень и индуцируют в ней процесс
апоптоза (генетически запрограммированный
механизм гибели клетки). Наряду с контакт-
ным умерщвлением, Тк способны оказывать и
гуморальное цитотоксическое действие. Оно
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
357
осуществляется путем секреции в окружаю-
щую среду активных форм кислорода, а также
простагландина Е2
Угнетающие клетки (Т-супрессоры, - Тс)
похожи на Тк способностью синтезировать
CD-8 и, следовательно, распознавать те из
«своих» антигенов, которые комплексированы
с маркерами класса МНС-L Однако, в отличие
от киллеров, супрессоры могут взаимодейство-
вать не с любыми клетками, обладающими ука-
занными признаками, а лишь с теми, которые
относятся к числу В-лимфоцитов, Т-хелперов
или Т-киллеров. Супрессоры подавляют функ-
циональную активность названных клеток-ми-
шеней при непосредственном контакте с ними
либо путем секреции угнетающих факторов.
Молекулярные механизмы такого действия пока
не установлены, равно как и причины избира-
тельности лишь к некоторым носителям МНС-1.
В-лимфоциты - это клетки, специализи-
рованные на выработке индивидуальных анти-
тел (иммуноглобулинов) и обеспечивающие
тем самым механизмы гуморального иммуни-
тета. Главную особенность этих клеток состав-
ляет наличие высокоспецифичного антпиген-
распознающего рецептора (АРР) на их поверх-
ности. Клетка содержит очень много таких ре-
цепторов одинакового строения ~ до 100 000.
Каждый представляет собой молекулу имму-
ноглобулина класса М (IgM), вариабельная
часть которого образует около миллиарда
различных модификаций, экспрессируемых
В-лимфоцитами разных клонов.
К другим элементам рецепторного аппара-
та В-лимфоцитов относятся маркеры гистосов-
местимости обоих классов (МНС-I и МНС-П),
а также рецепторы к Гс-участку иммуногло-
булинов и к СЗ-компоненту комплемента.
Покоящиеся В-лимфоциты соответствую-
щего клона, обнаружив антиген своим АРР,
подвергают его эидоцитозу и далее - ограни-
ченному протеолизу. После этого антигенный
эпитоп «выставляется» на поверхность клетки
в виде комплексов с МНС-IL Именно они рас-
познаются комплементарными им рецептор-
ными структурами (TKP/CD4) Т-хелперов,
предварительно подготовленных («обучен-
ных») антиген-представляющими клетками.
Такой контакт с Тх - вполне достаточный сти-
мул, побуждающий В-лимфоциты к пролифе-
рации и преобразованию в плазматические
клетки. Его эффект усиливается ассоциацией
рецепторного белка CD40 на плазмолемме
В-лимфоцита с комплементарным ему лиган-
дом CD40L, имеющимся на активированном
Тх. Эти дополнительные взаимодействия нуж-
ны еще и для переключения синтетического ап-
парата В-лимфоцита с выработки IgM на про-
дукцию иммуноглобулинов других изотипов.
Некоторые антигены могут стимулировать
В-лимфоциты без привлечения Т-клеток. Эта
небольшая группа тимус-независимых антиге-
нов представлена веществами, в молекуле ко-
торых антигенная детерминанта повторяется
многократно. К ним относятся, в частности,
крупные полисахариды микроорганизмов и
полимеры D-аминокислот. Такой антиген спо-
собен связывать несколько АРР в пределах од-
ной клетки и уже только этим вызывать акти-
вацию В-лимфоцитов (включая стимулирова-
ние их к биосинтезу антител).
Плазматические клетки (плазмоциты)
представляют собой конечный этап развития
В-лимфоцитов. В ходе дифференцировки, ини-
циированной описанными выше стимулами,
они лишаются мембранных иммуноглобули-
нов, рецепторов к СЗ-компоненту комплемен-
та, антигенов гистосовместимости системы
МНС и некоторых других маркеров. В основ-
ном плазмоциты сосредоточены на биосинтезе
антител: одна клетка вырабатывает тысячи им-
муноглобулиновых молекул за 1 секунду (по-
рядка 10 миллионов молекул в час). Этим объ-
ясняют неспособность этих клеток к дальней-
шему росту и делению; погибают они после
нескольких дней интенсивной выработки анти-
тел. Синтезируемые иммуноглобулины не на-
капливаются в секреторных гранулах, а посто-
янно выделяются в среду мелкими порциями
механизмом экзоцитоза.
Отмеченное выше переключение биосин-
теза иммуноглобулинов с одного изотипа на
другой плазмоциты осуществляют без измене-
ния их антиген-связывающего участка. Чаще
всего исходная выработка IgM сменяется на
продукцию изотипов класса IgG или IgA, при-
чем, клетка может синтезировать до трех клас-
сов иммуноглобулинов одновременно.
Тучные клетки занимают несколько осо-
бое место в механизмах защиты. Обильно
358
Глава 10
представленные в рыхлой соединительной тка-
ни (до 10% клеточного состава), они распола-
гаются преимущественно около мелких сосу-
дов и живут сравнительно долго (до несколь-
ких месяцев), сохраняя при этом готовность к
делению. Способны к миграции, устанавлива-
ют многочисленные контакты с коллагеновыми
волокнами и иными белками межклеточного
вещества, а также с эндотелием мелких сосу-
дов и с нервными волокнами. Но главная осо-
бенность тучных клеток обусловлена тем, что
их цитоплазма очень богата разными гранула-
ми, в которых аккумулированы многие фер-
менты, ряд гликопротеинов и протеогликанов,
фосфолипиды. Из депонированных в гранулах
веществ наиболее высокой биологической ак-
тивностью обладают такие, как гистамин, до-
фамин. гепарин, хемоаттрактанты нейтрофилов
и эозинофилов.
В обычных условиях происходит медлен-
ная дегрануляция тучных клеток механизмом
микровезикулярного экзоцитоза. Малые дозы
секретируемых эффекторов обеспечивают по-
вседневную локальную регуляцию, главным об-
разом, сосудистого тонуса и проницаемости ка-
пилляров. Значительное усиление дегрануляции
могут стимулировать ряд бактериальных про-
дуктов; анафилатоксины СЗа и С5а системы ком-
племента; некоторые цитокины. Эта активиза-
ция секреторной функции является составной
частью ответных реакций на повреждение ткани.
Гораздо интенсивнее протекает дегрануля-
ция в сенсибилизированных клетках. Она реали-
зуется в течение нескольких минут, а процесс
восстановления клеток (регрануляция) требует
затем не менее 1-2 дней.
Способность к сенсибилизации обуслов-
лена наличием у тучных клеток, как и у базо-
филов, множества рецепторов (до 100 тысяч
на клетку) с очень высоким сродством к
Рс-участку иммуноглобулинов класса Е (IgE).
Последние могут вырабатываться только у лю-
дей с генетически обусловленной чувствитель-
ностью к определенному антигену, который
получил специальное название - аллерген (не-
редко наблюдается индивидуальная восприим-
чивость к нескольким аллергенам). Первый же
контакт с экзогенными молекулами, обладаю-
щими признаками аллергена, ведет к синтезу
иммуноглобулинов класса IgE, который проис-
ходит в соответствующих клонах плазматиче-
ских клеток. Антитела, поступающие затем в
межклеточное пространство, легко улавливают-
ся и прочно фиксируются рецепторами тучных
клеток. В этом и заключается их сенсибилиза-
ция. Для разных людей в качестве аллергена
могут выступать компоненты цветочной пыль-
цы, домашней пыли, перхоти животных, пчели-
ного яда, некоторых пищевых продуктов и т.д.
При повторном попадании в организм ал-
лерген сорбируется своими антигенными де-
терминантами на Гаь-участках фиксированных
IgE. Обладая поливалентностью, аллерген свя-
зывается с двумя-тремя молекулами IgE на од-
ной клетке. Это и служит сигналом к массив-
ной дегрануляции тучных клеток (анафилак-
тическая дегрануляция), реализуемой при уча-
стии вторичных посредников. Выброшенные в
среду высокоактивные компоненты гранул вы-
зывают спазм гладких мышц, расширение со-
судов (с падением кровяного давления), повы-
шение проницаемости капилляров, способст-
вуют развитию отеков и других повреждений
ткани. Эти эффекты сопровождаются активи-
рованием в тучных клетках липоксигеназного и
циклооксигеназного путей метаболизма арахи-
доновой кислоты, которое приводит к усиле-
нию продукции целого спектра сигнальных
молекул в виде лейкотриенов (см. рис. 5-53) и
простаноидов (см. рис. 5-54). Проявления мас-
сивной дегрануляции тучных клеток могут
быть локальными (крапивница, пищевая аллер-
гия, аллергический ринит и т.п.) либо генера-
лизованными (анафилактический шок).
10.1.4. МЕЖКЛЕТОЧНОЕ ОБЩЕНИЕ
Фундаментальным свойством иммунной
системы является способность отличать чужое
от своего. И, соответственно, эффективно ней-
трализовать чуждый материал, не нанося
ущерба нормальным клеткам (и макромолеку-
лам) собственного организма. Для этого в про-
цессе эволюции у позвоночных сформировался
механизм дифференцировки клеток защиты на
различные популяции, каждая из которых вно-
сит свой специфический вклад в противодейст-
вие повреждающим факторам. Это разделение
обязанностей требует и четкой межклеточной
кооперации. Зачастую она реализуется путем
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
359
прямых контактов между клетками защиты,
отмеченных выше. Однако чрезвычайно важ-
ную роль играет еще и межклеточное общение
посредством химических сигналов.
Среди сигнальных молекул наиболее мно-
гочисленна группа так называемых цитокинов.
Как правило, это небольшие (5-30 кДа) глико-
протеиновые молекулы, нередко димерные. К
настоящему времени известны многие сотни
цитокинов. Названия им давали обычно по
первому обнаруженному эффекту. Так возник-
ли наиболее распространенные термины: ин-
терлейкины (ИЛ); интерфероны (ИФН); раз-
личные факторы роста, включая эпидермаль-
ный (ЭФР) и трансформирующие факторы рос-
та (ТФР); факторы, стимулирующие рост коло-
ний (колониестимулирующие факторы - КСФ);
факторы некроза опухолей (ФНО). Теперь эти
названия мало что говорят о характере прояв-
ляемой активности. Многие цитокины (особен-
но ИЛ-8, ИЛ-15, ИЛ-16) выполняют роль хемо-
кинов, осуществляя избирательное привлечение
(рекрутирование) клеток, обладающих соответ-
ствующими рецепторами. Часто это сочетается
с влиянием на пролиферацию клеток-мишеней,
а также на интенсивность их основной функции.
Однако самым типичным свойством цитокинов
является способность управлять дифференци-
ровкой клеток-мишеней, т.е., регулировать экс-
прессию тех или иных генов. Направленность
конкретных эффектов (стимуляция, угнетение)
может изменяться в зависимости от состояния
мишени, а также от сочетания разных сигналь-
ных молекул.
Биогенез цитокинов регулируется в основ-
ном индукторами кратковременного действия,
реализуемого на уровне транскрипции, и реак-
циями постсинтетической модификации. Эффек-
тивность цитокинов исключительно высока: свое
действие на рецепторы они проявляют в чрез-
вычайно низких концентрациях (10'9-1СГ12 М).
Однако, будучи чувствительными к протеоли-
тическим ферментам, они успевают воздейст-
вовать только на клетки, расположенные непо-
далеку (паракринная регуляция). Многие цито-
кины некоторое время остаются связанными с
плазматической мембраной («заякоренные»
молекулы) и тогда могут связываться с рецепто-
ром только непосредственно примыкающей
клетки-мишени, модулируя ее функции (юк-
стакринная регуляция). Наконец, нередко клет-
ка способна к выработке и сигнальной молеку-
лы, и рецептора к ней (аутокринная регуляция}',
как правило, этим способом реализуется эффект
самоактивации (самовозбуждения) клеток.
Регуляторные функции цитокинов про-
являются на всех этапах осуществления функ-
ции защиты.
Так, активацию Тх прямым контактом с ан-
тиген-представляющими клетками дополняет
стимулирующий эффект интерлейкина-1, кото-
рый эти клетки выделяют в ходе контакта. В
итоге резко ускоряется пролиферация «пробуж-
денного» клона лимфоцитов. Кроме того, вклю-
чается биосинтез хелперами ряда адгезивных
молекул и цитокинов. В частности, индуцирует-
ся выработка интерлейкина-2 и - одновременно
- рецептора к нему; благодаря этому усиливает-
ся клональная экспансия (эффект самоактива-
ции Тх). Отмечается и четкая специализация
Т-хелперов. Одни из них секретируют ряд ин-
терлейкинов (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-15), под-
крепляющих контактную активацию В-лимфо-
цитов хелперами. Другие вырабатывают у-ИФН
- главный из цитокинов, активирующих макро-
фаги (тем самым привлекается потенциал кле-
ток неспецифической защиты). Активные мак-
рофаги, со своей стороны, выделяют ИЛ-12, уси-
ливающий продукцию у-интерферона Т-клет-
ками, и ИЛ-10, подавляющий ее. Так достигает-
ся не только разнообразие регуляторных взаи-
мовлияний, но и возможность направления за-
щитных реакций по альтернативному пути.
Приведенными примерами далеко не ис-
черпывается богатство языка межклеточного
общения посредством сигнальных молекул. Бо-
лее того: оно не ограничивается только клетка-
ми защиты. Вовлекаются и клетки-строители.
Установлено, что ряд цитокинов, выде-
ляемых клетками защиты при активации, вы-
зывает стимуляцию фибробластов. В частно-
сти, изоформы тромбоцитарного фактора рос-
та, продуцируемые макрофагами, действуют на
фибробласты и как хемоаттрактанты, и как ин-
дукторы пролиферации. Рост фибробластов и
их активность стимулируют также ИЛ-1 и
трансформирующие факторы роста, синтези-
руемые макрофагами и Т-лимфоцитами, а еще
и факторы некроза опухолей, происходящие из
Т- и В-клеток.
360
Глава 10
С другой стороны, активация фибробла-
стов приводит к выработке ими цитокинов, ре-
гулирующих деятельность определенных кле-
ток защиты. Таких как ИЛ-15, являющийся хе-
моаттрактантом для Т-лимфоцитов, и ИЛ-6,
который стимулирует дифференциацию кле-
ток-киллеров и способствует превращению
В-лимфоцитов в плазматические клетки.
Наконец, фибробласты способны выраба-
тывать и такие цитокины, к которым сами об-
ладают рецепторами. Особенно это относится к
упоминавшемуся ИЛ-1. В данном случае эф-
фект аутокринной самоактивации клеток до-
полняется еще одним регуляторным механиз-
мом: фибробласты способны синтезировать и
выделять антагонист рецептора к ИЛ-1. Все это
обеспечивает структурным клеткам определен-
ную автономию в процессах построения вне-
клеточного матрикса. Эта автономия не абсо-
лютна хотя бы уже потому, что вырабатывать
упомянутый антагонист способны и другие
клетки (в том числе нейтрофилы и макрофаги).
Итак, в целом клетки защиты осуществля-
ют тесную кооперацию между собой и с рези-
дентными клетками, подвигая фибробласты на
репаративную деятельность. В сущности,
именно соединительная ткань, особенно рых-
лая, становится главной ареной, где разверты-
ваются процессы как неспецифической, так и
иммунной защиты. Максимальная выражен-
ность этих процессов проявляется как воспале-
ние. Его инициируют и исполняют клетки за-
щиты. Очередность и варианты их действий,
полнота и конкретные последствия очень раз-
личны. В большой степени это зависит от ха-
рактера повреждающих факторов, каковыми
могут быть состоявшаяся деструкция ткани
(механические травмы, термические поврежде-
ния и т.д.) или потенциальная угроза (микробы,
их продукты). Поэтому используют соответст-
вующие уточнения - острое воспаление, хро-
ническое, асептическое, инфекционное, аллер-
гическое и т.д. При благоприятном исходе к
заживлению очагов деструкции привлекаются
фибробласты, обеспечиващие восстановление
целости разрушенных участков межклеточного
вещества. Образуемая ими грануляционная
ткань, созревая, превращается в рубцовую.
Завершая характеристику клеточных эле-
ментов соединительной ткани, можно сделать
следующие обобщения:
1. Фибробласты и родственные им клетки
осуществляют построение внеклеточных струк-
тур и «оформление» ткани в целом, обеспечивая
метаболическое обновление ее при сохранении
постоянства состава.
2. Потомки стволовой клетки крови обес-
печивают защиту от микробных и иных повре-
ждений, участвуют в уничтожении (или отгра-
ничении) фактора агрессии и помогают фиб-
робластам формировать грануляционную ткань
и рубцы для компенсации нанесенного ущерба.
10.2. ВОЛОКНА ВНЕКЛЕТОЧНОГО
МАТРИКСА
Видимые под микроскопом волокнистые
образования в межклеточном веществе весьма
разнообразны. Тем не менее, в подавляющем
большинстве своем они построены из коллаге-
на. Совсем иные белки входят в состав других
волокон - эластических.
10.2.1. СТРОЕНИЕ КОЛЛАГЕНОВЫХ ВОЛОКОН
Коллаген - это общее название, большого
семейства очень похожих белков. Каждая мо-
лекула такого белка состоит из трех поли пеп-
тидных целей, обозначаемых как a-цепи (не
путать с а-спиралью’).
К настоящему времени у человека выявле-
но до 30 нормальных вариантов a-цепи, разли-
чающихся по аминокислотному составу (табл.
10-1) и кодируемых, соответственно, разными
генами. Сочетание одинаковых или разных а-
цепей позволяет формировать различные типы
коллагена. Их обозначают римскими цифрами.
Что же касается самих субъединиц, то их ну-
меруют арабскими цифрами, обычно - с добав-
лением в скобках римской цифры, указываю-
щей на тип коллагена, в котором встречается
данная a-цепь. Например, коллаген типа I име-
ет состав cd(I)2a.2(I). Это значит, что его моле-
кула построена из двух субъединиц a 1(1) и од-
ной субъединицы a2(I).
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
361
Таблица 10-1
Процентная доля аминокислот в составе спирализованных (СУ)
и неспирализованных (НСУ) участков некоторых a-цепей коллагена и в эластине
Амино- кислота а1 III) o2(IV) o3(Vl) о1 (IX) Эластин
СУ НСУ СУ НСУ СУ НСУ СУ НСУ СУ НСУ
Ала 11.7 7,0 8,7 14,3 4,4 7.5 2,1 8,0 4,6 6,3 22,6
Apr 5,0 4,7 4,7 0 4,3 3,5 9,5 5,5 5,4 6,6 0,9
Асн 1,1 0 2,2 3,6 0,7 3,1 3.0 4,3 0.8 4,4 0,1
Асп 3,1 7,0 2.5 7,1 4.9 3,9 5.3 5,7 3,4 5,7 0,1
Цис 0 0 0.1 3,6 0,3 5,3 0,3 1,0 0,2 2,5 0,3
Глн 2.7 7,0 2,3 7,1 3,2 3,9 3,3 4,8 3.2 6,0 1.1
Глу 4,6 4,7 4,7 0 3,4 4,4 6,8 5,7 5,6 4,7 0,3
Гли 33,6 14,0 35,2 17,9 31,1 8.3 34,4 6,6 33,3 6,0 29,5
Гис 0,2 2,3 0,7 0 0,8 3.1 0 1,5 0,5 1,9 0
Иле 0,6 2,3 1.4 3,6 4,1 4,8 3,3 5,0 2,5 6,0 2,3
Лей 1.9 4,7 2.1 0 5,7 8,3 2,1 9,7 5,9 9,1 6,1
Лиз 3,6 4,7 3,7 3,6 5,0 3,5 5,3 4,9 4,4 4,7 5,0
Мет 0,7 0 0,9 0 1,2 3.1 0,3 1,2 0,8 1,9 0
Фен 1,2 7,0 0,8 ‘ 0 3,4 3.5 1.5 5,0 0,7 4,1 2,3
Про 23,3 9,3 23,2 3,6 18,9 6,6 13,9 5,8 21,0 7,3 12,2
Сер 3,4 11,6 4,1 10,7 2,7 10,5 3,0 7,3 2,7 8,5 0,9
Тре 1,6 2,3 1.5 0 2,7 4,8 2.4 5,7 1.7 5,7 1,3
Три 0 0 0 0 0.2 2,2 0 0,2 0 1,6 0
Тир 0 9,3 0,2 10,7 0.8 5.3 1,2 2,1 0,3 1,3 2,1
Вал 1.9 2,3 1,1 14,3 2,2 4,4 2.4 10,1 2,9 5,7 12,9
Несмотря на обилие генетически обуслов-
ленных вариантов a-цепи, все они обладают
одним общим признаком. А именно: наличием
протяженных участков чередования последова-
тельности .. .-гли-про-Х-..где в качестве Xвы-
ступает остаток какой-либо иной аминокисло-
ты (чаще всего — аланина, нередко - лизина).
Часть остатков лизина и пролина гидроксили-
рована (некоторые из остатков гидроксипроли-
на занимают еще и позицию АО-
Как уже отмечалось, наличие «пролино-
вых изломов» (см. рис. 1-13) вынуждает поли-
пептидную цепь принимать форму «коллагено-
вой спирали» (раздел 1.5.2, Б). При этом три
левозакрученных a-цели, обвивая друг друга,
образуют тройную суперспираль, закрученную
вправо (см. рис. 1-22). Шаг такой суперспирали
(расстояние между соседними витками) со-
ставляет около 10 нм при толщине всего лишь
1,5 нм. Столь высокая плотность укладки обу-
словлена обилием остатков глицина: его ради-
кал минимален по размерам, ибо представлен
только атомом водорода, и потому легко уме-
щается внутри суперспирали, тогда как ради-
калы остальных аминокислот обращены кна-
ружи.
Сформированная таким образом тройная
суперспираль составляет главную отличитель-
ную черту молекулы тропоколлагена, который
является структурной единицей всех коллаге-
новых волокон внеклеточного матрикса.
Здесь важно, однако, отметить, что супер-
спирализация охватывает лишь часть молекулы
тропоколлагена, ибо чередование триады
...-гли-про-Х-... наблюдается не по всей длине
a-цепи. Оно отсутствует на обоих концах поч-
ти любой субъединицы, а также в срединных
участках определенных a-целей. Сопоставле-
ние, приведенное в табл. 10-1, показывает, что
по аминокислотному составу неспирализован-
ные участки резко отличаются от спирализо-
ванных (прежде всего — отсутствием преобла-
дания глицина и пролина над другими амино-
кислотами). Количественное соотношение тех
и других фрагментов в разных вариантах кол-
лагеновых молекул варьирует в широких пре-
делах и играет важную роль в обеспечении их
структурно-функциональной специализации.
К настоящему времени установлено
строение в общей сложности 15 типов коллаге-
на. По особенностям строения и функциональ-
ной роли их подразделяют на три группы:
362
Глава 10
- фибриллярные (I, II, III, V, XI);
- коллагены, формирующие сетеобраз-
ную структуру (IV, VI, VII, VIII, X);
- коллагены, ассоциированные с фибрил-
лами (IX, XII, XV, XVI и XVIII).
Главные структурные особенности наи-
более изученных коллагенов перечислены в
табл. 10-2. Кратко обобщая, можно отметить,
что фибриллярная часть охватывает почти всю
молекулу коллагенов первой группы и что
именно она несет радикалы гидроксилизина
(как правило, единичные). Неспирализованны-
ми остаются лишь короткие концевые отрезки
a-цепей. Наиболее распространенными являют-
ся коллагены типа I и типа III, на долю которых
в рыхлой соединительной ткани приходится со-
ответственно до 70% и примерно 25% всего
коллагена. Им сопутствует минорный коллаген
типа V. В хряще минорным спутником является
коллаген типа XI. участвующий, как полагают, в
регуляции латерального роста тонких волокон
коллагена типа II, присущих хрящевым тканям.
Таблица 10-2
Характеристика типов коллагена и их наиболее изученных а-цепей
Типы белка Субъединицы Распространение; особенности строения субъединиц
1 2 3
А. Группа фибриппярных коллагенов
I С11(1)2л2(1) Главный (90%) коллаген дермы, сухожилий, кости, дентина, цемента и т.д. В пределах N-НСУ обоих вариантов a-цепи имеется по остатку аллизина, участ- вующего в сшивках. Длина СУ - чуть более 1000 АО; здесь гидроксилированы 3 остатка пролина в a2(l) и остаток лизина в а1(1). Половину N-ПП в а1-цепи составляет ФВС.
III а1(111)3 Содержится в растяжимых тканях (кожа, легкие, сосуды и др.), наряду с колла- геном-l. Размеры НСУ (9-19 АО) меньше, чем в a1 (I). СУ состоит из 1029 АО и содержит 6 остатков 5-гидроксипизина (к одному из которых присоединена гпюкозил-галактоза). Соседние цистеины в конце СУ образуют два межцепо- чечных S-S-мостика.
V Обычно цепь a2(V) и две цепи а1 (V) Минорный компонент тканей, содержащих коллаген типа I. Легко связывает молекулы тромбоспондина, гепарина, гепарансульфата, инсулина и др. В са- мой изученной цепи (а1) гидроксилировано 45 остатков пролина и 14 остатков лизина (все - в пределах СУ). В составе С-концевого пропептида 40% радика- лов тирозина сульфатировано.
II о1(Н)з Специфичен для хрящевых тканей. В предшественнике a-цепи С-ПП втрое крупнее, чем N-концевой, и идентичен хондрокальцину.
XI Тримеры из а1-, а2- и, возможно, аЗ-цепей типа XI Содержится в хряще, плаценте, некоторых опухолях. Участвует в регуляции фибриллогенеза, контролируя латеральный рост волокон коллагена типа II. Особенностью о1(Х1) является короткий участок деспирализации в начале СУ; в последующем фрагменте выявлены два остатка лизина, вовлеченные в межцепочечные сшивки.
Б. Коллагены, формирующие структуру типа сети (паутины)
IV Цепи oto1(IV) до a6(l V) образуют 6 триплетных вариантоа Главный коллаген базальной мембраны. В клубочках почек образует мелко- ячеистую сеть, включающую протеогликаны. Обычно нет ПП, а N-НСУ отсутст- вует либо очень мал (14-30 АО). Крупный С-НСУ (=230 АО) содержит 6 S-S- мостиков в любой субъединице, кроме a3(IV), у которой в этом домене выявлен антигенный эпитоп из 18 АО. СУ длиннее обычного (=1400 АО) и часто имеет от 3 до 8 RGD. Последних нет в a5(IV), но зато здесь выявлено три цистеиновых остатка, образующих мостики между цепями. Почти на границе с С-НСУ в a3(IV) имеются два подряд остатка серина, которые фосфорилированы.
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
363
Окончание таблицы 10-2
1 2 3
VI Тримеры построены из ci1 (VI), a2(VI) и Q3(VI) Обозначают как белок, связывающий клетки: в каждой из a-цепей есть 3-6 RGD. Полностью первичная структура выяснена только для o3(VI). Короткий СУ (=340 АО) сочетается в ней с огромным N-НСУ (>2000 АО), содержащим 4 повтора ФВА, и с крупным С-НСУ (800 АО), который обладает тремя S-S-мостиками, двумя доменами ФВА, участком ФН, а также фрагментом, подобным одному из ингибиторов сериноаых протеиназ. По всей длине a-цепи расположено 8 гликозилированных радикалов асларагина.
VII a1(VII)3 Образует якорные фибриллы базальной мвмбраны эпителия, которые взаимо- действуют с коллагеном-1 V. Субъединица очень похожа на a3(VI), включая инги- битор протеиназ в С-НСУ, но содержит крупный СУ (>1500 АО), а в N-НСУ - 9 повторов ФН вместо ФВА. Центроа гликозилироаания всего 3 (все - в N-НСУ), а оба S-S-мостика расположены в С-НСУ и являются межцепочечными.
VIII Гомо- или ге- теротримеры al(VIII) и a2(VIII) Формирует волокнистую сеть базвльной мембраны эндотелия и заднего эпите- лия роговицы глаза (десцементова мембрана). Каждая a-цепь содержит не- большой СУ (= 450 АО), обрамленный короткими НСУ. Фрагмент из 136 АО, сходный с Clq, занимает более чем 2/3 протяженности С-НСУ.
X О1(Х)э Синтезируется гипертрофированными хондроцитами и локализуется в участках гиалинового хряща, подготавливаемых к минерализации. Молекула а1-цепи (680 АО) слирализована на две трети. Конечный участок С-НСУ представлен доме- ном С1 а. что усиливает общее сходство с субъединицами коллагена типа VIII.
В. Коллагены, ассоциированные с фибриллами
XII о1(Х11)з Необычно длинная a-цепь (более 3000 АО) содержит два небольших отрезка С-СУ (103 и 152 АО), разделенных коротким НС. Меньший включает 14 радика- лов гидроксипролина и ассоциирован на фибриллах коллагена типа I, а другой (вместе с соседним НС из 316 АО) выступает в перифибриллярный матрикс. Остальная часть о-цепи (80%) состоит из 4 доменов ФВА, разделяющих 18 по- второв ФН, к трем из которых присоединено по одному хондроитинсульфату. В выступающей зонв цепи выявлено 5 гликозилируемых редикалов асларагина и три RGD.
IX с1(1Х). вероятно, совместно с □2(1Х) и a3(IX) Минорный коллаген хряща, ковалентно сшитый с тонкими волокнами коллагена- ll. Изучена пока только цепь а1(1Х). Она содержит 4 домена НСУ, между которы- ми распределены небольшие СУ (совокупной длиной в 611 АО). Все НСУ-до- мены короткие (12-30 АО), кроме N-НСУ, глобула которого электростатически притягивает гликозаминогликаны. Один из НСУ формирует две межцепочечные S-S-связи.
XV a1(XV)3 В основном содержится в строме внутренних органов (почки, поджелудочная железа и др.). Субъединица ограничена крупными отрезками НСУ, меж которы- ми включвны 9 участков СУ (по 15-55 АО), разделенных еще более короткими доменами НСУ. Гликозилированные редикалы аспарагина (их 6) находятся пре- имущественно в СУ-доменах.
XVI a1(XVI)3 Присутствует в ряде структур плаценты. Девять фрагментов СУ общей длиной 1128 АО перемежаются в a-цепи короткими (11-39 АО) доменами НСУ, что при- дает молекуле высокую гибкость.
XVIII a1(XVIII)3 Находится в строме многих органов, особенно печени, легких, почек. Изучена пока лишь часть цепи протяженностью в 684 АО. N-конец ее (371 АО) спирали- зован, а С-концеаой отрезок (183 АО) содержит даа S-S-мостика и представляет собой эндостатин - пептид, угнетающий пролиферацию эндотелия, ангиогенез и рост ряда первичных опухолей.
Сокращения: АО — аминокислотный остаток; С - С-концевой; N - N-концевой; СУ - суперслирализован-
ный участок цепи; НСУ- неспирализованный участок цепи; ПП - пропептид(ы); C1q - субкомпонент 1q ком-
племента; ФН - фибронектин типа III; RGD (-арг-гли-асп-) - центр связывания с клетками; ФВА и ФВС - доме-
ны А и С фактора ФВ.
364
Глава 10
Для коллагенов, формирующих сетевид-
ные структуры, типичным является наличие
нескольких центров взаимодействия с клетка-
ми (последовательность RGD). При этом уча-
сток суперспирализации либо крупнее обыч-
ного (коллагены типа IV и типа VII), либо не-
велик, но сочетается с необычно длинными
концевыми фрагментами, не способными к
спирализации. К этой же группе относятся
коллаген типа VIII (доминирующий в базаль-
ной мембране эндотелия) и коллаген типа X,
вырабатываемый гипертрофированными хон-
дроцитами. Оба эти варианта отличаются
сравнительно небольшими размерами трех-
спирального стержня и наличием особого до-
мена, который по структуре очень близок Clq-
субкомпоненту комплемента и локализован в
неспирализованном С-концевом участке мо-
лекулы.
Группа коллагенов, обладающих высокой
склонностью к ассоциации с фибриллами, от-
личается разбивкой суперспиральной структу-
ры на небольшие фрагменты, прерываемые ко-
роткими отрезками неспирализованных участ-
ков. Это придает молекулам высокую гибкость.
В нековалентных взаимодействиях с другими
коллагенами участвуют как трехспиральные
фрагменты, так и неспирализованные участки,
особенно если они содержат повторы доменов
фактора ФВ или фибронектина-Ш (о нем - в
разделе 10.3.1).
10.2.2. БИОГЕНЕЗ КОЛЛАГЕНОВЫХ ВОЛОКОН
Биосинтез коллагена, предваряющий фор-
мирование коллагеновых волокон, уникален
тем, что некоторые его стадии реализуются не
в клетках, а в межклеточном пространстве.
Начинается синтез a-цепей, как обычно, в
рибосомах. Осуществляют его в основном
фибробласты и родственные им клетки (хонд-
робласты, остеобласты и т.д.), в меньшей сте-
пени — эпителиальные, гладкомышечные клет-
ки и некоторые другие.
Синтезируемые исходно предшественники
не содержат ни гидроксипролина, ни гидрокси-
лизина (как не предусмотренных в генетиче-
ском коде). Образуются они лишь путем окис-
ления аминокислот, уже включенных в поли-
пептидную цепь. Происходит эта модификация
под действием монооксигеназ, сопряженных с
окислением а-кетокислот (раздел 5.4.3). Одна
из них — лизил-гидроксилаза — окисляет опре-
деленные лизильные радикалы в положении 5
(см. рис. 5-50). Другой фермент (пролил-4-гид-
роксилаза) воздействует на остатки пролина,
но только из числа тех, что соединены с со-
седним глицином своей карбоксильной груп-
пой (т.е.. находятся в положении X коллагено-
вой триады). Наконец, существует еще и про-
лил-3-гидроксилаза, внедряющая кислород в
положение 3 пролина, если он своей амино-
группой связан с глицином, а карбоксильной -
с образовавшимся ранее 4-гидроксипролином
(формулы обоих гидроксипролинов показаны
на рис. 2-27).
Все три монооксигеназы содержат Fe2+,
а для поддержания его в восстановленном
состоянии нуждаются в аскорбиновой кислоте.
Нарушение гидроксилирования из-за дефицита
витамина С лежит в основе ведущих симпто-
мов цинги. Недавно установлено, что аскорбат,
помимо этого, еще и стимулирует биосинтез
пролил-гидроксилаз в клетках, усиливая
экспрессию соответствующего гена.
Благодаря монооксигеназным реакциям, в
спирализованной части наиболее окисленной
цепи — al(V) — в гидроксипролин превращается
четверть из 180 остатков пролина, а доля 5-гид-
роксилизина достигает здесь почти 1,5% от
общего аминокислотного состава (в других
a-цепях - обычно не более 0,6%).
Другая реакция постсинтетической моди-
фикации коллагена — N-гликозилирование еди-
ничных радикалов аспарагина под действием
соответствующих гликозилтрансфераз. Обычно
a-цепь содержит 1-2 олигосахаридных фрагмен-
та, и лишь в al(XV) и a3(VI) их число достигает
6-8. В коллагенах типа I и III возможно также
О-гликозилирование гидроксилизина (но не
гидроксипролина’). При этом в костной ткани к
нему присоединяется обычно галактоза, а в кол-
лагене дермы - а-глюкозидо(1,2)-галактоза.
После завершения синтеза полипептидной
цепи процессы гидроксилирования и гликози-
лирования прекращаются. Одновременно (или
раньше - еще в растущей цепи) происходит
отщепление сигнального пептида (от 15 до
38 АО в разных цепях). В результате появляет-
ся про-а-цепъ, готовая к спонтанному склады-
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
365
ванию в тройную суперспираль. На ее концах
нередко бывает пропептид — фрагмент, под-
вергаемый в дальнейшем отщеплению. На
N-конце он сравнительно невелик (не более
160 АО) и имеется лишь в коллагенах I-IV и XI
(точнее, в их про-а-цепях). С-концевые про-
пептиды (длиной около 250 АО) есть в пред-
шественниках только фибриллярных коллаге-
нов (I, II, III, V и XI) и всегда содержат по
7-8 радикалов цистеина.
Дисульфидные мостики, возникающие
между С-концевыми пролептидами всех трех
про-а-цепей, облегчают «правильное» форми-
рование трехпепочечной суперспирали, так как
способствуют установке субъединиц в соосное
положение, благоприятное для сплетения их в
единый «жгут».
Суперспирализация охватывает только
центральную часть молекулы проколлагена,
который попадает в секреторные пузырьки, а
затем выделяется в среду, где и подвергается
дальнейшим превращениям.
Внеклеточный этап биогенеза кол-
лагена протекает в 4 последовательные стадии,
из которых лишь первая и третья являются
ферментативными.
1-я стадия - отщепление пропептидов
специальными протеиназами, которые выде-
ляются в ВКМ фибробластами. В результате
проколлаген превращается в почти готовый
тропоколлаген, молекулы которого способны к
самоорганизации в надмолекулярные волокни-
стые структуры. На концах его, как правило,
сохраняются неспирализованные участки
(обычно их называют телопептидами). Они не-
велики у главнейших из фибриллярных колла-
генов (от 9 до 35 АО), а у минорных бывают на
порядок крупнее (коллагены типа V и XI).
2-я стадия - самосборка коллагеновых во-
локон, не требующая участия ферментов. Про-
текает она по-разному. Но начинается всегда с
формирования коллагеновой микрофибриллы.
Строение ее лучше всего прослеживается в
фибриллярных коллагенах. Десятки молекул
тропоколлагена уложены в одну линию по типу
«голова к хвосту»: начало каждой из них
(N-концы всех ее трех субъединиц) направлено
к С-концу предшествующей. В местах сближе-
ния эти суперспирали никак не связаны между
собой. Более того, они разделены промежутком
в 35 нм. Поддерживается такое расположение
молекул тропоколлагена слабыми взаимодей-
ствиями «бок о бок» со смежными, столь же
линейными укладками, но смещенными почти
на четверть длины каждой молекулы (рис. 10-
1). Регулярность смещения обусловлена тем,
что места сосредоточения заряженных ради-
калов аминокислот вдоль тройной суперспи-
рали чередуются с участками скопления неза-
ряженных участков. Периодичность чередо-
вания составляет примерно 67 нм. Поэтому
максимум водородных и ионных связей между
смежными молекулами достигается при отно-
сительных сдвигах, кратных 67 им (отсюда -
упомянутое расстояние в 35 нм между конца-
ми молекул: 67x5 = 335 нм, а реальная длина
тропоколлагена фибриллярного типа состав-
ляет 300 нм). Свободные промежутки в 35 нм
часто называют просветами («зазорами»). В
костной ткани и дентине здесь формируются
центры кристаллизации фосфорно-кальциевых
солей.
Объединяются, как правило, от 20 до 100
параллельных рядов, каждый протяженностью
в десятки молекул тропоколлагена. Поэтому в
целом микрофибрилла имеет форму стержня
(прутка) толщиной 30-150 нм при длине, до-
стигающей многих микрометров. Сами микро-
фибриллы, в свою очередь, организуются в бо-
лее крупные образования — фибриллы.
В сухожилиях они обычно уложены в про-
дольные пучки толшиной в несколько микро-
метров, именуемые коллагеновыми волокнами.
В коже укладка фибрилл напоминает пру-
тья в плетеных изделиях, благодаря чему обес-
печивается устойчивость к нагрузкам в разных
направлениях.
В костях и роговице глаза наблюдается
слоистое расположение волокон. При этом па-
раллельные ряды их в одном слое направлены
примерно перпендикулярно волокнам соседне-
го слоя (это напоминает взаимно перпендику-
лярное направление волокон древесины в
смежных слоях фанеры).
Вся эта постадийная самосборка волок-
нистых структур протекает спонтанно, за счет
слабых типов связи. Но дальнейшие стадии не
дожидаются полного завершения всего процес-
са в целом, а подключаются по мере завершен-
ности каждой очередной стадии.
366
Глава 10
Рис. 10-1. Схема строения коллагеновой микрофибриллы
3-я стадия начинается по ходу формиро-
вания микрофибрилл и заключается в окисли-
тельном дезаминировании части лизильных
фрагментов. Похоже, оно затрагивает лишь те
радикалы аминокислот, что находятся в преде-
лах телопептидов. Катализирует реакцию медь-
содержащая протеин-Ъ-лизил-б-оксидаза (раз-
дел 5.4.1), преобразуя лизин и 5-гидроксилизин
в их альдегидные аналоги - аллизин и 5-гид-
роксиаллизин (см. рис. 5-36).
4-я стадия, заключительная, сводится к
формированию ковалентных связей между мо-
лекулами тропоколлагена. Благодаря высокой
реакционной способности, свойственной аль-
дегидам, становятся возможными спонтан-
ные (без участия ферментов!) химические ре-
акции аллизинов с подходящими группировка-
ми, расположенными на доступном расстоя-
нии. Обычной «мишенью» является £-амино-
группа того радикала лизина (или 5-гидрокси-
лизина), который находится поблизости в со-
седней молекуле тропоколлагена. Точнее - в ее
спирализованном участке. Происходит, в сущ-
ности, реакция параметаболизма. В данном
случае - реакция конденсации с образованием
шиффова основания R—CH2-CH=N-~CH2-R'.
Ее называют алъдиминной конденсацией (если
участвует аллизин) или кетоиминной (если во-
влекается 5-гидроксиаллизин).
На рис. 10-2 представлены схемы обоих
вариантов конденсации (А и Б), а также строе-
ние возникающих шиффовых оснований (I и
IV). Эти соединения не очень устойчивы. Ста-
билизация их в продуктах альдиминной кон-
денсации осуществляется путем восстановле-
ния двойной связи, а при кетоиминной — по-
средством внутримолекулярной перегруппи-
ровки с «вытеснением» двойной связи из цепи
в состав кетогруппы. В обоих вариантах две
молекулы тропоколлагена оказываются свя-
занными цепочкой лизинонорлейцина (II) ли-
бо, соответственно, лизино-5-кетонорлейцина
(VI). Это - если реакция шла с участием ради-
кала лизина. Если же вместо лизильного фраг-
мента изначально был вовлечен 5-гидрокси-
лизильный, то межмолекулярная связь (после
стабилизации) имеет строение соответственно
гидроксилизино-норлейцина (III) или гидро-
ксилизино-5-кетонорлейцина (V).
Стабилизация любой из упомянутых свя-
зей приводит к тому, что две молекулы тропо-
коллагена оказываются соединенными прочной
8-углеродной цепочкой с атомом азота посере-
дине. Такого рода межмолекулярные перемыч-
ки принято называть поперечными сшивками.
В данном случае сшивку называют бифункцио-
нальной, т.к. она соединяет два тропоколлагена
(точнее, две субъединицы, принадлежащих
обычно разным молекулам этого белка). Кова-
лентное соединение атомов цепочки придает ей
высокую прочность, а значительная протяжен-
ность — еще и определенную гибкость. Такие
перемычки характерны для ведущих коллаге-
нов из группы фибриллярных — коллагенов ти-
па I, II и III. Однако соотношение разных сши-
вок имеет заметную тканевую специфику. Так,
коллагены кожи содержат мало гидроксиалли-
зина. Поэтому преобладают здесь альдимин-
ные сшивки, главным образом гидроксилизи-
но-норлейциновые (III). А кетоимины типичны
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
367
/
Н—N _______
\ г 1
НСа-СН2“СН2-СН2-СН2-^Н2 + ОФС-СН2-СН2-СН2-
О=с U-------
Лизин
Аллизин
Н2О
НСа-СН2-СН2-СН2-СН2-№С-СН2-СН2-СН2-Н(
< А
I. Дегид ро-лизинонорлейцин
2Н < V Т )
---> HCa-CH2-CH2“CH2-CH2-N-C-CH2-CH2-CH2-HCc
< н >
II. Лизинонорлейцин (ПН)
< ? >
НСа-СНг-СНг-СН -CH2-N-CHz-CH2- СН2- СН2-НСа
(он У
III. Гидроксилизино-норлейцин
НСа-СНг-СНг-СН-СНг-М^ + С*С~СН -СН2-СНг-НСа
О=С ОН ' 'н ОН с=О
5-Гид роксилизин
5-Гидроксиаллизин (ГАл)
Н2О
\ I /
НС»-СН;-СНг-СН-СН;-№С-СН-СНг-СН2-НСа ---->
( ОН ОН У
< К >
HCa- CH2-CH2-CH-CH2-N- С-С-СНг-СНг-НСа
( ОН А О У
IV. Дегидро-дигидроксилизинонорлейцин
V. Гидроксмлизино-5-кетонорлейцин (ГПК)
< 7
НСа-СНг-СНг-СН-СНг-И-СНг-С - СНг-СН2-
/ 11
( о
VI. Лизино-5-кетонорлейцин
Рис. 10-2. Ковалентное связывание молекул тропоколлагена
неферментативной реакцией альдиминной (А) или кетоиминной (Б) конденсации.
для коллагенов сухожилий, кости и хряща.
Преобладает здесь гидроксилизино-5-кетонор-
лейцин (V), а доля лизино-5-кетонорлейцина
(VI) резко уменьшается с возрастом, но в твер-
дых тканях возрастает в период их кальцифи-
кации.
Ковалентно закрепляя регулярную струк-
туру микрофибрилл, возникшую в процессе их
самосборки, бифункциональные сшивки и сами
имеют тоже очень упорядоченное расположе-
ние. Как правило, каждый концевой телопеп-
тид соединен одной сшивкой с расположенным
на том же уровне участком суперспирали
смежной молекулы тропоколлагена.
По мере созревания ткани возникают пе-
ремычки и между микрофибриллами. Проис-
ходит это путем спонтанного взаимодействия
кетоиминной бифункциональной сшивки, уже
имеющейся в одной микрофибрилле, с альде-
гидным радикалом, расположенным в другой
микрофибрилле (точнее, в ее телолептидной
части). В итоге образуется пиридиниевое коль-
368
Глава 10
цо, которое через углеродные цепочки связы-
вает три a-цепи разных молекул тропоколлаге-
на. Иными словами, создается трифункцио-
нальная сшивка. В качестве «донора» альде-
гидной группы чаще всего выступает 5-гид-
роксиаллизин (ГАл). При его взаимодействии с
гидроксилизино-5-кетонорлейцином (ГЛК) во-
зникает гетероцикл, обозначаемый как гидро-
ксилизил-пиридинолин (рис. 10-3,1). Этот вари-
ант трифункциональной перемычки преоблада-
ет в коллагенах большинства тканей, включая
сухожилия и хрящ. С другой стороны, в мине-
рализуемых тканях (кость, дентин) число пи-
ридиниевых сшивок вообще невелико (в 5-10
раз меньше, чем в хряще), и представлены они
в значительной мере лизил-пиридинолином
(этот дезокси-аналог I является продуктом ре-
акции ГАл с лизино-5-кетонорлейцином и по-
тому не содержит гидроксильной группы в са-
мой длинной из боковых цепей). Если вместо
ГАл с кетоиминной сшивкой реагирует аллизин.
то образуются перемычки пиррольного типа
(рис. 10-3, II). Они специфичны для минерали-
зуемых тканей, хотя и их здесь немного.
НСа
\
/ н
НО-CH С-СНг-СН2-НСа.
I I \
НС СН2 с=о
[О---HN /
•АЛ L----™ ГЛК
сн2
снон
I
(СН2)2
I
НС сн
х©^
N
НО-С С—СНг—СН2—НСа
сн2
снон
I
(СН2)2
I
НСа
I. Гидроксилизил-пиридинолин
НСа
I \
СН2 N-H
I /
сн2 сн2-сн2- НСа
^=0
ал 93? ! РНг глк /
сн2
СНОН
I
(СН2)2
НСа
НСа
>
СН2 СН2-СН2-НСа
С=(/
I I
к
I
СН2
снон
I
(СН2)2
I
НСа
II. Гидроксилизип-пиррол
Рис. 10-3. Схема образования трифункциональных сшивок в коллагеновых волокнах.
Сокращения: Ал - Аллизин; ГАл - 5-Гидроксиаллизин; ГЛК - Гидроксилизино-5-кетонорлейцин.
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
369
Таким образом, «дозревание» кетоиминной
бифункциональной сшивки не только делает ее
трифункциональной, но и переводит в разряд
межфибриллярных перемычек. Благодаря им
обеспечивается прочное ковалентное соедине-
ние микрофибрилл в составе коллагенового во-
локна. В детском возрасте общее число таких
сшивок в костной ткани и в хряще постепенно
увеличивается, достигая к 10-15 годам уровня,
который сохраняется затем всю жизнь. Биоло-
гическая стабильность циклических сшивок
столь значительна, что даже при деградации
коллагеновых молекул пиридиниевые и пир-
рольные фрагменты не подвергаются расщепле-
нию, попадают в кровь и выводятся с мочой (где
их содержание дает представление об интенсив-
ности распада коллагена в организме).
От довольно единообразных коллагенов
фибриллярной группы значительно отличаются
тропоколлагены базальных мембран, форми-
рующие не параллельные ряды волокон, а сете-
видную структуру. Главная особенность - про-
тяженность участка суперспирализации: он ли-
бо почти в 1,5 раза длиннее обычного (коллаге-
ны типов IV и VII), либо в 2-3 раза короче (кол-
лагены типов VI, VIII и X). Кроме того, почти у
всех коллагенов этой группы неспирализован-
ные концы молекул имеют очень большие раз-
меры, насчитывая до 800-1200 АО, а у ct3(VI) -
даже свыше 2000 таких звеньев. Нередко в этих
крупных участках a-цепи содержатся фрагмен-
ты, подобные определенным доменам ряда по-
лифункциональных белков, таких как фактор
ФВ (раздел 8.6.1) и фибронектин (подробно
описан в разделе 10.3.1), Clq-субкомпонент
комплемента, ингибиторы сериновых протеи-
наз. Наконец, многие a-цепи коллагенов базаль-
ной мембраны содержат от 3 до 8 центров свя-
зывания с клетками (RGD-модуль). Межмоле-
кулярные сшивки представлены в основном
гидроксилизино-5-кетонорлейцином (рис. 10-2,
V); пиридинолиновых сшивок не обнаружено.
Перечисленные особенности не позволяют
коллагенам данной группы создавать пучки па-
раллельных волокон, типичные для фибрилляр-
ных коллагенов. Вместо этого они формируют
специфическую ячеистую структуру, которая
напоминает рыболовную сеть: множество моле-
кул тропоколлагена типа IV, расположенных в
одной плоскости, соединены между собой кова-
лентными перемычками, формируя ячейки сети.
Более того, появляются еще и сшивки с сосед-
ней сетью, расположенной в параллельной
плоскости. Возникает обширный пласт много-
слойной сети. Именно так, полагают, коллагены
типов IV и VIII создают волокнистую основу
базальной мембраны. Контакты между элемен-
тами этой основы подкрепляются другим из
главнейших ее белков - ламинином. Этот муль-
тифункциональный гликопротеин, состоящий из
разных субъединиц, способен связываться не
только с молекулами коллагена типа IV, но и с
клеточными рецепторами, участвуя тем самым в
обеспечении тесного взаимодействия клеток и
базальной мембраны.
Тропоколлаген типа VII выполняет иные
функции. Он формирует так называемые якор-
ные фибриллы. Своими неспирал изованны ми
концами они закрепляются в плотной пластинке
базальной мембраны эпителия, взаимодействуя
с волокнами коллагена-IV. Средняя часть якор-
ной фибриллы, образованная протяженными
участками суперспирализации, выступает в
подлежащий слой в виде петли, сквозь которую
продеты фибриллы ретикулярной пластинки,
образуемые коллагенами I и III.
Коллаген типа X специфичен для минера-
лизуемых участков хрящевой ткани. С коллаге-
нами базальной мембраны его роднит не только
структура, но и способность формировать сети.
Подобно коллагену-VIII в десцементовой мем-
бране роговицы глаза, он образует весьма регу-
лярную структуру (гексагональная сеть).
Коллагены, ассоциированные с фибрилла-
ми (см. табл. 10-2), резко отличаются от ос-
тальных прерывистостью тройной суперспира-
ли, разделяемой на 2-9 фрагментов короткими
неслирализованными участками. Не будучи
пригодными для самоагрегации в коллагено-
вые фибириллы, они появляются на поверхно-
сти завершающих свое созревание волокон,
образуемых коллагенами фибриллярной груп-
пы. Этим лимитируется боковой рост коллаге-
новых волокон (их утолщение). Так, коллаген
типа IX обнаруживается на поверхности тон-
ких фибрилл хрящевой ткани, где он ковалент-
но связан с цепями коллагенов II и XI. Анало-
гичным образом коллаген-ХП ассоциирован с
фибриллами коллагена-1, преобладающего в
костной ткани.
370
Глава 10
Помимо участия в регулировании роста
волокнистых структур, ассоциированные кол-
лагены способствуют их взаимодействию с
другими компонентами соединительной ткани.
Важную роль в этом играют неспирализован-
ные фрагменты, содержащие домены подобия
фибронектину типа III, фрагментам фактора
ФВ, субкомпоненту Clq комплемента, а также
RGD-центры взаимодействия с клетками.
10.2.3. СТРОЕНИЕ ЭЛАСТИЧЕСКИХ ВОЛОКОН
И по строению, и по своему предназначе-
нию от коллагеновых волокон существенно
отличаются те, которые названы эластически-
ми. Обычно они составляют лишь небольшую
часть фибриллярных структур соединительной
ткани. Например, в ахилловом сухожилии их
примерно в 20 раз меньше, чем коллагеновых,
а в коже объемная плотность эластических во-
локон, нарастая от рождения до зрелости, до-
стигает лишь 3-4%. Вместе с тем, они преобла-
дают в эластическом слое артерий, стенок
бронхов, а также в некоторых связках. Так, в
желтой затылочной связке эластических воло-
кон приблизительно в 5 раз больше, чем колла-
геновых.
Название этих волокон отражает их свой-
ство эластичности, т.е., способность возвра-
щаться в исходное состояние после деформа-
ции (растяжение, сжатие, скручивание). Выде-
ленный из них белок получил название эла-
стин. Синтезируется он в виде тропоэластина,
который, в отличие от a-цепей коллагена, ко-
дируется единственным геном (у человека на-
ходится в хромосоме 7). Это довольно «моло-
дой» ген: он возник лишь у позвоночных. Ина-
че говоря, его появление совпадает с формиро-
ванием замкнутой системы пульсирующей
циркуляции при высоком давлении крови.
Молекула тропоэластина (около 700 АО)
заметно меньше коллагеновой a-цепи и не име-
ет пропептидных фрагментов. По аминокис-
лотному составу (см. табл. 10-1) эластин похож
на коллаген изобилием глицина (около 30%) и
пролина (примерно 12%); отсутствием трипто-
фана, метионина и гистидина; ничтожным со-
держанием цистеина. Вместе с тем, есть и су-
щественные отличия. Главные из них: в эласти-
не содержится очень мало аминокислот с гид-
рофильным радикалом (включая серин, арги-
нин, аспартат и глутамат, - но не лизин!) и, на-
оборот, много аланина (около 23%) и вообще
аминокислот с неполярными радикалами (в их
числе - валин, доля которого достигает 13%, что
в 5-10 раз больше, чем в спирализованных уча-
стках коллагена). Все это обусловливает выра-
женную специфику первичной и высших струк-
тур эластина. В нем нет чередования триады
...-гли-про~Х~..., которое свойственно коллаге-
ну. Вместо этого часто повторяются гидрофоб-
ные фрагменты типа ...’вал-гли-вал-ала-про-гли-
... и .,,-вал-про-гли-еал(ала)-..., не пригодные
для формирования коллагеновой спирали. Легче
всего такие фрагменты организуются в короткие
P-повороты (см. рис. 1-12), чему способствует
обилие глицина и неполярных радикалов валина
и лейцина. Как уже отмечалось (раздел 1.4.1),
P-поворот подобен шпильке: он изгибает поли-
пептидную цепь в обратном направлении. Час-
тое повторение таких поворотов, присущее мо-
лекуле тропоэластина, ведет к появлению регу-
лярной структуры, обозначаемой как р-спираль.
Ей свойственна упругая гибкость и растяжи-
мость. К этому причастны и подвижные звенья
...-вал-гли-... между p-поворотами, допускающие
обратимое смещение витков спирали относи-
тельно друг друга. В целом участки такой спи-
рализации составляют почти половину всей по-
липептидной цепи. Еще примерно 10% склады-
вается в а-спирали. Остальная часть молекулы
представлена различными вариациями нерегу-
лярной цепи.
Отмеченные особенности приводят к тому,
что каждая молекула тропоэластина по своей
третичной структуре близка к глобулярным
белкам. При этом между обширными гидро-
фобными фрагментами находятся гораздо
меньшие полиаланиновые участки, в которые
включены функционально важные остатки ли-
зина. Последние в большинстве своем окисля-
ются до аплизина (или 5-гидроксиаллизина)
под действием той же внеклеточной лизил-
оксидазы, которая осуществляет этот процесс и
в коллагене. За счет лизильного радикала од-
ной полипептидной цепи и аллизина другой
могут формироваться бифункциональные
сшивки лизино-норлейцинового типа (см. рис.
10-2, II). А главное - в эластине создаются еше
и совершенно уникальные сшивки, присущие
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
371
цепь Б
НСа
I
(СНз)э аллизин
цепь А
НгС=|О
I I
цепь В
HCa-CH2-CH2-C-fQH
н^с-сн2-сн2-нсг
НС-тОН
сн
5-гидрокси-
аллизин
О
аллизин
I®;
Hj-N-lHz
ЛИЗИН
цепь Г
НСа
I
(СН2)3
3C-CH2-CH2-HCc
4н >
N
Десмозин
Рис. 10-4. Схема формирования «паучьей» структуры десмозина (изодесмозин отличается «смещением»
одной из боковых цепочек из положения 4 в положение 2; чтобы это произошло, должны поменяться местами
взаимодействующие цепи А и В, содержащие соответственно 5-гидроксиаллизин и аллизин).
только этому белку. Они образуются путем
конденсации 5-гидроксиаллизина, двух ради-
калов аллизина и одного лизильного фрагмен-
та. Возникает тетрафункционалъная сшивка.
как это показано на рис. 10-4. Основу ее со-
ставляет тоже пиридиниевое кольцо (как в кол-
лагенах), но от него отходят не три, а четыре
полиметиленовых цепочки. Они ведут к раз-
ным молекулам тропоэластина (теоретически -
до четырех). Такая «паучья» структура называ-
ется десмозином (если одна из цепей оказыва-
ется в положении 2, а не 4, то такая сшивка
обозначается как изодесмозин).
Итак, в отличие от тропоколлагена, тропо-
эластин не обладает четвертичной структурой.
Эластические волокна формируются путем ко-
валентного связывания множества молекул гло-
булярного типа. В итоге хорошо растворимый
предшественник полимеризуется в зрелый элас-
тин, совершенно нерастворимый в водной среде.
Недавно удалось установить локализацию,
по меньшей мере, некоторых сшивок, соеди-
няющих разные молекулы тропоэластина. Как
показано на рис. 10-5, в образовании сшивки
десмозинового типа (Де) участвуют два поли-
аланиновых домена, каждый из которых «деле-
гирует» по два лизильных фрагмента (в основ-
ном после их окисления до аллизина). Так мо-
гут быть соединены две молекулы тропоэла-
стина. В каждом из указанных полиаланиновых
доменов остается пока свободным последний
из имеющихся здесь остатков лизина. Он спо-
собен образовать лизино-норлейциновую
сшивку (ЛН) с еще одной (третьей по счету)
372
Глава 10
Рис. 10-5. Соединение молекул тролоэластина десмозиновыми (Де) и лизино-норлейциновыми (ЛН)
сшивками (Лиз - лизин, гидроксилизин или их альдегидные аналоги).
молекулой тролоэластина (см. рис. 10-5). По-
следняя участвует в образовании бифункцио-
нальных перемычек своими лизиновыми фраг-
ментами, расположенными в участке, богатом
радикалами пролина. Такой вариант соедине-
ния мономеров обеспечивают возможность
разветвления волокнистых структур, которое
является исключительно важной особенностью
зрелого (полимеризованного) эластина. В ко-
нечном итоге возникает крупное надмолеку-
лярное образование в виде ветвящихся и ана-
стомозирующих между собой тонких (12 нм)
эластиновых волокон, объединяющихся в бо-
лее толстые филаменты, которые структурно
организованы в трехмерную сеть.
Величина ячеек эластиновой сети значи-
тельно варьирует в разных морфологических
образованиях. Благодаря протяженным кова-
лентным перемычкам и обратимой податливо-
сти каждого из гидрофобных доменов между
ними, трехмерная сеть в целом приобретает
упругую эластичность при растяжении в лю-
бом направлении. Это качество пружинистости
особенно важно в эластическом слое аорты и
крупных артерий, где оно необходимо для
сглаживания пульсовых ударов.
Вырабатываются белковые компоненты
эластических волокон не только фибробласта-
ми, но и хондроцитами и гладкомышечными
клетками.
Эластин является преобладающей, но не
единственной составной частью эластических
волокон. На ранних стадиях эмбрионального
развития, еще до выработки и секреции тропо-
эластина, в ВКМ формируются особые микро-
фибриллы, которые образуют сетеобразную
структуру. Она служит тем каркасом («подмо-
стками»), на котором откладываются молекулы
тропоэластина, происходит их ориентация и
укладка в длинные ряды. Последующее кова-
лентное соединение мономеров превращает
набор молекул глобулярного белка-предшест-
венника в фибриллярную структуру зрелого
эластина.
