Автор: Троценко Ю.А. Доронина Н.В. Торгонская М.Л.
Теги: общая микробиология прикладная микробиология классификация и систематика микроорганизмов биология монография аэробные метилобактерии таксономия экофизиология
ISBN: 978-5-904385-10-1
Год: 2010
Текст
(CH3)nN НАД
CH3NH
Рибулозо-5Ф
Г ексулозо-бФ
Серин
Малат
СН2С1
PQQ
GSH
НСООН З-Фгк
Рибулозо-1,5Ф;
Ацетил-КоА
Глицин
L ФЕП
r(CH3)nSn N‘Mr ГМА
\ \TTQ1 I
СН3С1 тгф [л](§[п](О)
Со2+ ТГФ тгмп
ЭРОБНЫЕ
[ДОБАКТЕРИИ
Ю.А.ТРОЦЕНКО, Н.В.ДОРОНИНА
М.Л.ТОРГОНСКАЯ
Троценко Юрий Александрович -
доктор биологических наук, профессор,
зав. лабораторией метилотрофии Ин-
ститута биохимии и физиологии микро-
организмов им. Г.К.Скрябина РАН (г. Пу-
щино, Московской обл.). Основные на-
правления научной деятельности -
экофизиология, таксономия, биохимия
и биотехнология аэробных метилотро-
фов. Ю.А.Троценко - автор трех моно-
графий и более 300 научных статей. Лау-
реат премии имени С.Н.Виноградского
РАН (2009 г.)
Доронина Нина Васильевна - доктор
биологических наук, ведущий научный
сотрудник лаборатории метилотрофии
ИБФМ РАН. Основные направления на-
учной деятельности связаны с изучени-
ем биоразнообразия и биотехнологии
аэробных метилобактерий. Н.В.Доро-
нина - автор 200 научных статей. Лау-
реат премии имени Моррисон Рогозы
Американского микробиологического
общества (2004 г.)
Торгонская Мария Леонидовна - кан-
дидат биологических наук, научный сот-
рудник лаборатории метилотрофии
ИБФМ РАН. Научные интересы связаны
с изучением особенностей биологии и
метаболизма аэробных метилобакте-
рий. Автор 15 научных публикаций
9 785904 385101
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
им. Г.К.СКРЯБИНА
Ю.А.ТРОЦЕНКО, Н.В.ДОРОНИНА,
М.Л.ТОРГОНСКАЯ
Аэробные
МЕТИАОБАКТБРИИ
ПУЩИНО
2010
ИЗДАНИЕ ОСУЩЕСТВЛЕНО ПРИ ПОДДЕРЖКЕ
РОССИЙСКОГО ФОНДА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ
ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ПРОЕКТУ № 10-04-07028
УДК 579.2:579.66:579.695:579.8
Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные ме-
тилобактерии. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. 325 с.
В монографии впервые обобщены результаты исследований особен-
ностей биологии аэробных метилобактерий, использующих широкий
спектр окисленных и замещенных производных метана в качестве ис-
точников энергии и углерода. Рассмотрены основные этапы развития
представлений о таксономии, экофизиологии и уникальной структурно-
функциональной организации и регуляции метаболизма, перспективы и
примеры реализации биотехнологического потенциала аэробных мети-
лобактерий.
Для специалистов, работающих в области метилотрофии, студентов,
аспирантов и преподавателей микробиологического профиля.
Ответственный редактор:
член-корреспондент РАН В.Ф. Гальченко
Рецензенты:
д.б.н., проф. А.И. Нетрусов, д.б.н. С.Н. Дедыш
О Ю.А. Троценко, Н.В. Доронина, М.Л. Торгонская, 2010 г.
О Институт биохимии и физиологии
ISBN 978-5-904385-10-1 микроорганизмов РАН, 2010 г.
RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCE
G.K. SKRYABIN INSTITUTE OF BIOCHEMISTRY AND PHYSIOLOGY
OF MICROORGANISMS
Yu.A.TROTSENKO, N.V.DORONINA,
M.L.TORGONSKAYA
Aerobic
METHYLOBACTERIA
PUSHCHINO
2010
Published by the financial support of Russian
Foundation for Basic Research
grant № 10-04-07028
Trotsenko Yu.A., Doronina N.V., Torgonskaya M.L. Aerobic me-
thylobacteria. Pushchino: ONTI PSC RAS, 2010. 325 p.
This book first summarizes state of the art of our knowledge on the biol-
ogy of aerobic methylotrophic bacteria utilizing a wide spectrum of oxidized
and substituted derivatives of methane as the carbon and energy sources. The
key steps of exploration into taxonomic positioning, ecophysiology and the
unique metabolic and genomic organization of aerobic methylobacteria as
well as their biotechnological applications are highlighted.
For those who are working or interested in the fascinating methylotrophic
microbial planet.
Executive editor
corresponding member of RAS V.F. Galchenko
Reviewers: profs. A.I. Netrusov, S.N. Dedysh
Q Yu.A. Trotsenko, N.V. Doronina, M.L. Torgonskaya, 2010
© Institute of Biochemistry and Physiology
ISBN 978-5-904385-10-1
of Microorganisms
RAS, 2010
Посвящается академикам РАН
Е.Н. Кондратьевой, Г.К. Скрябину,
М.В. Иванову и ГЛ, Заварзину -
инициаторам и вдохновителям
комплексных исследований
метилотрофии в России
Предисловие
Аэробные метилобактерии - группа метилотрофных прокариот,
использующих окисленные и замещенные производные метана в ка-
честве источников углерода и энергии. Поскольку спектр этих соеди-
нений, не имеющих С-С связи, достаточно широк (~50), представля-
лось логичным существование значительного числа таксонов метило-
бактерий, метаболизирующих данные соединения. Однако открытые
в конце XIX века аэробные метилобактерии долгое время оставались
энигматическими объектами, о чем свидетельствовали редкие публи-
кации. Лишь во второй половине XX века основополагающие иссле-
дования Дж.Р. Квейла, Л. Затмана, К. Энтони, М. Лидстром и К. Мар-
релла, открывших новые ферменты и гены путей С i-метаболизма,
придали мощный импульс развитию метилотрофии как научного на-
правления. В немалой степени этому способствовало активное вне-
дрение молекулярно-биологических и генетических методов, которые
революционизировали наши представления об особенностях биоло-
гии и поистине планетарной роли метилотрофов.
Со времени выхода классической книги К. Энтони “The biochemis-
try of methylotrophs” прошло почти 30 лет, поэтому возникла идея
проанализировать и обобщить новые экспериментальные данные. Ав-
торы считают такую попытку оправданной ввиду повсеместного рас-
пространения, поразительного таксономического многообразия, уни-
кальной структурно-функциональной организации метаболизма и
биотехнологического потенциала аэробных метилобактерий. Несмот-
ря на значительный прогресс в понимании особенностей биологии
аэробных метилобактерий, многие аспекты их жизнедеятельности
остаются неясными, а имеющаяся информация нуждается в совре-
менном аналитическом обобщении. Это определило цель моногра-
фии - восполнить существующий пробел в отечественной литературе
по данному разделу микробиологии. Осознавая сложность поставлен-
ной цели, авторы полагают, что данная книга окажется полезной для
изучающих удивительное многообразие мира метилотрофов, неотъ-
емлемым компонентом которого являются аэробные метилобактерии.
Не претендуя на исчерпывающую полноту изложения, мы хотели бы
привлечь внимание читателей к этой недостаточно изученной группе
прокариот, занимающей промежуточное положение между аэробны-
ми метанотрофами, автотрофами и гетеротрофами. Считаем своим
приятным долгом выразить глубокую благодарность всем, кто спо-
собствовал появлению этой книги, и будем признательны за конст-
руктивные предложения.
Preface
Aerobic methylobacteria is a group of methylotrophic prokaryotes util-
izing oxidized and substituted derivatives of methane as the carbon and
energy sources. Since the spectrum of the compounds, having no C-C
bond, is rather wide (~50), it seemed to be logical the existence of consid-
erable number of methylobacterial taxons. However, being discovered at
the end of XIX century, the aerobic methylobacteria retained as enigmatic
and marginal objects. Only in the second half of XX century the fundamen-
tal studies by J.R. Quayle, L.J. Zatman, C. Anthony, M.E. Lidstrom, J.C.
Murrell, who discovered the new genes and enzymes involved in Cr
metabolism, gave a great impact to development of methylotrophy as a
scientific field. The active adventure of molecular methodology revolu-
tionarized our insights into biology and planetary role of aerobic methy-
lotrophs.
Since classical book “The biochemistry of methylotrophs” by C. An-
thony was published 30 years ago, it seemed reasonable to analyze and
summarize the new experimental findings. This attempt looks quite justi-
fied due to ubiquitous distribution, taxonomic and structure-functional di-
versity and promising biotechnological potential of aerobic methylobacte-
ria. Despite significant progress many aspects of their unique biology are
still obscure and must be comprehensively reviewed. Being awared of the
complexity of such a goal the authors hope to fill up the gap and this book
will be useful for those who are interested in unprecedent diversity of the
methylotrophic world composed by aerobic methylobacteria as the integral
part. Being unable to cover all aspects of their biology we would like to
draw attention of the readers to this still unsufficiently studied group of
prokaryotes occupying an intermediate position between methanotrophs,
autotrophs and true heterotrophs. The authors wish to thank all of those
who helped to the appearance of this book and will be acknowledged for
any useful comments.
Глава 1
ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИИ АЭРОБНЫХ
МЕТИЛОБАКТЕРИЙ
1.1. Краткий исторический очерк развития метилотрофии
как научного направления
Метилотрофии - это специализированный тип питания микроорга-
низмов, растущих на восстановленных одноуглеродных (С0 соеди-
нениях или соединениях с несколькими С-атомами, но не имеющих
С-С связи. Как видно из табл. 1.1.1, спектр Ci-соединений биогенного
и абиогенного происхождения достаточно широк и включает около 50
наименований: от предельно восстановленного СН4 до предельно
окисленного СОг, среди которых моноокись углерода, муравьиная
кислота, диметиловый эфир, метилированные амины, галометаны,
метилсульфид, метилсульфоксиды, тиоцианаты и др. Многие из этих
летучих соединений обладают цитотоксическим и даже канцероген-
ным действием, а также ответственны за так называемый парниковый
эффект, поскольку истощают озоновый слой атмосферы.
Аэробные метилотрофные бактерии, использующие в качестве ис-
точников углерода и энергии окисленные или замещенные производ-
ные метана, но неспособные расти на метане, предлагается называть
метилобактериями. Ростовыми субстратами для метилобактерий
служат метанол, метиламин, диметиламин, триметиламин, галомета-
ны (хлорметан и дихлорметан), серосодержащие соединения - метан-
сульфоновая кислота, диметилсульфид и многие другие. Некоторые
из этих соединений, например триметиламин - (СНз)зЫ, содержат
более одного атома углерода, но не имеют С-С связи. Метилобакте-
рии, в отличие от метанотрофов, не имеют сложной системы внутри-
цитоплазматических мембран (ВЦМ).
По типу питания различают три группы метилобактерий: облигат-
ные - растут только на Сi-соединениях; ограниченно-факультатив-
ные - используют наряду с С i-субстратами одно или несколько поли-
углеродных (Сп) соединений; факультативные - используют, кроме
С1-соединений, широкий спектр Сп-соединений. В последние годы ус-
тановлено, что аэробные метилобактерий повсеместно распростране-
ны в природе и вносят жизненно важный вклад в биосферные циклы
углерода, азота, фосфора и других биогенных макро- и микроэлемен-
тов. Наряду с метанотрофами, метилобактерий являются важнейшим
звеном в цепи метаболических превращений летучих Сгсоединений,
9
Таблица 1.1.
Восстановленные С(-соединения, используемые как ростовые
субстраты аэробными метилобактериями
Соединение
Метанол
Формальдегид
Формамид
Диметилформамид
Мочевина
Муравьиная кислота
Моноокись углерода
Диметиловый эфир
Бром метан
Дибром метан
Метилйодид
Хлорметан
Дихлорметан
Хлороформ
Тетрахлорметан
Монометиламин
Диметиламин
Триметиламин
Триметиламин N-оксид
Тетраметиламмоний
Метилнитрат
Сероуглерод
Карбонилсульфид
Диметилсульфид
Д и м ети л д и су л ьф ид
Диметилтрисульфид
Диметилсульфонио-
пропионат
Диметилсульфоксид
Метантиол
Триметилсул ьфонат
Метансульфоновая кислота
Метилсульфат
Диметилсульфат
Т иоцианаты
Цианиды
Роданиды
Формула
СН3ОН ~
НСНО
CHONH2
HCON(CH3)2
CO(NH2)2
нсоон
со
(СНз)2О
СН3Вг
СН2Вг2
СН31
CH3CI
СН2С12
СНС13
СС14
СНзМН2
(CH3)2NH
(СНз)зИ
(СНз)зНО
(CH3)4N+
ch3ono2
cs2
cos
(CH3)2s
(CH3)2s2
(CH3)2s3
(CH3)2S+(CH2)2COO-
(CH3O)2SO
CH3SH
(CH3)3S+
CH3SO3H
CH3OSO3H
(CH3O)2SO2
SCN"
CN“
CNS"
Основной источник
Окисление CH4, лигнин,
пектин
Деревообрабатывающая
промышленность, микроб-
ный метаболизм
Химический синтез
То же
Метаболизм животных
Микробный метаболйзм
Продукт горения
Окисление СН4, син-газ
Планктон, водоросли
То же
Химический синтез
Древесина, океаны
Химический синтез
То же
Нефтехимия
Продукт разложения рыбы
То же
- // -
Рыбы и беспозвоночные
Химический синтез
Выдыхаемый газ диабетиков
Почва, растения
Продукт окисления CS2
Целлюлозно-бумажная
промышленность
Микробный метаболизм
Газ, образуемый клетками
раковых опухолей
Метаболит фитопланктона,
бактерий и растений
То же
— // —
Нефтехимия
Фотоокисление (СНз)28
Химический синтез
Горение угля
Обогащение металлов
То же
- // -
10
а также своеобразным биофильтром на их пути в тропосферу, умень-
шающим опасную вероятность истощения озонового слоя Земли.
Известно более 40 родов аэробных метилобактерий, относящихся
к а-, 0- и у-классам Proteobacteria. Необходимо также упомянуть о
метазотрофах. Это микроорганизмы, способные только окислять,
либо ассимилировать, но не расти на Срсоединениях, т.е. не могут
использовать их одновременно как источник углерода и энергии. На-
пример, есть бактерии, которые могут только окислять метанол до
СО и даже получать энергию, но не способны его ассимилировать из-
за отсутствия соответствующих генов/ферментов. Другие бактерии
ассимилируют, но не окисляют формальдегид, поскольку у них нет
генов/ферментов, окисляющих формальдегид.
Доступность метанола как возобновляемого субстрата и успехи в
расшифровке биохимической и генетической структуры уникальных
путей С ।-метаболизма у метилобактерий создали научную основу для
промышленной реализации их биотехнологического потенциала.
Аэробные метилобактерий, использующие восстановленные
С।-соединения в качестве источникоЪ углерода и энергии, выполняют
уникальную функцию природного биофильтра на пути их эмиссии в
атмосферу. Жизненно важная роль аэробных метилобактерий, осуще-
ствляющих трансформацию и деградацию Сi-соединений, является
причиной большого интереса к исследованию таксономического раз-
нообразия, особенностей экофизиологии и метаболизма этих микро-
организмов, занимающих промежуточное положение между типич-
ными автотрофами и гетеротрофами.
Несмотря на структурную простоту, Ci-соединения существенно
различаются по физико-химическим свойствам, что, в свою очередь,
определяет особенности биологии и метаболизма метилотрофных
микроорганизмов. В принципе, большинство Ci-соединений являются
окисленными или замещенными производными метана. В зависимо-
сти от того, какая группировка (радикал) связана с С]-атомом, пути
метаболизма этих соединений значительно различаются. Так, метили-
рованные амины и формальдегид могут иметь до пяти путей окисле-
ния. Примеры поразительной метаболической гибкости метилобакте-
рий будут более детально рассмотрены в этой и последующих главах.
Метилсодержащие соединения (серин, глицин, биотин, холин, бе-
таин, метионин, триптофан, гистидин, лигнин, тимин, никотин и др.)
являются центраболитами при синтезе многих полиуглеродных со-
единений (рис. 1.1.1). В центре их превращений метильные, метиле-
новые, оксиметильные, и формильные группировки, которые участ-
вуют в метаболизме Сп-соединений. Таким образом, видно, что
С1-фрагменты очень важны метаболически для существования всего
11
*
живого, поэтому использующие их метилотрофные микроорганизм
представляют значительный интерес как в плане изучена
особенностей биологии, так и в целях практического применения.
HCO2H
нсно
N
RC
СН2ОН
NH2CHCO2H
Серин
N
N
ЧСН
н
Пурин
НзСО
ОН
Лигнин
HN С-СНз
' н
0C^NxCH
н
Тимин
CH3COOCH3
N
СНз
Никотин
nh2
NH2CH2CO2H
Глицин
Ct-фрагмент
' ? iil ।, „j,; jГ, Г —
C-CH2CCHO2H
NH. NH2
CH2COCH2CH2CO2H
д-Аминолевулиновая
кислота
НзСх
НзС- NCH2CO2
h3cz
Бетаин
НзС$СН2СН2СНСО2Н
Метионин
С-СН2СНСО2Н
II
N'CH
н Триптофан
НзС\
НзС — nch2ch2oh
H3CZ
Холин
nh2
nh2
н Гистидин
Рис. 1.1.1. Метаболические превращения с участием “активных” Ci-фрагментов
Вкратце рассмотрим ключевые этапы становления и развития ме-
тилотрофии как научного направления. Основополагающая роль в
этом по праву принадлежит профессору Дж.Р. Квейлу (Англия), по-
скольку именно он с коллегами расшифровал физиолого-биохими-
ческую сущность феномена метилотрофии, открыв четыре метаболи-
ческих цикла углерода.
Однако исследования метилотрофии начались не с работ Квейла, а
значительно раньше. Еще в 1892 г. Loew в Мюнхенском университе-
12
те продувая воздух через минеральную среду с бисульфитной ловуш-
кой формальдегида (NaHSO3 + НСНО), наблюдал, что белая жидкость
через несколько недель становилась розовой. Из этой жидкости Loew
выделил культуру розовых палочковидных бактерий. Культура хоро-
шо росла не только на формальдегиде, метаноле, метиламине, му-
равьиной кислоте, но и на полиуглеродных соединениях (ацетат, пи-
руват, малат и сукцинат). Loew назвал культуру Bacillus methylicus и
предположил, что глиоксилат является интермедиатом превращений
формиата в углекислоту:
2НСООН -► '
сносоон + Н2О — нсно + со2.
Однако это интересное предположение нашло лишь частичное
подтверждение в классических работах Дж.Р. Квейла. В дальнейшем
этот метилотроф был утерян и только через 70 лет вновь выделен как
Pseudomonas sp. AML
Фактически, в течение полувека систематической работы с мети-
ло-бактериями не проводилось, за исключением единичных сообще-
ний о выделении метанол- и метиламиниспользующих гифомикробов
и псевдомонад. Лишь в 1956 г. (в связи с нехваткой нефти из-за Суэц-
кого кризиса и более активным использованием природного газа)
вновь появился интерес к этим организмам. Наряду с метанотрофами
и метилотрофными дрожжами были выделены новые виды метило-
бактерий, растущих в основном на метаноле, метиламинах и несколь-
ких полиуглеродных субстратах. В результате, к 1975 г., благодаря
прежде всего усилиям сотрудников нашей лаборатории, в России бы-
ла создана собственная представительная коллекция аэробных мети-
лотрофных микроорганизмов, являющаяся объектом национального
достояния. В настоящее время продолжаются активные исследования
таксономического и структурно-функционального разнообразия
аэробных метилобактерий, в том числе, обитающих в различных био-
топах с экстремальными значениями pH, температуры и солености.
Следуя хронологическому принципу построения этой главы, вкратце
проанализируем основные особенности путей первичного Ci-мета-
болизма метилобактерий.
В 1955 г. группа Мелвина Кальвина (США), используя методику
кратковременных экспозиций (до 15 мин) суспензий клеток хлореллы
с радиоактивным изотопом углерода, впервые показала накопление
сахарофосфатов в качестве первичных продуктов фотоассимиляции
СО2. По данным двумерной хроматографии, радиоуглерод сначала
содержался в фосфорных эфирах сахаров и триоз, а далее радиоак-
тивная метка переходила в аминокислоты, органические кислоты и
Т Д. Было идентифицировано одно из основных 14С-меченных соеди-
нений, которым оказалась 3-фосфоглицериновая кислота (3-ФГК).
13
Классики метилотрофии
Профессор Дж. Родней Квейл (1926-2006) -
выдающийся английский биохимик, член Ко-
ролевского научного общества, основополож-
ник метилотрофии как научного направления.
Открыл и расшифровал сериновый, рибуло-
зомонофосфатный и ксилулозомонофосфат-
ный пути С i-метаболизма, а также доказал
участие рибулозобисфосфаткарбоксилазы в
первичной ассимиляции СОг и метанмоноок-
сигеназы в окислении метана.
Кристофер Энтони - почетный профессор
биохимии Саутгемптонского университет?
(Великобритания). Открыл и расшифровал
структуру классической PQQ-метанолдегид-
рогеназы. Автор первого фундаментального
труда по биологии аэробных метилотрофов
“The biochemistry of uiethylotrophs” (1982 г.).
Мэри Лидстром - профессор микробиологии
и генетики Вашингтонского университета
(Сиэтл, США), инициатор оригинальных ис-
следований, автор многочисленных экспери-
ментальных и обзорных публикаций по моле-
кулярной экологии и геномике аэробных ме-
тилотрофных бактерий.
Колин Маррелл — профессор микробиологии
Уорикского Университета (Великобритания),
широко известен пионерными исследования-
ми биологии и молекулярной генетики мета-
нотрофов и метилобактерий.
14
Интересно отметить, что Дж.Р. Квейл также участвовал в этой рабо-
те. В частности, он впервые показал, что ферментом, ответственным
за образование 3-ФГК, является рибулозобисфосфаткарбоксилаза
(РубисКО). При этом СО2 акцептируется на рибулозо-1,5-бисфосфате
и в результате образуются 2 молекулы 3-ФГК. Таким образом, был
расшифрован цикл Кальвина, а его автор удостоен Нобелевской пре-
мии.
В случае оксигеназной функции РубисКО могут образовываться
два продукта (3-ФГК и фосфогликолат) или один (3-ФГК) - в случае
карбоксилазной. 3-ФГК затем восстанавливается в глицеральдегид-
фосфат (ГАФ), который далее ассимилируется. В целом, на образова-
ние одной молекулы фосфотриозы клеткам необходимо затратить три
молекулы АТФ и 2 молекулы НАД(Ф)Н2. Впервые это было показано
для водорослей, а затем для ряда хемо- и фототрофных бактерий,
включая некоторых метилотрофов.
Когда Квейл приступил к работе с метилотрофными бактериями,
возникли два концептуальных вопроса: каким образом метилотрофы
из С1-соединений синтезируют Сз-соединения, т.е. метаболиты, об-
щие для всех живых организмов, и как получают энергию? Сначала
Квейл работал с Pseudomonas oxalaticus, который оказался автотро-
фом, поскольку окислял оксалат через муравьиную кислоту до СО2 с
последующей ассимиляцией в цикле Кальвина. Случайно Квейл оста-
вил культуру Ps. oxalaticus продуваться и через некоторое время она
превратилась из белой в розовую. Из этого консорциума он выделил
розовоокрашенную культуру Pseudomonas sp. AMI и расшифровал
сериновый путь Ci-ассимиляции. Структура серинового пути была
доказана с применением радиоизотопного и энзимологического под-
ходов. В этом случае метка из 14СНзОН появлялась сначала в органи-
ческих кислотах и аминокислотах - серине и глицине.
Принципиальным отличием еще одного открытого Квейлом цикла
Сгассимиляции является фиксация формальдегида (НСНО), а не уг-
лекислоты на начальном этапе пути. Далее, З-гексулозо-6-фосфат
изомеризуется во фруктозо-6-фосфат, который через перестройки с
участием трансальдолазы и транскетолазы (ТА/ТК) регенерирует ак-
цептор рибулозо-5-фосфат. Новый цикл представляет, по существу,
шунтированный вариант цикла Кальвина, в котором отсутствуют
фосфорибулокиназа и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. В них
нет необходимости, т.к. формальдегид - более восстановленное, чем
СО2, соединение, близкое по среднему уровню восстановленности
клеточным компонентам (СН2О).
Как видно, метилотрофы изящно используют уникальную химиче-
скую природу формальдегида, реализуя известную из органической
15
Глицеральдегид-ЗФ
* БИОСИНТЕЗ;
3 Рибулозо-1,5Ф2
4 РубисКО
Фосфорибулокиназа
6 ФГК
Фр-бФ + Фр-бФ +ГАФ
бНАДНг
Рибулозобисфосфатный цикл
ЗСО2 + 9АТФ + 6НАДН2 —► триозофосфат
3 Рибулозо-5Ф <
перестройки
3 нс из
3 Рибулозо-5Ф ——>3 Гексулозо-бФ
► Фр-бФ + Фр-бФ + Фр-бФ
Гексулозофосфат
синтаза
Гексулозофосфат
изомераза
| Рибулозомонофосфатный цикл
ЗНСНО + ФФМ (АТФ) —►триозофосфат
перестройки
Фр-1,6Ф2
Глицеральдегид-ЗФ
8 Ксилулозо-5Ф
ФБФальдолаза
БИОСИНТЕЗ
ФБФаза
ДОАС
3 Диоксиацетон
ДО А К /
3 Диоксиацетон-Ф
3 АТФ
| Ксилулозомоноф^фатный щГкл
ЗНСНО + ЗАТФ —►триозофосфат
перестройки
Рис. 1.1.2. Пентозофосфатные пути первичной Срассимиляции у метилотрофов
РМФ-цикл: ЗСН2О + АТФ (ФФН)-------------\
Сериновый цикл: 2СН2О+СО2+4АТФ+2НАДН2----4 Триозофосфат (С3)
Цикл Кальвина: ЗСО2 + 6НАДН2 + 9АТФ-----/
Рис. 1.1.3. Энергетические потребности первичных путей Сгассимиляции у мети-
лобактерий
16
имии реакцию альдольной конденсации формальдегида с образова-
ка: пНСНО
Нормируют с помощью ферментов гликолитического и пентозофос-
фатного путей в фосфотриозы, а далее - в ацетил-КоА, поступающий
в НТК. Этот путь получил название рибулозомонофосфатного (РМФ)
нием формозных сахаров, открытую Бутлеровым в середине XIX ве-
ка- пНСНО —> [СН2О]П. Акцептируя формальдегид на рибулозо-5-
фосфате, метилотрофы синтезируют фосфогексозу, которую транс-
фатного путей в фосфотриозы, а далее -
в
ипИ гексулозофосфатного цикла фиксации формальдегида (рис. 1.1.2).
Долгое время было неясно, каким путем метилотрофные дрожжи
ассимилируют формальдегид, образуемый алкогольоксидазой. Ра-
диоизотопные и энзимологические исследования показали, что фор-
мальдегид конденсируется с другим фосфосахаром, ксилулозо-5-фос-
фатом. При этом происходит транскетолазная реакция, т.е. С2-фраг-
мент ксилулозо-5-фосфата (гликольальдегид) переносится на фор-
мальдегид, в результате образуются две триозы - глицеральдегидфос-
фат (ГАФ) и диоксиацетон (ДОА). Последний фосфорилируется ди-
оксиацетонкиназой (ДОАК) до диоксиацетонфосфата (ДОАФ). Далее
ГАФ и ДОАФ объединяются во фруктозо-1,6-бисфосфат с помощью
обращенной альдолазной реакции при участии фруктозобисфос-
фатальдолазы. Затем фосфат отщепляется бисфосфатазой и образует-
ся фруктозо-6-фосфат, который вступает в ТА/ТК перестройки. В
энергетическом отношении этот путь, получивший название ксилуло-
зо-монофосфатный (КМФ), - более “дорогой” вариант с затратой трех
АТФ на синтез одной триозы, поскольку на каждую молекулу ассими-
лированного формальдегида тратится одна молекула АТФ. Следова-
тельно, самый энергоемкий из пентозофосфатных путей Сгассими-
ляции - РБФ-цикл (Кальвина), а наименее энергозатратный - рибу-
лозомонофосфатный цикл: РБФ>сериновый>КМФ>РМФ (рис. 1.1.3).
В отличие от гетеротрофов, метилобактерии часто имеют ограни-
ченные возможности энергетического и конструктивного метаболиз-
ма, свидетельствующие о строгой направленности и специализации
обмена этих бактерий. Особенностью облигатных метилотрофов яв-
ляется наличие множественных метаболических блоков, т.е. отсутст-
вие ряда ключевых ферментов, характерных для обмена гетеротро-
фов.
К настоящему времени удалось определить генетическую орга-
низацию вышеупомянутых метаболических путей, выявлены специа-
лизированные генные модули, кодирующие ферменты Срметаболиз-
ма. Опубликованы и аннотированы геномы Methylobacterium extor-
4uens AMI, Methylobacterium dichloromethanicum DM4, Methylobacil-
Us tlagellatus KT, Methyhbium petroleiphilum PM1, Paracoccus denitri-
ficans Pdl222, Methylophaga thiooxidans DMS010, Methylophilus sp.
17
Таблица 1.
Основные этапы исследований биологии аэробных метилобактерий
{. Таксономическое разнообразие аэробных метилобактерий
Выделение первых монокультур: “Bacillus methylicus”, "Pseudomonas sp. AMI
(Methylobacterium extorquens AMI), "Hyphomicrobium vulgare”
Создание представительных коллекций и таксономических схем для грамотр»
дательных и грамположительных метилобактерий.
Выделение и характеристика экстремофильных метилобактерий.
П. Экология и биотехнологический потенциал метилотрофов
Доказательство глобальной биогеохимической роли метилобактерий в циклз
углерода, азота и серы.
Открытие симбиоза метилобактерий с растениями и животными.
Реализация биотехнологического потенциала метилобактерий для целей биоси
теза, биокатализа и биодеградации.
III. Пути первичного окисления С|-соединений
Открытие ферментов окисления метанола, метиламина (МДГ, МАДГ), N-ме
тилглутаматного пути и метаболизма м'етилсернистых соединений. Определи
ние структуры хиноновых кофакторов (PQO и TTQ), а также MNO.
Расшифровка генных кластеров, кодирующих МДГ, МАДГ, создание специфл
ческих генных проб mxaF, таи для молекулярной таксономии и экологии ме
тилобактерий. Расшифровка структуры НАД+-зависимой МДГ и микотиола ’
грамположительных метилобактерий.
Идентификация генов и ферментов птериновых (ТГМП- и ТГФ-), НАД+- и ми
котиолзависимых путей окисления формальдегида.
Идентификация генов четырех форм ФДГ у Methylobacterium extorquens AMI.
Расшифровка путей метаболизма моно- и дигалометанов: характеристика гено
и ферментов дегалогенирования (DemA) и корриноидного пути (CmuABC).
IV. Пути первичной ассимиляции С(>соединений
Расшифровка биохимической структуры серинового и РМФ путей у метило
бактерий и характеристика ключевых ферментов этих путей (ОПР, ГФС, ФГИ).
Выявление ферментов и генов РБФ-нути у метилобактерий.
V. Пути промежуточного метаболизма
Выявление дихотомии путей метаболизма С и N у метилобактерий.
Обнаружение множественных энзиматических дефектов в центральных путя>
метаболизма облигатных метилобактерий (ЦТК, глиоксилатный шунт, глик
лиз, глюконеогенез).
Характеристика генов и ферментов азотфиксации у метилобактерий.
VI. Геномика и протеомика аэробных метилотрофов
Methylobacterium extorquens AMI, Methylobacterium dichloromethanicum DM»
Methylobacillus flagellatus KT, Methylibium petroleiphilum PM1, Paracoccus deni
trificans Pdl222, Methylotenera mobilis JLW8, Methylophaga thalassica SI. Meth\'
lophaga thiooxidans DMS010, Methylophilus sp. HTCC2181
18
итСС2181, на очереди еще десятки геномов. Это является своеобраз-
“ “дорожной картой” для будущих поколений микробиологов, био-
химиков и генетиков на пути к полной расшифровке функциональной
еномики и протеомики метилотрофов. Основные этапы становления
и развития метилотрофии как научного направления, суммированы в
таблице 1.1.2. Более подробно они будут рассмотрены ниже. В этом
яз еле мы ограничимся упоминанием о биотехнологическом потен-
циале аэробных метилобактерий.
Прежде всего, следует упомянуть, что метанол является возобнов-
ляемым субстратом, его доступность и относительная дешевизна соз-
вали рельные предпосылки для использования аэробных метилобак-
герий в биотехнологических процессах. Второе существенное обстоя-
тельство, позволяющее активно применять аэробные метилотрофные
микроорганизмы в современной биотехнологии - хорошая изучен-
ность их метаболизма и геномики. Третье немаловажное преимущест-
во - аэробные метилобактерий непатогенны.
Большие надежды биотехнологи связывают с генетическими ма-
нипуляциями на аэробных метилобактериях, имеющих сильные про-
моторы генов метанолдегидрогеназы и других ферментов. Следова-
тельно, реализуется возможность под этими промоторами клониро-
вать соответствующие гены и синтезировать различные полезные со-
единения. В настоящее время известен целый ряд ценных продуктов,
синтезируемых с помощью генетических систем метилобактерий.
Неудивительно, что метилобактерий все более активно использу-
ются в качестве биокаталитических агентов для получения ферментов
и генетической трансформации, для аналитических целей как биосен-
соры, для синтеза моно- и полимеров (полигидроксибутирата, поли-
сахаридов, каротиноидов и различных продуктов), а также для биоде-
градации токсичных Ср и Сп-поллютантов или биоремедиации окру-
жающей среды. Спектр соединений и продуктов, синтезируемых с
помощью аэробных метилобактерий, постоянно расширяется и по-
полняется новыми наименованиями. Таким образом, аэробные мети-
лобактерии можно с полным основанием считать идеальными и пер-
спективными объектами современной биотехнологии для целей био-
катализа, биосинтеза и биоремедиации.
Завершая этот краткий исторический очерк, следует особо отме-
тить, что аэробные метилобактерий не имеют себе равных в микроб-
ном мире по филогенетическому и физиолого-биохимическому раз-
нообразию. По мере расшифровки их структурно-функциональных
°собенностей становится все более очевидным, что аэробные метило-
^актерии являются одним из важнейших первичных звеньев в трофи-
Ческой цепи нашей планеты. В последующих главах будут детально
19
проанализированы фундаментальные и прикладные аспекты биолог»
аэробных метилобактерий.
1.2. Первичные пути (Д-метаболизма у аэробных метилобактери
в
Формальдегид (ФА) является центральным С)-метаболитом, п<
ступающим в первичные биосинтетические пути ассимиляции (РМ
и сериновый) и подвергающимся дальнейшему окислению с целы
получения энергии. Автотрофные метилобактерий окисляют Сгсо.
динения до СО2, который затем ассимилируется через классически
РБФ-путь (цикл Кальвина). Поскольку СН2О обладает высокой то»
сичностью из-за неспецифической реактивности к аминогруппам бег
ков и основаниям нуклеиновых кислот, у аэробных метилобактери
должны существовать механизмы его эффективной детоксикаци
[Attwood, Quayle, 1984; Graves et al., 1994]. В зависимости от органш
ма, образующийся при росте на С]-соединениях ФА участвует в энер
гетическом и/или конструктивном метаболизме. Превращение СН2О
СО2 происходит в цитоплазме клеток. В случае образования ФА пери
плазматическими PQQ-зависимыми МДГ или МАДГ СН2О должен
проникнуть в цитоплазму клетки для последующих метаболически:
превращений. Однако специфический транспортер ФА еще не идеи
тифицирован [Van Spanning et al., 2000].
Большинство метилобактерий обладают несколькими путям
окисления формальдегида, которые могут одновременно использ-
ваться для разных целей, включая вклад в энергетику и детоксикаци»
СН2О.
Прямое окисление формальдегида до формиата реализуется прак
тически у всех метилотрофных бактерий и катализируется тремя раз
личными ферментами: 1) НАД+-зависимой дегидрогеназой, требую
щей GSH и обнаруженной у Brevibacterium fuscum, Methylorhabdu
multivorans и Paracoccus kondratievae; 2) НАД+-зависимой дегидроге
назой, не требующей GSH, которая обнаружена у большинства мети
лотрофов; 3) дегидрогеназой, in vitro проявляющей активность <
2,6-дихлорфенолиндофенолом (ДХФИФ) и ФМС, как акцепторам»
электронов, в соответствии с уравнением:
СН2О + ДХФИФ + Н2О НСООН + ДХФИФН2.
Циклическое окисление формальдегида до СО2, происходящее .
диссимиляционном РМФ-цикле (рис. 1.2.1), не связано с участием де
гидрогеназ формальдегида и формиата, а представляет собой после-
довательную цепь реакций, катализируемых синтазой и изомеразой
З-гексулозо-6-фосфата, изомеразой фруктозо-6-фосфата, дегидроген
20
фосфата и 6-фосфоглюконата. Последняя дегидроге-
зами глюкозо-6-
а является декарбоксилирующей. В результате происходит образо-
вание СО2, 2 моль НАДФН2 и регенерация рибулозо-5-фосфата, пер-
вичного акцептора формальдегида [Соколов, Троценко, 1977]. Мети-
лобактерии с сериновым или РБФ-путями получают энергию посред-
ством прямого окисления формальдегида до формиата и СО2. Напро-
|ИВ бактерии с РМФ-путем реализуют оба способа окисления
формальдегида
в разных соотношениях.
нсно
б- Фосфоглюконат-
дегидрогеназа
НАД(Ф)Н2
НАД(Ф)
6-Фосфоглюконат
Рибулозо-5Ф
НАД(Ф)Н2
Гексулозофосфат
синтаза
Глюкозо-6-фосфат-
дегидрогеназа
НАД(Ф)
3-Гексулозо-6Ф
Фосфогексуло-
изомераза
Глюкозо-бФ
Фруктозо-6Ф
Гпюкозофосфатизомераза
Рис. 1.2.1. Диссимиляционный РМФ-цикл окисления формальдегида
Птер ин-зав исимые пути окисления формальдегида
Недавно обнаружено, что метилобактерий используют тетрагид-
рофолат (ТГФ)- или тетрагидрометаноптерин (ТГМП)-зависимые пу-
ти окисления ФА. Структурные формулы кофакторов представлены
на рис. 1.2.2.
ТГФ-зависимый путь. Образование комплекса Ci-субъединиц с
ТГФ имеет место практически у всех организмов, поскольку Сгфраг-
менты используются в различных биосинтетических процессах, на-
пример при синтезе пуринов. Превращение метила происходит через
Н5-метил-ТГФ, М^Г^’-метилен-ТГФ, И5^10-метенил-ТГФ и М,0-фор-
мил-ТГФ. Однако, если у большинства организмов ферменты ТГФ-
пути имеют низкие уровни, у метилобактерий с сериновым циклом
активность этих ферментов существенно повышается при росте на
метаноле или метиламине. Это обусловлено тем, что конденсация ме-
гилен-ТГФ и глицина с образованием серина является первой ключе-
вой реакцией серинового пути. Ферменты ТГФ-пути из М. extorquens
АМ1 очищены и идентифицированы кодирующие их гены. ТГФ-зави-
21
симое окисление ФА индуцируется спонтанной конденсацией ТГФ
СН2О до Г<5,Ь110-метилен-ТГФ (рис. 1.2.3).
У большинства бактерий метилен-ТГФ-дегидрогеназа и метени.
ТГФ-циклогидролаза расположены в одном бифункциональном по
липептиде, кодируемом геном folD. Однако у М. extorquens AMI ol
наружены два отдельных фермента: НАДФ'-специфичная метилен
ТГМП-зависимая дегидрогеназа, которая также активна с метилен
ТГФ, и метенил-ТГФ-специфичная циклогидролаза (Fch). Дальней
шее превращение катализирует М,0-формил-ТГФ-синтетаза. Ген fh<
кодирующий этот белок у М. extorquens AMI, имеет высокую степец
сходства нуклеотидных последовательностей генов соответствующие
ферментов из других бактерий и формил-ТГФ-синтетазного домен;
эукариот.
(а)
10
н
h2n
COO'
N
(6)
h2n
H
H
H
н
Y-GIuN
I
н
SH
о
Рис. 1.2.2. Структурные формулы кофакторов,
мальдегида у аэробных метилотрофных бактерий
(GSH); (г) микотиол (MySH)
участвующих в метаболизме фор-
, . • (а) тетрагидрофолат (ТГФ, H4F);
(б) дефосфотетрагидрометанолтерин (ТГМП, Н4МРТ); (в) восстановленный глутатион
Предполагается, что ТГФ-зависимые ферменты прежде всего
беспечивают высокий уровень интермедиатов серинового цикла. В
°аком случае реакции ТГФ-зависимого пути окисления ФА должны
быть обратимы in vivo. Действительно, реакции, катализируемые
цдД+-зависимой метилен-ТГФ-дегидрогеназой, метенил-ТГФ-цикло-
гигфолазой и М11)-формил-ТГФ-синтетазой, полностью обратимы.
ТГФ-путь
ТГМП-путь
Серин-ТГФ-гидраксиметил-
трансфераза
ТГФ-------------------—
Сериновым <*--) метилен-ТГФ <==> СН/ t
ЦИКЛ
Метилен-ТГФ- /
дегидрогеназа. \
MtdA
НАДФН2
ТГМП
Метилен-ТГМП
Fae
MtdB/A
Метилен- ТГМП-
дегидрргеназа
Метенил-ТГФ
Метенил-ТГМП
Метенил-ТГФ-
циклогидролаза
Fch
Биосинтез
пуринов
Н2О
]М|С-Формил-ТГФ
синтетаза
АТФ
Метенил-ТГМП-
циклогидролаза
Meh
Н2О
№-Формил-ТГМП
МФ
Fhc
ТГМП
Формил-МФ: ТГМП-
формилтрансфераза
нсоон
Fdh
НАДН2
Формил-МФ
>-•
J I Формил-МФ-
J '^дегидрогеназа
МФ
Рис. 1.2.3, Тетрагидрофолатный (ТГФ) и тетрагидрометаноптериновый (ТГМП)
пути метаболизма формальдегида [Vorholt et al., 1998]. ФДГ - формиатдегидрагеназа;
МФ - метанофуран
ТГМП-зависимый путь. Долгое время считалось, что ТГМП-за-
висимые реакции, впервые обнаруженные у метаногенов и сульфат-
редуцирующих архей, присущи только этим строгим анаэробам, по-
скольку играют ключевую роль в их энергетическом метаболизме.
Ферменты, подобные ТГМП-зависимым ферментам архей, недавно
найдены у М. extorquens AMI. Однако этот аэробный метилотроф со-
держит модифицированный ТГМП в дефосфорилированной форме,
лишенной терминальной а-гидроксиглутарилфосфатной единицы,
присутствующей как кофактор у анаэробов [Chistoserdova et al., 1998].
ТГМП-зависимые ферменты выявлены у всех тестированных ме-
тилобактерий, реализующих сериновый, РМФ- и РБФ-пути, кроме
Paracoccus denitrificans и Xanthobacter. Филогенетический анализ по-
казал, что эти ферменты, хотя и близки, но прошли самостоятельную
23
эволюцию. Предполагается, что аэробные метилобактерий приобрел
ТГМП-зависимые ферменты посредством горизонтального перенос
соответствующих генов от архей [Vorholt et al., 1999; Vorholt, 2002].
ТГМП-зависимый путь и ферменты, катализирующие его этапы
М. extorquens AMI, представлены на схеме (рис. 1.2.3). Показано, чт
гены этих ферментов локализованы в одном кластере и имеют bwcj
кую степень сходства нуклеотидных последовательностей с таковым!
метаногенов. Примечательно, что ТГМП-зависимые ферменты инду
цируются при росте М. extorquens AMI на метаноле, но не на сукци
нате. Исследования на мутантах подтвердили важную роль этих фер
ментов при метилотрофном росте бактерий [Chistoserdova et al., 1998]
Формалъдегидактивирующий фермент (Fae). По аналогии с ТГФ
зависимым окислением формальдегида, ТГМП-зависимое превращу
ние ФА инициируется конденсацией СНгО и птеринового кофактор}
до М5,1Ч11)-метиленпроизводного. Fae существенно ускоряет эту спон
тайную реакцию. Фермент присутствует в экстрактах клеток, выр-'
щенных на метаноле, причем его содержание превышает 2% от обще
го белка клеток. Мутант, дефектный по Fae, рос на сукцинате, но н
на СН3ОН, и был более чувствителен к СН3ОН
и СН2О, чем дикий
тип. Fae метилобактерий - гомотример, состоящий из 18 кДа субъе-
диниц, не имеет хромофорной простегической группы [Acharya et al.,
2005]. I
HАД(Ф)+-зависимая метилен-ТГМЛ-дегидрогеназа (MtdB/A) окис-
ляет образовавшийся М5,№°-метилен-ТГМП до №,№°-метенил-
ТГМП. У М. extorquens AMI обнаружены две дегидрогеназы:
НАДФ*-специфичная, катализирующая также обратимое дегидроге-
нирование метилен-ТГФ, и НАД(Ф)+-зависимая, специфичная к мети-
лен-ТГМП, но не активная с метилен-ТГФ. Пиридиннуклеотидзависи-
мое окисление метилен-ТГМП — экзэргоничная необратимая реакции
(AG = -13 кДж/моль), которая вместе с Fae обеспечивает эффективное
количественное превращение ФА в формиат [Vorholt et al., 1998]. ’
Метенил-ТГМП-циклогидролаза (Meh) гидролизует метенил-
ТГМП до 5М-формил-ТГМП. Фермент из М. extorquens AMI имеет
лишь 35% сходства с Meh архей, хотя близок по молекулярной массе
и монофункционален. В отличие от архейного фермента лишен хро-
мофорной простетической группы. Активировался в 20 раз 1.2 М
фосфатом калия, что необычно для ферментов а-протеобактерий, н«
характерно для архей [Vorholt et al., 1999].
Формилтрансфераза/гидролазный комплекс (Fhc) катализирует
превращение Гч5-формил-ТГМП до формиата. Одна субъединица это-
го фермента соответствует формилтрансферазе из метаногенов и
сульфатредуцирующих архей и имеет сходство нуклеотидной после-
24
ельности около 40%. Катализирует обратимый перенос фор-
•°"ной группы от М5-формил-ТГМП до метанофурана (МФ). Другие
мИ/1Ь линицы комплекса идентичны по последовательности соответ-
шим субъединицам формилметанофурандегидрогеназы архей.
гтВУ ил-МФ-дегидрогеназа катализирует гидролиз формилметанофу-
г д0 формиата и метанофурана [Vorholt, 2002].
3 ТГМП-зависимое окисление формальдегида у М. extorquens AMI,
видимому, является важным катаболическим путем, генерирую-
щим больше НАДН2, чем НАДФН2, причем НАДН2 используется для '
1 бного дыхания. ТГМП-зависимые ферменты широко распростра-
нены у метилотрофных протеобактерий и могут играть различную
. оль Так, например, у Methylobacillus flagellatus КТ, реализующего
Ассимиляционный РМФ-цикл, нет метенилциклогидролазы (Meh).
Полагают, что ТГМП-путь у этого облигатного метилотрофа обеспе-
, ивает детоксикацию ФА. Напротив, у метанотрофов активности
ферментов ТГМП-пути высоки, а уровни других ферментов окисления
‘ ормальдегида довольно низкие. Следовательно, у метанотрофов
ТГМП-путь является основным механизмом окисления ФА до фор-
миата [Vorholt et al., 1999; Vorholt, 2002].
В настоящее время активно обсуждается и принимается точка зре-
ния о том, что метаноптериновый путь переноса Ci-соединений в на-
правлении их восстановления является прототипом окислительных
еакций. При этом основной сценарий эволюции Сi-метаболизирую-
щих микроорганизмов заключался в латеральном переносе соответст-
вующих генов от анаэробных архей к аэробным бактериям. Однако
отсутствуют свидетельства, датирующие метаногенез как процесс,
более древний по сравнению с метилотрофией [Brocks et al., 2003]. Не
обнаружен также прототип для такого переноса среди архей, посколь-
ку у них гены ТГМП-пути “разбросаны” по хромосоме. Следователь-
но, латеральный перенос небольшого числа генов не мог привести к
метаболической инновации, предоставляющей селективное преиму-
щество рецепиенту. Альтернативная гипотеза о переносе этих генов
от (аэробной) метилотрофной протеобактерий к археям предполагает,
что аэробная метилотрофия предшествовала анаэробному метаноге-
незу. Но это противоречит сложившемуся представлению об истории
земной атмосферы [Cavalier-Smith, 2002; Kasting, Sefert, 2002].
Недавно гены ТГМП-пути обнаружены у различных представите-
лей группы Planctomycetales, которые, хотя и отнесены к Bacteria,
представляют собой независимую филогенетическую ветвь микроор-
ганизмов [Gloeckner et al., 2003; Chistoserdova et al., 2004]. Планкто-
мчцеты проявляют уникальные свойства, не характерные для домена
бактерий - не имеют пептидогликана в клеточной стенке (аналогично
25
Archaea), но обладают сложной внутриклеточной компартментациЛ
что напоминает эукариоты, и, подобно дрожжам, размножаются пД
кованием. Планктомицеты также характеризуются большими размв
рами геномов и разнообразием метаболических возможностей. Хош
гомологи генов, ответственных за финальную стадию метаногенеЯ
или первичное окисление/ассимиляцию С [-соединений, отсутствуют!
геномах планктомицетов, не найдены также штаммы, растущие Д
метаноле или формальдегиде [Lindsay et aL, 2001; Sinnighe Damste J
al., 2002; Gloeckner et al., 2003]. 1
В данный момент планктомицеты представляются наиболее noJ
ходящими кандидатами в качестве универсального предшественник!
генов, связанных с реакциями метаноптерин- и метанофуран-опосря
дованного переноса Ci-соединений [Chistoserdova et al., 2004]. BepJ
ятно, модуль генов ТГМП-пути у планктомицетов, также как у мети!
лобактерий и неметилотрофных протеобактерий, обеспечивает ис|
ключительно функцию детоксикации формальдегида [Marx et all
2003а,b; 2004]. Селективное давление, способствовавшее сохранении
этого набора генов, заключалось в обилии ФА в ранней истории ЗеЛ
ли. Филогенетический анализ показал, что транслированные последов
вательности С]-переносящих полипептидов у планктомицетов до!
вольно далеки от таковых архей и протеобактерий, предполагая но!
вый сценарий эволюции Cj-трансфераз у метаногенов и (не)метило|
трофов [Arrhenius et al., 1994]. I
Функциональное значение ТГМП- и ТГФ-метаболических путей
полностью не выяснено. Активности ферментов ТГМП-пути на поряч
док выше активностей ферментов ТГФ-пути, что позволяет предпоч
дожить его участие в окислении формальдегида, тогда как ТГФ-пути
выполняет преимущественно процессы трансметилирования, в том
числе оксиметилирование глицина с образованием серина в серинов
вом пути. Кроме того, оба пути участвуют в детоксикации образую-
щегося формальдегида [Vorholt et aL, 2002; Marx et al., 2005].
С использованием комбинации стратегии слежения за судьбой ме-»
ток 14С и дейтерия были определены потоки через каждый метаболи-
ческий модуль в метилотрофном метаболизме Af. extorquens АМ1^
когда поток ФА в системе изменялся десятикратно (рис. 1.2.4). Опи^
санный подход позволил проверить и подтвердить гипотезу, что роль
ТГФ-модуля при метилотрофном росте состоит в том, чтобы обеспе-
чить метилен-ТГФ из формиата, хотя фракция общего потока, проход
дящего через этот путь, всегда мала [Pomper et al., 2002; Vorholt, 2002;|
Marx et al., 2003a,b; 2005]. |
Известно, что активность ферментов метилотрофии в 3-6 раз уве-
личивается после индукции метанолом, предсказывая заметное уве-
е общего потока в систему [Vorholt, 2002]. Однако измерения
;1И ка ФА показали, что наблюдается динамическое распределение,
и- ла М. extorquens AMI использует метанол, система окисления ме-
танола имеет низкую, но значимую активность. В этих условиях, по-
ток ФА в систему относительно низок (см. рис. 1.2.4), и большая
часть ФА окисляется до СО2 через ТГМП-модуль и формиатдегидро-
геназу, генерируя НАД(Ф)Н2. Ассимилируются только следовые ко-
личества ФА и почти все через длинный путь, включающий формиат
и тГФ-интермедиаты. Как только поток ФА возрастает, большая его
часть перетекает через прямой путь в ассимиляционный метаболизм.
Гладкий переход наблюдается при индукции мощности системы, ко-
гда приблизительно треть общего пула ФА протекает через этот путь,
т е. ассимиляционный и диссимиляционный метаболизм сбалансиро-
ваны.
Малый поток СН2О
Большой поток СН2О
СНзОН
БИОМАССА
АТФ
СН3ОН
Прямой путь
БИОМАССА
АТФ
Прямой
путь
ТГФ
Длинный путь ’
Длинный путь
СО2
Рис. 1.2.4. Метаболическая петля детоксикации формальдегида у М, extroquens
AMI [Marx et al., 2005]
Элегантность этой взаимосвязанной динамической метаболиче-
ской петли создает эффективный амортизатор потоков ФА при пере-
ходах, в которых клетка имеет время для ответа на присутствие
Сгсубстрата, производя энергию без риска образования токсичных
интермедиатов. Как только активность серинового цикла начинает
Увеличиваться, больше ФА может быть безопасно направлено на ас-
симиляцию через прямой АТФ-независимый путь, таким образом
обеспечивая переход к росту на Сгсубстрате без повышения уровня
фА [Marx et al., 2005].
26
27
Анализ с использованием мутантов показал, что ТГМП- и TI1
пути необходимы для роста на Cj-соединениях, но было не понят!
почему требуется два очевидно избыточных пути. Было предполоя
но, что ТГФ-путь может быть необходим для подачи метилен-ТГ<1
сериновый цикл. Эта гипотеза подкреплялась кинетическими свой!
вами MtdA, активной в обоих кофакторзависимых путях. В дальш
шем эта гипотеза нашла подтверждение в открытии, что продукт!
ТГМП-зависимого окисления является скорее формиат, чем форми
метанофуран. Тем самым подчеркивалась важность формиата в кач
стве интермедиата [Chistoserdova, Lidstrom, 1994; Vorholt et al., 19ч
Pomper et al., 2002; Vorholt, 2002]. 1
Однако еще одним препятствием для дальнейшего развития эн
гипотезы была длительно существовавшая догма, что формальдеп
реагирует с ТГФ спонтанно в условиях in vivo. Таким образом, энц
гозатратный путь (требующий 1 молекулу АТФ и 1 молеку]
НАДФНг на 1 молекулу ассимилированного формиата), выполни!
щий ту же функцию реакции прямой конденсации ФА с кофактора
кажется нерациональным. Хотя изотопным методом доказан знач
тельный поток 13С по прямому пути конденсации [Marx et al., 200.!
исследования на мутантах не подтвердили этого заключения. Сле (
вательно, значение пути прямой конденсации ФА оставалось неут -
ненным.
Недавно анализ углеродных потоков был выполнен на мутантэ!
дефектных по ТГФ-зависимому пути, исходя из предпосылки, чп
прямая конденсация является единственным возможным путем асси
миляции метанола. Хотя такие мутанты неспособны к метилотрофии
му росту, они могут быть выращены в условиях, когда пути Cj-okhJ
ления частично индуцированы, а ассимиляция метанола близка к ну
лю. В соответствии с этими результатами ТГФ-зависимый путь, nq
видимому, является доминирующим в поступлении Сгединиц в cd
риновый цикл [Crowther et al., 2008]. Эта находка указывает на фсф
миат, а не формальдегид, как основную точку разветвления метилЛ
трофного метаболизма у М. extorquens AMI и, вероятно, у других се
риновых метилобактерий, бросая вызов еще одной долго существо
вавшей в метилотрофии догме.
Значение ТГМП-зависимой активности MtdA остается неясным
поскольку существует фермент MtdB, который катализирует эту р/
акцию и также требуется при росте бактерий на Отсоединениях. Эп
может указывать на происхождение MtdA из MtdB, имеющего выси
кое сродство к ТГФ, но сохраняющего сродство к ТГМП. Иначе эт
может быть свидетельством специфической, но еще не выяснении)
28
связи между двумя аналогичными путями [Chistoserdova et al., 1998,
Vorholt, 2002].
Некоторые метилобактерии обладают FolD, бифункциональной
тилен-ТГФ-дегидрогеназой/метенил-ТГФ-циклогидролазой, в до-
полнение к MtdA/Fch паре, тогда как другие имеют только FolD. У
М chloromethanicum СМ4, FolD, по-видимому, более специфична для
диссимиляции метил-ТГФ, продукта деметилирования хлорметана
[Studer et al., 2002]. FolD M. chloromethanicum, будучи внесенным в
mtdA-мутант М. extorquens, не комплементировал рост на метаноле,
подчеркивая различные функции MtdA и FolD у разных видов Methy-
lobacterium [Marx, Lidstrom, 2004].
Тиол-зависимое окисление формальдегида. Тиол- (глутатион/
микотиол) зависимое окисление ФА, по-видимому, является наиболее
распространенной ферментной системой конверсии СНгО и происхо-
дит у бактерий при помощи глутатион- и НАД+-зависимой ФАДГ и
S-формилглутатионгидролазы. Этот путь обнаружен у многих других
бактерий, а также у млекопитающих, растений и дрожжей, где играет
общую роль в детоксикации СНгО. У метилобактерий GSH-зависимое
окисление ФА было обнаружено у автотрофного метилотрофа
Ра. denitrificans и несерной пурпурной бактерии Rhodobacter sphae-
roides, где участвует в диссимиляторной конверсии формальдегида в
СО2 [Ras et al., 1995; Goenrich et al., 2002]. У грамположительных ме-
тилобактерий в качестве тиолового кофактора может выступать ми-
котиол (MySH) (см. рис. 1.2.2). Так, у Amycolatopsis methanolica и
Rh. erythropolis обнаружена НАД+- и MySH-зависимая ФАДГ, которая
ранее была охарактеризована как НАД+-зависимая ФАДГ, участвую-
щая в диссимиляции ФА у этих бактерий [Van Ophem et al., 1992;
Spies, Steenkamp, 1994; Misset-Smits, 1997].
Таким образом, аэробные метилобактерии адаптированы к исполь-
зованию С1-субстратов благодаря вовлечению образующегося фор-
мальдегида - токсичного центрального интермедиата Сi-окисления, в
дальнейшие метаболические превращения. Очевидно, что нет и не
может быть универсального пути для всех бактерий, использующих
ФА. У одного и того же штамма бактерий могут реализоваться разные
пути метаболизма ФА: как для детоксикации, так и в процессах асси-
миляции-диссимиляции.
Окисление формиата - завершающая стадия цепи реакций пря-
мого Срокисления у аэробных метилотрофных бактерий. Известны
четыре негомологичных фермента, участвующих в окислении фор-
миата до СО2 [Vorholt, 2002; Chistoserdova et al., 2003; 2007a]:
29
1. Мембрансвязанная формиатоксидаза, использующая в качесг;
акцепторов электронов О2 и ФМС/ДХФИФ [Hopner, Trautwei
1971].
2. ФДГ, связанная с мембранами и проявляющая активность
ДХФИФ или цитохромом с [Deyhle, Barton, 1977].
3. НАД^-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ), локализованная
растворимой фракции, наиболее распространена, однако им^
низкий уровень активности или вообще отсутствует у метил,
бактерий с РМФ-путем, у которых преобладает циклическ.
окисление формальдегида до СО2 [Johnson, Quayle, 1964]. Фе,
мент содержит негемовое железо (11-18 г-атом/моль белка) и н
органическую серу (15-20 моль/моль белка). ФДГ обладает в*
сокой субстратной специфичностью, высокими значениями Кт
формиату и низкими к НАД+, как правило, активна в широко
диапазоне pH (6.0-10). Активность ФДГ стимулируется добавл
нием ФМН (Кп для ФМН 0.015-0.03 мкМ). Окисление формиа
происходит согласно уравнению: НСООН + НАД" —* СО2
НАДН + + Н+ [Egorov et al., 1979; Yoch et al., 1990].
4. ФДГ, являющаяся высокогомологичной молибдоптеринзависм
мым оксидоредуктазоподобным белкам [Chistoserdova et al.
2007а].
В зависимости от вида бактерии и природы Ci-субстрата у аэро*"
ных метилобактерий реализуются различные механизмы первичног
окисления. Общим продуктом первичного окисления восстановлен
ных Ci-соединений является формальдегид, который непосредственна
или после окисления до СО2 вовлекается в основные биосинтетичс
ские пути.
Пути Ci-ассимиляции. Известны три основных циклических пу-
ти, ответственных за биосинтез клеточных компонентов при метило-
трофном росте бактерий: рибулозомонофосфатный (РМФ), серино-
вый и рибулозобисфосфатный (РБФ).
Рибулозобисфосфатный путь автотрофной ассимиляции СО2,
встречается у метилобактерий реже, чем РМФ- и сериновый пути, т.к.
энергетически менее выгоден [Strom et al., 1974]. Реализующие этот
путь факультативные метилобактерий окисляют С]-субстраты после-
довательно до СО2, который фиксируется в реакции карбоксилирова-
ния рибулозо-1,5-бисфосфата с образованием 3-фосфоглицерата.
Ключевыми ферментами этого пути являются фосфорибулокиназа и
рибулозобисфосфаткарбоксилаза (РБФК/О или РубисКО). Интересно,
что РБФК/О может действовать и как оксигеназа, в этом случае обра-
зуются фосфоглицерат и фосфогликолат (рис. 1.2.5).
30
тановление 3-фосфоглицерата до глицеральдегид-3-фосфата, катали-
дрогеназой; 3) регенерация первичного акцептора СО2 - рибулозо-1,5-
превращения пяти молекул глицеральдегид-3-фосфата в три молекулы
роходить с участием трансальдолазы и транскетолазы, либо транске-
катализируемой РубисКО, через глиоксилат превращается в глицин,
рБФ-цикл можно разделить на три этапа: 1) фиксация СО2; 2) вос-
новление 3-фосфоглицерата до глицеральдегид-3-фосфата, катали-
-* уемое 3-фосфоглицераткиназой и глицеральдегид-3-фосфатдеги-
бисфосфата- При этом возможны два варианта, отличающиеся путями
евращения пяти молекул глицеральдегид-3-фосфата в три молекулы
ибупозо-5-фосфата. У метилобактерий реакции перестроек могут
проходить с участием трансальдолазы и транскетолазы, либо транске-
топазы и СБФазы. Фосфогликолат - продукт оксигеназной реакции,
катализируемой РубисКО, через глиоксилат превращается в глицин,
который может вовлекаться в сериновый путь. Как уже отмечалось,
РБФ-цикл является наиболее энергоемким путем С|-ассимиляции, по-
скольку синтез триоз осуществляется из СО2 с затратой АТФ и вос-
становителей. Сериновый путь более эргономичен, чем РБФ-цикл, т.к.
образование триоз в нем происходит из двух молекул формальдегида
и одной молекулы СО2.
сн2о-р
I
с=о
| РБФК1О о2 соон соон
НС-ОН {РубисКО) / | |
| ► Н-С-ОН + СН2О-Р
НС-ОН |
| ' СН2О-Р
СН2О-Р Н2О
Рибу лозо-1,5-6 исфос фат З-Фосфоглицерат 2-Фосфогликолат
Рис. 1.2.5. Реакция окисления рибулозо-1,5-бисфосфата, катализируемая рибуло-
зобисфосфаткарбоксилазой (РБФК/О)
РБФ-путь реализуют метилобактерий родов: Albibacter, Ancylobac-
ter, Angulomicrobium, Beijerinckia, Hansschlegelia, Methylonatrum, Me-
thylovirgula, Paracoccus, Xanthobacter.
Сериновый путь представляет собой циклическую цепь реакций,
катализируемых сериноксиметилтрансферазой, серин-глиоксилатами-
нотрансферазой (СГАТ), оксипируватредуктазой (ОПР), глицератки-
назой и малил-КоА-лиазой и начинающихся с образования серина из
глицина и формальдегида. Интермедиатами серинового цикла явля-
ются органические кислоты и аминокислоты (рис. 1.2.6а). В итоге од-
на молекула фосфоглицерата синтезируется из двух молекул фор-
мальдегида и одной молекулы СО2. У М. extorquens AMI в этом про-
цессе участвуют 11 ферментов. Сериноксиметилтрансфераза (GlyA),
найденная у многих организмов, катализирует сопряжение Ci-субъе-
Диниц в форме метилен-ТГФ с другими биосинтетическими путями,
31
например синтезом пуринов. Поскольку серинокси мети лтрансфераза
у М. extorquens AMI не требуется для роста на полиуглеродных со-
единениях, у этого метилотрофа должен существовать альтернатив-
ный источник Ci-единиц для биосинтеза пуринов.
Гены сериноксиметилтрансферазы и глицераткиназы не связаны с
другими генами серинового цикла. Напротив, 6 генов серинового пу-
ти, кодирующих СГАТ, ОПР, две субъединицы малаттиокиназы, аце-
тил-КоА-зависимую ФЕП-карбоксилазу и малил-КоА-лиазу, образу-
ют кластер. Большинство генов серинового цикла ответственны толь-
ко за метилотрофию, соответственно, мутанты по этим генам могут
расти на полиуглеродных субстратах. В то же время анализ мутантов
показал, что гены малатдегидрогеназы и энолазы необходимы при
росте как на Сг, так и на Сп-субстратах, поскольку не удалось полу-
чить мутанты по этим генам/ферментам.
Сериновый путь реализуют метилобактерий родов: Afipia, Amino-
bacter, Granulibacter, Hyphomicrobium, Labrys, Methylarcula, Methylo-
bacterium, Methylohalomonas, Methylopila, Methylorhabdus, Methylosul-
phonomonas, Methyloversatilis, Silicibacter.
Изоцитратлиазоположительный (ицл*) вариант серинового цикла
(рис. 1.2.66). Важной проблемой серинового цикла является превра-
щение ацетил-КоА в Сз- и С4-соединения, необходимые для биосин-
теза. Их отток нужно компенсировать, иначе цикл не сможет функ-
ционировать. Одним из путей восполнения интермедиатов серинового
цикла является окисление ацетил-КоА до глиоксилата с участием ре-
акций, катализируемых цитратсинтазой, аконитазой, малатсинтазой и
изоцитратлиазой. Глиоксилат трансаминируется в глицин, который
акцептирует формальдегидную единицу и превращается в фосфогли-
церат. Ицл+-вариант серинового пути реализуют метилобактерий ро-
дов Aminobacter и Hyphomicrobium, Для них характерно наличие двух
изоформ изоцитратлиазы, кодируемых различными генами и индуци-
руемых Сг или Сп-субстратами, соответственно. Кроме того, сущест-
вует большая группа метилобактерий, включая М. extorquens AMI,
которые реализуют сериновый путь, но ицл~-вариант.
Этилмалонатный цикл регенерации глиоксилата. Одно из био-
химических свойств многих сериновых метилотрофов - отсутствие
изоцитратлиазы, ключевого фермента глиоксилатного шунта, и нали-
чие альтернативного пути конверсии ацетил-КоА в глиоксилат. Это
необычное метаболическое свойство было отмечено вскоре после от-
крытия серинового цикла и активно исследовалось группами Квейла
и Энтони с использованием в качестве модели М. extorquens AMI.
Основным итогом этой работы стало доказательство участия пути
также в Сг-метаболизме, подтвержденное фенотипами мутантов, де-
3-ФГК
>БИОСИНТЕЗ
2 Атф
глицерат
2 2-ФГК
>ФЕП
ФЕП-карбоксилаза
НАДН,
гиДроксипируват
Гидроксипируеатредуктаза
оксалоацетат
2 серин
малат
ясно—*
Сериноксиметил-
трансфераза
;
малил-КоА
СО2
надн2
АТФ
2 глицин
Мал ил- Ко А
лиаза
глиоксилат ацетил-КоА ♦
Цитрате и нтаза оксалоацетат
цитрат
изоцитрат
Изоцитратлиаза
*> сукцинат
глиоксилат
Ацетил-КоА —► Глиоксилат 2 Глицин
Глиоксилат
2НСНО
2 Серин
2-Г идроксипируват
(б)
Малил-КоА
АДФ+Ф
2 НАДН2
2 НАД
2-Глицерат
2 АТФ
НАД
АТФ
L-Малат
2 АДФ
2-Глицерат-2-Ф
НАДН2 п
Оксалоацетат
СО2
З-Фосфоглицерат
Фосфоенолпируват I
Биосинтез
^ис. 1.2.6. Изоцитратлиазоположительный (ицл+) (а) и изоцитратлиазонегативный
(иЦл ) (б) варианты серинового цикла
33
фектных по росту на Ср и Сг-соединениях. Однако рост на обоих Д
пах субстратов восстанавливался при добавлении глиоксилата [г\|
thony, 1982; Dunstan et al., 1972]. I
Несмотря на большие усилия по исследованию этого феномеЛ
биохимическая последовательность указанного пути оставалась тЛ
ной еще два десятилетия, в течение которых были выдвинуты
предположения. Первое - гомоизоцитрат как интермедиат, век >1
признанное ошибочным [Kortstee, 1980; Bellion et al., 1981]. Друг J
предположение - участие пропионил-КоА и метилмалонил-КоА п<Л
тверждено генетическими и энзимологическими доказательствами. I
Прорыв был достигнут в 1990-х гг., когда стали доступны техн I
логии секвенирования ДНК в комбинации с новыми методами прям<1
го мутагенеза. В результате на основе идентификации одного из н-4
обходимых генов - гена пропионил-КоА карбоксилазы (рссВ), был!
подтверждены два интермедиата пути (вначале названного цикл»,!
регенерации глиоксилата, а позднее - этил малой ил-Ко А путем): пр 1
пионил-КоА и метилмалонил-КоА. I
Дальнейшие усилия по расшифровке пути у М. extorquens AMI
были дополнены анализом мутантов и детекцией метаболитов, при!
ведшими в 2005 г. к идентификации ряда ферментов пути и учасг!
вующих генов (рис. 1.2.7) [Korotkova, Lidstrom, 2001; 2004; KorotkovJ
et al., 2002; 2005]. Однако точная роль некоторых ферментов, таким
как МеаА, гомолога метилмалонил-КоА-мутазы, а также некоторым
интермедиатов, оставалась неизвестной.
Окончательно большая часть ицл~-пути была расшифрована, бла-
годаря последним достижениям в детализации метаболизма ацетата у
Rhodobacter sphaeroides, происходящего по пути, сходному с путем
регенерации глиоксилата в сериновом цикле метилотрофов, что про-
демонстрировано в лаборатории Г. Фухса (см. рис. 1.2.7) [Meister U
al., 2005; Alber et al., 2006; Erb et al., 2007; 2008; Zarzycki et al., 2008].
Наиболее важными открытиями, приведшими к расшифровке пути
конверсии ацетил-КоА в глиоксилат, были следующие: (а) мезаконил-
КоА-дегидратаза оказалась важным ферментом пути, а мезаконил-
КоА и метилмалил-КоА - интермедиатами; (б) была продемонстриро-
вана реакция превращения этилмалонил-КоА в метилсукцинил-КоА,
катализируемая этилмалонил-КоА-мутазой, кодируемой теаА; (в)
функция кротонил-КоА-редуктазы, кодируемой ссг, была пересмот-
рена, с указанием, что этот фермент катализирует восстановление и
карбоксилирование кротонил-КоА для образования этилмалонил-
КоА; (г) было показано, что малил-КоА-лиаза обладает двойной спе-
цифичностью к малил-КоА и метилмалил-КоА и, по-видимому, ката-
□ует обе реакции [Meister et al., 2005; Alber et al., 2006; Erb et al
2007; 2008; Zarzycki et al., 2008].
6 H+
* 3 ФЕП 2 co2
г Биомасса
3 Серин
3 Глицин
2 Оксалоацетат
цтк
3NH/
Сериновый
цикл
2 Малил-КоА
3 Глиоксилат
Сукцинат
Сукцинил-КоА
Метилмалонил-КоА
Пропионил-КоА \
карбоксилаза (3Q /\
Пропионил-КоА
А.
2 Ацетил-КоА
Р-кетотиолаза
P-метилмалил-КоА / АцеТОЭЦетИЛ-КоА
L-малил-КоА лиаза \ и*
Ацетоацетил-КоАК и
редуктаза Ч
R-3-гидроксибутират
p-метилмалил-КоА Этилмалонатный |
| Мезаконил-КоА
\гидратаза
Мезаконил-КоА
Кротонил-КоА
Кротонил-КоА /
карбоксилаза/редуктаза/'-*z
Этилмалонил-КоА
2 \
Метилсукцинил-КоА
Этилмалонил-КоА
мутаза
Рис. 1.2.7. Схема этилмалонатного пути у Methylobacterium extorquens AMI [Erb et
al-, 2007]
Подтверждение реальности цикла регенерации глиоксилата (этил-
малонил-КоА пути) у метилотрофов было получено в элегантных ис-
следованиях группы Ю. Ворхолт с использованием М. extorquens
АМ1 и высокоразрешающей масс-спектрометрии для демонстрации
наличия большинства тиоэфиров, специфичных для этого пути. Кро-
того, доказательства функционирования данного пути были полу-
чены в кратковременных 1 'С-пульсовых экспериментах, показавших
последовательность реакций по порядку включения метки в предо!
занные КоА-производные. Из этой работы стало ясно, что вырацн
ные на метаноле клетки превращают метилсукцинил-КоА в глиок<
лат и пропионил-КоА через мезаконил-КоА и метилмалил-КоА, т
самым были даны ответы на оставшиеся вопросы по этой части пу
[Kiefer et al., 2008; Peyraud et aL, 2009]. 1
Новая схема превращения ацетил-КоА в глиоксилат имеет бод
шое значение для Ci-ассимиляции в плане понимания баланса уг]
рода. В соответствии с этой схемой два С-атома образуются из
СО2, а две молекулы глиоксилата регенерируются на каждую моле*
лу ацетил-КоА. Это противоречит ранее широко распространенно)
представлению о балансе серинового цикла - две молекулы ФА
одну молекулу СО2, и указывает на то, что на одну молекулу С(Я
приходится одна молекула ФА [Anthony, 1982]. Данное соотношенЦ
(1:1) находится в соответствии с результатами классических изотоЯ
ных экспериментов группы Квейла и недавних изотопных измерен Л
[Large et al., 1961; Crowther et al., 2008]. II
Общепринятая последовательность реакций этилмалонатного пуЦ
почти вдвое короче ранее предложенного цикла регенерации глиоксм
лата, что является дополнительным аргументом в пользу реальное»
функционирования этилмалонил-КоА пути [Korotkova et aL, 200Я
2005]. Существенным преимуществом данного варианта сериновой
цикла является то, что он интегрирует различные метаболические п||
ти, требующие глиоксилатный цикл, метилотрофию, биосинтез анти
биотиков, а также синтез и распад полигидроксибутирата - основной
запасного материала многих прокариот. I
Рибулозомонофосфатный цикл является шунтированным варю!
антом цикла Кальвина. В РМФ-пути синтез триозофосфата осущест-
вляется из трех молекул ФА. Ключевой реакцией является катализи-
руемая гексулозофосфатсинтазой (ГФС) альдольная конденсация ФЛ
и рибулозо-5-фосфата с образованием З-гексулозо-6-фосфата. Это!
весьма нестабильный продукт под действием фосфогексулозоизоме^
разы (ФГИ) быстро превращается во фруктозо-6-фосфат (рис. 1.2.8я
По существу, эти два специфических фермента катализируют образов
вание С-С связей и фосфогексоз. У метилобактерий ГФС является
моно- или гомодимером (32-47 кДа), ФГИ - гомодимером (-40 кДа).
Они кодируются спаренными генами hps и hpi, соответственно. <
РМФ-цикл можно условно разделить на три стадии. На первой
стадии - “фиксации” - образуются три молекулы фруктозо-6-фос^
фата. Этот этап является общим для всех бактерий, реализующий
РМФ-цикл ассимиляции формальдегида (рис. 1.2.9). I
36
сн2он сн2он
С=О но-с-он
нсно ♦ нс-он ..с=о
неон 1 м"2 неон
I I
СН2О-Р нс-он
СН2О-Р
ФГИ
СН2ОН
с=о
HO-CH
НС-ОН
I
нс-он
сн2о-р
Рибулозо-5Ф
3-Гексулозо-6Ф
Фруктозо-6-Ф
Рис. 1.2.8. Ключевые реакции рибулозомонофосфатного цикла
РФЭ I»
-----► Рибулозо-5Ф —Ьь.
РФЭ
------► Рибулозо-5Ф
...-!.. .-'Л.Ч.М.'.'
СН2О
-- Г. ГФС
ФРИ
।—> Рибулозо-5Ф
Рибозо-5Ф
СН2О
ГФС ФГИ
•>--► 3-Гексулозо-бФ----►Фруктозо-бФ
ФФК^Г " ФГлИ
АТФ
ГЛЮКОЗО-бФ
гфдг надф’
I* надфн2
6-Фосфо-
глюконат
* 3-Гексулозо-6Ф
ФГИ »ддф
I — ’
Фруктозо-бФ 1
ГФС
3-Гексулозо-бФ
ФГИ
Фруктозо-
Кс и л ул озо-
5Ф
77^
С едогепту л озо-7Ф
Фруктозо-бФ
Г лицеральдегид-ЗФ
Эритрозо-4Ф
2-Кето-З-дезокси-
6-фосфоглюконат
J W
Ксилулозо-5Ф
Диокси-
ацетон-Ф
< । .iT.i '|1-..ййу..
Глицеральдегид-ЗФ
Пируват
Рис. 1.2.9. Рибулозомонофосфатный цикл фиксации формальдегида
На второй стадии, “расщепления”, из каждой молекулы фруктозо-
6-фосфата образуются две молекулы триоз. Причем на этой стадии
возможны два варианта РМФ-цикла:
а. Фруктозо-6-фосфат фосфорилируется до фруктозо-1,6-бисфос-
фата (ФБФ), затем подвергается расщеплению на две молекулы
ГАФ в реакции, катализируемой фруктозобисфосфатальдолазой
(ФБФА-вариант);
б. Фруктозо-6-фосфат через глюкозо-6-фосфат и 6-фосфоглюконат
окисляется до 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконата (КДФГ) фер-
ментами пути Энтнера-Дудорова и далее расщепляется КДФГ-
альдолазой до ГАФ и пирувата (КДФГА-вариант).
ФБФ-вариант, как правило, реализуют факультативные метилобак-
терии, тогда как КДФГА-вариант характерен для облигатных и огра-
ниченно-факультативных метилобактерий родов Methylophilus, Methy-
lobacillus, Methylovorus u Methylophaga. Грамположительные метило-
37
бактерии реализуют ФБФ-вариант РМФ-цикла. ФБФ/СБФ вариант?
обнаружен у ограниченно-факультативных метилотрофов, а также у
Bacillus methanolicus [Colby, Zatman, 1975].
На третьей стадии (“перестроек”) происходит регенерация треа
молекул первичного акцептора, рибулозо-5-фосфата [Strom et al.,
1974]. При этом также возможны два варианта, в которых участвуют
транскетолаза, рибозо-5-фосфатизомераза и рибулозо-5-фосфатэпи-
мераза. В первом варианте в эту последовательность включается тран-
сальдолаза (ТА-вариант), во втором - седогептулозо-1,7-бисфосфатаз
(СБФ-вариант). В результате различных комбинаций упомянутых ре-
акций возможны 4 варианта метаболизма сахаров у метилобактерий.
КДФГА/ТА-вариант встречается у облигатных метилобактерий,
которые могут превращать глицеральдегид-3-фосфат в пируват в пути
Энтнера-Дудорова. Второй вариант (ФБФА/СБФ) обычно функцио-
нирует у факультативных метилобактерий. Третий вариант РМФ-пути
(ФБФА/ТА) найден у грамположительных метилобактерий. Вариант
КДФГА/СБФ возможен теоретически, но до сих пор не обнаружен.
Это наименее энергетически выгодный вариант РМФ-цикла.
Облигатные и ограниченно-факультативные метилобактерий с
РМФ-циклом (КДФГА-вариант) характеризуются весьма редуциро-
ванным набором ферментов гетеротрофного метаболизма. Как прави-
ло, они не имеют активностей а-кетоглутаратдегидрогеназы, изоцит-
ратлиазы и малатсинтазы, 6-фосфофруктокиназы, ФБФазы, ФЕП-
синтетазы и пируваткиназы. Биохимические основы облигатной мети-
лотрофии рассмотрены в разделе 1.3.
Генетическая организация, регуляция и функции РМФ-пути. Гены,
кодирующие ключевые ферменты РМФ-пути - ГФС и ФГИ, были
впервые клонированы из облигатного метилотрофа Methylobacillus
aminofaciens Т1ъ, в дальнейшем также из факультативного Mycobacte-
rium gastri МВ19 и термотолерантного Bacillus brevis SI [Yanase et al.,
1996; Sakai et al., 1999; Mitsui et al., 2000; Yurimoto et al., 2009]. Перво-
начально распространение РМФ-пути ограничивалось только метило-
трофами, но недавно показано, что реакция фиксации ФА широко рас-
пространена среди метилотрофных и неметилотрофных бактерий, не-
способных использовать Ci-соединения как единственный источник
углерода, и архей [Dijkhuizen et al., 1992; Mitsui et al., 2000; Vorholt et
al., 2000; Kato et al., 2006]. Выявлено, что, кроме детоксикации ФА,
ферменты РМФ-пути могут участвовать в синтезе пентозофосфатов у
ряда архей с несовершенным (неполным) пентозофосфатным путем
[Xavier et al., 2000; Verhees et al., 2000; Soderberg, 2005; Orita et al.,
2005; Goenrich et al., 2005].
филогенетический анализ показал, что ГФС могут быть сгруппи-
рованы в 6 кластеров, а ФГИ четко разделяются на бактериальные и
арХейные [Kato et al., 2006]. Хотя первичные аминокислотные после-
довательности ГФС и ФГИ имеют более чем 50%-ное сходство у этих
организмов [Mitsui et al., 2000], организация генов и регуляторные
механизмы у них различны. Метилобактерий с РМФ-путем обнаруже-
ны в трех группах: 1) грамотрицательные облигатные и ограниченно-
факультативные; 2) грамположительные факультативные; и 3) термо-
толерантные виды рода Bacillus. Гены ГФС и ФГИ из всех трех типов
метилобактерий клонированы (рис. 1.2.10) [Yurimoto et al., 2009].
Репрессия Активация
Methylobacillus aminofaciens 77а
(облигатный метилотроф)
Mycobacterium gastri МВ19
(факультативный метилотроф)
Bacillus brevis S1
(термотолерантный метилотроф)
Рис. 1,2.10. Организация генов ГФС и ФГИ у метилобактерий [Yurimoto et al.,
2009]
У Mb. aminofaciens 77а гены hps и phi экспрессируются моноцис-
тронно. Транспозаза Rmpl, ген которой расположен между hps и phi,
по-видимому, регулирует экспрессию этих генов [Sakai et al., 1999]. У
Methylobacillus flagellatus KT идентифицированы две копии hps: одна
является частью генного кластера с phi, тогда как другая - часть кла-
стера генов биосинтеза гистидина, подобно Aminomonas aminovo-
rus С2А1 [Taylor et al., 2004; Chistoserdova et al., 2007]. Mb. aminofa-
ciens 77a также имеет второй ген hps в кластере биосинтеза гистидина.
У факультативных метилотрофов гены hps и phi транскрибируют-
ся как полицистронный оперон, а экспрессия индуцируется формаль-
дегидом. У Мус. gastri МВ 19, ген rmpR, который кодирует вероятный
ДНК-связывающий белок, предположительно, участвует в регуляции
оперона hps/phi и расположен выше оперона hps/phi [Mitsui et al.,
2000]. Однако молекулярный механизм ФА-индуцируемой экспрес-
сии генов у этой метилобактерий неясен.
У Bacillus brevis S1 организация hps и phi генов отлична от таковой
У Мус. gastri МВ 19. Не обнаружены ОРС, кодирующие регуляторный
белок, выше и ниже hps/phi оперона у В. brevis SI [Yurimoto et al.,
2009]. Другой термотолерантный метилотроф, Bacillus methanolicus
М«АЗ, имеет такой же оперон hps/phi, как и В. brevis S1. В. methano-
39
Ileus MG АЗ обладает 19 167-п.н. кольцевой плазмидой, которая с
держит гены, кодирующие МДГ и 5 ферментов РМФ-пути; 6-фосф
фруктокиназу, рибулозо-5-фосфат 3-эпимеразу, транскетолазу, фру
тозо-1,6-бисфосфатазу и фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазу. Экспре
сия хромосомного оперона hps/phi и шести вышеупомянутых плт
мидных генов индуцировалась при росте на метаноле [Brautaset et al
2004; Jakobsen et al., 2006].
Биохимические свойства ГФС и ФГИ. ГФС была очищена и ох;
рактеризована у нескольких видов метилобактерий [Соколов, Троце>
ко, 1978; Kato et al., 2006; Arfman et al., 1990]. ГФС катализирует ал>
дольную конденсацию ФА с рибулозо-5Ф для образования гексулоз .
6Ф (рис. 1.2.11).
сн2он
с~о
н—с—он _
I
н—с—он
СН2ОРО32'
1,2-Эндиолат
СН2ОН
СН2ОРОз2’
D-Арабино-З-гексулозо-бФ
0-Рибулозо-5Ф
Рис. 1.2.11. Механизм реакции, катализируемой ГФС [Kato et al., 2006]
ГФС требует Mg2+ или Мп2+ для проявления максимальной актив-
ности. Фермент специфичен к рибулозо-5Ф в качестве субстрата. Ри-
бозо-5Ф, ксилулозо-5Ф, аллюлозо-бФ и фруктозо-бФ не могут быть
субстратами. В дополнение к ФА фермент может использовать глико-
альдегид и метил глиоксаль. ГФС является членом суперсемейства
оротидин 5’-монофосфат декарбоксилаз (ОМФДК), включая ОМФДК,
З-кето-Ь-гулонат-б-фосфат декарбоксилазу (КГФДК), Б-рибулозо-5Ф
3-эпимеразу и ГФС [Wise et al., 2002]. Члены этого суперсемейства,
не имеющие консервативного каталитического механизма и суб-
стратной специфичности, четко кластеризуются на филогенетическом
дереве [Kato et al., 2006].
Однако в некоторых бактериальных геномах КГФДК некорректно
аннотированы как “вероятные ГФС”, имеющие гомологию с ГФС'
(30% идентичности). Ферменты, относящиеся к этому суперсемейст-
ву, обладают (0/а)8-баррельной складчатостью и консервативной ар-
хитектурой активного сайта, хотя механизм катализа может сильно
варьировать [Gerlt, Raushel, 2003]. Недавно была расшифрована кри-
сталлическая структура ГФС из Мус. gastri МВ 19, выявившая наличие
40
этому суперсемейству. КГФДК катализирует декарбоксилиро-
ося К
анис
ти
пизаиии L-аскорбата. ГФС и КГФДК катализируют реакции, вклю-
(1 2-эндиолата). ГФС катализирует реакцию КГФДК с высокой
а КГФДК катализирует реакцию ГФС с низкой эф-
их (р/а)8-баррельных складок, присущих другим фермен-
:ЛЗССИперсемейства ОМФДК [Yurimoto et al., 2009].
аМ Нуждался реакционный механизм каждого фермента, относяще-
З-кето-Ь-гулонат-6-Ф в Ь-ксилулозо-5-Ф в анаэробном пути
а"'"зации L-аскорбата. ГФС и КГФДК катализируют реакции, е:ее::
^юшие Mg2+-°nocPeAOBaHHoe образование и стабилизацию интерме-
диата I.
ффективностью,
ьективностью. На основе выравнивания аминокислотных последова-
льНОстей от КГФДК и ГФС четыре консервативных аминокислот-
ых остатка в КГФДК были заменены на консервативные для ГФС.
Кинетические константы активности ГФС и мутированного фермента
гыли сильно повышены, но снижены у КГФДК [Gerlt, Raushel, 2003;
Yew et al., 2005]. Это предполагает, что КГФДК и ГФС разнородны
ля реакций декарбоксилирования и альдольной конденсации.
ФГИ катализирует изомеризацию гексулозо-бФ во фруктозо-бФ.
; ГИ была очищена и охарактеризована у нескольких метилобактерий
I Ferenci et al., 1974; Beardsmore et al., 1982; Kato et al., 2006]. 3a nep-
ой кристаллизацией ФГИ из В. subtilis последовали сообщения о
кристаллических структурах ФГИ из метаногенных архей Methano-
tarcina jannaschii. Белок ФГИ проявляет a/p-структуру, состоящую из
пяти параллельно направленных P-листов, фланкированных с обеих
сторон а-спиралями, образующими трехслойный ара-сэндвич [Taylor
Л al., 2001; Martinez-Cruz et al., 2002; Sanishvili et a!., 2004].
1.3. Биохимические основы облигатной метилотрофии
Облигатные метилобактерии не способны использовать сложные
органические вещества в качестве энергетических и углеродных суб-
стратов, По аналогии с облигатной автотрофией, выдвинуто несколь-
ко гипотез для объяснения этого феномена [Smith, Ноаге, 1977; Whit-
tenbury, Kelly, 1977; Wood et al., 2004; Trotsenko, Murrell, 2008],
Для многих облигатных и ограниченно-факультативных метило-
оактерий с РМФ-путем характерно отсутствие а-кетоглутаратдегид-
Рогеназы и ферментов глиоксилатного шунта, вследствие чего пред-
полагается, что ЦТК у них разобщен и представляет собой две ветви
биосинтетической направленности [Trotsenko et al,, 1986], Напротив,
Ме гилобактерии с сериновым путем имеют замкнутый ЦТК, выпол-
няющий ввиду низкой активности а-кетоглутаратдегидрогеназы в
°сновном анаболическую функцию.
41
У метилобактерий с сериновым путем некоторые ферменты утм
водного обмена отсутствуют (гексокиназа, дегидрогеназы глюкозо-
фосфата и 6-фосфоглюконата) или имеют крайне низкие активное
(фруктозобисфосфатальдолаза), что обусловливает неспособное
этих бактерий расти на сахарах. Множественные энзиматические бл
ки в путях центрального метаболизма (табл. 1.3.1) - отсутствие пир
ваткиназы, ФЕП-синтазы, пируватфосфатдикиназы, а-кетоглутарз
дегидрогеназы и ферментов глиоксилатного шунта у всех исслед
ванных облигатных метанотрофов и метилобактерий, наряду с фун
ционированием специализированных механизмов трансформащ
энергии, обусловливают их неспособность к росту на Сп-субстрат;
[Shishkina, Trotsenko, 1982; Trotsenko et al., 1987].
Фермент
Таблица 1.3
Множественные энзиматические дефекты
в путях центрального метаболизма облигатных метилобактерий
Путь Ci-ассимиляции
Сериновый
Г ексокиназа
6-Фосфофруктокиназа
АТФ
ФФН
Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза
КДФГ-альдолаза
Глюкозо-6-Ф-дегидрогеназа
Фруктозо-1,6-бисфосфатаза
6-Фосфоглюконатдегидрогеназа
Седогептулозо-1,7-бисфосфатаза
Пируваткиназа
П ируватдегидрогеназа
а-Кетоглутаратдегидрогеназа
Изоцитратлиаза
Малатсинтаза
ФЕП-синтаза
ФЕП-карбоксикиназа
Ф ЕП - карбо кс и л аза
Ф Е П-карбо кс итран сфосфо р и л аза
Пируватфосфатдикиназы
Пируваткарбоксилаза
Окончательный ответ на вопрос об истинных причинах облигатно-
сти метилобактерий могут дать сравнительные геномные и протеом-
ные исследования, позволяющие выяснить, какие из генов/ферментов
были “потеряны” в процессе эволюции или являются неактивными.
42
Глава 2
БИОРАЗНООБРАЗИЕ АЭРОБНЫХ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ
2.1. Облигатные и факультативные метилобактерий
Биологическое окисление метанола до углекислого газа в назем-
ных экосистемах вносит непосредственный вклад в химию атмосферы
(снижение эмиссии метанола и, как следствие, концентрации озона в
атмосфере) [Galbally, Kirstine, 2002]. Факторы окружающей среды,
контролирующие биологическое окисление метанола, не вполне по-
нятны. Так как этот процесс опосредован микробными сообществами,
состоящими из большого количества видов, биотические и абиотиче-
ские факторы ограничивают рост каждого отдельного вида специфи-
чески. Следовательно, эти факторы являются ключевыми параметра-
ми для понимания изменений в уровне окисления метанола в почве в
ответ на влияние окружающей среды, например характера и интен-
сивности землепользования в сельском хозяйстве [Kolb, 2009].
Наземные экосистемы являются главным источником атмосферно-
го метанола. Метанол вносит вклад в атмосферный пул химически
активных летучих органических веществ и приводит в действие меха-
низм образования тропосферного озона [Warneke et al., 1999; Galbally,
Kirstine, 2002]. В целом, 25 x 10*2 моль/г. метанола высвобождается из
мертвых растительных остатков и 3 х 101 моль/г. - живыми расте-
ниями. Однако только малая часть этого метанола поступает в атмо-
сферу: 4.9 х 1012 моль/г. Различие между продукцией и эмиссией ско-
рее всего возникает в результате окисления метанола в наземных эко-
системах. Основным источником атмосферного метанола является
эмиссия растениями (67% глобальной ежегодной продукции) [Gal-
bally, Kirstine, 2002]. Полимеры клеточных стенок растений, содер-
жащие пектин, деметилируются на протяжении роста растения, а
также при деградации пектина и лигнина. Метанол высвобождается в
результате химического и ферментативного деметилирования меток-
си-групп [Kolb, 2009].
Хорошо известно, что метанол является ключевым субстратом для
многих метилотрофов. Эта точка зрения подтверждается тем фактом,
что большинство почвенных изолятов аэробных метилотрофных бак-
терий (83%) утилизируют метанол. До сих пор не понятно, какое ко-
личество существующих в настоящий момент видов метилотрофов
способно использовать метанол in situ. Концентрация, при которой
бактерии растут в лабораторных условиях, находится в миллимоляр-
43
ном диапазоне, тогда как концентрации in situ, вероятно, значите
ниже. Тем не менее очень низкий уровень Кт МДГ у отдельных i
(например, Hyphomicrobium denitrificans) позволяет предполо:
что изоляты могут выживать при микро- и наномолярных конце
циях. В дальнейшем это необходимо исследовать более подро(
основательно [Kolb, 2009].
Метанолокисляющие организмы используют метанол в кач
источника углерода и энергии. Первая аэробная бактерия, окис
щая метанол (Bacillus methylicus), была описана Loew в 1892 г. <
пор было выделено большое количество новых видов. Ключ
ферменты и пути биосинтеза метилобактерий стали важными вс
сами биохимии и микробиологии. Метилотрофные прокариоты д
на метанотрофов и собственно метилобактерий. Начиная с XIX i
было описано 108 видов (40 родов) метилобактерий, относящих
Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, Verrucomicrobia, Firmicutes, z
nobacteria, Cytophagales. Аэробные метилобактерий в основном в<
факультативно-метилотрофный образ жизни (91%, 100 видов
только 9% облигатны в отношении одноуглеродных субстратов
танол, серо- или азотсодержащие С i-соединения) - Methylobaci
Methylophilus, Methylovorus, Methylophaga. Некоторые метилоба
рии не используют метанол. Эти организмы являются облигатн1
или факультативными метилотрофами, обладающими способное
утилизировать диметилсульфид, диметилсульфоксид, галомет
моно-, ди- и триметиламины, тетраметиламмоний, формамид. Од>
те же самые Ci-соединения также потребляются и некоторыми м
нолзависимыми бактериями [Kolb, 2009].
Кроме того, существует необходимость дополнительного иссл<
вания уже описанных гетеротрофных видов, так как способное!
аэробной метилотрофии недавно обнаружена у описанных ранее
jerinckia mobilis и Mycobacterium spp. Логично полагать, что спо<
ность использовать метанол в качестве источника углерода и энер
широко распространена среди гетеротрофных аэробных бакте)
Метилотрофные сообщества различных экониш анализируются с
пользованием биомаркеров [McDonald et al., 2008]. Разработаны n
тические маркеры, позволяющие детектировать метилобактерий: гс
протеобактериальной метанолдегидрогеназы, ферментов ТГМП-п)
(fae, mtdB, meh, fhcD), гены деградации хлорметана (спгиА) и дихл
метана (demA) [Vuilleumier et al., 2001; McDonald et a!., 2002; Q
toserdova et al., 2009]. Непосредственную взаимосвязь между асси'
ляцией Cj-субстрата и биоразнообразием позволяет установить и
топный анализ фосфолипидов, жирных кислот и нуклеиновых кисл
Этот подход применяется для обнаружения видов, которые актив
44
частвуют в потреблении меченого метанола в почвах [Lueders et al.,
2004; Kolb, 2009].
Результаты оценки почвенных сообществ микроорганизмов, по-
- метанол, с использованием биомаркеров, совпали с дан-
ными по разнообразию на уровне филумов, полученными методами
ринадлежат к Alpha-, Beta- и Gammaproteobacteria, Verrucomicrobia
С-метанола свидетельству-
требляющих
культивирования. Известные метилотрофы, выделенные из почвы,
принадлежат к Alpha-, Beta- и Gammaproteobacteria, Verrucomicrobia,
firmicutes, Actinobacteria. Результаты анализа изотопного состава
ДНК в экспериментах с использованием 13С-метанола свидетельству-
ют что такие филумы как Acidobacteria и Chloroflexi, также содержат
метилотрофных представителей [Lueders et al., 2004]. Однако эти но-
вые филотипы могли быть помечены в результате перекрестного ме-
таболизма. и относиться к ним следует с осторожностью. Тем не ме-
нее использование биомаркеров облегчает мониторинг метилотроф-
ных сообществ во времени и пространстве, позволяет проводить экс-
перименты, дающие информацию касательно влияния факторов ок-
ружающей среды на структуру этих сообществ [Kolb, 2009].
Известные виды метилобактерий в основном являются факульта-
тивными метилотрофами и строго аэробны. В аэрируемых почвах
(лесные и луговые почвы) и на границах раздела кислородных и бес-
кислородных зон в заболоченных почвах аэробные метилобактерий
являются ключевыми организмами, осуществляющими превращение
метанола. Изоляты факультативных метилобактерий тестировались
на разнообразных альтернативных субстратах с различным спектром
источников углерода в миллимолярных концентрациях. Однако в
почве концентрация растворенных источников углерода может быть
ниже, вплоть до микро - и наномолярной. Показано, что виды раз-
личных родов способны использовать обширный спектр субстратов.
Рост факультативных метилобактерий, как правило, обнаруживался
на следующих водорастворимых Сп-субстратах: моно-, ди- и полиса-
харидах (инулин, декстрин), полиолах, одноатомных спиртах (этанол,
бутанол, изхопропанол), глицерине, аминокислотах, моно-, ди- и три-
карбоновых кислотах, ароматических и других азот- и серосодержа-
щих соединениях. Обнаружено, что гифомикробы не разлагают саха-
ра до производных кислот и полиолов, в то время как представители
Xanthobacter, Paracoccus, Mycobacterium, Methylosulfonomonas methy-
lovora, Bacillus methanolicus и Amycolotopsis methanolica обладают
такой способностью [Kolb, 2009]. В 1995 г. была изолирована морская
бактерия Sagittula stellata - единственный документированный и опи-
санный вид целлюлозолитического метилотрофа [Gonzalez et al.,
1997а,Ь].
45
Большинство метилобактерий растут в условиях интенсивно*
снабжения кислородом. Однако количественные данные относител
но концентраций кислорода, используемых известными видами,
большинстве случаев недоступны. Способность использовать альте
нативные акцепторы электронов может служить преимуществом д.
определенных метилотрофов в почве, так как это позволяет им сохр
нять активность в аноксигенных условиях. Тем не менее 75% метши
бактерий - строгие аэробы. Единственным альтернативным акцепт
ром электронов является нитрат. Были обнаружены некоторые виде
денитрификаторы, например Paracoccus denitrificans, Hyphomicr
bium denitrificans. Многие почвенные изоляты не исследовались i
способность к диссимиляционной нитратредукции. Несмотря на су
ществующие вопросы, способность использовать нитрат в качеств-
альтернативного акцептора электронов - ключевой фактор, опреде
ляяющий, могут ли метилобактерии выжить при различных окисли
тельно-восстановительных условиях [Kolb, 2009].
Таблица 2.1.
Таксономическое и метаболическое разнообразие метилобактерий
Рибулозомонофосфатный путь
Сериновый путь
Рибулозо-
бисфосфатный
путь
Облигатные/
ограниченно-
'|акультативные
л-------------ж-------------------------------------------—
Methylophilus
Methylobacillus
Methylovorus
Methylophaga
Methylotenera
Факультативные
Mycobacterium
Bacillus
Arthrobacter
A cidomonas
Amycolatopsis
Burkholderia *
Факультативные
Факул ьтати вн ые
Methylobacterium
Hyphomicrobium
Aminobacter
M ethylorhabdus
Methylopila
Methylarcula
Methylosulfonomonas
Marinosulfonomonas
Labrys
Afipia
Methyloversatilis
Methylohalomonas
Granulibacter
Ruegeria (Silicibacter)
Xanthobacter
Paracoccus
Angulomicrobium
Ancylobacter
Albibacter
Beijerinckia
Methylibium
Hansschlegelia
Methylonatrum
Methylovirgula
* - в геноме присутствуют гены серинового пути
Исследование бактериальной метилотрофии ведется, чаще всего, с
быстрорастущими в лабораторных условиях и ставшими модельными
микроорганизмами. Основные концепции и постулаты метилотрофии
46
были сформулированы для Methylobacterium extorquens, Paracoccus
jenitrificans и Methylophilus methylotrophus. Знания, полученные при
изучении этих модельных организмов, использовали для первичной
классификации метилобактерий по функциональным и филогенетиче-
ским группам, таким как факультативные/облигатные и автотроф-
ные/гетеротрофные метилотрофы [Anthony, 1982], позиционирован-
ным в небольшое число таксонов протео- и актинобактерий. Основ-
ные таксоны аэробных метилобактерий представлены в табл. 2.1.1.
Недавние успехи в поиске и культивировании новых метилобакте-
рий, многие из которых растут в условиях in situ, привели к значи-
тельному расширению и углублению наших представлений о распро-
странении и филогенетическом разнообразии аэробных метилобакте-
рий. Описание определенных функциональных групп также подверг-
лось существенной ревизии. Понятие о метилотрофии, как свойстве
специализированных бактериальных групп, также изменяется, т.к.
выявляется все больше бактериальных групп, способных к метило-
трофии среди a-, ft- и y-Proteobacteria [Lidstrom, 2006; Boden et al.,
2008; Chistoserdova et al., 2009].
Метилобактерии с РМФ-путем. Грамотрицательные, облигатные
и ограниченно-факультативные метилобактерии представлены рода-
ми: Methylophilus, Methylobacillus, Methylovorus, Methylophaga и Me-
thylotenera. Из них только метилобактерии рода Methylophaga явля-
ются умеренными галофилами, некоторые представители ауксотроф-
ны по витамину В^. Несмотря на то, что современная систематика
метилобактерий основана на секвенировании гена 16S рРНК и ДНК-
ДНК гибридизации, хемотаксономические признаки и биохимические
свойства позволяют быстро провести предварительную идентифика-
цию новых изолятов до рода. У облигатных и ограниченно-факуль-
тативных метилобактерий (фосфо)триозы образуются через 2-кето-З-
дезокси-6-фосфоглюконатальдолазу (КДФГА-вариант).
Факультативные метилобактерии, реализующие РМФ-путь, пред-
ставлены грамположительными бактериями родов Arthtrobacter, My-
cobacterium, Bacillus, Amycolatopsis и одним родом ацидофильных
Неотрицательных метилобактерий - Acidomonas, Образование
(фосфо)триоз у них осуществляется в гликолитическом пути через
Фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазу (ФБФ-вариант).
Метилобактерии с сериновым путем делят на две подгруппы -
Изоцитратлиазоположительные (ицл+), т.е. имеющие изоцитратлиазу,
и изоцитратлиазоотрицательные (ицл~), у которых изоцитратлиаза
отсутствует. Ицл+-вариант серинового цикла реализуют образующие
гифы почкующиеся метилобактерии рода Hyphomicrobium и почкую-
щиеся метилобактерии рода Aminobacter, использующие метили-
47
Paracoccus kondratievae
W
Albibacter methylovorans
Methylopila capsulata
Methylobacillus pratensis
Xanthobacter
autothrophicus
Hyph от icrobium
chloromethanicum
Methylobacterium
extorquens
же
r
wSwWIWIo
aWP v v.
Methylobacillus pratensis
............. : ; . :
Рис. 2.1.1. Морфология клеток аэробных метилобактерий. а - негативное контра-
стирование, б - ультратон кие срезы, в - криоскалывание. Длина масштабной линейки
0.5 цт.
48
Xantobacter viscosus
Xantobacter viscosus
0.5 pin
0.5 pm
Mycobacterium |
methylovorum t
Angulomicrobium
tetraedrale
°ванные амины. Ицл~-вариант серинового пути реализуют розовоо-
рашенные представители рода Methylobacterium, а также бесцветные
1етилобактерии родов Methylorhabdus, Methylopila и галотолерантные
1етилобактерии рода Methylarcula. ЦРГ в ицл--сериновом пути не-
авно изучен у Methylobacterium extorquens AMI (см. главу 1).
Methylorhabdus multivorans °-5Hm
Рис. 2.1.1. (продолжение). Морфология клеток аэробных метилобактерий. а - нега
ивное контрастирование, б - ультратонкие срезы, в - криоскалывание
Methylarc и la marin а
tat
Ж:
Methylorfi&Jbdu
а multivorans^
Methylarcula marina
49
Метилобактерий с РБФ-путем являются факультативными mJ
лотрофами и, как правило, способны расти автотрофно в атмос’Л
Н2 + СО2 + О2. Зависят от биотина, получают энергию, окис!
С|-субстраты до СО2, который ассимилируют через цикл Кальви!
Некоторые представители имеют специфическую морфологию (р|
2.1.1). Например, бактерии родов Paracoccus и Albibacter предстан!
ны кокками, а виды рода Angulomicrobium обладают тетраэдралы!
симметрией клеток. Напротив, бактерии рода Xanthobacter характер
зуются плеоморфизмом клеток.
До недавнего времени способность к метилотрофии была извес!
для представителей только одного семейства p-протеобактерий - 1|
thylophilaceae, включающего облигатные или ограниченно-факу;
тативные варианты [Anthony, 1982; Lidstrom, 2006]. Описаны мети/
трофы, относящиеся к порядку Burkholderiales. Один из них — Methy
bium petroleiphilum, способный к биодеградации синтетического а
тилированного соединения — метил трет-бутилового эфира (МТБ'
принадлежит к семейству Comamonadaceae, активно растет на Mei
ноле, а также на широком спектре Сп-соединений, включая ар о мл)
ческие [Nakatsu et al., 2006]. Кроме того, метилотрофные представив
ли семейства Rhodocyclaceae порядка Burkholderiales, выделенные
древних и загрязненных экосистем, являются типично факультати
ними [Kalyuzhnaya et al., 2006а,Ь]. Метилотрофные представите
Burkholderiales биохимически также отличаются от Methylophilacei
о чем более подробно будет сказано ниже.
2.2. Метилотрофные микобактерии
Несколько видов рода Mycobacterium (Мус. flavescens, Мус. gastt
Мус. пеоаигит, Мус. parafortuitum, Мус. peregrenium, Мус. phk
Мус. smegmatis, Мус. vaccae и Mycobacterium sp. JC1) способны pact
на моноокиси углерода (СО) и метаноле как единственных источи!
ках углерода и энергии. В экстрактах клеток этих микобактерий, вь
ращенных на СО, найдены активности СО-дегидрогеназы и РубисЮ
У клеток, выращенных на метаноле, обнаружены активности ДМН/
зависимой МДГ, РубисКО, ГФС, а также диоксиацетонсинтаз
(ДОАС). Методом двойной иммунодиффузии выявлено, что антиге»
ные участки СО-дегидрогеназ, РубисКО и ДОАС у данных микоба?
терий идентичны [Park et al., 2003].
Результаты энзимологического анализа свидетельствуют о то*
что указанные виды микобактерий реализуют новую комбинаци!
путей первичного Сi-метаболизма, а именно РБФ- и КМФ-цикл
о типичных РМФ/серинового путей, при росте на метаноле. Это
ВМ ма интересное исключение из правила позволяет считать мико-
ВеС еоии первой таксономической группой прокариот, обладающих
шэАС ферментом первичной Ci-ассимиляции метилотрофных дрож-
ей [Pafk et а^’ 2003]. Справедливо, однако, напомнить, что впервые
Же?ИмОжность реализации транскетолазной реакции у метилотрофных
бактерий была постулирована Л. Затманом [Colby, Zatman, 1972;
1975]- Предстоит дальнейшая работа по выяснению вклада РБФ/
КМФ-путей в первичную ассимиляцию углерода метанола у микобак-
терий в зависимости от условий культивирования.
Непреложным фактом является то, что аэробные бактерии, при-
надлежащие к разным таксонам, совмещают способность к метило-
трофии и карбоксидотрофии. Это представляется крайне любопыт-
ным для выяснения/понимания механизмов резистентности их цито-
хромов к губительному действию СО. Возможно, такая способность
была приобретена посредством консервативной независимой эволю-
ции древних микобактерий, т.е. до того, как произошла их диверген-
ция. В то же время не исключена возможность возникновения, утраты
и повторной передачи этого признака путем генетического обмена.
Остается надеяться, что сравнительные геномно-протеомные иссле-
дования прояснят биохимическую суть и эволюцию метаболической
мозаики аэробных метилобактерий.
2.3. Метилотрофный актиномицет Amycolatopsis methanolica
Этот нокардиоподобный актиномицет, выделенный из почвы Но-
вой Гвинеи, первоначально назывался Streptomyces sp. 239, а затем -
Nocardia sp. 239 [Kato et al., 1974; Hazeu et al., 1983]. Развитие мето-
. ов таксономии актиномицетов привело к его реидентификации, ос-
нованной на хемо- и генотаксономических критериях. В отличие от
представителей рода Nocardia, клеточные стенки этого актиномицета
лишены миколовой кислоты и относятся к IV типу, имеющему мезо-
иаминопимелиновую кислоту, арабинозу и галактозу. Дальнейшие
Аемотаксономические и морфологические исследования, а также сек-
венирование 16S рДНК позволили отнести организм к новому виду
И^ycolatopsis methanolica [De Boer et al., 1990]. В связи с отсутствием
физиолого-биохимической информации об актиномицетах A. metha-
стал своеобразным модельным организмом, на котором были
проведены систематические исследования организации и регуляции
РгУтей метаболизма метанола и глюкозы [Alves et al., 1994].
50
51
Как отмечалось выше, у A. methanolica и Мус. gastri обнар
мультиферментный комплекс, катализирующий окисление метан
других первичных спиртов в соответствующие альдегиды с учас
кофакторов НАД(Ф)Н2 или МТТ и ДХФИФ [Hektor et al., 2000].
Ассимиляция формальдегида осуществляется в гликолитиче
варианте РМФ-пути. Соответственно, фосфорилирование фрук
6Ф является общим необходимым этапом путей метаболизма мет
ла и глюкозы у A. methanolica. Однако катализируется эта реа'
разными формами ФФК. Клетки, выращенные на глюкозе, обл -
только пирофосфатзависимой 6-фосфофруктокиназой (PPj-ФФК).
против, при метилотрофном росте клеток индуцируются ГФС, Ф1
АТФ-зависимая активность, полностью заменяющая PPj-ФФК [Z
et al., 1994; 2001].
Оба изофермента были очищены и охарактеризованы на биох|
ческом и молекулярном уровне как АТФ-ФФК-димер (2 х 50 к
тогда как PPj-ФФК - гомотетрамер с м.м. суъединиц 43 кДа. Из
кого сходства их аминокислотных последовательностей (24%) сл
ет, что эти белки не являются результатом дупликации гена PPj-<
pfp. Если PPj-ФФК близка другим аналогам актинобактерий, то А
ФФК наиболее близка ферментам из трипаносом и спирохет,
данные позволяют предположить появление у A. methanolica pfp г
кодирующего АТФ-ФФК, посредством латерального переноса.
