Текст
                    

Ярилин Александр Александрович Доктор медицинских наук, профессор, заведующий отде- лом клеточной иммунологии ГНЦ — Института иммуно- логии Минздрава России, действительный член Академии естественных наук. Родился в 1941 г. Окончил Горьков- ский медицинский институт. Работал в Институте меди- цинской радиологии в г. Обнинске (1966—1980). С 1980 г. возглавляет лабораторию клеточной иммунологии в Ин- ституте иммунологии. Автор более 300 публикаций, в том числе 6 монографий. Читает курсы лекций по иммуноло- гии в МГУ, Пущинском, Нижегородском университетах. Под его руководством выполнено 5 докторских и 24 кан- дидатских диссертаций. Является членом редколлегий журналов «Иммунология», «Радиационная биология. Ра- диоэкология», «Физиологические науки».
Учебная литература для студентов медицинских вузов А. А. Ярилин Основы иммунологии Рекомендовано Управлением научных и образовательных медицинских учреждений Министерства здравоохранения Российской Федерации в качестве учебника для студентов медицинских вузов Москва "Медицина" 1999
УДК 616-092:612.017.1(075.8) ББК 52.5 Я73 Рецензент Р.В.Петров — академик РАН и РАМН, вице-президент РАН Ярилин А.А. Я73 Основы иммунологии: Учебник. — М.: Медицина, 1999. — 608 с.: ил. (Учеб. лит. Для студ. мед. вузов). ISBN 5-225- 02755-5 В учебнике отражены новейшие достижения иммунологии. Описаны структура и организация иммунной системы, факторы естественного иммунитета, молекулярные и клеточные основы адаптивного иммунитета, иммунный ответ. Большое внимание уделено патологии иммунной системы. ББК 52.5 ISBN 5-225-02755-5 © Издательство «Медицина» Москва, 1999 Все права автора защищены. Ни одна часть этого издания не может быть занесена в памят компьютера либо воспроизведена любым способом без предварительного письменного разрешение издателя.
Предисловие История научной иммунологии насчитывает чуть более 100 лет. Несмотря на молодость, она относится к наиболее значимым и «влиятельным» наукам медико-биологического профиля. Ей принадлежит одно из первых мест по числу профильных журналов, издаваемых в мире, и объему помещаемых в них публикаций. Во всех странах мира иммунология вошла в число самостоятельных вузовских дисциплин относительно недавно, лишь в 70-е, а в широком масштабе — в 80-е годы. Мне сопутствовала удача, ив 1971 г. удалось организовать первую в нашей стране кафедру иммунологии во II Московском медицинском институте им. Н.И.Пиро- гова. Первый учебник по иммунологии на русском языке был опублико- ван автором этих строк в 1982 г. и переиздан в 1987 г. Позже был опуб- ликован учебник А.Е.Вершигоры (1990). За истекшие годы объем знаний в области иммунологии чрезвычайно расширился, более того, был перес- мотрен ряд фундаментальных положений этой науки. В результате ма- териал, содержащийся в упомянутых учебниках, на сегодня уже недоста- точен и частично устарел, и в последние годы с большой остротой встала проблема создания нового учебника по иммунологии. Ответом на запрос времени стала данная книга, а среди зарубежных изданий — «Иммуноло- гия» А.Ройта и соавт. (1998). Индивидуальность различных учебников заключается не столько в подборе и характере представления научных фактов (набор основных фактов в целом неизбежен для всех), сколько в логике, из которой ав- торы исходят при изложении материала. Эта логика определяет постро- ение учебника, характер и последовательность размещения материала. Автор данного учебника вначале приводит сведения о статике иммун- ной системы, затем рассматривает эту систему «в работе», т.е. при от- вете на биологическую агрессию, анализируя сначала врожденную, неспецифическую, а затем антигенспецифическую составляющие им- мунитета, и, наконец, приводит сведения о патологии иммунной сис- темы. В первой главе учебника описано строение лимфоидных органов, охарактеризованы свойства и развитие иммуноцитов в отсутствие анти- генной стимуляции. Во второй главе рассмотрены факторы и механиз- мы иммунной защиты, связанные с процессами, которые не требуют распознавания индивидуальных чужеродных молекул. Третья глава (наиболее важная, самая объемная и в то же время самая трудная для восприятия) посвящена феноменам и процессам, занимающим цен- 5
тральное место в иммунной защите: распознаванию антигенов, природе рецепторов, осуществляющих распознавание, сигналам, которые оно порождает, и процессам, включаемым этими сигналами. В четвертой главе описан специфический иммунный ответ, т.е. система реакций организма, вызываемых внедрением конкретных чужеродных агентов и направленных на их удаление из организма. Здесь же рассмотрены ос- новные проявления иммунной защиты — противоинфекционной и про- тивоопухолевой, а также специфической ареактивности — иммуно- логической толерантности. Заключительная, пятая, глава посвящена па- тологии иммунной системы — иммунодефицитам, аллергии, аутоим- мунным и лимфопролиферативным процессам, а также вопросам иммунодиагностики и иммунотерапии. Эта глава служит теоретическим введением в клиническую иммунологию. Учебник содержит очень большой объем современной иммунологи- ческой информации. Возникает серьезная пррблема доступности этой информации для читателей, особенно для студентов старших курсов ме- дицинских институтов, которым в первую очередь адресован учебник. В связи с этим следует сразу с полной определенностью сказать, что автор поступил правильно, не упрощая материал и не приспосабливая его к уровню тех студентов, которым не свойственна любознательность и которые располагают малым багажом знаний. Объективный факт состоит в том, что иммунология представляет собой непростую науку, особенно в настоящее время, когда она базируется на последних достижениях самых различных научных дисциплин и в первую очередь — молекуляр- ной биологии. В то же время именно сведения о тонких молекулярных иммунологических процессах чрезвычайно оперативно используются для создания новых фармацевтических препаратов и других средств активно- го воздействия на патологические процессы. Следовательно, знания сложных для понимания фактов из области иммунологии особенно акту- альны, поскольку на их основе «строятся» средства активного воздейст- вия на патологические процессы, болезни или их предупреждение. Игнорирование сложностей «из жалости» к студентам в наше время чре- вато выхолащиванием основ науки, потерей ее наиболее активного «фак- тора роста». Тем не менее проблема доступности материала учебника существует и решается как путем максимально ясного изложения, так и с помощью ряда специальных приемов. В данном учебнике описание материала со- провождается большим числом иллюстраций, которые в схематической форме проясняют наиболее значимые и сложные вопросы. Аналогич- ную роль выполняют многочисленные таблицы, которые представляют собой краткие сводки по ключевым аспектам иммунологии. Крупные разделы учебника завершаются резюме, которые специально выделены в тексте. Кроме того, краткое изложение наиболее важных вопросов иммунологии содержится во вступлении, с которым обязательно долж- ны ознакомиться читатели перед изучением основного материала учеб- ника. Наконец, для облегчения восприятия специальной терминологии автор приводит краткий словарь иммунологических терминов. Все это не снимает полностью проблему сложности материала, однако помогает 6
любознательному студенту преодолеть трудности, возникающие при чтении учебника. Предсказать судьбу учебника трудно. Как уже говорилось, острая по- требность в его издании очевидна. Можно надеяться, что он в той или иной степени удовлетворит запросы студентов, аспирантов, преподавате- лей, научных сотрудников и врачей, т.е. тех медиков и биологов, специ- ализирующихся в области иммунологии и смежных дисциплинах, кому этот учебник адресован. Академик Р.В.Петров, вице-президент Российской академии наук
Введение Иммунология как специальная наука, изучающая устойчивость к инфе! циям, возникла относительно недавно. Хотя эта проблема волнова; людей еще в древности, а первые методы вакцинации были созданы XVIII в., научные основы_иммунологии были заложены лишь в 70—80- годах прошлого века Л.Пастером. Как самостоятельная наука со своим научными журналами, вузовскими кафедрами, исследовательскими ш статутами она утвердилась еще позже — уже на протяжении XX Достаточно сказать, что в нашей стране иммунология стала преподаваты как самостоятельная дисциплина фактически с 80-х годов (до это! существовало всего несколько кафедр в медицинских институтах и ун1 верситетах страны). Первый учебник Р.В.Петрова «Иммунология» выше в 1982 г. Хотя он переиздавался, чрезвычайно бурное накопление знани в области иммунологии потребовало написания нового учебника, которы должен отразить значительно больший объем материала в современно осмыслении. В последние десятилетия иммунология развивается непрерывно н< растающими темпами. Оказалось, что объекты ее изучения тесно взаимс связаны с объектами других наук, а иммунологические методы плоде творны для смежных научных дисциплин. В свою очередь развитие ик мунологии немыслимо без внедрения методов молекулярной биологи! цитологии, генетики, биохимии и др. Со временем изменялось даже понимание основного предмета имм] нологии. Сейчас мы уже не можем просто, как это было 100 лет наза, утверждать, что иммунология — наука об устойчивости к инфекция? Дело в том, что те же механизмы, которые обусловливают защиту от иг фекционных агентов, защищают организм от внедрения в его внутрег нюю среду любых чужеродных для него объектов. При этом понят? чужеродности определяется структурой макромолекул, прежде всего бе; ков, которые индивидуальны не только для различных видов живых cj ществ, но в определенной степени и для каждого индивида. Таки образом, иммунология в настоящее время рассматривается как наука биологической индивидуальности и механизмах ее сохранения. Эти механизмы весьма сложны и изощренны. Для их реализации к определенных этапах эволюции возникла специализированная система - иммунная система. Ее назначение состоит в защите организма от биолс гической агрессии — внешней (инфекции) и внутренней (опухоли). Дл распознавания агрессивных агентов и выработалась стратегия, основан ная на выявлении чужеродных для данного организма макромолеку; 8
обычно присутствующих в составе инфекционных агентов и мутантных клеток. Несмотря на то что отнюдь не всегда присутствие чужеродных молекул действительно сопряжено с биологической агрессией, такой путь ее обнаружения оказался наиболее надежным и был «поддержан» эволюционным процессом. Для обозначения молекул, распознаваемых организмом как чужеродные, иммунологи ввели термин «антиген». Он отражает одно из самых сложных и неоднозначных понятий иммуноло- гии. Здесь мы ограничимся определением, данным Р.В.Петровым: анти- гены — это продукты чужеродной генетической информации, способные при введении в организм вызывать развитие специфических иммунных реакций. Иммунная защита от биологической агрессии достигается триадой реакций, включающей: • распознавание чужеродных и измененных собственных макромо- лекул (антигенов); • удаление из организма антигенов и несущих их клеток; • запоминание контакта с конкретными антигенами, определяющее их ускоренное удаление при повторном поступлении в организм. В основе всех трех реакций лежат механизмы, специфичные в отноше- нии конкретных антигенов, которые распознаются белковыми структура- ми, комплементарными антигенам (т.е. пространственно соответст- вующими им как отпечаток оригиналу). Происхождение этих комплемен- тарных структур наряду с механизмами осуществления иммунной защиты стало основным содержанием теоретической иммунологии. В определен- ном смысле можно сказать, что иммунология — это наука о биологичес- кой комплементарности. Иммунология накопила очень большой объем знаний. Последова- тельно изложить их без повторов и забегания вперед практически невоз- можно. Например, рассмотрение рецепторов для распознавания анти- генов невозможно без предварительного описания лимфоцитов, на кото- рых они присутствуют, и их развития, что в свою очередь затруднительно без ясного представления о структуре рецепторов и природе антигенов. Единственная возможность обойти эти трудности состоит в том, чтобы предварительно «набросать» очень краткую схему устройства и функцио- нирования иммунной системы, а затем более детально рассматривать по- дробности в избранной последовательности. Эту общую схему мы и представим во введении. ^Иммунная система представляет собой комплекс специализирован- ныуТлимфоидных органов, а также диссеминированных клеток мезенхи- мального происхождения, способных выполнять иммунологические функции. В схематизированной форме структура иммунной системы и взаимосвязи составляющих ее органов представлена на рис. 1. Большин- ство клеток иммунной системы происходит из кроветворных тканей и некоторое время находится в кровотоке (в этом смысле иммунная систе- ма является дочерней по отношению к кроветворной). Это относится как к общеизвестным клеткам крови — лимфоцитам, моноцитам и нейтрофи- лам, так и к дендритным и тучным клеткам, которые формально не отно- 9 о 9
Пути рециркуляции лимфоцитов Рис. 1. Взаимосвязи органов иммунной системы. Показаны взаимоотношения центральных и периферических органов иммунной системы и направления миграции лимфоцитов в процессе созревания и рецирку- ляции (указано стрелками). В — В-лимфоциты; М — моноциты; Г — гранулоци- ты; Т — Т-лимфоциты. сят к клеткам крови из-за их малой численности в крови и непродолжи- тельности пребывания в циркуляции. У взрослых людей и животных раз- витие клеток иммунной системы практически завершается в костном мозгу, в условиях его микроокружения. Лишь Т-лимфоциты нуждаются в особых условиях развития, которые они находят, мигрируя из костного мозга в тимус (вилочковая железа). Лимфоциты, подчиняясь основным закономерностям развития кро- ветворных клеток, при своем формировании проходят особый, только им присущий этап, который имеет прямое отношение к иммунной специфи- ке: на определенной стадии развития на поверхности лимфоцитов появ- ляются рецепторы для антигена. При этом одна клетка может иметь рецептор лишь для одного антигена, т.е. каждый лимфоцит способен рас- познать только одну пространственную конфигурацию чужеродных мак- ромолекул. На уровне генов, содержащихся в зародышевых клетках, обеспечивается весьма грубое распознавание за счет существования не- скольких сотен так называемых вариабельных генов, и для достижения более тонкого распознавания эти «зародышевые» гены должны подверг- нуться перестройке (реаранжировкё) в процессе дифференцировки кле- ток. В итоге на поверхности лимфоцитов, как развивающихся в тимусе 10
(Т-клетки), так и завершающих свое развитие в костном мозгу (В-клет- ки), появляются продукты перестроенных вариабельных, а также неизмен- ных константных генов, которые формируют мембранный рецептор. Основу рецептора В-лимфоцита составляет молекула иммуноглобулина (Ig), рецептора Тчслеток — димер а|Гили у8, обозначаемый как Т-клеточ- ный рецептор, или IcR (от англ. Т cell receptor). Затем следует двухстадийный процесс селекции клеток, несущих ре- цепторы разной специфичности, и формируемых ими клонов (потомства одной клетки). Сначала отбираются клетки и их клоны, распознающие молекулярные конфигурации, значимые с точки зрения защиты организ- ма; потом выбраковываются аутореактивные (т.е. потенциально агрес- сивные в отношении собственных тканей) клоны и остаются лишь те лимфоциты, которые способны распознавать чужеродные молекулы. Этот процесс может быть иллюстрирован следующей схемой. Предста- вим себе набор букв из различных алфавитов. Сначала из них следует вы- брать буквы языка, на котором мы говорим. На схеме это отражено путем подчеркивания русских букв (в том числе общих с латинским алфави- том), что соответствует фазе положительного отбора. С выделенными таким образом буквами проделывается следующая процедура: из нее уда- ляются буквы, из которых построено слово «человек», что соответствует стадии отрицательного отбора. В результате формируется набор букв, ко- торым мы пользуемся в письме, но не можем написать слово «человек». Примерно такие принципы лежат в основе формирования антигенраспоз- нающего репертуара. Первичный антигенраспознающий репертуар: АСБаВИутЛУЮЕцД51Ш0\УЭрЧРФ Положительная селекция: AGEaBRyEN8£VIQEMaSKX3OW3pHF$ Отрицательная селекция АБКГЯЮКДК30ЭЯФ Вторичный (окончательный) антигенраспознающий репертуар: АБГЮДЗЭФ Параллельно с этим процессом происходит дифференцировка лим- фоцитов на функциональные субпопуляции, т.е. на типы клеток, кото- рые могут выполнять определенную работу, различную для каждого из этих типов. Этот процесс особенно четко выражен в случае развития Т- лимфоцитов, единая линия которых уже в тимусе разделяется на две ос- новные ветви — Т-хелперы и Т-киллеры (цитотоксические Т-лимфоциты). Созревшие клетки со сформированными функциями и сложившимся репертуаром для распознавания антигенов расселяются в лимфоидных органах и скоплениях, причем не только в глубине организма, но и на его границах с окружающей средой — в барьерных тканях (кожа, слизистые оболочки). Это вполне естественно, так как именно внешняя среда чаще всего служит источником биологической агрессии. При этом лимфоциты разных типов занимают относительно обособленные, но не строго изоли- рованные места. Значительная часть клеток иммунной системы заверша- ет свой жизненный цикл, так и не приняв участия в иммунной защите. При этом лимфоциты (особенно Т-клетки) постоянно рециркулируют, И
Рис. 2. Участие клеток иммунной системы в иммунном ответе. Антиген (АГ) обрабатывается антигенпредставляющими клетками (АПК) и пре- зентируется Т-лимфоцитам с участием молекул МНС АПК и корецепторов CD4 и CD8 Т-клеток. Рецепторы В-лимфоцитов способны связывать свободный АГ и презентировать его Т-хелперам. Для активации лимфоцитов, помимо связывания АГ, требуется дополнительная стимуляция, которая осуществляется в процессе контактных взаимодействий с АПК (в случае В-клеток с Т-хелперами), а также при действии цитокинов. Активированные лимфоциты пролиферируют и диффе- ренцируются в эффекторные клетки. СГ)4+-Т-клетки дифференцируются в два типа хелперов — ТЫ и ТЪ2, которые секретируют наборы цитокинов, указанные на рисунке. ТЫ активируют макрофаги, что проявляется в усилении фагоцитоза бактерий, разрушении измененных клеток организма, секреции цитокинов. Th2 способствуют дифференцировке В-лимфоцитов в плазматические клетки, секре- тирующие антитела. Антитела связывают свободные и связанные с мембранами АГ, способствуя их расщеплению. СП8+-Т-клетки при участии ИЛ-2 пролифери- 12
т.е. покидают органы с током лимфы, проникают в кровоток, а из него — вновь в лимфоидные органы. Организованная таким образом иммунная система находится в со- стоянии готовности к защите внутренней среды организма от вторжения чужеродных агентов или сформировавшихся внутри организма изменен- ных макромолекул. Уже упоминалось, что источниками внешней агрес- сии служат, как правило, инфекционные агенты, источником внутренней агрессии — опухолевые клетки. Реакция на них организма складывается из двух линий защиты: базовой воспалительной реакции, лишенной какой-либо специфичности в отношении конкретных агентов, и специ- фического иммунного ответа, направленного против конкретных агрес- соров (точнее, содержащихся в их составе антигенов). Неспецифическая составляющая защитных реакций традиционно рассматривается в рамках как иммунологии, так и общей патологии; антигенспецифический ком- понент защиты {иммунный ответ) — основной объект изучения иммуно- логии. Главная особенность неспецифической составляющей иммунных процессов заключается в том, что ее формирование происходит вне зави- симости от агрессии и является частью естественного развития организма (поэтому их называют естественными факторами иммунитета). Такие процессы могут включаться практически немедленно после появления в организме чужеродного агента. При этом вовлечение факторов естествен- ной защиты в реакцию определяется не их чужеродностью, а другими свойствами (например, выделением некоторых биологически активных веществ) и не зависит от антигенной специфичности агрессивных агентов. В отличие от естественных факторов иммунной защиты ее антиген- специфическая составляющая окончательно формируется лишь в про- цессе ответа на агрессию, что является содержанием адаптивного (т.е. приспособительного) иммунного ответа. Антигенспецифические и не- специфические факторы действуют в тесной взаимосвязи и их бывает трудно разграничить. Однако само понятие «иммунный ответ» подразу- мевает в первую очередь реакцию антигенспецифических элементов им- мунной системы. В схематизированной форме комплекс реакций, обра- зующих иммунный ответ, отражен на рис. 2. Основой неспецифической компоненты иммунного ответа служит воспалительная реакция, индукторами которой являются инфекционные агенты и выделяемые ими продукты, а также компоненты поврежденных тканей. Важная роль этой реакции состоит в привлечении к месту внед- рения чужеродных агентов клеток иммунной системы (нейтрофилы, мо- ноциты и макрофаги, а затем и лимфоциты) и их активации. Они выделяют медиаторы воспаления (в том числе цитокины) и непосредст- венно участвуют в защите от микроорганизмов и опухолевых клеток, спо- руют и дифференцируются в цитотоксические Т-лимфоциты, которые разруша- ют клетки, несущие на поверхности антиген. При дифференцировке лимфоцитов в процессе иммунного ответа, кроме эффекторных клеток, образуются Т- и В- клетки памяти. 13
собствуя их блокировке, поглощению (фагоцитоз) и разрушению. В ходе неспецифической реакции на агрессию активируется ряд гуморальных систем защиты, среди которых особенно важной является система ком- Как отмечалось, неспецифические факторы иммунитета и обуслов- ленная ими воспалительная реакция служат базой для включения адап- тивной реакции лимфоцитов. Ее важнейшая особенность — избира- тельное вовлечение в иммунный ответ только тех клонов лимфоцитов, которые несут рецепторы, распознающие антигены — маркеры чужерод- ности агрессивных агентов. Нативный антиген, в частности раствори- мый, распознается только иммуноглобулиновыми рецепторами В-лим- фоцитов. Т-лимфоциты способны распознавать не антиген как таковой, а «измененное свое» — фрагменты антигена, встроенные в специализи- рованные молекулы поверхности клеток организма — молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС, от англ. Major Histocompatibility Complex). Это связано с особенностями специфичности рецептора Т- клеток: он распознает только антигенные детерминанты, встроенные в молекулы МНС. Молекула МНС служит как бы эталоном «своего» (как буквы русского языка — см. выше), и все отклонения от эталона распо- знаются рецепторами Т-лимфоцитов. Таким образом, В-лимфоциты, ко- торые являются предшественниками клеток, образующих антитела, распознают свободный антиген, а предшественники эффекторных Т-кле- ток — антиген, связанный с молекулами МНС, в частности на поверх- ности инфицированных или мутантных собственных клеток организма. Однако для включения реакций иммунитета — образования антител или цитотоксических Т-клеток — недостаточно, чтобы антиген или его комплекс с молекулой МНС связался с рецепторами соответствующих клеток-предшественников. Для развития ответа требуется цепь подгото- вительных процессов, в основе которых лежат межклеточные взаимодей- ствия. На начальном этапе индукции иммунного ответа главными участниками межклеточных взаимодействий являются антигенпредстав- ляющие клетки (АПК) и Т-хелперы. АПК осуществляют обработку (про- цессинг) антигена и его представление (презентация) Т-хелперам. В ка- честве АПК выступают дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты осо,бь1х,условиях — Суть пР°Цессов> которые осуществляютАПК в отношении антигена, состоит в поглощении анти- гена, фрагментации и встраивании фрагментов в молекулу МНС, т.е. в подготовке молекулярного комплекса, который могли бы распознать Т- хелперы. Одновременно с распознаванием этого антигенсодержащего комплекса происходит контактное взаимодействие АПК и Т-хелперов с помощью ряда взаимно комплементарных молекул их поверхности, кото- рое обеспечивает взаимную адгезию (прилипание) названных клеток и дополнительную стимуляцию Т-хелперов. Кроме того, АПК выделяют ряд цитокинов, которые служат еще одним источником стимулирующих сигналов. Фактически распознавание антигена является лишь указанием, какому клону Т-клеток предстоит вступить в реакцию. Но клетки исход- но малочисленного клона должны размножиться и превратиться в актив- но работающие Т-хелперы. Для того чтобы это произошло, требуются 14
дополнительные стимулы. Результатом этой комплексной стимуляции является сначала активация Т-лимфоцитов, а затем их деление (проли- ферация) и созревание (дифференцировка) в эффекторные клетки. Функция Т-хелперов состоит в оказании «помощи» (отсюда обозна- чение этих клеток — от англ, hepl) В-лимфоцитам и Т-киллерам, которые распознали антиген. Как и в случае с Т-хелперами, для этих клеток недо- статочно одного антигенного стимула, поскольку он лишь определяет выбор клеток, включаемых в ответную реакцию. Для вступления в реак- цию требуется активация этих клеток, условия которой аналогичны рас- смотренным выше условиям активации Т-хелперов: они должны полу- чить дополнительно сигналы костимуляции от контакта с клетками (на этот раз не с АПК, а с Т-хелперами) и от цитокинов. Активация приводит к размножению клеток соответствующих клонов и их дифференцировке в клетки-эффекторы, т.е. в «исполнители» конечных эффектов иммунно- го ответа. В ходе иммунного ответа В-лимфоциты дифференцируются в плаз- матические клетки, секретирующие антитела. Последние представляют собой молекулы иммуноглобулинов, которые фактически представляют собой растворимую форму антигенраспознающего рецептора В-клеток. Антитела связывают растворимые антигены, способствуя их поглощению фагоцитами и расщеплению. Фиксируясь на чужеродных клетках, они делают их доступными для цитолитической атаки комплемента, естест- венных киллеров или для фагоцитоза макрофагами. Т-лимфоциты дифференцируются в цитотоксические лимфоциты, способные распознавать чужеродные или измененные собственные клет- ки. Следствием такого распознавания является иммунный цитолиз клеток- мишеней: организм не делает попыток «излечить» измененные клетки — он уничтожает их. Другой тип эффекторных Т-лимфоцитов — эффекторы гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) — реализуют свое дейст- вие, повышая активность макрофагов, т.е. придавая специфическую на- правленность реакциям первой линии защиты и стимулируя их. Помимо цитотоксических Т-лимфоцитов, гибель чужеродных кле- ток-мишеней вызывают естественные киллеры (NK-клетки — от англ, natural killer), которые, как следует из их названия, относятся к факторам естественного иммунитета, поскольку они находятся в состоянии готов- ности к цитолизу вне зависимости от антигенной стимуляции (в процес- се иммунного ответа они лишь дополнительно активируются). В иммун- ной защите участвуют также эозинофилы, тучные клетки и тромбоциты. При этом, как правило, факторы естественного и адаптивного иммуни- тета выступают в комбинации, примером чего может служить «вооруже- ние» макрофагов антителами, что придает им специфичность, или активация тех же макрофагов лимфоцитарными цитокинами при ГЗТ. Как следует из изложенного выше, в результате иммунного ответа исходно малочисленная группа неактивных лимфоцитов в результате специфического распознавания чужеродного антигена размножается, ак- тивируется и дифференцируется в эффекторные клетки, способные с по- мощью тех или иных механизмов убивать клетки — носители антигена и удалять их (с участием неспецифических факторов естественной резис- 15
тентности) из организма. Это сопровождается серьезными изменениями структуры иммунной системы. Поэтому по мере успешного выполнения задачи на уровне организма включаются и срабатывают механизмы, ко- торые ограничивают иммунные процессы и приводят к устранению ви- димых последствий иммунного ответа. В осуществлении этой задачи участвуют антитела и лимфоциты благодаря проявлению ими особой функции — супрессорной. Однако иммунный ответ не проходит для организма бесследно: после него остается иммунологическая память. Ее материальной основой служат лимфоциты — клетки памяти, которые образуются параллельно эффек- торным клеткам, но не участвуют в устранении антигенов и их носите- лей. Эти клетки отличаются большой продолжительностью жизни. При повторном поступлении в организм того же инфекционного агента (и следовательно, тех же антигенов) клетки памяти быстрее вовлекаются в иммунный ответ, который развивается, минуя ряд промежуточных фаз, и более интенсивно. На наличии иммунологической памяти основано со- стояние иммунитета — невосприимчивость к инфекционным заболева- ниям, а также эффект искусственной вакцинации. Представленный краткий экскурс в устройство и работу иммунной системы может служить не только введением, но и путеводителем по ма- териалу, изложенному в учебнике, и может облегчить понимание более детализированного изложения современных иммунологических знаний. Схема распределения материала в учебнике следующая. Глава 1 со- держит описание структуры иммунной системы в состоянии' покоя. В главе 2 представлены факторы и механизмы естественного иммуните- та — неспецифической составляющей иммунного ответа. В главе 3 отра- жены молекулярные и клеточные основы распознавания антигенов, активации клеток, межклеточных взаимодействий при иммунном ответе. Глава 4 посвящена описанию иммунного ответа как такового, его эффек- торных механизмов и основных проявлений иммунной защиты. Глава 5 посвящена рассмотрению патологии иммунной системы (без углубления в клинические аспекты). Крупные разделы учебника завершаются крат- кими резюме. В приложение 1 вынесена таблица, отражающая классифи- кацию мембранных маркеров клеток иммунной системы. Ознакомление с материалом может быть облегчено обращением к краткому словарю иммунологических терминов (см. приложение 2).
Структура и организация иммунной системы Гистологически иммунная система практически соответствует лимфоид- ной ткани. Важнейшая особенность последней состоит в том, что она распространена по всему организму, исключая немногие органы или отдельные их участки, называемые иммунологически привилегированны- ми. При этом локализация клеток иммунной системы, прежде всего лимфоцитов, отнюдь не ограничивается лимфоидными органами: значи- тельная их часть рециркулирует (т.е. постоянно поступает в кровоток и возвращается обратно) и при этом может мигрировать не только в лимфоидную ткань. Поскольку наши представления об иммунитете свя- заны прежде всего с клетками иммунной системы, в первую очередь с лимфоцитами, с их описания мы начнем изложение материала. 1.1. КЛЕТКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ Клетки иммунной системы могут быть разделены на три группы на основе их происхождения и функциональных различий, в частности, способнос- ти к распознаванию антигенов. Это лимфоциты, вспомогательные (в том числе антигенпредставляющие) клетки и клетки стромы. Лимфоциты и вспомогательные клетки происходят из кроветворной стволовой клетки, стромальные клетки — от местных мезодермальных элементов. Лимфо- циты распознают чужеродные антигены и осуществляют реакции, приво- дящие к удалению антигенов из организма. Вспомогательные клетки обрабатывают антиген, «представляют» его лимфоцитам, выполняют не- которые эффекторные функции; им несвойственна способность распо- знавать антигены, хотя некоторые из них участвуют в антигенспецифи- ческих процессах. Стромальные клетки создают среду для нормального функционирования клеток первых двух типов, формируя их микроокру- жение и определяя пути их миграции. В иммунологической литературе ранее использовался и иногда еще применяется термин «иммунокомпе- тентная клетка». Им обозначали клетки, способные распознавать антиген; однако в связи с отсутствием строгого определения соответствующего понятия использование этого термина нежелательно. 1.1.1. Лимфоциты Антигенная специфичность иммунных процессов определяется участием в них лимфоцитов, наиболее характерной особенностью которых явля- 17
Рис. 3. Лимфоцит. Электронограмма малого лим фоцита (х 13 000). Следуе' обратить внимание на плот ную упаковку хроматина i бобовидном ядре, слабо раз витую цитоплазму, содержа щую митохондрию и рибо сомы, неровную наружнук поверхность клетки (из учеб ника А.Ройта «Основы имму нологии», 1991). ется присутствие на их поверхности рецепторов для распознавания анти гена. В отсутствие контакта с чужеродными субстанциями лимфоцить представляют собой покоящиеся клетки: они не делятся, не секретирую' активных продуктов, их метаболическая активность минимальна. Это на ходит отражение в морфологии лимфоцитов. Они представляют собор округлые клетки диаметром 7—9 мкм с круглым или бобовидным ядрок и узкой цитоплазмой, бедной цитоплазматическими гранулами (рис. 3) Эти клетки являются почти бездействующим носителем рецепторов дш распознавания антигенов, и лишь после связывания антигенов происхо дит активация лимфоцитов, приводящая к их дифференцировке в эф фекгорные и регуляторные клетки иммунной системы. Популяция лимфоцитов имеет клональную структуру. Это означав' следующее. Антигенраспознающие рецепторы формируются таким обра зом, что на каждой клетке образуется уникальный по специфичности ре цептор, передающийся дочерним клеткам. В результате возникают клонъ (клон — это потомство одной клетки), отличающиеся по специфичносп рецепторов. Каждый клон «знает» единственный антиген, а все клонь лимфоцитов в совокупности «знают» все возможные антигены. При по падании в организм конкретного антигена в ответ на это вовлекаете; лишь тот клон (обычно группа клонов), клетки которого несут соответст вующие рецепторы. Все лимфоциты имеют общий источник — кроветворную стволовук клетку и проходят начальные этапы развития в костном мозгу (в эмбри- ональном периоде — в желточном мешке и печени). Основные этапь дифференцировки лимфоцитов разных типов осуществляются в различ- ных органах. Это было установлено при изучении последствий удалени; вилочковой железы у новорожденных мышей, когда обнаружилось, чтс одна часть лимфоцитов нуждается при своем развитии в присутствии же- 18
Таблица 1. Характеристика основных популяций лимфоцитов человека Признак В-лимфоциты Т-лимфоциты NK-клетки Органы, в которых развиваются клетки Костный мозг Костный мозг, вилочковая железа Костный мозг, селезенка Рецептор для антигена Иммуноглобулин Два типа димеров TCR (а0 или у§) Отсутствует Основные мембран- ные маркеры общие субпопуляционные CD19, 20, 21, 72 ' CD5 CD3, 2, 5, 7 CD4 и CD8 CD16, 56, 57 Содержание в крови 8-20% 65-80 % 5-20 % Рециркуляция Слабая Сильная Умеренная Функция Предшественники клеток, секретиру- ющих антитела (плазмоцитов) Предшественники эффекторов клеточ- ного иммунитета, регуляторные клетки Естественные киллеры лезы, тогда как другая полноценно развивается у неонатально тимэкто- мированных животных. У птиц развитие этой второй группы лимфо- цитов нуждается в присутствии фабрициевой сумки (бурсы) — органа, рас- положенного рядом с клоакой. Лимфоциты первого типа были названы тимусзависимыми, или Т-лимфоцитами, а клетки второго типа — бурса- зависимыми, или В-лимфоцитами [Roit I., 1969]. В последующем была обнаружена неоднородность каждого из этих типов лимфоцитов, причем особенно гетерогенными оказались Т-клетки. Кроме того, был открыт еще один тип лимфоцитов — естественные киллеры, или NK-клетки, ко- торые развиваются в костном мозгу и селезенке. Они не распознают антигены в том смысле, как это делают лимфоциты, однако и им прису- ща определенная распознавательная способность. Сведения о свойствах основных типов лимфоцитов отражены в табл. 1. Долгое время не удавалось найти признаки, по которым можно было бы различать указанные типы клеток. Дело в том, что гетерогенность лимфоцитов практически не отражается на их морфологии. Попытки найти ферментативные маркеры также заканчивались неудачей, а целена- правленные попытки обнаружить различия в антигенах, присутствующих на поверхности лимфоцитов, были успешными только при взаимной им- мунизации мышей различных генетически чистых линий. При гетероло- гичной иммунизации (например, иммунизации кроликов клетками человека) тонкие различия между антигенными маркерами клеток мас- кировались более сильными межвидовыми различиями. Лишь после того как была разработана гибридомная технология (см. раздел 4.1.2), были по- лучены многочисленные моноклональные антитела к маркерным антиге- нам поверхности лимфоцитов различных классов и подклассов (обычно их обозначают как популяции и субпопуляции). В определенный момент 19
возникла потребность в сопоставлении специфичности наработанных моноклональных антител. Тогда на конференции по типированию лейко- цитов была предложена единая классификация мембранных антигенов и распознающих их моноклональных антител (точнее, их групп — класте- ров). Было введено обозначение антигенов как CD (от англ, cluster desig- nation) с указанием соответствующего номера. Эта классификация распространяется в первую очередь на маркеры клеток костномозгового происхождения, причем число кластеров превысило 100 (см. таблицу в приложении 1). 1.1.1.1. В-лимфоциты Основной характеристикой В-лимфоцитов является наличие на их по- верхности рецепторов для распознавания антигенов, основу которых составляют молекулы иммуноглобулинов. После взаимодействия рецеп- тора с антигеном В-лимфоциты дифференцируются в плазматические клетки, секретирующие иммуноглобулины — молекулы, которые способ- ны связывать соответствующий антиген, т.е. являются антителами. Как уже отмечалось, В-клетки каждого клона имеют уникальный по специ- фичности рецептор, распознающий одну молекулу антигена (точнее, ее участок — эпитоп). Иными словами, В-лимфоциты способны распозна- вать антигены благодаря наличию на их поверхности специальных рецеп- торов, причем конечным результатом распознавания является секреция клетками практически тех же распознающих структур — антител (см. разделы 3.1.1 и 4.1.2). Таким образом, В-лимфоциты являются основным клеточным субстратом гуморального иммунного ответа, состоящего в выработке антител, способных связать и нейтрализовать антигены, кото- рые проникли в организм. Рецептор В-клеток для распознавания антигена. Мембранный рецеп- тор для антигена В-лимфоцитов (рис. 4) обозначается как BCR (от англ. В cell receptor). Его главной частью, как уже отмечалось, является молеку- ла иммуноглобулина, встроенная в мембрану (мембранные или поверх- ностные иммуноглобулины обычно сокращенно обозначают как mlg или sig). Подробно структура иммуноглобулинов будет рассмотрена в разде- ле 3.1.1. Здесь необходимо сказать лишь о самых главных особенностях молекул иммуноглобулинов. Молекула так называемого мономерного им- муноглобулина состоит из двух легких (L) и двух тяжелых (Н) цепей, кото- рые построены из относительно автономных гомологичных участков — доменов. N-концевые домены отличаются исключительно высокой вариа- бельностью внутри каждого организма; они называются вариабельными (V) доменами. При комбинировании V-доменов L- и Н-цепей формиру- ются антигенсвязывающие участки (активные центры) антител, предна- значенные для распознавания антигенных детерминант. Другие домены (1 в легкой цепи и 3—4 в тяжелых цепях) называют константными (С); они обеспечивают выполнение биологических функций иммуноглобулинов (связывание со специализированными рецепторами на клеточных мем- бранах, с компонентами комплемента и т.д.). Они же обусловливают структурно-функциональные особенности L- и Н-цепей, определяющие 20
BCR Дополнительные молекулы --------------------------—। CD21 Рис. 4. Строение антигенраспознающего рецептора В-лимфоцитов. Представлены молекулы, входящие в состав собственно рецептора (BCR) и коре- цепторных структур (дополнительные молекулы). В BCR обозначены полипеп- тидные цепи, а в молекуле мембранного IgM (mlgM) — также домены. изотип цепей. У человека существует два изотипа L-цепей (к и X) и 10 изо- типов (классов и субклассов) Н-цепей (ц, 5, yl, у2, уЗ, у4, е, al и а2), кото- рые обусловливают название молекул иммуноглобулинов: греческие буквы, которыми обознают тяжелые цепи, соответствуют латинским бук- венным обозначениям классов иммуноглобулинов. Например, ц-цепь входит в состав молекулы иммуноглобулина класса М (IgM), a-цепь — мо- лекулы IgA и т.д. Часть молекулы иммуноглобулина, содержащую анти- генсвязывающие центры, легкие цепи, V- и Cl-домены тяжелых цепей, называют Fab-порцией (Fab-фрагмент). «Хвостовую» часть, лишенную антигенсвязывающей функции и включающую остальные константные домены, называют Fc-порцией (Fc-фрагмент). Природа этих фрагментов и происхождение сокращенных обозначений будут рассмотрены в разде- ле 3.1.1. Существует 3 кластера (скопления) генов, детерминирующих структу- ру иммуноглобулинов: для к, X и всех Н-цепей иммуноглобулинов. Внутри кластеров имеется несколько генетических элементов: серия V-генов (не- сколько сотен для Н- и к-цепей), на некотором расстоянии (более 10 000 пар нуклеотидов) от их З'-конца («справа») — короткие участки D (от англ, di- versity), которые присутствуют только в кластере генов Н-цепей, и J (от англ, joint), затем С-гены. В кластерах генов к- и Х-цепей имеется по одно- му С-гену, в кластере генов Н-цепей — серия С-генов, детерминирующих классы иммуноглобулинов. У мышей они расположены в последователь- ности ц, 5, уЗ, у 1, у2Ь, у2а, е, а, у человека — ц, 5, уЗ, у 1, ц/, al, у2, у4, е, а2 (знак означает неработающий ген — псевдоген). 21
С-гены V-гены D-гены J-гены Рис. 5. Принципиальная схема перестройкти (реаранжировки) генов антигенрас- познающих рецепторов лимфоцитов. Линии между верхним и нижним рядами генов (отражающими рецепторные гены в зародышевом и перестроенном виде) обозначают сближение ранее пространст- венно разобщенных генетических сегментов. Основным мембранным иммуноглобулином В-клеток является мо- номерный IgM (сывороточный IgM является пентамером). Большинство зрелых В-клеток, не контактировавших с антигеном (т.е. «наивных» кле- ток), содержат на поверхности BCR, основой которых служат иммуно- глобулины класса D (slgD). В состав рецептора входят также два гетеро- димера, образованных полипептидными цепями Iga и Igp (CD79a и b). Они не способны распознавать и связывать антиген, но участвуют в пе- редаче сигнала о связывании антигена внутри клетки. Сигнальной функ- цией обладает ряд дополнительных молекул, образующих корецептор. В его состав входят молекулы CD 19, CD20, рецептор для комплемента CR2 (CD21), связывающий фрагменты СЗ-компонента комплемента iC3b, C3dg и C3d (см. раздел 2.3.1), а также лектин Leul3 и молекула ТАРА-1 (CD8), 4 раза пронизывающая мембрану. Часть корецепторных комплексов имеет в своем составе молекулу CD22. Некоторые дополни- тельные сведения о BCR приведены в разделе 3.1.1. Генез В-лимфоцитов. У млекопитающих развитие В-лимфоцитов осу- ществляется в эмбриональном периоде в печени (у человека — с 8—9-й недели, у мышей — с 14-х суток развития), в постнатальном периоде — в костном мозгу. У птиц развитие В-клеток начинается в костном мозгу и завершается в фабрициевой сумке (бурсе). Аналог бурсы у млекопитаю- щих не найден, несмотря на длительные целенаправленные поиски; предполагалось, что аналогичную функцию выполняет лимфоидная ткань кишечника. Лишь у овец с определенной уверенностью можно го- ворить о роли групповых лимфатических фолликулов (пейеровы бляшки) подвздошной кишки в качестве аналога сумки Фабрициуса. Имеются немногочисленные сведения о существовании общего предшественника для В- и Т-клеток, который сохраняет маркер стволо- вых клеток CD34, но лишен маркеров других кроветворных рядов; у мышей они экспрессируют также молекулу Thy-1. Клетки, развивающие- ся в направлении В-лимфоцитов, уже на ранних стадиях приобретают не- которые свойственные им маркеры, в частности CD 19. В костном мозгу человека на долю лимфоцитов В-ряда приходится 15—20 % кариоцитов. Ранние предшественники В-лимфоцитов локализуются преимуществен- 22
но в субэндостальной зоне костного мозга в тесной связи с крупными стромальными клетками, не образуют кластеров (по-видимому, вследст- вие постоянного перемещения). Основой процесса развития В-лимфоцитов является формирование рецепторного комплекса BCR, в первую очередь его иммуноглобулиновой составляющей. Предпосылкой экспрессии генов иммуноглобулинов слу- жит перестройка (реаранжировка) генов. Дело в том, что в геноме зароды- шевых и всех соматических клеток, кроме зрелых лимфоцитов, отсутству- ют «в готовом виде» гены, кодирующие вариабельные домены иммуногло- булинов и полипептидных цепей Т-клеточных рецепторов, т.е. структур, распознающих антигены. Имеются фрагменты таких генов (V, D, J), раз- деленные довольно большими «генетическими расстояниями». «Зрелые» гены, кодирующие эти структуры, формируются при созревании лимфо- цитов. Процесс, приводящий к формированию зрелых V-генов, состоит в изъятии генетического материала, разъединяющего указанные фрагмен- ты. Этот процесс называется реаранжировкой генов. Принципиальная схема реаранжировки V-генов лимфоцитов представлена на рис. 5; не- сколько подробнее этот процесс будет рассмотрен в разделе 3.1.3. Пере- стройка генов и объединение участков V, D и J осуществляются при участии специальных ферментов — рекомбиназ (сегмент D сохраняется в генах Н-, но не L-цепей). Экспрессия генов этих ферментов — RAG-1 и RAG-2 — предшествует процессу реаранжировки. Реаранжировка У-генов иммуноглобулинов начинается со .сближения случайно избргишыхэлё- ментрв D и J в кластере Н-генов путем формирования цепью. ДНК петли на участке между этими элементами. Затем по тому же механизму сближа- Тбтся У£и10^г^^^вгенах легких цепей — V и J). При этом из большой ’серии зародышевых V-генов в процесс перестройки вовлекается только один (выбор происходит случайно), что в основном и определяет специ- фичность рецептора данной клетки. Реаранжировка генов иммуноглобу- линов служит существенным источником повышения гетерогенности V-генов и соответственно рецепторов для антигена. Существует ряд до- полнительных механизмов формирования разнообразия рецепторов, ко- торые будут рассмотрены в разделе 3.1.3. Один из них сострит в немат- ричном приращении в области соединения V- и DJ-участков коротких олигонуклеотидов (N-фрагментов), обусловленном активацией терми- нальной дезоксинуклеотйдйЛТрйНсфе]эазь1 (TdT). Описанная перестройка сначала затрагивает V-ген p-цепи и лишь позже — V-гены L-цепей. Перестройка в каждом случае происходит вна- чале в одной хромосоме и в случае генов L-цепей затрагивает лишь один их тип (причем сначала к, а затем X). Если она прошла успешно, анало- гичный процесс в другой хромосоме блокируется в результате прекраще- ния экспрессии генов RAG-1 и RAG-2. Так достигается аллельное исключение, т.е. наличие в каждой клетке одного типа (по структуре и специфичности) иммуноглобулиновых рецепторов. В случае непродук- тивной перестройки генов (соединение сегментов в неправильной рамке считывания, образование вслед за участками соединения терминирую- щих последовательностей, прекращающих считывание, и т.д.) реаранжи- ровка генов происходит в другой хромосоме. Если же и в этом случае 23
Таблица 2. Стадии развития лимфоцитов В-ряда Стадия развития Состояние генов BCR (Н—L)* Состояние рецептора Антигенные маркеры Ростовые факторы Примерная численность у мышей ПроВ з/DJ—з Igap, CD19” CD19, 34, 10, 45, TdT, RAG1, 2 ИЛ-7, ФСК 1,7 х 10^ ПреВ! DJ/VDJ-з VnpeB— Х5/р130 CD19, 34, 10, 45, 43, RAG-1, 2 ИЛ-7, ФСК 2,0 х 106 ПреВП VDJ-3/VJ VnpeB Х5/|д, ср CD19, 20, 21, 10, 72, 25, 43, 45 ИЛ-7,2 3,5 х 10’ Незрелые В VDJ-VJ slgM CD19, 20, 21, 22, 45, 25, 72, 32 ИЛ-2 1,8 х 10’ Зрелые В VDJ-VJ slgM, slgD CD19, 20, 21, 22, 45, 72, 32, 40, 80 ИЛ-4, 2, 5, 1 5,0 х 108 ‘Слева — состояние V-гена ц-цепи, после тире — состояние V-гена L-цепи, з — ген в зародышевой конфигурации; DJ, VDJ, VJ — типы перестроек V-генов. “Неспецифические компоненты представлены только для проВ-клеток; для преВ-кле- ток представлены данные о L- и Н-цепях рецептора, разделенные косой линией. ФСК — фактор стволовых клеток. перестройка оказалась неудачной, клетка гибнет. После формирования «зрелых» перестроенных V-генов их экспрессия осуществляется в сочета- нии с экспрессией С-генов (для Н-цепей — в первую очередь Ср-гена). Результатом является формирование полных полипептидных цепей им- муноглобулина, содержащих продукты V- и С-генов. Путем оценки состояния иммуноглобулиновых генов и определения экспрессии на поверхности клеток антигенных маркеров удается расчле- нить развитие В-клеток на ряд этапов (табл. 2, рис. 6). Самый ранний этап на пути развития В-лимфоцитов соответствует стадии проВ-клеток. На этом этапе гены иммуноглобулинов находятся в неперестроенной форме (в «зародышевой конфигурации»), но уже экспрессированы гены RAG-1, RAG-2 и TdT, на поверхности клеток появляются невариабельные компо- ненты BCR — димеры Iga и Igp (CD79a и b) и CD 19 — самые ранние пан- В-клеточные (т.е. присущие всем В-клеткам) маркеры. На этапе преВ! происходит сближение сегментов D и J V-генов Н-цепей, т.е. реализуется первый этап реаранжировки этих генов. В это время на поверхности клет- ки появляется молекула — предшественница иммуноглобулина — «сурро- гатная» L-цепь, которая содержит продукты невариабельных генов VnpeB и Х5. До момента формирования полноценного (VDJ) Vp-гена суррогатная L-цепь на поверхности npeBI-клетки связана с белками pl30 и р35/р65, связь которых с иммуноглобулинами неизвестна. Переход на стадию преВП-клетки связан с завершением перестройки Vp-гена и экспрессией ц-цепи. Последняя появляется одновременно в свободной форме в цитоплазме клетки и в составе мембранного проторе- цептора в соединении с суррогатной L-цепью. При этом ослабляется экс- прессия генов RAG-1, RAG-2 и TdT, которая вскоре вновь усиливается, 24
а ПроВ Пре 81 ПреВП Незрелая В-клетка ПроТ ПреТ1 ПреТП Незрелый тимоцит В-клетки Т-клетки Рис. 6. Перестройка рецепторных генов и экспрессия антигенраспознающих ре- цепторов на поверхности В- (а) и Т-(б) лимфоцитов в процессе их развития. б знаменуя начало перестройки генов L-цепей. Начиная со стадии преВП и до полного созревания В-клеток, на поверхности этих клеток присутст- вуют общие В-клеточные маркеры — CD20 и 72. Биологическое значение проторецепторов В-клеток, содержащих сур- рогатную L-цепь, до конца не выяснено. Считается, что проторецепторы воспринимают сигналы от микроокружения, необходимые для осущест- вления первоначальной пролиферации — «экспансии» В-лимфоцитов, ко- торая важна для формирования обширного антигенраспознающего репер- туара; иногда этот процесс называют положительной селекцией (по анало- гии с положительной селекцией Т-лимфоцитов, см. ниже). Две волны пролиферации предшественников В-клеток действительно происходят на стадиях проВ и преВП. Эта экспансия приводит к 20-кратному увеличе- нию численности клеток В-ряда. В то же время примерно 55 % этих клеток гибнет вследствие неудачной реаранжировки. На стадии проВ ростовыми факторами юных представителей В-ряда служат фактор стволовых клеток и интерлейкин (ИЛ) 7, на стадии преВП — только ИЛ-7. На стадии преВП происходит перестройка генов L-цепей, которая завершает процесс генетических преобразований в лимфоцитах В-ряда. При этом в каждой конкретной клетке перестраивается и экспрессирует- 25
ся один тип L-цепей — только к или только X, причем число к+В-клето почти в 10 раз превышает численность Х+В-клеток. Следствием реаран жировки генов L-цепей является экспрессия последних в составе полно ценного мембранного IgM в сочетании с другими вспомогательным молекулами рецепторного комплекса. Появление на поверхности клетк сформировавшегося BCR знаменует переход клеток В-ряда на стадию не зрелой В-клетки. Завершение генетических преобразований в генах ВС1 находит отражение в окончательном прекращении экспрессии гено RAG-1 и RAG-2. На этом этапе развития гибнет примерно 85—90 % не зрелых В-лимфоцитов, вероятно, вследствие отрицательной селекции - выбраковки и гибели аутоспецифических клонов (осуществление этог процесса, хорошо изученного в случае Т-лимфоцитов, при развитии Е клеток строго не доказано). В итоге численность созревающих В-клето лишь в 10 раз превышает число проВ-клеток, первоначально вступающи на путь В-лимфопоэза (у мышей за сутки образуется около 1,5 х 1( проВ-клеток и 15 х 106 зрелых В-лимфоцитов). Динамика численност лимфоцитов В-ряда на разных этапах их развития отражена в табл. 2. Процесс антигеннезависимого развития В-клеток завершается экс прессией IgD-рецептора, который сосуществует с IgM-рецепторок IgM+IgD+-ioieTKH обозначают как зрелые В-лимфоциты. Экспресси IgD-рецептора становится возможной благодаря «переключению» С генов, суть которого состоит в том, что прилегающий к V-гену Ср-ген ис ключается из процесса транскрипции и вместо него считываете следующий за ним С5-ген. В последующем уже в процессе иммунного от вета происходят дальнейшее переключение С-генов рецептора и последе вательное появление на поверхности В-лимфоцитов рецепторот относящихся к различным подклассам IgG, затем — к IgE и IgA. Этс процесс переключения изотипов DCR будет рассмотрен в связи с антг гениндуцированной дифференцировкой В-лимфоцитов (см. раздел 3.5.2 Решающую роль в контроле развития клеток В-ряда играют костнс мозговое микроокружение — клетки стромы и молекулы межклеточног матрикса, с которыми клетки В-ряда контактируют благодаря мембраг ным интегринам, а также вырабатываемые ими близкодействующие гумс ральные факторы. Для развития В-клеток и формирования их клонально структуры важны сигналы, подаваемые цитокинами, которые вырабать ваются клетками стромы костного мозга. Уже упоминалось, что ИЛ-7 ел; жит основным ростовым и дифференцировочным фактором на стадия проВ (наряду с фактором стволовых клеток) и преВ; возможно, ИЛ-7 ог ределяет дифференцировку клеток в направлении В-лимфоцитов. Выжр ванию и развитию В-лимфоцитов на ранних стадиях способствуют факте стволовых клеток и, по-видимому, ИЛ-3. Наоборот, ИЛ-1 и 4 отменяк ростовое действие ИЛ-7 на преВ-клетки. В то же время ИЛ-1 способствус экспрессии генов иммуноглобулинов, а ИЛ-4 повышает выживаемое! преВ-клеток (в отсутствие ИЛ-4 они подвергаются программирование гибели — апоптозу). Трансформирующий фактор роста 0 отменяет ка ростовой, так и дифференцировочный эффекты ИЛ-7. Осуществлени! дифференцировки преВ-клеток способствует интерферон у. С момента завершения формирования рецепторного комплекса Е 26
клетка приобретает способность взаимодействовать с антигеном. В слу- чае, если происходит перекрестное сшивание рецепторов, их агрегация на поверхности с образованием «шапочки», видимой при флюоресцент- ном мечении антител, клетка реагирует на действие антигена. Форма ре- акции зависит от степени зрелости В-клетки. Как уже отмечалось, незре- лая В-клетка реагирует на такую стимуляцию развитием апоптоза. Зре- лые В-клетки отвечают на связывание и перекрестное сшивание имму- ноглобулиновых рецепторов активацией и дифференцировкой в клетки, продуцирующие антитела, как правило, при условии наличия вспомога- тельных сигналов со стороны Т-хелперов; в отсутствие этих сигналов В- клетка подвергается апоптозу. Эти реакции В-лимфоцитов на связывание BCR подробно рассмотрены в главе 3. Мембранные маркеры и ростовые факторы В-лимфоцитов. Для опре- деления В-лимфоцитов при экспериментальной работе и клинико-имму- нологическом обследовании людей чаще всего используют выявление на их поверхности молекул, свойственных всем зрелым В-лимфоцитам, но не другим типам клеток. Такими маркерными молекулами В-лимфоци- тов являются slgM, CD 19 и 20 и другие компоненты рецепторного ком- плекса (см. рис. 4), а также CD72, которая, как предполагают, является рецептором для IgM и, кроме того, служит лигандом для маркерной мо- лекулы CD5 Т-клеток. Для выявления мембранных маркеров клетки об- рабатывают моноклональными антителами (см. раздел 4.1.1); в случае определения мембранного IgM используют также поликлональные анти- сыворотки. Антитела могут быть помечены флюоресцентным красителем флюорохромом или после инкубации клеток с немечеными мышиными антителами их дополнительно обрабатывают Fab-фрагментами антител к IgG мыши, меченными флюорохромом. После этого определяют процент флюоресцирующих клеток с помощью проточной цитофлюорометрии или флюоресцентной микроскопии (что менее предпочтительно в связи с субъективностью оценки результатов). Использование проточных цито- метров позволяет выделить меченые клетки и получить чистую популя- цию В-лимфоцитов или любых клеток, которые помечены флюорохро- мом. Принципы изучения клеток иммунной системы в практике клини- ческой иммунологии рассмотрены в разделе 5.5.1. Зрелые В-лимфоциты располагают необходимыми мембранными мо- лекулами (табл. 3, рис. 7), чтобы не только распознать антиген, но и эф- фективно контактировать с другими клетками иммунной системы, в частности с Т-хелперами (CD40, CD80, CD86, уже упоминавшаяся CD72), а также с межклеточным матриксом (интегрины семейства pj— VLA-2 и 4, р2—LFA-1), молекулами иммуноглобулинов (рецептор для Fc- порции IgG — Fcyl, или CD32), компонентами комплемента СЗЬ (CD35) и C3d (CD21, он же — рецептор для вируса Эпштейна — Барр), цитоки- нами (рецепторы ИЛ-1 и 4, интерферона у). Особое место среди мем- бранных структур В-лимфоцитов занимают молекулы главного комп- лекса гистосовместимости (МНС) I и II классов, позволяющие им вы- полнять функцию антигенпредставляющих клеток. Субпопуляции В-лимфоцитов. Известны две субпопуляции В-лимфо- цитов, отличающиеся экспрессией молекулы CD5. Последняя является 27
Таблица 3. Маркеры В-лимфоцитов человека Группа маркеров Название маркеров Мол. масса, xlOOO Семейство I. Рецептор Мембранные 1g классов М, 970, 184, 146, 1g для антигена D, G, А или Е 160, 190 CD79-a (Iga), b (IgP) 33, 39 Ig II. Общие марке- CD19 95 Ig ры В-лимфоци- CD20 33/37 тов неиммуно- CD22 130-140 Ig глобулиновой CD72 43/39 С-лектин природы CD40 48/40 NGFR III. Продукты генов гистосов- Антигены класса I (HLA-A, В, С) 43/11 Ig (частично) местимости Антигены класса II (HLA-DR, DP, DQ) 35/30 Ig (частично) IV. Маркер субпопуляции CD5 67 SCR V. Рецепторы CD32 (FcyRII) 40 CD23 (FceRII) CD35 (CR1) 45-50 140 С-лектин CD21 (CR2) 145 ССР VI. Адгезивные CD 11 а/CD 18 (LFA-1) 180/95 Рз-интегрины молекулы CD1 lb/CD18(Mac-l) 150/95 м VLA-2, 3 и 4 160/130 Р1-интегрины (CD29/CD49) 125/130; 150/130 м CD31 (PECAM-1) 140 Ig CD34 105-120 Муцин CD58 (LFA-3) 65-70 Ig CD62L (L-селектин) 70-90 С-лектин CD80 (B7.1) 60 Ig CD86 (B7.2) 80 Ig CD102 (ICAM-2) 60 Ig VII. Ферменты VIII. Маркеры активации CD10 (Zn-металлопротеиназа) CD73 (экто-5’-нуклеотидаза) CD25, CD30, CD40, CD54, CD69, CD70, CD126, CD130, молекулы МНС II класса 100 69 IX. Рецепторы CD25/122/132 (для ИЛ-2; а/р/у) 55/70/64 CCP/CKR для цитокинов CD119 (для у-интерферона) 130/64 CKR (экспрессируют- CD121b (для ИЛ-1, тип И) Ig ся на активиро- CD124/132 (для ИЛ-4) 60/95 CKR ванных клетках) CD 125 (для ИЛ-5, чф) 80/130 CKR CD126/130 (для ИЛ-6) 68/64 CKR CD127/132 (для ИЛ-7) НО CKR(II) Примечание. ССР — контрольные белки системы комплемента; CKR — цито- киновые рецепторы; SCR — рецепторы-«мусорщики» (от англ, scavenger); NGFR — семей- ство рецепторов фактора роста нервов; муцин — муциноподобные молекулы. При обозначении молекулярной массы цифры, разделенные косой линией, соответствуют мас- сам субъединиц молекулы. 28
BCR(mlgM)-CD79 С 045 CD44 LFA-1 Рис. 7. Основные мембранные маркеры лимфоцитов. Т — Т-лимфоциты; В — В-лимфо- циты; NK — NK-клетки. Пред- ставлены наиболее важные мар- керы. В скобках даны дополни- тельные обозначения (после ос- новных названий). Курсивом от- мечены маркеры субпопуляций, а звездочкой — маркеры активации. В распределении обозначений маркеров по окружности отсутст- вует строгая закономерность, лишь антигенраспознающий ре- цептор и связанные с ним струк- туры всегда расположены в верх- ней части, молекулы адгезии — в левой части, а активационные маркеры — в нижней части ок- ружности. IL-R — рецептор для интерлейкина. CD62L CD80 CD86 (В7.1) (В 7.2) NK1.1 CD19 CD20 CD21 ( С& 2>> CD22 _ , х i) CD23 (FceRII) CD32 (FcyRII) CD72 CD5 CD40 IL-4R МНС CD691 CD71 маркером Т-клеток, взаимодействующим с мембранной молекулой В- лимфоцитов — CD72 (табл. 4). Основная масса В-лимфоцитов («обыч- ные», или В2-клетки) лишена этого антигена. Он присутствует на поверх- ности минорной фракции В-лимфоцитов — В1-клеток, на долю которых в крови приходится 20 % от числа В-клеток. Такие клетки преобладают в брюшной и других серозных полостях; важным источником СО5+-кле- ток во взрослом организме считается сальник. В костном мозгу эти клет- ки образуются в основном на ранних этапах рнтогенеза и мигрируют преимущественно в брюшную полость, где сохраняют способность к самоподдержанию. Принципиальное отличие СО5+-клеток от обычных В-лимфоцитов состоит в том, что при иммунном ответе в их V-генах не повышается час- 29
Таблица 4. Характеристика субпопуляций В-лимфоцитов Признаки и свойства Субпопуляция В1 Субпопуляция В2 («обычные» В-клетки) Происхождение (у взрослых) Из сальника, самоподдержива- ются в брюшной полости Из костного мозга Локализация Преобладают в брюшной полос- ти и миндалинах. В крови, селе- зенке (маргинальная зона), ЛУ - 25-35 % В крови, селезенке (фол- ликулы), ЛУ — 65—75 % Маркеры CD5+IgM+IgD+CD45+CD23- ИЛ-5Р+* CD5-IgM+IgD+CD45+ СО23+ИЛ-5Р- Селекция клонов Нет Есть Класс образуемых антител IgM, IgA IgM, затем IgG и другие классы Аффинитет антител Низкий, не повышается в про- цессе ответа Повышается («созревает») в процессе ответа Аутоареакгивность Есть Нет Частота мутаций V-генов Обычная Повышенная * Существует также субфракция В-лимфоцитов с мембранным фенотипом В1-клето1 но без CD5; их обозначают как СП5~-клетки-сестры. Функции их неизвестны. ИЛ-5Р — рецептор для ИЛ-5; ЛУ — лимфатические узлы. тота мутаций и вариабельность продуцируемых ими антител ограничива ется репертуаром зародышевых V-генов. Эти клетки не подвергаются се лекции и служат источником естественных полиспецифически IgM-аутоантител, играя важную роль в развитии аутоиммунной патоло гии и лимфопролиферативных процессов. Основные различия двух ос новных субпопуляций В-клеток отражены в табл. 4. В-лимфоциты в периферическом отделе иммунной системы. Зрелые В лимфоциты покидают костный мозг через синусы и заносятся кровью периферические лимфоидные органы (в наибольших количествах экстрафолликулярные пространства селезенки). В этих органах они и вы полняют свои специфические функции, локализуясь преимущественно । лимфоидных фолликулах разных лимфоидных органов, наружных слоя коры лимфатических узлов, краевой зоне белой пульпы селезенки. Долгое время считалось, что В-лимфоциты являются короткоживу щими клетками и обмениваются через 3—5 сут. Однако выяснилось, чт< условия, при которых производилась оценка срока жизни В-клеток, спо собствовали укорочению жизни. Более точные оценки показали, что про должительность жизни большинства зрелых В-лимфоцитов в отсутстви антигенной стимуляции составляет несколько месяцев. Основным источ ником обновления популяции В-клеток служит костный мозг. За суткт из него эмигрирует (у мышей) 1,5—5 х 107 В-лимфоцитов, что составля 30