Главным компонентом упомянутых мик-
рофибрилл является довольно своеобразный
белок фибриллин. Этот гликопротеин в 5 раз
крупнее тропоэластина. В его составе есть уча-
стки из примерно 40 АО, очень похожие на
эпидермальный фактор роста (ЭФР) и нередко
содержащие центры связывания Са2+. Такие
участки повторяются друг за другом обычно 5-
7 раз (в середине молекулы - даже 12 раз). Раз-
деляются эти блоки тандемных повторов семью
доменами, каждый из которых насчитывает
около 70 АО и по первичной структуре подобен
белку, связывающему один из трансформирую-
щих факторов роста (ТФР-0). В целом фибрил-
лин выглядит как вытянутая гибкая молекула
длиной до 150 нм при толщине 2,2 нм. Она со-
держит 15 участков N-гликозилирования и
множество остатков цистеина (14%), в боль-
шинстве своем образующих дисульфидные свя-
зи. Часть из них замыкается в пределах своей
молекулы, другие соединяют ее с соседними.
Благодаря этому, мономеры фибриллина соеди-
няются (по типу «голова к хвосту») в длинные
нити, параллельные пучки которых объединены
в микрофибриллы диаметром 10-12 нм. Обилие
межмолекулярных S-S-мостиков создает доста-
точно возможностей для разветвления этих
фибриллярных структур. Так создается тот ор-
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
373
ганизующий каркас, на который затем посте-
пенно наслаиваются молекулы тропоэластина.
В фиксации тропоэластина на этом каркасе
участвует особый белок небольших размеров
(—30 кДа), обозначаемый как «гликопротеин,
ассоциированный с микрофибриллами» (MAGP
- Microfibril Associated Glycoproten). Его
С-концевая половина богата положительными
зарядами и содержит все 13 остатков цистеина,
имеющихся в молекуле. Именно они образуют
дисульфидные связи с фибриллином. С другой
стороны, N-концевая половина содержит много
отрицательно заряженных остатков глутамата,
благодаря чему возникают ионные связи с
С-концевым участком тропоэластина, несущим
сильный положительный заряд (р! - 13).
Доставку тропоэластина к микрофибрил-
лам обеспечивает специальный белок, близкий
ему по размерам. Он способен распознавать
галактозу, т.е., относится к числу галактолек-
тинов. Вместе с тем, он выполняет и функцию
шаперона. Образуя комплекс с тропоэластином
сразу после его синтеза и удаления сигнально-
го пептида, этот галактолектин защищает сво-
его «пленника» от самоагрегации и от возмож-
ной деструкции в клетках. Защита продолжает-
ся и вне клеток, вплоть до той поры, когда
комплекс приходит в контакт со строящимися
эластическими волокнами. Здесь шаперон сво-
им лектиновым участком связывается с галак-
тозными фрагментами фибрилл инового карка-
са. В результате резко падает сродство шапе-
рона к тропоэластину. Происходит точная
укладка последнего на участке каркаса, еще не
занятом предыдущими молекулами мономера,
а вслед за этим - и фиксация тропоэластина
ионными связями на N-концевой части моле-
кулы MAGP. Освобожденный шаперон воз-
вращается в клетку за новыми порциями тро-
поэластина (впрочем, часть этого галактолек-
тина задерживается в мембране для включения
в состав эластиновых рецепторов клетки).
По мере «выстраивания» мономерных
звеньев на поверхности микрофибрилл проис-
ходит окисление лизильных остатков тропо-
эластина с последуюшим образованием меж-
молекулярных сшивок - лизино-норлейцино-
вых и десмозиновых. Тем самым закрепляется
взаимное положение молекул предшественника
в формируемой полимерной структуре зрелого
эластина, составляющего главный компонент
трехмерной сети эластических волокон. Кроме
того, дезаминирование лизильных радикалов и
вовлечение их в создание сшивок ведет к рез-
кому уменьшению числа катионных групп (р!
изменяется от —13 у тропоэластина до — 6 в
зрелом эластине). Соответственно исчезают
ионные связи с MAGP. Полимеризованный
эластин уже не столь плотно прилегает к мик-
рофибриллам и вытесняется новыми молеку-
лами тропоэластина, доставляемыми в составе
комплекса с шапероном. Они, в свою очередь,
формируют новые нити зрелого эластина. В
конечном счете почти все микрофибриллы ока-
зываются по периферии эластического волок-
на, центральную часть которого заполняет
множество нитей зрелого эластина.
В отличие от других компонентов внекле-
точного матрикса, эластические волокна фор-
мируются только в развивающихся тканях и
почти совсем не синтезируются у взрослых.
Поэтому метаболическое обновление их проте-
кает крайне медленно.
Как уже отмечалось, ген тропоэластина
возникает только у позвоночных, когда появля-
ется замкнутая система кровеносных сосудов.
А фибриллин и другие компоненты микрофиб-
рилл - эволюционно гораздо более древние бел-
ки. Они имеются уже у ранних форм беспозво-
ночных. Очевидно, природа использовала гото-
вую конструкцию микрофибрилл в качестве
«подмостков» для сборки эластиновых волокон
из глобулярного белка - тропоэластина. Столь
же очевидно, что микрофибриллы должны об-
ладать и собственными функциями. Тем более,
что и у высших животных некоторая часть мик-
рофибриллярных структур остается ненагру-
женной эластином. Эти функции остаются пока
неизвестными. Проясняется пока лишь один
аспект - участие в объединении внеклеточных
структур и в их взаимодействии с клетками.
В частности молекулы MAGP опосредуют
связывание микрофибрилл не только с эласти-
ном. Тот же самый фрагмент в N-концевой час-
ти MAGP (и с примерно той же степенью срод-
ства) способен соединяться и с определенным
участком в спирализованном фрагменте колла-
гена-VI (но не с другими типами коллагена).
Тем самым обеспечивается ассоциация коллаге-
новых и эластических волокон. А один из нор-
374
Глава 10
мальных вариантов MAGP (MAGP-2), будучи
неспособным к взаимодействию с коллагеном,
содержит RGD-центры связывания с клетками
(комплементарные определенным участкам
трансмембранных белков - интегринов).
Фибулин - еще один из гликопротеинов,
выявленных в составе эластических волокон.
По имеющимся данным, он ассоциирован не с
MAGP или фибриллином, а непосредственно с
молекулами эластина. Кроме того, фибулин
способен связываться с другими структурными
гликопротеинами межклеточного матрикса -
фибронектином, ламинином, индогеном (эн-
тактином), а также с фибриногеном.
Насчитывая ~ 800 АО, фибулин-1 очень
похож на фибриллин многократными (9 раз)
повторами фрагмента, сходного с эпидермаль-
ным фактором роста (ЭФР-подобный модуль).
Большинство из этих модулей обладает срод-
ством к ионам Са2+, а в двух средних находятся
центр связывания с фибронектином и участок,
вовлекаемый в Са2+-зависимую самоассоциа-
цию фибулина-1. Вся эта срединная часть моле-
кулы имеет форму стержня (домен II). С N-koh-
ца к нему примыкает домен I, содержащий три
сегмента, родственных анафилатоксину, а с
С-конца — сравнительно небольшой домен Ш,
который имеет глобулярное строение и спосо-
бен связываться с нидогеном и ламинином.
Вырабатывают фибулин фибробласты,
гладкие миоциты, эпителиальные, но не эндо-
телиальные клетки. Многие исследованные
линии опухолевых клеток не обладают такой
способностью.
Таким образом, эластические волокна от-
личаются значительной гетерогенностью сво-
его состава. Перечисленные гликопротеины
(фибриллин, MAGP, фибулин) являются необ-
ходимыми факторами структурной организа-
ции эластина. Более того, обладая разнообра-
зием центров «узнавания» различных лиган-
дов, они обеспечивают эластическим волокнам,
помимо уникальных биомеханических свойств,
еще и участие в интеграции внеклеточных
структур и клеток.
10.3. ОСНОВНОЕ ВЕЩЕСТВО МАТРИКСА
Помимо коллагеновых и эластических во-
локон все остальное содержимое ВКМ обозна-
чают как основное вещество. Макромолеку-
лярными компонентами его являются специа-
лизированные гликопротеины и протеоглика-
ны. Именно они формируют ту сильно гидра-
тированную среду, в которую погружены и
клетки, и волокна соединительной ткани.
10.3.1. СТРОЕНИЕ ГЛИКОПРОТЕИНОВ
В отличие от описанных выше фибрилли-
на, MAGP и фибулина, гликопротеины основ-
ного вещества не входят в состав волокон, хотя
и тесно взаимодействуют с ними.
Фибронектин — сильно преобладающий
гликопротеин основного вещества. Это очень
крупный белок: его полипептидная цепь насчи-
тывает без малого 2500 АО. Обычно молекула
состоит из двух таких субъединиц - одинаковых
или немного различающихся. Соединены они
двумя S-S-мостиками, расположенными побли-
зости от С-конца. Посредством таких же связей
они склонны формировать мультидимеры.
Субъединица фибронектина (ФН) имеет
модульное строение. Каждый модуль - это ти-
повая последовательность нескольких десятков
аминокислот. Молекула содержит три типа мо-
дулей. Их так и называют — фибронектины ти-
па I, II и III, ибо тот или иной из них встречает-
ся и в других белках. Эти модули состоят из
соответственно 40-45, 60-65 и около 90 АО.
Полипептидная цепь мономера представляет
собой тандемное повторение 12 доменов ФН-1,
прерываемое двумя модулями ФН-П и немного
подальше - блоком из 16 повторов ФН-Ш, за
которым следуют последние три модуля типа I
(рис. 10-6). Семь участков гликозилирования
распределены почти по всей цепи белка.
Два важных качества присущи фибронек-
тину. Одно обусловлено особенностями вто-
ричной структуры модуля ФН-Ш. Здесь 7 ко-
ротких Р-складчатых отрезков плотно упакова-
ны рядом друг с другом посредством водород-
ных связей, образуя компактный домен разме-
ром в 4 нм. Довольно умеренным усилием мож-
но преодолеть прочность слабых связей и «вы-
прямить» изгибы цепи, обеспечив растягивание
домена до 29 нм. Однако после прекращения
внешнего воздействия происходит спонтанный
возврат в исходную компактную форму. Спо-
собность ФН-Ш к этим обратимым изменениям
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
375
СООН
Рис. 10-6. Модульное строение фибронектина.
(Модули ФН-I обозначены прямоугольниками, ФН-Il - квадратами, ФН-Ill - овалами).
лежит в основе упругой эластичности молеку-
лы, что делает ее подобной эластину.
Другое из важнейших качеств фибронекти-
на - это разнообразие центров узнавания других
макромолекул. Наибольший вклад в их форми-
рование вносят модули ФН-I. Обилие остатков
цистеина в этих доменах способствует образо-
ванию дисульфидных связей. Часть из них со-
единяет довольно удаленные друг от друга ра-
дикалы цистеина, «вынуждая» заключенный
между ними участок полипептидной цепи изги-
баться в виде петли (см. рис. 10-6). Обычно эти
петли имеют здесь вытянутую форму («фибро-
нектиновые пальцы»). В их наиболее высту-
пающих участках расположены детерминанты,
обладающие высоким сродством к некоторым
структурам. Благодаря этому пять N-концевых
доменов ФН-I образуют центр электростатиче-
ского связывания гепарансульфатов и (обособ-
ленно от него) место сорбции фибрина и ряда
других белков (в том числе тромбоспондина,
нидогена, ФНО-а). Далее следует довольно
протяженный участок связывания с коллагеном
(содержащий раздельные центры связывания
для коллагена-П и для коллагена-IV). В средней
части молекулы (блок доменов ФН-П1) содер-
жатся RGD-центры сцепления с клетками. В
этом же блоке (ближе к его С-концевой части)
располагается еще один, довольно протяженный
(270 АО) участок для гепарансульфата, сорби-
руемого благодаря ионным связям с радикалами
аргинина и лизина. Здесь же выявлены пента-
пептидные фрагменты, способные к избира-
тельной ассоциации с интегрином, протекаю-
щей, по-видимому, согласованно с сорбцией ге-
парансульфатов. Наконец, три С-концевых до-
мена ФН-I тоже формируют (как и N-концевые)
центр связывания фибрина.
Особо следует отметить, что N-конеи фиб-
ронектина имеет сродство к специальным ре-
цепторам на поверхности клеток, получившим
название «места сборки матрикса». Считается,
что эти рецепторы опосредуют процесс орга-
низации растворимых димеров фибронектина в
нерастворимые мультидимерные структуры
фибриллярного типа. Последние, в свою оче-
редь, вносят весомый вклад в создание надмо-
лекулярной композиции межклеточного про-
странства.
Ламинин является ведущим гликопротеи-
ном базальных мембран. Это большая молеку-
ла, состоящая из трех различных субъединиц
размерами от ~ 180 до «340 кДа. Они соединены
S-S-мостиками, формируя крестообразную
структуру с глобулярными концами. Субъеди-
ницы существуют в разных вариантах, сходных,
однако, по обилию олигосахаридных «веточек»
(до 40) и радикалов цистеина (которые образу-
ют 40-50 внутренних S-S-мостиков), а также
участков, подобных эпидермальному фактору
роста (ЭФР-домены). В полипептидных цепях
ламинина есть фрагменты своеобразного строе-
ния, которые (с небольшими вариациями) по-
вторяются во многих других белках. Их приня-
то обозначать римскими цифрами (I, П, IV, VI)
или буквенными символами (ламининовый до-
мен G; домеи S-ламинина и другие).
Далеко не для каждого домена в точности
известна его функциональная роль. Есть дан-
ные, что домен G обеспечивает возможность
376
Глава 10
сорбции гепарансульфатных структур. Более
строго установлена роль участка RGD-центра
прикрепления клеток, имеющегося в средней
части некоторых субъединиц ламинина. Пола-
гают, что и домен VI (N-концевой отрезок це-
пи) участвует в связывании с клетками и в
обеспечении их взаимодействия с /фугими
компонентами внеклеточного матрикса.
Нидоген (знтпактин) также сосредоточен
в базальных мембранах Этот гликопротеин
(—140 кДа) тесно ассоциирован с ламинином и
имеет явные черты сходства с ним, включая на-
личие нескольких ЭФР-доменов и центра кле-
точной адгезии (RGD), а также обилие внутрен-
них дисульфидных мостиков. Вместе с тем, ни-
доген обладает и собственной спецификой. В
частности, в нем содержатся два остатка сульфа-
тированного тирозина; домен, подобный N-koh-
цевому фрагменту тироглобулина; два участка
связывания Са2+ (неподалеку от N-конца). Очень
важны также зоны связывания с коллагеном-IV
и имеющиеся в молекуле 5 доменов подобия
рецептору липопротеинов низкой плотности
(мотив YWID - ...-тир-трп-иле-асп-...). Все это
свидетельствует о больших возможностях нидо-
гена (и ламинина) в обеспечении специализиро-
ванных контактов между клетками и межкле-
точными структурами, что необходимо как для
правильной организации ВКМ, так и для влияния
на функциональное состояние клеток.
10.3.2. ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ
Полисахаридные компоненты межклеточ-
ного вещества, при всем их разнообразии, по-
строены очень однотипно. Каждая молекула
представляет собой длинную цепь, образован-
ную многократным повторением дисахаридного
фрагмента, в состав которого почти всегда вхо-
дит глюкуроновая кислота (ее строение показа-
но на рис. 6-9). Другим компонентом дисаха-
ридной единицы является остаток глюкозамина
или галактозамина, что и отражено в названии —
гликозаминогликаны (вместо устаревшего «му-
кополисахариды»). В обоих этих аминопроиз-
водных гексоз гидроксильная группа в положе-
нии 2 заменена на аминогруппу, которая обычно
ацетилирована (см. формулы на рис. 1-25). Ти-
пичными для позвоночных гликозаминоглика-
нами являются:
- гиалуроновая кислота;
— хондроитинсульфаты и дерматансуль-
фаты;
- гепарансульфаты и гепарин;
- кератансульфаты.
Названные группы гликозаминогликанов
различаются особенностями строения дисаха-
ридной единицы. Десятки или сотни таких еди-
ниц (в гиалуроновой кислоте до десятков ты-
сяч), последовательно соединяясь друг с дру-
гом, формируют линейную (неразветвленную)
гликозаминогликаиовую цепь полианионного
характера.
Формулы структурных звеньев разных це-
пей представлены в табл. 10-3. Можно видеть,
что хондроитин- и дерматансульфаты относят-
ся к числу галактозаминогликанов, а осталь-
ные - к разряду гляжозаминогликанов. Кроме
того, за исключением гиалуроновой кислоты,
все гликозаминогликаны являются сульфати-
рованными полисахаридами, ибо их дисаха-
ридные звенья содержат до 3-4 остатков серной
кислоты. Следует отметить также, что в глико-
заминогликанах иногда содержатся производ-
ные нейраминовой кислоты - так называемые
сиаловые кислоты (см. рис. 1-25). Они не вхо-
дят в состав дисахаридных единиц и могут рас-
полагаться только на свободном конце
полисахаридной цепи.
Будучи очень гидрофильными, гликозами-
ногликаны могут связывать большое количество
воды. Этому способствует и обилие отрица-
тельных зарядов (обусловленных наличием
сульфатных и карбоксильных групп), которые
притягивают осмотически активные катионы.
В итоге даже в небольших концентрациях (ме-
нее 10%) протеогликаны придают основному
веществу характер сильно гидратированного
геля, создающего «давление набухания» (тур-
гор) и вполне проницаемого для молекул, рас-
творимых в воде. В таком геле легко могут про-
двигаться клетки и их отростки.
Гиалуроновая кислота (гиалуронан) состо-
ит из дисахаридных звеньев, в которых глюку-
роновая кислота соединена р(1—»3)-гликозид-
ной связью с (К-ацетил)глюкозамином (см.
табл. 10-3). Это - единственный структурный
углевод, который существует как свободная
молекула, не соединенная ковалентно ни с бел-
ками, ни с чем иным. И биосинтез ее необычен.
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
377
Структурные звенья различных гликозаминогликанов
Таблица 10-3
Г иа л уроновая кислота (гиалуронан) в I НОСНз J' г 6СООН о I W 1Л—< он D-глюкуронид о-[3(1,3)-(N-а цетил) глюкоза мин
Хондроитинсульфат А (R’ = H, R”=SO3H) Хондроитинсульфат С (R’ = SO3H, R” = H) е I R-O-CHa 4- о / I \₽ ° I К /’ Г СООН О I si О Г) н Я # I Л\ / NH-C | Кон / Хсн’ lz° Г 51 •L o-so3h О-глюкуронидо-0(1,3)-(М-ацетил)галактозамин
Хондроитинсульфат В (Дерматансульфат) в I НОСН2 J- 4- о „zi HOsS-o/! \₽/° J п г 0 I sj 0 0 (з Я । Хг V | Кон /’ сн« Iz° Г П •t 0-S03H 1_-идуронидо-а(1,3)-(М-ацетил)галактозамин
Гепарансульфаты и гепарин (R = H или SO3H) ROCHi L OR D-гл юкурон идо- В (1,4)-(N-a цетил )глюкозамин
Кератансульфаты (R = H или SO3H) С в 1 HO3S—ОСНз J ОН -галактозидо-р(1,4)-(Н-ацетил)глюкозамин
378
Глава 10
Он уникален тем, что протекает в плазматичес-
кой мембране (на ее внутренней поверхности),
а не в ЭР или рибосомах, где создаются другие
биополимеры.
Один и тот же фермент - гиалуронан-
синтетаза — осуществляет поочередный пере-
нос остатков глюкуроновой кислоты и (N-аце-
тил)глюкозамина на строящуюся цепь полиса-
харида. Оба субстрата образуются в клетке
путем преобразований углеводной части
УДФ-глюкозы (показанных в разделе 6.4.2) и
используются синтетазой в уже активирован-
ной форме, т.е., в виде своих УДФ-производ-
ных. Для каждого из них имеется специальный
адсорбционный центр и, соответственно, своя
каталитическая активность (в данном случае -
гликозилтрансферазная). Перенос очередного
моносахаридного звена на предыдущее сопро-
вождается отщеплением молекулы УДФ- Од-
новременно другой адсорбционный центр ста-
новится готовым принять молекулу следующе-
го субстрата, который затем подвергается ана-
логичной процедуре переноса на растущую
цепь. Специальная зона фиксации синтезируе-
мой цепи обеспечивает перемещение ее на од-
но звено по мере присоединения очередного
мономера. Однако механизмы инициации и
прекращения синтеза полимерной цепи оста-
ются пока невыясненными. Похоже, фермент
сам каким-то образом определяет эти моменты.
Гиалуронан-синтетаза - сравнительно не-
большой белок (около 50 кДа). Несколько раз
пронизывая плазматическую мембрану, он об-
разует канал, через который вырабатываемый
de novo гиалуронан выводится из клетки. Часть
выводимого в среду гиалуронана остается свя-
занной с поверхностью клетки (защищая ее),
другая взаимодействует с компонентами ВКМ,
участвуя в формировании его структуры. Но
наибольшая доля находится в свободном (мо-
бильном) состоянии. Физико-химические свой-
ства, особенно способность гиалуронана к гид-
ратации и к формированию трехмерной сети
путем нековалентной ассоциации с протеогли-
канами, обусловливают важную роль его в го-
меостазе воды, в обеспечении фильтрующих
эффектов, в уменьшении доли свободной воды,
доступной для растворения, например, белков.
Гиалуроновая кислота встречается повсе-
местно. Особенно преобладает она в рыхлой
волокнистой соединительной ткани. В теле че-
ловека весом 70 кг содержится около 15 г гиа-
луронана; из них примерно половина находит-
ся в коже, а около четверти - в скелетных тка-
нях, включая суставной хрящ. Содержится гиа-
луронан и в жидкостях тела. Водные растворы
его обладают высокой вязкостью. Поэтому,
входя в состав синовиальной жидкости, гиалу-
ронан придает ей свойства хорошей смазки.
Хондроитинсульфаты и дерматансуль-
фаты в качестве структурной единицы содер-
жат один и тот же дисахаридный фрагмент (см.
табл. 10-3). Он отличается от аналогичного
звена гиалуроновой кислоты заменой глюкоза-
мина на галактозамин. Но самой весомой осо-
бенностью является наличие сульфатных групп
-SO3H. В хондроитинсульфатах они присо-
единены эфирной связью к (Ы-ацетил)галактоз-
амину (в положениях 6 или 4), а также к глю-
куроновой кислоте (в положении 2, а иногда -
и 3). Дерматансульфаты обычно менее суль-
фатированы. Но главная их особенность за-
ключается в ином пространственном располо-
жении заместителей -Н и -СООН при 5-м угле-
родном атоме уроновой кислоты. Возникает
оно из-за ферментативной эпимеризации
D-глюкуроновой кислоты в L-идуроновую, на-
ступающей в уже синтезированной полимер-
ной цепи (из-за этого ^-гликозидная связь ки-
слоты с гексозамином превращается в фор-
мально а-гликозидную).
Величина гликозаминогликанов этой груп-
пы варьирует от 10 до 50 кДа. Ими очень богата
хрящевая ткань, где содержание хоидроитин-
сульфатов составляет до 40% сухого веса. Кро-
ме того, такие гликозаминогликаны входят в сос-
тав кожи, сухожилий, костной ткани, межпозвон-
ковых дисков, пуповины, клапанов сердца.
Гепарансульфаты и гепарин сходны с гиа-
луроновой кислотой по строению дисахарид-
ного звена (табл. 10-3). Главное отличие -
сульфатные группы, которые могут находиться
в положении 2 уроновой кислоты, а в (N-аце-
тил)глюкозамине - в положениях 3 и 6 и даже
заменять собой ацетильный фрагмент при азоте
глюкозамина.
Группы -SO3H распределяются по длине
полимерной цепи отнюдь не равномерно. Как
правило, немодифицированные участки (длиной
обычно в 16-20 дисахаридных единиц) переме-
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
379
жаются с более короткими (6-10 единиц) доме-
нами полной сульфатации (в том числе и по азо-
ту). Кроме того, благодаря ферментативной эпи-
меризации в некоторых отрезках цепи D-глю-
куроновая кислота чередуется с L-идуроновой, а
N-ацетилированные мономеры - с N-сульфати-
рованными (домены частичной модификации).
Различия в числе и протяженности всех этих до-
менов приводят к многообразию структурных
вариантов гепарансульфатов, что способствует
повышению избирательности их взаимодейст-
вия с разными лигандами (включая белки).
Гепарин отличается от своих аналогов
меньшими размерами (5-20 кДа) и тем, что в
качестве белка, на котором формируются гепа-
рансульфатные цепи, всегда выступает только
серглицин. Это небольшой полипептид (~130
АО), в средней части которого 9 раз подряд по-
вторяется дипептидный фрагмент ...-сер-гли-...;
углеводные цепи строятся на двух из его сери-
новых радикалов, ближайших к N-концу моле-
кулы. Локализован гепарин в секреторных гра-
нулах тучных клеток. При их дегрануляции, вы-
зываемой действием определенных стимулов,
он попадает во внеклеточную среду, где и про-
являет свою высокую биологическую активность
(в частности, препятствует свертыванию крови).
Две структурные особенности выделяют
гепарин среди всех гепарансульфатных цепей:
крайне высокая степень N-сульфатирования (до
80-90%) и сильное преобладание L-идуроновой
кислоты над D-глюкуроновой. Антикоагуляци-
онный эффект гепарина обусловлен способно-
стью избирательно связываться с антитромби-
ном III. В этом связывании участвует пентаса-
харндный фрагмент .. .-Га-Гу-Га-Иу-Га-..., в
строго определенных местах которого находят-
ся 6 сульфатных групп (здесь Гу и Иу обозна-
чают соответственно глюкуроновую и идуро-
новую кислоты, а Га - N-ацетилглюкозамин).
Кератансульфаты не содержат в своем
составе уроновых кислот (в отличие от всех
других гликозаминогликанов). Их цепь пред-
ставлена повторением (Г4-ацетил)лактозамина
(табл. 10-3). Сульфатные группы находятся в
позиции 6 остатков (К-ацетил)глюкозамина, но
нередко - и в положении 6 галактозильных
фрагментов.
Кератансульфатные цепи невелики (5-15
кДа). В зависимости от способа их присоеди-
нения к белку, различают кератансульфаты I и
кератансульфаты II. У первых гексозамииовый
конец формирует N-гликозидную связь с азотом
радикала аспарагина, а у вторых - О-глико-
зидную связь с радикалом треонина или серина.
Содержатся кератансульфаты в хрящевых тка-
нях, межпозвонковых дисках, роговице глаза.
10.3.3. СТРОЕНИЕ ПРОТЕОГЛИКАНОВ
Длинные цепи всех гликозаминогликанов
(кроме гиалуроновой кислоты) существуют не
сами по себе, а ковалентно соединены с белко-
выми молекулами, образуя протеогликаны. Ис-
торически сложилось так, что названия глико-
заминогликанов распространяли и на соответ-
ствующие им (как считалось) группы протео-
гликанов. Такой подход создавал иллюзию,
будто в молекуле протеогликана содержатся
углеводные цепи одинакового строения. Ока-
залось, это не так. Теперь твердо установлено,
что полипептидный стержень может нести гли-
козаминогликановые цепи различного строе-
ния. Более того, нередко с одним и тем же бел-
ком ковалентно соединены не только полиса-
хариды. но и олигосахариды — как N-связан-
ные, так и О-связанные.
Современные методические возможности
позволяют детально выяснять структуру кон-
кретных протеогликанов, в том числе - их по-
липептидного компонента, который называют
сердцевинным, или коровым белком (от англ.
core - сердцевина, ядро, корень). По существу,
сейчас совершается переход от архаичного раз-
деления протеогликанов по характеру их угле-
водных фрагментов к систематизации на основе
специфики коровых белков (но и с учетом со-
става углеводных фрагментов). К настоящему
времени полностью выяснена структура более
30 протеогликанов. Их объединяют в суперсе-
мейство и подразделяют на 4 семейства:
гиаяектаны;
• малые протеогликаны, богатые лейци-
ном;
протеогликаны базальных мембран;
протеогликаны, встроенные в мембра-
ну клеток.
Краткое описание наиболее изученных
представителей перечисленных семейств при-
ведено в таблицах 104 - 10-6.
380
Глава 10
Таблица Ю-4
Г иалектаны
Агрекан (Aggrecan) Крупнейший из протеогликанов (=2500 кДа). Распространен довольно широко (сухо- жилия, стенка аорты, мозг и т.д.), но наиболее богат им хрящ. Коровый белок (210-250 кДа) имеет форму длинного стержня, заключенного между двумя глобулами. В N-koh- цевой есть иммуноглобулиновый (типа V) домен и 4 зоны высокого сродства к гиалуро- нану (Kd = 4 нМ). С-концевая глобула имеет два ЭФР-домена, участок Са2+-зависимой сорбции фукозы или (М-ацетил)глюкозамина (модуль, подобный пектину типа С), а также область контакта с белками комплемента. В стержневой части, богатой повторами ...-сер-гпи-..., ковалентно присоединено до 100-150 целей хондроитинсупьфата и (в N-стороне) 30-60 более коротких цепочек кератансульфатов. Небольшое число олигоса- харидов фиксировано преимущественно в N-концевой глобуле.
Вер си как (Versican) Мультидоменный белок, очень похожий на агрекан наличием как иммуноглобулиново- го и гиалуронан-связывающих участков, так и лектиноподобным, комплемент- связывающим и ЭФР-доменами. Отличается более крупным коровым белком (до 370 кДа), но меньшими размерами молекулы в целом (=1000 кДа), - из-за малого числа (10-30) хондроитин- и дерматансульфатных цепей. Кератансульфаты вовсе отсутствуют, но есть более 20 мест присоединения N-олигосахаридов (в промежутках между гликоза- миногликанами). Встречается в свмых разных тканях.
Таблице 10-5
Малые протеогликаны, богатые лейцином
[коровый белок состоит из блока 10 подряд «лейциновых повторов» (ЛП)
между двумя доменами, содержащими по 2 или 4 остатка цистеина]
Бигликан (Biglycan) Коровый белок (40 кДа) содержит две цепи хондроитин- или дерматансульфата, при- соединенных к N-концевому цистеиновому домену. В двух из ЛП есть по N-связанной олигосахаридной цепи. Содержится в ВКМ многих тканей, особенно в суставном хряще
Декорин (Decorin) Вблизи N-конца корового белка (40 кДа) присоединена единственная цепь хондрои- тин- или дерматансульфата (в зависимости от специфики ткани). По одному N-олигосв- хариду имеют три ЛП в С-концевой части молекулы. Декорин относительно преобпеда- ет в костях, сухожилиях, коже, стенке аорты, склере и роговице глаза. Способен связы- ваться с коллагенами типов I и II, а также с фибронектином и ТФР-₽.
Фибро- модулин (Fibro- modulin) Коровый белок (42 кДа) содержит по одной цели кератансупьфата I в 2-4 разных ЛП. Как и у всех белков этого семейства, перечисленных ниже, в N-концевом домене обна- руживаются радикалы тирозинсульфата. Фибромодулин присутствует в хряще, сухожи- лиях, коже и других тканях. Обладает высоким сродством к коллагенам I и II типов, бла- годаря чему влияет на скорость построения фибрилл.
Люмикан (Lumican) По всем характеристикам подобен фибромодулину (включая сродство к коллагенам); отличается меньшим числом тирозинсульфатов. Содержится в хряще, роговице, мыш- цах, стенке кишки и других тканях. В роговице люмикан особенно богат сульфатными группами в кератансульфатных цепях.
Кератокан (Keratocan) Синоним - остеоиндуктивный фактор (ОИФ). По строению близок фибромодулину и люмикану, но содержит лишь 6 ЛП. Обледает сродством к фактору роста ТФР-Р, в соче- тании с которым индуцирует образование кости.
Эпификан (Epiphycan) Название попучил, будучи впервые обнаружен в эпифизарном хряще. Выявлен также в связках, плаценте. Коровый белок (35 кДа) содержит 6 ЛП, 3 дерматансульфатных цепи и единичные N-олигосвхариды. Участвует в упорядочении структуры ВКМ хряща и, вероятно, в формировании костной ткани.
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
381
Гиалектаны до недавних пор обознача-
лись как «большие хондроитинсулъфатные
протеогликаны». Новое название лучше отра-
жает самые важные особенности этих белков.
С одной стороны - наличие особых участков,
обеспечивающих нековалентное связывание с
гиалуронаном. С другой - присутствие домена,
сходного с лектинами (так обозначают белки,
избирательно сорбирующие определенную
олигосахаридную структуру или даже отдель-
ный моносахарид - например, D-галактозу,
N-ацетилглюкозамин, L-фукозу).
Наибольшими размерами среди гиапекта-
нов обладают агрекан и версикан (см. табл.
10-4), впервые выделенные из хряща. Значи-
тельно уступают им по величине нейрокан и
бревикан, свойственные ВКМ мозга. Тем не
менее, общий план построения молекулы оди-
наков у всех гиалектанов. Их коровые белки
имеют протяженную центральную часть, где
сосредоточены ковалентно прикрепленные
гликозаминогликановые цепи, которые расхо-
дятся в разные стороны, примерно перпенди-
кулярно белковому стержню. На N-конце, об-
разующем глобулу, имеется 2 или 4 «.связую-
щих домена», обладающих очень высоким
сродством к гиалуронану. Другой конец коро-
вых белков тоже имеет глобулярное строение и
содержит набор центров взаимодействия с раз-
личными макромолекулами.
Агрекан — наиболее гликозилированный из
всех протеогликанов. Его коровый белок со-
держит до 100-150 хондроитинсульфатных це-
пей, а также 30-60 цепочек кератансульфата,
гораздо более коротких. Обилие полисахарид-
ных цепей со свойственной им гидрофильно-
стью придает этой молекуле способность к
поддержанию высокого уровня гидратации. В
суставном хряще агрекан сильно преобладает
над другими компонентами.
Версикан отличается более крупным коро-
вым белком (до 370 кДа), на порядок меньшим
числом полисахаридных цепей и относительно
высокой долей олигосахаридов. Распространен
во многих тканях, особенно в хрящевой.
Будучи мультидоменными белками, гиа-
лектаны существуют во внеклеточном матрик-
се не порознь, а формируют еще более крупные
агрегаты, - надмолекулярные (что нашло от-
ражение в названии агрекана). Основной прин-
цип заключается в нековалентном объединении
множества молекул гиалектана с огромной мо-
лекулой гиалуронана. Ведущую роль играют
связующие домены N-концевых глобул. Обра-
зуемые ими «узлы связи» прочно удерживают
до 100 гиалектановых «веточек» вдоль всей
молекулы гиалуроновой кислоты (длина кото-
рой может достигать 15 мкм). В итоге возника-
ет комплекс, по внешнему виду напоминаю-
щий ершик для мытья посуды. Масса таких
агрегатов может достигать многих сотен мил-
лионов дальтон. Высокая степень их гидрата-
ции позволяет генерировать осмотическое на-
бухание внеклеточного матрикса.
Богатые лейцином малые протеогликаны
поначалу именовали неагрегирующими проте-
огликанами - из-за неспособности формиро-
вать комплексы с гиалуронаном. Все члены
этого семейства (см. табл. 10-5) обладают не-
большим коровым белком (—40 кДа), в котором
повторяются подряд 10 (иногда 6) фрагментов,
содержащих последовательность
...LxxLxLxxNxLSxL... , где L - лейцин, изо-
лейцин или валин; N - аспарагин; S - серин
(или треонин); х - иные аминокислоты. Глав-
ной чертой этих «лейциновых повторов» (ЛП)
является склонность к нековалентному связы-
ванию со многими другими белками, а также с
клеточными мембранами. С обеих сторон к
блоку ЛП примыкают сравнительно короткие
концы полипептидной цепи, содержащие ради-
калы цистеина. С-концевой отрезок образует до-
вольно большую петлю, фиксируемую S-S-moc-
тиком между двумя цистеинами, разделенными
более чем 30 АО. Коровый белок способен не-
ковалентно связываться с участками тройной
спирали коллагенов I, II, III, V и VI. Это вызы-
вает задержку начальной сборки тропоколла-
гена, а в конечном итоге — уменьшение диамет-
ра коллагеновых фибрилл. Олиго- и полисаха-
ридные цепи в неагрегирующих протеоглика-
нах единичны, но, тем не менее, важны для
поддержания межфибриллярных расстояний.
При этом молекулы бигликана, декорина и эпи-
фикана (которым наиболее богат эпифизарный
хрящ) содержат хондроитин- или дерматан-
сульфатные цепи, тогда как фибромодулин, лю-
микан и кератокан (рстеоглицин) включают в
себя кератансульфаты и, кроме того, отличают-
ся наличием сульфотирозина в коровом белке.
382
Глава 10
Т аблица 1 0-6
Протеогликаны базальных и клеточных мембран
Протеогликаны базальных мембран
Перлекан (Perlecan) Название (от англ, pearl - жемчуг) отражает внешнее сходство с ниткой жемчуга. Необы- чайно крупный коровый белок (до 470 кДа) изобилует S-S-мостиками (=50), имеет мульти- доменную структуру и содержит более 10 олигосахаридов. С участками SGD (...-сер-гли- асп-...) N-концевого домена соединено 3 гепарансульфата. Последующий домен II состоит из 4 зон подобия рецептору липопротеинов низкой плотности. Домен IV - это череда >20 звеньев по =100 АО, сходных с иммуноглобулиновой (типа С2) структурой. Соседние с ним домены III и V включают по 3 глобулы, подобные соответственно зонам IV и G ламинина и разделенные блоками по 2-5 участков сходства с ЭФР.
Агрин (Agrin) С-концевая часть молекулы почти идентична домену V перлекана, с которым роднит также наличие 3 цепей гепарансупьфата. нескольких ЭФР-подобных участков и серии олигосаха- ридов. В целом же агрин имеет почти вдвое меньшие размеры, в основном из-за отсутст- вия участков подобия иммуноглобулину. N-концевой фрагмент способен связываться с ла- минином, а следующий зв ним домен содержит серию повторов, сходных с одним из инги- биторов сериновых протеиназ. Больше всего агрина в базальной мембране почечных ка- нальцев, а также в лостсинаптической мембране, где он формирует кластеры рецепторов ацетилхолина и агрегаты молекул ацетипхолинэстеразы.
Бамакан (Bamacan) Локализован в разных базальных мембранах, кроме капиллярной сети клубочков. Коровый белок (=140 кДа) несет 3 хондроитин сульфатных цепи. Оба его конца образуют гидрофиль- ные глобулы. Средняя часть содержит место связывания с клетками (фрагмент ...-вал-тре-Х-гли-.,.). На С-конце, как и у перлекана, есть сайт LRE (...-пей-арг-глу-...) для ассоциации с S-ламинином.
Протеогликаны, встроенные в мембрану клеток
Синдеканы (Synde- cans) Группа трансмембранных белков (22-43 кДа) с большим внеклеточным доменом, который растянут из-за обилия пролина. Рядом с N-концом содержится 3-5 гепарансульфатных це- пей, а еще 2-3 встречается около мембраны (часть из них может быть заменена хондрои- тинсульфатами). Внутриклеточный домен невелик, связан с элементами цитоскелета и, имея редикалы серина и тирозина, может участвовать в трансдукции внешних сигналов. Некоторые синдеканы специализированы по типам клеток (эпителиальные и мезенхим- ные, нейроны, клетки перихондрия и надкостницы) и стадиям их развития.
Глипиканы (Glypicans) Удерживаются на мембране клеток посредством «якоря» - молекулы гл и коз и л фосфа- тидилинозитола, жирнокислотные цели которого погружены в бислойную мембрану. Высту- пающий тетрасахвридный фрагмент «якоря» соединяет инозитол с фосфоэтанол амином, образующим, в свою очередь, пептидную связь с концевой группой -СООН корового белка (57-84 кДа). Белок богат цистеином, имеет компактную форму, стабилизированную ди- сульфидными саязями, и содержит 2-6 гепарансупьфатных цепей. Глипиканы обнаружива- ются на нейронах, в почках и, в меньшей степени, в мышцах.
Протеогликаны базальных мембран (табл.
10-6) сильно разнятся по размерам и содержат
обычно около 10 N- и О-связанных олигосаха-
ридов, но всего лишь по 3-4 полисахаридных
цепи. Своеобразие перлекана и агрина обуслов-
лено и тем, что эти цепи представлены в них
гепарансульфатами, в отличие от бамакана
(еще одного члена семейства) и от остальных
протеогликанов, перечисленных выше.
Самый крупный белок данного семейства
- перлекан - наиболее богат дисульфидными
мостиками внутри цепи и изобилует фрагмен-
тами, подобными иммуноглобулиновой (типа
С2) структуре. Вообще протеогликаны базаль-
ных мембран отличаются разнообразием
структурно-функциональных доменов в преде-
лах одной молекулы- Среди них следует отме-
тить ЭФР-домены; места связывания с клетка-
ми; участки подобия рецепторам липопротеи-
нов низкой плотности; ламинин-связывающие
или сходные с ламинином зоны; области ана-
логии с одним из ингибиторов сериновых про-
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
383
теиназ. Все это позволяет перечисленным гли-
копротеинам комплексироваться между собой,
с другими обязательными белками базальной
мембраны (коллаген типа ГУ, ламинин, нидо-
ген), а также устанавливать связи с клетками,
предоставляя им места прикрепления к под-
ложке, и модулировать воздействие факторов
роста. Будучи преобладающим протеогликаном
базальных мембран, перлекан ассоциируется в
звездчатые структуры, формирующие своеоб-
разное «сито», анионные группы которого
обеспечивают избирательную ультрафильтра-
цию заряженных частиц.
Протеогликаны, встроенные в мембрану,
тоже являются носителями цепей гепарансуль-
фата. Впрочем, встраивание здесь не является
ковалентным, а потому допускает довольно
свободное перемещение макромолекулы вдоль
плазматической мембраны. Как отмечено в
табл. 10-6, синдеканы удерживаются благодаря
наличию трансмембранного участка полипеп-
тидной цепи (за которым следует сравнительно
короткий цитоплазматический отрезок). Близ-
кие им глипиканы фиксированы еще слабее: их
коровый белок ковалентно соединен с гликози-
лированным фосфатидилинозитолом, жирно-
кислотные «хвосты» которого, подобно якорю,
погружены в бислойную мембрану.
Становится очевидным, что гепарансуль-
фатные структуры тяготеют к клеткам. В зави-
симости от специфики корового белка они ло-
кализуются в базальной мембране (перлекан и
агрин), на поверхности клеток (глипиканы и
синдеканы) или в гранулах тучных клеток (ге-
парин).
В заключение следует подчеркнуть, что
мультидоменный тип строения является наибо-
лее яркой чертой многих макромолекул основ-
ного вещества ВКМ. Эта особенность открыва-
ет широкие возможности разнообразных взаи-
модействий. Свой вклад вносят и углеводные
фрагменты, особенно гепарансульфатные. Бла-
годаря этому, в частности, протеогликаны,
встроенные в мембраны, не только обеспечи-
вают более тесное взаимодействие клеток с
окружающим матриксом, но и способны вы-
полнять роль корецепторов в трансмембранной
передаче внешних сигналов регуляторного ха-
рактера. Некоторые из таких сигналов ведут к
смене спектра изоформ синдекана, синтези-
руемых клеткой, и тем самым участвуют в ме-
ханизмах клеточной дифференцировки.
10.3.4. БИОСИНТЕЗ ГЛ И КО КОНЪЮГАТОВ
В биогенезе гликопротеинов и протеогли-
канов много общего (см. раздел 6.4.3). По-
строение каждого из углеводных фрагментов
на молекуле корового белка начинается еще в
растущей полипептидной цепи или сразу после
завершения ее синтеза. Первый моносахарид-
ный фрагмент присоединяется гликозидной
связью в определенном месте белка. Затем
происходит наращивание углеводной цепочки
путем добавления к ней следующего моносаха-
ридного звена, присоединяемого гликозидной
связью к нередуцирующему концу предыдуще-
го. Каждый шаг в этой череде событий реали-
зуется соответствующей гликозилтрансфера-
зой. В этом названии отражена специализация
фермента на том, чтобы переносить на форми-
руемую цепь очередной моносахарид, исполь-
зуя его активированную форму. В большинстве
случаев она представлена соединением моно-
сахарида с уридиндифосфатом: УДФ-глюкоза
(см. рис. 6-8), УДФ-галактоза (уравнение [6-3],
УДФ-(1У-ацетил)глюкозамин (см. рис. 6-11)
и т.п. Иногда используются производные
других нуклеотидов; примерами могут быть
ЦМФ-(М-ацетил)нейраминовая кислота и ГДФ-
манноза.
По такой схеме осуществляется синтез
любого О-олигосахарида гликопротеинов. Точ-
но так же протекает создание цепей кератан-
сульфата II, которое начинается в цис-зоне ап-
парата Гольджи переносом (М-ацетил)гексоз-
амина из его соединения с УДФ на радикал се-
рина (или треонина) в молекуле корового бел-
ка. Синтез кератансульфатов I отличается лишь
тем, что начальное звено цепи - (N-аце-
тил)глюкозамин - фиксируется не на гидро-
ксильной группе белка, а на амидной группе
радикала аспарагина, образуя с коровым бел-
ком N-гликозидную связь.
В срединных участках комплекса Гольджи
углеводные цепи растут затем путем поочеред-
ного добавления моносахаридных звеньев —
(К-ацетил)глюкозамина, галактозы, фукозы и
т.д. В некоторых из них в качестве концевых
384
Глава 10
фрагментов присоединяются сиаловые кислоты,
что осуществляется в транс-цистернах Гольджи.
Как уже отмечалось, реализуются все эти
реакции гликозилтрансферазами. Каждый та-
кой фермент «распознает» структуру и «сво-
его» моносахарида, и того участка белковой
молекулы (или наращиваемой углеводной це-
пи), на который можно перенести этот моноса-
харид с его активированной (нуклеозиддифос-
фатной) формы.
К настоящему времени открыто более 200
различных гликозилтрансфераз. Именно суб-
стратная специфичность их, а также очеред-
ность действия предопределяют структуру
строящейся углеводной цепи. Будучи связан-
ными с мембраной, гликозилтрансферазы рас-
пределены в различных субрегионах комплекса
Гольджи. Пространственное их разграничение
вносит свой вклад в последовательность реак-
ций гликозилирования белка, а, значит, и в
специфику гликановых цепей, создаваемых в
гликоконъюгатах.
От описанной общей схемы существенно
отличается синтез остальных сульфатирован-
ных протеогликанов и, особенно, биогенез
N-олигосахаридов. Те и другие присоединяют-
ся к белковой молекуле не прямо, а через про-
межуточный фрагмент определенного строения.
Сульфатированные гликозамино-
гликаны (кроме кератансульфатов) в качестве
такого фрагмента используют тетрасахарид
стандартного строения (рис. 10-7). Его созда-
ние инициирует ксилозилтрансфераза, перено-
сящая пентозный фрагмент с УДФ-ксилозы на
радикал серина в молекуле корового белка.
Субстратная специфичность фермента такова,
что он использует в качестве «мишени» обыч-
но только те сериновые радикалы, которые
входят в состав последовательности ...-У-Х-
сер-гли-... , где У - это глутамат или аспартат,
а X— любая аминокислота.
После завершения постройки тетрасахари-
да (путем присоединения к фиксированной
ксилозе двух подряд остатков галактозы и, в
заключение, остатка глюкуроновой кислоты)
наступает второй «критический» момент, кото-
рый определяет, по какому пути пойдет даль-
нейший синтез полисахаридной цепи. Одна из
гликозилтрансфераз переносит на глюкуроно-
вую кислоту остаток (К-ацетил)глюкозамина,
присоединяя его связью а(1—>4), а другая - ос-
таток (М-ацетил)галактозамина, присоединяе-
мый тоже связью 0(1—*4). Соответственно это-
му дальнейший синтез идет по пути формиро-
вания цепей либо гепарансульфатного, либо
хондроитинсульфатного типа. Первый из упо-
мянутых ферментов требует, чтобы с глицино-
вой стороны «надстраиваемого» серина приле-
гал триптофановый или иной гидрофобный
радикал, а на некотором удалении - еще и уча-
Глюкуронидо(Р1 -»3)-галактозидо(р1 ->3)-галактозидо(р1 -»4)-ксилозидо(Р-»)-0-белок
Рис. 10-7. Стандартный тетрасахаридный «стебель» для наращивания цепей
сульфатированных гликозаминогликанов (кроме кератансульфатов).
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
385
сток, обогащенный глутаматом и/или аспарта-
том. Условия, необходимые для другого фер-
мента (направляющего синтез по пути хонд-
роитин- и дерматансульфатов), пока не выяс-
нены. Известно лишь, что с увеличением гид-
рофобности корового белка цепи этого типа
синтезируются с большей скоростью, но ока-
зываются менее длинными.
Последующее нарашивание регулярного
участка гликозаминогликановой цепи на стан-
дартном тетрасахариде происходит под дейст-
вием гликозилтрансфераз, поочередно перено-
сящих на растущую цепь остатки ацетилиро-
ванного гексозамина и глюкуроновой кислоты.
В случае гепарансульфатов это делает один
фермент (гепарансульфат-синтетаза), способ-
ный чередовать присоединение и (N-aue-
тил)глюкозамина. и D-глюкуроната.
N-связанные олигосахариды форми-
руются тоже на заранее подготовленном про-
межуточном фрагменте, но не тетра-, а пента-
сахаридного строения и к тому же разветвлен-
ного. Самая же главная особенность заключа-
ется в том, что сборка этого стандартного пен-
тасахарида происходит не на белковой молеку-
ле (как описано выше для остальных глико-
конъюгатов), а на специальном «носителе», и
только потом заготовка пентасахарида пере-
мещается на коровый белок.
Роль носителя выполняет долихолфосфат
— длинная цепь изопреноидных единиц, на од-
ном конце которой имеется гидроксильная
группа, образующая эфир с фосфорной кисло-
той (рис. 10-8). Синтезируется эта цепь путем
постепенной конденсации молекул ацетил-
КоА. Начальные стадии осуществляются так
же, как и при биогенезе холестерола (см. раз-
дел 7.7.1), но после образования фарнезилпи-
рофосфата (см. рис. 7-29) происходит не кон-
денсация его, а дальнейшее наращивание цепи
путем последовательного присоединения не
менее чем 10 изопентенильных фрагментов.
Гидрофобная молекула долихолфосфата
встроена в мембрану ЭР так, что фосфатный
Г СН3 ] СНз ОН
Н— СН2—С=СН—СН2 -СН2-СН-СН2-СН2- О- Р=О
он
Рис. 10-8. Строение долихолфосфата.
остаток расположен на внешней (цитоплазма-
тической) стороне мембраны. Именно на нем
происходит синтез пентасахаридной структу-
ры, начиная с присоединения первого звена,
переносимого с УДФ-(М-ацетил)глюкозамина,
и кончая введением «избыточных» звеньев к
разветвленному концу олигосахарида. Затем
долихол «проворачивается» в мембране таким
образом, что олигосахаридный фрагмент ока-
зывается обращенным в просвет ЭР. Здесь про-
должается удлинение свободных концов угле-
вода и формируется еще одна «веточка» (тре-
тья по счету). И только потом в действие всту-
пает олигосахарид-трансфераза. Она освобож-
дает молекулу долихолфосфата, а всю углевод-
ную часть переносит на коровый белок (синтез
которого еще продолжается). Присоединение
(М-ацетил)глюкозамина олигосахаридной заго-
товки происходит к амидному азоту такого ра-
дикала аспарагина, который включен в после-
довательность ...-асн-Х-сер-..., где вместо се-
рина допустимо присутствие треонина, а X -
остаток любой аминокислоты, кроме аспартата
или пролина.
После переноса на белковую молекулу
развивается процесс «отделки» (аранжировки)
олигосахаридной структуры, придания ей той
или иной специфики. Он завершается по мере
прохождения гликопротеином различных суб-
регионов аппарата Гольджи. Первыми участву-
ют гликозидазы, отщепляя концевые остатки
глюкозы и часть остатков маннозы. Эти реакции
не затрагивают, однако, стандартного пентаса-
харида (почему он и одинаков у всех N-связан-
ных олигосахаридов). Затем (а нередко - и впе-
ремежку) вовлекаются гликозилтрансферазы,
обеспечивающие дальнейшее разветвление оли-
госахаридной цепи стандартного пентасахарида
(рис. 10-9) и/или наращивание концевых вето-
чек («антенн»). В итоге может изменяться коли-
чество разных «антенн» (от 2 до 5), а их свобод-
ные концы представлены обычно либо манно-
зой, либо галактозой, к которой нередко при-
соединена сиаловая кислота. Все это обеспечи-
вает возможность большого разнообразия
N-связанных олигосахаридов и, тем самым, уча-
стие их в обеспечении специфических функций
белковой молекулы, в том числе функции узна-
вания.
386
Глава 10
Манн(а1->3).
Рис. 10-9. Структура стандартного пентасахарида молекул N-олигосахаридов.
Обозначения: Асн — радикал аспарагина в молекуле корового белка; Манн - манноза; (Мац)Глк- (И-ацетил)глюкозамин.
10.3.5. РЕАКЦИЯ СУЛЬФАТИРОВАНИЯ
Процесс внедрения сульфатных групп за-
трагивает все гликозаминогликаны, кроме гиа-
луроновой кислоты. Он начинается сразу после
завершения синтеза полисахаридных цепей или
несколько ранее. У млекопитающих единст-
венным источником необходимых сульфо-
групп служит 3’-фосфоаденозин-5'-фосфосуль-
фат (ФАФС). Образование этой активирован-
ной формы сульфата осуществляет бифунк-
циональный фермент, обозначаемый как
ФАФС-синтетпаза. Сначала он, используя не-
органический сульфат, заменяет им концевую
пирофосфатную группу в молекуле АТФ (ре-
акция ( на рис. 10-10). Затем фермент катали-
зирует киназную реакцию. А именно: возник-
ший аденозин-5'-фосфосульфат подвергает
фосфорилированию в положении 3' за счет еще
одной молекулы АТФ, завершая тем самым
образование конечного продукта - ФАФС (ре-
акция II на рис. 10-10).
Таким образом, перевод молекулы сульфа-
та в активную форму требует затраты энергии,
Аденозин-5'-фосфосульфат
(АфС)
Аценоз и н-5 -фосфосул ьфат
З'-Фосфоаденозин-б’-фосфосульфат
(ФАФС)
Рис. 10-10. АТФ-сульфурилазная (I) и аденилилсульфат-киназная (II) реакции,
катализируемые бифункциональным ферментом ФАФС-синтетазой.
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
387
эквивалентной расщеплению 3 молекул АТФ
до АДФ и Ф. Столь значительная «стоимость»
органификации сульфата свидетельствует о
жизненно важном значении процессов сульфа-
тирования различных веществ (причем, не
только протеогликанов).
Непосредственно сульфогрупп с молекул
ФАФС в состав гликозаминогликанов катали-
зируют чаще всего О-сульфотрансферазы. Их
субстратная специфичность обеспечивает воз-
можность присоединения переносимого суль-
фата к гидроксильной группе гексозаминового
звена (в положении 4 или 6, иногда - 3) либо
глюкуроновой (идуроновой) кислоты (в поло-
жении 2, реже — 3). Более того: распознается не
только атакуемый мономер, но и особенности
звеньев, примыкающих к нему. Совсем други-
ми качествами обладает фермент, осуществ-
ляющий реакцию N-сульфатирования ацетили-
рованных аминогрупп в молекулах гепаран-
сульфатов. Будучи бифункциональным, он ка-
тализирует две разные реакции: сначала N-де-
ацетилирование определенных глюкозамино-
вых звеньев, а затем - трансферазное присое-
динение сульфатной группы к азоту взамен
изъятого остатка уксусной кислоты.
10.3.6. КАТАБОЛИЗМ КОМПОНЕНТОВ ВКМ
Протеолиз является ведущим фактором,
определяющим скорость деградации внеклеточ-
ных структур. В нем участвуют все 4 класса
протеиназ. Однако, главную роль играют метал-
лопротеиназы, поскольку именно они преобла-
дают в межклеточном пространстве и способны
расщеплять нативный коллаген и все другие
белки матрикса, включая протеогликаны. Эти
цинк-содержащие эндопептидазы, активные при
нейтральных значениях pH, вырабатываются
многими клетками - от фибробластов и макро-
фагов до эндотелиальных и тучных клеток.
Идентифицировано около 15 матриксных
металлопротеиназ (ММП). Различаются они по
месту синтеза (тип клеток), некоторым особен-
ностям строения, а главное - по спектру суб-
стратной специфичности. Вновь открываемым
ферментам давали разные названия, - такие как
стромелизин, матрилизин, металлоэластаза.
Часто употребляют термины коллагеназа (раз-
рывает тройную суперспираль нативного колла-
гена в определенном месте) и желатиназа (рас-
щепляет дезинтегрированный коллаген, особен-
но одиночные ct-цепи и их обрывки). Постепен-
но выяснилось, однако, что четких граней между
ними нет. Оказалось, что коллагеназы способны
гидролизовать и денатурированные формы кол-
лагена (или его фрагменты), а желатиназы
обычно эффективны и в отношении нативных
тропоколлагенов того или иного типа. По со-
временной номенклатуре прежние «коллагена-
зы» получили обозначения ММП-1, ММП-8 и
ММП-13, а «желатиназы» - ММП-2 и ММП-9.
В активном центре последних двух ферментов
выявлены повторяющиеся домены фибронекти-
на типа П, которые, как оказалось, участвуют во
взаимодействии с коллагеновыми субстратами.
Данные о наиболее изученных ММП при-
ведены в табл. 10-7. Ради краткости, для каж-
дого фермента здесь приведены все рас-
щепляемые им формы коллагена, будь то на-
тивный или желатинированный. Следует толь-
ко добавить, что скорость гидролиза разных
коллагенов одним и тем же ферментом может
различаться очень сильно.
Как видно из таблицы, многие ММП спо-
собны гидролизовать и другой из ведущих
белков волокнистых структур - эластин. Наибо-
лее эффективна среди них металлоэластаза
(ММП-12), продуцируемая макрофагами. В от-
личие от нее. эластаза, вырабатываемая нейтро-
филами, относится к другому классу протеиназ
— к числу сериновых ферментов. Тем не менее,
подобно металлопротеиназам, она расщепляет
не только эластин, но и другие белки, включая
некоторые коллагены. Этот фермент гидролизу-
ет в основном те пептидные связи, которые об-
разованы с участием карбоксильной группы ва-
лина (в меньшей степени - аланина). Нейтро-
фильная эластаза чувствительна к ингибиторам
сериновых протеиназ. Из эндогенных ингиби-
торов особенно эффективным для нее является
сц-антнтрипсин (агАТ). Этот небольшой глико-
протеин (М5 кДа) вырабатывается гепатоцита-
ми в виде предшественника. Активная форма
ингибитора сосредоточена во внеклеточных
пространствах и жидкостях тела (в том числе в
слюне и бронхиальном секрете). Свое название
cq-AT получил в связи с тем, что впервые был
обнаружен в сыворотке как белок фракции аг
глобулинов, угнетаюший активность трипсина.
388
Глава 10
Т аблица 1 0-7
Субстратная специфичность очищенных металлопротеиназ (ММП) in vitro
[ММП-1, ММП-2, ММП-3, ММП-7 и другие обозначены в первой строке таблицы
только их цифровыми индексами - соответственно 1,2, 3, 7 и т.д.]
Субстрат 1 2 3 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Коллаген (типы) I I III IV I IV III IV IV 1 I III
II IV IV X II V IV II 11
III V V III VII V 111 III
VII VII IX V X IV
VIII X X VII IX
X XI VIII X
X
Эластин + + + + + + +
Фибронектин + + + + + + + + + + +
Ламинин + + + + + + +
Нидоген + + + + + + +
Тенасцин + + + + + +
Агрекан + + + + + + + + +
Версикан + + + +
Связующий белок1 + + + + + +
Декорин + + +
Перлекан + + +
Остеонектин2 + + + + +
щ-АТ + + + + + + + + +
at-AXTJ + + +
аг-антиплазмин +
Антитромбин III +
а2-МГ + + + +
Про-ММП-1 + + + +
Про-ММП-2 + + + + +
Про-ММП-7 +
Про-ММП-8 + +
Про-ММП-9 + + + + +
Про-ММП-13 + + +
Про-лизил- оксидаза +
ММП27ГИМП2 +
ММП9/ТИМП1 +
Фибриноген + +
Фибрин + +
Плазминоген + + + +
Ингибитор плаз- миноген- активатора +
Примечание:1 - саязующие домены гиалектанов;2 - описание белка см. в табл. 11-1; 3 - сд-антихимотрипсин.
Гораздо позже установили, что его сродство к
эластазе на 3 порядка выше, чем к трипсину.
Иными словами, в условиях организма он вы-
полняет фактически роль антиэластазы. Назва-
ние, однако, менять не стали, тем более что этот
ингибитор способен угнетать и многие другие
сериновые протеиназы (плазмин, тромбин и
т.д.), хотя и в меньшей степени. Врожденная
недостаточность щ-АТ приводит к эмфиземе
легких, проявляющейся уже в раннем возрасте
из-за слабой защиты эластических волокон сте-
нок альвеол от действия нейтрофильной эласта-
зы. Эмфизема курильщиков тоже объясняется
дефицитом ct!-АТ, разрушение которого вызы-
вают компоненты табачного дыма. Интересно
отметить, что в опытах на мышах с недостаточ-
ностью ММП-12 принудительное «курение»
сигарет не вызывало развития эмфиземы легких.
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
389
Сведения о субстратной специфичности
наиболее изученных ММП, приведенные в табл.
10-7, нельзя считать исчерпывающими. Тем не
менее, можно видеть, что многие ферменты это-
го семейства расщепляют не только компоненты
волокнистых структур матрикса, но и коровые
белки иных макромолекул основного вещества
— гликопротеинов и протеогликанов. При этом
металлопротеиназы в значительной степени
дублируют друг друга. Так, фибронектин и аг-
рекан могут расщепляться большинством ММП.
