Текст
                    МИКРООРГАНИЗМОВ
экология


ВЫСШЕЕ ОБРАЗОВАНИЕ ЭКОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Под редакцией проф. А.И.НЕТРУСОВА Рекомендовано Учебно-методическим объединением по классическому университетскому образованию в качестве учебника для студентов университетов, обучающихся по специальности 012400 «Микробиология» и другим биологическим специальностям Москва academ'a 2004
УДК 579.26(075.8) ББК 28.4я73 Э40 Авторы: А. И. Нетрусов, Е.А. Бонч-Осмоловская, В. М. Горленко, М.В.Иванов, Г. И.Каравайко, П.А.Кожевин, Н. Н.Колотилова, И.Б.Котова, В.Н.Максимов, А.Н.Ножевникова, А.М.Семенов, Т.П.Турова, Т.Г.Юдина Рецензенты: д-р биол. наук, проф. Н. Б. Градова (кафедра биотехнологии МХТУ им. Д. И. Менделеева); д-р биол. наук, проф. Ю.Д. Цыганков (зав. лабораторией генетики метилотрофных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика») Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов / А. И. Нет- Э40 русов, Е.А. Бонч-Осмоловская, В. М. Горленко и др.; Под ред. А. И. Нетрусова. — М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с. ISBN 5-7695-1566-Х Учебник охватывает все разделы экологии микроорганизмов. В нем рассмотрены развитие микробов в их естественных средах обитания, механизмы приспособления микробов к экстремальным условиям, описаны современные молекулярно-биологические методы изучения микробного разнообразия в природных нишах, приемы изучения и измерения микробной активности в природе. Для студентов биологических специальностей вузов. Может быть полезен всем, кто интересуется проблемами глобальной экологии. УДК 579.26(075.8) ББК 28.4я73 © Коллектив авторов, 2004 ISBN 5-7695-1566-Х © Издательский центр «Академия», 2004
Посвящается 250-летию Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова и 80-летию кафедры микробиологии МГУ ПРЕДИСЛОВИЕ Несмотря на обилие книг по экологии на книжном рынке страны, одна «экологическая ниша» до сих пор остается практически вакантной. На прилавках почти нет литературы по экологии микроорганизмов, тогда как на Западе только за последние годы выпущено более 15 названий книг по данному вопросу. Предлагаемый учебник призван, во-первых, заполнить образовавшуюся вакансию, во-вторых, помочь студентам-микробиологам, а также биологам смежных дисциплин расширить свои знания в области экологии микроорганизмов, которые до этого они могли почерпнуть лишь из университетского курса лекций, и, в-третьих, расширить круг знаний специалистов-экологов, которые часто не подозревают о многообразной и масштабной деятельности микроорганизмов в формировании и поддержании устойчивости всей биосферы. Книга представляет интерес и для специалистов, работающих в таких хозяйственных отраслях, как агробиология, мониторинг и очистка окружающей среды, рыбоводство и рыборазведение, подземная гидрометаллургия, захоронение отходов и переработка стоков, биотехнология и др. В учебнике отображены все современные аспекты экологии микроорганизмов — от теоретических вопросов («экологическая ниша», «экофизиология вида») до тем, связанных с развитием и активностью отдельных групп микроорганизмов в природе. Рассматриваются примеры практического использования результатов изучения экологии микроорганизмов для решения хозяйственных вопросов относительно ликвидации загрязнений ксенобиотиками и нефтяными разливами, а также для поиска «экологических» путей утилизации твердых бытовых и промышленных отходов. Животные, растения и микроорганизмы создают биологическое разнообразие биосферы Земли, однако до сих пор очень мало известно о вкладе микроорганизмов в тот или иной процесс по сравнению с животными или растениями. Еще меньше известно о специфическом вкладе микробов в структурирование тех или иных сложных природных систем. Мы скорее догадываемся, что вклад этот велик хотя бы потому, что микроорганизмы составляют половину всей живой биомассы Земли, что они населяют практи- 3
чески все местообитания животных и растений, занимая также экстремальные ниши, где растения и животные развиваться не могут. Микроорганизмы катализируют уникальные и важнейшие реакции живого мира: они расщепляют мертвую органическую биомассу, способны к фотосинтезу (в том числе и без выделения кислорода), участвуют в глобальных циклах элементов (С, N, S, Р, Са и др.), минерализуют микро- и макроэлементы, необходимые растениям и животным. Без этих реакций жизнь на Земле никогда бы не возникла или прекратилась очень скоро. Как самостоятельная дисциплина экология микроорганизмов зародилась к 1960 г. и к концу 70-х годов прочно заняла свое место в ряду других направлений микробиологии. Многие годы экологи- микробиологи ограничивались изучением природных образцов, выделением тех немногих организмов, которые растут на общепринятых средах, и изучением начальных и/или конечных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов в природе. С 90-х годов в экологии микроорганизмов стали применять молекулярно- биологические методы для изучения процессов, происходящих в природе с участием микроорганизмов. Возникновение технологий, связанных с клонированием ДНК, в том числе рекомбинан- тной, привело к появлению возможностей использовать генетически измененные микроорганизмы для борьбы с загрязнениями окружающей среды, контроля роста растений и др. За последние 5—10 лет появились новые методы, позволяющие изучать: состав и динамику микробных сообществ, не разделяя их на отдельных членов, например гибридизацию с применением флуоресцирующих зондов; состав метиловых эфиров жирных кислот; микрочипы ДНК; группоспецифичные праймеры; гены-репортеры; ферментные и микробные сенсоры и т.д. Число новых методов, применяемых в экологии микроорганизмов, а также в смежных областях — геомикробиологии, биологии почв, морской микробиологии и т.д., растет год от года. Книга написана коллективом авторов — ведущих российских специалистов в области общей экологии микроорганизмов. Предисловие, введение, подразделы 5.1, 5.2 и 5.3 «Методы экологии микроорганизмов» подготовлены заведующим кафедрой микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова профессором А. И. Нетрусовым; глава 1 «Основные понятия общей экологии» — заведующим кафедрой экологии биологического факультета МГУ профессором В.Н.Максимовым; подраздел 2.6 «Роль микроорганизмов в глобальных циклах элементов» — директором Института микробиологии РАН академиком М.В.Ивановым; подраздел 4.4 «Биотехнология металлов» — членом-корреспондентом РАН Г. И. Каравайко; подраздел 2.4 «Экология водных микроорганизмов» — профессором В. М. Горленко; подразде- 4
лы 4.2 и 4.3 по биологической обработке органических отходов — доктором биологических наук А. Н. Кожевниковой. В подготовке книги приняли также участие сотрудники кафедры микробиологии и биологии почв МГУ, специалисты в области экологии микроорганизмов, читающие лекции по этому курсу в МГУ и ведущие научную работу в том же направлении: доктор биологических наук П. А. Кожевин (подраздел 2.5); доценты Н. Н. Колотилова (подразделы 2.1 и 2.2) и И. Б. Котова (подраздел 4.1); старшие научные сотрудники А. М. Семенов (подразделы 3.3 и 5.4) и Т. Г. Юдина (подразделы 3.1 и 3.2). Подраздел 2.3 подготовлен доктором биологических наук Е.А. Бонч-Осмоловской; глава 6 — кандидатом биологических наук Т. П. Туровой (сотрудники ИНМИ РАН). В России учебник по экологии микроорганизмов издается впервые и, по-видимому, не свободен от некоторых недочетов. Авторский коллектив с благодарностью примет все замечания и пожелания, которые в последующих изданиях непременно будут учтены. Авторы книги благодарны рецензентам — профессору Н. Б. Градовой (каф. биотехнологии МХТУ им. Д. И. Менделеева) и профессору Ю. Б. Цыганкову (ФГУП «ГосНИИгенетика») за внимательное ознакомление с рукописью и высказанные ценные замечания. Авторы надеются, что читатели найдут в книге полезные для себя сведения, позволяющие им прикоснуться к таинственному и во многом еще неизведанному миру микробов, понять и полюбить мир маленьких трудолюбивых организмов, которые без устали работают, стараясь, чтобы жизненные условия на Земле не ухудшались, несмотря на все негативные результаты вмешательства человека в природу.
ВВЕДЕНИЕ Одним из направлений современной микробиологии является экология микроорганизмов. В настоящее время эта наука бурно развивается, используя новые методы микроэлектродной техники для изучения микроокружения экологических ниш микробов, точные методы химического анализа с применением техники высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), газовой хроматографии и масс-спектроскопии (ГХ-МС), методы молекулярной биологии в манипулировании и анализе экстрактов нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) из природных образцов, позволяющих с высокой избирательностью исследовать состав микробных сообществ на молекулярном уровне. Не теряют актуальности методы анализа микроорганизмов в отношении состава жирных кислот, клеточной стенки, отдельных липидов. Исследователи, занимающиеся проблемами экологии микроорганизмов, доказали, что среда обитания последних охватывает весьма широкие зоны биосферы, часто с экстремальными условиями обитания, где не могут развиваться ни растения, ни животные. Микроорганизмы найдены в самых глубоких слоях океана, где рядом с подводными термальными источниками они формируют новые оазисы жизни, не основанной на первичной фото- трофной продукции органического вещества, а полностью зависящей от образования органического вещества в результате деятельности хемолитотрофных микроорганизмов. В толще скальных пород на глубинах 4—6 км микроорганизмы осуществляют «водородный» и «метановый» циклы. Наконец, микроорганизмы обнаружены высоко в горах, вплоть до высоты 8 км, а также внутри метеоритных остатков. Микроорганизмы часто рассматриваются в качестве первых обитателей Земли. Впервые за живыми микроорганизмами наблюдал под микроскопом А.Левенгук в 1776 г., а роль их в превращениях химических веществ и возникновении болезней была доказана в работах Л.Пастера и Р.Коха в конце XIX столетия. Постулаты Коха создали надежную основу для изучения роли микроорганизмов в инфекционном процессе. Хотя термин «экология микроорганизмов» («микробная экология») стали широко использовать в 60-х годах XX в., экологически ориентированные работы с микроорганизмами проводили уже давно. Еще Левен- 6
гук обнаружил микроорганизмы в каплях дождевой воды (их естественное местообитание) и выявил действие перца на микробы (влияние окружающей среды). В конце XIX — начале XX вв. С.Н.Виноградский и М.Бейеринк разработали принципы элективных культур, что можно определить как дату рождения науки, которую впоследствии стали называть «экология микроорганизмов». С. Н. Виноградскому принадлежит идея использовать градиенты света, сульфида и кислорода (знаменитая «колонка Винограде кого») для изучения природных популяций сульфид- окисляющих фотоавтотрофных бактерий, сульфатвосстанавлива- ющих и хемоавтотрофных сульфид- и сероокисляющих бактерий, одновременно присутствующих в одном местообитании и осуществляющих взаимозависимые процессы. Экология микроорганизмов является наукой, которая специальным образом изучает взаимоотношения между микроорганизмами и их биотическим или абиотическим окружением. Последующее развитие микробиологии было связано с постоянным выделением микроорганизмов из их природных местообитаний, определением метаболитического потенциала и изучением их роли в биогеохимических циклах азота и серы. Микроорганизмы стали находить в каждой пробе воды, почвы, воздуха, у животных и растений. Микроорганизмы продемонстрировали огромное разнообразие форм и мест заселений, включая экстремальные по температурам, давлению, солености и рН. За последние 30 лет стало понятно, что из определенных мест выделяют определенные микроорганизмы с определенными функциями. Тот факт, что в пробах, взятых в природе, почти никогда не находят микроорганизмов в виде чистых культур, позволил сделать вывод о взаимодействии микробных популяций друг с другом и микроокружением, с его быстро изменяющимися физико-химическими параметрами. Было также продемонстрировано, что микроорганизмы обладают сенсорами, т. е. способны к фото- и хемотаксису, и активно выбирают для себя наиболее выгодные места в градиентных местообитаниях. В большинстве своем современные экологи были вначале зоологами, ботаниками или микробиологами. Это обстоятельство приводило их к специализации в области экологии растений или животных (макроэкология) или экологии микроорганизмов. Однако изучение экосистем и глобальных процессов требует более интегративного подхода. В учебниках по экологии объяснение феноменов экологии растений и животных удовлетворительно объединено в одно целое, тогда как объяснение процессов с участием микробов все еще рудиментарно, если вообще приведено. В лучшем случае объяснены процессы биодеградации органического вещества и циклы минералов с участием микроорганизмов (хотя пока не более чем с позиций «загадки черного ящика»). 7
Не вызывает сомнений, что в будущем экология микроорганизмов интегрируется в общую экологию, но этот процесс потребует длительного времени. Одной из причин исторического разделения макро- и микроэкологии являются значительные различия в методологическом аппарате этих двух частей одной науки. Макроэкологи используют полевые наблюдения и количественные оценки состава и разнообразия видов в качестве основного методического подхода. Лабораторные исследования лишь помогают им обрабатывать данные и позволяют проводить некоторые химические анализы. Напротив, эколог-микробиолог помимо сбора образцов для анализа мало что может сделать в поле. Основную работу он проводит в лаборатории. Немногие экспериментаторы одинаково владеют приемами и методами макроэкологии и экологии микроорганизмов, что заставляет организовывать совместные проекты, где работают большие группы специалистов разного профиля и развиваются научно-методологические контакты между макроэкологами и микробными экологами. Хотя микроорганизмы часто не попадают в поле зрения классических экологов вследствие своего малого размера и быстрых скоростей размножения, они имеют значительные преимущества как объекты при изучении динамики популяций. Знаменитые эксперименты были проведены Г.Ф.Гаузе (1934) по изучению динамики равновесия системы хищник—жертва с Paramecium caudatum и Didinium nasutum, в которой последний организм питался инфузорией, а также системы Schizosaccharomyces pombe (дрожжи) и Paramecium bursaria (реснитчатые), в которой простейшее выполняло роль хищника. В то время эти эксперименты едва были замечены микробиологами, однако вызвали живую дискуссию среди зоологов и экологов. Экология микроорганизмов имеет дело с популяциями и взаимоотношениями популяций в их экологических нишах. Наиболее полно и глубоко в этом плане изучена микробиология рубца жвачных животных. Огромный вклад в эти исследования профессора Р.Хангейта признан во всем мире и неоспорим. Разработанные им приемы («техника Хангейта») сделали возможной работу со строгими анаэробами и позволили описать сложную пищевую микробную цепь, формирующуюся в рубце и приводящую к образованию метана. При изучении популяций строгих анаэробов была разработана концепция «синтрофных микроорганизмов», позволяющих совместными усилиями проводить такие реакции и перерабатывать вещества, которые не под силу переработать ни одному члену сообщества в отдельности. При этом возникла концепция «межвидового переноса водорода», позволяющая существовать синтрофным ассоциациям микроорганизмов за счет термодинамически сложных процессов. Микробные процессы, приво- 8
дящие к перевариванию целлюлозы в рубце, стали также примером взаимоотношения микроорганизмов и животных. Впоследствии аналогичное взаимоотношение было обнаружено при изучении пищевой цепи термиты — ассоциации микробов — высшие организмы. Пищевые цепи, подобные этим, приводящие к разложению мортмассы, обнаружены в морских и пресноводных осадках, а также в системах очистки стоков в анаэробных метантенках. В природе микробные сообщества растут, образуя биопленки, о чем впервые сообщили К.Зобэлл и М.Андерсон еще в 50-х годах XX столетия, однако документированные подтверждения уникальности проходящих там процессов были получены лишь в последние 20 лет благодаря в основном развитию техники микроэлектродов. В настоящее время общепринято, что при развитии в природе биопленки преобладают над свободноживущими микроорганизмами как в численном отношении, так и по уровню мета- . болизма. Доказано, что клетки в составе биопленки фенотипиче- ски отличаются от свободноживущих и что способностью к образованию биопленок обладают все представители домена бактерий. Тесные структурные ассоциации клеток в составе биопленок ведут к интенсивному обмену метаболитами (химическая коммуникация) и, возможно, генетическим материалом, что может приводить к адаптивной изменчивости функций всего сообщества. Фундаментальным подходом к изучению экологии высших растений и животных являются количественные наблюдения за развитием отдельных популяций в различных условиях среды. За более чем 100 лет наблюдений экологи растений и животных приобрели ценный опыт, который позволяет предсказывать появление и направление развития отдельных популяций растений и животных в зависимости от смены условий существования. Были построены модели развития той или иной популяции и взаимоотношений между популяциями. К сожалению, наши знания о микробных сообществах пока находятся на «эмбриональном уровне» как в отношении описания систем, так и в плане предсказания их развития. В 1956 г. голландский профессор А. Клюйвер предположил, что половина существующей на Земле «живой протоплазмы» принадлежит клеткам микроорганизмов. В настоящее время эта догадка научно обоснована, но даже существующие современные методы все еще не дают возможности экологам-микробиологам наблюдать за развитием микроорганизмов в их микроокружении, не нарушая последние в процессе наблюдений. Так же трудно подсчитать количество живых и неживых клеток микроорганизмов в их природных местообитаниях. Новые методы исследований позволяют глубже понять принципы функционирования микробных сообществ в их естественных местообитаниях, однако до сих пор эти методы далеки от идеала. С приходом методов молекулярной 9
биологии стало возможным определять количество микроорганизмов и находить новые без их выделения в чистые культуры. Эти же методы поставили микробиологов перед шокирующим фактом, что выделенных чистых культур по отношению ко всей численности видов в природе удивительно мало: они составляют лишь менее 0,1 % от общего количества. Некоторые расчеты показывают, что при существующей скорости описания новых видов все растения и животные будут описаны в течение ближайших 50 лет, тогда как на описание всех микроорганизмов потребуется 10000 лет! Сколько интересных открытий должно таиться в остающихся невыделенными и неизученными 99,9 % микроорганизмов, которые вызовут к жизни новые биотехнологические процессы и приведут к открытию новых веществ, полезных для практики. Микробы и их сообщества рассматривали в качестве универсальных «химических машин», которым под силу расщепить любые органические молекулы аэробно либо анаэробно. И если данное положение верно для любых природных молекул, сколь бы сложны они ни были, то для препаратов антропогенного происхождения этого сказать нельзя. Появление таких практически не поддающихся микробному разложению веществ, как ДДТ или полихлорированные бифенилы (ПХБ), привело к возникновению концепции о применении в качестве гербицидов, пестицидов или антимикробных препаратов только таких субстанций, которые впоследствии могут быть расщеплены в природе до простых молекул. Толчком к развитию методов экологии микроорганизмов послужили также исследование космического пространства и поиск микробной жизни на других планетах. Проверку приборов и систем, которые были призваны определить наличие жизни вне Земли, проводили в жестких условиях высокой или низкой температуры, высокого давления или экстремальной солености и кислотности среды. Такие тесты позволили обнаружить жизнь микробов в Антарктике при -36 °С, на дне океанов при давлении более 800 атм, в горячих вулканических, наземных и подводных источниках при рН 0,5, солености 30 %о и температуре до 113 °С. Часто говорят, что успехи экологии микроорганизмов ограничены методами, которые применяют для анализа микробных систем. И хотя постоянное развитие микроэлектродной техники и оптических методов увеличивает наши возможности измерять и наблюдать микроорганизмы в их природных экологических нишах, попытки создать более тонкие и чувствительные инструменты исследований должны продолжаться для более точного понимания изменений в микробных сообществах и для предсказания влияния таких изменений на функции сообщества. Значительная часть исследований связана с восстановлением участков окружающей среды, загрязненных вследствие антропогенной активное - 10
ти. Умелое использование свойств природных микробных сообществ может в значительной степени помочь процессу ремедиа- ции (лечения) загрязненных территорий, что является предметом прикладного направления экологии микробов. Вышеперечисленные аспекты современной экологии микроорганизмов требуют дальнейшей работы, направленной на более глубокое понимание структурных и функциональных особенностей микробных сообществ. Ощущается острая необходимость в ускоренном развитии методов, позволяющих лучше понимать характер изменений в микроокружениях сообществ при смене физико-химических условий. Это фактически и составляет предмет и задачи экологии микроорганизмов, которым посвящен настоящий учебник.
ГЛАВА 1 ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ОБЩЕЙ ЭКОЛОГИИ Термин «экология» ввел в научный обиход один из крупнейших немецких биологов Эрнст Геккель. В 1866 г. в книге «Всеобщая морфология организмов» он предложил это название, происходящее от двух греческих слов («oikos» — жилище или местообитание и «logos» — учение, слово), для отрасли биологии, которой дал определение, сохраняющее свое значение и по сей день. Геккель писал: «Под экологией мы понимаем общую науку об отношениях организмов с окружающей средой, куда мы относим в широком смысле все условия существования». Далее ученый разъяснял, что он имел в виду под «условиями существования», разделив их на неорганические и органические. К неорганическим Геккель относил физические и химические свойства местообитаний: свет, тепло, влажность и другие климатические условия, состав воды, почвы, содержание биогенных элементов. Под органическими условиями подразумевалась совокупность отношений данного организма со всеми остальными организмами, с которыми он встречается в природе. За прошедшие 130 лет несколько изменилась лишь терминология: вместо «неорганических условий» говорят об «абиотических факторах»; «биотические факторы» в современных учебниках экологии — это то же самое, что «органические условия» у Э. Гекке- ля. Развитие экологии как науки пошло по различным направлениям в зависимости от того, какие именно факторы внешней среды выбирали исследователи в качестве объекта изучения. Так обособилась «факториалъная экология», предмет которой — изучение влияния внешних физико-химических условий (абиотических факторов) на организмы. Иногда ее называют аутэкологией (от англ. «aut» — внешний). Самостоятельным направлением стала синэко- логия, изучающая взаимоотношения организмов данного вида с окружающими их особями других видов, т.е. влияние биотических факторов на эти организмы. Возникли и другие направления экологии, существенно дополнившие наши представления о предмете и содержании этой науки. Назовем прежде всего популяционную экологию (демэколо- гию), объектом которой является уже не индивидуальный орга- 12
низм, а популяция. Она рассматривается как некоторая целостность, т.е. система «надорганизменного» уровня со свойствами, не сводящимися к сумме свойств отдельных индивидуумов. В свою очередь, популяции как составные части (подсистемы), связанные разнообразными биотическими отношениями, образуют сообщество, или биоценоз. В единстве с абиотической средой обитания сообщество образует экосистему, или биогеоценоз, — объект системной экологии. В этом разделе последовательно рассматриваются важнейшие представления, лежащие в основе каждого из названных направлений современной экологии. 1.1. Абиотические факторы (аутэкология) Абиотические факторы по их физической природе и механизму действия на организмы могут принципиально отличаться друг от друга, тем не менее характер зависимости показателей жизнедеятельности организма от уровней этих факторов при всем их многообразии во многом очень сходен. Для любого абиотического фактора можно найти интервал изменений, в пределах которого показатели состояния организма меняются мало или не меняются вовсе, оставаясь на уровне, называемом оптимальным. Соответственно и сам интервал получил название «зона, или область, оптимума». Более низкие уровни фактора не обеспечивают полноценное функционирование организма (ограничивают интенсивность процессов жизнедеятельности), и соответствующий интервал называют зоной лимитирования. В свою очередь, избыточные уровни фактора могут подавлять жизнедеятельность организма. Этот интервал называют зоной ин- гибирования. Физиологи предпочитают называть зону оптимума зоной {областью) адаптации, имея в виду, что слово «оптимум» означает «наилучший», тогда как далеко не всегда можно точно определить, что для организма «хорошо», а что «плохо». Адаптация же (независимо от ее конкретного механизма) проявляется именно в том, что при изменении силы внешнего воздействия в определенном интервале некоторый показатель жизнедеятельности организма остается практически неизменным. Существуют такие экстремально низкие или экстремально высокие уровни фактора, при которых жизнь организма становится невозможной. Крайние пределы изменений фактора, которые организм еще способен перенести, принято называть пределами толерантности. Различные организмы имеют значительно различающиеся пределы толерантности по отношению к одному и тому же экологическому фактору. Организмы с широкими пределами толерантности называются эврибионтами, а организмы, способные 13
существовать только в относительно узких пределах изменений экологического фактора, — стенобионтами. Для стенобионтов следует также принимать во внимание и положение их зоны оптимума на всей шкале возможных изменений данного фактора. В частности, среди стенотермных организмов различают психрофилов, чей температурный оптимум находится в области низких температур (т. е. близких к 4 °С и порой даже ниже 0°С), и термофилов с оптимальными температурами в некотором интервале около точки кипения воды (70— 110 °С!). Впрочем, приходится упомянуть о существовании огромного числа абиотических факторов, для которых понятие экологического оптимума в принципе лишено смысла. К ним относятся так называемые ксенобиотики — вещества, как правило, ядовитые. В большинстве своем они вообще не существовали в природе до того, как были синтезированы человеком. Рассмотренные выше зависимости отражают наши представления о действии на организм каждого экологического фактора как единственного, т.е. вне зависимости от действия других факторов или по крайней мере на фоне постоянства уровней остальных факторов. Между тем реакция организма на изменение любого внешнего фактора может в сильнейшей степени зависеть от того, на каком уровне находятся остальные факторы. Подобная зависимость действия одного фактора от уровня другого называется взаимодействием факторов. Наличие взаимодействий факторов создает серьезные трудности при изучении их влияния на организмы, так как требует постановки многофакторных опытов, в которых необходимо варьировать одновременно и независимо друг от друга все исследуемые факторы. Соответствующие планы эксперимента оказываются чрезвычайно громоздкими. Например, для получения наиболее простого нелинейного описания — модели 2-го порядка — зависимости роста микробной культуры всего от семи факторов необходимо поставить примерно 150 вариантов опытов. Между тем в окружающей нас среде обитания действуют десятки абиотических факторов. К их числу приходится, к сожалению, относить и так называемые антропогенные факторы, которые представляют собой множество самых разнородных воздействий результатов деятельности человека, — от возделывания сельскохозяйственных угодий и вырубки лесов до загрязнения атмосферы, почвы и водоемов многочисленными отходами промышленного производства. Последние в большинстве своем относятся к категории вышеупомянутых ксенобиотиков. Есть, однако, и другое, не менее принципиальное затруднение, возникающее при любой попытке исследовать влияние даже единственного фактора на какой-либо конкретный организм. Речь идет о выборе того самого показателя жизнедеятельности орга- 14
низма, по изменению которого собственно и определяют зону адаптации и пределы толерантности этого организма по отношению к данному фактору. Во-первых, показателей жизнедеятельности может быть много (во всяком случае, больше одного), а конкретный вид зависимости каждого из них от любого экологического фактора может быть весьма различным даже у одного и того же индивидуума. Во-вторых, — и это, наверное, наиболее важно — хорошо известно, что характер изменений любого физиологического показателя состояния организма в ответ на любое внешнее воздействие может заметно различаться у особей одного и того же вида. Чтобы получить более или менее ясное представление о реакции особей данного вида на изменение экологического фактора, необходимо многократно повторять измерения выбранного показателя жизнедеятельности в экспериментах с группой особей этого вида. Тогда можно вывести некоторые обобщенные оценки, относящиеся уже не к отдельной особи, а к группе особей, принадлежащих одному и тому же виду. Таким образом, переходим от экологии особей (а правильнее — от экологической физиологии) к экологии популяций. 1.2. Популяции (демэкология) Совокупность особей одного вида представляет собой самостоятельный объект исследования. У данного объекта имеются свойства, которые можно измерить, но которых нет у одной отдельной особи. Это, например, количество особей в совокупности, скорость изменения их обилия, средний размер особи в совокупности и т. п. Русскому слову «совокупность» соответствует английское слово «population», которое при употреблении в обычной повседневной речи переводится, как «население». Объединяя особей одного вида в группы и обращая при этом особое внимание на то, где и в каком количестве данные особи обитают, англоязычные экологи назвали их, естественно, тем же словом «population», но при переводе соответствующих статей и книг на русский язык с самого начала было использовано как термин иностранное слово «популяция». В разных учебниках экологии можно встретить различные определения популяции. Подробное обсуждение причин такого положения и различные варианты определений приведены в книге А. М. Гилярова «Популяционная экология» (М.: Изд-во МГУ, 1990), поэтому здесь мы ограничимся только одним определением, предложенным в этой книге в качестве своего рода «усредненной» формулировки, наиболее пригодной для использования в экологических исследованиях: 15
«Популяция — любая способная к самовоспроизведению совокупность особей одного вида, более или менее изолированная в пространстве и времени от других аналогичных совокупностей того же вида». 1.2.1. Характеристики популяции Важнейшие характеристики популяции — это численность и плотность (т.е. число особей на единицу занимаемой территории). Добавим к ним такие специфические характеристики популяции, как соотношение полов, распределение особей по возрасту {возрастная структура), размерам {размерная структура) и особенности пространственного распределения особей {пространственная структура). Эти показатели относятся к категории статических характеристик популяции. Слово «статический» вовсе не означает постоянство этих характеристик во времени, а лишь отражает то обстоятельство, что их измерение дает нам сведения о состоянии популяции, подобные фотографическому снимку. Мы как бы фиксируем положение, к которому пришла популяция в момент измерения, как итог всей предшествующей истории этой популяции. Для того же, чтобы оценить изменения во времени, происходящие в популяции, надо, очевидно, провести серию измерений через определенные интервалы времени. Тогда можно оценить скорости соответствующих процессов в популяции. Эти скорости также являются групповыми характеристиками популяции, и их принято называть динамическими. К ним относятся такие важнейшие показатели, как рождаемость — количество особей в популяции, родившихся за единицу времени; смертность — количество особей, погибших в той же популяции за единицу времени. Добавим к ним также скорость изменения численности популяции (чаще всего ее называют не совсем точно скоростью роста), количество потребляемой пищи за определенный период времени (например, суточный рацион), количество органического вещества, синтезированного организмами данной популяции за единицу времени, — это будут соответственно суточная, сезонная или годовая продукция популяции. Рассмотрим процессы, которые непосредственно определяют численность популяции. Это — рождаемость, смертность, иммиграция (вселение) и эмиграция. Ясно, что прирост численности популяции может происходить только за счет размножения и вселения извне, а убыль численности — за счет гибели (выедания, возрастной смертности, болезней) и эмиграции. Введем обозначения: В — рождаемость, D — смертность, / — иммиграция, Е — эмиграция. Тогда вышеприведенное высказывание можно записать в виде простого алгебраического выражения: 16
AN=NX- N0 = B+I-D- E, (1) где N0 — исходная численность популяции в момент времени /0; N] — численность популяции в момент времени /,, т.е. через интервал времени А/ = tx - t0. Введем величину R — удельный прирост, или прирост, приходящийся (в среднем!) на одну особь в популяции: R - AN/N0 = = (В + / - D - E)/N0. Удельный прирост часто служит тем самым показателем жизнедеятельности (см. выше), по изменению которого можно судить о влиянии экологических факторов (как биотических, так и абиотических) на популяцию. Для математического описания динамики численности популяции нужно сформулировать некоторую гипотезу относительно величины R как характеристики популяции. Простейшее из предположений сводится к тому, что удельный прирост не зависит от плотности популяции, иными словами, R = const при любых значениях N. Такую гипотезу можно принять как правдоподобную только для изолированной, не подверженной каким-либо внешним воздействиям популяции в стабильных условиях, к тому же не ограниченной каким-либо ресурсом. Тогда можно предположить, что /= Е- О, и в соответствии с уравнением (1) следует принять, что смертность D и рождаемость В не зависят от плотности популяции. Эта гипотеза приводит к не слишком очевидному выводу (по крайней мере для людей, не искушенных в математике) о росте численности такой популяции в геометрической прогрессии. Конечно, в природе ничем не ограниченный рост численности невозможен, поэтому вместо гипотезы R = const (биологически совершенно неоправданной) предлагаются различные альтернативные гипотезы о зависимости удельного прироста R от плотности популяции Nt. Согласно наиболее популярной гипотезе, удельный прирост уменьшается с ростом плотности популяции по линейному закону: R=Rmax-sN. (2) Тогда при N= /?maxA получаем R-0, т.е. при достижении некоторой предельной плотности популяции рост ее численности прекращается. Величины Rmax и s можно определить экспериментально, измеряя рост численности популяции на стадии активного роста. Следовательно, получаем возможность заранее предсказать, каков будет в данных условиях предел роста численности популяции. Коэффициенты в уравнении (2) имеют и некоторый биологический смысл. При N, близком к 0 (т.е. при очень малой плотности популяции), удельный прирост R будет близок к максимально возможному значению Rmax. Эта константа называется биотический потенциал. 17
Смысл линейного коэффициента s можно понять, если предположить, что ограничение роста популяции объясняется исчерпанием некоего ресурса. Предположим, что для роста численности популяции необходим ресурс, исходное количество которого равно Q. Если каждая особь за свою жизнь должна потребить q единиц этого ресурса, то предельная численность популяции К будет достигнута, когда ресурс будет исчерпан, т.е. К= Q/q. Поэтому константу А" называют емкостью среды. Это также означает, что чем больше «прожорливость» q каждой особи, тем меньше будет их максимальная численность в конце роста. К этому же сводится и содержание понятия «внутривидовая конкуренция за ресурс» — одного из фундаментальных понятий популяционной экологии. В то же время по модели (2) предел роста К- Rmax/s. Так как Q и Rmax — постоянные, s должен быть пропорционален q, поэтому величину s можно с некоторой долей условности назвать коэффициентом внутривидовой конкуренции. Поскольку наш объект — это гипотетическая популяция, изолированная от окружающего мира и состоящая из абсолютно одинаковых особей, в равной степени способных к размножению и потребляющих абсолютно одинаковое количество ресурса, трудно найти реальную популяцию, поведение которой можно было бы сопоставить с поведением модели, основанной на уравнении (2). Пожалуй, ближе всего к такой идеализированной популяции может быть лабораторная популяция бактерий, растущих в пробирке или колбе на полноценной питательной среде в термостате при оптимальной температуре. И действительно, в огромном числе работ по микробиологии так называемая логистическая модель, основанная на гипотезе (2), обеспечивает вполне удовлетворительное согласие теоретических и экспериментальных данных. Заметим, однако, что в этой модели не учитывается наличие лаг-фазы и фазы отмирания культуры, а поэтому весьма велико количество работ, в которых предлагаются совсем иные модели роста. Следует также вспомнить о биотических факторах, т.е. о возможном влиянии на изучаемую популяцию других популяций, населяющих то же местообитание. Вообще говоря, в рассмотренной выше модели изолированной популяции в неявном виде присутствовала по крайней мере еще одна популяция (а может быть, и две). Действительно, что скрывается за емкостью среды К? Мы говорили — ресурс или, в более узком смысле, — количество пищи. Но за исключением зеленых растений и некоторых бактерий — фото- и хемосинтетиков — все остальные живые существа потребляют в пищу другие организмы или продукты их жизнедеятельности. Значит, емкость среды — это прежде всего обилие популяции (возможно, и многих популяций) организмов, которые служат пищей организмам рассматриваемой популяции. С дру- 18
гой стороны, в соответствии с основным уравнением динамики (1) мы рассматривали прирост численности изолированной популяции как разность между рождаемостью и смертностью. Но смертность сама по себе есть сумма нескольких слагаемых, одно из которых — выедание хищниками, т. е. тоже эффект влияния на нашу популяцию какой-то другой популяции. 1.2.2. Взаимодействие популяций Разнообразие взаимодействий двух популяций достаточно велико, поэтому, как принято в таких ситуациях, полезно провести некоторую классификацию этих взаимодействий, хотя бы для того, чтобы установить определенный порядок в их рассмотрении. Воспользуемся здесь подходом, который был предложен Ю.Одумом в его известной книге «Экология». За основной признак предлагается принять изменение удельной скорости роста численности каждой из популяций как результат их взаимодействия. Таким образом, мы рассматриваем каждую из популяций как биотический фактор внешней среды, а скорость роста популяции — как показатель ее жизнедеятельности, аналогично тому, как это делают при рассмотрении влияния на организмы абиотических факторов. Если две популяции сосуществуют на одном и том же местообитании, то присутствие каждой из них может, очевидно, либо способствовать ускорению роста второй, либо замедлять его, но, возможно, скорость роста одной из популяций никак не меняется при наличии второй. Обозначим ускорение роста знаком «+», замедление роста знаком «-», а отсутствие влияния — «О». Тогда получим шесть основных типов межпопуляционных взаимодействий. • (ОО)-Взаимодействие, или нейтрализм. Как говорят математики, это «вырожденный» вариант: взаимодействие, при котором каждая из популяций никак не влияет на скорость роста другой популяции. • (0+)-Взаимодействие, или комменсализм. В присутствии первой популяции вторая растет быстрее, но это никак не отражается на скорости роста первой. • (О-)-Взаимодействие, или аменсализм. В присутствии первой популяции рост второй замедляется, но это никак не отражается на скорости роста первой. • (++)-Взаимодействие, имеющее в природе разные формы своего проявления и в зависимости от этого называемое по-разному. Если две популяции не только взаимно ускоряют рост численности друг друга, но и вообще друг без друга существовать не могут, то такое «взаимовыгодное сотрудничество» называют мутуализ- 19
мом. Если же такое взаимодействие возникает при более или менее случайной встрече и не является остро необходимым, его называют протокооперацией. • (+-)-Взаимодействие, проявляемое также в двух видах, названия которых говорят сами за себя: хищничество и паразитизм. Общее между этими видами взаимодействий сводится к тому, что для одной из популяций присутствие второй несомненно «+», так как и для хищника, и для паразита жертва или соответственно хозяин служит пищей. Для второй популяции присутствие первой очевидный «-», так как деятельность хищника сокращает численность жертвы, а деятельность паразита, если и не приводит обязательно к гибели хозяина, то может снизить его биотический потенциал в результате истощения организма. • (—)-Взаимодействие, называемое чаще всего конкуренцией. Такое взаимодействие проявляется в том, что при совместном существовании скорость роста каждой из популяций оказывается меньше, чем в отсутствие конкурента. В разных учебниках экологии можно встретить определения конкуренции, иногда существенно отличающиеся друг от друга. Выше мы уже обсуждали содержание понятия внутривидовой конкуренции при рассмотрении модели роста популяции при ограничении по ресурсу. По сути конкуренция между двумя популяциями — межвидовая конкуренция — отличается от внутривидовой только тем, что дефицитный ресурс распределяется между особями разных видов. Поэтому наиболее точным представляется определение, данное Р. Риклефсом в его учебнике «Основы общей экологии»: «Конкуренцию можно определить как использование некоего ресурса (пищи, воды, света, пространства) каким-либо организмом, который тем самым уменьшает доступность этого ресурса для других организмов». В некоторых учебниках экологии знаки «+» и «-» в обозначении типов взаимодействий трактуются как «польза» или соответственно «вред» одному из видов от присутствия другого. Этот явный антропоморфизм совершенно не оправдан. На простейших математических моделях показано, что (+-)-взаимодействия могут быть причиной возникновения колебаний численности популяций («волн жизни»). При этом отрицательное воздействие хищника на скорость роста жертвы может быть полезно для популяции последней. В то же время (++)-взаимодействия (якобы взаимно полезного) теоретически способны привести к неограниченному росту численности обеих популяций, и только недостаток ресурса у каждой из них (т.е. внутривидовая конкуренция) может стабилизировать такую систему. Наиболее сложной оказывается роль межвидовой конкуренции, которая в определенных условиях может приводить к полному вытеснению одного из видов из данного местообитания в соот- 20
ветствии с широко известным принципом конкурентного исключения Г. Ф. Гаузе. Однако анализ математических моделей конкуренции показывает, что этот принцип отнюдь не универсален, и в тех случаях, когда внутривидовая конкуренция сильнее межвидовой (что кажется вполне естественным), устойчивое сосуществование двух конкурирующих видов вполне возможно. Таким образом, «взаимно отрицательное взаимодействие» как между видами, так и между особями одного и того же вида оказывается для двухвидовой системы единственным фактором, обеспечивающим ее стабильность. Конечно, рассмотренные шесть типов межпопуляционных взаимодействий даже с теми разновидностями, которые были здесь упомянуты, не отражают всей пестроты взаимоотношений видов в реальных природных условиях, где число популяций, населяющих одно и то же местообитание, измеряется сотнями, а то и тысячами. 1.3. Сообщества (синэкология) В 1877 г. профессор зоологии Кильского университета Карл Мёбиус, описывая совокупность видов и условия их существования на устричной отмели, предложил термин «биоценоз» для обозначения такого сообщества, «в котором сумма видов и индивидуумов, ограничивающих друг друга и подвергающихся постоянному отбору под влиянием внешних условий жизни, благодаря размножению устойчиво занимает некоторую определенную территорию». Обстоятельства сложились так, что в англоязычной литературе этот термин так и не прижился, и в современных учебниках экологии, изданных в Англии и США, он практически не встречается. Но принятый в них термин «community» — «сообщество» — по своему содержанию мало отличается от термина «биоценоз». Наиболее важно, что независимо от названия биоценоз, или сообщество, — это система надорганизменного уровня, имеющая специфические свойства и характеристики, отличающие ее от популяции и тем более от организма. Первая из таких характеристик — видовой состав сообщества, или перечень видов, из которых оно состоит. Ясно, что два разных сообщества различаются по набору видов. Никто не затруднится отличить березовую рощу от соснового бора или ковыльную степь от мохового болота — названия этих сообществ говорят сами за себя. При более внимательном анализе можно убедиться, что эти сообщества отличаются не только по тем видам, которые бросаются в глаза (так как преобладают и по численности, и по размерам особей), но и по набору остальных, менее обильных или бо- 21
лее мелких видов. Следовательно, для видов, составляющих сообщество, характерна их сопряженность друг с другом. Принципиально важно, что сопряженность видов — это своего рода объективное свидетельство того, что сообщество реально существует как биологическая система независимо от произвола наблюдателя. Важнейшая характеристика сообщества как системы более высокого уровня организации, чем популяция, — видовое богатство, т.е. число видов в сообществе. Экологи всегда проявляли большой интерес к такой характеристике сообщества. Уже давно было замечено, что между видовым богатством и абиотическими условиями существования конкретных сообществ есть определенная связь. Достаточно сравнить контрастные сообщества, например полярную тундру и тропический лес, чтобы убедиться в наличии такой связи даже без каких-либо специальных расчетов. Кроме того, есть основания предполагать, что сообщество с высоким видовым богатством должно быть более устойчивым к изменению внешних условий, так как оно может реагировать на эти изменения более разнообразными способами, чем сообщество из малого числа видов. Особенно большие надежды возлагались на то, что уменьшение видового богатства, или, как теперь говорят, биоразнообразия, будет хорошим диагностическим признаком ухудшения состояния сообщества при чрезмерном антропогенном воздействии, в частности при загрязнении промышленными отходами среды обитания. Однако при попытке точного измерения этой характеристики экологи столкнулись с тем, что ее величина тесно связана с размером обследуемого пространства, который ограничен прежде всего техническими возможностями естествоиспытателя. Поэтому вместо видового богатства, величина которого не поддается надежному определению, была предложена другая характеристика сообщества, по смыслу в общем вполне равноценная, но более легко определяемая, — видовое разнообразие. Для его измерения было придумано множество разнообразных индексов. В обзорах, посвященных измерению биоразнообразия, упоминается не менее 15 — 20 таких индексов и приводятся удачные примеры их использования. К сожалению, по мере накопления фактического материала оказалось, что получаемые с их помощью оценки зачастую трудно сопоставимы и могут приводить к противоречивым выводам. Такое «разнообразие индексов разнообразия» свидетельствует, кроме всего прочего, и о слабой теоретической разработке самой концепции разнообразия, вследствие чего каждый автор изобретает свой индекс, исходя из своих собственных представлений о содержании понятия «разнообразие», и о том, для чего он этот индекс предполагает использовать. Приходится констатировать, что за последние 40 лет практическое применение концепции видового разнообразия привело к 22
не слишком утешительным результатам. Во-первых, оказалась несостоятельной надежда на то, что биотическое разнообразие может служить аналогом медицинского термометра для ранней диагностики «патологических» изменений в состоянии сообществ. Хотя при загрязнении среды обитания (например, воды в озере) число видов действительно может уменьшиться, но все больше накапливается конкретных примеров, когда в заведомо загрязненных экосистемах разнообразие обитающих там видов не меньше, а иногда и больше, чем оно было ранее в отсутствие загрязнения. Это особенно характерно для тех мест, где загрязнения носят хронический характер, т.е. поступают в окружающую среду постоянно в течение многих лет. В этом случае кардинально изменяется весь видовой состав сообщества, когда на место видов, чувствительных к данным загрязнениям, приходят другие, более выносливые виды либо существовавшие раньше в том же сообществе, но в незначительном количестве, либо вообще вселившиеся извне благодаря устранению конкурентов. Стали известны и примеры, когда видовое разнообразие снижалось в результате такого изменения условий среды, которое всегда было принято считать улучшением, а вовсе не ухудшением качества этой среды. Наиболее показательным среди таких примеров может быть уникальный эксперимент, который был заложен еще в 1856 г. на знаменитой Ротамстедской станции в Англии. На площади примерно в 2 га, занятой сообществом трав, сходным с традиционным газоном в английских парках, были заложены 20 делянок, на которых испытывали действие различных комбинаций удобрений. При этом, как и полагается, две делянки были оставлены для контроля без каких-либо воздействий, не считая ежегодных укосов, проводившихся на всех делянках одновременно и с одинаковой периодичностью. К 1949 г. видовое разнообразие на делянках, ежегодно получавших полный набор удобрений, резко снизилось, тогда как на неудобряемых (контрольных) делянках оно в течение почти 100 лет практически не изменилось. Выше уже было сказано, что для сообщества как системы характерна определенная сопряженность между видами, когда в пределах одного и того же местообитания в течение достаточно длительного времени встречаются одни и те же виды, хотя при этом их относительные обилия могут изменяться в результате межпо- пуляционных взаимодействий или под влиянием внешних воздействий. Такая сопряженность определена наличием разнообразных биоценотических связей между видами, важнейшие из которых — трофические {пищевые) связи. Они обусловлены тем, что особи одного вида питаются веществом, происходящим от особей другого вида, либо, как хищники, поедают жертву или потребляют остатки отмерших организмов, прижизненные выделения других организмов. 23
Множество форм трофических связей можно классифицировать различными способами. Например, различают автотрофов и гетеротрофов. Автотрофы, т.е. организмы, питающиеся автономно, независимо, — это фотосинтезирующие и хемосинтезирующие организмы. Их способ питания — синтез из углекислого газа и ряда других неорганических веществ всего того многообразия органических соединений, которые и составляют живое вещество Земли. Название «автотрофы» подчеркивает то обстоятельство, что эти организмы не нуждаются (или почти не нуждаются) в органических веществах, производимых другими организмами, в чем собственно и проявляется их независимость. В отличие от них гетеротрофы (питающиеся другими) — это все остальные живые существа, которым для пропитания приходится либо убивать другие организмы, либо довольствоваться их остатками и продуктами жизнедеятельности. При всей пестроте типов и форм трофических связей можно, однако, заметить их очень важную общую особенность: эти связи определенным образом ориентированы, или однонаправле- ны, т.е. по крайней мере на уровне особей жертва не может съесть хищника, а паразит никогда не поменяется местом с хозяином. Но благодаря этому в любом сообществе образуется цепочка: органические вещества жертвы после ее гибели превращаются в теле хищника в другие органические вещества, служащие пищей для другого хищника, для которого первый хищник становится жертвой, и т.д. Такая последовательность превращений органических веществ в сообществах, называется трофической {пищевой) цепью. По этой цепи через сообщество идет поток вещества. Вот как он выглядит на суше: из минеральных веществ — диоксида углерода, воды, солей, содержащих фосфор, азот, серу и другие биогенные элементы, автотрофы синтезируют органические вещества и строят из них свои организмы. Органы и ткани этих организмов составляют пищу для гетеротрофов, и с этого собственно начинается трофическая цепь. Поэтому вся сумма органических веществ, синтезированных автотрофами, называется первичной продукцией, а сами автотрофы — первичными продуцентами. Те гетеротрофы, для которых первичная продукция служит пищей, получают соответственно наименование первичных консументов (потребителей). Эти животные будут жертвами «первичных хищников», но в трофической цепи уже не существенна разница между первичными консументами («травоядными») и хищниками: гораздо важнее то, что ни те, ни другие уже ничего нового не производят, а лишь трансформируют готовые органические вещества. Они, следовательно, такие же потребители — их называют вторичными консументами, или консументами второго порядка. Далее 24
появляются «хищники хищников» — консументы третьего порядка—и т.д. В этой цепи, впрочем, нет крайне важного звена, обязательно присутствующего как в наземных, так и в водных сообществах. Это — редуценты (главным образом микроорганизмы и грибы), которым достаются остатки и разнообразные продукты жизнедеятельности любых организмов, от первичных продуцентов до кон- сументов самого последнего трофического звена. Редуцентов потому и ставят на особое место в трофической цепи, что они могут быть первичными консументами — если разлагают отмершие остатки растений (первичных продуцентов), а могут оказаться и дальше самого последнего звена трофической цепи — если их пищей окажется труп столь крупного и страшного хищника, что его никакой другой хищник съесть не в состоянии. Иначе говоря, редуценты могут принадлежать сразу всем звеньям трофической цепи. Кроме того, долгое время было принято считать, что только редуценты замыкают поток вещества по трофической цепи в кольцо, возвращая минеральные вещества первичным продуцентам. Не следует забывать, однако, что пищей для многих других кон- сументов служат также бактерии и грибы, поэтому в некоторых сообществах их роль как вторичных продуцентов не менее существенна. Теперь обратим внимание на хорошо известный факт, что пища служит источником энергии для всех живых организмов. Если сжечь любой пищевой продукт в калориметрической бомбе и измерить выделившееся при этом тепло, то можно установить, что 1 г углеводов «содержит» примерно 4000 калорий, 1 г белков — около 5000 калорий и т.д. В среднем калорийность 1 г живой (сырой) биомассы оценивается в 2000 калорий, поскольку большинство живых организмов на 65 — 70% состоят из воды и минеральных солей. Таким образом, с потоком веществ по трофической цепи идет и поток энергии, но если вещества после всех превращений возвращаются, как говорят технологи, «в голову процесса», то энергия, потраченная организмом, рассеивается безвозвратно в виде тепла, выделяющегося при любом преобразовании энергии из одной формы в другую. Вследствие этого организмам каждого следующего звена трофической цепи достается все меньшая доля энергии от того общего количества, которое запасают автотрофы. Как принято говорить, организмы каждого следующего звена находятся на другом, более высоком трофическом уровне. Отношение продукции данного трофического уровня к продукции предыдущего называется экологической эффективностью. Этот показатель в разных экологических условиях меняется от 5 % в тропических лесах до 20 —25 % — в водоемах. Особое положение занимает первый трофический уровень — первичные продуценты. 25
Их энергетические траты на собственные обменные процессы составляют 50 — 70% от того количества солнечной энергии, которая превращается ими в энергию химических связей в процессе фотосинтеза и называется валовой первичной продукцией. Оставшиеся 30 — 50% энергии, запасенной в виде биомассы растений, называются чистой первичной продукцией, или продукцией, доступной для консументов. 1.4. Экосистемы Итак, в любом экологическом сообществе постоянно идут два противоположно направленных процесса: продукция, т.е. новообразование органических веществ из неорганических, «косных», компонентов, и деструкция — разложение живого вещества с возвращением минеральных веществ в окружающую среду. Эти процессы тесно связывают все живые организмы и их абиотическое окружение в единую систему, которую и называют экосистемой. Экосистемный подход принципиально отличается от рассмотренной выше аутэкологической методологии тем, что вместо искусственного разграничения организма и среды его обитания они рассматриваются как единое целое. Иначе говоря, вместо одностороннего изучения влияния внешних абиотических факторов на организм или группу организмов мы должны обращать столь же пристальное внимание на то, как жизнедеятельность организмов отражается на состоянии окружающей их неживой природы. Только на экосистемном уровне можно изучать такое важнейшее явление в жизни сообществ, как сукцессия. Этим термином называют последовательную смену видового состава сообщества на определенном местообитании. Основная причина такой смены как раз и заключается в том, что под влиянием сообщества меняется среда его обитания. Сами же эти изменения обусловлены отсутствием баланса продукции и деструкции. Если в каком-либо сообществе продукция превышает деструкцию, то в такой экосистеме будет накапливаться органическое вещество. На суше это может быть накопление древесины, т.е. рост леса — увеличение числа деревьев, их толщины и высоты, смыкание крон и т.д. Это может быть также накопление отмерших растительных остатков — опавшей листвы и веток, дальнейшее разложение которых приводит к увеличению содержания гумуса в почве, т.е. к изменению характера почвы. Такое же накопление органических веществ в водоеме в виде иловых отложений приводит к заболачиванию. Сначала озеро мелеет настолько, что водная растительность распространяется в нем по всему дну. Одновременно с берега на поверхность воды наползает так называемая сплавина, состоящая главным образом из 26
сфагновых мхов. Заиление усиливается и начинается образование торфа. На отвердевшей вследствие этого сплавине начинают расти кустарники, а позднее и деревья, чаще всего хвойные — сосны или лиственницы. Изменения идут очень медленно, но через несколько тысяч лет на месте озера может оказаться лес. Многолетние исследования наземных и водных экосистем показали, что при всем многообразии исследованных сообществ можно обнаружить сходные черты в характере их сукцессионных изменений. Рано или поздно усиление деструкционных процессов и снижение первичной продукции приводят к тому, что в экосистеме устанавливается продукционно-деструкционное равновесие. Совокупность видов, образующих сообщество в такой экосистеме, называют климаксом. Сходным образом в разных экосистемах меняется и видовое разнообразие сообществ. На начальных стадиях видовое богатство мало, так как лишь немногие виды способны жить, скажем, на песчаных дюнах или голых скалах. По мере обогащения почв органическими веществами и увеличения биомассы растительного покрова число видов растений и животных существенно возрастает, но при наступлении климакса обычно наблюдается некоторое снижение видового богатства за счет вытеснения менее конкурентоспособных организмов. Это сопровождается увеличением среднего размера организмов и усложнением их жизненных циклов. Любое нарушение продукционно-деструкционного равновесия приводит к возврату экосистемы к одной из более ранних сериальных стадий. Причиной такого нарушения может быть лесной пожар, катастрофическое наводнение, вмешательство человека. Вырубка лесов, распашка целины, строительство городов, гидроэлектростанций, разработка полезных ископаемых — все эти и многие другие виды хозяйственной деятельности людей разрушают климаксные экосистемы и могут положить начало вторичной сукцессии. В некоторых случаях люди сознательно создают условия, при которых продукция экосистемы должна постоянно превышать деструкцию. В этом, в сущности, состоит смысл сельскохозяйственного производства, так как избыточная продукция любой агроэкоси- стемы — это либо урожай продовольственной или технической культуры (первичная продукция), либо прирост продукции животноводства в любой форме (получение мяса, молока, шерсти и т. д., вплоть до рогов и копыт). Таким образом, для обеспечения устойчивых урожаев необходимо все время удерживать экосистему в неравновесном состоянии, затрачивая на это немалую дополнительную энергию. В частности, при выращивании сельскохозяйственных культур приходится ежегодно перепахивать поля, предотвращая вторичную сукцессию растительного сообщества. Достаточно часто не слишком разумные действия человека приводят к образованию экосистем, в которых деструкция пре- 27
вышает продукцию. Если после вырубки леса на лесосеке остается неубранная масса щепы и веток с листвой и хвоей, то в течение многих лет после такой «хозяйственной» деятельности на этой территории процессы разложения растительных остатков будут преобладать над той продукцией, которую в состоянии произвести сообщество мелких кустарников и небольшого числа видов трав. Точно так же после постройки плотины на реке и образования водохранилища на месте речной поймы в первые годы существования этого водоема процессы деструкции органических веществ из затопленных почв могут идти более интенсивно, чем процессы первичной продукции. Если вспомнить, что образование первичной продукции сопровождается выделением кислорода, а при деструкции кислород расходуется на окисление органических веществ, то нетрудно понять, что превышение деструкции над продукцией должно приводить к дефициту кислорода в воде, т. е. к существенному ухудшению условий жизни аэробных организмов в данной экосистеме. Есть основания полагать, что в постоянных климатических условиях видовой состав климаксного сообщества будет один и тот же независимо от того, каковы начальные стадии сукцессии. Известны примеры, когда травянистое сообщество на сухих песчаных дюнах и сообщество торфяного болота в результате сукцессии превращаются в один и тот же елово-пихтово-березовый лес. Не все экологи согласны с этой концепцией моноклимакса, высказанной еще в начале нашего века одним из основоположников представлений о сукцессиях Ф.Клементсом. Во всяком случае, нельзя быть уверенным в том, что экосистемы, преобразованные до неузнаваемости в результате деятельности человека, могут подобно природным экосистемам (пусть даже через много столетий) вернуться в равновесное состояние, совершенно идентичное тому, которое было на данной территории до появления на ней Homo sapiens.