Данный фермент имеет слабое сродство к фруктозо-бФ (6-10 м
зависимости от концентрации АТФ), в отличие от PPj-ФФК (0.4 м
Это может отражать специфическую роль АТФ-ФФК в РМФ-цикл
результате ассимиляции трех молекул ФА в РМФ-цикле образук
три молекулы фруктозо-бФ. Одна из них превращается АТФ-ФФ
ФБФ-альдолазой в две молекулы фосфотриоз - ГАФ и ДОАФ, гц
шественники пирувата и далее ацетил-КоА, поступающего в Ц
Остающиеся две молекулы фруктозо-бФ вместе со второй молеку.
ГАФ/ДОАФ используются трансальдолазой и транскетолазой для
генерации трех молекул акцептора ФА (рибулозо-5Ф) в реакциях i
рестроек. Чтобы обеспечить достаточную степень регенерации ри<
лозо-5Ф и функционирование РМФ-цикла, требуется необратим
фосфорилирование, катализируемое АТФ-ФФК, особенно при по«
шении внутриклеточного уровня фруктозо-бФ, т.е. во избежание р
роингибирования. Таким образом, регуляторные и кинетические св*
ства АТФ-ФФК A. methanolica точно соответствуют важной и спе<
фической роли в качестве фермента РМФ-цикла.
Учитывая способность актинобактерий к биосинтезу широк<
спектра вторичных метаболитов, голландской группой Л. Дайкхай
на были проведены биохимические и генетические исследования
52
.,егуляции синтеза ароматических L-аминокислот (фенилаланин, ти-
позин, триптофан). Итоги этой масштабной работы - создание пред-
ставительной коллекции мутантов с нарушенными этапами регуляции
синтеза ряда L-аминокислот и более четкое представление о механиз-
мах сверхсинтеза при выращивании A. methanolica на метаноле, глю-
козе или их смеси [Euverink et aL, 1996; Abou-Zeid et al., 1995].
2.4. Аэробные метилобактерии-десгрукторы галометанов
В последние годы все возрастающее внимание исследователей
привлекает проблема разложения персистентных биологически опас-
ных соединений, накапливающихся в окружающей среде вследствие
интенсивного промышленного производства и использования. Одной
из представительных групп таких поллютантов являются галометаны
(метилгалиды) - класс галогенированных производных метана, со-
держащих один или несколько галогенных заместителей (Cl, Br, I или
F). Это химически стабильные неполярные соединения с низкой тем-
пературой кипения. Известно около 30 различных галометанов, важ-
нейшими из которых являются метилгалиды (хлор- и бромметаны), а
также хлорфторметаны (фреоны). Галометаны синтезируются и ак-
тивно используются в промышленности в качестве растворителей и
хладагентов. Предполагается, что, реагируя со стратосферным озо-
ном, эти соединения обусловливают разложение озонового слоя. Для
основных представителей ряда метилгалидов - хлорметана (СН3С1) и
бромметана (СН3Вг), установлено, что их биогенное образование су-
щественно превышает химический синтез [Wackett et al., 1992; Butler,
2000; Goodwin et al., 2001].
Метилгалиды (МГ) - доминирующие галометаны в атмосфере.
Они играют важную роль в регуляции концентрации стратосферного
озона и, таким образом, более опосредованно в процессе глобального
потепления - двух факторах, обеспечивающих обитаемость планеты.
Хлор-, бром- и йодметан являются следовыми газами в атмосфере с
Достижением тропосферных соотношений в смеси 600, 10 и 2 ppt, со-
ответственно. Однако МГ, как активные светопоглотители, вносят
вклад в глобальное потепление, абсорбируя излучение в ИК-спектре.
Это свойство существенно для увеличения коэффициента их потен-
циального вклада в глобальное потепление (Global Warming Poten-
tial), рассчитанного для оценки эффекта от каждого соединения (на
основе масс) относительно той же массы СОг- Соединения с высоким
индексом GWP, включая присутствующие в низких концентрациях,
53
>
могут вносить значительный вклад в потепление атмосферы наравне
другими парниковыми газами с низким GWP.
Являясь основным природным источником галогенсодержащр
радикалов в стратосфере (на высоте >15 км), МГ участвуют в каталi
тическом разложении озона. Эти реакции вносят вклад в образовани<
“озоновых дыр”, которые появляются весной в верхних слоях атмЛ
сферы над полярными регионами [Solomon et al., 1986]. МГ частично
ответственны за постепенное снижение эффективного слоя озона, Bv
дущее к большей проницаемости атмосферы для УФ-излученш
UV-В. По существующей оценке, бромметан является источнике*-
более половины брома, находящегося в стратосфере, а хлорметан от-
ветствен, по меньшей мере, за 15% катализируемого хлором разложе-
ния озона [Montzka, Fraser, 2003; Сох et al., 2005].
Интенсивное промышленное производство и использование пер»
систентных галометанов привело к их накоплению в окружающей
среде. Отрицательным следствием этого является мутагенное и кан-
церогенное действие галометанов на живые организмы, а также ис-
тощение озонового слоя. Учитывая это, галометаны были отнесены к
категории веществ повышенной биоопасности. Производство и при-
менение разрушающих озон соединений с 1987 г. регулируются Мон-
реальским протоколом. Это международное соглашение обязывает
ведущие державы снижать эмиссию всех разрушающих озон соеди-
нений, что эффективно уменьшило влияние хлора и брома на атмо-
сферу. Галоны (бромированные соединения, используемые для борь-<
бы с огнем, огнегасители) и другие синтетические соединения стали
первыми, от применения которых постепенно отказываются, поэтому
их концентрации в атмосфере снижаются [Montzka, Fraser, 2003; Hurst
et al., 2006]. Концентрации бромметана также снизились, но проблема
сильно усложняется тем фактом, что только около 30% бромметана
имеет антропогенное происхождение и может контролироваться на-
прямую. Альтернативой снижению эмиссии галометанов может быть
разработка новых технологий их биодеградации на основе активных
штаммов и соответствующих ферментов-дегалогеназ [Leisinger, 1996].
Большинство МГ образуются поверхностью Земли. Большое вни-
мание привлекают увеличившиеся в последние 50-100 лет концен-
трация и потоки МГ в атмосфере (в частности, бромметана) в резуль-
тате изменений соотношения источников и стоков МГ. Бром- и хлор-
метан реагируют с атмосферными гидроксильными радикалами, и это
окисление представляет первичный механизм их удаления из тропо-
сферы. Баланс между образованием на поверхности Земли и разложе-
нием в тропосфере приводит к достаточному времени жизни этих МГ
в атмосфере: такому, что значительные их количества способны дос-
54
ть стратосферы, где они могут реагировать с озоном. Напротив,
Йодметан удаляется быстрее фотолизом в тропосфере и его более ко-
ткое время жизни ограничивает значение для разложения страто-
сферного озона> 0,час™ это происходит из-за химической реакцион-
ной О
дИД"-
ной способности МГ, которая увеличивается с атомным числом га-
лид-иона в ряду: фторметан < хлорметан < бромметан < йодметан.
Неясным, однако, остается общий бюджет МГ. В настоящее время
стоки бром- и хлорметана преобладают над источниками приблизи-
тельно на 35%. В целом бюджет йодметана сбалансирован, хотя име-
ются неточности в оценке океанических источников и стока путем
фотолиза [Montzka, Fraser, 2003; Сох et al., 2005].
Антропогенные источники. МГ синтезируют посредством реакции
кислот, содержащих галогены, с метанолом и биогазом. Антропоген-
ный бромметан используется как допосевной и послеурожайный фу-
мигант для зерновых культур во многих странах мира. Также он ис-
пользуется для обработки от вредителей и карантинной фумигации
транспортируемых товаров во всем мире. Кроме того, обработка
бромметаном может носить антитеррористический характер при де-
зинфекции почты, зданий и транспорта, зараженных спорами Bacillus
anthracis, хотя он намного ранее (с 1950-х гг.) повсеместно использо-
вался для обеззараживания шкур животных до их дубления. Йодметан
начинает заменять бромметан как фумигант почв, так как он менее
опасен для стратосферного озона. Хлор- и бромметан используются в
промышленности для производства других соединений, но их малая
часть попадает в атмосферу. Большая часть антропогенной эмиссии
МГ происходит из-за сгорания ископаемого топлива, в частности, уг-
ля в случае хлорметана и этилированного бензина в случае броммета-
на. Эти источники в целом сравнимы или меньше, чем поток в атмо-
сферу от сгорающей биомассы [Gan et al., 1997; Schaefer et al., 2007].
Природные химические источники и стоки. Фракция МГ создается
и разрушается в ходе химических процессов. Эта фракция может быть
большой, как в случае продукции йодметана в фотохимических реак-
циях на поверхности морской воды [Richter, Wallace, 2004]. Сущест-
венное количество хлорметана продуцируется в почве реакцией рас-
тительного пектина с неорганическим СГ [Hamilton et al., 2003]. Зна-
чительное, но неизвестное количество МГ образуется путем окисле-
ния органического материала в присутствии железа и галидов в почве
и осадках [Keppler et al., 2000]. В водных средах МГ трансформиру-
йся нуклеофильным замещением одного галида на другой, извест-
ным как обмен галидов [Lovelock, 1975; Zafiriou, 1975; Jeffers, Wolfe,
996]. Гидролиз - похожий химический процесс, включающий нук-
Ле°фильное замещение с водой или гидроксид-ионом, приводит к
55
удалению МГ и образованию метанола [Elliott, Rowland, 1995]. Значе-
ние этих абиотических реакций остается неоцененным, но они важн’ ।
для баланса МГ в почве и морской воде [Bill et al., 2002а,b; Baesman,
Miller, 2005].
Природные биологические источники. Безусловно, основная часть
МГ в атмосфере имеет естественное происхождение и является ре-
зультатом биологической активности на поверхности Земли. МГ про-
дуцируются рядом цианобактерий и морских водорослей, включая
фитопланктон и макроводоросли, а также наземными растениями и
грибами. У водорослей, высших растений и грибов метилирование
неорганического Вг” или СГ S-аденозилметионином для образования
S-аденозилгомоцистеина, бром- или хлорметана катализируется ме-
тилтрансферазами. МГ образуют большой ряд галофильных растений,
растущих в соленых болотах. Однако этот путь продукции не особен-
но эффективен при удалении избытка галидов. Скорее, продукция МГ
может быть простым метаболическим совпадением, происходящим,
из-за близости галид-ионов и метилтрансфераз в клетках растений.
Продукция МГ может дать конкурентное преимущество некоторым
микроорганизмам, в частности грибам, оказывая прямые антимикроб-
ные эффекты на их конкурентов/хищников или предоставляя субстрат
для биосинтеза вторичных метаболитов, облегчающих деструкцию
лигнина [Harper, 2000].
Хлорметан (CH3CI или метилхлорид) образуется при лесных по-
жарах и в результате вулканической деятельности, морскими водо-
рослями, некоторыми высшими растениями, лесными гнилостными
грибами и болотными микроорганизмами. Биогенное образование
CH3CI составляет 5 млн. т/г., а содержание в атмосфере достигает
2 г/м3. Полагают, что именно хлорметан обусловливает разложение до
15% озонового слоя стратосферы.
Аналог хлорметана — бромметан (СНзВг или метилбромид) — ши-
роко используемый в сельском хозяйстве пестицид-фумигант. Поток
СНзВг в атмосферу в результате окуривания (фумигации) растений
оценивается как 16-48 т/г., но в большей степени образуется фито-
планктоном, морскими водорослями, грибами и высшими растения-
ми, а также при горении органических соединений [Manley et al.,
1992; Saini et al., 1995]. Бромметан - основной источник ионов Вг~ в
атмосфере, которые в 50-60 раз активнее, чем СГ, разлагают озон.
Появление Антарктической “озоновой дыры” отчасти (20-25%) свя-
зывают с реакцией хлор- и бромметана со стратосферным озоном.
Дибромметан (СН2Вг2 или метиленбромид) в основном образует-
ся морским фитопланктоном и высшими растениями, а также синте-
зируется химически и используется в качестве растворителя. Время
56
хими-
и СН2ВГ2 вдвое короче (4 месяца), чем СН3Вг (10 месяцев), что
я<и менее вероятным попадание ионов ВГ в стратосферу. Однако
де петучие короткоживущие соединения могут достигать больших
эТИо1 Действительно, дибромметан был обнаружен вблизи тропо-
1И" пы и в нижней стратосфере, что указывает на возможное участие
гН Ви в разрушении стратосферного озона. Атмосферная нагрузка
г омметанами контролируется балансом их источников и стоков. Ис-
точники бромметанов - природные и антропогенные, а стоки - хими-
ческие и биотические.
В отличие от вышеуказанных галогенпроизводных метана, ди-
хлорметан (ДХМ, CH2CI2) является антропогенным загрязнителем
оКружающей среды, поскольку эмиссия этого поллютанта в атмосфе-
ру преимущественно обусловлена его использованием. Он также яв-
ляется распространенным компонентом городских и индустриальных
стоков [Line et al., 1997; Andreae et al., 2001; Harper, 2000; Worton et
al., 2006]. Промышленное применение ДХМ связано с его физически-
ми и химическими свойствами, такими как низкая температура кипе-
ния (40еС), высокая растворимость в воде (около 20 г/л, т.е.
235 мМ), относительная инертность и низкая температура замерзания
(_97°С) [MacKay et al., 1993]. ДХМ используется в качестве хладаген-
та (фреон-30, хладон-30), растворителя для химиического синтеза в
фармацевтической промышленности (30%) и удаления лакокрасоч-
ных покрытий (19%). Благодаря способности снижать горючесть, вяз-
кость и давление паров, ДХМ входит в состав аэрозолей (9%), а также
применяется при производстве термопластиков, синтетических воло-
кон, фотопленки и для экстракции чувствительных к нагреванию ве-
ществ (пищевые жиры, кофеин). При этом промышленное производ-
ство этого соединения путем термического, каталитического или фо-
толитического хлорирования СН4 или СН3С1 достигает 3 х 10 т/г.
[Keene et al., 1999; Winterton, 2000]. Ранее было предположено суще-
ствование таких природных источников ДХМ, как вулканическая дея-
тельность и синтез de novo в природных процессах [Isidorov, 1990;
Urhahn, Ballschmiter, 1998; Winterton, 2000; Дембицкий, Толстиков,
2003]. Однако пока нет экспериментальных данных, подтверждающих
эту гипотезу.
Поскольку в водных системах период полураспада ДХМ составля-
ет до 700 лет, а в атмосфере - 70 суток, он считается одним из основ-
ных загрязнителей воды и атмосферы. Относительно короткое время
Разложения CH2CI2 в атмосфере, по виртуальным оценкам, может
ныть обусловлено реакцией с гидроксильными радикалами в тропо-
сфере и образованием СО, НС1 и Н2О [Dhillon, Von Burg, 1995; Line et
ak 1997; Law, Sturges, 2006]. Однако вклад ДХМ в глобальные уровни
57
этих газов может быть незначителен. Кроме того, отсутствуют диЛ
зательства участия ДХМ в образовании озона в нижних слоях атщИ
сферы, формировании фотохимического смога и процессе глобальЛ
го потепления [Houghton et а!., 1992; Martin, 1995; Worton et al., 20 в
Высокая токсичность ДХМ для млекопитающих, напротив, ста»
вится весьма актуальной проблемой. Показано, что этот мутаген «
щшает образование опухолей печени и легких у мышей и крыс. Г1
результатам токсикологических тестов ДХМ отнесен также к чело J
ческим канцерогенам. Обнаружено, что длительный контакт персон!
ла с CH2CI2 приводил к различным профессиональным заболеваний
[Green, 1997; Thier et al., 1998]. При концентрации ДХМ 10 мг/л >!
блюдали нарушение биологического режима водоемов [Dhillon, Vj
Burg, 1995]. 1
Природные биологические стоки. Потребление МГ, по-видимом!
большей частью происходит в биологических процессах на земн J
поверхности. В анаэробных осадках, содержащих свободный суля
фид, бром- и хлорметан могут химически трансформироваться в м!
тантиол или диметил сульф ид, которые являются субстратами ,гц!
сульфатредуцирующих бактерий и метаногенных архей [Oremland J
al., 1994b]. Однако некоторые анаэробные зоны находятся на поверя
ности Земли в прямом контакте с атмосферой, поэтому основнья
биологические стоки для атмосферных МГ существуют в аэробюш
эконишах. Показано, что океаны являются стоком атмосферное!
бромметана, и биологическая активность в океанах ответственна <1
часть его потребления [Lobert et al., 1995; Pilinis et al., 1996]. I
Измеряли потоки углерода в присутствии антибиотиков для , J
монстрации связи глобального потребления бромметана из тропосфл
ры с метаболической активностью аэробных бактерий, живущих !
исследуемых почвах [Shoerter et al., 1995]. Эти результаты BnepBJj!
показали биологическое потребление бромметана из реальных троп-ч
сферных смесей с концентрацией около 10-12 ppt. Затем было вы<
двинуто предположение, что сродство окислительных ферментов I
этим редким следовым газам не проявляется ниже некоторого noport
коцентраций около 100 ppb.
Описан широкий спектр микроорганизмов, способных к деградя
ции галометанов (рис. 2.4.1). Хлор- и бромметан успешно использ1>
вались в экспериментах с накопительными культурами, в результат;
был выделен ряд бактериальных культур, способных расти на МГ
Они были выделены из ряда экониш, включая сельскохозяйственные
лесные и промышленно загрязненные почвы, активные илы, донны;
осадки озер, образцы эстуарной и морской воды, что предполагав
повсеместное распространение МГ-использующих бактерий в окру-
58
аюшей среде [McAnnulla et al., 2001а]. Бактерии, растущие на МГ,
* шей частью являются представителями a-Proteobacteria, но так-
е принадлежат к y-Proteobacteria и Actinobacteria.
^золяты из активных илов. О бактериальном росте на хлорметане
качестве единственного источника углерода впервые сообщалось
0 Hyphomicrobium sp. СМ1, который был выделен из активного ила,
о вскоре утерян [Hartmans et al., 1986].
0.02
89r Ancylobacter dichloromethanicus DM16
_ t— Ancylobacter aquaticus
j — Starkey a novella
Gottschalkia methylica DM15T
----Methylorhabdus muttivorans DM13T
Xanthobacter agilis
— Blastochloris viridis
— Methylosinus trichosponum
- Methylocystis echinoides
100 — Methylococcus capsulatus
100f
100
100
100
100
84
100
100
100
Albibacter methyiovorans DM10
1QQt Methylopila helvetica DM9
— Methylopila helvetica DM6
- Methylobacterium radiotolerans
Methylobacterium organophilum
Methylobacterium rhodinum
Methylobacterium rhodesianum
Methylobacterium zatmanii
Methylobacterium chloromethanicum CM4T
Methylobacterium extorquens DM17
Methylobacterium dichloromethanicum DM4
Methylobacterium extorquens AM1T
------------Hyphomicrobium chloromethanicum CM2T
76< Aminobacter aminovorans
00 ’ Aminobacter ciceronei IMB-1T
Aminobacter lissarensis CC495T
Rhodovulum sulfidophilum
Rhodobacter sphaeroides
— Leisingera methylohalidivorans MB2T
------Roseobacter denitrificans
- Paracoccue kocurii
Paracoccus solventivorans
Paracoccus aminophilus
Para coccus thiocyanatus
— Paracoccus denitrificans
100p Paracoccus varsutus
’------ Paracoccus methylutens DM12T
----Paracoccus aminovorans
----Paracoccus alcaliphilus
----Alcaligenes faecalis
Methylobacillus flagellatus
1 oo r— Methylophilus methylotrophus
Methylophilus leisingeri DM11T
100
88
96
100
190
77
a
Рис. 2.4.1. Филогенетическое положение аэробных деструкторов галометанов, ос-
н°ванное на сравнении нуклеотидных последовательностей 16S рДНК. Цифрами по-
юзана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью
Wotstrap’’-анализа 100 альтернативных деревьев
59
Изоляты из почв и питьевой воды. Десять штаммов Hypha
crobium и Methylobacterium были выделены из загрязненных почв
территории Нижнекамского нефтехимического завода, а также
почвы Алуштинского дендрария [Доронина и соавт., 1996; Doronin:
al., 1996; McDonald et al., 2001]. Эти штаммы реализовали серинов
цикл и были способны расти на хлорметане в качестве единственж
источника углерода и энергии с использованием неизвестной индуг
бельной ферментной системы деградации хлорметана.
Затем из почвенных образцов были выделены другие факулы
тивные метилотрофы, способные к деградации МГ. Штамм IME
выделенный из почвы земляничного поля южной Калифорнии, об*
ботанного фумигантом бромметаном, вначале был идентифицироб
как близкий родственник членов рода Rhizobium. Он был выделен
использованием бромметана как единственного источника углерода,
нергии [Miller et al., 1997]. Высокая токсичность бромметана бц
преодолена путем дробного внесения бромметана в низких конце
трациях в газовую фазу (обычно около 0.5%) в течение периода инк
бации. Похожую стратегию использовали для демонстрации рос
этого изолята на йодметане. Близкий изолят, росший на хлорметан
штамм СС 495, был получен из лесных почв Северной Ирландии. Э
штаммы были охарактеризованы как новые виды рода Aminobacter
A. ciceronei 1МВ-1 и A. lissarensis СС 495 [Connell Hancock et al., 199
Coulter et al., 1999; McDonald et al., 2005]. Дополнительно штамм
Hyphomicrobium были выделены из ряда лесных почв, а также из до
ных осадков озер. Показано, что изолят Ps. aeruginosa NB1 способен
деградации хлорметана в аэробных и денитрифицирующих услови,
[McAnnulla et al., 2001а; Freedman et al., 2004; Schaefer et al., 2007].
Морские метилгалидиспользующие штаммы. Несмотря на ва>
ность морской среды как стока в глобальном цикле МГ, было выдел
но лишь несколько морских штаммов, растущих на МГ. Хотя штам
Hyphomicrobium был выделен из эстуария Северн в Великобританг
[McAnnulla et al., 2001а], гифомикробы не являются типичными мо
скими бактериями. Таким образом, выделенный из приливы;
отливной зоны Калифорнийского побережья Leisingera methylohalid
vorans МВ2 может рассматриваться как первый морской штамм, р.м
тущий на бромметане [Goodwin et al., 1998]. Штамм МВ2 был oxapai
теризован как факультативный метилотроф, относящийся к ветР
Roseobacter - группе распространенных в морской воде прокарич
[Gonzales, Moran, 1997; Schaefer et al., 2002]. 13 других факультативн
метилотрофных штаммов, растущих на бромметане, отнесенных
Roseobacter, были выделены из проб грунта и воды Шотландског
побережья и Английского канала. Эти штаммы идентифицирован!
60
три вида Roseobacter, близких видам рода Roseovarius и Ruegeria
Schaefer et al., 2005].
r дальнейшем бромметан-использующие штаммы были выделены
йз морской воды, но не идентифицированы. Один из этих изолятов
шгамм LIS-3) слабо рос на бромметане, а другой (штамм FV) соокис-
пял бромметан, но не мог расти на этом соединении [Hoeft et al.,
2000]. Аналогично отнесенный к Sphingomonadaceae штамм Оху6
ко метаболизирует бромметан. Этот штамм выделен из накопительной
культуры с толуолом, а потребление бромметана, по-видимому, было
кометаболическим и ингибировалось толуолом [Goodwin et al., 2005].
При анализе сельскохозяйственных почв для идентификации ак-
тивных популяций МГ-использующих бактерий успешно использо-
вался ДНК-SIP с хлор- и бромметаном. Легкие и тяжелые фракции
градиента ДНК, экстрагированные из почвенных микроорганизмов,
которые экспонировали с 13С-меченными хлор- и бромметаном, для
которые экспонировали с
исследования биоразнообразия анализировали с использованием
ДГГЭ-фрагментов бактериальных 16S рДНК и секвенированием кло-
нированных 16S рРНК генов [Miller et al., 2004].
Функциональное разнообразие МГ-использующих микроорганиз-
мов изучали путем анализа генов стиА в библиотеке клонов. ДГТЭ-
анализ тяжелых фракций ДНК выявил различные фингерпринты (от-
печатки) сообществ для микрокосмов, экспонированных с хлор- и
бромметаном. Следовательно, популяции, деградирующие эти суб-
страты in situ, различаются. Из этих наблюдений также следовало, что
CmuA-путь участвует в деградации хлор- и бромметана. Поскольку не
все МГ-деструкторы способны к росту на хлор-, бром- и йодметане,
предполагалось, что бактерии дифференцированно используют эти
субстраты, имеющие различную токсичность. Анализ библиотек кло-
нов 16S рРНК генов тяжелой фракции ДНК не выявил совпадений
последовательностей с таковыми известных изолятов, использующих
МГ, таких как Methylobacterium, Hyphomicrobium и Aminobacter. До-
минирующие типы последовательностей, восстановленных из тяже-
лой фракции ДНК почвенных микрокосмов после экспозиции с
бромметаном, были отнесены к Burkholderia.
Напротив, доминирующие клонированные последовательности в
тяжелой фракции ДНК почвенных микрокосмов, инкубированных с
хлорметаном, отнесены к Rhodobacter, Lysobacter и TVbcardioides.
Дальнейшие фенотипы детектировали в обоих микрокосмах, однако
обнаруженное в библиотеках клонов разнообразие было больше в
почвенных микрокосмах, инкубированных с хлорметаном, по сравне-
нию с обработанными бромметаном, вероятно, вследствие большей
токсичности последнего [McAnnulla et al., 2001а].
61
Показано, что доминирующие типы МГ-использующих бактери
сельскохозяйственных почвах могут отличаться от известных и
тов. Предполагается, что филогенетическое разнообразие МГ-испод
зующих бактерий не ограничивается штаммами, выделенными в чи
тые культуры. Также анализировали разнообразие стиА-генов в i
желой фракции ДНК. Последовательности стиА, полученные в SI
эксперименте, отнесены к четырем различным филогенетичесю
группам. Причем гены первой группы имели сходство с стиА
A. lissarensis СС 495, второй - были менее родственны последов
тельностям стиА из видов Aminobacter, а третьей - принадлежали
глубоко разветвленным последовательностям. Четвертую груш
представлял единственный клон, имеющий сходство с последоь
тельностями стиА видов Hyphomicrobium. Большее общее разноо
зие
16S рДНК библиотек,
чем таковое для
библиотек
клонов
ст и,
может быть отнесено к определенным отклонениям в последовател
ностях праймеров, разработанных на основе стиА-генов из изолято
представленных только a-Proteobacteria. Таким образом, они мог)
оказаться неэффективными для амплификации дивергентных сти
[Miller et al., 2004]. Более того, некоторые из МГ-использующих п
пуляций, обнаруженные в библиотеках генов 16S рРНК, могут име1
альтернативные пути деградации МГ.
ДНК-SIP применяли также для анализа разнообразия хлормета»
использующих популяций различных почв. Подход S1P был дополна
обогащением и выделением хлорметан-деградирующих бактер
Несколько изолятов, идентифицированных секвенированием 16
рРНК генов, оказались близкородственными Aminobacter и Mezorhi
zobium. Большинство изолятов, однако, были идентифицированы К4|
виды Hyphomicrobium. Разнообразие стиА также было проанализиро
вано с использованием ДНК, экстрагированной непосредственно и
почвенных образцов, накопительных культур и 13С-меченной ДНК
SIP-экспериментах.
Основная группа последовательностей стиА относилась к ветви
которая не имела культивируемых представителей и включала клони
рованные стиА последовательности, полученные из метагеномно»
ДНК окололесных, лесных и садовых почв, а также клоны стиА и
накопительных культур, инокулированных садовой почвой. Последо
вательности стиА, близкие таковым Aminobacter, были идентифици
рованы в ДНК накопительных культур из садовой почвы и ДНК, экс-
трагированной из лесных почв.
Другая ветвь состояла из последовательностей стиА видов Ну-
phomicrobium и близких последовательностей, детектированных ь
ДНК из садовой почвы, а также последовательностей из библиотек
нов тяжелой фракции ДНК из SIP-экспериментов с лесными поч-
К ив качестве доминирующего типа стиА. Удивительно, что после-
В ятельности других доминирующих клонированных с/имА-генов из
тяже пой фракции SIP-экспериментов оказались близки таковым, по-
ученным из накопительных культур прибрежных морских экосистем
Английского канала с бромметаном [Schaefer et al., 2005]. Дальней-
шие последовательности стиА из почв, идентифицированные SIP,
аналогичны таковым морского изолята Roseovarius sp. 179, но не-
сколько менее близки последовательностям стиА из SIP-экспери-
ментов с почвами [Miller et al., 2004].
Эти результаты свидетельствуют о том, что гифомикробы активны
в специфических почвах и преобладали в условиях, используемых в
экспериментах. Другие доминирующие типы хлорметаниспользую-
щих бактерий (обнаруженные прямым клонированием и секвенирова-
нием, а также SIP-экспериментами) необходимо выделить из почв,
идентифицировать и охарактеризовать на физиологическом уровне.
Высокое сходство последовательностей стиА из морских накопи-
тельных культур и изолятов, а также некоторых cwuA-генов, детекти-
рованных ДНК-SIP в почвах, стало неожиданным и интересным на-
блюдением.
Относительно мало известно о разнообразии МГ-использующих
бактерий в морской воде. До настоящего времени их идентификация
обычно ограничивалась выделением штаммов, способных к росту или
кометаболизму бромметана [Goodwin et al., 1998; 2005; Hoeft et al.,
2000; Schaefer et al., 2002; 2005]. Так, L. methylohalidivorans MB2,
Ruegeria sp. 198 и Roseovarius sp. 179 и sp. 217 были отнесены к ветви
Roseobacter [Buchan et al., 2005], но использование МГ не является
главной чертой этой группы. Анализ разнообразия генов стиА, полу-
ченных ПЦР-амплификацией, клонированием и секвенированием
ДНК, экстрагированной из образцов морской воды и МГ-деградирую-
Щих накопительных культур, выявил дополнительные некультиви-
руемые бактерии [Сох et al., 2005]. Показано, что бромметан может
разлагаться в морских средах такими бактериями, как Sphingomonas
SP- Охуб, которые соокисляют бромметан с использованием фермен-
та, ингибируемого толуолом [Goodwin et al., 2005].
Интригующим аспектом является обнаружение близкородствен-
ных последовательностей гена стиА в лесных почвах и морских изо-
лятах. Пока не доказано функционирование у некоторых морских изо-
лятов дополнительных ферментов первичного метилотрофного мета-
°лизма. Следовательно, МГ являются единственными Ci-субстра-
тами, поддерживающими рост штаммов Roseovarius sp. 179 и Ruegeria
SP- 198. Дальнейшее секвенирование геномов МГ-использующих изо-
63
лятов может помочь ответить на вопрос: развились ли пути дегра,,
ции МГ первично в земных или морских экосистемах? Тот факт, ч
ряд известных генов, вовлеченных в деградацию МГ, эволюцион,
близок генам, кодирующим ферменты Ci-метаболизма у метаногс
ных архей, подчеркивает важную роль горизонтального переноса г
нов в диверсификации и распространении ферментов/генов метаГ
лизма МГ [Schaefer et al., 2007].
Приобретение и удержание генов утилизации МГ, возможно, дд
селективное преимущество организмам в экосистемах, где образуй
ся МГ (морская вода, почвы, ризо- и филлосфера). Маловероятно, ч
МГ-использующие организмы могут жить при атмосферных уровн
бромметана [Hoeft et al., 2000]. Поскольку тропосферные ypoei
бромметана охотно потреблялись A. ciceronei IMB-1 и L. methylohi
divorans МВ2, факультативные метилобактерий могут использова
МГ как дополнительные источники углерода в почвах и морских ср
дах. Таким образом, потребление МГ будет снабжать клетки допо
нительной энергией (и может потенциально также приводить к асе
миляции углерода), когда они используют другие ростовые субстрат
[Goodwin et al., 2001]. Это не исключает возможность существоваш
в окружающей среде микрозон с более высокими концентрация»^
МГ, способными поддерживать рост. Такие микрозоны могут быт»
почвах в непосредственной близости к МГ-продуцирующим грибам
растениям или в филлосфере морского фитопланктона, образующе
бромметан.
Как известно, С-С1 связь дихлорметана трудно расщепляется аби
генно. Биодеградация ДХМ, напротив, происходила как в почвах, т
и в активных илах и водоемах в аэробных и анаэробных условиях,
начала 1980-х гг. из почв и вод Нидерландов, Германии и Швейцари
загрязненных алифатическими хлорированными углеводородами, б1
ло выделено более десятка штаммов, способных к деградации ДХМ
использованием различных ферментных систем [Brunner et al., 19N
Osterman-Golkar et al., 1983; Gaelli, Leisinger, 1985; Scholtz et al., 1983
McDonald et aL, 2002; Vuilleumier, Pagni, 2002; Krausova et al., 2003].
Большинство аэробных деструкторов ДХМ являются грамотриц
тельными факультативными метилобактериями родов Hyphotnicr>
bium (штаммы DM2, KDM2, KDM4, GJ21, LZ и др.), Methylobacteriu
(DM4) и Methylopila (DM1, DM3, DM5-9), использующими ДХМ
качестве источника углерода и энергии [Stucki et al., 1981; Ottengraf
aL, 1986; Janssen et aL, 1991; Leisinger, 1996; Zyber et aL, 1997; Doro.
ina et aL, 2000b]. Детально охарактеризованы 13 штаммов, относ:
щихся к «- и ft-Proteobacteria и реализующих сериновый, РМФ- ил
РБФ-пути. Эти штаммы составили основу уникальной коллекци
64
бнык деструкторов ДХМ и являются представителями 11 новых
в аэробных метилобактерий, в том числе трех новых родов:
Та hvlorhabdus, Methylopila, Albibacter и семи новых видов: Methy-
МCferiutn dichloromethanicum, Methylopila helvetica, Methylorhabdus
° Itivorans, Me thy lophilus leisingeri, Paracoccus methylutens, Albibacter
,thvlovorans, Ancylobacter dichloromethanicus [Доронина, Троценко,
1Q94- Доронина и соавт., 1996а; Троценко, Доронина, 2003; Doronina
et al 1995; 1998; 2000b; 2001 ’ 2005’ Firsova et aL, 2009L
Сведения о широком распространении, филогенетическом разно-
образии аэробных деструкторов ДХМ (см. рис. 2.4.1), а также биогео-
химические данные подтверждают гипотезу о том, что способность к
разложению этого ксенобиотика развивается в природной популяции
вследствие длительного селективного воздействия и не является свой-
ством. присущим определенной группе метилобактерий [Ottengraf et
al. 1986; Goodwin et al., 2001; McDonald et al., 2002; Турова и соавт.,
2001].
2.5. Аэробные метилобактерии-деструкторы S-метилсоединений
Наиболее распространенными серосодержащими С [-соединениями
являются диметилсульфид, диметилдисульфид, диметилсульфоксид,
метантиол, метансульфоновая кислота, диметилсульфон, сероуглерод
и карбонилсульфид (рис. 2.5.1). Важнейший из них - диметилсульфид
(CH3)2S, (ДМС), образуется преимущественно при разложении диме-
тилсульфониопропионата (СНз)25+СН2СН2СОО-, (ДМСП), синтези-
руемого морскими водорослями в качестве осмопротектора. Поверх-
ностные зоны океанов насыщены диметилсульфидом, который обра-
зуется также микроорганизмами в болотах и морских осадках. Гло-
бальное образование диметилсульфида оценивается в ~70 млн. т S/r.
В результате фотохимического окисления из ДМС образуются метан-
сульфоновая кислота (CH3SO3OH) и диметилсульфон CH3SO2CH3,
(ДМСО2). Метансульфоновая кислота - стабильное соединение, кото-
рое не подвергается фотохимическому разложению, а возвращается с
Дождем и снегом в водные и почвенные экосистемы. Анализ льда в
Антарктике и Гренландии выявил глобальные запасы метансульфоно-
в°и кислоты, накопленные в течение многих тысячелетий [Kelly,
Murrell, 1999; Moosvi et al., 2005a,b].
Сероуглерод (CS2) образуется растениями и микроорганизмами из
различных предшественников в почвах, болотах, океанах, а также при
загрязнении почв вискозными волокнами и целлофаном. Ежегодная
ЗИ(,генная эмиссия CS2 в атмосферу оценивается в 5 млн. т S/r. и еще
65
1 млн. т CS2 имеет промышленное происхождение. CS2 фотохимр
ски окисляется в атмосфере до карбонилсульфида (OCS). Этот
образуется также биогенно со скоростью 3 млн. т S/r. в болота
влажных почвах из цистеина как предшественника. В высоких к
центрациях OCS присутствует в поверхностных водах океанов. У,
новлено, что основные продуценты карбонилсульфида - расте.1
при этом возможно участие микрофлоры филло- и ризосферы [Ь
nenberg, 1989].
CH3-S-S-CH3
Диметилдисульфид
CH3-S-CH3
II
О
Аутоокисление
в атмосфере
25-70%
I CH ,SO3CH~|
Метансульфоновая
кислота
Диметилсульфоксид
Окислениев
атмосфере
2.5-10%
| СНз-5-СНэ~|
Диметилсульфид
Морские водоросли,
цианобактерии,
болотные растения -
50 млн. т/год
- CH3-SO2-CH3
Диметилсульфон
| 2-8 млн. т/год |
' (CH3)2-S+-CH2-CH2-COOH
Диметилсульфониопропионат
I
CH3SH
Метантиол
(метил мерка птан)
Фитопланктон, морские водоросли,
водные и наземные растения
I Бактерии
CS2
Сероуглерод
| Болота и почвы I
| Фотохимическое
s=c=o
Карбонилсульфид
окисление
Биогенное образование в
океанах, во влажных
почвах из цистеина,
растениями - 3 млн. т/год
Рис. 2.5.1. Серосодержащие С|-соединения и их превращения в природе
Многие почвенные бактерии, способные образовывать метант
(CH3SH), содержат S-аденозилметионинзависимую тиолметилтра
феразу, метилирующую сульфид с образованием метантиола. Ди
66
упьфид образуется бактериями родов Lactobacter, Alcaligenes,
Tl4J1C nebacterium, Streptomyces и Pseudomonas. Механизм образования
неясен, но должен включать окислительную конденсацию двух
молекул метантиола.
Принимая во внимание роль, приписываемую ДМС, по влиянию
химию атмосферы и климат, интересно понять факторы, контроли-
НаюШие поток ДМС в атмосферу. В поверхностных слоях морской
воды концентрация ДМС определяется, в основном, скоростью обра-
зования из ДМСП. Водно-воздушный транспорт ДМС зависит от гид-
рологических и метеорологических параметров, например, скорости
ветра и действия волн. ДМС также фотохимически окисляется в по-
верхностных слоях воды до ДМСО. Хотя большие количества ДМС
образуются в верхнем слое океанов, только небольшая часть ДМС
достигает атмосферы, в то время как основная масса (-90%) разруша-
емся в смешанном поверхностном слое благодаря микробиологиче-
ским процессам, включая использование в качестве источников С и S,
либо биодеградацию до ДМСО.
Первые представления о микробиологии деструкторов ДМС были
получены в начале 1970-х гг. после выделения штаммов тиобацилл из
сосновой коры биофильтра, используемой для удаления пахучих со-
единений (H2S, CH3SH, ДМС и ДМДС) из стоков целлюлозно-бумаж-
ного производства в Финляндии. Затем были выделены штаммы Thio-
bacillus и Hyphomicrobium, которые росли на ДМС как источнике уг-
лерода. С тех пор был выделен широкий спектр бактерий-деструк-
торов ДМС из различных источников, включая почвы, ризосферу рас-
тений, активный ил, биофильтры, морскую воду, культуры морских
водорослей, осадки из морей и пресноводных водоемов, микробные
маты, подошвы ног и зубной налет людей [Sivelae, Sundman, 1975; De
Boat et al., 1981; Kanagawa, Kelly, 1986; Suylen, Kuenen, 1986; Smith,
Kelly, 1988; Pol et al., 1994; Schaefer et al., 2010].
Дальнейшие исследования существенно расширили спектр таксо-
нов бактерий, использующих ДМС и другие S-метилсоединения, ко-
торые раньше ограничивались гифомикробами и тиобациллами
[Suylen, Kuenen, 1986; Smith, Kelly, 1988]. Разнообразие культивируе-
мых деструкторов ДМС все еще препятствует описанию основных
закономерностей их распространения. Почти очевидно, что истинная
степень филогенетического разнообразия деструкторов ДМС еще не
определена или из-за неподходящих условий культивирования, или
из-за способности деградировать ДМС в качестве фенотипического
свойства, редко проверяемого даже при исследовании метилобакте-
Рии. Весьма вероятно, это связано с малопривлекательной работой со
столь неприятно пахнущим соединением.
67
Способность деградировать ДМС обычно не сохраняется с J
близкородственных видов, т.е. нет четкой корреляции филотиЛ
фенотипа. Это, в основном, препятствует активному применению
роко используемого независимого от культивирования подходЛ
основе рибосомной РНК для изучения ДМС-деградирующих мик I
ных популяций в природе. Тем не менее ряду исследователей уд-.J
показать их наличие с использованием 16S рРНК зондов в морЛ
накопительных культурах, относящихся к роду Methylophaga [VI
Costa et al., 2006; Schaefer, 2007]. I
Популяции родственных бактерий были обнаружены в SIP-экJ
риментах с |3С-ДМС на ДМСП-образующем цветении фитопланк-1
Etniliaria huxleyi в Английском канале [Neufeld et al., 2008]. Даль.ч|
шее применение SIP позволит улучшить определение филогенетя
ского разнообразия ДМС-деградирующих микробных популяция
природных образцах, хотя этот подход может выявить только шт|
мы бактерий, ассимилирующие углерод ДМС. Поэтому для карти|
вания разнообразия и активности деструкторов ДМС требу юге,. 1
полнительные методы, нацеленные на ключевые ферменты мет”1
лизма данного соединения. Это потребует нового понимания пу|
метаболизма на молекулярном уровне, включая изучение биохими!
генетики модельных организмов, чтобы получить представления
ферментах и генах, вовлеченных в деградацию ДМС у ряда изолят]
Молекулярные методы, нацеленные на функциональные гены mJ
болизма ДМС, не только прояснят характер распределения дестр!
торов ДМС в природе, независимо от возможности культивировал
но также выявят специфические микробные популяции для цел J
правленного выделения чистых культур. Детальное изучение мoдvJ
ных организмов, соответствующих природным условиям, доллс
оказаться полезным для описания физиологических ответов дестрч
торов ДМС и реализации их метаболического потенциала в постоял
изменяющихся природных условиях. I
Многие из известных ДМС-деградирующих бактерий способ!
расти на ряде субстратов. Например, ДМС-деградирующие виды Ч
thylophaga растут на метаноле и метилированных аминах, присущ
вующих в морской среде в концентрациях 50-250 нМ в тропичесы
широтах Атлантики. Эти концентрации близки или немного преч
шают уровни ДМС и обычно находятся в низкой наномолярной q
ласти [De Zwart et al., 1996; Kettle et al., 1999; Williams et al., 2!4
Schaefer, 2007]. Присутствие нескольких ростовых субстратов моЖ
оказывать важное воздействие и вызывать физиологические и тран
крипционные ответы деструкторов ДМС в этих условиях, что требу
дальнейшего изучения. ।
68
дМС"ДегРаДиРУющие бактерии широко распространены в приро-
НО нет полного понимания их филогенетического и функциональ-
но разнообразия. Развитие и применение функциональных генных
зондов на основе ключевых ферментов метаболизма ДМС и других
г -соединений приведет к расшифровке принципов распространения
еструкторов ДМС в природе и позволит детально исследовать роль
деструкторов ДМС в контроле потоков испаряющейся в атмосферу
серы. Таким образом можно будет оценить их вклад в метаболизм
связанных органических сульфосоединений и возврат неорганической
серы в окружающую среду.
Бактериальный метаболизм ДМС влияет на поток ДМС в атмосфе-
ру, и, следовательно, на состав атмосферы и глобальный климат. Ус-
тановление филогенетической принадлежности деструкторов ДМС в
природе и идентификация путей, используемых бактериальными по-
пуляциями для удаления ДМС из водной толщи, поможет определить
регуляцию окисления ДМС морскими бактериями. Это приведет к
лучшему пониманию сложных микробиологических процессов, уча-
ствующих в контроле потока серы из океанов в атмосферу, и окажет-
ся полезным в улучшении перспектив моделирования эмиссии ДМС
из морей и будущих климатических сценариев [Schaefer et al., 2010].
2.6. Аэробные метилобактерии-деструкторы метилацетата, МТБЭ
и других этерифицированных оксигенатов
Метилацетат - метиловый эфир уксусной кислоты — применяют
как растворитель при приготовлении лаков, пленок, клеев, ацетил- и
нитроцеллюлозы, растворов различных смол. Это летучее высокоток-
сичное и химически устойчивое при нормальных условиях соедине-
ние содержится также в стоках ацетальдегидного производства. Нами
выделены 10 штаммов грамположительных и грамотрицательных
бактерий, использующих метилацетат в качестве источника углерода
и энергии. Два наиболее активных штамма, Pseudomonas esterophilus
27RD и Pseudomonas esterovorus 24RA, утилизируют данный субстрат
в концентрации 2 г/л за 24 и 36 ч, соответственно. Оба штамма обла-
дают карбоксилэстеразой (КЭ), катализирующей гидролиз эфирной
связи метилацетата с образованием метанола и ацетата. Ps. estero-
Philus 27RD имеет индуцибельные дегидрогеназы метанола, ФА,
формиата и ГФС (ключевой фермент РМФ-цикла). Ацетат ассимили-
руется обеими культурами через ЦТК и глиоксилатный шунт.
Интересно, что у Ps. esterovorus 24 RA нет МДГ (ФМС, НАД+), но
найдена небольшая активность алкогольоксидазы, что не характерно
69
для бактерий, поскольку этот фермент обычно присутствует у мел
лотрофных дрожжей. Выявлены также дегидрогеназы ФА (HAJ
GSH), формиата (ФМС) и индикаторные ферменты серинового пу;
Однако наиболее активным деструктором метилацетата является •]
культативный метилотроф Ps. esterophilus 27RD, реализующий п
колитический вариант РМФ-пути и использующий одновременно о;
продукта гидролиза метилацетата. Напротив, Ps. esterovorus 24R
ассимилирует ацетат активнее, чем метанол, причем последний ц
степенно накапливается в среде и подавляет рост культуры (ри
2.6.1). Низкая скорость усвоения метанола обусловлена слабой акти
ностью алкогольоксидазы. Ингибирующий эффект метанола снимч
ся при внесении клеток облигатной метилобактерий Мethylobacilli
methanolovorus. В результате ассоциативная культура утилизировав
5 г/л метилацетата за 36 ч [Rakov et al., 1990; Раков и соавт., 1991]. I
СНз-С
РМФ-цикл~|
Pseudomonas
esterophilus 27 RD
ОСН3
НАД’
нсно ———► нсоон
‘Аме \'
СНзСООН
Ацетил-КоА
СНзОН
СО2
АО
О2~^г\АО
Н2о2 НСНО —---------► нсоон
и НАД (GSH)
ФМС
цтк,
глиоксилатный
шунт
Сериновый
цикл
Pseudomonas
esterovorus 24RA
Рис. 2.6.1. Пути метаболизма метилацетата у Pseudomonas spp. 27RD и 24RA [М
kov et al., 1990] 1
Метил-третичный бутиловый эфир (МТБЭ) и его аналоги широка
применяются для оксигенирования бензина. Интенсивное использ**
вание этих соединений в последние два десятилетия привело к зч
грязнению среды в результате утечек и разливов. Высокая раствор*!
мость в воде, неприятный запах и потенциальная канцерогенное^
этих поллютантов представляют серьезную угрозу для источнике^
питьевой воды. Следовательно, насущной задачей является понима
ние метаболической судьбы эфирных оксигенатов и разработка эф
фективных мер против загрязнения биосферы.
70
о эТ0М отношении перспективным подходом является микробио-
ическая деградация, однако МТБЭ и его структурные аналоги ока-
зались весьма устойчивыми, что обусловлено наличием эфирной свя-
и третичного С-атома. Тем не менее многолетние интенсивные по-
иски привели к выделению нескольких деструкторов МТБЭ - Ме-
thylibium petroleiphilum РМ1, Hydrogenophaga flava и Mycobacterium
austroafricanum. Несмотря на это, их численность даже в загрязнен-
ных местах довольно низкая, что может быть связано с длительным
периодом полураспада МТБЭ и его основного интермедиата — тре-
тичного бутанола [Mueller et al., 2008].
Метил-шрет-бутиловый эфир
Г идроксиметил-трет-
бутиловый эфир
нсоон
СН2О
СО2
Tpem-бутиловый спирт
1
I
Метилен-ТГФ
»
I
t
Сериновый цикл
РМФ-, РБФ-пут’
2-гидрокси- ----2-гидрокси-
изобутират изобутирил-КоА
Пируват
3-гид роке и*
бутирил-КоА
Изопропанол 2,3-дигидрокси-2- Метакрилил-КоА
метилпропионат :
1 I I
I I
1 I I
Рис. 2.6.2. Пути метаболизма МТБЭ Methylibium petroleiphilum РМ1
Согласно энзимологическим и геномным данным, в окислении
МТБЭ до СОг участвуют более 30 ферментов, а первичная Сi-асси-
миляция осуществляется РБФ- и сериновым путями, в составе кото-
рых также несколько десятков ферментов (рис. 2.6.2). Логичен во-
прос: каким образом за 20 лет - довольно короткое для биохимиче-
скои эволюции время - бактерии смогли решить проблему минерали-
зации столь сложного соединения? Очевидно, ответ на этот принци-
пиальный вопрос может быть получен с помощью функциональной
Ген°мики, протеомики и биоинформатики.
71
Глава 3
ГЕНЫ И ФЕРМЕНТЫ ПЕРВИЧНОГО СрМЕТАБОЛИЗМА
У АЭРОБНЫХ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ
3.1. Пути первичного окисления метанола
Большинство грамотрицательных метилобактерий окисляют мета
нол до ФА классической метанолдегидрогеназой (МДГ
К.Ф. 1.1.99.8), кофактором которой является пирролохинолинхино!
(PQQ) (рис. 3.1.1). Классическая МДГ, впервые найденная у Methylo
bacterium sp. М27, представляет собой тетрамер а2р2, состоящий и:
двух больших (60-67 кДа) и двух малых (8.5 кДа) субъединиц, двуз
молекул PQQ и одного атома Са2+ [Anthony, Zatman, 1964; Anthony
1992]. Этот фермент окисляет первичные спирты (Cj-Cs) и формаль
дегид, активируется аммонием или метиламином, имеет оптимул
pH - 9. Использует in vitro в качестве акцептора электронов феназин
метосульфат (ФМС), феназинэтосульфат (ФЭС) или другие искусст
венные акцепторы (2,6-дихлорфенолиндофенол, ДХФИФ), но н<
НАД(Ф)+. In vivo электроны передаются на цитохромы отипа (см
ниже). МДГ и оба цитохрома с локализованы в периплазме, что свя
зано с токсичностью формальдегида - продукта реакции. Максималь
ное содержание МДГ
белка [Anthony, 1982].
в клетке может достигать 50% растворимог
Рис. 3.1.1. Структуры окисленного (а) и восстановленного (б) PQQ
ноос
соон
В совокупности, для образования активной периплазматической
МДГ необходимы: синтез и транспорт PQQ, а также препептидов дл:
а- и Р-субъединиц, сборка этих белков в периплазме, изомеризации
пролинов, образование дисульфидных связей, введение Са2+ и PQQ
закручивание p-цепей вокруг а-субъединиц и сборка ар-субъединиц i
а2р2-тетрамер (рис. 3.1.2). Кластеры /иох-генов наиболее детально ис
следованы у М. extorquens AMI и Paracoccus denitrificans. Ген mxaF
1
72
уЮщий большую субъединицу МДГ, весьма консервативен, по-
коДиР работанные праймеры позволяют детектировать этот белок у
офных бактерий различного таксономического положения
[Bastien et al., 1989; Anthony, Williams, 2003].
Рис. 3.1.2. Экваториальные взаимодействия PQQ и координация Са“+в активном
сайте МДГ [Anthony, 2004; Williams et al., 2005]. Предполагается, что Asp3O3 и Arg331
в основании активного сайта могут быть вовлечены в механизм реакции
У Ps. esterovoru ^обнаружена минорная активность неспецифиче-
ской алкогольоксидазы [Rakov et al., 1990], окисляющей метанол, со-
гласно уравнению: СН3ОН + О2 —> НСНО + Н2О2.
Из грамположительной термотолерантной метилобактерий Bacillus
methanolicusCA выделена и очищена до гомогенного состояния уни-
кальная МДГ, проявляющая активность относительно С1-С4 первич-
ных спиртов исключительно с НАД+ [Dijkhuizen, Arfman, 1990]:
СН3ОН + НАД+ -> НСНО + НАДН2.
Фермент состоит из 10 идентичных субъединиц (43 кДа), каждая из
них^ содержит по одному атому Zn2+ в активном центре, два атома
^8 и прочно (но не ковалентно) связана с НАДН2 (кофактором),
который не высвобождается при катализе. Кроме того, для активно-
сти декамеру требуется экзогенный НАД+ (кофермент) в качестве
первичного акцептора электронов, а также белок-активатор, состоя-
ний из двух субъединиц (27 кДа) [De Vries et al., 1992; Hektor et al.,
2000].
У других грамположительных метилобактерий - Amycolato,
methanolica и Mycobacterium gastri MB 19, окисление метанола кат*]
зирует метанол: М,ЬГ-диметил-4-нитрозоанилин оксидоредукт
(MNO) [Bystrykh et al., 1993; 1997]. Формула кофактора представж
на рис. 3.1.3. Предполагали, что НАД+-зависимая МДГ связана с к
плексом ферментов из PQQ-содержащей МДГ, НАДт-зависимой ф
мальдегиддегидрогеназы и НАДН2-дегидрогеназы, что делает в»,
процесс Ci-окисления зависимым от НАД+ [Duine et al., 1984].
Рис. 3.1.3, Трехмерная структура гомодекамера N,N Чдиметил-4-нитрозоани
оксидоредуктазы (1): а - вид сверху, б - сбоку с широкой стороны, в - сбоку с узь
стороны. 2. Структура кофактора М,ЬГ-диметил-4-нитрозоанилина (ДМНА)
Дальнейшие исследования показали, что MNO (49 к,]
(К.Ф. 1.1.99.-) сходна с НАД+-зависимой МДГ Bacillus methanolic
(К.Ф. 1.1.1.244) - также содержит ионы металлов (Zn2+ и Mg2+)
прочно, но не ковалентно, связана с НАДФН2 (кофактором), котор'
не высвобождается во время катализа. Однако НАД не является пм
вичным акцептором электронов и не обнаружен белок-активат-
Вторым компонентом этого мультиферментного комплекса являет
высокомолекулярный белок (>650 кДа), состоящий из двух субъед
ниц по 44 и 72 кДа, обладающий НАДН2-дегидрогеназной активн-
стью с ДХФИФ или 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетраъ
лий бромидом (МТТ) в качестве акцептора электронов. Третьим ко-
понентом служит низкомолекулярный белок (15 кДа) со свойствам!
близкими, но не идентичными НАД+-коферменту [Hektor et al., 2000)
У Ps. putida F61 при выращивании на метаноле не удалось обнар
жить активности МДГ и МОХ, хотя рост стимулировался добавлен
ем формиата. Установлено, что этот штамм имеет никотинопротеин
вую формальдегид дисмутазу, катализирующую реакцию:
СНзОН + НСООН -> 2 НСНО + Н2О.
Фермент является гомотетрамером (4 х 44 кДа), каждая субъедини)
содержит 1 моль нековалентно связанного НАДН2 и 2 моля Zn2+.
Активность МДГ до недавнего времени рассматривалась как ва?
ный атрибут метилотрофного роста, а наличие этого фермента дес.
тилетиями считалось признаком метилотрофии. Гены, кодирующи
74
.-шпицы МДГ (mxaFГ) и акцептор электронов - цитохром с
были вначале идентифицированы у М. extorquens, а затем об-
7 /жены у большинства модельных метилобактерий вместе с до-
Н нительными генами, кодирующими функции, необходимые для
теза активной МДГ, генами биосинтеза кофермента PQQ и регуля-
рными генами [Lidstrom et а!., 1994; Anthony, 2004; Lidstrom, 2006].
Поскольку ген mxaF весьма консервативен у охарактеризованных ме-
тилобактерий, именно он использовался для их детекции в природе
[Dumont, Murrell, 2005а,Ь].
1 однако некоторые недавно идентифицированные метилобактерии,
принадлежащие к порядку Burkholderiales, по-видимому, лишены ге-
нов mxaFI, а свойства частично очищенных ферментов, ответствен-
ных за активность МДГ, несколько отличаются от таковых, прояв-
ляемых типичным ферментом, кодируемым дихаГЛгенами. Предпола-
гается. что они состоят из одного типа субъединиц, имеющих высокие
значения pl, и требуют для активности высокомолярный буфер. По-
иск в геноме последовательностей, кодирующих эти полипептиды
(Mdh2), выявил гены этих ферментов у Burkholderiales. Кодируемые
полипептиды (Mdh2) имели низкое сходство (<35%) с полипептидом
MxaF, но были близки (до 80% идентичных аминокислот) к другому
классу хорошо охарактеризованных PQQ-зависимых алкогольдегид-
nuaFL а свойства частично очищенных ферментов, ответствен-
рогеназ, имеющих низкое сродство к метанолу.
Эта находка расширила возможности детекции метилобактерий в
природе и продемонстрировала, что способность использовать мета-
нол распространяется за пределы популяций, обладающих маркерным
mxaF геном. Кроме того, сравнение последовательностей показало,
что новая группа ферментов МДГ не детектировалась существующи-
ми пробами на mxaF и могла быть ошибочно аннотирована как алко-
гольдегидрогеназы в геномных базах данных. Это открытие также
важно для понимания эволюции ферментов окисления метанола,
предполагающей конвергенцию белков MxaF и Mdh2 к функции
окисления метанола [Kalyuzhnaya et al., 2008а]. Кстати, у Мethylо -
phaga sp. найдены две изоформы МДГ, однако они не охарактеризо-
ваны на генетическом уровне.
3.2. Пути первичного окисления метилированных аминов
Метилированные амины или восстановленные формы органиче-
ского азота ([CH3]nNHx) образуются в природе как побочные продук-
Гы разложения белков [Lee, 1988; Neff et al., 2002]. Эти соединения
ЯВляются важными интермедиатами метаболизма растений, образую-
75
щих кофеин, теанин и теобромин, а также служат центральными к
понентами синтеза и распада таких осмолитов, как глицин/бет^
нролин/бетаин и N-окись триметиламина у морских животных, га
фильных водорослей и прокариот [Konishi et aL, 1972; Oren, 1>
Brad et al., 2002; Yamamoto et al., 2007]. Первичные амины образую
в результате разложения белков, аминокислот и некоторых алктл
дов, присутствуют в растительных и животных тканях как норм
ные продукты азотного обмена. Например, неприятный запах пор
щейся рыбы обусловлен образованием метилированных аминов. К
ме того, они образуются в анаэробных матах цианобактериями. >
тиламин играет значительную роль в деятельности и нарушен!
центральной нервной системы людей. Этот простейший алифати
ский амин обнаружен в человеческой моче со средним ежедневн
выведением ~12 мг.
Метилированные амины - общие предшественники в органа
ском синтезе, поэтому они повсеместно используются в химическ
фармацевтической, каучуковой/ резиновой промышленности, а так
в производстве пластиков, красителей, текстиля, косметики и мет
лических изделий.
Обычно в первичных экосистемах метилированные амины прис
ствуют в низких концентрациях, вероятно, благодаря быстрой мик
биологической деградации. Однако ситуация изменяется, когда
точники метиламинов преобладают. Основными глобальными ист
никами выделяемых метиламинов являются океаны (0.6 Тг/г N), ж
недеятельность животных (0.15 Тг/г N) и сжигание биомас
(0.06 Тг/г N). В ряде случаев, например в кормоцехах, концентра!
метиламинов могут варьировать от 20 до 280 ppmv и превышать у
вень NH3 в воздушных массах. Метиламины могут накапливатьс
осадках, подземных водах и почвах, богатых органикой, в результ
гидролиза N-метилкарбаматных пестицидов, используемых повсе-
стно. Однако относительно мало известно об экологической суд1
этих соединений, что делает актуальным понимание глобальных ц
лов метиламинов. Микробиологическое окисление метиламинов
ляется важным компонентом биосферных циклов С и N, а также
шественным этапом в предотвращении образования метана, втор<
после СОп важнейшего парникового газа, но с более чем в 25 раз п
восходящим эффектом.
Установлено, что способность использовать метиламины в каче
ве источников С, N и Е широко распространена у микроорганизм
Известны три основных класса ферментов, катализирующих окис,
тельный распад N-алкильных связей алифатических аминов: окси,
зы, дегидрогеназы и монооксигеназы [Троценко, Логинова, 19
76
Bamforth, 1988]. Рассмотрим распространение и основные
окислительных ферментов у метилобактерий, использую-
третичные, вторичные или первичные метилированные амины в
честве источников углерода, азота и энергии.
> (CH3)3NO + НАДФ+ + H20.
l>arge’
свойства
щИ*
К3 Окисление триметиламина. Обнаружены два способа окисли-
ельных превращений триметиламина до формальдегида и диметила-
1ина‘ оксигеназный и дегидрогеназный. Aminobacter aminovorans
кистяет триметиламин в N-окись триметиламина при участии
ыдДФНт-зависимой монооксигеназы (К.Ф. 1.14.13.-):
(CH3)3N + О2 + НАДФН2 + Н+ (CH3)3NO + НАДФ+ + Н2О.
фермент, катализирующий эту реакцию, отличается от монооксигена-
зы вторичных аминов слабой чувствительностью к цианиду и СО, в
неочищенном экстракте теряет половину активности за 20 мин при
35°С. Обладает широким спектром действия, окисляет третичные и
вторичные амины, но отсутствует у бактерий, выращенных на сукци-
нате, диметиламине или метиламине. Продукт монооксигеназной ре-
акции, N-окись триметиламина, деметилируется соответствующей
альдолазой (К.Ф. 4.1.2.32): (CH3)3NO
Монооксигеназный механизм окисления триметиламина обнару-
жен у метилобактерий родов Arthrobacter, Bacillus, Aminobacter. Два
способа окисления триметиламина реализуют гифомикробы, имею-
щие также специфическую дегидрогеназу (К.Ф. 1.5.8.2), использую-
щую ФМС или другие красители в качестве акцептора электронов:
(CH3)3N +Н2О + ФМС
Если монооксигеназный механизм является аэробным, то дегидро-
геназный может функционировать в отсутствие кислорода при уча-
стии терминального акцептора, способного взаимодействовать с ци-
тохромной цепочкой. Это позволяет гифомикробам расти на аминах и
осуществлять денитрификацию при разных значениях рО2.
Окисление диметиламина. Многие метилобактерий окисляют
диметиламин соответствующей монооксигеназой, использующей
НАД(ф)Н2 в качестве донора электронов (К.Ф. 1.14.99.-):
(CH3)2NH + НАД(Ф)Н2 + О
> (CH3)2NH + нсно.
(CH3)2NH+ НСНО + ФМСН2.
(CH3)2NH + НАД(Ф)Н2 + О2 CH3NH2 + НСНО + НАД(Ф)+ + Н2О.
Диметиламинмонооксигеназа Aminobacter aminovorans содержит фла-
вин и негемовое железо, использует для деметилирования вторичных
аминов чувствительный к СО гемопротеид со спектральными свойст-
вами, напоминающими функционально активный цитохром Р-420.
1 ифомикробы. растущие при низких значениях рО2, окисляют
Диметиламин дегидрогеназой, отличающейся по ряду свойств от три-
Метиламиндегидрогеназы A. aminovorans (К.Ф. 1.5.8.1):
(CH3)2NH + Н2О + ФМС CH3NH2 + НСНО + ФМСН2.
77
Окисление метиламина. В 1970-х гг. было обнаружено, чт I
тиламин может использоваться либо путем прямого окисления до I
с помощью МАДГ (у грамотрицательных бактерий) или МА(1
грамположительных бактерий), или через опосредованные п!
включающие перенос метильных групп на аминокислотные ост<
(глутамат, аланин или их кетоаналоги) с последующим окислен!
соответствующих N-метилированных аминокислот [Eady, Large, 11
Троценко, Логинова, 1979; Lidstrom, 2006]. 1
Периплазматическая МАДГ (К.Ф. 1.4.99.3) катализирует реакций
CH3NH2 + Н2О + ФМС -> NH3 + НСНО + ФМСН2 + Н2О.
МАДГ — первый хинопротеин, природа которого была определ
рентгеноструктурным анализом, является а2р2 гетеротетрамер
(м.м. субъединиц 40 и 13 кДа) с тринтофантриптофилхиноном (Т1
в качестве простетической группы (рис. 3.2.1). Геномика фермеч
прямого окисления метиламина - МАДГ и МАО, изучена детально
М. extorquens AMI, Mb. flagellatus KT, Mph. methylotrophus и Pa. ..’J
trificans идентифицированы 14 таи генов, 8 из которых необходи1
для роста на метиламине [Zhang et al., 1993; Van der Palen et al., 1J
Gak et al., 1997; Langley et al., 2006; Chistoserdova et al., 2003; 2tlp
От МАДГ электроны передаются на голубой Си ^-содержащий бег
амицианин и далее, через цитохромы cL и сн, - на цитохромоксидаз1
(а) (б)
Рис. 3.2.1. Структуры окисленного (а) и восстановленного (б) TTQ
У Arthrobacter globiformis обнаружена мембрансвязанная М;
(К.Ф. 1.4.3.4), катализирующая реакцию:
CH3NH2 + О2 + Н2О -» НСНО + NH3 + Н2О2.
Фермент содержит Си2+ и ковалентносвязанный PQQ.
Принципиально иные первичные механизмы метаболизма амин
с промежуточным образованием N-метилпроизводных глутамата р
лизуют метилобактерий родов Aminobacter, Hyphomicrobium, Methy
phaga, Methylarcula и некоторые виды рода Methylobacteria
(рис. 3.2.2-3). Этот двухстадийный механизм получил название N-.'
тилглутаматного (N-МГ) пути. В то время как некоторые метилоб:
терии проявляют относительно высокие активности ферментов N-M
пути в присутствии функциональной МАДГ, у других метилобак
78
- не имеющих МАДГ, этот путь считается основным для окисле-
РйИ’ Метиламина [Shaw et al., 1966; Bamforth, Large, 1977a; Chlumsky et
н.ИЯ|995; Kalyuzhnaya et al., 2006b].
РМФ
цикл
АТФ
N-МГ синтаза
N-метилглутамат
N-МГ дегидрогеназа
у-ГМА синтетаза
NH3
у-ГМА лиаза
у-Глутамилметиламид
сн2о -► нсоон—► со2
Сериновый
цикл
рис. 3.2.2. Пути первичного метаболизма метиламина у аэробных метилобактерий
АДФ + Фн [*CH3NH3
АТФ
СООН
CO-NH-*CH3
(СН2)2
(СН2)2
CHNH2
СООН
L-глутамат
chnh2
NH;
СООН
СООН
у-глутамилметиламид
L-глутамат
СООН
N-метилглутамат
(СН2)2
CH-NH-*CH3
Рис. 3.2.3. Путь окисления метиламина у некоторых аэробных метилобактерий 1 -
' ГлУтам ил метилам ид синтетаза; 2 - у-глутамилметиламид : глутаматметиламин
Рансфераза; 3 - N-метилглутаматдегидрогеназа
Е<СнО|
79
В качестве первичных продуктов фиксации клетками 4С-ме
амина образуются N-метилглутамат и у-глутамилметиламид. Соот
ственно, при росте клеток на среде с метиламином индуциру:
N-метилглутаматсинтаза (К.Ф. 2.1.1.21) и у-глутамилметиламидси
таза (К.Ф. 6.3.4.12). В опытах с бесклеточными экстрактами ряда
тилобактерий показано, что синтаза включает CH3I5NH2, зам<.
аминогруппу глутамата, с образованием N-метилглутамата и NH3:
CH3NH2+HOOC-(CH2)-CHNH2-COOH -►
-> HOOC-(CH2)2-CH-NH-CH3-COOH + NH3.
N-метилглутаматдегидрогеназа (К.Ф. 1.5.99.5) катализирует оки*
тельный распад N-метилглутамата до глутамата и формальдегида:
HOOC-(CH2)2-CH-NH-CH3-COOH -►
HOOC-(CH2)-CH-NH2-COOH + нсно.
Фермент прочно связан с клеточными структурами и прояв
активность in vitro только с ФМС или феррицианидом как акцепт
ми электронов. Стехиометрия реакции и восстановление цитохро
b w с при окислении N-метилглутамата указывают на то, что ферь/
ассоциирован с дыхательной цепью и участвует в образовании АТ’
Еще один фермент, у-глутамилметиламидсинтетаза, катализиг
реакцию:
CH3NH2 + глутамат + АТФ —* у-глутамилметиламид + Н2О + А
В отличие от метилобактерий родов Methylophaga и Methylarc
у представителей Methylobacterium и Hyphomicrobium, реализую!
N-метилглутаматный путь, не удалось выявить активность у-глу
милметиламидлиазы, катализирующей превращение у-глутамил?
тиламида до СН2О и глутамата (рис. 3.2.4). В то же время в опыт ’,
меченным 14С по аминометильной группе у-глутамилметилами
показано, что метильная группа переносится с у-ГМА на
глутамат
образуется N-метилглутамат, который далее окисляется дегидроги
зой до глутамата и ФА. Последний поступает в ассимиляционные .
ти, а глутамат вновь используется в качестве акцептора CH3NH2. С.
довательно, N-метилпроизводные глутамата служат переносчик?.'
метильных групп метиламина в сериновый или РМФ-пути.
МАДГ интенсивно исследовалась, включая идентификацию уча»,
вующих генов и их функции [Davidson, 2004], тогда как генети
N-метилглутаматного пути окисления метиламина до недавнего в;
мени оставалась неизвестной. Первое генетическое подтвержден
потенциальной важности у-глутамилметиламида в качестве интерн
диата метаболизма метиламина было получено при очистке у-гЛ
тамилметиламидсинтетазы (ГМАС) из продуцента теанина Methyl
vorus mays No.9. Этот фермент проявлял высокую активность с м< г
ламином, но не аммонием, и индуцировался в присутствии метилам
80
г Yamamoto et al., 2007; 2008]. Функцию этого и других генов, свя-
- с метаболизмом метиламина, изучали у Methylov ersatilis uni-
al is FAM5, активно растущего на метиламине, но лишенного
на
Занных
МДГ [Kalyuzhnaya et al., 2006].
^Глутамилметиламид CH3NH2
г синтаза
АТФ Глутамат Глутамат
АДФ, Фн
у-Глу та м ил мети л а м ид
N-Метилглутамат
синтаза
NH4
Н-Метил глутамат
фад; тгф J
ФАДН2
Глутамат
Н2С=ТГ
Burkholderia phymatum
Methylobadllus flagellatus
Pseudomonas mtndodna
TMomlarospIra crunogena
Mdhylovenatllis universalis
Ы-метилглутамат
дегидрогеназа
PurU
Н2О
СНО-ТГФ
Н2О
ТГФ
purU
НСООН
mgdA В
D gma mgsA В
w
Рис. 3.2.4. Предполагаемые функции N-метилглутамат синтазы, у-глутамиламид
синтетазы и N-метилглутамат дегидрогеназы в окислении метиламина и кластеры
генов, кодирующих ферменты этих путей [Chistoserdova et al., 2009]
Недавно были идентифицированы генетические детерминанты
ключевых ферментов N-МГ-путии получены первые доказательства
ег° функционирования у использующих метиламины р- протеобак-
81
терий Burkholderia phymatum и Mb. jlagellatus KT. Поскольку у
следнего присутствует также активная МАДГ, N-МГ-путь, по-вц
мому, играет роль в балансе аммония при росте на метиламине,
добно ГС/ГОГАТ синтазному пути у Methylotenera mobilis [Gak et
1997; Bosch et al., 2009; Chistoserdova et al., 2009].
Показано, что рост на метиламине кодируется восьмигенным .
стером. Первые 4 гена (mgdABCD) проявили умеренную гомолсм
последовательности с опероном саркозиноксидазы (soxBDAG) и
дируют N-МГДГ. Хотя скорости окисления саркозина N-МГДГ .
раз ниже скорости окисления N-МГ, эти ферментные системы им.
некоторое сходство в каталитических параметрах. Показано, что
лая субъединица (MgdA) существенна для окисления N-МГ, тогда
большая субъединица (MgdC), вероятно, переносит С|-единицы
ТГФ. Фермент Mv. universalis FAM5 во многих отношениях нап'
нает гетеротетрамерную саркозиноксидазу. Будучи сложным мул*
субъединичным ферментом, принадлежащим к семейству флави
вых аминоксидаз, требует НАД в качестве кофермента, имеет п|
сказанный участок связывания с ТГФ и, видимо, образует мети.'
ТГФ как конечный продукт окисления аминометильной группы.
На основании предсказанного состава субъединиц (44, 100, 1
10 кДа) N-МГДГ отличается от ранее очищенных и охарактеризо4
ных ферментов из Ps. aminovorans и Pseudomonas sp. МА, кото;
были предсказаны как гомотетрамерные (м.м. субъединиц ~130 к
интегральные мембранные белки [Hersh et al., 1971; Bamforth, La
1977b; Boulton et al., 1980]. N-МГ синтаза Mv. universalis FAM5,
видимому, состоит из трех субъединиц (~ 24, 33 и 48 кДа) и отличч
ся от описанного 12-субъединичного (м.м. каждой 30-35 кДа) ф
мента Pseudomonas sp. MS [Pollock, Hersh, 1971; 1973]. Ввиду отс
ствия геномных данных для этих псевдомонад не удалось сравш
функции окисления метиламина на генетическом уровне. Одна
возможно, опосредованное глутаматом окисление метиламина у ;
ных видов бактерий катализируется различными ферментными с
темами.
Аналогичные генные кластеры обнаружены у нескольких ви
бактерий: Burkholderia phymatum STM815, Methylobacillus flagell
KT, Pseudomonas mendocina, Thiomicrospira crunogena XCL-2 и Ru'
bacter xylanophilus DSM (см. рис. 3.2.4). Несмотря на высокое фи
генетическое разнообразие, генные кластеры mgdABCD-gms-mgs \
разделяют высокую идентичность последовательностей. Способно
к метилотрофии не сообщалась для Т. crunogena XCL-2 и R. xylanoi
lus DSM, в отличие от В. phymatum STM815, использующего мет
амин в качестве ростового субстрата.
нЫ
f„ID Ta"tle>
Известна способность штаммов Ps. mendocina окислять метилиро-
ные соединения, что нашло биотехнологическое применение. Ге-
ы-МГ-пути у этих бактерий кластеризованы вместе с двумя гена-
ключевых ферментов фолатзависимого Сг метаболизма, purU и
et al., 2006].
Другие гены, участвующие в Q-метаболизме (сериновый путь)
иД61
санных бактерий, обладающих этим высококонсервативным генным
пастером, только Mb. flagellatus КТ имеет МАДГ, канонический
жепмент прямого окисления метиламина. N-МГ-путь у этого орга-
низма может участвовать в балансе NH4+ при росте на метиламине,
подобно роли глутаматного цикла (ГС/ГОГАТ), как предложено для
uediylotenera mobilis [Gak et al., 1997; Bosch et al., 2009]. В геномах
В phymatum STM815 и Ps. mendocina отсутствуют /лям-гены. Весьма
вероятно, что у этих бактерий ключевую роль в метаболизме метил-
амина играет N-метилглутаматный путь.
Мутанты по гену gma, кодирующему ГМАС, не имели активности
этого фермента и их способность использовать метиламин снижалась.
Однако ГМАС не была абсолютно необходима для окисления метил-
амина и, скорее, участвует в уравновешивании потока C]/NH4+ при
росте на метиламине. Тем не менее мутации в генах, окружающих
gma, mgdABCD, кодирующих N-метилглутаматдегидрогеназу, и в ге-
нах mgsABC, кодирующих N-метилглутаматсинтазу, приводили к
нтифицированы ниже folD у В. phymatum STM815. Из всех опи-
прекращснию роста на метиламине, предполагая их участие в окисле-
нии метиламина [Chistoserdova et al., 2009] (см. рис. 3.2.4).
Ранее считалось, что у-ГМА служит временным запасным стоком
метиламина. Предполагалось, что ГМАС может играть роль в ослаб-
лении потока NH4+, продукта окисления метиламина [Konishi et al.,
1972; Jones, Bellion, 1991]. Действительно, такой механизм мог ка-
заться существенным при росте на высоких концентрациях метила-
мина из-за слишком высокого отношения С : N, по сравнению с необ-
ходимым для роста. С другой стороны, фермент, участвующий в дис-
симиляции у-ГМА до а-кетоглутарата, ФА и NH4+, очищен и охарак-
теризован, что предполагает роль этого фермента в окислении метил-
амина [Kimura et al., 1995]. Не удалось обнаружить диссимиляцию
У-ГМА у Mv. universalis FAM5. Следовательно, ГМАС несущественна
Д-1я окисления метиламина или для роста при низких концентрациях
Метиламинов. Фермент из Mv. universalis FAM5, весьма вероятно,
Участвует в регуляции высокого соотношения С : N, хотя эта гипотеза
нуждается в экспериментальной проверке.
83
3.3. Пути метаболизма галометанов
Галометаны образуются биогенно поверхностью Земли при сг<
нии биомассы и антропогенно при сжигании ископаемого топлив
частности, угля в случае хлорметана и этилированного бензина в с
чае бромметана, а также производятся и используются в качестве
мигантов.
Показано, что метилгалиды могут разрушаться в ходе химичес»
и биологических процессов. В качестве последних могут выступ
деградация МГ штаммами-деструкторами, использующими эти
единения как источники углерода и энергии, и соокисление МГ
териальными ферментами метанмонооксигеназой (ММО) и ам'
нпй-монооксигеназой (AMO) [Stirling et al., 1979; Stirling. Dalt
1979; Ra-sche et al., 1990].
Хлорметан. Первые указания на необычный механизм аэробн
дегалогенирования CH3CI были получены в опытах с Hyphomicrob
sp. СМ1.
Было показано,
что деградация хлорметана этим штамм
приводит к стехиометрическому выбросу С1 . Удельные скорое
роста культуры на метаноле, хлорметане и формиате составляли 0.
0.09 и 0.04 ч , соответственно. Неспособность окислять метан
ключала возможность участия ММО в деградации СН3С1. Клег
штамма СМ1, выращенные на хлорметане, активно дехлорирова
этот метилгалид с сопутствующим потреблением кислорода. Han?
тив, клетки, выращенные на метаноле, с высокой скоростью окис и
метанол, но слабо - хлорметан. Было предположено, что интермед»
том метаболизма CH3CI является ФА, и что в процессе деградаи
может участвовать монооксигеназа [Hartmans et al., 1986]. Однэ
механизм дегалогенирования СН3С1 не исследовался, поскол»
штамм был утерян. Спустя
десятилетие, исследования биодегалог
нирования МГ получили новый импульс, благодаря выделению ш
рокого спектра штаммов аэробных метилобактерий-деструкторов.
Для Methylobacterium chlor от ethani сиггСЪМ, Hyph omicrobi
chloromethanicumCM2, морских изолятов Roseovan z/sspp. 217 и 17
Ruegeriasp. 198 отмечено, что метаболизм МГ является индуцибел
ным. Хотя клетки A. ciceronei IMB-1, выращенные в отсутсп-ч
бромметана, имели конститутивную активность деградации при ни
ких концентрациях (<20 нМ), для потребления больших концентр
ций (>100 мкМ СН3В1) требовалась индукция [Doronina et al., 199
Vannelli et aL, 1998; Schaefer, Oremland, 1999; Schaefer et al., 2005].
Эксперименты по окислению бромметана клетками Leisingera m
thylohalidivoransMQ2 в присутствии ингибитора синтеза белков (хло
амфеникола) продемонстрировали быстрый оборот ферментов дегр
84
и бромметана даже при экспозиции с тропосферными уровнями
;ia' nt) CH;Br [Goodwin et al., 2001]. Однако у Aminobacter ciceronei
7R l не удалось определить ферментную систему, ответственную за
пеб пение бромметана при тропосферных концентрациях. Возмож-
П она идентична таковой, отвечающей за потребление СН3Вг при
5олее высоких концентрациях. Интересно отметить, что кинетические
параметры потребления бромметана, рассчитанные при концентраци-
ях близких к тропосферным, аналогичны полученным в эксперимен-
таХ с использованием больших соотношений и при инкубации клеток
в котбах. Хотя значения Ks были в 100-1000 раз выше, чем тропо-
сферные концентрации, клетки A. ciceronei IMB-1 и L. methylohalidi-
кцгя/^МВ2 потребляли бромметан при тропосферных уровнях [Good-
win et al., 2001].
Стехиометрическое образование СН2О и С1 из СН3С1 было пока-
зано в опытах на растущих культурах М. chloromethanicurrCAAA. Сус-
пензии выросших на хлорметане клеток активно окисляли СН3С1,
СН2О. НСООН, но очень медленно - СН3ОН. Напротив, выросшие на
метаноле клетки совсем не окисляли СН3С1, но активно окисляли
СП ОН, НСНО и НСООН. Экстракты выращенных на хлорметане
клеток катализировали образование НСНО и НС1 из СН3С1 в реакции,
не зависящей от НАД(Ф)+ и НАД(Ф)Н2, GSH и О2. Из этих данных
щ?МВ2 потребляли бромметан при тропосферных уровнях [Good-
следовало, что метанол не является интермедиатом превращения
СН3С1 в НСНО, а соответствующий фермент отличается от известных
оксидоредуктаз и дегалогеназ [Доронина и соавт., 19966].
Последующие биохимические и генетические исследования при-
вели к расшифровке механизма дегалогенирования СН3С1 у М. chloro-
/nethanicumCM4. Были обнаружены два полипептида (67 и 35 кДа),
синтез которых индуцировался при росте культуры на хлорметане.
Причем клетки могли также дегалогенировать СН^Вг и СН31, но не
СН2С12 или другие хлоралканы (СН3СН2С1?), что свидетельствовало о
высокой субстратной специфичности хлорметандегалогеназы к моно-
галометанам. Однако М. chloromethanicumCMA не способен расти па
СНзВги СН31, вероятно, из-за большей токсичности образующихся
ионов Вг и Г [Vannelli et al., 1998].
Далее с помощью минитранспозонной Тп5 системы мутагенеза
были получены мутанты М. с hloromethanicumCM4, не способные
расти на СН3С1. Анализ сайтов транспозонных инсерций, которые
привели к потере способности деградировать хлорметан, выявил ряд
1енов, необходимых для роста на хлорметане. Эти гены, обозначен-
ные стиА, стиВи стиС, как было предсказано на основе сходства
Последовательностей с генами метаногенных архей, кодировали метил-
тРансферазы [Vannelli et al., 1998; 1999; Studer et al., 1999; 2001; 2002].
85
Ген стиА кодировал необычный белок CmuA, состоящий из
аминокислот, который имел два функционально различных домеЛ
N-концевой домен CmuA был близок коферменту М метил грансфед
зы MtbA, участвующей в метаногенезе из метиламина у MethanosA
cina barkeri. С-концевой домен был подобен монометиламин-кор;,|
ноидному белку MtmC того же организма, акцептирующему метил
ную группу метиламина при росте на этом соединении [ Vannelli et .]
1999]. Это еще один пример латерального переноса генов архей к ’•
тилотрофам. I
Было показано in vitro, что CmuA и CmuB, очищенные из 1
chloromethanicum СМ4, в комбинации способны переносить метил
ную группу хлорметана на ТГФ. CmuA из М. chloromethanicum CM ‘J
мономерный (67 кДа) фермент, содержит Zn2+ и Со , а также витами
В12. Продемонстрировано, что ТГМП не акцептирует СН3 группу J
CmuB in vitro [Studer et al., 1999; 2001]. Наиболее вероятным канди J
том на роль метилтрансферазы III, переносящей СН3 группу от Cmii
на ТГМП, является белок CmuC. Он кодируется геном стиС и има
значительное сходство с некоторыми метилтрансферазами. Инакп
вация CmuC мутагенезом приводила к потере способности культуи
расти на хлорметане.
Другие гены, расположенные в непосредственной близости к сти
и стиВ, также были необходимы для роста М. chloromethanicum СМ
на хлорметане. Эти дополнительные гены - metF (метил-ТГФ реду]
таза), folD (метилен-ТГФ дегидрогеназа/метенил-ТГФ циклогидрол;
за) и purU (формил-ТГФ гидролаза) - специфически индуцировали*:
при росте культуры в присутствии хлорметана и транскрибировали^
с сопряженых промоторов, отличающихся от ранее идентифицир
ванных у М. extorquens AMI [Studer et al., 2001].
На основании этих генетических и биохимических данных б.ч
сформулирован новый путь метаболизма хлорметана у М. chlor
methanicum СМ4 (рис. 3.3.1), который частично подобен ТГФ-завиа
мому пути окисления ФА. В этом
CmuA на первом этапе, и метильная группа связывается с коррин
дом на той же полипептидной цепи. Затем вторая метилтрансфера
CmuB переносит метильную группу на ТГФ с образованием мети
ТГФ, который далее окисляется 5,10-метилен-ТГФ редуктазой д|
5,10-метилен-ТГФ. Последний интермедиат дает ФА для ассими-Ы
ции углерода в сериновом цикле [Studer et al., 2002]. |
Однако 5,10-метилен-ТГФ может также окисляться с образовани
ем восстановительных эквивалентов для генерации энергии. Эт *1
процесс катализируется бифункциональным ферментом, 5,10-мети
лен-ТГФ дегидрогеназой/5,10-метенил-ТГФ циклогидролазой (FolD)
4
пути хлорметан дегалогенируете!
Г
86
образованием 10-формил-ТГФ. На заключительных этапах 10-фор-
С n-ТГФ окисляется гидролазой до формиата, а последний окисляет-
ФДГ Д° СО2. Интересно отметить, что часть потенциальной энер-
гии полученной от окисления 10-формил-ТГФ, “высвобождается"
идролазной реакцией, поскольку окисление этого соединения также
может быть сопряжено с генерацией АТФ формиат-ТГФ лигазой
(формил-ТГФ синтетазой), если она присутствует [Studer et al., 2002].
CHjCl
CmuA s'
Мети та лид- f
трансфераза Г4-
СН3-С0
CmuB I
Метилгалид-
трансфераза Г
HCI
ТГФ
СНз-ТГФ
MetF I
Метилен-ТГФ
редуктаза I
СН2 = ТГФ
2НГ
Сериновый
. цикл
НАДФ+
FolD
Метилен-ТГФ
дегидрогеназа/
циклогидролаза
НАДФН2
Фосфотриозы
СН = ТГФ
FolD
Метилен-ТГФ
дегидрогеназа/
циклогидролаза
Биосинтез
PurU
Формил-ТГФ
гидролаза
СНО - ТГФ....► Пурины
н2о
ТГФ
нсоон
Fdh Н-
Формиат- К
дегидрогеназы
СО2
НАД*
НАДН2
Рис. 3.3.1. Схема пути первичного метаболизма хлорметана у сериновых метило-
бактерий
Метаболизм хлорметана у Aminobacter lissarensis СС 495. Была
Очищена галометан:бисульфид/галид-ион метилтрансфераза (67 кДа),
87
которая индуцировалась у A. lissarensis СС495 при росте на хлор
тане. Фермент переносил метильные группы от хлор-, бром- и йод
тана к корриноиду, связанному с той же полипептидной цепью. ]
липептид также проявлял трансгалогеназную активность, перен
метильные группы от МГ к ряду ионов-акцепторов, в том числе:
HS , СГ, ВГ, NO2 ,CN и SCN-. Было предположено, что HS мо:
быть физиологическим акцептирующим ионом для метильных гр;
от МГ, поскольку активности метантиолоксидазы и формальдегид
гидрогеназы, обнаруженные в экстрактах клеток, выращенных
хлорметане, образуют путь С i-метаболизма до формиата [Coulter
al., 1999]. Клонирование и секвенирование генов позволило идеи:
фицировать эту галометан:бисульфид/галид-ион метилтрансфер?
как гомолог СтиА (см. ниже). I
Другие гены, участвующие в метаболизме МГ у М. chlorom etha
сит СМ4, Н chlorom ethanicumCMl и A. ciceronei, обнаружены вып
и ниже гена, кодирующего СтиА у штамма СС 495. Предполагаете
что метаболизм МГ у штамма СС 495 также происходит через ТГ
или альтернативно. Следовательно, разные пути деградации МГ м
гут функционировать у одного и того же организма при различи^
физиологических условиях [Warner et al., 2005].
Methylobacterium
chloromethanicum CM4
|| cobQ
orf219
cobC
cobU
. ~ ! 4 л
-A’
Aminobacter
lissarensis CC495
gee
___
Г
Aminobacter
ciceronei IMB1
metf
Hyphomicrobium
chloromethanicum СМ2
fmdB
fmdB
vvy- y’yii*
J -
cmuC
fmdB
fmdBpaaE
Ruegeria sp. 198
nrdF
Roseovarius sp. 179
met?
fmdB
Рис. 3.3.2. Генные кластеры метилгалид-использующих штаммов, содержащие
ны CmuA-пути [Schaefer et al., 2007]
Кластеры генов emu, содержащие также гены, кодирующие ф
менты биосинтеза кобаламина {cobU, cobQ, cobDw cobC) и птер
88
ые ферменты Сгметаболизма (folC, folD, purU и metF), кло-
^ованы и секвенированы у шести МГ-использующих штаммов,
ц chloromethanicum СМ2, М. chloromethanicum СМ4, A. ci-
ci A. lissarensis СС 495, Roseovarius sp. 179 и Ruegeria sp.
f ^(Woodall et al., 2001; Schaefer et al., 2005; Warner et al., 2005].
" Обнаружена высокая степень консервативности структуры сти-
ластеров среди МГ-использующих бактерий (рис. 3.3.2). В болыпин-
к^е случаев порядок генов в с/лм-кластерах до некоторой степени
нсервативен, за исключением М. chloromethanicum СМ4, где стиВ и
К° q являются одной транскрипционной единицей, а стиА находится
отдельно [Studer et al., 2002].
Иная организация ст?ш-генов обнаружена у И. chloromethanicum
СМ2, A. ciceronei 1МВ-1, A. lissarensis СС 495 и штаммов 179 и 198.
Кроме И. chloromethanicum СМ2, у которого folD был найден выше
кластера сти, генные кластеры не содержат соб-генов синтеза коба-
ламина, folC, folD и purU, кодирующего формил-ТГФ гидролазу. Од-
нако это не исключает возможность их нахождения выше или ниже
частично секвенированных генных кластеров у этих изолятов.
В результате секвенирования сттш-генных кластеров у Н. chloro-
methanicum СМ2, A. ciceronei IMB-1, A. lissarensis СС 495 и штаммов
179 и 198 были идентифицированы дополнительные гены fmdB, рааЕ,
и hutl с консервативным порядком расположения. Эти гены могут
кодировать транскрипционный регулятор (fmdB), редуктазу (рааЕ) и
имидазолон пропионазу (hutf) [McAnnulla et al., 2001b]. Хотя роль
этих генов и кодируемых ими белков/полипептидов неясна, возмож-
но, они участвуют в метаболизме МГ. Из трех дополнительных ОРС
выше стиВ, идентифицированных у Н. chloromethanicum СМ2, одна
была подобна предшественнику порина из Neisseria denitrificans, а для
двух других не найдено совпадений в базе данных.
Ген, кодирующий метил-ТГФ редуктазу (metF) у Н. chloromethani-
cum СМ2, A. ciceronei IMB-1 и морского изолята Roseovarius sp. 179,
находится, как и у А/, chloromethanicum СМ4, ниже (3’) гена hutl. У
Другого морского изолята Ruegeria sp. 198 metF не найден, а последо-
вательность ниже (3’) hutl содержала гены рибонуклеозиддифосфат
Редуктазы nrdF и nrdA, ориентированные дивергентно кластеру генов
сти. Локализация metF, таким образом, не является консервативной у
этих штаммов. В четырех генных кластерах стиС был обнаружен
выше стиА, а стиВ - выше стиС у A. lissarensis СС 495 и Н. chloro-
methanicum СМ2. Высокая степень сходства между другими генными
Кластерами предполагает, что порядок генов стиВСА может быть
консервативным среди всех этих генных кластеров, за исключением
89
M. chloromethanicum СМ4. Необходима дальнейшая работа по кл
рованию и секвенированию генов для решения данного вопроса.
Первоначально был клонирован и секвенирован с/тш-генный
стер Н. chloromethanicum СМ2 [McAnnulla et al., 2001b]. Дальней|
прогресс достигнут благодаря успешной разработке и примене,
генетической системы для штамма СМ2, внедренной с помо;
электропорации векторов для транспозонного мутагенеза (Tn5). Н
зультате получен ряд инсерционных мутантов, не способных раст
хлорметане. У одного из этих мутантов инсерция Тп5-транспо
произошла на З’-конце гена метил-ТГФ редуктазы (metF), neper
вавшегося с концом hutl. Другие 8 транспозонных инсерций разру
ли ген, кодирующий вероятную метилтрансферазу CmuC. Инсе-
онная инактивация стиС также приводила к хлорметан-негативш
фенотипу у М. chloromethanicum СМ4, ay Н. chloromethanicum С
мутация затрагивала экспрессию CmuA, как показал анализ эксг;
тов клеток мутантов методом ДСН-ПААГЭ. Эти данные отличаг
от находки, что у М. chloromethanicum СМ4 CmuA и CmuB экспрес
ровались и функционировали у стиС~ мутантов [Borodina et al., 20
Поскольку мутация стиС привела к хлорметан-негативному ф<^
типу у М. chloromethanicum СМ4, предполагается, что метилтрано
раза CmuC играет роль в метаболизме МГ, которую еще предст
определить. У Н. chloromethanicum СМ2 мутация в регионе hutl-rn
оказывала похожий эффект на экспрессию CmuA, также выявленн
методом ДСН-ПААГЭ, как и мутация стиВ, полученная мето.,
маркер-обменного мутагенеза. В итоге предположено, что мута!
стиВ, стиС и hutl-metF вызвали полярные эффекты, которые в
кращали экспрессию CmuA. ПЦР-эксперименты с обратной трл
криптазой показали, что cmuBCA-metF оперон котранскрибируетс
Н. chloromethanicum СМ2 и облигатно корегулируется хлорметан
Причем наличие хлорметана приводило к транскрипции этого one
на, даже в присутствии метанола. Затем методом RACE-ПЦР (Ra
Amplification of cDNA Ends) был идентифицирован промотор one
на, локализованный впереди стиА [Borodina et al., 2004].
Идентичные полипептидные профили клеток Ruegeria sp. 198,
ращенных на хлор- и бромметане, подтвердили, что один и тот
путь ответствен за деградацию этих МГ. У Н. chloromethanicum С
транскрипция с/ип-генов контролировалась хлор- и бромметан
[Schaefer et al., 2007]. Хотя деградация СН31 у МГ-использующих и
лятов детально не исследовалась, вполне вероятно, что CmuA-ir
также может быть ответствен за деградацию СН31, поскольку Ст
A. lissarensis СС 495 способен переносить СН3 группу от хлор-, бр<
и йодметана к ряду ионов-акцепторов [Coulter et al., 1999].
90
Природные концентрации МГ, вероятно, достаточны для индукции
ентной системы, хотя сложно обнаружить полосу 67 кДа (CmuA)
тоДпМ ДСН-ПААГЭ, когда клетки выращены при атмосферных
ме ,еНТрациях МГ, так как уровень этого полипептида может быть
м. Действительно ли природные пикомолярные концентрации
МГ достаточны для индукции CmuA-пути, можно определить при
авнении мутантных и исходных штаммов М. chloromethanicum СМ4
С Д chloromethanicum СМ2. Мутационный анализ пока не проводился
лЛя штаммов Aminobacter.
J Важно отметить, что рост МГ-использующих бактерий на более
предпочтительных субстратах не подавлял окисление МГ. Так,
и chloromethanicum СМ2 растет одновременно на метаноле и хлор-
тане а экспрессия CmuA подтверждена ДСН-ПААГЭ. Аналогично,
экспрессия CmuA у растущего на бетаине и бромметане Roseovarius
Sp 179, была доказана масс-спектрометрическим методом [Borodina et
al., 2004; Schaefer et al., 2005].
Хотя идентифицировано несколько генов, участвующих в дегра-
дации СН3С1, только ген стиА был выбран в качестве “функциональ-
ного” маркера при поиске деструкторов хлорметана, так как именно
белок CmuA катализирует первичное связывание и дегалогенирова-
ние этого соединения. Естественно, уникальная структура гена стиА
была принята во внимание при разработке праймерной системы.
Несмотря на достигнутые успехи в изучении аэробного метабо-
лизма метилгалидов, остается ряд нерешенных вопросов. В их числе
механизмы транспорта МГ и механизмы удаления токсичных продук-
тов дегалогенирования (Н+ и СГ). Неясно, все ли стиАВС гены и со-
ответствующие ферменты необходимы для деградации МГ грамотри-
цательными и грамположительными аэробными метил ©бактериям и?
Кроме того, предстоит выяснить, являются ли метилтрансферазы, от-
ветственные за окисление СН3С1 и СН3Вг у разных аэробных метило-
бактерий, одним и тем же ферментом или различаются? Характери-
стика мутантов, полученных маркерным обменным мутагенезом, и
Детальный анализ кинетики ферментов первичного окисления МГ у
бактерий помогут ответить на эти вопросы.
Для понимания регуляции метаболизма МГ у аэробных метило-
бактерий и механизмов ингибирования/репрессии/индукции белка
CmuA требуется детальный анализ штаммов, доступных для генети-
Ческих манипуляций с разработанными системами мутагенеза и
тРансформации. Вклад аэробных метилобактерий в разложение МГ в
п°чвенных и водных биотопах изучается на накопительных и чистых
^Дьтурах, а также методами молекулярной экологии с применением
функциональных генных зондов. Для исследования транскрипцион-
«
91
ной организации и коэкспрессии ключевых генов метаболизму
используется достаточно широкий спектр праймеров, Но
блоттинг и ПЦР-анализ. Наконец, работы по кристаллизации и ц
дованию структуры белка CmuA также должны способствовать
шему пониманию молекулярных механизмов деградации метилг
дов у бактерий.
Получены доказательства, что CmuA - не единственный пут-
лизации МГ. Саузерн-блоттинг и анализ L. methylohalidivorans М
пробами из почвенных изолятов и близкородственного морс
штамма Roseovarius sp. 179 не выявили наличие гомолога спи
штамма МВ2 [Warner, 2003; Schaefer et al., 2005]. Возможно, L. т
lohalidivorans MB2 имеет альтернативный путь деградации М
другого представителя ветви Roseobacter - Roseovarius sp. 217,
росте на МГ 67 кДа полипептид не индуцировался. Так же к
L. methylohalidivorans МВ2, Саузерн-блоттинг и генные пробы Нч
наружили гомолог стиА у Roseovarius sp. 217 [Schaefer et al., 2 ।
По-видимому, штамм LIS-3 метаболизирует бромметан по и
включающему метилтрансферазные реакции, что было предпол
но, исходя из результатов ингибирования окисления бромметана :
роформом [Hoeft et al., 2000]. Показано, что активность гомолога
тилтрансферазы CmuA из A. lissarensis СС 495 не подавлялась хл
формом. Поэтому вполне возможно, что штамм LIS-3 и A. lissare
СС 495 использовали ферментные системы деградации бромметан:
Интерес представляет оценка вклада различных путей дегра,
МГ в общий биологический сток. Продемонстрировано, что т
является потенциальным ингибитором окисления бромметана в
ской среде [Goodwin et al., 2005]. Остается оценить, может ли 1
также ингибировать окисление МГ у морских изолятов, кроме L.
thylohalidivorans МВ2, у которого деградация МГ не подавляете/.
луолом. |
Таким образом, деградация МГ бактериями происходит различ
ми путями. Для лучшего понимания бактериальных циклов МГ '
буются дополнительные исследования по характеристике неиз
ных путей деградации МГ, например, у Roseovarius sp. 217 и L. пи
lohalidivorans МВ2. Оценить вклад отдельных путей возможно, е
удастся найти специфические ингибиторы, включая действующи^
CmuA-путь. Для изучения функционального разнообразия бакте;
использующих МГ не через CmuA-путь, необходимо также разр
тать функциональные генные маркеры. Метаболомные исследова
с применением меченных стабильными или радиоактивными из
пами МГ, сопряженные с ЯМР-анализом, могут дать шанс просле.:
92
судьбой углерода метильной группы для оценки доминирующих
33 тей ассимиляции МГ.
Исследование путей деградации МГ зависит от результатов секве-
ования геномов М. chloromethanicum СМ4 и Roseovarius sp. 217. У
сдеднего штамма деградация МГ происходит по еще не охаракте-
ризованному пути. Предварительный анализ геномных последова-
тельностей выявил ряд ферментов серинового цикла, но не стиА, что
подтверждено результатами Саузерн-гибридизации и ПЦР. Проводит-
ся масс-спектрометрический анализ белков, индуцируемых при росте
на МГ, для идентификации соответствующих генов [Schaefer et al.,
2007].
Дихлорметан. Установлено, что при росте аэробных бактерий-
деструкторов на ДХМ индуцируется дихлорметандегалогеназа
(ДХМДГ, К.Ф. 4.5.1.3.) - цитоплазматический белок с м.м. мономеров
34 кДа, катализирующий трансформацию ДХМ до ФА и двух моле-
кул НС1 (рис. 3.3.3) в реакции, зависимой от GSH. В этой реакции
конъюгат GSH (предположительно S-хлорметилглутатион) образуется
энзиматически и далее спонтанно гидролизуется до S-гидроксиметил-
глутатиона, разлагаемого до ФА и GSH. Предполагается, что реакция
происходит по механизму нуклеофильного замещения Sn2. Но, в от-
личие от других алифатических дегалогеназ, хлорид замещается по-
средством прямой атаки тиольной группы GSH, а не гидроксилов во-
ды или карбоксильной группы в активном сайте фермента [Kohler-
Staub, Leisinger, 1985; Wackett et al., 1992; Vuilleumier, Leisinger,
1996].
Механизм дегалогенирования ДХМ у метилобактерий не вполне
понятен. Образование короткоживущего S-хлорметилглутатиона, как
вероятного интермедиата реакции, пока не доказано, а его химически
синтезированная модель, 8-(хлорметил)-М-ацетилцистеин, имеет пе-
риод полураспада 4 с при 0°С в нейтральном буфере [Hashmi et al.,
1994]. S-фторметилглутатион, другой, менее реакционноспособный
гомолог S-хлорметилглутатиона, гидролизуется с полураспадом
5.8 мин в Д2О. Промежуточное образование этого соединения, имею-
щего "'р-ЯМР сигнал, сравнимый с S-фторметилглутатионом, наблю-
дали в опытах с ДХМДГ Mph. leisingeri DM11 в реакционной смеси,
содержащей GSH и CH2C1F [Blocki et al., 1994]. Показано, что хими-
чески синтезированный S-хлорметилглутатион алкилирует in vitro ос-
нования ДНК, вызывая ее разрывы, т.е. нарушает репликацию in vivo
и оказывает мутагенное действие. Таким образом, данные о метабо-
лической активации ДХМ до более токсичного продукта, способного
нзаимодействовать с ДНК и вызывать генотоксические эффекты, так-
93
Генсек]
ICHsOHI
Мха
HCHO .....................СНзОН
Метамолдеаидрсаенала *
Периплазма
Цитоплазма
СНа-ТГФ
НАДФ
Фосфотриозы
। Дихлорметан*
i деаалоееназа
л..\, DemA
CHjCIj ——
GSH
ТГФ
МША
Метилен-ТГФ
дааидроаеназа
СН1ТГФ
Биосинтез
Н2О
Fch
4йтам№7ГИ
цикпоеибролаза
НСНО
Fm
Форм«лы?*«ид>
ктиаирующий
ермемт
НСООН
ТГМП
МШВ I MtdA
Метилен-ТГМП
аеаидроаенеза
CHj-ТГМП
НАД(Ф)
CH « ТГМП
Meh
МетеншьТГМП
цшиюзибропаза
CHO - ТГМП
Fhct
трансфераза
Пурины CHO - ТГФ
СНО-МФР
Г FtfL
I ФормшьТТФ
«Кролам
НСООН
Fdh
НСООН
СОа
НАД
Рис. 3.3.3. Интегральная схема путей первичного метаболизма дихлорметана и ме
танола у аэробных метилобактерий
же свидетельствуют в пользу образования этого интермедиата [Keith
Telliard, 1979; Guengerich et al., 1994; Dekant, 1997; Green, 1997].
Функционально и структурно ДХМДГ М. dichlorom ethanicunDM
и Mph. leisingeriO^AW были отнесены к тета-классу суперсемейств
глутатион-8-трансфераз (GST, К.Ф. 2.5.1.18) — ферментов, обнаружен
ных ранее у млекопитающих, рыб, птиц, растений, насекомых й
дрожжей [Leisinger et al., 1994; Blocki et al., 1994; Vuilleumier, 199'
94
. j et al., 2001]. Главной функцией GST эукариот являются связыва-
трансформация и детоксикация электрофильных соединений
Я /родного и искусственного происхождения путем конъюгации с
GSH- Показано, что, обладая низкой гомологией с другими семейст-
вами белков, GST существенно различаются между собой. Так, доля
идентичных последовательностей ДХМДГ из штаммов DM4 и DM И
с известными ферментами этого семейства составляет лишь 22-30%
[Vuilleumier, Leisinger, 1996; Vuilleumier, 1997]. Будучи активной с
ДХМ, экспрессируемая с плазмиды GST 0-класса из печени крыс
(GST Т1-1), тем не менее не поддерживала рост на ДХМ мутанта
у dichloromethamcum DM4, дефектного по ДХМДГ, что указывает на
различия в каталитических свойствах GST бактерий и млекопитаю-
щих [Gisi et al., 1999].
Особенностью бактериальных GST является ограниченное количе-
ство субстратов, тогда как типичные GST способны превращать также
ароматические хлорированные соединения, пероксиды и эпоксиды.
Так, бактериальные GST неактивны с 1-хлор-2,4-динитробензолом,
являющимся тестовым субстратом для обнаружения глутатионтранс-
феразной активности. Установлено, что бактериальные ферменты се-
мейства GST обладают высокой специфичностью, а катализируемая
ими реакция в 108 раз превышает скорость абиотического разложения
ДХМ [Blocki et al., 1994]. Еще одно отличие бактериальных ДХМДГ
заключается в нестабильности GSH-конъюгатов, образующихся при
ферментативной реакции и спонтанно гидролизующихся до GSH,
СН2О и НС1 [Vuilleumier, 1997].
ДХМДГ М. dichloromethanicum DM4 и Hyphomicrobium sp. ДМ2
имеют идентичные N-концевые аминокислотные последовательности
и гексамерную структуру мономеров м.м. 33 кДа. Оба фермента отне-
сены к дегалогеназам группы А, которые индуцируются только ДХМ,
но проявляют с ним низкую каталитическую активность. При росте
этих бактерий на ДХМ до 20% белка клеток приходится на ДХМДГ, а
при лимитировании роста в условиях хемостата - до 50% [Kohler-
Staub, Leisinger, 1985; Gisi et al., 1998]. Однако отнесенная к группе В
ДХМДГ Mph. leisingeri DM11 с м.м. мономеров 31 кДа в 5.6 раза бо-
лее активна с ДХМ, чем ферменты группы A (kcat = 3.3 с"1, Кт = 59
мкМ для ДХМДГ группы В и kcat = 0.6 с-1, Кт = 9 мкМ для ферментов
гРУппы A) [Vuilleumier, 1997].
Различия в кинетических свойствах ферментов штаммов DM 11 и
^М4, по-видимому, отражают их эволюцию в условиях естественных
Мест обитания этих деструкторов [Vuilleumier, 2001]. Так, штамм
Mil был выделен из экосистем, десятилетиями загрязняемых высо-
Кими концентрациями ДХМ, и эволюционировал в условиях большо-
95
го избытка этого поллютанта. Напротив, штамм DM4 был изолировя
из осадочных отложений стоков с низкой концентрацией ДХМ. Гц
мимо различных кинетических констант ДХМДГ А- и В-групп, инт|
ресной особенностью фермента Mph. leisingeri DM11 является над!
чие положительной кооперативности при связывании GSH [Kohle
Staub, Leisinger, 1985; Scholtz et al., 1988]. Методом сайт-направлем
ного мутагенеза показана необходимость для каталитической эффей
тивности этой ДХМДГ Ser12, типичного для 0-класса GST, но не Туй
важного для а-, ц- и л-классов GST [Vuilleumier, Leisinger, 1996]. I
Все ДХМДГ известных деструкторов СН2С12, за исключение!
единственной, обнаруженной до настоящего времени, дегалогеназ]
группы В, каталитически и иммунологически подобны и проявляй]
выраженную перекрестную реакцию с антителами на соответствуй
щий фермент штамма DM4 [Kohler-Staub et al., 1986]. Электронна
микроскопия ультратонких срезов клеток М. dichloromethanicum DM
продемонстрировала цитоплазматическую локализацию ДХМДГ,
отличие от МДГ и МАДГ, являющихся периплазматическими фе|
ментами [De Vries et al., 1990; Schmid-Appert et al., 1997]. I
I
IS1354. IS1355 IS1357
IS1354r
Рис. 3.3.4. ДХМ-оперон Methylobacterium dichloromethanicum DM4, содержащй
структурный (demA) и регуляторный (dcmR) гены дихлорметандегалогеназы. Pi и Рг
соответствующие промоторы [Schmid-Appert et al., 1997]
orf421 orf179 orf153 orf411 dcmR demA orf353 orf192 orf421 orf12
Анализ нуклеотидных последовательностей, ответственных за ИС]
пользование ДХМ у М. dichloromethanicum DM4, выявил два гена
продукты которых, по-видимому, участвуют в метаболизме этого cd
единения - структурный ген demA, кодирующий ДХМДГ, и регулж
торный ген dcmR (рис. 3.3.4). Последний расположен перед структур
ним геном, но транскрибируется в противоположном направлении и
предположительно, участвует в негативной регуляции экспресс*!
demA. Продукт dcmR, по-видимому, действует как репрессор транз
крипции demA в отсутствие ДХМ, однако специфическое связыванй
DcmR с участком ДНК перед структурным геном экспериментальн!
не доказано. При утрате dcmR наблюдали конститутивную экспре!
сию гена demA [La Roche, Leisinger, 1990, 1991]. I
Кроме того, при использовании ДХМ в качестве единственной
источника углерода и энергии трансконъюгантом DM4-2cr/pME822l
96
лНительно индуцировалась ДХМДГ, что предполагает несколько
^оП^ней контроля экспрессии этого фермента у штамма DM4: dcmR-
УР° лИруемой репрессии в отсутствие ДХМ и ДХМ-зависимой ин-
РеГУ.ии demA. Следовательно, регуляция экспрессии ДХМДГ имеет
ее сложные механизмы, чем сообщалось ранее [Schmidt-Appert et
I 1997]- Так, у деструкторов Methylopila Helvetica DM6 и Albibacter
3 ethylov°rans DM10, выращенных на метаноле и адаптированных к
WO мМ NaCl, выявлено ускорение ДХМ-зависимой экспрессии
пХМДГ [Торгонская, 2009]. Этот эффект может указывать на регуля-
торную роль изменений концентрации СГ, отмеченную для других
микроорганизмов [Davis-Kaplan et al., 1998; Mueller, Oren, 2003].