Наиболее универсальны ММП-2, ММП-7 и,
особенно, ММП-3, которые способны расщеп-
лять почти все из перечисленных белков мат-
рикса. Остальные металлопротеиназы имеют
более узкий спектр субстратной избирательно-
сти. К ним относятся мембраносвязаниые фер-
менты (ММП-14, -15, -16 и -17), у которых ак-
тивный центр находится во внеклеточном про-
странстве, а С-концевая часть молекулы прони-
зывает плазматическую мембрану и завершает-
ся коротким цитоплазматическим фрагментом.
Важно отметить, что многие ММП могут
осуществлять деградацию не только структур-
ных белков матрикса. Они разрушают также
белковые ингибиторы сериновых протеиназ, -
такие как сц-АТ (уязвим для большинства
ММП), а2-антиплазмин и антитромбин III.
А самая «всеядная» протеиназа (ММП-3) мо-
жет расщеплять еще и а2-МГ, являющийся
универсальным ингибитором для протеиназ
всех 4 классов (в том числе коллагеназ!). Таким
образом, многие ММП (если не все) участвуют
не только в деградации матрикса, но и в регу-
лировании этого процесса.
Регуляция протеолиза компонентов ВКМ
чрезвычайно важна как для сохранения струк-
тур соединительной ткани, так и для их посто-
янного обновления.
В целом базальный уровень биосинтеза
матриксных металлопротеиназ очень незначи-
телен. Но он может резко возрастать в ответ на
изменения в состоянии компонентов ВКМ и
межклеточных контактов, а также под действи-
ем сигнальных молекул. Хранение запасов в
секреторных гранулах - редкое явление: оно
установлено только для ММП-8 (коллагеназа) и
ММП-9 (желатиназа), которые обнаружены в
секреторных гранулах нейтрофилов и эозино-
филов, а также для ММП-7 (матрилизин), кото-
рый накапливается в секреторных клетках эк-
зокринных желез. В основном же регуляция
функционирования ММП реализуется на уровне
транскрипции с последующей активацией зимо-
генов и возможностью угнетения эндогенными
ингибиторами протеиназ. Инициирующая роль
в транскрипции генов различных ММП уста-
новлена для ряда цитокинов (таких как ТФР-р,
ИЛ-1 и ФИО). С другой стороны, многие из
этих регуляторов могут разрушаться отдель-
ными металлопротеиназами. Становится оче-
видной сложность системы взаимозависимых
факторов, регулирующих процессы деградации
матрикса. Пока известны лишь отдельные эле-
менты этой системы. Однако ясно, что она спо-
собна чутко реагировать на баланс множества
регуляторов и обеспечивать не только сохран-
ность и обновление состава ВКМ, но и вносить
важный вклад в реализацию таких процессов,
как морфогенез клеток, дифференциация тка-
ней, прорастание сосудов (ангиогенез), мигра-
ция клеток (в том числе злокачественных)
и т.д.
Почти все ММП выделяются в матрикс
в форме неактивных предшественников. Их
N-концевой пропептид содержит радикал цис-
теина, образующий хелатное соединение с ато-
мом цинка в каталитическом центре ММП.
Ферментативное отщепление пропептида де-
блокирует этот цинк и переводит проферменты
в активную форму (функционирование кото-
рой, как правило, требует присутствия ионов
кальция). Как видно из табл. 10-7, многие из
ММП катализируют такую активацию ряда
своих партнеров. Этим усиливается надеж-
ность работы системы в целом. Лишь для
ММП-1 описан феномен аутоактивации.
Помимо семейства ММП, важную роль иг-
рают также активаторы плазминогена. Эти фер-
менты инициируют протеолиз, приводящий к
образованию плазмина, который, среди прочего,
способен активировать металлопротеиназы.
Кроме того, некоторые ММП могут напрямую
превращать плазминоген в плазмин, а ММП-16
разрушает ингибитор плазминоген-активатора
(см. табл. 10-7). Получается сложная сеть об-
ратных связей, в которую вовлечено и отмечен-
ное в таблице разрушение некоторыми ММП
а2-антиплазмина и других ингибиторов серино-
вых протеиназ, а также а2-макроглобулина.
390
Глава 10
Еще одни аспект: внеклеточные протеина-
зы обеспечивают не только общую деградацию
белков матрикса, но и участвуют в функцио-
нально важных реакциях ограниченного проте-
олиза. Так, ММП-2 избирательно отщепляет
пропептид от предшественника лизилоксидазы,
преобразуя его в активный фермент. Кроме то-
го, такой выборочный гидролиз может приво-
дить к освобождению биологически активных
пептидов, включенных в структуру многих
белков матрикса (среди таких пептидов уста-
новлены различные факторы роста, эидоста-
тин, ингибитор протеиназ типа Кунитца, фак-
торы ФВ, хондрокальцин и другие).
Угрозу избыточной деградации компо-
нентов ВКМ предотвращают эндогенные инги-
биторы протеиназ. Будучи белковыми молеку-
лами (обычно небольших размеров), они выде-
ляются клетками в окружающую среду, где и
осуществляют защиту от чрезмерного протео-
лиза. В межклеточном пространстве наиболее
важную роль играют ингибиторы активаторов
плазминогена и, особенно, тканевые ингибито-
ры металлопротеиназ (ТИМП). Последние спе-
цифически угнетают активный фермент, обра-
тимо связываясь с его адсорбционным центром
и блокируя при этом атом Zn2+ в каталитиче-
ском центре. Выявлено 4 белка семейства
ТИМП. Все они содержат по 12 остатков цис-
теина, которые, образуя S-S-мостики, форми-
руют 6 петель полипептидной цепи. ТИМП-1 и
-2 способны угнетать активность большинства
ММП (кроме мембраносвязанных), но с очень
разной степенью сродства. Ингибиторы группы
ТИМП не только подавляют активность ММП,
но и обладают более широким биологическим
действием. В частности, установлена их спо-
собность тормозить ангиогенез, противостоять
метастазированию раковых клеток, а при избы-
точной выработке - даже приостанавливать
рост злокачественных опухолей.
Имеющиеся в плазме крови эндогенные
ингибиторы протеиназ тоже участвуют в защи-
те от избыточного протеолиза компонентов
ВКМ. Даже такой крупный ингибитор, как
а2-МГ (>700 кДа), довольно обильно представ-
лен во внеклеточной среде практически всех
тканей, проявляя свои универсальные антипро-
теолитические свойства.
Локальный баланс между выработкой ак-
тивных ММП (и других протеиназ) и уровнем
их эндогенных ингибиторов влияет на итоговую
скорость деструкции матрикса. Обеспечивая
контролируемый протеолиз, внеклеточные про-
теиназы играют важную роль в процессах об-
новления коллагена и других белковых компо-
нентов ВКМ. Интенсивность его сильно варьи-
рует в разных тканях. Так, в опытах на живот-
ных показано, что в мышцах, коже и стенке
кишки общий коллаген обновляется наполовину
в среднем соответственно за 45, 74 и 244 дня.
Чрезмерная продукция протеиназ клетками со-
единительной ткани лежит в основе таких пато-
логических процессов, как ревматоидный арт-
рит, остеоартрит, хронические кожные язвы,
изъязвление кишечника, периодонтит, а также
вносит свой вклад в процессы инвазии и мета-
стазирования опухолевых клеток.
Катаболизм углеводных фрагментов гли-
копротеинов и протеогликанов матрикса осу-
ществляется с участием различных эндо- и эк-
зогликозидаз. В значительной степени это про-
исходит в лизосомах, которые обладают бога-
тым набором и гликозидаз, и протеиназ. В ито-
ге макромолекулы расщепляются до мономе-
ров (моносахаридов и аминокислот), которые
поступают в цитоплазму и подвергаются либо
повторному использованию, либо распаду до
конечных продуктов.
При исследовании катаболизма N-связан-
ных олигосахаридов удалось выявить два спо-
соба их отщепления от корового белка. Один
из них - обычный, осуществляемый эндо-р-
(Н-ацетил)глюкозаминидазой, гидролизующей
связь между двумя остатками ацетилированно-
го глюкозамина, ближайшими к аспарагину
белковой молекулы. Другой способ необычен
для гидролаз. Он заключается в амидазном от-
щеплении N-гликаназой всего олигосахаридного
фрагмента от аспарагина корового белка. Под
действием этого фермента происходит не толь-
ко гидролиз связи между углеводом и амидной
группой аспарагина, но и выделение аммиака, в
результате чего в белковой цепи появляется ос-
таток аспарагиновой кислоты вместо бывшего
аспарагина. Это меняет свойства белка и делает
его более доступным для протеолитической де-
градации. Находясь в эндоплазматической сети,
N-гликаназа может, таким образом, осуществ-
лять «контроль качества» синтезируемого гли-
СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ
391
копротеина, удаляя ошибочно присоединенные
олигосахариды и тем самым облегчая протеолиз
«неправильного» белка.
Для деградации гиалуронана - единствен-
ного из гликозаминогликанов, не состоящего в
ковалентной связи с белками, - тоже требуются
особые гликозидазы. Общее их обозначение -
гиалуронидазы. Известно три группы таких
ферментов.
В организме млекопитающих гиалурони-
дазы (особенно активные в яичках и спер-
матозоидах) обладают гексозаминидазным дей-
ствием, расщепляя связи между дисахаридны-
ми звеньями, т.е., Р(1—^-гликозидные связи
между (ГЧ-ацетил)глюкозамином и D-глюкуро-
новой кислотой (см. табл. 10-3). При этом оче-
редность атаки на разные участки полимера не
регламентирована, но конечными продуктами
становятся тетра- и гексасахариды. Они, в свою
очередь, являются субстратами для двух разных
экзогликозидаз — Р-глюкуронидазы и 0-(М-аце-
тил)глюкозаминидазы. Действуя поочередно,
они отщепляют соответственно глюкуронат или
ацетилглюкозамин от нередуцирующего конца
(т.е., не обладающего свободным полуацеталь-
ным гидроксилом). Аминидазный тип расщеп-
ления присущ и гиалуронидазе змеиного яда.
Некоторые бактериальные гиалуронидазы
тоже обладают гексозаминидазной спецификой,
но реализуют более глубокое разложение поли-
мера — до дисахаридных единиц. Как и у млеко-
питающих, они в той или иной степени могут
расщеплять еще и цепи хондроитин- и дерма-
тансульфатов. Способность «разжижать» меж-
клеточное вещество помогает микроорганизмам
преодолевать соединительнотканные барьеры.
Особая гиалуронидаза вырабатывается в
слюнных железах пиявок. Как и фермент мле-
копитающих, она гидролизует гиалуроновую
кислоту тоже до тетра- и гексасахаридов, но
разрывает связи не между дисахаридными еди-
ницами, а внутри них, т.е., расщепляет |3( 1—>3)-
гликозидные связи между глюкуроновой ки-
слотой и (Ы-ацетил)глюкозамином.
Следует отметить, что в плазме крови че-
ловека гиалуронидаза содержится в крайне ма-
лых количествах. Ее угнетению эндогенными
ингибиторами придают ведущую роль в увели-
чении концентрации гиалуронана, которое от-
мечается при таких острых состояниях, как
шок, ожоговая болезнь, септицемия. Считается,
что накопление этих сильно гидратированных
молекул позволяет стабилизировать объем
крови и тем самым противоборствовать разви-
тию циркуляторного коллапса.
Таким образом, гликоконъюгаты могут
расщепляться как непосредственно в матриксе,
так и внутри клеток, куда они поступают путем
эндоцитоза. Последнее особенно типично для
макромолекул, связанных с клеточной поверх-
ностью. В частности, это установлено для ге-
парансульфатных протеогликанов, которые
после поглощения клетками подвергаются ско-
ординированному воздействию разных про-
теиназ и гликозидаз. Начальные этапы их фер-
ментативного гидролиза протекают вне лизо-
сом (при нейтральных значениях pH), а образо-
вавшиеся фрагменты расщепляются до моно-
меров в лизосомах с участием кислых гидролаз
(включая экзогликозидазы и сульфатазы). Не-
давно появились данные, что раковые клетки
могут секретировать гепараназу, которая гид-
ролизует связи между глюкуроновой кислотой
и (М-ацетил)глюкозамином. Разрушая гепаран-
сульфатные цепи, этот фермент ослабляет
«прикрытие» ими молекул коллагена-IV от
воздействия протеиназ, что ведет к повышению
проницаемости базальной мембраны, в том
числе - для метастазирующих клеток.
Все изложенное показывает, что внекле-
точный матрикс — не инертная среда для кле-
ток, а очень динамичная система, которая во
взаимодействии со «своими» клетками непре-
рывно обновляется и способна к ремоделиро-
ванию - определенной перестройке морфоло-
гических структур при изменении функцио-
нальных нагрузок. Резидентные клетки спо-
собны улавливать даже небольшие сдвиги в
комбинации, концентрации и распределении
компонентов матрикса, динамично отвечать на
них и на основе этого очень точно поддержи-
вать гомеостаз и ремоделирование. При этом
интенсивность метаболизма компонентов ВКМ
сильно варьирует в разных тканях. Так, гиалу-
ронан кожи обновляется наполовину примерно
за 1 сутки, а в гораздо более инертной хряще-
вой ткани - за 1-3 недели (т.е., тоже довольно
быстро). В экстремальных условиях и при по-
вреждении скорость метаболизма тех или иных
компонентов ВКМ может резко возрастать.
Глава 11
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
К числу скелетных тканей относят хряще-
вые и костные структуры. С другими вариан-
тами соединительной ткани их роднит и общ-
ность происхождения (из мезенхимы), и одна
из ведущих функций (опорная), а главное -
большое сходство в строении макромолеку-
лярных компонентов ВКМ. К особенностям же
скелетных тканей относятся ограниченность
набора клеточных элементов (при почти полном
отсутствии клеток защиты), а также значитель-
ное преобладание и высокая плотность межкле-
точного вещества, обеспечивающая твердость
ткани и ее механическую прочность (в костях
эти свойства усилены минерализацией).
11.1. ХРЯЩЕВАЯ ТКАНЬ
По существу, единственным типом клеток
в хрящевой ткани является хондроцит. Диффе-
ренцируясь из мезенхимы в ходе формирова-
ния хондрогенных островков у эмбриона, хон-
дроциты вырабатывают и секретируют все
структурные компоненты собственного ВКМ.
В растущем хряще клетки обладают особенно
высокой синтетической активностью, за что их
часто называют хондробластами. В зрелой тка-
ни метаболическая активность хондроцитов
невелика и направлена на поддержание струк-
турной организации хряща.
При делении хондроцитов в процессе соз-
дания хряща дочерние клетки постепенно от-
даляются друг от Друга из-за наращивания слоя
матрикса, секретируемого каждой из них. Это
явление получило название «интерстициаль-
ный рост» (рост ткани «изнутри»). Благодаря
ему хондроциты в конечном счете располага-
ются поодиночке, занимая свои «персональ-
ные» полости (лакуны).
Каждое хрящевое образование (за исклю-
чением суставного хряща) окружено слоем
плотной соединительной ткани, содержащей
коллаген типов I и III, протеогликаны, глико-
протеины и специализированные фибробласты.
Этот слой, обозначаемый как перихондрий, или
надхрящница, появляется параллельно с воз-
никновением и развитием хрящевых закладок
(островков). В нем формируются нервы и кро-
веносные сосуды, которые, однако, не прорас-
тают вглубь хряща. Надхрящница играет роль
корсета, сдерживающего возможные измене-
ния формы конкретного хряща. Вместе с тем,
фибробласты ее внутренней стороны могут
превращаться в хондроциты, которые, секрети-
руя хрящевой матрикс, обеспечивают аппози-
ционный рост (рост хряща путем наслоения его
снаружи). У взрослых эта способность сохра-
няется в латентном состоянии, чтобы быть вос-
требованной для репарации хряща в случае его
повреждения.
Соотношение главных внеклеточных ком-
понентов и некоторые их структурные особен-
ности различны в разных видах хрящевой тка-
ни. Соответственно этому хондроциты гиали-
нового хряща, волокнистого хряща и эластиче-
ского хряща рассматривают как отдельные фе-
нотипы клеток.
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
393
Наиболее распространен в теле млекопи-
тающих гиалиновый хрящ. Из него формиру-
ются суставные поверхности костей (сустав-
ной хрящ); концы ребер; хрящи крупных брон-
хов, трахеи, носа, некоторые хрящи гортани.
Волокна в гиалиновом хряще составля-
ют 20-25% массы ВКМ; это несколько меньше,
чем в сухожилиях и дерме. Основную часть
составляет коллаген типа II, специфичный для
хрящевых тканей вообще. Его строение типич-
но для фибриллярных коллагенов, но С-конце-
вой пропептид представляет собой хондро-
кальцин, - структуру, обладающую собствен-
ной биологической активностью (в частности,
способностью связывать ионы кальция). В ка-
честве минорного компонента выявлен колла-
ген типа XI, который, как полагают, участвует
в регулировании бокового роста фибрилл кол-
лагена-11, из-за чего волокна в хряще сравни-
тельно тонкие (до 25 нм в диаметре). Про-
странственная ориентация их соответствует
преобладающему направлению механических
напряжений. В небольшом количестве содер-
жится также коллаген-IX, молекулы которого
ассоциированы с поверхностью волокон колла-
гена-11 и, кроме того, электростатически взаи-
модействуют с гликозаминогликанами своим
глобулярным N-конпевым участком. Еще один
минорный компонент — коллаген типа VI — от-
личается разнообразием доменов (см. табл.
10-2) и наличием RGD-центров связывания с
клетками. Это позволяет ему обеспечивать
прикрепление хондроцитов к коллагеновым
волокнам II/XI и осуществлять контакты с дру-
гими компонентами ВКМ. Наконец, коллаген
типа X: он появляется только в участках дегра-
дации гиалинового хряща, возникающих в ходе
преобразования его в кость.
Гликопротеины гиалинового хряща
представлены, как и в других вариантах соеди-
нительной ткани, в основном фибронектином.
Но есть и такие гликопротеины, которые спе-
цифичны для хрящевых тканей. Наиболее изу-
чены из них следующие.
Матрилин (синоним — хрягцевой матрикс-
ный белок). Состоит из трех одинаковых субъ-
единиц (размерами ~50 кДа), которые соедине-
ны S-S-мостиками и обладают на обоих концах
доменом подобия фактору ФВ типа А, обра-
зующим большую (до 200 АО) петлю, скреп-
ленную дисульфидной связью. Каждая субъ-
единица содержит также N-олигосахарид и
участки, подобные ЭФР. Они представляют
собой последовательности из 30-40 АО, обыч-
ные для многих белков разного функциональ-
ного предназначения; все 6 имеющихся здесь
остатков цистеина вовлечены в образование
внутридоменных S-S-связей. Некоторые вари-
анты ЭФР-домена обладают зоной фиксации
ионов Са2+, содержащей радикалы глутамата и
аспартата. Матрилин легко связывается с кол-
лагенами и протеогликанами. Не обнаружива-
ется в суставном хряще и в межпозвонковых
дисках.
Матриксный Gia протеин (MGP) созвучен
матрилину только по названию. Как отмечено в
табл. 11-1, он очень невелик (менее 80 АО) и
содержит (в N-конневой половине) 5 радикалов
у-карбоксиглутаминовой кислоты (обозначае-
мой как Gia). Они возникают в ходе посттранс-
ляционной модификации остатков глутамата,
реализуемой посредством их карбоксилирова-
ния в у-положении с участием ферментов, за-
висимых от витамина К (раздел 2.6.3). Кроме
того, у самого N-конца этого белка расположе-
ны почти подряд три радикала фосфосерина.
Матриксный GZn-протеин ассоциирован с дру-
гими макромолекулами и содержится ие только
в хрящевой, но и в костной ткани. Полагают, что
он задерживает процессы формирования кости.
Тромбоспондин - адгезивный гликопроте-
ин, опосредующий взаимодействия клеток с
клетками и с матриксом. Гомотример, в кото-
ром субъединицы связаны S-S-мостиками. Из-
вестны 4 варианта субъединиц (100-130 кДа).
В каждом из них содержится несколько ЭФР-
подобных участков и до 10 повторов, именуе-
мых тромбоспондиновыми доменами (TSP-1 и
TSP-3). Некоторые имеют также RGD-центр
контакта с клетками, а на N-конце — гепарин-
связывающий фрагмент и домен фактора ФВ
типа С. Тромбоспондин способен и к ассоциа-
ции с коллагеном-V, ламинином, остеонекти-
ном, плазминогеном, фибриногеном, а также с
одной из сериновых протеиназ (угиетая ее
ферментативную активность). Он обнаружен в
самых разных органах и, как считают, участву-
ет в угнетении ангиогенеза.
Олигомерный матриксный белок хряща
выявлен в зоне, примыкающей к хондроцитам
394
Глава 11
(территориальный матрикс). Этот гликопроте-
ин построен из 5 одинаковых субъединиц
(~80 кДа), объединенных дисульфидными мос-
тиками. Каждая из них содержит RGD-центр
связывания с клетками, многократные повторы
тромбоспондиновых доменов TSP-3 и серию
ЭФР-подобных фрагментов (часть из которых
обладает сродством к ионам Са2+). Врожденные
дефекты этого белка приводят к дезинтеграции
хрящевой ткани в зонах роста трубчатых кос-
тей и могут проявляться разными сочетаниями
карликовости, брахидактилии, деформации
костей, разболтанности суставов.
Таким образом, для хрящевых гликопро-
теинов очень характерно разнообразие участ-
ков «узнавания», благодаря чему эти белки иг-
рают важную роль в кооперации макромолекул
ВКМ и в их взаимодействии с клетками.
Протеогликаны содержатся в гиалино-
вом хряще в большем количестве, чем в других
ведущих вариантах соединительной ткани.
Преобладает здесь агрекан, который составляет
до 10% сухого веса. Богатые лейцином малые
протеогликаны (табл. 10-5) по общей массе в
5-100 раз уступают гиалектанам, но по моляр-
ной концентрации вполне сопоставимы с агре-
каном (из-за большой разницы в размерах мо-
лекулы). Функциональная роль малых протеог-
ликанов обусловлена наличием участков связы-
вания с коллагенами (в хряще — типа П), благо-
даря чему эти белки могут вносить свой вклад
в ограничение бокового роста коллагеновых
фибрилл, столь важное для гиалинового хряща.
Обилие протеогликанов в хрящевой ткани
приводит к высокому содержанию сульфати-
рованных гликозаминогликанов. По их сум-
марному уровню гиалиновый хрящ превосхо-
дит все другие варианты соединительной тка-
ни. Преобладают в нем хондроитинсульфаты,
но немало также дерматан- и кератансульфа-
тов. Следует отметить, что в суставном хряще
кератансульфаты II отличаются определенны-
ми особенностями структуры. В частности, не-
которые из глюкозаминовых звеньев содержат
в качестве «боковой веточки» остаток £(1—>3)-
фукозы. Кроме того, гликановую цепь нередко
венчает добавочное звено в виде (N-аце-
тил)нейраминовой кислоты (рис. 1-25), которая
соединена а-гликозидной связью с 3-м или 6-м
углеродным атомом концевой галактозы.
Высокое содержание агрекана имеет особое
функциональное значение для гиалинового
хряща. Состоящий на 90% из гликозаминогли-
кановых цепей (преимущественно хондроитин-
сульфатных) с их высокой гидрофильностью и
обилием отрицательных зарядов (группы -СОО"
и -8Оз~)» этот гиалектан образует крупные над-
молекулярные комплексы с гиалуронаном, ко-
торым гиалиновый хрящ тоже богат. Как уже
отмечалось, такой комплекс возникает благо-
даря сорбции множества молекул агрекана на
длинной цепи гиалуроновой кислоты. Сорбция
эта происходит за счет связующих доменов,
расположенных в N-концевом домене агрекана.
Но в хрящевой ткани есть еще один белок, ко-
торый специфичен для нее и получил название
«связующий белок». Он представляет собой
сравнительно небольшой гликопротеин (менее
350 АО), стабилизированный пятью S-S-связя-
ми. Его полипептидная цепь в 7 раз короче ко-
рового белка агрекана и, почти повторяя N-koh-
цевой отрезок последнего, состоит только из
иммуноглобулинового домена и двух гиалуро-
нан-связывающих участков. Это позволяет ему
соединяться с полисахаридом ие одним своим
концом (как гиалектаны), а обоими. Иными сло-
вами, становится возможным прикрепление
«связующего белка» к разным молекулам гиа-
луронана, благодаря чему надмолекулярные
комплексы гиалуроновой кислоты с молекулами
агрекана объединяются в еще более крупные
образования — суперагрегаты. Они включены в
ячейки прочной, но растяжимой сети, сформи-
рованной волокнами коллагена. Тем самым вы-
сокая степень гидратации макромолекул допол-
няется удержанием воды в ячеистых структурах.
Эта интерстициальная вода участвует в обеспе-
чении эластичной упругости ткани, а благодаря
своей несжимаемости придает хрящу опреде-
ленную жесткость. В целом содержание воды в
хряще составляет 65-75% (протеогликанов - от
5 до 10%). Высокие нагрузки вытесняют интер-
стициальную воду в соседние участки матрик-
са, а после снятия внешнего давления происхо-
дит обратный процесс. Это качество особенно
важно для суставного хряща, позволяя смяг-
чать воздействие перемежающихся нагрузок на
сустав. Кстати, и коллагеновые волокна в сус-
тавном хряще гораздо толще обычного, дости-
гая в диаметре более 100 нм.
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
395
Волокнистый хрящ отличается от
гиалинового не только наличием, но и резким
преобладанием коллагена типа I, тогда как до-
ля коллагена-П невелика (<10%). Располага-
ются коллагеновые волокна очень упорядочен-
но, нередко — параллельными пучками, в соот-
ветствии с направлением силовых нагрузок.
Основное вещество матрикса, представленное
главным образом протеогликанами, занимает
сравнительно небольшой объем, будучи сосре-
доточенным преимущественно около хондроци-
тов. Все эти особенности обеспечивают высо-
кую механическую прочность волокнистого
хряща, который локализуется в местах прикреп-
ления сухожилий и связок к костям или гиали-
новым хрящам, а также в лонном симфизе и
межпозвонковых дисках.
Эластический хрящ характеризуется
обилием эластина, составляющего 10-30% су-
хой массы ткани. Плотная сеть ветвящихся эла-
стических волокон толщиной от 0,2 до 5 мкм
обеспечивает упругую гибкость соответствую-
щих хрящей средних бронхов, гортани, надгор-
танника, евстахиевой трубы, наружного слухо-
вого прохода, ушной раковины. Доля основного
вещества в эластической хрящевой ткани отно-
сительно невелика. Сравнительно немногочис-
ленные коллагеновые волокна, как и эластиче-
ские, вплетаются в перихондрий.
Метаболические особенности хря-
щевой ткани приспособлены к отсутствию в
ней капиллярной сети. Ближайшие кровенос-
ные сосуды проходят в окружении хряща,
главным образом - в перихоидрии. Снабжение
ткани питательными веществами (включая ки-
слород и минеральные вещества) и удаление
продуктов метаболизма осуществляется только
диффузией через толщу ВКМ. В итоге парци-
альное давление кислорода в матриксе хряща
(не более 5-8 мм рт. ст.) в несколько раз ниже,
чем в межклеточном веществе мягких тканей.
Поэтому энергообеспечение хондроцитов осу-
ществляется в основном за счет гликолиза. Из-
за слабого поступления питательных веществ
интенсивность метаболизма в зрелом хряще
вообще очень невелика. В суставной хрящ, ко-
торый не обладает перихондрием, диффузия
различных веществ осуществляется как со сто-
роны синовиальной жидкости, так и из подле-
жащей субхондральной кости.
Низкому уровню скорости обменных про-
цессов в зрелом хряще соответствует и низкая
активность ферментов катаболизма. Так, в хон-
дроцитах найдены все ферменты, требуемые
для деградации гликозаминогликанов (за ис-
ключением гиалуронидазы). Однако разрушать
углеводные цепи протеогликанов эти гли-
козидазы способны только после расщепления
коровых белков. Необходимые для этого мат-
риксные металлопротеиназы находятся здесь в
латентном состоянии, да и набор их гораздо
беднее, чем в большинстве других видов со-
единительной ткани. Тканевые ингибиторы
протеиназ представлены 3-4 вариантами, спектр
угнетающего действия которых охватывает все
хрящевые протеиназы, включая специфичную
для этой ткани ММП-8.
Регуляторные воздействия на хрящевую
ткань оказывают многие гормоны. Конечный
эффект их проявляется в стимуляции роста
(гормоны щитовидной железы, гормон роста,
андрогены) либо в его подавлении (кортико-
стероиды, эстрогены). Важный вклад вносят
также различные факторы роста и другие цито-
кины. Наиболее обширна группа небольших
белков, обозначаемых как костные морфогене-
тические протеины (их число достигает 20).
Несмотря на название, они функционируют не
только в костной и хрящевой тканях, ио и в
других. Свое действие эти цитокины реализу-
ют через специальные рецепторы двух типов,
взаимодействующих с лигандами, а затем и
между собой. Действуя согласованно и, оче-
видно, в определенной последовательности,
морфогенетические белки участвуют в форми-
ровании хрящевой, костной и других тканей,
влияя на процессы клеточной пролиферации,
дифференциации, морфогенеза и апоптоза. Все
эти белки отнесены к семейству трансформи-
рующего ростового фактора-p (ТФР-Р), т.к. они
очень близки ему по строению и по проявлени-
ям свойств локального регулятора.
Подавляющая часть хрящевой ткани, фор-
мирующейся в ходе развития организма, под-
вергается затем преобразованию в костную.
Иными словами, почти каждый хрящ создается
лишь в качестве модели (заготовки) будущей
кости. Общая масса хрящевой ткани, остающей-
ся у взрослого человека, составляет около 2% от
массы тела.
396
Глава 11
11.2. СОСТАВ КОСТНОЙ ТКАНИ
Наиболее яркой особенностью кости явля-
ется наличие в ней минеральной фазы, состоя-
щей из кристаллов неорганических солей, в
основном фосфорнокальциевых. В зрелой кор-
тикальной кости содержание их составляет в
среднем 45% от массы костной ткани, обеспе-
чивая ей прочность и твердость. Около 25%
составляет вода. Остальная часть внеклеточ-
ных структур приходится на долю органиче-
ских макромолекул; в только что сформиро-
ванном состоянии (до минерализации) ее часто
обозначают как остеоид. По своему составу он
близок собственно соединительной ткани,
будучи построенным из коллагеновых волокон
и основного вещества, состоящего из различ-
ных гликоконъюгатов. Вместе с тем, есть и зна-
чительное своеобразие внеклеточных белков,
особенно неколлагеновых; оно обусловлено
спецификой клеточных элементов костной
ткани.
11.2.1. КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ
Уникальной особенностью костной ткани
является четкое разделение функции строи-
тельства ВКМ и функции его разрушения (ре-
зорбции). Первую осуществляют клетки мезен-
химного происхождения - остеобласты. Вто-
рую - остеокласты, первоисточником кото-
рых является стволовая клетка крови. Из этого
следует, что костная ткаиь, в отличие от всех
других, обновляется не только путем метабо-
лической замены «постаревших» макромоле-
кул вновь синтезируемыми. Ведущую роль
здесь играет обновление на морфологическом
уровне — ремоделирование. Оно заключается в
полном разрушении точечных участков кости и
заполнении возникших дефектов новообразо-
ванным веществом, которое структурируется
несколько иначе. Такая перестройка протекает
всю жизнь, возникая то в одном, то в другом
локусе зрелой кости.
Остеобласты, в соответствии со своим
предназначением, вырабатывают макромоле-
кулы остеоида и обеспечивают его минерали-
зацию (обызвествление). В период активной
деятельности остеобласты характеризуются
сильно развитым биосинтетическим аппаратом
(включая рибосомы, ЭР, комплекс Гольджи),
а также обилием митохондрий, поставляющих
энергию для процессов биосинтеза. Такие
клетки называют активными остеобластами.
Окружая себя обызвествляющимся матриксом,
они постепенно снижают свою метаболиче-
скую активность, перестают делиться и в ко-
нечном счете превращаются в остеоциты, ко-
торые являются преобладающим клеточным
элементом зрелой кости. Каждый остеоцит. за-
ключенный в отдельную лакуну, соединяется с
себе подобными благодаря очень многочислен-
ным отросткам, которые проходят в узких кост-
ных канальцах и обеспечивают межклеточный
обмен низкомолекулярными метаболитами и
минеральными ионами через так называемые
щелевые соединения. Те остеобласты, которые
оказываются на поверхности кости, преобра-
зуются в особый слой покоящихся (неактив-
ных) остеобластов. Снижение биосинтетиче-
ской активности сопровождается в этих клет-
ках изменением спектра создаваемых макро-
молекул. Поэтому вырабатываемый ими ВКМ
никогда не минерализуется, образуя так назы-
ваемую эндостальную мембрану толщиной
всего 0,1-0,5 мкм, которая отделяет такие ос-
теобласты от кости. Эта особая форма остеоида
не только останавливает рост кости «в ширину»,
но и защищает ее поверхность от «несанкцио-
нированной» атаки клетками, способными раз-
рушать костную ткань. Важно отметить, что и
остеоциты, и покоящиеся остеобласты, несмот-
ря на невысокую метаболическую активность,
сохраняют разнообразный рецепторный аппарат
и способность реагировать на гормональные и
иные регуляторные воздействия.
Остеокласты образуются путем слияния
моноцитов. Поэтому каждый остеокласт со-
держит десятки ядер и отличается очень круп-
ными размерами (20-100 мкм). Среди особен-
ностей этих клеток - высокая активность кар-
боангидразы; наличие Н+-АТФазы (протонный
насос) в плазматической мембране и рецепто-
ров кальцитонина; способность вырабатывать
особый изофермент кислой фосфатазы (невос-
приимчивый к угнетающему действию тартра-
та). Многочисленные лизосомы накапливают и
выделяют в среду целый спектр кислых гидро-
лаз, участвующих в расщеплении макромоле-
кул остеоида.
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
397
11.2.2. ОРГАНИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ
По сравнению с хрящами кость содержит
гораздо больше коллагена и намного меньше
протеогликанов и воды. Волокнистые структу-
ры костного матрикса примерно на 90% состоят
из коллагена типа I (в зрелой коста, как и в
хряще, коллагеи-П1 отсутствует, хотя в других
тканях он обнаруживается обычно вместе с кол-
лагеном типа I). Среди межмолекулярных сши-
вок в фибриллярных структурах кости преобла-
дают бифункциональные: их здесь в 2-4 раза
больше, чем пиридинолиновых и пиррольных.
Из минорных компонентов следует отме-
тить коллагены типов V и ХИ, которые входят
в состав волокон или ассоциированы с ними.
Первый из них способен связываться с проте-
огликанами (особенно гепарансульфатными) и
рядом других белков; похоже, он контролирует
конечный диаметр коллагеновых фибрилл.
Второй же, кроме аналогичных свойств и на-
личия участков подобия фибронектину, имеет
несколько RGD-центров связывания с клет-
ками и, следовательно, участвует в реализации
функционального единения клеточных элемен-
тов и межклеточных структур. Свой вклад в
это вносит еще один минорный коллаген — ти-
па VI. Будучи тоже мультидоменным (см. табл.
10-2) и обладая RGD-центрами, он опосредует
прикрепление клеток к волокнам коллагена
W, а также взаимодействие их с неколлагено-
выми макромолекулами.
Содержание гиалуроновой кислоты в кос-
тях невелико, равно как и количество протео-
гликанов - декорина и бигликана (см. табл.
10-5). Из гликопротеинов здесь присутствует
вездесущий фибронектин. В основном же не-
коллагеновые белки кости представлены более
специфичными гликопротеинами, которые в
совокупности составляют более 10% органиче-
ского матрикса кости. Преобладающими среди
них являются:
- сиалопротеины (остеопонтин и костный
сиалопротеин II);
— остеонектин;
- остеокальцин и матриксный Glc-npo-
теин, - белки, которые содержат остатки у-кар-
боксиглутаминовой кислоты (Gia).
Краткое описание этих групп белков при-
ведено в табл. 11-1. Следует только добавить,
что соотношение их претерпевает значитель-
ную динамику в ходе морфогенеза и иногда
сильно различается в разных костных структу-
рах. Так, в компактной кости человека содер-
жание остеокальцина (костный GZo-протеин) в
30 раз выше, чем в губчатом веществе, тогда
как для остеоиектина наблюдается обратная
картина. Некоторые из упомянутых белков со-
держатся в самых разных органах и тканях
(включая мозг, почки, печень, плаценту). Осо-
бенно это относится к остеопонтину и остео-
нектину. С другой стороны, такие гликопро-
теины, как костный сиалопротеин П и остео-
кальцин, специфичны именно для кости и дру-
гих минерализуемых тканей (включая дентин).
Кроме перечисленных макромолекул, ко-
стная ткань содержит заметные количества
белков плазмы, особенно тех, что обладают
сродством к кристаллическим компонентам
кости, содержащим кальций. Прежде всего это
относится к альбумину.
Из низкомолекулярных метаболитов кост-
ной ткани следует отметить цитрат. Его содер-
жание здесь во много раз выше, чем в других
тканях, и может достигать 1%. В значительной
степени это обусловлено высокой активностью
цитратсинтетазы в остеогенных клетках. Обра-
зуя растворимые соли с ионами Са2+, цитрат
тем самым способен выполнять роль перенос-
чика кальция, участвуя как в его доставке к зо-
не минерализации матрикса, так и в растворе-
нии ранее сформированных кристаллов.
11.2.3. МИНЕРАЛЬНАЯ ФАЗА
Отложения минеральных солей в костной
ткани сосредоточены во внеклеточном матрик-
се и представлены в основном кристаллами
гидроксиапатита.
Общая формула апатитов выглядит так:
Са]^РО4)бХ2. Если в качестве X выступают гид-
роксильные ионы, то такой минерал называют
гидроксиапатитом (ГАП). Он редко встречается
в природе, но в биологических объектах (твер-
дые ткани) составляет около 75% их минераль-
ной фазы. Напротив, фторапатиты, где X - это
ионы F~, очень широко распространены в нежи-
вой природе, тогда как в биогенных апатитах на
их долю приходится не более 0,7%.
Ионная решетка апатитов очень стабильна,
что обусловлено плотностью упаковки ионов,
398
Глава 11
Таблица 11-1
Неколлагеновые белки ВКМ костной ткани
Остеопонтин (BSP 1) Синонимы: костный сиалопротеин 1', уропонтин. Четверть из 298 АО белка представ- лена аспартатом и глутаматом. Кислый характер усилен фосфатными группами на мно- гих из более чем 40 остатков серина. Молекула обладает фрагментом RGD и несет не- сколько О- и N-олигосахаридов, содержащих сиаловые кислоты. Костные ткани относи- тельно богаты остеопонтином, который прочно связан с гидроксиапатитом, являясь ин- тегральной частью минерализованного матрикса. Известно 3 изоформы этого фосфо- гликопротеина, которые встречаются и в иных тканях (мозг, почки, печень). Играет ве- дущую роль в формировании мочевых камней (в качестве их органической основы).
Костный сиалопро- теин II (BSP II) Кислый гликопротеин минерализуемых тканей. С остеопонтином сходен по размерам корового белка, наличию RGD и изобилию глутамата, но отличается меньшей степенью фосфорилирования, присутствием 7-12 сульфатных групп на редикалах тирозина, а также обилием углеводных цепей, которые составляют половину массы молекулы и содержат 12% сиаловых кислот, 7% глюкозамина и 6% галактозамина. Группы из 8-10 подряд радикалов глутамата образуют в N-стороне кластеры карбоксильных групп, обеспечивающие высокое сродство к гидроксиапатиту. В кости и цементе зуба BSP II составляет до 15% от всех неколлагеновых белков ВКМ.
Остеокальцин (Костный Gla-протеин) (BGP) Относится к белкам, содержащим у-карбоксиглутаминовую кислоту (Gia), которая обра- зуется путам посттрансляционного карбоксилирования глутамата ферментами, зависи- мыми от витамина К. Специфичен для кости. Состоит из =50 АО, не фосфорилирован и составляет 1-2% от всего белка костной ткани. Наличие 2-3 остатков Gia придает спо- собность к прочному связыванию Са2+ и, особенно, гидроксиапатита.
Матриксный Gla-протеин (MGP) Бвлок того же семейства, что и остеокальцин, но несколько крупнее (=80 АО) и облада- ет пятью Gia. Подобно остеокальцину, содержит небольшую S-S-петлю, но отличается от него наличием 3 радикалов фосфосерина. Содержится в ВКМ не только кости, но и хряща. Считается ингибитором костеобразования.
Остеонектин (ON) Кислый гликопротеин, содержащий чуть менее 300 АО. Обилие цистеина позволяет создать 7 дисульфидных мостиков. N-концевая часть белка на треть построена из глу- тамата и аспартата и потому способна, хотя и слабо, но удерживать до 5-8 ионов Са2+. В С-концевой стороне есть два участка высокого сродства к Са2+ и элементы сходства с фоллистатином. ЭФР и одним из ингибиторов сериновых протеиназ. Остеонектйн может связываться со многими лигандами (ионы кальция и меди, разные типы коллагена, аль- бумин, гепарин, тромбоцитарный фактор роста, другие цитокины), а также с клеточными мембранами. Все это лежит в основе его участия в регуляции роста клеток, в процессах морфогенеза, ремоделирования и репарации ткани.
реализуемой силами электростатического при-
тяжения. Эти силы гетерополярны (действуют
в любом направлении). Поэтому самый круп-
ный ион — фосфатный — может быть представ-
лен в форме шара, равномерно окруженного
ионами Са2+ и X-. При этом между рядами
фосфат-ионов остаются пространства, в кото-
рых рассредоточены гораздо меньшие по раз-
мерам Са2+ и X-. В целом упаковка частиц в
кристалле ГАП представляет собой много-
слойную гексагональную структуру, где с каж-
дым ионом фосфата соседствуют 12 ионов Са2+
и НО-, из которых 6 лежат в одном слое с
фосфатом, а по 3 — в соседних слоях, располо-
женных выше и ниже. Идеальный кристалл
ГАП имеет форму уплощенной гексагональной
призмы, размеры которой могут заметно варь-
ировать в разных твердых тканях. В костях
почти 90% кристаллов имеет длину не более
45 нм при ширине в среднем 25 нм. Каждый из
них покрыт собственной гидратной оболочкой
толщиной около 1 нм.
В минеральной фазе твердых тканей иде-
альную структуру имеют далеко не все кри-
сталлы ГАП. Это обусловлено заменой отдель-
ных ионов кристаллической решетки аналога-
ми из жидкой фазы, сходными по размеру или
физико-химическим свойствам. Такие реакции
ионного обмена называются изоморфным за-
мещением. Из-за различий в величине ионного
радиуса оно в той или иной степени искажает
решетку и обычно делает кристаллы менее
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
399
Саю (РО4)6(ОН)2 + Мд2* <-> Са9Мд(РО4)6(ОН)2 + Са2* [11-1]
Саю(Р04)б(ОН)2 + Sr2* ~ Ca9Sr(PO4)6(OH)2 + Са2* [11-2]
устойчивыми к различным воздействиям, в том
числе механическим. В частности, возможно
замещение Са2+ на ионы Mg2+ или Sr2+ [см.
уравнения 11-1 и 11-2].
В геохимических провинциях, отличаю-
щихся повышенным содержанием соединений
стронция, накопление стронциевых деформа-
ций настолько повышает хрупкость минераль-
ной фазы, что может привести к патологиче-
ским переломам костей.
Наиболее вероятны следующие реакции
внутрикристаллического обмена ионов:
- фосфатный ион РО4" замещается гидро-
генфосфатом (НРО4“), карбонатом (С0|~)
или цитратом (С6Н3О^“ );
- место Са2+ занимает ион Mg2+, Sr2+, Na+,
реже - Ва2+, Pb2+, Мо2+ или ион гидроксо-
ния НзО+;
- гидроксильный ион обменивается на F",
СГ, Вг“, Г, а иногда - на СО2- или Н2О.
Каждая реакция ионного обмена протекает
в три стадии. Начинается процесс с диффузии
ионов из окружающей биологической жидко-
сти в гидратный слой кристалла. Эта стадия
занимает несколько минут. Затем происходит
обмен ионами между гидратной оболочкой и
поверхностью кристалла. Для многих ионов эта
стадия очень затруднительна. Гораздо легче (в
течение нескольких часов) преодолевают ее
Са2+, Mg2+, Na\ Sr2*. Ва2+. РО^. СО? , СГ и F.
Наконец, третья стадия - переход ионов с по-
верхности в глубину ионной решетки — требует
от нескольких дней до нескольких месяцев.
Реализуется она преимущественно с ионами
Ca2+,Mg2+, РО4~, Sr2*, F“.
Снижение концентрации Са2+ и/или фос-
фата в жидкостях тела приводит к усилению
реакций изоморфного замещения, увеличивает
вероятность образования вакантных ячеек в
кристаллической решетке ГАП. Напротив, по-
вышенное поступление Са2+ в организм спо-
собствует вытеснению из ионной решетки его
антагонистов (в том числе стронция), обеспе-
чивая регенерацию «правильной» структуры
кристаллов ГАП.
Внутри кристаллической решетки апати-
тов и на поверхности кристаллов встречаются в
очень малых количествах различные микро-
элементы (включая J, Zn, Si, Си, Со, Se, As, Mo,
Мп) и ионы других веществ, особенно из числа
тех, что загрязняют среду обитания человека
(Sr, Ba, Pb, Al, Ti и другие).
В целом скорость и масштаб изоморфного
замещения зависят не столько от заряда вне-
дряющегося иона, сколько от его размеров
(ионный радиус), концентрации и длительности
воздействия. Очень большое значение имеют
условия микроокружения, в том числе физико-
химические параметры, включая pH среды.
В частности, достаточно высокий уровень би-
карбонатов способствует образованию карбо-
натапатита путем замещения фосфат-иона кар-
бонатом (уравнение [11-3]). Среди всех апати-
тов твердых тканей карбонатапатиты могут сос-
тавлять до 20%, уступая в этом отношении
только гидроксиапатитам (третью позицию за-
нимают хлорапатиты, — немногим более 4%).
Снижение pH среды способствует замеще-
нию Са2+ в ГАП протонами или ионом гидро-
ксония (уравнения [11-4] и [11-5]). Очень вы-
сокие концентрации Н+ вызывают уже не про-
сто замещение ионов Са2+, а кислотное раство-
рение кристаллов ГАП (уравнение [11-6]).
Помимо кристаллов ГАП и его аналогов,
минеральная фаза содержит и аморфные соли.
Они характеризуются более низким отношени-
ем Са:Р и обнаруживаются в небольших коли-
чествах, но постоянно, - в основном, на ранних
стадиях процесса минерализации. В составе
этих отложений встречаются моно-, ди-, три- и
тетракальцийфосфаты (обычно в гидратирован-
ной форме), дигидрат кальцийпирофосфата, а
также кальция гидрокарбонат Са(НСО3)2 и
магния карбонат MgCO3. Преобладают, однако,
кислые фосфаты, содержащие ионы НРО4“
Преимущественно это кальция гидрофосфат в
дигидратиой форме [СаНРО4-2Н2О] и октакаль-
цийфосфат (ОКФ) - пентагидрат восьмикаль-
циевого фосфата [Са8Н2(РО4)6-5Н2О]. Все эти
начальные отложения выполняют роль легко
мобилизуемого резерва ионов кальция и фос-
фата, используемого при построении кристал-
лической структуры ГАП, а некоторые (осо-
бенно ОКФ) способны спонтанно превра-
400
Глава 11
Са10(РО4)6(ОН)2 + 3 Н+ + 3 НСО3~ <---> Са10(РО4)4(СО3)з (ОН)2 + 2 Н3РО4 [11-3]
Саи(РО4)6(ОН)2 + 2 Н* <---> Са9(Н*)2(РО,)6(ОН)2 + Са2* [11-4]
Саю(РО4)6(ОН)2 + НзО+ <---> Са9(Н3О*)(РО4)6(ОН)2 + Са2+ [11-5]
Саю(РО4)б(ОН)2 + 8 Н+-----» ЮСа2' + 6НРОЛ + 2Н2О [11-6]
щаться в гидроксиапатит, выполняя функцию
его предшественников.
В целом зрелая, полностью минерализо-
ванная кортикальная кость содержит (в весо-
вом отношении) примерно 45% кристалличе-
ских минералов, до 28% коллагена, не менее
2% других органических веществ и 25% воды.
По объему минеральная фаза, органические
молекулы и вода составляют соответственно
23,37 и 40% кости.
11.3. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ФОРМИРОВАНИЯ
КОСТЕЙ
Процесс построения костей начинается
еще в эмбриональном периоде. Лишь немногие
из них (плоские кости черепа, ключицы, фа-
ланги пальцев) происходят непосредственно из
мезенхимы (прямой остеогенез). Большинство
же костей у человека образуется путем заме-
щения предварительно сформированной хря-
щевой модели (непрямой остеогенез). Она за-
кладывается на втором месяце эмбриогенеза и
развивается в форме будущей кости, увеличи-
ваясь путем как аппозиционного, так и интер-
стициального роста. Состоит такая закладка из
гиалинового хряща, покрытого перихондрием;
диафизарной полости она не содержит.
11.3.1. ПРЯМОЙ ОСТЕОГЕНЕЗ
Изначальное формирование костной ткани
непосредственно из мезенхимы наступает уже
на первом месяце эмбриогенеза. При этом
определенные группы мезенхимных клеток
дифференцируются в остеобласты, которые
затем вырабатывают остеоид и обеспечивают
его минерализацию. Накапливающийся остео-
ид постепенно раздвигает клетки, но замуро-
ванные в лакунах остеоциты сохраняют сооб-
щение между собой посредством отростков.
Так создается грубоволокнистая костная ткань.
Ее отличают неупорядоченное расположение
коллагеновых волокон, пониженная степень
минерализации, относительно высокое содер-
жание остеоцитов и отсутствие закономерной
ориентации лакун, содержащих эти клетки.
Образующиеся трабекулы увеличиваются в
размерах путем аппозиционного роста за счет
деятельности остеобластов, генерируемых из
клеток окружающей мезенхимы. Постепенно
трабекулы сливаются в единую сеть, а про-
странство между ними остается заполненным
волокнистой соединительной тканью, богатой
сосудами. Окружающая растущую кость ме-
зенхима формирует надкостницу. Механиче-
ская прочность образовавшейся первичной губ-
чатой кости сравнительно невелика. Обычная
судьба ее - постепенное замещение пластинча-
той костной тканью.
11.3.2. НЕПРЯМОЙ ОСТЕОГЕНЕЗ
Построение кости на основе сформиро-
ванной хрящевой модели начинается тоже во
внутриутробном периоде. Замену хряща кост-
ной тканью обеспечивает дифференциация
остеогенных клеток внутренней стороны пери-
хондрия в остеобласты, которые приступают к
выработке остеоида, типичного для грубово-
локнистой костной ткани.
Начавшись в середине диафиза модели,
это перихондральное формирование кости рас-
пространяется и в толщину, и по направлению
к эпифизам. Оно сопровождается трансформа-
цией самой хрящевой ткани. Ее клетки резко (в
5 раз!) увеличиваются в размерах и округляют-
ся, превращаясь в так называемые гипертро-
фированные хондроциты. Они приступают к
глубокой перестройке матрикса. Сначала от-
щепляется N-концевой глобулярный домен
коллагена-IX, прилегающего к фибриллам кол-
лагена-11. Это ведет к нарушению обеспечи-
ваемой им ассоциации коллагеновых волокон с
углеводными цепями протеогликанов. Клетки
прекращают синтез коллагена-П и переходят к
выработке коллагена-Х. Одновременно они
резко усиливают продукцию коллагеназы
(ММП-13), разрушающей коллаген-П и остатки
коллагена-IX. Агрекан при этом сохраняется.
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
401
концентрируясь в местах, где накапливается
хондрокальцин - С-концевой пропептид кол-
лагена-П, способный (после отщепления) свя-
зываться с ионами Са2+и кристаллами ГАП. На
интенсивность освобождения хондрокальцина
в ходе развития и формирования скелета ука-
зывает содержание этого пептида в плазме
крови. У детей до 10 лет оно вдвое, а в период
полового созревания - втрое выше, чем у
взрослых людей (6-8 наног/мл), вне зависимо-
сти от пола. В зрелой костной ткани и зубах
хондрокальцин отсутствует Наличие его в кро-
ви взрослых людей (хотя и в ничтожных коли-
чествах) следует рассматривать как следствие
естественного метаболизма хряща, а не его ми-
нерализации.
Остальные продукты деградации хряшево-
го матрикса поглощаются клетками, где рас-
щепляются до конца. Взамен гипертрофиро-
ванные хондроциты начинают выработку и
секрецию белков, свойственных костной ткани,
включая коллаген типа I, остеопонтин, остео-
кальцин и остеонектин. Однако эти белки, как
и хондрокальцин, не могут создавать центры
«зарождения» кристаллов ГАП {центры нук-
леации) и потому неспособны инициировать
процесс построения регулярной структуры ми-
неральной фазы. Ведущую роль на этом этапе
играют не остеобласты, а гипертрофированные
хондроциты. Создаваемые ими кристалличе-
ские отложения имеют, однако, неупорядочен-
ный характер и подлежат переработке в ходе
последующего формирования зрелой кости.
По мере роста кристаллов и слияния мине-
рализованных участков хряща все больше за-
трудняется диффузия питательных веществ и
наступает постепенная гибель хондроцитов.
Дегенеративные изменения обызвествленного
хряща облегчают его разрушение клетками ти-
па остеокластов, вслед за которыми из надко-
стницы прорастают кровеносные сосуды и
нервные волокна вместе с окружающей их ме-
зенхимой. Остеогенные клетки последней
дифференцируются в остеобласты, которые и
вырабатывают костную ткань внутри разру-
шающегося хряща {эндохондральное окостене-
ние). В постнатальном периоде к окостенению
диафиза трубчатых костей присоединяется эн-
дохондральное образование губчатой костной
ткани в эпифизах. Неизмененный гиалиновый
хрящ сохраняется лишь на суставной их по-
верхности и в зоне, пограничной с диафизом.
Размножение хондроцитов этой зоны, активно
вырабатывающих хрящевой матрикс, направ-
лено на ее утолшение, которого, однако, не
происходит из-за продолжающегося разраста-
ния костной ткани со стороны диафиза. Так
обеспечивается рост трубчатых костей в длину.
Он протекает вплоть до полного завершения
формирования скелета примерно к 25 годам (ко-
гда общая масса костной ткани увеличивается с
момента рождения в 30-40 раз). Главным регу-
лятором этого роста является соматотропный
гормон гипофиза (гормон роста), который через
систему факторов роста стимулирует пролифе-
рацию хондроцитов эпифизарных пластинок.
В центральной части диафиза сформиро-
вавшаяся эндохондральная кость подвергается
разрушению остеокластами, вследствие чего
образуется костномозговая полость, заполняе-
мая красным костным мозгом. Утолщение диа-
физа трубчатых костей происходит аппозици-
онно, т.к. осуществляется оно остеобластами
внутреннего слоя надкостницы.
11.3.3. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
КОСТНОЙ ТКАНИ
Зрелая кость характеризуется очень нерав-
номерным распределением клеток в межкле-
точном веществе. Структурной единицей
его минеральной фазы можно считать костную
пластинку. Обычно она имеет толщину
3-5 мкм и содержит до 5 слоев минерализован-
ных коллагеновых фибрилл. В каждом из них
соседние микрофибриллы скреплены кристал-
лами апатита и ориентированы в одном на-
правлении, но под углом к волокнам соседнего
слоя. Такая структура напоминает лист фане-
ры. Однако есть два важных отличия. Во-пер-
вых, толщина слоев в костной пластинке не-
одинакова: с одной стороны она составляет
несколько рядов микрофибрилл, а с противо-
положной плоскости число таких рядов дости-
гает 20. Во-вторых, изменение направленности
волокон в соседних слоях происходит обычно
не параллельно поверхности (как в фанере), а
под углом к ней, причем, ротация идет в одну
сторону. Эту особенность обозначают терми-
ном «скрученная фанера» (twisted plywood).
402
Глава 11
Благодаря ей, костные пластинки чаще всего ие
плоские, а обладают кривизной, несколько на-
поминая створку раковины моллюска.
В компактной кости пластинки распола-
гаются концентрически вокруг центрального
канала, образуя остеон. Формируется он во-
круг прорастающего в кость кровеносного со-
суда и имеет форму цилиндра диаметром 0,1-
0,5 мм и протяженностью до нескольких сан-
тиметров. В узких пространствах между кост-
ными пластинками сосредоточены лакуны с
остеоцитами, отростки которых пронизывают
пластинки и контактируют с себе подобными,
как это отмечено выше (раздел 11.2.1). Канал
остеона заполнен рыхлой соединительной тка-
нью, которая окружает проходящие здесь 1-2
мелких кровеносных сосуда, нервные волокна,
лимфатические капилляры и содержит остео-
генные клетки-предшественники, покоящиеся
остеобласты, остеокласты и макрофаги. Отро-
стки остеоцитов, достаточно близких к каналу,
доходят до периваскулярного пространства,
получая отсюда питательные вещества и отда-
вая продукты метаболизма. Сами каналы ана-
стомозируют между собой и имеют выходы в
надкостницу и костномозговую полость, бла-
годаря чему обеспечивается сообщение остео-
нов с общим крово- и лимфотоком, а также с
соответствующими нервами. Каждый остеон
окружен тонким (1-2 мкм) слоем основного
вещества, почти лишенным волокон (спайная
линия). В промежутках между остеонами нахо-
дятся вставочные пластинки (остатки ранее
существовавших остеонов).
Такая организация, присущая компакт-
ному веществу кости, создает наибольшую
плотность укладки минерализованных струк-
турных единиц (костных пластинок) при обес-
печении достаточного их питания (кровоснаб-
жения) и необходимой иннервации остеона.
Около 80% скелета устроено именно так (кор-
тикальная кость).
Надкостница состоит в основном из плот-
ной волокнистой соединительной ткани. С ко-
стью она прочно соединяется пучками коллаге-
новых волокон, вплетающихся в наружный слой
костных пластинок. Внешний слой надкостницы
содержит коллагеновые волокна, направленные
преимущественно параллельно ее поверхности,
и плавно переходит в участки прикрепления
связок, сухожилий, мышц. Внутренний же слой
более похож на рыхлую соединительную ткань.
Здесь пребывают покоящиеся остеобласты и
преостеобласты, по мере надобности привле-
каемые для регенерации кости.
Губчатое вещество, расположенное в глу-
бине кости, построено тоже из костных пла-
стинок. Однако здесь они не образуют остео-
нов, а уложены стопками (пакетами), формируя
трабекулы толщиной до 0,2 мм. Последние
разделены межтрабекулярными пространства-
ми, но анастомозируют между собой, создавая
трехмерную сеть, в ячейках которой находится
костный мозг. Большинство трабекул имеет
форму уплощенной арки и не содержит крове-
носных сосудов; поверхность их покрыта сло-
ем покоящихся остеобластов. Остеоциты, как и
обычно, расположены в лакунах между кост-
ными пластинками. Их отростки проходят в
канальцах, пронизывающих эти пластинки, и,
как правило, достигают поверхности трабекул,
откуда и происходит питание клеток.
Метаболическая активность губчатой кос-
ти на порядок выше, чем кортикальной. Это
обусловлено большей величиной костной по-
верхности на единицу объема и, следовательно,
лучшими условиями для питания и ремодели-
рования кости.
11.4. МЕХАНИЗМЫ МИНЕРАЛИЗАЦИИ КОСТИ
Хотя структура кристаллов (и ее вариан-
ты) выяснены довольно подробно, детали про-
цесса их зарождения и дальнейшего роста во
многом остаются пока неясными. Эксперимен-
тально доказанные факты позволяют выделить
два главных способа минерализации остеоида.
Один из них типичен для гипертрофированных
хондроцитов, которые направляют в среду ми-
неральные соли, способные спонтанно
трансформироваться в кристаллы ГАП. Этот
способ обозначают как механизм непрямой
кристаллизации гидроксиапатита, поскольку
он требует предварительного образования ми-
нералов-предшественников. Как синоним ис-
пользуют термин гомогенная нуклеация, т.к.
зарождение кристаллов ГАП происходит в
этом случае без участия органических молекул.
Другой из главных способов - гетерогенная
нуклеация — реализуется при формировании
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
403
Са8(НРО4)2(РО4)4-5Н2О + 2 Са2+-----> Са10(РО4)6(ОН)2 + 4 Н+ + 3 Н2О [11 -7]
зрелой кости и ее ремоделировании. Название
указывает на то, что зарождение минералов
происходит на поверхности органических мо-
лекул. Точнее - в специально организованных
местах, которые созданы межбелковыми ком-
плексами и именуются центрами кристаллиза-
ции (нуклеации). Поэтому возникающие кри-
сталлы с самого начала соответствуют пра-
вильной структуре ГАП. Такой процесс обо-
значают еще как механизм прямой кристалли-
зации гидроксиапатита. Построение центров
зарождения кристаллов требует времени, из-за
чего отложение минералов следует не сразу за
секрецией остеоида, а после его «дозревания»,
т.е., на некотором удалении от остеобластов
{фронт минерализаций).
11.4.1. ГОМОГЕННАЯ НУКЛЕАЦИЯ
Механизм непрямой кристаллизации осу-
ществляется, главным образом, с участием ги-
пертрофированных хондроцитов и основан на
их способности выделять так называемые мат-
риксные везикулы. Эти округлые образования
диаметром 100-200 мкм, покрытые мембраной,
возникают путем отпочкования специфических
участков плазматической мембраны и обладают
высокой активностью щелочной фосфатазы.
