Микробиология виноделия - Бурьян Н.И., Тюрина Л.В.

Автор: Бурьян Н.И. Тюрина Л.В.

Теги: биология клетки и субклеточных частиц цитология виноделие энология виноградные вина биология микробиология пищевая промышленность пищевое производство алкогольные напитки

Год: 1979

Похожие

Технологические правила виноделия. Том 1: Общие положения. Тихие вина

Технологические правила виноделия. Том 2: Игристые вина. Коньяки. Плодово-ягодные вина

Производство шампанского

Избранные работы по химии и технологии вина, шампанского и коньяка

Текст

Н И. Бурьян
Л. В. Тюрина
МИКРОБИОЛОГИЯ
ВИНОДЕЛИЯ
МОСКВА
«ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ*
1979
www.ovine.ru
УДК 576.8:663.2
Микробиология виноделия. Бурьян Н. И., Тюрина Л. В. 1979.
В книге рассматриваются микроорганизмы, развивающиеся на виноград-
ном растении, в сусле и вине: дрожжи, уксуснокислые и молочнокислые бак-
терии, плесневые грибы. Описаны особенности морфологии, цитологии и фи-
зиологии этих микроорганизмов, процессы, ими вызываемые, продукты обме-
на веществ и влияние их на органолептические свойства вина. Большое вни-
мание уделено роли чистых культур дрожжей в виноделии. Показано, что
микроорганизмы, развивающиеся в виноградном сусле и вине, различаются
по скорости размножения, брожения и биосинтезу вторичных продуктов. По-
этому важно выбрать соответствующую расу и обеспечить чистоту техноло-
гического процесса на заданной культуре микроорганизма.
Приведены основные методы изучения и отбора культур дрожжей, уксус-
нокислых и молочнокислых бактерий по признкам, имеющим практическое
значение для виноделия.
В книге даны рекомендации по использованию тех или иных свойств мик-
роорганизмов в производственных условиях для повышения качества и био-
логической стабильности вин.
Таблиц 52. Иллюстраций — 56. Список литературы — 336 названий.
Рецензенты: д-р биол. наук Н. Ф. Саенко, канд. техн, наук Н. Г. С а-
р и ш в и л и.
Б 31709 030 30_79 2908000000
044(01)—79
© Издательство «Пищевая
промышленность», 1979 г.
ВВЕДЕНИЕ
В десятой пятилетке перед винодельческой промышленностью
стоят большие задачи по увеличению выпуска продукции, улуч-
шению ее качества и повышению эффективности производ-
ства.
Виноделие — сложный процесс превращения веществ вино-
града в вино, обусловленный в основном жизнедеятельностью
микроорганизмов. Поэтому для управления технологическим
процессом с целью получения вин высокого качества необходи-
мо знание биологии микроорганизмов виноградного сусла и
вина.
В процессе приготовления вина из виноградного сусла про-
текают сложные биохимические реакции, связанные с жизнедея-
тельностью дрожжей и бактерий.
Брожение, вызываемое дрожжами, использовалось человеком
с незапамятных времен. Однако только в 1857 г. Л. Пастер опуб-
ликовал первое исследование о брожении. Он создал биологиче-
скую теорию брожения, определив роль бактерий в уксуснокис-
лом и молочнокислом, дрожжей — в спиртовом брожении.
Л. Пастер впервые определил функции микробов в процессах,
сущность которых он видел в обмене веществ, в тех закономер-
ных превращениях, которые беспрерывно совершаются в орга-
низме.
Л. Пастер в работе «Исследования о вине, его болезнях и
причинах, которые их вызывают. Новые способы его хранения и
ускорения созревания» 1 установил причины различных болезней
вина и открыл простой и удобный метод их предупреждения.
Рекомендация предохранять вина и пиво от порчи прогрева-
нием при температуре 50—65°С привела к возникновению ново-
го термина — пастеризация.
Важной вехой в истории развития микробиологии виноделия
явились работы датского ботаника Э. Ганзена, который в 1881 г.
разработал способ получения чистых культур из одной изолиро-
ванной клетки дрожжей. Изучая свойства выделенных культур,
он установил различия между расами дрожжей одного и того
же вида. И хотя эти исследования имели непосредственное от-
ношение к пивоварению, виноделы вскоре воспользовались
предложенным методом и оценили роль чистых культур дрож-
жей в приготовлении вин.
1 Пастер Луи. Избранные труды в двух томах. М., I960, т. I,' с. 317.
3
Г. Мюллер-Тургау и Ю. Вортман выделили и применили чис-
тые культуры дрожжей в виноделии (раса Штейнберг 1892 г.
применяется и в настоящее время).
Благодаря работам Г. Мюллер-Тургау и А. Остервальдера1,
обобщенным в классическом труде «Бактерии в виноградном и
плодовом вине и вызываемые ими изменения», была раскрыта
роль бактерий в разложении яблочной кислоты до молочной, в
образовании в вине маннита и мышиного..шлпаха1в снижении
количества винной кислоты и глицерина.
Все эти работы позволили установить тесную связь между
жизнедеятельностью определенных групп микроорганизмов и ка-
чеством получаемого вина.
Исследования с целью получения чистых культур дрожжей с
высокими производственными показателями, установления путей
распространения дрожжей в природе, выделения и отбора мест-
ных производственных рас дрожжей начали проводиться в Рос-
сии с 1893 г. Основные работы по микробиологии виноделия бы-
ли сосредоточены в институте «Магарач», существовавшем вна-
чале как Магарачская энохимическая лаборатория Никитского
ботанического сада, затем как Крымская зональная станция, на
базе которой был создан Всесоюзный научно-исследовательский
институт виноделия и виноградарства «Магарач» (ВНИИВиВ
«Магарач»).
Работы по получению чистых культур дрожжей для виноде-
лия были начаты в Магарачской энохимической лаборатории
Никитского ботанического сада химиком-виноделом А. Е. Сало-
моном и продолжены К. А. Рудзским.
Результаты работ по применению в виноделии чистых куль-
тур дрожжей были опубликованы в 1893 г. в «Записках Никит-
ского ботанического сада».
А. М. Настюков в 1897 г. создал первую коллекцию чистых
культур дрожжей и приступил к их изучению в лабораторных
условиях. Научно-опытная винодельческая станция в Одессе, ор-
ганизованная в 1905 г. В. Е. Таировым, рассылала чистые куль-
туры коллекционных дрожжей, полученные из западноевропей-
ских стран.
М. А. Ховренко установил преимущество местных чистых
культур дрожжей перед западноевропейскими и указал на не-
обходимость изучения физиологии дрожжей для отбора лучших,
повышающих вкусовые достоинства вина.
Работы М. Ф. Щербакова и А. М. Фролова-Багреева в 1907—
1908 гг. также были направлены на отбор лучших культур дрож-
жей для виноделия с учетом брожения при различной темпера-
туре. Однако, несмотря на достигнутые в этом вопросе успехи
1 Muller-Thurgau Н., Osterwalder A. Die Bakterien im Wein und Obstwein
und die dadurch verursachten Veranderungen. Verlag von Gustav Fischer. Jena,.
4 1913.
исследователей, чистые культуры дрожжей в производстве ис-
пользовались мало. Основной 'причиной являлся нестерильный
‘процесс виноделия?
---Новую главу в развитии микробиологии виноделия открыли
исследования, проведенные в 1924—1926 гг. М. А. Герасимовым.
Он рекомендовал использовать сернистую кислоту при отстаива-
ний сусла, что имело большое практическое значение, так как
'введёние*Ъ хорошо осветленное сусло активных чистых культур
дрожжей, приученных к сернистому ангидриду, способствует бо-
лее успешному их применению.
Первой проблемой микробиологии виноделия, которой посвя-
щены работы многих исследователей, являлось выделение чистых
культур дрожжей и отбор наиболее ценных для производства в
разных условиях. Культуры дрожжей были выделены для сле-
дующих районов виноделия: Крыма — М. А. Герасимовым,
Н. Ф. Саенко, А. А. Бачинской и А. Г. Конокотиной, М. А. Бор-
дуновой, Е. Н. Одинцовой и Н. И. Бурьян; Средней Азии —
Е. И. Квасниковым и В. А. Хроликовой, А. В. Шахсуварян,
В. П. Журавлевой, М. И. Мавлани и Н. Б. Эгамбердиевым,
Р. Д. Зубковой; Молдавии — А. А. Богачевым, Н. П. Трофимен-
ко, И. И. Баштанной; Северного Кавказа и Грузии — И. М. Ряб-
ченко, Г. И. Мосиашвили, Ш. Абрамовым; Армении — Б. П. Ава-
кяном; Е. А. Геворкян, Л. Г. Даниелян; Закарпатской области —
Л. В. Тюриной.
В результате анализа выделенных культур установлено боль-
шое разнообразие дрожжей, способных к полному выбраживанию
виноградного сусла. Всестороннее изучение выделенных культур,
определение принципов отбора их для виноделия позволили ре-
комендовать для применения в производстве большое количество
рас дрожжей с высокими производственными качествами для
приготовления вин различных типов: столовых сухих, полуслад-
ких, крепких, хереса и шампанского.
Для снабжения винодельческой промышленности чистыми
культурами дрожжей, изучения и отбора лучших, характери-
зующихся высокими производственными показателями, были
созданы коллекции. В настоящее время в одной из основных
коллекций чистых культур дрожжей для виноделия воВНИИВиВ
«Магарач» насчитывается свыше 400 культур. Работы по паспор-
тизации чистых культур дрожжей, направленные на подробное
описание свойств и условий, способствующих выявлению и со-
хранению ценных качеств, были начаты в 1939 г. А. М. Шумако-
вым и И. Е. Белым. Дальнейшие работы по паспортизации чис-
тых культур дрожжей, выполненные под руководством
Н. Ф. Саенко, основаны на полной общей характеристике про-
изводственных рас дрожжей. Эта характеристика помимо био-
логических показателей включает и чисто технологические (вли-
яние величины pH на интенсивность роста; бродильную функ-
цию и структуру осадка дрожжей; влияние SO2; способность 5
усваивать кислоты и др.), что позволило рекомендовать лучшие
расы дрожжей для приготовления вина того или иного типа.
Исследования и разработка методов по сохранению свойств
чистых культур дрожжей при длительном хранении их в коллек-
циях были выполнены Н. Ф. Саенко и Т. А. Сахаровой — пред-
ложен метод направленного культивирования дрожжей с целью
их адаптации к влиянию различных факторов (спирта, SO2, вы-
сокой температуры, давления СОг и пр.), Н. И. Бурьян под ру-
ководством Е. Н. Одинцовой — установлены биологические ос-
новы стабилизации свойств культур дрожжей в коллекциях.
Дальнейшее развитие микробиологии виноделия позволило
получить важные результаты по определению взаимоотношений
различных видов дрожжей рода Saccharomyces: Л. В. Тюриной
установлено, что дрожжи вида Sacch. vini более приспособлены
к обитанию в плодово-ягодных соках, а дрожжи Sacch. ovifor-
mis — к жизнедеятельности в вине. В коллекции чистых куль-
тур дрожжей для виноделия и в пробах спонтанно сброженного
виноградного сусла определены 3 фенотипа дрожжей: киллер
(убийца), нейтральные и чувствительные. Фенотипическая ха-
рактеристика рас дрожжей явилась основой метода для опреде-
ления чистоты брожения виноградного сусла на заданной куль-
туре (Л. В. Тюрина, Н. И. Бурьян).
Изучая продукты биосинтеза различных видов и рас дрож-
жей с использованием современных физико-химических методов
анализа (газожидкостная хроматография, спектральный анализ
и др.), биохимики и микробиологи определили, что количествен-
ное соотношение компонентов комплекса вторичных продуктов
зависит не только от температуры, степени аэрации, концентра-
ции водородных ионов, окислительно-восстановительного потен-
циала, состава среды, фазы брожения, но и от рас дрожжей, на
которых ведется брожение. Важную роль в этом отношении
сыграли работы, проведенные в 50—60-х годах Л. Женевуа,
Э. Пейно, Ж. Риберо-Гайоном, М. Лафоном, Ф. Радлером,
Б. Ранкином, С. Оугом, Р. Веббом и Д. Инграгамом, М. Амери-
ном и А. Соумалайненом. В Советском Союзе продукты обмена
веществ различных рас дрожжей в последние годы начали изу-
чать Г. И. Мосиашвили, Ф. Г. Саруханян, Б. П. Авакян, Т. А. Са-
харова, Н. Г. Саришвили, Н. И. Бурьян.
Исследования физиологии хересных дрожжей и установление
их положения в систематике дрожжей, впервые начатые совет-
скими учеными Н. Ф. Саенко, Н. Н. Простосердовым и др.,
вскрыли биохимические процессы, протекающие в вине под хе-
ресной пленкой, что позволило рационально подойти к органи-
зации производства советского хереса. Благодаря работам со-
ветских ученых — Г. Г. Агабальянца, Н. Ф. Саенко, А. А. Преоб-
раженского — впервые в мировой практике предложено
осуществлять процесс хересования виноматериалов в потоке в
6 специальных установках.
Большой вклад в изучение функциональной деятельности
дрожжей шампанского производства внес Н. Г. Саришвили. Ис-
следования, посвященные отбору рас дрожжей, обладающих вы-
сокой биосинтезирующей способностью, установлению оптималь-
ного состава питательной среды для размножения дрожжей,
разработке эффективных способов размножения и подготовки
культур дрожжей к шампанизации, позволили рекомендовать
новые способы повышения физиолого-биохимической активности
дрожжей, регулирования биохимических процессов в производ-
стве шампанских вин, приготовляемых непрерывным способом.
Второй проблемой, связанной с микробиологией виноделия,
является учение о спиртовом и других типах брожения. Иссле-
дования, которые провели Л. Пастер, А. Н. Лебедев, С. П. Косты-
чев, Л. А. Иванов, К. Нейберг, Г. Эмбден, Я. О. Парнас, О. Мей-
ергоф, раскрыли биохимизм отдельных стадий алкогольного и
молочнокислого брожения. Одна из интересных закономернос-
тей, установленная Л. Пастером, касается торможения процесса
спиртового брожения кислородом воздуха, впоследствии назван-
ная пастеровским эффектом. Успехи биохимии и микробиологии
в современных условиях позволили выявить сущность этого яв-
ления и практически использовать полученные данные в вино-
делии. В процессе исследований детально выяснялся механизм
реакции торможения. А. А. Мартаковым было показано, что
торможение спиртового брожения при аэрации виноградных вин
вызывается окислением спирта и кислот, а не прямым окислени-
ем сахара, хотя частичное окисление его до СОг в этих условиях
происходит. Установлено, что торможение процесса разложения
сахара при аэрации обусловлено получением энергии дрожжами
при окислении более калорийного продукта — спирта.
Е. Н. Одинцова, выясняя существующие у дрожжей связи
между энергией брожения и энергией дыхания (степень анаэро-
биоза), установила, что культуры вида Sacch. vini — основные
возбудители брожения виноградного сусла, характеризуются
наиболее низкой степенью анаэробиоза по сравнению со спирто-
выми и пивными дрожжами. Однако расы винных дрожжей в
свою очередь неодинаковы. Для виноделия отобраны перспектив-
ные расы дрожжей более анаэробного типа, у которых снижена
потребность в кислороде воздуха.
Молочнокислые бактерии в вине вызывают процессы броже-
ния сахаров и кислот. Советские ученые интенсивно развивают
исследования по изучению молочнокислых бактерий. Получены
важные результаты по изучению взаимоотношений бактерий с
дрожжами, определено систематическое положение бактерий,
развивающихся в винах, исследуются отдельные элементы обме-
на веществ. Успехи в изучении молочнокислых бактерий позво-
лили по-новому подходить к практически важным вопросам ре-
комендаций методов контроля и частичного регулирования про-
цессов, вызываемых молочнокислыми бактериями. Большой 7
вклад в эту область исследований внесли советские исследова-
тели— Н. Ф. Саенко, Е. И. Квасников и Г. Ф. Кондо, Ф. Г. Сару-
ханяп, 3. Д. Рабинович и зарубежные — Э. Пейно, Г. Шандерль,
Ф. Радлер, Б. Ранкин, С. Оуг, П. Бидан, Г. Кук, М. Америн.
Е. И. Квасниковым впервые доказано, что естественной сре-
дой обитания отдельных групп молочнокислых бактерий являет-
ся почва и заболевание вин разных типов вызывается ими, а не
специфическими видами молочнокислых бактерий. Изучение
биологии молочнокислых бактерий и их свойств позволило
Е. И. Квасникову разработать систему мероприятий по профи-
лактике заболеваний и лечению вин, а также регулированию
яблочно-молочного брожения в столовых винах для повышения
их качества.
Третья проблема микробиологии виноделия — микробиологи-
ческий контроль производства, являющийся одним из основных
средств повышения качества продукции. Возникла необходи-
мость в научной разработке наиболее простых, точных и быст-
рых методов микробиологического контроля. В 1938—1939 гг.
под руководством и при непосредственном участии Н. Ф. Саен-
ко разработан экспресс-метод определения чистоты обработки
тары, оборудования, воздуха производственных помещений и
вспомогательных материалов, а также даны шкалы для оценки
их состояния. Установлены объекты контроля и места взятия
проб для анализа. До сих пор эти методы не утратили своей
важности наряду с другими методами микробиологического
контроля производства, предложенными Е. И. Квасниковым и
Г. Ф. Кондо, 3. Д. Рабинович.
Большой вклад в организацию и обоснование микробиологи-
ческого контроля в винодельческой промышленности внесли
А. М. Шумаков, Н. К. Могилянский, М. А. Мальцева, Н. И. Дрбо-
глав, Д. К- Чаленко, Т. А. Чистович.
Все эти исследования, являясь базой виноделия, оказали не-
сомненное влияние на развитие винодельческой промышлен-
ности.
Введение, главы I и III написаны Н. И. Бурьян; главы II,
IV — Л. В. Тюриной; глава V — совместно.
Авторы надеются, что настоящая книга поможет широкому
кругу работников винодельческой промышленности в решении
практических задач в области микробиологии виноделия.
ГЛАВА I
ДРОЖЖИ
Технология виноделия базируется на жизнедеятельности
дрожжей, на биохимических превращениях ими углеводов в ос-
новной продукт — этиловый спирт—и вторичные продукты бро-
жения. Поэтому для управления технологическим процессом
наиболее эффективно необходимо знать биологию дрожжей,
влияние внешних факторов на рост и развитие их клеток, на об-
мен веществ и биосинтез тех или иных продуктов метаболизма,
биологию и биохимические особенности различных видов и ро-
дов дрожжей.
ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ ГРУПП ДРОЖЖЕЙ ВИНОДЕЛИЯ И ИХ
КЛАССИФИКАЦИЯ
Критерии классификации. В виноделии, как и в другой от-
расли бродильных производств, основной единицей в классифи-
кации является раса (штамм), представленная чистой культу-
рой выделенной дрожжевой клетки в пределах одного и того же
вида. Расы объединяются в виды (species), виды — в роды (ge-
nus, genera), а роды — в семейства.
Для точного определения вида дрожжей приходится проде-
лать ряд сложных и длительных операций, в значительной сте-
пени имеющих глубокий исследовательский характер, направ-
ленных к накоплению возможно большего числа диагностиче-
ских, распознавательных признаков.
Существует две группы диагностических признаков: морфо-
логические и культуральные. В состав культуральных входят и
физиологические признаки (форма колоний в определенных пи-
тательных средах, биохимические процессы, отношение к темпе-
ратуре и другим условиям среды). Следует отметить, что ди-
агностические признаки могут быть надежными лишь в том слу-
чае, если они получены при изучении заведомо чистой культуры.
В настоящей монографии мы ограничимся более частной за-
дачей систематики и рассмотрим критерии, используемые для
разделения родов и основных видов дрожжей, наиболее интерес-
ных в физиолого-биохимическом и производственном отноше-
нии. Виды и роды спорогенных дрожжей представлены по сис-
тематике В. И. Кудрявцева [90]. К каждому описываемому виду
дрожжей будут даны синонимы по систематике Ж. Лоддер [274].
Виды и роды аспорогенных дрожжей описаны по систематике
Ж. Лоддер [274], поскольку русской классификации аспороген-
ных дрожжей нет.
Дрожжи и дрожжеподобные организмы относятся к двум 9
большим группам — спорообразующие дрожжи, объединяемые
в один класс сумчатых грибов (Fungi), и неспорообразующие
дрожжи, которые объединяются в группы несовершенных грибов
(Fungi imperfecti).
Класс сумчатых грибов — Fungi (грибы, образующие аско-
споры) .
Порядок одноклеточные грибы-дрожжи — Unicellomycetales.
Семейство Saccharomycetaceae, включает 17 родов, из кото-
рых производственное значение имеют 3: Saccharomyces, Pichia,
Hansenula.
Семейство Schizosaccharomycetaceae, включает роды: Schi-
zosaccharomyces, Octosporomyces.
Семейство Saccharomycodaceae, включает роды: Saccharo-
mycodes, Saenkia, Hanseniaspora, Nadsonia.
Класс несовершенных грибов — Fungi imperfecti (неспоро-
образующие грибы, половой способ размножения неизвестен).
Семейство Cryptococcaceae.
Подсемейство Cryptococcoideae, включает следующие роды:
Cryptococcus, Torulopsis, Pityrosporum, Brettanomyces, Candida,
Trigonopsis, Rhodotorula.
Род Saccharomyces Meyen К этому роду, наиболее обшир-
ному и хорошо известному, принадлежит большинство дрожжей,
имеющих значение в бродильной промышленности.
Клетки дрожжей рода Saccharomyces различной формы, ча-
ще округлой, овальной или эллиптической, размножение вегета-
тивное почкованием. Споры по 1—4 в аске, очень редко до 8.
Вегетативное поколение дрожжей этого рода в обычных для них
условиях развития всегда диплоидно. Старые культуры в жид-
кой среде дают кольцо и рост на поверхности с образованием
ложного мицелия. Хорошо сбраживают сахара (но не более
30%) с образованием этанола до 18% об. Соли азотной кислоты
не усваивают.
Внутри рода Saccharomyces по систематике В. И. Кудрявце-
ва насчитывается 18 видов. Виды, относящиеся к этому роду, не
различаются по морфологии, но хорошо различаются по отно-
шению к углеводам (см. табл. 1). Ниже описаны 7 основных ви-
дов дрожжей рода Saccharomyces, встречающихся при перера-
ботке плодово-ягодного сырья и имеющих производственное зна-
чение.
1. Saccharomyces vini Meyen (по Лоддер — Sacch. cerevisiae
Hansen) — наиболее распространенный вид дрожжей при сбра-
живании соков плодов и ягод (рис. 1). Общепринятым и рас-
пространенным наименованием этих дрожжей долгое время было
Sacch. ellipsoideus.
1 Meyen в 1838 г. впервые объединил пивные, винные и сидровые дрож-
жи в один род Saccharomyces, дав им одновременно и видовые обозначе-
ния. В классификации принято при описании родов и видов помещать имя
10 автора, давшего им название.
Рис. 1. Saccharomyces vini (X2000)
[90].
Рис. 2. Saccharomyces cerevisiae (pa-
ca XII) (X2000) [90].
Среди всех дрожжей рода Saccharomyces, развивающихся
при брожении соков, Sacch. vini составляют 80%. Сбраживае-
мая среда покрывается пеной; характер дрожжевого осадка за-
висит от расы: он пылевидный, легко взмучиваемый или хлопье-
видный — легко осаждающийся.
Возможными источниками углеродистого питания всех видов
дрожжей этого рода являются сахара, спирты, кислоты.
Для Sacch. vini всегда наиболее эффективны следующие рос-
товые вещества: пантотеновая кислота, биотин, мезоинозит. Оп-
ределенное влияние оказывают тиамин и пиридоксин.
Расы дрожжей вида Sacch. vini обладают индивидуальными
особенностями по спиртообразующей способности, сульфитовы-
носливости, по биосинтезу летучих компонентов и других про-
дуктов, создающих органолептические свойства вин (см. гла-
ву II).
В старых винах дрожжи этого вида встречаются очень ред-
ко, так как они, закончив брожение сусла, быстро отмирают.
Брожение сладких вин всегда вызывают дрожжи более спирто-
выносливые и устойчивые к сернистому ангидриду.
2. Sacch. cerevisiae Meyen (по Лоддер — Sacch. cerevisiae
Hansen) — дрожжи, применяемые в других отраслях бродиль- 11
ной промышленности: при производстве спирта, в хлебопекарной
промышленности, в пивоварении (рис. 2).
По морфологии они не отличаются от других видов своего
рода. Способность к образованию аскоспор понижена по срав-
нению с Sacch. vini, Sacch. uvarum и др.
Расы данного вида глубже, чем дрожжи любого другого ви-
да рода Saccharomyces, сбраживают осахаренные крахмалистые
субстраты, поскольку способны сбраживать еще и простые дек-
стрины. По этому признаку пивные верхового брожения или
спиртовые дрожжи отличаются от винных дрожжей. Возможные
источники углеродистого питания видов дрожжей рода Saccharo-
myces, встречающихся в виноделии, приведены в табл. 1.
Таблица 1
Отношение к источникам углеродистого питания
сахара
спирты
Виды дрожжей
рода
Saccharomyces
X
се
X
органические
кислоты
и
Св
X
э*
о
ч
о
X
се
X
а
се
х
X
к
X
X
X
о
ч
\о
к
X
се
X
X
X
X
х
X
X
о
S
X
ч
Sacch. vini
Sacch. cerevisiae
Sacch. uvarum
Sacch. carlsbergen-
sis
Sacch. chevalieri
Sacch. oviformis
Sacch. chodati
Обозначения: + усваивает; — не усваивает; при расщеплении рафинозы на
фруктозу и мелибиозу сбраживают только фруктозу, т. е. 1/3 части рафинозы.
£
3. Sacch. uvarum Beijerinck (по Лоддер — Sacch. uvarum
Beijerinck)—выделены из самозабродившего сока смородины,
виноградного сусла и вина; отдельные расы (рис. 3) использу-
ются в хлебопекарной промышленности, а также при производ-
стве пива методом низового брожения.
По морфологии не отличимы от других видов дрожжей рода
Saccharomyces. Обильное спорообразование на солодовом агаре
наблюдается только в первое время после выделения их из при-
родных условий.
Расы дрожжей Sacch. uvarum при брожении виноградного
сока образуют около 12—13% об. спирта. При брожении пены
нет. Некоторые расы Sacch. uvarum применяются в виноделии,
например Новоцимлянская 3. Заметного влияния на состав и де-
густационные особенности вина они не оказывают. Но обладают
12 высокой холодовыносливостью [22].
Рис. 3. Saccharomyces uvarum
(X2000) [90].
Рис. 4. Saccharomyces carlsbergensis
(X2000) [90].
4. Sacch. carlsbergensis Hansen (по Лоддер — Sacch. uvarum
Beijerinck) —на дрожжах этого вида (рис. 4) ведется производ-
ство пива методом низового брожения. Sacch. carlsbergensis не
отличается от других видов того же рода. Способность к спо-
рообразованию слабая, чаще всего не проявляется.
По степени сбраживания сусла Sacch. carlsbergensis не от-
личается от Sacch. cerevisiae, однако приспособление этого вида
дрожжей к развитию при низкой температуре (5—10°С) по
сравнению с Sacch. cerevisiae дало основание В. И. Кудрявцеву
выделить их в самостоятельный вид.
В виноградном соке и в вине дрожжи этого вида встречаются
редко, поэтому практическая роль их в виноделии незначительна.
5. Sacch. chevalieri Guilliermond (по Лоддер —Sacch. chevalie-
ri Guilliermond)—выделены из самозабродившего виноградно-
го сока и из молодого вина, вырабатываемого из сока пальмы.
В чистых культурах Sacch. chevalieri (рис. 5) хорошо разви-
ваются в виноградном соке и образуют в нем до 16% об. спирта.
Особого значения в виноделии не имеют, так как могут вытес-
няться дрожжами Sacch. vini.
6. Sacch. oviformis Osterwalder (по Лоддер — Sacch. bay-
anus Saccardo)—выделены из самозабродившего виноградного 13
Ряс. 5. Saccharomyces chevalier!
(X2000) [90].
Рис. 6. Saccharomyces oviformis
(X2000) [90].
сока, но обнаруживаются в нем реже, чем Sacch. vini. Чаще
встречаются в шампанском производстве.
В чистых культурах Sacch. oviformis (рис. 6) хорошо разви-
ваются в виноградном соке, сбраживая почти полностью содер-
жащиеся в нем сахара, образуя около 18% об. спирта. Потреб-
ности в факторах роста у них такие же, как и у Sacch. vini.
В начале брожения они развиваются несколько медленнее, чем
Sacch. vini, но вследствие большей устойчивости к спирту содер-
жание их непрерывно повышается в ходе брожения. При исполь-
зовании этих дрожжей в виноделии получают хорошие результа-
ты в случае сбраживания сусла с высоким содержанием сахаров
при получении сухих вин.
Вследствие широкого распространения, высокой спиртообра-
зующей способности и устойчивости к этанолу Sacch. oviformis
в основном вызывают брожение вин, содержащих сахар. Дрож-
жи шампанского производства часто принадлежат к этому виду
[204].
Все хересные дрожжи, образующие на поверхности вина плен-
ку, являются разновидностью Sacch. oviformis.
Sacch. oviformis var. cheresiensis (рис. 7) — вызывают энер-
14 гичное брожение сахаров с образованием до 17,6% об. спирта.
Рис. 7. Saccharomyces oviformis var.
cheresiensis (X2000) [90].
Рис. 8. Saccharomyces chodati
(X2000) [90].
После окончания брожения на этом же вине развиваются в ви-
де пленки. В результате окисления спирта с образованием ацет-
альдегида (до 700 мг/л) и параллельного накопления ацеталей и
летучих эфиров придают вину хересный тон. Наиболее благо-
приятной для развития хересных дрожжей является температу-
ра 18—20°С при обязательном доступе кислорода воздуха.
Н. Ф. Саенко [178] рекомендует применять хересные дрожжи
для исправления больных вин, содержащих уксусную и молоч-
ную кислоты и обладающих мышиным тоном.
7. Sacch. chodati Steiner (по Лоддер — Sacch. italicus Castel-
li) — культура (рис. 8) выделена из спонтанно сброженного ви-
ноградного сока в Швейцарии. В виноделии встречаются весь-
ма редко. Не сбраживают сахарозу, однако некоторые штаммы
легко приспосабливаются и используют ее, хотя медленнее, чем
глюкозу.
Род Pichia Hansen. Дрожжевые организмы, принадлежащие
к этому роду, образуют споры полушаровидной или угловатой
формы по 1—2, реже до 4 в аске. В сахарсодержащих средах
они развиваются с образованием морщинистой пленки. На плот-
ной среде культура дрожжей матовая, очень скудная, тонкомор-
щинистая. Форма клеток овальная или эллиптическая, часто 15
Рис. 9. Pichia (Х1500) [176].
Рис. 10. Hansenula (Х2000) [90].
палочковидная (рис. 9). Дрожжи этого рода обладают способ-
ностью усваивать сахара только путем окисления. Кроме того,,
они могут развиваться за счет окисления спиртов, органических
кислот, поэтому хорошо растут на поверхности уже сброженных
субстратов — вина, пива и других, содержание спирта в которых
не превышает 12—13% об. В молодых винах дрожжи рода Pichia
могут встречаться в больших количествах, во много раз превы-
шающих количество других дрожжей.
Дрожжи рода Pichia вызывают заболевание столовых вин1
(«цвель») и помутнение вин, разлитых в бутылки. За счет со-
держания в этих винах минимальных количеств сахаров, спир-
та, глицерина и органических кислот в присутствии кислорода
воздуха они быстро развиваются и образуют осадок, который
делает вино совершенно непригодным к реализации.
При развитии на поверхности вина в виде белой мучнистой
пленки дрожжи рода Pichia значительно изменяют как состав:
вина, так и вкусовые его достоинства. В вине увеличивается ко-
личество летучих кислот, эфиров, во вкусе появляется несвойст-
венный ему фруктовый и лекарственный тон, вино становится:
менее экстрактивным, слабее окрашенным. Продукты обмена
дрожжей рода Pichia тормозят рост и снижают бродильную»
15 энергию шампанских и хересных дрожжей [175].
Пленчатые дрожжи, в том числе и рода Pichia, весьма устой-
чивы к сернистому ангидриду. Их развитие можно задержать
введением в вино 500 мг/л сернистой кислоты. Они являются
сильными восстановителями сульфатов и сульфитов до элемен-
тарной серы, часть которой может восстанавливаться в серово-
дород.
Из видов Pichia только вид Р. alcoholophilа (синоним —
Р. membranaefaciens) найден в винах. Р. alcoholophila усваива-
ют путем окисления глюкозу (фруктозу и маннозу), этиловый
спирт, глицерин, уксусную, молочную, янтарную, яблочную (сла-
бо) и винную (слабо) кислоты.
Род Hansenula Sydow. Дрожжевые организмы рода Hansenu-
1а так же, как и дрожжи рода Pichia, образуют характерную
сухую, гладкую, позднее складчатую пленку серовато-белого
цвета, высоковсползающую по стенкам сосуда. В цикл развития
этих организмов входит образование спор. В каждой сумке об-
разуются шляповидные споры в количестве от одной до четырех
(рис. 10).
На поверхности виноградного сусла дрожжи рода Hansenula
развиваются быстро, образуя на 2—3 сут пленку и осадок, вы-
зывая одновременно брожение с образованием 2—3% об. спирта.
Клетки пленки отличаются от клеток осадка более удлиненной
формой, наличием больших вакуолей и жировых включений,,
сильно преломляющих свет. В осадке клетки овальной или ок-
руглой формы.
На плотной среде культура сначала белая, матовая, сплош-
ная, затем морщинистая.
Размножаются не только в сахарсодержащих средах, вызы-
вая одновременно их окисление и брожение, но и в уже сбро-
женных, содержащих спирта не более 13% об., при доступе кис-
лорода воздуха за счет окисления оставшихся сахаров, а также-
за счет спиртов и органических кислот. При этом кислая реак-
ция субстрата может меняться на щелочную. При развитии
дрожжей рода Hansenula в сахарсодержащих субстратах обра-
зуются этиловый, бутиловый и амиловый спирты, уксусная, мас-
ляная и янтарная кислоты, летучие эфиры (особенно уксусно-
этиловый), придающие сброженному материалу резкий аромат.
Способны развиваться на мезге в ходе брожения, на стенках бо-
чек, пропитанных вином.
Дрожжи рода Hansenula являются представителями вредной
микрофлоры брожения. Они вызывают помутнения вин. При роз-
ливе вина в бутылки с доступом воздуха при температуре 18—
20°С они быстро развиваются, образуя легко взмучивающийся
осадок в бутылке.
Из видов рода Hansenula вид Н. anomala является одним из
наиболее опасных сорняков спиртового брожения. В ягодных
соках они окисляют винную кислоту, которая обычно не усваи-
вается другими дрожжами [176].
17
Рис. 11. Candida mycoderma (X800).
Рис. 12. Schizosaccharomyces pombe
(X2000) [90].
Род Candida Berkhout. Дрожжевые организмы рода Candi-
da относятся к пленчатым неспорообразующим дрожжам. Клет-
ки овальной и удлиненно-цилиндрической формы содержат 1—
2 жировые капельки, расположенные иногда биполярно и силь-
но преломляющие свет (рис. 11).
На поверхности сред, содержащих сахар и этиловый спирт,
Candida быстро образует сухую матовую пленку, сначала глад-
кую, затем морщинистую серовато-белого цвета, часто опадаю-
щую на дно.
Этот род дрожжей включдет 81 вид. Но в винах встречаются
Candida valida, часто сбраживающие глюкозу, и Candida vini, у
которых брожение сахаров отсутствует. Синонимом обоих видов
является Candida mycoderma. Развиваясь на поверхности вина
при свободном доступе воздуха, они снижают содержание спир-
та и экстракта, обогащая его летучими кислотами, придающими
вину острый вкус. Вино теряет свежесть, становится плоским, с
характерным ароматом и вкусом выветрившегося, жидкого, пус-
того («цвель вина»).
На винах с большим количеством продуктов обмена веществ
дрожжей рода Candida хересная пленка не развивается. Многие
18 штаммы могут расти в винах, содержащих 9—12% об. спирта,
и вызывать помутнения вина в бутылках, образуя легко взмучи-
ваемый осадок. В этих условиях дрожжи рода Candida развива-
ются в вине за счет небольших (сотые доли процента) коли-
честв остаточных сахаров, спирта и органических кислот.
Род Schizosaccharomys Lindner. В практике виноградного ви-
ноделия эти дрожжевые организмы встречаются чрезвычайно
редко. Однако при производстве плодово-ягодных вин, особенно
яблочных, они хорошо размножаются и приносят большой вред
производству, так как одновременно со сбраживанием сахара
могут сбраживать яблочную кислоту в спирт и углекислый газ..
Клетки дрожжей рода Schizosaccharomyces цилиндрической
формы с закругленными концами. С наступлением неблагопри-
ятных для размножения условий (делением) происходит попар-
ная копуляция вегетативных клеток, затем образование асков со»
спорами по 4 и 8 в каждом (рис. 12). Эти дрожжи развиваются
не только за счет глюкозы и сахарозы, широко распространен-
ных в природных субстратах, но и за счет осахаренных крахма-
листых субстратов — мальтозы и декстринов. Окислительная
способность у дрожжей этого рода развита очень слабо. Они ус-
ваивают источники углеродистого питания главным образом в
процессе брожения.
По систематике Кудрявцева род Schizosaccharomyces вклю-
чает 2 вида: Schiz. pombe и Schiz. acidodevoratus Chalenko (по»
Лоддер — Schiz. pombe). Различие между ними сводится к то-
му, что Schiz. acidodevoratus обладает способностью усваивать
яблочную кислоту в процессе сбраживания глюкозы. При этом
яблочная кислота сбраживается ими в спирт и углекислоту при
наличии в среде хотя бы небольших количеств (1—2%) сахара.
Впервые в СССР дрожжи вида Schiz. acidodevoratus были вы-
делены из бродящего яблочного сока и изучены Д. К. Чаленко
[221]. Это видовое название было сохранено В. И. Кудрявцевым
в его систематике дрожжей.
Schiz. acidodevoratus помимо разрушения яблочной кислоты
способны сбраживать сахара с образованием спирта (этанола)
до 12% об. Они чрезвычайно устойчивы к сернистому ангидри-
ду, поэтому рекомендуют их иногда для биологической десуль-
фитации. Дрожжи этого вида выносят без вреда для своей жиз-
недеятельности содержание в среде SO2 до 1000 мг/л. Высокая
температура (70—80°С) в течение 10—15 мин вызывает их ги-
бель. При низких температурах 10—15°С дрожжи Schiz. acidode-
voratus развиваются значительно медленнее, чем Sacch. vini.
Способность дрожжей рода Schizosaccharomyces использо-
вать яблочную кислоту иногда применяют в виноделии для био-
логического кислотопонижения вин [183, 284, 294]. Однако при-
менение их часто не обеспечивает приемлемых дегустационных
качеств вина [284].
Род Saccharomycodes Hansen. Дрожжи в виде крупных ли-
моновидных клеток со смешанным типом вегетативного размно-
19
Рис. 13. Sacch ar omycodes ludwigii
4X2000) [90].
Рис. 14. Hanseniaspora apiculata
(X2000) [90].
жения—почкованием и делением (рис. 13); при неблагоприят-
ных для вегетативного размножения условиях клетки превра-
щаются в аски с 4 шаровидными спорами.
В нормально бродящих виноградных соках встречается ред-
ко, но очень часто — в сульфитированных винах и соках, содер-
жащих от 80 до 120 мг/л свободной сернистой кислоты. Пред-
ложено [223] использовать эти дрожжи для возбуждения бро-
жения высокосульфитированных соков (для десульфитации) и
дальнейшего дображивания винными дрожжами.
При брожении дрожжи этого рода образуют этанола в сред-
нем 10% об. Содержание летучих кислот и других вторичных
продуктов идентично содержанйю веществ, образуемых дрожжа-
ми рода Saccharomyces. Повышенная способность к синтезу ук-
сусноэтилового эфира (80 мг/л при аэробном брожении и
200 мг/л — без доступа воздуха), придающего неприятный про-
кисший запах, не позволяет рекомендовать их для приготовле-
ния вин [154]. Поэтому практически дрожжи рода Saccharomyco-
des относятся к вредным микроорганизмам вина. Они способны
размножаться в винах, содержащих сахар и в консервированных
сернистым ангидридом; в шампанском производстве могут тор-
20 мозить вторичное брожение [154, 223].
По систематике Лоддер этот род включает один вид дрож-
жей — Saccharomycodes ludwigii.
Род Hanseniaspora (Zikes) Klocker. Это довольно мелкие,
овальные, эллиптические и лимоновидные одноклеточные орга-
низмы, известные в виноделии под названием апикулятусов.
Вегетативное размножение происходит путем почкования по про-
дольной оси материнской клетки с одного или двух ее концов.
Споры образуют редко, 1—2 или 3—4 в аске (рис. 14). Дрожжи
этого рода хорошо развиваются на поврежденных ягодах, пло-
дах, фруктах, а также в соках, почти в 2 раза опережая по ско-
рости размножения Sacch. vini. Hanseniaspora apiculata являет-
ся наиболее распространенным в природе сорняком брожения и
во многих винодельческих районах составляет 90% и выше всей
микрофлоры сусла, поступающего на брожение. Некоторые расы
сбраживают 6—7% об. спирта; образуют много летучих кислот
(до 1,5 г/л) и уксусноэтилового эфира (250 мг/л), муравьиную,
янтарную, пропионовую и масляную кислоты. Эти продукты
брожения сообщают виноматериалу не только посторонний тон,
но и тормозят рост и бродильную энергию винных дрожжей как
при брожении виноградного сусла, так и при брожении вин (при
шампанизации), являясь причиной недобродов. Шампанские ви-
номатериалы, сброженные с участием дрожжей рода Hansenia-
spora, после шампанизации труднее осветляются вследствие об-
разования шампанскими дрожжами липнущих осадков, трудно-
смываемых «масок» на стенках бутылок, затрудняющих полное
сведение осадка на пробку. Особенно опасно присутствие этих
дрожжей в сусле, перерабатываемом на хересные виноматериа-
лы, так как продукты их обмена тормозят рост хересной пленки
на вине [176].
Дрожжи Hanseniaspora apiculata чувствительны к сернисто-
му ангидриду. Введение 75 мг/л SO2 задерживает их развитие.
Для удаления этих сорняков брожения была предложена Се-
мишоном система «брожения свыше четырех», которая состоит
в том, чтобы начинать брожение в среде, содержащей 3—4% об.
спирта. Однако эта система виноделия не привилась, поскольку
преимуществ в достижении чистоты брожения недостаточно.
Дрожжи рода Hanseniaspora, таким образом, нежелательны
в процессе приготовления вин. Но некоторые авторы считают
их полезными с точки зрения образуемых ими эфиров, сообщаю-
щих винам особый плодовый аромат.
Род Brettanomyces Kufferath. Клетки этого рода имеют раз-
нообразную форму: овальную, иногда со стрельчато-заостренны-
ми концами, сильно удлиненные, палочковидной формы, чаще
соединенные по 2 или больше (рис. 15). Почкование двусторон-
нее и множественное [46, 176]. Размножение очень медленное
(начало роста в сусле на 5-е сут). На поверхности вина боль-
шинство штаммов образует тонкую, гладкую, серовато-белую
пленку.
21
Рис. 15. Brettanomyces (Х1500)
[176].
В виноградном виноделии широко
распространены 2 вида: Br. intermedi-
ns и Br. custersii.
Br. custersii обладает высокой спир-
тообразующей способностью: полно-
стью сбраживает 18% сахара в сусле
с образованием 11—12% об. спирта;
спиртовыносливость ослаблена, и в ви-
не, содержащем более 12% об. спирта,
рост культуры прекращается. Количе-
ство уксусноэтилового эфира, образуе-
мого этими дрожжами, зависит от
штамма и может быть очень большим,
легко ощущаемым. Является сильным
кислотообразователем, обогащает вино
летучими и нелетучими кислотами с
резким неприятным запахом уксусного
амида, что делает вино совершенно не-
пригодным для употребления.
Наиболее благоприятной средой
для Brettanomyces является тиражное
вино с 2% сахара, поэтому наиболее
часто эти дрожжи находят в шампан-
ском виноделии. Они могут задержать
и нарушить нормальный ход вторич-
ного брожения, а также проведение
ремюажа и дегоржажа [176]. Вызыва-
ют они помутнения столовых вин, даже при добавлении сорби-
новой кислоты, так как оказались очень устойчивыми к этому
консерванту в противоположность другим родам и видам дрож-
жей [103].
Дрожжи этого рода относятся к термофильным, с оптималь-
ной температурой роста 31—32°С; при температуре ниже 12°С
рост их в вине прекращается. Весьма чувствительны к SO2: при
введении 100 мг/л полностью погибают.
Род Torulopsis Berlese. Клетки дрожжей этого рода округ-
лой, реже овальной формы. В клетках содержатся крупные кап-
ли жира, иногда заполняющие всю клетку. Характерным для
этих дрожжей является многостороннее почкование, одновре-
менное образование нескольких почек.
Дрожжи рода Torulopsis широко распространены в вино-
дельческом производстве и легко выделяются из свежеотжато-
го сусла в начале брожения. На винограде и в соках найдены
2 вида: Т. bacillaris и Т. Candida.
Т. bacillaris в противоположность другим дрожжам из смеси
сахаров сбраживают фруктозу быстрее, чем глюкозу (50% фрук-
тозы и 5% глюкозы) [154]. Дрожжи этого рода обладают осмо-
22 фильными свойствами (могут развиваться в среде с 50% саха-
www.ovme.ru
рОв). Хорошо ассимилируют пептон, чем и отличаются по азо-
тистому питанию от дрожжей рода Saccharomyces. Образуют
10% °б. спирта, могут развиваться при более высоком содержа-
нии спирта — 12,5% об. Летучие кислоты образуют умеренно,
принадлежат к очень слабым эфирообразующим дрожжам. Очень
чувствительны к низким температурам и хорошо развиваются
при повышенных температурах.
Т. bacillaris в основном выделяют из винограда, пораженно-
го благородной гнилью.
Дрожжи этого рода не придают винам особых органолепти-
ческих свойств. Однако некоторые виды образуют в сусле и в
вине слизь.
Род Rhodotorula Harrison. Это пигментированные (красные)
дрожжевые организмы. Из полусладких и десертных вин Самар-
кандского завода М. Мавлани [103] было выделено несколько
штаммов слизистых красных дрожжей.
Дрожжевые организмы Rhodotorula характеризуются силь-
ным полиморфизмом, клетки имеют округлую форму, овальную,
вытянутую изогнутую. Каротиноидные пигменты придают им ок-
раску от желтого до красного цвета. На поверхности виноград-
ного сока образуют кольцо красного и оранжевого цвета. В ви-
ноградо-винодельческих районах Узбекистана наиболее часто
встречаются виды Rh. glutinis и Rh. rubra.
Rh. glutinis усваивают глюкозу окислением, спирта не обра-
зуют. В качестве продуктов углеводного обмена образуют незна-
чительные количества летучих кислот и эфиров [103].
МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ
Форма и размеры. Клетки дрожжей имеют разнообразную
форму: круглую, овальную или эллиптическую, лимонообразную,
цилиндрическую, иногда сильно вытянутую в виде гифов.
По сравнению с другими микроорганизмами дрожжи являют-
ся довольно крупными формами. Диаметр клеток дрожжей до-
стигает 1—8 мкм, длина— 1—10 мкм. При таких размерах кле-
ток поверхность их в 1 л сбраживаемого виноградного сока мо-
жет достигать 10 м2. Именно такая большая поверхность клеток
дрожжей определяет интенсивность их метаболизма и процесса
обмена веществ с окружающей средой. Масса дрожжевых кле-
ток, равнозначная по массе животному (500 кг), за сутки синте-
зирует более 50 т белка, а животное — всего около 0,5 кг.
Плотность (удельный вес) клеток дрожжей мало отличает-
ся от плотности бактериальных клеток. Относительная плот-
ность бактериальных клеток составляет от 1,050 до 1,112; дрож-
жевых — от 1,055 до 1,060 [139].
Морфологически неизменные формы клеток дрожжей наблю-
даются только у молодых культур на стандартной питательной
среде. Одна и та же культура дрожжей может состоять из кле- 23
Рис. 16. Схема строения дрожжевой
клетки [280]:
1 — цитоплазматическая мембрана; 2—ци-
топлазма; 3—аппарат Гольджи; 4 —эндо-
плазматическая сеть; 5 — жировые капель-
ки; 6 — митохондрия; 7 — ядро; 8 — ру-
бец, где отпочковалась клетка; 9 — ядры-
шко; 10 — гранулы метахроматина (волю-
тина); 11 — рибосомы; 12 — вакуоль; 13 —
клеточная оболочка.
ток, различающихся по форме и раз-
мерам, особенно в зависимости от
стадий развития и условий окру-
жающей среды. Так, хересные дрож-
жи в период брожения, как прави-
ло, крупные, имеют эллиптическую
или круглую форму клеток, тогда
как в стадии образования пленки
они становятся мельче, приобретают
более вытянутую конфигурацию
[177, 223]. Дрожжи рода Hansenula,
обычно образующие пленку на по-
верхности вина из скоплений клеток
сильно вытянутых, мелких, при раз-
витии в среде с ограниченным досту-
пом воздуха, например на дне бу-
тылки, становятся крупнее, круглой
формы. Форма и величина клеток
дрожжей при введении СОг в сре-
ду значительно изменяется. Разме-
ры клеток пивных дрожжей (Sacch.
carlsbergensis *) увеличиваются и„
наоборот, клетки слабо бродящих
дрожжей (Torula latvica) становят-
ся значительно мельче [37].
Структура. Клетка дрожжей име-
ет сложное строение и состав. Раз-
меры отдельных элементов ее нахо-
дятся за пределами разрешающей
способности светового микроскопа. Значительные успехи, достиг-
нутые в настоящее время в расшифровке структур клетки дрож-
жей и их функций, основаны на новых методах исследования —
электронной микроскопии и комплексной цитологии.
Дрожжевая клетка является одноклеточным микроскопиче-
ским организмом и имеет в основном то же строение, что и клет-
ки животных и растений (рис. 16, 17). Внутри клетки содержат-
ся компоненты, которые обычно подразделяются на органеллы
и включения. К органеллам относятся клеточная оболочка, ци-
топлазматическая мембрана, цитоплазма, митохондрии, вакуо-
ли, аппарат Гольджи, ядро. Включения — это временные обра-
зования клетки (гликоген, трегалоза, жир, метахроматин и др.)г
которые появляются и исчезают в процессе обмена веществ.
Клеточная оболочка — плотная, тонкая и эластичная,
окружает цитоплазму и придает характерную форму клетке
дрожжей, защищает ее от вредных факторов среды, несет элект-
1 При цитировании чужих исследований мы по всей работе сохраняем
24 оригинальную транскрипцию видов, употребляемую авторами.
рический заряд. Оболочка поддер-
живает внутриклеточное осмотиче-
ское давление, регулируя поступле-
ние в клетку через поры солей и
других низкомолекулярных соедине-
ний.
В химический состав клеточной
оболочки входят белково-нолисаха-
ридные комплексы, фосфаты и ли-
пиды. У Sacch. cerevisiae полисаха-
ридная часть комплекса состоит
примерно из равных количеств глю-
кана и маннана, сумма которых со-
ставляет около 90% от сухой массы
оболочки; остальное количество ее
приходится на долю белка, липидов,
глюкозамина [165]. Белковые комп-
лексы насыщены дисульфидными и
сульфгидрильными группами. Липи-
ды в основном (примерно на 2/з) со-
стоят из свободных жирных кис-
лот (олеиновой, пальмитолеиновой,
пальмитиновой и стеариновой); ос-
Рис. 17. Электронная микрофотогра-
фия клетки дрожжей Saccharomyces
cerevisiae [280]:
тальную часть их представляют три-
глицериды, стерины и фосфолипиды.
В клеточных оболочках других
видов дрожжей содержится глюкан,
который не всегда связан с маннаном. Маннан может содержать-
ся в клеточных оболочках дрожжей в небольших количествах
(Sacch. guttulata и Endomycopsis capsularis), или совсем отсут-
ствовать (Nadsonia fulvescens, Schizosaccharomyces). Оболочки
клеток дрожжей, лишенные маннана, за исключением видов ро-
да Schizosaccharomyces, содержат повышенные количества хи-
видны клеточная оболочка и цитоплазма-
тическая мембрана, эндоплазматическая
сеть, ядро, включения.
тина.
В области периплазмы, которая находится между внутренней
поверхностью клеточной оболочки и внешней поверхностью ци-
топлазматической мембраны, найден ряд ферментов. В основном
это гидролитические ферменты, в том числе 0-фруктофуранози-
даза (инвертаза) и кислая фосфатаза.
Обычно с составом клеточной оболочки связывают явление
хлопьеобразования (флокуляции) дрожжей. Для дрожжей, так
же как и для бактерий, установлено, что переход S-форм (глад-
ких) в R-формы (шероховатые) и образование хлопьев в жид-
кой среде обусловлены превращением гидрофильных групп кле-
точной оболочки в гидрофобные [115, 146]. Однако анализ кле-
точных оболочек дрожжей, выделенных из хлопьеобразующих и
нехлопьеобразующих штаммов Sacch. cerevisiae и Sacch. carls-
bergensis, выращенных на синтетической среде, не выявил зна- 25
чительных различии в содержании основных компонентов, хотя
по мере роста как у тех, так и у других количество маннана по-
степенно уменьшалось, а глюкана — увеличивалось. И лишь ак-
тивная связь фосфоманнана и ионов кальция у двух соседних
хлопьеобразующих клеток дрожжей может служить объяснением
явления флокуляции [275].
Электронно-микроскопически также не обнаружены какие-
либо особенности клеточных оболочек у флокулирующих дрож-
жей. По-видимому, эффект флокуляции дрожжей обусловлен на-
следственностью штамма.
Цитоплазматическая мембрана образует наруж-
ный слой цитоплазмы. Она окружает протопласт — отдельную
структурную фракцию клетки, которую можно получить при уда-
лении клеточной оболочки с помощью ферментов. Цитоплазма-
тическая мембрана состоит из разных по плотности электронных
слоев общей толщиной не более 10 нм \ тесно связанных с цито-
плазмой. При микроскопировании в темном поле мембрану мож-
но наблюдать в виде тонкого светящегося ободка.
В клетке микроорганизма цитоплазматическая мембрана осу-
ществляет 4 основные функции [165]: действует как осмотиче-
ский барьер, регулирует проникновение питательных веществ из
раствора в клетку и удаление продуктов обмена веществ, вы-
полняет биосинтез некоторых составных частей клетки (компо-
нентов клеточной оболочки), представляет собой место локали-
зации некоторых ферментов и органелл (рибосомы).
Поступление (транспорт) веществ в клетку связано с изме-
нением проницаемости мембраны, которая в свою очередь зави-
сит от активности фосфолипазы и липазы [77].
Цитоплазма клетки дрожжей содержит все основные
структуры, присущие высокодифференцированным клеткам, а
именно: митохондрии, рибосомы, более или менее развитый эн-
доплазматический ретикулум (эндоплазматическая сеть), запас-
ные вещества и другие внутриклеточные включения липоидной
и углеводной природы. Они принимают активное участие в осу-
ществлении важных ферментативных процессов в цитоплазме.
В результате электронно-микроскопических и биохимических
исследований установлено, что цитоплазма представляет собой
коллоидную систему, состоящую из белков, углеводов, липидов,
минеральных веществ, воды и соединений других видов. По кон-
систенции она характеризуется высоким показателем вязкости,
превышающим вязкость воды в 800—8000 раз, что соответствует
вязкости глицерина или густого сиропа. Вязкость цитоплазмы
при старении клеток возрастает.
Структура цитоплазмы изменяется в зависимости от усло-
вий культивирования и возраста клетки. Изменения цитоплазмы
могут быть обратимые (паранекроз) и необратимые (некротиче-
26
1 1 нанометр (нм) = Ы0-9 м.
ские), что обусловлено степенью воздействия внешних факторов.
У молодых клеток дрожжей цитоплазма гомогенна; при старе-
нии появляются вакуоли, зернистость, жировые капельки, гра-
нулы лолифосфатов и липоидов, т. е. цитоплазма становится ге-
терогенной.
При длительном дифференциальном центрифугировании ци-
топлазма делится на растворимую фракцию (клеточный сок) и
на фракцию частиц, состоящую из мембран и рибосом. Раство-
римая фракция, заполняющая пространство между частицами в
интактной клетке, является основным компонентом, который
обеспечивает взаимодействие метаболитов с той средой, где на-
ходятся и функционируют структурные элементы. В растворимой
фракции содержатся вещества с высокой молекулярной массой,
преимущественно ферменты и транспортная РНК (тРНК), а
также низкомолекулярные соединения, к которым относятся
запасные углеводы, например, трегалоза и фонд (пул) амино-
кислот и нуклеотидов [165]. В результате наличия в цитоплазме
низкомолекулярных соединений возникает заметная разность в
осмотическом давлении клеточного содержимого и наружной
среды. Величина осмотического давления у дрожжей обычно
составляет около 1,2 МПа [165].
Электронно-микроскопические исследования ультратонких
срезов клеток показали, что цитоплазму пронизывает эндоплаз-
матическая сеть (ретикулум), имеющая гранулярную или глад-
кую структуру. Тесный контакт ретикулума с другими компонен-
тами клетки позволяет ему выполнять важную роль в обменных
процессах клетки.
Одним из компонентов эндоплазматического ретикулума яв-
ляются рибосомы. Это ультрамикроскопические плотные сфери-
ческие гранулы. Они содержат почти равное количество РНК. и
белка, незначительное — липидов. С функциональной особенно-
стью рибосом связан синтез клеточных белков. На них происхо-
дит конденсация активированных аминокислот и укладка их в
полипептидную цепь в соответствии с генетической информацией,
переданной из ядра через информационную РНК [88].
Митохондрии — это высокоспециализированные обяза-
тельные мельчайшие органеллы дрожжевой клетки. Они обыч-
но распределены равномерно между клеточной оболочкой и ва-
куолью. Их можно обнаружить не только в покоящихся клетках
дрожжей, но и в клетках почкующихся, находящихся на различ-
ных стадиях роста и размножения, в почках и спорах. В моно-
графии А. В. Котельниковой и Р. А. Звягильской «Биохимия
дрожжевых митохондрий» [85] рассмотрена подробно структур-
но-функциональная организация дрожжевых митохондрий.
Форме и размерам дрожжевых митохондрий присуща измен-
чивость. Длина их у различных дрожжевых организмов состав-
ляет от 0,2 до 7,5 мкм. По форме они могут быть в виде неболь-
ших гранул, палочек, нитей, цепочек.
27
Обычно число митохондрий в клетке колеблется от одной до
50. Но даже если в клетке присутствует всего одна митохонд-
рия, она занимает не менее 20% объема клетки. В дрожжах
Sacch. cerevisiae объем этих органелл может достигать 80%
объема всей клетки. При низкой концентрации глюкозы в среде
дрожжевая клетка содержит 100—200 митохондрий, при высо-
кой — 30—40.
Митохондрии совершают свои функции при непрерывном пе-
ремещении с изменением размеров и формы, характеризуются
быстротой и специфичностью реакции на изменения условий
культивирования и физиологического состояния клетки.
Митохондрии отделены от цитоплазмы наружной двухслой-
ной мембраной. Внутренняя мембрана образует выступы-кристы,
чаще всего пузырчато-трубчатого строения. Пространство между
кристами заполнено гомогенным веществом — матриксом. Слой
внешней мембраны митохондрий, прилегающий к цитоплазме,
имеет шероховатую поверхность и содержит перфорацию нере-
гулярного устройства.
Факт обязательного присутствия митохондрий в структуре
клетки свидетельствует о локализации в них особых процессов,
важных в обмене веществ. Дрожжевые митохондрии состоят
главным образом из липидов — около 30% и белков — 65—70%
сухой массы митохондрий, из которых около 25—35% находят-
ся в форме структурного белка.
Дрожжевые митохондрии содержат ферменты, которые обес-
печивают выполнение основной энергетической функции (окис-
ление субстратов в цикле Кребса, перенос электронов через ды-
хательную цепь и окислительное фосфорилирование) — участву-
ют в сложном механизме воспроизведения митохондриальной
ДНК, транскрипции и трансляции генетической информации, в
биосинтезе фосфолипидов стеринов, в активации жирных кис-
лот и др. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеи-
новая кислота (РНК) составляют количественно небольшой
структурный компонент митохондрий.
Одним из наиболее значительных достижений молекулярной
биологии последних лет считают обнаружение в митохондриях
специфической ДНК [85]. Митохондриальная ДНК (мДНК) су-
щественно отличается от ядерного компонента ДНК клетки.
Вакуоли в дрожжевых клетках являются обязательным ор-
ганоидом. Кроме растворенных в воде электролитов, в вакуолях
содержатся в коллоидном состоянии белки, жиры, углеводы и
ферменты. В вакуолях накапливаются: Na, К, Са, Mg, Cl, SO4 и
РО4 в виде отдельных элементов и солей, причем концентрация
их во много раз превышает содержание солей в окружающей
среде [109].
Размеры и форма вакуолей в дрожжевых клетках подверже-
ны значительным изменениям. В одной дрожжевой клетке их мо-
28 жет быть или несколько, или одна — центральная вакуоль.
www.ovme.ru
Вакуоли содержат разнообразные включения как в состоя-
нии раствора, так и в форме кристаллических или аморфных гра-
нул и капель; pH сока вакуоли 5,9—6,0; осмотическое давление
составляет величину, близкую осмотическому давлению 2,5—
3,5%-ных растворов хлористого натрия. Содержимое вакуоли
обычно оптически пусто. Светятся лишь кристаллические и липо-
идные включения, находящиеся в энергичном броуновском дви-
жении. В вакуолях протекают активные окислительно-восстано-
вительные процессы [109].
Аппарат Гольджи (диктиосома) состоит из ряда двой-
ных мембран, концентрически изогнутых. Иногда от концов мем-
бран отшнуровываются круглые пузырьки, которые могут затем
превращаться в крупные вакуоли. Считают, что функция аппа-
рата Гольджи заключается в управлении общим ходом физиоло-
гических процессов.
Ядро является постоянным структурным компонентом дрож-
жевой клетки. В живых дрожжах ядра можно отчетливо наблю-
дать в клетках, пробывших несколько дней в стерильной воде,
цитоплазма которых вследствие голодания становится более го-
могенной и прозрачной, а также при флуоресцентной микро-
скопии после обработки дрожжевых клеток растворами флуоро-
хромов и при фазово-контрастной микроскопии.
Ядро у дрожжей имеет оболочку, ядрышко (кариосому) и
основное содержимое — кариоплазму. Оболочка принимает учас-
тие в регуляции внутриядерных процессов путем изменения про-
ницаемости и непосредственных сообщений между ядром и вне-
клеточной средой и ядром и цитоплазмой [109, 168].
Диаметр дрожжевого ядра около 2 мкм, чаще всего ядра име-
ют шаровидную или эллиптическую форму. Расположение их мо-
жет меняться в процессе жизнедеятельности клетки.
Размеры дрожжевого ядра неодинаковы не только в клетках
различных родов, но и в клетках одной и той же культуры при
разном физиологическом состоянии. Крупные ядра с отчетливой
кариосомой наблюдаются у дрожжей представителей родов
Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Saccharomycodes. В про-
тивоположность им клетки, принадлежащие к слабо бродящим
и небродящим дрожжам (Torulopsis pulcherrima, Т. utilis), име-
ют обычно относительно мелкие ядра. У растущих дрожжевых
клеток ядра обогащаются нуклеиновыми кислотами и часто пе-
ремещаются в активные участки роста ближе к участкам, в ко-
торых происходит почкование или деление клеток.
Основным химическим ингредиентом ядра является ДНК.
С нею и только с нею связана передача генетической информа-
ции от одного поколения клеток к другому. В состав ядра обя-
зательно входит также РНК, но обычно в меньшем количестве,
чем ДНК- Ядро содержит и белки, не связанные с нуклеиновыми
кислотами. Молекулами ДНК и РНК обусловливаются синтез и
особенности белков клетки. Поток генетической информации на- 29
правлен от ДНК через РНК к белку (ДНК—>РНК—>белок).
Содержание ДНК в любой клетке или в организме строго
постоянно и не зависит от условий внешней среды, от питания
или от воздействия различных факторов, влияющих на метабо-
лизм клетки. Так, количество ДНК в дрожжах Sacch. cerevisiae
XII расы на различных фазах роста в пределах 72 ч составляло
0,18—0,17% в расчете на сухую биомассу. Содержание ДНК в
дрожжевых клетках винных дрожжей после термической обра-
ботки почти не изменяется [6].
Нуклеотидный состав ДНК весьма специфическим образом
зависит от вида организма. Однако число остатков аденина рав-
но числу остатков тимина (т. е. А=Т), а число остатков гуанина
равно числу остатков цитозина (Г = Ц), т. е. число пиримидино-
вых остатков равно числу пуриновых остатков (А + Г = Т + Ц).
Близкие виды дрожжей имеют сходный нуклеотидный состав, а
эволюционно отдаленные организмы весьма заметно различа-
ются по этому показателю. Поэтому часто нуклеотидный состав
ДНК используют как таксономический признак [76].
При размножении клеток в ядрах обнаруживаются структу-
ры, содержащие ДНК,— хромосомы, которые у дрожжей можно
видеть иногда на фиксированных препаратах при окраске [109].
В хромосомах ДНК, связанная с белками-гистонами, образует
нуклеопротеидные нити толщиной около 10 нм [63]. Для конкрет-
ного вида дрожжей число хромосом, длина и форма их посто-
янны.
Однако данные о числе хромосом у дрожжей весьма противо-
речивы и пока не подкрепляются ни результатами электронно-
микроскопических исследований, ни генетическими данными
[168].
В определенных условиях в природе и в эксперименте при
воздействии различных химических и физических агентов число
хромосом в клетке может изменяться. У гаплоидных клеток на-
бор хромосом одинарный («), у диплоидных — двойной (2 п).
С увеличением числа хромосомных наборов возрастает содержа-
ние ДНК, увеличиваются размеры клетки, ее ядра и ядрышка.
Гаплоидные клетки содержат точно половину того количества
ДНК, которое обнаруживается в диплоидных.
Внутриклеточные включения и запасные ве-
щества, находящиеся в цитоплазме и вакуолях клеток в про-
цессе их жизнедеятельности,— это морфологически дифферен-
цированные образования гранул гликогена, метахроматина (во-
лютина), жироподобных веществ и капель жира, скоплений
серы, кристаллов кислот и сахаров. Они находятся в клетке в
осмотически инертной форме, обычно нерастворимы в воде.
Трегалоза (нередуцирующий дисахарид) и гликоген (по-
лисахарид) содержатся в клетке в значительных пределах: тре-
галоза — от 20 до 150 мг, гликоген — от 30 до 100 мг на 1 г су-
30 хих веществ клеток. В дрожжах, выращенных в аэробных уело-
Бцях, преобладает трегалоза, в то время как в дрожжах,
выращенных анаэробно,— гликоген. С повышением температуры
среды количество трегалозы в клетках увеличивается [4]. Гра-
нулы гликогена появляются в начале брожения и постепенно ис-
чезают к концу. По современным сведениям, гликоген у дрож-
жей Sacch. cerevisiae локализован снаружи цитоплазматической
мембраны в периплазматическом пространстве и связан с не-
растворимыми компонентами клеточных оболочек.
Липиды (жиры и жироподобные вещества), являясь важны-
ми компонентами цитоплазматических мембран органоидов клет-
ки, выполняют и роль запасного питательного материала. Жиры
дрожжей представляют собой смесь истинных жиров (глицери-
дов жирных кислот) с фосфолипидами (лецитин, кефалин) и сте-
ролами (эргостеролом). Капельки жира в клетках дрожжей хо-
рошо различимы в световом микроскопе благодаря тому, что
они сильно преломляют свет. Особенно хорошо они видны у
пленчатых дрожжей.
Фосфолипиды наряду со стеринами, каротиноидами и сквале-
нами способствуют росту дрожжей и выполнению биосинтети-
ческих реакций в анаэробиозе [62, 240].
В зависимости от вида и условий культивирования дрожжи
способны синтезировать от 1 до 74% липидов в расчете на су-
хую массу. Наибольшей способностью накапливать липиды в
клетках обладают дрожжи Rhodotorula gracile. В клетках дрож-
жей этого рода количество липидов может достигать 74% сухой
массы клеток.
Метахроматин (волютин), в состав которого входят преиму-
щественно полифосфаты, находится в состоянии коллоидного
раствора в вакуолях и без окраски или осаждения фиксаторами
как правило неразличим. Однако иногда в результате каких-то
отклонений в клеточном обмене веществ в вакуолях можно на-
блюдать метахроматин, частично выпавший из раствора в виде
сферических гранул, хорошо преломляющих свет и энергично
броунирующих. Метахроматин используется при построении кле-
точного протопласта и как источник энергии. Поэтому количе-
ство его уменьшается при активных синтетических процессах и
увеличивается при задержанном размножении [109].
Сера, иногда содержащаяся в протоплазме дрожжей, обна-
руживается по сильному преломлению света. Отложение серы в
клетках дрожжей приводит к появлению инволюционных форм
[223].
Клетки некоторых родов дрожжей (Rhodotorula, Sporobolo-
myces salmonicolor) окрашены в оранжевый и красный цвета,
обусловленные содержанием пигментов, принадлежащих к груп-
пе каротиноидов. Дрожжи рода Candida (С. pulcherrima, С. reu-
kaufii) на средах, содержащих железо, образуют колонии тем-
но-красного цвета за счет красного пиразинового пигмента, в
состав которого входит комплексно-связанное железо. 31
Итак, в структуре дрожжевой клетки содержатся различные
вещества, изменения которых в результате биохимических про-
цессов должны быть идеально согласованы между собой.
Переход клеток дрожжей от аэробного существования к ана-
эробному (брожение) сопровождается укрупнением ядра и ка-
риосом, уменьшением содержания дезоксирибонуклеиновой кис-
лоты; поверхность митохондрий по отношению к биомассе их
вещества уменьшается; в клетках дрожжей бродильного типа
обычно накапливаются метахроматин и гликоген.
Структура клеток дрожжей разных родов неодинакова. Уста-
новлено, что митохондрии, эндоплазматический ретикулум и
оболочки клеток дрожжей Sacch. vini и Rhodotorula glutinis су-
щественно различаются. Ультраструктурная организация клеток
дрожжей Rh. glutinis более развита и специализирована, чем
дрожжей Sacch. vini. У Rh. glutinis митохондрии более много-
численны, с более упорядоченной внутренней структурой, со зна-
чительно развитым и своеобразно построенным ретикулумом.
Размножение, рост и развитие культур дрожжей. Одним из
последствий морфолого-физиологических изменений, объединяе-
мых понятием развитие, является размножение — воспроизведе-
ние новой клетки, тождественной с материнской.
У большинства одноклеточных организмов следствием раз-
множения является увеличение числа организмов в популяции.
Процесс размножения клеток микроорганизмов обусловлен
прежде всего «взаимосвязью» их с питательной средой, в кото-
рой создаются благоприятные физико-химические условия, ре-
гулирующие действие соответствующих ферментов. Установлено,
что в период задержки роста клеток дрожжей выделяемые в сре-
ду мощные восстановители (редуцирующие ферменты), дейст-
вуя на дисульфидные связи белка клеточной оболочки, делают
ее проницаемой для питательных веществ из среды, чем и обес-
печивается индуцированный биосинтез ферментов, в том числе
конститутивных [77].
Размножение. В зависимости от условий культивирова-
ния клетки дрожжей размножаются вегетативным и' половым
способами. Форма вегетативного способа размножения опреде-
ляется принадлежностью к той или иной биологически самостоя-
тельной группе — семейству — почкованием, делением, посред-
ством почкования, завершающегося делением.
В результате цитологического изучения функциональной мор-
фологии клеточных оболочек дрожжей, электронно-микроскопи-
ческого исследования «родовых шрамов», или рубцов, остающих-
ся на месте отделения дочерней клетки от материнской, описано
4 типа вегетативного размножения клеток дрожжей (рис. 18)
[НО]:
первый тип — у почкующихся дрожжей, например, семейства
Saccharomycetaceae, рода Saccharomyces, когда материал оболо-
32 чек материнских клеток непосредственно не переходит на обо-
лочки дочерних клеток. Клетки в на-
Рис. 18. Структура клеточной
оболочки у дрожжей с разны-
ми типами вегетативного раз-
множения [110]:
а — Saccharomyces cerevisiae; б —
Saccharomycodes ludwigii; в — Schi-
zosaccharomyces pombe; г — Endo-
myces magnusii.
делении происходят на
Если делений много, то
чальных стадиях своего роста получа-
ют тот материал клеточных оболочек,
который синтезируется и накапливает-
ся у основания образующейся почки.
Рубцы располагаются в областях мак-
симальной кривизны клеточной обо-
лочки, часто тесно примыкая один к
другому, по кругу или по спирали;
второй тип — у дрожжей семейства
Saccharomycodaceae родов Saccharo-
mycodes и Hanseniaspora, особенно-
стью которых является полярное поч-
кование с образованием множествен-
ного рубца. Почка образуется путем
выпячивания почечного рубца, остав-
шегося от предыдущего почкования, и
растяжения межклеточной перегород-
ки;
третий тип — у делящихся дрож-
жей семейства Schizosaccharomyceta-
сеае, например рода Schizosaccharomy-
ces, для которых характерным являет-
ся биполярный рост клеточных оболо-
чек. Новый материал стенок отклады-
вается от центра к концам клетки в ви-
де кольцеобразного выроста в месте ее
деления;
четвертый тип — принадлежит ци-
линдрическим клеткам Endomyces
magnusii. Структурные изменения при
всей оболочке цилиндрической клетки,
оболочка состоит из нескольких пластин, расположенных парал-
лельно и заключенных одна в другой на рубце.
В процессе вегетативного размножения дрожжей из материн-
ской клетки в дочернюю переходит часть структурных образо-
ваний цитоплазмы и ядра. При этом перед каждым клеточным
делением в ядре хромосомы воспроизводятся все одновременно
и по одному разу, чем и обеспечивается равное распределение
их между материнской и дочерней клеткой. В основе превраще-
ния хромосом лежит молекулярный механизм воссоздания ДНК-
При таком типе деления ядра, называемом митозом, в поколе-
ниях клеток сохраняется строго постоянное число хромосом [63].
Если рассматривать размножение дрожжей во времени, то
в оптимальных условиях примерно за 1 ч происходит полное
формирование новой дочерней клетки. Однако одна дрожжевая
клетка не может бесконечно повторять процесс почкования.
На протяжении всего периода жизни материнская клетка веред- 33
2—568
12 3 4
<2^0°
Рис. 19. Схема жизненного цикла дрожжей родов:
а — Saccharomyces; б — Saccharomycodes; в — Zygosaccharomyces (1 — аскоспоры; 2 —
прорастание спор; 3 — гаплофаза; 4 — копуляция; 5 — зигота; 6 — диплофаза; 7—аско-
споры).
нем имеет 25—30 родовых шрамов, т. е. почкований. Сдержи-
вающим фактором является изменение структуры клеточной обо-
лочки, связанное с образованием рубцов, уменьшающих полез-
ную поверхность материнской клетки, что ведет к снижению
обмена веществ и содержания РНК, ДНК, протеина в клетках и
в конечном счете к гибели.
Половой способ размножения дрожжей, связанный с прорас-
танием аскоспор (спор, находящихся в сумках или асках) в ве-
гетативные клетки, сопровождается мейотическим процессом де-
ления ядра.
Резкий переход культивирования дрожжей из полноценной
среды в среду, бедную питательными веществами, при достаточ-
ной влажности, значительном накоплении запасных веществ в
клетке и доступе кислорода воздуха приводит к спорообразо-
ванию. Аскоспоры устойчивы к неблагоприятным внешним усло-
виям, действию высокой температуры, высушиванию, но они
менее термостабильны, чем бактериальные споры, и погибают
при температуре 60°С, а споры бактерий выдерживают темпера-
туру кипящей воды и более высокую.
Аскоспоры обычно образуются в результате предшествующе-
го полового слияния двух дрожжевых клеток и деления оплодо-
творенного ядра. В одном аске образуются 1—4, иногда 8 спор.
При условиях, благоприятных для вегетативного развития, на
свежей питательной среде споры прорастают и снова превраща-
34 ются в почкующиеся клетки.
Рис. 20. Жизненный цикл (схема) гетероталличных дрожжей Saccharomyces
cerevisiae; а и a-типы спаривания.
Жизненный цикл у дрожжей связан с чередованием вегета-
тивного размножения и спорообразования с разной продолжи-
тельностью гаплоидной и диплоидной стадий (рис. 19). Дрожжи-
сахаромицеты со сменой дипло- и гаплофаз делятся на 2 груп-
пы: гетероталличные и гомоталличные [64].
Гетероталличные штаммы дрожжей имеют устойчивые дипло-
идную и гаплоидную фазы. Диплоидные клетки могут неограни-
ченно долго размножаться вегетативно, переходить при неблаго-
приятных условиях к спорообразованию, в результате чего обра-
зуются аски с гаплоидными спорами, каждая из которых
принадлежит к одному из двух типов спаривания (а и а). При
этом копуляция совершается лишь при встрече двух аскоспор
или клеток из разных гаплоидных штаммов, происходит образо-
вание зигот и восстановление диплофазы (рис. 20) [63]. Приро-
да различия клеток а и а обусловлена их способностью выраба-
тывать соединения гормональной природы. Предполагается, что
«половой гормон» увеличивает активность ферментов, разрушаю-
щих клеточную стенку. Реакция клеток, предшествующая их
копуляции (удлинение клеток), может проявляться при помеще-
нии клеток разных типов спаривания на некотором расстоянии
одна от другой [64].
Гомоталличные штаммы дрожжей отличаются от гетеротал-
личных тем, что имеют только устойчивую диплофазу. Гаплоид-
ные споры, изолированные из аска, образуют диплоидную куль-
ТУРУ, т. е. в потомстве отдельной споры происходит слияние гап-
лоидных клеток — самодиплоидизация, за счет слияния спор в
любых комбинациях сестринских гаплоидных клеток или мате-
ринской клетки со своей почкой. Типы спаривания существуют и
у гомоталличных дрожжей [64, 121]. А. Ф. Руснак, проанализиро-
вав большой набор рас дрожжей вида Sacch. vini, используемых 35
2*
в виноделии, сделала вывод о преимущественно гомоталличной
природе их [169].
Однако некоторые дрожжи, например Zygosaccharomyces и
Schizosaccharomyces, длительное время размножаются вегета-
тивно, находясь в гаплоидном состоянии. Перед спорообразова-
нием гаплоидные клетки сливаются и образуется диплоидная зи-
гота, которая делится путем мейоза и дает начало 4 или 8 гап-
лоидным спорам. Споры эти прорастают и начинают размно-
жаться бесполым путем в гаплоидном состоянии.
При спорообразовании замедлен обмен веществ и общая жиз-
недеятельность микроорганизмов. Такое состояние обеспечивает
их выживаемость в условиях, неблагоприятных для вегетативно-
го размножения. Поэтому спорообразование, объединяющее в
себе процесс размножения и сохранения вида, следует рассмат-
ривать как положительную стадию в индивидуальном развитии
дрожжевых организмов [83].
Интересные результаты получены Б. Пазоньи [290] по влиянию
половой стадии размножения у дрожжей на их жизненность и
продуктивность. Культуры винных дрожжей, прошедшие массо-
вую споруляцию с последующим прорастанием спор и диплоиди-
зацией, превосходят те же культуры, не прошедшие этих стадий,,
по быстроте сбраживания виноградного сусла, и при испытании
в полупроизводственных условиях наблюдалось сокращение пе-
риода главного брожения с 35 до 21—31 сут.
Рост и развитие культур дрожжей. Микробные
культуры в жидкой питательной среде развиваются по кривой.
Наблюдение за ходом ее, сопровождаемое определением морфо-
лого-физиологических и химических изменений в клетках и вере-
де, является основным методом микробиологии [65, 151]. Фазы
роста на определенных участках кривой могут свидетельствовать
до некоторой степени об определенных стадиях развития и фи-
зиологическом состоянии культуры дрожжей (рис. 21). В общем
виде кривая роста приведена на рис. 22. В периодических усло-
виях культивирования различают 4 основные фазы роста.
Лаг-фаза — это период с момента внесения посевного мате-
риала в питательную среду до установившейся постоянной ско-
рости роста культуры. Эта фаза включает латентный (скрытый)
этап, когда микроорганизмы приспосабливаются к новым усло-
виям и некоторое число клеток может даже погибнуть, и этап
начала роста — этот период характеризуется интенсивной мета-
болической активностью, хотя число организмов в культуре или
совсем не увеличивается или увеличивается незначительно. На-
блюдается заметное увеличение размеров клеток, возрастает со-
держание в них общего белка, нуклеиновых кислот, энергично
синтезируются адаптивные ферменты. Чем полноценнее среда и
моложе культура, тем короче лаг-фаза. Если вносят значитель-
ное количество молодого посевного материала, то культура раз-
36 вивается без лаг-фазы [151].
I
Рис. 22. Общий вид кривой роста од-
ноклеточных микроорганизмов:
м — общее число клеток; м' — число жиз-
неспособных клеток; I — лаг-фаза; II —
экспоненциальная фаза; III — стационар-
ная фаза; IV — фаза отмирания.
Рис. 21. Стадии физиологического со-
стояния дрожжей (схема):
а —- почкующиеся клетки; б — мертвые
клетки; в — автолизированные клетки; г—
покоящиеся клетки; д — аскоспоры.
Логарифмическая, или экспоненциальная, фаза характеризу-
ется максимальной скоростью размножения дрожжей, самой
быстрой для данных условий. В этот период численность клеток
и их суммарная биомасса возрастают в геометрической прогрес-
сии. Средний размер клеток дрожжей становится минимальным,
большинство из них — почкующиеся, с однородной цитоплазмой
и тонкой оболочкой. Для них характерна физиолого-биохимиче-
ская активность и в то же время они более чувствительны к дей-
ствию различных неблагоприятных факторов, чем зрелые и по-
коящиеся.
Культура состоит из «стандартных клеток». Однако длитель-
ность экспоненциальной фазы роста для периодических условий
культивирования на жидких питательных средах невелика, так
как питательные вещества потребляются из среды, а в ней на-
капливаются ненужные продукты обмена, т. е. среда постепенно
становится менее благоприятной для роста, в результате чего
культура переходит в стационарную фазу.
Чтобы стабилизировать культуру в одном и том же состоя-
нии, применяют проточные, непрерывно обновляемые среды.
В непрерывно обновляемой культуре устанавливается динамиче-
ское равновесие между составом среды и количеством клеток.
Метод непрерывных культур имеет практическое применение в
генетике: он позволяет наблюдать за появлением и исчезновени-
ем мутантных форм в популяции; в бродильной и микробиологи- 37
ческой промышленности он используется при производстве про-
дукции определенного состава.
Стационарной фазе свойственно постоянное число живых ор-
ганизмов и максимальная плотность популяции. В этот период
число погибающих клеток становится равным числу вновь обра-
зующихся, устанавливается уравновешенное размножение их и
отмирание.
Фаза отмирания клеток характеризуется уменьшением числа
жизнеспособных клеток в культуре, преобладанием мертвых,
часто автолизованных. При брожении виноградного сусла эта
фаза проявляется после полного сбраживания сахара и при вы-
держке виноматериала на дрожжевом осадке. В этой фазе на-
ступает старость культуры, которая сопровождается резкой функ-
ционально-морфологической перестройкой клеток. Они стано-
вятся мельче, часто деформируются, протоплазма приобретает
зернистый вид. Особенно вид клеток меняется при долгом пребы-
вании дрожжей в осадке вина при недостатке или полном отсут-
ствии кислорода воздуха. Количество протоплазмы у автолизую-
щихся клеток постепенно уменьшается в результате расщепле-
ния белков под влиянием собственных протеолитических
ферментов, клетки становятся почти пустыми с небольшими ка-
пельками жира. При длительном пребывании клеток дрожжей в
осадке вина с доступом кислорода воздуха можно видеть покоя-
щиеся формы, которые долго остаются жизнеспособными глав-
ным образом за счет усвоения органических кислот.
Каждая фаза соответствует определенным скоростям роста,
для выражения которых пользуются абсолютными и относитель-
ными показателями. Абсолютную (валовую) скорость роста
культуры (и) за определенный отрезок времени вычисляют по
формуле [65, 152]
dx
где dx — прирост числа клеток (может быть выражен в весовых единицах
или величиной показаний нефелометра);
dt — отрезок времени.
Удельная скорость роста (ц) —это часовой прирост в рас-
чете на единицу биомассы
v dx 1
[1 =--- ------------
х dt х
Средняя удельная скорость роста (цСр) за определенный про-
межуток времени
1пхг— 1пх0 2,3 (1g — lgx0)
l^cp = z t
41 l0 11 l0
где x0 и Xi — число клеток соответственно в начале и конце роста;
38 t0 — ti — время роста.
Другим показателем скорости роста культуры служит про-
должительность генерации — время удвоения клеток g. Удель-
ная скорость роста (ц) связана с временем генерации следую-
щим образом:
In 2 0,693
[j. -=- -. ------,
g g
или время генерации прямо пропорционально удельной скорос-
ти роста:
0,693
g =------
р-
Существенным показателем физиологического состояния
культуры является экономический коэффициент у, который по-
казывает, какая доля потребленного субстрата (глюкозы или са-
харозы, или глицерина) превращается в биомассу [152]
Количество образовавшейся биомассы
— Количество потребленного субстрата *
Величина экономического коэффициента зависит от харак-
тера энергетических процессов. При дыхании этот коэффициент
относительно высок, при брожении он ниже и меняется в зави-
симости от условий.
Скорость роста дрожжей и ее лимитирование разнообразны-
ми факторами влияют на кинетические свойства культуры (по-
пуляции), на состав клеток и состав продуктов обмена веществ
[152].
Рост культуры дрожжей на виноградном сусле определяется
главным образом четырьмя факторами: концентрацией продук-
тов обмена (этанола), температурой, концентрацией растворен-
ного кислорода и концентрацией клеток дрожжей. Поскольку
этиловый спирт всегда присутствует в бражке, а брожение про-
текает в анаэробных условиях (концентрация растворенного кис-
лорода практически равна нулю) обычно при постоянной темпе-
ратуре, влияние этилового спирта на рост культуры имеет ре-
шающее значение и основным уравнением кинетики процесса
является уравнение [27]:
{1 = 0,19—0,019?,
где Р — концентрация этилового спирта, % об.
Следует отметить, что в литературе еще мало сведений, ко-
торые позволили бы выявить зависимость образования опреде-
ленных продуктов брожения от той или иной скорости роста
культуры (популяции) и вида фактора, ограничивающего рост.
Изучение это осуществимо только при непрерывном методе куль-
тивирования, математическое описание которого позволяет отой-
ти от эмпирического подбора оптимальных условий [19, 32, 59,
ФИЗИОЛОГИЯ ДРОЖЖЕЙ
Энергетический и конструктивный обмен веществ. Многооб-
разные проявления жизнедеятельности дрожжей можно наибо-
лее полно и целенаправленно использовать при знании физио-
логии обмена веществ, особенностей биохимических процессов,
характерных для них в естественных условиях. Основной функ-
цией обменных процессов является накопление энергии и ее це-
лесообразное расходование для поддержания жизнеспособности
клеток, т. е. синтез и обмен элементов биологических структур.
Обмен веществ в клетке (превращение веществ, метабо-
лизм) складывается из двух процессов — катаболизма и анабо-
лизма. Схема процессов изображена на рис. 23.
Катаболизм (диссимиляция) — это ферментативное расщеп-
ление крупных молекул питательных веществ (углеводов, жиров,
белков) для получения энергии.
Диссимиляция органического вещества дрожжами в процес-
се брожения или дыхания является основным источником полу-
чения соединений, из которых одни представляют собой ненуж-
ные продукты обмена и выделяются из клетки, а другие исполь-
зуются для биосинтетических реакций и таким образом включа-
ются в анаболический процесс.
Извлекаемая энергия запасается в форме фосфатных связей
аденозинтрифосфата (АТФ) или некоторых других богатых энер-
гией соединений, которые используются на многочисленные ре-
акции обмена веществ, обеспечивающие рост, развитие и размно-
жение. Такой диссимиляционный процесс называют энергетиче-
ским обменом [65, 112, 165].
Анаболизм (ассимиляция) —это использование питательных
веществ для биосинтеза сложных соединений, в частности, вы-
сокомолекулярных (полисахаридов, нуклеиновых кислот, белков,
жиров), необходимых для роста и самовоспроизведения клетки
из простых предшественников (аминокислот, пуриновых и пири-
мидиновых оснований, органических кислот, фосфатов сахаров).
Синтез связан с потреблением свободной энергии, высвобождае-
мой при дефосфорилировании АТФ. Такой биосинтетический про-
цесс часто называют конструктивным (строительным) обменом
веществ.
Анаболический и катаболический процессы часто локализу-
ются в разных структурных единицах клетки, однако протекают
они одновременно, что обусловливается специфическими особен-
ностями ферментов [165]. Скорость катаболизма в клетке регу-
лируется не концентрацией тех или иных питательных веществ в
окружающей среде, а потребностью клетки в энергии в каждый
определенный момент. Используя энергию в форме АТФ, клетка
для получения ее перерабатывает такое количество исходного
материала, которое может удовлетворить потребность в энергии,
40 необходимой для выполнения жизненных функций.
Рис. 23. Схема обмена веществ у микроорганизмов [165]:
1 — окружающая среда; 2 — клеточная оболочка и цитоплазматическая мембрана; 3 —
цитоплазма.
Таким образом, в результате обмена веществ дрожжи из пи-
тательной среды берут все необходимые элементы для накопле-
ния энергии, синтеза структурных элементов клетки, многочис-
ленных ферментов и в нее возвращают промежуточные отрабо-
танные продукты.
В настоящее время установлено, что в природе существует
единый универсальный способ энергетического и конструктивно-
го метаболизма у живых организмов — анаэробная диссимиля-
ция углеводов [66, 165, 166].
Процессы брожения и дыхания, или анаэробный и аэробный
распад углеводов, играют основную роль в метаболизме дрож-
жевой клетки.
Дрожжи относятся к факультативным анаэробам. Микроор-
ганизмы, принадлежащие к группе факультативно-анаэробных,
В условиях анаэробиоза получают энергию в результате внутрен-
них окислительно-восстановительных процессов. Попадая в аэ-
робные условия, они обычно также используют свое «топливо»
анаэробным способом, после чего продукты анаэробного рас-
щепления окисляются молекулярным кислородом. Следователь-
но, анаэробное превращение глюкозы у дрожжей есть обяза-
тельная первая стадия, за которой может следовать аэробная
фаза — дыхание, интенсивность которого находится в прямой за-
висимости от условий культивирования [66]: 41
Анаэробные условия
Глюкоза
| Брожение
i
Продукты брожения
Аэробные условия
Глюкоза
| Брожение
V
(Продукты брожения)
О2 | Дыхание
СО2 4~ Н2О
Главным источником энергии у дрожжей бродящего типа яв-
ляется анаэробный распад шестиуглеродных сахаров, в первую
очередь D-глюкозы. При этом потребленная глюкоза практичес-
ки полностью расщепляется до этанола и СОз с одновременным
накоплением высших спиртов и других продуктов обмена. Раз-
ные сахара сбраживаются с различной скоростью. Легко сбра-
живаются глюкоза и фруктоза, медленнее — манноза и еще мед-
леннее— галактоза. Дисахариды (сахароза и мальтоза) хорошо
сбраживаются дрожжами. Пентозы дрожжами не сбражива-
ются.
Различают три биохимические фазы энергетического обмена
[77].
В первой фазе, сопровождающейся выделением ничтожного
количества энергии, происходит в основном гидролиз сложных
питательных веществ.
Во второй фазе характер процессов энергетического обмена
веществ определяется доступностью кислорода для клеток. В ана-
эробных условиях происходит выделение энергии в результате
брожения углеводов с образованием этанола, что характерно
для дрожжей бродящего типа; в аэробных — в результате окис-
лительного (апотомического) превращения гексозомонофосфа-
та, обычно характерного для дышащих дрожжевых клеток.
Третья фаза — цикл трикарбоновых кислот — основная фаза
не только энергетического, но и конструктивного обмена веществ
дрожжей в аэробных условиях.
Реакции обмена веществ в клетке катализируются фермен-
тами
1 Ферменты — самый крупный и наиболее высокоспециализированный
класс белковых молекул.
В живой дрожжевой клетке, как и в других микроорганизмах, непрерыв-
но протекает синтез ферментов, причем только тех, для которых имеются
соответствующие гены. Количество различных ферментов в клетке фиксиро-
вано не строго и изменяется в соответствии с изменением химических и фи-
зических свойств среды. Синтезируются ферменты так же, как и неактивные
белки — из свободных аминокислот. Активность одних ферментов зависит
только от структуры белка, тогда как других ферментов — и от присутствия
групп небелковой природы, так называемых кофакторов. Кофакторами могут
быть или ионы металлов (магний, медь, кобальт, цинк, железо), или сложные
42 органические соединения, называемые коферментами, или те и другие. Мно-
rue коферменты, например, содержат в качестве активных компонентов ви-
тамины. Так, в состав ферментов аминотрансфераз входит фосфопиридок-
саль— производное витамина Be; в состав дегидрогеназ входит рибофлавин
(витамин В2) в соединении с фосфорной кислотой (флавинмононуклеотид);
фосфорный эфир тиамина (витамина Bi), соединяясь с белком, образует пи-
руватдекарбоксилазу, расщепляющую пировиноградную кислоту на уксусный
альдегид и СО2, и т. д.
Ферменты подразделяются на 6 основных классов, каждый из которых
в свою очередь делится на подклассы, а эти последние — на группы [88].
1. Оксидоредуктазы — это ферменты, катализирующие реакции биологи-
ческого окисления и восстановления и, следовательно, связанные с процесса-
ми брожения и дыхания. К этому классу относятся дегидрогеназы:
алкогольдегидрогеназа (алкоголь: НАД-оксидоредуктаза), лактатдегидрогеназа
(L-лактат: НАД-оксидоредуктаза), глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (D-гли-
церальдегид-3-фосфат: НАД-оксидоредуктаза), малатдегидрогеназа (L-малат:
НАД-оксидоредуктаза), цитохромоксидаза (цитохром с: О2-оксидоредуктаза)
и др. В качестве коферментов дегидрогеназы содержат НАД+ или НАДФ+,
ФМН или ФАД.
Считают, что дегидрогеназы расположены в цитоплазме и в митохондри-
ях [85].
Показано, что у дрожжей имеются три различные алкогольдегидрогена-
зы, зависимые от НАД. Из них АД1 и АДП локализованы в цитоплазме, а
АДП1 — в митохондриях.
2. Трансферазы — катализируют перенос целых атомных групп (остатков
фосфорной кислоты, моносахаридов и аминокислот и т. д.) с одной молеку-
лы на другую. В зависимости от того, какую химическую группировку пере-
носит данный фермент, природа кофермента различна.
Особенно активна в дрожжах транскетолаза (седогептулозо-Ь-фосфат:
D-глицеральдегид-З-фосфат-гликольальдегидтрансфераза). Коферментом транс-
кетолазы является тиаминпирофосфат-гексокиназа (АТФ: D-гексоза-б-фосфо-
трансфераза), который катализирует реакцию фосфорилирования — перенос
остатка фосфорной кислоты от АТФ на глюкозу, пентозу и др.
Аминотрансферазы осуществляют перенос аминогруппы с аминокислот на
кетокислоты, например, тирозин-аминотрансфераза (L-тирозин: 2-оксоглута-
рат-аминотрансфераза).
3. Гидролазы — катализируют реакции расщепления более сложных со-
единений на более простые с присоединением воды. К этому классу относят-
ся эстеразы, расщепляющие и синтезирующие сложные эфиры (липазы, тана-
зы, пектинэстеразы, фосфатазы, сульфатазы). Гидролазы эфиров карбоновых
кислот найдены в столовых винах, шампанском, хересе.
Инвертаза (P-D-фруктофуранозид-фруктогидролаза, |3-фруктофуранозида-
за) катализирует гидролиз сахарозы. Незначительная активность инвертазы в
сусле некоторых сортов винограда значительно повышается после сбражива-
ния его вследствие перехода этого фермента из дрожжей [7].
Протеолитические ферменты (протеазы) также относятся к классу гидро-
лаз. Они катализируют гидролиз пептидов и белков и в связи с этим имеют
большое значение в практике применения ферментных препаратов.
4. Лиазы катализируют реакции негидролитического отщепления каких-
либо групп от субстрата. К ферментам этого класса относятся: пируватдекар-
боксилаза, декарбоксилазы аминокислот, альдолаза.
Пируватдекарбоксилаза (карбоксилиаза 2-оксокислот) в качестве кофер-
мента содержит тиаминпирофосфат, играет важную роль у дрожжей — ка-
тализирует образование спирта
Декарбоксилазы аминокислот содержат в качестве кофермента пири-
Доксальфосфат.
Альдолаза (кетозо-1-фосфат-альдегид-лиаза) играет важную роль в угле-
водном обмене. В процессе брожения молекула фруктозы с присоединенными
остатками фосфорной кислоты под действием альдолазы разрывается с об-
разованием двух молекул фосфотриоз, которые впоследствии образуют спирт.
43
Активность дрожжевой альдолазы специфически усиливают ионы калия, по-
этому введение хлористого калия ускоряет процесс спиртового брожения.
5. Изомеразы — это ферменты, катализирующие превращения органиче-
ских соединений в их изомеры (аминокислот, оксикислот и углеводов или их
производных). Например, УДФ глюкозо-эпимераза превращает галактозу в
глюкозу. С наличием или отсутствием у дрожжей данного фермента связана
способность или неспособность сбраживать галактозу (Sacch. oviformis галак-
тозу не сбраживают).
6. Лигазы (синтетазы) катализируют процесс соединения двух молекул,
протекающий одновременно с расщеплением АТФ. К этому классу принадле-
жат карбоксилазы, содержащие биотин, которые катализируют при участии
АТФ реакции карбоксилирования различных органических кислот. Пируват-
карбоксилаза [пируват: СОг— лигаза (АДФ)] катализирует синтез щавелево-
уксусной кислоты из пировиноградной кислоты и СО2. К классу лигаз отно-
сится ацетил-КоА синтетаза [ацетат: КоА-лигаза (АМФ)], которая катализи-
рует важную реакцию синтеза самых разнообразных соединений, в том числе
и стероидов. К лигазам относятся аспарагинсинтетаза и глютаминсинтетаза,
катализирующие при участии АТФ синтез аспарагина и глютамина из соот-
ветствующих дикарбоновых аминокислот.
Различные ферменты и ферментные системы локализуются обычно в ор-
ганеллах или просто растворены в цитоплазме. Все детали клетки, на кото-
рых размещены ферменты, построены из мембран, содержащих белковые и
липидные компоненты. Ферменты гликолиза локализуются в растворимой
фракции цитоплазмы. Инвертаза и пермеазы, обеспечивающие транспорт пи-
тательных веществ в клетку, так же как и гексокиназа — важнейший фермент
фосфорилирования,— находятся в оболочке дрожжевой клетки. Ферменты,
участвующие в окислении пировиноградной кислоты, жирных кислот и неко-
торых аминокислот, находятся в митохондриях. В рибосомах находятся фер-
менты, обеспечивающие синтез белков.
Спиртовое брожение. Анаэробный распад углеводов,
происходящий в результате жизнедеятельности дрожжей (про-
цесс спиртового брожения), завершается образованием в основ-
ном этилового спирта и СО2.
Механизм спиртового брожения определен многолетними ис-
следованиями. Л. Пастер впервые простыми и убедительными
опытами доказал, что сбраживание сахаров происходит только
в присутствии клеток дрожжей. В 1897 г. Э. Бухнер и Т. Бухнер
обнаружили, что дрожжевой сок, полученный растиранием дрож-
жей с песком, способен сбраживать глюкозу до спирта. Этим был
доказан ферментативный характер спиртового брожения, в вы-
яснении сущности реакций которого большую роль сыграли ис-
следования советского биохимика А. Н. Лебедева. Однако
М. М. Монассеина задолго до опытов Бухнеров указывала на
ферментативный характер спиртового брожения и в 1871 г.
опубликовала работу «К учению об алкогольном брожении».
Предложенная Нейбергом схема спиртового брожения (пер-
вая форма брожения Нейберга) представляла собой попытку
объяснить процесс при помощи ряда гипотетических промежу-
точных ступеней.
Следующим этапом в расшифровке процесса спиртового
брожения было открытие, сделанное в 1905 г. Л. А. Ивановым, а
также А. Гарденом и У. Йонгом. Они обнаружили, что для спир-
тового брожения, индуцируемого дрожжевым экстрактом, необ-
ходим фосфат и что гексозодифосфат (фруктозо-1,6-дифосфат)
й другие идентифицированные вещества играют роль промежу-
точных продуктов в суммарном процессе брожения.
Г. Эмбден, О. Мейергоф и Я. О. Парнас детально раскрыли
последовательность реакций и энергетику гликолиза. Поэтому
гликолиз часто называют путем Эмбдена — Мейергофа — Пар-
наса.
Спиртовое брожение — это один из путей анаэробного пре-
вращения углеводов. Он состоит из ряда последовательно про-
текающих реакций.
Установлено, что процесс анаэробного расщепления сахаров
дрожжами осуществляется с тем же запасом энергии в форме
АТФ и тем же ферментативным путем, что и гликолиз, вплоть
до образования пировиноградной кислоты. Поэтому в настоящее
время термин «гликолиз», характеризующий основной путь пре-
вращения глюкозы в пировиноградную кислоту без участия сво-
бодного кислорода, применяют к начальной стадии спиртового
и других видов брожения и к анаэробной, подготовительной ста-
дии дыхания в растениях [166].
Глюкоза
АТФ
НАД*
СН2О — Ф
СН2О — Ф
СН2О— Ф
СН2О-Ф
снон
снон
снон
снон
СНОН АТФ
снон
снон
снон
с=о
С=О
Н
СН2ОН
СН2О-Ф
снон
снон
с=о
снон
снон
СН2О— Ф
СН2О— Ф
+
НАД-Н
снон
СН.О—Ф
снон
Глюкоэо-6-
фосфат
фруктозо-6—
фосфат
Фруктозе-1,6-
дифосфат
С=О
Н
Глицеральдегид-
3-фосфат
И
сн2он
с=о
фн
с-он
с=о
Н О—Ф
13- дифосфо-
глицерат
(£)
13- дифосфо—
глицерат
“ \)Н
3—фосфогли—
церат
сн2о—Ф
Д иоксиацетонфосфат
СНз
с=о
сн2
сн2он
СНО—Ф
Этанол
или ацетат
соон ♦
Пируват
фосфоенол—
пируват
; соон
2-фосфо—
глицерат