Гены demA из M. dichloromethanicum DM4 и Mph. leisingeri DM11
проявили большое сходство нуклеотидных последовательностей, од-
нако соответствующие аминокислотные последовательности ДХМДГ
оказались близки лишь на 56% [La Roche, Leisinger, 1990; Bader, Leis-
inger, 1994]. За исключением остатка His9, а также аминокислотной
пары Leu-Arg в положении 4-5 у штамма DM11, аналогичной такой
же паре в положении 14-15 у штамма DM4, не обнаружена прямая
гомология между N-концевыми аминокислотными последовательно-
стями А- и В-групп ДХМДГ. Это проявилось в различиях поверхно-
стного заряда молекул ферментов и объемах элюции с носителя при
анионообменной хроматографии. Тем не менее очевидна эволюцион-
ная связь между дегалогеназами А и В групп, что следует из резуль-
татов гибридизации генов, кодирующих эти ферменты, их одинаковой
потребности в GSH и близкой м.м. субъединиц [Scholtz et al., 1988].
Сходство ДХМДГ группы А у большинства исследованных бакте-
рий привело к заключению, что гены участка ДНК, ответственного за
использование ДХМ, могут распространяться горизонтально с помо-
щью мобильных генетических элементов. В пользу этого предполо-
жения свидетельствует амплификация генов ДХМДГ группы А у раз-
личных метилобактерий с зондами на последовательности, фланки-
рующие ген demA у штамма DM4 [Kohler-Staub et al., 1986; Scholtz et
aU 1988; Leisinger, 1996; Schmid-Appert et al., 1997].
Кроме того, анализ 10 т.п.н. фрагмента, содержащего гены dcmR и
demA у ряда деструкторов ДХМ, привел к идентификации трех типов
ннсерционных последовательностей и двух открытых рамок считыва-
ния неизвестной функции (рис. 3.3.4) [Schmid-Appert et al., 1997]. Се-
Квенирование фрагментов ДНК, фланкирующих ген demA у новых
пробных деструктроров ДХМ “Gottschalkia те thy lica” DM15, Апсу-
l°bacter dichloromethanicus DM16 и Methylobacterium extorquens
^M17, выявило наличие ОРС, гомологичных dcmR и orf 353
dichloromethanicum DM4 [Фирсова и соавт., 2010]. Сходство генов
97
деградации ДХМ у метилобактерий различного таксономическом
географического положения свидетельствует об их распространен
среди метилобактерий путем горизонтального переноса. |
Учитывая скорость мутаций и сходство генов ДХМДГ различи
метилобактерий, предполагается, что эти ферменты произошли!
общего предшественника миллиарды лет назад [Bader, Leisinger, 19<
Vuilleumier, 2001]. В отсутствие антропогенного загрязнения дигат
метанами вероятные предшественники ДХМДГ могли участвовав
деградации других, близких по структуре, субстратов естественна
происхождения - СН2ВГ2 или CH3CI [Nikolausz et al., 2005]. В nonj
этой гипотезы свидетельствуют высокая активность ДХМДГ шта
мов ДМ 13 и GJ21 с дибромметаном, несмотря на крайнюю токси
ность продуктов катаболизма этого соединения, а также больц
сходство генных кластеров, ответственных за деградацию хлор-
бромалканов (dhaA, dhaAh) [Vuilleumier, 2001; Poelarends et al., 2000
Рис. 3.3.5. Нерешенные проблемы деградации дихлорметана аэробными мет
бактериями [Vuilleumier, 2001]
Хотя процесс аэробной минерализации ДХМ изучается более j
лет, молекулярные основы адаптации бактерий к деградации это
ксенобиотика долгое время оставались вне поля зрения исследоваз
лей (рис. 3.3.5). Однако недавние работы показали, что важны :
только дегалогеназы, но и другие дополнительные ферменты и ген
участвующие в бактериальном метаболизме ДХМ. Так, с использов
нием плазмид рМЕ8220, рМЕ8221 и челночного вектора рСМ62 61
осуществлен перенос гена demA из М. dichloromethanlcumDMA
М. chloro methanicu лСМ.4 и М. extorque zisAMl, неспособные расти
ДХМ. Трансконъюганты активно экспрессировали ДХМДГ, но толь
трансконъюгант М. ch lorom ethanIcumCMA мог расти на ДХМ, ч
qenta
Black
чие
мети
ется
тельствует о специфической структурно-функциональной орга-
^зании деструкторов галометанов [Kayser et al., 2002].
НИ Прежде всего, штаммы-деструкторы могут нуждаться в механиз-
активного транспорта ДХМ в клетки. С другой стороны, в отли-
от первичного метаболизма метанола, процесс деградации ДХМ у
лобактерий зависит от величины пула GSH, а также сопровожда-
образованием в цитоплазме высоких концентраций Н+ и СГ,
$ хлорметилглУтатиона и СН2О (см. рис. 3.3.5). Эти реакционноспо-
собные интермедиаты оказывают летальное действие на клетки, не
имеющие соответствующих механизмов защиты [Evans et al., 2000;
Kayser et al., 2000]. Однако механизмы транспорта ДХМ, преодоления
токсического действия его метаболитов и особенности внутриклеточ-
ного осмопроцесса остаются малоизученными.
Транспорт ДХМ, Как показано для Е. coll, малые незаряженные
молекулы ДХМ проникают в клетку посредством пассивной диффу-
зии со скоростью, зависящей от их концентрации [Evans et al., 2000].
Однако вследствие высокой растворимости этого ксенобиотика в во-
де, у клеток деструкторов могут существовать и другие, возможно,
регулируемые пути транспорта ДХМ [MacKay et al., 1993]. Так, низ-
кие скорости диффузии, ожидаемые при низких концентрациях в сре-
де, предполагают потребность бактерий в соответствующих мембран-
ных поринах и цитоплазматических транспортных системах для суб-
стратов. Подобная высокоаффинная система транспорта короткоце-
почечных амидов и мочевины, индуцируемая при лимитирующих ус-
ловиях роста, детально описана у Methylophilus methylotrophus и
включает внешнемембранный порин и цитоплазматический белок,
специфически связывающий эти субстраты [Mills et aL, 1998].
Различия констант сродства, рассчитанных для клеток и дегалоге-
наз М. dichloromethanicum DM4 при ограничении ДХМ в условиях
хемостата, свидетельствуют о способности деструктора создавать для
ДХМДГ более высокую, чем в среде, концентрацию ДХМ [Gisi et aL,
1998], Это позволяет предположить, что штамм DM4 развил меха-
низмы активного транспорта ДХМ при субстратном лимитировании
Роста. Напротив, при высокой концентрации ДХМ в среде различия в
кинетических показателях фракционирования изотопов 12/1 С и 35/37С1
молекул СН2С12 клетками и ДХМДГ указывают на диффузионный
механизм транспорта этого соединения в цитоплазму, а также на су-
ществование у штаммов DM4 и DM 10 механизмов активного выброса
избытка ДХМ из клеток для защиты от его токсического действия
[Зякун и соавт., 2003; 2007; Torgonskaya et al., 2008].
Защита от генотоксического действия метаболитов ДХМ. Ре-
зультаты многочисленных исследований демонстрируют канцероген-
99
ное действие ДХМ на людей и животных. Постулировано, что
действием GST дигалометаны активируются с образованием б
токсичных S-галометилглутатионов. Последние являются сильш
алкилирующими агентами для ДНК, способными ковалентно св.,
ваться с аминогруппой гуанина в С -положении, что вызывает раз
вы ДНК и приводит к нарушению репликации и мутагенному эф?
ту [Ahmed, Anders, 1978; Keith, Telliard, 1979; Schiestl et al., 1
Guengerich et al., 1994; Green, 1997; Dekant, 1997]. Следовательно,
структоры ДХМ должны обладать эффективными механизмами
щиты от генотоксичного действия интермедиатов дегалогенирован
Ранее для розовоокрашенных представителей рода Methylob..
riutn была продемонстрирована высокая устойчивость к Н2О2, У!1
ионизирующему излучению, оказывающим на ДНК действие, под
ное эффекту S-хлорметилглутатиона. При этом деструктор ,'J]
М. dichloromethanicum DM4 превосходил по устойчивости к ука1
ным неспецифическим ДНК-повреждающим агентам М. extorqu
AMI, неспособный использовать это соединение. Оцениваемое
протяженности брешей повреждение ДНК при инкубации с
также было ниже у деструкторов ДХМ, по сравнению с метилобак
риями, не разлагающими данный поллютант [Фирсова и соавт., 20J
Установлено, что наиболее вероятной причиной отсутствия ро
на ДХМ трансконъюгантов М. extorquens АМ1/рМЕ8220 и А*
рМЕ8221, экспрессирующих активные ДХМДГ из М. dichloromet
nicum DM4 [Kayser et al., 2002], является не пониженный уров<
синтеза GSH, нарушение pH- и анионного гомеостаза вследст.
внутриклеточного образования НС1 или накопление в среде токе:
ных концентраций ФА и формиата, но повреждение ДНК под дел
вием S-хлорметилглутатиона [Фирсова и соавт., 2003]. Эти резул1
ты определенно свидетельствуют о наличии у деструкторов ДХМ :
фективных механизмов репарации ДНК.
Кроме прямого генотоксического действия интермедиатов дегп_
генирования ДХМ, негативное влияние на клетки может оказывч
усиленное использование пула GSH в процессе деградации ДХМ. И
этом может снижаться эффективность защиты клеток от АФК и у;1
вень обеспечения клеток восстановительными эквивалентами от г.<
татионредуктазной тиолспецифической системы. Вследствие это
возможно развитие окислительного стресса, при котором, наряду
ДНК, повреждаются липидные и белковые компоненты клетки, I
также требует соответствующих механизмов защиты [Uziel et •
2004]. Установлено, что активность глутатионредуктазы у М.
chloromethanicum DM4, Мр. helvetica DM6 и A. methylovorans DM
повышалась на 40% при росте на ДХМ,
по сравнению с метанола
100
свидетельствует о функциональной подстройке метаболизма GSH
естрУкт0Р0В ПРИ дегалогенировании СН2С12 [Торгонская, 2009].
^Как известно, для удаления повреждений ДНК, вызванных алки-
лированием
белков: гликозилазный комплекс (UvrABC) и специфическая эк-
клеаза (дезоксирибофосфодиэстераза), вырезающие химически
поврежденные основания ДНК, а также ДНК-полимераза I и ДНК-
помощью мини-Тп5 транспозонного мутагенеза показано, что мута-
пованием основании, главным механизмом является эксцизионная
' еПараиия. В этом репарационном пути участвуют несколько различ-
ных
зону
пигаза I, застраивающие возникшие бреши [Friedberg et al., 1995]. С
помощью мини-Тп5 транспозонного мутагенеза показано, что мута-
ция гена uvrA, кодирующего одну из субъединиц гликозилазного ком-
плекса, не была летальна для мутанта DM4-Z1252, но существенно
снижала скорость роста на ДХМ. Другой Тп5 мутант (DM4-Z1445)
экспрессировал ДХМДГ на уровне дикого штамма DM4, но, будучи
лишен ДНК полимеразы I (polA), не рос на ДХМ. При этом показано
наличие только одной копии polA в геноме хозяина. Путем переноса
гена polA на плазмиде рМЕ8112 удалось восстановить способность
мутанта DM4-Z1445 расти на ДХМ. Следовательно, ДНК-полимераза
I необходима метилобактериям для эффективной репарации ДНК при
росте на ДХМ [Kayser et al., 2000].
Утилизация образуемого в цитоплазме формальдегида. ФА -
крайне реакционноспособное химическое соединение, оказывающее
токсическое действие на организмы вследствие неспецифической ре-
активности к белкам и нуклеиновым кислотам [Grafstrom et al., 1983;
O’Donovan, Mee, 1993]. Поскольку CH2O является центраболитом
превращений восстановленных Ci-соединений, метилобактерии раз-
вили эффективные системы его утилизации. Выше были описаны 4
возможных пути метаболизма ФА, включающих прямое окисление
формальдегиддегидрогеназами, дальнейшее окисление или ассимиля-
цию в РМФ- или сериновом цикле, а также в реакциях трансметили-
рования, зависимых от ТГФ или ТГМП [Vorholt, 2002].
Окисление ФА до СО2 происходит в цитоплазме клеток. При росте
бактерий на метаноле или метиламине соответствующие дегидрогена-
зы образуют СН2О в периплазматическом пространстве клеток, а для
последующих превращений это соединение должно проникнуть в ци-
топлазму. Хотя специфическая система транспорта СН2О не охарак-
теризована, высокая токсичность данного метаболита подразумевает
существование механизмов, ограничивающих его поток в цитоплазму
[Van Spanning et al., 2000]. Однако в случае метаболизма ДХМ ФА
образуется в цитоплазме (-200 нмоль/мин х мг белка), что усиливает
ег° цитотоксическое действие [Kayser et al., 2002].
Для неиспользующего ДХМ М. extorquens AMI показано, что
относительно низком потоке ФА в цитоплазму большая часть эг
соединения окисляется до СО2 через ТГМП-модуль и формиатдег
рогеназы. Однако при возрастающей концентрации ФА увеличив
ся и процент его утилизации. Соответственно, ассимиляционны
диссимиляционный потоки ФА становятся сбалансированными
быстрого роста бактерий на метаноле [Marx et al., 2005]. В прощ
утилизации ФА, образованного при дегалогенировании ДХМ, у шт
мов-деструкторов, по-видимому, также следует ожидать подоб-
динамической регуляции. В этом случае скорость потока СН2О в
топлазму будет регулироваться активностью ДХМДГ. Вместе с
соотношение диссимиляционного и ассимиляционного потоков
оптимальное для роста бактерий на ДХМ, может отличаться от бг,
са, достигаемого при использовании метанола, поскольку более
тивный поток СН2О в цитоплазму требует его оперативной деток
кации [Троценко, Торгонская, 2009].
Установлено, что в равновесных условиях большая часть ФА, j
центраболита реакции дегалогенирования ДХМ, находится в раств
в виде конъюгата с GSH (S-гидроксиметилглутатиона). Это, вероят
способствует защите клеток от СН2О путем снижения его реакци
ной способности и одновременного направления по пути дальней^
го окисления S-гидроксиметилглутатион дегидрогеназой [Uotila, К
vusalo, 1974]. В пользу данного предположения свидетельствует 5.»
ное ингибирование роста в присутствии ДХМ у трансформант
Е. coli JTG10, экспрессирующих ДХМДГ из штамма DM11, но
способных к биосинтезу GSH, по сравнению с 10%-ным ингибиро
нием у трансформантов, сохранивших способность синтезиров
данный кофактор [Evans et al., 2000].
Для М. dichloromethanicum DM4 и экспрессирующих актива'
ДХМДГ трансконъюгантов М. extorquens АМ1/рМЕ8220 и AM
рМЕ8221, показано, что образующийся из ДХМ ФА, не использовт
ный клетками для энергетических нужд и биосинтеза, выделяете,,
культуральную среду [Фирсова и соавт., 2005]. Вполне вероятно, ч’
для защиты от цитотоксического влияния ФА деструкторы ДХМ, -
ладая общими для метилотрофных бактерий путями утилизации эт i
интермедиата, осуществляют более эффективную регуляцию его м
таболизма в цитоплазме [Троценко, Торгонская, 2009].
Поддержание pH-гомеостаза при дегалогенировании ДХМ.
цесс деградации ДХМ у аэробных метилобактерий сопровождает
образованием в цитоплазме высоких концентраций НС1 и, хотя ДХ^
использующие бактерии образуют НС1 внутриклеточно, Н+ и СГ эк
кретируются в среду. Тем не менее несколько сниженный урове»
102
да по углероду при использовании ДХМ, по сравнению с
|’1’ ОН, может быть обусловлен закислением цитоплазмы клеток
holtz et al., 1988; Evans et al., 2000]. Следовательно, эффективные
^канизмы поддержания внутриклеточного pH-гомеостаза крайне
ажны для деструкторов ДХМ. Однако исследования бактериальных
В ханизмов защиты от изменений pH до настоящего времени прово-
^или только с использованием Е. coli, S. typhimurium и экстремофиль-
„ых прокариот.
Как известно, pH-стресс оказывает на клетки комплексное воздей-
твие, обычно сопряженное с влиянием других факторов - оксигена-
ции, ростовой фазы, осмолярности среды, различных метаболитов
Pratt. Silhavy, 1995; Chagneau et al., 2001]. Так, окислительный стресс,
по-видимому, интенсифицируется повышением кислотности цито-
плазмы за счет увеличения растворимости солей Fe3+, Мо2+, Cd'+,
Mg2+, Al34 и, как следствие, образования АФК. Изменение цитоплаз-
матического pH приводит к изменению активности ферментов, а так-
же ионного баланса клеток путем прямого или опосредованного
влияния на целостность мембранных структур и функцию кислото-
чувствительных ионных каналов [Booth, 1985; Chagneau et al., 2001;
Stancik et al., 2002; Ермилова, 2007].
Одним из неиндуцируемых компонентов pH-гомеостаза является
буферная система, представленная, главным образом, аминокислот-
ными цепями белков. Однако действие такой системы ограничено
буферной емкостью. Вследствие этого рост бактерий на средах с раз-
личной кислотностью должен сопровождаться изменением ионной
проницаемости мембраны и биосинтезом специфических белков, за-
щищающих клетки от стрессоров. Кислотоустойчивый ответ индуци-
руется у М. dichloromethanicum DM4, о чем свидетельствует повы-
шенная устойчивость клеток к низкой кислотности (pH 4.0) при росте
на ДХМ, по сравнению с метанолом [Evans et al., 2000].
Ранее в качестве основного механизма контроля кислотности ци-
топлазмы рассматривались протонные FiFo-АТФазы, присутствую-
щие у большинства бактерий. В частности, обнаружена связь между
pH-гомеостазом и регуляцией биосинтеза АТФаз у кислоточувстви-
тельных мутантов Е. coli. Однако активность протонных АТФаз в
большей степени направлена на создание трансмембранного электро-
химического градиента Нь - протондвижущей силы (ПДС) [Booth,
1985; Ермилова, 2007].
Еще одним механизмом защиты клеток от снижения цитоплазма-
тического pH является стимуляция выброса протонов во внешнюю
сРеду в обмен на другие катионы системами соответствующих анти-
портеров. В частности, за внутренний pH клеток, растущих в кислой
103
среде, как полагают, ответствен К /Н -антипорт. В этом случае за; J
Н+ компенсируется у бактерий потреблением калия, так как К яЛ
ется основным катионом, повышающим внутриклеточный pH. 1]1
этом катион/протонные антипортеры, по-видимому, играют домин!
рующую роль при закислении цитоплазмы клеток. Кроме того, I
защиты от закисления могут использоваться “ионные циклы”, су J
ствующие на мембране клеток (Na+/H+, Na'IICOf/lFCl и др.) [Bol
1985; Koyama, Nosoh, 1985; Ventosa et al., 1998]. 1
Показано, что в кислотоустойчивость некоторых бактерий во J
чен пул GSH, участвующий в дегалогенировании ДХМ деструктор
ми. Так, у Е. coli GSH является регулятором системы калиевых к <i J
лов KelB/С, контролирующим pH цитоплазмы и внутриклеточно
пул калия. Показано, что у GSH" мутантов Е. coli происходит утеч!
ионов калия из клеток и уровень pH в цитоплазме снижается [Во<_.|
1985; Ferguson et al., 1995; 2000; Chesney et al., 1996; Evans et al., 20 il
Ricillo et al., 2000; Saier, 2000]. Очевидно, у метилобактерий GSH tJ
же играет заметную роль в поддержании внутриклеточного pH и №
ного баланса путем регуляции пула К+. Однако некоторые аддум
GSH повышают активность системы KefB/C, снижая pH цитоплазм1
Для защиты от хлорированных соединений более эффективен пул
восстановленного, а окисленного глутатиона, не участвующего в л
галогенировании ДХМ.
Универсальный механизм устойчивости бактерий к изменение
pH среды включает не только изменения ионной проводимости mv*i
браны, но и биосинтез стресс-специфичных белков [Ronson et а|
1987; Miller et al., 1989; Chang et al., 1998; Miyoshi et al., 2003]. Cpe.i
белков, индуцируемых изменениями кислотности среды, особое mi
сто принадлежит поринам - внешнемембранным каналообразующи
белкам, осуществляющим неспецифическую спонтанную диффузш
малых гидрофильных молекул. Установлено, что во внешней мемС* •
не Е. coli присутствуют два порина OmpF и ОтрС, общее количеств
которых в клетке постоянно, а соотношение контролируется pH сред,
и осмолярностью. Показано, что при закислении среды, как и в случ;
осмотического стресса, уровень экспрессии гена ompF не изменяете
но увеличивается биосинтез ОтрС, размер канала которого при см1
жении внешнего pH способен уменьшаться [Thomas, Booth, 19'/
Todt, McGroarty, 1992; Nikaido, 1994; Schulz et al., 1993; Pratt, Silhav
1995]. У E. coli предполагалось существование двух транскрипций*
ных регуляторов биосинтеза поринов, чувствительных к осмотич
скому давлению (EnvZ) и pH (OmpR) [Foster et al., 1994]. Общий от»
бактерий на снижение внеклеточного pH проявляется также в измен
104
фер
омошью транспортеров в обмен на новый субстрат [Lin et al., 1996;
пяются из клеток, предотвращая изменение внутриклеточного pH до
состава мембран и активностей функционирующих ферментов
."owe et а!.. 1993].
При снижении pH среды у Е. coli возрастала экспрессия генов де-
пбоксилаз глутамата (gadAB), аргинина (adiA), лизина (cadA) и ор-
* тйна (speF). Считается, что в процессе декарбоксилирования эти
Аепменты используют протоны, а продукты метаболизма (СОг и ще-
дОчные амины) для нейтрализации среды экспортируются из клеток с
омошью транспортеров в обмен на новый субстрат [Lin et al., 1996;
Castanie-Cornet et al., 1999; Tramonti et al., 2002]. Протоны вновь уда-
пякхгся из клеток, предотвращая изменение внутриклеточного pH до
детального уровня. Показано, что pH-модулирующая функция декар-
боксилаз может быть усилена транспортерами аминокислот и пепти-
дов [Kashiwagi et al., 1990; Butler et al., 1993; Wissenbach et al., 1995].
Однако, в отличие от кислотности культуральной среды, для цито-
плазматического pH не показано прямой связи с биосинтезом декар-
боксилаз аминокислот и дезаминаз [Booth, 1985; Lowe et al., 1993].
Важно отметить, что клетки М. dichloromethanicum DM4 менее ус-
тойчивы к обработке муравьиной и уксусной кислотами, нежели НС1.
Поскольку экзогенная НС1 не способна проникать в клетки из-за вы-
сокой полярности, последствия такой обработки могут существенно
отличаться от эффектов, вызванных ее образованием в цитоплазме
при деградации ДХМ. У аэробных метилобактерий это не исследова-
лось, тогда как для Е. coli показана большая чувствительность клеток
к изменениям внутреннего pH, чем внешнего. Таким образом, вероят-
но, устойчивость метилобактерий-деструкторов ДХМ к внутрикле-
точной продукции НС1 обеспечивают не только вышеперечисленные,
но и другие неизвестные системы резистентности [Evans et al., 2000;
Торгонская и соавт., 2007; Троценко, Торгонская, 2009].
Поддержание анионного гомеостаза при дегалогенировании ДХМ.
Интригующим аспектом биодеградации ДХМ остаются механизмы
защиты бактерий от внутриклеточной продукции СГ. Как известно,
ионы хлора при накоплении в цитоплазме могут инактивировать фер-
менты и влиять на анионный баланс, являющийся ключевым факто-
ром поддержания тургора клеток и пула К+ [Grabow et al., 1983;
McLaggan et al., 1994]. Хотя необходимость эффективных систем уда-
ления СГ вполне очевидна, механизмы поддержания ионного гомео-
стаза деструкторами ДХМ до сих пор неизвестны.
Более того, метилобактерий мало изучены в связи с солеустойчи-
востью. Недавно описаны новые таксоны умеренно галофильных ме-
тилобактерий, обитающих в водоемах и почвах различной степени
Минерализации [Ventosa et al., 1998; Троценко и соавт., 2007]. В ис-
кусственных хлорированных средах (системы подачи воды, ванные,
105
душевые установки) также выявлены фенотипически и филогенет
ски гетерогенные резистентные к хлору штаммы Methylobacte.
spp. Однако для большинства штаммов-деструкторов ДХМ, за ис*
чением Мр. Helvetica DM6 и A. methylovorans DM 10, показана низ
галотолерантность [Doronina et ai., 2000b; 2001; Hiraishi et al., 2005J
Поскольку повышение солености среды ведет к увеличению о.
тического давления, механизмы устойчивости клеток к этим
рам рассматриваются как сходные, несмотря на некоторые разлит
профилях экспрессируемых генов. Как известно, биоэнергетичес
аспекты галотолерантности клеток включают изменение ионн
транспорта через мембрану, переориентацию метаболических пу
на повышение синтеза осморегуляторов, замену солечувствительн
компонентов на солеустойчивые, а также сигналы, включающие
выключающие эти процессы при солевом стрессе [Csonka, 19
Weretylnik, Hanson, 1990; Fernandes et al., 1993; Ventosa et al., 1998].
Установлено, что в первой фазе солевого стресса изменяются ।
тивные конформации белков, ингибируются потребление аминок»
лот, активность ферментов ЦТК и синтетаз жирных кислот. Кри
того, ионы хлора оказывают влияние на биосинтез белков, пре.,
вращая агрегацию 508-субъединицы с комплексом 30S-M-PHK,
разъединяют уже связанные рибосомы, хотя точность самого проц»
са трансляции не нарушают [Grabow et al., 1983; Ventosa et al., 1998]
В этих условиях одним из общих механизмов устойчивости бак
рий к повышению внутриклеточной концентрации солей являет
биосинтез и накопление осмолитов - высокорастворимых незаряж<
ных цвиттерионных молекул, нетоксичных даже в высоких конщ
грациях. К ним относятся некоторые спирты (глицерин, сорбит, мз
нит), сахара (сахароза, трегалоза), аминокислоты и их производные
глутамат, бетаины, пролин, 5-оксопролин, карнитин, эктоины. Э
низкомолекулярные совместимые соединения защищают структу
клетки и поддерживают активность чувствительных ферментных сл
тем при повышении солености, осмотического давления, заморал
вании, нагреве и высушивании [Ventosa et al., 1998; Street et al., 2006
Показано, что при повышении солености среды глутамат и гл
цин-бетаин нормализуют работу ингибируемых СГ рибосом, а таю»
синтетаз жирных кислот и ферментов ЦТК. Глицин-бетаин и прол»
увеличивают объем цитоплазмы и содержание свободной воды
клетках при высокой осмолярности среды; их аккумуляция позволь
клеткам продолжать делиться при неблагоприятных условиях. Сле,;
вательно, синтез de novo или поглощение экзогенных осмолитов рй
сматриваются как стратегия адаптации бактерий к повышенному о
мотическому давлению [Ventosa et al., 1998; Roe et al., 1998; Bayk
106
л, 2000; Ермилова, 2007]. При сравнительном анализе уров-
аминокислот в клетках Мр. helvetica DM6 и A. methylovorans
"мЮ, выращенных на метаноле или ДХМ, выявлено увеличение от-
дельного содержания пролина (на 1.5—4.5%). Это свидетельствует
ажности данного осмолитика для защиты клеток от продукции НС1
Wilkinson
ней -
ительного содержания пролина (на 1.
.5%). Это свидетельствует
0 Ba^nw '
(Торгонская, 2009]. Тем не менее мутант М. dichloromethanicum DM4
;n]y|4-zl332) с инсерцией минитранспозона в гене, гомологичном
^ццн-бетаиновому транспортеру opuD Bacillus subtilis, не отличался
по скорости роста при различных концентрациях NaCl от родитель-
ского штамма [Kappes et al., 1996; Kayser et al., 2000].
Важную роль в ответе бактерий на солевой стресс играет актива-
ция “усилителями” экспрессии биосинтеза стресс-специфических бел-
ков. При этом синтезируются вне- и внутриклеточные ферменты, а
также мембрансвязанные транспортные белки. У галофильных аэроб-
ных бактерий обнаружен синтез солеустойчивых белков, имеющих
более высокий процент кислых (аспартат, глутамат) и малое количе-
ство гидрофобных аминокислот (глицин, серин, лизин). При этом
контроль качества белков осуществляется шаперонами и протеазами
[Ventosa et al., 1998; Madern et al., 2000; Mueller, Oren, 2003].
Тем не менее при высокой солености среды даже у галофильных
прокариот цитоплазматическая концентрация ионов, поддерживаемая
для нормального функционирования ферментов, значительно ниже
внеклеточной. В этом случае наиболее распространенным способом
поддержания ионного гомеостаза является энергозависимый выброс
солей и создание ступенчатого ионного градиента посредством сни-
жения проницаемости мембраны и активного экспорта ионов.
У аэробных бактерий подстройка ионной проницаемости и актив-
ности интегральных мембранных белков осуществляется путем регу-
ляции состава и свойств мембран [Lowe et al., 1993; Ventosa et al.,
1998]. При росте на ДХМ, как и в присутствии 100 мМ NaCl, на по-
верхности клеток Мр. helvetica DM6 и A. methylovorans DM10 обна-
ружены необычные хлор- и фосфорсодержащие структуры (рис.
3.3.6). Их функция, вероятно, связана с транспортом СГ ионов и/или
созданием внешнего отрицательного заряда, препятствующего обрат-
ному потоку анионов в цитоплазму [Торгонская, 2009].
Однако, если у галофильных микроорганизмов основную роль в
защите от внешней осмолярности играет ионоплотная мембрана, то у
бактерий с цитоплазматической продукцией СГ важнейшим меха-
низмом защиты клеток могут быть эффективные системы экскреции
ЭТИХ ионов. Доказательством данного предположения является полу-
ченный минитранспозонным (Тп5) мутагенезом мутант М. dichloro-
^thanicum DM4, неспособный экскретировать ионы хлора и расту-
107
щий лишь при низких концентрациях ДХМ с параллельным увел
нием содержания СГ в ростовой среде [Kayser et al., 2000].
До недавнего времени транспорт СГ через цитоплазматичес
мембрану бактерий был недостаточно охарактеризован. Известно,
неспецифический перенос СГ может осуществляться мембранн!
поринами, ионными каналами с низкой селективностью, Тгк-тр-’
портерами К и переносчиками анионов. Установлено, что в напр
лении выброса СГ из клетки работает симпортер К7СГ [De Li'
Hopfer, 1986; Saier, 2000; Jentsch et al., 2002; Rivetta et al., 2005]. К
ме того, электронейтральный транспорт ионов хлора осуществл..
котранспортеры Na+/C!~, Na+/K+/2C1 , (Na /НСОз )/(Н+/С1 ) и (
НСОз”. Однако эги транспортные системы обычно используются
ввода СГ в клетку против электрохимического градиента.
Рис 3.3.6. Ультраструктура клеток Мр. Helvetica DM6 (a-в) и A. methylovor
DM10 (г-е) при различных условиях культивирования: на метаноле при 0.05% N
(а, г); на метаноле при 1.5% NaCl (б, д); на дихлорметане при 0.05% NaCl (в, е). ПГ
гранулы полигидроксибутирата. ПФ - гранулы полифосфата. Длина масштабной
нейки 0.5 цт [Торгонская, 2009].
Практически у всех организмов (от бактерий до млекопитающ»
найдены 12 различных типов хлорных каналов, основной функци
которых является транслокация СГ через мембрану. Геномный анзл
108
оКариот выявил 9 возможных генов переносчиков СГ у бактерий и
Два гомолога хлорных каналов (CIC-Ecl, С1С-Ес2), кодируе-
W к генами yadQ (EriC) и mriT (MriT), найдены у Е. coli. В геноме
,. e(ipsulatus Bath также обнаружен участок ДНК, гомологичный
аМ белков хлор-канального семейства [Jentsch et al., 1999; 2002;
Lilis. Fong, 2001; Ward et al., 2004]. Показано, что у E. coli и других
и111ечных бактерий хлорные каналы функционируют как защитный
механизм при экстремальной кислотности среды, являясь не канала-
ми а Н+/СГ-обменными транспортерами с соотношением 2СГ/1Н+.
Предполагается, что эти каналы создают электрический шунт для на-
правленной наружу протонной АТФазы, связанной с декарбоксили-
рованием аминокислот [Iyer et al., 2002; Babini, Pusch, 2004].
Предполагалось, что начальная концентрация ионов хлора в среде
(-0.25 мМ) при дегалогенировании ДХМ позволяет бактериям экс-
кретировать ионы СГ по химическому градиенту, и их выход осуще-
ствляется путем диффузии через хлорные каналы. Подавление пас-
сивного выброса хлор-ионов в присутствии 100 мМ NaCl не приводи-
ло к ингибированию роста на ДХМ трансформантов Е. coli JTG10,
экспрессирующих функционально активную ДХМДГ Mph. leisingeri
DM 11. При этом максимальная активность транспорта СГ, по-види-
мому, превышала скорость метаболизма ДХМ и не могла быть отра-
жена линейным подъемом концентрации СГ в культуральной жидко-
сти [Evans et al., 2000].
Предполагается функционирование у деструкторов потенциал-
управляемых или энергозависимых механизмов экскреции СГ, таких
как СГ-АТФаза, активность которой недавно найдена не только в ми-
тохондриальной. но и в цитоплазматической мембране клеток млеко-
питающих [Booth. 1985; Evans et al., 2000; Gerencser, Zhang, 2003].
Дополнительными доказательствами являются обнаруженное у
Мр. Helvetica DM6 и A. methylovorans DM10 сокращение лаг-периода в
использовании ДХМ, специфичное для солевого стресса, а также не-
давно выявленная зависимость процесса дегалогенирования ДХМ от
Н -градиента и энергии АТФ [Торгонская и соавт., 2007].
Таким образом, несмотря на достигнутый прогресс в понимании
принципов структурно-функциональной организации и регуляции ми-
нерализации ДХМ у бактерий, расшифровка молекулярных меха-
низмов этого процесса требует привлечения современных методов и
подходов, включающих функциональную геномику/протеомику. В
Эт°й связи новые горизонты открывает мультимерный мониторинг и
анализ единичных клеток в микролитровых реакторах, сопряженных с
электронными мини-чипами-сенсорами, что уменьшает стохастиче-
ские эффекты гетерогенности популяций, маскирующие реальные
109
ответы клеток на воздействие различных стрессоров [Lidstrom,
drum, 2003]. Остается надеяться, что разработка и реализация 1
уникальной методологии позволит в недалеком будущем сделать
доступной для фундаментальных и прикладных исследований. ]
3.4. Пути метаболизма метилсернистых соединений
деградации серосодержа
Метилобактерий, способные к
Ci-соединений, филогенетический функционально разнообразны!
используют различные ферментные системы (монооксигеназы, мет^
трансферазы, оксидазы, редуктазы) для разложения этих субстратов.»
Бактериальное
окисление
неорганической серы
Сульфштоксидаза
I* H2SO4
МТ-оксидаз
дадс- /
редуктаза /
ДМДС<=± МТ
«Химическое] \
{окисление । 5
H2SO3 Монооксиаана
^\матансульфти
Rhodococcus ФМН-НгДМСОг \
SY1 монооксиаамаза \
Метансульфоновая
кислота
ДА<С-
дмидроаеназа
ДМС<=± ДМС05=± ДМСО2
ДМСО- ДМСОг
радуктаза дааидроааназа
\ДМО или ДМСмтил*
Сх. пфвисфараза
г Моноомсиаана
метамсульфом
Пути окисления
формальдегида
НСООН
Формиат* I
дааидроаелазы I
Рис 3.4.1. Интегральная схема биохимических и химических взаимопревращени
S-метилсоединений и ключевые интермедиаты метаболизма серы и углерода 1
Известно несколько путей биодеградации диметилсульфида:
использование в качестве источника углерода и энергии; 2) окислен!
до ДМСО фото- и гетеротрофами; 3) использование в качестве исто’
ника S. В литературе сообщалось о путях деградации ДМС, вклй
чающих метантиол и/ или H2S в качестве интермедиатов, тогда №
другие пути не продуцировали летучие сульфосоединения. Инт<
тральная схема иллюстрирует взаимопревращения ДМС и родств^
ных Ci-сульфосоединений у различных организмов (рис. 3.4.1).
Использование ДМС бактериями в качестве источника угЛ
рода и энергии. Бактерии используют ДМС в качестве источника G
НО
Mciq^nta
одним ИЗ двух путей, включающих ДМС-монооксигеназу или ме-
£ трансферазу, осуществляющих начальное окисление ДМС [De
тИ t et aL, 1981; Visscher, Taylor, 1993b]. Предполагалось, что метил-
нсфераза ингибируется хлороформом, тогда как ДМС-моноокси-
- МТБЭ.
Монооксигеназный путь
ранее было предположено, что метаболизм Hyphomicrobium sp. S
клК)Чает начальный НАД(Ф)Н2-зависимый этап окисления ДМС мо-
нооксигеназой (ДМО) до ФА и метантиола (МТ). Участие ДМО было
также предположено у ряда штаммов Thiobacillus [De Bont et al., 1981;
Visscher, Taylor, 1993b]. Они окисляют ФА через формиат с образова-
нием восстановительных эквивалентов и СО2, который ассимилируют
в рБФщикле [Kelly, Baker, 1990]. Метантиол, образуемый ДМО на
первом этапе, деградируется оксидазой до ФА, Н2О2 и H2S. ФА или
ассимилируется, или окисляется до СО2, тогда как H2S превращается
МТ-оксидазой (Hyphomicrobium spp.), либо сульфидоксигеназой (Thio-
bacillus spp.) в H2SO3, которая далее окисляется в сульфат. Перекись
водорода расщепляется до Н2О и О2 каталазой. В последнем случае
рост бактерий, использующих МТ-оксидазу, обычно ингибируется
З-амино-1,2,4-триазолом [Suylen et al., 1987; Gould, Kanagawa, 1992].
Биохимическая и генетическая основы деградации ДМС и МТ у
этих изолятов мало охарактеризованы, хотя МТ-оксидаза была очи-
щена из нескольких видов, включая Hyphomicrobium sp. EG, Thioba-
cillus thioparus TK-m и Rhodococcus rhodochrous. МТ-оксидаза из Hy-
phomicrobium sp. EG не требует кофакторов для проявления активно-
сти [Suylen et aL, 1987; Gould, Kanagawa, 1992; Kim et aL, 2000].
Нечувствительность этой МТ-оксидазы (К.Ф. 1.8.3.4) к металл-
хелатирующим агентам (ЭДТА и неокупроину) предполагает, что
фермент не содержит ионы металлов или гемовые кофакторы. Натив-
ный фермент Hyphomicrobium - мономер м.м. 29-40 кДа. Недавние
исследования, однако, дали более высокие значения: -61 кДа для МТ-
°ксидазы Rh. rhodochrous и Г. thioparus TK-m [Kim et al., 2000; Lee et
aU 2002]. Неясно, могут ли существовать МТ-оксидазы с разными
Мм- В любом случае, имеется значительный пробел в знании биохи-
Мии окисления МТ у бактерий.
Умеренно галофильный облигатный метилотроф Methylophaga sul-
fidovorans, выделенный из морского микробного мата, окисляет диме-
ТиЛсульфид до формальдегида и метантиола соответствующей моно-
°Ксигеназой [De Zwart et al., 1996; Gonzales et al., 2010] по уравнению:
(CH3)2S + НАДН2 + O2 -> HCHO + CH3SH + H2O + НАД+.
^тантиол далее трансформируется оксидазой в сульфид и ФА, асси-
МИлиРуемый РМФ-путем: CH3SH + О2 + Н2О НСНО + H2S + Н2О2.
111
Хотя активность ДМС-моноокисгеназы найдена у аэробных
ло- и автотрофных деструкторов, дальнейшая информация о фер^Л
те не появлялась, по-видимому, из-за его нестабильности. СоотвеЛ
венно, гены, кодирующие ДМО, не идентифицированы. Я
Метилтрансферазный путь 1
Thiobacillus sp. ASN-1 использует альтернативный начальный эД
деградации ДМС, независимый от кислорода, связанный с участив
метилтрансферазы [Visscher, Taylor, 1993а,Ь]. Предполагается, Л
метильная группа переносится на молекулу акцептора и затем qkjJ
ляется через фолатсвязанные интермедиаты. В качестве метилакцД
тирующего фактора предложен, но не идентифицирован, кобаламин
Дальнейшее окисление остающегося МТ, по-видимому, следует Л
же схеме, как и в случае ДМС-монооксигеназного пути.
Метаболизм ДМСО2 и ДМ СО через ДМС
Начальные исследования на Hyphomicrobium sp. X показали, Л
ДМСО восстанавливался в ДМС, который поступал в монооксигеназ-
ный путь. Недавно найдено, что ДМСО2 также может метаболизиро.
ваться через ДМС редуктазами и монооксигеназой у Hyphomicrobium
sulfonivorans и Arthrobacter sulfonivorans [Borodina et al., 2002]. f
НАДФН2 НАДФ+
ДМДС
H2O + O2 H2O2
2Н2О
4Н++ 4ё
2Н2О
4Н+ + 4ё
нсно
H2O+1/2 о2
ДМСО ДМС
4Н2О
8Н+ + 8ё
H2SO4
I ...
Рис. 3.4.2. Пути окисления и ассимиляции диметилсульфоксида (ДМСО),
тилсульфида (ДМС), диметилдисульфида (ДМДС) и метантиола (CH3SH)
Thiobacillus thioparus использует ДМС, ДМДС и МТ как энерг°
дающие субстраты, фиксируя СО2 через РБФ-цикл. ГифомикробЫ 1
метилофаги усваивают S-метилсоединения в качестве источнике®
112
^ерода и энергии, ассимилируя образующийся ФА, соответственно,
у иновым или РМФ-путем (рис. 3.4.2).
сеРфакультативные метилобактерии рода Arthrobacter обладают ре-
ктазами диметилсульфона и диметилсульфоксида, монооксигеназой
иметилсульфида и метантиолоксидазой, а образующийся формаль-
ГИД ассимилируют РМФ-путем.
Известно несколько видов метилобактерий, способных расти на
^етансульфоновой кислоте. Из почвы выделен “Methylos ulfonom onas
inethylovora” а из морской воды - умеренный галофил “Marinosul-
fonomonas methylotropha^y них обнаружена специфическая моноок-
сигеназа, разлагающая метансульфоновую кислоту до ФА и сульфита:
CH2SO3H + о2 + надн2 НСНО + НАД+ + H2SO3 + н2о.
Транспорт Большая Малая Фвррвдоксин Редуктаза
мета и сульфо ио вой субъединицы
кислоты гидроксилазы
Пермеаза
(32кДа)
АТФ-свяэывающий
белок (32 «Да)
Мембран-
ассоциированный
белок (29 кДа)
Периллазматимеский
связывающий белок
И2кДа)
Рис.3.4.3. Генетическая организация оперонов транспорта (mszzzEFGH) и окисле-
ния (msmABCty метансульфоновой кислоты у Methylosulfonomonas methylovora'M'2.
Образующийся ФА далее ассимилируется сериновым путем. Мо-
лекулярный анализ этой монооксигеназы (К.Ф. 1.14.13.111) показал,
что фермент является уникальным мультикомпонентным комплексом,
состоящим из четырех различных полипептидов. Выявлены двухком-
понентная гидроксилаза MsmAB (48 и 20 кДа), образующая а 3/р3
структуру с м.м . нативного белка 210 кДа, а также ферредоксин
MsmC (16 кДа) и редуктаза MsmD (38 кДа) (рис. 3.4.3). Идентифици-
рованы соответствующие структурные гены msmABCDn их кластер
На хромосоме. Рядом расположены гены, кодирующие транспортную
систему для метансульфоната.
Эта система имеет большое сходство с транспортерами АВС-типа
и включает периплазматический субстратсвязывающий белок MsmE
(42 кДа), интегральный мембран-ассоциированный белок MsmF
(33 кДа), АТФ-связывающий белок MsmG (31 кДа) и пермеазу MsmH
(см. рис. 3.4.3). Показано, что гены msmABCDw тзлтЕРОНобразуют
^Ва разных оперона, соответствующих оксигеназной и транспортной
системам. При этом метансульфонат индуцировал экспрессию оперо-
113
на msmABCD, тогда как оперон msmEFGH экспрессировался коне
тутивно, т.е. даже при росте “Methylosulfonomonas methylovora"
среде с метанолом [De Marco et aL, 1999; Jamshad et al., 2006]. J
По-видимому, галофильные аэробные метилобактерий nrpaiJ
важную роль в разложении метилсернистых соединений в морсК03
среде, а негалофильные представители родов Methylosulfonomoncti
Hyphomicrobium, Methylobacterium, Pedomicrobium, Arthrobacter - B
пресных водоемах и почве.
3.5. Транспорт электронов и окислительное фосфорилирование
у метилобактерий
Окисление метанола сопровождается генерацией протонного грц.
диента (ДрН), поскольку освобождающиеся протоны остаются в пе-
риплазме, а электроны транспортируются через мембрану цитохром-
ными компонентами к терминальной оксидазе а/аЗ и акцептируются
кислородом с потреблением Н+ цитоплазмы. Эффективность переноса
электронов от МДГ на кислород (—> Н/О = 3.0-3.5) предполагает
функционирование нескольких транслоказ [Четина, Троценко, 1986;
Троценко, Четина, 1988]. Компоненты электронтранспортной цепи
(ЭТЦ) наиболее детально исследованы у Methylophilus methylotrophus,
Methylobacterium extorquens AMI и Paracoccus denitrificans, имеющих
цитохромы b, с и а/аз. Цитохромы b и с могут реагировать с СО. I
СН3ОН —>МДГ—►
ЦИТ CL--► ЦИТ Сн
-г ЦИТ Ссо --► О2
цит а/а3 —► О2
CH3NH2—>МАДГ —* амицианин—>цит cL—► цит сн—►цит а/а3—► О2
Рис. 3.5.1. Пути переноса электронов при окислении метанола и метиламина
аэробными метилобактериями
ЭТЦ метилобактерий для окисления НАДН? по своей организации
и функциям мало отличаются от других видов бактерий, поскольку
содержат убихиноны, железосерные белки и цитохромы типа Ь, с, а*
Все метилобактерий имеют хинопротеиновые дегидрогеназы для
окисления метанола и метиламина, содержат высокие концентраций
двух различных цитохромов типа с, оксидазы типа a/a3, о, или, в не*
которых случаях, могут синтезировать оба типа оксидаз. Первичным
акцептором электронов от МДГ служит необычный цитохром ей
(19 кДа), имеющий гемсвязывающий сайт. От цитохрома cL электро!
ны передаются на цитохром сн, который является субстратом для ЦИ1
114
пПмоксидазы (рис. 3.5.1). Анализ МДГ-дефицитных мутантов вы-
тО^Р
л что синтез метанолокисляющеи системы представляет сложный
Я оцесс, в котором участвуют около 30 генов.
растворимые цитохромы типа с. Растворимые цитохромы типа с,
Еденные у большинства метилобактерий, имеют единственную по-
^пептидную цепь, которая несет единственный гем. Они различают-
ся по редокс-потенциалу: су (L - low, низкий) и си (Н - high, высокий).
Цитохром является непосредственным акцептором электронов от
затем они передаются на цитохром сн и далее на цитохром Со
или а!а3- [Anthony, 1982].
Рис. 3.5.2. Структура цитохрома cl, определенная методом рентгенокристаллогра-
фии (1.6 Е) [Williams et al., 2006]
Цитохром с l- Это необычный цитохром типа с, возможно, уни-
кальный для метилотрофов; превосходит цитохром сц по молекуляр-
ной массе, имеет более низкие значения р! и окислительно-восста-
новительного потенциала (ОВП), содержит дополнительный цистеи-
новый остаток и более чувствителен к воздействию протеаз. Несмотря
на локализацию в периплазматическом пространстве, он тесно связан
с Мембраной. После удаления с мембраны посредством детергентов
Цитохром Cl имеет те же свойства, что и растворимый аналог. По-
ртимому, цитохром cl выполняет на мембране его функцию, являясь
первичным акцептором электронов от МДГ и регулируется вместе с
^ДГ в одном опероне [Nunn, Lidstrom, 1986]. Цитохром Cl способен
быстро восстанавливаться при повышении pH раствора. После добав-
Ления МДГ к раствору цитохрома Cl рК реакции восстановления за-
метно понижался, и она легко протекала даже при нейтральном pH
115
периплазматического пространства. Возможно, самовосстановле,
цитохрома играет роль в процессе передачи электронов от МДГ
цитохром [Elliott, Anthony, 1988]. Рентгенокристаллографичес
анализ структуры цитохрома Ci, несмотря на большие отличия
аминокислотной последовательности от других цитохромов, вы-„
ядро, типичное для цитохромов с класса 1, с а-спиралями, закрут
ными в компактную структуру, включающую простетическую гру
гема, открытую с одной стороны. Еще одним необычным свойсц
цитохрома cl является наличие дисульфидного мостика, связываю
го длинный С-концевой вырост с телом структуры. Также обнару
но, что с внутренним гем-пропионатом тесно связан Са2+,
видимому, участвующий в стабилизации редокс-потенциала и в?,
ный для потока электронов от восстановленного PQQ в МДГ к rci
цитохрома С[ . Гем-пропионаты соприкасаются с внешней средой, ч
указывает на необычное влияние pH на редокс-потенциал этого ци1
крома (рис. 3.5.2) [Williams et al., 2006].
Цитохром сн меньше по массе, но имеет более высокие значен
ОВП, только два остатка цистеина (связанных с гемом), менее пс
вержен протеолизу. Аминокислотная последовательность и структу
этого цитохрома похожа на последовательность цитохромов с клас
I, которые переносят электроны с комплекса митохондрий на цит
хромоксидазу [Read et al., 2008]. Этот цитохром всегда локализова,"
периплазме и легко солюбилизируется.
Голубые медьсодержащие белки (купредоксины). У некотор
метилотрофных бактерий в ЭТЦ обнаружены Си2+-содержащие белк
которые названы купредоксинами по аналогии с ферредоксинам
Это водорастворимые белки небольшой молекулярной массы, со. ,с
жат один атом Си2+, связанный двумя остатками гистидина и по
ному — цистеина и метионина — с единственной полипептидной цеш
[Adman, 1985; Husain et al., 1986]. Подобно цитохрому с, купредокс
ны действуют как переносчики электронов в ЭТЦ и имеют OBI
близкие к цитохрому, с которым они связаны. На основании изучен!
аминокислотных последовательностей купредоксины разделены ня
класса, которые, однако, не коррелируют с функциями этих белко
клетках: пластоцианины, псевдоазурины, имицианины и азурит
причем последний класс отличается от остальных тем, что его пре
ставители имеют в молекуле дисульфидный мостик [Ambler, Tobai
1985]. У метилобактерий до настоящего времени найдены два купр
доксина - амицианин и азурин. Показано, что у М. extorquens AM
амицианин служит естественным акцептором электронов для МА, .
[Tobari, Harada, 1981]. В случае окисления метиламина, электроны
МАДГ передаются на амицианин — голубой Cu-содержащий бело
116
тохром а!аз ~ терминальная оксидаза у М. extorquens AMI, специ-
чески окисляет цитохром сн (см. рис. 3.5.1).
Ф14 цитохромоксидазы. В качестве цитохромоксидаз метилотрофные
бактериИ обычно содержат цитохром а/а3 или цитохром о, который
ходит в цитохромоксидазу со- У Methylobacterium sp. AMI преобла-
0а1Ощая оксидаза - цитохром а/а3. Этот цитохром очищен до гомо-
^[ного состояния и по свойствам близок другим оксидазам типа а!а3
[Fukumori et al., 1985]. Mph. methylotrophus синтезирует в зависимости
QT условий выращивания 2 типа оксидаз: в случае лимита по углероду
в условиях хемостата основной оксидазой является цитохром а!а3.
Напротив, в случае лимита по кислороду (углерод в избытке) клетки
переключали поток электронов к кислороду на оксидазу cq, уровень
которой повышался в 10 раз [Greenwood, Jones, 1986]. Оксидаза cq
выделена и очищена, содержит по два идентичных гема b и с, связан-
ных с полипептидной цепью, последовательность которой отличается
от растворимых цитохромов сн и С[, хотя по молекулярной массе они
близки [Frond, Anthony, 1984а,Ь].
Как уже отмечалось, МДГ и МАДГ локализованы в периплазмати-
ческом пространстве и слабо прикреплены к периплазматической
мембране. Там же локализованы цитохромы с и купредоксины, быст-
ро реагирующие между собой. МДГ восстанавливает цитохром сн,
однако для чистых белков скорость реакции оказалась неожиданно
мала [Beardmore-Gray, Anthony, 1984]. Возможно, в процессе участву-
ет низкомолекулярный фактор, природа которого не выяснена. МАДГ
быстро восстанавливает амицианин, служащий первичным акцепто-
ром электронов, синтез которого стимулируется при росте клеток на
метиламинах [Tobari, Harada, 1981; Lawton, Anthony, 1985a,Ь]. Коли-
чество амицианина у различных организмов варьирует и у некоторых
видов его трудно определить (например, у Mph. methylotrophus), по-
скольку функции амицианина могут выполнять цитохромы.
Очищенные оксидазы а/а3 и cq М. extorquens AMI и Mph. methy-
lotrophus специфически реагируют на цитохром Сь, причем в опытах с
фосфатидилхолиновыми искусственными мембранами показано, что
встроенный в них цитохром ссо имеет одинаковое сродство к цито-
хромам сн и сь однако, скорость окисления восстановленного цито-
хрома сн оксидазой в 50 раз выше [Нетрусов, 1987]. Азурин также
окисляется реконструированной цитохромоксидазой со, а это свиде-
тельствует, что путь электронов от МАДГ к кислороду может мино-
вЭ1ь цитохромы сн и cl [Anthony, Jones, 1987].
МДГ и МАДГ, цитохромы сн и cl, купредоксины амицианин и
азУрин расположены на периплазматической поверхности бактери-
^ьных мембран [Jones et al., 1982; Carver, Jones, 1984; Husain et al.,
1986; Fassel et al., 1992J. Степень прикрепления этих гидрофильц
компонентов к мембране определяется их концентрацией. Так, по
шение концентрации МДГ в клетках Mph. methylotrophus, лимити
ванных по углероду, приводило к большей "растворимости” ферм^
по сравнению с лимитированными по кислороду, что, видимо, оц
деляется числом мест прикрепления на мембране, специфичных ,
МДГ.
НАДН2
2Н-72О2 Н2О
Цитоплазма
Внутренняя
мембрана
НАДНг
дегидрогеназа
Убихинон
цит Ьс
оксидаза
Оксидаза
Периплазма
НСНО
СНзОН
МДГ
ЦИТ CL
ЦИТ Сн
Клеточная стенка
2Н+
Рис. 3.5.3. Структурно-функциональная организация электронтранспортной
метилобактерий [Anthony, 1980]
В противоположность этому, гидрофобные оксидазы а/аз и со л
но связаны с мембраной. По аналогии с высшими организмами, ци1
кром а/аз может занимать трансмембранное положение у метилотр
фов. Радиоизотопные исследования показали, что цитохромы с и
оксидазы частично расположены на внешней стороне мембраны,
нельзя исключить их трансмембранной локализации [Anthony, Jon
1987]. Имеются, по крайней мере, три точки сопряжения транспо;!
электронов с синтезом АТФ: НАДН2 - хинон, хинон - цитохром с
цитохром с и О2. Напротив, у типичных аэробных гетеротроф»!'
бактерий большинство дегидрогеназ находятся в цитоплазме или
цитоплазматической мембране. Расчет энергетического выхода п
окислении метанола показал, что 2Н+, транслоцируясь на внешн
стороне мембраны, создают ПДС для продукции ~0.6 АТФ на кажд}
молекулу спирта (рис. 3.5.3) [Нетрусов, 1987; Троценко, Чети;
1988].
Глава 4
АЭРОБНЫЕ метилобактерий экстремальных
ЭКОСИСТЕМ
4.1. Умеренно гало(алкало)фильные и ацидофильные
аэробные метилобактерий
На фоне глобального загрязнения окружающей среды и возрас-
та(о1цего числа местообитаний с высоким содержанием токсичных
-соединений все большее внимание исследователей привлекают
микроорганизмы, обитающие в экстремальных условиях, и механиз-
мы их устойчивости к различным типам стрессовых факторов. Такой
интерес к экстремофильным/толерантным микроорганизмам обуслов-
лен необходимостью разработки более совершенных биотехнологиче-
ских процессов разложения этих поллютантов с использованием
культур и ферментов, активных в широком диапазоне физико-
химических параметров, а также возможным влиянием эксгремофи-
лов на глобальные и локальные биогеохимические процессы [Безбо-
родов и соавт., 2008; Троценко, Хмеленина, 2008].
К умеренным галофилам принято относить микроорганизмы, оп-
тимально растущие при 0.5-2.5 М NaCl в среде. Это гетерогенная фи-
зиологическая группа микроорганизмов, принадлежащих к различ-
ным классам прокариот и эукариот [Кашнер, 1981]. До 1980 года бы-
ло описано только шесть умеренно галофильных видов (неметило-
трофных) бактерий, которые были включены в Approved Lists of Bac-
terial Names [Skerman et al., 1980]. Однако в настоящее время известно
несколько десятков видов умеренно галофильных бактерий, принад-
лежащих к различным родам. Первыми среди них оказались изоляты
морских аэробных метилобактерий рода Methylophaga. Позднее было
продемонстрировано широкое распространение умеренно галофиль-
ных метилобактерий в различных биотопах и описаны представители
новых таксонов [Yamamoto et al., 1978; 1980; Strand, Lidstrom, 1984;
Janvier et al., 1985; Ventosa et al., 1998; Намсараев и соавт., 2006; Тро-
ценко и соавт., 2007; Намсараев, 2009].
Способность бактерий расти или выживать в соленой и щелочной
сРеде имеет большое экологическое, промышленное и эпидемиологи-
ческое значение, поскольку галоалкалофилы/толеранты вызывают
п°рчу материалов и пищевых продуктов, некоторые заболевания у
Человека и животных [Padan et al., 2005]. Соленые и щелочные места
скитания присутствуют на всех континентах и заселены адаптирован-
119
ними к этим биотопам микробными сообществами. Интерес к гад,
калофильным/толерантным микроорганизмам обусловлен не то,-
необходимостью понимания механизмов адаптации к высоким зц
ниям солености и pH, но и перспективами их использования в ‘
технологии. Многие известные метилобактерии являются нейтр
лами. Однако в последние годы спектр галофильных и алкалоф;
ных метилобактерий значительно расширен. Установлено, что
являются участниками глобального цикла углерода в соленых и
лочных биотопах. Обладая минимальными ростовыми потреби
ми, галоал кал оф ильные метилобактерии удобны для исследовз
механизмов осмоадаптации. Ниже рассмотрены более детально <
бенности биологии умеренно галофильных нейтрофильных и алк'
фильных метилобактерий.
Экология умеренно галофильных метилобактерий
Морские экосистемы. Метанол, метилированные амины, хл
бром- и йодметан, ди метилсульф ид, диметилсульфоксид, метанп
метансульфоновая кислота и другие С]-соединения присутствуй
морских экосистемах, образуются анаэробными микроорганизма
водорослями, а также поступают в эти биотопы с осадками.
Первые галофильные метилобактерии были выделены из морс-
проб и представлены видами рода Methylophaga'. М. marina, М. i
lassica, М. sulfidovorans, М. Hmanica, М. aminisulfidivorans [Janvier
al., 1985; De Zwart et al., 1996; Доронина и соавт., 1997; Kim et
2007]. Недавно, с использованием метода in situ гибридизации с 1
рРНК-специфичными флуоресцентно-меченными олигонуклеои
ними зондами (FISH), было показано широкое распространение
терий рода Methylophaga в морских образцах. Так, во всех 10 исс.
дуемых пробах морских осадков побережья Франции in situ гибри.
зация с праймером МРН-730, специфичным для представите
Methylophaga, выявила присутствие метилобактерий этого рода. Бои
того, в 5 образцах с использованием другого видоспецифичп
праймера МРН-994 обнаружены штаммы М. marina [Janvier et I
2003]. Однако оценка численности бактерий рода Methylophaga в м.
ских пробах не проводилась.
Из образцов зеленых морских водорослей Ulva lactuca и Cystos*
trinodes, отобранных в разных участках прибрежных зон Красн
моря, нами выделены метилобактерии, идентифицированные мето,
ми полифазной таксономии, включая секвенирование генов 1
рРНК, как штаммы КМ вида М. marina (99% сходства). Как извесп
ауксотрофность по витамину BJ2 считалась одним из характера
признаков рода Methylophaga. Однако существенным отличием но>
изолятов М. marina КМЗ и КМ5 оказалось отсутствие зависимости
120
oBbix факторов, в частности, от витамина В12 [Ли и соавт., 2007],
р°с изВодит этот признак на уровень фенотипического проявления.
ч'г°03 лимана Азовского моря выделена нейтрофильная умеренно га-
(Ъильная метилобактерия, идентифицированная как представитель
ого рода Methylarcula marina [Doronina et al., 2000a; Doronina,
tsenko, 2005b]. Новый род “Marinosulfonomonas” предложен также
я штаммов метилотрофных бактерий, выделенных из водных об-
разцов Плимутского пролива (Английский канал) и представленных
пом “Marinosulfonomonas methylotropha” [Baker et al., 1991; Holmes
ц al-, 1997]. Умеренный галоалкалофил Paracoccus haeundaensis sp.
nov. выделен из Японского моря [Lee et al., 2004], а факультативный
еЙтрофильный метилотроф Leisingera methylohalidivorans изолиро-
ван из морской воды побережья Калифорнии [Schaefer et al., 2002]. Из
гиперсоленого хлорид-сульфатного озера в Кулундинской степи изо-
лирован умеренно галофильный облигатный метилотроф Methyloha-
lotnonas lacus. Донные осадки озера Магади (Кения) послужили ис-
точником выделения еще одной галоалкалофильной факультативной
метилобактерии Methylonatrum kenyense [Sorokin et al., 2007].
Таким образом, согласно немногочисленным литературным дан-
ным, наиболее распространенными в морской среде являются уме-
ренно галофильные метилобактерии рода Methylophaga. Резонно по-
лагать, что биоразнообразие метилобактерий морских экосистем этим
не исчерпывается [Schaefer et al., 2010].
Содовые озера. Микробные сообщества эпиконтинентальных со-
довых водоемов рассматривают как аналоги реликтовых центров раз-
нообразия наземной микробиоты [Заварзин, 1993; Grant, Jones, 2000].
Установлено, что микробные сообщества щелочных водоемов пред-
ставляют многомерную кооперативную систему с устойчивыми тро-
фическими связями и почти замкнутым круговоротом веществ [Завар-
зин и соавт., 1999]. Следовательно, эти водоемы удобны для изучения
филогении, биоразнообразия и механизмов выживания прокариот в
Условиях воздействия комплекса стресс-факторов и, прежде всего,
существенного колебания значений t°, pH, концентрации NaCl и об-
щей минерализации среды.
В последнее десятилетие активно исследуются аталассические
озера Африканского Рифта, Центральной Азии, Юго-Восточной Си-
бири, Южного Забайкалья и Северной Америки. Комплексные иссле-
дования этих экосистем выявили различные физиологические группы
(гало)алкалофильных прокариот - цианобактерии, ацетогены, суль-
Фатредукторы, фототрофы, Нг-использующие и сероокисляющие бак-
1ерии, натронобактерии-археи, спирохеты и алкалофильные термото-
Ги> В том числе аэробные метанотрофы [Ventosa et al., 1998; Заварзин
121
и соавт., 1999; Joye et al., 1999; Горленко и соавт., 1999; Калюжн
соавт., 1999]. Известно, что в содовых озерах образуются различ
Отсоединения: метанол, формальдегид, формиат как интермед!
окисления метана метанотрофами, а также метилированные ами|
продукты разложения бетаина метаногенами. Кроме того, неком
(^-соединения поступают из атмосферы с дождем и снегом, hJ
мер, метансульфоновая кислота [Kelly et al., 1994; Заварзин и c-J
1999; Троценко, Хмеленина, 2002]. Логично было предположите
аэробные метилобактерий также могут входить в состав алкалоф^
ных микробных сообществ содовых озер. 1
Действительно, из 35 проб щелочных озер Южного Забайкг»
Монголии нами были выделены накопительные бактериальные и
туры, активно растущие на метаноле как источнике углерода и J
гии при содержании NaCl 3-9 % и pH 9-10 и не требующие доп. j
тельных ростовых факторов. Эти ассоциативные культуры d
весьма стабильны: они поддерживались при 4еС в жидкой среде е
чение многих лет при пересеве один раз в год. При их высыхя
культуральная среда становилась желеобразной из-за накопления
зополисахарида (ЭПС), очевидно, стабилизирующего клетки [Д<
нина, Троценко, 1997а].
Выделение чистых культур метилобактерий из таких галоалк.
фильных консорциумов осложнялось тем, что колонии на arad
ванных средах были представлены несколькими морфотипами кле
т.е. ассоциациями разных видов бактерий. Полагая, что монокул! f
нуждаются в ростовых факторах, поставляемых спутниками, мы
пользовали агаризованные среды с добавлением культуральной я
кости метанотрофов, ранее выделенных из тех же самых проб ила
довых озер. В результате удалось выделить 15 чистых культур Г8
отрицательных метилобактерий. Большинство из них были ayi
трофны по витамину В ]2, а два изолята нуждались в биотине.
В ^-зависимые штаммы были представлены мелкими подвижн?
монотрихами. Характерной особенностью клеток было наличие
ширного периплазматического пространства (~20 нм). Клетки с
добной ультраструктурой присутствовали во всех 35 ассоциатиь
метилотрофных культурах, выделенных нами из проб ила различ:
содовых озер. Два В ^-зависимых изолята были идентифицирон
как новые алкалофильные виды рода Methylophaga: М. alcali
М. natronica. Напротив, два биотинзависимых галотолерантных
культативно-метилотрофных изолята идентифицированы как hoi
вид Ancylobacter natronum. Из этих же проб ила ранее были выдел
метанотрофы [Калюжная и соавт., 1999; Доронина и соавт., 21
Doronina et al., 2003а,Ь]. По-видимому, эта трофическая связь
122
лена тем, что интермедиаты окисления метана (метанол, ФА и
СЛрМиат) частично экскретируются метанотрофами в окружающую
с^рОме того, многие виды рода Ancylobacter, будучи олиготрофами,
г использовать водород в качестве донора электронов, а СО2 -
источник углерода. Такая метаболическая гибкость позволяет
кзК хемолитотрофам сосуществовать с истинными метилотрофами в
Э стремальных биотопах [Raj, 1989]. Интересно отметить, что Ancylo-
э r aquaticus Z-238 и Z-2434 (ранее Microcyclus aquaticus) также
быШ изолированы из накопительной культуры метанотрофных бак-
терий. полученной из низового болота [Намсараев, Заварзин, 1972].
Фото(хемо)литотрофы
Метаногены
Аэробные метилобактерий Метанотрофы
нсоон -----СН2О «----СН3ОН
Аэробные метилобактерий
Рис. 4.1.1. Аэробные метилобактерий как компоненты микробной трофической
цепи метанового цикла в содовых и соленых озерах
Наши результаты дают основание считать аэробные метилобакте-
рии функциональными компонентами микробных сообществ содовых
водоемов и дополняют предложенные ранее схемы трофических
взаимосвязей (гало)алкалофильных гетеротрофов и олиготрофов, ме-
таногенов и метанотрофов [Заварзин, 1993; Заварзин и соавт., 1999;
Калюжная и соавт., 1999]. Следовательно, аэробные метилобактерий,
являясь необходимым звеном трофической цепи микробиоты щелоч-
ных экосистем, обеспечивают возврат углерода продуктов неполного
окисления метана и метиламинов в общий пул органического вещест-
83 этих водоемов (рис. 4.1.1).
Почвы и породы выветривания. Несмотря на то что Отсоединения
Повсеместно распространены в природе, метилобактерий засоленных
п"Чв практически не исследованы. Опубликовано только одно сооб-
щение о выделении галофильных метилобактерий Methylarcula terri-
Со^° из почв с высоким содержанием NaCl [Doronina et al., 2000а].
123
Наряду с воздействием физико-химических факторов, каме". .А
памятники подвержены процессам деструкции микробными сооГ.Л
ствами биопленок, в состав которых входят бактерии, грибы и н Ж
росли. Установлено, что микроорганизмы биопленок на поверхц,
камня связаны трофическими взаимодействиями. Наиболее разном
разной микрофлорой характеризуются поверхности разрушающее^
мрамора. Отдельные представители этой микробиоты отличацЛ
высокой устойчивостью к неблагоприятным внешним факторам, слл.
собностью проникать в толщу субстрата и длительное время pijfl
ваться на мраморе, вызывая его постепенное разрушение [Воск, S-Л
1993; Горбушина и соавт., 2002]. Л
Деструктивное действие микроорганизмов на мрамор обусловив
образованием и выделением органических и неорганических кисл
ферментов, пигментов и полисахаридов, катализирующих процсЛ
деструкции мрамора. Кроме того, проникающие в толщу мрамлв
микроорганизмы изменяют его прочностные характеристики. ФорцИ
рование биологических налетов на поверхности мраморных памягЛ
ков чаще всего обусловлено наличием источников органических (Л
пример, близостью зеленых насаждений) и атмосферных загрязнений
Ранее на разрушающемся мраморе были обнаружены метанотро
родов Methylocystis и Methylosinus [Kussmaul et al., 1998а]. Хотя an
сферное содержание метана, достигающее 1.7 ppmv, не достат *
для роста большинства метанотрофов, отдельные представители р/,
Methylocystis способны расти при столь низких концентрациях С|
благодаря наличию высокоаффинной метанмонооксигеназы Pm-J
[Кравченко, Быкова, 2004; Knief, Dunfield, 2005]. Предполагается, ч
локальная концентрация метана в камне выше, что связывают с мс1
ногенезом в результате разложения органических соединений разл4
ными микроорганизмами [Kussmaul et al., 1998а,Ь]. <
Более того, недавно появилось сенсационное сообщение о том, ч
растения образуют метан в неизвестном биохимическом процесс
отличающемся от архейного метаногенеза. По предварительна
оценкам, живые растения выделяют от 60 до 240 млн. т углерода CI
в год, еще от 0.5 до 7 млн. т углерода СН4 производят опавшие
стья. В итоге это составляет 10-30% общего ежегодного поступлю-и
метана в атмосферу (>500 млн. т С), включая техногенные источнй
[Keppler et al., 2006]. Очевидно, вблизи зеленых насаждений коьмК
трация СН4 выше среднеатмосферной. Наряду с этим, эксперимй
тально доказано, что растения образуют метанол в результате деЙ(
вия внутриклеточных пектинметилэстераз и лигниндеметилаз, яв!
ясь глобальными поставщиками атмосферного СНзОН, достигают
более 100 млн. т С/г. [Fall, 1996; Galbally, Kirstine, 2002]. Вероят»
124
и источники метана и метанола обеспечивают развитие аэробных
метано- и метилотрофных бактерий в составе биопленок камней.
Из соскобов разрушающейся части мраморных памятников Мос-
ковского Кремля (pH поверхности мрамора в месте отбора проб со-
ставлял 8.7-9.1) нами были выделены 6 накопительных и 5 чистых
культур аэробных метилобактерий. Последние оказались идентичны
по морфологии, физиолого-биохимическим свойствам и имели уро-
вень ДНК-ДНК гомологии 98-99%. Представитель этой группы гало-
адкалофильных метилобактерий описан как новый вид Methylophaga
Buraia. Он способен к образованию и экскреции муравьиной кислоты
(4-10 мМ) из метанола, что может быть одной из причин разрушения
мрамора [Доронина и соавт., 2005]. Следовательно, аэробные метило-
бактерии, являясь функциональным компонентом олиготрофных со-
обществ (биопленок) на поверхности камней, участвуют в их дест-
рукции и ускоряют процессы физико-химического выветривания.
Таксономия и физиолого-биохимические особенности галоалкало-
фильных метилобактерий. Все ныне известные галоалкалофильные
метилобактерий принадлежат к а- и y-Proteobacteria (рис. 4.1.2).
Ancylobacter natronum, выделенный из содовых озер, относится к
Alphaproteobacteria, представлен бесцветными, неспорообразующи-
ми, неподвижными, овоидными палочками. Растет в широком диапа-
зоне температур 5-42°С и pH 6.5-9.0, оптимально - при 25-29°С, pH
8.0-8.5 и 0.5-0.75% NaCl. Хотя скорость роста на среде с метанолом
существенно снижается уже при 2% NaCl, тем не менее возможен
очень медленный рост в присутствии 6% NaCl. Реализует РБФ-цикл
[Доронина и соавт., 2001].
Умеренно-галофильные метилобактерий рода Methylophaga растут
в широком диапазоне концентраций NaCl (0.5-20%), нуждаются в
ионах Na+, многие ауксотрофны по витамину В12. Однако изоляты из
водорослей Красного моря, идентифицированные нами как новые
штаммы М. marina, не зависят от витамина В|2 и других ростовых
факторов. Причем М. marina, М. thalassica, М. limanica, М. natronica и
М. murata являются ограниченно-факультативными метилотрофами
(растут на глюкозе или фруктозе, метаноле и метиламине), тогда как
М. alcalica и М. sulfidovorans - облигатные метилотрофы, растущие
только на С1-субстратах. М. sulfidovorans растет в жидкой культуре на
Метаноле, метиламине и метансульфоновой кислоте, но, что харак-
терно, не растет на агаризованных средах. Алкалофильные виды
W. alcalica, М. natronica и М. murata способны расти при более низких
температурах (0-4°С), чем нейтрофилы М. marina, М. thalassica,
limanica и М. sulfidovorans [Ли и соавт., 2007].
125
Факультативные метилобактерии рода Methylarcula, принадле^
щие к Alphaproteobacteria, оптимально растут на метиламине при сл|
бощелочных значениях pH и содержании NaCl 3-8%.
0.02
100
98
I
95
99
98 L
100
93
97
100
- Paracoccus denitrificans
у
Paracoccus alcaiiphilus JCM7364
Paracoccus haeundaensis BC741711
— Methylarcula terricola h37T t
Methylarcula marina pT |
— “Marinosulfonomonas methylotropha^ PSCt14 ;
— Lei sing era methylohalldlvorans MB2T
Methylopila capsulata
— Methylorhabdus multivorans
moi— Methylobacterium organophilum
i— Methylobacterium extorquens
----Methylohalomonas lacus HMT 1T
Юрт Methylonatrum kenyense AMT 3
Methylonatrum kenyense AMT 1T
Methylobacillus glycogenes
- Methylophilus methylotrophus
- Methylophilus leisingeri
- “Methylophaga murata" Kr3
- Methylophaga alcalica M39T
Methylophaga thiooxldans DMS010T
- Methylophaga aminlsulfidivorans MP1
---Methylophaga natronlca Bur2T
Methylophaga thalassica ATCC331461
90 p Methylophaga sulfidovorans RB-1T
92io(f Methylophaga marina 222T
T Methylophaga marina KM3
99i Methylophaga marina KM5
Escherichia coli
88
100
88
100
100
J Methylophaga
Methylophaga
MethvioDhaaa
Рис. 4.1.2. Филогенетическое положение галоал кал оф ильных аэробных метил»
бактерий на основании сходства 16S рДНК. Цифрами показана статистическая дост
верность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap’’-анализа
Новый факультативный метилотроф Leisingera methylohalidivorans,
использует галометаны (СН3Вг, СН3С1 и СН31) в качестве источников
углерода и энергии. Слабо растет на ДМС, но не использует метили-
рованные амины, метанол или формиат в качестве источников С и EJ
Представлен непигментированными подвижными грамотрицатель-
ными палочками, плеоморфными при росте на средах с дрожжевым
экстрактом или глицин-бетаином. Оптимально растет при 3-4% NaCl,
pH 7.7 и 27°С, принадлежат к Alphaproteobacteria. Хотя £. methylo-
halidivorans валидирован, хемотаксономические признаки и путь
С1-метаболизма этого метилотрофа не описаны [Schaefer et al., 2002]. 1
Род “Marinosulfonomonas” включает “Marinosulfonomonas methy-
lotropha”, использующий метансульфоновую кислоту, метанол, хло-
рид метиламмония и различные полиуглеродные субстраты. Опти-
126
fl
127
мально растет при pH 7.4, 3% NaCl и 30 С. Представлен неподвии
ними палочками, одиночными и собранными в розетки по 5-30 к.<-
ток в жидкой культуре. Рост на твердой среде очень слабый, но хо;.
шо растет в жидкой среде. Реализует сериновый путь, принадлежг
Alphaproteobacteria. 1
Общие и отличительные признаки наиболее исследованных такс^
нов аэробных умеренно гало(алкало)фильных/толерантных метилу
бактерий суммированы в табл. 4.1.1.
Осмоадаптация аэробных метилобактерий-галоалкалофилов
Установлено, что с увеличением солености ростовой среды в фооц
фолипидном пуле М. murata возрастали уровни отрицательно заря]
женных фосфатидилглицерина и кардиолипина, но уменьшалась дол^
фосфатидилэтаноламина [Доронина и соавт., 2005]. Ранее такой э*1
фект отмечался у грамотрицательных галофилов и галотолерантныя
эубактерий, в том числе у метанотрофов. По-видимому, количествен]
ные изменения фосфолипидного состава при высокой осмолярности
среды связаны с необходимостью дополнительной стабилизации кле-
точных мембран [Thiemann, Imhoff, 1991; Хмеленина и соавт., 1997а].
Как известно, в микробном мире реализуются две стратегии по -
держания и регуляции осмотического равновесия. Первая стратегия
предусматривает избирательное накопление неорганических ионов я
цитоплазме (так называемый “солевой” тип осмоадаптации), что тре-
бует дополнительной приспособленности клеточных органелл и всей
ферментативной системы. Вторая стратегия - уравновешивание осм. ч
тического давления окружающей среды, связана с накоплением низ]
комолекулярных органических соединений, не влияющих на физи
логические функции клетки (стратегия “совместимых растворимых
веществ”). Такой тип осмоадаптации не предполагает существенна]
структурно-функциональных изменений клеток, что обеспечивав!
более гибкую и надежную адаптацию к осмотическим колебания'!
[Roberts, 2005; Хочачка, Сомеро, 1988]. I
Следует отметить, что многие осмопротекторы, накапливаемьк
клетками в молярных концентрациях, ответственны за осмотически!
баланс и в то же время метаболически инертны. Одним из них являет*
ся эктоин (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидинкарбоновая кисли''
та), открытый Э. Галинским как минорный осмопротектор у гaЛ’,,,
фильного фототрофа Ectothiorhodospira halochloris [Galinski et al.
1985; Galinski, Truper, 1994]. В дальнейшем эктоин и гидроксиэктош
были найдены у ряда гетеротрофных галотолерантных бактерий р>
дов Brevibacterium, Nocardiopsis, Streptomyces, Bacillus, Marinococcus,
Sporosarcina, Chromohalobacter, Halomonas, Vibrio, а также у облигат-
ных метанотрофов рода Methylomicrobiutn [Galinski, 1995; Da Costa d
128
1998; Lous, Galinski, 1997; Khmelenina et al., 1999; Heidelberg et al.,
2000; Takami et al., 2000; Kuhlmann, Bremer, 2002]. Показано, что эк-
обладает протекторными свойствами, стабилизирует ферменты и
ejibie клетки против стрессов, таких как УФ-облучение или цитоток-
сины [Lippert, Galinski,1992].
Нами впервые установлено, что метилобактерий родов Methylar-
ctila и Methylophaga синтезируют два основных осмо протектора -
глутамат и эктоин, а представители рода Methylophaga накапливают
также в небольших количествах сахарозу. В клетках метилобактерий
ода Methylophaga, выращенных при низких концентрациях NaCl
/2—3%), обнаружен только глутамат, тогда как при увеличении соле-
ности среды до 10-12% накапливались эктоин, глутамат и сахароза.
Суммарное внутриклеточное содержание этих осмопротекторов у ис-
следованных штаммов в пересчете на внутриклеточную воду полно-
стью уравновешивало осмолярность среды. Кроме того, у М. murata
концентрация данных осмопротекторов возрастала при снижении
температуры культивирования. Так, внутриклеточное содержание
эктоина при 4°С было вдвое выше, чем при 29СС. Примечательно, что
клетки М. murata, выращенные при 6-9% NaCl, выживали после на-
гревания при 7 О'-С в течение 15-20 мин, выдерживали множественные
циклы замораживания-оттаивания, хорошо переносили лиофилиза-
цию без добавления криопротекторов, что, по-видимому, связано с
высоким уровнем аккумуляции эктоина [Доронина и соавт., 1998;
Doronina et al., 2000а; 2003а,Ь].
Накопление ПГБ бактериями рода Methylarcula, по-видимому,
обусловлено реализацией серинового пути, включающего превраще-
ния органических и аминокислот, а не фосфосахаров, как в РМФ-
цикле. Напротив, у бактерий рода Methylophaga синтез сахарозы осу-
ществляется из УДФ-глюкозы и фруктозо-6-фосфата с участием саха-
розофосфатсинтазы/фосфатазы. Следовательно, предшественники
сахарозы образуются уже в первых реакциях РМФ-цикла.
Путь биосинтеза эктоина детально изучен у трех видов умеренно
галофильных эубактерий: у грамположительных Marinococcus halo-
philus. у грамотрицательных Halomonas elongata и Chromohalobacter
salexigens, растущих на сложных питательных средах с глюкозой, и у
облигатного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z [Lous,
Galinski, 1997; Ono et al., 1999; Calderon et al., 2004; Reshetnikov et al.,
2004; 2005; 2006; Решетников и соавт., 2004]. Нами установлено, что
талофильные метилобактерий родов Methylophaga и Methylarcula, рас-
тущие на С i-субстратах в присутствии NaCl, также реализуют этот
путь биосинтеза эктоина, т.к. обладают высокими активностями ас-
партокиназы, аспартатполуальдегиддегидрогеназы, 2,4-диаминобути-
129
рат (ДАБ) аминотрансферазы (EctB), ДАБ-ацетилтрансферазы (ЕсШ
и эктоинсинтазы (EctC) (рис. 4.1.3). '1
На основе анализа аминокислотных последовательностей Есц
EctB и EctC, представленных в GenBank, была разработана систеьД
олигонуклеотидных праймеров, с использованием которых удалось
расшифровать структуру и порядок расположения генов eel A. ectB^
ectC, кодирующих ферменты биосинтеза эктоина (ДАБ-ацетилтранс;
феразу, ДАБ-аминотрансферазу и эктоинсинтазу, соответственно) у
метилобактерий Methylophaga alcalicaMS и Methylophaga thalassica
МТ. Анализ транслированных нуклеотидных последовательностей
генов кластера ectABC у М. alcalicaM^ показал, что их продуктами
являются белки, состоящие из 172, 443 и 134 аминокислотных остат-
ков с рассчитанными м.м. 19.0, 48.7 и 15.3 кДа, а у М. thalassicaMA L
169, 445 и 134 аминокислотных остатков с рассчитанными м.м. 18.8,
48.9 и 15.4 кДа, соответственно.
а-кетоглутарат КоА
Диаминобутират Диамииобутирвт Эктоинсинтаза
амимотрансфараза ацетилтрансфераза
Рис. 4.1.3. Организация генов пути биосинтеза эктоина у гало(алкало)фильных
аэробных метилобактерий: ectA - ДАБ-ацетилтрансфераза, ectB- аминотрансфераза,
ectC- эктоинсинтаза, ask- аспартокиназа I
Филогенетический анализ нуклеотидных и аминокислотных по-
следовательностей генов/ферментов синтеза эктоина у этих метило-
бактерий выявил наиболее высокую степень (75-85%) гомологии с
соответствующими последовательностями галоалкалофильных/толе-
рантных метанотрофов и только 36-63% сходства с соответствующи-
ми последовательностями других галофилов. Кроме того, у М. ah
calica М8 и М. thalassica МТ, как и у метанотрофа Methylom icrobiuffl
alcaliphHum 20Z, выявлены отличия в организации генов биосинтеза
эктоина по сравнению с гетеротрофными галофилами. В частности, к
генам ectABC примыкает дополнительный ген аспартокиназы, что
предполагает присутствие специфической изоформы аспартокиназы У
метилобактерий (см. рис. 4.1.3). Это, по-видимому, обеспечивает от-
носительно независимый от основного конструктивного метаболизма
контроль синтеза предшественника эктоина - аспартилфосфата. 1
Недавно у аэробной метилобактерий Methyarcula marina, принад-
ле^ащей к а-Proteobacteria, расшифрована полная последовательность
оГ1ер°на генов синтеза эктоина ectABC -ask. Вместе с тем обнаружена
рачительная дивергенция есАгенов у метилотрофных и гетеротроф-
ных прокариот [Reshetnikov et al., 2004; 2005; 2006].
Ген eclA, кодирующий ДАБ-ацетилтрансферазу галоалкалофиль-
ной метилобактерий М. alcalicaMti, клонирован и экспрессирован в
с coli Показано, что ДАБ-ацетилтрансфераза является гомо димер ом
и имеет м.м. 40 кДа. Фермент наиболее активен при pH 9.5 и темпера-
туре 32-34°С, причем активность возрастала в три раза в присутствии
250 мкМ КС1. Константы Михаэлиса рекомбинантной ДАБ-ацетил-
трансферазы, определенные при оптимальных условиях, составляют
465 и 32.7 мкМ для Ь-2,4-ДАБ и ацетил-КоА, соответственно
[Mustakhimov et al., 2008].
Низкая осмолярность
ectApl
10
10
•35
есСАрЗ
-35|ио
ысокая осмолярность
ectApl
-35
ectAp2
-35
Аналогично Мт. alcaliphi lumlCZ, У М. thal assicavww ectABC ask
транскрибировались с двух промоторов, проявлявших гомологию с
о' -зависимым промотором Е. coli, причем -10 и -35 последовательно-
сти промоторов ectApl у метанотрофаи метилобактерий были иден-
тичны. Поскольку последовательности промотора ectApl наиболее
близки каноническим, возможно, что экспрессия есАоперона с него
эффективнее, чем с промотора ectAp2. При этом транскрипция с бо-
лее сильного промотора ectApl, вероятно, регулируется осмолярно-
стью среды, а с промотора ectAp2 осуществляется слабая конститу-
тивная транскрипция есАтенов (рис. 4.1.4). Однако в промоторных
областях ectABC-ask-mvpwdi у метилобактерий не обнаружены по-
следовательности, гомологичные os-зависимому промотору Е. coli.
При секвенировании и анализе нуклеотидной последовательности
льцце генов биосинтеза эктоина у М. alcalica^ М. thalassiсабыли об-
наружены ОРС, названные ectR, продукты которых проявляли сход-
131
ство с известными транскрипционными регуляторами Маг-семейс
Показано, что белки EctR гало(алкало)фильных метилобактерий п
являют низкую гомологию (12-20%) с транскрипционными рек-
торами MarR-семейства, однако, имеют сходное доменное строени
содержат аналогичные ДНК-связывающие мотивы “Helix-Turn-Hel
и “боковая лопасть” [Мустахимов и соавт., 2009]
У М. thalassica транскрипция гена ectR осуществляется с трех п
моторов, причем -10 и -35 последовательности только одного гом
гичны каноническим последовательностям о °-зависимого промот
у Е. coli, тогда как соответствующие последовательности двух дру
промоторов вырожденны. В отличие от Mtn. alcaliphilutn 20Z, у к
рого промоторная область (ectRip) гена ectR находится между про-
торами ectApl и ectAp2 ect-оперона, свидетельствуя о том, что тра
крипция с промотора ectRip может негативно контролироваться с
ственным продуктом - белком EctR, у М. thalassica промотс
ectRlpl, ectRlp2 и ectRlp3 гена ectR не перекрываются с промот
ной областью ecf-оперона. Сайт связывания для белка EctR в пре
торных областях гена ectR не найден. Следовательно, транскриш
гена ectR у М. thalassica осуществляется конститутивно на низк
уровне.
Как рыночный продукт, эктоин тоннами производится ежегодн
биотехнологическом процессе с использованием галофильной у-п;
теобактерии Halomonas elongata в качестве продуцента [Lentzi
Schwarz, 2006]. Соответственно, несомненный научно-практическ
интерес представляет знание путей деградации эктоина у разных mi
роорганизмов.
HN
н
Эктоин
Эктоин
гидроксилаза u
___________M3N
DoeA
COO'
H3C-C-NH
ДАБ-ацилаза
DoeB
COO
NH3*
H3N COO-
ДАБ
N-ацетил-ДАБ
70
doeB
Рис. 4.1.5. Организация генов пути деградации эктоина у Halomonas elong
doeA - эктоингидроксилаза, doeB - ДАБ-ацилаза, doeX — транскрипционный регуля
семейства AsnC/Lrp [Schwibbert et al., 2009]
Геномный поиск H. elongata идентифицировал генные класт-
doeABX и doeCD (degradation of ectoine), участвующие в деградаи
эктоина. Ферменты, ответственные за деградацию эктоина, кодл.
132
я rfoeAldoeB и doeC/doeD. Рекомбинантная экспрессия doeA вы-
10 .па, что белок DoeA катализирует гидролиз эктоина до N-ацетил-
Яцаминобутирата (N-ацетил-ДАБ), который служит субстратом для
следующего деацетилирования DoeB. На основании последующего
генетического и биохимического анализа предполагается, что путь от
паБ Д° аспартата, включающий аспартил-полуальдегид, катализиру-
ется новой трансаминазой DoeD и дегидрогеназой DoeC, соответст-
венно (рис. 4.1.5) [Schwibbert et al., 2009].
RT-ПЦР показал, что doeAB транскрибируется вместе с третьей
лрС doeX. Участок начальной транскрипции doeABX оперона карти-
ровали быстрой амплификацией кДНК концов (RACE). Проверка по-
сЛедовательности ДНК верхнего участка инициации выявила наличие
возможных -10 и -35 сиквенсов, напоминающих консенсусную после-
довательность о °-зависимых промоторов. Вновь идентифицирован-
ный doeX локус кодирует возможный белок с расчетной м.м. 17.9 кДа.
Выведенная аминокислотная последовательность DoeX свидетельст-
вует о высокой степени идентичности с транскрипционными регуля-
торными белками семейства AsnC/Lrp. Анализ электрофоретических
сдвигов (EMSA) показал, что DoeX действительно является ДНК-
связывающим белком со значительным сродством к промоторной об-
ласти doeABX [Schwibbert et al., 2009]. Аналогичные исследования
проводятся с метилобактериями.
Таким образом, галофильные аэробные метилобактерии родов Me-
thylophaga и Methylarcula, накапливающие эктоин (до 20% сухой био-
массы) или глицин-бетаин (в случае Methylohalomonas), хорошо при-
способлены к существованию в экстремальных экосистемах, харак-
теризующихся резкими колебаниями температуры и солености среды.
В последнее десятилетие сформировалось представление о таксо-
номическом и структурно-функциональном многообразии умеренно
галофильных аэробных метилобактерий, их важной экофизиологиче-
ской роли в различных биотопах и механизмах осмоадаптации.
Аэробные умеренно гало(алкало)фильные метилобактерии обнаруже-
ны в морской воде, содовых озерах, засоленных почвах и разрушаю-
щемся мраморе. Как правило, эти метилобактерии ассоциированы с
метанотрофами, поскольку используют продукты неполного окисле-
ния метана - метанол, ФА и муравьиную кислоту. Кроме того, га-
Ло(алкало)фильные метилобактерии образуют с гетеротрофами ус-
гойчивые метилотрофные сообщества, поставляя гетеротрофам экзо-
метаболиты и, в свою очередь, получают факторы роста (витамины).
Недавние успехи в расшифровке четырехгенного кластера ectABC-
Qsk у аэробных метилотрофов [Reshetnikov et al., 2006] создали реаль-
ные предпосылки конструирования новых эффективных продуцентов
133
эктоина из метанола, например, экспрессирующих эти гены под с
ным МДГ-промотором тхаЕ. Наряду с этим можно создать шта-.
деструкторы токсичных С i -соединений (например, галометано
условиях высокой минерализации и щелочности среды.
Полученная информация о структурной организации есАген
метилотрофов позволяет использовать современную, основаннуг
клонировании и аффинной хроматографии, стратегию очистки
ментов биосинтеза эктоина для детального исследования их свой<
регуляции. Более того, имеющиеся в нашей коллекции штаммы г
фильных нейтрофильных и алкалофильных метилобактерий м
найти применение в качестве модельных объектов для выяснения
бенностей их энергетического и конструктивного метаболизма, вк
чая принципы орг анизации и регуляции биосин геза эктоина на м
кулярно-генетическом уровне.
Осмоадаптация галофильных бактерий, кроме синтеза ocmoi
текторов (эктоина, глутамата и сахарозы), включает изменения ;
нокислотного и
фосфолипидного состава мембран
[Khmelenina
1999]. В настоящий момент не представляется возможным оп
весь регуляторный каскад, начиная от восприятия клеткой сигн •
об изменениях осмотических условий и заканчивая структур
функциональными перестройками. Необходимо выяснить прир
первичного сигнала, определить осмосенсоры и механизмы перед
сигнала от клеточной мембраны на возможные транскрипционые
гуляторы. Кроме того, важно определить другие осморег улируе?
гены, а также выявить связи между системами ответа на различ;
стресс-факторы, такие как температура, осмолярность, pH, что по;
лит понять и расшифровать сложный механизм перекрестной ада.
ции бактерий к изменяющимся условиям окружающей среды. С
видно, что постулируемые механизмы осмоадаптации у галоалк?
фильных метилобактерий нуждаются в дальнейших специальных
следованиях с применением методов геномики и протеомики.
В целом, достижения последних лет в изучении биологии гал
калофильных аэробных метилобактерий приблизили нас не тол. 5
пониманию основ их жизнедеятельности, но и к разработке биоте*
логий синтеза эктоина из метанола и конструированию новых пол1
зистентных стрессустойчивых штаммов-деструкторов для биор*
диации от токсичных С i-соединений.
Ацидофильные/толерантные аэробные метилобактерий
Большинство наземных экосистем Северного полушария хара1
ризуются кислой реакцией среды. Однако микробные агенты окш
ния С ]-соединений в кислых наземных экосистемах остаются не
таточно изученными.
134
^□казано, что в этих эконишах широко распространены аэробные
]1ЛОбактерии семейства Beijennckiaceae благодаря хорошей адап-
цИп к низким значениям pH среды. Нуклеотидные последователь-
ней генов 16S рРНК представителей Beijerinckiaceaeb\Anu. обнару-
Пны в лесных почвах и почвах агроценозов, в болотах различных
Ппов. а также в покрывающих почвах свалок [Radajewski et al., 2000;
^ief et al., 2003; Raghoebarsing et al., 2005; СйЬгоп et al., 2007; Chen et
। 2007, 2008]. Однако анализ этих последовательностей не позволя-
сделать однозначное заключение о метаболическом типе тех орга-
низмов, к которым они принадлежат, из-за гетерогенности данной
, руппЫ бактерий. Количество культивируемых метилотрофных пред-
ставителей этого семейства также очень мало, что объясняется, в ча-
стности, сложностью работы по их выделению.
Одним из отличительных свойств представителей рода Beijerinckia
является ацидотолерантность, т.е. способность выживать при pH
3.0—4.0, хотя они широко распространены как в кислых, так и в ней-
тральных почвах различных регионов. Эти бактерии - несимбиотиче-
скле, аэробные хемогетеротрофы и диазотрофы, способные использо-
вать широкий спектр полиуглеродных субстратов, из которых наибо-
лее предпочтительны сахара. Недавно обнаружено, что В mobilisiAO-
жет автотрофно расти на метаноле и формиате [Becking, 2006; Dedysh
et al., 2005].
Показано, что В. тobilisассимилирует углерод метанола в основ-
ном на уровне СО2 через РБФ-цикл. В реакции, катализируемой Ру-
бисКО, наряду с 3-фосфоглицератом, образуется фосфогликолат, ко-
торый дефосфорилируется в гликолат. Последний далее превращается
в глиоксилат, глицин и серин, образуя шунтированный вариант сери-
нового пути. Ввиду низких активностей НАДН?-оксипируватредук-
тазы, серин-глиоксилатаминотрансферазы и глицераткиназы серино-
вый путь играет минорную роль в ассимиляции углерода метанола на
Уровне ФА [Смирнова и соавт., 2005].
Интересно, что некоторые ферменты углеводного метаболизма
(АТф-зависимая 6-фосфофруктокиназа, дегидрогеназы глюкозо-6-
Фосфата и 6-фосфоглюконата) репрессировались при росте В. mobilis
На метаноле, в отличие от фруктозе-1,6-бисфосфатальдолазы и фрук-
г°зо-1,6-бисфосфатазы, участвующих в глюконеогенезе. Напротив, у
Клеток, выросших на глюкозе, активизировались глюкокиназа (АТФ),
6'фосфофруктокиназа, фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза и 6-фосфо-
ГлЮконатдегидрогеназа (НАДФ ). Это свидетельствует о том, что в
Катаболизм глюкозы у В. mobilisвовлечены как гликолитический, так
и Пентозофосфатный окислительный путь. В то же время отсутствие
г
i
135
активности КДФГ-альдолазы исключает катаболизм гексозофосфЛ
через путь Энтнера-Дудорова [Смирнова и соавт., 2005]. I
При росте на метаноле у В. mobilis обнаружены небольшие акт
ности пируватдегидрогеназы, цитрате и нтазы, изоцитратдегидрогс
зы, а-кетоглутаратдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, что указ* ।
на преимущественно биосинтетическую функцию цикла Кребса,
факт, что активности изоцитратлиазы и малатсинтазы были нам
ниже у клеток, выросших на метаноле, по сравнению с клетками,
росшими на глюкозе, свидетельствует о минорной роли глиокси’
ного шунта при метилотрофном росте культуры. В ассимиляцию
мония вовлечены НАДФНг-глутаматдегидрогеназа, аланиндегидр
наза и глутаматный цикл. Наличие высокоактивных фосфоглюкс
тазы,
УДФ-глюкопирофосфорилазы,
гликогене и нтазы и НАД<
ацетоацетил-КоА-редуктазы подтверждает их участие в синтезе
mobilis запасных биополимеров, таких как гликоген и ПГБ, соответ
венно [Смирнова и соавт., 2005].
Рис. 4.1.6. Электронные микрофотографии ультратонких срезов клеток Methyl
gula ligni BW863 . ПГБ - лоли-Р-гидроксибутират; П - пили-подобные струит}
Длина масштабной линейки — 0.5 pm [ Vorob’ev et al., 2009]
Недавно из микробного сообщества, участвующего в разложе»
древесины бука в кислой (pH 3.3-3.6) лесной почве, выделены шт
мы ацидофильных бактерий BW863T и BW872 [Folman et al., 20:
Установлена их принадлежность к новому роду и виду семейс
Beijerinckiaceae - Methylovirgula ligni. Штаммы BW863r и BW'
представлены грамотрицательными клетками палочковидной фор’
136
умножающимися бинарным делением. Размер клеток составлял
Р 2-2.5 pm в длину и 0.4-0.65 цт в ширину (рис. 4.1.6). Изоляты хо-
0ц1О росли на метаноле и этаноле, слабо - на малате, сукцинате и
^ирУвате’ но не были способны использовать для роста ацетат, сахара
" другие Сп-субстраты. Данные мезофильные и облигатно ацидофиль-
1е штаммы могли расти при pH 3.1-6.5 в диапазоне температур
^з0°С, оптимально при pH 4.5-5.0 и 15-18SC [Vorob’ev et al., 2009].
Таблица 4.1.2
Дифференцирующие признаки метилобактерий
семейства Beijerinckiaceae
Характеристика
Морфология клеток
Размер клеток, цм
Тип метаболизма
Используемые
органические
субстраты
Образование розеток
Потребность в
факторах роста
Диапазон pH
(оптимум)
Диапазон температур
(оптимум), °C
Рост при 0.5% NaCl
Содержание Г + Ц в
LflHJC, мол.%
Вецеппскла______
Биполярные прямые или
изогнутые палочки
0.5-1.5 х 1.7-4.5
Факул ьтативная
метил отрофия
Сахара, органические
кислоты, спирты (СгСз)
3.0-10.0
20-30
54.7-59.1
Methylovirgula
Прямые или изогнутые
палочки
0.4-0.65 х 1.2-2.5
Факул ьтативная
метил отрофия
Метанол, этанол,
пируват, сукцинат,
малат
3.1-7.0 (4.5-5.3)
4-30 (15-22)
61.8-62.8
Из кислых сфагновых болот (Торфяное, Архангельской области и
Бакчарское, Томской области) группой С.Н. Дедыш были выделены
еЩе два штамма метилобактерий (RP01 и ESY), гены 16S рРНК кото-
рых обнаруживали 98.5-99% сходства с таковыми у штаммов
B\V863T и BW872. Штаммы RP01 и ESY представлены грамотрица-
Тельными палочками, размножающимися бинарным делением. Изоля-
ты RP01 и ESY - аэробные метилобактерии, предпочтительным ис-
т°чником углерода и энергии для которых являлся метанол, исполь-
3Уемый в диапазоне концентраций от 0.01 до 3%, с оптимумом при
0-1-О.5%. Помимо метанола, новые изоляты слабо росли на этаноле,
Малате, валерате и капронате. Таким образом, спектр утилизируемых
Даммами RP01 и ESY субстратов отличался от такового BW8631 и
W872. Изоляты RP01 и ESY - ацидофильные организмы, способные
137
к росту при pH от 4 до 7 в диапазоне от +4 до +30°С, с оптимумом d
pH 4.7-5.3 и 18-22QC (табл. 4.4.1). Ингибирование роста происхо,
при содержании NaCl >0.7 %. Поскольку уровень ДНК-ДНК гибрцД
зации штаммов BW863T и ESY составил 35%, последний отнесеД
новому виду рода Methylovirgula. Я
Таким образом, представители рода Methylovirgula населяют кЯ
лые наземные экосистемы различных типов и представляют раД
некультивируемую группу бактерий, важная роль которых в процесс
окисления метанола в данных местообитаниях установлена молеД
лярными методами [Dedysh, 2009]. Я
4.2. Умеренно термофильные и психрофильные
аэробные метилобактерий
Умеренно термофильные/толерантные метилобактерий
Бактерии, способные расти при повышенных температурах, пред-
ставляют интерес как потенциальные продуценты аминокислот и бел»
ка одноклеточных, а также как агенты для деградации растворителей.
Вслед за опубликованием работ, посвященных росту смешанной
культуры со спорообразующими бактериями на метаноле [Snedecor,
Cooney, 1974], в патентной литературе появился спрос на штамта
Bacillus, которые могли бы расти на метаноле с оптимумом темпера-
тур около 55°С и максимальными температурами роста около 65°С.
Несколькими группами исследователей были разработаны способы
выделения и культивирования штаммов Bacillus, быстро растущих В
метаноле при 55°С [Al-Awadhi et al., 1989; Dijkhuisen et al., 1988;
Brooke et al., 1989; Govorukhina, Trotsenko, 1984; Schendel et al., 1990].
Детально изучены пути метаболизма метанола, этанола, глюкозы!
контроль метаболических потоков у этих организмов, выращенных!
колбах и в непрерывном режиме при ряде ограничений по питаниюА
также в стационарных и переходных условиях [Arfman et al., 1989;
1991; 1992; Dijkhuisen, Arfman, 1990; Vonck et al., 1991]. Я
Показано, что метилотрофные штаммы Bacillus устойчивы к выса
ким концентрациям метанола, а молярные выходы роста на метано^
в хемостате при оптимальных температурах и лимите метанола явлЯ-
ются наивысшими, сообщавшимися для метилотрофных бактерий
Энзимологический анализ выявил, что изоляты используют новую ,
НАД+-зависимую МДГ для окисления метанола и ФБФА-вариа#
РМФ-пути для ассимиляции ФА [Arfman et al., 1989; 1991а,Ь]. Я
ж
Половина из 14 аэробных термотолерантных метилотрофных изо-
яТов была вначале отнесена к виду Bacillus brevis на основе ряда фе-
эпических признаков. Дальнейший анализ последовательностей
16S и 5$ РДНК позволил реклассифицировать эти штаммы как новый
Bacillus methanolicus [Al-Awadhi et al., 1989; Arfman et al., 19921.
0ИД
Представлены грамположительными неподвижными палочками. Об-
дуют овальные споры, но способность к спорообразованию может
Исчезать у некоторых культур. Облигатные аэробы, растут в диапазо-
температур 35-60°С с оптимумом около 55°С.
не
Рис. 4.2.1. Морфология и ультраструктура термотолерантных метилотрофных изо-
лятов: а) негативно контрастированные интактные клетки (штамм М40); б) вегетатив-
ные клетки штамма М40 (криоскалывание); в) ультратонкий срез с полярно располо-
женной эндоспорой (штамм М40); г) спора штамма М40; д), е), ж) область клеточной
стенки изолятов МП, М40 и Ml, соответственно
В дальнейшем еще три штамма аэробных термотолерантных мети-
лотрофных бацилл были выделены из образцов термальных вод Кам-
чатки при обогащении накопительной культуры путем тепловой обра-
ботки (40 мин при 100°С). Клетки новых штаммов Bacillus spp. Ml,
и М40 представлены спорообразующими грамположительными,
Пробными, нейтрофильными палочками и подвижны благодаря на-
личию жгутиков (рис. 4.2.1). В качестве источников углерода и энер-
гии эти штаммы используют метанол, метилированные амины, а так-
)Ке глюкозу, пируват, фумарат и лизин, т.е. являются ограниченно-фа-
кУльтативными метилотрофами (табл. 4.2.1). Оптимальная концен-
трация NaCl - 0.02%. Не выявлен стимулирующий эффект отдельных
139
Основные свойства термофильных метилотрофных бацилл
Свойства_________________
Окрашивание по Граму
Размер клеток, цм
Наличие жгутиков
Спорообразование на среде
с метанолом
Расположение
и форма спор
Отношение к Ог
Диапазон температур роста
(оптимум), °C
Оптимум pH
Каталаза, уреаза, аргиназа
Оксидаза
Образование:
кислоты из глюкозы
NH3, H2S, ацетоина
индолов, газа
С1-субстраты для роста
Тип метилотрофии
Путь С|-ассимиляции
Потребность в ростовых
факторах
Устойчивость к:
метанолу
NaN3 (0.02%)
н итротетразол и ю
метиленовому синему
(0.01%)
молибдату (0.5%)
ДНК Г + Ц, мол.% (Тт)
ДНК гомология с ДНК
штамма М40, %
Штамм Ml
Штамм МИ
0.5-0.8 х 2-4
перитрих
полярное
эллипсоиды
Облигатный
аэроб
35-65 (55)
7.5
0.6-0.7 х 2-4
перитрих
полярное
эллипсоиды
Облигатный
аэроб
30-55 (53)
7.5
Штамм М40‘
0.5-0.8 х |.sJ
перитрих
полярная
ЭЛЛИПСОИДЫ
Облигатный
аэроб
35-65 (55)
7.5
СН3ОН, CH3NH2, (CH3)2NH, (CH3)3N
Факультативный
РМФ (ФБФА-вариант)
2.0 М
1.5 М
2.0 М
42.4
42.0
68
42.3
100
витаминов, однако дрожжевой экстракт стимулировал рост. Оксид
зо-, каталазо- и пероксидазонегативные, гидролизуют крахмал, н I
Tween 80 или Tween 20, накапливают гликогеноподобные полимер
устойчивы к 0.02% NaNs и нитротетразолий хлориду. Резистентн.Ч
антибиотикам. Содержание Г + Ц в ДНК 42.0-42.4 мол.%. ИзоЛнЧ
корошо росли на метаноле в диапазоне температур 35-65°С с опг
2 ч. Оптимальная концентрация м»-’
мумом 55°С. Время удвоения
нола для роста - 2% (об./об.). 50%-ное ингибирование роста наблю.
ли при 6% (об./об.) метанола.
140
НАДФН2 НАДН2 ФМС
Ацетил-КоА
Глутамат
Рис. 4.2.2. Схема путей первичного и промежуточного метаболизма метанола и
Тированных аминов у Bacillus sp. М40
Штамм М40 не имеет классической PQQ-МДГ, проявляющей • *
тивность с ФМС, метанол окисляет НАД+-зависимой алкогольдегцЯ
рогеназой (АДГ). Наличие активности ГФС свидетельствует о peajw.
закии РМФ-пути. Образование фосфотриоз осуществляется в глим
литическом пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, т.е. через фруктоз^!
1,6-бисфосфатальдолазу. Имеет замкнутый цикл Кребса и глиокси/
латный шунт. Аммоний ассимилирует с помощью дегидрогеназ г.цД
цина, аланина и глутамата, а также через глутаматный цикл (глущ*
матсинтазу и глутаминсинтетазу). При росте на метилированных
аминах окисляет триметиламин НАДФН2-зависимой монооксигена-
зой до N-окиси триметиламина, которую далее расщепляет де мети
зой до ди метиламина и ФА. Диметиламин окисляет монооксигеназ J
до метиламина и ФА, а метиламин - аминдегидрогеназой до фор»
мальдегида и аммиака (рис. 4.2.2). Л
Психрофильные/толерантные метилобактерий Д
Низкотемпературные микробиологические процессы играют ван-
ную роль в глобальной экологии, поскольку почти 90% суммарна *
объема океанов имеют температуру ~5°С, а более половины террито!
рии России находится в области вечной мерзлоты. I
Географическая изолированность островов Антарктики, озонов**4
“дыра”, которая вызывает в этом регионе высокий уровень УМ
излучения, действующие вулканы (и, следовательно, поступление
разнообразных химических соединений из глубин Земли в окружаю-
щую среду) и низкая температура сформировали специфическую!
микробиоту. В последнее десятилетие среднегодовое повышенна
температуры и уровня УФ-радиации в Антарктике, таяние ледников И
увеличение потоков свободной воды вызвали значительное усиление
биогеохимической активности микроорганизмов. I
Среди психрофильных аэробных метилотрофов наиболее инк ’•
сивно изучались метанотрофы [Гальченко, 2001; Троценко, Хмелен(•-
на, 2008]. Напротив, сведения относительно психрофильных метилу
бактерий, усваивающих окисленные и замещенные производные ме-
тана, такие как метанол, метилированные амины и сульфонаты, не!
многочисленны [Moosvi et al., 2005а,Ь]. Системные исследований
группы В.А. Романовской показали, что факультативные метилобаяя
терии широко распространены на островах в Тихоокеанском сект Д
Антарктики. Они обнаружены в траве и мхах около водоемов, я
скальных трещинах, на розовых, оранжевых и темноокрашенных
шайниках, которые находятся на камнях и скальном массиве. В аМ
тарктической почве, на которой отсутствовала растительность, кя!
правило, не были найдены метилобактерий, поскольку они, являясь
эпифитной микрофлорой, приурочены к фитоценозам. 1
142
Видимо, более типичным местом обитания антарктических мети-
оТрофов являются мхи, а также растительно-почвенные образцы.
Это неудивительно, так как известно, что метилобактерий составляют
д0 60% от общего числа прокариот филлосферы растений в регионах
с умеренным климатом [Романовская и соавт., 1991]. Экологическая
роль метилобактерий определяется тем, что они, будучи фитосимби-
онтами, синтезируют ауксины, цитокинины, витамины и другие фи-
зиологически активные вещества и тем самым способствуют росту
растений [Троценко и соавт., 2001].
Сравнительный анализ показал, что количество метилобактерий в
образцах почвы из Антарктики на один-два порядка меньше, чем в
образцах, отобранных в регионах с умеренным климатом. В целом,
полученные результаты свидетельствуют о широком распространении
метилобактерий в изученных наземных биотопах Антарктики. Коли-
чество хемоорганотрофов значительно превышало (на 2-5 порядков)
численность метилобактерий. Данная закономерность характерна не
только для антарктических наземных биотопов, но также для подоб-
ных фитоценозов и почв в регионах с умеренным климатом.
Из антарктических образцов выделено 50 накопительных культур
метилобактерий, из них 15 - в чистую культуру. Из большинства об-
разцов выделены либо розовоокрашенные морфотипы метилотрофов,
либо белые и желтые. Как правило, при наличии в образце белых и
желтых морфотипов РОФМ не выявляются. Возможно, это вызвано
тем, что количество клеток белых и желтых морфотипов больше на
1-2 порядка в исследованных образцах, чем розовоокрашенных мор-
фотипов. Преобладание в микроценозах тех или иных морфотипов
определяется скоростью роста популяции, антагонистическими взаи-
моотношениями, конкуренцией за субстрат и т.п.
Большинство антарктических изолятов образуют розовопигменти-
рованные колонии, способны усваивать, кроме метанола, другие ор-
ганические соединения, у них отсутствует ГФС, но функционируют
ОПР и С ГАТ, что свидетельствует о реализации серинового цикла.