Гидролизуя органические эфиры фосфорной
кислоты, она содействует накоплению фосфат-
ионов внутри везикул. Притоку Са2+ служат
трансмембранные кальциевые каналы. Задержку
и накопление этих ионов в везикулах осуществ-
ляют Са2+-связывающие белки, которые, воз-
можно, участвуют и в образовании комплексов
кальция с неорганическим фосфатом.
Ведущая функция матриксных везикул в
том и состоит, что они создают защищенное
пространство, в котором накапливаются ионы
Са2+ и фосфата. Концентрации их достаточны
для образования нерастворимых солей. Однако
в везикулах нет таких белковых ансамблей, ка-
кие возникают в костном матриксе для обеспе-
чения механизма гетерогенной нуклеации. По-
этому накопление солей приводит здесь к выпа-
дению осадка аморфного фосфата кальция. Со-
став его неопределенный, но заметная часть
приходится на долю кристаллов октакальций-
фосфата (ОКФ). Важным свойством этого ми-
нерала является склонность к превращению в
еще более труднорастворимую форму - кри-
сталлы гидроксиапатита Саю(РО4)б(ОН)2. Осу-
ществляется оно путем дегидратации (уравне-
ние [11-7]). Будучи самопроизвольным, это
спонтанное преобразование протекает очень
медленно, занимая не одни сутки. Поэтому в
матриксных везикулах лишь небольшая доля
минеральной фазы представлена гидроксиапа-
титом. Кроме того, для поддержания процесса
необходима нейтрализация (или откачка) обра-
зующихся протонов.
Вне клеток, при контакте с коллагенами II
и X, а также с протеогликанами деградирую-
щего хряща, мембрана везикул разрушается.
Освобожденные в среду кристаллы ОКФ про-
должают трансформироваться, становясь цен-
трами роста кристаллов гидроксиапатита. Мат-
риксные везикулы не только обогащают места
минерализации кристаллами ОКФ и других
предшественников ГАП, но и доставляют сюда
ферменты, разрушающие ряд хрящевых проте-
огликанов и иных ингибиторов кристаллизации.
Поскольку гомогенная нуклеация не нуж-
дается в специальной подготовке матрикса,
этот механизм доминирует лишь в тех струк-
турах. белки которых не успели дозреть до
формирования центров кристаллизации. К та-
ким структурам относятся прежде всего хря-
щевые модели будущих костей, а также пла-
щевой дентин зуба. Начав их обызвествление,
матриксные везикулы становятся ненужными
при формировании зрелой кости и уничтожа-
ются наступающим фронтом минерализации.
11.4.2. ГЕТЕРОГЕННАЯ НУКЛЕАЦИЯ
Механизм прямой кристаллизации харак-
теризуется тем, что само зарождение кристал-
лов ГАП (инициация процесса) происходит на
реактивных группах в специально подготов-
ленных местах - центрах кристаллизации (нук-
леации). В их создании участвуют белки, син-
тезируемые остеобластами. Начинается оно с
внеклеточного дозревания коллагена (см. раз-
дел 10.2.2). По мере формирования фибрилл
становится возможным привлечение некого-
404
Глава II
рых из неколлагеновых белков костной ткани
(табл. 11-1). Они встраиваются в показанные на
рис. 10-1 просветы («зазоры») между соседни-
ми молекулами тропоколлагена. На этом за-
вершается подготовка центров нуклеации, хотя
не исключено, что соотношение неколлагено-
вых белков в них меняется по мере зарожде-
ния, роста кристаллов и его остановки.
Ведущую роль в инициации образования
кристаллов ГАП играет костный сиалопротеин
II (BSP II). Этот некрупный гликопротеин спе-
цифичен для минерализуемых тканей и состав-
ляет до 15% от всех неколлагеновых белков
кости. Его растянутая молекула (длиной
~40 нм) локализуется в просветах между тор-
цами тропоколлагена и тесно ассоциирована с
волокнистыми структурами (возможно, с уча-
стием ковалентных связей). Наличие множест-
ва фосфатных и сульфатных групп, обилие ра-
дикалов глутамата (и аспартата), а также сиа-
ловых кислот (табл. 11-1), - все это придает
молекуле сильно кислый характер (pl — 3,9).
Следовательно, в физиологических условиях
BSP II несет на себе значительный отрицатель-
ный заряд и уже поэтому способен связывать
катионы. В целом молекула может присоеди-
нять более 80 ионов Са2+ (с константой связы-
вания 0,5-1,0 мМ). Третичная структура белка
обеспечивает такое пространственное распо-
ложение реактивных групп (фосфатные и суль-
фатные фрагменты, полиглутаматные класте-
ры), которое оптимально для связывания ионов
Са2+ в ориентации, соответствующей их местам
в кристаллической решетке ГАП. Поэтому ко-
стный сиалопротеин II даже в очень малых ко-
личествах (0,3 мкг/мл = 9 нМ) способен ини-
циировать начальную кристаллизацию в усло-
виях, когда концентрации свободных ионов
Са2+ и фосфата не достигают насыщения, кото-
рое могло бы привести к спонтанному осаж-
дению фосфорно-кальциевых солей (неопреде-
ленного состава). Иными словами, этот белок-
нуклеатор выполняет своеобразную каталити-
ческую функцию. Необходимую для этого
конформацию он приобретает, скорее всего, в
ходе внедрения в зазоры между молекулами
тропоколлагена и взаимодействия с ними и,
возможно, с другими белками матрикса. До-
стижение нужного конформационного состоя-
ния дает импульс формированию «зародыше-
вых» кристаллов. Оставаясь соединенным с
ними через свои полиглутаматные кластеры,
костный сиалопротеин II еще и опосредует свя-
зывание кристаллов ГАП с коллагеновыми
микрофибриллами.
Другой сиалопротеин кости — остеопонтин
(BSP I) - очень похож на костный сиалопроте-
ин II, отличаясь главным образом отсутствием
сульфатных групп, гораздо меньшим числом
олигосахаридных фрагментов и значительно
более высокой степенью фосфорилирования.
Тем не менее, он не обладает свойствами нук-
леатора. Напротив, остеопонтин препятствует
образованию осадка солей даже в условиях пе-
ренасыщенности среды ионами Са2+ и фосфата.
Оказалось, однако, что этот фосфогликопроте-
ин тоже необходим для осуществления процес-
са минерализации с самого его начала. По всей
видимости, остеопонтин препятствует образо-
ванию солей «случайного» состава, обеспечи-
вая формирование правильного типа кристал-
лов (т.е., строгое построение кристаллической
решетки именно гидроксиапатита, - по закону
«все или ничего»). Такую трактовку подтвер-
ждает тот факт, что максимум продукции ос-
теопонтина несколько предшествуют появле-
нию «зародышевых» кристаллов (создавая не-
обходимый «фон»), тогда как продукция BSP II
усиливается одновременно с минерализацией,
для начала которой необходимы центры кри-
сталлизации. Похоже, что остеопонтин (как и
BSP II) тоже входит в состав центров кристал-
лизации. Во всяком случае, в кости его доволь-
но много, и он прочно связан с кристаллами
минеральной фазы.
Последовательность укладки ионов в кри-
сталлическую решетку гидроксиапатита пока
не установлена. Однако выявлены факторы,
способствующие этому или контролирующие
рост кристаллов.
К первым относится щелочная фосфатаза.
Костная изоформа этого фермента выявляется
уже в преостеобластах (которые еще не спо-
собны вырабатывать остеоид) и достигает
очень высокого уровня в активных остеобла-
стах. В матриксе она появляется очень рано, ио
отсутствует в участках завершенной минерали-
зации. При pH 7,4 и выше этот фермент гидро-
лизует эфирную связь ортофосфата с различ-
ными молекулами - от глицерина, этаноламина
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
405
и моносахаридов до нуклеозидов и радикалов
серина, тирозина, треонина в фосфопротеинах.
Сродство к субстратам довольно высокое:
Км составляет от 1,4 мМ (p-глицерофосфат) до
5-6 мМ (АМФ, АДФ, фосфорные эфиры глюко-
зы). Молекулярная активность тоже очень зна-
чительна: 8-40 тысяч фосфоэфирных связей в
минуту (в зависимости от субстрата). Освобож-
дая неорганический фосфат из его эфиров, фос-
фатаза вызывает повышение концентрации
фосфат-ионов, способствуя тем самым образо-
ванию кристаллов на центрах нуклеации. Ионы
карбоната угнетают фермент.
Примечательно, что оба костных сиало-
протеина, включаемых в центры нуклеации,
появляются в остеобластах позже, чем щелоч-
ная фосфатаза. Вырабатываются они вместе с
другими компонентами остеоида и оказывают-
ся диффузно распределенными в нем, но от-
четливо концентрируются впереди фронта ми-
нерализации, вплотную примыкая к нему.
К факторам контроля роста кристаллов от-
носятся остальные неколлагеновые белки кости
из числа приведенных в таблице 1-1. Все они -
остеокальцин, остеонектин и матриксный Gia-
протеин - не обладают свойствами нуклеато-
ров и поэтому не обнаруживаются в местах за-
рождения кристаллов. Первые два из этих бел-
ков не несут фосфатных групп и присутствуют
только там, где минерализация уже завершена.
При этом в молекуле остеокальцина, преобла-
дающего количественно, содержится 2-3 остат-
ка Gia. Эти у-карбоксилатные группы (см
рис.2-28) прочно связываются с ионами Са2+ и,
особенно, с гидроксиапатитом, обеспечивая
тем самым участие белка в регулировании рос-
та кристаллов. Второй белок - остеонектин -
обладает более широким набором различных
доменов. Поэтому он способен не только
удерживать ионы Са2+, но и взаимодействовать
с разнообразными лигандами (часть из них на-
звана в табл. 11-1). Остеонектин обнаруживает-
ся во всех клетках периоста (даже в фибро-
бластах), но во внеклеточном матриксе появля-
ется лишь на довольно поздней стадии минера-
лизации. В свободном состоянии остеокальцин
замедляет зарождение кристалов, а остеонектин
задерживает их рост. Вместе с тем, будучи свя-
занными с другими белками, они могут способ-
ствовать формированию гидроксиапатита, но
могут и тормозить этот процесс, в зависимости
от конформационного состояния. В целом же в
условиях in vivo и остеокальцин, и остеонектин
ограничивают рост кристаллов ГАП, тем самым
регулируя их размеры и предотвращая избыточ-
ную минерализацию костной ткани.
Приведенный в табл. 11-1 матриксный
С/д-протеин подобен остеокальцину, но богаче
остатками Gia и содержит фосфатные группы.
Входя в состав и костной, и хряшевой ткани,
этот белок обладает (в сравнении с остеокаль-
цином) еще более выраженными свойствами
отрицательного регулятора, проявляя себя как
ингибитор костеобразования.
Важно подчеркнуть, что центры нуклеа-
ции пространственно разделены и взаимно не-
зависимы даже в пределах одной фибриллы.
Прирост минеральной фазы происходит путем
приумножения числа кристаллов и лишь в ма-
лой степени - за счет увеличения их размеров.
Это обусловлено разнообразием тех неколла-
геновых белков, которые контролируют рост
кристаллов, а не их зарождение. Тормозят рост
кристаллов также цитрат и сывороточный аль-
бумин, которые, однако, не мешают появлению
новых кристаллов, меньших по размерам.
С другой стороны, поглощение ионов F” костью
взрослого человека сопровождается увеличени-
ем кристаллов апатита, но преимущественно не
в длину, а в ширину. Латеральный рост in vivo
при концентрации F” в среде, равной примерно
2 мкМ, является результатом прямого взаимо-
действия этих ионов с кристаллами.
Формирование центров нуклеации занима-
ет 5-10 дней. Остеобласт в это время продол-
жает наращивать вокруг себя свежий матрикс,
периферия которого, «дозревая», подвергается
минерализации. Дальнейшее увеличение слоя
секретируемого (и созревающего) остеоида
компенсируется продвижением фронта мине-
рализации к остеобласту (и его отросткам). По-
этому толщина неминерализованного матрикса
вокруг клетки остается сравнительно постоян-
ной. По мере ослабления синтетической актив-
ности остеобласта (с превращением его в ос-
теоцит) продвижение фронта минерализации
постепенно замедляется и в конце концов оста-
навливается, так и не достигнув поверхности
клетки (она остается покрытой тонким слоем
неминерализуемого матрикса). Весь процесс
406
Глава 11
минерализации свежего остеоида занимает
(у человека) не более 15 суток.
11.5. РЕМОДЕЛИРОВАНИЕ КОСТИ
Как уже отмечалось, процесс перестройки
костей протекает постоянно: он не только со-
путствует первичному формированию костной
ткани в период роста организма, но и продол-
жается всю жизнь. В детском и юношеском
возрасте новообразование кости происходит
значительно интенсивнее, чем ее резорбция.
У взрослых обновление ткани резко замедляет-
ся и в пожилом возрасте может составлять все-
го лишь от 2 до 5% костной массы в год. При
этом развивается некоторое преобладание ре-
зорбции над выработкой новой ткани. Особен-
но заметна эта разница у женщин после насту-
пления менопаузы. В результате избыточной
потери костной ткани развивается ее разреже-
ние — остеопороз.
Очаги ремоделирования постоянно появ-
ляются по всему скелету, причем, независимо
друг от друга ни во времени, ни пространствен-
но. Каждый из них возникает дискретно на тра-
бекулярной поверхности или в остеоне. Все это
свидетельствует, что инициация ремоделирова-
ния контролируется локально, - скорее всего,
факторами аутокринной и паракринной регуля-
ции, генерируемыми в костной ткани в ответ на
различные воздействия, в том числе механиче-
ские. У взрослого человека ежегодно появляется
около 3 млн новых локусов перестройки кости.
В каждом таком локусе процесс протекает
циклично - сначала локальная резорбция кост-
ной ткани остеокластами, после чего остеобла-
сты заполняют возникшие дефекты путем син-
теза нового остеоида и его минерализации.
Первая фаза цикла ремоделирования
начинается с «рекрутирования» и активации
остеокластов. Ведущую роль в этом играет
один из неколлагеновых белков кости - остео-
понтин (см. табл. 11-1). Он распределен в ми-
нерализованном матриксе кости и дистрофиче-
ски измененного хряща, но обладает свойством
специфической ассоциации с пограничными
слоями скелетных тканей. В частности, он со-
держится в эндостальной мембране, которая
отделяет кость от покрывающего ее слоя по-
коящихся остеобластов. Посредством своего
RGD-центра остеопонтин способен соединяться
с рецепторным участком интегринов - важной
группы трансмембранных белков, опосредую-
щих связь между внешними сигналами и отве-
тами клетки на них. Доказано, что локальные
механические напряжения в кости, действуя
через белковые молекулы матрикса, стимули-
руют покоящиеся остеобласты к выработке ос-
теопонтина, который привлекает клетки-пред-
шественницы к локусу резорбции и способству-
ет их дифференцировке до остеокластов. Такой
же способностью «вербовать» остеокласты об-
ладает и другой неколлагеновый белок минера-
лизованного матрикса - остеокальцин.
Важным фактором начальной стимуляции
остеокластов являются локальные изменения
pH окружающей их среды. Установлено, что
при pH выше 7,30 эти клетки совсем не склон-
ны к резорбции кости, а при pH 7,00 почти до-
стигают максимума своей функциональной ак-
тивности. Наибольший прирост скорости ре-
зорбции наступает при снижении pH среды от
7,25 до 7,15. В этом узком диапазоне резор-
бтивная способность клетки возрастает в 6 раз!
Явно сигмоидный характер описанной зависи-
мости свидетельствует, что слабые колебания
pH среды могут эффективно «включать» или
«выключать» работу остеокластов.
Мобилизованные клетки фиксируются на
костной поверхности. По периферии области
примыкания возникает особенно плотное со-
единение клеточной мембраны с костью. Оно
идет в виде полосы, отграничивающей зону
контакта остеокласта с костью от остальной час-
ти плазматической мембраны. Главный вклад в
создание этой пограничной полосы вносят мо-
лекулы остеопонтина, которые своим RGD-
центром связаны с мембраной остеокласта и, с
другой стороны, являются интегральной частью
минерализованного матрикса. Активированные
остеокласты и сами начинают вырабатывать
остеопонтин, усиливая прочность своего при-
крепления к кости. Заметный вклад в «прияко-
ривание» клеток вносит и близкий аналог ос-
теопонтина, тоже обладающий RGD-центром, -
костный сиалопротеин II (см. табл. 11-1).
Таким образом, остеокальцин, остеопон-
тин и костный сиалопротеин II играют двойст-
венную роль, участвуя не только в формирова-
нии минерализованного матрикса (как это опи-
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
407
сано выше), но и в его разрушении. Все эти три
белка обнаруживаются в зоне резорбции. Осо-
бенно много здесь остеопонтина, но совсем
отсутствует остеонектин, хотя он распростра-
нен по всей минерализованной фазе матрикса.
После фиксации остеокласта та часть
плазматической мембраны, которая прилегает
к костной поверхности, образует многочислен-
ные складки. Тем самым резко увеличивается
поверхность, через которую клетка выделяет
протоны и гидролитические ферменты в зону
резорбции — узкое пространство под клеткой,
герметично отгороженное упомянутой выше
пограничной полосой. Источником протонов в
цитоплазме является карбоангидраза, катали-
зирующая обратимую реакцию гидратации ди-
оксида углерода (уравнение [ 11-8]).
Образующиеся при диссоциации угольной
кислоты протоны выбрасываются в зону
резорбции под действием специальной
Н+-АТФазы плазматической мембраны. Этот
протонный насос подкисляет среду, а в дру-
гих (базолатеральных) участках мембраны
остеокласта имеются транспортные системы
(включая Ма+/К+-АТФазу, калиевые каналы,
На+/Н+-антипортер, Са2+-АТФазу, НСО3“/СГ-
обменник), призванные компенсировать поте-
рю протонов клеткой и поддерживать ее элек-
трохимический баланс. На ведущую роль про-
тонного насоса указывает тот факт, что избира-
тельный ингибитор Н+-АТФазы (бафиломицин
А1) полностью блокирует деградацию костно-
го матрикса остеокластами.
СО2 + Н2О <-> Н2СО3 <--> Н+ + НСО3- [11 -8]
Массивная секреция кислоты в зону ре-
зорбции снижает pH вплоть до 4,0. Это ведет к
растворению кристаллов ГАП и, кроме того,
создает оптимальную среду для работы кислых
гидролаз (включая коллагеназы), выделяемых
сюда лизосомами и расщепляющих как белко-
вые, так и гликановые компоненты внеклеточ-
ного матрикса. К числу лизосомальных фер-
ментов относится и кислая фосфатаза (тартрат-
резистентная), в больших количествах выраба-
тываемая остеокластами. Осуществляя гидроли-
тическое отщепление фосфатных групп, имею-
щихся в ряде неколлагеновых белков матрикса,
она облегчает разрушение их протеиназами.
Определенную роль играет и неферментативное
расщепление пептидных связей под действием
супероксидного анион-радикала, который ак-
тивно генерируется в зоне резорбции.
Удаление продуктов, возникающих в ре-
зультате растворения кристаллической фазы и
деградации остеоида, осуществляется путем
трансцитоза мембранных везикул. Это позво-
ляет остеокластам сохранять постоянство сво-
его состава, в том числе поддерживать нор-
мальную внутриклеточную концентрацию Са2+.
Фаза резорбции продолжается около 10
дней. При этом совокупное действие кислой
среды и разнообразных ферментов приводит к
разрушению внеклеточного матрикса непо-
средственно под остеокластом, в результате
чего образуется углубление на поверхности
кости, постепенно превращающееся в лакуну
(выход из которой «закупорен» остеокластом).
Продукты деградации костного вещества, по-
являющиеся в процессе резорбции, могут по-
ступать в кровь не только посредством везику-
лярного транспорта через остеокласты, но и
механизмом «разгерметизации» лакун. По мере
увеличения зоны разрушенной кости остео-
класт приостанавливает свою резорбтивную
деятельность и перемещается в глубину обра-
зовавшейся лакуны, где снова прикрепляется к
кости и возобновляет процедуру ее рассасыва-
ния. Группа остеокластов, чередуя периоды
движения с периодами резорбции, может про-
делывать глубокие ходы в компактной кости,
направленные обычно под тем или иным углом
к ранее существовавшим остеонам.
Фаза резорбции завершается переходным
периодом, когда наступает апоптоз остеокла-
стов, затем хемотаксис остеогенных клеток, их
пролиферация и дифференцировка в зрелые
остеобласты. Управление этими переходными
процессами осуществляется факторами локаль-
ной регуляции, освобождаемыми из резорби-
руемой кости. В частности, трансформирующий
фактор роста (ТФР) содействует апоптозу ос-
теокластов и хемотаксису остеобластов. Спо-
собностью привлекать клетки, являющиеся пред-
шественниками остеобластов, обладают также
фрагменты молекул коллагена-I и остеокальци-
на. Пролиферацию и дифференциацию регу-
лирует большая группа ростовых факторов,
«хранимых» в костном матриксе и освобождае-
мых при его остеокластном разрушении: кост-
408
Глава II
ные морфогенетические протеины (BMP), остео-
индуктивный фактор (кератокан-см. табл. 10-5),
тромбоцитарный и инсулиноподобные факторы
роста, а также вырабатываемый фибробластами
гепарин-связываюший фактор роста.
Вторая фаза цикла ремоделирования
осуществляется привлеченными остеобластами
в обычной последовательности: сначала фор-
мируется остеоид, затем он подвергается мине-
рализации. Весь процесс заполнения дефекта
новой костью, производимый бригвдой моби-
лизованных остеобластов, может продолжаться
до трех месяцев. Новообразованная ткань не
копирует прежнюю структуру. Она соответст-
вует требованиям укрепления участков, наибо-
лее уязвимых для механических нагрузок на
кость. В частности, в компактной кости новые
остеоны не повторяют хода прежних и потому
оказываются окруженными вставочными ко-
стными пластинками, - остатками тех остео-
нов, которые существовали в данном участке
до ремоделирования.
У взрослых людей интенсивность ремоде-
лирования такова, что ежегодно скелет обнов-
ляется в среднем на 10%. Однако в губчатой
кости этот процесс идет гораздо быстрее, по-
скольку инициируется он всегда на костной
поверхности, которая в компактной кости не-
сравненно меньше (на единицу массы).
Некоторое отставание репарации кости от
быстро текущей резорбции приводит к тому,
что постоянно около 0,76% массы скелета при-
ходится на долю «недолеченных» дефектов.
При ускорении процесса ремоделирования эта
доля заметно возрастает.
Феномен ремоделирования имеет важное
значение не только как механизм корректиров-
ки структуры костей применительно к измене-
ниям характера механических нагрузок. Не ме-
нее важно и то, что этот отлаженный («привыч-
ный») процесс поддерживает постоянную го-
товность к быстрому исправлению травматиче-
ских повреждений кости (включая переломы).
Наконец, структурная перестройка кости явля-
ется необходимым звеном в обеспечении круго-
оборота кальция (и фосфата). Хотя в костях со-
средоточено примерно 99% всего кальция орга-
низма (и около 85% фосфата), эти ионы не хра-
нятся инертным грузом, а в определенном темпе
изымаются в общий кровоток и заменяются
вновь поступающим материалом. У взрослого
человека этот ежесуточный кругооборот состав-
ляет 0,2-0,6 г кальция и 0,3-0,9 г фосфата, т.е.,
очень малую долю от их количества во всем
скелете (в среднем около 1 кг и 1,5 кг соответ-
ственно). Благодаря этому минерализованная
ткань выступает как мощный резервуар, за счет
которого можно регулировать потоки кальция и
фосфата с целью поддержания оптимального
уровня этих ионов в жидкостях тела.
Скорость отложения кальция в костях, как
и скорость его обновления, достигает макси-
мума непосредственно перед наступлением
половой зрелости; в дальнейшем оба показате-
ля экспоненциально снижаются с возрастом.
Вместе с тем, в расчете на массу тела наивыс-
шие темпы и отложения кальция, и мобилиза-
ции его из костей наблюдаются в младенче-
ском возрасте, особенно у недоношенных
детей.
Важную роль скелет играет и в регулиро-
вании гомеостаза Mg2+ и Na+: почти половина
каждого из этих ионов сосредоточена в костях,
подвергаясь непрерывному обновлению, в том
числе путем сорбции и десорбции на поверх-
ности кристаллов.
11.6. ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ
ОСТЕОГЕНЕЗА
Сложный характер процессов формирова-
ния, роста и ремоделирования костной ткани
требует четкого управления как очередностью
вовлечения разных клеток, так и уровнем их
активности (включая финальный апоптоз). Ве-
дущая роль в гормональной координации всех
этих процессов установлена для гормона роста,
половых гормонов, глюкокортикостероидов и
гормонов щитовидной железы. Однако влияние
их на скелетные ткани известно в основном по
внешним проявлениям гипо- или гиперфунк-
ции соответствующих желез. Конкретные ме-
ханизмы почти не изучены. Ясно лишь, что
реализуются они в конечном счете на уровне
генома, - путем включения или подавления
биосинтеза соответствующих белков, в том
числе факторов ауто- и паракринной регуля-
ции. Более всего исследованы три группы
таких белков: группа р трансформирующих
факторов роста (ТФР-р), инсулиноподобные
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
409
факторы роста и костные морфогенетические
протеины (BMP). Молекулярные механизмы
действия каждого из таких белков, вся неодно-
значность взаимоотношений между ними, «со-
перничества» за влияние на клетку, — все эти
проблемы еще очень далеки от разрешения.
Поэтому до сих пор главными остаются
успехи в изучении той части гормонального
контроля костной ткани, которая затрагивает
процессы минерализации (ибо отслеживать
судьбу минералов в организме несравненно
легче, чем динамику минорных белков).
Около 1% кальция, содержащегося в кос-
тях, свободно обменивается с ионами Са24
внеклеточной жидкости. Именно эта доля со-
ставляет ту фазу, через которую проходит Са2+
в ходе обызвествления или резорбции костной
ткани. Поэтому регуляция уровня кальция
в крови столь важна для протекания процессов
минерализации и деминерализации кости.
Ведущим звеном этой регуляции является
специальный рецептор клеточных мембран, ко-
торый чувствителен к изменениям концентра-
ции ионов Са2+ во внеклеточной среде и через
G-протеин сопряжен с фосфатидилинозитол-
кальциевой системой трансдукции. Он обнару-
жен в паращитовидных железах и почках, но
отсутствует в легких, печени, плаценте, сердеч-
ной и скелетной мышцах. Реагируя на повыше-
ние содержания Са2+в среде, этот рецептор обес-
печивает задержку секреции паратгормона, но
стимулирует выделение кальцитонина. Обратное
происходит при снижении уровня Са2+ в плазме.
Паратгормон - небольшой белок, со-
стоящий из 84 АО. Его главными мишенями
являются клетки скелета и почек, обладающие
специфическим рецептором, который через
G-протеин сопряжен преимущественно с аде-
нилатциклазой. В костной ткани действие гор-
мона стимулирует дифференциацию остеокла-
стов из клеток-предшественников. Это приво-
дит к усилению процессов резорбции, из-за
чего возрастает поступление Са2+ (а, следова-
тельно, и фосфата) в общий кровоток. Разру-
шается и остеоид, о чем свидетельствует уве-
личение почечной экскреции гидроксипролина.
Кроме того, гормон стимулирует канальцевую
реабсорбцию Са2+ и снижает почечный порог
для фосфата, усиливая выведение последнего с
мочой. Все эти эффекты способствуют повы-
шению концентрации Са2+ в плазме крови и
снижению содержания в ней фосфата.
Недостаточность выработки паратгормона
обычно является следствием дефекта особой
пропептидазы, которая отщепляет N-концевой
гексапептид, превращая предшественник в ак-
тивный гормон. Его дефицит, как и врожденная
неполноценность рецепторов паратгормона,
приводит к гипокальциемии и гиперфосфате-
мии, что часто сопровождается мышечными
судорогами. Избыточная продукция паратгор-
мона (гиперпаратиреоз), напротив, ведет к ги-
перкальциемии, увеличению почечной экскре-
ции фосфата и снижению его концентрации в
крови; костная масса постепенно уменьшается.
Известны мутации, при которых активность
рецептора паратгормона не подавлена, а усиле-
на. Такие состояния почти неотличимы от про-
явлений гиперпаратиреоза.
Кальцитонин - это пептид, состоящий
из 32 АО. Он вырабатывается не только пара-
щитовидными, но и щитовидной и вилочковой
железами. Секреция его протекает постоянно и
изменяется пропорционально концентрации
Са2+ в плазме крови. Воздействуя на специфи-
ческие рецепторы, кальцитонин, в противопо-
ложность паратгормону и кальцитриолу, по-
давляет «рекрутирование» и активацию остео-
кластов. Вместе с тем, он содействует проли-
ферации и функционированию остеобластов.
Наступающее усиление остеогенеза требует
повышенной доставки Са2+ и фосфата. Стиму-
лируя включение этих ионов в минеральную
фазу, кальцитонин тем самым приводит к сни-
жению их уровня в крови. Инъекции этого
гормона ускоряют заживление переломов кос-
ти и эффективны при лечении остеопороза,
приводя к постепенному увеличению костной
массы.
В последнее время открыты пептиды, очень
сходные с кальцитонином. Часть из них интен-
сивно синтезируется в мозгу или в р-клетках
поджелудочной железы. Поэтому в целом эф-
фекты кальцитонинового семейства (сосудо-
расширяющее действие, противоинсулиновое
действие на утилизацию глюкозы мышцами)
выходят далеко за рамки влияния на костную
ткань и метаболизм кальция и фосфата.
Гормональная регуляция процессов остео-
генеза и резорбции кости осуществляется
410
Глава 11
очень интенсивно. Об этом свидетельствует, в
частности, высокий темп обновления выделяе-
мых в кровь кальцитонина и паратгормона: пе-
риод их полусушествования составляет соот-
ветственно всего лишь 2-15 и 20-30 мин.
Несмотря на отмеченный выше антагонизм
кальцитонина и паратгормона, оба они сходны в
том, что содействуют активации витамина D.
Как известно, в организме человека обычная
(пищевая) форма этого витамина (холекальци-
ферол; вит. D3) превращается в активную путем
двукратного гидроксилирования (рис. 5-41).
Первое из них протекает в печени и ведет к об-
разованию 25-гидроксивитамина D3 (калъциди-
ол), которым представлен почти весь витамин,
циркулирующий в крови. В почках этот продукт
вновь окисляется, давая 1,25-дигидроксивита-
мин D3 (кальцитриол), являющийся наиболее
эффективным производным витамина D. По-
следнюю реакцию катализирует 1-гидроксилаза
кальцидиола. Выработку этого ключевого фер-
мента в почках и стимулируют как паратгормон,
так и кальцитонин (к аналогичному эффекту
приводит также снижение концентрации каль-
ция и/или фосфата в плазме крови).
Указанная гидроксилаза угнетается избыт-
ком своего продукта - кальцнтриола. Этот ме-
ханизм саморегуляции позволяет смягчать
чрезмерность биогенеза кальцитриола в случа-
ях избыточности паратгормона или кальцито-
нина. Но есть и еще один регуляторный меха-
низм, независимый от упомянутого. Он заклю-
чается в том, что кальцнтриол обладает сти-
мулирующим действием на биосинтез 24-гцд-
роксилазы в почечных и ряде других клеток,
включая остеобласты. Окисляя кальцитриол до
1,24,25-тригидроксивитамина D3, фермент тем
самым инициирует деградацию боковой цепи
витамина с полной утратой его биологической
активности. Такое дублирование способов за-
щиты от избыточности активного метаболита
(в данном случае - кальцитриола) является
лишь одним из примеров повышения надежно-
сти биохимических систем, особенно типично-
го для регуляторных процессов. В прикладном
аспекте этот пример свидетельствует, в частно-
сти, о сложности создания фармакологических
препаратов, которые могли бы «перекрывать»
сразу все пути, ведущие к одному и тому же
конечному результату.
Кальцитриол, будучи витамином (точнее,
активированным витамином), по механизму
своего действия принципиально сходен со сте-
роидными гормонами. Как и они, главные свои
эффекты дигидроксивитамии D3 реализует на
уровне генома, взаимодействуя с внутрикле-
точным рецептором кальцитриола (ВРК). Это
довольно крупный белок (50-60 кДа) с двумя
пространственно разделенными доменами.
Один обладает высоким сродством к кальцит-
риолу (но малой емкостью связывания, что очень
важно для регуляторных белков). Другой домен
обеспечивает прямое взаимодействие с опреде-
ленными участками ДНК, расположенными в
5'-концевом регионе генов, являющихся мише-
нями для комплекса ВРК-кальцитриол. К на-
стоящему времени выявлено более 50 генов,
регулируемых активной формой витамина D3.
К ним относятся, в частности, гены, кодирую-
щие остеопонтин, остеокальцин, а также один
из интегринов (интегрин оф3, который необхо-
дим для связывания остеокластов с поверхно-
стью кости). Опосредуя усиление транскрипции
определенных генов кальцитриолом, ВРК, в
свою очередь, контролируется различными ре-
гуляторными воздействиями. Так, паратгормон
и сам кальцитриол стимулируют биосинтез это-
го рецептора, тогда как эффект глюкокортико-
стероидов различен в клетках разного типа.
11.7. НАРУШЕНИЯ КАЛЬЦИЕВОГО ОБМЕНА
Хотя взаимоотношения кальцитриола с
другими регуляторами метаболизма очень
сложны и выяснены лишь в малой степени,
главные конечные эффекты витамина известны
давно. Они сводятся к обеспечению нормаль-
ного формирования костной ткани и ее мине-
рализации. Кальцнтриол способствует увели-
чению костной массы, улучшая снабжение кле-
ток ионами кальция и фосфата. Недавно кон-
кретизирован механизм одного из этих эффек-
тов: витамин усиливает поглощение фосфата
остеобластами, на уровне транскрипции сти-
мулируя биосинтез соответствующих транс-
портных белков.
Важную роль играет содействие кальцит-
риола всасыванию Са2+ в тонком кишечнике
(благодаря стимуляции биогенеза Са2+-связы-
вающих белков в эпителии кишки), а также вса-
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
411
сыванию фосфата. Усиленное поступление этих
ионов в сосудистое русло приводит к повыше-
нию их содержания в плазме крови до уровня,
необходимого для нормальной минерализации
костей. У взрослого человека он составляет
2,2-2,8 мМ для Са2+и 0,9-1,4 мМ для фосфата.
Гипервитаминоз D развивается, если
суточная доза превышена в сотни раз. Диагно-
стическим признаком является стойкое повы-
шение содержания кальция в крови (в 1.5-2 ра-
за). Важность этого критерия обусловлена тем,
что остальные проявления неспецифичны и
наблюдаются при многих интоксикациях (сла-
бость, тошнота, рвота, анорексия: позднее на-
рушаются функции почек, что проявляется
снижением плотности мочи, протеинурией,
азотемией). Известны несчастные случаи ост-
рого отравления препаратами витамина D, при-
водившие к летальному исходу.
Гиповитаминоз D может возникать
при его недостатке в пище (в сочетании с от-
сутствием образования 7-дегидрохолестерола в
коже под действием УФ-лучей) или в результа-
те нарушения процессов активации холекаль-
циферола. Наиболее значительные последствия
наблюдаются в период быстрого роста орга-
низма и формирования костей (особенно у де-
тей до 4 лет). При этом новообразование орга-
нического матрикса продолжается, а его мине-
рализация значительно отстает. Развивается
типичное сочетание костных нарушений (за-
паздывание закрытия родничков, искривление
ног, «четки» на ребрах, «птичья грудь»). Это
заболевание издавна обозначают как рахит.
11.7.1. НОРМЫ КАЛЬЦИЯ В ПИТАНИИ
Недостаточное потребление кальция в дет-
стве тоже может привести к рахиту и, кроме то-
го, стать предпосылкой юношеских переломов
костей и развития остеопороза в зрелом возрас-
те. По современным оценкам, содержание этого
катиона в суточном рационе человека должно
увеличиваться с возрастом от 250-400 мг у мла-
денцев до 1200-1500 мг у взрослого человека
(табл. 11-2). Соблюдение этих нормативов при-
звано не только предотвращать патологию ко-
стной ткани, но и обеспечивать достижение
необходимого пика костной массы к моменту
достижения зрелости. Минимум потребления
кальция для предупреждения рахита не уста-
новлен, а избыток его неэффективен, т.к. из-
лишний Са2+ попросту выводится из организма.
Это не относится к нормативам для пожилых
людей, у которых суточное потребление каль-
ция не должно превышать 2000 мг.
Таблица 11-2
Рекомендуемые нормы потребления
кальция человеком
Возраст Суточное потребление (мг)
до 6 мес. 250-400
6-12 мес. 300-600
1 -3 года 500-800
4-5 лет 700-800
6-10 лет 800-1200
11-18 лет 1200-1500
Хотя в основе скелетных нарушений при
детском рахите лежит относительная мягкость
костей из-за недостаточной их минерализации,
соответствующий термин остеомаляция (раз-
мягчение костей) принято употреблять лишь
применительно к взрослым. У них D-витамин-
ная недостаточность тоже приводит к сниже-
нию степени обызвествления, но не растущих,
а уже сформированных костей. По существу,
здесь нарушается полноценность их ремодели-
рования. Ослабленная минерализация затраги-
вает при этом в основном позвоночник, кости
таза и нижних конечностей, а типичным при-
знаком при рентгеноскопии являются ложные
переломы — узкие полоски деминерализации в
кортикальном слое, не пересекающие весь по-
перечник кости. И у детей, и у взрослых нередко
наблюдается наклонность к судорогам, обу-
словленная пониженным содержанием Са2+ в
плазме крови, типичным для гиповитаминоза D.
11.7.2. ДИСБАЛАНС ПРОЦЕССОВ
РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ
Несравненно чаще, чем остеомаляция, у
взрослых наблюдается остеопороз. Так обозна-
чают уменьшение количества костной ткани
(в данном объеме кости) без явного изменения
ее качества (т.е., соотношения органических и
минеральных компонентов). В основе такого
снижения плотности кости лежит недостаточное
новообразование костной ткани в очагах ее ре-
зорбции. Этот дисбаланс процессов ремодели-
412
Глава 11
рования, нарастая с возрастом, ведет к развитию
порозности (разреженности) кортикального слоя
костей и уменьшению его толщины. Еще значи-
тельнее нарушения в губчатой кости, решетча-
тая структура которой в основном и определяет
устойчивость к механическим нагрузкам. Здесь
происходит истончение трабекул, - вплоть до
фрагментации или даже исчезновения некото-
рых из них. Нарушение микроархитектоники
костей делает их более хрупкими и повышает
риск переломов. При недостаточности витамина
D остеопороз может сопровождаться и проявле-
ниями остеомаляции, т.е., уменьшением степени
минерализации костей.
В детстве плотность кости растет, достигая
максимума в возрасте около 20 лет. Подмече-
но, что чем больше нарастание плотности кос-
тей в молодости, тем меньше вероятность раз-
вития остеопороза. У женщин его проявления
сказываются обычно после наступления мено-
паузы, когда скорость потери костной массы
достигает 1-5% в год. У мужчин того же воз-
раста частота остеопороза в 6 раз меньше. Это
различие снижается до двукратного у лиц
старше 70 лет, когда ведущим фактором стано-
вится инволюционное уменьшение биогенеза
кальцитриола или рецепторов к нему. Но в це-
лом темп убыли костной массы в пожилом воз-
расте отчетливо замедляется.
Недостаточное потребление солей кальция,
гиповитаминоз D, сидячий образ жизни, куре-
ние, алкоголизм, неблагоприятные экологиче-
ские факторы - все это ускоряет развитие ос-
теопороза и повышает опасность переломов.
Длительное пребывание космонавтов в невесо-
мости само по себе тоже способствует умень-
шению костной массы, которое в отсутствие
тренировок может достигать 1-2% в месяц.
В лечении остеопороза применяют уве-
личение кальция в рационе и кальцитриол.
В необходимых случаях проводят гормональ-
ную коррекцию (например, введение эстроге-
нов у женщин). С недавних пор стали исполь-
зовать бисфосфонаты (см. ниже).
Особые формы остеопороза встречаются
при некоторых, довольно редких заболеваниях
неясной этиологии. К их числу относится мие-
ломная болезнь, в основе которой лежит безу-
держная пролиферация какого-либо из клонов
плазматических клеток, вырабатывающих ан-
титела. Характерно появление множественных
очагов остеолиза, что приводит к выраженной
гиперкальциемии. В лечении, наряду с мерами
по торможению пролиферации клеток, приме-
няют препараты бисфосфонатов. Чрезмерная
активность остеокластов, недостаточно ком-
пенсируемая деятельностью остеобластов (то-
же усиленной), наблюдается и при болезни
Педжета. При этой патологии скорость ремо-
делирования может быть повышена в 10-20 раз,
а новообразование кости не только отстает от
ее резорбции, но и становится несовершенным:
остеобласты продуцируют грубоволокнистую
костную ткань с мозаичным расположением
коллагеновых волокон, что приводит к утол-
щению костных пластинок и трабекул. Однако
механическая прочность костной ткани при
этом снижается, даже при ее избыточной каль-
цификации. Все это приводит к деформациям
костей и частым переломам. Для лечения бо-
лезни Педжета используют препараты кальци-
тонина и опять-таки бисфосфонаты.
11.7.3. ЛЕЧЕБНЫЕ ЭФФЕКТЫ БИСФОСФОНАТОВ
Естественным метаболитом ряда фермен-
тативных реакций, в том числе идущих с уча-
стием АТФ, является пирофосфорная кислота.
В основном она быстро гидролизуется пиро-
фосфатазой, но, тем не менее, всегда обнару-
живается в плазме крови и моче, хотя и в очень
малых концентрациях. Было установлено, что
пирофосфат (как и другие полифосфаты) спо-
собен связываться с кристаллами ГАП и тем
самым предотвращать их дальнейший рост.
В поисках средств, блокирующих эктопиче-
скую кальцификацию, попытались применить
бисфосфонаты:
но / /
Rt /Р-он
с
Rf \р-он /%7он
но % Но О
Бисфосфоновая кислота Пирофосфорная кислота
Замысел был простым и ясным: «подме-
нить» легко гидролизуемую связь Р-О-Р в мо-
лекуле пирофосфата на очень стабильную
связь Р-С-Р, устойчивую к расщеплению даже
при пероральном приеме препаратов.
СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ
413
Как и пирофосфату, бисфосфонатам при-
суще высокое сродство к ионам Са2+. особенно
если в качестве Rj выступает гидроксильная
группа. Поэтому они легко сорбируются на по-
верхности минеральной фазы, препятствуя как
росту кристаллов ГАП, так и их растворению.
Иными словами, бисфосфонаты предотвраща-
ют кальцификацию посредством физико-хими-
ческого механизма, «отравляя» кристаллы при
сорбции на них. Позднее было установлено,
что, вдобавок к этому антиминерализационно-
му действию, бисфосфонаты обладают еще и
способностью угнетать резорбцию костной
ткани. Оказалось, что это свойство обусловле-
но наличием фрагмента Р-С-Р и совсем отсут-
ствует у структур типа Р-С-С-Р или P-N-P. Оно
сильно зависит от характера группы R2 в моле-
куле бисфосфоната; антирезорбтивный эффект
возрастает на 4 порядка, если в этом месте на-
ходится ароматический гетероцикл, содержа-
щий 1 или 2 атома азота.
Подавление костной резорбции бисфосфо-
натами в основном обусловлено их воздейст-
вием на остеокласты. Принимаемые препараты
легко покидают кровеносное русло и накапли-
ваются на поверхности кристаллов ГАП путем
сорбции за счет обеих фосфонатных групп и
гидроксила в положении Rj. Кислая среда, соз-
даваемая остеокластами в зоне резорбции, при-
водит к растворению кристаллов ГАП и, как
следствие, к десорбции связанного с ними ле-
карства. В итоге локальная концентрация сво-
бодного бисфосфоната в зоне резорбции очень
сильно возрастает (до 1 ммоль/л, или 0,3% !),
что способствует его проникновению в клетку
(в основном посредством эндоцитоза, очень
интенсивного у остеокластов). Здесь характер
их действия зависит от структуры радикалов R.
Простые бисфосфонаты (наиболее похо-
жие на пирофосфат) конкурируют с последним,
включаясь в различные фосфотрансферазы,
аминоацил-тРНК-синтетазы, фосфатазы, про-
теи нкиназы (50%-ное угнетение некоторых из
них обнаруживалось при концентрациях бис-
фосфоната, вполне достижимых в остеокла-
стах, а именно: 0,2-3 мМ). Среди прочих эф-
фектов наблюдалось прямое угнетение протон-
ного насоса в остеокластах, а также появление
неметаболизируемых аналогов АТФ (содержа-
щих углерод вместо кислорода между двумя
концевыми атомами фосфора).
Препараты же. содержащие гетероцикли-
ческий азот, устойчивы к метаболическим пре-
вращениям. Но они оказались ингибиторами
ряда ферментов мевалонатного пути и, следо-
вательно, тормозят синтез холестерола и изо-
преноидных липидов. Как оказалось, некото-
рые изопреноиды необходимы для посттранс-
ляционной модификации ряда белков (в част-
ности, «малых» ГТФаз). Дефицит этих белков,
наступающий при торможении мевалонатного
пути, ведет к нарушению резорбтивных (и
иных) функций остеокластов, а в конечном сче-
те - к их гибели путем апоптоза.
Различия в механизмах внутриклеточного
действия двух групп бисфосфонатов, возмож-
но, объясняют разницу и в других фармаколо-
гических эффектах (помимо антирезорбтивно-
го). Так, некоторые из метаболизируемых пре-
паратов обладают противовоспалительными
свойствами, тогда как азотсодержащие бис-
фосфонаты оказывают провоспалительное дей-
ствие и могут вызвать острофазный ответ.
Накопление метаболических расстройств
в остеокластах при достаточно долгом приме-
нении бисфосфонатов ускоряет гибель клеток
и, следовательно, уменьшает их общее количе-
ство, делая антирезорбтивный эффект более
стабильным. Применяют бисфосфонаты при
болезни Педжета, миеломатозе и других про-
явлениях чрезмерной остеокластной резорб-
ции, в том числе при возрастном остеопорозе,
особенно у женщин после наступления мено-
паузы.
Пример бисфосфонатов очень поучителен.
Он показывает, что нет и не может быть такого
лекарственного (или токсичного) вещества,
действие которого направлено на одну-един-
ственную мишень. Проблема создания средств
химиотерапии сводится к повышению их изби-
рательности до уровня, позволяющего доста-
точно ослабить побочные эффекты.
Глава 12
ЗУБЫ. СЛЮНА
Каждый зуб представляет собой твердое
образование, основание которого (корень) фик-
сировано в челюстной кости, а свободная часть
(коронка) обращена в полость рта. Она не
только принимает на себя механические на-
грузки, но и подвержена воздействию среды,
сильно варьирующей по составу, физическим и
химическим свойствам. Противостоять нега-
тивным последствиям этих воздействий - глав-
ное предназначение слюны, биохимические
параметры которой целесообразно рассмотреть
тоже в данной главе.
12.1. ТКАНИ ЗУБА
Преобладающую часть зуба составляет
дентин. Этот специализированный вариант ко-
стной ткани в корневом отделе покрыт сравни-
тельно тонким слоем цемента, еще более сход-
ного с костью, а в области коронки - эмалью.
Граничат эти покрытия в месте перехода корон-
ки в корень, обозначаемом как шейка зуба.
Обычно она находится на уровне края зубной
альвеолы - особого углубления в челюстной
кости, где располагается корень зуба. Простран-
ство между ним и стенкой альвеолы заполнено
периодонтальной связкой {периодонтом), кото-
рая амортизирует жевательные нагрузки.
Срединная часть зуба {пульпарная камера)
остается неминерализованной и заполнена
пульпой. В области коронки эта камера имеет
наибольшие размеры, а к верхушке корня су-
жается, переходя в корневой канал, заканчи-
вающийся верхушечным отверстием (нередко
формируются и добавочные корневые каналы).
Все перечисленные части зуба, кроме эма-
ли, имеют мезенхимное происхождение, как и
любая соединительная ткань. Эмаль же, хотя и
тесно спаяна с дентином, имеет совсем иной
генез, являясь продуктом деятельности особых
клеток - амелобластов, происходящих из эпи-
телия.
12.1.1. РАЗВИТИЕ ЗУБА
Зарождение зуба у человека происходит на
6-й неделе жизни эмбриона. Оно начинается с
врастания многослойного эпителия ротовой
полости в подлежащую мезенхиму. На 8-й не-
деле формируются локальные выпячивания
эпителия {зубные почки), которые намечают
положение будущих зубов. Пролиферируя, ка-
ждое такое выпячивание постепенно образует
эпителиальный эмалевый орган, У временных
зубов к концу 4-го месяца внутриутробной
жизни он приобретает форму колокольчика,
открытым краем врастающего вглубь мезенхи-
мы. Скопление мезенхимных клеток, оказав-
шихся внутри «колокольчика», обозначается
как зубной сосочек. С внешней стороны эмале-
вого органа мезенхимные клетки, сближаясь,
образуют так называемый зубной мешочек. Из-
ложенная последовательность, как и дальней-
шие события, в главном одинаковы для всех
зубов, но у постоянных развиваются с большой
отсрочкой.
ЗУБЫ. СЛЮНА
415
Вместе эмалевый орган, зубной сосочек и
зубной мешочек составляют зубной зачаток.
Их дальнейший гистогенез сопровождается
дифференциацией клеток и завершается после
рождения.
Вначале эпителиальные клетки эмалевого
органа, расположенные на внутренней поверх-
ности упомянутого «колокольчика», преобра-
зуются в вытянутые преамелобласты, которые
часто обозначают как несекреторные амело-
бласты. Они тесно прилегают друг к Другу,
составляя однорядный слой клеток с базальной
мембраной, отделяющей их от зубного сосочка.
Примыкающие к ней мезенхимные клетки со-
сочка под индуцирующим воздействием пре-
амелобластов развиваются в преодонтобласты,
а затем поляризуются, превращаясь в одонтоб-
ласты. Последние формируют плотный слой
клеток и собственную базальную мембрану, от-
деляющую его от остальной части зубного со-
сочка (будущей пульпы зуба). Противополож-
ная сторона клетки образует ветвящийся на
конце отросток, направленный к эмалевому ор-
гану. Именно через эту (апикальную) поверх-
ность (и при участии отростков) одонтобласты
секретируют органическую основу дентина
(которая в дальнейшем подвергается минера-
лизации).
Первое же проявление функциональной
активности одонтобластов служит сигналом
для быстрой (в течение суток-полутора) диф-
ференцировки преамелобластов в зрелую фор-
му (секреторные амелобласты). Она начина-
ется с перемены полярности клеток: разруша-
ется базальная мембрана, отделявшая их от
одонтобластов; комплекс Гольджи и богатые
рибосомами участки эндоплазматического ре-
тикулума смещаются в ту сторону клеток, ко-
торая обращена к одонтобластам и где появля-
ется множество секреторных пузырьков; этот
(ставший апикальным) конец клетки вскоре
приобретает несколько заостренную форму и
обозначается как отросток Томса. Через его
плазматическую мембрану амелобласты осу-
ществляют секрецию компонентов строящейся
эмали. Интенсификации этого процесса спо-
собствуют прорастание кровеносных сосудов
со стороны зубного мешочка и развитие капил-
лярной сети вокруг слоя клеток, строящих
эмаль. Тем самым, параллельно дифференци-
ровке амелобастов, создается новый источник
их питания, который приходит на смену преж-
нему потоку веществ из зубного сосочка, пере-
крываемому теперь слоем дентина.
Таким образом, смыкавшиеся ранее ряд
преодонтобластов и ряд преамелобластов, со-
зревая при участии механизмов взаимной ин-
дукции, начинают выделять навстречу друг
ДРУГУ компоненты соответственно дентина и
эмали. По мере развития этого процесса упо-
мянутые клеточные ряды все более отдаляются
друг от друга.
Процесс превращения клеток-предшест-
венников в одонтобласты и амелобласты воз-
никает в области верхушки зубного сосочка и
затем распространяется к его основанию в виде
волны дифференциации. Скорость ее продви-
жения варьирует в разных зубах. Надежно она
измерена только для резца крыс: около 0,5 мм в
сутки. Есть основания полагать, что у человека
эта величина гораздо меньше.
С приближением волны дифференциации
клетки эмалевого органа, расположенные по
краю «колокольчика», начинают прорастать по
границе между зубным сосочком и зубным
мешочком в виде тонкостенного цилиндриче-
ского футляра (эпителиальное корневое влага-
лище), который ограничивает пространство бу-
дущего корня зуба. Обычно это совпадает с
периодом начала прорезывания зуба. Края рас-
тущего корневого влагалища огибают основа-
ние удлиняющегося зубного сосочка и сбли-
жаются к центру, оставляя, однако, место для
будущего верхушечного отверстия (или не-
скольких - в многокорневых зубах). В отличие
от внутреннего слоя эпителия собственно «ко-
локольчика», эпителиальные клетки корнево-
го влагалища не дифференцируются в амелоб-
ласты. Тем не менее, они сохраняют способ-
ность индуцировать трансформацию приле-
гающих к ним клеток зубного сосочка в одон-
тобласты, которые затем начинают вырабаты-
вать дентин, постепенно формирующий осно-
ву корня зуба. Выполнив свою миссию, эпи-
телиальные клетки корневого влагалища со
временем редуцируются. Их место занимают
мезенхимные клетки зубного мешочка, кото-
рые дифференцируются в цементобласты,
наслаивающие слой цемента на корневую
часть дентина.
416
Глава 12
12.1.2. ПУЛЬПА ЗУБА
По строению и функциональным возмож-
ностям пульпа зуба представляет собой рых-
лую соединительную ткань. Заполняя цен-
тральную полость зуба, она обеспечивает вы-
работку и питание дентина, метаболическое
обновление твердых частей зуба, его защиту и
репарацию в случае повреждений. Именно
пульпа, обильное кровоснабжение и иннерва-
ция которой осуществляется через апикальное
отверстие, играет ведущую роль в вовлечении
зуба в общий гомеостаз организма-
Резидентные клетки пульпы, проис-
ходя из мезенхимы, имеют разную специали-
зацию. Одни из них - одонтобласты — располо-
жены по периферии пульпы и осуществляют
создание дентина (дентиногенез). Другие - это
малодифференцированные клетки, которые
преобладают в субодонтобластической зоне;
они способны давать начало как одонтобластам,
так и фибробластам. Последние - наиболее мно-
гочисленные — заполняют всю остальную пуль-
пу и являются главными строителями ее внекле-
точного матрикса; посредством отростков они
контактируют между собой и с одонтобластами
и часто формируют трехмерные сети.
Клетки защиты, как и обычно, имеют
своим источником стволовую клетку крови.
К их числу относятся:
- макрофаги (расположены преимущест-
венно в центре пульпы; с возрастом число их
уменьшается);
- дендритные анти ген-представляющие
клетки, которые преобладают в периферичес-
ких участках и немногочисленны после рожде-
ния (по мере созревания пульпы их становится,
однако, вчетверо больше, чем макрофагов,
вместе с которыми они составляют около 8%
от общего числа клеток);
- лимфоциты, преимущественно покоя-
щиеся (в здоровой пульпе их немного и при-
надлежат они к разным субпопуляциям Т-кле-
ток, тогда как В-клетки почти отсутствуют;
плазматические клетки выявляются только при
воспалении);
- тучные клетки (они в пульпе очень не-
многочисленны и больше свойственны детско-
му возрасту; при воспалении их число резко
возрастает).
Волокна внеклеточного матрикса фор-
мируются коллагенами типов I и III, как это и
свойственно рыхлой соединительной ткани.
Однако преобладание первого здесь несколько
меньше, чем обычно. В целом на долю колла-
гена приходится 25-30% сухой массы пульпы
(у человека). Волокнистые структуры не имеют
выраженной ориентации, образуя сети, более
плотные по периферии. Лишь в корневом кана-
ле, где фибриллы уложены еще плотнее, они
часто располагаются вдоль его оси и нередко
образуют пучки.
Основное вещество пульпы тоже ти-
пично для рыхлой соединительной ткани. Оно
содержит довольно значительные количества
гликопротеинов (особенно фибронектина) и
гиалуроновой кислоты, комплексы которой с
гиалектанами обеспечивают высокую гидрати-
рованность пульпы.
Кровоснабжение и иннервация
пульпы хорошо развиты, что очень важно для
полноценного формирования зуба и под-
держания его жизнеспособности. Сосуды и
нервные волокна проходят через апикальные
отверстия, образуя в корневом канале сосуди-
сто-нервный пучок. Многие из них достигают
периферии пульпы, формируя капиллярное и
нервное субодонтобластические сплетения.
Капилляры нередко проходят в слой одонто-
бластов, а концевые нервные веточки оплетают
тела этих клеток и оканчиваются терминалями
вблизи их дистального конца. Часть нервных
веточек проникает рядом с отростками одон-
тобластов в дентин на глубину до 100-150 мкм.
В большинстве своем нервные окончания в об-
ласти одонтобластов являются рецепторами; их
раздражение вызывает боль.
Возрастные изменения пульпы зуба
после завершения его формирования сводятся
к общему уменьшению числа клеток и сниже-
нию синтетической функции оставшихся; со-
кращению объема пульпарной камеры; увели-
чению содержания коллагеновых волокон; ре-
дукции микроциркуляторного русла, особенно
в субодонтобластическом сплетении; регрес-
сивным изменениям нервного аппарата, а так-
же к появлению и нарастанию числа участков
обызвествления (кальцифи катов).
Уменьшение количества клеток происхо-
дит во всех частях пульпы, достигая к пожило-
ЗУБЫ. СЛЮНА
417
му возрасту 50% от исходного уровня. Оно со-
провождается увеличением межклеточных рас-
стояний и изменениями самих клеток, отра-
жающими ослабление синтетической и секре-
торной функций. Это касается и одонтобла-
стов, и фибробластов, причем у последних од-
новременно наступает усиление фагоцитарной
активности.
Возрастное накопление волокнистых струк-
тур может приводить к увеличению их доли
почти втрое. Это сопровождается и изменения-
ми свойств коллагена, в том числе уменьшением
его растворимости. Последнее обусловлено тем,
что бифункциональные сшивки со временем
спонтанно превращаются в межфибриллярные
трифункциональные перемычки, делающие
структуру коллагеновых волокон более жест-
кой.
Объем пульпарной камеры с возрастом
уменьшается из-за накопления вторичного ден-
тина (см. ниже). Этот процесс усугубляется
появлением очагов отложения солей кальция.
Они различаются по происхождению и струк-
туре, чаще наблюдаются в корневой пульпе и
могут даже приводить к облитерации корнево-
го канала.
Депульпация зуба является одним из
частых лечебных мероприятий. Она лишает зуб
кровоснабжения (питания) и иннервации (в том
числе - болевой чувствительности), из-за чего
нарушается его естественный метаболизм. Это
серьезно отражается на жизнеспособности зу-
ба. Тем не менее, депульпация дает положи-
тельный эффект в том плане, что прерывает
пути воздействия повреждающих агентов через
пульпу. А главное — ликвидирует ее клеточные
элементы, реализующие воспалительную реак-
цию, опасные аспекты которой усугубляются
малым объемом и изолированностью пульпар-
ной камеры. Позитивному эффекту депульпа-
ции способствует и то, что метаболические
процессы в твердых тканях зрелого зуба проте-
кают крайне медленно, а сформировавшаяся
минеральная фаза очень стабильна и долговеч-
на. Следует, однако, иметь в виду, что незащи-
щенность твердых тканей со стороны пульпы
делает их более уязвимыми для воздействий
внешнего окружения, в том числе содержимого
полости рта.
12.1.3. ДЕНТИН
Дентином называют слой внеклеточного
матрикса, расположенный между пульпой зуба
и эмалью (в коронке) или цементом (в корне-
вой части). Компоненты его выделяются одон-
тобластами и, накапливаясь, постепенно оттес-
няют границу с эмалевым органом. Соответст-
венно удлиняется и отросток каждого одонто-
бласта, сохраняя при этом концевое ветвление
на уровне приграничья с эмалью (в корне зуба
- с цементом). По мере удлинения главный
ствол отростка (диаметром 0,5-1 мкм) через
каждые 1-2 мкм дает боковые веточки (толщи-
ной 0,1-0,2 мкм). Они облегчают питание ден-
тина и, в свою очередь, тоже делятся, образуя
концевые контакты с веточками соседних
одонтобластов.
Плазматическая мембрана отростков по-
крыта снаружи слоем основного вещества. Эта
периплазматическая зона толщиной 150-200 нм
состоит преимущественно из протеогликанов и
практически не содержит коллагеновых воло-
кон. Поэтому здесь не могут возникать центры
кристаллизации. Так появляется не подвергае-
мая минерализации дентинная трубочка, ок-
ружающая отросток (и имеющая ответвления
для каждой из его боковых веточек). В зрелой
ткани эти трубочки выглядят как поры в мине-
рализованном матриксе. Диаметр их вблизи
тела клетки составляет 2-3 мкм, а к концу (у
границы с эмалью или цементом) уменьшается
до 0.5-1 мкм. Помимо сильно гидратированных
протеогликанов в просвете дентинной трубоч-
ки есть и свободная вода - дентинная жид-
кость. Она представляет собой транссудат ка-
пилляров пульпы и по составу близка плазме
крови. Заполняемое ею пространство внутри
дентинной трубочки служит важным путем
транспорта растворимых веществ от пульпы до
границы с эмалью или цементом.
Обилие дентинных трубочек обеспечивает
очень высокую проницаемость дентина. Отсю-
да - быстрая реакция дентина и пульпы на
внешние повреждения зуба и легкость распро-
странения инфекции при кариесе.