ГЛАВА 2 МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСФЕРА Микроорганизмы — наиболее многочисленные обитатели биосферы, занимающие все доступные для жизни уголки планеты. Благодаря разнообразию условий, в которых могут расти эти существа, наши представления о границах жизни постоянно расширяются. Повсеместное распространение микроорганизмов обусловлено их малыми размерами, позволяющими легко переноситься с потоками воды и воздуха, разнообразием и гибкостью метаболизма, устойчивостью к неблагоприятным факторам среды. Особенности экологии микроорганизмов определяются их преимущественно химическим взаимодействием со средой обитания. Обладая высокой химической активностью, они представляют действительно важнейшую геологическую силу, причем речь идет не только о взаимодействии с горными породами или о процессах минералообразования, но прежде всего об участии их в процессах деструкции и минерализации органического вещества как природного (например, разложение целлюлозы), так и антропогенного происхождения. Еще одна важная особенность экологии микроорганизмов связана с их древностью и первичностью в истории биосферы. Основную (более 3Д) часть своей истории биосфера была «бакте- риосферой», представленной только (или в основном) прокариотами. Именно они сформировали ту биосферную систему Земли, в которой появились и смогли существовать все остальные организмы. Прокариоты активно участвуют в функционировании и взаимодействии круговоротов всех биогенных элементов. Мир эука- риот является надстройкой по отношению к практически автономной системе прокариотного блока биосферы, и его существование обязательно зависит от прокариот. Эволюцию живого мира можно представить в виде пирамиды, в верхней, сужающейся части которой находятся эукариоты, а в основании — прокариоты с их наиболее разнообразными метаболическими возможностями, приспособленностью к широкому спектру условий окружающей среды, высокой устойчивостью к экстремальным факторам и т.д. 29
2.1. Экофизиология микроорганизмов Развитие микроорганизма в природе определяется его биологическими особенностями, энергетическим обменом, кинетикой роста, регуляцией, способностями к адаптации, стратегией, границами устойчивости к факторам внешней среды и т.д. Изучение экофизиологии позволяет представить возможную роль микроорганизма в сообществе, его экологическую нишу, потенциальное место в экосистеме. Физико-химические факторы, характеризующие условия среды обитания организмов, разнообразны. К ним относят магнитные и электрические поля, солнечную активность, разные виды излучения, гидростатическое давление, температуру, кислотность (рН) среды, водную активность, окислительно-восстановительный потенциал, концентрации кислорода, питательных веществ, токсичных соединений и др. (Б. В. Громов, Г. В. Павленко, 1989). В большинстве случаев отношение микроорганизмов к тому или иному фактору характеризуют графиком зависимости роста (например, числа клеток или скорости размножения) от интенсивности фактора. При этом определяют так называемые кардинальные точки: оптимальное значение (или область значений), обеспечивающее наилучший рост, а также минимальное и максимальное значения, при которых рост прекращается. Диапазон между минимальным и максимальным значениями составляет область толерантности. В этой области (вне оптимума) организм активен, но имеет более низкую конкурентоспособность и может быть вытеснен другими видами. Помимо области толерантности, характеризуемой активной жизнедеятельностью бактерий, существуют пределы, в которых организм может длительное время сохранять жизнеспособность, но активно не развивается, например при низкой температуре или высушивании. Область толерантности организма к тому или иному фактору может быть узкой или широкой, и соответственно говорят о сте- но- и эврибионтных организмах (например, стено- и эвритерм- ных, стено- и эвригалинных по отношению к температуре и солености соответственно). Часто употребляют и другую пару эпитетов: «-фильные» и «-толерантные» (например, термофильные и термотолерантные, галофильные и галотолерантные). Так, термотолерантные организмы, как и термофилы, имеют высокую максимальную температуру роста, однако их температурный оптимум существенно ниже. Физико-химические условия обитания организмов в природе меняются в широких пределах. Повсеместно распространенные условия часто называют «обычными», или «нормальными», а крайние значения факторов, отличные от повсеместно распространенных, — «экстремальными». Рассмотрим подробнее наиболее 30
экологически значимые факторы и отношение к ним микроорганизмов (экстремальные условия и приспособленные к ним микроорганизмы преимущественно обсуждаются в подразд. 2.3). 2.1.1. Отношение к температуре Действие температуры на рост микроорганизмов может быть обусловлено ее непосредственным влиянием на скорость химических реакций и на состояние макромолекулярных компонентов клетки (вязкость мембран, конформацию белков и т.д.). В отличие от теплокровных животных микроорганизмы не могут регулировать свою температуру (хотя нередко вызывают своей деятельностью ее повышение, например в «саморазогревающихся» кучах компоста). Их функциональная активность определяется температурой окружающей среды. С повышением температуры скорость роста микроорганизмов вначале увеличивается, достигая максимальной. Дальнейшее увеличение температуры ведет к необратимой инактивации клеточных компонентов, прежде всего денатурации белков и нуклеиновых кислот, и гибели клетки. Для большинства организмов характерен весьма незначительный интервал между оптимальной и максимальной температурами. При минимальной температуре и дальнейшем ее понижении микроорганизмы в основном не погибают и могут длительное время (например, до наступления теплого сезона) сохранять жизнеспособность. При пониженной температуре снижается не только скорость роста, но и скорость отмирания, и соответственно увеличивается выживаемость организмов. Длительное хранение при низких и сверхнизких (до -196 °С) температурах широко используется для поддержания культур микроорганизмов в коллекциях. Природное «хранение», т.е. длительное, в течение тысячелетий, существование микроорганизмов в состоянии, близком к анабиозу, обнаружено (и активно изучается) в ледниках Антарктиды и зонах вечной мерзлоты. По отношению к температуре микроорганизмы подразделяют на несколько групп. • Самые «обычные» для окружающей природы мезофилы растут при умеренных температурах. У многих из них температурный оптимум близок к температуре тела теплокровных животных (30 — 37 °С) или несколько ниже (20—25 °С). Максимальная температура роста свободноживущих мезофилов близка к максимальному нагреву почвы (45 — 50 °С). • Психрофилъные — холодолюбивые — микроорганизмы растут при температурах ниже 20 °С (оптимум ниже 15 °С), вплоть до отрицательных значений температур (см. подразд. 2.3). Как правило, психрофилы существуют в постоянно холодных условиях и чув- 31
ствительны даже к небольшому повышению температуры. Одна из причин психрофилии — тепловая денатурация белков при умеренной температуре. • Психроактывные (психротрофные) микроорганизмы, также растущие при О °С, в отличие от психрофилов имеют более высокие оптимальную (25 — 30 °С) и максимальную (примерно 35 °С) температуры роста. Они приспособлены к сезонным изменениям климата и имеют селективные преимущества перед стенотермны- ми видами, поскольку активны и в теплое, и в холодное время года. Многие из них — типичные обитатели холодильников. Приспособление к пониженной температуре проявляется в изменении состава мембран (в ней повышается содержание ненасыщенных жирных кислот) и синтезе криопротекторов (например, гли- церола). Другой механизм связан с накоплением в клетках больших количеств наиболее важных ферментов, так что даже при неоптимальной температуре их функционирование позволяет клетке поддерживать достаточную активность. В зоне холодного и умеренного климата, характерного для большей части России, значение психрофильных и психротрофных микроорганизмов в природных процессах очень велико. При исследовании метаногенного сообщества тундры группой российских ученых под руководством Г. А. Заварзина впервые было обнаружено переключение трофического маршрута сообщества в зависимости от температуры, обусловленное сменой доминирующих групп микроорганизмов. Так, при температуре выше 15 °С основным конечным процессом в сообществе был метаногенез, а ниже 15 °С — образование ацетата. • К термофилам относят микроорганизмы, имеющие оптимум развития при температуре выше 50 °С. В зависимости от кардинальных температур их подразделяют на ряд групп: термотолерантные (максимум 45 — 50 °С), факультативные, облигатные, а также экстремальные термофилы и гипертермофилы (оптимум 80 — 105 °С, максимум 110 °С и выше; см. подразд. 2.3). Эта классификация в значительной мере условна, однако позволяет выделить достаточно четкие экофизиологические группы. Многие термофилы встречаются практически повсеместно (в почве, пищеварительном тракте человека и животных, на растениях и пищевых продуктах), другие приурочены к местам с высокой температурой (горячим источникам, саморазогревающимся скоплениям торфа или угля). Антропогенная деятельность, например развитие горячего водоснабжения, может вести к расширению зон активности термофилов, скажем, в грунтах, окружающих подземные трубопроводы. Примером практического использования термофилов может служить термофильный процесс анаэробной утилизации органических отходов с образованием биогаза. 32
2.1.2. Кислотность среды Кислотность среды является важным фактором, определяющим существование прокариот. С одной стороны, концентрация ионов водорода непосредственно влияет на клетку, ее электрический заряд, состояние мембраны, возможность протекания окислительно-восстановительных реакций, с другой стороны, — косвенно, определяя ионное состояние металлов, кислот, их доступность и токсичность. Значения реакции среды различных природных вод и растворов, где развиваются микроорганизмы (от рН 1 — 2 в кислых источниках и рудничных стоках до рН 10 в содовых озерах), покрывают почти весь теоретически возможный диапазон значений рН (0— 14). По отношению к рН среды микроорганизмы подразделяют на ряд физиологических групп. • Нейтрофилы развиваются при значении рН, близком к нейтральному (рН 6—8); многие виды растут или выдерживают более низкие или высокие значения рН, соответственно их относят к ацидотолерантным или алкалотолерантным. Большинство природных местообитаний (пресноводные озера и реки, многие почвы, внутренняя среда растительных и животных организмов) имеют близкую к нейтральной реакцию среды; слабощелочной является и морская вода. • К ацидофилам относят организмы, растущие в кислой среде (рН < 6). Среди них выделяют облигатные и факультативные (аци- дотолерантные), способные расти и в нейтральных условиях. Примером ацидофилов служат молочнокислые, уксуснокислые бактерии, многие грибы. • Среди алкалифилов, предпочитающих значения рН 8,5 и выше, например среди уробактерий и многих цианобактерий, также выделяют факультативные (способные расти в нейтральной среде) и облигатные виды. Организмы, растущие при экстремальных значениях рН, описаны в подразд. 2.3. Независимо от рН окружающей среды внутриклеточное значение рН поддерживается близким к нейтральному (6 — 8) даже у алкали- и ацидофилов, что достигается прежде всего работой протонной и натриевой (у ал- калифилов) помпы. Жизнедеятельность микроорганизмов часто может приводить к изменению рН среды. Так, к подкислению среды ведут окисление сульфидов до серной кислоты тионовыми бактериями, процессы нитрификации, многие брожения. В некоторых случаях бактерии могут регулировать рН среды за счет изменения метаболизма. Наиболее известным примером является двухфазность брожений, подробно изученная в 30-х годах XX в. В. Н. Шапошниковым на примере ацетоно-бутилового брожения (Clostridium acetobutilicum). При снижении рН до критического уровня в результате выделения 2 I letpyco» 33
масляной кислоты бактерия переключается на образование нейтральных продуктов, ацетона и бутанола. К подщелачиванию среды приводят дезаминирование белков и аминокислот аммонификаторами, разложение мочевины уробактериями, а также фотоассимиляция С02 (так, в часы интенсивного фотосинтеза значение рН воды в фотической зоне водоема может возрастать на 1 — 2 единицы). Стабильное значение рН среды в некоторых местообитаниях связано с ее буферностью. Наибольшие масштабы имеет карбонат/бикарбонатная система, обеспечивающая постоянство рН вод Мирового океана. 2.1.3. Активность воды и соленость Важной характеристикой местообитаний микроорганизмов является доступность воды, которую выражают через величину ее активности (aw), рассчитываемую как отношение давления пара жидкости к давлению пара дистиллированной воды. Значения ат при которых возможен рост микроорганизмов, составляют от 0,99 до менее 0,7. Одной из причин снижения активности воды может быть концентрация солей. Водные местообитания на Земле имеют различную соленость — от почти нулевой (например, дождевая вода) до очень высокой, как в насыщенных растворах в солеварнях. По отношению к солености микроорганизмы подразделяют на ряд групп. • Пресноводные (негалофильные) организмы, в том числе обитатели ультрапресных вод (см. подразд. 2.3), развиваются в среде с содержанием солей < 0,01 % и обычно чувствительны к 3 %-й концентрации NaCl. • Галотолерантные организмы выдерживают более высокие концентрации и часто обитают в местах с меняющейся соленостью, например в почве. • Для морских бактерий оптимум солености составляет около 3,5 %. Как правило, они растут в узком диапазоне концентраций соли: 2,5 — 5,0% NaCl. Типичными морскими бактериями являются Alteromonas, Vibrio, Photobacterium. • Умеренные галофилы растут в диапазоне солености примерно 5-15%. • Экстремальные галофилы (см. подразд. 2.3) развиваются при концентрации NaCl от 12—15 % вплоть до насыщенных растворов соли. • Особую группу составляют галоалкалифилы, растущие при высоких концентрациях соды и сочетающие в себе свойства экстремальных гало- и алкалифилов. Типичными их местообитаниями являются высокоминерализованные содовые озера. Основным механизмом приспособления к осмотическому состоянию среды служит синтез микроорганизмами осмопротекто- 34
ров (осмолитов) — низкомолекулярных органических веществ, концентрация которых в цитоплазме уравновешивает внешнее давление. Их состав зависит от концентрации NaCl в среде и не одинаков у разных микроорганизмов. К осмопротекторам относятся некоторые аминокислоты и их производные, сахара, гетероглико- зиды. Необычные по строению осмолиты обнаружены у экстремальных галофилов. Эукариоты, например осмотрофные мицелиаль- ные грибы и дрожжи, одноклеточная водоросль Dunaliella, накапливают глицерол и другие многоатомные спирты; характерным осмолитом многих морских водорослей является диметил- сульфопропионат, при разложении которого образуется диметил- сульфид (ДМС). При изучении галофильного цианобактериального сообщества, развивающегося в пересыхающих лагунах озера Сиваш в Крыму, было установлено существование особых трофических маршрутов и специализированных бактерий, метаболизм которых связан с разложением осмопротекторных соединений (см. также подразд. 2.3). Адаптация к солености у экстремально галофильных архей (порядок Halobacteriales) основана на аккумуляции ионов К+. Внутриклеточная концентрация ионов может быть выше в 1000 раз, чем в окружающей среде, т.е. ферменты галобактерий работают в солевом растворе. Подобная же стратегия обнаружена у некоторых эубактерий — Salinibacter ruber и представителей порядка Haloanaerobiales. Помимо концентрации солей повышенное осмотическое давление и низкая активность воды создаются высоким содержанием органических веществ. Приспособленные к таким условиям организмы называют осмофилами — это спироплазмы, размножающиеся в нектаре цветов, мицелиальные грибы и дрожжи, обитающие в варенье, сиропах, сухофруктах. Для организмов, развивающихся на суше, большое значение имеет приспособление к сухости и контакту с воздухом. Условия водного стресса и опасность высыхания создаются на поверхности скал, камней, деревьев, различных сооружений, в почве, особенно почве пустынь. Основными механизмами защиты от высыхания служит образование слизистых капсул или переживающих клеток (спор, конидий, цист). Высокую устойчивость на воздухе обнаруживают многие микобактерии с высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Типичными компонентами микроценозов, развивающихся на поверхности камня и в почве, являются микрококки, артробактеры, нокардии, проактиномицеты и ак- тиномицеты. В целом грамположительные бактерии актиномицет- ной линии рассматривают как континентальную ветвь эволюции прокариот, приспособившуюся к жизни в наземных условиях. 35
2Л.4. Редокс-потенциал и кислород Микроорганизмы используют энергию окислительно-восстановительных реакций, поэтому одним из важнейших факторов, влияющих на их развитие, является окислительно-восстановительный потенциал среды Eh. Значение Eh характеризует восстанов- ленность среды и определяет термодинамическую возможность осуществления окислительно-восстановительных реакций. В 20— 30-х годах XX в. профессор МГУ Е. Е. Успенский с учениками одними из первых провели исследования влияния редокс-потенци- ала на метаболизм микроорганизмов. Для многих веществ в координатах Eh—рН вычислены так называемые термодинамические поля устойчивости. Установлено, что развитие физиологических групп микроорганизмов приурочено к определенным полям. Для хемотрофных микроорганизмов общим правилом является развитие в области термодинамической устойчивости продуктов реакции. Жизнедеятельность микроорганизмов приводит к изменению окислительно-восстановительного потенциала среды. Основными восстановителями в природе служат Н2 и H2S, часто образуемые микроорганизмами, главный окислитель — продукт оксигенных фототрофов, молекулярный кислород. Кислород выступает по отношению к микроорганизмам не только как фактор, определяющий окислительно-восстановительные условия среды и возможность протекания многих химических реакций, но и как важнейший катаболический субстрат, акцептор электронов для аэробных организмов. По отношению к кислороду микроорганизмы делятся на аэробные, использующие 02 как акцептор электронов при дыхании, и анаэробные, не нуждающиеся в 02. Аэробов можно обнаружить в хорошо аэрируемых биотопах: в воздухе, сухой почве, на камне, поверхности кожи и т.д. К ним относятся многие тионовые, нитрифицирующие бактерии, разнообразные органотрофы, в том числе большинство актиномице- тов и грибов. Мыкроаэрофилы (например, водные спириллы) нуждаются в низкой концентрации 02 и часто обладают высоким сродством к нему, что позволяет им развиваться в зонах пониженного содержания 02. В отличие от облигатных аэробов, использующих в качестве акцептора электронов при дыхании только 02, факультативные аэробы (факультативные анаэробы) могут переключаться с аэробного метаболизма на анаэробный, например с дыхания на брожение. Классическим примером их служат дрожжи. Факультативными аэробами являются энтеробактерии, подавляющее большинство денитрификаторов. К ним относятся и некоторые фототрофы (например, пурпурные несерные бактерии), осуществляющие фото- 36
синтез в анаэробных условиях на свету, но способные к аэробному дыханию в темноте. Облигатные анаэробы чувствительны к токсическому действию 02 и часто нуждаются для своего развития в восстановительной обстановке. Процессы получения энергии связаны у них с брожениями или восстановлением неорганических акцепторов электронов (С02, S°, S04~, Fe3+ и т.д.), последовательность использования которых в природных местообитаниях определяется окислительно-восстановительным потенциалом среды. Обли- гатными анаэробами являются многие аноксигенные фототро- фы — гелиобактерии, зеленые и ряд пурпурных серобактерий. Аэротолерантные анаэробы могут расти в присутствии некоторого количества 02, не изменяя при этом анаэробный тип метаболизма, например брожение у ряда стрептококков. Концентрация кислорода в природных местообитаниях варьирует в широких пределах, и ее изменения часто обусловлены именно микроорганизмами. Атмосфера (состав которой в эволюционном плане также является результатом деятельности микроорганизмов) содержит 21 % 02. Растворимость 02 в воде мала (около 8 мг/л при 20 °С) и еще более снижается с ростом температуры и солености. При наличии в среде окисляемых субстратов и прежде всего органического вещества кислород быстро потребляется аэробами, «подъедается» микроаэрофилами и поэтому в условиях ограниченного обмена с атмосферой быстро становится лимитирующим фактором. Во многих местообитаниях (илах, цианобактериальных матах) в пределах долей миллиметра создаются резкие градиенты концентрации 02 вплоть до полного исчерпания. Аналогичный перепад концентраций наблюдается и в почве, где в пределах одной почвенной частицы имеются аэробные и полностью анаэробные микрозоны. На свету, в непосредственной близости от цианобактерий, водорослей или высших растений нередко создаются условия со 100 %-м насыщением 02. Например, пятна цветения цианобактерий при освещении часто бывают покрыты пузырьками выделяющегося 02. Однако в темное время суток даже населенные фото- трофами местообитания могут становиться бескислородными, что обусловлено дыханием аэробов и диффундирующими из более глубоких слоев восстановленными соединениями. В таких условиях преимущество имеют факультативные анаэробы, переключающиеся с одного типа обмена на другой. Другим аспектом взаимодействия микроорганизмов с 02 является защита от его токсичных высокореакционных форм: фотохимически образуемого синглетного (атомарного) кислорода и не полностью восстановленных соединений (радикала гидроксила ОН*, пероксида водорода Н202, супероксидного радикала OJ. Де- токсикацию (тушение) синглетного кислорода обеспечивают раз- 37
личные антиоксиданты, из которых наиболее распространены каротиноиды, присущие не только фототрофам, но и многим аэробным хемотрофам (микобактериям, микрококкам, актино- мицетам). Реакции детоксикации не полностью восстановленных соединений кислорода катализируются ферментами супероксид- дисмутазой, пероксидазой, каталазой. Подобные механизмы защиты существуют как у аэробов, так и у многих анаэробов, но развиты в разной степени. В то же время микроаэрофилия у аэробов часто связана именно с недостаточно мощной системой защиты от токсичных форм кислорода. У представителей ряда физиологических групп (например, бесцветных нитчатых серобактерий, железобактерий) деток- сикация Н202 сопряжена с окислением восстановленных соединений серы или железа. Недостаток каталазы, отмеченный у некоторых цианобактерий, компенсируется обильным развитием в их чехлах и слизи аэробных бактерий, устойчивых к 02. 2.1.5. Свет Солнечный свет, используемый в реакциях фотосинтеза, служит основным источником энергии для подавляющего большинства экосистем на Земле. Важнейшими параметрами, определяющими активность фототрофных организмов, являются интенсивность падающего света, его спектральный состав, длительность светового дня. Около 50 % падающей на Землю лучистой энергии приходится на видимую область света (380—760 нм), другие 50 % составляют ИК-лучи и менее 1 % — УФ-лучи. Интенсивность света, проходящего сквозь толщу воды, снижается с глубиной, при этом меняется и его спектральный состав. Наиболее резко (на глубине первых метров) отсекаются инфракрасные и красные лучи, глубже всех проникают лучи с длиной волны 540 — 560 нм. Свет часто оказывается лимитирующим фактором. Поэтому фототрофные микроорганизмы обладают многочисленными механизмами, позволяющими использовать его энергию с максимальной эффективностью. Спектры поглощения света у разных групп оксигенных и аноксигенных фототрофов сдвинуты друг относительно друга, что дает им возможность, располагаясь на разных глубинах, довольствоваться остатками прошедшего света и в конечном итоге достаточно полно усваивать его энергию. Большинство фототрофных микроорганизмов способны к фототаксису и могут занимать местоположение с оптимальной освещенностью. Другим способом адаптации к свету является изменение в зависимости от интенсивности освещения содержания фотосинтетических пигментов, количества тилакоидов, светособи- рающих ловушек, площади фотосинтезирующих мембран. Зеле- 38
ные серобактерии (Ancalochloris, Prostecochloris) способны к увеличению светособирающей поверхности за счет образования выростов (простек), содержащих хлоросомы, что дает им возможность эффективно использовать свет низкой интенсивности. Важнейшим механизмом приспособления к освещению служит и свойственная ряду цианобактерий хроматическая адаптация — изменение соотношения в их клетках фикобилиновых пигментов (фикоэрит- рина, фикоцианина и др.) в ответ на изменение спектрального состава света. Фототрофные микроорганизмы различаются по отношению к освещенности — от светолюбивых (например, образующая пятна цветения цианобактерия Anabaena flos-aquae; фототрофные симбионты лишайников, растущих на поверхности скал; обитающие в мелких, ярко освещенных прудах-испарителях галобактерии) до обитающих при низкой освещенности на глубине водоемов. Низкая освещенность (доли процента от падающего света) характерна и для пещер, заселенных типичным обитателем — цианобактерией Scytonema julianum. Свет относится к группе периодически действующих факторов, поэтому все фототрофы так или иначе приспособлены к суточным и сезонным ритмам, т. е. к переживанию периодов темноты. Большинству из них свойственно накопление на свету разнообразных запасных веществ, которые могут расходоваться в темноте для получения энергии. У многих фототрофов метаболизм гибкий, и они способны не только к переживанию, но и к росту в отсутствие света, причем некоторые (Thiocapsa roseopersicina) даже в хемолитоавтотрофных условиях. Разнообразие метаболизма фототрофных бактерий было подробно исследовано Е. Н. Кондратьевой и ее учениками. Метаболизм многих фототрофов меняется не только при смене света и темноты, но и в условиях промежуточной освещенности (на рассвете и в сумерки). Примером может служить утренний «глоток азота» (по образному выражению Г. А. Заварзина), т.е. зарегистрированный в часы восхода кратковременный период азотфиксации цианобактерией Microcoleus chtchonoplastes, важнейшим компонентом цианобактериальных матов. Такая возможность обеспечивается возникновением за ночь в мате восстановительной среды. Свет может служить для микроорганизмов «источником информации», что проявляется, например, в реакциях фототаксиса, индукции синтеза пигментов, регуляции образования и прорастания спор (у грибов) и т.д. Наконец, рассматривая свет как экологический фактор, важно отметить и антимикробное действие коротковолнового излучения. Одним из универсальных механизмов адаптации к свету высокой интенсивности и защиты от токсичных форм фотосенси- 39
билизированного кислорода является синтез каротиноидных пигментов. Характерным примером может служить яркая окраска микроорганизмов, живущих в условиях высокой освещенности (в воздухе, на поверхности скал, обнажений горных пород, в высокогорье и т.д.). Для грибов, в частности для так называемых черных дрожжей, характерно высокое содержание в клеточной стенке меланинов — пигментов, с которыми связывают универсальную функцию защиты от многих стрессовых факторов (света, солености, температуры). 2.1.6. Концентрация питательных веществ Доступность питательных веществ имеет определяющее значение для существования микроорганизмов и часто лимитирует их рост. Как правило, концентрация субстрата в экосистеме — величина непостоянная. Содержание органических веществ, продуцируемых фототрофами, может колебаться с суточной периодичностью. Поступление в экосистему питательных веществ часто имеет случайный характер (например, при попадании в почву экскрементов, трупа животного или мертвого растения). При этом локальное содержание органического углерода может быть очень высоким, однако микроорганизмы могут быстро использовать лишь небольшую часть его (сахара, аминокислоты и другие легко утилизируемые вещества). Дальнейшее образование легко доступных субстратов происходит в результате разложения сложных полимерных соединений, составляющих основную часть массы животных и растительных организмов. Некоторые полимеры, образующие запасные вещества, могут быть гидролизованы до мономеров и использованы быстро, в течение часов или дней. Однако соединения, образующие структурные компоненты растений (целлюлоза, лигнин), или нерастворимые белки, входящие в состав шерсти, волос, хрящей, рогов, копыт животных (кератин, коллаген), разлагаются гораздо медленнее: в течение десятков, сотен, а иногда и тысяч лет, что хорошо иллюстрируется сохранностью некоторых археологических и палеонтологических находок. Скорость распада полимеров служит, таким образом, лимитирующей стадией в разложении биомассы и является одной из причин постоянно низкой концентрации мономеров. Более того, не все промежуточные продукты разложения морт- массы могут легко использоваться микроорганизмами и подвергаться полной минерализации. Часть их (например, в виде гумуса), надолго выводится из сферы реакции и чрезвычайно медленно утилизируется метаболически специализированной так называемой автохтонной микрофлорой (термин, предложенный С. Н. Виноградским; противоположное понятие — зимогенная мик- 40
рофлора, развивающаяся на легко доступном органическом веществе). В результате этого концентрация легко утилизируемого органического вещества (сахаров, аминокислот) в природных экосистемах в основном очень низкая. Большую часть времени микроорганизмы в природе обычно находятся в состоянии лимитирования по субстрату или «голодного ожидания». Поэтому ключевое значение в конкуренции за использование субстрата имеют сродство к субстрату (константа насыщения), связанные с ним скорость роста и скорость потребления субстрата, пороговая концентрация субстрата и другие кинетические характеристики. По отношению к концентрации субстрата микроорганизмы делят на копиотрофы, организмы-колонизаторы, растущие при его высоких концентрациях, и олиготрофы — преимущественно медленно растущие формы, использующие питательные вещества в очень низкой концентрации. Помимо кинетических характеристик, обусловленных прежде всего эффективностью транспортных систем, важны и другие биологические особенности, позволяющие олиготрофным микроорганизмам существовать в условиях низкой концентрации субстратов. К ним относятся: форма клеток, обеспечивающая высокое отношение поверхности к объему (например, у спирохет); образование выростов у простекобактерий, или мицелиальная организация, позволяющая захватывать значительные пространства, осуществляя «активный поиск пищи». Для поиска пищи важна и подвижность (и связанные с ней реакции таксиса), присущая бактериям в течение всего жизненного цикла или на стадии расселения, например роящимся клеткам у Caulobacter. Для многих оли- готрофов характерно образование запасных веществ даже при росте на бедных средах, что позволяет им выдержать период голодания и обеспечить индукцию синтеза ферментов при появлении нового субстрата. В большинстве случаев в качестве запасного вещества у них накапливается поли-Р-гидроксимасляная кислота, для синтеза которой в отличие от полисахаридов не требуется АТФ. Важнейшая особенность метаболизма олиготрофов — низкие затраты энергии на поддержание. 2.1.7. Местоположение Подавляющее большинство микроорганизмов встречается в природе в прикрепленном (иммобилизованном) состоянии: в виде биопленок, образуя погруженные в слизь микроколонии, или в виде наростов на твердых субстратах. Большое значение прикрепление имеет для обитающих в текучих водах (ручьях, источниках) кренофильных микроорганизмов. Многие из них имеют форму одетой чехлом нити, один конец которой прикрепляется к суб- 41
страту, а другой конец, омываемый текущей водой с растворенными питательными веществами, развевается в потоке. Прикрепленные микроорганизмы находятся в ином физиологическом состоянии по сравнению с взвешенными в воде подвижными бактериями. Это может быть обусловлено генетически контролируемой физиологической дифференциацией, сменой стадии жизненного цикла (например, Caulobacter из подвижной стадии расселения переходит в прикрепленную репродуктивную стадию с характерным образованием стебелька). Кроме того, условия, создающиеся в биопленке или макроскопических полисахаридных структурах (например, вязкость, влажность, градиент 02, содержание питательных веществ, наконец, плотность популяции микроорганизмов и расстояния между клетками вплоть до связанных с ними «социальных» явлений и «кворум-эффекта»), значительно отличаются от условий окружающей биопленку среды. Яркое выражение это получает в «архитектуре» микробных сообществ. Структурная организация метаногенного сообщества была выявлена при анализе работы метантенка. Сообщество развивается в виде своеобразных гранул, сложенных клетками Methanosarcina, в пространствах между которыми располагаются разнообразные микроорганизмы, осуществляющие анаэробное разложение органических веществ. Подобные взаимодействия могут быть проиллюстрированы и другими примерами: аэробные органотрофы ассоциированы с чехлами и капсулами цианобактерий; бактерии сообщества активного ила в полисахаридным матриксе, образуемом Zoogloea ramigera; «чайный гриб» — консорциум дрожжей Saccharomyces cerevisiae и уксуснокислой бактерии Acetobacter xylinum, из целлюлозоподобного экзополисахарида которой и сложено тело «гриба». Другой тип архитектуры микробного сообщества представляет мат, или псевдоткань, «сотканная», например, из нитей Micro- coleus chthonoplastes (эдификатора, т.е. «строителя» цианобакте- риального сообщества). 2.1.8. Дифференциация и переживание неблагоприятных условий Многие микроорганизмы имеют сложные циклы развития и способны к дифференциации, которая может быть естественной стадией в цикле их развития или является ответом на изменение условий. Важнейшее значение для выживания в неблагоприятных условиях имеет образование покоящихся форм: цист, конидий, акинет, экзо- и эндоспор. Наиболее устойчивы к разнообразным неблагоприятным физическим и химическим воздействиям эндоспоры (образуются бактериями Bacillus, Clostridium и др.), способные сохранять жизнеспособность в течение десятков, сотен и более лет. 42
Другим случаем приспособления к неблагоприятным условиям некоторые авторы рассматривают так называемое некультивируе- мое состояние (потеря способности прорастать на питательных средах), свойственное некоторым не образующим спор бактериям. Это регулируемый многостадийный процесс, возникающий в ответ на снижение температуры, голодание и ряд других стрессовых факторов (см. также подразд. 2.5 и 5.1). 2.1.9. Экологические ниши микроорганизмов У каждого микроорганизма имеется определенное местообитание — участок пространства, где он живет, размножается, где его можно обнаружить. Понятие экологическая ниша подразумевает совокупность условий, в которых возможно существование вида. В общей экологии экониша рассматривается как абстрактное многомерное пространство, в котором каждая ось (а число их может быть бесконечно велико) представляет собой некоторый фактор. Если сравнить местообитание с адресом, по которому «прописан» организм, то экологическая ниша, по образному сравнению Ю. Одума, — это его профессия. Это более емкое понятие, включающее не только физическое пространство, но и условия, трофическое положение, функциональную роль организма в сообществе. По мнению Г. А. Заварзина, фундаментальной нише в микробиологии наиболее соответствует физиологическая группа организмов (т. е. группа с определенными функциональными свойствами), например азотфиксаторы, нитрификаторы, сульфатре- дукторы, метаногены и т.д. В различных участках пространства может создаваться сходная совокупность условий, поэтому одни и те же виды могут существовать в различных местообитаниях (иметь «несколько» адресов): например, метаногены могут найти подходящие условия для существования в анаэробной зоне озера или болота, в рубце жвачных животных, в реакторе для получения биогаза и т.д. Экологические ниши могут быть узкими и широкими, что связано с узкой (специалисты) или широкой (генералисты, например, псевдомонады или пурпурные несерные бактерии) специализацией организмов по метаболическим возможностям. Согласно правилу Гаузе, два вида со сходными пищевыми потребностями не могут занимать одну экологическую нишу. Поэтому реализованная экологическая ниша, т. е. занимаемая организмом в действительности, всегда оказывается более узкой, чем потенциальная, т.е. та, которую организм с данными свойствами мог бы занять. Например, в чистой культуре многие пурпурные серные бактерии хорошо растут не только за счет использования H2S, но и как органотрофы (скажем, на среде с малатом), однако 43
в природе в этих условиях их вытесняют более конкурентоспособные пурпурные несерные бактерии. Другой типичный пример — организмы-целлюлозолитики, которые могут предпочитать глюкозу и другие легко метаболизируемые субстраты, однако вследствие низкой конкурентоспособности вынуждены ограничиваться более трудно утилизируемой целлюлозой. Связи между нишами могут быть трофическими (функциональными) и топическими (по характеру местообитания). Наиболее четко «профессии» микроорганизмов можно представить, рассмотрев их взаимодействия в микробном сообществе. 2.2. Микробное сообщество Даже очень подробное изучение питания микроорганизма, его метаболизма, кинетики роста, устойчивости к физико-химическим факторам и других вопросов, составляющих основное содержание аутоэкологии, обычно оказывается недостаточным для понимания многих природных процессов, осуществляемых микроорганизмами. В биосфере микробы практически никогда не действуют «в одиночку». Их жизнедеятельность, взаимодействие (обмен) с окружающей средой, живой и неживой природой являются результатом сложных взаимодействий между разными видами. Функциональной единицей в экологии микроорганизмов является микробное сообщество, его изучение служит предметом син- экологии. Микробное сообщество представляет собой совокупность взаимодействующих между собой микроорганизмов, связанных различными, прежде всего трофическими связями. Это может быть как кооперация в совместном использовании субстрата, так и конкуренция за питательные вещества. В отличие от растительных и животных сообществ в микробном сообществе первостепенными являются кооперативные взаимодействия, когда продукты обмена одних организмов служат субстратами для других, и т.д. Учитывая преимущественно химический характер взаимодействия микроорганизмов со средой, это позволяет рассматривать микробные процессы как сложную, часто разветвленную последовательность химических реакций. При этом каждая реакция в соответствии с требованиями термодинамики должна быть достаточно энергетически выгодной, чтобы обеспечить рост осуществляющего ее организма. Кроме того, среди микроорганизмов с близкими потребностями доминировать будут те, чьи кинетические характеристики более всего соответствуют условиям, складывающимся в сообществе. Пути взаимодействий в сообществе обычно разветвлены и опосредованы прямыми и обратными, положительными и отрицательными, трофическими и топическими связями. В результате 44
микробное сообщество выступает как «кооперативное целое», способное взаимодействовать с окружающей средой как некое единство. Наиболее четко кооперативные взаимодействия можно проследить на примере деструкции микроорганизмами сложного органического субстрата, например растительных остатков. В состав биомассы (мортмассы) наземных растений входят (в пересчете на сухой вес): целлюлоза (50 %), лигнин (10 — 25 %), пектин, гемицеллюлоза (10 — 20 %), белки (5—10 %), липиды (2 — 5 %). Для каждой группы веществ (полисахаридов, белков, жиров) существует свой маршрут деструкции: сахаролитический, пептолитический, липолитический, и на каждом из нрх функционируют определенные группы микроорганизмов. Первую стадию деструкции полимеров осуществляют микро- организмы-гидролитики, синтезирующие ферменты-гидролазы, работающие вне клеток. Образованные в результате гидролиза полимеров унифицированные растворимые мономеры (сахара, аминокислоты, жирные кислоты) могут легко поглощаться микроорганизмами и вовлекаться в основные метаболические пути. Гидролиз целлюлозы (основного структурного компонента клеточной оболочки растений) осуществляют несколько групп микроорганизмов. Из аэробов к ним относятся Cytophaga, Cellulomonas, Cellvibrio, многие грибы (Trichoderma), из анаэробов — Clostridium, Bacteroides и др. Особенностью стратегии гидролитиков является тесный контакт с поверхностью субстрата. Часть мономеров окисляется самими гидролитиками, а часть рассеивается в окружающей среде и может быть использована диссипотрофами (или микрофлорой рассеяния), развитие которых происходит на некотором расстоянии от разлагаемого субстрата. К экологической группировке микрофлоры рассеяния относятся многие аэробные и анаэробные олиготрофы, получающие преимущество при низкой концентрации субстрата. Часто это одиночные подвижные бактерии с высоким отношением поверхности клетки к объему — спириллы, спирохеты, простекобакте- рии (например, Caulobacter, Hyphomicrobium, Prostecomicrobium). Образование выростов (простек) позволяет увеличить не только всасывающую поверхность, но и эффективное сечение клетки, т.е. размер телесного угла, в пределах которого рассеиваемое вещество достигает микроорганизма. Другая особенность диссипотро- фов — высокое сродство к субстрату, которое обеспечивается, в частности, высокой концентрацией транспортных белков в пе- риплазматическом пространстве. Для диссипотрофов, использующих продукты гидролиза растительных полимеров, характерна способность расти преимущественно на моносахаридах. На примере гидролиза фильтровальной бумаги можно проследить, как диссипотрофы развиваются вслед за гидролитиками, и выявить их присутствие в местах сильного разложения бумаги. 45
Гидролитики и диссипотрофы в функциональном отношении тесно взаимосвязаны. Гидролитики поставляют субстрат диссипот- рофам. Роль же диссипотрофов может быть связана с регуляцией синтеза гидролитических ферментов: потребляя мономеры — продукты гидролиза, диссипотрофы уменьшают их концентрацию до некоторого порогового уровня, что, в свою очередь, ведет к дерепрессии синтеза ферментов гидролитиками. Примерами группировок гидролитиков и диссипотрофов могут служить цитофаги и простекобактерии в аэробных условиях, а среди анаэробов — пары Clostridium/Thermoanaerobacter, Halocella/Haloanaerobium и др. Поскольку сообщество микроорганизмов, развивающееся за счет разложения целлюлозы, как правило, лимитировано источником азота, в группировку с целлюлозолитиками входят обычно и бак- терии-азотфиксаторы. В присутствии 02 аэробно дышащие микроорганизмы окисляют сахара до С02 и Н20. В отсутствие 02 деградация Сахаров начинается с брожения. Анаэробные гидролитики и диссипотрофы составляют группировку первичных анаэробов, осуществляющих водородную или кислотогенную фазу. Продуктами их брожения являются Н2, С02, ацетат, другие летучие жирные кислоты (ЛЖК) и спирты, которые не могут далее подвергаться брожению. При накоплении таких продуктов, например при квашении капусты, последующие метаболические процессы в сообществе приостанавливаются (консервация) в связи со снижением рН среды. Дальнейшее разложение этих веществ может осуществляться группировкой так называемых вторичных анаэробов — микроорганизмов, способных к анаэробному дыханию с использованием в качестве акцепторов электронов Fe3+, NO3, SO4", С02 и соответственно образующих физиологические группы железоредук- торов, денитрификаторов, сульфидогенов, метаногенов. Последовательность использования акцепторов электронов определяется величиной их редокс-потенциала. Очевидно, необходимо также и наличие в среде соответствующего акцептора электронов. Последнее место в цепи занимают метаногены. Они характеризуются независимостью от внешних акцепторов электронов. Поскольку С02 — один из продуктов брожения, метаногенное сообщество в отличие от сульфидогенного (и других анаэробных сообществ) является автономным. В анаэробном сообществе важнейшие трофические маршруты — водородный и ацетатный. Организмы, способные окислять Н2 и ацетат (а также возникающие в обратимых реакциях формиат и этанол), имеются во всех группах вторичных анаэробов, поэтому, как правило, эти вещества в системе не накапливаются. Часть Н2 может идти также на образование ацетата, осуществляемое гидрогенотрофными (т.е. использующими Н2) ацетогенами, создавая «мостик» между водородным и ацетатным путями: 46
4Н2 + 2С02 = СНзСООН + 2Н20 Окисление ЛЖК в анаэробных условиях представляет более сложную проблему. К прямому окислению ЛЖК до С02 или ацетата способны многие денитрификаторы и сульфатредукторы. В отличие от них метаногены способны окислять лишь Н2, ацетат и некоторые метилированные соединения, а использовать ЛЖК не могут. Другой термодинамически возможный процесс анаэробного разложения ЛЖК осуществляется синтрофными микроорганизмами и связан с так называемым межвидовым переносом водорода. Реакция разложения ЛЖК на ацетат и Н2 термодинамически невыгодна и способна обеспечить рост микроорганизмов только при очень низкой концентрации продуктов реакции, т. е. в случае быстрого и полного удаления Н2. Функцию удаления Н2 выполняют гидрогенотрофы, чаще всего метаногены или сульфидогены. Син- трофные ассоциации настолько тесны, что многие из них (например, «Methanobacterium omelianskii») раньше были описаны как чистые культуры метаногенов. Сегодня известен ряд культур, в которых возможность анаэробного окисления субстрата (например, бутирата Syntrophomonas wolfei, пропионата Syntrophobacter wolinii) обусловлена присутствием Н2-использующего компонента. Синт- рофы буквально существуют «на пределе термодинамических возможностей»: получая очень мало энергии, они растут медленно, и общая скорость осуществляемого ими процесса зависит от накопленной биомассы. Поэтому появлению синтрофов в сообществе может предшествовать довольно длительный лаг-период. Оказалось, что среди анаэробов синтрофные взаимодействия наблюдаются очень часто. В некоторых случаях межвидовой перенос Н2 возникает и между сульфидогенами и метаногенами, хотя обычно обе группы выполняют функцию гидрогенотрофов. Для роста синтрофов важен нижний предел концентрации Н2, до которого гидрогенотрофные партнеры способны его удалять. Пороговые значения для разных групп, использующих Н2 организмов (внутри групп можно выделить более дробные подразделения), располагаются в таком порядке: гомоацетогены > метаногены > сульфатредукторы > железоредукторы > Н2-окисляющие аэробные бактерии. Хотя по эффективности удаления Н2 метаногены уступают сульфат- или железоредукторам, они важны, поскольку, как уже отмечалось, не зависят от внешнего акцептора электронов. Объектом межвидового переноса помимо Н2 могут быть H2S (такая возможность установлена в давно описанных консорциумах зеленых серобактерий с сульфат- или сероредукторами) и, возможно, формиат и ацетат. Это свидетельствует об универсальности явления синтрофии в мире микроорганизмов. 47
Таким образом, основными продуктами разложения целлюлозы в анаэробных условиях могут быть газообразные соединения С02 и СН4 (в отсутствие внешних акцепторов электронов) или С02 и H2S (в присутствии сульфата). Во всех случаях (в том числе и в аэробных условиях) определенная часть углерода переходит также в биомассу организмов, которая может быть далее разложена согласно общей схеме деструкции органического вещества (этот маршрут, получивший название «бактериолитической петли», часто начинается с функционирования группы гидролитиков — миксобактерий). В зависимости от условий поток углерода через те или иные маршруты может меняться, приводя к изменению конечных продуктов сообщества. Соотношение маршрутов, по которым распределяются потоки углерода, зависит от конкурентных взаимоотношений между группами организмов, использующих одни и те же субстраты (Н2, ацетат), и наличия акцепторов электронов; оно тонко регулируется в зависимости от концентраций этих соединений и факторов окружающей среды. В анаэробных условиях конечные газообразные продукты деятельности сообщества могут накапливаться, либо выносятся в аэробную зону, где могут окисляться бактериями так называемого аэробного газового фильтра (метанокисляющими, тионовыми бактериями и т. д.). Особая ситуация возникает в фотической зоне анаэробной водной толщи или илов. Аноксигенные серные и несерные фототрофные бактерии способны окислять с использованием в качестве доноров электронов при фотосинтезе практически все продукты первичных анаэробов (Н2, ацетат, ЛЖК), а также H2S (но не метан). Это приводит к изменению соотношения потоков углерода в трофических маршрутах и позволяет замкнуть многие пути в пределах анаэробной зоны. До сих пор рассматривались главным образом пути разложения целлюлозы. При наложении трофических цепей деструкции остальных компонентов растительных остатков (белков, жиров, других природных или неприродных соединений) схема существенно усложняется, поскольку каждому веществу соответствуют свои специалисты и свои маршруты, но принцип организации микробного сообщества остается универсальным. Описанная пищевая цепь соответствует деструкционной ветви микробного сообщества. При добавлении продукционной ветви, представленной первичными продуцентами, в первую очередь цианобактериями (и водорослями), трофическая цепь замыкается в цикл, т.е. микробное сообщество может функционировать автономно. Изложенные закономерности функционирования микробного сообщества универсальны и справедливы для большинства самых разнообразных местообитаний — от почвенных и водных экосистем до пищеварительного тракта животных. 48
2.3. Экстремофильные микроорганизмы Оптимальные условия развития большинства микроорганизмов определяются свойствами входящих в состав их клеток макромолекул и в целом соответствуют параметрам наиболее распространенных на Земле экосистем: это умеренные температуры (25 — 35 °С), нейтральный рН среды, соленость природных вод (пресной или морской). Местообитания, значительно отличающиеся по одному или нескольким параметрам от повсеместно распространенных, принято называть экстремальными, а населяющие их микроорганизмы — экстремофильными. К экстремальным условиям относятся крайние значения температуры, рН, солености, повышенное давление, иногда также высокие концентрации токсических веществ, или анаэробиоз. Экстремальные местообитания достаточно широко распространены в природе, хотя могут иметь и антропогенное происхождение, например сточные воды с низкими или высокими значениями рН. Исследование экстремофильных микроорганизмов важно с точки зрения определения физико-химических границ функционирования живых систем, в том числе и при рассмотрении возможности существования жизни на иных, чем Земля, планетах. С практической точки зрения оно важно для понимания особенностей циклов различных элементов в экстремальных экосистемах, в том числе антропогенных, а также при поиске новых биологически активных соединений для биотехнологии. Неспособность большинства микроорганизмов развиваться в экстремальных условиях издавна используется человеком для предотвращения порчи пищевых или иных продуктов за счет повышения солености, понижения или повышения рН, понижения температуры при хранении. Всегда, однако, находятся микроорганизмы, способные расти и в этих условиях и образующие специфические антропогенные биоценозы. Представлены они, как правило, не специализированными, а так называемыми толерантными к данному фактору формами. Как уже отмечалось, влияние того или иного фактора на рост микроорганизмов выражается в трех величинах: минимальное значение, при котором возможен активный рост, т.е. репликация ДНК и деление клеток, соответствующее максимальное значение и оптимальное значение, создающее наиболее благоприятные условия для роста. При этом рост иногда оценивается по конечному урожаю клеток, но чаще всего — по скорости роста. Скорость роста может выражаться во времени генерации (удвоения) в часах или минутах или же его обратной величине — удельной скорости роста (ч-1). Экосистемы природных экстремальных местообитаний, за небольшими исключениями, бывают образованы прокариотными 49
микроорганизмами. Помимо высокоспециализированных истинных экстремофилов в них входят организмы с широким диапазоном роста в зависимости от того или иного фактора. Роль и соотношение этих двух групп в большой степени определяется постоянством условий в экстремальном местообитании. Здесь в основном будут рассмотрены биоразнообразие и экологическая роль именно высокоспециализированных экстремофильных прокариот, разделенных на группы в соответствии с физико-химическими факторами, определяющими экстремальные условия. 2.3.1. Температура Как уже отмечено в подразделе 2.1, прокариотные организмы отличаются широкими диапазонами температур развития, в буквальном смысле от точки замерзания до точки кипения воды. В сочетании с другими факторами (соленость, давление) эти температуры могут быть соответственно ниже и выше 0 и 100 °С. В настоящее время общий температурный диапазон активного развития (деления клеток, сопровождаемого репликацией ДНК) определяется как -5 ...+113 °С (с поверхности антарктических снегов выделены водоросли, способные расти при -36 °С — прим. ред.). Однако температурный диапазон развития одного определенного вида значительно уже, обычно порядка 30 — 40 °С. В зависимости от оптимальной температуры развития выделяются три основные группы микроорганизмов: психрофилы (оптимум < 20 °С), мезофилы (оптимум 20—40 °С), термофилы (оптимум > 50 °С). Психрофильные микроорганизмы очень широко распространены на поверхности Земли. Средняя температура воды Мирового океана, занимающего более половины поверхности Земли, составляет 5°С, в то время как в глубинных слоях постоянная температура воды не превышает 1 — 2 °С. Значительная часть суши занята вечной мерзлотой, верхние слои которой незначительно прогреваются лишь в летние месяцы. Местообитаниями психрофильных организмов являются арктические и антарктические льды, а также ледники высокогорья. Первым истинно психрофильным микроорганизмом, полученным в чистой культуре в 1964 г., был Vibrio marinus. Впоследствии оказалось, что психрофилы не образуют единой, или хотя бы нескольких филогенетических групп. Среди морских психрофильных бактерий преобладают протеобактерии, однако встречаются и грам- положительные организмы, например представители родов Bacillus и Clostridium. Среди фототрофных микроорганизмов встречаются психрофилы, способные развиваться на поверхности снега или льда. Наиболее распространена одноклеточная водоросль Chlamydomonas 50
nivalis, в результате развития которой поверхность снега окрашивается в розовый цвет. Нижний температурный предел развития психрофилов — точка замерзания. В обычных условиях это О °С, но в ряде случаев могут возникать и переохлажденные жидкости с минусовой температурой. В лабораторных условиях это достигается добавлением химических веществ, препятствующих замерзанию, например глицерина. В природе переохлажденные растворы могут образовываться при вымораживании воды в соленых местообитаниях, например под слоем льда в антарктических озерах или в линзах, образующихся на литорали в условиях вечной мерзлоты. Скорость развития микроорганизмов в переохлажденных растворах может быть достаточно высокой. Так, для Bacillus cryophilus при температуре культивирования -5 °С было установлено время удвоения, равное 6 ч. Большинство психрофильных микроорганизмов развивается крайне медленно, что делает их весьма трудными лабораторными объектами, поэтому сведения о физиолого-биохимических особенностях этой группы малочисленны. Вместе с тем в некоторых случаях низкая температура может создавать преимущества для развития определенных физиологических групп. Так, например, повышение растворимости газов при снижении температуры благоприятствует росту микроорганизмов с газовым питанием. Примером может стать быстро растущая метанокисляющая бактерия Methanococcus pshychrophilus, выделенная из тундрового болота. Метаболизм истинно психрофильных микроорганизмов имеет характерные особенности. Так, их ферменты имеют низкие температурные оптимумы активности и обладают термолабильностью — разрушаются при более высоких температурах. В целом белки психрофилов по сравнению с мезофильными содержат больше полярных групп, чем гидрофобных. Одним из механизмов приспособления психрофилов к низким температурам является повышенное содержание ненасыщенных жирных кислот в цито- плазматических мембранах, в результате чего мембраны способны функционировать и при низких температурах. Их транспортные системы также работают лучше при низких температурах. Помимо истинных психрофильных микроорганизмов выделяется группа психротрофных (психроактивных, психротолерантных) микроорганизмов, которые имеют такие же низкие нижние температурные пределы роста, что и истинные психрофилы, но оптимально все же развиваются при температуре выше 20 °С. Психро- трофные организмы характерны для местообитаний с меняющимися температурными условиями — почв, болот и осадков мелководных водоемов, расположенных в холодной климатической зоне. Они же вызывают порчу пищевых продуктов, сохраняемых в холодильных камерах. 51
Термофильные микроорганизмы, или термофилы, имеют оптимум развития выше 50 °С. Более дробное деление выделяет группы умеренных термофилов с температурным оптимумом развития в области 50 — 60 °С, экстремальных термофилов (70 °С), гипертермофилов (80 °С и выше). Соответственно оптимумам распределяются и общие температурные интервалы развития этих групп: условно это 40 — 70, 50 — 80 и 70—115°С ддя умеренных, экстремальных и гипертермофилов соответственно. В настоящее время наиболее высокие температурные характеристики роста известны для гипертермофильной археи Pyrolobus fumarii (оптимум развития — 105 °С и максимум — ИЗ °С). Естественными природными местообитаниями термофильных микроорганизмов являются наземные и морские горячие источники, термальные площадки и почвы вулканического происхождения. Температура в природных термальных местообитаниях может достигать точки кипения; в глубоководных морских гидротермах благодаря гидростатическому давлению температура перегретого водяного пара превышает 350 °С. К природным местообитаниям термофильных микроорганизмов относится и глубинная гидросфера Земли, температура которой на глубине 2,5 — 3 тыс. м достигает 85 — 95 °С. Температура в антропогенных термальных биотопах (к ним относятся термофильные метантенки, компос- ты, саморазогревающиеся угольные отвалы, системы водоснабжения) обычно ниже, чем в природных, и в большинстве случаев соответствует температурным границам роста умеренных термофилов. Для вулканических местообитаний характерно поступление с гидротермальной жидкостью большого количества неорганических соединений, которые могут быть использованы хемолито- трофными микроорганизмами в качестве источников энергии для роста, — это водород, сероводород (в том числе продукты его окисления, например элементная сера или тиосульфат), оксид углерода, восстановленное железо. Энергия этих субстратов может быть использована в процессе аэробного или, в случае водорода и СО, анаэробного дыхания. Низкая растворимость кислорода при высоких температурах и преобладание восстановительных условий обусловливает весьма невысокое число экологических ниш, пригодных для развития аэробных микроорганизмов. В наземных источниках это так называемая «дневная поверхность гидротерм», т.е. область контакта гидротермального раствора с воздухом, а в морских гидротермах — граница смешения потока с холодной морской или океанской водой, обогащенной растворенным кислородом. Наилучшие условия для роста аэробных термофильных прокариот создаются в мелких горячих ручьях, где в протоке воды, содержащей сероводород или органическое вещество, при свободном доступе к ат- 52
мосферному кислороду можно наблюдать развитие микробных обрастаний, напоминающих космы или страусовые перья (например, сероводородокисляющей экстремально термофильной бактерии Thermothrix thiopara). Соединения серы служат субстратом аэробным археям пор. Sulfolobales, продуктом метаболизма которых является серная кислота. Эта группа включает термоацидофильные микроорганизмы, развивающиеся в горячих источниках с низкими значениями рН воды. Основной субстрат анаэробных литотрофных прокариот — молекулярный водород, который потребляется термофильными ме- таногенами, сульфат-, серо-, нитрат- и железоредукторами. Среди термофильных метаногенов есть умеренные, экстремальные и гипертермофилы. К наиболее высокотемпературным метаногенам относится использующий водород Methanopyms kandleri, выделенный из глубоководных гидротерм и имеющий оптимум роста при температуре 105 °С. Микроорганизмы, способные к ацетокласти- ческому метаногенезу, в природных термальных местообитаниях распространены значительно меньше. Термофильные сульфатре- дукторы представляют собой гетерогенную группу, в которую входят умеренно-термофильные споровые бактерии рода De- sulfotomaculum, экстремально-термофильные неспоровые бактерии рода Thermodesulfobacterium и Thermoanaerovibrio, а также гипертермофильные археи рода Archaeoglobus. Особое значение для микробных сообществ гидротерм имеет процесс восстановления элементной серы в сероводород, свойственный многим гипертермофильным археям (роды Thermoproteus, Pyrodictium и др.) и специализированным умеренно-термофильным бактериям (например, род Desulfurella). Все эти организмы — облигатные или факультативные литоавтотрофы. Способность восстанавливать окис- ное железо в закисное с использованием молекулярного водорода, напротив, оказалась свойственной широкому кругу анаэробных термофильных прокариот, как архей, так и бактерий, ранее считавшихся строго органотрофными. Таким образом, литоавтотрофные термофильные прокариоты могут образовывать экосистемы, первичный источник энергии в которых — восстановленные неорганические субстраты вулканического происхождения. Такие системы автономны от солнечного света как источника энергии. Наиболее ярким примером служат сообщества глубоководных гидротерм, где колонии беспозвоночных животных развиваются за счет энергии и органического углерода, поставляемого хемолитотрофными бактериями, в том числе и термофильными. На дневной поверхности наземных горячих источников идет также активный процесс фотосинтеза, осуществляемый сообществами цианобактерий, так называемыми цианобактериальными матами. Это плотные образования со слоистой структурой площа- 53
дью до нескольких квадратных метров и толщиной несколько сантиметров. Они развиваются в горячих источниках в интервалах температур 40 — 70 °С. Основу цианобактериальных матов составляют нитчатые термофильные цианобактерии, а также зеленая несерная фотосинтезирующая бактерия Chloroflexus aurantiacus. Помимо фотосинтезирующего компонента в цианобактериальные маты входит большое количество органотрофных термофильных прокариот, которые осуществляют деструкцию органического вещества цианобактерии в нижних слоях матов. Минерализация клеток цианобактерии привела к сохранению слоистой структуры матов в виде ископаемых структур — строматолитов. Метаболизм термофильных микроорганизмов соответствует их существованию при высоких температурах. В частности, ферменты отличаются не только высокой термостабильностью, но имеют оптимум активности при существенно более высокой температуре, чем их мезофильные аналоги. Несмотря на то что в целом первичная структура этих ферментов различается лишь немного, точечные аминокислотные замены значительно увеличивают термостабильность вторичной структуры. Термостабильность ДНК обеспечивается суперспирализацией, которая достигается действием специфического фермента — обратной гиразы. Высокой термостабильностью отличаются также рибосомальный аппарат и цитоплазматические мембраны, в которых преобладают насыщенные жирные кислоты. В состав мембран гипертермофильных архей вместо жирных кислот входят специфические липиды — углево- дородсодержащие бифитаниловые эфиры. 2.3.2. Соленость Экстремофилия микроорганизмов в отношении солености, или ионной силы раствора, может выражаться в приуроченности организмов к оптимальному росту в ультрапресных водах, и наоборот, к развитию при высоких и крайне высоких содержаниях солей. Первая из этих групп изучена весьма слабо и пока не имеет специального названия. В нее входят организмы, обитающие в среде с общим содержанием солей ниже 0,01 %. Естественным местообитанием такой микрофлоры являются, например, сфагновые болота. Вторая группа — микроорганизмы, нуждающиеся в повышенной солености, или галофилы, исследованы значительно полнее. Галофильные микроорганизмы (буквально: любящие соль) подразделяются на умеренных и экстремальных галофилов. Некоторые авторы делят умеренных галофилов также на две группы: морские организмы, имеющие оптимум солености 2—4% NaCl, и собственно умеренные галофилы, оптимум солености для роста которых лежит в области 10 %. Верхним пределом развития послед- 54
них является уровень солености, соответствующий 15 % NaCl. К экстремальным галофилам относятся организмы, развивающиеся вплоть до насыщения раствора NaCl (30 %) и имеющие оптимум развития при 10 —20 % NaCl. Морские местообитания распространены настолько широко, а круг микроорганизмов, нуждающихся в солености уровня морской воды, настолько велик, что их рассмотрение выходит за рамки этого подраздела. Поэтому здесь ограничимся характеристикой собственно галофильных микроорганизмов, оптимум развития которых выше солености морской воды. Одним из местообитаний экстремально-галофильных микроорганизмов являются морские лагуны, где за счет испарения значительно повышается уровень солености морской воды. Там происходит активное развитие зеленых водорослей рода Dunaliella, цианобактерий рода Microcoleus, фототрофных бактерий. Образуются обширные цианобактериальные маты, разложение которых в значительной степени происходит в анаэробных условиях. В процессе анаэробной деструкции органического вещества принимают участие бактерии порядка Haloanaerobiales. Основным терминальным восстановительным процессом, идущим в морских галофильных системах, является сульфатредукция. В галофильных микробных сообществах обнаружены экстремально-галофильные сульфатредукторы Desulfovibrio halophilus и D. retbaense. Образование метана идет по так называемому одноуглеродному пути с использованием метанола и метиламинов и участием метаногенных архей родов Methanohalophilus, Methanohalobium, Methanolobus. Methanohalobium, наиболее галофильный из перечисленных родов, развивается в интервале солености 15 — 30% NaCl с оптимумом при 25 %. Экстремально-галофильные бактерии рода Acetohalobium используют те же субстраты, но с образованием ацетата как конечного продукта. Источником метанола и метиламина являются вещества-осмопротекторы, в значительных количествах содержащиеся в клетках галофильных прокариот. В аэробных условиях в засоленных водоемах, солеварнях, солончаковых почвах развиваются галофильные аэробные органо- трофные археи (раннее название этой группы — галобактерии). Они представлены родами Halobacterium, Halococcus, Haloarcula, отличающихся наличием Красного пигмента. В континентальных засоленных водоемах присутствие высоких концентраций NaCl часто сопровождается высоким содержанием карбонат-иона и соответственно высокими значениями рН среды. Микроорганизмы, развивающиеся в подобных биотопах, называются галоалкалифилами (особенности этой группы будут рассмотрены далее). Для удержания воды в цитоплазме в условиях высокой солености у галофильных микроорганизмов существуют разнообразные 55
механизмы. Одни из них накапливают в цитоплазме осмопротек- торы — низкомолекулярные органические вещества (аминокислоты, олигосахара, в частности, трегалозу, полиспирты, глицин- бетаин). Другие (в частности, галофильные археи и бактерии порядка Haloanaerobiales) накачивают в клетку ионы К+, что выражается в зависимости внутриклеточной ферментативной активности от концентрации этого элемента. 2.3.3. Водородный показатель среды Каждому микроорганизму свойствен определенный интервал кислотности или щелочности среды, в котором возможен его активный рост. В зависимости от положения оптимального рН развития различают ацидофильные, нейтрофильные и алкалифильные микроорганизмы. Большинство естественных местообитаний имеет нейтральный или близкий к нему (слабокислый или слабощелочной) рН. Так, если рН пресной воды равен 7,0, то реакция морской воды скорее слабощелочная (рН 7,5 — 8,0). В почве рН может быть достаточно низким, до 4,0. В таких местообитаниях развиваются организмы, называемые алкали- или ацидотолеран- тными и умеренными алкали- или ацидофилами. К последним относится большинство грибов, имеющих оптимум роста при рН 5,0 и ниже. Тем не менее встречаются как природные, так и антропогенные местообитания, которые можно отнести к экстремальным: экстремально кислые с рН < 4,0 и экстремально щелочные с рН > 10,0. Развивающиеся там микробные сообщества представлены соответствующими экстремофильными микроорганизмами. Ацидофильные микроорганизмы имеют рН оптимума роста 4,0 или ниже. К экстремальным ацидофилам относят микроорганизмы, рН оптимум роста которых равен или ниже 3,0. Местообитания с низкими значениями рН имеют самую разнообразную природу и характеристики. Наиболее распространены местообитания со значениями рН — от 1,5 и выше: горные отвалы и шахтные воды, где за счет выщелачивания сульфидных минералов и образования серной кислоты происходит резкое закисление среды. Тот же процесс наблюдается и в термальных местообитаниях, как в высокотемпературных, так и в окружающих холодных зонах, где окислению кислородом воздуха подвергаются сульфиды вулканического происхождения. Таким образом, наиболее обширную и хорошо изученную группу ацидофилов представляют литоавтотрофные аэробные прокариоты, окисляющие различные соединения серы и двухвалентное железо. Бактерии этой группы относятся к мезофильным родам Thiobacillus и Sulfobacillus. Несмотря на схожие названия, филоге- 56
нетически эти группы организмов очень далеки, представляя гра- мотрицательную и грамположительную ветви царства бактерий соответственно. Хемолитотрофные ацидофильные археи представлены термофильными или гипертермофильными родами Sulfolobus, Thermoplasma, Metallosphaera, Acidianus, Stigioglobus. Недавно, однако, выделен новый род ацидофильных архей Ferroplasma, представленный мезофильными железоокисляющими организмами. В биоценозах с низким рН могут встречаться и фототрофные микроорганизмы — одноклеточные водоросли родов Chlorella, Chlamydomonas и некоторые другие. Среди органотрофных ацидофильных прокариот также встречаются бактерии (большинство из них мезофилы) и археи (умеренные и гипертермофилы). Так, бактерии рода Acidiphiluim аэробно растут на среде с глюкозой в интервале рН 2,5 — 5,9, а гипертермофильные археи рода Picrophilus имеют наиболее низкий из известных в настоящее время оптимум рН для роста — 0,7. Большинство известных ацидофильных микроорганизмов относится к аэробам; иногда это факультативные анаэробы, способные к дыханию с иными, чем кислород, акцепторами электрона. Так, гипертермофильные археи рода Acidianus способны или окислять элементную серу кислородом воздуха, или восстанавливать ее молекулярным водородом. Организмы близкого рода Stigioglobus осуществляют только вторую реакцию — это облигат- ные анаэробы. К анаэробным термоацидофильным археям относится также недавно описанный род Acidilobus, сбраживающий различные органические субстраты. Помимо горных отвалов и термальных биотопов к биотопам с низкими значениями рН среды относятся болота и торфяники, где рН — 2,5 — 6,0. Показано, что там развивается целостное сообщество, состоящее из грибов, в большинстве своем умеренных ацидофилов, и органотрофных аэробных и анаэробных бактерий. К ацидофильным биотопам антропогенного происхождения, помимо горных отвалов, можно отнести различные промышленные стоки и их хранилища с крайне низким рН. Присутствие токсичных веществ в таких биотопах часто препятствует развитию биологических процессов. В процессе силосования, как и при консервировании пищевых продуктов, низкий рН, напротив, используют для прекращения или предотвращения нежелательных микробных процессов. Тем не менее и в этих местообитаниях с рН 3,5—4,0 были обнаружены умеренно ацидофильные бактерии родов Lactobacillus и Clostridium. Ряд бактерий, развивающихся при низких рН, выделен из желудка животных и человека, где диапазон рН составляет 1,5 — 4,0. Это факультативно-анаэробные органотрофные микроорганизмы родов Lactobacillus, Streptococcus, Sarcina. Однако эту микрофлору скорее можно отнести к ацидотолерантной, так как рН-интервал 57
развития, например Sarcina ventriculi, лежит в области 2,0 — 9,0, а оптимум рН для роста — в нейтральной области. Внутриклеточный рН экстремальных ацидофилов обычно не ниже 4,5. Транспорт ионов и синтез АТФ управляются протонной помпой. Внеклеточные белки экстремальных ацидофилов отличаются высокой стабильностью по отношению к кислотам, в то время как внутриклеточные имеют нейтральный или слабокислый оптимум активности. Вместе с тем нейтральный рН часто бывает токсичным для клеток экстремальных ацидофилов. Возможно, это связано с нарушением целостности цитоплазматической мембраны, для стабильности которой требуются высокие концентрации ионов водорода. К группе алкалифильных микроорганизмов относят микроорганизмы, у которых рН оптимума развития превышает 8,0. Как и в других группах экстремофильных микроорганизмов, различают алкалитолерантные формы, растущие при щелочных рН, но имеющие оптимум в нейтральной области, и истинных алкалифи- лов, не растущих при нейтральных значениях рН. Часто верхний рН-предел развития микроорганизма оказывается значительно выше значения рН в его природном местообитании. Так, щелочные почвы имеют рН не выше 8,5, однако выделяемые оттуда представители ряда Bacillus растут в интервале рН 8,0— 11,5. Природными местообитаниями с наиболее высокими и стабильными значениями рН являются содовые озера и пустыни, где щелочность обусловлена высокой концентрацией бикарбоната натрия. Его доступность обеспечивает необычайно высокую продуктивность алкалифильных фототрофов — цианобактерий родов Spirulina, Cyanospira, Chroococcus, диатомовых водорослей, а также серных пурпурных бактерий рода Ectothiorhodospira. В цикле серы участвуют литотрофные алкалифильные сульфатредукторы — Desulfonatronovibrio и Desulfonatronum. Деструкцию органического вещества осуществляют алкалифильные бродилыцики рода Spirochaeta. В содовых озерах, как и в галофильных местообитаниях, процесс образования метана идет по одноуглеродному пути (субстраты метанол и метиламин). Интервал развития наиболее алкалифильного метаногена Methanohalophilus zhilinae лежит в области 8,2—10,3, а оптимум — 9,2. Как и в большинстве других экстремофильных местообитаний, в алкалифильные сообщества входят специализированные группы архей, представленные аэробными органотрофными родами Natronococcus и Natronobacterium. Сочетание высокой температуры и высокого рН особенно влияет на стабильность белков. Видимо, поэтому сочетание экстремальной термофилии и экстремальной алкалифилии практически не встречается. Единственный представитель алкалифилов среди гипертермофильных архей выделен из глубоководных гидротерм Thermococcus alkaliphilus. Он растет в диапазоне рН 6,5—10,5 и имеет 58
оптимум роста при рН 9,0. Анаэробные алкалифильные умеренно термофильные бактерии рода Anaerobranca были выделены из наземных гидротерм с щелочным рН, a Clostridium paradoxum — из аэробного водоочистного сооружения с нейтральным рН. Внутриклеточный рН экстремальных алкалифилов также достаточно высок, однако не превышает 9,5. Белки экстремальных алкалифилов обладают большой алкалистабильностью, а также имеют оптимум активности при щелочных значениях рН. Благодаря этому протеазы, липазы и целлюлазы из алкалифильных микроорганизмов широко используют при производстве детергентов. Транспортные процессы в клетках алкалофилов и движение клеток основаны на градиенте Na+, однако синтез АТФ происходит за счет функционирования протонной помпы. 2.3.4. Давление Микроорганизмы, рост которых облигатно зависит от повышенного давления или стимулируется им, называются пьезофила- ми (старое название — барофилы). Их естественным местообитанием являются глубины Мирового океана, где помимо других факторов на микроорганизмы воздействует высокое гидростатическое давление. Многие морские организмы, выделенные из глубинных водных толщ или осадков Мирового океана, не являются пьезофила- ми и прекрасно развиваются как при повышенном давлении, так и в его отсутствие. Недавно, однако, из Марианской впадины было получено два штамма, относящихся к ранее известным бактериальным родам Shewanella и Maritella. Новые изоляты, выделение которых исходно проводили при повышенном давлении, оптимально развиваются при давлении 70 и 80 МПа соответственно и не растут при давлении ниже 50 МПа. Таким образом, показано существование облигатно-пьезофильных прокариот. Было исследовано влияние давления на рост гипертермофильных микроорганизмов, выделенных из глубоководных гидротерм, и в ряде случаев отмечалось его стимулирующее действие на рост, а также на стабильность ферментов. Если выделение изначально вели при повышенном давлении, удавалось выделить организмы, оптимально растущие при повышенном давлении (40 МПа) — архею Thermococcus barophilus и бактерию Marinitoga piezophila. Оба организма принадлежат к термофильным родам, в которые входят организмы, не нуждающиеся в повышенном давлении, и таким образом, о группе термопьезофильных прокариот говорить пока рано. Однако если верхний температурный предел для Т. barophilus при атмосферном давлении лежит в области 95 °С, то при 59
40 МПа он достигает 100 °С, т.е. в температурном интервале 95 — 100 °С новый организм является облигатным пьезофилом. Таким образом, для каждого физико-химического фактора, вызывающего необратимые изменения биомолекул большинства живых микроорганизмов, существует группа высокоспециализированных прокариот, оптимально развивающихся именно при экстремальных значениях данного фактора. При этом в каждом экстремальном местообитании существует комплексная прокариот- ная экосистема, позволяющая успешно функционировать циклам основных элементов. 2.4. Экология водных микроорганизмов Задачей водной микробиологии является изучение микроорганизмов, а также микробиологических процессов в пресных и соленых водоемах. Водные микроорганизмы играют ключевую роль в жизни водоемов, осуществляя замкнутые циклы основных биогенных элементов (С, N, S, P, Fe и др.), и могут быть подразделены на три основные категории: планктон, основные организмы водной толщи; гаптобентос, микроорганизмы прикрепляющиеся к плавающим частичкам и водным растениям, и перифитон, включающий бентосные микроорганизмы, обитающие непосредственно в донных осадках. В состав сообществ входят продуценты (микроводоросли, цианобактерии, фото- и хемоавтотрофные бактерии), деструкторы (большинство бактерий и грибы), а также консумен- ты — протозоа, присутствующие в водных экосистемах в разных пропорциях. Условия существования микроорганизмов в сравнительно небольших озерах существенно отличаются от таковых в масштабных по площади и глубоководных морях и океанах. Поэтому микробиология озер, морей и океанов обычно рассматривается раздельно. Объектами исследования водных микробиологов являются также реки, подземные воды и термальные источники. Все эти водные экосистемы весьма специфичны и имеют различные микробные сообщества. Объем и задачи настоящего учебного пособия позволят дать лишь общие представления о проблемах и задачах водной микробиологии. Основное внимание при изложении материала будет уделено озерной микробиологии, как наиболее разработанной части водной микробиологии. 2.4.1. Характеристика водоемов как среды обитания микроорганизмов Озера и другие водоемы относятся к разным трофическим уровням на основании величин первичной продукции. Различают моря и озера с низкой продукцией — «олиготрофные», с высокой — 60
«евтрофные» и с промежуточными показателями продуктивности — «мезотрофные». В особый тип выделяют «дистрофные» озера болотного происхождения. Органическое вещество, синтезированное в водоеме (автохтонное) и поступающее извне (аллохтонное), претерпевает биодеструкцию в аэробной и анаэробной зонах водоема. Для ясного представления об условиях жизнедеятельности микроорганизмов, населяющих водоем, весьма важна физико-химическая характеристика как воды, так и донных отложений. Физико-химические свойства водной массы. По своим физическим свойствам и химизму воды пресные и соленые водоемы чрезвычайно разнообразны. Основными свойствами, характеризующими водоем как внешнюю среду для развития организмов, следует считать прозрачность воды, ее температурный режим, солевой состав, в частности наличие биогенных элементов, активную кислотность среды, окислительно-востановительный потенциал и, наконец, газовый режим водоема. Физико-химические свойства озер зависят от их происхождения. Океаны и моря образовались в результате тектонической деятельности и меняли свои параметры на протяжении геологической истории Земли. Постепенно происходило их засоление хлоридом натрия до 20—40 г/л. Некоторые пресные глубоководные озера также имеют тектоническое происхождение — Байкал, озера Те- лецкое, Танганьика и ряд озер Центральной Африки. Озера, связанные с вулканической деятельностью, расположены в кратерах или кальдерах вулканов. Весьма распространены обычно мелководные озера ледникового происхождения. Озера образовывались также в результате термокарста — проседания покрывающих ледник пород. Особые экологические условия создаются в провальных озерах. Если осадочные породы состоят из известняков, гипсов или каменной соли, то при движении грунтовых вод они могут растворяться. При обрушении потолка образуемых пустот образуется воронка, которая заполняется глубинными минерализованными водами, в результате чего возникает озеро провального типа и нередко его воды расслаиваются на опресненные поверхностные и соленые глубинные, разделенные зоной солевого скачка — га- локлина. В некоторых озерах, образовавшихся за счет растворения хлористого натрия, таких, как озеро Эльтон, Баскунчак, Развал, расположенное в районе Илецкой защиты, даже в летние месяцы температура воды имеет отрицательное значение. Суффозионные озера образуются в мелких блюдцеобразных впадинах, остающихся после выщелачивания солей из почвогрунтов, отложившихся на месте бывших морских бассейнов. Постройка плотины на реках ведет к созданию искусственных озер или водохранилищ. От характера водного баланса озера, его связи с морем или расположения в районе засоленных почв зависит степень минера- 61
лизации воды. Если приток поверхностных или морских вод значительно превосходит сток или компенсируется испарением, то может происходить постепенное засоление озера. Особо следует выделить гиперсоленые и содовые озера, в которых существуют экстремальные сообщества микроорганизмов. Температура. Годовой цикл изменений температуры в водоемах средней полосы состоит из весенней циркуляции, летней стратификации, осенней циркуляции и зимней стагнации. Полное перемешивание водоемов связано с выравниванием температуры воды по всей глубине с последующим ветровым воздействием. В летний период наступает период температурной стратификации, или летней стагнации. На основании вертикального распределения температуры воды в это время в озерах можно выделить: 1) поверхностный слой воды — эпилимнион, имеющий почти одинаковую температуру по глубине; 2) непосредственно под ним лежащий слой — слой температурного скачка, металимнион, в котором наблюдается очень резкое падение температуры с глубиной; 3) нижележащие слои — гиполимнион, в них температура низкая и соответствует температуре всей толщи воды к концу весенней циркуляции, а понижение температуры с глубиной очень незначительно. По сравнению с периодом летней стагнации температурные условия зимой получаются как раз обратными: более теплая вода находится у дна, а более холодная — у поверхности. Тонкий подледный слой воды имеет температуру около 0°С, затем она быстро повышается до 3°С, а еще глубже постепенно повышается до 4 °С. Океаны и большинство морей принадлежит к голомиктическому типу, в них до дна присутствует кислород, однако температура глубинных вод постоянно низкая, ниже 8 °С. Таким образом, в океанах существует обширная стабильная зона, благоприятная для развития психрофильных микроорганизмов. Основной фактор, необходимый для фотосинтеза, — свет. Глубина проникновения солнечного света в водную массу в основном зависит от степени прозрачности воды. Прозрачность велика в альпийских горных озерах и мала в мутных равнинных водоемах. В наиболее прозрачных водоемах свет может проникать приблизительно до 100 м. Предельной границей эуфотической зоны, в которой возможен активный оксигенный фотосинтез, принято считать 30 м. Лучи солнечного спектра поглощаются водой с разной интенсивностью. Оптимальная интенсивность света для развития и фотосинтеза фитопланктона соответствует длинам волны 450 и 680 нм в пределах освещенности 3000— 10 000 лк. Максимальное поглощение характерно для ультрафиолетовых и красных лучей, глубже всего проникают в воду зеленые и голубые лучи длиной волны 500 — 560 нм, поэтому на больших глубинах получают преимущества цианобактерии и зеленые бактерии, обогащенные ка- ротиноидами или фикоэритрином. Если свет достигает поверхно- 62
сти донных осадков, на них происходит развитие макрофитов и (или) фототрофных микробных сообществ с преобладанием циа- нобактерий — цианобактериальных матов. Солевой состав вод Мирового океана, хлоридно-натриевый с общей минерализацией 3,5 — 4%, сформировался около 2 млрд лет тому назад. Современные морские формы микроорганизмов приспособлены к повышенной солености среды и являются гало- филами или галотолерантами. Формирование солевого состава малых водоемов зависит от ряда причин. В числе ведущих факторов может быть географическая зона расположения водоема. Геологические особенности провинции и климатические условия обусловливают тип питания озерных вод и внутриконтиненталь- ных морей. Для бессточных озер особое значение имеет соотношение между поступлением воды в озеро с водосборного бассейна и величиной испарения. Воды, имеющие соленость меньше 50 мг/л, в основном стекают с кристаллических массивов. Мелководные гиперсоленые озера имеют часто морское происхождение. Не менее распространены эпиконтинентальные степные и пустынные соленые и щелочные озера, расположенные в климатических зонах с высоким испарением воды. Установлено, что в гиперсоленых и содовых озерах существуют микроорганизмы, приспособленные к жизни при крайне высоких концентрациях солей в водной среде. В меромиктических озерах верхние слои сильно распреснены, тогда как нижние могут иметь минерализацию, близкую к морской воде. Глубинные слои такого типа озер все время остаются изолированными от соприкосновения с воздухом, и в них постоянно сохраняются анаэробные условия. В водоемах этого типа соседствуют и функционируют как пресноводные, так и соленовод- ные микроорганизмы, разнокачественные по своим физиологическим свойствам. Для активного развития жизни в водоеме имеет значение не столько степень общей минерализации воды, сколько содержание в ней биогенных элементов: азота, фосфора, калия, серы и железа. Озерная вода кроме солей содержит в большем или меньшем количестве растворенные газы — азот, кислород, углекислоту, метан и водород. Кислород и азот поступают из атмосферы, растворяясь в поверхностных слоях воды. Метан и водород поступают в воду в основном в результате анаэробного распада иловых отложений; таким же способом частично попадает в водоем и углекислота. При очень сильном цветении воды наблюдается дневное пересыщение водоема кислородом, достигающее в редких случаях 20 мг 02 на 1 л. В гиполимнионе растворенный кислород используется на окислительные процессы, и его содержание может резко падать в зависимости от трофики водоема. Свободная углекислота образуется как в водной массе озера, так и в иловых отложениях в результате минерализации органического вещества. Метан и водород в более или 63
менее заметных количествах накапливаются в евтрофных водоемах. Они могут служить энергетическим источником для развития во- дородокисляющих и метанокисляющих бактерий, В некоторых особых случаях в озерной воде меромиктических водоемов может накапливаться сульфид. Образование сероводорода и его дальнейшее окисление связаны с жизнедеятельностью микроорганизмов серного цикла. В различных зонах Мирового океана сульфатредукция и метаногенез идут в донных осадках с неодинаковой скоростью, однако сульфатредукция всегда доминирует. Тем не менее доля парникового газа метана, поступающего в атмосферу из Мирового океана, весьма ощутима (см. подразд. 2.6). Активная кислотность среды как экологический фактор оказывает сильное влияние на характер и распределение гидробион- тов. В морской воде рН близок к нейтральному значению. В период максимального фотосинтеза в обычных пресных озерах наблюдаются колебания рН от 6,3 (ночью) до 10,1 (днем). Водородный показатель может варьироваться в водоемах в очень широких пределах: от рН 2 — в вулканических озерах до рН 12 — в степных и пустынных содовых озерах. При крайних значениях рН формируются ацидофильные или алкалофильные сообщества микроорганизмов. Показателем напряжения окислительно-восстановительных условий является величина окислительно-восстановительного потенциала (Eh). Окислительно-восстановительный потенциал в озерной воде прямо связан с присутствием кислорода, солей железа или же сульфида. Донные отложения. Одну из неотъемлемых частей водоемов озерного типа составляют их иловые, или донные, отложения. От их минерального состава, содержания органического вещества и других физико-химических параметров зависит активность микроорганизмов в донных осадках. Донные отложения могут иметь различную мощность и компонентный состав. Они подразделяются на сильноминерализованные, содержащие глины, кальцит, же- лезомарганцевые руды или створки диатомей, и слабоминерализованные, обычно называемые илом, состоящие из тонких разложившихся структур или из различных остатков высших растений, мхов и частично зоопланктона и водорослей. В силу биологических и физико-химических причин поверхностные слои озерных или морских донных отложений неоднородны. Тончайшие слои донных отложений называют микрозонами. По происхождению различают три типа микрозон: 1) микрозоны превращения, 2) микрозоны осаждения и 3) микрозоны нарастания. Микрозоны превращения возникают в толще ила на небольшом расстоянии от его поверхности, там, где прекращается механическое влияние волнения воды. Процесс начинается при установлении подвижного химического равновесия двух встречных диффузионных потоков противоположного характера: из водной массы в 64
глубь ила диффундируют продукты, окисленные кислородом при участии закисных соединений; противоположный ток создается диффузией восстановленных продуктов реакции из более глубоких слоев. Микрозоны осаждения возникают вследствие того, что состав твердого стока резко изменяется по сезонам. Микрозоны нарастания — это биологические пленки на поверхности донных осадков. К ним относятся микробные и в частности цианобактериальные маты, формирующиеся в неглубоких водоемах. В донные отложения глубоководных озер, морей и океанов не проникает свет, поэтому в них господствуют темновые микробиотические процессы. Органические вещества, накапливаясь на дне, продолжают участвовать в круговороте вещества в водоеме. Минерализуясь, они, с одной стороны, составляют постоянный источник пополнения водной массы биогенными и зольными элементами, а с другой — служат местом деятельности сообщества микроорганизмов-деструкторов. В результате выделяющейся углекислоты и других кислых продуктов брожения рН ила ниже, чем придонной воды. Следует отметить, что температура основной массы донных отложений озер средней широты не превышает 4— 10°С. Более высокие температуры наблюдаются лишь в летний период в самых поверхностных слоях ила, особенно в мелководных водоемах в условиях жаркого и резко континентального климата, например в степных и пустынных водоемах, где днем в летнее время температура поднимается выше 40 °С. 2.4.2. Общая характеристика водных микроорганизмов Основные экологические типы микроорганизмов. Средой обитания для микроорганизмов внутренних водоемов являются водная толща и иловые отложения. В водной массе преобладают планктонные формы и формы, прикрепляющиеся для поддержания клеток во взвешенном состоянии. Подвижные формы передвигаются с помощью жгутиков. Неподвижные виды или содержат газовые вакуоли, или имеют чрезвычайно малые размеры и ничтожную массу, препятствующие быстрому оседанию. Среди микрофлоры иловых отложений также имеются подвижные жгутиковые формы, однако для бентосных микроорганизмов характерна способность прикрепляться к субстрату или передвигаться скольжением. Особенно широко представлены скользящие формы на поверхности ила, имеющего контакт с кислородной зоной. Как водная толща, так и иловые осадки стратифицированы по физико-химическим свойствам. Они содержат неодинаковое количество питательных субстратов и поэтому представляют собой чрезвычайно сложную динамическую систему, открывающую воз- 3 Пструсои 65
можность для развития разнообразных видов микроорганизмов. Жизнь водоема — это непрерывная цепь превращения органических и минеральных веществ, как образующихся в самом водоеме, так и привносимых извне. Микроорганизмы обеспечивают цикличность круговорота всех главных элементов и осуществляют энергетическую взаимосвязь процессов, происходящих в разных экологических зонах единой экосистемы. Группы микроорганизмов в силу физиологических особенностей (типа обмена, специфичности используемого субстрата, конкурентных и метабологиче- ских взаимоотношений) занимают строго определенные экологические зоны. В водоеме можно найти почти всех представителей систематических и физиологических групп бактерий. Их можно подразделить на аллохтонные, поступающие извне, и на автохтонные, которые составляют собственную микрофлору экосистемы. Последние приспособлены к экологическим условиям конкретного водоема. В водоемах с экстремальными условиями среды обитания существуют высокоприспособленные экстремофильные, преимущественно прокариотные реликтовые сообщества микроорганизмов. Разработка прямых методов исследования микрофлоры водоемов в сравнении с методом высева на питательные среды показала громадный разрыв результатов при учете численности бактерий. Современные молекулярно-биологические методы диагностики природных сообществ подтверждают присутствие в морях и озерах большого количества пока не культивируемых форм микроорганизмов. Распределение бактерий. В евтрофных водоемах численность бактерий может достигать десятки миллионов клеток на 1 мл, а в мезотрофных и олиготрофных она на несколько порядков меньше. Распределение бактерий зависит от гидрологического режима водоема и времени года. В перемешиваемых голомиктических озерах с гомогенной водной массой бактерии распределяются равномерно от поверхности воды до дна. К этому типу водоемов кроме многих озер относятся также океаны и большинство морей. В стратифицированных водоемах, и прежде всего меромиктических, бактерии концентрируются в эпилимнионе, в зоне максимума оксигенного фотосинтеза, в зонах галоклина и термоклина, хе- моклина, а также непосредственно вблизи донных отложений. Во всех случаях численность бактерий увеличивается на границе резких изменений физико-химических условий, что объясняется плот- ностными изменениями водной среды, поступлением в эти зоны встречных диффузионных потоков газов, органического вещества, биогенных элементов или минеральных источников энергии (сульфид, аммоний, Fe(ll) и др.). Часто в меромиктических озерах, содержащих сульфид, наблюдается массовое развитие фотосинте- зирующих пурпурных и зеленых серобактерий в виде узкого слоя 66
(0,5 — 2,0 м) в зоне хемоклина, окрашенного в красный, зеленый или коричневый цвет. В морях и океанах распределение бактерий в водной толще зависит от теплых и холодных подводных течений, но основные продукционно-деструкционные процессы в них сосредоточены в более или менее прогреваемых поверхностных слоях воды. Отличительная особенность донных отложений как местообитания микроорганизмов состоит прежде всего в том, что они представляют собой твердый субстрат с очень тонкой стратификацией физико-химических условий. В перемешиваемых водоемах в них тесно соседствуют как аэробные, так и анаэробные процессы. Общее число микроорганизмов в поверхностных слоях озерных, морских и океанических отложений выражается сотнями миллионов на 1 г сырого ила, что в евтрофных и мезотрофных озерах составляет от 2 до 8 % от органического вещества осадков. В глубинных слоях осадков число бактерий снижается в несколько раз, оставаясь высоким по сравнению с водной массой. Микроорганизмы аэробной зоны. В аэробной зоне водной части водоема можно выделить несколько экологических ниш, отличающихся условиями окружающей среды и соответственно микробным населением. Первая экологическая ниша аэробной зоны — поверхностная пленка воды. Она характеризуется обилием питательных веществ, преимущественно липидов, которые вследствие высокого поверхностного натяжения накапливаются здесь из водной массы и из воздуха. Поверхностная пленка представляет собой аналог твердого субстрата, к которому прикрепляются в массовом количестве микроорганизмы, такие, как Caulobacter, Hyp- homicrobium и др. В зимний период особым местообитанием является граница раздела фаз — льда и воды. Нижняя поверхность льда, соприкасающаяся с водой, имеет губчатую структуру. Она сорбирует биогенные факторы из водной массы, сюда поступают и концентрируются газы, нередко проникает свет, здесь образуется талая вода. Все эти факторы способствуют относительно густому по сравнению с водой заселению данной экологической зоны микроорганизмами, включая первичные продуценты. Роль таких сообществ особенно важна в арктических морях и океанах, всегда или большую часть времени года покрытых льдом. Важнейшая из экологических зон — это водное пространство или пленка на поверхности донных осадков, где происходит массовое развитие фототрофных сообществ и осуществляется первичная продукция органического вещества. Продукция органического вещества в результате фотосинтеза является необходимым условием обеспечения жизни в водоеме. Конечные продукты фотосинтеза обычно имеют большую молекулярную массу. К этой группе веществ относятся углеводы, пептиды, целлюлоза, растворимые 67
и летучие вещества — прямые субстраты для роста микроорганизмов, а также ряд веществ ингибиторов или стимуляторов роста. Кроме продуктов отмирающей биомассы, заметную роль в трофических связях водоема играют низкомолекулярные внеклеточные продукты метаболизма водорослей и цианобактерий. Среди них заметную роль в развитии микрофлоры рассеяния играет глико- левая кислота. В водоемах фотосинтез в основном идет за счет деятельности оксигенного фитопланктона, зеленых и диатомовых водорослей, в зависимости от времени года. В специфических условиях среды он обусловлен развитием аноксигенных фотосинтезирующих бактерий, которые по-существу являются «вторичными первичными продуцентами», так как потребляют продукты (сульфид, водород, органические кислоты), высвобождаемые в результате анаэробной деструкции органического вещества, синтезированного водорослями и цианобактериями. В создании первичной продукции Мирового океана и некоторых озер значительную роль играет фотосинтез пикопланктона, состоящего из эукариотных микроводорослей и бактериальных размеров цианобактерий. В силу несовершенства методов учета деятельность этой группы оксигенных фото- трофов длительное время не принималась в расчет. Световые условия наиболее благоприятны для развития фитопланктона в поверхностных слоях водоема, преимущественно на глубине 20 — 50 см, где интенсивность солнечного света и его спектральный состав приближаются к оптимуму развития водорослей. Здесь и находятся предпочтительные условия для большинства видов фитопланктона. Среди водорослей имеются виды, предпочитающие развиваться в условиях более низкой освещенности. К ним принадлежат некоторые виды цианобактерий, обогащенные каротиноидами или фикоэритрином. Фотосинтезирующие зеленые серобактерии могут развиваться при крайне низкой освещенности: 50—100 лк. В этих световых условиях ни одна другая группа фототрофов не способна к фотосинтезу. Другим важным фактором развития фитопланктона (кроме света) служит обеспеченность водной среды биогенными элементами. В геологическом прошлом Земли в силу распространенности мелководных водоемов преобладали бентосные фототрофные сообщества, в которых доминировали цианобактерий. Это так называемые цианобактериальные маты, которые в настоящее время развиваются в мелких морских заливах, соленых мелководных озерах, имеющих связь с морем, и в ложах минеральных источников с температурой до 72 °С. Бентосные фототрофные сообщества чрезвычайно высокопродуктивны, в них тесно содействуют аэробно- анаэробные продукционные и деструкционные микробные процессы. Микроорганизмы в составе микробных матов теснейшим образом взаимосвязанные, рассматриваются некоторыми иссле- 68
дователями как единый консорциум. Цианобактериальные маты экстремальных местообитаний, состоящие преимущественно из прокариотных представителей, признаны реликтовыми сообществами и являются предметом пристального изучения. В хемоавтотрофной ассимиляции С02 участвуют тионовые, фо- тотрофные и бесцветные серобактерии, нитрифицирующие, водородные, карбоксидобактерии, а в анаэробных условиях — некоторые виды сульфатредуцирующих, метанобразующих и ацетоген- ных бактерий. Как правило, активная ассимиляция С02 наблюдается только в тех озерах, где гиполимнион или монимолимнион обогащены сероводородом, аммонием или закисным железом. Этот процесс происходит только в узком слое воды, куда поступает кислород. Если процессы хемоавтотрофного синтеза органического вещества в пересчете на 1 л воды могут достигать в сутки до 400 мкг углерода, то при пересчете на 1 м2 площади озера эта величина, как правило, значительно меньше фотосинтеза. Взвешенные органические вещества автохтонного и аллохтон- ного происхождения, прежде чем опуститься на дно, проходят через водную массу, где до 80 % их подвергается аэробной деструкции. В разложении отмирающих планктонных организмов участвует ряд специализированных групп микроорганизмов, часто связанных кооперативными взаимоотношениями. Микроорганизмы, разрушающие индивидуальные вещества растительных остатков, более или менее изучены и могут быть подразделены на ряд физиологических групп. Сюда относятся первичные деструкторы — организмы, разрушающие полимеры (белки, целлюлозу, альги- новые кислоты, хитин, лигнин и т.д.). Минерализация этих веществ и продуктов их деградации происходит во всей водной толще, но особенно интенсивно там, где скапливается детрит, — в слое температурного скачка и поверхностном слое донных осадков. В результате потребления органических субстратов бактерии одновременно фиксируют углекислоту, участвуя в валовой продукции водоема. Гетеротрофная фиксация углекислоты обычно составляет от 2 до 6 % от синтезированной бактериальной массы, но иногда превышает 30 %. Микроорганизмы микроаэрофильной зоны. Микроаэрофиль- ная зона в водоеме как в водной толще, так и в донных осадках имеет ряд существенных особенностей. Наиболее характерно для этой зоны одновременное присутствие кислорода и ряда восстановленных продуктов, поступающих сюда снизу, где они образуются в результате анаэробного разложения органического вещества и редукции минеральных соединений серы, азота, железа и марганца. Это создает благоприятные условия развития для ряда физиологических групп микроорганизмов, участвующих в окислении перечисленных веществ: водородокисляющих, метанокис- ляющих, тионовых, железобактерий, а в случае проникновения 69
света — и некоторых фотосинтезирующих анаэробных бактерий. Пространственно микроаэрофильная зона занимает слой воды мощностью не более 2—3 м, но благодаря тому, что восстановленные соединения поступают снизу, а кислород — сверху, здесь создается резкий градиент Eh, концентрации кислорода и восстановленных соединений, а в случае совпадения данной зоны с термоклином — еще и температуры. Это приводит к тому, что развитие отдельных видов бактерий происходит в тонко стратифицированных слоях воды с наиболее оптимальными для каждого вида внешними условиями. Такая зона является связующим звеном в круговороте ряда веществ между водой и илом. «Бактериальная пластинка», в свою очередь, препятствует рассеиванию энергии восстановленных соединений железа, марганца, метана, водорода и сероводорода в вышележащую толщу воды. Используя восстановленные продукты как энергетический материал, бактерии участвуют в новообразовании органического вещества в водоеме. Следует отметить особую роль метанокисляющих бактерий в жизни водоема. Она заключается не только в потреблении образуемого (в основном в иле) метана, но и в создании дефицита в водной массе растворенного кислорода до 0,1 — 1,0 мг/л. Микрофлора поверхностного слоя ила, где хотя бы временно существуют аэробные или микроаэрофильные условия, характеризуется присутствием форм, способных к скользящим движениям, либо прикрепленных к субстрату. К их числу относятся многие цианобактерии, диатомеи, зеленые фототрофные нитчатые бактерии, флексибактерии, нитчатые серные бактерии. Бесцветные флексибактерии обнаруживаются преимущественно в морских водоемах и минеральных источниках. По-видимому, они играют большую роль в минерализации органических остатков. Многие из флексибактерии обладают активными гидролитическими экзоферментами, способными разрушать полимерные соединения — целлюлозу, хитин, крахмал, альгиновые кислоты, пектины, т.е. те вещества, которые поступают в иловые отложения после первичной деструкции из водной массы. Микроорганизмы анаэробной зоны. Образование анаэробной зоны в водоемах зависит от различных причин и тесно связано с составом и количеством растворенных солей. Как правило, анаэробные условия существуют и в гиполимнионе (монимолимнио- не) меромиктических озер, где из-за повышенного солевого состава вода не участвует в весенней и осенней циркуляции. При наличии в воде сульфатов анаэробиоз поддерживается за счет образования сероводорода в процессе их редукции. Кроме факультативно анаэробных бактерий, встречающихся в анаэробной зоне озер, здесь могут находиться также специфические группы обли- гатно-анаэробных микроорганизмов: метаногенных, сульфатреду- цирующих, бродильных микроорганизмов. Если свет проникает 70
до верхней границы сероводородной зоны, то возникают экологические ниши, наиболее благоприятные для развития отдельных видов фототрофных бактерий. Интенсивность анаэробных процессов в водной массе на порядок ниже по сравнению с иловыми отложениями. В круговороте веществ в водоеме активно участвуют лишь те органические и минеральные вещества, которые находятся в самых поверхностных слоях донных отложений. Иловые отложения олиготрофных озер характеризуются малым содержанием органических веществ и высоким окислительно-восстановительным потенциалом. В некоторых озерах здесь могут преобладать бактерии, окисляющие закисные соединения железа и марганца, поступающие из мик- роаэрофильной зоны. Пониженный окислительно-востановитель- ный потенциал в нижних микрозонах благоприятен для организмов, восстанавливающих захороненные окисные соединения железа и марганца. В димиктических мезотрофных и евтрофных озерах иловые отложения характеризуются большим количеством органического вещества и сезонной изменчивостью окислительно-восстановительных условий в поверхностном слое. Формирование и характер экологических ниш в этих водоемах зависит от окислительно-восстановительного потенциала и степени проникновения света до поверхности ила. Терминальным процессом в цепи анаэробного разложения органического вещества в пресных озерах является метаногенез, а в морях, океанах и осадках засоленных водоемов, содержащих сульфаты, — сульфатредукция. Деятельность микробных сообществ во всех отмеченных экологических зонах водоемов взаимосвязана потоками вещества и энергии и оказывает решающее влияние на существование в экосистеме более высокоорганизованных по сравнению с микроорганизмами форм жизни. 2.5. Экология почвенных микроорганизмов Под почвой понимается поверхностный слой суши земного шара («благородная ржавчина земли», по выражению В.И.Вернадского), который образуется в результате изменения горных пород при воздействии биоты, климата и других факторов почвообразования. Почвоведение как научная дисциплина оформилась благодаря трудам В.В.Докучаева и его последователей. Приоритет русской школы прослеживается до настоящего времени. Современные классификации почв по сложности напоминают таксономию микроорганизмов и могут шокировать естествоиспытателей, но до сих пор в зарубежных работах по экологии почвенных микроорганизмов употребляются такие термины, как подзол (podzol) и чернозем (chernozem). 71
Важнейшее свойство почвы, плодородие, определяет ее очевидную значимость как основного средства сельскохозяйственного производства. Кроме того, этот относительно маломощный слой суши участвует во всех важнейших процессах функционирования наземных экосистем и биосферы в целом (от обеспечения ресурсами и пространством всей наземной растительности до поддержания параметров атмосферы и гидросферы, включая проблемы «парниковых» газов, чистых поверхностных и грунтовых вод, устранения ксенобиотиков). Во всех этих процессах ключевую роль играют микроорганизмы, которые обитают в почве и выполняют многообразные экосистемные функции. Интерес к почвенным микроорганизмам во многом определяется их исключительной ролью в формировании качества почвы (почвенного «здоровья») как способности почвенной биосистемы в заданных пространственных границах поддерживать продуктивность растений и животных, сохранять приемлемое качество воды и воздуха, а также обеспечивать здоровье людей, животных и растений. Именно почвенные организмы отвечают за разложение органического вещества, образовавшегося в наземной экосистеме при фотосинтезе, и снабжают растения доступными ресурсами. Они также играют существенную роль в формировании стабильных почвенных агрегатов. Жизнедеятельность почвенной биоты определяет уровень плодородия почв, а возможность управления биотой на основе контроля почвенной влаги представляет интерес с точки зрения дискуссионной проблемы устойчивого развития. Почвенная биота — идеальный пример системы, обеспечивающей устойчивое существование ненарушенных экосистем в течение очень больших промежутков времени. Важнейшая роль почвенной биоты связана с организацией циклов элементов (С, N, Р и др.), что позволяет многократно использовать ограниченное количество каждого ресурса, т.е. как бы придать конечному свойства бесконечного. Бактерии, грибы, а также их хищники, включая простейших, нематод, клещей, дождевых червей и другие организмы, обеспечивают деструкцию органического вещества. Органическое вещество естественного происхождения представлено продуктами фотосинтеза (опад, корневые выделения растений). Основная роль почвенной биоты связана с минерализацией органического вещества и сохранением питательных ресурсов в пределах экосистемы. Биота поставляет растениям минеральные ресурсы, которые образуются в процессе минерализации органического вещества. Те ресурсы, которые в данный момент времени не потребляются растениями и могут быть потеряны экосистемой в случае их выноса (поверхностные, грунтовые воды), связываются почвенной биотой и временно консервируется в их биомассе. Последний процесс называется иммобилизацией ресурсов. В ходе последующих ес- 72
тественных процессов частичной гибели биоты (отмирание, действие хищников) эти ресурсы снова поступают в среду. В ненарушенных экосистемах процессы минерализации и иммобилизации тесно связаны с ростом растений, что обеспечивает устойчивое существование экосистемы. 2.5.1. Почва — гетерогенная среда обитания микроорганизмов Отличительная особенность почвы как природного местообитания микроорганизмов связана с ее гетерогенностью, которая проявляется в разных пространственных масштабах. Почвенные микроорганизмы обитают в трехфазной полидисперсной среде, представленной твердой (минеральные и органические частицы), жидкой (почвенная вода) и газообразной (почвенный воздух) фазами. Жизнедеятельность микроорганизмов в почве осуществляется в основном на почвенных частицах, в определенных микрозонах которых представлены клетки, ресурсы и микробные метаболиты. Поверхность почвенных частиц как жизненное пространство микроорганизмов может составлять несколько десятков квадратных метров в 1 г почвы. В работах Д. Г. Звягинцева и других почвенных микробиологов по особенностям жизнедеятельности адсорбированных микробных клеток в почвах фактически обсуждались вопросы, которые в биотехнологии получили развитие в рамках направления по иммобилизованным клеткам и ферментам. Пространственная гетерогенность почв на макроуровне (пространственный масштаб примерно до 2 м) видна невооруженным глазом в почвенном разрезе. Выявляются почвенные горизонты, которые отличаются друг от друга по цвету, плотности, влажности и другим признакам. В первом приближении можно выделить несколько основных горизонтов (рис. 2.1). • Горизонт О — лесная подстилка или степной войлок в виде опада растений на различных стадиях разложения. • Горизонт А — гумусовый, наиболее темноокрашенный в почвенном профиле, в котором накапливается органическое вещество в форме гумуса, тесно связанного с минеральной частью почвы. Этот горизонт фактически представляет собой «кладбище» биомассы растений и наиболее развит в черноземах. • Горизонт Е — подзолистый, элювиальный (вынос веществ), формируется под влиянием разрушения минеральной части кислотами, включая органические кислоты микробного происхождения. Этот сильно осветленный (цвет золы) рыхлый горизонт характерен для подзолистых почв таежно-лесных областей. Он обеднен гумусом и другими соединениями, а также илистыми частицами (вымывание в нижележащие слои при промывном режиме) и относительно обогащен остаточным кремнеземом. 73
• Горизонт В расположен под элювиальным горизонтом Е и имеет иллювиальный характер (отложение веществ). Это красновато-бурый уплотненный горизонт с накоплением глины, окислов железа, алюминия и других коллоидных веществ, поступающих из вышележащих горизонтов. В почвах без существенных перемещений веществ в почвенной толще горизонт В является переходным слоем к почвообразующей породе с признаками постепенного ослабления процессов аккумуляции гумуса и разложения первичных минералов. • Горизонт Вк — уровень максимальной аккумуляции карбонатов, обычно располагается в средней и нижней части профиля и характеризуется видимыми выделениями карбонатов — налетами, прожилками, псевдомицелием, белоглазками, редкими конкрециями. • Горизонт G — глеевый, характерен для почв с избыточным увлажнением, которое способствует развитию анаэробных почвенных микроорганизмов с развитием восстановительных процессов, переходом железа в двухвалентное состояние и его выносом, что придает горизонту характерные черты — сизую, серовато-голубую или грязно-зеленую окраску, наличие ржавых и охристых пятен. • Горизонт С — материнская (почвообразующая) горная порода без специфических признаков процесса почвообразования. Таким образом, картина почвенного профиля свидетельствует о том, что условия жизнедеятельности микроорганизмов в разных горизонтах и в разных почвах существенно различаются (см. рис. 2.1). В почвенном профиле выявляются также «горячие пятна« микробной жизни, расположенные по преимущественным путям миграции почвенной влаги. В «горячих пятнах», расположенных в пространстве макро- пор и трещин, показатели микробной биомассы, содержания ДНК, численности бактерий, по данным микроскопии, могут быть существенно выше, чем в почвенном матриксе (рис. 2.2). Структурные отличительные особенности микробных сообществ «горячих пятен», по дан- см 0| 20 А 40 60 АВ 80 100 Вк 120 140 Ск 160 1$И''Г'? к#; • 0| о А 20 40 Е 60 ЕВ 80 В 1001 120 140 С 160 Рис. 2.1. Профили чернозема (А) и дерново-подзолистой почвы (Б) 74
ным ПЦР (с рРНК на уровне Bacteria, Archaea, Eukaria), пока не выявлены. Возможно, что в «горячих пятнах» и за их пределами действует одно и то же микробное сообщество с высокой функциональной «пластичностью». Гетерогенность почвы как среды обитания микроорганизмов проявляется и на других пространственных масштабах. Например, расчеты и эксперименты показывают, что в центре почвенного комочка (диаметром примерно 1 см) могут создаваться условия для жизнедеятельности облигатных анаэробов, а на его поверхности при достаточно высоком содержании кислорода в почвенной атмосфере могут развиваться только аэробные популяции. Тонкая биопленка бактерий на поверхности корней растений может перехватывать практически весь поток корневых выделений, что ведет к существенной гетерогенности почвенной среды по концентрации легкодоступных ресурсов на дистанции 1 — 2 мм. При развитии микроорганизмов в почве следует учитывать и другие особенности, включая так называемый «рН-эффект». Величина рН на границе раздела отрицательно заряженного адсорбента и жидкости отличается от рН раствора на 0,5 — 2 единицы. В результате оптимальное значение рН для адсорбированных клеток смещено в щелочную сторону, если о нем судить по рН жидкой фазы. На границе раздела адсорбента и почвенного раствора концентрируются как ионы водорода, так и разнообразные вещества, составляющие окислительно-восстановительные системы. В этой микросреде за счет регуляторных механизмов микробные клетки могут в определенной степени создавать приемлемые для них условия по рН и окислительно-восстановительному потенциалу. Есть основания полагать, что показатели темпа размножения 0 50 150 250 0 25 50 75 0,0 0,5 1,0 С (мг/кг) ДНК (мг/кг) [10Ю клеток] Рис. 2.2. Сравнение характеристик микробных сообществ в матриксе почвы и зонах преимущественных путей миграции влаги (ППМВ), выявленных при поливе раствором пищевого красителя: А — профиль почвы; Б — биомасса; В — ДНК; Г— численность бактерий 75
и энергетики роста для клеток в пленках почвенной воды отличаются от аналогичных показателей для популяций, развивающихся в большом объеме жидкости. Эти и другие примеры показывают чрезвычайно высокую гетерогенность почвенной матрицы как арены микромира, на которой микробные популяции размножаются, обмениваются генетической информацией, мигрируют, погибают. Пространственная гетерогенность почвы как природного местообитания микроорганизмов еще в 30-х годах XX в. была охарактеризована Н. А. Красильниковым как естественная «очаговость», но до настоящего времени необходимость изучения микробной жизни в разных масштабах пространства (фрактальность) осознается далеко не всегда. Наиболее остро эта проблема может проявиться в популярных современных задачах, когда на основе данных о конкретной микробной активности в ограниченном наборе образцов исследователь переходит на уровень глобальных проблем (например, в задачах по парниковым газам и изменению климата). Для наглядности можно воспользоваться примером с расчетом плотности швейцарского сыра; если первое измерение плотности выполнено в центре дыры, то вплоть до выхода к границам полости плотность сыра будет равна нулю, а затем начнет расти в зависимости от особенностей геометрии исследуемого пространства. Таким образом, в гетерогенных средах оценки регистрируемых микробиологических показателей зависят от масштаба, в котором осуществляются измерения. 2.5.2. Микробное население почвы Пестрая микрозональная картина среды обитания предполагает высокое разнообразие почвенных микроорганизмов, что подтверждается разными методами. В частности, при всей условности подхода на основе кинетики реассоциации ДНК:ДНК ожидаемое число видов бактерий в 1 г лесной почвы, по данным В. Тор- свика (V.Torsvik), существенно превышает 10 000. Для расчета числа видов грибов при определенных условиях (логнормальное распределение) можно воспользоваться формулой S=u(3,14°.y*), где S— общее число видов; S0 — число видов модальной октавы; а — константа (часто приблизительно равная 0,2). Данный подход позволил по показателям обилия учитываемых посевом конкретных видовых популяций рассчитать общее число видов грибов (в том числе и не выявленных при посеве): S= 30—40 видов в 1 г почвы. Таким образом, и для более крупных и существенно более однородных в функциональном отношении по срав- 76
нению с бактериями обитателей почвы характерно высокое биоразнообразие. Масса биоты, включая бактерии, грибы, водоросли, по данным прямых методов микроскопии, может достигать нескольких тонн на гектар почв. В первом приближении по биомассе в поверхностных почвенных образцах (особенно в таежно-лесной зоне) доминируют грибы. Биомасса бактерий сопоставима по порядку величин с биомассой грибов, а остальные компоненты, включая представителей почвенной фауны, составляют второй план. Вместе с тем сами по себе показатели биомассы, к тому же рассчитанные на основе тотальных количественных учетов (без дифференциации «активной» и «неактивной и мертвой» биомассы), не дают представления о функциональной роли отдельных представителей почвенной биоты. Более обоснована в этом случае оценка «активной» поверхности (например, с признаками эстеразной активности по расщеплению диацетата флуоресцеина или с признаками дыхания по тесту с люминесцирующими солями тетразоля), через которую осуществляется взаимодействие клеток с окружающей средой. При учете «активной» поверхности бактерии не уступают грибам в функциональном отношении. Несомненно также, что бактерии выполняют важнейшие пищеварительные функции в организме почвенных животных. В целом можно охарактеризовать почву как чрезвычайно гетерогенную среду обитания, в которой существует обильная и разнообразная микробная биомасса. 2.5.3. Функциональная роль почвенных микроорганизмов Почвенные микроорганизмы не просто обитают в естественной гетерогенной среде, но сами являются ключевым фактором почвообразования и участвуют в процессах преобразования горной породы в почву с характерным строением. Оценивая роль микроорганизмов, Т. В. Аристовская выделила пять важнейших элементарных почвенно-микробиологических процессов: разложение растительного опада, образование гумуса, разложение гумуса, деструкция минералов почвообразующей породы и новообразование минералов. Указанные и другие функции почвенных микроорганизмов составляют как бы фундамент наземных экосистем. Относительно более подробно исследован процесс разложения органического вещества в почве. Ежегодно при фотосинтезе связывается примерно 5 • 1010 т атмосферного углерода, а в виде опада в почву поступает приблизительно 4 • 1010 т. Основную часть опада почвенные микроорганизмы минерализуют до углекислого газа и воды. Вместе с тем существенная часть опада превращается в гуминовые вещества (от 0,6 77
до 2,5 • 109 т) — особый класс природных соединений, для которых до сих пор нет точных молекулярных формул и выделение которых задается операционально (процедурой). Гуминовые вещества извлекают из почвы раствором щелочи. Затем осаждают кислотой фракцию гуминовых и гиматомелановых кислот. В растворе остаются фульвокислоты и неспецифические вещества. Нерастворимую часть называют гумином. Все гуминовые вещества содержат большой набор функциональных групп. При их гидролизе в раствор переходят до 22 аминокислот (их массовая доля достигает 10%), разнообразные моносахариды (до 25 %) и другие соединения. Продуктами окисления являются в основном бензолполикарбоновые кислоты. Источниками аминокислот и Сахаров в гуминовых веществах могут быть белки и углеводы растений и микроорганизмов, а исходным материалом для бензоидных циклов служат лигнин и флавоноиды. Некоторое представление о содержании гумуса дает окраска почвы. В сухом состоянии малогумусные почвы (не более 1,5 % гумуса) имеют светло-серый цвет. Черный или буро-черный цвет (5 — 6 % гумуса и более) сухих образцов характерен для почв с высоким уровнем плодородия (чернозем). Несмотря на то что до сих пор дискуссионными остаются многие вопросы по строению, механизмам образования и разложения гуминовых веществ, эти соединения играют исключительную роль в поддержании плодородия и других почвенных характеристик. Согласно одной из гипотез образования гумуса (П. А. Костычев, Т. Г. Мирчинк, Д. Г. Звягинцев и др.), ядра молекул гумуса представлены микробными меланинами. Процессы разложения растительного опада (продукты фотосинтеза как основной ресурс почвенных микроорганизмов) в первом приближении удовлетворительно описывает кинетическое уравнение первого порядка: где At и А0 — концентрация ресурса в момент t и в начальный момент; к — константа с размерностью обратного времени. Формально применимость такой простейшей модели предполагает, что обильный микробный потенциал не лимитирует процесс. Лабораторные и полевые эксперименты показывают, что &чаще всего не зависит от количества поступившего в почву органического вещества при условии, что нагрузка по углероду не превышает 1,5 % от массы сухой почвы (в противном случае могут существенно измениться почвенные характеристики). Поступивший в почву органический материал содержит, как правило, разные компоненты. Определенное представление о диапазонах скоростей разложения органики в почве могут дать значения к для разных ресурсов в условиях лабораторного эксперимен- 78
та: от 0,02 — 0,03 — для соломы, гемицеллюлозы и мертвой грибной биомассы до 0,003 сут"1 для лигнина. Процесс разложения органики в почве существенно зависит от процентного содержания в растительном опаде углеводов (С/) и лигнина (Z), а также от соотношения C/N. Примером может служить эмпирическое уравнение для индекса дыхания почвы: C02 = (U)l/2/((C/N)L). Отношение C/N для почвенных бактерий варьирует обычно в диапазоне от 3 :1 до 8:1. Для биомассы почвенных грибов максимальное значение отношения C/N выше и достигает 16. В этом отношении грибы более конкурентоспособны при разложении соединений с низким содержанием азота (например, лигнина). К тому же мицелиальная организация позволяет осуществлять перенос соединений азота по гифе как трубе (транслокация лимитирующего ресурса). Не исключено, что мицелий грибов поставляет азот в подстилку (здесь значение C/N очень высокое: 40— 100) из нижележащего почвенного горизонта. Общее правило заключается в следующем. Если C/N микробной массы больше C/N органического вещества, то в результате минерализации почва обогащается азотом. Это наблюдается, в частности, при разложении мертвой биомассы животных (C/N = 10) и фитомассы бобовых растений (C/N = 18). Если C/N микробной массы меньше C/N органического вещества, то в ходе иммобилизации начнется потребление минерального азота почвы. При этом общая скорость разложения может существенно снизиться, пока не погибнет часть микробной биомассы и (или) не появится дополнительный источник азота в ходе микробной атаки на почвенное органическое вещество. Указанные закономерности учитываются в классическом эмпирическом правиле внесения соломы: чтобы исключить нежелательный процесс иммобилизации ресурса в почве, к 100 кг соломы следует добавить 1 кг азота. Сходные проблемы возникают при решении оптимизационных задач по восстановлению почвенного плодородия в ситуациях с загрязнением среды. Например, крайне сложная ситуация возникает при загрязнении почв углеводородным сырьем на нефтяных месторождениях и при авариях на нефтепроводах. При этом в силу разных причин (ухудшение водного режима в гидрофобной обстановке, выпадение растений, возрастание отношения C/N и т.д.) ингибируется активность большинства почвенных микроорганизмов. Для активизации микробных сообществ и ускорения процессов самоочищения необходимо внесение удобрений (на окисление 1 г нефти требуется примерно 80 мг азота и 8 мг фосфора) с созданием соответствующих условий по влажности и аэрации (например, путем внесения торфа, соломы и других рыхлых материалов). Помимо прочего интерес представляет интродукция 79
микробных популяций, разлагающих нефтепродукты. Любопытной представляется возможность применения коры хвойных деревьев с природным микробным комплексом, адаптированным к природным смолам. Процесс разложения органического вещества в почве зависит от влажности, температуры, рН, окислительно-восстановительного потенциала и других параметров. Относительно подробно изучен температурный фактор. Зависимость дыхания почвы от температуры в первом приближении соответствует правилу Вант-Гоф- фа: скорость продукции С02 при нагревании на 10 °С увеличивается примерно в 2 раза (обычно Q10 варьирует от 2,0 до 2,5). Близкие значения Q10 получены для продукции N20, NO и СН4. Вполне очевидно, что процесс разложения органического вещества почвенными микроорганизмами зависит также от влажности почвы и других факторов (и их взаимодействия). Примерная картина зависимости скорости разложения растительного опада от температуры и влажности почвы как ключевых факторов в обобщенном случае показана на рис. 2.3. Попыткам уточнить эту зависимость посвящены многочисленные работы по сценариям последствий глобального изменения климата. На глобальном уровне запасы углерода в почвах, биомассе суши и в атмосфере составляют примерно (1500, 600 и 720) • 1015 г соответственно. Изменение уровня почвенного углерода может существенно повлиять на пул атмосферного углерода, который усту- Рис. 2.3. Зависимость относительной скорости разложения органического вещества (%) от температуры и влажности почвы. Для характеристики влажности почвы представлены простейшие градации полевого описания в диапазоне примерно от -0,01 до -100 бар: «мокрая» — выделяет воду при сжимании в руке, «сырая» — напоминает тесто, «влажная» — увлажняет фильтровальную бумагу, «свежая» — холодит руку, «сухая» — пылит 80
пает почвенному. Подобные расчеты подчеркивают значимость почвенного органического вещества и почвенного микробного блока как факторов, определяющих климат. Для глобальной оценки величины углерода почвенной микробной биомассы предлагались разные методы и схемы расчета, которые позволили очертить диапазон значений — (2,5— 10) • 1015 г. В относительно сбалансированных экосистемах («климакс») отношение углерода микробной биомассы к углероду почвенного органического вещества Смикр /Сорг составляет примерно 2 %. Через это «игольное ушко» должно пройти органическое вещество, поступающее в почву. Отклонение Смикр /Сорг от данного значения может указывать на нарушение режима системы по органическому веществу. Для оценки увлажнения почв часто используются показатели объемной и весовой влажности, однако эти показатели неудовлетворительно характеризуют степень доступности воды для микроорганизмов. Вода может находиться в природной среде в различных состояниях, начиная от гигроскопической влаги, прочно адсорбированной на почвенных частицах, до гравитационной воды, свободно перемещающейся в крупных порах под действием силы тяжести. Для более строгой оценки степени доступности воды информативным является определение потенциала влаги как количества термодинамической работы, которая должна быть затрачена организмом на извлечение воды. Чаще всего диапазоны потенциалов воды для почвенных микроорганизмов представлены в барах. Среди других термодинамических показателей используют также показатель активности воды — отношение показателей давления водяного пара в исследуемой системе и чистой воды. Развитие микроорганизмов в почвах обычно проходит не в большом объеме жидкости, а в капиллярах, заполненных водным раствором, или в тонких пленках. Толщина пленок и капилляров имеет существенное значение для жизнедеятельности микроорганизмов. Даже толстые капилляры часто заполнены воздухом и только на поверхности их стенок находится пленочная вода. В тонких пленках микроорганизмы практически не развиваются. По некоторым данным, органическое вещество в капиллярах с диаметром менее 1 мкм недоступно для микроорганизмов. Хорошее развитие микроорганизмов наблюдается в водных пленках толщиной 10 мкм и более. На микроорганизмы, расположенные в капиллярах и пленках, оказывает влияние (кроме большой адсорбирующей поверхности) специфика распределения и диффузии ресурсов и продуктов жизнедеятельности. Отмечено, что при развитии в тонких водных пленках уменьшаются размеры клеток. По всей видимости, одна из основных причин более мелких размеров клеток в почве по сравнению с питательными средами заключается в том, что в почве 81
клетки развиваются в капиллярах. Статистический анализ особенностей размножения почвенных микроорганизмов с помощью разработанной Б. В. Перфильевым капиллярной микроскопии показал, что микроколонии бактерий разных классов в стеклянных капиллярах in situ распределены по закону редких событий (закон Пуассона). По мнению японского микробиолога Т.Хаттори, наблюдаемая малая величина вероятности размножения бактерий в почве объясняет, почему в ней не выполняется теорема Гаузе о конкурентном исключении популяций с близкими экологическими нишами. В зависимости от влажности почвы режим функционирования почвенной биоты меняется столь существенно, что это может принципиально изменить направленность экосистемных процессов и привести к нежелательным последствиям. Нижний предел водного потенциала для микроорганизмов существенно ниже, чем для растений, и составляет -150 бар и менее для некоторых почвенных грибов, включая Penicillium spp. и Aspergillus spp. В таких условиях активная биота может быть представлена системой, построенной в основном на грибах и их хищниках (некоторых почвенных клещах). При повышении потенциала почвенной влаги примерно до -55 бар и выше биоразнообразие возрастает. В частности, заметную роль в минерализации органического вещества в почве начинают играть актиномицеты — мицелиальные бактерии, которые являются продуцентами основных антибиотиков, используемых в медицине. Вероятно, эффективность метода лечения специально подготовленной землей (почвенная катаплазма), который, в частности, применял в прошлом веке выдающийся специалист в области гнойной хирургии В. Ф. Войно-Ясенецкий, связана с синтезом актиномицетами комплекса антибиотиков. Характерный запах почвы определяется некоторыми летучими продуктами жизнедеятельности актиномицетов (геосмин, 2-метилизоборнеол), причем в ряде случаев показана значимость этих соединений в координации процессов в микробном сообществе (например, инициация прорастания спор микоризных грибов). Рост большинства бактерий обеспечивается при более высоких значениях потенциала почвенной влаги: от — 40 до 0 бар, а миграция бактерий возможна в диапазоне — (0,1 — 0,5) бар и выше. Применяя бактериальные удобрения, необходимо обеспечить непосредственный контакт клеток бактерий с корнем растения. Примером может служить активная миграция симбиотических азот- фиксаторов клубеньковых бактерий к корню растения-хозяина с последующим проникновением в корень и формированием клубеньков. При благоприятных условиях на 1 см2 поверхности корня из почвы поступает примерно 20 клеток клубеньковых бактерий за 1 ч, причем значимость фактора миграции на этом этапе взаи- 82
модействия может превосходить значимость процесса размножения бактерий. Вместе с тем в этом же интервале потенциала почвенной влаги активно прорастают многие фитопатогенные грибы (Pythium spp., Phytophtora spp., Fusarium spp.). При наличии таких популяций в природной среде это может привести к их доминированию в микробном сообществе, болезням растений и существенной потере урожая. Самая высокая скорость разложения органического вещества микроорганизмами как условия снабжения растений основными минеральными ресурсами обеспечивается примерно при -0,1 бар. В этом случае почвенная биота наиболее эффективно выполняет свою основную экосистемную функцию по рециклизации ресурсов. При переувлажнении скорость минерализации снижается, а в микробной системе на первый план выходят анаэробные бактерии. В ряде случаев такое переключение режима микробной системы нежелательно для сельскохозяйственного производства, поскольку в результате денитрификации происходит потеря азота и могут накапливаться токсические продукты (летучие жирные кислоты, аммиак, этилен, сероводород, двухвалентное железо и др.). В переувлажненной почве обычно окислительно-восстановительный потенциал на первых этапах разложения органического вещества сохраняется на уровне примерно 200 мВ, а затем происходит резкое снижение потенциала до -200 мВ, что близко к пороговому значению для образования метана. Наличие в почве нитратов существенно задерживает возникновение условий сильного восстановления. В этом случае в среде появляются продукты денитрификации, включая азот. Анаэробные микрозоны создаются и в почвах, которые не переувлажнены. Примером может служить небольшой почвенный агрегат с органическим веществом. На его поверхности в аэробных условиях в результате жизнедеятельности нитрифицирующих бактерий образуются нитраты. Внутренняя часть агрегата будет анаэробной и благоприятной для денитрификации при диффузии нитрата в почвенной влаге внутрь комочка. В ряде случаев переключение в анаэробный режим может оказаться эффективным для ликвидации загрязнения окружающей среды. Например, при интенсивном сельскохозяйственном производстве серьезной проблемой стала избыточная концентрация нитратов. Для их удаления предложен микробиологический механизм денитрификации с помощью временного переувлажнения почв. Нитраты в этом случае будут использоваться почвенными микроорганизмами в качестве альтернативного акцептора электронов с образованием газов — азота и закиси азота. Таким путем удается достаточно быстро устранить загрязнение почв нитратами и предотвратить их поступление в поверхностные воды. Однако 83
может возникнуть и другая проблема. Закись азота после поступления в атмосферу способствует разрушению озонового слоя. Поэтому возникает необходимость контроля процесса денитрифика- ции с созданием условий для преимущественного образования азота как конечного продукта. Создание анаэробных условий с помощью переувлажнения почвы может оказаться также эффективным способом микробиологического разрушения некоторых ксенобиотиков. Особенность почвы как природного местообитания различных организмов состоит в том, что условия для жизнедеятельности биоты непостоянны, а меняются в зависимости от климатических и других факторов. Например, типична ситуация с чередованием процессов увлажнения (после дождя или полива) и высушивания почв. В таких условиях существенно снижается функциональное потенциальное разнообразие почвенного бактериального сообщества, оцениваемое по способности утилизировать различные органические вещества. Есть основания полагать, что ведущая экоси- стемная функция почвенной биоты определяется не только параметрами, складывающимися в местообитании в данный момент времени, но и предысторией водного режима. 2.5.4. Почва — гетерохронная среда обитания микроорганизмов Почва представляется не только гетерогенной (характеристики системы варьируют в пространстве), но и гетерохронной средой обитания, параметры которой изменяются во времени. Необходимость изучения динамики почвенной микробной системы осознана давно. Выдающийся русский микробиолог С. Н. Виноградский описал на основе микроскопических наблюдений последовательную смену микробных популяций в ходе разложения внесенных в почву органических веществ. На первом этапе разложения легкодоступной органики доминировали быстрорастущие популяции с банальной морфологией и относительно крупными размерами клеток. Данная микрофлора напоминала формы, учитываемые на богатых питательных средах in vitro, и была названа зимогенной {гите — закваска). Представители второго этапа разложения труднодоступной почвенной органики характеризовались своеобразием морфологии и были названы С. Н. Виноградским автохтонной микрофлорой {khthonos — почва). По существу, ученый описал то, что на языке современной науки называется сукцессией сообщества с последовательным развитием г- и ^-стратегов. Гетерохронность почвенного микробного сообщества выявляется, в частности, в динамике показателя к - М/Р, отражающего отношение между количеством бактерий по данным микроскопии (М) к количеству, найденному по посеву (Р). 84
Для анализа различий между показателями численности бактерий в почве, по данным микроскопии, и посева запишем следующее равенство: М= Р\ + Р2 + РЗ + Р4 + Р5, где М — численность бактерий по данным микроскопии; Р\ — выросшие и учтенные на данной среде бактерии; Р2 — неучтенные на данной среде бактерии с иными пищевыми потребностями или другими требованиями к условиям культивирования; РЗ — бактерии, неучтенные в связи с их медленным ростом; РА — бактерии, растущие на данной среде, но не учитываемые из-за стрессов; Р5 — мертвые клетки. • Р2 отражает селективность среды и условий культивирования. В самом деле, нельзя учесть анаэробов при инкубировании чашек с посевом в аэробных условиях, так же как бессмысленно учитывать хемоавтотрофных нитрификаторов при посеве на мясо- пептонный агар (МПА). Схема микробной системы развернута во времени, и по мере развития сукцессии подключаются новые микробные популяции. Представителей поздних этапов с трудом удается культивировать даже на специально подобранных средах. Развертывание сукцессии — не что иное, как рост разнообразия Р2, поэтому тенденции изменения данного компонента по сравнению с остальными являются, по всей видимости, определяющими. • РЗ — количество бактерий, способных расти на данной питательной среде, но имеющих низкую радиальную скорость роста колонии. Обычно быстрорастущие формы, колонизируя практически все пространство и к тому же часто контролируя питательную среду физиологически активными веществами (антибиотиками), делают рост и учет медленнорастущих форм практически невозможными. • РА — отражает влияние стрессов на бактерии. В последнее время в микробиологию введена гипотеза о так называемых некульти- вируемых формах бактерий (НФБ) («viable but nonculturable», VNBC). Предполагается, что многие неспорообразующие бактерии в силу разных причин способны переходить в особое (дормантное) состояние, при котором они уже не регистрируются методами посева, но тем не менее не погибают и могут быть выделены и учтены после «реанимационной« процедуры. В данное время признаки способности перехода в НФБ отмечены для более 30 видов 16 родов бактерий (Aeromonas, Campylobacter, Klebsiella, Legionella, Vibrio, Yersinia и др.). Дискуссионными остаются многие вопросы, связанные с надежными критериями определения НФБ. Почвенным микробиологам проблема НФБ известна давно. Показано, что лабораторные манипуляции при посеве приводят к недоучету микроорганизма, если в естественной среде обитания он испытывал стрессовое напряжение. Примером может служить 85
«ускоренная субстратом гибель»: при посеве на богатую питательную среду значительная часть популяции может погибнуть, если до посева клетки голодали. Поскольку ситуация с голоданием весьма типична для микроорганизмов в почве, часто наблюдаемый недоучет бактерий на концентрированных средах по сравнению с теми же средами, но разбавленными, может быть обусловлен стрессом указанной природы. Необходим учет и других стрессов: например, устранение вторичного стресса путем добавления ката- лазы на поверхность питательной среды может приводить к возрастанию полноты учета Escherichia coli почти в 100 раз. Кроме того, на основе расписания появления колоний почвенных бактерий на питательной среде установлена вероятностная природа процесса размножения, который может быть описан уравнением Хаттори: N(t) = Nf[l-exp(-L(t-tr))l где N(t) и Nf— число колоний в момент /ив конце инкубации соответственно; /г— время появления первой колонии; L — вероятность формирования колонии (размножения). Значение L характеризует состояние бактериальной клетки in situ: например, уже через несколько часов после увлажнения воздушно-сухой почвы (размножение in situ еще не происходит) значение L возрастает от 0,02 до 0,04 ч"1. Таким образом, проблема учета Р4 может быть конструктивно решена исходя из того, что процессы размножения клеток и остановки роста микроколоний имеют вероятностную природу. • Р5 — численность мертвых клеток, экспериментально дифференцировать которые в почве до сих пор весьма затруднительно. Доля «мертвых» клеток без признаков эстеразной активности (окрашивание диацетатом флуоресцеина) варьирует в диапазоне от 20 до 90%. Ограничившись указанными компонентами, обратимся к оценке соотношения: к=М/Р1, где к — коэффициент, отражающий различия между показателями численности бактерий по посеву и микроскопии. Показатель к возрастает, если одновременно растут Р2, РЗ, Р4, Р5. Возрастание значений перечисленных компонентов сопоставим с ключевыми закономерностями сукцессии: рост разнообразия (Р2), развитие медленнорастущих форм (РЗ), состояние, близкое к поддержанию в условиях голодания (Р4) с возрастанием доли нежизнеспособных клеток (Р5) при низких скоростях роста, — все это типично для так называемых «зрелых» экосистем. Тогда возрастание к может указывать на поздние этапы сукцессии, для которых характерна низкая скорость роста. Соответственно 86
низкое значение к — индикатор начальных этапов сукцессии («молодая экосистема») с более высоким темпом размножения. Действительно, вниз по почвенному профилю к возрастает в десятки и сотни раз. В верхних горизонтах за счет непосредственно поступающего сюда опада как бы поддерживается состояние относительно «молодой экосистемы». Закономерная последовательность событий выявляется в эксперименте: при исходном к > 200 после внесения в почву глюкозы уже на 7-е сутки показатели обилия бактерий по данным люминесцентной микроскопии и посева на МПА различаются не более чем на порядок, а затем наблюдается медленное, но неуклонное возрастание к. Расчетное время генерации учитываемых посевом бактерий для момента времени, когда к = 10, составляет примерно 30 ч. Таким образом, бактерии, учитываемые на богатой питательной среде (на которой теоретически должны выявляться объекты с относительной /--стратегией), действительно демонстрируют популяционный «взрыв» как раз на начальной стадии сукцессии при минимальном значении к. Отметим кратковременность этапа «молодой» системы. Соответствующие события происходят буквально в течение двух-трех суток, причем только здесь и не в полной мере (если сравнивать с темпом размножения лабораторных культур) проявляется свойственная микроорганизмам способность к быстрому размножению. Последующее возрастание к — указатель перехода системы на более поздние сукцессионные стадии, для которых, в частности, характерно снижение скорости размножения. В равновесной климаксной микробной системе время генерации существенно возрастает и может выражаться не часами, а неделями и даже месяцами. Для понимания особенностей функционирования климаксно- го почвенного микробного сообщества используем уравнение микробного роста с учетом трат на поддержание: dX/dt+aX= YdS/dt, где X— биомасса; t — время; S— ресурс; а — показатель поддержания; Y — экономический коэффициент. В условиях равновесия dX/dt - 0, так что dS/dt = aX/ Y На основе имеющихся в литературе усредненных оценок значений параметров {а = 0,001 ч-1, Y= 0,35) можно рассчитать, что для поддержания 1 кг микробной биомассы в течение года (8760 ч) потребуется примерно 25 кг доступного субстрата. Величина микробной биомассы, по разным оценкам, в различных почвах варьирует (для слоя 0—10 см) в диапазоне примерно от 100 до 2000 кг по углероду в расчете на 1 га. Таким образом, траты только на поддержание почвенной микробной массы сопоставимы по порядку величины с продуктивностью растений. Аналогичные расчеты на глобальном уровне показывают, что для умеренного климатического по- 87
яса траты на поддержание почвенной микробной массы в лесной зоне и агроценозах составляют соответственно примерно (6,3 и 5,3) • 1015 г углерода в год, что практически равно чистой первичной продуктивности этих экосистем. Из представленных данных следует, что поступающее в почву органическое вещество обеспечивает в основном процессы поддержания микробной биомассы (траты энергоресурса на осморе- гуляцию, обмен макромолекул, миграцию и прочие нужды, не связанные с ростом). Налицо дефицит ресурса для размножения микроорганизмов. На этом фоне парадоксальными представляются данные об энергетических характеристиках почвенной микробной биомассы: содержание АТФ составляет примерно 12 мкмоль/г углерода биомассы при энергетическом заряде клетки (ЭЗК) = = 0,80—0,94. Такие значения характерны для клеток в экспоненциальной фазе роста in vitro. Тем не менее именно такие значения АТФ и ЭЗК регистрируются в течение нескольких месяцев инкубации почв без внесения органического вещества. Почему столь внушительная и в основном покоящаяся в условиях «голодной» среды почвенная микробная биомасса поддерживает «рекордные» уровни АТФ и ЭЗК? Вероятное объяснение парадокса связано с необходимостью минимизации времени реакции почвенных микроорганизмов на появление легкодоступного субстрата в бедном местообитании. С таким объяснением согласуются данные о «триггерном» эффекте, регистрируемом при внесении в почву разбавленных растворов (на уровне около 10 мкг углерода на 1 г почвы) глюкозы, аминокислот, экстрактов корней растений. Предполагается, что легкодоступные мономеры выполняют в данном случае в основном информационную роль и служат сигналом для функциональной активизации почвенной микробной биомассы. Это проявляется в быстром отклике по дыханию еще до запуска процессов минерализации почвенного органического вещества. Гетерохронность почвенного микробного сообщества в полной мере выявляется в ходе анализа микробных сукцессии. В соответствии с одним из основных классических определений в экологии под сукцессией подразумевается телеономический (целесообразный) процесс развития сообщества по определенной программе. Согласно данной метафоре в развитии сообщества как «суперорганизма» проявляется эквифинальность — заданность на определенное конечное состояние (климакс) с воспроизведением определенного равновесного сообщества. В этом смысле регистрируемые в ходе сукцессии события являются следствием, а причиной как бы выступает будущее состояние системы (causa finalis). Такое понимание связано с работами Ф. Е. Клементса по многолетнему естественному восстановлению исходного облика макрокосма (сообщества растений) после их полного уничтожения в результате катастроф. 88
Аналогичные сукцессионные процессы регистрируются в почвенном микробном сообществе. Сценарий вероятных событий в координатах, отражающих «капитал» системы (например, живая биомасса) и интенсивность межпопуляционных взаимодействий, можно представить следующим образом (рис. 2.4). Для определенности в качестве катастрофы рассмотрим типичную ситуацию — высушивание почвы, которое ведет к распаду системы с разрушением функционального потенциала и потерей (частичной или полной) биоразнообразия. Этап возрождения связан с активизацией выживших и аллохтонных (миграция) популяций в «экологическом вакууме«. Они начинают «эксплуатации^ среды, которая после катастрофы стала богаче по запасам различных ресурсов в результате гибели аборигенов и других процессов. Стратегия таких популяций с выраженной r-стратегией предполагает относительно быстрый рост в условиях «молодой» (ненасыщенной) системы. Время генерации бактерий составляет не более 2—3 суток, а по показателю вероятности размножения (уравнение Хаттори) клетки имеют высокую активность. Этап характеризуется относительно низкими значениями коэффициента к и высокой функциональной активностью грибов. При последующем возрастании «капитала» («насыщенная», «зрелая» система) наблю- «слабые» Связи -*¦ «сильные» Рис. 2.4. Сукцессионные события на уровне микрокосма в почвенной микробной системе 89
дается восстановление исходных параметров с признаками относительной А'-стратегии. Существенно, что сукцессионные процессы в природных макро- и микрокосмах определенным образом коррелируют. Примером может служить восстановление бореального таежного ландшафта, представленного хвойными лесами и подзолистыми почвами. После полного разрушения макрокосма в результате природных катастроф или антропогенного воздействия (например, после пожара) на голом месте начинается постепенное восстановление макрокосма, которое в значительной степени определяется почвенным микробным блоком. На самых первых этапах почва содержит максимальное количество минеральных соединений азота и фосфора, что обеспечивает рост так называемых ру- дералов — быстрорастущих травянистых растений (крестоцветные, маревые, гречишные). В такой ситуации с относительным обилием ресурсов быстрорастущие растения скорее всего не нуждаются в особой помощи от микробных популяций. Более того, растения и микроорганизмы на данном этапе могут конкурировать за ресурсы. В результате достаточно быстро понижается концентрация минеральных веществ до уровня, при котором рудералы утрачивают конкурентоспособность. Следующие поселенцы представлены травами, кустарниками и деревьями, способными к мутуалистическому взаимодействию с микроорганизмами. Эти растения получают «за определенную плату» (снабжение микроорганизмов энергией и углеродом) фиксированный симбиотическими и ассоциативными бактериями азот, а также ионы фосфата и другие минеральные ресурсы от грибов посредством формирования везикулярно-арбускулярной микоризы (ВАМ). Для невооруженного глаза ВАМ невидима, но роль тонких гиф, пронизывающих клетки корней, весьма существенна. ВАМ грибы способны взаимодействовать с растениями разных видов. Возможно, именно они в существенной степени определяют «сборку» растительного сообщества при относительном дефиците минерального фосфора. На этой фазе возможен процесс перераспределения через сеть мицелия доступного азота между растениями, способными и неспособными к симбиозу с микроорганизмами-азот- фиксаторами (например, связка ольха-ива). В случае с ВАМ в корневой системе может формироваться комплекс полезных микроорганизмов. События в рассматриваемом макрокосме с определенного момента в заметной степени определяются грибами, но при этом минерализационный потенциал системы не возрастает, а снижается. Процесс сопровождается аккумуляцией грубого органического вещества (подстилка) и кислых продуктов, образующихся 90
обычно при несбалансированном росте сапротрофных грибов и их массовом отмирании. Известно, например, что в промышленной биотехнологии грибы используются в качестве основного продуцента лимонной и других органических кислот. Именно такие соединения оказывают сильное разрушающее действие на минералы и способствуют формированию в условиях промывного режима характерного профиля подзолистых почв. Потребление кислых органических веществ, по данным мультисубстратного тестирования и микроскопии, осуществляется в основном бактериями, уровень активности которых («миколитическая» петля) скорее всего контролирует события в микрокосме и макрокосме в качестве «узкого» места. В конечном счете в макрокосме в той или иной степени может происходить переход от снабжения растений продуктами полной минерализации опада к использованию органических макромолекул, включая прежде всего азотсодержащие соединения. Роль основных «снабженцев» переходит к эктомикоризным грибам с признаками очевидной специфичности взаимодействия с растением-хозяином, от которых грибы получают легкодоступный источник углерода. Еще более определенно о возможности снабжения растений непосредственно органическим азотом можно говорить на примере микоризы вересковых. Таким образом, самовосстановление макрокосма на примере таежного ландшафта в существенной степени определяется уровнем минерализационного потенциала микробного блока и формированием обходных путей для обеспечения рециклизации ресурсов. Представленный выше пример описывает естественную устойчивость экосистемы. Концепция устойчивого развития предполагает иную «устойчивость», которая навязывается экосистеме извне и нацелена на бесконечное удержание параметров системы в определенном диапазоне. По существу практика интенсивного земледелия связывает создание и удержание начального сукцессионного этапа с высокой продуктивностью. В таких условиях микробный блок с собственной логикой развития микрокосма представляется вредной подсистемой, которую пытаются устранить или заменить. Высокие урожаи сельскохозяйственных культур в первую очередь обеспечиваются за счет отказа от «услуг» азотфиксаторов и других микроорганизмов-снабженцев и применения минеральных азотных, фосфорных и других удобрений. Продукция среднего по масштабам завода химического производства азотных удобрений может обеспечить питание примерно 1 млн человек, но далеко не все страны могут практически осуществить столь энергоемкое производство. Чтобы исключить потери внесенного азота, применяются ингибиторы развития нитрифицирующих бактерий. Для по- 91
давления роста грибов (основные потенциальные конкуренты растений за ресурсы, фитопатогены и продуценты фитотоксинов) приходится применять фунгициды. Чтобы в полной мере контролировать ростовой потенциал растений, используются синтетические фитогормоны, которые по-своему заменяют естественные фитогормоны микроорганизмов, обитающих на корнях растений. Для борьбы с разнообразными вредителями вносятся гербициды и пестициды. Особый вклад в интенсивные технологии вносит в последнее время генная инженерия. Примером могут служить трансгенные растения, в которые перенесена от Bacillus thuringiensis генетическая информация о синтезе эндотоксина с выраженным инсектицидным эффектом. Заверения в полной экологичности и безопасности таких растений вряд ли заслуживают полного доверия, поскольку синтезируемый растениями токсин в активной форме аккумулируется в почве в результате связывания с глинистыми частицами и гумусовыми веществами. Нередко заявления о преимуществах трансгенных растений не подкреплены достаточно надежными статистическими данными и представляют собой агрессивную рекламу на рынке семян. В общем случае экспрессия новой генетической информации в силу принципа сохранения требует дополнительных энергозатрат, а значит, в ряде весьма типичных случаев объекты генной инженерии будут характеризоваться пониженной конкурентоспособностью. Доказано, что микробные сообщества контрольных и трансгенных растений существенно различаются. Трансгенные растения с высокой устойчивостью к гербициду действительно могут давать относительно высокий урожай, но это преимущество в полной мере будет реализовано лишь в ситуации с применением гербицида. Понятно, что такие ситуации нельзя считать оптимальными по экологии. Научным мифом является также утверждение об отсутствии риска при применении генноинженерных микробных популяций. Факты, которыми располагает популяционная экология почвенных микроорганизмов, позволяют с недоверием относиться к подобным утверждениям. В частности, создание оптимальных условий в почве в краткосрочном эксперименте (3 —- 8 сут) для клубеньковых бактерий в конечном счете неожиданно приводило к гибели данной полезной популяции на 50-е сутки, т.е. в зависимости от масштаба времени принципиально менялся знак эффекта управления. Таким образом, динамику конкретных микробных популяций не удается предсказывать на достаточно большие времена, причем малые причины действительно имеют большие следствия. Интродуцированная микробная популяция действует в рамках почвенного микробного сообщества. Знак эффекта существенно 92
зависит от состояния почвенной микробной системы (системы более высокого уровня иерархии) в момент интродукции популяции и посева семян, что определяет нестабильность эффектов при применении бактериальных удобрений. Надежда, что все проблемы интродукции микробных популяций можно решить с помощью биоинженерных процедур без экологического анализа, не оправдана. Современные подходы к регуляции биоты почвы предполагают нарушение цикличности на уровне как микрокосма, так и макрокосма. Для контроля почвенной биоты требуется полная информация о системе. Между тем, по точному определению Т. Брока, природные местообитания микроорганизмов характеризуются именно тем, что их нельзя полностью контролировать. Это определение в полной мере относится и к экологии подпочвенных микроорганизмов. В последнее время пересматриваются привычные представления о том, что микроорганизмы в наземных экосистемах сосредоточены в основном в почве, а ролью микроорганизмов в подпочвенных слоях можно вообще пренебречь. Микробная жизнь в глубинах литосферы не просто существует. Она уникальна, разнообразна и представлена автономными микробными системами. Если принять во внимание доказанную способность к активной жизнедеятельности при 110°С и исходить из усредненного температурного градиента (увеличение температуры на 15 —25 °С с каждым километром), то микроорганизмы могут функционировать на глубине 4—7 км. Таким образом, среда обитания микроорганизмов в литосфере представляет собой не тонкую поверхностную пленку, а слой толщиной в несколько километров. В отличие от микробного блока почвы, который функционирует на основе продуктов фотосинтеза, автономные микробные системы литосферы не зависят от солнечной энергии, а в качестве ресурсов используют глубинные газы (Н2, СО. С02, СН4), а также некоторые соединения серы (S0, БОз", S203") и запасы органического углерода. В литературе представлены гипотезы о возможности существования подобных микробных экосистем на Марсе (на глубине около 2 км) и на тектонически активных спутниках планет-гигантов. Пока пространственно-временные характеристики глубинных микробных экосистем, существующих на основе «дыхания» планеты (газовые эксгаляции), практически не изучены. Неопределенность, в частности, выявилась в ходе разработки проектов по захоронению радиоактивных и высокотоксичных отходов в глубинах литосферы. Завершая краткое рассмотрение экологии почвенных микроорганизмов, можно сделать вывод, что микробное население, функционирующее в данной сложной гетерогенной и гетерохрон- 93
ной среде, выполняет многообразные фундаментальные экосис- темные функции. С точки зрения прикладных проблем установлена непосредственная связь между деятельностью почвенных микроорганизмов и глобальными проблемами, включая проблемы продовольствия, климата, ликвидации загрязнений. Вполне очевидно, что природные почвенные и подпочвенные микроорганизмы не являются случайным набором разнообразных микробных популяций, а в определенном пространственно-временном масштабе действуют как телеономическая система, способная к противодействию (в смысле правила Ле Шателье) и самовосстановлению. Поэтому попытки взять под полный контроль данные микробные системы представляются утопичными. 2.6. Роль микроорганизмов в глобальных циклах элементов Интенсивное развитие промышленности и сельского хозяйства в годы, последовавшие за окончанием Второй мировой войны, сопровождалось растущим из года в год потреблением всех видов природных ресурсов (полезных ископаемых, пресной воды, лесных ресурсов, целинных почв и т.д.) с одновременным ухудшением условий окружающей среды, особенно в крупных городах и индустриальных областях нашей планеты. Впервые за всю историю цивилизации люди начали понимать, что ресурсы планеты и ее биосферы не безграничны и их потребление необходимо контролировать и по возможности возобновлять. К сожалению, классические методы прямого учета и количественной оценки специализированных групп микроорганизмов на элективных питательных средах не дают информации о реальной геохимической деятельности микроорганизмов в природных условиях, поскольку на питательных средах вырастают не только активные микробы, но и все жизнеспособные формы, включая споры и покоящиеся клетки. Современные молекулярно-биоло- гические методы также не позволяют количественно оценивать активность микроорганизмов в условиях in situ. Поэтому для количественной оценки специализированных физиологических групп микроорганизмов в биогеохимические процессы круговорота биогенных элементов (углерода, серы, кислорода, азота), были разработаны специальные методы и подходы, основанные на детальном изучении геохимических условий в природных экосистемах, населенных микроорганизмами, а также методики, основанные на использовании радиоактивных и стабильных изотопов. Детальный анализ распределения субстратов и метаболитов специфических физиологических групп микроорганизмов позволяет в ряде случаев получить ценную информацию о геохимиче- 94
ской активности микроорганизмов в природных условиях. Так, например, при анализе послойного распределения метана по профилю заболоченной почвы или анаэробного озерного ила можно составить представление о продукции метана метаногенами и о процессах микробного окисления части этого метана. Анализируя изменение содержания сульфата и сероводорода в подземном водоносном горизонте от области «питания» до области «разгрузки», можно получить довольно полное представление о масштабах процесса сульфатредукции в изучаемых подземных водах. Более полную информацию о природных микробиологических процессах получают при проведении краткосрочных экспериментов с изолированными природными образцами (озерная, морская и подземная вода, образцы почвы, грунта и донных осадков), к которым добавляют радиоактивно меченные субстраты, используемые теми или иными физиологическими группами микроорганизмов. Данными методами определяют содержание специфического субстрата (М, мг/кг или мг/л), радиоактивность добавленного меченого субстрата (R, имп/мин на 1 л или 1 кг) и радиоактивность метаболитов (г, имп/мин), образовавшихся за время краткосрочной инкубации (/, ч) изолированного образца, населенного микроорганизмами. Расчет продукции метаболитов (Р) осуществляют по формуле Р = Mr/Rt (мг на 1 л или 1 кг природного образца за 1 ч). Разработанные отечественными микробиологами методы количественной оценки геохимической активности микроорганизмов с использованием меченых соединений углерода и серы широко используются во всем мире для количественной оценки активности фото- и хемоавтотрофных бактерий, метаногенов, ме- танотрофов, сульфатредукторов, аэробных и анаэробных серных и тионовых бактерий. Полезную информацию о природных микробиологических процессах дает также изучение соотношения стабильных изотопов серы, углерода, азота, кислорода и водорода в различных природных соединениях (органические вещества, серные и углерод- содержащие газы и минералы), образуемых и потребляемых микроорганизмами. Лабораторные эксперименты с чистыми культурами микроорганизмов (рис. 2.5) показали, что продукты метаболизма заметно обогащаются легкими стабильными изотопами, а в остаточном субстрате происходит накопление тяжелых стабильных изотопов. Наиболее изотопно легкие метаболиты накапливаются при использовании первых порций субстрата (рис. 2.5, А, В) и при медленной удельной скорости потребления субстрата (рис. 2.5, ?). Кроме того, величина эффекта фракционирования стабильных изотопов при прочих равных условиях выше на небольших моле- 95
со2, % Д13С, %о 20 т Ю-10 мл СН4 20 на клетку/ч НСО], % Рис. 2.5. Закономерности фракционирования стабильных изотопов углерода в экспериментах с чистыми культурами микроорганизмов: А — потребление С02 и образование СН4 автотрофными метаногенами (по оси абсцисс — время культивирования, ч; по оси ординат — С, мг); Б — изменение величины А13С новообразованного метана и остаточной С02 (по оси абсцисс — потребление С02, % от исходного содержания; по оси ординат — Д13С, %о); В — зависимость величины фракционирования изотопов углерода от скорости метано- генеза при использовании одноуглеродных (Сх) и двууглеродных субстратов (С2) (по оси абсцисс — скорость метаногенеза, 10~10 мл СН4 на клетку в час; по оси ординат — величина Д13С, %о); Г— изменение величины Д13С метильной и карбоксильных групп ацетата и остаточного бикарбоната в зависимости от доли потребленного бикарбоната в процессе ацетогенеза чистой культурой Sporomusa sphaeroides (по оси абсцисс — потребление НСОз, %; по оси ординат — Д13С, %о) 96
кулах субстрата (рис. 2.5, В) и зависит от количества ступеней ферментативного синтеза метаболита (рис. 2.5, В). Изотопный состав химических соединений измеряется на специализированных изотопных масс-спектрометрах и выражается в промиллях, т.е. тысячных частях, показывающих относительное обогащение (положительные величины А13С или A34S, %o) или обеднением (отрицательные величины А13С и A34S) тяжелым изотопом по сравнению с соотношением изотопов 12С и 13С и 32S и 34S в стандартах, где оно принято за нулевое. Небольшие величины фракционирования стабильных изотопов (в пределах долей промиллей и единиц промиллей) наблюдаются и при таких физико-химических процессах, как диффузия, растворение газа в жидкости, кристаллизация из растворов. Однако эти величины не идут ни в какое сравнение с масштабами фракционирования, проходящего при процессах метаболизма (рис. 2.5, Г). Важно подчеркнуть, что изотопный состав минералов, органических веществ и газов микробного происхождения не изменяется с момента образования этих соединений, поэтому по изотопному составу можно судить не только о современных микробных процессах, но и процессах, происходивших в геологическом прошлом нашей планеты. В последней трети XX в. были проведены многочисленные исследования скоростей природных биогеохимических процессов, позволившие создать физические модели глобальных циклов биогенных элементов (рис. 2.6 и 2.7). Модели состоят из оценок запасов тех или иных элементов в различных геосферах (атмосфере, гидросфере, почве, литосфере) и потоков вещества (стрелки на рис. 2.6 и 2.7) между основными резервуарами. На рис. 2.6 приведена схема глобального цикла серы. Основные потоки, соединяющие четыре главных природных резервуара (атмосферу, почву, литосферу и гидросферу), не связаны с деятельностью живых организмов. Исключение составляет процесс сульфатредукции в восстановленных донных осадках Мирового океана. Результаты экспериментальных определений скорости процесса бактериальной сульфатредукции в различных зонах океана, полученные с помощью методики краткосрочных экспериментов с добавкой Na235S04, приведены в табл. 2.1. Из таблицы следует, что максимальные скорости сульфатредукции, достигающие первых десятков миллиграммов серы на кубический дециметр осадка в сутки, обнаруживаются в донных отложениях шельфа, где оседают максимальные количества свежего органического вещества из речного стока и зоны фотосинтеза. По мере удаления от берега и увеличения глубины морского бассейна скорость сульфатредукции снижается, а в осадках подножия континентального склона измеряется уже долями микрограмма на дециметр кубический в сутки. 4 11струсов 97
S* -zS '-JOS <zOSv w* киээиме вюгеэьинюнгЛд ^—E а эинвагаиид* w" -zOS ИЭ1ГОЭ xiraodow wdao киээиие ( .г§ энвэяо wouqdxxo я iqdso иинэн -ияэоэ хитлаижолгос киээиие _jS энвэяо woxiqdxxo я iqdao уинэн -иЯэоэ хитлаижояхосЮл киээиме ,;S XBHOHgd xiqHxadQHdu a iqdao иин -энияэоэ хитЛаижояхойоя киээии^у о -г§ аохнэнихном о iqdso цинэни!Г <%?- w * -ЭОЭ ХИШЛаИЖОЯХС^ОЯ ЪИООИП?ф1. -ZS аохнэнихноз э iadao иинэнтг -ЭОЭ ХИШХЯИЖ0ЛГ01Г КИЭЭИИ1? a -tos c*i OS KHDDHWG-s^ OS ихнэнихнох вн эинваимид 2 ь- .Д О CQ О О <U X 3 о о. « в s О О е §? -zS ' ?os о4 <;qs киээике ^ *ивмээьинвя1гЛд Р Р- -?OS ниээике кв&<шо? KBHH9JOUOOLHV о* О *-« 1°°° " Р "Я з- о so ja ? 5 Q. S 3 J3 О, 98
Океан Аэробное окисление (40) Атмосфера (725) Фотосинтез (43) I Фитопланктон (3) Осаждение органического вещества (3) Континенты Дыхание Фотосинтез (60) (43) t i, _ (15) Растения (110) (54-60) 1\ Аэробное окисление " (1,9) * _ Анаэробные щ процессы (0,4) Осаждение - СаС03 (40) Гетеротрофные организмы (45) (40) (15) Подстилка (60) Донные осадки Захоронение (0,7) (5-6) СаСОя (2-5) Почва (1300) Торф (100) Ископаемое топливо (5000-10 000) Литосфера Рис. 2.7. Резервуары (в прямоугольниках) и потоки глобального геохимического цикла углерода (цифры в скобках — количество углерода в мегатоннах в год) В полном соответствии с законами биологического фракционирования стабильных изотопов находится и изотопный состав восстановленных серных соединений из донных осадков разных зон океана. В глубоководных осадках с очень медленной скоростью суль- фатредукции и небольшой долей потребления сульфата, имеющего во всем океане A34S, близкую к +20 %о, восстановленные соединения серы (H2S, гидротроилит, пирит и другие сульфидные минералы) обеднены тяжелым изотопом серы до A34S = -56 %о. В осадках шельфа с высокой скоростью процесса сульфатредукции и почти полным потреблением сульфата поровых вод значения A34S восстановленной серы обычно положительные, а остаточный сульфат очень сильно обогащен изотопом 34S (A34S — до +50 %о). 99
Таблица 2.1 Экспериментальные определения скорости процесса бактериальной сульфатредукции в Мировом океане ИГеоморфол оги - ческая зона Внутренний шельф Внутренний шельф Континентальный склон Континентальный склон Глубоководные впадины [Итого Глубина, м 0-50 50-200 200-1000 1000 -4000 >4000 Площадь зоны, 10,2м2 13 18 15 106 208 360 мкг/кг 55,6 37,2 28,2 5,5 1,0 — A34S, 24,2 — 33,2 — 41,1 — Р, Мт/год 79,2 53,1 201,0 158,6 — — Мт/год 59,5 40,0 151,0 119,2 — 369 с 1 Мт/год 940 750 164 117 36 1907 Суммарная продукция восстановленной серы в осадках океана достигает 492 Мт серы в год (см. табл. 2.1). Таким образом, годовая продукция микробного сероводорода почти в три раза превышает суммарную годовую добычу всех видов серосодержащего сырья (169 Мт, см. рис. 2.5), используемого человечеством. Основная часть микробного сероводорода, образующегося в восстановленных донных осадках, окисляется в верхних горизонтах осадков или в придонной воде, однако около 111 Мт восстановленной серы ежегодно связывается с металлами и выводится из глобального круговорота в виде сульфидов, главным из которых является дисульфид железа — пирит (см. рис. 2.6). Полученные экспериментальным путем оценки глобальной продукции микробного сероводорода позволяют рассчитать и количество органического углерода, потребляемого анаэробными сульфатредукторами в осадках Мирового океана. Эти цифры, рассчитанные по реакции S04~ + 2Сорг -> S2~ + 2C02, также приведены в табл. 2.1. Как будет видно при рассмотрении глобального цикла углерода, на долю сульфатредуцирующих бактерий приходится потребление более 10 % органического вещества, поступающего из зоны фотосинтеза в донные осадки. Главным отличием глобального цикла углерода (см. рис. 2.7) от цикла серы (см. рис. 2.6) является ведущая роль в реакциях цикла живых организмов, в первую очередь фотосинтезирующих организмов, продуцирующих органическое вещество из С02, и микроорганизмов, разлагающих органику и возвращающих С02 в круговорот углерода. 100
В континентальном секторе за счет совокупной деятельности беспозвоночных животных и микроорганизмов (органотрофных бактерий и мицелиальных грибов) ежегодно минерализуется порядка 50—55 Гт (гигатонн) органического углерода листового опада. Еще от 3 до 6 Гт органического углерода почвы и торфа также минерализуется микроорганизмами. Из 43 Гт органического углерода, фиксируемого в процессе фотосинтеза в Мировом океане, около 40 Гт минерализуется в водной толще, причем участие микроорганизмов в этом процессе оценивается в 70 — 75 %. Кроме того, из 3 Гт органического углерода, достигающих поверхности донных осадков океана, более двух третей минерализуется донной микрофлорой, при этом аэробные ор- ганотрофы окисляют 1,9 Гт органического углерода, сульфатредук- торы минерализуют 0,37 Гт, метаногены — 0,04 Гт (см. табл. 2.1). На рис. 2.7 приведены также цифры, характеризующие вклад индустриального общества в потоки углерода на нашей планете. Суммарная оценка выброса в атмосферу углерода в виде С02 за счет сжигания всех видов ископаемого топлива (каменный уголь, нефть, газ) составляет 5 —6 Гт в год. Таким образом, геохимическая активность микроорганизмов, метаболизирующих природные органические вещества, более чем на порядок величин превышает минерализующую активность шестимиллиардного населения Земли. Систематические наблюдения за изменением химического состава атмосферы, организованные с середины прошлого века, и изучение состава газовых пузырьков в ледниках Антарктиды и Гренландии, позволяющие судить об изменении химического состава атмосферных газов за последние 300—400 лет, показали, что в атмосфере Земли нарастающим темпом увеличивается содержание так называемых парниковых газов, в первую очередь С02 и СН4. Увеличение концентрации парниковых газов может привести к потеплению климата планеты, что будет сопровождаться таянием ледников и вечномерзлых почв и грунтов, повышением уровня Мирового океана и опустыниванием наиболее плодородных по- чвенно-климатических зон, в частности зоны русских черноземов. В связи с проблемой увеличения концентрации парниковых газов усилился интерес к изучению круговорота метана, поскольку, хотя содержание метана в атмосфере значительно ниже, чем содержание С02, ежегодный прирост концентрации этого газа в атмосфере в три раза выше, чем концентрации С02, и, кроме того, парниковый эффект метана в 23 раза выше, чем парниковый эффект такого же количества С02. Из приведенных в табл. 2.2 данных следует, что основная часть метана, поступающего в атмосферу, имеет микробное происхождение. 101
Основными источниками микробного метана являются болотные и увлажненные почвы, в том числе поля для выращивания риса, а также растительноядные животные и термиты, у которых метан образуется в пищеварительном тракте. Приведенные в табл. 2.2 оценки потоков метана микробного происхождения в атмосферу следует рассматривать в качестве минимальных оценок продукции метана в таких анаэробных экосистемах, как болота, увлажненные почвы и донные осадки озер и морей. Дело в том, что значительная часть метана, образуемого мета- ногенами в этих экосистемах, не достигает атмосферы, так как на границе аэробных и анаэробных условий существенная часть метана (до 50 % и более) окисляется аэробными метанотрофами. Более того, в последние годы показано, что сообщество пока еще не идентифицированных анаэробных метанотрофов и суль- фатредукторов окисляет часть метана в строго анаэробных условиях. Детали механизма анаэробного окисления метана и взаимодействия компонентов микробного сообщества находятся в стадии изучения и обсуждения, однако сам факт интенсивного анаэробного окисления метана, по крайней мере в морских осадках и анаэробной водной толще, четко регистрируется с помощью краткосрочных экспериментов in situ с добавкой |4СН4 и уже не вызывает сомнений. Таблица 2.2 Потоки метана в атмосферу (Мт/год) Источник Поток | Потоки микробного происхождения Заболоченные почвы и болота Плантации риса Растительноядные животные Термиты Свалки Океан 1 Тундра Всего 120-200 70-170 80-100 25-125 1 5-70 1-20 1-5 320—715 Источник Поток | Антропогенные и геологические источники \ Индустриальные потери Выхлопы автомобилей Потери на газопроводах Сжигание лесов Угольные шахты Разрушение метаногидратов Вулканы Всего 20-55 0,5 10-20 10-40 10-35 2-4 0,5 53-155 102
Таким образом, если в глобальном цикле серы крупномасштабная геохимическая активность микроорганизмов проявляется лишь на этапе восстановления сульфатов до сероводорода (см. рис. 2.6), то в глобальном цикле углерода их активность сопоставима с активностью фотосинтезирующих организмов, а биогеохимический цикл метана практически полностью зависит от активности микроорганизмов, продуцирующих и потребляющих метан. Не вызывает сомнения также, что микроорганизмы, в особенности азотфиксаторы и нитрификаторы первой и второй фазы, играют ведущую роль в глобальном цикле азота, а водородокис- ляющие и углеводородокисляющие бактерии являются основными потребителями водорода, жидких и газообразных углеводородов в аэробных условиях. К сожалению, количественная оценка этих процессов как на экосистемном, так и на глобальном уровне пока сдерживается методическими трудностями. Это же замечание относится и к оценке геохимической деятельности микроорганизмов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях преобразования элементов с переменной валентностью (железо, марганец, уран, технеций и др.). Продолжение этих исследований и осознание, а тем более количественная оценка роли микроорганизмов в крупномасштабных природных процессах круговорота элементов в биосфере — это путь к созданию новых биотехнологий добычи и переработки полезных ископаемых и к разработке эффективных методов очистки окружающей среды, основанных на использовании специфических групп микроорганизмов. На этом пути уже сделаны первые шаги: разработаны и широко используются в горнодобывающей промышленности биотехнологии бактериально-химического извлечения цветных и благородных металлов (см. 4.4), биогеотехнологические методы повышения нефтеотдачи и многочисленные технологии очистки бытовых и промышленных сточных вод (см. 4.2). ЛИТЕРАТУРА Основная Громов Б. В., Павленко Г. В. Экология бактерий. — Л.: Изд-во ЛГУ, 1989. Заварзын Г.Л., Колотилова И. И. Введение в природоведческую микробиологию. — М.: Книжный дом «Университет», 2001. Кузнецов С. #., Горленко В. М., Дубинина Г. А. Экология водных микроорганизмов. — М.: Наука, 1977. Кузнецов С. И., Иванов М. В., Ляликова Н. Н. Введение в геологическую микробиологию. — М.: Наука, 1962. Кожевин П. А. Микробные популяции в природе. — М.: Изд-во МГУ, 1989. 103
Дополнительная Бабьева //. П., Зенова Г. М. Биология почв. — М.: Изд-во МГУ, 1989. Бактериальная палеонтология / Под ред. А. Ю. Розанова. — М.: ПИН РАН, 2002. Биология гидротермальных систем / Отв. ред. А. В.Гебрук. — М.: КМК Press, 2002. Добровольская Т. Г. Структура бактериальных сообществ почв. — М.: ИКЦ «Академкнига», 2002. Жизнь микробов в экстремальных условиях / Под ред. Д. Кашнера. — М.: Мир, 1981. Заварзин Г. А. Бактерии и состав атмосферы. — М.: Наука, 1983. Заварзын ГА. Лекции по природоведческой микробиологии. — М.: Наука, 2003. Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы. — М.: Изд-во МГУ, 1987. Иванов М. В., ФренейДж. (ред.) Глобальный геохимический цикл серы и влияние на него деятельности человека. — М.: Наука, 1983. Круговорот углерода на территории России / Под ред. Н. П. Лаверова, Г.А.Заварзина. — М.: Изд-во МГУ, 1999. Кузнецов С. И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность. — Л.: Наука, 1970. Леин А. Ю.} Бримблекумб П. Эволюция глобального геохимического цикла серы. — М.: Наука, 1985. Bolin В., Degens E.T., Кетре S., Ketner />. The global carbon cycle. — Chichester: J.Wiley a. Sons, 1979. Rogers J. E., Whitman W.B. (eds.). Microbial production and consumption of geenhouses gases: methane, nitrogen oxides and halomethanes. — Washington D.C.: Amer. Soc. Microbiol., 1991.
ГЛАВА 3 ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ СТРАТЕГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ВО ВЗАИМООТНОШЕНИЯХ С МИКРООРГАНИЗМАМИ, ЖИВОТНЫМИ И РАСТЕНИЯМИ Экологическая стратегия — это сформировавшиеся в различных условиях естественного отбора способы взаимодействия организмов с внешней средой. Благодаря разным реакциям определенных организмов на одинаковые изменения условий среды возможно оптимальное развитие популяций, а также переживание ими неблагоприятных условий. 3.1. Особенности экологической стратегии и биотических связей у микроорганизмов 3.1.1. Комплексность экологической стратегии микроорганизмов Теория основных типов экологических стратегий, соответствующих разным типам отбора, была разработана фитоценологами и зоологами. Согласно этой теории, различные организмы достигают преимуществ в борьбе за существование, используя один из трех типов экологической стратегии: • ^-стратегии — благодаря наиболее эффективному использованию ими субстрата (ресурсов), т. е. высокой конкурентоспособности и достижению высокой плотности популяции; • г-стратегии — благодаря их высокой удельной скорости роста при освоении новых субстратов; • L-стратегии — благодаря их чрезвычайно высокой приспособленности к переживанию неблагоприятных условий. Дальнейшее изучение экологических стратегий показало, что даже некоторые высшие растения (например, одуванчик), на примере разных типов отбора которых была разработана эта теория, способны реализовать в борьбе за существование не одну, а все три основных типа канонических г-А^-стратегий. Каждая из этих стратегий становится одним из элементов их общей стратегии жизни. Для микроорганизмов характерны элементы нескольких типов экологических стратегий. Например, даже в популяции одного штамма бактерий, хотя она и представляет собой клон потомков 105
одной клетки, имеются диссоцианты. Это отдельные группы клеток в клональной популяции, отличающиеся особенностями структуры генома, что обусловливает изменения морфологических, физиологических и биохимических свойств этих клеток. Обычно в популяциях присутствуют три основных вида диссоциантов, различающихся прежде всего по морфологии клеток. Их отличия в скорости потребления субстратов и другие реакции на изменения условий жизни напоминают реакции г-, К-, Z-стратегов. Кроме того, у микроорганизмов определено много типов экологических стратегий, которые неизвестны у высших растений и животных. В качестве примеров приведем относительно недавно обнаруженные у различных прокариот: жизнеспособное, но не культивируемое состояние — некультивируемая форма многих неспорулиру- ющих бактерий (НФБ, см. подразд. 2.5); экстремофильность; экст- ремотолерантность; образование структурированных популяций в биопленках, образование нанобактерий при наступлении неблагоприятных условий. Важно подчеркнуть, что динамика численности микробных популяций в природных местообитаниях определяется не столько соотношением скорости размножения и смертности, как у высших организмов (на основе чего и рассчитаны уравнения, описывающие экологические стратегии), сколько выживаемостью в неблагоприятных условиях. Таким образом, у большинства микроорганизмов стратегия жизни — комплексная. Она складывается из многих типов реакций, комбинация которых чрезвычайно велика, на изменения факторов среды обитания. Как известно, есть две группы таких факторов — абиотические и биотические. 3.1.2. Биотические связи с участием микроорганизмов Биотическими факторами, или связями, называют прямое или косвенное влияние жизнедеятельности одних живых организмов на другие. В этой главе рассматриваются связи не между абстрактными популяциями организмов, как обычно принято в общей экологии, а только между популяциями различных микроорганизмов, а также между одним макроорганизмом-хозяином и микроорганизмами. Микроорганизмы образуют разнообразные биотические связи практически со всеми живыми существами, причем один многоклеточный организм (макроорганизм) вступает в биотическую связь не с одной клеткой микроорганизма, а по крайней мере с одной клональной, но все равно гетерогенной (благодаря диссоциации) популяцией таких клеток. В природе обычно взаимодействуют популяции нескольких видов микроорганизмов как с макроорганизмом, так и между собой. Две основные формы межвидовых биотических связей — это антибиоз и симбиоз. 106
Антибиоз (от греч. «anti» — против, «bios» — жизнь) — невозможность сосуществования двух видов организмов, основанная на конкуренции, прежде всего за источники питания, а также за другие факторы среды. Между микроорганизмами такие взаимоотношения чаще называют не антибиозом, а конкуренцией (от греч. «concurrere» — сталкиваться). Если обоим микроорганизмам нужны одинаковые ресурсы или другие факторы среды, их конкуренция называется пассивной, а если при этом один микроорганизм подавляет развитие другого благодаря образуемым им продуктам обмена, — активной. Активную конкуренцию между различными организмами обычно называют антагонизмом (от греч. «antagonis- та» — спор, борьба), если один вид задерживает или полностью подавляет развитие другого, и взаимным антагонизмом, если угнетение взаимно. Однако если один вид образует метаболиты, подавляющие развитие другого вида, не получая при этом ни пользы, ни вреда, говорят об аменсализме (от лат. amens — безрассудный). Одна популяция микроорганизмов может подавлять развитие других благодаря своим продуктам обмена — органическим кислотам, щелочам, спиртам, ферментам гидролазам и особенно антибиотикам. Антибиотики — это специфические конечные продукты обмена (или их модификации), подавляющие жизнедеятельность некоторых микроорганизмов с разной избирательностью. Они имеют различную химическую природу: от простых ациклических соединений до сложных структур, в состав которых часто входят модифицированные полипептидные цепи. Синтез таких соединений проходит различными путями, причем чаще в период завершения экспоненциального роста, поэтому их называют вторичными метаболитами. Антибиотическими свойствами обладают также некоторые белки, синтезированные на рибосомах. Обычно их антибиотическая активность высокоспецифична по отношению к близкородственным микроорганизмам или к животным (в таких случаях их называют бактериоцинами или токсинами соответственно) и менее специфична к некоторым другим микроорганизмам. Сейчас известно более 10 тыс. синтезируемых микроорганизмами соединений, проявляющих антибиотическую активность. Еще один случай антагонистических взаимоотношений — хищничество, при котором одна группа организмов использует другие в пищу. Для микроорганизмов примеры хищничества относительно редки. Между хищниками и жертвами существуют только пищевые отношения, а пространственные отсутствуют. Однако при этом происходит процесс взаимоприспособления, сопряженная эволюция в системе «хищник—жертва», включаются механизмы группового отбора. При особой форме хищничества — инквили- низме (от лат. «inquilinus» — пришелец) — организм-инквилин, 107
проникая в жилище своей жертвы, питается ею и использует оставшееся жилище в качестве убежища. Среди биотических факторов выделяют и нейтрализм (от лат. «neutralis» — ни тот, ни другой) — отсутствие взаимного влияния организмов, находящихся в составе одного биоценоза. Но так как организмы являются членами одного сообщества, между ними обязательна хотя бы косвенная взаимозависимость. По-видимому, нейтрализмом иногда называют невыясненную опосредованную форму взаимного влияния организмов. Самая многообразная группа межвидовых биотических связей — симбиозы (от греч. «symbiosis» — совместная жизнь). Симбиозы — это различные формы совместного существования разных организмов. Термин «симбиоз» ввел в науку А. де Бари в 1879 г. В результате симбиотических связей приобретается возможность выигрыша в борьбе за существование у одного или всех членов симбиоза. Основой для возникновения симбиозов могут быть трофические, пространственные, защитные и другие типы связей. Обычно под симбиозами понимают весь спектр взаимоотношений совместно живущих организмов. Границы между различными типами симбиозов часто трудно различимы и неопределенны. Иногда разные формы симбиотических взаимоотношений могут переходить друг в друга. Микроорганизмы вступают в наибольшее число симбиотических отношений со всеми живыми существами именно благодаря гибкости и разнообразию своей стратегии жизни. Типы симбиоза выделяют по нескольким признакам. • По обязательности симбиотической связи: а) факультативный, когда каждый из организмов при отсутствии партнера может жить самостоятельно; б) облигатный, когда один из симбионтов (или оба) оказывается в такой зависимости от другого, что не может существовать самостоятельно. • По расположению микросимбионта (микроорганизма) относительно макросимбионта: а) эктосимбиозы — в этом случае более мелкие члены симбиотической системы (эпибионты) располагаются на поверхности макросимбионта; б) энтосимбиозы, когда эндосимбионты (их еще называют эн- добионтами) располагаются внутри тела хозяина, в том числе в различных, иногда специализированных, полостях тела. • По характеру отношений между симбионтами: а) мутуализм (от лат. «mutuus» — взаимный) — форма взаимовыгодного симбиоза организмов, при котором существование обоих или одного из партнеров невозможно без сожителя; б) комменсализм (от лат. «сот» — с, вместе и «mensa» — трапеза, а также от фр. «commensal» — сотрапезник) — форма сожи- 108
тельства, приносящая пользу одному партнеру и безразличная для другого; выделяют варианты комменсализма: сотрапезничество, нахлебничество, синойкию — «квартирантство»; в) паразитизм (от греч. «parasites» — нахлебник) — форма межвидового антагонистического сожительства, при которой один вид (паразит) использует другой (хозяина) как источник питания и среду обитания, нанося при этом вред хозяину. Паразитизм очень широко распространен среди микроорганизмов. Хозяин для паразита является средой обитания первого порядка, через хозяина происходит регуляция взаимоотношений паразита с внешней средой — средой второго порядка. Особое отличие этого типа биотических связей от большинства других: влияние паразитов на состояние экосистем осуществляется благодаря не трофическим, а патогенным воздействиям их на популяции хозяев. Паразитов подразделяют по различным признакам: — по локализации — эктопаразиты (живущие на поверхности тела хозяина) и эндопаразиты (живущие в полостях тела или в тканях внутренней среды хозяина); — по обязательности связи с хозяином — облигатные и факультативные паразиты; — по времени контакта с хозяином — временные, посещающие хозяина только для питания, и постоянные; — по отношению с хозяином в конкретном пищевом звене — первичные и вторичные (паразиты первичных), которых еще называют надпаразитами или сверхпаразитами. Одна из форм паразитизма — носительство — выживание и сохранение (благодаря адаптации) паразитов в организме хозяина, которые не приводят к его гибели. Еще пример взаимной адаптации микро- и макроорганизмов: авирулентные штаммы возбудителей инфекций, способные размножаться в организме хозяина, не причиняя ему существенного вреда. 3.1.3. Особенности симбиотических отношений между микроорганизмами Симбиотические взаимоотношения между различными микроорганизмами, в которых хотя бы один из партнеров получает выгоду, иногда называют не симбиозами, а кооперацией. Кооперация встречается между микроорганизмами реже, чем конкуренция. В зависимости от степени связи различают несколько типов кооперации. При наибольшей степени кооперации говорят о консорциуме (от лат. «consortium» — соучастие) — структурированной симбиотической ассоциации из двух или большего числа видов различных микроорганизмов с высокой степенью интеграции их метаболизма. Однако микроорганизмы могут жить практически со- 109
вместно и без объединения в единую симбиотическую структуру благодаря их микрозональному развитию. Эти осмотрофы объединены общим межклеточным матриксом, состоящим из полисахаридов, а также гликопротеинов, полиглутаминовой кислоты и других биополимеров. Через слизь матрикса посредством молекулярной диффузии происходит не только обмен субстратами и продуктами, но и обмен сигнальными молекулами, свободно диффундирующими через клеточную мембрану. Наиболее изученными среди таких соединений являются ауто- индукторы. Информационная связь между клетками одного или разных видов грамотрицательных бактерий осуществляется обычно с помощью ацильных производных лактона L-гомосерина, а грамположительных —- с помощью пептидов, модифицированных пептидов, аминокислот (например, дикетопиперазинов, фурано- нов, циклических тиолактон-пептидов). Эта связь регулируется посредством системы «quorum sensing» — эффекта кворума, зависящей от плотности микробной популяции. Только при достижении высокой плотности клеток бактериальной популяции образуется комплекс аутоиндуктора с определенными генами, активизирующий транкрипцию генов, кодирующих синтез ферментов, токсинов, антибиотиков и других соединений. Впервые системы регуляции типа «quorum sensing» были обнаружены при исследовании биолюминесценции морских бактерий. Сейчас показано, что подобным образом регулируется синтез многих биологически активных веществ у микроорганизмов —- представителей родов Proteus, Serratia, Citrobacter, Erwinta, Escherichia, Pseudomonas, Staphylococcus и др. Системы регуляции такого типа играют чрезвычайно важную роль и при взаимодействии бактерий с макроорганизмом. Эффектом кворума определяется также образование биопленок — структурированных комплексов микроколоний и продуктов их жизнедеятельности (особенно полисахаридов), прикрепленных к поверхностям и более устойчивых к антимикробным агентам и дезинфектантам. Эффект кворума обусловливает также возникновение способности к движению по твердому субстрату у некоторых клеток-«бродяжек» при колониальном развитии микроорганизмов. Следовательно, благодаря регу- ляторным системам кворума происходит обмен информацией между отдельными клетками микробной популяции, дающий ей возможность выбрать оптимальный вариант взаимодействия с внешней средой и с клетками макро- и микроорганизмов. Известны также двухкомпонентные сенсорно-регуляторные системы бактерий, обеспечивающие поступление сигнала в клетку путем аутофосфорилирования сенсорных белков и передачи ими фосфатной группы соответствующим белкам-регуляторам, которые в фосфорилированной форме осуществляют контроль за необходимым ответом клеток на эти сигналы. ПО
Таким образом, в микрозонах существует своеобразная совместная жизнь микроорганизмов, при которой естественно возникновение между ними биотических связей различной интенсивности. Так, метабиозом называют комменсализм в пищевой цепи, если последующий член пищевой цепи получает выгоду от «работы» предыдущего. Наиболее интересен синтрофический тип кооперативных взаимоотношений между микроорганизмами. Синт- рофия (от греч. «syn» — вместе, «trophe» — пища) — способность различных микроорганизмов осуществлять такой процесс, который ни один из них не может осуществить в отдельности (например, обмен субстратом, удаление из среды токсических продуктов, двунаправленный перенос соединений серы и др.). Такую взаимную зависимость партнеров друг от друга нельзя ослабить (убрать) добавлением какого-либо субстрата. Например, благодаря синтрофным ассоциациям микроорганизмов проходит межвидовой перенос молекулярного водорода. Как известно, если водород накапливается в среде, то реакции сбраживания летучих жирных кислот и спиртов становятся энергетически невыгодными. Благодаря окислению водорода до метана в синтрофных ассоциациях с метанобразующими прокариотами реакции сбраживания пропионата, бушлата, лактата, этанола до ацетата ацетогенными микроорганизмами становятся энергетически выгодными при низком парциальном давлении водорода. Условность классификации биотических связей и нечеткость их отграниченности друг от друга являются отражением эволюции не только взаимодействующих видов, но и самих межвидовых взаимоотношений. Обычно популяция микроорганизмов одного вида взаимодействует посредством нескольких разных биотических связей с другими микроорганизмами, населяющими общего хозяина, а во взаимоотношениях каждой из микробных популяций с макроорганизмом-хозяином чаще прослеживается один вид биотической связи, который, как уже указывалось, может изменяться. Эволюционная роль таких взаимоотношений чрезвычайно велика. 3.1.4. Эволюционная роль симбиотических взаимоотношений с участием микроорганизмов Гипотеза симбиогенеза и ее значение. Симбиозы стали мощным фактором эволюции более 1 — 1,5 млрд лет назад, начиная с образования эукариотической клетки. Это принципиальное усложнение организации клетки скорее всего является результатом сим- биотического объединения древних прокариот. Гипотеза эндосим- биотического происхождения эукариот (гипотеза симбиогенеза) впервые была высказана К. С. Мережковским в 1910 г. Сейчас она 111
получила много подтверждений на молекулярном уровне благодаря работам Л. Маргулис, хотя пока не признана теорией. Митохондрии произошли от аэробных органотрофных грамотрицатель- ных бактерий, а пластиды — от оксигенных цианобактерий. Это подтверждается также сравнительным анализом их 16S рРНК и белков. Труднее всего объяснить, каким образом в клетках прокариот, неспособных к фагоцитозу, могли оказываться другие про- кариоты-эндобиоты. Предложили, что такое взаимодействие происходило у древних бактероидных доклеточных форм, так как слабая специализация клеток способствует их лучшей приспособляемости к изменяющимся условиям. Высказано также мнение, что прокариотические клетки, давшие начало пластидам, митохондриям и, возможно, ядру, поглощались путем фагоцитоза клеткой-предшественницей эукариотической. Вероятно, у некоторых древних прокариот могла возникнуть способность к фагоцитозу, чему предшествовало тесное объединение прокариотических клеток, подобное нынешним консорциумам. Появилось сообщение о возможности фагоцитоза даже у современных прокариот. В любом случае принципиально важной является разделяемая многими учеными главная мысль гипотезы симбиогенеза о том, что эукариотическая клетка возникла в результате комплексного эндосимбиоза нескольких прокариотических. Такая система облигатного эндосимбиоза преобразовалась в новый организм — эукариотический. Произошел глобальный аро- морфоз (принципиальное усложнение организации), положивший начало развитию многоклеточное™ и образованию нового над- царства — эукариот. Одноклеточных и колониальных представителей этого надцарства иногда объединяют общим названием «протесты», считая их низшими эукариотами. Именно у протистов происходило, вероятно, становление основных типов питания и клеточных систем. При этом протесты вновь вступали в симбиозы с прокариотами, что значительно расширило их возможности в борьбе за существование. Симбиотические взаимоотношения разных одноклеточных эукариот привели к возникновению многоклеточное™. Многоклеточные организмы также вступали в симбиозы с микроорганизмами. Их совместная жизнь определяет и их совместную эволюцию (коэволюцию). Значение коэволюции в симбиозах микроорганизмов с макроорганизмами. Необходимы ли микроорганизмам, вступающим в различные симбиозы, особые свойства по сравнению со свободно- живущими микроорганизмами? Для микроорганизма более крупный организм — новая экологическая ниша, которую он стремится занять, используя все свои адаптивные возможности, выработанные в процессе эволюции. Это — способность к адгезии, колонизации, синтезу антибиотиков, ферментативная активность и т.д. За 2,5 млрд лет эволюции 112
прокариот (до возникновения эукариот) уже сложились многие типы биотических взаимоотношений, позволяющие этим микроорганизмам выживать в борьбе за существование. При использовании в качестве новой экологической ниши других живых организмов микроорганизмы столкнулись с новыми трудностями — реакциями хозяина на воздействие симбионта. Осталось и большинство «старых» проблем (кроме, пожалуй, недостатка питания), так как необходимо устанавливать разные типы биотических связей и с другими микроорганизмами, вступившими в симбиоз с этим хозяином. Таким образом, в организме хозяина создается микроценоз, члены которого взаимодействуют между собой разными биотическими связями, а также осуществляют взаимодействие с хозяином, а уже через него — с внешней средой. Для успешной борьбы за существование в новых условиях у микроорганизмов должны были в результате эволюции усовершенствоваться старые возможности и выработаться (появиться) новые, например способствующие проникновению в организм хозяина специфические факторы подавления его защитных реакций и др. Поэтому при совместном (симбиотическом) существовании микроорганизмов с макроорганизмом идет процесс их коэволюции. Это приводит к увеличению генетической пластичности симбиотических, особенно микробных, популяций. В последних наиболее интенсивно стимулируются перенос генов и селективные процессы. Так, с помощью современных методов по- пуляционной генетики на примере энтеробактерий показано, что у этих симбионтов высших организмов (как мутуалистов, так и паразитов) популяции в целом более разнообразны, чем у сво- бодноживущих форм или у малоспециализированных симбионтов. Также показано, что хозяин (макросимбионт) обычно оказывает более сильное влияние на структуру микросимбионтов, чем условия окружающей среды. Для микроорганизмов-симбионтов характерен особый тип изменчивости — экотипическый полиморфизм. Это одновременное присутствие в популяциях микроорганизмов форм как симбиоти- чески активных, так и асимбиотических, способных только к автономному образу жизни. Экотипический полиморфизм связан с присутствием или отсутствием «симбиотических» генов, которые или компактно локализованы на хромосомах (например, в составе генных кассет, «островов патогенности»), или находятся на специальных плазмидах. Перенос генов вносит в структуру симбиотических бактериальных популяций не менее значимый вклад, чем мутации или отбор, так как обычно приводит к возникновению генотипов с качественно новыми (расширенными) экологическими возможностями. Такие новые генотипы являются материалом для макроэволюции прокариот. 113
Большинство случаев интенсивного переноса генов выявлено у бактерий, взаимодействующих с высшими организмами, именно для этих прокариот характерны более полиморфные популяции, чем для свободноживущих. В ряде симбиозов микробные клетки дифференцированы на две формы: участвующие в создании эффекта мутуализма и ответственные за размножение популяции. Кроме того, в симбиотических системах у микроорганизмов иногда проявляются признаки, которые не нужны для самих микроорганизмов, однако повышают жизнеспособность хозяина. Происходит коэволюция симбионтов в составе эволюционирующих сообществ, поэтому обычно облигатные симбионты не способны развиваться вне организма хозяина. Симбионты используют общий поток энергии, экспрессия их генов часто регулируется совместно. Кроме того, есть много путей взаимной передачи между членами симбиоза физиологической, клеточной, организменной, социальной информации благодаря уже упомянутым регулятор- ным системам или их модификациям. Таким образом, симбиотические взаимоотношения микроорганизмов с макроорганизмом-хозяином являются важным эволюционным фактором для всех членов этой системы. Иногда их называют внутренним фактором эволюции. Благодаря огромному разнообразию взаимоотношений микроорганизмов со всеми представителями царств живой природы эволюция микроорганизмов проходит под воздействием более многочисленных форм отбора в их сложном сочетании во времени и пространстве, чем у высших растений и животных. 3.2. Роль симбиозов прокариот с протистами и микроорганизмами в эволюции биосистем 3.2.1. Симбиозы прокариот и протистов Сейчас известно более 10 тыс. симбионтов из разных групп протистов, что составляет около 10 % от их общего числа. Среди этих симбионтов-протистов многие вступили в симбиозы с многоклеточными животными. Однако значительная часть симбиозов протистов с прокариотами ведет и свободный образ жизни. Например, инфузории Paramecium candatum образовали облигатные видоспецифичные эндосимбиозы с бактериями Holospora obtusa, H. undulata, H. recta, Nonospora macronucleata. Эти бактерии, как и многие другие облигатные эндосимбионты, не выделяются в чистую культуру, так как они не могут развиваться вне организма хозяина. Бактериальные клетки (по данным электронной микроскопии) способны находиться в двух состояниях: вегетативные — длиной до 2 мкм, размножающиеся бинарным делением, и в 10 раз 114
более длинные, неподвижные, неделящиеся, служащие для заражения других инфузорий. Эта дифференцировка клеток обеспечивает сохранение симбионтов в окружающей среде и заражение ими другого хозяина. Эндобионты размножаются в микронуклеусе парамеций, при этом происходит активизация микронуклеуса, парамеции нормально делятся, но не могут вступать в половой процесс. Эти симбиозы были описаны одними из первых в конце XIX в. и приводились И.И.Мечниковым в качестве примера паразитизма бактерий в клетках простейших. У Paramecia aurelia изучены эндосимбионты — представители рода Caedibacter (С. taeniospiralis, С. varicaedens). Внутри некоторых клеток у популяции этих бактерий обнаружены белковые /?-тела, образованные скрученной белковой лентой. Бактериальные клетки с Л-телами не размножаются. Парамеции, не содержащие бактерий рода Caedibacter, гибнут при заглатывании /?-тел. По-видимому, таким способом эндосимбионты способствуют преимущественному развитию именно парамеций — своих хозяев. В цитоплазме парамеций живут и другие симбионты, например до нескольких сотен бактерий — представителей родов Lyticum, Tectibacter. Значительное число симбиозов протистов с прокариотами увеличивает приспособительные возможности обоих членов, т. е. является мутуалистическими. Так, бактерии—облигатные эндосимбионты обнаружены в цитоплазме и ядрах более 100 видов различных амеб, а также у гемофлагеллят. При этом бактерии, потерявшие клеточную стенку, окружены в клетках протистов дополнительной мембраной хозяина: находятся в его симбионтофорной вакуоли. Клетки эндобионтов могут и свободно лежать в цитоплазме. Очень редко эндобионтов обнаруживают в перинуклеарном пространстве, еще реже — в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме. Обычно эндобионты протистов — это различные грамотрицательные бактерии. Показано на многих примерах, что они снабжают макросимбионта витаминами, ростовыми факторами, например гемином, аминокислотами и другими соединениями. Известны и эпибионты протистов. Такие прокариоты ассоциированы с поверхностью клеток протистов в течение большей части их жизненного цикла. Особенно характерны эпибионты для жгутиконосцев парабазалий и оксимонад, а также некоторых инфузорий. Они прежде всего снабжают хозяина веществами, необходимыми для его нормального развития. Часть таких эпибионтов (например, спирохеты) участвует в движении клетки протиста. Особенно плодотворными оказались симбиотические связи протистов с археями-метаногенами. Такие симбиозы значительно расширили ареалы своего местообитания, так как получили возможность размножаться в пищеварительной системе многих животных. Наличие метаногенов легко обнаружить в симбиозах благодаря тому, что их специфический фермент, участвующий в об- 115
разовании метана (фактор F42q), в окисленном состоянии обладает сильной зеленой флуоресценцией. Поэтому при освещении синим светом все метаногены флуоресцируют. Метаногены — строгие анаэробы. Симбиоз с ними привел протестов к вторичной анаэробности. Они имеют в своих клетках особые органеллы-гидрогеносомы, образовавшиеся из митохондрий. Протисты-симбионты известны, например, среди реснитчатых (Ciliata): Metopuspalaeformis, Trimyema compression, Plagyopylafrontata, жгутиковых (Flagellata): представителей отрядов Oxymonadida, Retor- tamonadida. Известна ассоциация Methanobacteriumformicicum с гид- рогеносомами Psalteriomonas и некоторых анаэробных инфузорий. К вторичным анаэробам, имеющим гидрогеносомы, относятся также хитридиевые грибы. Гидрогеносомы и метаногены-сим- бионты (например, Methanobacteriumformicicum, Methanoplanus endo- symbiosis) вместе выполняют функцию митохондрий (синтез АТФ) в анаэробных условиях. При этом они выделяют Н2. Иногда у сравнительно больших цилиат (например, у Plagyopyla frontata) гидрогеносомы и метаногены, такие как Methanocorpusculum parvum, некоторые виды рода Methanospirillum, образуют подобную сэндвичу структуру, которая обеспечивает оптимальный перенос молекулярного водорода. На рис. 3.1 показана схема потока субстрата и функции гидрогеносомы в клетке строго анаэробного протиста. Высокомолекулярные биополимеры, попадая в пищевую вакуоль протиста, расщепляются в ней до мономеров и далее до пирувата, который поступает в гидрогеносому. Здесь пируват расщепляется до ацетата, который затем окисляется в цикле трикарбоновых кислот, подобно тому как это происходит и в митохондрии. Выделившаяся энергия запасается в виде АТФ. Однако протоны не могут соединиться с кислородом (из-за его отсутствия), как это происходит в оксиген- ных условиях, и выделяются в виде Н2. Этот молекулярный водород поступает к метаногену, где при взаимодействии с С02 превращается в метан. Благодаря этому снижается давление водорода и реакция становится необратимой. Таким образом, в симбиозе с метано- генами клетка протиста проводит ферментативный метаболизм с максимальным выходом АТФ. Показано, что скорости роста и выход биомассы у таких протистов-симбионтов на треть выше, чем у контрольных культур. Метаногены могут достигать 10 % от общей массы клетки протиста (до 700 клеток на клетку протиста). Каждый вид протиста обычно содержит метаногенов-симбионтов только одного вида. Обнаружены и метаногены-эпибионты, также окисляющие водород. Анаэробные симбиозы протистов и метаногенов часто являются компонентами сложных микроценозов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) многих животных, питающихся растительной пищей. Они необходимы там для того, чтобы выделяющиеся при 116
Полимерный субстрат Мономеры Метаноген- эндобионт со2 сн4 Метаноген- эпибионт JC02-^CH4 Рис. 3.1. Поток субстрата и функции гидрогеносомы в клетке строго анаэробного протиста расщеплении значительной части сложных органических субстратов водород, ацетат и другие компоненты окислялись до метана, процесс становился необратимым и термодинамически выгодным. 3.2.2. Значение симбиозов с участием микроорганизмов в питании растительноядных животных Микроценозы ЖКТ животных, питающихся преимущественно растениями, выполняют в организме хозяина ряд важных задач: • входят в состав трофических цепей, приводящих к расщеплению сложных целлюлозосодержащих биополимеров до легко усвояемых хозяином мономеров; • обеспечивают непрерывность и термодинамическую выгодность таких процессов в условиях ЖКТ; • обеспечивают хозяина витаминами, ростовыми факторами, регуляторами развития, как выделяемыми микроорганизмами, так и поступающими хозяину в результате гидролиза биомассы мик- робионтов; • защищают хозяина от патогенных микроорганизмов; • активируют системы иммунитета хозяина. 117
При использовании растительной пищи прежде всего должны быть расщеплены целлюлозосодержащие клеточные стенки растений. Часто такая пища содержит еще гемицеллюлозу, лигноцел- люлозу и другие трудно гидролизуемые целлюлозосодержащие биополимеры. Следует подчеркнуть, что животные не способны синтезировать целлюлазы. Поэтому в процессе эволюции возникли симбиозы животных с разными микроорганизмами — продуцентами активных гидролаз, расщепляющих целлюлозосодержащие биополимеры. Это дало возможность таким симбиозам эффективно развиваться за счет органических соединений, образуемых растениями — первичными продуцентами. Как известно, наиболее активные целлюлазы, ксиланазы, лиг- ноцеллюлазы экскретируют грибы. Среди насекомых, питающихся древесиной (термиты, тараканы, личинки жуков рода Melo- loutha, двукрылых рода Tipula и др.), описаны виды, вступившие в своеобразный симбиоз с грибами: они выращивают в своих жилищах «грибные сады». В определенных местах термитников, муравейников такие насекомые хранят размельченные части листьев (как, например, муравьи), свежей или сухой древесины, гумуса, сухих экскрементов жвачных животных, обогащенные лигнином, целлюлозой (как, например, термиты субсемейства Масго- termitinae), на которых развивается мицелий грибов. Наиболее изучены трофические цепи термитов — экологически очень важных насекомых, перерабатывающих 3 — 7 млрд т лингоцеллюлозы в год. «Грибные сады» выращивают термиты, основная пища которых содержит наиболее трудно гидролизуе- мую лигноцеллюлозу древесины. Обычно к ним относят низших термитов. У других термитов (в большинстве — высших), питающихся древесными остатками, клетчатка разлагается преимущественно эндобионтами. В «грибных садах» встречаются чаще всего представители родов Termitomyces, Altemaria, Aspergillus, Trichoder- ma, Chaetomium. Проведенные исследования с термитами Termopci- dae, Rhinotermitidae показали, что насекомые не могут жить без «грибных садов», т.е. симбиоз грибов и насекомых-ксилофагов му- туалистический. Расщепленные гидролазами грибов растительные остатки поедаются насекомыми. Насекомые могут использовать и органические соединения, синтезированные грибами, благодаря их симбиозам с протистами и прокариотами, синтезирующими хитиназы и глюкозаминидазы. Процесс разложения хитина, остальных растительных и грибных макромолекул происходит уже в пищеварительной системе, преимущественно — в задней кишке термитов. В нем принимает участие сложный микроценоз, в котором есть все типы биотических связей. У высших термитов, к которым относятся 3Д всех термитов, в этом микроценозе преобладают бактерии. В кишечнике низших термитов много жгутиковых протистов. Они составляют по- 118
ловину всей микрофлоры кишечника этих термитов, питающихся древесиной. Среди протистов-симбионтов термитов выделены представители родов Oxymonas, Lophomonas, Trychonympha, Nyctitherus и др. У всех термитов среди микрофлоры значительную часть составляют молочнокислые бактерии. Половина всех микробионтов задней кишки этих насекомых — анаэробы и строгие анаэробы, являющиеся обязательными компонентами синтрофных ассоциаций, благодаря которым проходит межвидовой перенос молекулярного водорода. Поэтому для описываемого микроценоза наиболее благоприятны аноксигенные условия. Однако оксигенная фракция в объеме кишечника термитов составляет около 40 %. Анаэробы преобладают на периферии задней кишки, в слизи, покрывающей ее внутреннюю поверхность. Среди них есть синтезирующие каталазу и супероксиддисмутазу аэротолерантные археи — представители родов Methanobrevibacter, Methanosarcina. Филогенетическое сравнение микроорганизмов кишечника низших и высших термитов показало, что у них различаются группы мета- ногенов, а также 7>е/юле/гш-подобных спирохет, представителей Bacteroides и азотфиксаторов (среди них и азотфиксирующие спирохеты). Это отражает особенности пищевого поведения разных семейств термитов. Разложение сложного органического материала в пищеварительной системе растительноядных животных происходит благодаря кооперации различных трофических групп микроорганизмов согласно общей для таких процессов схеме (рис. 3.2). В этом разложении обычно участвуют разные синтрофные группы микроорганизмов: 1) первичные бродилыцики (гетеротрофы), включая сульфат- редукторов; 2) водородокисляющие и (реже) ацетатрасщепляющие мета- ногенные бактерии; 3) гомоацетогенные бактерии (встречаются не всегда). В отличие от полной конверсии сложного органического материала в природных осадках или при очистке сточных вод подобная система в ЖКТ растительноядных животных приспособлена прежде всего к эффективному расщеплению углеводов до жирных кислот, сукцината, лактата, пропионата, бутирата и других полезных для организма хозяина соединений, которые всасываются слизистой оболочкой его ЖКТ. Бактериями, осуществляющими брожение у термитов, являются представители родов Clostridium, Sporomusa, Bifidobacterium, Edwardsidella, Micromonospora, Microbacterium, многие виды которых — облигатные эндобионты термитов, например Seboidella (Bacteroides) termitidis. В состав микроценоза задней кишки термитов входят ряд актиномицетов, а также крупные спирохеты Cristispira 119
Целлюлозосодержащие полимеры клеточных стенок растений Л Мономеры 1 1 А \ Жирные кислоты, лактат (всасываются слизистой оболочкой хозяина), сукцинат, спирты 2 1 Ацетат (всасывается слизистой оболочкой хозяина) 2 ? н2, со2, нсо3, СН3- R 3 1 сн4,со2 Рис. 3.2. Утилизация целлюлозосодержащих полимеров клеточных стенок растений симбиотической системой рубца жвачных животных: 1 — первичные бродилыдики (бактерии и грибы); 2 — вторичные бродилыци- ки (бактерии); 3 — водородо кисляю щи е метаногенные археи — симбионты простейших и грибов pectinis длиной до 80 мкм и некоторые риккетсии, синтезирующие вещества, необходимые для нормального размножения и развития хозяина. Пищеварение термитов, как и других ксилофагов, происходит в двухступенчатом процессе. Окисление органических соединений в анаэробных условиях обязательно дополняется «работой» метано- генов — свободноживущих (Methanobrevibacter arboriphilus, представителей рода Methanosphaera) и в симбиозе с протистами, как уже было описано (см. рис. 3.1). Необратимый и термодинамически выгодный в этом случае процесс завершается выделением сероводорода, углекислого газа и метана. У почвенных термитов преимущественно выделяется метан, а у древесных — ацетат. У некоторых термитов, питающихся в основном грибами, активны гомоацетат- ные бактерии, сходные с представителями рода Acetobacterium, поэтому такие насекомые выделяют водород. Часть трудноразлагае- мых полимеров, типа гумуса, остается негидролизованной и выделяется вместе с мочевой кислотой и другими пищевыми остатками, а также с некоторым количеством микроорганизмов. Значительно усложнился микроценоз, обеспечивающий разложение богатой клетчаткой пищи, у жвачных млекопитающих. 120
У этих животных весь процесс, включая гидролиз деревянистых частей растений (ксилемы), происходит в преджелудках. Самый большой из них — рубец, составляющий 85 % объема сложного желудка жвачных. Масса рубца достигает 10 —20 % от общей массы животного. Рубец — это природный ферментер, в котором поддерживается постоянная температура (37 — 39 °С), рН (6,5 — 7,0), осуществляется периодическое поступление питательных веществ, перемешивание субстрата и отток непереваренных остатков корма и метаболитов в низлежащие отделы пищеварительного тракта жвачных. Это обеспечивает расщепление растительной пищи с большим количеством клетчатки (70—85 % сухого вещества корма) за 0,5 — 2 суток. Сложное многокомпонентное сообщество прокариот, грибов и протистов рубца, включающее эндо- и экто- симбиозы, ассоциации, консорциумы, а также свободноживущих анаэробных микроорганизмов, устанавливается у молодняка в первые дни после рождения, передаваясь ему с кормом и слюной матери. Нормальная (присущая здоровому животному) микрофлора рубца располагается на поверхности клеток слизистой и в рубцо- вой жидкости. Число клеток протистов в рубце достигает 200 тыс. в 1 мл, а прокариот — нескольких миллиардов. Гидролиз лигнинсодержащих оболочек растительных клеток в рубце обеспечивается прежде всего хитридиевыми грибами — вторичными анаэробами. Они имеют гидрогеносомы и водородокис- ляющих метаногенов-симбионтов, подобно тому как это описано для протистов. Только хитридиомицеты способны разлагать наиболее устойчивую растительную ткань-ксилему — благодаря комплексу своих экскретируемых полисахараз. Из рубца выделено несколько видов хитридиомицетов — представителей рода Neocalli- mastix: N. frontalis, N. patriciarium, N. joyonii, а также Sphaeromyces communis, Orpinomyces bovis, Anaeromyces mucronatus. Показан синергизм целлюлозолитического действия в сокультуре грибов и ряда прокариот, в том числе свободноживущих метаногенов. В то же время целлюлозолитические бактерии подавляют активность грибов. Анаэробные жгутиковые протисты рубца, например представители родов Dasytricha, Entodindium, Epidinium, переваривают меньше всего (не более четверти от всего количества) растительных волокон по сравнению с грибами и бактериями. Хитиназа и глю- козаминидаза протистов способны лизировать клеточные стенки грибов. Протисты поглощают зооспоры хитридиомицетов, которые тесно связаны с поверхностью протистов в период поступления субстрата и отделяются после переваривания последнего. Среди бактерий рубца многие синтезируют также высокоактивные хитиназы и целлюлазы, например клостридии. При питании крупного рогатого скота рисовой соломой клостридии даже более интенсивно размножаются в рубце, чем грибы. Из рубца выделен и ряд уникальных прокариот, обладающих выраженной целлюлозо- 121
литической активностью, например Butyrivibrio fibrisolvens, В. cros- sotus, Ruminococcus albus, ft. flavefaciens, Bacteroides (Fibrobacter) succinogenes и др. В переваривании пектина важную роль играют Lachnospira multiparus. Из рубца выделены также Wolinella succinogenes, Anaerovibrio lipolytica, Bacteroides fragilis, Ruminobacter amylophilus, Selenomonas sputigena, Succinimonas amylolytica, Succinivibrio dextrinisolvens, Syntrophococcus sucromutans, Micromonospora chalcea, Anaeroplasma abactoclastricum и многие другие бактерии. Методом сканирования генома в рубце обнаружена уникальная субпопуляция штаммов Е. сой. Для нормальной деятельности микроценоза рубца особенно важны синтрофные ассоциации микроорганизмов, основанные на межвидовом переносе водорода, как уже отмечалось и для микроценозов насекомых-ксилофагов, причем конечные продукты, образующиеся при развитии синтрофных ассоциаций, обычно иные, чем при развитии соответствующих чистых культур. Например, Selenomonas ruminantium в чистой культуре сбраживает глюкозу с образованием лактата, а в рубцовой синтрофной ассоциации с Methano- brevibacter ruminantium образуются ацетат, метан и углекислый газ. Только из рубца выделен строгий анаэроб Methanospirillum hungatei, который образует облигатную синтрофную ассоциацию с Syntropho- monas wolfei. Бактерия окисляет насыщенные жирные кислоты с образованием ацетата или ацетата и пропионата, передавая водород архею или сульфатвосстанавливающим бактериям — представителям Desulfovibrio. При этом в синтрофной ассоциации накапливается метан или сероводород соответственно. Прокариоты, как и другие микроорганизмы рубца, не только кооперируются в процессе пищеварения, но и вступают в антагонистические взаимоотношения. Например, R. albus выделяет бактерицидный белок, подавляющий рост R. flavefaciens. За период до 2 суток, когда происходит разложение пищи в рубце, не развиваются ацетат-расщепляющие метаногены или синтрофные микробные ассоциации, окисляющие жирные кислоты. Система рубца еще больше, чем микроценоз насекомых- ксилофагов, приспособлена к эффективному сбраживанию углеводов до жирных кислот — основного энергетического источника в питании жвачных, всасывающихся слизистой оболочкой и обеспечивающих наряду со всем комплексом веществ микробной биомассы (основным источником аминокислот) оптимальное питание животных-хозяев. Обобщенное стехиометрическое уравнение ферментации в рубце выглядит приблизительно так (моль): 57,5 глюкоза —> 65 ацетат + 20 пропионат + 15 бутират + 60 углекислый газ + 35 метан + 25 вода. Общая масса микроорганизмов рубца коровы превышает 30 кг. У коров длина ЖКТ больше длины тела животного в 20 раз, у лошади — в 12 раз, у человека — в 7 раз. 122
Микроценоз рубца составляет нормальную микрофлору этого отдела пищеварительной системы жвачных животных. Другие микроценозы сложились в ряде других отделов ЖКТ, а также в других полостях тела животных. При изменении условий жизни, ведущих к ослаблению иммунитета животного, лишении его соответствующего питания, лечении антибиотиками может произойти сукцессия микроценозов. Особенно чувствительны микробионты, прикрепленные к слизистой, которые при ослаблении организма хозяина, его заболевании заменяются патогенами. В то же время при повреждении слизистой рубца микробионты могут проникать в другие органы животного, становясь там патогенами, как, например, бактерия Fusobacterium necroforus, способная вызывать некротическое поражение печени. Микроценозы ЖКТ других животных менее изучены. У многих грызунов процессы, сходные с перевариванием пищи в рубце, происходят в слепой кишке и ее червеобразном отростке, где также сложились уникальные микроценозы. В их составе обнаружены крупные (длиной до 25 мкм и диаметром 5 мкм) некультивируе- мые бактерии Metabacterium polyspora, способные к образованию нескольких эндоспор в клетке. Интересно, что у птиц, питающихся растительной пищей и семенами, подобно грызунам, микроценозы ЖКТ существенно иные. Показано, что доминирующей микрофлорой (у индеек и кур) являются бактерии, осуществляющие молочнокислое брожение. Это многие виды рода Lactobacillus', acidophilus, salivarius,fermentum, buchneri, ruminis, vitulinus, delbrueckii, viridescens, а также стрептококки. У гусей и уток преобладают Streptococcus faecium, S.faecalis. Для клеток некоторых из этих микробионтов характерен большой полиморфизм. Многие из обнаруженных у птиц бактерий проявляют специфический антагонизм в отношении Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium smegmatis, Nocardia asteroides, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и других патогенов. Такая способность показана для ряда членов нормальных микроценозов многих животных. Симбиозы с микроорганизмами обеспечивают полноценное развитие всех животных, имеющих узкоспециализированный тип питания. Например, бактерии-эндобионты рода Buchnera снабжают молодых тлей, питающихся соком растений, рибофлавином и другими важными для нормального развития соединениями. Сами эндобионты также необходимы для полноценного питания тлей. Показано совместное видообразование членов этого симбиоза, причем передача Buchnera осуществляется вертикально, т. е. потомству. Нет горизонтальной передачи этих эндобионтов даже среди близкородственных тлей-хозяев, что говорит о высокой специфичности симбиоза. Следует помнить, что в состав симбиотических микроценозов растительноядных животных часто входит множество микроорга- 123
низмов, хотя иногда изучают отдельных преобладающих уникальных симбионтов. Тех из симбионтов, которые выделяются из организма постоянно, называют резидентными. Однако штаммы резидентных микроорганизмов обычно заменяются другими штаммами через несколько недель или месяцев. Микроорганизмы, выделяемые только однажды или в течение очень непродолжительного периода времени, называют транзитными. Филогенетический анализ показал, что бактерии-эндобионты (или эндоцитобионты) насекомых в большинстве случаев относятся к группе у 3-протео- бактерий семейства Enterobacteriaceae, близкородственных представителям родов, которые располагаются между Proteus и Yersinia. Часто встречаются в ЖКТ насекомых и микоплазмы, особенно Acholeplasma entomophilum. Человек питается разнообразной растительной и животной пищей. При таком смешанном типе питания наиболее обильна микрофлора толстой кишки. Ее представителями-прокариотами являются энтерококки, кишечная палочка, бифидобактерии, стрептококки, лактобациллы и другие молочнокислые бактерии. Часто встречаются также определенные виды родов Clostridium, Bacteroides, Ruminococcus, Butyrivibrio, Eubacterium. Нормальная микрофлора ЖКТ человека обеспечивает переваривание пищи, стимулирует перистальтику кишечника, участвует в расщеплении макромолекул, в синтезе ряда витаминов группы В, витаминов Е и К, фолиевой и никотиновой кислот, а также незаменимых аминокислот. Она способствует усвоению солей кальция, а также витамина D, улучшает работу иммунной системы. Обычно микроорганизмы покрывают слизистую оболочку ЖКТ, защищая поверхностные рецепторы от патогенных микроорганизмов. Показано, что молочнокислые бактерии ЖКТ человека подавляют развитие патогенов, выделяя ряд бактериоциноподобных веществ. Нарушение нормального состава кишечной микрофлоры называют дисбактериозом. У человека, как и у различных животных, микроценозы локализованы не только в ЖКТ, но и в других полостях тела и на его поверхности. Состав таких микроценозов в большей степени определяется организмом хозяина и в меньшей — типом питания и другими факторами внешней среды. Нагляден в связи с этим пример образования зубных бляшек, представляющих собой смешанную нормальную микрофлору разных областей полости рта, накапливающуюся на поверхности зубов. Микроценоз бляшки стабилен на протяжении больших отрезков времени, несмотря на то что он длительно формируется (в течение 16—18 лет в период роста детей) и вынужден постоянно обновляться в связи с чисткой зубов. Специальные исследования показали, что состав нормального микроценоза зубной бляшки практически не зависит от диеты хозяина и сходен у большинства взрослых здоровых людей. Глав- 124
ную роль в поддержании целостности и стабильности этого микроценоза играют не пищевые метабиотические взаимодействия, а межклеточные физико-химические связи — межродовая коаггре- гацыя бактерий, а также их способность к образованию биопленок. Именно сложные и прочные межклеточные связи между микроорганизмами, а не конкуренция за субстрат, обеспечивают стабильность сообщества зубной бляшки, а также способность к самоорганизации и самовоспроизведению в постоянном составе. Благодаря таким взаимодействиям состав нормальной микрофлоры зубной бляшки с видами и родами-эндемиками высокостабилен и сходен у разных представителей Homo sapiens. Возможно, зубная бляшка является результатом эволюции сообщества в целом и действия жесткого стабилизирующего отбора на уровне всей гетерогенной популяции людей. 3.2.3. Симбиозы микроорганизмов и морских животных В последние десятилетия пристальное внимание исследователей привлекают симбиозы микроорганизмов и морских животных, хотя первый из них, со светящимися бактериями, был описан Р. Пьерантони еще в 1918 г. Сейчас известно, что в кишечнике многих морских животных (рыб, моллюсков и др.) развиваются светящиеся бактерии — представители родов Photobacterium, Vibrio, которые обладают хитиназной активностью, необходимой для гидролиза оболочек планктона — главной пищи большинства морских относительно крупных животных. Свечение (биолюминесценция) происходит благодаря ферменту люциферазе и регулируется системой кворума: свечение отсутствует при малых концентрациях микробных клеток, живущих в морской воде, и резко усиливается при достижении популяцией критической плотности (кворума) в организмах животных. Светящиеся бактерии могут входить и в высокоспециализированные симбиотические системы, не связанные с перевариванием пищи. При этом они населяют, достигая плотности 10й клеток/мл, особые полые органы эктодермального происхождения — бактериофотофоры, которые соединены выводным протоком с внешней средой. Потому такие связи являются эктосимбиозами. Некоторые головоногие моллюски имеют вспомогательные органы, напоминающие рефлекторы и линзы, которые усиливают мощность свечения. Светящиеся органы выполняют различные функции в половом размножении, во взаимоотношениях организмов в популяции, важны при отпугивании врагов. Например, свечение головоногих моллюсков Euphymna scolopes, резко возрастающее ночью благодаря эффекту кворума, обеспечивает им сравнительную безопасность, предохраняя от атаки хищников снизу, 125
так как из глубин океана свечение сходно с лунным светом, и тело моллюска теряет тень. Плотность популяции бактерий, а следовательно, и эффект свечения регулируются самим моллюском в течение суток. Для губок главным источником питания служит бактериальная часть планктона. Эндобионты губок (представители около 20 родов гетеротрофных бактерий, а также цианобактерии-фототрофы) поддерживают фильтрационную активность животных благодаря очищению бактериальными гидролазами каналов внутри тела губок, а также снабжают своих хозяев комплексом витаминов и других биологически активных соединений. Симбионты живут преимущественно в бактериоцитах, достигая 40 % от всей массы клеток губок. Симбиотическая кишечная микрофлора рыб также участвует в деструкции пищевого материала (планктона, водорослей), защищает хозяев от вирулентных морских микроорганизмов. Например, в кишечнике нескольких видов рыб-хирургов обнаружены гигантские (длиной до 600 мкм) грамположительные прокарио- ты-эндобионты, которых выделили в особое семейство Epulopiscia- сеае. Их покрытые толстой кутикулой клетки со жгутиками способны к зеленой флуоресценции. Некоторые черты этих прокариот сходны с чертами протистов, например электронноплотная трубчатая сеть мембран в цитоплазме, способность поделившихся клеток находиться в общей оболочке. По результатами анализа 16S рРНК представитель этого семейства Epulopiscium fishelsoni — эндобионт живущей в Красном море рыбы Acanthurus nigrofuscus, близок к Metabacterium polyspora. Полагают, что в результате коэволюции рыб — акантурид и их микробионтов, начавшейся более 60 млн лет назад, свободноживущие формы этих уникальных прокариот не сохранились. По этой же причине в настоящее время известны только как облигатные эндобионты цилиаты из кишечника термитов и многие другие микробионты. Бактерии-симбионты кишечника морских животных участвуют не только в полостном или внеклеточном пищеварении. Резидентная микрофлора морских животных, например губок и моллюсков, также экскретирует много ферментов, гидролизующих пищу, используемую преимущественно организмом хозяина. Так осуществляется симбионтное пищеварение. При этом решающей является способность гидролаз разрушать клеточные оболочки бактерий — существенной части планктонной пищи многих животных. В данном процессе большую роль играют лизоцимы — ферменты, гид- ролизующие пептидогликаны. В свою очередь, многие бактерии, например кишечная палочка, выделяют ингибиторы лизоцима. Лизоцим-антилизоцимные взаимодействия играют большую роль в поддержании устойчивости водных биоценозов. Обитатель северных морей моллюск-гребешок Clamys islandica запасает в своем ЖКТ лизоцимподобный фермент хламизин в виде 126
кристаллических включений, накапливая его для интенсивного гидролиза бактерий планктона. Этот лизоцим не только лизирует клеточные стенки бактерий по известному механизму, но и проявляет антимикробный эффект даже после потери ферментативной активности, разрушая бактериальную цитоплазматическую мембрану. Это дает возможность эффективно преодолевать анти- лизоцимную активность бактерий. Неферментативная антимикробная активность, показанная и для нескольких других лизоцимов, — один из примеров полифун- кционааъности белков. В соответствии с принципом экономии генома некоторые белки способны проявлять не одну, а две отличающиеся активности, осуществляемые обычно различными участками своих молекул по разным механизмам. Полифункциональность особенно важна при вступлении микроорганизмов в различные биотические связи. Так, лектины Bacillus polymyxa не только связываются с углеводными остатками на поверхности клеток, но и обладают протеолитической активностью; некоторые высокоспецифичные белковые токсины, убивающие животных (например, Cry-белки Bacillus thuringiensis), проявляют наряду с этим и менее специфический антимикробный эффект. Роль прокариот в глубоководных симбиозах является определяющей. Один из ярких примеров морских симбиозов — особые экосистемы на дне океана на глубинах в несколько километров, в градиентных условиях между анаэробными и аэробными. Впервые жизнь в таких условиях была выявлена в 1977 г. вокруг гидротермальных источников. Среда обитания вблизи гидротермальных выходов отличается не только наличием высокой температуры, но и обогащением восстановленными соединениями — сероводородом, метаном, водородом, двухвалентными ионами железа, марганца, сульфита и др. Подобные условия очень благоприятны для бактериального хемосинтеза и/или окисления метана. В других биотопах в океане также встречается повышенная концентрация восстановленных соединений. Все такие биотопы были названы восстановительными — это помимо гидротермальных источников холодные метановые высачивания (сипы), зоны кислородного минимума, изолированные или полуизолированные водоемы типа фьордов, места захоронения органики (например, трупы китов) и др. Наиболее интенсивное развитие жизни встречается в восстановительных биотопах, связанных с глубинными источниками тепла. Полагают, что области, где сконцентрированы гидротермальные системы, занимают до Уз площади Мирового океана. Часто в этих местах образуются вертикально стоящие геологические структуры из сульфидов и серного ангидрида до 25 м высотой — «черные курильщики». Сроки их жизни — несколько сотен тысяч лет. У жерла «курильщика» температура может достигать 400 °С и выше, но она быстро падает. Встречаются и менее 127
разогретые «белые курильщики». Из верхней части «черных курильщиков» выходит черный «дым» с очень высоким содержанием сероводорода. В этом «дыме» и на поверхности труб курильщиков, где температура составляет 10—25 °С, обнаружены высокоспецифичные представители 20 типов животных: инфузорий, саркомастигофор, турбеллярий, нематод, олигохет, вестименти- фер, коловраток и др. Эти сообщества животных занимают относительно небольшие площади дна, но достигают значительной биомассы. Многие из них имеют значительно большие размеры, чем у их «сородичей», живущих на небольших глубинах (например, вестиментиферы — до 15 м в длину при ширине несколько миллиметров, моллюски — до 30 см в длину). Потребляемая этими животными первичная продукция базируется прежде всего на энергии хемосинтеза. Многоклеточные животные смогли освоить новое жизненное пространство на больших глубинах Мирового океана благодаря вступлению в симбиоз с прокариотами-хемосинтетиками, а часто еще и с метанотрофами. Это дало возможность многоклеточным животным не только перейти на новые источники питания, но и освоить новый способ питания — симбиотрофное питание за счет биомассы прокариот, образующейся в результате хемосинтеза и/или метанотрофии. При этом прокариотами используются в качестве источников энергии реакции окисления серы, метана, других восстановленных соединений, а необходимые кислород и углекислый газ поставляют микробионтам их хозяева-животные. Кроме того, благодаря подобным симбиозам животные смогли приспособиться к присутствию смертоносного сероводорода, а также выживанию при частой гипоксии и значительном перепаде температур в течение нескольких минут. Для обеспечения симбиоза между многоклеточными животными и хемоавтотрофными и/или метанотрофными бактериями необходимо одновременное соблюдение двух условий: наличие кислорода для организма-хозяина и восстановленных соединений для бактерий-симбионтов (для реакций хемосинтеза также необходим кислород). Обеспечить такие условия возможно лишь на границе окислительных и восстановительных зон, поэтому фауна восстановительных условий приурочена к зоне смешения восстановленного раствора с морской водой. Для одновременного использования кислорода и сероводорода, которые разнесены в пространстве, животные вынуждены зарываться в грунт, так что выступающая над осадком часть тела оказывается в окисленной зоне, а нога проникает глубоко в грунт, обогащенный сероводородом. Свободноплавающие организмы, например коловратки и инфузории, используют разнесение процессов усвоения кислорода и сероводорода во времени благодаря поочередному перемещению то в окисленные, то в восстановленные условия. 128
Первым изученным животным, во взрослом состоянии практически всецело зависящим от симбиотрофного питания, была вестиментифера Riftia pachyphita. Пищеварительный тракт у нее отсутствует, обмен веществами с внешней средой осуществляется через эпидермис. Питание обеспечивается процессами, происходящими в трофосомах — специализированных участках ткани животного, включающих клетки-бактериоциты. Новые бак- териоциты возникают за счет деления неспециализированных клеток вблизи кровеносных сосудов рифтии и заражаются бактериями от ближайших инфицированных клеток. Постепенно бак- териоциты перемещаются в периферическую зону, где начинается лизис бактерий, использующихся хозяином в качестве пищи. Серобактерии, населяющие трофосому, окисляют сероводород до S04~. В качестве источника углерода они используют углекислый газ, поступающий в бактериоциты через кровеносную систему хозяина. Содержание ферментов цикла Кальвина—Бенсона, зарегистрированное в трофосоме вестиментифер, наиболее высокое среди всех известных случаев симбиоза беспозвоночных с хемоавто- трофными бактериями. Микробионты занимают до 35 % всего объема трофосомы, их плотность достигает 10 млрд клеток на 1 г сырой биомассы этого органа, причем только сульфиды стимулируют поглощение кислорода эндобионтами. Благодаря способности последних к образованию серосодержащих аминокислот (таурина и его аналогов, которые могут служить ловушкой для сульфидов), клетки животного защищены от токсического действия высоких концентраций сульфидов. Накапливающийся при этом тиотаурин является резервом для дальнейшей утилизации симбионтами. Исследования последовательности нуклеотидов в 16S рРНК показали, что симбионты одного хозяина представлены одним видом бактерий. Сульфидокисляющих эндобионтов вестиментифер относят к подгруппе протеобактерий. Они напоминают представителей тиобацилл или Thiomicrospira. Наличие хемоавтотрофных микробионтов показано и в жабрах брюхоногих моллюсков гастропод. В этом случае выявлены тионо- вые бактерии-эндобионты: длинные палочковидные и короткие толстые вибрионы. Они также располагаются в бактериоцитах и занимают не менее 60 — 70 % пространства последних. Другая картина наблюдается у двустворчатых моллюсков, в жабрах которых выявлено окисление метана, практически не наблюдаемое у рифтии. Этот процесс проводится грамотрицательными метанотро- фами. Морфологически они близки к представителям рода Met- hylobacter: M. vinelandii, M. whittenburyi. В жаберных тканях моллюска Ifremeria nautilei обнаружены и хемоавтотрофные, и метанот- рофные эндобионты, позволяющие моллюску использовать энергетический потенциал как неорганических восстановленных со- 5 Петрусов 129
единений серы, так и метана. У моллюсков и их эндобионтов настолько тесная связь, что наблюдается их параллельное видообразование. Имеется тенденция к частичной редукции пищеварительной системы у моллюсков (у вестиментифер она отсутствует полностью), однако в определенных условиях они питаются и сап- ротрофно. Для симбиотрофного питания морские животные могут использовать и автотрофных эпибионтов. Ими являются чаще всего бесцветные сероокисляющие хемоавтотрофы. Покрывают кутикулу морских нематод Eubostrichus parasitiferus, Laxus oniestus, а также других нематод из субсемейства Stibonematinae у-протеобактерии, родственные эндемичным эндобионтам животных из гидротерм. Эти серо- окисляющие автотрофы чаще живут в виде монокультуры на теле хозяина, что подтверждается анализом их 16S рРНК. Они имеют форму нитей или палочек и покрывают в виде монослоя все тело нематод. Встречаются и коккообразные формы, образующие множественные слои над монослоем из нитчатых форм. Преимущественно питаются эпибионтами и колониальные нитчатые цилиаты Zoothamnium niveum, а также креветки — представители рода Rimicaris, например Rimicaris exoculata. Их эпибионтов относят к е-протеобактериям, включая представителей рода Thiovulum. Морские животные и их автотрофные эпибионты, как и эндо- бионты, коэволюционируют. Например, у креветок эпибионты живут на специальных ветвящихся придатках — бактериофорах. Частота деления эпибионтов коррелирует со сменой кутикулы их хозяев. Для развития всех этих прокариот необходимы условия, где сульфатредукторы разлагают органический материал и образуется сульфид, причем их развитие наиболее интенсивно в градиентах сульфида и кислорода. Углерод эпибионты поглощают автотрофно, а энергию получают при окислении серы. Известно и о субкутикулярных (живущих между эктодермой и кутикулой) бактериях, коэволюционирующих в симбиозе с различными эхинодерматами. Например, полагают, что симбиоз офиурид Ophiactis balli (Echinodermata: Ophiuroidea) с субкутикулярными ос- протеобактериями сложился в палеозое. Члены этого симбиоза имеют общий метаболизм азота. Микробионты явно отличаются от уже описанных главных групп морских симбиотических бактерий, так как они родственны представителям рода Rhizobium. До недавнего времени считали, что жизнь глубоководных восстановленных биотопов полностью зависит от хемосинтеза, что она возможна исключительно благодаря геотермальной энергии и не зависит от энергии Солнца. Однако теперь ученые считают такое мнение некорректным. Во-первых, уникальные глубоководные организмы нуждаются в кислороде — продукте фотосинтеза. Кроме того, личинки многих беспозвоночных животных плавают и питаются растительными остатками. Затем накопленные благо- 130
даря такому питанию липиды используются в период симбиот- рофного питания. Это явление показано даже для вестиментифер, во взрослом состоянии не имеющих пищеварительной системы. Мутуалистические симбиозы с микроорганизмами играют очень важную роль в эволюции биосистем. Именно благодаря им возникли и эволюционно развиваются, успешно выдерживая борьбу за существование, одноклеточные, а затем и многоклеточные эука- риоты, значительно увеличившие разнообразие и красоту биосферы Земли. Животные приспособились эффективно использовать растительную пищу с богатым содержанием целлюлозы, в том числе грубую клетчатку стволов трав и деревьев. Благодаря этому значительно увеличилось количество потребляемого первичного органического вещества. Это дало возможность животным более интенсивно размножаться в разных экологических нишах и значительно расширило число этих ниш. Пищеварение с участием микроценозов сыграло решающую роль в повышении интенсивности метаболических процессов у животных, особенно у млекопитающих, что явилось одним из факторов, способствующих установлению их теплокровности. Симбиозы с прокариотами позволили значительной части беспозвоночных животных широко расселиться и интенсивно размножаться благодаря симбио- трофному пищеварению даже в таких «непригодных» для жизни местах, как дно Мирового океана. Отметим также, что микроби- онты выделяют множество уникальных токсинов, антибиотиков, ферментов, их ингибиторов, жирных кислот (типа экзопентаено- вой), противовирусных веществ, часть которых может быть использована человеком. Открытия в области популяционной генетики указывают на важную роль симбиозов с микроорганизмами, прежде всего мутуалис- тических, которую они играют в увеличении и сохранении биоразнообразия. Мутуализм приводит к интеграции партнеров в над- организменную систему. При этом регулирующим воздействием в экосистеме обычно является положительная обратная связь между симбионтами, основанная на трофических взаимодействиях. Иная картина наблюдается при паразитизме — обратной стороне мутуализма (хотя следует отметить, что в естественных условиях иногда трудно провести границу между мутуализмом и паразитизмом). 3.2.4. Особенности паразитизма микроорганизмов Основные отличия паразитизма от других форм симбиозов у микроорганизмов. Паразитизм — составная часть общей стратегии жизни микроорганизмов. Влияние паразитов на состояние экосистем происходит благодаря не трофическим, как при других формах симбиоза, а патогенным воздействиям на хозяев, вызываю- 131
щимся прежде всего токсическими и иммунологически чужеродными метаболитами паразитов. Имеется несколько концепций паразитизма, наиболее значимая из которых — экологическая, трансформирующаяся в биоценологическую, с особым вниманием оценивающую функции паразитов в биоценозах. Согласно биоценоло- гической концепции паразитизма, паразиты образуют паразитарные комплексы со своими хозяевами, которые стабилизируют экосистемы. Кроме того, паразиты защищают биоценозы от чуждых им организмов. Сбалансированность антагонистических взаимодействий паразита и хозяина формируется в процессе коэволюции партнеров и строится на принципе соответствия, или ком- плементарности, базирующегося на распознавании «своего-чужого». Наиболее наглядный пример таких взаимодействий — широко распространенные и очень динамичные иммунологические реакции хозяина на влияние паразитов. Эти реакции являются прежде всего ответом на патогенность паразитов. Патогенностью называется способность некоторых микроорганизмов (патогенов) причинять вред хозяину — вызывать болезнь. Болезнь может быть и интегрированным результатом действия нескольких сочленов паразитоценоза хозяина. Мера патогеннос- ти — вирулентность. Обычно термин «патогенность» используется в отношении видов микроорганизмов — паразитов, а термин «вирулентность» — в отношении штаммов внутри этих видов. К основным факторам патогенности, каждый из которых ответствен за проявление конкретных свойств микроорганизма в инфекционном процессе, относят: факторы адгезии — прикрепления к клетке хозяина; факторы колонизации — закрепления и размножения на поверхности клетки хозяина; факторы инвазии — проникновения в клетку хозяина; факторы, препятствующие фагоцитозу и подавляющие его; молекулярную мимикрию — способность противостоять антителозависимым реакциям хозяина благодаря наличию сходных по строению молекул у хозяина и паразита, антигенной изменчивости, способности микроорганизмов к имитации некоторых метаболитов и структур хозяина; ферменты, причем часто полифункциональные, способствующие распространению микроорганизмов по тканям хозяина, а также разрушающие защитные факторы хозяина (такие, как комплемент, ли- зоцим, гистоны, дефенсины, антибиотики, синтезируемые человеком, и др.); токсины. Способности к адгезии, колонизации необходимы микроорганизмам, и при сапротрофном существовании они закреплены естественным отбором. Ряд других факторов выработался в связи с паразитизмом. Токсины — особенно мощный специфический фактор патогенности микроорганизмов. Эти соединения часто приводят к гибели хозяина, действуя с высокой специфичностью в чрезвычайно малых дозах. Благодаря прежде всего токсинам многие микроорганизмы превращаются из сво- 132
бодноживущих, комменсалов или мутуалистов в паразитов, что часто дает им возможность более интенсивно развиваться в новых экологических нишах. Существуют и некоторые другие функции токсинов: защита хозяина от хищников в экосистемах; использование токсинов как средств антагонизма в микробных сообществах; участие токсинов в авторегуляторных процессах в бактериальных популяциях. Таким образом, патогенность — сложное явление, генетически закрепленное естественным отбором, дающее паразиту преимущества в борьбе за существование, а также помогающее в периодической смене хозяев. Чем менее способен хозяин предотвращать нарушения, вызванные паразитом (т.е. чем слабее его реактивность — механизм устойчивости к вредным влияниям), тем тяжелее протекает инфекция (антагонистическое взаимодействие паразита и хозяина) и более выражены проявления болезни. Реактивность хозяина обеспечивается прежде всего его иммунитетом — способностью противостоять агрессии со стороны других видов живых существ. У беспозвоночных животных две системы иммунитета — конституционная и фагоцитарная, у позвоночных животных к ним прибавилась третья — лимфоидная. Особенно важна роль иммунитета в защите от микроорганизмов. Одной из особенностей паразитизма некоторых микроорганизмов является его сходство с хищничеством. Как известно, хищники вначале убивают свою жертву, а затем питаются ею. Так часто поступают и бактерии, образующие сильнодействующие токсины, такие, например, как ботулинистические. Однако прокариоты-хищники в большинстве случаев мельче своих жертв, к тому же для них не характерна способность к фагоцитозу. Поэтому большинство бактерий, размножающихся в убитой ими жертве, называют паразитами или патогенами. Хищниками обычно называют только бактерий — представителей родов Bdellovibrio, Micavibrio, Vampirovi- brio. Во время стадии хищничества их мелкие клетки со жгутиком не размножаются, а прикрепляются к различным грамотрицательным бактериям, проникая в периплазматическое пространство жертв и убивая последних. Пораженные раздувшиеся клетки служат субстратом для развития вибрионов и их репродуктивной стадии. Наиболее полно изучен паразитизм микроорганизмов в отношении человека. Сделанные при этом обобщения справедливы и для других организмов. Основные закономерности паразитизма и его связь с другими видами биотических отношений будут рассмотрены прежде всего на примерах микроорганизмов — патогенов человека и насекомых (для сравнения) — самых высокоорганизованных представителей позвоночных и беспозвоночных животных. Еще три-четыре десятилетия назад считалось, что вакцинация, применение новых антибиотиков и других лекарств дают надежду на скорую победу человечества над инфекционными (т.е. вызываемы - 133
ми микроорганизмами, а также вирусами) болезнями. Вместо этого в последние годы мир узнал о распространении новых, еще более опасных инфекций (СПИД и др.), а многие болезни, мало известные ранее или, наоборот, такие, как почти «побежденные» (туберкулез и др.), имеют тенденцию к распространению (табл. 3.1). Таблица 3.1 Возбудители инфекционных болезней, имеющие тенденцию к распространению Инфекционные агенты [ Болезнь [ Бактерии \ Aeromonas hydrophila, A. veronii, A. caviaei Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Chlamydia pneumoniae (TWAR-штамм) Chlamydia trachomatis Clostridium difficile \ Ehrlichia chaffeensis Escherichia coli 0157: H7 Chaemophilus influenzae var. aegyptis Helicobacter pylori Legionella pneumophila | Listeria monocytogenes | Staphylococcus aureus 1 Streptococcus pyogenes (A) \ Vibrio cholerae 1 Vibrio vulnificus 1 Mycobacterium tuberculosis Аэромонадный гастроэнтерит. 1 Целлюлиты. Раневая инфекция. Септицемия | Болезнь Лайма 1 Кампилобактериоз. Кампилобак- 1 териозный энтерит TWAR-пневмония | Генитальный хламидиоз 1 Колиты антибиотико-ассоцииро- 1 ванные | Эрлихиоз | Геморрагические колиты. 1 Гемолитический уретический синдром 1 Бразильская пурпурная лихорадка 1 Пептическая язва, рак желудка 1 Легионеллез, лихорадка Понтиак | Листериоз | Синдром токсического шока 1 Воспаление в горле, кожные 1 поражения, пневмония | Холера 1 Варьирующие симптомы 1 от целлюлитов до фатальной бактериемии Туберкулез 1 | Простейшие, гельминты и грибы 1 Личиночные нематоды семейства Anisakidae — паразиты морских | млекопитающих и рыб Анизакиаз, болезни селедочного или трескового глиста 134
Окончание табл. 3.1 | Инфекционные агенты Babesia microti Cryptococcus neoformans Представители Cryptosporidium \Giardia lamblia Представители Microspora — роды Encephalitozoon, Enterocytozoon, \Nosema, Pleistophora \ Plasmodium falciparum, P. vivax, IP ovale, P malariae Pneumocystis carini Strongybides stercoralis Toxoplasma gondii Болезнь Бабезиоз ~ лихорадка Криптококкоз (индикатор СПИДа) Криптоспоридоз Жиардиаз, илилямблиоз Микроспоридиозы Малярия Пневмоцистозная пневмония Стронгилоидиаз Токсоплазмоз Распространение инфекционных болезней обусловлено совершенствованием стратегий паразитизма вызывающих эти болезни микроорганизмов — наиболее древних и адаптированных форм жизни. Патогенность «новых» возбудителей может объясняться тем, что они уже были преадаптированы к таким встречам, например с человеком, в занимаемых ими ранее экологических нишах, где они поражали сходным путем других жертв. Стратегию паразитизма, при которой продолжительность инфекционного процесса лимитируется иммунной системой хозяина, называют первой стратегией. При этом организм хозяина или побеждает паразита (часто с помощью лекарств) и выздоравливает, или погибает. Известно и бессимптомное носительство паразитов. В любом из этих случаев паразит обычно способен быстро распространяться среди своих хозяев. Такие инфекции называют быстрыми. Они вызываются некоторыми микроскопическими грибами (синтезирующими токсины, например афлатоксин), протистами, а также рядом вирусов. Первую стратегию прежде всего использует большинство бактерий, что определяется наличием пептидогликана в их клеточных стенках, который обычно легко узнается, наряду с липо- полисахаридами, иммунной системой хозяина. Патогенные бактерии выработали механизмы защиты от факторов иммунитета. Основные из них следующие: I) экранирование клеточной стенки. Неспецифические «экраны» — это капсулы и капсулоподоб- ные образования. Специфическое экранирование — антигенная вариабельность клеточных стенок и многих поверхностных структур — жгутиков, пилей, капсул, 5-слоев; 2) секреция бактериями факторов, инактивирующих защиту хозяина, — полифункциональных ферментов; 3) антигенная мимикрия; 4) образование L-форм бактерий (с отсутствием или дефектом клеточной стен- 135
ки). Оружием не защиты, а нападения являются у бактерий, использующих первую стратегию паразитизма, прежде всего специфические белковые токсины. Перечень таких токсинов и механизмов их действия приведен в табл. 3.2. Таблица 3.2 Бактериальные токсины и механизм их действия (по М.В.Супотницкому, 2000) Микроорганизм/токсин Механизм действия Мишень действия Болезнь* Повреждение цитоплазматической мембраны путем образования пор Aeromonas hydrophila / Аэролизин Clostridium perfringens / Перфринголизин О \ Escherichia coli / Гемолизин Staphylococcus aureus / Альфа-токсин Staphylococcus pneumoniae 1 Плазмолизин Listeria monocytogenes/ Листериолизин О Streptococcus pyogenes / \ Стрептолизин О 1 Bacillus thuringiensis / Оу-белки параспоральных кристаллов (дельта — эндотоксины) Пороформиру- ющий Тоже » » » Пороформиру- ющие Тоже » Гликопротеин Холестерин Плазматическая мембрана Плазматическая мембрана Холестерин Плазматическая мембрана клеток средней кишки чувствительных насекомых, клещей, нематод Холестерин Плазматическая мембрана клеток средней кишки чувствительных насекомых, клещей, нематод Диарея 1 Газовая 1 гангрена | Инфекции 1 уретарного тракта | Абсцессы 1 Пневмония 1 Системные 1 пищевые инфекции, менингиты Стрептокок- 1 ковая ангина, скарлатина Отдельные виды чешуекрылых, двукрылых, жестокрылых и некоторых других насекомых, а также нематод и клещей*. Бактериальная инфекция. Антибиотическое действие на 136
Продолжение табл. 3.2 Микроорганизм/токсин Bacillus thuringiensis / Qtf-белки параспоральных кристаллов Bacillus laterosporus, Bacillus sphaericus / Белки параспоральных включений Механизм действия Пороформиру- ющие Тоже Мишень действия Плазматическая мембрана разных клеток Плазматическая мембрана клеток средней кишки Болезнь* ряд микроорганизмов (Micrococcus, Nocardia, Streptomyces, Erwinia и др.). Бактериальная инфекция к Оу-белкам | Человек, на- 1 секомые, другие животные, прокариоты. Цитолити- ческий фактор | Определен- 1 ные двукрылые насекомые. Бактериальная инфекция | Ингибиторы белкового синтеза | Corynebacterium diphteriae / Дифтерийный токсин Е. coli, Shigella ! dysenteriae / Шига-токсины \Pseudomonas aeru- \ginosa 1 Экзотоксина АДФ-рибозил- трансфераза N-гликозидаза • АДФ-рибозил- трансфераза Фактор элонгации 2 28S рРНК Фактор элонгации-2 Дифтерия 1 Геморрагиче-1 ский колит, гемолитический уремический синдром | Пневмония 1 Активаторы путей вторичных мессенджеров Е. coli I цитотоксиче- ский некротизирую- щий фактор Е. coli I термолабильный токсин Е. coli I температуро- стабильный токсин Деамидаза АДФ-рибозил- трансфераза Сшмуляция гуанилатцик- лазы Rho G-белок G-белки Гуанилатци- клазный рецептор Инфекция 1 уретарного тракта | Диарея 1 Тоже 1 137
Окончание табл. 3.2 Микроорганизм/токсин Е. coli I цитолетальный растягивающий токсин Bacillus anthracis / отечный фактор \Bordetella pertussis / а) коклюшный токсин; б) дермонекротиче- ский токсин \ Vibrio cholerae / холерный токсин Clostridium botutinum / а) С2-токсин; б) СЗ-токсин Механизм действия Блокирование G2 Аденилатцик- лаза АДФ-рибозил- трансфераза. Деамидаза АДФ-рибозил- трансфераза Тоже Мишень действия Неизвестна АТФ G-белки. Rho G-белки G-белок Мономерный G-актин. Rho G-белок Болезнь* Тоже 1 Человек, кру- 1 пный рогатый скот, другие млекопитающие. Сибирская язва 1 Коклюш. 1 Риниты Холера 1 Ботулизм 1 Активаторы иммунного ответа 1 Staphylococcus aureus / а) энтеротоксины; б) эксфолиативные токсины; в) токсин синдрома токсического шока Streptococcus pyogenes / пироген-ные экзотоксины Суперантигены Суперантигены Главный комплекс гистосовмести- мости II Тоже Пищевое 1 отравление. Синдром шелушения кожи. Скарлатина. Синдром токсического шока 1 Синдром токсического шока 1 Протеазы 1 Bacillus anthracis / летальный фактор Clostridium botulinum / нейротоксины A—G 1 Clostridium tetani / [столбнячный токсин Металлопроте- аза Цинк-металло- протеазы — Митогенактиви- рованная протеинкиназа Везикуло-ассо- циированный мембранный белок/синапто- бревин; синтаксин Синаптобревин Сибирская язва Ботулизм Столбняк * Хозяином возбудителя является человек, если специально не указаны другие хозяева. 138
Среди токсинов, вызывающих болезни человека, обнаружены самые сильнодействующие — семь серотипов ботулинистических, а также столбнячные. Для большинства белковых токсинов характерна мультидоменная структура. Наличие доменов, независимо свертывающихся в разных частях молекул токсинов, свидетельствует о происхождении последних путем объединения генов различных глобулярных белков. Сейчас известно, что гены, кодирующие факторы патогенности бактерий и системы их секреции, в большинстве кластированы на участках хромосомной ДНК — «островах патогенности». Многие токсины нарушают целостность или функционирование клеточной мембраны ферментативным путем или путем образования в ней пор. Известна также группа токсинов-суперантигенов, нарушающих нормальную работу иммунной системы. Множество других токсинов бактерий модифицирует различными путями ключевые элементы клеточного метаболизма. Механизмы действия белковых токсинов, вызывающих болезни человека, во многих случаях изучены достаточно полно, как видно из табл. 3.2. В настоящее время стали известны также новые данные о механизмах действия и экологической роли белковых токсинов, вызывающих болезни насекомых и некоторых нематод, клещей. Речь идет о широко распространенных в природе Cry- и Су/-белках большой группы энтомопатогенных, способных в то же время к сапротрофной жизни в почве бактерий вида Bacillus thuringiensis, насчитывающего около 80 подвидов. Оу-белки (молекулярная масса 60-—140 кДа), иногда Qtf-белки (молекулярная масса 28 кДа) и некоторые другие образуют в клетках этой бациллы включения, имеющие обычно форму различных кристаллов (рис. 3.3). Включения токсичных для насекомых белков известны и у других бацилл, например у В. laterosporus, В. sphaericus, В. popilliae (см. табл. 3.2). Включения называют параспоральными, так как они образуются в период спорообразования культуры наряду со спорами. После завершения этого процесса клетки лизируются, а споры вместе с включениями попадают в почву, на растения. Личинки насекомых, питающиеся растениями, заглатывают включения вместе со спорами. Кристаллы растворяются в кишечнике только чувствительных личинок, и Оу-белки разрушают клетки их средней кишки, что приводит к выходу содержимого кишечника в гемолимфу и гибели насекомых. Споры при этом прорастают и дают начало новой популяции бактерий, развивающейся в организме погибшего насекомого. Специфичность действия Оу-бел- ков очень высока. Сейчас известно более 30 классов таких белков. Таким образом, кристаллы, часто состоящие из разных белковых токсинов, являются первичными, причем автономными факторами вирулентности, синтезируемыми популяцией бацилл «впрок», для использования уже последующими дочерними популяциями, которые разовьются в телах, пораженных Оу-белка- 139
д Рис. 3.3. Белковые включения бактерий: Л — Bacillus thuringiensis subsp. monterrey (вместе со спорами); Б — В. thuringiensis subsp. tenebrionis; В — В. thuringiensis subsp. mexicanensis; Г — Xenorhabdus bovenii (рядом с клетками); Д — Xenorhabdus nematophilus; E— Photorhabdus luminescens 140
ми насекомых из спор материнской популяции. Cry-белки полифункциональны: они не только с высокой специфичностью убивают беспозвоночных, но и проявляют менее специфичный антимикробный эффект в отношении некоторых, в основном грам- положительных, бактерий. Инсектицидная активность Оу-белков дает возможность бактериям В. thuringiensis поражать чувствительных насекомых. Антибактериальная активность этих белков необходима на первых этапах развития популяции В. thuringiensis в пораженном насекомом после прорастания спор и в начальный период деления клеток, пока плотность популяции бактерий еще не достигла таких величин, когда начинает работать «эффект кворума», в результате которого клетки синтезируют большие количества различных антибиотиков, ферментов, способных подавлять развитие микроорганизмов, конкурирующих с В. thuringiensis за новую экологическую нишу. В последние годы выявляются примеры и второй стратегии паразитизма, в результате которой хозяин чаще всего не погибает и не выздоравливает, а его болезнь переходит в хроническую, давая обострения в связи с ослаблением иммунитета. Такие инфекции называют медленными, их продолжительность ограничивается сроком жизни хозяина. Они вызываются чаще всего микоп- лазмами, Z-формами бактерий, а также вирусами. Микоплазмы — самые маленькие самореплицирующиеся формы жизни, не имеющие клеточной стенки. У микоплазм очень интенсивна антигенная мимикрия. Для уклонения от иммунной системы хозяина микоплазмы используют множество копий генов белков адгезии, поэтому иммунные ответы хозяину направляются на вариабельные регионы и не имеют защитного эффекта. Микоплазмы для размножения во внутренней среде хозяина образуют перекись водорода и перекисные радикалы, повреждающие мембраны клетки через окислительный стресс. Они секретируют фосфолипазы, гемолизины и другие ферменты, разрушающие клетки хозяина. Микоплазмы, ослабляя иммунитет, вызывая аутоиммунные заболевания, способствуют развитию и активизации других инфекций в организме. Локальные клеточные разрушения вызывают и хромосомные аберрации, которые способны уклоняться от иммунной системы хозяина и даже переключать ее на разрушение собственных органов и тканей. Все больше данных указывает на то, что некоторые болезни, считавшиеся еще недавно соматическими или генетическими, также вызываются микроорганизмами, которые используют вторую стратегию паразитизма, исключающую быстрое распространение возбудителей в популяциях их хозяев. Например, показана этиологическая роль различных видов микоплазм в развитии атеросклероза, язвы желудка и язвенной В-клеточной лимфомы 141
{Helicobacterpylori), хронических воспалительных заболеваний кишечника, легких, а также ревматоидного артрита {Chlamydia pneumoniae). Эти болезни и ряд других многие медики до сих пор не рассматривают как инфекционные и не разрабатывают адекватные способы их лечения. Поэтому инфицирование человечества возбудителями медленных инфекций намного превышает соответствующие показатели для микроорганизмов, использующих первую стратегию паразитизма. Эпидемиологи предлагают выделить и третью стратегию паразитизма, при которой продолжительность медленных инфекций ограничивается сроком жизни вида хозяина. Такую стратегию используют вирусы, вызывающие СПИД, а также некоторые другие ретровирусы. Микроорганизмы, использующие различные стратегии паразитизма, часто провоцируют тяжелые аутоиммунные заболевания. Например, патогенные штаммы кишечной палочки, шигеллы, стафилококки и многие другие бактерии способны синтезировать белки, сходные с инсулином, гонадотропином, кальмодулином, против которых у человека вырабатываются антитела, что приводит к развитию аутоиммунных заболеваний. Паразитизм микроорганизмов — эукариот имеет свои особенности, которые будут рассмотрены на примере анаэробных про- тистов-паразитов животных и человека. Анаэробные протисты — паразиты животных и человека. Многие протисты являются высокоспециализированными паразитами. Большинство ученых считают древнейшими протистами представителей дипломонад {Diplomastigina) и отделившихся от них микроспоридий {Microsporidia). Свыше 100 видов представителей дипломонад — лямблии, или жиардии, паразитируют в кишечнике людей, кроликов, мышей, а также у некоторых земноводных и беспозвоночных. Микроспоридии, которых известно более 1000 видов, способны развиваться практически у всех животных разных уровней организации, что свидетельствует об очень раннем их переходе к паразитизму. В большинстве они высокоспецифичны, паразитируют без смены хозяев. Клетки микроспоридий, несмотря на наличие оформленного ядра, имеют много признаков, характерных для прокариот. Размер генома микроспоридий наименьший среди известных геномов эукариот и сопоставим с размерами генома бактерий, в этом геноме не обнаружены интроны, многократные повторы генов рРНК. Процесс совместной эволюции микроспоридий и их хозяев привел к формированию совершенных и уникальных взаимоотношений между членами системы. Так, споры микроспоридий благодаря запасному дисахариду тре- галозе сохраняют в течение многих лет способность перорально заражать своих хозяев. Споры содержат амебовидную зародышевую клетку, аппарат экструзии (доставки зародыша в клетку хозяина) и покрыты оболочкой из хитина, кератина и гликопротеи- 142
нов. Характерная для всех микроспоридий органелла, входящая в аппарат экструзии, — это полярная трубка. При выбросе из споры в трубке образуется полость, через которую зародышевая клетка проходит в клетку хозяина, избегая отрицательного воздействия ферментов и рН пищеварительного тракта. Микроспоридии в большинстве случаев развиваются в прямом контакте с цитоплазмой инвазированных клеток хозяина. Они — прежде всего паразиты sro энергетических систем. Также микроспоридии синтезируют полиамины и другие соединения, приводящие к гормональному дисбалансу у хозяина. Они нарушают проницаемость мембран, ингибируют активность эстераз, фенолоксидаз и других ферментов. Размножение микроспоридий, паразитирующих на насекомых, продолжается в гемоцитах, его не способны прервать фагоцитоз, инкапсулация, меланизация и другие защитные реакции, элагодаря которым хозяин обычно побеждает многих других па- эазитов, но не микроспоридий. Насекомые (главным образом кровососущие — двукрылые, клопы, блохи) обычно служат переносчиками (векторами) протестов, патогенных для человека и животных, чаще всего для жгутиконосцев (трипаносом) и споровиков (малярийных плазмодиев). Цве большие группы трипаносомид имеют различные симбиоти- ческие связи. Первую группу (представители родов Leishmania Trypanosoma, Endotrypanum) называют гетероксенными, так как их жизненный цикл проходит со сменой хозяев. Для насекомых эти протесты в большинстве случаев являются комменсалами. Поэтому насекомые-векторы могут переносить их в организм окончательных хозяев, где протесты паразитируют. У позвоночных (от рыб до человека) трипаносомы паразитируют в крови или/и спинномозговой жидкости, вызывая тяжелые болезни — трипаносо- мозы, при которых поражается прежде всего нервная система. Человек является хозяином трипаносом видов brucei, gambiense, rhodesiense (вызывают сонную болезнь), cruzei (вызывают болезнь Чагаса). После укуса насекомыми-переносчиками у хозяина включается механизм защиты от попавших в кровь паразитов, одна из сторон которого — запрограммированная гибель {апоптоз) зараженных клеток. Но паразиты способны ингибировать апоптоз, в частности благодаря работе своего фермента транссиалидазы, действующего синергически с цитокинами клетки хозяина. В этот период клетки протиста интенсивно делятся. Трипаносом, размножившихся в организме зараженных людей, насекомые при укусах переносят в кровь значительного количества других людей — окончательных хозяев, где паразиты проникают в спинномозговую жидкость и разрушают нейроны, вызывая болезнь Чагаса. Вторую группу составляют гомоксенные трипаносомиды, преимущественно паразитирующие в двукрылых и полужесткокрылых насекомых без смены хозяев. Заражение насекомых происходит при попадании в 143
различные отделы кишечного тракта специальных расселитель- ных стадий этих паразитов. Они прикрепляются к клеткам кишечника кончиком своего жгута, который распластывается по кутикуле, и затем начинают разрушать эти клетки, в результате чего блокируются процессы полостного и пристеночного пищеварения. Анализ современной эпидемиологической ситуации и сведений (за последние три тысячи лет) о пандемиях (инфекционных заболеваниях большого числа особей хозяина на больших территориях) дал основание М. В. Супотницкому выдвинуть гипотезу о многовековых глобальных циклах быстрых и медленных инфекций. Согласно данной гипотезе, процесс эволюционного формирования возбудителей, обладающих новым потенциалом патогенное™, идет постоянно. Кроме того, периодически, в зависимости от иммунодефицитности популяции (автор гипотезы имеет в виду популяцию людей), обусловленной некоторыми возбудителями медленных инфекций и другими факторами, возвращаются и «старые» микроорганизмы, использующие первую стратегию паразитизма. Это приводило и может еще привести к пандемиям, уменьшающим численность вида, так как в первую очередь от быстрых инфекций погибнут хозяева, ослабленные возбудителями медленных инфекций. 3.2.5. Взаимосвязь паразитизма и мутуализма В природе часто встречают комплексы нескольких типов биотических связей, в которых обязательно участвуют микроорганизмы. Например, образование мутуалистических симбиозов бактерий родов Xenorhabdus, Photorhabdus с нематодами Steinernema, Heterorhabditis соответственно дает возможность этим системам стать паразитами членистоногих. Только благодаря такому мутуализму нематоды, живущие в почве, могут проникать в насекомых и поражать их с помощью различных токсинов, образуемых и нематодами, и бактериями. Очень интересно явление фазовой вариабельности, характерное для бактерий-симбионтов энтомопатоген- ных нематод. Его природа сходна с диссоциацией, хотя еще до конца не изучена. В организме нематод развиваются только симбионты I фазы, способные к синтезу антибиотиков, ряда пигментов, инсектицидных токсинов. Клетки II фазы, растущие на лабораторных средах, не синтезируют эти соединения и менее жизнеспособны. Следует отметить, что в почве редко встречаются свободножи- вущие представители рода Xenorhabdus. Однако эти бактерии существенно отличаются от симбиотических, находящихся в обеих фазах. В клетках бактерий-эндобионтов нематод I фазы также об- 144
разуются белковые включения, подобные включениям бацилл. Белки таких включений не обладают инсектицидной активностью. Эти включения поедаются молодыми нематодами, размножившимися в теле пораженных насекомых. Растворяясь в кишечнике нематод, белки включений подавляют рост некоторых микроорганизмов, способных помешать установлению симбиоза молодых нематод с бактериями родов Xenorhabdus или Photorhabdus. Таким образом, бактерии-симбионты энтомопатогенных нематод также запасают белки в виде кристаллов «впрок» для последующих своих популяций. Однако в отличие от белков, образующих кристаллы бацилл, белки включений микробионтов нематод не являются первичными автономными факторами вирулентности. Способность этих белков к антимикробной активности необходима для установления в последующем поколении нематод симбиоза с бактериями — представителями родов Xenorhabdus или Photorhabdus. 3.3. Микробно-растительные взаимодействия Микробно-растительные взаимодействия являются основой поддержания жизни на планете. Растения поставляют кислород и продукты питания для человека, животных и существенной части микромира. Микроорганизмы осуществляют возврат питательных элементов для растений, разлагая и потребляя в качестве субстратов как отмершие растения, так и зачастую живые. В последнем случае мы имеем дело с паразитизмом микроорганизмов на растениях. В целом же микроорганизмы и растения успешно сосуществуют вместе. Более того, именно совместное развитие бактерий рода Rhizobium и растений семейства бобовых, а также микоризных грибов и разнообразных растений — распространенный пример симбиоза. История изучения микробно-растительных взаимодействий фактически восходит к периоду первых «охотников за микробами», когда шел процесс первого активного и осознанного познания микробного мира. Однако будет справедливо сказать, что двигателем в познании микробно-растительных взаимодействий была и является фитопатология, где накоплен огромный материал о микробно-растительных взаимодействиях. О важности проблемы микробно-растительных взаимодействий до некоторой степени можно судить по тому факту, что созданы многочисленные научно-исследовательские кафедры, лаборатории, институты и компании, занимающиеся проблемами микробно- растительных взаимодействий, и в частности защитой растений от действия на них грибов, бактерий, вирусов и простейших. 145
3.3.1. Систематизация микробно-растительных взаимодействий Микробно-растительные взаимодействия классифицируют с разных точек зрения. Их можно подразделить на специфические, эволюционно закрепленные, даже облигатные, и неспецифические, временные и случайные. Оценивая пространство или среду, где имеют место такие взаимодействия, нужно отметить надземные и внутрипочвенные. Видимо, можно было бы говорить и о воде как среде взаимодействия микроорганизмов и растений, но так как даже в почве микроорганизмы фактически обитают в водных пленках, то с учетом этого факта вода как самостоятельная среда и пространство взаимодействия микроорганизмов и растений не рассматривается. Вместе с тем следует отметить, что и пресноводные, и морские макро- и микроскопические растения колонизируются микроорганизмами, и их взаимодействия, несомненно, представляют интерес. Эволюционно микроорганизмы — более древние живые существа, чем растения. Считается, что бактерии возникли ранее 3,5 млрд лет назад (архей), одноклеточные растения и водоросли появились в протерозое (1,6 млрд лет назад), а первые микроскопические наземные водоросли возникли, вероятно, на границе протерозоя и палеозоя (0,6—0,5 млрд лет назад). И только в раннем девоне (около 0,4 млрд лет назад) высшие растения были уже весьма разнообразны и имели корни и зачатки сосудов. Грибы, как предполагается, возникли в кембрии, т.е. как минимум 0,6 млрд лет назад. Так как растения появились позже бактерий, следовательно, их взаимодействие развивалось постепенно, и растениям приходилось внедряться в уже занятые бактериями экониши. Это означает, что растения обладают такими особенностями, которые позволяют им успешно конкурировать с микроорганизмами, уверенно занимать заселенные микроорганизмами экониши и, более того, использовать микроорганизмы. В свою очередь, микроорганизмы также приобрели способность использовать растения для роста, развития и расселения. Растения подразделяют на низшие и высшие, микроскопические и макроскопические. В силу довольно близких размеров и даже морфологии низших, особенно одноклеточных растений и бактерий и грибов, эти живые объекты часто занимают те же самые экониши. В таких условиях их взаимодействия скорее напоминают сосуществование подобного с подобным. Гораздо большее значение имеет взаимодействие микроорганизмов с высшими растениями. Взаимодействие микроорганизмов и растений следует рассматривать как со стороны микроорганизмов, так и со стороны растений. Такой подход является редукционистским (замена целого его частями), но он оправдан, если за изучением разных сторон од- 146
ной проблемы не забывается главное, что в результате возникает микробно-растительный комплекс. Рассмотрение проблемы с этих двух позиций не совсем равнозначно, так как взгляд со стороны микроорганизмов является более историческим, эволюционным, чем со стороны растений. С организационно-морфологической точки зрения прокариоты представлены как одноклеточными (в основном), так и «многоклеточными», точнее — мицелиалъными организмами, к которым относятся актиномицеты. Следовательно, в бактериально-растительных взаимодействиях имеют место взаимодействия прока- риотных одноклеточных и мицелиальных организмов с одноклеточными, многоклеточными и организованными в ткани и органы высшими растениями. К микроорганизмам относят и царство грибов. Грибо-расти- тельные взаимодействия и взаимоотношения составляют важную часть биологии. В грибо-растительных взаимодействиях также имеются свои особенности, обусловленные разным уровнем организации. Грибы и растения относятся к эукариотам, т.е. формально принадлежат к равному уровню клеточной организации. Именно благодаря высокой обоюдной организации грибов и растений их взаимодействия носят более широкий и часто более драматический характер. По разным оценкам, известно от 120 000 до 250 000 видов грибов, и среди них свыше 8 000 видов фитопатогенных, тогда как среди бактерий известно только около 200 фитопатогенных видов. Среди грибов есть одноклеточные организмы, дрожжи и, следовательно, имеет место взаимодействие одноклеточных грибов с одноклеточными и многоклеточными, низшими и высшими растениями. Однако более многочисленны талломные или мицели- альные грибы. По наличию или отсутствию полового процесса у грибов их подразделяют на высшие, совершенные, и низшие, или несовершенные. Среди взаимодействий тех и других грибов с растениями имеются общие закономерности, но есть и различия. Например, разные стадии развития грибов могут проходить как на одном растении-хозяине, так и на разных. Вирусы, другие микроскопические биологические объекты также вписываются в систему микробно-растительных взаимодействий. Однако положение вирусов в иерархии живого остается спорным, и они скорее воздействуют на растения, чем взаимодействуют с ними, хотя при движении вирусных частиц в плаз- модесмах растений можно говорить и о вирусно-растительном взаимодействии. В любом случае отношения вирусов и растений представляются очень специфичной областью науки, поэтому здесь не рассматриваются. К сфере микробно-растительных взаимодействий относятся также взаимодействия микроскопических животных (простейшие, 147
нематоды) и растений. Часто эти отношения носят паразитарный характер, где растения выполняют роль хозяина. Эту часть микробно-растительных взаимодействий традиционно рассматривают, как и в случае с вирусами, отдельно. Рассмотрение проблемы микробно-растительных взаимодействий со стороны растений представляется более прагматическим подходом. Такой подход хотя и не эволюционен, но важен. Например, для получения трансгенных растений используют векторы бактериального и вирусного происхождения. При систематизации микробно-растительных взаимодействий необходимо отметить уровни способов взаимодействия с точки зрения организации материи. Наиболее важным является химический уровень взаимодействий. На этом уровне имеют место такие взаимодействия, как «узнавание» хозяина, обмен «информацией», восприятие или отторжение молекул и организмов, и др. Физический уровень — это физический контакт микроорганизма и растения. Удерживание микроорганизмов на поверхностях растений часто оказывается решающим фактором в дальнейшем развитии событий. Биологический уровень — это и молекулярно-ге- нетический уровень взаимодействий, и клеточный уровень, который для многих микроорганизмов является уже и организменным. Клеточный уровень взаимодействий по отношению к микроорганизмам трудно отделим от популяционного уровня. В микробно- растительных взаимодействиях имеет место и уровень сообщества (или сообществ), который наиболее сложен. Этот уровень взаимодействий обычно связывают с эпидемиологией. Однако в связи с попытками выделить и использовать в качестве биоконтролирую- щих агентов против некоторых фитопатогенных грибов бактериальные сообщества вместо монокультуры становится очевидным, что этот уровень взаимодействий гораздо шире, чем считалось. Проблему микробно-растительных взаимодействий можно рассматривать и с практической стороны, что имеет место в специальных курсах, посвященных фитопатологии конкретных групп растений, защите растений, их продуктивности и др. С некоторыми допущениями, в каком-то промежутке времени, по-видимому, можно говорить о продолжении взаимодействия микроорганизмов и растений после отмирания одного из компонентов. При отмирании растения происходит его разрушение и утилизация микроорганизмами, как и наоборот, однако этот аспект взаимодействий традиционно рассматривается в других разделах биологии. Таким образом, проблема микробно-растительных взаимодействий многогранна. Подробное рассмотрение всех тонкостей и особенностей возможно только в большой отдельной книге или даже серии книг. Именно по такому пути пошло Американское общество фитопатологов, начав публикацию серии книг о расти - 148
тельно-микробных взаимодействиях. В настоящее время уже опубликовано более шести книг по разным направлениям микробно- растительных взаимодействий. 3.3.2. Роль микроорганизмов в жизни растений Микроорганизмы в жизни растений выполняют функцию ере- дообразования и общего питания. Они осуществляют разложение и минерализацию растительных остатков и органического вещества в целом, высвобождая и возвращая в почву минеральные элементы, необходимые для роста растений, а в атмосферу — С02 и некоторые другие газы. Микроорганизмы продуцируют стимуляторы роста и токсические для растений вещества и др. Микроорганизмы фактически создают почву. Важность микроорганизмов для растений можно лучше понять, ответив на вопрос: смогут ли в настоящее время микроорганизмы существовать без растений? С некоторыми оговорками, но ответ — положительный. Однако растения без микроорганизмов очень скоро прекратят свое существование. Бактерии играют ключевую роль в обеспечении экосистем азотом. Активными и наиболее изученными азотфиксаторами являются симбиотические азотфиксирующие бактерии, особенно представители родов Rhizobium, Bradyrhizobium и Azospirillum. Помимо таких, можно сказать облигатных, компонентов в настоящее время выявлено много бактерий, которые не являются активными азотфиксаторами, но обладают этой способностью. Список таких бактерий продолжает пополняться. Недавно был изолирован диа- зотроф Acetobacter diazotrophicus, свободноживущий подобно представителям родов Azotobacter, Azomonas и др. и способный вступать в обоюдно выгодные, мутуалистические отношения с растениями. Роль этих бактерий заключается не только в фиксации азота, но и в других разносторонних положительных воздействиях на растения. Существенную роль микроорганизмы, а именно грибы, играют и в обеспечении растений фосфором. Грибами обрастают корни растений с образованием микоризы. В других случаях, например поглощая из почвы микроэлемент цинк, микроорганизмы могут способствовать заболеванию растений. Ризосферные микроорганизмы могут оказывать и прямое защитное действие одних растений относительно других. Микроорганизмы из ризосферы пшеницы, например, ингибируют рост растений салата. В настоящее время все больше открываются менее заметные, но не менее важные аспекты микробно-растительных взаимодействий. Существуют бактерии — стимуляторы роста растений (plant growth-promoting bacteria — PGPB). Это, например, некоторые штаммы бактерий рода Pseudomonas, которые защищают растения 149
от заморозков, предотвращая кристаллообразование на надземных частях растения при кратковременном резком понижении температуры. Представители родов Bacillus, Agrobacterium и Pseudomo- nas являются «поставщиками» биоконтролирующих агентов. К сожалению, микроорганизмы оказывают на растения и много негативных воздействий. Кроме прямого паразитизма микроорганизмов на растениях имеют место и опосредованные негативные воздействия, например создание микроорганизмами анаэробиоза в переувлажненных почвах. Если такие почвы к тому же богаты органическим веществом, то иногда имеет место массовое развитие сульфатредуцирующих бактерий, один из продуктов метаболизма которых — сероводород, крайне ядовитый для всего живого. В качестве менее драматического непрямого воздействия микроорганизмов на растения можно привести взаимодействие растений риса и метаногенных архей. Растения риса служат как бы «трубами», выводящими газ метан из анаэробной зоны в атмосферу, а с другой стороны, в таких экосистемах растения служат проводниками кислорода в почву. 3.3.3. Роль растений в жизни микроорганизмов Растения являются источниками питания для микроорганизмов, в первую очередь для гетеротрофных организмов, как аэробных, так и анаэробных. В некоторых случаях в переувлажненных почвах корневые выделения растений служат непосредственными источниками углерода и энергии не только для «первичных», но и для «вторичных» анаэробных прокариот — некоторых метаногенов. Микроорганизмы используют растения в качестве источника питания как пассивно, так и активно, паразитируя на них и часто приводя к гибели, т.е. растения также частично являются средой обитания для микроорганизмов. Растения, несомненно, оказывают какое-то селектирующее влияние на окружающее его и находящееся на нем микробное сообщество. Так, например, С4-расте- ния, к которым, в частности, принадлежат злаковые, с большей эффективностью колонизируются такими азотфиксирующими бактериями, как Azospirillum sp. и Enterobacter sp. Растения осуществляют физическую защиту микроорганизмов, а также участвуют в их распространении. Во время роста растений имеет место физический перенос микроорганизмов как в глубь почвы, так и на поверхность, в надпочвенное пространство, и, следовательно, наряду с животными растения служат переносчиками, или, как их еще называют, векторами, для микроорганизмов. При поедании растений животными разного уровня организации микроорганизмы попадают в желудочно-кишечный тракт этих животных. При этом часть микроорганизмов погибает, под- 150
вергаясь физико-химическим и биологическим (ферментативным) воздействиям. Другая часть (иногда даже в более высокой концентрации за счет размножения в пищеварительном тракте) с экскрементами опять попадает на поверхность растений и в почву. Таким образом, можно говорить о цикле микроорганизмов, где растения исполняют роль и переносчиков, и субстратов одновременно. Данный цикл микроорганизмов появился, по-видимому, с момента возникновения голозойного питания и хищничества. Он отмечен как на поверхности почвы, так и в почве, где происходит поедание корней растений животными и возвращение части микроорганизмов с экскрементами в почву. Значимость и глобальность этого цикла пока еще до конца не оценена. 3.3.4. Микробно-растительные взаимодействия при росте и развитии растений В качестве точки отсчета взаимодействия микроорганизмов и растений логично избрать прорастание семени в почве. Однако следует отметить, что семена растений, попадающие в почву, уже заселены микроорганизмами, т.е. микробно-растительные отношения начинаются гораздо раньше. Довольно часто, и особенно это характерно для фитопатогенов, микроорганизмы уже находятся внутри созревшего семени. Потенциально семя растения может нести на (в) себе бактериальные клетки, их эндоспоры или цисты, конидиоспоры и/или обрывки гиф актиномицетов, обрывки мицелия грибов и/или их конидиоспоры, цисты простейших, а также, возможно, яйца нематод и вирусы. Численность разных групп микроорганизмов варьирует и зависит от многих факторов, размера, формы, родовой и видовой принадлежности растения, наличия или отсутствия специфических покровов, местообитания растения, т.е. географических и климатических факторов и др. Обилие и разнообразие микроорганизмов, колонизирующих поверхность семени, в существенной степени определяются и биологией самих микроорганизмов. Важную роль в контаминации поверхности семян, способности удерживаться на их поверхности играют такие характеристики микроорганизмов, как размеры и морфология, структура поверхности клетки, способность к длительному выживанию в условиях низкой влажности (обезвоживании), при воздействии света и т.д. В связи с этим фактически невозможно предсказать, сколько на поверхности здорового семени может быть бактерий, тем более грибов. На поверхности и в покровах, а в некоторых случаях и в тканях разных семян можно обнаружить бактерии, принадлежащие к родам Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia, Clavibacter, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas, Rhizobacter, Rhizomonas, 151
Streptomyces, Xanthomonas и др., грибы родов: Acremonium, Alternaria, Aureobasidium, Aspergillus, Botrytis, Cephalosporidium, Claviceps, Drechslera, Fusarium, Gibberella, Helminthosporium, Humicola, Penicillium, Perenospora, Phoma, Phytophthora, Plasmopara, Puccinia, Pythium, Rhizoctonia, Septoria, Trichothecium, Ustilago, Verticillium и др. Среди перечисленных родов бактерий и грибов много истинных фитопатогенов. В семенах растений, даже находящихся в состоянии глубокого покоя, протекают процессы метаболизма и, следовательно, происходят обменные процессы с окружающей средой. Многие семена растений обладают специфическим, характерным для соответствующего вида запахом за счет синтеза летучих органических веществ. Эти вещества являются потенциальными субстратами для микроорганизмов. Естественно, что микроорганизмы — обитатели поверхности семян и растений в меньшей или большей степени, но постоянно ощущают на себе воздействия этих обменных процессов. При попадании в благоприятные условия влажности и температуры семя растения набухает и прорастает. При набухании, а тем более прорастании в семени происходят соответствующие молекулярно-генетические и физиолого-биохимические процессы. Те же факторы — влажность и температура — оказывают соответствующее действие и на микроорганизмы, находившиеся на поверхности семени. Однако основное действие на микробное сообщество поверхности семян оказывает «выброс» органических веществ из набухающего и прорастающего семени. Концентрация и состав таких веществ вида специфичны. Например, при прорастании семян пшеницы обнаруживаются углеводы (главным образом глюкоза и фруктоза, а в целом — до 10 компонентов), органические кислоты (в большинстве своем — сукцинат, фумарат и малат) и до 16 аминокислот, среди которых доминируют аспара- гиновая и глутаминовая. Помимо нелетучих веществ как при прорастании семени, так и активации метаболизма поверхностных микроорганизмов имеет место «выброс» и летучих органических веществ (ЛОВ). Взаимовлияния веществ на макро- и микроорганизмы в настоящее время активно исследуются. 3.3.5. Микробно-растительные взаимодействия в ризосфере и ризоплане Прорастающее и развивающееся из семени в почве растение сталкивается с различными микроскопическими биологическими объектами: микроскопическими животными, простейшими, грибами, бактериями и вирусами. Будущее растение контактирует с этими объектами как формирующейся корневой системой, так 152
и будущей надпочвенной частью — стеблем, пока проростком. Корень контактирует с неспецифическими для него микроорганизмами, т. е. такими, контакт с которыми не приводит к его инфицированию, и со специфическими, инфицирующими корень микроорганизмами. Среди инфицирующих имеются непатогенные и типичные патогены. К непатогенным относятся, например, клубеньковые бактерии, а из грибов — микоризные, эндо- и эктоми- коризные. Однако имеется и другая точка зрения, когда взаимодействие с растениями упомянутых бактерий и грибов в более широком контексте рассматривается как патогенез. Пространство и почву, окружающие формирующийся корень, называют ризосферой. Считается, что первое определение понятия ризосферы было дано Хилтнером в 1904 г. В настоящее время под ризосферой понимают пространство вокруг корня от 0 до 2 — 8 мм в диаметре, в котором имеет место более обильное развитие микроорганизмов из-за стимулирования их роста корневыми экссудатами (выделениями), а в более широком смысле — корневыми депозитами. Пространство ризосферы иногда называют еще эндоризосферой, включая в это понятие и ткани самого корня в противовес ризоплане, под которой подразумевают только то, что находится непосредственно на поверхности корня и прикреплено к корню. Корневые экссудаты представляют собой низкомолекулярные органические вещества, продукты фотосинтеза и метаболизма растения. К ним относятся сахара, органические и аминокислоты, спирты, гормоны, витамины и др. Эти вещества «утекают» из зоны вблизи кончика корня, точнее зоны «растяжения» корня в процессе его роста и развития. Корневые ризодепозиты — более широкое понятие. Они включают не только экссудаты, но и все другие вещества — высокополимерные слизи полисахаридной и белковой природы, ферменты, отмирающие и слущивающиеся поверхностные клетки с их содержимым, куски тканей, в частности кортекс верхних стареющих участков корня, корневой чехлик, корневые волоски, летучие органические вещества и др. Считают, что в виде ризодепози- тов растение теряет более 30 — 40% продуктов фотосинтеза. Помимо химического воздействия на почву и находящихся в ней микроорганизмов, в том числе через изменение рН и Eh имеет место и чисто механическое воздействие растущего корня на окружающую его эконишу. Феномен более высокой плотности микроорганизмов вокруг корня за счет потребления экссудатов и ри- зодепозитов называется ризосферным эффектом. В сравнительных экспериментах с выращиванием стерильных растений в стерильной и нестерильной почве показано, что в ризосфере микробно- растительные взаимодействия выражаются, в частности, и в стимуляции экссудирования растений. Численность микроорганизмов в ризосфере может превышать их численность в окружающей по- 153
чве от нескольких процентов до десятков процентов и даже на порядок. Общую численность микроорганизмов в ризосфере назвать очень трудно. Она зависит от типа почвы, растения и других факторов и может колебаться от миллионов до сотен миллиардов клеток на грамм сухой почвы. Оказалось, что пространственно-временная организация микробного сообщества ризосферы не просто отражает зоны экссудации корня, а имеет свою специфическую структуру. Микробное сообщество развивается вдоль растущего корня волнообразно, т.е. зоны с более высокой плотностью микроорганизмов чередуются с зонами низкой плотности. При этом пики разной плотности микроорганизмов смещаются во времени вдоль корня и, следовательно, можно говорить о форме «движущейся волны» развивающегося микробного сообщества ризосферы. Волнообразное развитие микробных популяций наблюдали и в ризо- плане, и в перпендикулярном корню направлении, т.е. явление волнообразного роста микроорганизмов в ризосфере представляет собой всеобщую форму развития микробного сообщества ризосферы. 3.3.6. Микробно-растительные взаимодействия в филлосфере и филлоплане Пространство, окружающее надпочвенную поверхность растения, включая ткани этого растения, называют филлосферой, а поверхность растения — филлопланой. Микроорганизмы, колонизирующие надземные поверхности растений, называют иногда эпифитными микроорганизмами (от греч. epi — вокруг; phytos — растение). Количество микроорганизмов, обнаруживаемых на поверхности листьев, иногда может достигать 108 клеток на грамм свежих листьев, или 106 на 1 см2, что вполне сопоставимо с численностью микроорганизмов в грамме почвы. Численность и разнообразие микроорганизмов, например тех же бактерий, существенно зависят от вида растения и его местообитания, климата, погодных условий и некоторых других обстоятельств. Некоторые из них уже были упомянуты при обсуждении наличия микроорганизмов на семенах растений. Это опять же сапротрофные и фито- патогенные представители родов Pseudomonas (P. syringae, P.fluores- cens и др.), Erwinia (Е. carotovora, E. amylovora), Xanthomonas (X. сат- pestris), Agrobacterium {A. tumefaciens), родов Beijerinckia, Enterobacter, Klebsiella, Methylobacterium и многих других. Имеются различия в микробном сообществе верхней стороны листа и нижней. Существенную роль в этом играют свет и температура. Естественно, что растения пустынь, суккуленты, содержат гораздо меньше микро- 154
организмов на единицу площади поверхности или на грамм, чем растения влажных тропических лесов. При прорастании растение выносит на своей поверхности из почвы типично почвенные микроорганизмы. Однако со временем, под влиянием окружающих условий, качественный состав микробного сообщества на поверхности растений меняется. Локализация или пространственная приуроченность микроорганизмов на поверхности листьев растений родо- и даже видоспецифична. В экспериментах с использованием генетически модифицированных бактерий, способных конститутивно синтезировать зеленый флуоресцирующий белок, было установлено, что одни бактерии (Pantoea agglomerans) преимущественно диссипативно локализуются на поверхностях эпидермальных клеток, тогда как другие (Pseudomonas syringae) группируются преимущественно вокруг устьиц. Устьица, имеющиеся на листьях и других частях растений, служат главными местами газообмена (С02 и 02) растений с окружающей средой и одновременно — местами выделений некоторых других веществ, в частности ЛОВ, которые, в свою очередь, могут служить субстратами для микроорганизмов. Существенную часть нелетучих веществ составляют сахара и органические кислоты, к ЛОВ относятся эфирные масла, высшие спирты и др. Оказалось, что именно устьица очень часто служат «входными воротами» для инфекций. Некоторые фитопатогенные бактерии и грибы даже приспособились проникать в растения только через устьица и не обладают другими способами проникновения к внутренним тканям и клеткам растений. Однако не все органические вещества, выделяемые растениями, и не всегда являются субстратами и полезны для микроорганизмов. Некоторые из них — фитоциды — оказывают ингибирую- щее действие. К ним относятся гликозиды, терпеноиды и др. Сосна (Pinus sylvestris) выделяет вещества, подавляющие рост туберкулезной палочки (Mycobacterium tuberculosis), и именно в связи с этим противотуберкулезные санатории стараются размещать именно в сосновых борах. 3.3.7. Специфические взаимовыгодные формы микробно-растительных взаимодействий Симбиотические взаимоотношения бактерий и растений. Симбиоз, по определению автора термина Антуана Де Бари (1879), — это «совместное сосуществование разных организмов». Однако традиционно сложилось, что в качестве классического примера симбиоза микроорганизмов и растений приводится взаимовыгодное сосуществование бактерий рода Rhizobium, способных к азот- 155
фиксации, с бобовыми растениями, хотя этот тип взаимоотношений более соответствует понятию мутуализма. Прежде чем перейти к рассмотрению бобово-ризобиального симбиоза, необходимо познакомиться с некоторыми биохимическими механизмами микробно-растительных отношений. Растения и ризосферные бактерии (их еще иногда называют ризобактериями) «обмениваются» химическими веществами — «сигналами», которые позволяют им вступать в мутуалистические взаимоотношения. Среди таких веществ, образуемых ризобактериями, имеются стимуляторы роста растений — гормоны роста растений, в частности ауксин (индолил-3-уксусная кислота, ИУК). Активными продуцентами ИУК являются бактерии Aeromonas veronii, Edwardsiella tarda, Listonella anguillarum, Pantoea ananas, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii, в том числе типичные почвенные бактерии, представители родов Arthrobacter, Agrobacterium, Pseudomonas и некоторые другие. Кроме ауксина некоторые ризобактерии продуцируют N-ацилированный лактон гомосерина (АЛГ), который служит аутоиндуктором активности бактериальной популяции и взаимодействия бактерий с окружающей средой и растением-хозяином. Широко известен продуцент АЛГ — Agrobacterium tumefa- ciens. Помимо низкомолекулярных веществ, упомянутых выше, как и многих других, важную роль в микробно-растительных взаимодействиях играют и некоторые высокомолекулярные вещества, в частности лектины. Лектины — это углеводсодержащие белки (неиммуноглобули- новой природы), обладающие свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные детерминанты биополимеров без изменения их ковалентной структуры. Лектины синтезируются фактически всеми живыми организмами и в связи с этим, по- видимому, играют роль в межорганизменных взаимодействиях всех уровней. Роль лектинов в бактериально-растительных взаимодействиях с некоторыми допущениями можно свести к посредничеству. Она достаточно хорошо продемонстрирована на примере лектинов, образуемых бактериями рода Azospirillum, симбионтов для многих небобовых растений, в частности злаковых. Разные виды Azospirillum синтезируют лектины, участвующие в адгезии соответствующих штаммов к корням пшеницы и, в конечном счете, в формировании азотфиксирующей ассоциации. Помимо адгезии, лектины микроорганизмов выполняют и другие функции, активно влияя на растения непосредственно и опосредованно. Лектины Azospirillum brasilense избирательно влияют на прорастание семян, подавляя прорастание семян пшеницы при концентрации 0,5 мг/мл раствора и, наоборот, стимулируя при концентрации 10 мкг/мл. Лектины, синтезируемые растениями, могут выполнять для них защитную роль: в частности, лектины пшеницы способны подавлять рост некоторых грибов. Лектин связывается с апи- 156
кальной частью гифы и ингибирует синтез хитина, основной конструктивный компонент клеточной стенки у большинства грибов. Эволюция возникновения симбиоза Rhizobium и бобовых далеко не ясна. Согласно одной из гипотез, такой симбиоз возник как результат защитной реакции бобовых от патогенов, которыми выступали бактерии рода Rliizobium. Взаимодействие бактерий рода Rhizobium с бобовыми растениями — это сложный многоступенчатый процесс, контролируемый множеством генов как в бактериях, так и в растениях. Процесс давно привлекает внимание микробиологов, физиологов растений, молекулярных биологов и др. Многие, хотя и далеко не все, детали этого явления довольно хорошо исследованы и описаны в учебниках по микробиологии и микробной экологии. В связи с этим механизм симбиоза бактерий, в первую очередь рода Rhizobium, а также Azorhizobium и Bradyrhizobium, с бобовыми растениями рассмотрен ниже только в общих чертах. Азотфиксация осуществляется ферментным комплексом бактерий — нитрогеназой. Нитрогеназа очень чувствительна к кислороду, инактивируясь в его присутствии. Следовательно, процесс азотфиксации может часто лимитироваться наличием кислорода. Существует мнение, что ткани клубенька как раз и способствуют защите ферментного комплекса бактерий от кислорода. Процесс инфицирования начинается с адгезии клеток бактерий на поверхности корневых волосков. Корневые волоски бобовых продуцируют особые вещества — хемоаттрактанты для бактерий. К таким соединениям, в частности, относятся флавоноиды и изофлавоноиды. В процессе распознавания принимают участие уже упоминаемые лектины, способствующие прикреплению бактерий к корневым волоскам. Флавоноиды и изофлавоноиды индуцируют экспрессию бактериальных nod-тенов, которые отвечают за синтез веществ, называемых Nod-факторами, обеспечивающих межвидовое взаимодействие. Дело в том, что бобово-ризобиальный симбиоз со стороны растений видо-, а со стороны бактерий даже штаммоспецифичен. В настоящее время известно более 24 веществ, продуктов экспрессии nod-генов, большинство из них ферменты. Компонент корневых экссудатов, аминокислоту триптофан, ри- зобии способны трансформировать в индолилуксусную кислоту. ИУК по своей природе является ростовым гормоном, стимулирующим рост растительных клеток. В месте выделения экссудатов (а это кончик корневого волоска) имеет место и повышенное скопление бактерий, а следовательно и повышенное выделение ИУК. Это приводит к более активному росту части поверхностных клеток корневого волоска, в результате чего волосок закручивается, а бактерии оказываются как бы внутри спирали. В процессе участвует и фермент полигалактуроназа, который может синтезироваться как бактериями, так и растением. 157
Этот фермент, гидролизуя пектины, размягчает поверхностные покровы волоска. Бактерии, проникая через корневые волоски внутрь клеток растения, формируют там инфекционную нить, которая, развиваясь в кортексе корня, активно инфицирует его тет- раплоидные клетки. Клетки ризобий, выходя из инфекционной нити, теряют свою первоначальную палочковидную форму, и в этом состоянии их называют бактероидами. Интенсивный рост и размножение тетраплоидных клеток и бактероидов приводит к образованию наростов (опухолей) на корнях растения, называемых клубеньками (в англоязычной транскрипции — nodules). Внутри клубеньков протекает процесс азотфиксации — биологическое превращение бактериями газообразного атмосферного азота в доступную растениям форму — аммоний. В акте азотфиксации главную роль играет вещество леггемогло- бин. Этот пигмент, по-видимому, находится в растительных клетках, а его синтез осуществляется частично бактериями (прото- гем) и частично растением (белковая часть), т.е. можно говорить о симбиозе на молекулярно-генетическом уровне. Особенность описанного примера микробно-растительных взаимодействий состоит в том, что бактерии родов Rhizobium и Bradyrhizobium фактически не способны к активной фиксации атмосферного азота вне связи с растениями, тогда как представители рода Azorhizobium обладают такой способностью. Следовательно, здесь можно говорить об эволюционном формировании специфической «органел- лы» растений — бактероидов. Симбиоз актиномицетов и растений. В симбиотические отношения с растениями способны вступать представители цианобакте- рий и актиномицетов, в частности представители рода Frankia. Симбиотические отношения Frankia могут возникнуть с более чем 200 видами двудольных древесных растений, принадлежащих к восьми семействам, среди которых ольха (Alnus), облепиха (Hippophae), стланик (Dryas) и др. При проникновении в растения часть гиф Frankia превращается в морфологически уникальные структуры, способные к азотфиксации и называемые везикулами. В конечном итоге на корнях инфицированных растений образуются азотфиксирующие клубеньки, где и происходят синтез нитро- геназы и фиксация азота. Отметим, что бактерии рода Frankia способны к азотфиксации и в свободноживущем состоянии, т. е. без контакта с растением. Грибо-растительный симбиоз. Микориза. Грибы, как и бактерии, также вступают с растениями в симбиотические (мутуалис- тические) отношения. Партнерами такого симбиоза являются в первую очередь высшие грибы, а со стороны растений — небобовые растения, в том числе многолетние древесные растения. Речь идет о микоризообразовании (от греч. «mykes» — гриб и «rhiza» — корень, дословно — грибокорень). В таких отношениях гриб ис- 158
пользует растение как источник питательных веществ, не вызывая его заболевания. Для гриба, установившего связь с растением, существенно снижается конкурентное давление со стороны других микро- и макроорганизмов. В свою очередь, гриб способствует обеспечению растения соответствующими питательными веществами, в первую очередь фосфором, азотом и калием, а также и влагой. Гриб «защищает» инфицированное растение от реальных фитопа- тогенов, в частности от грибов Fuzarium, способствует выработке у него устойчивости к токсинам и др. Такое явление называют индуцированной устойчивостью. Точно установлено, например, что благодаря везикулярно-арбускулярной микоризе происходит прямой обмен углеродом между корнями разных растений. Чтобы увидеть всю картину возможных взаимодействий гриба и растения, фактически нужно представить метаболические системы обоих организмов. Среди грибов к такому симбиозу способны и склонны представители классов Zygomycota (представители родов Glomus, Acaulospora, Scutellospora, Gigaspora и др.), Ascomycota, но главным образом Basidiomycota (агариковые и болетовые). Представители этих классов вступают и развиваются при очень сложных связях с корнями почти 80 % наземных растений. Интеграция растения и гриба бывает настолько велика, что можно фактически говорить о новой функциональной единице. Следует отметить, что микоризообразование не приводит к каким-либо существенным внешним изменениям корней и обнаруживается только при соответствующих исследованиях. Различают эктотрофную микоризу и эндотрофную. Эктомико- ризные грибы (из аскомицетов, например трюфели, а среди ба- зидиомицетов — болетовые, сыроежки, паутинник и др.) на корнях растений образуют внешний покров до 40 мкм толщиной. Гифы проникают в межклеточное пространство тканей корней, но не в клетки. В случае эндотрофной микоризы — это, как правило, представители несовершенных грибов, их мицелий проникает внутрь тканей и клеток корня. Такой тип микоризы часто образуется с растениями семейств вересковых, орхидных и др. Орхидные являются облигатными «носителями» микоризы, которую образуют с грибами Armillaria mellea и Rhizoctonia solani. Так как среди упомянутых грибов много истинно паразитических штаммов, то этот симбиоз можно рассматривать в качестве примера сбалансированного мутуалистического паразитизма. Таким образом, микоризные грибы занимают уникальную экологическую нишу, связывая внешнюю окружающую среду и внутреннюю среду растений. Большинство эндомикоризных грибов в процессе взаимодействия с растениями образуют морфологически особые структуры, везикулы и арбускулы, из-за чего ее часто называют везикулярно-арбускулярной микоризой (ВАМ). После проникновения в корень (обычно это корневой волосок) гифа растет в двух направлениях — 159
к кончику и основанию волоска. В клетках кортекса корня гифы образуют дихотомически ветвящиеся структуры, называемые ар- бускулами (от лат. arbusculum — древообразная структура). Помимо арбускул гифы грибов образуют в других клетках кортекса корня пузырьковидные вздутия — везикулы, отсюда и соответствующее название. Считается, что именно через эти структуры происходит химическое взаимодействие гриба и растения. При исследовании фоссилий и использовании молекулярно- биологических методов установлена большая древность арбуску- лярных микоризных грибов: они существовали 350 — 450 млн лет назад. Однако часть эндомикоризных грибов не образует везикул, и речь идет только об арбускулярной микоризе (AM). К такой функции неспособны, например, грибы, образующие эндомикоризу с растениями порядка Erikales (эрика, азалия и др.). В частности, в упомянутых выше орхидных везикулы и арбускулы не образуются. ВАМ возникает на корнях как однолетних, так и многолетних диких и культурных растений, в том числе пшеницы, кукурузы, многих пасленовых, винограде и др. Микоризные грибы имеют много особенностей. Они являются многоядерными, в цитоплазме многих ВАМ, таких как Glomus caledonium, Acaulospora laevis, Gigaspora margarita и некоторых других, а также в образуемых ими спорах присутствуют структуры, напоминающие бактерии. Комбинацией электронно-микроскопических и молекулярно-биоло- гических методов было установлено, что в спорах G. margarita действительно присутствуют бактерии, генетически близкородственные бактериям рода Burkholderia. Таким образом, в данном случае уже можно говорить о тройственном бактерио-грибо-раститель- ном взаимодействии. ВАМ — облигатные симбионты, и их не удается выращивать на искусственных средах. Другие формы взаимовыгодных микробно-растительных взаимодействий. Азотфиксация имеет место не только в почве, в ассоциации с корнями растений или вне их, но и на поверхности растений. Цианобактерия Anabaena образует на нижней стороне листьев тропического водного папоротника Azolla слизистые углубления, которые со временем как бы погружаются (инвагинируют) в лист папоротника. Anabaena фиксирует атмосферный азот, a Azolla, как и положено растению, обеспечивает цианобактерию необходимыми ей питательными веществами. Другие тропические растения, такие как Paretta и Psichotria, образуют своеобразные клубеньки на листьях, в которых бактерии родов Chromobacterium и Klebsiella соответственно осуществляют азотфиксацию. Примером облигатного симбиоза одноклеточных фотосинте- зирующих организмов и грибов является лишайник. Своеобразная морфология и особенности обмена веществ лишайников формируются в результате симбиоза высших грибов, в основном сумчатых (Ascomycetes), и водорослей, а также в основном зеленых 160
(Chlorophyta), реже — цианобактерий. Именно цианобактерии осуществляют азотфиксацию и тем самым снабжают азотными компонентами весь таллом лишайника. Паразитизм микроорганизмов на растениях и некоторые механизмы защиты растений от патогенов. Паразитизм бактерий, грибов, вирусов и некоторых микроскопических животных на растениях и в связи с этим болезни растений изучает наука фитопатология. Фитопатогенов среди грибов гораздо больше, чем среди бактерий. Например, у культурного растения ржи (Secale cereale) насчитывают более 70 грибных заболеваний. Часть фитопатогенов может существовать и сапротрофно, а некоторые из грибных фитопатогенов имеют так называемую сапротрофную фазу. Микроорганизмы, которые могут переходить от сапротрофного существования к паразитическому, называют иногда «оппортунистическими» видами. Среди бактерий — типичный представитель Pseudomonas syringae. При изменении условий, например при ранении растения или других обстоятельствах, когда такой «оппортунист» случайно попадает в растение, он может «перейти» к паразитической фазе. Механизмы таких переходов малоизучены, хотя очевидно, что им часто способствуют резкие изменения окружающей среды, например изменения температуры и влажности, т.е. шоковые воздействия. Довольно много и облигатных паразитов. Контакт паразита с хозяином происходит через филлоплану или ризоплану соответственно. Проникновение патогена внутрь растения происходит различными способами: через естественные отверстия, например устьица и места образования боковых корней, после активного (энзиматического, целлюлазами и пектиназами) разрушения покровных оболочек, тканей и клеточных стенок растений, через раны при механических воздействиях, например повреждениях, вызываемых насекомыми. Как известно, в растениях довольно много пектина, особенно в некоторых плодах. Одним из способов воздействия и проникновения патогена в растение-хозяина — это выделение пектинолитических ферментов. При этом происходят гидролиз пектинов растения и расслоение тканей и клеток. Пектинолитическая система фитопатогенной бактерии Erwinia chrysanthemi включает 16 генов, которые вовлечены в кодирование и управление синтезом пектинразрушающих ферментов. Результат воздействия патогена на растение может проявляться в разрушении тканей растения (появляются раневые участки или участки гниющих тканей); образовании токсинов, которые вызывают локальные некрозы тканей; изменении гормонального баланса (происходит локальный быстрый рост тканей, в результате чего образуются опухоли, например галлы); поглощении патогеном питательных веществ и энергии, в результате чего снижается или даже прекращается совсем рост растения-хозяина; нарушении транспортных путей питательных веществ и воды или их пе- 6 Нетрусов 161
рехват, что приводит к увяданию растения или сильным нарушениям развития. Наконец, может иметь место нарушение или полное разрушение системы транскрипционных и трансляционных процессов, последствия таких нарушений вполне понятны. Примером одной из наиболее агрессивных бактерий-фитопа- тогенов, наносящей существенный вред культурным растениям, может быть Agrobacterium tumefaciens. Эта бактерия поражает однодольные и двудольные растения. В результате инфицирования растений на листьях образуются вздутия — галлы. Галлы — это разрастания, фактически опухоль тканей растений, в которых концентрируются A. tumefaciens. Считается, что растения не имеют специальной иммунной системы. Тем не менее они имеют различные типы защитных механизмов. В некоторых из них активную роль играют синтезируемые растениями низко- и высокомолекулярные соединения с антимикробной активностью. Первой и фактически универсальной реакцией растения на контакт с патогеном является включение «программы гиперчувствительной смерти» клеток растения, в результате чего клетка продуцирует активные радикалы кислорода, пагубно действующие как на патогена, так и на само растение. Гиперчувствительный ответ клеток растения — первая линия защиты растения от патогена. Связанная с гиперчувствительностью смерть клеток растения представляет собой часть более общего явления, а именно отражает «ответную индуцированную устойчивость» (induced resistance response) растения, которая усиливает и мобилизует его защитные возможности против последующих атак патогена. Наиболее известны и изучены два типа ответной индуцированной устойчивости — накопление растением специальных, вызванных патогенезом белков и других, небелковых «защитных» вторичных метаболитов. Белки синтезируются как локально, в месте проникновения патогена, так и системно, во всем растении. В связи с эти различают «локальную приобретенную устойчивость» (ЛПУ) и «системную приобретенную устойчивость». Двумя наибольшими группами патогенных белков, синтезируемых растением в результате системно приобретенной устойчивостью, являются глю- каназы и хитиназы. Вследствие воздействия этих ферментов на клеточные стенки патогенов (в данном случае грибов) накапливаются олигомеры глюкана и хитозана, которые, в свою очередь, могут функционировать как вещества, вызывающие дальнейшие, не связанные с патогенными белками защитные реакции растения. Эти вещества называют еще элиситорами. Другим типом защитных реакций растений, связанных с гиперчувствительностью, является аккумуляция растением некоторых вторичных метаболитов, включая фитоалексины. Фитоалек- сины крайне специфичны, причем не только видо-, но часто даже органо- и тканеспецифичны для одного и того же растения. 162
Биоконтролирующие агенты. Положительные формы микроб- но-растительных взаимодействий можно использовать для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов с помощью других микроорганизмов. Микроорганизмы, которые используют для защиты растений от фитопатогенов, называют биоконтро- лирующими агентами. Биоконтроль подразумевает не полное уничтожение нежелательного микроорганизма, а ограничение его доминирования и тем более безудержного размножения, приводящего к уничтожению растения(й)-хозяина. Преимущество использования биоконтролирующих агентов по сравнению с «контролем» фитопатогенов пестицидами очевидно. При таком способе не происходит загрязнение окружающей среды и растительной продукции пестицидами. У фитопатогенов гораздо труднее развивается «привыкание» к соответствующему контролирующему агенту или не развивается совсем. В качестве биоконтролирующих агентов в настоящее время используются очень многие микроорганизмы. Известно несколько способов биоконтролирующего действия микроорганизма-суп- рессора на фитопатоген. Предполагается, что биоконтролирую- щий агент и растение-хозяин обмениваются «сигналами» в виде химических веществ, которые помогают этому «агенту» более успешно колонизировать растение. Биоконтролирующий эффект может быть результатом выделения биоконтролирующим агентом каких-то веществ антибиотической природы. В качестве примера — способность некоторых бактерий Pseudomonas fluorescens продуцировать 2,4-фтороглюцинол, который подавляет рост гриба Gaeumannomyces graminis, вызывающего болезнь «увядания» растений пшеницы. Биоконтролирующий агент может вытеснять фитопатоген, конкурируя с ним за сходные субстраты, лизиро- вать его, выделяя литические ферменты и др. Исследования на стыке наук всегда были наиболее сложными и трудно интерпретируемыми. Микробно-растительные взаимодействия относятся к одной науке — биологии. Более того, довольно долго микроорганизмы относили к растениям, и до сих пор многие микробиологи совокупность микроорганизмов неправильно называют микрофлорой. Однако мы знаем, что микробно- растительные взаимодействия — это взаимоотношения и взаимодействия представителей бактерий, грибов и растений. Область взаимоотношений микроорганизмов и растений — фундаментально важное сулящее новые открытия и большой практический эффект направление науки. - ЛИТЕРАТУРА Agarval V. К., Sinclair J. В. Principles of seed pathology. — 2-th ed. — CRC Press Inc. Lewis publishers, 1997. 163
Agrios G.N. Plant Pathology. — 4-th ed. — Acad. Press. CA. USA, 1997. Atlas R. M, Bartha R. 1998. Microbial Ecology. Fundamentals and applications. — 4-th ed. — An imprint of Addison Wesley Longman, Inc., 1998. Graham T.L., Graham M.Y. 2000. Defense potentiation and elicitation competency: redox conditioning effects of salicylic acid and genistein // Plant- Microbe Interactions. Ed. Stacey G. and Keen N.T. APS Press. St. Paul. Minnesota. USA- 2000. - V. 5. - P. 181-219. Harrison M.J. Molecular and cellular aspects of the arbuscular mycorrhizal symbiosis // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. — 1999. — V. 50. — P. 361 — 389. Semenov A. M., Van Bruggen A. H. C, Zelenev V. V. Moving waves of bacterial populations and total organic carbon along roots of wheat // Microbial Ecology. - 1999. - V. 37. - P. 116-128.
ГЛАВА 4 МИКРОБНЫЕ ПРОЦЕССЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 4.1. Биоразрушения Биоразрушение (биодеградация) — это преобразование сложных веществ с помощью биологической активности. Это широкое понятие включает: 1) трансформацию, или незначительные изменения молекулы; 2) фрагментацию, или разложение сложной молекулы на более простые соединения и 3) минерализацию, или превращение сложного вещества в самые простые (Н20, С02, Н2, NH3, СН4 и т.д.). Основными биологическими агентами, осуществляющими биоразрушения, являются микроорганизмы, обладающие огромным разнообразием ферментных систем и большой лабильностью метаболизма. Именно они способны разлагать широкий спектр химически устойчивых соединений, тем самым возвращая основные питательные элементы в глобальные циклы и предотвращая накопление «мертвых» остатков на поверхности Земли. Особую актуальность разрушающая способность микроорганизмов приобрела в последние десятилетия в связи с накоплением в биосфере устойчивых загрязнителей антропогенного происхождения, причем нередко в масштабах, превышающих природную самоочищающую способность. Дело в том, что человек создал такие соединения, которые не разрушаются в природе в обычных условиях, — различные синтетические полимеры, красители, пестициды, фармацевтические препараты, моющие средства и т.д. Эти чужеродные (живой природе) вещества — ксенобиотики — имеют уникальную биологическую активность уже на уровне микропримесей. В широком смысле к ним могут быть отнесены и вещества природного происхождения, но полученные в сверхколичествах и перемещенные в несвойственные им места (например, нефть). Большинство таких соединений обладает значительной стабильностью, и для их полного разложения при обычных условиях требуются столетия. Происходит непрерывный перенос этих веществ по пищевым цепям и накопление на их конечных этапах, к которым относится и человек. Огромное число ксенобиотиков чрезвычайно токсично и проявляет мутагенную, канцерогенную, аллергенную и тератогенную активности. Однако понятно, что человечество не может полностью отказаться от использования таких веществ, поскольку они применяются практически во всех областях его дея- 165
тельности. Поэтому на первый план выходит использование био- разрушающей способности микроорганизмов для очистки окружающей среды от антропогенных загрязнителей. Деградация ксенобиотиков может происходить различными путями в зависимости от химической структуры разрушаемого вещества, наличия тех или иных биологических активностей, а также в зависимости от условий окружающей среды. Химическая природа ксенобиотиков чрезвычайно разнообразна: это линейные и разветвленные алканы и алкены, ароматические соединения с различными заместителями, гетероциклические соединения, конденсированные циклические структуры и полимеры. Все они характеризуются высокой стабильностью и устойчивостью в окружающей среде. В аэробных условиях первой стадией биодеградации ксенобиотиков может быть гидроксшшрование. Введение в молекулу гидро- ксильной группы приводит к поляризации и лучшей растворимости вещества в воде, что делает его более доступным для биологической атаки. Такие реакции катализируются либо гидролазами, либо оксидазами смешанных функций. Еще одним способом разрушения ксенобиотиков является реакция N-деалкилирования, играющая важную роль на ранних этапах разрушения алкилзаме- щенных соединений. В проведении этих реакций участвуют также различные оксидазы. В деградации ксенобиотиков принимают участие и реакции окислительного метаболизма, такие, как декар- боксилирование, (3-окисление, гидролиз эфирных связей, образование эпоксидов и сульфоксидов, окислительное расщепление ароматического и гетероциклических колец. Значительно меньше известно о разрушении ксенобиотиков в анаэробных условиях. Более того, еще 15 — 20 лет назад считали, что без участия кислорода их биодеградация невозможна. Несмотря на то что многие стадии анаэробного метаболизма этих сложных соединений пока не до конца ясны, уже сейчас очевидно, что начальные этапы биоразрушения в неокислительных условиях осуществляются через реакции восстановительной трансформации — конверсию нитрогруппы в аминогруппу, восстановительное дегалогенирование, насыщение двойных и тройных связей, восстановление альдегидов и кетонов в соответствующие спирты, превращение сульфоксида в сульфид. И в аэробном, и в анаэробном метаболизме ксенобиотиков важное место занимают реакции гидролиза, в которых молекула расщепляется при присоединении воды. Под действием соответствующих эстераз, фосфатаз и лиаз гидролизуются эфирные, фос- фоэфирные или амидные связи. Гидролитическое дегалогенирование может происходить путем замещения атома галогена в молекуле на гидроксильную группу из воды. Синтетические пути преобразования ксенобиотиков включают их модификацию путем присоединения некоторых химичес- 166
ких групп или конденсацию нескольких молекул с образованием димерных или полимерных структур. Микроорганизмы в основном участвуют в присоединении алкильных (метальных) и ациль- ных (формильных и ацетильных) групп. Продукты синтетических путей трансформации ксенобиотиков часто обладают иной токсичностью, чем исходные вещества. Следует учитывать, что микроорганизмы могут преобразовывать ксенобиотики для получения энергии и углерода или с целью детоксикации. В первом случае обычно участвуют ферменты, задействованные в основных метаболических путях. Здесь происходит более глубокое разрушение чужеродного соединения вплоть до его полной минерализации. В детоксикации могут участвовать ферменты периферического метаболизма, которые обычно катализируют реакции трансформации и фрагментации молекулы. В то же время отмечено, что синтетические соединения, подобные природным, разрушаются микроорганизмами эффективнее, чем созданные человеком вещества, химическая структура которых сильно отличается от природных соединений. В связи с этим высказываются предположения о происхождении ферментов, способных к деградации ксенобиотиков, путем мутаций и естественного отбора генов, кодирующих конститутивные или индуци- бельные ферменты общего микробного метаболизма. Таким образом, способность использовать чужеродные вещества может быть результатом сверхпродукции ранее существовавших ферментов благодаря дупликации генов, мутациям, которые изменили процессы регуляции, и мутациям, которые привели к появлению ферментов с новыми специфическими активностями. Некоторые гены, кодирующие ферменты биодеградации, могут быть обнаружены на плазмидах, горизонтальный перенос которых приводит к образованию новых штаммов микроорганизмов с биоразру- шающей активностью по отношению к целому ряду ксенобиотиков. Это еще раз показывает, что способность к быстрой адаптации позволяет микроорганизмам приспосабливать свои ферментные системы к утилизации широкого спектра антропогенных соединений. Для деградации трудноразлагаемых веществ может быть использовано явление, называемое кометаболизмом (в аэробных условиях — соокисление), когда способность к трансформации сложной молекулы обусловливается наличием доступного источника энергии для поддержания жизнедеятельности, так как сам ксенобиотик не может использоваться микроорганизмом в этих целях. Как правило, процесс кометаболизма характеризуется тем, что культура, трансформирующая чужеродное соединение, в это время не размножается, скорость процесса остается постоянно низкой, а продукты трансформации могут накапливаться в окружающей среде. В настоящее время нет общепринятых критериев, позволяющих прогнозировать судьбу того или иного ксенобиотика в при- 167
роде. Однако известны некоторые свойства, которые влияют на устойчивость данного соединения к микробному разрушению. Например, наличие в молекуле таких заместителей, как галоген, нитро-, сульфонатная или метильная группы, ведет к уменьшению биодеградабильности данных веществ. Введение в молекулу двух и более заместителей повышает устойчивость соединения к микробной деструкции. Многие авторы отмечают важность позиции заместителя, однако данные по этому вопросу фрагментарны и противоречивы. Следует учитывать, что на процесс биоразрушения влияет целый комплекс факторов. Во-первых, необходимо присутствие микроорганизма, способного к преобразованию данного соединения. Во-вторых, требуется ряд условий для проявления соответствующей активности (оптимальные значения температуры, рН, осмолярности, аэрации, доступность питательных веществ и акцепторов электронов). На микробный рост и ферментативную активность могут оказывать влияние присутствие хищников и конкурентные или кооперативные взаимоотношения с другими микроорганизмами, ингибирующее действие высоких концентраций самого ксенобиотика и других токсинов, а также связывание данного соединения в высокомолекулярные комплексы, снижающие его растворимость в воде и уменьшающие доступность для микроорганизма. Наиболее активно участвуют в разрушении ксенобиотиков бактерии и грибы, основное количество которых выделено из почвы и воды. Представители бактерий относятся к различным родам гра- мотрицательных и грамположительных аэробных и анаэробных организмов. Из наиболее важных аэробных грамотрицательных бактерий следует отметить виды родов Pseudomonas, Sphingomonas, Burkholderia, Alcaligenes, Acinetobacter, Flavobacterium, метанокисляющие и нитрифицирующие бактерии, а из грамположительных — представителей родов Arthrobacter, Nocardia, Rhodococcus и Bacillus. Некоторые виды нитрат- и сульфатредуцирующих бактерий, а также метаногенные археи активно участвуют в анаэробной деградации ксенобиотиков. Грибы, способные аэробно разрушать такие соединения, относятся к родам Phanerochaete (возбудители «белой гнили»), Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium. Несмотря на то что найдены микроорганизмы, способные самостоятельно осуществлять преобразования ксенобиотиков, в природных местообитаниях биодеградация определяется преимущественно активностью гетерогенных микробных сообществ, основанных на прочных трофических связях. В анаэробных условиях такая кооперация более обязательна, так как часто отдельные члены ассоциации в виде чистых культур вообще не могут использовать химически стабильные соединения из-за энергетических барьеров. В таких условиях именно группа микроорганизмов способна 168
полностью минерализовать ксенобиотик до простых веществ, часто с получением полезного продукта (например, биогаза в мета- ногенном сообществе). Как правило, для нормального функционирования анаэробной пищевой цепи необходим межвидовой перенос некоторых интермедиатов, обычно молекулярного водорода, иногда ацетата, формиата, так как эндергонические реакции начальной фазы деградации требуют отвода Н2. В таких условиях возникает синтрофия, т.е. полная взаимозависимость микроорганизмов друг от друга в пищевых потребностях. Обычно эти тесные ассоциации оформлены структурно в виде гранул, хлопьев, сложных биопленок, что позволяет микроорганизмам, ответственным за разные стадии биодеградации сложного вещества, находиться пространственно близко друг к другу для облегчения межвидового переноса интермедиатов. Даже в аэробных условиях микробные ассоциации по сравнению с чистыми культурами позволяют увеличить скорость, эффективность и глубину деградации сложных соединений, хотя большинство аэробных микроорганизмов способны расщеплять субстрат самостоятельно. Поскольку каждая группа ксенобиотиков имеет в своем составе соединения самой разнообразной химической структуры, процесс биодеградации сложного загрязнителя складывается из нескольких путей, осуществляемых определенными группами микроорганизмов и направленных на конкретный класс химических веществ. Так, нефть и нефтепродукты содержат линейные и разветвленные алканы и алкены, ароматические соединения с разными заместителями, полициклические ароматические углеводороды. Различные биоциды наряду с подобными веществами включают также сложные гетероциклические соединения. Моющие средства состоят в основном из различных алкилбензолсульфонатов. Основу пластмасс, синтетических материалов, пластиков составляют полимерные молекулы разной структуры. Лакокрасочные и фармацевтические препараты представлены всеми вышеперечисленными классами соединений, а также могут включать очень сложные конденсированные молекулы. Конкретные пути преобразования веществ отдельных классов изучены в разной степени. Наиболее подробно прослежены реакции деградации алифатических и простых ароматических углеводородов в аэробных условиях. В большинстве случаев разложение углеводорода начинается с окисления концевой метильной группы в первичную спиртовую с участием монооксигеназы. Первичный спирт далее окисляется последовательно до альдегида и жирной кислоты, которая подвергается Р-окислению. Иногда окисление молекулы алкана идет с двух концов с образованием соответствующей дикарбоновой кислоты. Окисление непредельных углеводородов идет до спиртов, альдегидов, кето- и оксикислот с последующим образованием дикарбоновых кислот, далее разла- 169
гающихся путем |3-окисления. Промежуточными продуктами биоразрушения непредельных углеводородов могут быть эпоксиды, (3-, у-ненасыщенные кислоты, акрилат, лактат, пируват. Использование алканов и алкенов в аэробных условиях широко распространено среди бактерий. На средах с этаном, пропаном, бутаном и углеводородами, содержащими до 8 атомов углерода, способны расти некоторые флавобактерии, микобактерии и нокардии. Разрушение же алканов с 10—18 атомами идет с большой скоростью при участии бактерий родов Pseudomonas (P. aeruginosa, P.fluorescens, P. oleovorans), Mycobacterium (M smegmatis), Nocardia (N.petroliophila), Arthrobacter (A. paraffineus, A. simplex), Corynebacterium glutamicum, a также грибов Cladosporium resinae, Aspergillus, Penicillium, Alternaria. Об анаэробной деградации линейных углеводородов известно мало. Есть данные, что длинноцепочечные алканы и алкены могут использоваться сульфатредуцирующими бактериями, отнесенными к 5-подклассу протеобактерий, а также метаногенны- ми сообществами анаэробных осадков. Однако механизм биодеградации таких соединений, в особенности его начальные стадии, остается неясным. Предполагается, что анаэробная деструкция алканов начинается либо с превращения их в соответствующие алкены, либо с «активации» молекулы и последующего отрыва С!-фрагмента. Аэробная деградация простых ароматических соединений инициируется введением в молекулу одной или двух гидроксильных групп под действием моно- или диоксигеназы. Далее катехол подвергается орто- или мета -расщеплению ароматического кольца с образованием соответствующих производных муконовой кислоты. Эти неароматические продукты дальше окисляются с использованием реакций общих метаболических путей до воды и углекислоты. Если на бензольном кольце имеются заместители, то они могут преобразовываться и отщепляться как до, так и после раскрытия кольца. Разложение ароматических кислот может начинаться с неокислительного декарбоксилирования, приводящего к образованию фенолов, которые затем окисляются в линейные непредельные дикарбоновые кислоты. Основными микроорганизмами, разрушающими в аэробных условиях простые ароматические соединения, являются представители родов Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus и грибы рода Aspergillus, широко распространенные в почвенных и водных экосистемах. В анаэробных условиях при отсутствии такого окислителя, как кислород, разрушение ароматических веществ происходит более сложно, в многоэтапном процессе, при участии различных ферментов. Микроорганизмы способны использовать широкий набор ароматических субстратов в нитрат-, сульфат-, железо- и карбо- нат-восстанавливающих условиях. Основными этапами процесса биодеградации являются активирование бензольного кольца, его 170
разрыв и образование Сги С2-соединений. Активирование кольца может быть результатом реакций карбоксилирования, анаэробного гидроксилирования и образования КоА-тиоэфиров ароматических кислот. В последней реакции участвуют растворимые, неспецифичные, индуцибельные КоА-лигазы или КоА-трансфе- разы. При наличии заместителя на бензольном кольце далее может следовать восстановительное или гидролитическое его удаление. Центральным интермедиатом процесса биодеградации ароматических соединений является бензоил-КоА, который подвергается серии последовательных восстановлений под действием бензоил-КоА-редуктазы и гидролитическому расщеплению образовавшегося производного циклогексана. Первым неароматическим продуктом является пимелил-КоА. Далее происходит ряд окислений и декарбоксилирование глутаконил-КоА с образованием в конечном счете ацетил-КоА. Лишь немногие микроорганизмы, способные к биодеструкции ароматических соединений, выделены в виде чистых культур. Это Pseudomonas sp., Thauera aro- matica, Т. chlorobenzoica, Desulfobacterium anilini, Azoarcus evansii, Magne- tospirillwn sp., Delftia acidovorans, Rhodopseudomonaspalustris, Syntrophus gentinae и S. buswellii. Значительно больше сведений о биодеградации таких соединений анаэробными микробными сообществами. В метаногенных условиях конечные стадии биодеструкции представлены археями родов Methanobacterium, Methanospirillum, Metha- nosarcina, Methanosaeta. Биодеструкция поверхностно-активных веществ типа алкилбен- золсульфонатов, имеющих в алкильной цепи от одного до трех атомов углерода, начинается с сульфонатной группы, а у соединений с большим числом атомов — с боковой цепи. В аэробных условиях такие соединения разлагаются бактериями и грибами, способными к деструкции ароматических соединений. В отсутствие кислорода разрыв C-S-связи сульфоароматических соединений могут проводить бактерии с бродильным типом метаболизма. Есть данные об использовании алкилсульфонатов в качестве акцепторов электронов при анаэробном дыхании. Процессы анаэробной деградации алкилбензолсульфонатов эффективней идут в сообществе, содержащем микроорганизмы родов Clostridium, Desulfovibrio, Methanobacterium, Methanosarcina. На начальных этапах биодеградации сложных ароматических и гетероциклических соединений (красителей, фармацевтических препаратов) в аэробных условиях у разных микроорганизмов участвуют разные ферменты. Так, у бактерий рода Pseudomonas разрыв ин- дольного кольца катализирует диоксигеназа. Грибы родов Penicillium, Aspergillus, Verticillium, Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Helminthospori- um, Geotrichum имеют мощные пероксидазы, участвующие в окислении гетероциклических соединений. Для бактерий рода Strepto- myces получена строгая корреляция между способностью к рас- 171
щеплению полициклических соединений и лигнолитической активностью. Из ксенобиотиков с поли- и гетероциклической структурой наиболее часто используются азокрасители. Предполагают, что пероксидазы стрептомицетов трансформируют молекулу азокра- сителя в катион-радикал, который подвергается нуклеофильной атаке молекулой воды или перекиси. В результате происходит симметричный или асимметричный разрыв азосвязи с образованием интермедиатов, которые последовательно проходят ряд окислительно-восстановительных реакций. Азосвязи сложных ароматических соединений могут подвергаться восстановительному расщеплению с помощью азоредуктаз псевдомонад с образованием однокольцевых молекул, которые затем разрушаются на путях метаболизма ароматических веществ, как описано выше. Вызывающий гниение древесины базидиомицет Phanerochaete chrysosporium способен в аэробных условиях разрушать широкий спектр ксенобиотиков, в том числе таких устойчивых, как ДДТ, бензпирен, полихлорированные бифенилы, линдан, кристаллви- олет, различные азокрасители. При этом за начальные стадии процесса отвечают лигниназы и Mn-пероксидазы гриба. Наиболее распространенными аэробными деструкторами полициклических ароматических углеводородов, входящих в состав тяжелых фракций нефти, являются бактерии родов Rhodococcus, Pseudomonas, Burkholderia, Arthrobacter и Acinetobacter. Значительно более обычно восстановительное расщепление азокрасителей в анаэробных условиях с образованием соответствующих ароматических аминов. Среди бактерий, проводящих такой процесс, — молочнокислые бактерии, Proteus sp., Enterococcus sp., Streptococcus faecalis, Bacillus pyосу aneus, B. subtilis, B. cereus, Pseudo- monas sp., Aeromonas hydrophila, Caprococcus catus, Fusobacterium sp., Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium infantis, Eubacterium biforme, Peptostreptococcusproductus, Citrobactersp., обладающие неспецифичными анаэробными азоредуктазами. В восстановительном расщеплении азокрасителей в этом случае участвуют низкомолекулярные окислительно-восстановительные медиаторы (флавины или хиноны), которые ферментативно восстанавливаются клетками, а затем сами в химической реакции восстанавливают азосвязь в красителе. Гетероциклические соединения — индол, хинолин, производные пиридина, фурана, никотиновой кислоты — полностью минерализуются микробными сообществами анаэробных осадков в нитрат-, сульфатредуцирующих и метаногенных условиях. Считается, что такие соединения сначала анаэробно окисляются, а затем происходит раскрытие кольца, причем легче разрушаются азот- и кислородсодержащие гетероциклы по сравнению с серосодержащими веществами. 172
К использованию полимерных соединений, синтетических тканей и пластиков в аэробных условиях способны прежде всего грибы с их высокоактивными, часто внеклеточными гидролазами. Мицелиальные грибы родов Aspergillus, Penicillium, Trichoderma обладают фосфатазами, которые могут служить инициаторами биодеструкции некоторых полимеров. Полимерные материалы, содержащие амидные и эфирные связи (например, капрон, нейлон, поролон), часто подвергаются атаке микробных протеиназ. Присутствие в полимерной молекуле простой эфирной связи облегчает расщепление и дальнейшее использование полимера плесневыми грибами. Первичная колонизация пластиков происходит в результате разрастания колоний грибов на поверхности, проникновения мицелия в толщу материала через микротрещины, а затем начинается агрессивное воздействие ферментов и выделяемых кислот на отдельные компоненты пластиков. Бактерии разрушают пластики реже, и в отдельных случаях их присутствие трудно обнаружить. К числу полимерных смол, обладающих повышенной стойкостью к деструкции плесневыми грибами и бактериями, относят полиэтилен, полипропилен, полистирол, жесткий поливинилхлорид, полиамид, полиэтилентерефталат. Менее стойки поливинилацетат, поливиниловый спирт, хлорсульфированный полиэтилен. Пластификаторы, входящие в состав пластиков, более подвержены биодеградации, так как являются смесью эфиров фталевой и адипино- вой кислот. Итак, основными деструкторами резины, пластиков и других полимерных соединений в окислительных условиях можно считать микроскопические грибы родов Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Cladosporium, Fusarium, а также бактерии родов Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter. В термофильных условиях некоторые синтетические волокна разрушаются В. subtilis, В, mycoides, Aerobacter aerogenes и некоторыми грибами. Есть данные, что в деградации высокомолекулярных полиэтиленов и нейлонов принимают участие грибы, вызывающие «белую гниль». С помощью ферментного комплекса, гидролизующего лигнин, эти микроорганизмы способны разлагать такие полимеры до растворимых олигомеров в условиях лимитации по углероду и азоту. Представителями этой группы микроорганизмов являются Phanerochaete chrysosporium и Trametes versicolor. О процессах биоразрушения полимеров-ксенобиотиков в анаэробных условиях сведений нет. Только полимеры природного происхождения — полигидроксиалканоаты могут разлагаться микробными сообществами анаэробных илов очистных сооружений. На способности микроорганизмов к разложению сложных органических веществ основан процесс биоремедиации, т. е. устранения загрязняющих агентов из окружающей среды посредством биологической активности. При этом есть две возможности его осуществ- 173
ления: либо стимулировать развитие активных микроорганизмов, уже имеющихся в окружающей среде, либо интродуцировать в загрязненную область микроорганизмы с уже известной деструктивной активностью. Следует отметить, что в большинстве случаев такая интродукция не бывает успешной, так как для лабораторно полученных штаммов в природе не всегда удается создать оптимальные условия проявления их активности и, как правило, такие микроорганизмы менее конкурентоспособны, чем резидентная микрофлора. В различных природных местообитаниях доступность ксенобиотика для способных разрушить его организмов может быть разной, что во многом зависит от физико-химических свойств данного местообитания. Если свойства водной экосистемы довольно легко поддаются лабораторному моделированию, то такая гетерогенная система как почва может значительно изменять характеристики процессов, разработанных в лаборатории. Так как почва и подстилающие ее грунты могут рассматриваться как сочетания локальных областей с разными наборами физико-химических свойств, то при пространственной миграции загрязняющего вещества существенно меняются и факторы, влияющие на процесс его биоразрушения. Ксенобиотик может связываться с веществами гумуса и минеральных частиц как за счет сорбции, так и вступая в химические реакции, тем самым становясь малодоступным для микроорганизмов. Почвенные частицы могут создавать физический барьер между клетками и чужеродными веществами путем избирательной фильтрации через микропоры. В качестве приема, стимулирующего разрушающую активность резидентных микроорганизмов, используют внесение в загрязненную область лимитирующих процесс элементов в доступной форме. Например, добавление азота и фосфора при разливе нефти на Аляске ускорило биодеградацию углеводородов, и за 16 месяцев 60 —70 % нефтяных загрязнений было ликвидировано. Многими исследователями отмечен феномен адаптации микроорганизмов в природных и искусственных местообитаниях, когда контакт с новым чужеродным соединением приводит к выявлению разрушающей активности в микробном сообществе, ранее не подвергавшемся воздействию этого ксенобиотика. При повторном попадании данного соединения такое сообщество осуществляет его преобразование уже с большей скоростью и при более высоких концентрациях. Это явление позволяет надеяться, что для любого вновь созданного вещества будут найдены микроорганизмы, способные его разрушать. Для пестицидов в настоящее время принято положение о том, что новое соединение допускается к применению, если может разлагаться микроорганизмами в природе без образования токсичных продуктов и за относительно короткое время. В искусственных очистных сооружениях значительно больше возможностей применять полученные в лаборатории сверхак- 174
тивные штаммы микроорганизмов-деструкторов или специально созданные микробные сообщества, в том числе и генноин- женерные. Соответствующее аппаратурное оформление и технологические приемы позволяют создавать и поддерживать условия, оптимальные для проведения процесса биодеградации ксенобиотических веществ. Часто при этом возможно получение на выходе полезного продукта (биогаза, органических удобрений, металлов и т.д.). Всегда следует помнить, что наряду с биоремедиацией, т.е. позитивной, с точки зрения человеческой деятельности, стороной биоразрушающей активности, есть и отрицательное проявление этого процесса, называемое биокоррозией. Под биокоррозией (биоповреждениями) понимают нежелательные изменения свойств промышленных и бытовых объектов и материалов, основанные как на непосредственной метаболической активности микроорганизмов, так и на выделении ими агрессивных продуктов жизнедеятельности. Поскольку оба эти явления (биоремедиация и биокоррозия) основаны на одном и том же свойстве микробного метаболизма, то среди микроорганизмов, вызывающих биоповреждения, логично ожидать выделения активных штаммов, способных использовать в своем обмене веществ чужеродные соединения. В перспективе выяснение видового состава микробных сообществ, осуществляющих процесс биодеградации, взаимосвязей в нем, а также изучение механизмов преобразования чужеродных веществ позволит понять и стимулировать процессы самоочищения в природных местообитаниях, создать эффективные системы микробной переработки промышленных и бытовых отходов и, в конечном счете, позволит снизить негативное антропогенное давление на природу. 4.2. Биологическая обработка органических отходов «Отходы в доходы» — так кратко можно обозначить стратегию по очистке окружающей среды от продуктов жизнедеятельности человека. Тактика современной (био)технологии окружающей среды определяется словами «Не навреди природе». Издревле в крестьянских хозяйствах практиковалось получение из отходов удобрений, улучшающих структуру и плодородие почвы. При этом проблемы отходов практически не существовало. Концентрация населения в городах и промышленных районах привела к перепроизводству отходов, превышающему способность микробного населения окружающей почвы и водоемов минерализовать их. Еще в городах Древнего Египта, Греции и Рима существовали канализационные системы, по которым отходы жизнедеятельности людей и животных транспортировали в водоемы — реки, озера и моря. В Древнем Риме перед сбросом в реку Тибр канализационные сто- 175
ки накапливали и выдерживали в накопительном пруде-отстойнике. В Средние века этот опыт был в значительной степени забыт. Помои, экскременты людей и животных выливались на городские улицы и удалялись эпизодически. Это вызывало загрязнение и заражение источников питьевой воды и приводило к возникновению эпидемий холеры, тифа, амебной дизентерии и др. В начале XIX в. в Англии был изобретен туалет с водяным смывом. Возникла очевидная необходимость в обработке сточных вод и предотвращении их попадания в источники питьевой воды. Сточные воды собирали и выдерживали в больших емкостях, осадок использовали в качестве удобрений. В начале XX в. были разработаны интенсивные системы очистки бытовых сточных вод, включая поля орошения, где вода очищалась, фильтруясь через почву, струйные фильтры со щебневой и песчаной загрузкой, а также резервуары с принудительной аэрацией — аэротенки. Последние являются основным узлом современных станций аэробной очистки городских сточных вод. Первоначально основной целью очистки стоков было их обеззараживание. Понимание важности качественной очистки сточных вод для охраны природных водоемов пришло позже. Сегодня проблема чистой воды считается одной из актуальнейших проблем наступившего века. Стремительный рост населения Земли, развитие промышленности и сельского хозяйства, которые помимо полезной продукции производят большое количество отходов, вырубка лесов и распашка земель ведут к нарушению экологического равновесия и загрязнению водоемов и грунтовых вод — источников питьевой воды. Для поддержания чистоты мест забора питьевой воды необходима качественная очистка сточных вод. Эти проблемы тесно взаимосвязаны, тем более что производство сточных вод в России достигает в настоящее время 500 л в сутки на душу городского населения. Огромный вклад в загрязнение грунтовых и поверхностных вод вносят свалки твердых бытовых и промышленных отходов, сброс навозных стоков, бесконтрольное применение удобрений, а также загрязнение целых территорий нефтью и другими химическими продуктами, выработка полезных ископаемых. С ростом использования бумаги, упаковочных материалов, одноразовой посуды и т. п. количество твердых бытовых отходов (ТБО) на душу городского населения в индустриальных странах достигло 300 (Россия) — 650 (США) кг в год. Практически единственным методом утилизации ТБО до последнего времени является его захоронение на специальных полигонах и последующая анаэробная деградация спонтанной микробной популяцией. При этом вследствие атмосферных осадков, потоков поверхностных и грунтовых вод происходит вымывание растворимых продуктов разложения мусора и загрязнение грунтовых вод и водоемов. 176
В настоящее время разработаны и развиваются современные технологии по очистке бытовых, промышленных и сельскохозяйственных отходов. Наибольший интерес представляют (и имеют перспективу) естественные и самые дешевые биологические методы очистки, представляющие собой интенсификацию природных процессов разложения органических соединений микроорганизмами в аэробных или анаэробных условиях. Наряду с ними развиваются физико-химические методы фильтрации, осаждения, флотации, электрокоагуляции и др., которые применяются для очистки стоков различных видов промышленности с извлечением (по возможности) из них полезных продуктов. Ниже рассмотрены современные технологии обработки бытовых, промышленных и сельскохозяйственных отходов. Наибольшее внимание уделяется биологическим, а точнее — микробиологическим методам, имеющим главенствующее значение. Затрагиваются проблемы биоремедиации почвы, загрязненной биодеградабельны- ми химическими продуктами. 4.2.1. Обработка органических отходов Характеристика отходов. Органические отходы в соответствии с источником подразделяются на бытовые, промышленные и сельскохозяйственные, а по физическому состоянию — на жидкие (сточные воды), полужидкие текучие (осадки сточных вод и полужидкий навоз) и твердые (бытовой мусор, подстилочный навоз). Для характеристики отходов используются специальные определения: • Абсолютно сухая масса (АСМ) — для твердых и полужидких отходов (%), или общие взвешенные вещества (ОВВ) — для сточных вод (г/кг, мг/л) — масса сухих веществ (органических и неорганических) в отходах, определенная при высушивании образца до постоянной массы при 110 °С. • Летучие вещества (ЛВ) (г/кг, мг/л) — часть загрязнений, удаляемых сжиганием при 600 — 650 °С; представлены в основном органическими веществами и включают микробную биомассу. • Зольность (г/кг, мг/л) — оставшаяся после сжигания часть — зола (минеральные соли). В сумме зольность и ЛВ дают АСМ. • Химическое потребление кислорода (ХПК) (мг/л) — количество кислородных эквивалентов, необходимое для полного химического окисления органических и неорганических загрязнений до С02, например бихроматом калия в концентрированной серной кислоте при 160 °С. Если загрязнения в сточной воде представлены органическими веществами, то концентрация их близка к значению ХПК. • Биологическое потребление кислорода (ВПК) (мг/л) — количество кислородных эквивалентов, необходимое для окисления 177
органических и неорганических загрязнений до С02 микроорганизмами активного ила при 25 °С, за определенное время, обычно 5 (БПК5) или 20 дней (БПКполное). В большинстве развитых стран мира стоимость очистки или сброса сточных вод промышленных предприятий и бытовых в центральную канализацию или водоем определяется величинами ХПК и БПК в стоках. Содержание и характер загрязнений в сточных водах промышленных предприятий сильно варьируют в зависимости от происхождения стоков. Даже для одного типа промышленных производств стоки могут различаться по концентрации загрязнений в десятки раз в зависимости от технологий, применяемых на предприятиях. В целом российские промышленные предприятия производят в 3— 10 раз более разбавленные стоки, чем аналогичные производства Западной Европы. Традиционно в быту и на предприятиях нашей страны используется большое количество чистой воды. Это связано с очень низкими ценами на воду в России в прошлом и с ориентацией на аэробную очистку. С увеличением дефицита чистой воды и резким повышением цен на воду промышленные предприятия вынуждены менять технологические схемы. Это означает, что они будут производить более концентрированные стоки. Принципы биологической обработки отходов. Обработка отходов подразумевает биологическое разложение органических соединений. В случае очистки сточных вод содержащиеся в них загрязнения должны быть практически полностью удалены. По существующим нормам содержание органических веществ в очищенной воде не должно превышать 10 мг/л. При обработке полужидких и твердых отходов удаляется наиболее легко разлагаемая часть органических веществ, что приводит к так называемой стабилизации отходов. Например, из навоза получается качественное удобрение. Деградация органических веществ осуществляется микроорганизмами как в аэробных, так и в анаэробных условиях, с разными энергетическими балансами суммарных реакций. При аэробном биоокислении глюкозы 59 % энергии, содержащейся в ней, расходуется на прирост биомассы и 41 % составляют тепловые потери. При анаэробной деградации глюкозы с образованием метана лишь 8 % энергии расходуется на прирост биомассы, 3 % составляют тепловые потери, 89 % переходит в метан. Аэробный процесс: С6Н1206 + 602 —> 6С02 + 6Н20 + микробная биомасса + теплота. Анаэробный процесс: С6Н1206 -» ЗСН4 + ЗС02 + микробная биомасса + теплота. Аэробное микробное сообщество представлено разнообразными микроорганизмами, в основном бактериями, окисляющими различные органические вещества в большинстве случаев независимо друг от друга, хотя окисление некоторых веществ осуществ- 178
ляется путем соокисления (кометаболизм). Анаэробная деградация органических веществ при метаногенезе осуществляется как многоступенчатый процесс, в котором необходимо участие по меньшей мере четырех групп микроорганизмов: гидролитиков, бродилыциков, ацетогенов и метаногенов. В анаэробном сообществе между микроорганизмами существуют тесные и сложные взаимосвязи, имеющие аналогии в многоклеточных организмах, поскольку ввиду субстратной специфичности метаногенов их развитие невозможно без трофической связи с бактериями предыдущих стадий. В свою очередь, метаногены, используя вещества, образуемые первичными анаэробами, определяют скорость реакций, осуществляемых этими бактериями. Преимущество аэробного процесса состоит в высокой скорости и использовании веществ в низких концентрациях, недостаток — в образовании большого количества микробной биомассы. Аэробный процесс используется при очистке бытовых, некоторых промышленных и свиноводческих сточных вод с ХПК не выше 2000 мг/л. Компостирование твердых отходов также является аэробным процессом. Преимущество анаэробного процесса заключается в относительно незначительном образовании микробной биомассы, возможности обработки концентрированных стоков, а также в образовании энергоносителя — метана. К недостаткам следует отнести невозможности удаления органических загрязнений в низких концентрациях, и для глубокой очистки анаэробную обработку следует использовать в комбинации с последующей аэробной стадией (рис. 4.1). Выбор технологии и особенности обработки отходов определяются их физическим состоянием и содержанием органических загрязнений (табл. 4.1). Рис. 4.1. Сравнение методов аэробной и анаэробной очистки сточных вод 179
Табл и ца 4.1 Типы органических отходов и методы их биологической обработки Физическое состояние Жидкое (сточные воды) Полужидкое (текучее) 1 Твердое Типы отходов Городские Промышленные Навозные стоки при гидросмывной уборке Осадки сточных вод Навоз при самотечной уборке Твердые бытовые (ТБО) Органическая часть ТБО Подстилочный навоз ХПК, мг/л 200-500 300 — 50000 1000 — 3000 4000- 6000 2000- 7000 Вид обработки Аэробная* Тоже Анаэробная** Аэробная Выдерживание в отстойниках Анаэробная Анаэробная То же Выдерживание в отстойниках Компостирование с наполнителем Анаэробная Тоже Компостирование Анаэробная Компостирование Преимущество Глубокая 1 очистка Тоже Отсутствие избыточного ила Очистка воды Дешевизна, удобрение Нет избыточного ила, удобрение | Метан, отсут- 1 ствие запаха Метан, удобрение, отсутствие запаха Дешевизна, удобрение Качественное удобрение Метан Метан, удобрение Удобрение Метан, удобрение Дешевое качественное удобрение *Аэробный процесс активированного ила. **Анаэробное сбраживание с образованием метана. 180
4.2.2 Аэробная очистка сточных вод Биологическая очистка сточных вод по сути представляет интенсифицированную модель процессов, происходящих в природных водоемах при попадании в них избытка органических соединений. На повышение концентрации доступного субстрата автохтонная микробная популяция водоема отвечает увеличением своей плотности. Развиваются микроорганизмы, способные использовать субстрат в более высоких концентрациях, при этом резко понижается содержание растворенного кислорода в воде. Увеличение в воде содержания соединений азота и фосфора вызывает в водоемах массовое развитие зеленых водорослей и водных растений, что, в свою очередь, приводит к увеличению концентрации кислорода в воде. В проточных водоемах, в реках, ручьях очищению воды способствуют микробные обрастания (биопленки) на твердых поверхностях. Избыток бактерий потребляется простейшими. В иловых осадках природных водоемов осуществляется анаэробная деградация органических веществ. Важный природный фактор очистки поверхностных вод — фильтрация через почву и грунт, где микроорганизмами обрастают твердые поверхности. В условиях доступа кислорода преобладают аэробные микроорганизмы, в его отсутствие соответственно анаэробные. Таким образом, для улучшения процесса очистки необходимо улучшение снабжения кислородом и удержание высокой плотности и разнообразия микроорганизмов в системе. Простые методы очистки стоков. Окислительные пруды (лагуны) и каналы представляют собой простейшие и наиболее дешевые системы очистки бытовых сточных вод. Это аналоги гиперевтро- фицированных водоемов. Микроорганизмы находятся во взвешенном состоянии и в осадке. Снабжение кислородом осуществляется за счет диффузии и фотосинтетической активности водорослей и водных растений, поэтому водоемы должны быть неглубокими. Более эффективны системы из нескольких прудов, соединенных каналами, где происходит ступенчатая очистка, причем последний инфильтрационный пруд обычно очень мелкий, в нем идет естественная фильтрация через песок и глину в грунтовые воды. Иногда для естественного окисления загрязнений и фильтрации воды через почву и грунт используют низины (поля орошения, искусственные болота). Такая очистка может применяться в местах, где имеется слой глины, залегающий под фильтрационным слоем почвы и песка и предохраняющий грунтовые воды от загрязнения. Разновидностью окислительных прудов и каналов являются водоемы, заросшие тростником (камышом). Очищаемая вода медленно течет через камышовые плавни. Через полые стебли растений кислород поступает в ризосферу, где развивается сложное 181
микробное сообщество, представленное взвешенными и прикрепленными к корням тростника аэробными и анаэробными микроорганизмами. Эффективность очистки зависит от температуры, наличия свободных территорий, поэтому применение окислительных прудов и полей орошения ограничено сельской местностью и районами с теплым климатом. Для стабилизации навозных стоков, деградации легкоразлагае- мых органических веществ используют длительное, от 6 месяцев и более, выдерживание навоза в прудах-отстойниках или закрытых навозохранилищах. При этом в верхней части осуществляется аэробная деградация, а в нижней — анаэробная. Струйные биофильтры с прикрепленными микроорганизмами также являются простыми и дешевыми очистными сооружениями. Они представляют собой емкости или наклонные каналы, заполненные пористым материалом (щебень, керамзит и т.п.). Вода поступает сверху, медленно струится между обросшим микробной биопленкой наполнителем и собирается внизу. В формировании микробной биопленки важную роль играет выделяющая слизь Zoogloea ramigera и близкие к ней виды. В слизистой матрице, толщина которой обычно составляет около 200 мкм, развивается сложное микробное сообщество, включающее бактерии, микроскопические грибы, простейшие, нематоды. Простейшие выполняют важную санитарную функцию, поедая бактерии, не прикрепленные к пленке, в том числе отмирающие и патогенные. Для улучшения очистки используют циркуляцию очищаемой воды в одном фильтре, иногда вода проходит через два или несколько соединенных последовательно струйных биофильтров. Открытые окислительные каналы или резервуары, в которых установлены вращающиеся диски, изготовленные из синтетических материалов и наполовину погруженные в медленно протекающую воду, также являются недорогими устройствами для очистки сточных вод. Диски обрастают микробной биопленкой, в которой, как правило, наблюдаются два слоя — наружный светлый с преобладанием аэробных микроорганизмов и внутренний темный благодаря развитию в нем анаэробных сульфатвосстанавливающих бактерий. При медленном вращении дисков оказывающаяся снаружи часть биопленки захватывает кислород. При работе в периодическом режиме подачи воды на дисковых фильтрах происходит чередование аэробных и анаэробных условий. Температурные и, следовательно, климатические ограничения для применения струйных и дисковых биофильтров весьма существенны. Сооружения применяются в теплых регионах либо устанавливаются в помещениях. Простые системы с невысокой скоростью процесса очистки, конечно, не могут решить проблем городов с большим населением и крупных промышленных предприятий, особенно в регионах 182
с умеренным и холодным климатом, где необходимо применение гораздо более эффективных систем обработки сточных вод. Процессы с использованием активированного ила и централизованная очистка сточных вод. При самоочищении природных водоемов и в функционировании окислительных прудов лимитирующими факторами при попадании органических соединений в воду являются низкая плотность микробной популяции, способной использовать загрязнения, и недостаточный доступ кислорода. Эти ограничения преодолеваются в современных системах аэробной очистки путем применения принудительной интенсивной аэрации и поддержания высокой плотности микробной популяции в аэротенках путем возврата части активного микробного ила. Это позволяет обеспечивать необходимую плотность и разнообразие микробной популяции, окисляющей органические загрязнения вплоть до практически полного их удаления. Технология «Процесс активированного ила» применяется в настоящее время во всем мире для очистки городских сточных вод. Централизованные очистные сооружения в больших городах представляют собой крупные промышленные предприятия, от которых в большой степени зависит функционирование городского хозяйства. Так, в Москве на Курьяновской и Люберецкой станциях очищают около 6 млн м3 сточных вод в сутки. Городские сточные воды включают: 1) бытовые — туалетные и кухонные стоки; 2) ливневые — дождевые и снеговые воды; 3) промышленные — стоки различных предприятий. Ливневые стоки в России практически не очищают, однако в связи с резким увеличением автомобильного транспорта в крупных городах эта проблема требует решения. Городские станции очистки воды очищают бытовые сточные воды и обычно принимают нетоксичные стоки промышленных предприятий. Сточные воды, поступающие для очистки на станции аэрации российских городов, содержат от 200 до 400 мг/л загрязнений, из них около 50% составляют углеводы, 35 — 40% — азотсодержащие соединения, 10% — жиры и детергенты, около 5% — другие, включая полимерные и полициклические соединения. При этом около трети загрязнений находятся в нерастворимой фракции (взвешенные частицы). Из неорганических загрязнений наиболее важными являются соединения аммония и нитраты (до 40 мг N/л), а также фосфаты (до 10 мг Р/л). В сточных водах обычно присутствует до 1010/л микробных клеток, при этом содержание патогенных микроорганизмов очень мало. Так, численность клеток индикатора фекальных загрязнений Escherichia coli составляет обычно не более 1 % от общей численности микробных клеток. Среди непатогенных бактерий доминируют Pseudomonasfluorescens, P. aeruginosa, Bacillus cereus, В. subtilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumonie, Enterobacter cloacae, Zoogloea ramigera. 183
Табл и ца 4.2 Загрязнения в очищаемой воде до и после обработки на станциях аэрации городов центральной части России Вода Поступающая на очистку Очищенная для сброса в водоемы культурно-бытового назначения рыбного хозяйства ХПК, мг/л 300-350 10 3 БПК, мг/л 140-160 6 2 Азот (общий), мг/л 25-30 1 0,4 Фосфор (фосфат), мг/л 2-3 1,6 0,2 На современных предприятиях очистки воды (станциях аэрации) обеспечивается не только окисление органических загрязнений, но и удаление соединений азота и фосфора (табл. 4.2). Типовая схема аэробной очистки сточных вод «процесс активированного ила» включает 3 или 4 ступени (рис. 4.2): 1) удаление твердых включений (механическая обработка, осаждение); 2) биологическое окисление органических загрязнений (микробиологическая обработка, собственно процесс активированного ила); 3) химическое и/или биологическое удаление неорганических загрязнений (доочистка); 4) обеззараживание (хлорирование, озонирование). 1-я ступень - механическая очистка 2-я ступень - биологическая очистка 3-я ступень - химическая и биологическая доочистка гт: z 1 |Аэротенк |Отстойник|-Н j^gl "t: Отстойник №1 Песколовка] . Т , ¦ 1 Решетка| Сточная вода [Аэротенк I №2 t —> Отстойник №2 Удаление NhP I ' г Метантенк Очищенная вода Уплотнение ила Полигон ТБО К • - вода - - микробный ил - - твердые отходы Рис. 4.2. Типовая схема аэробной очистки сточных вод «Процесс активированного ила» 184
На первой механической ступени (см. рис. 4.2) при прохождении стока через решетки, песколовку и первичный отстойник отделяются крупные и мелкие твердые включения, при этом удаляется до 30 % загрязнений. Крупные включения захораниваются на полигонах ТБО, осадок из отстойника (первичный осадок) направляется на анаэробную обработку в метантенк. Биологическая очистка — вторая, центральная, ступень обработки сточных вод. Она осуществляется с помощью «процесса активированного ила». Основной процесс происходит в открытом бассейне, аэротенке, содержимое которого перемешивается и снабжается кислородом с помощью мешалок и воздуходувок разных конструкций. Контролируемая подача воздуха обеспечивает поддержание в аэротенке содержания кислорода в пределах 10 — 40 % насыщения воздухом. Растворенные и суспендированные загрязнения окисляются сложным микробным сообществом, при этом удаление органических загрязнений достигает часто 99 % от первоначального. В аэротенке происходит активный рост микроорганизмов, которые благодаря наличию слизистых капсул у многих микроорганизмов, нитчатых форм бактерий, притяжению положительно заряженных ионов и образованию полисахаридных фибрилл спонтанно агрегируются, образуя рыхловатые флоки неправильной формы размером до 1 — 2 мм. Обработанная в аэротенке вода и активный ил, состоящий в основном из микробной биомассы, разделяются в отстойнике (вторичный отстойник), из которого вода направляется для сброса в принимающий водоем или на доочистку (удаление азота и фосфора). Обычно на крупных станциях очистки сточных вод применяется система из двух последовательных аэротенков с отстойниками (см. рис. 4.2). Агрегированная микробная биомасса, выносимая с водой из аэротенка в отстойник, осаждается довольно эффективно, и 70 —95 % ее направляется обратно в аэротенк. Это позволяет поддерживать максимально возможное разнообразие микроорганизмов, необходимое для обеспечения использования различных веществ, присутствующих в сточных водах в разных концентрациях. Возврат в аэротенк части активного микробного ила обеспечивает и другие важные функции, отличающие процесс активированного ила от обычной проточной культуры. Во-первых, возврат ила разобщает время пребывания в аэротенке ила и очищаемой воды. Время пребывания воды составляет 4—12 ч, а ила — от нескольких дней до нескольких недель, что позволяет удерживать в системе медленно растущие микроорганизмы. Во-вторых, возврат ила поддерживает количество активной биомассы в аэротенке намного выше необходимого для деградации поступающих со сточной водой загрязнений. Это позволяет повысить скорость окисления, поддерживать биоразнообразие микробного сообщества и 185
увеличить сродство ила к нерастворимому субстрату. Наконец, возврат ила регулирует эффективность его осаждения, так как в аэротенк возвращаются только агрегированные микроорганизмы, которые уже прошли осаждение, в то время как суспендированные микробы вымываются из системы. Способность ила к осаждению — ключевое свойство, позволяющее контролировать систему. Эффективность процесса регулируется путем поддержания тонкого баланса между возвратом активного и удалением избыточного ила. Недостаточный возврат ила в аэротенк приводит к уменьшению биоразнообразия микробного сообщества, а избыточный возврат — к так называемому старению ила, что означает уменьшение метаболической активности микробного сообщества. Активированный ил представлен агрегатами (флоками) бактериальных клеток и некоторым количеством простейших. Одиночных суспендированных клеток в действительно активном иле не так много. Этому способствуют простейшие, которые питаются преимущественно одиночно плавающими микробными клетками. Простейшие в активированном иле представлены инфузориями родов Paramecium и Vorticella и амебами. Кроме того, часто присутствуют нематоды и иногда олигохеты. Таким образом, хищники улучшают способность активированного ила к осаждению. Кроме того, простейшие осуществляют и обеззараживающую функцию, поедая патогенные и условно патогенные микроорганизмы. Важная роль простейших в очистке воды в процессе аэробного процесса подтверждена путем математического и экспериментального моделирования. В стабильных условиях прирост бактерий, ассоциированных с агрегатами, должен быть равен биомассе, удаляемой с оседающим избыточным илом. В отсутствие простейших увеличивается количество взвешенных микробных клеток, которые выносятся с очищенной водой, что ухудшает ее качество. Тип и количество простейших в активированном иле используется как индикатор качества ила и, следовательно, очистки воды. Микробное сообщество активированного ила представлено исключительным биоразнообразием. Для него характерны бактерии, способствующие формированию агрегатов, в первую очередь зооглейные Zoogloea ramigera и близкие к ней виды и нитчатые LeucothrixiA Thiothrix. В иле содержится много форм, не поддающихся культивированию в лабораторных условиях и идентификации классическими методами микробиологии. В последние годы с помощью новых молекулярно-биологических методов, в частности специфических проб рРНК, в иле показано присутствие бактерий родов Paracoccus, Caulobacter, Hyphomicrobium, Nitrobacter, Acine- tobacter, Sphaerotilus, Aeromonas, Pseudomonas, Cytophaga, Flavobacterium, Flexibacter, Haliscomenobacter, Arthrobacter, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Bacillus, Clostridium, Lactobacillus, Staphylococcus. Счита- 186
ется, однако, что к настоящему времени идентифицировано не более 5 % видов микроорганизмов активированного ила. Интересно, что условия очистки воды в процессе активированного ила неблагоприятны для развития патогенных бактерий. Там их очень немного. Обычно численность Salmonella, Shigella и Е. coli в очищенной воде на 90—-99 % ниже, чем в воде, поступающей на очистку. Гибели патогенов способствует интенсивная аэрация, неспособность их к агрегированию, уничтожение простейшими и Bdellovibrio. Энтеровирусы также эффективно удаляются при очистке воды, адсорбируясь на осаждающихся твердых частицах и флокулах ила. Активированный ил не всегда хорошо осаждается. Практикам известна ситуация, когда микробный ил всплывает на поверхность воды и выносится с очищенной водой, ухудшая ее качество. Так называемая флотация ила обусловлена развитием избытка нитчатых бактерий, которые формируют сеть между микробными фло- кулами ила, образуя гигантские пенообразные хлопья. Всплывающий ил содержит большое количество нитчатых бактерий родов Sphaerotilus, Beggiatoa, Thiothrix, Bacillus, а также нитчатых грибов и ак- тиномицетов родов Geothrichum, Cephalosporium, Cladosporium, Penicillium. Хотя точно неизвестно, сочетание каких условий приводит к внезапному массовому развитию нитчатых форм в активированном иле, к предполагаемым причинам относятся изменение состава сточных вод, высокие соотношения С: N и С: Р, низкая концентрация растворенного кислорода, изменение рН и др. Избыток активированного ила удаляется из вторичных отстойников, смешивается с первичным осадком и направляется на анаэробную обработку в метантенк (см. рис. 4.2), где удаляется 20 — 30 % легко разлагаемых органических веществ. Затем стабилизированный осадок уплотняется механически с помощью центрифуг и фильтр-прессов. Однако в России большая часть осадка транспортируется на иловые площадки, где уплотняется в иловых чеках. Последние представляют собой искусственные лагуны глубиной 3—4 м. Уплотненные механически или в иловых чеках осадки вывозятся на полигоны захоронения ТБО. В последнее время осадки с допустимыми концентрациями тяжелых металлов все чаще используются как удобрения в озеленительных хозяйствах. На сооружения третьей ступени очистки (см. рис. 4.2) очищенная в аэротенках вода поступает на доонистку от азота и фосфора, попадание которых в водоем вызывает евтрофикацию. Для удаления этих элементов используются химические, физические и биологические методы. Азот удаляется в виде N2. В поступающей на доочистку воде азот присутствует в виде аммония, который образуется при деградации белков и гидролизе мочевины, нитрита и нитрата, в которые аммоний частично окисляется в аэротенках. Для полного окисления до нитрата нитрифицирую- 187
щим бактериям необходимы интенсивная аэрация и низкая концентрация органических веществ. Образующийся нитрат может быть восстановлен до молекулярного азота N2 в процессе денитрифи- кации. Для этого денитрифицирующим бактериям необходимы анаэробные условия и присутствие неорганического (или органического) донора электронов, которым могут быть водород, метанол, этанол. На практике окисление аммония и восстановление нитрата обычно осуществляются в одном бассейне (емкости), в условиях периодического ограничения доступа кислорода, т.е. путем чередования аэробных и анаэробных условий. Источником углерода и электронов служат органические загрязнения, которые подаются с порцией неочищенной воды. NH; -> l N02 -» | NOJ -> i N2 Аэробно Аэробно Анаэробно Подобный процесс способствует развитию бактерий, аккумулирующих фосфат, в частности представителей рода Acinetobacter и некоторых грамположительных бактерий с высоким содержанием ГЦ. В условиях интенсивной аэрации эти бактерии накапливают в клетках в качестве запасного материала полифосфат, а при ограничении доступа кислорода в анаэробных условиях выделяют неорганический фосфат. Таким образом, фосфат может быть удален с осадком аэробного ила. Другим путем удаления фосфора является химическое осаждение в виде фосфатов железа и алюминия — FeP04 и А1Р04. Следует отметить, что это наиболее распространенный метод очистки воды от фосфора. Однако осаждение его из воды без стадии развития фосфатаккумулирующих бактерий требует большого расхода химических реагентов. Дезинфекция — четвертая ступень очистки сточных вод, применяется довольно редко для уничтожения остающихся после очистки патогенных бактерий и вирусов и обычно в тех случаях, когда очищенная, так называемая оборотная вода, используется для технических нужд. Для дезинфекции используют обычно газообразный хлор (С12), гипохлорит кальция Са(ОС1)2 или натрия NaOCl, либо эффективный, но дорогостоящий метод озонирования с использованием 03. Процесс активированного ила используется в России очень широко. Станции централизованной очистки воды были построены и функционируют в большинстве городов. Более того, многие крупные промышленные предприятия, включая целлюлозно-бумажные, пищевые, химические производства, крупные свиноводческие комплексы (продукция отходов на стандартном комплексе на 100 тыс. голов свиней по количеству загрязнений эквивалентна городу с полумиллионным населением), оборудованы станциями аэрации. Недостатками этой системы очистки являются необхо- 188
димость отчуждения довольно больших площадей, образование аэрозолей над открытыми аэротенками, образование большого количества избыточного ила. Интенсификация аэробной очистки сточных вод. Методы аэробной очистки сточных вод развиваются и совершенствуются в направлении увеличения эффективности процесса, экономии площадей, использования закрытых емкостей и уменьшения образования избыточного ила. Это особенно важно для локальных систем очистки непосредственно на промышленных предприятиях, в небольших городах и поселках и даже в индивидуальных хозяйствах. Совершенствование аэробной очистки достигается путем интенсификации работы аэротенков, улучшения их конструкции, разработки реакторов нового поколения с прикрепленной и суспендированной микробной биомассой. Для улучшения аэрации устанавливают эффективные мешалки, воздуходувки (барботеры), иногда вместо воздуха используют кислород. Пример — шахтные реакторы, имитирующие водопад. В них вода падает с большой высоты и насыщается кислородом, который подают в виде 02 или воздуха в нижнюю или среднюю часть шахты. При этом производится циркуляция воды и снабжение системы активированным илом. Совершенствуются также биофильтры — системы с прикрепленной активной микробной биомассой. В реакторах с погруженным фильтром очищаемая вода поступает сверху, а навстречу ей снизу подается воздух или кислород. В качестве носителей используют природные и синтетические пористые материалы. Реакторы с подачей воздуха или кислорода снизу называют иначе эрлифтными. При периодической подаче воздуха в реакторе могут чередоваться аэробные и анаэробные условия. Это используется в системах очистки для удаления азота, фосфора, серы. На интенсивной подаче воздуха и воды снизу основана работа реакторов с взвешенным или «кипящим» слоем активного ила. В таком реакторе микробная биомасса, иммобилизованная на измельченной пемзе, пластике или песке, находится во взвешенном состоянии. Следует отметить высокие энергетические затраты при эксплуатации таких реакторов. Устройства с иммобилизованными микроорганизмами — микробные биофильтры — используются также для очистки газообразных выбросов промышленных предприятий. Отработанные газы проходят через увлажняемые фильтры и окисляются микроорганизмами, развивающимися в биопленке. 4.2.3. Анаэробная обработка концентрированных стоков Интенсивная анаэробная очистка сточных вод. Постоянный рост цен на чистую воду и на очистку сточных вод привел промыш- 189
ленные предприятия к необходимости экономии чистой воды и дал толчок развитию предочистки стоков перед сбросом в централизованную канализационную систему или полной очистки перед сбросом в водоем. Благодаря развитию систем интенсивной анаэробной очистки стоков, так называемых анаэробных реакторов нового поколения, широкое распространение находит первичная анаэробная очистка концентрированных сточных вод. Применяется чередование аэробных и анаэробных ступеней очистки. Первичная анаэробная обработка оказалась чрезвычайно подходящей и экономичной для современных концентрированных сточных вод различных отраслей промышленности. Более того, для стоков, ХПК которых превышает 2000 мг/л, анаэробная обработка является единственно приемлемым методом очистки, позволяющим удалить до 90 % загрязнений. Последующая аэробная очистка нужна для окисления остатка органических веществ, аммония и сульфида. Так как анаэробное микробное сообщество развивается очень медленно, необходимо максимальное удержание активной биомассы в реакторе. Этому способствует использование реакторов нового поколения с прикрепленной микробной биомассой — анаэробных биофильтров и взвешенного слоя активного ила (рис. 4.3). Реакторы с фиксированной жесткой загрузкой представляют собой анаэробную модификацию биофильтра (рис. 4.3, А). Очищаемая вода может подаваться как сверху, так и снизу. Недостатком анаэробного биофильтра считается относительно быстрое забивание пористого материала. Этот недостаток преодолевается в системах взвешенного слоя ила (рис. 4.3, Б). Наиболее эффективна система, представленная реактором восходящего потока с взвешенным слоем ила (upflow anaerobic sludge blanket reactor, UASB), разработанная в Нидерландах (рис. 4.3, В). Эти реакторы имеют достаточно простую конструкцию и относительно просты в эксплуатации. Инертный носитель в них не используется. Очищаемая вода подается в нижнюю часть реактора, и ее восходящий поток медленно проходит через толстый Биогаз Биогаз Биогаз Рис. 4.3. Типы современных реакторов для интенсивной аэробной и анаэробной очистки сточных вод 190
(обычно 2 —4 м) слой активного ила, более плотного внизу и взвешенного в верхней части. Метаногенный ил представлен плотными агрегатами до 2 — 3 мм в диаметре, так называемыми гранулами, которые спонтанно формируются из микробных клеток. Вместе с пузырьками образуемого ими метана микробные гранулы поднимаются в верхнюю часть реактора, пузырьки газа отрываются и гранулы ила опускаются вниз. В верхней части реактора установлены отбойники для сбора газа и предотвращения выноса микробных гранул. Критическим для этой системы является начальное образование легко осаждающихся микробных гранул, поскольку от этого зависит эффективность функционирования реактора. Важными факторами образования гранул являются морфология и физиология микроорганизмов метаногенного сообщества и гидродинамический режим реактора. Основу структуры метано- генных гранул составляют археи родов Methanosarcina и Methanosaeta {Methanothrix). Метаносарцины образуют макроколонии и имеют гликокаликс, в который погружены клетки и колонии других бактерий, входящих в сообщество. Однако агрегаты с преобладанием метаносарцин мелкие, рыхлые и образуются, как правило, на сильно концентрированных стоках. Настоящие плотные гранулы формируются на основе Methanosaeta {Methanothrix), Ее нити образуют клубковые структуры, а в промежутках обитают остальные члены сообщества, для которых тесное пространственное расположение выгодно для транспорта промежуточных продуктов. Образование метаногенных гранул является феноменом естественной самоорганизации микробного сообщества в искусственной среде обитания. Сформированный гранулированный ил используется в качестве посевного материала для пуска новых реакторов. Дальнейшим развитием UASB-системы являются башенные реакторы с расширенным взвешенным слоем ила (expanded granular sludge bed, EGSB), где толщина слоя ила благодаря рециклу воды и более высокой скорости ее подачи достигает 10 м. Гибридные реакторы объединяют преимущества анаэробного биофильтра и взвешенного слоя ила, В них жесткая фиксированная загрузка расположена в верхней части реактора. Реакторы для интенсивной анаэробной очистки, особенно UASB-системы, получили в последние 20 лет широчайшее распространение и используются для очистки самых разнообразных стоков — от концентрированных бытовых в странах с дефицитом воды до специфичных сточных вод химической промышленности, в частности, содержащих галогенизированные соединения. Важная особенность систем с взвешенным слоем ила — высокая селективность в отношении микроорганизмов и сообществ, способных деградировать те или иные вещества в заданных условиях, лишние микроорганизмы не включаются в гранулы и вымыва- 191
ются из реактора. Из анаэробных реакторов выделены новые анаэробные бактерии. Образующийся в реакторах биогаз используют для обогрева реакторов или подаваемой на очистку воды, так как процесс очистки проходит в большинстве случаев в мезо- фильном режиме при 30 °С. В последнее время уделяется большое внимание анаэробной обработке при пониженных температурах (10-20 °С). Новые анаэробные методы и реакторы разработаны недавно для обработки специфических стоков с высоким содержанием аммония или сульфата. Основу процесса «анаммокс» (anammox — anaerobic ammonia oxidation) составляет анаэробное окисление аммония нитритом с образованием молекулярного азота в качестве конечного продукта. Процесс сульфатредукции используется для осаждения тяжелых металлов. Анаэробная обработка полужидких отходов. Только анаэробная обработка пригодна для полужидких текучих отходов с содержанием сухого вещества до 15 г/л, к которым относятся осадки сточных вод и навоз при самотечной системе уборки. Анаэробные пруды {лагуны) используются в странах с теплым климатом для обработки полужидкого, в основном свиного, навоза с целью получения удобрений и биогаза как источника энергии. При этом пруды или большие емкости, установленные на поверхности земли для лучшего обогрева, сверху покрывают пластиковыми матрасами, в которые собирают биогаз, состоящий из метана и углекислоты. Анаэробные лагуны применяются в теплых странах также для стабилизации концентрированных стоков боен, включающих содержимое желудочно-кишечного тракта животных. Большое количество жира всплывает, поднимая твердые частицы и образуя плотную корку на поверхности. Корка создает анаэробные условия и уменьшает распространение чудовищного запаха. Иловые чеки и пруды-накопители, куда транспортируют сырой, не прошедший анаэробную обработку осадок сточных вод, также являются анаэробными лагунами, так как кислород проникает только в самый верхний слой осадка. В климатических условиях России анаэробная деградация в прудах осуществляется крайне медленно. Для обработки осадков сточных вод и навоза широко используются метантенки, которые представляют собой емкости самых разных размеров: от 0,1 м3 до 20 тыс. м3 (китайский «семейный горшок» и метантенки на станциях Мосочиствод соответственно). Сбраживание обычно производится в периодическом или полупериодическом режимах при 30 — 35 °С или 50—55 °С, длительность процесса составляет обычно 3 — 5 и 2 — 3 недели соответственно. Перемешивание осуществляется различного типа мешалками либо, особенно в больших метантенках, вдуванием пара, что обеспечивает одновременно и обогрев. Количества образую- 192
щегося биогаза, содержащего не менее 50 % метана, обычно достаточно для обогрева реактора. При анаэробной обработке навоза быстро получается качественное обеззараженное удобрение. Вместе с навозом возможно сбраживание растительных остатков, пищевых отходов и т.п., как это традиционно осуществляется в Китае, Индии и в других странах Юго-Восточной Азии, где функционируют сотни тысяч семейных и кооперативных метантенков, снабжая население энергией и удобрением. Этот метод переработки полужидких отходов получил развитие в теплых регионах, в то время как в России и других странах с умеренным и холодным климатом традиционным методом обработки навоза в крестьянских хозяйствах является компостирование. Для этого в полужидкие отходы добавляют твердые наполнители, в основном торф и растительные остатки (солому). 4.2.4. Обработка твердых отходов С ростом населения Земли количество твердых отходов, подлежащих обработке, постоянно возрастает. В настоящее время количество городских твердых бытовых отходов (ТБО) превышает 500 млн т в год. Часть из них представлена инертными материалами, стеклом, металлом, пластиками, однако более половины ТБО составляют органические материалы, в основном это пищевые отходы (до 25 %) и бумага (до 40 %). Твердые органические отходы образуются также при очистке сточных вод и в сельском хозяйстве. В сельской местности и небольших хозяйствах традиционно большинство твердых органических отходов компостируется и органика возвращается в почву в качестве навозных удобрений. Однако количество и качество твердых отходов, образующихся в городах, породило проблему свалок и полигонов захоронения ТБО и промышленных отходов. Практически во всех развитых странах Европы организован раздельный сбор твердых бытовых отходов. Отдельно собираются кухонные и садовые органические отходы, бумага, стекло и металл, что позволяет перерабатывать и использовать их более рационально. Компостирование. Компостирование, аэробный процесс окисления органических веществ биомассы микроорганизмами, сопровождается выделением большого количества тепла. Оно традиционно широко используется для получения удобрений на сельскохозяйственных предприятиях и в индивидуальных крестьянских и садоводческих хозяйствах. Обработке подлежат навоз животных, растительные остатки, кухонные и туалетные отходы. В результате из органических отходов получается гумусоподобный продукт — компост, который используется как почвенное удобрение. Экстенсивный процесс компостирования происходит в компостных кучах и длится 7 Мструсов 193
несколько месяцев. Интенсивное компостирование происходит в буртах и штабелях с аэрацией, которая осуществляется с помощью перфорированных труб и/или вентиляторов. При этом длительность процесса сокращается до 3 — 4 недель. В реакторах разной конструкции компостирование может завершаться всего за несколько дней. В компостируемой массе благодаря жизнедеятельности бактерий и грибов температура поднимается до 65 — 70 °С и даже до 76 — 78 °С, что ингибирует процесс биодеградации отходов. Переворачивание или принудительная аэрация компоста, а также опрыскивание водой способствуют поддержанию оптимальной температуры 52 — 63 °С. В процессе компостирования происходит чередование преобладающих микроорганизмов, участвующих в деградации органических соединений. На начальной стадии компостирования важную роль играют мезофильные грибы и бактерии. По мере повышения температуры до 50—60 °С, которое происходит в компостных кучах всего за несколько дней, начинают преобладать термофильные бактерии родов Thermoactinomyces, Mictvpolyspora, Thermomonospora, Bacillus и грибы Geotrichium candidum, Aspergillus fumigatus, Mucorpusilis, Chaetomium thermophile, Theroascus auranticus, Torula thermophila и др. При более высокой температуре развиваются Bacillus subtilis, В. stearothermophilus, В. licheniformis, Clostridium thermocellum, представители рода Thermus. Нагрев до высокой температуры способствует гибели патогенных бактерий и грибов, простейших, паразитов, яиц глистов и семян сорняков. При всех типах компостирования вслед за термофильным процессом следует мезофильная стадия, в которой активны выжившие мезофильные микроорганизмы и во время которой происходит «дозревание» компоста. Конечный продукт является высококачественным обеззараженным удобрением. В последнее время компостирование все чаще применяется для обработки органической фракции городских бытовых отходов. Полученный компост используют в основном в парковом хозяйстве, в декоративном оформлении дорог, промышленных зон и т. п. Твердофазная анаэробная ферментация. Для переработки органической фракции ТБО и подстилочного навоза иногда используется анаэробная обработка с получением метана в специальных реакторах. В сельском хозяйстве используют обычно периодический процесс. Как правило, в хозяйстве имеется несколько автономных установок, которые заполняются последовательно. Каждая порция навоза сначала проходит часть процесса компостирования. Когда температура повышается до 40 — 50 °С, компостная куча накрывается колпаком или загружается в емкость. Образующийся метан используется для обогрева реактора и хозяйственных нужд. Для обработки органической фракции ТБО в Бельгии разработан непрерывный процесс (dranco — dry anaerobic conversion). Ци- 194
линдрический реактор заполняется сверху предварительно измельченными и нагретыми паром до 50 °С органическими отходами с содержанием сухих веществ (АСМ) 35 — 40%. Каждая порция по мере выгрузки реактора движется постепенно вниз. Время обработки при 55 °С составляет три недели. Из сброженной массы отжимается часть воды до получения продукта с 55 % АСМ, который подвергается аэробному компостированию в течение 10 дней. Конечный продукт представляет собой высококачественное обеззараженное удобрение, пригодное для использования в сельском хозяйстве. Свалки и полигоны твердых бытовых отходов (ТБО). Самым простым и распространенным методом утилизации твердых бытовых и промышленных отходов является их захоронение, для чего используются овраги, карьеры и другие понижения рельефа. До недавнего времени практиковалось почти бесконтрольное сваливание городского бытового, промышленного и строительного мусора, который затем засыпали слоем грунта. Захоронение на полигонах ТБО предусматривает уплотнение дна полигона глиной и регулярное уплотнение и пересыпание слоев мусора грунтом. Размеры свалок и полигонов различны и варьируют от нескольких сотен квадратных метров до десятков гектаров. Толщина мусорных отложений также различна. Для большинства свалок Московской области она составляет порядка 20 м. В европейских странах с высокой плотностью населения и недостатком свободных земель насыпаются мусорные холмы, высота которых ограничена законом до 40 м. В погребенных отходах осуществляется анаэробная деградация органических соединений микроорганизмами, привнесенными с отходами и проникающими из почвы и грунта. Разложение отходов происходит медленно. В закрытых (запечатанных) мусорных отложениях образование метана начинается через несколько месяцев (до года) и продолжается 30—50 лет, при этом разлагается около 30 % захороненной органики. Основными факторами, ограничивающими скорость деградации, являются низкая влажность и необходимость развития высокой плотности микроорганизмов, способных разлагать различные органические соединения, в том числе ксенобиотики. Интересно, что в анаэробной зоне свалочного тела с высоким содержанием органики в период активного метаногенеза поддерживается достаточно высокая температура — обычно 30 — 35 °С, в отдельных местах она достигает 50—55 °С. В свалочных отложениях присутствуют все анаэробные микроорганизмы, необходимые для разложения сложных полимерных соединений до метана и углекислоты. В верхней аэрируемой части свалки активны аэробные микроорганизмы. Плотность популяции, активность и разнообразие метанокисляющих бактерий не имеют аналогов в природных экосистемах. Эти бактерии формируют микробный биофильтр, существенно снижающий эмиссию образующегося в анаэробной зоне метана. 195
Свалочный биогаз состоит в основном из метана (до 60 %) и углекислоты (до 40 %). В ней содержится также большое количество микропримесей, в том числе токсичных, таких, как сероводород, углеводороды, меркаптаны, ртуть- и галогенсодержащие соединения и множество неидентифицированных газов и летучих продуктов. Около 1000 компонентов регистрируется методом газожидкостной хроматографии, из них идентифицированы менее половины. Свалки и полигоны ТБО вносят существенный вклад в тепличный эффект, производя по средним оценкам не менее 7 % атмосферного метана. Однако это один из немногих источников тепличных газов, который можно контролировать и регулировать. Во многих странах на крупных полигонах ТБО организована добыча газа, который используется как топливо или преобразуется в электроэнергию. Современные полигоны захоронения ТБО в развитых странах представляют собой анаэробные реакторы геологического масштаба. В них обеспечены герметизация от окружающего грунта, поверхностных и грунтовых вод, сбор и очистка промывных (дождевых) вод, экстракция биогаза. Большинство промышленных отходов в настоящее время подвергается, если необходимо, физико-химической обработке и захоранивается глубоко под землей. Так, радиоактивные отходы захораниваются в базальтах, которые, однако, не являются вполне инертной средой. Отходы с АСМ более 50 %, как правило, подвергаются сжиганию. 4.3. Биоремедиация загрязненных почв и грунтов Интенсивный рост промышленности и городов в последние 50—100 лет привели к необратимому загрязнению почв и грунтов на значительных территориях. Загрязненные места должны быть рано или поздно подвергнуты очистке — ремедиации (лечению). Это крайне сложная задача, так как почвы и грунты ге- терогенны и геологическая структура загрязненных территорий разнообразна. Растворимые или частично растворимые продукты могут транспортироваться на значительные расстояния в горизонтальном направлении; некоторые легкие малорастворимые соединения, попав в грунтовые воды, могут плавать на поверхности и выноситься в верхние горизонты; тяжелые компоненты, такие, как смолистые фракции нефти, могут оседать на дно и транспортироваться очень медленно. Таким образом, загрязнения могут накапливаться в разных участках, что требует специфических подходов к разработке методов ремедиации загрязненных территорий. В настоящее время существует два основных подхода к очистке загрязненных почв и грунтов — (1) обработка на месте (in situ) или (2) экскавация, т.е. вывоз и обработка на специальных предприятиях (ex situ). 196
4.3.1. Ремедиация загрязненных почв in situ В настоящее время большинство загрязненных территорий обрабатывается на месте с помощью описанных ниже методов и их комбинаций. Вымывание загрязняющих веществ применяется в случае загрязнения почвы растворимыми веществами. Почву промывают поливом сверху и с помощью различных ирригационных приемов, часто с использованием циркуляции воды. Промывные воды собирают, обрабатывают ex situ биологическими и физико-химическими методами. При такой обработке малорастворимые соединения остаются в почве. Внесение химических веществ, стимулирующих развитие деградирующих загрязнения микроорганизмов, применяется наиболее часто. На загрязнение почвы различными органическими веществами природа, как правило, отвечает развитием микроорганизмов, способных использовать эти вещества. Именно из загрязненных мест были выделены многие бактерии, разлагающие различные ксенобиотики, нефтепродукты и т.д. Для активации автохтонной микробной популяции в почву вносят окислители (02, NO3), косубст- раты (мелассу, этанол и даже навозные стоки), источники азота и фосфора, эмульгаторы для ускорения транспорта и разрушения структуры липофильных загрязнений. Для внесения растворимых компонентов используют ирригационные методы. Промывные воды очищают методами анаэробной и аэробной очистки. Для улучшения аэрации производится вспашка почвы, в более глубокие слои кислород или воздух подаются под давлением через систему перфорированных труб. Этот метод обработки относительно недорог и дает хорошие результаты, но для достижения положительного эффекта иногда требуются годы. Он широко используется для очистки мест, загрязненных нефтепродуктами. Воздух, насыщенный при вентиляции почвы летучими веществами, такими, как бензол, толуол, ксилол и др., откачивают и подвергают очистке, прогоняя через воду для удаления растворимых веществ и через увлажненный микробный биофильтр. Для извлечения растворимых нефтепродуктов из почвы ее промывают водой с необходимыми добавками. Снабжение кислородом и вытеснение промывной воды может осуществляться одновременно в циркуляционном процессе. Промывные воды очищают ex situ. При загрязнении высокоокисленными соединениями, такими, как пентахлорфенол (пропитка деревянных конструкций), нит- роароматические соединения (взрывчатые вещества), хлорированные алкены и алканы (растворители), для интенсификации деградации необходимо снабжение популяции микроорганизмов донорами электронов. Для этого используют недорогие субстраты — метанол, этанол, мелассу, которые добавляют в циркулируемую 197
воду. В анаэробных условиях эти субстраты используются с образованием водорода, способствующего восстановительной дегалоге- низации и разрыву ароматических колец. Характер загрязнений, химический состав и структура почв и грунтов определяют выбор добавок и методов обработки. Внесение в загрязненные почвы микроорганизмов, способных разлагать соответствующие специфические вещества, применяется не часто и не всегда дает существенный эффект. Как правило, одновременно необходимо применение мер, описанных в предыдущем разделе. Тем не менее к настоящему времени выделено и описано большое количество бактерий, способных использовать нефтяные загрязнения, ксенобиотики, токсические соединения (см. подразд. 4.1). Применение таких культур в качестве посевного материала может быть полезно в свежих загрязнениях, когда автохтонная микробная популяция еще не успела развиться или плотность ее очень низка. В любом случае необходимо обеспечить доступность загрязняющих веществ для использования их микроорганизмами. Здесь важную роль играют дисперсия и растворение загрязнителей, а также снабжение микроорганизмов источниками азота и фосфора. Их недостаток лимитирует микробный метаболизм и рост, а это, в свою очередь, ограничивает процесс биодеградации. 4.3.2. Обработка удаленных почв и грунтов Когда по тем или иным причинам очистка загрязненных территорий in situ невозможна, почвенный слой удаляют и в большинстве случаев производят выемку (экскавацию) грунта для последующей обработки или сжигания. Обычно очистку ex situ применяют при особо опасных загрязнениях, если они проникли или захоронены на глубине и существует серьезная опасность попадания загрязнений в поверхностные и грунтовые воды. Окисление воздухом производят в снятой почве, уложенной в виде штабеля, конуса или тонкого слоя, которую аэрируют обычно с помощью перфорированных труб. Для такой обработки требуется длительное время, иногда годы. Промывка водой с последующей ее биологической и физико-химической очисткой используется в случае растворимых загрязнений. Сжигание загрязненной почвы является быстрым, но дорогостоящим методом. Кроме того, почва перестает быть таковой, превращаясь в минерализованный продукт — золу. Для полной рекультивации территорий, занятых под свалки и полигоны ТБО, с целью использования их под строительство или для иных хозяйственных нужд необходима полная выемка грунта. Обычно его просеивают, отделяя неразложившиеся крупные вклю- 198
чения — стекло, пластики, металл и т.п. Эта часть сжигается или перезахоранивается. Просеянная фракция при отсутствии высокого содержания тяжелых металлов и других токсичных компонентов может использоваться в озеленительном хозяйстве. В противном случае она должна быть подвергнута обработке или перезахоронена. 4.4. Биогеотехнология металлов Добыча полезных ископаемых лежит в основе самого существования человеческой цивилизации. Особое место здесь занимает проблема экологической безопасности освоения полезных ископаемых. Кислые рудничные воды рудников, отвалов и угольных шахт, образование которых связано с бактериально-химическим окислением сульфидных минералов, загрязняют окружающую среду ионами металлов. Загрязнение водной среды и почв ионами металлов или выбросы токсичных газов в атмосферу вызывают наибольшее истощение и деградацию естественных экосистем и представляют серьезную угрозу здоровью человека. Рассматриваемые ниже микробные процессы и биогидроме- таллургические технологии направлены на решение не только рациональной и комплексной переработки сложных богатых и забалансовых руд, но и экологических проблем в горнодобывающей промышленности. Биогеотехнология металлов (биогидрометаллургия) — это наука об извлечении металлов из руд, концентратов, горных пород и растворов под воздействием микроорганизмов или их метаболитов при нормальном давлении и температуре от 5 до 80—90 °С. 4.4.1. История биогеотехнологии металлов Выщелачивание. Наиболее ранние сведения о выщелачивании меди встречаются в записях об античных горных производствах. Около 160 г. до н.э. К. Гален (натуралист и врач) сообщил о методе выщелачивания меди в древних медных рудниках острова Кипр. В 1497 г. в северном районе Венгрии получали медь из растворов, поступающих из руды, методом цементации на железном скрапе: Cu2+ + Fe° -> Cu° + Fe2+ (1) В 1566 г. там же осуществили полный цикл выщелачивания с использованием системы орошения. Примерно в 1750 г. ежегодно получали гидрометаллургическим способом 200 т цементной меди. На территории Германии выщелачивание меди из отвалов практи- 199
ковалось также в XVI в. В Испании на руднике Рио-Тинто начали применять принудительное кучное выщелачивание медных руд в 1725 г. Однако из рудничных вод медь здесь извлекали еще в 1670 г. На территории бывшего СССР кучное выщелачивание осуществляли в Кедабеке (Азербайджан) в конце XIX столетия. В Америке выщелачивание меди из руд было начато в 20-е годы XX в. в Бисби (Аризона) и Тироне (Нью-Мексико). Извлечение меди из растворов, поступающих из шахт медно- колчеданных месторождений, активно практиковали на Урале в середине 40 — 50-х годов XX в. В 1949 г. на Урале было добыто 5 730 т меди из сточных вод. В отдельных случаях осуществляли также орошение руды либо водой, либо рудничными растворами. Позже кучное выщелачивание меди было начато рядом компаний в юго- западной части США, в Перу, Африке, Австралии, Югославии, Болгарии и других странах. В 60-е годы в Канаде начали промышленное подземное выщелачивание урана. Несколько позже выщелачивание урана стали практиковать и в других странах, например в Португалии, США, ЮАР и Франции. В настоящее время разработкой и освоением биогидрометаллургических технологий занимается более 100 фирм и организаций в 25 странах мира. Открытие микроорганизмов, важных для биогеотехнологии металлов. Русский ученый С. Н. Виноградский в конце XIX в. впервые сформулировал концепцию литотрофии. Бесспорно, что его исследования стимулировали изучение роли микроорганизмов в круговороте серы и других элементов в природе. В 1902 г. крупнейший голландский микробиолог М. Бейеринк выделил новый автотрофный микроорганизм Thiobacillus thioparus, окисляющий серу и ряд ее восстановленных соединений при высоких значениях рН среды. В 1921 — 1922 гг. В. Рудольф и А.Хельброннер впервые провели исследования на рудниках, которые показали, что некоторые не- идентифицированные сероокисляющие микроорганизмы способны окислять пирит и сульфиды цинка. В это же время С. А. Ваксман и Дж. С. Джоффи выделили автотрофный ацидофильный микроорганизм Thiobacillus thiooxidans (ныне Acidithiobacillus thiooxidans), окисляющий серу и ряд ее восстановленных соединений до серной кислоты. Предположения о возможной роли бактерий в образовании серной кислоты в шахтных водах в угольных месторождениях впервые были высказаны Л. Карпентором и Дж. Херндоном в 1933 г., однако биологическая природа этого процесса экспериментально ими не была установлена. Первые доказательства биологического окисления закисного железа при низких рН были получены А. Р. Колмером и М. Хинк- лем в 1947 г. Они выделили чистую культуру бактерий Thiobacillus ferrooxidans (ныне Acidithiobacillus ferrooxidans), ответственных за 200
окисление Fe2+ в шахтных водах. В настоящее время известен ряд хемолитотрофных бактерий, важных для биогидрометаллургии. Перечень хемолитотрофных бактерий, окисляющих Fe +, S ", S0 и сульфидные минералы, приведен в табл. 4.3. В практике добычи металлов особое внимание уделяется бактериям A.ferrooxidans, A. thiooxidans, A. caldus и Leptospirillwn ferrooxi- dans, которые окисляют Fe2+, S2", S° и сульфидные минералы. Тем Таблица 4.3 Микроорганизмы, важные для биогидрометаллургии Микроорганизмы Грамотрицательные бактерии: \Aferrooxidans Leptospirillwn ferro- oxidans A. thiooxidans \А. caldus Грамположительные бактерии p. Sulfobacillus: S. thermosulfidooxi- dans\ S. acidophilus Археи: Acidianus brierleyi \Metallosphaera sedula \Sulfolobus metallicus Ferroplasma \acidifhilum Источник энергии Сульфидные минералы, S° (S2-), Fe2+ Fe2+, FeS2 S° (S2-) S° (S2-) Fe2+, S° (S2-), сульфидные минералы в присутствии органических веществ или без них в сообществе с хемолитотрофными бактериями F2+, S°(S2-), сульфидные минералы в присутствии дрожжевого автол изара Тоже Строгий автотроф, S0, сульфидные минералы, Fe2+ FeS2, Fe2+ Оптимальные условия жизнедеятельности (пределы) рН 1,7-2,0 (1,0-5,5); 30-35°С(2-40°С);О2 рН 2,0-2,5 (1,0-4,0); 30-45°С(2-50°С);О2 рН 2,0-2,5 (0,5-6,0); 30°С(2-40°С);О2 рН 2,0-2,5 (0,5-6,0); 45 °С (30-52 °С);02 рН 1,7-2,4(1,1-5,0); 48-50вС (20-60°С);02 рН 1,5-20; 70 °С (45-75 °С);02 рН 1,0-4,5; 75 °С (50-80°С);02 рН 1,0-4,5; (50-75 °С);02 рН 1,7-1,8(1,3-2,2); 35 °С (15-45 °С);02 201
не менее в рудах и концентратах, как это видно из табл. 4.3, присутствуют умеренно- и облигатно-термофильные бактерии, которые существуют в области температур от 20 до 80 °С. Естественно, что скорость окислительных процессов зависит от того, насколько условия благоприятны для бактерий. Представляют интерес ацидофильные гетеротрофные бактерии Acidiphilium cryptum, Ac. angustum, Ac. rubrum и Ac.facilis. Они способствуют выщелачиванию металлов хемолитотрофными бактериями. 4.4.2. Физико-химические основы выщелачивания металлов из руд Основными физико-химическими факторами при кучном, подземном и чановом выщелачивании меди, цинка, никеля, урана являются рН, Eh, температура, наличие кислорода, ионов сернокислого оксидного железа (Fe3+) и т.д. Они в той или иной степени определяются типом руды, степенью ее окисления и проницаемостью, а следовательно, и характером складирования, габаритами отвалов, способом подготовки руды или рудного тела к выщелачиванию на месте залегания и т.д. От совокупности благоприятных факторов (рН 1,2 — 2,0; Eh 700 мВ, и др.) зависит активность сообщества бактерий, окисляющих сернокислое закис- ное железо (Fe2+), серу (S°, S2+) и сульфидные минералы. Химические реакции, которые происходят в процессе бактериального окисления, могут быть показаны на примере окисления пирита: катодная реакция: 02 + 4Н+ + 4е -» 2Н20 (2) анодная реакция: FeS2 -> Fe2+ + 2S° + 2ё (3) суммарно: FeS2 + 02 + 4Н+ -> Fe2+ + 2S° + 2H20 (4) Бактерии воздействуют на сам минерал, будучи в контакте с ним и экзометаболитами (рис. 4.4), создавая его электродный потенциал, заряд и т.д. и тем самым ускоряя биоэлектрохимическое окисление минерала. Пирит в этой паре занимает позицию катода, а халькопирит — анода, имея более низкий окислительно-восстановительный потенциал. Образующиеся продукты этой реакции (Fe2+, S° и др.) окисляются бактериями до конечных продуктов: Fe2+ 6-^^ Fe3+ + ё (5) 4<? + 02 + 4Н+->2Н20 (6) , бактерии , 4Fe2+ + 02 + 4Н+ » 4Fe3+ + 2H20 (ДС= -74,4 кДж/моль) (7) So +4H20 ^=> S042" + 8Н+ + 6ё (8) 202
Рис. 4.4. Схематическое изображение Бактерии ^-^H2S04 Аналогичный механизм окисления характерен и для других сульфидных минералов. Образующийся Fe3+ также является окислителем многих сульфидных минералов: FeS2 + Fe2(S04)3 химически > 3FeS04 + 2S° (9) Продукты этой и подобных ей реакций окисляются бактериями до Fe3+ или H2S04. Таким образом, эти бактериально-химические процессы едины и создают низкую величину рН, высокий окислительно-восстановительный потенциал среды, необходимую концентрацию Fe3+ и обеспечивают активные процессы выщелачивания металлов из руд. Следует отметить особые окислительные свойства Fe3+ в кислой среде в отношении вторичных сульфидных минералов меди, цинка и некоторых минералов никеля. Электрохимическое взаимодействие сульфидных минералов. Руды и получаемые из них концентраты всегда представляют собой полиминеральные ассоциации. Сульфидные минералы в пульпе или рудах находятся в электрохимическом взаимодействии, т.е. между ними возникают гальванические токи. При этом окислительно- восстановительные потенциалы (ОВП) отдельных минералов могут значительно отличаться от стационарных потенциалов, замеренных раздельно. В табл. 4.4 представлены ОВП ряда пар сульфид- Табл и ца 4.4 Величины Eh и ОВП при бактериальном окислении ассоциацией сульфидных минералов Минералы CuFeS2 Cu2S, Cu5FeS4* FeAsS* CuFeS2 CuFeS2 ZnS* FeS2 |CuFeS2* Eh среды, мВ 0,5-0,7 0,77-0,8 0,6-0,7 0,6-0,7 ОВП минералов, мВ 0,4-0,5 0,3-0,4 0,62-0,64 0,76-0,77 0,6-0,68 0,23-0,43 0,6 0,5 * Минералы-аноды. 203
ных минералов. В смеси сульфидных минералов легче всего окисляется минерал с более низким ОВП, т.е. сульфид-анод, причем активность его окисления зависит от разности электродных потенциалов сульфида-анода и сульфида-катода. Бактериальное окисление сульфидных минералов имеет ту же направленность, что и электрохимическое, однако значительно ускоряется микроорганизмами. Минералы-аноды окисляются в первую очередь. Это можно проиллюстрировать на примере окисления ассоциации минералов CuFeS2 (анод) и FeS2 (катод, рис. 4.4). Когда FeS2 и CuFeS2 были в контакте, первый минерал был пассивирован (катод), в то время как второй был корродирован (анод). Это гальваническое превращение ускоряется бактериями вследствие каталитического окисления как CuFeS2, так и Fe2+ и серы, образующейся на поверхности халькопирита. В более сложной системе FeS2 - CuFeS2 и ZnS первые два минерала с более высоким электродным потенциалом окисляются слабо, выполняя функцию катода. Окислению подвергается ZnS (анод). Химизм этих процессов представляется в следующем виде. • Кислород восстанавливается на поверхности FeS2 (катод): 02 + 4Н+ + 4ё-> 2Н20 (10) • CuFeS2 в первой системе окисляется как анод: CuFeS2 -> Cu2+ + Fe2+ + 2S° + 4ё (11) • Гальваническая реакция представляется уравнением: CuFeS2 + <Э2 + 4Н+ -> Cu2+ + Fe2+ + 2S° +2H20 (12) • Во второй системе ZnS окисляется как анод: ZnS -> Zn2+ + S° + 2ё (13) Электронтранспортная система бактериальной клетки действует как каталитический проводник при переносе электрона непосредственно из катодной зоны на поверхности сульфидного минерала на 02. Fe2+ и 2S0 также окисляются бактериями по уже известным реакциям. Это приводит к созданию высокого Eh среды и разрушению пленки серы на поверхности минерала. Без бактерий в присутствии 02 как окислителя ток коррозии низкий. Он лимитируется анодным процессом, который приводит к образованию серы, пассивирующей поверхность сульфидных минералов. В присутствии Fe + без бактерий окислительные процессы вначале могут протекать активно, однако образование Fe2+ и S0 на поверхности минералов подавляет их дальнейшее окисление. Итак, бактериально-химическое окисление сульфидных минералов осуществляется по законам электрохимической (коррозионной) модели, точнее — по законам биоэлектрохимии. 204
Механизм бактериального окисления Fe2+, S2~/S° и сульфидных минералов. Хемолитотрофные бактерии окисляют неорганические субстраты и получают энергию в соответствии с хемиосмотической теорией П. Митчела, а также по электрохимическим (коррозионным) механизмам. Бактериальное окисление субстратов включает следующие стадии: 1) взаимодействие поверхностных структур бактерий с окисляемым субстратом (сорбция, адгезия); 2) изменение физико-химических свойств окисляемых субстратов и их транспорт в клеточную стенку; 3) окисление субстратов в поверхностных структурах клеток; 4) транспорт электронов и протонов; образование мембранного потенциала; 5) синтез АТФ и образование воды на внутренней поверхности цпм. Окисление Fe2+. Окисление Fe2+ грамотрицательным A. fer- rooxidans связано с его транспортом в периплазматическое пространство клетки, по-видимому, в комплексе с липополисаха- ридами, и функционированием электронтранспортной системы. Эта система включает: порин наружной мембраны (92 кДа), Fe +- Наружная мембрана Рустицианин (16 кДа) кислотоустойчивый, медьсодержащий белок Внутренняя мембрана рН2,0 рН6,5 Цитохром с-оксидаза (ааъ тип, 84 кДа), нуждающаяся в сульфате Fe2+ индуциро ванные порины (Зх32кДа субъединицы) FeII-цитохром с552-оксидоредуктаза цИТохромы: с552 (S) (бЗкДа 8—10 субъединиц), с (т) железосерный мономер с с /тч высоким редокс-потенциалом (6 кДа) н2о