Исследуемые штаммы классифицированы как представители рода
Methylobacterium. Они не проявляли амило- и липолитическую актив-
ность, но были положительны по каталазе, оксидазе и глюкозооксида-
3е1 тест Фогеса-Проскауэра отрицательный. Хорошо росли на мета-
ноле, лактате, ГКА; слабо - на этаноле, глутамате и МПА, не способ-
ны ассимилировать глюкозу, фруктозу, арабинозу, ксилозу, галактозу,
Цитрат и аспартат.
Исследованные антарктические штаммы UCM В-3391 и UCM
°'3392 по сиквенсу гена 16S рРНК имеют высокий уровень сходства
с Л/. extorquens (99.4-99.7%). С другими видами рода Methylobacte-
143
rium эти штаммы имели низкий уровень сходства (93-96%). Сле^ Л
отметить, что М. extorquens является наиболее распространенным Л
дом как в почве, так и в филлосфере растений в различных регион-*
умеренным климатом по сравнению с другими видами Methylob^cU
rium [Романовская и соавт., 1991]. *
Оказалось, что в антарктических образцах отсутствуют метилобщ,
терии, резистентные к токсичным металлам. Показано, что рост чД
тых культур изолированных антарктических метилобактерий и ком
лекционных метилотрофных штаммов ингибируется даже меньищЛ
концентрациями токсичных металлов (1-2 мг иона металла/л cpv ц)
Видимо, у метилобактерий отсутствуют механизмы, обеспечивают^
устойчивость к токсичным металлам.
Выявлено, что антарктические штаммы способны расти в шир^.^И
диапазоне температур: от +1 до +37°С, оптимально при +18‘ С.
щает внимание тот факт, что некоторые антарктические метилобак-J
рии не росли при +ЗО°С. Психротолерантные формы выявлены с; с Л
коллекционных штаммов рода Methylobacterium (М. mesophilicuA
М. fujisawaense, М. extorquens, М. zatmanii, М. organophilum), что с и»
детельствует о потенциальной возможности этих бактерий сущее г
вать при низких температурах [Романовская и соавт., 1991]. Л
Являются ли метилотрофные бактерии аборигенной микрофлор®
в Антарктике? На этот вопрос нет однозначного ответа. Не исклн Л
но, что они имеют антропогенное происхождение или занесены ка
рами, осадками, орнитофауной. Однако среди представителей меЛ
лобактерий выявлены психротолерантные формы, что свидетельстве
ет о потенциальной возможности этих бактерий существовать пД
низких температурах. Чем бы ни объяснялось происхождение меЛ
лотрофных бактерий в Антарктике, объективные условия для их Л
шествования имеются в данном регионе. Так, естественные процессы
трансформации органических веществ (мха, птичьего помета и т.Л
до метилсульфонатов, метанола и метана могут обеспечить трофичЛ
ские потребности метилотрофов, а их способность существовать пм
низких температурах может быть реализована в суровых услозиИ
Антарктики. Утилизация метилотрофами метана, метанола и метиэ
сульфонатов в экосистемах Антарктики, несомненно, имеет важнЛ
экологическое значение, так как предохраняет атмосферу от загряз
ния этими токсичными летучими соединениями [Романовская
соавт., 1991]. I
Глава 5
дЭРОБНЫЕ МЕТИЛОБАКТЕРИИ КАК ФИТОСИМБИОНТЫ
5.1» Ассоциации аэробных метилобактерий с растениями
Аэробные метилотрофные бактерии часто ассоциированы с расте-
ниями, колонизуя с высокой плотностью листовую поверхность, при-
сутствуют в ризосфере и на/в семенах. Эта связь объясняется функ-
ционированием “метанольного цикла”, т.е. образованием и выделени-
еМ растениями метанола, который активно используется аэробными
метилобактериями как источник углерода и энергии.
Как известно, растения являются глобальным источником атмо-
сферного метанола, составляющего 40-46% от общего обнаруженно-
го летучего органического углерода атмосферы. Основным источни-
ком выделяемого растениями метанола служит деметилирование пек-
тина в клеточных стенках под действием пектинметилэстеразы. Дру-
гими источниками метанола из растений являются интермедиаты
ТГФ-пути, функционирование метилтрансферазы белков, деградация
деметилазами лигнина во вторичных клеточных стенках [MacDonald,
Fall, 1993; Fall, 1996; Frenkel et al., 1998; Hanson, Roje, 2001].
В разных компартментах растительных клеток обнаружены ин-
термедиаты С1-метаболизма: метанол (1 мкмоль/г биомассы), форми-
ат (0.1-1 мкмоль/г) и ФА (0.1-10 мкмоль/г), которые участвуют в
биосинтезе белков, нуклеиновых кислот, пантотеновой кислоты и
большого количества метилированных соединений, а также связаны
со стабилизацией пектина в клеточных стенках растений. Большая
часть ФА обратимо связана с различными клеточными нуклеофилами
(GSH, аргинином, ТГФ). В то же время метанол и формиат могут ос-
вобождаться из С]-метаболизма растительных клеток и выделяться в
межклеточное пространство, откуда через устьица поступают в атмо-
сферу. Метанол также может окисляться до ФА [Hanson, Roje, 2001].
Ежегодная эмиссия метанола растениями оценивается до 100 млн.
т C/г., часть его растворяется в поверхностных слоях океана. Таким
образом, Мировой океан является огромным резервуаром метанола,
запасы которого составляют 228 млн. т [Galbally, Kirstine, 2002]. Из-
устно, что в результате распада основного осмопротектора морских
в°Дорослей - диметилсульфониопропионата (ДМСП), также образу-
йся различные С।-соединения.
Будучи одним из важнейших источников гидроксильных радика-
лов в тропосфере (после СН4, СОд и изопренов), метанол существенно
145
влияет на формирование климата на планете. 76% метанола, ежер
поступающего в атмосферу, выделяется за счет роста растений,
щий приток СН3ОН в атмосферу достигает ~150 млн. т С/г. Остэ.к
часть приходится на гниение опавших листьев (13 т/г. С), сжит
биомассы (13 млн. т С) и лишь небольшая часть (4 млн. т С) и
антропогенное происхождение. 19 млн. т С метанола образуется
посредственно в атмосфере [Galbally, Kirstine, 2002].
Существует тесная взаимосвязь между образованием и выде;
ем метанола и Ci-метаболизмом растений. Например, синтез ф<
вой кислоты через ТГФ-путь особенно активен у зародышей при
растании семян, а также в молодых растительных тканях при пе;
де к автотрофному способу питания и необходим для поддерж
пула метильных групп в цитозоле клетки [Jabrin, 2003]. К тому ;
растущих клеток происходит элонгация клеточной стенки, требу»
активное деметилирование пектина. Поэтому неудивительно, ч
молодых клеток уровень образования метанола выше. Отмечено,
образование метанола происходит во время роста клеток и фор
вания межклеточного пространства. Метанол из листьев может
ряться через устьица, а также посредством эмиссии с кутикулы л
ев. Уменьшение кутикулы у растений приводит к снижению ко
ства выделяемого метанола [Nemecek-Marshall et al., 1995]. Кроме
танола, высшие растения способны поставлять другие Сгсоед
ния - метилированные амины, галометаны, а водоросли - метила
нистые соединения [De Zwart et al., 1996; Троценко, Доронина, 200
Показано, что бактерии активно колонизуют растения. В заыз
мости от части растения, в которой бактерии локализуются, разл*
ют ризосферные (ассоциированы с корнями), филлосферные или d
фиты (прикрепляются к поверхности растений) и эндофиты (npj
кают и живут внутри тканей растения). Считается, что в ochobi
они локализуются в ризосфере вследствие сравнительно высо
концентрации корневых экссудатов, используемых бактериями
своего роста [Whipps, 1990; Schaefer et al., 2010].
Преобладающим типом микробиоты филлосферы растений б'
розовоокрашенные факультативные метилобактерий, впервые вь
ленные в ассоциации с печеночным мхом Scapania nemorosa. Пре. (
лагалось, что РОФМ отвечают за стимуляцию роста и развития ра-
ння в лабораторной культуре [Basile et al., 1969]. Позднее из мик
флоры плевела многолетнего удалось выделить розовую культ
Ps. mesophilica, которая оказалась подобна коллекционным штамм
РОФМ и штаммам, изолированным с поверхности других растений
дальнейшем эта культура была идентифицирована как Methyloba*
rium mesophilicum [Basile et al., 1969; Dickinson et al., 1975; Aus
146
^dfellow, 1979; Green et al., 1983]. РОФМ составляли более трети от
бшеГ° числа гетеР0ТР°Ф0В в пересчете на единицу листовой поверх-
0 сТц, причем их доля варьировала от 3 до 79% в зависимости от вида
11 стений. М. tnesophilicum (от 0.5 до 69.4 колоний на см") обнаружен
щстовой поверхности более 40 видов растений и даже в гомогени-
зированных тканях листьев, поверхность которых предварительно
,ерИлизовали [Corpe, Rheem, 1989; Chanprame et al., 1996].
3 последнее время существенно расширены представления о так-
ономическом многообразии метилобактерий, ассоциированных с
растениями. Так, например, описаны и валидированы следующие ви-
bi; М. nodulans - клубеньковый симбионт африканских бобовых
lotononis, М. oryzae, выделенный из риса, М. phyllosphaerae, изолиро-
ванный из филлосферы риса, М. platani, выделенный из листьев пла-
тана, 4/. populi, выделенный из проростков тополя [Jourand et al.,
2004; Van Aken et al., 2004; Madhaiyan et al., 2007a; 2009; Kang et al.,
2007]. Кроме того, описаны следующие виды непигментированных
облигатных или ограниченно-факультативных метилотрофов, связан-
ных с растениями: Methylobacillus pratensis ассоциирован с мятликом,
Methylovorus mays выделен из кукурузы, Нansschlegelia plantiphila
выделена из почек сирени и липы, а также хвои голубой ели [Дорони-
на и соавт., 2000; Doronina et al., 2004; 2005; Ivanova et al., 2007].
Показано, что РОФМ являются постоянными обитателями филло-
сферы более 200 лекарственных, декоративных, сельскохозяйствен-
ных и диких растений Украины. Эти метилобактерий обнаружены
также и в почве. Авторы предположили, что весной РОФМ колони-
зуют поверхность листьев, попадая на них с почвенной пылью. Уда-
ленные от земли листья менее подвержены колонизации РОФМ. Од-
нако видовая и региональная специфичность РОФМ не отмечалась.
Метилобактерий филлосферы характеризуются высокой выживаемо-
стью при высушивании и замораживании на гигроскопичных носите-
лях, устойчивостью к УФ и ионизирующему облучению, низкой
влажности и высокой температуре. Примечательно, что РОФМ сохра-
няли способность к репродукции после УФ-облучения в дозах, ле-
тальных для энтерококков, псевдомонад и метанотрофов [Романов-
ская и соавт., 1996; 1998].
Поскольку эмиссия метанола вблизи устьиц привлекает метило-
^актерий, эта область служит первичным местом их локализации, от-
кУДа они проникают и распространяются по апопласту [Omer et al.,
^04]. Значительно более скромный размер популяций РОФМ на
ВгРхней поверхности листьев обусловлен различными абиотическими
Экторами (солнечное излучение, ветер, атмосферные осадки), а так-
конкуренцией за питательные вещества с другими эпифитными
147
бактериями и грибами [Hirano et al., 1996]. Большие количества м >
иола выделяются в утренние часы, когда устьица открыты. На
жении последующих часов эмиссия метанола снижается, еле (а;
тельно, имеет место суточный ритм этого процесса [Holland, 1997], ft
силу того, что метилобактерий используют метанол в качестве ист. Л
ника углерода и энергии, рост бактериальных популяций зависит А
динамики эмиссии метанола. На поверхности листьев различных р^а
тений обнаружены агрегаты бактериальных клеток, погруженных J
внеклеточный матрикс [Monier, Lindow, 2004]. Возможно, ассоцил^
ванные с листьями метилобактерий также существуют в подобщЛ
агрегатах, напоминающих биопленки. В лабораторных условиях б<дД
показано, что прикрепленные колонии метилобактерий способна
синтезировать ЭПС. Вопрос о том, зависит ли формирование ж< у-щ.
ков метилобактерий от условий окружающей среды, остается невыяс-
ненным [Schauer, Kutschera, 2008]. Я
Эксперименты с нокаут-мутантами М. extorquens AMI по ген':м
большой субъединицы МДГ mxaF и синтезу ТГМП показали, что мн
тилотрофы имеют селективное преимущество в колонизации ф> г,-
сферы по сравнению с неметилотрофными эпифитами [Sy et al., 2005].
У данного штамма имеет место кометаболизм метанола с альтерна-
тивными субстратами, так как он способен использовать различнее
органические соединения при колонизации растений. Эксперимен-
тально доказано, что метилотрофия дает определенное преимущест о,
только при наличии С4-субстратов в концентрациях, лимитирующад
рост. Известно, что участвующие в утилизации метанола МДГ- Я
ТГМП-зависимые ферменты факультативных метилобактерий акт '•>
ны и синтезируются в отсутствие метанола, но в меньшем количестве.
Принимая во внимание этот факт, следует отметить, что описаний
изоляты метилобактерий, ассоциированных с растениями, преимуи’я
ственно являются факультативными, нежели облигатными, метили
трофами [Corpe, Basile, 1982]. Доступность метанола значительно из-
меняется со временем или в зависимости от локализации бактерии
Максимальная эмиссия метанола происходит через устьица, следов^*
тельно, бактерии, находящиеся внутри листьев, подвергаются дейст*
вию больших концентраций этого субстрата по сравнению с эпифЛ
тами. Очевидно, в природе доступность альтернативных органиче-
ских субстратов для видов Methylobacterium зависит от конкуренции!
другими бактериями, в том числе и неметилотрофными. След- зч
тельно, специализация метаболизма играет важную роль при сосуще*
ствовании эпифитных бактерий [Wilson, Lindow, 1994].
Обнаружение активности пектинметилэстераз в корнях растения
делает вполне вероятной эмиссию метанола с их поверхности и обЯ
148
с11яет причины ассоциации метилотрофов с ризосферой [Sy et al.,
?005]- Интересно отметить, что в экспериментах с гнотобиотическими
астениями представители Methylobacterium преимущественно коло-
низовали корни, нежели надземные органы. Скорее всего, в естест-
венных условиях метилотрофы не выдерживают конкуренции за кор-
невые экссудаты с многочисленными ризосферными бактериями. В
каЧестве исключения отметим М. nodulans [Sy et al., 2001; Kent,
Triplett, 2002].
Если ранее на листовой поверхности растений в теплое время года
обнаруживали только РОФМ рода Methylobacterium [Corpe, Rheem,
1989; Романовская и соавт., 1996; Holland, 1997], то наши исследова-
ния впервые показали присутствие на растениях желтоокрашенных
плеоморфных бактерий рода Xanthobacter, кокковидных непигменти-
рованных бактерий рода Paracoccus, облигатных и ограниченно-
факультативных метилобактерий родов Methylobacillus, Methylophilus
и Methylovorus. Так, несмотря на связь РОФМ со многими растениями,
из филлосферы и ризосферы кукурузы выделялись преимущественно
бесцветные метилобактерий, принадлежащие к родам Methylovorus и
Paracoccus [Доронина, Троценко, 2000; Доронина и соавт., 2000]. Впол-
не вероятно, что для кукурузы — растения с С^типом метаболизма, бо-
лее характерна связь с иными, нежели РОФМ, метилобактериями.
Обнаруженные на листьях метилобактерий присутствуют также в
ризосфере растений, на семенах и в составе эндофитной микробиоты
плодов. Установлено, что для аэробных метилобактерий характерна
высокая плотность колоний на единицу листовой поверхности (до
90 КОЕ/см2). В опытах с подсолнечником выявлена приуроченность
различных видов рода Methylobacterium к эпифитным местообитани-
ям на поверхности растения. М. mesophilicum был обнаружен как на
освещаемой солнцем верхней (адаксиальной) поверхности листьев,
так и в ризоплане [Schauer, Kutschera, 2008]. Вопрос о том, почему
обитающие в ризосфере виды рода Methylobacterium продолжают
синтезировать каротиноиды и сохраняют розовую окраску, остается
открытым.
Ранее предполагалось, что РОФМ, являясь обитателями филлосфе-
Ры, колонизуют весной листья растений, попадая на них с почвенны-
ми частицами, переносимыми воздушно-пылевыми потоками [Рома-
новская и соавт., 2001]. Однако наши наблюдения свидетельствуют в
Пользу постоянной связи метилотрофных бактерий с растениями не-
зависимо от времени года. Так, метилобактерий различного таксоно-
мического положения обнаружены в отобранных зимой образцах семян
и почек липы, почек сирени, клена, яблони, хвои сосны и голубой ели
(рис. 5.1.1) [Доронина и соавт., 2004].
149
100
100
73
100
76Г
юор-
100
96
75
81
98
100
100
96
100
100
100
93
100
95
I'
I
1001 Xanthobacter sp. Р2
' Xanthobacter autotrophicus
----Ancylobacter aquatic us
- Methylosinus trichosporium
— Methylocystis parvus
I------Methylobacterium mesophilicum
_ 1QQ| Methylobacterium extorquens G-iq
i Methylobacterium extorquens
— Methylopila helvetica
Aibibacter methylovorans
Methylopila capsulata
— 'Methylosulfonomonas methylovora4
100Г Hansschlegelia plantiphila S4
ъ Hansschlegelia plantiphila S2
L Hansschlegelia plantiphila S1
100 p Paracoccus sp. S5
I---Paracoccus denitrificans
-----Agrobacterium tumefaciens
100 г Rhizobium tropic!
L Agrobacterium rhizogenes
Rhodocyclus purpureus
— Alcaligenes faecalis
C Methylophilus leisingeri
Methylophilus methylotrophus
Methylobacilius glycogenes
Methylobacillus pratensis F31T
‘‘Aminomonas aminovorus”
Methylovorus sp. F12
• Methylovorus sp. F13
. Methylovorus mays CT
Methylovorus glucosotrophus 6b1T
Methylophaga sulfidovorans
Methylophaga thalassica
Methylophaga marina
Methylophaga sp. KMK5
Methylophaga sp. KM КЗ
100
100
||
86
100
70
л»
Escherichia coli
fl
Рис. 5.1.1. Филогенетическое положение метилотрофных изолятов, ассоциирован*
ных с растениями, среди представителей Proteobacteria, определенное при сравнения
нуклеотидных последовательностей 16S рДНК. Цифрами показана статистическая
достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap’’-анализа 1001
альтернативных деревьев н
С использованием сканирующей электронной микроскопии выявя
лено, что микроколонии метилобактерий покрыты кутикулой или пОЖ
лисахаридами [Corpe, Rheem, 1989]. Другие данные указывают, что,
метилобактерии находятся не только на поверхности листьев, но И.
проникают в межклеточное пространство тканей и внутрь клеток рас;
150
тений. Так, на ультратонких срезах почек липы (из которых были вы-
делены чистые культуры метилобактерий) выявлены бактерии внутри
растительной ткани (рис. 5.1.2), причем некоторые клетки содержали
фанулы ПГБ, что характерно для РОФМ [Доронина и соавт., 2004].
Рис. 5.1.2. Ультратонкие срезы тканей почек липы (а) и хвои голубой ели (б). РК -
растительные клетки, БК - бактериальные клетки, ПГБ - гранулы поли гидроксибутира-
та. Длина масштабной линейки 1 pm
В дальнейшем было обнаружено, что метилобактерии находятся
не только на поверхности листьев, но и проникают в межклеточное
пространство тканей и внутрь клеток растений. Методом FISH пока-
зано присутствие М. extorquens внутри клеток вокруг смоляных ходов
и зародышевого щитка почек сосны. Примечательно, что интенсив-
ность сигнала гибридизации внутри меристемных тканей почек сосны
варьировала сезонно. Весной, во время активного роста почки и диф-
ференциации ткани, наблюдали сильный сигнал, что указывало на
доминирование РОФМ среди других эндофитов, тогда как после пол-
ного развития тканей почек сигнал ослабевал и внутри тканей не об-
наруживался. При этом метаболическая активность эндофитов подав-
лялась зимой и восстанавливалась во время следующего вегетацион-
ного периода [Ivanova et al., 2008; Pirttilae et al., 2008]. Наконец, выде-
ление метилобактерий из проб тканей древесных растений, отобран-
ных в зимний период, свидетельствует о постоянной связи метило-
бактерий с растениями независимо от времени года [Доронина с со-
авт., 2004].
Ранее было показано, что в иммобилизованном состоянии метило-
бактерии и метанотрофы достаточно хорошо переносят множествен-
ные циклы замораживания-оттаивания [Доронина, Троценко, 19946].
151
По-видимому, локализация внутри растительных тканей обеспечив^
этим бактериям лучшую выживаемость при низких и высоких теп: 1
ратурах или при засухе. При благоприятных внешних условиях, J
тивном росте и метаболизме растений, сопровождающемся выделу
ем летучих С i-соединений, метилотрофные бактерии препятствуй
их испарению в атмосферу, образуя биопленки на листовой повер;
ности. В целом, эти данные определенно свидетельствовали о том, щ
колонизация растений в вегетационный период роста обусловлена р-
витием предсуществующих в растительных тканях метилотрофии
бактерий, находившихся в состоянии покоя [Доронина и соавт., 2004].
5.2. Адаптация метилобактерий к эпифитному росту
Следует отметить, что физико-химические свойства листовой ц-
верхности не вполне ясны, так же как и особенности, позволяющц
бактериям жить и. размножаться в постоянно изменяющихся (флу1
туирующих) условиях. Показано, что способность репарировать г
вреждения, вызванные УФ-облучением, подвижность благодаря жгу
тикам, а также продукция ЭПС играют существенную роль при эпи
фитном росте бактерий [Yu et al., 1999]. Дня исследования другц
важных особенностей при бактериальной колонизации филлосферы
используют методы геномики и протеомики. I
Появление первой версии генома М. extorquens AMI позволив
сравнить бактериальные протеомы при эпифитной колонизации и пл
культивировании в минеральной среде. Выяснилось, что при эпиф*г]
ном росте бактерий действительно происходило увеличение содержи
ния 45 белков, по сравнению с бактериями, растущими на синтетик
ской среде. Среди белков, индуцированных при эпифитном росте
терий, обнаружены белки утилизации метанола, стрессовые белки,
также белки с неизвестной функцией, в частности, предполагаем»,
регуляторный белок PhyR (“phyllosphere-induced regulator"), проя
ляющий сходство с о-субъединицами РНК-полимеразы [Gourion et
2006]. Этот белок интересен по следующим причинам:
• N-концевая последовательность PhyR имеет RpoE (о)-подобиь
домен (рис. 5.2.1);
• Домены, подобные сигма-фактору, отсутствуют в составе отве
ных регуляторов, что предполагает потенциальную способн
PhyR самостоятельно инициировать транскрипцию.
• Сигма-фактор RpoE играет ведущую роль в поддержании целое
ности и нормального функционирования клеточной стенки, а та
м<е обеспечивает устойчивость клеток к обезвоживанию и окисли-
тельному стрессу.
Исследования доменной структуры PhyR показали, что предпола-
гаемый фосфорилируемый акцепторный домен располагается на
С-конце белка, а не на N-конце, как у всех описанных ответных
регуляторов [West, Stock, 2001].
Мутант М. extorquens, имеющий делению по гену phyR, оказывал
значительно меньшее стимулирующее влияние на растения по срав-
еНию с исходным вариантом. Кроме того, через 3 недели после ко-
д0Низации мутантными штаммами растений титр клеток уменьшался
до недетектируемого уровня. Однако при введении гена phyR в му-
тантные клетки их колонизующая способность полностью восстанав-
ливалась [Gourion et al., 2006].
Домен-акцептор
Сайт фосфорилирования
Рис. 5.2.1. Предполагаемая двухдоменная структура белка PhyR. Сайт фосфорили-
рования соответствует Aspl90 [Gourion et al., 2006]
Примечательно, что при исследовании белковой базы данных
практически у всех свободноживущих представителей класса А1-
phaproteobacteria удалось обнаружить белки, гомологичные PhyR.
Это свидетельствует о более общих функциях белков, гомологичных
PhyR, помимо адаптации к жизни в филлосфере, а так же о древнем
происхождении протеобактерий, обладающих такими гомологами.
Дальнейшие исследования привели к пониманию того, что PhyR
играет ключевую роль в стресс-ответе Alphaproteobacteria, будучи
высококонсервативным у данной группы бактерий. При помощи
сверхэкспрессии PhyR в М. extorquens установлено, что этот белок
является позитивным регулятором 246 целевых генов, продукты мно-
гих из которых участвуют в различных стрессовых ответах бактерий -
KatE (каталаза), SodA (супероксиддисмутаза), Hsp20 (белок теплового
шока), Dps (протектор ДНК), GloA и другие неидентифицированные
белки. Известно, что эти белки участвуют в борьбе со стрессом, спро-
воцированным введением ловушек электронов (GloA, Dps), а также
АФК (KatE, SodA, Dps). Последняя группа включает белки, защи-
щающие клетку не только против повреждений, вызываемых супер-
°ксид-ионами, перекисью водорода и алкилпероксидами, которые
играют важную роль в защитных реакциях растений против инфици-
рования микроорганизмами и воздействия побочных продуктов
аэробного метаболизма [Levine et al., 1994].
Ряд дегидрогеназ тоже индуцируются PhyR. Субстратная сщ
фичность и функции этих белков не вполне ясны. Возможно, они j
ствуют в утилизации субстратов, образующихся при голодании, эс
гия которых используется для поддержания таких процессов, как
парация окисленных белков и липидов. Дегидрогеназа RMQOGOl^
всей видимости, является GSH-ФАДГ, которая выполняет вспом
тельную роль при утилизации избыточного ФА, образующегося J
функционировании ТГМП- и ТГФ-зависимых путей. Кроме того, э]
периментально подтверждено участие PhyR в реакции М. extorquj
на высушивание, тепловой и окислительный шок, УФ-, этанольный
осмотический стрессы [Gourion et а!., 2008]. Предложена модель j
гуляции экспрессии генов с участием PhyR, согласно которой в юи
ках М. extorquens, попавших в стрессовые условия, PhyR фосфорит
руется и связывает анти-о-фактор NepR, подавляющий активное
стрессового о-фактора в отсутствие стресса. В результате этих coGj
тий клетки М. extorquens инициируют стрессовый ответ [France
Chariot et al., 2009] I
Аналогичный подход был предпринят для исследования микр<
ных сообществ сои, клевера и дикорастущей резушки Таля. Про е
геномным методом был проведен анализ белков и ДНК из бактери
смытых с повехности растений для последующего сравнения с м •
геномной информацией. В целом, исследования всех образцов рас г
ний выявили высокую корреляцию. Так, например, доминирующ^
группой эпифитов являются a-Proteobacteria, среди которых, в си
очередь, преобладают представители родов Methylobacterium (20.2',
и Sphingomonas (20.1%). Изучение белков, обнаруженных при эп
фитном росте метилобактерий, показало прямую связь с их способа
стью использовать метанол. С другой стороны, многие белки Sphi
gomonas, обнаруженные при эпифитном росте, участвуют в рецепг1
и транспорте различных сахаров [Delmotte et al., 2009].
Ключевую роль в способности метилобактерий колонизовать р
тения играет С [-метаболизм, что было установлено в эксперимент?
мутантами [Sy et al., 2005]. Так, инокуляция Crotalaria podocarpa 1
тактом клубенькового симбионта М. nodulans по гену mxaF, нес
собным расти на метаноле, приводила к уменьшению числа клубе
ков на корнях, подавлению азотфиксации и снижению сухой мае
растений. Кроме того, посредством слияния промотора mxaF с реп
терным геном lacZ и последующего переноса полученной плазмид!
клетки М. nodulans показано, что гены, кодирующие МДГ, экспрес
руются в апикальной части клубенька, где происходит рост тканей
соответственно, выделяется наибольшее количество метан
[Jourand et al., 2005].
154
Мутанты М. extorquens, дефектные по синтезу МДГ (A/mraF) и
^[у|П (J\mptG'), колонизовали растения люцерны Medicago truncatula
эффективностью, сопоставимой со штаммом дикого типа. Однако
J и конкурентной колонизации растений мутантным и исходным
таммами, смешанными в равных пропорциях, происходило посте-
пеНное вытеснение неметилотрофного штамма, что указывает на важ-
10 роль метилотрофии в успешной колонизации растений. В этой
а5оте методом флуоресцентной микроскопии установлено, что бак-
терии локализуются, в основном, на нижней части листовой пластин-
имеющей особенно высокую плотность микроколоний вблизи
устьиц - потенциальных сайтов наибольшей эмиссии метанола в рас-
тениях [Sy et al., 2005]. Действительно, используя метилотрофные
дрожжи Pichia pastoris, несущие метанол-чувствительный промотор,
слитый с репортерным геном gfp, установлено, что устьица являются
главным источником метанола на поверхности листьев. Помимо это-
го. экспериментально доказано, что инокуляция метилобактериями
растений приводит к значительному снижению уровня метанола, вы-
деляемого растениями в атмосферу [Abanda-Nkpwatt et al., 2006].
Зачастую во взаимоотношениях симбиотических бактерий с хо-
зяйскими организмами ключевую роль играет механизм чувства кво-
рума (“quorum sensing"), который заключается в образовании бакте-
риями низкомолекулярных соединений - А-ацилгомосеринлактонов
(АГЛ), в зависимости от плотности популяции клеток. При достиже-
нии определенной концентрации АГЛ в окружающей среде у бакте-
рий начинается экспрессия генов, зависимых от кворума. Механизм
чувства кворума обеспечивает патогенным бактериям экспрессию
различных генов, участвующих в патогенезе, а бактериям, ассоцииро-
ванным с растениями, придает различные свойства, позволяющие
стимулировать рост растений [Williams, 2007]. У М. extorquens AMI
идентифицированы несколько типов АГЛ. Это уже известные У-гек-
саноил-гомосеринлактон (Сб-ГЛ) и А'-октаноилгомосеринлактон
(С8-ГЛ), а также новые АГЛ с двумя ненасыщенными связями,
У-тетрадеценоил-гомосеринлактон (С^-ГЛ), или одной ненасыщен-
ной связью (Сид-ГД) [Nieto Penalver et al., 2006].
В геноме М. extorquens AMI обнаружены два гена, кодирующих
белки, которые проявляют сходство с АГЛ (LuxI), обозначенные mlal
и msal. Они обеспечивают биосинтез длинноцепочечных (Ci4:2- и
С14:1-) и короткоцепочечных (Сб- и С8-) АГЛ, соответственно. Приме-
чательно, что длинноцепочечные АГЛ обнаружены в культуральной
Жидкости только при метилотрофном росте, тогда как их короткоце-
Чочечные аналоги найдены в средах с метанолом или сукцинатом.
Более того, системы кворум-сенсинга у М. extorquens AMI взаимосвя-
155
заны, поскольку биосинтез С14;2- и Смп-ГЛ снизился на 20% у м\Я
та kmsal [Nieto Penalver et al., 2006]. Биосинтез короткоцепоче»гЯ
АГЛ регулируется, в свою очередь, продуктом гена tsll, кодирую^J
усеченный гомолог luxl и находящегося на плазмиде, поскольку ,Л
ция гена tsll привела к потере способности М. extorquens AMI к rI
синтезу С6- и С8-ГЛ. Кроме того, продукт tsll влияет на образо Л
ЭПС. К сожалению, несмотря на наличие мутантов по генам син-Д
АГЛ, нет сообщений о роли систем кворум-сенсинга в установленЛ
связи Methylobacterium с растениями. Большой интерес представлЛ
кворумзависимые гены, поскольку аналогичные гены других ба*т|
рий-симбионтов нередко обусловливают установление симбиоз:!
хозяином.
5.3. Влияние аэробных метилобактерий на рост
и развитие растений
Образование растениями большого количества различных Сгс ф
динений, прежде всего метанола, создает предпосылки постоянной
метаболической взаимосвязи с ними метилобактерий. Однако св<ди
ния о метилотрофных бактериях, ассоциированных с растениям»
долгое время ограничивались представителями рода MethyloliA
terium. К настоящему моменту выделено большое количество ба i\>
рий, которые обладают одним или несколькими свойствами, по -
ляющими в определенных условиях стимулировать рост и развиги!
растений. Некоторые из этих бактерий могут напрямую влиять Л
рост растений, например, продуцируя фитогормоны или потребляв
питательные вещества из почвы. Другие бактерии могут косее ч
влиять на рост растений путем подавления роста фитопатогенов.
В противоположность высшим растениям, способным расти и рЯ
множаться в относительно засушливых регионах, мхи - это сво». Л
разные живые ископаемые, которые никогда не покидают влажнЛ
местообитания и нуждаются в капельно-жидкой влаге для процесв
оплодотворения. Рост гаплоидных гаметофитов типичных видов мх-1
стимулировался определенными видами бактерий. При колонизанЯ
протонем мха Funaria hydrometrica штаммами метилобактерий, р Я
мха значительно усиливался по сравнению со стерильным контро.тсИ
Аналогичный эффект продемонстрирован в отношении таких ви.;Я
мхов, как Marchantia polymorpha и Lunularia cruciata. В присутст. Я
М. mesophilicum площадь поверхности зрелого гаметофита увеличЯ
валась в три раза по сравнению с неколонизованным контро ]-
[Basile, 1969; Koopman, Kutschera, 2005; Kutschera, Niklas, 2005]. Я
156
рии
д
Предложена гипотетическая модель взаимодействия метилобакте-
Ч с растениями (рис. 5.3.1). Растущие клетки зеленых растений вы-
еляют побочные продукты, такие как метанол и другие органические
□единения (например, аминокислоты), которые потребляются бакте-
риями. Эпифиты метаболизируют эти вещества до еще более про-
cTbix, таких как ионы аммония, которые, в свою очередь, используют-
сЯ клетками растения. В процессе этого непрерывного трофического
цикла метилобактерии синтезируют цитокинины и ауксины, сигнали-
зирующие растению о присутствии эписимбионтов на их поверхно-
сти. Эти экзогенные фитогормоны стимулируют рост и развитие га-
метофитов - деление и растяжение клеток.
Питание бактерии
Сигналы от бактерии
(гаметофит) жизнедеятельности (СНзОН,
аминокислоты и т.п.)
Стимуляция
роста
Рис. 5.3.1. Схема, иллюстрирующая взаимоотношения бактерий рода Methylobac-
terium с клетками гаметофита мха [Kutschera, 2007]
Прокариоты возникли около 3.5 млрд, лет назад, тогда как первые
эукариотические клетки - результат древних симбиозов, намного мо-
ложе (около 2 млрд. лет). Это свидетельствует о том, что многокле-
точные организмы, такие как животные и растения, развивались в
среде, где доминировали бактерии. Когда первые мохообразные рас-
тения начали заселять влажные местообитания вблизи рек и озер око-
ло 400 миллионов лет назад в раннем Силуре, бактерии, подобные
современному роду Methylobacterium, уже существовали.
Возможно, протометилобактерии, ассоциированные с древними
м*ами, коэволюционировали вместе с растением-хозяином [Thomp-
son, 1994]. Следовательно, данный тип взаимоотношений стоит рас-
сматривать как очень древний, т.е. метилобактерии являются первич-
ными фитосимбионтами. Новейшие данные подтверждают, что рост,
вживание и репродуктивный успех гаметофитов в очень большой
степени обусловлен наличием на их поверхности метилобактерий.
ледует особо отметить, что это справедливо только в отношении
‘аких низших растений, как мхи и печеночники. Что касается цветко-
вых растений, то их колонизация метил ©бактериям и незначительМ
стимулировала рост восьми из десяти видов [Gourion et al., 2006].
Показано, что метилобактерий не только присутствуют на/в сч(Д
нах, стимулируя их прорастание и сохранение всхожести. Так, в о^М
тах с семенами сои in vivo показано, что длительное прогревание (48 ч
при 50°С) снижало популяцию РОФМ до 3-5% от первоначалы* ,Л
уровня. Однако через 6-8 недель после прорастания обработанн?^
семян популяция РОФМ восстанавливалась. Вероятно, термообра^И
•и к
ка снижала скорость прорастания семян вследствие уменьшения к..
личества метилобактерий на поверхности семян. Повторная иноку, J
ция отмытыми клетками РОФМ или культуральной жидкостью при,
водила к нормализации скорости прорастания и значительному ух-
личению всхожести семян [Holland, 1997]. I
Проростки сои из термообработанных семян из-за снижения по ,<у.
ляции РОФМ резко отличались от проростков, полученных из необ-
работанных семян. Через неделю после прорастания их масса сос
ляла лишь четверть таковой контрольных ростков, причем ее согр$|
щение происходило за счет уменьшения роста корней. После иног
ляции семян, обработанных отмытыми клетками РОФМ, рост прог:
стков восстанавливался, а их масса даже превышала массу контро.п
ных вариантов, причем восстанавливался рост корней. Масса ино
лированных ростков из необработанных семян на 30% превышав
массу контрольных растений [Holland, 1997].
Обнаружено стимулирующее влияние экзогенного метанола г.
растения кукурузы, шпината, свеклы и сои. Опрыскивание расте
20%-ным раствором метанола приводило к увеличению урожая, а
ко данный метод не нашел широкого применения. Позднее этот оп л
повторили в полевых условиях с растениями сои. Через 10 дней п сЛ
опрыскивания метанолом у растений определяли численность РОФМ,
а после вегетационного периода собрали урожай. Двукратное увели
чение количества РОФМ в ответ на опрыскивание растений метив
лом приводило к повышению урожая на 45%, по сравнению с к ♦
трольными растениями. В условиях теплицы растения сои из сем-нИ
сниженным термообработкой количеством РОФМ сравнивали с
трольными вариантами через две недели после опрыскивания мет
лом. Только у растений с нормальной популяцией РОФМ наблюдЯ
увеличение роста и урожая в ответ на обработку метанолом. Авг Д
объясняли такой эффект способностью РОФМ вырабатывать
гормоны - цитокинины. Метанол способствует росту метилобактерЯ
которые поставляют цитокинины, стимулирующие рост растений, V
приводит к дополнительному выделению метанола и замыканию Uw
ла [Nishio et al., 1977; Nonomura, Benson, 1991; Holland, 1997]. V
158
I
Участие метилобактерий в развитии одно- и двудольных растений
убедительно продемонстрировано в экспериментах с гнотобионтами.
'рзк, колонизация предварительно стерилизованных семян льна-дол-
। униа облигатными метилобактериями Methylovorus mays приводила к
увеличению всхожести семян: процент проросших семян увеличился
30%, сократилось на 3-4 суток время прорастания (рис. 5.3.2).
Дальнейшее культивирование гипокотилей льна, полученных после
колонизации семян, повышало эффективность регенерации, по срав-
нению с контрольными. Начало побегообразования происходило на
2-3 суток раньше, причем регенеранты отличались интенсивным рос-
том и ярко-зеленой окраской листьев [Каляева и соавт., 2003а,б].
При колонизации аэробными облигатными бесцветными метило-
бактериями Mv. mays растений картофеля и табака отмечен более ак-
тивный рост, развитие и накопление биомассы этих растений по срав-
нению с контрольными неколонизованными (рис. 5.3.3-4). В варианте
со средой В (без витаминов) наблюдали наиболее значительную сти-
муляцию метилобактериями роста табака и картофеля: коэффициент
размножения возрастал в два-три раза, и происходило интенсивное
корнеобразование, тогда как у контрольных растений отмечено за-
медление роста, уменьшение образования корней (табак) или их от-
сутствие (картофель). На среде без сахарозы колонизованные расте-
ния продолжали медленно расти, а неколонизованные погибали в те-
чение 7-10 сут. Все колонизованные растения отличались от кон-
трольных по внешнему виду и даже на средах без витаминов имели
ярко-зеленую окраску, большие листья и хорошо развитые корни.
Эти результаты подтверждают стабильность ассоциаций метило-
бактерий с высшими растениями. Колонизация метилобактериями
значительно стимулирует прорастание семян, рост, морфогенез и ре-
генерацию растений, культивируемых in vitro, что не может быть объ-
яснено простым комменсализмом, так как свидетельствует о тесной
взаимосвязи метилобактерий с растениями и наличии “метаболиче-
ского диалога'’. Колонизация незрелых зародышей облигатными ме-
тилобактериями может быть использована для индукции морфогенеза
и увеличения эффективности генетической трансформации различ-
ных сортов пшеницы, которые являются проблемными объектами в
биотехнологии растений, поскольку эффективные системы регенера-
ции однодольных не разработаны. Широкому применению облигат-
ных метилобактерий в современной агробиотехнологии благоприят-
ствует их неспособность расти на богатых средах, используемых для
иУпьтивирования растений in vitro [Каляева и соавт., 2003а,б]. Обли-
Гатные метилобактерий стимулировали рост гнотобиотических выс-
ших растений и в дальнейшем могут послужить основой новой мо-
159
Рис. 5.3.2. Семена льна-долгунца на среде МС без витаминов через 4 сутОк
культивирования: 1 — контроль, 2 — колонизованные Methylovoru s mays fl
Рис. 5.3.3. Растения картофеля на разных средах. А - среда МС без витаминов: 1 -
контроль, 2 - колонизованные Methylovorus mays, Б - среда с пониженным содержа-
нием сахарозы (8%): 1 - колонизованные Methylovorus mays 2 - контроль fl
Рис. 5.3.4. Растения табака на среде МС без витаминов через 2 недели культивИ'
рования: 1 - контроль, 2 - колонизованные Methylovorus mays w
160
и для изучения метаболических и генетических аспектов взаимо-
Йствия метилобактерий с растениями [Иванова и соавт., 2006].
косвенное влияние бактерий на рост и развитие растений
Способность бактерий подавлять рост фитопатогенов и таким об-
а3оМ косвенно влиять на рост и развитие растений является следст-
вен одного или нескольких механизмов, включающих биосинтез
аИтибиотиков, связывание железа в ризосфере, индуцированную сис-
теМНУю устойчивость растений, биосинтез ферментов, лизирующих
щеточные стенки грибов, а также конкуренцию за сайты связывания
на корнях.
Биосинтез сидерофоров. Некоторые бактерии подавляют рост фи-
т0патогенов, синтезируя низкомолекулярные сидерофоры, которые
связывают наибольшее количество доступного железа в ризосфере.
Соответственно, рост грибковых фитопатогенов нарушается в резуль-
тате недостатка железа [Castignetti, Smarrelli, 1986]. Недавно появи-
лось сообщение о том, что у 37 метилотрофных штаммов-эндофитов,
идентифицированных как М. mesophilicum, М. extorquens, М. zatmanii,
д/. radiotolerans, М. fujisawaense, обнаружена способность к биосин-
тезу сидерофоров [Lacava et al., 2008]. Однако структура и функции
сидерофоров, образуемых этими метилобактериями, не исследованы.
Биосинтез противогрибковых ферментов. Многие бактерии, ассо-
циированные с растениями, образуют хитиназу, фермент гидроли-
зующий хитин - главный компонент клеточных стенок фитопатоген-
ных грибов. Кроме хитиназы, бактерии выделяют [}-1,3-глюканазу,
протеазы и липазу, которые также могут участвовать в лизисе грибко-
вых клеточных стенок [Chet, Inbar, 1994]. Инокуляция растений риса
штаммами Methylobacterium приводила к увеличению активности
ферментов, ассоциированных с патогенезом (фенилаланин-аммоний-
лиазы, хитиназы, р-1,3-глюканазы, пероксидазы). Более того, преино-
куляция растений риса метилобактериями снижала развитие прикор-
невой гнили, вызываемой фитопатогенным грибом Rhizoctonia solani,
но сравнению с необработанным метилобактериями контролем. Ино-
куляция метилобактериями также усиливала устойчивость арахиса к
Фитопатогенным грибам Aspergillus niger и Sclerotium rolfsii. Иноку-
ляция растений томата клетками М. oryzae снижала на 26% пораже-
ние тканей растений вследствие последующего заражения фитопато-
Геном Pseudomonas syringae pv. tomato [Madhaiyan et al., 2004; 2006;
hdiragandhi et al., 2008].
Индуцированная системная устойчивость. В последние два деся-
тилетия большое внимание уделяется системной устойчивости расте-
ний. В свою очередь, системная устойчивость растений подразделяет-
ся на два типа. Некоторые непатогенные бактерии, непосредственно
161
не контактируя с фитопатогеном, способны вызывать такое состо^Д
растений, что при последующем инфицировании растения эффег-J
но противодействуют патогену. Такое состояние называют индуц^И
ванной системной устойчивостью (ИСУ). Этот механизм, Bne J
обнаруженный у модельного растения Arabidopsis thaliana, с< йш
описан у многих видов растений - бобов, табака, томата и хрена [Д
Peer et al., 1991; Wei et al., 1991; Van Loon, Bakker, 2006]. ।
Приобретенная устойчивость растений после инфицировании Д
топатогеном, результатом которого являются небольшие повр^иД
ния или локальные некрозы, а также резистентность к последу
инфекциям, известна давно. Данное явление называется систечД
приобретенной устойчивостью (СПУ) [Ryals et al., 1996]. При инфж
ции происходит образование АФК в тканях растения, подвергающем
ся некрозу, что вызывает омертвение тканей и остановку роста
патогена. Защитные ответы при ИСУ и системной приобретеннойМ
тойчивости (СПУ) вызываются молекулами - элиситорами, присуД
вующими в фитопатогенах, либо синтезируемыми фитосимбионт-уЖ
По своему химическому составу элиситоры могут быть белками, Д
лисахаридами, липополисахаридами и летучими соединениями [Д
Loon, Bakker, 2006]. Я
Существуют принципиальные отличия в регуляции ответа Д
ИСУ и СПУ. Так, например, ответ при системной приобретенной *
тойчивости проявляется в результате повышения концентрации сл>
циловой кислоты, а также трансляции анкиринподобного белка NPA
локализованного в ядре и индуцирующего транскрипцию генов, сж
занных с патогенезом. При ИСУ-ответе главную роль играет изм<Д
ние концентраций двух фитогормонов - этилена и жасмоновой кисА
ты, которые участвуют в качестве переносчиков сигнала, а не и
стрессовые фитогормоны [Van Loon, Bakker, 2006]. В основном, .*
изученные случаи ИСУ описаны для ризобактерий, но не для метнЛ
бактерий. Недавно показано, что колонизация Methylovorus mays кВ
тайской капусты существенно повышала ее устойчивость к фито
гену Fusarium oxysporum L., а колонизация сахарной свеклы увеличу
вала устойчивость к Erwinia carotovora [Доронина и соавт., 2009; II#
голева и соавт., 2009].
Экзополисахариды. Как известно,
взаимодействие с растениями только
популяция достигает определенной
2000]. Для бактериальных колоний
клеточных покровов (капсул, экстракапсулярной слизи) с образов»
ем биополимерного матрикса. В его состав входят кислые полиса
риды, гликозилфосфатсодержащие биополимеры типа тейхоевых
микроорганизмы вступают
в том случае, если микроб*
плотности [Олескин и сод!
характерно слияние наружи
162
т и гликопротеинов. Благодаря матриксу, колония состоит не из
%цочнь1Х клеток> а из субколониальной ассоциации с системой
оД.кр0трубочек, предназначенных для передвижения клеток и транс-
порта веществ- Кроме структурообразующей роли, матрикс выполня-
т защитную функцию.
Обволакивающий клетки матрикс выступает как своеобразная бу-
керная внутренняя среда колонии, предохраняющая отдельные клет-
и колонию в целом от неблагоприятных воздействий извне (высы-
хание, нагревание или охлаждение, атака гидролитических фермен-
тов, УФ-облучение и др.). Полисахаридные и пептидные компоненты
матрикса могут включать крио-, термо- и ксеропротекторы. Кроме
того, в матрикс выделяются и распространяются экзометаболиты и
продукты автолиза клеток, включая химические сигнальные вещест-
ва. которые иногда присутствуют в культуральной жидкости бактерий
лишь в незначительных количествах, поскольку задерживаются в
матриксе. Резонно полагать, что ЭПС фитосимбионтов, создавая мик-
ропленку, способствуют лучшей передаче растению бактериальных
экзометаболитов и, кроме того, защищают растения от воздействия
упомянутых неблагоприятных факторов.
Осмопротекторы. Показано, что аэробные умеренно галофильные
метилобактерий родов Methylophaga и Methylarcula в ответ на повы-
шение осмолярности среды синтезируют глутамат и эктоин [Дорони-
на и соавт., 1998; 2009; Doronina et al., 2003а,Ь]. Синтез осмолитов
метилобактериями рассматривается как стратегия адаптации микро-
организмов к повышенному осмотическому давлению. Однако, по
предварительным данным, даже у негалофильных метилобактерий
обнаружены гены биосинтеза эктоина, что указывает на широкое рас-
пространение способности к биосинтезу осмопротекторов. Абиотиче-
ские стрессы, такие как засуха, засоленность почв, низкие температу-
ры, являются основными факторами, лимитирующими рост и продук-
тивность растений из-за нарушения внутриклеточного водного балан-
са. В ответ на такие стрессоры многие растения синтезируют и накап-
ливают осмолиты, а также криопротекторные белки - осмотин и ос-
Мопротектин [Nakayama et al., 2000; Newton, Duman, 2000]. Вместе с
Тем показано, что у трансгенных растений, содержащих бактериаль-
Ht»ie гены биосинтеза осмопротекторов, повышается устойчивость к
Одному стрессу. Не исключено, что в природе эти вещества синтези-
руются бактериями-фитосимбионтами, а затем поступают в растение.
Прямое влияние бактерий на рост и развитие растений
Еще Ч. Дарвин в своей книге ‘‘The Power of Movement in Plants”
Ропустил возможность передачи ^раздражения” у растений химиче-
1|(Ими веществами, что было подтверждено позднее. Фитогормоны -
163
это низкомолекулярные органические соединения небелковой пр
ды, которые действуют в очень низких концентрациях (10”5-10~'
на некотором расстоянии от места их биосинтеза, включая и per
руя целые физиологические программы. Известно 5 групп фит«
монов: ауксины, гиббереллины, цитокинины, абсцизовая кисло
этилен. Все они полифункциональны, могут взаимодействовать др
другом, причем разные процессы могут регулироваться одними и
ми же фитогормонами, но в различных соотношениях. Кроме г-
известны негормональные регуляторы роста и физиологических г
цессов у растений. Это вещества, усиливающие действие фитогор
нов, но непосредственно с их обменом не связанные (стимулятор*
витамины, фенольные протекторы, фенольные синергисты и им‘
торы фитогормонов, а также природные ингибиторы роста - фен
ные и терпеноидные соединения [Кефели, 1981].
Биосинтез цитокининов. Цитокинины - один из классов фито<
монов, производных аденина, содержащих в N-6 положении пури
вого кольца заместитель, структура которого может варьировать,
ределяя физиологическую активность цитокининов. Цитокинины
лифункциональны и регулируют многие физиологические процес
стимулируют деление растительных клеток, снимают апикальное,
минирование, прерывают покой спящих почек, стимулируют прц
тание семян, задерживают старение срезанных листьев. Цитокина
повышают устойчивость клеток к различным неблагоприятным :
действиям: высоким и низким температурам, обезвоживанию, г
ной и вирусной инфекции, механическим воздействиям, токсич
химическим агентам. Цитокинины регулируют формирование хл
пластов на ранних стадиях развития листа: участвуют в индук
биосинтеза хлорофилла, нуклеиновых кислот и белков хлороплл
Образуя специфический комплекс с белковым рецептором, цитл
нины, по-видимому, усиливают активность РНК-полимераз и магр;
ную активность хроматина, увеличивают количество полирибосол
таким образом влияют на синтез РНК и белков. Кроме того, цит.
нины активируют АТФазу плазмалеммы, усиливают протонную п<
пу, изменяя величину pH и мембранный потенциал клеток [MilKi
al., 1956, Skoog, Miller, 1957; Кулаева, 1973; 1982; Мокроносов, 19
Кулаева, Чайлахян, 1984; Чернядьев, 1993].
В зависимости от природы боковой цепи различают ароматичен
и изопреноидные цитокинины. Изопреноидные цитокинины быв:
двух типов: изопентениладенин (1Р)-подобные цитокинины, несуг
изопентенильную группу в боковой цепи,
или
зеатинподобные
ци
кинины, несущие гидроксилированную изопентенильную группу.
ковая цепь зеатинподобных цитокининов может находиться в ц
164
лИ ^ронс-форме, причем наиболее активной считается /ирянс-форма
цитокининов. Кроме того, цитокинины могут находиться либо в ос-
новной форме, либо в виде рибозидов или риботидов - запасной и
меНее активной формы цитокининов у растений. В целом, известно
вЬ1ще 300 соединений непуриновой природы, обладающих цитоки-
ниновой активностью [Кулаева, 1973].
Специфические пути биосинтеза цитокининов обнаружены у мно-
гих фитопатогенных бактерий: Agrobacterium spp., Pseudomonas spp.,
grwinia herbicola и др. Продуцентами цитокининов являются и непа-
тогенные бактерии, стимулирующие рост растениий, однако пути их
биосинтеза неспецифичны. В растениях также были идентифициро-
ваны гены изопентенилтрансфераз - ключевых ферментов биосинтеза
цитокининов [Kakimoto, 2001; Takei et al., 2001].
Известно несколько источников цитокининов в клетке. Синтез
de novo, в основном, осуществляется изопентенилтрансферазами, ка-
тализирующими реакцию: диметилаллилпирофосфат (DMAPP) +
+ АМФ —> изопентениладенинмонофосфат (iAMP) (у бактерий), либо
реакцию: DMAPP + АТФ/АДФ —* изопентениладенинтри/дифосфат (у
растений) [Kakimoto, 2003]. Кроме того, изопентенилтрансферазы
растений и бактерий значительно различаются аминокислотными по-
следовательностями, субстратной специфичностью и оптимумами pH.
Альтернативный или непрямой биосинтез цитокининов осуществ-
ляется путем изопентенилирования аденинового основания, прикреп-
ленного к антикодоновой петле некоторых т-РНК. Данную реакцию
катализирует т-РНК-изопентенилтрансфераза, кодируемая геном
rniaA, причем источником изопентенильной группы служит мевало-
новая кислота. При деградации такой т-РНК цитокинины переходят в
свободную форму. В большинстве случаев при деградации т-РНК об-
разуются неактивные г/ис-изомеры зеатина, в отличие от активных
юрш/с-изомеров, синтезируемых de novo. Известны примеры образо-
вания w/w/c'-изомеров зеатина при деградации т-РНК [Koenig et al.,
2002; Kakimoto, 2003].
Зачастую сложно определить, является ли уровень цитокинина,
который синтезируют Methylobacterium, достаточным для воздейст-
вия на растение. Исследование эффектов цитокинина в основном про-
водят на культурах растительных тканей с концентрацией фитогор-
мона от наномолярной до миллимолярной. Влияние цитокинина на
Целое растение во многих случаях зависит от постоянного или изме-
няющего количества этого фитогормона. В действительности, трудно
оценить вклад, который вносит столь малое количество метилобакте-
риального цитокинина в жизнедеятельность растительного организма.
Функционирование транс-зеатина в т-РНК тех видов Methylobacte-
165
У*
rium, которые не ассоциированы с растениями, до сих пор остается
вполне понятным [Lidstrom, Chistoserdova, 2002]. |
Стоит отметить, что модификация аденина в транс-полоя^ш
была обнаружена только у бактерий, образующих корневые клу5^^
ки или колонизующих поверхность листьев. Принимая во внимацЛ
намного большую активность транс-изомера зеатина, по сравнение
i/wc-формой, можно предположить, что существует некоторая взачмо.
связь между такой модификацией т-РНК и механизмом формирои^
ния взаимоотношений между бактериями и растениями [Koenig etd
2002]. Однако точная природа этой взаимосвязи не установлена. ,
Интересно, что miaA~ мутанты М. extorquens не выделяли в сэдЛ
цитокинины, но стимулировали прорастание семян сои на том Л
уровне, что и дикий тип. Вероятно, существует другое вещество, ко.
торое может маскировать эффект цитокининов на растение. Показацл
что Nod-факторы, синтезируемые представителями родов RhizobiumA
Bradyrhizobium, могут стимулировать деление клеток тем же обра&Л
что и цитокинины [Cooper, Long, 1994]. Возможно, представите^
рода Methylobacterium, филогенетически родственные вышеупомянут
тым бактериям, образуют вещества, подобные факторам нодуляции. |
В геноме М. extorquens обнаружены гены, сходные с nodB,C,D,J,m
генами, однако синтез фактора нодуляции до сих пор не доказан. Г Л
nodA, необходимый для синтеза фактора нодуляции, у М. extorqucA
отсутствует, но найден у М. nodulans, вызывающего клубенькообрв
зование у Crotalaria. Кроме того, возможно, стимуляция прорастаем
РОФМ происходит благодаря механизмам, принципиально отличим^
от тех, что стимулируют деление кортикальных клеток при ноду.Л
ции. При нарушении покоя и прорастании семян значительную р Л
играют и гиббереллины, хотя способность метилобактерий синтеза!
ровать эти фитогормоны не доказана. •
Известно, что действие РОФМ на прорастание семян и развитЛ
растений в опытах in vivo аналогично действию растворов цитокичЛ
нов или культуральной жидкости метилобактерий на растения [ТрЛ
ценко и соавт., 2001]. Используя иммуноаффинную хроматографии^
ВЭЖХ и радиоиммуноферментный анализ культуральной жидкосЛ
РОФМ, выделенных с растений сои, кукурузы, ячменя и резушки 1Л
ля, удалось показать наличие зеатина и зеатинрибозида (от 50 Л
400 нг/г сухих клеток) [Long et al., 1997]. 1
Способность к образованию цитокининов найдена также у М. тЛ
sophilicutn, выделенного с поверхности листьев плевела многолетнего
и у бесцветной облигатной метилобактерий Mv. mays, выделенной
поверхности листьев кукурузы. Биотест с использованием проросткЛ
амарантуса выявил цитокининовую активность как культуральнЛ
166
0 iкости, так и у выделенных из нее индивидуальных веществ. Хро-
^аТОграфический и иммуноферментный анализы подтвердили нали-
0С зеатин(рибозида) в культуральной жидкости обоих штаммов. Бо-
е того, биотест выявил цитокининовую активность в культуральной
жидкости как окрашенных, так и непигментированных метилобакте-
оИй и метанотрофов [Иванова и соавт., 2000].
Методом ПЦР у М. extorquens был выявлен ген изопентенил-
трансферазы, ответственной за первый этап биосинтеза цитокининов
[Long et al., 1997]. Позднее было показано наличие в геноме участков,
гомологичных последовательностям генов биосинтеза и секреции ци-
токининов, у метилобактерий различного таксономического и фило-
генетического положения [Шепеляковская и соавт., 1999]. Из доступ-
ной геномной информации следовало, что у метилобактерий нет ге-
нов, кодирующих изопентенил-аденинтрансферазы, подобных ipt или
izs генам агробактерий. Это указывало на неспецифический биосинтез
цитокининов путем гидролиза т-РНК. Данная гипотеза подтверждена
в случае М. extorquens, у которого делеция гена miaA, кодирующего
изопентенил-т-РНК-синтетазу, привела к полной потере способности
синтезировать цитокинины [Koenig et al., 2002]. По-видимому, боль-
шинство непатогенных бактерий образуют цитокинины таким спосо-
бом. Поэтому представляет интерес изучение влияния биосинтеза ци-
токининов путем гидролиза т-РНК на рост и развитие растений.
Биосинтез ауксинов. Ауксины - класс растительных гормонов,
производных индола, образующихся в апикальных меристемах расте-
ний. Один из наиболее распространенных ауксинов - индолил-3-ук-
сусная кислота (ИУК), предшественником которой является трипто-
фан. Кроме ИУК, в растениях найдены другие индольные вещества,
которые можно рассматривать либо как предшественники ИУК, либо
как продукты ее дальнейшего превращения. К числу первых можно
отнести индолилпировиноградную кислоту (ИПвК), индолилмолоч-
ную кислоту (ИМК), индолилацетамид (ИААм), индолилацетонитрил,
индолилацетальдегид, триптамин и триптофол. Ауксиновая актив-
ность индольных соединений может быть обусловлена либо их пре-
вращением в ИУК, либо собственной активностью, которая зависит
от химической структуры. Подобно другим фитогормонам, ИУК вы-
зывает разнообразные физиологические эффекты: стимулирует деле-
ние, растяжение и дифференциацию клеток. ИУК нужна для образо-
Вания проводящих пучков и тканей, т.к. превращает паренхимные
Клетки в клетки ксилемы и флоэмы, стимулирует корнеобразование,
Регулирует опадание листьев и плодов [Муромцев и соавт., 1987]. В
с°четании с цитокининами ауксины стимулируют дифференциацию
Клеток и индуцируют заложение корней в культуре тканей.
167
Способность к биосинтезу ИУК широко распространена с; с.Д
микроорганизмов. Бактерии, синтезирующие и экскретируй цД
ИУК, могут оказывать как положительное влияние на рост и развиД
растений (Azospirillum, Rhizobium), так и отрицательное, когда И
выступает как фактор патогенности. Действие экзо- и эндогенц< й
ИУК охватывает практически все аспекты онтогенеза растения: уддЛ
нение и дифференциацию клеток, развитие корневой системы,
пизмы, развитие цветка, образование сосудистой системы, созревццл
плодов [Taiz, Zeiger, 2002]. Поэтому бактерии, ассоциированны^ с
растениями, влияют на рост и развитие растении. J
Способность к образованию ИУК обнаружена у всех высших
тений, многих водорослей, грибов и бактерий, но, несмотря на мног-.
летние исследования, биосинтез ИУК во многом остается неясныш
Ауксин синтезируется, как минимум, двумя путями de novo:
триптофан (Тгр) или через его предшественники, возможно, через
дол (рис. 5.3.5) [Bartel et al., 2001]. Л
ИУК-Х
Индол
Тгр
> ИУК
ИУК-Z
> охИУК
охИУК-Z
ИБ <
ИБ-Х
Рис. 5.3.5. Упрощенная схема метаболизма ИУК в живых организмах. Тгр -тр.1 .*
тофан; ИУК - индолилуксусная кислота; ИБ - индолил-3-бутират; ИУК-Х - коньки^*!
ИУК; ИБ-Х - конъюгат индолилбутирата; охИУК - окисленная ИУК; охИУК-ZI
окисленный конъюгат ИУК
Многие растения реализуют одновременно триптофанзависимый
триптофаннезависимый пути биосинтеза ИУК [Normanly et al, 195j
1999; Bartel, 1997]. Множественность путей биосинтеза ИУК, спос<Д|
бов ее инактивации и сохранения позволяет растениям точно контрл
лировать биосинтез ИУК. Однако пока понимание процесса регу. Д
ции биосинтеза ИУК отсутствует. Исследование ауксинов в наст Д
щее время сводится, в основном, к идентификации и подсчету сод-Л
жания индольных соединений в живых организмах, а также генетичД
скому анализу ферментов, участвующих в биосинтезе ИУК. I
168
уриптофанзависимый путь биосинтеза ИУК, в отличие от трип-
фаннезависимого пути, богат различными интермедиатами и ва-
аЦиями (рис. 5.3.6).
Индолил-З-ацетальдоксим
!»
Окси база боковой цели
Индо л ил-3-ацетон итрил
Нитрилгибратаза
ОН И П-te карбокси лаза
Иодолил-З-а це та л ьдегид
Триптофан
м оноокаиаеназа
Триптофанбокарбоксилаза
Инд о л ил -3-ацвта м ид
ИА М -аийролаза
Нитрилаза
триптофан
Аминотрансфераза
О
Индолил-З-уксусная
АминоксиОаза КИСЛОТЭ
ИА А -беаибр оаеназа
Индол ил -3-пиру ват
Триптофол
Индолил-З-молочная кислота
Рис. 5.3.6. Пути биосинтеза ИУК из триптофана у бактерий [Spaepen et al., 2007].
ИАА - индолил-3-ацетальдегид, ИАМ - индолил-3-ацетамид, ИП - индолил-3-пируват
Индолил-З-ацетамидный путь. Интермедиаты этого пути обнару-
жены у многих фитопатогенных бактерий: Pseudomonas syringae,
tyrobacterium tumefaciens, Erwinia herbicola, а также у непатогенных
представителей Bradyrhizobium и Streptomyces. Считается, что индо-
лил-ацетамидный путь биосинтеза ИУК осуществляется только бак-
териями, хотя в ряде работ сообщалось о наличии индолилацетамида
в тканях стерильно выращенных растений [Comai, Kosuge, 1980;
Tbomashow et al., 1984; Manulis et al., 1991; Kawaguchi et al., 1993;
Saotome et al., 1993; Pollmann et al., 2002].
Ключевым ферментом индолилацетамидного пути является ФАД+-
зависимая триптофан-2-монооксигеназа (К.Ф. 1.13.12.3) м.м. 64 кДа.
Фермент кодируется геном iaaM и хорошо изучен у псевдомонад.
Нуклеотидная последовательность гена iaaM проявляет высокую го-
м°логию с локусом tmsl в Т-ДНК агробактерий [Emanuele et al.,
Индолил-З-ацетальдегидный путь. Ключевой фермент этого пу-
" оксидаза боковой цепи триптофана (TSO, Trp-side chain oxidase,
1.13.99.3), обнаружен только у Ps. fluorescens. TSO катализирует
169
окисление триптофана с образованием индолил-З-ацеталь^^^И
(ИАА), который затем окисляется при помощи ИАА-дегидрокц?
(см. рис. 5.3.6) [Narumiya et al., 1979; Oberhaensli et al., 1991].
Индолил-3-пируватный путь. Интермедиаты индолилпирувтг^В
(ИПвК) пути найдены как у растений, так и микроорганизмов, о, }Л
ферменты, осуществляющие биосинтез ИУК посредством этоп
в растениях, не обнаружены. ИПвК-путь реализуют бактерии, ;Со-
циированные с растениями: Enterobacter cloacae, Azospirillum АуД
lense, Ps. putida, а также некоторые непатогенные штаммы £п,й|г
herbicola [Koga et al., 1991; Costacurta et al., 1995; Patten, Glick, 1Д
Manulis et al., 1998].
Ключевой фермент ИПвК-пути - индолил-З-пируватдекарГ^Д
лаза (К.Ф. 4.1.1.74), очищен и охарактеризован у A. brasilense, Е. fl
асае и Mycobacterium tuberculosis. С одной стороны, ферменты*
разных бактерий различаются по аминокислотной последовател'А.
сти, и, как следствие, по субстратной специфичности, хотя все Ж
декарбоксилируют индолилпируват. С другой стороны, фермент иД
brasilense декарбоксилирующий фенилпируват с большей катал'тц.
ческой эффективностью, поэтому для него предложено название
нилпируватдекарбоксилаза (К.Ф. 4.1.1.43). Фермент из Мус. tuberctU,
sis условно назван декарбоксилазой а-кетокислот, благодаря спос®
ности декарбоксилировать широкий спектр алифатических и ар 'МЮ-
тических кислот [Koga et al., 1995; Schuetz et al., 2003; Spaepen et Д
2007; Werther et al., 2008]. fl
У A. brasilense делеция гена ipdC, кодирующего индол ил пируй
декарбоксилазу, привела к 90%-ному снижению уровня индоли яяЯ
тата в культуральной жидкости. Следовательно, ИПвК-путь бшяВ
теза ИУК у данной бактерии доминирует [Prinsen et al., 1993]. АнЯ
гичный эксперимент с Pantoea agglomerans (ранее Erwinia ЬегЫсиЯ
выявил наличие двух путей биосинтеза ауксинов, каждый из коте Д
выполняет определенную экологическую функцию. Так, ИПвК-пЯ
участвует в повышении конкурентоспособности бактерий на по^.д
ности листьев, тогда как биосинтез ИУК через индолилацетамид Я
ляется одним из факторов патогенности [Manulis et al., 1998].
Триптаминовый путь считается, наряду с ИПвК-путем, ocuot^fl
путем биосинтеза ауксинов в растениях, поскольку ключевой фЯ
мент - триптофандекарбоксилаза (декарбоксилаза ароматичесЛ
аминокислот, К.Ф. 4.1.1.28) - хорошо изучен у многих растений (Я
рис. 5.3.6) [Facchini et al., 2000]. В то же время остаются неяснаД
этапы окисления триптамина. У бактерий показана триптофандехЯ
боксилазная активность, однако охарактеризован только фермент
Micrococcus percitreus [Nakazawa et al., 1981]. Несмотря на то, '<1
170
и н до л и л ацето н ит-
огие бактерии, в отличие от растений, способны напрямую окис-
триптамин до индолилацетальдегида за счет активности аминок-
^дазы, функционирование триптаминового пути биосинтеза ИУК у
С окари°т не доказано [Spaepen et aL, 2007].
$ Мндолил-З-ацетонитрильный путь. Данный путь биосинтеза ИУК
пеДставляется гипотетичным, поскольку этапы образования индо-
даиетонитрила из триптофана полностью не доказаны. Предполага-
йся, что в растениях триптофан может окисляться до индолилацето-
нитрила через индолил-3-ацетальдоксим, либо через индольные глю-
козинолаты [Bak et al., 2001; Zhao et al., 2001]. У бактерий, в отличие
т растений, обнаружены альдоксимдегидратазы, катализирующие, в
том числе, и реакцию индолил-3-ацетальдоксим
рил, но не известны пути образования альдоксима [Kato et al., 1999;
2000]. Последний этап этого пути - превращение индолилацетонит-
рила в ИУК, катализируемый нитрилазой, обнаружен у бактерий и
растений [Bartling et al., 1994; Kobayashi et al., 1995].
функции бактериальной ИУК в растительно-микробных взаимо-
действиях многообразны. Изначально считалось, что биосинтез аук-
синов бактериями в основном сопряжен с патогенезом, особенно с
формированием бактериальных галлов. Позднее стало ясно, что мно-
гие фитопатогены (не образующие галлы) и фитосимбионты также
способны синтезировать ИУК. Широкое распространение генов био-
синтеза ИУК у бактерий, существование различных метаболических
путей и разнообразие действия на растения вызывает логичный во-
прос - почему бактерии образуют ИУК?
ИУК - основной ауксин растений, регулирующий важные физио-
логические процессы, такие как удлинение и деление клеток, диффе-
ренциацию тканей и тропизмы [Taiz, Zeiger, 2003; Woodward, Bartel,
2005]. Поэтому бактерии-продуценты ИУК, взаимодействующие с
Растениями, могут влиять на каждый из этих процессов путем изме-
иения пула ауксина в растениях. Вклад экзогенной ИУК в развитие
Растений приводит как к позитивным, так и негативным эффектам.
Они являются следствием количества ИУК, синтезированной бакте-
риями и доступной для растений, а также чувствительности тканей
Растений к изменению концентрации ИУК. Так, мутант фитостимуля-
т°ра Ps. putida, образующий всего в четыре раза больше ИУК, чем
Годный штамм, ингибировал рост растений [Xie et al., 1996]. Воз-
м°Жно, определенную роль играет путь, по которому синтезируется
бактериями. Как правило, фитопатогенные бактерии реализуют
иМолилацетамидный путь биосинтеза ауксинов, тогда как бактерии-
с,Имуляторы роста - индолилпируватный путь (см. выше).
171
Роль различных путей биосинтеза ИУК показана на приме* .
toea agglomerans pv. gypsophilae - фитопатогенной бактерии, • g
зующей два пути биосинтеза ауксинов - индолилпируватный и иЗ
лил-ацетамидный. Если индолилпируватный путь влияет на
ваемость клеток на поверхности листьев растения, то индол и
мидный путь участвует в образовании галлов [Manulis et al., ц*Ж
Чувствительность растений-хозяев к ИУК также определяет xataZ?
взаи-моотношениий растений с бактериями. Ps. thivervalensis
зывал влияния на нечувствительные к ИУК мутанты Arabidopsix
время как инокуляция растений дикого типа приводила к изли-нед*'
корневой системы растений [Persello-Cartieaux et al., 2001].
Ключевая роль бактериальной ИУК в образовании галлов фи^Н
тогенами Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes, Ps. savastan i,
toea agglomerans pv. gypsophilae хорошо известна. Получены .щдо
об участии бактериальной ИУК в инфекции растений фитол i
ными бактериями, не образующими галлы. Ассоциированные с до
тениями ризобактерии Azospirillum и Ps. putida используют ИУК|т>|
стимуляции роста и развития растений. Клубеньковые ризобии
зуют ИУК для установления симбиоза [Spaepen et al., 2007].
ИУК как сигнальная молекула бактерий. Показано, что ИУК рЛ
лирует экспрессию генов, участвующих в биосинтезе по механ|В
положительной обратной связи. У Azospirillum последовате
ДНК, называемая ауксин-чувствительным элементом, находится ы-
ше ОРС ipdC, которая регулируется ИУК [Vande Broek et al.. 199;,
2005]. У A. tumefaciens ИУК препятствует экспрессии vzr-гена, конф*
рируя с индукцией фенольными компонентами ацетосиринпфф
Предполагается, что ингибирование экспрессии v/r-гена явля. Нб*
гативной регуляцией при избыточной продукции ИУК трансф; рми-
рованными клетками растений [Liu, Nester, 2006]. ЛР
При помощи транспозонного мутагенеза плазмидой, несущей Sx-
промоторный репортерный ген (gusA), установлено, что четыре
Rhizobium etli, участвующие в обработке растительного сигнхЗД^И
вижности и прикреплении бактерий к корням растений, регулируьИШ
экзогенной ИУК [Spaepen et al., 2009]. ><0
У Е. coli ИУК может быть сигнальной молекулой, повы ^акЩР*
устойчивость к неблагоприятным условиям среды. Установлен '» W
ИУК инициирует экспрессию генов, связанных с выживанием^
стрессовых условиях. Кроме того, гены, кодирующие ферменты Н**
глиоксилатного шунта и биосинтеза аминокислот, позитивно
руются ИУК, в то время как ген алкогольдегидрогеназы adhE '
тивно [Bianco et al., 2006 a,b]. W
>
172
Обнаружено стимулирующее влияние ИУК на активности фермен-
первичного и центрального метаболизма метанола у мутанта
u extorquens AMI, дефектного по индолил-3-пируватдекарбоксилазе
/AipdC)- Это указывает на участие ИУК в качестве ауторегулятора.
цаконец, показано, что высокие концентрации ИУК замедляют рост
бактерий’ ассоциированных с растениями, но не занимающих другие
коНиши. Это подчеркивает роль ИУК как сигнальной молекулы во
взаимодействии бактерий с растениями [Liu, Nester, 2006; Федоров и
соавт., 2009].
Способность синтезировать индол из триптофана является таксо-
номическим признаком бактерий. Однако у многих метилобактерий
эТу способность ранее не удавалось обнаружить, поскольку синтез
индола из триптофана ингибируется ионами аммония [Иванова и со-
авт., 2001]. При замене (NH4)2SO4 на KNO3 количество индольных
соединений в культуральной среде метилобактерий увеличивалось в
2-15 раз. Вероятно, ионы аммония ингибируют триптофандезамина-
3v осуществляющую элиминирование аминогруппы триптофана в
процессе биосинтеза индола. Десятикратное уменьшение концентра-
ции (NH4)2SO4 или повышение pH среды до 8.2 у всех исследованных
штаммов также усиливало синтез индола, что во втором варианте обу-
словлено снижением ингибирующего действия ионов аммония вслед-
ствие их превращения в свободный NH3.
Показано наличие индольных соединений (5-120 мкг/мл) в куль-
туральной жидкости метилобактерий различного таксономического
положения. У облигатных и факультативных метилобактерий, реали-
зующих различные пути С [-метаболизма: Methylobacterium mesophili-
сит и Aminobacter aminovorans (сериновый), Methylovorus mays
(РМФ), Paracoccus kondratievae (РБФ), синтез ИУК изучался более
Детально. Индольные соединения идентифицированы как индолилук-
сусная кислота, индолилмолочная кислота или индолилпируват, а у
бактерий с сериновым путем метаболизма найден также индолилаце-
тамид. Активности триптофандекарбоксилазы, фермента TSO, у ме-
тилобактерий не обнаружены. Хотя среди экзометаболитов метило-
*актерий выявлен индолилацетамид, функционирование этого пути
биосинтеза ИУК у метилобактерий остается под вопросом [Иванова и
с°авт., 2001; Доронина и соавт., 2002].
о геноме М. extorquens AMI обнаружен ген RMQ09094, ко диру ю-
‘Чнй ТПФ-декарбоксилазу, имеющую наибольшую гомологию с бак-
териальными бензоилформиатдекарбоксилазами [Федоров и соавт.,
иу]. Последние могут использовать в качестве субстрата индолил-3-
ъЛуват (ИПвК), поэтому вполне ожидаемо, что белок, кодируемый
Q09094, способен декарбоксилировать ИПвК. Кроме того, в куль-
173
ИУК
туральной жидкости обнаружен ацетальдегид, что подразум,
функционирование ИПвК-пути биосинтеза ИУК. Среди предст^
ных в GenBank геномов Methylobacterium имеются два штамма, >
dulans ORS2060 и Methylobacterium sp. 4-46, лишенные гено.;
(indolepyruvate decarboxylase). С другой стороны, наличие гено.
дирующих декарбоксилазы ароматических аминокислот, указьп а
вероятность триптаминового пути биосинтеза ИУК у этих бакт<
L-триптофан —* триптамин —» индолил-3-ацетальдегид
Ген RMQ09094 М. extorquens АМ1, названный ipdC, был г,.м1
фицирован и клонирован в плазмиде рЕТ-22Ь(+). На основе Е.
BL21 (DE3, pT-GroE) получен суперпродуцент IpdC. Методом 1
NTA-хроматографии выделен электрофоретически гомогенный
комбинантный белок IpdC. Установлено, что IpdC является гом«
рамером с м.м. 245 кДа и наибольшим сродством к индолилпиру;,
но скорость реакции была максимальной с бензоилформиатом.
Рекомбинант М. extorquens с делетированным геном ipdC при
те на минеральной среде с триптофаном синтезировал в три г
меньше индольных соединений, чем исходный штамм. Напр л
комплементированный штамм синтезировал втрое больше индолы
соединений, нежели штамм дикого типа. Из этого следует, что "•с,
IpdC катализирует ключевую реакцию в биосинтезе ИУК - декярб
силирование индолил-3-пирувата. ]
Аналогично, ген aodA из М. nodulans, кодирующий декарбокси
зу ароматических аминокислот, был клонирован, получен cynepi
дуцент и препарат рекомбинантного белка. Но вместо ожидаем
декарбоксилирования ароматических аминокислот AodA катализи
вал их окислительное дезаминирование:
ароматическая аминокислота + О2 + Н2О —>
—» ароматический альдегид + СО2+ NH3 + Н2О2.
Это указывает на уникальность данного фермента, использующ»-г
качестве субстратов L-триптофан, Е-3,4-дигидроксифенилтлз1
(ДОФА) и L-фенилаланин. Показано, что AodA является гомоди
ром с м.м. 115 кДа, имеет наибольшее сродство к триптофану, 1
скорость реакции была максимальной с ДОФА.
Таким образом, впервые доказано наличие нескольких ключе
ферментов биосинтеза ауксинов у метилобактерий. У М. extent
ИУК образуется индол ил пиру ватным путем, в то время как у М. л
Ians - в результате окислительного декарбоксилирования трипто
ферментом AodA. Кроме того, делеция ipdC у М. extorquens не nf
ла к полному нарушению биосинтеза ИУК, что указывает на pa3t
разие генов, ферментов и путей биосинтеза ауксинов у метилов
рий-фитосимбионтов [Федоров и соавт., 2009].
174
одеяние бактерий на содержание этилена в растениях. Одним из
МеХа' - _______ ___________ - - - ______ ___
снос- -
^низмов влияния бактерий на рост и развитие растений является
uexar
собность снижать уровень этилена в растениях за счет активности
С ;1ми поникло пропан-1-карбоксилат (АЦК) дезаминазы. Этилен - га-
1 образный углеводород, играющий важную роль в регуляции про-
3°стания семян, развития проростков, опадании листьев и лепестков,
^также в стрессовом ответе на проникновение патогенов. Примеча-
еЛЬно, что этилен способен ингибировать или стимулировать рост в
зависимости от типа клеток и вида растения. В низких концентрациях
тиден усиливает удлинение побегов, но растущие корни продуциру-
ют большое количество этилена, что приводит к подавлению их уд-
линения. В норме этилен ингибирует удлинение корней и побегов, а в
высоких концентрациях вызывает пролиферацию небольших боковых
корней. Роль этилена в процессе ризогенеза не вполне ясна, хотя из-
вестно, что усиление роста корней происходит в небольшом интерва-
ле концентраций этого соединения [Glick et al., 2007].
ОН
он
S-аденозилметионин
МЦА’С Uni Па Jd
а-Кетобутират
\АЦК-оксидаза
АЦК-дезаминаза
н2с=сн2
Этилен
Рис. 5.3.7. Метаболизм 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (АЦК)
У высших растений АЦК-синтаза гидролизует S-аденозилметио-
нин до АЦК и 5’-метилтиоаденозина. В последующей реакции АЦК-
°ксидаза превращает АЦК в этилен, углекислоту и циановодород. В
свою очередь, бактерии утилизируют АЦК при помощи АЦК-
Дезаминазы (К.Ф. 3.5.99.7), катализирующей гидролиз АЦК до а-кето-
Утирата и ионов аммония (рис. 5.3.7) [Honma, Shimomura, 1978]. Ген
J Живность АЦК-дезаминазы (acdS) обнаружены у бактерий различ-
но недавнего времени считалось
J?K)Ke имеют этот фермент [Glick et al, 2007; McDonnell et al., 2009].
^ЦК-дезаминазы изучен, фермент очищен и охарактеризован.
Ся ген acdR
утирата и ионов аммония (рис. 5.3.7) [Honma, Shimomura, 1978]. Ген
и активность АЦК-дезаминазы (acdS) обнаружены у бактерий различ-
ного таксономического положения, ассоциированных с растениями.
. ____________, что АЦК-дезаминазы распростране-
та,.ТОлько среди микроорганизмов. Однако показано, что растения
р — jivi tpcpiVl^ni [VI1IVK UL <11, ZAJU/, 1V1VLFUI1I1C11 Ul dl., ZUUVJ,
v АЦК-дезаминазы изучен, фермент очищен и охарактеризован,
правило, радом со структурным геном acdS , но выше, располага-
., кодирующий регуляторный белок из /гр-семейства.
Чу
Транскрипционная регуляция acdS исследована только у Ps. ;
UW4 [Cheng et al., 2008; Prigent-Combaret et al., 2008]. **
Бактерии, обладающие АЦК-дезаминазой, стимулируют рост
тений, поскольку снижают концентрацию этилена, фитогормон ,
давляющего рост растений. С другой стороны, этилен выдел>1С|Я
растениями в неблагоприятных условиях (температурный, соас1 *
кислотный и водный стрессы). Поэтому инокуляция таких растс|цЯ
бактериями с АЦК-дезаминазой приводит к частичному или по
снятию стрессового состояния растений. Наконец, этилен участвуй7Н
образовании индуцированной системной устойчивости (ИСУ) Р:ч-,<3
ний к фитопатогенам. Несмотря на то, что бактерии снижают уро ^яЯ
этилена в растениях, способность вызывать ИСУ у них оста*/);*
[Glick et al., 2007].
Хотя АЦК-дезаминаза позволяет бактериям расти на АЦК в к-лтД
стве источника азота, активность этого фермента приводит к разцц^И
разным эффектам в развитии растений (см. выше). Впервые \ЦК.
дезаминазная активность выявлена у М. fujisawaense. Инокуляция
растений капусты полевой способствовала снижению уровня выде-
ляемого растениями этилена, стимуляции удлинения корней, а также
снижению концентрации АЦК в проростках. Аналогичные экспети*
менты были проведены с М. oryzae [Madhaiyan et al., 2006; 2007a,bl.
Кроме того, из филлосферы риса выделены штаммы М. radiotolerans,
обладающие АЦК-дезаминазой. Структурный ген acdS, кодирующий
АЦК-дезаминазу, секвенирован, и его последовательность имеет 949'-
ное сходство с соответствующим геном из Rhizobium leguminosartA
Инокуляция растений риса и томата штаммами М. radiotolerans, со-
держащими АЦК-дезаминазу, приводила к стандартным эффектам
[Chinnadurai et al., 2009]. Несмотря на полученные результаты, оста-
ются открытыми следующие вопросы: действительно ли ген acdS ме-
тилобактерий кодирует АЦК-дезаминазу, каковы свойства этого фер-
мента и распространение гена acdS у метилотрофов?
Витамин Вобъединяет группу корриноидов - комплексных
единений трехвалентного кобальта, важнейшим представителем
торых является цианокобаламин. В|2 играет существенную
синтезе биологически важных соединений, содержащих метил!ную|
группу, поскольку участвует в качестве кофермента в некоторых (ЯI
акциях изомеризации и трансметилирования. Я
Ферменты с кобамидным кофактором найдены у микроорг 1
мов, способных к синтезу В12, а также в корневых клубеньках б
вых растений и ольхи, где происходит процесс азотфиксации [Кр-^ЧД
вич, 1974]. Показано, что представители цветковых растений из ;;'3'
ных семейств, включая одно- и двудольные, содержат В^-зависи^Ыв-
176
ся,
но р
ииков этого витамина [Тамбиев, Кирикова, 1981; Robinson, 1983;
1 _ хл.4- ГЧ 1 1 GG1 • Dr ГЛГГТУ/ЛПЛ Т-5 <\1/П/-\ГЛТТ! II 1IJ ПТГ'-Г'ГЪ
\Vata
мин
фитов
Ве- “ о г.
мхи используют экзогенный В]2 бактериального происхожде-
ния [Spiess et al., 1973; Basile et al., 1985].
менты [Poston, 1977, 1978]. В природе корриноиды синтезируют-
в основном, прокариотами - представителями Bacteria и Archaea,
еже встречаются у одноклеточных водорослей. Поэтому многие
1,0 Юристы, в том числе и высшие растения, зависят от внешних ис-
I
nabe et al., 1991; Рыжкова, 2003]. В частности, экзогенный вита-
В, стимулировал рост и развитие аксенично растущих гамето-
- мхов разных классов (увеличивалось количество, длина и раз-
^ твленность побегов, накапливалась биомасса). Известно, что неко-
ве bie мхи используют экзогенный В]2 бактериального происхожде-
ния [Spiess et al., 1973; Basile et al., 1985].
В дальнейшем было показано, что действие экзогенного витамина
g на растения аналогично действию РОФМ, ассоциативно растущих
со мхом Scapania nemorosa в лабораторной культуре [Basile et al.,
1969] Это позволило предположить, что стимулирующее действие
РОФМ на растения связано со способностью метилобактерий синте-
зировать витамин В!2. Способность к биосинтезу витамина Bi2 обна-
ружена у метилобактерий различного таксономического положения,
реализующих разные пути С i-метаболизма. Представители родов Me-
thylobacterium, Methylovorus, Methylobacillus, Methylophilus, Hansschle-
gelia, Paracoccus синтезировали витамин BJ2 с выходом 5-700 нг/л.
Исключение составляли некоторые представители умеренно гало-
фильных метилобактерий рода Methylophaga, ауксотрофные по вита-
мину В[2. Следовательно, метилобактерии-фитосимбионты могут по-
ставлять растениям этот кофактор, необходимый для реакций изоме-
ризации и трансметилирования [Иванова и соавт., 2006].
5.4. Диазотрофия у метилобактерий
Известно, что во многих случаях фитосимбиоза важную роль игра-
ет способность бактерий фиксировать атмосферный азот, характерная
только для прокариот. Диазотрофия свойственна бактериям с самой
Разнообразной физиологией, образующим разрозненные таксономи-
' сские группы среди представителей a-, fl- и у-классов Proteobacteria,
атакже архей, циано- и актинобактерий [Zehr et al., 2003]. Биологиче-
с*ая азотфиксация - сложный процесс, в котором участвует целый
РЯД ферментов, катализирующих реакцию восстановления азота в
___j доступный аммоний, а также множество регуляторных
кодируемых 20 генами, расположенными в 7 или 8 оперонах
i ам-
^иологически
белков,
ж /-1^ Г1 L.Z ▼ V/1V1 1 V/А Л. С41VJ. Г1 а V/ Ж А. КЛ®/ 1 X А > JLFX1VI JT JL АЛ t
'^//441,150.157.117:8080/prok PUB/index.htm). В природе пул
Ния может также пополняться из абиогенных источников (грозы
вулканы), однако вклад диазотрофов намного превышает поступд^^М
NH/ из других источников.
Микроорганизмы фиксируют азот при помощи нитрогеназы _ .J
сококонсервативного комплекса ферментов, состоящего из ДИниткС
геназы (MoFe-белок) и редуктазы динитрогеназы (Fe-белок), koi
кодируются nifDK- и nifH- генам и, соответственно [Martinez-Roi
2000]. Азотфиксация может также осуществляться при помощи 3Я
тернативных нитрогеназ, кодируемых anf- и vnf-генами. Кроме т т
известна уникальная О2-зависимая нитрогеназа, обнаруженной
Streptomyces thermoautotrophicus, белки которой радикально от. |
ются по последовательности от известных нитрогеназ [Bishop д а|
1980; Chisnell et aL, 1988; Ribbe et aL, 1997]. Наиболее изученными*
нитрогеназа, обнаруженное
распространенными являются нитрогеназы, кодируемые генами
поэтому в качестве маркера азотфиксации используют nifH-ген.
ветственно, существует представительная база данных, содержщая
последовательности nifH-гена из различных местообитаний [Zehr et
aL, 2003]. Разработана система вырожденных олигонуклеотида!!*
праймеров, позволяющая идентифицировать структурные гены нит-
рогеназы nifHD у различных таксономических групп прокариот !Ма-
русина и соавт., 2001; Федоров и соавт., 2008]. Последние достижсЛ
с применением стабильных изотопов также позволяют детектировать
метилотрофные виды, ассимилирующие l5N2. Л
Метилобактерий являются метаболически гетерогенной группой.
поэтому резонно предположить, что среди них встречаются диазо*
трофы. Однако среди 30 описанных родов метилобактерий аз. гфяк*
сация однозначно доказана только для представителей Xanthobader,
Ancylobacter и Beijerinckia. Факультативные метилобактерий ; ода
Xanthobacter способны фиксировать молекулярный азот в хемолито-
автотрофных условиях, что существенно отличает их от других ;иа-
зотрофов [Raj, 1989; Reding et al., 1991; Wiegel, 2005; Kennedy, 2' 05].
Обитая в ризосфере риса на заливных полях, в микроаэробных усЯ
виях с высокой концентрацией Н2, СО2 и/или других продукте»
болизма анаэробных бактерий (органические кислоты и спирты), че-
тилотрофные ксантобактерии вносят существенный вклад в пит?ДИ
растений и азотный баланс в промежуточной (между аэробной и .на]
эробной) зоне [Oyaizu-Masuchi, Komagata, 1988].
РОФМ также вносят физиологически значимый вклад в аз»
метаболизм колонизованных растений [Holland, Polacco, 1992]. У:Д
известно несколько изоферментов уреазы: в семенах ветре*
уреаза, кодируемая геном Еи1, и уреаза, кодируемая геном Ей ’Tj
рая присутствует во всех тканях растения, но в меньших количес
Кроме того, для нормальной уреазной активности растению н- ' Ч
Ь1 ферменты, кодируемые генами Еи2 и ЕиЗ. У растений с мутаци-
по гену eu3-elleu3-el мочевина накапливалась в тканях из-за от-
е тствия УРеазы- Колонизация таких растений РОФМ не приводила к
^ становлению уреазной активности. Однако у двойных мутантов
eltl-sun!eul-sun, еи4/еи4, колонизованных РОФМ, уреазная актив-
сть частично восстанавливалась (на 20-40% от дикого типа) за счет
вклада уреазы РОФМ.
Клубеньковый симбиоз бактерий с растениями
На корнях растений образуются клубеньки, в которых находятся
^фиксирующие бактерии-эндосимбионты. Поскольку нитрогеназа,
катализирующая азотфиксацию, необратимо инактивируется кисло-
родом, этот процесс может осуществляться только в анаэробных или
микроаэробных условиях. Многие бактерии обладают различными
цитобиохимическими способами защиты нитрогеназы от инактивации
кислородом. Соответственно, образование клубеньков создает сим-
биотическим бактериям микроаэробные условия для эффективной
фиксации азота.
Клубеньковый симбиоз - сложный процесс с участием тонко ско-
ординированного обмена сигналами между растением и бактериями,
который приводит к направленному изменению физиологии и мета-
болизма партнеров [Brcncic, Winans, 2005]. Ключевым событием в
формировании клубеньков является высвобождение бактериями сиг-
нальных молекул, которые детектируются растениями и запускают
формирование клубеньков. Эти молекулы называются Nod-факторами
и являются 0-1,4-#-ацетил-В-глюкозаминами с 4-5 различными ос-
татками. Nod-факторы синтезируются при помощи продуктов nod-
генов и вызывают структурные изменения в корневых волосках и в
экспрессии множества генов растения [Lerouge et al., 1990; Downie,
1998; El Yahyaoui et al., 2004]. Экспрессию /ioJ-генов индуцируют
различные вещества, которые выделяются растениями. Индукторами
экспрессии ло(/-генов служат, в основном, флавоноиды, а также ста-
хВДрин, тригонеллин и некоторые производные фенола [Spaink et al.,
1987].
Среди метилобактерий способностью образовывать клубеньки об-
лают Methylobacterium nodulans и Burkholderia [Moulin et al., 2001;
У et al., 2001; Jourand et al., 2005]. Способность образовывать клу-
ньки аэробными метилобактериями недостаточно изучена. Сооб-
^ение о новом виде М. nodulans, выделенном из клубеньков африкан-
Го растения Crotalaria, появилось недавно. Первоначально, в каче-
п доказательства способности образовывать клубеньки был ам-
Фицирован и секвенирован псх£4-ген М. nodulans. Позднее, другая
Па исследователей выделила еще один штамм М. nodulans, у ко-
торого обнаружен nifH-ген нитрогеназы, что указывало на сд
ность к симбиотической азотфиксации [Sy et al., 2001; Jaftha
2002]. J
В последние годы достигнут значительный прогресс в иссле л
нии клубеньковых симбионтов из рода Methylobacterium. Резу Ьтя
проекта по секвенированию геномов М. nodulans и Methylobac:
sp. 4-46, выделенного из Lotononis, привели к выводу о том, что vej(a
низм установления симбиоза метилобактерий с растениями и _ет
“классическому” для ризобий типу. Данный механизм был уст
лен путем идентификации генного кластера nodDABCULJHQ, 0(('
рующего ферменты биосинтеза «orZ-факторов, а также структур-
мих woJ-факторов. Несмотря на это, филогенетически wtZ-reB
М. nodulans проявляют большее сходство с последовательн.с^И
соответствующих генов Burkholderia tuberum STM678, чем с генгш
ризобий [Renier et al., 2008]. Отсутствие логМ-гена у несимбиот^Д
ских видов рода Methylobacterium, а также значительное схо гД
белков NodA у М. nodulans и Bradyrhizobium позволяют предп ло
жить, что М. nodulans приобрел способность к клубенькообразовп^Н
в результате латерального переноса генов. И
По данным филогенетического анализа т/Н-гена, М. nodulans ли-
зок Gluconacetobacter diazotrophicus - эндофиту сахарного тростниД
Типовой штамм М. nodulans ORS2060 способен формировать а»
фиксирующие клубеньки на корнях Crotalaria (С г. glaucoides, Сг. /еж
rottetii и С г. podocarpa). Более того, на корнях другого бобовог- рИ
тения - Lotononis bainesii, также обнаружены клубенькообразующие
РОФМ. Клубенькообразующие и не обладающие такой способн- стью
представители рода Methylobacterium изолированы из ризосферы три
пических бобовых растений с высокой нитрогеназной активностью
[Jaftha et al., 2002; Raja et al., 2006].
Исследование роли метилотрофии в симбиотических отнош нях
М. nodidans с Crotalariae крайне интересно. Экспериментально ока-
зано, что способность использовать метанол дает преимуг еств!
М. nodulans при симбиозе с Сг. podocarpa. У этого вида ген /их 1,6
экспрессируется конститутивно, а контролируется метанол-и । уЦИ'
бельным промотором, так же как у М. extorquens и М. organopl^^
[Zhang, Lidstrom, 2003].
Экспрессия mxaF-гена была обнаружена в корневых клубегь^
что подтверждало присутствие в них метанола и последующ^
пользование бактериями. Апикальная ткань клубеньков, форМИ'’лР
мых М. nodulans, в значительной степени дезинтегрирована, что
ло быть следствием образования растением или бактериями пектин
Как известно, растения образуют несколько классов пектиназ [Рга
180
1999], но не было доказательств того, что М. nodulans способен
3 панировать пектин. Результаты экспериментов с инокуляцией рас-
ний метанол-негативными мутантами свидетельствуют в пользу
частия метилобактерий в таких симбиотических отношениях: на-
й юдаД°сь Резкое уменьшение биомассы растения (до 42%) и замед-
ние роста. Одновременно было обнаружено резкое снижение коли-
а клубеньков и активности азотфиксации.
Скорее всего, метилобактерии играют разную роль в развитии
клубеньковой инфекции. На начальном этапе способность использо-
ть метанол повышала активность колонизации бактериями корня.
Обнаружено, что некоторые виды Crotalaria, включая Сг. podocarpa,
образуют токсичные метилированные соединения, такие как пирроли-
зидиновые алкалоиды [Kinghorn, Smolenski, 1981], а метилобактерии
способны их деградировать. Следовательно, симбиотическая специ-
фичность видов Methylobacterium и Crotalariae может быть результа-
том селекции растением бактерий, основанной на экскреции корнями
таких токсичных соединений.
Вероятно, во время нодуляции М. nodulans реутилизирует метанол,
образующийся при деградации тканей развивающегося клубенька.
Это позволяет растению экономить энергию, которую оно должно
поставлять бактериям для осуществления азотфиксации. Одновре-
менно показано, что негативные по способности к метилотрофии му-
танты испытывают недостаток в энергетических ресурсах для под-
держания нитрогеназной активности. Известно, что метанол - ключе-
вой сигнальный метаболит, регулирующий экспрессию большого ко-
личества генов, участвующих в клеточном делении, метаболизме и
защитных реакциях растений [Downie et al., 2004]. Поэтому нельзя
исключать возможность участия метилобактерий в перестройках кле-
точной стенки при формировании клубенька или супрессии защитных
механизмов растения в результате утилизации метанола.
В совокупности, эти результаты свидетельствуют о разнообразии и
Целесообразности механизмов взаимодействия аэробных метилобак-
терий с растениями. Очевидно, способность к использованию
'-i-метаболитов растений в качестве источников углерода и энергии
Дает метилобактериям определенные преимущества по сравнению с
Другими прокариотами. Предстоит выяснить специфику стратегий и
Тактик, реализуемых метилобактериями-фитосимбионтами.
Глава 6
ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА
АЭРОБНЫХ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ
С развитием и активным внедрением молекулярно-биологиче<К1|Х
методов появилась возможность выйти на новый уровень понимание
феномена метилотрофии. Определение геномных последовател' ню|
стей метилотрофных бактерий позволяет реконструировать их м..та.
болические модули и функциональные сегменты - метаболомы. Л
Первой удобной моделью для таких исследований стал Methyl
bacterium extorquens AMI, ранее использованный для изучения м ла.
нолдегидрогеназ и серинового цикла [Lidstrom, 2006]. Посредст^ м
химически индуцируемого мутагенеза были получены мутнпс
М. extorquens AMI, неспособные расти на Сгсоединениях, в частиц,
сти на метаноле, и выявлены соответствующие участки ДНК, кодл-
рующие ключевые гены метилотрофии. Направленный мутагенез га
нов, расположенных в таких регионах, и секвенирование хромо< мы
позволили к концу 1990-х годов аннотировать около 70 генов метгло-
трофии у М. extorquens AMI в 8 регионах хромосомы. Проект секве-
нирования геномной последовательности М. extorquens AMI, ини-
циированный в 1998 г. М. Лидстром, выявил еще около 30 генов цм
тилотрофии и заполнил пробелы в знании генетической и метаболи-
ческой организации этого метилотрофа [Chistoserdova et al., 2003]. 4
Геном М. extorquens AMI представлен кольцевой хромое v й
размером 6.8 м.п.н. и тремя плазмидами (44, 38 и 25 т.п.н.), соде» жит
7552 предсказанных кодирующих последовательности. Плазмиды
считаются криптическими, поскольку их функции не описаны [Chis-
toserdova et al., 2003; Penalver et al., 2006].
Ключевые гены метилотрофии у М. extorquens AMI кластери- УГ'Т
ся в так называемых “метилотрофных островках”, самый больпюи из
которых (~ 60 т.п.н.) содержит сопряженные гены, кодирующие
личные модули С]-метаболизма (часть метанолокисляющих функиИ
большинство реакций окисления формальдегида и серинового цикЖЬ
(рис. 6.1.1). Однако некоторые гены метилотрофии находятся ЫИ
этих “островков" [Chistoserdova et al., 2003]. ’Я
Большинство генов окисления метанола у М. extorquens АМИИ
кализуются на хромосоме в кластере 1 (12.5 т.п.н.) в виде отделы4 ч»
большого оперона mxaFJGIRSACKLDEHB. Все 14 генов этого
на транскрибируются в одном направлении и кодируют полипе
МДГ, специфичный цитохром с, а также белки, необходимые
182
д^чения ионов Са
сК
НО
в апопротеин, один регуляторный белок и не-
о;!ько белков неизвестной функции (см. рис. 6.1.1). Непосредствен-
, перед кластером 1 находится ген mxaW, дивергентно транскриби-
’ уемый с метанол-индуцируемого промотора, но функция его неясна,
рте два локуса содержат гены транскрипционных регуляторов МДГ
>nxbMD (кластер 2 наибольшего “островка метилотрофии”) и
мете-
mxbMD (кластер 2 наибольшего “островка метилотрофии”)
niXcQE- Гены биосинтеза кофактора МДГ (PQQ), также локализован-
ные в двух кластерах: pqqABC/DE, т.е. в “островке метилотрофии”
непосредственно после mxbMD, pqqFC, - не связаны с другими мета-
трофными генами. Кроме того, в геноме представлены гомологи
генов МДГ - xoxFGJI, не участвующие в первичном окислении мета-
нола [Chistoserdova et aL, 2003; Giovannoni et al., 2008].
В отдельном регионе (8.4 т.п.н.) хромосомы М. extorquens AMI
находится кластер утилизации метиламина mauFBEDACJGIMN,
включающий 11 генов, кодирующих МАДГ, специфический акцептор
электронов (амицианин) и ферменты биосинтеза TTQ. Гены этого
кластера транскрибируются в одном направлении, кроме неиденти-
фицированного гена-регулятора [Chistoserdova et aL, 2003].
Как известно, у М. extorquens AMI функционируют ТГФ- и
ТГМП-зависимые метаболические модули Ci-переноса между фор-
мальдегидом и формиатом. В геноме идентифицированы уникальные
для метилотрофов гены метилен-ТГФ-дегидрогеназы (mtdA),
нил-ТГФ-циклогидролазы (fch), котранскрибируемые и локализован-
ные вместе с частью генов серинового пути, а также гены, кодирую-
щие формиат-ТГФ-лигазу (ftfL) и ферменты синтеза фолата: folKBP
(кластер 2 наибольшего “островка метилотрофии”), связанный с ге-
ном фумаразы (fumA) ген dyr (кластер 13) и не связанные с другими
генами метилотрофии folC,E [Chistoserdova et aL, 2003; 2005].
ТГМП-модуль, ответственный за утилизацию большей части фор-
мальдегида у М. extorquens AMI, представлен архееподобными гена-
ми, локализованными на одном конце наибольшего “метилотрофного
островка” (кластер 2): flicCDAB-orf4-mtdB-orfY-mch-orf7-fae-orfl7-
°г/9-3-“неархейных reHa"-orfl9-orf20-orf21-orf22. Некоторые из этих
гснов транскрибируются дивергентно, что приводит к образованию
^скольких транскриптов. Предполагается, что orf4 кодирует вероят-
НЬ]и ген биосинтеза метаноптерина [Chistoserdova et aL, 2003]. Ген
Дигидрометаноптеринредуктазы (dmrA) локализован в другом участке
^Ромосомы и не сопряжен с генами метилотрофии. В геноме выявле-
Гакже гомологи генов дигидрофолатредуктаз двух типов: триме-
и ассоциированной с тимидилатсинтазой
также i
.^Рим-резистентной (dfrB)
[Marx et aL, 2003b].
183
mxeWFJGtRSACKLDeHB
mxODM, mxcQB
CHjOH
|Shocmht>3 FQQ|
pqqABC^B,
p<iqPG
CHjNHa
mauFBEDACJQLMN
PQQ JICHjO
Синтаз
ПГБ
dmr^orU, (orf7,9,17,19,20,21,21,22)
Матами» т Матанмл- , Формил*
ТГМП mtdB ТГМП meh ТГМП fhcAB
(mtdA)
MBCEKP, dyr
Гидроксмпмруаат
ff/yA
Глицин
Серин
Маталаи»<Д1^и Метенил-
ТГФ ' ТГФ
Формил*
ТГФ
•НСООН
I Штдд
Глиоксилат
mcl
2 Ацетил-КоА
[ Р^лА
Ацетоацетал-КоА
phxB
ям
Глицерат
Синтез
пуринов
j Биосинтез C3t C« |
со>
Окислен^
Формиат
ело^ /
ФВП-Л
___^,_СО;
Ацетал*КоА
Цитрат
Биосинтезе,
Оксалоацетат
mdh^mdh
Малат
Малмл-КоА
Изоцитрат
led
t
i
fumA
Фумарат
sdhABCD
сМСатоглутарат
sucAB, Ipd
ПГБ 4- - - - Э«Гидр<жсибутарил*КоА
рМС \
Сукцмнип-КоА
_ scsAftfcst/ \mcmAB
Сухцинат ^^ \moxBD
Метал малокмл-КоА
щ рссАв|
ННр Пролионмл-КоА
/х* Глиоксилат
croft
mcl
Кротоиил-КоА
Р*Метилмалил*КоА
Эталмалонмл-КоА
msd
Me законил-КоА
•стп
(тооА) МетилсукцинмлЖоА
Рис. 6.1.1. Гены первичных путей Ci-метаболизма у М. extorquens AMI
Показано, что для окисления формиата М. extorquensMAX облада-
ет четырьмя негомологичными ФДГ, кодируемыми генами fdhlAR
fdh2ABCD (НАД+-зависимая ФДГ), fdh3ABC (цитохромзависимая
ФДГ) и fdh4AB. Пептид, транслированный с гена fdh4A, имеет низкое
сходство аминокислотных последовательностей с а-субъединидеи
ФДГ М. extorquensAMI (24-36%), но высокогомологичен неохара#'
теризованным молибдоптеринзависимым оксидоредуктазоподобным
белкам других протеобактерий (кластер ортологических rpJJ
COG0243). Котранскрибируемый с fdh4A ген fdh4B кодирует n°^j
пептид из 107 аминокислотных остатков, не имеющий опознаваем
мотивов в последовательности , однако гомологи этого гена с I
m
Black
184
чНостью 40-45% аминокислотного состава присутствуют у пред-
ав1
среД
иТелей Agrobacterium, Rhizobium и Brucella, располагаясь непо-
сТвенно за fdh4A-гомологами. В геноме extorquens AMI иден-
Vf rbидированы также гены белков А биосинтеза молибденового ко-
тЯ^тОра (тоаА) и молибдоптерин-гуанин динуклеотида (mobA) [Chis-
tserd°va et aL, 2003; 2007а].
реномный анализ выявил 10 генов, ответственных за ассимиляцию
мальдегида у М. extorquens AMI. Большинство генов серинового
цикла кластеризованы на одном конце наибольшего “островка мети-
лотрофии” вместе с двумя ТГФ-связанными генами mtdA и fell, но
транскрибируются в двух единицах: sga (серин-глиоксилатамино-
трансфсраза)-Л/7г(оксипируватредуктаза)-/иГб£4-/сА и mtkA-mtkB (ма-
латгиокиназа)-/?рс(ФЕП-карбоксилаза)-тс/ (малил-КоА-лиаза) дивер-
гентно генам ТГМП-модуля. Сериноксиметилтрансфераза (GlyA),
первый фермент серинового пути, кодируется на хромосоме отдельно,
так же как и глицераткиназа (Gck). Необходимые для Ср и Сп-
метаболизма гены малатдегидрогеназы (mdh) и энолазы (епо) содер-
жатся только в одной копии. Большинство генов серинового пути на-
ходятся под контролем регулятора LysR-типа QscR, имеющего высо-
кое сходство с транскрипционным CbbR-регулятором автотрофии и
фотосинтеза у бактерий. Расположение гена qscR на хромосоме в не-
посредственной близости к генам фруктозо-1,6-бисфосфатазы и фос-
форибулокиназы свидетельствует о сравнительно недавнем приобре-
тении этого гена от автотрофных бактерий [Chistoserdova et al., 2003].
Циклическая регенерация глиоксилата осуществляется у М. ех-
torquens AMI в этилмалонатном пути с использованием кротонил-
КоА-редуктазы (err) и пропионил-КоА-карбоксилазы (рссВ), класте-
ризованных с двумя генами теаА,В (кластер 22), кодирующими
В12-зависимую этилмалонил-КоА-мутазу и полипептид неизвестной
Функции. Образующийся под действием мутазы МеаА метилсукци-
нил-КоА, по-видимому, окисляется ацил-КоА-дегидрогеназой с по-
следующим гидроксилированием и расщеплением соответствующими
базами до пропионил-КоА и глиоксилата, тем самым замыкая сери-
новый цикл [Erb et al., 2007; Peyraud et al., 2009].
Поскольку этилмалонатный путь включает также реакции серино-
Вого пути, ЦТК и биосинтеза ПГБ, катализирующие их ферменты яв-
Ля*отся общими для перечисленных путей. Так, специфичными для
ЭтНлмалонил-КоА пути являются только 11 генов - croR, err, рссАВ,
ectn (теаА), meaBD, msd, med, тстАВ, тогда как 3 гена важны также
серинового пути (mtkAB, тсГ), 5 генов - для ЦТК (sdhABCD, fumA)
Гепа для образования ПГБ (phaABR). Обнаружено, что, за исклю-
Ием четырех генов в кластере 22, а также sdh- и р/ш-генов, гены
185
этилмалонатного пути у М. extorquens AM 1 не связаны между с
с другими генами метилотрофии [Chistoserdova et al., 2003; 200^|^M
В пути биосинтеза ПГБ, который является способом адаптации
лимиту по NH4+, SO4“", Mg2+, Fe2+ и Mn2+, идентифицирован'
phaA,B, продукты которых катализируют также две первые
этилмалонатного пути. Контроль за направлением потоков
КоА на синтез ПГБ или Ci-ассимиляцию, по-видимому, осущест^/*
регулятор PhaR [Chistoserdova et al., 2003].
У М. extorquens AMI ген а-кетоглутаратдегидрогеназы
репрессирован, поэтому ЦТК выполняет преимущественно ан Гпщ
ческую роль, причем многие ферменты этого цикла участву- т1Ц
С]-ассимиляции. Реакции превращения сукцинил-КоА в сукцадЙ
также являющиеся этапами этилмалонатного пути, катализируете
сукцинил-КоА-синтазой и кетоацидсукцинил-КоА-трансферази|^И
дируемыми генами scsAJB (связаны с mdh) и kst, соответственно. Геи
сукцинил-КоА-гидролазы не найден. Дальнейшее превращение cw.
цината в рамках ЦТК и этилмалонил-КоА пути осуществляют укци-
натдегидрогеназа (sdhABCD), гены которой локализованы в ojflK
кластере (кластер 29), и фумараза, чьи гомологи (fumA и fumB) . Гщ.
ружены на хромосоме [Chistoserdova et al., 2003].