I .~н*°
соон <
Схема сбраживания глюкозы (молекула глюкозы для простоты изображена
на схеме в виде цепи) [66].
1. Фосфорилирование D-глюкозы за счет АТФ с образовани-
ем глюкозо-6-фосфата. Эта первая реакция гликолиза катализи-
руется ферментом гексокиназой. В клетке количество свободной
D-глюкозы сравнительно невелико; большая часть ее находится
в фосфорилированной форме
Mg2+
АТФ 4-D-глюкоза ----> АДФ + D-глюкозо-б-фосфат. 45
2. Превращение D-глюкозо-б-фосфата во фруктозо-6-фосфат
в результате реакции изомеризации, катализируемой ферментом
фосфогексоизомеразой
D-глюкозо-б-фосфат D-фруктозо-б-фосфат.
3. Фосфорилирование D-фруктозо-б-фосфата путем присое-
динения еще одного остатка фосфорной кислоты с образовани-
ем фруктозо-1,6-дифосфата. В этой второй «пусковой» реакции
используется еще одна молекула АТФ при участии фермента
фосфофруктокиназы. Считается доказанным, что суммарная ско-
рость гликолиза лимитируется именно этой реакцией, катализи-
руемой фосфофруктокиназой
АТФ -ф D-фруктозо-б-фосфат —> АДФ 4- D-фруктозо-! ,6-Дифосфат.
4. Расщепление фруктозо-1,6-дифосфата на две фосфотриозы:
глицеральдегид-3-фосфат и диоксиацетонфосфат. Эта реакция
катализируется ферментом альдолазой
D-фруктозо-! ,6-дифосфат Диоксиацетонфосфат 4*
+ D-глицеральдегид-З-фосфат.
5. В последующие реакции гликолиза может непосредственно
включаться только одна из двух образующихся фосфотриоз, а
именно глицеральдегид-3-фосфат. Однако и диоксиацетонфосфат
благодаря присутствию в клетке специфического фермента
триозофосфатизомеразы полностью преобразуется в глицераль-
дегид-3-фосфат. В результате этой реакции обеспечивается пол-
ное использование глюкозы в энергетическом обмене клетки
диоксиацетонфосфат D-глицеральдегид-З-фосфат.
6. Окисление глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглице-
рата. Эта реакция катализируется специфической дегидрогена-
зой триозофосфата (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназой).
Она называется реакцией гликолитического окисления — восста-
новления.
Окисление глицеральдегид-3-фосфата, катализируемого де-
гидрогеназой, является единственным окислительным этапом на
всем протяжении гликолитического пути. Однако кислород в
этой реакции не участвует. Требуется лишь присутствие окис-
лителя НАД+, который при этом восстанавливается до НАД-Н
(символом НАД обозначается окислительно-восстановительный
кофермент — никотинамид-адениндинуклеотид: НАД+ — окис-
ленная форма и НАД *Н — восстановленная)
D-глицеральдегид-З-фосфат + НАД* 4- Фн —> 1,3-дифосфоглицерат 4-
4- НАД • Н 4- Н+.
7. Перенос фосфатной группы от 1,3-дифосфоглицерата на
46 АДФ. Благодаря действию двух ферментов (глицеральдегид-3-
фосфат-дегидрогеназы и фосфоглицераткиназы) энергия, высво-
бождающаяся при окислении альдегидной группы до карбоксиль-
ной, запасается в форме энергии фосфатных связей АТФ
1,3- дифосфоглицерат + АДФ 3-фосфоглицерат + АТФ.-*
Глидеральдегид-З-фосфат + Фн + АДФ + НАД+
3-фосфоглицерат + АТФ 4- НАД • Н + Н+.
I
(к реакциям 1 и 3)
8. Превращение 3-фосфоглицерата в 2-фосфоглицерат ката-
лизируется ферментом фосфоглицеромутазой
3-фосфоглицерат дД^2-фосфоглицерат.
9. Дегидратация 2-фосфоглицерата с образованием фосфо-
енолпирувата катализируется енолазой
2-фосфоглицерат ^Д фосфоенол пируват + Н2О.
10. Перенос фосфатной группы от фосфоенолпирувата на
АДФ с образованием пирувата и АТФ катализируется пируват-
кпназой (АТФ: пируват-фосфотрансферазой)
Фосфоенолпируват + АДФ ДД Пируват + АТФ.
Образование пировиноградной кислоты рассматривается как
поворотный этап анаэробного расщепления сахара, являющийся
общим для дыхания, гликолиза и брожения всех видов.
Основное значение гликолиза состоит в перестройке струк-
туры молекулы глюкозы в высокоактивный и лабильный в хи-
мическом отношении пируват, что облегчает биохимические пре-
вращения исходного субстрата на последующих этапах окисли-
тельно-восстановительных процессов.
И. Если О2 отсутствует, то дальнейшие превращения пиро-
виноградной кислоты происходят анаэробным путем, в процессе
брожения (молочнокислого, спиртового и др.).
При спиртовом брожении последний этап гликолиза, катали-
зируемого лактатдегидрогеназой, заменен двумя другими фер-
ментативными реакциями при участии соответственно пируват-
декарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы. В результате этих ре-
акций образуется этанол — конечный продукт спиртового
брожения
1. Пируват ->• Ацетальдегид + СО2 (необратимая реакция).
2. Ацетальдегид + НАД • Н + Н+ дД Этанол + НАД+.
Суммарное уравнение спиртового брожения можно написать
в следующем виде:
С6Н12О6 + 2ФК + 2АДФ 2С2Н5ОН + 2СО2 + 2АТФ.
Глюкоза Этиловый
спирт
47
При введении специфических ингибиторов формы спиртового
брожения изменяются:
а) вторая форма брожения Нейберга. Для получения глице-
рина в сбраживаемую среду вводят бисульфит натрия, который
связывает ацетальдегид и предотвращает этим реакцию восста-
новления его до спирта. Водород восстановленного НАД-Нг в
этом случае используется на восстановление фосфоглицериново-
го альдегида до глицерина (реакции 4 и 5). Таким образом, при
брожении сульфитированного виноградного сусла происходит
накопление в виноматериалах глицерина и уксусного альдегида
в виде бисульфитного производного;
б) третья форма брожения Нейберга. При щелочной реакции
среды ход брожения изменяется: половина молекул ацетальде-
гида окисляется до уксусной кислоты, другая — восстанавлива-
ется до этилового спирта. В этом процессе происходит подкис-
ление субстрата.
Иногда в клетках дрожжей возникает необходимость в ис-
пользовании запасного полисахарида — гликогена. В результа-
те реакции, катализируемой ферментом фосфоглюкомутазой,
гликоген вовлекается в гликолиз в виде глюкозо-6-фосфата. Про-
дукты брожения, которые в анаэробных условиях уже не могут
быть использованы клеткой и поэтому выводятся из нее, все еще
содержат значительную часть нереализованной химической энер-
гии. Поэтому клеткам, находящимся в анаэробных условиях,
для получения энергии приходится расходовать гораздо больше
глюкозы, чем тем же самым клеткам в условиях аэробиоза [66].
Дыхание. В присутствии кислорода воздуха дрожжи полу-
чают энергию за счет дыхания. Процессы гликолиза, протекаю-
щие при этом, поставляют относительно малое количество вос-
становленных соединений, которые могут быть переданы затем
в дыхательную цепь. Обеспечение дыхательной цепи должно ид-
ти из каких-то других источников. Доказано, что цикл трикарбо-
новых кислот (цикл Кребса) является тем основным общим рус-
лом, по которому осуществляется окончательное окисление не
только продуктов обмена углеводов, но также белков, предва-
рительно преобразованных молекул жиров.
Исходным продуктом превращений, состоящих из ряда по-
следовательных ферментативных реакций, замкнутых в цикл, яв-
ляется пировиноградная кислота. Первое звено в цепи реакций—
окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты
с образованием исходного метаболита цикла — ацетил-КоА. При
каждом обороте цикла молекула уксусной кислоты в форме аце-
тил-КоА вступает во взаимодействие с щавелевоуксусной кисло-
той, образуя лимонную кислоту. Затем лимонная кислота пре-
вращается в изолимонную и затем — в а-кетоглутаровую кисло-
ту, из которой в результате окислительного декарбоксилирования
образуется янтарная кислота. Последняя, как наиболее быстро
48 превращающееся соединение цикла Кребса, окисляется далее до
щавелевоуксусной кислоты, которая может снова включаться в
цикл.
На уровне а-кетоглутаровой кислоты от цикла Кребса име-
ется ответвление, ведущее к системе глутамин-глутамат. Эта
система является узлом, от которого отходят метаболические
пути, ведущие к образованию аминокислот аргинина и пролина.
Суммарная реакция цикла трикарбоновых кислот описыва-
ется уравнением
СНзСОСООН + ЗН2О -> ЗСО2 4- 10Н+
Из этого уравнения видно, что в цикл не вовлекается ни мо-
лекулярный кислород, ни неорганический фосфат, ни АТФ. Окис-
ление происходит за счет кислорода воды и отщепления атомов
водорода. Затем водород переносится на дыхательную цепь.
Дыхательная цепь дрожжей в принципе сходна с таковой
высших организмов. Она включает ряд дегидрогеназ, связанных
с НАД-Н (пируват-, изоцитрат-, а-кетоглутарат, лактат- и ма-
латдегидрогеназы), флавопротеиды, кофермент Q (убихинон) и
цитохромы в, Ci, с, а, аз. Особенностью ее является наличие ми-
охондриальной НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы, ката-
лизирующей окисление этанола помимо алкогольдегидрогена-
зы I и II, локализованной в цитоплазме [85, 88].
Механизм аэробного извлечения энергии из питательных ве-
ществ основан на реакции окислительного фосфорилирования
АДФ.
Таким образом осуществляется акт дыхания, состоящий из
ряда последовательных окислительно-восстановительных реак-
ций между водородом, который отщепляется от карбоновых кис-
лот в цикле Кребса, и молекулярным кислородом [77].
Следует отметить, что все ферменты, катализирующие инди-
видуальные реакции цикла, локализованы в дрожжевых мито-
хондриях. Для непрерывной работы цикла обязательно требу-
ются акцепторы водорода, и поскольку наиболее эффективным
акцептором является кислород, то максимальная скорость цик-
ла наблюдается только в условиях достаточного снабжения кис-
лородом.
В условиях анаэробиоза происходит полная редукция основ-
ной энергетической функции митохондрий. Отсутствие дыхания
компенсируется усилением гликолиза, который становится глав-
ным механизмом энергообеспечения клетки. Функционирует
лишь модифицированный цикл Кребса, который приводит к на-
коплению в клетке пировиноградной и уксусной кислот, что в
свою очередь способствует накоплению в среде этилового спирта
[66, 85].
Для аэробных дрожжевых организмов основным механиз-
мом конечного окисления метаболитов является цикл трикарбо-
новых кислот. Следовательно, условия культивирования, тип об- 49
мена дрожжей (аэробный, анаэробный) могут изменять относи
тельную значимость цикла Кребса в обмене веществ.
Дрожжи рода Saccharomyces будучи полностью лишены ис
точников питания часто сохраняют жизнеспособность и даже об
наруживают признаки активного эндогенного метаболизма
В этом случае они используют для получения энергии эндоген
ный субстрат — осуществляют брожение и дыхание в первуг
очередь за счет гликогена, а затем — трегалозы.
Таким образом, метаболизм углеводов является одним и
центральных путей обмена, выполняя функцию не только ос
новного поставщика энергии, но и главного источника углерод
содержащих фрагментов, которые необходимы для синтеза все.
других компонентов клетки [66, 166].
Важную роль в биосинтетических процессах играют кофер
менты, обладающие макроэргическими связями: АТФ, УТФ> Ко7
и др. Процесс синтеза белка в рибосоме схематически протека
ет так [88]: активированные аминокислоты, соединенные <
мРНК, переходят в рибосомы клетки, где и происходит их свя
зывание в белки.
Биосинтетический путь образования полисахаридов (основ
ных компонентов клеточной оболочки), сахаров и запасных по
лимеров (гликогена) из неуглеводных предшественников начи
нается от пировиноградной кислоты. Это обратный процесс гли
колиза [165].
Строительным материалом для высших жирных кислот, сте
роидов и других соединений протоплазмы служит уксусная кис
лота в форме ацетил-КоА [65].
Витамины группы В в обмене веществ выполняют роль ко
ферментов или компонентов коферментов. Синтезируются они i
очень небольших количествах. Исходным сырьем для биосинте
за большинства витаминов служат низкомолекулярные соеди
нения, используемые также и в синтезе других клеточных ком-
понентов.
Итак, в результате основного обмена питательные вещества
поглощенные клеткой, ассимилируются и перерабатываются г
компоненты цитоплазмы, обеспечивая этим прирост биомассы к
ресинтез веществ клетки, и разлагаются, окисляются, освобож-
дая нужную для жизни энергию. Продукты энергетического об-
мена выделяются из клетки вместе с продуктами диссимиляции
компонентов клетки. Часть усвоенных веществ откладывается в
виде запасных (жиров, гликогена, волютина), которые могут быть
использованы наравне с поступающими питательными вещества-
ми [65] (см. рис. 23). В итоге сложных биохимических превраще-
ний происходит прирост биомассы и образуются продукты обме-
на. По этим конечным показателям судят об интенсивности
энергетического и конструктивного обмена веществ.
Физиолого-биохимические изменения дрожжей в аэробных и
50 анаэробных условиях. В процессе спиртового брожения в отсут-
1
ствие молекул кислорода воздуха высвобождается лишь незна-
чительная часть энергии (117 кДж), потенциально заложенной
в одном моле глюкозы (2817 кДж), тогда как при дыхании —
полном окислении глюкозы до СО2 и Н2О — значительно боль-
ше— 1504 кДж. Такое огромное различие в количестве высво-
бождаемой энергии определяет высокую чувствительность кле-
ток дрожжей ко всяким изменениям окислительного метаболиз-
ма, вызывая в них различные функциональные изменения.
Принято считать, что в производственных условиях при ве-
дении процесса брожения дрожжи получают необходимую для
них энергию не только за счет анаэробного превращения углево-
дов, но и за счет дыхания [77]. Именно в начальной фазе анаэроб-
ного роста клеток энергия поступает и от аэробного окисления
сахара (сбраживаемое виноградное сусло содержит до 7 мг/л
растворенного кислорода) с возможным использованием метабо-
литов цикла Кребса.
Доступ кислорода, обеспечивающий более эффективное в
энергетическом отношении аэробное дыхание, предохраняет
клетки от излишних трат веществ, происходящих в процессе ана-
эробного дыхания. Подобное действие кислорода, выражающее-
ся в угнетении брожения дыханием и в значительном снижении
потребления элементов субстрата — глюкозы, названо эффек-
том Пастера. Эффект Пастера наиболее существенен при аэроб-
ном сбраживании малосахаристых сред. И наоборот, аэрация
высокосахаристых сред вызывает противоположный сдвиг энер-
гетического обмена у дрожжей — тормозит дыхание и активи-
зирует брожение [85]. Этот эффект получил название эффекта
Крэбтри. В настоящее время считают, что подавление дыхания
в присутствии высоких концентраций глюкозы имеет генетиче-
скую природу и обусловлено подавлением синтеза цитохромов.
Аэробные условия. А. А. Мартаковым [41, 105] при аэ-
робном сбраживании высокосахаристых сред виноградного сус-
ла установлен альдегидный эффект. По механизму действия он
отличается от эффекта Пастера и эффекта Крэбтри тем, что
вызывает одновременное торможение брожения и дыхания в ре-
зультате неполного окисления этанола до ацетальдегида. В этом
случае сахар сначала разлагается дрожжами в спирт, а послед-
ний окисляется далее в ацетальдегид, который и накапливается
в бродящем сусле в качестве вторичного продукта аэробного
брожения. Следовательно, протекает одновременно процесс раз-
ложения сахара в спирт и окисление спирта в ацетальдегид. Воз-
можность альдегидного эффекта обусловлена наличием у дрож-
жей пространственно разобщенных ферментов гликолиза (в ци-
топлазме) и окислительного комплекса (в митохондриях). Эта
особенность винных дрожжей использована для ускорения про-
цесса созревания вин на этапе брожения сусла путем его аэра-
ЦЦи для технологии хереса глубинным способом; интенсифика-
ции процесса созревания крепких вин типа портвейна [105, 106].
51
Кроме того, аэробно-анаэробный способ сбраживания сусла обес-
печивает не только ускорение процесса созревания вина, но и
желаемую степень снижения его кислотности при переработке
высоко кислотного винограда.
Непрерывным брожением сусла при повышенном содержании
спирта (8—10% об.) достигается снижение степени окисленнос-
ти столовых вин [106].
Способность дрожжей к интенсивному окислению и исполь-
зованию в аэробных условиях брожения винной, молочной, яб-
лочной, уксусной и других органических кислот послужила ос-
новой для создания способа снижения кислотности крепких вин.
Изменение содержания кислот при брожении высококислотного
сусла показано в табл. 2. Аэробное брожение рекомендуется для
•снижения содержания летучих кислот в вине [106].
Известно, что снижение кислотности сусла при получении ви-
на общепринятым способом происходит главным образом за счет
винной и яблочной кислот; при этом степень накопления молоч-
ной, янтарной и лимонной кислот меньшая, чем степень усвое-
ния винной и яблочной [106, 156]. При аэробном же брожении
содержание всех указанных кислот уменьшается.
Таким образом, в аэробных условиях дрожжи склонны к
преимущественному окислению этилового спирта в присутствии
сахара и без сахара.
В ходе аэробного роста дрожжей в зависимости от исходной
концентрации глюкозы и количества инокулята наблюдается по-
давление их дыхательной активности [85]. Исчезновение глюко-
зы приводит к быстрому восстановлению дыхательной активнос-
ти, клетки начинают снова расти, используя в качестве источ-
ника углерода и энергии этанол и продукты метаболизма
глюкозы. Такая трактовка подтверждена экспериментально в
работах Н. Г. Саришвили и нашла применение в виноделии [181].
Проведенные исследования достаточно убедительно показали, что
потребление кислорода дрожжами на среде без сахара значи-
тельно повышается, при этом наиболее интенсивно при темпера-
туре 30°С. Влияние содержания сахара в субстрате (г/100 мл) на
Таблица 2
Кислоты Количество кислот, г/л
перед аэрацией после брожения
с аэрацией без аэрации
Глюконовая 0,09 0,05 0,09
Винная 4,80 3,80 4,35
Лимонная 0,08 0,14 0,10
Яблочная 2,75 2,05 2,55
Гликолевая 0,02 0,01 0,01
Молочная 0,15 0,08 0,19
Янтарная 0,15 0,10 0,21
52
Таблица 3
Активность дыхания дрожжей
Температура опыта, °C общая (в мкл) на среде удельная (в мкл/мг) на среде
с сахаром без сахара с сахаром без сахара
5 5,15 8,87 30 42
15 22,69 26,88 637 717
30 50,76 56,96 1220 2068
активность дыхания дрожжей характеризуется данными, приве-
денными в табл. 3.
С увеличением в субстрате концентрации клеток дрожжей с
5—6 до 500—600 млн./мл возрастает скорость потребления кис-
лорода (рис. 24) [122]. На основе этих неоспоримых фактов для
совершенствования подготовки бродильной смеси к шампани-
зации предложен способ биологического обескислороживания
купажа виноматериалов в потоке с последующей выдержкой вин
для обогащения их биологически активными веществами [180].
Шампанские виноматериалы, прошедшие технологическую об-
работку и обычно содержащие кислорода в количестве 4,5—
5,0 мг/л, непрерывно подают в вертикально расположенный
аппарат с наполнителями (в нижнюю часть) и одновременно
вводят дрожжевую разводку в количестве 2—3 млн/мл. В купа-
же, прошедшем биологическое обескислороживание, кислород
не содержится.
Анаэробные условия. При развитии клеток дрожжей
в условиях анаэробиоза происходит резкая перестройка энерге-
тического обмена. Дрожжи обладают окислительным механиз-
мом синтеза стеринов, порфиринов и ненасыщенных жирных
кислот, являющихся существенными компонентами мембран
[85]. Поэтому в условиях глубокого анаэробиоза при отсутствии
этих компонентов наступает дегенерация клеток. При введении
стеринов и ненасыщенных жирных кислот в среду с сахарами
факультативные анаэробы (способные к брожению) могут рас-
ти практически неограниченно долго и по характеру обмена на-
поминают типичные анаэробные организмы. Они характеризу-
ются резко сниженным содержанием фосфолипидов, эргостерина
и ненасыщенных жирных кислот, полным отсутствием цитохро-
мов дыхательной цепи, уменьшенным содержанием ферментов
Цикла Кребса и первичных дегидрогеназ [85]. В соответствии с
этими изменениями наблюдается почти полная редукция дыха-
тельной активности.
Таким образом, в условиях анаэробиоза митохондрии превра-
щаются в недифференцированные структуры, называемые про-
митохондриями, происходит полная редукция основной энерге- 53
тической функции их. Отсутствие
дыхания компенсируется усилением
гликолиза, который становится ос-
новным источником энергии клетки.
Бродильная функция клеток дрож-
жей при этом достигает максимума.
В связи с этим интересно привести
данные по брожению виноградного
сусла под давлением СО2 и отметить
некоторые особенности энергетиче-
ского обмена дрожжей в анаэроб-
ных условиях.
Н. И. Бурьян и сотр. [41] установ-
лено, что винные дрожжи, выросшие
в условиях избыточного давления
СО2, используют при брожении са-
хар значительно интенсивнее, чем те
же дрожжи, развившиеся в аэроб-
ных условиях. Расчет количества
сброженного сахара на 1 г воздуш-
но-сухих дрожжей показывает, что
бродильная способность определен-
ной массы (1 г) клеток, развиваю-
щихся в условиях избыточного дав-
ления СО2 до 0,5 МПа, выше на
Продолжительность культивирования, ч
Рис. 24. Скорость потребления кисло-
рода дрожжами при различной тем-
пературе в °C [181]. (Сплошные ли-
нии — 5—6 млн./мл, прерывистые —
500—600 млн./мл клеток).
25% по сравнению с бродильной
способностью клеток, развивавшихся при брожении со свобод-
ным доступом воздуха. Влияние избыточного давления СО2 на
скорость размножения дрожжей и процессы брожения характе-
ризуется данными, приведенными в табл. 4.
Размножение дрожжей тесно связано с запасом в клетках
АТФ, АДФ и АМФ, характеризующих их энергетическое состоя-
ние [29]. Избыточное давление СО2 приводит у дрожжей расы
Судак VI-5 (т) к увеличению суммы адениловых нуклеотидов в
основном за счет прироста АТФ (табл. 5).
Таблица 4
Раса дрожжей Избыточное дав- ление СО», МПа Биомасса, млн./мл Бродильная активность vc
Судак VI-5 0,5 51,3 8,4
0,0 155,0 7,3
Судак VI-5 (т) 0,5 55,0 8,2
0,0 153,6 7,4
Примечание. &с — скорость утилизации сахаров к концу брожения (в мкг
на 1 млн, клеток дрожжей за 1 ч).
Таблица 5
Избыточное давление СО2, МПа Содержание в дрожжах, мкмоль/г сухих дрожжей
АТФ АДФ АМФ сумма адениловых нуклеотидов
0,5 0,0 9,5+0,78 6,2 + 0,97 1,41+0,32 0,99±0,16 0,24+0,09 0,40+0,09 11,15 + 0,67 7,59+0,54
Основным поставщиком энергии у факультативных анаэро-
бов в условиях недостатка кислорода, как известно, становится
брожение. В связи с этим найденный высокий уровень АТФ в
дрожжах, бродивших под давлением СО2, коррелирует с отме-
ченным ранее для этих условий усилением утилизации из среды
энергетического субстрата глюкозы и повышенной активностью
гексокиназы, так называемого пускового фермента брожения.
Активность гексокиназы в дрожжах (количество восстановлен-
ного НАДФ-Нг в миллимикромолях/1 мин-1 мг белка) при из-
быточном давлении СО2 (МПа) по сравнению с обычными усло-
виями брожения (при атмосферном давлении) характеризуется
следующими данными:
Давление СО2 0,5 0,0
Активность гексокиназы 472±14,5 371 ± 12,5
Однако, несмотря на высокоэнергетическое состояние, ско-
рость размножения дрожжей в этих условиях была низкой, что
свидетельствует о специфическом действии высоких концентра-
ций углекислого газа на функцию почкования дрожжей.
Проведенные исследования по выявлению влияния избыточ-
ного давления СОг на физиолого-биохимические свойства дрож-
жей позволяют сделать вывод о том, что у дрожжей в этих усло-
виях наблюдается нарушение корреляции между скоростью раз-
множения и скоростью утилизации сахаров из среды. Такое
несоответствие, как известно, ведет к обогащению среды культи-
вирования вторичными продуктами, а также к повышенному
содержанию в ней восстановленных веществ [29].
Функциональная перестройка клеток наступает и при выра-
щивании дрожжей на неполноценной питательной среде или в
среде с несбалансированным содержанием витаминов, микро-
элементов и других питательных веществ. Так, избыточное
обеспечение дрожжей витамином Bi приводит к перестройке их
Даже в аэробных условиях культивирования на бродильный тип;
недостаток пантотеновой кислоты в среде резко снижает дыха-
тельную активность, при этом такое изменение передается по
наследству [85]. Добавление в среду эргостерина и ненасыщен-
ных жирных кислот (в форме твин-80) способствует росту дрож-
55
Таблица 6
Показатели Обмен газов при содержании азота, мг на 100 г сухих дрожжей
4,4 5,1 5,8 7,5 8,5 8,9
<?о2 33 33 37 22 18 15
^СО2 со2 189 193 205 258 298 304
Примечание. Qo —количество кислорода в мм3, поглощенного за 1 ч на
1 мг сухих дрожжей;
(?со —количество СО2 в мм3, выделенного за 1 ч на 1 мг сухих дрожжей в
ссС
атмосфере СО2 или другого инертного газа.
жей, что позволяет считать эти вещества необходимыми факто-
рами роста в анаэробных условиях [232, 239, 242].
Запас азотистых веществ в клетках дрожжей связан с энер-
гетическим обменом: чем богаче дрожжи азотом, тем ниже ин-
тенсивность дыхания и, наоборот, выше интенсивность брожения
[109, 154]. Зависимость между содержанием азота и обменом га-
зов показана в табл. 6 [154].
Бродильные свойства производственных рас
дрожжей. Как уже отмечалось, дрожжи для полного обеспе-
чения энергией всех жизненно важных функций свои энергети-
ческие потребности восполняют за счет спиртового брожения и
аэробного дыхания.
Дрожжи различаются по интенсивности брожения и дыхания.
Одни значительно богаче дыхательными ферментами, другие
имеют бродильный метаболизм [154]. Для характеристики истин-
ных бродильных свойств различных рас производственных дрож-
жей Е. Н. Одинцова рекомендует использовать коэффициент
Qco2 IQo3 (отношение интенсивности брожения к интенсивности
дыхания) [128]. Определение этого коэффициента у многих рас
винных дрожжей позволило отобрать лучшие для брожения ви-
ноградного сусла под давлением СОз и поточного процесса бро-
жения [17, 228].
При сравнительном исследовании бродильных свойств рас
винных (Sacch. vini), спиртовых (Sacch. cerevisiae) и пивова-
ренных (Sacch. carlsbergensis) дрожжей установлено, что вин-
ные дрожжи наряду с большей спиртоустойчивостью и способ-
ностью сбраживать более высокие концентрации сахаров, чем'
дрожжи спиртового и пивоваренного производств, нуждаются в
относительно большем доступе воздуха, обладают меньшей сте-
пенью анаэробиоза (табл. 7) [128].
Дрожжи вида Sacch. vini чаще имеют повышенную интен-
56 сивность брожения и более высокую степень анаэробиоза, чем
Таблица 7
Показатели Бродильные свойства производственных рас дрожжей
пылевидных хлопьевидных
Sacch. vini, раса Ркацители 6 Sacch. cerevisiae, раса К-16 Sacch. vini. раса Штейнберг 1892 г. Sacch. carl sbergen- sis, раса Фроберг
$О2 86 102 90 96
Qcot 124 166 146 212
К 1,4 1,6 1,6 2,2
Примечание. Qo —по табл. 6;
QCo — количество СО2 в мм3, выделенного за 1 ч на 1 мг су-
хих дрожжей;
к Qco-
<2о, •
дрожжи других видов, используемые в виноделии, тогда как сре-
ди культур вида Sacch. oviformis чаще обнаруживаются расы с
большей спиртообразующей способностью (табл. 8) [154].
Таблица 8
Показатели Интенсивность брожения видов дрожжей
Sacch. vini Sacch. uvarum Sacch. carlsber- gen sis Sacch. chevalieri Sacch. oviformis Sacch. chodati
Qo2 6—18 4—7 13 11—19 12—20 2—20
Qco2 56—329 47—56 127—165 191—234 160—176 146—257
Qco2 co2 Спиртообразующая способность 89—420 89—99 158—205 247—249 164—212 151—283
минимальная 8,0 7,2 7,3 11,2 11,9 12,6
максимальная 16,8 9,9 13,0 18,3 18,4 17,0
Примечание. Обозначения по табл. 6 и 7.
Питание. Питательные вещества либо входят в состав клет-
ки, либо снабжают ее необходимой для жизни энергией.
Перенос питательных веществ через цитоплазматическую
мембрану, которая обладает способностью регулировать проник-
новение различных веществ в клетку и выход из нее, осущест-
вляется в результате переноса двух типов: диффузии и стерео-
химического специфичного переноса. Каждый тип переноса име-
ет активную и пассивную формы (рис. 25).
Процесс пассивной диффузии происходит без затрат энергии
клеткой, и вещества проникают через цитоплазматическую мем-
брану при растворении в ней, а процесс активной диффузии — 57
Цитоплазматическая
мембрана
Рис. 25. Схема механизмов пере-
носа веществ через цитоплазмати-
ческую мембрану:
I — пассивная диффузия; II — актив-
ная диффузия; III — пассивный стерео-
химический специфичный перенос;
IV — активный стереохимический спе-
цифичный перенос [112].
с затратой энергии (обычно АТФ) в про-
цессе дыхания. Так, для проникновения
вещества R—-О в клетку потребуется за-
трата энергии на восстановление его во-
дородом до R— ОН, растворимого в ци-
топлазматической мембране, с последую-
щим окислением до R—О в клетке и ос-
вобождением водорода для восстановле-
ния новой молекулы R—О.
Перенос же в клетку большинства ве-
ществ, нерастворимых в цитоплазмати-
ческой мембране, осуществляется нахо-
дящимися на мембранах особыми белка-
ми-переносчиками — пермеазами. Таким
образом, проницаемость цитоплазматиче-
ской мембраны связана с наличием ве-
ществ, роль которых заключается в
транспорте ряда веществ в клетку микро-
организма. При пассивном стереохимиче-
ском специфичном переносе питательных
веществ комплекс вещество — пермеаза
растворяется в цитоплазматической мем-
бране, диффундирует в клетку и пермеа-
за возвращается за новым веществом.
Активный стереохимический специфичный перенос питатель-
ных веществ требует затраты энергии клеткой микроорганизма
на превращение вещества в форму, способную соединиться с бел-
ком-носителем и пройти через мембрану. Например, вещество
R2—О должно быть превращено в R2—ОН, которое и объединя-
ется со специфической пермеазой [112].
Следует отметить, что эффект переноса растворенных ве-
ществ обеспечивает определенная стереохимическая структура
пермеазы и транспортируемого вещества. Так, перенос опреде-
ленного углевода протекает только при участии одной пермеазы.
Установлена зависимость поступления в клетки дрожжей саха-
ров от их циклического строения. Потеря циклического строения
у сорбита, маннита и других шестиатомных спиртов приводит к
четкому изменению проницаемости. Обнаружена видовая специ-
фичность проникновения сахаров. Клетки Sacch. cerevisiae ис-
пользуют трегалозу, тогда как Sacch. fragilis - нет. Проницае-
мость клеток в смесях сахаров обусловлена конкуренцией, на-
пример, между глюкозой и галактозой, галактозой и мальтозой.
Таким образом, физиологическую разнокачественность микро-
организмов определяет не только комплекс ферментов, но и об-
ладание специфической проницаемостью или транспортным ме-
ханизмом.
На процессы переноса растворенных веществ у микроорга-
58 низмов влияют факторы окружающей среды. Активность пермеаз
обычно ингибируется ионами тяжелых металлов, величиной pH»
температурой и др. Изменяется проницаемость мембран дрож-
жей и от условий культивирования. Так, на среде с большим не-
достатком биотина проницаемость мембран увеличивается [77].
Как и во всех живых организмах, основную часть дрожжевой
клетки составляет вода — в пределах 75% от общей массы. Со-
став сухой массы дрожжей следующий [154], %:
Неорганические вещества 5—10
Углеводы 25—50
Азот 4,8—12
Белки (NX6.25) 30—75
Липиды 2—5
Неорганические вещества дрожжевой клетки в основном со-
стоят из фосфорной кислоты (около 50%) и калия (около 25%).
Остальные элементы (сера, кальций, железо, хлор, марганец,
цинк, молибден, бор и др.) содержатся в ней в незначительных
количествах. Углеводы дрожжей составляют полисахариды, гли-
коген. Содержание свободных аминокислот в дрожжах к концу
брожения составляет (в мг/г лиофильно-высушенных дрожжей)
[135]: лизин — 7,5; аргинин—1,3; гистидин—11,0; аспарагино-
вая кислота — 2,9; серин — 2,7; глицин— 1,5; глутаминовая кис-
лота —- 3,9; аланин — 8,7; пролин — 2,0; тирозин — 2,8; метио-
нин — 2,9; лейцин (изолейцин) — 5,4; цистеин — следы.
Нуклеиновые кислоты дрожжей — пуриновые и пиримидино-
вые основания — составляют соответственно 8 и 4% от общего
количества азота [154].
Витамины, содержание в 1 г сухих дрожжей, мкг
Инозит Биотин Пантотеновая кислота Тиамин Пиридоксин Никотинамид Рибофлавин 6000—15000 0,6—2,7 2,0—19,0 24—50 14—39 370—750 30—60
Химический состав дрожжей может изменяться в зависимо-
сти от состава питательной среды, возраста культуры и условий
культивирования. Отношение дрожжей к веществам, входящим
в состав среды, зависит главным образом от ферментов, выраба-
тываемых данным видом или расой дрожжей.
Среды для культивирования дрожжей должны содержать все
необходимые им химические элементы и в достаточно легко ус-
вояемой форме,
Угле р о д н о е пи та н и е. Источниками углерода для дрож-
жей могут быть самые разнообразные органические соединения:
углеводы (сахара и их производные), спирты, органические кис-
лоты, аминокислоты, белки, углеводороды и многие другие. Од- ш
нако в отношении сахаров существует видовая специфичность.
На этом построена диагностика видов дрожжей. Так, при общ-
ности химизма углеводного обмена большая часть видов рода
Saccharomyces различается между собой прежде всего по отно-
шению к сахарам. Что касается других источников углерода —
спиртов и органических кислот,— то отношение к ним одинако-
во у всех видов данного рода [90].
Однако большинство видов винных дрожжей сбраживают
глюкозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу и галактозу; рафинозу ис-
пользуют частично, а лактозу, мелибиозу, пентозы, декстрины
и крахмал совсем не сбраживают. В виноградном сусле пример-
но в равных количествах содержатся глюкоза и фруктоза. Фрук-
тоза значительно слаще глюкозы, поэтому для приготовления
вин с остаточным сахаром лучше использовать дрожжи, обла-
дающие способностью в первую очередь сбраживать глюкозу.
По интенсивности утилизации глюкозы или фруктозы (к мо-
менту, когда сброжено около 50% фруктозы) дрожжи разделя-
ют на 3 группы [154]:
1) глюкозофильные — сбраживают к этому моменту от 80 до
85% глюкозы (большая часть видов рода Saccharomyces, а так-
же виды родов Saccharomycodes и Brettanomyces);
2) фруктозофильные — в этот период используют только от 5
до 10% глюкозы (Sacch. bailli, Sacch. rouxii, T. stellata);
3) дрожжи, использующие оба сахара почти с одинаковой
скоростью: к моменту, когда они утилизируют половину фрук-
тозы, исчезает 40—60% глюкозы (Sacch. rosei, Pichia membra-
naefaciens).
Органические кислоты занимают важное место в обмене ве-
ществ у дрожжей: они могут стимулировать или ингибировать
их рост, служить единственным источником углерода и энергии
[26,126,178].
Все промежуточные продукты цикла Кребса (пировиноград-
ную, уксусную, янтарную, фумаровую и яблочную кислоты)
дрожжи в состоянии использовать в качестве единственного ис-
точника углерода. Однако скорость роста на средах с этими кис-
лотами ниже, чем на средах с глюкозой. При выдержке вина
под хересной пленкой показано образование щавелевой, глико-
левой, фумаровой и глутаровой кислот, которых в исходном вине
не было [178]. Специальные опыты подтвердили синтез хересны-
ми дрожжами из яблочной кислоты фумаровой, янтарной, гли-
колевой; из пировиноградной — лимонной, яблочной, молочной,
янтарной кислот.
Ненасыщенные жирные кислоты, особенно олеиновая, линоле-
вая, линоленовая, пальмитолеиновая, арахидиновая, являются
важными ростовыми факторами дрожжей в анаэробных услови-
ях. А. Андреазен и Т. Стийер [232] установили, что винные дрож-
жи могут свободно размножаться в анаэробных условиях, если
60 в среду для культивирования ввести два вещества: какую-либо
ненасыщенную жирную кислоту (олеиновую, линолевую, лино-
леновую) и стерины (эргостерин или холестерин). П. Брешо с
соавторами [239, 242] изучали дрожжи в процессе приготовления
вин углекислотной мацерацией. Ими установлено присутствие
стимуляторов роста дрожжей в виноградном сусле (пруин вино-
града), необходимых для развития в анаэробных условиях.
Использование дрожжами углеводородов как единственного
источника углерода широко применяется для получения кормо-
вого белка. Парафины могут активно потребляться углеводо-
родокисляющими дрожжами рода Candida при технологическом
процессе производства дрожжевой массы.
В настоящее время существует подкрепленное эксперимен-
тальными данными мнение об участии СО2 в обмене веществ
дрожжей [35]. А. К. Родопуло [161] была доказана способность
дрожжей синтезировать из пировиноградной кислоты и углекис-
лоты ряд органических кислот: лимонную, яблочную, янтарную,
молочную и др.
При производстве шампанских вин дрожжи оказываются в
среде с повышенным содержанием СОг. Л. В. Дубинчук,
Н. Н. Глонина, Е. С. Дрбоглав исследовали фиксацию СИО2
дрожжами при шампанизации и установили активное использо-
вание СО2 для синтеза белковых веществ, кислот [54, 56].
Таким образом, среди всех разнообразных органических ис-
точников углерода углекислый газ является биологически ак-
тивным веществом, связанные формы которого являются необ-
ходимым продуктом для дрожжей [50].
Азотное питание. Источники азота, необходимые для
синтеза азотсодержащих компонентов клетки (аминокислот, бел-
ков, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов и некоторых ви-
таминов), должны содержаться в среде в виде органических
или неорганических соединений. Большинство дрожжей не ус-
ваивают нитраты. Однако род Hansenula характеризуется спо-
собностью использовать их, чем и отличается от рода Pichia.
Некоторые виды рода Brettanomyces также усваивают нитраты.
В качестве неорганических источников азота дрожжи хорошо ис-
пользуют: сернокислый и фосфорнокислый аммоний, аммиачные
соли уксусной, молочной, яблочной и янтарной кислот [76].
В этом случае ближайшим предшественником органического
азота является аммиак, который дрожжи рода Saccharomyces
усваивают в первую очередь и только потом — органические
азотистые вещества — аминокислоты. Дрожжи могут использо-
вать в качестве источника азота мочевину и пептон. Для полу-
чения большой биомассы Sacch. cerevisiae в аэробных условиях
в среде должен содержаться азот как в органической, так и не-
органической форме. Один миллиард клеток усваивает около
4—7 мг азота [78].
Аммиачный азот, содержащийся в виноградном сусле (от 25
до 100 мг/л), быстро усваивается дрожжами в первые часы (сут- 61
ки) размножения клеток. Иногда, при недостатке аммиачного
азота в сусле (в годы сильного вызревания винограда или пора-
жения ягод грибом Botrytis cinerea), для усиления роста куль-
туры дрожжей вводят соли аммония. Но делать это можно толь-
ко перед забраживанием, так как в процессе брожения дрожжи
усваивают аммонийные соли не полностью [154]. Следует также
обратить внимание на то, что добавки солей аммония повыша-
ют в вине титруемую кислотность и снижают величину pH.
Н. Ф. Саенко и другие исследователи установили, что херес-
ные дрожжи лучше развиваются при внесении дополнительных
источников азотистого питания (0,5% дрожжевого автолизата
или лебедевского мацерационного сока или водного раствора
аммиака в количестве 80—120 мг/л). Наиболее быстрому разви-
тию хересной пленки способствует одновременное внесение 0,5%
автолизата и 80 мг/л аммиачного азота [178].
Хорошо усваиваются дрожжами аминокислоты, хуже — пеп-
тиды и совсем не усваивается нативный белок. Однако при на-
личии усвояемого азота в среде дрожжи способны расщеплять
белок, выделяя протеолитические ферменты [229].
По питательной ценности для вийных дрожжей Э. Пейно и
С. Лафон-Лафуркад [292] аминокислоты разделили на хорошо
усваиваемые — изолейцин, триптофан, аргинин, валин, гистидин,
аспарагиновая кислота и плохо усвояемые — треонин, фенилала-
нин, тирозин, метионин, серин, лизин, глицин, глутаминовая кис-
лота, лейцин. Совершенно не усваивается пролин.
Примечательным фактом является то, что дрожжи использу-
ют только природные формы аминокислот (L-формы).
Дрожжи в процессе брожения виноградного сусла, с одной
стороны, потребляют азотистые вещества, с другой — выделяют
их в среду. При этом поступление аминокислот и других азоти-
стых веществ значительно увеличивается к концу брожения,
когда возрастает число мертвых клеток дрожжей и соответст-
венно — автолитические процессы усиливаются. Однако надо
учесть и то, что аминокислоты могут выделяться в среду и жи-
выми клетками.
Н. М. Сисакян и Э. Н. Безингер [188] исследовали изменение
состава аминокислот в процессе брожения виноградного сусла
и формирования вина и показали, что в процессе сбраживания
сусла дрожжи интенсивно ассимилируют большинство амино-
кислот, не затрагивая пролин, и по окончании брожения отдают
в вино аспарагиновую, глутаминовую и у-аминомасляную кисло-
ты, аланин, валин, гликокол, серин, треонин. Таким образом,
при культивировании дрожжевых клеток на среде, содержащей
полную смесь аминокислот, возможна прямая их ассимиляция
в таком количестве, которое соответствует их содержанию в бел-
ке дрожжей [76]. Это свидетельствует о том, что для построения
белков при размножении и росте клеток необходим не только
62 азот, но и углеродистый остаток аминокислоты. Установлено,
что дезаминированный остаток аминокислоты является факто-
ром, определяющим его питательную ценность, позволяет рас-
сматривать аминокислоты не только как источник азота, но одно-
временно и как источник углерода. Этим можно объяснить прин-
ципиальную разницу в ценности различных аминокислот.
Основой метаболизма аминокислот являются реакции трех
главных типов: дезаминирование, переаминирование, декарбок-
силирование.
В процессе распада и образования «вторичных» аминокислот
исключительная роль принадлежит реакциям переаминирования
при участии аминотрансфераз. Наличие систем переаминирова-
ния у винных дрожжей Sacch. vini и Sacch. oviformis показано
В. К. Липатовой [41]. Дрожжи, выращенные в аэробных услови-
ях (виноградное сусло-агар), имели незначительную активность
L-аспартат- и L-аланин-аминотрансфераз. У них отсутствовала
L-тирозин-аминотрансфераза по сравнению с этими же дрож-
жами, выращенными в анаэробных условиях (виноградное сус-
ло), хотя выход клеточного экстракта из 1 г сухих дрожжей ос-
тавался в тех же пределах. Активность аминотрансфераз дрож-
жей, выращенных на виноградном сусле, характеризуется
данными, приведенными в табл. 9. Несмотря на то что содержа-
ние белка в дрожжах рас Киевская и Херес 20 С/96 в аэробных
условиях было выше, чем в анаэробных, активность аминотранс-
фераз была незначительной. Это указывает на связь реакций
переаминирования с функциональной деятельностью дрожжей —
брожением. Наряду с влиянием условий культивирования на
активность аминотрансферазных систем дрожжей оказывал вли-
Таблица 9
Расы дрожжей, выращенных на виноградном сусле Выход клеточно- го экстракта, мг/г сухих дрож- жей Содержание бел- ка, мг/г сухих дрожжей Активность аминотрансфераз
L -Аспартат: 2-оксоглутарат- аминотрансфера за Ь-Аланин; 2-оксоглутарат- аминотрансфераза L-Тирозин; 2-оксоглутарат- аминотрансфераза
Удельная активность, ед./мг белка
Феодосия 1-19 0,73 21,17 50,0 4,30 2,17
Судак VI-5 1,17 25,74 20,0 2,57 1,80
Киевская 0,50 4,30 60,6 4,54 1,45
Херес 20С/96 0,875 5,51 30,3 2,50 1,80
Активность, ед./г сухих дрожжей
Феодосия 1-19 0,73 21,17 1058,50 91,00 45,90
Судак VI-5 1,17 25,74 514,80 66,20 46,30
Киевскя 0,50 4,30 260,58 19,50 6,25
Херес 20С/96 0,875 5,51 166,95 13,78 9,92
63
Таблица 10
Источник азота среды Ридер Активность аминотрансфераз дрожжей расы Феодосия 1-19
L-Аспартат: 2-оксо- глутарат-аминотра нс- фераза L-Аланин.- 2-оксоглу- тарат-аминотрансфе- раза Ь-Тирозин.' 2-оксоглутарат- аминотрансфера за
I II I П I II
(NH4)2SO4 3,1 61,1 0,35 6,9 Сл. Сл.
(NH4)2SO4 + + 0,25 г/л аланина 48,2 3528,0 2,65 158,4 3,87 227,2
Аланин 56,8 2862,7 3,2 161,3 4,12 207,6
(NH4)2SO4+0,25 г/л аспарагиновой кислоты 49,0 1239,7 0,46 11,6 3,62 15,7
Аспарагиновая кис- лота 54,5 2485,2 1,47 67,0 5,31 241,7
(NH4)3SO4+ 0,25 г/л тирозина 0,82 18,4 0,21 4,7 0,1 2,24
Тирозин 38,2 565,4 1,15 17,0 1,22 18,0
Примечание. I — удельная активность, ед./мгбелка; II — активность, ед./г
сухих дрожжей.
яние также и азотистый состав среды, применяемой для культи-
вирования (табл. 10).
Добавки аминокислот к сернокислому аммонию и полная за-
мена сернокислого аммония аминокислотами значительно увели-
чивали активность изучаемых ферментов.
Аминокислоты оказывали влияние не только на соответствую-
щие аминотрансферазы, но и на другие, для которых они не яв-
лялись субстратами. Аланин, добавленный в среду, оказывал
заметное воздействие на активность всех исследуемых фермен-
тов. При добавке тирозина увеличивалась активность только ти-
розин-аминотрансферазы, и лишь при полной замене сернокис-
лого аммония тирозином повышалась активность аминотранс-
фераз.
Вполне очевиден факт проявления аминотрансферазной ак-
тивности при наличии в среде аминокислот. Об этом же свиде-
тельствуют данные увеличения активности ферментов на синте-
тической среде с сернокислым аммонием к концу брожения,
когда в ней появляются аминокислоты, как в результате обмена
веществ дрожжей, так и частичного автолиза дрожжевых клеток.
Активность аспартат-аминотрансферазы с 3,1 ед./мг белка в се-
редине брожения возросла до 47,7 ед./мг белка к концу броже-
ния; активность аланин-аминотрансферазы увеличилась с 0,35 до
0,92 ед./мг белка. В конце брожения активность тирозин-амино-
трансферазы составляла 2,64 ед./мг, в то время как в середине
64 брожения обнаружены только следы этого фермента.
Таким образом, наличие в среде аминокислот служит усло-
вием для проявления аминотрансферазной активности, что поз-
воляет предполагать их индуцируемость.
Экстремальное воздействие на дрожжи как избытка кисло-
рода, так и избытка СО2 значительно изменяет азотистый об-
мен. Так, наличие кислорода сдвигает обмен в сторону накопле-
ния больших количеств биомассы и способствует усиленному
потреблению азотистых веществ, в том числе и аминокислот из
среды. Поэтому в ней уже к середине брожения остается только
25% аминокислот и 9% общего азота. Наоборот, избыточное
давление СО2 тормозит размножение дрожжей, но единицей био-
массы расходуется больше и аминокислот, и общего азота.
Влияние условий брожения на содержание азотистых ве-
ществ в дрожжах и в виноматериале к концу брожения вино-
градного сусла видно из данных, приведенных в табл. 11.
Условия брожения оказывают существенное влияние на про-
теиназную активность. Максимальной удельной активностью об-
ладают дрожжи в аэробных условиях брожения—100% и ми-
нимальной— 66% при брожении в атмосфере СО2 при давлении
0,4 МПа. Пептидазная активность во много раз ниже протеиназ-
ной. Это обусловлено тем, что гидролиз белка в живой клетке
идет главным образом до полипептидов и в очень незначитель-
ной степени до аминокислот [135].
В целом при выдержке вина на осадке дрожжи могут воз-
вратить 75% аминокислот, потребленных ими во время броже-
ния [252].
Динамика аминокислот в процессе сбраживания виноград-
ного сусла различными расами дрожжей описана В. К. Липато-
Таблица 11
Условия брожения Содержание азотистых веществ к концу брожения виноградного сусла, мг/л
в виноматериале в дрожжах
« 3 к О S я о ч вори- белок ад 3 к О S я о „
« S О 5 ® н S о 2 га £ 3 О ’S та из Я f- Е о S та Я 43 S Ь s о
о та Ю та та И Ч О та а.2 та та га Ч
Аэробные 43,8 3,6 11,5 45,5 39,7 52,8 7,7 31,7
— принудительная по- дача воздуха Анаэробные 119,4 5,5 77,3 429,0 65,8 40,7 9,0 42,0
—с затворами Мейссля При избыточном дав- лении СО2—0,4 МПа 239,2 4,9 88,8 752,4 64,1 53,5 5,2 26,6
Примечание. В виноградном сусле содержалось (в мг/л): общего азота —
532,0; белка —11,1; аминного азота—142,1; аминокислот— 1333,6.
3—568
65
вой [41, 96] и И. И. Бурьян с сотр. Выдержка вина на дрожжах
показала, что расы дрожжей Судак VI-5 и Херес 20 С/96 сильнее
обогащают вино аминокислотами, чем расы Феодосия 1-19 и Ки-
евская.
Описаны случаи усвоения атмосферного азота хересными
дрожжами при недостаточном содержании азотистых веществ в
виноматериале [178].
Азотистый обмен наряду с углеводным является основным в
процессе брожения. На грани этих двух обменов синтезируются
компоненты, влияющие на органолептические показатели вина
[145]. Избыток азотистых веществ в винах при наличии доступа
кислорода воздуха приводит к переокисленности и появлению в
вине мадерных тонов. Г. Г. Валуйко для регулирования содер-
жания азотистых веществ в виноматериалах рекомендует про-
водить брожение при температуре 16—18°С, что обеспечивает
получение легких шампанских и столовых виноматериалов
[32, 40].
Для снижения содержания азотистых веществ в винах реко-
мендуется биологическое азотопонижение (многократное броже-
ние и фильтрация), используемое в технологии приготовления
мускатных игристых вин, описанной Е. П. Шольцем [41], и сто-
ловых полусладких,— Л. Т. Ермачковой [41].
Неорганические элементы питания. Для пита-
ния дрожжей также необходимы неорганические элементы: фос-
фор, сера, калий, кальций и др.
Фосфор входит в состав важнейших соединений клетки: нук-
леопротеидов, нуклеиновых кислот, полифосфатов, фосфолипи-
дов. Соединения фосфора играют определенную роль в различ-
ных химических превращениях и в особенности в углеводном об-
мене и в переносе энергии. Дрожжи хорошо используют в
качестве источников фосфора неорганические ортофосфаты, ко-
торые превращаются в полифосфаты и после активирования ис-
пользуются для синтетических процессов. Недостаток фосфора в
среде приводит к резкому изменению у дрожжей обмена ве-
ществ, связанного с нарушением потребления и усвоения угле-
водов и азота. Для физиологических потребностей расходуется
около 10—13 мг фосфора на 10 млрд, клеток [77].
При изучении влияния фосфорного питания на процесс спир-
тового брожения винных дрожжей (Sacch. vini и Sacch. ovifor-
mis) установлено активирование размножения клеток и повыше-
ние интенсивности брожения при дополнительном введении фос-
форного питания в виде двузамещенного фосфата натрия (100—
500 мг/л). В вине снижается количество общих и летучих кис-
лот, повышаются вкусовые достоинства [75].
В дрожжевых клетках полифосфаты обнаружены в двух раз-
личных формах: кислоторастворимые (в холодной трихлорук-
сусной кислоте) — меньшая часть и кислотонерастворимые —
66 большая часть.
Наибольшее количество фосфора полифосфатов (0,12—0,07%
на сухую биомассу) содержат молодые, интенсивно почкующие-
ся клетки. Такой факт свидетельствует о том, что полифосфаты
определяют начало и скорость процесса почкования клеток. При
этом в период активного роста и размножения, когда интенсив-
но синтезируются белок и нуклеиновые кислоты, расходуются в
первую очередь кислотонерастворимые полифосфаты как более
физиологически активная фракция, а затем — полифосфаты кис-
лоторастворимой фракции.
С прекращением почкования клеток отмечается почти пол-
ное использование полифосфатов. При выдержке вина на дрож-
жевом осадке содержание общего фосфора в дрожжах умень-
шается, а в вине соответственно увеличивается, т. е. кислото-
растворимые фосфорные соединения переходят из дрожжевых
клеток в вино [6].
Сера входит в состав белка и простетических групп (—SH)
некоторых ферментов и коэнзима А, поэтому без наличия серы в
среде нарушаются обменные процессы и синтез полноценного
белка. Существенную роль в жизнедеятельности дрожжей игра-
ют такие серусодержащие вещества, как аминокислоты (цисте-
ин, цистин, метионин), витамины (тиамин и биотин) и другие
соединения. В виноградном соке естественным источником серы
являются сульфаты [223]. В анаэробных условиях в процессе
брожения элементарная сера в клетках восстанавливается в
сероводород, а в аэробных — растворяется в жироподобных ве-
ществах клеток и накапливается в них.
Малые количества серы усиливают- почкование дрожжей. Но
уже 1 мг/л значительно задерживает этот процесс, поэтому осо-
бенно опасно содержание элементарной серы в виноматериалах,
используемых для вторичного брожения.
В присутствии ионов металлов (железа, меди) сера в клет-
ках образует сульфиды металлов, которые и окрашивают дрож-
жевой осадок в коричнево-красный или серо-черный цвет. Отло-
жение элементарной серы в клетках дрожжей приводит к обра-
зованию инволюционных форм.
Кальций и калий необходимы для активирования некоторых
ферментов. Вместе с тем кальций может выступать и в роли ин-
гибитора многих ферментов.
Микроэлементы оказывают влияние на размножение дрож-
жей и на брожение. Мп в количестве 1 мг/л повышает энергию
дыхания, большие количества (45—90 мг/л) активируют броже-
ние, повышают биосинтез эстераз дрожжей. Молибден активиру-
ет размножение, бор — сбраживающую способность дрожжей.
Смесь микроэлементов Li, Rb, Ni, Со способствует увеличе-
нию прироста массы дрожжей [218].
Факторы роста — это стимуляторы роста, к которым от-
носятся витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые
основания. Основными факторами роста беспигментных (бес- 67
3*
цветных) форм дрожжевых организмов являются шесть витами-
нов группы В: инозит (витамин В3), биотин (витамин В?), пан-
тотеновая кислота (витамин В3), тиамин (витамин BJ, пиридок-
син (витамин В6), никотиновая кислота (витамин В5; РР).
Для витаминов не найдено до сих пор никакого другого меха-
низма действия, кроме прямого участия в той или иной фермен-
тативной реакции. Этим определяется их значение для живых ор-
ганизмов. Следовательно, витамины, входящие в состав вино-
града и вина, важны не только с пищевой точки зрения, но они
могут играть ведущую роль в процессе формирования молодого
вина, входя в состав ферментов, катализирующих окислитель-
но-восстановительные процессы, обмен углеводов и азотистых
веществ [40, 41].
Минимальные количества их для развития дрожжевых орга-
низмов на синтетической среде составляют (в мкг на 1 мл): ино-
зита— 5; биотина — 0,0001; пантотеновой кислоты — 0,25; тиа-
мина — 1,0; пиридоксина — 0,25; никотиновой кислоты — 0,5
[129].
Необходимым фактором роста красных дрожжей Rhodotorula
помимо тиамина служит парааминобензойная кислота.
Витамины группы В относятся к наиболее активной по фи-
зиологическому действию группе биокатализаторов. Среди дрож-
жей встречаются формы полностью не способные к синтезу од-
ного, двух, а в некоторых случаях и нескольких витаминов
данной группы. У таких тест-культур совершенно отсутствует
рост, если требуемого витамина нет в питательной среде [65].
Уменьшение дозы требуемого витамина — от полной до предель-
но малой — вызывает адекватную реакцию ростом: урожай куль-
туры будет предельно большим при наличии в среде достаточной
дозы этого витамина и постепенно сниженным при постепенном
уменьшении количества требуемого витамина в опытных образ-
цах. На этом принципе Е. Н. Одинцовой [129] разработаны ко-
личественные методы микробиологического определения витами-
нов группы В.
Для нормальной жизнедеятельности и размножения опреде-
ленных групп дрожжевых организмов и отдельных рас требуют-
ся микроаминокислоты. Некоторые аминокислоты, добавленные
к синтетической среде совместно с необходимыми витаминами,
оказывали стимулирующее действие на размножение отдельных
штаммов дрожжей. Однако этот вопрос почти не изучался. !
ПРОДУКТЫ БРОЖЕНИЯ
Продукты, образующиеся в процессе жизнедеятельности
дрожжей. Они представляют собой отходы, от которых организм
освобождается, выделяя их в среду. Некоторые продукты обме-
на веществ дрожжей представляют большой интерес для виноде-
68 лия, так как они обусловливают букет и вкус вина.
Обычно продукты распада углеводов при брожении, за ис-
ключением этилового спирта и углекислого газа, называют вто-
ричными. Продукты, образованные из белков, т. е. из аминокис-
лот, называют побочными. Однако строго разграничить проис-
хождение вторичных и побочных продуктов невозможно,
поскольку одни и те же вещества, например высшие спирты, об-
разуются как из углеводов, так и из аминокислот.
Ко вторичным продуктам брожения относятся глицерин, ян-
тарная кислота, уксусный альдегид, уксусная, пировиноградная,
молочная и лимонная кислоты, 2,3-бутиленгликоль, ацетоин, диа-
цетил, эфиры, высшие спирты [124].
Механизм образования вторичных продуктов брожения еще
не вполне ясен. Однако установлено, что первоначально возни-
кают глицерин и уксусный альдегид, а все остальные указанные
соединения, по-видимому, можно рассматривать как продукты
превращения последнего.
Количественное соотношение вторичных продуктов может
быть выражено уравнением Женевуа:
г>5я-|-2Ь + С[ + б+ я + + 9л 4- Зх 4- Зу,
где г — глицерин;
я — янтарная кислота;
Ь — уксусная кислота;
а— ацетальдегид;
б— 2,3-бутиленгликоль;
п—пировиноградная кислота;
ац — ацетоин;
л — лимонная кислота;
х — изопропанол;
у — изоамилол.
Коэффициенты перед буквами обозначают число молекул ук-
сусного альдегида, затраченных на синтез одной молекулы дан-
ного вещества.
На обширном экспериментальном материале французские
ученые показали, что образование вторичных продуктов броже-
ния и их количественное соотношение зависят от фазы брожения
и условий (температуры, аэрации, pH, состава среды, окисли-
тельно-восстановительного потенциала, типа используемых дрож-
жей — с превалирующим аэробным или анаэробным метаболиз-
мом). Однако во всех случаях уравнение Л. Женевуа справедли-
во [265].
Глицерин образуется в процессе брожения, когда уксус-
ный альдегид связывается с бисульфитом натрия (по второй
форме брожения Нейберга), а также при брожении в щелочной
среде. Образование глицерина значительно сильнее в начале
брожения. Благодаря сладкому вкусу и маслянистости, он иг-
рает определенную роль во вкусовой гармонии вин. В обычных
винах глицерин содержится в количествах от 7 до 14 г/л; в ви-
нах, приготовленных из винограда, поврежденного грибком
Botrytis cinerea,— до 20 г/л. При хересовании вин содержание 69
глицерина снижается на !/з от исходного количества [178]. Раз-
личия в содержании глицерина в винах зависят от технологии,
температуры брожения, сульфитации и расы дрожжей [277, 278].
Ацетоин и диацетил влияют на качество вин, хотя ко-
личество их невелико — ацетоина от 2,0 до 84 мг/л, диацетила —
от 0,1 до 1,8 мг/л. Присутствие их в винах является интересным
по двум причинам: потенциальному влиянию на букет и аромат
и роли в биохимических превращениях. Диацетил имеет опреде-
ленный запах при низких концентрациях. Большие количества
диацетила (более 1 мг/л) придают вину тон окисленности, иног-
да переходящий в мышиный. Сухие столовые вина и шампанское
высокого качества содержат следы диацетила, низкого качест-
ва— выше 1 мг/л [160—163].
Образование диацетила и ацетоина при брожении находится
в обратной зависимости от сульфитации [133]. Максимальное со-
держание ацетоина в несульфитированном сусле в 2 раза пре-
вышает максимум ацетоина, образующегося в сульфитирован-
ном сусле.
В процессе брожения, особенно при аэрации сусла, количе-
ство диацетила увеличивается, однако накопление его не ана-
логично образованию ацетоина. Максимальное количество
(100 мг/л) ацетоина достигается в середине брожения сусла, а
к концу он весь восстанавливается в 2,3-бутиленгликоль. Таким
образом, все эти 3 вещества (диацетил, легко восстанавливаю-
щийся в ацетоин, а последний — в 2,3-бутиленгликоль) образу-
ют в средах окислительно-восстановительную систему.
Количества диацетила, ацетоина и 2,3-бутиленгликоля, обра-
зуемых при брожении, находятся в зависимости и от исходной
концентрации сахаров в сусле: чем выше концентрация сахаров
(2, 5 и 10 г/100 мл), тем больше накапливается диацетила. Расы
дрожжей, используемые при изготовлении вин, различаются по
биосинтетической способности: одни, например раса Туркестан-
ская 36/5, образуют диацетила 0,5 мг/л, ацетоина 9,7 мг/л, дру-
гие, например раса Кахури 7, — диацетила 9,6 мг/л, ацетоина
64,7 мг/л.
Из альдегидов в вине наиболее часто встречаются уксус-
ный, пропионовый, масляный, валериановый, энантовый и др.
В неразбавленном, виде альдегиды имеют острый запах. При раз-
бавлении альдегидов, кроме уксусного, появляются приятные
фруктовые тона [161]. Особенно много уксусного альдегида на-
капливается при брожении сульфитированного сусла. При этом
образуется связанная сернистая кислота (альдегидсернистая
кислота), количество которой при выдержке вина уменьшается
вследствие распада ее и накопления в вине уксусного альдегида.
В присутствии кислорода воздуха винные дрожжи способны
окислять этанол в уксусный альдегид [41, 178]. Небольшие коли-
чества уксусного альдегида (до 10 мг/л) образуются винными
70 дрожжами при сбраживании глюкозы.
Хересные дрожжи способны активно окислять этанол в аль-
дегид. На образование продуктов окисления расходуется не бо-
лее 4% общего количества спирта [178].
Ацетали обнаружены в винах в незначительных количест-
вах, кроме вин типа херес, где содержание альдегидов и ацета-
лей повышенное. Н. Ф. Саенко установила связь синтеза ацета-
лей с изменением ОВ-потенциала и отсутствие связи ацеталеоб-
разования с жизнедеятельностью хересной пленки [178].
Кислоты. В составе летучих кислот обнаружены: уксус-
ная, пропионовая, изомасляная, масляная, изовалериановая, ва-
лериановая, капроновая, каприловая. Следы энантовой кислоты
выявлены только в аэробных условиях брожения. Содержание
летучих кислот в виноматериалах, приготовленных в различных
условиях брожения, показано в табл. 12. Летучие кислоты в ос-
новном накапливаются на начальных этапах брожения. Наи-
больший удельный вес к общему количеству образовавшихся
кислот приходится на уксусную: в аэробных условиях брожения
количество ее составило 82—90%, в анаэробных — 92—94% и,
при избыточном давлении СО2—98%. Повышенный синтез кап-
роновой и каприловой кислот наблюдался в анаэробных услови-
ях брожения.
Уксусная кислота быстро образуется в начале брожения, а
затем к концу брожения ее содержание может резко понижать-
ся [154]. Некоторые дрожжи способны использовать уксусную
кислоту. Так, Ж. Вантр еще в 1937 г. показал, что летучие кис-
лоты, внесенные в сусло, частично исчезают в процессе броже-
ния.
На этом свойстве дрожжей основана рекомендация посред-
ством возобновления брожения снижать содержание летучих
кислот в испорченном вине.
Н. Ф. Саейко [173] предложен способ лечения больных вин
хересными дрожжами, так как при этом не образуется много
альдегидов и столовые вина не теряют своих особенностей.
Таблица 12
Летучие кислоты Содержание летучих кислот (в мг/л) при брожении
аэробном анаэробном при избыточном дав- лении СО2—0,4 МПа
Уксусная 340,1 515,2 880,0
Пропионовая 4- изомасля- 40,8 14,8 5,9
пая
Масляная 1,9 2,6 1,2
Изовалериановая 1,6 1,2 0,7
Валериановая 1,4 0,3 <0,1
Капроновая 1,9 7,6 4,3
Энантовая <0,1 Не обнаружены Не обнаружены
Каприловая 1,1 8,3 3,8
С у м м а 419 550 896
71
Янтарная кислота полностью отсутствует в винограде и об-
наружена в вине как продукт спиртового брожения в количест-
ве 0,1—0,4%.
Молочная кислота всегда образуется в процессе спиртового
брожения — около 0,5% сбраживаемых сахаров расходуется на
образование молочной кислоты. В здоровых белых винах коли-
чество молочной кислоты достигает 2,5 г/л, в красных — 4,5 г/л.
Молочную кислоту, синтезированную дрожжами в процессе бро-
жения, можно отличить от молочной кислоты яблочно-молочно-
го брожения по оптической активности: D(—)-молочная кислота
образуется дрожжами в анаэробных условиях, a L( + )-молоч-
ная — бактериями яблочно-молочного брожения из L-яблочной
кислоты [244, 267]. Из остаточных гексоз и пентоз определенные
виды молочнокислых бактерий могут синтезировать небольшие
количества D-молочной кислоты.
Лимонная кислота появляется в случае нормального броже-
ния в очень малом количестве — в пределах 0,3—0,8 г/л.
Яблочная кислота в сусле с высокой титруемой кислотно-
стью присутствует в сравнительно большом количестве — 3,0—
4,5 г/л. В процессе брожения яблочную кислоту используют
дрожжи, содержание ее уменьшается примерно на 25% [124,
161].
Повышенное количество яблочной кислоты в вине вызывает
резкое вкусовое ощущение, определяемое как «зеленая кислот-
ность».
Кетокислоты в вине представлены пировиноградной, щавеле-
воуксусной, а-кетоглутаровой и др.
Содержание пировиноградной кислоты колеблется в винах
от 11 до 460 мг/л, а-кетоглутаровой — от 2 до 341 мг/л [124, 237].
При брожении в условиях избыточного давления СО2 содер-
жание пировиноградной кислоты уменьшается, тогда как а-кето-
глутаровой — увеличивается [167].
Согласно данным С. Лафон-Лафуркад и Э. Пейно, образо-
вание пировиноградной и а-кетоглутаровой кислот зависит от
рас дрожжей, различающихся по активности карбоксилазы: чем
активнее пируваткарбоксилаза, тем меньше образуется пирови-
ноградной кислоты.
Б. Ранкин [313] нашел, что некоторые расы дрожжей Sacch.
cerevisiae и других видов, например Sacch. oviformis, Sacch.
carlsbergensis, давали различные количества пировиноградной
кислоты. Это имеет некоторое значение в практике виноделия,
так как пировиноградная кислота связывает SO2 и таким обра-
зом снижает его антисептическую активность.
Эфиры при брожении образуются в заметных количествах
и считаются важнейшей ароматической составляющей вин, сре-
ди которых этилацетат превалирует в количественном отноше-
нии. Этилацетат имеет простой фруктовый аромат. Этиловые
72 эфиры масляной кислоты, а также эфиры высших спиртов обла-
дают фруктово-цветочным запахом. Данные по образованию
сложных эфиров дрожжами различных родов и видов свиде-
тельствуют об их неодинаковых биосинтетических способностях.
Так, Sacch. oviformis синтезируют гораздо больше этилацетата
(в анаэробных условиях — 80 мг/л, в аэробных — 40 мг/л) и
изоамилацетата (в анаэробных—1,21 мг/л и аэробных —
0,14 мг/л), чем Sacch. vini (в анаэробных условиях соответст-
венно— 64 и 0,62 мг/л, в аэробных — 36 и 0,13 мг/л). Порог
ощущения этилацетата в вине 180—200 мг/л. При более низких
концентрациях влияет непосредственно на вкус вина, усиливая
неблагоприятное впечатление жесткости и горечи [161].
В шампанских винах особое значение придается содержанию
высококипящих эфиров — этилкапроната, этилкаприлата, этил-
каприната, изоамилкапроната. Из липидов образуются этиловые
эфиры линолевой, линоленовой и других кислот. Исследования
[57] свидетельствуют о том, что 5-суточные дрожжи более бога-
ты ароматообразующими веществами, чем 2-суточные, причем
такое увеличение наблюдается в основном за счет этиллинолеа-
та, обусловливающего подсолнечный тон шампанского
(0,78 мг/кг — у 2-суточных и 5,8 мг/кг — у 5-суточных). Неболь-
шое количество легколетучих сложных эфиров — этилацетата,
этилизобутирата — также положительно влияет на букет шам-
панского.
По нашим данным, при брожении виноградного сусла наблю-
дается накопление эфиров как низкокипящих, так и высококи-
пящих. Условия брожения влияют только на количественный со-
став эфиров. В анаэробных условиях уровень накопления эфи-
ров увеличивается в 6 раз по сравнению с брожением в присутст-
вии кислорода воздуха и в 4 раза по сравнению с брожением в
условиях избыточного давления СОг (табл. 13).
Выдержка виноматериалов, сброженных в аэробных и ана-
эробных условиях, на дрожжевом осадке привела к снижению
процентного содержания высококипящих эфиров и увеличению
низкокипящих и, наоборот, виноматериалы, полученные при бро-
Таблица 13
Содержание этиловых эфиров, мг/л
Условия брожения этилбути- рат 1 этилвалериат этилкапронат этилкап- рилат этилкапри- нат фенилэтил- ацетат этиллаурат этил мири- стат сумма ।
Аэробные 0,04 0,15 0,11 0,15 0,10 Следы 0,10 Следы 0,65
Анаэробные 0,07 1,30 0,72 0,78 0,64 » 0,34 0,36 4,21
При избыточном давлении СО2— 0,4 МПа 0,05 0,23 0,17 0,22 о,п 0,03 0,11 Нет 0,93
73
жении в условиях избыточного давления СО2, имели наиболее
высокое процентное содержание высококипящих эфиров.
В вине содержатся значительные количества этиловых эфи-
ров высших жирных кислот (энантовых эфиров), образуемых
дрожжами в процессе брожения [8, 162]. Липиды наряду с дру-
гими компонентами вина участвуют в окислительных процессах
при выдержке белых столовых вин, выполняя роль антиокисли-
телей, а в определенной концентрации придают мягкость и гар-
моничность букету и вкусу вина [8, 162, 214]. Для анаэробного
роста дрожжей рода Sacch. cerevisiae требуются олеиновая, ли-
нолевая и линоленовая кислоты. Эргостерин и некоторые дру-
гие стеролы также необходимы при анаэробном росте дрожжей.
По-видимому, потребность в ненасыщенных жирных кислотах
обусловлена тем, что синтез их в анаэробных условиях не про-
исходит [232, 240, 307].
Липиды являются смесью истинных жиров (эфиры жир-
ных кислот и глицерина), восков (эфиры жирных кислот и выс-
ших спиртов), фосфолипидов (содержащие жирную кислоту,
глицерин, неорганический фосфат и амин или аминокислоту),
стеринов. Клетки дрожжей Sacch. cerevisiae способны накапли-
вать от 12,6 до 42,8% липидов по отношению к сухим веществам.
Особенно они богаты стеринами, в основном эргостерином, со-
держание которого достигает 3% на сухую массу [6].
Синтез липидов у дрожжевых организмов тесно связан с про-
дуктами углеводного обмена.
Липиды, содержащиеся в вине, могут иметь двоякое проис-
хождение: из виноградной ягоды и из дрожжей. Семена вино-
града содержат масла, которые при брожении переходят в ви-
но. В виноградное сусло попадает воск, находящийся на поверх-
ности ягод винограда, основной составной частью которого
является олеанолевая кислота и спирты [307].
Увеличение содержания липидов в вине по сравнению с сус-
лом свидетельствует о том, что кроме липидов сусла в нем есть
липиды, синтезируемые дрожжами. Так, по данным Н. А. Ме-
хузлы и др. [111], в виноградном сусле количество общих липи-
дов составляло 50 мг/л, в крепленом вине — 73 мг/л, в сухом ви-
не — 113 мг/л.
Работы, выполненные нами совместно с Н. Я. Портновой, по
изучению содержания липидов в вине и в дрожжах в зависимос-
ти от условий культивирования показали, что имеются количе-
ственные различия содержания их в процессе брожения и при
выдержке виноматериала на дрожжевом осадке. Влияние усло-
вий брожения на содержание липидов в виноматериале и в дрож-
жах показано в табл. 14. В процессе выдержки вина на дрож-
жевом осадке содержание липидов в дрожжах несколько воз-
растает при аэробном брожении и снижается при анаэробном и
под давлением СО2. При выдержке вина протекают 2 противо-
74 положно направленных процесса: синтез липидов в живых клет-
Таблица 14
Условия брожения Общее содержание липидов, мг/л
в сусле в виноматериале в лиофильно-высушенных дрожжах
середина брожения конец броже- ния после выдер- жки на дрож- жевом осадке середина брожения конец брожения после выдер- жки винома- териала на дрожжевом осадке
Аэробные — с принуди- тельной подачей воздуха 35,3 48,0 56,9 57,8 191,0 239,2 248,4
Анаэробные — с затвора- ми Мейссля 35,3 31,3 51,9 56,3 133,4 141,6 131,5
При избыточном давле- нии СО2 — 0,4 МПа 35,3 25,0 31,7 57,5 101,2 118,8 106,9
ках за счет внутриклеточных сахаров [62] и извлечение липидов
из мертвых клеток, содержание которых в дрожжах при броже-
нии в анаэробных условиях и под давлением СО2 значительно
выше, чем при брожении в аэробных условиях.
При сравнительном изучении состава жирных кислот липи-
дов дрожжей и вина установлено, что в процессе брожения дрож-
жи потребляют из виноградного сусла ненасыщенные жирные
кислоты (олеиновую, линолевую, линоленовую), причем наибо-
лее интенсивно в условиях брожения под давлением СО2. В ус-
ловиях недостатка кислорода’ эти кислоты наиболее необходимы
дрожжам для их жизнедеятельности [232]. Выдержка вина на
дрожжевом осадке приводит к обогащению его преимуществен-
но олеиновой и линолевой кислотами. Среди насыщенных жир-
ных кислот как в сусле, так и в вине и дрожжах преобладают
пальмитиновая и стеариновая.
Таким образом, изменяя условия брожения, можно влиять на
липидный состав виноматериалов, а следовательно, и на вторич-
ный процесс брожения, поскольку ненасыщенные жирные кис-
лоты являются необходимым фактором роста дрожжей в ана-
эробных условиях.
Высшие спирты образуются путем дезаминирования или
переаминирования аминокислот, последующего декарбоксилиро-
вания кетокислот и восстановления альдегидов в процессе спир-
тового брожения. Убедительно доказано, что высшие спирты мо-
гут образовываться и в результате превращений углеводов при
брожении [157, 293, 323]. И. Я. Веселовым и И. М. Грачевой
[36, 49] установлено, что высшие спирты при брожении возника-
ют главным образом в фазе размножения дрожжей, т. е. про-
цесс этот является результатом конструктивного обмена, связан-
ного с ростом и размножением. Высшие спирты являются про- 75
Таблица 15
Условия брожения Содержание высших спиртов, мг/л
! сумма изобути- ловый 1 1 я-бутиловый изоамиловый гексиловый лактат (i - фенил - этиловый
Аэробные Анаэробные При избыточном давлении СО2 — 0,4 МПа 282 237 142 68 102 40 Следы Нет Следы 171 132 85 2,7 3,5 1.2 21,4 13,3 17,7
дуктами, синтез которых совершается на грани углеводного и
азотистого обмена дрожжей.
При введении аммонийных солей в среду, обедненную по со-
держанию азота, снижается образование высших спиртов в 1,4—
1,7 раза. Введение в эту среду избытка аминокислот а-аланина,
а-аминомасляной кислоты, лейцина, изолейцина и валина спо-
собствует накоплению не только спирта, соответствующего строе-
нию аминокислоты, но и ряда других высших спиртов.
В вине найдены следующие спирты: метанол, «-пропанол,
изопропанол, w-бутанол, изобутанол, «-пентанол (амиловый
спирт), 2-метилбутанол (оптически активный амиловый спирт),
3-метилбутанол (изоамиловый спирт), «-гексанол, 0-фенилэти-
ловый спирт, триптофол. Содержание их в вине в зависимости
от условий брожения виноградного сусла показано в табл. 15.
В условиях избытка кислорода воздуха сумма высших спир-
тов выше, чем в анаэробных и под давлением СО2.