ет, по разным оценкам, 3—25 % от их содержания на периферии. Интен- сивность антигеннезависимого размножения В-лимфоцитов на пери- ферии невелика и связана в основном с частичным самоподдержанием субпопуляции СО5+-клеток. 1.1.1.2. Т-лимфоциты Т-клетки образуют вторую группу лимфоцитов, количественно несколько превосходящую популяцию В-лимфоцитов и отличающуюся существенно большей гетерогенностью. К Т-лимфоцитам относят клетки, основной характеристикой которых является способ распознавания антигенов. Они распознают пептидные фрагменты чужеродных белков, встроенные в аутологичные молекулы гистосовместимости. Этот молекулярный ком- плекс им «презентируют» антигенпредставляющие клетки (АПК). Распо- знавание осуществляется с помощью клоноспецифического рецептора неиммуноглобулиновой природы, экспрессируемого на поверхности Т- клеток. Таким образом, Т-клетки распознают не «чужое», как В-клетки. а «измененное свое», причем, как иногда говорят, антигенный пептид распознается «в контексте» аутологичной молекулы гистосовместимости. В результате акта распознавания Т-клетки активируются и дифференци- руются в эффекторные (киллеры, эффекторы гиперчувствительности за- медленного типа) и регуляторные (два типа хелперов — ТЫ и Th2 и супрессоры) клетки. Особенность развития Т-лимфоцитов, определившая их название, состоит в том, что ключевые этапы созревания и формиро- вания клональной структуры этих клеток осуществляются в тимусе. Т-клеточный рецептор и связанные с ним структуры. Подобно тому, как BCR является структурой, определяющей функцию В-клеток, глав- ной структурой поверхности Т-лимфоцитов, от которой зависят диффе- ренцировка и выполнение функций этими клетками, также служит рецептор для антигенов — TCR (от англ. Т cell receptor) (рис. 8). Его ос- новной частью, которая ответственна за распознавание антигенного пеп- тида, связанного с молекулой МНС, является гетеродимер. Его состав различен в двух типах TCR: один его вариант содержит полипептидные цепи аир, другой — у и 6. Названные цепи связаны ковалентно (их мо- лекулярная характеристика представлена в разделе 3.1.2). С основным димером нековалентно связан комплекс CD3, в состав которого входят полипептидные цепи у/|Г(не путать с аналогичными цепями TCR!) и е; несколько обособленное место в комплексе занимает димер, состоящий из двух i^-цепей или из и p-цепей. Все указанные полипептидные цепи, особенно <!;-цепь, играют определенную роль в передаче сигнала о связы- вании рецептора внутрь клетки. К рецептору TCR имеют отношение еще несколько молекул, кото- рые устанавливают с ним связь при действии антигена и способствуют распознаванию комплекса антигенного пептида с молекулой МНС. Это молекула CD4, обладающая сродством к. молекулам МНС II класса, и CD8, имеющая сродство к молекулам МНС I класса. В зрелых клетках с TCR может связываться лишь одна из этих молекул, которая и присутст- вует на поверхности зрелых Т-лимфоцитов, принадлежащих к одной из 31
TCR Дополнительные молекулы I-----------------------------------------------------------------------------1 CD45 Рис. 8. Строение антигенраспознающего аР-рецептора CD4+ Т-лимфоцитов. Показаны молекулы, входящие в состав собственно рецептора (TCR-CD3) и к< рецепторные структуры (дополнительные молекулы). В составе TCR обозначен домены а- и р-цепей. двух основных субпопуляций — хелперам или киллерам (цитотоксичес ким Т-лимфоцитам). Часто вторую субпопуляцию называют супрессор но-киллерной, поскольку СО8+-клетки выступают и в роли супрессоре иммунного ответа. Однако, поскольку ту же функцию могут выполнять СЭ4+-клетки, едва ли такое обозначение СО8+-субпопуляции правоме{ но. В практике экспериментальных и клинико-иммунологических исслс дований очень широко используется определение молекул CD4 и 8 дл идентификации соответственно Т-хелперной и Т-киллерной субпопуж ций, маркерами которых они служат. Еще одна дополнительная трансмембранная молекула, влияюща на функционирование TCR, это CD45, цитоплазматический домен кс торой обладает активностью тирозинфосфатазы и также участвует в за пуске активационных сигналов (см. раздел 3.5.1). Эта очень крупна молекула существует в нескольких вариантах (изоформах), отличаю щихся наличием или отсутствием трех внеклеточных доменов — А, В 32
С. Наибольший по размерам вариант имеет все три домена; он имеет молекулярную массу 220 000 и обозначается CD45RA. Именно эта изо- форма свойственна так называемым наивным Т-лимфоцитам, т.е. лим- фоцитам, ранее не контактировавшим с антигеном. При дифференци- ровке Т-клеток происходит последовательное переключение изоформ CD45 вплоть до формирования варианта CD45R0, свойственного клет- кам памяти (см. раздел 3.5.2). Полноценность сигнализации, зависящей от TCR, обусловливается активностью молекулы-корецептора CD28. CD28 присутствует практи- чески на всех CD4+-T-клетках и на 60—70 % СП8+-лимфоцитов. На по- коящихся клетках эта молекула не связана с рецепторным комплексом. Однако она оказывается нековалентно связанной с ним в процессе рас- познавания антигена и активации молекулы CD28. Генез Т-лимфоцитов. В своем происхождении Т-лимфоциты, как и В-лимфоциты и другие клетки крови, связаны с костным мозгом (у эмб- рионов — с желточным мешком и печенью). Однако Т-лимфоциты явля- ются единственным типом клеток крови, для развития которых микроокружение костного мозга не является достаточным. В связи с этим на определенном этапе созревания предшественники Т-лимфоци- тов покидают костный мозг и мигрируют в тимус, где и завершают свое развитие. Основные этапы развития Т-лимфоцитов отражены в табл. 5 и на рис. 5. В костном мозгу формируются (по-видимому, из общего лимфоид- ного предшественника) ранние предшественники Т-лимфоцитов. Они лишь частично детерминированы к развитию в направлении Т-лимфоци- тов, сохраняя способность при соответствующих условиях развиваться в направлении В-лимфоцитов, миелоидных клеток и естественных килле- ров. Раньше других Т-клеточных маркеров на поверхности развивающих- ся клеток Т-ряда человека экспрессируется (уже на стадии проТ) CD7 (см. табл. 5). Однако этот маркер не может служить абсолютным показа- телем того, что клетка детерминирована к развитию только в направле- нии Т-лимфоцитов. Эти клетки несут также мембранный маркер CD38, свойственный многим кроветворным клеткам на промежуточных этапах развития. У мышей ранними маркерами клеток Т-ряда служат антигены, выяв- ляемые также в головном мозгу, Sca-1 и 2, которые содержатся и на более ранних кроветворных предшественниках. Экспрессия другого антигена, общего для Т-клеток и головного мозга, Thy-1, также характерна для кро- ветворных клеток и ранних представителей Т-ряда. Однако в отличие от названных выше маркеров Thy-1 экспрессируется у мышей и на зрелых Т-клетках, причем сильнее, чем на предшественниках Т-лимфоцитов, и нередко определение этого антигена используют для идентификации Т- лимфоцитов. Еще одним маркером клеток, способных дифференциро- ваться в сторону Т-лимфоцитов, является CD4. Эта молекула известна как маркер зрелых Т-хелперов. На клетках-предшественниках она появ- ляется на короткий промежуток времени и в малом количестве (CD410). О пролиферативной активности костномозговых клеток — предшест- венников Т-лимфоцитов известно мало. Их размножение поддерживают 33 2 -1092
Таблица 5. Стадии созревания Т-лимфоцитов человека Стадия (локализация) Рецептор для антигена Мембранные маркеры Ростовые факторы ПроТ (костный мозг) Продукты V8- и Ур8-генов в заро- дышевой конфи- гурации CD34 ФСК, ИЛ-7 ПреТ: а) костного мозга б) субкапсулярной зоны тимуса (стадии 1, 2, 3) а) Отсутствует 61) Отсутствует 62)VanpeT/p-CD3 63) То же Общие — CD7 и 38 а) CD410 61) CD2, 5, 44 62) CD2, 31°, 5> 25 63) CD2, ЗЮ, 5, HSA а) ИЛ-7, 3, 2 6) ИЛ-2, 4, 7, 1, кофакторы ФНОа, ИЛ-6 Незрелые (корти- кальные) тимоци- ты TCRap-CD310/int CD1 а, Ь, с, 2, 4, 8, 38, CD33*°/int, 52, 95 ? Зрелые аР+-Т-клетки: а) медуллярные тимоциты б) периферичес- кие аР+-Т-клетки хелперы киллеры TCRaP-CD3hi Общие — CD2, Зы, 5, 7, 27, 28, 45 а) CD38, 48, 52, 69, 121а, 127 б) CD6, 11с, 31, 35, 43, 45RB, 57, 60, 73, 76, 94, 98, 101, 102, 103, 122, 124, 128 CD4 CD8 Общие — ИЛ-2, 7, 13, 15, кофакт ры ИЛ-1, ФНОа ИЛ-9 Зрелые у8+-Т-клетки TCRyS-CD3 CD2, 5, 3, 8, 43, 45 ИЛ-2 Примечание. Надстрочный значок «hi» означает высокую экспрессию марк (от англ, high), «1о» — низкую (от англ, low), int — промежуточную (от англ, intermediate фактор стволовых клеток и ИЛ-7, рецепторы которых присутствуют поверхности этих клеток. Пролиферация указанных клеток может бы вызвана ИЛ-3, 2, 9, 1 и 6 (в различных сочетаниях друг с другом). Кр< ковременную пролиферацию (вероятно, одно деление) костномозгов предшественников Т-лимфоцитов вызывают пептиды тимусного прог хождения, в том числе гормоны. У тимэктомированных и генетически бестимусных животных (г пример, «голых» мышей с мутацией nude) развитие клеток Т-ряда в кос ном мозгу приостанавливается на стадии рассмотренных выше клетс предшественников. Их главное предназначение — превращение в Т-ли фоциты — может быть реализовано лишь при условии их миграции тимус (пока это не произошло, клетки способны выполнять некотор] функции, например регулировать процесс гемопоэза). Это связано с те что только в условиях микроокружения тимуса может сформировать рецептор для распознавания антигена — TCR оф-типа. В костном мог не происходит перестройки генов а- и p-цепей Т-клеточного рецептора 34
лишь в очень ограниченной степени реализуется перестройка у- и 8- цепей TCR. Таким образом, для того чтобы реализовалось решающее со- бытие в развитии большинства Т-лимфоцитов — формирование антигенраспознающего рецептора, клетки-предшественники должны мигрировать из костного мозга в тимус. Миграция предшественников Т-лимфоцитов из костного мозга в тимус обусловлена целым рядом свойств этих клеток, что позволяет им покинуть костный мозг, целенаправленно задержаться в сосудистой сис- теме тимуса и преодолеть гематотимишмий Ялры>р (см. раздел 1.2.2). Это достигается благодаря достаточно высокой подвижности клеток, нали- чию поверхностных структур — рецепторов хоминга (например, CD44), которые позволяют претимоцитам распознавать молекулы клеток, обра- зующих гематотимический барьер, а также благодаря инвазивности. обеспечивающей преодоление преград в виде базальных мембран. Из клеток-предшественников Т-ряда, покинувших костный мозг, в тимус проникает не более 5 %. Под влиянием микроокружения тимуса они включаются в дальнейшее развитие. Судьба проТ-клеток, «затеряв- шихся» после выхода из тимуса, неизвестна; есть данные, что, попадая в селезенку, часть из них дифференцируется в NK-клетки. Формула мембранного фенотипа клеток-предшественников, мигри- рующих в тимус, такова: CD2_3-4lo5“7+8“25“16+44+45+. Кроме того, они несут на своей поверхности интегрин VLA-4 (у мышей также VLA-6), ре- цептор для фактора стволовых клеток (CD117), a-цепь рецептора ИЛ-7, а также у-цепь, общую для рецепторов ИЛ-7 и 2 и ряда других интерлейки- нов. Попав в субкапсулярную зону тимуса (см. раздел 1.2.2), эти клетки быстро теряют CD4, на короткий срок экспрессируют 0-цепь рецептора ИЛ-2, которая вскоре сменяется его a-цепью (CD25). Тогда же на поверх- ности клеток появляется молекула CD2. В этот начальный период пребы- вания в тимусе клетки сохраняют способность дифференцироваться в направлении не только Т-лимфоцитов, но и В-, NK-клеток, дендритных клеток. Для удобства выдедщо1_4 стадии развития предщ.сс1£енникод,Т- ммфоцитов^хц^сс до момснта появления наи^поверхности ррцеисор- ного кдмппежеа TCR - CD± аЯ4+СО25", CD44+CD25+, CD44"CD25+ и CI544_CD25_. Следует обратить внимание, что лишь наиболее юные из внутритимусных предшественников Т-лимфоцитов несут мембранный антиген CD44, который послужил им проводником в тимус. Эта уже вы- полнившая свою роль молекула исчезает в условиях микроокружения ти- муса до времени, когда зрелым тимоцитам предстоит покинуть этот орган и вновь возникнет потребность в «рецепторе хоминга». Экспрессия CD25 знаменует собой «сужение» дифференцировочных потенций клеток-предшественников (они способны дифференцировать- ся, кроме Т-лимфоцитов, и в дендритные клетки, но эта способность утра- чивается на следующем этапе развития с потерей мембранной молекулы CD44) (рис. 9). На этом этапе включаются процессы, в конечном итоге приводящие к формированию рецептора TCR. По аналогии с дифферен- цировкой В-лимфоцитов стадия, на которой начинается реаранжировка рецепторных генов, обозначается как проТ (CD44+CD25+), стадия реали- зации реаранжировки первой группы генов (Vp) — как npeTI(CD44“ 35 2*
Рис. 9. Дифференцировочные потен- ции предшественников Т-лимфоцитов. Сплошными линиями обозначены ос- новные пути дифференцировки кле- ток; прерывистые линии отражают по- тенциальную способность предшест- венников Т-лимфоцитов на разных стадиях развития дифференцировать- ся в клетки других рядов при воздей- ствии соответствующих факторов мик- роокружения. ЛП — общий лимфоид- ный предшественник; МП — общий миелоидный предшественник; ПВ — предшественник В-лимфоцитов; ПТ — претимоциты (клетки, способные миг- рировать в тимус); МоП — моноцитар- но-макрофагальные предшественники; ГП — гранулоцитарные предшествен- ники; Мон — моноцит; ДК — дендрит- ная клетка; Мф — макрофаг. При обо- значении предшественников Т-клеток и зрелых лимфоцитов опущено слово «клетка». CD25+), стадия завершения реаранжировки — как npeTII(CD44“CD25~) (см. рис. 6, табл. 5). Во взрослом тимусе дифференцируются в основном Т-клетки, несу- щие рецептор TCR оф-типа. Значительное число уЗ-клеток созревает в тимусе в эмбриональном периоде, тогда как у взрослых особей интенсив- ность развития этих клеток в тимусе резко снижается, что отражается е низком содержании уЗ+-клеток в тимусе (около 1 %). Для внутритимус- ных предшественников Т-лимфоцитов характерно отсутствие антигенов CD4 и 8, что послужило основанием для их обозначения как двойных от- рицательных клеток (оно используется для их дифференцирования от других тимоцитов). Значительная (наиболее молодая) часть этих клеток лишена также рецепторного комплекса TCR — CD3, т.е. эти клетки яв- ляются «тройными отрицательными клетками». На долю CD4“CD8_- клеток приходится 3—5 % от общего числа тимоцитов, причем примерно 50 % их несут на поверхности CD25. Формирование рецептора Т-клеток для антигена. Как и при развитии В-клеток, самое раннее событие в процессе перестройки генов TCR за- ключается в экспрессии генов рекомбиназ — RAG-1 и RAG-2, а также гена терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы (TdT), катали- зирующей нематричный синтез олигонуклеотидных вставок в участках рекомбинации генов. Вскоре, на стадии npeTI, усиливается (под влияни- ем ИЛ-7) экспрессия в митохондриях клеток протоонкогена Вс1-2, предохраняющего их от развития апоптоза, к которому предрасполагает формирование разрывов ДНК в процессе реаранжировки (см. табл. 6). На стадии проТ гены а- и p-цепей еще не перестроены, лишь в не- 36
которых клетках определяется реаранжировка типа DJ гена Vp. На стадии npeTI осуществляется VDJ-перестройка этого гена, а также генов Vy и V8 (как уже говорилось, их реаранжировка может включаться еще до по- падания клеток в тимус, однако в основном она осуществляется на ста- дии npeTI). Факторы, обусловливающие включение процесса реаран- жировки генов TCR, не установлены. Известно лишь, что ИЛ-7 выступа- ет при этом в роли кофактора (в случае включения реаранжировки гена Vy он, по-видимому, служит основным фактором). Успешное завершение перестройки гена Vp и других генов сопровождается прекращением экс- прессии генов RAG-1 и RAG-2, что обеспечивает блокаду реаранжиров- ки второй p-цепи (это служит основой аллельного исключения, т.е. экспрессии в каждой Т-клетке продуктов только одного р-гена). Экспрессия продуктов перестроенных генов происходит на следую- щей стадии — npeTI I, когда клетка утрачивает мембранную молекулу CD25 и приобретает мембранный фенотип CD44“25_. Известно, что антигенраспознающие рецепторы как В-, так и Т-клеток появляются на поверхности клетки только при условии синтеза всех компонентов ре- цептора. Однако на преТ-клетках удается обнаружить p-цепь еще до того, как произойдет реаранжировка гена a-цепи. Происходит это потому, что на этих клетках экспрессируется проторецептор, аналогичный примитив- ному рецептору В-клеток, содержащему суррогатную L-цепь. Образую- щаяся p-цепь соединяется с так называемой a-цепью проторецептора (preTCR-a). Проторецептор — димер p/preTCR-a — содержит также ком- плекс CD3. Экспрессия перестроенного гена p-цепи существенна для дальнейшего развития Т-клеток, поскольку направленная инактивация этого гена приводит к задержке клеток на стадии CD44_CD25+, и лишь трансфекция интактного p-гена восстанавливает способность клеток к дальнейшему развитию. Мутация гена p-цепи не влияет на развитие уЗ+- Т-клеток. Функции проторецепторов преТ- и преВ-клеток аналогичны друг другу. Вследствие контакта с неизвестным лигандом, локализующимся на поверхности эпителиальных клеток, в преТ-клетку подается сигнал (при участии цепей CD3), который вызывает их пролиферацию, обозначаемую как р-селекция. Как и в случае с В-лимфоцитами, эта волна пролифера- ции обеспечивает поддержку клеток, в которых успешно осуществился первый этап реаранжировки генов TCR. Она важна и для достижения до- статочной численности предшественников Т-лимфоцитов, позволяющей сформировать разнообразный рецепторный репертуар. Помимо проли- ферации, указанное взаимодействие проторецептора с эндогенным ли- гандом приводит к экспрессии небольшого количества молекул CD4 и 8 на поверхности преТП-клеток. На стадии CD44_CD25_ преТП-клеток окончательно «решается» выбор в пользу формирования рецепторов ар- или уЗ-типа. До этого мо- мента перестройка V-генов р-, у- и 3-цепей могла совершаться парал- лельно в каждой клетке. Хотя механизмы выбора до конца не выяснены, установлено, что решающая роль в этом принадлежит регуляторному участку Vy-гена, в частности последовательностям, ответственным за блокаду его экспрессии (сайленсерам). По-видимому, в тимусе существу- 57
ют условия, благоприятствующие формированию TCR оф-типа,.для nei нужна реаранжировка Va-гена. Как и в случае перестройки Vp-гена, реаранжировке Va-гена пре; шествует повторная активация генов RAG-1 и RAG-2, которая открывав стадию преТП. Успешное ее завершение и экспрессия a-цепи приводят формированию зрелого рецептора aP-типа и его появлению на повер: ности клетки. Мутации зрелого гена a-цепи предотвращают экспресси TCR-aP, но не влияют на формирование TCR-уб. Экспрессия TCR-c определяется также активностью генов 8- и £-цепей. Перестройка Vc гена окончательно блокирует экспрессию VS-гена в случае, если после; ний уже был перестроен. Этому способствует то, что 5-гены встроены генетический регион, занимаемый семейством генов a-цепи (см. разд< 3.1.3). И в данном случае очевидна аналогия описанной последовател] ности с порядком перестройки генов иммуноглобулинов, при которс вначале реаранжировке подвергается V-ген ц-цепи, последняя экспре< сируется на поверхности клетки в составе проторецептора, и лишь зате перестраивается ген легкой цепи. Одновременно с формированием полноценного рецептора аР на п< верхности тимоцитов усиливается экспрессия молекул CD4 и 8 и пода] ляется экспрессия генов RAG-1, RAG-2, npeTCRa, а также протоонкв гена Вс1-2. В результате свойства клеток существенно меняются, в час ности они становятся чрезвычайно уязвимы к индукции программирв ванной гибели. Клетки этой стадии обозначают как незрелые, ил двойные положительные (CD4+CD8+) тимоциты (см. ниже). В процессе формирования зрелых генных комплексов TCR использ ется только один из многочисленных V-генов. В результате этого, а так» вследствие индивидуальной комбинации пары цепей, образующих ТС1 на каждой клетке формируются практически неповторимые по спещ фичности рецепторы. Потомки Т-клеток, несущих эти уникальные pi цепторы, образуют моноспецифичные клоны. Если каждый клс распознает только один антигенный эпитоп, то в сумме все клетки сп< собны обеспечить распознавание практически всех мыслимых пептиднь структур и их комбинаций с продуктами генов МНС (об особенностз распознавания антигенов Т-клетками см. раздел 3.3.2). Среди них есть клетки, распознающие комплексы пептид — молекула МНС, свойстве! ные данному организму. Этот набор специфичностей рецепторов тим< цитов обозначают как первичный клональный репертуар Т-клеток. Помимо основных рецепторных молекул, в осуществлении описа! ных выше событий большую роль играют адгезивные взаимодействия ti моцитов с клетками эпителия, а на стадиях СО44+-клеток — также фибробластами и клетками эндотелия. В их реализации участвуют адг< зивные молекулы тимоцитов CD2, LFA-1 и VLA-4, взаимодействуюпц с молекулами клеток стромы тимуса — соответственно CD58, ICAM-1 VCAM-1, а также с белками межклеточного матрикса, особенно с фибре нектином. В обеспечении пролиферации преТ-клеток (в частности, р-а лекции) важная роль принадлежит цитокинам — уже упоминавшемус ИЛ-7 и в меньшей степени ИЛ-2, 1 и 6, ГМ-КСФ и ФНОа, которые различных сочетаниях вызывают пролиферацию этих клеток. Однако пр 38
Таблица 6. Экспрессия в тимоцитах факторов, способствующих и препятствующих развитию апоптоза Популяция Процент Fas+'icneroK Процент клеток, содержащих Вс1-2 CD4-CD8" 10-15 25-40 CD4+CD8+ 80-95 5-10 CD4+CD8- 48-65 100 CD4-CD8+ 40-68 100 инактивации гена цитокинов процесс внутритимусного развития Т-кле- ток почти не изменяется. Лишь выключение гена ИЛ-7 приводит к бло- каде этого процесса и опустошению тимуса, а инактивация гена фактора стволовых клеток — к двукратному снижению численности тимоцитов. ПреТ-клетки сами выделяют аутокринные цитокины, способные обеспе- чить пролиферацию этих клеток и восстановление их при действии по- вреждающих факторов. Итак, основным результатом событий, происходящих на стадии СО4“СО8“-тимоцитов на уровне генов и клеточной мембраны, является формирование на поверхности каждой клетки антигенраспознающего ре- цептора TCR с индивидуальной специфичностью, а на уровне популяции тимоцитов — первичного антигенраспознающего репертуара. Кортикальные тимоциты и селекция их клонов. Незрелые кортикаль- ные тимоциты образуют самую многочисленную фракцию клеток тимуса (80—85 % от общего числа тимоцитов). Они локализуются преимущест- венно в глубоких слоях коры тимуса. Важной особенностью этих клеток является одновременная экспрессия двух корецепторов — CD4 и 8 и до- вольно низкий уровень мембранной экспрессии рецепторного комплекса TCR-CD3 (CD310). Молекула CD8 на поверхности тимоцитов представ- лена гетеродимером оф, тогда как на тех Т-клетках слизистых оболочек, которые развиваются вне тимуса (см. раздел 1.2.3), CD8 присутствует в форме гомодимера аа. У незрелых кортикальных тимоцитов есть и ста- диоспецифический антиген — CD1, существующий в трех разновиднос- тях (а, Ь, с). Для этих клеток характерны блокада экспрессии гена а-цепи рецептора для ИЛ-2 (CD25) и отсутствие высокоаффинного рецептора ИЛ-2 даже в условиях активации клеток. Тем не менее около 20 % клеток этого типа находятся в клеточном цикле; природа ростового фактора для них не установлена. На поверхности СО4+СО8+-тимоцитов присутствует молекула Fas (CD95), служащая проводником в клетку сигналов к апоптозу — актив- ной форме гибели клеток (см. раздел 3.5.3). В сочетании с низкой экс- прессией Вс1-2 (табл. 6) это делает незрелые кортикальные тимоциты очень чувствительными к действию индукторов апоптоза, так что на мно- гие стимулирующие влияния они реагируют не активацией и пролифера- цией, а развитием апоптоза. Этим же обусловлена их высокая чувстви- тельность к кортикостероидам и ионизирующим излучениям. 39
цГМФ I ГТФ ♦ ГМФ---------------------------- | --- Гуанин (д)Гуанозин | | ПНФ | ГМФ I ГДФ f ГТФ de novo цАМФ I АТФ ИМФ --------------------------АМФ | Инозин | ^^Аденин Гипоксантин | АДА [^Аденозин | |ПНф] I Ксантин дАМФ I * Мочевая дАДФ кислота ДАТФ Рис. 10. Превращение пуриновых нуклеотидов. Показаны этапы превращений, катализируемые аденозиндезаминазой (АДА) пуриннуклеотидфосфорилазой (ПНФ). Для развития и выживания кортикальных тимоцитов важны особег ности экспрессии в них ферментов, имеющих отношение к метаболиз\ нуклеиновых кислот, экто-5'-нуклеотидазы, аденозиндезаминазы и щ риннуклеотидфосфорилазы (рис. 10). Они катализируют последовател] ные фазы превращения пуриновых нуклеотидов, содержание которых е внутренней среде тимуса велико в связи с массовой гибелью клеток. Hi копление некоторых метаболитов пуринового обмена токсично для кл< ток. В кортикальных тимоцитах выше, чем в периферических Т-клетка активность экто-5'-нуклеотидазы и аденозиндезаминазы и ниже — актш ность пуриннуклеотидфосфорилазы. Вследствие этого в кортикальных та моцитах накапливаются дезоксигуанозин, гуанозин, соответствующе нуклеотиды, ди- и трифосфаты, среди которых наиболее токсичны ГТФ дезоксиГТФ. Это служит одной из причин массовой гибели кортикальнь тимоцитов. Фактором, защищающим их от токсического действия эта метаболитов, может служить контакт с макрофагами стромы тимуса, бон тыми пуриннуклеотидфосфорилазой, которая может передаваться в тимс цит через цитоплазматические мостики. Наследственный дефицит аденс зиндезаминазы и пуриннуклеотидфосфорилазы служит основой двух ра: новидностей Т-клеточного иммунодефицита (см. раздел 5.1.1). Выше отмечалось, что первичный клональный репертуар теоретичес ки перекрывает все мыслимые антигенные специфичности, включая aj тологичные. Для того чтобы он соответствовал своему назначению - распознавать чужеродные для данного конкретного организма, но не aj тологичные белки (точнее, их пептидные фрагменты в комплексе с пре дуктами аутологичных генов МНС), клоны тимоцитов должны подвер] нугься процедуре отбора, осуществляемого в несколько этапов на стади незрелых тимоцитов. Сказанное выше относится к Т-клеткам, несущи TCR оф-типа, поскольку селекция их клонов осуществляется в тимус! Что касается у8+-Т-клеток, в том числе происходящих из тимуса, т практически неизвестно, где и каким образом происходит их селекция. 40
Структуры, не связанные с МНС Апоптоз "Чужой" пептид, "чужая" молекула МНС Апоптоз "Свой* пептид, "чужая" молекула МНС Апоптоз "Свой” пептид, "Чужой" пептид, "своя" молекула "своя" молекуле МНС МНС Распознаваемые структуры Поддержка Поддержка Апоптоз Выживание Положительная селекция Отрицательная селекция Дальнейшее развитие Рис. 11. Судьба клонов тимоцитов в зависимости от специфичности их рецепто- ров (TCR). Заштрихованы символические изображения распознаваемых молекул МНС и пептидов, отличающихся от аутологичных («своих»); изображения «своих» моле- кул не заштрихованы. Наиболее широко приняты следующие представления о селекции Т- клеток (рис. 11; см. также введение). Более ранняя по времени положи- тельная селекция осуществляется в глубоких слоях коры тимуса. Ее осно- вой служит взаимодействие тимоцитов с эпителиальными клетками, несу- щими на поверхности молекулы МНС II класса. На этом этапе поддержи- ваются те клоны тимоцитов, рецепторы которых обладают той или иной степенью сродства к продуктам аутологичных генов МНС в сочетании с любыми антигенными пептидами, т.е. на этом этапе поддерживаются клоны, способные распознать как полностью аутологичные комбинации молекул МНС и пептидов, так и аутологичные молекулы МНС, модифи- цированные чужеродными пептидами. Все остальные «конструкции» не имеют отношения к функциям Т-клеток, которые состоят в поддержании нативности, сохранности клеток организма, и клетки, распознающие «по- сторонние» антигенные детерминанты, игнорируются отбором. Основой положительной селекции является контактное взаимодей- ствие клеток вследствие комплементарности рецептора тимоцита и моле- кулы МНС эпителиальной клетки (рис. 12). В этом взаимодействии участвуют уже упоминавшиеся пары адгезивных молекул, стабилизирую- щие взаимодействие. Его результаты до конца не выяснены: или аутоспе- цифические клетки стимулируются к пролиферации, или они лишь избегают гибели (спонтанной, индуцируемой эндогенными гормонами коры надпочечников, метаболитами гуанидина или иными агентами). Не исключено, что срабатывают оба механизма. В пользу участия активации и пролиферации свидетельствует экспрессия на клетках, поддержанных положительным отбором, раннего маркера активации — молекулы CD69. Уже упоминалось о чувствительности незрелых тимоцитов к действию кортикоидов и пуриновых метаболитов, которые включают программу 41
1. Положительная селекция Клон не распознает "свои" молекулы МНС; не поддержан селекцие» подвергается апоптозу 2. Отрицательная селекция Клон распознает комплекс МНС - пептид; аутологичный комплекс МНС - пептид; подвергается апоптозу Рис. 12. Межклеточные взаимодействия при селекции тимоцитов. Показана судьба клонов тимоцитов в зависимости от способности или неспосо( ности распознавать комплекс аутологичной молекулы МНС с аутологичным nei тидом на поверхности эпителиальных и дендритных клеток стромы тимуса. Кор TH — кортикальный тимоцит; ЭК — эпителиальная клетка; ДК — дендритнг клетка. гибели по механизму апоптоза. Защита части клеток от действия корта коидов может осуществляться при одновременной подаче сигнала чер< рецептор CD3—TCR (когда тимоцит распознает «свою» молекулу МНС или путем индукции вследствие этого же распознавания перехода клето на кортизонустойчивую стадию развития. О возможных путях защиты та моцитов от токсического действия продуктов метаболизма пуриновы 42
Таблица 7. Судьба клонов тимоцитов, экспрессирующих рецепторы различной специфичности Специфичность клонов тимоцитов Судьба клонов Этап селекции К молекулам, не связанным с продуктами МНС Элиминируются Положительная К чужому пептиду/чужому МНС п «1 К своему пептиду/чужому МНС «1 п К чужому пептиду/своему МНС Сохраняются, пролиферируют Отрицательная К своему пептиду/своему МНС Элиминируются нуклеотидов речь шла выше. Пролиферация выживших клеток осущест- вляется при условии снятия блокады с a-гена рецептора ИЛ-2 (что явля- ется результатом дифференцировки клеток, поддержанных отбором), и при этом ИЛ-2 является основным ростовым фактором. После осуществления фазы положительного отбора на поверхности клеток выживших клонов усиливается экспрессия CD3—TCR и вспомо- гательных молекул CD4 и 8. Клетки, претерпевшие такие изменения, ста- новятся субстратом для отрицательной селекции. Она осуществляется в мозговом слое и кортико-медуллярной зоне тимуса в процессе взаимо- Таблица 8. Характеристика основных субпопуляций зрелых Т-лимфоцитов Тип ре- цептора Экспрессия CD4 и 8 Распознавание АГ в составе МНС Локализация, содержание Функции а₽ CD4+CD8- II класса Т 8-10 %; ЛУ 30-40 %; С 20—25 %; кровь 35—50 %; кожа; слизистые оболочки, групповые лимфатические фолликулы Хелперы, супрессоры аР CD4-CD8+ I класса Т4-5 %; ЛУ 15-20 %; С 10—15 %; кровь 20—25 %; кожа; слизистые оболочки Киллеры, ограни- ченные по МНС, супрессоры аР CD4-CD8- ? Печень; брюшная полость; костный мозг ? аР CD4+CD8+ ? Т 80—85 %; кровь < 1 % ? у5 CD4-CD8* — Т 1 %; С, ЛУ и кровь 3— 4 %; слизистые оболочки, кожа Киллеры, не ограниченные по МНС Примечание.? — тимус; С — селезенка; ЛУ — лимфатические узлы; АГ — антиген. 43
действия с дендритными клетками, богатыми продуктами МНС I и I классов. Достаточно высокая экспрессия молекул МНС на дендритны клетках и рецептора на тимоцитах может стать источником сильного сиг нала в случае распознавания аутологичного антигенного комплекса (ау тологичного пептида на «своей» молекуле МНС). Такой сигнал вызывающий активацию зрелых Т-клеток, индуцирует гибель незрелы тимоцитов по механизму апоптоза. Эта активационная форма апоптоз лишь в деталях отличается от апоптоза, вызванного кортизолом (имеютс некоторые отличия в чувствительности к ингибиторам, особенно к цик лоспорину А, который подавляет только апоптоз, вызванный связывани ем рецептора). Такая форма реакции тимоцитов (апоптоз вместо актива ции) обусловлена уже упоминавшейся предрасположенностью корти кальных тимоцитов к апоптозу вследствие высокой экспрессии рецепто pa Fas и слабой — рецептора Вс1-2. В конечном счете внутри тимуса гибнет более 90 % развивающихс клеток Т-ряда. В результате двух фаз отбора элиминируются те клоны ти моцитов, которые несут рецепторы, специфичные к антигенам, не имею щим никакого отношения к аутологичным МНС, а также к комплекса; аутологичных антигенных пептидов с аутологичными МНС. И лиш клоны Т-клеток, несущих рецепторы к комплексам чужеродных антиген ных пептидов с аутологичными МНС, поддерживаются отбором (табл. ' см. рис. 11). Специфичностью этих клеток и определяется вторичны: клональный репертуар популяции Т-лимфоцитов. Формирование субпопуляций Т-клеток. На стадии селекции тимоци тов формируется другой тип гетерогенности Т-клеток — субпопуляцион ный (табл. 8). В основе разделения Т-лимфоцитов на субпопуляции ле жит характер распознавания антигенных пептидов. Т-клетки, распознаю щие комплекс антигенного пептида с продуктами генов МНС I класса, функциональном отношении являются предшественниками цитотокси ческих Т-лимфоцитов, а Т-клетки, распознающие комплекс антигенног пептида с продуктами генов МНС II класса, — хелперов. Указанны типы распознавания определяются вспомогательными молекулами CD и 8, связанными с комплексом TCR — CD3 и обладающими сродством молекулам соответственно МНС II и I класса. Для Т-киллеров такой мо лекулой является CD8, участвующая в распознавании пептида на молеку ле МНС I класса, для Т-хелперов — CD4, определяющая распознавание зависимое от молекул II класса. Уже отмечалось, что на кортикальных тимоцитах обе молекулы сосу ществуют одновременно. В процессе созревания утрачивается одна и вспомогательных молекул. Пока неясно, каким образом это происходит однако предполагается следующая схема событий (рис. 13). Допускается что тип вспомогательной молекулы, сохраняемой на поверхности Т-клет ки, зависит от случайности — от того, с какой молекулой МНС (I ил: II класса) раньше проконтактирует соответствующая мембранная молеку ла тимоцита (CD8 или 4). В результате комплементарный тип вспомога тельной молекулы (I класс — CD8, II класс — CD4) сохранится, экспрессия молекулы альтернативного типа будет блокирована. Затем воз никший вариант закрепляется или отвергается путем «сверки» экспресси 44
Рис. 13. Условия дифференцировки Т-лимфоцитов на субпопуляции. I — спонтанное прекращение экспрессии одного из корецепторов; II — «пример- ка» корецептора при распознавании комплекса молекулы МНС с пептидом (кон- такт клеток означает соответствие корецепторов специфичности TCR, отсутствие контакта означает их несоответствие); III — судьба клеток при соответствии и не- соответствии корецепторов специфичности TCR. CD4 и TCR, специфичный к пептидам в составе молекулы МНС II класса, зачернены, CD8 и TCR, специфич- ный к пептидам в составе молекул МНС I класса, — белые. Клетки, подвергаю- щиеся апоптозу, перечеркнуты. руемого корецептора со специфичностью рецептора TCR (которая опре- деляется не только структурой пептида, но и классом молекулы МНС, в составе которой находится распознаваемый пептид). Так, экспрессия CD4 оказывается «правильной» в том случае, если TCR детерминирован к рас- познаванию пептида в составе молекулы МНС II класса. В этом случае данный тип дифференцировки закрепляется. Если же клетка, на которой сохранен корецептор CD4, специфична к пептиду, связанному с молеку- лой МНС I класса, возникшая комбинация оказывается бессмысленной, и такая клетка выбраковывается (очевидно, по механизму апоптоза). Ана- логично клетка, на которой сохранился корецептор CD8, выживает в том 45
DpoT(CD44+) , I IL-2/7y----------- Размножение t р56** ------------1 Дифференцировка RAG-1,RAG-2 I | SCID -----1 Перестройка генов TCR I ПреТ l(CD44~CD25+) TCR-P----------------11 IL-7 I------------1 р-селекция CD3; I | ПреТИ (CD44-CD25") P56* TCRa-----------------1 CD3e CD38 ----------------1 Fas(CD95)l FasL |---------------1 CD3; CD45-6 экзон________I p56*ck ' Незрелые тимоциты (CD4+CD8+) I Положительная селекция I Отрицательная селекция I Разделание на субпопуляции: -ч| (—ll CD4+CD8- CD4-CD8+ CD8a р2-мг MHC-I ТАР-1 IRF-1 ZAP-70 CD4 li MHC-II Рис. 14. Нарушения развития Т- лимфоцитов при нарушении ак- тивности генов. Слева — гены, влияющие на раз- витие Т-клеток, справа — стадии развития Т-лимфоцитов и связан- ные с ними процессы. Знаком —I отмечена блокада развития Т-кле- ток при мутации или направлен- ной инактивации соответствую- щих генов. случае, если ее рецептор распознает пептид «в контексте» молекулы МНС I класса. После «выбора» вспомогательной молекулы (которая с этого мо- мента становится маркером субпопуляции) формируется способность Т- клетки выполнять ту или иную функцию после стимуляции антигеном — выделять комплекс цитокинов (для СВ4+-хелперов) или превращаться в цитотоксические клетки (для С1)8+-киллеров). Небольшая часть созревших и дифференцировавшихся тимоцитов сохраняется в медуллярном слое. На долю медуллярных тимоцитов при- ходится 12—15 % от общего числа лимфоидных клеток тимуса, из них 8— 10 % составляют CD4+CD8~- и 4—5 % — CD4~CD8+-клетки. Назначе- ние медуллярных тимоцитов не вполне ясно; возможно, они участвуют в формировании внутренней среды тимуса, в частности, выделяя цитоки- ны. По своим основным свойствам они идентичны зрелым Т-лимфоци- там периферического пула и отличаются лишь деталями (низкой способностью секретировать ИЛ-2 после активации, наличием антигена CD38, развитием апоптоза по крайней мере части клеток в ответ на ак- тивирующие воздействия и тщ.). 46
Общая продолжительность развития тимоцитов составляет примерно 20 сут (in vitro 5—7 сут). Как уже можно было убедиться, знакомясь с из- ложенным выше материалом, процесс развития Т-клеток осуществляется в результате перестройки и активации ряда генов в самих Т-клетках и контролируется разнообразными факторами микроокружения. Наиболее точная информация о незаменимых факторах, определяющих развитие Т-клеток, получена при изучении последствий прицельной инактивации конкретных генов (как правило, такие исследования проводят на мышах, см. раздел 5.1.1). Эта информация в определенной степени отражена на рис. 14. Подготовка Т-клеток к эмиграции. Эмиграция и заселение периферии. Перед тем как покинуть тимус и поступить в кровоток, Т-лимфоциты подвергаются ряду изменений, важных для защиты Т-клеток, попадаю- щих в периферический отдел иммунной системы, от поглощения макро- фагами. Последние несут на своей поверхности лектиновые структуры, распознающие мембранные гликоконъюгаты лимфоцитов. Подобное распознавание служит сигналом к фагоцитозу. Поэтому углеводные де- терминанты на поверхности Т-лимфоцитов перед их выходом в циркуля- цию блокируются путем присоединения к ним остатков сиаловой кис- лоты. Изменения углеводного состава поверхности созревающих Т-лим- фоцитов удается проконтролировать с помощью меченых лектинов. Юные представители Т-ряда на стадии CD4“CD8~-iaieTOK связывают лектин сои (SBA), распознающий концевые остатки D-N-ацетилглюко- замина, а кортикальные СВ4+СВ8+-тимоциты связывают лектин арахи- са (PNA), распознающий остатки D-маннозы. Т-клетки, покидающие тимус, являются 8ВА~РКА~-клетками, т.е. не связывают ни тот, ни дру- гой из названных лектинов вследствие блокады концевых сахаров остат- ками. сиаловой кислоты, что достигается благодаря активации сиалил- трансферазы медуллярных тимоцитов. Другое изменение состоит в том, что перед эмиграцией из тимуса на поверхности медуллярных тимоцитов экспрессируются «рецепторы хоминга», в частности CD44. Зрелые Т-клетки покидают тимус через сосуды кортико-медуллярной зоны. За сутки из тимуса эмигрирует около 1 % от общего числа тимоци- тов. Поступив в кровоток, Т-лимфоциты становятся частью единого пула рециркулирующих Т-клеток. До встречи с антигеном они экспрессируют наряду с другими маркерами Т-лимфоцитов изоформу CD45RA молеку- лы CD45, на их поверхности содержится много селектина L (CD62L) и относительно мало CD44, что обусловливает особенности их миграции в ткани (хоминга), которые будут рассмотрены ниже. Такие клетки обозна- чают как «наивные» Т-лимфоциты (в отличие от активированных лимфо- цитов и клеток памяти). В лимфоидных органах Т-лимфоциты занимают преимущественно специализированные тимусзависимые участки: паракортикальные зоны лимфатических узлов, параартериальные муфты селезенки и групповых лимфатических фолликулов (пейеровых бляшек) и т.д.; в других участках они перемешаны с В-лимфоцитами. Т-лимфоциты ненадолго задержива- ются в лимфоидных органах, вскоре они покидают их, поступая в лимфу (из селезенки Т-клетки эмигрируют с током крови). Скорость рецирку- 47
Таблица 9. Маркеры зрелых Т-лимфоцитов человека Группа маркеров Название маркеров Мол. масса, хЮОО Семейства I. Рецепторный комплекс TCR, ар-тип 27/32 1g для антигена TCR, уЗ-тип 35/45 Ig CD3, цепи у, 3, е <^2 ИЛИ 26, 20, 16 16 х 2; 16/21 Ig II. Основные общие CD2 50 Ig маркеры Т-клеток CD5 67 SCR III. Основные маркеры субпопуляций и стадий развития CD7 40 Ig Т-хелперов CD4 59 Ig Т-киллеров CD8, аР, аа 34/32, 34/34 Ig кортикальных тимоцитов CDla, Ъ, с 55/12 Ig/MHC наивных Т-клеток CD45RA 220 Фосфатаза Т-клеток памяти CD45R0 180 IV. Сигнальные молекулы CD28 44 Ig CD30 105 Ig CD43 (лейкосиалин) 115 NGFR CD 152 (CTLA) 32-37 Ig CD154 (CD40L) 33 TNF V. Адгезивные молекулы CDlla/CD18 (LFA-1) 180/95 Рз-интегрин CDllc/CD18 (CR4) 150/95 Р2-интегрин VLA-2, 4, 5 и 6 (CD29/CD49) 150/ 120-150 Pi-интегрин CD54 (ICAM-1) 90-115 Ig CD58 (LFA-3) 55-70 Ig CD56 (N-CAM) 220/135 Ig CD44 (рецептор хоминга) 80-95 Протеогликан CD31 (РЕСАМ) 130 Ig CD48 45 Ig CD54 (ICAM-1) 95-115 Ig CD50 (ICAM-3) 116-140 Ig CD62L (L-селектин) 70-90 С-лекгин VI. Рецепторы и ферменты CD16 (FcyRIII) CD26 (эктопептидаза DPPIV) CD73 (экзо-5'-нуклеоти- даза) 50-65 120 69 Ig CD90 (Thyl) 25-35 Ig VII. Молекулы активации CD69 32/28 С-лектин CD25 (a-цепь ИЛ-2Р) CD71 (рецептор для трансферрина) 55 34/28 ССР CD95 (Fas, АРО-1) 36-45 NGFR HLA-DR, DQ, DP 35/30 Ig 1 48
Продолжение Группа маркеров Название маркеров Мол. масса, xlOOO Семейства VIII. Рецепторы цитокинов CD117 (c-kit, для ФСК) CD121a (для ИЛ-1, тип I) CD25/122/132 (для ИЛ-2) CD124/132 (для ИЛ-4) CD127/132 (для ИЛ-7) CD129/132 (для ИЛ-9) 145-150 80 55/70/64 140/64 75/64 64/64 Ig, киназа Ig CKR, ССР CKR CKR CKR Примечание. ССР — контрольные белки системы комплемента; CKR — цито- киновые рецепторы; NGFR — рецепторы фактора роста нервов; SCR — рецепторы-мусор- щики (scavenger); TNF — семейство факторов некроза опухоли. ляции Т-лимфоцитов (особенно Т-хелперов) выше, чем В-лимфоцитов. При контакте с антигеном Т-клетки вовлекаются в процессы активации и иммунного ответа. Т-лимфоциты гетерогенны по продолжительности жизни. Большая часть их относится к долгоживущим клеткам, время их полуобновления составляет годы, что обнаруживается по длительному сроку (иногда со- поставимому со сроком жизни) сохранения индуцированных хромосом- ных перестроек. Лишь небольшая часть Т-лимфоцитов живет несколько недель или месяцев. Определенных сведений о различиях в сроке жизни Т-клеток, относящихся к разным субпопуляциям, нет, но принято счи- тать, что Т-хелперы живут дольше, чем Т-киллеры. Маркеры Т-лимфоцитов, определение Т-клеток и их субпопуляций. В начале этой главы мы уже рассматривали маркеры Т-лимфоцитов, свя- занные с комплексом TCR. К мембранным маркерам Т-клеток относится также ряд молекул, которые играют определенную роль в адгезивных вза- имодействиях Т-лимфоцитов с окружающими клетками. К ним относят- ся гликопротеины CD2, 5 и 7. CD2 распознает широко распростра- ненную в тканях молекулу CD58, a CD5 — маркер В-клеток CD72. Взаи- модействия, опосредованные этими молекулами, могут служить источни- ком вспомогательных, а иногда и самостоятельных активационных сигналов. Другие адгезивные молекулы особенно важны для осуществле- ния контактов с межклеточным матриксом и клетками стромы при миг- рации Т-лимфоцитов, а также с вспомогательными клетками иммунной системы и с клетками-мишенями в процессе индукции иммунного ответа и при осуществлении реакций иммунитета. К ним относятся L-селекти- ны — тканевые лектины, которые распознают углеводные остатки (сиа- лированную фукозу) мембранных гликопротеинов других клеток, а также интегрины. Среди Рринтегринов для Т-лимфоцитов свойственны моле- кулы VLA-4 (a4Pi) и VLA-5 ((Х5Р1), среди Р2-интегринов — LFA-1. Сведе- ния о мембранных маркерах Т-лимфоцитов обобщены в табл. 9 и на рис. 7. На выявлении мембранных маркеров основаны определение Т-лим- фоцитов и их субпопуляций, подсчет их количества в норме и при пато- 49
логии. Наиболее специфичным маркером зрелых Т-лимфоцитов следует признать комплекс TCR — CD3, поскольку антигенраспознающий ре- цептор неиммуноглобулиновой природы присущ только Т-лимфоцитам. Менее специфичны, но свойственны преимущественно Т-клеткам адге- зивные молекулы CD7, 2 и 5 (CD2 определяется также на естественных киллерах, a CD5 — на субпопуляции В-лимфоцитов Bl). CD2 взаимодей- ствует с другой адгезивной молекулой CD58, которая экспрессирована практически на всех клетках организма, включая эритроциты. В резуль- тате взаимодействия CD2 с гомологом CD58 происходит адгезия эритро- цитов барана на Т-клетках, что проявляется в формировании так называ- емых Е-розеток (агрегаты клеток, в центре которых находится Т-лимфо- цит, а вокруг — прилипшие к нему эритроциты). До создания гибридомной технологии, когда отсутствовали антитела, при- годные для идентификации маркеров Т-клеток, реакцию образования розеток с эритроцитами барана использовали для определения Т-клеток. Этот метод иног- да применяют и в настоящее время — при недоступности моноклональных анти- тел и проточного цитомера. Недостатком этого метода, помимо нестандартности и невозможности его автоматизации, является зависимость формирования розе- ток не только от присутствия на поверхности Т-клетки достаточно большого числа молекул CD2, необходимого для удержания эритроцитов, но и от состоя- ния цитоскелета, определяющего феномен розеткообразования. Поэтому исполь- зование теста Е-розеткообразования можно считать оправданным только для оценки адгезивной способности Т-лимфоцитов (как тест на СВ2-зависимую ад- гезию Т-клеток). Корецепторные молекулы CD4 и 8 определяют с целью идентифика- ции субпопуляций Т-клеток (см. табл. 8). Следует еще раз подчеркнуть, что эти молекулы обусловливают не столько функции клетки, сколько тип распознавания антигена — «в контексте» молекул МНС I или II класса. Тем не менее в настоящее время считается общепринятой идентификация Т- хелперов путем определения экспрессии на поверхности клеток молекулы CD4, а Т-киллеров — по экспрессии молекулы CD8. Как уже отмечалось, трактовка СО8+-клеток как супрессорной субпопуляции некорректна, по- скольку СВ4+-клетки также могут выступать в качестве супрессоров. Развитие Т-клеток вне тимуса. Большинство Т-лимфоцитов диффе- ренцируется и проходит селекцию в тимусе. Однако некоторые процес- сы, связанные с развитием и даже образованием Т-лимфоцитов, проис- ходят вне тимуса. В экспериментах на трансгенных животных показано, что на периферии завершается процесс отрицательной селекции Т-лим- фоцитов путем индукции анергии и (в меньшей степени) апоптоза кле- ток, недавно покинувших тимус, при их контакте с суперантигенами и некоторыми обычными антигенами. На периферии завершается также функциональное созревание Т-клеток. Важными факторами, ответствен- ными за «дозревание» Т-клеток на периферии, являются гормоны тиму- са, циркулирующие в кровотоке (подробнее о них см. раздел 1.2.2). Под влиянием гормонов тимуса устанавливается более высокий уровень функциональных потенций Т-клеток, реализующихся после контакта с антигеном (в частности, более высокая способность к выработке ИЛ-2, 50
чем у медуллярных тимоцитов). Наконец, на периферии происходит так называемая периферическая экспансия Т-лимфоцитов, т.е. не зависящее от антигена поликлональное размножение Т-клеток, которое не сопро- вождается их дифференцировкой в эффекторные клетки. Полагают, что образование из преТ-клеток зрелых Т-лимфоцитов, несущих рецептор ар-типа, в норме осуществляется только в тимусе и лишь в отсутствие последнего в очень слабой степени реализуется в дру- гих органах, в частности в костном мозгу. Однако для Т-клеток, несущих TCR у5-типа, внетимусное развитие характерно в значительно большей степени. Известно, что 90 % ТСRy3-тимоцитов, прошедших развитие в тимусе, имеют в составе рецептора продукты семейств V-генов Vy9 и V32, а также Vyl и Vy2. Другая субпопуляция у5-клеток, рецептор которых со- держит продукты подсемейств Vy3, Vy4 и V31, образуется в тимусе в эмб- риональном периоде, затем выселяется в кожу и слизистые оболочки и там самоподдерживается в течение оставшейся жизни. Наконец, уб-клет- ки, имеющие в составе TCR продукты подсемейств генов Vy4 и V56, раз- виваются вне тимуса — в основном в слизистой оболочке кишечника или в печени (см. раздел 1.2.3). Таким образом, в целом Т-клетки, несущие рецептор TCR уЗ-типа, в меньшей степени зависят от тимуса, проводя в нем более короткое время или полностью минуя его при своем развитии. 1.1.1.3. NK-клетки (естественные киллеры) В периферическом пуле лимфоцитов присутствует фракция клеток, ли- шенных маркеров Т- и В-лимфоцитов, обозначаемая как 0-клетки. Вели- чина этой фракции оценивается по-разному в зависимости от чувстви- тельности используемых методов. Доля ^~СОЗ-лимфоцитов в крови и периферических лимфоидных органах составляет около 10—15 % от об- щего числа лимфоцитов. Эта фракция гетерогенна. В ее состав входят небольшое число незрелых лимфоидных предшественников, неидентифи- цированные лимфоциты, однако большую часть их составляют NK-клет- ки (от англ, natural killer), или естественные киллеры. Основное свойство, обусловившее название этих клеток, состоит в том, что они способны лизировать определенные клетки-мишени без предварительного контакта и развития реакции типа иммунного ответа. Свойства естественных киллеров могут проявлять Т- и В-лимфоциты, а также макрофаги. Однако лишь NK-клетки представляют собой специа- лизированные естественные киллеры. Они идентифицируются морфоло- гически как большие гранулярные лимфоциты. Их содержание в крови составляет 5—20 % от общего числа лимфоцитов. По размеру они соот- ветствуют большим лимфоцитам (12—15 мкм в диаметре при 7—9 мкм для малых лимфоцитов). Плотность (1,062—1,064) NK-клеток ниже, чем у большинства лимфоцитов, что используется для выделения этих клеток в градиенте перколла. Гранулы больших гранулярных лимфоцитов содер- жат перфорин — белок, обусловливающий образование пор в мембране клеток-мишеней, а также сериновые эстеразы — гранзимы, обусловлива- ющие индукцию апоптоза при проникновении в клетки-мишени (см. раздел 2.2), и хондроитинсульфат А, защищающий NK-клетки от аутолиза. 51
Таблица 10. Мембранные маркеры NK-клеток Группа маркеров Название Мол. масса, xlOOO Семейство Маркеры, при- CD56(NKH1, N-CAM) 175-185 Ig частные к распо- CD57 (HNK1, Leu-7) ПО Ig знаванию и NK цитолизу CD161 (NKRP-1) NK1.1 KAR (p50.1, p50.2) KAR (p50.3) 80-80 50, 50 55-58 С-лектин Ig Ингибиторные NKB1 70 Ig рецепторы кил- CD158a (KIR) 58 Ig леров (KIR) CD158b (KIR) p70/pl40 (KIR) CD94 58 70/140 70 Ig Ig С-лектин Маркер К-клеток CD16 (FcyRIII) 50-65 Ig Молекулы адгезии Прочие мембран- ные молекулы 02-интегрины (CD11/CD18) — LFA-1, MAC-1, CR4 01-интегрины (VLA-2) CD2 (LFA-2) CD7 CD8aa CD58 CD54 (ICAM-1) CD44 CD48, 69, 122 (p-цепь ИЛ-2- рецептора) 180/, 170/, 150/95 160/130 50 40 32/32 55-70 90-115 80-95 Интегрины Интегрин Ig Ig Ig Ig Ig Протеогликан Маркерами естественных киллеров (см. рис. 8; табл. 10) служат анти гены CD56 и 57; CD56 представляет собой изоформу адгезивной молекул! N-CAM. Субфракцию К-клеток (т.е. клеток, осуществляющих зависи мый от антител клеточный цитолиз — лизис клеток, опсонизированны антителами) маркирует молекула CD 16, являющаяся низкоаффинным ре цептором IgG — FcyRIII, способным связывать агрегированные IgGl и IgG; Очевидна связь этого рецептора с функцией К-клеток. Определение с по мощью указанных маркеров содержания NK-клеток в популяциях лимфо цитов различных органов показало их высокий уровень в печени (42 %) j селезенке (36 %) при низком содержании в лимфатических узлах (3 %) легких (5 %), тонкой кишке (3 %), костном мозгу (2 %); по этим данным, крови на долю NK-клеток приходится 12 % от общего числа лимфоцитов. Кроме названных маркеров, на NK-клетках определяются адгезив ные молекулы, в том числе интегрины и их рецепторы. Преобладание ад гезивных молекул среди маркеров естественных киллеров не случайно оно отражает важность межклеточных контактов для осуществления ци толиза. Среди маркеров этих лимфоцитов необходимо упомянуть такж ганглиозид асиалоОМ!, а у мышей — антиген Thy-1. Участие NK-клеток в иммунной защите будет рассмотрено в раздел 2.2; здесь мы приведем лишь самые общие сведения. Мишенями естест венных киллеров служат разного рода трансформированные (инфициро 52
ванные вирусом, опухолевые) и быстро пролиферирующие (например, кроветворные) клетки. При тестировании активности NK-клеток in vitro в качестве мишеней используют ограниченное число культивируемых клеточных линий, чаще других — клетки эритромиелолейкоза человека К562 и клетки лимфомы мыши YAC-1. Природа рецепторов, распознаю- щих клетки-мишени естественных киллеров, начала раскрываться совсем недавно. Описана группа молекул, обладающих лектиноподобной распо- знающей способностью, к которой относятся высокомолекулярный гли- копротеин NKR.1P(CD161), а также так называемые KAR-рецепторы (от англ, killer activation receptor). Недавно установлена природа рецепторов, подавляющих цитолити- ческую активность NK-клеток в случае распознавания ими аутологичных молекул МНС I класса на клетках-мишенях. Ими оказались мембранные рецепторы, по структуре родственные иммуноглобулину, — NKB1, кото- рый распознает молекулы HLA-B, имеет 4 Ig-подобных внеклеточных до- мена, и два белка р58 — р58.1 и р58.2 (CD158a и Ь), имеющие по два Ig-подобных домена и распознающие HLA-C. У мышей ту же функцию выполняют молекулы семейства Ly49. Эта группа рецепторов получила наименование KIR (от англ, killer inhibitory receptor). Они вариабельны и формируют индивидуальную распознающую способность клетки, что дает основание говорить о клональной структуре NK-клеток. Генез естественных киллеров изучен фрагментарно. Не вызывает сомнений, что их предшественники происходят от стволовой крове- творной клетки. Несмотря на определенные черты близости NK-клеток к миелоидному ряду, а также В-лимфоцитам, преобладает представле- ние о том, что NK-лимфоциты являются ответвлением Т-клеточного ряда развития лимфоцитов. Об этом свидетельствуют наличие общих маркеров, ростстимулирующих факторов, присутствие предшественни- ков NK-клеток в тимусе, общность функции с Т-киллерами и даже на- личие начальных признаков реаранжировки (D-J-типа) p-гена TCR в естественных киллерах. В то же время очевидна определенная реци- прокность содержания в периферических лимфоидных органах NK-кле- ток и активности тимуса: численность и активность естественных кил- леров у врожденно бестимусных и тимэктомированных мышей выше, чем у животных с нормальной функцией тимуса. Показано, что CD4- СО8~-клетки эмбрионального тимуса, несущие на поверхности Fcy-pe- цептор II и/или III типа, могут развиваться в Т- или NK-клетки в зависимости от того, попадают ли они в тимическое или селезеночное микроокружение. В процессе развития предшественников естественных киллеров в костном мозгу под влиянием ИЛ-1 экспрессируется p-цепь рецептора для ИЛ-2. После этого ИЛ-2 становится важнейшим фактором пролифера- ции и созревания NK-клеток. Вторым важным фактором, обусловливаю- щим дифференцировку и активацию естественных киллеров, служит интерферон у. ИЛ-3, наоборот, подавляет развитие NK-клеток. В норме содержание этих клеток особенно велико в селезенке, мик- роокружение которой, как полагают, необходимо для завершения разви- тия NK-лимфоцитов. Они присутствуют также в лимфатических узлах и 53
лимфоидных образованиях кишечника. В тимусе и костном мозгу зрелые NK-клетки не определяются, но присутствуют их предшественники, ак- тивируемые под влиянием ИЛ-2. Под действием ряда цитокинов, в пер- вую очередь ИЛ-2, повышается литическая активность и расширяется спектр клеток — мишеней естественных киллеров. NK-клетки превраща- ются в ЛАК-клетки (см. раздел 2.2 и 4.3.2). 1.1.2. Антигенпредставляющие и фагоцитирующие клетки Важнейшую группу клеток иммунной системы составляют антигенпред- ставляющие клетки, а также частично «перекрывающаяся» с этой группой популяция фагоцитирующих клеток. Назначение первых состоит в обра- ботке антигена (которая в случае макрофагов включает фагоцитоз) у представлении (презентации) его Т-хелперам. Эту группу образуют мак- рофаги и дендритные клетки; указанную функцию выполняют также В-лимфоциты. Функция клеток данной группы не ограничивается пре- зентацией антигена; выделение этих клеток в особую группу подчеркивает центральную роль для осуществления функций иммунитета процессов связанных с судьбой антигенов в организме. К фагоцитам, помимс макрофагов, относятся нейтрофильные, а также (с некоторой долей услов- ности) эозинофильные гранулоциты. 1.1.2.1. Моноциты и макрофаги Наиболее изученными и численно преобладающими клетками этой груп- пы являются моноциты крови и образующиеся из них макрофаги тканей Они происходят от стволовых кроветворных клеток костного мозга (j эмбрионов — желточного мешка и печени). Моноцитарный ряд является ответвлением миелоидного ствола кроветворения, имея общие предшест- венники с нейтрофильными гранулоцитами (рис. 15). В костном мозг) клетки проходят стадии монобласта, промоноцита и, дозревая до стадии моноцита, поступают в кровоток. Длительность пребывания моноцитов е кровотоке составляет 2—4 сут. После этого они мигрируют в ткани, превращаясь в макрофаги. Развитие клеток моноцитарного ряда в костном мозгу поддерживает- ся факторами микроокружения — контактными и гуморальными. Пос- ледние включают в первую очередь колониестимулирующие факторы — гранулоцитарно-моноцитарный (ГМ-КСФ) и моноцитарно-макрофа- гальный (М-КСФ). Некоторые цитокины (ИЛ-3, ГМ-КСФ) действуют на общие миелоидные предшественники, а на стадии моноцитарных пред- шественников оказывают вспомогательное влияние. М-КСФ является специализированным цитокином, поддерживающим выживаемость и пролиферацию коммитированных предшественников моноцитов, а также зрелых моноцитов и макрофагов в тех случаях, когда они вступают в пролиферативный процесс. В качестве кофакторов, способствующих развитию моноцитов, могут выступать и другие цитокины (например, ИЛ-6), в то время как некоторые факторы ингибируют их развитие (на- пример, трансформирующий фактор роста р). 54
Рис. 15. Дифференцировка миелоидных клеток. В кружках — стадии развития миелоидных клеток в костном мозгу, выявленные при культивировании кроветворных клеток, в прямоугольниках — традиционные обозначения стадий их развития, описанные традиционными морфологическими методами; цифры соответствуют продолжительности стадий развития и длитель- ности пребывания клеток в кровотоке и тканях. СК — стволовая клетка; КОЕ — колониеобразующая клетка: ГМ — гранулоцитарно-моноцитарная, Г — грануло- цитарная, М — моноцитарно-макрофагальная; НГр — нейтрофильный грануло- цит; Мон — моноцит; ДК — дендритная клетка; МФ — макрофаг. 55
Таблица 11. Маркеры макрофагов и дендритных клеток Тип клеток Характерные ферменты Мембранные антигены Некоторые рецепторы Моноциты/ макрофаги Дендритные клетки (белые отростчатые эпи- дермоциты, ин- тердигитальные клетки) Неспецифическая эс- тераза (диффузная), миелопероксидаза (-), 5'-нуклеотидаза (+), [3-галактозидаза (+), аминопептидаза (+), трансглутаминаза (в зрелых клетках), NADR-оксидаза, су- пероксиддисмутаза, каталаза, аргиназа, лизоцим, катепсин G и т.д. АТФаза, неспецифи- ческая эстераза МНС I и II (DR); Рз-интегрины: LFA-1, Мас-1, gpl50/95; Pi-инте- грины: VLA-1, 2, 3, 4, 5, 6; ICAM-1, 2, 3; CD14, CD9, CD12, 13, 17, 31, 33, 36, 4, 45, 68, CD40*°, CD80 - только на макрофа- гах; CD86 ± ГКГ I и II (DR, DP, DQ), LFA-1, 3; ICAM-1, CDla, CD4 и 68, CD14 - на субфракциях, CD404 80 и 86 FcyRI, II, III (CD64, CD32, CD16); FcpR, FcaR, FceRII (CD23), CR1, CR2, CR3, CR4 и другие рецепторы для С', рецепторы для фибрина, гормонов, нейро- медиаторов, ци- токинов и т.д. FcyRI и 11 (CD32, 64), iC3bR и др. Примечание. + — при созревании клетки содержание фермента возрастает и - — убывает. Жирным шрифтом выделены характерные отличия между моноцитами/макрофа- гами и дендритными клетками. Продолжительность жизни моноцитов/макрофагов составляет, по разным данным, от 20 сут до 7 мес (речь идет о различных субпопуляциях тканевых макрофагов); в большинстве случаев срок обновления популя- ций тканевых макрофагов равен 20—40 дням. Общая численность моно- цитов и макрофагов в организме человека — около 2 х 1011. Интен- сивность их пролиферации вне костного мозга невелика (2—3 % rqjul- щихся клеток). Моноциты и макрофаги хорошо охарактеризованы морфологически. Это крупные клетки (диаметр 15—25 мкм) с ядром неправильной формы, тонкой структурой хроматина. Макрофаги крупнее моноцитов из-за рас- пластанной конфигурации. В отличие от округлых моноцитов они имеют неправильные очертания и весьма полиморфны. Макрофаги разделяют на резидентные (стабильно локализующиеся в определенных тканях) и подвижные, мобилизуемые в очаг воспаления. Резидентные макрофаги в ряде случаев имеют специальные названия. Так, в особую группу выделя- ют звездчатые ретикулоэндотелиоциты (клетки Купфера), выстилающие пространство между сосудами печени и гепатоцитами и участвующие в фильтрации продуктов, которые поступают из кровотока в паренхиму пе- чени. На их долю приходится около 50 % популяции моноцитарно-мак- рофагальных клеток. Определенным своеобразием отличаются альвео- лярные макрофаги, служащие посредниками между воздушным про- странством альвеол и кровотоком, перитонеальные макрофаги, макрофа- 56
ги лимфоидных органов, центральной нервной системы (микроглия) и почек (мезангиальные клетки) и т.д. Часто морфологические признаки оказываются недостаточными для того, чтобы идентифицировать моноциты и макрофаги. В этом случае ис- пользуют дополнительные приемы. В отличие от лимфоцитов, разновид- ности которых определяют практически только идентификацией мем- бранных маркеров, при определении моноцитов/макрофагов наряду с этим способом широко используют энзимологический метод идентифи- кации этих клеток (табл. 11). Чаще с этой целью определяют неспецифи- ческую эстеразу, локализующуюся в цитоплазме моноцитов-макрофагов диффузно (иногда она выявляется в Т-лимфоцитах, но в гранулах). Дру- гим ферментом, определение которого важно для изучения клеток ука- занной группы, является миелопероксидаза. Существенна динамика изменения активности этого фермента в процессе превращения моноци- тов в макрофаги: его активность при этом снижается. Активность 5'-нук- леотидазы, р-галактозидазы и аминопептидазы в той же ситуации повы- шается. Лишь в зрелых формах макрофагов определяется трансглутами- наза. Помимо названных ферментов, в макрофагах присутствуют, а в ус- ловиях активации секретируются и другие разнообразные ферменты: коллагеназа, эластаза, протеиназы, липазы, нуклеазы, фосфатазы и др. Некоторые ферменты моноцитов/макрофагов участвуют в реализации бактерицидной активности — как кислородзависимой (NADPH-оксида- за, миелопероксидаза, супероксиддисмутаза, каталаза), так и не завися- щей от кислорода (лизоцим, катепсин G, аргиназа, протеазы и другие гидролазы, катионные белки). Сами механизмы реализации антимикроб- ной защиты, включая детали осуществления «кислородного взрыва», описаны в разделе 2.1. Моноциты и макрофаги, помимо некоторых из упомянутых фермен- тов, активно секретируют ряд других субстанций разнообразной приро- ды — продукты метаболизма арахидоновой кислоты, цитокины, компо- ненты комплемента, гормоны, катионные белки, эритропоэтин, протео- гликаны, фибронектин, тромбоспондин. Секреторная активность моно- цитов и макрофагов специально рассмотрена в разделе 2.1.3. Среди разнообразных мембранных белков моноцитов/макрофагов (рис. 16), ответственных за взаимодействие с клетками и матриксом и прием сигналов, первыми должны быть упомянуты рецепторы для Fc-nop- ции иммуноглобулинов. Только для Fc-IgG эти клетки располагают тремя типами рецепторов: высокоаффинным FcyRI (CD64), взаимодействую- щим как с агрегированным, так и с мономерным IgG, FcyRII (CD32), ко- торый взаимодействует с меньшим аффинитетом только с агрегирован- ными IgG и низкоаффинным FcyRIII (CD16). Кроме рецепторов для Fc- IgG, макрофаги располагают рецепторами для Fc-порций IgM, IgA, IgE (FceRII, CD23). Как правило, взаимодействие иммуноглобулинов (агреги- рованных или в составе иммунных комплексов) с соответствующими ре- цепторами приводит к перераспределению последних на поверхности клетки (к образованию «шляпки») и поглощению комплекса клеткой. Затем развивается ответная реакция в виде активации макрофага, сопро- вождаемой синтезом цитокинов и других биологически активных субстан- 57