Исследование механизмов quorum sensing показало специфичнее
синтезируемых регуляторных молекул - гомосеринлактонов, в опре-
деленных условиях культивирования и привело к идентификации'^
нов их биосинтеза при метилотрофном и гетеротрофном рость
torquens AMI. Установлено, что за продукцию длинноцепочечичх
гомосеринлактонов (Cl4:i, С]4:2) при росте на Ci-соединениях ответе^
вен гомолог ацилгомосеринлактонсинтетазы, кодируемый геном ЯШ
(RMQ02395), тогда как короткоцепочечные гомосеринлактоны (&
Си) синтезируются при росте клеток на сукцинате с помощью проду>
та гена msal (RMQ10089). Оба гена расположены близко к
занным вероятным транскрипционным регуляторам luxR-TW^
[Penalver et al., 2006]. 'J
Обнаружено, что одна из криптических плазмид штамма
(44 т.п.н.) содержит ген tsll (RMQ03963) - укороченный гомол^Н^В
luxl, продукт которого, состоящий из 123 аминокислотных оСГЛ5Й|
содержит сайт связывания для рибосомы и контролирует трачс1^И
цию гена msal, а также непрямым путем - образование ацил г
ринлактонов и ЭПС. Очевидно, что для полной экспрессии ген'
необходима активность Msal. Ген tsll не является частью опер*'
как перед ним находятся кодирующие последовательности пг
занных транспозазы и белка МоЬС, вовлеченного в конъюгации* IS
nalver et al., 2006].
I
г,.дучИ факультативным метилотрофом, способным к фитосим-
д/ extorquens AMI послужил удобной моделью и для оценки
^/циональности имеющейся геномной информации методами про-
йКи. которые, несмотря на некоторые ограничения [Van Dien et
те°2003], активно используются для исследования адаптации к изме-
3 ’ иям внешних условий или определения регулонов [O’Connor et al.,
^nOO' Antelmann et al., 2001; Bernhardt et al., 2003].
В результате сравнительного анализа протеома клеток М. extor-
s дМ1, растущих на синтетических средах и колонизующих ли-
р-ья и корни растений, обнаружено появление 45 белков у бактерий,
.10низовавших филлосферу, по сравнению с выращенными на син-
-етических средах. Выявлено высокое сходство между филло- и ризо-
сферными профилями белков, однако 40 белков более активно экс-
прессировались в условиях эпифитного роста. При этом увеличива-
лась экспрессия ключевых маркеров метилотрофного метаболизма:
MxaJ, MxaF, Fae, PhaA, филлосфероспецифичного гомолога AcoD
Ralstonia eutrophus, вовлеченного в катаболизм этанола и ацетоина,
гомолога AldB Е. coli для детоксикации спиртов и альдегидов, гомо-
лога вероятной глутатионлиазы GloA Е. coli для детоксикации ме-
тилглиоксаля, образующегося при катаболизме некоторых аминокис-
лот и ацетона, компонентов ABC-транспортеров сульфата и железа
(лимитирующие факторы для других микроорганизмов при колониза-
ции листьев), потенциальных аминокислот- и олигопептидсвязываю-
щих белков. Возрастали уровни ряда ферментов: кротонил-КоА-
редуктазы (Сгг), малил-КоА-лиазоподобного белка,
НАДФН-зависимой оксидоредуктазы, альдегиддегидрогеназы,
тиноксидазоподобной оксидоредуктазы, возможной хинопротеиновой
аденилаткиназы [Cooper, 1984; Priefert et al., 1992; Xu, Johnson, 1995;
Marco et al., 2005].
Для выживания в жестких условиях филлосферы клетки М. ех-
torquens AMI экспрессировали два класса стрессорных белков. Во-
первых, шапероны/протеазы: трипсиноподобные сериновые протеазы
(DegP/HrA) для внецитоплазматического стресс-ответа и транспорта
компонентов клеточной стенки, необходимые для эпифитного роста,
протеолитическая субъединица АТФ-зависимой С1р-протеазы (С1рР),
^Риновая протеаза I (DJ-1/Pfpl), общий стресс-белок семейства
(гомолог GSP18 Bacillus subtilis), белки теплового шока (Hsp70
И Hsp20). Во-вторых, появлялись белки окислительного стресса, пре-
дстоящие также АФК, образуемым растениями: супероксиддисму-
5^ (SodA), каталаза (KatE), неспецифический ДНК-связывающий
гк (Dps) - ключевой компонент защиты от Н2О2, УФ и электрофи-
’ таких как метилглиоксаль.
вероятной
ксан-
187
Юр
Весьма значимым фактом стало обнаружение двухкомпоне.ц,^
а-бактериального регулятора стресс-ответа PhyR (“phyllosphe^Jj
duced regulator”), важного для эпифитного роста. Показано, что бел
PhyR является мономером с м.м. 32 кДа и частично относится к суИ
существующим системам регуляции - альтернативным <т-факт ам*
зависимым от фосфорилирования регуляторам ответа, поскольку hw
ет и внецитоплазматический домен-ресивер и и-факторо-подо^, J
домен. В отличие от других двухкомпонентных систем регуляции
N-конец PhyR содержит ECF-подобный а-фактор, узнающий TipQM<J
тор и инициирующий транскрипцию как субъединица РНК-полю»,
разы, а С-конец - ресиверный домен. Непосредственно перед гСН0|.
phyR обнаружен ген анти-ЕСЕ-сг-фактора nepR, транскрибируем! jfi.
противоположном направлении. Показано, что в ответ на стресс
фосфорилируется и взаимодействует с NepR. При этом высвобож. а.
ется а -фактор, который связывается с РНК-полимеразои, и прг-
исходит транскрипция генов регулона. Регулятор PhyR выявлен у
всех свободноживущих a.-Proteobacteria, что свидетельствует ег
древнем происхождении и общности функции при адаптации к и*,
лосферным условиям обитания [Gourion et al., 2006; Franccz-Charlot et
al., 2009]. W
Анализ транскриптомов и протеомов мутантов с делецией phyR и
повышенной экспрессией этого гена обнаружил 246 генов с изме-
няющейся экспрессией. Причем на 229 генов этого регулона PhyR
действовал как транскрипционный активатор [Gourion et al., 2008],
Половина генов с возрастающей экспрессией кодирует гипотетиче-
ские белки чувствительности и регуляции (около 60), а также елки,
ассоциированные со стресс-ответом: (ко)шапероны или протеаз,’4 теп-
лового шока или окислительного стресса (htrA, ibpA, grpE, гйв
cbpA, hsp2O), альтернативный о-фактор для роста при повышеШЖ*
температурах (гроЕГ), ферменты защиты от окислительного стрЛь
(katE, sodA, 2 g/оЛ-гомолога) и алкилпероксидов, важных для заШИВ
растений от микробных инфекций и побочных продуктов аэро^НЧ''
метаболизма (орг и ahpC), высококонсервативные а-протеобактери*
альные мембранные белки, индуцируемые при различных стресс3
(csbD, yciF), белки для защиты от окислительного, осмотические
УФ-стрессов (dps, ostnC, uvrA, mscL), гомолог гена гликозил
разы Staphylococcus aureus, вовлеченной в биосинтез каротин
защищающих клетки при окислительном стрессе (ctrQ), гипотс^И
ские мембранные белки и транспортеры, некоторые дегидро^ЧМ
возможно, для утилизации субстратов при голодании
pfam00107), вероятная GSH-зависимая ФАДГ для защиты при 1,3
ке ФА и фитоендесатураза, необходимая для пигментации
188
, Из 17 генов со снижающейся экспрессией И кодируют гипоте-
тические белки, а 3 - вероятный сенсор и регуляторные белки [Zhou et
i, 1988; Gutheil et al., 1997; Gourion et al., 2008].
Сравнительный анализ протеома M. extorquens AMI фингерприн-
тингом масс пептидов и фрагментов трипсинолиза, и более эффек-
тным безгельным мультимерным подходом (ВЭЖХ + двумерная
масс-спектрометрия), выявил индукцию белков, участвующих в окис-
лении метанола до СОг и ассимиляции Ci-единиц в сериновом цикле.
При покрытии протеома на 58%, достигнутом вторым методом, 2959
белков были обнаружены при росте клеток на метаноле и 3115 - на
сукцинате [Bosch et al., 2008].
При росте клеток на метаноле была характерна индукция малой
субъединицы МАДГ (МаиА) и PQQ-зависимой МДГ, состоящей из
двух субъединиц аир (MxaF и Мха!) - агрг- MxaF - мажорный белок
найден на двумерном электрофорезе в главном пятне и 7 дополни-
тельных минорных пятнах. Малая субъединица Мха! не обнаружена
на двумерном электрофорезе из-за малого размера (-75 аминокислот)
и pl 9.3, но визуализирована при безгельном подходе, который также
показал индукцию этого белка при метилотрофном росте бактерий.
Показано, что MxaJ и MxaD, необходимые для оптимизации ЭТЦ при
окислении метанола, также индуцировались, а МхаЕ не проявлял раз-
личий в экспрессии при смене субстрата [Toyama et al., 1998; 2003].
Идентифицированы 3 из 6 генных продуктов, ответственных за синтез
PQQ (PqqB, PqqE и PqqF), индуцируемых при метилотрофном росте
культуры [Laukel et al., 2004; Bosch et al., 2008].
Среди ферментов кофакторзависимых путей утилизации ФА при
росте культуры на метаноле индуцировались: Fae (формальдегид-
активирующий фермент), MtdA (НАД+-метилен-ТГМП-дегидрогена-
за), Meh (метенил-ТГМП-циклогидролаза), FhcABCD (формилтранс-
фераза/гидролазный комплекс), FtfL (формиат-ТГФ-лигаза), Fch (ме-
зенил-ТГФ-циклогидролаза). Однако источник углерода и энергии не
оказывал влияния на экспрессию MtdB (НАДФ+-метилен-ТГМП/ТГФ-
Дегидрогеназа), что согласуется с активностью этого фермента [Chis-
toserdova et al., 1998; Vorholt et al., 1998; Bosch et al., 2008]. Выявлен-
ии гомолог Fae синтезировался при росте клеток на обоих субстра-
7х» но чуть более активно на сукцинате, что ставит вопрос о специ-
фичности катализируемой им реакции.
Фичности катализируемой им реакции.
Методом двумерного электрофореза не удалось идентифицировать
» хотя безгельный подход позволил обнаружить индукцию при
^лотрофном росте FdhlA,B, Fdh2A,B,C,D, (НАД+-ФДГ) и Fdh4A,B
Зависимая ФДГ). Напротив, экспрессия цитохромзависимой ФДГ
189
'ниц,
Fdh3A,B,C при смене субстрата не изменялась [Laukel et al., 2 # Л
Bosch et al., 2008].
Из числа ферментов, катализирующих реакции Cj-ассимилпщЛ
при росте AZ. extorquens AMI на метаноле индуцировались: Sga (с^
рин-глиоксилатаминотрансфераза), MtkA,B (а, р-субъединицы м?мЯ
тиокиназы), Нрг (оксипируватредуктаза), Мс1 (малил-КоА-л
GiyA (сериноксиметилтрансфераза), Епо (энолаза серинового Цпк^д?
Gck (глицераткиназа), аконитаза, Р-кетотиолаза, R-специфическ^
эноил-КоА-гидратаза, пропионил-КоА-карбоксилаза. При этом снВ1
жался синтез регулятора серинового цикла QscR, являющегося -.iqj
ватором генов метилотрофии и ауторепрессором [Bosch et al., 21 ОМ
Большинство ферментов серинового цикла найдено во множеств*^
ных пятнах. Так, Мс1 обнаружена в основном и в нескольких минм.
ных пятнах, различающихся по р! или молекулярной массе. Пар лог
Мс1, идентичный на 38%, также индуцировался при метилотроф н<ж
росте клеток [Laukel et al., 2004]. Л
При метилотрофном росте М. extorquens AMI индуцировались
ClpA (АТФ-связывающая субъединица АТФ-зависимой С1р-протеа-
зы), 60 кДа шаперонин GroEL, пептидил-пролил цис-транс изомерам
компоненты ЭТЦ (цитохром с, ферредоксин, алкансульфонат моноок-
сигеназа, флавогемопротеин, субъединица I цитохром d убихинод
оксидазы, субъединица НАДЬЬгубихинон оксидоредуктазы NuM
НАДФ+-трансгидрогеназа PntA,B и др.), ряд транспортных и связи
вающих белков, в том числе, олигопептидный транспортер, гипЛ
сульфонатсвязывающий белок, ферменты биосинтеза бактериохлоро
филла (субъединицы N, В независимой от света протохлорофилл ре-
дуктазы, Mg-протопорфирин, аэробная IX монометил эфирокисл .ю-
щая циклаза, фактор-посредник пирофосфатазы, а-субъединица aw
тил-КоА-ацетоацетил-КоА трансферазы, SSU белок рибосомного се-
мейства S12P, универсальный стрессовый белок, глюкозо-фрукт. зо-
оксидоредуктаза, белок переключения жгутикового “мотора” (FliM|
металл зависимая гидролаза, а также белки неизвестной функции. - И
тенциальные 2-кето-4-пентеноатгидратаза, 2-дегидропантоат-2-ре. '-'I'
таза и КоА-синтаза могут образовывать оперон с вероятным антип Д
тером формиата и оксалата [Bosch et al., 2008]. <
При гетеротрофном росте М. extorquens AMI наблюдали релр
сию синтеза регулятора метаболизма ПГБ (PhaR) и индукцию синтез
ферментов центрального метаболизма и биосинтеза ПГБ: PhaA ( 11е*
ТИЛ
PhaC (поли-3-гидроксиалканоат полимеразы), белков, ассоциир
ных с гранулами ПГБ или деградацией ПГБ, транспортеров дикар^ ЯМ
силатов, изоцитратдегидрогеназы, малатдегидрогеназы (Mdh), малаг •
FTTI
b *
-КоА-ацетилтрансферазы), PhaB (ацетоацетил-КоА редукт’ЗгД
ПТЛ-Д-ГТ/Г nvoLmo'T1 ппппшрппот Л плпшiij
' I
190
3
ДНК-направленной p-первичной цепи РНК-полимеразы,
нОн оксидоредуктазы (МХОР, К.Ф. 1.1.99.16), важной для восста-
* вдения малата в оксалоацетат при росте на органических кислотах
!u0|enaar et aU 2000], пируватдегидрогеназного комплекса (PdhA, В,
L пИруватфосфатдикиназы (Pdk), ФЕП-карбоксикиназы (Рек), ФЕП-
синтазы (Pps), малик-энзима, одного из двух изоферментов фумаразы
/ригпА), компонентов глюконеогенеза и ферментов биосинтеза сери-
^а/глицина [Laukel et al., 2004; Bosch et al., 2008].
При культивировании M. extorquens AMI на сукцинате возрастала
также экспрессия НАДФ+-трансгидрогеназы PntA,B, субъединиц
НАДН2 : убихинон оксидоредуктазы (NuoB,F,G), LSU рибосомного
белка, ДНК-направленной p-первичной цепи РНК-полимеразы,
0-цепи АТФ-синтазы, а также ряда оксидоредуктаз и флагеллинов.
При росте клеток на метаноле или сукцинате, наиболее распростра-
ненным внешнемембранным белком был продукт гена RMQ12418
[Laukel et al., 2004; Bosch et al., 2008].
Для исследования роли горизонтального переноса генов и геном-
ных перестроек в эволюции специализированного С,-метаболизма у
различных видов Methylobacterium была инициирована программа
секвенирования геномов нескольких представителей этого рода
(рис. 6.1.2). Геномы факультативных метилотрофов М. extorquens
AMI (6.9 м.п.н.) и ДХМ-использующего М. dichloromethanicum DM4
(6.1 м.п.н.) полностью проанализированы [Vuilleumier et al., 2009].
Они почти вдвое больше генома облигатного метилотрофа Me. capsu-
latus (3.3 м.п.н.). Кроме хромосомы, штамм АМ1 имеет мегаплазмиду
(1.2 м.п.н.) и три небольших плазмиды, тогда как в геноме штамма
DM4 есть две плазмиды в дополнение к хромосоме. Большинство ге-
нов метилотрофии высококонсервативны для обоих штаммов. Гены
хромосом этих штаммов, в отличие от плазмид в основном характери-
зуются высокой синтенией и идентичностью последовательностей.
Главное отличие между хромосомами состоит в присутствии раз-
личного числа IS-элементов, широко распространенных в обоих ге-
номах, что предполагает значительный потенциал пластичности ге-
нома. Некоторые из этих элементов являются общими для обоих
Штаммов, тогда как другие штаммоспецифичны [Chistoserdova et al.,
2009]. Так, по-видимому, путем горизонтального переноса генов
dichloromethanicum DM4 приобрел большой геномный “островок”
(126 т.п.н.), значительно отличающийся по Г + Ц составу (60 мол.%)
От генома в целом (68 мол.%) и содержащий 133 предсказанных по-
следовательности, в том числе ген ДХМДГ demA, а также гены, во-
влеченные в поддержание плазмид, репликацию и контроль копийно-
। и Ряд частично перекрывающихся IS-элементов [Schmid-Appert et
а •> 1997; Vuilleumier et al., 2009].
0.02
100
Methylobacterium extorquens AM1
Methylobacterium extorquens PA1
Methylobacterium extorquens IAM126311
J Methylobcaterium dichloromethanicum DM4
Methylobacterium chloromethanicum CM4T
|L Methylobacterium zatmanii
r Methylobacterium suomiense
' Methylobacterium aminovorans
[- Methylobacterium rhodesianum
Y Methylobacterium populi BJ001T
•— Methylobacterium thiocyanatum
---Methylobacterium podarium
— Methylobacterium rhodinum
---Methylobacterium variable
---Methylobacterium aquaticum
100 — Methylobacterium isbiliense
—74 j------Methylobacterium sp. 4-46
1----Methylobacterium nodulans ORS2060T
- Methylobacterium organophilum
— Methylobacterium hispanicum
Methylobacterium mesophilicum
Methylobacterium radiotolerans JCM2831T
Methylobacterium fujisawaense
Methylorhabdus multivorans
75
98
81
82
92
100
93
100
~85
Рис. 6.1.2. Филогенетическое положение представителей рода Methylobacterium,
для которых секвенируются геномы, определенное на основании сравнения нукл. -
тидных последовательностей 16S рДНК. Цифрами показана статистическая достовер-
ность порядка ветвления, определенная с помощью “oootstrap’’-анализа 100 альтерн .-
тивных деревьев И
Дополнительным открытием при сравнении геномов стало тсуг*
ствие кластера генов утилизации метиламина (таи} в геноме шттмм^
DM4, что совпадало с энзимологическими данными, показавшими
отсутствие активности МАДГ, но наличие ферментов N-метилглуИ
матного пути [Doronina et al., 2000]. Поскольку этот штамм, как и
АМ1, способен к росту на метиламине, было предположено, чт*> он
использует негомологичную систему утилизации метиламина. Кек
ожидалось, кластер генов деградации дихлорметана (dem} оказяЯ
уникальным для штамма DM4. Кластеры тиам-генов штамма АМГ•
dc/л-генов штамма DM4 ассоциированы с мобильными элементами,
что указывает на их латеральный перенос [Chistoserdova et al., 2 ' 9И
Недавно были представлены полные геномные последовате. ь#”
сти шести других штаммов Methylobacterium (табл. 6.1.1). Эти
довательности находятся в процессе аннотационного анализа. ДоС
тупность охарактеризованных геномов будет служить платфоТ**^
для внутри- и межвидовых геномных сравнений и исследований
ханизмов адаптации, позволяющих представителям рода Methyl'4*»
terium процветать в различных эконишах. /Л
192
Таблица 6.1.1
Геквенированные геномы представителей рода Methylobacterium
Объект
йсслеД°вания
AM1
Methylobacterium
extorquens PA 1
Methylobacterium
dichloromethanicum
DM4
Methylobacterium
chloromethanicum
CM4
Methylobacterium
nodulans ORS206Q
Methylobacterium
popultBlOOl
Methylobacterium
radiotolerans
JCM2831
^hylobacterium
SP Мб
Отличительное свойство
Генетические элементы
Номер в
GenBank
Контрольный штамм
В 103 раз более эффективен при
эпифитной колонизации
Arabidopsis thaliana
Рост на ДХМ [Doronina et aL,
2000с]
Рост на хлорметане,
корриноидный путь [Vannelli
et al., 1998; 1999; McDonald et
al, 2001]
Вызывает нодуляцию у
Crotolaria, фиксирует азот,
имеет nod-гены,
непигментированный [Sy et
al., 2001; Jourand et al., 2004)
Эндофит тополя [Van Aken et
al., 2004]
Устойчивость к радиации,
широкий спектр используемых
субстратов [Green, Bousficld,
1983]
Не растет на метаноле,
вызывает нодуляцию у
Lotonoms, фиксирует азот,
способен к фотосинтезу
[Fleischman, Kramer, 1998;
Jaftha et al., 2002]
Хромосома (5.51 м п.н )
Мегаплазмида (1.26 м.п.н.)
Плазмиды:
plMETAl (44 20 т.п.н.)
р2МЕТА1 (37.86 т.п.н.)
рЗМЕТА! (24.94 т.п.н.)
Хромосома (5.47 м.п.н.)
Хромосома (5.94 м.п.н.)
Плазмиды.
plMETDl (141.50 т.п.н.)
p2METDl (38.58 т.п.н.)
Хромосома (5.78 м.п.н.)
Плазмиды:
pMCHLOl (380.27 т.п.н.)
PMCHL02 (22.62 т.п.н.)
Хромосома (7.77 м п.н.)
Плазмиды:
pMNODOl (487.73 т.п н.)
pMNOD02 (458.07 т.п.н.)
pMNOD03 (40.46 т.п.н.)
PMNOD04 (37.54 т.п.н.)
PMNOD05 (20.29 т.п.н.)
pMNOD06 (12.64 т.п.н.)
pMNOD07 (9.83 т.п н.)
Хромосома (5.80 м.п.н.)
Плазмиды:
рМРОРО! (25.16 т.п.н.)
рМРОР02 (23.39 т.п н.)
Хромосома (6.08 м.п.н.)
Плазмиды:
pMRADOl (586.16 т.п.н.)
PMRAD02 (47.0 т.п н.)
pMRAD03 (42.99 т.п н.)
pMRAD04 (37.74 т.п н.)
pMRAD05 (36.41 т.п.н.)
PMRAD06 (27.84 т.п.н)
pMRAD07 (22 11 т.п.н.)
pMRAD08 (21 02 т п.н )
Хромосома (7.66 м.п.н.)
Плазмиды:
рМ44601 (57.95 т.п и.)
рМ44602 (20.02 т.п.н.)
СР001510.1
СР001511.1
СР001512 1
СРОО1513.1
СРОО1514 1
СР000908.1
FP103042.2
FP103043.1
FP103044.1
СР001298.1
СР001299.1
СРОО 1300.1
СРОО 1349.1
СР001350.1
СРОО1351 1
СР001352.1
СР001353.1
СР001354.1
СР001355.1
СР001356.1
СР001029 1
СР001030.1
СР001031.1
СР001001.1
СР001002.1
СР001003.1
СР001004.1
СРОО 1005.1
СР001006.1
СР001007.1
СРОО 1008 1
СР001009 1
СР000943.1
СРООО944.1
СР000945 1
193
JHoM
• HHefc,
I
Газ-
, от.
-e из
Другим интересным модельным объектом геномики аэробных
тилотрофов, относящихся к a-Proteobacteria, является Рагасоссщ
nitrificans Pdl222, реализующий РБФ-путь Сгассимиляции. г
этой метилобактерий представлен одной кольцевой и двумя
ними молекулами ДНК (1.83, 1.16 и 0.67 м.п.н.) с высоким сод.^?1’
нием Г + Ц 65.5 мол.%. Выявлены два основных механизма, . ’
ценных в интеграцию гетерологичной ДНК в геном Ра. denitrify^
функционирование ТпЗ-опосредованной сайт-специфической peimZ*
бинации и репликативный перенос с участием IS-элементов, у
личных штаммов Ра. denitrificans обнаружены 4-6 копий IS724*j
носящегося к большому семейству IS-элементов, встречающихся вд
у грамотрицательных, так и у грамположительных бактерий. Д
пяти предсказанных ОРС, идентифицированных в IS1248, п0.
видимому, кодируют транспозазы [Baker et al., 1998].
Метилотрофная компонента генома Ра. denitrificans Pdl222, citK
собного расти на метаноле, включает кластеры генов, кодируют»
биосинтез МДГ (mxaF, mxaGIJ, orfl-mxaACKl.D-orf2-orf3) и коф?к^
pa PQQ (pqqABC/DE и pqqFC). Контроль экспрессии генов МДГ су.
ществляется с помощью продуктов генов mxaZYX, расположенных
впереди структурного диха-кластера, а для кластеров pqqABCl'TjR
pqqABC, кодирующих биосинтез PQQ и его вероятный АВС-транс-
портер. Регуляторы кодируются генами flhRS. МхаХ и MxaY отяоедй
ся к двухкомпонентным системам и функционируют как ДНК-
связывающий регулятор ответа и гистидинкиназа-сенсор, чьим эф»
фектором, по-видимому, является формальдегид. Ген mxaZ не имел
известных гомологов и его роль неясна [Baker et aL, 1998].
Обладая широким набором мембрансвязанных цитохромов с-1ЙЯ
в качестве первичного акцептора электронов от МДГ, Ра. denitrifiaU
Pdl222 использует цитохром С55Ц (MxaG), однако на последую^Д
этапах окисления метанола также осуществляет восстановление ЦЙД
хромов С550 (СусА) и С552 (СусМ) [De Vries et al., 1990; Baker ct fc
1998]. Показано, что при росте на Ci-соединениях индуцируется^Д
тез еще одного цитохрома с-типа - Css.n (СусВ), ген которого локлж
зован в кластере xoxF-cycB-xoxJl, кодирующем гомологи а-су^^Д
ницы МДГ (MxaF) и MxaJ.
У Ра. denitrificans степень экспрессии и функционирование wCTF
болических путей контролируется согласно энергетической иерадш
Эти бактерии предпочитают источники и стоки электронов,
зующие большую часть свободной энергии для роста и поддерж^Д
жизнедеятельности клеток. При использовании органических
стратов в качестве источника углерода и энергии в присутствий'W
слорода, как терминального акцептора электронов, клетки экспр
194
т ферменты, необходимые для такого метаболизма, подавляя син-
РУ тех, которые связаны с альтернативными дыхательными путями.
те3 мецты, участвующие в этих, не требующих кислорода, процессах,
прессируются только в случае, если доступен иной сток электро-
эКС и отсутствует О2. Соответствующий контроль этого, так называе-
*’оГО (ан)оксипереключения, весьма полезен, поскольку альтернатив-
ки противостоять крайне токсичным интермедиатам - NO2 и NO.
Другой тип контроля, хорошо изученный у Ра. denitrificans, связан
правильным выбором донора электронов в дыхательной цепи. Клет-
ки преДпочитают полиуглеродные субстраты, но когда они заканчи-
ваются, могут переключаться на иной тип метаболизма (дыхания),
(NO, NO2). Например, при росте клеток на метаноле или метиламине,
НОВ
ими nponecc нитратного дыхания (денитрификация) вынуждает клет-
ки противостоять крайне токсичным интермедиатам - NO2 и NO.
Другой тип контроля, хорошо изученный у Ра. denitrificans, связан
правильным выбором донора электронов в дыхательной цепи. Клет-
ки предп°читают полиуглеродные субстраты, но когда они заканчи-
ваются, могут переключаться на иной тип метаболизма (дыхания),
использующего альтернативные субстраты как доноры электронов
(NO, NO2). Например, при росте клеток на метаноле или метиламине,
необходимые для их окисления МДГ и МАДГ индуцируются, а осво-
Сдающиеся электроны переносятся от них через соответствующие
акцепторы конститутивной части дыхательной системы клеток.
Важная часть дыхательной системы Ра. denitrificans состоит из
НАДН2-дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, убихинона Ою, ком-
плекса цитохрома Ьс/, цитохромов С550 (локализованного в периплаз-
ме) и С552 (связанного с мембраной). Клетки имеют возможность син-
тезировать три типа терминальных оксидаз: Ьдз-хинолоксидазы, а!аЗ-
и cbbj-цитохром с оксидазы.
Оксидаза а/аЗ является структурным и функциональным гомоло-
гом фермента, найденного в митохондриальной дыхательной цепи.
Хинолоксидаза cbbj обнаружена только у бактерий и имеет на поря-
док более высокое сродство к кислороду, чем а/аЗ- и Ьяз-типы цито-
хром оксидаз. Экспрессия этой высокоэффективной оксидазы увели-
чивается при понижении концентрации кислорода. Хинолоксидаза
Ьа3 - аналог хорошо известной Ьо3 хинолоксидазы Е. coli, общей для
всех эубактерий [Baker et aL, 1998].
У Ра. denitrificans они препятствуют перевосстановлению дыха-
тельной системы. НАДН2-дегидрогеназа, цитохром Ьс/ и терминаль-
ные оксидазы являются белковыми комплексами, сопряженными с
нитоплазматической мембраной. Свободная энергия, которую они
Делают доступной, катализируя реакции переноса электронов, ис-
пользуется для генерации протонного градиента через мембрану. В
^елом, организация и функция аэробной дыхательной цепи у Ра. deni-
trtficans напоминает таковую митохондрий эукариот [Van Spanning et
а,->2000].
Функция окисления метиламина у Ра. denitrificans Pdl222 закоди-
Р°нана в mau-кластере (mauFBEDACIGMN), состоящем из 10 струк-
195
♦
турных генов синтеза МАДГ, кофактора TTQ и специфического Л
цептора электронов - амицианина. Выше расположен Дивергеи-Ж
транскрибируемый регуляторный ген mauR, кодирующий транск-Д,
ционный активатор LysR-типа [Baker et al., 1998].
Формальдегид, являющийся продуктом периплазматическци
окисления метанола и метиламина, далее в цитоплазме окисляете* л
формиата в двух последовательных реакциях, катализируемых Ндр
GSH-ФАДГ (FlhA) и S-формилглутатионгидролазой. Генный кластеп
flhA Ра. denitrificans Pdl222, кодирующий эти ферменты, расп.
ется выше генов хог-кластера. Дальнейшее окисление формиата су.
ществляет НАД+-зависимая ФДГ. Однако получены данные, <^0
Ра. denitrificans может синтезировать и НАД+-независимые изоф> .
менты ФАДГ и ФДГ [Baker et al., 1998]. ж
Ферменты биосинтеза ПГБ ф-кетотиолаза, ацетоацетил-КоА^
дуктаза и поли-3-гидроксиалканоат синтаза) кодируются у Ра. den
ficans Pdl222 генами phaAB и phaC. Денитрифицирующие функции
кодируются генными кластерами nirXISECFD, norFEDQBC и nosRL
ответственными за восстановление нитритов (NO и NO2) и транскри-
бируемыми в противоположных направлениях [Baker et al., 1998]. fl
Первым метилотрофным представителем fi-Proteobacteria, .л* ко-
торого определена геномная последовательность, стал Methylibuun
petroleiphilum РМ1, способный к деградации оксигенированног • ме-
тил-?я/?е?и-бутилового эфира (МТБЭ), ароматики и нефтепродукта с
алкильными цепями протяженностью от 5 до 12 атомов С. Геном
Ml. petroleiphilum РМ1 состоит из хромосомы (4.04 м.п.н., Г + Ц
69.2 мол.%) и мегаплазмиды рРМ1 (600 т.п.н., Г + Ц 66 мол.%) с 3831
и 646 предсказанными кодирующими последовательностями соот ет-
ственно. На хромосоме идентифицированы генные локусы путей
градации ароматики и алканов, устойчивости к металлам и метило-
трофных модулей. Мегаплазмида, по-видимому, приобретенная не-
давно, служит для деградации МТБЭ и содержит пути разлог пня
алканов, островок генов т-РНК и 3 копии fra-генов для конъюгятив-
ного переноса. Из 4477 вероятных кодирующих последовательное!^
генома 395 гомологичны генам представителей a-Proteobacteria, 2332
- генам fi-Proteobacteria, 690 - генам y-Proteobacteria, а 964 уник Л®'
ны для Ml. petroleiphilum РМ1. При этом плазмида рРМ1 соде0^И
непропорционально большое число (382) уникальных генов [КлП^
al., 2007].
В хромосоме находятся ггл-оперон (16S-T-PHK
и все гены рибосомных белков, а также 42 гена т-РНК. На мегап-"лг
миде рРМ1 идентифицированы 27 генов т-РНК, 25 из которых
гичны хромосомным, а 2 не имеют четких антикодонов. Геном Titffl
Ala
196
одержит гены подвижности и биосинтеза жгутика, хемотаксиса и
Греции, в частности, гены метилакцептирующих белков хемотакси-
(МБХ), точечно расположенных в опероне pilG-L (cheYA(fAY>X)W-
0пероН) и Д?/ЛЛ-генном кластере. Один из генов «er-подобных МБХ,
участвующих в аэротаксисе, локализован непосредственно за актива-
уорным геном LuxR-типа оперона РубисКО и может котранскрибиро-
аТься с геном, похожим на прямой сенсор кислорода (dos) Е. coli.
|Дз числа мобильных генетических элементов, у Ml. petroleiphilum
pft/l l обнаружены до 25 копий IS-элементов семейства ISwp, а также
фланкированные ими 2 геномных сегмента (29 и 40 т.п.н.). Каждая из
копий 29 т.п.н. региона содержит 2 оперона phnFDC-htxFGHIJKLMN,
кодирующих ферменты метаболизма фосфоната и кобаламина. Htx и
phn CP-лиазы поддерживают рост на метил- и алкилфосфонатах. По-
вторы также содержат гены, ответственные за синтез витамина В]2.
Анаэробный путь биосинтеза кобаламина закодирован сбг-генами в
cob-кластерах [Kane et al., 2007].
Неспособный к росту на метиламине Ml. petroleiphilum РМ1 не
имеет гена, кодирующего большую субъединицу МАДГ, и активно-
сти этого фермента. Интересно, однако, что этот использующий ме-
танол метилотроф также не обладает MxaF- и Mxal-субъединицами
МДГ. Кластер генов МДГ у Ml. petroleiphilum РМ1 представлен их
гомологами xoxF-J, присутствующими у неметилотрофов, а также
дополнительными генами mxaLKCASR и mxaJ. Уровень сходства
XoxF-белка Ml. petroleiphilum РМ1 с MxaF М. extorquens AMI состав-
ляет 74%, тогда как вероятный MxaJ/XoxJ белок имеет меньшее сход-
ство с XoxJ Ра. denitrificans Pdl222 (54%) и Me. capsulatus Bath (42%).
Предполагается, что ни один из кластеров, содержащих xoxF, не уча-
ствует в окислении метанола. Вероятно, для этого используется дру-
гой фермент. Однако недавно показано, что хох-гомологи МДГ могут
проявлять активность [Wilson et al., 2008]. Биосинтез кофактора МДГ
и хинопротеин : этанолдегидрогеназы (PQQ) в геноме закодирован 5
генами - pqqABCDE. Ген цитохрома С555, акцептирующего электроны
от МДГ, у Ml. petroleiphilum РМ1 имеет 56% сходства с геном цито-
хрома cltMc. capsulatus Bath [Kane et al., 2007].
Для переноса Сгединиц в геноме Ml. petroleiphilum РМ1 присутст-
вует ТГМП-модуль, включающий архееподобный генный кластер, и
пред ставленный генами mptGD, meh. fae, folDP, fhcBADC, folC, mtdA,
4c Hfch. Окисление формиата катализируют три ФДГ, гены которых
пРоявляют сходство с соответствующими генами М. extorquens AMI
; capsulatus Bath: вольфрамзависимой fdhlAB, НАД+-зависимой
z hlABC и цитохромзависимой fdh3ABC. Показано, что с генами
197
alkHJKL,
fdhlAB и fdh2ABC связан ABC-транспортер для вольфрама [К^
aL, 2007]. 1
Геном Ml. petroleiphdum PM1 содержит два модуля С]-ассими*
ции: 1) 2 набора генов формы I РБФК/О cbbL и cbbS с ассоциир. ?
ными ферментами для СО2-фиксации через РБФ-путь; 2) набор гснТ?
кодирующих ферменты серинового цикла - mcl, ррс, mtkBA, Д и. *
glyA, gck. Однако активность РБФК/О не показана.
Идентифицированы также гены ферментов глиоксилатного цу^Я
метилмалонил-КоА мутазы (тстВА, теаВ}, пропионил-КоА карЗ
силазы (рссВА) и метилмалонил-КоА эпимеразы (eptri). Кластер
цинатдегидрогеназы Ml. petroleiphilum РМ1, кроме sdhBADC-wj^
включает гены цитратсинтазы (getA) и субъединицы цитохрома 6
латдегидрогеназы (mdh). Однако данный факультативный метилол»
лишен генов 2-оксоглутарат:ферредоксин оксидоредуктазы, АТ
тратлиазы (восстановительный ЦТК), ацетил-КоА синтазы/СО-.;
рогеназы (восстановительный ацетил-КоА-путь), малонил-КоД
дуктазы и пропионил-КоА синтазы (3-гидроксипропионатный ник-).
Наряду с вышеуказанными метаболическими модулями, ML рейМ
leiphilum РМ1 обладает кластером генов утилизации этано • чиин
(eutJEMN), находящимся между тандемными повторами генов <люг
нотрофии (alkB2-alkG 1 G2-alkS-MpeB600-598-alkT,
кластер, mstnABCDEFGHG, ssuAADCB, adh-1, adh-3), деградации о
луола (tbuTX), МТБЭ (alkB, 3-гидроксибутирил-КоА дегидроген-
двумя кластерами генов деградации фенола (dmpRKLMNOPQUk
EHFGP) [Kane et al., 2007].
В геноме ML petroleiphilum РМ1 идентифицированы гены Т*
транспортеров (tonB, exbB, tolQ) и переносчиков неорганич
ионов (NO.3-, SO42-, Mg':+, К+, РО4 )> линейных и разветвленных ai
нокислот, углеводов, ди- и олигопептидов, полиаминов и анти
ков. Так, гены устойчивости к арсенату (arsHRBC), необходимые
его экскреции, представлены в двух копиях на хромосоме - arsH
arsCB, arsR. Обнаружены также 3 хромосомных копии гена трап
тера хрома (c/ir), 15 генов резистентности к меди (copOA/PRSFGM
нимающие совокупно 14.4 т.п.н. За устойчивость к Cd, Zn, * <*ч
видимому, ответствен хемиосмотический антипортер CzcCBA KpJM®
того, в геноме выявлены гены металл-транспортирующих Pj-Al^
для экспорта меди, никеля и кобальта (copF, nikBCDE, cbiOQ^^
также гены потребления молибдена (modABC). Присутствуют гснЦ
белков транспорта и Fe-гомеостаза, в том числе гены сидерр ?*^
участвующих в деградации МТБЭ (fepABC) [Kane et aL, 2007].
Секвенирование генома другого близкого к семейству М>-^
philaceae представителя класса (i-Proteobacteria - Methylol
198
flagellatuis KT, не только выявило интересные особенности С
J ЫГЧ ГЛ nniJUUULT ГТ1Л r'Q'T'Ljriil Л/Г^’ГТЯ 1Л ТЯ ИГ'Т’Ожж
i-мета-
болизма, но и причины облигатной метилотрофии этого штамма. Ге-
нетическая информация заключена в одной хромосоме (2.97 м.п.н.,
г + Ц 55.7 мол.%), содержащей 2766 кодирующих регионов, 144 из
которых - идентичные дубли, являющиеся частью прямого идентич-
ного повтора размером 143 032 п.н. Последний состоит из группы
уникальных для Mb. flagellatus КТ генов, большинство которых пред-
ставляют профаги, указывая на такой механизм эволюции геномов,
как дупликация при интеграции фаговой ДНК, а также существование
фагов, инфицирующих представителей Methylophilaceae.
В пользу этого предположения свидетельствует и обнаружение ря-
да генов, родственных фаговым, многие из них, за исключением уни-
кальных, гомологичны родственным ft-Proteobacteria. В геноме иден-
тифицированы полный и частичный гены ТпЗ-транспозазы которые
окружены двумя группами, кодирующими гены резистентности к ар-
сенату, а также регион CRISPR. Последний состоит из 93 идентичных
последовательностей (32 п.н.), находящихся между неидентичными
последовательностями (33-39 п.н.), и представлен 6 генами, коди-
рующими CRISPR-ассоциированные белки. Их роль окончательно не
выяснена, но возможно их участие в перестройках ДНК, латеральном
переносе, репликации и регуляции. Показано, что структура CRISPR
у Mb. flagellatus КТ не идентична известным гомологам [Chistoser-
dova et al., 2007].
Из предсказанных кодирующих последовательностей генома толь-
ко 233 являются уникальными для Mb. flagellatus КТ, а 2520 характе-
ризуются высоким сходством с генами других бактерий, 10-е генами
архей, 3-е генами эукариот. На хромосоме идентифицированы 2 ри-
босомных оперона, кодирующих 16S-23S-5S и гены рибосомных бел-
ков, а также 46 генов т-РНК, соответствующих 38 т-РНК-акцепторам
Для опознавания 20 аминокислот. В геноме закодирован биосинтез
аминокислот, нуклеотидов, витаминов, кофакторов, предшественника
ерпеноидов (геранилгераниол), а также ABC-транспортеров амино-
кислот, ЭПС и других органических веществ, металлов, ионов нитра-
Ч аммония и сульфата, но отсутствуют гены ферментов синтеза вто-
ричных метаболитов (антибиотиков) и путей деградации ксенобиоти-
В потреблении Fe у Mb. flagellatus КТ участвует большое количе-
^Тво вероятных транспортеров, в том числе некоторые из имеющихся
Ологов TonB-зависимых сидерофорных рецепторных генов. Пред-
секреторные системы I, II и IV типа. Кластер генов, коди-
части транспортной системы сахаров фосфотрансферазного
С|<азаны
РУющих
------------ijjuiivilV 1 IlV/n V/F14/ 1 ViVIDl VCi/VClJJk/D V I раП VVp VJJUJU VI V
сходен с таковыми Nitrosomonas europaea и N. oceani, но функ-
199
*!(ЛИ-
Ho
ции этих генов неизвестны. Большой генный кластер Mflal940-[де-
кодирует функции жгутика [Chistoserdova et aL, 2007b].
Специфические компоненты ЭТЦ у Mb. flagellatus КТ предсгц^И
ны двумя основными типами терминальных оксидаз: о-тип (ал^?
гичный bo-типу у Е. coli) и bb-тип (сходный с М-типом у Е. со/АдЯ
ответственно, в геноме идентифицированы два кластера генов ‘и
синтеза цитохром с оксидазы (комплекс IV ЭТЦ). Гены НА,пЯ
кинонредуктазы (комплекс I ЭТЦ) локализованы в одном кллсщИ
[Chistoserdova et al., 2007b].
Анализ метилотрофной компоненты генома Mb. flagellatus КТ вм
казал, что ее функциональные модули метаболически и филоге
чески ближе к таковым М. extorquens AMI и Me. capsulatus Batt ц Л
жели более родственного Ml. petroleiphilum РМ1, что указывает Ж
полифилетическое происхождение метилотрофии у f-Proteobacteru^
Так, полногеномное секвенирование Mb. flagellatus КТ поклзяДа
наличие сходного с охарактеризованными у других метилотрр’ов
генного кластера, кодирующего МДГ и дополнительные T.ikj
mxaFJGIRSACKLD. В отличие от аналогичного кластера у М. смог-
quens AMI, отсутствуют гомологи двух дополнительных к»®.
тхаЕН неизвестной функции. Обнаружено, что некоторые гены м
тилотрофии в геноме Mb. flagellatus КТ содержатся в нескольким
(не)идентичных копиях. В частности, выявлены еще 4 дополнитель-
ных генных кластера, кодирующих гомологи MxaF, 3 из которых сав-
аны с генами, кодирующими цитохром с. Первый цитохром с нс тей
ждествен MxaG, обычно акцептирующему электроны от МДГ, a ng
следние два гена имеют лишь 35% сходства с ним. Только один №
указанных генных кластеров содержит гомолог tnxaJ, но в них !'Ж
mxal гомологов, кодирующих малую субъединицу МДГ. Необх >g|
мые для активности МДГ функции кодируют 2 дополнительных КМ
стера mxaRSACKL, не связанные с генами PQQ-зависимых дегидр ге-
, наз, а также кластер гомологов tnxaED. Гены биосинтеза PQQ, гжм
других метилотрофов, локализованы в отдельных кластерах р^’Л
CDE и pqqFG [Chistoserdova et al., 2007b]. -M
Организация /пам-кластера генов утилизации метиламина у
fla-gellatus КТ сходна с таковой Methylophilus methylotrophus W3Ag
NS [Gak et al., 1997]. Большая часть генов МАДГ расположен!Ж
хромосоме в одном кластере 9orf-mauFBEDAGLMNazu, однако «МН
ствуют гомологи регуляторных генов, найденных у М. extor-,f*^
AMI и Ра. denitrificans Pdl222 [Van Spanning et al., 1995; Chist Ж
dova et al., 2003, 2007b]. Еще одна последовательность (orfl), нах
щаяся перед яшн-кластером, кодирует полипептид неизвестной Уж
ции. Вне кластера локализованы также гены таи18,19. Инт<^И
200
2
0 в отличие от М. extorquens AMI и Ра. denitrificans Pdl222, у
Н°’ flageHatus КТ ген таиМ необходим для активности МАДГ.
Пля окисления и ассимиляции ФА Mb. flagellatus КТ обладает на-
оМ генов ТГМП- и РМФ-путей. При этом РМФ-модуль представ-
геноме двумя копиями гена ГФС (lips'), одна из которых являет-
цастью кластера генов биосинтеза гистидина, а другая вместе с ге-
сЯ ГфИ и трансальдолазы локализована в большом метилотрофном
! стр°вке”’ содержащем большинство генов ТГМП-пути. Формальде-
активирующий фермент (Fae) также кодируется двумя генами,
ин из которых расположен в большом метилотрофном кластере,
тогда как ДРУг°й не связан с известными генами метилотрофии, хотя
транслируемые последовательности идентичны на 83%.
В геноме идентифицированы также два гомолога fae с неизвест-
ными функциями - fae2 и fae3. Еще 4 дополнительных гена ТГМП-
модуля (afp, orf20, orfl9, orf22) образуют отдельный кластер. Выяв-
ленная физическая связь генов РМФ- и ТГМП-путей на хромосоме
уникальна для Methylophilaceae. При этом большее сходство генов
ТГМП-модуля Mb. flagellatus КТ с аналогичными генами метанотро-
фа Me. capsulatus Bath свидетельствует о том, что этот функциональ-
ный сегмент был приобретен представителями Methylobacillus (и дру-
гих Methylophilaceae) от Ml. petroleiphilum РМ1 (и других Burkholderi-
ales). Идентифицированные у Mb. flagellatus КТ гены окисления фор-
мата также оказались гомологичными генам ФДГ Me. capsulatus
Bath [Kalyuzhnaya et al., 2005; Chistoserdova et al., 2007b].
Ассимилирующий ФА по КДФГА-варианту РМФ-пути Mb. flagel-
latus КТ содержит гены пируваткарбоксилазы, пируваткиназы и ФЕП-
синтазы, 3 гена пентозофосфатизомеразы. Два последних кодируют
белки, идентичные на 41%, а также ген гомолога а-субъединицы ок-
салоацетатдекарбоксилазы. Однако в геноме не найдены гены Р- и
Т-субъединиц оксалоацетатдекарбоксилазы, фосфофруктокиназы,
ФБф-азы и СГБФазы. Пируват является конечным продуктом РМФ-
Цикла у Mb. flagellatus КТ. Фосфоглюкозоизомераза (pgi) имеет толь-
ко одну копию гена в геноме, не связанную с другими генами Сг
Метаболизма, тогда как gnrZ-кластер zwf-gndA-pgl, содержащий гены
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконолактоназы, пред-
с авлен в двух копиях, одна из которых является частью большого
Античного повтора. Ген pgl транскрибируется дивергентно генам
и gndA. В геноме также идентифицирована дополнительная копия
^еНа gnd (gndB), кодирующая белок, идентичный Gnd Me. capsulatus
a(h на 70% и GndA - на 28%. В отличие от НАД+-зависимой GndA,
Армент GndB
ответствен за НАД(Ф)+-зависимую активность.
201
Геномный анализ показал, что Mb. flagellatus КТ не обладав Л
ним набором генов, кодирующих ферменты ЦТК. Так, не обнар^И
ны гены дегидрогеназ а-кетоглутарата, малата и сукцината. Биоси*
тическая функция ЦТК, по-видимому, осуществляется ферментЗУ
кодируемыми кандидатными генами синтеза а-кетоглутарата и мал’
(малат : хинон-оксидоредуктаза). Однако пока трудно предсказав
как сукцинат или сукцинил-КоА становятся частью центрального у
таболизма [Chistoserdova et al., 2007b].
Одним из важных для биотехнологии свойств Mb. flagellatusЖ,
является биосинтез большого количества ЭПС. Эта функция закодц
рована в большом генном кластере, имеющем высокую синтез I
(консервативный порядок генов) с аналогичным 21-генным кластере
синтеза полисахарида “метанолана” родственным штаммом Methyfo
bacillus sp. 12S. Однако сходство полипептидных последовательно,
стей белков у данных штаммов очень низкое (<51% идентичности)
Кроме того, в биосинтез ЭПС Mb. flagellatus КТ, по-видимому, вовле-
чен дополнительный кластер генов, содержащий ряд дальних гомоло-
гов, вероятно, необходимых для биосинтеза других ЭПС. .
Интересной особенностью Mb. flagellatus КТ является геномное
предсказание сложных адаптивных механизмов, основанное на при-
сутствии большого числа генов/белков передачи сигналов. Геном это-
го метилотрофа кодирует как двухкомпонентные системы отве^а^
“бактериальный IQ” (гены 31 гистидинкиназы и 31 регулятору отве-
та), так и однокомпонентные регуляторные белки (LysR, TetR) [Chis-
toserdova et al., 2007b].
Наименьший обнаруженный до настоящего времени геном свобод-
ноживущей клетки выявлен у облигатно метилотрофного представи-
теля /З-Proteobacteria - Methylophilus sp. НТСС2181, выделенного с
помощью нового метода культивирования в морской воде из ассоциа*
ции ОМ43 микроорганизмов береговых океанических экосистем (рис.
6.1.3) [Giovannoni et al., 2008]. -ЗИ
Показано, что штамм НТСС2181 использует метанол, метилам#^
формальдегид и формиат в качестве источников углерода и энергии*
Полный геном этой метилобактерии составляет всего 1.30 wH
(Г + Ц 37.95 мол.%), т.е. около 44% генома Mb. flagellatus КТ, НО Ср*
держит полные пути биосинтеза 20 аминокислот, ксантородопСИ$>
ретиналя, а также все белки, необходимые для окислительного фос-
форилирования, и дополнительную систему генерации трансМД*
бранного электрохимического потенциала из света. Тем не менев У
данного штамма отсутствуют гены, кодирующие транспозазы, ФХЯ
цию подвижности, а также ферменты биосинтеза витамина Ви> ЯМ
лизации МТБЭ и ароматических углеводородов. Уникальными W
202
ivlophilus sp. HTCC2181 являются лишь 215 генов, тогда как 1007
№ гИчны соответствующим генам Mb. flagellatus КТ, а 955 — генам
e(roleiphilum РМ1 (рис. 6.1.3).
Рис. 6.1.3. Общие гены геномов метилотрофных p-Proteobacteria
Наименьший объем некодирующей ДНК (спейсеров) среди секве-
нированных микробных геномов (2.5%) свидетельствует о направ-
ленной эволюции генома данного метилотрофа в сторону высокой
специализации метаболических функций [Giovannoni et al., 2008].
Ранние исследования транскриптомов Е. coli, Mycobacterium leprae и
цианобактерий Prochlorococcus и Synechococcus выявили экспрессию
РНК с некодирующих регионов, в том числе “псевдогенов”, являю-
щихся функционально неактивными представителями генов, возник-
ших в результате транспозонной инсерции или инактивации одной
копии гена после дупликации [Vogel et al., 2003; D’Errico et al., 2004;
Axmann et al., 2005; Ochman et al., 2006; Akama et al., 2009]. Интерес-
но, что “псевдогены” не кодируют функционально активные белки
(“junk’’-гены), однако продукты некоторых из них способны функ-
ционировать как регуляторы экспрессии других генов [Hirotsune et al.,
2003].
При анализе метилотрофных модулей генома штамма НТСС2181
Не найдены /иди-кластер генов МАДГ, а также гены mxaF и mxal
б°лыиой и малой субъединиц МДГ. Последние два функционально
Умещены у данной метилобактерии хох-генами паралогов, найден-
нЫМн также у М. extorquens AMI, Ра. denitrificans Pdl222, Mb. flagel-
“tlis KT [Giovannoni et al., 2008]. Установлено, что xoxF ген Rhodo-
^ter sphaeroides, проявляющий высокое сходство c xoxF Ра. denitri-
^ns (аминокислотные последовательности идентичны на 80%), не-
°Дим для использования метанола в качестве единственного ис-
ника углерода при фотосинтезе и окисления метанола до формаль-
203
дегида [Wilson et al., 2008]. Дополнительные гены паралогов
синтеза холофермента МДГ у штамма НТСС2181, вместо ДЛицДр
оперона mxaFJGIRSACKL, представлены кластерами mxal (j/
mxaLKCASR. Кластер генов биосинтеза кофактора PQQ (pqqBC&fj£
аналогичен таковому Ml. petroleiphilum РМ1. Наличие в геноме Meth
lophilus sp. НТСС2181 кластера mxaED свидетельствует в пользу2*
зависимого развития аналога МДГ у данного метилотрофа [Giov^
noni et al., 2008]. ф
Полное отсутствие ТГМП-модуля окисления ФА компенсируй
наличием последовательностей, кодирующих ТГФ-путь Суперен®»
Methylophilus sp. НТСС2181 ассимилирует Ci-единицы исключит^?
но через единственный, кодируемый хромосомой, РМФ-путь. ж
Одним из доказательств облигатной метилотрофии штамм»
НТСС2181 является наличие блоков в центральном метаболизме на
уровне ЦТК и глюконеогенеза. Так, в геноме данного метилотрофа it
найдены гены субъединиц а-кетоглутаратдегидрогеназного комп лекса
(sucAJB). Отсутствуют гены двух обратимых ферментов пути Эм^де-
на-Мейергофа-Парнаса для глюконеогенеза - фруктозоби с;[ .с*ф>.
тальдолазы и фруктозобисфосфатазы. Анализ геномных данных пока-
зал, что штамм НТСС2181 скорее преобразует фруктозо-6-фосфатдо
ГАФ и пирувата, нежели до ДОАФ и ГАФ. w
Системы регуляции в геноме Methylophilus sp. НТСС2181 прсу-
ставлены генами rpoD, <г2, транскрипционного фактора теплд^В
шока, третьего <т-фактора, гомологичного гроЕ2 и $ро7/-генам, меж*
чая гистидинкиназу, а также генами TonB-зависимых рецепту ЯИ
двухкомпонентных систем осморегуляции и контроля потреблИВ
фосфатов, железа и азота. Из 6 генов субъединиц фосфотрансф^ азч
найдены только 3 кодирующих гена, что указывает на более корвет-
ную регуляторную, нежели транспортную, функцию этого белка [Gio-
vannoni et al., 2008].
Анализ shot-gun протеома и метагеномных данных, получснМ
для еще одного представителя семейства Methylophilaceae -
lotenera mobilis JLW8, выявил наличие белковых субъединиц
а также ферментов ТГМП-пути окисления формальдегида и
пути. Окисление формиата катализируют, по-видимому, НАД - и
либдоптеринзависимые ФДГ. Показано, что у данного оргзн^И
также присутствуют пептиды, составляющие глутамин син^И
зу/глутамат синтазу, что вместе с отсутствием глутаматдегидр'Г’^И
указывает на утилизацию аммония при росте на метиламШ^Н
ГС/ГОГАТ-цикле. При этом неполный ЦТК в дополнение к ач?П^И
тической функции в центральном метаболизме, по-видимому, !
ляет а-кетоглутарат в цикл ГС/ГОГАТ. Интересная особенность
204
hvlotenera mobilis JLW8, отличающая его от Mb. flagellatus KT, - на-
1ИЧие полного набора генов/ферментов метилцитратного цикла, роль
тОрого, впРочем> неясна. Интригующим является также наличие
б0льШ°го числа гомологов большой субъединицы МДГ и ассоцииро-
ванного цитохрома (XoxF и XoxG), тогда как гены биосинтеза PQQ в
геНоме Methylotenera mobilis JLW8 не обнаружены [Bosch et al., 2009].
п настоящее время секвенируются еще два генома представителей
рода Methylotenera, что сделает возможным полную метаболическую
реконструкцию у этих широко распространенных метилотрофов.
Исследования генетических основ метилотрофии у грамположи-
тельного термотолеранта Bacillus methanolicus РВ1 обнаружили плаз-
мидную локализацию генов окисления метанола и РМФ-пути
Сгассимиляции: НАД+-зависимой МДГ (mdh), фосфофруктокиназы
(рЛ)’ рибулозо-5-фосфат-З-эпимеразы (гре), транскетолазы (tkf), фрук-
тозобисфосфатазы (glpX) и фруктозобисфосфат альдолазы (fba). Плаз-
мида рВМ19 (19.2 т.п.н., Г + Ц 36.7 мол.%), несущая эти гены, содер-
жит 2 региона, кодирующих гены, транскрибируемые в противопо-
ложных направлениях, что указывает на ее образование путем слия-
ния двух отдельных плазмид. Показано, что указанные гены РМФ-
пути (glpX, fba, tkt, pfk и гре) не имеют хромосомных копий. У В.
methanolicus РВ1 выявлена хромосомная локализация котранскриби-
руемых генов ГФС и ФГИ (hps,phi) [Brautaset et al., 2004].
Хотя вопросы эволюции метилотрофии, как метаболической спо-
собности, далеки от решения, ясно, что, по крайней мере, у Beta-
proteobacteria метилотрофия возникала неоднократно. В этом смысле
ML petroleiphilum - не изолированный организм с “неканоническими”
метилотрофными модулями. Недавно охарактеризована группа штам-
мов, классифицированных как Methyloversatilis universalis, из семей-
ства Rhodocyclaceae. Подобно Ml. petroleiphilum, они не имеют клас-
сической МДГ и МАДГ, но реализуют сериновый цикл. Следователь-
Но> родство Methylophilales, Rhodocyclales и Burkholderiales предпола-
гает недавнюю эволюцию одного, а возможно, и обоих различных
Типов метилотрофии внутри Betaproteobacteria. Вполне очевидно, что
Сдельные метилотрофные метаболические “острова” или их фраг-
Менты могли передаваться посредством латерального переноса соот-
Ветствующих
генов на плазмидах. Показателен в этом отношении
Рейф пары генов hps и hpi, первоначально возникших у анаэробных
п ан°генов для компенсации нефункционального (или отсутствую-
г°) пентозофосфатного пути, а в дальнейшем приобретенного
Рыбными метилотрофами для фиксации и детоксикации ФА.
То .СНованнь,е на геномах предсказания способности к метило-
Фии. Ранее метилотрофия обсуждалась в рамках специфических
205
функциональных метаболических модулей, как определенных Исае
дованиями на мутантах модельных метилотрофов, так и выведен.,^
из генетических последовательностей метилотрофов [Chistoserck.vJj
al., 2003, 2005]. По-видимому, для “качественной” метилотрофии
обходим минимальный набор метаболических модулей, который слХ
лает возможным окисление/деметилирование первичного Ci-cy6cj3
та, окисление/детоксикацию продуктов первичного окисления (фд
или метил-ТГФ) и Ci-ассимиляцию. Таким образом, присутствие [^2
ного набора важных метилотрофных модулей в геноме может
использовано для предсказания способности организма к мети цгрГ|
фии (табл. 6.1.2).
Например, в геноме Granulibacter bethesdensis CGDNIH1, не.
описанного возбудителя хронического гранулематоза и отнесенного к
семейству Acetobacteraceae, обнаружен необходимый набор метнем
трофных модулей, позволяющих рост на метаноле: гены синтеза клас-
сической МДГ (тхаРГ) и кофактора PQQ, ферментов ТГМП-цутц
окисления ФА, серинового цикла и глиоксилатного шунта. Дейси^.
тельно, проведенные тесты показали способность этого штамма расти
на метаноле. Поскольку представители Acetobacteraceae хар ктсри-
зуются способностью к неполному окислению широкого спектра
леводов и спиртов и растут при высоких концентрациях этих соеди-
нений в среде, естественные местообитания этих бактерий час г •< ас-
социированы с цветами и плодами растений. Поэтому вполне вер ят-
но, что гены МДГ могли быть приобретены G. bethesdensis от М.
torquens или других метилобактерий, широко распространенный
филлосфере, наземных и водных эконишах. Этому могло способ во-
вать и наличие у G. bethesdensis облегчающих горизонтальный пере-
нос систем конъюгации trb и tra [Greenberg et al., 2006b; 2007].
Другим примером является недавно секвенированный геном
Burkholderia phymatum STM815, высокоэффективного азотфиксн»
рующего фитосимбионта, у которого выявлены гены гр и метил"** ИН-
дегидрогеназы, окисления метиламина в N-МГ-пути, ТГМП-путм-Л
серинового цикла [Moulin et al., 2001, Elliott et al., 2007; ChistoscbWj
et al., 2009]. Ж
Присутствие полного набора генов серинового цикла, а
этил малой ил-Ко А пути в геноме Ruegeria (ранее Silicibacter) ромбЯШ
DSS-3, морского организма, важного для деградации диметилсу--г,Фф
ниопропионата, подразумевает, использование пути ассимиляции*^
тильных групп, образующихся в реакциях деметилирования [Мог3®
al., 2004; Buergmann et al., 2007; Reisch et al., 2008]. Хотя в геноме
го метилотрофа не идентифицированы известные гены пер*
окисления С1-соединений, для других представителей семЭВИ
1
d
J
X
P-
o
s
Л
VO
о
£
5
«в
S
о
x
£
И
X
X
rt
X
Q
X-
S
X
о
X
X
о
Q
и
x
x
Q
Ф
Б
Ф
Ю
«
Ф
S
207
Rhodobacteraceae известна “качественная” метилотрофия [Schaefer |
al., 2002; 2005]. Два из значимых метилотрофных модулей (r,J|
ГФС/ФГИ и ТГМП-зависимое окисление формальдегида) иг
роль в детоксикации ФА у гетеротрофных бактерий [Yasueda et i
1999, Mitsui et al., 2003, Marx et al., 2004, Chain et al., 2006]. Следов
тельно, их присутствие скорее указывает на метазотрофию, в отличу
от других существующих метилотрофных модулей. *
В качестве модели для фундаментальных исследований и
нологии большой интерес представляют экстремофильные/толеранЗ
ные микроорганизмы. Недавно секвенированы геномы двух вцмОв
галотолерантных метилотрофных y-Proteobacteria рода Methyloph^m
thiooxidans DMS010, способного окислять диметилсульфид и Afe/ftv.
lophaga thalassica S1. Однако информация о геноме последнего шгам-
ма пока не доступна. j
Предварительная автоматизированная аннотация сравнитель?а
большого генома Methylophaga thiooxidans DMS010 (3.0 м.п.н.), спо-
собного расти на ДМС, ДМСО, метаноле и метиламине, выявила къ
личие генов МДГ (mxaF и гомологов xoxF), МАДГ (mauBEDA), 5ц0.
синтеза PQQ, N-мети л глутаматного и ТГМП-путей, хотя соотк.тЯ
вующих энзимологических данных пока нет. Обнаружен т.к«е
ectABC-ask кластер генов биосинтеза осмопротектора эктоина. Л
Итак, активные геномные и протеомные исследования радикгыьно
изменили взгляд на метилотрофию как высокоспециализированный
способ питания микроорганизмов. В частности, информация о поро-
ке расположения и первичной последовательности генов поз <ляет
проследить эволюционные связи различных метилотрофов между со-
бой и с другими группами микроорганизмов, а также дает пре с . _>
ление о происхождении и взаимосвязи метаболических путей. Кроме
того, shot-gun-секвенирование метагеномов микробных сообществ
отдельных экониш дает возможность исследовать генетические и ИМ
таболические свойства некультивируемых метилотрофных прок , ио1.
Эти исследования призваны также помочь в оценке адаптивного и
биотехнологического потенциала аэробных метилобактерий. Д
Глава 7
биотехнологический потенциал
АЭРОБНЫХ МЕТИЛОБАКТЕРИЙ
Данная глава отражает недавний прогресс в нашем понимании ге-
етики, биохимии и физиологии метилобактерий, что должно способ-
ствовать целенаправленной реализации их биотехнологического по-
тенциала. Кроме того, представлен обзор существующих технологий
Сопроцессов с использованием метилобактерий и дана экономиче-
ская оценка, причем особое внимание уделено метанолу как альтерна-
тивному источнику углерода. Из такого комплексного исследования
становится более понятным, какое развитие событий в этой области
можно ожидать в ближайшие годы.
В промышленных процессах одним из факторов, определяющих
стоимость конечного продукта, является цена источника углерода. В
связи с этим весьма заманчиво получать целевые продукты на основе
сравнительно дешевого непищевого сырья - метанола, который мо-
жет быть синтезирован из природного газа (метана) или получен из
нефти, угля и древесины.
Попутный газ, сжигаемый в виде факелов при нефтедобыче - иде-
альный источник дешевого метанола, который можно использовать в
биотехнологии (рис. 7.1.1). Только в РФ ежегодно сжигается до
50 млрд, м5 попутного нефтяного газа, поэтому проводятся мероприя-
тия по организации контроля за его рациональным использованием.
В настоящее время мировое производство метанола достигло
50 млн. т/г., причем большая часть используется на химический син-
тез, например, формальдегида и уксусной кислоты (процесс Монсан-
то). Метанол также используется в качестве частичного заменителя
бензина. Производство метанола не зависит от сезонных изменений и
погодных условий, что выгодно отличает его от сырья сельскохозяй-
ственного происхождения.
II’
<
г
Природный газ (СНД
Р I*-"' н'°
Г, Ci
Синтез-газ
Химический
НгО, соли
Метане rl ;
Метилотрофы
Топливо
^Ис‘ 7.1.1. Производство и сферы применения метанола
Кормовой белок
Химреактивы
Ферменты
Метаболиты и кофакторы
Биотопливо
209
сссе
4 на
Метанол имеет другие очевидные преимущества как источник
лерода и энергии поскольку превосходно растворим в воде, об ।
высокой химической чистотой, доступен по сравнительно низкой iu
не, требует меньше кислорода и образует меньше тепла в процлс
культивирования, чем н-парафины и метан, что снижает затраты
перемешивание и охлаждение ферментеров. В отличие от взэдЛ
опасного метана, метанол не требует баростойких емкостей для хра
нения и транспортировки.
Вместе с тем метанол, как субстрат, не лишен некоторых нс-д»
татков. Наиболее существенным из них является генотоксичнее
метанола, в особенности продукта его окисления - формальдеги , ц,
только для обслуживающего персонала, но и для микроорганизме/
что проявляется при высоких концентрациях [Choi et al., i
Bourque et al., 1992; Kim et al., 2003]. Это вынуждает испольлЛИ
низкие концентрации метанола при культивировании метилотр^ЗИ
для получения биомассы и метаболитов. Будучи дефицитным по энер-
гии, метанол обусловливает несколько большие затраты метаболнч®.
ской энергии на биосинтез, нежели полиуглеродные субстраты. Уг.'е-
родный баланс, рассчитанный для метилобактерий с РМФ-путс'*, И
казывает, что в процессе окисляется 38% метанола и только 62% ис-
пользуется для синтеза биомассы. Для окисления 1 г метанола
ется 0.85 г О2, при этом образуется 0.52 г СО2. Оптимальная сю [хЖ
роста метилобактерий для накопления биомассы и продуктов vxw
гается поддержанием низкой стабильной концентрации метанола.
Повышение синтеза лизина у Methylophilus methylotrophus
нуто гетерологичной экспрессией соответствующих фермент-»В^И
Е. coli, резистентных к ретроингибированию, или аминокислот‘«г
экспортера из Corynebacterium glutamicum [Tsujimoto et al., 2цЖ
Gunji, Yasueda, 2006]. Кроме того, при периодическом культиви;хлР
нии Mph. methylotrophus установлено, что поддержание низкой исн-
ной силы среды увеличивает выход L-лизина [Ishikawa et al., 20*8]. °*
Использование термотолерантных метилобацилл В. methanriliQBt
оптимально растущих при 50°С, для целей биосинтеза снизило
ды на охлаждение ферментационной установки [Brautaset et al., 2 ^’tj*
Наряду с этим, толерантность к высоким концентрациям метанола и
скорость ассимиляции метанола у В. methanolicus удалось повыс*®
увеличением копийности генов hps и phi [Jakobsen et aL, 2006]. 1
Активные работы по секвенированию и аннотированию п
геномов метилобактерий в совокупности со знанием генетически
контроля С1-метаболизма позволят рационализировать генно-и»®в
нерные подходы к усилению или редуцированию метаболически*
модулей, т.е. конструировать активные штаммы-продуценты це)*^И
210
]
Пр
по
0 Суитов. Очевидный интерес представляют также разработка и ис-
пьзование системы вектор-хозяин метилобактерий для клонирова-
"~я генов эукариот. Следовательно, открываются новЫе перспективы
Н ирок°го использования метилобактерий в биотехнологии.
Биосинтез микробного белка (Single Cell Protein)
Проблема дефицита кормового белка остается нерешенной во мно-
|йх странах, являясь одной из причин низкой эффективности работы
птицефабрик и животноводческих комплексов. В принципе, она мо-
еТ быть решена за счет производства белка одноклеточных (SCP).
Специфика производства SCP выдвигает ряд требований к продуцен-
ту: высокие скорости роста и выходы по отношению к субстрату, спо-
собность расти при большой плотности популяции для обеспечения
экономической эффективности процесса, высокое сродство проду-
цента к метанолу, повышенный температурный оптимум для сниже-
ния затрат на охлаждение ферментера, стабильность процесса при
длительном непрерывном культивировании, устойчивость к зараже-
нию посторонней микрофлорой, отсутствие потребности в дополни-
тельных факторах роста, отсутствие патогенности и токсичности, а
также питательная ценность источника белка.
В качестве белковой добавки в корма можно использовать биомас-
су метилобактерий, которая по составу и количеству незаменимых
аминокислот сопоставима с рыбной и соевой мукой и даже имеет оп-
ределенные преимущества относительно таких продуктов раститель-
ного происхождения, как хлеб из пшеничной муки. Среди метилобак-
терий особенно выделяются продуценты с РМФ-путем С]-метаболиз-
ма. имеющие наиболее высокое содержание белка и лизина. При этом
уровень нуклеиновых кислот у изученных метилобактерий варьирует
°т И.5 до 15.5% [Доронина, Троценко, 1986].
По современным представлениям, жирные кислоты с нечетным
числом углеродных атомов, не обладая токсичностью, тем не менее
изменяют благоприятный химический состав продуктов или оказы-
вают отрицательное влияние на процессы трансформации обычных
пищевых веществ. По этой причине присутствие таких жирных ки-
слот в биомассе одноклеточных нежелательно.
Наиболее высокое содержание жирных кислот с нечетным числом
УГлеР°Дных атомов обнаружено в клетках метилобактерий с РБФ-пу-
Тем’ У метилобактерий с сериновым путем доминируют Ci8-i кислоты,
уставляющие 60-80% от общего содержания жирных кислот. Напро-
н В’ у бактерий с РМФ-путем преобладают Ci6;o и С1б;1. Следователь-
> актерии с сериновым и РМФ-путями имеют низкое содержание
РНых кислот с нечетным числом С-атомов. При этом отмечен до-
пнщевых веществ. По этой причине присутствие таких жирных ки-
Наиболее высокое содержание жирных кислот с нечетным числом
тем. у
211
вольно высокий уровень жирных кислот, характерных для о. ц
пищевых продуктов.
Перевариваемость клеток метилобактерий с РМФ- или сери (
путями составляла 85-98%. Напротив, у метилобактерий с РБф-^Д
она не превышала 40%, что может быть обусловлено большей и вм
ностью их клеточной стенки, препятствующей проникновению мК
теолитических ферментов [Доронина, Троценко, 1986].
Итак, метилобактерий с РМФ-путем отличаются от метилоСац»
рий с РБФ- и сериновым путями высокими показателями уделйК
скорости роста и экономического коэффициента, благоприятным эО
ментным составом клеток, содержанием белка и лизина, жирц<<^
лотным составом, лучшей перевариваемостью биомассы проте
ческими ферментами in vitro и, вследствие этого, пред почтите** »^
для крупномасштабного культивирования и получения корм^пА
белка. I*
Промышленное производство SCP на основе метанола было кф
вые реализовано фирмой ICI (Великобритания) в 80-х годах проплате,
века. Продуцентом служил облигатный метилотроф Methy'ophUm
methylotrophus AS1. Непрерывный, полностью автоматизированный
процесс ферментации проводили под давлением в асептическом гио-
реакторе с рабочим объемом 1500 м3. Производительность этоп ги-
ганта достигала 50000-70000 т белка одноклеточных (“Прутин”^
год. Проблема массообмена и перемешивания в биореактор^ ыл?
успешно решена с помощью системы из 3000 форсунок-разбрЫзгв-
вателей, а аэрация оптимизирована созданием рСЬ 3 бар в версией
части ферментера [MacLennan et al., 1973; Westlake, 1986; WindaA
1980; Senior, Windass, 1980]. По тем временам это была верши н *»
инженерной мысли, своеобразный биотехнологический “Эве дУ
стоимостью около 100 млн. USD.
Немецкая фирма Hoechst/Uhde также разработала промышленный
процесс получения SCP на метаноле при культивировании
philus clara. Использование двух биореакторов объемом 20 м3
матическим поддержанием аэрации, pH, температуры, частоты
бавления и концентрацией метанола 0.005% позволяли получат*
1000 т/г. белкового продукта (“Пробион”). Процесс культивир-
проводили при давлении 4 бар, до 80% отработанной среды ре**.Н|
лировало (возвращалось обратно) после фильтрации. j|
Метилобактерии-продуценты, использованные разными фи0®
по своим биотехнологическим показателям очень близки: cn-w
расти при нейтральном pH и температуре около 40°С, характер*
ся высокими значениями сродства к метанолу, скорости роста’Ч
9
3
, q'1), выхода биомассы (>50% по углеродному субстрату) и содер-
нИЯ сырого протеина (-80%).
* расчеты эффективности конверсии углерода в различные продук-
, у микроорганизмов, растущих на метаноле или глюкозе, свиде-
льствуют о том, что биопроцессы на основе метанола могут быть
оНомически конкурентоспособными. Большая потребность метило-
бактернй в кислороде считается недостатком. Так, в случае получения
слутамата на основе метанола требуется в 2-3 раза больше кислорода,
м для бактерий, растущих на глюкозе. Это приводит к повышенно-
му выделению тепла и увеличению расходов на охлаждение систем
культивирования. Тем не менее сопоставление стехиометрических
превращений метанола в РМФ- и сериновом циклах показывает рас-
четный выход 0.76 и 0.92 г/г, соответственно, в то время как теоре-
тический выход глутамата у бактерий, растущих на глюкозе, - 0.82 г/г
[Leak, 1999; Brautaset et al., 2007]. Сравнение синтеза лизина из мета-
нола у Bacillus methanolicus и из глюкозы у Corynebacterium glu-
tamicum показывает теоретический выход 0.71 и 0.82 г/г, соответст-
венно.
Эти примеры убедительно свидетельствуют о принципиальной
возможности крупнотоннажных процессов на основе метанола. Одна-
ко из-за низких цен на альтернативные источники белка, например,
сою, производство SCP из метана и метанола оказалось экономически
неконкурентоспособным и вскоре было прекращено.
Биосинтез аминокислот
Природные штаммы микроорганизмов, как правило, не способны к
сверхсинтезу клеточных метаболитов. Продуценты на их основе мо-
гут быть получены только путем определенных генетических измене-
ний в регуляторных механизмах.
Серин. L-серин получают из глицина с помощью глицин-резис-
тентных гетеротрофных бактерий (Corynebacterium, Nocardia, Sarci-
па) при выращивании на сахарах. Эти продуценты L-серина имеют
высокие активности серинтрансоксиметилазы (СТОМ), катализирую-
щей конденсацию Ci-единицы и глицина с образованием L-серина.
Метилобактерий с сериновым путем Ci-метаболизма привлекают
внимание как эффективные продуценты L-серина, поскольку их
ЮМ индуцируется при росте на метаноле. Ранее сообщалось о на-
К0Плении L-серина факультативным метилотрофом с сериновым пу-
Тем Pseudomonas sp. ЗаЬ при росте на метаноле. Поскольку L-серин не
^тезируется из сукцината или пирувата, как источников углерода и
ергии, синтез этой аминокислоты рассматривали как непосредст-
Но связанный с ассимиляцией метанола [Keune et al., 1976].
213
w
Чип
Максимальный выход L-серина (4.7 г/л) был получен из 2 .
глицина и 8 г/л метанола, когда pH культуральной среды повцЦмд|
до 8.5. Влияние pH на накопление L-серина объяснили сниж^щД
деградации L-серина и глицина культурой Pseudomonas sp. Заь ’
щелочных значениях pH. Родительский штамм другого метило-.
Pseudomonas sp. MS31 синтезировал 2.5 г/л L-серина при добавлен^
глицина и метанола к культуре, выросшей на метаноле. Однак эЯ
штамм имел высокую активность разложения L-серина, и для Игвы-
шения продуктивности необходимо было ингибировать деградацщ,
аминокислоты. Это удалось достигнуть добавлением в культуральную
среду хелатных агентов, Со2+ и Ni. Получен температурочу -стай-
те льны й мутант tsl62, не способный расти на метаноле при темпу*?
туре выше 37°С и дефектный по деградации L-серина. Мутант си!те.
зировал 6.8 г/л L-серина из глицина (12 г/л) и метанола. у
Активность СТОМ регулируется по принципу обратной с ^зм
(ретроингибирование) и репрессией (генетическая регуляция). У не-
тилобактерий с сериновым путем (М. extorquens AMI, М. organ trhi-
lum) обнаружены два изофермента СТОМ, один из которых конститу-
тивный, а другой - индуцибельный, его активность повышалась при
росте культуры на Сi-субстратах. Однако активность СТОМ у М. ,г-
ganophilum ингибировалась глицином. Следовательно, получение му-
тантов, резистентных к L-серину и глицину, может повысить пр дук-
цию L-серина. Действительно, резистентный к о-метил-DL-cepH®
мутант S395, полученный из термочувствительного мутанта tsl62,
накапливал 12 г/л L-серина из 15 г/л глицина и метанола. МолярнМ
уровень конверсии добавленного глицина в серин достигал 57^, что
значительно выше, чем у гетеротрофных продуцентов. Я
Скрининг мутантов с высокой активностью МДГ и СТОМ по:®**
лил отобрать штамм Hyphomicrobium methylovorum, покоящиеся ;... ст-
ки которого в иммобилизованном состоянии синтезировали до 55 г/л
L-серина [Izumi et al., 1993]. «И
Расчеты показали, что максимальное превращение глицина в L-cfr
рин гетеротрофами может достигать 50%, т.к. Сгединица, необх
мая для синтеза I -серина, образуется путем расщепления глиЦИЯ
Следовательно, для образования одной молекулы L-серина гетеро-
трофам требуются две молекулы глицина. Напротив, у метила’бзьЯ
рий можно предполагать полное (100%-ное) превращение глициния
серин, поскольку Ci-единица образуется из метанола. Таким обрззОЯ
дальнейшая работа по получению метилотрофных продуцснТ1Д1
L-серина представляется весьма перспективной.
Метионин обеспечивает серой и метильными группами различна
метаболические процессы. Рацемическую форму DL-метионина
214
зИруют в промышленности из акролеина и метилмеркаптана. Мик-
^рганизмы синтезируют эту аминокислоту в сложных и разветв-
Р •" метаболических путях. Необходимыми интермедиатами путей
иНтеза L-метионина являются L-гомосерин, сульфид, S-метил-ТГФ
и,
^цЦЫх
С-
' возможно, серин. Конечным этапом биосинтеза L-метионина явля-
ется трансметилирование L-гомоцистеина.
Этионин-резистентный
Мутант FM518, реализующий ицл" сериновый путь, накапливал в сре-
де с метанолом 0.8 г/л L-метионина. Очевидно, что метилобактерии с
сериновым путем перспективны для получения L-метионина.
Другие аминокислоты. Метилобактерии с РМФ-путем образуют из
метанола сахарофосфаты, которые являются интермедиатами биосин-
теза ароматических аминокислот - L-фенилаланина, L-тирозина и
L-триптофана. В связи с этим они рассматриваются как перспектив-
ные продуценты этих аминокислот.
Метилобактерии синтезируют ароматические аминокислоты по
разветвленному пути, который инициируется реакцией конденсации
фосфоенол пиру вата с эритрозо-4Ф, катализируемой З-дезокси-D-apa-
биногептулозонат-7Ф (ДАГФ) синтазой. Первые семь этапов завер-
шаются синтезом хоризмата, который является общим предшествен-
ником триптофана, фенилаланина и тирозина. Некоторые метилобак-
терии с РМФ-путем имеют высокую активность ДАГФ-синтазы, уро-
вень которой зависит от концентрации метанола в среде культивиро-
вания, что подтверждает гипотезу о связи и согласованности процес-
сов ассимиляции Cj-соединений и метаболизма ароматических со-
единений [Максимова, Доброжинецкая, 1990]. Роль связующих эле-
ментов между Ci-метаболизмом и синтезом ароматических соедине-
ний выполняют эритрозо-4Ф и ФЕП.
Изучена регуляция синтеза ДАГФ-синтазы с использованием му-
тантов, имеющих блоки того или иного участка шикиматного пути
(Аго -фенотипа) у ряда метилобактерий. ДАГФ-синтаза представлена
тремя (Methylobacillus mucogenes М75, Mb. flagellatus KT и Mp. capsu-
lQta ИМ) или двумя изоформами (Methylobacterium methylica 2 или
?s- putida M). ДАГФ-синтаза регулируется на транскрипционном
Уровне: у Mb. flagellatus КТ - триптофаном и тирозином, у Мр. capsu-
lata ИМ - триптофаном, а у Ps. putida М - фенилаланином и тирози-
ном, При этом число аго-генов не соответствует количеству обнару-
женных апорепрессоров: у Mb. flagellatus КТ из трех яго-генов ре-
пРессии подвержены агоН и aroF, у Мр. capsulata ИМ - только агоН,
У Ps. putida М - репрессируется aroF. Синтез триптофана регулиру-
®Тся посредством двойного контроля - репрессии trpE, trpD и trpC
°в и ретроингибированием ключевого фермента антранилатсинта-
b| L триптофаном [Максимова, 2005].
У Ps. putida M обнаружена индукция триптофансинтазы (ц- 0
генов trpAB) индол-3-глицерофосфатом. Получены регуляторное
танты, способные к сверхпродукции триптофана. Культура Ps. п
М35 рекомендована в качестве продуцента L-триптофана из мет.-»
(630 мг/л). Ps. putida М15 - продуцент триптофансинтазы (200 н
мин х мг белка), пригоден для получения данного фермента в
ших масштабах и синтеза L-триптофана из индола и серина
Mb. flagellatus КТ в условиях дерепрессии отмечена активное^
ДАГФ-синтазы, в 20 раз превышающая таковую других бактерий ц_
кого типа. По этому показателю Mb. flagellatus КТ отнесен к покццЗ
альным объектам биотехнологии для создания продуцентов аром^З
ческих аминокислот.
1
Метилобактерий пригодны для получения не только первичцщ
но и вторичных метаболитов ароматической природы - среди них
продуценты 2,3-диоксибензоата и флуоресцирующего пигмента т*у|
вердина Pm. Облигатный метилотроф Mb. mucogenes М75 являстД
природным продуцентом 2,3-диоксибензоата (180 мг/л). Показано
что это соединение выполняет функцию сидерофора и его синтез к. Д
тролируется Ре2+-ионами и рядом производных хоризмата (п-амино-
бензоатом, п-оксибензоатом, антранилатом) [Максимова, 2005].
Пути биосинтеза ароматических кислот детально исследов чш Л
метилотрофного актиномицета Amycolatopsis methanolica [De Во~г et
al., 1988; 1989; 1990; Abon-Zeid et al., 1995; Euverink et al., I
1995а,Ь,с]. Сконструированы мутантные штаммы A. methanolic* co
сверхпродукцией L-фенилаланина [De Boer et al., 1990с]. Л
Ps. putida M синтезирует флуоресцирующий пигмент пиовер/ий
Pm. В его состав, помимо ароматического (диоксихинолинового)
ра, входит пептид, включающий пять аминокислот (треонин, серин»
лизин, аспарагиновая кислота и Na-оксиорнитин) в молярном сорт-
ношении 3 : 2 : 1 : 1 : 1. Пигмент имеет высокое сродство к Fe
также к ионам тяжелых металлов: Zn2+, Ni2+, Со2+, Sn2+, Cu2+, Cd2\
Wo6+ и Mo6+. Хелатирующая активность пиовердина Pm обеспечиьчет^
бактериям Ps. putida М антимикробную активность в отношении инИ
рокого спектра про- и эукариот. Показано, что пиовердин Pm облаДИ
ет высокой антиоксидантной активностью. Антимикробная актвИ
ность пиовердина Pm и способность Ps. putida М стимулировать
ряда сельскохозяйственных культур послужили основой для созд°Н|Я
полифункционального биопрепарата “Бактофил” для защиты о^чЯ
ных культур от грибных и бактериальных заболеваний, а также ^4-
нематод [Максимова, 2005]. г»
Разработан новый метод конструирования мутантов облигатноиЯ
метилотрофа Mph. methylotrophus AS1, ауксотрофных по аромагиЧв
216
аминокислотам. Процедуру начинали с интеграции в геном
/ methylotrophus AS1 гена агоР из Е. coli, кодирующего общий для
матИческих аминокислот транспортер. Полученный рекомбинант
аР°Мпьзовали для мутагенеза, который проводили рекомбинацией
йсП°„етствующих генов в хромосому. Для этого FLP-маркер, фланки-
С°С ции участок линейной ДНК в 1000 п.н. с генами trpE, tyrA,pheA и
methylotrophus AS1, клонировали в Е. coli, секвенировали,
еляли in vitro, используя Ктя-маркер и вносили электропорацией
° Г(?р-несущий реципиентный штамм [Yomantas et al., 2010].
8 Предпринимались попытки повысить выход биомассы и целевых
одуктов у Mph. methylotrophus генно-инженерными методами:
П _ заменой PQQ-МДГ на более эффективную НАД+-АДГ,
-заменой АТФ-ГС/ГОГАТ на одностадийную глутаматдегидрогена-
зу для ассимиляции NH4+,
а также экспрессией эукариотных последовательностей а-1 интерферона
человека, овальбумина цыпленка и дегидрофолатредуктазы [De Маеуег
et al., 1982; Hennam et al., 1982; De Vries, 1986]. Однако они не дали же-
лаемого результата из-за нестабильности рекомбинантов.
Экзополисахариды (ЭПС). Метилобактерии-продуценты ЭПС
реализуют, в основном, РМФ- и РБФ-пути Срметаболизма [Гринберг
и соавт., 1992]. Биоконверсия Ci-соединений в полисахариды лими-
тирована кислородом. Так, выходы полисахарида из метанола и глю-
козы идентичны при пересчете на углерод, а расход кислорода на об-
разование ЭПС из метанола почти в 10 раз больше. Некоторые фа-
культативные метилотрофы, использующие различные источники
углерода, способны синтезировать ЭПС только на средах с метанолом
[Davis, Wallen, 1976; Hou et al., 1978]. Активными продуцентами ЭПС
из метанола являются облигатные метилотрофы Mph. methylotrophus,
Mb. viscosus и факультативные - Ps. polysaccharogenes и Ps. viscogena,
выход полисахарида у которых достигал 40-44% субстрата [Takayama
et al., 1978; Misaki et al., 1979; Rees et al., 1982; Southgate, Goodwin,
1989; Доронина, Троценко, 1991].
Облигатный метилотроф Mb. methylophilus ВСБ-792 синтезировал
ЭПС, являющийся линейным полимером с а,0-1—>3-связями между
Ходящими в его состав остатками D-глюкозы, D-маннозы, D-галак-
т°зы, L-рамнозы и D-глюкуроновой кислоты [Диканская и соавт.,
^7]. ps. viscogena TS1004 на среде с 1.5% метанола синтезировал
кислый ЭПС с выходом 30% по субстрату, состоящий из остатков
-актозы, маннозы, глюкуроновой кислоты, глюкозы и аллозы в со-
01 Ношении 5.65 : 1.33 : 1.12 : 1.08 : 1.00 [Misaki et aL, 1979]. Молеку-
^яРная масса ЭПС штамма TS1004 составляла 1 х 104-1 х 107. Раствор
в присутствии Са"+ при pH 10 образует гель. В продуктах гидро-
217
и
। (X*.
лиза этого полисахарида впервые обнаружена D-аллоза. Показан, t
Xanthobacter (ранее Blastobacter) viscosus 7d синтезировал 0r>
ЭПС, в состав которого входят рамноза, галактоза, глюкоза, ксидп
уроновая кислота [Логинова, Троценко, 1980]. J
У метилобактерий с РБФ-путем дополнительным субстратом
гулирующим фактором, влияющим на характер превращения уг
да метанола, является углекислота. Частичная замена метанола гд<Д1Г
бонатом существенно снижала синтез ЭПС [Троценко и соавт., 1|^Н
Hyphomicrobium sp. JTS-811 синтезировал ЭПС “гифомикран” J
стоящий из D-глюкозы, D-маннозы, 2-о-метил-О-маннозы (моном
тиловый сахар) и остатков пировиноградной кислоты в соотношу'
2 : 1 : 1 : 1. Высокая вязкость раствора “гифомикрана" (1160 мП^И
объясняется тем, что двугранные углы валентных связей остатку
глюкозы стремятся к 180°С и полисахарид характеризуется удлинен,
ними размерами спирали. Благодаря входящей в состав “гифоминпц.
на” пировиноградной кислоте, ЭПС приобретал дополнительную - ш
сткость за счет электростатического отталкивания равномерно распо-
ложенных одноименных зарядов [Kanamaru et al., 1982].
Для оценки вновь полученных полисахаридов определяют дина-
мическую вязкость их растворов. За эталон принимают вязкостг ас-
твора ксантана, измеренную в тех же условиях - вязкость 1%-ног
раствора при 20°С и 60 об ./мин - 1000 мПа х с. Вязкость 1%-нлх рас-
творов ЭПС метилобактерий достаточно высока - 400-600 мП х си
сравнима с таковой ксантана. Ряд ЭПС образует более вязкие раство-
ры. Так, ЭПС Ps. polysaccharogenes [Takayama et al., 1978] име^л уз-
кость 2100 мПа х с, а гифомикран — 1160 мПа х с.
Высокая вязкость растворов, способность к гелеобразов кик,
псевдопластичность, тиксотропность ЭПС метилобактерий поз 'Ыя*
обсуждать возможность их использования в пищевой промышленно
сти, медицине, сельском хозяйстве, для производства картонт и
вышения нефтедобычи. Однако остается актуальным выделений н
селекция новых штаммов-продуцентов ЭПС на основе метанола, с
Поли-/?-гидроксибутират/валерат (ПГБ/В). Производство
меров и пластмасс развивается высокими темпами, что обуслб -ЛР
стремительным ростом их потребления. Однако упаковка из син1<И
ческих полимеров (полиэтилен, поливинилхлорид, полипр
составляющая 40% бытового мусора, практически не разлаг?*-"1^И
почве, так как не найдены микроорганизмы и ферменты, способн'М^
деградировать. При сжигании синтетических полимеров образуй?^
крайне токсичные диоксины. Соответственно, утилизация син'К'ТН’Ч
ских пластмассовых изделий становится глобальной экологич<-с,с®
проблемой. Кроме того, в посуде, упаковочных материалах,
218
vuiKax и других изделиях из синтетических пластиков обнаружены
<экотоксичные соединения: бисфенол А, вызывющий рак груди, и
пЫ фталевой кислоты, наносящие вред развитию новорожденных
* и поражающие головной мозг. Кроме того, на производство
£ тетических пластиков расходуется более 8% добываемой нефти,
с^асЫ которой ограничены, а цены на нее постоянно растут. В связи
этим все большее внимание уделяется исследованиям по получению
° использованию различных биоразлагаемых пластиков, в том числе
прБ и ПГБ/В [Волова и соавт., 2006].
Многие прокариоты синтезируют и запасают ПГБ при несбаланси-
пованных условиях роста (дефицит азота, фосфора, кислорода или
магния) в виде цитоплазматических гранул. ПГБ обладает рядом по-
лезных свойств - биоразлагаемостью, биосовместимостью и термо-
пластичностью. Введение у?-гидроксивалерата в ПГБ существенно
улучшает физико-химические и реологические свойства полимера.
Образующийся сополимер (ПГБ/В) прочнее и эластичнее, чем ПГБ,
поэтому перспективен как биоразлагаемый заменитель персистент-
ных химических полимеров. Однако до сих пор себестоимость про-
цесса получения ПГБ/В препятствует промышленному производству
и широкому применению этого биополимера. Одна из причин - высо-
кая цена субстратов, используемых для культивирования микроорга-
низмов. Метанол является подходящим потенциальным субстратом
для производства сополимера, так как имеет низкую цену, высокую
чистоту, небольшую плотность и неограниченную растворимость в
воде.
Проведенный скрининг показал, что сериновые метилобактерий
накапливают наибольшее количество биополимера, в сравнении с
реализующими РМФ- или РБФ-пути. Отобраны метилотрофные про-
дуценты, накапливающие ПГБ/В при росте на метаноле в присутст-
вии пропанола, пентанола, пропионата и валерата, причем добавление
^-субстратов приводит к более высокому содержанию /?-гидроксива-
лгРата в составе сополимера, нежели внесение Сз-соединений [Гово-
рухина, Троценко, 1991; Доронина и соавт., 1992; Короткова и соавт.,
1997а,б]. Paracoccus methylutens синтезирует ПГБ/В из метанола так-
*6 в присутствии глицерина и гептана.
Ба основании данных энзимологического анализа и изотопных
ЭКспери.ментов предложена регуляторная модель биосинтеза ПГБ/В у
р €xtorquens — типичного представителя сериновых метилобактерий.
^гласно этой модели, метанол окисляется через ФА и формиат до
2 соответствующими дегидрогеназами. Следует, однако, отметить
Зкие активности формальдегид- и формиатдегидрогеназ, что ставит
219
под сомнение исключительную роль данных ферментов в гене«.
восстановительных эквивалентов [Короткова и соавт., 1999].
Формальдегид далее включается в сериновый цикл, в резу^Д.»
образуется ацетил-КоА, который может либо окисляться в ЦТК ^7*
идти на биосинтез ПГБ. В биосинтезе ПГБ участвуют Р-кетотп’З:
НАДФН2-зависимая ацетоацетил-КоА-редуктаза и ПГБ-синт?з>Л®
этому для поддержания в клетках определенной скорости биосим*»?
биополимера необходим соответствующий уровень НАДфЦ2
Ацетоацетил-КоА
редуктаза
phaB
2**^чч* З-Гидрокси-З-бутирил-КоА
Поли-3-гидроксибу^цм^
синтаза
phaC
р-кетотиолаза
phaA
2 Ацетил-КоА —Ацетоацетил-КоА
КоА НАДФН2 НАДФ* 2j*
Рис. 7.1.2. Гены и ферменты синтеза ПГБ у метилобактерий
Анализ с помощью математической модели метаболизма метай,
бактерий углеродных потоков в СОг, ПГБ и биомассу, позволи срав-
нить скорости образования восстановительных эквивалентов в ЦТК и
в пути прямого окисления метанола со скоростью биосинтеза ПГТ
Установлено, что при росте метилобактерий на метаноле ЦТК (из' -
цитратдегидрогеназа) является дополнительным поставщиком
НАДФН2 для ацетоацетил-КоА-редуктазы. Ингибирующее в.шьйи.
фторацетата на внутриклеточный пул НАДФН2 и накопление ПГБ у
М. extorquens подтвердило данный вывод. Следовательно, осно ным
источником НАДФН2 для синтеза биополимера должен быть участок
прямого окисления метанола. Результаты наших экспериме^тгй с
аминоптерином и сульфаниламидом (ингибиторами биосинтез, тет-
рагидрофолатов и метаноптеринов) свидетельствовали об учзфЦ
ТГМП- и/или ТГФ-путей переноса Ci-фрагментов в образовании юс-
становительных эквивалентов при метилотрофном росте М. ^ог-
quens. Более того, у Л/. extorquens и Methylopila helvetica были нДм
ны высокие уровни НАД(Ф)+-зависимой метилен-ТГМП-дегш|дЯ
назы - ключевого фермента ТГМП-пути. Это дает основание п fli*
гать, что у сериновых метилобактерий ТГМП-путь участвует в .-Kljfr
лении формальдегида, являясь основным источником восстШ^И
тельных эквивалентов, а ТГФ-путь необходим для ассимиляции фм
миата [Короткова и соавт., 1999].
Судя по данным анализа углеродных потоков, при метилотрофов
росте бактерий ЦТК функционирует менее активно, чем при вырЗИ
вании на ацетате и бутирате. Возможно, это связано с ингибировав
ем ферментов ЦТК высоким уровнем восстановительных эквивз.’^И
220
тОв, поставляемых ТГМП-путем. Предложенная модель координиро-
анного контроля ЦТК и биосинтеза ПГБ/В при росте продуцента на
н0- и полиуглеродных субстратах позволяет получать сополимер с
заданным соотношением мономеров и улучшенными физико-
химическими характеристиками. В результате проведенных ком-
плексных исследований разработан лабораторный регламент биосин-
теза ПГБ на основе метанола.
Пропанол и пропионат являются наиболее предпочтительными по
стоимости косубстратами для получения ПГБ/В, хотя результаты на-
ших экспериментов свидетельствуют о довольно низкой эффективно-
сти их превращения в Д-гидроксивалерат у данных метилобактерий.
go-первых, это связано с карбоксилированием пропионил-КоА, по-
скольку происходит отток углерода на биосинтез клеточных компо-
нентов через сукцинил-КоА в ЦТК. Во-вторых, имеет место стимули-
руемое метанолом декарбоксилирование пропионата, пропанола и
пентанола. Поэтому получение мутантов М. extorquens, дефектных по
пропионил-КоА-карбоксилазе, метилмалонил-КоА-мутазе и фермен-
там декарбоксилирования пропионил-КоА и валерил-КоА, может
стать одной из стратегий увеличения выхода сополимера и, следова-
тельно, снижения его себестоимости.
Общая стратегия синтеза ПГБ - это двухфазный процесс, разде-
ленный на фазу накопления биомассы, которая сменяется фазой нако-
пления продуктов, что индуцируется лимитированием по азоту. С по-
мощью этой стратегии были достигнуты уровни ПГБ до 130 г/л. При
этом ПГБ может составлять до 60% от общей биомассы [Zhao et al.,
1993; Kim et al., 1996].
Для оптимизации процессов получения ПГБ, рекомбинантных
белков и аминокислот, исследователи обычно управляют концентра-
цией метанола посредством анализа выходящих газов чувствитель-
ными газовыми датчиками или пламенно-ионизационными детекто-
рами, что способствует высокой плотности клеток и, как следствие,
высокой производительности. Повышенная потребность метилотро-
фов в кислороде зачастую диктует использование чистого кислорода
или работу систем культивирования при давлении большем, нежели
атмосферное, чтобы избежать лимитирования по кислороду при вы-
сокой плотности клеток. Для синтеза специфических продуктов раз-
работаны специализированные методы культивирования с целью по-
вышения уровня конкретного продукта.
В условиях периодического культивирования различные серино-
вые метилобактерии способны накапливать как низкомолекулярный
(50-60 кДа), так и высокомолекулярный ПГБ (1300-2000 кДа). В оп-
тимизированных условиях содержание ПГБ может составить 50-55%
221
1997; Madison, Huiswfl
1)(-)-3-гидроксищф
[Bourque et al., 1995]. При непрерывном культивировании макс,
ная продуктивность 0.64 г/л х ч получена для Hyphomicrobium'*^
varzinii, а содержание ПГБ варьировало от 40 до 59% [Zhao er
1993]. При периодическом культивировании с контролируемым . .
ношением C/N М. extorquens К накапливал до 60% ПГБ с вых <*В1
0.2 г/г метанола [Suzuki et al., 1986а,Ь]. Применение рекомбинанту*
технологии позволило в 2.5 раза увеличить содержание полимупЯ1
Муса plana rubra [Foollner et al., 1995]. При добавлении к мет?а104?
амилового спирта содержание сополимера ПГБВ у Ра. denitrified
(РБФ-путь С।-метаболизма) достигало 58%, а выход повышало.. •/,
0.97 г/г субстратов [Ueda et al., 1992]. Я
Ацетоацетил-КоА редуктаза (АКР) - второй фермент синтеза Ip.
обратимо восстанавливающий ацетоацетил-КоА до гидроксибутипЛВ
КоА, у М. rhodesianum и М. extorquens представлен двумя формой»
[Mothes, Babel, 1994; 1995; Belova et al.,
1999]. НАДН2-АКР активна как c L(+)-, так и с
КоА с широким диапазоном длины углеродной цепи, в то время(
НАДФНг-АКР активна с Сд-Сб П(-)-3-гидроксиацил-КоА, но
Ц+)-изомерами. Продукты восстановления ацетоацетил-КоА из-
ментами редуктазы также различаются: НАДФН2-АКР образует
П(-)-гидроксибутирил-КоА, тогда как НАДН2-АКР - только Ь(+)-сте-
реоизомер. Изоферменты АКР избирательны к кофермегпм
НАДФН2-АКР строго специфична к НАДФН2, а ИАДН2-АКР пре-
имущественно использует НАДН2. С помощью реконструирования
in vitro биосинтетических систем, содержащих очищенные [3-кет
лазу, АКР и ПГБ-синтазу, установлено, что только НАДФН2 AKF
участвует в синтезе ПГБ из ацетил-КоА. Второй изофермент уча у-
ет в синтезе и окислении жирных кислот [Haywood et al., 1988]. J
Регуляция синтеза ПГБ детально изучена у М. rhodesianum МВЯ
и М. extorquens. Важнейшими эффекторами, контролирующими поЛ
ки углерода в условиях синтеза ПГБ у этих метилобактерий, явлхюЯ
уровни ацетил-КоА и НАД(Ф)Н2. Вместе с тем М. rhodesianum ‘HfW
дает хараткерными особенностями регуляции синтеза полимера
метилотрофном или гетеротрофном росте. В первом случае ин> пи-
рующие ферменты синтеза ПГБ и ЦТК ([3-кетотиолаза и цитрате
за) конкурируют между собой за общий субстрат (ацетил-КоА).
ляция этих ферментов достигается за счет разного сродства к ацсч
КоА (Кт Р-кетотиолазы и цитратсинтазы - 500 и 70 мкМ, соотвс"
венно) и посредством изменения внутриклеточных концентраций СЯД
цифических эффекторов [Mothes et al., 1998; Madison, Huisman, 1
Показано, что Р-кетотиолаза ингибировалась низкими концентра! '
ми КоА, а цитратсинтаза проявляла чувствительность к НАДН2 (fe I
3
150 мкМ, соответственно). Активность цитратсинтазы в экстракте
л 12 В) была ниже, чем активность (З-кетотиолазы (0.3 Е).
Внутриклеточная концентрация КоА в ответ на индукцию биосин-
ПГБ снижалась почти до нуля, в то время как уровень НАДН2
менылался незначительно. Вероятно, при сбалансированном росте
культуры на метаноле Р-кетотиолаза ингибировалась КоА, а ацетил-
концентрация НАДН2 определяла только 25% активности цитрат-
теза
уМ1-
Р д направлялся в ЦТК. Напротив, в лимите по азоту внутриклеточ-
я концентрация НАДН2 определяла только 25% активности цитрат-
синтазы, уровень КоА быстро снижался, благодаря чему активность
В-кетотиолазы значительно возрастала. Изменения активности цит-
ратсинтазы приводили, по-видимому, к возрастанию концентрации
„цетил-КоА, что также способствовало увеличению активности Р-ке-
тотиолазы.
д/. rhodesianum накапливал ПГБ в экспоненциальной фазе роста на
фруктозе в отсутствие лимита по субстрату. Такое различие в накоп-
лении ПГБ при росте на метаноле или фруктозе отражает отличия в
физиологических функциях полимера. Синтез ПГБ в лимитированных
условиях культивирования на метаноле играет роль стока избыточных
электронов. Напротив, во время роста на фруктозе образуется недос-
таточно энергии, возможно, из-за низкой активности ферментов ЦТК,
что вызывает синтез ПГБ. Основанием для такого предположения
служит сравнение потоков углерода с активностями ферментов ЦТК и
синтеза ПГБ, а также влияние экзогенного формиата. Дополнительная
к фруктозе подача формиата в качестве самостоятельного и независи-
мого от ЦТК источника НАДН2 репрессировала синтез ПГБ у М. rho-
desianum, хотя рост продолжался [Ackermann, Babel, 1997].
Выявленные закономерности позволяют лучше понять принципы
метаболической организации у сериновых метилобактерий и служат
научной основой для разработки технологии биосинтеза ПГБ/В из
метанола и косубстратов. ПГБ и ПГБ/В, а также их нанокомпозиты
(например, с гидроксиапатитом) могут использоваться не только как
Упаковка, тара, пленки, посуда, но имеют перспективы широкого
применения в медицине ввиду биосовместимости и биодеградабель-
ности. Производство разлагаемых биопластиков, включающихся в
биосферные циклы, соответствует концепции экологически безопас-
ного устойчивого промышленного развития РФ. Следовательно, ак-
тивный переход к использованию биопластиков в народном хозяйстве
Должен быть поддержан на государственном уровне.
Энзимологические исследования выявили высокую активность це-
Лог° ряда ферментов у метилобактерий. Это послужило основой для
Получения чистых препаратов различных ферментов, которые мо-
использоваться в научных исследованиях, медицине и аналитиче-
.о-
i-продуктов метаболизма растений, прежде всего метанола
ских целях: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (250 Е/мг бе.1Ка\
НАДФ+-глутаматдегидрогеназы (180 Е/мг белка), НАД4-малатдспД
рогеназы (300 Е/мг белка), НАД+-формальдегиддегидрогеназы и ’^2
миатдегидрогеназы [Popov, Lamzin, 1994; Tishkov et al., 1999]. *
Фитогормоны (цитокинины, ауксины), Ви. В последнее десктм
летие установлена новая жизненно важная роль аэробных мети.ю
фов в качестве фитосимбионтов, поскольку показано, что метан, д и
другие Cj-соединения являются естественными продуктами метаб^.
лизма растений. Проведенный нами скрининг 140 видов одно- и
дольных растений показал, что филлосфера и ризосфера, а также се-
мена растений колонизованы метилотрофными бактериями. Высока
плотность метилобактерий на единицу листовой поверхности /3
600 КОЕ/см2) свидетельствует об образовании ими своеобразного ка-
таболического экрана, препятствующего поступлению в атмосферу
летучих С
и формальдегида. Показано, что колонизация метилотрофами ; асте-
ний повышала скорость роста, фотосинтетическую активность, реге-
нерационный потенциал и способность к корнеобразованию. КриЯ
того, у колонизованных метилобактериями растений повышалась ус-
тойчивость к фитопатогенным микроорганизмам (Erwinia carotovor.}
[Иванова и соавт., 2000; Пиголева и соавт., 2009]. *И
Биоактивные соединения, выделяемые метилобактериями прижиз-
ненно или в результате лизиса клеток, оказывают благоприятное ВмЗ-
действие на рост и развитие растений. При росте на одно- и полтуг-
леродных субстратах факультативные метилотрофы конститутивно
синтезируют цитокинины. Представители всех известных родов чс-
тилобактерий, выращенные на средах с метанолом или метиламином
в присутствии 5 мМ L-триптофана, синтезируют индольные сое, .мне-
ния, в частности, индолилуксусную кислоту (ИУК) [Иванова и создД
2000; Доронина и соавт., 2002]. И
Исследования структурно-функциональных основ взаимодейсх
аэробных метилобактерий с растениями создают методологические
основы повышения продуктивности сельскохозяйственных кул’.'ТИ
Нами показано, что облигатные метилотрофы имеют множественна
энзиматические блоки в центральных метаболических путях (ЦПС
гликолиз, глюконеогенез) и способны расти только на С i-субстрат' к.
Облигатные метилотрофы непатогенны и, в отличие от гетеротро [ '»
не развиваются на твердых средах, используемых для культивир 'йЯ
ния растений in vitro. В связи с этим облигатные метилотрофы вес
перспективны для разработки новых биотехнологий культивировали
трансгенных растений, микроразмножения и регенерации гното(«ИЯ
224
ких растении, с последующей адаптацией к условиям открытого
- или замкнутых экосистем [Доронина и соавт., 2009].
Предложена новая биотехнология культивирования растений в
алогах космических оранжерей. Установлено, что колонизация рас-
тИчес
rpy m а
г.
я ногах космических оранжереи. Установлено, что колонизация рас-
ений в таких оранжереях облигатными метилобактериями не только
стимулирует рост и развитие растений, индуцирует системную устой-
цивость растений к фитопатогенам (Fusarium oxysporum L), но и соз-
дает биофильтр, предотвращающий поступление С i-соединений, об-
язуемых растениями (прежде всего, метанола), в герметичное поме-
щение. и поглощающий С [-соединения техногенного и биогенного
происхождения. Ведется селекция метилотрофных культур с целью
создания нового стимулятора роста растений - “метилобактерина".
Целый ряд сообщений свидетельствует об образовании факульта-
тивными метилобактериями витамина Вп (кобаламина), выход кото-
рого был существенно выше при использовании Ci, чем Сп-субстра-
тов. Так, при росте на средах с метанолом или дихлорметаном Methy-
lobacterium dichloromethanicum DM4 образует 10 мкг В|г/г сухой био-
массы, а на средах с этанолом и сукцинатом - на 30% меньше [Дани-
лова и соавт., 2004]. Наряду с тем, что метионинсинтетаза метило-
трофов является В)2-зависимым ферментом, более высокий уровень
кобаламина при метилотрофном росте связан с участием в ключевых
реакциях путей Ci-метаболизма.
Кобаламин необходим как кофактор в этил- и метилмалонил-КоА-
изомеразной и мутазной реакциях, которые являются компонентами
ицл” варианта серинового пути. Недавно обнаружено участие кобала-
мина в первичном катаболизме хлорметана у Methylobacterium chloro-
methanicum. Установлено, что метильная группа хлорметана сначала
переносится с помощью белка CmuA на корриноид-содержащий бе-
лок, с которого далее при участии белка CmuB передается на ТГФ.
Белки кластера Cmu близки по аминокислотным последовательно-
стям с метилтрансферазами метаногенных архей. Хотя наиболее вы-
сокое содержание кобаламина выявлено у розовоокрашенных пред-
ставителей рода Methylobacterium (до 850 мкг/г сухой биомассы), на-
ми впервые установлено, что, за исключением умеренно галофиль-
ных видов рода Methylophaga, практически все метилобактерий обра-
зуют витамин В12 (30-150 мкг/г сухой биомассы) [Иванова и соавт.,
2006].
Эктоин. Эта циклическая иминокислота является одним из наи-
более распространенных в микробном мире осмопротекторов. В по-
следние годы эктоин все более активно используется в биохимиче-
ских и молекулярно-биологических исследованиях в качестве эффек-
тивного стабилизатора ферментов, нуклеиновых кислот и ДНК-
ведется интенсивный поиск новых перспективных штаммов-проду
центов, изучаются соответствующие ферменты и гены с целью совер
данного мультифункционального биопротектора [Graf et al., 2008].