По ходу дентиногенеза состав секретируе-
мого материала закономерно изменяется. По-
этому дентин — понятие, строго говоря, собира-
тельное, т.к. он состоит из слоев, различаю-
418
Глава 12
щихся по структурной организации матрикса и
по степени минерализации (или отсутствием
таковой). Эти различия отражают временную
динамику биогенеза дентина, соответствую-
щую разным этапам функционирования одон-
тобластов.
Плащевой дентин начинает создаваться
еще на стадии преодонтобластов. Выделяемые
молекулы проколлагена, превращаясь в тропо-
коллаген, используются для формирования
толстых (0,1-0,2 мкм) коллагеновых волокон.
Они состоят из коллагена типа I в сочетании с
небольшим количеством коллагена-V и ориен-
тированы поперек базальной мембраны эмале-
вого органа. В основном веществе доминируют
протеогликаны, фибронектин, остеонектин и
Gla-протеины. Однако здесь отсутствуют ос-
теопонтин и иные фосфорилированные сиало-
протеины, необходимые для построения цен-
тров зарождения кристаллов. Поэтому минера-
лизация плащевого дентина, которая стартует в
конце 5-го месяца внутриутробного развития,
осуществляется исключительно механизмом
гомогенной нуклеации, зависящим от матрикс-
ных везикул. Октакальцийфосфаг (ОКФ), до-
ставляемый ими к коллагеновым волокнам,
спонтанно трансформируется в кристаллы гид-
роксиапатита, которые по мере роста образуют
минеральную фазу. Она получается при этом
не сплошной, а в виде минерализованных гло-
бул диаметром около 2 мкм, расположенных
разрозненно или группами.
Образование плащевого дентина заверша-
ется по мере дозревания юных одонтобластов и
перехода их к выработке качественно иного
дентина, называемого интертубулярным. С его
накоплением плащевой дентин все более оттес-
няется от клеток, сохраняясь у границы с эма-
лью в виде полосы толщиной от 5 до 30 мкм.
Интертубулярный дентин заполняет поч-
ти все пространство между дентинными тру-
бочками. Он начинает вырабатываться, когда
биосинтетический аппарат одонтобластов до-
стигает наибольшей мощности. Это проявляет-
ся, в частности, накоплением секреторных пу-
зырьков в апикальном отделе клеток, перехо-
дящем в отросток. Их изобилие указывает на
интенсивность потока макромолекул, отправ-
ляемых в среду путем экзоцитоза. Одновре-
менно между соседними одонтобластами, не-
подалеку от их отростков, образуются соеди-
нительные комплексы, которые (вместе с тела-
ми клеток) отграничивают пульпу зуба от про-
странства, в которое секретируются белки
ВКМ.
Органический матрикс дентина по
составу близок остеоиду кости. Волокна стро-
ятся здесь тоже в основном из коллагена типа I
и не содержат коллагена-Ш; доля коллагена V
очень невелика. Как и во всех клетках, выраба-
тывающих проколлаген, значительная часть
его не выделяется в среду, а подвергается
внутриклеточному расщеплению, — вероятно,
путем слияния части секреторных пузырьков с
лизосомами. Вне клеток проколлаген посте-
пенно проходит все стадии созревания, опи-
санные в разделе 10.2.2, и формирует коллаге-
новые фибриллы, вытянутые поперек дентин-
ных трубочек. Вблизи одонтобластов они тон-
кие (около 20 нм), но со временем утолщаются
до 55-75 нм. Этому сопутствует ковалентное
связывание молекул. Как и в костной ткани, из
бифункциональных сшивок здесь преобладают
гидроксилизино-5-кетонорлейциновые (рис.
10-2, V). Позднее многие из них вовлекаются в
создание трифункциональных перемычек - ли-
зил-пиридинолиновых и, в меньшей степени,
лизил-пиррольных (см. рис. 10-3).
Всего на долю коллагена приходится до
90% органического матрикса дентина. Около
8% составляют неколлагеновые белки. Почти
все они относятся к числу тех, что есть и в ос-
теоиде. Среди них относительно немного про-
теогликанов - в основном декорина и биглика-
на (см. табл. 10-5). В основном же неколлаге-
новые белки представлены, как и в костной
ткани, определенным набором гликопротеинов
(они перечислены в табл. 11-1).
Особенности состава интертубуляр-
ного дентина сводятся к следующему. Во-
первых, в нем нет фибронектина. Во-вторых,
хотя здесь и имеются остеопонтин и костный
сиалопротеин II (отсутствующие в плащевом
дентине), представлены они далеко не так
обильно, как в кости. В-третьих, интертубу-
лярный дентин содержит такие белки, которых
нет в любой другой ткани, включая костную.
В их числе - дентинный сиалопротеин и фос-
фофорин. Уже по названиям этих белков мож-
но заключить, что они как бы возмещают собой
ЗУБЫ. СЛЮНА
419
упомянутую недостаточность костных сиало-
фосфопротеинов.
Неожиданным оказалось, что оба уникаль-
ных для дентина белка кодируются одним ге-
ном. У человека он расположен в 4-й хромосо-
ме (локус 4q21), неподалеку от генов остеопон-
тина и костного сиалопротеина II. Лишь в ходе
посттрансляционного процессинга продукт это-
го гена - дентинный сиалофосфопротеин -
расщепляется на два отдельных белка, сильно
разнящихся по составу и строению. Установле-
но, что именно в участке расположения назван-
ных генов находятся те фрагменты ДНК, дефек-
ты которых проявляются в виде дисплазии ден-
тина и несовершенного дентиногенеза типа IL
Фосфофорин (дентинный фосфопротеин)
составляет в интертубулярном дентине не менее
половины всех неколлагеновых белков. Он
прочно связан с коллагеном, а по строению уни-
кален тем, что содержит до 40% аспарагиновой
кислоты и около 50% остатков серина, подав-
ляющее большинство которых фосфорилирова-
но. Такое изобилие анионных групп делает
фосфофорин самым кислым из всех известных
белков (pl = 1,1 !). Неподалеку от N-конца вы-
явлен RGD-центр связывания с клетками.
Для первичной структуры фосфофорина
характерно обилие фрагментов, в каждом из
которых многократно повторяется звено, со-
стоящее из аспартата и следующих за ним двух
(реже - одного или трех) остатков фосфосерина.
Пространственная организация фрагментов та-
кова, что на противоположных сторонах поли-
пептидного стержня фосфатные группы форми-
руют два продольных гребня, рядом с которыми
проходят аналогичные выступы, составленные
карбоксильными группами аспартата.
Дентинный сиалопротеин составляет
здесь 5-8% от всех неколлагеновых белков ин-
тертубулярного дентина. Примерно на 30% он
состоит из углеводных компонентов, богатых
сиаловыми кислотами. В коровом белке доми-
нируют аспартат, глутамат, серин и глицин, но
отсутствует RGD-центр, обычный для других
сиалопротеинов.
Минерализация интертубулярного
дентина осуществляется механизмом прямой
кристаллизации гидроксиапатита (гетерогенная
нуклеация), типичным для зрелой кости. Одна-
ко здесь есть своя специфика. Она обусловлена
тем, что дентин, в отличие от кости, не подвер-
гается ремоделированию. Иными словами, он
строится раз и навсегда. Это обеспечивается не
только спецификой состава неколлагеновых
белков (наличие фосфофорина и дентинного
сиалопротеина). Важную роль играет также
структурная организация дентина, обеспечи-
вающая разделение путей доставки мак-
ромолекул к местам формирования центров
кристаллизации гидроксиапатита.
Главный организатор центров нуклеации -
коллаген - секретируется дистальной частью
одонтобластов. По мере созревания он все бо-
лее оттесняется новыми порциями материала,
непрерывно секретируемого клетками. Поэто-
му формирование фибриллярных структур с
типичными «зазорами» между концами моле-
кул тропоколлагена заканчивается на некото-
ром расстоянии от тел одонтобластов. Именно
на этом удалении в матрикс поступают другие
компоненты центров нуклеации - фосфофорин
и дентинный сиалопротеин. Они доставляются
сюда по отросткам одонтобластов (т.е., в обход
слоя, в котором еще не завершено дозревание
коллагена). Здесь эти фосфопротеины взаимо-
действуют с уже созревшими коллагеновыми
фибриллами, вытесняя из «зазоров» внедрив-
шиеся ранее макромолекулы (в частности, про-
теогликаны).
С завершением образования центров нук-
леации появляются первые кристаллы ГАП.
Так возникает фронт минерализации. Он по-
степенно продвигается в сторону одонтобла-
стов, захватывая все новые (дозревшие) слои
секретируемого матрикса и оставляя позади
себя полностью минерализованный интертубу-
лярный дентин (смыкающийся с плащевым).
Однако клеток он никогда не достигает. Ибо
соотношение темпа созревания матрикса со
скоростью секреции белков одонтобластами (и
их отростками) таково, что не готовый к мине-
рализации слой составляет обычно 15-20 мкм
(при интенсивности секреции органического
матрикса в среднем 4 мкм в сутки). Этот неми-
нерализуемый слой, отделяющий интергубу-
лярный дентин от остеобластов, обозначают
как предентин. Он сохраняется даже после за-
вершения биосинтетической активности одон-
тобластов.
420
Глава 12
В интертубулярном дентине ведущим
фрагментом центров нуклеации является фос-
фофорин. Часть его молекул очень прочно свя-
зывается со специфическими участками колла-
гена вблизи «зазоров». Именно фиксация этого
белка на нерастворимой подложке коллагена
играет решающую роль в инициации отложения
кристаллов.
Как уже отмечалось, по бокам полипеп-
тидного стержня фосфофорина формируются
продольные гребни, каждый из которых состо-
ит из серии либо фосфатных остатков, либо
карбоксильных групп аспартата. Вместе с кол-
лагеном и, по-видимому, некоторыми другими
белками они обеспечивают особую стереохи-
мическую геометрию реактивных групп, кото-
рая комплементарна определенным граням
кристалла, формируемого на их поверхности.
Конформационные соотношения позволяют
связывать ионы фосфата и Са2+ в таком про-
странственном взаиморасположении, которое
снижает энергию активации процесса образо-
вания кристаллов гидроксиапатита. Благодаря
этому минеральная фаза возникает из раствора,
в котором концентрации Са2+ и фосфат-ионов
находятся в пределах физиологических границ
и не достигают насыщения (при нейтральных
значениях pH).
Таким образом, фосфофорин является бел-
ком-нуклеатором, так как обеспечивает зарож-
дение начальных кристаллов гидроксиапатита.
Этот эффект он оказывает уже в минимальной
концентрации (10 мкг/мл, или 67 нМ). Однако
с ее увеличением возникает угнетающее дейст-
вие фосфофорина на рост кристаллов и форми-
рование новых. Похоже, оно обусловлено на-
растанием количества белка, не фиксированно-
го на коллагеновых фибриллах. Следует отме-
тить, однако, что его содержание в дентине
корня зуба (особенно на периферии) в несколь-
ко раз меньше, чем в коронковой части.
Помимо фосфофорина, в регулировании
роста кристаллов и ограничении их конечных
размеров участвуют и другие неколлагеновые
белки дентина, в том числе остеопонтин и ос-
теонектин. Гораздо слабее действие дентинно-
го сиалопротеина, который тоже замедляет
рост начальных кристаллов. Свой вклад вносят
и малые протеогликаны. Их гликозаминоглика-
новые цепи (особенно хондронтин-4-сульфат)
обладают высоким сродством к кристаллам гид-
роксиапатита и способностью связывать значи-
тельные количества ионов Са2+, тогда как бел-
ковая часть молекулы легко «приякоривается» к
коллагеновым фибриллам. Такое сочетание
свойств позволяет малым протеогликанам вно-
сить свой вклад в регулирование процессов ми-
нерализации дентина.
Снижение концентраций фосфата и Са2+
из-за перехода их в кристаллическую фазу
компенсируется притоком этих ионов, - в ко-
нечном счете из кровеносного русла. При этом
продвижение фосфатных ионов через тела
одонтобластов и их отростки к фронту минера-
лизации не нуждается в специальных механиз-
мах, т.к. анионы сравнительно легко проника-
ют через биомембраны, а их концентрации
внутри и вне клеток, если и различаются, то
обычно не очень сильно. Кроме того, при не-
обходимости могут быть мобилизованы фос-
фатные группы фосфопротеинов и низкомоле-
кулярных веществ (включая нуклеозидфосфа-
ты), отщепляемые различными фосфатазами.
Что же касается ионов Са2+, то их доставка
к растущим кристаллам требует преодоления
ряда барьеров. Как известно, распределение
этого катиона между вне- и внутриклеточными
пространствами чрезвычайно неравномерно.
В плазме крови кальция содержится до 3 мМ,
из которых около половины - в ионизирован-
ной форме. В цитоплазме же большинства кле-
ток содержание кальция на 3-4 порядка ниже.
Так, в одонтобластах оно находится на уровне
0,5 мкМ. Более того, ионы Са2+ пребывают
здесь преимущественно не в свободной форме,
а в виде комплексов с органическими лиганда-
ми. Прежде всего - с Са2+-связывающими бел-
ками, которые обратимо присоединяют значи-
тельные количества Са2+ и тем самым играют
важную роль в распределении его между раз-
ными субклеточными структурами.
Из-за высокого градиента концентраций
клетки не нуждаются в специальных механиз-
мах захвата кальция, которые требовали бы
расходования АТФ. Однако, контроль за ин-
тенсивностью потока в клетку необходим. Он
осуществляется разными типами кальциевых
каналов, каковые есть и в одонтобластах.
С другой стороны, поток Са2+ из клеток в
сторону дентина направлен против градиента
ЗУБЫ. СЛЮНА
421
концентраций, причем, очень высокого. Для
преодоления его используется механизм
Ма+/Са2+-обмена с участием специального
трансмембранного белка. Однако гораздо более
существенный вклад вносит Са2+-активируемая
АТФаза. Локализованная в плазматической
мембране одонтобластов, она способна обеспе-
чивать выход ионов Са2+ из цитоплазмы непо-
средственно в предентин. Очень высокая ак-
тивность фермента сосредоточена также в
мембране везикул, происходящих из аппарата
Гольджи и очень многочисленных в дисталь-
ной части тела одонтобластов. С помощью
Са2+-АТФазы эти везикулы накапливают Са2+ и
путем экзоцитоза переносят его во внеклеточ-
ную среду вблизи клеток или (через отростки)
непосредственно к фронту минерализации. В
целом концентрация ионов Са2+ в предентине
втрое выше, чем в пульпе зуба.
Транспорт кальция через одонтобласты и
по их отросткам проходит быстро: меченый
Са2+ появляется в минеральной фазе уже через
10-15 мин после его внутривенного введения.
Конечным итогом всех перечисленных
особенностей является гораздо более высокая
степень минерализации дентина и его прочно-
сти (в сравнении с компактной костью). Кри-
сталлы имеют здесь пластинчатую форму; тол-
щина их составляет 2-3 нм при длине около
60 нм. Ориентированы они вдоль волокон, рас-
полагаясь внутри и между коллагеновыми
фибриллами. Из-за отсутствия ремоделирова-
ния обновление минеральной фазы может осу-
ществляться только посредством медленных
процессов ионного обмена в уже готовых кри-
сталлах. В весовом отношении зрелый интер-
тубулярный дентин содержит в среднем 70%
минеральных веществ, 20% органических и
10% воды. По объему эти компоненты состав-
ляют соответственно 45, 30 и 25%. Довольно
высокий уровень воды объясняется обилием
дентинных трубочек, сравнительно богатых
свободной водой.
Все перечисленные слои дентина появля-
ются в процессе развития зуба. Но есть и такие
образования, становление которых происходит
у взрослых людей, много лет спустя после офор-
мления функционально готового, прорезавше-
гося зуба. К ним относятся перитубулярный,
вторичный и репаративный варианты дентина.
Перитубулярный дентин — термин, при-
нятый для обозначения того материала, кото-
рый откладывается изнутри на стенках уже
сформировавшихся дентинных трубочек (по-
этому правильнее его называть интратубуляр-
ным). Механизм его образования неизвестен.
Процесс протекает непрерывно и только в при-
сутствии жизнеспособных одонтобластов. Пе-
ритубулярный дентин отличается отсутствием
фибриллярных структур, наличием протеогли-
канов и значительно повышенной степенью
минерализации. Кристаллы здесь имеют форму
параллелепипедов размерами 36x26x10 нм и
представлены в основном гидроксиапатитом,
но богаты также магнием и содержат карбонат,
чем обусловлена их сравнительно легкая рас-
творимость. С годами толщина этого слоя мо-
жет достигать 0,5-1 мкм, приводя к заметному
уменьшению просвета дентинных трубочек.
Вторичный дентин представлен сравни-
тельно узким слоем, который расположен меж-
ду предентином и интертубулярным дентином.
Формирование его происходит крайне медлен-
но и растягивается на всю оставшуюся жизнь.
Судя по всему, оно отражает остаточную ак-
тивность одонтобластов, сохраняющуюся по-
сле периода интенсивного дентиногенеза. От
интертубулярного вторичный дентин отличает-
ся гораздо меньшей упорядоченностью колла-
геновых волокон и пониженной степенью ми-
нерализации. Его образование идет неравно-
мерно, из-за чего с возрастом наступает не
только уменьшение объема пульпарной каме-
ры, но и изменение ее формы.
Репаративный (третичный) дентин раз-
вивается в ответ на механические и, возможно,
бактериальные повреждения уже сформиро-
ванного матрикса. Реализуется эта постнаталь-
ная репарация путем активации одонтобластов,
которые поддерживаются в пульпе в виде осо-
бой популяции клеток-предшественников. Тре-
тичный дентин выполняет функцию защитного
барьера для предохранения пульпы. Он отли-
чается от вторичного еще меньшей регулярно-
стью структуры как органического матрикса,
так и минеральной фазы.
12.1.4. ЦЕМЕНТ
Формирование цемента начинается после
того, как интенсивный роет корня зуба приво-
422
Глава 12
дит к отмиранию покрывающих его эпители-
альных клеток корневого влагалища. В резуль-
тате возникает прямой контакт корневого ден-
тина с прилегающими к нему мезенхимными
клетками зубного мешочка. Они начинают бы-
стро пролиферировать и дифференцироваться в
цементобласты. Вырабатываемый этими клет-
ками матрикс близок по составу макромолекул
внеклеточному матриксу костей. Как и остеоид,
он состоит из волокон коллагена-I и основного
вещества, содержащего разнообразные глико-
протеины (фибронектин, остеопонтин, костный
сиалопротеин П, остеокальцин и др.) и протео-
гликаны (фибромодулин, люмикан, бигликан,
декорин, а также версикан, сосредоточенный
почти исключительно в лакунах). Цементоид
откладывается поверх плащевого дентина, по-
степенно формируя бесклеточный слой первич-
ного цемента. Толщина его варьирует от 20 до
230 мкм, будучи наименьшей в области шейки
зуба, где первичный цемент граничит с эмалью,
и максимальной — в апикальной части корня.
Минерализация первичного цемента на-
чинается с появления матриксных пузырьков,
как это происходит при формировании плаще-
вого дентина, а также при минерализации хряща
на ранней стадии замены его костной тканью.
Дальнейший ход минерализации аналогичен
таковому в кости.
После прорезывания зуба характер цемен-
тогенеза существенно изменяется. Лишь часть
цементобластов продолжает оставаться на пе-
риферии, примыкая к формирующемуся перио-
донту. Остальные замуровываются в секрети-
руемом ими матриксе и превращаются в много-
полюсные клетки — цементоциты, которые, по-
добно остеоцитам костной ткани, находятся в
лакунах и контактируют между собой через вет-
вящиеся отростки. Новый слой клеточного
(вторичного) цемента, расположенный поверх
первичного, формируется лишь на верхушке
корня зуба и тоже подвергается минерализации.
Его образование продолжается всю жизнь зуба,
хотя и очень медленно. Поэтому с возрастом
толщина вторичного цемента непрерывно рас-
тет, достигая местами 1-1,5 мм.
Занимая промежуточное положение между
дентином и периодонтальной связкой, цемент
скреплен с ними обилием прободающих колла-
геновых волокон. Важный вклад в это скрепле-
ние вносят и адгезивные свойства протеогли-
канов основного вещества ВКМ.
При всем сходстве цементогенеза с обра-
зованием костного матрикса и его минерализа-
цией, есть и существенные различия. Во-пер-
вых, цемент, подобно дентину и эмали, не под-
вергается ремоделированию, типичному для
костной ткани. Во-вторых, цементобласты не
организуют морфологических структур, анало-
гичных остеонам. Значит, цемент является бес-
сосудистой минерализованной тканью, и пита-
ние его осуществляется путем диффузии ве-
ществ со стороны периодонта. Поэтому цемент
весьма инертен метаболически и мало обновля-
ем. В-третьих, степень минерализации цемента,
особенно клеточного, заметно меньше, чем ден-
тина. В целом он содержит (по весу) 61% мине-
ральных веществ. 27% органических и 12% во-
ды. В объемных соотношениях эти компоненты
составляют соответственно 33,31 и 36%.
Неспособность цемента к ремоделирова-
нию не означает отсутствия в нем репаратив-
ного потенциала. Последний обеспечивается в
основном цементобластами, расположенными
у границы с периодонтом. В частности, при
переломах корня зуба они могут откладывать
слой вторичного цемента в виде кольца, соеди-
няющего обломки. Кроме того, за счет цемен-
тобластов возможен благоприятный исход раз-
рушения периодонтальной связки. Это дости-
гается путем локального новообразования це-
мента вплоть до сращенйя его с альвеолярной
костью. Однако репаративный цемент, обра-
зующийся после повреждения периодонта, не
образует фибриллярных взаимопереплетений с
окружающими тканями.
12.1.5. ПЕРИОДОНТ
(ПЕРИОДОНТАЛЬНАЯ СВЯЗКА)
Заполняя зазор между цементом и стенкой
зубной альвеолы, периодонтальная связка в
разных участках корня имеет толщину от 0,15
до 0,4 мм. Внеклеточный матрикс периодонта
представлен сплетением волнообразных фиб-
рилл коллагена типа I, погруженных в высоко-
гидратированное основное вещество. Лишь
вблизи границы с цементом фибриллы соби-
раются в толстые пучки, идущие параллельно
друг другу. Пересекая эту границу, они оказы-
ЗУБЫ. СЛЮНА
423
ваются инфильтрированными минеральной
фазой. В толще цемента пучки коллагеновых
волокон вновь разветвляются за счет того, что
составляющие их фибриллы опять изгибаются
и расходятся. Именно физическая непрерыв-
ность волокон, а не просто смыкание перио-
донтальной связки с цементом лежит в основе
неразрывного единства этих структур.
Аналогичным образом другая сторона
связки прочно скрепляется с компактной ко-
стью стенки альвеолы. Благодаря этим особен-
ностям центральная зона периодонта метабо-
лически более активна и быстрее обновляется,
чем та часть коллагеновых волокон, которая
внедрена в окружающие твердые ткани кости и
цемента. Этому способствуют обильное крово-
снабжение и богатая иннервация периодон-
тальной связки, которые обеспечиваются иду-
щими из костного окружения сосудами и нерв-
ными волокнами, образующими соответствен-
но капиллярное и нервное сплетения вокруг
корня зуба.
Основное вещество внеклеточного матрик-
са периодонта по составу напоминает рыхлую
соединительную ткань. Из числа гликопротеи-
нов здесь преобладает фибронектин, обеспечи-
вающий интеграцию межклеточного вещества и
взаимодействие его компонентов с клетками.
Вместе с тем, обилие протеогликанов (включая
декорин, в основном ассоциированный с колла-
геновыми волокнами) придает межклеточному
пространству периодонта характер очень вязко-
го геля, способного удерживать большое коли-
чество воды. Это имеет важное функциональное
значение, поскольку облегчает амортизацию
перемежающихся нагрузок на зуб.
Среди клеточных элементов периодонта
преобладают фибробласты, которые благодаря
обилию межклеточных контактов формируют
единую трехмерную сеть. Они обладают высо-
ким уровнем митохондриального окисления и
биосинтетических процессов в сочетании с вы-
раженной способностью к вне- и внутрикле-
точному перевариванию коллагена. Показа-
тельно, что скорость обновления коллагена
здесь в 4 раза выше, чем в коже. Поэтому, в
частности, самые ранние признаки недостаточ-
ности витамина С, участвующего в биогенезе
этого белка, проявляются в виде расшатывания
и выпадения зубов (цинга), свидетельствуя о
глубоком поражении периодонта. Некоторые
биохимические характеристики фибробластов
периодонтальной связки (высокая активность
щелочной фосфатазы, способность синтезиро-
вать остеокальцин) свидетельствуют о возмож-
ности дифференциации их в остеобласты и це-
ментобласты.
В зоне смыкания периодонта с цементом
сосредоточены цементобласты, а на границе с
альвеолярной костью - остеобласты и остео-
класты. Интерстиций периодонта содержит
макрофаги, дендритные антиген-представляю-
щие клетки, тучные клетки и, в меньшей сте-
пени, лейкоциты. Обычно этих клеток-защит-
ников немного (особенно лимфоцитов и грану-
лоцитов), но становится гораздо больше при
воспалении.
Воспалительные заболевания периодонта
составляют группу инфекций, которые ведут к
необратимому разрушению поддерживающего
аппарата зуба. Клиническое течение болезни
очень варьирует. Четко выделяют два вариан-
та: юношеский (ювенильный) периодонтит и
хронический периодонтит взрослых. Послед-
ний поражает более 10% населения и более
30% людей в возрастной группе 55-64 лет. Бо-
лезнь может сильно прогрессировать еще до
появления болей или других симптомов и час-
то завершается потерей зубов. Инициаторами
разрушения периодонтальной связки и ее ок-
ружения являются микроорганизмы. Долгое
время доминировала концепция «неспецифиче-
ского зубного налета», в соответствии с кото-
рой причиной периодонтальных заболеваний
является чрезмерное отложение бактерий на
зубной поверхности. Следствием таких пред-
ставлений стало преобладание хирургического
подхода к лечению: удаление воспаленных
тканей десны для уменьшения глубины десне-
вых карманов и повышения эффективности
механических процедур, предупреждающих
колонизацию бактериями. Однако в конце XX
века все более утверждалась гипотеза «специ-
фического зубного налета», отдающая приори-
тет микрофлоре, специфичной для пародонти-
та. Оказалось, что определенные штаммы са-
мых разных микроорганизмов (стрептококки,
лактобактерии, актиномицеты, спирохеты, тре-
понемы) ответственны за развитие пародонти-
та. Уже проводятся исследования по выясне-
424
Глава 12
нию тех особенностей структуры микробной
ДНК, с которыми связана избирательная агрес-
сивность в отношении периодонта. Выяснено
также, что важную роль играет и индивидуаль-
ная чувствительность человека к патогенным
штаммам, обусловленная генетически. В част-
ности, мутации гена катепсина С в участке
хромосомы 1 lq 14 способствует развитию юно-
шеского периодонтита.
По современным представлениям, анти-
микробная терапия призвана устранять причи-
ну заболевания, а хирургическое лечение сни-
жает результативность периодонтальной ин-
фекции. Критичная стадия в развитии воспали-
тельного процесса — это прикрепление пато-
генных микробов к тканям хозяина. Поэтому
разработка новых препаратов нацелена на соз-
дание таких антибиотиков, которые могли бы
лишать микроорганизмы способности перио-
донтального прикрепления.
У курильщиков заболевания периодонта
встречаются в 2,5-6 раз чаще, чем у некурящих.
Более того, тяжесть клинических проявлений
оказалась пропорциональной числу выкури-
ваемых сигарет. Механизм этой связи пока не-
ясен. Возможно, главной причиной является
способность компонентов табачного дыма раз-
рушать «1 -антитрипсин. Как уже отмечалось в
разделе 10.3.6, этот ингибитор блокирует про-
теиназы нейтрофилов, а они известны своей
ведущей ролью в деградации матрикса при
воспалении. Во всяком случае, твердо установ-
лено: после отказа от курения риск развития
хронического периодонтита взрослых снижает-
ся до уровня, типичного для тех, кто никогда
не курил.
12.1.6. ЭМАЛЬ ЗУБА
Зрелая эмаль - наиболее минерализован-
ное, самое твердое и долговечное образование
в теле млекопитающих. Будучи лишенной кле-
ток (после прорезывания зуба), она представ-
ляет собой только внеклеточный матрикс, к
тому же бессосудистый и совсем не иннерви-
руемый. По весу здесь содержится около 95%
минеральных веществ, примерно 1% органиче-
ских компонентов и не более 4% воды (в объ-
емном соотношении эти параметры составляют
соответственно 86, 2 и 12%). Структурная ор-
ганизация эмали позволяет на протяжении всей
жизни организма эффективно противостоять
механическим нагрузкам и обеспечивать ус-
тойчивость к истирающим воздействиям.
Формирование эмали амелобласты
осуществляют в две стадии. Сначала про-
исходит интенсивный синтез эмалевых белков
с секрецией их через апикальную поверхность
клеток в сторону дентина. Накопление белко-
вого матрикса приводит к постепенному утол-
щению эмали (у человека - со скоростью около
4 мкм в сутки). При этом каждый амелобласт,
удаляясь от границы с дентином, оставляет по-
сле себя шлейф в виде эмалевой призмы. Она
имеет форму прутка поперечником 3-5 мкм,
проходящего радиально через всю эмаль и не-
сколько изогнутого S-образно. Остановка кле-
ток по окончании секреторной стадии опреде-
ляет толщину созданной эмали и завершается
образованием базальной мембраны амелобла-
стов, отграничивающей их снаружи. В разви-
тии постоянных зубов человека вся начальная
стадия занимает 500-600 дней.
Вторая стадия — стадия созревания — на-
ступает после короткого периода коренной пе-
рестройки амелобластов. Интенсивная выра-
ботка белков эмали сменяется резким усилени-
ем процессов: (а) секреции протеиназ через
апикальную мембрану; (б) поглощения продук-
тов частичного протеолиза из эмали с после-
дующей полной деградацией их внутри клеток;
(в) транспорта минеральных ионов через клет-
ку в эмалевый слой.
В постоянных зубах человека стадия со-
зревания эмали длится адвое дольше секретор-
ной. За этот срок из матрикса почти полностью
удаляются белки н в очень значительной степе-
ни — вода. Гексагональные кристаллы гидро-
ксиапатита, возникшие и несколько выросшие в
длину на первой стадии, начинают утолщаться.
Зарождения новых не происходит; напротив,
общее число их даже уменьшается. В итоге кри-
сталлы ГАП в эмали оказываются гораздо более
крупными, чем в костной ткани, дентине или
цементе. Они имеют продолговатую форму:
при толщине 25-40 нм и ширине 40-90 нм их
длина может достигать 1000 нм. Каждый по-
крыт гидратной оболочкой толщиной ~1 нм,
а межкристаллические пространства (0,9-2,5 нм
в поперечнике) заполнены свободной водой.
ЗУБЫ. СЛЮНА
425
содержащей различные ионы и органические
молекулы (эмалевая жидкость).
Наиболее плотно кристаллы упакованы
внутри призмы, где они ориентированы вдоль
ее оси. По периферии плотность укладки не-
сколько меньше, а белковый компонент мат-
рикса соответственно более значителен. Из-за
этого поверхностный слой не вполне удачно
обозначили как «оболочку» призмы (ее «че-
хол»). В целом зрелая эмаль выглядит как
конгломерат тесно спрессованных призм с
очень тонкими прослойками межпризменного
пространства, в котором кристаллы ориентиро-
ваны под углом к призмам, а плотность их упа-
ковки вновь возрастает, не достигая, однако,
такой степени, как в призмах.
Органическая основа эмали уни-
кальна. Она не содержит белков, свойственных
матриксу других соединительнотканных струк-
тур, включая кости и дентин. В ней нет ни кол-
лагена, ни протеогликанов, ни костных или ден-
тиновых гликопротеинов. Преобладающим бел-
ком, вырабатываемым амелобластами (и только
ими!), является амелогенин. Во время секретор-
ной стадии он составляет 90% органического
матрикса эмали (по некоторым данным - даже
97%). Остальные белки - амелобластин и эна-
мелин. Не нашли подтверждения сообщения о
наличии туфтелинов, амелинов и других белков,
считавшихся поначалу самостоятельными.
Аминокислотный состав белков эмали
представлен в табл. 12-1. Единственное, что
роднит их с коллагеном - это высокое содер-
жание пролина. В амелогенинах оно достигает
23-28%, а в остальных — вдвое ниже. Вместе с
тем, глицина в амелогенинах почти в 10 раз
меньше, чем в коллагене. Даже в амелобласти-
нах его доля достигает лишь 7-9%, т.е., слиш-
ком мала, чтобы обеспечить чередование триа-
ды ...-гли-про-Х-..., присущее коллагенам.
Следовательно, полипептидные цепи эмалевых
белков неспособны формировать коллагеновую
спираль и фибриллярные структуры типа тро-
поколлагена. Более того, в белках эмали со-
вершенно отсутствуют гидроксилнзин и гидро-
ксипролин. Значит, здесь не могут возникать
Таблица 12-1
Процентный состав аминокислот в белках эмали
Амино- кислота АМЕЛОГЕНИНЫ ЭНАМЕЛИНЫ АМЕЛОБЛАСТИНЫ
Чх Чу Бх Бу Св Мы ч Св Мы Ч Б Кр
Ала 1,7 2,8 2,5 2,8 2,9 3,9 3,3 3,3 5.1 8,3 7,8 8,1
Apr 1,1 2,3 1,0 1,7 1,7 1.1 5,4 5,3 4,0 3,1 3,5 2,5
Асн 1,1 1,1 1.5 2,8 1,7 1.1 8,0 7,9 9,2 3.1 2,8 3,5
Асп 1,7 1,7 1,5 1,7 1,7 1,1 3,7 4,0 3,1 5,0 3,3 3,0
Вал 5,2 5,7 4,6 6,3 3,5 3,9 2,9 3,1 3,4 2,3 3,8 4,3
Гис 8,0 7,4 7,6 7,4 8,1 7,7 2,8 2,4 1,7 2,6 1,8 3,3
Гли 3,4 3,4 3,0 3,4 4,1 4,1 7,8 7,1 7.4 8,8 11,8 10,4
Глн 13,7 15,3 16,3 14,2 14,5 14,4 7,7 8,1 6,3 7,1 7,8 7,6
Глу 2,9 2,8 2,5 2,8 2,9 3,3 7,3 7,2 6,0 5,9 5,8 5,8
Иле 4,0 3,4 3,0 4,0 4,0 3,9 2,8 2,7 2,8 1,4 1,3 1,8
Лей 7,4 9,1 9,2 8,5 9,3 9,4 4,4 4,7 3,9 9,7 8,4 8,8
Лиз 1,7 1,7 2,0 1,7 1,7 1,7 4,5 3,9 5,8 3,6 3,0 2,3
Мет 5,7 5,1 5,6 4,0 5,8 5,0 1,7 2,3 2.1 5,2 4,1 4,0
Про 28,0 23,3 26,9 25,6 22,5 24,3 14,0 14,3 15,3 15,2 14,9 16,2
Сер 3,4 4,0 3,0 3,4 4,6 6,6 8,2 8,1 8,3 6,9 7,8 6,1
Тир 4,0 3,4 3,0 4,0 3,5 3,3 4.3 4,4 4,0 2,1 2,8 2,8
Тре 4,0 4,0 3,0 2,3 4,1 3,3 5,2 6,0 5,6 5,0 4,6 5,0
Три 1,7 1,7 1,5 1.7 1.7 1.7 1.4 1.3 1.3 0,7 0,8 0,8
Фен 1,1 1,7 2,0 1,7 1,7 1,7 3,6 3,4 4,1 4,3 3,8 3,8
Цис 0 0 0 0 0 0 0,5 0,5 0,4 0 0 0
Всего АО 175 176 197 176 173 180 1104 1104 1236 421 381 396
Сокращения:
Чу и Чу - белки человека, гены которых расположены в хромосомах X и Y; Бх и Бу- бычьи белки, коди-
руемые генами в хромосомах X и Y; Св - белки свиньи; Мы - белки мыши; Кр - белки крысы.
426
Глава 12
ковалентные сшивки между молекулами (равно
как и дисульфидные мостики в амелогенинах и
амелобластинах, совершенно лишенных цис-
теина). Общим для всех белков эмали является
высокое содержание аминокислот с крупным
гидрофобным радикалом, - оно достигает 25%,
и лишь в энамелинах чуть ниже.
Амелогенин вносит решающий вклад в
формирование нормальной эмали. У человека
этот белок на 90% является продуктом одного
из генов Х-ромосомы, мутации которого (их
выявлено уже 8) приводят к врожденным де-
фектам эмали (несовершенный амелогенез).
Остальная часть - продукт Y-хромосомной ко-
пии амелогенинового гена. Постсинтетическая
модификация сводится лишь к фосфорилиро-
ванию радикала серина в положении 16. Глико-
зилирование отсутствует, хотя в молекуле есть
подходящие для этого места. Зрелая молекула
амелогенина состоит из единственной поли-
пептидной цепи (менее 200 АО), преобладаю-
щая часть которой изобилует неполярными
радикалами. В коротком С-концевом отрезке
сосредоточены аспартат и глутамат, высту-
пающие на поверхность глобулы, образуемой
белком. После секреции в матрикс эти глобулы
подвергаются спонтанной самоагрегации, -
в основном за счет гидрофобных взаимодейст-
вий. В результате быстро возникают сферичес-
кие образования («наносферы») диаметром
20 нм или больше. На поверхность их тоже вы-
ступают карбоксильные группы С-концевых
фрагментов амелогенина, придавая наносферам
способность взаимодействовать с апатитами.
Амелобластин и энамелин соответственно
вдвое и в 5-6 раз крупнее амелогенина. В отли-
чие от последнего, они несут единичные угле-
водные фрагменты, структура которых, однако,
пока не выяснена. Энамелин содержит также
несколько фосфатных групп. Он очень прочно
связан с кристаллами, но быстро исчезает из
эмали в начале стадии созревания. Амелобла-
стин, напротив, имеет слабое сродство к апати-
ту и, кроме того, отличается биполярностью:
положительные заряды сосредоточены bN-koh-
цевом участке молекулы, а отрицательные - в
С-концевом. В развивающемся матриксе эмали
этот белок рано подвергается ограниченному
протеолизу, после которого N-концевые фраг-
менты концентрируются в «оболочках» эмале-
вых призм, тогда как С-концевые - в самих
призмах и межпризменном пространстве. Как и
амелогенин, амелобластин существует в не-
скольких изоформах, возникающих в резуль-
тате альтернативного сплайсинга мРНК.
Минерализация эмали стартует с са-
мого начала секреторной стадии. Способ заро-
ждения кристаллов гидроксиапатита остается
пока невыясненным. Твердо установлено, что
матриксные везикулы в эмали не появляются.
Не работает здесь и механизм прямой кристал-
лизации на заранее подготовленных центрах
(типичный для зрелой кости и дентина), ибо в
эмали нет ни коллагеновых структур, ни соот-
ветствующих гликопротеинов. Наконец, гипоте-
за о прорастании уже имеющихся минералов
дентина в эмаль тоже отвергнута, так как даже
начальные кристаллы эмали четко обособлены
от минеральной фазы дентина. Остаются лишь
предположения, что сиалофосфопротеины по-
верхности дентина каким-то образом способст-
вуют зарождению кристаллов в амелогениновом
слое, возникающем на дентино-эмалевой грани-
це. Не исключается, впрочем, и возможность по-
явления зародышевых кристаллов рядом с мем-
браной амелобластов, - опять-таки, в среде, со-
стоящей почти исключительно из амелогенина.
Так или иначе, но первичная минерализа-
ция эмали происходит очень быстро. Уже в
первые минуты после секреции амелогенина на
границе с дентином вдруг возникают много-
численные тонкие (1,5 нм) кристаллы гидро-
ксиапатита с заметной примесью карбонатапа-
тита. Они сильно вытянуты в направлении
движения амелобластов и своими боковыми
гранями образуют ионные связи с наносферами
амелогенина. Фиксируясь на кристаллах, эти
наносферы определяют расстояние между ни-
ми (20 нм) и блокируют их боковой рост
(утолщение), но не мешают отложению мине-
ралов по торцам. Поэтому на протяжении сек-
реторной стадии кристаллы растут только в
длину. В итоге к концу стадии создается около
14% будущей минеральной фазы эмали.
С переходом в стадию созревания эмали
кристаллы перестают расти в длину и начина-
ют утолщаться. Такую возможность создает
удаление амелогеннновых наносфер под дейст-
вием протеиназ, к выработке которых присту-
пают функционально перестроившиеся аме-
ЗУБЫ. СЛЮНА
427
лобласты. Начальную атаку осуществляют мат-
риксные металлопротеиназы (особенно ММП-
20). Они удаляют заряженный С-конец амело-
генина, прекращая тем самым фиксацию нано-
сфер на кристаллах. Гидрофобные остатки на-
носфер постепенно тоже подвергаются частич-
ной фрагментации этими ферментами (рис.
12-1). Более глубокую деградацию белков мат-
рикса производят малоспецифичные протеина-
зы из числа сериновых. Образующиеся пепти-
ды захватываются клетками, где подвергаются
тотальному протеолизу.
Почти полное удаление белков из эмали
завершается в середине стадии созревания.
К этому моменту накапливается около 50%
минеральной фазы (вдобавок к упомянутым
14%). Остальные 30-35% минералов отклады-
ваются уже после расчистки белков. Это зна-
чит, что рост кристаллов происходит теперь за
счет их экспансии в остаточные, заполненные
водой межкристаллические пространства. Объ-
емная доля воды, высокая в период секретор-
ной стадии (50-60%), снижается до 40% к мо-
менту удаления белков, после чего убывает
еще примерно втрое. Оккупация кристаллами
водных пространств вызывает дегидратацию
матрикса и ведет к формированию крупных,
часто смыкающихся кристаллов, что обеспечи-
вает исключительную твердость и прочность
эмали.
Отложение минералов сопровождается
подкислением среды. В расчете на ячейку кри-
сталлической решетки ГАП освобождается
обычно 8 протонов (уравнение [12-1]).
Поскольку эмаль фактически изолирована
от сосудистого русла, становится проблемой
Рис. 12-1. Роль эмалевых белков и процессов протеолиза в биогенезе эмали:
1 - секреция белков эмали «ранними» амелобластами; 2 - спонтанная агрегация амелогениновых молекул
с образованием «наносфер»; 3 - удлинение первичных кристаллических «нитей» путем торцовой минерализации;
4 - протеолитическое удаление С-концевых анионных пептидов с поверхности наносфер;
5 - начало бокового роста минеральной фазы; 6. 7 - протеолиз гидрофобной сердцевины наносфер протеиназами
вплоть до почти полного исчезновения белков, сопровождаемый утолщением кристаллических образований.
428
Глава 12
согласование доставки минеральных веществ в
матрикс с удалением из него протонов и избы-
точной воды. Природа разрешила это противо-
речие путем организации цикличной работы
амелобластов стадии созревания. Половину
каждого цикла клетки энергично транспорти-
руют в матрикс не только протеиназы, но и ио-
ны Са2+ и фосфата, необходимые для включе-
ния в кристаллическую решетку гидроксиапа-
тита. Кроме того, именно в этот период вблизи
апикальной мембраны клеток появляется ак-
тивная карбоангидраза. Сильно ускоряя гидра-
тацию метаболического СО2, она способствует
образованию бикарбоната, который тоже сек-
ретируется в матрикс.
Вне клеток карбоангидраза отсутствует.
Однако катализируемая ею обратимая гидрата-
ция СОз (ур-ние [11-8]) легко протекает и
спонтанно, достигая равновесия в течение 30 с.
Поэтому освобождаемые в матриксе протоны
быстро нейтрализуются бикарбонатом (ур-ние
[12-2]), который поступает из клеток.
рых в плазме крови много выше, чем в эмале-
вой жидкости. Избыток протонов, напротив,
покидает эмалевую жидкость, и ее pH быстро
возвращается к физиологическому уровню
(7,2-7,4). По завершении такой «корректиров-
ки» ионного состава эмалевой жидкости аме-
лобласты претерпевают очередную перестрой-
ку (занимающую последнюю четверть цикла),
после чего вступают в следующий из много-
кратно повторяющихся циклов. Точная про-
должительность каждого из них установлена
пока только для резца крыс, -8 ч. Следова-
тельно, за 15 дней созревания эмали у них по-
вторяется 45 таких циклов.
В одном и том же состоянии пребывают
одновременно не все амелобласты стадии со-
зревания, а только полоса их, кольцеобразно
охватывающая коронку. Переход их в следую-
щее функциональное состояние сопровождает-
ся трансформацией соседней круговой полосы
клеток. Волны такой модуляции клеток прохо-
дят одна за другой по всей поверхности эмали.
10 Са2’ + 6 НРО42- + 2 Н2О-----> Caio(P04)6(OH)2 + 8 Н+ [12-1]
8H+ + 8HCOf -> 8Н2О + 8СО2
[12-2]
Эта нейтрализация протонов не вполне
успевает за темпом их появления. Из-за этого в
эмалевой жидкости наряду с увеличением кон-
центрации СО2 происходит неуклонное сниже-
ние pH (до 6,8-6,1).
По-видимому, именно подкисление эмале-
вой жидкости служит сигналом для перехода
амелобластов в состояние второй фазы, зани-
мающей примерно четверть цикла. Снижается
функциональная активность клеток, изменяет-
ся внешний вид мембраны, а главное - «раз-
рыхляются» плотные межклеточные соедине-
ния. Во все иные времена они служат барье-
ром, который герметизирует эмаль снаружи и
проницаем только для газов. Теперь же через
«приоткрытые» пространства между амелобла-
стами свободно проходит вода с растворенны-
ми в ней веществами. Этим обеспечивается
устранение возникшего ионного дисбаланса
между эмалевой жидкостью и межклеточной
жидкостью, которая по составу практически
тождественна плазме крови (не считая белко-
вых компонентов). В частности, в эмаль посту-
пают ионы Са2+ и НСОз”, концентрации кото-
Это продолжается до полного завершения по-
строения эмалевого покрытия коронки зуба,
когда амелобласты подвергаются регрессии и
отмирают путем апоптоза по мере прорезыва-
ния зуба (исчезает так называемая «врожден-
ная пелликула»).
Именно поэтому зрелая эмаль не содержит
клеток и неспособна к регенерации прн повре-
ждении. Однако процессы деминерализации и
реминерализации протекают постоянно благо-
даря реакциям ионного обмена, направлен-
ность которых в значительной степени опреде-
ляется составом ротовой жидкости и слюны
как ее главного компонента.
12.2. СЛЮНА
Почти всю слюну (99%) производят три
пары больших слюнных желез. Основную до-
лю вносят подчелюстные, вдвое меньшую -
околоушные, и лишь 5% - подъязычные желе-
зы. Два типа секреторных клеток определяют
белковый состав слюны - сероциты и мукоци-
ты. Секрет первых жидкий, богат белками (се-
ЗУБЫ. СЛЮНА
429
розный секрет). Вторые выделяют вязкую, тя-
гучую слюну с высоким содержанием своеоб-
разных гликопротеинов - муцинов (слизистый
секрет). Мукоциты преобладают в подъязыч-
ных железах, а в подчелюстных составляют
20% железистых клеток. Малые слюнные же-
лезы заднего отдела полости рта вырабатывают
слизистую слюну, переднего - смешанную, и
только железы фон Эбнера (в желобоватых со-
сочках языка), как и околоушные, производят
чисто белковый секрет. Общее содержание
белков в смешанной слюне на порядок ниже,
чем в плазме крови, и колеблется обычно в
пределах 0,2-0,4%.
Низкомолекулярные вещества попадают в
слюну в основном путем диффузии из межкле-
точной жидкости. Поэтому состав их отражает
весь спектр органических метаболитов крови
(глюкоза, аминокислоты, лактат, цитрат, вита-
мины, мочевина, мочевая кислота, креатинин и
т.д.), концентрации которых, однако, гораздо
ниже, чем в плазме. Набор минеральных ве-
ществ тоже соответствует плазме крови и меж-
клеточной жидкости, но соотношение ведущих
ионов резко отличается (см. ниже, табл. 12-4).
Секреция слюны не является спонтанным
процессом. Она осуществляется в ответ на воз-
действия нейромедиаторов. В отличие от дру-
гих экзокринных желез, секреция белков и вы-
деление жидкости регулируются в слюнных
железах раздельно. Образованию жидкой фазы
ацинарными клетками способствует стимуля-
ция мускариновых холинорецепторов и оц-ад-
ренорецепторов, эффекты которой опосредует
внутриклеточный Са2+-зависимыЙ механизм. А
секрецию белков индуцирует 0-адренергичес-
кая стимуляция, которая через систему цАМФ
способствует экзоцитозу секреторных гранул,
богатых белками.
Во сне слюна почти не выделяется. В днев-
ные часы скорость секреции у взрослых состав-
ляет в среднем 0,32 мл/мин и возрастает до
2-7 мл/мин во время приема пищи. В возрасте
5 лет эти цифры чуть ниже - соответственно
0,26 и 1,5-6 мл/мин. За сутки взрослый человек
производит в среднем 600 мл слюны, а 5-летний
малыш - около 500 мл. Примерно 60% этих
объемов приходится на периоды приема пищи,
средняя продолжительность которых за день
достигает 60 мин (у детей - 80 мин).
Полость рта находится в начале и пищева-
рительного тракта, и дыхательных путей. Этим
обусловлено функциональное предназначение
слюны как главного компонента ротовой жид-
кости:
- - формировать влажное и скользкое по-
крытие («смазку») поверхности зубов и слизи-
стых оболочек, необходимое для смягчения ме-
ханических воздействий пищи;
- обеспечивать антимикробную защиту
этого обволакивающего покрытия, а также ле-
жащих под ним тканей;
- создавать условия для поддержания дол-
говечности эмали - единственной минеральной
структуры, которая прямо контактирует с
внешней средой, но выведена из процессов ме-
таболизма и даже не защищена какими-либо
клеточными слоями.
Первую из этих задач решают главным об-
разом муцины. Вторая задача - подавление
микрофлоры - выполняется преимущественно
белками серозного секрета (в том числе фер-
ментами). Наконец, решение третьей задачи
обеспечивается путем регулирования мине-
рального состава слюны, которое осуществля-
ют в основном клетки выводных протоков
(слюнных трубок), а также минералсвязываю-
щие белки серозного секрета.
12.2.1. МУЦИНЫ
Среди белков смешанной слюны на долю
муцинов приходится более 15%. В качестве
главного компонента они входят и в состав
слизи, покрывающей поверхность дыхатель-
ных, пищеварительных и мочеполовых путей.
Следует отметить, одиако, что многие муцины
являются мембранными белками; их сильно
доминирующий внеклеточный участок зачас-
тую может отщепляться, становясь компонен-
том собственно слизи.
Несмотря на изобилие углеводных фраг-
ментов (50-90% массы молекулы), муцины от-
носят к гликопротеинам, так как представлены
эти фрагменты олигосахаридами, а не гликоза-
миногликанами, длинные цепи которых - от-
личительный признак протеогликанов.
Многообразие муцинов обеспечивается
микрогетерогенностью углеводных структур, а
также особенностями строения и размерами ко-
430
Глава 12
рового белка (апомуцина), который может на-
считывать от нескольких сотен до более чем
5 000 АО. По крайней мере, в некоторых апому-
цииах присутствуют домены фактора ФВ (ино-
гда повторяющиеся), а также участок сходства с
ингибитором трипсиноподобных протеиназ.
Общая черта многих апомуцинов - тан-
демные повторы доменов, богатых серином и
треонином. Не на всех, но на большинстве из
этих аминокислот обычно и строятся олигоса-
харидные структуры, - линейные или разветв-
ленные. Они варьируют по размерам (чаще от 4
до 12 моносахаридных единиц), степени ветв-
ления, антигенным и иным функциональным
свойствам, зависящим в основном от строения
концевых звеньев олигосахарида (фукоза, сиа-
ловые кислоты, наличие сульфогрупп и т.д.).
Гликозилирование апомуцина делает белок
устойчивым к протеиназам - собственным,
пищевым или микробным. Кроме того, тесная
укладка углеводных «веточек» образует как бы
чехол и заставляет белковую молекулу прини-
мать вытянутую форму. Лишь концевые участ-
ки полипептидной цепи, почти лишенные оли-
госахаридов, организованы в глобулы, стаби-
лизированные дисульфидными связями.
Секреторные муцины (в том числе слюн-
ные) выделяются в среду в виде готовых муль-
тимеров, состоящих из множества мономерных
звеньев апомуцина. Каждое из них участвует в
процессах полимеризации обеими своими кон-
цевыми глобулами. Вскоре после завершения
биосинтеза полипептидной цепи и удаления
сигнального пептида появляются S-S-мостики
между С-концевыми глобулами двух молекул
апомуцина. Образовавшиеся димеры, попадая
затем в аппарат Гольджи, подвергаются интен-
сивному гликозилированию: на вытянутом
межглобулярном фрагменте каждого мономера
строятся многие десятки олигосахаридных «ве-
точек». К концу этой процедуры димеры до-
стигают транс-цистерн с их слегка кислой сре-
дой, где и происходит создание мультимерных
ансамблей. Реализуется оно путем образования
S-S-связей между тремя димерами. Каждый из
них участвует в этом процессе одной из своих
N-концевых глобул, тогда как другая анало-
гичным образом взаимодействует с такими же
концами еще двух димеров (рис. 12-2). В итоге
получается разветвленная структура, причем,
Рис. 12-2. Фрагмент полимеризованного муцина
(схема).
между точками ветвления всегда располагается
димерный фрагмент. И только после этого
происходит секреция готовых полимеров.
Несмотря на некоторые структурные осо-
бенности мономерных единиц, в целом слюн-
ные муцины по своим свойствам близки анало-
гичным молекулам других слизей. Это, прежде
всего, свойство эластичной вязкости слизистых
секретов. Оно обусловлено разветвленностью
муциновых мультимеров и изобилием в них уг-
леводных цепей, связывающих много воды. Об-
волакивая эпителиальные покровы, муцины за-
щищают их от дегидратации и от прилипания
бактерий, выполняют роль хорошей смазки (на-
пример, при глотании). И еще: своими олигоса-
харидными цепями они экранируют поверхно-
стные адгезины многих микробов, благодаря
чему затрудняют бактериальную колонизацию
полости рта и зубной эмали. Составляя физиче-
ский барьер для макромолекул, слой муцина,
вместе с тем, легко проницаем для воды, ионов
и простых вешеств.
Деградация муцинов наступает под дейст-
вием наиболее агрессивных микробов из числа
поглощенных слизью. Для выделяемых ими
гидролаз поначалу доступны только углеводные
цепочки, на концах которых и происходит
постепенное отщепление по одному моносаха-
ридному фрагменту. В ротовой полости процесс
этот только намечается, а в основном протекает
после поступления муцинов в тонкий кишечник.
ЗУБЫ. СЛЮНА
431
И лишь в толстой кишке, когда апомуцины
остаются совсем без олигосахаридной защиты,
они подвергаются тотальному протеолизу (с
утилизацией аминокислот микрофлорой).
12.2.2. БЕЛКИ СЕРОЗНОГО СЕКРЕТА
В отличие от мукозных клеток, серопиты
вырабатывают целый спектр белков, включая
ферменты. Краткое описание их приведено в
таблицах 12-2 и 12-3. Сюда включены только
те, для которых строго доказан факт их экс-
прессии в секреторных клетках. Многие фер-
менты и вообще белки, обнаруживаемые в
слюне, происходят из клеток окружающих тка-
ней (лейкоциты, макрофаги, тучные клетки)
или из плазмы, проникая путем диффузии че-
рез межклеточную среду и стенки слюнных
протоков. Поэтому содержание их в слюне
очень невелико. Это относится и к альбумину,
уровень которого считается показателем пас-
сивного попадания в слюну белков плазмы.
Таблица 12-2
Важнейшие макромолекулы белкового секрета слюнных желез человека
Белки, богатые пролином (ББП) Составляют до 70% белков паротидной слюны. Содержат 40-45% пролина и по 20% гли- цинв и аспвртата/аспарагина. Гетерогенность (от 6 до 36 кДа) обусловлена нвличием 6 разных генов и постсинтетической модификацией (протеолиз, фосфорилирование или гликозилирование). У N-конца сосредоточены аспартат и фосфосерин, а в С-концевой стороне - пролин, глицин и аспврагин, участвующие в связывании ряда бактерий и гри- бов. Обладая сродством к Са2+, ББП обеспечивают высокий уровень его в жидкой фазе, не допуская при этом появления камней в слюнных протоках. В составе пелликулы ББП действуют как мощные ингибиторы роста кристаллов ГАП и отложения кальциевых со- лей. Осаждвя таннины, ББП защищают организм от этих токсинов.
Гистатины Минорные (менее 1%) белки, богатые гистидином (до 20%). Двв главных варивнта (36 и 32 АО) кодируются разными генами. Почти все остатки гистидина, а также лизинв и арги- нина сосредоточены в N-концевой половине молекулы, придавая ей антибактериальную и мощную фунгицидную активность. С-концевая часть содержит кислые остатки аспарта- та и богата гидрофобными радикалами. Биологическую вктивность сохраняют и все 10 продуктов процессинга, насчитывающие от 7 до 25 АО. Гистатины угнетают выделение гистамина тучными клетками, нейтрализуют эндотоксины бактериальной стенки и участ- вуют в соэдвнии пелликулы зуба. Их выработка резко падает при СПИДе.
Статерин Кислый (pl 4,22) фосфопротеин (43 АО), выявленный только в слюне (менее 5%), слезах и слизи носовых ходов (менее 1%). Вместе с БПП стабилизирует перенасыщенность слюны фосфатами кальция. Гидрофобный С-конец богат глутамином, пролином и круп- ными неполярными радикалвми. Несущий заряды N-концевой фрагмент ...-асп-сер-сер- глу-глу-лиз-... (оба саринв в нвм фосфорилированы) придает способность сорбироваться нв поверхности эмали. В составе пелликулы зуба статерин препятствует осаждению солей кальция и росту кристаллов ГАП, в также способен связывать некоторые бактерии и грибы.
Цистатины Очень распространенная группа ингибиторов цистеиновых протеинвз. Онв включает се- мейство кининогенов (цистатины типа III). В слюне представлены белки другого семейст- ва (цистатины типв II), которые отличаются малыми размерами (около 120 АО), нвличием фосфатных групп и двух S-S-мостиков. Кроме слюны (до 5% белкового составе), они об- наруживаются (менее 1%) только в слезах (цистатин D), в мочв и сперме (цистатин S). Главное предназначение - защита от протеиназ бактеривльного и воспалительного про- исхождения. В этом же ряду стоят их антивирусные и противоопухолевые эффекты.
Лвктоферрин Содержится в экзокринных секретах, включая молоко и слюну, в также в нейтрофилах и других клетках. Белок состоит из 700 АО, причем С-концевая половине является почти копией N-концевой. Каждая имеет центры связывания Fe3+ и анионв (обычно НСОа" ). В молекуле выявлено 3 учвстка по 5-7 АО, способных блокировать опиоидные рацепторы. Лактоферрин ослабляет пвтогенный потенциал Haemophilus influenzae путем избира- тельной инактивации протеиназы 1дА1 и одного из адгезинов внешней мембраны этих бактерий.
432
Глава 12
Таблица 12-3
Ферменты слюны
а-Амилаза Фермент широко респространен (включая микробов). Расщепляет крахмал до трисахари- дов или более крупных фрагментов. Слюнная амилаза близка панкреатической, но коди- руется другим геном. Она состоит из =500 АО, богата S-S-мостиками и связывает Са2+, нужный для ферментативной активности (которая при захвате белком иона СГ резко воз- растает). Составляет >15% от всех белков слюны (в слезах и других секретах - менее 1%). Угнетает рост Neisseria gonorrhoeae и связывается с рядом стрептококков (спектр сродства к которым сильно изменяется при денатурации фермента).
Карбоангидраза Слюнные железы выделяют лишь карбоангидразу VI - одну из 8 форм этого Zn2+- металлоэнзима, ускоряющего обратимую гидратацию СОг. Состоит из =300 АО, содержит S-S-мостик и 2 олигосахарида. Эта секреторная форма есть и в молоке; она отлична от митохондриальной, цитозольных и мембраносвязанных вариантов, имеющихся в клетках крови, почек, мозга и т.д.
Лизоцим Назван по лизирующему действию на бактерии. Оно обусловлено мурамидазной активно- стью, обеспечивающей гидролиз р(1—»4)-связи (Н-ацетил)глюкозамина с его О-лактиль- ным аналогом (мурамовая кислота) в пептидогликанах клеточной стенки прокариотов. Лизоцим широко распространен в природе и является одним из факторов примитивной защиты («врожденный иммунитет»). В слюне его доля невелика (менее 1%), а в слезной жидкости, слизи носа и бронхов превышает 15% белкового состава.
Калликреин (КК) Калликреины - группа сериновых протеиназ, способных к протеолизу кининогенов с обра- зованием вазоактивных пептидов - кининов. Слюнной КК представляет собой гликопроте- ин, идентичный почечному и панкреатическому, но отличный от изоформ других тканей (включая простату) и, особенно, от плазменного КК. Избирательно освобождает каллидин (лизил-бредикинин). Синтезируется в виде профермента. Роль в слюне пока неясна, хотя недавно выявлена его способность к ограниченному протеолизу ББП. Повышенный уро- вень КК в слюне отмечен при снижении потребления натрия и при опухолях разной лока- лизации.
Лакто- пероксидаза Внеклеточный гемопротеин, окисляющий многие субстраты за счет Н2О2 и потому обла- дающий широким спектром антимикробного действия. Слюнной вариант фермента выра- батывается в виде предшественника с очень крупным пропептидом. Зралый белок (> 600 АО) идентичен гемопротеину молока и состоит из двух S-S-связанных цепей, имеющих по 5 углеводных фрагментов. Изоформы фермента содержатся и в других секретах и во мно- гих тканях. Весомый вклед в пероксидазную активность ротовой жидкости вносит лейко- цитарная миелопероксидаза, которой особенно много в нейтрофилах (2-4% массы клет- ки). Врожденная недостаточность миелопероксидазы часто сопровождается различными грибковыми поражениями.
Преобладает в серозном секрете группа
родственных белков, обозначаемых как «.белки,
богатые пролином» (ББП). Они строго специ-
фичны для слюны, как и минорные белки гис-
татины. Кислый фосфопротеин статерин
есть не только в слюне (до 5% от всех белков),
но и в слезах и в слизи дыхательных путей
(менее 1%). Гораздо шире распространены цис-
татины (ингибиторы цистеиновых протеиназ)
и железо-связывающий гликопротеин лакто-
феррин, которого особенно много в молоке,
слезной жидкости, слизи носовых ходов и брон-
хов, а также в нейтрофилах. Из минорных бел-
ков наиболее известен липокалин-1 из желез
фон Эбнера. Этот небольшой секреторный про-
теин подобен ретинол-связывающему и другим
белкам, осуществляющим транспорт липофиль-
ных веществ. Считается, что липокалин-1 уча-
ствует в восприятии вкусовых ощущений.
Почти все главные компоненты белкового
секрета обладают противомикробным действи-
ем. Одиако механизм его и степень избира-
тельности различны. Нередко оно обусловлено
связыванием с бактериями (иногда - и с гриба-
ми), что затрудняет их размножение и образо-
вание колоний. Это свойственно белкам, бога-
тым пролином (ББП), статерину, ферментному
белку а-амилазе, а также уже упоминавшимся
муцинам. Гораздо сильнее бактериостатиче-
ский эффект лактоферрина, который обладает
ЗУБЫ. СЛЮНА
433
исключительно высоким сродством к Fe3+ и,
обедняя среду железом, делает его недоступ-
ным для микробов. Выявлены и более избира-
тельные эффекты лактоферрина, включая бак-
терицидное действие благодаря соединению с
особыми рецепторами ряда микробов, а также
связывание с гликозаминогликанами мембран
эукариотических клеток, препятствующее про-
никновению вирусных частиц в клетки хозяи-
на. Цистатины реализуют свою антибактери-
альную и противовирусную активность иначе -
через способность угнетать цистеиновые про-
теиназы. Но наиболее мощным антимикроб-
ным действием обладают гистатины, в N-koh-
цевой части которых сосредоточены почти все
остатки лизина, аргинина и гистидина. Их по-
ложительные заряды обеспечивают легкость
связывания белка с биомембранами, эффектив-
ная деструкция которых лежит в основе на ред-
кость сильной фунгицидной и выраженной
бактерицидной активности гистатинов.
Преобладающие ферментные белки слюны
(см. табл. 12-3) лишь немного отличаются от
своих аналогов, встречающихся обычно во
многих других секретах и тканях. Прямым бак-
терицидным действием обладают только два
фермента: лизоцим, расщепляющий пептидо-
гликановые полимеры наружной оболочки
прокариотов, а также лактопероксидаза. Анти-
бактериальные и противогрибковые эффекты
последней основаны на окислительном повре-
ждении клеточных мембран и усиливаются
аналогичным действием миелопероксидазы
нейтрофилов, всегда присутствующей в рото-
вой жидкости.
Перечисленные антимикробные эффекты
отражают работу системы врожденной невос-
приимчивости к инфекциям. Более специфиче-
ские процессы возможны благодаря наличию в
слюне секреторных IgA. Этот преобладающий
иммуноглобулин слизистых оболочек синтези-
руется В-лимфоцитами и попадает в слюну
только после объединения с секреторным ком-
понентом, вырабатываемым слюнными желе-
зами. Иммунный ответ, реализуемый с участи-
ем таких антител, может быть либо следствием
локальной индукции антигеном, либо частью
генерализованной реакции на воздействие чу-
жеродных агентов в других участках желудоч-
но-кишечного тракта и дыхательных путей.
Типичное свойство белков слюны - муль-
тифункциональность. Например, наряду с ан-
тимикробным действием, лактоферрин спосо-
бен блокировать опиатные рецепторы; гиста-
тины подавляют выделение гистамина тучны-
ми клетками и нейтрализуют липополисаха-
ридные эндотоксины бактерий; ББП осаждают
таииин и другие полигидроксифенолы, блоки-
руя опасные эффекты этих растительных ток-
синов (есть данные, что ББП участвуют также
в обеспечении чувствительности к горькому).
Антимикробные свойства белков слюны
часто сочетаются с высоким сродством к ионам
Са2+. Эти качества обычно поляризованы, что
обеспечивается асимметричностью первичной
структуры молекул. В частности, у гистатинов
кислые остатки аспартата (вместе с неполяр-
ными радикалами) находятся в С-концевой
стороне, а N-концевая несет положительные
заряды (см. табл. 12-2). Иначе выглядит асим-
метричность статерина и ББП. Здесь незаря-
женный С-конец преимущественно гидрофо-
беи, а в N-концевом участке сосредоточены
отрицательные заряды глутамата, аспартата
и фосфосерина. В любом случае, все эти белки
взаимодействуют с Са2+ только одним своим
участком — С-концевым (гистатины) или
N-концевым (статерин и ББП).
Связывая Са2+, перечисленные белки под-
держивают довольно высокий уровень этих
ионов в жидкой фазе - вплоть до некоторой
перенасыщенности ее в отношении фосфатов
кальция. Иными словами, эти белки препятст-
вуют осаждению кальциевых солей, в том чис-
ле появлению камней в слюнных протоках и на
зубах. Но они могут соединяться не только с
растворенными ионами Са2+, но и с кристалла-
ми ГАП. Сорбция эта осуществляется заряжен-
ным доменом и позволяет белкам покрыть по-
верхность зуба так, что неполярные регионы,
ориентированные в сторону раствора, могут
вступать в гидрофобные взаимодействия меж-
ду собой. Так возникает тонкая (2-4 мкм), но
довольно прочно «приклеившаяся» пленка -
приобретенная пелликула зуба. В ее составе
белки сохраняют способность мешать росту
кристаллов ГАП и отложению карбонатов и
фосфатов кальция. Сохраняют они и свой ан-
тимикробный потенциал, затрудняющий бак-
териальную колонизацию эмали. Впрочем, этот
434
Глава 12
потенциал распространяется далеко не на всю
микрофлору и отнюдь не столь эффективен,
как высокая кислотность желудочного содер-
жимого, обеспечивающая практически полную
его стерилизацию.
Поверхность пелликулы со стороны по-
лости рта не имеет четких границ. Благодаря
белок-белковым взаимодействиям на ней обра-
зуется так называемый зубной налет («зубная
бляшка»). Состав его непостоянен и формиру-
ется из белков слюны с включением компонен-
тов плазмы крови (в том числе альбумина),
проникающих через стенки слюнных протоков,
и мельчайших остатков пищи (например, крах-
мальных зерен). Налет начинает накапливаться
уже через 2 часа после чистки зубов. Тогда же
в нем обнаруживаются и клетки слущенного
эпителия, на поверхности которых легко ад-
сорбируются микроорганизмы. Особую роль
играют бактерии Streptococcus mutans: они спо-
собны синтезировать внеклеточный полисаха-
рид, который увеличивает объем зубной бляш-
ки и, обладая высокими адгезивными свойст-
вами, облегчает фиксацию микрофлоры на по-
верхности зуба. В благоприятных для своего
развития условиях микробные клетки очень
быстро размножаются и образуют колонии,
составляющие вскоре основную массу налета
(отсюда термин - микробная бляшка). Отсутст-
вие здесь гемоглобина или иных переносчиков
О2 ведет к недостатку кислорода в глубине ко-
лоний. В сочетании с изобилием пищевых ре-
сурсов это приводит к «хищнической» утили-
зации добычи, а именно - к преобладанию ана-
эробного пути распада углеводов и накопле-
нию молочной кислоты и аналогичных продук-
тов неполного окисления питательных ве-
ществ. Параллельно изменяется и состав мик-
рофлоры: аэробные организмы вытесняются
анаэробными, конечными метаболитами кото-
рых являются, как правило, органические ки-
слоты. Появление очагов подкисления среды
на поверхности зубной эмали (или корневого
дентина) способствует растворению кристал-
лов ГАП (см. ур-иие 11-6). Этот процесс деми-
нерализации лежит в основе появления и раз-
вития кариесиой деструкции. Установлено, что
частота кариеса у человека пошла вверх в
средние века, когда рафинированные продукты
(сахароза, кондитерские изделия и т.д.) начали
вытеснять растительную пищу, богатую клет-
чаткой. Недавно показано, что пораженность
детей кариесом, невысокая при суточном
потреблении не более 30 г простых сахаров,
резко возрастает при увеличении его до 45 г.
Важнее, однако, даже не количество, а частота
приема углеводов.
Уход за зубами является необходимой ме-
рой профилактики кариеса, а также вос-
палительных процессов в периодонте. Показа-
но, что двукратной ежедневной чистки вполне
достаточно для предотвращения опасного
уровня микробной колонизации зубного нале-
та. Напротив, невнимание к гигиене ротовой
полости способствует его утолщению, накоп-
лению микрофлоры, а затем и отложению каль-
ций-фосфатных и иных солей. Немногим более
10 дней достаточно, чтобы очаг кристал-
лизации превратился в зубной камень - мине-
рализованную микробную бляшку, прикреп-
ленную к эмали (или дентину) и усугубляю-
щую опасность деструкции и воспалительных
поражений зуба и периодонта.
12.2.3. МИНЕРАЛЬНЫЙ СОСТАВ СЛЮНЫ
Жидкая фаза слюны изначально формиру-
ется в ацинарных просветах благодаря согласо-
ванной работе ряда ионных переносчиков и
каналов. Роль пускового фактора играет сти-
муляция М-холииорецепторов и оц -адрено-
рецепторов слюнных желез. Она приводит к
частичному высвобождению депонированного
в клетках кальция. Вызванное этим повышение
концентрации Са2+ в цитоплазме активирует
каналы для К+ и СГ в апикальной мембране, а
также котранспортную систему Na+/K+/2C1~ в
базолатеральной области. В совокупности эти
три эффекта обеспечивают трансцеллюлярный
поток ионов СГ из межклеточной среды в аци-
нарный просвет. Накопление ионов СГ стано-
вится движущей силой для привлечения Na+,
проникающего через межклеточные контакты.
Осмотический градиент, создаваемый высоким
уровнем NaCl, вызывает приток воды, посту-
пающей в основном через клетки. Вместе с нею
в просвет попадают и другие неорганические
вещества («минорные»).
Так в ацинарных просветах формируется
«первичная» слюна. Эта изотоничная жидкость
ЗУБЫ. СЛЮНА
435
по электролитному составу не очень отличается
от плазмы крови, но сильно изменяется, проходя
по слюнным протокам. Здесь происходит ин-
тенсивная реабсорбция Na+ и СГ, в 5-20 раз
снижающая их уровень в конечной слюне. Та-
кое падение лишь в малой степени восполняется
секрецией других иоиов, благодаря которой со-
держание К+ в слюне возрастает в 4-6 раз, а
HCOf - не более чем вдвое (табл. 12-4). Этого
недостаточно для компенсации убыли NaCl, и
потому к моменту поступления в рот слюна ста-
новится сильно гипотоничной: ее ионная сила
почти в 10 раз ниже, чем в плазме крови.
Таблица 12-4
Концентрация (ммоль/л)
важнейших минеральных веществ в слюне
(без стимуляции) и плазме крови
Вещество Слюна Плазма
Na+ 6,5-22 136-146
К+ 19-23 3,5-5,1
Са" 1,2-3,0 2,2-2,8
Мд" 0,4-0,9 0,6-1,1
2,2-6,5 0,9-1,5
НСОз" 10-20 21-28
СГ 5-20 100-110
F" (0,7-2,4)-Ю3 (1-3)-10'3
По содержанию остальных электролитов
(включая микроэлементы) столь резкого рас-
хождения между слюной и плазмой крови ие
наблюдается, если не считать существенно (в
2-4 раза) повышенной концентрации неоргани-
ческого фосфата в слюне.
Минеральные компоненты слюны необхо-
димы для создания оптимальной среды в по-
лости рта. Важное значение имеет, в частности,
регулирование кислотно-щелочного баланса.
Ведущую роль в этом играют бикарбонатная и
фосфатная буферные системы. Их потенциал в
слюне позволяет успешно противостоять фак-
торам, способным изменить кислотность рото-
вой жидкости. Среди таких факторов лидируют
лактат и другие органические кислоты, посто-
янно вырабатываемые микрофлорой. Интен-
сивность продукции кислот варьирует в широ-
ких пределах, но емкость буферных систем
слюны достаточна для поддержания pH рото-
вой жидкости в пределах, как правило, 6,5-7,4.
Обычная судьба минеральных веществ
слюны - попадание в желудочно-кишечный
тракт, где они подвергаются всасыванию на-
равне с такими же компонентами пищи и пить-
евой воды. Иными словами, слюна вовлечена в
общий круговорот минералов по системе:
плазма крови — слюна - пищеварительный
тракт — плазма крови. По этому пути проходит
лишь небольшая доля каждого из электроли-
тов, присутствующих в плазме крови. Тем не
менее, его наличие обеспечивает стабилизацию
минерального состава ротовой жидкости на
фоне возмущающих влияний компонентов пи-
щи и питья.
Из всех неорганических веществ слюны
функционально наиболее важны ионы Са2+ и
неорганического фосфата. Как уже отмечалось,
после прорезывания зуба эмаль оказывается
лишенной слоя амелобластов, которые ее соз-
давали. Поэтому зрелая эмаль не подвергается
обновлению процессами естественного мета-
болизма, которые свойственны всем другим
биологическим структурам. Более того, нет в
твердых тканях зуба и ремоделирования, при-
сущего костной ткани. Негативные последст-
вия этих особенностей преодолеваются благо-
даря процессам физико-химического обновле-
ния минеральной фазы путем ионного обмена.
Оно протекает не только на поверхности эма-
ли, но и в более глубоких слоях, куда Са2+ и
фосфат (как и другие электролиты) поступают
путем диффузии через эмалевую жидкость,
заполняющую межкристаллические простран-
ства. Изоионное замещение компонентов кри-
сталлической решетки ГАП кальцием и фосфа-
том из окружающей жидкости позволяет не
только обновлять структуру кристаллов, но и в
определенной мере осуществлять репарацию
возможных повреждений.
Нарушения кристаллической структуры
эмали не сводятся только к кислотному раство-
рению, упомянутому выше. Колебания мине-
рального состава жидкой фазы в окружении
зуба тоже могут способствовать усилению его
деминерализации. Например, полоскание рта в
течение 15-мин раствором сахарозы ведет к
значительному (на треть) обеднению зубного
налета фосфатом, поглощаемым микрофлорой.
Это способствует вымыванию фосфата из кри-
сталлов ГАП. По мере истощения (или удале-
ния) углеводов вакантные места, возникшие в
кристаллической решетке, могут вновь запол-
436
Глава 12
няться фосфатом, поступающим с новыми
порциями слюны. В определенных условиях
возможны и реакции изоморфного замещения,
описанные в разделе 11.2.3.
Таким образом, физико-химические про-
цессы деминерализации и реминерализации
постоянно протекают в зрелой эмали и варьи-
руют по интенсивности, в зависимости от
условий среды. Полноценное участие слюны в
кругообороте Са2+ и фосфата, в регуляции их
уровня в ротовой жидкости необходимо для
сбалансированности этих процессов, обеспечи-
вающей сохранность кристаллической струк-
туры эмали. Специфическое участие в поддер-
жании здоровья зуба принимают ионы фтора,
которые поступают в зрелую эмаль только че-
рез слюну и способны противодействовать
развитию кариеса.
12.2.4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ФТОРИДОВ
В небольших концентрациях F" препятст-
вует развитию кариозной деструкции зуба ки-
слотами, которые выделяют микроорганизмы
при изобилии легкоусвояемых углеводов. Од-
нако избыток фторидов приводит к аномалиям,
обозначаемым как флюороз. Это побудило де-
тальнее исследовать судьбу фторидов в орга-
низме.
Как известно, из-за высокой реактивности
фтор не встречается в природе в виде свободно-
го элемента. Содержание его соединений в поч-
вах обычно не превышает сотых долей процен-
та, но в некоторых регионах Южной Африки,
Индии, Китая, Казахстана, Украины и других
стран достигает 7-38 г/кг. Соответственно кон-
центрация растворимых фторидов в пресных
водах, как правило, не превышает 0,1-0,5 мг/л,
но нередко находится на уровне 0,6-1,5 мг/л,
а в упомянутых регионах может составлять
5-10 мг/л, а то и больше. В морской воде она ко-
леблется в более узких пределах (0,8-1.4 мг/л).
В организм человека соединения фтора
поступают в основном с питьевой водой; в
пищевых продуктах их очень мало (обычно
0,1-0,3 мг/кг, заметно больше в рыбе и чае).
Растворимые фториды почти полностью всасы-
ваются в пищеварительном тракте. Для них не
обнаружено механизмов активного транспорта
(подобных тем, что существуют, например, для
СГ) и вообще какого-либо связывания с бел-
ками. Трансмембранное перемещение ионов К
происходит на основе диффузионного равнове-
сия фтороводорода. Значит, их концентрация
будет выше с той стороны мембраны, где
меньше протонов (выше значение pH). Поэто-
му внутри клеток содержание фторидов ниже
внеклеточного и варьирует пропорционально
их уровню в плазме крови. С ним же устойчиво
соотносятся и концентрации F" в таких средах,
как слюна, жидкость десневой борозды, желчь
и моча.
Всасывание фторида в кишечнике затруд-
няют тяжелые металлы, образующие с ним
плохо растворимые соединения. Чаще всего
такую роль играет алюминий, который в виде
А1(ОН)з используется в медицине для пониже-
ния кислотности желудочного сока. Примене-
ние его более чем наполовину снижает усвое-
ние фтора (кстати, и фосфата тоже).
Удаление F" из организма осуществляют в
основном почки. Фториды свободно проника-
ют через эпителий клубочковых капилляров, а
канальцевая реабсорбция их относительно не-
велика. Об эффективности выведения F- сви-
детельствует высокое значение почечного кли-
ренса: у взрослых людей он составляет около
35 мл/мин (для сравнения: клиренс ионов хло-
ра, брома или йода обычно не превышает
1,0 мл/мин). С подкислением мочи реабсорб-
ция К возрастает (ибо она осуществляется пу-
тем диффузии HF). Поэтому состояние кислот-
но-щелочного равновесия заметно влияет на
почечное выведение фторидов: алкалоз благо-
приятствует ему, а ацидоз способствует за-
держке К в организме. В целом, однако, экс-
креция фторидов пропорциональна содержа-
нию их в крови и объему выводимой мочи.
Иными словами, у здоровых людей существует
прямая корреляция между содержанием фто-
ридов в питьевой воде и в моче.
Таким образом, попадая в организм в
очень небольших количествах, ионы фтора до-
вольно равномерно распределяются в нем и, не
вступая в какие-либо реакции, легко выводятся
почками. Только кости и зубы способны акку-
мулировать F-. Накапливая этот микроэлемент,
скелет выполняет роль своеобразного депо:
здесь заключено около 99% фторидов всего
тела. При дефиците их поступления в организм
ЗУБЫ. СЛЮНА
437
мобилизация из костной ткани способствует
поддержанию обычного уровня F" в жидкостях
тела (включая слюну) и мягких тканях. Поэто-
му временный дефицит фторидов не опасен
для здоровья.
Высокое сродство к твердым тканям обу-
словлено тем, что F" превосходит все прочие
ионы по способности замещать НО- благодаря
близости их ионных радиусов, одинаковым за-
ряду и степени гидратации. Начальная стадия
ионного обмена (диффузия в гидратный слой
кристалла) осуществляется быстро и легко об-
ратима. Последующие процессы связывания на
поверхности и, тем более, миграции в глубину
кристаллической решетки протекают гораздо
медленнее, а обратный переход в жидкую фазу
становится все более затруднительным. Поэто-
му динамика выхода поглощенного фторида из
кости имеет двуфазный характер. Быстрая фаза
(измеряемая неделями) отражает возврат F- с
поверхности кристаллов, т.е., касается «ла-
бильного» резерва (10-15% от всех запасов).
Выход же иоиов из глубоких слоев протекает
крайне медленно: обеднение фтором наполо-
вину протекает за 8 лет, в основном за счет
процессов ремоделирования.
Отмеченные особенности лежат в основе
возрастного накопления фторида в твердых тка-
нях. Так, у 20-30-летних людей содержание
фтора в компактной кости (в расчете на 1 кг зо-
лы) составляет 0,2-0,8 г, но достигает 1,0-2,5 г
после 70-80 лет. Сходная динамика отмечается и
в зубах, но здесь она менее значительна и каса-
ется в основном поверхностных слоев эмали
(толщиной до 50 мкм) и припульпарной зоны
дентина. В среднем же содержание фторид-иоиа
в дентине в 2-3 раза выше, чем в эмали, но (как
и в костной ткани) заметно ниже, чем в цементе.
Изоморфному замещению ионом F" под-
вергается лишь малая доля гидроксильных
групп кристаллической решетки апатитов
(примерно 0,4%). Тем не менее, образующиеся
фторапатиты (точнее, гидроксифторапатиты)
оказываются прочнее исходных кристаллов, а
главное - гораздо устойчивее к растворению, в
том числе кислотному. Особенно важно это для
зубов, т.к. ведет к укреплению поверхностного
слоя эмали.
Противокариесный эффект фторидов этим
не ограничивается. Установлено, что они уско-
ряют реминерализацию начальных кариозных
повреждений, стимулируя их спонтанную ре-
парацию. Кроме того, они обладают и бактери-
цидной активностью в отношении кариесоген-
ной (и иной) микрофлоры зубного налета.
Связь дефицита фтора с частотой кариеса
(особенно у детей) выявлена более полувека
тому назад: если питьевая вода бедна фторида-
ми (0,1-0,3 мг/л), то кариозные поражения обна-
руживаются вдвое чаще, чем в местностях, где
уровень F- в потребляемой воде не ниже 1 мг/л.
Фторирование воды до уровня 1-1,2 мг/л сни-
жало заболеваемость кариесом в 2-3 раза. Мак-
симальный эффект наступает, если оптимиза-
ция снабжения фторидом начинается с младен-
чества и продолжается не менее 2 лет. В сред-
нем возрасте и у пожилых людей, когда неред-
ко наблюдается оголение шейки зуба, приме-
нение фторидов уменьшает частоту кариозных
поражений не только эмали, но и цемента.
В отсутствие централизованной коррекции по-
требления фторидов главным средством про-
филактики кариеса становится использование
фторированных зубных паст.
Установлено, что безопасный диапазон
потребления F" очень узок. Принято считать,
что он составляет от 0,7 до 1,5 мг в сутки. По-
этому в тропиках, где воды потребляется
больше, рекомендуемый уровень ее фториро-
вания составляет 0,6-0.8 мг/л.
Избыточное поступление фторидов в ор-
ганизм приводит к неблагоприятным последст-
виям. Механизм их пока неясен. Известно
лишь, что чрезмерное накопление F" каким-то
образом нарушает процессы минерализации.
Поэтому флюороз зубов поражает эмаль только
в период ее формирования. Иными словами,
лишь в первые 7 лет жизни длительная избы-
точность фторида (более 2,5 мг в сутки) может
вызвать эту особую форму крапчатости зубов
(непрозрачные белые пятна). После прорезы-
вания зуба пятна не возникают заново и не
прогрессируют, а могут лишь впитывать
некоторые пигменты.
В отличие от зубов, костная ткань в любом
возрасте чувствительна к гиперфторозу, так как
ей свойственно постоянное ремоделирование,
сопряженное с реминерализацией. Проявления
флюороза скелета зависят от степени избытка
фторидов и длительности воздействия. На ран-
438
Глава 12
них стадиях типичны полиартралгии, кальци-
фикация мест прикрепления связок, сухожи-
лий, мышц. Позднее выявляются утолщение
компактной кости, неравномерный рост над-
костницы, ограничение подвижности суставов.
У взрослых людей рискованным считается по-
требление фторидов на уровне 8 мг в сутки.
Флюороз беременной женщины может быть
опасным для плода, поскольку фторид легко
проникает через плаценту, и его концентрации в
крови матери и плода одинаковы. Для грудных
детей минимальное суточное поступление фто-
ридов, которое может проявиться в более позд-
нем возрасте очень слабой формой флюороза,
оценивается в 0,1 мг/кг массы тела (в женском
молоке содержание F" составляет около 0,1 мг/л).
Профилактика эндемического флюороза
может быть обеспечена применением методов
дефторирования питьевой воды; проблема за-
ключается лишь в их дороговизне.
Чрезмерное поступление фторидов в орга-
низм способствует развитию остеопороза, если
это происходит на фоне слишком низкого по-
требления кальция (например, у вегетариан-
цев). Исключение кальциевой недостаточности
устраняло остеопороз, несмотря на прежнее
изобилие F”.
К особенно тяжелым формам избыточности
фторидов может приводить производственное
отравление фтороводородом. Выброс его сопут-
ствует промышленным технологиям выплавки
алюминия, производства фосфатных удобрений,
получения фторорганических соединений и ря-
да других. Будучи летучим газом, HF легко про-
никает в кровь через легкие. Скорость развития
и тяжесть флюороза костей зависит при этом от
длительности воздействия и концентрации ле-
тучих соединений фтора во вдыхаемом воздухе.
При очень высоком содержании возможно ост-
рое отравление фторидом.
Глава 13
КРОВЬ. ЛИМФА
Непосредственной средой, в которой су-
ществуют клетки нашего организма, является
межклеточная жидкость (тканевая жидкость).
Из нее они черпают все необходимое, выделяя
взамен продукты своей жизнедеятельности.
Обычно это конечные продукты метаболизма
(в том числе СО2, Н2О, мочевина), но нередко -
и такие вещества, которые потребляются клет-
ками другого типа (или служат для них сиг-
нальными молекулами, - как, например, гор-
моны). Иными словами, межклеточная жид-
кость находится в динамическом равновесии с
внутриклеточной. Неудивительно, что состав
тканевой жидкости может быть существенно
различным в разных органах и тканях. Сглажи-
ванию таких различий призвана служить кровь.
Будучи наиболее мобильной из всех жид-
костей тела, кровь интенсивно циркулирует в
замкнутой системе сосудов. Вместе с тем, путем
диффузии и под влиянием гидростатического
давления ее жидкая фаза частично проникает из
капилляров в межклеточное пространство, воз-
вращаясь обратно через стенки венозных капил-
ляров и по лимфатическим сосудам. Общий
объем тканевой жидкости примерно вдвое боль-
ше объема циркулирующей крови (т.е., почти
вчетверо превышает объем плазмы крови). Тем
не менее, темп взаимообмена между ними впол-
не достаточен для того, чтобы тканевая жид-
кость, обновляемая жидкой частью крови, успе-
вала обрести равновесие с внутриклеточной.
С лимфой у взрослых людей ежесуточно
поступает в кровяное русло 1-2 л жидкости,
«процеженной» из него в межклеточное про-
странство и успевшей (в пределах возможного)
уравновесить свой состав с жидкой фазой внут-
ри клеток.
Обобщая, можно заключить, что транс-
портная функция крови является главным
ее предназначением. Этим обеспечивается по-
стоянство внутренней среды организма (гомео-
стаз): постоянство температуры тела; поддер-
жание водного баланса; стабильность химиче-
ского состава и физико-химических параметров
(таких как pH, ионная сила, осмотическое дав-
ление); обеспечение широкого диапазона интен-
сивности газообмена при неизменности содер-
жания компонентов, переносящих О2 и СО2.
Многогранны проявления защитной
функции, реализация которых тоже в значи-
тельной степени связана с транспортной ролью
крови. С одной стороны, это защита от чуждо-
го биологического материала, которая распро-
страняется на весь организм (в частности, им-
мунная защита). Совсем другой аспект — это
защита от факторов, угрожающих самой цир-
куляции крови; эту задачу решают, в основном,
системы свертывания крови, фибринолиза и
вазоактивных пептидов (подробное описание
их дано в разделах 8.6.1, 8.6.2 и 8.6.4, соответ-
ственно).
Количество циркулирующей крови со-
ставляет у взрослого человека 5-6 л. Состоит
она из жидкой части (плазма крови), на долю
которой приходится в среднем 55% от общего
объема, и разнообразных клеток (форменных
440
Глава 13
элементов). Поэтому кровь иногда называют
жидкой тканью. Хотя в действительности в ией
нет клеток, которые создавали бы ее (подобно
тому, как межклеточное вещество вырабаты-
вают фибробласты и другие варианты рези-
дентных клеток).
Все форменные элементы крови являются
потомками стволовой клетки костного мозга.
Размножение стволовых клеток строго контро-
лируется, равно как и дифференцировка и
дальнейшее созревание клеток-потомков, важ-
ные этапы которого часть из них проходит в
вилочковой железе и других лимфоидных об-
разованиях. В этом плане роль крови сводится
лишь к транспортировке всего разнообразия
взвешенных в ней клеток, не связанных между
собой. Для нее они являются, по существу,
клетками-мигрантами, каждый из типов кото-
рых выполняет свое особое предназначение.
Преобладают в крови эритроциты: у взрос-
лых мужчин их количество несколько выше,
чем у женщин, и составляет обычно 4,5-5,9 млн.
в 1 мкл. Лейкоцитов - на три порядка меньше
(5000-8000 в 1 мкл). Численность тромбоцитов
(гораздо более мелких) достигает 150-300 тыс. в
1 мкл; продолжительность жизни этих непиг-
ментированных безъядерных клеток, лишенных
митохондрий, не превышает 8-10 дней, а глав-
ное предназначение сводится к участию в про-
цессах гемокоагуляции (как это описано в раз-
деле 8.6.1).
13.1. ЭРИТРОЦИТЫ
Лишь 0,5-1% циркулирующих эритроци-
тов пребывает в стадии дозревания (ретикуло-
циты). Основная же масса - это зрелые клетки,
уникальные тем, что не содержат ядра, мито-
хондрий и прочих цитоплазматических орга-
нелл. Иными словами, эритроцит состоит толь-
ко из цитоплазмы и плазматической мембраны.
Свойственная ему форма двояковогнутого дис-
ка увеличивает площадь контакта клетки со
средой.
Мембрана эритроцитов отличается опре-
деленным своеобразием. В частности, только
здесь встречается трансмембранный белок гли-
кофорин. Внеклеточная его часть содержит
около 20 олигосахаридных цепочек, в которые
включены антигенные детерминанты групп
крови. Кроме того, эти цепи богаты сиаловыми
кислотами, создающими значительный отрица-
тельный заряд на поверхности эритроцита.
Гликофорин является также одним из средств
защиты от мембраноатакующего комплекса
системы комплемента. В этой защите прини-
мают участие и такие белки мембраны, как
протектин, DAF и рецептор комплемента типа
1 (механизмы защитного действия всех этих
белков описаны в разделе 8.6.3).
К числу других интегральных белков мем-
браны, функционально наиболее важных для
эритроцита, относятся:
- аквапорин, тетрамерная молекула кото-
рого формирует 4 поры для транспорта воды
(диаметром 0,16-0,21 нм каждая);
- белок полосы 3 (назван по электрофоре-
тической подвижности), создающий канал для
транспорта анионов СГ и НСО3~ (реализуемого
по механизму пассивного антипорта);
— натрий-калиевый насос, являющийся
ферментом (Ыа+,К+-АТФаза), который за счет
энергии распада АТФ удаляет Na+ из клетки в
обмен на ионы К+, обеспечивая тем самым по-
стоянство трансмембранного градиента этих
катионов (подробности механизма функциони-
рования Ыа+,К+-АТФазы изложены в разделе
3.3.3);
- кальциевый насос (Са2+-АТФаза), кото-
рый эффективно удаляет ионы Са2+ из клеток
(см. раздел 3.3.3), в результате чего цитоплазма
эритроцитов почти не содержит кальция;
- ацетилхолинэстераза, локализованная
во внешнем монослое мембраны и обладающая
очень высокой активностью и строгой избира-
тельностью к ацетилхолину; функциональное
значение фермента до сих пор неясно, по-
скольку ее субстрат (ацетилхолин) в крови
практически не появляется.
Опорой для плазматической мембраны
служит цитоскелет эритроцитов. Он образован
фибриллярным белком спектрином, димерные
нити которого обладают гибкостью и, взаимо-
действуя между собой, формируют сетевидную
структуру, фиксированную на внутренней по-
верхности липидного бислоя. Эту фиксацию
укрепляют нековалентные связи некоторых
участков спектрина с интегральными белками
мембраны. С белком полосы 3 эти связи опо-
средованы специальным белком анкирином,
КРОВЬ. ЛИМФА
441
а с гликофорином они осуществляются через
комплекс двух других белков. Все это налагает
заметные ограничения на скорость латеральной
диффузии интегральных белков в липидном
бислое.
Состав цитоплазмы отражает главную
функцию эритроцитов - дыхательную. Она
заключается в доставке кислорода от легких к
остальным тканям и переносе СОг в обратном
направлении.
13.1.1. ТРАНСПОРТ КИСЛОРОДА
Доминирующим белком эритроцитов яв-
ляется гемоглобин (НЬ): их цитоплазма пред-
ставляет собой, по существу, 34%-ный раствор
этого гемопротеина. Благодаря ему 1 л крови
способен связывать около 210 мл кислорода,
тогда как в плазме этого количества крови мо-
жет раствориться не более 17-18 мл О2. Но са-
мое главное заключается в том, что особенно-
сти четвертичной структуры гемоглобина (см.
раздел 1.6) делают его очень чувствительным к
условиям среды. И прежде всего - к парциаль-
ному давлению кислорода (рОг) в окружающем
растворе.
График на рис. 1-21 (кривая Б) показывает,
что степень оксигенации гемоглобина не про-
порциональна значению рО2, а находится в
S-образной зависимости от него. За время про-
хождения крови по легочному капилляру
(обычно 0,8 с) газовый состав ее успевает
уравновеситься (путем простой диффузии) с
концентрацией газов в альвеолярном воздухе,
где рО2 составляет обычно около 100 мм рт.ст.
При таком содержании О2 гемоглобин практи-
чески полностью насыщается кислородом, пре-
вращаясь в оксигемоглобин (НЬО2).
Путем диффузии происходит и переход
кислорода из плазмы крови в другие ткани, где
рО2 находится на уровне примерно 40 мм рт. ст.
(в состоянии покоя). Как следует из кривой ок-
сигенации гемоглобина (рис. 1-21), в этих ус-
ловиях НЬО2 отдает почти четверть своего ки-
слорода (что составляет около 50 мл О2 на ка-
ждый литр крови, проходящей через капилля-
ры). В случае дальнейшего уменьшения рО2
наступает более крутое падение кривой насы-
щения гемоглобина кислородом. Действитель-
но, в этом диапазоне снижеиие рОг всего лишь
на 20 мм рт. ст. уменьшает оксигенацию гемо-
глобина еще на треть, т.е., приводит к добавоч-
ному освобождению 70-80 мл О2 (в расчете на
1 л крови), а не 50 мл О2, как это происходит
при начальном перепаде рО2 от 100 до 40 мм
рт. ст.
Таким образом, именно гемоглобину кровь
обязана способностью доставлять от легких ко
всем другим органам и тканям примерно 600 л
кислорода в сутки. Важно и то, что каждый из
потребителей черпает О2 из крови вне зависи-
мости от других, а лишь в соответствии с соб-
ственными нуждами. Удовлетворение их (т.е.,
утилизация поступающего кислорода) ведет к
локальному снижению рО2 и, как следствие, к
привлечению новых порций О2. И чем интен-
сивнее клетки потребляют кислород (в процес-
сах биологического окисления), тем больше
ускоряется темп передачи им кислорода окси-
гемоглобином. Иными словами, в ответ на
снижение рО2 в клетках гемоглобин автомати-
чески обеспечивает усиление их снабжения
кислородом, и степень этого усиления тем зна-
чительнее, чем интенсивнее утилизируется ки-
слород в митохондриях данного органа (ткани).
Например, при мышечной работе потребление
О2 миоцитами может увеличиваться в десятки
раз, и это не требует повышения концентрации
гемоглобина в крови!
13.1.2. ТРАНСПОРТ СО2
У взрослого человека ежесуточно образу-
ется до 500 л СО2 в качестве одного из конеч-
ных продуктов метаболизма. Поэтому в тканях
(кроме легочной) его парциальное давление
(рСО2) составляет не менее 60 мм рт. ст., что
заметно выше, чем в притекающей к ним арте-
риальной крови (—40 мм рт. ст). Хотя эта раз-
ница не очень велика, диффузия газа в кровь
протекает достаточно быстро, ибо СО2 при-
мерно в 20 раз более растворим, чем О2.
При прохождении кровью капилляров лег-
ких диффузия физически растворенного СО2
происходит в обратном направлении - из плаз-
мы крови, через стенки капилляров и альвеол в
просвет последних. В результате газовый со-
став венозной крови (рСО2 — 60 мм рт. ст.), до-
ставляемой легочными артериями, уравнове-
шивается с альвеолярным воздухом, так что
442
Глава 13
в оттекающей от легких крови рСО2 вновь сни-
жается до 40 мм рт. ст.
Здесь уместно пояснить, что альвеолярный
воздух обновляется перемешиванием не с ат-
мосферным, а с газовой смесью, заполняющей
трахею и бронхиальное дерево и лишь частич-
но обновляемой в цикле вдох-выдох. Отсюда и
градиент концентрации газов в альвеолярном,
выдыхаемом и вдыхаемом воздухе. При спо-
койном дыхании значения рСО2 в иих состав-
ляют соответственно 40. 28 и 0,2 мм рт. ст.,
а рО2 - 100,126 и 160 мм рт. ст.
Сравнительно небольшая величина арте-
рио-венозной разницы рСО2 позволяет перено-
сить в физически растворенном виде не более
5-10% углекислого газа, подлежащего удалению
из организма. Основная же масса СО2 транс-
портируется в виде ионов бикарбоната (НСО3).
И главную роль в этом играют эритроциты.
Уже при своем появлении СО2 относи-
тельно легко подвергается спонтанной гидра-
тации с образованием угольной кислоты (см.
уравнение [11-8]). В миллионы раз ускоряет
эту реакцию Zn2+-содержащий фермент карбо-
ангидраза, локализованная в цитоплазме эрит-
роцитов. Будучи слабой кислотой, Н2СО3 в фи-
зиологических условиях частично диссоции-
рует на протон и ион бикарбоната. Эта диссо-
циация угольной кислоты, накапливающейся в
эритроцитах, приводит к двум важным послед-
ствиям.
Одно их них - диффузия избыточного
НСОз’ из эритроцитов в плазму. Ее облегчает
встречный поток иоиов СГ, которые вне клеток
сильно преобладают над остальными аниона-
ми. Следовательно, при прохождении кровью
капилляров тканей поступающий в нее СО2
эритроциты не только сами накапливают в
форме НСОз’ (в дополнение к физически рас-
творенному газу СО2), но еще и обогащают би-
карбонатом плазму (рис. 13-1, справа).
Другое последствие связано с чувстви-
тельностью гемоглобина к pH среды. Накопле-
ние протонов (освобождаемых, в данном слу-
чае, угольной кислотой) смещает вправо кри-
вую насыщения гемоглобина кислородом (кри-
вая Б на рис. 1-21). Это означает, что при тех
же значениях рО2 диссоциация оксигемоглоби-
на становится более глубокой (эффект Бора).
Получается интересная закономерность: по-
ступление СО2 в кровь ие только освобождает
ткани от бремени этого конечного метаболита,
но и содействует более полной передаче им
кислорода, доставленного в форме НЬО2.
В основе эффекта Бора лежат аллостери-
ческие свойства НЬ. А именно: оксигенация
вызывает конформационные сдвиги, ведущие к
разрыву в глобине нескольких ионных связей
-COO-....+NH3- («солевых мостиков»). Этим
усиливаются кислотные свойства белка, ибо
НЬО2 как кислота сильнее, чем Н2СО3 или, тем
более, иеоксигеиированный гемоглобин (кото-
Рис. 13-1. Дыхательная функция эритроцитов.
КРОВЬ. ЛИМФА
443
рый часто обозначают как Н-НЬ, — протониро-
ванный гемоглобин). Подкисление среды спо-
собствует протоиированию глобина (и тем са-
мым диссоциации НЬО2 на О2 и Н-НЬ), а по-
вышение pH облегчает связывание О2 с Н-НЬ,
сопровождаемое выделением протонов. Как и
свойственно аллостерическим эффектам, соот-
ношения здесь не являются стехиометрически-
ми: связывание 1 экв. О2 освобождает из гемо-
глобина примерно 0,7 моля Н+.
Когда кровь проходит по капиллярам лег-
ких, с участием СОг протекают те же самые
процессы, но - в обратном направлении (левая
половина рисунка 13-1). Разумеется, и в этой
ситуации движущими силами, диктующими
итоговое направление обратимых процессов,
тоже являются перепады концентраций каждо-
го из газов. Здесь они предопределяют движе-
ние СО2 из крови в альвеолярное пространство,
а О2 - в противоположную сторону.
Диффузия СО2 из крови в просвет альвеол
создает тенденцию к уменьшению концентра-
ции физически растворенного газа в эритроци-
тах и. как следствие, содержания в них Н2СО3.
Замедлить эту убыль может только реакция
протонирования внутриклеточного бикарбона-
та, использование которого автоматически
компенсируется равновесным притоком его из
плазмы. Использование же протонов в этой
реакции грозит уменьшением их концентрации
в клетке (т.е., повышения внутриклеточного
pH). Противодействие этой угрозе оказывает
протекающий параллельно процесс оксигена-
ции гемоглобина, т.к. он сопровождается осво-
бождением протонов из Н-НЬ при превраще-
нии его в НЬО2(см. рис. 13-1).
Важно отметить: хотя связывание СО2 (в
виде бикарбоната) происходит в эритроцитах,
преобладающая часть НСОз" транспортируется
с плазмой крови, но в капиллярах легких вновь
проходит через эритроциты, чтобы превратить-
ся в Н2СО3 и далее (с участием карбоангидра-
зы) расщепиться на Н2О и СО2, способный
диффундировать в просвет альвеол. Соотноше-
ния обычно таковы: с плазмой переносится
в 7-8 раз больше СО2 (в форме бикарбоната),
чем в составе эритроцитов, продуцирующих
этот бикарбонат.
Немного СО2 переносится к легким в фор-
ме карбгемоглобина. Так называют продукт
присоединения СО2 к а-аминогруппам N-koh-
цов а- и P-цепей глобина:
R-NH2 + СО2 <----> R-N-C + н+
I Хг -
Н
Гемоглобин легче удерживает карбамино-
вые группы, чем НЬО2. Поэтому в капиллярах
тканей карбгемоглобина образуется несколько
больше, чем его остается после прохождения
кровью легочных капилляров. За счет этой раз-
ницы и осуществляется транспорт небольшой
доли СО2 к легким в форме карбгемоглобина.
Белки плазмы тоже склонны к образова-
нию карбаминовых соединений с СО2. Но
концентрация возникающих при этом продук-
тов не зависит от степени оксигенации крови, а
потому в артериальных сосудах практически
такая же. как в венозных. Следовательно, белки
плазмы не играют существенной роли в транс-
порте СО2 в форме карбаминов.
Таким образом, именно эритроциты вносят
решающий вклад в процессы газообмена в ор-
ганизме. Эти клетки обеспечивают взаимную
связь обеих частей дыхательной функции кро-
ви - транспорта кислорода и переноса углекис-
лоты. При этом оксигенация гемоглобина
в легких способствует более полному вытесне-
нию углекислоты из крови, тогда как поглоще-
ние тканевого СО2 эритроцитами усиливает
диссоциацию НЬО2, повышая тем самым
эффективность передачи кислорода тканям.
13.1.3. ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА
Из-за отсутствия цитоплазматических ор-
ганелл метаболические возможности эритро-
цита очень ограниченны. В зрелых клетках не-
возможны такие крупные блоки метаболизма,
как синтез и р-окисление жирных кислот; био-
генез и утилизация кетоновых тел; окислитель-
ное декарбоксилирование пирувата; реакции
ЦТК. Не осуществляется и синтез белков, а
протеолитические возможности ограничивают-
ся некоторыми частностями. К самым важным
из них относятся инактивация ангиотензина II
пролилолигопептидазой клеток, а также глубо-
кая деградация инсулина (поглощаемого ре-
цептор-опосредованным механизмом) под дей-
ствием высокоспециализированной и очень
активной инсулиназы.
444
Глава 13
В остальном специфику метаболизма в эри-
троцитах можно свести к следующим пунктам.
1. Глюкоза - единственный питательный
продукт для зрелого эритроцита на протяжении
всех 4 месяцев его существования.
2. ГБФ-путь распада глюкозы ограничен
только цитоплазматическим этапом. Поэтому
конечным продуктом является не пируват, а
лактат, единственная судьба которого — выход
в плазму крови. Утилизируя 20-30 г глюкозы в
сутки, эритроциты являются главным постав-
щиком лактата в кровь (еще более мощным
источником становятся мышцы, но только во
время интенсивной сократительной деятельно-
сти). Из крови лактат легко извлекают гепато-
циты, превращающие его в пируват и далее в
глюкозу (которая сразу или позднее вновь по-
ступает в кровь для питания других тканей,
включая эритроциты).
Энергетический выход аэробного гликоли-
за, присущего эритроцитам, составляет, естест-
венно, всего 2 молекулы АТФ на молекулу рас-
щепленной глюкозы (см. рис. 6-29). Тем не ме-
нее, общего количества перерабатываемого уг-
левода вполне достаточно для энергообеспече-
ния жизнедеятельности клетки. Следует, одна-
ко, отметить, что лактат возникает за счет водо-
рода НАД //2, образуемого на ранних стадиях
процесса {гликолитическая оксидоредукция, см.
раздел 6.7.4). Поэтому гликолиз не способен
генерировать восстановительные эквиваленты,
которые абсолютно необходимы клеткам.
3. Уникальной особенностью гликолиза в
эритроцитах является наличие обходного пути
для стадии VII, катализируемой фосфоглицерат-
киназой. Эта стадия обратима и приводит к соз-
данию АТФ за счет превращения 1,3-бисфосфо-
глицерата в 3-фосфоглицерат (см. рис. 6-24).
В эритроцитах же есть еще два фермента. Как
показано на рис. 13-2, один из них {бисфосфо-
глицератмутаза) необратимо преобразует
1,3-бисфосфоглицерат (1,3-БФГ) в его изомер -
2,3-БФГ, в который освободившаяся от фосфа-
та карбоксильная группа привносит еще один
отрицательный заряд (в дополнение к имею-
щимся на фосфатных группах). Второй фер-
мент {2,3-бисфосфоглицератфосфапгаза) гид-
ролитически отщепляет только что перенесен-
ную фосфатную группу, превращая 2,3-БФГ
в 3-фосфоглицерат. Эта реакция тоже необра-
тима; она завершает «обходный маневр», аль-
тернативный стадии VII.
Хотя для образования 2,3-БФГ использу-
ется лишь небольшая часть из всего потока
глюкозы через клетку, концентрация его в
эритроцитах (4 мМ) во много раз выше содер-
жания любого другого метаболита гликолиза
(включая лактат) и лишь немного уступает
концентрации глюкозы (5 мМ). Даже очень
малые количества 2,3-БФГ конкурентно угне-
тают собственный фермент (БФГ-мутазу); это
угнетение преодолевается высокими концен-
трациями субстрата (1,3-БФГ).
Гликолиз, идущий не обычным путем, а в
обход стадии VII, энергетически менее выго-
ден, т.к. производит только 1 молекулу АТФ,
теряя другую на этом обходном участке. Эта
жертва, однако, необходима, ибо генерируе-
1.3-Бисфосфо-
глицерат (1,3-БФГ)
3-Фосфо-
глицерат
Рис. 13-2. Генерация 2,3-бисфосфоглицерата (2,3-БФГ) в обход стадии VII гликолиза.
1 - БФГ-мутаза;2 - 2,3-БФГ-фосфатаза.
КРОВЬ. ЛИМФА
445
мый 2,3-БФГ требуется эритроцитам в качестве
аллостерического регулятора кислород-транс-
портной функции. Обладая сильным сродством
к дезоксигемоглобину (но не к НЬО2!), он обра-
зует с Н-НЬ эквимолярный комплекс, занимая
центральную полость, окруженную всеми че-
тырьмя субъединицами глобина (фиксируют
2,3-БФГ в ней 6 ионных связей с аминогруппа-
ми обеих 0-цепей). Результат такого связыва-
ния проявляется смещением кривой оксигена-
ции гемоглобина вправо, т.е., уменьшением
сродства гемоглобина к кислороду. Тем самым
2,3-БФГ содействует более полной отдаче ки-
слорода потребляющим его тканям (не мешая,
вместе с тем, образованию НЬО2 в капиллярной
сети легких). Противоположный эффект -
смещение кривой оксигенации влево - присущ
фетальному гемоглобину (HbF), доминирую-
щему в эритроцитах плода во второй половине
беременности. В отличие от обычного гемо-
глобина (НЬА), он вместо 0-цепей глобина со-
держит две у-цепи, у которых меньше точек
возможной фиксации 2,3-БФГ. Ослаблением
связывания этого метаболита обусловлено по-
вышенное сродство HbF к кислороду, а это по-
могает переходу кислорода из материнской
крови в кровь плода.
В адаптации к недостатку О2 в воздухе
(например, подъем в горы) или нарушениям
дыхательной функции легких важную роль иг-
рает повышение уровня 2,3-БФГ в эритроци-
тах, которое способствует поддержанию снаб-
жения тканей кислородом.
4. ГМФ-путь распада глюкозы (см. раздел
6.6) очень интенсивен в эритроцитах, т.к. явля-
ется в них единственным источником восстано-
вительных эквивалентов. Здесь они представле-
ны молекулами НАДФ //2, образуемыми двумя
дегидрогеназами начального этапа (см. рис.
6-17). Второй этап ГМФ-пути (см. рис. 6-18)
требуется эритроцитам только ради регенерации
глюкозо-6-фосфата из молекул пентозофосфата,
нарабатываемых на первом этапе (больше-то
эритроциту и не на что расходовать пентозо-
фосфатный материал). В достаточном восстано-
вительном потенциале (в виде НАДФ Hi) эрит-
роциты нуждаются для защиты от нежелатель-
ных последствий изобилия в них кислорода.
5. Эритроциты обладают мощными антиок-
сидантными системами. Это особенно важно
для гемоглобина, железо которого только в вос-
становленном состоянии (Fe2+) способно при-
соединять молекулу О2 (см. раздел 1.6.1). Пере-
нося кислород, эритроциты сами почти не по-
требляют его. Та очень небольшая убыль О2,
которую можно зарегистрировать, идет в основ-
ном на окисление Fe2+ гемоглобина до Fe3+.
Процесс этот протекает спонтанно, без участия
каких-либо ферментов. Тем не менее, за сутки
примерно 0,5% имеющегося в эритроцитах ге-
моглобина подвергается такому окислению,
превращаясь в метгемоглобин, обозначаемый
как Hb(Fe3+).
Не так страшно, что метгемоглобин неспо-
собен связывать кислород (и транспортировать
его). Несравненно опаснее то, что окисление
железа гемоглобина сопровождается образова-
нием супероксидного анион-радикала:
Hb(Fe2+)+О2---> Hb(Fe3+) + О2~
Среди активных форм кислорода суперок-
сидный анион-радикал является одним из наи-
более энергичных и опасных для биологиче-
ских структур. В срочном обезвреживании та-
ких радикалов заключается главное предназна-
чение антиоксидантных систем эритроцита.
Главный вклад вносят ферментные звенья за-
щиты, поскольку их каталитическая активность
многократно превышает возможную скорость
спонтанных процессов генерации АФК. Осо-
бенно это относится к супероксид-дисмутазе и
каталазе, одна молекула каждой из которых
способна расщеплять за 1 мин миллионы моле-
кул своего субстрата.
Супероксид-дисмутаза (см. раздел
5.5.2) катализирует взаимодействие двух моле-
кул супероксидного анион-радикала, из кото-
рых одна превращается в молекулярный ки-
слород, а другая (вовлекая два протона) - в мо-
лекулу водородпероксида:
Ог + С*2 + 2 Н+ —> О2 + Н2О2
Каталаза осуществляет, в свою очередь,
обезвреживание водородпероксида, расщепляя
2 молекулы Н2О2 на молекулярной кислород и
две молекулы воды; эта реакция представлена
уравнением [5-10].
Глутатионпероксидаза фактически
является дублером каталазы, хотя восстановле-
446
Глава 13
ние водородпероксида она реализует совсем
иным путем. Имея селеноцистеин в составе
активного центра, глутатионпероксидаза эф-
фективна даже при очень низких концентраци-
ях субстрата. Преобразование Н2О2 в две мо-
лекулы воды (уравнение [5-11]) она производит
за счет восстановленного глутатиона (Г-SH),
превращающегося при этом в окисленный глу-
татион TS-Sr (строение обеих форм глутатио-
на показано на рис. 5-56).
Глутатионредуктаза представляет со-
бой флавиновый фермент, который катализи-
рует реакцию восстановления FS-SF до Г-SH
за счет использования водорода молекулы
НАДФ Яг (см. уравнение [5-12]). Теперь пора
отметить, что именно эта реакция является од-
ним из главных потребителей молекул
НАДФ//2, единственным источником которых
в эритроцитах служит, как упомянуто выше,
окислительный этап ГМФ-путн. Эффектив-
ность этой связки такова, что глутатион, при-
сутствующий в эритроцитах в высоких концен-
трациях, на 90% представлен восстановленной
формой.
Еще одним потребителем НАДФ Н2 явля-
ется процесс регенерации гемоглобина путем
восстановления метгемоглобина, которое осу-
ществляет цитохром(Ь5)-редуктазная система.
Заключая, можно отметить, что метаболи-
ческие процессы, способность к которым со-
храняет зрелый эритроцит, сосредоточены поч-
ти исключительно на обеспечении дыхатель-
ной функции этих клеток и на надежной защи-
те их от токсического воздействия агрессивных
продуктов частичного восстановления молеку-
лы кислорода.
13.1.4. НАРУШЕНИЯ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ
ЭРИТРОЦИТОВ
Общий потенциал эритроцитов в осущест-
влении газообмена очень велик. Но реализует-
ся он в точном соответствии с текущими по-
требностями организма, обеспечивая гомеостаз
и в покое (в том числе, во сне), и при макси-
мально возможной нагрузке (включая интен-
сивную мышечную работу). Поэтому умерен-
ные нарушения дыхательной функции эритро-
цитов чаще всего не приводят к фатальным по-
следствиям, а лишь той или иной степени
ограничивают интенсификацию потребления
кислорода (и выведения СО2).
Среди внешних факторов, способных бло-
кировать гемоглобин, наиболее известен мон-
оксид углерода (СО, «угарный газ»). Его срод-
ство к Fe2+ гемоглобина в 300 раз выше, чем
сродство кислорода. Поэтому даже небольших
концентраций СО достаточно для полного бло-
кирования дыхательной функции эритроцитов.
Срочная помощь при отравлении угарным га-
зом сводится к повышению рО2 вдыхаемого
воздуха. В бытовых условиях для удаления СО
из крови следует вынести пострадавшего на
свежий воздух и постараться улучшить венти-
ляцию легких (искусственное дыхание). У здо-
рового человека доля карбоксигемоглобина
(НЬ СО) менее 1%, но при курении она возрас-
тает до 10%!
Другая из реальных опасностей для гемо-
глобина - это вещества, способные окислять
железо гема, т.е., превращать НЬ в метгемогло-
бин. К ним относятся оксид азота NO, нитриты,
ароматические амино- и нитросоединения, дру-
гие окислители, особенно если они летучие.
Первая помощь - введение восстановителей
(например, аскорбиновой кислоты).
Среди наследственных нарушений функции
эритроцитов преобладают те, которые обуслов-
лены генетическими дефектами синтезируемых
цепей глобина. Таковых известно к настоящему
времени очень много, но далеко не все они про-
являются клинической симптоматикой.
К наиболее частым относится так называе-
мая «серповидноклеточная анемия», впервые
описанная 100 лет тому назад как заболевание,
при котором многие эритроциты в крови имеют
форму полумесяца (серпа). Лишь в 1949 г. Лай-
нусу Полингу с сотрудниками удалось устано-
вить, что в основе патологии лежит замена глу-
тамильного звена в позиции 6 [3-цепи на оста-
ток валина. Дефект может затрагивать одну
или обе p-цепи. Соответственно возникают ге-
теро- и гомозиготный варианты гемоглобина
серповидноклеточности (HbS). В последнем
случае замена отрицательно заряженного глу-
тамата на гидрофобный радикал валина приво-
дит к «слипанию» дезоксигенированных моле-
кул HbS в длинные фибриллы. Будучи нерас-
творимыми в воде, они деформируют эритро-
цит, придавая ему вид серпа и способствуя ли-
КРОВЬ. ЛИМФА
447
зису клеток. Связывание дефектного гемогло-
бина с кислородом возможно, но оно требует
достаточно высоких значений рОг- Более того,
оксигенированный HbS не образует агрегатов и
поэтому не выключается из функции газообме-
на. Отсюда понятно, почему клинические про-
явления анемии (одышка, головокружение и
т.д.) усиливаются в ситуациях, способствую-
щих повышению доли дезоксигенированных
форм гемоглобина (мышечная работа, сниже-
ние содержания кислорода во вдыхаемом воз-
духе и т.п.). Гораздо легче протекает заболева-
ние у гетерозиготных индивидуумов (у кото-
рых лишь один из родителей имеет ген HbS).
Но и у них отмечается укорочение жизни эрит-
роцитов. Этим объясняют высокую частоту
гена HbS среди жителей регионов, где издавна
распространена тропическая малярия. Суть в
том, что возбудитель болезни (малярийный
плазмодий) не успевает созреть в эритроцитах
больного настолько, чтобы внедриться в сле-
дующую партию клеток, а потому у гетерози-
готов по гену HbS шансы на выживание гораз-
до выше, чем у людей с нормальным гемогло-
бином (НЬА).
С установлением молекулярной основы
возникновения серповидноклеточной анемии
появился термин молекулярная болезнь.
Некоторые точковые мутации гемоглобина
облегчают спонтанный процесс окисления же-
леза гемоглобина; главное их проявление -
метгемоглобинемия.
Более глубокие аномалии синтезируемых
субъединиц глобина либо пониженная скорость
их синтеза приводят к дефициту образования
тетрамерной молекулы гемоглобина. Эти забо-
левания обозначаются как а- или Р-талассемия
(в зависимости от того, синтез каких именно
цепей нарушен). У гомозиготов гибель часто
наступает в раннем детстве, у гетерозиготов
прогноз обычно несколько благоприятнее.
Помимо наследственных гемоглобинопа-
тий, к нарушению дыхательной функции крови
приводит врожденная недостаточность фер-
ментов гликолиза (особенно гексокиназы и пи-
руваткиназы) и ферментных звеньев антиокси-
дантной защиты. В частности, из-за неполно-
ценности цитохром(Ь5)-редуктазы уровень мет-
гемоглобина в эритроцитах может составлять
до 30% от общего содержания НЬ в клетках.
Генетические дефекты дегидрогеназ ГМФ-
пути пагубны тем, что обедняют клетку вос-
становительными эквивалентами (в виде
НАДФ-Нг), со всеми вытекающими из этого
последствиями, включая лизис эритроцитов
(из-за слабости антиоксидантной защиты их
мембраны). Так, для врожденной недостаточ-
ности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы ти-
пичны гемолитические кризы, вызываемые
факторами, провоцирующими выработку АФК.
К ним относятся прием некоторых медикамен-
тов (салицилаты, антималярийный препарат
примахин, сульфаниламиды и др.), употребле-
ние сырых конских бобов (отсюда старое на-
звание болезни - фавизм), а также острые вос-
палительные процессы.
13.2. ЛЕЙКОЦИТЫ
В отличие от однородной популяции зре-
лых эритроцитов белые клетки крови очень
разнотипны и по строению, и по функциональ-
ному предназначению. На 50-70% они пред-
ставлены полиморфноядерными нейтрофилами
и на 25-40% лимфоцитами; остальное прихо-
дится на долю моноцитов, а также эозинофи-
лов и базофилов. По существу, кровь является
для них лишь транспортным средством, хотя
некоторые лейкоциты часть своих функций
выполняют и во время пребывания в крови.
Нейтрофилы пребывают в перифериче-
ской крови всего 6-8 часов и, покидая ее, уст-
ремляются во внеклеточное пространство, где
и реагируют первыми на присутствие чуждого
материала, выполняя наиболее важную роль в
механизмах неспецифической (врожденной)
защиты организма (и при этом зачастую жерт-
вуя собой).
Моноциты после поступления из места
образования (костный мозг) в кровь тоже до-
вольно быстро покидают ее, поступая в меж-
клеточный матрикс и преобразуясь здесь в тка-
невые макрофаги, долго сохраняющие свою
функциональную активность.
И гранулоциты, и моноциты, действуя в
кооперации, сообща обеспечивают уничтоже-
ние разнообразных микроорганизмов и иного
опасного или ненужного материала, включая
аномальные клетки и поврежденные макромо-
лекулы собственного тела. Краткое описание
448
Глава 13
механизмов врожденной (неспецифической)
защиты, реализуемой этими клетками, приве-
дено в разделе 10.1.2.