Рис. 16. Мембранные маркеры мо- ноцитов, макрофагов и дендритных клеток. Мон/Мф — моноциты и макрофаги; ДК — дендритные клетки, а — од- ной звездочкой помечены маркеры, свойственные только моноцитам, двумя — только макрофагам; б — одной звездочкой помечены марке- ры, свойственные только клеткам Лангерганса, двумя — интердиги- тальным клеткам. ций. Но при активации, а также под влиянием интерферона повышается плотность экспрессии Fc-рецепторов на поверхности макрофагов. Отличия в экспрессии Fcy-рецепторов используют для маркировки субпопуляций моноцитов. Так, СО64+-моноциты сильнее продуцируют цитокины, особенно ИЛ-1, тогда как СО64~-клетки обладают более вы- раженной способностью представлять антиген. Повышение экспрессии CD 16 сопровождается снижением экспрессии CD 14 и приобретением моноцитами некоторых свойств тканевых макрофагов с выраженной провоспалительной активностью. Значительную группу мембранных структур макрофагов и моноцитов образуют рецепторы для компонентов комплемента — Clq, СЗа, C3e/C3d, С5а, фактора Н (об этих компонентах см. раздел 2.3.1). Фрагменты СЗ специфически распознают рецепторы CR1 (CD35), CR2 (CD21), CR3 (CD1 lb/CD18) и CR4 (CD1 lc/CD18), два последних рецептора относятся к группе Р2“интегринов. Эти рецепторы предназначены для распознава- ния опсонизированных клеток, в том числе микробных, а также иммун- ных комплексов; они необходимы для осуществления фагоцитоза и регуляции иммунных процессов. Чрезвычайно важную роль во взаимодействии с окружающими клет- 58
ками и межклеточным матриксом играет ряд адгезивных молекул и рецеп- торов поверхности макрофагов, которые обусловливают важнейшее свой- ство макрофагов — высокую адгезивность к субстратам различной природы. В группу адгезивных молекул входят прежде всего интегрины (см. раздел 1.2.4) — гетеродимеры, состоящие из а- и P-цепей, которые представлены в них в различных комбинациях. Макрофаги экспрессируют 3 типа р2-интегринов, имеющих одинаковую р2-цепь (CD18) и различные а-цепи — aL (CDПа) в молекуле LFA-1, ам (CD 11b) в молекуле Мас-1 (уже упоминавшемся CR3) или ах (CD 11с) в молекуле CR4. Молекулы, с которыми взаимодействует LFA-1, ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD 102) и ICAM-3 (CD50), также содержатся на поверхности макрофагов, но пре- имущественно после их активации, за исключением ICAM-2, которая экс- прессируется спонтанно. Интегрины Pi (главным образом VLA-2 и 4) взаимодействуют с молекулами межклеточного матрикса — фибронекти- ном, ламинином, коллагеном и т.д., а также с клеточными рецепторами (например, с VCAM-1, экспрессируемыми макрофагами). Наконец, для межклеточных взаимодействий и удаления старых и погибших клеток очень важны мембранные лектины макрофагов, специфичные для остат- ков D-глюкозы, D-галактозы, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилгалактоза- мина, маннозы, фукозы и др., «оголяющихся» вследствие утраты остатков сиаловых кислот на молекулах сывороточных гликопротеинов (в частнос- ти, иммуноглобулинов), а также при старении и в процессе гибели клеток. Для участия моноцитов и макрофагов в реакции на внедрение бакте- рий чрезвычайно важно присутствие на их поверхности рецепторов для бактериальных липополисахаридов, одним из которых является молекула CD 14, служащая также одним из основных маркеров миелоидных клеток. На поверхности моноцитов/макрофагов имеются многочисленные ре- цепторы для биологически активных субстанций — цитокинов, гормо- нов, нейромедиаторов, гистамина и др. На всех моноцитах и макрофагах содержатся продукты генов гистосовместимости I класса и только на ак- тивированных клетках — продукты II класса, имеющие прямое отноше- ние к представлению антигенных пептидов Т-хелперам, а также к индукции дифференцировки и селекции Т-хелперов в тимусе. Однако у человека из трех основных классов молекул МНС II класса на макрофа- гах экспрессируются лишь молекулы DR (но не DP и DQ). На некоторых моноцитах и макрофагах в малых количествах представлен рецептор про- дуктов МНС класса II — CD4. Кроме перечисленных выше молекул, на поверхности моноци- тов/макрофагов определяется ряд других молекул (см. табл. 11 и рис. 16). Активированные макрофаги экспрессируют рецепторы для ИЛ-2 (CD25, р55), ИЛ-1, ФНО (р55 и р75), ИЛ-6, а также для трансферрина (CD71). Из свойств моноцитов/макрофагов, определяющих их функциональ- ные особенности, кроме особенностей ферментативного спектра и ре- цепторной структуры поверхности, существенна высокая подвижность, обусловленная свойствами их цитоскелета и чувствительностью к хемо- таксическим стимулам. Такая подвижность связана с наличием на по- верхности клеток рецепторов хемокинов (хемотаксических цитокинов) подкласса р. Подвижность клеток является предпосылкой осуществления 59
фагоцитарной реакции — наиболее широко известного проявления функции этих клеток. Другая важная черта моноцитов/макрофагов — высокая «возбуди- мость» клеток, выражающаяся в их активации при самых разнообразных стимулах, включая простое прилипание к субстрату, действие бактери- альных продуктов, цитокинов и физиологических стимуляторов, напри- мер компонентов комплемента. Активация сопровождается изменением метаболизма макрофагов, развитием «кислородного взрыва», появлением на поверхности клеток новых рецепторов. Это в свою очередь служит предпосылкой для осуществления эффекторных функций, в том числе направленных на разрушение микробов. Макрофаги не имеют собствен- ных рецепторов для распознавания антигенов. Однако фиксация на их поверхности антител через Fc-рецепторы (армирование) придает им спо- собность к специфическому распознаванию мишеней. Подробнее роль макрофагов в презентации антигенов и осуществлении эффекторных функций иммунитета рассмотрена в разделе 2.1. 1.1.2.2. Дендритные клетки Уже в начале 60-х годов стало понятным, что макрофаги не являются единственным типом вспомогательных клеток. Было сформулировано представление об «А-клетках» — малочисленных адгезивных клетках, обладающих более высокой способностью обрабатывать антиген, чем мак- рофаги. Позже эту роль стали связывать с группой отростчатых клеток, чаще всего называемых дендритными. Несмотря на то что общая числен- ность этих клеток в организме достаточно велика (только белых отрост- чатых эпидермоцитов — клеток Лангерганса — у человека 109), в связи с диффузным распределением их концентрация даже в лимфоидных орга- нах незначительна, поэтому эти клетки до сих пор недостаточно полно изучены, хотя они и играют исключительно важную роль в иммунной защите. В эту группу входят прежде всего хорошо известные гистологам клет- ки Лангерганса, которые в соответствии с современной гистологической классификацией обозначаются как белые отростчатые эпидермоциты. Эти клетки локализуются в основном в эпидермисе (в его исчерченном сквамозном слое). Они происходят из костного мозга, являясь ветвью миелоидно-моноцитарного ряда кроветворения. Срок их пребывания в эпидермисе около 3 нед. Под влиянием цитокинов (ГМ-КСФ, ФНОа) они могут перемещаться в дерму или мигрировать в лимфатические узлы. Это происходит почти исключительно в условиях повреждения кожи, развития воспаления и иммунных процессов. В запуске этих процессов указанным клеткам принадлежит ключевая роль, поскольку они связыва- ют, обрабатывают антиген и доставляют его Т-лимфоцитам в регионар- ный лимфатический узел. Белые отростчатые эпидермоциты обладают слабой адгезивностью. Они практически лишены фагоцитарной активности. Морфологическим маркером этих клеток служат слоистые включения в цитоплазму — гра- нулы Бирбека. Важнейшей особенностью указанных клеток является 60
экспрессия на их поверхности продуктов генов гистосовместимости не только I, но и II класса (у человека DR, DP и DQ), а также рецепторов для Fc-порции IgG и компонентов комплемента. Они экспрессируют маркеры незрелых тимоцитов CD 1а и Т-хелперов — CD4, ряд адгезивных молекул, включая LFA-1 и ICAM-1 (см. рис. 16). В их цитоплазме опре- деляется активность АТФазы, кислой фосфатазы и неспецифической эс- теразы, но нет активности миелопероксидазы (см. табл. 11). Эти фермен- ты не определяются в культивируемых белых отростчатых эпидермоци- тах. Последние способны секретировать ряд активных продуктов, в част- ности ИЛ-1, 7 и 6, нейропептиды. Их отличительной особенностью является высокая чувствительность к действию ультрафиолетовых лучей, вызывающих функциональную инактивацию и гибель клеток. Белые отростчатые эпидермоциты (клетки Лангерганса) обладают выраженной способностью связывать антиген и обрабатывать его, в ре- зультате чего образующиеся пептиды заполняют специальную полость в молекулах 1а (в продуктах генов МНС II класса — см. раздел 3.3.1). При- сутствие на поверхности этих клеток молекул CD 1а свидетельствует об их возможной роли в презентации липидных антигенов (см. раздел 3.3.2). Тем не менее названные клетки практически не способны стимулировать реакцию Т-хелперов на антигенсодержащий комплекс, т.е. осуществлять презентацию антигена. Полагают, что это связано с отсутствием на их поверхности костимулирующих молекул В7 (CD80 и 86) и неспособнос- тью продуцировать ИЛ-12. Для приобретения всех этих свойств белые от- ростчатые эпидермоциты должны мигрировать в лимфатический узел и, пройдя определенные этапы развития, превратиться в интердигитальные (межпальцевые) клетки лимфатических узлов. Промежуточным звеном этого развития считают вуалевые клетки лимфы, обладающие характер- ными цитоплазматическими отростками — «вуалями» (отсюда их назва- ние), а также рядом свойств, «роднящих» их с белыми отростчатыми эпидермоцитами, с одной стороны, и интердигитальными клетками — с другой. Вуалевые клетки богаты продуктами МНС II класса, содержат не только АТФазу, но и пероксидазу, иногда в них определяются гранулы Бирбека (которые отсутствуют в интердигитальных клетках). На белые отростчатые эпидермоциты по своим свойствам похожи дендритные клетки слизистых оболочек бронхолегочного и пищеварительного трак- тов. Срок пребывания клеток этой группы в коже и слизистых оболочках составляет 2—3 сут, после чего клетки эмигрируют с током лимфы (этот процесс ускоряется при наличии воспалительной реакции). Существует несколько разновидностей клеток лимфоидных органов с дендритной морфологией (табл. 12). Интердигитальные (иногда их на- зывают и дендритными) клетки лимфатических узлов и других перифери- ческих лимфоидных органов представляют собой обязательный элемент микроокружения Т-клеток в тимусзависимых зонах (см. раздел 1.2.2). Бдльшая часть их является потомками белых отростчатых эпидермоцитов (они исчезают после перевязки афферентных лимфатических сосудов). В отличие от белых отростчатых эпидермоцитов интердигитальные клет- ки не способны связывать и обрабатывать антиген, но эффективно пред- ставляют антигенный пептид, процессированный на предыдущей стадии 61
Таблица 12. Разновидности дендритных клеток Вид клеток Локализация Происхождение Маркеры Функция БОЭ (клетки Лангерганса) Эпидермис Из костного мозга МНС-I, II, CD4, CDla, LFA-1, ICAM-1, АТФаза, гранулы Бирбека, FcyR Связывание и процессинг антигена Вуалевые клетки Лимфа Из БОЭ МНС-I, II, CD4, CDla, ICAM-1, АТФаза, пероксидаза Доставка антигена в лимфатические узлы ДК слизистых оболочек Слизистые оболочки Из костного мозга То же (кроме пе- роксидазы), CD80, CD86 Связывание, про- цессинг и презен- тация антигена ИК лимфа- тических узлов Тимусзависи- мые зоны То же МНС-I, II, CD40, 80 и 86, LFA-1, ICAM-1 Презентация антигена Т-хелперам ИК тимуса Кортико- медуллярная и медулляр- ная зоны •» и То же Отрицательная селекция и дифференцировка тимоцитов Фолликуляр- ные ДК Зародыше- вые центры Местное FcyR, ICAM-1 Контроль выжи- ваемости, проли- ферации и функци- онального созрева- ния В-клеток. Хра- нение антигена Примечание. ДК — дендритные клетки; ИК — интердигитальные клетки; БОЭ — белые отростчатые эпидермоциты. развития, Т-хелперам, вызывая их активацию, деление и секрецию цито- кинов. Эти клетки лишены активности эстеразы, АТФазы и пероксида- зы, на их поверхности много продуктов МНС класса II, но нет Fc-pe- цепторов и рецепторов для компонентов комплемента. Интердигиталь- ные клетки обладают адгезивностью, но более низкой, чем у макрофагов, не фагоцитируют, хотя и способны к пиноцитозу. Таким образом, они являются антигенпредставляющими клетками. Термин «дендритная клетка» в узком смысле относится к разновид- ности отростчатых клеток стромы лимфоидных органов (до 1 % от обще- го числа клеток), несущих молекулы МНС II класса (1а+-клетки). Эти клетки присутствуют также в большинстве нелимфоидных органов. Они лишены рецепторов для Fey и компонентов комплемента, пероксидазы, АТФазы, эстеразы и гранул Бирбека, не способны к фагоцитозу. Назван- ные клетки прикрепляются к поверхности стекла и пластика, но затем отделяются от нее и после этого утрачивают способность к адгезии. Эти клетки имеют выраженные отростки цитоплазмы с трубчатыми или пу- 62
зыревидными выступами. Им отводится важная роль в развитии смешан- ной лимфоцитарной реакции in vitro в качестве клеток, обрабатывающих и представляющих антигенный пептид. Интердигитальные (дендритные) клетки тимуса по своим свойствам больше напоминают белые отростчатые эпидермоциты (клетки Лангер- ганса), чем зрелые интердигитальные клетки периферических лимфоид- ных органов. В то же время им свойственна способность формировать агрегаты с тимоцитами, что сближает их с интердигитальными клетками лимфатических узлов. Указанные клетки локализуются в кортико-медул- лярной зоне и мозговом слое тимуса и отвечают, как полагают, за осу- ществление отрицательной селекции аутоспецифических клонов Т-кле- ток, вызывая их апоптоз. Эти клетки близки по генезу Т-лимфоцитам: те и другие могут развиваться из общего предшественника, мигрирующего из костного мозга в тимус. В коже мышей обнаружена разновидность отростчатых эпидермоци- тов — клетки Гранштейна. Их функция выявляется после инактивации ультрафиолетовыми лучами белых отростчатых эпидермоцитов. В этом случае связывание антигена клетками Гранштейна приводит к активации супрессорных клеток и развитию неотвечаемости на антиген. Как пола- гают, аналогичные клетки содержатся и в коже человека. Все перечисленные разновидности дендритных клеток имеют кост- номозговое происхождение и являются представителями миелоидного ряда (см. рис. 15). В костном мозгу и крови описаны кроветворные клет- ки-предшественники, способные формировать in vitro колонии моноци- тарно-макрофагального и дендритно-клеточного типов. При культивировании моноцитов в присутствии некоторых цитокинов (таких, как ГМ-КСФ, ИЛ-4, ФНОа), а также при действии факторов, повыша- ющих уровень внутриклеточного цАМФ, часть моноцитов дифференци- руется в дендритные клетки. Предполагают, что последние могут происходить как из моноцитарных предшественников (наряду с моноци- тами), так и из самих моноцитов (наряду с макрофагами). По некоторым данным, дендритные клетки тимуса могут дифференцироваться из обще- го миелолимфоцитарного предшественника, мигрирующего в этот орган из костного мозга. Как отмечалось, при рассмотрении дифференцировки Т-лимфоцитов, способность к дифференцировке в дендритные клетки сохраняется у клеток Т-ряда довольно долго (см. рис. 9). Уже из описания разновидностей дендритных клеток следует, что су- ществует несколько этапов созревания дендритных клеток в процессе их функционирования. Можно выделить 3 таких этапа. На первом они спо- собны связывать и обрабатывать антиген, но не могут презентировать его Т-клеткам (пример — белые отростчатые эпидермоциты, или клетки Лангерганса). Под влиянием сигналов, исходящих из их окружения, осо- бенно бактериальных продуктов и цитокинов (ИЛ-10, ГМ-КСФ, ФНОа), способность этих клеток процессировать антиген снижается, но повыша- ется способность презентировать его Т-клеткам. Это сопровождается уве- личением экспрессии молекул МНС, костимулирующих молекул CD80 и 86, адгезивных субстанций, возрастанием миграционной активности и секрецией цитокинов (ИЛ-10, ФНОа). Примером дендритных клеток на 63
этом этапе развития могут служить интердигитальные клетки лимфати- ческих узлов. Под влиянием продуктов активированных макрофагов и Т- хелперов (интерферона у) и контакта с Т-хелперами, опосредованного молекулами CD40 и CD40L, описанные выше изменения проявляются в еще большей степени, клетки начинают вырабатывать ИЛ-12, что сопро- вождается дальнейшим усилением способности представлять антиген. Однако эта фаза завершается апоптозом дендритных клеток. Еще одна разновидность дендритных клеток является составной час- тью стромы зародышевых центров и элементом микроокружения В-лим- фоцитов. Хотя природу этих клеток нельзя считать точно установленной, полагают, что они имеют местное происхождение, являясь потомками фибробластов. Если это подтвердится, эту группу клеток следует рассмат- ривать как независимую от остальных типов дендритных клеток, с кото- рыми описываемые клетки зародышевых центров сходны только морфо- логически. Они располагают длинными цитоплазматическими отростка- ми и бедны лизосомами. Эти клетки рассматривают как «хранилище» антигена, который долго обнаруживается на их поверхности. Считают, что это свойство дендритных клеток зародышевых центров обеспечивает длительное поддержание иммунологической памяти. 1.1.2.3. Нейтрофилы Нейтрофилы, как и другие типы гранулоцитов, традиционно рассматри- ваются в рамках гематологии (у взрослого человека на долю нейтрофилов приходится 60—70 % от числа белых клеток крови). Однако в связи с их очевидным участием в иммунологических процессах следует дать им краткую характеристику в ряду других клеток иммунной системы. Нейтрофилы, или полиморфно-ядерные гранулоциты, происходят из костного мозга, являясь основными продуктами миелоидного ряда крове- творения (см. рис. 15). Имея общего предшественника с моноцитами, миелоидные клетки затем обособляются и, пройдя стадии миелобласти, промиелоцита, миелоцита и палочкоядерного нейтрофила, достигают зре- лости на стадии сегментоядерного нейтрофила. Клетки этого ряда покида- ют костный мозг не только на последней стадии развития, но и на стадии палочкоядерного нейтрофила, особенно в условиях стимуляции миело- поэза. У человека за сутки вырабатывается около 10й нейтрофильных гра- нулоцитов. Зрелый гранулоцит пребывает в циркуляции всего несколько (8—10) часов, а затем поступает в ткани, образуя в них значительный по численности пул. Скорость обновления нейтрофилов 1,6 х 109 клеток на 1 кг массы в сутки. Общая продолжительность жизни нейтрофильного гранулоцита составляет 2—3 дня. После этого он гибнет по механизму апоптоза. Зрелый гранулоцит не способен к синтезу белка de novo. На поверхности нейтрофилов присутствуют продукты генов МНС I класса (HLA-A, В, С), молекулы CD 13 (аминопептидаза N), рецептор липополисахарида CD 14, 0гинтегрины LFA-1, Мас-1 и р 155/95, Fcy-pe- цепторы типа II (CD32) и III (CD16), рецепторы компонентов компле- мента CR1, 3 и 4, рецепторы для анафилактогенных пептидов СЗа и С5а, лейкотриена В4, а также хемотаксических пептидов. Нейтрофилы имеют 64
Таблица 13. Свойства гранул некоторых клеток иммунной системы Тип клеток Тип гранул Состав Функциональное назначение NK-клетки Перфорин, хондроитин- сульфат А, сериновые эстеразы Участие в цитолизе, защита от аутолиза Нейтрофилы 1. Азурофильные (первичные); 2. Специфичес- кие (вторичные) 1. Кислые гидролазы, сульфатазы, фосфатазы, нейтральные протеиназы, катионные белки, миело- пероксидаза, лизоцим 2. Щелочная фосфатаза, лактоферрин, лизоцим 1. Медленная фаза бактериолиза 2. Быстрая фаза бактериолиза Эозинофилы 1. Эозинофиль- ные (крупные) 2. Мелкие 1. Главный щелочной белок (в кристаллической форме), перекиси 2. Кислая фосфатаза, арилсульфатаза и т.д. 1. Внеклеточный цитолиз 2. Бактерицидность Тучные клетки Базофильные Гистамин, гепарин, трип- таза и другие протеина- зы, пероксидаза, РНКаза, дегидрогеназы Реакция гладкой мус- кулатуры сосудов и бронхов и другие проявления аллергии Базофилы Базофильные Хондроитинсульфат А, протеиназы, пероксидаза и т.д. Местные проявления аллергических реакций Тромбоциты 1. а-Гранулы 2. Плотные тельца 1. Катионные белки, Р-селектин, катионные белки 2. S-Гидрокситриптамин 1. Повреждение сосу- дов, бактерицидность 2. Сосудистые реак- ции при воспалении также рецепторы для ИЛ-8 и других а-хемокинов, что определяет их вы- сокую отвечаемость на хемотаксические стимулы, генерируемые в очаге воспаления. Основные морфологические особенности нейтрофильных грануло- цитов, позволяющие при их идентификации обходиться без использова- ния дополнительных маркеров, состоят в сегментированном ядре с плотной упаковкой хроматина и наличии в цитоплазме нейтральных (что определило название клеток) гранул, содержащих бактерицидные суб- станции и ферменты. Нейтрофилы отличаются высокими подвижностью и отвечаемостью на хемотаксические и активационные факторы. Именно это обеспечило им роль наиболее мобильных клеток, ранее всего вовле- каемых в воспалительные и иммунные процессы и обусловливающих пусковые механизмы развития воспаления и ранние защитные реакции (см. раздел 2.1.1). Существует два типа гранул нейтрофильных гранулоцитов — первич- 65 3 - 1092
ные (азурофильные) и вторичные (специфические) (табл. 13). Первые со- держат большой набор гидролаз и других ферментов: а-фукозидазу, 5’- нуклеотидазу, р-галактозидазу, арилсульфатазу, а-маннозидазу, N-аце- тилглюкозаминидазу, p-глюкуронидазу, кислую р-глицерофосфатазу, нейтральные протеиназы — катепсин G, эластазу, коллагеназу, катион- ные белки, миелопероксидазу, лизоцим (мурамилидаза), а также кислые гликозаминогликаны (мукополисахариды). Во вторичных гранулах кис- лые гидролазы отсутствуют и содержатся ферменты, проявляющие актив- ность при нейтральных и щелочных значениях pH: лактоферрин, щелоч- ная фосфатаза, лизоцим, а также белок, связывающий витамин В12- Со- держимое гранул способно облегчить разрушение практически любых микробов. Это достигается в процессе слияния гранул с фагосомами при фагоцитозе или дегрануляции, являющейся разновидностью секреторно- го процесса. Специфические гранулы быстрее сливаются с фагосомами и выбрасываются клеткой, чем азурофильные. После опорожнения гранул их восстановления не происходит. Быстрота мобилизации нейтрофилов дополняется их способностью в течение секунд развивать метаболические процессы, приводящие к «кис- лородному взрыву» (см. раздел 2.1.1), а также осуществлять выброс пред- существующих гранул, которые содержат бактерицидные субстанции (дегрануляцию). В нейтрофилах обнаружены ферменты, причастные к бактериолизу и перевариванию микроорганизмов. Среди перечисленных выше ферментов этой способностью обладают кислые протеиназы, мие- лопероксидаза, лактоферрин, лизоцим и щелочная фосфатаза. 1.1.2.4. Эозинофилы Эозинофилы составляют небольшую часть клеток крови (0,5—2 %), в которой циркулируют в течение 30 мин, после чего поступают в ткани; срок их полужизни — 12 сут. Эти клетки образуются в костном мозгу из миелоидных предшественников при участии ИЛ-5, который является фактором роста и дифференцировки эозинофилов. Обособление эозино- филов от миелоидного ствола происходит на той стадии развития, когда формируются эозинофильные гранулы. В целом же этапы развития эози- нофилов и нейтрофилов аналогичны. Зрелые эозинофилы представляют собой крупные клетки (около 9 мкм в диаметре) с сегментированным ядром. Они содержат крупные (около 1 мкм в диаметре) эозинофильные гранулы (см. табл. 13), в зрелых клетках имеются также более мелкие гранулы. Основными компонента- ми крупных гранул являются главный щелочной белок (мол. масса 9000— 10 000), локализующийся в их сердцевине в кристаллической форме, а также перекиси, обладающие бактерицидной активностью. В мелких гра- нулах преобладают кислая фосфатаза и арилсульфатаза. В эозинофилах выявлены также коллагеназа, эластаза, глюкуронидаза, катепсин, РНКа- за и миелопероксидаза. На поверхности этих клеток присутствуют Fc-pe- цепторы FcyRII (CD32) и FceRII (CD23), рецепторы для компонентов комплемента, а также молекулы CD9 (этот маркер позволяет дифферен- цировать эозинофилы от нейтрофилов) и CD35. 66
Рис. 17. Тучные клетки — покоящаяся (а) и стимулированная (б). Элекгроно- грамма (х 5400). В покоящихся клетках есть гранулы, содержащие медиатор; в стимулированных клетках часть гранул опустошена в результате дегрануляции, некоторые гранулы имеют сообщение с внеклеточным пространством (из учеб- ника C.A.Janeway, P.Travers «Immunobiology», 1994). Обладая слабой фагоцитарной активностью, эозинофилы обусловли- вают внеклеточный цитолиз, играя важную роль в защите от паразитов. Основное значение в осуществлении внеклеточного цитолиза имеет глав- ный щелочной белок, который перед тем, как секретироваться, должен перейти из кристаллической формы в растворимую. Для привлечения эо- зинофилов в очаг поражения важен IgE, который взаимодействует с низ- коаффинным рецептором CD23, расположенным на поверхности клеток. I.I.2.S. Базофилы и тучные клетки Базофилы представляют собой еще одну разновидность гранулоцитов крови (на их долю приходится всего 0,5 % от общего числа лейкоцитов). Их основная особенность — наличие базофильных гранул (см. табл. 13), в которых содержатся хондроитинсульфаты А и С, гистамин, гепарин, серотонин (у кроликов и мышей), а также ряд ферментов (трипсин, химотрипсин и другие протеиназы, дегидрогеназы, пероксидаза, РНКаза, гистидинкарбоксилаза) и кислые гликозаминогликаны. Второе важное свойство базофилов — наличие на их поверхности высокоаффинных и низкоаффинных рецепторов для IgE — FceRI и FceRII. Присутствие рецепторов первого типа обеспечивает возможность не только связывания IgE, но и реакции на это связывание, выражающейся в освобождении гранул, содержимое которых обусловливает развитие аллергических реак- ций. Базофилы подвижны, обладают способностью к фагоцитозу, но не могут делиться и восстанавливать гранулы. Тучные клетки являются тканевыми аналогами базофилов и основ- ными эффекторами аллергических реакций немедленного типа. Они ло- кализуются в серозных оболочках, селезенке, в эпителии и подслизистом 67 3*
Таблица 14. Разновидности тучных клеток Свойства Тучные клетки типа t (MCt; слизистые оболочки) Тучные клетки типа tc (MCtc, соединительнотканные) Локализация Кожа, миндалины, подсли- зистый слой кишечника Слизистая оболочка бронхов и альвеол, носа, кишечника Срок жизни < 40 сут > 40 сут Зависимость от тимуса + — Мембранный фенотип CD13+CD29+< 3D45+CD117+ Тип протеиназ Химаза, триптаза, карбо- ксипептидаза А, катепсин С Триптаза Среднее число FceRI на поверхности 2х Ю5 Зх 104 IgE в цитоплазме + — Наличие гистамина + + Преобладающий протеогликан Хондроитинсульфат Гепарин Соотношение LTC4: PTD2 25 : 1 1 : 40 слое пищеварительного, дыхательного и урогенитального трактов, в коже, а также соединительной ткани, окружающей капилляры. На 1 г тканей указанных локализаций приходится 104—106 тучных клеток. В от- личие от базофилов они способны к делению и имеют довольно большой срок жизни (месяцы, годы). Тучные клетки крупнее базофилов (размер 10—20 мкм), имеют ворсинчатую поверхность, содержат больше гранул (10—150 на клетку) (рис. 17). Их состав аналогичен составу гранул базо- филов, но они богаче трипсино- и химотрипсиноподобными протеиназа- ми. В тучных клетках, как и в базофилах, вырабатываются эйкозанои- ды — лейкотриены (особенно СД тромбоксаны, простагландины (в ос- новном D2) (см. раздел 2.3.2). Существуют различия в свойствах тучных клеток соединительной ткани (серозных) и слизистых оболочек, позволяющие квалифицировать эти два типа клеток как субпопуляции (табл. 14). Те и другие имеют кост- номозговое происхождение, но лишь вторые в своем развитии зависят от тимуса, т.е. отсутствуют у генетически бестимусных или тимэктомиро- ванных животных (роль тимуса в их развитии не вполне ясна). Эти клет- ки отличаются по зависимости их пролиферации от различных ростовых факторов: хотя основным ростовым цитокином для тех и других служит фактор стволовых клеток, существуют кофакторы роста: для серозных тучных клеток — ИЛ-3, для тучных клеток слизистых оболочек — ИЛ-3 в сочетании с ИЛ-4. В серозных тучных клетках преобладающим пепти- 68
догликаном является гепарин, а в тучных клетках слизистых оболочек — хондроитинсульфат. Аналоги этих типов тучных клеток обнаружены и у человека. Первые преобладают в коже; они содержатся также в перива- скулярном пространстве различных органов. В их гранулах наряду с триптазой имеются химотрипсиноподобная протеиназа (химаза), а также карбоксипептидаза А и катепсин С. Вторые преобладают в слизистых оболочках пищеварительного и дыхательного путей; в их гранулах отсут- ствует химаза. Спектр протеаз, свойственный двум типам тучных клеток человека, отражен в их обозначении — MCtc и MCt (МС — mast cell, t — триптаза, с — химаза). На поверхности тучных клеток присутствуют FceRI и FceRII, а также Fcy-рецепторы и рецепторы для комплемента (его фрагментов СЗ и С5). Дегрануляция базофилов и тучных клеток происходит главным образом при воздействии на них иммунных комплексов, содержащих IgE, но она может быть вызвана также действием ионофоров кальция, повышением внутриклеточного уровня цАМФ, связыванием рецепторов для компо- нентов комплемента. Механизмы активации и дегрануляции тучных кле- ток, а также их последствия будут рассмотрены детальнее при описании аллергических реакций (см. раздел 5.2.1). Дегрануляция не сопровожда- ется гибелью клеток. В тучных клетках (но не в базофилах) возможен процесс восстановления гранул. По некоторым свойствам тучные клетки «сближаются» с антиген- представляющими клетками и лимфоцитами. Так, они экспрессируют молекулы МНС не только I, но и II класса, а также вспомогательные мо- лекулы В7-2 (CD86). Подобно Т-лимфоцитам, они секретируют цитоки- ны: ИЛ-4, 5, 10, 12, 13, а также ГМ-КСФ и ФНОа. Полагают, что тучные клетки участвуют в регуляции дифференцировки Т-хелперов, способст- вуя образованию Th2, с которыми у них есть наибольшее сходство (см. раздел 3.5.2). 1.1.2.6. Тромбоциты Кровяные пластинки, тромбоциты, основная функция которых связана со свертыванием крови, также участвуют в выполнении иммунологичес- ких функций — в основном в качестве депо активных субстанций, освобождаемых под влиянием сигналов, которые генерируются при вос- палении и иммунных процессах. Носителями этих сигналов служат фак- тор, активирующий тромбоциты (ФАТ), иммунные комплексы и другие агенты. Эти сигналы воспринимаются соответствующими мембранными структурами — рецепторами для ФАТ, Fc-рецепторами. Особенно богата поверхность тромбоцитов молекулами адгезии, они несут мембранные молекулы ргинтегринов а201, а401, а501, аб01, av01, рецепторы для фибриногена (CD61/CD41), витронектина (CD61/CD51), тромбина (CD42a), фактора фон Виллебрандта (CD42b) и тромбоспондина (CD36). Это обеспечивает как выполнение основной функции тромбоцитов — участие в свертывании крови, так и вклад в развитие воспалительного процесса и иммунных реакций. Активные субстанции содержатся в гранулах двух типов: «плотные 69
Высокий (кубовидный) эндотелий Плоский эндотелий ICAM-2 CD58 H.-6R IL-1R TNFR IFNyR ___ . CD62P CD62E CD62L vUu4 । . ' - ’ ‘ ICAM-1 ICAM-2 ClCAM- -GlyCAI -MadCA CD58 IL—4R Активация IL-1, TNFa, IL-6, IFNy IL-1R П I 'iFNyR TNFR IL-6R Arc. 18. Изменение мембранного фенотипа эндотелиальных клеток при их акт вации цитокинами. TNF — фактор некроза опухолей (ФИО). тельца» содержат 5-гидрокситриптамин и АДФ, а a-гранулы — катио ные белки, протеазы, Р-селектин (см. табл. 13). Указанные субстанц] играют определенную роль в развитии воспалительных процессов, в час ности в формировании повреждений эндотелия при отложении имму ных комплексов (см. раздел 5.2.1). 1.1.3. Стромальные клетки Стромальные клетки принципиально не отличаются по составу и свойс вам от клеток рыхлой соединительной ткани других органов. В стро1 преобладают фибробласты, коллагеновые и эластиновые волокна, а таю клетки сосудистого эндотелия, относимые к эпителиальной ткани. Ва: ным свойством этих клеток для иммунологических процессов и развит клеток иммунной системы являются наличие мембранных адгезивн] молекул, определяющих взаимодействие самих стромальных клеток межклеточным матриксом, а также формирование контактов и обм сигналами между клетками. Особенно существенно присутствие молек адгезии на поверхности эндотелиальных клеток капилляров и посткапи лярных венул, поскольку их взаимодействие с комплементарными 1 молекулами поверхности лейкоцитов обеспечивает миграцию последи из кровяного русла в ткани. В отсутствие воспалительной реакции большинстве тканей эндотелий мелких сосудов представлен плоски? клетками с очень низким содержанием на их поверхности молекул адг зии. Лишь в лимфоидных органах — лимфатических узлах и группов] лимфатических фолликулах (пейеровы бляшки) — посткапиллярные в нулы выстланы высоким (кубовидным) эндотелием; аналогичный энд телий появляется и в других органах при воспалении. Он представля собой активированную форму эндотелиальных клеток (в качестве акт вирующих факторов выступают цитокины — ИЛ-1, ФНОа, интерферон (рис. 18). Эпителиальные клетки разной локализации несколько отличаются 1 набору экспрессируемых ими молекул адгезии. На большинстве эндотел альных клеток присутствует рецептор интегринов — молекула ICAM-2, i 10
условиях активации появляются две разновидности селектинов (тканевых лектинов, распознающих углеводные группировки) — Р и Е, а также ин- тегриновые рецепторы ICAM-1 и 3, ELAM и VCAM-1. На этих клетках присутствует также CD34, представляющий собой муциноподобную моле- кулу, углеводные ветви которой взаимодействуют с селектинами, в част- ности с L-селектином лейкоцитов. L-селектин распознается также молекулой GlyCAM-1, которая экспрессируется на клетках высокого эн- дотелия посткапиллярных венул. В слизистых оболочках эти клетки экс- прессируют молекулу MadCAM, распознающую наряду с L-селектином Ргинтегрин VLA-4. Эндотелиальные клетки несут рецепторы для хемоки- нов, ИЛ-1, ФНО, интерферона у, ИЛ-3, 4 и 6 и ГМ-КСФ. Клетки сосудистого эндотелия, а также другие стромальные клетки, будучи активированными, выделяют некоторые цитокины (например, ко- лониестимулирующие факторы, ИЛ-1, 6 и 7, ФНОа, трансформирующие факторы роста, хемокины и др.), весьма важные для функционирования клеток иммунной системы в условиях воспаления. Строма различных кро- ветворных и лимфоидных органов характеризуется своеобразием, прояв- ляющимся в формировании адекватного микроокружения, которое обеспечивает развитие и функционирование различных типов клеток. Эта специфика «заложена» уже в камбиальных элементах стромы этих орга- нов, пересадка которых позволяет сформировать соответствующее микро- окружение в новых местах. Детали и механизмы осуществления этих процессов изучены пока лишь в самых общих чертах. Лимфоциты — главные клетки иммунной системы. Они определя- ют специфичность иммунного ответа на конкретные антигены. Это достигается благодаря присутствию на их поверхности антигенрас- познающих рецепторов. Существуют 3 разновидности лимфоцитов: В-, Т- и NK-клетки. В-лимфоциты развиваются в костном мозгу (у птиц — в фабрициевой сумке), Т-клетки — в тимусе, местом завер- шения развития NK-клеток считают селезенку. Популяции Т- и В- лимфоцитов представляют собой совокупности клонов (клон — потомство одной клетки); клетки одного клона несут рецепторы, идентичные по специфичности, распознающие только один анти- ген. Лишь в совокупности клоны лимфоцитов способны распо- знать все мыслимые антигены. NK-клетки распознают углеводные детерминанты делящихся клеток. Группу вспомогательных клеток образуют фагоцитирующие, антигенпредставляющие (АПК) и не- которые другие клетки. Большинство их относится к клеткам мие- лоидного происхождения. Моноциты и их потомки — макрофаги «совмещают» свойства фагоцитов и АПК. Основным типом АПК являются дендритные клетки. Их особенность состоит в экспрес- сии на поверхности молекул МНС II класса, важных для «презен- тации» антигена. К клеткам, участвующим в иммунных процессах, относят также нейтрофилы, эозинофилы, тучные, эндотелиальные и другие клетки. 71
1.2. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ Хотя клетки, выполняющие иммунологические функции, рассеяны по всему организму, к иммунной системе, строго говоря, относятся лишь лимфоидные органы и лимфоидные скопления, т.е. органы и структурные образования, основу которых составляют лимфоциты. Лимфоидные орга- ны разделяют на центральные (первичные) и периферические (вторич- ные). Сведения о структуре иммунной системы представлены в табл. 15 (они отображены также на рис. 1). В табл. 16 представлены данные о со- держании в лимфоидных органах и циркуляции лимфоцитов, относящих- ся к различным популяциям. В первичных лимфоидных органах происходит дифференцировка лимфоцитов. К этим органам относится тимус, в котором созревают Т (ти- мусзависимые)-лимфоциты. Аналогичный орган для В-лимфоцитов, бур- са (фабрициева сумка), есть у птиц; у млекопитающих В-лимфоциты со- зревают в костном мозгу. Костный мозг лишь с оговорками может быть от- несен к центральным лимфоидным органам: это прежде всего крове- творный орган, в котором в силу общности происхождения от плюрипо- тентной стволовой клетки образуются и лимфоциты. Кроме того, костный мозг выполняет некоторые функции периферического лимфоидного орга- на, являясь местом развития вторичного гуморального иммунного ответа. В процессе развития лимфоциты мигрируют из центральных орга- нов в периферические (Т-клетки мигрируют дважды; промежуточным органом оказывается тимус). Организация периферического отдела им- мунной системы сложнее. Он включает органы, в которых осуществля- ются контакт лимфоцитов с антигенами и развитие иммунного ответа В основе организации системы этих органов лежит региональный прин- цип: каждый лимфоидный орган контролирует определенную часть тела, от которого к нему поступает лимфа (лимфатические узлы) илы является барьером на кровеносных путях (селезенка), или, наконец, не- посредственно контактирует с барьерами, ограничивающими внутрен- нюю среду организма (лимфоидная ткань, связанная с кожей и слизис- тыми оболочками). Периферические лимфоидные органы объединень системой рециркуляции лимфоцитов, обеспечивающей их постоянные перемещение и перемешивание, что позволяет им выполнять патруль- ную функцию по выявлению источников агрессии, являясь частью еди- ного клеточного пула. Однако полноценная иммунная реакция может развиться лишь в самих лимфоидных органах, где существует необхо- димый набор клеток, оптимально организованных для развития иммун- ных реакций. Иммунная система не только подвижная, но и непрерывно обнов- ляющаяся. В то же время постоянство ее состава поддерживается доста- точно строго. Хотя принципы этого гомеостаза еще недостаточнс понятны, очевидно, что регуляция осуществляется на уровне отдельны)! разделов (компартментов) системы: численность и состав клеток костно- го мозга, тимуса и периферических лимфоидных органов регулируются самостоятельно и относительно независимо друг от друга, причем пери- ферические лимфоидные органы регулируются как единое целое. 72
Таблица 15. Органы и другие структурные образования иммунной системы Группы органов и структур Органы и структуры Источники клеток- предшественников В эмбриогенезе — желточный мешок, печень; у взрос- лых — костный мозг (для В1 — сальник) Центральные орга- ны В-лимфопоэза Фабрициева сумка (у птиц), групповые лимфатические фолликулы подвздошной кишки (у овец), костный мозг (у грызунов), плевроперитонеальная полость (?) Центральный орган Т-лимфопоэза Периферические лимфоидные органы Лимфоидные скоп- ления в нелимфоид- ных органах Циркуляция Тимус Лимфатические узлы, селезенка, миндалины, групповые лимфатические фолликулы (пейеровы бляшки), аппендикс Внутриэпителиальные лимфоциты слизистых оболочек и кожи, lamina propria кишечника и матки, солитарные фол- ликулы слизистых оболочек; молочные пятна сальника Кровь, лимфа Уникальная особенность лимфоидных клеток состоит в том, что для их терминального созревания во внутренней среде организма в норме от- сутствуют необходимые стимулы: для этого требуется поступление извне или образование внутри (вследствие патологического процесса) чужерод- ной субстанции — антигена. Лишь при появлении последнего во внут- ренней среде организма лимфоциты превращаются в эффекторные Таблица 16. Клеточный состав лимфоидных органов человека Органы и тканевые жидкости % лим- фоцитов от обще- го числа клеток* % от об- щего числа лимфо- цитов В- клетки, % т- клетки, % CD4+- клетки, % CD8+- клетки, % Деля- щиеся клетки, % Костный мозг 10-15 8-10 10-12 1-4 2,6 2,3 25-30 Тимус 95-98 10-12 96-98 8-10 4-6 20-25 Селезенка 80-85 20-25 40-50 25-35 20-25 10-12 5-7 Лимфатические узлы 90-95 15-20 35-40 55-65 30-40 15-20 2-4 Миндалины 85-90 40-55 25-50 н.д. н.д. 5-10 Групповые лимфатические фолликулы 90-95 20-25** 30-40 25-30 н.д. н.д. 5-8 Кровь 20-35 0,5 13-18 60-70 35-50 20-25 < 5 * Этот показатель рассчитан для мышей. ** Данные для лимфоидной ткани пищеварительного тракта в целом. 73
клетки, способные выполнять иммунологические функции, которые и служат конечными стадиями их развития. 1.2.1. Костный мозг В костном мозгу образуются все форменные элементы крови, включая лейкоциты — клетки, непосредственно связанные с иммунной системой. Часть клеток, развивающихся из костномозговых предшественников и относящихся к иммунной системе, практически не определяется в крови, таковы дендритные и тучные клетки. Кроветворная ткань представлена в костном мозгу цилиндрическими скоплениями вокруг артериол, образу- ющими шнуры, отделенные друг от друга венозными синусоидами. Они расположены радиально и впадают в центральный синусоид. Клетки различных типов располагаются в кроветворной ткани островками. Наи- большее число стволовых элементов сосредоточено в периферической части просвета костномозгового канала. Рядом с ними вокруг разветвле- ний артериол располагаются лимфоидные и моноцитарные элементы, тогда как предшественники нейтрофильных гранулоцитов сосредоточены в центре гемопоэтических долек. Размножающиеся и созревающие кро- ветворные клетки располагаются в петлях, которые образуют ретикуляр- ные клетки. По мере созревания клетки (в частности, лимфоидные) перемещаются из периферической части просвета к центру, где они проникают в синусоиды и поступают в кровоток. На долю миелоидных элементов в костном мозгу человека прихо- дится 60—65 % клеток, на долю лимфоидных — около 10—15 % кари- оцитов. Примерно 60 % лимфоидных клеток находится в процессе созревания, остальные — зрелые клетки, готовые к эмиграции из кост- ного мозга или, наоборот, мигрировавшие в костный мозг из крови. Доля ежедневно эмигрирующих лимфоцитов составляет у мышей около 50 % от общего числа лимфоидных элементов в костном мозгу (180 из 230—320 млн клеток). Обратный приток лимфоцитов из крови в кост- ный мозг в 10 раз меньше (20 млн клеток в день). Содержание в кост- ном мозгу лимфоцитов В-ряда выше, чем Т-клеток и их предшествен- ников. Несколько более 50% клеток В-ряда приходится на преВ-клетки, имеющие p-цепь в цитоплазме (у человека 5,8 %). Содержание В-кле- ток, несущих иммуноглобулин на поверхности, 3,7 % при соотношении IgM+ : IgG+: IgA+, равном 20 : 10 : 1. Среди зрелых В-лимфоцитов лишь часть IgM+-wieTOK относится к новообразованным, остальные за- носятся кровью. В костном мозгу содержится 1—2 % плазматических клеток, что можно рассматривать как отражение иммунных реакций, реализуемых в костном мозгу. В-росток лимфопоэза отличается большой интенсивностью функцио- нирования. За сутки у мыши образуется 20—50 млн В-клеток, что значи- тельно превосходит число клеток, требующихся для обновления попу- ляции В-лимфоцитов. Полагают, что значительная часть образующихся клеток гибнет на стадии преВ-лимфоцитов. В настоящее время признано, что костный мозг служит основным местом дифференцировки В-лимфо- цитов у млекопитающих (хотя признается роль в В-лимфопоэзе групповых 74
лимфатических фолликулов толстой кишки у овец и некоторые другие особые случаи экстрамедуллярной дифференцировки В-клеток). Небольшое количество (7—8 %) кариоцитов костного мозга приобре- тает маркеры Т-клеток под влиянием дифференцировочных факторов, т.е. представляют собой предшественники Т-лимфоцитов. Часть из них экспрессирует маркеры Т-лимфоцитов — CD7, 2 и 5. Формирование этих маркеров зависит от гормонов тимуса, приносимых в костный мозг с кровью. У клеток-предшественников, испытавших воздействие этих гор- монов, повышается способность к миграции в тимус, в котором они про- должают свое развитие. На костномозговой стадии развития предшест- венники Т-лимфоцитов стимулируют (при участии выделяемого ими гу- морального фактора) пролиферацию стволовых клеток. До 4 % клеток костного мозга (20—30 % от общего числа его лимфо- идных клеток) несут маркеры зрелых Т-лимфоцитов, в частности CD3. Часть из них — Т-клетки, мигрировавшие из крови, — является предста- вителями рециркулирующего пула лимфоцитов. Для этих клеток харак- терно преобладание CD8+-лимфоцитов над CD4+-лимфоцитами: со- отношение CD4+/CD8+ составляет в костном мозгу 0,5—1,0 (в крови 1,5—2,0). Миграция зрелых Т-лимфоцитов, а также части тимоцитов в костный мозг усиливается под влиянием гормонов коры надпочечников. В связи с этим содержание Т-клеток в костном мозгу увеличивается при стрессе. Физиологический смысл этого явления неясен; возможно, это связано с усилением процесса образования антител в костном мозгу вследствие миграции сюда Т-клеток, но это объяснение имеет отноше- ние лишь к миграции СГ)4+-клеток. В то же время для костного мозга характерна субпопуляция Т-кле- ток, имеющих фенотип CD3+CD4“CD8~. На их долю приходится 60 % СОЗ+-клеток. Среди них 70—80 % несут рецептор ар-типа, а 20—30 % — уб-типа. Первые похожи на аналогичные клетки печени, но лишены (у мышей) маркера В220. Полагают, что они дифференцируются локально, минуя тимус. 1.2.2. Тимус (вилочковая железа) В отличие от костного мозга, совмещающего функции кроветворного органа и центрального органа иммунной системы, в котором детермини- руется развитие лимфоидных клеток и созревают В-лимфоциты, тимус специализирован исключительно на развитии Т-лимфоцитов (а также, как выяснилось в последнее время, миелоидных элементов собственного микроокружения). Это отражает особую сложность процесса развития Т-лимфоцитов. Тимус представляет собой лимфоэпителиальный орган. Эпителиаль- ная часть органа является стабильной составляющей, имеющей местное происхождение, а лимфоидные элементы (собственно тимоциты) явля- ются транзиторными: их предшественники мигрируют в тимус из кост- ного мозга (в эмбриональном периоде из печени), а бдльшая часть созревших в тимусе Т-лимфоцитов эмигрирует в периферический отдел иммунной системы, где они включаются в функциональный рециркули- 75
Рис. 19. Структура тимуса. Слева — клеточный состав и организация различных зон тимуса, справа — ста- дии развития клеток и основные процессы, приуроченные к изображенным зонам тимуса. К — капсула; Т — трабекула; ЭК — эпителиальная клетка; Тб — бластная форма тимоцита (субкапсулярные бласты); Тц — малый тимоцит; Мф — макрофаг; ДК — дендритная клетка; ТГ — тельце Гассаля. рующий пул Т-клеток. Основное назначение тимуса и состоит в форми- ровании данного пула, что включает в себя: • созревание Т-лимфоцитов, в частности появление у них антиген- распознающих рецепторов; • дифференцировку Т-клеток на субпопуляции; • отбор (селекцию) клонов Т-лимфоцитов, способных распознавать чужеродные пептиды в комплексе с аутологичными продуктами МНС. Эти процессы осуществляются путем воздействия на предшествен- ники Т-лимфоцитов и созревающие тимоциты клеточных и гуморальных факторов микроокружения, создаваемого элементами стромы тимуса. Тимус млекопитающих обычно состоит из двух долей, объединенных друг с другом (у человека) или изолированных (у грызунов). Каждая доля ограничена капсулой, от которой внутрь ткани отходят перегородки, де- лящие ее на дольки на уровне наружной части органа — коры. Внутрен- няя часть органа — мозговая — едина для каждой доли. 76
Тимус как бы разделен на два пространства (компартмента). Одно из них представлено обычной соединительнотканной стромой, сопровож- дающей сосуды и нервы. Строма образована фибробластами, эндотелием капилляров, волокнами; в периваскулярном пространстве присутствуют макрофаги, реже — плазматические и тучные клетки. Большая же часть объема органа приходится на второй — эпителиальный (внутритимус- ный) — компартмент, образованный трехмерным каркасом из эпители- альных клеток и ограниченный этими же клетками снаружи. В норме эпителиальное пространство заполнено тимоцитами, и эпителиальные клетки на гистологических срезах выглядят сдавленными. Структура ти- муса схематически представлена на рис. 19. Процессы в эмбриональном тимусе. Местные компоненты тимуса формируются из третьего глоточного кармана (эктодерма) с участием третьей жаберной щели (энтодерма). Некоторые авторы считают, что эпителиальные клетки являются по преимуществу производными энто- дермы, другие исследователи полагают, что эпителий глубоких слоев коры происходит из энтодермы, а субкапсулярной зоны коры и мозгово- го слоя — из эктодермы. Соединительнотканные элементы, как и клетки костномозгового происхождения, происходят из мезодермы. Формирова- ние эпителиальной закладки тимуса завершается у мышей и птиц к 9-м суткам эмбрионального развития. Затем происходит заселение закладки предшественниками Т-лимфоцитов из печени эмбрионов в виде не- скольких импульсных миграционных актов. Особенно детально этот про- цесс изучен у птиц благодаря удобной экспериментальной модели с подсадкой зачатков тимуса кур эмбрионам перепелки (и наоборот). По- скольку лимфоциты этих птиц легко различаются с помощью фермента- тивной метки, процесс заселения тимуса прослежен у них с высокой точностью. Оказалось, что заселение происходит в виде трех волн, у кур они осуществляются на 6—8-е, 12—14-е и 18—21-е сутки, у перепелок — на 5—6-е, 11—12-е и 17—20-е сутки. Аналогичные волны миграции кле- ток-предшественников в строму эмбрионального тимуса имеются и у млекопитающих. Так, у мышей они осуществляются на 11—13-е и на 17— 19-е сутки развития (рис. 20). В начальном периоде после заселения тимуса эмбрионов мышей в нем преобладают СО4_СО8“-клетки-предшественники, которые не- сколько отличаются от таковых в тимусе взрослых особей. Первыми раз- виваются тимоциты, содержащие в составе TCR-рецептора у- и 5-цепи (вероятно, в силу особенностей микроокружения эмбрионального тиму- са). Причем при построении их генов из большого разнообразия зароды- шевых Vy- и У5-генов используются лишь ограниченное их число (о формировании «зрелых» генов TCR см. раздел 3.1.3): сначала Vy3 и V81, несколько позже — Vy4 и V51. Образующиеся уб+-клетки покидают тимус на 15—16-е сутки эмбриогенеза (у мышей), причем первыми эмигрируют УуЗ+-клетки в эпидермис кожи, а вслед за ними — Уу4+-клетки в слизис- тую оболочку языка и репродуктивного аппарата самок. В последующем популяции этих клеток самоподдерживаются местно. После этого в тиму- се формируются у5+-клетки, имеющие в составе TCR сегменты Vy2, Vyl.l и Vyl.2, свойственные большинству периферических уб+-клеток. Эти 77
I II III 6,5 9 12 14 18 20,5 сут Куры 5 7 11 12 17 20 сут Перепелки В кожу В ели- В ЛУ, сел, ПБ В ЛУ, сел.ПБ зистые оболочки Рис. 20. Миграционные процессы в тимусе эмбрионов птиц и мышей. Заштриховано — периоды миграции в тимус клеток-предшественников. Римские цифры — порядковые номера волн миграции, арабские цифры — сроки развития эмбрионов. Внизу указаны семейства V-генов TCR эмигрирующих клеток и на- правления их миграции. ЛУ — лимфатические узлы; ПБ — пейеровы бляшки (групповые лимфатические фолликулы); сел. — селезенка. клетки мигрируют в основном сразу после рождения — до 13-х суток постнатального развития. Лимфоциты у5+, созревающие в тимусе в более поздние сроки, являются потомками клеток-предшественников, которые мигрировали в тимус на протяжении первой волны его заселения. Из клеток второй волны миграции в последние дни эмбриогенеза в тимусе начинают дифференцироваться Т-клетки, имеющие в составе TCR-ре- цептора а- и 0-цепи. Они выселяются на периферию в селезенку, лимфа- тические узлы и групповые лимфатические фолликулы (пейеровы бляш- ки) начиная с 7-х суток после рождения. Заселение тимуса клетками-предшественниками. Гематотимический барьер. Начиная с 7-х суток после рождения устанавливается свойствен- ный взрослым особям режим работы тимуса: в него постоянно поступают клетки-предшественники из костного мозга, которые дифференцируются преимущественно в а0+-Т-клетки, пополняющие периферический пул Т-лимфоцитов. Срок развития тимоцитов от момента поступления кле- ток-предшественников в тимус до эмиграции на периферию составляет около 20 сут, хотя in vitro весь процесс дифференцировки от стадии «тройных отрицательных» (CD3~CD4~CD8~) клеток до стадии «одинар- но положительных» (CD4+ или CD8+) клеток требуется всего 5 сут. При- ток костномозговых предшественников невелик. Расчеты показали, что в 78
Рис. 21. Гематотимический брьер. I — кровеносный сосуд; II — перива- скулярное пространство; III — «эпи- телиальное» («внутреннее») прост- ранство тимуса; 1 — сосуд; 2 — эндо- телиальная клетка; 3 — макрофаг; 4 — мигрирующие лимфоидные клет- ки; 5 — базальная мембрана; 6 — эпителиальные клетки; 7 — тимоциты. тимусе имеется не более 200 ниш, способных принять мигрантов из кост- ного мозга, причем в норме большинство из этих ниш занято. Они опус- тошаются при действии повреждающих факторов (стероидов, ионизи- рующих излучений). При этом мобилизуются внутритимусные предшест- венники, которые служат источником экстренного восстановления орга- на; существенно, что это восстановление реализуется в виде образования у5+-клеток. У взрослых особей воротами тимуса, в которые входят сосуды и нервы, является так называемое кортико-медуллярное сочленение. По- ступившие сюда клетки затем мигрируют в наружный слой коры — суб- капсулярную зону, откуда они продвигаются, созревая и размножаясь, в глубь коры. Скорее всего в кортико-медуллярном сочленении эти клетки проникают в венулы и покидают тимус. В мозговом слое сохраняются зрелые тимоциты, по-видимому, не покидающие тимус. Между сосудистым руслом и эпителиальным пространством тимуса имеется гематотимический барьер, который образован тремя клеточными слоями: эндотелием сосудов, окружающими их макрофагами и наружной эпителиальной выстилкой внутритимусного компартмента (рис. 21). Ба- рьер препятствует свободному обмену клетками и макромолекулами между кровью и корой тимуса и обеспечивает избирательное проникно- вение в орган претимоцитов и ограниченного набора других клеток. Во- прос о наличии барьера между кровью и мозговым слоем тимуса окон- чательно не решен. Полагают, что в этой части тимуса возможен свобод- ный обмен клетками и макромолекулами между тимусом и кровью. Механизмы преодоления гематотимического барьера предшествен- никами Т-лимфоцитов изучены недостаточно. Предполагают, что в осно- ве этого процесса лежат закономерности, свойственные хомингу лимфо- цитов, т.е. направленной миграции лимфоцитов в органы иммунной сис- темы. Надо учитывать, однако, что в тимусе отсутствует высокий эндоте- 79
Таблица 17. Основные субпопуляции тимоцитов человека Мембранный фено- тип субпопуляций Содержание, % Локализация Функция CD4-CD8-CD3- 4-5 Субкапсулярная зона Предшественник Т-лимфоцитов CD4+CD8+CD3/ TCRap>o/inf 80-85 Кора, глубокие слои Субстрат селекщ клонов CD4+CD8+CD3/ TCRaphi 8-10 Мозговой слой Хелперы CD4-CD8-CD3/ TCRaphi 4-5 То же Киллеры и супрессоры CD4-CD8-CD3/ TCRap+ < 1 II II ? CD4-CD8-CD3/ TCR?8 1 Субкапсулярная зона «Нерестриктиро- ванные» киллерь Примечание. 1о- низкое, int — промежуточное и hi — высокое содержа комплекса CD3 — TCR на поверхности клетки. лий, через который лимфоциты обычно мигрируют в лимфатичесь узлы и групповые лимфатические фолликулы (см. раздел 1.2.4), и, крс преодоления сосудистого барьера, претимоциты должны пройти че] базальные мембраны эпителиального компартмента. В качестве рецепторов хоминга в тимусе выступает ряд молекул, р; познающих (в силу комплементарности) сигнальные структуры на i верхности эндотелиальных клеток. Роль таких проводников претик цитов в тимус выполняют адгезивные молекулы CD44, р^интегри VLA-6 и 4, а также L-селектин (о функциях этих молекул см. также р делы 1.2.4, 2.1.1 и 3.4.1). Все они представлены на поверхности проТ-к. ток. Обработка клеток костного мозга антителами к этим молекул перед внутривенным введением мышам ослабляет их миграцию в тим CD44 распознает производные гиалуроновой кислоты, некоторые мо. кулы поверхности эндотелиальных клеток (адрессины) и компоне межклеточного матрикса фибронектин. Интегрины VLA-4 (адР^) и VU (а6р0 распознают молекулу эндотелия VCAM-1 и белки матрикса — ( ответственно фибронектин и ламинин. Для хоминга в тимус важно раст знавание последовательности аминокислотных остатков RGD (Аг; Gly—Asn), имеющейся в этих молекулах. L-селектин распознает углев< ные остатки мембранных белков клеток гематотимического барье] среди которых особенно важны сахара, имеющие в качестве термина! ных остатков D-p-галактозу и D-p-N-ацетилглюкозамин. Судя по эффс ту антител в осуществлении хоминга претимоцитов в тимус опре; ленную роль играет мембранная молекула Thy-1. Инвазивность протимоцитов проявляется в расплавлении мембрг ных структур благодаря выделению гиалуронидазы и коллагеназы. Ва ную роль в миграции клеток-предшественников в тимус играют хемотг 80
сические сигналы, роль которых, как полагают, выполняют хемокины, в частности 0-хемокин МСР-1 и лимфотаксин, вырабатываемый самими тимоцитами и клетками стромы, а также Р2"микРогл°булин (легкая цепь молекулы МНС I класса). Лимфоидные клетки тимуса. Лимфоидные клетки составляют подав- ляющее большинство клеток тимуса; большая часть их относится к Т- ряду. Развитие Т-клеток и их свойства на основных этапах созревания в тимусе описаны в разделе 1.1.1, посвященном Т-лимфоцитам и обобще- ны в табл. 6. Здесь мы представим лишь некоторые характеристики суб- популяций тимоцитов, соответствующие основным стадиям развития Т-клеток, которые они проходят внутри тимуса (табл. 17). 1. СО4'СО8_-клетки субкапсулярного слоя коры представляют собой предшественники Т-лимфоцитов. На этой стадии происхо- дит перестройка генетического аппарата, приводящая к формиро- ванию «зрелого» гена Т-клеточного рецептора (TCR). Эта стадия развития заканчивается экспрессией комплекса TCR — CD3 на поверхности клеток, т.е. приобретением тимоцитами способности распознавать антиген, а также появлением мембранных молекул CD4 и 8. 2. СО4+СВ8+-клетки — кортизончувствительные незрелые корковые тимоциты. На этой стадии развития происходят отбор клонов, распознающих аутологичные продукты МНС (положительная се- лекция), и выбраковка клонов, которые распознают аутологичные антигенные пептиды в комплексе с аутологичными молекулами МНС (отрицательная селекция). В результате гибнет более 90 % тимоцитов. Выжившие клетки дифференцируются в зрелые Т- клетки, мигрируют на периферию и в мозговой слой. Таблица 18. Клетки и их гуморальные продукты, формирующие микроокружение тимуса Клетки стромы Локализация Функции Гуморальные продукты Эпителиальные «Внутреннее» пространство тимуса Дифференцировка тимоцитов, положи- тельная селекция Гормоны тимуса, КСФ (ГМ, Г, М), ИЛ-1, 6 и 7 Макрофаги Все отделы тимуса Дифференцировка тимоцитов, отрица- тельная селекция ИЛ-1, ИЛ-6, ФНОа, ПГЕ2 Дендритные Кортико-медул- лярная зона Отрицательная селекция клонов ИЛ-6 и 12 Фибробласты Соединительно- тканное про- странство тимуса Формирование стромы ИЛ-7 и 6, все КСФ Миоидные Эпителиальное пространство Пролиферация, дифференцировка тимоцитов Фактор роста тимоцитов, ИЛ-1 81
Таблица 19. Эпителиальные клетки тимуса Типы клеток Локализация Морфологические особенности Маркеры Продукты Камбиаль- ные Субкапсуляр- ная зона Лопатковидная форма, немного- численные отростки Кератин, десмосомы ? Секретор- ные Субкапсуляр- ная и медул- лярная зоны Отростчатые, реже гладкие, содержат вакуоли Кератин, ТЕ 3, 4, MR10, 14, GO, GT, IP1 Тимозины, ти- мулин, тимо- поэтин, АКТГ, ИЛ-1, 6 и 7, нейропептиды, ГМ-, Г-, М-КСФ Клетки- няньки Наружные слои коры Крупные отрост- чатые клетки, со- держат внутри себя лимфоциты МНС I и II классов, кератин a 1-тимозин Ретикуляр- ные Глубокие слои коры Звездчатые, с дес- мосомами, тоно- филаментами, без вакуолей Кератин, МНС I и II классов, ТЕ 3, MP3, 6, IP1, 2 а7-тимозин (?) ИЛ-1 (?) Орогове- вающие Мозговой слой вокруг телец вилочковой железы Отростчатые с десмосомами, с признаками ороговения Кератин, ТЕ19, IP1, 3 (Хб-ТИМОЗИН (?) 3. Медуллярные CD4+CD8“- и CD4-CD8+-thmouhth — зрелые Т клетки со свойствами предшественников соответственно Т-хелпе ров и Т-киллеров. Почти все СВЗ+-тимоциты имеют рецепто] (TCR) ар-типа. Менее 1 % составляют CD3—TCRap+CD4"CD8~ клетки, функция которых неизвестна. На долю СВЗ+-Т-клеток < у8-рецептором приходится 1 % тимоцитов. По-видимому, они по кидают тимус на ранних этапах развития. В тимусе содержится небольшое число (около 1 %) В-лимфоцитов 1 плазматических клеток, функция которых не выяснена. В норме они ло кализуются исключительно в соединительнотканном компартменте и (1 меньшей степени) в мозговом слое. При некоторых заболеваниях числен ность В-клеток в тимусе, особенно в его мозговом слое, увеличивается Появление этих клеток в коре тимуса служит признаком грубых наруше ний структуры тимуса и гематотимического барьера. Микроокружение тимуса. Клетки и гормоны. Развитие Т-лимфоцито] является результатом серии взаимодействий клеток-предшественников i незрелых тимоцитов с компонентами стромы тимуса. Последняя содер- жит несколько типов клеток, создающих опорный каркас и формирую 82
Таблица 20. Характеристика гормонов тимуса Название Аминокислотная последовательность Число остат- ков Мол. масса pl Содер- жание в сыворот- ке крови Эффект тимэк- томии* Тимулин (Zn++-FTS) AcEAKSQGGSD 9 847 7,5 0,5-4,0 пг/мл Отсут- ствие фактора а 1-тимозин AcSDAAVDTSSEITTKDLKE KKEWEEAEN 28 3108 4,2 0,5-2,5 нг/мл = или 4- Тимопоэтин II AcSEFLEDPSVLTKEKLKSEL VANNVTLPAGEGRKDVYVE LYLQHLTAVKR* 49 5562 5,5 Нет данных = или 1 Примечание. = — концентрация гормона не меняется, i — снижается. ’ В структуре тимопоэтина выделена последовательность активного фрагмента ТР-5. щих микроокружение развивающихся тимоцитов (табл. 18). Основной и наиболее специфичный для органа тип клеток ретикулярного каркаса ти- муса — эпителиальные клетки. С помощью моноклональных антител, а также путем изучения линий эпителиальных клеток тимуса и их гумо- ральных продуктов выделено несколько разновидностей этих клеток (табл. 19). Основные из них — секреторные (субкапсулярные и медулляр- ные), ретикулярные, клетки-няньки и клетки, связанные с тельцами Гас- саля1 (участками ороговения эпителиальных клеток). Секреторные клетки, локализующиеся в наружных слоях коры и мозговом слое, выделяют гуморальные субстанции — несколько разно- видностей тимозина, тимулин, тимопоэтин. Часть из них — aj-тимозин, тимулин и тимопоэтин — поступает в кровь и выполняет функцию гор- монов (табл. 20). Полагают, что роль этих субстанций во внутритимусном развитии тимоцитов вспомогательная (более существенны прямые меж- клеточные взаимодействия тимоцитов с клетками стромы), в то время как вне тимуса им принадлежит важное значение в посттимусном «дозре- вании» Т-лимфоцитов и поддержании их функциональной активности, в частности секреции ИЛ-2, о чем уже говорилось в связи с Т-лимфоцита- ми. Снижение уровня сывороточных гормонов при старении, после тим- эктомии, при ряде заболеваний и действии неблагоприятных факторов среды, сопровождающееся ослаблением функций Т-лимфоцитов (в том числе супрессорной), может служить основой развития иммунодефицит- ного состояния, а также проявлений аутоагрессии. Эти ситуации являют- ся поводом для лечебного применения тимусных препаратов (см. раз- дел 5.5.2). До конца не решен вопрос о специфичности для тимуса названных выше гормонов. Известно, что ai-тимозин является N-концевым фраг- ментом более крупной молекулы — cq-протимозина, который образуется 1 По новой номенклатуре — тельца вилочковой железы. 83
Таблица 21. Образование цитокинов и проявление их активности в тимусе Цитокин Клетки-продуценты Эффекты ИЛ-1 Э, М Костимуляция пролиферации ПТЛ и CD3+4-8" ИЛ-2 ПТЛ, CD4+, CD8+ Пролиферация CD4+ и CD8+ ИЛ-3 CD4+ Костимуляция ПТЛ ИЛ-4 ПТЛ, CD4+, CD3+4-8- Пролиферация CD4+ и CD8+ ИЛ-5 CD4+ Костимуляция CD4+ и CD8+ (?) ИЛ-6 Ф, Э, М Костимуляция ПТЛ, CD4+ и CD8+ ИЛ-7 Э, Ф Пролиферация ПТЛ, CD4+, CD8+ и CD3+4-8" ИЛ-9 CD4+ Костимуляция ПТЛ ИЛ-10 CD4+ Подавление пролиферации (?) ИЛ-11 Ф Развитие миелоидных элементов (?) ИЛ-12 М Костимуляция ПТЛ и CD8+ ФНОа ПТЛ, м, э Костимуляция ПТЛ, CD4+ и CD8+ Фактор стволовых Ф Пролиферация ПТЛ, Э (?) клеток Интерферон у ПТЛ, CD4+ CD8+, CD3+4-8" Активация М, Э (?) и ДК (?) Интерферон р Ф Активация М ГМ-КСФ ПТЛ, Ф, м, э Костимуляция CD3+4_8~, развитие М и ДК Г-КСФ Ф, М, Э Развитие миелоидных клеток (?) М-КСФ Ф, М, Э Развитие макрофагов MIPla ПТЛ, CD3+4-8- Хемотаксис ПТЛ (?) MIPip CD3+4-8- Хемотаксис ПТЛ (?) Трансформирующий фактор роста р Ф Подавление пролиферации (?) Примечание. ПТЛ — предшественники Т-лимфоцитов, Ф — фибробласты, М — макрофаги, Э — эпителиальные клетки, ДК — дендритные клетки. Жирным шрифтом выделены цитокины, отсутствие которых (вследствие направленно- го удаления или мутации гена) приводит к существенным нарушениям в тимусе. в самых различных тканях и, вероятно, играет определенную роль во внутриклеточных процессах (как и а]-тимозин, взаимодействует с гисто- ном Н1, участвующим в регуляции активности генов). Некоторые пепти- ды тимуса обладают свойствами нейротрансмиттеров (т.е. участвуют в 84
передаче нервных сигналов) и эндорфинов (эндогенных обезболивающих факторов). К этой группе пептидов, помимо известных нейропептидов, которые также образуются в тимусе, относится тимопоэтин, подавляю- щий передачу импульсов от нервов к мышцам. Существуют две разно- видности этого полипептида — тимопоэтин I и тимопоэтин И, которые отличаются тремя аминокислотными остатками в позициях 1, 6 и 43. Они сходны по биологической активности; на Т-клетки сильнее действует ти- мопоэтин II. Тимопоэтины образуются также клетками эпидермиса, по крайней мере у эмбрионов. Пептид с очень сходной структурой — спле- нин, или тимопоэтин III, образуется в селезенке. Он отличается от тимо- поэтина II остатками в позициях 6, 34 и 43, а от тимопоэтина I — остатками в позициях 1 и 34 и обладает несколько иной биологической активностью. В тимусе образуется также ряд известных гормонов и дру- гих активных пептидов: АК.ТГ, пролактин, вазопрессин, соматостатин, нейрофизин, эндорфины, окситоцин. Пока лишь нонапептид тимулин, активность которого проявляется при условии его связывания с ионами Zn2+, считается фактором, специ- фичным для тимуса. Именно этот пептид, определяемый в сыворотке крови в свободной и связанной с белками-транспортерами форме, вы- полняет роль основного гормона тимуса. Однако понимание природы и биологической роли тимулина серьезно ограничивается тем обстоятель- ством, что до сих пор не выяснено, фрагментом какой более крупной мо- лекулы он является и какие гены детерминируют образование и расщеп- ление этой материнской молекулы. Кроме гормональных субстанций, эпителиальные клетки тимуса сек- ретируют цитокины (табл. 21): ИЛ-1, 6 и 7, колониестимулирующие фак- торы (ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ), по-видимому, «причастные» к собы- тиям дифференцировки и пролиферации тимоцитов. Судя по эффекту удаления цитокиновых генов (с помощью процедуры нокаута — см. раз- дел 5.1.1), наиболее важным для развития тимоцитов среди цитокинов, которые выделяются эпителиальными клетками, является ИЛ-7, эффек- ты остальных цитокинов в тимусе взаимозаменяемы. Ретикулярные клетки эпителия тимуса выполняют каркасную функ- цию. Кроме того, они являются факторами микроокружения развиваю- щихся тимоцитов (см. табл. 20 и рис. 19) и служат источниками сигналов, генерируемых при прямых клеточных контактах. В основе этих контак- тов лежат взаимодействия мембранных молекул CD2 тимоцитов и CD58 (LFA-3) эпителия, а также интегринов тимоцитов с их рецепторами ICAM-1 и VCAM-1 поверхности эпителиоцитов. На СО4~СО8~-тимоци- тах эмбрионов обнаружена экспрессия интегрина а^Р;, который играет ключевую роль во взаимодействии внутриэпителиальных лимфоцитов кишечника с эпителием слизистой оболочки. Возможно, этот интегрин имеет аналогичное значение в тимусе, взаимодействуя с Е-кадхерином эпителиальных клеток. Экспрессируемые на поверхности тимоцитов ин- тегрины VLA-4 и 5 обладают сродством к фибронектину, который не только присутствует в межклеточном матриксе, но и фиксируется на эпи- телиальных клетках. Вероятно, указанные интегрины могут вследствие этого участвовать во взаимодействиях тимоцитов и клеток эпителия. Мо- 85
лекулы CD81 и 27, экспрессируемые на эпителиальных клетках корковой зоны тимуса, очевидно, причастны к 0-селекции (размножению клеток несущих 0-цепь в составе проторецептора, см. 1.1.1). Взаимодействие созревающих тимоцитов с эпителиальными клетками служит условием процесса положительной селекции, который был рас- смотрен выше (см. раздел 1.1.1). В положительной селекции тимоцитое особенно существенно участие эпителиальных клеток, несущих на своег поверхности продукты МНС II класса (1а+-клеток). Следствием контакт- ных взаимодействий является взаимная активация как лимфоидных, так к эпителиальных клеток. Во всяком случае известно, что не только нормаль- ное развитие эпителиального ретикулума тимуса служит условием заселе- ния тимуса лимфоидными элементами, но и это заселение необходимо для поддержания нормального функционального состояния эпителия тимусг и даже для формирования эпителиального ретикулума и кортико-медул- лярной структуры тимуса в онтогенезе. Полагают, что в активации эпителиальных клеток важную роль наря- ду с контактной сигнализацией играет интерферон у, выделяемый тимо- цитами. Функция телец вилочковой железы (телец Гассаля) до сих пор не ус- тановлена. Они обнаруживаются в тимусе не всех видов млекопитающие (имеются у человека, но отсутствуют у мыши). Сама морфология этил телец (округлые образования, которые содержат концентрические орого- вевшие структуры, напоминающие срез луковицы) свидетельствует с том, что они предназначены для утилизации ороговевших клеток, однакс неясно, как она осуществляется. Особым компонентом микроокружения тимоцитов являются клетки- няньки. Они располагаются в нескольких наружных слоях коры и участ- вуют в формировании многоклеточных агрегатов путем эндоцитоза незрелых тимоцитов или обволакивания их. В любом случае тимоциты (до нескольких десятков) оказываются погруженными в клетки-няньки и, вероятно, испытывают действие комплекса факторов, необходимых для их созревания и дифференцирования на субпопуляции. In vitro тимо- циты спонтанно выходят из клеток-нянек через 12 ч, приобретая некото- рые признаки функциональной зрелости. Имеются свидетельства участия клеток-нянек в элиминации погибших тимоцитов (вероятно, тех клеток, которые не были поддержаны положительным отбором), возможно, и в индукции их апоптоза. Во всяком случае способность эпителиальных клеток индуцировать апоптоз тимоцитов многократно показана, и даже предполагают, что они могут участвовать в отрицательной селекции ти- моцитов. Наряду с эпителиальными клетками функционально важными эле- ментами стромы тимуса являются макрофаги и дендритные клетки. Мак- рофаги присутствуют во всех отделах органа. Примерно 50 % йх имеют признаки активации, в частности экспрессируют продукты генов МНС II класса (1а-антиген). Дендритные клетки локализуются преимущественно в кортико-медуллярном сочленении. Все они несут 1а-антиген. Дендрит- ным клеткам тимуса свойственны некоторые черты, «роднящие» их с ти- моцитами: они экспрессируют на своей поверхности молекулы CD1, 4, 8 86
(ар-типа), 2, 5, 25, 44, 45 и Thy-1. Как и другие дендритные клетки, они экспрессируют ряд молекул адгезии, в том числе участвующие в межкле- точных взаимодействиях с лимфоцитами — CD4, 8 и 86. Активированные макрофаги выделяют цитокины — ИЛ-1 и 6, ФНОа, служащие кофакто- рами роста тимоцитов (т.е. факторами, усиливающими действие других ростовых агентов). 1а+-макрофаги и особенно дендритные клетки играют роль факторов микроокружения при дифференцировке Т-хелперов и от- рицательной селекции тимоцитов — выбраковке потенциально аутоагрес- сивных клонов. Эти функции реализуются при условии формирования прямых межклеточных контактов, которые удается воспроизвести in vitro (гроздеобразование между макрофагами и тимоцитами). Ключевую роль при этом играют мембранные молекулы МНС, а также взаимодействие 02_ интегринов с молекулами ICAM-1. Взаимодействие тимоцитов с дендрит- ными клетками является предпосылкой процесса отрицательной селекции (см. раздел 1.1.1), в основе которой лежит распознавание аутологичных молекул МНС рецепторами TCR тимоцитов. При этом адгезивные взаи- модействия играют вспомогательную роль в качестве факторов, усиливаю- щих основной сигнал. Скорее всего в тимус не поступают зрелые дендритные клетки, а воз- можно, и макрофаги. Они образуются в тимусе из клеток-предшествен- ников, общих для миелоидного и лимфоидного рядов, мигрирующих из костного мозга. В пользу этого свидетельствуют упомянутые черты сход- ства мембранного фенотипа дендритных клеток и Т-лимфоцитов. Внутри тимуса имеется достаточно факторов, способных обеспечить развитие как дендритных клеток (ГМ-К.СФ, ИЛ-4), так и макрофагов (ГМ-КСФ, М-КСФ). Кроме рассмотренных клеток, в обеспечении развития тимоцитов участвуют и другие клеточные элементы. Так, фибробласты служат ис- точниками ряда гуморальных факторов — ИЛ-7 и 6, КСФ, фактора ство- ловых клеток, трансформирующего фактора роста р и др. Показана роль клеток мезенхимального происхождения в качестве факторов микроокру- жения на самых ранних стадиях развития тимоцитов. Некоторые мало- изученные ростовые факторы выделяются миоидными клетками. Миоид- ные клетки, лаброциты, а также малочисленные В-лимфоциты, присут- ствующие в тимусе, являются компонентами внутритимусного микро- окружения. В его формировании участвуют также сами тимоциты, выде- ляющие цитокины и контактирующие друг с другом. Помимо клеточных элементов, важной составной частью микроокру- жения тимоцитов является межклеточный матрикс. На поверхности ти- моцитов, в частности наиболее юных СВ4_СВ8_-клеток, содержатся интегрины, позволяющие тимоцитам взаимодействовать с основными компонентами межклеточного матрикса (о чем уже упоминалось в связи с миграцией клеток-предшественников в тимус). Инволюция тимуса. Тимус достигает наибольшей величины и актив- ности (образование гормонов, поддержание дифференцировки и проли- ферации тимоцитов) в возрасте 1 года, когда его объем у человека состав- ляет 25 см3. Начиная с этого возраста, происходит возрастная инволюция тимуса, сопровождающаяся уменьшением объема эпителиального ком- 87
партмента (у человека он замещается жиром и соединительной тканью, его масса снижается меньше, чем у мышей). Снижается также секреци гормонов, причем именно падение секреторной активности тимуса сл] жит самым ранним функциональным проявлением возрастной инволк ции тимуса, которое регистрируется уже в период полового созревани: Ежегодно теряется около 3 % активной ткани тимуса; теоретический рас чет показывает, что полная инволюция тимуса должна происходить в во: расте 120 лет. Среди популяций тимоцитов наиболее сильно убывает чис ленность кортикальных СГ>4+СВ8+-клеток. Тем не менее в тимус посте янно поступают костномозговые предшественники, и из тимуса эмигрр руют зрелые Т-клетки, хотя интенсивность этого потока снижается. После 50—60 лет регистрируется ослабление функции Т-клеток (раш ше других страдает функция Т-хелперов) и еще позже снижается их чис ленность в кровотоке и органах. При возрастной инволюции тимус благоприятное влияние оказывают препараты гормонов тимуса, а у экспс риментальных животных — подсадка тимуса новорожденных. Считаете) что возрастная инволюция органа определяет старение иммунной систе мы, а через нее — в значительной степени старение всего организма. С возрастом повышается автономность популяции периферически Т-клеток вследствие усиления способности этой популяции к самопол держанию: периферические Т-клетки становятся менее зависимыми с тимуса. Механизмы внетимусной дифференцировки и самоподцержани Т-лимфоцитов изучены недостаточно и в настоящее время привлекают себе пристальное внимание исследователей. 1.2.3. Периферические лимфоидные органы Как отмечалось, периферический отдел иммунной системы включае систему органов (лимфатические узлы, селезенка, лимфоидные структур) и диффузная лимфоидная ткань, связанные со слизистыми оболочками кожей), объединенных системой рециркуляции с относительной автоно мией субсистем, которые связаны с различными отделами слизисты оболочек (желудочно-кишечного тракта, бронхолегочного аппарата, уро генитального тракта) и кожи. 1.2.3.1. Лимфатические узлы Лимфатические узлы дренируют лимфу с определенных регионов тела 1 контролируют появление в них чужеродных объектов — антигенов и и носителей. В некоторых отделах организма, например вдоль крупны сосудов на брыжейке, узлы располагаются цепочками или образую конгломераты. Они имеют бобовидную форму и размеры от зерна д< миндального ореха. Схематическое изображение структуры лимфатического узла пред ставлено на рис. 22. Приносящие лимфатические и кровеносные сосу ды проникают в узел с его выпуклой стороны и впадают в краевой си нус, через который лимфа проникает в ткань коры. Узел покрыт кап сулой, от которой внутрь органа отходят тонкие соединительнотканньк 88
Рис. 22. Строение лимфатичес- кого узла. 1 — афферентный лимфатичес- кий сосуд; 2 — капсула; 3 — кра- евой синус; 4 — первичный лим- фоидный фолликул; 5 — на- ружные слои коры (перифолли- кулярное пространство); 6 — паракортикальная зона; 7 — мозговой слой; 8 — вторичный фолликул; 9 — зародышевый центр; 10 — артерия; 11 — вена; 12 — эфферентный лимфатичес- кий сосуд; 13 — медуллярный си- нус; 14 — медуллярный шнур. перегородки — трабекулы. Эфферентные сосуды выходят с вогнутой поверхности узла. Лимфатический узел содержит наружную, корковую и более глубо- кую, медуллярную, зоны. В наружной части коры имеются фолликулы, которые служат средоточием В-лимфоцитов; среди стромальных элемен- тов фолликулов находятся фолликулярные дендритные клетки. При раз- витии иммунного ответа в фолликулах появляются центры размножения (содержащий их фолликул называется вторичным). При этом дендрит- ные клетки длительное время сохраняют на своей поверхности антиген, что является условием для формирования в зародышевом центре клеток памяти. В пространстве, окружающем фолликулы, содержатся как В-, так и Т-лимфоциты. Фолликулярные дендритные клетки отсутствуют у мышей с разрушенными генами лимфотоксинов а и 0; параллельно бло- кируются развитие лимфатических узлов и формирование центров раз- множения в фолликулах селезенки. Очевидно, «выпадающие» морфо- генетические процессы контролируются лимфотоксинами. Глубокие слои коры лимфатических узлов — паракортикальные зо- ны — содержат почти исключительно Т-лимфоциты. Эти зоны недоразви- ты у наследственно бестимусных животных (голых мышей-носителей му- тации nude) и опустошаются после тимэктомии, что послужило основанием для обозначения их как тимусзависимых зон. Особенностью стромы этих участков лимфатических узлов является присутствие интер- дигитальных клеток. В различных участках лимфатических узлов, особен- но в зонах одновременного присутствия Т- и В-лимфоцитов, содержатся макрофаги. Мозговая зона лимфатических узлов содержит мякотные шнуры, об- разованные ретикулиновыми волокнами, лимфоцитами обоих классов (с преобладанием В-лимфоцитов) и плазматическими клетками, число ко- торых особенно увеличивается при иммунном ответе. Между мякотными шнурами находятся медуллярные синусы — скопления лимфы, собирае- мой в эфферентные лимфатические сосуды. Клеточный состав лимфатических узлов приведен в табл. 15. Из пред- 89
Красная пульпа Белая пульпа Рас. 23. Строение белой пульп селезенки. 1 — фолликул с зародышевы центром; 2 — мантия (В-клето1 ная зона); 3 — периартериал ная муфта (Т-клеточная зона). ставленных в ней данных следует, что в узлах преобладают Т-лимфоцил Хотя в них развивается как гуморальный, так и клеточный ответ на анл гены, полагают, что второй тип ответа в большей степени отражает спещ фику иммунологической функции лимфатических узлов. В основе это] лежат особенности микроокружения лимфатических узлов, которые в у< ловиях антигенной стимуляции способствуют дифференцировке CD4" клеток преимущественно в направлении «воспалительных» хелперов тиг ТЫ. Последние обеспечивают развитие клеточных иммунных реакци Отличия в структуре и функции лимфатических узлов, локализующихся различных отделах организма, невелики. Наибольшим своеобразием о личаются брыжеечные лимфатические узлы, в которых несколько вып процент В-лимфоцитов, особенно несущих мембранный IgA. Кроме тог они занимают особое место в рециркуляции лимфоцитов (см. ниже). 1.2.З.2. Селезенка Селезенка расположена на гематогенных путях распространения антип нов, что отличает ее от лимфатических узлов, контролирующих лимфап ческие пути, и обусловливает единичность этого органа (в отличие ( множественности лимфатических узлов, дренирующих определенные р гионы тела). Селезенка обладает более комплексными функциями, че лимфатический узел: у многих животных в ней осуществляется гемопоэ она служит фильтром для старых эритроцитов, резервуаром, регулируй щим объем циркулирующей крови и т.д. Селезенка окружена плотной капсулой, от которой внутрь отход; трабекулы, несущие сосуды (как и в лимфатических узлах). Содержимс селезенки представляет собой массу красного цвета (красная пульпа), которую вкраплены белесоватые зерновидные тельца (белая пульпа Строение белой пульпы схематически иллюстрировано рис. 23. Бела пульпа связана с артериолами селезенки и имеет наиболее прямое отношс ние к иммунологической функции органа. Артериолы, отходящие от тра 90
бекулярных артерий, окружены лимфоидными скоплениями, муфтами, образованными в основном Т-лимфоцитами и являющимися тимусзави- симыми зонами селезенки. Муфты соседствуют с фолликулами, аналогич- ными фолликулам лимфатических узлов и образованными В-лимфо- цитами. В фолликулах от артериол отделяются капилляры, открывающие- ся в ткань, которая окружает фолликулы, и муфты — маргинальную зону. Последняя отделяет белую пульпу от красной, в которую переходит арте- риола. В маргинальной зоне В-лимфоциты преобладают, но здесь присут- ствуют и Т-клетки. Плотность лимфоцитов в маргинальной зоне меньше, чем в фолликулах и муфтах. Структура стромы тимусзависимых и тимус- независимых зон селезенки напоминает таковую аналогичных зон лимфа- тических узлов и характеризуется теми же особыми типами клеток. В красной пульпе наряду с элементами крови, сосредоточенными в расширенных сосудах — синусоидах, содержатся губчатые скопления ткани, в которой присутствуют макрофаги, плазматические клетки и лим- фоциты обоих классов. Плазматические клетки обнаруживаются в селе- зенке даже вне явно выраженных иммунных реакций. Это связано с тем, что в организме всегда присутствуют антигены (например, пищевые), на которые реагирует прежде всего селезенка. «Спонтанные» антителообра- зующие клетки селезенки и являются отражением этого фонового уровня иммунных реакций организма, тем более что селезенка служит тем орга- ном периферического отдела иммунной системы, в котором существуют оптимальные условия именно для развития гуморального ответа. В табл. 16 приведены клеточный состав лимфоцитов селезенки. В се- лезенке В-лимфоциты преобладают над Т-клетками, что также свиде- тельствует о преимущественной ориентации органа на развитие гумо- рального иммунного ответа (в противоположность лимфатическим узлам). Среди Т-лимфоцитов преобладают, как и в других периферичес- ких органах иммунной системы, Т-хелперы. Однако в красной пульпе со- средоточены почти исключительно Т-клетки с супрессорной актив- ностью. Здесь имеются также 0-клетки (т.е. клетки, лишенные маркеров Т- и В-лимфоцитов), в том числе значительное число NK-киллеров. В селезенке много макрофагов, и уровень их функциональной активнос- ти достаточно высок. В связи с тем что селезенка служит хранилищем крови, регулятором ее циркуляторного объема и местом, где задержива- ются (при участии макрофагов) старые эритроциты, в суспензиях спле- ноцитов всегда имеется много красных кровяных элементов. Селезенка лишена афферентных лимфатических сосудов. Эфферент- ные лимфатические сосуды выходят рядом с венами, собирающими кровь от синусоидов красной пульпы, в воротах селезенки — там же, где в селезенку проникает артерия. 1.2.З.З. Лимфоидные ткань и структуры, связанные со слизистыми оболочками Лимфоидные структуры и диффузные лимфоциты свойственны всем основным типам слизистых оболочек — в пищеварительном, бронхоле- гочном и урогенитальном трактах. Это огромный по объему отдел иммун- 91
ной системы: площадь поверхности слизистых оболочек у человека с ставляет 400 м2 (для сравнения: поверхность кожи — 1,8 м2). Наиболыш объем данных накоплен относительно лимфоидной ткани, ассоциирова] ной со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта, на приме] которой и будет рассмотрен этот отдел иммунной системы. Различают структурированную и диффузную составляющие лимф» идной ткани, ассоциированной со слизистыми оболочками. Первг включает в себя единичные некапсулированные фолликулы, а так» такие организованные формирования лимфоидной ткани, как миндал! ны, аппендикс, групповые лимфатические фолликулы (пейеровы бляи ки). Вторая составляющая представлена единичными клетками, и] фильтрирующими эпителиальные пласты слизистых оболочек (Т-лимф< циты) и собственную пластинку (lamina propria), а также подслизисть слой (преимущественно В-лимфоциты). Другая классификация лимф< идных образований, связанных со слизистыми оболочками, основана i учете места этих образований в иммунных процессах: их разделяют i индуктивные и эффекторные участки. К первым в пищеварительнс тракте относятся миндалины, групповые лимфатические фолликулы региональные лимфатические узлы, ко вторым — межэпителиальнь лимфоциты и собственная пластинка. Первые осуществляют проце» восприятия и первичной обработки антигена, вторые реализуют имму1 ные реакции (подробнее об иммунном ответе, связанном со слизистый оболочками, см. в разделе 4.1.2). Лимфоидные структуры слизистых оболочек. Миндалины (глоточнь и небные) представляют собой скопления лимфоидной ткани между сл1 зистой оболочкой, формирующей крипты, и соединительнотканны слоем, который служит источником кровоснабжения миндалин. Лимф» циты в миндалинах находятся в фолликулах и межфолликулярном пр( странстве. Фолликулы миндалин в принципе устроены так же, как других лимфоидных органах, основой межфолликулярного пространен служит ретикулярная строма, в петлях которой располагаются лимфощ ты. В миндалинах преобладают В-лимфоциты с повышенной по сравн нию с таковыми в селезенке долей клеток, несущих мембранный I& Аппендикс представляет собой почти сплошной конгломерат фоллик лов, окружающих просвет отростка. Групповые лимфатические фолликулы (пейеровы бляшки) имеют тр отдела (рис. 24). В части бляшки, противоположной просвету, располап ется В-зона — фолликул (как и любые фолликулы, заселенные В-лимф< цитами), обычно содержащий зародышевый центр. Среди В-клеток этс зоны 20 % приходится на долю лимфоцитов, несущих на своей поверхно< ти IgA. Глубже располагается артериола с окружающими ее лимфоцитам] принадлежащими в основном к Т-ряду. На долю Т-клеток в групповь лимфатических фолликулах (пейеровых бляшках) приходится 45 % лил фоцитов. Подавляющее большинство из последних имеет рецептор (TCI типа а₽ и лишь менее 5 % — у5. СВ4+-клетки составляют 60 % от чис; Т-лимфоцитов, СВ8+-клетки — 25 %, СВЗ+СВ4~СВ8~-клетки — 5 °/< В зоне, прилегающей к просвету кишки, находится купол бляшки — уча< ток, содержащий Т- и В-лимфоциты, которые контактируют с эпителием 92
Рис. 24. Строение групповых лимфати- ческих фолликулов (пейеровой бляшки). 1 — энтероциты; 2 — эпителиальный купол (М-клетки); 3 — субэпителиаль- ный купол; 4 — фолликул; 5 — зароды- шевый центр; 6 — Т-зависимая зона. Этот эпителий образован так называемыми М-клетками — микроскладча- тыми или фолликулоассоциированными клетками. Это ворсинчатые клет- ки, содержащие небольшое число лизосом, непосредственно контакти- руют с окружающими их лимфоцитами и ответственны за проведение антигенов из просвета кишечника внутрь групповых лимфатических фол- ликул. Высказывалось предположение о том, что пейеровы бляшки, особен- но их купол, причастны к формированию популяции В-лимфоцитов. Эти представления нашли подтверждение лишь в отношении групповых лим- фатических фолликул толстой (подвздошной) кишки овец. На долю В-клеток в этих фолликулах приходится до 90 % лимфоцитов. Имеются данные, свидетельствующие о возможном участии сальника в В-лимфо- поэзе у млекопитающих других видов. В лимфоидных структурах кишеч- ника отмечается массовая гибель В-лимфоцитов, что иногда связывают с процессом формирования клонального репертуара В-клеток. К лимфоидным органам, связанным с кишечником, относится цент- ральный лимфоидный орган птиц, предназначенный для обеспечения развития В-лимфоцитов — бурса (сумка) Фабрициуса. Закладка стромы этого органа, являющейся производным слизистой оболочки кишечника, происходит у кур на 8-е сутки развития, после чего она в течение 6 сут заселяется клетками-предшественниками из печени эмбрионов. Бурса располагается в хвостовой части кишечника и соединяется с клоакой. По структуре она сходна с тимусом: разделена на корковую и мозговую части, первая из которых имеет дольчатое строение. Удаление бурсы сразу после рождения приводит к недоразвитию популяции В-лимфоци- тов. Однако есть данные, что В-лимфоциты, созревшие в бурсе, мигри- руют в тимус и лишь после этого заселяют периферические лимфоидные органы. В отличие от тимуса бурса содержит фолликулы и, возможно, со- вмещает свойства центрального и периферического органа иммунной системы. Эпителиальные клетки бурсы секретируют пептидные субстан- ции, вероятно являющиеся гормонами; их структура и биологическая ак- тивность не охарактеризованы. Через 4 мес после рождения происходит атрофия бурсы со снижением ее секреторной активности. В реализации этого процесса участвуют половые стероиды. Таким образом, имея сход- 95
ство с тимусом, бурса по ряду свойств не может служить его полным клеточным аналогом. Диффузная лимфоидная ткань. Диффузная лимфоидная ткань кише ника представлена лимфоцитами собственной пластинки (lamina ргорг и межэпителиальными лимфоцитами. Первые — это преимуществен В-клетки, несущие на поверхности IgA, а также плазматические клетк которые в своей цитоплазме содержат IgA (избирательность в отношен: сосредоточения здесь IgA+-KneTOK проявляется в условиях антигенн активации и отсутствует у стерильных животных). В-клетки собственн пластинки происходят в основном от В1-клеток брюшной полости. Ко центрация лимфоцитов в lamina propria и подслизистом слое кишечни достигает 75—150 млн в 1 мм3. Присутствующие здесь Т-клетки состз ляют часть рециркулирующего пула и мало отличаются от соответству щих клеток в селезенке и лимфатических узлах за исключением веско; ко более высокой доли у6+-Т-клеток (8 %), а также a0+-CD4_CD8_-KJ ток (5 %). Межэпителиальные лимфоциты — это почти исключительно Т-кл< ки. У человека выделяют три популяции межэпителиальных Т-клетс 75 % их приходится на СВЗ+-клетки, имеющие рецептор сф-типа, эн прессируются также CD2, 5 и 7. Подавляющее большинство (85—95 клеток этой группы несут субпопуляционный маркер CD8 и лишь 1 15 % — CD4. Для них характерно также наличие маркера клеток памя CD45R0. О том, что межэпителиальные а|3+-Т-клетки не являются «г ивными» лимфоцитами, свидетельствуют низкое их содержание у гноз бионтов и постепенное нарастание с возрастом их числа в кишечню В толстой кишке а0+-клеток больше, чем в тонкой кишке. Кишечн СВ4+-Т-клетки в условиях антигенной стимуляции дифференцируются основном в направлении ТЬ2-хелперов, обеспечивающих развитие гуы рального иммунного ответа. Вторая популяция межэпителиальных Т-клеток представляет соб СБЗ+-клетки, несущие TCRyS-типа. На их долю приходится около 15 Т-клеток этой локализации; их отличительная особенность — отсутств мембранной молекулы CD5; 70 % у8+-межэпителиальных клеток кише ника лишены маркеров субпопуляций, 30 % несут CD8. Спектр семейс Vy- и VS-генов, которые используются при построении рецептора эт клеток, отличается от такового у8+-клеток, локализующихся в других р гионах иммунной системы. Часть этих клеток экспрессирует гены RA кодирующие рекомбиназы, ответственные за перестройку генов ТС Это свидетельствует о дифференцировке данной субпопуляции у8+-кл ток в кишечнике, т.е. об их независимости от тимуса. Именно по особе ностям субпопуляции у8+-Т-клеток различаются слизистые оболоч] желудочно-кишечного и урогенитального тракта; в последнем у сам присутствуют Т-клетки, несущие Уу4-содержащий рецептор, эти клет: выселяются из тимуса в эмбриональном периоде. Среди межэпителиальных Т-лимфоцитов, несущих рецептор a типа, преобладают (75 %) СВ4“СВ8+-клетки, тогда как на дол CD4+CD8“-KHeTOK приходится всего 7 %. В межэпителиальном пр странстве слизистых оболочек встречаются также CD4+CD8+ (7 %) 94
Таблица 22. Особенности Т-лимфоирпов, дифференцирующихся в тимусе и вне его Свойство Тимусзависимые Т-клетки Тимуснезависимые Т-клетки Экспрессия генов RAG Нет Есть в части клеток Экспрессия TCR Сильная Слабая или умеренная Семейства Vy-генов, используемые при построении TCR-y8 Vyl.l, Vyl.2, Vy2, Vy3 Vy4, Vy5 Цепи, передающие сигнал от CD3-TCR С, £-цепь и у-цепь FcRII Цепи CD8, экспресси- руемые на СВ8+-клетках a, p а Локализация Во всех органах иммун- ной системы, особенно в лимфатических узлах, групповых лимфатичес- ких фолликулах и селе- зенке В печени, костном мозгу, брюшной полости (TCR- aploCD4“8“, часть у8+-кле- ток); в слизистой оболочке кишечника (Vy4+ и TCR- ар+СО8а+р~-клетки), эпи- дермисе (часть TCRy5+-Kne- ток), легких (Уу5+-клетки) CD3+CD4~CD8“-ap-клетки (10 %), т.е. незрелые Т-лимфоциты. Для межэпителиальных клеток характерен высокий уровень гибели по ме- ханизму апоптоза. Еще одна популяция межэпителиальных лимфоцитов имеет мембранный фенотип CD3~CD7+. Природа этих клеток не вы- яснена. Они обладают морфологическими признаками цитотоксических лимфоцитов (содержат внутриклеточные гранулы). Возможно это юные формы Т-лимфоцитов, но нет полной уверенности, что они относятся к Т-клеткам. В слизистых оболочках пищеварительного, дыхательного и урогени- тального тракта содержится два типа нелимфоидных клеток, выполняю- щих иммунологические функции. Дендритные клетки слизистых оболо- чек подобно белым отростчатым эпидермоцитам (клетки Лангерганса) кожи обладают выраженной способностью связывать антиген, но низкой способностью представлять его Т-лимфоцитам. Активация этих клеток происходит или после миграции в лимфатические узлы, или местно, в ус- ловиях воспаления под влиянием ГМ-КСФ и ФНОа. Дендритные клетки легких обмениваются в течение 2—3 сут и покидают слизистую оболочку с током лимфы (этот процесс ускоряется в участках воспаления). Другой тип иммунологически значимых нелимфоидных клеток сли- зистых оболочек — сами эпителиальные клетки. В покоящемся состоя- нии они не имеют признаков иммуноцитов, однако в условиях воспа- ления экспрессируют молекулы МНС II класса, а также корецепторную молекулу В7 (CD80) и секретируют ИЛ-7. Вследствие этого они начина- ют выполнять роль клеток, представляющих антиген СО4+-хелперам, и стимулируют пролиферацию Т-клеток (особенно CD8+). 95
Таким образом, для лимфоидных скоплений, локализующихся в сли- зистых оболочках различных органов и систем, характерны организация в виде комплексных лимфоидных органов (групповые лимфатические фолликулы, миндалины) или единичных фолликулов, а также диффузное распределение лимфоидных клеток в эпителиальном пласте (главным об- разом Т-лимфоцитов, в том числе у5+-Т-клеток) и в подслизистом слое (в основном В-лимфоцитов и плазматических клеток, содержащих IgA). Следует упомянуть также о лимфоцитах Т-ряда, которые присутству- ют в печени взрослых животных. Они имеют фенотип CD3+CD4_CD8“ В220+, который совпадает с фенотипом необычных Т-клеток, накапли- вающихся в периферических лимфоидных органах мышей — носителей мутаций 1рг и gid (см. разделы 3.5.3 и 5.3.3). Полагают, что клетки с этим фенотипом дифференцируются в печени, т.е. являются еще одним при- мером развития Т-клеток вне тимуса. Некоторые отличительные черты Т-клеток, созревающих в тимусе и вне его, отражены в табл. 22. Наконец, особым отделом иммунной системы является брюшная по- лость. В ней сосредоточиваются клетки СО5+-субпопуляции В-лимфо- цитов, СОЗ+СО4_СО8“-субпопуляции оф-Т-клеток и некоторые разно- видности у6+-Т-клеток. У этих клеток есть три общие черты. Во-первых, они образуются вне обычных мест дифференцировки В- и Т-клеток (со- ответственно костного мозга и тимуса), возможно, в самой брюшной по- лости. Во-вторых, они обладают относительно примитивной антиген- распознающей способностью, позволяющей распознавать скорее группы антигенов, чем индивидуальные эпитопы. В-третьих, среди них высока доля аутореактивных клеток. Физиологическая значимость этого ком- партмента иммунной системы пока не выяснена. 1.2.З.4. Лимфоидная ткань, связанная с кожей Другим компартментом иммунной системы, имеющим очень большой объем и связанным с барьерной системой, является лимфоидная ткань, ассоциированная с кожей. Для нее характерны три главных клеточных элемента — белые отростчатые эпидермоциты (клетки Лангерганса), лим- фоциты и кератиноциты (табл. 23). Белые отростчатые эпидермоциты, описанные выше (см. раздел 1.1.2), являются антигенпредставляющими клетками, связывающими и обрабатывающими антиген, но неспособными представлять его Т-хелпе- рам и активировать их. Они локализуются в эпидермисе. При проникно- вении в него антигена эти клетки фиксируют его и мигрируют в регио- нальный лимфатический узел,\созревая в процессе миграции до стадии интердигитальной клетки, способной активировать Т-хелперы. Лимфоидные клетки эпидермиса представлены исключительно Т-лимфоцитами, несущими <х(3- или у8-рецептор (см. табл. 23). Первые по- стоянно выполняются за счет созревания в тимусе; они составляют часть общего рециркулирующего пула лимфоцитов. yS-T-клетки частично пред- ставляют собой потомки клеток, выселившихся из тимуса в эмбриональ- ном периоде; их маркером является продукт УуЗ-гена, который содер- жится в составе их TCR. Другую группу образуют Уу5+-клетки, которые, 96
Таблица 23. Клетки кожи, связанные с выполнением иммунологических функций Название Лока- лиза- ция Основные маркеры Продукты* Функции Л и м ф о ц и т ы аР+-Т-хел- перы э, Д CD3, 4, 2, 5, 7, CLA ВК-2, 3, 4, 5, 6, 10, ИФНу, ФНОа, р Хелперы (в основном Thl) аР+-Т-кил- леры Э, д CD3, 8аР, 2, 5, 7 ИЛ-2, ИФНу Пре-киллеры, супрессоры (?) y8(Vy3+)-T- клетки э CD3, 2, 5, 7 ИЛ-2, ИФНу (?) Пре-киллеры (?) y8(Vy5+)-T- клетки э CD3, 8аа, 2, 5, 7 ИЛ-2, ИФНу (?) Пре-киллеры (?) В-клетки д IgM, CD19, 20 Ig**, ИЛ-1 Предшественники продуцентов антител Вспомог ательные и стромальные клетки Клетки Лангерганса э la, CDla, 4, 40 ИЛ-1, 12 (?) Обработка и пред- ставление антигена Макрофаги д CD14, 15, 32, 64 ИЛ-1,6, 11, 12, 15, ФНОа, ИФНа, хемокины Фагоцитоз, выде- ление цитокинов Фибробласты д ИЛ-6, 7, КСФ, ИФНр, хемокины Выделение цитокинов Эндотелиаль- ные клетки д ICAM-2, CD34, ICAM-Г, ELAM* и др. ИЛ-6, 7, КСФ, ИФНр, хемокины Контроль миграции Кератиноциты э Кератин, 1а* ИЛ-1, 3,6, 7, 8идр. хемокины, КСФ, ФНОа, ИФНар Механическая за- щита, представле- ние антигена, ис- точник цитокинов Примечание. Э — эпидермис; Д — дерма; ИФН — интерферон. * Только для активированных клеток. Для плазматических клеток (потомков В-лимфоцитов). как полагают, созревают вне тимуса. В коже мышей присутствуют уни- кальные уб+-Т-лимфоциты, имеющие морфологию дендритных клеток. Считают, что у5+-Т-клетки кожи осуществляют первую линию защиты, реагируя на наиболее распространенные детерминанты бактериальных антигенов, в частности стресс-белки (белки теплового шока). В дерме присутствуют как Т-, так и В-лимфоциты, поступающие в нее из рецирку- ляции. Кератиноциты, т.е.эпидермальные клетки, в неповрежденной коже служат барьерными клетками, строго говоря не относящимися к иммун- ной системе. Однако под влиянием повреждения и действия микроорга- 4 1092 97
Таблица 24. Нормальные показатели содержания в крови взрослого человека основных популяций и субпопуляций лимфоцитов [Симонова А.В. и др., 1989] Клетки Процент от числа мононуклеаров, М ± т* Интервал колебаний” Число клеток в 1 мкл, М ± m Интервал колебаний В (CD72+) 8± 1 5-12 240 ±22 100-500 NK (CD16+) 15 ± 2 5-25 380 ± 33 100-650 Т (CD3+) 69 ± 1 55-80 1500 ±76 800-2200 CD2+ 78 ± 1 68-88 1700 ±75 1100-2500 CD4+ 41 ± 1 31-49 950 ±37 600-1600 СВ8+ 18 ± 1 19-37 622 ± 35 300-800 * Содержание лимфоцитов 19—37 %, абсолютное число в 1 мкл 1200—3000; отношение CD4+/CD8+ составляет 1,2—2,5. низмов и их продуктов, а затем цитокинов они активируются, экспрес- сируют молекулы адгезии (Е-кадхерин, Е-селектин и т.д.) и начинают выделять разнообразные цитокины (ИЛ-1,, 3, 6 и 7, ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ), служащие пусковыми факторами и медиаторами иммунных ре- акций в коже. Особого внимания заслуживает специфичность миграции в кожу лимфоцитов. Установлено, что такая специфичность существует лишь в отношении проникновения Т-клеток в эпидермис, причем имеющиеся данные относятся только к СВ4+-клеткам. Проникновению в кожу спо- собствует экспрессия на поверхности CD4+-клеток памяти или активи- рованных Т-клеток маркера CLA, распознаваемого Е-селектином активированных клеток эндотелия. Экспрессия CLA индуцируется пред- почтительно при активации Т-клеток через молекулу CD2 при участии трансформирующего фактора роста 0 и ИЛ-2. Другим проводником Т-клеток в эпидермис является интегрин ар07, распознающий молекулу Е-кадхерина, которая экспрессируется на активированных кератиноци- тах. Указанный интегрин присутствует на активированных СВ4+-лимфо- цитах и клетках памяти; как и в случае с CLA, его экспрессии способ- ствует трансформирующий фактор роста р. Наконец, сама молекула CD4 благодаря ее сродству с молекулами МНС II класса, которые присутству- ют на активированных кератиноцитах, также, как полагают, способствует миграции в эпидермисе преимущественно СВ4+-Т-лимфоцитов. Обсуждается возможная роль кожи и слизистой оболочки кишеч- ника как мест внетимусного развития Т-лимфоцитов. Основанием для этого служит не только наличие в этих образованиях, как и в тимусе, контакта лимфоцитов с эпителиальными клетками, но и обнаружение пептидных продуктов эпителиальных клеток, родственных гормонам тимуса. Кроме того, как указывалось, в коже присутствуют тимуснеза- висимые Vy5+-Т-клетки. Однако имеющиеся в настоящее время данные недостаточны для положительного ответа на вопрос о возможности со- зревания здесь Т-клеток. 98
1.2.З.5. Кровь и лимфа Кровь является местом временного пребывания клеток иммунной систе- мы, будучи «руслом», по которому они перемещаются из кроветворных органов в периферические органы иммунной системы, а для лимфоци- тов — также одним из путей рециркуляции. К путям рециркуляции лим- фоцитов относится также лимфа, в которую лимфоциты проникают из лимфатических узлов и лимфоидной ткани слизистых оболочек и из которой они поступают в кровоток. Содержание в крови лимфоцитов составляет 20—35 % (обычно — около 25 %), моноцитов — 5—8 %, нейтрофильных гранулоцитов — 60— 75 %. Представительство в ней основных популяций и субпопуляций лимфоцитов отражено в табл. 16 и 24. Более высокое содержание Т-, чем В-клеток, связано, очевидно, с особенностями их рециркуляции — боль- шей интенсивностью рециркуляции Т-лимфоцитов. Преобладание суб- популяции CD4+-лимфоцитов (хелперов) над CD8+-киллерами отчасти также связано с разной скоростью их рециркуляции, но в целом отражает сходное соотношение клеток этих субпопуляций в периферическом отде- ле иммунной системы. Кровь и присутствующие в ней клетки, в частности лимфоциты, бу- дучи наиболее доступными для исследования, изучены особенно подроб- но. При этом следует иметь в виду, что они представляют всего лишь около 0,1 % от общего пула лимфоцитов и свойства циркулирующих лимфоцитов могут не вполне объективно отражать состояние этих клеток в органах иммунной системы. Во-первых, в рециркуляцию поступают в целом наиболее «здоровые» клетки, способные к активному перемеще- нию и взаимодействию с тканевыми барьерами. Во-вторых, разновиднос- ти лимфоцитов различаются по способности к рециркуляции и, следо- вательно, вероятности оказаться в кровотоке. Наконец, в крови почти от- сутствуют делящиеся клетки и клетки, участвующие в данное время в ре- акции на антиген. Напротив, популяция клеток памяти может быть предпочтительно представлена в крови в силу их высокой способности к рециркуляции. Сказанное в еще большей степени относится к лимфе, в которой нет примеси свежеобразованных клеток, перемещающихся из костного мозга в органы, а присутствуют практически исключительно рецирку- лирующие лимфоциты, преимущественно Т-класса. Содержание в лимфе лимфоцитов составляет около 95 %, из них 85 % приходится на долю Т-клеток с преобладанием СВ4+-лимфоцитов над СО8+-клетка- ми. В лимфе, оттекающей от ноги человека, содержится 1—3 % вуале- видных клеток — отростчатых клеток, несущих на своей поверхности молекулы МНС II класса и представляющих собой переходную стадию развития между белыми отростчатыми эпидермоцитами (клетками Лан- герганса) и дендритными (интердигитальными) клетками лимфатичес- ких узлов; лимфа является для них транспортным путем при миграции из кожи (где они получают активационный сигнал и связывают анти- ген) в лимфатические узлы (где они взаимодействуют с Т-хелперами и запускают иммунный ответ). 99 4*
Кровоток Рис. 25. Рециркуляция лимфоцитов. Стрелки — направления движения лимфоцитов; Афф. — афферентная; Эфф. — эфферентная. 1.2.4. Рециркуляция лимфоцитов Лимфоциты периферического отдела иммунной системы объединены в единый пул благодаря непрерывной рециркуляции (рис. 25). Под рецир- куляцией понимают процесс перехода клеток из кровяного русла в орга- ны, оттуда в лимфу и вновь в кровоток. При этом клетки, покинувшие конкретный лимфатический узел, возвращаются в любой узел или селе- зенку, что и обеспечивает перемешивание рециркулирующих лимфоцитов (с оговорками, которые будут сделаны далее). Большинство зрелых «на- ивных» лимфоцитов поступает из органов в циркуляцию и обратно 1—2 раза в день, причем время, соответствующее половине срока их однократного пребывания в циркуляции, составляет 30 мин. Предпосылкой рециркуляции являются слабая связь лимфоцитов с клетками стромы лимфоидных органов и достаточно высокая степень их подвижности. Однако в определении направления миграции и в преодо- лении барьеров между кровью и тканями основную роль играют хемотак- сические сигналы и специфические межклеточные взаимодействия, основанные на взаимном распознавании мембранных структур клеток. Механизм этого распознавания, обеспечивающий избирательность рас- селения рециркулирующих клеток («хоминг»), изучен достаточно по- дробно. 100
Таблица 25. Селектины и их рецепторы, экспрессируемые па клетках иммунной системы Основное название Другие названия Мол. масса, *1000 Лиганд Локализация Сел е к т и н ы L-селектин CD62L, LECAM, MEL-14 75-80 CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1 Л, М, Н, Эо Е-селектин CD62E, ELAM 115 sLex, С LA Эа Р-селектин CD62P 150 sLex Эа А д р есси ны CD34 — 105-120 L-селектин Э, ств. кл. GlyCAM-1 — 55 L-селектин Э MadCAM-1 — 50 L-селектин, интегрины (X4P7, aEp7, VLA-4 Э слизистых оболочек CD15, CD15s (свя- зан с белками) — Различная P- и Е-селектины М, Н Примечание.!! - лимфоциты, М — моноциты и макрофаги, Н — нейтрофилы, Эо — эозинофилы, Э — эндотелиальные клетки, Эа — активированные эндотелиальные клетки, ств. кл. — кроветворные стволовые клетки и юные клетки-предшественники. 1.2.4.1. Молекулы адгезии Установлено, что на поверхности рециркулирующих лимфоцитов имеют- ся адгезивные структуры — рецепторы хоминга. У человека описано несколько таких структур: L-селектин CD62L (его аналог у мыши MEL- 14), протеогликан CD44, рг, р2-, Р4" и Ру-интегрины. Они обладают сродством к адрессинам — адгезивным молекулам, экспрессируемым клетками эндотелия посткапиллярных венул — по преимуществу высоко- го (кубического), который представляет собой активированную форму плоских эндотелиальных клеток. Групповые и индивидуальные характе- ристики молекул адгезии, участвующих в миграции клеток иммунной системы и межклеточных взаимодействиях при воспалении и иммунном ответе, представлены в табл. 25 и 26 и на рис. 26. Селектины и их рецепторы. Селектины — это тканевые лектины, об- ладающие сродством к концевым остаткам маннозы и фукозы, для свя- зывания которых требуется присутствие Са2+ (свойство группы С-лек- тинов). Известно три их варианта — Р-, Е- и L-селектины. Они имеют однотипное строение. В качестве составляющих они включают три типа доменов: наружный — собственно лектиновый, промежуточный — по- добный эпидермальному фактору роста и несколько коротких повторов, прилегающих к мембране, — доменов контроля комплемента. Число пос- 707
Таблица 26. Интегрины и их рецепторы, экспрессируемые на клетках иммунной системы Название по CD-номен- клатуре " " — т Другие названия Мол. масса, X1000 Лиганды Локализация Р1 - интегрины CD49a/CD29 aiPj, VLA-1 210/130 Ламинин, коллаген Ta, Ba, Эо CD49b/CD29 (12Р1, VLA-2 160/130 Коллаген, ламинин (DGEA) Ta, Tp CD49d/CD29 С14Р1, VLA-4 150/130 Фибронектин, VCAM-1 (E1LDV) T, В, M, Эо CD49e/CD29 a5Pj, VLA-5 132/130 Фибронектин, ламинин (RGD) T, H, Tp p2- интегрины CDlla/CD18 aLp2, LFA-1 180/95 1САМ-1, 2, 3 T, B, NK, M CDllb/CD18 амРз> Мас-l, CR3 170/95 ICAM-1, iC3b M, H, NK CDllc/CD18 axp2, CR4 150/95 iC3b (GPRP) M, ДК, H P7- интегрины CD49d/X «407 150— 180/120 MadCAM В CD103/X aE07 150/120 MadCAM T (слиз.) Рецепторы интегринов из суперсемейства иммуноглобулинов CD54 ICAM-1 90 LFA-1, Mac-1 ЛаЭн-а CD102 ICAM-2 60 LFA-1 Эн, T, В, М, Тр CD50 ICAM-3 124 LFA-1 М, ДК, Н CD106 VCAM-1 100-110 VLA-4 Эн-а Другие молекулы адгезии из суперсемейства иммуноглобулинов CD2 LFA-2 50 CD58 Т, NK CD58 LFA-3 65-70 CD2 Практически все типы клеток Примечание. Т — Т-клетки, В — В-клетки, NK — NK-клетки, М — моноциты и макрофаги, ДК — дендритные клетки, Н — нейтрофилы, Эн — эндотелиальные клетки, Тр — тромбоциты, Эо — эозинофилы, а — активированные клетки, слиз. — клетки слизис- тых оболочек. В скобках — аминокислотные последовательности, распознаваемые фактора- ми, в однобуквенном коде. 102
Рис. 26. Схематическое изображение молекул адгезии, участвующих в миграции и взаимодействиях клеток иммунной системы. а — селекгины и интегрины, б — их рецепторы. Представлена доменная структу- ра молекул адгезии. Ромбами обозначены лектиновые домены, квадратами — до- мены, гомологичные эпидермальному фактору роста, кружками — повторы, гомологичные белкам, контролирующим систему комплемента, вытянутыми ова- лами — иммуноглобулиноподобные домены; отростки от прямых «стволов* — углеводные компоненты гликопротеинов. ледних варьирует в разных видах селектинов (L — 2, Е — 5, Р — 9), что и составляет основу структурных различий между видами селектинов. Часть из них представляет собой трансмембранные белки с коротким ци- топлазматическим участком, тогда как другая (бдльшая) представлена Молекулами, заякоренными в мембране через гликозилфосфоинозитол. Молекулы такого типа легко смываются с мембраны и обычно не спо- собны запускать сигнал в клетку. Р-селектин локализуется в эндотелиальных клетках и в гранулах тромбоцитов и нейтрофилов; он быстро мобилизуется на мембрану эндо- телиальных клеток при их активации и смывается с нее в среду. Р-селек- тин имеет отношение к активации тромбоцитов и ранним этапам миг- рации клеток в очаг воспаления (см. раздел 2.1.1). Е-форма является ос- новным селектином эндотелиальных клеток. Под влиянием активирую- 103
щих воздействий Е-селектин экспрессируется на поверхности эндотели- альных клеток и служит проводником нейтрофилов и других клеток в очаг воспаления. К миграции лимфоцитов в нормальные ткани имеет прямое отноше- ние лишь L-селектин, который экспрессируется на лимфоцитах (а также на нейтрофилах). Он обеспечивает осуществление начального этапа миг- рации лимфоцитов через высокий эндотелий — этапа прилипания и ка- чения — и после его завершения смывается с поверхности лимфоцита. Поскольку именно L-селектин определяет исходные моменты взаимо- действия лимфоцитов с высоким эндотелием, его иногда называют ре- цептором хоминга лимфоцитов. Селектины связываются с концевыми маннозой, фукозой, а также остатками сиаловой кислоты, которые присутствуют на мембранных мо- лекулах в нескольких формах (см. рис. 26). Прежде всего это групповое вещество Льюиса в двух его формах — Lea и Lex, присутствующих на мо- лекуле CD 15. Сиалированная форма Lex содержится в составе молекул CD66 и некоторых интегринов. На клетках эндотелия присутствует также углеводсодержащая молекула GlyCAM-1. Все они содержатся на поверх- ности клеток эндотелия и служат лигандами L-селектина лимфоцитов и в то же время могут экспрессироваться на нейтрофилах и моноцитах и распознаваться Р- и Е-селектинами эндотелия. Альтернативным лиган- дом для L-селектина служит молекула CD34 (маркер стволовых крове- творных клеток), которая экспрессируется на поверхности эндотелиаль- ных клеток. В эндотелии слизистых оболочек основной молекулярной формой, распознаваемой L-селектином, служит гликопротеин MadCAM, однако его экспрессия в значительной степени определяется цитокина- ми, выделяемыми при локальном воспалении. Селектиноподобную функцию выполняет еще один рецептор хомин- га лимфоцитов — пептидогликан CD44 (Pgp-1), который взаимодейству- ет с неидентифицированными компонентами мембраны эндотелиальных клеток и, кроме того, с компонентами межклеточного матрикса (фибро- нектином, коллагеном, гиалуроновой кислотой), способствуя продвиже- нию лимфоцитов в соответствующие тканевые домены. Интегрины и их рецепторы. Термин «интегрины» многозначен; одно из его толкований состоит в том, что эти молекулы соединяют внутрен- нюю и внешнюю среду клетки, проводя сигналы как изнутри клетки на ее поверхность, так и извне внутрь клетки. Внутриклеточная часть интег- ринов связана с компонентами цитоскелета, что определяет многие функции этих молекул. Интегрины представляют собой трансмембранные гетеродимеры. Известны 14 вариантов их a-цепей и 8 — p-цепей. Большинство р-цепей связывает различные a-цепи (рис. 27), и группы интегринов обозначают по общим p-цепям. Номенклатура индивидуальных интегринов имеет три варианта: используют формулу, содержащую обозначение цепей, ко- торые образуют данную молекулу (например, a4pi), CD-номенклатуру — CD49d/CD29 или традиционное обозначение, например, для того же ин- тегрина — VLA-4. Традиционные названия обычно связаны с обстоятель- ствами открытия соответствующих групп молекул. Так, обозначение VLA 104
Рис. 27. Способность различных полипептидных а- и p-цепей интегринов фор- мировать гетеродимеры. происходит от англ, very late antigen, так как вначале эти интегрины об- наружили в культуре лимфоцитов в поздние сроки после активации. Не- которые a-цепи способны связывать цепь-партнер только одного типа, другие ((Х4, а6, av) связываются с двумя типами p-цепей (см. рис. 27). Известно, что лигандсвязывающий центр интегринов формируется с участием обеих цепей, точнее, их доменов, включающих примерно 100— 200-е (считая от N-конца) остатки, организованные в виде петель, кото- рые расположены в а- и р-цепях друг против друга. Этот связывающий участок может находиться в неактивной и активной формах (только вто- рая обеспечивает эффективное связывание лиганда и выполнение функ- ции интегринов). «Активация» связывающего участка, в основе которой лежит изменение конформации с повышением сродства к лиганду, про- исходит под влиянием слабой адгезии клеток, создаваемой взаимодейст- вием других молекул и передающейся через цитоплазматический фрагмент к компонентам цитоскелета. Известно, например, что гигант- ский цитоплазматический участок ргцепи интегринов (он содержит 1000 остатков) связан с компонентами цитоскелета — винкулином, талином, a-актинином и через них — с актином. После этого устанавливается прочный контакт интегрина с рецептором, который не только обеспечи- вает надежную адгезию взаимодействующих клеток, но и служит источ- ником вспомогательных сигналов извне внутрь клетки. Природа сигна- ins
лов состоит в активации тирозинкиназ и фосфорилировании их белков - мишеней, а также в защелачивании внутренней среды клетки (вследствие усиления обмена Na+/H+ с выходом части протонов из клетки). Это спо- собствует активации клетки. «Активация» интегринов обратима; под вли- янием повышенного уровня внутриклеточного цАМФ интегрины перехо- дят в неактивную форму, что способствует ослаблению контакта между клетками и прекращению их взаимодействия. Интегрины содержатся на поверхности самых разнообразных клеток, включая эпителиальные, нервные, но особенно важную роль они и их ре- цепторы играют в функционировании клеток мезенхимального происхож- дения — лейкоцитов, тромбоцитов, клеток стромы, сосудистого эндоте- лия. Сведения о распределении интегринов в клетках иммунной системы приведены в табл. 26. Наибольший интерес с точки зрения иммунологии представляют интегрины семейств и 02, присутствующие на поверхнос- ти клеток иммунной системы (лимфоцитах, макрофагах, нейтрофилах). РрИнтегрины (молекулы группы VLA) взаимодействуют с компонентами межклеточного матрикса (фибронектином, ламинином, коллагеном, фиб- риногеном) и мембранным рецептором VCAM-1, экспрессируемым на ак- тивированных клетках эндотелия. Наиболее важную роль в физиологии лимфоцитов среди интегринов этой группы играет VLA-4. 02-Интегрины (LeuCAM) представлены на поверхности лейкоцитов. Основной интегрин лимфоцитов LFA-1 (от англ. Lymphocyte function an- tigen; первоначально он был обнаружен с помощью антител, которые блокировали цитотоксическую активность Т- и NK-киллеров). Он при- сутствует и на других лейкоцитах. Два других интегрина этой группы слу- жат рецепторами компонентов комплемента (CR3 и CR4); они находятся на поверхности моноцитов, макрофагов, нейтрофилов. Рецепторами интегринов служат, как отмечено выше, компоненты межклеточного матрикса, а также молекулы суперсемейства иммуногло- булинов. Последние, как правило, появляются на поверхности клеток при их активации — на активированных эндотелиальных клетках, лейкоцитах, включая лимфоциты, и т.д. Рецептором р^интегринов является молекула VCAM-1 (CD106), содержащая 7 внеклеточных иммуноглобулиновых до- менов. Рецепторами ^-интегринов служат три типа молекул ICAM (Inter- cellular adhesion molecules) - ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD 102) и ICAM-3 (CD50); из них только ICAM-2 присутствует на покоящихся эндотелиаль- ных клетках. Эти молекулы могут синтезироваться в растворимой форме и влиять на процессы, связанные с межклеточным взаимодействием. На клетках эндотелия слизистых оболочек экспрессируется молекула Mad- CAM-1, служащая рецептором как интегрина VLA-4, так и L-селектина. Часто оба типа взаимодействующих клеток экспрессируют как интегрин, так и его рецептор. Адгезивная молекула РЕСАМ (CD31) служит собствен- ным рецептором (явление гомотипической адгезии). Связывание интегринов с рецепторами зависит от двухвалентных ионов (Са2+ и особенно Mg2+); a-цепи интегринов имеют для них спе- циальный связывающий участок — «карман». Многие интегрины (в част- ности, 0! и 0з) распознают в молекуле рецепторов последовательность RGD (Arg—Gly—Asp), которая присутствует в составе мембранных ре-
цепторов, молекул межклеточного матрикса, некоторых компонентов комплемента. Однако связывание с молекулами семейств ICAM и VCAM не зависит от RGD. 1.2.4.2. Преодоление сосудистого барьера и миграция лимфоцитов в ткань В норме высокий эндотелий имеется в лимфатических узлах и групповых лимфатических фолликулах (пейеровых бляшках). Природа сродства лим- фоцитов этих органов и структур к эндотелию посткапиллярных венул соответствующих лимфоидных органов различна, и это различие обуслов- лено свойствами эндотелия. В групповых лимфатических фолликулах L-селектины и интегрины 014Р7 поверхности лимфоцитов распознают адрессины MadCAM поверхности эндотелиальных клеток, тогда как в лимфатических узлах L-селектины лимфоцитов взаимодействуют с дру- гими адрессинами, в частности с CD34, а также молекулами CD 15, несущими сиалированные остатки фукозы. Эти различия являются осно- вой обособления двух кругов рециркуляции «наивных» лимфоцитов. В брыжеечных лимфатических узлах эти пути рециркуляции пересекают- ся, т.е. их изоляция не является абсолютной. При рециркуляции активи- рованных лимфоцитов и клеток памяти распознавание эндотелиальных клеток несколько иное: оно в большей степени определяется интегринами и пептидогликаном CD44 и обладает более выраженной органоспецифич- ностью (см. раздел 4.1). Процесс проникновения рециркулирующих лимфоцитов (как и дру- гих клеток крови) в ткани включает 4 стадии (рис. 28): • стадия 1 — качение клетки вдоль внутренней поверхности сосуда, она обусловлена слабым обратимым взаимодействием селектинов (в случае групповых лимфатических фолликулов и интегрина 014Р7) с адрессинами и продолжается несколько секунд; • стадия 2 — активация, она занимает 1—20 с, обусловлена, вероятно, активностью выделяющихся локально хемокинов и реализуется с участием ГТФ-связывающего белка Rho; • стадия 3 — задержка (арест), она реализуется в течение нескольких минут при участии более сильных межмолекулярных взаимодейст- вий, чем те, которые определяют фазу 1. Эти взаимодействия опосредованы р2_интегринами (в случае лимфоцитов — молекулой LFA-1), распознающими молекулы семейства ICAM эндотелиаль- ных клеток, а также 014-интегринами, распознающими молекулы MadCAM и VCAM-1 эндотелия; • стадия 4 — диапедез лимфоцита, она осуществляется в течение примерно 10 мин. Лимфоцит проникает внутрь лимфоидного органа, продвигаясь между эндотелиальными клетками под влия- нием хемотаксических сигналов, обеспечиваемых скорее всего хемокинами. Дальнейшее продвижение лимфоцитов в ткани обусловлено теми Же хемотаксическими стимулами и сопровождается установлением об- 107
Рис. 28. Миграция лейкоцитов через сосудистую стенку. Л — лейкоцит (в частности, лимфоцит), Э — эндотелиальная клетка. Между ними схематически показаны рецепторные взаимодействия. Стрелки около обо- значения ХК (хемокины) — сигналы хемокинов, приводящие к усилению экс- прессии интегринов (2, 3) или миграции клетки внутрь ткани (4). ратимых контактов как с окружающими клетками, так и с межклеточ- ным матриксом. Эти контакты обусловлены в первую очередь (Зринтег- ринами (VLA), распознающими молекулы матрикса (фибронектин, ламинин, коллаген) и рецепторы на поверхности стромальных клеток (молекулы VCAM-1). Преодоление сосудистого барьера и начальный этап миграции внутрь ткани осуществляются Т- и В-лимфоцитами оди- наково. Однако внутри лимфоидных органов они перегруппировывают- ся, занимая специализированные участки, хотя в некоторых участках локализуются лимфоциты обоих классов. Вероятно, особенности лока- лизации Т- и В-лимфоцитов обусловлены их сродством к ключевым стромальным клеткам различных участков лимфоидных органов. Так, В-лимфоциты, очевидно, имеют сродство к дендритным фолликуляр- ным клеткам, а Т-лимфоциты — к интердигитальным клеткам паракор- тикальных зон лимфатических узлов. Возможны также различия в ответе на дифференцированные хемотаксические стимулы, исходящие из разных участков органа. В селезенке механизмы рециркуляции упрощены и лишены специ- фической компоненты в виде процесса хоминга. Здесь клетки «изливают- ся» в ткань из открытых капилляров на границе красной и белой пульпы в маргинальной зоне. Дальнейшие передвижения лимфоцитов внутри ор- гана аналогичны таковым в лимфатических узлах. Если в лимфатических узлах и групповых лимфатических фолликулах (пейеровых бляшках) лим- 1ЛО
фоциты, покидающие орган, поступают в лимфу, то в селезенке большую роль в оттоке клеток играет гематогенный путь. 1.2.4.3. Рециркуляция лимфоцитов и взаимодействие со стромой лимфоидных органов Как уже отмечалось, Т-лимфоциты рециркулируют более интенсивно, чем В-клетки. Для осуществления цикла рециркуляции В-лимфоцитам требу- ется примерно в 4 раза больше времени, чем Т-лимфоцитам. Относитель- но темпа рециркуляции субпопуляций Т-клеток четких данных нет; считается, что наиболее активно рециркулируют Т-хелперы. Макрофаги и другие вспомогательные клетки иммунной системы, по-видимому, не рециркулируют, хотя их выход из лимфоидных органов в кровь и лимфу вполне возможен [о миграции белых отростчатых эпидермоцитов (клеток Лангерганса) из кожи в лимфатические узлы говорилось выше]. Взаимодействия лимфоцитов и стромальных клеток очень важны не только для передвижений и локализации лимфоцитов внутри лимфоид- ных органов, но и для регуляции численности лимфоцитов и даже про- должительности их жизни. Контактные взаимодействия, осуществляемые с участием молекул адгезии (например, СБ2-лимфоцитов и стромальных СБ58-клеток, интегринов поверхности лимфоцитов и их рецепторов на стромальных клетках или в межклеточном матриксе), могут служить ис- точниками активации лимфоцитов (особенно при сочетанном действии). Следствием активации может стать пролиферация или гибель (апоптоз) клеток в зависимости от их исходного состояния, характера и интенсив- ности сигналов. Так, при низкой степени заполненности стромального каркаса лимфоцитами (например, после действия облучения и других ци- тотоксических факторов) создаются условия, благоприятствующие раз- множению клеток («периферическая экспансия лимфоцитов»), а при переполнении лимфоидных органов могут генерироваться сигналы к раз- витию апоптоза. Взаимодействие лимфоцитов со стромальными элементами сущест- венно также для удаления из циркуляции клеток, преждевременно по- кинувших органы лимфопоэза, а также старых клеток. При этом клю- чевая роль принадлежит упоминавшемуся углеводбелковому (лектино- вому) распознаванию поверхностных молекул клеток-мишеней. Ткане- вые лектиноподобные рецепторы, в наибольшем количестве содер- жащиеся на поверхности макрофагов, распознают свободные углевод- ные группы несиалированных мембранных гликоконъюгатов лимфоци- тов. Такие клетки, как правило, фагоцитируются. Зрелые покоящиеся лимфоциты защищены от подобного захвата макрофагами благодаря тому, что концевые углеводные группы на их поверхности блокированы сиаловой кислотой. Эта защита ослаблена у незрелых клеток, прежде- временно покинувших места образования (пре-В-клеток, незрелых ти- моцитов), у активированных и старых клеток в связи с ослаблением экспрессии сиалилтрансфераз. Поэтому эти клетки и становятся объек- том такого распознавания, приводящего к захвату и разрушению дан- ных клеток фагоцитами. 109
Иммунная система представляет собой динамическое образование, которое включает ряд лимфоидных органов, объединенных путями рециркуляции (повторяющееся перемещение клеток из органов в циркуляторное русло и обратно). Органы иммунной системы разде- ляют на центральные и периферические. В центральных органах происходит развитие клеток иммунной системы, в периферических органах эти клетки реализуют свое действие. Основным источни- ком клеток иммунной системы (миелоидных и лимфоидных) явля- ется костный мозг. В тимусе развиваются Т-лимфоциты. Здесь формируется их клональный репертуар, т.е. способность распозна- вать определенный спектр антигенов, происходят селекция клонов и дифференцировка субпопуляций (Т-хелперов и Т-киллеров); эпителиальные клетки тимуса секретируют гормоны. Перифери- ческие лимфоидные органы (лимфатические узлы, селезенка, груп- повые лимфатические фолликулы) сходны по своей структуре. Они содержат фолликулы, в которых сконцентрированы В-лимфоциты, тимусзависимые зоны, содержащие Т-лимфоциты, а также участки смешанного заселения клетками обоих типов. Лимфоциты присут- ствуют также в барьерных тканях (коже и слизистых оболочках): Т- клетки — в их наружных слоях, между эпителиальными клетками, В-клетки — в более глубоких слоях, в рыхлой соединительной ткани. Лимфоциты (особенно Т-клетки) активно рециркулируют, возвращаясь в лимфоидные органы благодаря механизму «хомин- га», основанному на сродстве молекул адгезии лимфоцитов и эндо- телиальных клеток лимфоидных органов.
2 Факторы естественного иммунитета Специфику функций иммунной системы определяют процессы, индуци- руемые чужеродными субстанциями, антигенами, и основанные на рас- познавании последних. Однако, как уже отмечалось во введении, базой для развертывания специфических иммунных процессов являются более древние реакции, связанные с воспалением. Поскольку они предсущест- вуют в любом организме до начала любой агрессии и для их развития не требуется развертывания иммунного ответа, эти защитные механизмы называют естественными, или врожденными. Они обеспечивают первую линию защиты от биологической агрессии. Вторая линия защиты — это реакции адаптивного иммунитета — антигенспецифический иммунный ответ. Факторы естественного иммунитета сами по себе обладают доста- точно высокой эффективностью в предотвращении биологической агрес- сии и борьбе с ней, однако у высших животных эти механизмы, как правило, обогащаются специфическими компонентами, которые как бы наслаиваются на них. Система естественных факторов иммунитета явля- ется пограничной между собственно иммунной системой и областью, относимой к компетенции патофизиологии, которая также рассматривает механизмы и биологическую значимость ряда проявлений естественного иммунитета, служащих составными компонентами воспалительной реак- ции, например фагоцитоза. Факторы врожденного иммунитета условно можно разделить на клеточные и гуморальные. 2.1. КЛЕТОЧНЫЕ ФАКТОРЫ ПЕРВОЙ ЛИНИИ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ В реализации первой линии иммунной защиты, обусловленной фактора- ми врожденного иммунитета, участвуют различные клетки миелоидно- моноцитарного ряда, в первую очередь фагоцитирующие клетки, а из лимфоцитов — естественные киллеры. Все эти клетки объединяют по меньшей мере две особенности. Первая из них состоит в том, что запуск активации этих клеток достигается при воздействии на рецепторы, рас- познающие не индивидуальные молекулы (как в случае Т- и В-лимфоци- тов), а группы молекул, которые сигнализируют о чужеродности или агрессивности их носителей. Вторая общая черта этих клеточных факто- ров заключается в том, что ответом на это распознавание служит быстрая реакция, не требующая процессов межклеточных взаимодействий, проли- ферации и дифференцировки, которые составляют основу иммунного 777
Таблица 27. Функции макрофагов при иммунных реакциях Функция Пуги реализации Значение для иммунитета фагоцитоз Поглощение и разрушение по- тенциально агрессивных аген- тов (микроорганизмов, опухо- левых клеток), погибших собст- венных клеток, детрита Противомикробная и противо- опухолевая зашита, очистка от продуктов тканевого распада Внеклеточный цитолиз Разрушение бактерий, парази- тов, опухолевых клеток с по- мощью секретируемых продук- тов и индукции цитолиза при контакте Противомикробная и противо- опухолевая защита Образование факторов иммунной зашиты Синтез и секреция цитокинов, компонентов комплемента, ферментов Выработка гуморальных эф- фекторных факторов иммуни- тета (в основном антимикроб ного) Обработка антигена Частичное расщепление погло- щенного антигена и связыва- ние его пептидов с молекулами МНС II класса Подготовка к восприятию антигена Т-хелперами Презентация антигена Контакт с Т-хелпером через его рецептор для антигена, актива- ция цитокинами (ИЛ-1 и др.) Включение специфического звена иммунного ответа через активацию клонов Т-хелперов Регуляция иммунного ответа Выработка простагландинов, лейкотриенов, цитокинов и других пептидных факторов Супрессия и ограничение им- мунного ответа, в основном на его поздних стадиях ответа. Такая врожденная готовность к осуществлению защитных реакций и определила обозначение данных факторов как естественных и врожден- ных, т.е. не индуцированных и приобретенных, каковыми являются факторы, формируемые при адаптивном иммунном ответе. 2.1.1. Вовлечение и активация клеток — эффекторов естественного иммунитета Основной группой клеток, обеспечивающих реакции естественного им- мунитета, являются фагоцитирующие лейкоциты. По особенностям мор- фологии и функции их разделяют на мононуклеарные клетки и гранулоциты, что примерно соответствует предложенному И.И.Мечнико- вым разделению на макрофаги и микрофаги. Роль этих клеток в иммунной защите достаточно разнообразна. Они участвуют и в развитии иммунного ответа. Однако обозначение этой группы клеток определила та функция, которая была обнаружена ранее других — фагоцитарная. Особенно многообразна роль главных эффекторных клеток этой группы — макрофагов, являющихся потомками моноцитов крови. Мак- 112
Таблица 28. Функциональные различия нейтрофилов и макрофагов Свойство Нейтрофилы Макрофаги Темп мобилизации и активации Длительность активации Срок жизни (и проявления активности) Способность к пиноцитозу Регенерация мембраны Реутилизация фагосом Fc-рецепторы Рецепторы для комплемента Нелизосомная секреция Быстрый (минуты) Короткая (минуты) Короткий (2—3 дня) Умеренная Отсутствует Невозможна FcyR II, III CR1, 3, 4 Отсутствует Более длительный (часы) Длительная (часы) Длительный (2—3 нед) Высокая Происходит Возможна FcyR I, II, III CR1, 3, 4, 5 Имеется (например, секреция цитокинов) рофаги выполняют ряд ключевых функций как в естественной защите, так и при иммунном ответе (табл. 27). Гранулоциты — более специализированные клетки. Однако и им свойственна определенная полифункциональность. Так, нейтрофильным гранулоцитам присуща не только фагоцитарная, но и секреторная функ- ция, состоящая в выделении цитокинов и других биологически важных продуктов, в осуществлении внеклеточного цитолиза. У эозинофилов последняя функция даже преобладает над фагоцитарной. В то же время эти клетки в отличие от макрофагов не причастны к обработке антигена и его представлению лимфоцитам. Основные функциональные различия нейтрофилов и макрофагов обобщены в табл. 28. Вовлечение эффекторных клеток естественной защиты в очаг воспале- ния. Основные эффекторы естественного иммунитета — нейтрофилы и макрофаги — прежде чем попасть в ткани, проходят стадию циркуляции в крови. Именно из кровотока они рекрутируются в очаг потенциальной угрозы, например в область повреждения тканей. Поскольку сами цирку- лирующие лейкоциты еще не испытали воздействия бактериальных и иных активирующих факторов, центральную роль в этом процессе игра- ют эндотелиальные клетки. Выше (см. раздел 1.2.4) рассматривались нор- мальные механизмы хоминга лимфоцитов — их поступления в лимфо- идные ткани из кровотока. При хоминге лимфоциты преодолевают сосу- дистый барьер через высокий эндотелий посткапиллярных венул лимфа- тических узлов и групповых лимфатических фолликулов, представля- ющий собой спонтанно активированный эндотелий. При развитии вос- палительной реакции эндотелиальные клетки в очаге воспаления (вне за- висимости от его локализации) активируются и приобретают свойства, аналогичные (хотя и не вполне идентичные) свойствам высокого эндоте- лия лимфоидных органов, и способность пропускать в воспаленные ткани лейкоциты. Активирующими факторами при этом могут служить 113
как бактериальные продукты (в первую очередь липополисахарид), так и цитокины, вырабатываемые местными клетками в очаге воспаления. Активация эндотелиальных клеток развертывается следующим обра- зом (см. рис. 25). В первые минуты в мембраны перемещается Р-селек- тин, который предсуществует в клетках, но хранится в цитоплазма- тических гранулах. Затем на протяжении 1-го часа экспрессируются гены Е-селектина, а также ряда цитокинов: а-хемокинов (ИЛ-8, IP-10, GRO-a), р-хемокинов (МСР-1 и 3, RANTES; о хемокинах см. раздел 2.1.2), ИЛ-1, ФНОа, ИЛ-6. Спустя несколько часов эти и другие цитокины начинают выделяться клетками. Особенно существенна при этом выработка хемо- кинов, поскольку хемокины эндотелиального происхождения служат ос- новными хемоаттрактантами на стадии преодоления сосудистой стенки. В то же время на поверхности эндотелиальных клеток экспрессируются рецепторы для цитокинов (ИЛ-1, ФНОа, интерферона у, хемокинов). В эндотелиальной клетке усиливается метаболизм арахидоновой кисло- ты. Он осуществляется в основном по циклооксигеназному пути и его главным продуктом становится простациклин PGI2 (см. раздел 2.3.2). Образуется и другой продукт липидного метаболизма — фактор актива- ции тромбоцитов. Наконец, вследствие усиления активности индуци- бельной NO-синтетазы повышается продукция окиси азота, обусловли- вающей бактерицидную активность этих клеток. Процесс миграции лейкоцитов в очаг воспаления осуществляется по схеме, описанной при рассмотрении хоминга лимфоцитов (см. раздел 1.2.4 и рис. 28), здесь мы лишь кратко напомним об основных его этапах. Этих этапов 4. Первый обозначается как качение: благодаря установле- нию слабых и обратимых связей муциноподобных и углеводных детерми- нант лейкоцита с Р- и Е-селектинами эндотелиальной клетки или L-селектина лейкоцита с углеводными детерминантами эндотелиальной клетки лейкоцит катится вдоль внутренней поверхности капилляра или посткапиллярной венулы. Второй этап — активация, которая обусловле- на усилением экспрессии мембранных молекул (в частности, Pj- и р2-ин- тегринов) на лейкоцитах и их рецепторов на эндотелиальных клетках. Этот этап осуществляется преимущественно хемокинами, выделяемыми эндотелиальными клетками (a-хемокины активируют в основном ней- трофилы, а р-хемокины — моноциты и лимфоциты). При миграции ней- трофилов и моноцитов в очаг воспаления их активация не ограничи- вается усилением экспрессии интегринов; на этом этапе включаются ме- таболические проявления (активации этих клеток), которые реализуются уже в очаге воспаления (см. ниже). Третий этап — задержка, обусловлен- ная прочной адгезией, которая является следствием предыдущего этапа. Она обусловлена установлением связей интегринов с рецепторами и при- водит к остановке клеток и прилипанию их к эндотелию. Эго вместе с хемотаксическим импульсом, исходящим от хемокинов, продуцирован- ных клетками и связанных с ними, служит сигналом для осуществления четвертой фазы — проникновения лейкоцита через сосудистую стенку в ткань. Этому способствует сокращение эндотелиальных клеток (под вли- янием фактора некроза опухоли и других цитокинов) и увеличению пор между ними. 114
Воспринимая стимулы со стороны цитокинов, достигающих сосуди- стой стенки из очага воспаления, эндотелиальная клетка проходит оче- редные фазы активации. В результате процесс, начинающийся с актива- ции клеток эндотелия бактериальными продуктами, через фазу мигра- ции, накопления лейкоцитов в очаге воспаления и их локальной актива- ции «возвращается» к эндотелиальным клеткам в результате их дальней- шей стимуляции цитокинами, что способствует прогрессированию вос- палительного процесса. Из других следствий активации эндотелиальных клеток отметим усиление экспрессии гена bcl-2, обусловливающее по- вышение устойчивости этих клеток к гибели по механизму апоптоза (см. раздел 3.5.3). Накопление цитокинов, обладающих ростовой активностью в отношении клеток эндотелия, обусловливает их пролиферацию и как следствие формирование новых сосудов, т.е. ангиогенез. Среди цитоки- нов ФНОа в зависимости от дозы может усиливать или подавлять этот процесс, однако в концентрациях, создающихся в очаге воспаления, он оказывает в основном стимулирующее действие на ангиогенез. В тех случаях, когда в очаге воспаления накапливаются специфичес- кие активированные Т-клетки, важную роль начинает играть интерфе- рон у — основной продукт CD4+-клеток типа ТЫ. Под его влиянием на поверхности эндотелиальных клеток усиливается экспрессия молекул МНС II класса, что обусловливает участие этих клеток в процессе обра- ботки антигенов и представления антигенных пептидов Т-хелперам. При аллергическом воспалении аналогичный, хотя и менее выраженный эф- фект вызывает ключевой продукт ТЬ2-клеток ИЛ-4. Таким образом, активация эндотелиальных клеток в ранний период воспалительной реакции обеспечивает миграцию в очаг биологической агрессии клеток, обусловливающих как первую (нейтрофилы, моноци- ты), так и вторую (лимфоциты) линию иммунной защиты. Сами эндоте- лиальные клетки при этом частично берут на себя роль макрофагов как ^бактерицидных клеток, источников цитокинов и других медиаторов вос- паления и даже антигенпредставляющих клеток. Распознающие структуры клеток — эффекторов естественного имму- нитета. Выше уже отмечалось, что рецепторы, запускающие реакции ес- тественного иммунитета, распознают химические структуры или группы структур, не свойственные нормальным клеткам данного организма. К ним относятся бактериальные липополисахариды и пептидогликаны, а также концевые сахара мембранных гликопротеинов. В результате кон- такт лейкоцитов с бактериальными клетками, на поверхности которых содержатся указанные субстанции, приводит к активации клеток и вклю- чению первой линии иммунной защиты, хотя распознавания индивиду- альных бактериальных антигенов при этом не происходит (на уровне первой линии защиты понятие «антиген» не имеет смысла). Аналогичная реакция распознавания осуществляется при контакте лейкоцитов с соб- ственными клетками организма — интенсивно пролиферирующими, трансформированными (в том числе опухолевыми) или «состарившими- ся», поскольку во всех этих случаях нарушается защита концевых угле- водных остатков мембранных гликоконъюгатов, и они становятся Доступными для распознавания. 115
Таблица 29. Основные распознающие структуры, ответственные за активацию клеток-эффекторов естественного иммунитета Рецепторы Структурные типы Клетки- носители Лиганды Функции Рецепторы май н о з ы ( Р М ) РМ Мф 8 цепей С-реак- тивного белка Мф, эндоте- лий печени Углеводы, содержащие маннозу Подключение к от- вету Т-хелперов DEC-205 10 цепей С-реак- тивного белка ДК, эпите- лий тимуса То же То же Р е ц е п т о р л и п о п )лисахаридЕ CD14 Гликопротеин, заякоренный в липидном бислое Мон, Мф, Нф ЛПС Удаление бакте- рий, индукция выработки цито- кинов Р е ц е 1 п т о р ы - м усорщики Тип I Трансмембран- ный белок типа 1Г, содержит домен SRCR Мф, эндоте- лий Компоненты стенок бактерий и дрожжей Удаление бакте- рий, адгезия Тип II Аналог типа I, лишенный доме- на SRCR Мф То же То же MARCO Аналог типа I большего размера Мф Компоненты стенок бактерий Удаление бактерий Р е ц е п торы КО! элемента CD35 (CR1) Содержит 30 по- вторяющихся пос- ледовательностей Мон, Мф, Нф, Лф СЗЬ, С4Ь С'-зависимый клиренс CD21 (CR2) Содержит 15 по- вторяющихся пос- ледовательностей В-Лф, фол- ликулярные ДК iC3b, C3dg, C3d Активация В-клеток CDllb/ CD18 (CR3) амР2-интегрин Мон, Мф, Нф, NK iC3b, ЛПС, фибронектин Удаление бакте- рий, адгезия Примечание. Мф — макрофаги; Мон — моноциты; Нф — нейтрофилы; Лф — лимфоциты; ДК — дендритные клетки; ЛПС — липополисахарид; SRCR — домен типа му- сорщика (scavenger), богатый цистеином. * Трансмембранные белки типа 11 — белки, встроенные в мембрану таким образом, что наружу клетки направлен С-конец молекулы (у белков типа I — N-конец). 116
В табл. 29 обобщены основные типы распознающих молекул естест- венного иммунитета, выполняющих функции клеточных рецепторов. Данные, представленные в последней колонке, показывают, что резуль- татом связывания рецепторов является удаление из организма соответст- вующего лиганда и его носителей (обычно микроорганизмов), иногда с подключением Т- или В-клеток, т.е. факторов второй (антигенспецифи- ческой) линии защиты. Активация макрофагов и нейтрофилов. В основе проявлений функци- ональной активности макрофагов и нейтрофилов лежит активация. По своей природе она родственна процессу активации других клеток, однако отличается многими проявлениями и последствиями. Так, активация лимфоцитов означает переход из фазы покоя в клеточный цикл, что от- нюдь не обязательно для макрофагов и гранулоцитов; «кислородный взрыв», являющийся одним из основных событий активации фагоцитиру- ющих клеток, не характерен для активируемых Т-лимфоцитов. Тем не менее, как и в случае с другими клетками, активация эффекторных кле- ток естественной защиты индуцируется внешними стимулами (как пра- вило, воздействием экзогенных молекул на мембранные рецепторы клеток, рассмотренных выше) и реализуется с помощью цепи внутрикле- точных сигналов, приводящих к изменению метаболических процессов и активности генов. Механизмы активации нейтрофилов и макрофагов в общих чертах сходны, хотя имеются и определенные различия, которые будут упомянуты ниже. Активирующими стимулами для фагоцитирующих клеток служат факторы, взаимодействующие с рассмотренными выше рецепторными структурами: • бактериальные продукты, в частности липополисахариды; • цитокины, среди которых в качестве активатора наиболее эффек- тивен интерферон у; • активированные компоненты комплемента, их фрагменты; • тканевые полисахариды, в частности содержащие концевую ман- нозу; • прилипание к различным поверхностям, происходящее с участием • адгезивных молекул поверхности макрофагов, а также процесс f фагоцитоза; с • любые другие факторы, вызывающие активацию протеинкиназы С и повышение содержания Са2+ в клетке (в модельных опытах in vitro — сочетание форболмиристатацетата и ионофоров кальция). Процесс активации в ряде случаев разделяется на два этапа: прайми- рование и запуск. Праймирующими агентами могут служить интерферон рГ и ГМ-КСФ, которые облегчают проявление активации под действием Пускового агента — липополисахарида. На молекулярном уровне эффект Праймирования трактуется как процесс, приводящий к активации проте- инкиназы С (вследствие накопления 1,2-диацилглицерина) без мобили- зации Са2+, т.е. как неполный сигнал. Последующее воздействие липополисахарида завершает формирование сигнала путем мобилизации 117
Са2+ с участием 1,4,5-инозитолтрифосфата — продукта расщепления фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата (см. раздел 3.5.1). Однако актива- ция может осуществляться и одномоментно вследствие одновременного прохождения обоих внутриклеточных процессов. Основные проявления активации макрофагов следующие: • «кислородный взрыв», накопление свободных радикалов; • генерация окиси азота; • изменение активности ряда ферментов, не связанных с кислород- ным и азотным метаболизмом; • усиление синтеза la-молекул (продуктов генов МНС И класса) и их экспрессии на поверхности клеток; • усиление синтеза и секреции цитокинов (ИЛ-1, ФНОа и т.д.) и других биологически активных молекул; • повышение фагоцитарной активности и эффективности фагоци- тоза; • увеличение противоопухолевой активности; • повышение способности обрабатывать антиген и представлять его Т-клеткам; • проявление регуляторной активности при иммунном ответе. Бблыпая часть перечисленных проявлений наблюдается и при акти- вации нейтрофилов. Это относится, в частности, к кислородному взрыву, некоторым изменениям метаболизма и повышению фагоцитарной актив- ности. Далее мы несколько детальнее рассмотрим механизмы кислородного взрыва и генерации окиси азота в связи с исключительно важной ролью этих процессов как в активации фагоцитирующих клеток, так и в реали- зации бактерицидной функции последних. Кислородный, или дыхательный, взрыв (рис. 29) — это процесс об- разования продуктов частичного восстановления кислорода, свободных радикалов, перекисей и других продуктов, обладающих высокой анти- микробной активностью. Образование этих метаболитов в своей основе имеет усиление потребления глюкозы и ее расщепление с участием NADP+ по механизму гексозомонофосфатного шунта, что сопровождает- ся накоплением NADPH. Взаимодействие NADPH с молекулой кислоро- да в клеточной мембране при участии NADPH-оксидазы приводит к генерации супероксид-ан ион а (О2“). NADPH-оксидаза представляет собой мультиферментный комплекс, включающий флавопротеин, убихи- нон, цитохром Ь558, а также пептиды — мембранные (р22 и gp91) и ци- топлазматические (р47 и р67). В активации этой системы участвуют фосфолипазы и протеинкиназа С, активируемые теми же пусковыми агентами. При последующих реакциях, в которые вовлекаются ионы водорода, образуются другие продукты с бактерицидной активностью — перекись водорода, синглетный кислород (!О2) и гидроксил-радикал ( ОН). Обра- зование перекиси водорода (дисмутация супероксид-радикала) происхо- дит как спонтанно, так и с участием супероксиддисмутазы. При участии
a Г люкозомонофосфатный шунт Глюкоза + NADP*------► Пвнтозофосфат+NADP.H Цитохром Ь245 NADP.H + О2----------► NADP.H + О2~ Спонтанная дисмутация 2О2- + 2Н+ ------------► Н2О2 + 1О2 О2“ + Н2О2--------------► НО + ОН“ + 1О2 Миелопероксидаза Н2О2 + С1“-------------► ОСГ + Н2О ОСГ + Н2О-------► ’О2 + СГ + Н2О Супероксиддисмутаза 2О2- + 2Н*------------► О2 + Н2О 2Н2О2 Каталаза 2Н2О + О2 б Рис. 29. Кислородзависимые процессы в фагоцитах, приводящие к образованию бактерицидных субстанций. а — основные стадии превращений продуктов «кислородного взрыва», б — хими- ческие реакции, составляющие их основу. миелопероксидазы, активность которой существенно возрастает, из пере- киси водорода с участием ионов галогенов формируются дополнитель- ные бактерицидные продукты. Для предотвращения ущерба собственным клеткам от накопления этих продуктов, цитотоксичных не только в отно- шении микроорганизмов, срабатывают механизмы их инактивации путем превращения в воду и кислород с участием супероксиддисмугазы и ката- лазы. Впрочем, эти же защитные механизмы могут проявлять и микроб- ные клетки. 7 70
Рассмотренные выше процессы развиваются в течение нескольких секунд, что и определило их обозначение как «взрыв». Место генерации бактерицидных продуктов точно не установлено, в конечном счете они оказываются в фаголизосоме и могут секретироваться во внеклеточное пространство. Кислородный взрыв вызывают все активирующие и прай- мирующие агенты, ряд хемоаттрактантов, цитокинов, препараты, разру- шающие микротрубочки (колхицин), и т.д. При действии различных агентов может проявляться определенное своеобразие, касающееся, на- пример, выраженности отдельных составляющих реакции. Обнаружены определенные различия в генерации кислородного взрыва при активации нейтрофилов и макрофагов: в первом случае реакция более кратковре- менна, но более интенсивна, она приводит к большему накоплению перекиси водорода и не зависит от синтеза белков, во втором случае она длится дольше и подавляется ингибитором синтеза белка циклогекси- мидом. Поскольку рассмотренные процессы сопровождаются переходом электронов с более высокоэнергетических орбит на менее высокоэнерге- тические, они сопровождаются и излучением квантов энергии, что реги- стрируется как люминесценция. Хемилюминесценция клеточных мемб- ран с использованием усилителей (легко окисляемых веществ типа лю- минола, люцигенина) широко используется для оценки кислородного взрыва в активированных клетках. Большое внимание в настоящее время привлекает NO-зависимый механизм бактерицидности фагоцитов. Окись азота образуется в резуль- тате расщепления аргинина до цитруллина, катализируемого NO-синте- тазой при участии Са2+, лейкотриена В4 и NADP. Существует консти- тутивная и индуцибельная формы NO-синтетазы. Первая содержится в активной форме в покоящихся клетках, вторая — iNO-синтетаза — акти- вируется при участии провоспалительных цитокинов. ИЛ-10, ФНОа и особенно интерферон у усиливают, а продукты 1Ъ2-клеток ИЛ-4, 10 и 13 подавляют эти процессы. 2.1.2. Фагоцитоз Открытие фагоцитоза И.И.Мечниковым в конце прошлого века было одним из самых впечатляющих достижений молодой тогда иммунологии. Оно сильно повлияло на направление исследований и теоретических построений по крайней мере на полвека вперед. Еще И.И.Мечников разделил фагоцитирующие клетки на микрофаги и макрофаги. К первым он отнес нейтрофильные гранулоциты, которые рано мобилизуются при развитии воспаления (через минуты, часы), но обладают умеренной спо- собностью к поглощению микробных и иных чужеродных частиц. Мак- рофаги (в отличие от первого этот термин сохранился до наших дней) мобилизуются позже (через часы, сутки), но обладают более значитель- ным фагоцитарным потенциалом и разнообразным спектром иных эф- фекторных функций. Тем не менее основные этапы фагоцитарной реакции сходны для клеток обоих типов, хотя в их феноменологии и механизмах имеются оп- 1ЭП
Таблица 30. Стадии фагоцитоза Стадия Событие Факторы клетки-ми- шени и ее окружения Факторы фагоцита Хемотаксис Сближение фагоцита и объекта Хемотаксины: бак- териальные, СЗа, С5а, хемокины Рецепторы хемотакси- нов, цитоскелет, лей- котриены и др. Прилипание Установление контакта Опсонины (анти- тела, компоненты комплемента, фиб- ронектин), моле- кулы адгезии Соответствующие рецепторы, интегрины Активация мембраны Подготовка к погружению Липополисахариды, лиганды рецепто- ров фагоцита Интегрины, рецепторы, липиды, Са2+, протеин- киназа С Инициация фагоцитоза Обволакивание объекта Молекулы адгезии Элементы цитоскелета, Са2+, интегрины Формирование фагосомы Замыкание мем- браны и погру- жение объекта — Элементы цитоскелета Формирование фагол изосомы Слияние фагосом и лизосом Блокирующие агенты (подавляют фагоцитоз) Компоненты мембраны, цитоскелета Киллинг и переваривание Гибель объекта фагоцитоза, его переваривание Компоненты кле- точной стенки (предотвращают фагоцитоз) Продукты кислородного и азотного метаболизма, галоидные производ- ные, гидролазы Выброс продуктов деградации Выброс содержи- мого фаголизо- сомы из клетки — Цитоскелет, мембрана ределенные различия. Реакция фагоцитоза может быть подразделена на несколько стадий: хемотаксис, прилипание к объекту, активация участка мембраны фагоцита, погружение частицы, формирование фагосомы, раз- рушение объекта, освобождение продуктов деградации (табл. 30, рис. 30). 1.1.2.1. Хемотаксис Хемотаксис — это направленное движение клеток, определяемое гради- ентом химических факторов, хемотаксинов, или хемоаттрактантов. Наря- ду с положительным (движение в сторону высокой концентрации хемо- таксина) наблюдается отрицательный (удаление от хемотаксина) хемотак- сис. В реакции фагоцитоза более важную роль играет положительный хемотаксис. Хемотаксис следует отличать от хемокинеза — ненаправлен- ного усиления подвижности клеток под влиянием химических агентов. В случае фагоцитоза хемоаттрактантами служат, как правило, про- 121
2. Адгезия 3. Активация мембраны 4. Погружение 5. Образование фагосомы Рис. 30. Основные стадии фагоцитоза [по Ройт А., 1991]. дукты, выделяемые микроорганизмами и активированными клетками в очаге воспаления (цитокины, лейкотриен В4, гистамин), а также продук- ты расщепления компонентов комплемента (СЗа, С5а), протеолитичес- кие фрагменты факторов свертывания крови и фибринолиза (тромбин, фибрин), нейропептиды, фрагменты иммуноглобулинов, С-реактивный белок, цАМФ и др. Среди микробных продуктов наиболее активен пеп- тид N-формил — метионил — лейцил — фенилаланин (fMLP) или его аналоги. Этот пептид участвует в инициации синтеза белка у бактерий; он отсутствует у эукариот, его появление служит сигналом бактериальной инвазии. Пептид fMLP часто используют в экспериментальной практике в качестве хемотаксического фактора. Большинство названных хемоатт- рактантов сами привлекают фагоциты (собственно цитотаксины), другие, например бактериальные эндотоксины, индуцируют выработку цитотак- синов другими клетками, в том числе самими фагоцитами. К хемотаксическим продуктам фагоцитов и лимфоцитов относится ряд цитокинов, например ИЛ-10 (привлекает нейтрофилы, моноциты, лимфоциты) и ИЛ-2 (привлекает Т-клетки). Однако «профессиональны- ми» хемотаксинами служат цитокины группы хемокинов. Они представ- ляют собой довольно короткие полипептиды с молекулярной массой 8000—10 000. Хемокины разделяют на два семейства, отличающиеся по взаиморасположению двух остатков цистеина вблизи N-конца молекулы. В молекуле а-хемокинов эти остатки разделены другой аминокислотой (последовательность Cys-X-Cys), тогда как в молекулах р-хемокинов они располагаются рядом (Cys-Cys). Хемокины а, как правило, служат хемо- аттрактантами для нейтрофилов, иногда для других клеток, а р-хемокины привлекают преимущественно моноциты и макрофаги, а также Т-лимфо- циты. Сведения об основных представителях этих семейств хемокинов приведены в табл. 31. 122
Таблица 31. Основные проявления хемотаксической активности хемокинов Название Клетки- продуценты Хемотаксическое действие в отношении клеток Активирующее действие с указанием типа клеток Б м Т Н Э a - х е м о к и г ы ИЛ-8 М, NK, Т + + + (+) Н, Э, Б IP-10 М, Ф, Энд, Кер, Т + + PF4 Тромбоциты + + (+) GROa, 0, у М + + 3 - х г м о к И F I ы RANTES м + + т, м МСР-1, 2, 3 м (+) + + + + Б MIP-la М, Т, В, БОЭ + + (CD4+) Т, М MIP-10 То же (+) + + + + (CD8+) т Примечание. Н — нейтрофилы; Э — эозинофилы; Б — базофилы; М — моно- циты и макрофаги; Т — Т-лимфоциты; В — В-лимфоциты; NK — NK-клетки; Ф — фибро- бласты; Энд — эндотелиальные клетки; Кер — кератиноциты; БОЭ — белые отростчатые эпидермоциты. Хемокины: IP-10 — индуцируемый интерфероном белок 10 (Interferone In- ducible Protein 10); PF4 — тромбоцитарный фактор 4 (Platelet Factor 4); МСР-1 — 3 — мак- рофагальные хемотаксические пептиды (Macrophage Chemotactic peptides 1—3); MIP-la, MIP-lp — макрофагальные воспалительные белки la, ip (Macrophage Inflammatory Proteins la, 1 p); RANTES — регулируемый активацией фактор, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками (Regulated upon Activation Normally T cell Expressed and Secreted). В организме наряду с факторами, способствующими хемотаксису, присутствуют ингибиторы хемотаксиса, подавляющие как активность хе- моаттрактантов (например, а.2-макроглобулин), так и реакцию клеток (некоторые гормоны, бактериальные продукты). Для большинства упомянутых факторов на поверхности фагоцитов найдены рецепторы, связывание которых служит пусковым сигналом на- правленного движения клеток, а также ряда других реакций, связанных с фагоцитозом и активацией клеток. Рецепторами хемокинов служат белки, 7 раз пронизывающие мембрану (аналогично другим членам се- мейства родопсинов, к которому они относятся). Известны 4 рецептора а-хемокинов и 5 рецепторов 0-хемокинов, большая часть которых взаи- модействует с несколькими представителями одного семейства. Лишь один рецептор (CXCR1, или ИЛ-8рА) обладает высоким сродством толь- ко к ИЛ-8; сродством к этому цитокину обладает еще один рецептор — ИЛ-8РВ. Все эти рецепторы, а также рецепторы для fMLP и лейкотриена В4 связаны с белком G, который служит передаточным фактором для за- пуска сигнала в клетку и для ее активации. Синтез de novo белков и нук- 123
леиновых кислот при этом необязателен. Энергия для хемотаксиса по- ставляется преимущественно за счет процессов гликолиза. При этом су- щественно изменяется метаболизм фагоцитов, усиливается секреторный процесс, повышается восприимчивость клеток к действию других акти- вирующих агентов. В основе направленного движения фагоцитов лежит реакция кон- трактильных белков цитоскелета, прежде всего актина и миозина. Моби- лизация компонентов цитоскелета происходит в процессе активации клетки. Вследствие реорганизации цитоскелета клетка из округлой стано- вится поляризованной (обычно треугольной). В сторону объекта хемо- таксиса выдвигается ламеллоподиум — участок цитоплазмы, бедный органеллами, но содержащий сеть микрофиламентов, в частности нитча- тый (F) актин. Последний образуется в результате полимеризации G-ак- тина. Ориентацию клетки в процессе хемотаксиса определяет полимери- зация микротрубочек, а процесс движения — сокращение микрофила- ментов. Определенная часть мембранных гликопротеинов перемещается в сторону полюса поляризации, на котором резко усиливается экспрессия Р2-интегринов (CDlla, b, c/CD18). Аппарат Гольджи переориентируется в направлении движения клетки. Происходит конформационная пере- стройка (ремоделирование) фосфолипидов мембран. Одновременно клетка секретирует эластазу, коллагеназу, катепсины, что способствует преодолению преград в виде базальных мембран. Как известно, ранее других клеток в очаг воспаления мигрируют ней- трофилы, существенно позже сюда поступают макрофаги. Однако ско- рость хемотаксического перемещения нейтрофилов и макрофагов сопоставима (около 15 мкм/мин). Различия во времени их проникнове- ния в очаг воспаления связаны, очевидно, с не вполне идентичным на- бором факторов, служащих для них хемоаттрактантами, и с более быстрой начальной реакцией нейтрофилов (запуск хемотаксиса), а также присутствием нейтрофилов в пристеночном слое сосудов (т.е. их готов- ность к проникновению в ткани). 2.1.2.2. Адгезия фагоцитов к объекту фагоцитоза Адгезия фагоцитирующих клеток к своим мишеням обусловлена наличи- ем на поверхности этих клеток рецепторов для молекул, представленных на поверхности объекта (собственных или связавшихся с ней). Когда объектом фагоцитоза служат клетки, рецепторная природа адге- зии проявляется особенно ярко, хотя и в этом случае в основе адгезии лежит взаимодействие, опосредованное рецепторами. При фагоцитозе бактерий или старых клеток организма хозяина происходит распознавание концевых сахаридных групп (глюкозы, галактозы, N-ацетилгалактозами - на, фукозы, маннозы и т.д.), которые представлены на поверхности фаго- цитируемых клеток. Распознавание осуществляется лектиноподобными рецепторами соответствующей специфичности, в первую очередь манно- зосвязывающим белком и селектинами, присутствующими на мембране фагоцитов. Другим типом рецепторов, важных для распознавания объек- 124
тов фагоцитоза, служат интегрины (см. раздел 1.2.4). На поверхности мак- рофагов, как отмечалось выше, имеются Рз-интегрины (LFA-1, Мас-1, 180/95), а также Pj-интегрины группы VLA. Они распознают такие мем- бранные рецепторы клеток, как ICAM-1, 2 и 3, а также фибронектин, ла- минин, коллаген и другие белки межклеточного матрикса, особенно те, которые содержат характерные последовательности. Из последних наибо- лее изучена последовательность Arg—Gin—Asp (в однобуквенном коде RGD; распознающие ее структуры обозначают как RGD-рецепторы). По- скольку эти последовательности присутствуют на поверхности различных клеток и на клеточном матриксе, их распознавание фагоцитами наряду с действием хемоаттрактантов способствует передвижению фагоцитов. В тех случаях, когда объектом фагоцитоза являются не живые клетки, а кусочки угля, асбеста, стекла, металла и т.д., фагоциты предварительно делают объект поглощения «приемлемым» для осуществления реакции, окутывая его собственными продуктами (в частности, компонентами межклеточного матрикса, который они продуцируют). Хотя фагоциты способны поглощать разного рода «неподготовленные» объекты, наи- большей интенсивности фагоцитарный процесс достигает при условии опсонизации — фиксации на поверхности объектов таких молекул, для которых на поверхности фагоцитов имеются специфические рецепторы. Наибольшую роль в распознавании опсонизированных клеток играют Fc-рецепторы и рецепторы для компонентов комплемента. Интактные компоненты комплемента практически не фиксируются на микробных клетках и не распознаются фагоцитами. Однако многие микроорганизмы способны вызывать активацию комплемента по альтер- нативному пути и продукты расщепления компонентов этой системы часто фиксируются на бактериальных клетках. Комплемент, активируе- мый по классическому пути, сорбируется на бактериальных клетках, оп- сонизированных IgG-антителами. Распознавание таких опсонизирован- ных клеток осуществляется с помощью соответствующих рецепторов для компонентов комплемента на поверхности фагоцитов (см. разделы 1.1.2 и 2.3.1). В процессе развития иммунного ответа на бактериальные анти- гены на поверхности микробных клеток фиксируются антитела и фраг- менты компонентов комплемента, активированных по классическому пути. Наиболее важным опсонизирующим фактором в этой группе явля- ется СЗЬ, который образуется при обоих путях активации комплемента и рецепторы к которому имеются на поверхности как макрофагов, так и Нейтрофилов. Несколько меньшую роль играет С4Ь, образующийся толь- ко при классической активации комплемента и имеющий рецепторы лишь на макрофагах, а также С5Ь, фактор Н и т.д. Но наиболее значимы в качестве опсонизирующих агентов иммуно- глобулины — антитела, распознаваемые разнообразными Fc-рецептора- Ми фагоцитов. Как правило, условием опсонизации такого рода служит Присутствие в организме или предобразованных антител (естественных, ранее индуцированных этим микроорганизмом, или посторонних, пере- крестно реагирующих с ним), или антител, сформировавшихся de novo в Процессе иммунного ответа на данный возбудитель. Наконец, опсонизи- рующим фактором могут служить неспецифические иммуноглобулины 125
(чаще их агрегаты), которые могут фиксироваться на объектах фагоцито- за. Наибольшую роль в качестве опсонизирующих агентов играют IgG- антитела (особенно IgGl), для Fc-порции которых имеются рецепторы на поверхности как макрофагов (FcyRI, FcyRII, FcyRIII), так и нейтро- филов (FcyRII, FcyRIII; подробнее см. разделы 1.1.2 и 3.1.1). Однако оп- сонинами могут служить и иммуноглобулины других классов. IgM обладают не меньшей опсонизирующей активностью, чем IgG, но их со- держание в сыворотке, как правило, ниже, чем IgG, и рецепторы для них имеются лишь на макрофагах. Процессы адгезии играют основную роль при миграции фагоцитиру- ющих клеток в очаг воспаления, особенно при преодолении преград в виде сосудистой стенки, базальной мембраны и т.д. 2.1.2.3. Активация фагоцитов при адгезии и распластывании Выше уже рассматривались основные проявления и механизмы активации фагоцитов. Адгезия фагоцитирующих клеток к субстрату является одним из факторов их активации, необходимой для осуществления последующих событий фагоцитоза, начиная от распластывания фагоцита на поверхнос- ти клетки-мишени и кончая перевариванием убитой клетки-мишени. Решающая роль в процессе запуска активации клеток под влиянием хемотаксических агентов, иммунных комплексов и молекул адгезии при- надлежит белку G, который, как уже отмечалось, связан с рецепторами для большинства этих агентов. При взаимодействии с ними клеточных рецепторов происходит диссоциация белка G, что приводит к активации фосфолипазы С. Она в свою очередь катализирует расщепление фосфои- нозитидов до диацилглицерина и инозитол-3-фосфата. Первый активиру- ет протеинкиназу С, второй обусловливает мобилизацию ионов Са2+ из внутриклеточных депо (подробнее см. раздел 3.5.1). Активация клетки сопровождается деполяризацией мембраны со снижением ее отрицательного заряда, изменением трансмембранного по- тока ионов (усилением поступления в клетку Са2+, К+, Na+), активацией сериновой эстеразы, изменениями в системе циклических нуклеотидов с преходящим повышением уровня цАМФ, усилением трансметилирова- ния белков. Мембранные структуры, взаимодействующие при контакте фагоци- тов с клетками-мишенями (в частности, опсонины на поверхности мик- робной клетки и их рецепторы на поверхности фагоцита), расположены на поверхности взаимодействующих клеток равномерно. Это создает ус- ловия для последовательного охвата частицы псевдоподиями, что обеспе- чивает, с одной стороны, тотальное вовлечение в процесс всей поверх- ности фагоцита, с другой — поглощение частицы вследствие замыкания мембраны по принципу застежки «молния». Условием распластывания фагоцита и охвата им частицы служат активация протеинкиназы С и мо- билизация Са2+. Процесс распластывания может быть смоделирован в обход адгезии — путем действия на клетку сочетания форболовых эфиров и ионофоров Са2+. Связующим звеном между активацией протеинкиназы С и мобилиза- 126
цией Са2+, с одной стороны, и распластыванием клетки — с другой, яв- ляются перемещение белков цитоскелета к рецепторам адгезии, особенно к интегринам, и их сосредоточение у поверхности клетки (происходящее, в частности, под влиянием взаимодействия молекулы CD14 с бактери- альными липополисахаридами). В событиях, происходящих в мембране фагоцита при его адгезии на клетках, большая роль принадлежит актоми- озиновой системе, а также переходам гель — золь в системе клеточных коллоидов. Сокращение актиновых волокон и разжижение коллоидов обеспечивают инвагинацию мембраны и формирование фагосомы. Указанные процессы сопровождаются другими проявлениями акти- вации фагоцитирующих клеток, такими как кислородный взрыв, а кроме того, в случае мононуклеарных фагоцитов — экспрессией мембранных 1а-антигенов, Fc- и СЗ-рецепторов и секрецией монокинов, в случае нейтрофилов — экспрессией Fcy-рецептора, секрецией гранул. 2.1.2.4. Погружение частицы Как упоминалось выше, прямым следствием контактной активации фа- гоцита является изменение состояния цитоскелета и физико-химической структуры цитоплазмы. Относительно низкомолекулярный G-актин пре- вращается в нитевидный полимеризованный F-актин. Последний входит в состав цитофиламентов, которыми богата псевдоподия, формируемая фагоцитом при контакте с частицей. Псевдоподия вытягивается в направ- лении частицы и прилипает к ней. Вследствие сокращения актиновых волокон и изменения вязкости цитоплазмы (желатинизации) частица полностью охватывается мембраной фагоцита, которая «застегивается» над частицей. Желатинизация представляет собой процесс сшивки нитей филамен- тов актиногелином (MARCKS) — белком, перекрестно связывающим актин, в результате F-актин переходит в состояние геля. Сокращение геля происходит при участии миозина, служащего источником энергии. Этот процесс регулируется Са2+ и белком гельсолином, препятствующим геле- образованию. Зона повышенной жесткости цитоплазмы возникает внача- ле в месте контакта частицы с клеткой, что и обеспечивает образование локального вдавления цитоплазмы. По мере расширения зоны адгезион- ного контакта распространяется область желатинизации цитоплазмы. В конечном счете в результате упомянутых процессов частица, а вместе с ней часть мембраны фагоцита (до 50 % общей ее поверхности) погружаются внутрь клетки в виде везикулы, называемой фагосомой. 2.1.2.5. Формирование фаголизосомы Фагосома, погруженная внутрь клетки, сливается с лизосомами, в резуль- тате чего формируется фаголизосома — гранула, в которой существуют оптимальные условия для бактериолиза и расщепления убитой микробной клетки. В нейтрофилах фагосома сначала (через 30 с) сливается с вторич- ными, несколько позже (через 1—3 мин) — с азурофильными гранулами. Механизмы сближения и слияния фагосом и лизосом неясны. По-види- 127
мому, имеют место активное движение лизосомных гранул к фагосоме, их адгезия и слияние на основе гидрофобных взаимодействий. Предполагают, что слиянию мембран способствуют локальное закис- ление в фаголизосоме, сопровождающееся нарушением гидрофобных связей в мембранах, а также перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот в липидах мембран под влиянием восстановленного кис- лорода. 2.1.2.6. Лизис и расщепление фагоцитированных клеток В фаголизосоме существует несколько систем факторов бактерицидности: • факторы, требующие участия кислорода для своего формирования (зависящие и не зависящие от миелопероксидазы); • азотистые метаболиты; • активные субстанции, в том числе ферменты; • локальное закисление. Кислородзависимые механизмы формирования факторов бактери- цидности рассмотрены выше и иллюстрированы рис. 29. Среди промеж- уточных форм восстановленного кислорода и продуктов переокисления бактерицидную активность в фаголизосоме проявляют перекись водоро- да, гидроксил-радикал и синглетный кислород, по-видимому, суперок- сид-анион сам по себе не обладает бактерицидной активностью: токсич- ны его продукты. Бактерицидность этих факторов усиливается под влиянием галогенов (особенно иодида), некоторых ионов металлов, витамина С. Иодид и дру- гие ионы галоидов вовлекаются в процесс бактериолиза при участии мие- лопероксидазы, катализирующей образование при участии упомянутых ионов из перекиси водорода синглетного кислорода и продуктов окисле- ния галоидов типа ионов 01”. Последние обладают токсичностью в отно- шении не только бактерий, но также грибов и микоплазм. Полагают, что кислородзависимые факторы, генерируемые при участии миелоперокси- дазы, обладают наибольшей эффективностью при бактериолизе. Они реа- лизуют свою активность в нейтрофилах и моноцитах, но не обнаружены в резидентных макрофагах. Основной эффекторной молекулой бактериоли- за в макрофагах считается перекись водорода. Все упомянутые бактери- цидные продукты лишены какой-либо специфичности в отношении микроорганизмов. Они обладают также туморицидной и вообще цитоток- сической активностью (отсюда — необходимость формирования в активи- рованных макрофагах защитных механизмов их инактивации). К весьма активным факторам бактерицидности относятся продукты азотного метаболизма, в частности окись азота и радикал NO-, образую- щиеся под влиянием NO-синтетазы, особенно при действии на фагоци- тирующие клетки интерферона у или его сочетания с ФНОа. Эти метабо- литы особенно важны при разрушении микобактерий, устойчивость к которым коррелирует с активностью NO-синтетазы. Среди кислород- и азотнезависимых факторов повреждение микроб 139
ной мембраны вызывают дефензины (низкомолекулярные, а также более высокомолекулярные катионные белки, в частности р25, р37 и р57), ка- тепсин G, белок ВР1, усиливающий проницаемость бактериальной стен- ки, и аргиназа. Определенный вклад в лизис микробной стенки вносит лизоцим (мурамидаза), расщепляющий пептидогликаны. Лактоферрин проявляет свой эффект через связывание ионов железа и активацию сис- темы кислородзависимого киллинга. Закисление внутренней среды фаголизосом (pH 4,5—6,5) может ока- зывать бактериостатическое или бактерицидное действие, поскольку при pH, близком к 4,5, затрудняется поступление в микробную клетку пита- тельных веществ вследствие снижения ее электрического потенциала. Кроме того, кислая среда способствует активации большего количества ферментов фаголизосом, в том числе участвующих в бактериолизе или обеспечивающих его. Продукты жизнедеятельности микроорганизмов сами могут способствовать усилению локального закисления в фаголизо- соме. Процесс разрушения фагоцитированных клеток завершается благо- даря активности протеаз, нуклеаз, липаз и ферментов, расщепляющих уг- леводы (всего в лизосомах обнаружено более 60 разновидностей фермен- тов). Активность этих ферментов оптимальна как раз при кислых значе- иях pH, имеющихся в фаголизосоме. Продукты разрушения микроорганизмов вместе с содержимым фаго- изосом выбрасываются из клетки наружу в результате процесса, анало- 1ичного дегрануляции. 2.1.3. Секреторная активность фагоцитов Расширение представлений о функциях фагоцитирующих клеток в пос- ледние годы было в первую очередь связано с разработкой учения о секреторной активности этих клеток. Такая активность свойственна пре- имущественно активированным фагоцитирующим клеткам, однако по крайней мере макрофаги выделяют ряд субстанций (например, лизоцим и простагландин Е2) спонтанно. Секреторная активность выражается по меньшей мере в двух формах — выбросе содержимого гранул (для макро- фагов — лизосом), т.е. дегрануляции, и секреции с участием эндоплазма- тического ретикулума и аппарата Гольджи. Дегрануляция свойственна всем основным типам фагоцитирующих клеток — нейтрофилам, эозино- филам и макрофагам, тогда как второй тип секреции присущ в основном или исключительно макрофагам. Процесс дегрануляции особенно подробно изучен на нейтрофилах. Хотя он тесно связан с фагоцитозом и даже составляет основу последнего его этапа (выброса переваренных частиц), это автономные процессы. В присутствии цитохалазина В, разрушающего микрофиламенты, подав- ляется фагоцитоз, но осуществляется дегрануляция. Стимуляторами де- грануляции нейтрофилов служат иммунные комплексы, фрагменты компонентов комплемента СЗа и С5а, некоторые регуляторные пептиды, цитокины, метаболиты арахидоновой кислоты (гидроксиэйкозотетраено- вые кислоты — ГЭТЕ), ионофоры Са-+, цГМФ (цАМФ подавляет дегра- 729
нуляцию). Освобождение специфических гранул происходит быстрее и интенсивнее, чем азурофильных. Состав гранул нейтрофилов уже рассматривался выше (см. раздел 1.1.2). Основу секретируемого содержимого гранул составляют предобра- зованные ферменты, способные вызвать гибель микробов, паразитов, опухолевых клеток, а также переварить компоненты этих клеток. Часть этих ферментов (содержащихся преимущественно в специфических гра- нулах) проявляет активность при нейтральных и щелочных значениях pH, другая (содержащаяся в азурофильных гранулах) представляет собой кислые гидролазы. Наиболее важны для проявления активности вне клетки нейтральные ферменты — преимущественно протеиназы (катеп- син G, эластаза, коллагеназа), активные при нормальных значениях pH внеклеточной среды. Кислые протеиназы активны в условиях закисле- ния, создающихся при высокой активности процессов лизиса тканей и формирования гноя. Протеолитические ферменты участвуют также в формировании вазо- активных пептидов и опосредуют, таким образом, развитие сосудистой компоненты воспалительной реакции. Так, под влиянием нейтральных и кислых протеиназ образуются кинины, влияющие на сократимость и про- ницаемость мелких сосудов (см. раздел 2.3.2). Под действием сериновой протеиназы, производимой нейтрофилами, ангиотензиноген плазмы пре- вращается в ангиотензин II, сужающий сосуды и повышающий кровяное давление. Низкомолекулярные катионные белки обусловливают высво- бождение вазоактивных аминов и гистамина из тучных клеток и тромбо- цитов, вызывают агрегацию последних. Фермент, сходный по специфич- ности с протеиназами системы комплемента и способный отщепить вазо- активный пептид С5а от молекулы С5 (см. раздел 2.3.1), содержится в спе- цифических, а ферменты, вызывающие деградацию пептида, — в азуро- фильных гранулах. Часть вазоактивных пептидов образуется в гранулах нейтрофилов и выделяется непосредственно при дегрануляции. Важную роль в развитии воспаления и его регуляции играют эйкоза- ноиды — липидные продукты расщепления арахидоновой кислоты (см. раздел 2.3.2). Среди последних нейтрофилы выделяют простагландин Е2, лейкотриен В4, 5-ГЭТЕ, в меньшем количестве — тромбоксан А2, лей- котриен С4 и ряд других соединений этой группы. Их выделение длится 10—15 мин, причем сами метаболиты разрушаются ферментами, выделя- ющимися при дегрануляции нейтрофилов. К липидным продуктам, вы- деляемым нейтрофилами и играющим определенную роль в развитии воспалительной реакции, относится фактор, активирующий тромбоциты. Важную группу субстанций, выделяемых нейтрофилами, составляют бактерицидные продукты дыхательного взрыва и переокисления — пере- кись водорода, синглетный кислород, гидроксил-радикал, а также миело- пероксидаза и галоидсодержащие продукты, образующиеся при участии последней (галиды и гипогалиты, особенно производные йода). Секрети- руемый нейтрофилами лизоцим обусловливает разрушение пептидоглика- нов бактериальной стенки, а лактоферрин связывает ионы железа, необхо- димые для жизнедеятельности бактерий. Продукты, секретируемые ней- трофилами, токсичны для бактерий, грибов, микоплазм, вирусов.
Таблица 32. Секреторная активность макрофагов Группы факторов Факторы Условия секреции Функциональная значимость Компоненты комплемента С1-9, СЗа, СЗЬ, С5а, ВЬ, пропердин, факторы В, D, I, Н Спонтанно, усилена при активации Эффекторные реакции иммунитета, бактерио- лиз, цитолиз Факторы свертывания крови Факторы V, VII, IX, X, протромбиназа То же Свертывание крови и смежные процессы Белки матрикса, интегрины Фибронектин, тромбо- спондин, протеогликаны: гепарин-и хондроитин- сульфаты м »• Формирование межкле- точного матрикса, меж- клеточные контакты Транспорт- ные белки, ингибиторы Трансферрин, «2-макро- глобулин, авидин, транс- кобаламин II, ингибито- ры протеиназ Спонтанно и при актива- ции Регуляция транспорта и метаболизма белков, раз- витие воспаления Метаболиты арахидоно- вой кислоты Простагландин Е2, лей- котриены В и С, тром- боксан А2, 5-НЕТЕ, 15-НЕТЕ То же Регуляция воспаления, иммунного ответа и дру- гих процессов, ауторегу- ляция Продукты «кислород- ного взрыва» О2~, Н2О2, ОН и др. При актива- ции Бактерицидное, тумори- цидное, цитотоксическое действие Ферменты, их ингибиторы Нейтральные протеина- зы, кислые гидролазы, лизоцим, лактоперокси- даза При актива- ции, лизо- цим — спонтанно Бактерицидное, тумори- цидное действие, разру- шение тканевого детрита Цитокины ИЛ-1, ФНОа, ИЛ-6 и 8, ИФНа и Р, ГМ-, Г- и М-КСФ, ТФРр, эритропоэтин и др. При актива- ции Обеспечение воспалитель- ной и иммунной реакций, пролиферации, гемопоэза, межсистемных коммуни- каций, авторегуляция, туморицидность Гормоны, регулятор- ные пептиды СТГ, АКТГ, р-эндорфи- ны, бомбезин В основном при актива- ции Регуляция активации и функционирования кле- ток, развития воспаления Примечание. ИЛ — интерлейкин, ИФН — интерферон, ФИО — фактор некроза опухоли, ТФР — трансформирующий фактор роста, К.СФ — колониестимулирующий фак- тор: Г — гранулоцитарный, М — макрофагальный, ГМ — гранулоцитарно-макрофагальный. Во многом аналогичны проявления секреторной активности эозино- филов. Их главная особенность — преимущественная способность уби- вать внеклеточных паразитов и относительно слабая бактерицидная активность. Хотя эозинофилы способны секретировать продукты, обра- зующиеся при дыхательном взрыве, а также метаболиты арахидоновой 131
кислоты, специфика их действия связана, по-видимому, с секрецией продукта их гранул — главного щелочного белка (мол. масса 21 000), ток- сичного для паразитов (например, шистосом). Секреты эозинофилов бо- гаты лизофосфолипазой, расщепляющей фосфолипиды мембран погиб- ших клеток, особенно лизолецитин. Продукты эозинофилов токсичны также для некоторых клеток организма-хозяина, а также для опухолевых клеток. Они участвуют в отрицательной регуляции воспаления и реакций гиперчувствительности. Сведения о продуктах, секретируемых моноцитами и макрофагами, обобщены в табл. 32. Главные особенности моноцитов/макрофагов в сравнении с нейтрофилами и эозинофилами состоят в значительной вы- раженности процессов секреции, не связанных с дегрануляцией, а также способность клеток к синтезу секретируемых белков и пептидов и фор- мированию гранул de novo. Это обусловливает большую длительность и интенсивность секреторной деятельности этих клеток, а также возмож- ность спонтанной секреции некоторых продуктов. Если секреторная ак- тивность нейтрофилов и эозинофилов связана преимущественно с их бактерицидной и киллерной активностью, то секреция моноцитов/мак- рофагов наряду с этой функцией в значительной степени направлена на выполнение регуляторной роли в развитии воспалительной реакции и иммунного ответа. Процесс секреции, не связанной с дегрануляцией, не зависит от мик- ротрубочек: их разрушение колхицином препятствует дегрануляции с ос- вобождением кислых гидролаз, но усиливает секрецию макрофагами элас- тазы, коллагеназы, активатора плазминогена. Циклические нуклеотиды в большей степени влияют на дегрануляцию (цГМФ усиливает, а цАМФ ос- лабляет ее), чем на истинную секрецию ферментов макрофагами. Макрофаги спонтанно секретируют ряд продуктов: лизоцим, компо- ненты комплемента, ряд ферментов (например, эластазу), фибронектин, аполипопротеин А и липопротеиновую липазу. Последние два продукта имеют отношение к липидному обмену. Поскольку липопротеиновая ли- паза способствует образованию из липопротеинов низкомолекулярных липидных метаболитов, способных проникать в стенки артерий, ее ак- тивность имеет отношение к развитию атеросклероза. К этому процессу причастны и макрофаги как таковые в связи со способностью этих кле- ток (в частности, поглотивших частицы липидов) проникать в стенку со- судов. Вырабатывая фибронектин и родственные белки, макрофаги участвуют в формировании межклеточного матрикса, который служит важнейшим компонентом микроокружения клеток иммунной системы. Нормальное содержание в сыворотке крови и биологических жидкостях компонентов комплемента поддерживается благодаря их секреции мак- рофагами и клетками печени. Активация макрофагов по-разному влияет на секрецию указанных ве- ществ. Образование липопротеиновой липазы и эластазы при этом умень- шается. Синтез компонентов комплемента, кроме С2, С4 и С5, изменяется мало. Синтез С5 модифицируется на посттрансляционном уровне. В то же время происходит истинное усиление выработки и секреции С2, С4, кис- лых гидролаз, фибронектина, активатора плазминогена, включается син
тез цитокинов (ИЛ-1, 6 и 8), ФНОа, интерферонов аир, гормонов и дру- гих пептидных факторов (АКТГ, СТГ, p-эндорфина и т.д.). Активация макрофагов приводит также к процессам дегрануляции лизосом и фагосом с выделением продуктов, аналогичных тем, которые выделяются при дегрануляции нейтрофилов, — продуктов дыхательного взрыва, миелопероксидазы и галоидных производных, многочисленных ферментов-протеиназ (сериновой, аспартатной, металлозависимых и т.д.), кислых гидролаз и др. Комплекс этих продуктов обусловливает вне- клеточный бактериолиз и цитолиз, а также переваривание компонентов разрушенных клеток. Однако внеклеточная бактерицидная активность у макрофагов выражена несколько слабее, чем у нейтрофилов. Макрофаги не вызывают и массированного аутолиза, приводящего к формированию гноя. Это связано с особенностями выделяемых ферментов (миелоперок- сидазы, протеиназ, гидролаз), а также с их количеством и особенностями динамики процесса, который никогда не бывает столь бурным и «кон- центрированным» во времени, как реакция нейтрофилов. Другая особен- ность секреции этих продуктов макрофагами состоит в ее регулируемос- ти, в осуществлении которой важная роль принадлежит метаболитам ара- хидоновой кислоты. В то же время продукты секреции моноцитов/макрофагов очень важны для регуляции развития воспаления и иммунных процессов. В этом отношении особенно значимы простагландины, лейкотриены, ре- гуляторные пептиды и особенно цитокины. Секреция этих веществ, как правило, не связана с освобождением гранул, а является классическим секреторным процессом, происходящим при участии аппарата Гольджи. Из простагландинов (см. раздел 2.3.2) макрофаги образуют PGE2, ко- торый является важным регулятором активности (в том числе секретор- ной) самих макрофагов и других клеток, преимущественно подавляя процессы, связанные с развитием воспаления и иммунного ответа. Про- дукты липооксигеназного пути также влияют на функции макрофагов, в основном усиливая их (в частности, хемотаксическую и секреторную). Эти продукты являются важными медиаторами реакции гиперчувстви- тельности немедленного типа. Из веществ этой группы макрофаги обра- зуют лейкотриены В и С, тромбоксан А2, 5-ГЭТЕ и 15-ГЭТЕ. К регуляции биохимических процессов в воспаленных тканях имеют отношение разного рода ингибиторы, выделяемые макрофагами, — ин- гибиторы протеаз (а2-макроглобулин, а-антитрипсин, ингибитор плаз- мина), фосфолипазы (липомодулин), ингибитор активатора плазмино- гена, ингибиторы компонентов комплемента (факторы I и Н). Важнейшими регуляторами воспалительных и иммунных процессов являются монокины — цитокины, выделяемые активированными моно- цитами и макрофагами. Стимуляторами выработки ИЛ-1, 6 и ФНОа слу- жат бактериальные липополисахариды, полигликаны, а также другие Цитокины, регуляторные пептиды и множество иных разнообразных суб- станций. С индукцией синтеза цитокинов сопряжены не любые формы активации макрофагов: например, частицы зимозана и латекса не инду- цируют, а частицы кремния индуцируют секрецию ИЛ-1, хотя все они активируют макрофаги. Включение генов ИЛ-1 регистрируется в преде- 133
лах 1—2 ч после действия активаторов по экспрессии цитоплазматичес- кой мРНК, белковый продукт появляется в цитоплазме через 3—4 ч, а через 4—6 ч цитокин выявляется в среде. Максимум секреции ИЛ-1 до- стигается через 24—48 ч; через 48 ч новая мРНК уже не образуется. Сек- реция ФНОа развертывается еще быстрее и достигает максимума через 3 ч после действия активирующего агента, однако условием такого бы- строго реагирования служит праймирование животных бактериальными клетками (у непраймированных животных секреция очень кратковремен- на и слаба). Если ФНОа и ряд других цитокинов секретируются при участии аппарата Гольджи, то ИЛ-1, не имеющий сигнальной последова- тельности, секретируется иным путем. В цитоплазме молекула — пред- шественник ИЛ-1 расщепляется протеиназой, конвертирующей ИЛ-1 (ICE — IL-1-converting enzyme). Этот фермент, специфически гидролизи- рующий пептидную цепь около остатков аспартата, играет, кроме того, ключевую роль в реализации апоптоза. Таким образом, секреторная активность свойственна всем фагоцити- рующим клеткам. Она часто сопряжена с их активацией, хотя механизмы запуска этих процессов не идентичны. Секреция осуществляется путем высвобождения содержимого клеточных гранул или путем выделения синтезируемых de novo веществ. Секреторный процесс связан с выполне- нием бактерицидной (шире — цитотоксической) и, особенно для макро- фагов, регуляторной функций фагоцитирующих клеток. 2.1.4. Киллерная активность фагоцитов Киллерный эффект макрофагов, столь важный для проявления противо- опухолевой активности этих клеток, не сводится ни к их фагоцитарной активности, ни к внеклеточному цитолизу, обусловленному секретируе- мыми продуктами (хотя оба этих процесса могут участвовать в реализации цитотоксического действия макрофагов). Более важную роль в его осу- ществлении играют механизмы, требующие прямого клеточного контакта. Для достижения контакта используются по меньшей мере три меха- низма: • неспецифический контакт, основанный на взаимодействии адге- зивных молекул типа интегринов (например, LFA-1 — ICAM-1); • взаимодействие Fc- и CR-рецепторов макрофага с опсонирующи- ми субстанциями на поверхности клетки-мишени (с антителами, компонентами комплемента), при этом макрофаг приобретает способность к антителозависимому цитолизу; • специфическое взаимодействие с клетками-мишенями макрофа- гов, «армированных» путем связывания с их поверхностнымг Fc-рецепторами антител к клеткам-мишеням. Поскольку при этол активные центры антител направлены наружу, макрофаг приобре тает способность распознавать специфические антигенные марке ры клетки-мишени и целенаправленно «находить» эту клетку В формировании «армированных» макрофагов важная роль при надлежит Т-клеткам и их продуктам, в частности интерферону у. 13 А
Эффективность цитолиза в этом ряду последовательно повышается; «армированные» макрофаги являются, по-видимому, наиболее эффек- тивными из известных киллерных клеток. Природа киллерного эффекта макрофагов не раскрыта. Вероятно, как и в случае киллерных лимфоци- тов, в основе киллерного действия макрофагов лежит сочетание различ- ных механизмов: индукции апоптоза, внедрения в мембрану клетки-ми- шени цитолитических молекул, продуцируемых макрофагом, выделения цитокинов с цитолитической активностью (например, ФНОа). Очевид- но, что продукты, образующиеся при дыхательном взрыве, а также гало- идные производные и некоторые ферменты, секретируемые в межклеточ- ную среду активированными макрофагами, также вносят вклад в опосре- дованный ими цитолиз. Допускается возможность «инъекции» в клетку- мишень лизосом макрофагов. Киллерной активностью обладают также гранулоциты. Если для эо- зинофилов это исключительно внеклеточный цитолиз, обусловленный секретируемыми продуктами, то для нейтрофилов природа цитотокси- ческой активности не установлена. По-видимому, как и в случае с мак- рофагами, она связана с действием нескольких механизмов — контакт- ной индукцией апоптоза, токсичностью секретируемых продуктов и, воз- можно, передачей в клетки-мишени токсического материала. Таким образом, клетки рассмотренной группы выполняют ряд важ- нейших функций, направленных на разрушение и удаление из организма чужеродных и потенциально вредных для него, а также устаревших эндо- генных компонентов. Это достигается путем фагоцитоза, а также меха- низмов внеклеточного киллинга с участием контактных взаимодействий и секретируемых продуктов. Опознание объектов атаки этих клеток осу- ществляется независимо от их антигенной специфичности — вследствие отсутствия элементов защиты клеточной поверхности (как результат де- сиалирования) или опсонизации антителами или компонентами компле- мента. Существенно, что активация клеток, опосредующих естественную защиту организма, происходит быстро и не требует развития иммунного ответа. В то же время некоторые из рассмотренных клеток (особенно макрофаги) участвуют в иммунном ответе. Факторы естественного иммунитета формируются в организме до внедрения чужеродных агентов и независимо от него. В условиях биологической агрессии происходят мобилизация и активация этих факторов в процессе развития воспалительной реакции. Источни- ком активации служат сами патогены и поврежденные клетки орга- низма. Условием развития местной защитной реакции является поступление в очаг поражения циркулирующих лейкоцитов. Это происходит благодаря повышению адгезивности клеток эндотелия мелких сосудов в очаге поражения, а также наличию хемотаксичес- кого сигнала, исходящего из этого очага. Активация лейкоцитов (нейтрофилов, моноцитов/макрофагов и т.д.) заключается в усиле- нии метаболических процессов, что приводит к образованию бак- терицидных субстанций (продуктов метаболизма кислорода и 135
азота, ферментов). Уничтожение агрессивных агентов реализуется в форме внеклеточного, внутриклеточного и контактного цитолиза. Внеклеточный цитолиз осуществляется секретируемыми бактери- цидными продуктами. Условием реализации внутриклеточного ци- толиза, наиболее эффективного при защите от микроорганизмов, является фагоцитоз — поглощение и переваривание микроорганиз- мов лейкоцитами. Контактный цитолиз основан на индукции апоптоза клеток-мишеней в результате поступления сигналов с мембраны или проникновения внутрь клетки сигнальных молекул. 2.2. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРОВ Система естественных киллеров представляет собой компонент первой линии защиты, в то же время имеющий некоторые черты, свойственные адаптивному звену иммунитета. С одной стороны, для реализации актив- ности естественных киллеров не требуется их предварительного контакта с индуцирующим агентом и развития иммунного ответа. С другой сторо- ны, типичные естественные киллеры представляют собой лимфоциты и, хотя они лишены антигенраспознающих рецепторов, им свойственны некоторые примитивные распознающие функции и ряд особенностей, сближающих их скорее с Т-лимфоцитами, чем с фагоцитирующими клет- ками. В фило- и онтогенезе эта система появляется раньше, чем факторы антигенспецифической иммунной защиты. Данная система ответственна за противоопухолевую и противовирусную резистентность. Кроме того, естественные киллеры выполняют регуляторную функцию, контролируя (через проявление цитотоксичности и выделение цитокинов) пролифера- цию гемопоэтических клеток-предшественников костного мозга, лимфо- цитов, вовлекаемых в иммунный ответ, а также других активно делящихся клеток. Это те же функции, которые выполняют Т-лимфоциты, но в отличие от них NK-лимфоциты убивают клетки-мишени быстро (1—2 ч), используя упрощенный механизм без распознавания индивидуальных антигенов и подготовки в виде иммунного ответа. Таблица 33. Типы активации естественных киллеров Тип активации Факторы Проявления Подготови- тельная Продукты активированных мак- рофагов: ИЛ-12, интерфероны Усиление адгезивности, индук- ция секреции интерферона у Контактная Контакт с клетками-мишенями, опосредованный интегринами, селектинами и CD16, 57 и 2 Освобождение гранул, секреция цитокинов, индукция гибели клеток-мишеней Цитокиновая ИЛ-2, кофакторы: ИЛ-1, 7, 12, 3 и 6, интерфероны Расширение спектра клеток- мишеней, повышение цитоли- тической активности
Рис. 31. Стадии активации NK- клеток и цитокины, которые обу- словливают эти стадии. Хотя NK-клетки реализуют цитотоксическую реакцию без разверну- того иммунного ответа, они все-таки нуждаются в предварительной акти- вации (табл. 33, рис. 31). В условиях целостного организма проявлению их активности обычно предшествуют инфицирование вирусами, форми- рование воспалительного или опухолевого процесса, а в условиях экспе- римента — введение интерферонов или их индукторов (среди которых двуспиральная РНК, свойственная вирусам). Индуцируемая при этом ак- тивация NK-клеток обусловлена выделением макрофагами интерферо- нов а и р и особенно ИЛ-12, который способен 100-кратно увеличить активность естественных киллеров. При этом усиливается адгезивность NK-клеток, изменяется экспрессия некоторых мембранных молекул, ин- дуцируется секреция интерферона у. Другой уровень активации естест- венных киллеров достигается при их взаимодействии с клетками-мише- нями, о чем будет сказано далее. Наконец, существенную перестройку свойств и функций NK-клеток вызывают продукты воспалительных Т- хелперов (Thl) — ИЛ-2 в сочетании с другими лимфокинами. В резуль- тате существенно повышается цитолитический потенциал NK-клеток и они превращаются в лимфокинактивированные (ЛАК) клетки. Взаимодействия естественных киллеров и клеток-мишеней, веду- щие к гибели последних, можно условно разделить на несколько стадий (рис. 32). Распознавание мишеней и установление межклеточного контакта (рис. 33). Рецептор NK-клеток, предназначенный для распознавания клеток- 237
Опосредуется рецепторами NKR, KAR, возможно, CD56 и др. Опосредуется молекулами адгезии, в частности 02-интегрином LFA-1, с участием Мд2*, участием микрофиламентов Перестройка гранул, секреция цитокинов, взаимная ориентация клеток Формирование перфори- новых пор в клетке-мишени, передача гранзимов, активация каспаз Деградация ДНК и другие проявления апоптоза. Формирование пор в мембранах и проявления некроза. Фагоцитоз Рас. 32. Стадии осущест- вления цитолиза клеток- мишеней естественными киллерами. NK-клетка Ингибиция Активация Костимуляция Усиление адгезии KIR: Лектин KAR: NKH1 HNK-1 FcyRIII LFA-2 LFA-1 Клетка-мишень Рис. 33. Мембранные молекулы, участвующие в адгезивном взаимодействии ес- тественных киллеров с клетками-мишенями. KIR — ингибиторные рецепторы киллеров; KAR — активирующие рецепторы киллеров; МСБ — белки, содержащие концевую маннозу; фиксир. АТ — антите- ла, опсонизирующие клетки-мишени. Г ЭР
мишеней (см. раздел 1.1.1), представляет собой С-лектин (т.е. белок, рас- познающий углеводные остатки при участии ионов Са2+) NKR-P1 (CD161). Он распознает концевые остатки маннозы на молекулах мем- бранных гликопротеинов и гликолипидов. В норме эти остатки на боль- шинстве клеток, с которыми контактируют зрелые лимфоциты и макро- фаги, блокированы остатками сиаловой кислоты. Это защищает их от фагоцитоза макрофагами, которые тоже имеют рецепторы, связывающие маннозу, и от лизиса NK-киллерами. Свободная манноза присутствует на поверхности юных и, наоборот, старых клеток, а также пролиферирую- щих и трансформированных (инфицированных вирусами и злокачест- венно перерожденных) клеток. Еще недавно считалось, что все эти клетки могут служить мишенями для естественных киллеров. Однако было известно, что NK-клетки способны убивать клетки очень ограниченного числа опухолевых линий и практически не убивают свежевыделенные опухолевые клетки. Природа ограничений в проявле- нии активности естественных киллеров в основном прояснилась в ре- зультате открытия рецепторов, ограничивающих киллинг (KIR). Как уже отмечалось, эти рецепторы (NKB-1, р58.1, р58.2) распознают аутологич- ные молекулы МНС, экспрессированные на клетках-мишенях, и подают в NK-клетку сигнал, который запрещает развитие дальнейших событий, ведущих к цитолизу. В результате мишенями естественных киллеров могут стать клетки, на поверхности которых присутствуют гликоконъю- гаты со свободными остатками маннозы и не содержатся молекулы МНС I класса. Наибольшую роль в ограничении активности NK-клеток играют молекулы HLA-C (у мышей — H-2.D) и HLA-B, распознаваемые соответ- ственно KIR-рецепторами р58 (CD158a и b) и NKB-1. В распознавании NK-клетками молекул I класса существует много важных деталей, кото- рые не до конца изучены. Так, пока непонятно значение распознавания вместе с молекулами МНС пептидов, которые в них встроены, а также некоего процесса, подобного обучению (селекции) NK-клеток этому рас- познаванию. При соблюдении условий, определяемых узнаванием углеводных компонентов клеточной поверхности и отсутствием распознавания моле- кул МНС, происходит сближение NK-клеток с их мишенями. Оно обу- словлено не только связыванием рецептора с гликоконъюгатом, но (в значительно большей степени) и сопутствующими адгезивными взаимо- действиями. В качестве участников этого взаимодействия рассматрива- ются различные адгезивные молекулы — CD57 (HNK1), ганглиозиды, P-цепь ламинина (р48), CD2, а также различные типы интегринов, осо- бенно р2-интегрин LFA-1, распознающий молекулы ICAM-1, 2 и 3. Предполагают, что распознающие и распознаваемые молекулы при уста- новлении контактов NK-клеток и клеток-мишеней могут меняться мес- тами, поскольку и те и другие могут присутствовать как на киллерах, так и на их мишенях. Это должно способствовать упрочению контактов между клетками. Особое место в этом отношении занимает молекула Fc- рецептора типа Fcylll (CD16), которая экспрессируется на значительной части (75 %), но не на всех NK-клетках. Поскольку эти рецепторы рас- познают Fc-порции иммуноглобулинов (IgG3 и IgGl), они обусловлива- 139
NK-клетка Экзоцитоз перфорина и гранзимов Клетка-мишень О Гранзимы Активация каспаз Реализация апоптоза Рис. 34. Иллюстрация основного механизма индукции апоптоза клеток-мишеней при их контакте с NK-клетками. Микрополость в области контакта NK-клеток и клеток мишеней, в которую из клеток-киллеров путем экзоцитоза поступают молекулы мономерного перфорина и гранзимов. Перфорин встраивается в мембрану клетки-мишени и, полимеризу- ясь, формирует пору, через которую в клетку-мишень поступают молекулы гран- зимов. Гранзимы активируют сериновые протеазы (каспазы), которые запускают заключительные этапы апоптоза клеток-мишеней. ют распознавание клеток, опсонизированных антителами соответствую- щих классов. Конечным результатом такого распознавания является ци- толиз, обозначаемый как антителозависимый клеточно опосредованный цитолиз. Клетки-эффекторы, которые его осуществляют, называют К- клетками (следовательно, К-клетки — это разновидность NK-клеток). Во всем, кроме механизмов распознавания клеток-мишеней, реакции кил- линга, обусловленные NK- и К-клетками, не отличаются друг от друга. Фаза сближения складывается из двух этапов, дифференцируемых по участию микрофиламентов цитоскелета (подавляется цитохалазином А) и зависимости от ионов Mg2+. Она предполагает переориентацию элемен- тов цитоскелета и цитоплазматических гранул с реорганизацией участков мембраны киллеров. 1ЛП
Программирование лизиса (рис. 34). Фаза включает основные собы- тия, осуществляющиеся в клетке-киллере и подготавливающие после- дующие стадии цитолиза. Несмотря на отсутствие видимых поврежде- ний, клетка-мишень уже на этой стадии оказывается обреченной на ги- бель даже после ее отделения от киллера. Еще недавно считалось, что механизмы цитолиза, обусловленного цитотоксическими Т-лимфоцитами и NK-клетками, практически иден- тичны. Однако выяснилось, что если Т-клетки используют несколько ме- ханизмов для разрушения клеток-мишеней (см. раздел 4.1.5), то в основе цитолиза, обусловленного естественными киллерами, по-видимому, лежит единственный — перфоринзависимый — механизм. Оказалось, что у мышей с удаленным геном перфорина может осуществляться Т-клеточ- ный цитолиз, но невозможен цитолиз, обусловленный NK-клетками. Контакт NK-лимфоцитов и клеток-мишеней приводит к активации NK-клеток, выражающейся в освобождении гранул и секреции ряда ци- токинов в локализованном участке, обращенном в сторону клетки-ми- шени. В гранулах содержится два типа субстанций — перфорин и гранзимы (фрагментины). Перфорин представляет собой белок с моле- кулярной массой 66 000—70 000. В присутствии ионов Са2+ он изменяет свою конформацию; при этом открываются гидрофобные участки, спо- собствующие внедрению белка в мембрану клетки-мишени. Акцепто- рами перфорина в мембране являются молекулы фосфорилхолина. Погрузившись в мембрану, перфорин полимеризуется. Соединения 3— 4 мономеров уже достаточно для формирования функционирующего канала, однако обычно формируется канал больших размеров, состоя- щий из 10—20 молекул перфорина. Его диаметр равен 10—20 нм (в среднем 16 нм). Такой канал создает возможность для прохождения не только ионов, но и молекул белка. Его образование, казалось бы, долж- но служить условием, достаточным для осуществления лизиса клетки вследствие нарушения изоляции внутренней среды клетки от ее окру- жения. Однако анализ с использованием клеток с инактивированными гена- ми перфорина и гранзимов показал, что в действительности для реализа- ции «перфоринового» лизиса необходимо участие гранзимов, для кото- рых перфориновый канал служит проводником. Гранзимы представляют собой сериновые протеиназы/эстеразы трипсин/хемотрипсинового типа. Имеется по меньшей мере три их варианта. При проникновении в клетку гранзимы активируют другие сериновые протеиназы — каспазы. Каспазы включают процессы, которые завершаются активацией эндонуклеазы и деградацией ДНК вследствие разрывов нитей ДНК между нуклеосомами, т.е. реализацией апоптоза (см. раздел 3.5.3). Как уже отмечалось, другие механизмы лизиса и индукции апоптоза естественными киллерами не ис- пользуются: это относится как к Fas-зависимым процессам, так и к про- явлению действия лимфотоксина, секретируемого NK-клетками при их контакте с мишенями. Таким образом, суть программирования лизиса в случае NK-клеток заключается в формировании в мембране клеток-мишеней перфорино- вых пор и проникновении через них гранзимов, запускающих в клетке 141
процесс, который приводит к развитию апоптоза. После программирова- ния лизиса NK-клетка отделяется от клетки-мишени; при этом сохраня- ется возможность повторного участия в цитолизе (рециклинга) естест- венных киллеров. Реализация лизиса. В цитолизе клеток-мишеней сочетаются проявле- ния апоптоза и некроза (см. раздел 3.5.3). Основой этого служат описан- ные выше процессы программирования. В клетке включаются механиз- мы апоптоза, но путь, который для этого используется (формирование пор), неизбежно приводит к проявлениям некроза (осмотические явле- ния, сопровождающиеся изменением работы ферментов и т.д.). В целом в клетках-мишенях преобладают признаки апоптоза, прежде всего смор- щивание клеток и конденсация хроматина. Общая продолжительность цитолиза, обусловленного NK-клетками, составляет 1—2 ч. Из этого времени на установление контакта между клетками тратится 0,5—1,5 мин (при этом температура не имеет значе- ния). Для стабилизации контактов и взаимной ориентации клеток требу- ется 5—15 мин, для программирования лизиса — от нескольких минут до часа (эта фаза осуществляется при 37 °C), столько же времени расходует- ся на реализацию лизиса. Гуморальные факторы, выделяемые NK-клетками и действующие на них. В процессе взаимодействия с клетками-мишенями и реализации цитолиза естественные киллеры выделяют цитокины — интерфероны а, Р и у, ИЛ-1 и 2, ФНОа и р, колониестимулирующие и хемотаксические факторы, а также простагландины, p-эндорфин, серотонин, адреналин и мелатонин. Возможно, некоторые из них выступают в качестве ко- факторов цитолиза. Однако, по-видимому, их главная роль состоит в иммунорегуляции. NK-клетки, испытывающие активирующее действие макрофагов (о чем говорилось выше), оказывают на них ответное вли- яние, которое также способствует активации этих клеток. Особенно это относится к основному продукту естественных киллеров — интерферо- ну у. В сочетании с ФНОа он повышает активность NO-синтетазы, обеспечивая генерацию окиси азота — одного из основных факторов бактерицидности макрофагов. Этот цитокин является, кроме того, ау- токринным активатором естественных киллеров. В его присутствии на- блюдается 5-кратное ускорение лизиса. Он усиливает экспрессию мембранных протеиназ и, по-видимому, других эффекторных факторов цитолиза. Кроме того, интерферон у обеспечивает условия для осущест- вления повторного проявления цитолитической активности естествен- ных киллеров. Факторами, способствующими осуществлению NK-опосредованного лизиса, являются лейкотриен В4 и тромбоцитактивирующий фактор. Факторами, угнетающими активность естественных киллеров, служат ингибиторы протеиназ, простагландины, кортикостероиды, адреналин, норадреналин, прогестерон, эстрадиол, циркулирующие иммунные ком- плексы. Любые факторы, действующие на NK-клетки через р-адренерги- ческие рецепторы и приводящие к повышению уровня внутриклеточного цАМФ, подавляют киллерную активность этих клеток. Ингибиторами ес- тественных киллеров служат Т-супрессоры, активированные макрофаги 142
и гранулоциты, причем подавляющее действие этих клеток связано в ос- новном с выделением указанных субстанций. Имеются сведения о само- регуляции активности NK-клеток по механизму обратной связи. Воз- можно, она реализуется через ингибирующий эффект повышенных кон- центраций интерферона у, достигающихся при чрезмерной активации ес- тественных киллеров. Не исключено, что авторегуляторные NK-клетки идентичны так называемым естественным супрессорным клеткам — суп- рессорным лимфоцитам, лишенным маркеров как Т-, так и В-клеток. Образование ЛАК-клеток. Особого рассмотрения заслуживает дейст- вие ИЛ-2 на естественные киллеры и обусловленный ими цитолиз (см. табл. 33 и рис. 31). Большие гранулярные лимфоциты непосредственно (без предварительной активации) реагируют на действие ИЛ-2 пролифе- рацией, повышением цитолитической активности и расширением спект- ра клеток-мишеней, хотя они не экспрессируют CD25 — a-цепи высоко- аффинного рецептора для ИЛ-2. Действие ИЛ-2 обусловлено присутст- вием на поверхности этих клеток р- (CD 122) и у- (CD 132) цепей, форми- рующих рецептор с промежуточным сродством к ИЛ-2. Весьма сущест- венно, что под влиянием активации ИЛ-2 естественных киллеров пос- ледние приобретают способность лизировать in vitro свежевыделенные опухолевые клетки, к чему, как правило, не способны обычные NK-клет- ки. Это означает, что, помимо повышения литической активности есте- ственных киллеров, ИЛ-2 снимает ингибирующий эффект распознава- ния аутологичных молекул МНС I класса, которые часто присутствуют на клетках опухолей. NK-клетки, активированные ИЛ-2, составляют основную фракцию так называемых ЛАК-клеток (лимфокинактивированных киллеров), ко- торые образуются в процессе 3—5-дневного культивирования мононук- леаров крови в присутствии ИЛ-2. Эту фракцию ЛАК-клеток иденти- фицируют по наличию мембранных маркеров NK-клеток — CD 16 и 56. Определенный вклад в популяцию ЛАК-клеток вносят активируемые Т- лимфоциты, которые определяются по экспрессии CD3. Методология получения ЛАК-клеток разработана в процессе поиска методов лечения злокачественных опухолей. Формированию ЛАК-клеток под влиянием ИЛ-2 способствуют ИЛ-1 и 7, ГМ-КСФ, интерфероны. ИЛ-4, действую- щий в комплексе с ИЛ-2, снижает активирующее действие ИЛ-2, но сам в определенных ситуациях может вызвать образование ЛАК-клеток. Роль естественных киллеров в иммунной защите. Естественным кил- лерам всегда отводилась большая роль в опосредовании защиты организ- ма от опухолей и внутриклеточных инфекций. Однако мнение об их месте в иммунной защите было существенно пересмотрено в связи с вы- явленным «запретом» на лизис этими киллерами клеток-мишеней, несу- щих аутологичные молекулы МНС I класса. В настоящее время полага- ют, что мишенями естественных киллеров служат клетки, утратившие молекулы МНС I класса. Известно, что некоторые вирусы (аденовирусы и т.д.) ингибируют экспрессию этих молекул. Утрата последних наблюда- ется и при росте некоторых опухолей (см. раздел 4.3.2). Это явление рас- сматривается как способ избежать распознавания СО8+-клеток Т-килле- рами (их рецепторы, как известно, специфичны к чужеродным пептидам, 143
представляемым молекулами I класса). В таком случае NK-клетки, выяв- ляющие и разрушающие мишени, которые «избежали» действия иммун- ных механизмов второй линии защиты, могут рассматриваться как факторы не первой, а третьей линии защиты, если таковая существует. Накопленные данные свидетельствуют о том, что содержание и функци- ональное состояние естественных киллеров коррелируют с резистентнос- тью к опухолям, особенно к лейкозам. До сих пор не решен вопрос о возможности формирования в организме-опухоленосителе ЛАК-клеток и их реальной роли в защите от опухолей. Значение NK-клеток в противоинфекционной защите прояснилось благодаря наблюдению за редкими случаями дефицита NK-клеток. У таких больных чрезвычайно бурно протекают ранние этапы заражения вирусами герпеса. Однако спустя 7—10 дней процесс сдерживается, на- ступает выздоровление. Аналогично у мышей, лишенных NK-клеток (но не Т- или В-лимфоцитов), очень тяжело протекает листериозная инфек- ция, которая часто приводит к гибели в первые дни заболевания. Эта фе- номенология объясняется следующим образом. При заражении внутри- клеточными агентами (вирусами, листериями и т.д.) решающая защитная роль на ранних этапах инфекции, когда не сформировались механизмы адаптивного иммунитета, принадлежит естественным киллерам. Поэтому в их отсутствие начальные этапы инфекции протекают очень тяжело. Но позже срабатывают иммунные механизмы (связанные с активностью Т- клеток) и происходит выздоровление, вклад в которое NK-клеток не- велик. Основная функция естественных киллеров — контактный цитолиз клеток-мишеней, пораженных вирусом или трансформированных. NK-клетки распознают свободные углеводные остатки на поверх- ности клеток-мишеней. При контакте из киллера в клетку-мишень поступают сигнальные молекулы, включающие процесс ее про- граммированной гибели (апоптоза). В случае присутствия на по- верхности клетки-мишени продуктов МНС I класса реакция цито- лиза блокируется (мера против повреждения собственных клеток организма). 23. ГУМОРАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ЕСТЕСТВЕННОГО ИММУНИТЕТА В сыворотке крови присутствуют белки, являющиеся компонентами сис- тем факторов, которые каскадно активируются в ответ на воздействия, возмущающие гомеостаз. Это системы комплемента, кининов, свертыва- ния крови и фибринолиза. Существуют и другие белковые факторы, участвующие в первой линии защиты организма. Указанные факторы и системы факторов при определенной автономии их выработки и функци- онирования связаны между собой звеньями, обусловливающими включе- ние одной системы при активации другой. Среди них система комп- 744
Таблица 34. Компоненты комплемента человека Компонент 1 Мол. масса, хЮОО Цепи (мол. масса, х1000, число цепей) Продукты расщепления Концентрация в сыворотке крови, мкг/мл Клас сический пут Ь Clq 459 18 (по 6 цепей 3 типов) 80 С1г 190 95 х 2 60; 35 34-50 Cis 85 1 цепь 59; 28 30-50 С2 ПО 1 цепь 87(a); 30(b) 15-25 С4 200 93 780 и 33 6(a); 197(b) 350-500 Альте рнативный п) т ь Фактор В 95 1 цепь 63(b); 30(a) 200 Фактор D 25 1 цепь 1-5 Пропердин 220 47,5 х 4 25 Общие компонент ы СЗ 190 110 и 75 185(b); 10(a) 1200 сзь 185 100 и 75 40(d); 145(c) — С5 190 а, Р 15(а); 185ф) 75 С6 128 1 цепь — 60 С7 120 1 цепь — 60 С8 160 а, Р> У — 60 С9 79 1 цепь — 60 Р е г у л я т оры и ингибиторы C1EI 105 1 цепь 1 1- 180 С4Ьр 560 70 х 8 250 Фактор Н 150 1 цепь — 500 Фактор I 90 40 и 50 — 25-35 Белок S (витронектин^ 89 J1 цепь — 500 лемента имеет наиболее длительную историю изучения и исследована наиболее полно. 2.3.1. Система комплемента Характеристика основных компонентов системы комплемента дана в табл. 34. Это белки, которые представлены в сыворотке крови, главным 145
Классический путь Альтернативный путь C1q,r,s АГ-АТ — C1qrs — СЗ(Н2О) --------ф.В,Ц СЗ(Н2О)ВЬ С2 •СЗ I сзьв h—D сзьвь -—р С5 С4Ь2аЗЬ—--------C3bnBb(P) С5-конвертазы С5Ь С5Ь6 С5Ь67 С5Ь678 I С5Ь6789 Лизис Рис. 55. Активация системы комплемента по классическому и альтернативному путям (объяснение см. в тексте). образом во фракции р-глобулинов. Они вырабатываются преимуществен- но макрофагами и клетками печени. В норме компоненты комплемента неактивны. Пусковые события их активации зависят от продуктов, формирую- щихся при иммунном ответе или содержащихся в микроорганизмах. Дальнейшее функционирование системы состоит в последовательной ак- тивации большого числа компонентов при постоянном отрицательном контроле со стороны регуляторных факторов, сдерживающих реакцию. Схема активации комплемента приведена на рис. 35, основное содержа- ние этапов активации — на рис. 36. Первый этап реакции, завершаю- щийся формированием СЗ/С5-конвертаз, связанных с клеточными мем- бранами, может реализоваться двумя различными путями, обозначаемы- ми как классическая и альтернативная активация. Следующий этап, 146
Стадии Классический путь Альтернативный путь Результаты Рис. 36. Основные этапы активации комплемента и их результаты (объяснение см. в тексте). общий для обоих путей, приводит к атаке мембран и лизису клеток, на поверхности которых осуществляется каскад реакций комплемента. 2.3.1.1. Классическая активация комплемента Эта форма активации включает фазы узнавания (инициации) и усиления (амплификации). В первую фазу вовлечены молекулы Cl — Clq, С1г и Cis, во вторую — С4, С2 и СЗ. Образование комплекса Clqrs. Пусковым этапом каскада классичес- кой активации комплемента является формирование иммунного ком- плекса. При этом важно, чтобы в состав комплекса входили антитела, принадлежащие к определенным классам и подклассам иммуноглобули- нов, — IgM, IgGl, IgG3, в меньшей степени — IgG2. В составе их кон- 747
Рис. 37. Строение комплекса Clqrs. стантных доменов (Сц4, Су2) имеется участок, обладающий сродством к Clq. Этот участок становится доступным для свя- зывания лишь после взаимодей- ствия антитела с антигеном, т.е. в составе иммунного комплекса. Clq связывается не менее чем с двумя Сн2-доменами одной и той же молекулы IgM и с Сн2- доменами одновременно двух молекул IgG (это обусловливает существенно более низкую ком- плементактивирующую актив- ность IgG по сравнению с та- ковой IgM). В последние годы установлено, что активаторами классического пути могут быть также некоторые компоненты бактерий (в том числе липопо- лисахарид, точнее липид А, вхо- дящий в его состав), холесте- ринсодержащие липиды, комплексированный С-реактивный белок, не- которые ретровирусы. Однако основными активаторами служат все-таки иммунные комплексы. Clq представляет собой большую молекулу, состоящую из 18 поли- пептидных цепей — по 6 цепей трех типов А, В и С. Белки такого типа называются коллектинами. Каждая из этих цепей имеет вблизи N-конца коллагеноподобный участок (78 остатков), тогда как С-концевая часть (103—108 остатков) имеет глобулярную структуру. В собранном виде мо- лекула Clq напоминает букет тюльпанов (рис. 37): «ствол» букета образо- ван переплетенными спиралями коллагеноподобных структур, а расходя- щиеся «ветви» и их бутонообразные завершения — глобулярными частя- ми молекул. Этими концевыми структурами Clq взаимодействуют с ком- плементсвязывающими участками антител. Связывание приводит к активации Clq, состоящей в приобретении Clq активности сериновой протеиназы (эстеразы). Субстратом для действия Clq-протеиназы служат гомодимерные мо- лекулы С1г и Cis. Каждая цепь этих молекул расщепляется при действии Clq-протеиназы на контактный и каталитический фрагменты, которые «удерживаются» в составе комплекса благодаря наличию внутримолеку- лярных связей. Расщепление сопровождается активацией каталитическо- го фрагмента. Первым активируется С 1г, который участвует в расщеп- лении — активации Cis. В результате попарного взаимодействия кон- тактных и каталитических фрагментов^ 1г и Cis и их встраивания в мо- лекулу Clq образуется комплекс Clqrs (точнее Clqr2s2), обладающий активностью трипсиновой протеиназы (эстеразы). Активации способст- вует сближение активных центров С1г и Cis. Формированием комплекса 1ЛО
Clqrs завершается фаза узнавания. Специфичность Clqrs складывается из специфичностей С 1г и Clq. Субстратом эстеразной активности С1г является Cis, субстратом аналогичного действия Clq — С4 и С2. Ком- плекс Clqrs может существовать в растворимой и мембранной формах. Последняя образуется, когда иммунный комплекс локализован на по- верхности клетки, и на ней же фиксируются компоненты комплемента. Процесс формирования комплекса Clqrs подавляется сывороточным ингибитором С1-эстеразы Clinh, который обладает способностью отщеп- лять С 1г и Cis. Ингибитор входит в систему факторов, ограничивающих активацию комплемента. Известен наследственный дефицит С ljnh, обо- значаемый по своему главному проявлению как ангионевротический отек. Причина развития отека, иногда представляющего угрозу жизни, состоит в накоплении анафилактогенных фрагментов компонентов ком- племента (см. ниже). Чрезмерная активация факторов комплемента при этом не происходит, поскольку их образование ограничивается другими регулирующими факторами. Формирование СЗ-конвертазы. Следующая стадия активации заклю- чается в образовании СЗ-конвертазы. Clqrs-эстераза обусловливает рас- щепление С4 и С2 на тяжелые (С4Ь и С2а) и легкие (С4а и С2Ь) фраг- менты. С4Ь взаимодействует с комплексом Clqrs и затем связывает С2а при участии ионов Са2+. Комплекс С4Ь2а обладает СЗ-конвертазной ак- тивностью. Возможно, он включает также фрагмент С2Ь, который упро- чивает комплекс С4Ь2а. Собственно СЗ-конвертазная активность комп- лекса определяется ферментативной специфичностью С2а. Недавно описан вариант классической активации комплемента, ко- торый можно трактовать и как самостоятельный — лектиновый — путь активации. Его запуск связан с маннозосвязывающим белком (МСБ), кото- рый присутствует в сыворотке крови (0,1—5 мкг/мл). Он имеет структуру, очень сходную со структурой Clq («букет тюльпанов»), хотя и не гомоло- гичен ему. МСБ является лектином С-типа (т.е. Са2+-зависимым лекти- ном), обладает сродством к маннозе, которая в свободной форме при- сутствует на микробных клетках, но не на клетках организма. Связав- шись с клеткой, МСБ приобретает способность, подобно Clqrs, активи- ровать С4 и С2 (черта над обозначением комплексов означает наличие ферментной активности). Все дальнейшие этапы лектинового и класси- ческого путей совпадают. При активации комплемента проявляется закономерность: каждый очередной продукт расщепления компонентов комплемента имеет два активных центра — для связывания с предобразованным комплексом (контактный) и для активации очередного компонента (каталитический). При этом больший по размерам компонент (обозначаемый обычно бук- вой «Ь»; исключение составляют продукты расщепления С2) обладает ак- тивностью трипсиноподобной сериновой протеиназы/эстеразы. Легкие фрагменты (обычно обозначаемые буквой «а») лишены ферментативной активности, но обладают собственной активностью, как правило, связан- ной с развитием воспаления (хемотаксические факторы) или реакций ги- перчувствительности (анафилактогены). Так, С4а обладает хемотакси- ческой и кининовой (сосудорасширяющей) активностью. 149
I СЗ Рис. 38. Расщепление компо- нента комплемента СЗ. Слева — типы мембранных ре- цепторов клеток, с которыми взаимодействуют соответст- вующие фрагменты. В скоб- ках — молекулярная масса. В случае формирования комплекса Clqrs2a4b на поверхности клеточ- ной мембраны он ковалентно иммобилизуется на ней благодаря наличию в структуре С4а тиосложноэфирной связи между остатками цистеина и глутамина. Если по той или иной причине комплекс остается в растворе, то он быстро инактивируется. На этой стадии может проявляться актив- ность инактиваторов — С4Ь-связывающего белка (С4Ьр), мембранного рецептора CR1 и мембранного фактора, ускоряющего распад, DAF (от англ. Decay-activating factor, CD55); все они обладают способностью вы- теснять С2 из комплекса. Активация СЗ. Мишень комплекса С2а4Ь — молекула СЗ является уз- ловым компонентом системы, общим для ее классической и альтернатив- ной составляющих. Комплекс представляет собой а-глобулин, сос- тоящий из двух полипептидных цепей с молекулярной массой 120 000 (а) и 75 000 (Р) (рис. 38). При действии конвертазы С4Ь2а (а также конвертазы альтернативного пути СЗЬВЬ, см. ниже) в присутствии двухвалентных ионов a-цепь СЗ расщепляется, в результате чего образуются комплекс р-це- пи с остатком а-цепи — фрагмент СЗЬ, в составе которого сохраняются 2 полипептидные цепи, соединенные дисульфидной связью (молекуляр- ная масса 185 000), и фрагмент а-цепи — СЗа (молекулярная масса 10 000). Фрагмент СЗа остается в жидкой фазе, обладает выраженной хемотакси-
ческой и более слабой анафилактогенной активностью, действует на лим- фоциты, нейтрофилы, тучные и эндотелиальные клетки. СЗЬ связывается с иммобилизованным на мембране комплексом Clqrs4b2a. При этом на клетке фиксируется значительно больше молекул СЗЬ (до 1000), чем тре- буется для насыщения комплекса. Часть молекул СЗЬ формирует кова- лентную связь непосредственно с мембранными молекулами клетки. Это осуществляется, как и при фиксации С4Ь, с участием тиоэфирной связи. Иммобилизованный комплекс С14Ь2аЗЬ способен расщеплять С5, т.е. об- ладает активностью С5-конвертазы, которая связана с С2а. Таким обра- зом, СЗ- и С5-конвертазы представляют собой фактически один фермент (часто они так и обозначаются — СЗ/С5-конвертаза). Однако в разные пе- риоды формирования С2а-содержащего комплекса создаются оптималь- ные условия для связывания сначала СЗ, затем С5. В связи с этим по традиции и для удобства часто используют раздельные обозначения кон- вертазы — СЗ- и С5-типов. Оставаясь в жидкой фазе, фрагмент СЗЬ быстро расщепляется в двух точках фактором I в присутствии фактора Н с образованием фрагмента iC3b. Фактор I способен действовать (хотя и слабее) и на иммобилизо- ванный СЗЬ. Фрагмент iC3b затем расщепляется на фрагменты C3d (ос- тающийся на мембране) и СЗс (выделяющийся в жидкую фазу). Как iC3b, так и C3d неактивны. На некоторых фагоцитирующих клетках (в частности, макрофагах) имеются рецепторы для iC3b и C3d. Присутствие СЗЬ на мембране обусловливает опсонизацию клеток (поскольку фагоци- ты несут на поверхности рецепторы для СЗЬ), повышает их адгезивность, определяет их участие в регуляции иммунного ответа, а также связь сис- тем комплемента и свертывания крови. 2.3.1.2. Альтернативная активация комплемента Начальная активация СЗ. Как и в случае активации комплемента по классическому пути, ключевым событием альтернативной активации яв- ляется формирование С5-конвертазы (см. рис. 35 и 36). Чтобы это про- изошло, необходимо присутствие активированного фактора В и компо- нента СЗЬ. Однако их образованию предшествует несколько иной про- цесс, составляющий содержание фазы инициации альтернативного пути. Суть его состоит в следующем. Уже говорилось о наличии в составе СЗ (как и в составе С4) тиоэфирной связи, которая активируется при взаи- модействии с водой или компонентами мембраны. Обычно эта связь недоступна для растворителя. Однако небольшая часть молекул СЗ имеет развернутую конформацию (в силу статистических закономерностей), при которой и происходит взаимодействие упомянутой связи с водой. При этом связь гидролизуется и развернутая (денатурированная) конформация стабилизируется. Эта спонтанная активация СЗ происходит редко, но при этом образуется небольшое количество активного СЗЬ-подобного продук- та СЗ(Н2О), достаточное, чтобы включить последующие события. Включение усиливающего звена. Молекула СЗ(Н2О) взаимодействует в присутствии ионов Mg2+ с фактором В. Фактор В — сывороточный зи- моген, по структуре сходный с компонентом классического пути С2 (во- 151
обще прослеживается очевидный структурный и функциональный парал- лелизм между некоторыми факторами классического и альтернативного путей). В результате связывания фактор В становится доступным для рас- щепления предсуществующей сывороточной трипсиноподобной серино- вой протеиназой (эстеразой) — фактором D — на фрагменты Ва (молеку- лярная масса 33 000) и ВЬ (60 000). Образуется комплекс СЗ(Н2О)ВЬ, ко- торый представляет собой СЗ/С5-конвертазу. Ее ферментативная актив- ность связана с фрагментом ВЬ, а СЗ(Н2О) играет вспомогательную роль. Этот вариант конвертазы, образующийся в следовых количествах, запус- кает фазу амплификации: в результате расщепления СЗ образуется СЗЬ, который, связываясь с ВЬ, формирует комплекс СЗЬВЬ — амплифици- рующую СЗ-конвертазу, под влиянием которой конверсия СЗ идет зна- чительно быстрее. СЗЬ, образующийся при классической активации, усиливает альтернативную активацию комплемента, действуя на этом этапе. ____ Находясь в растворе, комплекс СЗЬВЬ быстро инактивируется путем ускорения диссоциации под влиянием фактора Н (он вытесняет ВЬ из комплекса), а также расщепления a-цепи СЗ при действии фактора I. Последний проявляет активность при условии предварительного связы- вания фактора Н с атакуемым комплексом. Стабилизация комплекса СЗЬВЬ происходит при его иммобилизации за счет упомянутой выше тиосложноэфирной связи, находящейся в составе СЗЬ. Мембранносвя- занный комплекс СЗЬВЬ может быть доступен для фактора Н (и, сле- довательно, инактивирован) только при наличии на поверхности клетки остатков сиаловых кислот. Мембранные рецепторы CR1 и DAF высту- пают в качестве кофакторов фактора I и способствуют разрушению комплекса. Стабилизация комплекса. Все эти условия (наличие CR1, DAF, сиа- ловых кислот) выполняются в случае фиксации комплексов на собствен- ных клетках организма, но не на бактериальных клетках. Таким образом предотвращается спонтанная активация комплемента по альтернативно- му пути, но допускается ее осуществление при бактериальной агрессии. Более того, некоторые бактериальные продукты выступают в качестве стабилизаторов факторов альтернативного пути активации комплемента. Это относится к липополисахариду (его стабилизирующий эффект связан с полисахаридной частью молекулы) и полисахаридным токсинам, а также зимозану, полиэлектролитам, агрегированным иммуноглобулинам, которые предохраняют комплекс СЗЬВЬ (СЗ-конвертазу) от деградации под действием фактора Н. Принципиально, что эти агенты должны при- сутствовать на поверхности частиц (в частности, бактерий). Таким обра- зом, альтернативная активация служит примитивным способом атаки против чужеродных клеток. Другим фактором, обеспечивающим стабилизацию СЗЬВЬ за счет ос- лабления его спонтанной диссоциации, является пропердин (фактор Р). Он же ускоряет сборку этого комплекса и предотвращает действие на него фактора Н. Активностью, сходной с действием пропердина, обладает СЗ- нефритический фактор — естественные аутоантитела, специфичные к комплексу СЗЬВЬ. Пропердин способен связываться с поверхностью бак-
Мембрана Рис. 39. Литический комплекс комплемента. термальной клетки и ини- циировать при этом фикса- цию на ней СЗ-конвертазы. В этих условиях к комплек- су могут присоединяться дополнительные молекулы СЗЬ (т.е., как и при класси- ческой активации, СЗЬ фиксируются на поверх- ности клетки в избытке). Комплекс состава Р(СЗЬ)ВЬ выполняет функцию С5-конвертазы (при этом ферментативная актив- ность связана с С2а, как и при расщеплении СЗ). Таким образом достигается результат, аналогичный тому, к которому приводит классическая активация комплемента. Однако альтернативный путь является менее мощным и продуктивным, чем классический, и при его реализации вероятность возникновения ошибок больше. 2.3.1.3. Атака клеточной мембраны Формиро вание^С 5-кон вертаз классического (C14b2a3b) или альтернатив- ного [P(C3b)nBb] пути служит предпосылкой для осуществления терми- нальных стадий каскада, завершающегося лизисом клетки. Результаты действия обеих С5-конвертаз идентичны: расщепление фактора С5 на более крупный (С5Ь) и мелкий (С5а) фрагменты, из которых первый связывается с комплексом компонентов комплемента на клеточной мем- бране, а второй остается в жидкой фазе и реализует свою хемотаксическую активность, сходную с активностью СЗа. В отличие от СЗа С5а обладает высокой анафилактогенной активностью. Как и другие малые фрагменты компонентов комплемента (СЗа и С4а), С5а инактивируется карбокси- пептидазой N, хотя и обладает несколько большей стабильностью, чем С4а и СЗа. Ферментативная активность С5-конвертаз связана с фрагмен- тами ВЬ и С2а, роль СЗЬ состоит в обеспечении связывания нативного компонента С5 и поддержании ферментативной активности комплексов. С5Ь в составе мембранного комплекса быстро инактивируется. Активация С5 «открывает» терминальный этап активации компле- мента — формирование литического комплекса (рис. 39). Как на мембра- не, так и в растворе С5Ъ обладает способностью связывать компонент С6 с образованием комплекса С5Ь6, в свою очередь быстро связывающего компонент С7, а затем — С8. С5Ь и Сб обладают довольно слабым срод- ством к фиксированной на мембране С5-конвертазе, поэтому значитель- ная часть комплекса С5Ь6 оказывается в жидкой фазе и инактивируется. На терминальной стадии каскада не происходит повышения фермента- тивной активности очередных факторов; связывание факторов, начиная с С6, увеличивает сродство комплекса к очередным компонентам. Связывание С7 делает связь комплекса с мембраной более прочной благодаря наличию у этого компонента гидрофобного участка. С8 огра- ничивает образование комплекса С5Ь67 и его прикрепление к мембране, 153
т.е. является регулятором поздних этапов действия комплемента. Ком- плекс С5Ь678 уже насквозь прошивает мембрану, поскольку гидрофоб- ный домен в составе С8 имеет достаточную протяженность. Этот комп- лекс способен формировать поры диаметром 3 нм, что обеспечивает про- никновение в клетку низкомолекулярных веществ. При этом происходит и ограниченный лизис (в случае эритроцитов), однако он реализуется очень медленно и его функциональная значимость не выяснена. О том, что эта форма лизиса может иметь значение в защите организма, свиде- тельствует факт, что при наследственном дефиците факторов С5—С8 страдает защита от нессерий, тогда как дефект последующей стадии не имеет клинических проявлений. Завершающий этап формирования литического комплекса состоит в присоединении 12—20 молекул С9, который повышает в 1000 раз лити- ческую активность комплекса. С9 представляет собой белок, гомологич- ный перфорину. Как и перфорин, С9 способен полимеризоваться при контакте с фосфолипидами мембраны. В результате формируется ци- линдрический комплекс, встраивающийся в мембрану как ее интеграль- ный компонент, который может быть извлечен только с помощью детергентов. Его молекулярная масса составляет 1—1,7 х 106. Высота ци- линдров — 15 нм, внутренней диаметр — 8—12 нм. Цилиндры образуют поры, которые нарушают целостность мембраны и создают возможность для поступления в клетку ионов Н+, Na+ и воды (но не белков), что и приводит к разрыву мембраны и гибели клетки. При формировании поры комплекс С5Ь678 выполняет механическую роль «строительного каркаса», на котором «монтируется» литическая конструкция из молекул С9. Наружная поверхность этого комплекса образована гидрофобными, а внутренняя (трансмембранный канал) — гидрофильными участками. Комплекс С5Ь6789 может присутствовать и в жидкой фазе, однако при этом он не активен, что связывают с присутствием в его составе сы- вороточного белка S. Полагают, что этот белок препятствует формирова- нию литически активного димера С5Ь6789. Аналогичной активностью обладают липопротеины низкой плотности. Некоторые ингибирующие субстанции (протектин, DAF, С8Ьр, гликофорин) взаимодействуют с ата- кующим комплексом в составе мембран и препятствуют осуществлению лизиса клеток, в частности аутолиза клеток хозяина. 2.3.1.4. Роль комплементзависимых процессов в иммунной защите Комплементзависимый лизис бактериальных клеток является одним из факторов противоинфекционной защиты. В то же время он обусловливает гемолиз при переливании несовместимой крови и анемии аутоиммунного генеза, служит фактором повреждения микроорганизмов при инфекци- онных процессах и ядросодержащих клеток при аутоиммунной патологии. Впрочем, роль литической функции комплемента в отношении ядросо- держащих клеток в настоящее время склонны ограничивать вкладом в защиту от небольшого числа патогенов, в частности нессерий, поскольку, как уже отмечено, при наследственном дефекте факторов, определяющих мембранную атаку, снижается резистентность именно к этим возбудите- ISA
Таблица 35. Рецепторы для компонентов комплемента на клетках человека Название Лиганды Молекулярная масса, xlOOO Экспрессирующие клетки Биологические функции CR1 (CD35) C4b, C3b, iC3b 160-250 Эр, Мон/Мф, Нф, Эо, В Опсонизация, расщепление СЗЬ, клиренс ИК CR2 (CD21) iC3b, C3d, C3dg 140 В, Т, NK Иммунорегуляция, связывание ВЭБ CR3 (CDllb/ CD 18) iC3b 170/95 Мон/Мф, Нф Опсонизация, расщепление iC3b CR4 (CD 11с/ CD18) C3b, iC3b, C3dg 150/95 Мон/Мф, Нф Опсонизация C3aR C3a ТК, Бф, Эо, Мон/Мф, Нф, гладкомышечные при аллергии Освобождение медиаторов C4aR C4a ТК, Бф То же C5aR C5a ТК, Бф II II C3eR Нф Выброс Нф из депо Примечание. Эр — эритроциты, Мон — моноциты, Мф — макрофаги, Нф — нейтрофилы, Эо — эозинофилы, Бф — базофилы, ТК — тучные клетки, Т — Т-лимфоциты, В — В-лимфоциты, NK — NK-клетки, ИК — иммунные комплексы, ВЭБ — вирус Эпштей- на — Барр. лям. При этом значимость вклада С9 и, следовательно, полномасштабного цитолиза подвергается сомнению вследствие полной «безнаказанности» инактивации его гена с клинической точки зрения. Роль системы комплемента в защите от патогенных факторов сводит- ся, по-видимому, в первую очередь к опсонизации клеток-мишеней, кото- рые становятся доступными для проявления активности эффекторных клеток, несущих на своей поверхности рецепторы для этих компонентов, прежде всего фагоцитирующих клеток — макрофагов и нейтрофилов. Наиболее распространены рецепторы для СЗЬ и его фрагментов C3d, iC3b (табл. 35), что свидетельствует об особой функциональной значимости ги- перфиксации СЗЬ на поверхности клеток. Эти рецепторы служат инстру- ментами адгезии фагоцитирующих клеток к клеткам, опсонизированным компонентами комплемента. Лимфоциты также имеют рецепторы для фрагментов СЗЬ (CR2); более того, CR2 (CD21) в качестве корецептора входит в состав рецепторного комплекса В-лимфоцитов (см. раздел 1.1.1). Полагают, что распознавание опсонизированных клеток лимфоцитами (особенно В-клетками) является одним из факторов, определяющих акти- вацию клеток и их участие в регуляции иммунных процессов. Иммуноре- гуляторная роль компонентов комплемента состоит также в их участии в солюбилизации (переводе в растворимую форму) иммунных комплексов. 155
Как уже упоминалось, освобождающиеся при активации комплемен- та фрагменты С4а, СЗа и С5а являются активными хемотаксическими и сосудорасширяющими факторами, а С5а и в более слабой степени СЗа обладают анафилактогенной активностью и участвуют в реакциях воспа- ления и гиперчувствительности (отсюда их название — анафилатокси- ны). Рецепторы для этих фрагментов присутствуют на поверхности фагоцитирующих клеток, что обусловливает проявление хемотаксическо- го эффекта названных фрагментов, а также на поверхности тучных кле- ток и базофилов, что связано с функционированием СЗа и С5а в качестве анафилатоксинов. Они занимают особое положение в системе компле- мента в том отношении, что отсутствуют специальные факторы, ограни- чивающие их действия (у всех остальных компонентов системы компле- мента имеются ингибиторы). Иными словами, СЗа и С5а не имеют соб- ственных ингибиторов, и их гиперпродукция контролируется общими стадиоспецифическими ингибиторами. По этой причине удается наблю- дать последствия бесконтрольного накопления данных пептидных фак- торов при «ангионевротическом» отеке, который развивается при наследственном дефиците инактиватора Clq. Система комплемента взаимодействует с другими гуморальными сис- темами, активируемыми при воспалительных процессах, и при актива- ции способствует вовлечению этих систем в реакцию иммунного воспаления. Наконец, отложение компонентов комплемента в составе иммунных комплексов на биологических мембранах является иницииру- ющим фактором для развития иммунопатологии в силу их способности привлекать в очаг поражения макрофаги и другие эффекторы иммунного воспаления. 2.3.2. Медиаторы воспаления 2.3.2.1. Воспалительные цитокины Ключевая роль в реализации воспалительной реакции и в целом реакций первой линии иммунной защиты принадлежит цитокинам, выделяемым активированными макрофагами и моноцитами (табл. 36). Среди них выделяют воспалительные цитокины — три тесно взаимосвязанных по своим функциям и эффектам цитокина: ИЛ-1 (в его а- и 0-формах), ИЛ-6 и ФНОа. Хотя общей характеристике цитокинов и функциональной сис- темы, которую они образуют, а также описанию индивидуальных цито- кинов посвящен специальный раздел (3.4.2), приведем основные сведения о вкладе названных цитокинов в развитие воспалительной реакции и связанных с ним процессов. Все три указанных цитокина вырабатываются большим числом раз- личных клеток организма. Однако в условиях воспаления наиболее суще- ственно их продуцирование макрофагами, а также некоторыми локаль- ными клетками в очаге воспаления, например синовиальными клетками суставов. Естественными индукторами выработки этих цитокинов явля- ется действие микробов и их токсинов, а в условиях эксперимента — форболовых эфиров. Выше (см. раздел 2.1.3) уже говорилось о кинетике 156
Таблица 36. Вкладу цитокинов в развитие воспаления Цито- кин Клетки- продуценты Участие в воспалительной реакции ИЛ-1 М, Эн, Эп, СК, ДК, ТЕ, В Усиление прокоагулянтной активности, расширение сосу- дов, усиление экспрессии молекул адгезии, хемотаксис М,Н и Т, активация М и Н, усиление образования супероксид- радикалов и оксида азота, монокинов и PGE2, костимуля- ция Т и В, резорбция кости и хряща. Стимуляция миелопо- эза (нейтрофильный лейкоцитоз), повышение температуры тела, усиление синтеза белков острой фазы ФНОа М, Эн, ТЫ, СК Расширение сосудов, усиление экспрессии молекул адгезии, стимуляция ангиогенеза, усиление катаболизма липидов, ак- тивация М и Н, усиление выработки монокинов и PGE2, образования супероксидрадикалов и оксида азота, гибель клеток (апоптоз), костимуляция Т, регуляция миелопоэза. Вызывает септический шок ИЛ-6 Ф, Эн, М, Th2, СК, ТК Усиление синтеза белков острой фазы, костимуляция Т и В. Активирует М, усиливает выработку супероксид-радикалов, экспрессию молекул адгезии. В то же время оказывает про- тивовоспалительное действие, подавляя выработку провос- палительных монокинов и PGE2 а-хемо- кины М, Эн, Ф, ТК Хемотаксис и активация Н, стимуляция ангиогенеза, усиле- ние выработки окиси азота и супероксид-радикалов, хемо- таксис, М, Эн, Ф, ТК Р-хемо- кины М, Эн, Ф Хемотаксис и активация М, Эо, лимфоцитов, усиление ан- гиогенеза, пирогенный эффект ГМ- КСФ Ф, Эн, М, Т Стимуляция миелопоэза, активация Н, М, костимуляция Т. Усиливает ангиогенез, выработку острофазных белков, хе- мотаксис Н и М Г-К СФ Ф, Эн, М, Т Стимуляция гранулоцитоза, активация Н, усиление выра- ботки супероксид-радикалов М-КСФ Ф, Эн, М,Т Стимуляция моноцитопоэза, активация М ИЛ-12 М,дк Способствует образованию ТЫ и переключению на иммун- ное воспаление с вовлечением Т (ГЗТ) ИФНу ТЫ, NK Мощная активация М, усиление экспрессии молекул МНС обоих классов и молекул адгезии, стимуляция образования супероксид-радикалов и окиси азота (главный стимулятор) Главный фактор иммунного воспаления ИЛ-4 Th2, ТК Усиление экспрессии молекул адгезии и МНС. Усиливает образование окиси азота, способствует развитию аллерги- ческого воспаления, главный его фактор, подавляет ГЗТ ИЛ-1ра М, Эн Противовоспалительное действие, отмена эффектов ИЛ-1, в то же время индукция лихорадки и острофазной реакции Примечание. М — моноциты и макрофаги, Н — нейтрофилы, Т — Т-лимфоциты, В — В-лимфоциты, NK — NK-клетки, Эо — эозинофилы, Эн — эндотелиальные клетки, Эп — эпителиальные клетки, Ф — фибробласты, ТК — тучные клетки, СК — синовиальные клетки, ДК — дендритные клетки, PG — простагландины. 157
выработки этих цитокинов. Напомним лишь, что экспрессия генов про- исходит в пределах 1—2 ч после активации, а сами цитокины появляются в среде через 3—4 ч, причем их выработка на уровне индивидуальной клетки продолжается немногим долее 2 сут. Значительная часть ИЛ-1а продуцируется в мембранной форме, т.е. сохраняет связь с клеткой, про- являя при этом функциональную активность. На мембране присутствует также молекула — предшественник ФНОа. Продукция ИЛ-6 может по времени несколько отставать от секреции ИЛ-1 и ФНОа. Известно, что выработка всех трех рассматриваемых цитокинов стимулируется под дей- ствием ГМ-КСФ, интерферона у, ИЛ-2. ИЛ-1 и ФНОа взаимно усилива- ют секрецию друг друга и ИЛ-6, тогда как последний подавляет продукцию ИЛ-1 и ФНОа, участвуя в ограничении воспалительной реак- ции (см. рис. 63). Воспалительные цитокины обладают исключительной широтой дей- ствия и многочисленными мишенями. Остановимся на эффектах, имею- щих отношение к формированию воспалительной реакции. В комплексе эти эффекты способны обеспечить развитие воспаления и воспроизвести практически все его локальные и общие симптомы. ИЛ-1 действует на эндотелиальные клетки сосудов, усиливая экс- прессию на их поверхности молекул адгезии и повышая их прокоагулянт- ную активность, а также проницаемость капилляров. Тем самым созда- ются условия для развития местной гиперемии, тромбозов и стаза, выхо- да жидкой части крови и форменных элементов в ткани с формировани- ем отека и клеточных инфильтратов. Последнему способствуют некото- рые влияния, оказываемые ИЛ-1 на клетки крови: хемотаксическая ак- тивность ИЛ-1 по отношению к нейтрофилам, макрофагам и В-лимфо- цитам, усиление экспрессии молекул адгезии, а также участие в качестве костимулятора в индукции пролиферации Т- и В-лимфоцитов. ИЛ-1 по- вышает активность клеток, мигрировавших в очаг воспаления: увеличи- вает кислородный метаболизм нейтрофилов, освобождение ими фермен- тов, выработку макрофагами и фибробластами простагландинов, макро- фагами и Т-клетками — цитокинов. ИЛ-1 обусловливает проявление ряда общих симптомов воспаления. Действуя на гипоталамус, он вызы- вает развитие лихорадки, стимулируя клетки печени, обусловливает вы- работку белков острой фазы, проникая в костный мозг, усиливает грану- лоцитопоэз, что проявляется в нейтрофильном лейкоцитозе и омоложе- нии популяции нейтрофилов. ИЛ-1 опосредует также действие остео- кластов, вызывая резорбцию костей, стимулирует протеолитические процессы в миоцитах. Обе формы ИЛ-1 взаимодействуют с одними и теми же рецепторами и поэтому практически не различаются по физиологической активности. Известно две разновидности рецепторов ИЛ-1 — CD121a (рецептор I типа, представленный на Т-клетках, фибробластах и эндотелиальных клетках) и CD 121b (рецептор II типа, представленный на В-клетках, мак- рофагах и моноцитах); функциональная значимость последнего подвер- гается сомнению. С теми же рецепторами взаимодействует рецепторный антагонист ИЛ-1 (ИЛ-1ра), который, однако, не подает в клетку активи- рующих сигналов и таким образом блокирует действие ИЛ-1. ИЛ-1ра вы- 14я
рабатывается под влиянием тех же сигналов, что и ИЛ-1, но с несколько иной (замедленной) кинетикой. Соотношение их концентраций в значи- тельной степени определяет баланс про- и противовоспалительных фак- торов при местных воспалительных процессах (например, в суставах при ревматоидном артрите). Известны и другие ингибиторы ИЛ-1, например растворимый рецептор II типа, который связывает свободный ИЛ-1. ФНОа также синтезируется клетками многих типов, включая макро- фаги/моноциты и их производные в тканях (звездчатые ретикулоэндоте- лиоциты, астроциты и др.), Т- и В-лимфоциты, NK-клетки, и обладает столь же разнообразными эффектами. Действие ФНОа и ИЛ-1 во многом перекрывается. Он усиливает экспрессию ряда молекул адгезии на эндоте- лиальных клетках и лейкоцитах, активирует нейтрофилы и макрофаги, участвует в качестве кофактора в индукции пролиферации лимфоцитов, усиливает выработку макрофагами и Т-клетками цитокинов. Но ФНОа вызывает также некоторые эффекты, отличающие его от ИЛ-1. Так, он способен активировать в клетках-мишенях липопротеиновую липазу, что обусловливает расходование запасов жира и приводит к развитию кахек- сии (один из синонимов ФНОа — кахексии). ФНОа является основным гуморальным фактором, обусловливающим развитие септического шока. В сочетании с интерфероном ФНОа повышает активность NO-синтетазы и наработку активных метаболитов азота, чем способствует осуществле- нию защиты от ряда микроорганизмов, особенно от микобактерий. Имеется две разновидности рецепторов для ФНО (общих с ФНОр, или лимфотоксином): форма I (р55; CD121a), представленная на клетках самых разнообразных типов, и форма II (р75; CD121b), содержащаяся на клетках миелоидного происхождения. Рецепторы обоих типов гомоло- гичны рецептору Fas, принимающему сигналы к развитию апоптоза. Од- нако лишь рецептор р55 содержит цитоплазматический домен, свойст- венный также рецептору Fas. Этот домен служит для проведения сигнала к включению апоптоза («домен смерти»). И действительно, ФНОа может вызывать апоптоз клеток, особенно опухолевых; этот эффект проявляет- ся и при воспалении. ИЛ-6 вырабатывается клетками стромы (фибробластами и эндотели- альными клетками), макрофагами, активированными Т-лимфоцитами и рядом других клеток. Его эффекты реализуются в значительной степени помимо воспалительной реакции. Однако ИЛ-6 одновременно является важным фактором воспаления, объединяющим функции про- и противо- воспалительного агента. С одной стороны, ИЛ-6 служит основным акти- ватором синтеза гепатоцитами белков острой фазы, способствует вовле- чению в воспалительный процесс мезангиальных клеток почки, В- и Т- лимфоцитов и участвует в индукции пролиферации последних (особенно в случае В-клеток и плазмоцитов). Он действует также на гемопоэз, сти- мулируя его ранние этапы, на нейроэндокринную систему, способствует развитию лихорадки и секреции АКТГ. С другой стороны, ИЛ-6, как уже отмечалось, подавляет выработку ИЛ-1, ФНОа и простагландина Е2 мак- рофагами, тем самым способствуя завершению воспалительной реакции. Ограничительные сигналы ИЛ-6 частично реализуются через централь- ные механизмы. Стимулируя выработку АКТГ, ИЛ-6 участвует в развер- 159
тывании стрессорных реакций, в том числе связанных с ингибирующим действием глюкокортикоидов. Очевидно, альтернативные эффекты ИЛ-6 в отношении воспалительной реакции реализуются на разных этапах ее развертывания и в значительной степени определяются наличием в очаге воспаления соответствующих клеток-мишеней и их чувствительностью к ИЛ-6, а также различной скоростью реализации про- и противовоспали- тельного действия. Исключительно велика роль в развитии воспаления хемокинов, уже рассматривавшихся в связи с хемотаксисом клеток, вовлекаемых в воспа- лительный процесс (см. раздел 2.1.1). Помимо проявления хемотаксичес- кой активности, хемокины способны активировать клетки, имеющие для них рецепторы. Таковыми являются нейтрофилы, взаимодействующие с а-цитокинами, макрофагами, моноциты и Т-лимфоциты, несущие ре- цепторы для р-хемокинов. Третья важнейшая группа цитокинов, участвующих в первой линии защиты, — это интерфероны. В отличие от рассмотренных выше воспа- лительных цитокинов они вырабатываются в ответ на стимуляцию виру- сами или свойственной им двуспиральной РНК, а не бактериями и их продуктами. Группа из 20 интерферонов, обозначаемых как интерфероны а, вырабатывается макрофагами, интерферон р — фибробластами и мак- рофагами, интерферон у (который существенно отличается от интерфе- ронов а и Р) — активированными Т-хелперами (ТЫ), цитотоксическими Т-лимфоцитами и NK-клетками. В соответствии с природой индукторов назначение интерферонов а и р состоит в противовирусной защите. Это достигается двумя путями: с помощью подавления репликации вирусов в клетках и воздействием на инфицированные клетки, делающим их доступными для проявления им- мунной защиты. Под влиянием интерферонов в клетках индуцируется синтез 2'5'-олигоаденилатсинтетазы, которая активирует эндорибонук- леазу, расщепляющую вирусную РНК. Кроме того, интерфероны активи- руют серинтреониновую протеинкиназу (Pl-киназу), которая подавляет репликацию вируса, действуя на фактор инициации белкового синтеза eIF2. При реализации этого защитного механизма в клетке появляется белок Мх. У мышей, мутантных по этому белку, повышена чувствитель- ность к заражению вирусом гриппа. Под влиянием интерферонов на клетках усиливается экспрессия мо- лекул МНС I класса и, следовательно, повышается вероятность появле- ния на мембране этих молекул, несущих пептидные фрагменты вирусных (или опухолевых) белков, распознаваемых Т-киллерами. Реализации Т-клеточного механизма защиты способствует активация ТЫ под влия- нием ИЛ-12, вырабатываемого макрофагами, и интерферона у. Комплекс цитокинов, продуцируемых «воспалительными» ТЫ-хелперами (в пер- вую очередь интерферон у), стимулирует активность антигенпредставля- ющих клеток (усиливается экспрессия на их поверхности молекул МНС II класса) и макрофагов. Интерфероны всех типов повышают активность NK-клеток, участвующих в противовирусной защите при условии подав- ления экспрессии на клетках-мишенях молекул МНС I класса. Таким образом, интерфероны а и р, не являясь провоспалительными 160
факторами, обеспечивают защиту организма от вирусов. Интерферон у, также выполняющий эту функцию, кроме того, реализует связь между первым и вторым уровнями защиты: являясь продуктом Thl-клеток, он стимулирует активность макрофагов, включает секрецию ими цитоки- нов, опосредующих развитие воспаления. В этом смысле интерферон у может быть назван провоспалительным цитокином. Связь между макро- фагами и лимфоцитами в обратном направлении опосредует продукт макрофагов ИЛ-12, ответственный за дифференцировку ТЫ. Четвертую группу цитокинов, участвующих в реакциях первой линии защиты, образуют колониестимулирующие факторы — ГМ-КСФ, Г-КСФ и М-КСФ. Являясь гемопоэтинами, они сохраняют способность стиму- лировать активность зрелых миелоидных клеток: ГМ-КСФ активен в от- ношении моноцитов, макрофагов и гранулоцитов; Г-КСФ стимулирует развитие и проявления активности нейтрофильных гранулоцитов, а МК- КСФ — моноцитов и макрофагов. Эти факторы способствуют активации указанных типов клеток, осуществлению ими защитных функций, секре- ции цитокинов. Кроме того, ГМ-КСФ и Г-КСФ обусловливают развитие нейтрофильного лейкоцитоза, являющегося одним из важнейших сис- темных проявлений воспалительной реакции. 2.3.2.2. Белки острой фазы Известно, что существуют реакции врожденного иммунитета, которые по своему назначению и конечным результатам аналогичны реакциям адап- тивного иммунитета и являются, очевидно, их эволюционными предше- ственниками. Некоторые такие реакции клеточного типа были рассмот- рены выше. Однако существуют и гуморальные реакции, воспроизводя- щие по ряду параметров гуморальный иммунный ответ, но, с одной стороны, они развертываются быстрее, а с другой — лишены иммуноло- гической специфичности. Обладая некоторыми преимуществами перед специфическими иммунными процессами (прежде всего быстрота разви- тия), эти реакции не были вытеснены в процессе эволюции более совер- шенными реакциями адаптивного иммунитета, и сосуществуют с ними. Гуморальной реакцией такого рода, во многих отношениях сходной с процессом антителообразования, является реакция острой фазы воспа- ления. Как известно, клетки печени продуцируют разнообразные белки, в частности являются основным источником белков сыворотки крови. При действии на них воспалительных цитокинов ИЛ-6 и в меньшей сте- пени ИЛ-1 и ФНОа под влиянием внутриклеточного процесса, анало- гичного процессам активации клеток иммунной системы, изменяется спектр экспрессируемых генов гепатоцитов. В результате синтез некото- рых белков подавляется, а продукция других усиливается (иногда на не- сколько порядков за сутки). Последние белки называются белками острой фазы. К ним относятся фибриноген, С-реактивный белок, манно- зосвязывающий белок и сывороточный амилоидный протеин. Если фиб- риноген имеет отношение к сосудистым реакциям при воспалении, то остальные белки, будучи полифункциональными, «задействованы» в реа- лизации иммунных процессов. 161
С-реактивный белок и сывороточный амилоидный протеин родст- венны по структуре; они относятся к семейству пентраксинов, для ко- торого характерен комплекс из 5 дискообразных субъединиц. Их моле- кулярная масса в молекуле С-реактивного белка составляет 23 000, а молекулярная масса всего белка — ПО ООО—115 000. Если в норме кон- центрация С-реактивного белка в сыворотке крови составляет около 1 мкг/мл, то при острофазной реакции она быстро возрастает до 1— 2 мг/мл. Оба названных пентраксина обладают свойствами С-лектинов, т.е. связывают углеводные группы. Другими их лигандами являются фосфо- рилхолин, ДНК,, полиэлектролиты, белки межклеточного матрикса. Они не взаимодействуют с фосфолипидами собственных клеток организма, но связываются с фосфорилхолином грамположительных микроорганиз- мов. При связывании с ним С-реактивного белка в структуре фосфорил- холина открываются новые участки молекулы, которые ранее были замаскированы. Эти участки способны взаимодействовать с компонента- ми комплемента и активировать его классический и альтернативный пути. С другой стороны, связанный С-реактивный белок служит хемоатт- рактантом для нейтрофилов, а участки его молекулы, обнажающиеся при связывании с микроорганизмами, распознаются фагоцитирующими клетками, т.е. С-реактивный белок может играть роль опсонина. Эти следствия связывания С-реактивного белка позволяют рассматривать его как своеобразное «протоантитело» (тем более что между ним и иммуно- глобулинами существует некоторая гомология). После расщепления фа- гоцитирующими клетками могут освобождаться фрагменты молекулы С-реактивного белка, активирующие моноциты и индуцирующие секре- цию ими цитокинов; такими же свойствами обладает мономерная форма этого белка. С-реактивный белок способен связываться с рецепторами Т-лимфо- цитов. Кроме того, эти клетки в небольшом количестве синтезируют его, причем часть белка продуцируется в мембранной форме. В результате на поверхности 16—24 % Т-клеток определяется С-реактивный белок (свя- занный или собственный). Полагают, что этот белок играет определен- ную роль в регуляции иммунных процессов. Маннозосвязывающий белок относится к семейству коллектинов, к которому принадлежит Clq. Его исходная концентрация в сыворотке крови составляет 0,1—1 мкг/мл, но в острой фазе повышается в 5—10 раз. Практически не обладая гомологией по первичной структуре, молекулы маннозосвязывающего белка и Clq имеют сходную конфигурацию («бу- кет тюльпанов», см. рис. 36). Как и Clq, маннозосвязывающий белок со- держит 18 пептидных цепей трех типов, каждый из которых имеет колла- геноподобную структуру и С-лектиновый домен. Как отмечалось выше, связываясь с остатками маннозы, фукозы, глюкозамина, белок изменяет свою конформацию, приобретая активность сериновой протеиназы/эсте- разы, активирует сериновую протеиназу, ассоциированную с маннозо- связывающим белком. Эта протеиназа гомологична С1гиС1$и, подобно им, способна расщеплять С4 и С2, что обусловливает включение класси- ческого пути активации комплемента. 162
Таким образом, рассмотренные белки обтрой фазы выполняют функ- ции по элиминации патогенов. Эти функции во многом сходны с теми, которые выполняют антитела, особенно принадлежащие к IgM. 2.3.2.3. Другие медиаторы воспаления. Эйкозаноиды Помимо цитокинов, в реализации воспаления участвует ряд факторов, происходящих из различных клеток и определяющих в основном сосудис- тую составляющую воспалительной реакции. Большинство из этих фак- торов участвует в реализации аллергического воспаления. Как правило, они изучаются в контексте патологической физиологии, и мы здесь лишь кратко охарактеризуем их в самых общих чертах. Нонапептид брадикинин является основным представителем семей- ства кининов. Он образуется из высокомолекулярного кининогена путем его расщепления протеиназой — плазменным калликреином. Последний образуется из предшественника прекалликреина (циркулирующего в крови) при действии на него фактора Хагемана. Этот фактор относится к свертывающей системе (фактор ХПа) и активируется в процессе коагуля- ции крови. Такая взаимосвязь с другими патофизиологическими систе- мами весьма характерна для функционирования белков, участвующих в развитии воспаления. Другой представитель семейства кининов — калли- дин (лизилбрадикинин) образуется из низкомолекулярного кининогена после его расщепления тканевым калликреином. Последний образуется из прокалликреина под влиянием плазмина или плазменного калликреи- на; этот процесс включается при повреждении тканей. Образование ки- нинов ограничивают ингибитор С1 (Clinh), Рг-макроглобулин и ai-анти- трипсин. Кинины расщепляются карбоксипептидазами, как и некоторые другие медиаторы воспаления, например фрагменты компонентов ком- племента СЗа и С5а. Кинины участвуют в реализации местных проявлений воспаления, действуя в основном на уровне мелких сосудов. Кинины значительно расширяют венулы, снижают давление в микроциркуляции, повышают проницаемость сосудистой стенки, тем самым способствуя формирова- нию отека и эмиграции лейкоцитов. Кроме того, они вызывают спазм гладкой мускулатуры, усиливают синтез арахидоновой кислоты и образо- вание эйкозаноидов. Некоторые активные медиаторы аллергического воспаления содер- жатся в гранулах тучных клеток и базофилов, освобождающихся под вли- янием связывания IgE и перекрестного сшивания его мембранных ре- цепторов, а также ряда других стимулов (см. разделы 1.1.2 и 5.2.1). К этим медиаторам относятся гистамин, серотонин, гепарин, гепарин- сульфат и некоторые ферменты. Все они предсуществуют в гранулах до активирующего воздействия. Гистамин (5-р-имидазолилэтиламин) среди этих субстанций играет наиболее важную роль в развитии аллергических реакций. Поскольку процесс дегрануляции тучных клеток происходит быстро, гистамин и со- путствующие факторы очень рано появляются в очаге аллергического воспаления, причем сразу в достаточно больших концентрациях, чтобы 163 6*
вызвать ранние проявления гиперчувствительности немедленного типа. Они столь же быстро метаболизируются (95 % за 1 мин), уступая место эйкозаноидам, которые образуются клетками de novo под действием тех же стимулов. Гистамин действует преимущественно на гладкие мышцы и эндоте- лий сосудов, связываясь с их Н1-рецепторами. Через эти рецепторы включается активационный процесс, опосредованный превращениями фосфоинозитидов с образованием диацилглицерина и мобилизацией Са2+. Это по-разному проявляется в различных клетках, но конечный эффект сводится к расширению сосудов с усилением локального крово- тока и повышением проницаемости капилляров. Указанные эффекты частично связаны с образованием в клетках окиси азота и простациклина (см. ниже). Действуя на нервные окончания, гистамин обусловливает ощущение зуда, свойственное проявлениям аллергии в коже. У человека гистамин играет важную роль в развитии кожной гипере- мии и аллергического ринита. Менее очевидно его участие в развитии общих аллергических реакций и бронхиальной астмы. В то же время через Н2-рецепторы гистамин и родственные субстанции реализуют ре- гуляторные воздействия, иногда уменьшающие проявления воспаления путем ослабления хемотаксиса нейтрофилов и выброса ими лизосомных ферментов, а также освобождения самого гистамина. Через Н2-рецептор гистамин действует на сердце, секреторные клетки желудка, подавляет пролиферацию и цитотоксическую активность лимфоцитов, секрецию ими цитокинов. Бблыцая часть этих эффектов опосредована активацией аденилатциклазы и повышением уровня внутриклеточного цАМФ. Зна- ния об относительной роли различных гистаминовых рецепторов в реа- лизации их конкретного действия очень важны, поскольку значительная часть антиаллергических препаратов представляет собой блокаторы Ш- (но не Н2-)рецепторов гистамина. Роль серотонина (5-гидрокситриптамина) в патогенезе аллергичес- ких реакций более сомнительна, его влияние сильно варьирует в зависи- мости от вида животных. Вероятно, он имеет значение в системной анафилаксии у кроликов, а также в гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Протеогликан гепарин, освобождающийся из гранул тучных клеток и общеизвестный как антисвертывающий фактор, оказывает определенное регулирующее воздействие на пролиферативную и миграционную актив- ность клеток иммунной системы, на активацию эндотелиальных клеток. Он усиливает фагоцитарную реакцию, подавляет некоторые проявления цитотоксичности клеток, регулирует гиперчувствительность замедленно- го типа. Свойства малых фрагментов СЗа и С5а, образующихся в процессе ак- тивации комплемента, рассматривались выше (см. раздел 2.3.1). Эти пеп- тиды обладают выраженным сосудорасширяющим и хемотаксическим действием по отношению к нейтрофилам, макрофагам, эозинофилам и способны активировать их. В то же время значительная часть эффектов указанных пептидов опосредована усилением выброса гистамина тучны- ми клетками. Самостоятельные воздействия, в частности способность 164
Рис. 40. Метаболизм арахидоновой кислоты. Использованы международные сокращенные обозначения простагландинов (PG), лейкотриенов (LT) и тромбоксанов (Тх). вызывать бронхоспазм, в наибольшей степени свойственны С5а. Он яв- ляется очень сильным хемоаттрактантом; по способности повышать про- ницаемость сосудов и вызывать сокращение гладкой мускулатуры С5а в 10—100 раз превосходит СЗа и в тысячи раз — С4а. Фактор, активирующий тромбоциты (ФАТ, PAF), представляет собой продукт липидной природы. Он синтезируется de novo из лизогли- церинового эфира фосфорилхолина тучными клетками, базофилами, нейтрофилами и моноцитами при их активации. Вызывая агрегацию тромбоцитов, этот фактор способствует выбросу содержащихся в них ферментов и активных факторов. Он повышает проницаемость сосудов путем сокращения эндотелиальных клеток, активирует нейтрофилы, вы- зывает спазм гладкой мускулатуры бронхов и расслабляет гладкие мыш- 165
Таблица 37. Биологические эффекты эйкозаноидов Группы и названия Клетки- продуценты Действие на сосуды Действие на бронхи Хемотаксис Активация D4, С4, М, ТК Л е й к Расширяют, э т р и е н ы Сильный спазм + Подавляют Е4 В4 ТК, Н повышают проницаемость Сильно Спазм (±) Активируют Е2 М, Н расширяет Проста Расширяют, гландины Спазм (на фоне (Н, М, Э, 1) + М, Н, Э, Т Подавляет F2a, D2 М,ТК усиливая эффект гистамина Расширяют действия LT) или расшире- ние Спазм (усиливает эффект LT, С5а) ± М, Т, подав- ляет агр. тромб. Подавляет 12 Эндо- Сильно расши- агр. тромб. Подавляет А2 телий Тромбо- ряет, повышает проницаемость Т р о м Суживает б о к с а н ы Спазм агр. тромб. Вызывает (проста- циклин) 5-НЕТЕ циты, М ТК, Н — — агр. тромб. Активирует Н, ТК, Э Примечание. М — моноциты/макрофаги; Н — нейтрофилы; ТК — тучные клет- ки; Т — Т-лимфоциты; агр. тромб. — агрегация тромбоцитов; Э — эозинофилы; LT — лей- котриены. цы сосудистой стенки. В связи с коротким сроком жизни PAF его роль в развитии аллергических реакций подвергается сомнению. Эйкозаноидами называют продукты метаболизма арахидоновой кис- лоты (жирной ненасыщенной кислоты, молекула которой содержит 20 атомов углерода и 4 ненасыщенные связи). Арахидоновая кислота обра- зуется из мембранных фосфолипидов как прямой продукт проявления ак- тивности фосфолипазы А или косвенный продукт превращений, опосре- дованных фосфолипазой С. Это происходит при активации различных типов клеток, особенно тех, которые участвуют в развитии воспаления, в частности аллергического: эндотелиальных и тучных, базофилов, моноци- тов/макрофагов. Схема превращений арахидоновой кислоты представле- на на рис. 40, а характеристика образующихся при этом продуктов — в табл. 37. Наиболее принципиальным является раздвоение путей превра- щения арахидоновой кислоты, катализируемых двумя ферментами — цик- локсигеназой и 5'-липооксигеназой. Циклооксигеназный путь приводит к 166
образованию простагландинов и тромбоксанов из нестабильных промежу- точных продуктов — эндоперекисных простагландинов G2 и Н2, а липок- сигеназный — к образованию лейкотриенов и 5-ГЭТЕ (5-гадроксиэйкоза- тетраеноат) через промежуточные этапы — 5-ГПЭТЕ и лейкотриен А4. Простагландины и лейкотриены во многих отношениях альтернатив- ны по своим физиологическим эффектам, хотя и внутри этих групп су- шествуют значительные различия в активности. Общим их свойством •» являются преобладание действия на сосудистую стенку и гладкие мыш- цы, а также хемотаксический эффект. Эти воздействия реализуются в ре- зультате взаимодействия эйкозаноидов со специфическими рецепторами на поверхности клеток. Некоторые представители семейства эйкозанои- дов усиливают действие других вазоактивных и хемотаксических факто- ров (например, анафилактоксинов) в большей степени, чем проявляют собственное влияние. Лейкотриены С4, D4 и Е4 представляют собой Сзо-жирные кислоты, молекула которых в положении 5 содержит ОН-группу, а в положении 6 — боковые серосодержащие цепи (например, глутатион). Эти лейко- триены образуются и выделяются в среду в течение 5—10 мин после ак- тивации тучных клеток или базофилов. LTC4 присутствует в среде 3— 5 мин, в течение которых он превращается в LTD4; последний преобла- дает в последующие 15 мин, медленно превращаясь в LTE4. Эти лейко- триены (особенно LTD4) вызывают спазм гладкой мускулатуры и регу- лируют локальный кровоток, снижая артериальное давление. Активность LTD4 в отношении гладких мышц в 100 раз выше, чем гистамина, и в 2—10 раз выше, чем LTC4 и LTE4. Последние оказывают хемотаксичес- кое действие, но более слабое, чем LTD4. Лейкотриены этой группы яв- ляются медиаторами аллергических процессов, в частности медленной фазы бронхоспазма при бронхиальной астме. Ранее комплекс этих фак- торов (LTC4, LTD4 и LTE4) называли медленно реагирующей субстан- цией А. Кроме того, они подавляют пролиферацию лимфоцитов и способствуют их дифференцировке. LTB4 (дигидроксиэйкозотетраеновая кислота) в большей степени проявляет хемотаксическое и активирующее действие в отношении моноцитов, макрофагов, нейтрофилов, эозинофи- лов и даже Т-клеток. Еще один продукт липоксигеназного пути, 5-ГЭТЕ, менее активен, чем лейкотриены, но тем не менее и он может служить хемоаттрактантом и активатором нейтрофилов и тучных клеток. Простагландины представляют собой Сзо-жирные кислоты, молекула которых содержит циклопентановое кольцо. Варианты, отличающиеся по типу и положению замещающих групп (окси-, гидрокси-), обозначают раз- личными буквами, цифра в обозначении — число двойных связей в моле- куле. Простагландины накапливаются в очаге воспаления позже таких агентов, как кинины и гистамин, несколько позже лейкотриенов и одно- временно с монокинами (через 6—24 ч). Помимо вазоактивного и хемо- таксического воздействия, достигаемого в кооперации с другими фак- торами, простагландины (особенно PGE2) проявляют регулирующее дей- ствие при воспалительных и иммунных процессах. Экзогенный PGE2 вы- зывает некоторые проявления воспалительной реакции, но подавляет иммунный ответ и аллергические реакции. Так, PGE2 снижает цитотокси- 167,
ческую активность макрофагов, лимфоцитов и нейтрофилов, пролифера- цию лимфоцитов, продукцию цитокинов. Он способствует дифференци- ровке незрелых лимфоцитов и клеток других кроветворных рядов. Некото- рые его эффекты связаны с повышением уровня внутриклеточного цАМФ. PGE2 и PGD2 подавляют агрегацию тромбоцитов. PGF2 и PGD2 вызыва- ют сокращение мускулатуры бронхов, тогда как PGE2 расслабляют ее. Тромбоксан А2 (ТХА2) — С2о-жирная кислота; в его молекуле есть 6-членное кислородсодержащее кольцо. Это очень нестойкая субстанция (время полужизни 30 с), которая превращается в неактивный тромбоксан В2. ТХА2 вызывает сужение сосудов и бронхов, агрегацию тромбоцитов с освобождением их ферментов и других активных факторов, способству- ет митогенезу лимфоцитов. Еще один продукт циклогеназного пути, PGI2 (простациклин), также нестоек. Он реализует свое действие через цАМФ, сильно расширяет сосуды, увеличивает их проницаемость, инги- бирует агрегацию тромбоцитов. Наряду с брадикинином простациклин обусловливает ощущение боли при воспалении. Таким образом, часть медиаторов воспаления (кинины, анафилатокси- ны) формируется в жидкой фазе вследствие повреждения тканей и индук- ции свертывания крови, активации комплемента и других процессов, сопровождающихся активацией протеиназ. Роль основных медиаторов вос- паления выполняют цитокины, продуцируемые преимущественно макро- фагами. Небелковые медиаторы воспаления, вырабатываемые макрофагами и нейтрофилами (эйкозаноиды), играют вспомогательную и регуляторную роль в развитии воспаления и дополняют эффект других факторов. Особое место занимают продукты тучных клеток и базофилов, определяющие раз- витие аллергического воспаления. Эти продукты выделяются в два приема: практически мгновенно выбрасываются предобразованные медиаторы ко- роткого срока действия (гистамина и др.) и несколько позже продуцируются и секретируются эйкозаноиды (прежде всего — лейкотриены), которые оп- ределяют медленную фазу аллергической реакции. Существует несколько систем гуморальных факторов, участвующих в первой линии иммунной защиты. Основная из них — система ком- племента — работает по принципу каскада последовательно активи- руемых факторов. Эта система запускается с участием иммунных комплексов (классический путь) и без них (альтернативный путь). Ре- зультатами активации комплемента являются опсонизация клеток (что способствует их фагоцитозу), цитолиз вследствие образования пор в мембране, образование пептидных фрагментов, обладающих хе- мотаксическим и сосудорасширяющим действием. В первой линии защиты участвуют цитокины, секретируемые моноцитами и макрофа- гами (ИЛ-1, ФНОа, ИЛ-6, хемокины) и обладающие провоспали- тельным действием. В обеспечении естественной резистентности иг- рают роль также белки острой фазы, продукты расщепления арахидо- новой кислоты (эйкозаноиды) — простагландины и лейкотриены, факторы, секретируемые тучными клетками, воспалительные пептиды. 168
Молекулярные и клеточные основы адаптивного иммунитета 3.1. АНТИГЕНРАСПОЗНАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ Основу иммунологических процессов составляют события, связанные с распознаванием антигенов и реакцией на них клеток иммунной системы. Способностью специфически распознавать антигены и их пептидные фрагменты обладают две группы молекул — иммуноглобулины и Т-кле- точные рецепторы. Они присутствуют на поверхности соответственно В- и Т-лимфоцитов, выполняя роль антигенраспознающих рецепторов. Им- муноглобулины существуют, кроме того, в свободной, растворимой, фор- ме, представляя собой сывороточные антитела. 3.1.1. Иммуноглобулины (антитела) Антитела, т.е. молекулы, специфически взаимодействующие с антигена- ми, первоначально обнаружили во фракции у-глобулинов сыворотки крови. Позже было идентифицировано семейство молекул, с которыми связана активность антител, — иммуноглобулины. Было установлено, что молекулы антител различной специфичности имеют аналогичную струк- туру, но отличаются строением активного центра — антигенсвязывающего участка. В середине 60-х годов были описаны мембранные иммуноглобу- лины, составляющие основу антигенраспознающих рецепторов В-лимфо- цитов. Наиболее интенсивные исследования структуры иммуноглобу- линов и природы их сродства к антигену проводились в 60—70-е годы в лабораториях, возглавлявших R.Porter и G.Edelman. Большой вклад в изучение антител внесли работы C.Milstein, который ввел в научный обиход использование моноклональных миеломных иммуноглобулинов и был одним из создателей гибридомной технологии (G.Kohler, C.Milstein). С помощью этих методов были получены моноклональные антитела любой специфичности (см. раздел 4.1.2). Наконец, решающим достиже- нием в изучении генетических и молекулярно-биологических основ фор- мирования разнообразия антител явилось сделанное S.Tonegawa открытие процесса перестройки (реаранжировки) V-генов иммуноглобулинов. 3.1.1.1. Сывороточные иммуноглобулины — антитела Организация молекул иммуноглобулинов. Полипептидные цепи и домены. Молекула иммуноглобулинов построена из цепей двух типов — тяжелых (Н) и легких (L). Так называемый мономерный иммуноглобулин включает 169
a Ate. 41. Строение молекулы IgGl человека. a — расположение доменов, локализации углеводных остатков (ув), участков, чувствительных к протеолизу папаином (пап) и пепсином (пеп); L, Н — соответ- ственно обозначения легких и тяжелых цепей; VlVhClCh1—3 — обозначения до- менов; S-S — дисульфидные связи; Fab, Fc — фрагменты, образующиеся при действии папаина; a, F(ab')2, Fc' — при действии пепсина; I, II и III — гиперва- риабельные участки, б — формирование доменами молекулы IgGl петель за счет внутридоменных дисульфидных связей [по Дееву С.М., 1997] (обозначения те же; цифры соответствуют номерам аминокислотных остатков). 170
две Н- и две L-цепи, соединенные дисульфидными связями. Каждая цепь содержит от 2 до 5 гомологичных участков, состоящих примерно из 110 остатков аминокислот и имеющих сходную пространственную орга- низацию. Эти участки образуют компактные, относительно изолирован- ные пространственные структуры, скрепленные дисульфидной связью, и обладают автономными функциями. Такие структуры называют доменами (рис. 41). Во всех цепях лишь N-концевой домен имеет отношение к распозна- ванию антигена. Это связано с тем, что цепи индивидуальных молекул иммуноглобулинов, как правило, отличаются первичной структурой дан- ного домена (отсюда его название — вариабельный, или V-домен). Такая структура является основой для формирования антигенсвязывающих участков с индивидуальной, сильно варьирующей от молекулы к молеку- ле специфичностью. Эти участки образуются в результате комбинирова- ния V-доменов Н- и L-цепей. Структура остальных доменов постоянна в молекулах конкретных типов, поэтому они называются константными, или С-доменами. В L-цепях содержится один С-домен, в Н-цепях — 3— 4 С-домена. С С-доменами связаны некоторые функции иммуноглобули- нов, не имеющих отношения к распознаванию антигенов: взаимодейст- вие с рецепторами клеток, активация комплемента и др. При действии на молекулы иммуноглобулинов папаина молекулы расщепляются с образованием двух фрагментов — Fab (antigen-binding) и одного Fc (cristallizable). Первый фрагмент содержит всю легкую цепь, V- домен и первый С-домен Н-цепи; Fc-фрагмент включает остальные С- домены Н-цепей. При воздействии пепсина разрыв Н-цепей происходит ближе к С-концу. Образующиеся антигенсвязывающие фрагменты не- сколько больше по размерам, чем Fab-фрагменты, и соединены дисуль- фидной связью. Они обозначаются как Р(аЬ')2-фрагменты. Пепсиновый Fc'-фрагмент короче папаинового Fc-фрагмента. Строение С-домена L-цепей обусловливает принадлежность этих цепей одному из двух изотипов — к и Л. Строение константных участков Н-цепей определяет наличие нескольких изотипов этих молекул, кото- рые первоначально были идентифицированы серологически (с помощью антител). Существует 5 основных изотипов Н-цепей — ц, у, а, 5 и е. Каж- дая молекула может содержать цепи лишь одного изотипа. В зависимости от разновидностей Н-цепей различают 5 основных классов иммуноглобу- линов: IgM, IgG, IgA, IgD и IgE (латинские буквы в обозначении классов иммуноглобулинов соответствуют греческим буквам в обозначении Н- цепей). На основе более тонких различий аминокислотной последова- тельности Н-цепей среди IgG выделяют подклассы (субтипы) IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 (у мышей IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3), среди IgA — IgAl и IgA2. Иммуноглобулины всех классов могут относиться к К- или L-типу в зависимости от присутствия в их составе к- или Х-цепей. У человека соотношение К- и L-типов иммуноглобулинов составляет 3:2. Данные о свойствах иммуноглобулинов разных классов и подклассов и их содержании в сыворотке крови представлены в табл. 38. Как уже от- мечалось, домены иммуноглобулинов весьма сходны по пространствен- ной организации. Они представляют собой компактные глобулы, обра- 171
Рис. 42. Структура доменов иммуноглобулинов. Характер укладки p-слоев полипептидных цепей в вариабельном (V) и констант- ном (С) доменах. Буквенные обозначения отражают последовательность располо- жения участков цепи («полос») в молекуле (от N- к С-концу, которые также отмечены на схеме). Незаштрихованные и заштрихованные полосы относятся к двум разным p-слоям, лежащим напротив друг друга. S-S — внутридоменная ди- сульфидная связь. Следует обратить внимание на две полосы С' и С", которые присутствуют в V-, но не в С-домене. зованные двумя p-слоями, которые сформированы фрагментами поли- пептидной цепи, свернутой в виде гармошки (в С-доменах 4 фрагмента с одной стороны и 3 — с другой, в V-доменах — по 4 фрагмента). В центре этой двуслойной структуры находится дисульфидная связь. Ориентация слоев, состоящих из 4 и 3 фрагментов, в доменах противоположна (по- вернута на 180е относительно друг друга). Противоположна также ориен- тация слоев в прилегающих друг к другу доменах Н- и L-цепей. С-до- мены Н- и L-цепей контактируют гидрофобными поверхностями слоев, образованных четырьмя фрагментами. Структура V- и С-доменов в схе- матической форме отражена на рис. 42. V-домены. Антигенсвязывающие участки. V-домены содержат 4 участ- ка (занимающих большую часть домена), для которых характерна отно- сительная стабильность состава (каркас V-домена), и 3 участка с очень высокой вариабельностью между индивидуальными молекулами (гипер- вариабельные участки). Положение участков несколько варьирует в раз- ных цепях и примерно соответствует аминокислотным остаткам 28—36, 49—68, 92—103. Поскольку эти участки играют ключевую роль в распо- знавании и связывании антигена, их еще называют регионами, определя- ющими комплементарность (CDR от англ, complementarity determining regions). V-домены Н-цепей одинаковы для иммуноглобулинов всех классов. 172
Рис. 43. Строение пентамера IgM. Черные овалы — домены; прямоугольные выступы — углеводные цепи; линии, соединяющие мономеры IgM, — межмолекулярные дисульфидные связи. J — со- единительная цепь (см. с. 177). По строению каркаса эти домены подразделяются на 3 подгруппы, V-до- мены к-цепей — на 3 и Х-цепей — на 5 подгрупп. Каркасная последова- тельность V-доменов весьма консервативна. Гомология между V-доме- нами одной подгруппы составляет 85—90 %. В пространственной структуре V-домена вариабельные последова- тельности локализованы в зоне изгибов полипептидной цепи, направлен- ной в сторону, противоположную С-доменам, навстречу соответствую- щим участкам V-домена цепи другого типа (т.е. CDR Н- и L-цепей по-, вернуты навстречу друг другу). При этом формируется гидрофильный канал, соответствующий антигенсвязывающему участку (активному центру) антител. Он представляет собой полость, которая, по данным электронно-микроскопического изучения, имеет длину около 6 нм и диаметр 1,2—1,5 нм. Площадь поверхности, предназначенной для кон- такта с антигеном, составляет 7,2 нм2. В формировании антигенсвязывающего сайта участвуют пространст- венно разделенные остатки, входящие в состав Н- и L-цепей (см. рис. 41). В структуру сайта входят гипервариабельные участки V-доменов, однако не полностью: поверхность антигенсвязывающего участка захватывает лишь около 30 % поверхности CDR. Структура антигенсвязывающего 173
сродству. В основе метода лежит использование гаптена (низкомолеку- лярного соединения, связывающегося с активным центром антител), спо- собного при взаимодействии с антителом устанавливать с ним кова- лентную связь и, кроме того, несущего метку, с помощью которой это свя- зывание может быть зарегистрировано. Позже многие детали структуры активных центров антител и их взаимодействия с антигеном были уста- новлены с помощью рентгеноструктурного анализа. Антигенсвязывающая способность V-доменов Н- и особенно L-цепей в отдельности выражена значительно слабее, чем активного центра, сформированного в результате их комбинации. Поскольку молекулы мономерных иммуноглобулинов имеют две пары Н- и L-цепей, формируется два антигенсвязывающих участка. Это наглядно демонстрируется электронно-микроскопически, когда при связывании антителами бифункциональных молекул образуют- ся видимые кольцевые структуры. Хотя строение V-доменов и связывающих участков в целом однотип- но, вариации аминокислот, участвующих в формировании антигенсвязы- вающей полости, приводит к изменению тонких деталей ее конфи- гурации. Это служит основой огромной вариабельности данной части молекул иммуноглобулинов, в результате чего почти каждая индивиду- альная молекула иммуноглобулина-антитела уникальна по специфичнос- ти в отношении связывания антигенов. Биологические основы формиро- вания этой вариабельности рассмотрены ниже. Идиотипня и аллотнпия. Отражением структурного разнообразия антигенсвязывающего участка иммуноглобулинов-антител является их идиотипическое многообразие. Если рассматривать антитела как молеку- лы с антигенными свойствами, то естественно предположить, что анти- генная специфичность их вариабельных участков будет практически уни- кальна. Антигенные участки — эпитопы, локализующиеся в вариабель- ных зонах, называют идиотопами, а соответствующие антигенные типы иммуноглобулинов — идиотипами. Некоторые идиотипы свойственны практически всем антителам данной специфичности, вырабатываемым в организме генетически однородных животных. Таков идиотип Т15, свой- ственный антителам к фосфорилхолину, которые продуцируются у мышей линии C57DL/6. Конкретные антитела имеют повторяющиеся (перекрестно реагирующие, или общие, идиотипы) и так называемые частные идиотипы. Общие идиотипы характерны для антител к распро- страненным эпитопам, например, IdX — идиотип антител к декстрану мышей, имеющих аллель IgHa. Частные идиотипы являются уникальны- ми маркерами антител. Активный центр антител к некоторым идиотипам воспроизводит пространственную структуру антигена, против которого направлены антитела, несущие идиотип; такие активные центры обозна- чаются как внутренний образ антигена. Антиидиотипические антитела иг- рают важную роль в регуляции гуморального иммунного ответа (см. раздел 4.2.2). Генетически обусловленная вариабельность константных доменов или каркасных участков V-доменов проявляется в варьировании антиген- ных свойств иммуноглобулинов, обозначаемом как аллотипия. Как пра- 174
Свойство IgM IgG IgA IgD IgE Коэффициент седиментации 19S 7S 7S, 9S, 11S 7S 8S Мол. масса, хЮОО 950 150-170 160; 380 185 85 Число мономеров 5 1 1 или 2 1 1 Изотип Н-цепи М У а 5 Е Число С-доменов 5 4 4 • 4 5 Валентность 5 2 2 или 4 2 2 Число S—S-связей между Н-цепями 4 3-12* 4 или 5 1 3 Содержание углеводов, % 12 3 8 13 12 Содержание в сыворотке 0,5- 2 мг/мл 8—16 мг/мл 1,4— 4 мг/мл 0- 0,4 мг/мл 14- 450 нг/мл % от общего уровня 1g 6 80** 13 0-1 0,002 Срок полужизни, сут 5,1 23 5,8 2,8 2,5 Скорость синтеза, мг/кг в сутки 6,7 33 24 0,4 0,016 Функции Первичный иммунный ответ Вторичный иммунный ответ, защи- та от бакте- рий и токсинов Секретор- ные анти- тела Мембран- ный ре- цептор Реагины, защита от паразитов * IgGl - 3, IgG2 - 5, IgG3 - 13, IgG4 - 3. " Среди IgG: IgGl - 65, IgGl - 23, IgG3 - 8, IgG4 - 4 %. вило, аллотипические варианты обусловлены различиями по 1—2 амино- кислотным остаткам. Описаны аллотипические системы для различных цепей [к (Кт, или Inv), у (Gm; имеет 24 варианта, реализующихся в раз- личных подклассах), а, ц], а также V-доменов; аллотипы тяжелых цепей включают 2—3 варианта. Функциональная значимость аллотипии не вполне ясна. Аллотипы используют в качестве генетических маркеров молекул иммуноглобулинов в популяционных исследованиях. С-домены. Изотипы иммуноглобулинов. При явном принципиальном сходстве структуры различных константных доменов гомология их по аминокислотной последовательности невелика: эта гомология составляет 25—30 % и лишь в отдельных случаях существенно превышает эту вели- чину (например, для пары доменов Cyl и Cel — 45 %). Домены сущест- 175
Рис. 44. Строение секреторного IgA. Обозначения см. в подписи к рис. 43. SP — секреторный белок. Остальные обо- значения — названия доменов IgA. венно различаются по функциям, которые не имеют отношения к связы- ванию антигена, но важны для проявления биологических эффектов. Так, в молекулах IgG в домене Су2 находится участок, ответственный за связывание компонента комплемента С4Ь, а в домене СуЗ — за связыва- ние Clq. В домене Су2 находятся участки связывания рецепторов FcyRI и FcyRII, в доменах Су2 и СуЗ — последовательности, имеющие сродство к FcyRIII. Структура домена Су2 определяет скорость метаболизма моле- кулы. С этим доменом в молекуле IgG связаны углеводные цепи, величи- на, число, состав и локализация которых неодинаковы в молекулах иммуноглобулинов разных классов (табл. 38). Различия между классами и подклассами иммуноглобулинов определяются в основном особеннос- тями строения константных доменов, а также различиями в их числе (4 — в IgM и IgE, 3 — в иммуноглобулинах остальных классов). Помимо уже упоминавшихся внутрицепьевых дисульфидных связей, стабилизирующих структуру доменов, имеются дисульфидные связи между цепями (см. рис. 41). Единственная такая связь между Н- и L-це- пями соединяет домены CL и С1н. Она расположена в области С-конца L-цепи. Один из аллотипов молекулы IgA2 (Am2) сопряжен с утратой ос- татка цистеина в a-цепи, следствием чего является отсутствие межцепье- вой дисульфидной связи (Н- или L-цепи в молекулах этого иммуноглобу- лина связаны нековалентно). В формировании связей между Н-цепями особую роль играет шарнирный участок — особая часть полипептидной цепи, не входящая в состав доменов и генетически не родственная им. В этом гибком участке, доступном для протеолиза, локализуются остатки цистеина, формирующие межцепьевые связи. Их число, как и протяжен- ность шарнирного участка, варьирует в молекулах разных классов от 1 (IgD) до 12 (IgG3). 176
Структурные различия между классами иммуноглобулинов обуслов- лены, помимо особенностей строения, числом и организацией Н-цепей. Большинство классов иммуноглобулинов представляет собой «мономер- ные» структуры. В то же время молекула сывороточного IgM — пентамер. В нем мономерные субъединицы соединены дисульфидными цепями, особенно чувствительными к восстановлению: при действии 2-меркапто- этанола 198-молекула распадается на 78-мономеры. Мономеры располо- жены в виде круга, причем их Fab-фрагменты ориентированы наружу, а Fc-фрагменты — внутрь. В центральной части пентамера IgM локализу- ется полипептидная цепь J (от англ, joint), ответственная за стабилиза- цию полимера. Ее молекулярная масса составляет 15 000. Структурно эта цепь не родственна Н- и L-цепям молекул иммуноглобулинов. Строение IgM показано на рис. 43 (см. с. 173). Существенными структурными особенностями обладает молекула секреторного IgA. В отличие от сывороточного IgA, обычно представля- ющего собой мономер, IgA, секретируемый плазматическими клетками слизистых оболочек, — это димер, скрепленный дисульфидными связями между С-концами Н-цепей, а также между Н- и J-цепью. Димер IgA вза- имодействует с поли-Ig-penenTopoM (представитель суперсемейства им- муноглобулинов, содержит 5 доменов) на поверхности эпителиальных клеток слизистой оболочки кишечника. Комплекс подвергается эндоци- тозу и транспортируется к поверхности клетки, обращенной к просвету кишечника. Когда комплекс IgA с рецептором достигает мембраны, ре- цептор подвергается протеолизу, а его часть вместе с димером IgA выхо- дит в просвет кишки в результате экзоцитоза. Фрагмент рецептора, секретируемый вместе с IgA, называется секреторным компонентом (S- компонент). Его молекулярная масса составляет 60 000. S-компонент за- щищает IgA от протеолиза в содержимом кишечника, богатом протеаза- ми. Комплекс димера IgA с S-компонентом обозначается как секретор- ный IgA. В такой форме IgA присутствует в просвете не только кишечни- ка, но и других трактов (бронхиального, урогенитального), а также в секретах экзокринных желез (молочных, слюнных, слезных, потовых). Строение секреторного IgA показано на рис. 44. Иммуноглобулины представляют собой гликопротеины. Различные их классы существенно отличаются по содержанию углеводных остат- ков — от 3 до 12 % (см. табл. 38). Углеводные цепи представляют собой обычно 20-членные цепи, имеющие маннозил-хитобиозную основу и две антенны. Ббльшая часть углеводов связана с остатками аргинина (N-гли- козилирование). В молекуле IgG углеводные цепи локализованы преиму- щественно в Ун2-домене (см. рис. 41), а в иммуноглобулинах других изотипов они имеются во всех Сн-доменах (кроме Се4). Хотя углеводная составляющая молекулы иммуноглобулинов не влияет на их специфич- ность, дефекты гликозилирования могут существенно влиять на биологи- ческие эффекты антител и обусловливать некоторые проявления им- мунопатологии (см. раздел 5.3). Негликозилированные молекулы IgG об- ладают меньшим сродством к FcyRI, FcyRII и Clq. Роль иммуноглобулинов различных классов в иммунном ответе и за- щитных функциях иммунной системы различна. В соответствии с после- 177
Рис. 45. Суперсемейство иммуноглобулинов. Петли округлой формы соответствуют Ig-подобным доменам типов V, С1 или С2, прямоугольные петли — домены, не родственные Ig. Внизу — обозначения моле- кул. довательностью локализации С-генов иммуноглобулинов ранее других в процессе иммунного ответа начинают секретироваться IgM. С ними свя- зана значительная часть антител при первичном иммунном ответе. Эти антитела обладают высокой способностью связывать комплемент, агглю- тинировать и лизировать клетки-мишени. В то же время им свойственно относительно низкое сродство к антигену, причем это сродство не воз- растает в процессе иммунного ответа (отсутствует «созревание» аффини- тета — см. раздел 4.1.2). Fc-фрагмент IgM-антител относительно слабо взаимодействует с клетками, что ограничивает биологическую актив- ность последних. Это антитела экстренной иммунной защиты, предохра- няющие организм от бактериемии. Напротив, IgG-антитела, на долю которых приходится основная часть антител (особенно при вторичном иммунном ответе), обладают рядом преимуществ перед IgM-антителами по сродству к антигену, эф- фекторным и регуляторным функциям. Они обеспечивают защиту орга- низма от микроорганизмов и их токсинов. Ббльшая часть проявлений защитной активности антител обусловлена именно IgG-антителами. Из- вестны определенные различия биологических свойств IgG-антител раз- личных подклассов. Так, IgG4 не связывает комплемент, не взаимодейст- вует с белком А золотистого стафилококка; IgG2 плохо проникает через плаценту, не сенсибилизирует кожу, антитела этого класса образуются в ответ на действие углеводных антигенов. По сродству к FcyIR и FcyllR подклассы IgG располагаются в следующей последовательности: Gl > G3 > G4 > G2; с FcylllR взаимодействуют только IgGl и IgG3. Классическим носителем свойств антител является IgGl, на долю кото- рого приходится несколько более 50 % всего количества сывороточных иммуноглобулинов. IgA является основным иммуноглобулином секретов слизистых обо- лочек и основным фактором их специфической защиты. Аналогичную функцию выполняет IgE (особенно при паразитарных инфекциях). Этот 178
Рис. 46. Мембранные Fcy-рецепторы. Внеклеточные домены изображены в форме овалов. Трансмембранные части ок- рашены в черный цвет. Линия, соединяющая трансмембранные участки у-цепей FcyRIIIA, соответствует дисульфидной связи. (А и В — см. в тексте с. 182.) иммуноглобулин является главным фактором аллергических реакций ги- перчувствительности немедленного типа, что связано с его сродством к рецепторам тучных клеток. Функция сывороточного IgD не вполне ясна; общеизвестна его роль в качестве одного из основных (наряду с IgM) типов мембранных иммуноглобулинов. Суперсемейство иммуноглобулинов. Структурное сходство различных доменов молекул иммуноглобулинов дало основание предположить об- щность их происхождения. Считают, что существовал некий ген-предше- ственник, кодирующий первичный домен. От этого гена в результате .Публикаций и мутационного процесса возникло все разнообразие V- и С- генов иммуноглобулинов. Более того, оказалось, что домены, сходные с иммуноглобулиновыми, входят в состав других молекул (например, Т- клеточного рецептора), некоторых молекул адгезии, продуктов генов гис- тосовместимости, Thy-1-антигена и других структур (рис. 45). Все они объединяются в суперсемейство иммуноглобулинов, которому принадле- жит ключевая роль в иммунных процессах. 3.1.1.2. Мембранные иммуноглобулины как основа рецептора В-клеток для антигена Существование на поверхности лимфоцитов рецепторов для антигенов было предсказано Эрлихом; на этой же идее базировалась селекционно- 179
клональная теория Бернета. Обнаружение в середине 60-х годов мембран- ных иммуноглобулинов на поверхности В-лимфоцитов послужило осно- вой для понимания биохимической природы В-клеточных рецепторов для антигена, в качестве которых и стали рассматривать мембранные имму- ноглобулины (mlg). Недавно установлено, что рецептор В-лимфоцитов для антигена представляет собой комплексную структуру, включающую, помимо мембранного иммуноглобулина, несколько полипептидных це- пей иной природы, а также некоторые ферменты (см. раздел 1.1.1 и рис. 5). Преобладающим классом мембранных иммуноглобулинов является IgM, который присутствует на поверхности всех зрелых В-лимфоцитов, не контактировавших с антигенами. В-клетки, созревание которых уже завершилось в костном мозгу, наряду с IgM, несут рецептор IgD. В про- цессе иммунного ответа происходит смена изотипа рецептора на IgG, IgE и IgA. Число молекул иммуноглобулиновых рецепторов на зрелой В- клетке до ее контакта с антигеном составляет около 150 000. Все рецеп- торы каждой клетки идентичны по специфичности, поскольку их Н- и L-цепи имеют одинаковые V-домены. Молекулы идентичны также по типу L-цепей и аллотипу. Генетические механизмы этой унификации, а также переключения изотипов и смены экспрессии мембранных имму- ноглобулинов на секреторные рассмотрены ниже. Индивидуальные В-лимфоциты, как правило, различаются по специ- фичности Ig-рецептора. Лишь потомки одной клетки-предшественницы (клоны), если в их V-генах не произошло мутации, идентичны по специ- фичности. Сумма всех клонов, образующих популяцию В-лимфоцитов, обеспечивает возможность распознавания основных антигенных конфи- гураций, что определяет ее антигенраспознающий репертуар. По структуре мембранные иммуноглобулины несколько отличаются от сывороточных. Мембранный IgM представлен мономерной 88-фор- мой, а 50 % молекул мембранного IgD — полумолекулой (HL). Мембран- ные иммуноглобулины обладают гидрофобностью и выходят в раствор лишь с помощью детергентов. Это связано с наличием в С-концевой части их Н-цепей трансмембранного домена, не гомологичного другим доменам иммуноглобулинов. В ц-цепи этот участок включает 41 остаток и имеет молекулярную массу 1700. В мембранных иммуноглобулинах других классов величина трансмембранного и цитоплазматического участков может быть больше: их молекулярная масса варьирует от 2000 до 8000. Как уже отмечалось (см. раздел 1.1.1), В-клеточный рецептор для антигена содержит в своем составе дополнительные молекулы, не связан- ные с распознаванием, но важные для передачи сигнала (см. рис. 5; табл. 39). Прежде всего это гомодимерные молекулы Iga и Igp (CD79a и CD79b). Они сходны по величине и структуре, их молекулярная масса со- ставляет около 40 000. К дополнительным молекулам относятся также компоненты корецептора, который включает CD19, 22 и 81 (ТАРА-1). С рецепторным комплексом связаны также молекулы CD20, 21 и Leu 13. К цитоплазматическим доменам некоторых из дополнительных молекул примыкают тирозинкиназы р561ск, р59^п, р561Уп, а также blk, обеспечи- вающие включение активационного сигнала; с корецептором связана 180
Таблица 39. Молекулярные компоненты В-клеточного рецептора (BCR) Молекула Мол. масса, X число цепей Субъеди- ничный состав Семейство Функция IgM, мономер 200 2 ц- и 2 L-цепи Ig Связывание антигена IgD, мономер 185 2 8- и 2 L-цепи То же CD79a (Iga, димер) 35x2 2 а-цепи «1 Передача сигнала CD79b (IgP, димер) 37 х 2 2 р-цепи 11 То же CD19 95 1 цепь II Корецептор, часть комп- лекса CD19 — CD21 — CD81 CD21 (CR2) 145 1 цепь Контрольный белок компле- мента Рецептор для С 3d, корецеп- тор для антигена, часть комплекса CD 19 — CD21 — CD81 CD81 (ТАРА-1) 26 1 цепь 4-кратно про- низывает мем- брану Корецептор, часть комп- лекса CD19 — CD21 — CD81 CD20 33-37 1 цепь То же Регулирует активацию В-клеток CD22 130/140 а- и Р-цепи Ig Адгезия на Т-клетках, моноцитах Leul3 Нет данных Нет данных С-лектин Участвует в активации В-клеток Р13-киназа. Механизмы передачи сигналов через рецепторы лимфоцитов и роль указанных ферментов рассмотрены в разделе 3.4. 3.1.1.3. Fc-рецепторы Решающую роль в реализации биологических функций антител принад- лежит их взаимодействию с клетками организма (не только иммунной системы). Это взаимодействие осуществляется благодаря присутствию на поверхности клеток Fc-рецепторов, т.е. участков, обладающих сродством к уже упоминавшимся фрагментам Сн2- и Сн3-доменов иммуноглобу- линов. Характеристика различных Fc-рецепторов представлена в табл. 40. Мы уже неоднократно упоминали об этих рецепторах при рассмотрении функций макрофагов и NK-клеток и еще много раз обратимся к ним в дальнейшем. 181
Таблица 40. Характеристика Fc-рецепторов Традиционное обозначение CD Мол. масса, xlOOO Экспрессия на клетках Сродство к изотипам Аффинитет, Ка (М-1) FcyRI CD64 72-75 м, н, э G1>G3>G2>G4 108—109 FcyRII CD32 40-50 М,Н, В,Тр,КЛ,аТ Gl > G2, G4 > G3 2 - 106 FcyRIII CD16 50-65 М, Н, аТ, NK, аЭ Gl, G3 2 105 FceRI ТК, Б, М IgE 109-10Ю FceRII CD23 45-50 В, аМ, Э IgE 107 FcaR CD89 55-75 Т, В, М IgA — Примечание. М — моноциты/макрофаги, Н — нейтрофилы, Э — эозинофилы, В _ В-лимфоциты, Т — Т-лимфоциты, NK — естественные киллеры, Тр — тромбоциты, Б — базофилы, ТК — тучные клетки, а — активированные клетки. Известны 3 типа Fcy-рецепторов, 2 — Fce-рецепторов (рис. 46, с. 179) и 1 — Fca-рецептора. По-видимому, существует Fcp-рецептор, однако он пока не идентифицирован. Преобладание среди Fc-рецепторов молекул, специфичных к Fey, отражает основную роль субклассов IgG в осущест- влении гуморального иммунного ответа и его регуляции. Высокоаффин- ный рецептор FcyRI присутствует только на поверхности макрофагов и моноцитов (они имеют Fcy-рецепторы всех 3 типов) и способен взаимо- действовать с Су2-доменом IgG, как свободного, так и связанного с анти- геном. Последнее относится и к высокоаффинному рецептору FceRI, присутствующему на поверхности тучных клеток и базофилов. Осталь- ные рецепторы обладают более низким сродством к иммуноглобулинам и связываются только с иммуноглобулинами в составе иммунных комплек- сов. Соответствующие константы сродства приведены в табл. 40. Все разновидности Fcy-рецепторов, а также Fcal-рецептора постро- ены однотипно: их Fc-связывающие цепи имеют два (FcyllR, FcylllR и Fea) или три (Fcyl) внеклеточных домена, относящихся к суперсемейству иммуноглобулинов. Причем эти домены у FcyRI и FcyRII сходны по пер- вичной структуре. Все Fc-рецепторы, кроме одного из вариантов FcyHIRB, имеют трансмембранный участок и цитоплазматический домен, протяженность которого существенно варьирует: короткий — у FcaR и FcyHIRA, промежуточный — у FcyIR и длинный — у FcyRII. В последнем случае размер цитоплазматического участка может быть различным; один вариант FcyRII присущ лимфоцитам, два сходных вари- анта — моноцитам. Имеются принципиальные различия в строении вариантов FcyRIII А и В. Первый вариант представлен тримером, включающим уже упомяну- тую иммуноглобулиноподобную трансмембранную цепь и две у-цепи, родственные £-цепи Т-клеточного рецептора (см. раздел 3.1.2). Более того, эта у-цепь входит в состав TCR во многих Т-клетках слизистых обо- лочек. Она имеет цитоплазматический участок ITAM (см. раздел 3.5.1), предназначенный для передачи внутриклеточного сигнала. Вариант В 182
б Рис. 47. Строение рецепторного комплекса Т-клеток TCR—CD3. а — доменная структура TCR—CD3; указаны названия цепей и молекулярных комплексов и их расположение относительно клеточной мембраны; S-S — ди- сульфидные связи; + и — заряд трансмембранной части полипептидных цепей, б — взаиморасположение полипептидных цепей в рецепторном комплексе TCRap—CD3 (см. с. 186). лишен трансмембранного и цитоплазматического участков; он относится к белкам, заякоренным в мембране через гликозилфосфатидилинозитол. Как правило, такие белки легко смываются с поверхности клетки и обла- дают ограниченной способностью генерировать внутриклеточный сиг- нал. Указанные формы FcyRIII экспрессируются на разных клетках: FcyRIIIA — на NK-клетках, моноцитах и макрофагах; FcyRIIIB — на нейтрофилах. Сложной четвертичной структурой обладает FceRI. В его состав, по- мимо рассмотренной выше a-цепи, входят р-цепь (4 раза пересекающая мембрану) и две у-цепи, идентичные у-цепям FcyRIIIA, которые участву- ют в передаче сигнала (см. раздел 5.2.1). Низкоаффинный рецептор 183
FceRII (CD23) также является трансмембранным белком, но его внекле- точный домен относится к суперсемейству не иммуноглобулинов, а С- лектинов. Он легко смывается с поверхности клеток (прежде всего В-лимфоцитов) и участвует в регуляции их активности, в частности, уси- ливает синтез IgE. 3.1.2. Антигенраспознающий рецепторный комплекс Т-лимфоцитов TCR — CD3 Природа антигенраспознающего рецептора Т-клеток оставалась неизвест- ной до начала 80-х годов, когда совместными усилиями нескольких исследовательских групп были идентифицированы две полипептидные цепи (а и Р), входящие в состав рецептора Т-клеток вместе с ранее описанной молекулой CD3. Для обнаружения цепей, образующих рецеп- тор, были использованы клоноспецифические моноклональные антитела, оказывающие на клетки соответствующих клонов антигеноподобное дей- ствие, вызывая их пролиферацию и дифференцировку в киллеры. В конце 80-х годов было установлено существование второго типа рецептора Т-клеток, образованного двумя другими полипептидными цепями (у и 5), которые комплексированы с той же молекулой CD3. Если основным назначением собственно рецептора (TCR) является связывание антиген- ного пептида, комплексированного с продуктами главного комплекса гистосовместимости (МНС), то функция CD3 заключается в передаче антигенного сигнала в клетку. Структура и генетический контроль рецеп- торов а₽- и уЗ-типов аналогичны. Димеры ар и уЗ. Полипептидные цепи, образующие собственно ре- цепторную часть антигенраспознающих комплексов, относятся к супер- семейству иммуноглобулинов и имеют доменную структуру. Моле- кулярная организация TCRap и TCRyS совершенно аналогична (за ред- кими исключениями, которые будут упомянуты далее). Основные сведе- ния о полипептидных цепях TCR приведены в табл. 41. Гомология цепей TCR и молекул иммуноглобулинов невелика. Их сходство в большей степени относится к доменной организации и осо- бенностям вторичной и третичной структуры доменов, которая имеет слоистый вид и стабилизирована дисульфидной связью, как и в цепях молекул иммуноглобулинов. Каждая цепь TCR имеет по одному V- и С- домену (в каждом домене содержится 87— 113 аминокислотных остат- ков), трансмембранный (12—20 остатков) и очень короткий цитоплаз- матический (3—5 остатков) домены. Структура TCR схематически пока- зана на рис. 9. В V-доменах TCR, как и в V-доменах молекул иммуноглобулинов, имеется 4 участка с относительно постоянной аминокислотной последо- вательностью (каркасные участки) и 3 гипервариабельных участка (участ- ки, определяющие комплементарность, — CDR). Особенно высокая степень вариабельности свойственна третьему гипервариабельному участку. Гипервариабельные участки входят в состав полости, образую- щей антигенсвязывающий участок рецептора (его активный центр). V- домены TCR, как и молекул иммуноглобулинов, подразделяются на 184
Таблица 41. Характеристика полипептидных цепей, входящих в состав рецепторного комплекса TCR — CD3 Цепь Мол. масса, xlOOO Число остатков Число остатков Cys Число участков гликозилирования TCR a 27 (37-45) 250-270 5-6 3 Р 32 (52-54) 290-315 6 3 Y 35 (40-44) 300-315 8 3 8 45 (50-52) 400-425 6 3 CD3 у 25 160 3 3 8 20 150 4 3 £ 19 164 2 0 £ 16 142 1 0 И 22 1 0 несколько семейств со сходной каркасной последовательностью. Для не- которых семейств V-домена p-цепи установлена связь с определенной специфичностью в отношении суперантигенов или молекул МНС. На- пример, Vp6 связан с распознаванием эндогенного суперантигена Mis-1а, a Vpi7a — продуктов гена МНС I-Е. Гомология различных семейств V- доменов составляет 15—60 % (для каркасной последовательности — около 70 %), С-доменов — около 80 %. Для распознавания антигенного пептида в комплексе с продуктами МНС требуется сохранение целостности димера: антигенсвязывающий участок TCR образован V-доменами обеих цепей, а изолированные цепи практически лишены антигенсвязывающей способности. Несмотря на различие цепей, формирующих антигенсвязывающие участки TCR и мо- лекул иммуноглобулинов, иногда удавалось выявить перекрестную реак- тивность их идиотопов, что отражает сходство их пространственной структуры. Полипептидные цепи TCR соединены дисульфидными связя- ми (исключение составляет одна из разновидностей уб-TCR, в которой цепи связаны нековалентно). Эта связь находится в непосредственной близости к мембране вне иммуноглобулиновых доменов, в гибком (шар- нирном) участке. Обе цепи имеют по два участка гликозилирования. Цепи TCR экспрессируются на мембране только в комплексе с CD3. Для установления связи с ними в составе трансмембранного домена цепей TCR имеется положительно заряженный остаток лизина, который взаимодействует с отрицательно заряженным остатком аспарагиновой кислоты в цепях CD3. Доказана альтернативность экспрессии аР-TCR и уб-TCR. Как и в случае иммуноглобулинов, каждая клетка может экспрессировать только TCR, идентичные по составу и специфичности. В норме на поверхности зрелых Т-клеток содержится 30 000—40 000 молекул TCR. Растворимые 185
молекулы рецептора в норме не определяются, они продуцируются лишь клетками с мутациями по С-генам TCR. На основе аналогий с иммуноглобулинами и данных кристаллогра- фических исследований созданы модели активного центра TCR. Соглас- но одной из них, участки CDR1 и 2 вовлекаются во взаимодействие с наружными доменами молекул МНС, a CDR3 — с антигенным пепти- дом. В пользу такого распределения свидетельствует ограниченное разно- образие молекул МНС и высокое — антигенных пептидов, что соответст- вует аналогичной вариабельности CDR, участвующих в их распозна- вании. Комплекс CD3. Комплекс полипептидных цепей, обозначаемый CD3, выявлен в 1979 г. (т.е. раньше, чем цепи TCR) с помощью монокло- нальных антител ОКТЗ. Оказалось, что эта структура включает молекулы 4—5 типов (рис. 47, с. 183). Все цепи комплекса CD3 (у, 6, е, т|) явля- ются трансмембранными белками. Сведения о размерах и структуре цепей CD3 приведены в табл. 41. Цепи у, 5 и е гомологичны между собой, а также а- и 0-цепям В-клеточного рецептора; они относятся к суперсе- мейству иммуноглобулинов. Эти цепи весьма консервативны по структу- ре (межвидовая гомология составляет 85—90 % при 70—80 % для цепей TCR). Цепи у, 5 и е соединены между собой, а также с TCR и ^-димером нековалентно (уже упоминалось об их связывании с цепями TCR, через заряженные остатки аминокислот в трансмембранной части молекул). Четыре остатка цистеина в у- и 5-цепях используются для формирования доменов. Цепь С, представлена в рецепторном комплексе в виде димера, ко- торый иногда рассматривают как автономную часть комплекса TCR — CD3 благодаря его структурной обособленности и существенному отли- чию £-цепи от других составляющих комплекса CD3: £-цепь не отно- сится к суперсемейству иммуноглобулинов. Из 143 аминокислотных остатков £-цепи лишь 9 располагаются внеклеточно и 22 — трансмем- бранно; 112 остатков образуют цитоплазматический домен. Необычно большой размер цитоплазматического участка связан с важной ролью £-цепи в передаче сигнала внутрь клетки: эта цепь содержит так назы- ваемую активационную последовательность, связанную с рецептором (ITAM; подробнее см. в разделе 3.4.3). Через эту последовательность формируется нековалентная связь цепи с тирозинкиназой ZAP-70, что является ключевым звеном на начальном этапе передачи сигнала с мембраны внутрь клетки (см. раздел 3.4). Молекула £-цепи не гликози- лирована. Около 10 % ^-цепей комплекса образуют не гомодимер, а гетероди- мер с т|-цепью. Обе цепи являются продуктами одного гена; различия обусловлены присутствием или отсутствием в молекуле продуктов пос- леднего экзона. Как гомодимер, так и гетеродимер, содержащие £-цепь, соединены дисульфидной связью. В составе TCR Т-клеток слизистых оболочек наряду с £-цепыо имеется у-цепь, идентичная таковой FcyRIII и FceRI (см. раздел 3.1.1). Представления о четвертичной структуре комплекса TCR — CD3 окончательно не сложились. Его молекулярная масса при условии мяг- 186
Связывание ___ cgp120 ВИЧ-1 l( V Рис. 48. Строение корецепторных и костимулирующих молекул Т-лимфоцитов. Внизу названия молекул. Внутри кружков указан тип, к которому относятся со- ответствующие иммуноглобулиноподобные домены S-S — дисульфидные связи; прямоугольные выступы — углеводные остатки. В прямоугольных рамках назва- ния киназ, с которыми связаны цитоплазматические участки молекул. кой экстракции без применения восстанавливающих агентов составляет 300 000. Соотношение димера ар, е- и £-цепей составляет 1 : 1 : 1, а упо- мянутых компонентов и у-, 5-цепей — 2 : 1. На этом основании сделан вывод, что формула рецепторного комплекса такова: азРз, у, 5, ег> т е- это двухвалентный комплекс (см. рис. 47). Цепи CD3 синтезируются в избытке. Их сборка происходит в эндо- плазматическом ретикулуме. При этом сначала формируется тетрамер у5е2, затем к нему подсоединяются димеры ар или у5 (допускается, что к комплексу CD3 цепи рецептора могут подсоединяться по отдельности). В аппарате Гольджи происходит их гликозилирование, и полимер в со- ставе (аР)2убЕ2 перемещается на мембрану, где к нему подсоединяется димер ^2- Экспрессия становится возможной только при наличии всех компонентов комплекса TCR — CD3 («узким местом» обычно оказыва- ются компоненты TCR). До этого цепи CD3 присутствуют в цитоплазме клеток. В состав TCRaP и TCRyS входят идентичные цепи CD3; органи- зация комплексов обоих типов сходна. С Т-клеточным рецептором ассоциировано несколько молекул про- теинкиназ: помимо упомянутой тирозинкиназы ZAP-70, с ним некОва- лентно связана тирозинкиназа fyn. Кроме того, функционирование рецепторного комплекса связано с дополнительными адгезивными моле- кулами, представленными на поверхности клетки. CD4 и CD8. На зрелых Т-клетках присутствует один из двух вариан- 187
Таблица 42. Некоторые характеристики молекул CD4 и 8 Показатель CD4 CD8ap CD8aa Хромосома 3 2/2 2 Мол. масса, хЮОО 55-59 34/32 34/34 Доменная структура V-C-C-C-TM-Cy V-S-TM-Cy/V- S-TM-Cy V-S-TM-Cy Экспрессия на Т-клетках Т-хелперы Т-киллеры, развивающиеся в тимусе Т-киллеры, развивающие- ся вне тимуса Распознаваемый класс МНС (в скобках — распознающий домен) П (Ср2) I (Са3) I (0,3) функция Корецепция, передача сигнала, регуляция от- вета, индукция апо- птоза Корецепция, передача сигна- ла, регуляция ответа Вероятно, то же, что у CD8a0 Примечание. Сокращенные обозначения доменов: V — иммуноглобулиновый, подобный вариабельному; С — иммуноглобулиновый, подобный константному; S — соеди- нительный (спейсерный) участок; ТМ — трансмембранный; Су — цитоплазматический. тов молекул, играющих вспомогательную роль при распознавании анти- генных пептидов. Они различны для Т-клеток, распознающих антиген- ный пептид в комплексе с разными типами молекул МНС (см. разделы 1.2.2 и 3.3.2) и выполняющих различные функции: на Т-хелперах, распо- знающих антиген в молекулярном «контексте» молекул МНС II класса, это CD4 (gp56), а на Т-киллерах, распознающих антиген в комплексе с молекулами I класса, — CD8 (гетеродимер, содержащий а- и 0-цепи, gp34/32 или гомодимер, состоящий из двух а-цепей). Подобная «приуро- ченность» вспомогательных молекул к определенным типам молекул МНС связана с их сродством к этим молекулам. Это обусловливает ос- новную функцию CD4 и CD8, которая состоит в повышении сродства рецепторного комплекса Т-клеток к комплексу молекулы МНС с анти- генным пептидом, который представляют им антигенпрезентирующие клетки. На поверхности «наивных» клеток эти вспомогательные молеку- лы не связаны физически с комплексом TCR — CD3, физическое взаи- модействие с последним возникает в процессе распознавания молекул МНС, несущих пептиды. На основании косвенных данных предполага- ют, что связь CD4 и CD8 с рецепторным комплексом сохраняется у ак- тивированных Т-лимфоцитов и Т-клеток памяти. Сведения о молекулах CD4 приведены в табл. 42 и на рис. 48. Эти молекулы довольно сильно отличаются друг от друга, хотя основой обеих являются внеклеточные иммуноглобулиновые домены и цитоплазмати- ческая часть, связанная с тирозинкиназой p56Ick. Молекула CD4 имеет 4 внеклеточных домена. Из них N-концевой построен по типу V-доме- 188
Рис. 49. Локализация генетических сегментов неперестроенных генов Т-клсточ- ного рецептора AD (кодирует а- и 8-цепи TCR), В (кодирует p-цепь) и G (коди- рует у-цепь). п.о. — пары оснований. Для всех трех регионов схема построена в одном масшта- бе. Множественные вертикальные полоски в сегментах Va/V8 и Vp соответствуют многочисленным кодирующим участкам (с. 191). нов, а остальные по структуре аналогичны С-доменам. В наружном доме- не сосредоточены важные в функциональном отношении участки, ответ- ственные за связь с молекулой МНС II класса (точнее, с ее р2-доменом, с которым соединяется V-домен CD3). Известно, что CD4 является ре- цептором вируса СПИД — ВИЧ-1. Связывающий участок для него также находится в V-домене; в него вовлечены аминокислотные остатки 31—57 и 81-94. Обе цепи димера CD8 имеют по одному Ig-подобному внеклеточно- му домену V-типа, который соединен с трансмембранной частью молеку- лы с помощью длинного спейсерного («разъединительного») участка. Последний содержит в а-цепи 50, а в р-цепи — 30 аминокислотных ос- татков. Два участка, ответственных за взаимодействие с молекулой МНС I класса, расположены в V-домене. Цепи соединены дисульфидной свя- зью. С молекулой МНС I класса (ее аЗ-доменом) взаимодействует а-цепь CD8. Гетеродимер CD8-ap присутствует на поверхности большинства зрелых СП8+-Т-клеток, прошедших дифференцировку в тимусе, а гомо- димер CD8-aa — на Т-клетках, дифференцирующихся вне тимуса. Био- логический смысл использования гетеро- и гомодимеров CD8 разными Т-клетками не установлен. На поверхности кортикальных тимоцитов оба типа вспомогательных молекул сосуществуют. Выбор одного из них происходит в процессе диф- ференцировки на субпопуляции и неразрывно связан с селекцией (см. раздел 1.1.1 и рис. 14). Полагают, что одна из функций вспомогательных молекул состоит в обеспечении возможности использования одного и того же рецептора (TCR) Т-клетками с различными функциями. Дейст- вительно, функция клеток каким-то образом связана со способом распо- 189
1 а о л it ц я ларактеристика генов, оетерминирующих антигенраспознающие молекулы Цепь Хромо- сома Размер непере- строенного гена, тыс. п.о. Размер тран- скрипта, тыс. оснований Структура транскрипта Число генов (сегментов) V D J с Н 14q32 — — VDJC Около 500 15 4 9 к 2р12 — — VJC Около 200 — 4 1 22qll — — VJC 2 — 4 4 а 14qll 700-1000 1,7 VJC Около 100* — Около 80 1 Р 7q32— 35 Около 700 1,3 VDJC 50- 100” 4 17 2 Y 7р15 160 1,6 VJC 7 — 5 2 8 14ql 1 35 2,0 VDJC 7 3 2 4 * 22 семейства. ** 20 семейств. знавания, который определяется типом молекул МНС, входящих в состав распознаваемого комплекса. Распознавание молекул МНС в составе их комплекса с антигенным пептидом лишь частично обусловлено специ- фичностью TCR; значительный вклад в распознавание МНС вносят вспомогательные молекулы (корецепторы) CD4 и 8. Еще одна важнейшая функция молекул CD4 и 8а состоит в инициа- ции передачи сигнала в клетку. Эта функция реализуется благодаря уста- новлению связи данных молекул с тирозинкиназой src-типа (см. раздел 3.5.1) р561ск. Сродство киназы к CD4 и 8а повышается после того, как их конформация изменяется под влиянием взаимодействия с молекулой МНС. Когда происходит связывание р561ск с цитоплазматической частью вспомогательных молекул, киназа активируется, результатом чего являет- ся фосфорилирование нескольких белков, включая С,-цепь TCR — CD3 (см. раздел 3.5.1). Помимо рассмотренных «положительных» функций молекул CD4 и 8, они играют определенную регуляторную роль. Изолированное пере- крестное связывание этих молекул (без вовлечения рецептора) вызывает подавление ответа при действии на TCR. В случае предварительного свя- зывания CD4 последующая стимуляция через TCR вызывает апоптоз клеток. Можно заключить, что молекулы CD4 и 8 способствуют распознава- нию комплекса антигенного пептида с молекулами МНС, повышая срод- ство к нему рецептора Т-клеток, определяют специфику распознавания антигена Т-хелперами и Т-киллерами, участвуют в запуске активацион- ного сигнала благодаря контакту с тирозинкиназой р561ск и участвуют в 190
регуляции активности Т-клеток. Но ориентировочным данным, участие вспомогательных молекул повышает примерно в 100 раз эффективность стимуляции Т-клеток антигеном. 3.1.3. Формирование разнообразия антигенраспознающих молекул лимфоцитов Происхождение разнообразия антител и антигенраспознающих рецепто- ров Т-клеток относится к центральным проблемам иммунологии, в ос- новных чертах решенных лишь в последнее десятилетие. Очевидно, что при раскрытии природы разнообразия антигенраспоз- нающих структур антител и TCR неизбежно обращение к генетической детерминации синтеза этих молекул. У человека имеется 7 генетических кластеров, определяющих формирование к-, X- и Н-цепей иммуноглобу- линов, а-, 0, у- и 5-цепей TCR. Сведения об их локализации и структуре представлены в табл. 43. Принципиальна однотипность организации всех этих генных участков (рис. 49, с. 189): они имеют некоторое (как прави- ло, большое) количество зародышевых V-генов, соединительный сегмент J (от англ, joint — соединение), а также один или несколько С-генов. В случае Н-, 0- и 5-цепей между V-геном и J-сегментом имеется еще один сегмент — D (от англ, diversity). В генах зародышевых и соматичес- ких клеток (за исключением лимфоидных) V-, D- и J-сегменты про- странственно разделены (расстояние между V- и С-генами составляет обычно 700—1000 тыс. пар оснований). Число V-генов, которое теорети- чески должно определять разнообразие V-доменов соответствующих цепей, в ряде генных кластеров велико (100 или более), однако не на- столько, чтобы полностью обеспечить это разнообразие. Вариабельность антигенсвязывающих участков существенно увеличивается за счет ком- бинации V-доменов цепей, которые формируют этот участок. Однако и с учетом этого обстоятельства число вариантов антигенсвязывающих участков в молекуле антител должно составлять около 100 000, а в моле- куле TCR-aP — 3000 (см. табл. 44). Обнаружены несколько дополнительных механизмов формирования разнообразия антигенраспознающих структур. Основной из них связан с перестройкой (реаранжировкой) генов, которая осуществляется при со- зревании лимфоцитов (см. раздел 1.1.1 и см. рис. 5). Такая перестройка также приводит к формированию «зрелого» V-гена на основе одного из зародышевых V-генов и произвольно выбранных D- и J-сегментов. В со- бранном таким образом «зрелом» V-гене участок, происходящий из заро- дышевого V-гена, кодирует соответственно 95—96 аминокислотных остатков, а происходящий из D- и J-сегментов — 12—14 остатков V-до- мена. Этот процесс, родственный рекомбинации генов, осуществляется при участии экзонуклеаз, кодируемых генами RAG-1 (его продукт гомо- логичен бактериальным топоизомеразам — ферментам, обусловливаю- щим пространственную реорганизацию геномной ДНК) и RAG-2, которые экспрессируются непосредственно перед началом реаранжи- ровки. Последовательность событий реаранжировки приведена на рис. 50. 191
В процессе перестройки Образование "шпилек" До перестройки Формирование Р- и N-последо- вательностей После перестройки (-----Г 9 23 пвпваап TdT TdT Т IBHUHI J Ле. 50. Перестройка (реаранжировка) рецепторных зародышевых генов. V,J — генетические участки. Цифры на двух верхних схемах (сверху) — число нуклеотидов в отрезках генома, вовлекаемых в формирование петли. Цифры на 3- и 4-й схемах — участки, прилегающие к V- и J-генам, которые вовлекаются в формирование P-последовательностей. Стрелками указаны места нематричной подстройки нуклеотидов (N-вставок), катализируемой терминальной дезоксири- бонуклеотидилтрансферазой (TdT). 192
Кратко ее суть можно свести к сближению комплементарных последова- тельностей, содержащих 7 и 9 нуклеотидов (гептамеров и нонамеров). Эти последовательности находятся между сближаемыми участками, кото- рые застегиваются подобно застежке «молния» и формируют петлю, со- держащую изымаемый материал (TCR-делетирующий, или TCRD-эле- мент). Экзонуклеазы обусловливают разрыв двух нитей ДНК в гептаме- рах. Нити на участках, прилежащих к сближаемым сегментам, воссоеди- няются, формируя «шпильку». Затем эндонуклеазы катализируют разрыв одной нити в области, прилежащей к «шпильке», что приводит к вы- прямлению нити ДНК и достройке комплементарной нити (за счет до- стройки формируется фрагмент Р). В это время активируется терми- нальная дезоксирибонуклеотидилтрансфераза (TdT), которая обеспечи- вает нематричную (и следовательно, случайную, не детерминированную генетически) достройку олигонуклеотидного фрагмента в месте разрыва; такие вставки называют N-фрагментами. В реаранжировке участвует система ферментов, часть которых «за- действована» также в процессах репарации любых разрывов ДНК (в том числе продукты гена scid, мутация которого приводит к нарушению реа- ранжировки генов рецепторов Т- и В-лимфоцитов и к развитию тяжелого комбинированного иммунодефицита — см. раздел 5.1.1). В состав «зрело- го» V-гена входит лишь один зародышевый V-ген, выбор которого про- исходит случайно, но с определенным предпочтением V-генов, располо- женных ближе к З'-концу занимаемого ими участка. Из нескольких J-cer- ментов также произвольно выбирается один. Последовательность нуклео- тидов в D-сегменте может транскрибироваться в трех рамках считыва- ния, что также реализуется случайно. Все это служит дополнительным источником разнообразия, которое определяет структуру 3-го гипервари- абельного участка цепей, в наибольшей степени обусловливающего спе- цифичность рецепторов. Доказана гипермутабельность V-генов иммуноглобулинов: частота соматических мутаций в VH-reHe составляет 2—4 % при 0,0001 % для генов нелимфоидных клеток. Однако гипермутабельность лишь в малой степени реализуется при созревании В-клеток в костном мозгу; в основ- ном она происходит в процессе иммунного ответа в зародышевых цент- рах периферических лимфоидных органов (см. раздел 3.5.2). Наличие гипермутабельности в V-генах TCR не доказано. Таким образом, существует несколько источников разнообразия V- генов: • множественность зародышевых V-генов; • соматическая гипермутабельность V-генов (для V-генов антител); • комбинации V-генов с различными J- и D-сегментами; • вариабельность величины J-сегмента при соединении с V-геном; • использование различных рамок считывания в D-сегменте; • Р- и N-вставки; • комбинации V-доменов полипептидных цепей. Суммарное число вариантов структуры антигенсвязывающих участ- ков, рассчитанное с учетом только комбинаций различных V-генов, J- и 193 7 - 1092
Таблица 44. Источники вариабельности антигенраспознающих рецепторов лимфоцитов __________________ Характеристика BCR TCR Н К А. a Р Y 8 Число V-сегментов 500- 1000 250 2 100 50 7 7 Число D-сегментов 10 0 0 0 2 0 2 Число J-сегментов 4 4 3 50 12 3 2 N- и Р-вставки ++ — — + ++ + ++ Соматический гипермутагенез + + + — — — — Число перестроенных V-генов Зх 104 800 6 5000 1620 18 28 Число ассоциаций Нк - ю. - - 2,4 х 106, - 0,18 х 106 8,1 х 106 504 Число вариантов, обусловленных соединением V(D)J Около 10й Около 1013 Около 1015 Общее число вариантов Около 1017 Около 1019 Около 1017 Примечание. + имеются нерегулярно; ++ имеются как правило; — не имеются. D-сегментов, а также V-доменов полипептидных цепей, для молекул им- муноглобулинов составляет 24 х 106, а для молекул ap-TCR — 8 х 106 (комбинаторная вариабельность уЗ-TCR также высока). Реальные цифры должны быть увеличены с учетом гипермутабельности, N-вставок, вари- абельности, обусловленной особенностями считывания D-сегмента и подсоединения J-сегмента; по-видимому, они превышают сотни милли- онов (табл. 44). Хотя перестройка генов иммуноглобулинов и TCR может в принципе происходить независимо в обеих гомологичных хромосомах, реально экс- прессируются гены только одной из них, так как завершение перестрой- ки гена конкретной цепи в одной хромосоме приводит к прекращению экспрессии генов RAG-1 и RAG-2. Это обеспечивает аллельное исключе- ние в отношении V-генов (т.е. невозможность одновременной экспрес- сии в одной клетке молекул иммуноглобулинов или TCR с разной специфичностью). На сходных принципах основывается аллельное ис- ключение в отношении С-генов иммуноглобулинов. Оно проявляется в невозможности экспрессии одной клеткой молекул иммуноглобулинов разных классов (кроме ситуации с коэкспрессией IgM и IgD). На таких же принципах базируется запрет на одновременную экспрессию TCR а0- и уЗ-типов. При построении TCR аллельное исключение строго соблюда- ется в отношении p-цепи и значительно слабее — в отношении а- и у- цепей. Аллельное исключение достигается определенной последовательнос- тью событий перестройки генов иммуноглобулинов и TCR. Она начина- 794
ется по сближении J- и D-сегментов в генах Н-, у- и p-цепей обеих хро- мосом, после чего образуются перестроенные гены VJD или VJ в одной из хромосом. Если этот процесс завершился успешно (не возникло помех для считывания), аналогичный процесс в другой хромосоме блокируется. Если же перестройка произошла неудачно, такой процесс осуществляет- ся во второй хромосоме и заканчивается удачно (тогда происходят под- ключение С-генов и транскрипция мРНК) или неудачно (в этом случае клетка, как правило, гибнет). Затем по той же схеме происходит пере- стройка а-генов. В В-лимфоцитах описанный процесс сначала осуществляется в генах Н-цепей. Вслед за этим происходит перестройка генов L-цепей. Вначале она затрагивает гены к-цепи и осуществляется сначала в одной хромосо- ме. Удачная перестройка приводит к блоку аналогичных процессов в дру- гой хромосоме и в кластере генов Х-цепей. В случае неудачи перестройки k-генов в обеих хромосомах аналогичным образом осуществляется пере- стройка генов Х-цепей. В принципе аналогично происходит выбор типа рецептора в Т-клет- ках. Перестройки генов у- и p-цепей начинаются в одной из хромосом почти одновременно. Запрет или разрешение на перестройку генов в дру- гой хромосоме осуществляется в принципе так же, как для генов имму- ноглобулинов. Более специфичны закономерности выбора между перестройкой одной из пар генетических кластеров — у5 или ар. Нередко в одной и той же клетке параллельно перестраиваются гены полипептид- ных цепей, входящих в состав TCR ар- и у8-типов. В этом случае выбор определяется на уровне регуляторных участков этих генов. Установлено, что активация ингибирующего участка (сайленсера) гена у-цепи обуслов- ливает выбор клеткой TCR ар-типа. Противоположный выбор осущест- вляется при связывании сайленсера а-гена. Существует 3 типа антигенраспознающих молекул — иммуноглобу- лины, димеры ар и у5 Т-клеточных рецепторов (TCR). Иммуногло- булины составляют основу В-клеточных рецепторов (BCR), а в секретируемой форме представляют собой антитела. В состав им- муноглобулинов входит по две или более тяжелые и легкие цепи. Их структурными единицами являются домены (относительно автономные участки цепей). Наружные (от мембраны клетки) до- мены (V-домены) отличаются очень высокой вариабельностью. Комбинация V-доменов тяжелых и легких цепей формируют анти- генсвязывающий участок. Остальные домены (С-домены) имеют постоянную аминокислотную последовательность. В них содержат- ся участки, распознаваемые тканевыми Fc-рецепторами. Свойства С-доменов тяжелых цепей обусловливает принадлежность молеку- лы к изотипам — IgM, IgD, IgG, IgA, IgE. В составе BCR «наивных» В-клеток содержатся IgM и IgD. IgG представляет собой основной изотип антител при иммунном ответе (особенно вторичном), IgA- антитела преобладают в слизистых оболочках, IgE-антитела обеспе- чивают защиту от паразитов и являются аллергическими анти- 195 7*
телами, строение димеров оф и у5 TCR аналогично структуре им- муноглобулинов. Они также содержат V- и С-домены, из которых первые участвуют в формировании антигенраспознающего участка. Кроме рассмотренных молекул, в состав рецепторов лимфоцитов входят дополнительные молекулы, участвующие в передаче сигнала о связывании антигена внутрь клетки. В BCR это димеры CD79, в TCR — комплекс CD3. Разнообразие распознающих структур лишь в малой степени обусловлено множественностью V-генов и комби- нацией V-доменов полипептидных цепей, которые формируют свя- зывающий участок. В наибольшей степени это разнообразие обу- словлено процессом перестройки V-генов, которая происходит на определенных этапах развития лимфоцитов и сопряжена с удалени- ем части генетического материала, случайными стыковками сохра- нившихся фрагментов, достройкой новых фрагментов ДНК. Дос- тигаемое разнообразие антигенраспознающих структур обеспечива- ет возможность распознавания практически любых конфигураций молекул. 3.2. АНТИГЕНЫ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С АНТИТЕЛАМИ 3.2.1. Антигены Антигенами называются вещества, способные при попадании во внутрен- нюю среду организма вызывать иммунный ответ, т.е. систему реакций, направленных на удаление этих веществ из организма. Антигены — это не особый класс соединений: ими могут быть практически любые макро- молекулы, особенно белки и полисахариды. Антигенность определяется способностью вещества вызвать реакцию иммунной системы конкретного организма (подобно тому, как пахучие вещества — это любые соединения, воспринимаемые органами обоняния). Таким образом, возможность обо- значения вещества как антигена определяется не на основании однознач- ных объективных критериев, а исходя из его способности вызывать реакцию иммунной системы (т.е. как бы «с точки зрения» иммунной системы). Это существенно осложняет изучение антигенов, в том числе в практическом аспекте. Тем не менее есть несколько признаков, которыми должно обладать вещество, чтобы выступать в качестве антигена. Это — чужеродность, иммуногенность и специфичность. Однако даже эти призна- ки не совпадают при реакции на антиген В- и Т-лимфоцитов. В этой главе мы рассмотрим представления о природе антигенов, сложившиеся на основании изучения их способности индуцировать выработку антител и взаимодействовать с ними. В разделе 3.3 будет представлен материал, характеризующий антигены, распознаваемые Т-лимфоцитами. 3.2.1.1. Чужеродность Условие чужеродности антигена для организма связано с основной функ- цией иммунной системы, состоящей в защите организма от биологичес- 196
кой агрессии. Агрессия чаще всего исходит извне в виде микроорганизмов, вирусов, паразитов, а также выделяемых ими токсинов; и сами микроор- ганизмы, и их продукты чужеродны для высших животных. Эндогенная агрессия (рост опухолей) также часто связана с приобретением клетками определенных черт чужеродности (например, в результате экспрессии на поверхности опухолевых клеток вирусных белков). В результате антиген именно как чужеродная субстанция может рассматриваться в качестве маркера клеток или молекул, потенциально опасных для организма. Антигенность важна как наиболее ранний сигнал опасности, поскольку при поступлении в организм потенциально вредоносных объектов их действие проявляется не сразу и организм может «опознать» их потенци- альную агрессивность только по наличию антигена. Таким образом, эволюция избрала косвенный путь «опознания» по- тенциально опасных объектов по их чужеродности для данного организ- ма. Это послужило основанием для определения, данного Р.В.Петровым: антигены — это биологические тела и, молекулы, несущие признаки чуже- родной генетической информации. Поскольку чужеродность проявляется относительно конкретного организма, молекула, воспринимаемая как антиген одним организмом, может не восприниматься в качестве антиге- на другим организмом. Связь антигенности со степенью чужеродности макромолекулы для данного организма наглядно проявляется при оценке иммуногенности гомологичных белков. Их иммуногенность возрастает по мере увеличе- ния «эволюционного расстояния» между донором и реципиентом белка. В основе повышения иммуногенности лежит увеличение степени разли- чий в первичной структуре белков. Эти закономерности используют при серологической оценке степени эволюционного родства видов. Даже единичные замены аминокислот, лежащие в основе внутривидо- вого антигенного полиморфизма (в частности, в системе гистосовмести- мости), эффективно распознаются с помощью антител, особенно при аллоиммунизации (т.е. иммунизации генетически неидентичных особей того же вида). Комбинация достаточно большого числа полиморфных генов (особенно высокополиморфных генов гистосовместимости) обеспе- чивает биологическую индивидуальность, которая проявляется, в частнос- ти, в отторжении тканей, происходящих практически от любого другого индивидуума того же вида. На той же основе, хотя и не во всех случаях, ор- ганизм распознает неоантигены, возникающие вследствие мутаций. Однако требование чужеродности не является абсолютным при опре- делении понятия «антиген». Об этом свидетельствует возможность образо- вания аутоантител, т.е. антител к собственным компонентам организма, аутоантигенам (см. раздел 5.3). В тех случаях, когда аутоантигенами явля- ются компоненты тканей, в норме изолированных от иммунной системы («забарьерные ткани»), это не нарушает общего принципа чужеродности. В других случаях аутоантитела образуются в ответ на действие чужеродных субстанций, имеющих структурное сродство с аутологичными компонен- тами; эти антитела перекрестно реагируют с аутоантигенами. Так бывает, например, при стрептококковой инфекции, при которой образуются антитела к микробным полисахаридам, реагирующие с полисахаридами 197
соединительной и эпителиальных тканей. Лишь в редких случаях, обычно при патологии, затрагивающей иммунную систему, механизмы селекции клонов лимфоцитов и иммунорегуляцию, возникает истинная реакция на собственные антигены (например, при системной красной волчанке). Определенное количество аутоспецифических клонов лимфоцитов постоянно присутствует в организме. Среди В-лимфоцитов они характер- ны в основном для субпопуляции СВ5+-клеток. Их активность, как по- лагают, подавлена супрессорными вето-клетками. Однако некоторое фоновое количество их продуктов, аутоантител, постоянно присутствует в организме. Чаще всего это полиспецифические антитела, взаимодейст- вующие с ДНК, IgG, компонентами цитоскелета, миелином, тиреоглобу- лином, коллагеном, альбумином и другими широко распространенными в организме белками. Вероятно, эти фоновые аутоантитела играют регу- ляторную или какую-то иную роль в организме. Другую разновидность аутоантител, не только не связанных с пато- логией, но играющих важную регуляторную роль, представляют антитела к идиотипам иммуноглобулинов. Они копируют конфигурации антиген- ных детерминант, являясь их «внутренними образами», и играют опреде- ленную роль в регуляции гуморального иммунного ответа (см. разделы 3.1.1 и 4.2.2). 3.2.1.2. Иммуногенность Иммуногенность обусловливает способность антигена вызывать иммун- ный ответ независимо от его специфичности. Биологической основой для проявления этого свойства антигенов служат те механизмы развития иммунного ответа, которые предполагают участие, помимо лимфоцитов, определяющих специфическую компоненту реакции, некоторых вспомо- гательных клеток, а также кооперацию различных типов лимфоцитов. Способность чужеродных веществ вовлекать в реакцию весь необходимый клеточный ансамбль и составляет основу их иммуногенности. Иммуно- генность антигенов зависит не только от свойств молекулы, но и от пути и режима их введения в организм, от дополнительных воздействий. Структурно-химические условия иммуногенности. Антигенами могут быть прежде всего белки и углеводы. Липиды, нуклеиновые кислоты и другие органические вещества слабоиммуногенны и эффективны лишь в составе комплексных соединений (например, в виде конъюгатов с белка- ми). В составе таких конъюгатов они могут обусловливать антигенную специфичность. Использование конъюгатов низкомолекулярных соеди- нений (гаптенов) с белками-носителями, введенное в научную практику К.Ландштейнером, сыграло ключевую роль в анализе свойств антигенов. В частности, с помощью конъюгатов было показано, что специфичность антигена определяется преимущественно гаптеном, а иммуногенность — белком-носителем. С позиций современной иммунологии, предполагаю- щей необходимость кооперации В-лимфоцитов, вовлекаемых в гумораль- ный иммунный ответ, с Т-хелперами, иммуногенность в значительной степени обусловливается способностью антигена активировать Т-хелпер. Важнейшим качеством, определяющим иммуногенность антигенов, 198
является размер молекулы. С повышением молекулярной массы полимер- ных молекул увеличивается их иммуногенность. Исключения известны лишь для углеводных антигенов, для которых это правило срабатывает лишь до определенного предела. Универсальной шкалы зависимости им- муногенности от молекулярной массы не существует. Для белков порого- вый размер молекулы, определяющий появление иммуногенности, ниже, чем для углеводов. Для белков эта граница, вероятно, связана с появлени- ем а-спиральной структуры (7—10 аминокислотных остатков), однако она варьирует в зависимости от конкретного состава, в том числе от способ- ности остатков участвовать в формировании а-спирали. Минимальная описанная молекулярная масса иммуногена составляет 450 (арсанил—N- ацетил—DL-тирозин). При переходе от мономерной формы флагеллина (40 000) к полимерной (20 000 000) титры антител возрастают на два поряд- ка. Для углеводов граница между низкой и высокой иммуногенностью располагается на «уровне» молекулярной массы в десятки тысяч: полимер декстрана с массой 52 300 слабоиммуногенен, а с массой 90 700 обеспечи- вает развитие достаточно сильного ответа. Численность антителообразую- щих клеток, появляющихся в селезенке при иммунизации тремя полимерами пневмококкового полисахарида с молекулярными массами 220 000, 121 000 и 40 000, отличается примерно на порядок. Помимо формирования определенных структур, от которых зависит иммуногенность (например, а-спирали), размер молекулы важен и для увеличения числа групп, обусловливающих специфичность ответа, — антигенных детерминант, или эпитопов, т.е. повышения валентности антигена. Значение этого фактора также проявляется наиболее четко при использовании конъюгатов, содержащих различное число гаптенных групп. С повышением числа идентичных групп иммуногенность конъ- югата растет, даже если его размеры не увеличиваются. Однако после до- стижения определенной эпитопной плотности дальнейшее возрастание иммуногенности с увеличением числа эпитопов прекращается, и может наблюдаться даже снижение иммуногенности вследствие стерических помех в распознавании детерминант, их взаимной маскировки. Естест- венно, чем больше величина молекулы, тем больше детерминант она мо- жет вместить без подобного перенасыщения. Влияние валентности на иммуногенность имеет значение также в связи с разнообразием эпитопов, присутствующих на молекуле. Установ- лено, что молекула приобретает иммуногенность лишь при условии доста- точного разнообразия ее структуры. Так, поли-Ь-лизин иммуногенен толь- ко для ограниченного числа животных, например для некоторых линий морских свинок. Однако введение в состав этой молекулы боковых цепей или чередование лизина с другими остатками в составе основной цепи де- лает полимер иммуногенным практически для любых реципиентов. Наконец, роль размера молекулы в проявлении ее иммуногенности может быть проиллюстрирована на примере молекулярных агрегатов. Их высокая иммуногенность в значительной степени обусловлена тем, что они активно подвергаются эндоцитозу, это важно для процесса обработ- ки антигена и его представления Т-хелперам. Давно отмечено, что иммуногенность антигенов зависит от жесткос- 199
ти их структуры, т.е. способности сохранять достаточно определенную конфигурацию, детали которой и являются объектами распознавания лимфоцитарными рецепторами. Стабилизации конформации способст- вует присутствие ароматических, заряженных, полярных аминокислот- ных остатков. Так, молекула желатина, утратившая жесткость конфор- мации в результате обработки, практически неиммуногенна, но стано- вится иммуногенной после введения в ее состав ароматических амино- кислот. Наоборот, гидрофобные остатки в большом количестве препятст- вуют формированию а-спирали и стабилизации конформации молекул. Чрезмерную гибкость придают полимерам остатки пролина, особенно повторяющиеся. В обоих случаях снижение стабильности молекул сопро- вождается ослаблением их иммуногенности. На «уровне» выбора участка молекулы, определяющего специфичность антител (см. далее), однако предпочтительной является достаточно высокая его гибкость, позволяю- щая «подстроиться» под структуру активного центра иммуноглобулино- вого рецептора BCR. Существует еще одно свойство антигенов, от которого зависит их иммуногенность: они должны принадлежать к тем классам полимеров, из которых построены организмы высших животных. Так, полипептиды, состоящие из D-аминокислот, не свойственных позвоночным, не имму- ногенны или слабо иммуногенны для этих животных. Полагают, что это связано с затруднениями деградации этих веществ из-за отсутствия необ- ходимых ферментов (частичное разрушение является условием вовлече- ния в иммунный ответ Т-хелперов, т.е. реализации иммуногенности). Считают, что со снижением способности расщепляться ферментами свя- зано уменьшение иммуногенности белков после их рацемизации щелоча- ми. Таким образом, хотя антигены по определению должны быть чужеродны для организма-хозяина, эта чужеродность не должна перехо- дить определенные границы. Она проявляется в рамках типичного для высших животных и их окружения класса макромолекул, для расщепле- ния которых организм располагает необходимым арсеналом ферментов. Генетические аспекты иммуногенности. Поскольку иммуногенность антигена зависит от эффективности процессов обработки, которым он подвергается в организме, следует ожидать, что она зависит и от генотипа реципиента, что имеет место в действительности. Существование генети- ческого контроля иммунного ответа на конкретные антигены показано в разнообразных экспериментах. Так, при иммунизации инбредных мор- ских свинок полимерами (Glu — Lys)n или конъюгатом динитрофенил — поли-L-Lys свинки одной линии отвечали образованием антител на оба конъюгата, а свинки другой линии не отвечали ни на один из них. Гиб- ридологический анализ показал, что отвечаемость детерминируется одним доминантным геном. Аналогичные результаты получены также в экспериментах на мышах с использованием других синтетических полипептидов. Если мышей им- мунизировать разветвленными полипептидами (Т, G) — А-L и (His, G) — А-L (эти полипептиды содержат основную цепь, образованную поли-L- лизином, с боковыми полиаланиловыми цепями, заканчивающимися ос- татками тирозина и глутаминовой кислоты или гистидина и лизина), то 200
мыши линии C57BL/6 дают высокий иммунный ответ на первый, но не на второй пептид. Мыши линии СВА, наоборот, сильно реагируют на второй и слабо — на первый пептид. И в этом случае сильный ответ де- терминируется одним доминантным геном. И у морских свинок, и у мышей показана связь генов иммунного от- вета (Ir-1) с комплексом МНС. В столь четкой форме генетическая детер- минация иммуногенности проявляется лишь в отношении некоторых достаточно простых по структуре антигенов. Существуют и другие гены иммунного ответа; отвечаемость на сложные антигены подвержена ком- плексному генетическому контролю (см. раздел 4.2.1). Данные генетичес- ких исследований особенно наглядно подчеркивают относительность понятия «иммуногенность» и зависимость иммуногенности от свойств организма, в который введен антиген. Оказывается, что иммуногенность антигена может зависеть от особенностей реакции организма в большей степени, чем от структуры антигена. 3.2.1.3. Тимуснезависимые антигены Особую группу составляют антигены, гуморальный ответ на которые происходит без участия Т-клеток, например, у генетически бестимусных мышей nude. Такие антигены называют тимуснезависимыми. Антигены этой группы обладают некоторыми общими свойствами. Как правило, это очень крупные молекулы, их молекулярная масса превышает 106. Это могут быть белки и полисахариды, они поливалентны, обычно имеют повторяющиеся идентичные эпитопы. Полимеризация и агрегирование тимусзависимых антигенов, а также связывание их с полиэлектролитными носителями обычно делают эти антигены тимуснезависимыми. Для неко- торых антигенов этой группы свойственны митогенность по отношению к В-лимфоцитам и способность вызывать поликлональный иммунный ответ. Еще недавно считали, что тимуснезависимые антигены не нужда- ются в обработке макрофагами, поскольку ответ на них не зависит от генов гистосовместимости и по этой причине избегает Ir-генного контро- ля. В настоящее время допускают участие вспомогательных клеток в от- вете на тимуснезависимые антигены, хотя полной ясности в этом вопросе не достигнуто. Известно, что многие из этих антигенов медленно дегра- дируют, что обеспечивает их длительное персистирование в организме. Важные сведения были получены при изучении ответа на тимуснеза- висимые антигены мышей с мутацией xid, блокирующей дифференциров- ку В-лимфоцитов до стадии, на которой экспрессируется мембранный антиген Lyb-5. Эти мыши (а также новорожденные особи других линий, у которых не успели созреть ЬуЬ-5+-клетки) способны реагировать лишь на некоторые тимуснезависимые антигены (включая митогенные) и не реа- гируют на другие тимуснезависимые антигены. Антигены, на которые способны отвечать мыши с мутацией xid, обозначают как тимуснезависи- мые антигены I класса, а антигены, на которые они не отвечают, — как ти- муснезависимые антигены II класса. К первым относятся вещества, мито- генные для В-лимфоцитов: большинство бактериальных липополисахари- дов, туберкулин, полифлагеллин, полисахарид бордетелл, а также их конь- 207
югаты с гаптенами. К антигенам II класса относятся поливалентные конъ- югаты гаптенов с фиколлом, леваном, липополисахариды, выделенные некоторыми специальными способами, и т.д. Чисто полисахаридные суб- станции способны (при условии полимерности и полифункциональности) выступать в качестве тимуснезависимых антигенов II класса, тогда как для индукции тимусзависимого ответа молекулы должны содержать в своем составе наряду с углеводным белковый компонент. Как следует из сказанного выше, Lyb-5+-В-клетки способны реаги- ровать на тимуснезависимые антигены обоих классов, тогда как менее зрелые ЬуЬ-5“В-клетки — только на антигены I класса. При ответе на ти- муснезависимые антигены (особенно I класса) преобладают IgM-антите- ла, обычно не происходит переключение классов антител, повышение сродства антител к эпитопам в процессе ответа («созревания» ответа), от- сутствует или слабо выражена иммунологическая память. Из этого пра- вила бывают исключения, например, переключение классов антител и «созревание» их аффинитета при ответе на некоторые антигены II класса, в некоторых случаях — наличие вторичного ответа. Поскольку перечис- ленные особенности связаны с преобладанием наименее зависящих от Т- клеток звеньев гуморального иммунного ответа, можно предположить, что при ответе на тимуснезависимые антигены участие Т-лимфоцитов каким-то образом блокируется. В тех случаях, когда этой блокады нет, наблюдаются упомянутые исключения из правил. Полагают, что в основе независимости ответа на антигены I класса от Т-лимфоцитов лежит митогенность названных антигенов в отношении В-лимфоцитов. Связывание этих молекул с BCR создает на поверхности В-клеток концентрацию данных молекул, достаточную для реализации их активирующего действия через рецепторы митогенеза, для осущест- вления которого не требуются ростовые факторы Т-клеточного проис- хождения. Эффективность тимуснезависимых антигенов II класса связы- вают с их способностью к многоточечному взаимодействию с мембраной В-клеток, обусловливающему перекрестное сшивание их рецепторов, ко- торого оказывается достаточно для активации В-клеток. В настоящее время полагают, что по крайней мере при ответе на тимуснезависимые антигены II класса обязательно участие хелперных клеток. Однако их функцию могут выполнять не Т-лимфоциты, а естественные киллеры или другие клетки. Показана роль в развитии ответа на эти антигены ци- токинов, в первую очередь ИЛ-З, ГМ-КСФ и интерферона у. 3.2.1.4. Толерогенность Альтернативой индукции иммунного ответа при введении антигена может служить не только простое отсутствие ответа, но и развитие неотвечае- мости, обозначаемое для уровня клетки как анергия, а для уровня орга- низма — как иммунологическая толерантность (см. раздел 4.3.4), т.е. устойчивая неотвечаемость на данный антиген, восприятие его организ- мом как своего. Толерогенность индуцируется при введении высоких доз белков и полисахаридов; для белков существует также зона низких толе- рогенных доз. Из свойств молекулы антигена, способствующих развитию 202
толерантности, наиболее важными являются безагрегатность и мономер- ность. В связи с этим для индукции толерантности белковые растворы подвергают ультрацентрифугированию для освобождения от агрегатов. Два других свойства, способствующих проявлению толерогенности, — относительно низкая молекулярная масса (ее порог для полисахаридов выше, чем для белков) и высокая эпитопная плотность. Таким образом, молекулы одного класса могут выступать в качестве иммуногенов и толерогенов или не оказывать влияния на иммунную систему в зависи- мости от величины, состава, агрегированности, наличия примесей и т.д. Не меньшую роль в индукции анергии играют свойства отвечающих клеток, в частности, наличие у них должного рецепторного «оснащения» (см. разделы 3.5.2 и 4.3.4). При этом специфичность реакции существенно не меняется, поскольку она детерминируется другими структурами анти- гена и реализуется через другие процессы в реагирующем организме. 3.2.1.5. Специфичность Как уже отмечалось, при изучении иммунного ответа на конъюгаты гаптенов с белками-носителями было установлено, что специфичность конъюгатов обусловливается гаптеном, т.е. относительно небольшими порциями молекулы иммуногена, обладающими четкой структурной ин- дивидуальностью. Позже это подтвердилось при анализе специфичности природных молекул белков и полисахаридов, а также при изучении ответа на синтетические полипептиды. В этих работах было, в частности, установлено, что практически в любой молекуле антигена есть несколько детерминант, или эпитопов. Для антигенов с монотонной структурой (например, углеводных антиге- нов) характерны повторяющиеся однотипные детерминанты. Для белков свойственны разнообразные детерминанты, против каждой из которых в принципе может быть индуцирована выработка антител, отличающихся по специфичности от антител к другим детерминантам. При этом внутри молекулы устанавливается определенная иерархия детерминант, когда одна из них является доминирующей (явление иммунодоминантности), т.е. в спектре антител, которые образуются при введении этого антигена, преобладают антитела, специфичные к данной детерминанте. После ее искусственного удаления доминирующая роль переходит к другому эпи- топу. Связь специфичности антигенов с относительно небольшими фраг- ментами их молекулы объясняется самой природой этой специфичности. Она служит отражением особенностей тех структур, которые способны распознавать антиген и связывать его. Такими структурами являются ре- цепторы лимфоцитов и свободные антитела. Именно соответствие (прежде всего пространственное) между антигеном и рецептором или антителом, дающее им возможность взаимодействовать с высокой степе- нью сродства, является материальным проявлением специфичности антигенов. Но в этом случае размер антигенных детерминант неизбежно должен определяться размерами активных центров антигенсвязывающих рецепторов и антител, поскольку упомянутые активные центры представ- 203
ляют собой впадины, которые могут заполняться антигенной детерми- нантой. Объем детерминант составляет примерно 2—3 нм3, а протяжен- ность — 2—4 нм. Полипептидная цепь такой длины соответствует 7— 15 аминокислотным остаткам (мол. масса 600—1000), углеводная цепь — примерно 6 моносахаридным остаткам. Роль остатков в проявлении спе- цифичности эпитопа неодинакова: на долю концевого сахара приходится 39 % энергии взаимодействия эпитопа с активным центром антитела, по мере удаления от конца эта доля убывает и для 6-го остатка она состав- ляет менее 6 %. Следует подчеркнуть относительность границ эпитопов в нативных молекулах, особенно белковых. Не только животные разных видов, но и разные представители одного вида «различают» неидентичные по раз- мерам и составу эпитопы. Более того, анализ специфичности монокло- нальных антител, продуцируемых гибридными клонами, которые полу- чены на основе клеток селезенки одной мыши, иммунизированной антигеном, свидетельствует о размытости границ эпитопов и наличии целых популяций моноклональных антител к вариантам одного и того же эпитопа. Кроме того, при этом регистрируется разнообразие антител сходной специфичности по сродству к эпитопу, т.е. по степени про- странственного соответствия активных центров антител конфигурации эпитопа. Отсутствие жесткого соответствия их конфигураций — важная особенность иммунологической специфичности (особенно при первич- ном иммунном ответе). Это несоответствие выглядит вполне естествен- ным, если учесть, что связывающие структуры формируются без учас- тия антигена и поэтому соответствие конфигураций активного центра антител и эпитопа неизбежно является неполным. Формирование этого соответствия завершается в процессе «подгонки» при взаимодействии антигена с антителом. В него вовлекаются как антитела, так и антиген, незначительно изменяющие свою конфигурацию для достижения ком- плементарности (отсюда роль гибкости структуры в формировании им- мунодоминантных эпитопов). Разрешающая способность распознавания гаптенов антителами де- тально изучена с помощью реакции задержки. Сущность ее состоит в том, что исследуемый свободный гаптен, взаимодействуя с антителами, пре- пятствует реакции с ними конъюгата гаптен — белок, дающий видимые эффекты типа преципитации. При использовании идентичных гаптенов в свободной форме и в конъюгате реакцию можно полностью блокировать. При отсутствии идентичности степень подавления реакции будет тем выше, чем больше сходство между гаптенами. Аналогичные результаты можно получить при оценке перекрестной реакции конъюгатов, содержа- щих сравниваемые гаптены, с антителами к одному из них. Анализ, вы- полненный с помощью этих методик, позволил установить высокую разрешающую способность серологического распознавания (т.е. распо- знавания с помощью сыворотки, содержащей антитела). Выяснилось, что антитела различают оптическую конфигурацию углеводов, замещение атомов водорода в циклических соединениях на кислотные и азотсодержа- щие группы (в определенной степени даже на галогены). Четко распозна- 204
ются позиции замещения (орто, мета, пара), особенно при замещении кислотными группами. Наконец, распознается заряд детерминанты, кото- рому соответствует противоположный заряд активного центра. Как известно, белковые молекулы имеют развитую пространствен- ную структуру, причем гидрофильные аминокислотные остатки оказыва- ются экспонированными на поверхности белковой глобулы, тогда как другие (преимущественно гидрофобные) скрыты в глубине клубка. В ос- нове взаимодействия антигенов и антител лежит пространственное соот- ветствие конфигураций эпитопа и активного центра антител. Учитывая это, можно полагать, что в формировании детерминанты могут иметь значение не только линейная последовательность аминокислотных ос- татков, но и пространственные образования, включающие отдаленные друг от друга участки молекулы. Оказалось, что это действительно так. Серологически выявляемые антигенные детерминанты белков бывают двух типов — секвенциальные (линейные), по преимуществу концевые, и конформационные, причем последние количественно преобладают. Оба типа детерминант объединяет лишь локализация на поверхности белко- вой глобулы. Существование конформационных детерминант четко обосновано в опытах с синтетическими полипептидами. Было получено два типа поли- пептидов на основе остатков Glu, Ala, Туг. В одном из них триада этих остатков повторялась последовательно и многократно, причем цепь при- обретала а-спиральную конфигурацию. В другом полипептиде к линей- ному пептиду, образованному остатками Ala, «подшивали» боковые группы Glu—Ala—Туг. Схематически структура этих пептидов выглядит следующим образом. Пептид 1-го типа: Glu—Ala—Туг—Glu—Ala—Туг—Glu—Ala—Туг—Glu—Ala—Туг—.... Пептид 2-го типа: Glu Glu Ala Ala Туг Туг Ala—Ala—Ala—Ala—Ala—Ala—Ala—Ala—Ala—Ala—Ala—Ala—.... К пептидам обоих типов получали антитела. Оказалось, что они не реагировали между собой перекрестно. Реакция антител с полипептида- ми второго типа блокировалась трипептидом Glu-Ala-Tyr. Реакция поли- пептидов первого типа со своими антителами блокировалась линейными пептидами, образованными как минимум 17 чередующимися остатками Glu, Ala, Туг, формирующими а-спираль. Таким образом, антитела к ли- нейному полипептиду были направлены к конформационной детерми- нанте, формируемой а-спиралью, а антитела к разветвленному полипеп- тиду — к секвенциальной детерминанте, т.е. к детерминанте, зависящей от последовательности аминокислотных остатков. 205
Рис. 51. Конформационные эпитопы белковых антигенов (из учебника А. Ройта, 1991). а — эпитоп молекулы лизоцима, связанный с «петлей» полипептидной цепи, по- ложение в целой молекуле (петля выделена черным цветом); б — та же петля в изолированном виде сохраняет свою конформацию; в — конформация петли на- рушается после восстановления дисульфидной связи; г — эпитопы молекулы миоглобина спермы кашалота. Соединенные в виде цепочки остатки 18—22 со- ответствуют линейному эпитопу, две группы остатков, обведенные овалами, со- ответствуют двум конформационным эпитопам, распознаваемым моноклональ- ными антителами, остаток 109 входит в состав Т-клеточного эпитопа. Классическим примером конформационной детерминанты является петля в молекуле лизоцима, включающая аминокислотные остатки в по- ложении 60—83, скрепленная дисульфидной связью (рис. 51). Разрыв связи ликвидирует эту детерминанту. Эпитопы подобного рода обнару- жены в различных белках. Они ликвидируются при денатурации, восста- новлении и других воздействиях, влияющих на конформацию белковых молекул. Линейные и конформационные детерминанты могут «сосущест- вовать» в одной молекуле. Так, в составе молекулы миоглобина есть ли- нейная детерминанта, содержащая аминокислотные остатки в положе- нии 18—22 и конформационные детерминанты, включающие остатки в положениях 83, 144 и 145, а также 34, 53 и 113. Конформационные детерминанты особенно наглядно демонстрируют важность для серологического (и В-клеточного) распознавания не столько определенных химических соединений, сколько пространственных струк- тур, которые они образуют. Это положение может быть иллюстрировано на примере перекрестной реактивности конкретных химических соедине- ний — гаптенов — с эпитопами антиидиотипических антител (т.е. антител, распознающих некоторые идиотопы антител, специфичных к этим груп- пам). Перекрестная реактивность в этом случае основана на том, что кон- 206
Рис. 52. Зоны реакции преципитации. Изменение количества преципитата (б) и содержания (а) антигена (АГ) и антител (АТ) в надосадочной жидкости при добавлении к постоянному количеству анти- гена нарастающих количеств антител — кроличьих (1) и лошадиных (2) (с. 210). фигурация активного центра (и, следовательно, в определенной степени идиотопов) комплементарна, с одной стороны, конфигурации эпитопа иммуногена, с другой — антиидиотипу. Следовательно, эпитоп и анти- идиотип, если не идентичны, то сходны друг с другом. Анализ специфичности конформационных детерминант с помощью методов, разработанных при изучении гаптенов и применимых для сек- венциальных детерминант, практически невозможен. Это связано с тем, что при извлечении из целой молекулы конформационная детерминанта изменяет свою конфигурацию. Эти эпитопы изучают путем подбора бел- ков (от родственных видов, мутантных линий клеток и т.д.), отличаю- щихся единичными заменами аминокислотных остатков. При этом для оценки реакции часто используют твердофазный иммуноферментный анализ, позволяющий достичь высокой степени стандартизации и произ- водительности. В исследованиях такого рода широко применяют синте- тические пептиды достаточно большой протяженности (для воспроизве- дения конформационных структур). Размеры конформационных детерминант варьируют даже в более широких пределах, чем линейных детерминант; они соответствуют 6— 17 аминокислотным остаткам. Так, в молекуле миоглобина размер кон- формационного эпитопа соответствует 6—8, в молекуле бычьего сыворо- 207
точного альоумина — 1U—12 остаткам. Описаны случаи пространствен- ного разобщения частей конформационных детерминант (например, в некоторых аллотипических детерминантах иммуноглобулинов, в уже упо- минавшихся эпитопах миоглобина). Как и в линейных детерминантах, в конформационных эпитопах значение отдельных остатков может сущест- венно варьировать. Так, в формировании описанной выше петлевой де- терминанты лизоцима ключевая роль принадлежит остатку в положении 68. В данном случае проявляется уже упоминавшийся фактор гибкости эпитопа, позволяющей «подогнать» конфигурацию конформационного эпитопа к структуре активного центра антител. Оно реализуется благода- ря присутствию в эпитопах остатков, обеспечивающих эту гибкость (на- пример, пролина). Важным и практически неизученным является вопрос об активных факторах, обусловливающих иерархию эпитопов и реализуемых через ин- гибирование одними эпитопами иммунного ответа на другие эпитопы, что может происходить с участием супрессорных клеток. Несмотря на то что знания о структурных основах конформацион- ных и линейных эпитопов белков пока далеко не полные, их достаточ- но, чтобы с высокой долей уверенности прогнозировать, какие участки белковой молекулы окажутся антигенными детерминантами. В основе расчетов лежат различные соображения. В первую очередь выбираются участки с высоким соотношением гидрофильных и гидрофобных остат- ков (условие локализации эпитопа на поверхности молекулы), а также с аминокислотными остатками, придающими этому участку гибкость. Детерминанты, сконструированные на основе такого расчета (с исполь- зованием компьютерных программ), синтезируются и с успехом ис- пользуются в серодиагностике и для приготовления искусственных вакцин. 3.2.2. Взаимодействие антигенов и антител В основе реакции антиген — антитело лежит взаимодействие между эпитопами антигена и активными центрами антител, основанное на их пространственном соответствии (комплементарности). Реакция протекает в два этапа. На первом этапе происходит взаимодействие как таковое, на втором — видимые его проявления, возникающие вследствие изменения физико-химического состояния компонентов реакции при их комплекси- ровании. Первый этап реакции происходит очень быстро. Взаимодействие эпитопов с активными центрами антител основано на установлении хи- мических связей (нековалентных), не отличающихся от тех, которые воз- никают между молекулами других типов. В основе этих связей лежат следующие типы сил межмолекулярных взаимодействий: • электростатические, включающие ионные (между заряженными группами, например, карбоксильными и аминогруппами амино- кислотных остатков) и полярные (связанные с формированием диполей); 208
• водородные (связанные с образованием водородных мостиков между гидрофильными группами); • гидрофобные (обусловленные энергетическими преимуществами контакта гидрофобных участков молекул между собой по сравне- нию с их взаимодействием с водой); • силы Ван-дер-Ваальса (основанные на взаимодействии электрон- ных облаков). Все эти взаимодействия проявляются при близком контакте молекул, основой которого является комплементарность участков молекул антиге- на и антител. Известно, что интенсивность электростатических взаимо- действий убывает пропорционально квадрату расстояния, а сил Ван-дер- Ваальса — пропорционально расстоянию в седьмой степени. При близ- ком контакте молекул проявляются и силы отталкивания (в случае несо- ответствия конфигурации электронных облаков). Взаимодействие антигена с антителом обратимо и подчиняется закону действия масс, на основе которого рассчитывают константу равновесия формирования и диссоциации иммунных комплексов: К = [АЬН]/[АЬ][Н], где К — константа равновесия, [АЬ] — концентрация несвязанных анти- тел, [Н] — концентрация свободного гаптена, [АЬН] — концентрация ком- плекса антител с гаптеном. Константа равновесия служит мерой сродства (аффинности) анти- тел. Поскольку аффинность отражает степень пространственного соот- ветствия активного центра антитела и эпитопа, она может служить ко- личественной оценкой специфичности антител по отношению к данно- му эпитопу. Для ее определения используют метод равновесного диа- лиза. Антитела находятся внутри диализуемого объема, а свободный (но не связанный) гаптен способен проникать через диализационную мем- брану. Это создает возможность прямого измерения всех параметров приведенной выше формулы. Для расчетов аффинности используют также графический подход с применением координат Скэтчарда. Пос- ледние представляют собой зависимость отношения концентрации свя- занного гаптена на 1 моль антител (г) к концентрации свободного гап- тена от величины г, для гомогенных антител эта зависимость имеет ли- нейный характер. Помимо кинетического подхода к изучению аффинности, существует термодинамический подход, основанный на анализе изменений свобод- ной энергии при взаимодействии антиген — антитело. Изменение сво- бодной энергии обратно пропорционально логарифму константы аффин- ности. При использовании высокомолекулярных и поливалентных антиге- нов измерение аффинности антител осложняется. Для суммарной оценки сродства (функциональной аффинности, или авидности) антител в этом случае применяют дополнительные приемы, позволяющие оценить кон- центрацию хотя бы одного из компонентов реакции. Это осуществляют обычно на основе радиоиммунного или иммуноферментного тестов. Оценка функциональной аффинности актуальна также с точки зрения учета эффекта поливалентности антител. Так, каждый активный центр 209
IgM-антител обычно имеет меньшую аффинность по отношению к эпи- топам, чем активный центр IgG-антител той же специфичности, но сум- марная (функциональная) аффинность IgM-антител может оказаться выше вследствие большего числа активных центров. При анализе взаимодействий с антителами сложных молекул (осо- бенно белковых), которые несут несколько эпитопов, необходимо учиты- вать взаимные влияния связывания различных пар эпитоп — антитело. Установлено, что при связывании нескольких различных эпитопов моле- кулы антигена с соответствующими антителами эффективность (т.е. сродство) каждого взаимодействия повышается. Это объясняют сниже- нием вероятности диссоциации каждой связи при сохранении контакта взаимодействующих молекул благодаря наличию других связей. Другая проблема, осложняющая изучение сродства антигенов и анти- тел, это гетерогенность популяции антител по показателю сродства. Та- кая гетерогенность обусловлена тонкими различиями антител по специ- фичности. С помощью перечисленных выше подходов удается оценить усредненную аффинность популяции антител, а также рассчитать пока- затель их гетерогенности по аффинности. Указанная проблема полнос- тью решается в случае использования моноклональных антител, «гомо- генных» по всем показателям, включая специфичность и, следовательно, аффинность (см. раздел 4.1.2). Первый этап взаимодействия антигена с антителом сам по себе не имеет видимых проявлений. Для его обнаружения используют разного рода метки (флюоресцентные красители, ферменты, изотопы и др.). Обычно метят антитела; при их связывании с материалом, содержащим антиген (клетками, веществами, фиксированными на носителе и др.), на нем удается обнаружить метку. Этот подход лежит в основе разнообраз- ных тестов, широко используемых в исследовательской и клинико-лабо- раторной практике. Традиционно его комбинировали с гистологическим или электронно-микроскопическим исследованием фиксированного биологического материала (срезов). В последние годы широкое распро- странение получило определение мембранных молекул клеток с помо- щью моноклональных антител, меченных флюорохромами; определение в этом случае осуществляют методом проточной цитофлюорометрии. Со- зданы новые высокочувствительные методы регистрации связывания антигенов антителами, фиксированными на поверхностях, в основу ко- торых положена оценка трансформации энергии связывания в физичес- кие сигналы (биосенсорные системы). Другая группа методов основывается на оценке второго этапа реак- ции антиген — антитело, проявляющегося в образовании иммунного комплекса с разнообразными физико-химическими и биологическими последствиями. Основное из этих проявлений — формирование преци- питата. Еще в те времена, когда структура антител и их валентность были неизвестны, анализ реакции преципитации (количественная преципита- ция по Гейдельбергеру, рис. 52, с. 207) позволил сформулировать основ- ные иммунохимические закономерности. Реакция количественной пре- ципитации послужила важнейшим источником информации о свойствах антител, когда иные методы их изучения были недоступны. 210
I II ill П1-----------II--------1 |— TAP/LMP Bf HSP70 KPmIa EC4/C2 TNF D Q T M lllllllllll I II III I Puc. 53. Генетический регион главного комплекса (МНС) гистосовместимости мыши (Н-2) и человека (HLA). Римскими цифрами отмечены участки, занимаемые генами МНС I, II и III клас- сов; буквами обозначены индивидуальные гены (с. 214). Тогда же была создана теория решетки, согласно которой в основе формирования преципитата лежат бивалентность антитела и поливалент- ность антигена. В результате при взаимодействии антигена с малым ко- личеством антител формируются комплексы из одиночных пар молекул. Эти комплексы растворимы. По мере увеличения количества антител возникает возможность не только каждой молекуле антитела связывать две молекулы антигена, но и разным молекулам антитела взаимодейство- вать с одной молекулой антигена. В результате формируется молекуляр- ная решетка, не способная «удержаться» в растворе и формирующая преципитат. Размер решетки и объем преципитата увеличиваются с на- растанием дозы антител (при постоянной концентрации антигена). В зоне эквимолярных соотношений (когда в жидкости над преципитатом не удается обнаружить ни антигена, ни антител), а также при некотором избытке антител объем преципитата максимален. Дальнейшее добавле- ние антител приводит к своеобразной блокаде молекулы антигена: анти- ген оказывается связанным с обеими валентностями нескольких антител. Это препятствует формированию решетки и сопровождается образовани- ем относительно небольших растворимых комплексов состава Ag4Ab3, Ag3Ab2 или Ag2Ab. Такие представления в основном подтвердились, хотя и были уточнены во многих деталях. В настоящее время методы, основанные на преципитации, продолжа- ют использоваться в экспериментальной и клинической иммунологии. Примером может служить метод радиальной диффузии, позволяющий оценивать концентрацию антигена по радиусу кольца преципитации. Кольцо формируется при диффузии антигена из лунки в агар, содержа- щий антитела. На иммунопреципитации основаны многие современные 211
методы иммунохимического анализа, например осаждение моноклональ- ными антителами клеточных лизатов с последующим электрофоретичес- ким анализом преципитированного материала. Преципитация лежит в основе широко распространенного в настоящее время метода иммуно- блоттинга («иммунопромокания»), при котором комплекс белков разде- ляют электрофоретически, переносят в целлюлозу и «проявляют», осаждая антителами. В обоих этих случаях удается определить молеку- лярную массу изучаемых молекул и другие их свойства. Другой подход к регистрации реакции антиген — антитело основан на феномене агглютинации. Его сущность в том, что при взаимодействии час- тиц (в том числе клеток, например, эритроцитов), суспендированных в рас- творе, с антителами происходит перекрестное связывание, которое при- водит к формированию агрегатов частиц. Стабильность суспензии частиц, поддерживаемая их взаимным электростатическим отталкиванием, наруша- ется, и формируется агглютинат, обнаруживаемый визуально. В реакции агглютинации используют как нативные клетки, так и клетки (или другие частицы), нагруженные антигенами (непрямые варианты метода). Третий подход к выявлению второй фазы взаимодействия антиген — антитело основан на лизисе клеток, с поверхностью которых связались антитела, в присутствии комплемента. Для осуществления реакции лизи- са требуется перекрестное сшивание антителами мембранных молекул. Этот подход лежит в основе реакций гемолиза и лимфоцитотоксичности. Антигенами называют макромолекулы (чаще всего белки), способные вызывать иммунный ответ организма при условии их распознавания специфическими рецепторами лимфоцитов. Для и