белковых комплексов, а также в косметическом промышленности к
УФ-протектор и увлажнитель, поскольку легко проникает в клетки *
повышает их тургор (рис. 7.1.3). Однако химический синтез эктощ/
сопряжен с использованием дорогостоящих предшественник
(L-аминокислот) и трудоемких процедур очистки продукта, поэт х
ведется интенсивный поиск новых перспективных штаммов-проду
центов, изучаются соответствующие ферменты и гены с целью совер
шенствования известных и разработки новых технологий получения
Молекулярная биология: Гер моста*.', ил и за тор ферментов
нуклеиновых кислот, Д11К-белковых комплексов и целых клеток
Медицина: биопротектор клеток при радио- и химиотерапии
Косметика: в кремах как увлажни гедк кожи, повышает устойчивость
к УФ-облучению
Рис. 7.1.3. Сферы применения и молекулярная структура эктоина: таутомеры (а) и
гидрофильная оболочка, окрашенная в соответствии с зарядами атомов (б) Я
Недавно показано, что эктоин также защищает от пылеиндуци-
руемого воспаления легочного эпителия и небольших расстройств
кишечника от ишемии и перфузионного повреждения [Sydlik et al.,
2009; Wei et al., 2009]. Представленный фирмой “Merck” (Германия)
продукт RonaCare 1 Ectoine", как показано, способствует поддержа-
нию целостности клеточных мембран и действует как УФ-фильтр в
составе косметических средств [Oren, 2002]. Таким образом, протек-
торные свойства делают эктоин ценным соединением для поддержа-
ния здоровья и заботы о коже. I
Показано, что у галофильных/толерантных метилобактерий одних
из механизмов осмоадаптации является синтез de по von преимущест-
венное накопление в клетках эктоина — циклической иминокислоты,
обладающей высокой водоудерживающей способностью. Обычно
гало(алкало)фильные метилобактерии синтезируют эктоин только
при высоком содержании соли (>3% NaCl), когда возрастают энерге*
тические затраты на поддержание ионных градиентов и уменьшается
энергетический статус клеток [Doronina et al., 2003a.b], i
Интерес к биопротекторам (эктоины, бетаины) во многом обу-
лОвлен возможностью использования их в качестве “химических
^зперонов ”> оказывающих стабилизирующее и защитное действие на
ферментативные системы, ДНК- и РНК-белковые комплексы. Наи-
больший интерес представляют эктоин и гидроксиэктоин, поскольку
являются высокоэффективными биопротекторами при криоконсерва-
ции генетического материала и лиофилизации клеток, применяются в
биохимических исследованиях в качестве стабилизаторов ферментов,
косметической промышленности как водоудерживающие агенты,
легко проникающие в клетки и повышающие их тургор. Неудиви-
тельно, что метилобактерии с высоким внутриклеточным содержани-
ем эктоинов выдерживают нагревание, высушивание, множественные
никлы замораживания-оттаивания и, следовательно, весьма приспо-
соблены к постоянно изменяющимся условиям среды обитания [До-
ронина и соавт., 2005].
Биотехнологический способ получения эктоина при культивиро-
вании галофильного гетеротрофа Halomonas elongata и на среде с
глюкозой, L-аминокислотами и 12% NaCl реализован фирмами “Bio-
mol” и “Merck” (Германия). Современные биотехнологические про-
цессы позволяют получить до 2.1 г эктоина на 1 л среды в день [Oren,
2002]. В то же время нами показано, что умеренно галофильные ме-
тилобактерии при росте на среде с 6% NaCl способны накапливать до
20% эктоина, т.е. выше, чем у гетеротрофных продуцентов, растущих
при 12% NaCl. Причины этих различий могут быть в генетически де-
терминированных регуляторных механизмах биосинтеза эктоина. На-
ми обнаружено, что синтез эктоина у галофильных метилотрофов
происходит через биохимический путь, близкий, но не идентичный
таковому у гетеротрофных галофильных эубактерий. У метилобакте-
рий рода Methylophaga структура генов биосинтеза эктоина сущест-
венно отличается, поскольку они составляют четырехгенный кластер
ectABC-ask, включающий дополнительный ген аспартаткиназы. Это
предполагает присутствие специфической изоформы аспартаткиназы,
которая, по-видимому, обеспечивает относительно независимый от
основного конструктивного метаболизма синтез предшественников
эктоина - аспартилфосфата и аспартилполуальдегида [Троценко и
соавт., 2005; 2007].
Пока не ясна природа соответствующих регуляторов биосинтеза
эктоина, но установлено, что наряду с эктоином в клетках метилобак-
ТеРий накапливаются сахароза и глутамат, также выполняющие осмо-
нротекторные функции. Возможно, pH среды и соотношение С : N
влияют на распределение потока углерода на синтез этих осмолитов.
Р°ме того, внутриклеточный уровень эктоина у метилобактерий
227
выше, по сравнению с метанотрофами, что может быть обусловлен
способностью последних формировать поверхностные гликопротЛ
новые структуры (защитные S-слои) и ВЦМ, для чего требуются J
полнительные затраты углерода и энергии ростового субстрата [и
ронина и соавт., 2010]. Следовательно, изучение влияния темпера^/,
ры, рС>2, pH, источников азота, фосфора, микроэлементов на процесс
культивирования метилобактерий создает дополнительные возмоц.
ности для управления процессом биосинтеза эктоина с целью пошк
шения его производительности и выхода целевого продукта. Раснщф.
ровка структуры и организации генетических детерминант синтез?
эктоина у нейтрофильных и алкалофильных метилотрофов даст во>
можность регулировать процесс на уровне соответствующих генов н
ферментов галофильных метилотрофов, что позволит в дальнейшем
разработать более эффективные способы продукции эктоина из м -
танола (рис. 7.1.4) [Троценко, Хмеленина, 2008].
Культивирование инокулята (в колбах) Ч
Культивирование на минеральной среде
с СНзОН (%) (в 6-л ферментере)
Осаждение биомассы
I
| Экстракция эктоина осмотическим шоком
Очистка эктоина (60%)
органическими растворителями или
колоночной хроматографией
Перекристаллизация эктоина
для высокой чистоты (90%)
Рис. 7.1.4. Схема получения эктоина с использованием метилобактерий 1
Убихиноны (коферменты Q) - жирорастворимые (липофильные)
коферменты, существенные компоненты дыхательной цепи, локалй’
зуются в липидной фазе мембраны, участвуют в “сборе” и переносе
водорода и электронов на цитохромы. Благодаря этому, они приме!
няются при лечении болезней сердца, в особенности, кофермент Ою,®
также в косметологии. Фирмой “Мицубиси” (Япония) достигн 1‘‘
высокие выходы кофермента Ош при культивировании факультатив
ных метилобактерий на средах с метанолом или глюкозой (10-15 мгД
>
их клеток и 280 мг/л). Получены мутанты, способные продуциро-
ть значительное количество гомологов убихинона (Он, 0)2 и Ои)
£„i, 1985; 1991]. ' ’’
цитохромы - необходимые компоненты ЭТЦ метилотрофных
бактерий, поскольку непосредственно сопряжены с ферментами
q окисления и вместе с ними локализованы в периплазме, либо слабо
прикреплены к периплазматической мембране. Цитохромы исполь-
3уК)тся в медицине для лечения болезней, вызванных кислородной
недостаточностью. Метилобактерий рассматриваются в качестве по-
минальных продуцентов цитохрома с, поскольку внутриклеточный
Уровень этого кофермента достаточно высок (до 100 мг/л) [Tani, 1985;
1991]-
Пигменты. Представители рода Methylobacterium синтезируют
пигменты, наиболее обычными из которых являются каротиноиды,
придающие культурам розовый цвет. Пути биосинтеза каротиноидов
изучены у ряда бактерий [Eisenreich et al., 2004]. Первый этап пути,
общий для изопреноидов, - продукция изопентенилпирофосфата
(ИПП) и диметилаллилпирофосфата (ДМАПФ). У большинства бак-
терий она происходит по мевалонатнезависимому механизму и начи-
нается с образования 1-дезокси-П-ксилулозо-5Ф из глицеральдегид-
ЗФ. В геноме Methylobacterium extorquens AMI найдены гены всех
ферментов этого пути. ИПП и его изомер ДМАПФ конденсируются с
образованием изопреноидных соединений, в свою очередь, являю-
щихся предшественниками таких каротиноидов, как Р-каротин, зеак-
сантин и астаксантан. С помощью транспозонного мутагенеза показа-
но, что фитоендесатураза (Crtl) необходима М. extorquens AMI для
синтеза розового пигмента, близкого по структуре пигменту Protami-
nobacter ruber [Van Dien et al., 2003]. В случае необходимости синтез
пигментов можно интенсифицировать, варьируя физико-химические
факторы (pH, температуру, рОг).
в
Биосинтез 13С-сахарофосфагов
С-меченные сахара используются в экспериментах с применени-
ем ЯМР. Однако производство меченых соединений путем химиче-
ского синтеза представляет некоторую проблему из-за оптической
специфичности реакций, низкого выхода меченых сахаров и сложных
нроцессов разделения. Напротив использование биокатализаторов
Вп°лне подходит для синтеза сахаров, меченных 13С в специфических
Положениях. Катализируемые ГФС и ФГИ реакции применимы для
синтеза [1-'3С]-меченных сахарофосфатов с использованием [1-13С]-
[1°?зМальдегиДа как Ci-донора. При использовании D-рибозо-бФ и
С]-ФА в качестве субстратов [1-’3С]В-фруктозо-6Ф успешно син-
иРовался ферментной системой, содержавшей ГФС и ФГИ из
[10(з1ал1,дегида
и* ।
езиРовался ферментной
С-ЯМР анализом, СпЛI
синтез^
Mb, aminofaciens 77а и фосфорибоизомеразу^ шпината. В этой систЛ
13С из формальдегида, как было показано В * * * * 13С-ЯМР анализом, СпйЯ
фически включался в С-1 положение фруктозо-бФ и выход конвертд
(синтезированный фруктозо-бФ/потребленный ФА) был выще
[1-13С]-Э-глюкозо-6Ф также продуцировался ферментной систем $
включавшей ГФС и ФГИ [Yanase et al., 1992; 1993]. Таким образ°И’
ГФС и ФГИ являются перспективными ферментами для сицт ’
13С-меченного фруктозо-бФ, который последовательно трансфер^
руется в различные кетозы и альдозы с помощью химических и бвд
химических модификаций.
Биодеградация токсичных соединений. Перспективности Л
пользования аэробных метилобактерий в биотехнологии обусловлена
не только их способностью синтезировать различные полезные про-
дукты, довольствуясь минимальными, в сравнении с гетеротрофами
питательными потребностями, но и разлагать широкий спектр высо-
котоксичных соединений. В нашей коллекции представлены бакте-
рии, использующие в качестве источников углерода и энергии мета-
нол, формальдегид, метилированные амины, метилсернистые со-
единения, галометаны, метил- и этилацетат, ацетон и толуол.
Рис. 7.1.5. Схема биофильтра для деградации С [-соединений. 1 - реактор, 2-по
лиакриламидный слой, 3 - керамзит, 4 - регулируемый насос, 5 - сборник, 6 - Рота’
метр для воздуха, 7 - термостат
В разработанных нами биореакторах (рис. 7.1.5) применяются
тилобактерии, выделенные из природных источников и активна
илов с селективным давлением этих соединений. Отобранные штаМ1
мы обладают свойствами, отвечающими специфическим требования*
технологического процесса очистки воздуха или промстоков, и иЙИ
рательно разлагают компонент(ы) выбросов при выращивании на М
нимальной среде [Доронина и соавт., 1996; 1997]. Культуры xopo^j
фиксируются на различных сорбентах, легко адаптируются к усл^'
230
в биореакторе, сохраняют высокую степень жизнеспособности при
^офилизации, замораживании на гигроскопичных носителях, не те-
специфических физиолого-биохимических свойств при длитель-
хранении (-70°С) [Доронина, Троценко, 1992; 19946; Троценко и
сОавт- 2005Ь
Природа конечных продуктов биодеградации важна для экологии
0йзводства. Аэробные метилобактерий способны утилизировать
е^ества наиболее полно и без образования нежелательных побочных
продуктов. Существенное значение имеют условия наработки био-
массы для сорбции в биореакторе на носителе. Метилобактерий хо-
ш0 растут на простых минеральных средах, легко переходят с не-
специфической среды, используемой для получения биомассы, на
конверсию поллютанта. Нами применялись различные типы носите-
ли в биореакторе: полиакриламидное волокно, керамзит и пенополи-
винилформаль. Иммобилизованные клетки метилобактерий обеспе-
чивают полную конверсию ряда токсичных соединений в проточных
условиях, что открывает перспективы их широкого использования
для целей биодеградации и биоремедиации [Доронина и соавт., 1997;
Троценко и соавт., 2005].
Приобретение неметилотрофами способности метаболизировать
(^-соединения или повышение эффективности СД-метаболизма у ме-
тилобактерий стало бы преимуществом для их промышленного при-
менения. Когда Ci-соединения используются в качестве субстратов
для микробного роста при ферментации, уровень формальдегида
должен тщательно контролироваться, поскольку он является ключе-
вым интермедиатом в (Д-метаболизме [Yurimoto et al., 2009]. Эффек-
тивная ассимиляция ФА может облегчить рост, минимизируя уровень
внутриклеточного формальдегида. Следовательно, интересно ввести
метаболический путь ФА в различные гетерологичные хозяева. По-
скольку РМФ-путь экзэргоничен и более эффективен, чем сериновый
Цикл и РБФ-путь, так как не требует кофакторов, использование
РМф-пути в биотехнологических процессах имеет преимущетсва пе-
ред другими реакциями элиминирования формальдегида, такими как
GSH-зависимая дегидрогеназная система [Quayle, Ferenci, 1978; Kato
etaU 2006]. Кроме ассимиляции и детоксикации ФА, каталитические
активности ГФС и ФГИ также использовались для ферментативной
пР°Дукции меченых сахарофосфатов. Примеры биотехнологического
пРименения ГФС и ФГИ приведены ниже.
природе одним из источников эмиссии ФА является метоксили-
Р°Ванный лигнин, наиболее распространенное ароматическое соеди-
Ние в биомассе [Taylor, 1983]. Применение бактериальных способов
егРаДации метоксилированных мономеров лигнина, ванилина и ва-
231
на
'•toio.
нильной кислоты широко изучалось для более эффективного Ис
ювания биомассы [Overhage et al., 1999]. При бактериальной д^./'
ции этих соединений формальдегид образуется в реакции, катадл
руемой деметилазой ванильной кислоты. В. се рас ia ТМ1 pacpg^
ванилине и ванильной кислоте, а деметилирование ванильной к-
ты, по-видимому, является этапом, лимитирующим скорость дб1
ции ванилина из-за токсичности ФА [Tanaka et al., 2001]. ‘I
Чтобы повысить скорость деградации ванилина В. cepacia Тм
гены hps и phi из Mb. aminofaciens 77а были гетерологично эксппа»’
сированы в штамме ТМ1 (рис. 7.1.6). Этот штамм не может испод» w
вать Cj-соединения в качестве единственного источника углерода I
энергии, поскольку hps- и phi-гены отсутствуют в геноме В. cepacfa
Получен штамм-трансформант, который конститутивно продуцмЗ
вал активные ГФС и ФГИ, а деградация ванильной кислоты и осг<.
вой выход у него значительно повышались. Более того, включение
14С-формальдегида в клеточные компоненты последовательно п вы-
шало гетерологичную экспрессию генов hps и phi [Mitsui et al., 2003].
Эти результаты показывают, что РМФ-путь, реализуемый В. cepacia
ТМ1, играет существенную роль в детоксикации и ассимиляции ФА.
Рибулозо-5Ф
Г ексулозо-6Ф--►Фруктозо-бФ
ГФС ФГИ Н
ванилина Burkholderia cepacia ТМ1. Образующийся
Рис. 7.1.6. Деградация
формальдегид ассимилируется в РМФ-пути [Kato et al., 2006]
В промышленных процессах использование смесей субстргпИМ
стоящих из сахара и недорогого дополнительного источника l '
ной энергии (эквиваленты АТФ или ПДС) и восстановленных <квяв*-
лентов [НАД(Ф)Н2], является практическим подходом к повЫИ*ЗИ
экономичности процесса. С i-соединения, такие как метанол,
формиат, являются многообещающими кандидатами в качеств*- пСЯг)
могательных субстратов, поскольку производятся из природной-.' гф
и биомассы. Сообщалось, что ФА и формиат могут успешно
няться в качестве дополнительных субстратов [Tani, 1985: ЯВ
Koopman et al., 2009; Babel, 2009]. V
'роперантный к растворителям Ps. putida SI2 подвергали модифи-
и путем введения генов hps и phi из термотолерантной метило-
терии В. brevis для более эффективного использования метанола и
ха
как вспомогательных субстратов [Koopman et al., 2009]. Ps. putida
Vf _ - - г л г» /"IS A Л nil it T II л l ГТЧ Л П I II fl 4 III I I ПП ПО П I I 1f i > л т
M0#eT - -----
улУ
Tpai
ЦСП
окислять ФА собственными ФАДГ и ФДГ. Для дальнейшего
•чтения способности использовать ФА, РМФ-путь был встроен
нСформацией Ps. putida S12 генами hps и phi. В экспериментах с
,0пьзованием глюкозы и ФА хемостатной культурой этот транс-
формант, экспрессирующий гены hps и phi, продемонстрировал зна-
* _ 1 inn п Т» I т ГЛТТГ Т/Л II ГТГЧТЛ ГЧ I "Ч ГГ О О DLIPA^
чи
ких
тельное увеличение биомассы и способность расти при более высо-
концентрациях ФА, чем исходный штамм. Благодаря введению
тандем3 генов hps и phi, трансформант получил возможность ассими-
ляции и циклического окисления ФА, как в случае Mb. flagellatus КТ
[Chistoserdova et al., 2000].
у некоторых грамотрицательных протеобактерий РМФ-путь пред-
ставляет циклический путь окисления ФА, в котором фруктозо-бФ
превращается в рибулозо-5Ф и СОг с сопутствующим образованием
двух молекул НАД(Ф)Н2. Таким образом, ФА может использоваться
не только как вспомогательный катаболический субстрат, но также
как субстрат для ассимиляции. Кроме того, замена ФА на метанол
также приводила к увеличению выхода биомассы, так как Ps. putida
S12 экспрессирует эндогенную метанолокисляющую активность, ис-
точником которой служила неспецифичная алкогольдегидрогеназа
[Koopman et al., 2009].
Бактериальный РМФ-путь и растительный цикл Кальвина имеют
общие интермедиаты, рибулозо-5Ф и фруктозо-бФ. Соответственно,
РМФ-путь может быть реализован в растениях путем введения бакте-
риальных генов hps и phi [Chen et al., 2004]. Эти гены Mycobacterium
gastri MB19 были встроены в табак и экспрессировались под контро-
лем промотора томата rbcS-ЗС. Продукты генов были направлены в
хлоропласты с помощью искусственно добавленной транзитной пеп-
тидной последовательности. Была обнаружена экспрессия обоих ге-
нов и подтверждено образование активных ГФС и ФГИ в раститель-
ных клетках. Экспрессия этих генов/ферментов в растениях увеличи-
вала устойчивость трансгенных растений к ФА и, что характерно,
способность удалять ФА из воздуха. Анализ уровня формальдегида
газовым сенсором выявил, что способность удалять ФА у трансген-
Нь,х растений была на 20% выше, чем у контрольных вариантов [Sa-
^ada et al., 2007]. Так как ФА, выделяемый новой мебелью, обычно
^Держащей фенолформальдегидные смолы, вызывает синдром
больного дома", трансгенные растения, имеющие РМФ-путь, могут
Ь’ТЬ полезны для уменьшения загрязнения воздуха в помещениях.
233
Соединение двух ферментов, катализирующих последовател Я
реакции, может увеличить каталитическую эффективность по ср НЬ,е
нию с простой смесью индивидуальных ферментов. Сое щн, ,
гены hps-phi найдены в геномах гипертермофильных археи 77
cocci. Как описано выше, слитые ферменты Hps-Phi из Ругос
horikoshii и Thermococcus kodakarensis являются бифункционал
ми, поскольку обладают обеими активностями. В случае фермент
---- _ _ Ми-
“te
'erthQ,
' Н ьь
horikoshii, ФГИ-домен, как было показано, стабилизировался слшЗ.
ем с ГФС. Более того, общая активность такого фермента, рассчиraiJ
пая на основе эквимолярных субъединиц, была значительно
чем у простой смеси ГФС и ФГИ. Однако фермент гипертермофцл. ’
иых археи не функционировал при комнатной температуре [Orita et
al., 2005; 2006]. Л
bulllgj
Рекомбинантный фермент ГФС-ФГИ, проявляющий обе актиыЯ
сти при комнатной температуре, был создан с использованием кнов
hps и phi из метилотрофной бактерии Мус. gastri МВ 19. Две слитых
генных конструкции, включающих hps- и р/п-гены (т.е., hps-phi и phi.
hps), были введены в Е. coli. Гены hps и phi были лигированы в ра*гку
считывания без добавления линкерных последовательностей. Про,.угг
слияния генов hps-phi проявлял активности ГФС и ФГИ при комнат-
ной температуре. Напротив, продукт слияния генов phi-hps не смел
ферментативной активности. Интригующим является тот факт, что
слитые гены phi-hps не найдены в базе данных последовательностей
ДНК. При сравнении молярных активностей бифункционального фер-
мента 1 ФС-ФГИ со смесью ГФС и ФГИ на основе эквимоляр' ых
субъединиц комбинированная активность соединенного фермента
была почти вдвое выше, чем у смеси двух отдельных ферментов. На-
блюдаемое двукратное увеличение каталитической эффективности,
предположительно, происходило из-за корректного физическог со-
пряжения ГФС и ФГИ [Orita et al., 2007]. Структурный анализ гиб-
ридного ГФС-ФГИ белка может облегчить понимание основ н ви-
шенной каталитической активности такого белка. Jr
Штаммы Е. coli, содержащие слитый ген hps-phi, потребляли -А
более эффективно и росли в ФА-содержащей среде лучше,
штамм-хозяин. Эти результаты показали, что сконструированы
слитый ген экспрессировал систему детоксикации для устойчивости
ФА различных организмов. Внедрение отдельных hps- и phi-гсн > 8
геном гетерологичного хозяина требовало индивидуальной грэ*Я
формации каждого гена, тогда как слитый ген hps-phi удалось пер^*'
сти в один этап [Orita et al., 2007]. Следовательно, ФА-резистент»т
фенотип, присущий слитому ферменту ГФС-ФГИ, можно испол'ЗО"
вать в качестве маркера трансформации. Л
234
цами впервые создана коллекция деструкторов галометанов, ко-
е активно используются для исследования механизмов дегалоге-
Т°^ования [Доронина и соавт., 1996; 1997; Doronina et al., 1995; 1996;
ш98Ь; 2000].
Бы-10 предложено испытать метилобактерии-деструкторы метил-
иДов для ускорения естественной деградации бромметана в поч-
га Продуктами лабораторных биореакторов, использующих A. ci-
Е\ronei, были СО2 и Вг~. Реакторы функционировали со 100%-ной
Лфективностью длительные периоды времени при контроле темпе-
атуры и pH, однако их масштабирование не было проведено [Schae-
fer et al., 2007]. Бактериальные клетки применяли для окисления
бромметана непосредственно на поверхности почв при фумигации
полей клубники в Монтеррее (Мексика). При этом выяснилось, что
такой способ биоремедиации обработанных фумигантом почв имеет
существенный недостаток. Бактериальная активность потребления
МГ ингибировалась вследствие: 1) токсичности локально повышен-
ных концентраций бромметана (>5%) в почве под пластиковым по-
крытием, предотвращающим попадание фумиганта в атмосферу; 2)
повышения температуры (>40°С) под пластиковым покрытием, пре-
восходящего допустимые пределы для клеток деструкторов; и 3) вы-
соких концентраций хлорпикрина - ингибитора окисления броммета-
на A. ciceronei [Connell Hancock et al., 1998].
Эти факторы сложно контролировать при коммерческих фумига-
циях, поэтому непосредственное применение метилобактерий с целью
обеспечения биологического барьера потоку бромметана было отло-
жено. Однако отмечено, что в случае возможности контроля этих пе-
ременных применение штаммов-деструкторов на поверхности почв
могло бы значительно снизить эмиссию бромметана при фумигации
полей. Более перспективным представляется метод сбора бромметана
между двумя слоями пластиковой пленки и его транспортировки по-
током воздуха в реакционную камеру с очистителем. Этот способ в
настоящее время внедряет компания Value Recovery, Inc. из Нью-
Джерси (США), и он также может быть модифицирован посредством
использования биологических методов деструкции [Chitwood,
Deschusses, 2001].
Были отобраны культуры метилобактерий для очистки стоков
сУльфатцеллюлозного производства от метанола [Болотникова и со-
авт., 1985], а также бактерии-деструкторы метилацетата, обладаю-
щие карбоксилэстеразой с широкой субстратной специфичностью
Isakov et al., 1990; Раков и соавт., 1991; Доронина и соавт., 2006].
Метил-третичный бутиловый эфир (МТБЭ) и его аналоги широ-
те применяются для оксигенирования бензина. Их персистентность,
и ок»
третичного Су.
• У'
cMv-
I W
ИЦ
ИИ. •
обусловленная наличием эфирной связи и третичного С-атома i
сичностью основного интермедиата биодеградации -
танола, привела к накоплению этих токсичных соединений в
жающей среде. Поиски бактериальных деструкторов МТБЭ прив.
выделению Methylibium petroleiphilum РМ1, Hydrogenophaga flav
Mycobacterium austroafricanum, способных расти на этом соедщ **
и являющихся перспективными для разработки технологий бш
диации почв и стоков [Mueller et al., 2008]. Бактериальная мине; ц.
зация МТБЭ и других этерифицированных оксигенатов - еще
пример поистине неисчерпаемого метаболического потенций
аэробных метилотрофов, реализация которого в биотехнолог
сущности, только началась.
Подземные микробные сообщества весьма разнообразны и спо*
собны осуществлять широкий спектр метаболических превращений
Независимо от глубины геологических слоев подземные микроогтз.
низмы участвуют во всех основных циклах биогенных макроэлемен-
тов (С, N, Р, S, Fe, Мп и Mg). Хотя каждый геологический слой, по-
видимому, имеет собственную микробиоту, песчаные почвы из-за
высокой проницаемости для воздуха или воды имеют наибольшую
микробиологическую активность. Учитывая общую значительную
численность подземной микробиоты, понятен большой интерес к де-
градации опасных поллютантов in situ посредством стимуляции се-
лективной бактериальной популяции (биостимуляция) или путем
внесения бактерий-деструкторов в загрязненные участки (биияуг-
ментация).
Понимание временных и пространственных связей, а также попу-
ляционной динамики взаимодействий метилобактерий в экосистеме
важно для оценки потенциала и эффективности биоремедиации. Cri-
новится все более очевидным, что аборигенная микрофлора способ на,
ускорять деградацию и минерализацию многих соединений, ртже
считавшихся биологически устойчивыми. Осознание этого повлек.*]
за собой создание новых технологий мониторинга структуры и акт ив-
ности микробиоты в реальном времени. Эти технологии во мн» пД
случаях избирательны, чувствительны и адаптабельны к почвам, ка-
дочным породам и грунтовым водам. fl
Будучи физиологически и метаболически весьма пластичнчмИ,
метилобактерий способны существовать в различных биотопах, в т.
числе в неблагоприятных условиях широких вариаций pH, темпера
туры, концентрации кислорода и тяжелых металлов, давления, с»'Я|
ности и радиации (см. главу 4). fl
Оценка, характеристика и использование метилотрофных о '
ществ, осуществляющих биоремедиацию in situ загрязнений поДгМЯ
236
нцых слоев и грунтовых вод, крайне важны, поскольку в результате
^дустриализации и урбанизации социума произведено огромное ко-
ицчество (не)органических отходов, часть которых проникла в водо-
оСные слои и грунтовые воды, что привело к неприемлемым послед-
т0Иям для биосферы. Адаптабельность и управляемость аборигенной
микр°Фл0Ры’ ОСНОВУ которой составляют метилотрофы, делают их
идеальным средством биоремедиации окружающей среды от опасных
загрязнений и отходов в широких пределах условий.
Экономические аспекты. Производительность биосинтеза боль-
шей части химических продуктов из метанола необходимо оценивать
в сравнении с процессами производства в химической промышленно-
сти, а также с обычной биотехнологией, основанной на сахаре. Есть
два главных требования к сырью в промышленности: доступность и
цена. Метанол давно является одним из важнейших исходных хими-
ческих веществ. В 2006 г. мировой ежегодный объем производства
метанола превышал 46 млн. т и около 35 млн. т/г. потребления [Saade,
2009]. Большая часть метанола производится из синтез-газа в гетеро-
генно катализируемой реакции, с помощью различных процессов.
Синтез-газ может быть получен из разнообразных исходных материа-
лов, содержащих углерод, таких как уголь, природный газ и нефть.
Для крупномасштабного синтеза метанола обычно используется при-
родный газ. Доступность метанола вместе с независимостью от се-
зонных изменений и погодных условий выгодно отличает его от
большинства видов сырья сельскохозяйственного происхождения.
Кроме того, так называемый биометанол может быть успешно
произведен из возобновляемого сырья, такого как глицерин, в ком-
мерческом масштабе. Биогаз и биомасса тоже являются потенциаль-
ными возобновляемыми ресурсами для синтеза газа и, таким образом,
Для производства метанола. Хотя о таких процессах в промышленных
масштабах не сообщалось, они не могут быть экономически конку-
рентоспособными в настоящее время. Получение метанола, как из
ископаемых, так и потенциально возобновляемых ресурсов, делает
промышленную биотехнологию на основе метанола весьма гибкой.
В последнее десятилетие цены на метанол показали уникальную
структуру. Цены на большинство видов химического сырья выросли
Так же, как цены на нефть, тогда как цена на метанол колебалась ме-
W 167 и 869 USD/т. В настоящее время она находится в середине
ЭТог° диапазона с малозаметными подвижками вверх. Цена на мета-
Нол имеет особое значение для поиска сырья и процессов как альтер-
нативы классической нефтехимии.
Поскольку основу многих продуктов составляет углерод, его со-
держание в сырье, как правило, используется при оценке привлека-
237
тельности для химической промышленности. Тонна метанола состои
из 38% углерода, 50% кислорода и 12% водорода. Для сравнения
пропилен состоит из 86% по объему углерода и 14% водорода по Ве’
су. Однако, несмотря на более низкое содержание углерода, по теку
щим европейским рыночным ценам, углерод в метаноле стоит Ю93
USD/т, что значительно меньше, чем углерод в пропилене (15^
USD/т). Поэтому процессы, разработанные для производства олефи.
нов, берут начало от метанола.
В принципе, динамика цен на метанол в недавнем прошлом делает
его привлекательным сырьем для промышленного биопроизводства
высокоценных белков, особо чистых и специальных химических ве-
ществ. Однако это не распространяется на малозначимые и массовые
вещества, для производства которых используется дешевое сырье
Для этих целей только попутный нефтяной газ, сжигаемый в факелах
является потенциальным источником дешевого метанола в промыш-
ленной биотехнологии. В
Хотя метанол пока не может конкурировать с международными
ценами на сахар, которые колеблются в настоящее время, составляя
около 300 USD/т, что соответствует примерно 715 USD/т углерода,
есть важные причины стимулировать его использование в качестве
сырья для промышленных биопроцессов. Меньшие потребности в
компонентах питательных сред для биопроцессов, основанных на ме-
таноле, дают в результате низкие цены и также уменьшают обработ-
ку, что может сократить затраты, более чем на 50%. ’’В
Кроме того, метанол не подвергается строгому лимитированию в
использовании, ценовому регулированию или ограничениям на им-
порт. Это регулирование сельскохозяйственных продуктов - главный
недостаток любого биотехнологического производства, потому что
ограничивает доступ к условиям свободного рынка или влечет за со-
бой высокие административные расходы со значительными отрица-
тельными последствиями для экономики процесса. Подобные мета-
морфозы рынка, в результате особенностей законодательства, не яв-
ляются проблемой для метанола. Поскольку они часто наблюдаются в
развитых странах с традиционно сильной химической промышленно-
стью, метанол является перспективным альтернативным сырьем ДО*
биотехнологического производства. "
Биопроцессы, основанные на метаноле, могут быть объединены в
мегаметанольные производства, т.е. объекты мощностью 1 млн. т
танола в год или более, с подобными преимуществами. Таким обра
зом, пока доступ к дешевому метанолу обеспечен, промышленная
биотехнология, основанная на метаноле, может конкурировать с пр°?
цессами производства на сахаре или продуктах нефтехимии. Рис. '*
238
суммирует главные движущие силы , необходимые для разработки
сопроцессов, основанных на метилотрофных бактериях.
В последние годы достигнут значительный прогресс в изучении
^утей метаболизма метанола у различных метилобактерий и разра-
ботке инструментов для метаболической инженерии. Важной предпо-
сылкой для большей части биотехнологических производств приме-
нительно к метилотрофам будет активация анаплеротических ключе-
вых ферментов вместе со снижением активности путей окисления.
Это позволит приблизиться к выходам, которые выше, чем получен-
ные в лабораторном масштабе. С использованием системной биоло-
гии и интерпретацией все большего количества доступных геномов и
протеомов в течение следующего десятилетия ожидается достижение
всестороннего понимания центрального метаболизма метилобакте-
рий. Это знание будет фундаментом для рациональной модернизации
существующих и проектирования новых путей биосинтеза.
Законодательно» регулирование
Цена и доступность метанола
Независимое регулирование рынка сахаров
Различные ресурсы
Предприятия по массовому производству
—
«омик».тахнологии
ГЕНЕТИКА
Понимание регуляции и
взаимодействий клеток
ТЕХНОЛОГИИ
ФЕРМЕНТАЦИИ
Отбор,
экстракция
очистка
Наработка рекомбинантных
штаммов и возможная
метаболическая инженерия
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ
ПРОЦЕСС
Масштабные реакторы
Испытанные протоколы с
высокой плотностью
клеток
"Wfww
ство чистых и грубых препаратов аэробными метило!
Рис. 7.1.7. Ключевые факторы, влияющие на экономические и технические показа-
Тели промышленной биотехнологии, основанной на метаноле
По сравнению с химическим синтезом, начинающимся с метанола,
И°технологические процессы более востребованы и вселяют надеж-
особенно в случаях, когда нужна высокая избирательность или
С}ТоЖные продукты нужно разделить на С 3-С6 метаболиты. Кроме
239
того, многие метаболиты, отсутствующие у организмов, культи
руемых на глюкозе, таких как Е. coli, могут стать важными интер*4е
диатами для получения не только особо чистых, но и обычных хими.
ческих веществ и, таким образом, сделают доступными новые ви
топлива и биополимеров.
Поскольку способы культивирования метилобактерий при вь*счь
кой плотности клеток уже доступны, в будущем может быть сущ<Сь
венно повышена продуктивность биопроцессов. Способность метц,| 1
бактерий использовать синтетические и недорогие ингредиенты в со-
четании с уменьшенным риском загрязнения, по сравнению с кул» ги-
вированием на сахаре, ввиду токсичности метанола позволит мини-
мизировать издержки производства, включая последующую пере; з
ботку. Метанол является доступным химическим сырьем, экономиче-
ски конкурентоспособным с нефтехимическими продуктами и мох:«<
быть также получен из возобновляемых ресурсов. Поэтому концетцц,,
химического сырья и экономичность метанола, как альтернативного
топлива, широко обсуждаются в научном сообществе [Olah, 20.15;
Olah et al., 2006]. fl
Факультативные метилобактерий, способные расти на некоторых
полиуглеродных субстратах, обладают полным набором фермент, ь
ЦТК, в отличие от облигатных, и более перспективны для различных
производств [Lidstrom, 2006]. Особенно показательны процессы
М. extorquens AMI как интегральная часть их центрального метаг -
лизма, серии реакций, включающих активацию таких тиоэфиров, как
ацетоацетил-КоА, этилмалонил-КоА, пропионил-КоА и метилмгл -
нил-КоА, участвующих в регенерации глиоксилата в ищГ-вариантс
серинового цикла [Chistoserdova et al., 2004; Chen et al., 2007]. Этр
может быть использовано, например, в биосинтезе поликетидов. Кро-
ме того, метилобактерий образуют продукты, интересные для пр -
мышленности, такие как каротиноиды или ПГБ. fl
Хотя темпы роста и метаболическая эффективность конверсии
субстрата в биомассу и/или продукт зависят от условий культивиро-
вания и могут быть, в принципе, улучшены с помощью инженерии,
они являются важными критериями для оценки основных показателе
в промышленных масштабах. Как и в случае других микробиологи4^
ских процессов, ключевыми вопросами при использовании метило*
бактерий являются скорости роста культуры (производительное^--)
выход (эффективность конверсии углерода). При этом должна ьггь
принята во внимание токсичность метанола. Скорости роста и ур°
накопления биомассы могут быть оптимизированы путем поДДеР^[
ния низкой и стабильной концентрации метанола, поскольку б
высокие значения и внезапные ее сдвиги оказывают токсичное дейс1*
240
ие на бактерии в связи с накоплением ФА [Choi et al., 1989; Plushkell,
Flickinger, 2002]. Кроме того, метаболизм метанола должен тщательно
регулироваться для обеспечения более высокой устойчивости культу-
ра и скорости потребления ФА. Это было достигнуто увеличением
числа копий генов hps и phi у термотолеранта Bacillus methanolicus
rjakobsen et al., 2006]. Недавние исследования показали важные раз-
личия во времени удвоения и степени индукции МДГ-промотора ме-
экду двумя клетками М. extorquens [Strovas et al., 2007]. Такая инфор-
мация позволит оптимизировать контроль роста метилобактерий и
производительность биотехнологического процесса.
Новыми продуктами, получаемыми из метилобактерий, являются
^njwc-зеатин и различные белки, такие как зеленый флуоресцирую-
щий белок (GFP), энтероцин П, ациламидгидролаза, галоалкандегало-
геназа и эстераза [Schrader et al., 2008]. Пример рекомбинантной экс-
прессии эстераз показывает, что М. extorquens может конкурировать с
с установленными системами экспрессии эстераз у дрожжей Pichia
pastoris и Е. coli. Проведена показательная ферментация М. extorquens
АТСС 55366 при высокой плотности клеток для получения GFP как
модельного рекомбинантного белка [Belanger et al., 2004].
В целом, несмотря на быстрое накопление биохимических и генети-
ческих знаний о метилобактериях, известно немного примеров разрабо-
танных биотехнологий применительно к метилотрофам. Причина в том,
что биопроцессы на метаноле не обеспечены ферментерами особого
типа и периферийным оборудованием. Тем не менее важные отличия от
обычного культивирования микроорганизмов касаются конкретных пи-
тательных сред и физиологии метилотрофов и имеют серьезные послед-
ствия для дизайна и масштабирования. Прежде всего используются про-
стые и экономичные минеральные среды. Это значительно сокращает
спектр образующихся продуктов и позволяет избежать различий в тех-
нологии биопроцессов в случае незначительных изменений в составе
исходного сырья. Кроме того, можно избежать различий в технологии
биопроцессов из-за незначительных изменений в составе исходного
сырьевого комплекса.
Суммируя информацию, изложенную в данной главе, следует при-
знать, что поистине неисчерпаемый биотехнологический потенциал
Пробных метилобактерий реализован поверхностно и в этом смысле
напоминает видимую часть айсберга. Однако нет сомнения, что совме-
стные усилия микробиологов, биохимиков и генетиков в итоге приведут
к полному пониманию структурно-функциональной организации и к
более эффективной практической реализации уникального метаболизма
Пробных метилобактерий.
241
Заключение
Последние десятилетия отмечены захватывающими открытия-•
которые привели к лучшему пониманию экологии, метаболизма J
нетики и филогении аэробных метилобактерий. 1
Разработаны новые методы детекции аэробных метилобактерий
природе, включая анализ консервативных, предположительц
древних генов, SIP с различными
ляции, основанные на редокс-чувствительном красителе.
Обнаружено, что способностью к метилотрофии обладают пре .
сгавители разных филумов, семейств и порядков бактериального
домена. J
।-субстратами, а также манигу
Открыты ранее неизвестные ферментные системы первичног
окисления Ci-соединений: кобальтзависимые CmuABC-метид.
трансферазы корриноидного пути метаболизма метилгалидов
ТГМП-модуль, включающий ФА-активирующий фермент (Fae) и
MtdA/B дегидрогеназы/трансферазы, а также низкоаффинная ме-
танолдегидрогеназа (Mdh2). Идентифицированы гены/ферменты,
ответственные за перенос аминометильных групп от метиламина
на глутамат с последующим окислением до ФА, метилен-ТГФ или
формиата. w
Постулировано, что не только формальдегид, но и формиат явля-
ются точками разветвления путей Cj-ассимиляции и диссимиля-
ции. Расшифрован этилмалонатный путь и решена давняя пробле-
ма конверсии ацетил-КоА в глиоксилат у метилобактерий, лишен-
ных изоцитратлиазы, что привело к перерасчету балансового урав-
нения серинового цикла: НСНО + СОг —* Ацетил-КоА. Л
Результаты геномики, протеомики и метагеномики подтвердили
модульную природу С]-метаболизма у метилобактерий, а также
возможность неоднократного появления, утраты и латерального
переноса соответствующих генов. &
Подтвержден принцип структурно-функциональной надежности,
проявляющийся во множественности генов/ферментов путей, оце-
нен их вклад в общий поток Сj-метаболизма в зависимости от ус-
ловий культивирования. Транскрипционная регуляция впер! не
показана для серинового цикла и пути биосинтеза эктоина,
весь каскад событий (сигналы, рецепторы и эффекторы) требу**
детальной расшифровки.
Биотехнологический потенциал аэробных метилобактерий расШ*1'
рен примерами успешной реализации в процессах биосинтеза
ных метаболитов (эктоины) и биополимеров (ПГБ, ЭПС).
В числе нерешенных проблем остается расшифровка механизмов
„эробной денитрификации с метаном и метанолом. Другим важным
иовом станет идентификация генов/ферментов и путей Срметабо-
пизма у вновь выделенных малоизученных метилобактерий. Струк-
аэр
pi>-
ерекрываюшейся специфичностью, таких как MtdA, MtdB и FolD
рно-функциональная характеристика ряда ключевых ферментов с
0ерекрь,ваюше^ся специфичностью, таких как MtdA, MtdB и FolD,
представляет еще одну интересную биохимическую загадку. Основ-
ная экологическая парадигма состоит в понимании механизмов взаи-
мОдействия метанотрофов и метилобактерий с другими участниками
биосферных циклов макроэлементов (С, N, Р, S) и обнаружении пока
неизвестных важных компонентов этих циклов.
Таким образом, основные нерешенные вопросы включают пони-
мание особенностей экофизиологии, биохимии и генетики новых
штаммов, а также свойств и регуляции известных генов/ферментов у
модельных метилобактерий. Важными направлениями будущих ис-
следований остаются разнообразие, распространение и молекулярные
основы адаптации метилобактерий в различных природных место-
обитаниях, включая фитосимбиоз, а также реализация их метаболиче-
ского потенциала в различных сферах биотехнологии.
Активное применение различных “омик ’-технологий, в том числе
секвенирование нового поколения в комбинации с эксперименталь-
ными подходами, является ключом к решению актуальных вопросов
аэробной метилотрофии. В частности, все возрастающие возможности
анализа некультивируемых бактерий на уровне популяций или одной
клетки, как ожидается, станут инструментом и залогом будущих от-
крытий новых удивительных аспектов феномена метилотрофии.
Приложение
А. Методы исследования аэробных метилотрофов
Культуральные методы
Выделение накопительных и чистых культур. Основной по
при выделении чистых культур метилотрофных бактерий, адаптщ о
ванных к условиям изучаемого биотопа, заключается в использова-'и
сред и параметров культивирования, максимально соответствующих
условиям in situ (pH, температура, NaCl). Часто метилотрофные со-
общества состоят из тесно связанных ассоциаций гетеротрофных и
метанотрофных бактерий, и попытки их разделения приводят к п тс-
ре метилотрофного компонента. Эго, по-видимому, связано с зависи-
мостью метилотрофов от образуемых гетеротрофами ростовых фак-
торов или биостабилизаторов. В таких случаях первичное накопление
метилотрофов ускоряется добавлением стерильного фильтрата куль-
туральной жидкости накопительной культуры или спутника.
Наиболее часто используемые среды и методы культивирования
метилобактерий приведены ниже. Методология идентификации и
описания новых изолятов аэробных метилотрофных бактерий приве-
дена в табл.1. "Ч
Культивирование аэробных метилобактерий на жидких сре-
дах. Для культивирования метилобактерий используют среду “К”
(г/л): КН2РО4 - 2, (NH4)2SO4 - 2, NaCl - 0.5, MgSO4 х 7Н2О - 0. i25,
FeSO4 х 7Н2О - 0.002. Среду готовят на дистиллированной воде, pH
7.2 устанавливают раствором NaOH. Культивирование бактерий:
- среду разливают по 100 или 200 мл в колбы Эрленмейера
(750 мл) и закрывают ватными пробками; А
- колбы со средой стерилизуют при 1 атм. 1ч; J
- в колбы после стерилизации асептически вносят Сгсубстрат-
метанол (0.5% об./об.) или метиламин (1 мл 30% стерильного
раствора CH3NH2 х НС1 на 100 мл среды)
- инокулируют среду 1-3 суточной культурой метилобактерий
(10 мл суспензии на 100 мл среды)
- колбы встряхивают на роторной качалке (120-180 об/мин) при
29°С или других температурах. 1
Многие метилобактерий хорошо растут на простой среде К, н'*
рост некоторых штаммов существенно стимулируется микроэлеме*1'
тами. Раствор микроэлементов может включать (мг/л): МагЭД'ГА
(ТрилонБ)- 4.0, СоС12 х 6Н2О - 0.3, MnCl2 х 4Н2О-0.1, CuSO4 *
244
Таблица 1
Методология описания новых щтаммов метилотрофных бактерий
Свойства
Морфология:
_ форма клетока
_ размеры клеток (диаметр, длина)6
_ подвижность11 и жгутикование"
, тип деления клеток (бинарное, почкование)
_ клеточная дифференциация и жизненный цикл
- образование структур (капсулы, слизь, споры, цисты)
_ тип клеточной стенки (Грам"1 или Грам-)
- ультраструктура11 (ВЦМ, гранулы ПГБ, полифосфаты, вакуоли)
Химический состав:
_ цвет биомассы и колоний
- каротиноиды
- хиноны
- жирные кислоты
- фосфолипиды
- запасные материалы (полигидроксибутират, гранулы гликогена)
Филогенетический анализ:
- Г + Ц мол.% ДНК
секвенирование гена 16S рРНК и построение филогенетического дерева
секвенирование функциональных генов метилотрофии (метанолдегидроге-
назы) и построение филогенетических деревьев по их транслированным
аминокислотным последовательностям
- ДНК-ДНК гибридизация (реассоциация или на фильтрах)
Физиология:
- среда выращивания
- температурная область роста и оптимум
- pH область роста и оптимум
- концентрация NaCl для роста и оптимум
- потребность в витаминах
~ источники углерода и азота
- отношение к кислороду (аэроб или микроаэрофил)
Пути первичного Срметаболизма:
~ определение активности ключевых ферментов Ci-окисления и ассимиля-
ции: МДГ (ФМС, НАД4, МТТ), МАДГ, МАО, ОПР, ГФС, РубисКО
Источник выделения:
физико-химические параметры
2 Н, соленость, температура
Примечания:
а~ световая микроскопия;
° ~ световая и электронная микроскопия;
8 ультратонкие срезы клеток, электронная микроскопия.
245
X 5H2O - 0.05, ZnSO4 X 7H2O - 0.1, Na2MoO4 X 2H2O - 0.02. PacTBo
1 _ 1 Л C\ - p
300, MnCl2 X 4H2O
стерилизуют при 1 атм 1 ч и хранят при 4°С, добавляют 1
100 мл среды. Содержание элементов в среде выделения или кузь
вирования метилобактерий не обязательно должно соответство
концентрациям в естественных эконишах. Для соответствия полези
определить общий элементный состав биомассы культуры.
Для выделения и культивирования алкалофильных метилобак?
рий используют среду “М” следующего состава (г/л): КН РО - । д'
KNO3 - 1.0, MgSO4 X 7Н2О - 0.2. После стерилизации добавляю*
5 мл/л среды раствора микроэлементов (мг): РеМН4-цитрат - 3qq
СаС12 X 2Н2О - 300, MnCl2 X 4Н2О - 50, ZnSO4 X 7Н2О - 50. CuSO4x
X 5Н2О - 5 в 100 мл дистиллированной воды. pH 9.0 устанавлива! т
добавляя 5 мл 2 М NaHCO3 и 1 мл 1 М Na2CO3 на 200 мл среды.
Некоторые представители рода Methylophag^зависят от витамин-
Bi2, который добавляют в концентрации 20 мкг/л среды, тогда ка -
представители рода Paracoccus могут нуждаться в биотине или тиа-
мине (10-20 мкг/л). В качестве комплексного источника витаминов
можно добавлять 0.1 мл дрожжевого автолизата на 100 мл среды.
Культивирование метилобактерий на плотных средах (в чашках
Петри или пробирках) осуществляют на агаризованной среде (“Difco”
2%), в которую перед застыванием добавляют Cj-субстрат. Я
Рис. 1. Культивирование деструкторов дихлорметана на жидкой (а) и агаризован-
ной (б) средах с бромтимоловым синим : образующаяся при дегалогенировании НС*
окрашивает среду в желтый цвет
Дестру кторы моно- и дихлорметанауупътмвжруют на среде, в ко-
торую вносят индикатор - бромтимоловый синий (0.1 г/л). Образу10'
щаяся из моно- и дихлорметана НС1 окрашивает среду в желтый ив*1
(рис. 1). На плотных средах (в чашках Петри или пробирках с ин
орным агаром) метилобактерий выращивают в парах моно- и ди-
дОрметана (0.1 мл/л объема) в эксикаторах. Культивирование в жид-
0 среде проводят в колбах Эрленмейера (250 мл) с 50 мл среды,
плотно закрытых завинчивающимися пробками с резиновыми мем-
бранами (Precision Sampling Corp., Baton-Rouge, США) (см. рис. 1).
Поскольку рост бактерий на среде с моно- и дихлорметаном ингиби-
руется при концентрации выше 20 мМ, субстрат вносят шприцем рав-
ными порциями по 10 мМ. Перед добавлением второй порции гало-
метанов образующуюся НО нейтрализуют стерильным 5N NaOH.
Хранение культур
Для хранения метилобактерий в лиофилизованном состоянии
используют культуры, выращенные на агаризованной среде и ото-
бранные в начале стационарной фазы роста. В качестве биопротекто-
ра используют стерилизованное текучим паром обезжиренное молоко
или Ю% молоко фирмы Difco (USA). Биомассу бактерий суспенди-
руют в молоке и разливают Пастеровской пипеткой по стеклянным
ампулам. Культуры подвергают сублимационной сушке, согласно
инструкции, разработанной для конкретной лиофильной установки.
Вскрывают одну ампулу из каждой лиофилизованной культуры и оп-
ределяют численность колониеобразующих единиц посевом из деся-
тикратных разведений на агаризованную среду в чашках Петри. Ам-
пулы распределяют на две группы и хранят при +4°С и -70°С. Еже-
годно в ампулах определяют КОЕ.
Хранение при низких температурах. Суспензии культур в
25-45% глицерине или 10% диметилсульфоксиде (ДМСО) в ростовой
среде в пластиковых завинчивающихся пробирках типа “Nunc” (Да-
ния) хранят в замороженном состоянии при -70°С. Кроме того, био-
массу культур с агаризованной среды можно хранить на хроматогра-
фической (Ватман 1-3) или стекловолокнистой (Ватман GF/A, GF/F)
бумаге при -70°С. Жизнеспособность культур проверяют ежегодно.
Современные методы изучения разнообразия аэробных мети-
лотрофных бактерий
Исследования последних десятилетий подтвердили мнение, что
большинство микроорганизмов остаются некультивируемыми [Rappe,
Giovannoni, 2003]. Одним из следствий такого вывода стала волна
независимых от культивирования подходов, особенно детекция рибо-
сомной ДНК и необходимых функциональных генов методом ПЦР
IHe et al., 2007; Huse et al., 2008]. Однако, несмотря на успешность
этих методов, стало ясно, что комбинация подходов, соединяющих
Генетическую информацию с метаболической функцией, включая бо-
,£е творческие попытки культивирования, лучше служит пониманию
Экофизиологической роли природных микробных сообществ [Orem-
247
land et al., 2005; Donachie et al., 2007]. Когда речь идет о метилобакГе
риях, важен вопрос, насколько хорошо в лабораторных условиях «зу.
ценные модельные объекты отражают поведение природных попудо
ций, участвующих в круговороте различных Сi-соединений в прир0,
де? В самом деле, открытие новых метилотрофных филумов, таедй
как Verrucomicrobia и метилобактерий, представляющих известные
группы, но не обладающих обычными генами Сгокисления (напри.
мер, Burkholderiales), является предупреждением против излишНег
доверия подходам, основанным на ПЦР.
Оценка разнообразия и активности метилотрофов в местах обита-
ния - необходимый этап при исследовании их биогеохимической и
экофизиологической роли. Однако традиционные культуральные ме-
тоды, как правило, не выявляют реальный состав метилотрофных со-
обществ. В то же время, структурно-функциональная специализации
метилотрофов на использование С i-субстратов дает возможность при-
менять специфические биомаркеры. <И
Молекулярно-биологические методы основаны на наличии уни-
версальных генетических маркеров, таких как рибосомные и группо-
специфичные структурные гены. Эти методы позволяют обнаружит
представителей различных таксономических групп, определить их
видовой состав, а также выявить микроорганизмы, ранее не описан-
ные и не культивируемые в лабораторных условиях. В настоящее
время разработан ряд методических подходов к исследованию бакте-
риальных геномов in situ, и, что характерно, большинство из них бы-
ли применены при изучении метилотрофных популяций.
Объектами ПЦР-анализа при исследовании метилобактерий явля-
ются гены, кодирующие 16S рРНК (“филогенетические” гены), а так-
же “функциональные” гены, такие как mxaF, кодирующий большую
субъединицу МДГ. Для детекции гена mxaF используются пары прай-
меров fl003-г 1561 или fl003-1555r (табл. 2) [McDonald, Murrell, 1997;
Neufeld et al., 2007b], Однако более точной является двухступенчатая
амплификация с дополнительной парой праймеров mxaFjor-
mxaF_rev [Moosvi et al., 2005а]. Специфические пробы были разрабо-
таны для детекции специализированных функций, таких как окисле-
ние метиламина, метилгалидов и метансульфоновой кислоты. Так. с
помощью пары праймеров mauAfl-mauArl амплифицируется фраг*
мент гена малой субъединицы МАДГ - таиА, а пара праймеров 929/’
1669г применялась для детекции корриноидной метилтрансфераз^
стиА, участвующей в разложении хлорметана у аэробных метилобаК^
терий (см. табл. 2) [McAnnulla et al., 2001а,b; Neufeld et al., 2007b[-
учетом клонированных и секвенированных последовательностей cltai
генного кластера Aminobacter ciceronei IMB-1 и Aminobacter liss
248
249
sis CC495 ПЦР-праймеры для амплификации стиА были в дальне*'
шем усовершенствованы [Warner et al., 2005]. Они оказались Полвк
ными для анализа разнообразия этого гена в различных накопитеп/
ных культурах, бактериальных изолятах и природных образцах [Milk
et al., 2004; Borodina et al., 2005; Schaefer et al., 2005].
Пара праймеров Cfor-Crev, используемая для амплификации ков
сервативного фрагмента генов дихлорметандегалогеназ (dcm/л
аэробных метилобактерий, дает возможность определить при над.
лежность обнаруженных ДХМДГ к А- или В-типу по длине целевого
продукта (450 п.н. для A-типа и 441 п.н. для типа В) [Vuilleumier и а]
2001]. Для детекции гена субъединицы гидроксилазы метансульфоно-
вой кислоты msmA в чистых культурах и метагеномной ДНК испол' -
зуются праймеры forA-Blrev2 [Baxter et al., 2002]. Для дополнитель-
ной точности может быть использован второй шаг амплификации с
парой праймеров msmA_for-msmA_rev (см. табл. 2) [Moosvi сч al.
2005а]. Перечисленные целевые гены/ферменты высококонсерч>тив-
ны у известных метилобактерий.
Разработаны вырожденные праймеры на менее консервативные
ферменты, являющиеся частью ТГМП-зависимого пути окисления
формальдегида, общего для большинства метилотрофов. Последова-
тельная двухступенчатая амплификация генов формальдегид-акгиви-
рующего фермента fae (faelf-faelr и fae2f-fae2r), метилен-ТГМП-
дегидрогеназы mtdB (mtdB 1 f-mtdB 1 г и mtdB2f-mtdB2r), меТинил-
ТГМП-циклогидролазы meh (mch-2a-mch-3 и mchl-mch2) может ис-
пользоваться для детекции ТГМП-пути у метилотрофов различных
филогенетических групп (см. табл. 2). Разработаны также специфиче-
ские праймеры на ген D-субъединицы формил-МФ : ТГМП-формил-
трансферазы flicD [Vorholt et al., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2004; Ka-
lyuzhnaya et al., 2005b]. Эти праймеры могут помочь выявить оСшир-
ный спектр филогенетических групп, включая новые, еще не иденти-
фицированные филумы [Kalyuzhnaya et al., 2005а; Nercessian et al,
2005].
Пул ПЦР-фрагментов филогенетических или функциональных ге-
нов метилотрофов подвергается клонированию с последующим рест'
рикционным анализом. После разбиения ампликонов на группы с
одинаковыми нуклеотидными последовательностями производите* ИХ
секвенирование и анализ, позволяющий установить филогенетиче-
скую принадлежность метилотрофов. Эти праймеры могут поМ'*’
выявить обширный спектр филогенетических групп, включая нй^ые,
еще не идентифицированные филумы [Kalyuzhnaya et al., 2005а; ч*еГ
cessian et al., 2005].
Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) по-
Зроляет разделить амплифицированные фрагменты ДНК с минималь-
ными вариациями последовательностей при возрастающих денатури-
рующих условиях и прямое их сравнение. Интересующие фрагменты
иогут быть вырезаны из геля, реамплифицированы и секвенированы,
qTo значительно упрощает проведение филогенетического анализа.
Анализ одних только генов 16S рРНК вполне достаточен в случа-
ях. когда устанавливается филогенетическая принадлежность данной
цистой культуры метилобактерий или если нуклеотидные последова-
тельности фрагментов генов 16S рРНК обладают высоким сходством
с таковыми известных бактерий. Однако амплифицированные фраг-
менты генов 16S рРНК часто имеют последовательности, значительно
различающиеся у культивируемых бактерий, что затрудняет установ-
ление принадлежности новых изолятов к метилобактериям. Напротив,
анализ “функциональных” генов обеспечивает высокую избиратель-
ность детекции, поэтому является инструментом большинства совре-
менных исследований экологии метилобактерий. Наиболее полную и
достоверную информацию о присутствующих в изучаемом образце
метилобактериях удается получить путем одновременного анализа
“филогенетических” и “функциональных” генов.
Редокс-чувствительностъ. Разработан оригинальный метод, по-
зволяющий выявлять специфический ответ членов сложных природ-
ных сообществ на экзогенные Ci-субстраты по интенсивности флуо-
ресценции редокс-чувствительного красителя Redox Sensor Green
(RSG) (Invitrogen, США). Обнаруженные в реальном времени субпо-
пуляции, отвечающие на такой Ci-стимул, могут быть отделены про-
точной цитометрией и сортировкой клеток с последующим профили-
рованием методом ПЦР. Сообщество донных осадков озера Вашинг-
тон (США) использовали в качестве модели активации специфиче-
ских субпопуляций экзогенным метаном, метанолом, метиламином
или формальдегидом. Некоторые члены этих субпопуляций, отнесены
к известным метилотрофным филумам, тогда как другие представля-
ли новые филумы [Kalyuzhnaya et al., 2008с].
Недавно этот редокс-чувствительный краситель использовали для
Разработки нового подхода, названного отображением дыхательного
01 вета RRI (Respiration Response Imaging). Постулировано, что ско-
рость такого дыхания пропорциональна интенсивности флуоресцен-
ции (RR[) и позволяет наблюдать за ответом популяций микробных
К1еток на природные изменения/стрессы в реальном времени на
Уровне отдельной клетки. Ответы чистых культур метилобактерий
Мучали после добавления С i-субстратов. Подобные эксперименты
также проводили на природных образцах для демонстрации приме-
251
С-субстраз-ассимилирующих прокариот
С; организмы, которые не усваивают
нимости RRI и выявления индивидуальных клеток, отвечающих
С|-стимулы [Chistoserdova et al., 2009].
Анализ состава стабильных изотопов. Результативным мем
дом, широко используемым для выявления активно метаболизируй
щих метилотрофов, является анализ состава стабильных изотоп
(DNA-Stable Isotope Probing), впервые введенный проф. К. Марр^л
лом. Среди зондов, нацеленных на нуклеиновые кислоты, изначально
был разработан ДНК-SIP (на основе анализа ДНК), примененный,^
метанолиспользующих метилобактерий [Radajewski et al., 2000; 2003]
Затем был разработан SIP с использованием ДНК/РНК и ряда 13С-ме.
ченных субстратов. Принцип метода основан на ассимиляции “тяже-
лого"’ углерода в биомассу активной популяции в окружающей сре
при добавлении 13С-меченного субстрата (>99%) в экспериментах на
микрокосмах. Биомасса 13
включая ДНК/РНК, метится 13
“тяжелый” субстрат, остаются немеченными. Далее нуклеиновые хи-
слоты меченых и немеченых прокариот физически разделяются ульт-
рацентрифугированием в градиенте плотности, а “легкие” и “тяже-
лые” фракции ДНК и РНК затем можно исследовать с помощью мо-
лекулярных методов микробной экологии. Добавление этому микроб-
ному сообществу Ci-соединений, изотопно меченных различным об-
разом, дает более сложную картину специализированных метило-
трофных “гильдий” по отношению к универсалам.
Методология SIP все еще является объектом исследования, по-
скольку, как не зависящий от культивирования подход, иногда при ’T-
ДИТ к ошибкам. Для получения действительной картины активности'
и нативных процессов в данном окружении SIP-эксперименты долж-
ны проводиться в условиях, наиболее близких in situ. Для успешном
мечения требуется несколько большая концентрация субстрата, *км
in situ, а зачастую необходимые длительные инкубации могут привес-
ти к некоторому обогащению ДНК быстрорастущих бактерий. Одна-
ко, если концентрация меченого субстрата находится в пределах при-
родных концентраций и мало метки включается в ДНК, нужны до-
полнительные шаги, такие как полногеномная амплификация. Вдоба-
вок, длительные инкубации повышают вероятность мечения других
клеток путем перекрестного питания. Несмотря на возможность от-
крытия неожиданных участников цикла С i-соединений, результаты
S1P всегда должны интерпретироваться критически. Детальное
сание, анализ достоинств и недостатков этого метода можно найти ’•
экспериментальных и обзорных статьях [Radajewski et al., 2000; 2003;
Borodina et al., 2005; Neufeld et al., 2007a,b,c; 2008]. x
Метагеномика или природная геномика недавно стала эффектив-
ным средством сбора информации о микробных сообществах вместо
культивирования отдельных видов, и этот подход продолжает разви-
ваться [Schloss, Handelsman, 2005]. В случае малой сложности мик-
робных сообществ могут быть получены геномные данные высокого
качества для отдельных видов и собраны практически полные геном-
ные последовательности [Tyson et al., 2004]. Однако в сообществах с
высокой сложностью секвенирование обычно заканчивается получе-
нием коротких несобираемых последовательностей [Tringe et al.,
2005; Rusch et al., 2007].
Метилобактерии зачастую являются членами таких сложных мик-
робных сообществ. Для повышения степени разрешения метагеноми-
ки и полного покрытия геномов метилотрофов метагеномным набо-
ром данных применяется стратегия комбинированного субстрат-
специфичного мечения метилотрофной ДНК путем SIP с метагеном-
ным секвенированием. Так, использование пяти различных По-
меченных субстратов (метана, метанола, метиламина, формальдегида
и формиата) привело к секвенированию пяти shot-gun-библиотек и
получению набора данных размером 255 м.п.н. (от 26 до 59 м.п.н. на
последовательность). Анализ последовательностей 16S рДНК пока-
зал, что сложность сообщества метагенома значительно уменьшилась,
по сравнению с таковой необогащенного сообщества (>5000 видов), и
произошел сдвиг к специфическим функциональным группам, кото-
рые также включали известные виды метилотрофов. Таким путем
почти полностью удалось извлечь из метагенома собранный геном
одного из доминирующих метилотрофов Мethylotenera mobilis и осу-
ществить сравнительный анализ [Kalyuzhnaya et al., 2006, 2008b].
Б. Диагнозы родов аэробных метилобактерий
A cidomonas
[A.ci.do.monas. Gr. adj. acid — кислота; Gr. n. monas — единица, мо-
нада; M.L. fem. n. Acidomonas - ацидофильная монада].
Грамотрицательные неподвижные палочки, 0.8-1.0 х 1.5-3.0 pm,
одиночные, реже спаренные. Спор не образуют. На пептонно-дрож-
жевом агаре образуют колонии от белых до желтых. Строгие аэробы с
Дыхательным типом метаболизма; факультативно используют мета-
нол. Реализуют ФБФА-вариант РМФ-пути. Оптимальные для роста
температура 30еС и pH 4.0-4.5. Каталазоположительные. Окисляют
31 анол до уксусной кислоты, а затем до СО2 и Н2О. К нитратредукции
Не способны. Преобладающие жирные кислоты Ci8:i,3OH Ci&o и 2ОН
С|бо- Основной убихинон Ою, в то время как и Qu - минорные
Содержание Г + Ц в ДНК 62 мол.%. 1
Род Acidomonas относится к классу Alphaproteobacteria, поряди
Rhodospirillales, семейству Acetobacteraceae. Типовой вид - Acidonio.
nas methanolic ах [Urakami et al., 1989a]
I
Afipia
[A.fip'i.a.N. L. fem. n. Afipia - от аббревиатуры AFIP, Armed Forces
Institute of Pathology - Военный институт патологии (США), где был
изолирован и идентифицирован типовой вид данного рода]. “
Грамотрицательные палочки, подвижные благодаря одному иди
двум латеральным или приполярным жгутикам. Оксидазо- и уреазо-
положительные. Растут на питательном агаре, ВСУЕ агаре, но не в
присутствии 6% NaCl. Оптимально растут при температуре 25-30иС,
pH 6.8. После 3-х суток инкубации при 32QC на кровяном агаре или на
среде ВСУЕ образуют серовато-белые блестящие колонии с ровным
краем диаметром 0.5-1.5 мм. Подщелачивают лакмусовое молоко. Не
образуют индолы и сероводород. Не вызывают гемолиз, гидролиз же-
латина и эскулина. Брожение не характерно, не образуют кислоты из
D-глюкозы, лактозы, мальтозы или сахарозы. Факультативные м<ти-
лотрофы, реализуют сериновый путь, вариант неизвестен. Использу-
ют такие С]-соединения, как метансульфонат, метанол, метилсуль\о-
нилметан, метилированные амины, формиат. Некоторые представите-
ли рода патогенны для человека. Выделены из питьевой воды. Со-
держание Г + Ц в ДНК 61.5-69 мол.%. ^g|
Род Afipia относится к классу Alphaproteobacteria, порядку
Rhizobiales, семейству Bradyrhizobiaceae. Описано 5 видов: A. birgiae,
A. broomeae, A. clevelandensis, A. fells, A. massiliensis. Типовой
Afipia fells1 - метилотрофный [Brenner et al., 1992]. «м.
A Ibibacter
[Al.bi.bac’ter. L.adj. albus - белый; bacter - эквивалент Gr.n. baktron
- маленькая палочка; M.L.masc.n. Albibacter - маленькая белая пал**!*
Грамотрицательные, аспорогенные бесцветные неподвижньк па-
лочки, располагающиеся по отдельности, парами или кластерами*
Размножаются бинарным делением. На агаризованной среде с м-та-
нолом и глюкозо-пептонном агаре образуют округлые белые выну*'
лые, полупрозрачные, слизистые, матовые колонии 1-2 мм в диэмб!*'
ре. Тесты с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра отрицатели
ные. Образуют индол из триптофана на среде с нитратом в качеств®
источника азота. Нитраты восстанавливают до нитритов. Гидролиз
jot крахмал, но не желатин и целлюлозу. Хемолитогетеротрофы, фа-
культативные метилотрофы, ассимилируют С|-соединения посредст-
вом РБФ-пути после окисления до СО2. Растут на дихлорметане, ме-
тиламине, метаноле, формиате, СО2/Н2 и на широком спектре полиуг-
леродных субстратов. Соли аммония, нитраты, мочевина, пептон, не-
которые аминокислоты и метиламин используют в качестве источни-
ков азота. Строгие аэробы с дыхательным типом метаболизма. Ней-
трофилы и мезофилы. Растут при pH 6.0-9.0 (оптимум 7.5-8.0) и тем-
пературе 10-37-’С (оптимум 28-30-’С). Не растут в присутствии 3%
]ЧаС1. Основной убихинон - Qw- Доминирующие фосфолипиды -
фЭА, ФГ, ФХ и ФС. В жирнокислотном профиле преобладают
С|8;1(о7 и С io. Содержание Г + Ц в ДНК 66.7 мол.%.
Род Albibacter относится к классу Alphaproteobacteria, порядку
Rhizobiales, семейству Methylocystaceae. Типовой вид - Albibacter те-
thylovorans1 [Doronina et al., 2001].
Aminobacter
[Am.i.no.bac’ter. M.L. n. aminum - амин; M.L. n. bacter - палочка,
staff; M.L. masc. n. Aminobacter - аминовая палочка].
Грамотрицательные палочки с закругленными концами, 0.5-0.9 х
1.0-3.0 pm, одиночные, реже спаренные. Спор не образуют, размно-
жаются почкованием. Подвижны благодаря приполярному жгутику.
Накапливают гранулы ПГБ. Строгие аэробы. Хорошо растут на глю-
козо-пептонном агаре. Тесты с метиловым красным и Фогеса-Прос-
кауэра отрицательные. Желатин и крахмал не гидролизуют. Образуют
индол из триптофана. Сероводород не образуют. Выделяют аммиак.
Денитрификация не обнаружена. Тест с лакмусовым молоком отрица-
тельный. Не сбраживают сахара. В качестве источников углерода ис-
пользуют метиламин, триметиламин, триметиламин-М-оксид и саха-
ра. Метанол, метан и водород не используют. Реализуют ищТ-вариант
серинового цикла. В ростовых факторах не нуждаются. Источниками
азота служат аммиак, нитраты, мочевина, пептон и метиламин. Окси-
дазо- и каталазоположительные, не имеют уреазы. Хорошо растут в
интервале pH 6.0-8.0, при температуре 30 и 37,?С, но не 42еС. Не рас-
тут в присутствии 3% NaCl. Преобладающая жирная кислота - Ci8:i,
сРеди гидроксикислот доминирует ЗОН С 12л- Основной убихинон -
Qio. Содержание Г + Ц в ДНК 62-64 мол.%.
Род Aminobacter относится к классу Alphaproteobacteria, порядку
Rhizobiales, семейству Phyllobacteriaceae. Описано 5 видов: A. agano-
ensjs, A aminovorans, A. ciceronei, A. lissarensis, A. niigataensis. Типо-
в°й вид -Aminobacter aminovorans1 [Urakami et al., 1992].
Amycolatopsis
[A.my.co.la.top’sis. M.L. fem. n. Amycolata - род, относящийся к по-
рядку Actinomycetales\ Gr. n. opsis - появление; M.L. fem.n. Amycol..
topsis - похожий на Amycolata], I
Представлены ветвящимися гифами, диаметром 0.5-2.0 цщ
склонными распадаться на квадратные фрагменты. Воздушный мице-
лий иногда может присутствовать. Во время развития воздушные ги-
фы могут оставаться стерильными или дифференцироваться в длин-
ные цепочки, состоящие из квадратных или эллипсоидных споро-
подобных структур. Цепочки спор также образуются на вегетативных
гифах. Эндоспор, склероциев, спорангиев не образуют. Клетки неп .
вижные. Клеточная стенка грамположительного типа, содержит мезо-
диаминопимелиновую (ДАП) и мурамовую кислоты, глюкозамин,
галактозу, арабинозу, глутамат и аланин. Миколовые кислоты не об-
разуют. Мезофилы, аэробы, имеют каталазу. Растут в диапазоне тем-
ператур 10-42аС. Оптимальный pH 6.8-7.2. Некоторые штаммы фа-
культативно автотрофные или метилотрофные. Метилотрофы реали-
зуют ФБФА-вариант РМФ-пути. Доминирующие фосфолипиды -
ФЭА и ФГ. Фосфатидилметилэтаноламин и глюкозам и нсодержащие
фосфолипиды отсутствуют. Основные изопреноидные компоненты -
ди-, тетра- и гексагидрогенизированные менахиноны с девятью изо-
преновыми единицами (МК-9(Н2,Н4,Н6)]. Представители рода изоли-
рованы из почвы, клинических образцов, растительного материала.
Содержание Г + Ц в ДНК 66-69 мол.%.
Род относится к классу Actinobacteria, подклассу Actinobacteridae,
порядку Actinotnycetales, подпорядку Pseudonocardineae, семейству
Pseudonocardiaceae. Описано 38 видов. К метилотрофии способен
только A. methanolica. Типовой вид - Amycolatopsis orientalis
[Lechevalier et al., 1986].
Ancylobacter
[An’cy.lo.bac_ter. Gr. adj. ankylos - резко изогнутый; Gr. n. bakteri-
on - палочка; M.L. masc. n. Ancylobacter - изогнутая палочка].
Изогнутые грамотрицательные палочки, 0.3-1.0 х 1.0-3.0 цт. За-
частую делению клеток предшествует формирование кольца с внеш-
ним диаметром 0.9-0.3 pm. Спиральные, винтообразные, нитчатые и
почкующиеся формы не образуют. Клетки заключены в капсулу. Не*,
которые штаммы имеют газовые вакуоли. Неподвижные, за искль че-
нием одного штамма, имеющего полярный жгутик. Облигатные аэреч
бы с дыхательным типом метаболизма. Температурный диапазон
22-37“С, оптимум pH 7.0. Колонии полупрозрачные, матовые, белые
или кремовые. В жидких культурах образуют тонкие пленки. ОксиД8'
0. и каталазоположительные. Хемоорганотрофы, используют сахара
4 орг анические кислоты в качестве источников углерода. В атмосфере
\]2 наблюдается хемолитотрофный рост. Факультативные метилотро-
фЬ1, способны использовать метанол, формиат, ДХМ. Реализуют РБФ-
руть С ।-метаболизма. Обитают в почве, активных илах, водных эко-
системах. Содержание Г + Ц в ДНК 66-69 мол.%.
Род Ancylobacter относится к классу Alphaproteobacteria, порядку
ghizobiales, семейству Xanthobacteraceae. Род включает 6 видов:
д. aquaticus, A. oerskovii, A. polymorphus, A. rudongensis, A. vacuolatus,
д. dichloromethanicus. Типовой вид - Ancylobacter aquaticus [Raj et al,
1983].
A ngulomicrobium
[An'gu.lo.mi.cro’bi.um. M.L. fem. n. angularis - угловатый; Gr. adj.
micros - маленький; Gr. masc. n. bios - жизнь; M.L.neut. n. Angulomic-
robium - угловатый микроорганизм].
Грамотрицательные, неподвижные, полигональные клетки, ради-
ально симметричные, диаметром 1.1-1.5 цт, тетраэдральной или гри-
боподобной формы. К роду также относятся представители с клетка-
ми треугольной формы. Размножаются почкованием: дочерние клетки
закладываются непосредственно у вершин тетраэдра материнской
клетки, которая удлиняется в диагональном направлении. Между раз-
деляющимися клетками образуется перетяжка. Простек, ламеллярных
мембранных структур и газовых вакуолей не образуют. Облигатно
аэробные хемоорганотрофы. Растут на широком спектре органиче-
ских кислот, моносахаридов и аминокислот, а также на метаноле и
формиате. Реализуют РБФ-путь Ci-метаболизма. Оптимальный рост
при 28-30еС и pH 6.8-7.0. Каталазо- и оксидазоположительные. Со-
держание Г + Ц в ДНК 64.3-68 мол.%.
Род Angulomicrobium относится к классу Alphaproteobacteria, по-
рядку Rhizobiales, семейству Hyphomicrobiaceae. Род представлен
Двумя видами: An. amanitiforme, An. tetraedrale. Типовой вид - Angu-
lomicrobium tetraedrale' [Vasilyeva et al., 1986].
Arthrobacter
[Ar’thro.bac_ter. Gr. adj. arthros - сочлененный; Gr. n. bakterion -
палочка; M.L. masc. n. Arthrobacter- сочлененная палочка]
Клетки на сложных средах претерпевают заметные изменения на
протяжении жизненного цикла. Молодые клетки представлены не-
правильными палочками размером 0.8-1.2 х 1.0-8.0 цт, часто V-
°браз-ные с утолщениями на концах, филаментов не образуют. Сга-
Рьге культуры (2-7 дней) состоят из кокковидных клеток диаметром
257
0.6-1.0 pm, единичных, спаренных, или располагающихся небольщц
ми группами. Такой клеточный цикл характерен для рода. Грамполп
жительные, однако, палочки могут легко обесцвечиваться и грамщи
ложительными оказываются только гранулы. Клеточные стенки
содержат мезодиаминопимелиновой кислоты и арабинозы. Хемоорг?.
нотрофы. Строгие аэробы. Не расщепляют целлюлозу. Каталазополо-
жительные. Растут в среде, содержащей почвенный и дрожжевые экс-
тракты. Температурный оптимум 20-30‘-’С, большинство растут при
1 (PC, но не 37ЙС. Лучше всего растут при нейтральном или слабо щ .
лочном pH. Содержание Г + Ц в ДНК 60-72 мол.%. В
Род Arthrobacter относится к классу Actinobacteria, подклассу АсЦ-
nobacteridae, порядку Actinomycetales, подпорядку Мicrococcineue,
семейству Micrococcaceae. Описано более 60 видов рода Arthrobacter.
К метилотрофии способны A.globiformis, A. sulfonivorans, A. methy-
lotrophus, реализующие РМФ-путь (ФБФА-вариант). Типовой мети-
лотрофный вид: Arthrobacter globiformis 1 (Conn, Dimmick, 1947) [Ло-
гинова, Троценко, 1976; Skerman et al., 1980].
Bacillus
[L. masc. n. bacillus- маленькая палочка]. НИ
Клетки палочковидные, 0.3-2.2 х 1.2-7.0 цт. Обычно подвижные,
жгутики латеральные. Образуют термоустойчивые споры, не боле<
одной в клетке-спорангии. Реакция по Граму положительная, по
крайней мере на ранних стадиях роста. Хемоорганотрофы. Строгие
аэробы или факультативные анаэробы. Метаболизм строго дыхатель-
ный и (или) бродильный, с использованием различных субстрате .
Конечным акцептором электронов служит кислород, который у неко-
торых видов может быть заменен нитратами. Большинство видов ка-
талазоположительные. Строгие аэробы или факультативные акоэрс*
бы. Содержание Г + Ц в ДНК - 32-69 мол.%. I
Род Bacillus относится к филуму Firmicutes, классу Bacilli, пор*,
Bacillales, подпорядку Corynebacteriaceae, семейству Bacillaceae.
Описано 158 видов. К метилотрофии способен В. methanolicus,
культативный умеренный термофил, реализующий РМФ путь (ФБФ*
вариант), имеющий НАД+-зависимую МДГ. Типовой вид - BaciUus
subtilisr (Cohn, 1872) [Skerman et al., 1980]. ifl
Beijerinckia
[Beij.e.rinck_i.a. M.L. fem. n. Beijerinckia названа в честь M.
ринка, известного голландского микробиолога].
Грамотринательные палочки 0.5-1.5 х 7—4.5 цт, концы клёТЛС Я
круглены. Располагаются поодиночке или парами. Иногда образу**’*
258
большие искривленные клетки 3.0 х 5.0-6.0 цт, имеющие развилки и
ответвления. Откладывают гранулы ПГБ на полюсах клетки. Некото-
рое виды обладают капсулой, покрывающей несколько клеток, а так-
формируют цисты. Если имеют жгутики, то они располагаются
перитрихально. Строгие аэробы. Фиксируют молекулярный азот в
анаэробных или микроаэробных условиях. Растут при 20-30йС и
pH 3.0-10. При росте на жидких средах культура становится очень
вязкой, полупрозрачной, а среда - мутной и опалесцирующей. На ага-
ризованных средах, особенно в условиях азотфиксации, продуцируют
большое количество слизи, образуя крупные колонии с гладкой или
складчатой поверхностью. Слизь имеет зернистую консистенцию.
Окисляют глюкозу, фруктозу и сахарозу до СО2. Некоторые штаммы
слабо ассимилируют глутамат. Представители рода обнаружены в
почве, особенно тропических регионов. Содержание Г + Ц в ДНК
54.7-60.7 мол.%.
Род Beijerinckia относится к классу Alphaproteobacteria, порядку
Rhizobiales, семейству Beijerinckiaceae. К роду Beijerinckia относится
5 видов: B.derxii, В. doebereinerae, В. flumenensis, В. indica, В. mobilis.
К метилотрофии способен один вид - В. mobilis, реализующий РБФ-
путь. Типовой вид-Beijerinckia indica1 [Skerman et al., 1980].
Burkholderia
[Burk.hol.de.ri.a. M.L. fem. n. Burkholderia названа в честь
В.Г. Буркхолдера, американского бактериолога, открывшего возбуди-
теля гнили лука].
Грамотрицательне одиночные или спаренные прямые или изогну-
тые палочки размером 0.5-1 х 1.5-4 цт. Подвижны благодаря одному
или чаще нескольким жгутикам. Капсул и простек и покоящихся
форм не образуют. Аккумулируют ПГБ в качестве запасного источ-
ника углерода. Хемоорганотрофы. Обладают строго дыхательным
типом метаболизма, терминальным акцептором электронов служит
кислород. Некоторые виды способны к бескислородному дыханию на
нитрате. Каталазоположительные. В качестве источников углерода и
энергии могут использовать широкий спектр органических соедине-
ний. Растут при температуре 30-40flC, pH 5.5. В жирнокислотном
профиле преобладают С]4;о зон, С|б:о, С|6:о гон, C)6;i, Ci8:i. Реализуют
РМФ-путь, вариант неизвестен. Более половины представителей рода
патогенны для растений, животных и людей. Содержание Г + Цв ДНК
59-69.6 мол.%.
Род Burkholderia относится к классу Betaproteobacteria, порядку
Burkholderiales, семейству Burkholderiaceae. Род представлен 58 ви-
дами. Типовой вид- Burkholderia cepacia [Palleroni, Holmes, 1981]. К
1
метилотрофии способен Burkholderia phymatum [Vandamme
2003].
концами 0.5
Flavobacterium
[L. adj. flavus, желтый; L. neut. n. bacterium, маленькая палоч
N.L. neut. n. Flavobacterium, желтая палочка].
Грамотрицательные палочки с округлыми концами 0.5
х 1.0-3.0 pm, неподвижные. Внутриклеточные включения ПГБ отсут
ствуют. Эндоспор не образуют. Аэробы со строго дыхательным ти,
метаболизма. Растут при температуре 37flC. На твердых средах обр&.
зуют желтые или оранжевые выпуклые полупрозрачные гладкие Где
стящие округлые колонии диаметром 1-2 мм. Имеют каталазу,. КСь>
дазу и фосфатазу. Хемоорганотрофы. На углеводных средах с низким
содержанием пептона образуют кислоту, но не газ. Большинство
штаммов разжижают желатин и разлагают казеин. Широко распр
странены в почве и водных местообитаниях; также обнаружен11 :
ром мясе, молоке и клинических образцах. Содержание Г + Ц в ДНК
31 -40 мол.%.
сы-
Род Flavobacterium относится к филуму Bacteroidetes, классу
Flavobacteria, порядку Flavobacteriales, семейству Flavobacteriace
Описано 60 видов. Типовой вид - Flavobacterium aquatile [Reichen-
bach, 1992]. Метилотрофия у представителей рода показана недавно
[Moosvi et al., 2005а].
Granulibacter
[Gra.nu.li.bac.ter. L. neut. n. granulum зерно, крупинка: N.L. masc. n.
bacter от Gr. n. baktron палочка; N.L. masc. n. Granulibacter — палочка,
вызывающая образование гранулем].
Грамотрицательные неподвижные клетки, кокки или палочки.
Строгие аэробы. Каталазоположительные, оксидазы не имеют. Про-
дуцируют желтый пигмент. Оптимальные для роста температура
35-37 °C и pH 5.0-6.5. Окисляют лактат и ацетат до углекислого г а
и воды. Продуцируют небольшое количество уксусной кислпты из
этанола. Могут использовать метанол в качестве единственной г ис-
точника углерода и энергии сериновым путем. ПредпочитаьэТ ДР
роста высокую концентрацию глюкозы (5% об./об.). Растут на глут**
матном и маннитоловом агаре. Ассимилируют аммонийный аЗ т «.*•
среде с глюкозой. Не образуют дигидроксиацетон из глицерина. (
разуют кислоту из глюкозы и этанола, в меньшей степени - из глкНС-
рина. Содержание Г + Ц в ДНК 59.1 мол.%. -
260
род Granulibacter относится к классу Alphaproteobacteria, порядку
oftodospirillales, семейству Acetobacteraceae. Типовой и единственный
вид - Granulibacter bethesdensis [Greenberg et al., 2006b].
Hansschlegelia
[Hans.schle.ge’lLa M.L fem.n Hansshlegelia - названа в честь из-
gecTHoro немецкого микробиолога - Ханса Г. Шлегеля].
Грамотрицательные, аспорогенные, бесцветные короткие палочки,
единичные или спаренные. Размножаются бинарным делением. Коло-
нии на минеральной среде с метанолом белые, полупрозрачные, вы-
пуклые, округлые 0.1-0.5 мм в диаметре. Облигатные аэробы. Нитра-
ты восстанавливают до нитритов. Ограниченно-факультативные ме-
тилотрофы и хемолитотрофы. Ассимилируют Ci-соединения посред-
ством РБФ-пути. Используют ограниченный спектр полиуглеродных
субстратов. Растут на минеральной среде с Н2/О2/СО2, метанолом,
метиламином, формиатом и глицерином. Ростовые факторы не тре-
буются, но биотин и дрожжевой экстракт оказывают стимулирующее
действие. Источниками азота служат метиламин, аминокислоты, соли
аммония и нитраты. Тесты с метиловым красным и Фогеса-Прос-
кауэра отрицательные. Каталазо-, уреазо- и оксидазоположительные.
Образуют индол из L-триптофана на среде с KNO3 в качестве источ-
ника азота. Растут при pH 5.0-9.0 и 12-379С. Не растут в присутствии
2% NaCl. Основной убихинон - Ою- В жирнокислотном профиле пре-
обладают С18;1С07, С16;о и Cj9:ocyclo. Доминирующие фосфолипиды -
ФЭА, ФХ и ДФГ. Содержание Г + Ц в ДНК 68.5 мол.%. Описано два
вида: Н. plantiphila и Н. zhihuaiae.
Род Hansschlegelia относится к классу AIphaproteobacteria.Типовой
вид-Hansschlegeliaplantiphila' [Ivanova et al., 2007].
Hyphomicrobium
[Hy.pho.mi.cro’ bi.um. Gr. hyphe - нить; Gr. adj. micros - маленький;
Gr. masc. n. bios - жизнь; M.L. neut. n. Hyphomicrobium - микроб, об-
разующий нити].
Грамотрицательные палочки с заостренными концами бобовидной
или овальной формы, 0.3-1.2 х 1-3 щп: образуют моно- и биполяр-
ные нитевидные отростки (гифы или простеки) различной длины
Диаметром 0.2-0.3 щп. Спор не образуют. Гифы не септированы, но
Мембранные перетяжки внутри гиф хорошо заметны. Гифы могут
быть истинно ветвящимися, вторичное ветвление наблюдается редко.
Клетки окрашиваются фуксином. Дочерние клетки возникают в про-
цессе почкования на одном из концов гиф. Зрелые почки становятся
Подвижными, отделяются и прикрепляются к поверхности или другим
261
клеткам, образуя скопления или розетки. Гранулы ПГБ обычно оТКл
дываются на полюсах клетки. Колонии на твердых средах мелки *
даже после длительной инкубации; коричневые в проходящем с--,.
или ярко-бежевые - в отраженном. Поверхность колоний блестяща»
или гранулированная, складчатая, или гладкая. Хемоорганотр Лц
аэробы, олигокарбофилы, нуждаются в СОг. Добавление почваннол
вытяжки может стимулировать рост при сохранении нейтральны»
значений pH. Используют метанол, моно-, ди- и триметиламины мо-
но- и дихлорметан, а также S-метил соединения - ДМС, ДМСО, диме-
тилсульфон. Реализуют ицл+-вариант серинового пути. Аммиак и не-
которые аминокислоты могут служить источниками азота. Нитрид и_
кация не обнаружена. Мезофилы, оптимум температуры - 20-15аС
оптимум pH - 7.0. Широко распространены в почвах и водных место-
обитаниях. Содержание Г + Ц в ДНК 59-65 мол.%.
Род Hyphomicrobium относится к классу Alphaproteobacteria, по-
рядку Rhizobiales, семейству Hyphomicrobiaceae. Описано 13 ви.. в:
Н. aestuarii, Н. chloromethanicum, Н. coagulans, Н. denitrificans, Н.
le subsp. facile (corrig.), H. facile subsp. tolerans (corrig.), H. facile S'.jbsp,
ureaphilum, H. hollandicum, H. indicum, H. methylovorum, H. neptunium,
H. sulfonivorans, H. vulgare, H. zavarzinii. Типовой вид - Hyphomicro-
bium vulgare[ [Hirsch, 1989].
Labrys
[Lab'rys. Gr.n. Labrys - двухголовый организм, формой клеток на-
поминающий Минойский топор]. В
Грамотрицательные, треугольные, радиально симметричны? клст-
ки, 1.1-1.3 х 1.3-1.5 цт. Образуют две или три простеки, заостренные
на концах (длиной менее 0.6 цт), берущие начало в углах треуголг-
ника. Третий угол остается свободным и задействован в размножении,
которое происходит по типу почкования. Почки образуются непо-
средственно из материнской клетки, на вершине треугольника, ли-
шенной простек. На этой стадии клетка напоминает двуглавый т< гор.
Клетки неподвижные, лишены пилей. Облигатно аэробные, хемоор-
ганотрофы. В качестве единственного источника углерода и энергии
используют углеводы и некоторые органические кислоты. Метан‘«Д-И
метилированные амины ассимилируют сериновым путем, вариант
неизвестен. Типовой штамм нуждается в витаминах группы В Л*||
роста. Оксидазо- и каталазоположительные. Растут при температур®
289С и pH 7.2. Негалофильные. Встречаются в пресноводных озер-'-**
Содержание Г + Ц в ДНК 67.9 мол.%.
Род Labrys относится к классу Alphaproteobacteria, порядку R °'
biales, семейству Hyphomicrobiaceae. Описано 6 видов: L. methyl1*^
262
Itiphilus, L. miyagiensis, L. monachus, L. neptuniae, L. okinawensis, L. por-
flicalensis. Типовой вид -Labrys monachal [Vasilyeva, Semenov, 1985].
Methylarcula
[Me.thyl.ar.cu’la. Fr. methyl - метильная группа; L. fem.n. arcula -
маленькая коробка; M.L. fem.n. Methylarcula - маленькая метило-
трофная клетка].
Неподвижные грамотрицательные палочки, 0.5-0.8 х 0.8-2.0 цт.
Аккумулируют гранулы ПГБ. Эндоспор и простек не образуют. Цвет
колонии от белого до бледно-розового. Пиоцианин и флуоресцеин не
продуцируют. Строгие аэробы с дыхательным типом метаболизма.
Умеренные галофилы, NaCl необходим для роста, накапливают экто-
ин внутриклеточно в качестве главного осмопротектора. Нитраты
восстанавливают до нитритов. Хемоорганотрофы. Факультативные
метилотрофы, ассимилируют метилированные амины посредством
ицл-варианта серинового цикла. В качестве источников углерода и
энергии используют, наряду с метиламином, сахара и некоторые ор-
ганические кислоты. Соли аммония, некоторые аминокислоты и ме-
тиламин служат источниками азота. Не требуют добавления ростовых
факторов. Оксидазоположительные. Кислоты образуют из сахаров
путем окисления. Ацетоин, сероводород и аммиак не выделяют. Син-
тезируют индолы из L-триптофана. Растут при 29QC, pH 6.5-7.5
6-11% NaCl. Преобладающие жирные кислоты Ci8;o, Ci8:i и C^ocyclo.
Основной убихинон - Ою. Доминирующие фосфолипиды - ФЭА и
ФХ. Содержание Г + Ц в ДНК 57-60 мол.%.
Род Methylarcula относится к классу Alphaproteobacteria, порядку
Rhodobacterales, семейству Rhodobacteraceae. Род представлен двумя
видами: М. marina, М. terricola. Типовой вид - Methylarcula marina7
[Doronina et al., 2000а].
Methylibium
[Me.thy.li.bi. 'urn. N.L.n.n. Fr. methyl - метильная группа; Gr.n. bios -
жизнь; N.L. neut. n. Methylibium - метилотрофный организм].
Грамотрицательные прямые подвижные палочки, размножаются
бинарным делением. Оксидазоположительные, лишены желатиназы и
каталазы. Гидролизуют мочевину, восстанавливают нитраты до нит-
ритов. В клетках откладываются гранулы ПГБ. Растут гетеротрофно в
аэробных условиях. Факультативные метилотрофы, в качестве источ-
ника углерода и энергии используют метанол наряду с широким спек-
тРом полиуглеродных субстратов. Реализуют сериновый или РБФ-
пУть. Основной убихинон - О8. В жирнокислотном профиле домини-
руют С16:1(о7с И С16:о; минорная фракция СОСТОИТ ИЗ 3-ОН Сю:0, Cj2:(b
2-ОН С12:0> 3-ОН С|2:0, С[4;о, С |7:oO)Cycl07-8c, С18;|ш7сИ С)8:0 кислот. С, ,
держание Г + Ц в ДНК 69 мол.%.
Род Methylibium относится к классу Betaproteobacteria, порядку
Burkholderiales. Описано 4 вида: Ml. aquaticum, Ml. fulvum, Ml. petr0.
leiphilum, Ml. subsaxonicum. Типовой вид - Methylibium petroleiphilum1
[Nakatsu et al., 2006].
Methylobacillus
[Meth.yl.o.ba.cil'lus. Fr. methyl - метильная группа; L. dim. n. bacib
lus маленькая палочка; M.L. masc. n. Methylobacillus - маленькая ме-
тилотрофная палочка].
Грамотрицательные палочки, 0.3-0.6 х 0.8-2.0 цт. Неподвижные,
а также с одним или несколькими полярными жгутиками. Большинст-
во представителей - облигатные метилотрофы, растущие на метан. ле
и метиламине, некоторые могут также использовать фруктозу или
глюкозу. Реализуют КДФГА-вариант РМФ-пути. Строгие аэробы п-
тимально растут при 30QC, pH 6-8. Не растут в присутствии 3% hhCl.
Доминирующие жирные кислоты Ci6;o и Ci6:i Основной убихи’юн -
Q8. Содержание Г + Ц в ДНК 50-56 мол.%.
Род Methylobacillus относится к классу Betaproteobacteria, пор* ,ку
Methylophilales, семейству Methylophilaceae. Включает три вида: Ml.
flagellatus, Mb. glycogenes и Mb. pratensis. Типовой вид - Methylobacil-
lus glycogenes1 [Urakami, Komagata, 1986].
Methylobacterium
[Meth.yl.o.bac.te'ri.um. Gr. n. Fr. methyl - метильная группа; Gr n.
bacterion - маленькая палочка; M.L. neut. n. Methylobacterium - мети-
лотрофная палочка].
Грамотрицательные палочки, 0.8-1.2 х 1.0-8.0 цт, зачастую пжо-
морфные; могут ветвиться, что особенно характерно для старых кле-
ток. На агаризованных минеральных средах с метанолом большинст-
во видов образует розовые колонии (за счет синтеза каротинош н го
пигмента), кроме одного неокрашенного вида (М. nodulans). Подвиж-
ны благодаря единственному полярному, около полярному или лите-
ральному жгутику. Строгие аэробы, кислород служит терминаленl,lt
акцептором электронов. Каталазо-, уреазо- и оксидазоположительн1^
Некоторые штаммы способны к нитратредукции. Мезофилы, хемоор-
ганотрофы. Ростовые факторы не требуют, однако пантотенат к?-ЛИ.
ция может оказывать стимулирующее влияние. Факультативные
тилотрофы, растут на ФА (в микромолярных концентрациях), Ф°Р‘
миате и метаноле, некоторые штаммы растут на метилированным
аминах и галометанах. Ассимилируют Ci-соединения посредст^И
264
„еринового цикла (ицл“-вариант). Доминирующая жирная кислота -
С(Н.|. Широко распространены в природе. Содержание Г + Ц в ДНК
^g.0-72.4 мол.%.
Род относится к классу Alphaproteobacteria, порядку Rhizobiales,
семейству Methylobacteriaceae. Описано 35 видов: М. adhaesivum,
д/ aerolatum, М. aminovorans, М. aquaticum, М. brachiatum, М. extor-
quens, М. fujisawaen.se, М. gregans, М. hispanicum, М. iners, М. isbili-
ense, М. jeotgali, М. komagatae, М. rhodesianum, М. mesophilicum,
д/. nodulans, М. organophilum, М. oryzae, М. persicinum, М. phyllo-
sphaerae, М. platani, М. podarium, М. populi, М. radiotolerans, М. rho-
desianum, М. rhodinum, М. salsuginis, М. suomiense, М. tardum, М. thio-
cyanatum, M. variabile, M. zatmanii, M. dichloromethanicum. Типовой
вид- Methylobacterium organophilumT [Patt et al., 1976].
M ethylohalomonas
[Me.thy’lo.ha.lo.mo’nas. N. Gr. n. methyl - метильный радикал; Gr.n.
hals, halos - соль; monas - Gr.n. единица, монада.; N.L. fem. n. Methy-
lohalomonas - галотолерантная палочка, использующая СНз-группы].
Грамотрицательные палочки, облигатные метилотрофы, исполь-
зуют метанол и метиламин в качестве источников углерода и энергии,
реализуют ицл"-вариант серинового цикла. Гало- и нейтрофильные.
Растут при pH 6.8-8.2 (оптимум 7.5), 0.5-4.0 М NaCl (оптимум
2.0 М). Доминирующие жирные кислоты С^ю, С^осус и 10-метил
С]6;о. Типичные местообитания - гиперсоленые хлоридно-сульфатные
озера Кулундинской степи. Основной осмопротектор - глицин-
бетаин. Содержание Г + Ц в ДНК 59.6 мол.%
Род Мethylohalomonas относится к классу Gammaproteobacteria.
Типовой вид - Мethylohalomonas lacusY [Sorokin et al., 2007]
Methylonatrum
[Me.thy’lo.na.’ trum. N.Gr. n Fr. methyl - метильная группа; N.Gr.n.
natron - заимствовано из арабского n. natrum или natron - сода, угле-
кислый натрий; N.L.neut.n. Methylonatrum - метилотрофная бактерия,
любящая соду].
Грамотрицательные короткие палочки. Облигатные аэробы, обли-
вные метилотрофы. Реализуют РБФ-путь при росте на метаноле.
Умеренно галотолерантные, облигатно алкалофильные. Растут при pH
8-3-10.5 (оптимум 10.0) и содержании Na+ 0.3-4 М (оптимум 0.5-
’ И). Доминирующая жирная кислота - Сie:ico7. Типичные местооби-
Тания - содовые озера Кении. Содержание Г + Ц в ДНК 62-63 мол.%.
классу Gammaproteobacteria. Типовой вид - Me-
г [Sorokin et al., 2007].
^од относится к
Methylophaga
[Me.thyl.o’pha.ga. M.L.n. methyl - метильная группа; Gr. v. phagej,.
- есть; M.L. n. Methylophaga — потребляющая метильные группы].
Одиночные или спаренные грамотрицательные палочки, 0.2 х
х 0.9-1.0 цт, подвижные благодаря единственному полярному жгу.
тику. Споры и другие покоящиеся формы не образуют. Хемогетеро.
трофы, имеющие дыхательный тип метаболизма, кислород служит
конечным акцептором электронов. Ограниченно-факультативные ме-
тилотрофы, способны использовать для роста ограниченное числ
соединений, включающих метанол, моно-, ди- и триметиламиыы. По-
лиуглеродными субстратами являются фруктоза, глюкоза или caxaip.
за. Реализуют КДФГА-вариант РМФ-пути. Имеют каталазу и окси. а-
зу. Умеренные галофилы. Ионы Na+ и Mg2+, а также для ряда штам»
мов витамин необходимы для оптимального роста. Доминирую-
щие жирные кислоты С|6:ои C16:ico7c. Основной убихинон - Q8. Пред-
ставители рода выделены из морской воды, соленых вод озер и п«гчв,
а также бентосных отложений морей. Содержание Г + Ц в ДНК 42-45
мол.%.
Род Methylophaga относится к классу Gammaproteobacteria, поро -
ку Thiotrichales, семейству Piscirickettsiaceae. Включает 6 видов: М. ul-
calica, М. aminisulfidivorans, М. marina, М. sulfidovorans, М. thalassica,
М. murata. Типовой вид -Methylophaga marina [Janvier et al., 1985].
Methylophilus
[Me.thy.lo.phi.lus. M.L.n. methyl - метильная группа; Gr. adyphilns-
любить; M.L. masc. n. Methylophilus — любитель метильных групп].
При росте на средах с метанолом - прямые или слегка изогнутые
палочки, 0.3-0.6 х 0.8-1.5 цт, единичные или спаренные. Клеточная
стенка грамотрицательного типа, но зачастую плохо окрашивается.
Имеют полярные жгутики или неподвижны. Эндоспор, капсул и про-
стек не образуют. Колонии на минеральной среде с метанолом после
двух дней инкубации при температуре 30-37QC - округлые с ровным
краем, выпуклые, полупрозрачные, матовые или желтые, 1-2 мм в
диаметре. Оптимум pH - 6.5-7.2. Строгие аэробы. Облигатные и г-
раниченно-факультативные метилотрофы, используют метанол, ме-
тилированные амины, формиат, а также глюкозу и фруктозу в качест-
ве источников углерода и энергии. Реализуют КДФГА-вариант РМЧ
пути. Используют нитраты и соли аммония в качестве источников
азота. Каталазо- и оксидазоположительные. Доминирующие жир**1*'
кислоты - С|б:0 и С]б:ь Основным изопреноидным хиноном являете*
убихинон О8. Содержание Г + Ц в ДНК 50-54 мол.% (Тпл). Источники
выделения: активный ил, почва, речная и озерная вода, растения.
Род Methylophilus относится к классу Betaproteobacteria, порядку
yfethylophilales, семейству Methylophilaceae. Род включает 6 видов:
yfph. leisingeri, Mph. methylotrophus, Mph. quaylei, Mph. rhisosphaera,
yfph. flavus, Mph. luteus. Типовой вид - Methylophilus methylotrophus^
penkins et al., 1987]
Methylopila
[Me.thyl.o.pi.la. M.L.n. methyl - метильная группа; Gr.n. pila - шар
йЛи сфера; M.L Methylopila метилотрофная сферическая клетка].
Грамотрицательные палочки, 0.5-0.7 х 1.0-1.3 цт, единичные или
спаренные. Размножаются бинарным делением, простек не образуют.
Ца минеральной среде с метанолом формируют белые колонии. Пио-
цианин и флуоресцеин не образуют. Растут на питательном и глюко-
зо-пептонном агаре. Тесты с метиловым красным и Фогеса-Прос-
кауэра отрицательные. Каталазо- и уреазоположительные. Восстанав-
ливают нитраты до нитритов. Хемоорганотрофы, факультативные
метилотрофы, ассимилируют метанол, метиламин, дихлорметан сери-
новым путем (ицл -вариант). Не нуждаются в факторах роста. Источ-
никами азота служат метиламин, некоторые аминокислоты, соли ам-
мония, нитраты, мочевина, пептон. Строгие аэробы. Оптимальные
значения pH 6.5-7.5 и 28-35QC. Не растут в присутствии 3% NaCl. В
жирнокислотном профиле преобладают Ci8:ico7 и 3-ОН С]4:о. Основ-
ной убихинон - Qio- Доминирующие фосфолипиды - ФЭА и ФХ. Со-
держание Г + Ц в ДНК 66-70 мол.%.
Род Methylopila относится к классу Alphaproteobacteria, порядку
Rhizobiales, семейству Methylocystaceae. Род включает 3 вида -
Мр. capsulata, Мр. Helvetica и Мр. jiangsuen.se. Типовой вид - Methy-
lopila capsulata7 [Doronina et al., 1998а].
Methylorhabdus
[Me.thy.lo.rhab'dus. M.L.n. methyl - метильная группа; Gr.n. rhab-
dus~ палочка; M.L. masc. n. Methylorhabdus - метильная палочка].
Грамотрицательные неподвижные палочки, 0.4-0.6 х 1.2-2.5 цт,
Не образуют эндоспор. Размножаются бинарным делением с форми-
рованием перетяжки. Строгие аэробы с дыхательным типом метабо-
лизма. Способны к нитратредукции. Растут на питательном агаре, а
также на глюкозо-пептонном агаре. Температурный оптимум -
28-34*'с, pH - оптимум 6.8-7.4. Не растут в присутствии 3% NaCl.
1 есты с метиловым красным и Фогеса-Проскауэра отрицательны. Ка-
талазо- и уреазоположительные. Образуют индол из L-триптофана на
сРеДе с KNO3 в качестве источника азота. Хемоорганотрофы и фа-
культативные метилотрофы, ассимилируют Ci-соединения (дихлор-
267
метан, метанол и метиламин) посредством ицл~-варианта сериновог
пути. Основной убихинон - Сю- В жирнокислотном профиле npegg
ладают Ci8:ico7, С]9;осус1о и Ci6:o- Доминирующие фосфолипида
ФЭА, ФГ, ФХ и ДФГ. Содержание Г + Ц в ДНК 66.2 мол.%. 9
Род Methylorhabdus относится к классу Alphaproteobacteria, поряд
ку Rhizobiales, семейству Hyphomicrobiaceae. Типовой вид - Methylor
habdus multivoransr [Doronina et al., 1995].
Methylotenera
[Me.thy.lo.ten.’er.a. Gr. n. Fr. methyl - метильная группа; L. fem. a(j:
tenera - утонченный, тонкий; N.L. fem. n. Methylotenera - тонкий ме-
тилотрофный организм]. j
Грамотрицательные палочки, 0.6-1.2 х 0.3-0.4 цш, подвижны бла-
годаря единственному жгутику. Покоящихся форм не образуют. Раз-
множаются бинарным делением. Не растут на богатых средах (TGY
LB, питательном агаре). Облигатно используют метиламин в качеств^
единственного источника энергии, углерода и азота, но не метанол.
Не имеют уреазы, нитратредукцию не осуществляют. Рост ингибиру-
ется нитратами. При концентрациях NaCl выше 0.1% не растут. Ката-
лазо- и оксидазоположительные. Оптимальные условия для роста -
30°С и pH 7.5. Окисляют метиламин МАДГ. Реализуют РМФ-путь,
вариант неизвестен. Преобладающие жирные кислоты С16;1(о7си С»&о.
В фосфолипидном профиле доминирует ФЭА. Содержание Г + Ц к
ДНК 54.3 мол.%.
Род Methylotenera относится к классу Betaproteobacteria, порядку
Methylophilales, семейству Methylophilaceae. Типовой вид — Methy-
lotenera mobilis1 [Kalyuzhnaya et al., 2006а].
Methyloversatilis
[Me.thy’lo.ver.sa.tilis. N. Gr. n. methyl - метильный радикал; L. adj.
versatilis - разносторонний, изменчивый, универсальный; N.L. fem. fl-
Methyloversatilis универсальный потребитель метилов, подразумева-
ется универсальность трофических возможностей].
Грамотрицательные неподвижные палочки, размножаются бинар-
ным делением. Оптимально растут при 30-37“С, pH 7.5-8. Не глл*-
фил. Используют метанол, метилированные амины, формальдегид,
формиат, а также полиуглеродные соединения в качестве источника
углерода и энергии. Реализуют ицл~-вариант серинового пути. Д<?М1г
нирующие жирные кислоты Ci6:j(o7c и Ci6:o- Основной убихинон -0»*
Содержание Г + Ц в ДНК 64-65 мол.%. 'Я
268
Род Methyloversatilis относится к классу Betaproteobacteria, поряд-
ку Rhodocyclales, семейству Rhodocyclaceae. Типовой вид - Methylo-
yersatilis universalis [Kalyuzhnaya et al., 2006b].
Methylovirgula
[Me.thy.lo.vir'gu.la. Gr. n. Fr. methyl - метильная группа; L. fem. n.
virgule - маленькая палочка; N.L. fem. n. Methylovirgula - метило-
трофная палочка].
Одиночные, образующие розетки или скопления неправильной
формы, грамотрицательные палочки. Размножаются бинарным деле-
нием. Колонии выпуклые, непрозрачные, кремово-белые, диаметром
0.5-1 мм, плотной консистенции с ровным краем и гладкой поверхно-
стью. Рост в жидких средах гомогенный. Аэробные, ограниченно-
факультативные метилотрофы. Предпочтительный Сi-субстрат - ме-
танол. Реализуют РБФ-путь. Растут на этаноле, слабо на малате, пи-
рувате и сукцинате. Облигатные ацидофилы и мезофилы. Рост инги-
бируется 0.7% NaCl. Оптимальные значения температуры 20-24уС,
pH - 4.5-5.0. Доминирующая жирная кислота - Ci8:ico7c. Основной
убихинон - Сю- Содержание Г + Ц в ДНК 61.8-62.8 мол.%.
Род относится к классу Alphaproteobacteria, порядку Rhizobiales,
семейству Beijerinckiaceae. Типовой вид - Methylovirgula ligni
[Vorob’ev et al., 2009].
Methylovorus
[Me.thy.lo.vo’rus. N.L.n. methyl, the methyl radical - метильный ра-
дикал; N.L masc. adj. vorus - потребляющий; N.L. masc. n. Methylo-
vorus- потребляющий метильные группы].
Грамотрицательные подвижные палочки-монотрихи, 0.4-0.6 х
х 1.0-1.4 цт. Не образуют эндоспор, сложных ВЦМ и простек, не
имеют капсулы. Некоторые штаммы образуют слизь. Размножаются
бинарным делением. В жидкой среде не агрегируют и не образуют
пигмент. Колонии на минеральной агаризованной среде с метанолом
после двух дней инкубации при 30еС округлые, 1-2 мм в диаметре, с
ровным краем, выпуклые, полупрозрачные, матовые, молочно-белого
Цвета. Не растут в атмосфере Н2 + СО2 + О2, а также в присутствии
3% NaCl. Оптимальный рост при pH 7.0-7.5 и температуре 35-40йС.
Строгие аэробы. Облигатные или ограниченно-факультативные мети-
'отрофы. Используют метанол в качестве источника углерода и энер-
гии. Некоторые штаммы способны слабо расти на метилированных
аминах и глюкозе. Нитраты, соли аммония, метилированные амины и
ГлУтамат служат источниками азота. Не образуют ацетоин, сероводо-
Р°Д и аммиак. Уреазо-, каталазо- и оксидазоположительные. Не разла-
269
гают целлюлозу, желатин и Tween 80. Образуют индол из L-трипт. ~
фана на среде с KNO3 в качестве источника азота. Реализуют КДфрд
вариант РМФ-пути. Ассимилируют аммоний посредством глутамат,
ного цикла. а-Кетоглутаратдегидрогеназа и ферменты глиоксилатного
шунта отсутствуют. 6-фосфоглюконатдегидрогеназа активна с НАД*
Доминирующие жирные кислоты Ci6;o и Ci6.ico7. Основной убихинон
- Q8. В фосфолипидном профиле преобладают ФЭА, ФГ и ДФГ. Тн-
личные местообитания - активный ил, почва, грязь, пресноводные
стоячие водоемы, растения. Содержание Г + Ц в ДНК 56-58 мол.%.
Род Methylovorus относится к классу Betaproteobacteria, порящу
Methylophilales, семейству Methylophilaceae. Род включает 2 вид _
М. glucosotrophus и М. mays. Типовой вид - Methylovorus gluco^ -
trophus* [Doronina et al., 2005].
Mycobacterium
[Myc.o.bac.te’ri.um. Gr. n. tnykes - гриб; Gr. n. bacterion — малень-
кая палочка; M.L. neut. n. Mycobacterium - грибковая палочка].