По мере сбраживания сахаров биосинтез высших спиртов
продолжается, однако он для отдельных спиртов идет неравно-
мерно и зависит от условий брожения. Так, при брожении под
давлением СО2 снижается содержание высших спиртов, особен-
но изобутилового и изоамилового; повышается процентное со-
держание р-фенилэтилового спирта. Это является положитель-
ным явлением, поскольку изобутиловый и изоамиловый спирты,
особенно плохо влияющие на вкус, составляют 90% всех спир-
тов вина.
Приятным ароматом обладают спирты с циклическим строе-
нием, такие, как р-фенилэтиловый, тирозол, триптофол. Н. М. Си-
сакян, А. К. Родопуло, И. А. Егоров и Н. Г. Саришвили [145] до-
бавляли в тиражированное шампанское фенилаланин, тирозин.
Качество шампанского после выдержки в течение года улучша-
лось на 0,6—0,7 балла. Сочетание незначительных количеств
высших спиртов, полученных из этих аминокислот, придавало
вину характерные тона бутылочной выдержки.
Л. Уссеглио-Томассе [327], исследуя 25 образцов итальянских
вин разных типов, полученных из различных сортов винограда
76
разных лет урожая, показал, что при изменении содержания
р-фенилаланина в сусле можно получить вино с различным со-
держанием фенилэтилового спирта. Образование фенилэтилово-
го спирта во время брожения сусла находится в соответствии с
образованием этилового спирта. Отдельные культуры дрожжей
различаются по своей способности образовывать фенилэтиловый
спирт. Установлено, что дрожжи продуцируют в среду фенилэти-
ловый спирт в зависимости от содержания фенилаланина, при-
сутствующего в субстрате, но не более 20—25 мг/л.
Сульфгидрильные — SH-c о е д и н е н и я дрожжи мо-
гут выделять в среду в процессе брожения. В. Л. Кретовичем с
соавторами показано, что наиболее активным продуцентом
SH-соединений являются шампанские дрожжи; меньше их выде-
ляют Sacch. carlsbergensis 776, наименее активно — пекарские
дрожжи Sacch. cerevisiae 0—14. Результаты данной работы по-
казывают, что выделение SH-соединений — физиологический
процесс, связанный с обменом веществ клетки в процессе броже-
ния и обусловленный особенностями данной расы дрожжей [89].
Выделение дрожжами сульфгидрильных соединений глюта-
тиона и цистеина, снижающих редокспотенциал (Eh),— важный
показатель технологического процесса, поскольку развитие вина,
начиная с выдержки и кончая созреванием и старением, связано
в основном с течением окислительно-восстановительных реакций
[161].
Изменение редокспотенциала в ходе брожения виноградного
сусла зависит от скорости размножения дрожжей, накопления
биомассы. Eh-потенциал начинает снижаться в момент размно-
жения дрожжей, когда происходит максимальное потребление
ими растворенного кислорода (табл. 16). При брожении суль-
фитированного сусла редокспотенциал уменьшается значительно
интенсивнее [156].
SH-соединения относятся к редуктонам — веществам с высо-
кой восстанавливающей способностью. Редуктоны вина — это
восстанавливающие вещества винограда и продукты биохими-
ческих реакций, протекающих в процессе приготовления вина.
Присутствие редуктонов придает вину определенную способ-
Т аблица 16
Стадии процесса pH виноград- ного сусла Eh, мВ Количество растворен- ного кислорода, мг/л
До начала брожения з,з 402 4,0
Начало брожения 3,3 345 1,8
Интенсивное брожение 3,2 265 0,0
Конец брожения 3,2 255 0,0
После снятия вина с дрож- 3,2 355 2,5
жей
77
ность защищать в первую очередь ароматические компоненты от
окисления. Содержание редуктонов на различных этапах приго-
товления виноматериалов изучалось А. В. Трофимченко и сотр.
[196]. Установлено наличие их в свежеотжатом сусле, при этом
неодинаковое количество в различных сортах винограда. Суще-
ственные изменения в содержании редуктонов происходят в
процессе брожения: количество их значительно повышается к
моменту бурного брожения, а к концу брожения несколько сни-
жается. Дробная сульфитация при брожении способствовала по-
вышению количества редуктонов до 47 мг/л по сравнению с
33 мг/л при сульфитации сусла на отстаивании.
Наши определения показали более высокое содержание ре-
дуктонов в винах, сброженных под давлением СОг 0,4 МПа (50—
56 мг/л), чем в винах, приготовленных по общепринятой техно-
логии (17 мг/л).
В виноматериалах, полученных путем сбраживания вино-
градного сусла под давлением СОг, запас сульфгидрильных сое-
динений значительно выше. В них содержалось (в мг/л): восста-
новленного глютатиона 98 и SH-соединений 245, а в виномате-
риалах, приготовленных в обычных условиях брожения,
соответственно би 113.
Термотолерантные расы винных дрожжей способны в боль-
шей степени обогащать виноматериалы редуктонами. Eh вино-
материалов, приготовленных на термотолерантных расах дрож-
жей Судак VI-5 (т), Феодосия 1-19 (т), Берегово 1 (т), был
на 40—60 мВ ниже по сравнению с контрольными образцами.
Сероводород обладает неприятным запахом и его при-
сутствие в вине в количествах, превышающих порог вкусовой
чувствительности (0,005 мг/л), нежелательно [326]. Образова-
ние сероводорода при брожении виноградного сусла зависит от
расы дрожжей, температуры брожения и состава среды. При ис-
пытании 10 различных рас дрожжей на способность накапли-
вать H2S при сбраживании виноградного сусла обнаружена спо-
собность накапливать SO2 в количестве до 116 мг/л и H2S—до
10 мг/л. Обсуждаются данные по влиянию состава питательной
среды на образование H2S дрожжами и наследственность этого
признака [249, 331].
Дрожжи могут превращать элементарную серу и SO2 в H2S:
цистеин, аспарагиновая, глютаминовая кислоты, глицерин, гис-
тидин, орнитон, серин, треонин активируют образование H2S.
Накопление H2S в винах задерживалось лишь присутствием ме-
тионина, пантотеновой кислоты или витамина В6 [244, 331]. Ко-
личество образуемого H2S для каждой расы было наследствен-
ным.
Разработан электролитический способ мгновенного удаления
летучих соединений серы из пива путем пропускания его через
камеру с двумя медными электродами [326].
78 Исследуя биологическое происхождение H2S в вине, Ружие
[318] не обнаруживала его в винах, приготовленных путем быст-
рого брожения при высоких температурах. Снижение концентра-
ции H2S наблюдалось и при применении смешанных культур
дрожжей, способных и неспособных восстанавливать сульфаты.
Продукты, образующиеся в процессе автолиза дрожжей. Ав-
толиз — это разложение компонентов клетки [65] под действием
своих же гидролитических ферментов. При автолизе происхо-
дит распад белков, углеводов, нуклеотидов, липидов и других
веществ клетки и выход их составных частей в среду. Необходи-
мым условием автолиза является смерть клеток при сохранении
активности внутриклеточных ферментов [159].
В виноделии длительное время поддерживалось мнение, что
выдержка виноматериалов на дрожжах или добавление в вино-
материал специально приготовленных автолизатов дрожжей зна-
чительно улучшает качество виноматериалов за счет увеличения
азотистых веществ, в основном аминокислот. Однако позже ис-
следованиями В. Н. Нилова и Г. Г. Валуйко [40] было установ-
лено, что азотистые вещества дрожжей не улучшают качества
виноматериалов, и только концентрат, полученный настаивани-
ем вина на дрожжах при температуре +8°С, улучшает качество,
придавая виноматериалам слаженный и мягкий вкус и тонкие
тона бутылочной выдержки в букете. При дальнейшей расшиф-
ровке таких концентратов В. И. Ниловым и Е. Н. Датунашвили
[40] было показано, что при температуре 0—10°С и pH в преде-
лах 3, автолиз клеток дрожжей практически не идет, нет при-
роста азотистых веществ, а проявляется активность ферментов.
Поэтому ферментные концентраты, получаемые в результате кон-
такта небольшого количества виноматериала с большой массой
дрожжей, отличаются активностью комплекса ферментов, сни-
жающих ОВ-потенциал, и повышенным содержанием в них ви-
таминов группы В, в особенности тиамина, пиридоксина и пан-
тотеновой кислоты [41, 130].
Витамины группы В являются биологически активными сое-
динениями и в ничтожных количествах могут оказывать суще-
ственное влияние на биохимические процессы, происходящие
при созревании вина и формировании его букета. Поэтому поло-
жительное влияние ферментных концентратов на качество вина
может быть связано с повышенным содержанием в них вита-
минов.
Ферментные концентраты, приготовленные на дрожжах раз-
ных рас, различаются по содержанию витаминов группы В.
В ферментных концентратах дрожжей Sacch. vini пантотеновой
(1000—1400 мкг/л) и никотиновой (20000—25000 мкг/л) кислот
было в 2 раза больше, чем в концентратах дрожжей Sacch. ovi-
formis (пантотеновой — 500—600 мкг/л, никотиновой 10000—
10200 мкг/л). Органолептическая оценка образцов вин, приго-
товленных с введением ферментных концентратов дрожжей раз-
личных рас, показала различие в аромате и букете готового ви- 79
на. Наиболее существенное воздействие на качество вина оказы-
вал ферментный концентрат дрожжей расы Феодосия 1-19 [41].
Введение в вино пантотената кальция дало такого же харак-
тера сдвиги в букете, что и ферментный концентрат. Внесение
пантотената кальция в предварительно прокипяченное вино эф-
фекта не дало, в связи с чем можно сделать вывод, что дейст-
вие пантотената связано с его участием в биохимических про-
цессах.
С продуктами автолиза дрожжей связан эффект созревания
шампанского, обогащение вина биологически активными веще-
ствами, развитие тонкого букета и продолжительность игры [9,
161, 289]. С. П. Авакянц и Ф. И. Шакарова [5], изучая автоли-
тические процессы у дрожжей при шампанизации, установили,
что состав продуктов автолиза клеток зависит от температурно-
го режима, продолжительности процесса и состава вина. Обра-
ботка дрожжей теплом (40°С) приводит к обогащению вина азо-
тистыми и фосфорными веществами, участвующими в создании
букета продукта. Для обогащения вина ферментами эффектив-
ной является обработка вина с дрожжами холодом (—5°С) в
течение 2—5 сут.
Этими сведениями, естественно, не исчерпывается механизм
действия продуктов автолиза дрожжей на вино. Не могут не
привлечь внимания материалы, свидетельствующие о неодинако-
вой способности различных рас дрожжей синтезировать витами-
ны, в том числе и витамин С [95]. Такая особенность дрожжей
может быть важным показателем в селекции культур для про-
изводства, поскольку аскорбиновая кислота снижает редокспо-
тенциал [38].
На основе изучения автолитических процессов в клетках
дрожжей разработаны рациональные методы использования по-
лезных свойств дрожжей в практике виноделия — применение
ферментных концентратов для повышения качества вин [40, 124].
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ
Температура. Одним из наиболее важных факторов, влияю-
щих на активность дрожжей, качество вина и содержание в нем
спирта и ароматических веществ, является температура, кото-
рая при брожении обычно поддерживается в пределах 10—30°С.
Для размножения дрожжей оптимальной является температура
ниже 30°С, для брожения 35°С. С повышением температуры в
процессе брожения спирт все в большей мере угнетает жизне-
деятельность дрожжей. Поэтому чем выше температура, тем
раньше брожение начинается, интенсивнее протекает, но закан-
чивается с большим количеством остаточных сахаров. Скорость
возникновения брожения в зависимости от температуры харак-
80 теризуется данными, приведенными в табл. 17 [154].
Таблица 17
Температура, °C Начало бро- жения через, сут Количество образовавше- гося спирта, % об. Температура, 'С Начало брожения через, сут Количество образовавше- гося спирта, % об.
10 8 16,2 25 3 14,5
15 6 15,8 30 1,5 10,2
20 4 15,2 35 1 6,0
Прекращение процесса брожения может быть опасно для
технологического процесса, так как остаточные сахара обычно
используются молочнокислыми бактериями, которые вызывают
молочнокислое брожение и образуют в вине молочную и уксус-
ную кислоты. Кроме того, используя фруктозу, молочнокислые
бактерии образуют шестиатомный спирт — маннит и уксусную
кислоту, что придает вину с остаточным сахаром неприятный
кисло-сладкий вкус. Высокая температура усиливает фактор
анаэробиоза, поэтому иногда трудно вызвать вторичное забра-
живание остаточных сахаров, особенно, если брожение шло без
доступа воздуха, и начальное содержание сахаров было относи-
тельно высоким.
Температура оказывает влияние не только на интенсивность
брожения и размножения дрожжей, но и на биосинтез вторич-
ных продуктов. Поэтому температура брожения для производст-
ва различных типов вин должна быть различной [124], что пре-
дусматривается в соответствующих технологических инструкци-
ях.
Необходимо учитывать и то, что сбраживание при постоянной
температуре наиболее целесообразно: дрожжи лучше переносят
температуру 35°С от начала до конца брожения, чем переход
от 25 до 35°С.
Существует связь между температурой и аэрацией. Наибо-
лее интенсивный рост дрожжей наблюдается с аэрацией в пер-
вые дни брожения при температуре 25—30°С, когда клетки ис-
пользуют весь введенный кислород. Аэрация при низкой тем-
пературе мало эффективна [154].
Активность дыхания дрожжей при применении купажа шам-
панских виноматериалов и синтетической питательной среды при
температуре 5°С была примерно в 5 раз ниже, чем при темпера-
туре 30°С [181].
Возможна адаптация дрожжей к высокой температуре среды
(40—42°С). Термотолерантные культуры дрожжей обладают
значительно более высокой энергией брожения и резко снижен-
ной энергией дыхания, а также иными синтетическими способ-
ностями витаминов — синтез пантотеновой кислоты у них пре-
обладает над синтезом витамина В6. Перестройка таких физио- 81
4—568
логически важных функций клеток дрожжей должна привести к
изменению обмена веществ, а следовательно, и к другому каче-
ственному и количественному соотношению веществ, участвую-
щих в создании напитка [97, 98]. Выращивание винных дрожжей
вида Sacch. vini при температуре 40°С с последовательными пе-
ресевами привело к повышению энергии брожения и снижению
энергии дыхания.
Культура дрожжей, полученная таким способом, имеет более
анаэробный тип обмена. Она рекомендована нами для брожения
виноградного сусла под давлением СО2.
Термотолерантные штаммы винных дрожжей кроме приме-
нения их для брожения при повышенных температурах могут
быть рекомендованы производству как культуры с высокой био-
химической активностью. При использовании этих штаммов в
вине накапливаются продукты жизнедеятельности, обусловли-
вающие формирование высоких органолептических качеств. Ви-
номатериалы, приготовленные на термотолерантных расах дрож-
жей, в отличие от контрольных содержали меньшее количество
высших спиртов, придающих винам сивушный тон; имели повы-
шенное содержание редуктонов, пониженное — диацетила и аце-
тоина.
Окислительно-восстановительный потенциал был на 40—
60 мВ ниже. Все эти показатели характеризуют вина как мало-
окисленные.
Дрожжи чрезвычайно устойчивы к холоду и переносят тем-
пературу —200°С. При температуре 0°С некоторые виды дрож-
жей могут медленно размножаться и вызывать брожение. Обыч-
но заметно брожение при температуре 2°С. И. И. Баштанная,
проверив холодовыносливость 198 штаммов дрожжей видов
Sacch. vini, Sacch. oviformis, Sacch. steineri, Sacch. uvarum, уста-
новила, что для Sacch. uvarum характерна природная устойчи-
вость к низким температурам, которая не утрачивалась и при
длительном хранении этих дрожжей в коллекции [22].
Приведенные сведения о влиянии температуры на дрожжи,
однако, не могут служить основанием для установления режи-
мов пастеризации вин, эффект которой зависит от состава вина.
Микробиологические основы пастеризации вина разработаны
М. А. Мальцевой [104]. На основании определения термоустой-
чивости микроорганизмов сусла и вина ею установлено, что наи-
более термоустойчивыми являются дрожжи рода Schizosaccha-
romyces, которые отмирали только при температуре 73—75°С.
Этиловый спирт по сравнению с другими составными частями
вина (кислоты, танин, сахара) оказывает наиболее губительное
действие на микроорганизмы. Термоустойчивость микроорганиз-
мов в присутствии этилового спирта значительно снижается, по-
этому сравнительно высокое содержание его в винах (до-
20 % об.) существенно повышает эффективность пастеризации.
82 Оптимальные температуры То пастеризации вин всех типов фи-
зико-химически стойких, но инфицированных микроорганизмами,
следует рассчитывать по формуле:
7'0 = 75—1,5Q,
где 75 — температура пастеризации виноградного сусла;
1,5 — эмпирический коэффициент;
Q —содержание этилового спирта, % об.
Таким образом, пастеризация вина, содержащего 17—20% об.
этилового спирта, возможна при температуре 45—50°С, а содер-
жащего этилового спирта 13—16 и 9—14% об. — соответственно
при температуре 50—55 и 55—65°С. Л. У. Ниязбекова [125] уста-
новила более низкую температуру пастеризации сульфитирован-
ных вин и вин, лишенных кислорода. В винах, содержащих сер-
нистого ангидрида 75—100 мг/л, при температуре 45—50°С в
течение 10 мин утрачивают жизнеспособность дрожжи, уксусно-
кислые и молочнокислые бактерии.
Байо д’Эстиво [154] установил следующие температуры пас-
теризации вин в бутылках:
Температура, °C 40 43 47
Содержание этилового 10 9 8
спирта, % об.
Б. А. Филиппов и Л. Е. Высоцкая [41] описали режим, обес-
печивающий биологическую стабильность шампанских вин в бу-
тылках: нагревание в термокамерах до 38—40°С в течение 8—
10 ч, выдержка при этой температуре 2 ч, а затем медленное в
течение 7—8 ч охлаждение до 20°С.
Кислород воздуха. Кислород, введенный в сбраживаемую
среду в виде мельчайших пузырьков воздуха, стимулирует раз-
множение клеток дрожжей. Механизм такого действия воздуха
складывается из непосредственного влияния кислорода, перемен
шивания, улучшающего контакт клеток дрожжей с питательны-
ми веществами и освобождение от продуктов обмена. Кислород
необходим дрожжевым клеткам для размножения. Если кон-
центрация его в среде снижается до 1 мг на 1 л, то размноже-
ние дрожжей прекращается.
Кислород является одним из основных факторов, определяю-
щих размножение дрожжей, а брожение проходит тем быстрее,
чем больше число клеток. Рост и развитие дрожжей во время
брожения виноградного сусла (особенно выбраживание сусла с
высоким содержанием сахаров) зависят от количества кислоро-
да воздуха. Опыты по выявлению влияния кислорода воздуха
па активность дрожжей проводились на виноградном сусле, со-
держащем 21% сахаров, при температуре 25°С с небольшим за-
севом дрожжей в колбах, закрытых пробкой с капиллярной
трубкой (анаэробиоз), и колбах, закрытых ватными тампонами
(полуаэробиоз) [154]. Брожение без доступа воздуха проходило
медленно, осталось 2,5% несброженных сахаров, тогда как при
4*
83
Время, сутки
Рис. 26. Рост дрожжей во время бро-
жения виноградного сусла [154]:
в присутствии воздуха: 1 — общее количе-
ство клеток; 2 — количество живых клеток;
в отсутствие воздуха: 3 — общее количест-
во клеток; 4 — количество живых клеток.
доступе воздуха через 10 дней саха-
ра были выброжены полностью. На
рис. 26 изображены кривые роста
культур дрожжей, которые показы-
вают, что в присутствии воздуха
клетки остаются живыми до пол-
ного выбраживания, после чего они
быстро отмирают и автолизуются.
В отсутствие воздуха на 8-й день,
когда в среде было еще 5% сахаров,
живых клеток дрожжей оставалось
около 50%, количество мертвых
быстро увеличивалось, дрожжи на-
чинали автолизоваться.
Для виноделия весьма важно ус-
тановить, на каких стадиях процес-
са брожения лучше вводить кисло-
род воздуха. В табл. 18 приведены
результаты опытов, показывающие, что кислород воздуха, вве-
денный в один прием во время брожения, когда дрожжи нахо-
дятся в логарифмической фазе роста, повышает общее количест-
Таблица 18
Количество кислорода (Ог), вве- денного в среду, см3/л Количество сброженных сахаров (в %) в процессе брожения, сут Число клеток дрожжей (в млн/мл) в процессе брожения, сут
2 4 6 14 30 2 4 6 14 30
0 10,5 П о л у а 16,5 | 22,5 эробиоз ю 87 93
6 6,5 10,4 Анаэробиоз Аэрация до брожения 13,2 | 16,4 | 20,3 | 38 50 62 62 61
0,15 8,9 1 11,9 \.эраци5 19,0 на 2-< 21,3 ? сут 40 47 58 59
0,75 9,6 12,5 19,6 21,5 — 48 55 61 63
1,5 9,6 13,5 20,5 21,5 — 49 56 63 65
6,0 — 10,7 15,5 22,3 —— — 61 76 75 —’
0,75 А. 10,7 эрация 18,4 на 4-е 20,5 сут 45 53 52
1,5 - - 12,5 20,2 22,4 —— - — 49 60 60
6,0 — 13,2 20,2 22,5 — —- 51 60 63
6,0 —. — Аэрация на 8 17,3 | 20,8 -е сут 52 52
84
во дрожжей и процент сброженных сахаров [154]. Введение даже
незначительных количеств кислорода (0,15 см3 на 1 л, или око-
ло 0,2 мг) заметно влияет на скорость брожения и величину био-
массы. Однако в процессе брожения, когда содержание спирта уже
велико, размножение клеток при введении кислорода не усилива-
ется, хотя дрожжи используют его как и в начале брожения.
Поскольку растворимость кислорода в жидких средах увели-
чивается при понижении температуры, рост дрожжей не лимити-
руется содержанием его в такой степени, как в случае развития
при высокой температуре. При этом общая биомасса культуры,
выращенная при низкой температуре, часто оказывается выше,
чем биомасса, выращенная при высокой температуре, хотя ско-
рость роста в последнем случае может быть и больше. Особенно
полезна аэрация во время приготовления дрожжевой разводки.
В условиях строгого анаэробиоза дрожжи не размножаются.
Однако экспериментально было установлено, что дрожжи, раз-
множавшиеся в аэробных условиях и используемые при анаэроб-
ном засеве, могут дать 4—5 поколений, утилизируя запас окис-
ленных дыхательных ферментов.
Таким образом, при брожении без доступа воздуха существу-
ет зависимость между общим количеством клеток дрожжей и
количеством посевного материала (я) : »Х24, или пх25
[154].
В условиях избыточного давления СО2 (0,4 МПа) — сугубо
анаэробных — размножение клеток дрожжей резко замедляет-
ся. Введение в виноградное сусло кислорода воздуха 2,6—
5,2 мг/(л-ч) активизировало размножение дрожжей, что приво-
дило к увеличению количества клеток (с 30 до 90 млн./мл) и
ускорению процесса сбраживания. При этом резкой бродильной
перестройки клеток дрожжей не наблюдалось.
Введение в виноградное сусло кислорода воздуха в значи-
тельно большем количестве—17 мг/(л-ч) повышало содержа-
ние клеток дрожжей до 174 млн./мл и соответственно ускоряло
процесс брожения. При этом в вине увеличивалось содержание
ацетальдегида, высших спиртов, летучих кислот, ацетоина, диа-
цетила, т. е. веществ, ухудшающих качество продукта.
Этиловый спирт. Концентрация этилового спирта, образуе-
мого дрожжами в процессе брожения, при последовательном
введении в сбраживаемый субстрат 50%-ного раствора сахаров
может достигать 19% об.
При повышении концентрации этилового спирта в сбраживае-
мом сусле развитие дрожжей замедляется, особенно при повы-
шении температуры. Влияние этилового спирта на выживаемость
дрожжей при повышенной температуре (50°С) показано в
табл. 19(223].
Таким образом, при содержании в виноградном вине этило-
вого спирта 9% об. и выше обработка вин в течение 5 мин при
температуре 50°С практически достаточна для их обеспложива-
85
Таблица 19
Продолжительность обработки вина при температуре 50°С, мин Количество жизнеспособных клетой дрожжей (в %) при содержании этанола в среде, % об.
0 3 6 9 12 15
1 15,0 1.5 0,28 0,20 0,009 0,05
2 5,3 0,28 0,30 0,03 0 0
3 1,0 0,20 0,18 0,03 0 0
4 0,25 0,28 0,09 0,02 0 0
5 0,22 0,04 0,02 0,002 0 0
ния. Другие спирты также оказывают угнетающее действие на
дрожжи.
Сахара. Содержание в виноградном сусле сахаров в количе-
стве до 20% не задерживает брожение [154]. Высокие концентра-
ции сахаров могут остановить брожение, при этом дополняющим
ингибитором является этиловый спирт. Влияние концентрации
сахаров в среде на количество образовавшегося спирта харак-
теризуется следующими данными:
Концентрация сахаров, % 37 42 47 55 75
Количество образованию- 8,6 6,3 5,9 3,4 0
гося спирта, % об.
Угнетение брожения при высокой концентрации сахара свя-
зано с тем, что дрожжи не могут преодолеть осмотическое дав-
ление сахарсодержащей жидкости.
Для нормального функционирования клетки дрожжей долж-
ны находиться в растворе с осмотическим давлением меньшим,
чем давление содержимого вакуоли. В 25%-ном растворе саха-
розы дрожжи, вызывая брожение, преодолевают противодавле-
ние 2,3 МПа, а в 25%-ном растворе глюкозы — 5,8 МПа [223].
Дрожжи рода Zygosaccharomyces развиваются в субстратах,
содержащих 50—60% сахаров, преодолевая осмотическое давле-
ние 12—25 МПа. Чаще всего бродильная способность таких
дрожжей невелика.
Предельные значения осмотического давления для роста и
сбраживания сахаров различными видами дрожжей рода
Saccharomyces неодинаковы. В растворе фруктозы осмотическое
давление для сбраживания осмотолерантных видов составляет
от 62 (Sacch. mellis и Sacch. geterogenicus) до 23 МПа (Sacch.
rose!); неосмотолерантных — от 16 (Sacch. cerevisiae) до 12 МПа
(Sacch. carlsbergensis).
Кислотность среды. Кислотность виноградного сусла может
колебаться в пределах pH 2,8—3,8. Вид дрожжей Sacch. vini в
целом приспособлен к нормальному развитию при pH 3,5. По
сравнению с видами дрожжей Sacch. carlsbergensis и Sacch. ce-
revisiae вид Sacch. vini'характеризуется более высокой кислото-
86 выносливостью. На повышенную кислотность среды дрожжи реа-
гируют изменением морфологического вида: клетки мельчают,
приобретают круглую форму, в протоплазме накапливается жир
[126].
Фенольные вещества. Влияние полифенолов на рост дрожжей
исследовано очень мало. Однако замечено, что виды дрожжей
рода Saccharomyces относительно устойчивее к полифенолам,
чем дрожжи родов Pichia, Hanseniaspora, Kloeckera [223]. И тем
не менее на поверхности красных вин, содержащих до 0,3% та-
нина, растут пленчатые дрожжи. Хорошо известно также, что
клетки дрожжей при сбраживании красных вин адсорбируют
антоцианы и зависит это от вида дрожжей. Антоцианы влияют
на развитие винных дрожжей и молочнокислых бактерий, раз-
вивающихся в вине. При высоком содержании спирта (11% об.)
все фенолкарбоновые кислоты угнетают процесс брожения и вы-
зывают дегенерацию дрожжевых клеток. Более сильное ингиби-
рующее действие на дрожжевые клетки оказывал пеонидин по
сравнению с мальвидином, дельфинидином и петунидином. Гал-
ловая кислота и танин ингибируют развитие культур только в
больших концентрациях (800 мг/л и выше) [31].
Углекислый газ (СО2). При атмосферном давлении СО2 поч-
ти не оказывает ингибирующего влияния на рост дрожжей и
брожение. При удалении СО2 из бродящей среды азотом или
воздухом процесс брожения не ускорялся. Если СО2 по мере его
образования выкачивать вакуумным насосом, то брожение не-
значительно усиливается.
Влияние углекислого газа на размножение и бродильную
способность дрожжей изучалось И. Я. Веселовым и его ученика-
ми с использованием радиоактивных веществ, меченых по угле-
роду. Установлено, что размножение дрожжей Sacch. carlsber-
gensis, обладающих высокой активностью брожения, незначи-
тельно снижалось в анаэробных условиях, создаваемых углекис-
лотой. При введении в среду СО2 размеры клеток пивных дрож-
жей увеличиваются и, наоборот, клетки дрожжей слабо бродя-
щих становятся значительно мельче. Бродильная способность
пивных дрожжей при наличии в атмосфере СО2 повышалась в 3—
4 раза. При выращивании дрожжей в присутствии С14О2 радио-
активный углерод обнаружен в белках, ДНК, РНК и углеводах,
т. е. СО2 участвует в построении основных структур компонен-
тов клеточного вещества, причем размножающимися клетками
дрожжей СО2 используется в 10 раз больше, чем неразмножаю-
щимися [35, 156].
При избыточном давлении СО2 клетки винных дрожжей зна-
чительно увеличиваются и приобретают более округлую форму.
Углекислый газ как естественный метаболит при определен-
ных концентрациях тормозит или даже подавляет размножение
дрожжей. Свойство углекислого газа задерживать брожение
используется в ряде технологических процессов: при хранении
фруктово-ягодных соков, при изготовлении белых вин в атмос-
87
фере С02 [319], красных с углекислотным настаиванием, нату-
ральных полусладких игристых — брожением при избыточном
давлении СО2 в специальных резервуарах [28].
Количество растворенного в среде СО2 влияет на развитие
дрожжей. На этом основан метод Бёхи хранения виноградных
соков в танках под давлением СО2. В 1 л сока должно быть рас-
творено 15 г углекислого газа. Для того чтобы растворить такое
количество газа в 1 л сока, надо применить давление 0,72 МПа
при температуре 15°С. Основными условиями хранения фрук-
тово-ягодных соков являются по возможности минимальное со-
держание в них микроорганизмов и низкая температура соков
в танках (0—2°С).
Давление. При выращивании хлебопекарных дрожжей с
аэрацией под давлением 0,2 МПа усвояемость кислорода воздуха
увеличивается в 5—6 раз по сравнению с усвояемостью его при
обычном способе барботирования.
Гидростатическое давление 40 МПа влияло на активность ка-
талазы. У пекарских и пивных дрожжей активность каталазы
возрастала на 11,8—27,3% пропорционально увеличению давле-
ния. Но наиболее резкий сдвиг был отмечен при увеличении дав-
ления до 20 МПа.
Избыточное давление СО2 задерживает размножение дрож-
жей. В связи с тем что, насыщая среду СО2, можно регулировать
температуру брожения, способ брожения под давлением СО2
(давление в танках достигает от 0,8 до 1,2 МПа) нашел приме-
нение в Австралии, Северной Африке, Швейцарии и других стра-
нах [194]. Для получения натуральных полусладких игристых
вин из сусла нами разработана автоматическая линия, преду-
сматривающая брожение в потоке под давлением СО2, обработ-
ку холодом и розлив вина в бутылки [28].
Высушивание. Дрожжи, как и многие другие микроорганиз-
мы, способны долго сохраняться после высушивания, хотя рас-
ти в этих условиях они не могут, т. е. находятся в состоянии
анабиоза, или состоянии «скрытой жизни». Это состояние дости-
гается путем обезвоживания высушиванием или замораживани-
ем и высушиванием в вакууме. Например, хлебопекарные дрож-
жи сушат на специальных сушилках до содержания влаги не
более 11—12%.
Высушивание дрожжей в условиях высокого вакуума, когда
процессы обмена почти полностью прекращаются, имеет очень
большое практическое значение. Высушивание из замороженно-
го состояния — метод сублимационной сушки — применяют для
длительного хранения культур. Быстрое, в течение 1—10 с, замо-
раживание дрожжей при температуре —30 и —70°С с образо-
ванием некристаллической массы льда и последующее высуши-
вание в условиях высокого вакуума превращает культуру в
гигроскопический (лиофильный) порошок. В процессе обезвожи-
88 вания клеток могут наступить структурные и молекулярные из-
менения, поэтому для сохранения наибольшего количества жиз-
неспособных клеток необходимо использовать щадящий режим
высушивания. Лиофильно-высушенные коллекционные культуры
дрожжей, хранившиеся в запаянных ампулах в течение 15 лет,
несмотря на небольшой процент выживших клеток (1,0—0,1%),
через 2 пассажа на виноградное сусло обладали высокой бро-
дильной активностью.
Лучистая энергия. Ионизирующие излучения вызывают иони-
зацию среды, в результате чего клетки микроорганизмов гиб-
нут. Нами установлено, что дрожжи в полусладком вине поги-
бали при экспозиционной дозе рентгеновского облучения
160000 Р, а молочнокислые бактерии оставались живыми при
облучении даже дозой 1 млн. Р. Вкусовые свойства вина начи-
нали ухудшаться уже при облучении его дозой 50 000 Р [40].
О том, что вкус напитков при обработке их ионизирующими лу-
чами ухудшается, имеются наблюдения и других исследовате-
лей [154].
Ультразвуковые волны применяют для интенсификации тех-
нологических процессов и для стерилизации, поскольку они раз-
рушают клетки при длительном воздействии. Но при обработке
вина ультразвуком всегда остается небольшой процент непо-
врежденных клеток, способных размножаться. Однако Б. П. Ава-
кяном разработана технология стерилизации вина холодным
способом, основой которой является совместное действие ульт-
рафиолетовых лучей и ультразвуковых волн. При этом обработка
вин в тонком слое изменяла химический состав незначитель-
но [3].
В некоторых исследованиях отмечалось стимулирование гли-
колитических процессов в дрожжах при длительном облучении
ультрафиолетовыми лучами малой интенсивности.
Монохроматическое красное излучение (лазерный, монохро-
матический красный свет) стимулирует биохимические реакции
в растениях. Предпосевное освещение инокулята интенсифици-
рует процессы жизнедеятельности микроорганизмов, например
биосинтез белка, витаминов, ускоряет отдельные стадии цикла
развития при посеве в питательную среду. При облучении дрож-
жей Schizosaccharomyces pombe, как и других микроорганиз-
мов, обнаружен стабильный эффект повышения выхода белко-
вых продуктов (до 75%), увеличение скорости размножения в
1,7 раза, сокращение продолжительности лаг-фазы почти в 2 ра-
за, усиление биосинтеза рибофлавина (до 130%).
Видимый свет угнетает дыхание и брожение дрожжей, при
этом в большей степени дыхание.
Магнитное поле. Магнитное поле может интенсифицировать
энергию размножения и бродильную способность винных дрож-
жей. Однако эффект зависит от вида и напряженности магнит-
ного поля (постоянного или пульсирующего) и продолжитель-
ности обработки [42].
89
Антисептики. Сернистый ангидрид (SO2). Окисли-
тельно-восстановительный потенциал вина при действии SO2 по-
нижается, так как SO2 обладает восстановительными свойства-
ми, является активным антиоксидантом, парализуя оксидазы, в
том числе и полифенолоксидазу. Сернистый ангидрид считается
пока что лучшим антисептиком в виноделии. В растворах, сус-
ле и винах он может находиться в виде недиссоциированной
кислоты (H2SO3) и ее ионной формы (HSO3 и SO3), условно на-
зываемых свободная сернистая кислота, и в соединении с неко-
торыми важными компонентами (альдегидами, сахарами, крася-
щими веществами, белками, серусодержащими аминокислотами,
кетокислотами) — связанная сернистая кислота [124].
Скорость связывания веществ вина с сернистой кислотой за-
висит от температуры, pH среды и расы дрожжей. Только сво-
бодные формы сернистой кислоты, главным образом недиссоции-
рованная H2SO3, являются биологически активными, обладают
антисептическим действием. Количество свободной сернистой
кислоты колеблется от 1% (при pH 3,8) до 10% (при pH 2,8).
Антисептическое действие определенного количества сернистой
кислоты при прочих равных условиях в очень кислом сусле или
в вине примерно в 10 раз сильнее, чем в соке (или вине) слабо-
кислом. Поэтому при отстаивании сусла необходимо вносить
такое количество сернистого ангидрида, чтобы к моменту вне-
сения чистой культуры дрожжей в сусле было не менее 30 мг/л
свободной сернистой кислоты и не более 200 мг/л общего содер-
жания сернистой кислоты. В мезгу красного винограда при
открытом способе брожения следует вводить больше сернистого
ангидрида, в пределах 250—300 мг/л. При установлении режи-
мов сульфитации необходимо учитывать и то, что после оконча-
ния брожения в вине содержится сернистой кислоты только 40—
60% от начального общего количества ее, так как дрожжи вос-
станавливают сернистую кислоту и ее соли (сульфаты) в элемен-
тарную серу. В клетках сера растворяется в липоидах и отлага-
ется в цитоплазме или восстанавливается в H2S, большая часть
которого выделяется с углекислым газом.
Чтобы предотвратить развитие дрожжей в вине, содержание
свободной сернистой кислоты в нем должно быть довольно вы-
соким — 200—300 мг/л. Пленчатые дрожжи весьма устойчивы к
сернистой кислоте. Наибольшей устойчивостью к SO2 обладают
клетки дрожжей в стадии размножения и брожения и наимень-
шей— в стадии голодания и покоя. Высокосульфитированное
сусло (200—250 мг/л SO2) медленно забраживает, но все же
полностью выбраживает. К концу процесса брожения оно содер-
жит только 40—60% начального количества сернистого ангид-
рида.
Дрожжи при восстановлении сульфатов в процессе брожения
образуют небольшие количества сернистого ангидрида. Некото-
90 рые расы дрожжей образуют SO2 за счет а-цистеина или восста-
новленного глутатиона. Выделены 5О2-образующие расы дрож-
жей, которые при сбраживании свежего сусла могут накапливать
SO2 до 50 мг/л. Отмечается, что в молодом вине значительно
больше SO2 образуют расы дрожжей Sacch. bayanus, чем расы
Sacch. cerevisiae. Заметное влияние на этот процесс оказывает
большое количество сульфатов в исходном сусле [285]. На осно-
вании изучения 123 рас дрожжей различного происхождения
А. Дюфо и К. Майер [247] отвергают возможность повышения
SO2 в винах за счет образования его дрожжами. Только 2% дрож-
жей заметно повышало количество SO2 в процессе брожения
(>50 мг/л). В основном дрожжи (78% рас) могут незначитель-
но увеличивать в сусле количество SO2 — до 1 —10 мг/л, или да-
же «потреблять» его.
Изотиоцианат аллила является основным компонен-
том аллилгорчичного масла и содержится в нем в количестве
94—99%. Это фитонцид горчицы с высокой антимикробной ак-
тивностью [205]. Он не затрагивает функцию брожения клетки,
но энергию дыхания значительно ослабляет [154]. Рекомендова-
ны оптимальные дозы аллилгорчичного масла для обеспечения
стойкости вин: для столовых сухих вин — 0,9 мг/л при содержа-
нии в них 20 мг/л свободного и не более 200 мг/л общего сер-
нистого ангидрида; для столовых полусладких вин—1,2 мг/л
при содержании 30 мг/л свободного и не более 300 мг/л общего
сернистого ангидрида. Синтетическое аллилгорчичное масло об-
ладает такими же антисептическими свойствами. Однако при
неправильном хранении аллилгорчичного масла и передозиров-
ке в винах может появиться чесночный тон [111а].
Природные и синтетические изотиоцианаты обладают специ-
фическим спектром биологического действия, особенно высокая
у них антигрибная активность [164].
Сорбиновая кислота в сочетании с сернистым ангид-
ридом (40 и 60 мг/л) рекомендуется для обеспечения биологиче-
ской стабильности вин. Однако в разрешенной дозе (200 мг/л),
не влияющей на вкус вина, она не действует на бактерии. Вина,
разлитые в бутылки, часто мутнеют от размножения в них мо-
лочнокислых бактерий. Вина приобретают неприятный герание-
вый тон. Уксуснокислые бактерии могут использовать сорбит в
качестве единственного источника углерода.
ПИРЭФ (диэтиловый эфир пироугольной кислоты, ДПК, бай-
ковин) был предложен как консервант для вин при розливе их
в бутылки. Он нестоек и быстро разлагается на спирт и угольную
кислоту. Теперь использование ПИРЭФ запрещено, поскольку
он вызывает образование уретана в белом вине и пиве.
5-Н и т р о ф у р и л а к р и л о в а я кислота (5-НФА) обла-
дает антимикробным действием. Группа NO2 взаимодействует
с энзиматическими системами микробов, происходит необрати-
мое окисление ферментов, рост и размножение микроорганизмов
подавляются [212]. 5-НФА рекомендуется применять в столовых
91
сухих винах и винах, содержащих сахар, в дозе 5—10 мг/л для
предотвращения размножения в них дрожжей и бактерий [33,
271].
Серебро (металлическое ионизированное или коллоидаль-
ное) задерживает процесс брожения, обладая фунгицидным
свойством. Относится к группе токсичных веществ [94].
Серебряная вода обладает бактерицидным действием на па-
тогенные штаммы кишечной палочки. Бактерицидный эффект
малых доз в воде может быть значительно повышен ультра-
звуком.
Озон получается при пропускании тока кислорода через ге-
нератор, в котором кислород подвергается действию электриче-
ского разряда. Во французском виноделии озоном стерилизуют
пустые баллоны. Обсуждается возможность использования озо-
на в качестве эффективного бактерицидного средства [282].
СЕЛЕКЦИЯ ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ ВИНОДЕЛИЯ
Адаптация. Выращивая дрожжи при постепенно изменяю-
щихся условиях культивирования, можно получить новые фор-
мы их, приспособленные к высоким концентрациям сернистой
кислоты, сахаров, этанола, кислой реакции среды, к высоким
или низким температурам и т. п.
Показательным примером выведения новых форм дрожжей
в процессе адаптации может быть работа, проведенная Н. Ф. Са-
енко по получению спиртоустойчивых дрожжей для хересного
производства [178].
Н. Ф. Саенко разработаны методы селекции хересных дрож-
жей на спиртоустойчивость, основанные на адаптации в процес-
се непрерывного культивирования их в периодически обновляе-
мой среде, в которой постепенно повышалась концентрация спир-
та, и при последовательных пересевах на вино с постепенно
повышающейся концентрацией спирта от 14 до 17% об. Получе-
Таблица 20
Культура Образование сплошной пленки на вине, сут Содержание иа 30-й день опыта в вине с 15,5 % об. спирта, мг/л
с 15,5 % об. спирта с 17,0 % об. спирта ацетальде- гида ацеталя
Херес 20-С, исходная культура На 7-е Роста нет 48,0 17,5
Херес 20-С/п, адаптиро- ванная путем последо- вательных пересевов На 5-е На 9-е 217,98 26,0
92 Херес 20-С/96К, адапти- рованная в сменной сре- де На 3-и На 3-и 322,38 35,0
ны спиртоустойчивые расы Херес 20-С/96К, Херес 20-С/96-5 и дру-
гие, которые образуют сплошной рост на вине на третьи сутки.
По данным, приведенным в табл. 20, можно судить также об
усилении биохимической активности полученных рас хересных
дрожжей — при поверхностном развитии накопление в вине аце-
тальдегида и ацеталя — компонентов, обусловливающих специ-
фический хересный тон в вине.
При адаптации дрожжей, применяемых для изготовления
плодово-ягодных вин, к повышенной концентрации сахара полу-
чена раса Вишневая 33, которая быстро и полно сбраживала
яблочное сусло с содержанием сахара 28%. При этом количест-
во образовавшегося спирта составляло 16,8% об. [178].
Культивированием при постепенно повышающейся темпера-
туре получен наиболее термостойкий вариант дрожжей расы
Ркацители 6. Он отличается от исходной расы более полным вы-
браживанием сахара и высокой жизнеспособностью клеток при
температуре 37—38°С [10].
В результате длительной адаптации нескольких рас винных
дрожжей к температуре 38°С нами получены термотолерант-
ные формы, которые по сравнению с исходными культурами
больше синтезируют витаминов (пантотеновой кислоты, пиридок-
сина), обладают более высокой энергией брожения и резко сни-
женной энергией дыхания. Однако методом адаптации не удает-
ся быстро усиливать определенные полезные свойства у дрож-
жей.
Индуцированный мутагенез. Селекция с применением разно-
образных мутагенов является методом, наиболее интенсивно ис-
пользуемым в работах по повышению продуктивности полезных
форм микроорганизмов. Под мутацией понимается стойкое изме-
нение генетически значимых структур, функция которых вос-
произведение типичной организации клетки из поколения в по-
коление. Мутации делят на два вида:
цитоплазматические — наследственные изменения, возникаю-
щие в цитоплазме и передаваемые с цитоплазмой,
ядерные — наследственные изменения, возникающие в ядре
и передаваемые с ядром.
При искусственном получении мутаций главная роль при-
надлежит методам радиационного и химического мутагенеза при
использовании УФ-лучей, рентгеновских лучей и нейтронов, азо-
тистой формы иприта, этиленимина и диэтилсульфата и др. Об
эффективности индуцированного мутагенеза судят по частоте
возникновения активных вариантов, достоверно превышающих
по активности крайние варианты контрольного ряда, а оконча-
тельная проверка осуществляется в производственных услови-
ях [43].
Селекция винных дрожжей с применением мутагенов —
ультрафиолетовых лучей и паров диэтилсульфата (ДЭС) — про-
ведена С. И. Алиханяном и Г. М. Налбандяном [12, 13]. Новые
93
формы дрожжей характеризуются высокой спиртонакапливаю-
щей способностью. Они рекомендованы для сбраживания вино-
градных соков с высоким содержанием сахара при изготовле-
нии натуральных крепких столовых вин, устойчивых к помутне-
ниям биологического характера. При проведении опытов спир-
тоустойчивые штаммы Sacch. oviformis на поверхности вина с
содержанием спирта 17,5% об. быстро образовывали пленку, в
течение 30 дней ферментации накапливали от 700 до 800 мг/л
альдегидов. Ни в одном случае в контрольных образцах, засе-
янных исходным штаммом Sacch. oviformis Херес 96К, клетки
не размножались.
Получены мутантные формы дрожжей, образующие зернис-
тые, подвижные осадки. Однако эти штаммы не нашли широко-
го применения в винодельческой промышленности.
Гибридизация, Применение гибридизации в селекции основа-
но на возможности объединения полезных признаков скрещивае-
мых штаммов и на получении гибридов, обладающих гетерози-
сом (более мощным ростом и размножением, чем исходные ро-
дительские формы) по одному или нескольким признакам.
Наименее разработана гибридизация полезных форм микроор-
ганизмов, вследствие чего практический эффект ее в селекции бо-
лее продуктивных форм невелик.
Гибридизация дрожжей основана на способности спор или
гаплоидных клеток копулировать между собой. В результате
копуляции и слияния ядер образовавшаяся зигота при размно-
жении вегетативным путем дает гибридные диплоидные клетки.
В практической работе по гибридизации дрожжей пользуются
скрещиванием как спор, так и гаплоидных клеток.
Искусственная гибридизация гетероталличных дрожжей на
уровне аскоспор была проведена впервые О. Винге и О. Лауст-
зеном в 1938 г. Они соединяли аскоспоры дрожжей одного или
различных видов попарно в каплях питательной среды при по-
мощи микроманипулятора. В нашей стране такой метод гибри-
дизации впервые был применен К. В. Косиковым [83, 84].
Другой метод гибридизации гетероталличных дрожжей был
предложен в 1943 г. К- Линдегреном и Г. Линдегрен. Он осно-
ван на смешивании устойчивых гаплоидных культур, получен-
ных из одиночных спор, с последующей изоляцией зигот при по-
мощи микроманипулятора. При размножении такие зиготы об'
разуют диплоидные гибридные культуры.
Что касается третьего способа гибридизации гомоталличных
штаммов [64], то в этом случае гаплоидные споры, изолирован-
ные из аска, образуют диплоидную культуру, т. е. в потомстве
отдельной споры происходит слияние гаплоидных клеток.
При помощи микроманипулятора путем скрещивания спирто-
вых рас Sacch. cerevisiae (расы Я) с Sacch. carlsbergensis
К. В. Косиковым и О. Раевской [43, 84] получены для спиртового
94 производства гибриды, сбраживающие полностью рафинозу.
Весьма интересными являются опыты по скрещиванию форм,
относящихся к разным семействам: Sacch. cerevisiae и Schiz.
pombe.
Полученный гибрид обладал морфологическими и физиоло-
гическими особенностями.
Таким же методом с использованием микроманипулятора
Г. И. Мосиашвили и И. Д. Шалуташвили получили гибриды
дрожжей для виноделия [120]. Было проведено скрещивание рас
различных видов рода Saccharomyces (Sacch. vini раса Каху-
ри 42, Sacch. chodati раса ГИВ-51, Sacch. uvarum раса С-61) с
расой Sacch. paradoxus, обладающей высокой пектолитической
активностью.
Новые формы дрожжей наряду с высокой энергией брожения
обладали пектолитической активностью, что позволяло получать
вина лучшего качества. Основные показатели гибридных куль-
тур приведены в табл. 21.
Селекцию дрожжей для виноделия на основе получения гиб-
ридов ведут ученые Франции [259], Италии [336], США [250],
ФРГ [330]. Получены мутантные формы, не образующие пену и
отличающиеся от исходных дрожжей электрофоретической под-
вижностью. Однако условия брожения также могут влиять на
этот признак, поскольку пенообразование обусловлено выделе-
нием дрожжами белков и полисахаридов [250].
Гаплоидные и диплоидные штаммы дрожжей, несмотря на
одинаковую биомассу, различались по спиртообразующей спо-
собности, причем больше спирта давали диплоидные штаммы
[330].
Гибридизацию можно применять для получения полиплоид-
ного эффекта. Существование у дрожжей копуляции гаплоид-
ных клеток и клеток более высокой плоидности позволяет после-
довательно вводить гаплоидные геномы в клетку, постепенно по-
вышая таким образом плоидность.
Таблица 21
Культуры Количество образовавше- гося спирта, % об. Содержание в вине, г/л
титруемых кислот летучих кислот глицерина
Sacch. vini 10,4 6,5 0,62 10,5
Sacch. chodati 10,5 6,2 0,65 2,8
Sacch. uvarum 10,4 6,5 0,60 8,0
Sacch. paradoxus 8,4 5,1 0,59 3,2
Sacch. vinixSacch. para- 10,8 6,2 0,58 9,2
doxus Sacch. chodatiXSacch. pa- 10,8 6,5 0,65 9,0
radoxus Sacch. uvarumXSacch. paradoxus 10,6 6,2 0,70 9,7
95
Так можно получить полипло-
Рис. 27. Культуры дрожжей (Х1200)
[141]:
а — диплоидная; б — триплоидная.
идные серии от гаплоида до гекса-
плоида, которые остаются стабиль-
ными в отношении их плоидности
при вегетативном размножении [64].
Методические трудности обнару-
жения у дрожжей хромосом вследст-
вие относительно малых их разме-
ров привели к тому, что полиплоид-
ность у дрожжей преимущественно
определяется косвенными метода-
ми: морфологическим (объем клеток
и ядер); биохимическим (количество
ДНК, РНК и других химических
компонентов в клетке); генетиче-
ским (частота летальных мутаций,,
индуцированных радиацией, анализ
расщепления по маркерам) [107].
Спонтанная полиплоидизация у
сахаромицетов может возникать не
только в результате эндомитоза, но
и путем прямой копуляции диплоид-
ных клеток и конъюгации материн-
ской клетки с одной или нескольки-
ми почками. Более того, высказыва-
ется мнение, что все культурные
дрожжи и наиболее близкие к ним
дикие формы практически полиплоидны, при этом чаще всего-
встречаются триплоиды. Так, выделен из производства штамм
винных дрожжей (RS-6), обладающий высокими производст-
венными показателями. Генетический анализ показал, что штамм
является триплоидом [107]. Установлена триплоидная природа
хлебопекарной расы 14-2 (рис. 27) [141].
Существование высокопродуктивного триплоида среди про-
изводственных штаммов подтверждает перспективность экспе-
риментального получения и использования полиплоидных форм
дрожжей в практической селекции. У дрожжей рода Saccharomy-
ces (Sacch. cerevisiae, Sacch. vini и Sacch. oviformis) полиплоид-
ные формы получены действием камфоры, а-нафтиламина, аце-
нафтена и хризина, колхицина, УФ-облучения с последующей
гибридизацией, а также посредством межвидовой и внутривидо-
вой гибридизации. Межвидовые и внутривидовые тетраплоидные
гибриды, созданные А. Ф. Руснак [170] на основе ауксотрофных
мутантов рас винных дрожжей Ленинградская (Sacch. ovifor-
mis) и С-28 (Sacch. vini), отличаются от исходных форм. Пред-
ставленные данные свидетельствуют о большей скорости броже-
ния (на 30% и выше) у тетраплоидной культуры по сравнению-
96 с диплоидной.
Полиплоидные расы дрожжей, имеющие клетки большего
объема, быстрее оседают, их можно легче и полнее отфильтро-
вывать. В то же время крупные клетки легче разрушаются при
механических воздействиях при помощи дезинтеграторов, что
особенно важно для получения практически ценных эндофермен-
тов, не накапливающихся в культуральной жидкости, или выде-
ления других физиологически активных веществ, содержащихся
в самой клетке [43, 82, 190]. Однако широкого практического
применения полиплоидные формы дрожжей пока не получили.
Это обусловлено тем, что биохимические свойства полиплоидных
форм дрожжей и методы их экспериментального получения мало
изучены.
Производственный метод селекции дрожжей. Основой этого
метода является повторное выделение в производственных усло-
виях ряда культур, сравнение их и отбор лучшей для дальней-
шего применения. Этот метод предложен В. И. Кудрявцевым
[90, 91] и основан на изменениях культур дрожжей, возникаю-
щих в результате влияния условий производства. Область его
применения суживается, поскольку выделение культуры в про-
изводстве, где условия нестерильны, может приводить не толь-
ко к усилению, но и к ослаблению ее или к вытеснению спонтан-
ной флорой. По этой причине селекция в производстве не нашла
отражения в условиях приготовления виноматериалов. В шам-
панском производстве бутылочным методом, где действие посто-
ронней микрофлоры минимально, В. И. Кудрявцев и Р. Д. Зуб-
кова [91] выделили новые расы дрожжей, которые по производ-
ственным показателям значительно превосходят исходные.
Однако при обследовании заводов шампанских вин акратофор-
ного производства [204] установлено, что производственный ме-
тод селекции дрожжей привел к вытеснению дрожжей вида
Sacch. vini дрожжами Sacch. oviformis, которые оказались бо-
лее приспособленными к жизнедеятельности в вине.
На Горьковском заводе шампанских вин был получен произ-
водственный штамм расы Штейнберг 1892 г. — Штейнберг Горь-
ковский. Позднее на Ленинградском заводе шампанских вин из
штамма Штейнберг Горьковский была отселекционирована но-
вая производственная раса Ленинградская [174].
Н. Ф. Саенко отмечала, что все полученные производственные
штаммы хорошо бродят при температуре 11 — 12°С и при pH 2,8—
3,0, но все они потеряли зернистую структуру осадка исходной
расы Штейнберг 1892 г.
Однако проведенное нами определение систематического по-
ложения дрожжей расы Ленинградская, применявшейся на за-
водах с резервуарным методом шампанизации, показало, что она
принадлежит к виду Sacch. oviformis, а не к Sacch. vini, к кото-
рому относится Штейнберг 1892 г. [204]. Определение скорости
размножения клеток дрожжей рас Штейнберг 1892 г. и Ленин-
градская на вине с содержанием этилового спирта 11,15% об. и 97
ё 2,0
А
Время,сутки
Рис. 28. Интенсивность брожения ви-
на при использовании дрожжей раз-
личных видов:
1 — Sacch. oviformis раса Ленинградская;
2 — Sacch. vini раса Штейнберг 1892 г.
глюкозы 8,15% показало, что дрож-
жи расы Ленинградская размножа-
ются быстрее. Количество клеток
дрожжей было через 24 ч у расы
Штейнберг 5,7 млн./мл, а у расы Ле-
нинградской—11,9 млн./мл. Из
рис. 28 видно, что при применении
дрожжей расы Ленинградская вино
забраживает раньше, чем при ис-
пользовании дрожжей расы Штейн-
берг 1892 г.
На Киевском заводе шампанских
вин производственная селекция поз-
волила отобрать расу Киевская вида
Sacch. oviformis, хотя применявшая-
ся там культура дрожжей Ркаците-
ли 6 принадлежит к виду Sacch. vini
[204].
Анализ дрожжевых осадков из
лучших по результатам брожения
вин в акратофорах Харьковского,
Ростовского и Алма-Атинского за-
водов шампанских вин, проведенный
нами в 1964 г. путем их рассева на
плотную питательную среду, выделения отдельных колоний и оп-
ределения их систематического положения, показал, что на этих
заводах также используются дрожжи вида Sacch. oviformis.
Таким образом, производственный метод селекции позволил
отобрать дрожжи, более приспособленные к условиям шампан-
ского производства. Такими культурами оказались дрожжи вида
Sacch. oviformis, попавшие в акратофоры вместе с шампанизи-
руемым нестерильным виноматериалом, а не производственные
штаммы рас Штейнберг 1892 г. и Ркацители 6 вида Sacch. vini.
Более поздние исследования микрофлоры большинства за-
водов шампанских вин показали, что процесс шампанизации и
в настоящее время осуществляется дрожжами вида Sacch. ovi-
formis (по систематике Лоддер — Sacch. bayanus) [55]. В произ-
водственной дрожжевой разводке в качестве сопутствующих
дрожжей выявлены дрожжи Sacch. vini, а также родов Candida,
Pichia и иногда Brettanomyces. Основным источником инфициро-
вания чистой культуры дрожжей в производственных условиях
являются шампанские виноматериалы и приготовляемая из них
бродильная смесь, которую используют в качестве питательной
среды для размножения дрожжей [55].
* *
*
Таким образом, производство вин связано с жизнедеятельно-
98 стью дрожжей. Брожение виноградного сусла, шампанизация и
хересование вин происходят в результате сложных биохимиче-
ских реакций, осуществляемых дрожжевыми клетками. В зави-
симости от физиолого-биохимических особенностей дрожжей и
технологических приемов, создающих разные условия для их
жизнедеятельности (состав среды, температура, режим аэрации),
образуются разнообразные продукты обмена веществ дрожжей,
которые определяют тип получаемого вина, оказывают влияние
не только на вкусовые и ароматические свойства, но и на форми-
рование вин в процессе выдержки и хранения.
На основании оценки видов и рас дрожжей рода Saccharomy-
ces и других родов дрожжей, встречающихся в виноделии, оп-
ределения оптимальных условий развития их и биосинтеза тех
или иных продуктов метаболизма с целью более эффективного
использования технологических возможностей дрожжей для по-
вышения качества вин предлагаются следующие рекомендации.
1. Определение возбудителей брожения. Микроскопирование
позволяет определить физиологическое состояние дрожжей и
идентифицировать некоторые дрожжи по способу их размноже-
ния, по величине и форме клеток и спор. Однако такая характе-
ристика недостаточна для определения состава дрожжей, участ-
вующих в брожении, и оценки возможного влияния их на каче-
ство продукции на разных этапах виноделия. Поэтому для опре-
деления возбудителей брожения необходимо уметь определять
род и вид дрожжей, пользуясь их систематикой.
2. Контроль условий развития дрожжей. Необходимо следить
за размножением дрожжей, изменением их физиологического со-
стояния, а также за скоростью брожения. Весьма опасной явля-
ется преждевременная остановка брожения вследствие массово-
го отмирания дрожжей. Возобновить размножение дрожжей и
завершить сбраживание сахаров в таких случаях очень трудно.
Для дображивания рекомендуются расы дрожжей вида Sacch.
oviformis.
3. Регулирование режимов технологического процесса для
предотвращения развития вредных микроорганизмов. После
окончания брожения молодые виноматериалы, находящиеся на
осадках дрожжей, самоосветляются. Степень осветления реко-
мендуется проверять микроскопированием их после центрифуги-
рования, при этом обращают внимание на физиологическое со-
стояние дрожжевых клеток (процент мертвых, ход автолиза) и
наличие посторонней микрофлоры.
По окончании спиртового брожения, если не приняты соот-
ветствующие меры (быстрое снятие виноматериалов с дрожже-
вого осадка и повышенная сульфитация), в вине обычно разви-
ваются молочнокислые бактерии. Внешним признаком наличия
молочнокислых бактерий в молодом вине служит образование
легкого осадка, слабое выделение углекислоты. При микроско-
пировании в нем обнаруживаются палочки или кокки. Если в
виноматериалах необходимо понизить кислотность, то следят за 99
развитием бактерий. После использования ими яблочной кисло-
ты виноматериалы обрабатывают, чтобы освободить их от бак-
терий, и сульфитируют.
Виноматериалы, находящиеся на хранении, следует микро-
скопировать не реже одного раза в месяц.
Микробиологическое состояние вина проверяют также на дру-
гих стадиях технологического процесса: при переливках, оклей-
ках, доливках, фильтрации путем микроскопирования после
центрифугирования.
4. Определение веществ, усиливающих и угнетающих разви-
тие дрожжей. Помимо необходимых витаминов стимулировать
развитие дрожжей могут и другие вещества. Например, пирови-
ноградная кислота (по 60 мг/л) и уксусный альдегид (по 14 мг/л),
вводимые перед началом брожения, активируют размножение
дрожжей; экстракты дрожжей (специально гидролизованные)
также положительно влияют на рост дрожжей, активируют бро-
жение. Однако продукты эти еще мало изучены.
К химическим веществам — антисептикам, угнетающим раз-
витие дрожжей и бактерий, допущенным к использованию в ви-
ноделии Министерством здравоохранения СССР, относятся сер-
нистая кислота, сорбиновая кислота, аллилгорчичное масло.
Из физических способов угнетения брожения в виноделии реко-
мендуются только нагревание и охлаждение. Ультрафиолетовые
лучи, ультразвук, ионизирующие излучения пока не рекомен-
дуются.
Микробиологический контроль ведут в соответствии с инст-
рукциями, в которых изложены методы исследования, объекты
микробиологического контроля, определение микробиологиче-
ской стойкости виноматериалов при выдержке и хранении вин,
подготовленных к розливу [184].
ГЛАВА II
ДРОЖЖЕВАЯ ФЛОРА ВИНОГРАДНЫХ ЯГОД, СОКА И ВИНА
Дрожжевая флора винограда, сусла и вина разнообразна и
непостоянна. Качество получаемого вина зависит от продуктов
обмена дрожжей. Данные о составе дрожжевой флоры на раз-
ных этапах спонтанного брожения виноградного сусла, при шам-
панизации и хересовании вина в последнее время дополнились
новыми сведениями.
КРУГОВОРОТ ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ В ПРИРОДЕ
Л. Пастер, доказавший необходимость присутствия дрожжей
для возникновения процессов брожения, первым в конце XIX в.
обнаружил дрожжи на зрелых ягодах винограда и не нашел их
на зеленых ягодах. Он считал, что на зеленом винограде нет
дрожжевых клеток, они появляются в период созревания и за-
носятся воздухом.
Исследования, проведенные известным датским ученым
Э. Ганзеном в 1880—1882 гг., показали, что главным местом оби-
тания и размножения дрожжей апикулятусов и сахаромицетов
в природе в течение лета и осени являются поврежденные слад-
кие сочные плоды, в том числе и виноград. При смывании дож-
дями и опадании плодов дрожжи попадают в землю, где пере-
зимовывают.
С земли при помощи ветра, дождя, насекомых и мелких жи-
вотных дрожжи вновь переносятся на плоды. На незрелых и не-
поврежденных плодах дрожжи не размножаются, а на повреж-
денных размножаются. Таков круговорот дрожжей в природе.
Учение Э. Ганзена о круговороте дрожжей в природе стало
общепринятым и было подтверждено Ю. Бортманом, Г. Мюлле-
ром-Тургау и другими исследователями.
Г. Мюллер-Тургау установил, что дрожжей в воздухе мало.
Во время сбора винограда он помещал стеклянные сосуды со
стерильным виноградным соком на открытом воздухе на вино-
градниках, а также в различных местах винодельческих подва-
лов и оставлял их открытыми на полчаса. Примерно в 80% со-
судов размножались плесневые грибы, чаще всего представите-
ли родов Penicillium и Botrytis, и только в 1—2% сосудов,
находившихся в подвале, возникало брожение. В некоторых сосу-
дах сок оставался стерильным. Такие опыты проводились им
в сезоны виноделия в течение нескольких лет и всегда получа-
лись аналогичные результаты [223]. 101
Более поздние исследования микрофлоры воздуха виноград-
ников, проводившиеся рядом ученых с применением различных
методов исследования (метода осаждения Коха, с добавлением
в плотную питательную среду дифенила, подавляющего рост
плесневых грибов и не препятствующего росту дрожжей), под-
твердили наблюдения Г. Мюллера-Тургау и показали, что дрож-
жи в воздухе виноградников встречаются редко [195].
А. Берлезе отмечал, что он часто находил дрожжи на насеко-
мых (мухах, бабочках и особенно на мушках-дрозофиллах),
всегда появляющихся в огромном количестве около бродящего
сусла. Однако прямые доказательства главной роли насекомых
в переносе дрожжей на спелые ягоды винограда получили
Е. Сержант и Г. Ружебьеф в опытах на виноградниках в Алжи-
ре в 1924 и 1925 гг. Лозы на корню в начале июля они закры-
вали особо устроенными ящиками и оставляли там до полной
зрелости винограда. Ящики были четырех типов: одни — с пол-
ностью застекленными сторонами, через которые не могли про-
никать ни пыль, ни насекомые, другие — застекленные, но с не-
большими отверстиями, через которые могли проникать насеко-
мые, третьи — затянутые металлической сеткой с отверстиями
(0,6 мм), пропускающими пыль, но не насекомых, и четвертые —
с более крупными отверстиями (1,6 мм), пропускающими также
и насекомых. Контрольные лозы ничем не закрывали.
После созревания винограда из каждого варианта опыта бра-
ли стерильно в количестве нескольких сотен ягоды, помещали
по одной в пробирки со стерильным суслом и отмечали начало
забраживания. Авторы установили, что там, где нет доступа на-
секомых, нет и брожения. Лишь виноград из ящиков, куда мог-
ли проникать насекомые (ящики из сетки с отверстиями в 1,6 мм
и застекленные с небольшими отверстиями), был инфицирован
дрожжами, в результате чего наблюдалось забраживание сусла,
причем процент пробирок с забродившим суслом равнялся 100.
Так было доказано, что насекомые, посещая поспевающие яго-
ды винограда, заносят на них дрожжи.
Дрозофилла обладает чрезвычайно развитым обонянием и
всегда появляется там, где идет процесс брожения. В стериль-
ных условиях исследователи препарировали кишечный тракт му-
шек и посевами на плотную питательную среду обнаруживали в
нем живые дрожжи различных семейств, родов и видов [223].
Муравьи, выловленные на винограднике и помещенные в сте-
рильные чашки Петри с сусло-агаром, при передвижении по по-
верхности агара оставляли след, на котором через несколько
дней вырастали колонии дрожжей [195]. Насекомых (жуков, ос,
пчел) вылавливали в пробирки со стерильным виноградным со-
ком. В пробирках с насекомыми отмечался рост плесневых гри-
бов наряду с дрожжами или рост одних дрожжей. Особенно
охотно посещаются насекомыми (уксусной мушкой, осами, пче-
102 лами) ягоды, поврежденные птицами, осами, градом [223].
По-видимому, насекомым должно быть отведено главное мес-
то в распространении дрожжей. Однако брызги дождя, увлекаю-
щие частицы почвы, пыль, переносимая сильным ветром, также
способствуют попаданию дрожжей на ягоды винограда. Еще
Г. Мюллер-Тургау находил на низковисящих гроздях в 4,8 раза
больше дрожжей, чем на высоковисящих, более удаленных от
земли.
В нашей стране изучением круговорота винных дрожжей в
природе занимались многие исследователи и пришли к различ-
ным выводам. Одни находили дрожжи в почве в течение всего
года и поэтому считали основным местом обитания дрожжей поч-
ву, другие не находили совсем или только изредка встречали
дрожжи в почве и считали основным источником их распро-
странения винные подвалы и плодохранилища. Так, Е. В. Тюни-
на обнаруживала дрожжи в почвах Краснодарского края круг-
лый год. Больше всего их было в почве в ноябре — декабре,
меньше всего — в марте. Обследование виноградных кустов (по-
бегов, листьев, ягод) показало, что дрожжи на них можно обна-
ружить не всегда.
А. Ф. Флеров и Н. Н. Коваленко пришли к аналогичным вы-
водам, исследуя почвы и виноградные кусты на виноградниках
Ростовской области. В жаркие месяцы (июль — август) винных
дрожжей в почве междурядий было найдено очень мало и боль-
ше— в почве под кустами винограда. Обнаружены были также
дрожжи на стволах, ветвях, листьях древесных пород и ягодни-
ков. А. М. Шумаков, проведя исследования в Одесской области,
пришел к выводу, что основным местопребыванием дрожжей в
течение года является почва.
Н. М. Трофименко [195] обнаруживала дрожжи в почвах ви-
ноградников Молдавии в течение всего вегетационного периода.
Дрожжевая флора состояла в основном из представителей се-
мейства Torulopsidaceae и Saccharomycetaceae. В поверхностном
слое почвы в 1 г содержалось от 300 до 2000 клеток различных
грибов (в сентябре максимум). Дрожжи составляли 5—15% от
их общего количества.
Другие авторы, хотя и не отрицают, что дрожжи могут пере-
зимовывать в почве, но основным источником их распростране-
ния считают хозяйство человека, в частности, винные подвалы.
Академиком Г. А. Надсоном, проводившим исследования на Юж-
ном берегу Крыма и в Прикумско-Терском районе, было обсле-
довано около 40 образцов почв, собранных в августе — сентяб-
ре 1924—1926 гг. под и между кустами винограда нескольких
сортов. Только из одного образца почвы виноградника были
выделены дрожжи-сахаромицеты. Вопрос о том, откуда и как
попадают дрожжи на ягоды винограда, Надсон считал нере-
шенным.
Большая работа по вопросу о круговороте дрожжей была
проведена Н. Ф. Саенко в Крыму и в Грузии. В течение трех 103
лет проводились исследования микрофлоры винограда, почв и
воздуха на виноградниках. Весной и летом не были обнаружены
в почве дрожжи-сахаромицеты, за исключением одного случая.
Дрожжи на винограднике распределены неравномерно.
Н. Ф. Саенко наибольшее их количество находила на ягодах
кустов, расположенных со стороны подвала, плодового сада и
дикорастущих ягодных насаждений, и меньшее на ягодах кустов,
расположенных в центре виноградника. На ягодах винограда
сорта Педро Хименес, имеющих тонкую кожицу и нежную соч-
ную мякоть, дрожжи обнаруживались чаще, чем на ягодах ви-
нограда сортов Семильон, Алиготе с толстой грубой кожицей,
которая труднее повреждается насекомыми.
В результате проведенных исследований Н. Ф. Саенко при-
шла к выводу, что дрожжевая флора зрелого винограда опреде-
ляется микроорганизмами, принесенными извне, а не из почвы
данного участка. Основным местом пребывания дрожжей явля-
ются винные подвалы, откуда они переносятся насекомыми,
главным образом дрозофиллой, на близлежащие фруктовые и
ягодные насаждения, а затем на позднее созревающие ягоды ви-
нограда.
В. И. Кудрявцев обобщил большой материал о распростра-
нении дрожжей в различных географических пунктах СССР,
собранный возглавлявшейся им экспедицией Академии наук
СССР. В свежеотжатом соке только что собранных плодов и
ягод винные дрожжи были настолько редки, что не обнаружива-
лись ни микроскопированием, ни посевом в чашки Петри.
Изучение дрожжевой флоры винограда Дальнего Востока,
Армении и других районов показало, что на зрелых ягодах ви-
нограда и в воздухе виноградников винные дрожжи встречают-
ся редко, основным местообитанием их являются перерабаты-
ваемые ягодные соки. Аналогичные данные были получены
Г. И. Мосиашвили, Г. В. Арабидзе в Грузии; Э. Минариком в
Чехословакии, Р. Д. Зубковой в Казахстане.
Р. Д. Зубкова анализировала дрожжевую флору виноград-
ников основных винодельческих районов Казахстана в течение
нескольких лет. Было выделено 7322 штамма дрожжей. Показа-
но, что в сезон виноделия в воздухе, в почве виноградников и
на неповрежденных виноградных ягодах, отобранных стерильно,
винные дрожжи практически отсутствуют. Однако при исследо-
вании нестерильно собранных проб ягод винограда сахаромице-
ты обнаруживались почти в каждой пробе.
И. М. Рябченко, изучавший микрофлору виноградников «Аб-
рау-Дюрсо», проанализировал 356 проб различных частей вино-
градного куста, 385 почвенных образцов и провел 83 анализа
воздуха. На виноградном кусте в течение всего года он находил
винные дрожжи на почках, побегах, на зрелых ягодах и усиках.
В почвах и воздухе винные дрожжи встречались редко. Основ-
104 ным местообитанием винных дрожжей И. М. Рябченко считал
виноградный куст. В доказательство того, что дрожжевая флора
виноградников не зависит от дрожжей винных подвалов, он при-
водил тот факт, что в течение многих лет на предприятиях ком-
бината «Абрау-Дюрсо» первичное виноделие и шампанизация
проводились на дрожжах, образующих зернистокомковатые
осадки, а с виноградников выделялись винные дрожжи, дающие
пылевидные осадки.
Н. И. Простосердов и С. В. Краснокутская не обнаружили
винные дрожжи ни в почве, ни на кустах винограда на виноград-
нике Тимирязевской сельскохозяйственной академии, где нет
производства вина. Они делают вывод, что в виноградных на-
саждениях, если поблизости отсутствует виноделие, отсутствуют
и винные дрожжи в почве и на виноградных кустах.
Такая разноречивость данных обусловлена прежде всего тем,
что авторы проводили изучение в районах с неодинаковыми
климатическими и почвенными условиями и, кроме того, пользо-
вались различными методиками исследования отобранных проб.
Несомненно, что круговорот винных дрожжей в природе су-
ществовал до появления человека и его хозяйственной деятель-
ности. Неоднократное обнаружение многими исследователями
живых дрожжей в почвах виноградников в разное время года
свидетельствует о том, что дрожжи могут перезимовывать в поч-
ве и оттуда попадать на ягоды винограда. Попадая снова в поч-
ву вместе с опавшими ягодами, винные дрожжи после размно-
жения и использования сахаров в условиях доступа воздуха мо-
гут образовывать споры, более устойчивые к неблагоприятным
условиям среды, и в виде спор перезимовывать. Могут перези-
мовывать дрожжи и на различных частях виноградного куста.
Обнаружение же большего количества винных дрожжей на
ягодах, собранных с участков виноградников, расположенных
ближе к винным подвалам, чем с участков, удаленных от них, и
на ягодах винограда, собранных нестерильно, чем на собранных
стерильно, служит доказательством того, что хозяйство челове-
ка и, в частности, виноделие, является постоянным местообита-
нием дрожжей, и из этого источника дрожжи также могут по-
падать на ягоды винограда.
Таким образом, в настоящее время и природа и хозяйство
человека являются постоянными местами обитания дрожжей,
имеющими значение в виноделии, и могут быть источниками, из
которых дрожжи попадают на ягоды винограда.
ДРОЖЖИ ВИНОДЕЛЬЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА
Дрожжи виноградных ягод
По данным многих исследователей, дрожжевая флора ягод
винограда, собранных стерильно, очень бедна. На ягодах чаще
и в большем количестве обнаруживаются неспороносные бакте- 105
рии и плесневые грибы, чем дрожжи. Так, М. Мавлани, опреде-
лявшая микрофлору ягод винограда в Узбекистане, и В. П. Жу-
равлева — в Туркмении показали, что наибольшую часть мик-
рофлоры ягод составляют бактерии, не образующие спор [61,
103]. Большинство штаммов бактерий принадлежало к родам
Pseudomonas, Micrococcus и Chromobacterium. По данным япон-
ских исследователей, на ягодах винограда, особенно в период
созревания, преобладают плесневые грибы родов Penicillium и
Aspergillus [186].
Ж. Риберо-Гайон и Э. Пейно приводят данные подсчета ко-
личества дрожжей (методом посева на плотную среду) в соках,
полученных из винограда, взятого стерильно с куста, в соках из
винограда, собранного сборщиками и доставленного для пере-
работки, и в соках, собранных при выходе из дробилки-гребне-
отделителя (табл. 22) [154].
Дрожжи на ягодах винограда распределены очень неравно-
мерно. Если срезать несколько здоровых гроздей и размельчить
их с соблюдением асептики, то может иногда даже не возник-
нуть брожение из-за отсутствия дрожжей. Значительно возрас-
тает их количество на ягодах поврежденных и особенно после
дробления винограда, так как на оборудовании для переработ-
ки винограда сок находится в аэробных условиях, благоприят-
ных для быстрого размножения дрожжей.
Почти все авторы, определявшие количество дрожжей, на-
ходящихся на винограде в момент наступления полной зрелости,
отмечали малое число дрожжей-сахаромицетов и преобладание
апикулятусов.
Т. Кастелли показал, что в южных районах Италии больше
на винограде распространены апикулятусы, образующие спо-
ры— Hanseniaspora apiculata, а в северных — Kloeckera apicula-
ta, не образующие спор. Эта разница в распределении на вино-
граде дрожжей-сахаромицетов зависит от климатических усло-
вий. Чем жарче климат, тем больше распространены
Таблица 22
Номер виноград- Количество клеток дрожжей в 1 мм3 сока винограда р адника Количество клеток дрожжей в 1 мм3 сока винограда
ника доставлен- о. доставлен-
ВЗЯТОГО ного для после о о ВЗЯТОГО ного для после
с куста переработ- ки дробления X - S и с куста переработ- ки дробления
1 <1 5 800 7 2 40 660
2 30 - 1 1360 8 50 10 6400
3 26 —- .— 9 4 280 460
4 <1 25 .—. 10 65 -— —
5 120 — .— 11 <1 2 . —
6 160 23 —— 12 13 1 1 4 15 1800 1500
106
спорогенные формы, как наиболее стойкие по отношению к ко-
лебаниям температуры и влажности воздуха.
Японские ученые Ю. Симатани и П. Нагата [186] выделяли с
ягод винограда в период их созревания дрожжи Kloeckera api-
culata, Candida mycoderma, Candida crucei, Pichia membranaefa-
ciens, Pichia fermentans, Torulopsis famata. Дрожжи-сахароми-
цеты не были выделены.
На виноградниках Грузии, по данным Г. В. Арабидзе, основ-
ную часть дрожжевой флоры спелых ягод составляют Hansenia-
spora apiculata — 50% и Torulopsis — до 18%. Дрожжи вида
Sacch. vini не были обнаружены.
С поверхности ягод винограда, выросшего в районе Бордо, за
несколько дней до сбора выделялось 100 000 клеток на 1 г ви-
нограда. Преобладали дрожжи Rhodotorula и Kloeckera apicu-
lata.
Таким образом, исследования дрожжевой флоры виноград-
ных ягод, проведенные в разных странах, показывают, что ко-
личество дрожжей на ягодах к моменту сбора для переработки
может быть самым различным (от единичных клеток до 105 на
1 г винограда).
Дрожжей-сахаромицетов обнаружить на ягодах обычно не
удается, так как преобладают дрожжи других семейств и родов.
Дрожжи винодельческих заводов
Условия производства вин далеки от стерильных. На обору-
довании, в стеклянных трубопроводах, в емкостях для сбражива-
ния сусла и хранения вина всегда есть живые микроорганизмы,
которые при переработке винограда попадают в сусло и
вино.
Нами определялось на трех винодельческих заводах Крыма
количество живых микроорганизмов (дрожжей, плесневых гри-
бов, уксуснокислых и молочнокислых бактерий) на внутренней
поверхности эмалированных стальных сборников и стеклянных
трубопроводов, а также разливочных автоматов путем посева
проб последней порции промывной воды на элективные пита-
тельные среды и подсчета выросших колоний. Результаты ана-
лизов показали, что даже после дезинфекции 0,5%-ным раство-
ром катапина (четвертичного аммониевого соединения) часть
дрожжей оставалась живой (табл. 23).
При определении обсемененности микроорганизмами вымы-
тых и стоящих пустыми железобетонных емкостей, не облицо-
ванных изнутри стеклянной плиткой, а покрытых слоем винного
камня, обнаружено, что основной микрофлорой в них были плес-
невые грибы родов PeniciHium и Aspergillus и дрожжи, причем
преобладали пленчатые дрожжи родов Pichia и Candida. При по-
севах на питательные среды смывов с поверхностей емкостей
установлено, что в 85% проб содержались живые плесневые гри- 107
Таблица 23
Место отбора проб Содержание в 1 мл промывной воды живых микроорганизмов
плесневых грибов дрожжей уксуснокислых бактерий молочнокислых бактерий
Эмалированный стальной После 10 МОЙКИ 2270 140 0
сборник Стеклянный трубопровод 10 54000 100 юо
Разливочный автомат 0 1500 1000 0
После дезинфекции
Эмалированный стальной 0 17 0 0
сборник Стеклянный трубопровод 0 51 0 0
Разливочный автомат 0 1 0 0
бы и в 81 % проб — живые дрожжи. Уксуснокислые и молочно-
кислые бактерии были обнаружены соответственно в 44 и 33%
проб (табл. 24).
Таблица 24
Микроорганизмы Количество проб (в %), содержащих следующее число микроорганизмов на 1 см2 поверхности железобетонных емкостей
0 Ю1—103 104—10е
Плесневые грибы 15 40 45
Дрожжи 19 40 41
Уксуснокислые бактерии 55 24 21
Молочнокислые бактерии 67 19 14
По данным В. П. Журавлевой [61], в микрофлоре оборудова-
ния и тары винодельческих заводов преобладают дрожжи-саха-
ромицеты, реже встречаются пленчатые дрожжи родов Pichia,
Hansenula, Candida, а также плесневые грибы и бактерии.
Ж. Риберо-Гайон и Э. Пейно [154] приводят результаты иден-
тификации 132 штаммов дрожжей, выделенных в винподвалах с
оборудования, тары, инвентаря, и показывают, что они распреде-
ляются следующим образом (табл. 25).
Из данных, приведенных в табл. 24 и 25, видно, что оборудо-
вание и емкости винодельческих заводов являются источниками
дрожжей, плесневых грибов, уксуснокислых и молочнокислых
бактерий, попадающих в виноградное сусло и вино. Количество
микроорганизмов зависит от санитарного состояния оборудова-
на ния и емкостей. На винодельческих заводах необходимо строго
Таблица 25
Микроорганизмы Число штаммов Микроорганизмы Число штаммов
Sacch. oviformis 19 Sacch. chevalieri 5
Sacch. ellipsoideus 18 Pichia 10
Sacch. acidifaciens 14 Brettanomyces 17
Sacch. elegans 14 Candida mycoderma 38
следить за тем, чтобы сразу после освобождения от сусла или
вина емкости и оборудование тщательно промывались водой и
их поверхности не служили питательным субстратом для раз-
множения различных групп микроорганизмов.
Нами была определена обсемененность микроорганизмами
виноматериалов, хранящихся в железобетонных емкостях. Было
проанализировано 85 проб столовых виноматериалов. В 68%
проб в 1 мл вина содержалось от 10 до 1000 ив 11% проб — от
10 000 до 1 млн. живых клеток дрожжей. Микрофлора столовых
виноматериалов, хранящихся в железобетонных емкостях, ха-
рактеризуется данными, приведенными в табл. 26.
Таблица 26
Микроорганизмы Количество (в %) проб, содержащих следующее число микроорганизмов в 1 мл виноматериалов
0 101—103 104—10е
Дрожжи 21 68 11
Уксуснокислые бактерии 56 39 5
Молочнокислые бактерии 75 23 2
В винах, поступающих на розлив в бутылки, тоже содержат-
ся микроорганизмы. При розливе вина в бутылки на обычных
нестерильных линиях нами обнаружено от 10 до 500 живых
дрожжевых клеток в 1 мл вина. Аналогичные данные получены
Э. Пейно и С. Сапи-Домерк о содержании живых микроорганиз-
мов в винах, разливаемых в бутылки в районе Бордо.
Дрожжи являются основной причиной биологических помут-
нений столовых вин, разлитых в бутылки [172, 246]. Определе-
ние систематического положения дрожжей, выделенных из по-
мутневших столовых вин, позволило обнаружить в них дрожжи
родов Saccharomyces, Brettanomyces, Pichia, Hansenula, Candi-
da. Среди сахаромицетов наиболее часто выделяются из помут-
невших вин дрожжи вида Sacch. oviformis как наиболее спирто-
выносливые и приспособленные к жизнедеятельности в винах.
Достаточно бывает присутствия нескольких живых дрожже-
вых клеток в 1 мл вина, разливаемого в бутылки с доступом Ю9
воздуха, чтобы в нем спустя некоторое время возникло дрож-
жевое помутнение. Применяемые дозы сернистой кислоты для
стерилизации готовых к розливу столовых сухих и полусладких
вин, разрешенные в нашей стране ГОСТ 7208—70 «Вина виног-
радные», не обеспечивают их биологической стабильности. По-
этому для ее достижения необходимо применять дополнительную
обработку (горячий розлив, бутылочную пастеризацию, стери-
лизующую фильтрацию и стерильный розлив или введение до-
полнительных консервантов).
Дрожжевая флора спонтанно бродящего виноградного сусла и вина
Виноградное сусло в отличие от пивного, стерилизованного и
сбраживаемого на селекционированных дрожжах, часто забра-
живает самопроизвольно (спонтанно) на естественной микро-
флоре. Результаты брожения бывают различными, что является
одной из причин подробного изучения состава дрожжевой фло-
ры виноградного сока на различных этапах брожения во многих
винодельческих районах.
Исследования микрофлоры виноградного сусла показали, что
в свежеотжатом сусле могут быть представители разных групп
микроорганизмов, попавшие в сусло при переработке виногра-
да с поверхности ягод, гребней и оборудования. Большую часть
микрофлоры составляют плесневые грибы (76—90%), дрожжи
(9—22%) и значительно меньшую — неспоровые и споровые бак-
терии, актиномицеты и микобактерии [61].
Высокая кислотность виноградного сока (pH 2,7—3,8) созда-
ет неблагоприятные условия для жизнедеятельности большинст-
ва групп микроорганизмов, и поэтому в сусле они обычно не раз-
множаются.
Наиболее кислотовыносливыми являются дрожжи и плесне-
вые грибы. Дрожжей в свежеотжатом соке обычно бывает мень-
ше, чем плесневых грибов, но дрожжи способны быстрее раз-
множаться во всей массе жидкости. Накопив определенную био-
массу, дрожжи перестраивают свой обмен на анаэробное исполь-
зование сахаров и вызывают забраживание сусла. Спиртовое
брожение обедняет сусло кислородом и приводит к накоплению
в среде спирта. Анаэробные условия и спирт неблагоприятны для ;
размножения и жизнедеятельности плесневых грибов, поэтому
создаются элективные условия для жизнедеятельности дрожжей. ;
Среди дрожжей различных семейств, родов и видов сущест- <
вуют сложные конкурентные взаимоотношения и в связи с этим
наблюдается изменение состава дрожжевой флоры в процессе
спонтанного брожения виноградного сусла. В анаэробных уело
виях прекращается размножение пленчатых дрожжей. Слабс
бродящие дрожжи постепенно уступают место дрожжам с бо-
лее высокой спиртообразующей способностью. С повышением
110 концентрации спирта значительное количество конкурентов гиб-
нет и к концу брожения ос-
таются жизнедеятельными
только спиртовыносливые
виды дрожжей. Однако про-
дукты обмена всех дрож-
жей, участвовавших в бро-
жении сусла, оказывают
влияние на качество вина.
До недавнего времени
считалось, что в процессе
спонтанного спиртового бро-
жения виноградного сусла
принимают участие всего
лишь 2—3 вида дрожжей.
В начале брожения преобла-
дают апикулятусы, состав-
ляющие 90—95% всей мик-
рофлоры. После накопления
в бродящем сусле 2—4% об.
спирта состав дрожжевой
флоры меняется. Винные
дрожжи Sacch. ellipsoideus
продолжают размножаться,
а апикулятусы прекращают
свою жизнедеятельность и
постепенно отмирают. Ос-
новное брожение и дображи-
вание проходит на дрожжах
Sacch. ellipsoideus.
Классическая схема спон-
танного брожения сусла, со-
гласно которой апикулятусы
начинают брожение, а эллип-
тические дрожжи его завер-
шают, дополняется в последнее
Рис. 29. Дрожжи, преобладающие в неко-
торых образцах бродящего сусла [329]:
I — в зоне Умбрия; II — Кьянти; III — Апулия;
IV — Пичено; V — Пьемонт;
1 — Sacch. ellipsoideus; 2 — Sacch. bayanus; 3 —
KI. magna; 4 — Sacch. rosei; 5 — Sacch. chevali-
er!; 6 — Cand. pulcherrima; 7 — Sacch. uvarum;
8 — KI. apiculata; 9 — другие виды.
время новыми сведениями бла-
годаря усовершенствованиям классификации дрожжей и подроб-
ному изучению дрожжевой флоры во многих винодельческих
районах различных стран.
Особенно подробно проведено изучение эколого-географиче-
ского распространения дрожжевых организмов, продуктов их
обмена и роли отдельных видов дрожжей в брожении сусла в
таких винодельческих странах, как Италия и Франция.
В Италии под руководством Т. Кастелли изучена дрожжевая
флора виноградников южных и северных районов страны, рас-
положенных у моря и на высоте 700 м. Обследовано более
600 виноградарских местностей Италии, Сардинии и Сицилии.
Было исследовано 500 проб различных соков и выделено ОЙМО
6000 штаммов дрожжей [329]. Ш
в разных количестве1
Многие вийы дро;
На рис. 29 показано, что в пробах бродящего сусла из вино-
града различных местностей Италии наряду с Kloeckera apicula-
ta и Sacch. ellipsoideus находятся дрожжи других родов и видов
>ix сооЛошениях.
ей, тащге как Sacch. rosei, Sacch. bay-
anus, Sacch. uvarum, Candida pulcherrima, Kloeckera magna,
встречаются настолько часто, что нельзя отрицать их участие в
процессе спонтанного брожения.
Сравнение результатов изучения дрожжевой флоры северных
и южных районов Италии показало, что чем жарче климат, тем
более распространены спорогенные формы, более устойчивые к
колебаниям температуры и влажности воздуха. Климат оказы-
вает влияние на качественный состав микрофлоры, на распро-
странение определенных видов дрожжей. Кроме того, в южных
районах происходит селекция дрожжей разных видов с более
высокой спиртообразующей способностью, чем в северных, в свя-
зи с более высоким содержанием сахара в сусле. Труды италь-
янских исследователей расширили наши представления о соста-
ве дрожжевой флоры спонтанно бродящего виноградного сусла
и внесли существенный вклад в изучение этого вопроса.
Во Франции С. Домерк было проведено подробное исследо-
вание дрожжей в департаменте Жиронда [246]. Изучался состав
дрожжевой флоры винограда и сусла в начале, середине и в кон-
це брожения в районах производства красных и белых вин. Все-
го было выделено 2023 штамма дрожжей из 96 проб. Из них
58 проб были взяты в районах производства красных вин и 38 —
в районах производства белых вин. Дрожжи при определении
систематического положения были отнесены к 11 родам и 28 ви-
дам. Из них дрожжи аспорогенные принадлежали к пяти родам,
включающим восемь видов (Kloeckera apiculata, KI. africana,
KI. jensenii, Torulopsis bacillaris, T. famata, Brettanomyces vini,
Candida pulcherrima, Rhodotorula mucilaginosa), и спороген-
ные — к шести родам, включающим 20 видов (Saccharomyces
ellipsoideus, Sacch. oviformis, Sacch. chevalieri, Sacch. bayanus,
Sacch. fructum, Sacch. carlsbergensis, Sacch. uvarum, Sacch. flo-
rentinus, Sacch. steineri, Sacch. heterogenicus, Sacch. acidifaciens,
Sacch. elegans, Sacch. veronae, Saccharomycodes ludwigii, Toru-
laspora rosei, T. delbriieckii, Hansenula anomala, Pichia fermen-
tans, P. membranaefaciens, Debaryomyces hansenii).
Наблюдалось большое разнообразие дрожжей в спонтанно
сброженных соках. До начала брожения виноградного сусла
районов производства красных вин апикулятусы и другие неспо-
рообразующие дрожжи в изолированных штаммах дрожжей со-
ставляли 84%, а в конце брожения они не были обнаружены.
Дрожжей вида Sacch. ellipsoideus до брожения было 13%, в се-
редине, когда было сброжено 50% сахаров от исходного содер-
жания,—62% и в конце, через 3 мес от начала процесса броже-
И2 ния,— 74%, Sacch. oviformis к концу брожения было 6%; спо-
рообразующие дрожжи других видов и родов были обнаружены
в небольшом количестве — от 1 до 7%.
В районах производства белых вин в сусле до брожения на-
ряду с дрожжами Kloeckera apiculata, которые составляли толь-
ко 36%, находились дрожжи Torulopsis bacillaris —23% и Sacch.
ellipsoideus — 31%. По ходу брожения сусла микрофлора меня-
лась. Неспорообразующие дрожжи Kloeckera apiculata и Toru-
lopsis bacillaris уступали место спорообразующим дрожжам ро-
да Saccharomyces. Через 3 мес после начала забраживания сус-
ла дрожжи вида Sacch. ellipsoideus составляли 50% и вида
Sacch. oviformis — 38%. Сахаромицеты других видов были обна-
ружены в незначительном количестве. Более высокое содержа-
ние дрожжей вида Sacch. oviformis в конце брожения при про-
изводстве белых вин, чем при производстве красных, наблюдав-
шееся С. Домерк в винах Франции, незакономерно. Э. Минарик
[283], определявший состав дрожжевой флоры молодых вин Че-
хословакии, не обнаружил существенных видовых различий са-
харомицетов в белых и красных винах.
С. Домерк была изучена также спиртообразующая способ-
ность 1782 штаммов дрожжей разных родов и видов, выделен-
ных в районах производства белых и красных вин. При сбражи-
вании высокосахаристого сусла 353 изученных штамма апикуля-
тусов образовали спирта только от 3 до 6% об., 1015 штаммов
Sacch. ellipsoideus — от 8 до 20% об., причем большинство штам-
мов (60%) —от 12 до 15% об. Наибольшая спиртообразующая
способность обнаружена у дрожжей вида Sacch. oviformis: из
92 изученных штаммов 50, т. е. более половины, образовали спир-
та от 17 до 19% об.
Изучение видового состава дрожжевой флоры при спонтан-
ном брожении сусла в условиях виноделия западных районов
Грузии показало, что в начале брожения преобладали апикуля-
тусы, а в середине брожения — сахаромицеты видов Sacch. vini
и Sacch. uvarum. Дрожжевая флора осадков вин состояла из са-
харомицетов, среди которых около 83% принадлежало к Sacch.
vini, количество Sacch. oviformis достигало 10% [15].
Н. М. Трофименко, изучавшая дрожжевую флору Молдавии,
установила, что род Saccharomyces представлен там в основном
видами Sacch. uvarum и Sacch. vini. Некоторые штаммы вида
Sacch. uvarum дают вино хорошего качества и вызываемое ими
брожение сусла протекает без пенообразования [195].
Определение систематического положения 331 штамма дрож-
жей, выделенных нами из дрожжевых осадков после спонтанного
сбраживания виноградного сусла в пяти винсовхозах Закарпат-
ской области Украинской ССР, показало, что 97% их принадле-
жало к четырем родам семейства Saccharomycetaceae: Saccha-
romyces— 90,7%, Pichia — 4,5%, Zygosaccharomyces — 0,9%, De-
baryomyces — 0,9%; 3% культур составили дрожжи семейства
Saccharomycodaceae рода Saccharomycodes. Род Saccharomyces
5—568
113
был представлен в сброженном виноградном сусле Закарпатья
следующими видами: Sacch. vini — 88,0%, Sacch. oviformis —
8,3%, Sacch. paradoxus — 3,3% и Sacch. chevalieri — 0,3% [203].
Изучение состава дрожжевой флоры винограда, бродящего-
сусла и вина проводилось в винодельческих районах Калифор-
нии, Чехословакии, Болгарии, Испании, Японии, Новой Зелан-
дии и многих других стран.
Данные исследований дрожжевой флоры в винодельческих
районах различных стран показали, что из самопроизвольно-
сбраживаемого виноградного сусла можно выделить дрожжи,
принадлежащие к различным семействам, родам и видам
(2023 штамма дрожжей, выделенных в Жиронде, отнесены к
11 родам и 28 видам; 1014 культур района Малых Карпат в Че-
хословакии отнесены к 7 родам и 25 видам). Дрожжевая флора
сусел одного и того же района неодинакова [283].
Дрожжи разных семейств, родов и видов обладают разными
свойствами: скоростью размножения, бродильной активностью,
спиртообразующей способностью, холодо-, термо-, спирто-, суль-
фитовыносливостью, образуют разные вторичные и побочные
продукты брожения, оказывающие влияние на вкусовые качест-
ва получаемых вин. Поэтому при сбраживании сусла на спон-
танной микрофлоре неизбежны случайности, и наряду с возмож-
ностью получения вин полностью выброженных и высокого
качества есть всегда опасность получения недобродов, виномате-
риалов с меньшим содержанием спирта при полном сбражива-
нии сахара и вин низкого качества.
Дрожжевая флора плодово-ягодных сусел и вин идентична
микрофлоре виноградных сусел и вин: в начале самопроизволь-
ного брожения преобладают апикулятусы, а затем дрожжи-саха-
ромицеты. Главное различие состоит в том, что в плодово-ягод-
ных соках, особенно в яблочных, часто размножаются дрожжи
вида Schizosaccharomyces acidodevoratus, которые разлагают яб-
лочную кислоту и вызывают нежелательный для плодово-ягод-
ного виноделия процесс кислотопонижения.
ЧИСТЫЕ КУЛЬТУРЫ ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ
Получение чистых культур винных дрожжей
Первые опыты с чистыми культурами винных дрожжей. Изу-
чение свойств дрожжей и их классификация стали возможны
лишь после того, как были разработаны методы выделения кле-
ток микроорганизмов в изолированном состоянии, в виде чис-
тых культур. Впервые чистая культура бактерий была получена
методом разведения в 1877 г. Д. Листером.
В 1881 г. Р. Кох предложил метод культивирования микро-
Н4 организмов на плотных средах для выделения их в чистые куль-
туры. Впоследствии метод Коха нашел широкое применение не
только для выделения чистых культур микроорганизмов, но и
для изучения микрофлоры различных объектов с качественной
и количественной стороны.
Чистые культуры винных дрожжей вида Sacch. ellipsoideus
с ягод винограда были впервые выделены Э. Ганзеном в 1883 г.
Он же разработал способ выделения дрожжей из одной клетки
посевом на плотных средах с контролем микроскопированием.
Первым исследованием, имевшим своей целью изучение во-
проса о существовании различий между расами дрожжей вида
Sacch. ellipsoideus, была работа Л. Маркса (1888 г.). Пользуясь
методом Э. Ганзена, он выделил 56 рас дрожжей из дрожжевых
-осадков, полученных в результате сбраживания виноградного
сусла, доставленного из Кло-Вужо, Эперне, Либурне и Бордоле.
Выделенные культуры различались по морфологическим и фи-
зиологическим признакам, а также по влиянию их на вкус и
букет вин.
Позднее выделением чистых культур дрожжей в различных
винодельческих районах Франции занялись М. Ромье, В. Мар-
тинан, М. Ритш, Г. Жакмен и др. Новый прием сбраживания
виноградного сусла с внесением в него чистых культур дрожжей
-быстро входил в практику виноделия. В 1891 г. фирма «Шле-
зинг» в Марселе приобрела исключительное право на продажу
дрожжей В. Мартинана и М. Ритша.
Однако роль чистых культур дрожжей переоценивалась. Так,
М. Ритш и В. Мартинан указывали, что одно и то же сусло,
сбродившее на чистых культурах дрожжей из четырех районов
Франции, давало различные по букету вина, напоминающие ви-
но той местности, откуда были получены дрожжи. К таким же
выводам пришли Ж. Дюкло, Л. Маркс и М. Ромье. Дальше всех
в этом направлении пошел Г. Жакмен, который сообщил даже
о том, что ему якобы удалось сбраживанием ячменного сусла на
винных дрожжах получить вина, не отличающиеся от вино-
градных.
Благодаря рекламам фирмы «Шлезинг» виноделы стали при-
обретать чистые культуры дрожжей, выделенные в лучших ви-
нодельческих районах, и надеялись с их помощью получать из
посредственных сортов винограда высококачественные вина.
Естественно, что надежды виноделов не оправдались.
Международный съезд виноделов, состоявшийся в 1897 г. в
Триенте, отметил, что громкие названия дрожжей по местнос-
тям еще ничего не говорят, «ибо и в знаменитых своими винами
местностях есть плохие дрожжи» [217].
Изучение свойств чистых культур винных дрожжей, способов
я результатов их применения в виноделии продолжалось.
В 1895 г. Ю. Бортман в брошюре «Применение и действие чис-
тых дрожжей в виноделии» указывал, что виноделам не следу-
ет увлекаться приобретением дрожжей, носящих громкие назва-
5*
115
ния известных винодельческих районов или лучших сортов ви-
нограда, так как эти названия не определяют свойств
дрожжевых культур. Но в то же время не следует думать, будто
любые чистые дрожжи должны отличаться хорошими свойства-
ми только потому, что они чистые. Необходимо знать свойства
приобретаемых культур (силу брожения, количественное соотно-
шение важнейших продуктов брожения, влияние на букет вина).
Ю. Бортман указывал, что своевременное внесение чистых куль-
тур дрожжей подавляет посторонние микроорганизмы, обеспе-
чивает быстрое наступление брожения и полное выбраживание,
повышает содержание спирта в вине и устойчивость его против
заболеваний.
Г. Мюллер-Тургау рекомендовал для подавления апикуляту-
сов и ускорения забраживания сусла на истинных винных дрож-
жах вносить в свежеотжатое сусло не чистую культуру дрожжей,
а сусло, забродившее на своих дрожжах и находящееся в ста-
дии бурного брожения.
В России изучение вопроса о целесообразности добавления
в виноградное сусло чистых культур дрожжей было начато в.
90-х годах прошлого века в Магарачской энохимической лабо-
ратории Никитского ботанического сада. В 1891 г. А. Е. Сало-
мон и в 1893 г. К. А. Рудзский добавляли естественно отселек-
ционированные популяции винных дрожжей для сбраживания
виноградного сусла и нашли этот прием целесообразным, так
как подавлялась деятельность посторонних микроорганизмов и
ускорялось забраживание сусла.
В 1894 г. Г. И. Гоголь-Яновский сделал сообщение на Между-
народном съезде плодоводов в Петербурге о положительных ре-
зультатах применения некоторых рейнских и французских рас
дрожжей для сбраживания виноградного сусла на Кавказе.
В 1893 г. известный химик-винодел М. А. Ховренко выделил
первые отечественные культуры дрожжей. Из результатов опыт-
ного ебражщвания крымского сусла на местных культурах дрож-
жей и на французских расах он делает правильный вывод о не-
обходимости ботанического и физиологического изучения дрож-
жей для успешного их применения в практике виноделия, так
как не все местные дрожжи дают лучшие вина [217].
Журнал «Вестник виноделия» с 1892 г. популяризировал при-
менение чистых культур дрожжей в виноделии. В нем помеща-
лись литературные обзоры, результаты научных исследований,
наставления по использованию чистых культур дрожжей и ре-
зультаты их применения в производстве.
В 1907 г. в Никитском ботаническом саду опыты с чистыми
культурами дрожжей проводили М. Ф. Щербаков и А. М. Фро-
лов-Багреев. С 1908 г. почти все вина экспериментального вин-
подвала «Магарач» стали сбраживать на чистых культурах
дрожжей, причем местные расы давали лучший результат по
11$ сравнению с импортными.
Однако применение чистых культур дрожжей еще не прини-
мало широких размеров в винодельческой практике. Недоброды
и заболевания вин были нередким явлением в винодельческих
хозяйствах.
Значительную роль в повышении качества вин, а также в бо-
лее широком применении чистых культур дрожжей в отечествен-
ном виноделии сыграло введение М. А. Герасимовым в 1925 г.
отстаивания сусла с сульфитацией его определенными дозами
сернистого ангидрида [45].
Различия между расами винных дрожжей. Сбраживание сте-
рильного виноградного сока в лабораторных условиях с приме-
нением дрожжей разных рас позволяет сравнивать их между
собой. Давно известно, что расы винных дрожжей различаются
по скорости размножения, скорости сбраживания сусла, суль-
фитостойкости, термо- и холодостойкости, кислотовыносливости,
скорости осветления вина в связи с образованием пылевидных
или хлопьевидных (конгломератных) осадков.
Чистые культуры дрожжей различаются и по спиртообразую-
щей способности, определяемой по количеству образованного
спирта при сбраживании сусла с повышенным содержанием са-
хара, и по спиртовыносливости, т. е. способности размножаться
в винах с разной спиртуозностью.
Перечисленные свойства используются при выборе культуры
дрожжей для сбраживания сусла в различных условиях. Так, в
сусло, содержащее повышенное количество свободной сернистой
кислоты (более 20 мг/л), рекомендуется вносить сульфитостой-
кие расы дрожжей; при низкой температуре сусла и окружаю-
щего воздуха (ниже 15°С) —холодостойкие культуры; при высо-
кой температуре (выше 30°С) —термостойкие, при высокой кис-
лотности (величина pH сусла ниже 3,0) — кислотовыносливые,
при высоком содержании сахаров сусла (выше 22%) и необхо-
димости полного сбраживания — расы дрожжей, обладающие
высокой спиртообразующей способностью, для возобновления
брожения вина — спиртовыносливые. При необходимости воз-
можно большего контакта дрожжей со средой вносят расы
дрожжей, образующие пылевидные осадки, а для бутылочной
шампанизации для облегчения ремюажа и дегоржажа — расы
дрожжей, образующие хлопьевидные осадки. Некоторые расы
дрожжей с перечисленными выше свойствами приведены в
табл. 27.
Установлены различия между винными дрожжами по пено-
образующей способности. Показано, что расы дрожжей вида
Sacch. uvarum сбраживают сусло без пены [195]. Дрожжи этого
вида накапливают повышенные количества глицерина [14] и ха-
рактеризуются холодостойкостью [22].
Кроме основного продукта брожения—этилового спирта —
дрожжи-сахаромицеты накапливают вторичные и побочные про-
дукты брожения в различных соотношениях. Многие из них уча- 117
Таблица 27
Условия брожения Чистые культуры дрожжей, рекомендуемые для сбраживания виноградного сусла и вина
раса дрожжей вид дрожжей
Низкая температура при брожении сусла или мез- ги (ниже 15°С) Ркацители 6, Феодосия 1-19 Бордо 20, Прикумская 80/9 Кишиневская 341, Новоцимлянская 3 Sacch. vini Sacch. uvarum
Высокая температура (вы- ше 30°С) Судак VI-5(t), Ркаците- ли 6 (терм) Sacch. vini
Высокая кислотность (pH сусла ниже 3,0) Феодосия 1-19, Судак VI-5 Ужгород 67 Sacch. vini Sacch. oviformis
Высокая са харистость, необходимая для получе- ния высокоспиртуозных натуральных вин Бастардо 1965, Киевская, Мускат белый, Токай 1965, Магарач 17-35 Sacch. oviformis
Повышенное содержание сернистой кислоты в сус- ле (свободной SO2 более 20 мг/л) 47-К, 5-N, Раса 7, Су- дак П-9, Кахури 7, Ркаци- тели 6, Ашхабадская, Романешты 47, Ужгород 192 Sacch. vini
То же, в вине Ленинградская, Массанд- ра III, ВИР III Sacch. oviformis
Дображивание сахара в недобродах Магарач 17-35, Киевская, Ленинградская Sacch. oviformis
Шампанизация вина в по- токе Киевская, Ленинградская Sacch. oviformis
Шампанизация вина в бу- тылках Кахури 7, Шампанская 7-10-С, Судак VI-5 Sacch. vini
ствуют в образовании аромата молодых вин. Сюда относятся
высшие спирты, эфиры, жирные кислоты, альдегиды, диацетил и
ряд других соединений.
Литературные данные, относящиеся к изучению образования
высших спиртов при сбраживании виноградного сусла, свиде-
тельствуют, что этот процесс зависит от состава сусла, степени
его осветления, условий аэрации, стадии брожения и расы дрож-
жей. Проведенные нами определения показали, что разные расы
винных дрожжей образовывали высших спиртов при сбражива-
нии сусла от 80 до 500 мг/л. Наименьшее их количество было в
вине при сбраживании сусла расой дрожжей Магарач 17-35 ви-
да Sacch. oviformis и наибольшее — расой Яблочная 17 вида
Sacch. vini. Культуры были рекомендованы для испытаний при
приготовлении коньячных виноматериалов в Молдавии. Испыта-
ния показали целесообразность применения культур, образую-
щих небольшие количества высших спиртов, для : получения
148 коньячных виноматериалов, так как высшие спирты при перегон-
ке концентрируются. Виноматериал, полученный сбраживанием
сусла на расе дрожжей Яблочная 17, был обогащен такими не-
желательными компонентами, как изобутиловый, амиловый и
изоамиловый спирты [215].
Образование летучих кислот, так же, как и высших спиртов,
зависит от условий брожения и расы дрожжей. Количество ле-
тучих кислот колебалось в пределах 0,7—1,08 г/л при сбражива-
нии сусла несколькими сотнями штаммов вида Sacch. ellipsoideus
[154]. Показано, что расы дрожжей образуют одинаковый набор
летучих кислот (уксусную, пропионовую, изомасляную, масля-
ную, изовалериановую, валериановую, капроновую, каприловую),
но количества их различны. Содержание уксусной кислоты со-
ставляет около 90% от суммы летучих кислот. Расы дрожжей
Туркестанская 36/5, Романешты 46, Яблочная 17 образуют на
0,4—0,5 г/л летучих кислот больше, чем Шампань Аи, Судак VI-5
вида Sacch. vini [41].
Состав фракций летучих сложных эфиров вин зависит от ви-
да, расы дрожжей и условий брожения. Однако о роли отдель-
ных эфиров в сложении вкусовых и ароматических свойств вина
наши сведения еще недостаточны, кроме этилацетата, который,
легко обнаруживается органолептически и образуется в значи-
тельно больших количествах дрожжами пленчатыми и апикуля-'
тусами, чем сахаромицетами [325].
Н. И. Бурьян и сотр. [41] получены сведения о различиях меж-
ду расами дрожжей по образованию диацетила и ацетоина. Ра-
сы Ркацители 6, Ленинградская образуют их меньше, чем Ка-
хури 7, Штейнберг 1892 г., Шампань Аи. Высказывается предпо-
ложение, что присутствие в винах сниженных количеств высших
спиртов, ацетоина, диацетила и незначительных количеств вы-
сококипящих летучих кислот будет играть положительную роль
в образовании аромата вин.
Установлены различия между расами дрожжей по способ-
ности образовывать пировиноградную и а-кетоглутаровую кис-
лоты, которые связывают свободную сернистую кислоту и сни-
жают ее антисептическое действие [325]. Показано, что некото-
рые штаммы дрожжей могут образовывать при брожении
сероводород из H2SO3 и элементарной серы и придавать вину
сероводородный тон. В Австралии проведена селекция рас дрож-
жей, не образующих сероводорода даже в присутствии элемен-
тарной серы, попадающей в сусло с ягод винограда, обработан-
ных серой. Сообщается о резком снижении сероводородного то-
на в винах в результате применения отселекционированных рас
дрожжей [312].
Появились работы, в которых сообщается о различиях между
расами винных дрожжей по потреблению яблочной кислоты в
процессе брожения сусла [310]. Некоторые расы дрожжей спо-
собны разлагать почти половину яблочной кислоты, а другие-—
очень немного [312]. Вероятно, можно будет отобрать расы дрож* 11^
жей с минимальной способностью поглощения яблочной кислоты
и использовать их для сбраживания низкокислотных сусел и, на-
оборот, расы дрожжей с максимальным потреблением яблочной
кислоты, которые будут снижать кислотность при брожении вы-
сококислотных сусел.
Определение активности ферментов пектинрасщепляющего
комплекса у 292 рас дрожжей-сахаромицетов показало, что они
различаются по активности пектинэстеразы и полигалактурона-
зы, т. е. по способности расщеплять пектиновые вещества [86].
Появилось сообщение о том, что замечена разница между
расами дрожжей по фиксации пигментов. Возможно, это свой-
ство будет учитываться при отборе рас дрожжей для виноделия
по красному [281]. В настоящее время для приготовления крас-
ных вин рекомендуются культуры, выделенные из красных вин,
имеющие названия Бордо, Каберне 5 и др.
Ассимиляция аминокислот дрожжами из среды происходит
сложными биосинтетическими путями, включая переаминирова-
ние. Исследование некоторых трансаминаз показало, что расы
винных дрожжей обладают разной активностью этих ферментов
и она остается достаточно высокой у некоторых культур при вы-
держке вина на дрожжевом осадке. Ферментные концентраты,
приготовленные из разных рас винных дрожжей, различаются по
содержанию в них аминокислот и витаминов группы В, в связи
с чем возможно индивидуальное воздействие того или иного фер-
ментного концентрата на качество вина. Для получения фермент-
ных концентратов рекомендуется раса Феодосия 1-19 [96, 95].
Показано, что на размножение молочнокислых бактерий, вы-
зывающих яблочно-молочное брожение, влияет штамм дрожжей,
на котором проходит спиртовое брожение. Высказано предполо-
жение, что штаммы дрожжей могут выделять стимуляторы и ин-
гибиторы размножения молочнокислых бактерий [270].
Установлена связь между спиртовыносливостью рас дрож-
жей, их выживаемостью и образованием больших количеств аль-
дегидов при выдерживании виноматериалов на дрожжевых осад-
ках в условиях ограниченного доступа воздуха к виноматериалу.
Для накопления альдегидов при получении хереса беспленочным
методом рекомендуется проводить сбраживание сусла и после-
дующую выдержку вина на спиртовыносливых расах дрожжей
вида Sacch. oviformis. К числу таких рас относятся Мага-
рач 17-35, Ленинградская, Киевская.
Недавно получены данные о существовании антагонистиче-
ских отношений между культурами дрожжей-сахаромицетов.
Оказалось, что все они принадлежат к одному из трех феноти-
пов: убийца или киллер (killer — К), нейтральный (neutral —
AZ), чувствительный (sensitive — S). Киллеры вызывают гибель
чувствительных культур при совместном развитии в виноград-
ном сусле. Дрожжи, имеющие фенотип нейтральных, не убивают
120 чувствительные и не погибают от действия киллеров. В связи с
тем что виноградное сусло, поступающее на брожение, несте-
рильно и содержит дрожжи разных фенотипов (К, N, 5), целесо-
образнее для обеспечения брожения сусла на чистых культурах
дрожжей вводить в него разводки более конкурентоспособных
рас фенотипов К или N [208]. Среди культур, имеющихся в кол-
лекции дрожжей ВНИИВиВ «Магарач», такими свойствами об-
ладают расы 47-Л и 5-N вида Sacch. vini, которые к тому же
являются сульфитостойкими, что делает их еще более конкурен-
тоспособными и позволяет им быстрее размножаться в сусле
после его отстаивания с сульфитацией.
Местные расы дрожжей. Во всех республиках нашей страны,
занимающихся виноградарством и виноделием, проводилась ра-
бота по выделению штаммов винных дрожжей из спонтанно бро-
дящего виноградного сусла и изучению их свойств с целью от-
бора для использования в производстве местных рас дрожжей,
наиболее приспособленных к условиям виноделия данного рай-
она. Такие работы были проведены в Крыму, Грузии, Армении,
Узбекистане, Туркмении, Казахстане, на Дальнем Востоке, в
Молдавии и в других районах нашей страны. Везде оказалось
возможным отобрать местные расы винных дрожжей, с приме-
нением которых были получены полностью выброженные, хо-
рошо осветленные виноматериалы с гармоничным вкусом. Од-
нако особая приспособленность местных рас дрожжей к сбражи-
ванию виноградного сусла данного района остается недока-
занной.
Изучение свойств местных рас винных дрожжей, выделенных
нами в пяти винсовхозах Закарпатской области из дрожжевых
осадков виноматериалов, сброженных без внесения чистых куль-
тур дрожжей, показало, что в данном районе отселекциониро-
вались дрожжи-сахаромицеты, обладающие высокой бродиль-
ной и спиртообразующей способностью, кислотовыносливостью
и сульфитостойкостью, способные обеспечить полное сбражива-
ние сахаров в сусле, идущем на приготовление столовых вин и
шампанских виноматериалов. Однако особых преимуществ при-
менения местных рас дрожжей установить не удалось, так как
одновременное сбраживание такого сусла на активной расе
дрожжей Феодосия 1-19, выделенной в Крыму, обеспечивало по-
лучение виноматериалов такого же качества [203]. Более важным
для характеристики рас дрожжей является не место их выделе-
ния, а такие свойства, как бродильная способность, сульфито-
стойкость, спиртообразующая способность, холодо- или термо-
стойкость, спиртовыносливость и т. д. Поэтому, например, на
сульфитостойкой расе дрожжей, выделенной в другом винодель-
ческом'.районе, обеспечить забраживание сильно сульфитирован-
ного сусла будет легче, чем на местной расе дрожжей, не обла-
дающей этим свойством.
Ф. Радлер считает вообще научно необоснованным представ-
ление о том, что дрожжи, находящиеся на гроздях винограда 124
данной местности, более подходят для брожения, чем «чужие»
дрожжи, выделенные в других местах, так как в природе сбра-
живание сока до вина никогда не происходит [310].
Во всяком случае в настоящее время еще нет научных дока-
зательств преимуществ сбраживания виноградного сусла на мест-
ных культурах дрожжей.
Смешанные культуры дрожжей. Изучение свойств чистых
культур дрожжей других родов, кроме сахаромицетов, привело
некоторых ученых к мысли о целесообразности использования
комплексных культур дрожжей. Так, Т. Кастелли предложил для
уменьшения образования летучих кислот вносить в сусло внача-
ле разводку дрожжей Torulaspora rosei, накапливающих только
0,15—0,20 г/л летучих кислот, а затем на четвертый или пятый
день брожения добавлять чистую культуру сахаромицетов.
До сих пор имеются разные мнения о роли апикулятусов в
спиртовом брожении виноградного сусла: большинство ученых
считает их участие вредным, но некоторые исследователи нахо-
дят целесообразным применение их в смеси с сахаромицетами
или зигосахаромицетами для повышения содержания эфиров в
винах [117, 187]. Для увеличения выхода сусла рекомендуется
совместное применение Sacch. vini с дрожжами Sacch. paradoxus,
обладающими повышенной пектолитической активностью [119].
Есть предложение готовить разводки смеси разных штаммов вин-
ных дрожжей (холодостойких, термостойких, сбраживающих
высокосахаристое сусло) и вводить их в сусло до начала броже-
ния в расчете на то, что брожение пойдет на той культуре, для
которой будут наиболее благоприятны условия [116]. Однако
позже было установлено, что между расами дрожжей-сахароми-
цетов существуют антагонистические отношения и одни вытес-
няют других при совместном внесении в стерильное сусло [208].
Поэтому при рекомендации комплексов культур необходимо
предварительно изучить, не находятся ли расы в антагонистиче-
ских отношениях. Применение комплексов, в состав которых вхо-
дят дрожжи других родов и семейств, встречает еще большие
трудности, чём применение чистых культур винных дрожжей, так
как дрожжи других родов и семейств менее, чем сахаромицеты,
приспособлены к сбраживанию сусла и часто не обнаруживают-
ся уже в период забраживания нестерильного сусла [142].
Роль чистых культур дрожжей в виноделии. Использование
чистых культур дрожжей в виноделии оказалось более сложным,
чем в пивоварении. Пивное сусло обычно готовится относитель-
но постоянного состава, стерилизуется, и засев его чистыми куль-
турами позволяет получать пиво стандартного качества. Качест-
во же вина в значительно большей степени зависит от сорта
винограда и района его произрастания, чем от дрожжей. Кроме
того, виноградное сусло не стерилизуется, и поэтому в брожении
участвуют дрожжи, попадающие в сусло с ягод винограда и обо-
122 рудования винодельческих заводов. При внесении в нестериль-
ное сусло разводки определенной расы дрожжей нет уверен-
ности в том, что брожение происходит на ней, а не на дрожжах
сусла. До сих пор не были разработаны способы, позволяющие
отличить потомство внесенной расы от дрожжей сусла того же
вида.
Повсеместное и обязательное применение чистых культур
дрожжей при сбраживании виноградного сусла тормозится еще
и тем, что вина, изготовленные из зрелого здорового винограда
путем самопроизвольного сбраживания на спонтанной микрофло-
ре, обычно бывают полностью выброженными. Разница между
винами, полученными брожением сусла с применением чистых
культур дрожжей и спонтанно, обычно невелика и непостоянна.
Международная организация по виноградарству и виноделию
предложила в 1973 г. участникам девятой сессии группы «Мик-
робиология вина» представить сведения о фактическом примене-
нии чистых культур дрожжей в виноделии своей страны в нас-
тоящее время и сообщить о перспективах на будущее. Материа-
лы, полученные в 1974 г., показали, что в таких винодельческих
странах, как Франция, Италия, Мексика, Португалия, Греция,
Испания, нет регулярного применения чистых культур дрожжей
при сбраживании виноградных сусел. Брожение сусла в боль-
шинстве случаев проходит на спонтанной микрофлоре, и неко-
торые из превосходных вин мира получают до сих пор путем
спонтанного брожения. Однако в будущем в большинстве стран
считают целесообразным применять чистые культуры более ре-
гулярно [281].
Ученые винодельческих стран продолжают изучать роль чис-
тых культур дрожжей в виноделии. В настоящее время среди
ведущих ученых-виноделов существуют различные мнения о при-
менении чистых культур дрожжей для сбраживания сусла.
Ж. Риберо-Гайон и Э. Пейно полагают, что в районах полу-
чения тонких высококачественных вин не возникает вопрос о вне-
сении дрожжей, посторонних для виноградника. Однако селек-
ция в пределах самого виноградника может быть благоприятна.
Она будет состоять в изучении свойств дрожжей и выборе тех
культур, которые более полезны и заслуживают размножения
предпочтительно перед другими.
Селекционированные дрожжи не должны обозначаться на-
званием местности, из которой они происходят. «Это почти об-
ман, так как их подлинное качество обусловлено не их проис-
хождением, как думали раньше, а другими свойствами, с про-
исхождением не связанными. Следовало бы обозначать их
названием вида; различать по назначению, например, дрожжи
для сухих вин и дрожжи для сладких; уточнить их спиртообра-
зующую способность, образование ими летучих кислот или дру-
гие характерные свойства» [154].
При помощи чистых культур могут быть достигнуты повыше-
ние содержания спирта на несколько десятых процентов объем-
123
ных и более, приятный букет в молодом вине. Однако не следу-
ет преувеличивать возможности дрожжей, которые сами не мо-
гут сообщить высокое качество вину из сусла простого сорта ви-
нограда. Обычно букет, образованный дрожжами в процессе
брожения, непрочен и исчезает после нескольких месяцев хра-
нения вина. Э. Пейно и С. Домерк поставили несколько опытов.
В условиях производства сбраживали один и тот же сок расами
вида Sacch. ellipsoideus, происходящими из различных стран, вы-
ращивающих виноград. Наблюдаемое различие в ходе броже-
ния было небольшим и не сохранилось после двух переливок.
В марте все вина оценивались одинаково или отмеченная разни-
ца не имела товарного значения [154].
Э. Пейно предлагает применять расы дрожжей вида Sacch.
oviformis для получения совершенно сухих красных и белых вин
с высоким содержанием спирта (до 13—14% об.). Дрожжи это-
го вида не придают винам особых характерных свойств, но по-
могают получать наиболее полное выбраживание сахара. Он на-
ходит целесообразным также применение холодостойких рас
дрожжей, позволяющих сбраживать весь сахар сусла при тем-
пературе около 10°С за 2—3 мес с выходом 10% об. спирта из
16 г сахара. Полученные вина обладают исключительными вку-
совыми и ароматическими свойствами, так как происходит мини-
мальная их потеря, что очень важно при выработке тонких вин.
Т. Кастелли [241] на основании подробного изучения дрожже-
вой флоры по ходу спонтанного брожения виноградных сусел в
различных районах Италии, определения систематического поло-
жения выделенных культур и изучения их свойств сделал вывод,
что нельзя пренебрегать влиянием продуктов обмена дрожжей
других родов и видов, принимающих участие в спонтанном бро-
жении виноградного сусла. Он обращает внимание исследовате-
лей на необходимость более подробного изучения свойств дрож-
жей других родов и видов, кроме Sacch. ellipsoideus, особенно
таких, как Kloeckera apiculata, разных видов рода Torulopsis,
видов Sacch. bayanus и Sacch. uvarum.
Ф. Радлер [310] рекомендует применять чистые культуры вин-
ных дрожжей на крупных винзаводах, так как благодаря этому
снижается риск неправильного хода брожения в больших объе-
мах сусла. Он считает необходимым применение чистых культур
при низкой температуре брожения, при производстве красных
вин с экстракцией красящих веществ нагреванием мезги, при
сбраживании пораженного болезнями винограда с повышенной
дозой сульфитации, сбраживании высокосахаристого сусла, до-
браживании недобродов, приготовлении игристых вин и хереса,
при сортоиспытании и т. д.
Б. Ранкин [311, 312], изучавший в Австралии свойства
98 штаммов винных дрожжей, показал, что они значительно раз-
личаются по образованию спирта, летучих кислот, глицерина,
124 уксусного альдегида. Он сообщает о том, что в виноделии Авст-
ралии применение чистых культур дрожжей увеличивается, но
еще не стало повсеместным. Человек должен, по его мнению,
управлять брожением, так как при спонтанном сбраживании воз-
можно получение вин более низкого качества и более инфици-
рованных нежелательными микроорганизмами.
М. Америн [231] на основании собственных наблюдений и ана-
лиза результатов исследований ученых других стран допускает
возможность получения вин с лучшим ароматом и букетом при
спонтанном брожении, а также при использовании определенных
смесей культур, чем на монокультурах дрожжей вида Sacch.
ellipsoideus. Но из-за непостоянства микрофлоры при спонтан-
ном брожении сусла и трудностей в селекции, сохранении и при-
менении специальных смесей культур дрожжей он рекомендует,
по крайней мере, в настоящее время, применять в коммерческом
производстве вина только отселекционированные проверенные
расы винных дрожжей.
У нас в стране «Общими правилами по переработке виногра-
да на виноматериалы», утвержденными в 1967 г., рекомендуется
брожение для всех типов вин проводить на дрожжах чистой куль-
туры [184].
М. А. Герасимов [44] отмечал следующие преимущества, ко-
торые дает• применение чистых культур дрожжей по сравнению
с самопроизвольным брожением: сусло быстрее забраживает;-
брожение протекает без замедления и остановок; сахар в сусле
полностью сбраживается; спирта в винах получается на 0,1—
1,0% об. больше; вина быстрее осветляются; дрожжи не могут
придать ординарным винам: свойства высококачественных, но
наблюдается улучшение вкуса и аромата в винах, сброженных с
применением селекционированных дрожжей.
На всех винодельческих заводах нашей страны к началу се-
зона виноделия готовят разводки чистых культур винных дрож-
жей и начинают сбраживание сусла обычно с их внесением.
На большинстве винодельческих заводов в настоящее время вино
готовится в установках непрерывного брожения и дрожжевую
разводку вносят в первый резервуар при заполнении установки.
При массовой переработке винограда и сбраживании сусла пе-
риодическим способом дрожжевую разводку для всех емкостей
не всегда применяют и сбраживают сусло после сульфитации и
отстаивания либо на спонтанной, но отселекционированной сер-
нистым ангидридом (при отстаивании сусла) микрофлоре, либо
с внесением сусла, забродившего в соседних емкостях.
Для успешного применения чистых культур дрожжей в вино-
делии необходимы разработка и применение быстрых способов
осветления сусла и освобождения его от спонтанной микро-
флоры.
Методы хранения рас Дрожжей в коллекциях. Известно, что
при длительном хранении культур дрожжей в музейных услови-
ях, отличающихся от природных и производственных, некоторые 125
их свойства ослабевают или даже утрачиваются, например, та-
кие, как способность образовывать зернистый осадок, спорообра-
зование и некоторые другие. Недавно нами было установлено,
что расы винных дрожжей, хранящиеся в музее более 25 лет,
имеют фенотип только чувствительный, в то время как среди
штаммов, недавно выделенных из производственных условий,
преобладают киллеры и нейтральные [208].
Вместо однократного отбора производственных рас дрожжей
с последующим бесконечным культивированием их в музейных
условиях В. И. Кудрявцев предложил метод непрерывно улуч-
шающего отбора рас дрожжей из производственных условий [92].
Однако непрерывно улучшать расу дрожжей, вводя ее разводку
в нестерильное сусло, опасно, так как можно потерять расу и
выделить другие штаммы дрожжей того же вида, но попавшие
в сусло с винограда или оборудования и обладающие другими
свойствами. Таким образом, это уже будет не сохранение и улуч-
шение свойств исходной музейной культуры, а селекция новой
культуры.
В музеях часто хранятся уникальные дрожжевые культуры,
например индикаторные, для определения витаминов, обладаю-
щие такими ценными свойствами, как способность образовывать
зернистый осадок, спиртовыносливость, кислотовыносливость,
холодостойкость, сульфитостойкость и т. д. Поэтому сохранение
свойств микроорганизмов в неизменном состоянии является пред-
метом постоянных забот специалистов, работающих с музейны-
ми культурами.
Во Всесоюзном научно-исследовательском институте виноде-
лия и виноградарства «Магарач» имеется большая коллекция,
состоящая из нескольких сот рас дрожжей-сахаромицетов, выде-
ленных в различных винодельческих районах Советского Союза
и в зарубежных странах. Есть культуры, например Штейнберг
1892 г., выделенйые в прошлом веке и с тех пор хранящиеся все
время в музее, и есть расы дрожжей, выделенные в последние
годы из самопроизвольно бродящего виноградного сусла, шам-
панского и хересного производства. Все культуры раз в четыре
месяца пересевают в пробирки со стерильным виноградным сус-
лом, которое расы дрожжей сбраживают, и затем хранят их в
вине в пробирках, закрытых ватными пробками, при температу-
ре 10—15°С. В некоторых музеях дрожжи хранят в стерильной
дистиллированной воде, в 10%-ном водном растворе сахарозы,
на солодовом сусло-агаре, в лиофильно-высушенном состоянии,
под слоем стерильного вазелинового масла [231, 262]. Расы дрож-
жей для шампанского производства хранят в вине (на тиражной
смеси) под давлением СОг при пониженной температуре [174],
Нами было проведено сравнение основных свойств культур дрож-
жей, хранившихся в течение 15 лет в музейных условиях, раз-
ными, способами: в виноградном сусле, на солодовом сусло-агаре
126 с пересевами 1 раз в четыре месяца, в лиофильно-высушенном
состоянии, в виде спор на 2 %-ном водном агаре с добавлением
0,14% уксуснокислого натрия в запаянных ампулах при темпе-
ратуре 10°С без пересева. Определялись энергия брожения и ды-
хания, скорость и полнота сбраживания сахаров в виноградном
сусле (17 и 27,6%), сульфитостойкость, дегидрогеназная актив-
ность. Показано сохранение этих свойств культур примерно в
одинаковой степени при разных способах хранения [30J.
Возможно, время хранения разными способами было недоста-
точным для заметного изменения свойств культур и следует про-
вести сравнение этих же и других свойств через 30—50 лет, что-
бы отобрать метод, позволяющий наиболее долго сохранять важ-
ные производственные свойства рас дрожжей в неизменном со-
стоянии.
Дрожжи для первичного виноделия
Необходимые условия для успешного применения чистых
культур дрожжей. При спонтанном брожении сусла неизбежны
случайности: получение недобродов, большая инфицированность
вин, меньшее содержание в винах спирта, большее — летучих
кислот, более медленное осветление, чем при сбраживании сус-
ла с применением чистых культур дрожжей. Чтобы избежать
случайностей при брожении, в виноградное сусло вносят развод-
ку чистой культуры дрожжей-сахаромицетов. Чтобы брожение
прошло на чистой культуре дрожжей, необходимо соблюдать
следующие условия:
осветление сусла проводить так, чтобы количество дрожжей
в нем значительно уменьшалось, а не увеличивалось;
применять конкурентоспособные расы дрожжей;
дрожжевую разводку вносить в сусло в стадии бурного бро-
жения и в достаточном количестве;
быстро перемешивать внесенную дрожжевую разводку со всей
массой сусла, поступившего после отстаивания на брожение.
Свежий виноградный сок в первые дни сбора винограда обыч-
но содержит в 1 мл от 1000 до 100 тыс. клеток различных дрож-
жей, Позже, при массовой переработке винограда, их количество
часто возрастает до 1 млн./мл.
Разводка чистой культуры дрожжей, приготовленная на ви-
ноградном сусле, в стадии бурного брожения обычно содержит
дрожжевых клеток 100—150 млн./мл. При внесении 2% (по объ-
ему) разводки в сусле будет содержаться около 2—3 млн./мл
клеток чистой культуры дрожжей. Для обеспечения сбражива-
ния сусла на внесенной расе дрожжей необходимо, чтобы коли-
чество ее клеток в сусле было примерно в 10 раз больше, чем
содержалось дрожжей в сусле до внесения дрожжевой разводки.
Значит в сусле должно быть дрожжей не более 200—300 тыс./мл.
Нам удалось уменьшить содержание дрожжей в сусле
(в 1 мл) с 1 млн. 360 тыс. до 78 тыс. при отстаивании сусла с ох- 127
лаждением до 10°С и сульфитацией с применением сернистой
кислоты в количестве 100 мг/л. В сусло без отстаивания и после
отстаивания было внесено по 2% дрожжевой разводки расы ви-
да Sacch. oviformis. Отбор проб в процессе брожения и по окон-
чании выбраживания сусла с определением в них количества
дрожжей видов Sacch. vini и Sacch. oviformis показал, что в сус-
ле с отстаиванием брожение прошло на чистой культуре дрож-
жей (ее было 98% от общего количества клеток), а в сусле без
отстаивания брожение прошло на дрожжах сусла вида Sacch.
vini (дрожжи чистой культуры были обнаружены только в ко-
личестве 4 %).
Таким образом, было показано, что успех применения одной
и той же культуры дрожжей зависит от соотношения между вне-
сенным количеством клеток определенной расы дрожжей и дрож-
жей сусла [203].
Обычно нецелесообразно вносить большое количество дрож-
жевой разводки (5—10%), особенно при сбраживании сусла без
охлаждения, так как брожение будет очень бурным со всеми не-
желательными последствиями. Поэтому для успешного примене-
ния чистых культур дрожжей в виноделии необходимо получать
сусло с меньшим количеством дрожжей. Для этого виноград пос-
ле сбора необходимо быстро перерабатывать, а полученное сус-
ло сразу осветлять для уменьшения содержания в нем взвешен-
ных частиц и микроорганизмов.
В США для осветления сусла используют мощные фильтра-
ционные установки, оборудованные центрифугами, или проводят
отстаивание сусла при температуре 4°С 12—14 ч, а затем освет-
ленное сусло перекачивают на брожение, которое ведут на чис-
тых культурах дрожжей [134].
В большинстве винодельческих стран сусло отстаивают без
охлаждения с применением сернистой кислоты, которая при пра-
вильно выбранной дозировке прекращает размножение слабо
бродящих дрожжей, задерживает размножение сахаромицетов и
предохраняет сусло от окисления. Однако сусло из разных рай-
онов и сортов винограда в разной степени связывает свободную
сернистую кислоту, обладающую антисептическим действием.
Поэтому при сульфитации одинаковыми дозами сернистой кис-
лоты иногда сусло может быть пересульфитированным с высо-
ким содержанием свободной SO2, в результате чего в нем поги-
бают и винные дрожжи, а иногда эти же дозы оказываются не-
достаточными для задержки размножения дрожжей и оно
начинает забраживать во время отстаивания. Особенно часто
наблюдается забраживание сусла при отстаивании в случаях
плохого перемешивания и неравномерного распределения сер-
нистой кислоты во всем его объеме. Внесение дрожжевой раз-
водки в сусло, в котором уже начали размножаться дрожжи сус-
ла, не Позволяет провести его сбраживание на чистой культуре
128 дрожжей. . --р - • ч
Для успешного применения чистых культур дрожжей необ-
ходимо осветлять сусло на мощных фильтрационных установках,
оборудованных центрифугами, либо применять флокулянты, спо-
собствующие быстрому и хорошему осветлению сусла и сокра-
щению срока его отстаивания, либо использовать холод во время
отстаивания.
Применяемая чистая культура дрожжей должна быть кон-
курентоспособна. К сбраживанию виноградного сусла более дру-
гих приспособлены дрожжи вида Sacch. vini. Поэтому следует
выбирать расы дрожжей для сбраживания виноградного сусла
среди дрожжей этого вида. Опыты по совместному внесению
чистых культур дрожжей видов Sacch. vini и Sacch. oviformis
для сбраживания виноградного сусла в потоке показали, что
Sacch. vini вытесняют Sacch. oviformis вследствие большей при-
способленности к жизнедеятельности в виноградном сусле.
Чистые культуры дрожжей, применяемые в виноделии, что-
бы быть конкурентоспособными, должны быть сульфитостойки-
ми. Нами была определена сульфитостойкость 454 музейных
культур дрожжей-сахаромицетов и 80 штаммов, выделенных в
сезон виноделия 1973 г. Из данных табл. 28 видно, что среди
штаммов винных дрожжей, недавнр выделенных в производст-
венных условиях, процент сульфитостойких выше, чем среди му-
зейных. В производственных условиях происходит селекция
дрожжей, более приспособленных к сбраживанию сусла, содер?
жащего сернистую кислоту.
Проведенные нами опыты по внесению в нестерильное сусло,
содержащее 30 мг/л свободной сернистой кислоты, одинаковых
количеств дрожжевых разводок рас, имеющих разную сульфи-
тостойкость, показали, что только сульфитостойкие расы дрож-
жей быстро размножились в сусле и процесс брожения осуще-
ствлялся этими дрожжами. Внесение же рас дрожжей менее
сульфитостойких, которые медленнее размножались в сульфити-
рованном сусле, оказалось бесполезным, и брожение проходило
на дрожжах сусла. Чтобы отличить внесенную расу дрожжей от
винных дрожжей сусла, были использованы расы, имеющие фе-
нотипы киллер (Л), нейтральный (N) и чувствительный (S).
Таблица 28
Культуры винных дрожжей Количество исследован- ных штам- мов Количество культур (в %), размноживших- ся при содержании свободной сернистой кислоты в сусле, мг/л
90 150
Музейные .454 14 5
Выделенные в 1973 г. в про- 80 . 55 32
изврдственных условиях - 129
Применение рас дрожжей определенных фенотипов (К, N или S)
Позволяет контролировать, в какой степени разные расы дрож-
жей овладевают средой [206]. Для этого определяют процентное
содержание дрожжей фенотипов К, N, S в спонтанно сбраживае-
мом сусле (контроль) и в отстоенном сусле, забродившем после
внесения в него разводки чистой культуры дрожжей определен-
ного фенотипа.
К числу наиболее сульфитостойких музейных чистых культур
дрожжей вида Sacch. vini относятся расы 47-Л, 5-N, 27В S, Хо-
лодостойкая 1898 г., раса 7, Перлыпаум, Креман, Кахури 7, Рка-
цители 6, Ужгород 192, Романешты 47, Пино 5, Тербаш, Кара
Узюм, Ашхабадская 3.
Интересно отметить, что среди сульфитостойких дрожжей ока-
зались расы дрожжей Холодостойкая, выделенная в 1898 г.,
Перлыпаум и Креман, хранящиеся в течение многих десятиле-
тий в музее на виноградном сусле без сернистой кислоты. Они
без пассажей в сульфитированном сусле быстрее многих других
музейных рас дрожжей размножаются в сусле, содержащем 90
и 150 мг/л свободной сернистой кислоты.
Среди сульфитостойких дрожжей вида Sacch. vini расы, имею-
щие фенотип киллер (К) или нейтральный (N), более конкурен-
тоспособны, чем имеющие фенотип чувствительный (S).
Для сбраживания сусла при высоких температурах более кон-
курентоспособными будут термовыносливые расы дрожжей, при
низких температурах — холодостойкие и т. д.
Рекомендуемые расы дрожжей для разных условий брожения
приведены выше (см. табл. 27). В связи с имеющимися данными
о большой приспособленности дрожжей вида Sacch. uvarum к
размножению и сбраживанию сусла при низких температурах
[22] указаны культуры дрожжей и этого вида.
Таким образом, необходимо управлять процессом спиртово-
го брожения, используя различные отселекционированные чистые
культуры дрожжей наряду с применением различных технологи-
ческих приемов.
Приготовление дрожжевой разводки. Чистые культуры дрож-
жей обычно рассылают на винодельческие заводы в пробирках
на солодовом скошенном сусло-агаре.
Иногда их рассылают в лиофилизированном или отпрессован-
ном состоянии [231, 325].
Приготовление дрожжевой разводки сводится к постепенно-
му наращиванию массы активных клеток чистой культуры дрож-
жей, достаточной для сбраживания поступающих на брожение
виноградного сусла или мезги.
С плотной питательной среды дрожжи пересевают в пробир-
ку со стерильным виноградным суслом и после бурного забра-
живания переносят в колбу с 0,5—1 л стерильного сусла, закры-
тую ватной пробкой. Затем дрожжи пересевают во все возрас-
130 тающие объемы пастеризованного и охлажденного сусла: 10 л,
30 дал и т. д. Каждый последующий пересев производят по до-
стижении бурного брожения в предыдущей емкости.
В активной дрожжевой разводке должно содержаться 100—
150 млн. клеток в 1 мл, 30—50% почкующихся клеток и не бо-
лее 5% мертвых. Дрожжевую разводку вносят в сусло, подле-
жащее сбраживанию, в количестве 1—3%, а в мезгу — 3—5%.
Небольшие порции сусла для приготовления дрожжевой раз-
водки нагревают в кипятильнике Коха до кипения. После охлаж-
дения отфильтровывают через двойной слой марли или бумаж-
ный фильтр и разливают в колбы и баллоны на 2/з их объема.
Закрывают ватными пробками, стерилизуют в кипятильнике Ко-
ха, а при его отсутствии — на водяной бане 30 мин с момента
закипания воды в бане.
Для приготовления дрожжевой разводки в больших количе-
ствах стерильное сусло можно получить заполнением подготов-
ленных для этой цели емкостей горячим суслом при температу-
ре 70—80°С непосредственно из пастеризатора. При отсутствии
пастеризатора сусло заливают в емкости на 2/з, нагревают ост-
рым паром и кипятят в течение 20 мин.
Ввиду того что винодельческие заводы нуждаются в больших
количествах разводки чистых культур дрожжей, разработан про-
ект установки непрерывного действия из двух секций. Первая
выполняет функцию аэробного дрожжерастильного аппарата, а
во второй создаются анаэробные условия [276].
Для равномерного и быстрого распределения дрожжевой раз-
водки во всем объеме сусла, поступающего на брожение после
отстаивания, целесообразно вначале вносить разводку в ем-
кость, предназначенную для брожения, а затем заполнять ее
суслом.
Наши опыты с внесением дрожжевой разводки в нижнюю
часть емкости до заполнения ее суслом или сверху после запол-
нения суслом показали, что в первом случае чистая культура со-
ставила 95—99% дрожжевой флоры бродящего сусла, а во вто-
ром только 21—36% [203].
Дрожжи для шампанского производства
Бутылочный метод производства шампанского. Дрожжи при
производстве шампанского находятся в более трудных услови-
ях, чем при сбраживании виноградного сусла. Они должны на-
чинать размножаться при относительно низких температурах
(10—12°С) в вине, содержащем 10—12% об. спирта, 80—120 мг/л
общей сернистой кислоты и обедненном некоторыми питатель-
ными веществами и факторами роста при первичном брожении.
Отобранные дрожжи должны образовывать зернистый осадок,
легко отстающий от внутренних стенок бутылок и переходящий
на пробку при ремюаже без образования масок, полностью сбра- 131
живать сахара в вине при высоких концентрациях углекислоты
и этилового спирта, при величине pH среды 2,8—3,2.
В Шампани чистые культуры дрожжей при тираже стали
применять с 1900 г., используя расы Шампань Аи, Верзней, Кре-
ман. Г. Шандрль рекомендовал выделенную им холодостойкую
расу Шампань Эперне [223].
А. М. Фролов-Багреев — основоположник технологии Совет-
ского шампанского, придавал большое значение подбору рас
дрожжей для производства шампанского и подчеркивал, что раз-
витие тонкого букета вина зависит не только от сорта винограда,
но и от культуры дрожжей. Он рекомендовал для производства
шампанского бутылочным методом расу Штейнберг 1892 г., ко-
торая позволяла в то время получать хорошие результаты при
брожении и ремюаже.
Практика показала, что расы дрожжей, выделенные несколь-
ко, десятков лет назад и хранящиеся в музейных условиях, по-
степенно теряют свою способность давать зернистые осадки.
Поэтому периодически проводился отбор дрожжей в условиях
производства. Так, И. М. Рябченко получил расу Кахури 7, ко-
торая долгое время применялась для бутылочной шампаниза-
ции [171].
В течение ряда лет селекцией дрожжей, дающих зернистые
осадки, занималась Н. Ф. Саенко. Была проведена паспортиза-
ция рас дрожжей, налажены централизованное снабжение шам-
панских заводов чистыми культурами дрожжей и периодическая
проверка свойств культур, применяемых на заводах. Вместо хра-
нения шампанских дрожжей в виноградном сусле предложено
хранить их в условиях, близких к производственным,— на тираж-
ном вине при низкой температуре [174].
Г. И. Мосиашвили обратил внимание на диссоциацию шам-
панских музейных рас Кахури 5, Штейнберг 1892 г. на гладкие
(S) и шероховатые (7?) формы. Изучение их свойств доказало
целесообразность отбора /?-форм для шампанизации вина буты-
лочным способом, так как они образуют крупнозернистые, быст-
ро отделяющиеся осадки, лучше сбраживают сахар при низких
температурах [115].
3. Д. Рабинович показала, что расы Кахури 7 и Шампан-
ская 7 тоже находятся в состоянии диссоциации, состоят из по-
пуляций шероховатых и гладких форм. Они образуют шерохова-
тые и гладкие колонии при росте на плотной питательной среде
и неоднородный осадок, состоящий из зернистой и пылевидной
частей, при размножении в вине. На стенках бутылок возникают
как твердые, так и смываемые маски, являющиеся браком шам-
панского. Было установлено, что гладкие формы дрожжей обра-
зуют пылевидные осадки, медленно переводимые на пробку.
В процессе ремюажа они, как правило, образуют смываемую
маску, что объясняется гидрофильным характером поверхности
132 их клеточной оболочки. Поэтому на заводах бутылочного' мето-
да шампанизации необходим систематический отбор шерохова-
тых форм дрожжей, образующих однородный зернистый осадок,
легко переводимый на пробку. Однако иногда шероховатые ва-
рианты образуют твердые несмываемые маски в результате проч-
ного прилипания к стеклу, одной из причин которого является
гидрофобный характер их клеточной поверхности [146]. Для пред-
отвращения возникновения твердых масок успешно применен
метод оклейки тиражной смеси бентонитом [175].
В настоящее время расы дрожжей, применяемые в производ-
стве Советского шампанского, ежегодно проверяются Отрасле-
вой научно-исследовательской лабораторией технологии игрис-
тых вин. Применение дрожжей, не проверенных указанной ла-
бораторией, запрещено.
Приготовление дрожжевой разводки и шампанизация тираж-
ной смеси проводятся в соответствии с «Технологическими ин-
струкциями по производству и контролю качества Советского
шампанского» [193].
Резервуарный метод шампанизации. Для шампанизации вина
резервуарным периодическим способом желательно, чтобы
дрожжи обладали способностью давать крупнозернистый оса-
док, способствующий быстрому осветлению вина и улучшению
фильтрации. Для шампанизации вина в непрерывном потоке ре-
комендуются дрожжи, образующие пылевидные осадки [181].
Нами была показана большая приспособленность дрожжей
вида Sacch. oviformis к жизнедеятельности в условиях шампан-
ского производства, чем дрожжей вида Sacch. vini, и установле-
но вытеснение рас Штейнберг 1892 г. и Ркацители 6 вида Sacch.
vini дрожжами вида Sacch. oviformis [204].
В настоящее время для процесса шампанизации вина резер-
вуарным периодическим способом и в непрерывном потоке ис-
пользуют отселекционированные расы дрожжей вида Sacch. ovi-
formis (по систематике Лоддер— Sacch. bayanus), и процесс
проходит на дрожжах этого вида [55].
Большой вклад в разработку способов приготовления дрож-
жевой разводки для шампанизации вина резервуарными метода-
ми сделал Н. Г. Саришвили. Им показано, что дрожжи в усло-
виях непрерывного культивирования находятся в состоянии вы-
сокой физиологической активности. Была предложена и внедрена
промышленная установка для производства чистой культуры
дрожжей в непрерывном потоке с автоматизацией процесса
[179]. Позднее были оптимизированы следующие условия куль-
тивирования: интенсивность массообмена (аэрация и перемеши-
вание среды), температура, содержание сахара и аммиачного
азота в среде. Результатом этих исследований явилась разработ-
ка способа культивирования дрожжей не в батарейной, а в од-
ноемкостной системе с постоянным содержанием сахара 0,4—
0,6%. Высокий массообмен в среде, создаваемый интенсивным
перемешиванием и аэрацией, позволяет получать дрожжевую 133
разводку, в которой содержится 300—500 млн. клеток дрожжей
в 1 мл. Затем дрожжевую разводку концентрируют и направ-
ляют в активатор, где дрожжи в условиях сверхвысокой их кон- ,
центрации при температуре 4—Ю°С и повышенном давлении пе-
рестраивают свой обмен с дыхания на брожение, происходит под-
готовка к условиям шампанизации [20]. Предлагаемый способ
культивирования дрожжей позволяет повысить производитель-
ность дрожжевых установок, получать дрожжевую разводку в
состоянии высокой физиологической активности и в количестве,
способствующем интенсификации процесса производства шам-
панского.
Дрожжи для производства хереса
Пленочный способ производства хереса. Дрожжи, используе-
мые для хересования вин пленочным методом, должны быть
спиртовыносливыми и способными к быстрому размножению и
образованию пленки на поверхности вина, содержащего 16,5% об.
спирта. Такое высокое содержание спирта необходимо для
предохранения вина, длительно находящегося в не полностью за-
полненных емкостях, от размножения на его поверхности уксус-
нокислых бактерий и пленчатых дрожжей.
Наибольшей спиртовыносливостыо обладают дрожжи вида
Sacch. oviformis, поэтому целесообразно чистые культуры дрож-
жей для производства хереса отбирать среди штаммов этого-
вида.
Вино херес первоначально получали в результате спонтанно-
го сбраживания высокосахаристых сусел, появления дрожжевой
пленки на поверхности сухих вин, содержащих более 14% об.
спирта, и последующей выдержки вина под пленкой в неполных
бочках. Испанские виноделы полагали, что на поверхности вина
в этом случае размножались обычные пленчатые дрожжи Myco-
derma.
Первым, кто доказал, что хересные дрожжи принадлежат к
роду Saccharomyces, был А. М. Фролов-Багреев. Им были изу-
чены дрожжи пленки, привезенной в 1908 г. из Испании в Ма--
гарачскую энохимическую лабораторию, и установлено, что онигз
в отличие от микодермы образуют споры и сбраживают вино*;
градное сусло с накоплением до 17,57% об. спирта при высокой!»
исходной сахаристости сусла. j
В 1913 г. М. А. Ховренко вторично была привезена из Испа*|
нии хересная пленка. При ее изучении подтвердились данные, по-1
лученные А. М. Фроловым-Багреевым. М. А. Ховренко и Б. И. Ба*й
бенко отнесли хересные дрожжи к новому виду—Sacch. chere-|
sanus и обратили внимание на накопление альдегидов в вине;
под пленкой хересных дрожжей. г|
В 1930 г. хересная пленка была привезена из ИспанииI
134 М. А. Герасимовым и подробно изучена И. Ф. Саенко. Было пен!

шт
казано, что пленка состоит из штаммов-сахаромицетов, обладаю-
щих разной пленкообразующей и альдегидообразующей способ-
ностью. Н. Ф. Саенко было выделено в чистую культуру не-
сколько рас и отобрана лучшая Херес 20-С, которая нашла
широкое применение на заводах Советского Союза [178].
В 1931 г. Н. Н. Простосердов и Р. Л. Африкян обнаружили
в Армении на винах в неплотно закрытых кувшинах пленки, об-
разованные дрожжами, аналогичными испанским хересным
дрожжам. Авторы дали им новое название Sacch. cheresiensis
armeniensis. Так впервые было доказано, что хересные дрожжи
имеются в винах других стран.
Испанский исследователь Марсилла в 1936 г. предложил для
хересных дрожжей новое видовое название Sacch. beticus. Одна-
ко это обозначение вида, часто используемое и в Калифорнии, не
было принято повсеместно [231].
В систематике дрожжей В. И. Кудрявцева [90] хересные дрож-
жи отнесены к виду Sacch. ovilormis var. cheresiensis — новому
варианту, предложенному автором на том основании, что херес-
ные дрожжи быстрее остальных дрожжей этого вида образуют
пленку на поверхности вина, содержащего более 14% об. спир-
та, и увеличивают в нем содержание альдегидов.
Многие штаммы дрожжей-сахаромицетов разных видов, в том
числе и Sacch. vini, способны образовывать пленки на поверх-
ности столового вина, окисляя при этом спирты до альдегидов,
а не до СОг и воды, как это делают пленчатые дрожжи [178].
Однако при обычной спиртуозности столовых вин на их поверх-
ности могут одновременно размножаться пленчатые дрожжи и
уксуснокислые бактерии. Поэтому, чтобы получить херес, а не
больное вино, нужно создать элективные условия для размноже-
ния только дрожжей-сахаромицетов. Их создают спиртованием
столового виноматериала, на поверхности которого могут раз-
множаться только спиртовыносливые расы дрожжей вида Sacch.
oviformis.
Большинство рас дрожжей, выделенных Н. Ф. Саенко из ис-
панской хересной пленки, даже лучшая из них Херес 20-С, не
росли при концентрации спирта в вине выше 15% об. или росли
очень медленно. В результате адаптации к спирту в вине с по-
степенно повышающейся концентрацией спирта под пленкой в
специальном культиваторе Н. Ф. Саенко удалось получить спир-
тоустойчивый штамм Херес 96-К, дающий быстрый рост на ви-
не с содержанием спирта 16—17% об. Эта раса дрожжей нашла
широкое применение на заводах Советского Союза, производя-
щих херес. Спиртовыносливые расы хересных дрожжей были вы-
делены в Узбекистане А. В. Шахсуварян [225], в Армении —
Е. С. Унанян [210].
Приготовление разводки чистой культуры хересных дрожжей
для пленкования вина, биохимические изменения состава вина
при выдержке его под пленкой и технология приготовления хе-
135
реса в различных странах подробно описаны Н. Ф. Саенко
[178, 39].
Беспленочный способ хересования вина. В различных вино-
дельческих районах нашей страны неоднократно отмечалось по-
явление хересного тона в винах при выдержке их с доступом
воздуха на дрожжевых осадках без образования пленки.
Ряд ученых занимались исследованием причин появления в
вине без пленки хересного тона и давали противоречивые объ-
яснения этому явлению. Так, А. М. Шумаков полагал, что в этом
случае дрожжи размножаются на поверхности дрожжевого осад-
ка и все расы дрожжей могут придать винам хересный тон [227].
А. М. Диланян микроскопировала дрожжевые осадки в процес-
се выдержки вина и не зафиксировала размножения на них
дрожжей. Появление же хересного тона в винах, содержащих бо-
лее 14% об. спирта, она наблюдала при выдержке вин на дрож-
жевых осадках не всех рас, а только некоторых «хересующих»
[53].
Г. Г. Агабальянц и В. М. Лоза считали, что раса дрожжей не
имеет значения. Причиной появления хересного тона в винах,
выдерживаемых на дрожжевых осадках без пленки с доступом
воздуха, является окислительный автолиз дрожжей [99].
Г. В. Курганова считает, что альдегидообразование при бес-
пленочном методе хересования вина происходит как за счет жиз-
недеятельности дрожжей, так и в результате действия растворен-
ной алкогольдегидрогеназы, перешедшей из дрожжей в вино [93].
В связи с такими разными мнениями по вопросу о роли рас
дрожжей в процессе получения вина типа хереса беспленочным
методом необходимо было выяснить, зависит ли образование аль-
дегидов и появление хересного тона от расы дрожжей и нужны
ли для этого процесса живые дрожжи. Для выяснения этих во-
просов нами было проведено сбраживание стерильного вино-
градного сусла на 68 расах дрожжей вида Sacch. oviformis и
16 расах вида Sacch. vini. Брожение сусла и последующую вы-
держку виноматериалов на дрожжевых осадках проводили в те-
чение 5 мес при температуре 18—20°С в колбах, заполненных на
70% их объема и закрытых пробками с отверстиями, в которые
были вставлены стеклянные трубки с клапанами Бунзена. Опы-
ты с каждой расой дрожжей проводили в четырех повторностях.
В две колбы каждого варианта по окончании брожения спирт не
добавляли, и его содержание равнялось 12,4% об., а в двух дру-
гих содержание спирта доводили до 15,5% об. Через 5 мес во
всех опытных образцах было определено содержание альдеги-
дов. При этом было установлено, что образцы виноматериала,
выдержанного в одинаковых условиях на осадках дрожжей раз-
ных рас, значительно различаются по содержанию альдегидов.
Так, при выдержке виноматериала с содержанием спирта
12,4% об. на дрожжевом осадке дрожжи 33 рас образовали более
136 500 мг/л альдегидов, а 16 рас — менее 100 мг/л, остальные ра*
www.ovme.ru
сы — от 100 до 500 мг/л альдегидов. При выдержке на осадке
виноматериала, спиртованного до 15,5% об., только 7 рас (из
них две расы были хересные и дали пленки) образовали более
500 мг/л альдегидов, а 38 рас — менее 100 мг/л.
В табл. 29 приведено содержание альдегидов в виноматериа-
лах, полученных брожением и выдержкой на осадке дрожжей
нескольких рас видов Sacch. oviformis и Sacch. vini.
Определение наличия живых дрожжрй в осадках, сделанное
методом посева, позволило установить, что образование альде-
гидов проходило при выдержке только на тех осадках, в которых
были живые дрожжевые клетки. У дрожжей всех рас определя-
лась спиртовыносливость по скорости забраживания вина, со-
держащего 2% сахара и 13 или 15% об. спирта.
Сопоставление полученных данных позволяет сделать вывод
о том, что значительное количество альдегидов накапливается
только в виноматериалах, выдерживаемых на дрожжевых осад-
ках рас, обладающих высокой спиртовыносливостью, а в связи
Таблица 29
Раса дрожжей Выживаемость рас дрожжей и образование альдегидов через 5 мес выдержки вина на дрожжевых'осад- ках с доступом воздуха при содер- жании спирта, % об. Спиртовыносливость рас дрожжей (в сутках, на которые забродило вино) при содержании спирта, % об.
12,4 15,5 12,4 15,5 13,0 15,0
содержание альдегидов, мг/л наличие живых дрожжей
Sacch. oviformis
Киевская 733 698 4* 4- 7 12
Бастардо 1965 684 685 + 4- 7 12
Гибрид 217 590 545 4- 4- 7 12
Магарач 17-35 789 461 4- 4- 7 18
Херес 96-К 568 660 4- пленка 4- пленка 9 12
Херес 20-С 701 654 4-пленка 4- пленка 14 17
Харьковская 42 36 — — 44 Не забродило
Токай 22 29 33 — — 44 54
Л-2 27 27 S acch. vini — 54 64
Шампанская 7-10-С 464 64 4- — 9 82
Кахури 7 591 60 4- .—. 12 Не забродило
Штейнберг 1892 г. 25 27 —. —— не забро- дило »
Шампань Аи 32 29 — - — 54 »
Феодосия 1-19 29 37 — не забро- дило »
Примечание. (44—наличие; (—)— отсутствие живых клеток дрожжей в
осадках. i
137
с этим сохраняющих жизнедеятельные клетки. В виноматериа-1
лах, выдерживаемых на дрожжевых осадках, в которых не было
живых клеток, накопления альдегидов не происходило. Необхо-
димо отметить, что среди дрожжей видов Sacch. oviformis и
Sacch. vini можно отобрать расы с разной спиртовыносливостью,
с разной выживаемостью и способностью образовывать альдеги-
ды в винах при выдержке на дрожжевых осадках с доступом
воздуха. Даже при содержании в виноматериалах 12,4% об.
спирта не все расы дрожжей образовывали альдегиды в вине.
Некоторые же расы вида Sacch. oviformis накопили много альде-
гидов даже при содержании спирта 15,5% об. без образования
пленки.
Для выяснения предельных концентраций спирта, до которых
можно спиртовать виноматериалы при выдержке их на дрожже-
вых осадках наиболее спиртовыносливых рас дрожжей, нами
были отобраны расы Киевская, Бастардо 1965, Гибрид 217 и Ма-
гарач 17-35 и в качестве контроля Херес 96-К. По окончании бро-
жения содержание альдегидов в виноматериалах было соответ-
ственно (в мг/л): 44,5; 56,7; 46,5; 52,9. и 59,1.
Спиртование виноматериалов проводили на дрожжах до со-
держания в них спирта (в % об.): 15,75; 16,00; 16,55 и 17,10. Вы-
держивали их в таких же условиях, как и в предыдущем опыте.
Через 3 мес были сделаны высевы дрожжей и определено содер-
жание альдегидов (табл. 30).
В образцах с расами дрожжей Киевская и Магарач 17-35 бы-
ло подсчитано общее число клеток дрожжей в 1 мл виномате-
риала после перемешивания его с осадком и определено количе-
ство живых клеток путем посева. Через 3 мес после выдержки в
виноматериалах с содержанием спирта 15,75% об. еще сохрани-
лись в жизнеспособном состоянии 1,5—1,8% дрожжей, что со-
ставляло 2—3 млн. клеток в 1 мл вина. При содержании спирта
16,0—16,5% об. живые дрожжи содержались в количестве 300—
Таблица 30
Раса дрожжей Выживаемость и образование альдегидов в виноматериале, выдержанном 3 мес на дрожжевых осадках при содержании спирта, % об.
15,75 16,00 16,55 17,10
Киевская 605+ 580+ 516+ 132—
Бастардо 1965 567+ 556+ 567+ 128—
Гибрид 217 587+ 528+ 459+ 116—
Магарач 17-35 437+ 457+ 375+ 257+
Херес 96-К Пленка, Пленка, Пленка, Пленка,
646+ 558+ 506+ 330+
Примечание. (+) — наличие; (—) — отсутствие роста в высевах из дрожж<
вых осадков в виноградное сусло.
600 тыс. в 1 мл вина, а при 17,1% об. спирта живые клетки были
обнаружены в количестве 200 тыс. в 1 мл у расы Магарач 17-35,
раса же Киевская погибла.
Хересование вина, спиртованного до 16,5% об., беспленочным
методом, проведенное в бочках в производственных условиях на
расах Киевская, Магарач 17-35 и Токай 22, подтвердило влияние
расы дрожжей. При выдержке вина на дрожжевом осадке расы
Токай 22 содержание альдегидов не увеличилось (по окончании
брожения сусла их было 108,8 мг/л, после выдержки стало
116,0 мг/л).
После выдержки в тех же условиях на дрожжевых осадках
рас Киевская и Магарач 17-35 образовалось 343 и 466 мг/л аль-
дегидов и в вине появился хересный тон.
Таким образом, для получения хереса беспленочным методом
целесообразно сбраживать сусло на расах вида Sacch. oviformis,
обладающих высокой спиртовыносливостью. Образование зна-
чительных количеств альдегидов при этом методе хересования
происходит только при выдержке на осадках, содержащих жи-
вые клетки дрожжей. Применение рас Магарач 17-35 и Киевская
позволяет спиртовать виноматериалы на дрожжевых осадках не
до 14,5% об., как рекомендовалось ранее, а до содержания в них
спирта 16% об. При выдержке виноматериалов на дрожжевых
осадках при более высокой спиртуозности можно проводить про-
цесс чище с микробиологической точки зрения, так как при этом
не происходит размножение уксуснокислых бактерий, пленчатых
дрожжей и задерживается размножение молочнокислых бак-
терий.
Глубинный способ производства хереса. Классический спо-
соб производства хереса (пленочный) трудоемкий и малопроиз-
водительный. Для ускорения окислительных процессов во мно-
гих отраслях технической микробиологии получил широкое при-
менение метод глубинного культивирования микроорганизмов с
аэрацией среды, при котором реакции окисления и биосинтеза
значительно ускоряются в результате увеличения поверхности
соприкосновения клеток культуры со средой путем перемеши-
вания.
Впервые на возможность применения метода погруженных
культур в виноделии для ускорения первой стадии хересова-
ния— альдегидообразования — указал М. А. Тер-Карапетян
[192].
С. Оуг и М. Америк установили, что скорость образования
альдегидов находится в прямой зависимости от скорости роста
дрожжевой культуры [288]. Корреляцию между количеством
функционирующих клеток и накоплением альдегидов заметили
А. А. Мартаков и В. А. Колесников [105].
Т. С. Цыб изучала альдегидообразующую способность куль-
тур нескольких рас дрожжей видов Sacch. vini — Серсиалъ 14,
Феодосия 1-19; Sacch. oviformis — Берегово 1, Ленинградская 139
Таблица 31
Вид и раса дрожжей рода Saccharomyces Образование альдегидов при аэрации вина с содержанием спирта, % об. Окислительная активность (10~9 мг)* вина с содержанием спирта, % об.
12,8 15,3 12,8 15,3
Sacch. vini
Серсиаль 14 305 225 5,8 5,4
Феодосия 1-19 380 215 5,7 5,2
Sacch. oviformis
Берегово 1 480 463 10,0 9,8
Ленинградская (шамп.) 421 403 10,7 10,6
Херес 96-К 477 446 10,4 10,2
Sacch. cerevisiae
Ленинградская (пе- 137 83 2,0 2,2
карская)
X11 раса 160 91 2,4 2,0
* Количество альдегидов в миллиграммах, продуцируемое одной дрожжевой
клеткой за сутки.
(шампанская раса), Херес 96-К; Sacch. cerevisiae — Ленинград-
ская (пекарская раса) и XII раса при аэрации и перемешивании
вина в течение 5 сут [220].
Из данных табл. 31 видно, что наиболее высокой окислитель-
ной активностью обладают дрожжи вида Sacch. oviformis при
культирировании их в вине с содержанием спирта 12,8 и 15,3% об.
У рас дрожжей вида Sacch. vini в 2 раза, а у Sacch. cerevisiae —
в 5 раз меньше окислительная активность по сравнению с дрож-
жами вида Sacch. oviformis.
Альдегидообразующая способность изученных рас дрожжей
вида Sacch. oviformis одинакова в вине при концентрации спир-
та 12,8 и 15,3% об., а дрожжи вида Sacch. vini в конце опыта
образовали в вине с 15,3% об. спирта в 1,5 раза меньше альде-
гидов, чем в вине с 12,8% об. Это обуслрвлено их меньшей спир-
тоустойчивостью. Размножение расы дрожжей этого вида задер-
живается при содержании спирта 15,3% об. без снижения окис-
лительной активности. Изучение скорости размножения дрожжей
показало, чтр к концу опыта общее количество клеток у рас дрож-
жей Серсиаль 14 и Феодосия 1-19 было в 1,5 раза меньше, чем,
у рас дрожжей вида Sacch. oviformis.
Таким образом, было установлено, что различные расы и ви-
ды дрожжей в условиях аэрации и перемешивания вина облада-
ют разной скорость^) накопления биомассы и альдегидов. Дока-
зана целесообразность использования дрожжей вида Sacch. ovi-
140 formis Tpw производства хереса глубинным способом. Обычно
для хересования вина глубинным способом применяют расу Хе-
рес 96-К.
При глубинном способе значительно ускоряется процесс аль-
дегидообразования, однако специфические свойства хереса выра-
жены значительно слабее, чем при пленочном методе.
Биохимические процессы, протекающие при различных мето-
дах хересования, описаны Н. Ф. Саенко с соавт. [24].
* *
*
Таким образом, на основании проведенных исследований со-
става дрожжевой флоры виноградного сусла и вин и изучения
физиолого-биохимических особенностей дрожжей разных родов
и видов можно рекомендовать мероприятия, необходимые для со-
вершенствования технологии виноделия:
сбраживание виноградного сусла целесообразно проводить
на чистых культурах дрожжей. Для обеспечения брожения ви-
ноградного сусла на чистой культуре сульфитированное сусло
необходимо осветлять с применением мощных фильтрационных
установок, оборудованных центрифугами, либо применять фло-
кулянты, способствующие быстрому и хорошему осветлению сус-
ла и сокращению срока его отстаивания, либо охлаждать сусло
во время отстаивания. В сусле после отстаивания должно быть
дрожжевых клеток не более 200—300 тыс./мл;
для сбраживания виноградного сусла следует применять кон-
курентоспособные расы дрожжей вида Sacch. vini. Перечень рас,
наиболее приспособленных к определенным условиям брожения,
приведен в табл. 27;
разводку чистой культуры дрожжей необходимо вносить в
сусло в стадии бурного брожения в количестве 2—3% от объема
сусла и сразу перемешивать со всей партией сусла, снятого с
отстоя;
контроль чистоты брожения виноградного сусла на внесенной
в него разводке чистой культуры дрожжей, имеющей фенотип
киллер, нейтральный или чувствительный, можно осуществлять
путем определения этих фенотипов дрожжей в забродившем
сусле;
в связи с тем что к жизнедеятельности в вине наиболее при-
способлены дрожжи вида Sacch. oviformis, шампанизацию вина
(в потоке и бутылочным способом), а также хересование (пле-
ночным, беспленочным и глубинным методами) следует прово-
дить на дрожжах этого вида;
для шампанизации вина бутылочным методом целесообразно
отселекционировать расы вида Sacch. oviformis, образующие зер-
нистые осадки.
ГЛАВА III.
БАКТЕРИИ
Обычно поверхность виноградных ягод ко времени их созре-
вания бывает обильно заселена не только дрожжами, но и бак-
териями. Однако развитие бактерий в сусле и вине ограничива-
ется в связи с их высокой активной кислотностью, осмотическим
давлением сахаров в сусле и спирта в вине. Поэтому в сусле и
вине находятся только бактерии, способные развиваться при
pH 2,5—4,5 и при концентрации спирта 12—18% об.
Из всех известных групп бактерий существенную роль в ви-
ноделии играют молочнокислые и уксуснокислые бактерии, ко-
торые легко и быстро развиваются на поврежденных ягодах и,
попав в сусло, при брожении сохраняются и развиваются в нем.
УКСУСНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ
ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ ВИДОВ УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
И ИХ КЛАССИФИКАЦИЯ
В настоящее время известно несколько видов и много рас ук-
суснокислых бактерий, развивающихся в вине.
Родовое название, предложенное Бейеринком для уксусно-
кислых бактерий — Acetobacter, в настоящее время является поч-
ти общепринятым и вошло в определители бактерий. Бердже в
своем определителе к роду Acetobacter относит 12 видов бакте-
рий. Н. А. Красильников в основу определения видов положил
биохимические особенности этих бактерий и распределил их на
4 вида [87]:
1. Культуры образуют каталазу ..................(2)
— Каталазы не имеют
Acetobacter peroxydans
2. Усваивают аммонийную соль как источник азотного питания:
Acetobacter aceti
— Не усваивают минерального азота...............(3)
3. Культуры образуют бурый пигмент:
Acetobacter melanogenum
— Культуры бесцветные:
Acetobacter xylinum
В монографии, специально посвященной систематике уксус-
нокислых бактерий, Ж. Фратер, на основании литературных дан-
ных и собственных исследований, предложил новую классифика-
142 цию рода Acetobacter [256]. Критерии для разграничения групп
уксуснокислых бактерий (по Фратеру), установленные на осно-
вании биохимических показателей, приведены в табл. 32.
Под влиянием бактерий группы Oxydans происходит более
глубокий распад окисляемых ими органических соединений, чем
бактерий группы Suboxydans, тогда как группа Mesoxydans за-
нимает промежуточное положение между ними. Уксуснокислые
бактерии, лишенные каталазы, объединены в группу Peroxydans.
Для выявления бактерий, относящихся к указанным группам,
выбрано 5 критериев: наличие у бактерий каталазы, способность
к окислению уксусной кислоты, лактата кальция, глюкозы в
глюконовую кислоту и способность к образованию кетосоеди-
нений.
’В качестве признаков для разделения видов бактерий внутри
указанных групп рода Acetobacter рекомендовано использовать
физиологические особенности, такие, как способность усваивать
аммонийный азот, образование глюконовой кислоты из различ-
ных сахаров, образование пигмента, целлюлозы и т. д.
Группа Peroxydans включает виды: A. peroxydans, A. parado-
xum; группа Oxydans — A. ascendens, A. rancens, A. lovaniense;
группа Mesoxydans — A. aceti, A. zylinum, A. mesoxydans; груп-
па Suboxydans — A. suboxydans, A. melanogenum.
Имеются, однако, данные, свидетельствующие, что способнос-
ти к использованию аммонийного азота и к образованию кето-
соединений присущи большинству уксуснокислых бактерий. Кро-
ме того, в систематике уксуснокислых бактерий, предложенной
Фратером, некоторые виды бактерий рода Acetobacter не нашли
места, хотя широко используются как в научных исследованиях,
так и в практике.
Описаны уксуснокислые бактерии, распространенные в винах
Грузии и Армении [1, 118]. На основании физиологической ха-
Таблица 32
Показатели Тесты для разделения уксуснокислых бактерий на группы по Фратеру
Peroxydans Oxydans Mesoxydans Suboxydans
Наличие каталазы 4- 4- 4-
Окисление уксусной кис- лоты до СО2 и Н2О 4- 4* 4* и +
Окисление лактата Са 4- 4- 4* —
Кетогенная способность — От до 4-4-
Образование глюконовой кислоты из глюкозы — — и 4- От 4- До 4-4- 4—1-
Обозначения: «4-» — положительные тесты; «-)- 4-* — активно положи-
тельные; «—» — отрицательные; «±» — в большинстве случаев положитель-
ные тесты.
_____________________________________________________________________________ 143
рактеристики выделенных культур, согласно классификации
Фратера, они были отнесены к двум группам — Oxydans и Meso-
xydans и к видам: A. aceti, A. ascendens, A. rancens, A. xylinum.
Морфология клеток и биохимические свойства, образование
на поверхности вина пленок, различных по внешнему виду, по-
служили основанием Н. К. Могилянскому разделить уксуснокис-
лые бактерии, развивающиеся в винах, на 3 группы и описать
9 видов рода Acetobacter: A. orleanense, A. xylinoides, A. xylinum,
A. plicatum, A. ascendens, A. kiitzingianum, A. aceti, A. pasteuria-
num, A. vini aceti.
Виды и расы уксуснокислых бактерий различаются между
собой по степени накопления уксусной кислоты. Так, в крепких
южных винах развиваются расы бактерий, переносящие высо-
кие концентрации спирта и вырабатывающие больше уксусной
кислоты. В малоспиртуозных винах развиваются менее сильные
расы бактерий. Неодинаковым получается и качество уксуса; од-
ни виды и расы сообщают уксусу приятный букет, а другие вы-
рабатывают уксус низкого качества с неприятным запахом.
МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Морфология клеток. Клетки уксуснокислых бактерий палоч-
ковидной формы, иногда очень короткие, одиночные или соеди-
нены в длинные цепочки-нити, спор не образуют, грамотрица-
тельны (рис. 30). Средние размеры клеток (1,2—1,8) X (0,4—
—0,8) мкм. Обычно они встречаются в неподвижном состоянии.
Но в молодой 24—48-часовой культуре многие клетки уксусно-
кислых бактерий подвижны, и при электронно-микроскопическом
просмотре отчетливо видны жгутики. Жгутик отходит от одного
из полюсов клетки, часто субполярно, т. е. немного сбоку. Иног-
да наблюдается расщепление жгутика на 3—4 и более тонкие
нити.
Неблагоприятные условия для развития уксуснокислых бак-
терий (высокие концентрации спирта — 15—16% об., уксусной
кислоты и других кислот—10—11%, высокая температура — в
пределах 40°С) нарушают процессы роста и деления клеток бак-
терий, вследствие чего изменяются их формы и размеры. При
этом появляются характерные для уксуснокислых бактерий ин-
волюционные формы: клетки-гиганты — очень длинные, в десят-
ки раз длиннее и значительно шире, чем нормальные особи, иног-
да длиной до 30—40 мкм, со вздутиями, шаровидные, колбовид-
ные, нитевидные, изогнутые. Инволюционные формы уксуснокис-
лых бактерий неподвижны и лишены жгутиков. Количество
сильно измененных клеток обычно увеличивается при повыше-
нии концентрации уксусной кислоты в среде до 2—4,5%, при от-
клонении температуры и pH от оптимальных величин [114].
Специальные методы окраски позволяют рассмотреть при
144 микроскопировании внутри бактериальных клеток зернышки во-
лютина, капли жира и нуклеоиды.
Инволюционные формы содержат
несколько нуклеоидов [102].
Уксуснокислые бактерии раз-
множаются чрезвычайно быстро.
Их число удваивается через каж-
дые 30 мин. Из одной бактери-
альной клетки в течение 12 ч мо-
жет возникнуть 17 млн. особей.
Несколько клеток бактерий, по-
мещенных на поверхности вина,
за короткое время образуют
300 млрд, клеток — слой в 1 м2,
общая масса их составляет 1 г.
Такое количество уксуснокислых
бактерий в течение нескольких
дней может превратить в уксус-
ную кислоту 10 кг спирта, т. е.
Рис. 30. Acetobacter aceti (Х1000)
[46].
«переработать» количество спир-
та, в 10000 раз превышающее их собственную массу [114].
Характерной чертой многих видов уксуснокислых бактерий
является рост на поверхности питательной среды — образование
пленки. Основной предпосылкой этого является относительная
гидрофобность поверхности клеток и сцепление слоя клеток с от-
крытой поверхностью среды на разных стадиях роста. При до-
стижении достаточной толщины пленка опускается и начинает
расти в глубине среды до тех пор, пока на поверхности не обра-
зуется новый слой, прекращающий доступ кислорода воздуха
[114]. Строение и внешняя форма пленки бактерий зависят от
питательной среды и окружающих условий. Некоторые виды ук-
суснокислых бактерий образуют толстую пленку, другие тон-
кую, у одних она слизистая, у других — сухая. Общей особенно-
стью пленки уксуснокислых бактерий является ее способность
«всползать» на стенки стеклянной посуды.
Потребность бактерий в питательных веществах и образуемые
продукты обмена. Потребность уксуснокислых бактерий в основ-
ных питательных веществах — источниках углерода, азота и ви-
таминов — неоднородна у различных видов. Все они хорошо ис-
пользуют в качестве единственного источника углерода глюкозу
и другие моносахариды, многоатомные спирты и хуже растут в
питательных средах, содержащих этиловый спирт и уксусную
кислоту.
Все уксуснокислые бактерии аминоавтотрофны, т. е. способ-
ны к синтезу аминокислот, основных из них, путем аминирова-
ния кетокислот. Они могут использовать азот в минеральной
форме, однако неорганический азот усваивают при наличии не-
обходимых источников углерода и витаминов. Выявлено, что не-
которые виды уксуснокислых бактерий используют неорганиче- 145
6—568
ский азот только тогда, когда в качестве источника углерода в
среде присутствует глюкоза, а не этиловый спирт; другие — толь-
ко при наличии в питательной среде необходимых им витаминов
[102].
Уксуснокислые бактерии, обитающие в субстратах, содержа-
щих этиловый спирт и бедных другими органическими вещест-
вами, более приспособлены к использованию спирта. Они хоро-
шо развиваются в синтетических средах с аммонийными солями
и проявляют себя как ауксоавтотрофы, синтезируя все необхо-
димые им вещества из уксусной кислоты, воды и минеральных
солей. Наиболее типичными в такой потребности в питательных
веществах являются Acetobacter aceti.
Бактерии A. aceti, предпочитающие этиловый спирт и уксус-
ную кислоту глюкозе и многоатомным спиртам, способные к син-
тезу всех необходимых им витаминов, быстро развивающиеся
в средах с азотом в виде аммонийной соли, нашли широкое
применение в производстве при скором (немецком) способе по-
лучения уксуса. Они окисляют спирт при pH 2,5—3,0, накапливая
при этом до 10—11 % уксусной кислоты [102].
Многие виды уксуснокислых бактерий способны превращать
молочную кислоту в ацетоин [102]. Установлено, что представи-
тели групп Peroxydans, Mesoxydans, Suboxydans образуют
лишь следы ацетоина. Наиболее активно синтезируют ацетоин
бактерии группы Oxydans, особенно A. rancens и A. ascendens,
образующие ацетоина до 74% от теоретически возможного. Бак-
терии группы Oxydans способны также к окислению ацетоина в
диацетил.
Некоторые виды уксуснокислых бактерий обладают исключи-
тельно редким в мире бактерий биосинтезом полисахарида цел-
люлозы. Ферменты, участвующие в образовании этого полиса-
харида, содержатся в A. xylinum и A. acetigenum [100].
Уксуснокислые бактерии синтезируют целлюлозу из различ-
ных моно- и дисахаридов (арабинозы, ксилозы, рамнозы, глюко-
зы, фруктозы, галактозы, мальтозы, сахарозы, лактозы), из мно-
гоатомных спиртов (глицерина, эритрита, сорбита, маннита), из
глюконовой, 2- и 5-кетоглюконовых кислот (рис. 31). A. xylinum
в некоторых условиях образует целлюлозу при развитии за счет
этилового спирта, уксусной, янтарной или L-яблочной кислот
[102]. Некоторые уксуснокислые бактерии синтезируют крахма-
лоподобные соединения, химическая природа которых не выясне-
на. Известно лишь, что бактериальные пленки на поверхности
жидких питательных сред и колонии на сусло-агаре определен-
ных видов уксуснокислых бактерий при обработке йодом окраши-
ваются в синий цвет [114].
Давно известно образование уксуснокислыми бактериями
слизистых веществ. Одни синтезируют из декстрина декстран,
идентичный декстрану, синтезируемому Leuconostoc mesenteroi-
146? des из сахарозы, другие из сахарозы — леван. Массовое разви-
тие уксуснокислых бактерий, обра-
зующих слизистые вещества, вызы-
вает «тягучесть» жидкости [102].
Метаболизм уксуснокислых
бактерий. Уксуснокислые бактерии
отличаются от других аэробных бак-
терий выраженной способностью к
окислению различных органических
веществ. Обладая комплексом фер-
ментов, катализирующих разнооб-
разные реакции окисления, они ис-
пользуют в энергетическом обмене
многие спирты, кислоты, углеводы и
Рис. 31. Acetobacter xylinum. Элект-
ронная микрофотография. Клетку
окружают синтезированные ею фиб-
риллы целлюлозы (Х24000) [139].
их производные, накапливая в окру-
жающей среде большое количество
окисленных веществ, главным обра-
зом кислот и кетосоединений.
Наиболее общей и характерной
для всех видов уксуснокислых бак-
терий является реакция окисления этилового спирта в уксусную
кислоту. Окисляют они также другие одноатомные спирты в
соответствующие кислоты и углеводы, образуя адекватные са-
харокарбоновые кислоты.
Способность к окислительным реакциям неодинаково выраже-
на у представителей рода Acetobacter. Имеются виды, окисляю-
щие только одноатомные спирты, пировиноградную и молочную
кислоты и неспособные к окислению углеводов и многоатомных
спиртов (A. peroxydans, A. ascendens). Другие, наоборот, про-
являют способность к разнообразным окислительным превра-
щениям и весьма активны в окислении, многих углеводов и их
производных (A. aceti, A. suboxydans, A. xylinum).
Уксуснокислые бактерии лишены протеолитических фермен-
тов и поэтому не могут использовать белковые вещества.
Окисление этилового спирта уксуснокислыми бактериями в
уксусную кислоту называется уксуснокислым брожением. Осу-
ществляется оно только при доступе воздуха. В первой фазе это-
го процесса происходит окисление спирта в уксусную кислоту с
промежуточным образованием уксусного альдегида, во второй —
окисление уксусной кислоты до СО2 и Н2О.
Суммарно уксуснокислое брожение выражается следующим
.уравнением:
СН3СН2ОН + О2 = СН3СООН + Н2О + энергия (489 кДж).
Этиловый Уксусная
спирт кислота
Из 1% об. этанола образуется 1 г уксусной кислоты. При
этом на грам-молекулу окисляемого спирта освобождается энер-
гии 489 кДж [102, 114]. 147
6*
Большинство уксуснокислых бактерий, когда израсходован
весь спирт и накопилось предельное количество уксусной кисло-
ты, приостанавливающей их жизнедеятельность, способно к пе-
реокислению ее, т. е. расщеплению в присутствии кислорода воз-
духа на углекислый газ и воду по химическому уравнению
СН3СООН + 2О2 = 2СО2 + 2Н2О.
По мере разрушения уксусной кислоты условия для переокис-
ления ее становятся более благоприятными, и оно усиливается.
Переокисление уксусной кислоты в процессе производства уксу-
са может снижать производительность предприятий по выработ-
ке этого продукта. Разные виды и расы уксуснокислых бактерий
обладают различной способностью как накопления, так и пере-
окисления уксусной кислоты [114].
На другие одноатомные спирты уксуснокислые бактерии, по-
видимому, действуют так же, как и на этиловый спирт. Многие
представители рода Acetobacter окисляют пропиловый спирт в
пропионовую кислоту, бутиловый— в масляную, изобутиловый —
в изомасляную и изоамиловый — в изовалериановую кислоты
[102]. Однако максимальное количество образуемых при этом кис-
лот всегда значительно меньше, чем в случае окисления этилово-
го спирта, когда бактерии накапливают до 11—12% уксусной
кислоты, а длительность процессов окисления указанных спир-
тов в развивающихся культурах уксуснокислых бактерий значи-
тельно больше, чем при использовании ими этилового спирта.
Наиболее активными в окислении многоатомных спиртов —
сорбита, глицерина, маннита и других — являются представите-
ли групп Mesoxydans и Suboxydans. Они окисляют маннит во
фруктозу, сорбит — в сорбозу, глицерин — в диоксиацетон. Изу-
чение условий, способствующих интенсификации биохимического
окисления сорбита в сорбозу, имело большое значение в разви-
тии производства витамина С [58]. Окисление многоатомных
спиртов при помощи уксуснокислых бактерий является наиболее
простым способом образования соединений, из которых могут
быть получены редкие и даже не существующие в природе много-
атомные спирты и их эфиры [102].
Углеводы окисляются уксуснокислыми бактериями в соот-
ветствующие сахарокарбоновые кислоты: глюкоза в глюконо-
вую, манноза в манноновую, галактоза в галактоновую, ксилоза
в ксилоновую [114]. Наиболее активно окисляется глюкоза. Не-
которые штаммы уксуснокислых бактерий дают выход глюко-
новой кислоты до 95% от количества сахара, концентрация ко-
торого в среде составляет 15%. Активно образуют глюконовую
кислоту представители групп Mesoxydans и Suboxydans и, наобо-
рот, не образуют ее A. ascendens, A. paradoxum, A. peroxydans.
Фруктоза принадлежит к сахарам, трудно окисляемым уксус-
нокислыми бактериями, но некоторые представители их способ-
148 ны окислять ее и образуют койевую кислоту.
Дисахариды подвергаются уксуснокислыми бактериями гид-
ролитическому расщеплению, однако лишь в незначительной сте-
пени. Декстрин и крахмал окисляются уксуснокислыми бакте-
риями немногих форм. Таким образом, в результате воздействия
уксуснокислых бактерий на углеводы образуются разнообразные
органические соединения, которые изменяют химический состав
и активную реакцию окружающей среды.
Наиболее активная окисляющая деятельность уксуснокислых
бактерий наблюдается в фазе развития, характеризующейся мак-
симальной скоростью размножения, т. е. в начале фазы логариф-
мического роста. По данным И. Л. Работновой, на образование
1 г уксусной кислоты используется от 5 до 23 мг сахаров.
- Обладая уникальной способностью к осуществлению аэроб-
ных окислительных реакций, уксуснокислые бактерии лишены
способности к анаэробному расщеплению углеводов. Изучение
ферментного аппарата их показало, что они имеют лишь неко-
торые ферменты, участвующие в гликолизе. Поэтому гликоли-
тический путь расщепления углеводов не имеет значения в об-
мене веществ уксуснокислых бактерий [102].
Кислоты вина — пропионовая, масляная и муравьиная — не
используются уксуснокислыми бактериями. Одноосновная молоч-
ная кислота и двуосновные — янтарная, яблочная и винная — в
большей или меньшей степени могут окисляться до углекислоты
и воды. Частично эти кислоты используются бактериями как ис-
точник углеродного питания.
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ УКСУСНОКИСЛЫХ
БАКТЕРИЙ
Кислород. Уксуснокислые бактерии являются облигатными
аэробами. Размножение их и окислительная деятельность наи-
более интенсивно проходят при непрерывном и усиленном аэри-
ровании питательной среды.
При окислении спирта одна клетка Acetobacter sp. за 1 ч по-
требляет 8Х10-10 мг Ог. Оптимальные условия для размножения
Acetobacter sp. создаются при парциальном давлении кислоро-
да 0,02 МПа; снижение парциального давления до 0,0045 МПа
приостанавливает ферментативную деятельность уксуснокислых
бактерий [102].
При глубинном выращивании их в питательной среде, содер-
жащей спирта и уксусной кислоты 9,4% (общая концентрация),
прекращение аэрации на 1 мин приводит к отмиранию 100% кле-
ток. При парциальном давлении кислорода в газовой фазе
0,06 МПа и выше уксуснокислые бактерии не размножаются.
По-видимому, избыточное количество кислорода также отрица-
тельно влияет на них. В очень разбавленных растворах спирта
и уксусной кислоты бактерии мало чувствительны к дефициту
воздуха, особенно при низкой температуре. При высоком окис- 149
лительно-восстановительном потенциале среды (350 мВ) также
создаются благоприятные условия для размножения уксуснокис-
лых бактерий.
Углекислый газ. Установлено, что уксуснокислые бактерии
нуждаются и в углекислоте воздуха. При недостатке в среде уг-
лекислоты наблюдается не только задержка развития этих бак-
терий, но и потеря клетками способности к дальнейшему разви-
тию. Опытами с использованием меченого углерода углекислоты
(С14Ог) доказано значение углекислоты в конструктивном обме-
не уксуснокислых бактерий. Углекислота активно усваивается
главным образом на первые и вторые сутки развития культуры
уксуснокислых бактерий, когда идут интенсивные синтетические
процессы. Развившиеся бактерии углекислоту не усваивают
[102].
Температура. На развитие уксуснокислых бактерий большое
влияние оказывает температура среды. Температурный минимум
почти одинаков для всех видов: 6—10°С. Выше этой температу-
ры, до 15°С, они размножаются медленно и имеют вид коротких
толстых палочек. Температурный оптимум по Геннебергу лежит
между 15 и 37°С и различен для разных видов бактерий. При
таких условиях уксуснокислые бактерии быстро развиваются,
образуя цепочки. Особенно высокий температурный оптимум
(37°С) имеют A. rancens.
Температурный максимум также колеблется в широких пре-
делах: 35—45°С. Некоторые виды уксуснокислых бактерий при
таких высоких температурах превращаются в прозрачные нити
без поперечных перегородок. Оставшись жизнеспособными, они
могут утратить свои характерные биохимические свойства [102].
Температура гибели уксуснокислых бактерий различна в за-
висимости от физиологического состояния их, а также от соста-
ва и концентрации веществ в среде. A. aceti в столовом вине без
добавления SO2 погибают в отсутствие кислорода в течение
10 мин при температуре 50°С, а с добавлением SO2 75—
100 мг/л — при температуре 45°С [125].
В вине с низким значением pH (2,8) и содержанием спирта
11—12% об. в присутствии кислорода воздуха они отмирают при
10-минутном воздействии температуры 40°С. При более высоких
значениях pH (3,2—3,4) и содержании спирта в вине 12% об.
летальной (смертельной) для уксуснокислых бактерий является
температура 50—55°С.
Спирт этиловый. Уксуснокислые бактерии довольно спирто-
устойчивые микроорганизмы. A. ascendens прекращает свою
жизнедеятельность лишь при концентрации спирта в среде
12,5% об., а для A. rancens доза в 6,5% об. уже детальна. Для
остальных культур степень выносливости уксуснокислых бакте-
рий находится в пределах 11—12% об. спирта.
Сернистый ангидрид. На выживаемость бактерий в винах ока-
150 зывает влияние содержание сернистого ангидрида, главным об-
разом в свободной форме, обладающего антисептическими свой-
ствами. Содержание SO2 в вине изменяется в зависимости от ус-
ловий хранения — с доступом и без доступа воздуха. При введе-
нии в виноматериал SO2 в количестве 50 мг/л (и несколько бо-
лее) в анаэробных условиях клетки A. aceti теряют свою жизне-
способность при температуре 10°С и ниже в течение 5—10 сут, а
при температуре 28—35°С — обычно в течение нескольких часов
[199].
Для инактивации всех видов уксуснокислых бактерий, разви-
вающихся в винах, рекомендуется сульфитация вина до содер-
жания в нем 175 мг/л общего SO2. При содержании SO2 в винах
125 и 150 мг/л жизнедеятельность бактерий при температуре
15—18°С приостанавливается только на 10 дней.
Величина pH. Поскольку продукты жизнедеятельности ук-
суснокислых бактерий представляют собой в основном соедине-
ния, увеличивающие общую и активную кислотность среды, они
более других бактерий приспособлены к развитию в кислой сре-
де. Некоторые из них размножаются при pH 2,5—3,0.
Сорбиновая кислота. Сорбиновая кислота не защищает в до-
статочной мере вино от развития уксуснокислых бактерий. Мож-
но даже сказать, что она способствует прокисанию вин, посколь-
ку вызывает гибель дрожжевых культур и создает лучшие усло-
вия для развития уксуснокислых бактерий. Эффективное
действие сорбиновой кислоты против этих бактерий проявляется
только при дозировке ее от 800 до 1600 мг/л, но такая большая
доза не может быть допущена в виноделии [114].
Свет. Солнечный свет, не только прямой, но и рассеянный,
приостанавливает размножение уксуснокислых бактерий. Это
связано, по-видимому, с действием ультрафиолетовых лучей на
ферментные системы клеток.
Однако облучение слабо и сильно развитой пленки уксусно-
кислых бактерий на вине ультрафиолетовой лампой на высоте
50 см в течение 15—25 мин не дает эффекта. При облучении ульт-
рафиолетовыми лучами в течение 35 и 45 мин у некоторых кле-
ток изменяется форма, начинается их лизис. Но большинство
клеток в течение 24 ч восстанавливают свои функции. И только
55-минутное облучение полностью подавляет жизнеспособность
уксуснокислых бактерий [251].
УКСУСНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ В ПРОИЗВОДСТВЕ
Получение уксуса. При получении пищевого уксуса наилуч-
ший эффект достигается в случае применения чистых культур
уксуснокислых бактерий, которые характеризуются более высо-
кой окислительной активностью. Основным сырьем для получе-
ния уксуса являются естественные субстраты и напитки, содер-
жащие этиловый спирт (сидр, вино, пивное сусло, мед, плодо- 151
во-ягодные соки после брожения) или водный раствор этилового
спирта. В последнем случае получают спиртовой (белый) уксус,
который в Советском Союзе выпускается в больших количест-
вах, чем винный.
В состав спиртового уксуса кроме уксусной кислоты (6—
11%) входят ничтожно малые количества высших эфиров, при-
дающих продукту особый вкус и приятный аромат, чего лишена
уксусная эссенция, получаемая химическим путем. Качественный
состав эфиров и их количество определяются особенностями бак-
терий и условиями их жизнедеятельности.
К основным способам получения спиртового уксуса отно-
сятся:
скорый способ Шуценбаха (непрерывный), когда уксуснокис-
лые бактерии, находясь на поверхности древесных (буковых)
стружек, окисляют разбрызгиваемый раствор спирта, уксуса, ми-
неральных солей;
циркуляционный (периодический) — питательный состав, со-
держащий 10—11% спирта и около 1% уксусной кислоты, цир-
кулирует до получения раствора, содержащего уксусной кисло-
ты 10—11 %;
глубинный, когда микроорганизмы в аппаратах равномерно
развиваются во всей жидкости при непрерывной подаче воздуха.
Винный уксус по своему химическому составу и органолеп-
тическим свойствам обладает наиболее ценными качествами по
сравнению с уксусом, изготовленным из другого сырья [211]. К со-
жалению, производство уксуса из вина еще слабо налажено.
Тбилисский винодельческий завод для получения уксуса ис-
пользует малоспиртуозные вина с применением подспиртовыва-
ния.
В Италии готовят бальзамический уксус. Для этого уварен-
ный виноградный сок сбраживают в бочках при низкой тем-
пературе на особых заквасках, состоящих из уксуснокислых
бактерий и дрожжей рода Zygosaccharomyces. В бальзамиче-
ском уксусе содержится ацетилметилкарбинол, уксусная и ян-
тарная кислоты,спирт и глицерин.
Для определения качества уксуса рекомендуются методы оп-
ределения окисляемых или редуцирующих веществ, присутствие
которых характерно для уксусов, полученных из вин, пива, сид-
ра, спиртовых растворов. Это позволяет также отличить пищевой
уксус от синтетического.
При развитии уксуснокислых бактерий на поверхности вин
особое значение имеет способность их к биосинтезу эфиров. Ха-
рактерный запах скисшему вину придает уксусноэтиловый эфир,
который ясно ощущается и во вкусе при содержании 40 мг/л.
Однако другие химические компоненты, входящие в состав вина,
препятствуют ощущению запаха скисших вин. Ниже приведен
порог ощущения запаха этилового эфира уксусной кислоты при
152 содержании его (в мг/л) [114]:
В воде 25—30
В 10%-ном спиртовом растворе 40
В 10 %-ном спиртовом растворе с одной кап- 160
лей этилового эфира энантовой кислоты на
1 л
В красных винах с 10,5—12% об. спирта 180—2<
180—200
Таким образом, порог ощущения уксусноэтилового эфира в
винах зависит от содержания в нем спирта и ароматических
веществ. Экстрактивные вещества оказывают незначительное
влияние на усиление характерного запаха.
Степень образования уксусноэтилового эфира в скисшем ви-
не зависит от различных факторов: от вида и расы бактерий, от
температуры, при которой развивались уксуснокислые бактерии,
от отношения поверхности пленки к объему вина, от содержания
в вине этилового спирта, азотистых веществ и др.
Другие бактерии вина, образующие летучие кислоты (молоч-
нокислые при разложении сахаров, глицерина, винной кислоты
и др.), не обладают эфирообразующей способностью. Поэтому
показатель превращения в эфир уксусной кислоты может слу-
жить основанием при определении причин и вида микроорганиз-
мов, вызвавших повышение содержания летучих кислот в вине
и его порчу.
С давних пор в быту у населения многих стран культивирует-
ся симбиоз уксуснокислых бактерий и дрожжей. Питательной
средой для них обычно служит раствор сахара и экстракта чая.
Жидкость, содержащую продукты обмена дрожжей и бактерий,
в России называют «чайный гриб» и «чайный квас», в Японии —
комбу-ча, в Китае — ха-бом. Установлено [101], что в «чайном
квасе» присутствует A. xylinum, разновидность A. suboxydans,
расщепляющая сахарозу с образованием полисахарида левана,
и разнообразные дрожжевые организмы, не сбраживающие са-
харозу: Н. apiculata, Н. javanica, Torulopsis sp., Candida tropi-
calis, C. albicans. Дрожжи в «чайном квасе» образуют витамины
и другие биологически активные вещества.
Заболевание вина. При заболевании вина уксуснокислые бак-
терии на его поверхности образуют пленку, которая по внешне-
му виду отличается от пленки, образуемой пленчатыми дрожжа-
ми. Цвет ее беловатый, иногда с голубым оттенком, она масля-
нистая, не рыхлая. К предметам, опущенным в вино, пленка не
прилипает.
Уксуснокислые бактерии попадают в вино с поверхности обо-
рудования и емкостей. Иногда они развиваются при изготовле-
нии красных вин, когда ведут брожение на мезге с доступом кис-
лорода воздуха. Медленное брожение, при котором поверхность
среды недостаточно защищена выделяющимся углекислым га-
зом от доступа воздуха, и повышенная температура способствуют
развитию уксуснокислых бактерий и ускоряют образование ук-
сусной кислоты, затрудняющей полезную работу дрожжей. По- 153
этому опасность уксуснокислого брожения особенно велика при
переработке винограда в теплую осень. Очень важно, чтобы
спиртовое брожение наступило возможно скорее и сопровожда-
лось обильным выделением СОг. Для этого надежным средст-
вом является брожение на сильной чистой культуре дрожжей
и систематическое наблюдение за поддержанием благоприятной
температуры.
Вина, в которых брожение закончилось, надо хранить без до-
ступа воздуха в помещении при температуре, препятствующей
развитию уксуснокислых бактерий. Необходимо следить, чтобы
содержание свободной сернистой кислоты в вине оставалось на
уровне 25 мг/л, и в случае его понижения снова доводить до
этой нормы.
При обнаружении в вине уксуснокислого брожения прежде
всего надо приостановить этот процесс. Наиболее надежным спо-
собом для этого является пастеризация вина в течение несколь-
ких минут при температуре 60—62°С или фильтрация через обес-
пложивающий пластинчатый фильтр. Затем можно проводить
купаж его с последующей сульфитацией внесением сернистого
ангидрида 80—100 мг/л и хранить при низкой температуре в пол-
ных емкостях.
При хранении вин в металлических и железобетонных емкос-
тях, заполненных ниже установленной нормы (недолитых), реко-
мендуется использовать герметизирующий состав СВС с 2% ме-
табисульфита калия.
Тара и коммуникации, освобожденные из-под заболевшего
вина, должны быть подвергнуты тщательной обработке в соот-
ветствии с технологической инструкцией по санитарной обработ-
ке винодельческих емкостей [184].
Неприятный царапающий вкус больного вина можно смяг-
чить обработкой активным углем. Для этого в большинстве слу-
чаев бывает достаточным ввести 50—100 г угля на 10 дал вина.
После обработки углем вносят сернистый ангидрид и проводят
пастеризацию или фильтрацию вина через пластинчатый фильтр,
так как только таким приемом можно окончательно удалить
бактерии из вина. В большинстве случаев после обработки углем
требуется купаж или обработка его осадочными дрожжами.
Дрожжи должны быть здоровыми, чистыми. На 10 дал вина бе-
рут 5—10 л дрожжей.
Для исправления вкуса заболевших вин рекомендуется при-
менять перебраживание на свежих выжимках. При этом выход
спирта из единицы сахара в перебраживаемом вине увеличива-
ется, поскольку уксусная кислота восстанавливается в спир-
'ты — пропиловый, бутиловый; 0,85 г летучих кислот могут повы-
сить содержание спирта в вине на 0,1% об. Большой инте-
рес представляет лечение вин с содержанием летучих кислот
не более 3,0 г/л путем культивирования хересной пленки. Этот
154 метод предложен Н. Ф. Саенко, но он требует внимательного
микробиологического контроля, чтобы не допустить развития бак-
терий в пленке хересных дрожжей. Больное вино пастери-
зуют, фильтруют и доводят содержание в нем спирта до 14—
14,5% об. На поверхность вина наносят пленку чистой культуры
хересных дрожжей.
Если в процессе уксуснокислого брожения в вине образова-
лось более 3 г/л летучих кислот, то его следует превратить в
уксус или перегнать на спирт.
МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ1
ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ ГРУПП МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
И ИХ КЛАССИФИКАЦИЯ
Схемы классификации. Изучение процессов, вызываемых мо-
лочнокислыми бактериями в вине, должно проводиться после
предварительного таксономического исследования и определе-
ния видовой принадлежности бактерий-возбудителей. Без таксо-
номической идентификации бактерий даже тщательные техно-
логические и биохимические исследования не смогут установить
закономерностей в жизнедеятельности бактерий и воспроизвести
цх. Поэтому все работы в этой области прежде всего начинают-
ся с изолирования из вин чистых культур молочнокислых бак-
терий и определения их вида.
Первую научную систему классификации молочнокислых бак-
терий разработал Орла-Иенсен в 1919 г.
Швейцарские исследователи Г. Мюллер-Тургау и А. Остер-
вальдер подробно изучили химические изменения в больных
винах, выделили возбудителей заболевания, изучили их морфо-
логические, культуральные и биохимические свойства и присвои-
ли им видовые названия Bact. mannitopoeum, Bact. gracile, Bact.
intermedium, Micrococcus acidovorax, Micrococcus variococcus.
Перечисленные названия были даны, однако, произвольно, без
сопоставления с известными, уже описанными видами. В совре-
менных учебниках по технологии и микробиологии виноделия
приводятся описания и названия этих микроорганизмов, которые
при критическом рассмотрении являются в лучшем случае сино-
нимами известных ранее.
Е. И. Квасников обосновывает необходимость сравнительного
подхода к изучению молочнокислых бактерий, выделенных из
различных природных субстратов [68, 73].
Большой вклад в изучение молочнокислых бактерий вина и
их классификацию сделан группой ученых винодельческой стан-
1 При написании раздела «Молочнокислые бактерии» использованы науч-
ные отчеты канд. биол. наук 3. Д. Рабинович, старшего научного сотрудника
отдела микробиологии ВНИИВиВ «Магарач», много лет посвятившей изуче-
нию этой группы микроорганизмов. 155'
ции в Бордо (Франция) под руководством Э. Пейно [295, 300,
315]. Ими изучено более 700 штаммов молочнокислых бактерий,
выделенных из вин, и установлено соответствие признаков бак-
терий, описанных Г. Мюллером-Тургау и А. Остервальдером,
вновь выделенным бактериям, идентифицированным по совре-
менным системам.
В табл. 33, составленной 3. Д. Рабинович по работам Э. Пей-
но, приведены возбудители заболеваний вина, идентичные по
своим признакам и свойствам ранее описанным.
Таким образом, молочнокислые бактерии вина, описанные
Г. Мюллером-Тургау и А. Остервальдером, нашли место в общей
системе классификации молочнокислых бактерий и должны име-
новаться согласно номенклатуре, принятой в настоящее время.
Исключение составляет В act. tartarophtorum, описание которой
не удалось идентифицировать ни с одним из выделенных штам-
мов. Э. Пейно считает, что свойство разлагать винную кислоту,
положенное в основу характеристики данного вида, присуще так-
же молочнокислым бактериям других видов и не может считать-
ся основным видовым признаком.
В последние годы было предложено много новых схем и
принципов классификаций.
Кроме общепринятых методов изучения морфологических,
культуральных и физиологических свойств в качестве диагности-
ческих признаков учитывают потребность молочнокислых бакте-
Таблица 33
Видовое название молочнокислых бактерий по данным Основные свойства вида
Мюллера-Тургау и Остервальдера Пейно
Micrococcus variococcus Pediococcus cerevisiae Гомоферментативные кок- ки , не сбраживающие пентоз
Micrococcus acidovorax Pediococcus cerevisiae То же
Bact. intermedium Lactobacillus hilgardii Гетероферментативные па- лочки , сбраживающие ксилозу, не сбражи- вающие арабинозу
Bact. mannitopoeum Lactobacillus brevis Г етероферментативные палочки, сбраживаю- щие пентозы
Bact. gracile Leuconostoc gracile Гетероферментативные кокки, не сбраживаю- щие пентоз
156 Bact. tartarophtorum He соответствует какому- либо виду современной классификации Палочки, разлагающие винную кислоту
рий в витаминах, инфракрасные спектры поглощения, химиче-
ский состав клеточных оболочек бактерий, серологические свой-
ства, данные хроматографического изучения свободных
аминокислот и другие методы [185].
Подробный анализ имеющихся схем классификаций молоч-
нокислых бактерий проведен Е. И. Квасниковым и О. А. Несте-
ренко в монографии [73]. Схема классификации, предложенная
для молочнокислых палочек английскими исследователями М. Ро-
гозой и М. Шарп, признана европейскими микробиологами наи-
более удовлетворительной [317].
Род Lactobacillus. К роду молочнокислых бактерий Lacto-
bacillus относятся грамположительные неветвящиеся палочки,
неподвижные, не восстанавливающие нитратов в нитриты, не
образующие каталазы, сбраживающие углеводы с образовани-
ем молочной кислоты. Они характеризуются сложными потреб-
ностями в источниках питания, слабой дыхательной активностью,
незначительным воздействием на белки и жиры, относительно
кислотоустойчивы (способны расти при pH 3,8 и ниже), разви-
ваются в анаэробных условиях.
До настоящего времени общепринятым является разделение
рода лактобацилл на три подрода, проведенное Орла-Иенсеном:
Thermobacterium объединяют гомоферментативные бактерии, ко-
торые развиваются при высоких температурах; Streptobacteri-
um — гомоферментативные, развивающиеся при температурах
15—30°С; Betabacterium — гетероферментативные бактерии.
Для определения вида молочнокислых бактерий в литерату-
ре описан 41 тест [70]: рост при температуре 15 и 45°С и в при-
сутствии 0,4% типоля, характер роста в лакмусовом молоке, пре-
дельное кислотообразование в молоке, конфигурация образуе-
мой молочной кислоты, образование зерен волютина, образование
аммиака из аргинина и углекислого газа из глюкозы и цит-
ратов, гидролиз эскулина, сбраживание арабинозы, ксилозы, рам-
нозы, фруктозы, маннозы, галактозы, сорбозы, а-метил-П-ман-
нозида, а-метил-1)-глюкозида, мальтозы, лактозы, сахарозы,
трегалозы, целлобиозы, мелибиозы, рафинозы, мелезитозы, ину-
лина, декстрина, гликогена, крахмала, глицерина, эритрита, адо-
нита, маннита, дульцита, сорбита, инозита, салицина, амигда-
лина.
А. А. Ленцнер, М. А. Тоом и сотр. [132] отобрали 16 тестов,
диагностическая ценность которых, по их мнению, достаточна
для определения вида лактобацилл. В табл. 34 приведены фи-
зиолого-биохимические свойства некоторых видов молочнокис-
лых бактерий и видовая характеристика палочковидных бакте-
рий, составленная ими с учетом общепризнанных схем класси-
фикации.
Согласно схеме классификации М. Рогозы и М. Шарп [317],
гетероферментативные палочки L. buchneri отличаются от L. bre-
vis сбраживанием мелезитозы, L. fermenti отличаются от других
157
158
Таблица 34
•1ИННВМ + + 4- 44 H- H- 14- I 14- • да да
ШЙНИГВЭ + + + +1 1 1 14- 4-1 1 О Ф да да x да es
EEOlMEIf + + 1 +1 4-1 14- H- 4-1 1 I T+i
EEOHHEW + + 4- 4~ 44 1 1 4-1 4- т s Й о ° ж « « £5 я
о о о т о BEOdBXBO + H- 4- 4- -H 4- 4-1 4- 4-1 я м и о - я (U <у 3 5>
5 >> о S да BEOiqifew + +1 4~ 44 4~ 4- 4- 4- 4- Я S я р ? О я о Ж m
« S S О. Ю EEOXHBBBJ + 4- 4- 4- +1 4- 4-1 4- 1 О л о S YO
и ееохиеэвэи +1 + 4- 44 1 4- 1 1 1 ж Я Я Н * а * 2 — -да н
BeoHwsd
+1
X
<u
CJ
и
о Я
Ю »Я
я 3
BEongoiriraii
XHQdOO
Ш
<D
2
я
4
<u
я
*
о
ч
о
с •
Ж [4-
я £5
1 □oSI Hdu xaoj 4~ 4- 4- 4- I 4-1 4-1 4- 4- o *• да ~ s к ex id u- (V ~ 2 о зЙ

BIT -оиих %f*o Hdu xooj I 1 1 4~ 1 4- 44 4- 4- о ф н да да S О н о ю да ч а> я Я я
ш гг
HSOMOUTJ ЕИ BEEJ 9HHBH0EBd9Q 1 1 1 1 4- 4- 4- 4- 4- 4-) отм( 0> да о да да ж я ж к о
Виды молочнокислых бактерий Г омоферментативные L. casei, var. casei L. casei, var. rhamnosus L. casei, var. alactosus L. plantarum Г етероферментативные L. fermenti L. buchneri L. brevis L. cellobiosus L. viridescens S § ж*° 5 я ш | я & со ь ° . S о Ь о Я я _ к да* «Щ £ я £ и V « S 3 S ® 2S СХч >—< а> о С Е-<?
Рис. 32. Lactobacillus plantarutn
(X1000) [315].
Рис. 33. Lactobacillus brevis (X1000)
[315].
гетероферментативных палочек тем, что не растут при темпера-
туре 15°С, а растут при 45°С. Гомоферментативные палочки
L. plantarum отличаются от гетероферментативных сбраживани-
ем целлобиозы, рамнозы, мелезитозы, маннозы и другими при-
знаками (рис. 32 и 33).
Французские исследователи [266, 315] предлагают и следую-
щим образом обосновывают необходимость введения специфиче-
ской классификации молочнокислых бактерий для энологиче-
ской бактериологии. Сбраживание мелезитозы, целлобиозы, ра-
финозы и других сахаров для энологии не имеет большого
практического значения. Гораздо важнее отношение бактерий к
сахарам, распространенным в винных средах, таким, как араби-
ноза и ксилоза.
Функция сбраживания пентоз у кокков и палочек заслужива-
ет особого внимания. Оказывается, что кокки чрезвычайно ред-
ко сбраживают ксилозу, но еще реже палочки сбраживают ара-
бинозу. Также немногочисленны кокки, которые сбраживают обе
эти пентозы, и палочки, которые не сбраживают ни одну из
пентоз.
Таким образом, обнаруживается параллелизм между формой
клеток и некоторыми функциями брожения. Эти наблюдения
придают большую ценность тестам сбраживания пентоз. В связи
с этим предложен для дифференциации молочнокислых палочек
пентозный тест, который взят за основу в системе классифика-
ции Вогна. Для энологической классификации предложен и вто-
рой тест — сбраживание лимонной кислоты. . 15
В табл. 35 приведена классификация молочнокислых бакте-
рий вина на основании пентозного теста и сбраживания лимон-
ной кислоты [315].
Таким образом, по энологической классификации имеется две
разновидности L. plantarum: гомоферментативные бактерии,
сбраживающие пентозы и разлагающие лимонную кислоту, и
бактерии, разлагающие лимонную кислоту и не сбраживающие
пентоз. Такая характеристика бактериальных видов удобна для
практического виноделия.
Род Pediococcus. К роду Pediococcus относятся грамположи-
тельные, неспорообразующие, неподвижные кокки, располагаю-
щиеся единично, парами, кучками (см. рис. 36), тетрадами, но
никогда цепочками; микроаэрофильные или анаэробные, часто
требующие присутствия СО2 для роста, образующие D (—) мо-
лочную кислоту или смесь кислот D (—) и L ( + ), не восстанав-
Таблица 35
Классификация молочнокис- лых бактерий вин Особенности молочнокислых бактерий Условные обозначения
Кокки Гомоферментативные
Pediococcus cerevisiae He сбраживают пентозы (арабинозу, ксилозу) Р—
Pediococcus pentosa- Сбраживают пентозы (ара- Р+
ceus Гетероферментативные бинозу, ксилозу)
Leuconostoc gracile Не сбраживают пентозы (арабинозу, ксилозу) Р—
Leuconoctoc oenos Сбраживают арабинозу А+
Leuconostoc oenos Сбраживают ксилозу х+
Leuconostoc oenos Палочки Г омоферментативные Сбраживают пентозы (ара- бинозу, ксилозу) Р+
Lactobacillus planta- Чаще сбраживает пентозы Р±; С+
rum (арабинозу, ксилозу); сбраживает лимонную кислоту
Lactobacillus casei Не сбраживает пентозы (арабинозу, ксилозу); чаще сбраживает лимон- ную кислоту Р—; С±
Streptobacterium sp. Г етероферментативные Не сбраживает пентозы (арабинозу, ксилозу) Р—
Lactobacillus fructi- Не сбраживает пентозы Р—
vorans (арабинозу, ксилозу)
Lactobacillus desidi- osus Сбраживает арабинозу А 4-
Lactobacillus hilgardii Сбраживает ксилозу X-j-
Lactobacillus brevis Сбраживает пентозы (ара- бинозу, ксилозу) Р 4-
160
Рис. 34. Leuconostoc gracile (хЮОО)
[315].
Рис. 35. Leuconostoc oenos (X + )
(ХЮ00) [315].
ливающие нитраты и нитриты, не разжижающие желатину, в ос-
новном не образующие каталазу, гомоферментативные. Некото-
рые штаммы продуцируют слизь из сахарозы [73].
В вине встречается вид Pediococcus cerevisiae — гомофер-
ментативные кокки, не сбраживающие пентоз. Этот вид анаэро-
бен и требует для своего роста присутствия углекислого газа.
Всегда сбраживает глюкозу, фруктозу, маннозу, целлобиозу,
трегалозу.
Гомоферментативные кокки, сбраживающие пентозы, отно-
сятся к виду Pediococcus pentosaceus.
Род Leuconostoc. Бактерии рода Leuconostoc относятся к ге-
тероферментативным коккам, имеющим удлиненную яйцевид-
ную форму; располагаются единично, парами или короткими це-
почками (рис. 34, 35). Особенностью лейконостоков является не-
способность их образовывать из аргинина аммиак, как правило,
они не имеют каталазы. При сбраживании углеводов наряду с
молочной кислотой образуют СО2, этиловый спирт и летучие кис-
лоты; некоторые штаммы образуют маннит из фруктозы. Растут
при температуре 10°С, но не при 45°С [73].
Энологический интерес представляет отношение гетерофер-
ментативных кокков к пентозам, которые сбраживаются преиму-
щественнее гексоз. Брожение сахарозы и гексоз часто ослаблен-
ное и эта черта стабильная, не адаптивная. Предлагается раз-
личать варианты вида Leuconostoc oenos (см. табл. 35) по
классификации молочнокислых бактерий вин, приведенной выше
[315].
Характеристика вида Leuconostoc oenos: гетероферментатив-
ные кокки, располагающиеся в виде цепочек, грамположитель- 161
ны, развиваются при pH ниже 5,0 и даже ниже 4,0; микроаэро-
фильны или анаэробны, сбраживают глюкозу, иногда сахарозу,
редко — рафинозу. Пентозы (арабиноза и ксилоза) сбражива-
ются обе или одна из них. Яблочная кислота сбраживается при
низком pH, сбраживается лимонная кислота. При потреблении
сахаров образуется D (—)-молочная кислота. Leuconostoc oenos
выделяется из вин при яблочно-молочном брожении, реже — из
испорченных вин.
Э. Пейно [297] приводит следующее описание вида Leuconos-
toc gracile: грамположительные кокки, располагающиеся иногда
в виде цепочек, развивающиеся при pH ниже 5,0 и даже ниже 4,0,
гетероферментативные, микроаэрофильны или анаэробны. Кроме
глюкозы и фруктозы ферментируют лишь немногие сахара. Иног-
да сбраживают сахарозу, редко мальтозу, в исключительных
случаях — лактозу. Не сбраживают арабинозу, ксилозу, рамно-
зу. Яблочную кислоту сбраживают при низких значениях pH,
всегда разлагают лимонную кислоту. При потреблении сахаров
образуется молочная кислота D (—). Leuconostoc gracile изоли-
руется из вин при яблочно-молочном брожении.
По мнению ряда авторов [223, 297, 304, 306], Leuconostoc gra-
cile совершенно идентичен виду Bact. gracile, описанному Г. Мюл-
лером-Тургау и А. Остервальдером в 1913 г.
Классификация молочнокислых бактерий, изолированных из
вин, выполнена во многих винодельческих районах мира. Прове-
дено определение видового состава молочнокислых бактерий и
в нашей стране. По наблюдениям Л. С. Юстратовой [230], из вин
Молдавии наиболее часто выделяются гомоферментативные па-
лочки, реже гетероферментативные палочки. Г. Ф. Кондо [79]
в молдавских винах неоднократно найдены молочнокислые
кокки.
Выделение в чистую культуру и таксономическое определе-
ние молочнокислых бактерий из армянских вин проведено
Э. О. Петян [138] и Б. П. Авакяном [2]. Определен видовой состав
молочнокислых бактерий в винах Крыма (Южный берег, пред-
горная и степная части), в винах Кировабадского района Азер-
байджанской ССР и в некоторых винах Одесской области. Вы-
деленные штаммы молочнокислых бактерий принадлежали к го-
моферментативным палочкам Lactobacillus plantarum и коккам
Pediococcus cerevisiae и гетероферментативным палочкам Lacto-
bacillus brevis и L. buchneri и коккам Leuconostoc gracile и
Leuconostoc oenos. В табл. 36 приведен количественный состав
выделенных культур по районам и соотношение биохимических
групп бактерий. Из приведенных данных видно, что наиболее
распространены в исследованных винах гетероферментативные
палочки и гетероферментативные кокки. Гомоферментативные
палочки и кокки встречались реже. Для сравнения в таблице при-
ведены также данные, полученные Э. Пейно в основном при ана-
162 лизе французских вин [150].
Таблица 36
Молочнокислые бактерии Количество штаммов, выделенных в районах виноделия
Азербайджан- ской ССР Одесской области Крымской области По данным Э. Пейно (Франция)
Кокки гомоферментативные 10 34
гетероферментативные 56 2 55 398
Палочки гомоферментативные 14 40 27
гетероферментативные 53 6 82 253
Всего 109 22 187 712
В других винодельческих районах соотношение биохимиче-
ских групп молочнокислых бактерий может быть, несомненно,
иным. Не исключена возможность иного соотношения и в за-
висимости от состава вина, условий года, природных условий
района.
Из работ, посвященных экологии молочнокислых бактерий в
отдельных винодельческих районах страны, надо отметить иссле-
дования Р. Г. Гогоберидзе [47] грузинских вин и В. П. Журавле-
вой [60] туркменских вин.
МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Морфология клеток. Молочнокислые бактерии имеют форму
палочек или кокков, размеры которых зависят от состава среды
и условий культивирования.
Палочковидные формы могут быть короткими, почти кокко-
образными, длиной 0,5—0,7 мкм и длинными нитевидными, иног-
да достигающими длины 8,0 мкм. Располагаются они единично,
парами или цепочками, некоторые с характерными «обрубленны-
ми» концами.
Кокковые формы молочнокислых бактерий бывают овальны-
ми, диаметр клеток от 0,5—0,6 до 1 мкм. Они располагаются еди-
нично, парами или цепочками различной длины (рис. 36).
На форму клеток значительное влияние оказывает состав
среды. Так, длина клеток молочнокислых бактерий увеличивает-
ся в средах с высоким содержанием этилового спирта [69, 73,137].
Этиловый спирт тормозит деление клеток сильнее, чем рост. По-
этому в спиртсодержащих средах палочки вытягиваются в дли-
ну, становятся тонкими, кокки сохраняют свою форму [69].
Молочнокислые бактерии, встречающиеся в виноделии, не-
подвижны, не образуют спор, положительно окрашиваются по 163
Граму, не образуют пигмент, не вос-
Рис. 36. Форма клеток молочнокис-
лых бактерий. Электронно-микроско-
пические снимки:
кокки — а — Leuconostoc oenos (Х6000);
б — Pediococcus cerevisiae (Х5000); па-
лочки — в — Lactobacillus casei (Х8500);
г — Lactobacillus brevis (X5500) [309].
станавливают нитраты в нитриты,
характеризуются неактивной ката-
лазой.
Структура и компоненты клеток
молочнокислых бактерий во многом
сходны с другими грамположитель-
ными бактериями.
Клеточная оболочка представля-
ет собой электронноплотный гомо-
генный слой толщиной 15—60 нм.
Цитоплазматическая мембрана мо-
жет быть двухслойной или трехслой-
ной толщиной до 7—8 нм [73].
В цитоплазме клеток обнаруже-
ны рибосомы диаметром до 15 нм,
ядерный материал (нуклеоид), со-
стоящий из тонких плотных нитей,
отождествляемых с дезоксирибонук-
леиновой кислотой (ДНК) (рис. 37, 38). Структура и состав
клеток могут быть различными у молочнокислых бактерий от-
дельных видов. Некоторые палочковидные формы содержат в
качестве включений зерна метахроматина.
Молочнокислые бактерии размножаются путем простого де-
ления. Бактериальная клетка увеличивается в размерах и де-
лится на две одинаковых клетки. Деление клетки в одной плос-
кости приводит к образованию цепочек, в двух плоскостях — к
образованию тетрад, характерных для рода Pediococcus. При
благоприятных условиях некоторые бактерии дают новое поколе-
ние через 15 мин и менее, при неблагоприятных — через 24 ч и
более.
На поверхности желатиновых, агаризованных сред молочно-
кислые бактерии образуют мелкие колонии, иногда без выра-
женного поверхностного роста. По данным О. К. Палладиной
[136], палочковидные бактерии на средах, содержащих вещества
с восстановительными свойствами, например с 0,2% цистеина,
образуют типичные шероховатые формы колоний. У бактерий
рода Leuconostoc найдены S-, О- и R-типы колоний.
Физиология молочнокислых бактерий. Характерным призна-
ком молочнокислых бактерий является отсутствие каталазы. Од-
нако в последние годы появились сообщения об обнаружении
каталазной активности у различных видов молочнокислых бак-
терий. Псевдокаталаза есть у штаммов некоторых видов родов
Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus.
Протеолитическая активность установлена как у кокковых
форм, так и у палочек и стрептобактерий, при этом палочко-
видные бактерии обладают большей активностью, чем кокковые
164 формы. Обнаружены протеазы, разрушающие пептиды. В про-
Рис. 38. Электронная микрофотогра-
фия клеток Leuconostoc (X 80000);
видны стенка клетки и цитоплазма-
тическая мембрана [315].
Рис. 37. Электронная микрофотогра-
фия клетки Lactobacillus casei
ч—(Х88000):
п — полифосфатные включения; р — рибо-
сомы; кс — клеточная стенка; цм — цито-
плазматическая мембрана [73].
изводстве важно использовать молочнокислые бактерии, обра-
зующие в больших количествах свободные аминокислоты. При
подборе штаммов важно также отобрать такие, которые не об-
разуют фракции пептидов с горьким вкусом [74].
Липолитической активностью обладают штаммы многих ви-
дов молочнокислых бактерий кокковых и палочковидных форм.
Препарат липазы, полученный из бесклеточных экстрактов
L. brevis, довольно легко гидролизовал простые триглицери-
ды [73].
По биохимической деятельности молочнокислые бактерии в
зависимости от характера продуктов сбраживания гексоз (глю-
коза, фруктоза, манноза, галактоза), дисахаридов (лактоза,
мальтоза, сахароза) и полисахаридов (декстрин, крахмал) де-
лятся на гомоферментативные и гетероферментативные. Гомо-
ферментативные бактерии при брожении сахаров образуют в ос-
новном молочную кислоту и незначительные количества фума-
ровой и янтарной, летучих кислот, этилового спирта и
углекислоты; гетероферментативные — наряду с молочной зна-
чительно большие количества уксусной кислоты, этилового спир-
та, углекислого газа и других продуктов, используя на это до
50% сахаров.
Гомоферментативное молочнокислое брожение выражается
формулой:
С6Н12О6 — 2С3Н6О3 + энергия (64,4 кДж).
Глюкоза Молочная
кислота 165
Осуществляется гомоферментативное молочнокислое броже-
ние по гликолитической схеме Эмбдена — Мейергофа — Парнаса
(см. главу I). При этом выход молочной кислоты от потреблен-
ной глюкозы составляет почти 100%.
Процесс расщепления гексозы проходит через те же стадии,
что и при спиртовом брожении, т. е. по гексозодифосфатному
пути до образования пировиноградной кислоты. Далее пировино-
градная кислота не превращается как при спиртовом брожении
в уксусный альдегид и углекислый газ из-за отсутствия фермен-
та карбоксилазы, а восстанавливается в молочную кислоту.
В. Н. Шапошников [224] рассматривает процесс гомофермен-
тативного брожения как классический пример строгого разгра-
ничения в материальном отношении конструктивного и энерге-
тического обменов. Гомоферментативное брожение — только
энергетический обмен. Для построения массы бактерий исполь-
зуется не глюкоза, а готовые аминокислоты субстрата.
Гетероферментативное молочнокислое брожение происходит
по другому пути — по пентозофосфатному и выражается общей
формулой:
2С6Н12О6 —► С3Н6О4 С4Н8О4 -f* С2Н4О2 4~ С2Н5ОН -f- СО2 -f- Н2 -f- энергия.
Глюкоза Молочная Янтарная Уксусная Этиловый
кислота кислота кислота спирт
Пировиноградная кислота частично расщепляется до уксус-
ного альдегида и СОг. В результате превращений уксусного аль-
дегида и пировиноградной кислоты образуются янтарная и ук-
сусная кислоты и этиловый спирт.
При гетероферментативном брожении может накопиться мо-
лочной кислоты до 40% от количества сброженного сахара, ян-
тарной кислоты — около 20%, этилового спирта—10%, уксус-
ной кислоты — 10%, газов — около 20%.
Гетероферментативные бактерии вызывают молочнокислое
брожение в крепких, десертных и столовых недоброженных ви-
нах. При этом наблюдается уменьшение сахара, увеличение тит-
руемой кислотности (до 9 г/л) и летучей (до 4 г/л), выделение
углекислого газа.
Деление молочнокислых бактерий на гомо- и гетерофермента-
тивные было предложено Орла-Иенсеном. Однако следует заме-
тить, что нет строгого функционального различия между этими
группами молочнокислых бактерий. Приводится много исследо-
ваний, свидетельствующих о том, что в зависимости от ряда фак-
торов (pH, присутствия СО2 и О2, физиологического состояния
клеток) изменяется характер конечных продуктов брожения. Так,
некоторые штаммы L. plantarum, L. easel, не обладающие спо-
собностью образовывать газ из глюкозы на специальной среде, в
аэробных условиях накапливают летучие кислоты, диацетил,,
ацетоин [73], т. е. гомоферментативные бактерии в зависимости
от состава среды могут образовать кроме молочной кислоты раз-
166 личные вторичные продукты брожения.
Е. И. Квасников и Г. Ф. Кондо [68] при исследовании молоч-
нокислых бактерий, развивающихся в винах, наблюдали у штам-
мов L. buchneri, L. brevis, L. fermenti потерю способности к об-
разованию летучих кислот, углекислоты и спирта. Такое превра-
щение гетероферментативных бактерий в гомоферментативные
происходило при длительном культивировании бактерий, выде-
ленных из больных вин, на автолизатглюкозных и люцерновых
средах.
А. Ф. Войткевич считал необоснованным отказываться на
этом основании от деления бактерий на гомо- и гетерофермента-
тивцые, так как наличие переходных форм не исключает воз-
можности выделения основных типов.
Молочнокислые бактерии могут также проводить в вине про-<
цесс яблочно-молочного брожения, который заключается в раз-
ложении яблочной кислоты до молочной по схеме:
С4Н6О5 С3Н6О3 + СО2.
Яблочная Молочная
кислота кислота
В результате превращения двухосновной яблочной кислоты в
одноосновную молочную уменьшается титруемая кислотность,
увеличивается значение pH, выделяется углекислый газ. В весо-
вом отношении из 134 г яблочной кислоты образуется 90 г мо-
лочной кислоты и 44 г углекислого газа, т. е. 1 г яблочной кис-
лоты дает 0,67 г молочной кислоты. Эта реакция не сопровожда-
ется выделением энергии. Следовательно, энергетический обмен
осуществляется иным путем. Источником энергии при процессе
яблочно-молочного брожения являются очень незначительные
количества углеводов. Для разложения 1 г яблочной кислоты
бактериям достаточно 0,1—0,2 г глюкозы.
Превращение яблочной кислоты в молочную через пирови-
ноградную осуществляется при помощи яблочного фермента (ма-
лик-фермента), который является адаптивным и образуется бак-
териями в том случае, если в субстрате имеется яблочная кис-
лота.
Превращение яблочной кислоты в молочную осуществляется
молочнокислыми бактериями и через щавелевоуксусную кисло-
ту, а также прямым декарбоксилированием.
Общепризнано, что гомо- и гетероферментативный тип бро-
жения гексоз вызывается в вине соответственно гомо- и гетеро-
ферментативными бактериями. Существенные разногласия вызы-
вает вопрос о принадлежности возбудителей яблочно-молочного
брожения к определенному биохимическому типу молочнокислых
бактерий, строго приспособленному к гомо- или гетерофермента-
тивному процессу.
Е. И. Квасников и Г. Ф. Кондо [68], в течение ряда лет изу-
чавшие биологию молочнокислых бактерий, выделенных из боль-
ных вин Средней Азии, считали неправильным связывать процес-
сы молочнокислого скисания и яблочно-молочного брожения с
167
определенными, узко специализированными видами бактерий.
Проведенное ими искусственное заражение вин различными
штаммами молочнокислых бактерий показало, что гетерофер-
ментативные бактерии вызывают заболевание вин молочнокис-
лым скисанием, сбраживая сахар с образованием молочной и
летучих кислот.
Эти же бактерии при недостатке сахара вызывают процесс
яблочно-молочного брожения, используя яблочную кислоту.
В настоящее время мнения большинства ученых сходятся на
том, что и гомо- и гетероферментативные бактерии могут вести
в вине процесс яблочно-молочного брожения [71, 72, 235, 251, 264,
287, 291, 304].
Многочисленные исследования, проведенные в последнее вре-
мя за рубежом, показали, что из вин, подвергшихся яблочно-мо-
лочному брожению, изолируются различные виды молочнокис-
лых бактерий гомоферментативных (L. plantarum, L. casei) и
гетероферментативных (палочек L. buchneri, L. brevis, L. hilgar-
dii, кокков — Leuconostoc mesenteroides, Leuc. citrovorum, Leuc.
vini, Leuc. gracile).
Таким образом, яблочно-молочное брожение в вине м’ожет
быть вызвано любым видом гомо- и гетероферментативных мо-
лочнокислых бактерий. Разложение яблочной кислоты — свойст-
во всех видов молочнокислых бактерий. Его легко обнаружить,
выращивая молочнокислые бактерии на средах, в которых един-
ственным источником углерода является яблочная кислота. Ли-
монная, винная и молочная кислоты используются меньшим ко-
личеством молочнокислых бактерий, поэтому деление молочно-
кислых бактерий на гомоферментативных, гетероферментатив-
ных и яблочно-молочного брожения является неверным.
Самостоятельно третьей группы бактерий не существует, имеют-
ся лишь гомо- и гетероферментативные, вызывающие яблочно-
молочное брожение в винах с различной кислотной характерис-
тикой.
Продукты обмена веществ. Основными веществами функцио-
нальной деятельности молочнокислых бактерий являются молоч-
ная кислота, спирты и летучие кислоты, диацетил и ацетоин
и др.
Образование молочной кислоты. Форма молоч-
ной кислоты, образуемой при брожении сахаров, зависит от ви-
да бактерий. Гомоферментативные L. casei образуют только
L ( + )-молочную кислоту. Все гетероферментативные кокки и
редкие штаммы гетероферментативных палочек образуют толь-
ко молочную кислоту D (—). Смесь молочной кислоты L ( + ) и
D (—) продуцируют все гетероферментативные палочки L. plan-
tarum, другие неклассифицированные Streptobacterium и гомо-
ферментативные кокки [257, 324].
В винах, в которых молочнокислые бактерии не развивались^
168 содержится мало молочной кислоты, в пределах 0,7—1,0 г/л с до-
волыю высокой пропорцией изомера D (—). Наоборот, в процес-
се яблочно-молочного брожения накапливается L ( + )-молочная
кислота, которая составляет 75% общего количества кислоты
{243, 253, 296]. Таким образом, считается, что все молочнокислые
бактерии, даже те, которые образуют из сахара молочную кис-
лоту D (—), и те, которые дают смесь двух изомеров, превраща-
ют (//-яблочную кислоту в L ( + )-молочную [268, 298, 308]. Обра-
зование молочной кислоты в процессе яблочно-молочного броже-
ния Leuconostoc oenos в красном вине характеризуется
данными, приведенными в табл. 37 [238].
Такие данные являются свидетельством того, что путь пре-
вращения яблочной кислоты отличается от пути сбраживания са-
харов молочнокислыми бактериями, и механизм яблочно-молоч-
ного брожения следует рассматривать как прямое декарбоксили-
рование, а не участие в нем специфических лактатдегидрогеназ
[254, 269, 303, 320, 321].
Образование полиолов (многоатомных спир-
тов). При брожении глюкозы и пентоз молочнокислые бактерии
образуют глицерин и бутандиол-2,3, фруктозы—маннитол. При
этом» качественный и количественный составы многоатомных
спиртов находятся в зависимости от вида бактерий.
Образование летучих кислот. Летучие кислоты об-
разуются в винах разными биохимическими группами молочно-
кислых бактерий при брожении сахаров (гексоз и пентоз), орга-
нических кислот (яблочной, лимонной, винной) и глицерина [148,
149]. Данные, полученные 3. Д. Рабинович [149], свидетельству-
ют о следующем: гетероферментативные палочки образуют мно-
го летучих кислот (1—3 г/л) при сбраживании фруктозы, ара-
Таблица 37
Величина pH красного вина (первоначальная) Количество молочной кислоты1, образовавшейся в процессе яблочно-молочного брожения Leuconostoc oenos, мг/мл Содержание L (+) молочной кислоты, % от общего количе- ства
общей L (+) D (-)
3,15 2,10 1,71 0,42 81,5
3,30 2,70 2,26 0,44 83,7
3,40 2,13 1,66 0,33 77,8
3,50 2,50 2,36 0,14 94,5
3,63 2,41 2,30 0,11 95,5
3,73 2,64 2,38 0,26 90,2
3,83 2,81 2,42 0,37 86,2
1 Цифры представляют собой разницу между содержанием молочной кислоты,
обнаруженной в винах после яблочно-молочного брожения, и содержанием ее в
соответствующих контрольных пробах вина.
169
а б л и ц a 38 S каприловой
е- МОЛОЧНОКИСЛИЛ- «-капроновой
1ии субстрата «-валери- ановой
ТО CQ
•я при сбражи IT/J ‘IIWKI изовалери- ановой
X С.
Н л ТО CQ О со то а \о о 0) й2 то ю «-масляной

летучих кислс нзомасляной

Количеств< пропионо- вой
о ж
CJ ье >»
170
бинозы, ксилозы; лимонную кислоту сбраживают слабо; гомо-
ферментативные палочки почти не образуют летучих кислот при
сбраживании фруктозы и, напротив, синтезируют до 2 г/л из ли-
монной кислоты. При культивировании на среде с глицерином
летучие кислоты образуют только гомоферментативные палочки.
При сбраживании глюкозы и яблочной кислоты все виды мо-
лочнокислых бактерий образуют лишь очень незначительные ко-
личества летучих кислот.
Гетероферментативные кокки синтезируют летучие кислоты
при сбраживании фруктозы, арабинозы и лимонной кислоты.
В табл. 38 приведен качественный анализ летучих кислот, об-
разуемых молочнокислыми бактериями при использовании тех
или иных источников углерода. Летучие кислоты, как видно, поч-
ти на 100% состоят из уксусной кислоты. Лишь в процессе сбра-
живания глицерина гомоферментативными палочками образует-
ся заметное количество пропионовой кислоты (0,035 г/л). Ос-
тальные летучие кислоты образуются в очень малых
количествах (0,001—0,005 г/л) или в виде следов.
Образование диацетила и ацетоина. Установ-
лена связь между яблочно-молочным брожением и наличием в
вине повышенных количеств диацетила и ацетоина. В винах, в
которых прошло кислотопонижение, образуется ацетоина и диа-
цетила в среднем (в сумме) 9,3 мг/л, а в винах, не прошедших
яблочно-молочное брожение,— 4,3 мг/л.
Диацетил рассматривается как вкусовое вещество, оптималь-
ные концентрации которого улучшают аромат и не ухудшают
качества вин окисленного типа [161, 261]. Диацетил образуется
в процессе яблочно-молочного брожения гетероферментативны-
Таблица 39
Основная питательная среда с добавлением субстратов Биосинтез диацетила и ацетоина молочнокислыми бактериями, мг/л
гомоферментатив- ные палочки, штамм 0-21-б гетерофермента - тивные палочки, штамм к-24-3 Г ете рофе рментативные кокки, штамм 31-III-1
диацетил аце- тоин диацетил аце- тоин диацетил ацетоин
Глюкоза 5,3 П,4 0,2 0,4 0,2 0,1
Фруктоза 22,1 10,0 0,0 0,3 0,0 0,8
Арабиноза 6,3 12,8 0,0 0,0 0,0 1,3
Ксилоза 9,4 14,1 0,2 3,2 0,0 0,3
Яблочная кислота 1,0 1,5 0,2 0,7 0,3 1,3
Лимонная кислота 4,6 29,8 0,2 3,9 2,5 39,0
Винная кислота 3,0 13,6 0,1 1,1 0,0 0,6
Глицерин —> — — — 0,0 0,5
Примечание. Среды без бактерий содержали диацетила до 0,4 мг/л, ацето-
ина — 4,0 мг/л.
-_________________________________________________________ 171
ми кокками рода Leuconostoc и гомоферментативными бакте-
риями.
3. Д. Рабинович [41] хотя и не удалось выяснить вопрос об
источниках образования диацетила и ацетоина молочнокислыми
бактериями, но полученные данные свидетельствуют о том, что
гетероферментативные палочки при культивировании на испы-
танных питательных субстратах диацетила и ацетоина не обра-
зуют и, наоборот, гомоферментативные образуют, гетерофермен-
тативные кокки синтезируют диацетил и ацетоин при сбражива-
нии лимонной кислоты. В табл. 39 приведены данные, характе-
ризующие биосинтез диацетила и ацетоина молочнокислыми
бактериями (выборочно из изученных 20 штаммов).
Таким образом, есть основание предполагать, что в процес-
се биологического кислотопонижения, проходящего в винах за
счет сбраживания яблочной и лимонной кислот, повышение со-
держания диацетила и ацетоина вызывается гомоферментатив-
иыми палочками и гетероферментативными кокками. При молоч-
нокислом брожении сахаров вина диацетил и ацетоин образуют
только гомоферментативные палочки.
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РАЗВИТИЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Углеродное питание. Молочнокислые бактерии используют
незначительные количества тех соединений, которые служат ис-
точником энергии. Основным источником энергии для молочно-
кислых бактерий являются моно- и дисахариды — глюкоза, лак-
тоза, сахароза, мальтоза.
В качестве источника энергии и в конструктивном обмене они
используют и органические кислоты — лимонную, яблочную, пи-
ровиноградную, фумаровую и др. L. brevis в качестве источника
углерода могут использовать уроновые кислоты — глюкуроно-
вую и галактуроновую с образованием СО2, уксусной и молочной
кислот [73]. В отсутствие сбраживаемых углеродсодержащих суб-
стратов молочнокислые бактерии в качестве источника энергии
утилизируют аминокислоты (глутаминовую кислоту, аргинин, ти-
розин), декарбоксилируя их с выделением СО2. Полисахариды,
как правило, молочнокислые бактерии не используют.
Многие молочнокислые бактерии нуждаются при развитии в
наличии СО2, который они употребляют для биосинтеза белков,
жирных кислот и др.
Азотное питание. По потребности в источниках азота молоч-
нокислые бактерии можно разделить на три основные группы:
нуждаются в сложном комплексе аминокислот (подрод Ther-
mobacterium) ;
хорошо развивающиеся на цистеине и аммонийных солях
(подрод Streptobacterium);
могут развиваться на аммонийных солях в качестве единст-
172 венного источника азота (подрод Streptococcus).
Поскольку значительное число молочнокислых бактерий не
способно синтезировать сложные органические формы азота, им
необходимы питательные среды со сложными органическими
формами азота — смесями аминокислот, гидролизатами белков
(мяса, казеина, муки фасолевой, соевой, виковой), являющими-
ся источниками пептонов, пептидов, различных аминокислот.
Витамины. Для развития молочнокислых бактерий, особенно
для палочковидных форм, витамины являются необходимыми
факторами [73].
Установлено, что все виды палочковидных бактерий нужда-
ются в пантотеновой кислоте, биотине, никотиновой кислоте, а
гетероферментативные—еще и в тиамине. Не требуется им ино-
зит, холин и n-аминобензойная кислота.
Количество пиридоксина (витамина Вб), необходимое для
развития молочнокислых бактерий, зависит от качественного и
количественного аминокислотного состава среды, что является
свидетельством определенной функции витамина В6 — катализ
синтеза необходимых им аминокислот.
При наличии в среде олеиновой кислоты у L. fermenti утрачи-
вается потребность в биотине [21].
Е. И. Квасников и О. А. Нестеренко, используя полную пита-
тельную среду, изучили большую коллекцию штаммов молочно-
кислых бактерий и установили зависимость между потребностью
в витаминах и видовой принадлежностью штаммов.
Следует обратить внимание на то, что потребность молочно-
кислых бактерий в отдельных витаминах может изменяться от
присутствия тех или иных аминокислот, жирных кислот и дезок-
сирибозидов. Пуриновые основания влияют на потребность бак-
терий в л-аминобензойной кислоте; потребность в фолиевой кис-
лоте значительно снижается, если используют среду, содержа-
щую все известные аминокислоты, тимин (или тимидин) и
пуриновые основания, которые синтезируются бактериями при
участии фолиевой кислоты.
В винах витамины содержатся в количествах, необходимых
для развития молочнокислых бактерий. Потребность молочнокис-
лых бактерий в витаминах показана в табл. 40 [315].
Отчетливую стимуляцию роста молочнокислых бактерий, кро-
ме аминокислот и витаминов, вызывает олеиновая кислота (до
4 мкг/мл), а также линолевая и линоленовая, которые могут за-
менять олеиновую кислоту; уксусная (до 40 мкг/мл) и лимонная
кислоты; тимидин (до 2 мкг/мл) [21J. Для роста некоторых бак-
терий эффективны вещества с высокой восстановительной спо-
собностью, такие, как глутатион, аскорбиновая кислота [73].
Иногда пептиды стимулируют рост клеток молочнокислых
бактерий более эффективно, чем свободные аминокислоты, к при-
меру, гистидиновый пептид по сравнению с гистидином.
Неорганические соединения. Для развития молочнокислых
бактерий необходимы неорганические соединения — медь, желе-
173
Таблица 40
Витамины Потребность молочнокис- лых бактерий в витаминах, мкг/л Среднее содержание витами- нов, мкг/л
в сусле в винах
Тиамин 2,5 330 8
Рибофлавин 25 21 100
Пантотеновая кислота 25 820 890
Пиридоксин 2,5 420 460
Никотиновая кислота 50 3260 1730
Биотин 0,012 2,6 2,0
Мезоинозит 250 500000 415000
Парааминобензойная кис- 5 51 67
лота Птероилглютаминовая кис- 0,5 1,2 2,0
лота Холин 5000 26000 25000
зо, натрий, калий, фосфор, йод, сера, магний, марганец. Особен-
но важен марганец, который предохраняет клетки от автоли-
за [73].
Бактерии-кислотопонижатели нуждаются в присутствии комп-
лекса минеральных веществ. Гетероферментативные кокки не
развиваются в средах, лишенных путем ионообмена катионов
металлов. Рост бактерий может быть вызван добавлением ионов
К+ совместно с ионами Mg2+ или Мп2+. При содержании в среде
Na+ совместно с К+ рост молочнокислых бактерий усиливается,
в отсутствие ионов К+ усиление роста ион Na+ не вызывает. Ион
Мп2+ расщепление яблочной кислоты увеличивает в 4 раза,
Mg2+— на 50%.
Отмечено [333] положительное влияние на яблочно-молочное
брожение стимуляторов роста, содержащихся в томатном соке.
Наличие этого рода стимуляторов обнаружено и в других пло-
дах и винограде, в красном больше, чем в белом, а в кожуре
больше, чем в мякоти. Для выяснения природы этого фактора
томатный сок был разделен физико-химическими способами на
фракции. Исследования показали, что Мп оказывает такое же
влияние, как томатный сок, и его заменяет. Из 71 штамма бакте-
рий 63 нуждались в добавлении к основной среде томатного со-
ка или иона Мп. Несмотря на несомненно стимулирующее влия-
ние такого рода активаторов внесение их в вино вряд ли жела-
тельно, так как нарушает его натуральное сложение. Для
стимуляции яблочно-молочного брожения могут быть применены
приемы, свойственные технологическому процессу виноделия.
Кислород. Молочнокислые бактерии в отличие от аэробных,
цитохромсодержащих, не имеют цитохромов, участвующих вды-
хании, но они осуществляют активное окисление некоторых ве-
174 ществ благодаря наличию флавопротеидных систем [51, 73].
Процесс окисления у молочнокислых бактерий часто связан
с образованием перекиси водорода, подавляющей окисление.
А некоторые из них могут вести процесс дальше, восстанавливая
перекись до воды в присутствии окисляемых субстратов [335].
Максимум образования перекиси водорода наблюдается в лога-
рифмической фазе роста культуры.
Отношение видов молочнокислых бактерий к аэрации среды
различно и иногда противоположно., Так, строгий анаэробиоз,
как правило, замедляет только начало развития гетерофермен-
тативных палочек; рост же гомоферментативных палочек явно
снижает на 10%, а брожение на 23% [295]. Из кокковых форм, от-
носящихся к гетероферментативным (Leuc. oenos), сбраживаю-
щие арабинозу достигают оптимального роста в анаэробных ус-
ловиях, тогда как формы, не усваивающие пентозы, очень плохо
развиваются в этих условиях [315].
Температура. В качестве основного критерия при классифи-
кации используется рост при температуре 15°С или при 45°С.
Бактерии, изолированные из вин, не термофильны, не развива-
ются при температуре 45°С. Некоторые штаммы гомофермента-
тивных молочнокислых бактерий могут развиваться при темпера-
туре 40°С в первые сутки. Оптимальной для развития молочно-
кислых бактерий признана температура 25°С. Однако кокковые
формы в общем менее чувствительны к температуре, чем бакте-
рии, и могут хорошо развиваться при температуре от 15 до 25°С.
Результаты практики подтверждают эти сведения, поскольку яб-
лочно-молочное брожение происходит при температуре 15°С и
несколько медленнее при 10—12°С.
Спирты. Спирты обладают бактерицидным и бактериостати-
ческим действием. Наибольшее бактерицидное действие этило-
вого спирта наблюдается при концентрации 60—75% об.
Е. И. Квасниковым [69] и Э. О. Петян [137] изучено отношение
к спирту нескольких тысяч штаммов молочнокислых бактерий
как свежевыделенных из различных природных и производст-
венных субстратов, так и коллекционных. Значительное количе-
ство штаммов молочнокислых палочковидных бактерий разви-
валось при концентрации этилового спирта (в % об.) 15—18, не-
которые при 20 и 22 и даже при 24. Более низкие концентрации
этилового спирта — 12—16% об. были предельными для кокко-
вых форм.
Таким образом, приспособленность молочнокислых бактерий
к развитию при высоких концентрациях этилового спирта явля-
ется характерным свойством, присущим как гомо-, так и гете-
роферментативным формам. Так, из больных вин (сухих столо-
вых и десертных) были выделены штаммы L. buchneri, которые
развивались при содержании спирта 16—22% об. Значительной
(до 23—25% об.) спиртоустойчивостью обладали штаммы, выде-
ленные из резервуарного шампанского [67, 68]. Однако макси-
мальная устойчивость к спирту проявляется на полноценных пи- 175
Таблица 41
Максимальное содержание этилового спирта в среде, % об. Спиртоустойчивость молочнокислых бактерий, % штаммов Максимальное содержание этилового спирта в среде, % об. Спиртоустойчивость молочнокислых бактерий, % штаммов
палочки кокки палочки кокки
15 38 2 11 13 12
14 14 12 10 0 2
13 22 35 8 0 2
12 13 35
тательных средах, богатых аминокислотами и витаминами, и, на-
оборот, устойчивость к спирту значительно снижается на
неполноценных питательных средах. Обогащение среды автоли-
затом дрожжей повышает спиртоустойчивость молочнокислых
бактерий. Устойчивость бактерий к спирту также повышалась
на 2% об. при длительном культивировании их с винными дрож-
жами.
Э. Пейно и С. Домерк [299] приводят процентное соотношение
штаммов бактерий, способных развиваться в присутствии мак-
симального количества этилового спирта (табл. 41).
Температура повышает угнетающее действие спирта. L. buch-
neri в средах без спирта развиваются при температуре 45°С, тог-
да как в присутствии спирта в количестве 16% об. они не разви-
ваются уже при 36°С.
Наличие спирта в питательных средах способствует длитель-
ному выживанию бактерий. Установлена высокая продолжитель-
ность жизни молочнокислых бактерий в винах (в осветленных
винах в течение 7 мес и более, в дрожжевых осадках сухих вин—
свыше 4 лет) [69, 73].
Спирт у многих видов бактерий вызывает морфологические
изменения, проявляющиеся в увеличении длины клеток. В херес-
ных виноматериалах при пленочном методе хересования бакте-
рии принимают вид длинных тонких изогнутых нитей.
Молочнокислые бактерии оказались менее устойчивыми к бу-
тиловому спирту, чем к этиловому. Глицерин они хорошо усваи-
вают [69, 73].
Величина pH. Большинство штаммов молочнокислых бакте-
рий, развивающихся в винах, выдерживают кислотность среды,
соответствующую pH 3,0—3,5; незначительный процент состав-
ляют кислотовыносливые штаммы, способные к развитию в ви-
не при pH 2,9 [238].
Наибольшей кислотовыносливостью обладают гетерофермен-
тативные кокки, наименьшей — гетероферментативные палочки.
Гомоферментативные палочки занимают промежуточное положе-
176 ние. 3. Д. Рабинович определила последовательность потребле-
пия молочнокислыми бактериями глюкозы, фруктозы и яблочной
кислоты при низких значениях pH на солодовом сусле. Из дан-
ных, приведенных в табл. 42, следует, что гетероферментатив-
ные кокки при низких значениях pH среды потребляют сначала
яблочную кислоту, не затрагивая сахаров, при более высоких
pH — яблочную кислоту и фруктозу, при еще более высоких —
яблочную кислоту, фруктозу и глюкозу одновременно [147, 153].
Гомоферментативные палочки потребляют сахара и кислоты
в такой же последовательности, но при крайне низких значени-
ях pH они не развиваются.
Гетероферментативные палочки начинают развиваться при
более высоких значениях pH, причем потребляют яблочную кис-
лоту одновременно с сахарами, либо только одни сахара, не за-
трагивая яблочной кислоты.
Таким образом, только гетероферментативные кокки являют-
ся наиболее пригодными для кислотопонижения высококислот-
ных вин. Гомоферментативные бактерии несколько менее при-
годны для этой цели, так как они менее кислотовыносливы. Ге-
тероферментативные палочки приносят несомненный вред, так
как развиваются в малокислотных винах, где используют одно-
Т а б л1 и ц а 42
pH среды Количество штаммов, давших рост1 Количество штаммов, сбраживающих
яблочную кислоту яблочную кислоту, фруктозу яблочную кислоту, фруктозу и глюкозу фруктозу и глюкозу
Гомоферментативные палочки
2,7 2 2 — — ——.
2,8 8 3 4 1 —
3,0 10 —— 1 9 —
3,2 10 —- — 10 —
Гетероферментативные палочки
2,7 0 — — — —
2,8 0 —- —, —
3,0 5 1 •— 4 —.
3,2 10 —- — 7 3
Гетероферментативные кокки
2,7 9 9 »« — —
2,8 10 5 4 1 —
3,0 10 1 1 8 —
3,2 10 1 — 9 —
1 Для опыта взято по 10 штаммов.
177
7—568
Табл и ц а 43:
pH среды Количество жизнеспособных клеток бактерий разных видов после контакта с кислотами, %
сернистой пировиноградно- сернистой альдегидсернистой
3,0 Pediococcus 0 cerevisiae 0 0
3,2 0 0 48
3,4 15 75 75
3,0 Leuconosti 0 эс gracile 33 63
3,2 0 56 79
3,4 0 70 87
з,о Streptoh 10 icterium 66 96
3,2 23 88 76
3,4 33 82 85
3,0 Lactobacilltr 5 5 hilgardii 13 35
3,2 6 100 37
3,4 8 75 68
временно яблочную кислоту и сахара, вызывая ненужный для
этого вина процесс яблочно-молочного брожения и вредный про-
цесс молочнокислого скисания.
Сернистый ангидрид. Бактерии очень чувствительны к сер-
нистому ангидриду (SO2). Он ограничивает рост молочнокис-
лых бактерий гораздо в большей степени, чем рост дрожжей.
Через несколько минут контакта бактериальной суспензии с раз-
личными формами сернистой кислоты — свободной или связан-
ной (пируватсернистая и альдегидсернистая кислота), введен-
ной в среду в количестве 30 мг/л, — процент жизнеспособных
клеток молочнокислых бактерий уменьшается (табл. 43) [300].
ПРОЦЕССЫ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫМИ БАКТЕРИЯМИ
В ВИНАХ
Яблочно-молочное брожение вин
Возбудители яблочно-молочного брожения. Единственно по-
лезным процессом, который вызывается молочнокислыми бак-
териями в вине, является яблочно-молочное брожение в высоко-
кислотных винах. Разложение других составных частей, а так-
же яблочной кислоты в винах с нормальной или низкой кислот-
ностью нежелательно и даже вредно. Совершенно безопасным
178 для качества вина может быть такой процесс яблочно-молочного
брожения, при котором бактерии атакуют яблочную кислоту и
не затрагивают других компонентов.
Э. Пейно [295] приводит классификацию бактериологических
атак по степени возрастающей опасности: при сбраживании ара-
бинозы, лимонной кислоты и ксилозы — образуется небольшое
количество летучих кислот и незначительно снижается качество
вина; при сбраживании винной кислоты, глицерина, глюкозы и
фруктозы — в вине происходят серьезные изменения, повышает-
ся содержание летучих кислот и резко снижается качество.
Степень опасности, которую молочнокислые бактерии пред-
ставляют для вина, зависит от свойств вида бактерий и харак-
теристики вина. Наименее опасными являются те молочнокис-
лые бактерии, которые сбраживают яблочную кислоту, не затра-
гивая сахаров, либо сбраживают сахара без образования
летучих кислот.
Г. Ф. Кондо [79] экспериментально показала, что на винодель-
ческих заводах Молдавии некоторые группы молочнокислых бак-
терий используют в кислых винах яблочную кислоту, не затраги-
вая сахаров. Э. Пейно [295] объясняет это явление, свойственное
гетероферментативным коккам, несоответствием порогов pH
сбраживания сахаров и яблочной кислоты. Изученные им
398 штаммов гетероферментативных кокков использовали яблоч-
ную кислоту, в среднем начиная с pH 3,23, а сахара — с pH 3,51.
У некоторых штаммов разрыв между порогами pH сбраживания
сахаров и яблочной кислоты составлял от 0,6 до 0,8. Наиболее
желательными агентами яблочно-молочного сбраживания явля-
ются гетероферментативные кокки, особенно штаммы, не сбра-
живающие лимонную кислоту и арабинозу. Другим подходящим
возбудителем яблочно-молочного брожения считают гомофер-
меитативные бактерии. Они рекомендуются исследователями на
том основании, что при сбраживании глюкозы не образуют ле-
тучих кислот.
Яблочно-молочное брожение считается необходимым для
приготовления немецких рейнских вин [223], французских крас-
ных бордоских [154], молдавских [79], хереса [80] и других вин,
имеющих высокую кислотность. Однако для качества вина да-
леко не безразлично, каким именно видом бактерий вызвано яб-
лочно-молочное брожение. Помимо разложения яблочной кисло-
ты бактерии частично используют также сахара. При этом необ-
ходимо отдать предпочтение тем бактериям, которые не дают
побочных продуктов при потреблении сахаров, либо совсем их
не затрагивают. Исследователи остановили свой выбор на двух
видах бактерий: гомоферментативных палочках [72, 258] и гете-
роферментативных кокках рода Leuconostoc (по старой номен-
клатуре Bact. gracile) [263, 316, 321, 334].
Гомоферментативные бактерии одновременно с разложением
яблочной кислоты могут сбраживать глюкозу, которая в незна-
чительном количестве имеется в сухом вине, и образовывать при
7*
179
Таблица 44
Биохимический тип бактерий Штамм pH среды Содержание сахара, % Образование летучих кислот после развития бактерий, г/л
Сусло
Г етероферментативные П42 4,1 17,2 6,5
М 4,1 17,2 6,7
Г омоферментативные к-ю 4,1 17,2 0,49
Вино
Г етероферментативные 114, 3,7 0,12 1,27
» М 3,7 0.12 1,19
» РК 3,7 0,12 1,05
» 30 М 3,7 0,12 1,42
Г етероферментативные П42 3,7 1,0 1,27
» М 3,7 1,0 1,39
» РК 3,7 1,0 1,58
» 30 М 3,7 1,0 1,88
Г етероферментативные 50 к 3,2 0,18 0,65
Г омоферментативные 552 3,2 0,18 0,48
Гетероферментативные 50 к 3,2 2,8 0,93
Г омоферментативные 552 3,2 2,8 0,47
Г етероферментативные 50 к 3,8 2,8 1,8
Г омоферментативные 552 3,8 2,8 0,43
этом молочную кислоту без побочных продуктов. В табл. 44 при-
ведены данные [72, 258] о накоплении летучих кислот при совме-
стно идущих в вине процессах молочнокислого и яблочно-молоч-
ного брожения, экспериментально вызванных молочнокислыми
бактериями. Эти результаты наглядно показывают, что гетеро-
ферментативные палочки как в сусле, так и в сухом вине обра-
зуют большое количество летучих кислот, в то время как образо-
вание летучих кислот в вине (по сравнению с контролем) гомо-
ферментативными палочками не наблюдалось.
Гетероферментативные кокки Э. Пейно [295] считает еще бо-
лее подходящими .агентами яблочно-молочного брожения. В его
опытах (табл. 45) из 398 изученных штаммов рода Leuconostoc
при pH 3 сбраживали яблочную кислоту 36% штаммов и только
7% сбраживали сахар, при pH 3,2 яблочную кислоту сбраживали
31% штаммов, а сахар — 12% штаммов. При более высоких зна-
чениях pH все большее число штаммов начинают сбраживать
сахара и все меньшее — яблочную кислоту. Таким образом, в
сухих винах, нуждающихся в биологическом кислотопонижении,
гетероферментативные кокки преимущественно используют яб-
180 лочную кислоту, не затрагивая сахаров,
Таблица 45
pH вина Число штаммов гетерофермен- тативных кокков (в %), сб раживающих pH вина Число штаммов гетерофер- ментативных кокков (в %), сбраживающих
яблочную кислоту сахара яблочную кислоту сахара
3,0 36 7 3,8 4 14 '
3,2 31 12 | 4,0 1 4
3,4 21 31 I 4,2 1 3
3,6 6 29
Спонтанный процесс яблочно-молочного брожения в винах.
Самопроизвольным процессом яблочно-молочного брожения
можно управлять на основании знания биологии возбудителя и
факторов, влияющих на его жизнедеятельность. Благоприятным
для сложения высококислотного вина может быть развитие в
нем гетероферментативных кокков или гомоферментативных па-
лочек. Для стимулирования их развития высококислотные вина
не следует сульфидировать. Однако сразу после использования
этими бактериями яблочной кислоты необходимо их инактиви-
ровать [69]. В тех случаях, когда в винах хотят сохранить боль-
шую свежесть, а в мускатах сортовой аромат, яблочно-молочное
брожение не проводят до конца, т. е. оставляют часть яблочной
кислоты несброженной.
Развитие всех видов бактерий в низкокислотных винах или
гетероферментативных бактерий в сахарсодержащих винах долж-
но быть остановлено.
Регулируя режим сульфитации сусла при отстаивании и ви-
на после окончания спиртового брожения, можно стимулировать
или подавлять биологическое кислотопонижение. При необходи-
мости проведения яблочно-молочного брожения высококислот-
ное сусло можно сульфитировать при отстаивании введением сер-
нистой кислоты не более 50—75 мг/л. После окончания спирто-
вого брожения сульфитация такого вина нежелательна, так как
понижение кислотности может произойти слишком поздно либо
совсем не развиться.
Г. Г. Валуйко [34] показал, что спонтанному возникновению
яблочно-молочного брожения в сухих белых и красных винах
способствует обогащение вина азотистыми веществами при вы-
держке его на дрожжах.
В низкокислотных винах процесс биологического кислотопо-
нижения не следует допускать, так как он ухудшает вкус и бу-
кет. Поэтому при изготовлении вин из низкокислотных сусел
желательно проводить отстаивание их при сульфитации до со-
держания сернистой кислоты 120—150 мг/л, а после выбражи-
вания сахаров вино снимать с дрожжевого осадка и хранить при
температуре ниже 10°С. Дополнительную сульфитацию вина еле- 181
дует проводить до содержания в нем сернистой кислоты в коли-
честве, не допускающем развития бактерий.
Процесс яблочно-молочного брожения можно остановить
сульфитацией до содержания в вине 25—30 мг/л свободной сер-
нистой кислоты, оклейкой, фильтрацией, а также пастеризацией.
На скорость процесса яблочно-молочного брожения большое
влияние оказывает температура. Как низкие (ниже 10°С), так и
высокие (выше 35°С) температуры препятствуют процессу био-
логического кислотопонижения вин. Однако после того, как в
вине размножились бактерии и процесс разложения яблочной
кислоты начался, он может продолжаться и при температу-
ре 5°С.
Окислительно-восстановительный потенциал также влияет на
течение процесса кислотопонижения. При более низкой величи-
не окислительно-восстановительного потенциала активнее разви-
ваются бактерии и быстрее завершается процесс. Этим некото-
рые авторы [81] объясняют более интенсивный процесс яблочно-
молочного брожения в крупных герметииеских резервуарах, чем
в мелкой таре; по мнению других, это связано с большей веро-
ятностью попадания бактерий из сусла.
Оптимальное содержание в сухих столовых винах титруемых
кислот в пересчете на винную составляет 6 г/л, отклонения до-
пускаются ±2 г/л. Практически нередко титруемая кислотность
достигает 9,5—10,5 г/л. Кроме перечисленных выше условий,
способствующих развитию спонтанного процесса яблочно-молоч-
ного брожения, а именно режима сульфитации, необходимо учи-
тывать содержание винной и яблочной кислот в винах, в кото-
рых понижение кислотности является желательным. В соответ-
ствии с содержанием яблочной кислоты в винах следует
рассчитывать на ту или иную интенсивность процесса яблочно-
молочного брожения и возможное снижение титруемой кислот-
ности.
Известно, что соотношение винной и яблочной кислот в ви-
нах зависит от сорта и района произрастания винограда. Подан-
ным Г. Ф. Кондо [79] за ряд лет, в столовых винах Молдавии со-
держится довольно разнообразный комплекс кислот. В винах
из сортов винограда Фетяска и Алиготе содержится — яблочной
до 3,5 г/л и винной до 6,5 г/л; Ркацители и Совиньон — яблочной
до 6 г/л и винной до 6 г/л.
По данным Варненского района НРБ за последние 10 лет, в
виноматериале из винограда сорта Рислинг итальянский содер-
жится наименьшее количество яблочной кислоты по сравнению с
10 другими виноматериалами из других сортов винограда — от
0,5 до 2,4 г/л. В вине из винограда сорта Ркацители содержится
яблочной кислоты от 1,2 до 3,1 г/л, а из винограда сорта Алиго-
те — от 3,3 до 5,0 г/л [191].
3. Д. Рабинович [153] при обследовании вин Одесской облас-
182 ти и Предгорной зоны Крыма установила наименьшее содержа-
ние яблочной кислоты в вине из винограда сорта Рислинг (1,2—
1,8 г/л), причем оно сочетается с наличием большого количест-
ва винной кислоты (4—6 г/л). Все другие вина содержат яблоч-
ной кислоты больше или столько же, сколько и винной.
Такое сочетание кислот особенно характерно для красных
вин. Вина из винограда сортов Бастардо, Каберне, Рубиновый
Л4агарача содержат мало винной кислоты (свободной и ее кис-
лых солей), их титруемая кислотность обусловлена в основном
яблочной и молочной кислотами.
Значение pH вина находится в зависимости от содержания
винной кислоты в общем количестве титруемой кислотности
[124]. Так, при одинаковой титруемой кислотности 6,5 г/л вино
из винограда сорта Алиготе урожаев двух лет (1967 и 1972 гг.)
содержало разное количество винной кислоты от 3,0 до 1,8 г/л,
что отразилось на величине pH — 3,1 и 3,2 соответственно.
Соотношения винной и яблочной кислот, найденные в опы-
тах для некоторых сортов вин, позволяют выбрать способ пони-
жения кислотности: биологический, состоящий в утилизации мик-
роорганизмами яблочной кислоты, или химический — путем
осаждения винной кислоты.
Влияние pH вина на скорость использования яблочной кис-
лоты молочнокислыми бактериями показано в табл. 46 [315].
Состав кислотного комплекса, типичный для вин из виногра-
да сорта Рислинг, как правило, характеризующийся очень ма-
лыми количествами яблочной кислоты при большом содержании
винной и в соответствии с этим низким значением pH, по-види-
мому, не стимулирует, а даже препятствует развитию молочно-
кислых бактерий.
В красных винах в связи со значительно меньшим содержа-
нием винной кислоты, чем яблочной, значение pH выше. При
содержании титруемых кислот 8—10 г/л pH вина соответствен-
но составляет 3,2 и 3,4. Это является одной из причин того, что
понижение кислотности в красных винах возникает и проходит
значительно быстрее, чем в белых. Естественно, перечисленными
Таблица 46
pH вина Содержание яблочной кислоты, г/л
первоначаль- ное при разной длительности яблочно-молочного брожения, сут
41 53 63 133
3,0 5,3 5,10 5,02 4,58 0,20
3,2 5,3 4,18 1,78 0,20 0 •
3,4 5,3 1,62 0,15 0 —.
3,6 5,3 0,25 0 — —
183
факторами не исчерпываются возможности управления процес-
сом яблочно-молочного брожения. Активная кислотность (pH)
является весьма важным показателем в регулировании процес-
сов, вызываемых молочнокислыми бактериями. В большинстве
случаев pH вин находится в пределах 2,8—3,8, для вин южных
районов СССР величина pH составляет 3,8—4,6. Высокая ак-
тивная кислотность замедляет разложение яблочной кислоты.
Так, в винах с pH 3,24 яблочная кислота была использована бак-
териями через полтора месяца после спиртового брожения, а в
винах с pH 2,8 — только через шесть месяцев.
Развитие молочнокислых бактерий в шампанских винах опи-
сано в литературе [67, 219]. По данным 3. Д. Рабинович, при
шампанизации вин в потоке сбраживается около 3 г/л яблоч-
ной кислоты (остаются только следы ее); сбраживается и
вся лимонная кислота 0,3 г/л; содержание молочной увеличива-
ется на 1,4 г/л. Титруемая кислотность’при этом уменьшается от
7,0 до 5,4 г/л. Возбудителем яблочно-молочного брожения ока-
зались гомоферментативные палочки Lactobacillus plantarum,
особенностью которых является их принадлежность к R-формам
и способность расти при температуре 45—50°С. Следует обратить
внимание на рекомендацию при производстве виноматериалов
для игристых вин принимать меры по сохранению яблочной кис-
лоты, поскольку установлено, что виноматериалы с более высо-
ким содержанием яблочной кислоты обладают высоким коэф-
фициентом сопротивления к выделению СОг, что указывает на
хорошие игристые свойства [219].
Яблочно-молочное брожение в винах при введении чистых
культур бактерий. Вызвать процесс яблочно-молочного броже-
ния в винах путем введения чистых культур молочнокислых
бактерий очень трудно. Вино содержит довольно ограниченный
по составу набор необходимых питательных веществ, что затруд-
няет их размножение. Тормозит развитие их также высокая
активная кислотность вин и наличие спирта. Поэтому введение в
вино селекционированной бактериальной разводки чаще всего
не дает положительных результатов [301].
Опыт применения лиофилизированного порошка молочно-
кислых бактерий для стимулирования яблочно-молочного броже-
ния в красных винах разных винодельческих подвалов Франции
не дал положительных результатов. Внесение бактерий в вина
иногда вызывало процесс яблочно-молочного брожения [328].
На востоке США рекомендуют для активирования размно-
жения бактерий L. citrovorum в винах применять биостимулято-
ры, которые способствуют развитию процесса биологического
кислотопонижения столовых вин даже при pH 3,0, когда без сти-
муляторов превращение яблочной кислоты вообще не происхо-
дит [233].
Есть сообщения об удачных опытах экспериментального кис-
184 лотопонижения вина путем введения бактериальной разводки
как в сусло, так и в вино. При использовании этого приема тре-
буется правильно выбирать культуру возбудителя, т. е. учиты-
вать биохимические и физиологические свойства молочнокислых
бактерий. Применяемая культура должна быть достаточно кис-
лотоустойчива, чтобы развиваться при высокой активной кислот-
ности вина (pH 2,7—3,2). Из смеси питательных веществ в пер-
вую очередь она должна использовать яблочную кислоту и не
давать побочных продуктов, ухудшающих качество вина. Это
должны быть гетероферментативные кокки или кислотоустойчи-
вые штаммы гомоферментативных палочек, не сбраживающих
лимонной кислоты и пентоз.
Однако наряду с правильным выбором культуры необходи-
мо выбрать наиболее подходящий момент для внесения разводки
молочнокислых бактерий в бродящую среду. При наличии в ви-
не большого количества несброженных сахаров существует опас-
ность образования из них молочной кислоты. К нежелательным
последствиям могла бы привести и. остановка по различным при-
чинам спиртового брожения. Наиболее безопасно введение бак-
териальной разводки в вино, содержащее не более 0,2% несбро-
женных сахаров.
С. Лафон-Лафуркад, С. Домерк и Э. Пейно на протяжении
ряда лет проводили опыты экспериментального заражения вин
бактериями яблочно-молочного брожения. Для адаптации бак-
терий к спиртуозности вина бактериальную разводку выращива-
ли с дрожжами в смешанной культуре на среде, состоящей из
виноградного сусла (в два раза разведенного водой), 5 г/л дрож-
жевого экстракта, 10% этилового спирта; pH 4,8. При темпера-
туре 25°С в течение 3 сут алкогольное брожение заканчивалось,
а бактериальная культура развивалась в спиртовой среде. За-
тем центрифугированием при частоте вращения 3000 об/мин
большее количество дрожжей удаляли, а из оставшейся среды
центрифугированием при 9000 об/мин собирали бактерии и про-
мывали раствором хлористого натрия (7 г/л).
Для экспериментального посева в вино использовались са-
мые кислотоустойчивые и спиртовыносливые штаммы молочно-
кислых бактерий. В опытах испытывалось 27 штаммов палочек
и кокков, из них 2 — гомоферментативных, 25 — гетерофермен-
тативных. Из всех испытанных культур молочнокислых бакте-
рий систематически вызывали яблочно-молочное брожение толь-
ко 5 штаммов гетероферментативных кокков. Процессу броже-
ния предшествовал продолжительный период адаптации бакте-
рий к вину (рис. 39) [315].
У всех испытанных видов молочнокислых бактерий наблюда-
лось уменьшение количества жизнеспособных клеток с первых
же часов внесения разводки в вино. За 48 ч пребывания в вине
25—90% клеток теряли способность к размножению. В течение
последующих 15—30 сут продолжалось, но более медленно от-
мирание бактерий. Затем оставшиеся живые клетки начали адап-
185
Рис. 39. Кривая развития бактерий при яблочно-молочном брожении
(ЯМБ) красных вин [315].
тироваться к среде, количество их постепенно возрастало. Скры-
тый период адаптации бактерий до заметного их увеличения
длился 8—30 дней.
Первым фактором, лимитирующим быстрое развитие бакте-
рий в экспериментальных посевах, является pH вина. Влияние
pH на устойчивость молочнокислых бактерий в вине показано
в табл. 47. В момент засева в 1 мл вина содержалось 620000 жиз-
неспособных бактерий. Чем выше значение pH, тем большее ко-
личество бактерий остается в жизнеспособном состоянии. Рост
культуры начинается только после 14-дневной и более длитель-
ной адаптации бактерий. Спонтанное яблочно-молочное броже-
ние наблюдается иногда и при pH 2,9 и 3,0. Относительно быст-
рое развитие бактерий при спонтанном кислотопонижении
Таблица 47
pH вина Количество бактерий в 1 мл вина, через
30 мин 24 ч 3 сут 14 сут
3,25 3,45 3,65 186 325000 410000 505000 10000 120000 360000 800 45000 184000 0 0 19000
обусловлено, вероятно, формированием естественно отселекцио-
нированной популяции кислотоустойчивых штаммов, у которых
к тому же период адаптации в вине проходит незаметно для на-
блюдателя (315]. Однако при равном значении pH в разных ви-
нах рост бактерий неодинаков. По-видимому, играют роль и дру-
гие факторы: содержание в вине спирта, недостаток минераль-
ных солей, витаминов и аминокислот.
Существует связь между pH и другими факторами, оказы-
вающими влияние на процесс яблочно-молочного брожения [258].
Скорость яблочно-молочного брожения в винах, инокулирован-
ных бактериями Leuconostoc oenos, в зависимости от pH различ-
на (табл. 48). При этом скорость брожения прямо пропорцио-
нальна первоначальным величинам pH.
Таблица 48
pH вина Время завершения яблочно-мо- лочного брожения, нед Скорость яблочно- молочного брожения, нед-i pH вина Время завершения яблочно-мо- лочного брожения, нед Скорость яблочно- молочного брожения, нед~1
3,15 23,4 0,04 3,63 3,6 0,28
3,30 9,4 0,11 3,73 2,7 0,37
3,40 5,3 0,19 3,83 2,0 0,50
3,50 3,9 0,25
При более высоких первоначальных значениях pH вина к кон-
цу процесса pH увеличивалось на 0,2.
Рассматривая особенности культур молочнокислых бактерий,
разных по биохимической деятельности и по систематическому
положению, 3. Д. Рабинович [150] отмечает высокую активность
гетероферментативных кокков рода Leuconostoc в снижении кис-
лотности высококислотных вин. Этот вид молочнокислых бакте-
рий может размножаться и вызывать яблочно-молочное броже-
ние даже в винах с содержанием титруемых кислот 11 г/л, вин-
ной кислоты — 5 г/л, pH 3,0. В табл. 49 приведены данные,
характеризующие кислотопонижение в белых винах чистыми
культурами молочнокислых бактерий. Гомо- и гетерофермента-
тивные палочки размножаются и вызывают яблочно-молочное
брожение в винах с меньшей кислотностью и значительно более
высоким значением pH. Здесь же следует отметить и то, что
лучшим способом индуцирования яблочно-молочного брожения
чистыми культурами молочнокислых бактерий является внесе-
ние бактериальной разводки в бродящее или дображивающее
сусло.
По наблюдениям [150, 264, 270, 279] сильно стимулирующее
влияние на развитие внесенной бактериальной разводки оказы-
вает брожение сусла на мезге. Это характерно как для красных 187
Таблица 49
Чистые культуры молочнокислых бактерий pH Содержание кислот в белых винах, г/л
титруемых летучих винной яблочной
Ркацители
Контроль 3,3 8,0 0,23 1,5 3,5
Г омоферментативные па - ЛОЧКИ 3,5 6,0 0,30 1,5 Следы
Гетероферментативные па- лочки з.з 8,3 0,24 1,8 3,6
Г етероферментативные кокки 3,5 5,4 Рислинг 0,38 1,2 Следы
Контроль Гомоферментативные па- 3,2 7,2 0,15 2,5 2,3
ЛОЧКИ Гетероферментативные па- 3,2 7,2 0,15 2,9 2,2
ЛОЧКИ Г етероферментативные ЗД 7,2 0,18 2,8 2,2
кокки Г 3,3 ’ислинг 5,7 обработанны 0,21 й мелом 2,5 Следы
Контроль 1 3,1 9,0 0,45 3,7 2,7
Г етероферментативные кокки Рг 3,2 [СЛИНГ, 7,7 не обработан 0,82 яый мелом з,з Следы
Контроль 3,0 11,3 0,81 5,4 2,8
Г етероферментативные кокки 3,1 9,2 0,66 5,3 Следы
вин, так и для белых вин. Предполагается, что активизирующая
роль принадлежит веществам, экстрагирующимся из кожицы ви-
нограда.
3. Д. Рабинович [150], исследуя процесс кислотопонижения
в пастеризованных красных столовых винах при введении раз-
водки бактерий совместно с дрожжами в количестве 3—5%, ус-
тановила, что процесс начинался и полностью завершался в те-
чение 7—10 дней. При этом смесь штаммов бактерий рода Leuco-
nostoc вызывала яблочно-молочное брожение, использовав 3,0—
5,0 г/л яблочной кислоты (табл. 50). Действие продуктов обме--
на различных родов и видов дрожжей при сбраживании вино-
градного сусла на активность использования яблочной кислоты
в виноматериалах бактериями изучено С. Лафон-Лафуркад [270].
Установлено минимально угнетающее действие среды, сбро-
женной Sacch. ellipsoideus или Sacch. oviformis; большее — в сре-
де, сброженной Sacch. rose!? Sacch? chevalieri, и значительное —
в среде, сброженной Saccharomycodes ludwigii, Н. uvarumr
188 Н. anomala.
Таблица 50
Показатели Индуцирование кислотопонижения в красных столовых винах
контроль после введения чистых куль- тур молочнокислых бактерий
Кабер- не Матраса Саперави Кабер- не Матраса Саперави
pH вина Титруемая кислотность, г/л Летучая кислотность, г/л Содержание сахаров, % Содержание кислот, г/л винная яблочная молочная 3,6 8,4 0,32 0,15 1,4 3,0 1,4 3,3 8,0 0,17 0,08 1,3 3,1 1,4 .3,3 10,8 0,2 1,8 2,0 5,0 1,7 3,7 7,0 0,41 0,06 0,9 0 3,3 3,6 6,0 0,62 0,02 0,6 0 2,8 3,4 8,1 0,53 0,06 1,6 0 4,2
Антагонистические взаимоотношения между дрожжами и мо-
лочнокислыми бактериями описаны в литературе [11, 182, 260].
Эти исследования взаимодействия дрожжей и бактерий свиде-
тельствуют о том, что для успешного проведения процесса био-
логического кислотопонижения спиртовое брожение должно осу-
ществляться чистыми культурами дрожжей, причем определен-
ными видами и штаммами.
Яблочно-молочное брожение в непрерывном потоке. Как из-
вестно, непрерывное культивирование микроорганизмов явилось
основой усовершенствования многих технологических процессов.
Весьма важное значение для виноделия имеет способ биоло-
гического регулирования снижения кислотности и окислительно-
восстановительных процессов в виноматериалах [18, 197, 198].
Сущность способа кислотопонижения виноматериалов в непре-
рывном потоке заключается в комплексном использовании дрож-
жей и молочнокислых бактерий, что позволяет вести биологиче-
ское кислотопонижение и регулировать окислительно-восстано-
вительные процессы при производстве столовых вин. На рис. 40
изображена схема установки [18]. Виноматериал непрерывно
подается в систему последовательно соединенных ферментеров,
заполненных наполнителями со сверхвысокой концентрацией
дрожжей. В первый ферментер непрерывно совместно с винома-
териалом подается около 1% 3—4-суточной разводки дрожжей
и 1% разводки молочнокислых бактерий. Размножение бакте-
рий происходит при температуре 30—35°С в специальном куль-
тиваторе, в который все время поступает 2—5% виноматериала,
выходящего из первого ферментера, обогащенного продуктами
автолиза дрожжей. Процесс биологического кислотопонижения 189
1
Рис. 40. Технологическая схема биологического регулирования снижения кис-
лотности и окислительно-восстановительных процессов в производстве столо-
вых вин:
1 — ферментеры с наполнителями; 2 — пастеризатор; 3 — термос-резервуары; 4 — тепло-
обменник; 5—'фильтр; 6 — культиватор молочнокислых бактерий; д — дрожжевая раз-
водка; мб — разводка молочнокислых бактерий [97].
осуществляется в первом ферментере при температуре 18—20°С.
Во втором ферментере, куда перетекает 95—98% виноматериа-
ла из первого ферментера и вводится 1,5—2% разводки дрож-
жей, при температуре 6—8°С практически прекращается деятель-
ность бактерий, проходят восстановительные процессы и вино-
материал обогащается биологически активными веществами.
Содержание сернистой кислоты в винах не должно превышать
общей 100—140 мг/л и свободной 8—14 мг/'л. В процессе такой
обработки улучшалось качество ординарных сухих столовых вин,
существенно снижался окислительный потенциал, содержание
летучих кислот и альдегидов, вина утрачивали излишнюю окис-
ленность.
В табл. 51 приведена химическая характеристика контроль-
ных и опытных образцов вин после процесса бактериального кис-
лотопонижения в непрерывном потоке в НПО «Яловены».
После обработки в аппаратах виноматериал рекомендуется
дополнительно обработать (пастеризовать при температуре 55—
60°С, выдержать в термос-резервуарах 12—24 ч, охладить до 10—
12°С), отфильтровать и направить на отдых.
3. Д. Рабинович проведены опыты яблочно-молочного броже-
ния в непрерывном потоке на лабораторных аппаратах с исполь-
зованием чистых .культур бактерий рода Leuconostoc.
190
В вине с титруемой кислотностью 10,0 г/л в результате 8,5-су-
точного цикла поточного яблочно-молочного брожения сброжено
3,0 г/л яблочной кислоты. Учет концентрации бактерий в сбра-
живаемой среде показал возможность воспроизводства их в по-
токе со скоростью, достаточной для проведения брожения. Для
осуществления брожения виноматериалов в потоке в них долж-
но содержаться бактерий не менее 60—70 млн./мл.
Влияние биологического снижения кислотности на качество
вин. До настоящего времени оно полностью не выяснено. Дан-
ные многих исследователей свидетельствуют о том, что этот про-
цесс повышает качество в основном красных вин. Так, Э. Пейно
[302] в книге «Практическое виноделие» отмечает улучшение вку-
совых качеств красных вин после биологического снижения кис-
лотности: они становятся мягкими, бархатистыми, улучшается
окраска, изменяется аромат. Качество белых вин при яблочно-
молочном брожении улучшается не всегда.
Ф. Радлер [309], проведя хроматографическое исследование
1217 образцов высококачественных белых и красных вин, пока-
зал, что процесс понижения кислотности происходит преимуще-
ственно в красных винах, в белых значительно реже. При этом
в красных винах он не отмечает явной связи между качеством
вина и степенью использования яблочной кислоты бактериями.
Бактериальное расщепление яблочной кислоты на качество бе-
лых вин, по его мнению, влияет неблагоприятно.
Б. Ранкин [314] отмечает, что дрожжи рода Saccharomyces
могут разлагать в процессе алкогольного брожения около 45%
яблочной кислоты в сусле, положительно влияя этим на качест-
во вин. Что касается яблочно-молочного брожения, то образую-
щиеся при разложении сахаров и других компонентов вин диаце-
тил, ацетоин, 2,3-бутиленгликоль, муравьиная кислота и иногда
сероводород могут ухудшить качество вин. Понижение кислотнос-
ти в результате яблочно-молочного брожения может уменьшить
интенсивность окраски и изменить оттенок цвета красных вин, а
Таблица 51
Внно
Содержание кислот,
г/л
1 Исходное
После обработки
Исходное
После обработки
7,5 0,6 3,4 72 8,0 12,0 3,14 2,78 0,37
5,7 0,6 3,6 69 6,9 12,1 2,81 0,15 1,54
8,8 0,4 3,1 64 5,1 11,1 3,76 3,36 0,36
6,3 0,5 з,з 62 5,1 П,2 3,20 1,00 1,30
2
191
также способствовать осаждению кислого виннокислого калия.
При определении влияния яблочно-молочного брожения на
отдельные компоненты сухих красных вин, приготовленных из
различных сортов винограда Австралии, выявлено сходство с
данными, ранее полученными при обследовании вин Калифор-
нии. В сухих красных винах процесс яблочно-молочного броже-
ния был вызван кокковыми формами бактерий, относящимися к
роду Leuconostoc; содержание диацетила повысилось до 2,8 мг/л.
Снижения качества вин не отмечено, за исключением случаев бак-
териального разложения винной кислоты [273].
Р. Вебб и Д. Инграхам [332] изучали индуцированное яблоч-
но-молочное брожение введением культур ML — 34 и 31 и пока-
зали, что в аромате вин имеются различия в зависимости от ис-
пользуемых культур. Другие работы [248, 263] подтвердили та-
кое заключение.
В результате исследований, проведенных И. Шнейдером [322],
стало известно, что молочнокислые бактерии в процессе биоло-
гического кислотопонижения обогащают вино гистамином и дру-
гими летучими аминами, обладающими токсическим действием.
Содержание гистамина в винах может достигать 30 мг/л. Допус-
каемое максимальное содержание гистамина в винах по разным
данным составляет 2—6 мг/л. Виноградный сок не содержит гис-
тамина. Образуется он в результате жизнедеятельности молоч-
нокислых бактерий при декарбоксилировании гистидина.
Таким образом, мнение многих исследователей сходится на
том, что процесс бактериального кислотопонижения не может
быть рекомендован для всех столовых вин. Из множества факто-
ров, которые можно использовать для управления биологиче-
ским кислотопонижением вин, основным должно быть использо-
вание селекционированных культур бактерий, обладающих опре-
деленными физиолого-биохимическими свойствами. Такое же
толкование подтверждается сведениями о том, что бактерии ро-
дов Leuconostoc и Pediococcus — возбудители яблочно-молочно-
го брожения в винах образуют различное количество веществ, из-
меняющих букет и вкус вин [158, 209, 255, 272, 305, 322].
Молочнокислое брожение вин
Этот тип брожения (заболевание вина) также вызывают мо-
лочнокислые бактерии. Они сбраживают сахара с образованием
молочной и уксусной кислот. В заболевшем вине уменьшается
содержание сахара, увеличивается титруемая и летучая кислот-
ность. Иногда выделяется СОг.
Молочнокислому брожению подвергаются все типы вин, со-
держащие в своем составе то или иное количество сахаров, осо-
бенно малокислотные столовые с остаточным сахаром, крепкие
192 и десертные с любым содержанием спирта, принятым в виноде-
лии. Молочнокислые бактерии также могут использовать для
развития альдегиды, глицерин, винную кислоту и др. Отсюда яс-
но, какой вред они наносят хересному производству, разлагая
накопившиеся альдегиды.
Вино, в котором развивались молочнокислые бактерии, ста-
новится тусклым, теряет блеск. При встряхивании пробирки с
вином появляются шелковистые волны (огромное скопление па-
лочковидных бактерий). Внешний вид вина изменяется раньше,
чем обнаруживаются другие признаки порчи. В дальнейшем ви-
но приобретает неприятный сладковато-кислый вкус, своеобраз-
ный запах, напоминающий квашеную капусту. Иногда заболева-
ние вина сопровождается появлением «мышиного привкуса».
При глубоко зашедшем процессе, когда вино почти совсем испор-
чено, бактерии осаждаются на дно.
Процесс скисания вина наиболее активно вызывают молочно-
кислые палочки. Особенно большую опасность представляют ге-
тероферментативные молочнокислые бактерии — Lactobacillus
brevis, L. buchneri и L. fermenti, менее опасны гомоферментатив-
ные — L. plantarum.
В настоящее время считают, что нет оснований выделять в
отдельный вид заболевания вин, именуемые «турн» и «пусс», по-
скольку возбудители их чаще всего относятся к группе молочно-
кислых бактерий и симптомы заболеваний, такие, как наличие
шелковистых волн, выделение СО2, изменение вкуса, идентичны
молочнокислому скисанию. Предложено характеризовать забо-
левание вина изменением его определенной составной части или
образованием нежелательных продуктов обмена. Например,
«турн» — разложение винной кислоты, «прогоркание» — разло-
жение глицерина, «маннитная болезнь» — превращение фрукто-
зы в маннит. Такая характеристика заболеваний более стандар-
тизована и заключает в себе конкретные сведения о происшед-
ших в вине нежелательных изменениях [69].
Наиболее опасным заболеванием сахарсодержащих вин явля-
ется гетероферментативное брожение, сопровождающееся обыч-
но значительным повышением содержания летучих кислот (до
4 г/л) и накоплением молочной кислоты. Заболеванию подвер-
гаются в основном малокислотные вина, возбудителями его яв-
ляются гетероферментативные бактерии. Гомоферментативное
брожение сахаров сопровождается значительным увеличением
содержания молочной кислоты и повышением кислотности без
повышения содержания летучих кислот. Оно может сопровож-
даться возникновением неприятно кислого вкуса и тонов «ква-
шения». Источником этих пороков вина считают не молочную
кислоту, а вторичные продукты, образуемые молочнокислыми
бактериями при брожении. Возбудители брожения — гомофер-
ментативные бактерии.
Замечено, что в результате молочнокислого брожения всегда
появляются «квашеные» тона и вкус молочной сыворотки, а «мы-
193
шиный тон» в отдельных случаях. Возникновение этого порока
не является прямым следствием метаболизма в вине молочно-
кислых бактерий, а подготовляется сочетанием действия дру-
гих факторов — определенной величины pH, установившейся в
результате деятельности молочнокислых бактерий, и наличия
железа.
Свойством разлагать фруктозу с образованием маннита об-
ладают гетероферментативные молочнокислые бактерии. Они
развиваются в малокислотных винах, содержащих сахар. При
восстановлении фруктозы в маннит вино приобретает неприят-
ный кисло-сладкий вкус. Маннитному брожению обычно сопут-
ствует молочнокислое брожение сахаров, сопровождающееся по-
вышением кислотности.
Разложение винной кислоты не является свойством одного
какого-либо вида молочнокислых бактерий. Известно, что разла-
гать винную кислоту могут гомо- и гетероферментативные па-
лочки и гетероферментативные кокки. Этим свойством обладают
не все молочнокислые бактерии, а лишь отдельные штаммы. Про-
цесс происходит в основном в малокислотных винах (pH 3,6).
При разложении винной кислоты образуется уксусная кислота
и углекислый газ. По другим данным, при разложении винной
кислоты гомоферментативными палочками образуется молочная
кислота и углекислый газ. Возможно, что разложение винной
кислоты гомо- и гетероферментативными микроорганизмами про-
исходит различными путями. При разложении винной кислоты
кислотность вина уменьшается, появляется «плоскость» вкуса.
Свойством разлагать глицерин обладают отдельные предста-
вители всех видов молочнокислых палочек и кокков. Такие бак-
терии встречаются довольно редко. При разложении глицерина
образуются уксусная, молочная и пропионовая кислоты, углекис-
лый газ и остро пахнущий акролеин с резкими вкусовыми каче-
ствами. В красных винах акролеин в сочетании с полифенола-
ми, в особенности с дубильными веществами типа эпикатехина,
образует горькие вещества. Разложение глицерина происходит
при средней кислотности вина (pH 3,3) и сопровождается ее по-
вышением.
Молочнокислые бактерии в вине часто вызывают большее
или меньшее повышение содержания летучих кислот. Наряду с
уксусной кислотой, которая преобладает, в вине накапливаются
пропионовая и муравьиная кислоты. Особенно интенсивно лету-
чие кислоты образуются при гетероферментативном брожении
сахаров, а также при разложении винной кислоты и глицерина.
Значительное повышение летучих кислот, сопряженное с други-
ми нежелательными изменениями в винах, приводит к необра-
тимым изменениям качества вина. Если содержание летучих кис-
лот в вине превышает 0,8—0,9 г/л, вино становится пустым и ме-
нее доброкачественным, хотя кислый привкус уксусной кислоты
194 в нем еще не ощущается.
Однако возможны и менее значительные изменения состава
вина, ведущие к увеличению летучих кислот в пределах допус-
тимой нормы. Источники их образования необходимо иметь в
виду при анализе изменения состава вина в процессе выдержки.
Наблюдения показывают, что некоторое повышение содержания
летучих кислот (на 0,1—0,2 г/л) происходит при нормальном
биологическом кислотопонижении. Такое количество летучих
кислот в значительно меньшей степени ухудшает качество вина,
чем избыток яблочной кислоты.
Другим источником образования летучих кислот является
разложение бактериями лимонной кислоты до молочной и ук-
сусной и углекислого газа. Обычно оно происходит сразу после
разложения яблочной кислоты. За счет сбраживания лимонной
кислоты содержание летучих кислот в вине может увеличиться
на 0,2 г/л. Поэтому для приготовления бактериальной разводки
с целью кислотопонижения вина лучше отбирать штаммы, не
разлагающие лимонной кислоты. При подкислении вин введени-
ем органических кислот необходимо помнить, что лимонная кис-
лота легко атакуется бактериями.
Глюкуроновая кислота также разлагается молочнокислыми
бактериями. Это объясняет ее отсутствие в некоторых винах. Га-
лактуроновая кислота и полисахариды используются бактерия-
ми слабо.
Постоянным источником повышения летучих кислот являют-
ся и пентозы, всегда присутствующие в молодых винах. В сред-
нем в винах содержится 0,7 г/л арабинозы и 0,16 г/л ксилозы.
Гетероферментативные кокки могут потреблять арабинозу пред-
почтительно перед другими сахарами. Из 1 г арабинозы может
образоваться 0,3 г летучих кислот (в пересчете на серную) и
молочная кислота. Арабиноза сбраживается в основном кокка-
ми, ксилоза — палочками. Заслуживает внимания тот факт,
что летучие кислоты образуются при сбраживании пентоз как
гетероферментативными бактериями, так и гомоферментатив-
ными.
В процессе жизнедеятельности молочнокислые бактерии об-
разуют кроме основных продуктов некоторое количество вто-
ричных, оказывающих значительное влияние на сложение вина.
К ним относятся диацетил, ацетоин и 2,3-бутиленгликоль.
Мало ощутимый во вкусовом отношении ацетоин (ацетил ме-
тилкарбинол) окисляется в диацетил, который ощущается во
вкусе уже при концентрации 1 : 1000000. Пороговая концентра-
ция ощущения диацетила в вине — 0,7—0,8 мг/л. По сведениям
А. К. Родопуло, вина шампанские и сухие высокого качества
содержат следы диацетила, вина среднего качества 0,4—0,8 мг/л,
вина низкого качества — свыше 0,8 мг/л. Большие количества
диацетила придают вину молочнокислые тона, тона квашения,
переходящие в мышиный тон. Вино становится переокисленным,
с грубым ароматом и вкусом. Диацетил и ацетоин образуются 195
молочнокислыми бактериями и в процессе биологического кисло-
топонижения.
Скорость заболевания инфицированных вин зависит от их
состава [68]. Бактерии размножаются быстро в винах с низкой
титруемой кислотностью, с высоким pH (выше 3,0), содержа-
щих сахар, и, наоборот, размножаются медленно в более жестких
условиях (низкая температура, pH ниже 3,0), вследствие чего
признаки заболевания проявляются через несколько месяцев.
В связи с медленным размножением и заторможенным накопле-
нием продуктов обмена молочнокислые бактерии обладают вы-
сокой выживаемостью. Особенно долго живут бактерии в дрож?
жевых осадках [69]. Высокие концентрации сахара тормозят раз-
витие бактерий. При концентрации SO2 общей свыше 100 мг/л в
сусле и 80 мг/л в вине молочнокислые бактерии не развиваются.
Однако для остановки уже начавшегося заболевания, вызванно-
го молочнокислыми бактериями, необходимо вводить SO2 в ко-
личестве 200 мг/л.
Молочнокислые бактерии, развиваясь в столовых сухих низ-
кокислотных винах, также вызывают вредный процесс — забо-
левание, связанное с использованием бактериями яблочной кис-
лоты, лимонной, глицерина. Вино становится мутным; плоским
и резким во вкусе, приобретает квашеные и часто мышиный
тона.
Лечение заболеваний вин, вызванных развитием молочнокис-
лых бактерий, является трудоемким, требуются тщательная об-
работка вина и длительные наблюдения.
В процессе оклейки и обработки адсорбентами (рыбий клей,
желатин, бентонит) с последующей фильтрацией из вина выво-
дится основная масса бактерий. Однако перед этой технологиче-
ской операцией необходимо ввести в вино сернистый ангидрид в
таких количествах, чтобы остановить жизнедеятельность бакте-
рий. Отфильтрованное вино также сульфитируют до содержа-
ния SO2 в количествах, допустимых в промышленности, или пас-
теризуют. Столовые вина, склонные к заболеванию и содержа-
щие молочнокислые бактерии, следует пастеризовать при более
высокой температуре (70—72°С). Вина с высоким содержани-
ем спирта (20—17% об.) рекомендуется пастеризовать при тем-
пературе 50°С, а десертные (16—-14% об.)—при температуре
55°С. Вино перед пастеризацией должно быть осветлено путем
обработки оклеивающими веществами или фильтрацией, но без
доступа воздуха.
Хорошие результаты дает фильтрация вин через стерилизую-
щие фильтр-пластины. Мутные вина перед фильтрацией через
обеспложивающий фильтр необходимо оклеить и профильтро-
вать через обычные фильтр-пластины.
, От мышиного тона в больных винах избавиться очень труд-
но, практически невозможно. Такое вино считается испорченным
196 и непригодным даже для получения коньячных спиртов, потому
что неприятный тон переходит во все фракции отгона. Для лече-
ния вин с незначительным мышиным запахом рекомендуется
многократная переливка с проветриванием и последующей суль-
фитацией; оклейка и фильтрация; пастеризация с последующей
оклейкой и фильтрацией; фильтрация через древесный уголь
(но он одновременно выводит из вин красящие и ароматические
вещества).
Для предотвращения развития молочнокислых бактерий в бу-
тылочных винах необходимо своевременное проведение яблочно-
молочного брожения с последующей обработкой, способствующей
максимальному выведению бактерий из вин, предельная доза
сульфитации с введением разрешенных антисептиков.
Ожирение, или ослизнение, вина
Эта болезнь также вызывается развитием молочнокислых
бактерий, проявляется она обычно в молодых белых малокислот-
ных и малоспиртуозных столовых винах, бедных дубильными ве-
ществами и содержащих остаточный сахар.
Возникновение вязкости, ожирения, ослизнения вина А. Ос-
тервальдер в 1933 г. связал с процессом кислотопонижения, од-
нако природа веществ, вызывающих изменение консистенции,
не была выяснена. Предполагается, что тягучесть вина возника-
ет в результате развития гетероферментативных кокков, кото-
рые образуют вискозные полимерные углеводы.
Характерным признаком больного вина является вязкость.
Оно льется медленно, струей, бесшумно. При глубоко зашедшем
процессе вино становится слизистым, пустым, тягучим, похожим
на яичный белок. Во вкусе чувствуется неприятная слизистость,
однако первоначальный букет вина не исчезает.
Такие вина легко поддаются лечению. При слабом развитии
ожирения слизь удаляют оклейкой, причем перед оклейкой в ви-
но обязательно добавляют танин. Для лечения вина достаточно,
например, применить сульфитацию, а затем удалить слизистые
остатки бактерий, обрабатывая вино диатомитовым порошком.
Однако сахар, оставшийся несброженным, может снова вызвать
заболевание вина, поэтому после снятия вина с осадка необходи-
мо провести его дображивание.
ЯВЛЕНИЕ ЛИЗОГЕНИИ У МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ВИНА
Лизогения — своеобразный генетический симбиоз бактерийи
фага — у молочнокислых бактерий вина вида Lactobacillus plan-
tarum имеет широкое распространение и может служить источ-
ником соответствующего фага в природе и производстве. Уме-
ренный фаг обнаружен у 33* штаммов из 48 испытанных [48]. Вы-
делено и получено в «чистую» линию 10 фагов, однако применять 197
их для лечения больных вин совершенно невозможно, поскольку
они, хотя и устойчивы к действию спирта (10—25% об.), облада-
ют очень повышенной чувствительностью к низким значениям
pH (2,8—3,2) и к сернистому ангидриду (40—60 мг/л).
, * *
*
Таким образом, виноградное сусло, соки и вина являются
благоприятной средой для развития уксуснокислых и молочно-
кислых бактерий. Уксуснокислые бактерии, используя этиловый
спирт, а молочнокислые бактерии — сахара, яблочную кислоту
(в винах с низкой кислотностью), лимонную и винную кислоты,
глицерин — образуют летучие кислоты, эфиры и другие продук-
ты, приводящие к снижению качества и порче продукта. Иногда
изменения, вызываемые этими микроорганизмами, незначитель-
ны, но чаще бывает так, что через некоторое время вино стано-
вится совершенно непригодным к употреблению из-за неприят-
ного вкуса и запаха, изменения цвета и значительных помутне-
ний. Устранить изменения в составе и снижении качества в
заболевших винах полностью чаще всего не представляется воз-
можным, что приводит к потерям. Поэтому очень важно преду-
предить появление болезней вин.
Для виноделия опасны все виды уксуснокислых бактерий.
Из молочнокислых бактерий заболевания вин чаще всего вы-
зывают гетероферментативные палочки, быстро развивающиеся
в винах с pH выше 3.
Молочнокислые бактерии могут вызывать только один полез-
ный процесс — яблочно-молочное брожение в высококислотных
винах. Наиболее подходящими возбудителями яблочно-молоч-
ного брожения являются гетероферментативные кокки рода
Leuconostoc, которые преимущественно используют яблочную
кислоту, не затрагивая сахаров и других компонентов вина.
На основании знаний физиолого-биохимических особенностей
уксуснокислых и молочнокислых бактерий, условий их разви-
тия и процессов, ими вызываемых, для совершенствования техно-
логии и предотвращения заболеваний вин предлагаются следую-
щие рекомендации:
защита виноградного сусла и вина от попадания в них посто-
ронних микроорганизмов;
контроль за изготовлением виноматериалов;
повышение кислотности сусла и вина;
повышение концентрации в вине спирта;
уход за вином;
регулирование процесса биологического кислотопонижения
вин;
контроль качества вина, подготовленного к розливу.
Для защиты виноградного сусла и вина от попадания в них
посторонних микроорганизмов следует соблюдать чистоту <гарыг
198 коммуникаций, оборудования. Своевременно удалять с завода
промывные воды, отбросы и отходы виноделия, так как они яв-
ляются основным источником инфекции.
Обработку оборудования необходимо вести в соответствии с
технологической инструкцией по санитарной обработке вино-
дельческих емкостей, оборудования, винопроводов и помещений
[184].
Контроль за изготовлением виноматериалов предотвращает
развитие в них посторонних микроорганизмов. Для брожения
необходимо применять хорошо осветленное сусло при сульфита-
ции 100—150 мг/л SO2, дополнительно используется холод, коа-
гулянты, адсорбенты.
При меньшем содержании взвесей процесс брожения сусла
протекает спокойно, без резкого повышения температуры. Для
сбраживания виноградного сусла наилучшей является темпера-
тура 16—18°С. Поэтому рекомендуется применять охлаждение
или приемы управляемого брожения, например, брожение под
давлением СОг.
Глубокое выбраживание сахаров достигается при использова-
нии сильной расы дрожжей, способной вести брожение при соот-
ветствующих сульфитации и содержании сахаров в сусле.
Для предотвращения развития бактерий по окончании бро-
жения необходимо освобождать молодые вина от дрожжевого
осадка для того, чтобы они не обогащались продуктами авто-
лиза дрожжей.
Для предупреждения заболеваний большое значение имеет
повышение кислотности сусел и вин. Высокая активная кислот-
ность защищает вина от развития молочнокислых бактерий, по-
этому в южных районах виноделия необходимо стремиться к со-
хранению кислотности в сусле и в вине или повышению ее под-
кислением различными способами.
Одним из способов повышения кислотности является гипсо-
вание сусел и вин. Оно уменьшает потери винного камня и спо-
собствует повышению кислотности и снижению pH (1 г/л снижа-
ет pH с 3,6 до 3,5; 2 г/л — до 3,3). Гипс необходимо использо-
вать химически чистый, лишенный постороннего запаха
(аптечный гипс непригоден). Можно применять и обычный але-
бастр.
При подкислении виноградного сусла целесообразно приме-
нять винную кислоту, при подкислении вина — лимонную. Одна-
ко подкисление виноградного сусла и вина винной и лимонной
кислотами не защищает их полностью от развития бактерий, по-
скольку молочнокислые бактерии, вызывающие процесс яблоч-
но-молочного брожения, являются кислотовыносливыми форма-
ми бактерий и активно усваивают лимонную кислоту.
Повышение концентрации спирта в вине делает его более ус-
тойчивым к заболеваниям, в том числе и к молочнокислому ски-
санию. Поэтому при изготовлении крепких и десертных вин важ-
но концентрацию спирта в виноматериалах доводить сразу до 199
нормы. Некондиционные по спирту виноматериалы хранить не
следует.
Вина, находящиеся на хранении и выдержке, при всех техно-
логических операциях необходимо тщательно защищать от вне-
сения в них инфекции.
По окончании бурного брожения виноматериал надо долить.
Для доливки вин следует применять только здоровые, хорошо
проверенные материалы. Проводить ее надо систематически и
тщательно.
Для защиты поверхности сухих виноматериалов при наличии
воздушной камеры от развития уксуснокислых бактерий и плен-
чатых дрожжей рекомендуется использовать герметизирующий
состав СВС с добавлением метабисульфита калия. Условия и
техника применения СВС описаны [184].
В обработанных винах, предназначенных для выдержки и
хранения, допускается наличие в поле зрения при микроскопи-
ровании центрифугированной пробы 1—2 клеток живых микро-
организмов. Для дифференциации живых и мертвых клеток мик-
роорганизмов рекомендуется использовать люминесцентный мик-
роскоп.
При наличии в каждом поле зрения большего числа микро-
организмов вино считают инфицированным и проводят дальней-
шее определение его микробиологического состояния по отноше-
нию к дрожжам и уксуснокислым бактериям, к молочнокислым
бактериям [184].
Для вин, оцененных по шкале как «нестойкие», назначают
сульфитацию до содержания свободной SO2 20—25 мг/л и ведут
за ними постоянный микробиологический контроль.
Для вин, оцененных по шкале как «больные», назначают
комплекс технологических обработок: сульфитацию до 20 мг/л-
свободной SO2, пастеризацию при 70—75°С в течение 10—15 мин,
оклейку и фильтрацию. Дальнейшее хранение больных обрабо-
танных вин не рекомендуется.
Виноматериалы с высокой титруемой кислотностью и наличи-
ем молочнокислых бактерий проверяют методом хроматографии,
на наличие яблочной кислоты для того, чтобы решить вопрос о
проведении или предотвращении процесса яблочно-молочного
брожения. Чтобы предупредить развитие активных возбудителей
процесса яблочно-молочного брожения в низкокислотных винах,,
содержание свободного сернистого ангидрида в них должно быть
не менее 20 мг/л. И наоборот, если хотят, чтобы прошел процес
яблочно-молочного брожения в высококислотных винах, допол-
нительную сульфитацию ведут в незначительных количествах
только для защиты вина от окисления.
Для регулирования процесса кислотопонижения вин (биоло-
гического, состоящего в использовании микроорганизмами яблоч-
ной кислоты, или химического, заключающегося в осаждении:
200 солей винной кислоты) используют данные, полученные при оп-
ределении титруемой кислотности, pH и содержания винной и
яблочной кислот.
Кислотопонижение может проходить как в виноматериалах
после окончания спиртового брожения, так и в винах, находящих-
ся на выдержке и хранении, за счет спонтанного развития бак-
терий или введения разводки чистой культуры молочнокислых
бактерий.
Биологическое кислотопонижение целесообразно проводить в
потоке путем комплексного воздействия на вино чистых культур
дрожжей и молочнокислых бактерий.
Периодический процесс яблочно-молочного брожения реко-
мендуется вести при следующих условиях:
1) содержание титруемых кислот не более 9—10 г/л, в том
числе яблочной кислоты не менее 2 г/л; при более высокой тит-
руемой кислотности — частичное химическое кислотопонижение,
не более чем на 3 г/'л;
2) температура помещения 18—25°С;
3) минимальное содержание свободной SO2 (не более
10 мг/л)..
Для контроля процесса яблочно-молочного брожения осуще-
ствляют микроскопирование вина; определение титруемых кис-
лот; определение содержания винной, яблочной и молочной кис-
лот (качественный или количественный анализ).
Контроль вин, подготовленных к розливу, заключается в
определении наличия в них микроорганизмов. Вина, подготов-
ленные к розливу, должны содержать после центрифугирования
не более 1—2 клеток микроорганизмов в 10 полях зрения.
Для придания биологической стабильности нестойкие столо-
вые вина сухие, с остаточным сахаром и полусладкие при розли-
ве в бутылки должны быть обработаны одним из способов:
горячий розлив;
консервация антисептиками, применяемыми в винодельческой
промышленности, совместно с сернистым ангидридом;
бутылочная пастеризация;
стерилизующая фильтрация и стерильный розлив.
Для получения вин, устойчивых к бактериальным помутне-
ниям, завод может использовать любые режимы и виды обра-
ботки в соответствии с утвержденными технологическими инст-
рукциями [184].
ГЛАВА IV
ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ
К плесневым грибам (иногда их называют плесенями) отно-
сят микроскопические грибы-сапрофиты, питающиеся органиче-
скими веществами мертвых растительных остатков и образую-
щие на их поверхности налеты разного цвета.
В виноделии нашли применение ферментные препараты, об-
ладающие пекто-протеолитическим, целлюлолитическим и геми-
целлюлазным действием, готовящиеся из плесневых грибов рода
Aspergillus, которые ускоряют отделение сусла от мезги и освет-
ление сусла, увеличивают его выход, интенсифицируют биохими-
ческие процессы, протекающие при созревании вин [52].
В вине плесневые грибы не размножаются, но вино, налитое
в тару с запахом плесени или укупоренное заплесневевшими
пробками, приобретает плесневелый тон и становится испорчен-
ным. Обычно винодел принимает меры, предупреждающие появ-
ление плесени на различных объектах винодельческого произ-
водства, но мало знает о распространенных на винограде и вин-
заводах видах плесневых грибов и об особенностях их биологии.
КЛАССИФИКАЦИЯ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
В основу классификации плесневых грибов положены спосо-
бы их размножения, строение мицелия и органов размножения.
Большинство плесневых грибов размножается бесполым и поло-
вым путем. Их называют совершенными. Плесневые грибы, раз-
множающиеся только бесполым путем, относят к несовершен-
ным. Грибы, образующие несептированный мицелий, называют
низшими, а образующие многоклеточный (септированный) ми-
целий— высшими грибами.
Плесневые грибы можно обнаружить среди представителей
четырех больших классов грибов:
фикомицетов (Phycomycetes), имеющих несептированный ми-
целий;
аскомицетов (Ascomycetes), которые еще называют сумчаты-
ми грибами, образующими септированный мицелий и эндоген-
ные половые споры в сумках (асках);
базидиомицетов (Basidiomycetes), образующих экзогенные
половые споры на особых структурах базидиях;
несовершенных грибов (Fungi imperfecti), которые обладают
многоклеточным мицелием, но не образуют половых спор. Несо-
вершенные грибы называют также дейтеромицетами (Deutero-
202 myces) [216, 223].
1
Рис. 41. Споры бесполого способа размножения;
а — Mucor: 1 — споры; 2 — спорангий; 3 — мицелий; б — Botrytis: 1 —конидии; в —
Penicillium: 1 — метулы; 2 — стеригмы; 3 — конидии; 4 — конидиофор; 5 — вегетатив-
ная гифа; г — Aspergillus: 1 — булавовидное расширение конидиеносца; 2 — конидии;
3 — стеригмы; 4 — конидиофор; 5 — вегетативная гифа.
В группу несовершенных грибов объединены все грибные фор-
мы, которые по характеру своего многоклеточного мицелия долж-
ны быть отнесены к высшим грибам (сумчатым или базидиаль-
ным), но у которых не обнаружено полового спороношения,
вследствие чего они и названы несовершенными.
Род Mucor. Плесневые грибы рода Mucor относятся к низ-
шим грибам, к классу Phycomycetes. Мицелий у них обильно вет- 203
Рис. 42. Мицелий плесневых грибов и его видоизменения:
а — одноклеточный мицелий; б — многоклеточный мицелий; в — оидии; г — хлайидо-
споры.
вящийся, но несептированный. Кверху от него отходят гифы-спо-
рангиеносцы, несущие шарообразные спорангии, видимые прос-
тым глазом в виде головок, внутри которых находятся споры
(рис. 41, а). Стенки спорангиев растрескиваются, освобождая
споры, которые, попав в благоприятные условия, вновь прорас-
тают в мицелий. Обычно у мукоровых грибов мицелий бывает
вначале белый, позднее сероватый. Спорангии вначале желтова-
тые, позже темнеют, приобретая черную окраску.
Бесполое размножение мукоровых грибов может происходить
также оидиями — дрожжеподобными образованиями, называе-
мыми мукоровыми дрожжами (рис. 42, в).
Они образуются путем распада гифов на отдельные корот-
кие членики при попадании мицелия в жидкую питательную сре-
ду с недостаточным притоком воздуха. Мукоровые дрожжи об-
ладают слабой сбраживающей способностью. При свободном до-
ступе воздуха к среде они снова прорастают в мицелий.
Род Aspergillus. Грибы рода Aspergillus относятся к высшим
грибам, так как имеют многоклеточный мицелий. Конидиеносцы
плесневых грибов этого рода несептированы, на верхнем конце
их находятся шаровидные или булавовидные вздутия. От взду-
тий отходят во все стороны по одному или по два ряда стеригм
и цепочки конидий (см. рис. 41, г).
Общая картина конидиеносца с конидиями напоминает го-
ловку лейки, из которой струями выходят водяные брызги. Это
сходство и привело к названию леечная плесень (по-латински
аспергере — поливать, опрыскивать).
В зависимости от видовой принадлежности аспергиллов ко-
нидии их бывают окрашены в зеленый, желтовато-зеленый, бу-
рый, темно-коричневый или черный цвет. Благодаря огромному
их количеству, расположенному на приземистых конидиеносцах,
весь налет плесени кажется окрашенным в цвет конидий.
204
Аспергиллы относятся к классу Ascomycetes. Половое размно-
жение у них происходит спорами, образующимися в округлых
сумках (асках), расположенных в замкнутых плодовых телах
(клейстокарпиях), с диаметром от 80—350 мкм.
Род Penicillium. Грибы рода Peniciliium относятся к высшим
грибам к классу Ascomycetes и являются наиболее распростра-
ненными среди плесневых грибов.
У пенициллов конидиеносцы большей частью имеют попереч-
ные перегородки. В верхней части конидиеносцы разветвлены и
образуют характерно построенную кисточку (отсюда и назва-
ние пенициллиум, по-латински — кисть), несущую на конечных
разветвлениях цепочки конидий (см. рис. 41, в). Различное строе-
ние кисточки у разных видов пенициллов положено в основу их
систематики. Конидиеносцы часто прилегают плотно один к дру-
гому или склеены в коремии (от греч. корос — веник). Конидии
у большинства видов пенициллов зеленого цвета, характерной
для видов формы. Сверху они покрыты слоем воска, вследствие
чего трудно смачиваются водой. Конидии могут размножаться
даже после многолетнего пребывания в сухом состоянии. Они
быстро прорастают в кислых средах. В нейтральных или щелоч-
ных средах прорастание их замедляется или не происходит.
Споры полового размножения образуются в асках (сумках),
расположенных в плодовых телах (клейстокарпиях). Клейсто-
карпии обнаружены не у всех видов пенициллов, но по типично-
му строению конидиеносцев их относят к одному роду.
Род Sphaerulina. Грибы рода Sphaerulina относятся к выс-
шим грибам, к классу Ascomycetes. На листьях, побегах, ягодах
винограда, а также на бочках и стенах подвалов иногда можно
наблюдать черный сажистый налет. Его образует гриб черни
Sphaerulina intermixta, который раньше был известен под назва-
ниями Dematium pullulans и Pullularia pullulans.
Черный налет, по виду напоминающий сажу, состоит из ог-
ромного количества темноокрашенных устойчивых к неблаго-
приятным условиям конидий. При благоприятных условиях кони-
дии прорастают и из них образуются белые гифы, в протоплазме
которых много крупных вакуолей. От гиф, сплетающихся в ми-
целий, отчленяются дрожжеподобные почкующиеся клетки
(бластоконидии) (рис. 43).
Род Botrytis. Впервые возбудитель серой гнили винограда
был описан в 1801 г. X. Г. Петерсоном, давшим ему название
Botrytis cinerea (по-гречески ботритис — гроздь, цинереа — се-
рый как зола). Вначале он был известен только в конидиальной
форме и отнесен к классу несовершенных грибов. Позже Антон
де Бари, подробно изучавший его биологию, обнаружил форму
полового развития и включил его в род Sclerotinia, дав видовое
название fuckeliana. Но старое название, относившееся к обыч-
но наблюдаемой конидиальной стадии этого гриба, более рас-
пространено и им часто пользуются в научной литературе.
205
Мицелий Botrytis многоклеточный, конидиеносцы нитевид-
ные, древовидно-разветвленные. На концах их образуются мало-
заметные вздутия, от которых отходят тонкие стеригмы с серо-
ватыми конидиями, расположенными в виде гроздей (см.
рис. 41,6). При исследовании микрофлоры виноградного сусла
конидии ботритиса легко отличить от дрожжей по более круп-
ным размерам (10—14X7—9 мкм).
Перезимовывает ботритис в форме склероциев — плотных
мицелиальных образований размером 2—4X1—2,5 мм, окра-
шенных в темный цвет. Склероции образуются осенью на опав-
ших листьях, на различных частях виноградного куста (рис. 45).
При благоприятных условиях прорастание склероциев про-
исходит либо в конидиальную, либо в сумчатую стадию (поло-
вое размножение).
МОРФОЛОГИЯ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
Строение. Плесневые грибы при размножении на различных
питательных субстратах образуют бархатистые, порошкообраз-
ные, войлочные, паутинообразные, моховидные налеты зеленого,
белого, черного, желтого и других цветов различных оттенков.
Налет, образуемый плесневыми грибами, состоит из массы
ветвящихся тонких нитей, называемых гифами. Скопление гифов
образует мицелий. Гифы представляют собой нитевидные тяжи
протоплазмы, сверху покрытые оболочкой (рис. 43).
В состав клеточной оболочки высших грибов (сумчатых и ба-
зидиальных) входит хитин, у некоторых плесневых грибов обо-
лочка состоит из целлюлозы или соединений, близких к ней.
В клетках гифов грибов содержится по одному или несколь-
ко ядер. К особенностям ядерного аппарата грибов относится
также наличие дикарионов, спаренных ядер в клетке после слия-
ния их протоплазмы. Так же, как и в клетках дрожжей, имеются
митохондрии, выполняющие функцию генераторов энергии, ри-
босомы, принимающие участие в синтезе белка, вакуоли, запол-
ненные клеточным соком и содержащие гранулы полифосфатов
(волютина). Основным запасным компонентом клеток плесневых
грибов является гликоген, распределенный в виде мелких гранул
по всей цитоплазме. Липиды и жировые вещества находятся в
клетках в виде капелек, называемых липосомами. В старых клет-
ках гифов грибов содержится много пигментов.
Многие виды плесневых грибов образуют гифы на поверх-
ности и одновременно в толще используемого ими субстрата.
Часть гифов служит для прикрепления к субстрату и потребле-
ния питательных веществ и называется субстратным мицелием, а
часть образует воздушный мицелий, в котором формируются пло-
доносящие гифы со спорами. Гифы могут быть короткими или
длинными. Толщина их колеблется от 1 до 15 мкм, длина — от
206 5 до 50 мкм и более. Гифы могут не иметь поперечных перего-
Рис. 43. Гифы, бластоконидии и ус-
тойчивые конидии Sph. intermixta:
а — гифы с бластоконидиями; б — дрож-
жеподобные бластоконидии; в — устойчи-
вые конидии.
Рис. 44. Склероции, апотеции и сум-
ки со спорами В. cinerea:
а — склероции иа ягодах; б — склероции
с апотециями; в — сумки со спорами.
родок (септ) и образовывать одноклеточный, несептированный
мицелий или многоклеточный (септированный) (см. рис. 42, а, б).
У плесневых грибов известны такие видоизменения мицели-
ального роста, как оидии, хламидоспоры, мицелиальные тяжи
(см. рис. 42, в, г) и склероции (рис. 44, а). Так, например, у гри-
ба Mucor racemosus в сахаристых жидкостях грибница может
распадаться на отдельные клетки, называемые оидиями, кото-
рые затем могут снова образовать мицелий.
При формировании хламидоспор обособляются участки мице-
лия, которые покрываются толстой оболочкой, заполняются за-
пасными питательными веществами и в некоторой степени обез-
воживаются. В таком виде они могут оставаться длительное вре-
мя в состоянии покоя, выдерживать высушивание и другие не-
благоприятные воздействия.
Грибы родов Aspergillus, Botrytis могут при неблагоприят-
ных условиях (высыхание, понижение температуры) образовы-
вать склероции. Это округлые тела плотной консистенции, об-
разующиеся в результате тесного переплетения гифов, богатые
запасными питательными веществами.
На одном склероции вырастает один или несколько апотеци-
ев •—плодовых тел (рис. 44, б). В апотеции правильными ряда-
ми располагаются сумки со спорами среди парафиз — бесплод-
ных нитей, предохраняющих сумки от повреждения и высыхания
(рис. 44, в). В нормальной развитой сумке формируется 8 аско-
спор, которые, освободившись из асков, прорастают, образуя ми-
целий и конидиеносцы. 207
В годы с повышенной влажно-
Рис. 45. Виноградная гроздь, пора-
женная В. cinerea. Слева — склеро-
ции на побеге.
стью воздуха Botrytis cinerea быст-
ро размножается на ягодах виногра-
да в виде серого налета войлочной
консистенции (рис. 45), который
приводит к значительным потерям
урожая и понижению его качества.
Мицелий так называемого домо-
вого гриба Merulius domesticus, про-
никающего внутрь древесины и раз-
рушающего ее, образует мицелиаль-
ные тяжи сложного строения. Длина
их достигает иногда нескольких мет-
ров. По ним передается вода, пита-
тельные вещества, и поэтому гриб
может распространяться на большие
расстояния по поверхности, не спо-
собной поддерживать его существо-
вание. Встретив древесину и благо-
приятные условия существования,
гриб снова образует мицелий, а за-
тем мицелиальные тяжи.
Способы размножения плесне-
вых грибов. В связи с тем что плес-
невые грибы можно обнаружить
среди представителей четырех боль-
ших классов грибов, процесс раз-
множения у них очень разнообразен. Типичный половой про-
цесс — это слияние двух клеток-гамет и их ядер с последующим
редукционным делением.
В( цикле развития многих плесневых грибов гаплоидная и
диплоидная фазы последовательно чередуются: от копуляции до
редукции — диплоидная, от редукции до новой копуляции —
гаплоидная.
Для грибов характерно явление гетерокариозиса — наличия в
соматической клетке гетерокарионов (генетически неоднородных
ядер), возникающих при мутации гомокарионов или при анасто-
мозах (слиянии) гифов различных штаммов и переходе таким
путем ядер из одной клетки в другую. Гетерокариозис обуслов-
ливает большую изменчивость грибов.
Распространен у плесневых грибов и парасексуальный
процесс, во время которого происходит слияние двух гапло-
идных ядер в гетерокариотических клетках, после чего происхо-
дит не редукционное, а митотическое деление. В ходе этого деле-
ния происходит кроссинговер (обмен гомологичными участками
между гомологичными хромосомами) и возникают генетические
рекомбинанты, т. е. особи, несущие новые комбинации родитель-
208 ских генов [23].
Рис. 46. Споры полового способа раз-
множения:
а — зигоспора фикомнцета; б — сумка с 8
спорами аскомицета; в — 4 базидиоспоры
базидиомицета.
Рис. 47. Формы плодовых тел аско-
мицетов:
а — клейстокарпий; б — перитеций; в —
апотеций.
Органы полового размножения у плесневых грибов очень раз-
нообразны. У плесневых грибов, принадлежащих к классу фи-
комицетов, гаметы обычно образуются на разных особях. Поло-
вые различия у этих грибов внешне не проявляются; их пол
обычно обозначают знаками «плюс» ( + ) и «минус» (—). В ре-
зультате слияния гамет (оплодотворения, которое у этих грибов
называют изогамией) образуется зигоспора (рис. 46, а). При ее
прорастании происходит мейотическое деление диплоидного ядра
и образуются ядра с гаплоидным числом хромосом. Весь даль-
нейший цикл развития гриба — гаплоидная фаза.
Половой процесс у типичных аскомицетов характеризуется
оплодотворением дифференцированной женской половой клетки
(архикарпа) мужской половой клеткой (антеридием). При этом
сначала сливаются цитоплазмы (цитогамия), а ядра, сближаясь
друг с другом, но не сливаясь, образуют дикарион. Из оплодо-
творенной клетки вырастают аскогенные гифы, в которые пере-
ходят и дикарионы.
Ядра несколько раз раздельно делятся и сливаются в разви-
вающейся сумке, затем сразу же происходит редукционное де-
ление. При этом образуется 4—8 спор с гаплоидными ядрами в
сумке, называемой аском (рис. 46, б).
У некоторых сумчатых грибов аски со спорами образуются
непосредственно на мицелии, у других они помещаются в пло-
довых телах разной формы и строения (рис. 47). В цикле разви-
тия аскомицетов преобладает гаплоидная фаза, весь мицелий и
плодовые тела имеют гаплоидный набор хромосом, кроме аско-
генных гиф. 209
8—568
У дереворазрушающих плесневых грибов, принадлежащих к
базидиальным грибам, неизвестны специальные половые клетки.
Диплоидный мицелий образуется в результате анастомозов
и слияния клеток одного или двух мицелиев. Через пере-
тяжки сливающихся клеток ядро переходит из одной клетки в
другую, получаются клетки с дикарионами, разрастающиеся в
мощную систему мицелия. На нем образуются базидии, в кото-
рых ядра дикарионов сливаются, копуляционное ядро сразу
вновь редукционно делится и образуемые на базидиях базидио-
споры имеют гаплоидные ядра (см. рис. 46, в). Базидиоспоры
вновь прорастают в первичный гаплоидный мицелий. В цикле
развития преобладает диплоидная фаза.
Все способы формирования новой особи без полового про-
цесса, т. е. слияния ядер, можно считать бесполыми, или
вегетативными, способами размножения. У плесневых
грибов бесполое размножение может происходить частями гифы
или мицелия, оидиями, хламидоспорами, склероциями, частями
мицелиальных тяжей. Однако наибольшее значение имеет бес-
полый способ размножения спорами (спорангиоспорами илико-
нидиоспорами), образующимися в огромных количествах. Так,
на 1 см2 поверхности плесневого налета может находиться не-
сколько тысяч спорангиеносцев или конидиеносцев, и на каж-
дом из них может образоваться по несколько тысяч спор. Каж-
дая спора при благоприятных условиях через 4—7 дней может
дать новый такой же налет со спорами. У фикомицетов на пло-
доносящих гифах, называемых спорангиеносцами, формируются
спорангии, внутри которых находятся спорангиоспоры (см.
рис. 41, а).
У аскомицетов и многих несовершенных грибов споры беспо-
лого размножения — конидиоспоры или конидии, образуются эк-
зогенно на кончиках плодоносящих гифов, называемых конидие-
носцами, или конидиофорами. Размеры, форма, расположение
цепочек и цвет конидий очень разнообразны и являются харак-
терными признаками различных родов и видов высших грибов
(см. рис. 41 б, в, г).
ФИЗИОЛОГИЯ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
Питание. Плесневые грибы в качестве источников углерода
могут использовать самые разнообразные соединения: сахара и
полисахариды, спирты, органические кислоты, аминокислоты,
белки, углеводороды, производные фенолов и многие др.
В качестве источников азота кроме органического азота
большинство плесневых грибов способны усваивать нитратный
и аммиачный азот. Органический азот используется главным об-
разом в виде аминного азота, находящегося в составе NHs-rpyn-
пы аминокислот. Наилучшими источниками азота аминокислот
являются аспарагиновая и глютаминовая кислоты и их амиды.
210 Использование белков возможно только после их гидролиза про-
теолитическими ферментами. Описаны отдельные виды грибов,
способные фиксировать атмосферный азот. К их числу относит-
ся, например, Aspergillus flavus [23].
Для роста и жизнедеятельности плесневых грибов необходи-
мы минеральные вещества. Одни из них необходимы в относи-
тельно высокой концентрации, к ним относятся сера, фосфор, ка-
лий, кальций, магний, железо. Другие, их называют микроэле-
ментами, необходимы в низких концентрациях (обычно в
мкг/л). К ним относятся марганец, молибден, цинк, медь, ко-
бальт, никель, бор и многие др.
Потребности плесневых грибов в витаминах обычно менее
выражены, чем у дрожжей. Наиболее часто наблюдается потреб-
ность в тиамине, биотине, пиридоксине и мезоинозите, в то время
как многие дрожжи нуждаются еще в никотиновой и пантотено-
вой кислотах.
Ферменты. Плесневые грибы имеют богатый комплекс фер-
ментов, позволяющий им использовать в качестве питательных
субстратов многие вещества. Ферменты плесневых грибов с древ-
нейших времен использовались человеком для осахаривания
крахмала риса в восточных странах при производстве рисовой
водки — саке, известной более 2500 лет. В Японии для этой це-
ли применяют культуру гриба Aspergillus oryzae, образующего
активную амилазу. В нашей стране и большинстве западных
стран осахаривание крахмала зерна проводили при помощи ами-
лаз проросшего зерна (солода). В настоящее время на большин-
стве спиртовых заводов вместо солода применяют культуры
плесневых грибов.
В специально созданных условиях плесневые грибы способны
синтезировать большие количества разнообразных ферментов.
При получении амилаз, пектиназ, протеаз, целлюлаз, глюкозо-
оксидазы, каталазы используют различные виды плесневых гри-
бов родов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Mucor.
Штаммы плесневых грибов одного и того же рода и даже ви-
да могут резко различаться по количеству синтезируемых фер-
ментов. Поэтому для промышленного производства ферментов
проводят селекцию наиболее активных штаммов продуцентов
ферментов путем отбора из природных условий, воздействия
ультрафиолетовыми лучами или химическими мутагенами, а так-
же подбирают оптимальный состав среды и условия культиви-
рования.
Ферменты плесневых грибов используются в качестве биока-
тализаторов в виде ферментных препаратов в различных отрас-
лях пищевой и легкой промышленности, бытовой химии, медици-
не, сельском хозяйстве. Сведения о производстве и применении
ферментных препаратов можно найти в ряде руководств [155,
213].
Антибиотики. Образование антибиотиков имеет эволюционно
приспособительный характер. Большинство антибиотиков, обра- 211
8*
www.ovme.ru
зуемых грибами, являются вторичными продуктами метаболиз-
ма, которые активно не участвуют в процессах конструктивного
и энергетического обмена. Антибиотикообразующая способность
большинства природных штаммов плесневых грибов обычно низ-
кая, и только штаммы, полученные путем селекции, обладают
высокой антибиотической активностью.
Из грибов разных систематических групп выделено свыше
100 антибиотиков. Однако только немногие нашли практическое
применение и изучены более детально. К ним относятся пени-
циллины, гризеофульвин, фумагиллин и некоторые др. Современ-
ная медицина и ветеринария используют антибиотики для лече-
ния некоторых заболеваний человека и животных. Антибиотики
находят применение и как стимуляторы роста сельскохозяйст-
венных животных и птиц [23].
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РОСТ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКУЮ
АКТИВНОСТЬ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
Температура. Температура является одним из главных фак-
торов регулирования роста и физиологической активности плес-
невых грибов. Оптимальная температура роста плесневых грибов
большинства видов не всегда бывает оптимальной для образова-
ния репродуктивных органов и физиологической активности.
Амплитуда оптимальной температуры роста у разных видов гри-
бов неодинакова. Так, для многих видов пенициллов она нахо-
дится в пределах 26—28°С, для некоторых видов аспергиллов
составляет 25—40°С. Виды аспергиллов более теплолюбивы по-
сравнению с видами пенициллов. Они в значительном количестве
выделяются из почв южных зон.
Температура оказывает фунгистатическое и фунгицидное дей-
ствие на грибы. Фунгистатическое действие оказывает обычно
низкая температура, она не вызывает гибели грибов. Фунгицид-
ное действие повышенной и высокой температуры зависит от
pH и состава среды, количества микроорганизмов, их физиоло-
гического состояния и других факторов.
Споры и конидии плесневых грибов, находящиеся в жидкос-
тях, значительно чувствительней к высоким температурам, чем
в обезвоженных средах. Обычно пастеризация виноградного со-
ка при температуре 85°С в течение 15 мин вызывает гибель плес-
невых грибов. Однако описаны случаи порчи пастеризованного
сока плесневым грибом Byssochlamys fulva. Этот гриб обладает
удивительной теплоустойчивостью. Взвесь его конидий в плодо-
вых соках выдерживает действие температуры 85°С — в течение
20 мин, а для гибели аскоспор при температуре 85°С требуется
65 мин [223].
Свет. Прямой солнечный свет ингибирует рост плесневых гри-
бов. Чередование освещения и темноты, наоборот, стимулирует
212 рост и спорообразование многих из них.
На грибы, как и другие микроорганизмы, влияют радиоак-
тивные излучения. Устойчивость к излучению у различных так-
сономических групп грибов неодинакова. Более устойчивы тем-
ноокрашенные грибы, которые содержат пигменты в оболочках
конидий, склероциев и других структур.
Ионизирующее облучение влияет на изменение генетических
свойств плесневых грибов и обусловливает появление мутаций.
Облучение УФ-лучами применяется при получении высокопро-
дуктивных мутантов плесневых грибов — продуцентов антибио-
тиков, ферментов и для получения биохимических мутантов, ко-
торые затем используют для выяснения путей биосинтеза мно-
гих метаболитов.
Кислотность среды. Величина pH среды является важным
фактором роста микроорганизмов. Если для большинства бакте-
рий оптимальной величиной pH среды является нейтральная и
слабощелочная, то для плесневых грибов — кислая реакция сре-
ды (pH 4—5). В виноградном сусле, имеющем величину pH 3—4,
большинство плесневых грибов быстро размножается, однако в
вине с такой же величиной pH спирт ингибирует их развитие.
Некоторые плесневые грибы, например Aspergillus niger, могут
размножаться при pH среды от 2 до 8 [113].
Аэрация. Для своего нормального развития плесневые грибы
нуждаются в кислороде воздуха, особенно для образования ко-
нидий. Среди плесневых грибов неизвестны облигатные анаэро-
бы, но многие виды могут расти при пониженном содержании
кислорода в среде. Например, некоторые виды Mucor, Penicilli-
um, Aspergillus могут размножаться на среде с глюкозой при
содержании кислорода около 0,1—0,2%. Гриб Merulius lacri-
mans, разрушающий дерево, более чувствителен к недостатку
кислорода, допустимый минимум его составляет около 3%.
В условиях пониженного содержания кислорода у многих ви-
дов грибов изменяется морфология и фазы развития, так, на-
пример, у грибов рода Mucor мицелиальный тип роста трансфор-
мируется в дрожжеподобный. Углекислота тормозит размноже-
ние плесневых грибов.
Влажность. От относительной влажности воздуха в период
созревания винограда зависит степень его поражения плесневы-
ми грибами. В сырую дождливую погоду степень поражения ягод
винограда всегда сильнее, чем в сухую солнечную. Замечено, что
в периоды очень частых дождей преобладают на ягодах предста-
вители рода Penicillium, а в сухие солнечные месяцы — рода
Aspergillus. Наличие видов рода Mucor довольно постоянно.
Размножение гриба Botrytis cinerea на созревающих ягодах ви-
нограда находится в прямой зависимости от влажности возду-
ха: при дождливой погоде ягоды покрываются серой плесенью
(порошкообразный налет из конидий), особенно у сортов с плот-
ными гроздями, а при сухой и солнечной погоде налет на ягодах
бывает скудным и мало заметным.
21
РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
В ВИНОДЕЛИИ
Наиболее часто на винограде встречаются плесневые грибы
родов Aspergillus, Penicillium, Botrytis, Mucor, Sphaerulina.
В годы с повышенной влажностью воздуха размножение плес-
невых грибов вызывает значительные потери урожая винограда
и понижение его качества. Особенно сильно размножаются плес-
невые грибы на ягодах винограда, если после долгой засушли-
вой погоды начинается дождливый период. При таком резком
переходе на ягодах образуется большое количество трещин, че-
рез которые проникают споры грибов. Прорастая, споры обра-
зуют мицелий, и виноград плесневеет.
В некоторых винодельческих районах, где, как правило, осен-
ние дожди выпадают редко, раза два-три в десятилетие, бывают
благоприятные погодные условия для так называемого «благо-
родного гниения» винограда. В такие годы виноград рано созре-
вает при достаточной, но не чрезмерной влажности и происходит
заизюмливание ягод при умеренном развитии гриба Botrytis ci-
пегеа. Мицелий гриба разрыхляет клетки кожицы, облегчает ис-
парение воды. При дождливой погоде из поврежденных грибом
ягод вымывается сахар и качество винограда снижается, а при
солнечной и сухой осенней погоде Botrytis cinerea способствует
испарению воды из ягод винограда и повышению концентрации
сахара в соке до 40% и более.
В отличие от плесневых грибов других родов Botrytis потреб-
ляет в первую очередь органические кислоты, а не сахара. По-
этому при повышении концентрации сахара в ягодах, происхо-
дящей от испарения воды, в них не наблюдается увеличения кис-
лотности. Содержание пектиновых и фенольных веществ, а также
общего азота уменьшается в зависимости от степени размноже-
ния Botrytis cinerea.
В связи с тем что «благородное гниение» развивается посте-
пенно, сбор гроздей и даже отдельных ягод в надлежащей сте-
пени готовности приходится производить несколько раз. Вслед-
ствие этого приготовленные вина называются выборочными
(ауслезевейн). Сотернские вина, особенно Шато-Икем, пользу-
ются заслуженной славой и являются одними из самых дорогих
вин в мире. Состав их в зависимости от условий года очень не-
постоянен: содержание сахара от 1,34 до 44%; спирта от 6,4 до
17,5% об., глицерина от 0,7 до 2,4% [144]. Вина мягкие, масляни-
стые во вкусе, со своеобразным букетом.
В связи с высоким качеством вин типа Шато-Икем и невоз-
можностью получения их в других винодельческих районах бы-
ли предприняты попытки искусственного создания условий, не-
обходимых для «благородного гниения» винограда в специаль-
ных камерах. У нас в стране такие опыты проводил А. А. Преоб-
214 раженский [144], в Калифорнии К. Е. Нельсон и М. А. Америн
[286]. Были подобраны оптимальные температура и относитель-
ная влажность для искусственного воспроизведения «благород-
ного гниения» винограда, из которого получали вина типа со-
тернских. Однако технические затруднения служат препятствием
для внедрения этого приема в производство.
Е. М. Поповой в течение многих лет проводились опыты по
внесению ферментных препаратов, полученных из мицелия Botry-
tis, в виноградное сусло и вино вначале с целью замены «благо-
родного гниения» винограда, а затем для гидролиза пектиновых
веществ и ускорения созревания вин. Изучался биохимизм про-
цессов, протекающих в сусле и вине при внесении препаратов
[143]. Позднее были отобраны штаммы Botrytis cinerea — актив-
ные продуценты комплексного ферментного препарата, обладаю-
щего пектолитической, целлюлолитической и протеолитической
активностью [226].
Ботритис образует еше вещества, названные «ботритицином»,
обладающие антибиотической активностью в отношении дрож-
жей. В соке, полученном из винограда, пораженного грибом, об-
разуется меньшая масса дрожжей и задерживается брожение.
Ускорить брожение такого сусла можно сульфитацией (введе-
нием 50 мг/л SO2) или продолжительным нагреванием до 120*С
[154].
В винограде, пораженном грибом В. cinerea, образуется мно-
го оксидаз, вызывающих впоследствии побурение и оксидазный
касс в белых столовых винах.
Чем больше виноград поражен плесневым грибом, тем боль-
ше связанной и меньше свободной сернистой кислоты получает-
ся при сульфитации сусла. Поэтому чем больше степень пораже-
ния винограда, тем большую дозу сернистого ангидрида нужно
вводить в сусло. Так, если для сусла из винограда, пораженного
плесневым грибом на 10%, для инактивации оксидаз достаточна
доза сернистого ангидрида 150 мг/л, то для сусла из винограда,
пораженного плесневым грибом на 40%, необходима уже доза
сернистого ангидрида 250 мг/л.
Ж. Блоуэн считает, что уксуснокислые бактерии, находящие-
ся на винограде, пораженном плесневым грибом, являются в
большей степени, чем плесневые грибы, причиной образования
карбонильных соединений, наиболее легко связывающих сернис-
тую кислоту [237].
Г. Дитрих, изучавший продукты брожения сусла, полученно-
го из здоровых и пораженных грибом ягод, показал, что в пос-
леднем случае образовалось в 3,5 раза больше пировиноградной
кислоты, в 2 раза больше кетоглютаровой кислоты и на 58%
больше ацетальдегида [245].
Эти кислоты и ацетальдегид легко связывают SO2, и поэтому
для инактивации окислительных ферментов и предотвращения
побурения столового вина и оксидазного касса требуется суль-
фитация его повышенными дозами сернистой кислоты.
215
Окислительные ферменты из сусла, полученного из виногра-
да, пораженного ботритисом, можно удалить путем обработки его
бентонитом (3—5 г/л) с полиакриламидом (2 мг/л). Сусло и ви-
но из винограда, пораженного на 20% плесневым грибом, после
такой обработки имели хороший вкус и окраску (исчезали корич-
невые и бурые тона).
Для удаления плесневого тона и оксидазного касса в винах
без применения сернистой кислоты рекомендуется нагревание
до 55—60°С в течение 15 мин, затем охлаждение и обработка ак-
тивным углем (1 г/л), диатомитом (1 г/л), желатином (0,1 г/л)
и бентонитом (1 г/л).
Вина, имеющие в аромате и во вкусе сильные плесневые то-
на и пораженные оксидазным кассом, можно исправить, выдер-
живая их под хересной пленкой. Перед этим вина пастеризуют
при температуре 70°С 5 мин [32].
Таким образом, размножение гриба Botrytis cinerea на вино-
граде бывает полезным только в редкие годы в определенных
винодельческих районах для выработки вин особого типа. Во всех
остальных случаях размножение на винограде плесневых грибов
всех родов снижает его качество.
Sphaerulina intermixta при размножении в виноградном соке
может превратить сок в слизистую массу с содержанием спирта
около 2% об. В вине этот гриб не размножается, так как при со-
держании спирта свыше 2% об. его жизнедеятельность прекра-
щается. Гриб часто встречается в слизистом налете на стенах
подвалов, на бочках.
* *
*
На винодельческих заводах во избежание появления нежела-
тельной микрофлоры — плесневых грибов — следует соблюдать
чистоту.
В винподвалах размножение плесневых грибов так же вред-
но, как и на винограде. Споры плесневых грибов родов Mucor,
Aspergillus, Penicillium, обычно всегда находящиеся в воздухе,
легко прорастают на остатках сусла и вина, своевременно не уда-
ленных из емкостей, с оборудования, из шлангов. При размно-
жении плесневые грибы образуют летучие вещества, которые
при контакте с вином в нем растворяются и придают винам очень
неприятный трудно устранимый плесневый тон.
Для предотвращения размножения плесневых грибов необ-
ходимо тару и оборудование сразу после освобождения от сус-
ла и вина тщательно промыть водой. Внутренняя поверхность
деревянной и железобетонной тары без защитных покрытий
обычно пористая, пропитанная остатками вина или сусла, трудно
вымываемыми из пор. При достаточной влажности внутренние
поверхности в таких емкостях быстро плесневеют. Поэтому для
предотвращения размножения плесневых грибов деревянную та-
216 ру, находящуюся без употребления, после тщательной мойки оку-
ривают сернистым ангидридом или хранят заполненной 0,1 % -ным
раствором сернистой кислоты. Надежно устраняется пористость
внутренних поверхностей железобетонных резервуаров при по-
мощи синтетических защитных покрытий эполукс, эполор, эпро-
син, ХС-558 «В» и др.
Бродильные чаны протирают насыщенным раствором каль-
цинированной соды. Железобетонные емкости после тщательной
мойки необходимо хранить с открытыми верхним и нижним лю-
ками. Приемы обработки заплесневевшей тары описаны в «Тех-
нологической инструкции по санитарной обработке винодельче-
ских емкостей, оборудования винопроводов и помещени;» [184].
Одним из новых и перспективных направлений в современ-
ном виноделии является применение ферментных препаратов из
плесневых грибов. Установлено, что обработка виноградной мез-
ги ферментными препаратами грибов Aspergillus awamori (Пек-
таваморином П10Х, Пектаваморином Г10Х), Aspergillus focti-
dus (Пектофоетидином П10Х, Пектофоетидином Г10Х) и Botry-
tis cinerea (Пектоцинерином Г 10Х) ускоряет процесс отделения
сусла, увеличивает его общий выход, ускоряет процесс осветле-
ния сусла и молодых виноматериалов, а также созревание вин.
В настоящее время изучается действие отдельных фермент-
ных систем, входящих в состав препаратов, с целью оптимизации
их состава для использования при производстве вин различных
типов.
Ферментные препараты ускоряют процесс гидролиза белков
и полисахаридов. Уменьшение количества полимеров в резуль-
тате их гидролиза происходит в период осветления сусла, во
время его брожения и дальнейшего хранения виноматериалов.
Получаемые с применением ферментных препаратов виномате-
риалы быстрее осветляются, требуют меньше затрат при обра-
ботке и более стабильны к помутнениям.
www.ovine.ru
217
ГЛАВА V
ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕХНИКИ
Сусло, соки и вина являются благоприятной средой для раз-
вития как полезных микроорганизмов, на биохимической дея-
тельности которых основана технология вин, так и вредных, вы-
зывающих нежелательные изменения вина, его порчу (болезни
вин). Следовательно, весь цикл приготовления вина характери-
зуется определенной направленностью микробиологических про-
цессов, начиная с брожения и кончая розливом вина в бутылки.
Поэтому освоение методов своевременного определения принад-
лежности микроорганизмов к той или иной группе даст возмож-
ность рекомендовать меры по устранению деятельности вредных
для виноделия микроорганизмов и созданию благоприятных ус-
ловий для развития и жизнедеятельности полезных.
ПОДГОТОВКА ПОСУДЫ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Обработка посуды. Для микробиологических работ применя-
ют посуду из специального стекла, выдерживающего нагревание
при высокой температуре.
Пробирки, чашки Петри, не бывшие в употреблении, промы-
вают подкисленной (1—2% НС1) водой, так как при нагревании
новое стекло выделяет много щелочи и может изменить реакцию
питательной среды.
Посуду моют в проточной теплой воде ершами с использова-
нием кальцинированной соды, полужидкого мыла, мыльного рас-
твора и синтетических моющих средств, после чего тщательно
ополаскивают водопроводной, а затем дистиллированной водой.
Сильно загрязненную посуду со следами жира обрабатывают
хромовой смесью.
Состав хромовой смеси: в 150 мл концентрированной серной кислоты всы-
пают 25 г измельченного двухромовокислого калия. Через сутки, после раство-
рения осадка, смесь темно-оранжевого цвета можно применять для мойки
посуды. Перед применением смесь следует подогреть до температуры 45—60°С.
Изменение темно-оранжевого цвета хромовой смеси на темно-зеленый свиде-
тельствует о ее непригодности.
Пипетки и другие градуированные приборы должны быть со-
вершенно чистыми и хорошо обезжиренными. Моют градуиро-
ванные приборы в теплом растворе горчицы, мыльной воды или
стирального порошка в сосудах, где они могут быть полностью
погружены в раствор, ополаскивают теплой проточной водой, а
218 затем дистиллированной.
При ополаскивании чисто вымытой посуды вода стекает, ос-
тавляя на поверхности стекла ровную водяную пленку. Отдель-
ные капельки воды на стенках посуды свидетельствуют о том,
что она плохо обезжирена.
Вымытую посуду сушат при комнатной температуре или в
сушильном шкафу при температуре 100—105°С.
Чисто, вымытую и высушенную посуду закрывают ватными
пробками и хранят в местах, надежно защищенных от пыли,
лучше всего в плотно закрывающемся шкафу. Ватные пробки
предохраняют посуду, питательные среды и культуры от зара-
жения посторонними микроорганизмами (микробы оседают в во-
локнах ваты). Лучше употреблять для изготовления пробок гиг-
роскопическую вату, так как она не так сильно тлеет. Ватная
пробка должна легко входить в пробирки и при извлечении из
них не терять своей формы. Длина пробки для обычной пробир-
ки около 4 см. Пробка должна входить в пробирку на 1,5—
2,0 см. Удобно для работы обертывать пробку чистой марлевой
салфеткой. Ватные пробки делают из пласта ваты, скручивая
его руками на столе или на пинцете, или на специальной ма-
шине.
Стерилизация посуды. Перед стерилизацией посуду заверты-
вают в бумагу для сохранения стерильности после прогревания.
Бумагу удаляют непосредственно перед использованием посуды.
Пробирки завертывают в бумагу по 10—20—40 шт., закры-
вая верхнюю часть пробирок, чашки Петри — каждую отдельно
или по 5—10 шт. в пакеты.
В концы пипеток, которые берут в рот, вставляют ватные
тампоны. Пастеровские пипетки завертывают в бумагу по 3—
15 шт. Градуированные пипетки завертывают в длинные полоски
бумаги шириной 4—5 см. Обмотку начинают с конца, который
опускают в среду. Пипетку обматывают по спирали. Конец бу-
маги закручивают или приклеивают. Пипетки можно завертывать
в лист бумаги по 3—5 шт. На бумаге указывают объем завер-
нутых пипеток. При наличии пеналов пипетки стерилизуют в них.
Шпатели стерилизуют завернутыми в бумагу по одному или
несколько (до 5) штук.
На пробки колб, склянок, трубок надевают бумажные кол-
пачки.
Посуду, подготовленную для стерилизации, загружают в су-
шильный шкаф не слишком плотно, чтобы обеспечить некоторую
циркуляцию воздуха и равномерный, надежный прогрев стери-
лизуемого материала. Сушильный шкаф при стерилизации дол-
жен быть закрыт. За температурой необходимо следить, так как
при понижении ее не осуществляется стерилизация, а при нагре-
ве выше 175°С бумага и пробки начинают разрушаться. Стери-
лизация длится 2 ч при температуре 160—170°С. По окончании
стерилизации шкаф не открывают до тех пор, пока температура
в нем не снизится до 100—70°С, так как при резком охлаждении
219
иногда нарушается стерильность материала, а стекло может рас-
трескаться.
Посуду можно стерилизовать и в автоклаве.
Мелкие металлические инструменты стерилизуют прокалива-
нием в пламени непосредственно перед использованием.
Приборы для культивирования микроорганизмов, а также де-
тали к этим приборам (резиновые пробки и шланги) стерилизу-
ют автоклавированием. Предметы, подлежащие стерилизации в
автоклаве, завертывают в бумагу.
Стерилизация кипячением является наиболее простым и лег-
кодоступным способом. В стерилизатор наливают дистиллиро-
ванную воду, так как водопроводная вода образует накипь. Стек-
лянные предметы погружают в холодную воду, металлические—
в горячую с добавлением соды. Кипячение ведут на слабом огне
[131, 140].
Предметы, изготовленные из термолабильных пластмасс, на-
пример центрифужные пробирки, стерилизуют этиловым спир-
том или ультрафиолетовыми лучами. Время стерилизации зави-
сит от мощности используемой бактерицидной лампы и расстоя-
ния между лампой и объектом. После облучения предметы до
использования следует хранить в стерильной посуде [25].
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Синтетические среды. В эту группу питательных сред входят
среды, имеющие определенный состав, т. е. их основные состав-
ные части известны.
Для микробиологического исследования дрожжей исполь-
зуют среду Ридер. В состав среды входят следующие соли (в г на
1 л воды):
Сернокислый аммоний 3
Сернокислый магний 0,7
Азотнокислый кальций 0,4
Хлористый натрий 0,5
Фосфорнокислый калий’однозамещенный 1
Фосфорнокислый калий двузамещенный 0,1
Начальная величина pH среды 6,6. Из состава среды может
быть исключен азотнокислый кальций, который не использует-
ся дрожжами. Для опытов по размножению в среду добавляется
2% сахара, для опытов по брожению — 5—10%.
Полная синтетическая среда содержит кристаллические ви-
тамины в следующих концентрациях (в мкг на 1 мл):
Инозит 5,0
Биотин 0,0001
Пантотеновая кислота 0,25
Тиамин 1,0
Пиридоксин 0,25
220 Никотиновая кислота 0,5
Состав синтетических сред для размножения уксуснокислых
и молочнокислых бактерий очень сложный [73]. Рекомендуются
полусинтетические среды.
Для уксуснокислых бактерий с набором веществ
(в г на 1 л дистиллированной воды):
Глюкоза 20
(NH4)2SO4 3
КН3РО4 2
MgSO4-7H2O 2
Этанол 20
Для молочнокислых бактерий рода Lactoba-
cillus среда Де Мана: МРС — жидкая и МРС-1 — полужидкая
с 0,15% агара. В среду МРС с pH 6,2—6,6 входят (в %):
Дрожжевой экстракт 0,5 Уксуснокислый натрий 0,5
Мясной экстракт 1,0 Твин-80 0,1
Пептон 1,0 К2НРО4 0,2
Глюкоза 2,0 MgSO4-7H2O 0,02
Лимоннокислый аммоний 0,2 MnSO4-4H2O 0,005
Для молочнокислых бактерий рода Leuco-
nostoc используют среду МРС, а также среду Гарви — АТБ, в
состав которой входят (в г/л):
Пептон 10
Дрожжевой’экстракт 5
MnSO4-4H2O 0,05
MgSO4-7H2O 0,2
Глюкоза 10
В среду добавляют 250 мл томатного сока, pH среды 4,8.
Натуральные питательные среды. Для выращивания дрож-
жей, уксуснокислых и молочнокислых бактерий готовят различ-
ные питательные среды, состав которых точно не известен.
Виноградное сусло. Сусло помещают в колбу и нагре-
вают до кипения в кипятильнике Коха. После охлаждения его
отфильтровывают от выпавших белковых веществ через бумаж-
ный складчатый фильтр и разливают в пробирки по 5 мл, ста-
раясь не смочить горлышка. Среду используют для выращива-
ния дрожжей.
Солодовое сусло. Неохмеленное пивное сусло фильтру-
ют через бумажный фильтр для удаления осадка белковых ве-
ществ. Содержание сухих веществ (в % СВ) определяют сахаро-
метром. Путем разведения водопроводной водой готовят сусло с
различным содержанием сухих веществ: для выращивания гри-
бов 3—4%, дрожжей 6—8, молочнокислых бактерий 2—5%.
Дрожжевая вода. 70—100 г свежих прессованных или
7—10 г сухих дрожжей разбалтывают в 1 л дистиллированной
воды и кипятят 30 мин. После отстаивания на холоде в высоком
цилиндре жидкость декантируют и фильтруют. К фильтрату до-
бавляют 1 л воды, еще раз кипятят 30 мин и вновь фильтруют. 221
Для лучшего осветления жидкости можно прибавить до кипя-
чения взбитый с водой яичный белок. В дрожжевую воду вносят
необходимые вещества (углеводы, соли), доводят pH среды до
нужного значения и стерилизуют. Среда используется для выра-
щивания дрожжей [131].
Вино с сахаром. В белое сухое вино добавляют 8—10%
сахара. После его растворения среду фильтруют и разливают по
пробиркам. Среда используется для посева дрожжей и уксусно-
кислых бактерий.
Вино с суслом. Среда состоит из виноградного сусла —
7з объема, сухого вина — г/з и водопроводной воды — 7з объема.
Среду фильтруют и разливают в пробирки. Среда рекомендует-
ся для посева уксуснокислых бактерий.
Виноградное сусло разбавленное. Сусло разбав-
ляют водой до содержания сахара 5%, добавляют 1% автолиза-
та дрожжей и доводят pH до 5—6 добавлением 1 н. раствора ще-
лочи. Среда рекомендуется для выращивания молочнокислых
бактерий.
Дрожжевой автолизат. К 1 кг прессованных дрож-
жей прибавляют 1 л водопроводной воды, прокипяченной и ох-
лажденной до 60°С, смешивают в гомогенную массу и ставят в
термостат при температуре 48—50°С. Для предотвращения ин-
фицирования к дрожжевой суспензии добавляют толуол (несколь-
ко капель до появления ясного его запаха). Дрожжевую массу
помещают в сосуды с запасом пространства, учитывая расшире-
ние толуола. Во время перемешивания (1—2 раза в день) сосуд
открывают. Через 48—72 ч автолиз дрожжей заканчивается,
дрожжевая масса разжижается. Затем массу нагревают в авто-
клаве при давлении 0,02 МПа 30 мин, по остывании фильтруют
до полной прозрачности (лучше через бумажную мезгу на во-
ронке Бюхнера). Прозрачный фильтрат содержит около 0,9%
азота.
Осадок разводят в 600 мл воды и вновь фильтруют. Фильтра-
ты объединяют. В смеси содержание общего азота становится
равным 0,6—0,8%. При необходимости автолизат нейтрализуют
до pH 6,8—7,0, разливают в пробирки или склянки и стерилизу-
ют 15 мин при давлении 0,05 МПа.
Автолизат дрожжей особенно богат парааминобензойной кис-
лотой, пантотеновой кислотой и пиридоксином. Его удобно добав-
лять как источник витаминов в небольшом количестве к синтети-
ческим средам.
Полученный автолизат разбавляют водой (1 : 10) с добавле-
нием 1—2% сахара.
Для приготовления автолизата можно использовать осадоч-
ные винные дрожжи. Для этого их освобождают от вина, не-
сколько раз промывают холодной водой, которую после осажде-
ния дрожжей декантируют. Из отмытых дрожжей готовят авто-
222 лизат так же, как описано выше.
Среда из автолизата дрожжей применяется для посева мо-
лочнокислых бактерий.
Капустная среда. 200 г измельченной капусты помеща-
ют в кастрюлю, заливают 1 л воды и кипятят в течение 10 мин,
затем отжимают через двойной слой марли, полученную жид-
кость фильтруют и в 2 раза разводят водой. К отвару добавляют
2% глюкозы и 1% пептона.
Можно использовать сухую капусту (измельченную капусту
следует сушить в тени при температуре 20—35°С при притоке
свежего воздуха). Для приготовления питательной среды 6—8 г
сухой капусты кипятят в 1 л воды. Среду разливают в пробирки
высоким слоем, по 8—10 мл. Среда используется для накопле-
ния и выделения молочнокислых бактерий.
Элективные питательные среды. Эти среды обеспечивают пре-
имущественное развитие одного вида или группы родственных
микроорганизмов и менее пригодны или совсем не пригодны для
развития других.
Во все описанные жидкие питательные среды, предназначен-
ные дл'я высева молочнокислых бактерий из сусла и вина, перед
посевом вводят этиловый спирт из расчета содержания в среде
14% об, (0,95 мл спирта на 5 мл среды). При таком содержании
спирта размножаются преимущественно молочнокислые бак-
терии.
В питательной среде, содержащей 20 ед./мл мономицина, при
высеве пробы исследуемого вина развиваются уксуснокислые бак-
терии. В присутствии этого антибиотика молочнокислые бактерии
не размножаются.
Для преимущественного развития дрожжей и подавления со-
путствующих бактерий в среду рекомендуется вводить антибио-
тик неомицин в количестве 20 ед./мл среды или совместно пе-
нициллин и стрептомицин (50—100 ед. каждого на 1 мл среды).
Для подавления роста плесневых грибов, которые интенсив-
но растут на сусле и сусло-агаре, рекомендуется добавлять
4% об. спирта или 0,2% пропионовокислого натрия.
При необходимости получения изолированной культуры плен-
чатых дрожжей в среду добавляют йодуксусную кислоту в ко-
личестве 0,1—0,2 %.
Дифференциально-диагностические среды. Эти среды позво-
ляют быстро отличить одни виды микроорганизмов от других.
Готовят их часто с введением специальных красителей — инди-
каторов.
Для предварительного ориентировочного определения уксус-
нокислых бактерий и дифференциации их от молочнокислых де-
лают рассев культуры на дрожжевую воду с добавлением в нее
5—10% глюкозы, 10% желатина или 1% агара и 1% углекислого
цинка. Молочнокислые бактерии к вредному действию цинка
очень чувствительны, тогда как уксуснокислые бактерии растут
на этой среде хорошо [131].
223
Для раздельного определения уксуснокислых и молочнокис-
лых бактерий служит жидкая или плотная питательная среда 1
с pH 7, состоящая из дрожжевой воды с добавлением 10% дрож-
жевого автолизата и смешанного индикатора 1 : 1 (бромкрезол
красный и бромкрезол зеленый. 0,1%-ные растворы в смеси во-
ды со спиртом). Молочнокислые бактерии образуют молочную
и уксусную кислоты, в результате чего реакция среды стано-
вится кислой и цвет индикатора меняется от синего через жел-
то-зеленый до желтого. При развитии уксуснокислых бактерий
образуется аммиак, который подщелачивает среду и изменяет ее
цвет с синего на фиолетовый.
СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Жидкие и плотные питательные среды, содержащие сахара,
стерилизуют в кипятильнике Коха ежедневно по 20 мин в тече-
ние трех дней, либо в автоклаве под давлением не выше
0,05 МПа в течение 20 мин. Среды, не содержащие сахаров, сте-
рилизуют в автоклаве при давлении 0,1 МПа и температуре
12ГС в течение 20 мин. Соотношения показаний манометра и
температуры кипения воды приведены в табл. 52.
Таблица 52
Показания манометра, МПа Температура кипения воды, °C Показания манометра, МПа Температура кипения воды, °C
0,00 100,0 0,05 112,5
0,01 102,5 0,06 114,5
0,02 105,0 0,10 121,0
0,03 107,5 0,15 127,0
0,04 110,0 0,20 132,0
Виноградное сусло является кислой средой, поэтому стери-
лизуют его однократным кипячением в течение 20—30 мин в ки-
пятильнике Коха. Время стерилизации отсчитывают с момента
закипания воды, что определяют по показанию термометра,
вставленного в крышку кипятильника.
Вино как среду кислую и содержащую спирт стерилизуют пу-
тем пастеризации при температуре 70°С в течение 10—15 мин.
1 Плотные питательные среды готовят на тех же жидких субстратах, до-
бавляя к ним уплотнители — агар или желатин.
В питательные среды агар добавляют в количестве 2—2,5%. Для приго-
товления плотной среды (сусло-агара) смешивают расплавленный 4%-ный
водный раствор агара и сусло в горячем виде при температуре 60—70°С в
равных количествах над пламенем спиртовки. После перемешивания разлива-
ют в чашки Петри или в пробирки стерильно. Желатин добавляют в среды в
количестве 10—15%.
Для лучшего прилипания агаровых сред к стеклу рекомендуется к сусло-
224 агару добавлять желатин в количестве 5%.
9
Рис. 48. Пересев культуры микроор-
ганизма из одной пробирки в другую:
а — с плотной на плотную питательную
среду; б — из жидкой в жидкую пита-
тельную среду.
Рис. 49. Микробиологические игла,
петля и шпатель Дригальского.
Сохраняют питательные среды в прохладном, защищенном от
света и не слишком влажном помещении. В сыром помещении
ватные пробки пропитываются влагой и через них прорастает
мицелий плесневых грибов. На каждой склянке, колбе со средой
или на колпачке указывают название среды и время приготов-
ления. Надпись на стекле делают специальными чернилами, на
бумажном колпачке — карандашом.
Состав чернил для записи по стеклу:
раствор 1: 2 г танина растворить в 15 мл дистиллированной воды,
хорошо прокипятить, остудить;
раствор 2: 1 г основного фуксина или метиленового синего растворить
в 15 мл спирта концентрацией 96% об.
Растворы соединяют и хранят в склянке с притертой пробкой.
ПОСЕВ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Пересев из одной пробирки в другую. Берут 2 пробирки: од-
ну — с исследуемым микробом, выросшим в жидкой или на плот-
ной питательной среде, другую — со стерильной плотной или
жидкой средой. Первую пробирку помещают между большим и
указательным пальцами левой руки, вторую пробирку зажима-
ют между указательным и средним пальцами той же руки.
В правую руку берут микробиологическую петлю или иглу,
или стерильную пипетку и, держа пробирки в наклонном, почти
горизонтальном положении в левой руке, правой рукой выни-
мают ватные пробки из пробирок и зажимают их между свобод-
ными пальцами так, чтобы входившая в пробирку часть ватной
пробки не прикасалась к руке. Класть ватные пробки на стол
нельзя.
Обожженную иглу или петлю охлаждают в первой пробир-
ке, затем берут из нее немного исследуемого материала и пере- 225
носят его в пробирку со стерильной средой (рис. 48). Пробки
проводят через пламя и закрывают ими пробирки.
На пробирке обычно пишут специальными чернилами или
восковым карандашом название культуры и дату посева.
Посев из пробирки в чашку Петри. В левую руку берут про-
бирку с исследуемым материалом, в правую — петлю, иглу или
пипетку, этой же рукой около пламени вынимают пробку из про-
бирки, берут немного посевного материала и закрывают пробир-
ку пробкой. Левой рукой пробирку ставят в штатив, затем при-
открывают крышку чашки Петри, а правой вносят в чашку Пет-
ри на поверхность агара посевной материал петлей, иглой или
пипеткой и распределяют по поверхности агара штрихом или
размазывают легкими движениями стерильного стеклянного
шпателя (рис. 49). На дне чашки пишут название культуры, да-
ту посева или другое обозначение.
ПРИЕМЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ
Прямым микроскопированием исследуют объекты, содержа-
щие большое количество микроорганизмов (сусло до и после от-
стаивания, бродящее сусло, дрожжевую разводку), с предвари-
тельным центрифугированием, микроскопируют виноматериалы
после обработки и фильтрации, готовую продукцию, смывные
воды. Микроскопические наблюдения можно осуществлять, рас-
сматривая специально приготовленные препараты как живых,
так и убитых микроорганизмов.
Препарат для микроскопирования готовят на предметном
стекле размером 76X26 мм и толщиной не более 1,4 мм. Покров-
ные стекла обычно используют размером 14X14 и 18X18 мм и
толщиной 0,15—0,17 мм. Все стекла тщательно очищают кипя-
чением их в мыльной дистиллированной воде или в 1%-ном рас-
творе соды в течение 10—20 мин, затем ополаскивают водой и
сушат или протирают мягкой полотняной тканью. Предметные
стекла хранят сухими; покровные — в 95%-ном спирте или в
смеси спирта и эфира (1:1) в банках с притертыми пробками.
Стекла следует вынимать пинцетом. Перед использованием их
необходимо просушить фильтровальной бумагой и слегка об-
жечь над пламенем горелки.
Для изучения морфологии клеток микроорганизмов чаще все-
го используют светлопольную микроскопию, позволяющую иссле-
довать объекты в проходящем свете. При микроскопировании
препарата необходимо прежде всего установить правильное ос-
вещение. Лучше пользоваться рассеянным дневным светом, а при
недостаточности его — осветительными лампами. Независимо от
устройства источника света необходимо установить зеркало мик-
роскопа так, чтобы свет от источника был направлен в конден-
сор микроскопа. Конденсор поднимают до упора. Сняв с микро-
226 скопа окуляр и глядя прямо в объектив, устанавливают зеркало
таким образом, чтобы источник света был виден посредине объ-
ектива. Регулировка интенсивности освещения объекта достига-
ется поворотом зеркала и раскрытием или суживанием ирис-
диафрагмы. Готовый препарат кладут на предметный столик и
укрепляют зажимами. Глядя сбоку, опускают объектив почти до
соприкосновения с покровным стеклом. Затем макровинтом под-
нимают тубус до появления изображения. Пользуясь микровин-
том, получают четкое изображение. При микроскопировании раз-
давленной капли лучше пользоваться объективом 40X и окуля-
ром 10Х или 15Х.
При микроскопировании с иммерсионной системой очень ос-
торожно погружают объектив 90X в масло почти до соприкосно-
вения с поверхностью стекла и затем медленно при помощи мак-
ровинта поднимают до появления в поле зрения объекта. Даль-
нейшую фокусировку производят микрометрическим винтом.
После работы с иммерсией следует немедленно привести в
порядок объектив 90X — снять кедровое масло чистой тряпочкой
или тряпочкой, смоченной бензином. Ксилол употреблять не ре-
комендуется, так как он растворяет канадский бальзам, которым
прикреплены линзы к оправе.
Для повышения контрастности слабоконтрастных объектов
исследования применяют способ микроскопирования в темном
поле. Этот способ основан на освещении объекта косыми лучами
света при использовании специального конденсора темного по-
ля, который вставляют вместо обычного. При темнопольной мик-
роскопии необходим более мощный источник света, чем для мик-
роскопии в светлом поле, поэтому особое значение приобретает
правильная установка света, максимальное его использование и
тщательная центрировка [140]. Предметные стекла должны быть
не толще 1,2 мм, чистыми. При наблюдении микроорганизмов в
темном поле различают яркие объекты (только их контуры) на
интенсивно темном поле.
Для изучения препаратов слабоконтрастных живых микроор-
ганизмов (клетки мало отличаются по окраске и прозрачности
от окружающей среды) применяют фазово-контрастную микро-
скопию. Для микроскопирования этим способом используют кро-
ме обычного биологического микроскопа фазово-контрастное уст-
ройство, в комплект которого входит вспомогательный микро-
скоп, специальные фазовые объективы и конденсор с набором
кольцевых диафрагм; кроме того, необходима сильная освети-
тельная лампа. Методика и порядок работы с фазово-контраст-
ным устройством описаны в специальных руководствах [140].
Клетки микроорганизмов способны в большей или меньшей
степени светиться (люминесцировать, флуоресцировать) под
влиянием падающего на них света. Большинство микроорганиз-
мов обладает слабой собственной, или первичной, люминесцен-
цией. При обработке препаратов специальными красками (флуо-
рохромами) клетки микроорганизмов приобретают наведенную,
227
или вторичную, флуоресценцию. Флуоресценцию клеток наблю-
дают в люминесцентном микроскопе в проходящем и падающем
свете, часто в сочетании с фазово-контрастным устройством [25].
Для электронной микроскопии используют сложный элект-
ронный микроскоп, полезное увеличение которого достигает 20—
50 тыс. раз. При последующем оптическом увеличении в 5—
6 раз можно получить полезное увеличение до 200—300 тыс. раз.
Разрешающая способность современных электронных микроско-
пов составляет 1,5—1,0 и даже 0,5 нм. Электронная микроско-
пия позволяет исследовать микроорганизмы только в фиксиро-
ванном состоянии.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ
Препараты живых микроорганизмов. Для определения фор-
мы микроорганизмов, их подвижности, физиологического состоя-
ния готовят препараты живых микроорганизмов и ведут прижиз-
ненное наблюдение.
Приготовление препарата для наблюдения в
раздавленной капле. На чистое предметное стекло сте-
рильной петлей помещают каплю исследуемой жидкости и на-
крывают покровным стеклом. При опускании покровного стек-
ла на каплю следует прикоснуться ребром его к краю капли и,
постепенно наклоняя, опустить. Иногда под стеклом остаются
пузырьки воздуха. Если пузырьки воздуха единичные, то они не
мешают микроскопированию и ими можно воспользоваться при
отыскании мелких микроорганизмов в поле зрения микроскопа.
Если пузырьков воздуха много, то препарат следует переделать.
Капля должна быть небольшой, чтобы жидкость не выступала
за края покровного стекла. Излишек жидкости, вышедшей из-
под покровного стекла, удаляют полосками фильтровальной бу-
маги.
Если рассматривают культуру, выросшую на плотной пита-
тельной среде, то на чистое предметное стекло наносят каплю
водопроводной воды и в нее вводят иглой небольшое количест-
во исследуемой культуры. Приготовленный препарат рассмат-
ривают под микроскопом.
Приготовление препарата для наблюдения
в висячей капле. Для этого используют предметное стек-
ло со специальным углублением, с луночкой. Висячей каплей
удобнее пользоваться для наблюдения подвижности микроорга-
низмов, размножения, прорастания спор.
Препарат готовят так: в центр покровного стекла помещают
небольшую каплю жидкости с микроорганизмами; покровное
стекло с каплей культуры накрывают предметным стеклом с лун-
кой, предварительно смазав ее края тонким слоем вазелина;
предметное стекло осторожно прижимают к покровному и быст-
228 ро перевертывают препарат.
Приготовление препаратов для изучения
кл еточных структур. Микроорганизмы можно наблюдать
в неокрашенном виде и с прижизненной окраской. Для этого
используют малоконцентрированные растворы различных кра-
сок, которые не оказывают на микроорганизмы губительного дей-
ствия, дифференцированно окрашивают содержимое клетки и
способствуют более точному изучению формы клеточных
структур.
Для прижизненной окраски дрожжей и бактерий применяют
нейтральную красную, метиленовую синюю, нейтральную фио-
летовую, зеленый янус, эозин и эритрозин в очень незначитель-
ных концентрациях — от 0,001 до 0,0001%. Окрашенный препа-
рат готовят введением под покровное стекло небольшой капли
раствора красителя или микроорганизмы вносят в каплю крас-
ки на предметном стекле, после чего каплю накрывают покров-
ным стеклом. Метод подробно описан в руководствах [109, 140].
Препараты убитых микроорганизмов. Такими препаратами
пользуются в тех случаях, когда необходимо.,«рассмотреть дета-
ли строения клеток (ядро, включения, споры), произвести под-
счет микроорганизмов и т. д. Для этого микроорганизмы фик-
сируют на предметном стекле и окрашивают. Приготовление пре-
парата состоит из ряда операций.
Каплю с микроорганизмами петлей распределяют возможно
более тонким слоем на обезжиренном предметном стекле пло-
щадью около 4 см2. Можно приготовить мазок, пользуясь стек-
лом со шлифованным краем, которое для распределения капли
передвигают вдоль предметного стекла. Затем препарат высуши-
вают при комнатной температуре. Для ускорения высушивания
препарат мазком вверх осторожно прогревают над пламенем го-
релки.
Следующая важная операция — фиксация, целью которой яв-
ляется убить микроорганизмы и закрепить их на стекле. Суще’
ствует много способов фиксации. Простейшим из них является
фиксация пламенем. Для этого препарат медленно 3—4 раза
проводят над верхней частью пламени горелки таким образом,
чтобы сильно нагреть нижнюю поверхность стекла, чем и дости-
гается фиксация. Для фиксации микроорганизмов также широ-
ко применяют растворы различных химических веществ: этило-
вый спирт (96% об.) в течение 5—20 мин; смесь равных объе-
мов этилового спирта и эфира — 5 мин; метиловый спирт —
5 мин; смесь формалина (5 мл) со спиртом (95 мл) — 2 мин и др.
На фиксированный препарат наносят раствор какого-либо
красителя в зависимости от цели исследования.
Прямое флуорохромирование — это непосредст-
венная окраска живых или фиксированных микроорганизмов
флуоресцирующими красителями, такими, как берберин-суль-
фат, акридин оранжевый, аурофосфин, нейтральная красная,
примулин и др. Они объединяются по двум признакам: по спо-
229
собности ярко люминесцировать в сине-фиолетовых или ультра-
фиолетовых лучах и по избирательному связыванию с опреде-
ленными тканевыми или клеточными элементами.
При окраске для наблюдений за формой микроорганизмов
применяют водно-спиртовые растворы метиленовой синей или
метиленовой фиолетовой (насыщенный спиртовой раствор, раз-
веденный в 5—10 раз водой). Окрашивание длится 3—5 мин, пос-
ле чего краску сливают, препарат промывают легкой струей ди-
стиллированной или водопроводной воды и высушивают.
На сухой мазок наносят каплю воды, накрывают стеклом и
микроскопируют. Если для исследования пользуются иммерсион-
ной системой, то кедровое масло наносят непосредственно на
сухой мазок [131].
Окраска по Граму — это важный диагностический при-
знак. Метод основан на том, что протоплазма одних видов мик-
роорганизмов образует прочное, нерастворимое в спирте соеди-
нение йода с красителем, у других видов это соединение не об-
разуется. Для окраски препарат фиксируют и обрабатывают
карболовым раствором генцианового фиолетового, затем раство-
ром Люголя. Последовательность окраски препарата описана в
литературе [131].
Из микроорганизмов, развивающихся в сусле и в вине, кра-
сятся по Граму (грамположительные), имеют сине-фиолетовый
цвет — дрожжи, молочнокислые бактерии (стрептококки и па-
лочки); не красятся по Граму (грамотрицательные), имеют
красный цвет — уксуснокислые бактерии.
Окраска клеточных включений. Каплю исследуемой жидкос-
ти смешивают на предметном стекле с каплей водного раствора
красителя, накрывают покровным стеклом и через 5 мин мйкро-
скопируют.
При прижизненной окраске волютин чаще всего образует
зерна в вакуолях. При окраске нейтральной красной и метиле-
новой синей (растворы 1 :5000) волютин в вакуолях клеток
дрожжей выпадает в виде ярко окрашенных красных или синих
шариков [25]. При окраске фиксированного препарата метиле-
новым синим волютиновые зерна приобретают фиолетовый или
фиолетово-красный цвет, а цитоплазма клетки окрашивается в
голубой. Хорошо окрашиваются также включения молочнокис-
лых бактерий—палочек.
Для наблюдений живых микроорганизмов готовят 0,01%-ные
и 0,001 %-ные водные растворы красок. Для этого 10 мг сухой
краски растворяют в 1 л дистиллированной воды.
Для окраски фиксированных препаратов готовят растворы в
соотношении 1 :40 (1 мл насыщенного спиртового раствора крас-
ки смешивают с 40 мл воды).
Гликоген почти всегда содержится в клетках микроорга-^
низмов в виде включений или в растворенном состоянии в ци-
230 топлазме. Характерной для него является окраска йодом в
красно-бурый цвет. Для обнаружения гликогена на фиксирован-
ных препаратах используют крепкий раствор йода (7 г йода +
+ 20 г йодистого калия+100 мл дистиллированной воды). Пре-
парат рекомендуется предварительно обезжирить, можно при
фиксировании в смеси спирта с эфиром 1 : 2.
Для прижизненного окрашивания микроорганизмов исполь-
зуют раствор Люголя (0,33 г йода кристаллического+ 0,66 г йоди-
стого калия+100 мл воды дистиллированной). Сначала в 10 мл
воды растворяют йодистый калий, затем — йод и доливают во-
дой до 100 мл.
Жир в клетках микроорганизмов чаще всего встречается в
виде липопротеидных телец. Для окраски жира используют рас-
твор 0,1 г Судана (судан III) в 20 мл 95%-ного спирта или в кон-
центрированной молочной кислоте. К капле густой суспензии
микроорганизмов на предметном стекле добавляют каплю
40 %-ного формалина и оставляют на 5 мин. К фиксированному
таким образом препарату прибавляют каплю раствора метиле-
новой синей (1:40) и оставляют на 10 мин. Затем добавляют
каплю свежеприготовленной смеси равных объемов спиртового
раствора Судана и воды. Плазма окрашивается в синий цвет,
капли жира в розовый, а вакуоли остаются бесцветными.
Сера может быть в клетках в виде полужидких масляни-
стых капель, сильно преломляющих свет. Чтобы убедиться, что
клетки дрожжей содержат элементарную серу, их следует вы-
сушить, затем растворить капли серы в сероуглероде или без-
водном спирте, или в растворе гидроксида калия и соды (в пос-
ледней при нагревании). Обработав препарат высокой темпера-
турой, затем в течение 1 мин концентрированной пикриновой кис-
лотой, после промывания водой можно наблюдать кристаллиза-
цию серы в виде одноклиномерных кристаллов, чаще располо-
женных вне клеток.
При наличии большой массы дрожжей ее высушивают, по-
мещают в сероуглерод, а затем профильтровывают настой, да-
ют ему испариться на часовом стекле. Полученный желтый мас-
лянистый остаток при сжигании превращается в сернистый ан-
гидрид, легко обнаруживаемый по характерному запаху.
*
ПОДСЧЕТ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ
Для определения количества микроорганизмов в 1 мл жид-
кости производят подсчет их под микроскопом в счетной каме-
ре (Тома-Цейса, Горяева, Бюркера или Предтеченского). Счет-
ная камера имеет вид толстого предметного стекла, в центре ко-
торого находится стеклянная пластинка с выгравированной на
ней сеткой (или 2 сетки на разделенной пополам пластинке).
Справа и слева от центральной пластинки находятся 2 другие
стеклянные пластинки с уровнем на 0,1 мм выше. 231
После тщательного перемешивания исследуемой жидкости
берут каплю ее сухой стеклянной палочкой или петлей, наносят
на сетку счетной камеры, накрывают покровным стеклом разме-
ром 18X18 мм толщиной 0,25—0,35 мм и притирают покровное
стекло к боковым пластинкам камеры. Притирают покровное
стекло для того, чтобы высота слоя исследуемой жидкости в ка-
мере была 0,1 мм. Затем счетную камеру кладут на столик мик-
роскопа и находят в его поле зрения сетку. Легче ее находить
под малым увеличением (10X8). Затем, не двигая счетную ка-
меру, делают увеличение в 400 раз (окуляр ЮХобъектив 40).
При таком увеличении в поле зрения микроскопа помещается
1 большой квадрат, состоящий из 16 маленьких квадратов или
не разделенный на маленькие квадраты.
Подсчитывают все клетки микроорганизмов, находящиеся
внутри большого квадрата, а также на пограничных линиях, ес-
ли клетки большей половиной находятся в данном квадрате.
Клетки, большая половина которых находится в другом квад-
рате, не подсчитываются. Если клетки пересекаются погранич-
ной линией пополам, то клетки считают только на двух смежных
сторонах квадратов, например, на левой и нижней.
В каждом препарате подсчитывают клетки в пяти больших
квадратах, например, по углам и в центре сетки. В слишком
густых суспензиях считать микроорганизмы трудно, поэтому их
следует разбавлять водой и пользоваться такими разведениями^
при которых количество клеток в одном большом квадрате бу-
дет не более 30.
Для того чтобы результат подсчета был достоверен, необходи-
мо сосчитать не менее 600 микроорганизмов. Количество препа-
ратов, в которых нужно подсчитать микроорганизмы, будет за-
висеть от количества клеток в них. Так, если в пяти больших
квадратах одного препарата содержится около 150 клеток, то
нужно приготовить 4 препарата, чтобы общее количество сосчи-
танных клеток было около 600 [108].
Объем одного большого квадрата во всех счетных камерах
равен 7г5о мм3, соответственно объем 5 квадратов равен 5/25о или
7б0 ММ3.
Чтобы определить количество клеток в 1 мл (в 1000 мм3) ис-
следуемого субстрата нужно среднюю сумму количества клеток,
в пяти больших квадратах умножить на 50 000.
Число микроорганизмов в 1 мл исследуемого субстрата (х)
удобно определять по формуле
х ~ а • 50000 Ь,
где а — средняя сумма количества подсчитанных клеток в пяти больших квад-
ратах;
b — разведение исходной суспензии микроорганизмов;
50000 — коэффициент пересчета объема пяти больших квадратов на 1 мл.
Для подсчета общего количества клеток культур дрожжей,.
232 образующих конгломераты, рекомендуется в исследуемую про-
бу добавлять равное количество 10%-ной серной кислоты и тща-
тельно ее перемешивать для разъединения скоплений клеток.
Подсчитывая результаты, следует учитывать разбавление вдвое
раствором серной кислоты.
При дифференцированном подсчете почкующихся, живых и
мертвых клеток дрожжей на сетку помещают каплю исследуе-
мой дрожжевой суспензии, добавляют каплю водного раствора
метиленовой синей (1 : 10 000), перемешивают, накрывают по-
кровным стеклом, притирают его. Через 5 мин после приготов-
ления препарата подсчитывают отдельно количество почкующих-
ся, живых и мертвых клеток. Подсчитывая результаты, следует
учитывать разбавление вдвое метиленовой синей.
МЕТОД ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЖИВЫХ И МЕРТВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Метод состоит в окрашивании препарата в флуорохромом
примулином. При рассматривании препарата в люминесцентном
микроскопе тела мертвых микроорганизмов люминесцируют в
результате проникновения красителя внутрь клеток. Живые мик-
роорганизмы не видны.
При микроскопировании белых вин бактериологической пет-
лей диаметром не более 2 мм помещают на предметное стекло
каплю осадка и рядом каплю водного раствора примулина
(1 : 20 000), смешивают их и накрывают покровным стеклом, на
которое затем кладут каплю нелюминесцирующего иммерсион-
ного масла.
При микроскопировании красных вин в связи с гашением лю-
минесценции красным цветом вина последний необходимо уст-
ранить, что достигается созданием в препарате щелочной среды.
Красный цвет вина при этом превращается в синий. Бактерио-
логической петлей помещают на предметное стекло рядом кап-
лю осадка вина и 2 капли раствора примулина (1 : 20000) в фос-
фатном буферном растворе pH 8—9.
Все капли тщательно смешивают петлей и покачиванием
стекла в течение 1—2 мин, накрывают покровным стеклом, на
которое помещают каплю нелюминесцирующего иммерсионного
масла.
Приготовленные препараты рассматривают в люминесцент-
ном микроскопе в фиолетовой и синей видимой части спектра.
Для этого пользуются светофильтрами «синий свет», «сине-зеле-
ный свет», «белый свет» и запирающим желтым.
Применяют объектив масляной иммерсии 90Х, окуляр 5Х и
дополнительное увеличение 1,6Х (для микроскопа МЛ-2).
Сначала препарат рассматривают в проходящем свете и под-
считывают общее количество микроорганизмов, а затем в свете
люминесценции, подсчитывая только количество мертвых клеток.
В свете люминесценции живые микроорганизмы не видны,
иногда у дрожжевых клеток светится только оболочка в виде 233
Рис. 50. Дифференциация живых и мертвых клеток дрожжей, обработан-
ных примулином при люминесцентной микроскопии. Мертвые клетки све-
тятся, живые окружены светящимся кольцом оболочки.
тонкого зеленого кольца (рис. 50). Мертвые дрожжи и бактерии
в свете люминесценции светятся зеленым и желтым светом раз-
ной интенсивности. Исключение составляют уксуснокислые бак-
терии в красных винах, погибшие под воздействием высоких тем-
ператур. В этом случае мертвые бактерии не люминесцируют,
так же, как и живые.
Для уточнения физиологического состояния уксуснокислых
бактерий рекомендуется производить контрольное микроскопи-
рование убитой культуры. Для этого на два предметных стекла
наносят по капле осадка вина. На первом стекле готовят препа-
рат для микроскопирования, как описано выше, для красного
вина. Каплю вина на втором стекле осторожно подогревают, не-
сколько раз проводя стекло нижней поверхностью над пламенем
горелки, пока оно не станет горячим (определяется тыльной сто-
роной кисти руки). После остывания продолжают приготовление
препарата. Сравнивают микроскопическую картину в обоих пре-
паратах. Если уксуснокислые бактерии в исследуемой пробе ви-
на живы, то в первом препарате они не светятся, а во втором
(погибшие в результате мягкого термического воздействия) —
ярко люминесцируют. Если бактерии в пробе вина были мерт-
234
вы — в обоих препаратах микроскопическая картина будет оди-
наковой.
Контрольное параллельное микроскопирование препаратов
можно применять во всех случаях, когда определение физиологи-
ческого состояния микроорганизмов затруднительно.
При подсчете микроорганизмов необходимо учитывать разве-
дение исследуемого материала в 2 раза для белых вин и в 3 ра-
за — для красных.
ПОДСЧЕТ ЖИВЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ ПОСЕВА
Для определения небольшого количества живых клеток, кото-
рые нельзя подсчитать в счетной камере, и для более точного
определения большого количества живых микроорганизмов в ис-
следуемом материале пользуются методом посева и культивиро-
вания. Для этого делают посев исследуемого субстрата на плот-
ную питательную среду в чашки Петри и подсчитывают количе-
ство выросших колоний.
При небольшом количестве живых микроорганизмов в анали-
зируемой пробе делают посев без разведений, а при большом их
количестве делают разведения с таким расчетом, чтобы на чаш-
ке вырастали отдельные колонии и можно было их подсчитать.
Для разведений готовят пробирки со стерильной водопровод-
ной водой по 4,5 мл в каждой (разливают стерильной пипеткой в
стерильные пробирки около пламени). Затем стерильной пипет-
кой берут 0,5 мл исследуемой жидкости и вносят в пробирку
№ 1 с 4,5 мл стерильной воды. Получают разведение в 10 раз
(или 1-е). Другой стерильной пипеткой перемешивают содержи-
мое пробирки № 1, отбирают из нее 0,5 мл и вносят в пробирку
№ 2 с 4,5 мл стерильной воды — получают разведение в 100 раз
(или 2-е). Таким же образом, каждый раз беря новые стериль-
ные пипетки, делают разведения в 1000 раз (3-е), в 10000 (4-е)
и т. д.
Для посева берут стерильные чашки Петри (с заранее раз-
литой плотной питательной средой, благоприятной для размно-
жения исследуемых микроорганизмов), надписывают на дне ча-
шек номер разведения, берут новую стерильную пипетку и в
чашку с № 4 вносят 0,1 мл из 4-го разведения, этой же пипеткой
берут затем 0,1 мл из 3-го разведения и вносят в чашку с № 3,
этой же пипеткой берут 0,1 мл из 2-го разведения и вносят в
чашку № 2 и т. д.
Для равномерного распределения клеток на всей поверх-
ности агара посевной материал растирают стерильным шпате-
лем, начиная с большего разведения. Чашки с посевами перево-
рачивают вверх дном и помещают в термостат с температурой
25—28°С. Через 5—7 сут подсчитывают выросшие колонии. Для
подсчета лучшими разведениями следует считать те, которые да-
ли на агаре от 50 до 200 колоний. При большем числе колоний 235
1I|| 1111 Окулярный
[ I I Illi микрометр
0 5
II । . Объектив-
Illi НЫЙ
I I____J_____|микрометр
- s._X1 2 3 4
lb MKM
Рис. 52. Посев
штрихом для вы-
деления отдель-
ных колоний.
Рис. 51. Определение цены деле-
ния окулярного микрометра.
дно чашки Петри расчерчивают чернилами или восковым каран-
дашом на несколько одинаковых секторов, считают число коло-
ний в 2—3 секторах и среднее число, найденное для одного сек-
тора, умножают на количество секторов.
Для определения количества живых микроорганизмов в 1 мл
исследуемой^ жидкости умножают число сосчитанных колоний
на разведение и на 10, так как для посева на чашки бралось
0,1 мл. Например, на чашке выросло 120 колоний в 3-м разведе-
нии. Это означает, что в 1 мл исходного субстрата было 120Х
X1000Х 10=1 200 000 живых клеток микробов.
ИЗМЕРЕНИЕ ВЕЛИЧИНЫ КЛЕТОК
Величину микроорганизмов измеряют при помощи окулярно-
го микрометра — круглого стеклышка с нанесенными на него де-
лениями (1 мм разделен на 10 делений). Окулярный микрометр
вставляют стороной с делениями вверх на диафрагму оку-
ляра.
Для определения размеров клеток применяют также специаль-
ные винтовые окулярные микрометры.
Для определения истинной величины клетки необходим по-
правочный коэффициент, который устанавливают с помощью
объективного микрометра с делениями 1 мм на 100 частей (одно
деление равно 10 мкм). Объективный микрометр помещают на
столик микроскопа и определяют, сколько окулярных и объек-
тивных делений помещается на отрезке от окулярного нуля до
ближайшего совпадения черточек (рис. 51). В данном случае
одно деление окулярного микрометра равно 4 мкм (20 : 5).
При микроскопировании препарата с живыми микроорганиз-
мами с тем же объективом и окуляром, при которых определял-
ся поправочный коэффициент, измеряют длину и ширину клеток.
Замеряют обычно несколько клеток, затем средний показатель
236 умножают на поправочный коэффициент [108, 140].
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ
Выделение чистых культур дрожжей. Для изучения свойств
какого-либо микроба прежде всего необходимо получить его в
чистой культуре, т. е. в культуре, представляющей потомство од-
ной клетки.
Изолирование (выделение) микробов или получение чистых
культур возможно следующими методами:
из отдельной колонии методом посева на плотную питатель-
ную среду;
выделением чистой культуры заведомо из одной клетки (ме-
тодом Линднера или при помощи микроманипулятора).
Выделение микроорганизмов из отдельной
колонии. Этим методом часто пользуются для выделения чис-
тых культур винных дрожжей. Метод основан на выделении чис-
той культуры из дрожжевой колонии, выросшей изолированно
на плотной питательной среде. Для получения изолированных
колоний можно пользоваться поверхностным посевом. С этой
целью заранее за 2—3 сут разливают стерильно в чашки Петри
виноградный сусло-агар слоем 5—6 мм.
Каждая клетка дрожжей, попав на плотную питательную сре-
ду, начинает размножаться и образует колонию — скопление кле-
ток, расположенных вплотную одна к другой, которые являются
потомством одной клетки. Если суспензия дрожжей, из которой
делался посев, была густая, то на плотной питательной среде ко-
лонии вырастают близко одна к другой, часто сливаются вместе
и в таком случае невозможно выделить потомство одной клетки,
т. е. чистую культуру дрожжей.
Чтобы получить рост отдельных колоний на поверхности ага-
ра при выделении культур из бродящего виноградного сусла,
нужно сделать его разведение. Для этого только что прокален-
ную и остуженную иглу погружают примерно на 1 см в бродя-
щее сусло и сразу переносят в 0,5 мл стерильной водопроводной'
воды в пробирке. После перемешивания содержимого пробирки
из нее берут одну петлю посевного материала и переносят его
на поверхность агара в чашку Петри. Маленькую каплю иссле-
дуемого материала размазывают легкими движениями стериль-
ного стеклянного шпателя по поверхности агара.
Если чистую культуру дрожжей выделяют из виноматериала
или других проб, содержащих неизвестное количество живых
дрожжей, то делают обычно два посева. Первый — более густой
делают из первоначального материала без разведения, второй —
после предварительного разведения небольшого количества (1 —
2 капли) первоначального материала в 5 мл стерильной воды
в пробирке. Из этого разведения и из первоначального материа-
ла берут стерильной пипеткой по 1 капле посевного материала
и переносят на поверхность агара в чашки Петри, где его рас-
пределяют по поверхности агара шпателем. 237
Рис. 53. Выделение чистой культуры дрожжей из одной клетки:
а — нанесение капель; б — капля с развившейся колонией; в — снятие капли с ко-
лонией.
Можно посевной материал распределять по поверхности ага-
ра для получения отдельных колоний не шпателем, а посевом
при помощи петли штрихом. Для этого нужно взять стерильной
(прокаленной и остуженной) петлей каплю исследуемого мате-
риала и сделать штрих по всей поверхности чашки с агаром
(рис. 52). Чашки с посевами перевернуть вверх дном и инкуби-
ровать 4—5 сут при температуре 25—28°С.
Для выделения чистой культуры дрожжей прокаленной и ос-
туженной петлей или лучше иглой прикасаются к выросшей изо-
лированной колонии и переносят небольшое количество образую-
щих ее клеток в пробирку со стерильным виноградным суслом
или сусло-агаром. Через 2—3 сут размножится чистая культура.
Чашечным методом не всегда можно сразу получить колонии
чистых культур, так как часть выросших колоний может образо-
ваться не из одной клетки, а из нескольких, склеившихся между
собой или из попавших на поверхность агара близко одна к дру-
гой и давших сначала изолированные колонии, но вскоре слив-
шихся в одну смешанную. Поэтому необходимо провести повтор-
ный рассев выделенной из отдельной колонии культуры одним из
выше описанных способов и снова отсеять культуру из изолиро-
ванной колонии. Чистоту выделенной культуры проверяют как
микроскопированием (однородность клеток), так и повторными
рассевами в чашках Петри (однородность вырастающих ко-
лоний) .
238
Выделение дрожжей из одной клетки по ме-
тоду Линднера. На стерильное покровное стекло наносят
стерильным чертежным пером ряд мелких капель из последо-
вательных разведений дрожжей в стерильном сусле. Стекло пе-
ревертывают и помещают над лункой стерильного предметного
стекла, края покровного стекла замазывают расплавленным па-
рафином или смазывают вазелином, чтобы не происходило испа-
рения. При просмотре под микроскопом отмечают капли, содер-
жащие по одной клетке. Препараты помещают в термостат при
температуре 25—28°С. Через 12—24 ч снова просматривают кап-
ли и отмечают те, где образовалась одна колония. Эту каплю ос-
торожно снимают стерильной маленькой полоской фильтроваль-
ной бумаги, зажатой стерильным пинцетом, и вносят ее в про-
бирку со стерильным суслом (рис. 53).
Выделение дрожжей из одной клетки при по-
мощи микроманипулятора. Микроманипулятор позво-
ляет производить захват одной клетки дрожжей специальной
микроскопической пипеткой или иглой под контролем микроскопа.
Микроманипулятор имеет два операционных штатива (ас-
систента), между которыми расположен микроскоп. В держате-
лях штативов закрепляются микропипетки или иглы. Перемеще-
ние их осуществляется с микронной точностью благодаря систе-
ме винтов и рычагов, которые позволяют кончики инструментов
вводить в висячую каплю и захватывать ими отдельную клетку
[25, 140].
Выделение чистых культур уксуснокислых бактерий. Выделе-
ние ведут путем высева отдельных хорошо изолированных коло-
ний, выросших на плотной питательной среде. Для выделения
уксуснокислых бактерий отбирают образцы вин с запахом уксус-
ноэтилового эфира, в которых при микроскопировании обнару-
жены отдельные клетки бактерий или скопления их — неподвиж-
ные короткие палочки, иногда с инволюционными формами.
Накопительную культуру готовят на вине с суслом. Пробу ви-
на в количестве 0,5—1 мл высевают в среду. После 2—3 сут раз-
вития при температуре 28—30°С визуально судят о росте куль-
туры — появление тонкой, гладкой, глянцевато-влажной или су-
хой пленки на поверхности среды.
Рассев накопительной культуры (разведений в стерильной во-
допроводной воде) проводят на сусло-агаре в чашках Петри.
Через 2—3 сут при температуре 30—35°С вырастают колонии
дрожжей и между ними — мелкие, плоские, неправильной фор-
мы, беловато окрашенные, влажно блестящие, слизистые коло-
нии уксуснокислых бактерий. Отдельные колонии переносят в
пробирки со стерильной жидкой питательной средой и выдержи-
вают при температуре 28—30°С. О развитии бактерий судят
по образованию пленки на поверхности питательной среды,
внешние признаки которой следующие: тонкая, умеренно проч-
ная, несмачиваемая, всползающая по стенкам пробирки. 239
При определении чистоты выделенной культуры ее визуаль-
но осматривают, чтобы убедиться в росте пленки. Микроскопи-
ческий контроль должен подтвердить наличие бактерий палочек
укороченных или удлиненно-яйцевидных, одиночных или соеди-
ненных по 2—3. Для проверки чистоты культуры можно вос-
пользоваться окраской по Граму. Хранят выделенные культуры
уксуснокислых бактерий на жидких или плотных питательных
средах в холодильнике при температуре 5—10°С с пересевом
1 раз в месяц.
Выделение чистых культур молочнокислых бактерий. Для вы-
деления молочнокислых бактерий берут вина, в которых при
микроскопировании .обнаружены бактерии, могущие быть отне-
сенными к выделяемой группе на основании морфологических
признаков. Накопительную культуру получают при высеве про-
бы вина в любую питательную среду, рекомендуемую для разви-
тия молочнокислых бактерий, с добавлением этилового спирта.
Предпочтение отдается жидкой капустной среде или солодовому
суслу с содержанием сухих веществ 3% •
Пробу вина в количестве 0,5—1 мл стерильно высевают в
среду. После подращивания в термостате при температуре 28°С
в течение суток в посев добавляют этиловый спирт до содержа-
ния 12—16% об. и продолжают инкубацию в термостате. О по-
лучении накопительной культуры судят по помутнению среды,
появлению осадка. Помимо визуальной оценки культуральную
жидкость микроскопируют и выявляют присутствие молочнокис-
лых бактерий.
Накопительную культуру можно получить путем подращи-
вания бактерий в пробе вина. Для этого в пробу вина добавляют
несколько миллилитров дрожжевого автолизата (20—30 мл на
1 л вина) и оставляют при комнатной температуре на несколько
дней без доступа воздуха. Затем вино центрифугируют при
5000 об/мин дважды: первый раз 2—3 мин для отделения дрож-
жей, второй—10—20 мин для осаждения бактерий. Вино сли-
вают из центрифужных пробирок, а осадок используют для рас-
сева.
Основным методом выделения чистой культуры молочнокис-
лых бактерий является известный способ выделения отдельной
колонии, которую считают результатом развития одной клетки.
Накопительную культуру или ее разведения в стерильной во-
допроводной воде высевают на поверхность плотной среды —
1,5% солодового сусла-агара, содержащего 3% СВ. Порядок ра-
боты при этом такой же, как и при выделении чистых культур
дрожжей.
Через 7—14 дней на поверхности плотной среды вырастают
крупные выпуклые кремового оттенка колонии дрожжей, а меж-
ду ними — мельчайшие плоские, голубоватые, опалесцирующие
колонии молочнокислых бактерий не совсем правильной округ-
240 лой формы с неровными краями, хорошо видные в лупу с четы-
рехкратным увеличением. Из выросших на чашках типичных ко-
лоний бактерий, далеко отстоящих от колоний других микробов,
захватывают посевной петлей или лучше иглой колонию и пере-
носят ее в пробирку с жидкой средой. Пробирки помещают в тер-
мостат при температуре 20—25°С на 7—10 дней.
Когда среда в пробирках слегка помутнеет и в ней при встря-
хивании пробирки станут видны прозрачные шелковистые вол-
ны, а на дне — легкий беловатый осадок, это значит, что бакте-
рии размножились.
Чаще бывает достаточно одного посева на плотную среду, что-
бы получить чистую культуру. Однако для уверенности в чисто-
те культур посев на плотную питательную среду повторяют.
В качестве посевного материала при этом используют культуру,
полученную из отдельной колонии.
Чистота культуры выделенных молочнокислых бактерий
должна быть проверена визуальным способом, микроскопическим
контролем и высевом на диагностическую питательную среду.
Визуальный осмотр посева на скосе плотной питательной сре-
ды должен подтвердить однородность культуры.
Микроскопический контроль должен подтвердить наличие тон-
ких коротких или длинных палочек, или кокковых форм, распо-
ложенных по две или цепочками.
Для предварительного ориентировочного определения молоч-
нокислых бактерий делают рассев культуры на поверхность ага-
ризованного солодового сусла с 2% мела. Вокруг колоний мо-
лочнокислых бактерий возникает зона растворения мела в ре-
зультате образования ими молочной кислоты и растворимого
лактата кальция.
Хранят выделенные культуры молочнокислых бактерий на
жидких питательных средах, в том числе и на смеси (1:1) вино-
градного сусла с солодовым, содержащим 3% сухих веществ, в
холодильнике при температуре 5—10°С с пересевом 1 раз в
месяц.
Для хранения лейконостоков рекомендуется среда АТБ с
1,5% агара. Культуры, посеянные уколом, выращивают в анаэ-
робных условиях в атмосфере На и СОа (9 : 1), а затем хранят в
холодильнике в течение нескольких месяцев [73].
ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ
Дрожжи
Спорообразование. Форма спор, способ их образования и про-
растания являются родовыми признаками дрожжей. Поэтому при
определении систематического положения выделенных культур
дрожжей их высевают на специальные среды для спорообразо-
вания. 241
9—568
Для получения спор у дрожжей было предложено много раз-
ных сред [90]. В настоящее время для получения спор наиболее
распространенным является прием выращивания дрожжей в те-
чение 1—2 сут на полной среде, а затем пересев их на среду с
ацетатом [63].
Состав полной среды (в г на 1 л воды):
Пептон 10
Дрожжевой экстракт 5
Глюкоза 20
Агар 20
Стерилизацию проводят в течение 30 мин при давлении
0,08 МПа.
Состав среды с ацетатом (в г на 1 л воды):
Ацетат натрия 10
Хлористый калий 5
Агар 20
Стерилизацию ведут в течение 30 мин при давлении 0,1 МПа.
Усвоение сахаров. Изучение усвоения различных сахаров не-
обходимо для определения видовой принадлежности дрожжей.
Готовят дрожжевой отвар (200 г прессованных хлебопекар-
ных дрожжей в 1 л водопроводной воды) или полную жидкую
среду без глюкозы и агара (пептон—10 г, дрожжевой экс-
тракт — 5 г, вода — 1л). Среду фильтруют, разливают по склян-
кам, в каждую из них добавляют по 2% одного из сахаров (глю-
козы, галактозы, сахарозы, мальтозы, лактозы, рафинозы) и сте-
рилизуют либо 3 дня подряд в кипятильнике Коха, либо в
автоклаве при давлении 0,05 МПа в течение 20—30 мин.
Опыты по усвоению различных сахаров ставят в трубках Дун-
242 бара (рис. 54), в которые стерильно разливают приготовленную
питательную среду с разными сахарами и засевают изучаемыми
культурами дрожжей. После перемешивания содержимого тру-
бок их ставят таким образом, чтобы закрытое колено было на-
правлено вверх, а открытое было в наклонном положении. Труб-
ки помещают в термостат, ежедневно просматривают, их содер-
жимое перемешивают и отмечают по выделению углекислоты и
скоплению ее в закрытом колене трубок усвоение сахара.
Бродильная и спиртообразующая способность. У выделенных
чистых культур винных дрожжей обычно в первую очередь опре-
деляется бродильная способность (скорость и полнота сбражи-
вания 18—20% сахара в виноградном сусле).
Опыты по брожению ставят в колбах, закрытых пробками.
Для выхода углекислоты и предотвращения испарения бродя-
щего сусла в пробке делают отверстие и вставляют в него спе-
циальный бродильный затвор, а при его отсутствии — стеклянную
трубку с верхним концом, оттянутым в капилляр, или стеклян-
ную трубку с ватным тампоном, на верхний конец которой на-
девают резиновый клапан. Для изготовления клапанов берут ре-
зиновый шланг такого же диаметра, как стеклянная трубка,
разрезают на отрезки длиной 5 см, делают на каждом лезвием
острой бритвы прорезь длиной около 1 см, надевают каждый на
стеклянную трубку, а верхний конец закрывают стеклянной бу-
синкой или коротким отрезком стеклянной палочки. Углекисло-
та, выделяющаяся при брожении, будет выходить через прорезь
в клапане.
В колбы наливают виноградное сусло на 2/3 их объема, закры-
вают колбы ватными пробками и стерилизуют в кипятильнике
Коха текучим паром в течение 30 мин. Когда сусло остынет, в
него вносят разводки испытуемых культур дрожжей в одинако-
вом количестве и одного возраста. Колбы закрывают пробками
с бродильными затворами, капиллярами или клапанами, взвеши-
вают на технических весах и ставят в термостат при температуре
25—28°С. Ежедневно колбы взвешивают и по убыли в массе, ко-
торая соответствует количеству выделившейся углекислоты, су-
дят о скорости сбраживания сахара в сусле разными расами
дрожжей. Опыты с каждой культурой нужно ставить не менее
чем в двух повторностях. Конец брожения определяют по отсут-
ствию изменения в массе колб. По общему количеству выделив-
шейся к концу брожения углекислоты ориентировочно можно су-
дить о полноте сбраживания сахара сусла.
Чтобы отобрать сильные культуры, обладающие наибольшей
спиртообразующей способностью, сбраживают сусло с содержа-
нием сахаров 29—30%. Спиртообразующую способность опреде-
ляют по максимальному количеству спирта, которое могут об-
разовать расы при сбраживании высокосахаристого сусла. По
окончании брожения определяют содержание спирта. При изу-
чении большого количества культур и необходимости определе-
ния содержания спирта во многих образцах удобно пользовать-
9*
243
ся флотационным методом определения спирта [202]. По точ-
ности он не уступает пикнометрическому, к его преимуществам
относятся быстрота определения и потребность малых количеств
анализируемой жидкости.
Спиртовыносливость. В большинстве случаев расы, обладаю-
щие высокой спиртообразующей способностью, являются и спир-
товыносливыми. Под спиртовыносливостью следует понимать спо-
собность рас проявлять жизнедеятельность при высоких концен-
трациях спирта в среде.
Для определения спиртовыносливости рас дрожжей готовят
разводки исследуемых рас на пастеризованном вине, содержа-
щем 10—11% об. спирта и 2% глюкозы при температуре 25°С.
Через 5 сут разводку каждой расы дрожжей вносят в количест-
ве 1% в пропастеризованное вино, содержащее 15% об. спирта
и 2% глюкозы. Вино выдерживают при температуре 25°С и отме-
чают, на какие сутки в нем размножились дрожжи и оно начало
забраживать. Опыты удобно ставить в пенициллиновых склян-
ках, закрытых резиновыми пробками. Наиболее спиртовыносли-
выми являются расы дрожжей, ранее других размножившиеся
в вине с 15% об. спирта, наименее спиртовыносливые расы в та-
ком вине не размножаются.
Холодо- и термостойкость. Брожение сусла при температурах
ниже 10°С и выше 30°С часто заканчивается недобродом, т. е.
неполным сбраживанием сахаров виноградного сусла. Недобро-
ды дают некондиционный виноматериал, склонный к заболева-
ниям. Чтобы избежать этого, для сбраживания сусла при низких
и высоких температурах целесообразно применять холодо- и тер-
мовыносливые расы дрожжей.
Для отбора холодовыносливых культур изучают бродильную
способность (скорость и полноту сбраживания 18—20% сахаров
в виноградном сусле) при температуре 7°С и отбирают те расы,
которые начинают размножаться и сбраживают сусло быстрее и
полнее других.
Для отбора термовыносливых культур изучают бродильную
способность при температуре 35°С и отбирают те расы дрожжей,
которые начинают размножаться и сбраживают сусло быстрее
и полнее других при этой температуре.
Методика постановки опытов и контроль за ходом брожения
описаны в разделе «Определение бродильной и спиртообразую-
щей способности». Целесообразно при отборе новых холодо- и
термовыносливых рас дрожжей в качестве контроля брать му-
зейные расы, обладающие этими свойствами.
Сульфитостойкость. Для сравнительного изучения сульфито-
стойкости различных культур дрожжей их нужно подвергнуть
действию одинаковой дозы свободной SO2. Сульфитостойкие ра-
сы можно отбирать по скорости забраживания виноградного сус-
ла, содержащего 100 мг/л свободной SO2 в момент внесения в
244 сусло разводок изучаемых культур.
Вначале проводят пробную сульфитацию сусла разными до-
зами SO2 и выбирают такую, при которой через час после вне-
сения SO2 в сусло в нем будет содержаться около 100 мг/л сво-
бодной сернистой кислоты. Сразу после сульфитации содержание
ее быстро уменьшается, так как она вступает в соединение с со-
ставными частями сусла (сахарами, альдегидами и др.), а спус-
тя 1—2 ч ее количество уже заметно не меняется. Затем сульфи-
тируют сусло выбранной дозой SO2 в склянке вместимостью 2 л
с нижним тубусом, склянку закрывают, сусло перемешивают и
оставляют на час.
За это время в стерильные небольшого объема склянки, раз-
меченные до стерилизации по 20 мл, вносят по 0,2 мл двухсуточ-
ных разводок исследуемых рас дрожжей. Каждую культуру вно-
сят в три склянки, т. е. опыты ставят в трех повторностях.
Через час после сульфитации сусло из 2-литровой. склянки
разливают через нижний тубус по 20 мл в склянки быстро, но
осторожно, чтобы оно не разбрызгивалось. Для предотвращения
улетучивания SO2 склянки закрывают резиновыми пробками, об-
работанными спиртом, и затем ставят в термостат при темпера-
туре 27°С. При такой постановке опыта все культуры дрожжей
подвергаются действию одинаковой дозы свободной SO2. Еже-
дневно в течение 10 дней опытные склянки просматривают и от-
бирают сульфитостойкие расы дрожжей по скорости размноже-
ния и забраживания сусла.
Быстрее и проще можно определять сульфитостойкость по
скорости размножения штаммов дрожжей на сульфитирован-
ном виноградном сусло-агаре в чашках Петри [207]. Виноградное
сусло перед розливом в чашки Петри смешивают с равным ко-
личеством 3%-ного водного агара. В связи с невозможностью
определять содержание сернистой кислоты в сусло-агаре для
подбора дозы сульфитации виноградное сусло в нескольких конт-
рольных порциях смешивают с таким же количеством водопро-
водной воды (вместо 3%-ного водного агара). Разбавленное сус-
ло в склянках сульфитируют несколькими дозами крепкого вод-
ного раствора сернистой кислоты для того, чтобы можно было
выбрать дозу сульфитации, при которой через час после внесения
SO2 в сусле, а также в сусло-агаре будет содержаться около
100 мг/л свободной сернистой кислоты. Содержание свободной
сернистой кислоты определяют йодометрическим методом.
Штаммы исследуемых дрожжей предварительно выращивают
в течение 2 сут в виноградном сусле при температуре 27°С, а за-
тем уколом иглы наносят на поверхность сульфитированного сус-
ло-агара в количестве 25 штаммов на чашку. Кончик иглы при
этом погружают в разводки исследуемых культур примерно на
1 см. Чашки с посевами помещают в термостат и выдерживают
при температуре 27°С. Ежедневно в течение недели просматри-
вают чашки и отбирают сульфитостойкие штаммы, колонии ко-
торых вырастают раньше.
245
Первичный отбор проводится при содержании свободной сер-
нистой кислоты 100 мг/л, а затем наиболее сульфитостойкие
штаммы отбирают при содержании ее 150 мг/л.
Кислотовыносливость. В годы, неблагоприятные для вызрева-
ния винограда, отдельные его партии могут поступать на пере-
работку при величине pH сусла 2,5—2,9. Имеются наблюдения,
что не все расы дрожжей могут полностью сбродить сахар в сус-
ле с такой низкой кислотностью. Чтобы получить полностью вы-
броженные высококислотные виноматериалы, рекомендуется при-
менять кислотовыносливые расы дрожжей.
Для отбора кислотовыносливых культур необходимо опреде-
лять их бродильную способность в сусле с величиной pH 2,6 и
содержанием сахаров 18% при температуре 25°—27°С. При от-
сутствии в лаборатории сусла с такими кондициями его можно
получить подкислением 10%-ным раствором винной кислоты и
разбавлением водой обычного сусла с более высокой концентра-
цией сахаров и меньшей кислотностью. Отбирают те расы дрож-
жей, которые начинают размножаться и сбраживают сусло быст-
рее и полнее других. В конце брожения необходимо определить
остаточные сахара, чтобы убедиться в полном выбраживании их
в сусле с pH 2,6 отобранной культурой.
Ранее был предложен метод отбора кислотовыносливых рас
дрожжей, основанный на нефелометрическом определении интен-
сивности роста культур, выращиваемых в тонком слое виноград-
ного сусла с величиной pH 2,5—2,7 [127]. Однако этот метод
позволяет отбирать культуры, образующие биомассу с большим
количеством сухих веществ, которая зависит не только от числа
клеток, но и от их размеров, формы, различной проницаемости
плазмы и т. д. Как показали проведенные нами исследования,
культуры, образующие биомассу с большим количеством сухих
веществ, могут быть слабобродящими и менее кислотовыносли-
выми, чем культуры с биомассой, содержащей меньше сухих ве-
ществ [201]. Поэтому отбирать кислотовыносливые расы дрож-
жей этим методом нельзя, а нужно отбирать их по бродильной
способности в сусле с pH 2,6.
Определение фенотипов киллер, нейтральный, чувствитель-
ный. При описании различий между расами винных дрожжей
сообщалось о том, что все дрожжи-сахаромицеты принадлежат
к одному из трех фенотипов: убийца (киллер К), нейтральный
(N) или чувствительный (S).
Применение рас дрожжей определенных фенотипов (К, N или
S) позволяет проконтролировать, в какой степени чистая куль-
тура, внесенная в нестерильное виноградное сусло, овладела сре-
дой. Для этого необходимо определить процентное содержание
дрожжей фенотипов К, N, S в спонтанно сбраживаемом сусле
(контроль) и в отстоенном сусле, забродившем при внесении в
него разводки чистой культуры дрожжей определенного фено-
246 типа.
Рис. 56. Колонии штамма-убийцы
на газоне исследуемых штаммов.
Рис. 55. Колонии исследуемых
штаммов на газоне чувствитель-
ного штамма.
Техника определения фенотипов К, N, S состоит в следующем.
В чашки Петри разливают 1,5%-ный виноградный сусло-агар за
2—3 сут до использования, чтобы он слегка подсох и затем хо-
рошо впитывал нанесенные на него дрожжевые суспензии. Для
предотвращения гидролиза агара его 3%-ный водный раствор
стерилизуют отдельно от виноградного сусла и смешивают при
температуре 60—70°С в равных количествах. Для лучшей конт-
растности зон. подавления роста чувствительных культур в рас-
плавленную среду можно добавлять перед розливом в чашки
Петри стерильный 0,5%-ный водный раствор метиленового си-
него в количестве 1 мл на 200 мл среды.
Отдельную колонию штамма дрожжей, фенотип которого не-
обходимо определить, изолируют иглой с плотной питательной
среды и примерно в равном соотношении переносят на внутрен-
нюю стенку пробирки с 0,5 мл стерильной водопроводной во-
ды и уколом — на чашку Петри с газоном культуры фено-
типа S.
На одну чашку можно нанести в определенной последователь-
ности до 30 уколов исследуемых штаммов (рис. 55).
Стерильно готовят водные суспензии тех же колоний в про-
бирках с 0,5 мл водопроводной воды и на других чашках Петри
с виноградным сусло-агаром (без газона штамма фенотипа S)
делают петлей газоны исследуемых штаммов дрожжей диамет-
ром около 1,5 см. На них в центр наносят уколом штамм феноти-
па К, предварительно выращенный на виноградном сусло-агаре.
На одну чашку можно нанести газоны десяти исследуемых штам-
мов в той же последовательности, что и на газоне штамма фено-
типа S (рис. 56). Через 2 сут инкубации чашек Петри с посева- 247
ми при температуре 25—28°С определяют фенотипы штаммов.
Если вокруг колоний образовались зоны на газоне чувствитель-
ного штамма, то штаммы идентифицируются как киллеры. Штам-
мы, на газонах которых киллер образует зоны, являются чув-
ствительными, остальные — нейтральные.
В качестве тестеров (индикаторных культур) можно исполь-
зовать расы Берегово 4—7 (киллер) и Кахури 7 (чувствитель-
ная) вида Sacch. vini, имеющиеся в коллекции культур Всесоюз-
ного научно-исследовательского института виноделия и вино-
градарства «Магарач».
Уксуснокислые бактерии
Морфологические признаки. Морфологию уксуснокислых бак-
терий изучают при выращивании культур на какой-либо из опи-
санных питательных сред, например, на вине с суслом. Опреде-
ляют внешние признаки (характер пленки на жидкой среде и
колоний — на плотной), вид клеток под микроскопом (форма и
подвижность), размеры и др.
Пробу на каталазу ведут упрощенным методом: на предмет-
ное стекло берут каплю перекиси водорода и добавляют одну
петлю бактериальной массы. При микроскопировании с малым
увеличением в случае наличия каталазы у культуры наблюдает-
ся интенсивное выделение пузырьков кислорода.
Способность окислять этиловый спирт и уксусную кислоту.
Для изучения этого свойства делают посев культуры бактерий на
дрожжевой агар с 3% об. этилового спирта или уксусной кисло-
ты и 2% мела. Через 3—4 сут вокруг колоний уксуснокислых
бактерий возникают зоны растворения мела.
Способность окислять молочную кислоту. Ее определяют по-
севом бактерий на дрожжевой агар с 2% лактата кальция. Че-
рез несколько дней вокруг колоний бактерий, окисляющих мо-
лочную. кислоту, образуется расплывчатый белый ореол.
Кетогенная способность. Определяется по методу оксидо-
грамм Фратера. Для получения их на поверхность дрожжевого
агара с глицерином (2%) в чашках Петри наносят (петлей, пи-
петкой) густую бактериальную массу. Чашки выдерживают в
термостате при температуре 30°С. Через сутки агар осторожно
заливают раствором Фелинга. Бактерии, окисляющие глицерин
в диоксиацетон, образуют закись меди, и зона вокруг бактери-
альной массы окрашивается в желтый цвет. По количеству за-
кисной меди можно судить об относительной активности окисле-
ния многоатомных спиртов в кетосоединения.
Способность к окислению глюкозы. Для определения способ-
ности бактерий окислять глюкозу в глюконовую кислоту делают
их посев на дрожжевой агар, содержащий 10% глюкозы и 3%
мела. Вокруг колоний бактерий, окисляющих глюкозу, образу-
248 ются прозрачные зоны. Если бактерии обладают способностью
окислять глюконовую кислоту, то позднее вокруг колоний обра-
зуются кристаллы глюконата кальция.
Реакция на целлюлозу. Определяется раствором йода (0,5 г
йода в 100 мл 1,5%-ного раствора йодистого калия). В каплю
раствора на предметном стекле вносят каплю бактериальной
пленки и добавляют 2 капли 50—60%-ной (по объему) серной
кислоты. О наличии целлюлозы судят по окрашиванию клеток
в синий цвет.
Колонии бактерий, образующие крахмал, также окрашива-
ются в синий цвет.
Способность уксуснокислых бактерий усваивать различные
источники углерода (сахара, спирты, кислоты). Эту способность
определяют по интенсивности роста бактерий (в пробирках или
в чашках Петри) на плотной синтетической питательной среде
Ридер с добавлением 0,1%-ного дрожжевого автолизата. В ка-
честве индикатора добавляют на 100 мл среды 3 мл 0,04%-ного
щелочного раствора бромтимол синего. Сахара и спирты добав-
ляют в количестве 1%, органические кислоты — 0,2% (уксусная
кислота 0,1%). Контролем служит среда без добавления ис-
точников углерода. Степень усвоения источников углерода оце-
нивают по массе выросших бактерий и изменению цвета инди-
катора.
Молочнокислые бактерии
Морфологические признаки бактерий. Морфологию изучают
после выращивания культур (18—24 ч) на какой-либо из сред,
например на капустной. Изучают форму, размеры и соединение
клеток. Для этого готовят препараты живых или фиксированных
окрашенных клеток.
Форма ко л он и й 7? или S изучается на агаризованных сре-
дах, не содержащих поверхностно-активных веществ. Форму ко-
лоний исследуют в глубине питательного агара после засева его
уколом или внесения в него небольшой петлей культуры, вырос-
шей на жидкой среде. Посевы выдерживают при температуре
30°С в течение 2 сут.
Влияние температуры на рост культуры. Для молочнокислых
палочек показатель роста при различных температурах является
признаком для предварительной классификации [73]: при темпе-
ратуре 45°С растут L. fermenti и иногда L. buchneri; не растут —
L. brevis, L. cellobiosus, L. viridessens; при температуре 15°С рас-
тут L. buchneri, L. brevis, L. cellobiosus, L. viridescens, не рас-
тут — L. fermenti.
Жидкие питательные среды, лучше МРС или АТБ, разливают
по 10 мл в пробирки, засевают и выдерживают при температуре
15°С в течение 2—3 недель, а при температуре 45°С — 4—7 дней.
Пробирки закрывают колпачками или резиновыми пробками для
предотвращения испарения. 249
Принадлежность к гомо- или гетероферментативной группе
устанавливают по образованию бактериями углекислого газа из
сахаров. Для этого широко используется среда Джибсона и
Абд-эль-Малека: глюкоза •— 5,0 г; капустный или томатный сок —
10 мл; дрожжевой автолизат — 0,25 мл; мясопептонный желатин
10—12%-ный — до 100 мл. Капустный сок готовят из листьев,
нарезанных и нагретых на водяной бане в течение 15 мин. Затем
листья растирают, выжимают сок, фильтруют его и устанавлива-
ют pH 6,5. Можно использовать консервированный томатный сок,
профильтрованный через марлю и бумажный фильтр, с pH 6,5.
Среду разливают в пробирки по 5—6 мл и стерилизуют текучим
паром.
Перед засевом среды расплавляют, охлаждают до 40—45°С и
засевают 2—3 каплями активной культуры. Затем на поверхность
полужидкой среды осторожно по стенкам пробирки наливают
охлажденный до 45°С водный 2%-ный агар, который при осты-
вании образует пробку высотой 1—1,5 см. Через 2—4 сут куль-
тивирования в термостате гетероферментативные бактерии об-
разуют углекислый газ, что визуально определяется по разрыву
агаровой пробки. Гомоферментативные бактерии газа не образу-
ют. Наблюдения ведут в течение 14 сут.
Использование углеводов и спиртов. Способность молочнокис-
лых бактерий усваивать в качестве питательных веществ фрук-
тозу, глюкозу, пентозы, глицерин определяют по изменению
красного цвета среды в желтый. Среда Виттенбари имеет сле-
дующий состав в 1 л водопроводной воды: мясной экстракт —
5 г; пептон — 5 г; дрожжевой автолизат — 50 мл или дрожжевой
экстракт — 5 г; твин-80 — 0,5 мл; индикатор — бромкрезоловый
пурпурный (1,4 мл 1,6%-ного спиртового раствора на 1 л среды,
pH 6,8—7,0). Углеводы и спирты добавляют в виде стерильных
растворов в дистиллированной воде в таком объеме, чтобы окон-
чательная концентрация составляла 0,5%.
Наблюдения за изменением индикатора проводят в течение
10 сут при температуре 30°С.
Слизеобразование из сахарозы. Бактерии рода Leuconostoc
могут образовывать слизь на среде АТБ и на среде Виттенбари
с добавлением 5% сахарозы [73].
Образование СОг из яблочной и лимонной кислот. Это свой-
ство молочнокислых бактерий определяют, пользуясь средой МРС
с 0,5% глюкозы. К ней добавляют раствор яблочной или лимон-
ной кислоты, нейтрализованной КОН до pH 5,5. Окончательная
концентрация каждой кислоты —2 г на 100 мл среды. Среду
разливают по 10 мл и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в те-
чение 30 мин. После засева среды сверху наносят слой (1—
1,5 см) стерильного расплавленного вазелина.
Образование СОг из цитрата определяют по методу Джиб-
сона и Абд-эль-Малека, используемому для оценки принадлеж-
250 ности бактерий к гомо- или гетероферментативному типу (73].
Использование лимонной, яблочной и винной кислот. Это
свойство изучают на среде, содержащей в 1 л 400 мл водопро-
водной воды, 500 мл мясной воды, 100 мл томатного сока, 10 г
пептона и 2% изучаемого субстрата. pH среды 4,5—5,0. Стериль-
ную среду разливают по 4—5 мл в пробирки, засевают двумя
каплями активной культуры молочнокислых бактерий и термо-
статируют при 30°С. Об использовании бактериями кислот су-
дят по данным периодического хроматографического анализа
(контролем служит среда без кислот), проводимого следующим
образом.
Реактивы: 1. Растворитель — н-бутиловый спирт, муравьиная кислота
85%-ная, вода (4: 1 : 5). Смесь взбалтывают 10—15 мин в делительной ворон-
ке или колбе и оставляют на сутки для расслаивания. Верхний слой исполь-
зуют для хроматографирования.
2. Проявитель — 0,05 %-ный раствор бромфенолового синего в спирте-
ректификате концентрацией 96% об. На каждые 250 мл проявителя добавляют
2 мл 0,1 н. раствора NaOH.
Для приготовления свидетелей — чистых растворов винной, яблочной и
янтарной кислот — по 30 мг кислоты растворяют в 5 мл спирта. Для приго-
товления раствора молочной кислоты 1—2 капли 50%-ной молочной кислоты
растворяют в 5 мл спирта.
Используются хроматографическая бумага № 1—ленинградская или
фильтровальная, эксикатор (диаметром 20 см и больше) и капилляры для
нанесения капель.
Из бумаги вырезают круг по диаметру эксикатора. На бума-
ге описывают круг диаметром 2 см, на котором отмечают точки
на расстоянии 1,5 см одна от другой. В отмеченные точки (поло-
жив под круг бумаги что-нибудь твердое) наносят капиллярами
вина и растворы свидетелей. Размер пятна на бумаге должен
быть не более 3 мм. Каждую последующую каплю наносят после
высыхания предыдущей. Свидетели наносятся 5—6 раз, иссле-
дуемое вино 7—8. После подсушивания в центр круга вставляют
фитилек из хроматографической бумаги и круг помещают в эк-
сикатор, где находится чашка Петри с растворителем. Свобод-
ный конец фитилька помещают в растворитель, эксикатор гер-
метически закрывают крышкой. Когда растворитель пройдет по
радиусу расстояние 7—8 см от центра, разделение считают за-
конченным. Обычно это происходит за 50—60 мин. Затем бума-
гу извлекают, высушивают в вытяжном шкафу до исчезновения
запаха муравьиной кислоты и опрыскивают раствором прояви-
теля из пульверизатора. Кислоты располагаются по радиусу в
следующем порядке: винная, яблочная, янтарная и молочная.
Для идентификации пятен кислот на бумаге отмеряют цир-
кулем расстояние по радиусу от точки нанесения капли до на-
чала пятна. Полученное расстояние сравнивают с расстоянием,
пройденным свидетелем. Идентичные кислоты проходят одина-
ковое расстояние.
ОГЛАВЛЕНИЕ
www.ovme.ru
Введение .......................................................
Глава I. Дрожжи....................................:............
Характеристика основных групп дрожжей виноделия и их клас-
сификация ................................................
Морфология клеток дрожжей.................................
Физиология дрожжей........................................
Продукты брожения . ......................................
Факторы, влияющие на активность дрожжей...................
Селекция дрожжей для виноделия............................
Глава II. Дрожжевая флора виноградных ягод, сока и вина . . . .
Круговорот винных дрожжей в природе............................
Дрожжи винодельческого производства.......................
Чистые культуры винных дрожжей............................
Глава III. Бактерии . . ........................................
Уксуснокислые бактерии .........................................
Характеристика основных видов уксуснокислых бактерий и их
классификация....................................... . . .
Морфология и физиология уксуснокислых бактерий............
Факторы, влияющие на рост и развитие уксуснокислых бактерий
Уксуснокислые бактерии в производстве ....................
Молочнокислые бактерии..........................................
Характеристика основных групп молочнокислых бактерий и их
классификация.............................................
Морфология и физиология молочнокислых бактерий . . . .
Факторы, влияющие на развитие молочнокислых бактерий . .
Процессы, вызываемые молочнокислыми бактериями в винах .
Явление лизогении у молочнокислых бактерий вина...........
Глава IV. Плесневые грибы.......................................
Классификация плесневых грибов............................
Морфология плесневых грибов...............................
Физиология плесневых грибов...............................
Факторы, влияющие на рост и физиологическую активность
плесневых грибов..........................................
Роль отдельных представителей плесневых грибов в виноделии
Глава V. Основные методы микробиологической техники.............
Подготовка посуды для микробиологического анализа . . . .
Приготовление питательных сред............................
Стерилизация питательных сред.............................
Посев микроорганизмов на питательные среды................
3
9
9
23
40
68
80
92
101
101
105
114
142
142
142
144
149
151
155
155
163
172
178
197
202
202
206
210
212
214
218
218
220
224
225
270
Приемы микроскопирования объектов........................... 226
- Приготовление препаратов для микроскопирования.............. 228
Подсчет общего количества клеток микроорганизмов .... 231
Метод дифференциации живых и мертвых микроорганизмов . . 233
Подсчет живых клеток методом посева......................... 235
Измерение величины клеток.................................. 236
Методы выделения чистых культур микроорганизмов .... 237
Изучение некоторых свойств микроорганизмов.................. 241
Предметный указатель............................................ 252
Список использованной литературы ........................... 255