Лимфоциты являются главным орудием
специфического иммунитета, обретаемого
только в результате контакта этих клеток с ан-
тигенным материалом.
В крови содержится 2000-4000 лимфоци-
тов в 1 мкл, а общее число их составляет лишь
1% от всей совокупности таких клеток в орга-
низме. Основная же масса лимфоцитов сосре-
доточена в местах их размножения и первич-
ной дифференцировки (костный мозг, вилоч-
ковая железа) и, особенно, во вторичных лим-
фоидных органах (лимфатические узлы, аппен-
дикс, миндалины, пейеровы бляшки, селезен-
ка), а также во внеклеточном матриксе.
В отличие от других клеток большинство
лимфоцитов на протяжении своего существова-
ния пребывает в постоянном странствовании,
перемещаясь из крови в межклеточные про-
странства, откуда с током лимфы проходят сна-
чала через разные группы лимфоузлов и затем
вновь поступают в общий кровоток. Благодаря
такой циркуляции, лимфоциты выполняют не
только защитную роль, но еще и функцию им-
мунного надзора’, патрулируя по всему организ-
му, они имеют возможность выявлять чуждые
объекты (антигенные носители) в любом участ-
ке тела и на основе такого распознавания ини-
циировать запуск всей сложной системы меха-
низмов специфического (приобретенного) им-
мунитета, как она представлена в разделе 10.1.3.
При этом реализация заключительного акта
клеточного иммунитета происходит благодаря
прямому контакту специально подготовленно-
го Т-лимфоцита с клеткой-мишенью. Гумо-
ральный же иммунитет более всеобъемлющ
(пространственно), поскольку его опосредуют
специфические антитела, секретируемые в сре-
ду соответствующими клонами плазматических
клеток и циркулирующие с кровью в составе
иммуноглобулиновой фракции.
13.3. ПЛАЗМА КРОВИ
Жидкость, оставшуюся от крови после ак-
куратного удаления форменных элементов
(обычно - центрифугированием), именуют
плазмой. Она составляет ту среду, в которой
непосредственно существуют все клетки крови.
После полного свертывания ее (например, в
пробирке) над осадком остается прозрачная,
слегка желтоватая жидкость, которую принято
называть сывороткой крови. Таким образом,
сыворотка - это плазма, лишенная фибриноге-
на (и образовавшегося из него фибрина). И хо-
тя есть и другие отличия, количественно они
незначительны (если не считать некоторых ми-
норных белков плазмы, особенно из числа
предшественников протеиназ). Поэтому в
справочной литературе чаше фигурируют ко-
личественные параметры химического состава
не плазмы, а сыворотки, анализы которой го-
раздо проще в исполнении и дают более ста-
бильные результаты (что особенно важно для
их клинической интерпретации).
По составу плазму (сыворотку) можно
представить как солевой раствор множества
разнообразных белков. Но и другие органиче-
ские молекулы тоже содержатся в очень широ-
ком ассортименте, включающем почти все
промежуточные продукты метаболических
превращений, которым подвергаются в клетках
и углеводы, и липиды, и аминокислоты. Тем
самым плазма крови становится зеркалом, от-
ражающим состояние внутриклеточного мета-
болизма. К тому же она гораздо доступнее для
исследования, чем другие биопробы. Все это
сделало биохимические анализы сыворотки
крови (реже - плазмы) лидирующими среди
всех лабораторных исследований, проводимых
в диагностических целях.
13.3.1. МИНЕРАЛЬНЫЙ СОСТАВ
Общее содержание неорганических ве-
ществ составляет в плазме около 0,9%. В ос-
новном они представлены солями различных
кислот.
Как показывают данные табл. 13-1, доми-
нирующими являются ионы Na+ и СГ, которых
в плазме содержится в десятки раз больше, чем
любого другого минерального компонента. Ис-
ключение составляют ионы бикарбоната: их уро-
вень лишь в несколько раз уступает содержа-
нию хлоридов. Концентрации ионов Na+, Са2+ и
СГ в плазме выше, чем во внутриклеточной жид-
кости, тогда как для К\ Mgz+ и неорганического
фосфата наблюдается обратное соотношение.
КРОВЬ. ЛИМФА
449
Таблица 13-1
Доминирующие минеральные компоненты плазмы крови взрослого человека
Катионы Концентрация (мэкв/л) Анионы Концентрация (мэкв/л)
Натрий 136-146 Хлорид 96-108
Кальций, общий 4,2-5,1 Бикарбонат, в венах 22-29
ионизированный 2,24-2,46 в артериях 21—28
Калий 3,5-5,1 Фосфат 1,6-2,7
Магний 1,3-2.1 Сульфат 0,7-1.5
ВСЕГО 145-158 ВСЕГО 120-141
Разумеется, в плазме имеются и иные ми-
неральные вещества, включая железо и различ-
ные микроэлементы (медь, цинк, марганец, ко-
бальт, селен и другие). Однако они содержатся в
крайне низких концентрациях, а главное - почти
всегда транспортируются либо в составе орга-
нических молекул (например, йод в составе ти-
роксина), либо будучи довольно прочно связан-
ными с белковыми молекулами (чаще всего с
теми, которые предназначены для специализи-
рованного транспорта, — как, например, транс-
феррин для переноса железа или церулоплазмин
для транспорта меди из печени в другие ткани).
Суммарное содержание минеральных ка-
тионов в плазме заметно выше, чем общая кон-
центрация неорганических анионов (см. табл.
13-1). Эта разница компенсируется наличием
органических кислот (лактат, ПВК, цитрат,
кетоновые тела, а-КГ и другие).
Концентрация каждого из неорганических
компонентов плазмы крови в определенной
степени зависит, с одной стороны, от мине-
рального состава пищи и питьевой воды, а с
другой - от интенсивности экскреции почками,
пищеварительным трактом и, в меньшей сте-
пени, потовыми железами (бикарбонат частич-
но выводится в виде СО2 с выдыхаемым возду-
хом). Однако решающий вклад в поддержание
постоянства минерального состава плазмы вно-
сят регуляторные механизмы (в том числе
гормональные), которые специфичны для каж-
дого из неорганических ионов. Большинство из
этих механизмов контролирует экскрецию со-
ответствующего иона, реже - процессы всасы-
вания его в кишечнике.
Важным параметром является осмотиче-
ское давление плазмы. В норме оно варьирует
в пределах 275-295 мосмоль/л и почти цели-
ком определяется концентрациями Na+ и СГ
(поэтому для внутривенного введения лекарст-
ва готовят не на воде, а на 0,9%-ном растворе
NaCl, именуемом в медицине «физиологиче-
ским раствором»). Регулируется осмотическое
давление не прямо, а опосредованно, - меха-
низмами, контролирующими выведение Na+
(и воды) почками, а также механизмом жажды.
К числу наиболее общих функций, осуще-
ствляемых с участием минеральных компонен-
тов плазмы, относится поддержание постоян-
ства концентрации водородных ионов и в са-
мой плазме, и в межклеточной жидкости. По
существу, это сводится к обеспечению опреде-
ленного соотношения между всеми кислотами
плазмы, с одной стороны, и содержащимися в
ней щелочными компонентами, с другой.
13.3.2. КИСЛОТНО-ЩЕЛОЧНОЕ РАВНОВЕСИЕ
Выше уже отмечался характерный для
плазмы значительный дисбаланс между катио-
нами щелочных металлов (Na+, К+) и анионами
сильных кислот (представленными, в основ-
ном, ионами СГ). Многие факторы могут вли-
ять на него, сдвигая соотношение в ту или
иную сторону. Тем самым создается опасность
существенных изменений величины pH, одного
из физико-химических параметров, наиболее
значимых для функционирования белковых
молекул, особенно ферментов.
В плазме (и не только в ней) эффективно
поддерживается определенное соотношение
между кислотами (донорами протонов) и ще-
лочами (донорами гидроксильных групп, кото-
рые, захватывая протоны, быстро превращают-
450
Глава 13
ся в воду). Это кислотно-щелочное равновесие
(кислотно-основный баланс, кислотно-основ-
ное равновесие) обеспечивается наличием бу-
ферных систем, способных противостоять рез-
ким сдвигам pH, которые могли бы произойти
при поступлении кислых или щелочных экви-
валентов. Свойствами такого буфера обладают
слабые кислоты (и слабые основания), т.е., ве-
щества, степень электролитической диссоциа-
ции которых строго зависит от pH среды. Точ-
нее, системой является пара кислой и основной
формы буфера (например, недиссоциированная
кислота и ее анионная форма).
Б и карбонатный буфер является пре-
обладающим в плазме крови. Он не только са-
мый мощный, но и довольно просто регулируе-
мый, ибо при накоплении Н2СО3 (в случае уси-
ленного поступления в плазму протонов) уголь-
ная кислота достаточно быстро распадается на
НгО и растворенный газ СО2, избыток которого
легко выводится легкими (а недостаток компен-
сируется поступлением СОг из тканей).
Соотношение молярных концентраций
слабой кислоты ([НА]) и генерируемых ею
анионов ([А-]) и протонов ([Н+]) определяется
константой ее диссоциации (К):
[Н+]-[А"]
”шхг=к
При логарифмировании этого соотноше-
ния получаем:
lg[H+] = lgK-lg^l
[НА]
Поскольку логарифм концентрации водо-
родных ионов, взятый с отрицательным зна-
ком, принято обозначать символом pH и, ана-
логично этому, -1g К = рК, то после умноже-
ния последнего уравнения на (-1) его можно
записать в такой форме:
PH = pK + lg^-t
[НА]
Это соотношение, именуемое (по авторам)
уравнением Гендерсона-Гассельбальха, связы-
вает величины pH и рК с соотношением кон-
центраций ионизированной и неионизирован-
ной форм «буферящей» кислоты. Для Н2СО3
значение рК составляет 6,1. Поэтому обычное
для плазмы содержание анионов НСО3~
(— 24 мМ) и недиссоциированной кислоты
Н2СО3 (~ 1,2 мМ) соответствует величине pH,
равной 7,4 [т.е., 6,1 + lg(24/l,2) = 6,1 + 1g 20
= 6,1 + 1,3 = 7,4].
Реально в состоянии покоя pH плазмы ар-
териальной крови поддерживается в пределах
7,36-7,44. Венозная кровь немного кислее: pH
плазмы здесь на 0,01-0,03 единицы ниже (в
эритроцитах pH составляет 7,2).
При усиленном поступлении кислот би-
карбонаты плазмы связывают избыток прото-
нов, превращаясь в Н2СО3. В этом и заключа-
ется противодействие буфера резкому сдвигу
кислотности среды. Например, прибавка 2 мМ
протонов почти мгновенно приведет к падению
уровня НСО3~ (до -22 мМ), но при этом экви-
валентно возрастает концентрация Н2СО3 (до
—1,4 мМ). И хотя наступающий сдвиг соотно-
шения [НСОз"]/[Н2СОз] довольно значителен
(с 20 до —16), величина pH плазмы снизится
всего лишь на 0,1, т.е., с 7.4 до 7,3 [расчеты:
6,1 + lg(22/l,4) = 6,1 + 1g 16 = 6,1 + 1,2 = 7,3].
Но и это еще не все. Возникший избыток
угольной кислоты способствует ее разложению
на Н2О и СОг, который достаточно быстро уда-
ляется легкими. Необходимое для этого время
измеряется минутами, после чего соотношение
бикарбоната и Н2СО3 возвращается к исходно-
му уровню. Следовательно, и значение pH воз-
вратится к исходному (как это следует из урав-
нения Гендерсона-Гассельбальха). И это - не-
смотря на уменьшение абсолютных величин
концентрации и бикарбоната, и кислоты. Ины-
ми словами, ради стабилизации pH приходится
жертвовать буферной емкостью бикарбонат-
ной системы, т.е., степенью ее устойчивости к
поступлению новых порций протонов. Оцени-
вают буферную емкость количеством кислоты
или щелочи, которое необходимо добавить к
1 л буфера для сдвига pH на единицу (емкость
по кислоте и щелочная емкость совпадают толь-
ко в том случае, когда титрование начинают
при pH, равном значению рК буферной пары).
Аналогичные изменения наступают и в
противоположной ситуации, когда в плазму
поступают щелочные эквиваленты. Только в
этом случае начальные сдвиги будут обратны-
ми: уменьшение [Н2СО3] в ходе нейтрализации
КРОВЬ. ЛИМФА
451
оснований и соответствующий прирост кон-
центрации НСО3". Легче всего эти сдвиги ком-
пенсируются поступлением СОа из тканей, что
ведет к повышению концентрации Н2СО3,
вплоть до нормализации соотношения
[НСО3"]/[Н2СО3] и, следовательно, величины
pH. Однако в данном случае достигается это на
фоне увеличения буферной емкости системы
(обусловленного повышением абсолютных
значений концентрации и бикарбоната, и
Н2СО3).
Важно подчеркнуть, что сама по себе бу-
ферная система лишь ослабляет влияние при-
тока (или убыли) протонов на pH биологиче-
ской жидкости. Полная же стабилизация pH
(считая и нормализацию емкости буферной
системы) требует вовлечения физиологических
регуляторов. Для бикарбонатного буфера это,
прежде всего, выведение избыточного СО2 лег-
кими, дающее быстрый эффект. Не меньшую
роль играет ускорение (либо замедление) по-
чечной экскреции бикарбоната, а также фосфа-
тов, ионов СГ, Na+, К+, NH4+ и других (такой
способ компенсации реализуется не сразу, но
обеспечивает более полный результат).
Поскольку поток ионизируемых веществ
проходит через кровь непрерывно (причем, в
переменчивом темпе), то поддержание кислот-
но-щелочного баланса зависит, главным обра-
зом, от регуляции на физиологическом уровне.
В частности, недостаточность альвеолярной
вентиляции приводит к накоплению раство-
ренного в плазме СО2 (а, следовательно, и
Н2СО3), способствуя тем самым сдвигу кислот-
но-щелочного равновесия организма в кислую
сторону {дыхательный ацидоз, или респира-
торный ацидоз). Напротив, слишком чрезмер-
ная вентиляция легких, в том числе искусст-
венная, вызывает снижение содержания угле-
кислоты в крови, чреватое развитием дыха-
тельного (респираторного) алкалоза. Накопле-
ние в крови кислых метаболитов (чаще всего
это кетоновые тела или лактат) приводит к ме-
таболическому ацидозу, тогда как метаболи-
ческий алкалоз отражает обычно нарушения
натриевого баланса.
Перечисленные сдвиги кислотно-щелоч-
ного равновесия организма проявляются сна-
чала смещением емкости буферной системы, и
лишь по мере его нарастания наступают выра-
женные изменения величины pH. Поэтому
определение концентрации бикарбоната в
плазме крови играет важную роль и в оценке
кислотно-щелочного состояния, и в ранней ди-
агностике характера его нарушений.
Гемоглобиновый буфер заслуживает
здесь упоминания, хотя локализован он в эрит-
роцитах. Из приведенного в разделе 13.1.2 опи-
сания роли НЬ в переносе СО2 ясно, что сам
гемоглобин (Н-НЬ) и оксигемоглобин (НЬО2)
составляют сопряженную буферную пару, ко-
торая находится в равновесии с бикарбонат-
ным буфером эритроцита. Более того, вся эта
внутриклеточная система взаимодействует с
бикарбоиатной системой плазмы, ибо наличие
анионных каналов обеспечивает легкость пе-
ремещения ионов НСО3~ из эритроцита в плаз-
му (и обратно) в обмен на ионы СГ. К тому же
и растворенный СО2 легко диффундирует по
градиенту концентрации, благодаря чему вы-
равнивается содержание Н2СО3 в клетках и
плазме крови.
Таким образом, внеклеточные бикарбона-
ты и гемоглобин эритроцитов образуют еди-
ную систему поддержания постоянства pH.
В этой системе на долю бикарбонатов плазмы
приходится более половины общей буферной
емкости крови. Вдвое меньший вклад вносит
гемоглобиновый буфер. Что же касается бу-
ферной емкости белков плазмы, то она срав-
нительна невелика в силу низкой их концен-
трации (в молярном выражении) и составляет
примерно 15% от всего потенциала крови. Еще
меньшей емкостью обладает фосфатный буфер,
доля которого не превышает 1-2%.
Фосфатный буфер представлен в
плазме сопряженной парой, в которой роль ки-
слоты (донора протонов) выполняет Н2РО4”, а
анионным компонентом является НРО42", ко-
личественно вчетверо преобладающий над
своим партнером. Будучи несущественным в
деле стабилизации pH плазмы, этот буфер, тем
не менее, вносит заметный вклад в механизмы
экскреции избыточных протонов с мочой. Осо-
бенно ощутимо это при продолжительном аци-
дозе, когда с мочой усиленно выводится кислая
форма фосфата (Н2РО4"), а убыль неорганиче-
ского фосфата в плазме компенсируется посту-
плением его из минерализованных тканей (ибо,
как известно, подкисление среды способствует
452
Глава 13
растворению гидроксиапатита). Такая возмож-
ность преодоления ацидоза предпочтительна
тем, что она предотвращает потерю ионов Na+
(используемых обычно для нейтрализации уда-
ляемых с мочой кислот). Однако, в конечном
счете этот механизм может привести к опасной
степени деминерализации костей (и зубов).
13.3.3. БЕЛКОВЫЙ СПЕКТР ПЛАЗМЫ
У взрослого человека общее содержание
белка в плазме крови составляет в норме от 60
до 80 г/л. Всего в ней выявлено более 100 ин-
дивидуальных белков (и это — если не прини-
мать в расчет полиморфизма таких макромоле-
кул, как, например, каждая из групп иммуно-
глобулинов). Большинство из них синтезирует-
ся преимущественно в печени и почках, хотя
есть и исключения (главное из них - иммуног-
лобулины).
В практике клинико-биохимических лабо-
раторий белковый спектр плазмы чаще всего
анализируют посредством электрофоретиче-
ского фракционирования сыворотки крови (см.
раздел 1.12.2). Несмотря на стандартизацию
общепринятых методов электрофореза, неко-
торые вариации все же имеются. Соответст-
венно этому несколько колеблются и нормаль-
ные величины распределения белков по фрак-
циям, приводимые в справочной литературе.
В табл. 13-2 эти величины даны ориентировоч-
но, т.е., как наиболее типичные диапазоны до-
ли каждой фракции в общем количестве сыво-
роточных белков.
Любое изменение в нормальном соотно-
шении белковых фракций плазмы обозначают
термином диспротеинемия. Такого рода сдвиги
наблюдаются при разных заболеваниях, а по-
тому их регистрация имеет определенное диаг-
ностическое значение.
Таблица 13-2
Белковые фракции сыворотки крови
(в % к общему содержанию белка)
Альбумины 56-67
щ-Глобулины 2—4
Ог-Глсбулины 4-10
р-Глобулины 8-14
у-Глобулины 10-19
Впрочем, информативная ценность выяв-
ления диспротеинемии весьма относительна, а
потому требует дальнейшего уточнения. В ча-
стности, из-за того, что каждая электрофорети-
ческая фракция объединяет белки, сходные
лишь по физико-химическим параметрам (раз-
меры молекулы и ее заряд), но почти всегда
различающиеся по функциональному предна-
значению (и по количественной доле в своей
фракции).
Альбумины - наиболее гомогенная из
всех электрофоретических фракций сыворотки.
Она представлена практически единственным
белком - альбумином. Его молекулярная масса
составляет без малого 70 кДа, а содержание
в сыворотке находится обычно в пределах
30-50 г/л (0.44-0.73 мМ). Состоит альбумин из
трех гомологичных доменов, в каждом их ко-
торых имеется 5 или 6 дисульфидных связей.
Он является простым белком, в отличие от
других плазменных белков, которые относятся
к числу гликопротеинов или липопротеинов (по
разнообразию последних несравненно меньше).
В функциональном отношении наиболее
важные свойства альбумина - это высокое
сродство к воде и способность обратимо свя-
зывать катионы (такие как Са2+, Na+ и К+),
жирные кислоты, неконъюгированный («сво-
бодный») билирубин, липофильные гормоны,
многие лекарственные вещества. Тем самым
преобладающий белок плазмы вносит весомый
вклад в перенос этих веществ с током крови.
Главные места связывания для неполярных
веществ локализованы в двух гидрофобных
полостях, имеющихся в молекуле альбумина.
Среди минорных белков фракции альбуми-
нов известны а-альбумин (афалин), функция
которого пока неясна, и транстиретин (ТТР;
синоним: преальбумин). Последнего в сыворот-
ке содержится в сотни раз меньше, чем альбу-
мина, а специализирован он на транспорте ти-
роидных гормонов (хотя главный их переносчик
- тароксин-связывающий белок из фракции
«1-глобулинов). Есть основания полагать, что
ТТР осуществляет перенос тироксина из крово-
тока в мозг. Врожденные дефекты этого белка
являются причиной гипертироксинемии либо
различных форм амилоидоза (амилоидная по-
линейропатия, лептоменингеальный амилоидоз,
семейная амилоидная кардиомиопатия и другие).
КРОВЬ. ЛИМФА
453
Около 40% транстиретина циркулирует в
виде комплекса с ретинол-связывающим бел-
ком (РСБ), свободная форма которого выявля-
ется во фракции а2-глобулинов. Объединение
ретинола с белком уменьшает клубочковую
фильтрацию и почечный катаболизм довольно
небольшой молекулы РСБ.
Известны и другие белки, эволюционно
родственные альбумину и потому структурно
подобные ему. Однако из-за некоторых осо-
бенностей физико-химических свойств они
мигрируют в составе глобулинов. Наиболее
известны агфетоглобулин, присутствующий в
крови в период внутриутробного развития, и
белок, связывающий витамин D (обычный ком-
понент фракции а2-глобулинов).
Возвращаясь к собственно альбумину,
следует отметить, что он не только выполняет
транспортные функции, но и играет важную
роль в регуляции распределения жидкости ме-
жду плазмой и межклеточным пространством.
Химический состав обеих сред выравнивается
довольно быстро, - благодаря огромной пло-
щади поверхности капилляров и высокой ско-
рости диффузии низкомолекулярных веществ
через их стенки. К этому добавляется фильтра-
ция жидкости под действием давления крови
на стенки сосудов (гидростатическое давле-
ние), которое в начале капилляра составляет
обычно 25-30 мм рт. ст., а к венозному его кон-
цу снижается до 10-15 мм рт. ст. Оно способст-
вует переходу жидкой части плазмы в межкле-
точную среду. Противостоят этому белки, так
как они не способны проникать через биомем-
браны, но, будучи тоже частицами, вносят свой
вклад в суммарную величину осмотической
активности. Его называют коллоидно-осмоти-
ческим или, короче, онкотическим давлением.
В плазме крови оно достигает всего лишь 0,5%
от общего осмотического давления, т.е., при-
мерно 20 мм рт.ст. (что, однако, в 15-20 выше,
чем во внеклеточной жидкости, где концентра-
ция белка не превышает 4%).
От соотношения гидростатического и он-
котического давления зависит направление
(и интенсивность) процесса фильтрации. В ар-
териальной части капилляра давление крови на
стенки сосуда превышает величину онкотиче-
ского давления плазмы, а потому поток жидко-
сти направлен через сосудистую стенку в
окружающую среду. В обратном направлении
этот поток устремляется в венозной стороне
капилляра, где онкотическое давление плазмы
выше гидростатического давления крови.
Примерно на 80% онкотическое давление
крови обеспечивается именно альбумином, по-
скольку он составляет более половины всех
белков плазмы и, кроме того, его молекулярная
масса в несколько раз меньше, чем у большин-
ства глобулинов (а, значит, молярная концен-
трация соответственно выше). Существенное
снижение концентрации альбумина в плазме
ведет к усилению фильтрации плазмы в меж-
тканевые пространства и уменьшает обратный
поток жидкости. Поэтому гипоальбуминемия
является непосредственной причиной так на-
зываемых почечных отеков (потеря альбуми-
нов с мочой) и голодных отеков (развиваю-
щихся при длительном белковом голодании).
«i-Глобулнны сыворотки представлены
группой белков, очень различающихся по
функциональному предназначению. Молеку-
лярная масса большинства из них укладывается
в диапазон 40-70 кДа. Исключение составляют
ретинол-связывающий белок (всего лишь
21 кДа) и очень крупные молекулы липопро-
теинов высокой плотности (200-400 кДа), яв-
ляющихся главными переносчиками холесте-
рола в организме (см. раздел 7.72). Транспорт-
ную функцию выполняют также транскобала-
мин, переносящий витамин Bj2; «кислый
«1-гликопротеин» (связывающий прогестерон);
транскортин (переносчик кортикостерона, кор-
тизола, прогестерона) и уже упомянутый ти-
роксин-связывающий глобулин. С другой сто-
роны, фракция содержит а!-антитрипсин и
щ-антихимотрипсин, которые не имеют отно-
шения к транспорту веществ, а играют совсем
иную, не менее важную роль, будучи эффек-
тивными ингибиторами различных сериновых
протеиназ.
«2'Глобулины гетерогенны не только по
функциональной роли составляющих ее бел-
ков, но и по их величине. Наименьшими разме-
рами обладает белок, связывающий витамин D
(52 кДа), который транспортирует как витамин
D, так и некоторые его метаболиты. Церуло-
плазмин (135 кДа) переносит ионы меди и, по-
мимо того, обладает оксидазной активностью.
Еще один транспортный белок - гаптоглобин -
454
Глава 13
предназначен для захвата гемоглобина, попа-
дающего в плазму при внутрисосудистом ли-
зисе эритроцитов (возникающий белок-белко-
вый комплекс поглощают клетки ретикуло-
эндотелиальной системы, подвергая его затем
тотальному протеолизу; отсюда следует, что
роль гаптоглобина заключается не столько в
транспорте, сколько в предотвращении почеч-
ного выведения гемоглобина, но главное - вхо-
дящего в его состав железа).
К числу антипротеиназ данной фракции
относятся антитромбин III (58 кДа) и самый
«всеядный» ингибитор протеиназ — а2-макро-
глобулин (720 кДа), который исполняет еще и
роль переносчика ионов цинка. Наконец, в этой
фракции обнаруживается и холинэстераза, час-
то именуемая псевдохолинэстеразой, ибо она
гидролизует не только ацетилхолин (который в
плазму практически не попадает), но и другие
эфиры холина, а также ряда иных веществ (по-
этому данному ферменту приписывают функ-
цию общей защиты от такого рода эндо- или
экзогенных соединений в случае их появления
в крови).
P-Глобулины в значительной мере пред-
ставлены транспортными белками. К ним от-
носятся глобулин, связывающий половые гор-
моны (65 кДа), который осуществляет транс-
порт тестостерона и эстрадиола, и трансферрин
(80 кДа), охарактеризованный в разделе 9.6.1.
Наиболее крупными компонентами фракции
являются липопротеины низкой плотности,
молекулярная масса которых охватывает диа-
пазон от 2000 до 4500 кДа (липопротеины
очень низкой и промежуточной плотности в
силу разнообразия их состава распределяются
в той или иной степени между фракциями а2- и
р-глобулинов).
Помимо этого во фракции р-глобулинов со-
средоточено большинство компонентов компле-
мента. Исключение составляют лишь компонент
С6 (а-глобулин), компоненты С7, Clq и фактор
D, мигрирующие в составе у-глобулинов.
Особое место занимает С-реактивный бе-
лок. Обнаружен он был по способности всту-
пать в реакцию преципитации с С-полисаха-
ридом пневмококков. Белок вызывает актива-
цию комплемента по классическому пути, спо-
собствует фагоцитозу, влияет на функциональ-
ную активность лимфоцитов. В норме содер-
жание С-реактивного белка в плазме (сыворот-
ке) едва уловимо, но резко возрастает при ост-
рых воспалительных заболеваниях. Поэтому
его относят к белкам острой фазы, наряду
с такими компонентами, как ai-антитрипсин,
оц-антихимотрипсин, а2-макроглобулин, кис-
лый щ-гликопротеин, гаптоглобин и церуло-
плазмин, синтез которых тоже резко возрастает
при остром воспалении (хотя и в значительно
меньшей степени). Обычно при этом замедля-
ется биосинтез альбумина, транстиретина и
трансферрина (отрицательные острофазные
белки).
у-Глобулииы - это фракция, состоящая
почти исключительно из иммуноглобулинов. В
целом они представляют собой очень большой
набор специфических антител, спектр которого
отражает жизненный опыт индивидуума (точ-
нее, историю его контактов с инфекциями и
иным антигенным материалом). Вырабатыва-
ются антитела и секретируются в среду соот-
ветствующими клонами плазмоцитов (меха-
низм генерации этих клеток, обеспечивающих
гуморальный иммунитет, изложен в разделе
10.1.3).
Циркулирующие в плазме антитела, не-
смотря на все разнообразие, построены по еди-
ному плану. Каждое из них содержит субъеди-
ницы двух типов, обозначаемые как легкая
цепь (L-цепь, —23 кДа) и тяжелая (Н-цепь,
50-70 кДа); в последней имеется как минимум
одна олигосахаридная цепочка. Соединенные
дисульфидным мостиком, обе цепи образуют
гетеродимер, который связан с абсолютно та-
ким же димером посредством двух дисульфид-
ных мостиков между тяжелыми субъединица-
ми. Схематически строение тетрамерного им-
муноглобулина показано на рис. 13-3.
Легкие цепи иммуноглобулинов бывают
двух типов, но в каждую тетрамерную молекулу
может входить только один из них: либо к (кап-
па), либо X (лямбда). Они имеют различающие-
ся, но гомологичные аминокислотные по-
следовательности. Вместе с тем, обе разновид-
ности L-цепи содержат два глобулярных доме-
на. Один их них имеет довольно постоянный
состав (Cl - константный домен легкой цепи), а
структура другого сильно варьирует (Vl - ва-
риабельный домен легкой цепи), строго соот-
ветствуя только «своему» клону плазмоцитов.
КРОВЬ. ЛИМФА
455
С-конец
Рис. 13-3. Строение иммуноглобулинового тетрамера (схема).
Тяжелая цепь в своей N-концевой части
комплементарна строению легкой цепи: здесь
тоже имеются и вариабельный домен (Vh), и
константный. Последний обозначают как Сц1,
ибо в остальной части тяжелой цепи есть и
другие глобулярные образования, отмечаемые
как Сн2 и СнЗ. В зоне между участками Сн1 и
Сн2 тяжелые цепи обладают определенной гиб-
костью («шарнирный участок»), которая при-
дает антителам внутримолекулярную подвиж-
ность. В свое время было установлено, что в
этом месте Н-цепи уязвимы для атаки папаи-
ном (цистеиновая протеиназа растительного
происхождения), который расщепляет молеку-
лу иммуноглобулина на два фрагмента Fab и
фрагмент Fc (см. рис 13-3).
Фрагмент Fab (от англ, antigen-binding
fragment - антиген-связывающий фрагмент)
состоят из легкой цепи, соединенной дисуль-
фидным мостиком с N-концевым отрезком тя-
желой цепи. Даже в изолированном виде каж-
дый Раь-фрагмент сохраняет способность к рас-
познаванию и фиксации соответствующей ан-
тигенной детерминанты, осуществляя это сво-
им аптиген-связываюгцим участком, который
сформирован сочетанием домена Vl и домена
Vh- Поскольку тетрамерная структура имму-
ноглобулина содержит 2 фрагмента Fab, она
способна соединяться с двумя антигенами, т.е.,
является бивалентным антителом.
Фрагмент Fc (от англ, fragment crystalliz-
able - способный к кристаллизации), состоя-
щий из С-концевых половинок обеих Н-цепей,
несет в себе центр взаимодействия с компонен-
тами комплемента, участвует в связывании с
клеточной поверхностью и в переносе антител
клетками.
Полиморфизм антител в значительной
степени обусловлен разнообразием тяжелых
цепей. Они синтезируются в 5 главных вариан-
456
Глава 13
тах, заметно различающихся по длине поли-
пептидного стержня, а также по числу и распо-
ложению олигосахаридных цепочек, ковалент-
но присоединенных к нему. Обозначают эти
варианты буквами греческого алфавита: а-, у-,
6-, £- или g-цепь. Соответственно различают
иммуноглобулины класса A (IgA), класса G
(IgG), класса D (IgD), класса Е (IgE) и класса М
(IgM). Из них лишь IgG, IgD и IgE существуют
в тетрамерной (бивалентной) форме, показан-
ной на рис. 13-3.
В кровеносном русле доминируют имму-
ноглобулины класса G: их концентрация в
плазме составляет обычно 12-14 г/л (т.е., менее
чем 0,1 мМ). Содержание IgA в 7 раз, a IgM - в
10 раз ниже (в расчете на число тетрамерных
звеньев). Уровень IgD и IgE уступает иммуно-
глобулинам класса G в тысячу и в миллион раз
соответственно.
Эти количественные различия отражают
определенное своеобразие сферы «приложения
сил». В частности, иммуноглобулины класса G,
будучи доминирующими антителами плазмы и
межклеточной среды, эффективны не только в
отношении бактериальных токсинов, но и са-
мих микроорганизмов, способствуя лучшему
фагоцитозу их и удалению с участием системы
комплемента. Кроме того, IgG — это единст-
венные из антител, способные проникать через
плаценту и тем самым осуществлять имунную
защиту плода.
Иммуноглобулины класса А легко прони-
кают в слюну, слезную и носовую жидкости, в
пот и мочу, а также в секреты дыхательных
путей и желудочно-кишечного тракта. Уже из
этого ясно, что их прерогатива - защита «на
дальних подступах», еще до попадания инфек-
ции во внутреннюю среду организма. Кроме
того, будучи естественным компонентом мате-
ринского молока, они обеспечивают иммунную
защиту в младенческом возрасте. Иммуногло-
булины этого класса легко объединяются, об-
разуя удвоенную молекулу. Происходит это с
участием особого посредника - J-пептида (от
англ, joining - сращивание), способного созда-
вать по дисульфидному мостику с С-концевой
частью двух тетрамерных молекул IgA. В объ-
единение может быть вовлечена и третья моле-
кула иммуноглобулина. Тем самым укрупнен-
ная молекула IgA обретает способность связы-
вать не 2, а 4 или даже 6 антигенных детерми-
нант.
Сходным образом 4 молекулы J-пептида
образуют перемычки между С-концами пяти
молекул бивалентного иммуноглобулина клас-
са М. Так формируется центральное кольцо, из
которого выступают в виде лучей 5 пар анти-
ген-связывающих участков. Именно в форме
таких пентамеров циркулирует в плазме основ-
ная масса антител класса IgM, которые, как
отмечалось в разделе 10.1.3, являются ранней
формой иммунного ответа плазмоцитов. Обла-
дая поливалентностью, пентамерные агрегаты
IgM являются наиболее эффективными актива-
торами системы комплемента (как это отмече-
но в разделе 8.6.3).
Функциональные особенности иммуно-
глобулинов IgD остаются пока неясными, а ан-
титела класса IgE ответственны за развитие
аллергических реакций (раздел 10.1.3), в пато-
генезе которых решающую роль играют не
только наличие соответствующих иммуногло-
булинов, но и их способность фиксироваться
своим фрагментом Fc на рецепторах тучных
клеток и базофильных гранулоцитов.
13.3.4. ФЕРМЕНТЫ ПЛАЗМЫ
По сравнению с клетками, плазма крови
чрезвычайно бедна ферментами, — как по разно-
образию, так и по их активности. Единственны-
ми функционально значимыми ферментными
компонентами плазмы являются протеиназы,
циркулирующие, однако, в форме предшест-
венников (проферментов), взрывообразная ак-
тивация которых наступает лишь в особых си-
туациях. Набор таких предшественников в
плазме достаточно велик, чтобы обеспечить
строго контролируемые процессы каскадного
протеолиза, к которым относятся свертывание
крови (раздел 8.6.1), фибринолиз (раздел 8.6.2),
активация комплемента (8.6.3), управляемая ге-
нерация вазоактивных пептидов (раздел 8.6.4).
Ферментом, в активной форме секрети-
руемым в плазму для выполнения определен-
ной функции, является сывороточная холин-
эстераза (она вырабатывается печенью). На-
звание отражает факт пребывания ее в сыво-
ротке (в отличие от мембранной ацетилхолин-
эстеразы) и сложилось исторически, хотя бо-
КРОВЬ. ЛИМФА
457
лее точным обозначением является термин не-
специфическая холинэстераза, ибо она, как
уже упоминалось, гидролизует довольно ши-
рокий спектр различных эфиров (и тем самым
защищает от них). Интерес к ферменту усилил-
ся, когда в хирургической практике стали при-
менять сукцинилдихолин (в качестве миоре-
лаксанта кратковременного действия). Это ве-
щество можно представить как две молекулы
ацетилхолина, соединенные вместе метильны-
ми группами своих ацетильных фрагментов.
Поэтому сукцинилдихолин способен, как и
ацетилхолин, связываться с холинорецептора-
ми постсинаптической мембраны, но, в отли-
чие от истинного медиатора, не гидролизуется
мембранной ацетилхолинэстеразой (и, следова-
тельно, блокирует рецепторы, из-за чего и воз-
никает миорелаксантный эффект). С другой
стороны, неспецифическая холинэстераза, ак-
тивность которой в плазме очень высока, быст-
ро отщепляет холиновые фрагменты в молеку-
лах циркулирующего миорелаксанта, что сти-
мулирует десорбцию его с холинорецепторов
(с вымыванием в кровь) и тем самым способст-
вует возврату этих рецепторов в нормальное
функциональное состояние (отсюда - кратко-
временность миорелаксантного действия).
Известно только одно негативное послед-
ствие врожденных дефектов сывороточной хо-
линэстеразы. Оно проявляется тем, что рас-
слабление мышц после введения сукцинилди-
холина продолжается не несколько минут, а
часами. Поскольку релаксация охватывает ды-
хательные мышцы, возникает серьезная угроза
жизни пациента. В идеале, перед операцией
следовало бы проводить анализы на функцио-
нальную полноценность холинэстеразы. Про-
блема, однако, в том, что гомозиготность по
дефектному гену этого фермента встречается
лишь у одного из 2500-3000 человек, а главное
- бывает качественно разной. Поэтому предпо-
читают преодолевать уже возникшую угрозу
теми мерами, которые в современной медицине
вполне эффективны. Гетерозиготность встре-
чается в 100 раз чаще, ио сохраняющейся при
этом доли активного фермента достаточно для
того, чтобы применение сукцинилдихолина не
вызывало осложнений.
Все остальные ферменты, если и выявля-
ются в плазме здоровых людей, то лишь в ни-
чтожных количествах. Судя по всему, они об-
наруживаются как результат естественного
процесса отмирания клеток, приводящего к
попаданию их содержимого в среду (включая
плазму). Однако любое страдание клеток про-
является в первую очередь нарушением прони-
цаемости их мембран, которое вызывает утечку
внутриклеточных компонентов (прежде всего,
цитоплазматических). Легче всего выявить те
из них, которыми клетки наиболее богаты.
Особенно это относится к ферментам, ибо ме-
тоды их количественного анализа гораздо чув-
ствительнее и точнее, чем имеющиеся для дру-
гих белковых вешеств.
Первыми ферментами, определение кото-
рых стало широко применяться в целях диффе-
ренциальной диагностики, были аланин- и ас-
партат-аминотрансферазы. Они содержатся в
цитоплазме практически всех клеток, но наи-
более изобильны в гепатоцитах и миоцитах.
Активность каждой трансаминазы в сыворотке
крови возрастает в той или иной степени при
инфаркте миокарда и вирусном гепатите (но
не при стенокардии, циррозе печени или заку-
порке желчных путей, которая, как и гепатит,
проявляется желтухой).
Еще одним индикаторным ферментом
служит креатинкиназа (см. рис. 9-32, 3). Она
состоит из двух субъединиц и существует в
виде гомодимеров ВВ (в мозге и гладких мыш-
цах), ММ (в мышцах и миокарде) и гетероди-
мера МВ (только в миокарде). По клинической
картине поражение мозга или серьезную трав-
му мышц нетрудно отличить от заболевания
сердца. А вот стенокардию от инфаркта мио-
карда отличить бывает очень непросто, особен-
но в ранние сроки, когда изменения на электро-
кардиограмме еще не видны. Общая активность
креатинкиназы сыворотки, не изменяющаяся
при стенокардии, отчетливо возрастает уже в
первые часы от начала развития инфаркта. И
хотя держится этот подъем недолго (в отличие
от изменений ЭКГ), выявление его делает воз-
можным раннее лечение (начатые в первые
6 часов лечебные мероприятия гораздо эффек-
тивнее, чем в более поздние сроки). В затрудни-
тельных случаях можно провести анализ изо-
ферментного спектра, ибо повышение активно-
сти изофермента МВ в сыворотке однозначно
указывает на инфаркт миокарда и оказывается
458
Глава 13
более выраженным, чем увеличение общего
содержания разных изоферментов.
Диагностическое значение имеет также
электрофоретическое исследование лактатде-
гидрогеназы сыворотки. Как уже отмечалось
(раздел 4.12.3), этот фермент существует в виде
5 изоформ, количественное соотношение сильно
различается в клетках разного типа. Установле-
но, что ЛДГ-1 и ЛДГ-2 значительно преоблада-
ют в миокарде и эритроцитах, а также в корко-
вом слое почек, где к этому добавляется еще и
высокая доля ЛДГ-3. В скелетных мышцах и в
печени сильно доминируют ЛДГ-5 и, в значи-
тельно меньшей степени. ЛДГ-4. Исследование
изофермеитного спектра лактатдегидрогеназной
активности сыворотки помогает уточнить ис-
точник попадания этого фермента в кровь.
Очень чувствительными индикаторами за-
болеваний печени являются типичные для нее
у-глутамилтрансфераза (особенно при алко-
гольном поражении печени), аргиназа и орни-
тинкарбамоилтрансфераза.
К числу органоспецифических ферментов
относятся также амилаза (повышается в сыво-
ротке при остром панкреатите или паротите, а
также при закупорке протоков этих желез); ли-
паза (возрастает при панкреатитах любого про-
исхождения); кислая фосфатаза (индикатор ра-
ка предстательной железы). Гораздо менее
специфична шелочная фосфатаза, уровень ко-
торой в сыворотке возрастает не только при
поражении костной ткани (первичные опухоли,
раковые метастазы, пролиферация остеобла-
стов разного генеза), но и при инфекционном
мононуклеозе, нарушениях оттока желчи, ти-
ротоксикозе и некоторых других состояниях.
В целом энзимодиагностика по результа-
там анализов сыворотки играет важную роль в
системе средств раннего выявления ряда серь-
езных заболеваний.
13.3.5. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ
ОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА
В плазме крови (как и в межклеточной
жидкости) представлены практически все во-
дорастворимые метаболиты, которые присут-
ствуют в клетках в сколько-нибудь существен-
ных количествах (липидофильные молекулы
циркулируют в плазме в составе липопротеи-
нов либо в соединении с иными транспортны-
ми белками).
Как показывают данные таблицы 13-3,
среди низкомолекулярных органических ком-
понентов плазмы преобладают глюкоза, необ-
ходимая для питания всех клеток, и мочевина,
которую клетки отправляют в кровь для даль-
нейшего выведения с мочой. Примерно на та-
ком же уровне находится совокупное количе-
ство всех аминокислот. Однако представлены
они неравномерно. Больше всего в плазме со-
держится глутамина (0,5-0,6 мМ) и аланина
(0,4-0,6 мМ). В несколько меньших концентра-
циях (0,2-0,4 мМ) циркулируют глицин и ли-
зин. Наиболее бедна плазма такими аминокис-
лотами, как фенилаланин, тирозин, триптофан
(менее 0,1 мМ каждой) и, особенно, метионин
и аспартат (не более 0,03 мМ).
Количественное определение нормальных
метаболитов в плазме (сыворотке) крови быва-
ет необходимым при постановке или уточне-
нии диагноза. В частности, регулярные анали-
зы содержания глюкозы и кетоновых тел в кро-
ви очень существенны в ходе лечения сахарно-
го диабета (см. раздел 6.9.1). Другой метаболит
- мочевина - резко возрастает при почечной
Таблица 1 3-3
Концентрации преобладающих метаболитов в плазме крови человека
Метаболит Содержание (ммоль/л) Метаболит Содержание (ммоль/л)
Аминокислоты 2,5-4,6 Глюкоза 3,8-6,1
Мочевина 2,5-6,4 Фруктоза 0,06-0,3
Мочевая кислота 0,18-0,48 Лактат 0,4-1,8
Креатин 0,03-0,07 Пируват 0,07-0,11
Креатинин 0,05-0,11 Цитрат 0,10-0,15
Билирубин (общий) 0,004-0,026 о-Кетоглутарат 0,02-0,07
Билирубин (связанный) 0,000-0,003 Ацетоацетат 0,05-0,19
КРОВЬ. ЛИМФА
459
недостаточности, что служит едва ли не един-
ственным объективным критерием крайне тя-
желого поражения почек.
Многие из наследственных нарушений ме-
таболизма диагностируются по обнаружению
аномальных метаболитов в крови (часто - и в
моче). Перечень нарушений такого рода поис-
тине необъятен. Нередко проблема сводится к
вопросу: что именно искать (т.е., какое из воз-
можных маркерных веществ).
13.4. ЛИМФА
Из примерно 20 л жидкости, ежесуточно
проникающих из кровеносных капилляров во
внеклеточное пространство, лишь небольшая
часть (1-2 л) возвращается обратно в венозное
русло окольным путем, - в виде лимфы. Слепые
капилляры, которыми начинается лимфатиче-
ская сеть, велики по диаметру (до 100 мк); они
отсутствуют лишь в костном мозге, хряще и
пульпе селезенки. Стенки этих капилляров ли-
шены базальной мембраны, состоят из одного
слоя эндотелиальных клеток и легко пропуска-
ют довольно крупные частицы (до 40 кДа).
Локальные различия лимфы по содержа-
нию белка очень велики: от 0.25% в лимфе
подкожной клетчатки до 3% в содержимом
шейных протоков и даже до 6% в лимфе пече-
ни. Альбумины в лимфе преобладают над гло-
булинами в 3-5 раз, т.е., гораздо значительнее,
чем в плазме крови. Фибриноген и другие фак-
торы гемокоагуляции тоже содержатся в лим-
фе, а потому она может свертываться, хотя и
медленнее, чем кровь.
По концентрациям минеральных ком-
понентов и низкомолекулярных органических
веществ лимфа довольно близка плазме крови.
Ток лимфы очень медленный (около
1,5 мл/мин в грудных протоках). Осуществляя
постоянную «промывку» межклеточной среды,
лимфа производит эвакуацию бактерий и кле-
точных обломков. Одной из частных ее функ-
ций является доставка липидов от стенки ки-
шечника в кровь, в обход печени.
Клеточный состав лимфы представлен пре-
имущественно малыми лимфоцитами. Проходя
через регионарные лимфатические узлы, лимфа
подвергается фильтрации. С одной стороны, она
освобождается здесь от микроорганизмов, ток-
синов и клеточных фрагментов, изымаемых по-
средством фагоцитоза. С другой стороны, в
лимфоузлах функционируют антиген-представ-
ляющие клетки и реализуется индуцируемая
антигенами дифференциация и пролиферация
В-лимфоцитов, часть которых сохраняется в
виде клеток иммунной памяти, а другая преоб-
разуется в плазматические клетки соответст-
вующей специфики. Это означает, что к антиге-
ну, выявленному в каком-либо участке тела,
здесь создаются антитела, с током лимфы по-
ступающие в кровь для защиты всего организма.
Таким образом, система лимфообращения
является неотъемлемым дополнением к осуще-
ствляемой кровью функции поддержания по-
стоянства внутренней среды организма, и пре-
жде всего — стабилизации химического состава.
Глава 14
ПОЧКИ. МОЧА
Функциональное предназначение почек
сводится, прежде всего, к удалению конечных
продуктов метаболизма и поддержанию водно-
электролитного баланса организма. Эта работа
поглощает много энергии, интенсивная генера-
ция которой (в форме АТФ) относится к числу
метаболических особенностей почечной ткани.
Другие особенности проявляются в том, что
именно почки продуцируют ряд важнейших ре-
гуляторов, — таких как ренин (см. таблица 8-5),
кальцитриол (см. раздел 11.6), а также эритро-
поэтин, представляющий собой небольшой гли-
копротеин (30 кДа). который вырабатывается
перитубулярными фибробластами (особенно в
ответ на кровопотери и падение рО2 в артери-
альной крови) и стимулирует производство
эритроцитов в костном мозге.
Продуктом экскреторной деятельности по-
чек является моча, биохимический анализ кото-
рой дает важную для диагностики информацию.
14.1. ЭКСКРЕТОРНАЯ ФУНКЦИЯ ПОЧЕК
Структурно-функциональной единицей
почек является нефрон. Общее количество их у
человека составляет около 2 млн. Каждый на-
чинается клубочковой частью (гломерулой), где
происходит ультрафильтрация плазмы крови из
капиллярной сети клубочка в просвет капсулы
Боумена. Движущей силой является, как и
обычно, давление крови, которое здесь очень
стабильно (порядка 45 мм рт. ст.), несмотря на
пульсовые скачки в артериях. Противодейству-
ет фильтрации плазмы онкотическое давление
ее белков (примерно 25 мм рт. ст.), а также
гидростатическое давление в просвете боуме-
новой капсулы (10 мм рт. ст.). При этих усло-
виях совокупная скорость клубочковой фильт-
рации в обеих почках составляет 125 мл/мин,
или примерно 10% от общего почечного крово-
тока (1200 мл/мин, из них более 90% приходит-
ся на корковый слой почек). За сутки через поч-
ки человека прокачивается примерно 1,5 тонны
крови, а объем образующегося ультрафильтрата
достигает 180 л (что втрое больше общего коли-
чества воды в теле взрослого человека).
Ультрафильтрат, накапливаемый в просве-
те боуменовой капсулы, обозначают термином
первичная моча. По содержанию главных ком-
понентов (кроме белков) она очень близка плаз-
ме крови (табл. 14-1). Эта жидкость поступает в
остальную часть нефрона, которая представляет
собой длинную трубочку (каналец) переменного
диаметра, местами извитую. В ней выделяют
следующие друг за другом фрагменты, различ-
ные по строению, а главное - по своим функ-
циональным возможностям: начальный сегмент
(проксимальный каналец)-, петля Генле (с ее нис-
ходящим, а затем и восходящим коленом);
дистальный каналец. Последний через связую-
щую вставку впадает в собирательную трубоч-
ку, серия которых объединяется в сосочковые
протоки, открывающиеся в почечные чашки.
Проходя по проксимальному канальцу,
первичная моча почти на 70% всасывается об-
ратно. Эта доля реабсорбции не зависит от ин-
ПОЧКИ. МОЧА
461
тенсивности потока ультрафильтрата, а объем
ее составляет в среднем 110 л в сутки.
Таблица 14-1
Главные компоненты нормальной мочи
(ммоль/л)
Вещество Первичная моча Итоговая моча
Na+ 135-150 30-100
К+ 3,5-5 15-50
Са" 2,3-2,8 3-6
СГ 100-115 60-120
НСО3- 22-26 1-25
Фосфат 0,8-1,5 10-23
nh4+ 0,01-0,05 30-50
Аминокислоты 2-4 2-8
Креатинин 0,05-0,1 11
Мочевая кислота 0,3-0,4 0.9-2.3
Мочевина 3-6 100-300
Белок 10 мг/л < 40 мг/л
Решающим фактором обратного всасыва-
ния является первично-активный транспорт,
осуществляемый №+,К+-АТФазой (раздел
3.3.3). Гидролизуя молекулу АТФ, этот фер-
мент, локализованный в базолатеральной мем-
бране эпителия канальцев, выводит в межкле-
точную среду 3 иона Na+ в обмен на 2 иона К+.
Это способствует обеднению эпителиальных
клеток ионами Na+ и, вдобавок, появлению из-
бытка отрицательных зарядов на внутренней
стороне их мембраны. Оба фактора - и перепад
концентраций, и электрический градиент - вы-
зывают пассивный ток ионов Na из просвета
канальцев внутрь клеток. В порядке Na+-3a-
висимого симпорта вместе с этим потоком в
клетки устремляются анионы (хлорид, фосфат),
глюкоза, аминокислоты, переносимые, следо-
вательно, механизмом вторично-активного
транспорта. Накапливаясь внутриклеточно,
эти вещества диффундируют далее в межкле-
точную среду почек, следуя перепаду их кон-
центраций. Кроме того, по электрическому и
концентрационному градиенту в интерстиций
из просвета канальцев движутся и ионы СГ,
проникающие через межклеточные щели (па-
рацеллюлярный шунт).
Некоторым своеобразием отличается
транспорт бикарбоната, реабсорбция которого
в проксимальных канальцах достигает 90% от
профильтрованного в клубочках. В этом про-
цессе важную роль играет обмен части реаб-
сорбируемых ионов Na на внутриклеточные
протоны, которые механизмом антипорта пе-
реходят в просвет канальцев. Здесь они реаги-
руют с НСОз", образуя угольную кислоту, ко-
торая расщепляется на СОг и Н2О, чему содей-
ствует карбоангидраза щеточной каймы тубу-
лярных клеток. Растворенный газ СОг легко
проникает путем пассивной диффузии в эпите-
лий канальцев, где реагирует с водой, превра-
щаясь снова в угольную кислоту. Освобождае-
мые при ее диссоциации протоны возвращают-
ся в просвет канальцев (посредством антипорта
с ионами Na , упомянутого выше), а бикарбо-
нат вместе с частью остальных ионов Na+ от-
правляется в межклеточную среду почек (ме-
ханизм симпорта). Иначе говоря, ионы натрия
участвуют в подкислении ультрафильтрата,
направляя в него протоны и тем самым стиму-
лируя переход бикарбоната из первичной мочи
в тубулярные клетки, а затем в интерстиций.
В результате всех этих перемещений элек-
тролитов создается осмотический градиент
между просветом канальцев и внеклеточной
средой почек, способствующий выходу воды
из канальцев. Эта вода влечет за собой допол-
нительное количество электролитов, а также
гидрофильные вещества, в том числе глюкозу и
мочевину. Создаваемое в интерстиции гидро-
статическое давление всасываемой жидкости
(при почти полном отсутствии в ней белков)
способствует переходу ее в просвет перитубу-
лярных капилляров, чему содействует высокий
уровень осмотического давления белков плаз-
мы крови.
Таким образом, на уровне проксимальных
канальцев происходит изоосмотическая реаб-
сорбция первичной мочи. При этом из состава
клубочкового фильтрата обратному всасыва-
нию в венозные капилляры почек подвергается
почти 70% воды; такая же доля Na+, К+ и, воз-
можно, СГ; более 90% НСОз- и фосфата; до
85% Са2+; 3040% ионов Mg2+.
Органические вещества ультрафильтрата
реабсорбируются, как правило, механизмом сим-
порта с ионами Na+. Это относится, в частности,
к аминокислотам, извлекаемым из первичной
мочи почти полностью, а также к пептидам, ко-
торые предварительно подвергаются тотально-
му протеолизу ферментами щеточной каймы ли-
бо (после эндоцитозного поглощения эпителием
462
Глава 14
канальцев) внутриклеточными протеиназами.
Практически полностью реабсорбируется глю-
коза, если ее концентрация в ультрафильтрате не
превышает почечного порога (10-13 мМ). Об-
ратное всасывание мочевины происходит, глав-
ным образом, путем диффузии и охватывает
лишь 50% от содержащейся в ультрафильтрате.
Отставание от объема реабсорбируемой воды
приводит к постепенному подъему концентра-
ции мочевины в ультрафильтрате по мере про-
хождения им проксимальных канальцев.
Корректировка состава исходного ультра-
фильтрата продолжается и на уровне петли
Генле, где она осуществляется механизмом
противотока.
Суть его сводится к следующему. Стенка
нисходящего тонкого колена петли Генле не-
проницаема для ионов Na+, но сохраняет спо-
собность пропускать воду. С другой стороны,
тубулярные клетки восходящего колена, про-
ходящего рядом (но в обратном направлении),
активно выводят в интерстиций свои ионы Na
(с участием мембранной Na ,К -АТФазы).
В результате поступившее из проксимального
канальца содержимое нисходящего колена, со-
хранив изоосмотичиость плазме перитубуляр-
ных капилляров, оказывается гипотоничным
относительно межклеточной среды (обогащае-
мой ионами Na из восходящего колена петли
Генле). Возникающий осмотический градиент
«высасывает» воду из нисходящего колена,
содержимое которого становится все более
концентрированным (по мере приближения к
перегибу петли). Поступая в восходящее коле-
но, оно освобождается от оказавшихся в из-
бытке ионов Na4, которые путем пассивного
транспорта переходят в тубулярные клетки,
обедневающие натрием из-за упомянутого вы-
ше удаления внутриклеточного Na+ в интер-
стиций (под действием №+,К+-АТФазы).
С участием котранспортного переносчика по-
ток Na увлекает с собой ионы СГ и К из про-
света восходящего колена в интерстиций (ме-
ханизм вторично-активного транспорта). А
поскольку восходящее колено непроницаемо
для воды, уход электролитов делает его содер-
жимое гипотоничным, а окружающую межкле-
точную среду - гипертоничной (чем и поддер-
живается уже упомянутое «высасывание» воды
из нисходящего колена).
Переходящая в дистальный каналец жид-
кость еще остается гипотоничной. Поэтому
реабсорбция электролитов протекает здесь так
же, как и в проксимальном, но в гораздо мень-
шем масштабе. Главную же роль играет обрат-
ное всасывание воды под действием антидиу-
ретического гормона аденогипофиза (прежнее
название - вазопрессин). Кроме того, состав
канальцевой жидкости, воздействуя на клетки
юкстагломерулярного аппарата, оказывает
влияние на выделение ренина (см. ниже).
В собирательных трубочках происходит
окончательное (заключительное) концентриро-
вание мочи, которое тоже находится под кон-
тролем антидиуретического гормона, стимули-
рующего обратное всасывание воды. В итоге
формируется окончательная (вторичная) моча,
которая удаляется по мочевыводящим путям
сначала в мочевой пузырь, а затем - периоди-
чески - наружу.
14.2. ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ПОЧЕК
Почки характеризуются прежде всего вы-
соким уровнем энергетического метаболизма.
До 10% всего кислорода, поглощаемого чело-
веком в состоянии покоя, утилизируют именно
почки. По уровню потребления кислорода на
единицу массы ткани они превосходят даже
мозг. Соответственно - высокий уровень мито-
хондриального окисления, основным субстра-
том которого являются метаболиты глюкозы.
ГБФ-путь расщепления ее до СОг и воды наибо-
лее интенсивно протекает в клетках дистальных
канальцев (корковое вещество почек) и в соби-
рательных трубочках (наружная часть мозгово-
го вещества почек). В клетках проксимальных
канальцев (кора почек) интенсивно осуществля-
ется окисление жирных кислот и кетоновых тел
до СО2 и воды, тогда как в клетках петли Генле
(мозговое вещество почек) доминирует глико-
литический распад глюкозы до лактата.
Интенсивная выработка АТФ в почечной
ткани необходима для обеспечения процессов
активного транспорта веществ против гради-
ента концентрации. До 80% АТФ, генерируе-
мого в клетках почечных канальцев, расходу-
ется на работу Na+,K+'АТФазы.
Почечная ткань с ее высоким уровнем ме-
таболических процессов характеризуется вы-
ПОЧКИ. МОЧА
463
сокой активностью многих ферментов. Неко-
торые из них специфичны для почек. К ним
относится глицин-амидинотрансфераза, кото-
£ рая осуществляет первую реакцию на пути
синтеза креатина. Этот фермент имеется и в
печени, но наличие почечной формы фермента
позволяет не просто дублировать другие ткани,
j но и реализовать межтканевое разделение тру-
да. Тот же креатин может первую стадию био-
генеза проходить в почках, затем с током крови
поступать в печень, где протекает вторая ста-
дия, и. наконец, образовавшийся креатин с то-
ком крови достигает мозга и мышечных орга-
г нов, включая миокард, где служит материалом
для формирования креатинфосфата, столь
нужного этим тканям.
Некоторые ферменты распределены в поч-
ках очень иеравномерио. Так, высокоактивная
1 в них лактатдегидрогеназа в корковом вещест-
ве представлена в основном изоформами ЛДГi
' и ЛДГ2, а в мозговом - ЛДГ5 и ЛДГ4. При ост-
рой почечной недостаточности в крови повы-
шается активность первых изоферментов -
ЛДГ1ИЛДГ2.
♦ В отличие от ЛДГ изоферменты аланин-
аминопептидазы (их тоже 5) являются органо-
специфичными, т.е., в каждом типе клеток
представлены не всем спектром, а только од-
* ним из изоферментов. В частности, в почках
присутствует изофермент 3, тогда как в печени
i и поджелудочной железе - соответственно изо-
ферменты 1 и 2 (остальные два изофермента
выявлены в разных отделах кишечной стенки).
Обнаружение аланинаминопептидазы-3 в сы-
t воротке крови и в моче является специфиче-
ским признаком поражения почечной ткани.
14.3. ГОМЕОСТАТИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПОЧЕК
г
Почки являются совершенно необходи-
мым дополнением крови в реализации ею
функции стабилизации содержания различных
компонентов в циркулирующих жидкостях те-
ла. Кровь выравнивает состав внутренней сре-
ды не только и не столько перемешиванием
поступающих в нее отовсюду веществ. Обяза-
тельным подспорьем становятся имеющиеся
ресурсы для удаления из организма избыточ-
ной воды, электролитов, конечных продуктов
метаболизма, особенно азотсодержащих (моче-
вина, креатинин, мочевая кислота и другие).
Главным таким ресурсом являются почки. По-
мимо перечисленного, они способны выводить
из организма также медикаментозные и иные
чужеродные вещества (в случае достаточной
растворимости их в воде).
Для ряда веществ выведение с мочой явля-
ется не просто удалением избытка чего-то. Об-
ладая способностью контролировать интенсив-
ность выведения таких веществ из организма,
почки в значительной мере выполняют функ-
цию регулятора. Особенно важна роль почек в
регулировании экскреции солей, воды, а также
доноров протона или его акцепторов (при соот-
ветствующей избыточности тех или других).
14.3.1 . РЕГУЛЯЦИЯ ВОДНО-СОЛЕВОГО БАЛАНСА
Способность хорошо растворимых солей к
гидратации обеспечивает тесную взаимосвязь
экскреции воды и электролитов, особенно та-
ких, как преобладающий в плазме натрий. Это
играет очень важную роль во многих отноше-
ниях, в том числе и в поддержании необходи-
мого уровня осмотического давления в жидко-
стях тела.
Различают два аспекта в регуляции водно-
солевого обмена. С одной стороны - это регу-
лирование объема жидкости в организме и,
прежде всего, в кровяном русле. Оно имеет са-
мое прямое отношение к регуляции артериаль-
ного давления. С другой стороны - это необхо-
димость отдельно реагировать на нехватку ве-
дущих электролитов или их избыток.
За сутки взрослый человек потребляет
обычно 1-2 л воды в жидком виде и примерно
0,7 л - в составе плотных пищевых продуктов.
Кроме того, около 0,3 л воды образуется в са-
мом организме в реакциях биологического
окисления продуктов распада углеводов, жиров
и белков.
Основную массу из этих 2-3 л воды выво-
дят почки. Довольно значительная часть - в
среднем 0,9 л - удаляется с выдыхаемым возду-
хом и испарением с поверхности кожи (нечув-
ствительное потение - perspiratio insensibilis).
Выведение с фекалиями ничтожно (около 0,1 л в
сутки).
Если не считать усиленного потения при
физической работе и при лихорадке, то под-
464
Глава 14
держание водного баланса организма осущест-
вляется именно почками. Оии способны как
уменьшать количество выводимой воды при ее
дефиците, так и увеличивать объем конечной
мочи в случае чрезмерного потребления жид-
кости. Ведущую роль в этом играют механиз-
мы нейро-гормональной регуляции. Главными
звеньями ее являются антидиуретический гор-
мон, атриопептид, ренин и альдостерон.
Антидиуретический гормон (АДГ)
представляет собой нонапептид цис-тир-фал-
глн-асн-цис-про-арг-гли, в котором радикалы
цистеина соединены дисульфидной связью, а
С-концевой глицин амидирован. Синтезирует-
ся нейронами паравентрикулярных ядер гипо-
таламуса в виде предшественника, поступаю-
щего путем аксонального транспорта в заднюю
долю гипофиза. Здесь он подвергается ограни-
ченному протеолизу с освобождением активно-
го гормона, накапливаемого в нейросекретор-
ных гранулах.
Уменьшение растяжения предсердий из-за
недостаточного наполнения их венозной кровью
приводит к стимуляции предсердных волюмо-
рецепторов, которая по афферентным путям пе-
редается в гипоталамус, приводя к усилению
выработки АДГ. Наряду с этим существует и
центральный механизм, реализуемый через ос-
морецепторы гипоталамической области. С их
участием секреция АДГ усиливается в ответ иа
повышение осмотического давления плазмы
крови (аналогичный ответ вызывают никотин,
морфин, боль, страх). Уменьшение секреции
АДГ наступает при снижении осмотического
давления плазмы («разведение» крови), а также
под влиянием этанола и атриопептида (см. ни-
же). АДГ' называют также гормоном жажды.
Главный эффект АДГ опосредован V2-pe-
цепторами, которые сопряжены с аденилатцик-
лазной системой сигнальной трансдукции. Их
стимуляция способствует сборке субъединиц
аквапорина типа П, формирующих трансмем-
бранные каналы для воды в стенках дисталь-
ных канальцев и собирательных трубочек.
В результате происходит мощное усиление об-
ратного всасывания жидкости. Оно обеспечи-
вает заключительное концентрирование ульт-
рафильтрата, объем которого снижается с по-
ступающих сюда примерно 20 л до 1-1,5 л
окончательной мочи.
Другой мишенью для АДГ являются
V]-рецепторы гладкомышечного слоя сосудис-
той стенки. Их возбуждением активируется
фосфоинозитидный путь трансмембранной сиг-
нализации, благодаря чему возрастает концен-
трация ионов Са2+ в цитозоле и, как следствие,
повышается тонус гладких мышц (подробности
этого изложены в разделе 3.3.4). Наступающее
сужение артериол ведет к повышению АД. В
почках этот системный эффект проявляется ус-
корением кровотока в прямых артериолах моз-
гового вещества, облегчающим удаление из ин-
терстиция в кровь той воды, которая интенсивно
поступает в него под воздействием АДГ на
У2-рецепторы. Усиление транспорта реабсорби-
руемой жидкости в кровь способствует увели-
чению объема плазмы (и повышению АД).
О весомости вклада АДГ в регуляцию вод-
ного баланса организма свидетельствует тот
факт, что нарушение продукции этого гормона
или неполноценность У2-рецепторов становят-
ся причиной развития несахарного диабета
(diabetes insipidus), когда суточное выведение
мочи может достигать 20 л, причем эта моча
гипотонична и не обогащена глюкозой.
Атриопептид чаще обозначают как на-
трийуретический фактор предсердий (НУФ).
Нередко его называют гормоном. Синтезирует-
ся он миоэндокринными клетками предсердия
(преимущественно правого) в виде довольно
крупного белка. Путем ограниченного протео-
лиза этот предшественник превращается в ак-
тивный пептид, который насчитывает 33 АО и
накапливается в специальных везикулах. Неко-
торые фрагменты его дальнейшего гидролиза со-
храняют гормональные свойства атриопептида.
Секрецию НУФ вызывает чрезмерное рас-
тяжение предсердий, наступающее при увели-
чении объема притекающей в них крови. Воз-
действия АДГ или катехоламинов также сти-
мулируют освобождение атриопептида.
Рецепторы атриопептида относятся к чис-
лу гуанилатциклаз плазматической мембраны
(см. раздел 2.2.3) и выявлены в гладких мыш-
цах почечных сосудов и других артериол, в
центральной нервной системе, коре надпочеч-
ников, клетках эндотелия. Этим объясняется
разнообразие эффектов, вызываемых воздейст-
вием НУФ. Главнейшие из них сводятся к уве-
личению клубочковой фильтрации (из-за рас-
ПОЧКИ. МОЧА
465
слабления гладкой мускулатуры почечных арте-
риол) и к торможению реабсорбции ионов на-
трия в эпителии концевых отделов нефрона. Те
же результаты достигаются и более опосредо-
ванными эффектами НУФ, а именно - его спо-
собностью тормозить секрецию альдостерона в
коре надпочечников и угнетать выделение ре-
нина в юкстагломерулярном аппарате. Все это,
вместе взятое, приводит к усилению выведения
с мочой ионов натрия (а с ними - и воды).
Ренин подробно описан в разделе 8.6.4 в
качестве одного из важнейших звеньев системы
вазоактивных пептидов. Синтезируемый клет-
ками юкстагломерулярного аппарата почек в
виде проренина, он секретируется в кровь ре-
цептор-опосредованным механизмом в ответ на
падение АД, уменьшение объема плазмы крови
или снижение в ней концентрации ионов Na .
Хотя его часто называют гормоном, в дей-
ствительности ренин является ферментом, кото-
рый. появившись в крови, открывает череду
протеолитических реакций (см. рис. 8-10), при-
водящую к возникновению ангиотензина II. По-
мимо мощного сосудосуживающего действия,
этот октапептид стимулирует реабсорбцию Na*
и воды в дистальных канальцах, а также - что
особенно важно - выработку альдостерона в
коре надпочечника. Кроме перечисленного, ан-
гиотензин II является одним из участников
формирования чувства жажды, которое приво-
дит к освобождению АДГ нейрогипофизом.
Важным регуляторным свойством ангио-
тензина II является его способность тормозить
освобождение ренина по принципу отрица-
тельной обратной связи.
Альдостерон синтезируется клетками
zona glomerulosa коры надпочечников (схема
его биогенеза представлена на рис. 7-32). В от-
личие от многих других гормонов, этот мине-
ралкортикостероид не накапливается в клетке, а
секретируется по мере выработки (как и один из
его предшественников - 11-дезоксикортикос-
терон, гораздо меиее активный). Помимо ангио-
тензина II, продукцию альдостерона стимули-
руют снижение концентрации Na+ в плазме кро-
ви и повышение в ней уровня ионов калия.
Как и для ряда других гормонов, мишеня-
ми минералкортикоидов являются особые
внутриклеточные рецепторы, именуемые спе-
цифическими факторами транскрипции (см.
раздел 2.4.2). Избирательно взаимодействуя с
рядом таких факторов, альдостерон реализует
свое регуляторное воздействие на экспрессию
соответствующих генов. В клетках дистальных
канальцев и собирательных трубочек это при-
водит к усилению биогенеза белков апикаль-
ных натриевых каналов и Na+,K+-ATOa3bi ба-
золатеральной мембраны. Тем самым альдо-
стерон способствует усилению обратного вса-
сывания ионов натрия (и воды). Одним из по-
следствий является возникновение электриче-
ского потенциала с отрицательной зараженно-
стью той стороны апикальной мембраны, кото-
рая обращена в просвет мочевых путей. Это
способствует поступлению ионов К и прото-
нов в окончательную мочу. В итоге экскреция
калия может даже превосходить величину его
ультрафильтрации в клубочках.
Основные направления гормональной ре-
гуляции водно-солевого баланса проиллюстри-
рованы схемой на рис. 14-1. Она наглядно де-
монстрирует не только неразрывность меха-
низмов контроля за выведением воды и натрия,
но и важную роль регулирования водно-соле-
вого баланса в обеспечении должного уровня
АД. В частности, конкретизация этой роли на
молекулярном уровне открыла новую эпоху в
разработке современных средств химиотерапии
гипертонической болезни.
Тонкое регулирование выведения воды и
электролитов обеспечивает возможность ши-
рокого диапазона колебаний плотности мочи
(1,005-1,025 и даже до 1,032).
Основным электролитом и плазмы крови,
и мочи является Na , суточное потребление
которого может варьировать от 1,2 до 6,9 г.
И почти все это количество (точнее, около
95%) выводится в норме с мочой (остальные
5% удаляются с фекалиями и потом). В отли-
чие от этого, калий доминирует во внутрикле-
точной жидкости. Суточное поступление его
в организм составляет не менее 1 г, а выведе-
ние более чем на 90% осуществляют почки
(остальное удаляется через кишечник). Как уже
отмечалось, переход ионов К (как и СО в
окончательную мочу в значительной степени
зависит от трансмембранных потоков Na+.
Остальные электролиты поступают в орга-
низм в гораздо меньших количествах, чем Na+
или даже К , а их экскреция не зависит от тем-
466
Глава 14
Рис. 14-1. Гормональная регуляция водно-солевого баланса.
пов удаления натрия. В гормональной регуля-
ции почечного выведения фосфата участвует
паратгормон, а иоиов Mg - еще и кальцито-
нин. Экскрецию иоиов Са2+ контролируют оба
этих гормона, в также кальцитриол. Молеку-
лярные механизмы функционирования пере-
численных регуляторов и их взаимосвязи были
рассмотрены в разделе 11.6.
14.3.2 . ПОДДЕРЖАНИЕ КИСЛОТНО-ЩЕЛОЧНОГО
РАВНОВЕСИЯ
Участие почек в обеспечении постоянства
pH жидкостей внутренней среды очень значи-
тельно, но реализуется оно несравненно мед-
леннее (10-20 ч), чем эффекты буферных систем
крови и потенциал легочной вентиляции.
Главными средствами воздействия почек
на кислотно-щелочной баланс организма явля-
ются компенсаторные изменения реабсорбции
натрия и экскреции протонов. Они осуществ-
ляются разными механизмами.
Один из них - реабсорбция ионов Na+, ве-
дущая к превращению двузамещенных фосфа-
тов в одиозамещенные. Если в плазме крови
отиошеиие первого (НРО/Э ко второму
(Н2РОГ) составляет обычно 4:1, то уже в клу-
бочковом ультрафильтрате оио становится об-
ратным, достигая ~ 1:9 (этот эффект равнове-
сия Гиббса-Доннана является следствием удер-
жания части катионов анионными группами
белковых молекул, неспособных проникать
через биомембраны). Избирательная реабсорб-
ция иоиов Na+ канальцевыми клетками способ-
ствует выходу протонов в просвет канальцев,
из-за чего моча подкисляется, а отношение
[НРО42 ] к [Н2РО4*] снижается вплоть до 1:50!
Другой механизм основан на превращении
бикарбонатов первичной мочи в угольную кис-
лоту. Образуемая в клетках из СО2 и Н2О, она
ПОЧКИ. МОЧА
467
взамен реабсорбируемого Na+ отдает протоны в
просвет канальцев, а остающиеся ионы бикар-
боната через базолатеральную мембрану посту-
пают в кровь. Попадая в просвет канальцев,
протоны реагируют с бикарбонат-ионами ульт-
рафильтрата, превращая их в угольную кислоту,
которая легко диффундирует в клетки (в виде
растворенного СОг)- Суммарный эффект этих
процессов состоит в переносе протонов из крови
в мочу в обмен на ионы Na . Тем самым почки
вносят весомый вклад в поддержание опти-
мального соотношения [НСО3_]/[Н2СО3] в
плазме крови (т.е., в стабилизацию величины
pH плазмы и в устойчивость буферной емкости
бикарбонатной системы крови).
Третий механизм регулирования кислотно-
щелочного баланса реализуется благодаря по-
чечной глутаминазе. Осуществляя гидролиз
глутамина на глутамат и аммиак, она обеспе-
чивает возможность выведения его с мочой в
виде ионов аммония (способствуя тем самым
удалению протонов из плазмы крови). Как уже
упоминалось, роль почечной глутаминазы осо-
бенно возрастает при сдвиге кислотно-щелоч-
ного равновесия организма в сторону ацидоза,
когда крайне важным становится выаедение
избыточных протонов. При необходимости,
глутамин способен освобождать и вторую мо-
лекулу аммиака, превращаясь в а-кетоглутарат.
Последний, в зависимости от ситуации, может
либо окисляться далее реакциями ЦТК (с осво-
бождением энергии в виде АТФ), либо исполь-
зоваться в процессах гликонеогенеза.
В ходе процессов метаболизма образуются
преимущественно кислые продукты. Обычный
темп выработки их составляет у взрослого че-
ловека 60-100 ммоль протонов ежесуточно.
Способность же почек выводить ионы Н+ во
много раз больше. Иными словами, резервный
потенциал здесь очень велик, и он успешно
используется в случае необходимости. Об этом
свидетельствует значительная изменчивость
величины pH мочи, в том числе и на протяже-
нии суток. Если величина этого параметра в
пределах 5,5-6,5 наблюдается чаще всего, то в
крайних ситуациях pH мочи может снижаться
до 4,5 либо возрастать до 7,5-8,0. Это означает,
что в выводимой моче возможен тысячекрат-
ный диапазон колебаний молярной концентра-
ции протонов.
14.4. СОСТАВ НОРМАЛЬНОЙ МОЧИ
Суточный объем выводимой мочи (диурез)
варьирует в широких пределах, но обычно со-
ставляет у взрослого человека от 1 до 2 л. От
половины до 80% этого объема составляет во-
да, поступившая в составе пищи и питья.
Здоровые почки легко справляются с вы-
ведением избыточной воды в случае поступле-
ния ее в организм в чрезмерных количествах.
Однако повышенное выведение мочи (поли-
урия) может быть следствием патологических
состояний, приводящих к нарушению функций
почек (хронические нефриты и пиелонефриты,
сахарный диабет, несахарный диабет).
Гораздо опаснее для организма уменьше-
ние суточного объема мочи (олигурия). Оно
наблюдается не только при недостаточном
приеме жидкости, но и при чрезмерных ее по-
терях другими путями (рвота, понос, сильное
потеиие при лихорадке), а также при остром
нефрите, некоторых токсикозах. Полная заку-
порка мочевыводящих путей (чаще всего при
мочекаменной болезни) и некоторые тяжелые
интоксикации (свинец, ртуть, мышьяк) чреваты
полным прекращением оттока мочи (анурия).
Длительная анурия опасна развитием уремии -
отравления организма накапливающимися
продуктами азотистого обмена
Обычно моча прозрачна и имеет соломен-
но-желтый цвет, интенсивность которого зави-
сит от степени концентрирования первичного
ультрафильтрата. Этим же в значительной сте-
пени определяется и концентрация выводимых
с мочой веществ - как минеральных, так и ор-
ганических. Поэтому зачастую диагностиче-
скую ценность представляет не столько кон-
центрация того или иного из нормальных ком-
понентов мочи, сколько количество его в су-
точной моче. В табл. 14-2 приведены такие
данные для тех веществ, которые в наиболь-
шем количестве представлены в нормальной
моче.
В суточной моче из всех плотных веществ
(сухой остаток) на долю минеральных компо-
нентов приходится 15-25 г. Вдвое больше со-
держится органических молекул различного
строения (35-40 г). Крупные молекулы, масса
которых превышает 70 кДа, в нормальную мо-
чу не попадают.
468
Глава 14
Таблица 1 4-2
Суточное выведение главных компонентов
нормальной мочи
Вещество Количество
г/сутки ммоль/сутки
Na+ 1,4-4,6 60-200
К+ 1,2-3,9 30-100
Са" 0,1-0,25 2,5-6,2
Mq'* 0,1-0,2 4,1-8,2
nhC 0,5-0,9 30-50
СГ 4,3-9,5 120-240
НСОз’ 0,1-3,0 2-50
Фосфат 0,6-1,3 20-45
Сульфат = 2 = 20
Мочевая кислота 0,3-0,7 1,8-4,5
Мочевина 12-36 200-600
Креатинин (муж.) 1,0-2,0 8,8-17,7
Креатинин (жен.) 0,8-1,8 7,1-15,9
Реакция мочи при смешанной пище кислая
или слабокислая (значение pH варьирует обыч-
но в диапазоне 5,5-6,5)- Питание преимущест-
венно растительной пищей имеет тенденцию
смещать кислотно-щелочное равновесие орга-
низма в щелочную сторону. Это объясняется
тем, что такая пища богата солями щелочных
металлов. Органические кислоты, зачастую
придающие растительным продуктам кислый
вкус, расщепляются в ходе метаболизма до СОг
и воды, а остающиеся катионы Na+ и К+ под-
щелачивают среду. Удаление их из организма
предупреждает развитие алкалоза, но pH мочи
при этом смещается в более щелочную зону.
Напротив, мясная пища бедна солями, а содер-
жащиеся в ией белки расщепляются в основ-
ном до Н2О, СО2, нейтральную мочевину и не-
большое количество других азотсодержащих
веществ, а потому не подщелачивает среду.
Поэтому пищу животного происхождения на-
зывают кислой: преобладание ее в диете спо-
собствует снижению pH мочи. Более того, про-
дукты животного происхождения относительно
богаче кислыми эквивалентами (фосфатные и
сульфатные группы органических молекул;
сера цистеина и метионина). В реакциях ката-
болизма они освобождаются в виде неоргани-
ческих кислот, вызывающих сдвиг кислотно-
щелочного баланса организма в кислую сторо-
ну. Преодоление этой тенденции обеспечивают
механизмы усиления почечной экскреции про-
тонов, увеличивающие степень подкисления
мочи (в сравнении с ее pH при смешанном ха-
рактере питания).
14.4.1. МИНЕРАЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МОЧИ
Практически все минеральные вещества,
которые содержатся в жидкостях и тканях ор-
ганизма (или случайно попадают в него), обна-
руживаются и в моче. Однако соотношения их
в моче, как правило, совсем не такие, как в
плазме крови, - жидкости, из которой непо-
средственно формируется моча.
Как показывает сопоставление данных,
приведенных в таблицах 13-1 и 14-1, содержа-
ние ионов Na в окончательной моче гораздо
ниже, чем в плазме. Напротив, концентрация
ионов К* возрастает, по меньшей мере, в не-
сколько раз. Уровень хлорида, если и снижает-
ся, то ненамного. Концентрация Са2+ возраста-
ет обычно не очень значительно, а уровень
фосфат-ионов - примерно на порядок. Наибо-
лее значительный прирост концентрации фос-
фатов в моче отмечается при ацидозе, а также
при гиперфункции паращитовидных желез.
У здорового человека примерно 90% при-
нятой с пишей поваренной соли (8-15 г в су-
тки) выводится с мочой. Существенная доля
щелочноземельных металлов (Са2+ и Mg2+) мо-
жет выводиться кишечником.
Удаление аммиака с мочой (в виде ионов
аммония) значительно возрастает при ацидозе,
что способствует выведению из организма
избыточных протонов и, следовательно, вос-
становлению нормального баланса кислот и
оснований. Напротив, при алкалозе экскреция
аммиака резко уменьшается, что опять-таки
противодействует резким сдвигам кислотно-
щелочного баланса организма.
14.4.2. ОРГАНИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА МОЧИ
В моче можно выявить большинство из
промежуточных метаболитов, если они раство-
римы в воде и достаточно стабильны, чтобы
циркулировать с плазмой крови. К таковым
относятся метаболиты глюкозы, цикла трикар-
боновых кислот, некоторые продукты превра-
щений аминокислот да и сами аминокислоты
тоже. Содержание каждого из большого числа
этих метаболитов в суточной моче очень неве-
ПОЧКИ. МОЧА
469
лико; как правило, оно даже ниже тех скром-
ных концентраций, в которых они выявляются
в плазме крови (некоторые примеры приведены
в табл. 13-3).
В количественном отношении сильно до-
минирует мочевина, содержание которой в су-
точной моче многократно больше общей массы
всех остальных органических компонентов, а
по концентрации - почти в 100 раз выше, чем
ее уровень в плазме крови. Как показывают
данные табл. 14-2, у взрослого человека суточ-
ная моча содержит обычно от 12 до 36 г моче-
вины (в зависимости от количества потребляе-
мых белков).
Суточное выведение мочевины возрастает
при всех патологических состояниях, сопрово-
ждающихся усиленным распадом белков тка-
ней тела. Уменьшается оно только при тяже-
лых поражениях печени (где происходит био-
синтез мочевины), а также при крайней степе-
ни почечной недостаточности, когда нарушает-
ся ультрафильтрация даже такого простого по
строению вещества, обладающего к тому же
высоким сродством к воде.
Все другие азотсодержащие метаболиты
содержатся в моче в очень небольших количе-
ствах. К ним относится креатинин, суточная
экскреция которого (1-2 г) не зависит от харак-
тера питания, но коррелирует с величиной
мышечной массы тела (поэтому у женщин су-
точная моча содержит обычно несколько
меньше креатинина, чем у мужчин).
Мочевая кислота образуется в качестве
конечного продукта деградации пуриновых
оснований (см. рис. 9-39). В суточной моче ее
содержание не превышает обычно 0,7 г. Оно
возрастает после приема пищи, богатой нук-
леиновыми кислотами (например, рыбья икра),
а также при подагре, лейкемии, приеме некото-
рых лекарственных препаратов (включая аспи-
рин). Существенное уменьшение суточной экс-
креции мочевой кислоты (до 0,4-0,2 г) наступа-
ет при питании продуктами, бедными пурина-
ми. Наряду с мочевой кислотой, в моче обна-
руживаются небольшие количества других пу-
ринов, - как эндогенного, так и экзогенного
происхождения.
Суммарное содержание аминокислот в су-
точной моче составляет около 1 г. Соотноше-
ния между ними отличаются от таковых в
плазме крови, что свидетельствует об опреде-
ленной избирательности процессов канальце-
вой реабсорбции веществ этой группы. Больше
всего в моче содержится глицина и гистидина,
немного уступают им глутамин, аланин и се-
рин. Наследственные нарушения метаболизма
отдельных аминокислот часто проявляются
выведением с мочой аномальных метаболитов,
часть из которых упомянута в разделе 9.4.
Безазотистые органические вещества мочи
представлены преимущественно органически-
ми кислотами. Обычными в моче являются не-
большие количества молочной, пировиноград-
ной, лимонной, янтарной, а-кетоглутаровой,
масляной, p-гидроксимасляной, ацетоуксусной
и ряда других кислот. Совокупный уровень их
выведения обычно не превышает 1 г. Значи-
тельное повышение экскреции ацетоуксусной и
p-гидроксимасляной кислот является свиде-
тельством гиперкетонемии, наблюдаемой чаще
всего при сахарном диабете или при однобоком
жировом характере диеты.
14.5. ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ СОСТАВНЫЕ
ЧАСТИ МОЧИ
При некоторых заболеваниях в моче обна-
руживаются вещества, которые у здоровых
людей отсутствуют в ней (по крайней мере, в
измеримых количествах). Определение таких
веществ путем лабораторного анализа имеет
важное диагностическое значение.
Белок появляется в моче (протеинурия)
чаще всего при тяжелых заболеваниях почек,
приводящих к повышению проницаемости клу-
бочковых капилляров. Прежде всего в мочу
проникают альбумины (как наименее крупные
белки плазмы); появление глобулинов свиде-
тельствует о более тяжелом поражении нефро-
на. Тяжелая протеинурия (более 2 г/сут.) ти-
пична для гломерулопатии, вызывающей неф-
ротический синдром.
Гемоглобин может проникать в ультра-
фильтрат почечных клубочков лишь после по-
падания его в плазму крови. Иными словами,
гемоглобинурия является признаком внутрисо-
судистого лизиса эритроцитов. Причем, гемолиз
должен быть довольно значительным, ибо не-
большие количества гемоглобина, которые мо-
гут эпизодически попадать в плазму, упавлива-
470
Глава 14
ются гаптоглобином и, как отмечалось выше,
эффективно поглощаются в комплексе с ним
клетками ретикулоэндотелиальной системы.
Гемоглобин в моче обнаруживается и при
попадании в нее крови (гематурия). Почечная
гематурия является главным свидетельством
развития острого нефрита. Виепочечной назы-
вают гематурию, возникающую в результате
повреждения мочевыводящих путем (травма,
воспалительный процесс). Выявляют гемату-
рию обычно цитологическим исследованием
осадка, получаемого при центрифугировании
анализируемой пробы мочи.
Глюкоза в моче здоровых людей содер-
жится примерно в таких же концентрациях, как
и в плазме крови, а потому не выявляется ру-
тинными методами. Отсюда возник термин
глюкозурия, хотя точнее было бы назвать это
гиперглюкозурией (т.е., повышением содержа-
ния глюкозы в моче до уровня, достаточного
для количественного определения обычными
методами). О последствиях глюкозурии и ди-
агностическом значении ее выявления подроб-
но говорилось в разделе 6.9.1.
Другие моносахариды (фруктоза, галакто-
за, пентозы) обнаруживаются в моче редко и
являются свидетельством врожденной недоста-
точности соответствующих ферментов угле-
водного метаболизма.
Кетоиовые тела - термин, которым объе-
диняют ацетоуксусную и р-гидроксимасляную
кислоты (а также ацетон, спонтанно возни-
кающий из ацетоацетата). Являясь транспорт-
ной формой ацетил-КоА, обе кислоты генери-
руются печенью в качестве питательного про-
дукта для других тканей взамен дефицитной
глюкозы (сахарный диабет, недостаточное по-
требление углеводов). По своему происхожде-
нию кетонурия является следствием гиперке-
тоиемии. Выведение кетоновых тел с мочой
ослабляет проявления развивающегося кетоа-
цидоза, а определение их в моче может слу-
жить дополнительным диагностическим крите-
рием.
Билирубин (желчный пигмент) может по-
являться в моче только в глюкуронидной фор-
ме («прямой» билирубин). Более того, в улови-
мых количествах он обнаруживается в моче
лишь тогда, когда концентрация билирубин-
диглюкуронида в плазме крови превысит
34 мкмоль/л. Как правило, это наблюдается при
обтурационной желтухе, а также при паренхи-
матозных поражениях печени. Для свободного
(«непрямого») билирубина почечный барьер
непроницаем, а потому выявление в моче этой
формы пигмента свидетельствует о тяжелом
поражении почек.
Уробилин попадает в мочу в виде восста-
новленного предшественника (уробилиногена),
образующегося из билирубина под действием
кишечной микрофлоры (см. раздел 9.6.2). Со-
держание его в суточной моче обычно не пре-
вышает 17 мкмоль/л, но резко возрастает при
желтухе гемолитического или печеночного ге-
неза. Полное отсутствие уробилина в моче ука-
зывает на закупорку желчного протока, при-
ведшую к прекращению поступления билиру-
бина в кишечник.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Учебники
Березов, Т Т Биологическая химия / Т. Т. Березов, Б.
Ф. Коровкин . — Изд. 3-е. — М. : Медицина,
1998. —704 с.
Биохимия : учебник / под ред. Е. С. Северина. — М.
: ГЭОТАР-МЕД, 2003. — 784 с.
Биохимия человека : пер. с англ.: В 2 т. / Р. Марри и
[др.]. — М. : Мир, 2004. — Т. 1. — 381 с. ;
Т. 2. —414 с.
Кольман, Я. Наглядная биохимия : пер. с нем. /
Я. Кольман, К.-Г. Рём. — М. : Мир, 2000. —
469 с.
Ленинджер, А. Основы биохимии : пер. с англ.: В 3
т- / А. Ленинджер. — М. : Мир, 1985. — Т. 1.
— 367 с.; Т. 2. — 368 с.; Т. 3. — 320 с.
Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб, для
студ. мед. вузов / А. Я. Николаев. — Изд. 3-е. —
М.: Мед. информац. агентство, 2004. — 566 с.
Эллиот, В. Биохимия и молекулярная биология :
пер. с англ. / В. Эллиот, Д. Эллиот. — М. :
НИИ биомед. химии РАМН, 1999. — 372 с.
Loffler, G. Basiswissen Biochemie mit Pathobiochemie /
G. Loffler. — 5 Aufl. — Springer, 2003. — 834 s.
Stryer, L. Biochemistry / L. Stryer. — Ed. 4-th. —
Stanford : Stanford Univ., 1995. — 1065 p.
Практикумы
Галебская, Л. В. Биохимия системы комплемента :
учеб, пособие / Л. В. Галебская, Е. В. Рюмина.
— СПб.: СПбГМУ, 1999. — 49 с.
Зубаиров, Д. М. Медицинская биохимия : практикум
/ Д. М. Зубаиров, В. Н. Тимербаев, В. С. Давы-
дов. - Изд. 2-е. — Казань : Фэи, 2001. — 296 с.
Пустовалова, Л. М. Практикум по биохимии / Л. М.
Пустовалова. — Ростов н/Д : Феникс, 1999. —
544 с.
Монографии, обзоры
К главе 1:
Покровский, В. И. Прионы и прионные болезни / В.
И. Покровский, О. И. Киселев, Б. Л. Черкас-
ский. — М.: РАМН, 2004. — 380 с.
Ткачук, В. А. Введение в молекулярную эндокринно-
логию / В. А. Ткачук. — М.: Москов. ун-т, 1983.
—256 с.
Doolittle, R. F. The multiplicity of domains in proteins /
R. F. Doolittle H Annu. Rev. Biochem. — 1995.
— Vol. 64. —P. 287-314.
Yip, С. C. Three-dimensional structural interactions of
insulin and its receptor / С. C. Yip, P. Ot-
lensmeyer H J. Biol. Chem. — Vol. 278, № 30. —
P. 27329-27332.
К главе 2:
Арчаков, А. И. Что за геномикой : Протеомика / А.
И. Арчаков И Вопр. медиц. химии. — 2000. —
Т. 46, № 4. — Р. 335-343.
Спирин, А. С. Регуляция трансляции мРНК-
связывающими факторами у высших эукариот
/ А. С. Спирин И Успехи биол. химии. — 1996.
— Т. 36, №3. — С. 48.
472
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Beissinger, М. How chaperons fold proteins I M.
Beissinger, J. Buchner П Biol. Chem. — 1998. —
Vol. 379, № 3. — P. 245-259.
К главе 3:
Климов, A. H Липиды, липопротеиды и атероскле-
роз / А. Н. Климов, Н. Г. Никульчева. — СПб.:
Питер, 1995. — 297 с.
Von Heijne, G. Membrane protein assembly: rules of
the game / G. Von Heijne H Bioessays. — 1995.
— Vol. 17, № 1. — P. 25-30.
К главе 4:
Корниш-Боуден, Э. Основы ферментативной кине-
тики : пер. с англ. / Э. Корниш-Боуден. — М. :
Мир, 1979, —280 с.
Фёршт, Э. Структура и механизм действия фермен-
тов : пер. с англ. / Э. Фёршт. — М. : Мир, 1980.
— 432 с.
К главе 5:
Скулачев, В. П. Энергетика биологических мембран
/ В. П. Скулачев. — М.: Наука, 1989. — 564 с.
Finbow, М. Е. The vacuolar H+-ATPase : a universal
proton pump of eukaryotes / M. E. Finbow, M. A.
Harrison И Biochem. J. — 1997. — Vol. 324, №
3. — P. 697-712.
К главе 6:
Acker. T Hypoxia and hypoxia inducible factors (HIF)
as important regulators of tumor physiology I T.
Acker, К. H. Plate H Cancer Treat. Res. — 2004.
— Vol. 117. —P. 219-248.
Corssmit, E. P. M. Regulation of glucose production
with special attention to nonclassical regulatory
mechanisms: a review / E. P. M. Corssmit, J. A.
Romijn, H. P. Sauerwein // Metabolism. — 2001.
— Vol. 50, № 7. — P. 742-755.
DeFronzo, R. F. Pathogenesis of type 2 diabetes mellitus
IR. F. DeFronzo I I Med. Clin. North. Am. — 2004.
— Vol. 88, № 4. — P. 787-835.
Fernie, A. R. Respiratory metabolism : glycolysis, the
TCA cycle and mitochondrial electron transport /
A. R. Fernie, F. Carrari, L. J. Sweetlove H Curr.
Opin. Plant Biol. — 2004. — Vol. 7, № 3. — P.
254-261.
Gladden, L. B. Lactate metabolism : a new paradigm
for the third millennium / L. B. Gladden H J.
Physiol. — 2004. — Vol. 558, P-t 1. — P. 5-30.
Jiang, G. Glucagon and regulation of glucose metabo-
lism IG. Jiang, В. B. Zhang H Am. J. Physiol. En-
docrinol. Metab. — 2003. — Vol. 284, № 4. — P.
E671-E678.
К главе 7:
Fatty acid synthase: a metabolic oncogene in prostate
cancer? I A. Baron et [al] I I J. Cell Biochem. —
2004. — Vol. 91, № 1. — P. 47-53.
The background of beta-oxidation disorders in humans.
I. Theory ; II. Laboratory studies and clinical data
/ T. Kuryl et [al] П Cent. Eur. J. Public Health. —
2004. — Vol. 12, № 2. — P. 88-90; 91-93.
Veech, R. L. The therapeutic implications of ketone
bodies: the effects of ketone bodies in pathological
conditions: ketosis, ketogenic diet, redox states,
insulin resistance, and mitochondrial metabolism I
R. L. Veech П Proostaglandins Leukot. Essent.
Fatty Acids. — 2004. — Vol. 70, № 3. — P. 309-
319.
К главе 8:
Веремеенко, К. Н. Протеолиз в норме и при патоло-
гии / К. Н. Веремеенко, О. П. Голобородько. А.
И. Кизим. — К. : Здоров’я, 1988. — 188 с.
Концентрационно-функциональные взаимоотноше-
ния в альтернативном пути активации ком-
племента человека / Л. В. Галебская и [др.] И
Биохимия. — 1993. — Т. 58, № 11. — С. 1796-
1800.
Елисеева, Ю. Е. Ангиотензнн-превращающий фер-
мент, его физиологическая роль / Ю. Е. Ели-
сеева // Во пр. медиц. химии. — 2001. — Т. 47,
№ 1. — С. 43-54.
Зубаиров, Д. М. Молекулярные основы свертывания
крови и тромбообразования / Д. М. Зубаиров.
— Казань : Фэн, 2000. — 364 с.
Ротанова, Т В. Энергозависимый селективный
внутриклеточный протеолиз : Строение, актив-
ные центры и специфичность АТФ-завнсимых
протеиназ / Т. В. Ротанова // Вопр. медиц. хи-
мии. — 2001. — Т. 47, № 1. — С. 3-19.
Щербак, И. Г Пороговый механизм регуляции кас-
кадного протеолиза / И. Г. Щербак И Биоорга-
нич. химия. — 1998. — Т. 24, № 5. — С. 364—
369.
Яровая, Г А. Калликреин-кининовая система: новые
факты н концепции : обзор / Г. А. Яровая И
Вопр. медиц. химии. — 2001. — Т. 47, № 1. —
С. 20-42.
Inagami, Т. A memorial to Robert Tiegerstedt : the cen-
tennial of renin discovery / T. Inagami H Hyper-
tension. — 1998. — Vol. 32, Ke 6. — P. 953-957.
К главе 9:
Brosnan, J. T Glutamate, at the interface between
amino acid and carbohydrate. Metabolism / J. T.
Brosnan H J. Nutr. — 2000. — Vol. 130, № 4. —
P. 988-994.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
473
)
К главе 10:
Debelle, L. Elastin: molecular description and function I
L. Debelle, A. M. Tamburro H Int. J. Biochem.
, Cell Biol. — 1999. — Vol. 31, № 2. — P. 261-
272.
lozzo, R. V. Matrix proteoglycans : from molecular de-
sign to cellular function / R. V. lozzo П Annu.
Rev. Biochem. — 1998. —- Vol. 67. — P. 609-
> 652.
Lee, J. Y. Hyaluronan : A multifunctional, megaDakon,
) stealth molecule I J. Y. Lee, A. P. Spicer H Curr.
Opin. Cell Biol. — 2000. — Vol. 12, № 5. — P.
। 581-586.
Ramirez, F. The fibrillins IF. Ramirez, L. Pereira П Int.
J. Biochem. Cell Biol. — 1999. — Vol. 31, № 2.
’ — P. 255-259.
! Tumova, S. Heparan sulfate proteoglycans on cell sur-
I face : versatile coordinators of cellular functions /
S. Tumova, A. Woods, J. R. Couchman H Int. J.
) Biochem. Cell Biol. — 2000. — Vol. 32, № 3. —
P. 269-288.
, Weigel, P. H. Hyaluronan synthases I P. H. Weigel, V.
C. Hascall, M. Tammi // J. Biol. Chem. — 1997.
— Vol. 272. № 22. — P. 13997—14000.
К главе 11:
) Ganss, В., Kim R.H., Sodek J. Bone sialoprotein I B.
Ganss, R. H. Kim, J. Sodek H Crit. Rev. Oral Biol.
Med. — 1999. — Vol. 10, № 1. — P. 79-98.
Berridge, M. J. Capacitative calcium entry / M. J. Ber-
, ridge II Biochem. J. — 1995. — Vol. 312, P-t 1.
‘ —p. 1-11.
Knott, L. Collagen cross-links in mineralizing tissues :
1 A review of their chemistry, function, and clinical
relevance / L. Knott, A. J. Bailey П Bone. — 1998.
— Vol. 22, № 1. — P. 181-187.
Nagase, H.. Woessner J.F. Jr. Matrix metallopro-
I teinases / H. Nagase, J. F. Jr. Woessner H J. Biol.
Chem. — 1999. — Vol. 274, № 31. — P. 21491-
21494.
К главе 12:
1 Atnbudkar, I. S. Regulation of calcium in salivary gland
secretion / I. S. Ambudkar П Crit. Rev. Oral Biol.
' Med.—2000.—Vol. 11, № 1. — P. 4-25.
Butler, W. T Dentin matrix proteins I W. T. Butler H
Eur. J. Oral Sci. — 1998. — Vol. 106, Suppl. 1.
— P. 204-210.
Levine, M. J. Salivary macromolecules : A structure/
function synopsis IM. J. Levine // Ann. NY Acad.
Sci. — 1993. — Vol. 694. — P. 11-16.
Perez- Vilar, J. The structure and assembly of secreted
mucins I J. Perez-Vilar, R. L. Hill H J. Biol. Chem.
— 1999. — Vol. 274, № 45. — P. 31751-31754.
Schenkels, L. С. P. M., Veerman E.C.I., Nieuw Ame-
rang en A. V. Biochemical composition of human
saliva in relation to other mucosal fluids / L. С. P.
M. Schenkels, E. C. L. Veerman, A. V. Nieuw-
Amerongen H Crit. Rev. Oral Biol. Med. — 1995.
— Vol. 6, № 2. — P. 161-175.
Smith, С. E. Cellular and chemical events during
enamel maturation / С. E. Smith // Crit. Rev. Oral
Biol. Med. — 1998. — Vol. 9, № 2. — P. 128-
161.
К главе 1 3:
Шиффман, Ф. Дж. Патофизиология крови : пер. с
англ. / Ф. Дж. Шиффман. — М. : БИНОМ ;
СПБ.: Невский дналект, 2000. — 448 с.
Jensen, F. В. Red blood cell pH, the Bohr effect, and
other oxygenation-linked phenomena in blood O2
and CO2 transport I F. B. Jensen H Acta Physiol.
Scand. — 2004. — Vol. 182, № 3. — P. 215-227.
К главе 14:
Шейман, Дж. А. Патофизиология почки : пер. с
англ. / Ф. Дж. Шиффман. — М. : БИНОМ ;
СПБ. -. Невский диалект, 2001. — 208 с.
Reilly, R.F. Mammalian distal tubule : physiology,
pathophysiology, and molecular anatomy I R. F.
Reilly, D. H. Ellison И Physiol. Rev. — 2000. —
Vol. 80, № 1. — P. 277-313.
Madias, N. E. Cross-talk between two organs: how the
kidney responds to disruption of acid-base balance
by the lung / N. E. Madias, H. J. Adrogue H
Nephron Physiol. — 2003. — Vol. 93, № 3. —
P. 61-66.
ОГЛАВЛЕНИЕ
ПРЕДИСЛОВИЕ АВТОРА..................................................................3
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.................................................................4
ВВЕДЕНИЕ............................................................................6
Глава 1. БЕЛКИ: СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ.............................9
1.1. Строение природных аминокислот............................................9
1.2. Физико-химические свойства аминокислот...................................10
1.2.1. Растворимость..........................................................10
1.2.2. Электролитическая диссоциация..........................................12
1.3. Классификация аминокислот.................................................15
1.4. Типы связей между аминокислотами в молекуле белка.........................17
1.4.1. Пептидиая связь.......................................................17
1.4.2. Дисульфидная связь....................................................21
1.4.3. Нековалентные связи (слабые типы связей)..............................22
1.5. Пространственная организация белковой молекулы............................24
1.5.1. Первичная структура...................................................24
1.5.2. Вторичная структура...................................................25
1.5.3. Третичная структура...................................................28
1.5.4. Четвертичная структура................................................28
1.6. Высшие структуры глобулярных белков.......................................28
1.6.1. Пространственная организация миоглобина................................29
1.6.2. Пространственная организация гемоглобина...............................30
1.7. Высшие структуры фибриллярных белков......................................31
1.8. Конформация белковых молекул..............................................34
1.9. Узнавание и реагирование - две генеральные функции белковой молекулы.....35
1.10. Нативность белка и его денатурация........................................37
1.11. Коллоидное состояине белка..................... ............................. 38
1.11.1. Факторы стабилизации белка в коллоидном состоянии.................. 38
1.11.2. Способы необратимого осаждения белка.................................39
1.11.3. Способы обратимого осаждения белка...................................40
1.12. Разделение и очистка белков.......................................... 42
1.12.1. Улырацентрифугирование...............................................42
1.12.2. Электрофорез.........................................................43
1.12.3. Хроматография........................................................44
1.13. Номенклатура и классификация белков......................................45
1.13.1. Простые белки (протеины)........................................... 47
1.13.2. Сложные белки (устарелое название - протеиды)........................49
ОГЛАВЛЕНИЕ
475
Глава 2. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ......................................................54
2.1. Строение мононуклеотидов................................................54
2.2. Биологические функции мононуклеотидов...................................55
2.2.1. Нуклеотидные компоненты ферментов....................................56
2.2.2. Роль мононуклеотидов в энергетическом метаболизме.....................57
2.2.3. Циклические формы мононуклеотидов.....................................60
2.3. Строение полинуклеотидов................................................65
2.3.1. Рибонуклеиновые кислоты...............................................65
2.3.2. Дезоксирибонуклеиновые кислоты.......................................66
2.4. Функциональный потенциал молекул ДНК....................................68
2.4.1. Репликация (синтез ДНК)...............................................70
2.4.2. Транскрипция (синтез мРНК)............................................72
2.4.3. Обратная транскрипция.................................................75
2.5. Участие РНК в биосинтезе белковых молекул...............................75
2.5.1. Распознавание и активация аминокислот.................................76
2.5.2. Генетический код.....................................................78
2.5.3. Адапторная роль тРНК..................................................79
2.5.4. Механизм трансляции...................................................80
2.6. Посттрансляционная модификация белка....................................83
2.6.1. Фолдинг..............................................................83
2.6.2. Процессинг...........................................................84
2.6.3. Ковалентное преобразование радикалов аминокислот......................87
Глава 3. ЛИПИДЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ..........................................90
3.1. Строение липидов........................................................90
3.1.1. Воска.................................................................91
3.1.2. Ацилглицеролы (нейтральные жиры)......................................91
3.1.3. Фосфолипиды...........................................................92
3.1.4. Гликолипиды...........................................................94
3.1.5. Стеролы и стериды.....................................................94
3.2. Биологические мембраны..................................................94
3.2.1. Липидный бислой.......................................................95
3.2.2. Мембранные белки......................................................98
3.3.3. Транспорт веществ через мембрану......................................99
3.3.4. Трансмембранная сигнализация..........................................102
Глава 4. ФЕРМЕНТЫ.................................................................105
4.1. Сущность явления катализа...............................................105
4.2. Общие свойства катализаторов............................................110
4.3. Особенности ферментов как биологических катализаторов...................110
4.3.1. Эффективность ферментативного катализа...............................110
4.3.2. Влияние неспецифических факторов среды................................111
4.3.3. Субстратная специфичность ферментов..................................112
4.3.4. Специфичность действия ферментов.....................................113
4.3.5. Обратимые взаимодействия фермента с лигандами.........................113
4.4. Номенклатура, классификация и индексация ферментов......................113
4.5. Строение ферментов......................................................115
4.5.1. Каталитический центр.................................................115
4.5.2. Адсорбционный центр..................................................117
4.5.3. Аллостерические центры................................................119
4.6. Основные этапы ферментативного катализа.................................121
4.7. Кинетика ферментативного катализа.......................................122
4.7.1. Зависимость скорости реакции от концентрации фермента................122
4.7.2. Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата...............124
4.8. Методы определения главных кинетических констант.......................126
4.9. Кинетическая оценка обратимых ингибиторов...............................127
476
ОГЛАВЛЕНИЕ
4.10. Необратимые ингибиторы ферментов.......................................... 129
4.11. Активация ферментов..........................................................131
4.12. Автономная саморегуляция ферментов..........................................132
4.12.1. Простейшая ферментная система......................................... 133
4.12.2. Система двух ферментов для одного субстрата.............................134
4.12.3. Изоферменты........................................................... 135
4.12.4. Неразветвленная мультиферментная система................................136
4.12.5. Разветвленная мультиферментная система..................................137
Глава 5. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ......................................................139
5.1. История развития учения о биоокислении........................................139
5.2. Митохондриальное окисление...................................................142
5.2.1. Ферменты митохондриального окисления.....................................142
5.2.2. Полная цепь системы митохондриального окисления..........................145
5.2.3. Укороченная цепь митохондриального окисления.............................149
5.2.4. Механизм сопряжения окисления с фосфорилированием........................150
5.2.5. Дыхательный контроль.....................................................152
5.2.6. Разобщение окислительного фосфорилирования...............................153
5.2.7. Удлиненная цепь митохондриального окисления..............................155
5.3. Цикл трикарбоновых кислот....................................................159
5.3.1. Химизм реакций ЦТК.......................................................160
5.3.2. Итоговое уравнение ЦТК...................................................162
5.3.3. Энергетический итог реакций ЦТК..........................................163
5.3.4. Биологическое значение ЦТК...............................................164
5.3.5. Автономная саморегуляция ЦТК........................................... 164
5.3.6. Восполнение фонда ЩУК....................................................165
5.3.7. Челночный транспорт......................................................168
5.4. Внемитохондриальное окисление................................................170
5.4.1. Оксидазы...................-.............................................170
5.4.2. Десатуразы............................................................. 172
5.4.3. Монооксигеназы..................................................... 174
5.4.4. Диоксигеназы.............................................................183
5.4.5. Липоксигеназы............................................................184
5.4.6. Циклооксигеназы...........................................................185
5.5. Активные формы кислорода-.-—............................................... 187
5.5.1. Пути образования АФК и их превращения....................................188
5.5.2. Механизмы антиоксидантной защиты.........................................191
5.6. Заключение...................................................................195
Глава 6. МЕТАБОЛИЗМ УГЛЕВОДОВ.........................................................197
6.1. Строение и свойства углеводов.............................................. 197
6.2. Переваривание и всасывание углеводов.........................................202
6.3. Гексокиназная реакция..................................................................................204
6.4. Реакции биогенеза структурных углеводов......................................206
6.4.1. Взаимопревращения моносахаридов........................................ 206
6.4.2. Модификация моносахаридных молекул.......................................208
6.4.3. Биосинтез структурных гликополимеров.....................................211
6.5. Синтез и распад гликогена....................................................211
6.5.1. Биогенез гликогена.......................................................211
6.5.2. Распад гликогена....................................................... 212
63.3. Автономная саморегуляция метаболизма гликогена......................... 214
6.6. Гексозомонофосфатиый путь (ГМФ-путь).........................................214
6.6.1. Окислительный этап.......................................................214
6.6.2. Неокислительный этап.................................................. 215
6.6.3. Итоговое уравнение ГМФ-пути..............................................216
6.6.4. Доля ГМФ-пути в общей утилизации глюкозы клетками........................217
ОГЛАВЛЕНИЕ
477
6.7. Гексозобисфосфатный путь (ГБФ-путь)......................................218
6.7.1. Основные этапы гексозобисфосфатного пути.............................218
6.7.2. Цитоплазматический этап ГБФ-пути.....................................218
6.7.3. Итоговое уравнение цитоплазматического этапа ГБФ-пути................221
6.7.4. Гликолиз.............................................................222
6.7.5. Гликонеогенез........................................................224
6.8. Автономная саморегуляция энергетического метаболизма углеводов............226
6.8.1. Интенсивная мышечная работа..........................................227
6.8.2. Состояние покоя......................................................228
6.8.3. Гиподинамия при избыточном углеводном питании........................228
6.9. Гормональная регуляция энергетического метаболизма углеводов..............229
6.9.1. Инсулин..............................................................231
6.9.2. Глюкагон.............................................................234
6.9.3. Адреналин (норадреналин).............................................235
Глава 7. МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ.......................................................238
7.1. Переваривание и всасывание липидов........................................238
7.2. Метаболизм триацилглицеролов..............................................240
7.3. Катаболизм высших жирных кислот...........................................243
7.3.1. Перенос жирных кислот в матрикс митохондрий..........................243
7.3.2. Химизм реакций Р-окисления жирных кислот.............................243
7.3.3. Энергетический итог катаболизма жирных кислот........................245
7.3.4. Кетоновые тела.......................................................246
7.4. Синтез высших жирных кислот...............................................247
7.4.1. Транспорт аиетил-КоА в цитоплазму....................................248
7.4.2. Синтез малонил-КоА...................................................249
7.4.3. Биогенез насыщенной жирнокислотной цепи..............................250
7.5. Метаболизм глицерофосфолипидов...........................................253
7.5.1. Биогенез глицерофосфолипидов.........................................253
7.5.2. Катаболизм глицерофосфолипидов.......................................256
7.6. Метаболизм сфинголипидов.................................................257
7.7. Метаболизм холестерола...................................................258
7.7.1. Синтез холестерола...................................................258
7.7.2. Транспорт холестерола в организме................................ 261
7.7.3. Метаболические превращения холестерола...............................263
Глава 8. ПРОТЕОЛИЗ................................................................267
8.1. Нормы белка в питании.....................................................267
8.2. Темпы обновления белков тела..............................................269
8.3. Общая характеристика ферментов протеолиза.................................270
8.4. Тотальный протеолиз.......................................................271
8.4.1. Переваривание пищевых белков.........................................271
8.4.2. Внутриклеточный тотальный протеолиз..................................274
8.4.3. Механизмы защиты от избыточного протеолиза...........................275
8.5. Ограниченный протеолиз...................................................276
8.6. Системы каскадного протеолиза............................................277
8.6.1. Система свертывания крови (гемокоагуляции)...........................278
8.6.2. Система фибринолиза..................................................286
8.6.3. Система комплемента..................................................290
8.6.4. Протеолитическая система регуляции сосудистого тонуса................300
Глава 9. МЕТАБОЛИЗМ АМИНОКИСЛОТ...................................................306
9.1. Общие пути распада аминокислот...........................................306
9.1.1. Декарбоксилирование..................................................306
9.1.2. Дезаминирование......................................................310
9.1.3. Реакция трансаминирования.......................................... 313
478
ОГЛАВЛЕНИЕ
9.2. Биологическое значение процессов трансаминирования.......................314
9.2.1. Трансдезамннирование..................................................315
9.2.2. Синтез новых аминокислот из числа заменимых...........................317
9.3. Обезвреживание аммиака...................................................318
9.3.1. Временное связывание аммиака..........................................318
9.3.2. Биосинтез мочевины.................................................. 319
9.4. Особенности метаболизма отдельных аминокислот.......................... 322
9.4.1. Аланин, глицин, серин, треонин........................................322
9.4.2. Метионин, цистеин.....................................................325
9.4.3. Валин, лейцин, изолейции..............................................328
9.4.4. Лизнн.................................................................329
9.4.5. Фенилаланин, тирозин, триптофан.......................................330
9.4.6. Аспартат, аспарагин, глутамат, глутамин............................. 333
9.4.7. Гистидин, пролин, аргинин.............................................333
9.5. Метаболизм нуклеотидов...................................................336
9.5.1. Синтез пиримидиновых нуклеотидов......................................336
9.5.2. Катаболизм пиримидинов.............................................. 339
9.5.3. Синтез пуриновых нуклеотидов..........................................339
9.5.4. Катаболизм пуринов....................................................342
9.5.5. Регуляция биогенеза нуклеотидов.......................................345
9.6. Синтез и распад гемма....................................................345
9.6.1. Биогенез гемопротеинов................................................346
9.6.2. Катаболизм гемма......................................................349
9.7. Заключение...............................................................351
Глава 10. СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ.....................................................353
10.1. Клеточный состав.........................................................353
10.1.1. Структурные клетки....................................................354
10.1-2. Клетки неспецифической защиты........................................354
10.1.3. Клетки иммунной защиты................................................355
10.1.4. Межклеточное общение..................................................358
10.2. Волокна внеклеточного матрикса...........................................360
10.2.1. Строение коллагеновых волокон........................................360
10.2.2. Биогенез коллагеновых волокон........................................364
10.2.3. Строение эластических волокон.........................................370
10.3. Основное вещество матрикса...............................................374
10.3.1. Строение гликопротеинов............................................ 374
10.3.2. Гликозаминогликаны................................................. 376
10.3.3. Строение протеогликанов..............................................379
10.34. Биосинтез гликоконъюгатов............................................383
10.3.5. Реакция сульфатирования..............................................386
Ю.З.б.Катаболизм компонентов ВКМ..............................................387
Глава 11. СКЕЛЕТНЫЕ ТКАНИ..........................................................392
11.1. Хрящевая ткань...........................................................392
11.2. Состав костной ткани.....................................................396
11.2.1. Клеточный состав......................................................396
11.2.2. Органические компоненты...............................................397
11.2.3. Минеральная фаза................................................... 397
11.3. Основные этапы формирования костей..................................... 400
11.3.1. Прямой остегеиез.....................................................400
11.3.2. Непрямой остегеиез....................................................400
11.3.3. Структурная организация костной ткани................................401
11.4. Механизмы минерализации кости............................................402
11.4.1. Гомогенная нуклеация..................................................403
11.4.2. Гетерогенная нуклеация................................................403
ОГЛАВЛЕНИЕ
479
11.5. Ремоделирование кости......................................................406
11.6. Гормональная регуляция остеогенеза.........................................408
11.7. Нарушения кальциевого обмена...............................................410
11.7.1 .Нормы кальция в питании................................................411
11.7.2. Дисбаланс процессов ремоделирования....................................411
11.7.3. Лечебные эффекты бисфосфонатов-........................................412
Глава 12. ЗУБЫ. СЛЮНА................................................................414
12.1. Тканизуба..................................................................414
12.1.1. Развитие зуба..........................................................414
12.1.2. Пульпа зуба............................................................416
12.1.3. Дентин.................................................................417
12.1.4. Цемент.................................................................421
12.1.5. Периодонт (периодонтальная связка).....................................422
12.1.6. Эмаль зуба.............................................................424
12.2. Слюна......................................................................428
12.2.1. Муцины.................................................................429
12.2.2. Белки серозного секрета................................................431
12.2.3. Минеральный состав слюны...............................................434
12.2.4. Биологическая роль фторидов............................................436
Глава 13. КРОВЬ. ЛИМФА...............................................................439
13.1. Эритроциты.................................................................440
13.1.1 .Транспорт кислорода....................................................441
13.1.2.Транспорт СО2...........................................................441
13.1.3.Особенности метаболизма.................................................443
13.1.4.Нарушения дыхательной функции эритроцитов...............................446
13.2. Лейкоциты..................................................................447
13.3. Плазма крови...............................................................448
13.3.1. Минеральный состав.....................................................448
13.3.2. Кислотно-шелочное равновесие...........................................449
13.3.3. Белковый спектр плазмы.................................................452
13.3.4. Ферменты плазмы........................................................456
13.3.5. Низкомолекулярные органические вещества................................458
13.4. Лимфа......................................................................459
Глава 14. ПОЧКИ. МОЧА................................................................460
14.1. Экскреторная функция почек.................................................460
14.2. Особенности метаболизма почек..............................................462
14.3. Гомеостатическая роль почек................................................463
14.3.1. Регуляция водно-солевого баланса.......................................463
14.3.2. Поддержание кислотно-щелочного равновесия..............................466
14.4. Состав нормальной мочи......................................................467
14.4.1.Минеральные компоненты мочи.............................................468
14.4.2.Органические вещества мочи..............................................468
14.5. Патологические составные части мочи.........................................469
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА.............................................................471
Игорь Григорьевич Щербак
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Учебник для медицинских вузов
Редактор JJ. В. Галебская
Технический редактор Э. 17. Выборнова
Корректор Л. В. Киревичева
Верстка О. В. Ивановой
Лицензия ИД №00597 от 15.12.99 г. Подписано в печать 20.10.05. Формат бумаги 60x84 1/8.
Бумага офсетная. Гарнитура «Таймс». Печать офсетная. Уел. печ. л. 55,8. Тираж 3000 экз. Заказ № 595 /03.
197022, Санкт-Петербург, улица Льва Толстого, 6/8.
Издательство СПбГМУ
Отпечатано в типографии «Береста» с готовых диапозитивов
196006, Санкт-Петербург, ул. Коли Томчака, д. 28.
Межмембранное пр<
(Сукцинил-КоА)
кс митохондрии
9*785889
990529
Игорь Григорьевич Щербак родился в 1932 г. в Хиве (Узбекистан).
Окончив в 1950 г. среднюю школу № 3 города Ровно (Украина),
поступил в I Ленинградский медицинский институт имени
акад. ИЛПавлова (ныне Санкт-Петербургский государственный
медицинский университет им. акад. И.П.Павлова).
С кафедрой биологической химии этого вуза связана вся
дальнейшая его трудовая деятельность: аспирант, ассистент,
доцент и с 1972 г. руководитель коллектива. Перейдя в 2000 г.
на должность профессора кафедры, Игорь Григорьевич
продолжает активную научную и педагогическую работу.
Автор или соавтор более 150 научных публикаций и
20 изобретений, профессор И.Г.Щербак главным своим
научным достижением считает разработку концепции
порогового механизма регуляции систем каскадного протеолиза.
“...Основная задача, которую поставил перед собой
автор при написании этого нового учебника, состояла не
столько в том, чтобы изложить студентам конкретную
информацию о химических структурах и механизмах,
обеспечивающих жизнедеятельность организма, хотя и она
занимает большую часть книги, сколько в том, чтобы
разъяснить им общие принципы, которые лежат в основе
здоровья и болезни человека.
Достаточное внимание уделено молекулярной биологии
и процессам регуляции, ибо эти разделы относятся к
наиболее интенсивно развивающимся направлениям
современной биологической химии. Поскольку XXI век
открывает путь от геномики к протеомике, вполне
оправдано выделение в качестве самостоятельной главы
«Протеолиз», в которой в свете единой концепции
рассматриваются такие важные для медицины процессы,
как переваривание белков, свертывание крови,
фибринолиз, образование мембраноатакующего
комплекса комплемента и протеолитическая система
регуляции сосудистого тонуса...
Труд профессора И.Г.Щербака представляет собой
подлинно студенческий учебник и, полагаю, будет
достойным образом оценен именно зтой категорией
читателей...”
(Из рецеиз и проф. ДМ. Зубаирова,
заведующего кафедрой биологической химии
Казанского государственного
медицинского университета,
Заслуженного деятеля науки ТАССР и РФ,
Лауреата Государственной Премии РФ)
Глюкоза
И. Г. ЩЕРБАК
БИОЛОГИЧЕСКАЯ
ХИМИЯ
| УЧЕБНИК ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ ВУЗОВ
CAHJCT-ПЕТЕРБУРГ
2005