Слегка изогнутые или прямые палочки 0.2-0.6 х 1.0-10 цт, иногда
ветвящиеся; возможен нитевидный или мицелиеобразный рост, но
при легком механическом воздействии происходит фрагментация на
палочки или кокковидные элементы. По методу Грама окрашивак tw
нелегко, но обычно рассматриваются как грамположительные. Не-
подвижные. Нет эндоспор, конидий, капсул, хорошо заметных в э-
душных гиф. Род включает облигатных паразитов, сапрофитов и про-
межуточные формы, различающиеся по пищевым потребностям. Са-
профитные штаммы растут на очень простых средах; другие нужда-
ются для роста в более сложных средах; третьи не культи виру юте?,
вне живых клеток. Виды различаются по амидазной, каталазн й и
другим ферментативным активностям. Аэробы, хотя при дисперсном
посеве в пробирке с агаризованной средой рост у некоторых вилл»
происходит только в глубине. Характерно высокое содержание лиги-
дов в клетках, и особенно в клеточных стенках; имеются воска, со-
держащие растворимые в хлороформе миколовые кислоты с длинны-
ми разветвленными цепями примерно из 80 атомов углерода. К »-
нии некоторых видов постоянно или иногда бывают желтоватыми или
оранжевыми, обычно из-за каротиноидов. Пептидогликолипи.. клс*
точной стенки содержит мезо-диаминопимелиновую кислоту, аланин» |
глутаминовую кислоту, глюкозамин, мурамовую кислоту, арабин^г
и галактозу (IV тип клеточной стенки). Определенные виды вызы аь”*
туберкулез, лепру и другие хронические заболевания с более или мс-..
нее выраженным некрозом или гранулематозом. Встречаются в
воде и тканях животных. Содержание пар Г + Ц в ДНК 60-70 мол. /• В
270
I
Род Mycobacterium относится к классу Actinobacteria, подклассу
fictinobacteridae, порядку Actinomycetales, подпорядку Corynebacteri-
леае, семейству Mycobacteriaceae. Известно 150 видов рода Mycobac-
terium. К метилотрофии способны Мус. flavescens, Мус. gastri, Мус.
1геоаигит, Мус. parafortuitum, Мус. peregrenium, Мус. phlei, Мус. smeg-
matis, Мус. vaccae. Типовой вид: Mycobacterium tuberculosis1 (Leh-
mann, Neumann, 1896) [Skerman et al., 1980].
Paracoccus
[Pa.ra.coc cus. Gr. prep, para - как, подобно; Gr. n. coccus - зерно,
крупинка; M.L. masc. n. Paracoccus - похожий на крупинку].
Грамотрицательные сферические клетки диаметром 0.5-0.9 цт
или очень короткие палочки длиной 1.1-1.3 цт, единичные, спарен-
ные или образующие небольшие скопления. Обычно лишены капсу-
лы, споры не образуют, неподвижны. Аэробы. В анаэробных условиях
в качестве терминальных акцепторов электронов могут использовать
нитраты, нитриты и закись азота. Осуществляют денитрификацию
нитратов через нитрит, окись и закись азота до N2. Оксидазо- и ката-
лазоположительные. Растут на широком спектре органических суб-
стратов, а также хемолитоавтотрофно, используя СОг в качестве ис-
точника углерода, а молекулярный водород, метанол, метиламины
или тиосульфат - как доноры электронов. Реализуют РБФ-путь. До-
минирующий убихинон - Ql0, жирная кислота - Ci8;1, фосфолипиды -
фосфатидилглицерин и фосфатидилхолин. Обнаружены в воде, почве,
сточных водах, активном иле. Содержание Г + Ц в ДНК 64-67 мол.%.
Род Paracoccus относится к филуму Proteobacteria, классу Alpha-
proteobacteria, порядку Rhodobacterales, семейству Rhodobacteraceae.
Описано 27 видов рода Paracoccus, к метилотрофии способны Ра. de-
nitrificans, Ра. alcaliphilus, Ра. alkenifer, Ра. aminophilus, Ра. amino-
vorans, Ра. kocuri, Ра. methylutens, Ра. versutus. Типовой вид рода —
Paracoccus denitrificans [Kelly et al., 2006].
Pseudomonas
[Pseu.do_mo.nas или Pseu.do.mo_nas. Gr.adj. pseudes - ложный;
Or.n. monas - единица, монада; M.L. fem.n. Pseudomonas — ложная мо-
нада].
Грамотрицательные прямые или немного искривленные палочки
Размером 0.5-1.0 х 1.5-5.0 цт. Большинство видов неаккумулируют
*ГБ, но накапливают полигидроксиалконааты с количеством моно-
jJePHbix единиц больше четырех при росте на алканах или глюконате,
капсул, простек и покоящихся форм не образуют. Подвижны благо-
даря одному или нескольким полярным жгутикам, реже — неподвиж-
271
ные. Некоторые виды образуют короткие латеральные жгутики. дэ
робы со строгим дыхательным метаболизмом, терминальным акц^.
тором электронов служит кислород, в редких случаях - нитрат мож^г
быть альтернативным акцептором. Ксантомонадин не образуют. Не
растут при pH ниже 4.5. Большинство видов не нуждается в органиче-
ских факторах роста. Каталазоположительные. Хемоорганотроф, 1е
жирнокислотном профиле преобладают Сюю зон , С)2:о, С12;о гон- 4 Ос-
новной убихинон - Q9. Широко распространены в природе. Некото-
рые виды патогенны по отношению к животным и растениям. Содер-
жание Г + Ц в ДНК 58-69 мол.%.
Род Pseudomonas относится к классу Gammaproteobacteria, no0q.
ку Pseudomonadales, семейству Pseudomonadaceae. К роду относ)гтся
133 вида. Типовой вид - Pseudomonas aeruginosa [Anzai et al., 19,71
Метилотрофный вид - Pseudomonas synxantha [Pirttilae et al., 2000], a
также некоторые штаммы Ps. putida и других видов.
Ruegeria (Silicibacter)
[Rue.ge.ria. N.L. fem. n. Ruegeria - названа в по имени Г.-Дж. 1 уге-
ра, немецкого микробиолога, за вклад в таксономию морских пред-
ставителей Agrobacterium].
Грамотрицательные клетки яйцевидной формы или палочки. Име-
ют полярные жгутики или же лишены их. Оксидазо- и каталазосюло-
жительные. Колонии бежевые выпуклые, непрозрачные, маслянистые,
округлые с цельным краем. Спор не образуют. Аккумулируют ШТ.
Для роста нуждаются в морских солях. Строгие аэробы, аноксиген-
ный фотосинтез не обнаружен. Реализует сериновый путь Ci-лкта-
болизма. Бактериохлорофил отсутствует. Основной изопреноидн-1й
хинон - убихинон. В жирнокислотном профиле преобладают Cis-. i»7c
С18;1, Си methyl ы7с- ОСНОВНЬЮ фосфоЛИПИДЫ - ФХ, ФЭА И ФГ. СоДбр'
жание Г + Ц в ДНК 55-68 мол.%.
Род Ruegeria относится к классу Alphaproteobacteria, порядку
Rhodobacterales, семейству Rhodobacteraceae. К роду относится 7 ви-
дов. Типовой вид - Ruegeria atlantica (Rueger, Hoefle, 1992) [Uchin et
al., 1999, comb. nov.]. Метилотрофные компоненты обнаружены в ге-
номе штамма Ruegeria pomeroyi DSS-3 (Gonzalez et al., 2003) [Yi el з!..
2007, comb. nov.]. U
Xanthobacter
[Xan.tho.bac’ter. Gr. adj. xanthos - желтый; M.L. masc. n. bacter эк
вивалент Gr. neut. n. bacterion палочка; M.L. masc. n. Xanthobacter
желтая палочка].
272
Прямые или изогнутые палочки 0.4-1.0 х 0.8-6.0 цт. На среде, со-
ержащей кислоты цикла Кребса (особенно сукцинат), клетки плео-
' рфные, тогда как на среде с этанолом могут быть кокковидными и
вытянутыми (до 10 цт). Гранулы полифосфатов и ПГБ равномерно
распределены внутри клеток. Покоящиеся стадии не характерны,
речевые гены споруляции не обнаружены. Клетки могут быть как
сдвижными (перитрихи), так и неподвижными. Окрашивание по
рраму часто дает ложно-положительную реакцию, однако клеточная
стенка грамотрицательного типа. Строгие аэробы. Оптимальные зна-
чения температуры 25-30 1-’С и pH 5.8-9.0. Колонии матовые, слизи-
cTbie, однако есть штаммы, не продуцирующие слизь. Желтоокра-
щенные за счет водонерастворимого каротиноидного пигмента (зеак-
сантин дирамнозид). Интенсивность окраски зависит от количества
слизи, образуемой конкретными штаммами. Имеют каталазу. Все
щтаммы растут хемолитоавтотрофно на минеральной среде в атмо-
сфере Н2, Ог и СО2 (7:2: 1, об./об.), а также хемоорганогетеротрофно
на метаноле или метиламинах, реализуя РБФ-путь. Спектр утилизи-
руемых спиртов, органических кислот и углеводов ограничен. Неко-
торые штаммы витаминзависимые. Могут использовать замещенные
тиофены в качестве источника углерода, энергии и серы. Обладают
коэнзимом М, который также типичен для облигатных анаэробных
метаногенных архей. Фиксируют молекулярный азот на средах, обед-
неных азотом при гетеротрофном или хемолитотрофном выращива-
нии, однако многие штаммы способны к диазотрофии только при
сниженном рОг. Обнаружены в пресноводных местообитаниях, влаж-
ных почвах, содержащих гниющие растительные остатки, морских
отложениях, а также ассоциированы с корнями растений, в том числе
- растениями влажных местообитаний. К клубенькообразованию не
способны. Доминирующий убихинон - Q10, жирная кислота - Ci&i.
Содержание Г + Ц в ДНК 65-70 мол.%.
Род Xanthobacter относится к филуму Proteobacteria, классу A Ipha-
proteobacteria, порядку Rhizobiales, семейству Xanthobacteraceae.
Описано 6 видов рода: X. agilis, X. aminooxidans, X. autotrophicus,
flavus, X. tagetidis, X.viscosus. Xanthobacter autotrophicus - типовой
ВиД рода [Lee et al., 2005].
Оригинальные статьи, содержащие детальные описания указанных
ВиДов метилобактерий, можно найти с использованием “List of Pro-
taryotic Names with Standing Nomenclature’’ (http://www.bacterio.
Mfr/).
273
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
АДГ
АКР
АМО
АМФ (АДФ, АТФ)
АФК
АЦК
ВЦМ
ВЭЖХ
ГАФ
ГЛ / АГЛ
у-ГМА
ГМАС
ГОГ АТ
ГС
ГФС
ДАБ
ДАГФ
ДГГЭ
ДМАПФ
ДМДС
ДМНА
ДМС
ДМСО
ДМСО2
ДМСП
ДО А К
ДОАС
ДОАФ
ДОФА
ДСН-ПААГЭ
ДФГ
ДХМ(ДГ)
ДХФИФ / ДХФИФНг
жк
ИАА
ИААм
ИМК
ИПвК
ИПФ
ИСУ
ИУК
ицл
КГФДК
КДФГ(А)
КМФ
КоА
Алкогольдегидрогеназа д
Ацетоацетил-КоА редуктаза
Аммониймонооксигеназа
Аденозин-5’-моно(ди, три)-фосфат
Активные формы кислорода
1-Аминоциклопропан-1 -карбоксилатдезаминаза
Внутрицитоплазматические мембраны
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Гл и церал ьдегидфосфат 1 1
Гомосеринлактон / ацилгомосеринлактон
у-Глутамилметиламид
у-Г лутамилметиламидсинтетаза
Глутамин-2-оксоглутарат амидотрансфераза (глутаматсинтщ)
Г лутаминсинтетаза
Г ексулозофосфатсинтаза
Ь-2,4-Диаминобутират .
3-Дезокси-О-арабиногептулозонат-7Ф
Денатурирующий градиентный гель-электрофорез
Диметил аллилпирофосфат
Ди метилдисул ьфид
М,ЬГ-Диметил-4-нитрозоанилин
Диметилсульфид
Диметилсульфоксид
Диметилсульфон
Диметилсульфониопропионат
Диоксиацетонкиназа
Диоксиацетонсинтаза
Диоксиацетонфосфат
L-3,4-Дигидроксифенил аланин
Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфато*' Na
Дифосфатидилглицерин (кардиолипин)
Дихлорметан(дегалогеназа)
2,6-дихлорфенолиндофенол окисленный / восстановленный
Жирные кислоты
Индолил-З-ацетальдегид
Индолилацетамид
Индолилмолочная кислота
Индолилпировиноградная кислота Я
Изопентенилпирофосфат ,
Индуцированная системная устойчивость
Индолилуксусная кислота
Изоцитратлиаза
3-Кето-Ь-гулонат-6-фосфатдекарбоксилаза
2-Кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат(альдолаза)
Ксилулозомоыофосфат
Коэнзим А
274
КОЕ
КЭ ,
МАДГ
МА^
у|Г
н.мг(ДП
fj-МГС
МДГ
ММО
мт
МТБЭ
МФ
МХОР
НАД(Ф)+ /
ЦАД(Ф)Нг
овп
ОМФДК
ОПР
ОРС
ПГБ/В
пдс
ПЦР
RACE-ПЦР
RT-ПЦР
РБФ
РМФ
РОФМ
РубисКО (РБФК/О)
РФЭ
СБФ (CIБФ)
С ГАТ
СПУ
СТОМ
ТА
ТГМП
ТГФ
тк
УДФ
Уф
фа
фадг
ФБф(А)
фг
ФГИ
Фгк
ФДГ
ФЕП
Колониеобразующая единица
Карбо кс илэстераза
Метиламиндегидро! еназа
Моноаминооксидаза
Метил галид
М-Метилглутамат(дегидрогеназа)
N - Метил глутамате и нтаза
Метанолдегидрогеназа
Метанмонооксигеназа
Метантиол
Метил-трет-бутиловый эфир
Метанофуран
Малат:хинон оксидоредуктаза
Никотинамидадениндинуклеотид(фосфат) окисленный /
восстановлен н ы й
Окислительно-восстановительный потенциал
Орот идин 5’-монофосфатдекарбоксилаза
Оксипиру ватреду ктаза
Открытая рамка считывания
П ол игидрокс ибутират/ валерат
Протондвижущая сила
Полимеразная цепная реакция
Rapid amplification of cDNA ends (ПЦР с быстрой амплифика-
цией концов кДНК)
Reverse transcription (ПЦР с обратной транскрипцией)
Рибулозо-1,6-бисфосфат
Рибулозомонофосфат
Розовоокрашенные факультативные метилотрофы
Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа
Рибулозо-5-фосфат-З-эпимераза
Седогептулозо-1,7-бисфосфат
Серин-глиоксилатаминотрансфераза
Системная приобретенная устойчивость
Серинтрансоксиметилаза
Трансальдолаза
Тетрагидрометаноптерин
Т етрагидрофолат
Т ранскетолаза
У ридиндифосфат
Ультрафиолет
Формальдегид
Формальдегиддегидрогеназа
Фруктозобисфосфат( альдолаза)
Фосфатидилглицерин
Фосфогексулоизомераза
З-Фосфоглицериновая кислота
Форм иатд еги дрогеназа
Фосфоенолпируват
ФМН
ФМС
ФС
ФФК
ФХ
ФЭА
ФЭС
ЦРГ
цтк
ЭДТА
ЭПС
ЭТЦ
ЯМР
CRISPR
EMSA
FISH
GFP
GSH IGSSG
GST
GWP
HTH
IQ
MNO
MOX
MTT
MySH
OCS
PQQ
RSG
RR1
SAM
SCP
SIP
TSO
TTQ
Флавинмоыонуклеотид
Феназинметосульфат
Фосфатид илсерин
Фосфофруктокиназа
Фосфатидил хол ин
Фосфатидилэтанолам и н
Фенази нэтосул ьфат
Цикл регенерации глиоксилата
Цикл три карбоновых кислот
Этилендиаминтетраацетат
Экзополисахарид
Электрон-транспортная цепь
Ядерный магнитный резонанс
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (регу-
лярно расположенные группами короткие палиндромные п: -
вторы)
Electrophoretic mobility shift assay (анализ сдвигов электрофо-
ретической подвижности)
Fluorescent in situ hybridization (Гибридизация in situ с флюо-
ресцентно меченным зондом)
Green fluorescent protein (зеленый флуоресцирующий белок)
Глутатион восстановленный / окисленный
Glutathione-S-transferase (Глутатион-8-трансфераза)
Global warming potential (Потенциал глобального потепления)
Helix-Turn-Helix (спираль-поворот-спираль)
Intelligence quotient (коэффициент интеллекта)
М,М'-Диметил-4-нитрозоанилин оксидоредуктаза
Метанолоксидаза
3-[4,5-Диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий броми .
Микотиол восстановленный
Карбонилсульфид
Pyrroloquinoline quinone (пирролохинолинхинон)
Redox sensor green (зеленый редокс-чувствительный красите.эы
Respiration response imaging (отображение дыхательного ответа)
S-аденозилметионин fl
Single cell protein (белок одноклеточных)
Stable isotope probing (анализ состава стабильных изотопов)
Trp-side chain oxidase (оксидаза боковой цепи триптофана)
Tryptophan tryptophylquinone (триптофан триптофилхинон)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Безбородов А.М., Загустила Н.А., Попов В.О. Ферментативные процессы в био-
технологии // М.: Наука, 2008. 335 с.
2_ Болотникова Э.В., Померанц Л.Б., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Отбор культур
микроорганизмов, устойчивых к метилированным сульфидам, для очистки сто-
ков сульфатно-целлюлозного производства от метанола // Межвуз. сб. науч, тру-
дов “Охрана окружающей среды от загрязнений промышленными выбросами”.
ЦБП, ЛТА, 1985. С. 97-102.
3. Волова Т.Г, Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. Полиоксиалканоаты — биораз-
рушаемые полимеры для медицины / Ред.: В.И. Шумаков. Красноярск: Платина,
2006. 287 с.
4. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии // М.: ГЕОС, 2001. 500 с.
5. Говорухина Н.И., Троценко Ю.А. Содержание поли-Р-оксибутирата у метило-
трофных бактерий с различными путями первичной ассимиляции метанола //
Прикл. биохим. микробиол. 1991. Т. 27. № 1. С. 98-101.
6. Горбушина А.А., Ляликова Н.Н., Власов Д.Ю., Хижняк Т.В. Микробные сообще-
ства на мраморных памятниках Санкт-Петербурга и Москвы: видовой состав
(разнообразие) и трофические взаимодействия // Микробиология. 2002. Т. 71.
№ 3. С. 409—417.
7. Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Кулырова А.В., Заварзина Д.Г., Жилина Т.Н. Ак-
тивность сульфатредуцирующих бактерий в донных осадках содовых озер Юго-
Восточного Забайкалья И Микробиология. 1999. Т. 68. № 5. С. 664-670.
8. Гринберг Т.А., Пирог Т.П., Малашенко Ю.Р., Пинчук Г.Э. Микробный синтез
экзополисахаридов на Ci- и Сг-соединениях И Киев: Наукова думка, 1992. 212 С.
9. Данилова И.В, Доронина Н.В., Троценко Ю.А., Нетрусов А.И., Рыжкова Е.П.
(Иордан). Участие витамина Biz в биосинтезе витамина Biz у Methylobacterium
dichloromethanicum, зависимое от интенсивности аэрации // Микробиология.
2004. Т. 73. № 1. С. 169-174.
10. Дембицкий В.М., Толстиков Г.А. Природные галогенированные органические
соединения // Новосибирск: Изд-во СО РАН, филиал “Гео”, 2003. 366 с.
11. Диканская Э.М. Биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий и
пути его реализации И Сб. науч, трудов Биохимия и физиология микроорганиз-
мов/ Ред.: Ю.А. Троценко. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1987. С. 142-158.
12. Доронина Н.В, Дармаева Ц.Д., Троценко Ю.А. Новые аэробные метилотрофные
изоляты из содовых озер Южного Забайкалья // Микробиология. 2001. Т. 70.
№ 3. С. 398-404.
13. Доронина Н.В, Ли Ц.Д., Иванова Е.Г., Троценко Ю.А. Methylophaga murata
sp.nov., - галоалкалофильный аэробный метилотроф из разрушающегося мрамо-
ра Ц Микробиология. 2005. Т. 74. № 4. С. 511-519.
14. Доронина Н.В., Ежов В.А., Бесчастный А.П., Троценко Ю.А. Биосинтез биопро-
тектора эктоина аэробными метилотрофными бактериями // Прикл. биохим.
микробиол. 2010. Т. 46. № 2. С. 187-190.
15. Доронина Н.В., Ежов В.А., Троценко Ю.А. Аэробная биодеградация формальде-
гида, метанола и метиламина иммобилизованными клетками Methylobacterium
extorquens // Прикл. биохим. микробиол. 1997. Т. 33. № 2. С. 164—167.
16. Доронина Н.В., Иванова Е.Г., Сузина НЕ., Троценко Ю.А. Метанотрофы и мети-
лобактерии обнаружены в тканях древесных растений в зимний период // Мик-
робиология. 2004. Т. 73. № 6. С. 817-824.
17. Доронина Н.В., Иванова Е.Г., Троценко Ю.А. Новые данные о способности мети-
лобактерий и метанотрофов синтезировать ауксины // Микробиология. 2002.
Т. 71. № 1.С. 130-132.
277
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
В<Д
Доронина Н.В., Краузова В.И., Троценко Ю.А. Methylophaga limanica - новый
умеренно галофильных аэробных метилобактерий И Микробиология. 1997. Т Лл'
№ 4. С. 528-533. ’ '
Доронина Н.В., Кудинова Л. В., Троценко Ю.А. Methylovorus mays - новый Ви
аэробных облигатных метилобактерий, ассоциированных с растениями // Мик
робиология. 2000. Т. 69. № 5. С. 712-716.
Доронина Н.В., Назаров Н.М., Ежов В.А., Троценко Ю.А. Биодеградация Метил
ацетата и этилацетата иммобилизованными клетками Pseudomonas еsterophilus ц
Прикл. биохим. микробиол. 2006. Т. 42. № 1. С. 52-54.
Доронина Н.В., Остафин М., Троценко Ю.А. Methylobacterium extorquens - но-
вый факультативный метилотроф, образующий поли-В-гидроксибутират И Ми»
робиология. 1992. Т. 61. № 4. С. 678-682.
Доронина Н.В., Сахаровский В Г., Драчук С.В., Троценко Ю.А. Органически^
осмопротекторы аэробных умеренно галофильных метилобактерий // Микпп
биология. 1998. Т. 67. № 4. С. 457-462.
Доронина Н.В., Сузина Н.Г., Троценко Ю.А. Новый факультативный метилотроф,
использующий дихлорметан // Микробиология. 1996. Т. 65. № 2. С. 254—261.
Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Methylobacillus viscogenes - новый вид облигатно-
метилотрофных бактерий, образующих экзополисахарид // Микробиология
1991. Т. 60. № 5. С. 908-914.
Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Methylophilus leisingerii - новый вид ограниченно
факультативных метилотрофных бактерий // Микробиология. 1994а. Т. 63. № 3..
С.530-537.
Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Аэробные метилотрофные сообщества гиперсо
леных экосистем // Микробиология. 1997а. Т. 66. № 1. С. 175-181. '
Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Выделение и характеристика аэробных деструк-
торов хлорметана И Микробиология. 19976. Т. 66. № 1.С. 93-100.
Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Консервация метилотрофных бактерий посредст-
вом лиофилизации из обезвоженого состояния // Прикл. биохим. микробиол.
19946. Т. 30. № 6. С. 953-956.
Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Новый термотолерантный алкалофильный мети-
лотроф рода Paracoccus, ассоциированный с растениями // Микробиология
2000. Т. 69. № 5. С. 706-711. I
Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Состав биомассы бактерий, растущих на метано-
ле // Прикл. биохим. микробиол. 1986. Т. 22. № 4. С. 557-561. ti
Доронина НВ, Троценко Ю.А Способ хранения метилотрофных и гетеротроф-
ных микроорганизмов// Прикл. биохим. микробиол. 1992. Т. 28.№ 4. С.631-635.
Доронина Н.В., Троценко Ю.А., Краузова В.И., Безбородов А.М., Рогожин И.С,
Курлович А.Е., Ушакова Н.А. Новый факультативный метилотроф, перспектив-
ный для очистки воздуха от токсичных Ci-соединений // Прикл. биохим. микро-
биол. 1996. Т. 32. № 4. С. 438-443.
Доронина Н.В, Федоров Д.Н., Троценко Ю. А., Смолянина С.О. Стимуляция об-
лигатными метилотрофными бактериями морфогенеза и антигрибноЙ уст йчИ-
вости кит айской капусты Brassica chinenseL. // Биотехнология. 2009. Т. 6. С. 56-61
Ермилова Е.В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот // СПб.: Из. -в0
С.-Петерб. ун-та, 2007. 299 с.
Заварзин Г.А. Эпиконтинентальные содовые водоемы как предполагаемые Р6"/
ликтовые биотопы формирования наземной бчоты // Микробиология. 1993-
Т. 62. № 5. С. 789-800. А
Заварзин Г.А., Жилина Т., Кевбрин В.В. Алкалофильное микробное сообщество к
его функциональное разнообразие // Микробиология. 1999. Т. 68. № 5- С. 579-
599.
278
П-
38-
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
Зякун А.М., Доронина И.В., Захарченко В.И., Троценко Ю.А. Фракционирование
изотопов хлора аэробными метилотрофными бактериями Methylobacterium di-
chloromethanicum при росте на дихлорметане // Микробиология 2003. Т. 72. № 3
С. 390-394.
Зякун А.М., Фирсова Ю.Е., Торгонская М.Л., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Ва-
риации изотопного состава хлора как показатель бактериального дегалогениро-
вания дихлорметана// Прикл. биохим. микробиол. 2007. Т. 44. № 6. С. 666-671.
Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Аэробные метилобактерии синте-
зируют ауксины Ц Микробиология. 2001. Т. 70. № 4. С. 452-458.
Иванова Е.Г., Доронина И.В., Шепеляковская А.О., Ломан А.Г., Бровко Ф.А, Тро-
ценко Ю.А. Факультативные и облигатные метилобактерии синтезируют цито-
кинины // Микробиология. 2000. Т. 69. № 6. С. 764-769.
Иванова Е.Г., Федоров Д.И., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Образование вита-
мина В|2 аэробными метилотрофными бактериями // Микробиология. 2006. Т.
75. № 4. С. 570-572.
Калюжная М.Г., Хмеленина В.Н., Сузина Н.Е., Лысенко А.М., Троценко Ю.А. Но-
вые метанотрофные изоляты из содовых озер Южного Забайкалья // Микробио-
логия. 1999. Т. 68. № 5. С. 677-685.
Каляева М.А., Доронина Н.В., Иванова Е.Г., Троценко Ю.А., Бурьянов Я.И. Приме-
нение аэробных метилобактерий и метанотрофов для индукции морфогенеза пше-
ницы мягкой (Triticum aestivumL.) in vitro 11 Биотехнология. 2003a. T. 2. C. 38-44.
Каляева M.A., Иванова Е.Г., Доронина H- В., Троценко Ю.А., Бурьянов Я. И. Влия-
ние аэробных метилотрофных бактерий на морфогенез пшеницы мягкой (Triti-
cum aestivum L.) in vitro // Физиология растений. 20036. T. 50. № 3. С. 354—359.
КашнерД. Жизнь микробов в экстремальных условиях // М.: Мир, 1981. 520 с.
Кефели В.И. Природные ингибиторы и фитогормоны // М.: Наука, 1974. 253 с.
Короткова И.А., Аиаш В.В., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Определение поли-3-
гидроксибутирата и сополимера З-гидроксибутирата/З-гидроксивалерата в мик-
робной биомассе методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной
хроматографии // Прикл. биохим. микробиол. 1997а. Т. 33. № 3. С. 1-5.
Короткова Н.А., Доронина И.В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера 3-оксибу-
тирата/3-оксивалерата метилобактериями с сериновым путем метаболизма //
Прикл. биохим. микробиол. 19976. Т. 33. № 4. С. 398-403.
Короткова Н.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера 3-гидро-
ксибутирата/3-гидроксивалерата Methylobacterium extorquens: метаболизм про-
панола, пропионата, пентанола и валерата // Микробиология. 1999в. Т. 68. № 3.
С.351-359.
Кравченко И.К, БыковаС.А. Окисление атмосферного метана микроорганизмами
аэробных почв // Юбилейный сборник трудов ИНМИ им. С.Н. Виноградского,
посвященный 70-летию института / Отв. ред.: В.Ф. Гальченко. М.: Наука, 2004.
Вып. XII. С. 236-249.
Кретович В.Л. Введение в энзимологию // М.: Наука, 1974. С. 97-98.
Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на
уровне синтеза РНК и белка // XL1 Тимирязевские чтения. М.: Наука, 1982. С. 82.
Кулаева О.Н. Зависимость физиологической активности цитокининов от хими-
ческого строения их молекул. Цитокини ны их структура и функция // М.: Наука,
1973. С. 32-76.
Кулаева О.Н., Чайлахян МЛ'. Достижения и перспективы в исследовании фитогор-
монов И Материалы XI Международной конференции по ростовым веществам. Аг-
рохимия. 1984. Т. 90. № 1. С. 106-128.
279
55. Ли Ц.Д., Доронина Н.В., Иванова Е.Г., Троценко Ю.А. В ^-независимые изолят-1
Methylophaga marina с водорослей Красного моря // Микробиология. 2007. Т 7g
№ 1. С. 88-94. ’ '
56. Логинова Н.В., Троценко Ю.А. Образование экзополисахарида Blastobacter visco,
sus при росте на среде с метанолом // Прикл. биохим. микробиол. 1980. Т. ]g
№ 3. С. 331-334. ’ ‘
57. Логинова Н.В., Троценко Ю.А. Пути окисления и ассимиляции метилированных
аминов у Arthrobacter globiformis // Микробиология. 1976. Т. 45. № 2. С. 217-223
58. Максимова Н.П. Метаболизм ароматических соединений у метилотрофных бак-
терий // Автореф. дисс. ... доктора биол. наук. Минск, 2005. 43 с.
59. Максимова Н.П., Доброжинецкая Е.В., Фомичев Ю.К. Регуляция биосинтеза
формальдегида у облигатных метилотрофа Methylobacillus sp. М75 // Мол. генет
микробиол. вирусол. 1990. Т. 10. С. 28-30.
60. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Галь-
ченко В.Ф. Система вырожденных олигонуклеотидных праймеров для амплифи-
кации генов nifH различных таксономических групп прокариот // Микробиоло-
гия. 2001. Т. 70. № 1. С. 86-91.
61. Мокроносов А.Т. Интеграция функций роста и фотосинтеза // Физиология расте-
ний. 1983. Т. 30. № 5. С. 868-880.
62. Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.3. Система гормональ-
ной регуляции физиологических процессов в цветковом растении // Основы хи-
мической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агропромиздат,
1987. С. 80-133.
63. Мустахимов И.И., Решетников А.С., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. EctR - но-
вый транскрипционный регулятор генов биосинтеза эктоина у галофильной ме-
тилобактерииMethylophaga alcalica // Докл. РАН. 2009. Т. 429. № 2. С. 263-266.
64. Намсараев Б.Б. Солоноватые и соленые озера Забайкалья: гидрохимия, биол>
гия / Отв. ред.: Б.Б. Намсараев. Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2009. 340 с.
65. Намсараев Б.Б., Заварзин Г.А. Трофические связи в культуре, окисляющей метан
И Микробиология. 1972. Т. 41. № 6. С. 999-1006.
66. Намсараев З.Б., Горленко В.М., Намсараев Б.Б., Бархутова Д.Д. Микробные
сообщества щелочных гидротерм / Отв. ред.: М.Б. Вайнштейн. Новосибирск:
Изд-во СО РАН, 2006. 111с.
67. Нетрусов А.И. Энергетический метаболизм метилотрофных бактерий // Сб. на-
уч. трудов “Биохимия и физиология метилотрофов” / Ред.: Ю.А. Троценко. Пу-
щино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1987. С. 50-62.
68. Олеекин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и меж-
клеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т. 69. Я®
3. С. 309-327.
69. Пиголева С.В., Захарченко НС., Пиголев А.В., Троценко Ю.А. Влияние колонизи-
рующих метилобактерий на морфогенез и устойчивость к Erwinia carotovora са-
харной свеклы и капусты белокочанной // Прикл. биохим. микробиол. 2009.
Т. 45. № 6. С. 670-676.
70. РаковД.Ю., Доронина Н.В., Троценко Ю.А., АлиеваР.М. Рост метилотрофных бак-
терий на метилацетате // Прикл. биохим. микробиол. 1991. Т. 27. №4. С. 133-137.
71. Решетников А.С., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Обнаружение генов биосинте-
за эктоина у галотолерантных аэробных метилотрофных бактерий // Докл. РАН.
2004. Т. 396. № 6. С. 831-834.
72. Романовская В.А., Соколов И.Г., Малашенко Ю.Р., Рокитко ПВ. Экологические
последствия радиоактивного загрязнения для почвенных бактерий в десятики-
лометровой зоне ЧАЭС // Микробиология. 1998. Т. 67. № 1. С. 106-115.
73-
74.
75-
76.
77.
78-
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90,
91.
92.
93.
Романовская В.А., Столяр С.М., Малашенко Ю.П. Распространение бактерий
рода Methylobacterium в различных экосистемах Украины // Мшробюл. журн.
1996. Т. 58. № 3. С. 3-10.
Романовская В.А., Столяр С.М., Малашенко Ю.Р. Систематика метилотрофных
бактерий И Киев: Наукова думка, 1991. 221 с.
Рыжкова (Иордан) Е.П. Множественные функции корриноидов в биологии про-
кариотических организмов И Прикл. биохим. микробиол. 2003. Т. 39. № 2.
С.133-159.
Сахаровский В.Г., Быстрых Л.В., Баскунов Б.П. Исследование взаимодействия
формальдегида с глутатионом // Изв. АН СССР, биол. сер. 1987. Т. 6. С. 855—864.
Смирнова К. В., Дедыш С.Н., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Пути метаболизма
метанола и глюкозы у Beijerinckia mobilis // Микробиология. 2005. Т. 74. № 5.
С. 707-710.
Соколов А.П., Троценко Ю.А. Очистка и характеристика 3-гексулозофосфатсин-
тазы из факультативного метилотрофа Pseudomonas oleovorans // Биохимия.
1978. Т. 43. № 5. С. 782-787.
Соколов А.П., Троценко Ю.А. Циклический путь окисления формальдегида у
Pseudomonas oleovorans // Микробиология. 1977. Т. 46. № 6. С. 1119—1121.
Тамбиев Ф.Х., Кирикова Н.Н. Выделение органического вещества у морских
водорослей // Успехи современной биологии. 1981. Т. 92. С. 100-114.
Торгонская М.Л. Биодеградация дихлорметана аэробными метилобактериями //
Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. Москва, 2009. 24 с.
Торгонская М.Л., Фирсова Ю.Е., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Адаптация
аэробных метилобактерий к деградации дихлорметана // Прикл. биохим. микро-
биол. 2007. Т. 43. № 1. С. 53-58.
Троценко Ю.А. Особенности метаболизма метилотрофов // Сб. Генетика и фи-
зиология микроорганизмов-перспективных объектов генной инженерии / Ред.
С.В. Каменева, А,М. Боронин. Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1985. С. 39-60.
Троценко Ю.А., Доронина Н.В. Биология аэробных метилобактерий - деструкто-
ров галометанов И Микробиология. 2003. Т. 72. № 2. С. 149-160.
Троценко Ю.А., Доронина Н. В., Ли Ц.Д., Решетников А.С. Умеренно галоалкало-
фильные аэробные метилобактерий // Микробиология. 2007. Т. 76. № 3. С. 293-
305.
Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Хмеленина В.Н. Биотехнологический потенциал
аэробных метилотрофных бактерий: настоящее и будущее // Прикл. биохим.
микробиол. 2005. Т. 41. № 5. С. 495-503.
Троценко Ю.А., Иванова Е.Г., Доронина Н.В. Аэробные метилоз рофные бактерии
как фитосимбионты // Микробиология. 2001. Т. 70. № 6. С. 725-736.
Троценко Ю.А., Логинова Н.В. Пути метаболизма метилированных аминов у
бактерий // Успехи микробиологии. 1979. Т. 14. с 28-55.
Троценко Ю.А., Торгонская М.Л Аэробная биодеградация дихлорметана: струк-
турно-функциональные аспекты // Прикл. биохим. микробиол. 2009. Т. 45. № 3.
С. 261-276.
Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Особенности биологии и осмоадаптации галоал-
калофильных метаноторофов // Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 149-159.
Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Экстремофильные метанотрофы / Отв. ред.:
В.Ф. Гальченко. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2008. 205 с.
Троценко Ю.А., Четина Е.В. Энергетический метаболизм метанотрофных бакте-
рий // Успехи микробиологии. 1988. Т. 22. С. 3-34.
Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Филогенетический
анализ метилотрофных бактерий, использующих дихлорметан // Микробиоло-
гия. 2001. Т. 70. № 1. С. 92-97.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
Федоров Д.Н., Бут С.Ю., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Влияние экзог
индолилуксусной кислоты на активность ферментов центрального метабо "
у Methylobacterium extorquens // Микробиология. 2009. Т. 78. № 6. С. 844-^46
Федоров Д.Н., Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Новая система
рожденных олигонуклеотидных праймеров для детекции и амплификации п'^'
генов И Микробиология. 2008. Т. 77. № 2. С. 286-288. WZ)
Фирсова Ю.Е., Доронина И.В., Троценко Ю.А. Анализ ключевых функциона
ных генов у новых аэробных деструкторов дихлорметана // Микробиолог ***
2010. Т. 79. № 1. С. 72-78. Ия-
Фирсова Ю.Е., Доронина И.В., Троценко Ю.А. Физиолого-биохимический анал
трансформантов аэробных метилобактерий, экспресирующих ген дихлорметан
дегалогеназы demA // Микробиология. 2004. Т. 73. № 1. С. 31-36.
Фирсова Ю.Е., Торгонская М.Л., Доронина Н.В., Троценко Ю.А Влияние ЛНк\».
, _ _ по-
вреждающих факторов на аэробные метилобактерий, использующие и не исполь-
зующие дихлорметан // Прикл. биохим. микробиол. 2005. Т. 41. № 5. С. 547-552
Хмеленина В.Н., Калюжная М.Г., Троценко Ю.А. Физиолого-биохимические осо-
бенности галоалкалотолерантного метанотрофа // Микробиология. 1997а Г 6?
№ 4. С. 447-453. ’
зма
100. Хмеленина В.Н., Сахаровский В.Г., Решетников А.С., Троценко Ю.А. Синтез ос-
мопротекторов галофильными и алкалофильными метанотрофами // Микробио-
логия. 2000. Т. 69. № 4. С. 465-470.
101. Хочачка П., Семеро Дж. Биохимическая адаптация // М.: Мир. 1988. 568 с.
102. Чернядьев И.И. Фотосинтез и цитокинины // Прикл. биохим. микробиол. 1993
Т. 29. № 5. С. 644-674.
103. Четина Е.В., Троценко Ю.А. Активность окислительного фосфорилирования в ме-
мбранах метилотрофных бактерий//Микробиология. 1986. Т. 55. №4. С. 539-542.
104. Шепеляковская А.О., Доронина Н.В., Даман А.Г., Бровко Ф.А., Троценко Ю.А.
Новые данные о способности аэробных метилотрофных бактерий синтезировать
цитокинины и Докл. РАН. 1999. Т. 368. № 4. С. 555-557. W
105. Abanda-Nkpwatt D., Muesch М., Tschiersch J., Boettner M., Schwab W. Molecular
interaction between Methylobacterium extorquens and seedlings: growth promotion,
methanol consumption, and localization of the methanol emission site // J. Exp. Bot-
any. 2006. V. 57. P. 4025-4032.
106. Abon-Zeid A., Euverink G., Hessels G.I., Jensen R.A., Dijkhuizen L. Biosynthesis of L-
phenylalanine and L-tyrosine in the actinomycete Amycolatopsis methanolica // Appl.
Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 1298-1302.
107. Acharya P., Goenrich M., Hagemeier C.H., Demmer U., Vorhol J A., Thauer R.K.,
Ermler U. How an enzyme binds the Cl carrier tetrahydromethanopterin. Structure uf
the tetrahydromethanopterin-dependent formaldehyde-activating enzyme (Fae) from
Methylobacterium extorquens AMI //J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 13712-13719.
108. Ackermann J.-U., Babel W. Growth-associated synthesis of poly(hydroxybutyric acid)
in Methylobacterium rhodesianum as an expression of an internal bottleneck // Appl-
Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 147. P. 144-149.
109. Adman E.T. Topics in molecular and structural biology // Metalloproteins / Ed.:
P. Harrison. New York: Macmillan Ltd., 1985. V. 1. P. 1—42.
110. Ahmed EA., Anders M.W. Metabolism of dihalomethanes to formaldehyde and inor-
ganic halide // Biochem. Pharmacol. 1978. V. 27. P. 2021-2025. j
111. Akama T., Suzuki K., Tanigawa K., Kawashima A., Wu H., Nakata N., Osana Y, Sa-
kakibara Y., Ishii N. Whole-genome tiling array analysis of Mycobaterium lepr-i
RNA reveals high expression of pseudogenes and noncoding regions // J. Bacteriol-
2009. V. 191. P. 3321-3327.
282
л Al-Awadhi N., Egli T., Hamer G., Wehrli E. Thermotolerant and thermophilic solvent-
utilizing methylotrophic, aerobic bacteria // Syst. Appl. Microbiol. 1989. V. 11.
P. 207-216.
l3 Alber B.E., Spanheimer R., Ebenau-Jehle C., Fuchs G. Study of an alternate glyoxy-
iate cycle for acetate assimilation by Rhodobacter sphaeroides // Mol. Microbiol.
2006. V. 61. P. 297-309.
|4. Alves A.M.C.R., Euverink GJ. W., Hektor H.J., Hessels GJ., Van der VlagJ., Vrijbloed
J. W., Hondmann D., Visser J., Dijkhuizen L. Enzymes of glucose and methanol me-
tabolism in the actinomycete Amycolatopsis methanolica // J. Bacteriol. 1994. V. 176.
P. 6827-6835.
Il5. Alves A.M.C.R., Euverink G.J.W., Santos H., Dijkhuizen L. Different physiological
roles of ATP- and PPrdependent phosphofructokinase isoenzymes in the methylotro-
phic actinomycete Amycolatopsis methanolica!j J. Bacteriol. V. 183. P. 7231—7240.
116. Ambler R.P., Tobari J. The primary structures of Pseudomonas AMI amicyanin and
pseudoazurin. Two new sequence classes of blue copper proteins // Biochem. J. 1985.
V. 232. P. 451-457.
117. Andreae M.O., Merlet P. Emission of trace gases and aerosols from biomass burning //
Global Biogeochem. Cycles. 2001. V. 15. P. 955-966.
Ц8. Antelmann H., Tjalsma H., Voigt B., Ohlmeier S., Bron S., van DijlJ.M., Hecker M. A
proteomic view on genome-based signal peptide predictions // Genome Res. 2001.
V. 11. P.1484-1502.
119. Anthony C. Methanol as substrate; theoretical aspects // Hydrocarbons in biotechnol-
ogy I Eds.: D.E.F. Harrison et al. London: Heyden & Son, 1980. P. 35-57.
120. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs // London: Acad. Press, 1982. 251p.
121. Anthony C. The quinoprotein dehydrogenases for methanol and glucose // Arch. Bio-
chem. Biophys. 2004. V. 428. P. 2-9.
122. Anthony C. The structure of bacterial quinoprotein dehydrogenases // Int. J. Biochem.
1992. V. 24. P. 29-39.
123. Anthony C., Jones C.W. Energy metabolism of aerobic, methylotrophic bacteria //
Microbial growth on C-l compounds / Eds.: H.W. Van Verseveld, J.A. Duine.
Dordrecht: Martinus Nijhoff Publ., 1987. P. 195-202.
124. Anthony C., Williams P.W. The structure and function of methanol dehydrogenase //
Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1467. P. 18-23.
125. Anthony C., Zatman LJ. The microbial oxidation of methanol. The methanol-
oxidizing enzyme of Pseudomonas sp. M27 // Biochem. J. 1964. V. 92. P. 614-621.
126. Anzai Y., Kudo Y., Oyaizu H. The phylogeny of the genera Chryseomonas, Flavimo-
nas, and Pseudomonas supports synonymy of these three genera // Int. J. Syst. Bacte-
riol. 1997. V. 47. P. 249-251.
127. Arfrnan N., Bystrykh L., Govorukhina N.L, Dijkhuisen L. 3-Hexulose-6-phosphate syn-
thase from thermotolerant methylotroph Bacillus Cl // Methods Enzymol. 1990.
V. 188. P. 391-397.
128. Arfrnan N., de Vries K.J., Moezelaar H.R., Attwood M.M., Robinson G.K., van
Geel M., Dijkhuizen L. Regulation of methylotrophic metabolism in thermotolerant
Bacillus strains during growth in batch and continuous cultures // Arch. Microbiol.
1991. V. 157. P. 272-278.
129. Arfrnan N., Dijkhuizen L., Kirchof G., Ludwig W., Schleifer К-H., Bulygina E.S.,
Chumakov KM., Govorukhina N.L, Trotsenko KA., White D., Sharp R.J. Bacillus
methanolicus sp. nov., a new species of thermotolerant, methanol-utilizing, endospore-
forming bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. V. 42. P. 439—445.
13() . Arfrnan N.. Van Beeumen J., de Vries G.E., Harder W., Dijkhuizen L. Purification and
characterization of an activator protein for methanol dehydrogenase from thermotoler-
ant Bacillus spp. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 3955-3960.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
138.
139.
140.
141.
142.
143.
Arfman N., Watling E.M., Clement W., van Ossterwijk RJ., de Vries G.E., Hard
Attwood M.M., Dijkhuizen L. Methanol metabolism in thermotolerant me thy lot
Bacillus strains involving a novel catabolic NAD-dependent methanol dehydroГ°Р^’С
as a key enzyme // Arch. Microbiol. 1989. V. 152. P. 280-288. ^еПг-к
Arrhenius T., Arrhenius G., Paplawsky WJ. Archean geochemistry of fbrmaldeb
and cyanide and the oligomerization of cyanohydrin // Orig. Life Evol Вкк
1994. V. 24. P. 1-19. ' phere-
Attwood M.M., Quayle J. R. Formaldehyde is a central intermediary metabolit
methylotrophic metabolism // Microbial growth on Ci compounds / Eds.: R.L (j
ford, R.S. Hanson. Washington DC: ASM, 1984. P. 315-323. r'w"
Austin B., Goodfellow M. Pseudomonas mesophilica, a new species of pink bact •
isolated from leaf surfaces // Int. J. Syst. Bacteriol. 1979. V. 29. P. 373-378. ei,a
Axmann I.M., Kensche P., Vogel J., Kohl S., Herzel H., Hess W.R. Identification
cyanobacterial non-coding RNAs by comparative genome analysis // Genome Bi i
2005. V. 6. P. R73. •
иа
Babel IV. The auxiliary substrate concept: from simple considerations to heuristicall
valuable knowledge // Eng. Life Sciences. 2009. V. 9. P. 285-290. *
Babini E., Pusch M. A two-holed story: structural secrets about C1C proteins bee
unraveled? // Physiology. 2004. V. 19. P. 293-299.
Bader R., Leisinger T. Isolation and characterization of the Methylophilus sp. strain
DM11 gene dichloromethane dehalogenase/glutathione S-transferase // J. Bacteriol
1994. V. 176. P. 3466-3473.
Baesman S.M., Miller L.G. Laboratory determination of the carbon kinetic isotope
effects (KIEs) for reaction of methyl halides with various nucleophiles in soluti.n
J. Atmos. Chem. 2005. V. 52. P. 203-219.
Bak S., Tax F.E., Feldmann KA. Galbraith D. W. Feyereisen R. CYP83B1, a cyto-
chrome P450 at the metabolic branch point of auxin and indole glucosinolate biosyn-
thesis in Arabidopsis // Plant Ceil. 2001. V. 91. P. 101-111.
Baker S.C., Ferguson S.J., Ludwig B., Page M.D., Richter O.-M.H., van Spanning
R.J.M. Molecular genetics of the genus Paracoccus: metabolically versatile bacteria
with bioenergetic flexibility // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 1046-1078.
Baker S.C., Kelly D.P., Murrell J. C. Microbial degradation of methanesulfonic acid: •
missing link in the biogeochemical sulphur cycle // Nature. 1991. V. 350. P. 627-628.
Batnforth C.W., Large P.J. Solubilization, partial purification and properties f
N-methylglutamate dehydrogenase from Pseudomonas aminovorans // Biochem. J.
1977a. V. 161. P. 357-370. ?!
144. Bamforth C.W., Large P.J. The molecular size of N-methylglutamate dehydrogenase
of Pseudomonas aminovorans // Biochem. J. 1977b. V. 167. P. 509-512.
145. Bartel B. Auxin biosynthesis // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. V. 48.?
P. 51-66.
146. Bartel B., LeClere S., Magidin M., Zolman B.K. Inputs to the active indole-3-acetic
acid pool: de novo synthesis, conjugate hydrolysis, and indole-3-butyric acid ₽-
oxidation // J. Plant Growth Regul. 2001. V. 20. P. 198—216.
147. Bartling D., SeedorfM., Schmidt R. C., Weiler E. W. Molecular characterization of 2 clo-
ned nitrilases from Arabidopsis thaliana - key enzymes in biosynthesis of plant hor-
mone indole-3-acetic acid// Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91. P. 6021-6025.
148. Basile D.V., Basile M.R., Li Q.-Y., Corpe WA. Vitamin Bn-stimulated growth and
development of Jungermannia leiantha grolle and Gymnocolea inflata (Huds.) Duni.
(Hepaticae) // The Bryologist. 1985. V. 88. P. 77-81. <,
149. Basile D.V., Slade L.L., Corpe 1KA. An association between a bacterium and a liver”
wort, Scapania nemorosa // Bull Torrey Bot. Club. 1969. V. 96. P. 711-714.
284
15(). Baxter NJ., Scanlan J., De Marco P., Wood A.P., Murrell J.C. Duplicate copies of
genes encoding methanesulfonate monooxygenase in Marinosulfonomonas methy-
lotropha strain TR3 and detection of methanesulfonate utilizers in the environment //
Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 289-296.
151. Bayles D.O., Wilkinson B.J. Osmoprotectants and cryoprotectants for Listeria monocy-
togenes Ц Lett. Appl. Microbiol. 2000. V. 30. P. 23-27.
152. Beardmore-Gray M., Anthony C. Methanokcytochrome c oxidoreductase activity of
methylotrophs // Microbial growth onC-1 compounds/ Eds.: R.L. Crawford, R.S. Han-
son. Washington DC: ASM, 1984. P. 97-105.
153. Beardsmore A.J., Aperghis P.N.G., Quayle JR. Characterization of the assimilatory
and dissimilatory pathways of carbon metabolism during growth of Methylophilus me-
thylotrophus on methanol // J. Gen. Microbiol. 1982. V. 128. P. 1423-1439.
154. Becking J.H. The genus Beijerinckia H The Prokaryotes: an evolving electronic re-
source for the microbiological community. 3rd edn., release 3.0 / Eds.: M. Dworkin et
al. New York: Springer-Verlag, 2006. V. 5. P. 151-162.
155. Belanger L., Figueira M.M., Bourque D., Morel L., Beland M., Laramee L., Groleau
D-, Miguez C.B. Production of heterologous protein by Methylobacterium extorquens
in high cell density fermentation // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 231. P. 197-204.
156. Bellion E., Bolbot J.A., Lash T.D. Generation of glyoxylate in methylotrophic bacteria
// Curr. Microbiol. 1981. V. 6. P. 367-372.
157. Belova L.L., Sokolov A. P., Sidorov I A., Trotsenko YA. Purification and character-
ization of NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase from Methylobacterium ex-
torquens// FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 156. P. 275-279.
158. Bernhardt J., Weibezahn J., Scharf C., Hecker M. Bacillus subtilis during feast and
famine: visualization of the overall regulation of protein synthesis during glucose star-
vation by proteome analysis // Genome Res. 2003. V. 13. P. 224-237.
159. Bianco C., Imperlini E., Calogero R., Senatore B., Amoresano A., Carpentieri A.,
Pucci P., Defez R. Indole-3-acetic acid improves Escherichia coli’s defences to stress
// Arch. Microbiol. 2006a. V. 185. P. 373-382.
160. Bianco C., Imperlini E., Calogero R., Senatore B., Pucci P., Defez R. Indole-3-acetic
acid regulates the central metabolic pathways in Escherichia coli И Microbiology.
2006b. V. 152. P. 2421-2431.
161. Bill M., Miller L.G., Goldstein A.H. Carbon isotope fractionation of methyl bromide
during agricultural soil fumigations H Biogeochem. 2002a. V. 60. P. 181-190.
162. Bill M., Rhew R.C., Weiss R.F., Goldstein A.H. Carbon isotope ratios of methyl bro-
mide and methyl chloride emitted from a coastal salt marsh // Geophys. Res. Lett.
2002b. V. 29. P. 1045.
163. Bishop P. E., Jarlenski D.M.L., Hetherington D.R. Evidence for an alternative nitrogen
fixation system in Azotobacter vinelandii // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77.
P. 7342-7346.
164. Blocki FA., Logan M.S.P., Baoli C., Wackett L.P. Reaction of rat liver glutathione
S-transferases and bacterial dichloromethane dehalogenase with dihalomethanes //
J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 8826-8830.
165. Bock E., Sand W. The microbiology of masonry biodeterioration // J. Appl. Bacteriol.
1993. V. 74. P. 503-514.
166. Boden R., Thomas E., Savani P., Kelly D.P., WoodA.P. Novel methylotrophic bacteria
isolated from the River Thames (London, UK) // Environ. Microbiol. 2008. V. 10.
P.3225-3236.
167. Booth LR. Regulation of cytoplasmic pH in bacteria // Microbiol. Rev. 1985. V. 49.
P. 329-378.
285
* dizing
fnethy.
•robiol.
168, Borodina E., Cox M.J., McDonald I.R., Murrell J.C. Use of DNA stable isotope pr0L
ing and functional gene probes to investigate the diversity of methyl chloride-u
bacteria in soil // Environ Microbiol. 2005. V. 7. P. 1318-1328.
69. Borodina E., Kelly D.P., Schumann P., Rainey FA., Ward-Rainey N.L., Wood Д p
Enzymes of dimethylsulfone metabolism and the phylogenetic characterization of the
facultative methylotrophs Arthrobacter sulfonivorans sp. nov., Arthrobacter
lotrophus sp. nov., and Hyphomicrobium sulfonivorans sp. nov. H Arch. Mi
2002. V. 177. P. 173-183.
170. Borodina E., McDonald I.R., Murrell J.C. Chloromethane-dependent expression of the
emu gene cluster of Hyphomicrobium chloromethanicum // Appl. Environ. Microbiol
2004. V. 70. P. 4177-4186.
171. Bosch G., Skovran E., Xia Q., Wang T., Taub F., Miller J.A., Lidstrom M.E., f{a,
ckett M. Comprehensive proteomics of Methylobacterium extorquens AMI metabo-
lism under single carbon and nonmethylotrophic conditions // Proteomics. 2008. V 8
p. 3494-3505.
172. Bosch G., Wang T., Latypova E., Kalyuzhnaya M.G., Hackett M., Chistoserdova L.
Insights into the physiology of Methylotenera mobilis as revealed by metagenome-
based shotgun proteomic analysis // Microbiology. 2009. V. 155. P. 1103-1110.
173. Boulton C.A., Haywood G. W., Large P.J. N-methylglutamate dehydrogenase, a flavo-
haemoprotein purified from a new pink trimethylamine-utilizing bacterium // J. Gen
Microbiol. 1980. V. 117. P. 293-304.
174. Bourque D., Ouellette B., Andre G., Groleau D. Production of poly-p-hydroxyhutyrafe
from methanol: characterization of a new isolate of Methylobacterium extorquens //
Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 37. P. 7-12.
175. Bourque D., Pomerleau Y., Groleau D. High-cell-density production of poly-fl-
hydroxybutyrate (PHB) from methanol by Methylobacterium extorquens: production
of high-molecular-mass PHB // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 44. P. 367-376.
176. Brad A., Seibel BA., Walsh P.J. Trimethylamine-N-oxide accumulation in marine
animals: relationship to acylglycerol storage // J. Exp. Biol. 2002. V. 205. P. 297-306.
177. Brautaset T., Jakobsen 0.M., Flickinger M.C., Valla S., Ellingsen T. Plasmid-depen-
dent methylotrophy in thermotolerant Bacillus methanolicus Ц J. Bacteriol. 2004.
V. 186. P. 1229-1238.
178. Brautaset T., Jakobsen 0.M., Josefsen K.D., Flickinger M.C. Bacillus methanolicus: "
candidate for industrial production of amino acids from methanol at 50°C // Appl. En-
viron. Microbiol. 2007. V. 74. P. 22-34. I
179. Brencic A., Winans S.C. Detection of and response to signals involved in host-microbe
interactions by plant-associated bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2005. V. 69.
P. 155-194. <
180. Brenner D.J., Hollis D.G., Moss C. W., English C.K., Hall G.S., Vincent J., Radosevic
J., Birkness KA., Bibb W.F., Quinn F.D., Swaminathan B., Weaver R.E., Reeves
M. W., O'connor S.P., Hayes P.S., Tenover F.C., Steigerwalt A.G., Perkins BA., Dane-
shavr M.L, Hill B.C., Washington J.A., Woods T.C., Hunter S.B., Hadfield T.L.,Ajello
G.W., Kaufmann A.F., Wear D.J., Wenger J.D. Proposal of Aftpia gen. nov., with
Afipia felis sp. nov. (formerly the cat scratch disease bacillus), Afipia clevelandensis
sp. nov. (formerly the Cleveland Clinic Foundation strain), Afipia broomeae sp. nov.,
and three unnamed genospecies // J. Clin. Microbiol. 1991. V. 29. P. 2450-2460.
Validation list № 41 // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. V. 42. P. 327-328.
181. Brocks J.J., Buick R., Summons R.E., Logan GA. A reconstruction of Archaean bio-
logical diversity based on molecular fossils from the 2.78 to 2.45 billion year-old
Mount Bruce Supergroup, Hamersley Basin, Western Australia // Geochim. Cosmo-
chim. Acta 2003. V. 67. P. 4321-4335.
j32. Brooke A.G., Watling E.M., Attwood M.M., Tempest D.W. Environmental control of
metabolic fluxes in thermotolerant methylotrophic Bacillus strains // Arch. Microbiol.
1989. V. 151. P. 268-273.
133. Brunner W., Staub D., Leisinger T. Bacterial degradation of dichloromethane // Appl.
Environ. Microbiol. 1980. V. 40. P. 950-958.
134. Buchan A., Gonzalez J.M., Moran M.A. Overview of the marine Roseobacter lineage //
Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 5665-5677.
135. Buergmann H., Howard E.C., Ye W., Sun F., Sun S., Napierala S., Moran MA. Tran-
scriptional response of Silicibacter pomeroyi DSS-3 to dimethylsulfoniopropionate
(DMSP) // Environ. Microbiol. 2007. V. 9. P. 2742-2755.
136. Butler J. D., Levin S.W., Facchiano A., Miele L., Mukherjee A.B. Amino acid composi-
tion and N-terminal sequence of purified cystine binding protein of Escherichia coli //
Life Sci. 1993. V. 52. P. 1209-1215.
187. Butler J.H. Better budgets for methyl halides? // Nature. 2000. V. 403. P. 260-261.
188. Bystrykh L.V., Govorukhina N.L, Dijkhuizen L., Duine J A. Tetrazolium-dye-linked
alcohol dehydrogenase of the methylotrophic actinomycete Amycolatopsis metha-
nolica is a three-component complex // Eur. J. Biochem. 1997. V. 247. P. 280-287.
189. Bystrykh L.V., Govorukhina N.L, Van Ophem P.W., Hektor H.J., Dijkhuizen L., Dui-
ne J A. Formaldehyde dismutase activities in Gram-positive bacteria oxidizing metha-
nol //J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139. P. 1979-1985.
190. Calderon M.L, Vargas C., Rojo F., Iglesias-Guerra F., Csonka L.N., VentosaA., Nie-
to J J. Complex regulation of the synthesis of the compatible solutee ectoine in the
halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens DSM 3043' // Microbiology.
2004. V. 150. P. 3051-3063.
191. Carver MA., Jones C. W. The role of c-type cytochromes in the terminal respiratory
chain of the methylotrophic bacterium Methylophilus methylotrophus Ц Arch. Micro-
biol. 1984. V. 139. P. 76-82.
192. Castanie-Cornet М.-P., Penfound TA., Smith D., Elliott J.F., Foster J. W. Control of
acid resistance in Escherichia coli H J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 3525-3535.
193. Castignetti D., Smarrelli J., Jr. Siderophores, the iron nutrition of plants, and nitrate
reductase // FEBS Lett. 1986. V. 209. P. 147-151.
194. Cavalier-Smith T. The neomuran origin of archaebacteria, the negibacterial root of the
universal tree and bacterial megaclassification // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002.
V. 52. P. 7-76.
195. Cebron A., Bodrossy L., Stralis-Pavese N., Singer A.C., Thompson I.P., Prosser J.I.,
Murrell J.C. Analysis of methanotroph diversity in soils by DNA stable isotope prob-
ing: effects of incubation conditions // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73.
P. 798-807.
196. Chagneau C., Heyde M., Alonso S., Portalier R., Laloi P. External-pH-dependent
expression of the maltose regulon and ompF gene in Escherichia coli is affected by the
level of glycerol kinase, encoded by glpK I I J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 5675-5683.
197. Chain P.S., DenefVJ., Konstantinidis K.T., Verge? L.M., Agullo L., Reyes V.L., Hau-
ser L., Cordova M., Gomez L., Gonzalez M., Land M., Lao V., Larimer F., LiPu-
ma J.J., Mahenthiralingam E., Malfatti SA., Marx C.J., Parnell J.J., Rametie A.,
Richardson P., Seeger M., Smith D., Spilker T., Sul W.J., Tsoi T. V., Ulrich L.E., Zhulin
LB., Tiedje J.M. Burkholderia xenovorans LB400 harbors a multi-replicon, 9.73-Mbp
genome shaped for versatility // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 15280-
15287.
198. Chang G., Spencer R.H., Lee A.T., Barclay M.T., Rees D.C. Structure of the MscL
homolog from Mycobacterium tuberculosis', a gated mechanosensitive ion channel //
Science. 1998. V. 282. P. 2220-2226.
287
199. Chanprame S., Todd J.J., Widholm J.M. Prevention of pink-pigmented methylotrophic
bacteria (Methylobacterium mesophilicurn) contamination of plant tissue cultures //
Plant Cell Reports. 1996. V. 16. P. 222-225.
200. Chen Y., Dumont M.G., Cebron A., Murrell J. C. Identification of active methanotroph-ч
in a landfill cover soil through detection of expression of 16S rRNA and functional
genes // Environ. Microbiol. 2007. V. 9. P. 2855-2869.
201. Chen Y., Dumont M.G., McNamara N.P., Chamberlain P.M., Bodrossy L., Straits-
Pavese N., Murrell J.C. Diversity of the active methanotrophic community in the
acidic peatlands as assessed by rnRNA and SIP-PLFA analyses // Environ. Microbiol
2008. V. 10. P. 446-459.
202. Cheng Z., Duncker B.P., McConkey B.J., Glick B.R. Transcriptional regulation of ACC
deaminase gene expression in Pseudomonas putida UW4 // Can. J. Microbiol. 2008
V. 54. P. 128-136.
203. Chesney A., Eaton J.W., Mahoney J.R , Jr. Bacterial glutathione: a sacrificial defense
against chlorine compounds//!. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 2131-2135.
204. Chet I., Inbar J. Biological control of fungal pathogens // Appl. Biochem. Biotech.
1994. V. 48. P. 37-43.
205. Chinnadurai C., Balachaadar D., Sundaram S.P. Characterization of 1-aminocyclopro-
pane-1-carboxylate deaminase producing methylobacteria from phyllosphere of rice
and their role in ethylene regulation // World J. Microbiol. Biotech. 2009. V. 25.
P. 1403-1411.
206. Chisnell J.R., Premakumar R., Bishop P.E. Purification of a second alternative nitro-
genase from a nifHDK deleteon strain of Azotobacter vinelandii // J. Bacteriol. 1988.
V. 170. P. 27-33.
207. Chistoserdova L., Chen S. W., Lapidus A., Lidstrom M.E. Methylotrophy in Methyl
bacterium extorquens AMI from a genomic point of view // J. Bacteriol. 2003. V. 185.
P. 298^ -2987.
208. Chistoserdova L., Crowther G.J., Vorholt J A., Skovran E., Porlais J.C., Lil-
strom M.E. Identification of a fourth formate dehydrogenase in Methylobacterium ex-
torquens AMI and confirmalionn of the essential role of formate oxidation in methy-
lotrophy //J. Bacteriol. 2007a. V. 189. P. 9076-9081.
209. Chistoserdova L., Gomelsky L., Vorholt J.A., Gomelsky M., Tsygankov Y.D., Thau-
er R.K., Lidstrom M E. Analysis of two formaldehyde oxidation pathways in Meihy-
loba-cillus flagellatus KT, a ribulose monophosphate cycle methylotroph И Microbi-
ology. 2000. V. 146. P. 233-238.
210. Chistoserdova L., Kalyuzhnaya M.G., Lidstrom M.E. Cl transfer modules: from ge-
nomics to ecology // ASM News. 2005. V. 71. P. 521-528.
211. Chistoserdova L., Kalyuzhnaya M G., Lidstrom M.E. The expanding world of methy-
lotrophic metabolism // Annu. Rev. Microbiol. 2009. V. 63. P. 477—499.
212. Chistoserdova L., Lapidus A., Han C., Goodwin L., Saunders L., Brettin T., Tapia R-,
Gilna P., Lucas S., Richardson P.M., Lidstrom M.E. Genome of Methylobacillus fla -
ellatus, molecular basis for obligate methylotrophy, and polyphyletic origin of methy-
lotrophy // J. Bacteriol. 2007b. V. 189. P. 4020-4027.
213. Chistoserdova L., Laukel M., Portais J.C., Vorholt J A., Lidstrom M.E. Multiple for-
mate dehydrogenase enzymes in the facultative methylotroph Methylobacterium extor-
quens AMI are dispensable for growth on methanol // J. Bacteriol. 2004. V. ISO-
Р. 22-28.
214. Chistoserdova L., Vorholt J A., Thauer R.K, Lidstrom M.E. Cl transfer enzymes and
coenzymes linking methylotrophic bacteria and methanogenic archaea // Science
1998. V. 281. P. 99-102.
288
215-
216.
217-
218.
219.
220.
221.
222.
223.
224.
225.
226.
227.
228.
229,
230.
231.
232.
233.
234.
235.
Chistoserdova L. V., Lidstrom M E. Genetics of the serine cycle in Methylobacterium
extorquens AMI: identification of sgaA and mtdA and sequences of sgaA, hprA, and
mtdA //J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 1957-1968.
Chitwood D.E., Deshusses M.A. Development of a methyl bromide collection system
for fumigated farmland // Environ. Sci. Technol. 2001. V. 25. P. 636-642.
Chlumsky L.J., Zhang L., Jorns M.S. Sequence analysis of sarcosine oxidase and
nearby genes reveals homologies with key enzymes of folate one-carbon metabolism //
J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 18252-18259.
Choi J.H., Kim J.H., Daniel M., Lebeault J.M. Optimization of growth medium in
polyhydroxybutyric acid fermentation from methanol // Kor. J. Appl. Microbiol. Bio-
tech no I. 1989. V. 17. P. 392-296.
Colby J., ZatmanL.J. Hexose phosphate synthase and tricarboxylic acid-cycle enzymes
in bacterium 4B6, an obligate methylotrophs//Biochem J. 1972. V. 128. P. 1373-1376.
Colby J., Zatman L.J. Regulation of citrate synthase activity in methylotrophs by re-
duced nicotinamide-adenine dinucleotide, adenine nucleotides and 2-oxoglutarate //
Biochem J. 1975. V. 150. P. 141-144.
Comai L., Kosuge T. Involvement of plasmid deoxyribonucleic acid in indoleacetic
acid synthesis in PseudomonassavastanoiHi. Bacteriol. 1980. V. 143. P. 950-957.
Connell Hancock T.L., Costello A M., Lidstrom M.E., Oremland R.S. Strain IMB-1, a
novel bacterium tor the removal of methyl bromide in fumigated agricultural soils //
Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 2899-2905.
Cooper J.B., Long S.R. Morphogenetic rescue of Rhizobium meliloti nodulation mu-
tants by trans-zeatin secretion // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 215-225.
Cooper RA. Metabolism of methylglyoxal in microorganisms // Annu. Rev. Micro-
biol. 1984. V. 38. P. 49-68.
Corpe Ю., Basile D.V. Methanol-utilizing bacteria associated with green plants //
Dev. Ind. Microbiol. 1982. V. 23. P. 483-493.
Corpe WA., Rheem S. Ecology of the methylotrophic bacteria living on leaf surface //
FEMS Microbiol. Ecol. 1989. V. 62. P. 243-250.
Costacurta A., Vanderleyden J. Synthesis of phytohormones by plant-associated bac-
teria//Crit. Rev. Microbiol. 1995. V. 21. P. 1-18.
Coulter C„ Hamilton J.T.G., McRoberts W.C., Kulakov L., Larkin M.J., Harper D.B.
Halomethane : bisulfide/halide ion methyltransferase, an unusual corrinoid enzyme of
environmental significance isolated from an aerobic methylotroph using chlorometha-
ne as the sole carbon source // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 4301-4312.
Cox M.L., Sturrock G.A., Fraser P.J., Siems S. T., Frummel P.B. Identification of re-
gional sources of methyl bromide and methyl iodide from AGAGE observations at
Cape Grim, Tasmania // J. Atmos. Chem. 2005. V. 50. P. 59-77.
Crowther G.J., Kos aly G., Lidstrom M.E. Formate as the main branch point for me-
thylotrophic metabolism in Methylobacterium extorquens AMI // J. Bacteriol. 2008.
V. 190. P. 5057-5062.
Csonka L.N. Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress // Mi-
crobiol. Rev. 1989. V. 53. P. 121-147.
D'Errico I., Galadeta G., Saccone C. Pseudogenes in metazoa: origin and features 11
Brief. Funct. Genomics Proteomics. 2004. V. 3. P. 57-167.
Da Costa M.S., Santos H, Galinski EA. An overview of the role and diversity of
compatible solutes in bacteria and archaea // Advances in biochemical engineer-
ing/biotechnology / Ed.: T. Scheper. Berlin: Springer, 1998. V. 61, P. 117-153.
Davidson V.L. Electron transfer in quinoproteins // Arch. Biochem. Biophys. 2004.
V. 428. P. 32-40.
Davis E.N., Wallen L.L. Viscous product from activated sludge by methanol fermenta-
tion // Appl. Environ. Microbiol. 1976. V. 32. P. 303-305.
236.
237.
238.
239.
240.
241.
242.
243.
244.
245.
246.
247.
248.
249.
250.
251.
252.
253.
Davis-Kaplan S.R., Askwith C.C., Bengtzen A.C., Radisky D., Kaplan J. Chloride is
allosteric effector of copper assembly for the yeast multicopper oxidase Fet3p; an ***
expected role for intracellular chloride channels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA iqqo"
V. 95. P. 13641-13645. 98-
De Boer L., Dijkhuizen L., Grobben G., Goodfellow M., Stackebrandt E., Parlett J ff
Whitehead D., Witt D. Amycolatopsis methanolica sp. nov. a facultatively methvloi *
phic actinomycete // Int. J. Syst. Bacteriol. 1990. V. 40. P. 194—204. *0'
De Boer L., Euverink GJ., Van der VlagJ., Dijkhuisen L. Regulation of methanol meta
bolism in the facultative methylotroph Nocardia sp. 239 during growth on mixed sub'
stratesin batch- and continuous cultures//Arch. Microbiol. 1990b. V. 153. P. ЗЗ7-343
De Boer L., Grobben G., VrijbloedJ.W., Dijkhuisen L. Biosynthesis of aromatic amino
acids in Nocardia sp. 239: effects of amino acid analogues on growth and regulatory
enzymes//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990c. V. 33. P. 183-189.
De Boer L., Harder W., Dijkhuizen L. Phenylalanine and tyrosine metabolism in- fhe
facultative methylotroph Nocardia sp. 239//Arch. Microbiol. 1988. V. 149. P. 459-465
De Boer L., Vrijbloed J. W., Grobben G., Dijkhuizen L. Regulation of aromatic amino
acid biosynthesis in the ribulose monophosphate cycle methylotroph Nocardia sp. 239
// Arch. Microbiol. 1989. V. 151. P. 319-325.
De Bont JA.M., Van Dijken J.P., Harder W. Dimethyl sulphoxide and dimethyl suf.
phide as a carbon, sulphur and energy source for growth of Hyphomicrobium sp. S //
J. Gen. Microbiol. 1981. V. 127. P. 315-323.
De Lisle R.C., Hopfer U. Electrolyte permeabilities of pancreatic zymogen granules:
implications for pancreatic secretion // Amer. J. Physiol. 1986. V. 250. P. G489-G496,
De Maeyer E., Skup D., Prasad K.S., De Maeyer-Guignard J., Williams B., Meacook
P., Sharpe G., Pioli D., Hennam J., Schuch W., Atherton K. Expression of a chemi-
cally synthesized human alpha 1 interferon gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982
V. 79. P. 4256-4259.
De Marco P., Moradas-Ferreira P., Higgins T.P., McDonald I.R., Кеппа E.M., Mur-
rell J.C. Molecular analysis of a novel methanesulfonic acid monooxygenase from the
methylotroph Methylosulfonomonas methylovora // J. Bacteriol. 1999. V. 181.
P. 2244-2251.
De Vries G.E. Molecular biology of bacterial methanol oxidation // FEMS Microbiol.
Rev. 1986. V. 39. P. 235-258.
De Vries G.E., Arfman N., Terpstra P., Dijkhuizen L. Cloning, expression, and se-
quence analysis of the Bacillus methanolicus Cl methanol dehydrogenase
Bacteriol. 1992. V. 174. P. 5346-5353.
ene // J.
De Vries G.E., Kuees U., Stahl U. Physiology and genetics of methylotrophic bacteria
Ц FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 75. P. 57-102.
De Zwart J.M.M., Nelisse P.N., Kuenen J.G. Isolation and characterization of Methy-
lophaga sulfidovorans sp. nov.: an obligately methylotrophic, aerobic, dimethylsulfide
oxidizing bacterium from a microbial mat // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. V. 20.
P. 261-270.
Dedysh S.N. Exploring methanotroph diversity in acidic northern wetlands: Molecular
and cultivation-based studies // Microbiology (Moscow). 2009. V. 78. P. 655-669.
Dedysh S.N., Smirnova K.V., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Liesack W, Trotsenko
YA. Methylotrophic autotrophy in Beijerinckia mobilis // J. Bacteriol. 2005. V. 18 •
P. 3884-3888.
Dekant W. Glutathione-dependent bioactivation and renal toxicity of xenobiotics II
Recent Results Cancer Res. 1997. V. 143. P. 77-87.
Deyhle R.R., Barton L.L. Nicotinamide adeninedinucleotide — independent phlei //
Can. J. Microbiol. 1977. V. 23. P. 125-130.
290
?S4. Dhillon S., Von Burg R.J. Toxicology update. Methylene chloride // Appl. Toxicol.
1995. V. 15. P. 329-335.
255. Dickinson C.H., Austin B., Goodfellow M. Quantitative and qualitative studies of phyl-
loplane bacteria from Loliurn perenne Ц J. Gen. Microbiol. 1975. V. 91. P. 157-166.
256. Dijkhuizen L., Arfman N. Methanol metabolism in thermotolerant methylotrophic
Bacillus sp. // Microbial growth on Ci-compounds / Eds.: J.R. Andreesen, B. Bowien.
FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 87. P. 215-219.
257. Dijkhuizen L., Arfman N., Attwood M.M., Brooke A.G., Harder W., Watling E.M. Iso-
lation and initial characterization of thermotolerant methylotrophic Bacillus strains //
FEMS Microbiol. Lett. 1988. V. 52. P. 209-214.
258. Dijkhuizen L., Levering P.R., Vries D. The physiology and biochemistry of aerobic me-
thanol-utilizing gram-negative and gram-positive bacteria// Biotechnology handbooks
/ Eds.: J.C. Murrell, H. Dalton. New York: Plenum Publ. Co., 1992. P. 149-181.
259. Donachie S.P., Foster J.S., Brown M.V. Culture clash: challenging the dogma of mi-
crobial diversity // ISME J. 2007. V. 1. P. 97-99.
260. Doronina N. V., Braus-Stromeyer S.A., Leisinger T., Trotsenko YA. Isolation and char-
acterization of a new facultatively methylotrophic bacterium: description of Methylor-
habdus multivorans, gen. nov., sp. nov.//Syst. Appl. Microbiol. 1995. V. 18. P. 92-98.
261. Doronina N.V., Darmaeva T.D., Trotsenko YA. Methylophaga alcalica sp. nov., a
novel alkaliphilic and moderately halophilic, obligately methylotrophic bacterium
from the East Mongolian saline soda lake // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003a. V. 53.
P. 223-229.
262. Doronina N.V., Darmaeva Ts.D., Trotsenko KA. Methylophaga natronica sp. nov., a
new alkaliphilic and moderately halophilic, restricted-facultative methylotrophic bac-
terium from soda lake of the Southern Transbaikal region // Syst. Appl. Microbiol.
2003b. V. 26. P. 382-389.
263. Doronina N.V., Ivanova E.G., Trotsenko YA. Phylogenetic position and emended
description of the genus Methylovorus // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55.
P. 903-906.
264. Doronina N. V., Sokolov A.P., Trotsenko KA. Isolation and initial characterization of
aerobic chloromethane - utilizing bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 142.
P. 179-184.
265. Doronina N.V., Tourova T.P., Trotsenko YA. Methylarcula marina gen. nov., sp. nov.
and Methylarcula terricola sp. nov.: novel aerobic, moderately halophilic, faculta-
tively methylotrophic bacteria from coastal saline environments // Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 2000a. V. 50. P. 1849-1859.
266. Doronina N.V., Trotsenko KA. Genus Albibacter I I The Alpha-, Beta-, Delta- and
Epsilonproteobacteria, Part C, Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2nd edn. /
Eds.: D.J. Brenner et al. New York: Springer SBM, 2005a. V. 2. P. 416-420.
267. Doronina N.V., Trotsenko YA. Genus Methylarcula // The Alpha-, Beta-, Delta- and
Epsilonproteobacteria, Part C, Bergey’s manual of systematic bacteriology, 2nd edn. /
Eds.: D.J. Brenner et al. New York: Springer SBM, 2005b. V. 2. P. 192-194.
268. Doronina N.V., Trotsenko KA., Kolganova T.V., Tourova T.P., Salkinoja-Salo-
nen M.S. Methylobacillus pratensis sp. nov. - a novel non-pigmented aerobic obliga-
tory methylotrophic bacterium isolated from meadow grass // Int. J. Syst. Evol. Micro-
biol. 2004. V. 54. P. 1453-1457.
269. Doronina N.V., Trotsenko KA., Krausova V.L, Boulygina E.S., Tourova T.P. Methy-
lopila capsulata gen.nov., sp.nov., a novel of non-pigmented aerobic facultatively me-
thylotrophic bacterium// Int. J. Syst. Bacteriol. 1998a, V. 48. P. 1313-1321.
270. Doronina N.V., Trotsenko KA., Krausova V.L, Suzina N.E. Paracoccus methylutens
sp. nov. - a new aerobic facultatively methylotrophic bacterium utilizing dichloro-
methane // Syst. Appl. Microbiol. 1998b. V. 21. P. 230-236.
291
271.
acter
J me.
Doronina N.V., Trotsenko YA., Kuznetsov B.B., Tourova T.P. Emended description r*
Paracoccus kondratievae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 679-682.
272. Doronina N. V., Trotsenko YA., Tourova T. P., Kuznetsov B.B., Leisinger T. Albibacter
methylovorans gen. nov. sp. nov., a novel aerobic, facultatively autotrophic and me
thylotrophic bacterium that utilizes dichloromethane // Int. J. Syst. Evol. Microbiol
2001. V. 51. P. 1051-1058.
273. Doronina N.V., Trotsenko YA., Tourova T.P. Kuznetsov B.B., Leisinger T. Me thy
lopila Helvetica sp. nov. and Methylobacterium dichloromethanicum sp. nov. - novel
aerobic facultatively methylotrophic bacteria utilizing dichloromethane Ц Syst. Apn|
Microbiol. 2000a. V. 23. P. 210-218. ‘ ’
274. Downie J A. Functions of rhizobial nodulation genes // The Rhizobiaceae / Eds •
H.P. Spaink et al. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1998. P. 387-402.
275. Duine J A., Frank J., Berkhout M.P. NAD-dependent, PQQ-containing methanol de-
hydrogenase: a bacterial dehydrogenase in a multienzyme complex // FEBS Lett
1984. V. 168. P. 217-221.
276. Dumont M.G., Murrell J.C. Community-level analysis: key genes of aerobic methan
oxidation // Methods Enzymol. 2005a. V. 397. P. 413-427.
277. Dumont M.G., Murrell J.C. Stable isotope probing - linking microbial identity to
function // Nature Rev. Microbiol. 2005b. V. 3. P. 499-504.
278. Dunstan P.M., Anthony C., Drabble W.T. Microbial metabolism of Ci and C2 com-
pounds. The role of glyoxylate, glycolate and acetate in the growth of Pseudomonas
AMI on ethanol and on C| compounds// Biochem. J. 1972. V. 128. P. 107-115.
279. Eady R.R., Large PJ. Purification and propertyes of an amine dehydrogenase from
Pseudomonas AMI and its role in growth on methylamine // Biochem. J. 1968.
V. 106. P. 245-255.
280. Egorov A.M., Avilova T.V., Dikov M.M., Popov V.O., Rodionov Y.V., Berezin LV.
NAD4-dependent formate dehydrogenase from methyllotrophic bacterium strain 1. Pu-
rification and characterization // Eur. J. Biochem. 1979. V. 99. P. 569-576.
281. Eisenreich W., Bacher A., Arigoni D., Rohdich F. Biosynthesis of isoprenoids via the
non-mevalonate pathway // Cell Mol. Life Sci. 2004. V. 61. P. 1401-1426.
282. El Yahyaoui F., Kuester H., Ben Amor B., Hohnjec N., Puehler A., Becker A., Gou-
zy J., Vernie T., Gough C., Niebel A., Godiard L., Gamas P. Expression profiling in
Medicago truncatula identifies more than 750 genes differentially expressed during
nodulation, including many potential regulators of the symbiotic program // Plant
Physiol. 2004. V. 136. P. 3159-3176.
283. Elliott E.J., Anthony C. The interaction between methanol dehydrogenase and cyto-
chrome c in the acidophilic methylotroph Acetobacter methanolicus It J. Gen. Micw-
biol. 1988. V. 134. P. 369-377.
284. Elliott G.N., Chen W.-M., Chou J.-H., Wang H.-С., Sheu S.-Y., Perin L., Reis V.M.,
Moulin L., Simon M.F., Bontemps C., Sutherland J.M., Bessi R., de Faria S.M., Tri-
nick MJ., Prescott A.R., Sprent J.I., James E.K Burkholderia phymatum is a highly
effective nitrogen-fixing symbiont of Mimosa spp. and fixes nitrogen ex planta // New
Phytol. 2007. V. 173. P. 168-180.
285. Elliott S.M., Rowland F.S. Methyl halide hydrolysis rates in natural waters // J. Atmos.
Chem. 1995. V. 20. P. 229-236.
286. Emanuele J.J., Heasley C.J., Fitzpatrick P.F. Purification and characterization of the
flavoprotein tryptophan 2-monooxygenase expressed at high levels in Escherichia colt
//Arch. Biochem. Biophys. 1995. V. 316. P. 241-248.
287. Erb T.J. Berg I A., Brecht V., Muller M., Fuchs G., Alber B.E. Synthesis of Cs-d
carboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The
ethylmalonyl-CoA pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 10631-
10636.
288. Erb T.J., RreteyJ., Fuchs G., Alber B.E. Ethylmalonyl-CoA mutase from Rhodobacter
sphaeroides defines a new subclade of coenzyme Bi2-dependent acyl-CoA mutases //
J. Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 32283-32293.
289. EuverinkGJ.W., Hessels G.L, VrijbloedJ.W., Coggins J.R., Dijkhuizen L. Purification
and characterization of a dual function 3-dehydroquinate dehydratase from Amycola-
topsis methanolica // J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. P. 2449-2457.
290. Evans G.J., Ferguson G.P., Booth I.R., Vuilleumier S. Growth inhibition of Es-
cherichia coli by dichloromethane in cells expressing dichloromethane dehalo-
genase/glutathione S-transferase H Microbiology. 2000. V. 146. P. 2967-2975.
291. Facchini P.J., Huber-Allanach K.L. Tari L.W. Plant aromatic L-aminoacid decarboxy-
lases: evolution, biochemistry, regulation, and metabolic engineering applications //
Phytochemistry. 2000. V. 54. P. 121-138.
292. Fall R. Cycling of methanol between plants, methylotrophs and the atmosphere //
Microbial growth on Ci-compounds / Eds.: M.E. Lidstrom, F.R. Tabita. Dordrecht:
Kluwer Acad. Pub!., 1996. P. 343-350.
293. Fassel T.A., Buchholz LA., Collins M.L., Remsen C.C. Localization of methanol de-
hydrogenase in two strains of methylotrophic bacteria detected by immunogold label-
ing И Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 2302-2307.
294. Ferenci T., Strome T., Quayle J R. Purification and properties of 3-hexulose phosphate
synthase and phospho-3-hexuloisomerase from Methylococcus capsulatus H Biochem.
J. 1974. V. 144. P. 477-486.
295. Ferguson G.P., Batistta J., Lee A.T., Booth LR. Protection of the DNA during the
exposure of Escherichia coli cells to a toxic metabolite: The role of the KefB and
KefC potassium channels // Moi. Microbiol. 2000. V. 35. P. 113-120.
296. Ferguson G.P., McLaggan D., Booth LR. Potassium channel activation by glutathione-
S-conjugates in Escherichia coli: protection against methylglyoxal is mediated by cy-
toplasmic acidification // Mol. Microbiol. 1995. V. 17. P. 1025-1033.
297. Firsova J., Doronina N., Lang E., Sprbeer C., Vuilleumier S., Trotsenko Y. Ancylobac-
ter dichloromethanicus sp. nov. - a new aerobic facultatively methylotrophic bacte-
rium utilizing dichloromethane // Syst. Appl. Microbiol. 2009. V. 32. P. 227-232.
298. Fleischman D., Kramer D. Photosynthetic rhizobia // Biochim. Biophys. Acta. 1998.
V. 1364. P. 17-36.
299. Folman L.B., Gunnewiek P., Boddy L., de Boer W. Impact of white-rot fungi on num-
bers and community composition of bacteria colonizing beech wood from forest soil //
FEMS Microbiol. Ecol. 2008. V. 63. P. 181-191.
300. Fodllner C.G., Mueller S., Steinbuechel A., Babel W. Biosynthesis of poly-3-
hydroxybutyric acid by the facultatively methanol-assimilating bacterium Mycoplana
rubra B346 and recombinant strains // J. Basic Microbiol. 2007. V. 35. P. 179-188.
301. Foster J. Ж Microbial responses to acid stress // Bacterial stress responses I Eds.:
G. Storz, R. Hengge-Aronis. Washington DC: ASM, 2000. P. 99-115.
302. Foster J. W., Park Y.K., Bang I.S., Karem K, Betts H., Hall H.K., Shaw E. Regulatory
circuits involved with pH-regulated gene expression in Salmonella typhimurium // Mi-
crobiology. 1994. V. 140. P. 341-352.
303. Francez-Charlot A., Frunzke J., Reichen C., Ebneter J.Z., Gourion B., Vorholt J A.
Sigma factor mimicry involved in regulation of general stress response // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 3467-3472.
304. Freedman D.L., Swamy M., Bell N.C., Verce M.F. Biodegradation of chloromethane
by Pseudomonas aeruginosa strain NB1 under nitrate-reducing and aerobic conditions
// Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 4629^1634.
305. Frenkel C., Peters J.S., Tieman D M., Tiznado M.E., Honda A.K. Pectin methyles-
terase regulates methanol and ethanol accumulation in ripening tomato (Lycopersicon
esculentum) fruit // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 4293-4295.
293
306.
307.
308.
309.
310.
311.
312.
313.
314.
315.
Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W. DNA repair and mutagenesis // Washing»
DC: ASM, 1995. 698 p. g°n
Fraud S.J., Anthony C. The purification and characterization of the о-type oxid
from Methylophilus methylotrophus, and its reconstitution into a 'methanol oxida*. <
electron transport chain // J. Gen. Microbiol. 1984a. V. 130. P. 2201-2212.
Fraud S.J., Anthony C. The role of cytochrome c in membranes of Methylophilus tn
thylotrophus // J. Gen. Microbiol. 1984b. V. 130. P. 3319-3325. e*
Fukumori Y., Nakayama K., Yamanaka T. One of two copper atoms is not necessar
for the cytochrome c oxidase activity of Pseudomonas AM 1 cytochrome aa3// j gj y
chem. (Tokyo). 1985. V. 98. P. 1719-1722.
Gaelli R., Leisinger T. Specialized bacterial strains for the removal of dichloromethane
from industrial waste // Conservation and Recycling. 1985. V. 8. P. 91-100.
Gak E.R., Tsygankov Y.D., Chistoserdov A.Y. Organization of methylamine utilization
genes (mau) in “Methylobacillus flagellatum ” KT and analysis of mau mutants // Mi-
crobiology. 1997. V. 143. P. 1827-1835.
Galbally I.E., Kirstine W The production of methanol by flowering plants and the
global cycle of methanol Ц J. Atmospheric Chemistry. 2002. V. 43. P. 195-229.
Galinski EA. Osmoadaptation in bacteria // Adv. Microbial. Physiol. I Ed •
R.K. Poole. London: Acad. Press, 1995. V. 37. P. 273-328.
Galinski EA., Pfeiffer H.P., Trueper H.G. 1.4,5.6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine-
carboxylic acid : a novel cyclic amino acid from halophilic phototrophic bacteria of
the genus Ectothiorhodospira // Eur. J. Biochem. 1985. V. 149. P. 135-139.
Galinski EA., Trueper H.G. Microbial behaviour in salt-stressed ecosystems // FEMS
Microbiol. Rev. 1994. V. 15. P. 95-108.
n
316. Gan J., Yates S.R., Ohr H.D., Sims J. J. Volatilization and distribution of methyl iodide
and methyl bromide after subsoil application // J. Environ. Qual. 1997. V. 26. P. 1107-
1115.
317. Gerencser GA., Zhang J. Chloride ATPase pumps in nature: do they exist? I I Biol
Rev. Camb. Philos. Soc. 2003. V. 78. P. 197-218.
318. Gerlt J A., Raushel F.M. Evolution of function in (P/a)8-barrel enzyme // Curr. Opin.
Chem. Biol. 2003. V. 7. P. 252-264.
319. Giovannoni S.J., Hayakawa D.H., Tripp H.J., Stingl U., Givan SA., Cho J.-C.,
Oh H.-М., Kitner J.B., Vergin K.L., Rappe M.S. The small genome of an abunda t
coastal ocean methylotroph // Environ. Microbiol. 2008. V. 10. P. 1771-1782.
320. Gisi D., Leisinger T., Vuilleumier S. Enzyme-mediated dichloromethane toxicity and
mutagenicity of bacterial and mammalian dichloromethane-active glutathiom
S-transferases // Arch. Toxicol. 1999. V. 73. P. 71-79.
321. Gisi D., Maillard J., Flanagan J.U., Rossjohn J., Chelvanayagam G., Board P.G.,
Parker M. W., Leisinger T, Vuilleumier S. Dichloromethane mediated in vivo selection
and functional characterization of rat glutathione S-transferase Theta 1-1 variants//
Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 4001-4010.
322. Gisi D., Willi D., Traber H., Leisinger T., Vuilleumier S. Effects of bacterial host and
dichloromethane dehalogenase on the competitiveness of methylotrophic bacteria
growing with dichloromethane//Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 1194-1202.
323. Glick B.R., Todorovic B., Czarny J. Cheng Z., Duan J., McConkey B. Promotion of
plant growth by bacterial ACC deaminase // Crit. Rev. Plant Sci. 2007. V. 26. P. 227-
242.
324. Gloeckner F.O., Kube M., Bauer M., Teeling H., Lombardot T, Ludwig W., Gade D-,
Beck A., Borzym K., Heitmann K., Rabus R., Schlesner H., Amann R., Reinhardt R-
Complete genome sequence of the marine planctomycete Pirellula sp. strain 1 // Proc
Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 8298-8303.
294
325. Goenrich M., Bartoschek S., Hagemeier C.H., Griesinger C., Vorholt JA. A glu-
tathione-dependent formaldehyde - activating enzyme (Gfa) from Paracoccus denitri-
ficans detected and purified via 2D proton exchange NMR spectroscopy // J. Biol.
Chem. 2002. V. 277. P. 3069-3072.
326. Goenrich M., Thauer R.K., Yurimoto H., Kato N. Formaldehyde activating enzyme
(Fae) and hexulose-6-phosphate synthase (Hps) in Methanosarcina barkeri-. a possible
function in ribose-5-phosphate biosynthesis//Arch. Microbiol. 2005. V. 184. P. 41-48.
327. Gonzalez G.M., Johnston A. W.B., Vila-Costa M., Buchan A. Genetics and molecular
features of bacterial dimethylsulfoniopropionate (DMSP) and dimethylsulfide (DMS)
transformations // Handbook of hydrocarbon and lipid microbiology j Ed: K.N. Tim-
mis. Berlin-Heidelberg: Springer, 2010. V. 13. P. 1201-1211.
328. Gonzalez J.M., Kiene R.P., Moran MA. Transformation of sulfur compounds by an
abundant lineage of marine bacteria in the а-subclass of the class Proteobacteria //
Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 3810-3819.
329. Gonzalez J.M., Mayer F., Moran MA., Hodson R.E., Whitman W.B. Sagittula stellata
gen. nov, sp. nov., a lignintransforming bacterium from a coastal environment // Int. J.
Syst. Bacteriol. 1997b. V. 47. P. 773-780.
930. Gonzalez J.M., Moran MA. Numerical dominance of a group of marine bacteria in the
alpha-subclass of the class Proteobacteria in coastal seawater // Appl. Environ. Mi-
crobiol. 1997a. V. 63. P. 4237-4242.
331. Goodwin K.D., Schaefer J.K, Oremland R.S. Bacterial oxidation of dibromomethane
and methyl bromide in natural waters and enrichment cultures // Appl. Environ. Mi-
crobiol. 1998. V. 64. P. 4629-4636.
332. Goodwin K.D., Tokarczyk R., Stephens F.C., Saltzman E.S. Description of toluene
inhibition of methyl bromide biodegradation in seawater and isolation of a marine
toluene oxidizer that degrades methyl bromide И Appl. Environ. Microbiol. 2005.
V. 71. P. 3495-3503.
333. Goodwin K.D., Varner R.K., Crill P.M., Oremland R.S. Consumption of tropospheric
levels of methyl bromide by Ci compound-utilizing bacteria and comparison to satura-
tion kinetics // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 5437-5443.
334. Gould W.D., Kanagawa T. Purification and properties of methyl mercaptan oxidase
from Thiobacillus thioparus sp. TK-m // J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. P. 217-221,
335. Gourion B., Francez-Charlot A., Vorholt J A. PhyR is involved in the general stress
response of Methylobacterium extorquens AMI // J. Bacteriol. 2008. V. 190. P. 1027-
1035.
336. Gourion B., Rossignol M., Vorholt J A. A proteomic study of Methylobacterium ex-
torquens reveals a response regulator essential for epiphytic growth // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 13186-13191.
337. Grabow W.O.K., Grauss-Mueller V., Prozesky O. W., Deinhardt F. Inactivation of
hepatitis A virus and indicator organisms in water by free chlorine residuals // Appl.
Environ. Microbiol. 1983. V. 46. P. 619-624.
338. Graf R., Anzali S., Buenger J., Pfluecker F., Driller H. The multifunctional role of
ectoine as a natural cell protectant // Clin. Dermatol. 2008. V. 26. P. 326-333.
339. Grafstrom R.C., Fornace A.J., Autrup H., Lechner J.F., Harris C.C. Formaldehyde
damage to DNA and inhibition of DNA repair in human bronchial cells // Science
1983. V. 220. P. 216-218.
340. Grant W.D., Jones B.E. Alkaline environments // Encyclopedia of microbiology / Ed.:
J. Lederberg. London: Acad. Press, 2000. V. 1. P. 126-133.
341. Graves RJ., Callander R.D., Green T. The role of formaldehyde and S-chloromethyl-
glutathione in the bacterial mutagenicity of methylene chloride // Mutation Research.
1994. V. 320. P. 235-243.
295
егШщ
342. Green P.N., Bousfield l.J. Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hans
1976; Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb. nov. corrig.; Methylo}^
terium radiotolerans (Ito and lizuka 1971) comb. nov. corrig.; and Methylobacteriu '
mesophilicum (Austin and Goodfellow 1979) comb. nov. // Int. J. Syst. Bacteri l
1983. V. 33. P. 875-877. ° ’
343. Green T. Methylene chloride induced mouse liver and lung tumours: an overview of
the role of mechanistic studies in human safety assessment // Hum. Exp. Toxicol
1997. V. 16. P. 3-13.
344. Greenberg D.E., Porcella S.F., Stock F., Wong A., Conville P.S., Murray P.R,t Ffoi
land S.M., Zelazny A.M. Granulibacter bethesdensis gen. nov., sp. nov., a distinctive
pathogenic acetic acid bacterium in the family Acetobacteraceae Ц Int. J. Syst. Evol
Microbiol. 2006. V. 56. P. 2609-2616.
345. Greenberg D.E., Porcella S.F., Zelazny A.M., Virtaneva K., Sturdevant D.E., Kup.
ко J.J., Ill, Barbian K.D., Babar A., Dorward D. W., Holland S.M. Genome sequence
analysis of the emerging human pathogenic acetic acid bacterium Granulibacter be
thesdensis //J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 8727-8736.
346. Greenwood J A., Jones C.W. Environmental regulation of the methanol oxidase sys-
tem of Methylophilus methylotrophus// J. Gen. Microbiol. 1986. V. 132. P. 1247-1256.
347. Guengerich F.P., Persmark M K.-S., M., Kim М.-S., Humphreys W.G., Cmarik J M.
Thier R. Dihaloalkanes and polyhaloalkenes // DNA adducts: identification and bio-
logical significance I Ed.: K. Hemminki. World Health Organization. 1994. V. 12S
P. 57-72.
348. Gunji Y., Yasueda H. Enhancement of L-lysine production in methylotroph Methylo-
philus methylotrophus by introducing a mutant LysE exporter // J. Biotechnol. 2006.
V. 127. P. 1-13.
349. Gutheil W.G., Kasimoglu E., Nicholson P.C. Induction of glutathione-dependent for-
maldehyde dehydrogenase activity in Escherichia coli and Hemophilus influenza Ц
Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. V. 238. P. 693-696.
350. Hamilton J.T.G., McRoberts W.C., Keppler F., Kalin R.M., Harper D.B. Chloride
methylation by plant pectin: An efficient environmentally significant process // Sci-
ence. 2003. V. 301. P. 206-209.
351. Hanson A.D., Roje S. One-carbon metabolism in higher plants // Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P 119-137. т
352. Harper D.B. The global chloromethane cycle: biosynthesis, biodegradation and meta-
bolic role // Nat. Prod. Rep. 2000. V. 17. P. 337-348.
353. Hartmans S., Schmuckle A., Cook A.M., Leisinger T. Methyl chloride: naturally occur-
ring toxicant and C-l growth substrate//!. Gen. Microbiol. 1986. V. 132. P. 1139-1142.
354. Hashmi M., Dechert S., Dekant W., Anders M.W. Bioactivation of [l3C] dichl ro-
methane in mouse, rat, and human liver cytosol: nC nucleic magnetic resonance spec-
troscopic studies // Chem. Res. Toxicol. 1994. V. 7. P. 291-296.
355. Haywood G.W., Anderson A.J., Chu L. Dawes EA. The role of NADH- and NADPH-
linked acetoacetyl-CoA reductase in the poly-3-hydroxybutyrate synthesizing organ
ism Alcaligenes eutrophus // FEMS Microbiol Lett. 1988. V. 52. P. 259-264.
356. Hazeu W., De Bruyn J.C., Van Dijken J.P. Nocardia sp. 239, a facultative methanol
utilizer with the ribulose monophosphate pathway of formaldehyde fixation // Arch.
Microbiol. 1983. V. 135. P. 205-210.
357. He Z., Gentry T.J., Schadt C.W., Wu L., Liebich J., Chong S.C., Wu W.M., Gu C
Jardine P., Criddle C.S., Zhou J.-Z. GeoChip: A novel comprehensive microarray *or
investigating biogeochemical, ecological and environmental processes // ISME J-
2007. V. 1. P. 67-77.
358. Heidelberg J.F., Eisen J A., Nelson W.C., Clayton RA., Gwinn M.L., Dodson
Haft D H., Hikey E.K., Peterson J.D., Urnayam L., Gill S.R., Nelson K.E., Read T-D >
296
Tettelin H., Richardson D., Ermolaeva M.D., Vamathevan J., Bass S., Qin H.. Dra-
goi I., Sellers P., McDonald I., Utterback T., Feishmann T.B., Nierman W.C., White O.
DNA sequences of both chromosome of the cholera pathogen Vibrio cholerae // Na-
ture. 2000. V. 406. P. 477-483.
359. Hektor H.J., Kloosterman H., Dijkhuizen L. Nicotinoprotein methanol dehydrogenase
enzymes in gram-positive methylotrophic bacteria // J. Molecular Catalysis B: Enzy-
matic. 2000. V. 8. P. 103-109.
300. Hennam J.F., Cunningham A.E., Sharpe G.S., Atherton K.T. Expression of eukaryotic
coding sequences in Methylophilus methylotrophus // Nature. 1982. V. 297. P. 80-82.
361. Hersh L.B., Peterson J A., Thompson A.A. An N-methyl glutamate dehydrogenase
from Pseudomonas MA//Arch. Biochem. Biophys. 1971. V. 145. P. 115—120.
362. Hiraishi A., Furuhata K, Matsumoto A., Koike KA., Fukuyama M., Tabuchi K. Phe-
notypic and genetic diversity of chlorine-resistant Methylobacterium strains isolated
from various environment»// Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 61. P. 2099—2107.
363. Hirano S.S., Baker L.S., Upper C.D. Raindrop momentum triggers growth of leaf-
associated populations of Pseudomonas syringae on field-grown snap bean plants //
Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 2560-2566.
364. Hirotsune S., Yoshida N., Chen A., Garrett L., Sugiyama F., Takahashi S., Yagami K,
Wynshaw-Boris A., Yoshiki A. An expressed pseudogene regulates the messenger-
RNA stability of its homologous coding gene // Nature. 2003. V. 423. P. 91-96.
365. Hirsch P. Genus Hyphomicrobium Stutzer and Hartleb 1898, 76AL // Bergey’s manual
of systematic bacteriology. Is1 edn. / Eds.: J.T. Staley et al. Baltimore: The Williams &
Wilkins Co., 1989. V. 3. P. 1895-1904.
366. Hoeft S.E., Rogers D.R., Visscher P.T. Metabolism of methyl bromide end dimethyl
sulfide by marine bacteria isolated from coastal and open waters // Aquat. Microb.
Ecol. 2000. V. 21.P. 221-230.
367. Holland MA. Methylobacterium and plants // Recent Res. Devel. Plant Physiol. 1997.
V. 1. P. 207-213.
368. Holland M.A., Polacco J.C. Urease-null and hydrogenase-null phenotypes of a phyl-
loplane bacterium reveal altered nickel metabolism in two soybean mutants // Plant
Physiol. 1992. V. 98. P. 942-948.
369. Holmes A.J., Kelly D.P., Baker S.C., Thompson A.S., DeMarco P., Кеппа E.M., Mur-
rell J.C. Methylosulfonomonas methylovora gen nov., sp. nov. and Marinosulfonomo-
nas methylotropha gen. nov. sp. nov.: novel methylotrophs able to grow on methane-
sulfonic acid // Arch. Microbiol. 1997. V. 167. P. 46—53.
370. Honma M., Shimomura T. Metabolism of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid //
Agric. Biol. Chem. 1978. V. 42. P. 1825-1831.
371. Hopner J., Trautwein A. Pseudomonas oxalaticus: requirement of a cosubstrate for
growth on formate // Biochem. J. 1971. V. 155. P. 234—245.
372. Hou C.T., Laskin A.I., Patel R.N. Growth and polysaccharide production by Methylo-
cystisparvus OBBP on methanol//Appl. Environ. Microbiol. 1978. V. 37. P. 800-804.
373. Hurst D.F., Lin J.C., Romashkin PA., Daube B.C., Gerbig C., Matross D M., Wof-
sy S.C., Hall B.D., Elkins J.W. Continuing global significance of emissions of Mont-
real Protocol-restricted halocarbons in the United States and Canada // J. Geophys.
Res. 2006. V. 111. P. DI5302.
374. Husain M., Davidson V.L., Smith A.J. Properties of Paracoccus denitrificans amicya-
nin // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 2431-2436.
375. Huse S.M., Dethlefsen L., Huber J A., Mark Welch D., Reiman D.A., Sogin M.L. Ex-
ploring microbial diversity and taxonomy using SSU rRNA hypervanable tag se-
quencing // PLoS Genet. 2008. V. 4. P. elOOO255.
376. Jndiragandhi P., Anandham R., Kim K., Yim W., Madhaiyan M., Sa T. Induction of de-
fense responses in tomato against Pseudomonas syringae pv. tomato by regulating the
297
• ПОСу^
377.
378.
379.
380.
381.
382.
stress ethylene level with Methylobacterium otyzae CBMB20 containing 1-arnin
lopropane-1-carboxylate deaminase//World J. Microbiol. Biotech. V.24. P. 1037_ir/C'
Ishikawa K., Toda Murakoshi Y., Ohnishi F., Kondo K., Osumi T., Asano K. Med*
composition suitable for L-lysine production by Methylophilus methylotrophus in j*1*1
batch cultivation // J. Biosci. Bioeng. 2008. V. 106. P. 574-579.
Isidorov V.A. Organic chemistry of the earth’s atmosphere // Berlin: Springer Vert
1990.210 р. la&
Ivanova E., Doronina N., Trotsenko Yu. Hansschlegelia plantiphila gen. nov. sp ц-,
a new aerobic restricted facultative methylotrophic bacterium associated with plant //
Syst. Appl. Microbiol. 2007. V. 30. P. 444-452. S
Ivanova E.G., Pirttilae A.M., Hohtola A., Fedorov D.N., Doronina N.V., Trots
ко YA. Association of methylotrophic bacteria with plants: Metabolic aspects // pros
pects and applications for plant-associated microbes. A laboratory manual. Part A- Ba
cteria I Eds.: S. Sorvari, A.M. Pirttilae. Turku: Biobien Innovations, 2008. P. 225-231
Iyer R., Iverson T.M., Accardi A., Miller C. A biological role for prokaryotic C1C chlo-
ride channels// Nature. 2002. V. 419. P. 715-718.
Izumi Y., Yoshida T., Miyazaki S.S., Mitsunaga T., Ohshiro T., Shimao M., MiyataA
Tanabe T. L-serine production by a methylotroph and its related enzymes // Appl
crobioi. Biotechnol. 1993. V. 39. P. 427-432.
383. Jabrin S., Ravanel Gambonnet B., Douce R., Rebeille F. One-carbon metabolism in
plants. Regulation of tetrahydrofolate synthesis during germination and seedling de-
velopment // Plant Physiology. 2003. V. 131. P. 1431-1439.
384. Jaftha J.B., Strijdom B.W., Steyn P.L. Characterization of pigmented methylotrophic
bacteria which nodulate Lotononis bainesii // Syst. Appl. Microbiol. 2002. V 25
p. 440-449.
385. Jakobsen O.M., Benichou A., Flickinger M.C., Valla S., Ellingsen T.E., Braut .set T.
Upregulated transcription of plasmid and chromosomal ribulose monophosphate pan -
way genes is critical for methanol assimilation rate and methanol tolerance in the me-
thylotrophic bacterium Bacillus methanolicus HJ. Bacteriol. 2006. V. 188. P. 3063-3072
386. Jamshad M., De Marco P., Pdcheco C.C., Hanczar T., Murrell J.C. Identification, mu-
tagenesis, and transcriptional analysis of the methanesulfonate transport operon of Me-
thylosulfonomonas methylovora 11 Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. P. 276-2w3.
387. Janssen D.B., Van den Wijngaard A.J., van der Waarde J J., Oldenhuis R. Biochemis-
try and kinetics of aerobic degradation of chlorinated aliphatic hydrocarbons // Proc, of
the On-site bioreclamation - Processes for xenobiotic and hydrocarbon treatment /
Eds.: R.E. Hinchee, R.F. Olfenbuttel. Boston: Butterworth-Heinemann, 1991. P. 92-112.
388. Janvier M., Frehel C., Grimont F., Gasser F. Methylophaga marina gen. nov., sp.
nov. and Methylophaga thalassica sp. nov., marine methylotrophs // Int. J. Syst Baetc-
riol. 1985. V. 35. P. 131-139.
389. Janvier M., Regnaull B., Grimont P. Development and use of fluorescent 16S rRNA=
targeted probes for the specific detection of Methylophaga species by in situ hybridi-
zation in marine sediments// Res. Microbiol. 2003. V. 154. P. 483-490.
390. Jeffers P.M., Wolfe N.L. On the degradation of methyl bromide in sea water I I Geo-
phys. Res. Lett. 1996. V. 23. P. 1773-1776. I
391. Jenkins O., Byrom D., Jones D. Methylophilus: a new genus of methanol-utilizing
bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37. P. 446-448.
392. Jentsch T.J., Friedrich T., Schriever A., Yamada H. The CLC chloride channel family
// Pflugers Arch. 1999. V. 437. P. 783-795.
393. Jentsch T.J., Stein V., Weinreich F., ZdebikAA. Molecular structure and physiological
function of chloride channels // Physiol. Rev. 2002. V. 82. P. 503-568.
394. Johnson P.A., Quayle J.R. Microbial growth on Cj-compounds. Oxidation of metha-
nol, formaldehyde and formate by methanol-grown Pseudomonas AMI // Biochem. J.
1964. V. 93. P. 281-290.
395. Jones J.G., Bellion E. In vivo 1 C and l5N NMR studies of methylamine metabolism in
Pseudomonas species//J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 11705-11713.
396. Jourand P., Giraud E., Bena G., Sy A., Willems A., Gillis M., Dreyfus B., de Lajudie P.
Methylobacterium nodulans sp. nov., for a group of aerobic, facultatively methylotro-
phic, legume root-nodule-forming and nitrogen-fixing bacteria // Int. J. Syst. Evol. Mi-
crobiol. 2004. V. 54. P. 2269-2273.
397. Joye S.B., Connell T.L., Miller L.G., Oremland R.S., Jettison R.S. Oxidation of ammo-
nia and methane in an alkaline, saline lake//Limnol. Oceanogr. 1999. V. 44. P. 178-188.
398. Kakimoto T. Biosynthesis of cytokinins I I J. Plant Res. 2003. V. 116. P. 233-239.
399. Kakimoto T. Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl
diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases // Plant. Cell Physiol. 2001. V. 42.
P. 677-685.
400. Kalyuzhnaya M.G., Bowerman S., Lara J.C., Lidstrom ME., Chistoserdova L. Methy-
lotenera mobilis gen. nov., sp. nov., an obligately methylamine-utilizing bacterium
within the family Methylophilaceae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006a. V. 56.
P. 2819-2823.
401. Kalyuzhnaya M.G., Bowerman S., Nercessian O., Lidstrom M.E., Chistoserdova L.
Highly divergent genes for methanopterin-linked Cl transfer reactions in Lake Wash-
ington, assessed via metagenomic analysis and mRNA detection // Appl. Environ. Mi-
crobiol. 2005a. V. 71. P. 8846-8854.
402. Kalyuzhnaya M.G., Chistoserdova L. Community-level analysis: genes encoding
methanoptsrin-dependent enzymes// Methods Enzymol. 2005. V. 397. P. 443—454.
403. Kalyuzhnaya M.G., De Marco P., Bowerman S., Pacheco C.C., Lara J.C., Lid-
strom M.E., Chistoserdova L. Methyloversatilis universalis gen. nov., sp. nov., a novel
taxon within the Betaproteobacteria represented by three methylotrophic isolates //
Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006b. V. 56. P. 2517-2522.
404. Kalyuzhnaya M.G., Hristova K.R., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Characterization
of a novel methanol dehydrogenase in representatives of Burkholderiales: implications
for environmental detection of methylotrophy and evidence for convergent evolution //
J. Bacteriol. 2008a. V. 190. P. 3817-3823.
405. Kalyuzhnaya M.G., Korotkova N., Crowther V., Marx C.J., Lidstrom M.E., Chistoser-
dova L. Analysis of gene islands involved in methanopterin-linked Cl transfer reac-
tions reveals new functions and provides evolutionary insights // J. Bacteriol. 2005b.
V. 187. P. 4607-4614.
406. Kalyuzhnaya M.G., Lapidus A., Ivanova N., Copeland A.C., McHardy A.C., Szeto E.,
Salamov A., Grigoriev I. V., Suciu D., Levine S.R., Markovitz V.M., Rigoutsos L, Tringe
S.G., Bruce D.C., Richardson P.M., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. High-resloution
metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities //
Nature Biotechnology. 2008b. V. 26. P. 1029—1034.
407. Kalyuzhnaya M.G., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Real-time detection of actively
metabolizing microbes by redox sensing as applied to methylotroph populations in
Lake Washington // 1SME J. 2008c. V. 2. P. 696-706.
408. Kalyuzhnaya M.G., Lidstrom ME., Chistoserdova L. Utility of environmental primers
targeting ancient enzymes: methylotroph detection in Lake Washington H Microb.
Ecol. 2004. V. 48. P. 463-472.
409. Kalyuzhnaya M.G., Nercessian O., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Development and
application of polymerase chain reaction primers based on fhcD for environmental de-
tection of methanopterin-linked C1-metabolism in bacteria // Environ. Microbiol.
2005c. V. 7. P. 1269-1274.
299
410. Kanagawa T., Kelly D.P. Breakdown of dimethyl sulfide by mixed cultures and n
Thiobacillus thioparus I! FEMS Microbiol. Lett. 1986. V. 34. P. 13-19. '
. Kanamaru K., hvamura Y., Mikami Y., Obi Y, Kisaki T. 2-O-Methyl-D-mannose in
extracellular polysaccharide from Hyphomicrobium sp. // Agric. Biol. Chem 1оДП
V. 46. P. 2419-2424.
Kane S.R., Chakicherla A.Y., Chain P.S.G., Schmidt R., Shin M.W., Legler Tv
Scow K.M., Larimer F.W., Lucas S.M., Richardson P.M., Hristova K.R. Whol *
genome analysis of the methyl tert-butyl ether-degrading Beta-Proteobacterium M '
thylibiumpetroleiphilum PM1 // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 1931-1945. e*
Kang Y.S., Kim J., Shin H.D., Nam Y.D., BaeJ.W., Jeon C.O., Park W. Methylobact
rium platani sp. nov., isolated from a leaf of the tree Platanus orientalis // Int. J Svst"
Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 2849-2853. • • У t.
Kappes R.M., Kempf B., Bremer E. Three transport systems for the osmoprotectant
glycine betaine operate in Bacillus subtilis: characterization of OpuD // J. Bacteriol
1996. V. 178. P. 5071-5079.
Kashiwagi K., Yamaguchi Y., Sakai Y., Kobayashi H., Igarashi K. Identification of the
polyamine-induced protein as a periplasmic oligopeptide binding protein // J Biol
Chem. 1990. V. 265. P. 8387-8391.
411
412.
413.
414.
415.
416. Kasting J., Siefert J.L. Life and the evolution of Earth's atmosphere // Science 2002
V. 296. P.1066-1068.
417. Kato N., Tsuji K., Tani Y., Ogata K. A methanol utilizing actinomycete // J. Ferment
Technol. 1974. V. 52. P. 917-920.
418. Kato N., Yurimoto H., Thauer R.K. The physiological role of the ribulose monophos-
phate pathway in bacteria and archaea // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006. V 70
P. 10-21.
419. Kato Y., Ooi R., Asano Y. A new enzymatic method of nitrile synthesis by Rhodocac-
cus sp. strain YH3-3 //J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 1999. V. 6. P. 249-256.
420. Kato Y., Ooi R., Asano Y. Distribution of aldoxime dehydratase in microorganisms //
Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 2290-2296.
421. Kawaguchi M., Fujioka S., Sakurai A., Yamaki Y.T.R., Syono K. Presence of a pathway
for the biosynthesis of auxin via indole-3-acetamide in trifoliata orange // Plant Cell
Physiol. 1993. V. 34. P. 121-128.
422. Kayser M.F., Stumpp M.T., Vuilleumier S. DNA polymerase is essential for growth of
Methylobacterium dichloromethanicum DM4 with dichloromethane // J. Bacteriol.
2000. V. 182. P. 5433-5439.
423. Kayser M.F., Ucurum Z., Vuilleumier S. Dichloromethane metabolism and C(l) utili-
zation genes in Methylobacterium strains//Microbiology. 2002. V. 148. P. 1915-1922.
424. Keene W.C., Khalil MA.K, Erikson /// D.J., McCulloch A., Graedel T.E., LobertJ.M.,
Aucott M.L., Gong S.L., Harper D.B., Kleiman G., Midgley P., Moore R.M., Seuza-
ret C., Sturges W.T., Benkovitz C.M., Koropalov V., Barrie L.A., Li Y.-F. Composite
global emissions of reactive chlorine from anthropogenic and natural sources: Reac-
tive chlorine emissions inventory // Geophys. Res. 1999. V. 104. P. 8429-8440.
425. Keith L.H., Telliard WA. Priority pollutants 1 - a perspective view // Env. Sci. Tech-
nol. 1979. V. 13. P. 416-423.
426. KellyD.P., Baker S.C. The organosulfur cycle: aerobic and anaerobic processes leading
to turnover of Ci-sulfur compounds // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 87. P. 241-24<
427. Kelly D.P., Baker S.C., Tricket J., Davey M., Murrell J.C. Methane sulfonate utiliza-
tion by a novel methylotrophic bacterium involves an unusual monooxygenase // Mi-
crobiology. 1994. V. 140. P. 1419-1426.
428. Kelly D.P., Murrell J.C. Microbial metabolism of methane sulfonic acid // Arch. Mi-
crobiol. 1999. V. 172. P. 341-348.
300
429. Kelly D.P., Rainey F.A., Wood A.P. The genus Paracoccus // The prokaryotes. 3rd edn.
/ Eds.: M. Dworkin et al. New York: Springer Science+Business Media, 2006. V. 5.
P. 232-249.
430. Kennedy C. Genus Beijerinckia // Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2nd
edn. / Eds: D.J. Brenner et al. New York: Springer Verlag, 2005. V. 2. P. 423-432.
431. Kent A.D., Triplett E.W. Microbial communities and their interactions in soil and
rhizosphere ecosystems// Annu. Rev. Microbiol. 2002. V. 56. P. 211-236.
432. Keppler F., Eiden R., Niedan J., Pracht J., Schoeler H.F. Halocarbons produced by
natural oxidation processes during degradation of organic matter // Nature. 2000.
V. 403. P. 298-301.
433. Keppler F., Hamilton J.T.G., Brass M., Roeckmann T. Methane emissions from terres-
trial plants under aerobic conditions // Nature. 2006. V. 439. P. 187-191.
434. Kettle A J., Andreae M. O., Amouroux D., Andreae T. W., Bates T.S., Berresheim H.,
Bingemer H., Boniforti R., Curran M.A.J., DiTullio G.R., Helas G., Jones G.B., Keller
M.D., Kiene R P., Leek C., Levasseur M„ Malin G., Maspero M., Matrai P., McTag-
gart A.R., Mihalopoulos N., Nguyen B.C., Novo A., Putaud J.P., Rapsomanikis S.,
Roberts G., Schebeske G., Sharma S., Simo R., Staubes R., Turner S., Uher G. A glo-
bal database of sea surface dimethylsulfide (DMS) measurements and a .procedure to
predict sea surface DMS as a function of latitude, longitude, and month // Global Bio-
gcochem. Cycles 1999. V. 13. P. 399—444.
435. Кейпе H., Sahm H., Wagner F. Production of L-serine by the methanol utilizing bacte-
rium, Pseudomonas 3ab // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1976. V. 2. P. 175-184.
436. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M., Sakharovsky V.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A.,
Gottschalk G. Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilic methanotrophs // Arch.
Microbiol. 1999. V. 172. P. 321-329.
437. Kiefer P., Portais J.C., Vorholt J A. Quantitative metabolome analysis using liquid
chromatography high-resolution mass spectrometry // Anal. Biochem. 2008. V. 382.
P. 94-100.
438. Kim H.G., Doronina N. V., Trotsenko YA., Kim S. W. Methylophaga aminisulfidivorans
sp.nov., a novel restricted facultatively methylotrophic marine bacterium // Int. J. Syst.
Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 2096-2101.
439. Kim P., Kim J.H., Oh D.K. Improvement in cell yield of Methylobacterium sp. by
reducing the inhibition of medium components for poly-P-hydroxybutyrate production
//World J. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 19. P. 357-361.
440. Kim S.J., Shin H.-J., Kim Y.-C., Lee D.-S., Yang J.-W. Isolation and purification of
methyl mercaptan oxidase from Rhodococcus rhodochrous for mercaptan detection //
Biotechnol. Bioprocess Engineering. 2000. V. 5. P. 465-468.
441. Kim S. W, Kim P., Kim J.H. High production of PHB from Methylobacterium organo-
philum under potassium limitation // Biotechnol. Lett. 1996. V. 18. P. 25-30.
442. Kimura T., Sugahara I., Hanai K„ Asahi T. Purification and characterization of the
new y-glutamylmethylamide dissimilating enzyme system from Methylophaga sp.
AA-30// Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. V. 59. P. 648-655.
443. Kinghorn A.D., Smolenski S.J. Alkaloids of Papilionoideae H Advances in legume
systematics / Eds.: R.M. Polhill, P.H. Raven. Kew: Royal Botanic Gardens, 1981.
V. 2. P. 585-589.
444. Knief C., Dunfield P. F. Response and adaptation of different methanotrophic bacteria
to low methane mixing ratios // Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 1307—1317.
445. Knief C., Lipski A., Dunfield P.F. Diversity and activity of methanotrophic bacteria in
different upland soils // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 6703-6714.
446. Kobayashi M., Suzuki T., Fujita T., Masuda M., Shimizu S. Occurrence of enzymes in-
volved in biosynthesis of indole-3-acetic acid from mdole-3-acetonitrile in plant-asso-
301
ciated bacteria. Agrobacterium and Rhizobium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. lyoc
V. 92. P.714-718 '
447. Koenig R.L., Morris R.O., Polacco J.C. tRNA is the source of low-level ^ans-zeatin
production in Methylobacterium spp. //J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 1832-1842.
448. Koga J., Adachi T., Hidaka H. 1AA biosynthesis pathway from tryptophan via indole
3-pyruvic acid in Enterobacter cloacae // Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55. P. 701-7Qg
449. Kohler-Staub D., Hartmans S., Gaelli R., Suter F., Leisinger T. Evidence for identical
dichloromethane dehalogenase in different methylotrophic bacteria // J. Gen. Micro
biol. 1986. V. 132. P. 2837-2843.
450. Kohler-Staub D, Leisinger T. Dichloromethane dehalogenase of Hyphomicrobium so
strain DM2 // J. Bacteriol. 1985. V. 162. P. 676-681. ₽‘
451. Kolb S. Aerobic methanol-oxidising Bacteria in soil // FEMS Microbiol. Lett. 2009
V. 300. P. 1-10.
452. KonishiS., OzasaM., TakahashiE. Metabolic conversion of N-methyl carbon of y-elu-
tamylmethylamide to caffeine in tea plants//Plant Cell Physiol. 1972. V. 13. P. 365-375.
453. Koopman F.W., De Winde J.H., Ruijssenaars H.J. Cl compounds as auxiliary sub-
strates for engineered Pseudomonas putida S12 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009
V. 83. P. 705-713.
454. Korotkova N., Chistoserdova L., Kuksa V., Lidstrom M E. Glyoxylate regeneration
pathway in the methylotroph Methylobacterium extorquens AMI // J. Bacteriol. 2002.
V. 184. P. 1750-1758.
455. Korolkova N., Lidstrom M.E. Connection between poly-beta-hydroxybutyrate biosyn-
thesis and growth on C(l) and C(2) compounds in the methylotroph Methylobacterium
extorquens AMI //J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 1038-1046.
456. Korotkova N., Lidstrom M.E. MeaB is a component of the methylmalonyl-CoA mu-
tase complex required for protection of the enzyme from inactivation // J. Biol. Chem.
2004. V. 279. P. 13652-13658.
457. Korotkova N., L idstrom M.E., Chistoserdova L. Identification of genes involved in the
glyoxylate regeneration cycle in Methylobacterium extorquens AMI, including two
new genes, meaC and meaD // J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 1523-1526.
458. Kortstee G.J.J. The homoisocitrate-glyoxylate cycle in pink, facultative methylotrophs
// FEMS Microbiol. Lett. 1980. V. 8. P. 59-65.
459, Koyama N., Nosoh Y. Effect of potassium and sodium ions on the cytoplasmic pH of
an alkalophilic Bacillus // Biochim. Biophys. Acta 1985. V. 812. P. 206-212.
460. Krausova V.L, Robb F.T., Gonzalez J.M. Bacterial degradation of dichloromethane in
cultures and natural environments // J. Microbiol. Methods. 2003. V. 54. P. 419-422.
461. Kuhlmann A.U., Bremer E. Osmotically regulated synthesis of the compatible solute
ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp. I I Appl. Environ. Microbiol.
2002. V. 68. P. 772-783.
462. Kussmaul M., Wilimzig M., Bock E. Methanotrophs and methanogens in masonry //
Appl. Environ. Microbiol. 1998a. V. 64. P. 4530-4532.
463. Kussmaul M., Groengroeft A., Koethe H. Emissions of porewater compounds and ga-
ses from the subaquatic sediment disposal site “Rodewischhafen”, Hamburg harbour d
Wat.Sci. Tech. 1998b. V. 37. P. 87-93.
464. Kutschera U., Niklas KJ. Endosymbiosis, cell evolution, and speciation // Theory
Biosci. 2005. V. 24. P. 1-24.
465. Kutschera U., Thomas J., Hornschuh M. Cluster formation in liverwort-associate '
methylobacteria and its implications // Naturwissenschaften. 2007. V. 94. P. 687-692.
466. La Roche S.D., Leisinger T. Identification of dcmR, the regulatory gene governin-
expression of dichloromethane dehalogenase in Methylobacterium sp. DM4 // J. Вас
teriol. 1991. V. 173. P. 6714-6721.
302
467. La Roche S.D., Leisinger T. Sequence analysis and expression of the bacterial di-
chloromethane dehalogenase structural gene, a member of the glutathione S-trans-
ferase supergene family //J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 164-171.
468. Lacava P.T., Silva-Stenico M.E., Araujo W.L. Simionato A.V.C., Carrilho' E.
Tsai S.M., Azevedo J.L. Detection of siderophores in endophytic bacteria Methylobac-
terium spp. associated with Xilella fastidiosa subsp. pauca // Pesq. Agropec. Bias
2008. V. 43. P. 521-528.
469. Langley D.B., Duff A.P., Freeman H.C., Guss J.M. The copper-containing amine oxi-
dase from Arthrobacter globiformis: refinement at 1.55 and 2.20 A resolution in two
crystal forms// Acta Cryst. 2006. V. 62. P. 1052-1057.
470. Large P.J., Bamforth C.B. Methylotrophy and biotechnology // New York: Longman
Scientific & Technical, John Wiley & Sons, 1988. 303 p.
471. Large P.J., Peel D., Quayle J.R. Microbial growth on Cl compounds. II. Synthesis of
cell constituents by methanol- and formate-grown Pseudomonas AM 1, and methanol-
grown Hyphomicrobium vulgare // Biochem. J. 1961. V. 81. P. 470—480.
472. Laukel M., Rossignol M., Borderies G., Voelker U., Vorholt J A. Comparison of the
proteome of Methylobacterium extorquens AMI grown under methylotrophic and
nonmethylotrophic conditions // Proteomics. 2004. V. 4. P. 1247-1264.
473. Law K.S., Sturges W.T. Halogenated very short-lived substances. Scientific assessment
of ozone depletion: 2006. // Global ozone research and monitoring project - Report
No. 50 / Ed.: C.A. Ennis. Geneva: World Meteorol. Org., 2007. 572p.
474. Lawton SA., Anthony C. The role of blue copper proteins in the oxidation of methyl-
amine by an obligate methylotroph // Biochem J. 1985a. V. 228. P. 719-726.
475. Lawton SA., Anthony C. The roles of cytochromes and blue copper proteins in the
oxidation of methanol and methylamine in organism 4025, an obligate methylotroph //
J. Gen. Microbiol. 1985b. V. 131. P. 2165-2171.
476. Leak D.J. Methylotrophs, industrial applications // Encyclopaedia of bioprocess tech-
nology: fermentation, biocatalysis and bioseparation I Eds.: M.C. Flickinger,
S.W. Drew. New York: John Wiley & Sons, 1999. P. 1742-1753.
477. Lechevalier M.P., Prauser H., Labeda D.P., Ruan J.S. Two new genera of nocardio-
form actinomycetes: Amycolata gen. nov. and Amvcolatopsis gen. nov. // Int. J. Syst.
Bacteriol. 1986. V. 36. P. 29-37.
478. Lee C. Amino acid and amine biogeochemistry in marine particulate material and
sediments // Nitrogen cycling in coastal marine environments I Eds.: Т.Н. Blackburn,
J. Soerensen. New York: SCOPE, John Wiley & Sons, 1988. P. 125-141.
479. Lee H.-H., Kim S.-J., Shin H.-J., Park J.-Y., Yang J.-W. Purification and characterisa-
tion of methyl mercaptan oxidase from Thiobacillus thioparus for mercaptan detection
// Biotechnol. Bioprocess Engineering. 2002. V. 7. P. 375-379.
480. Lee J.H., Kim Y.S., Choi T-J., Lee W.J., Kim Y.T. Paracoccus haeundaensis sp.nov., a
gram-negative, halophilic, astaxanthin-producing bacterium // Int. J. Syst. Evol. Mi-
crobiol. 2004. V. 54. P. 1699-1702.
481. Lee K-В., Liu C.-Т., Anzai Y., Kim H., Aono T., Oyaizu H. The hierarchical system of
the Alphaproteobacteria ': description of Hyphomonadaceae fam. nov., Xanthobac-
teraceae fam. nov. and Erythrobacteraceae fam. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.
2005. V. 55. P. 1907-1919.
482. Leisinger T. Biodegradation of chlorinated aliphatic compounds // Curr. Opin. Bio-
technol. 1996. V. 7. P. 295-300.
483. Leisinger T., Bader R., Hermann R., Schmid-Appert M., Vuilleumier S. Microbes, enzy-
mes and genes involved in dichloromethane utilization // Biodegradation. 1994. V. 5.
P. 237-248.
484. Lentzen G., Schwarz T. Extremolytes: natural compounds from extremophiles for
versatile applications// Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72. P. 623-634.
303
485. Lerouge P., Roche P., Faucher C., Maillet F., Truchet G., Prome J.-C., Denarie J,
Symbiotic host-specificity of Rhizobium meliloti is determined by a sulphated and acy-
lated glucosamine oligosaccharide signal // Nature. 1990. V. 344. P. 781-784.
486. Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C. H2O2 from the oxidavite burst orchestratea
the plant hypersensitive disease resistance response // Cell. 1994. V. 79. P. 583-593.
487. Lidstrom M.E. Aerobic methylotrophic prokaryotes // The prokaryotes. 3rd edn, / Eds.:
A. Balows et al. New York: Springer Veriag, 2006. V. 2. P. 618-634.
488. Lidstrom M.E., Anthony C., Biville F., Gasser F., Goodwin P., Hanson R., Harms N,
New unified nomenclature for genes involved in the oxidation of methanol in gram-
negative bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V. 117. P. 103-106.
489. Lidstrom ME., Chistoserdova L. Plants in the pink: cytokinin production by Methylo-
bacterium //J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 1818.
490. Lidstrom ME., Meldrum D.R. Life-on-a-chip // Nature. 2003. V. 1. P. 158—164.
491. Lin J., Smith M.P., Chapin K.C., Baik H.S., Bennett G.N., Foster J.W. Mechanisms of
acid resistance in enterohemorrhagic Escherichia coli // Appl. Environ. Microbiol.
1996. V. 62. P. 3094-3100.
492. Lindsay M.R., Webb R.I., Strous M., Jetten M.S.M., Butler M.K., Forde R.J., Fuerst
J.A. Cell compartmentalisation in planctomycetes: novel types of structural organisa-
tion for the bacterial cell // Arch. Microbiol. 2001. V. 175. P. 413-429.
493. Line D.E., Wu J., Arnold J A., Jennings G.D., Rubin A.R. Water quality of first flush
runoff from 20 industrial sites // Water Environ. Res. 1997. V. 69. P. 305-310.
494. Lippert K., Galinski E.A. Enzyme stabilisation by ectoine-type compatible solutes:
protection against heating, freezing and drying // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992.
V. 37. P. 61-65.
495. Liu P„ Nester E.W. Indoleacetic acid, a product of transferred DNA, inhibits vir gene
expression and growth of Agrobacterium tumefaciens C58 // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 2006. V. 103. P. 4658—4662.
496. LobertJ.M., Butler J. H., Montzka SA., Geller L.S., Myers R.C., Elkins J.W. A net sink
for atmospheric CH iBr in the East Pacific Ocean // Science. 1995. V. 267. P. 1002—1005.
497. Long R., Morris R., Polacco J. Cytokinin production by plant-associated methylotro-
phic bacteria // The Amer. Soc. Plant Physiol. 1997. Abstr. № 1168.
498. Lous P., Galinski E.S. Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible
solute ectoine from Marinococcus halophilus and osmoregulated expression in Es-
cherichia coli // Microbiology. 1997. V. 143. P. 1141-1149.
499. Lovelock J.E. Natural halocarbons in the air and the sea // Nature. 1975. V. 256.
P. 193-194.
500. Lowe S.E., Jain M.K., ZeikusJ.G. Biology, ecology, and biotechnological applications
of anaerobic bacteria adjusted to environmental stresses in temperature, pH, salinity,
or substrates // Microbiol. Rev. 1993. V. 57. P. 451-509.
501. Lueders T., Wagner B., Claus P., Friedrich M.W. Stable isotope probing of rRNA and
DNA reveals a dynamic methylotroph community and trophic interactions with fungi
and protozoa in oxic rice field soil // Environ. Microbiol. 2004. V. 6. P. 60-72.
502. MacDonald R., Fall R. Detection of substantial emissions of methanol from plants to
the atmosphere //Atmos. Environ. 1993. V. 27A. P. 1709-1713.
503. MacKay D., Shiu W.Y., Ma K.C. Illustrated handbook of physical-chemical properties
and environmental fate of organic chemicals. III. Volatile organic chemicals // Ed.:
D. Mackay. Boca Raton: Lewis Publ. Inc., 1993. P. 400-406.
504. MacLennan D.G., GowJ.S., Stringer D.A. The ICI methanol-bacterium process for the
production of single-cell protein // Proc. Roy. Aust. Chem. Inst. 1973. V. 40. P. 54-61.
505. Modern D., Ebel C., Zaccai G. Halophilic adaptation of enzymes // Extremophiles.
2000. V. 4. P. 91-98.
304
506.
507-
508.
509.
510.
Madhaiyan M., Kim B.Y., Poonguzhali S., Kwon S. W., Song M.H., Ryu J.H., Go S.J.,
Koo B.S., Sa T.M. Methylobacterium oryzae sp. nov., an aerobic, pink-pigmented, fac-
ultatively methylotrophic, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase-producing
bacterium isolated from rice // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007a. V. 57. P. 326-331.
Madhaiyan M., Poonguzhali S., Kwon S. W. Sa T.M. Methylobacterium phyllosphaerae
sp. nov., a pink-pigmented, facultative methylotroph from the phyllosphere of rice //
Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. V. 59. P. 22-27.
Madhaiyan M., Poonguzhali S., Ryu J.-H., Sa T.-M. Regulation of ethylene levels in
canola (Brassica campestris) by 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase-con-
tain ing Methylobacterium fujisawaense // Planta. 2006. V. 224. P. 268-278.
Madhaiyan M., Poonguzhali S., Sa T. Characterization of 1-aminocyclopropane-l-
carboxylate (ACC) deaminase containing Methylobacterium oryzae and interactions
with auxins and ACC regulation of ethylene in canola (Brassica campestris) // Planta.
2007b. V. 226. P. 867-876.
Madhaiyan M., Poonguzhali S., Senthilkumar M., SeshadriS., Chung H., Yang J., Sun-
daram S., Sa T. Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar
Co-47 (Oryza sativa L.) by Methylobacterium sp. I I Bot. Bull. Acad. Sin. 2004. V. 45.
P. 315-324.
511.
512.
513.
From DNA to plastic // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V. 63. P. 21-53.
Manley S.L., Goodwin K.D., North W.J. Laboratory production of bromoform, me-
thylene bromide and methyl iodide by macroalgae and distribution in nearshore south-
ern California waters // Limnol. Oceanogr. 1992. V. 37. P. 1652-1659.
Manulis S., Haviv-Chesner A., Brandl M.T., Lindow S., Barash /. Differential invol-
vement of indole-3-acetic acid biosynthetic pathways in pathogenicity and epiphytic
fitness of Erwinia herbicola pv. gypsophilae // Mol. Plant-Microbe Interact. 1998.
V. 11. P. 634-642.
514.
515.
516.
517.
518.
519.
520.
521.
522.
Manulis S., Valinski L., Gafni Y., Hershenhorn Y. lndole-3-acetic acid biosynthetic
pathways in Erwinia herbicola in relation to pathogenicity on Gypsophda paniculata
// Physiol. Mol. Plant Pathol. 1991. V. 39. P. 161-171.
Marco M.L., LegacJ., Lindow S.E. Pseudomonas syringae
enes induced during colo-
nization of leaf surfaces // Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 1379-1391.
Martin J.L. Thioredoxins: a fold for all reasons // Structure. 1995. V. 3. P. 245-250.
Martinez-Cruz LA., Dreyer M.K, Boisvert D.C., Yokota H., Martinez-Chanter M.L.,
Kim R., Kim S.H. Crystal structure of MJ1247 protein from M. jannaschii at 2.0 A
resolution infers a molecular function of 3-hexulose-6-phosphate isomerase // Struc-
ture. 2002. V. 10. P. 195-204.
Martinez-Romero E. The dinitrogen-fixin
bacteria // The prokaryotes. 3rc edn. / Eds.:
Marx C.J., Laukel M., Vorholt J A., Lidstrom M.E. Purification of the formate-
tetrahydrofolate ligase from Methylobacterium extorquens AMI und demonstration of
its requirement for methylotrophic growth // J. Bacteriol. 2003a. V. 185. P. 7169-7175.
Marx C.J., Lidstrom M.E. Development of an insertional expression vector system for
Methylobacterium extorquens AMI and generation of null mutants lacking mtdA
and/or fch // Microbiology. 2004. V. 150. P. 9-19.
Marx C.J., Miller J A., Chistoserdova L., Lidstrom M.E. Multiple formaldehyde oxida-
tion/detoxification pathways in Burkholderia fungorum LB400 // J. Bacteriol. 2004.
V. 186. P. 2173-2178.
Marx C.J., O’Brien B.N., Breezee J., Lidstrom M.E. Novel methylotrophy genes of Me-
thylobacterium extorquens AMI identified by usin
transposon mutagenesis includin
a putative dihydromethanopterin reductase//J. Bacteriol. 2003b. V. 185. P. 669-673.
305
523.
524.
525.
526.
527.
528.
529.
530.
531.
532.
533.
534.
535.
536.
537.
538.
'Al
Ubiq.
Marx CJ., Van Dien S.J., Lidstrom M.E. Flux analysis uncovers key role of functl
redundancy in formaldehyde metabolism // PLoS Biology. 2005. V. 3. P. 0244-02«, '*
McAnulla C., McDonald I.R., Murrell J.C. Methyl chloride utilising bacteria are nk-
uitous in the natural environment // FEMS Microbiol. Lett. 2001a. V. 201. p. 15j
McAnulla C., Woodall CA., McDonald I.R., Studer A., Vuilleumier S., Leisinger ?
Murrell J.C. Chloromethane utilization gene cluster from Hyphomicrobium chia
melhaneicum strain СМ21 and development of functional gene probes to detect h°"
lomethane-degrading bacteria//Appl. Environ. Microbiol. 2001b. V. 67. P. 307-3
McDonald I.R., Kaempfer P., Topp E., Warner K.L., Cox M.J., Hancock TJL.C., Mill
L.G., Larkin MJ., Ducrocq V., Coulter C., Harper D.B., Murrell J.C., Oremland Rs
Aminobacter ciceronei sp. nov. and Aminobacter lissarensis sp. nov., isolated from v
rious terrestrial environments//Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V.55. P. 1827-1832
McDonald I.R., Doronina N.V., Trotsenko Y.A., McAnulla C., Murrell J.C. Hyphomi
crobium chloromethanicum sp. nov. and Methylobacterium chloromethanicum sn
nov., chloromethane-utilizing bacteria isolated from a polluted environment // In» j
Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 119-122. ’ ‘
McDonald I.R., Murrell J.C. The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and
its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs // Appl. Envi
ron. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3218-3224.
McDonald I.R., Warner K.L., McAnnula C., Woodall CA, Oremland R.S., Mur-
rellJ.C. A review of bacterial methyl halide degradation: biochemistry, genetics an.1
molecular ecology // Environ. Microbiol. 2002. V. 4. P. 193-203.
McDonnel L., Plett J.M., Andersson-Gunnerds S., Kozela C., Dugardeyn J., Van Der
Straeten D., Glick B.R., Sundberg B., Regan S. Ethylene levels are regulated by pj iy
encoded 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid deaminase // Physiol. Plant. 2009
V. 136. P. 94-109.
McLaggan D., Naprstek J., Buurman E. T., Epstein W. Interdependence of K+ and
glutamate accumulation during osmotic adaptation of Escherichia coli // J. Biol
Chem. 1994. V. 269. P. 1911-1917.
Meister M., Saum S., Alber B.E., Fuchs G. L-malyl-coenzyme A/beta-methylmalyl-
coenzyme A lyase is involved in acetate assimilation of the isocitrate lyase-negative
bacterium Rhodobacter capsulatus // J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 1415-1425.
Miller C., Skoog F., Okumura F., Saltza M., Von Strong F. Isolation, structure aid
synthesis of kinetin, a substance promoting cell division // J. Amer. Chem. Soc. 195'.
V. 78. P. 1375.
Miller J.F., Mekalanos J.J., Falkow S. Coordinate regulation and sensory transduction
in the control of bacterial virulence // Science. 1989. V. 243. P. 916-922.
Miller L.G., Baesman S.M., Oremland R.S. Bioreactors for removing methyl bromiX
following contained fumigations // Environ. Sci. Technol. 2003. V. 37. P. 603-607.
Miller L.G., Connell T.L., Guidetti J.R., Oremland R.S. Bacterial oxidation of methyl
bromide in fumigated agricultural soils // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. '3.
p. 4346-4354.
Miller L.G., Warner K., Baesman S.M., Oremland R.S., McDonald I.R., Radajewski S.,
Murrell J.C. Degradation of methyl bromide and methyl chloride in soil microcosms;
Use of stable C isotope fractionation and stable isotope probing to identify reactions
and the responsible microorganisms // Geochim. Cosmochim. Acta. 2004. V.
P.3271-3283.
Mills J., Wyborn N.R., Greenwood J A., Williams S.G., Jones C.W. Characterisation of
a binding-protein-dependent, active transport system for short-chain amides and uM
in the methylotrophic bacterium Methylophilus methylotrophus // Eur. J. Biochem.
1998. V. 251. P. 45-53.
306
539.
540-
541.
542.
543.
544.
545.
546.
547.
548.
549.
550.
551.
552.
553.
554.
555.
556.
Misaki A., Tsuburaya Y., Kakuta M. D-Allose-containing polysaccharide synthesized
from methanol by Pseudomonas sp. // Carbohydrate Res. 1979. V. 75. P. 8-19.
Misset-Smits M
acetyl-L-cysteinyl]amido-2'-deoxy-alpha-D-glucopyranosyl)-D-myo-inositol,
factor of NAD/factor-dependent formaldehyde dehydrogenase H FEBS. Lett. 1997.
V. 409. P. 221-222.
Van Ophem P.W., Sakuda S., Duine J A. Mycothiol, l-O-(2'-[N-
is the
Mitsui R., Kusano Y., Yurimoto H., Sakai Y., Kato N., Tanaka M. Formaldehyde fixa-
tion contributes to detoxification for growth of a nonmethylotroph, Burkholderia ce-
pacia TM1, on vanillic acid // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 6128-6132.
Mitsui R., Sakai Y., Yasueda H., Kato N. A novel operon encoding formaldehyde fixa-
tion: the ribulose monophosphate pathway in the Gram-positive facultative methylo-
trophic bacterium Mycobacterium gastri MB19//J. Bacteriol. 2000. V. 184. P. 944-948.
MiyoshiA., Rochat T., GratadeuxJJ., Le Loir Y., Oliveira S.C., Langella P., Azevedo
V. Oxidative stress in Lactococcus lactis // Genet. Mol. Res. 2003. V. 2. P. 348-359.
Molenaar D., Van der Rest M.E., Drysch A., Yuecel R. Functions of the membrane-
associated and cytoplasmic malate dehydrogenases in the citric acid cycle of Coryne-
bacterium glutamicum // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 6884-6891.
Monier J.M., Lindow S.E. Frequency, size, and localization of bacterial aggregates on
bean leaf surfaces // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 346-355.
Montzka SA., Fraser L.P. Controlled substances and other source gases // Scientific
assessment ofozone depletion:2002. World Meteorol.Org. 2003. V. 1. P. 1.1-1.83.
Moosvi SA., McDonald I.R., Pearce DA., Kelly D.P., WoodA.P. Molecular detection
row with methylated
and isolation from Antarctica of methylotrophic bacteria able to
sulfur compounds // Syst. Appl. Microbiol. 2005a. V. 28. P. 541-554.
Moosvi SA., Pacheco C.C., McDonald I.R., De Marco P., Pearce DA., Kelly D.P.
Wood A.P. Isolation and properties of methanesulfonate-degrading Afipia felis from
Antarctica and comparison with other strains of A. felis // Environ. Microbiol. 2005b.
V. 7. P. 22-33.
Moran M.A., Buchan A., Gonzralez J.M., Heidelberg J. F., Whitman W.B., Keine R.P.,
Henriksen J.R., King G.M., Belas R., Fuqua C., Brinkac L., Lewis M., Johri S., Wea-
ver B., Pai G., Eisen J A., Rahe E., Sheldon W.M., Ye W., Miller T.R., Carlton J.,
Rasko DA. Paulsen LT., Ren Q., Daugherty S.C., Deboy R.T., Dodson R.J., Dur-
kin A.S., Ma-dupu R., Nelson W.C., Sullivan SA., Rosovitz M.J., Haft D.H., Selen-
gut J., Ward N. Genome sequence of Silicibacter pomeroyi reveals adaptations to the
marine environment // Nature. 2004. V. 432. P. 910-913.
Mothes G., Ackermann J. U., Babel W. Regulation of poly(3-hydroxybutyrate) synthe-
sis in Methylobacterium rhodesianum MB 126 growing on methanol or fructose I I
Arch. Microbiol. 1998. V. 169. P. 360-363.
Mothes G., Babel W. Methylobacterium rhodesianum MB 126 possesses two acetoace-
tyl-CoA reductases//Arch. Microbiol. 1994. V. 161. P. 277-280.
Mothes G., Babel W. Methylobacterium rhodesianum MB 126 possesses two steno-
specific crotonyl-CoA hydratases Ц Can. J. Microbiol. 1995. V. 41. Suppl. 1. P. 68-72.
Moulin L., Munive A., Dreyfus B., Boivin-Masson C. Modulation of legumes by mem-
bers of the beta-subclass of Proteobacteria // Nature. 2001. V. 411. P. 948-950
Mueller R. H., Rohwerder T., Harms H. Degradation of fuel oxygenates and their main
intermediates by Aquincola tertiaricarbonis L108 // Microbiology. 2008. V. 154.
P. 1414-1421.
Mueller V., Oren A. Metabolism of chloride in halophilic prokaryotes // Extremo-
philes. 2003. V. 7. P. 261-266.
Mustakhimov LI., Rozova O.N., Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Murrell C.J.,
Trotsenko KA. Characterization of the recombinant diaminobutyric acid acetyltrans-
307
557.
558.
559.
ferase from Methylophaga thalassica and Methylophaga alcalica // FEMS Micros
Lett. 2008. V. 283. P. 91-96.
Nakatsu C.H., Hristova K., Hanada S., Meng X.Y., Hanson J.R., Scow K.M., Ratn
gata Y. Methylibium petroleiphilum gen. nov., sp. nov., a novel methyl tert-b t
ether-degrading methylotroph of the Betaproteobacteria // Int. J. Syst. Evol Mk*
biol. 2006. V. 56. P. 983-989. '
Nakayama H., Yoshida K., Ono H., Murooka Y., Shinmyo A. Ectoine, the compatibi
solute of Halomonas elongata, confers hyperosmotic tolerance in cultured tobacco
cells 11 Plant Physiol. 2000. V. 122. P. 1239-1247.
Nakazawa H., Kumagai H., Yamada H. Aromatic L-amino acid decarboxylase frtvn
Micrococcus percitreus: purification, crystallization and properties // Agric Bini
Chem. 1981. V. 45. P. 2543-2552. * '•
’60. Narumiya S., Takai К., Tokuyama T., Noda Y., Ushiro H., Hayaishi O. A new meta
bolic pathway of tryptophan initiated by tryptophan side chain oxidase // J Biol
Chem. 1979. V. 254. P. 7007-7015.
561. Neff J.C., Holland E.A., Dentener F.J., McDowell W.H., Russell K.M. The origin
composition and rates of organic nitrogen deposition: a missing piece of the nitrogen
cycle? // The nitrogen cycle at regional to global scales. Biogeochem. 2002. V 57/58
P. 99-136.
562. Nemecek-M ar shall M., MacDonald R.C., Franzen J.J., Woiciechowski C.L., Fall R
Methanol emission from leaves (enzymatic detection of gas-phase methanol and rela-
tion of methanol fluxes to stomatai conductance and leaf development) // Plant
Physiol. 1995. V. 108. P. 1359-1368.
563. Nercessian O., Noyes E., Kalyuzhnaya M.G., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Bacte-
rial populations active in metabolism of Cl compounds in the sediment of Lake Wash-
ington, a freshwater lake // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 6885-6899.
564. Neufeld J.D., Boden R., Moussard H., Schaefer H., Murrell J.C, Substrate-specific
clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloou. in a
temperate coastal environment//Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 7321-7328.
565. Neufeld J.D., Dumont M.G., VohraJ., Murrell J.C. Methodological considerations for
the use of stable isotope probing in microbial ecology // Microb. Ecol. 2007a. V. 53.
p. 435—442.
566. Neufeld J.D., Schaefer H., Cox MJ., Boden R., McDonald I.R., Murrell J.C. Stable-
isotope probing implicates Methylophaga spp. and novel Gammaproteobacteria in
marine methanol and methylamine metabolism I IISME J. 2007b. V. 1. P. 480-491.
567. Neufeld J.D., Wagner M., Murrell J.C. Who eats what, where and when? Isotojv
labeling experiments are coming of age // ISME J. 2007c. V. 1. P. 103-110.
568. Newton S.S., Duman J.G. An osmotin-like cryoprotective protein from the bittersweet
nightshade Solanum dulcamara // Plant Mol. Biol. 2000. V. 44. P. 581-589.
569. Nieto Penalver C.G., Morin D., Cantet F., Saurel O., Milon A., Vorholt J A. Methylo-
bacterium extorquens AM 1 produces a novel type of acyl-homoserine lactone with
double unsaturated side chain under methylotrophic growth conditions // FEBS Lett.
2006. V. 580. P. 561-567.
570. Nikaido H. Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes //
J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 3905-3908.
571. Nikolausz M., Kappelmeyer U., Nijenhuis I., Ziller K., Kaestner M. Molecular charac-
terization of dichloromethane-degrading Hyphomicrobium strains using 16S rDNA and
DCM dehalogenase gene sequences// Syst. Appl. Microbiol. 2005. V. 28. P. 582-587.
572. Nishio N., Tsuchiya Y., Hayashi M., Nagai S. A fed-batch culture of methanol-utilizing
bacteria with pH-stat // J. Ferment. Technol. 1977. V. 55. P. 151-155.
573. Normanly J., Bartel B. Redundancy as a way of life - 1AA metabolism // Curr. Opin-
Plant Biol. 1999. V. 2. P. 207-213.
308
574.
575.
576.
577.
578.
579.
580.
581.
582.
583.
584.
585.
586.
587.
588.
589.
590.
591.
592.
593.
594.
NormanlyJ., SlovinJ.P., Cohen J.D. Rethinking auxin biosynthesis and metabolism //
Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 323-329.
O’Connor C.D., Adams P., Alefounder P., Farris M., Kinsella N., Li Y., Payot S.,
Skipp P. The analysis of microbial proteomes: strategies and data exploitation // Elec-
trophoresis. 2000. V. 21. P. 1178-1186.
Oberhaensli T, Defago G., Haas D. Indole-3-acetic acid (IAA) synthesis in the bio-
control strain CHAO of Pseudomonas fluorescens: role of tryptophan side chain oxi-
dase //J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 2273-2279.
Ochman H., Davalos L.M. The nature and dynamics of bacterial genomes // Science.
2006. V. 311. P. 1730-1733.
O'Donovan M.R., Mee M.D. Formaldehyde is a bacterial mutagen in a range of Sal-
monella and Escherichia indicator strains // Mutagenesis. 1993. V. 8. P. 577-581.
Olah GA. Beyond oil and gas: the methanol economy // Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
2005. V. 44. P. 2636-2639.
Olah GA., GoeppertA., Prakash G.K.S. Beyond oil and gas: the methanol economy //
Weinheim: Wiley-VCH, 2006. 278 p.
Omer Z.S., Tombolini R., Broberg A., Gerhardson B. Indole-3-acetic acid production
by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria // J. Plant Growth Regul. 2004.
V. 43. P. 93-96.
Ono H.. Sawada K., Khunajakr N., Tao T., Yamamoto M., Hiramoto M., Shinmio A.,
Takano M., Murooka Y. Characterization of biosynthetic enzymes for ectoine as a
compatible solute in a moderately halophilic bacterium, Halomonas elongata // J. Bac-
teriol. 1999. V. 181. P. 91-99.
Oremland R.S., Capone D.G., Stolz J.F., Fuhrman J. Whither or wither geomicrobiol-
ogy in the era of “community metagenomics" // Nat. Rev. Microbiol. 2005. V. 3.
P. 572-578.
Oremland R.S., Miller L.G., Strohmaier F.E. Degradation of methyl bromide in an-
aerobic sediments // Environ. Sci. Technol. 1994. V. 28. P. 514-520.
Oren A. Formation and breakdown of glycine betaine and trimethylamine in hyper-
saline environments // Antonie van Leeuwenhoek. 1990. V. 58. P. 291-298.
Oren A. Halophilic microorganisms and their environments // Dordrecht: Kluwer
Acad. Publ., 2002. 545 p.
Orita I., Sakamoto N., Kato N., Yurimoto H., Sakai Y. Bifunctional enzyme fusion of
3-hexulose-6-phosphate synthase and 6-phospho-3-hexuloisomerase // Appl. Micro-
biol. Biotechnol. 2007. V. 76. P. 439^145.
Orita L, Sato T., Yurimoto H., Kato N., Atomi H., Imanaka T, Sakai Y. The ribulose
monophosphate pathway substitutes for the missing pentose phosphate pathway in the
archaeon Thermococcus kodakaraensis!! J. Bacteriol. 2006. V. 188. P. 4698-4704.
Orita I., Yurimoto H., Hirai R., Kawarabayasi Y., Sakai Y., Katou N. The archaeon
Pyrococcus horikoshii possesses a bifunctional enzyme for formaldehyde fixation via
the ribulose monophosphate pathway I I J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 3636-3642.
Osterman-Golkar S., Hussain S., Walles S., Anderstam B, Sigvardsson K. Chemical
reactivity and mutagenicity of some dihalomethanes // Chem. Biol. Interactions. 1983.
V. 46. P. 121-130.
Ottengraf S., Meesters J., Van den Oever A., Rosema H. Biological elimination of vo-
latile xenobiotic compounds in biofilters// Bioprocess Engineering. 1986. V. 1. P. 61-69.
Oyaizu-Masuchi Y., Komagata K. Isolation of free-living nitrogen-fixing bacteria from
the rhizosphere of rice // J. Gen. Appl. Microbiol. 1988. V. 34. P. 127-164.
Padan E., Bibi E„ Ito M., Krulwich TA. Alkaline pH homeostasis in bacteria: new
insights// Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1717. P. 67-88.
Palleroni N.J., Holmes B. Pseudomonas cepacia sp. nov., nom. rev. // Int. J. Syst.
Bacteriol. 1981. V. 31. P. 479—481.
309
595.
596.
597.
598.
Pandey R.A., Gangane R., Mudliak S.N., Rajvaidya A.S. Treatment of waste gas con-
taining monomethylamine in a biofilter enriched with Pseudomonas mendocina Ц
Waste management. 2006. V. 26. P. 233-244.
Park S.W., Hwang E.H., Park H., Kim J.A., Heo J., Lee K.H., Song T., Kim E
Ro Y.T., Kim S.W., Kim Y.M. Growth of Mycobacteria on carbon monoxide and
methanol // J. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 142-147.
Patt T.E., Cole G.C., Hanson R.S. Methylobacterium, a new genus of facultatively
methylotrophic bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1976. V. 26. P. 226-229.
Patten C.L., Glick B.R. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid // Can. J. Micro
biol. 1996. V. 42. P. 207-220.
599. Penalver C.G.N., Cantet F., Morin D., Haras D., Vorholt J.A. A plasmid-borne trun-
cated lux! homolog controls quorum-sensing systems and extracellular carbohydrate
production in Methylobacterium extorquens AMI // J. Bacteriol. 2006a. V. 188
P. 7321-7324.
600. Penalver C.G.N., Morin D., Cantet F., Saurel O., Milon A., Vorholt J A. Methylob.c-
terium extorquens AM 1 produces a novel type of acyl-homoserine lactone with a dou-
ble unsaturated side chain under methylotrophic growth conditions // FEBS Lett
2006b. V. 580. P. 561-567.
601.
602.
603.
604.
605.
606.
607.
608.
609.
610.
611.
612.
Persello-Cartieaux F., David P., Sarrobert C, Thibaud M.S., Achouak W., Robaglia
C., Nussaume L. Utilization of mutants to analyze the interaction between Arabidopsis
and its naturally root-associated Pseudomonas // Planta. 2001. V. 212. P. 190-198.
Peyraud R., Kiefer P., Christen P., Massou S., Portais J.-C, Vorholt J.A. Demonstra-
tion of the ethylmalonyl-CoA pathway using 13C metabolomics // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2009. V. 106. P. 4846-4851.
Pilinis C., King D.B., Saltzman E.S. The oceans: A source or a sink of methyl bro-
mide? //Geophys. Res. Lett. 1996. V. 23. P. 817-820.
Pirttilae A.M., Hohtola A., Ivanova E.G., Fedorov D.N., Doronina N.V., Trotsen-
ko YA. Localization of plant-associated bacteria by in situ hybridization // Prospects
and applications for plant-associated microbes. A laboratory manual. Part A: Bacteria /
Eds.: S. Sorvari, A.M. Pirttilae. Turku: Biobien Innovations, 2008. P. 61-64.
Pirttilae A.M., Laukkanen H., Pospiech H., Myllyla R., Hohtola A. Detection of intra-
cellular bacteria in the buds of Scotch pine (Pinus sylvestris L.) by in situ hybridization
// Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 3073-3077.
Pluschkell S.B., Flickinger M.C. Dissimilation of [(13)C]methanol by continuous
cultures of Bacillus methanolicus MG A3 at 50 degrees C studied by (13)C NMR and
isotope-ratio mass spectrometry // Microbiology. 2(X)2. V. 148. P. 3223-3233.
Poelarends GJ., Kulakov LA., Larkin M.J., Van Hylckama Vleig J.E.T., Janssen D.B.
Roles of horizontal gene transfer in gene integration of evolution of 1,3-dibromo-
ethane-degradative pathways//J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 2191-2199.
Pol A., Op den Camp HJ.M., Mees S.G.M., Kersten MA.S.H., Van der Drift C. Isola-
tion of a dimethylsulfide-utilizing Hyphomicrobium species and its application in
biofiltration of polluted air // Biodegradation. 1994. V. 5. P. 105-112.
Pollmann S., Mueller A., Piotrowski M., Weiler E.W. Occurrence and formation of
indole-3-acetamide in Arabidopsis thaliana // Planta. 2002. V. 216. P. 155-161.
Pollock R.J., Hersh L B. N-methylglutamate synthetase. Purification and properties of
the enzyme // J. Biol. Chem. 1971. V. 246. P. 4737^4743.
Pollock RJ., Hersh L.B. N-methylglutamate synthetase. The use of flavin mononu-
cleotide in oxidative catalysis // J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 6724-6733.
Pomper B.K., Saurel O., Milon A., Vorholt J A. Generation of formate by the formyl*
transferase/hydrolase complex (Fhc) from Methylobacterium extorquens AM 1 // FEBS
Lett. 2002. V. 523. P. 133-137.
310
613.
614.
615.
616.
617.
618.
619.
620.
621.
622.
623.
624.
625.
626.
627.
628.
629.
630.
631.
632.
Popov V.O., Lamzin VS. NAD+-dependent formate dehydrogenase // Biochem. J.
1994. V. 301. P. 625-643.
Poston J.M. Coenzyme Bi2-depended enzymes in potatoes: Leucine 2,3-aminomutase
and methylmalonyl-CoA mutase // Phytochemistry. 1978. V. 17. P. 401—402.
Poston J.M. Leucine 2,3-aminomutase: A cobalamin-dependent enzyme present in
bean seedlings// Science. 1977. V. 195. P. 301-302.
Prade R.A., Zhan D.F., Ayoubi P., Mort A.J. Pectins, pectinases and plant-microbe
interactions// Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 1999. V. 16. P. 361-391.
Pratt L.A., Silhavy TJ. Porin regulon of Escherichia coli // Two-component signal
transduction / Eds.: J.A. Hoch, T.J. Silhavy.
Washington DC: ASM, 1995. P. 105-127.
Priefert H., Krueger N., Jendrossek D., Schmidt B., Steinbuechel A. Identification and
molecular characterization of the gene coding for acetaldehyde dehydrogenase II
(acoD) of Alcaligenes eutrophus I IJ. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 899-907.
Prigent-Combaret C., Blaha D., Pothier J. F., Vial L., Poirier M.-A., Wisniewski-Dye,
Moenne-Loccoz Y. Physical organization and phylogenetic analysis of acdR as leucine-
responsive regulator of the 1-aminocyclopropane- 1-carboxylate deaminase
ene acdS
in phytobeneficial Azospirillum lipoferum 4B and other Proteobacteria // FEMS Mi-
crobiol. Ecol. 2008. V. 65. P. 202-219.
Prinsen E., Costacurta A., Michiels K., Vanderleyden J., Van Onckelen H. Azospiril-
lum brasilense indol-3-acetic biosynthesis: evidence for non-tryptophan dependent
pathway // Mol. Plant-Microbe Interact. 1993. V. 6. P. 609—615.
Quayle J.R. Aspects of the regulation of methylotrophic metabolism // FEBS Lett.
1980. V. 117. Suppl. P. K16-K27.
Quayle J.R., Ferenci T. Evolutionary aspects of autotrophy // Microbiol. Rev. 1978.
V. 42. P. 251-273.
Radajewski S., Ineson P., Parekh N.R., Murrell J.C. Stable-isotope probin
as a tool in
microbial ecolo
У //
Nature. 2000. V. 403. P. 646-649.
Radajewski S., McDonald I.R., Murrell J.C. Stable-isotope probing of nucleic acids: a
V. 14. P. 296-302.
Raghoebarsing A.A., Smolders A.J.P., Schmid M.C., Rijpstra W.I.C., Wolters-Arts M.,
Derksen J., Jetten M.S.M., Schouten S., Sinninghe Damste J.S., Larners L.P.M.,
Roelofs J.G.M., Op den Camp HJ.M., Strous M. Methanotrophic symbionts provide
carbon for photosynthesis in peat bogs // Nature. 2005. V. 436. P. 1153-1156.
Raj H.D. Oligotrophic methylotrophs: Ancylobacter (Basonym “Microcyclus” 0rskov)
Raj gen. nov I I Critical Rev. Microbiol. 1989. V. 17. P. 89-106.
Ra] H.D. Proposal of Ancylobacter gen. nov. as a substitute for the bacterial genus
Microcyclus 0rskov 1928 // Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. V. 33. P. 397-398.
Raja P., Sivaguru U., Subbiah S. Non-nodulating pink-pigmented facultative Methylo-
bacterium sp. with a functional nifH gene // World J. Microbiol. Biotechnol. 2006.
V. 22. P.1381-1384.
Rakov D.Y., Doronina N.V., Trotsenko YA., Alieva R.M. Pathway of methylacetate
metabolism in methylotrophic bacteria //FEMS Microbiol. Lett. 1990. V. 67. P. 67-72.
Rappe M.S., Giovannoni SJ. The uncultured microbial majority // Annu. Rev. Micro-
biol. 2003. V. 57. P. 369-394.
Ras J., Van Ophem P. W., Reijnders W.N.M., van Spanning R.J.M., Duine J A., Stout-
hamer A.H., Harms N. Isolation, sequencing and mutagenesis of the gene encoding
NAD- and glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (GD-FALDH) from
Paracoccus deniirificans, in which GD-FALDH is essential for the methylothrophic
growth //J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 247-251.
Rasche M.E., Hyman M.R., Arp D.J. Biodegradation of halogenated hydrocarbon fu-
migants by nitrifying bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 2568-2571.
311
633. Read J., Gill R., Dales S.L., Cooper J.B., Wood S.P., Anthony C. The molecular struc-
ture of an unusual cytochrome ci determined at 2.0A; the cytochrome ch from Methy.
lobacterium extorquens I I Protein Science. 2008. V. 8. P. 1232-1240.
634. Reding H.K, Hartel P.G., WiegelJ. Effect of Xatuhobacter, isolated and characterized
from rice roots on growth of wetland rice // Plant and Soil. 1991. V. 138. P. 221-229.
635. Rees D.A., Morris E.R., Thom D., Madden J.K. Shapes and interactions of carbohy.
drate chains // The polysaccharides I Ed.: G.O. Aspinall. London: Acad. Press, 1982
V. 1. P. 196-291.
636. Reichenbach H. Order 1. Cytophagales Leadbetter 1974, 99Л1' // Bergey’s manual of
systematic bacteriology. Г1 edn. / Eds.: J.T. Staley et al. Baltimore: The Williams &
Wilkins Co., 1989. V. 3. P. 2011-2013 / Validation List № 41 // Int. J. Syst. Bacteriol
1992. V. 42. P. 327-328.
637. Reisch C.R., Moran M.A., Whitman W.B. Dimethylsulfoniopropionate-dependent de-
methylase (DmdA) from Pelagibacter ubique and Silicibacter pomeroyi H J. Bacteriol
2008. V. 190. P. 8018-8024.
638.
639.
640.
641.
642.
643.
644.
645.
646.
647.
648.
649.
Renier A., Jourand P., Rapoir S., Poinsot V., Sy A., Dreyfus B., Moulin L. Symbiotic
properties of Methylobacteirum nodulans ORS 2060T: a classic process for an atypical
symbiont // Soil Biol. Biochem. 2008. V. 40. P. 1404-1412.
Rennenberg H. Synthesis and emission of hydrogen sulfide by higher plants // Bio-
genic sulfur in the environment. Amer. Chem. Soc. Symp. Series / Eds.: E.S. Saltz-
man, W.J. Cooper. Miami: Univ, of Miami, Florida Int. Univ., 1989. V. 393. P. 44—57.
Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Mustakhimov 1.1., Ryzhmanova КИ, Trotsenko
Y.A. Genes and enzymes of ectoine biosynthesis in haloalkahphilic obligate raethano-
troph Methylomicrobium alcaliphilum 20Z // Cellular origins, life in extreme habitats
and astrobiology (COLE). Meeting Proc, of the Halophiles I Eds.: J. Seckbach et al.
Ljubljana, 2004. V. 9. P. 328-336.
Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Mustakhimov. 1.1., Ryzhmanova Y. V, Trotsenko
Y.A. Genes and enzymes of ectoine biosynthesisin the haloalkaliphilic obligate metha-
notroph "'Methylomicrobium alcaliphilum 20Z” // Adaptation to life at high salt con-
centration in Archae, Bacteria and Eukarya I Eds.: N. Gunde-Cimerman et al.
Dordrecht: Springer Science + Business Media B.V., 2005. V. 9. P. 329-338.
Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Trotsenko YA. Characterization of the ectoine
biosynthesis genes in obligate haloalkalotolerant methanotroph Methylomicrobium al-
caliphilum 20Z//Arch. Microbiol. 2006. V. 184. P. 286-296.
Ribbe M., Gadkari D., Meyer O. N2 fixation by Streptomyces thermoautotrophicus
involves a molybdenum-dinitrogenase and a manganese-superoxide oxidoreductase
that couple N2 reduction to the oxidation of superoxide produced from O2 by a molyb-
denum-CO dehydrogenase // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 26627-26633.
Richter U., Wallace D. W.R. Production of methyl iodide in the tropical Atlantic Ocean
// Geophys. Res. Lett. 2004. V. 31. P. L23S03.
Ricillo P.M., Muglia C.I., de Buijn F.J., Roe A.J., Booth I.R., Aguilar O.M. Glu-
tathione is involved in environmental stress responses in Rhizobium tropici, including
acid tolerance // J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 1748-1753.
Rivetta A., Slayman C., Kuroda T. Quantitative modeling of chloride conductance in
yeast TRK potassium transporters // Biophys. J. 2005. V. 89. P. 2412-2426.
Roberts M.F. Organic compatible solutes of halotolerant and
isms // Saline Systems. 2005. V. 5. P. 1-30.
halophilic microorgan-
Robinson T. The organic constituents of higher plants // 5111 edn. Amherst, Massachu-
setts: Cordus Press., 1983. P. 77-79.
Roe A.J., McLaggan D., Davidson /., О Byrne C., Booth I.R. Perturbation of anion
1998. V. 180. P. 767-772.
312
650.
651.
652.
653.
654.
655.
656.
657.
658.
659.
660.
661.
662.
663.
664.
665.
666.
667.
Ronson C.W., Nixon B.T., Ausubel F.M. Conserved domains in bacterial regulatory
proteins that respond to environmental stimuli I I Cell. 1987. V. 49. P. 579-581.
Rusch D.B., Halpern A.L., Sutton G., Heidelberg K.B., Williamson S., Yooseph S.,
Wu D ., Eisen J.A., Hoffman J.M., Remington K., Beeson K., Tran B., Smith H., Baden-
Tillson H.. Stewart C., Thorpe J., Freeman J., Andrews-Pfannkoch C., Venter J.E.,
Li K., Kravitz S., Heidelberg J.F., Utterback T., Rogers Y.H., Falcon L.L, Souza V.,
Bonilla-Rosso G., Eguiarte L.E., Karl D.M., Sathyendranath S., Platt T., Berming-
ham E., Gallardo V., Tamayo-Castillo G., Ferrari M.R., Strausberg R.L., Nealson K.,
Friedman R., Frazier M., Venter J.C. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expediti-
on: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific//PLoS Biol. 2007. V.5. P. e77.
Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G., Molina A., Steiner H.Y., Hunt M.D.
Systemic acquired resistance // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1809-1819.
Saade GA. Marketing research report: methanol // Chemical economics handbook.
SRI consult. Int. 2009. http://www.sriconsulting.com/CEH/Public/Reports/674.5000/.
Saier M.H. Jr. A functional-phylogenetic classification system for transmembrane
solute transporters // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. V. 64. P. 354-411.
Saini H.S., Attieh J.M., Hanson A.D. Biosynthesis of halomethanes and methanethiol
by higher plants via a novel methyltransferase reaction // Plant Cell. Environ. 1995.
V. 18. P. 1027-1033.
Sakai Y., Mitsui R., Katayama Y., Yanase H., Kato N. Organization of the
enes invol-
ved in the ribulose monophosphate pathway in an obligate methylotrophic bacterium,
Methylomonas aminofaciens 77a // FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 176. P. 125-130.
Sanishvili R., WuR., KimD.E., Watson J.D., Collart F., JoachimiakA. Crystal structu-
re of Bacillus subtilis YckF: structural and functional evolution // J. Struct. Biol. 2004.
V. 148. P. 98-109.
Saotome M., Shirahata K., Nishimura R., Yahaba M., Kawaguchi M., Syono K., Kitsu-
wa T., Ishii Y., Nakamura T. The identification of indole-3-acetic acid and indole-3-acet-
amide in hypocotyls of Japanese cherry I I Plant Cell Physiol. 1993. V. 34. P. 157—159.
Sawada A., Oyabu T., Chen L.M., Li K.Z., Hirai N., Yurimoto H., Orita L, Sakai Y., Ka-
to N., Izui K. Purification capability of tobacco transformed with enzymes from a me-
thylotrophic bacterium for formaldehyde // Int. J. Phytoremediat. 2007. V. 9. P. 487-496.
Schaefer H. Isolation of Methylophaga spp. from marine dimethylsulfide-degrading
enrichment cultures and identification of polypeptides induced during growth on di-
methylsulfide // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 2580-2591.
Schaefer IL, McDonald I.R., Nightingale P.D., Murrell J.C. Evidence for the presence
of a CmuA methyltransferase pathway in novel marine methyl halide-oxidizing bacte-
ria // Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 839-852.
Schaefer H., Myronova N., Boden R. Microbial degradation of dimethylsulfide and
related C|-sulfur compounds: organisms and pathways controlling fluxes of sulfur in
the biosphere // J. Exp. Botany. 2010. V. 61. P. 315-334.
Schaefer J.K., Goodwin K.D., McDonald I.R., Murrell J. C., Oremland R.S. Leisingera
methylohalidivorans gen. nov., sp. nov., a marine methylotroph that grows on methyl
bromide // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 851-859.
Schaefer J.K., Miller L.G., Oremland R.S., Murrell J.C. Bacterial cycling of methyl
halides // Adv. Appl. Microbiol. 2007. V. 61. P. 307-346.
Schaefer J.K., Oremland R.S. Oxidation of methyl halides by the facultative methylo-
troph strain IMB-1 //Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 5035-5041.
Schauer S., Kutschera U. Methylotrophic bacteria on the surfaces of field-grown sun-
flower plants: a biogeographic perspesetive // Theory Biosci. 2008. V. 127. P. 23-29.
Schendel F.J., Bremmon C.E., Flickinger M.C., Guettler M., Hanson R.S. L-Lysine
production at 50°C by mutants of a newly isolated and characterized methylotrophic
Bacillus sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. V. 56. P. 963—970.
313
•ndugg
668. Schiestl R.H., Chan И/S., Gietz R.D., Mehta R.D., Hastings P.J. Carcinogens ipd
intrachromosomal recombination in yeast//Carcinogenesis. 1989. V. 10. P. 1445^id<e
669. Schloss P.D., Handelsman J. Metagenomics for studying unculturable microore
isms: cutting the Gordian knot // Genome Biol. 2005. V. 6. P. 229. °3*1'
670. Schmid-Appert M., Zoller K., Traber H., Vuilleumier S., Leisinger T. Association
newly discovered IS elements with the dichloromethane utilization genes of metbi
lotrophic bacteria // Microbiology. 1997. V. 143. P. 2557-2567.
671. Scholtz R., Wackett L.P., Egli C., Cook A.M., Leisinger T. Dichloromethane dehal
genase with improved catalytic activity isolated from a fast-growing dichloromethan
utilizing bacterium I I J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 5698-5704.
672. Schrader J., Schilling M., Hohmann D., Sell D., Filho M. V., Marx A., Vorholt Ji
Methanol-based industrial biotechnology: current status and future perspectives of me
thylotrophic bacteria // Trends in Biotechnology. 2008. V. 27. P. 107-115.
673. Schuetz A., Golbik R., Tittmann K., Svergun D.L, Koch M.H.J., Huebner G., KoenigS
Studies on structure-function relationships of indolepyruvate decarboxylase from Ел.
terobacter cloacae, a key enzyme of the indole acetic acid pathway // Eur. J. Biochem
2003. V. 270. P. 2322-2331.
674.
675.
676.
677.
678.
679.
680.
681.
682.
683.
684.
685.
686.
687.
Schulz B., Frammer W.B., Fluegge U.-L, Hummel S., Fischer K., Willmitzer L. Ex-
pression of the triose phosphate translocator gene from potato is light dependent and
restricted to green tissues // Mol. Gen. Genet. 1993. V. 238. P. 357-361.
Schwibbert K., Heidrich G., Lentzen G., Seitz H., Kunte H.J. Degradation of the com-
patible solute ectoine // Book of abstracts III International Conference on Environ-
mental, Industrial and Applied Microbiology / Lisbon, 2009. P. 577.
Senior P., Windass J.D. The IC1 single cell protein process // Biotechnol. Lett. 1980
V. 2. P. 205-210.
Shaw W.V., Tsai L., Stadtman E.R. The enzymatic synthesis of N- methylglutamic acid
//J. Biol. Chem. 1966. V. 241. P. 935-945.
Shishkina V.N., Trotsenko YA. Multiple enzymic lesions in obligate methanotrophic
bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1982. V. 13. P. 237-242.
Shoerter J.H., Kolb C.E., Crill P.M., Kerwin R.A., Talbot R.W., Hines M.E., Htrriss
R.C. Rapid degradation of atmospheric methyl bromide in soils // Nature. 1995.
V. 377. P. 717-719.
Sinninghe-Damste J.S., Rijpstrav W.I.C., Hopmans EC., Prahl F.G., Wakeham S.G.,
Schouten S. Distribution of membrane lipids of planktonic Crenarchaeota in the Ara-
bian Sea // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 2997-3002.
Sivelaee S., Sundman V. Demonstration of Thiobacillus-type bacteria, which utilize
methyl sulfides//Arch. Microbiol. 1975. V. 103. P. 303-304.
Skerman V.B.D., McGowan V., Sneath P.H.A. Approved lists of bacterial names // Ipt.
J. Syst Bacteriol. 1980. V. 30. P. 225-420.
Skoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant
tissues in vitro // The biological action of growth substances. Symp. Soc. Exp. Bi^i.
Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1957. V. 11. P. 118-131.
Slonczewski J.L., Foster J. W. pH-regulated genes and survival at extreme pH /'/ Esche-
richia coli and Salmonella: cellular and molecular biology / Eds.: F.C. Neidhardt et ?L
Washington DC: ASM, 1996. P. 1539-1549.
Smith A.J., Hoare D.S. Specialist phototrophs, lithotrophs, and methyiotrophs: a unity
among a diversity of procaryotes? // Bacteriol. Rev. 1977. V. 41. P. 419-448.
Smith NA., Kelly D.P. Isolation and physiological characterization of autotrophic
sulfur bacteria oxidizing dimethyl disulfide as sole source of energy // J. Gen. Micro-
biol. 1988. V. 134. P. 1407-1417.
Snedecor B., Cooney C.L. Thermophilic mixed culture of bacteria utilizing methanol
for growth // Appl. Microbiol. 1974. V. 27. P. 1112-1117.
314
688.
689-
690.
691.
692.
693.
694.
695.
696.
697.
698.
699.
700.
701.
702.
703.
704.
705.
706.
Soderberg Т. Biosynthesis of ribose-5-phosphate and erythrose-4-phosphate in ar-
chaea: a phylogenetic analysis of archaea! genomes// Archaea. 2005. V. I. P. 347-352.
Solomon S., Garcia R.R., Rowland F.S., Wuebbles D.J. On the depletion of Antarctic
ozone // Nature. 1986. V. 321. P. 755-758.
Sorokin D.Y., Trotsenko YA., Doronina N.V., Tourova T.P., Galinski E., Kolgano-
va T., Muyzer G. Methylohalomonas lacus gen. nov. sp. nov. and Methylonatrum ken-
yense gen.nov. sp.nov. - methylotrophic Gammaproteobacteria from hypersaline
lakes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 2762-2769.
Southgate G., Goodwin P.M. The regulation of exopolysaccharide production and of
enzymes involved in Cj metabolism in Methylophilus methylotrophus // J. Gen. Mi-
crobiol. 1989. V. 135. P. 2859-2867.
Spaepen S., Vanderleyden J., Remans R. Indole-3-acetic acid in microbial and micro-
organism-plant signaling// FEMS Microbiol. Rev. 2007. V. 31. P. 425-448.
Spaink H.P., Wijffelman С.Л., Pees E., Okker R.J.H., Lugtenberg B.J.J. Rhizobium no-
dulation gene nodD as a determinant of host specificity // Nature. 1987. V. 328.
P. 337-340.
Spies H.S., Steenkamp DJ. Thiols of intracellular pathogens. Identification of ovothiol
A in Leishmania donovani and structural analysis of a novel thiol from Mycobacte-
rium bovis 11 Eur. J. Biochem. 1994. V. 224. P. 203—213.
Spiess L.D., Lippincott B.B., Lippincott J A. Effect of hormones and vitamin B12 on
gametophore development in the moss Pylaisiella selwynii H Amer. J. Bot. 1973.
V. 60. P. 708-716.
Stancik L.M., Stancik D.M., Schmidt B., Barnhart D.M., Yancheva Y.N., Slonczew-
ski J.L. pH-dependent expression of periplasmic proteins and amino acid catabolism in
Escherichia coli // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 4246-4258.
Stirling H.B., Colby J., Dalton H. A comparison of the substrate and electron-donor
specificities of the methane mono-oxygenases from three strains of methane-oxidizing
bacteria // Biochem. J. 1979. V. 177. P. 361-364.
Stirling H.B., Dalton H. The fortuitous oxidation and cometabolism of various carbon
compounds by whole-cell suspensions of Methylococcus capsulatus (Bath) // FEMS
Microbiol. Lett. 1979. V. 5. P. 315-318.
Strand S.E., Lidstrom M.E. Characterization of a new marine methylotroph // FEMS
Microbiol. Lett. 1984. V. 21. P. 247-251.
Street T.O., Bolen D.W., Rose G.D. A molecular mechanism for osmolyte-induced
protein stability // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 13997-14002.
Strom T., Ferenci T., Quayle J.R. The carbon assimilation pathways of Methylococcus
capsulatus, Pseudomonas methanica and Methylosinus trichosporium // Biochem. J.
1974. V. 144. P. 465-476.
Strovas T.J., Sauter L.M., Guo X., Lidstrom M.E. Cell-to-cell heterogeneity in
rowth
rate and
ene expression in Methylobacterium extorquens
AMI // J. Bacteriol. 2007.
V. 189. P.7123-7133.
Stucki G., Gaelli R., Ebersold H R., Leisinger T. Dehalogenation of dichloromethane
by cell extract of Hypomicrobium DM2 // Arch. Microbiol. 1981. V. 130. P. 366-371.
Studer A., McAnulla C., Buechele R., Leisinger T., Vuilleumier S. Chloromethane-
induced genes define a third Cl utilization pathway in Methylobacterium chloro-
methanicum CM4 // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 3476-3484.
Studer A., Stupperich E., Vuilleumier S., Leisinger T. Chloromethane:tetrahydrofolate
methyl transfer by two proteins from Methylobacterium chloromethanicum strain
CM4 // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 2931-2938.
Studer A., Vuilleumier S., Leisinger T. Properties of the methylcobalamin: Hifolaie
methyltransferase involved in chloromethane utilization by Methylobacterium sp.
strain CM4 // Eur. J. Biochem. 1999. V. 264. P. 242-249.
315
707. Suylen KuenenJ.G. Chemostat enrichment and isolation of Hyphomicrobium
sp. EG a dimethyl sulfide oxidizing methylotroph and reevaluation of Thiobacillus sn
MSI // Antonie Van Leeuwenhoek. 1986. V. 52. P. 281-293.
708. Suylen G.M.H., Large P.J., Vandijken J.P., Kuenen J.G. Methyl mercaptan oxidase
key enzyme in the metabolism of methylated sulfur-compounds by Hyphomicrobium
sp. EG//J. Gen. Microbiol. 1987. V. 133. P. 2989-2997.
709. Suzuki T., Yamane T., Shimizu S. Mass production of poly-P-hydroxybutyric acid by
fed-batch culture with controlled carbon/nitrogen feeding // Appl. Microbiol. Biotech
nol. 1986a. V. 24. P. 370-374.
710. Suzuki T., Yamane T, Shimizu S. Mass production of poly-p-hydroxybutyric acid in
fully automatic fed-batch culture of methylotroph // Appl. Microbiol. Biotechnol
1986b. V. 23. P. 322-329.
711. Sy A., Giraud E., Jourand P., Garcia N., Willems A. Methylotrophic Methylobacte-
rium bacteria nodulate and fix nitrogen in symbiosis with legumes // J. Bacteriol
2001. V. 183. P. 214-220.
712. Sy A., Timmers A.CJ., Knief C., Vorholt J.A. Methylotrophic metabolism is advanta-
geous for Methylobacterium extorquens during colonization of Medicago truncatula
under competitive conditions // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 7245-7252.
713. Sydlik U., Gallitz L, Albrecht C., Abel J., Krutmann J., Unfried K. The compatible
solute ectoine protects against nanoparticle-induced neutrophilic lung inflammation //
Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2009. V. 180. P. 29-35.
714. Taiz L., Zeiger E. Auxin: the growth hormone // Plant physiology. 3rd edn. Sinauer
Associates, 2002. V. 19. P. 423-460.
715. Takami H., Nakasone K., Takaki Y., Maeno G., Sasaki R., Masui N., Fuji F., Hira-
ma C., Nakamura Y., Ogasawara N., Kuhara S., Horikoshi K. Complete genome
sequence of the alkaliphilic bacterium Bacillus halodurans and genomic sequence
comparison with Bacillus subtilis // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 4317-4331.
716. Takayama T., Endo F., Nozawa T., Masuda Y., Mori M., Kanayama T. Process for
producing a polysaccharide using Pseudomonas polysaccharogenes M-30 // US Patent
№4230800. 1978.
717. Takei K., Sakakibara H., Sugiyama T. Identification of genes encoding adenylate
isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana //
J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 26405-26410.
718. Tanaka M., Hirokane Y., Mitsui R., Tsuno T. Continuous oxidation of aromatic alde-
hyde to aromatic carboxylic acid by Burkholderia cepacia TM1 in a cell-holding reac-
tor //J. Biosci. Bioeng. 2001. V. 91. P. 267-271.
719. Tani Y. Methylotrophs for biotechnology; methanol as a raw material for fermentative
production // Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 1985. V. 3. P. 111-135.
720. Tani Y. Production of useful chemicals by methylotrophs // Biotechnology. 1991.
V. 18. P. 253-270.
721. Taylor B.F. Aerobic and anaerobic catabolism of vanillic acid and some other meth-
oxy-aromatic compounds by Pseudomonas sp. strain PN-1 // Appl. Environ. MicK-
biol. 1983. V. 46. P. 1286-1292.
722. Taylor EJ., Smith N.L., Colby J., Charnock S.J., Black G. W. The gene encoding the
ribulose monophosphate pathway enzyme, 3-hexulose-6-phophate synthase, from Ami-
nomonas aminovorus C2A1 is adjacent to coding sequences that exhibit similarity to
histidine biosynthesis enzymes//Antonie Van Leeuwenhoek. 2004. V. 86. P. 167-172.
723. Thiemann B., Imhoff l.F. The effect of salt on the lipid composition of Ectothi-
orhodospira 1/ Arch. Microbiol. 1991. V. 156. P. 376-384.
724. Thier R., Wiebel F.A., Hinkel A., Burger A., Bruening T., Morgenroth K., Senge T.,
Wilhelm M., Schulz T.G. Species differences in the glutathione transferase GSTT1-1
316
activity towards the model substrates methyl chloride and dichloromethane in liver and
kidney // Arch. Toxicol. 1998. V. 72. P. 622-629.
725. Thomas A.D., Booth LR. The regulation of expression of the porin gene ompC by acid
pH//J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. P. 1829-1835.
726. Thomashow L.S., Reeves S., Thomashow M.F. Crown gall oncogenesis: evidence that a
t-DNA gene from the Agrobacterium Ti plasmid pTiA6 encodes an enzyme that cata-
lyzes synthesis of indoleacetic acid // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81
P.5071-5075.
727. Thompson J.N. The coevolutionary process // Chicago: Univ. Press, 1994. 376 p.
728. Tishkov V.L, Galkin A.G., Fedorchuk V. V., Savitsky PA., Rojkova A.M., Gieren H.,
Kula M.-R. Pilot scale production and isolation of recombinant NAD+- and NADP+-
specific formate dehydrogenases // Biotechnol. Bioeng. 1999. V. 64. P. 188-193.
729. Tobari J., Harada Y. Amicyanin: an electron acceptor of methylamine dehydrogenase
// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. V. 101. P. 502-508.
730. Torgonskaya M.L., Firsova Yu.E., Zyakun A.M., Richnow H.-H., Vuilleumier S., Doro-
nina N.V., Trotsenko YuA. Compound specific stable isotopes fractionation analysis
(CS1A) is an useful approach in studies on the mechanisms involved in dichloro-
methane degradation by aerobic methylobacteria // European Geosciences Union Gen-
eral Assembly Research Abstracts. Vienna, 2008. V. 10. P. A-09038.
731. Toyama H., Anthony C., Lidstrom M.E. Construction of insertion and deletion mxa
mutants of Methylobacterium extorquens AMI by electroporation // FEMS Microbiol.
Lett. 1998. V. 166. P. 1-7.
732. Toyama H., Inagaki H., Matsushita K., Anthony C., Adachi O. The role of the MxaD
protein in the respiratory chain of Methylobacterium extorquens during growth on
methanol // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1647. P. 372-375.
733. Tramonti A., Visca P., De Canio M., Falconi M., De Biase D Functional characteri-
zation and regulation of gadX, a gene encoding an AraC/XylS-like transcriptional acti-
vator of the Escherichia coli glutamic acid decarboxylase system // J. Bacteriol. 2002.
V. 184. P. 2603-2613.
734. Tringe S.G., von Mering C., Kobayashi A., Salamov A A., Chen K, Cang H.W., Po-
dar M., Short J.M., Mathur E.J., Defter J.C., Bork P., HugenholtzP., Rubin E.M. Com-
parative metagenomics of microbial communities//Science. 2005. V. 308. P. 554—557.
735. Trotsenko YA., Doronina N.V. Genus Methylopila // The Alpha-, Beta-, Delta- and
Epsilonproteobacteria, Part C, Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2nd edn. /
Eds.: D.J. Brenner et al. New York: Springer SBM, 2005. V. 2. P. 420-422.
736. Trotsenko YA., Doronina N. V. Genus Methylorhabdus // The Alpha-, Beta-, Delta-
and Epsilonproteobacteria, Part C, Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2nd
edn. I Eds.: D.J. Brenner et al. New York: Springer SBM, 2005. V. 2. P. 525-527.
737. Trotsenko YA., Doronina N. V., Govorukhina N.I. Metabolism of non-motile obliga-
tely methylotrophic bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1986. V. 33. P. 293-297.
738. Trotsenko YA., Murrell J.C.M. Metabolic aspects of obligate aerobic methanotrophy.
Adv. Appl. Microbiol. 2008. V. 63. P. 183-229.
739. Trotsenko YA., Shishkina V.N., Govorukhina N.L, Sokolov A.P. Biochemical basis for
obligate methylotrophy and obligate autotrophy: comparative aspects // Book of ab-
stracts of Winogradsky Symposium on Lithoautotrophy. Goettingen, 1987. P. 26.
740. Tsujimoto N., Gunji Y., Ogawa-Miyata Y., Shimaoka M., Yasueda H. L-lysine biosyn-
thetic pathway of Methylophilus methylotrophus and construction of an L-lysine pro-
ducer // J. Biotechnol. 2006. V. 124. P. 327-337.
741. Tyson G. W., Chapman J., Hugenholtz P., Allen E.E., Ram R.J., Richardson P.M.,
Solovyev V.V., Rubin E.M., Rokhsar D.S., Banfield J. F. Community structure and me-
tabolism through reconstructtion of microbial genomes from the environment // Na-
ture. 2004. V. 428. P. 37-43.
317
742. Uchino Y., Hirata A., Yokota A., Sugiyama J. Reclassification of marine Agrobacte-
rium species: proposals of Stappia stellulata gen. nov., comb, nov., Stappia aggregata
sp. nov., nom. rev., Ruegeria atlantica gen. nov., comb, nov., Ruegeria gelatinovora
comb, nov., Ruegeria algicola comb, nov., and Ahrensia kieliense gen. nov., sp. nov
nom. rev. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1998. V. 44. P. 201-210 // Validation List № 68*
Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. V. 49. P. 1-3.
743. Ueda S., Matsumoto S., Takagi A., Yamane T. Synthesis of poly(3-hydroxybutyrate-
co-3-hydroxyvalerate) from methanol and n-amyl alcohol by the methylotrophic bacte-
ria Paracoccus denitrlificans and Methylobacterium extorquens // Appl. Environ. Mi-
crobiol. 1992. V. 58. P. 3574-3579.
744. Uotila L., Koivusalo M. Formaldehyde dehydrogenase from human liver // J. Biol
Chem. 1974. V. 249. P. 7653-7663.
745. Urakami T., Araki H., Oyanagi H., Suzuki K.L, Komagata K. Transfer of Pseudomo-
nas aminovorans (den Dooren de Jong 1926) to Aminobacter gen. nov. as Aminobac-
ter aminovorans comb. nov. and description of Aminobacter aganoensis sp. nov. and
Aminobacter niigataensis sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. V. 42. P. 84-92.
746. Urakami T., Komagata K. Emendation of Methylobacillus Yordy and Weaver 1977, a
genus of methanol-utilizing bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. P. 502-511.
747. Urakami T., Tamaoka J., Suzuki K.I., Komagata К Acidomonas gen. nov., incorpo-
rating Acetobacter methanolicus as Acidomouas methanolica comb. nov. // Int. J. Syst.
Bacteriol. 1989a. V. 39. P. 50-55.
748. Urakami T., Tamaoka J., Suzuki K-L, Komagata K. Paracoccus alcaliphilus sp.nov..
an alkaliphilic and facultatively methylotrophic bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol.
1989b. V. 39. P. 116-121.
749. Urhahn T, Ballschmiter K. Chemistry of the biosynthesis of halogenated methanes:
Cl-organohalogens as pre-industrial chemical stressors in the environment? // Chemo-
sphere 1998. V. 37. P. 1017-1032.
750. Uziel O., Borovok I., Schreiber R., Cohen G., Aharonowitz Y. Transcriptional regula-
tion of the Staphylococcus aureus thioredoxin and thioredoxin reductase genes in re-
sponse to oxygen and disulfide stress // J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 326-334.
751. Van Aken B., Peres C.M., Doty S.L., Yoon J.M., Schnoor J.L. Methylobacterium popuh
sp. nov., a novel aerobic, pink-pigmented, facultatively methylotrophic, methane*
utilizing bacterium isolated from poplar trees {Populus deltoides x nigra DN34) // Int.
J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1191-1196.
752. Van der Palen C.J., Slotboom D.J., Jongejan L., Reijnders WJV., Harms N., Dui-
neJA., Van Spanning R.J. Mutational analysis of mau genes involved in methylamine
metabolism in Paracoccus denitrificans // Eur. J. Biochem. 1995. V. 230. P. 860-871.
753. Van Dien SJ., Okubo Y., Hough M.T., Korotkova N., Taitano T., Lidstrom M.E. Re-
construction of Сз and Сд metabolism in Methylobacterium extorquens AMI usinv
transposon mutagenesis // Microbiology. 2003. V. 149. P. 601-609.
754. Van Loon L.C., Bakker P.A.H.M. Root-associated bacteria inducing systemic resis-
tance // Plant-associated bacteria / Ed.: S.S. Gnanamanickam. Dordrecht: Springer,
2006. P. 269-316.
755. Van Loon L.C., Rep M., Pieterse C.M.J. Significance of inducible defense-related
proteins in infected plants // Annu. Rev. Phytopathol. 2006. V. 44. P. 135-162.
756. Van Ophem P.W., Van Beeumen J., DuineJA. NAD-linked, factor-dependent formal-
dehyde dehydrogenase or trimeric, zinc-containing, long-chain alcohol dehydrogenase
from Amycolatopsis methanolica // Eur. J. Biochem. 1992. V. 206. P. 511-518.
757. Van Peer R., Niemann G.J., Shippers B. Induced resistance and phytoalexin accumula-
tion in biological control of Fusarium wilt of carnation by Pseudomonas sp. strain
WCS417r// Phytopathology. 1991. V. 81. P. 728-734.
318
758. Van Spanning R.J.M., de Vries S., Harms N. Coping with formaldehyde during Cj-me-
tabolism of Paracoccus denitrificans I'I J. Mol. Cat. B. Enzymatic. 2000. V. 8. P. 37-50,
759. Van Spanning RJ.M., Reijnders W.N.M., Slouthamer A.H. Integration of heterologous
DNA into the genome of Paracoccus denitrificans is mediated by a family of IS1248-
Related elements and a Second Type of integrative recombination event I I J. Bacteriol.
1995. V. 177. P. 4772-4778.
760. Vandamme P., GorisJ., Chen W.M., De Vos P., Willems A. Burkholderia tuberum sp.
nov. and Burkholderia phymatum sp. nov., nodulate the roots of tropical legumes //
Syst. Appl. Microbiol. 2002. V. 25. P. 502-512 // Validation List No. 91. 1JSEM.
2003. V. 53. P. 627-628.
761. Vande Broek A., Gysegom P., Ona O., Hendrichx N., Prinsen E., Van Impe J., Vander-
leyden J. Transcriptional analysis of the Azospirillum brasilense indole-3-pyruvate de-
carboxylase gene and identification of a cts-acting sequence involved in auxin respon-
sive expression // Mol. Plant-Microbe Interact. 2005. V. 18. P. 311—323.
762. Vande Broek A., Lambreht M., Eggemont K., Vanderleyden J. Auxins upregulate ex-
pression of the indole-3-pyruvate decarboxylase gene in Azospirillum brasilense //
J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 133&-1342.
763. Vannelli T., Messmer M., Studer A., Vuilleumier S., Leisinger T. A corrinoid-depen-
dent catabolic pathway for growth of a Methylobacterium strain with chloromethane //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 4615-4620.
764. Vannelli T, Studer A., Kertesz M., Leisinger T. Chloromethane metabolism by Methy-
lobacterium sp. strain CM4// Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 1933-1936.
765. Vasilyeva L.V., Lafitskaya T.N., Namsaraev B.B. Angulomicrobium tetraedrale, a new
genus of budding bacteria with radial cell symmetry // Mikrobiologiya. 1979. V. 48.
P. 843-849//Validation List et al., № 20. Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. P. 354-356.
766. Vasilyeva L.V., Semenov A.M. Labrys tnonahos, a new budding prosthecate bacterium
with radial symmetry // Mikrobiologiya. 1984. V. 53. P. 85-92 // Validation List №
18. Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. V. 35. P. 375-376.
767. Ventosa A., Nieto J J., Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria //
Microbiol. Mol. Biol. Revs. 1998. V. 62. P. 504-544.
768. Verhees C.H., Kengen W.M., Tuninga J.E., Schut GJ., Adams M. W. W., De Vos W.M.,
Van der Oost J. The unique features of glycolytic pathways in Archaea // Biochem. J.
2000. V. 375- P. 231-246.
769. Vila-Costa M., Del Valle DA., Gonzalez J.M., Slezak D., Kiene R.P., Sanchez O.,
Simo R. Phylogenetic identification and metabolism of dimethylsulfide degrading ma-
rine bacteria // Environ. Microbiol. 2006. V. 8. P. 2189-2200.
770. Visscher P.T., Taylor B.F. A new mechanism for the aerobic catabolism of dimethyl
sulfide // Appl. Environ. Microbiol. 1993b. V. 59. P. 3784-3789.
771. Visscher P.T., Taylor B.F. Aerobic and anaerobic degradation of a range of alkyl sul-
fides by a denitrifying marine bacterium // Appl. Environ. Microbiol. 1993a. V. 59.
P.4083-4089.
772. Vogel.]., Bartels V., Tang Т.Н., Churakov G., Slagter-JagerJ.G., Huttenhofer A., Wag-
ner E.G. RNomics of Escherichia coli detects new sRNA species and indicates paral-
lel transcriptional output in bacteria H Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 6435-6443.
773. Vo nek J., Arfrnan N., De Vries G.E., Van Beeumen J., van Bruggen E.FJ., Dijkhuizen
L. Electron microscopic analysis and biochemical characterization of a novel methanol
dehydrogenase from the thermotolerant Bacillus sp. Cl // J. Biol. Chem. 1991. V. 266.
P.3949-3954.
774. Vorholt J A. Cofactor-dependent pathways of formaldehyde oxidation in methylotro-
phic bacteria // Arch. Microbiol. 2002. V. 178. P. 239-249.
319
775. Vorholt J A., Chistoserdova L., Lidstrom M.E., Thauer R.K. The NADP-dependent
methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase in Methylobacterium extorquens
AMI //J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 5351-5356.
776. Vorholt J A., Chistoserdova L., Stolyar S.M., Thauer R.K., Lidstrom M.E. Distribution
of tetrahydromethanopterin-dependent enzymes in methylotrophic bacteria and phy.
logeny of methenyl tetrahydromethanopterin cyclohydrolases // J. Bacteriol. 1999
V. 181. P. 5750-5757.
777. Vorholt J A., Marx C.J., Lidstrom M.E., Thauer R.K. Novel formaldehyde-activating
enzyme m Methylobacterium extorquens AMI required for growth on methanol //
J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 6645-6650.
778. Vorob’ev A.V., De Boer W., Folman L.B., Bodelier P.L.E., Doronina N.V., Suzina
N.E., Trotsenko YA., Dedysh S.N. Methylovirgula ligni gen. nov., sp. nov., an obliga-
tely acidophilic, facultatively methylotrophic bacterium with a highly divergent mxaF
gene // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. V. 59. P. 2538-2545.
779. Vuilleumier S, Chistoserdova L, Lee M-C, Bringel F, Lajus A, Zhou Y., Gourion B.,
Barbe V., Chang J., Cruveiller S., DossatC., Gillett W., GruffazC, Haugen E., Hour-
cade E., Levy R., Mangenot S., Muller E., Nadalig T., Pagni M., Penny C., Peyraud R
Robinson D.G., Roche D., Rouy Z., Saenampechek C., Salvignol G., Vallenet D.,
Wu Z., Marx C.J., Vorholt J A., Olson M. V, Kaul R., Weissenbach J., Medigue C.,
Lidstrom M.E. Methylobacterium genome sequences: a reference blueprint to inves-
tigate microbial metabolism of Cl compounds from natural and industrial sources Ц
PLoS ONE. 2009. V. 4. P. e5584.
780. Vuilleumier S. Bacterial glutathione S-transferases: what are they good for? // J.
Bacteriol. 1997. V. 179. P. 1431-1441.
781. Vuilleumier S. Coping with a halogenated one-carbon diet: aerobic dichloromethane-
mineralising bacteria // Biotechnology for the environment I Eds.: S. Agathos, W. Rei-
neke. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 2001. V. 3. P. 105-130.
782. Vuilleumier S., Ivos N., Dean M., Leisinger T. Sequence variation in dichloromethane
dehalogenases/glutathione S-transferases// Microbiology. 2001 V. 147. P. 611-619.
783. Vuilleumier S., Leisinger T. Protein engineering studies of dichloromethane dehalo-
genase/glutathione S-transferase from Methylophilus sp. strain DM11. Serl2 but not
Tyr6 is required for enzyme activity // Eur. J. Biochem. 1996. V. 239. P. 410-417.
784. Vuilleumier S., Pagni M. Bacterial glutathione S-transferases: new lessons from bacte-
rial genomes//Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. P. 138-146.
785. Wackett L.P., Logan M.S.P., Blocki FA., Bao-li C. A mechanistic perspective on bac-
terial metabolism of chlorinated methanes // Biodegradation. 1992. V. 3. P. 19-36.
786. Ward N., Larsen Q., Sakwa J., Bruseth L,. Khouri H., Durkin A.S., Dimitrov G., Ji-
ang L., Scanlan D., Kang K.H., Lewis M., Nelson K.E., Methe B., Wu M., Heidel-
berg J.F., Paulsen LT., Fouts D , Ravel J., Tettelin H., Ren Q., Read T., DeBoy R.T.,
Seshadri R., Salzberg S.L., Jensen H.B., Birkelaud N.K., Nelson W.C., Dodson R.J.,
Grindhaug S.H., Holt L, Eidhammer L, Jonasen I., Vanaken S., Utterback T., Feld-
blyum T. V., Fraser C.M., Lillehaug J.R., Eisen J A. Genomic insights into methano-
trophy: the complete genome sequence of Methylococcus capsulatus (Bath) // PLoS
Biology. 2004. V. 2. P. 1616-1628.
787. Warneke C., Karl T., Judmaier H., Hansel A., Jordan A., Lindinger W., Crutzen P~L
Acetone, methanol, and other partially oxidized volatile organic emissions from dead
plant matter by a biological processes: Significance for atmospheric HOX chemistry //
Global Biogeochem. Cycles. 1999. V. 13. P. 9-17.
788. Warner K.L., Larkin M.J., Harper D.B., Murrell J.C., McDonald LR. Analysis of
genes involved in methyl halide degradation in Aminobacter lissarensis CC495 //
FEMS Microbiol. Lett. 2005. V. 251. P. 45-51.
320
789. Watanabe F., Nakano Y., Tamura Y., Yamanaka H. Vitamin Bj2 metabolism in a pho-
tosynthesizing green alga, Chlamydomonas reinhardtii // Biochim. Biophys. Acta
1991. V. 1075. P. 36-41.
790. Wei L., Wedeking A., Buettner R., Kalff J.C., Tolba R.H., Van Echten-Deckert G. A
natural tetrahydropyrimidine protects small bowel from cold ischemia and subsequent
warm in vitro reperfusion injury // Pathobiology. 2009. V. 76. P. 212-220.
791. Weretilnyk EA., Hanson A.D. Molecular cloning of a plant betaine-aldehyde dehydro-
genase, an enzyme implicated in adaptation to salinity and drought // Proc. Natl. Acad.
Sci.USA. 1990. V. 87. P. 2745-2749.
792. Werther T., Spinka M., Tittmann K, Schuetz A., Golbik R., Mrestani-Klaus C, Hueb-
ner G., Koenig S. Amino acids allosterically regulate the thiamine diphosphate-depen-
dent a-keto acid decarboxylase from Mycobacterium tuberculosis // J. Biol. Chem.
2008. V. 283. P. 5344-5354.
793. West A.H., Stock A.M. Histidine kinases and response regulator proteins in two-
component signaling systems //Trends Biochem. Sci. 2001. V. 26. P. 369—376.
794. Westlake R. Large-scale continuous production of single cell protein // Chem. Ing.
Tech. 1986. V. 58. P. 934-937.
795. Whipps J.M. Carbon utilization // The Rhizosphere / Ed.: J.M. Lynch. Chichester:
Wiley Interscience, 1990. P. 59-97.
796. Whipps J.M. Developments in the biological control of soil-borne plant pathogens //
Adv. Botan. Res. 1997. V. 26. P. 1-134.
797. Whittenbury R., Kelly D.P. Autotrophy: a conceptual phoenix // Symposia of the Soci-
ety for General Microbiology. 1977. V. 27. P. 121-149.
798. Wiegel J.K. W. Genus Xanthobacter // Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2nd
edn. / Eds.: DJ. Brenner et al. New York: Springer Verlag, 2005. V. 2. P. 555-566.
799. Williams J., Holzinger R., Gros V., Xu X., Atlas E., Wallace D.W.R. Measurements of
organic species in air and seawater from the tropical Atlantic H Geophys. Res. Lett.
2004. V. 31. P. L23S06.
800. Williams P. Quorum sensing, communication and cross-kingdom signaling in the
bacterial world // Microbiology. 2007. V. 153. P. 3923-3938.
801. Williams P.A., Coates L., Mohammed F., Gill R., Erskine P„ Bourgeois D., Wood S.P.,
Anthony C, Cooper J.B. The 1.6 Angstrom X-ray structure of the unusual c-type cyto-
chrome, cytochrome c(L) from the methylotrophic bacterium Methylobacterium ex-
torquens//J. Mol. Biol. 2006. V. 357. P. 151-162.
802. Williams PA., Coates L., Mohammed F., Gill R., Erskine P.T., Coker A., Wood S.P.,
Anthony C., Cooper J.B. The atomic resolution structure of methanol dehydrogenase
from Methylobacterium extorquens // Acta Cryst. (Sec. D Biol. Crystallography).
2005. V. D61. P. 75-79.
803. Wills N.K., Fong P. C1C chloride channels in epithelia: recent progress and remaining
puzzles// News Physiol. Sci. 2001. V. 16. P. 161-166.
804. Wilson M., Lindow S.E. Coexistence among epiphytic bacterial populations mediated
through nutritional resource partitioning // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 60.
P. 4468-4477.
805. Wilson S.M., Gleisten M.P., Donohue T.J. Identification of proteins involved in for-
maldehyde metabolism by Rhodobacter sphaeroides // Microbiology. 2008. V. 154.
P. 296-305.
806. Windass J.D., Worsey MJ., Pioli E.M., Pioli D., Barth P.T., Byrom D., Powell K.,
Senior P.J. Improved conversion of methanol to single-cell protein by Methylophilus
methylotrophus // Nature. 1980. V. 287. P. 396-401.
807. Winterton N. Chlorine: the only green element: towards a wider acceptance of its role
in natural cycles // Green chemistry. 2000. V. 2. P. 173-225.
321
808. Wise E., Yew W.S., Babbitt P.C., Gerlt J A., Rayment I. Homologous (beta/alpha)g
barrel enzyme that catalyzes unrelated reactions: orotidine 5'-monophosphate decarbo
xylase and 3-keto-L-gulonate 6-phosphate decarboxylase // Biochemistry. 2002. V 41
P. 3861-3869. ’ ‘ b
809. Wissenbach U., Six S., Bongaerts J., Ternes D., Steinwachs S., Unden G. A third pe
riplasmic transport system for L-arginine in Escherichia coli'. molecular characterize
tion of the artPIQMJ genes, arginine binding and transport // Mol. Microbiol. 1995
V. 17. P. 675-686.
810. Wood A.P., Aurikko J.P., Kelly D.P. A challenge for 2Г1 century molecular biology
and biochemistry: what are the causes of obligate autotrophy and methanotrophy? //
FEMS Microbiol. Rev. 2004. V. 28. P. 335-352.
811. Woodall CA., Warner K.L., Oremland R.S., Murrell J.C., McDonald I.R. Identifica-
tion of methyl haiide-utilizing genes in the methyl bromide-utilizing bacterial strain
IMB-1 suggests a high degree of conservation of methyl halide-specific genes in
gram-negative bacteria//Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 1959-1963.
812. Woodward A. W., Bartel B. Auxin: regulation, action and interaction // Annals of Bot-
any. 2005. V. 95. P. 707-735.
813. Worton D.R., Sturgers W.T.,Schwander J., Mulvaney R., Barnola J.-M., ChappellazJ.
20lh century trends and budget implications of chloroform and related tri- and dihalo-
methanes inferred from firnair // Atmos. Chem. Physics. 2006. V. 6. P. 2847-2863.
814. Xavier K.B., Da Costa M.S., Santos H. Demonstration of a novel glycolytic pathway in
the hyperthermophilic archaeon Thermococcus zilligii by l3C-labeling experiments and
nuclear magnetic resonance analysis//J. Bacteriol. 2000. V. 182. P. 4632-4636.
815. Xie H., Pasternak J.J., Glick B.R. Isolation and characterization of mutants of the plant
growth-promoting rhizobacterium Pseudomonas putida CR12-2 that overproduce in-
doleacetic acid // Curr. Microbiol. 1996. V. 32. P. 67-71.
816. Xu J., Johnson R.C. aldB, an RpoS-dependent gene in Escherichia coli encoding an
aldehyde dehydrogenase that is repressed by Fis and activated by Crp // J. Bacteriol.
1995. V. 177. P. 3166-3175.
817. Yamamoto M., Iwaki H., Kouno K., Inui T. Identification of marine methanol-utilizing
bacteria // J. Ferment. Technol. 1980. V. 58. P. 99-106.
818. Yamamoto M., Seriu Y., Kouno K., Okamoto R., Inui T. Isolation and characterization
of marine methanol-utilizing bacteria // J. Ferment. Technol. 1978. V. 56. P. 451-458.
819. Yamamoto S, Wakayama M, Tachiki T. Characterization of theanine-forming enzyme
from Methylovorus mays no. 9 in respect to utilization of theanine production // Bir-
sci. Biotechnol. Biochem. 2007. V. 71. P. 545-552.
820. Yamamoto S., Wakayama M., Tachiki T. Cloning and expression of Methylovorus
mays no. 9 gene encoding y-glutamylmethylamide synthetase: an enzyme usable in
theanine formation by coupling with the alcoholic fermentation system of baker’s
yeast// Biosci. Biotechnol. Biochem. 2008. V. 72. P. 101-109.
821. Yanase H., Ikeyama K., Mitsui R., Ra S., Kita K., Sakai Y., Kato N. Cloning and se-
quence analysis of the gene encoding 3-hexulose-6-phosphate synthase from the me-
thylotrophic bacterium, Methylomonas aminofaciens 77a, and its expression in Es-
cherichia coli // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 135. P. 201-205.
822. Yanase H., Matsuzaki K., Sato Y., Kita K., Sato Y., Kato N. Enzymatic preparation of
(l-l3C]D-fructose-6-phosphate from [13C]formaldehyde and D-ribose-5-phosphate us-
ing the formaldehyde-fixing system of Methylomonas aminofaciens Па // Appl. Mi-
crobiol. Biotechnol. 1992. V. 37. P. 301-304.
823. Yanase H., Sato Y., Kita K., Sato Y., Kato N. Preparation of [l-i3C]D-glucose 6-phos-
phate from [l3C]methanol and D-ribose 5-phosphate with methylotrophic enzymes ’/
Biosci. Biotechnol. Biochem. 1993. V. 57. P. 308-312.
322
824.
825.
826.
827.
828.
829.
830.
831.
832.
833.
834.
835.
836.
837.
838.
839.
Yasueda H., Kuwahara Y., Sugimoto S. Bacillus subtilis yckG and yckF encode two
key enzymes of the ribulose monophosphate pathway used by methylotrophs, and
yckH is required for their expression // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 7154—7160.
Yew W.5., AkanaJ., Wise E.L., Rayment I., Gerlt J A. Evolution of enzymatic activities
in the orotidine 5'-monophosphate decarboxylase suprafamily: enhancing the promis-
cuous D-arabino-Hex-3-ulose 6-phosphate synthase reaction catalyzed by 3-keto-L-
gulonate 6-phosphate decarboxylase // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 1807-1815.
Yi H., Lim Y. W., Chun J. Taxonomic evaluation of the genera Ruegeria and Silicibac-
ter: a proposal to transfer the genus Silicibacter Petursdottir and Kristjansson 1999 to
the genus Ruegeria Uchino et al. 1999 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57.
P. 815-819.
Yoch D.C., Chen Y.P., Hardin M.G. Formate dehydrogenase from the methane oxi-
dizer Methylosinus trichosporium OB3b // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 4456-4463.
Yomantas YA., Tokmakova I.L., Gorshkova N.V., Abalakina E.G., Kazakova S.M.,
Gak E.R., Mashko S. V. Aromatic amino acid anxotroph constructed by recombinant
marker exchange in Methylophilus methylotrophus AS1 cells expressing the aroP en-
coded transporter of Escherichia coliH Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 76. P. 75-83.
Yu J., Penaloza-Vazquez A., Chakrabarty A.M., Bender C.L. Involvement of the exo-
polysaccharide alginate in the virulence and epiphytic fitness of Pseudomonas syrin-
gae pv. syringae // Mol. Microbiol. 1999. V. 33. P. 712—720.
Yurimoto H., Kato N., Sakai Y. Genomic organization and biochemistry of the ribulo-
semonophosphate pathway and its application in biotechnology // Appl. Microbiol.
Biotechnol. 2009. V. 84. P. 407-416
Zafiriou O.C. Reaction of methyl halides with seawater and marine aerosols Ц J. Mar.
Res. 1975. V. 33. P. 75-81.
Zarzycki J., Schlichting A., Strychalsky N., Mueller M., Alber B.E., Fuchs G. Mesaco-
nyl-coenzyme A hydratase, a new enzyme of two central carbon metabolic pathways
in bacteria //J. Bacteriol. 2008. V. 190. P. 1366-1374.
ZehrJ.P., Jenkins B.D., Short S.M. Steward G.F. Nitrogenase gene diversity and mi-
crobial community structure: a cross-system comparison // Environ. Microbiol. 2003.
V. 5. P. 539-554.
Zhang M„ Lidstrom M.E. Promoters and transcripts for genes involved in methanol
oxidation in Methylobacterium extorquens AMI // Microbiology. 2003. V. 149.
P. 1033-1040.
Zhang X., Fuller J.H., McIntire W.S. Cloning, sequencing, expression, and regulation
of the structural gene for the copper/topa quinone-containing methylamine oxidase
from Arthrobacter strain Pl, a gram-positive facultative methylotroph // J. Bacteriol.
1993. V. 175. P. 5617-5627.
Zhao S., Fan С., Ни X., Chen J., Feng H. The microbial production of polyhydroxybu-
tyrate from methanol // Appl. Biochem. Biotechnol. 1993. V. 39-40. P. 191-199.
Zhao Y., Christensen S.K., Fankhauser C., Cashman J.R., Cohen J.D., Weigel D.,
Chory J. A role for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin biosynthesis // Sci-
ence. 2001. V. 291. P. 306-309.
Zhou Y.N., Kusukawa N., Erickson J. W., Gross CA., Yura T. Isolation and characteri-
zation of Escherichia coli mutants that lack the heat shock sigma factor sigma 32 //
J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 3640-3649.
Zuber L., Dunn I.J., Deshusses MA. Comparative scale-up and cost estimation of a
biological trickling filter and a three-phase airlift bioreactor for the removal of methyl-
ene chloride from polluted air//J. Air Waste Manag. Assoc. 1997. V. 47. P. 969-97э.
323
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие................................................
Глава 1. Особенности биологии аэробных метилобактерий......§
1.1. Краткий исторический очерк развития метилотрофии
как научного направления................................. 9
1.2. Первичные пути Ci-метаболизма у аэробных метилобактерий....20
1.3. Биохимические основы облигатной метилотрофии..........4j
Глава 2. Биоразнообразие аэробных метилобактерий..........43
2.1. Облигатные и факультативные метилобактерий...........43
2.2. Метилотрофные микобактерии...........................50
2.3. Метилотрофный актиномицет Amycolatopsis methanolica..5j
2.4. Аэробные метилобактерии-деструкторы галометанов......53
2.5. Аэробные метилобактерии-деструкторы S-метилсоединений.65
2.6. Аэробные метилобактерии-деструкторы метилацетата, МТБЭ
и других этерифицированных оксигенатов....................69
Глава 3. Гены и ферменты первичного Ci-метаболизма
у аэробных метилобактерий.................................72
3.1. Пути первичного окисления метанола....................72
3.2. Пути первичного окисления метилированных аминов......75
3.3. Пути метаболизма галометанов.........................84
3.4. Пути метаболизма метилсернистых соединений...........ПО
3.5. Транспорт электронов и окислительное фосфорилирование
у метилобактерий.........................................114
Глава 4. Аэробные метилобактери экстремальных экосистем..119
4.1. Умеренно гало(алкало)фильные и ацидофильные аэробные
метилобактерий........................................119
4.2. Умеренно термофильные и-психрофильные аэробные
метилобактерий........................................138
Глава 5. Аэробные метилобактерий как фитосимбионты.......145
5.1. Ассоциации аэробных метилобактерий с растениями.....145
5.2. Адаптация метилобактерий к эпифитному росту.........152
5.3. Влияние аэробных метилобактерий на рост и развитие
растений.................................................156
5.4. Диазотрофия у метилобактерий........................177
Глава 6. Геномика и протеомика аэробных метилобактерий...182
Глава 7. Биотехнологический потенциал аэробных
метилобактерий...........................................209
Заключение...............................................242
Приложение...............................................244
А. Методы исследования аэробных метилотрофов.............244
Б. Диагнозы родов аэробных метилобактерий................253
Список сокращений........................................274
Список литературы........................................277
324
CONTENTS
Preface..............................................................7
Chapter 1. The peculiarities of biology of aerobic methylobacteria...9
1.1. Brief historical overview of studies on methylotrophy...........9
1.2. The primary pathways of Crmetabolism in aerobic methylobacteria 20
1.3. The biochemical rationale of an obligate methylotrophy........41
Chapter 2. Biodiversity of aerobic methylobacteria.................43
2.1. Obligate and facultative methylobacteria......................43
2.2. Methylotrophic mycobacteria...................................50
2.3. Methylotrophic actinomycete Amycolatopsis methanolica.........51
2.4. Aerobic methylobacteria utilizing halomethanes................53
2.5. Aerobic methylobacteria utilizing S-methylated compounds.......65
2.6. Aerobic methylobacteria utilizing methylacetate, MTBE and other
esterified oxygenates..............................................69
Chapter 3. Genes and enzymes of primary Crmetabolism in aerobic
methylobacteria....................................................72
3.1. Metabolism of methanol........................................72
3.2. Metabolism of methylamines....................................75
3.3. Metabolism of halomethanes....................................84
3.4. Metabolism of S-methylated compounds.........................110
3.5. Electron transport and oxidative phosphorylation in methylobacteriall4
Chapter 4. Aerobic methylobacteria of extreme environements.......119
4.1. Moderately halo(alkalo)philic and acidophilic aerobic
methylobacteria...................................................119
4.2. Moderately thermophilic and psychrophilic aerobic
methylobacteria...................................................138
Chapter 5. Aerobic methylobacteria as phytosymbionts..............145
5.1. Association of aerobic methylobacteria with plants...........145
5.2. Adaptation of methylobacteria to epiphytic growth............152
5.3. Effect of methylobacteria on the growth of plants............156
5.4. Diazotrophy in aerobic methylobacteria.......................177
Chapter 6. Genomics and proteomics of aerobic methylobacteria.....182
Chapter 7. Biotechnological potential of aerobic methylobacteria..209
Conclusion........................................................242
Appendix..........................................................244
A. Methodological aspects.........................................244
B. Diagnoses of methylobacterial genera...........................253
Abbreviations.....................................................274
References........................................................277
325
Научное издание
Троценко Юрий Александрович,
Доронина Нина Васильевна,
Торгонская Мария Леонидовна
АЭРОБНЫЕ МЕТИЛОБАКТЕРИИ
Отредактировано и подготовлено к печати
в Объединенном научно-техническом издательстве
Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН.
Лицензия ЛР № 040829 от 11 июля 1997 г.
Подписано в печать 25.05.10. Формат 60x90/16.
Гарнитура Times. Печать офсетная. Бумага писчая. Уч.-изд.л. 22,0.
Усл. печ.л. 20,0. Тираж 400 экз. Заказ 10776Р. Изд. № 4.
Отпечатано с оригинала-макета в Объединенном научно-техническом
издательстве ИФХиБПП РАН.
142290, г. Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ.