РОССИЙСКАЯ лклдгмин МЛУК
ТИМИРЯЯ1М.КИ1 Ч1ЕНИЯ
LV1
М. Н. Запрометов
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ИХ РОЛЬ В ЖИЗНИ РАСТЕНИЯ
в
-НАУКА.
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А. ТИМИРЯЗЕВА
М.Н. ЗАПРОМЕТОВ
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ИХ РОЛЬ В ЖИЗНИ РАСТЕНИЯ
Доложено на пятьдесят шестом ежегодном Тимирязевском чтении 2 июня 1995 г.
В монографии в краткой форме излагаются 'современные представления о механизмах биосинтеза основных классов фенольных соединений (оксибензойные и оксикоричные кислоты, кумарины и флавоноиды) и их полимерных форм (лигнийы и дубильные вещества). Рассмотрен метаболизм фенольных соединений н внутриклеточная организация их образования и превращений. Наибольшее внимание уделено роли фенольных соединений в растениях. Фенольные соединения выполняют в растениях структурные, защитные н сигнальные функции, а также участвуют в процессах дыхания и фотосинтеза. Эти функции детально рассмотрены с включением новейшей библиографии.
Книга рассчитана на физиологов растений, биохимиков.
ВВЕДЕНИЕ
Среди многих отличий мира растений от животного мира можно отметить следующие два, с которыми, пожалуй, чаще всего приходится сталкиваться физиологам и биохимикам растений. Это, во-первых, то, что растения осуществляют такой абсолютно жизненно важный глобальный процесс, как фотосинтез. Во-вторых - это способность растений к образованию разнообразия так называемых вторичных соединений. Эти соединения различны как по своему строению, так и по функциям.
К числу таких соединений относятся и фенольные соединения, которые являются обязательными компонентами каждого растения и каждой растительной клетки. О том, что мы знаем сегодня о фенольных соединениях, как они образуются и каковы их функции в растениях, я и собираюсь в самом сжатом виде рассказать, пользуясь предоставленной мне возможностью.
Во времена К.А. Тимирязева этот раздел физиологии и биохимии растений фактически не существовал. Имелись лишь отдельные разрозненные наблюдения, носившие скорее созерцательный характер. Не было даже самого термина фенольные соединения, а вещества, дающие синюю или зеленую окраску с солями железа (характерная реакция на фенольные соединения), именовались дубильными веществами, поскольку особенно богатые ими растительные экстракты использовались для дубления невыделанных шкур животных.
Большинство физиологов растений считало, что фенольные соединения (дубильные вещества) являются конечными продуктами обмена веществ и даже как бы отбросами жизнедеятельности растений. Например, в конце прошлого столетия известный физиолог растений Ю. Сакс в своей "Опытной физиологии растений" писал, что "Дубильные вещества представляют собой, по-видимому, ...продукты разложения и, раз образовавшись, не принимают участия в обмене веществ" [Сакс, 1867].
Следует, правда, отметить, что еще при жизни К.А. Тимирязева появилась гипотеза В.И. Палладина о том, что в растениях хромогены (т.е. собственно фенольные соединения) в виде окисленных (хинонных) форм участвуют в процессе дыхания, являясь акцепторами водорода на конечных этапах этого процесса. Одна из его работ так и называлась -"Das Blut d₽r Pflanzen" ("Кровь растений") [Палладии, 1908]. Много позднее эта,гипотеза частично подтвердилась на примере убихинонов с тем отличием, что последние оказались встроенными в электронтранс-
портную цепь митохондрий не на ее кислородном конце, а значительно раньше - перед цепочкой цитохромов.
Серьезные физиолого-биохимические исследования в области фенольных соединений были впервые начаты в нашей стране А.Л. Кур-сановым и сотрудниками в начале 1940-х годов в лаборатории биосинтеза Института биохимии им. А.Н. Баха Академии наук СССР. Их итоги были отражены в широко известном Баховском чтении А.Л. Курсанова [Курсанов, 1952].
Позднее эти исследования переместились главным образом в Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Академии наук СССР, где была организована группа "физиологии и биохимии вторичного метаболизма", впоследствии переросшая в "лабораторию вторичного метаболизма”. Об этих позднейших исследованиях я собираюсь кратко рассказать, хотя моя главная цель — в сжатой форме обрисовать некоторые аспекты современного состояния проблемы фенольной ветви так называемого вторичного метаболизма.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О БИОГЕНЕЗЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Хотя разнообразие природных фенольных соединений чрезвычайно велико и исчисляется многими тысячами, их роднит не только строение, но и биогенетическая природа. Подавляющее большинство известных нам фенольных соединений образуется с использованием в качестве ключевого предшественника шикимовой кислоты. Отсюда сам этот путь биосинтеза называется шикиматным путем. По некоторым расчетам [Jensen, 1986] до 60% всей биомассы растений образуется с прохождением углерода по шикиматному пути.
Шикиматный путь объединяет в себе образование фенольных соединений и образование ароматических аминокислот, а именно-L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана. При этом, как было показано в наших исследованиях [Запрометов, Бухлаева, 1968], а также в работах других авторов [Ishikura et al., 1984; Amrhein et al., 1984], такие оксибензойные кислоты, как протокатеховая и галловая, образуются на самых ранних этапах шикиматного пути из 3-де-гидрошикимовой кислоты.
Как можно видеть из рис. 1, шикиматный путь начинается с конденсации фосфоенолпирувата и эритрозо-4-фосфата. Образовавшийся в результате такой конденсации 3-дезокси-£)-арабиногептулозонат-7-фосфат превращается в 3-дегидрохинную кислоту. Последняя далее дает начало либо хинной кислоте (на боковом ответвлении), либо 3-дегидрошикимовой кислоте. Из З-дегидрошикимовой кислоты образуется шикимовая кислота, а также галловая и протокатеховая кислоты.
В результате последующего фосфорилирования шикимовой кислоты и присоединения еще одной молекулы фосфоенолпирувата происходит образование хоризмовой кислоты. Хоризмовая кислота затем вовлекается либо в образование L-триптофана (через промежуточное образование антраниловой кислоты; на схеме это ответвление шикиматного пути не показано), либо превращается в префеновую кислоту и далее в L-арогеновую кислоту.
L-Арогеновая кислота в результате окислительного декарбоксилирования превращается в L-тирозин, а сопровождающаяся декарбоксилированием) дегидратация L-арогеновой кислоты приводит к образованию L-фенилаланина. При дезаминировании L-фенилаланина под действием £->фенилаланинаммиак-лиазы образуется простейший представитель фенилпропаноидов, а именно трпнс-коричная кислота.
но. хоон
Шикиматиый путь
1 - эритрозо-4-фосфат; 2 - фосфоенолпируват; 3 - З-дезокси-О-арабииогептулозо-нат-7-фосфат; 4 - 3-дегидрохинная кислота; 5 - хинная кислота; 6 - З-дегидрошикимовая кислота; 7 - галловая кислота; 8 - протокатеховая кислота; 9 - шикимовая кислота; 10 -хоризмовая кислота; II - префеновая кислота; 12 - L-арогеновая кислота; 13 - L-фенил-аланин; 14 - L-тирозин
Сходным путем из L-тирозина образуется и-оксикоричная (п-кума-ровая) кислота. Однако необходимо отметить, что масштабы дезаминирования L-тирозина, как правило, гораздо меньше масштабов дезаминирования L-фенилаланина, поэтому именно L-фе-нилаланин является основным предшественником фенольных соединений.
транс-Коричная кислота при участии 4-гидроксилазы коричной кислоты далее превращается в n-кумаровую кислоту, а орто-гидрокси-лирование n-кумаровой кислоты приводит к образованию кофейной кислоты. Из кофейной кислоты затем образуются последовательно феруловая, 5-оксиферуловая и синаповая кислоты. На этом завершается формирование основных представителей фенилпропаноидного блока фенольных соединений.
Биогенез фенилпропаноидов
1 - L-фенилаланин; 2 - тракс-корнчная кислота; 3 - n-кумаровая кислота; 4 - кофейная кислота; 5 - феруловая кислота; 6 - 5-оксиферуловая кислота; 7 - синаповая кислота
После активации при помощи образования эфиров с коферментом А при участии оксициннамоил : КоА лигазы (синоним п-кумарил : КоА лигаза) оксикоричные кислоты подвергаются последующим превращениям. Основными из них являются следующие:
1)	восстановление до оксикоричных спиртов - n-кумарового, кони-ферилового и синапового, которые служат непосредственными предшественниками лигнинов;
2)	Р-окисление с образованием оксибензойных кислот и прежде
всего n-оксибензойной (предшественник пластохинонов) и бензойной (предшественник салициловой кислоты);
3)	образование разнообразных ацильных производных или сложных эфиров, наиболее широко распространенным и известным примером которых может служить хлорогеновая (5-0-кофеил-D-хинная) кислота;
4)	образование гликозидов и сахарных эфиров оксикоричных кислот;
5)	орто-гидроксилирование транс-коричной кислоты с образованием орто-кумаровой кислоты, которая служит предшественником семейства многочисленных кумаринов;
6)	взаимодействие с тремя молекулами малонил-КоА при участии халконсинтазы, что в случае n-кумарил-КоА приводит к образованию основного предшественника флавоноидов халкона халко-нарингенина.
Последний пункт цмеет особое значение, поскольку он означает переход от фенилпропаноидного к флавоноидному блоку биосинтеза фенольных соединений.
Халконарингенин (тетраоксихалкон) под действием халконфлава-
2,4,6,4'-Тетраоксихалкоп
Образование халкона
1 - малонилкофермент А; 2 - n-кумарилкофермент А; 3 - промежуточный полике-тид; 4 — кофермент А; 5 - халконарингенин (2', 4', 6', 4-тетраоксихалкон)
нонизомеразы превращается во флаванон нарингенин, который служит родоначальником почти всех других классов флавоноидов за исключением халконов и дигидрохалконов. Помимо п-кумарил-КоА, субстратом халконсинтазы в ряде случаев мог служить кофеил-КоА. Однако он использовался в халконсинтазной реакции значительно менее эффективно. Кроме того, в растениях найдена высокоактивная флавоноид-3-гидроксилаза, катализирующая С—3' гидроксилирование нарингенина, что может исключить потребность в использовании кофеил-КоА как субстрата [Запрометов, 1993].
Катехины	Антоцианидины
Биогенез флавоноидов
Флавоноиды исключительно разнообразны по строению. Объясняется это тем, что они обычно присутствуют в тканях растений в виде моно-, ди-, три- и даже тетра-гликозидов, причем к сахарным фрагментам очень часто присоединяются ацильные остатки в виде оксико-ричных, оксибензойных или иных органических кислот (уксусной, малоновой, щавелевой, янтарной и некоторых других). Из примерно 9000 известных к настоящему времени фенольных соединений более половины приходится на долю флавоноидов.
Помимо мономерных и олигомерных фенольных соединений, в растениях образуются и полимерные их формы, такие, как лигнины, дубильные вещества и (сравнительно редко) меланины.
В самом упрощенном виде биогенетическую природу большинства
природных фенольных соединений можно представить в виде следующей схемы:
Малонип-КоА
Кумарины
Три основных блока в биосинтезе фенольных соединений
Здесь изображены три биосинтетических блока: шикиматный путь, блок фенилпропаноидов и флавоноидный блок. Каждый из этих блоков является источником тех или иных мономерных, олигомерных и полимерных фенольных соединений.
Так, помимо того, что шикиматным путем образуется основной предшественник большинства фенольных соединений L-фенилаланин, на начальных этапах этого пути происходит образование галловой кислоты, которая служит предшественником олигомерных и полимерных галловых и эллаговых дубильных веществ (ДВ).
Разнообразие мономерных фенольных соединений фенилпропа-ноидного блока было рассмотрено выше. Полимерные фенольные соединения этого блока представлены лигнинами, образующимися на основе оксикоричных спиртов.
Мономерные соединения флавоноидного блока, помимо самих флавоноидов (производных 3-фенилхромана), включают разнообразные изофлавоноиды (производные 2-фенилхромана) и редко встречающиеся неофлавоноиды (производные 4-фенилхромана). Полимерные и олигомерные фенольные соединения этого блока представлены конденсированными дубильными веществами, которые образуются главным образом на основе катехинов и флаван-3,4-ди-олов.
Я не могу здесь останавливаться на отдельных этапах перечисленных биосинтетических процессов. Укажу лишь, что расшировка энзимологии биосинтеза фенольных соединений началась свыше 20 лет тому назад и для конечных этапов в некоторых случаях продолжается и до сих пор.
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Следующий раздел, к которому я хочу перейти - это физиологобиохимические аспекты метаболизма фенольных соединений, изучавшиеся нами главным образом на примере чайного растения и инициированных на его основе культур клеток и тканей.
Выбор этот был хотя и традиционен, но не случаен. Чайное растение образует в листьях и в молодых побегах до 30—40% на сухую массу растворимых фенольных соединений и таким образом фенольные соединения являются для него основным продуктом жизнедеятельности и ради этого оно и культивируется в Индии, Китае, Японии и других странах Юго-Восточной Азии, включая Шри Ланка и Индонезию, в Центральной Африке (Кения), в прибрежных юго-восточных районах бассейна Черного моря (Россия, Грузия, Турция), а также в Азербайджане.
Фенольная специфика чайного растения и привлекательна и сложна для исследователя. Привлекательна из-за интенсивного фенольного метаболизма, а сложна потому, что доминирующие в чайном растении флаваны, представленные катехинами, их галлоильными эфирами и олигомерными проантоцианидинами, весьма реакционноспособны, легко подвергаются окислению и в окисленном состоянии необратимо взаимодействуют со многими компонентами клетки, в том числе и с ферментными белками.
В описанных ниже исследованиях нами использовались чайные растения плантаций Грузинского института чая и субтропических культур (Озургеты - Анасеули), растения, выращиваемые в оранжерее Института физиологии растений РАН, а также соответствующие тканевые и клеточные культуры.
Недостаток времени и места не позволяет остановиться на методических деталях проводившихся исследований. Укажу лишь, что были разработаны методы препаративного выделения [Запрометов, 1952], идентификации и количественного определения основных представителей сложного фенольного комплекса чайного растения [Запрометов, 1958], методы анализа функциональных групп полифенолов [Курсанов, Запрометов, 1949], анализ свободной и эфирносвязанной галловой кислоты [Запрометов, Бухлаева, 1963], получение меченных по углероду (14С) катехинов и шикимовой кислоты [Запрометов, 19626], метод щелочного расщепления флаванов [Запрометов, 1962а], анализ лигнина (Zaprometov et al., 1993) и ряд других методов.
После расшифровки механизма биосинтеза катехинов, когда с использованием меченых предшественников было установлено, что шикимовая кислота используется исключительно для образования бензольных колец В и С, а ацетат или малонат - преимущественно для образования кольца А [Запрометов, 1962а], основное внимание было обращено на общие закономерности образования и последующих превращений фенольных соединений.
Уже первые изотопные исследования показали, что в молодых побегах чайного растения в процессе фотосинтеза фенольные соединения образуются с высокой скоростью. Так, на свету уже через несколько минут экспозиции в атмосфере меченной 14С углекислоты значительная радиоактивность могла быть обнаружена в составе катехинов [Запрометов, 1966]. В то же время для такого типично вторичного соединения, как кофеин, даже для слабого внедрения метки в те же побеги потребовалась экспозиция в несколько часов [Запрометов, 1962в].
Оказалось также, что максимальная направленность продуктов фотосинтеза на образование фенольных соединений свойственна наиболее молодым и интенсивно растущим частям побега [Запрометов, 1958]. Уже один этот факт опровергал самую мысль о фенольных соединениях как об ингибиторах роста растений и, напротив, хотя бы косвенно свидетельствовал об активной их роли как компонентов ростового процесса.
Анализ продуктов более длительного 30-минутного фотосинтеза в атмосфере 14СОг показал, что на долю фенольных соединений приходится до 30% фотосинтата (т.е. суммарной экстрагируемой радиоактивности) и что в этом отношении они уступают лишь сахарам с их 45% включения радиоактивности [Запрометов, Бухлаева, 1970]. Если же взять для сравнения нефенолонакопляющие растения, например весенние побеги сосны, то даже у них фенольные соединения занимают третье место по радиоактивности фотосинтата после сахаров и органических кислот [Запрометов, Бухлаева, 1970]. Кстати, среди последних в весенних побегах сосны доминирует хинная кислота, которая наряду с шикимовой кислотой может рассматриваться как резервный фонд для образования фенольных соединений (табл. 1).
Более детальные исследования позволили установить, что простейшие представители катехинового комплекса, а именно (+)-катехин и (-)-эпикатехин, а также димерный проантоцианидин, содержатся в
Таблица 1
Состав растворимых продуктов фотосинтеза молодых побегов чайного растения п сосны (экспозиция в 14СС>2 30 мин; % от общей радиоактивности)
Вещество	Побег чайного растения	Побег сосны
Сахара п циклиты	45,04	78,84
Органические кислоты	4,28	10,64
Аминокислоты	11,93	1,24
Белки	7,90	0,45
Фенольные соединения	28,09	6,17
Терпеноиды н хлорофилл	2,75	2,65
Кофеин	Мепее 0,01	-
хлоропластах листьев чайного растения [Запрометов, Колонкова, 1967]. Кроме того, в хлоропластах была обнаружена значительная доля содержащейся в клетке общей активности L-фенилаланинаммиак-лиазы - первого фермента фенилпропаноидного звена биосинтеза [Шипилова, Запрометов, 1979].
Главное же состояло в том, что с помощью экспериментов, проведенных с использованием изотопной методики, удалось впервые показать, что на свету первичное образование простейших катехинов происходит в хлоропластах в результате процесса фотосинтеза. При этом оказалось, что после 15-минутной световой экспозиции молодых побегов чайного растения в атмосфере 14COj удельная радиоактивность суммы фенольных соединений (представленных главным образом катехином и эпикатехином) в хлоропластах более чем в 20 раз превосходит их удельную радиоактивность в надосадочной жидкости после отделения хлоропластов [Запрометов, Колонкова, 1967]. Дальнейшие исследования показали, что появление метки 14С среди продуктов фотосинтеза в простейших катехинах может быть зарегистрировано уже через 1-2 мин экспозиции на свету [Zaprometov, 1979].
Было установлено, что новообразовавшиеся в хлоропластах фенольные соединения покидают хлоропласты1 и уже вне этих органелл подвергаются последующим биосинтетическим процессам, в частности, дополнительному гидроксилированию первичнообразовавшихся катехинов [образование галлокатехинов : (+)-галлокатехина и (-)-эпигал-локатехина], этерификации катехинов галловой кислотой [образование (-)-эпикатехингаллата и (—)-эпигаллокатехингаллата] и гликози-дированию (образование флавонолгликозидов). Об этом свидетельствует отсутствие галлокатехинов и галлоильных эфиров катехинов в хлоропластах, а также гликозидирование флавонолов кемпферола и кверцетина внепластидными сахарами [Запрометов, 1968].
Также впервые на примере чайного растения было установлено, что высшие растения способны не только синтезировать фенольные соединения, но и подвергать их глубокому окислению с расщеплением ароматических структур, т.е. бензольных ядер [Запрометов, 1959,1964; Zaprometov, 1977]. Продукты такого катаболического расщепления вовлекаются в первичный метаболизм и могут использоваться либо в качестве запасного дыхательного материала, либо служить исходными компонентами для различных биосинтезов. Катаболизм фенольных соединений будет рассмотрен более детально несколько позднее.'
Для изучения закономерностей регуляции образования фенольных соединений, помимо самих растений, была использована также культура клеток и тканей, инициированных из листьев’и молодых стеблей чайных растений [Zaprometov, 1989]. При этом было установлено, что культивируемые in vitro клетки и ткани чайного растения сохраняют, хотя и заметно ослабленную способность к образованию характерных для этого растения флаванов (катехинов и проантоцианидинов), а также оксибензойных и оксикоричных кислот и фенольного полимера
лигнина [Корецкая, Запрометов, 1975; Zaprometov, 1988]. В них присутствуют и характерные ферменты фенольного метаболизма, такие как L-фенилаланинаммиак-лиаза [Шипилова и др., 1978] и кофеил-О-метил-трансфераза [Николаева, Запрометов, 1990].
Цитохимические исследования показали, что в каллусных тканях флаваны локализуются в специализированных клетках-вместилищах, а лигнин - не только в клеточных стенках и в области срединной пластинки, но также целиком заполняет содержимое отдельных клеток [Загоскина и др., 1979; Стрекова и др., 1980; Запрометов и др., 1982].
Длительное культивирование каллусных тканей в темновых условиях приводило к ослаблению их способности к образованию фенольных соединений. Это касалось прежде всего флаванов и суммы растворимых фенольных соединений и в значительно меньшей степени лигнина. Так, в случае каллусной ткани стеблевого происхождения за 60 пассажей содержание суммы растворимых фенольных соединений уменьшилось примерно в 13 раз, содержание флаванов - в 20 раз, а содержание лигнина-лишь в 2,5 раза [Запрометов и др., 1986]. Отсюда следует, что образование лигнина является наиболее консервативным процессом и это косвенно свидетельствует о важном физиологическом значении лигнина в жизнедеятельности высших растений.
Использование фитогормонов и их синтетических аналогов позволяет значительно интенсифицировать образование фенольных соединений [Zaprometov, 1979, 1989]. Так, например, при введении в питательную среду 1-нафтилуксусной кислоты (2 • 10-5 М) содержание суммы растворимых фенольных соединений в каллусных тканях может быть увеличено в 10 раз [Загоскина, Запрометов, 1979], а при введении кинетина (5 • 10-6 М) в два раза [Запрометов и др., 1986]. При этом кинетин оказывал специфическое действие на дифференциацию клеточных структур, принимающих участие в образовании фенольных соединений. Это проявлялось как в увеличении числа и размеров этиопластов и формировании в них протилакоидов, так и в лучшем развитии мембранной системы эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи и генерируемых с участием последнего мультивезику-лярных тел для их последующей транспортировки к плазмалемме [Запрометов и др., 1994].
В присутствии кинетина происходило также почти 10-кратное возрастание активности локализованной в клеточных стенках и ответственной за образование лигнина ковалентносвязанной формы пероксидазы [Загоскина, Запрометов, 1983].
Сходные данные о влиянии 1-нафтилуксусной кислоты и кинетина на образование фенольных соединений были получены и в случае суспензионной культуры клеток чайного растения [Багратишвили и ДР-, 1980].
Освещение также способствует интенсификации образования фенольных соединений как в каллусных тканях [Корецкая, Запрометов, 1975], так и в суспензионной культуре клеток чайного растения
[Багратишвили, Запрометов, 1982]. Это является следствием активации под действием света ряда ферментов, принимающих участие в биосинтезе фенольных соединений, в частности, L-фенилаланин-аммиак-лиазы и 4-гидроксилазы транс-коричной кислоты [Hahlbrock, Grisebach, 1975]. Однако наиболее ярко различия между световыми и темновыми каллусными тканями чайного растения выступают при сравнении темновых (гетеротрофных) культур с выращиваемыми при освещении содержащими хлоропласты (фотомиксотрофными) каллусными тканями.
Так, изучение продуктов щелочного нитробензольного окисления препаратов лигнина, выделенных из гетеротрофных и фотомиксо-трофных каллусных тканей листового и стеблевого происхождения показало, что лигнин выращиваемых в темноте гетеротрофных тканей содержит заметные количества n-оксифенильных (п-оксибензаль-дегид + n-оксибензойная кислота) структур наряду с доминирующими сирингильными (сиреневый альдегид + сиреневая кислота) и особенно гваяцильными (ванилин + ванилиновая кислота). Мономерный же состав продуктов расщепления лигнина зеленых фотомиксотрофных тканей представлен исключительно гваяцильными и сирингильными структурами со значительным доминированием последних [Zaprometov et al., 1993] (табл. 2).
Эти данные означают, что лигнин фотомиксотрофных каллусных тканей по своему строению приближается к лигнину листьев и стеблей исходного чайного растения, а лигнин гетеротрофных тканей - к филогенетически более примитивному так называемому "травянистому" типу. Отсюда становится несомненным, что наличие в фотомиксотрофных тканях хлоропласгов оказывает весьма заметное влияние как на особенности строения, так и на само образование лигнина.
Таблица 2
Продукты питробензольного окисления препаратов лягнииа из гетеротрофных и фотомиксотрофных каллусных культур стеблевого и листового происхождения (в % от суммы)
Каллусная культура	Идентифицированный продукт					
	Ванилин	Ванилиновая кислота	Сиреневый альдегид	Сиреневая кислота	п-Оксибен-зойный альдегид	п-Оксибен-зойная кислота
			Гетеротрофная культура			
Листовая	57,4		10,5	6,8	25,3	
Стеблевая	55,5	17,7	10,2	-	5,8	10,8
			Фотомиксотрофиая культура			
Листовая	26,2	—	—	73,8	—	—
Стеблевая	10,5	-	-	89,5	-	-
Еще одно доказательство активного участия хлоропластов в образовании фенольных соединений было продемонстрировано при сравнительном изучении состава растворимых полифенолов, образующихся в гетеротрофных и в фотомиксотрофных каллусных тканях. Так, при длительном культивировании каллусных тканей на свету по мере формирования в них хлоропластов происходит не только увеличение более чем вдвое общего содержания растворимых фенольных соединений, но меняется и их качественный состав. В фотомиксотрофных тканях начинают синтезироваться характерные для листьев чайного растения флавонолы, представленные агликонами кемпферолом, и кверцетином, а также серией их гликозидов [Запрометов, Загоскина, 1987]. Эти данные служат еще одним убедительным свидетельством активного участия хлоропластов в образовании фенольных соединений.
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ОБРАЗОВАНИЯ И МЕТАБОЛИЗМА ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
За последние годы проблема внутриклеточной организации и регуляции метаболизма фенольных соединений в растениях стала привлекать к себе все большее внимание исследователей.
Детальное изучение ферментов шикиматного пути в ряде лабораторий США, Германии и Франции позволило установить, что хотя бы некоторые из этих ферментов имеют двойную локализацию - в виде различающихся друг от друга изозимов они содержатся в пластидах и цитозоле. При этом образование пластидных ферментов кодируется ядерными генами. Такие ферментные белки синтезируются в виде белков-предшественников на цитоплазматических 80S рибосомах и затем с помощью транспортных пептидов перемещаются в хлоропласт, где транспортный пептид отщепляется под действием специфической протеазы.
Было показано, например, что в случае синтазы 5-енолпиру-вилшикимат-3-фосфата в культивируемых клетках петунии (Petunia hybrida) фермент-предшественник с молекулярной массой 55 кДа быстро перемещается из цитозоля в хлоропласт, где он превращается в активный фермент с молекулярной массой 48 кДа [Della-Cioppa et al., 1986]. Сходная картина была установлена и для катализирующей фосфорилирование шикимовой кислоты шикиматкиназы в листьях томата [Schmid et al., 1992].
Известно, что и в пластидах, и в цитозоле генерируются необходимые для функционирования шикиматного пути исходные субстраты, т.е. фосфоенолпируват и эритрозо-4-фосфат. Как было показано Иен-ceHONj. и сотр. [Jensen et al., 1989], в обоих указанных компартментах содержится активность первого фермента шикиматного пути, а именно синтазы З-дезокси-О-арабиногептулозонат-7-фосфата, которая катализирует образование этого семиуглеродного фосфоршуированного сахара из упомянутых выше исходных субстратов.
З-Дезокси-О-арабиногептулозонат-7-фосфат далее превращается в первое циклическое соединение, представленное 3-дегидрохинной кислотой. Те же авторы установили, что и активность хоризматмутазы -фермента, катализирующего образование префеновой кислоты из хоризмовой кислоты - также имеет двойную локализацию (пластидную и цитозольную).
Помимо разной локализации, пластидный и цитозольный изозимы этих двух ферментов отличаются и по механизмам регуляции их активностей. Так, например, пластидный изозим синтазы З-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфата активируется под действием света и ионов Мп2+ и аллостерически регулируется одним из конечных продуктов пшкиматного пути, а именно L-арогеновой кислотой.
В свою очередь цитозольный изозим активируется ионами Со2+ и ингибируется кофейной кислотой. Активность пластидного изозима хоризматмутазы избирательно регулируется ароматическими аминокислотами (L-триптофан ее стимулирует, а L-фенилаланин и L-тирозин ингибируют). Активность же цитозольного изозима подавляется, как и в случае синтазы 3-дезокси-£>-абариногептулозонат-7-фосфата, кофейной кислотой.
На том основании, что активности пластидных изозимов синтазы З-дезокси-О-арабиногептулозонат-7-фосфата и хоризматмутазы регулируются гораздо более строго, чем активности цитозольных изозимов, было высказано предположение, что синтезируемые в пластидах ароматические аминокислоты используются преимущественно для синтеза белка и поэтому потребность в них ограничивается количественным соотношением таких аминокислот в синтезируемых белковых молекулах. В то же время расход L-фенилаланина на образование фенольных соединений, а также других веществ так называемого вторичного происхождения (например, содержащих ароматические ядра алкалоидов, полиаминов, некоторых глюкозинолатов и цианогенных гликозидов) может в десятки и даже сотни раз превышать его затраты на синтез белка. Отсюда потребность у растений в нескоординированном с синтезом белка образовании свободных ароматических аминокислот и прежде всего £-фенила-ланина для их последующего использования в биосинтезе фенольных соединений.
Казалось бы, что такая потребность могла бы удовлетворяться параллельным функционированием не столь строго регулируемого пшкиматного пути в цитозоле. Однако изложенные выше наши данные [Запрометов, Колонкова, 1967], подкрепленные данными Вайссенбока в Кельне [Weissenbock et al., 1971], Монтиса в Гриньоне [Monties, 1969], Саундерса и МакКлюра в Майами [Saunders, McClure, 1975] о присутствии фенольных соединений в хлоропластах, свидетельствуют о том, что одним из компартментов, где образуются фенольные соединения, могут быть пластиды (хлоропласты). Поэтому проблема пространственного разграничения пшкиматного пути для его
реализации в биосинтезе либо белка, либо фенольных соединений еще требует дальнейшего изучения.
Внутриклеточная организация биосинтеза фенилпропаноидов изучена менее детально, чем организация шикиматного пути. Первым ферментом этой последовательности является L-фенилаланинаммиак-лиаза, катализирующая превращение L-фенилаланина в шранс-корич-ную кислоту. L-Фенилаланинаммиак-лиаза привлекла внимание очень многих исследователей, поскольку этот фермент находится в точке ветвления биосинтетической последовательности. Именно в этой точке образующийся по шикиматному пути L-фенилаланин направляется либо на синтез белка, либо вовлекается в цепочку реакций, ведущих к образованию многочисленных фенольных соединений.
Активность L-фенилаланинаммиак-лиазы обычно стимулируется при освещении видимым и, особенно, УФ-светом [Camm, Towers, 1973]. При дифференциальном центрифугировании она, как правило, оказывается сосредоточенной в растворимой фракции гомогената. В то же время часть общей активности фермента была обнаружена в хлоропластах у целого ряда растений [Loffelhardt et al., 1973; Nishizawa et al., 1979; Weissenbock et al., 1976; Saunders, McClure, 1972], в том числе в хлоропластах молодых листьев чайного растения [Шипилова, Запрометов, 1979].
Внутриклеточная локализация L-фенилаланинаммиак-лиазы не ограничивается цитозолем и хлоропластами. В клетках эндосперма прорастающих семян клещевины значительная часть активности L-фенилаланинаммиак-лиазы была локализована в глиоксисомах [Ruis, Kindi, 1970], а в листьях шпината и подсолнечника - в пероксисомах [Ruis, Kindi, 1971]. Кроме того, часть активности L-фенилаланинаммиак-лиазы была найдена в микросомальной фракции в случае семя-доль огурца [Czichi, Kindi, 1977], культивируемых клеток сои [Postius, Kindi, 1978], молодых корешков дуба [Alibert et al., 1972], а также проростков гречихи и красной капусты [Hrazdina, Wagner, 1985].
По данным, полученным в нашей лаборатории, в этиолированных проростках ячменя на некоторых стадиях развития до 15-20% суммарной активности L-фенилаланинаммиак-лиазы обнаруживается в микросомальной фракции и локализуется в области гладкого эндоплазматического ретикулума [Запрометов и др., 1985].
Было высказано предположение, что L-фенилаланинаммиак-лиаза может входить в состав лабильного ферментного комплекса присоединенного к мембранной системе эндоплазматического ретикулума [Stafford, 1981]. В процессе выделения клеточных фракций такой комплекс разрушается, поэтому активность L-фенилаланинаммиак-лиазы обнаруживается как бы "размазанной" по клеточным структурам с доминированием в цитозоле [Hrazdina, Wagner, 1985].
Следующий фермент фенилпропаноидного пути - 4-гидроксилаза шранс-коричной кислоты. Это типичная цитохром Р-450-зависимая монооксигеназа, требующая для проявления активности присутствия
молекулярного кислорода и НАДФН2. Ее активность обычно сосредоточена в микросомальной фракции, поэтому фермент часто используется в качестве "маркера" для эндоплазматического ретикулума. В этиолированных проростках ячменя часть активности 4-гидро-ксилазы трянс-коричной кислоты был найдена в несодержащей цитохрома Р-450 фракции гладкого эндоплазматического ретикулума, что позволяет предположить либо возможнось гидроксилирования транс-коричной кислоты без участия цитохрома Р-450, либо существование несвязанного с мембраной эндоплазматического ретикулума цитохрома Р-450 [Запрометов, Ермакова, 1986].
Образовавшаяся в результате 4-гидроксилирования транс-корич-ной кислоты n-кумаровая (и-оксикоричная) кислота далее подвергается орто-гидроксилированию с образованием кофейной кислоты. Предполагается, что этот процесс осуществляется при участии фенол-оксидазы, которая является пластидным ферментом. Следует, правда, отметить, что участие фенолоксидазы в орто-гидроксилировании п-кумаровой кислоты in vivo до сих пор до конца не выяснено [Butt, 1985]. Несмотря на все успехи энзимологии фенольных соединений, это звено биосинтеза фенилпропаноидов до сих пор остается загадочным.
Кофейная кислота далее под действием кофеил-О-метилтранс-феразы (5-аденозил-£-метионин : кофейная кислота 3-0-метилтранс-фераза) превращается в феруловую (4-окси-З-метоксикоричную) кислоту. Завершают фенилпропаноидный путь биосинтеза фенольных соединений 5-гидроксилаза феруловой кислоты и О-метилтрансфераза 5-оксиферуловой кислоты, которая, по-видимому, идентична кофеил-О-метилтрансферазе [Запрометов, 1993]. В результате образуется еще один из предшественников лигнина, а именно синаповая (4-окси-3,5-диметоксикоричная) кислота. Кофеил-О-метилтрансфераза принадлежит к числу растворимых или цитозольных ферментов, а 5-гидроксилаза феруловой кислоты — к числу микросомальных.
Кроме того, как уже указывалось, все оксикоричные кислоты (включая транс-коричную кислоту) при участии КоА-лигазы могут образовывать эфиры с коферментом А, приобретая в результате этого значительно большую реакционную способность. Именно в виде КоА-эфиров они, как правило,вовлекаются в последующие превращения.
Внутриклеточная локализация ферментов флавоноидного звена биосинтеза расшифрована еще менее, да и сами ферменты в ряде случаев изучены далеко недостаточно. Это особенно относится к НАДФН2-зависимым редуктазам, принимающим участие в образовании наиболее восстановленных классов флавоноидов : флаван-3,4-диолов, флаван-3-олов (катехинов) и флаван-4-олов [Stafford, 1990].
Можно лишь отметить, чо к настоящему времени большинство известных нам ферментов флавоноидного звена считаются растворимыми (цитозольными). В то же время среди них имеются и микросомальные монооксигеназы (флавонсинтаза и флавоноид-3-
гидроксилаза), катализирующие некоторые стадии гидроксилирования [Запрометов, 1993].
В целом становится ясным, что в клетках растений, помимо цитозоля, имеется несколько компартментов образования фенольных соединений. Это прежде всего хлоропласты (или этиопласты) и эндоплазматический ретикулум. Образовавшиеся в этих компартмен-тах фенольные соединения покидают место своего синтеза и транспортируются в места накопления.
В случае эндоплазматического ретикулума они в составе генерируемых аппаратом Гольджи микровезикул или мультивезикулярных образований направляются либо в центральную вакуоль, либо к плазмалемме. В последнем случае они отдают свое содержимое в виде КоА-эфиров оксикоричных кислот (или возможно в виде оксикорич-ных спиртов) клеточной оболочке, где на целлюлозных фибриллах как на матрице при участии ковалентносвязанной пероксидазы происходит формирование лигнина.
Судя по данным, полученным при изучении образования флавоноидов в суспензионной культуре клеток петрушки (Petroselinum crispum), возможно существование двух лабильных мультиферментных комплексов, принимающих участие в образовании гликозидов флавонов и флавонолов. Первый комплекс состоит из ферментов фенил-пропаноидного звена (L-фенилаланинаммиак-лиаза, 4-гидроксилаза шракс-коричной кислоты и 4-кумарил-КоА-лигаза), а второй - из ферментов, участвующих в образовании флавоноидов (халконсинтаза, халконфлаванонизомераза и 7-0-глюкозилтрансфераза) [Hahlbrock, Grisebach, 1975]. Однако эти данные основываются лишь на различиях в скоростях индукции указанных ферментов под действием ультрафиолетового освещения. Реальное же существование таких лабильных комплексов, каким бы логичным оно не представлялось, еще предстоит подтвердить.
ФУНКЦИИ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАСТЕНИЯХ И ИХ РАЗНООБРАЗИЕ
ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫЕ ФУНКЦИИ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Какова же роль фенольных соединений в жизни растения? Исчерпывающе ответить на этот вопрос пока невозможно. Можно лишь утверждать, что функции фенольных соединений в растениях важны и многообразны. Последние десятилетия внесли много нового в эту проблему, хотя до полной ясности еще далеко.
В своем изложении автор для упрощения попытался разбить выясненные к настоящему времени жизненно важные функции фенольных соединений на две большие подгруппы. Деление это весьма условно, и оно используется главным образом для упрощения изложения.
Кроме того, автором отобраны лишь главные функции фенольных соединений и полностью опущено изложение экологических аспектов проблемы, хотя последние, несомненно, имеют весьма важное значение. Опущены также все данные о влиянии тех или иных фенольных соединений на рост проростков, на растяжение колеоптилей злаков и на им подобные эксперименты, поскольку уже давно стало ясно, что полученные в таких опытах in vitro данные, как правило, не соответствуют реальной стуации in vivo.
Было также выяснено, что данные Г. Шильдкнехта и сотр. [Angew. Chem. Int. Ed. 1983. Vol. 22. P. 695] об участии фенольных соединений в настических движениях растений не нашли подтверждения в последующих исследованиях.
К первой подгруппе я отношу функции повсеместно распространенных фенольных соединений без узкой специфичности действия.
Лигнин как один из важнейших растительных полимеров
Лигнин (или точнее лигнины, поскольку теперь установлено, что несмотря на сходство строения лигнин даже одного и того же растения несколько различается в зависимости от органов или тканей) образуется в результате происходящей под действием пероксидазы неупорядоченной полимеризации оксикоричных спиртов: л-кумарового, кониферилового(продукт восстановления феруловой кислоты) и синапового. Лигнин является обязательным компонентом всех высших сосудистых растений, начиная с папоротникообразных [Gross, 1979; Lewis, Yamamoto, 1990]. В эволюционном аспекте со способностью синтезировать лигнин связано возникновение и широкое развитие наземной растительности.
Лигнин является важнейшим элементом опорных тканей. Без него было бы невозможным существование древесных растений, у которых его содержание достигает 20-35% от сухой массы. Склонность некоторых культивируемых сортов злаковых растений к полеганию под действием ветра в значительной мере определяется недостаточным содержанием в их стеблях лигнина.
Локализация лигнина не ограничивается трахеидами и сосудистыми элементами. Лигнин наряду с целлюлозой и гемицеллюлозами является компонентом вторичной клеточной стенки и межклеточной пластинки. При этом лигнин хвойных растений образуется главным образом на основе кониферилового спирта с некоторой долей п-кумарового спирта, в лигнине же двудольных растений доминируют синапоильные составляющие.
Как показали проводившиеся в нашей лаборатории исследования, культивируемые ткани чайного растения сохраняют почти неослабевающую способность к образованию лигнина на протяжении более 20 лет [Стрекова и др., 1980], несмотря на отсутствие в этом случае сосудистой системы. Подобные же данные были получены для культур клеток табака [Bergmann, 1964], моркови [Sugano et al., 1975], сои
сно
Типичный фрагмент молекулы лигнина
[Farmer, 1985] и ряда других клеточных и тканевых культур. Это косвенно также свидетельствует о важном значении лигнина как непременного компонента жизни высших растений.
Феруловая и и-кумаровая кислоты как компоненты полисахаридных комплексов и суберина, а также участники механизма трансдукции энергии света
Являющиеся предшественниками лигнина оксикоричные кислоты, в частности феруловая и и-оксикоричная (и-кумаровая), сами по себе также несут важные биологические функции. В первичной клеточной стенке они связываются сложноэфирными связями с концевыми группами гемицеллюлозных арабиноксилановых цепочек. Под воздействием присутствующей в клеточной стенке пероксидазы такие эфирносвязанные молекулы феруловой кислоты окисляются с образованием диферулоильных структур.
В результате образовавшийся диферулоильный мостик связывает друг с другом гемицеллюлозные цепочки.
Диферулоильный мостик, соединяющий гемицеллюлозные цепочки
Благодаря этому значительно меняется гелеобразующая способность гемицеллюлозы, уточняются механические свойства клеточной стенки. По некоторым данным [Kamisaka et al., 1990], диферуловая кислота имеет для механической прочности клеточной стенки едва ли не большее значение, чем лигнин.
Помимо связывания друг с другом арабиноксилановых цепочек, оксикоричные кислоты (и прежде всего феруловая кислота) способны принимать участие и в поперечном связывании гемицеллюлозных молекул с лигнином. Так, например, было показано, что во время лигнификации клеточных стенок кукурузы происходит интенсивное образование поперечных связей между арабиноксиланами и лигнином за счет формирования диферулоильных соединительных структур (мостиков) [Grabber et al., 1995].
Кроме этого, оксикоричные кислоты наряду с полиоксижирными кислотами, такими как бегеновая, лигноцериновая и докозановая, в виде комплекса с последними входят в состав основного компонента
покровных тканей растений - суберина [Kolattukudy, 1984]. При механических повреждениях коры происходит быстрое новообразование раневой перидермы, состоящей главным образом из суберина, что может быть наглядно продемонстрировано на примере срезов клубней картофеля, где новообразование суберинового слоя происходит особенно быстро и наглядно. Весьма важную роль в создании суберинового слоя играет опять-таки феруловая кислота.
И еще одно - способность оксикоричных кислот и их углеводных эфиров к цис-транс-изомеризации также вносит свой вклад в биологическую активность фенольных соединений. При освещении трансформы оксикоричных кислот преобразуются в более богатые энергией цис-формы. В результате при спонтанном обратном темновом переходе в транс-форму происходит преобразование поглощенной энергии, которая может быть использована, например, для создания тур-горного давления, для поступления воды или на иные физиологические процессы [Towers, Abeysekera, 1984].
Роль фенольных соединений в защите фотосинтетического и генетического аппарата против действия коротковолнового УФ-излучения
На примере культивируемых клеток розы (Rosa damascena) было показано, что если клетки облучать летальной дозой УФ-света (254 нм) и затем провести отбор на устойчивость к такому облучению, постепенно увеличивая дозу, то выживать будут только те клетки, которые способны синтезировать в ответ на облучение повышенные количества фенольных соединений, в частности флавоноидов. В результате последовательного отбора оказалось, что устойчивые к облучению УФ-светом клетки способны накапливать примерно в 15 раз больше флавоноидов по сравнению с исходными и образовывать примерно удвоенное количество ДНК [Murphy et al., 1979].
Кроме того, на примере растений ослинника (Oenothera stricta) удалось установить, что содержащие флавоноиды клетки эпидермиса листьев обладают высокой избирательной способностью поглощать УФ-излучение в интервале 280-320 нм (УФ-В область). Пропуская 70-80% видимого света, они адсорбируют 95% УФ-света [Robberecht, Caldwell, 1983].
В случае проростков гороха и конских бобов также было найдено, что содержащие флавонолгликозиды клетки эпидермиса защищают фотосинтезирующий аппарат клеток мезофилла от УФ-лучей [Shimazaki et al., 1988], а мутанты Arabidopsis thaliana с блокировкой биосинтеза флавоноидов в листьях оказались более чувствительны к повреждающему действию УФ-В радиации, чем нормальные растения [Li et al., 1993].
УФ-излучение оказывает повреждающее действие не только на фотосинтезирующий аппарат, где его основной мишенью служит белок фотосистемы П, но и на ДНК [Melis et al., 1992]. В последнем
случае под действием УФ-света происходит образование циклобутановых пиримидиновых димеров.
На примере двух генетически различных линий кукурузы было установлено, что растения, содержащие в тканях обвертки антоцианы, по сравнению с мутантными, не содержащими антоцианов, растениями в значительно большей мере защищены от повреждающего ДНК действия УФ-света [Stapleton, Walbot, 1994]. Еще ранее защитные функции некоторых фенольных соединений (ванилина, галловой кислоты и л«-дигалловой кислоты) по отношению к повреждающему действию УФ-света на генетический аппарат были продемонстрированы на примере культивируемых клеток китайского хомячка, судя по критерию их антимутагенной активности [Sasaki et al., 1988].
Фенольные соединения как сигнальные вещества во взаимоотношениях растения - микроорганизмы
За последние годы стало очевидно, что фенольные соединения относительно простого строения играют роль своего рода сигнальных веществ во взаимоотношениях растений с микроорганизмами. Растение-хозяин синтезирует эти сигнальные вещества, а микроорганизмы откликаются на них экспрессией генов, необходимых для последующих стадий взаимодействия с растением.
Наиболее подробно взаимодействие растений с микробами было изучено в двух случаях: на примере грамотрицательной почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, вызывающей у двудольных растений образование корончатых галлов, а также на примере бактерий рода Rhizobium, которые принимают участие в азотфиксирующем симбиозе растений семейства бобовых.
В случае A.tumefaciens этот микробный патоген реагирует на содержащиеся в поврежденных тканях растения специфические фенольные соединения передачей части своей генетической информации в геном растения-хозяина в виде индуцирующей опухолевый рост плазмиды. В результате этого происходит включение генов, которые кодируют образование ферментов, участвующих в биосинтезе ауксинов и цитокининов [Spencer, Towers, 1988,1989].
В тканях растений табака такими специфическими фенольными соединениями оказались ацетосирингон и а-оксиацетосирингон [Lynn, Chang, 1990]. По обобщенным данным Спенсера и Тауэрса, индуцирующие локус вирулентности у Agrobacterium фенольные соединения могут быть разбиты на 4 подгруппы: 1) ацетофеноны (т.е. ацетосирингон и а-оксиацетосирингон); 2) монолигнолы (оксикоричные спирты - конифериловый и синаповый); 3) оксикоричные кислоты (феруловая и синаповая); 4) халконы (2',4',4-триокси-З-метоксихалкон и 2',4',4-триокси-3,5-диметоксихалкон) [Spencer, Towers, 1989]. Все эти соединения содержат ферулоильное или синапоильное ядро и почти все они повсеместно распространены среди сосудистых растений.
При испытании 50 потенциально возможных сигнальных для Agrobacterium соединений фенольной природы на активацию ими экс-
а-Оксиацетосирингон
Ацетосирингон
Ацетофеноны - сигнальные вещества для A. tumefaciens 7 - ацетосирингон; 2 - а-оксиацетосирингон
прессии генов вирулентности оказалось, что наиболее эффективными индукторами вирулентности являются конифериловый спирт, гваякол, гомованилиновая и феруловая кислоты, а также 3,4-диметокси-4-окси-бензол, т.е. опять-таки полифенолы, которые содержат ферулоильное (синоним гваяцильное) или синапоильное ядро [Melchers et al., 1989]. Появляются также первые данные о сигнальной активности некоторых флавоноидов. Так, в качестве потенциального индуктора вирулентности у виноградной лозы был идентифицирован галлированный катехин, а именно (- )-эпикатехингаллат [Spencer, Towers, 1989].
Несмотря на сходство в строении большинства описанных выше сигнальных молекул фенольной природы, у растений различных семейств они, по-видимому, все же различны. Так, ацетофеноны (Сб-С2-полифенолы) характерны для представителей семейства пасленовых: Nicotiana, Solanum, Atropa, Scopolia и др. У растений иных семейств в качестве сигнальных соединений выступают Q-C] и С6-С3-поли-фенолы, т.е. производные оксибензойных и оксикоричных кислот [Spencer, Towers, 1991]. У хвойного растения Pseudotsuga menziesii в качестве индуктора был идентифицирован глюкозид кониферилового спирта - кониферин [Morris, Morris, 1990].
Второй пример взаимодействия растений с микробами - это бактерии рода Rhizobium, которые участвуют в азотфиксирующем симбиозе растений семейства бобовых (Leguminosae). Эти бактерии обладают крупными плазмидами, содержащими гены, необходимые для симбиоза. Среди них nod-гены ответственны за ранние события в формировании клубеньков на корнях растения-хозяина [Lynn, Chang, 1990]. При изучении химической природы сигнальных веществ или индукторов nod-генов, которые выделяются корнями растения-хозяина, было установлено, что они представлены флавоноидами.
Так, в случае пары Medicago sativa (nioHepHa)-Rhizobium meliloti индукторы были идентифицированы как флавоны лютеолин, З'-мето-ксилютеолин (хризоэриол), 4',7-диоксифлавон, а также 4,4'-диокси-2'-метоксихалкон [Maxwell et al., 1989; Hartwig et al., 1990]. Последний проявлял свою активность в столь малой концентрации, как 2 нМ. Позднее было обнаружено, что активаторами комплекса nod-генов у люцерны являются также изофлавоноиды, в частности формононетин-7-0-глюкозид-6"-0-малонат [Tiller et al„ 1994].
Сигнальные вещества для Rhizobium
1 - лютеолин; 2 - генистеин
Для пары Glycine max (соя) - Bradyrhizobium japonicum индукторами nod-генов служили изофлавоны 4',7-диоксиизофлавон (даидзеин) и 4',5,7-триоксиизофлавон (генистеин) [Cho, Harper, 1991], а для пары Trifolium pratense (клевер) - Rhizobium trifoli одним из индукторов оказался 4',7-диоксифлавон. В случае пар Pisum sativum (горох) - Rh. legumunosarum и Vicia sativa (вика посевная) - Rh. leguminosarum наилучшими индукторами были флаваноны эриодиктиол и гесперетин [Peters, Long, 1988]. Содержащиеся в корневых выделениях проростков Phaseolus vulgaris индукторы вирулентности nod-генов Rh. leguminosarum biovar phaseoli были идентифицированы как флаваноны нарингенин и эриодиктиол, а также изофлавоновый глюкозид генистин (7-0-глюкозид генистеина) [Hungria et al., 1991а]. При этом наибольшей активностью обладали нарингенин и генистин.
Любопытно отметить, что индукторы вирулентности, выделяемые не корнями, а прорастающими семенами Ph. vulgaris, имеют иную природу - это гликозиды антоцианидинов петунидина, дельфинидина и мальвидина и флавонолов кемпферола, кверцетина и мирицетина [Hungria et al., 19916].
Более детально значение фенольных соединений как индукторов (сигнальных веществ) во взаимоотношениях растений и микроорганизмов рассматривается, например, в обзоре Филлипса [Phillips, 1992].
Фенольные соединения как запасные или резервные вещества в метаболизме растений
Еще сравнительно недавно в науке господствовало представление о том, что растения способны лишь синтезировать содержащие бензольные ядра фенольные соединения, а расщепление последних в природе является прерогативой микроорганизмов и в весьма незначительной степени животных.
Первое экспериментальное доказательство того, что растения обладают способностью не только к синтезу фенольных соединений, но и к их глубокому расщеплению было получено в нашей лаборатории в 1959 г., когда при введении в молодые побеги чайного растения
равномерно меченных 14С катехинов было установлено, что при выдерживании таких побегов в темновых условиях через 60-70 ч до 70-80% введенной радиоактивности могло быть обнаружено в составе углекислоты дыхания [Запрометов, 1959]. При этом эффективность расщепления не зависела от того, вводились ли катехины при помощи вакуум-инфильтрации или засасыванием с транспирационным током.
Оказалось также, что за первые 30-35 ч экспозиции выделения меченой углекислоты почти не происходит, потому что в это время в качестве субстрата дыхания почти полностью используются содержащиеся в клетках моносахара (глюкоза и фруктоза) и примерно 50% внутриклеточной сахарозы [Запрометов, 1964; Zaprometov, 1977].
Эксперименты с фотосинтетическим введением метки позволили вычислить период полураспада основных компонентов фенольного комплекса молодых побегов чайного растения. Он оказался равным примерно 50 ч для простых катехинов (эпикатехина и эпигалло-катехина) и примерно 70 ч для их галлоильных эфиров (эпикатехин-галлата и эпигаллокатехингаллата) [Запрометов, Бухлаева, 1967].
Эти данные не означают, что фенольные соединения (в данном случае катехины) заменяют сахара в качестве основных субстратов дыхания. В нормальных условиях главная масса катехинов вовлекается в образование олигомерных и полимерных форм типа дубильных веществ, участвует в сополимеризации с лигнином, а также подвергается глубокому расщеплению с образованием продуктов первичного метаболизма, среди которых доминируют органические кислоты [Запрометов, Бухлаева, 1967; Zaprometov, 1977; Запрометов, 1985].
Позднее в Институте биохимии растений АН Грузии было показано, что проростки кукурузы и виноградной лозы подвергают интенсивному катаболизму введенный в них меченный 14С флавонол кверецетин [Дурмишидзе, Шалашвили, 1968], а в культуре ткани дикого винограда (Partenocisus tricuspidata) происходит быстрое расщепление меченного 14С цианидина [Дурмишидзе и др., 1974].
Теми же авторами далее на основании кинетического анализа было установлено, что в растениях виноградной лозы фенольные соединения активно вовлекаются в катаболические превращения, причем период полураспада (+)-катехина составляет примерно 55 ч, а кофейной кислоты — лишь 15 ч [Дурмишидзе и др., 1984].
В исследованиях, проведенных нами совместно с Центральным Сибирским ботаническим садом (В.Г. Минаева, Т.А. Жанаева), на примере бесклеточных экстрактов растений володушки (Bupleurum multinerve) было показано, что такие бесклеточные экстракты с большой скоростью окисляют характерные для этого растения (эндогенные) флавонолгликозиды рутин и изорамнетин-3-глюкозид. При этом сначала происходит отщепление сахарных фрагментов, а несколько позднее в реакционной смеси появляются продукты расщепления флавоноидных агликонов (кверцетина и изорамнетина) в виде протокате-ховой и ванилиновой кислот (из кольца Р агликонов), а также флороглюцинкарбоновой кислоты (из кольца А агликонов) [Жанаева
и др., 1977]. В дальнейшем оксибензойные кислоты, в частности флороглюцинкарбоновая кислота, подвергаются глубокому окислению с разрушением самого ароматического ядра [Zaprometov, 1977; Жанаева и др., 1978].
Расщепление кверцетина бесклеточными препаратами из листьев володушки (Bupleunim)
Образование оксибензойных кислот при окислении нескольких классов флавоноидов с частичным разрушением ароматических структур в культурах клеток и тканей ряда растений было подтверждено также в серии работ В. Барца и сотр. в Мюнстере [Barz, Hosel, 1979]. Разрушение бензольного ядра меченного 14С пирокатехина с образованием меченой углекислоты было продемонстрировано и в исследованиях Прасада и Эллиса в Канаде [Prasad, Ellis, 1978].
Таким образом доказано, что растения способны не только синтезировать фенольные соединения, но и подвергать их глубокому катаболизму с образованием продуктов первичного обмена веществ вплоть до углекислоты. Этот процесс, по-видимому, имеет особенно важное значение для растений, образующих значительные количества фенольных соединений. Число же таких растений достаточно велико.
В случае чайного растения нам удалось выяснить, что из образующихся в результате фотосинтеза меченых катехинов в условиях нормального чередования дня и ночи до 50% этих основных для чайного растения фенольных соединений может подвергаться глубокому окислительному расщеплению с частичным использованием продуктов расщепления в качестве дыхательных субстратов [Запрометов, Бухлаева, 1967; Запрометов, 1974].
Ко второй подгруппе жизненно важных для растений фенольных соединений и я условно отношу те из них, которые в основном обладают специфическим строением и/или специфическими функциями.
БОЛЕЕ УЗКО СПЕЦИФИЧНЫЕ ФУНКЦИИ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Фенольные соединения как защитные агенты в патогенезе растений
Проблема иммунитета растений достаточно сложна и многопла-нова. Я остановлюсь лишь на ее фенольном аспекте и то неполностью.
Во многих исследованиях было установлено, что при поражении растений теми или иными патогенами практически во всех случаях происходит интенсивная вспышка новообразования фенольных соединений, которая сопровождается индукцией активности соответствующих ферментов, таких, например, как L-фенилаланинаммиак-лиаза, 4-гидроксилаза транс-коричной кислоты и халконсинтаза.
Помимо увеличения общего содержания характерных для данного растения растворимых фенольных соединений, в качестве ответной реакции для защиты от дальнейшего проникновения патогена часто происходит образование так называемого раневого лигнина в клетках и тканях, примыкающих к месту проникновения инфекции. В случае патогенов грибной природы такой "раневой лигнин" выполняет целый ряд функций, таких, например, как увеличение сопротивляемости клеточных стенок растения механическому проникновению гриба, защита против атаки продуцируемых грибом гидролитических ферментов, инактивация ферментов гриба предшественниками "раневого лигнина", вывод из строя гиф гриба при помощи их лигнификации [Rhodes, 1985]. Это еще одно свидетельство важных функций лигнина в растениях.
Защитные функции "раневого лигнина" более всего изучены на примере травянистых растений, в частности, злаков. Так, например, из 22 испытанных грибных патогенов 20 индуцировали лигнификацию в листьях пшеницы [Pearce, Ride, 1980]. При этом бактерии и дрожжи подобной реакции у растений не вызывали.
Было также установлено, что с быстрым новообразованием в ответ на инфекцию "раневого лигнина" связана устойчивость некоторых сортов пшеницы к заболеванию стеблевой ржавчиной [Moerschbacher, 1988].
Однако наиболее ярким примером важной роли фенольных соединений в иммунитете растений могут служить фитоалексины. Фитоалексины представляют собой специфические защитные агенты, которые образуются в тканях растений как результат ответной реакции на контакт с патогеном (обычно грибной природы). Для патогена они токсичны. В здоровых тканях фитоалексины, как правило, либо вообще отсутствуют, либо содержатся в ничтожно малых количествах.
Следует отметить, что фитоалексины представлены не только фенольными соединениями, но также терпеноидами, индольными и ацетилиновыми производными. Однако среди известных к настоящему
времени фитоалексинов свыше 80% приходится именно на долю фенольных соединений.
Наиболее детально фитоалексины изучены у бобовых растений, где они представлены разнообразными изофлавоноидами. Таковы, например, изофлавоны формононетин, генистеин и кайянин у голубиного горошка (Cajanus cajan) и более сложные изофлавоноидные производные, такие, как пизатин у гороха, фазеоллин у фасоли, глицеоллины I-Ш у сои, медикарпин у клевера [Friend, 1985].
У растений рода лядвенец (Lotus comiculatus, L.edulis, L.an-gustissimus) фитоалексины представляют собой производные изофлавана, а именно веститол (7,2-диокси-4'-метоксиизофлаван), сативан (7-окси-2',4-диметоксиизофлаван) и лотизофлаван (5,7-диметокси-2',4-диоксиизофлаван [Ingham, Dewick, 1980].
Некоторые фитоалексины фенольной природы (изофлавоноиды)
1 - сативан; 2 - кайаиин; 3 - пнзатин; 4 - медикарпин
Среди собственно флавоноидных фитоалексинов можно упомянуть незамещенные в гетероцикле оксифлаваны, образующиеся при инфицировании в луковицах нарцисса (Narcissus pseudonarcissus), а именно 7-оксифлаван, 7,4-диоксифлаван и 7,4-диокси-8-метилфлаван [Сохоп et al., 1980], а также фитоалексины сорго (Sorghum bicolor), представленные 3-дезоксиантоцианидинами апигенидином и лютеолини-дином [Nicholson et al., 1987]. Было показано, что 3-дезоксианто-цианидины образуются в эпидермальных клетках листьев растения-хозяина при контакте с патогеном Colletotrichum graminicola, причем внутриклеточными центрами их синтеза и накопления служат специфические цитоплазматические сферические тельца, передвигающиеся по направлению к точкам присоединения апрессория гриба [Snyder, Nicholson, 1990].
У некоторых растений, принадлежащих к различным семействам, в ответ на грибную инфекцию образуются фитоалексины стильбеновой природы. Так у виноградной лозы фитоалексины представлены мономерным шранс-резвератролом (4,3',5-триоксистильбеном) и его олиго-
мерами е-виниферином и а-виниферином [Langcake, Pryce, 1977], а у сахарного тростника - 3,5,3'4-тетраоксистильбеном (пицеатаннолом) [Brinker, Seigler, 1991].
У растений диоскореи (Dioscorea alata) фитоалексины имеют дигидростильбеновую природу - это 3,5,4-триоксидигидростильбен (дигидрорезвератрол) и 3,5,2-триоксидигидростильбен (деметилбатата-зин IV) [Adesanya et al., 1989].
Примеры других фитоалексинов фенольной природы
1 - 7,4'-диоксифлаван; 2 - апигенидин; 3 - реэвератрол; 4 - айяпин (6,7-метилендн-оксикумарин)
Известны также фитоалексины кумариновой, ауроновой, фенантреновой, дифенильной и антрахиноновой природы [Запрометов, 19936; Harbome, 1994].
Фенольные соединения как компоненты электротранспортных цепей митохондрий и хлоропластов
Электротранспортные цепи как митохондрий, так и хлоропластов в качестве обязательных компонентов содержат специфические производные гидрохинона (или его хинонной формы, т.е. n-бензохинона) с изопреноидной боковой цепочкой.
Было выяснено, что убихиноны митохондрий, выделенных из клубней картофеля и батата (Ipomoea batatas), а также из суспензионной культуры клеток Petunia hybrida, на 60% находятся в восстановленной форме [Wagner A., Wagner М., 1995].
В митохондриях растений - это убихинон-9 и убихинон-10, содержащие соответственно 9 и 10 изопреновых фрагментов.
В хлоропластах же в цепь переноса водорода от воды к акцептору водорода (пиридиннуклеотиду) встроены близкие по строению к уби-
хинонам пластохиноны. Наиболее распространен из них пластохинон-45, боковая цепь которого составлена из девяти изопреновых фрагментов. В нормально функционирующих зеленых тканях пластохинон-45 на 50-70% присутствует в восстановленной форме (т.е. в виде соответствующего гидрохинона).
Пластохинон-45
Было показано, что пластохиноны принимают участие как в циклическом, так и в нециклическом фотофосфорилировании. Удаление пластохинонов из хлоропластов при помощи экстракции органическими растворителями приводит к нарушению способности хлоропластов осуществлять фотолиз воды и фотофосфорилирование. При добавлении экзогенных пластохинонов эта способность восстанавливается.
Помимо убихинонов и пластохинонов, к так называемым жизненно важным липидным кофакторам фенольной природы относятся а-токоферол (витамин Е) и фитилнафтохинон (витамин К]). а-Токо-ферол, в частности, защищает мембраны тилакоидов хлоропластов от фотоокисления, участвуя в удалении активированного кислорода и свободных радикалов [Fiyer, 1992].
Кроме встроенных в липидный матрикс пластохинонов, на процесс фотофосфорилирования в модельных опытах оказывают влияние некоторые флавоноиды. Так, например, флоридзин ингибировал фотофосфорилирование у хлоропластов шпината [Izawa et al., 1966], а хлорогеновая кислота, (+)-катехин и кверцетин стимулировали этот процесс [Krogmann, Stiller, 1962].
Необходимо отметить, что если предшественником убихинонов служит образующаяся при катаболическом распаде L-тирозина гомо-гентизиновая (2,5-диоксифенилуксусная) кислота и это единственно возможный путь ее образования, то предшественником пластохинонов является и-оксибензойная кислота. Последняя также образуется единственно возможным путем, а именно в результате 0-окисления л-окси-коричной кислоты. Это еще одно свидетельство жизненно необходимого функционирования фенилпропаноидного звена биосинтеза у растений.
Особая роль салициловой кислоты в растениях
За последние годы начинает выясняться специфическая роль салициловой кислоты в метаболизме растений. В конце 1980-х годов было обнаружено, что у нескольких видов ароидных, в частности у лилии вуду (Sauromatum guttatum), при распускании цветков их внутренняя
температура на короткое время повышается на 22° выше температуры окружающей среды. Это приводит к увеличению летучести экскретируемых в глубине цветков аминов ароматического ряда, которые имеют весьма неприятный запах. Такой специфический запах тем не менее привлекает насекомых-опылителей ароидных растений. При ближайшем изучении ответственной за такой значительный скачок температуры оказалась салициловая (2-оксибензойная) кислота. Ее образование находится под строгим фотопериодическим контролем и зависит от стадии развития растения. Термогенное действие салициловой кислоты высокоспецифично и лишь частично имитируется ацетилсалициловой кислотой (аспирином) [Raskin et al., 1989].
Перед началом распускания цветка S.guttatum содержание в нем салициловой кислоты возрастает в 50 раз. Было выяснено, что столь эффективное термогенное действие салициловой кислоты объясняется
тем, что она вызывает мощную вспышку цианидрезистентного дыхания, разобщая тем самым процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях [Diamond, 1989].
В дальнейшем было установлено, что салициловая ffYI кислота оказывает влияние на такие важнейшие процес-сы, как цветение, инициация образования адвентивных | 0Н корней, образование вегетативных почек, устьичные дви-СООН жения и устойчивость растений к поражению патогенами. Салициловая Кроме того, на примере клеток Pyrus communis было кислота показано, что салициловая кислота ингибирует образование этилена из 1-аминоциклопропанкарбоновой кислоты [Leslie, Romani, 1988] и, вероятно, поэтому она продлевает жизнь срезанных цветков [Raskin, 1992].
Из всего перечисленного выше наиболее широкое внимание за последние несколько лет привлекла к себе роль салициловой кислоты в качестве сигнального вещества при патогенезах. Известно, что растения откликаются на атаку патогенов как запрограммированной гибелью прилегающих участков ткани в попытке создать барьер для проникновения инфекции, так и активизацией защитных механизмов в неинфицированных частях растения. В первом случае отклик именуется "реакцией сверхчувствительности" (HR в английской литературе), во втором - так называемой системной приобретенной устойчивостью (SAR в английской литературе).
На растениях табака, устойчивых к вирусу табачной мозаики (ВТМ) и чувствительных к ВТМ, было показано, что устойчивые растения в ответ на заражение ВТМ синтезируют серию имеющих отношение к устойчивости белков (PR-белки), что сопровождается индукцией экспрессии соответствующих PR-генов. Было найдено, что лишь устойчивые растения в ответ на заражение вирусом образуют в листьях большие количества салициловой кислоты [Malamy et al., 1990]. При этом салициловая кислота накапливается не только в местах, прилегающих к месту проникновения инфекции, но и в удаленных от места проникновения патогена листьях. Параллельно с этим
происходит также и индукция PR-генов. На том основании, что обработка растений экзогенной салициловой кислотой индуцирует и PR-гены, и устойчивость, было высказано предположение, что салициловая кислота действует в качестве сигнального вещества.
Позднее также на растениях табака было показано, что образование салициловой кислоты происходит не только при заражении ВТМ, но и при обработке растений озоном или при облучении УФ-С светом (Хцаис 254 нм). При этом наблюдается и накопление PR-белков. В то же время механическое повреждение или резкое охлаждение не оказывают такого действия [Yalpani et al., 1994].
Примерно такой же вывод был сделан на основании изучения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии эндогенного содержания салициловой кислоты во флоэмном экссудате черешков листьев огурца, инокулированных либо вирусом некроза табака, либо патогенным грибом Colletotrichum lagenarium [Metraux et al., 1990].
Несколько позднее на основании данных, полученных при инокуляции листьев огурца бактерией Pseudomonas syringae pv syringae, была высказана гипотеза о том, что салициловая кислота представляет собой не первичный системный сигнал индуцированной устойчивости, а ее индуктор [Rasmussen et al., 1991].
Авторы еще одной публикации [Vemooij et al., 1994] считают, что сигнал, индуцирующий экспрессию генов системной приобретенной устойчивости (SAR), сам по себе не является салициловой кислотой, но такой сигнал требует присутствия салициловой кислоты в удаленных от места инфекции тканях. Иными словами, предполагается, что салициловая кислота играет важную роль в трансдукции сигнала, который запускает SAR. Подтверждением этому, по мнению авторов, служит то, что при введении в растения гена гидроксилазы салициловой кислоты (т.е. гена, кодирующего образование фермента, окисляющего салициловую кислоту) способность к проявлению SAR у таких трансгенных растений пропадает.
Из листьев табака удалось выделить специфический связывающий салициловую кислоту и обладающий каталазной активностью белок с молекулярной массой 240-280 кДа [Kleissig, Malamy, 1994], что согласуется с выявленной ранее способностью салициловой кислоты связывать и ингибировать активность каталазы. Последнее также указывает на возможную сигнальную функцию салициловой кислоты в развитии системной приобретенной устойчивости (SAR).
Продолжающаяся дискуссия о том, является ли салициловая кислота сигналом или индуктором в патогенезе не ставит под сомнение главного, а именно значения салициловой кислоты как важного слагаемого системной приобретенной устойчивости растений.
В заключение следует упомянуть, что салициловая кислота образуется в растениях из бензойной кислоты. Процесс этот катализируется 2-гидроксйлазой бензойной кислоты - цитохром Р-450-зависимой растворимой Монооксигеназой [Leon et al., 1994]. В свою очередь, бен
зойная кислота образуется при |3-окислении трпнс-корйчной кислоты, и этот факт еще раз указывает на жизненно важную необходимость функционирования фенилпропаноидного звена биосинтеза у высших растений.
Фенольные соединения как разобщители окислительного фосфорилирования
В экспериментах с изолированными митохондриями было продемонстрировано, что некоторые фенольные соединения способны служить разобщителями окислительного фосфорилирования. Это было показано на примере ряда флавонолов, флавонов и дигидрохалкона флоридзина для митохондрий, выделенных из растений огурца, гороха и кукурузы [Stenlid, 1968, 1970]. Однако (+)-катехин и такие фенолкарбоновые кислоты, как n-кумаровая, кофейная и хлорогеновая, этой активностью не обладали. Позднее разобщающее окислительное фосфорилирование действие было подтверждено на митохондриях, выделенных из клубней картофеля и проростков маша, для-серии халконов, дигидрохалконов, а также для флавонола кемпферола [Ravanel et al., 19826].
Наиболее же мощным разобщителем окислительного фосфорилирования оказался пренилированный флавонол платанетин (5,7,8-триокси-6-пренилфлавонол), выделенный из смолистых выделений почек платана {Ravanel et al., 1986]. В концентрации 2 мкМ платанетин полностью подавлял образование АТФ митохондриями из клубней картофеля и проростков маша. По своей разобщающей окислительное фосфорилирование активности платанетин превосходит такие классические синтетические разобщители, как 2,4-динитрофенол и пентахлорфенол.
Из приведенных примеров следует, что способность многих фенольных соединений разобщать окислительное фосфорилирование в условиях in vitro можно считать доказанной. Остается убедиться в том, что таким же образом они (как и в случае салициловой кислоты у ароидных) действуют и in vivo. Однако доказать это уже гораздо труднее. Ведь ткани и клетки большинства растений богаты разнообразными фенольными соединениями. Поэтому прежде всего необходимо выяс-
Платанетин
(3 Д ,7,8-тетраокси-6-пренил-флавонол)
нить, какие из них и в каком количестве контактируют в клетке с митохондриями и способны проникать в них. Без детального же знакомства с внутриклеточной организацией биосинтеза фенольных соединений ответить на этот вопрос невозможно. Можно лишь по аналогии с животным организмом, где нативным разобщителем окислительного фосфорилирования служит специфическое иодированное
вещество фенольной природы, а именно гормон тироксин, с достаточной степенью убедительности предположить, что хотя бы некоторые фенольные соединения выполняют аналогичные функции у растений.
Участие фенольных соединений в процессе опыления
Еще в 1960-х годах на примере двух видов растений володушки (Bupleurum) В.Г. Минаевой [Минаева, Горбалева, 1967; Минаева, 1978] было обнаружено, что характерные для этого растения флаво-нолгликозиды рутин и изорамнетин-3-глюкозид стимулируют прорастание пыльцы и рост пыльцевой трубкй.
В последнее время эти данные получили свое подтверждение и развитие. В частности, было показано, что в пыльниках цветков табака образуются флавонолы кемпферол и кверцетин, которые стимулируют развитие пыльцы и рост пыльцевой трубки [Ylstra et al., 1992]. Активен также мирицетин, но не ряд других флавоноидов. Авторы высказали предположение, что флавонолы участвуют в процессе опыления в качестве сигнальных молекул.
Почти в то же время появились публикации о том, что мутанты кукурузы и петунии, у которых блокировано образование флавоноидов за счет отсутствия активности халконсинтазы (фермента начального этапа биосинтеза флавоноидов), становятся самостерильными, поскольку теряют способность образовывать функционально активную пыльцевую трубку [Mo et al., 1992; Pollak et al., 1993]. Однако мутантная пыльца оказалась частично функционирующей на рыльцах растений дикого типа, которые содержали кемпферол. Кроме того, было выяснено, что добавление микромолярных количеств кемпферола в среду для прорастания пыльцевой трубки или к опыленным рыльцам восстанавливает нормальный процесс прорастания пыльцы и рост пыльцевой трубки. Помимо кемпферола, аналогичной, хотя и более слабой, активностью обладали два других флавонола, а именно галан-гин (5,7-диоксифлавонол) и изорамнетин (З'-метоксикверцетин), но не флавоны, халконы, флаваноны и катехины. В этих публикациях также был сделан вывод, что флавонолы выполняют роль сигнальных веществ в процессах прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изложенные в настоящем чтении сведения о метаболизме и функциях фенольных соединений в растениях носят лишь конспективный характер. Их цель - в сжатой форме дать представление о многоплановости этой, казавшейся ранее достаточно узкой, проблемы, а также о сложностях в ее решении и о тех успехах, которые достигнуты за последние десятилетия.
До сих пор остается неразгаданной функциональная причина огромного разнообразия синтезируемых растениями фенольных соединений. Очень часто, помимо основных, характерных для всех растений представителей (оксибензойные кислоты, фенилпропаноиды и простейшие флавоноиды), почти в каждом растении происходит образование десятков более сложных фенольных соединений. Некоторые из них специфичны для ограниченного числа видов, родов или семейств растений, а другие спорадически обнаруживаются у филогенетически самых разнообразных представителей.
Выполняют ли такие фенольные соединения какие-либо физиологические функции, ради которых они остались запечатленными в генетической памяти растения? Или же это результат недостаточно скоординированной активности ферментов завершающих этапов их биосинтеза? Ответа на эти вопросы пока нет.
Несомненно лишь одно. Фенольные соединения имеют жизненно важное значение для растений, где они выполняют разнообразные функции. Для упрощения известные к настоящему времени функции фенольных соединений отображены в табл. 3.
С достаточной степенью уверенности можно предположить, что данная таблица в недалеком будущем будет расширена и пополнена последующими исследованиями.
Таблица 3
Функции фенольных соединений н их участники
Функция	Участвующий компонент
Структурные древесина (ксилема), кутикула, клеточная стенка	Лигнин, димеры оксикоричных кислот (ОКК)
Защитные механические повреждения; УФ-свет; атака патогенов (фитоалексины)	Лигнин, ОКК в составе суберина; флавоноиды, реже стильбены, кумарины и некоторые другие фенольные соединения
Сигнальные во взаимоотношениях растения - микробы; при опылении; при патогенезах	Ацетофеноны, ОКК, оксикоричные , спирты, флавоноиды, салициловая кислота
Переносчики электронов в электронтранс* портных цепях	Убихиноны, пластохиноны
Резервные (запасные вещества)	Флавоноиды, ОКК, оксибензойные кислоты
ЛИТЕРАТУРА
Багратишвили Д.Г., Запрометов М.Н. Влияние света на образование фенольных соединений в суспензионной культуре клеток чайного растения // Сообщ. АН ГССР. 1982. Т. 105. С. 581.
Багратишвили Д.Г., Запрометов М.Н., Бутенко Р.Г. Образование фенольных соединений в суспензионной культуре клеток чайного растения и влияние на него уровня нитрата и гормональных эффектов в питательной среде // Физиология растений. 1980. Т. 27. С. 404.
Дурмишидзе С.В., Сапромадзе А.Н., Шалашвили А.Г., Месхи А.З. Расщепление циани-дина растительными тканями в стерильных условиях // Докл. АН СССР. 1974. Т. 214. С. 708.
Дурмишидзе С.В., Шалашвили А.Г. Усвоение и превращение кварцетина корнями высших растений //Там же. 1968. Т. 181. С. 1489.
Дурмишидзе С.В., Шалашвили А.Г., Сопромадзе А.Н., Гулбани Д.И. О метаболизме эндогенных фенольных соединений в виноградной лозе // Физиология растений. 1984. Т. 31. С. 317.
Жанаева ТА., Минаева В.Г., Запрометов М.Н. О ферментативном расщеплении флавонолов володушки И Докл. АН СССР. 1977. Т. 233. С.' 722.
Жанаева Т.А , Минаева В.Г., Запрометов М.Н. Флороглюцинкарбоновая кислота как промежуточный продукт расщепления флавонолов в бесклеточных экстрактах из листьев володушки // Там же. 1978. Т. 239. С. 479.
Загоскина НЯ., Запрометов М.Н. Влияние 1-иафтилуксусной кислоты иа рост и образование фенольных соединений в культуре тканей чайного растения И Физиология растений. 1979. Т. 26. С. 681.
Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Влияние кинетина иа образование фенольных соединений в длительно пассируемой культуре ткани чайного растения // Физиология и биохимия культ, растений. 1983. Т. 15. С. 250.
Запрометов М.Н. Хроматографическое разделение чайного таннина И Биохимия. 1952. Т. 17. С. 97.
Запрометов М.Н. К вопросу о месте образования катехинов в чайном растении // Физиология растений. 1958а. Т. 5. С. 51..
Запрометов М.Н. Количественное определение катехинов при их разделении хроматографией на бумаге // Там же. 19586. Т. 5. С. 296.
Запрометов М.Н. О способности к расщеплению бензольного кольца у высших растений //Докл. АН СССР. 1959. Т. 125. С. 1359.
Запрометов М.Н. Препаративное получение равномерно меченой 14С шикимовой кислотты Ц Биохимия. 1961. Т. 26. С. 597.
Запрометов М.Н. О механизме биосинтеза катехинов //Там же. 1962а. Т. 27. С 366.
Запрометов М.Н. Об образовании кофеина в побегах чайного растения //Там же. 19626. Т. 27. С. 679.
Запрометов М.Н. Биохимия катехинов. М.: Наука, 1964.226 с.
Запрометов М.Н. О скорости образования катехинов в молодых побегах чайного растения // Биохимия и прогрессивная технология чайного производства. М.: Наука, 1966. С. 32-36.
Запрометов М.Н. Достижения и перспективы биохимии фенольных соединений // Фенольные соединения и их биологические функции. М.: Наука, 1968. С. 109-128.
Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М.: Высш, шк., 1974.214 с.
Запрометов М.Н. Фенольные соединения растений: Биосинтез, превращения н функции // Новые направления в физиологии растений. М.: Наука, 1985. С. 143-162.
Запрометов М И Фенольные соединения: Распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993а. 272 с.
Запрометов М Н Специализированные функции фенольных соединений в растениях // Физиология растений. 19936. Т. 40. С. 921.
Запрометов М Н, Бухлаева В.Я. О продуктах фотосинтеза чайного растения и биосинтезе фенольных соединений //Там же. 1967а. Т. 14. С. 197.
Запрометов М.Н., Бухлаева В Я. Превращение 14С-катехинов при их введении в растение // Там же. 19676. Т. 14. С. 804.
Запрометов М.Н, Бухлаева В.Я. О двух путях биосинтеза галловой кислоты // Биохимия. 1968.Т. 33. С. 383.
Запрометов М Н., Бухлаева В.Я. О продуктах фотосинтеза сосны обыкновенной // Физиология растений. 1970. Т. 14. С. 274.
Запрометов М Н., Ермакова С.А. Мембраносвязацные ферменты биосинтеза фенольных соединений // Биохимия. 1985. Т. 50. С. 1175.
Запрометов М.Н., Ермакова С.А. Ферменты начальных этапов биосинтеза фенил-пропаноидов и их локализация в мембранах эндоплазматического ретикулума проростков ячменя Ц Физиология растений. 1986. Т. 33. С. 754.
Запрометов М.Н, Загоскина Н.В. Еще об одном доказательстве участия хлоропластов в биосинтезе фенольных соединений Ц Там же. 1987. Т. 34. С. 165.
Запрометов М Н„ Загоскина Н.В , Стрекова В Я., Субботина Г.А Локализация пероксидазы и лигнина в тканях чайного растения и полученных из них каллусных культурах И Там же. 1982. Т. 29. С. 302.
Запрометов М.Н, Колонкова С.В О биосинтезе фенольных соединений в хлоропластах чайного растения // Докл. АН СССР. 1967. Т. 176. С. 470.
Запрометов М.Н., Стрекова В.Ю., Субботина Г.А , Загоскина Н.В. Действие кинетина на дифференциацию и образование фенольных соединений в культуре ткани чайного растения // Физиология растений. 1986. Т. 33. С. 356.
Запрометов М.Н., Субботина Г.А , Николаева Т.Н. Влияние кинетина на образование фенольных соединений и ультраструктурную организацию каллусных тканей чайного растения // Там же. 1994. Т. 41. С. 354.
Корецкая Т.Ф., Запрометов М.Н. Фенольные соединения в культуре ткани чайного растения и влияние света на их образование //Там же. 1975. Т. 22. С. 941.
Курсанов АЛ. Синтез и превращения дубильных веществ в чайном растении. М.: Изд-во АН СССР, 1952. (7-е Баховское чтение).
Курсанов АЛ., Запрометов М.Н. Количественное определение рядовых н ортогидроксилов в полнфенолах и дубильных веществах // Биохимия. 1949. Т. 14. С. 467.
Минаева В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование. Новосибирск: Наука, 1978.255 с.
Минаева В.Г, Горбалева Г.Н. Влияние флавоноидов на прорастание пыльцы и рост пыльцевой трубки И Полезные растения Сибирской флоры. Новосибирск: Наука, 1967. С. 231-235.
Николаева Т.Н , Запрометов М.Н. Активность и субстратная специфичность 0-метил-трансферазы чайного растения и полученных из него каллусных культур // Физиология растений. 1990. Т. 37. С. 378.
Палладии В.И. Das Blut der Pflanzen // Ber. Bot Ges. 1908. Bd. 26A. S. 125.
Сакс Ю. Руководство к опытной физиологии растений. СПб. 1867.
Стрекова В.Ю., Субботина Г.А., Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. О возможных причинах нарушения процесса лигиификации в культуре ткани чайного растения // Физиология растений. 1980. Т. 27. С. 1192.
Шипилова С.В., Запрометов М.Н. Фенилаланинаммиак-лиаза в хлоропластах чайного растения // Там же. 1979. Т. 246. С. 239.
Шипилова С.В., Корецкая Т.Ф., Запрометов М.Н. Фенилалаиинаммиак-лиаза и образование флаванов в культуре ткани чайного растения //Там же. 1978. Т. 25. С. 552.
Adesanya SA., Ogundana S.K., Roberts M.F. Dihydrostilbene phytoalexins from Dioscorea balbifera and D. dumentorium // Phytochemistry. 1989. Vol. 28. P. 773.
Alibert G„ Ranjeva R„ Boudet A. Recherches sur les enzymes catalysant la biosynthese des phenoliques chez Quercus pedunculata. 2. Localization mtracellulaire de la phenylalanine ammoniaque-lyase, de la cinnamate 4-hydroxyliase, et de "benzoate-synthase" Ц Biochim. et biophys. acta. 1972. Vol. 279. P. 282.
Amrhein N., Topp H., OtfriedJ. The pathway of gallic acid biosynthesis in higher plants // Plant Physiol. 1984. Vol. 75, suppl. P. 18.
Ban W„ Hdsel W Metabolism and degradation of phenolic compounds in plants // Biochemistry and degradation of phenolic compounds in plants. N.Y.: Plenum press, 1979. P. 339-370.
Bergmann L. Der Einfluss von Kinetin auf die Lignmbildung und Differenzierung in Gewebekul-turen von Nicotiana tabacum // Planta. 1964. Vol. 62. P. 221.
Brinker A.M., Seigler D.S. Isolation and identification of piceatannol as a phytoalexin from sugarcane//Phytochemistry. 1991. Vol. 30. P. 3229.
Butt V.S Oxygenation and oxidation in the metabolism of aromatic compounds // The biochemistry of plant phenolics. Oxford: Clarendon press, 1985. P. 349-366.
Camm EL., Towers G.H.W. Phenylalanineammonia lyase // Phytochemistry. 1973. Vol. 12.
Cho M., Harper J.E. Effect of inoculation and nitrogen on isoflavonoid concentration in wild-type and nodulation-mutant soybean roots // Plant Physiol. 1991. Vol. 95. P. 435.
Coxon D.T., O'Neill T M., Mansfield J. M. et al. Identification of three hydroxyflavan phytoalexms from daffodil bulbs//Phytochemistry. 1980. Vol. 19. P. 889.
Czichi U„ Kindi H. Phenylalanine ammonia lyase and cinnamic acid hydroxylase as assembled consecutive enzymes in microsomal membranes of cucumber cotyledons: cooperation and subcellular distribution//Planta. 1977. Vol. 134. P. 133.
Della-Cioppa G , Bauer S.C., Klein В К. et al. Translocation of the precursor of 5-enolpyruvyl-slukimate-3-phosphate synthase into chloroplasts of higher plants in vitro // Proc. Nat Acad. Sci. US. 1986. Vol. 83. P. 6873.
Diamond J M Hot sex in vodoo lilies//Nature. 1989. Vol. 339. P. 258.
Farmer E E. Effects of fungal elicitor on lignin biosynthesis in cell suspension cultures of soybean И Plant Physiol. 1985. Vol'. 78. P. 338.
Friend J. Phenolic substances and plant disease // The biochemistry of plant phenolics. Oxford: Clarendon press, 1985. P. 367-392.
Fryer MJ. The antioxidant effects of thylakoid vitamin E (a-tocopherol) // Plant, Cell Environ. 1992. Vol. 15. P. 381.
Grabber J.H., Hatfield R.D., Ralph J., Zon J., Amrhein N. Ferulate cross-linking m cell w.ills isolated from maize cell suspensions // Phytochemistry. 1995. Vol. 40. P. 1077.
Gross G.G. Recent advances in the chemistry and biochemistry of lignin // Biochemistry of plant phenolics. N.Y.: Plenum press, 1979. P. 177-220.
Hahibrock K„ Grisebach H. Biosynthesis of flavonoids //The flavonoids. L.: Chapman and Hall, 1975. P. 866-915.
Harbome J.B. Do natural plant phenols play a role in ecology? // Acta hort. 1994. № 381. P. 36-43.
Hartwig UA., Maxwell CA., Joseph C.M. et al. Crysoeriol and luteolin released from alfalfa seeds induce nod genes m Rhizobium meliloti П Plant Physiol. 1990. Vol. 92. P. 116
Hrazdina G„ Wagner GJ. Metabolic pathways as enzyme complexes: evidence for the synthesis of phenylpropanoids and flavonoids on membrane associated enzyme complexes // Arch. Biochem. and Biophys. 1985. Vol. 237. P. 88.
Hungria M., Joseph C.M., Phillips DA. Anthocyanidines and flavonols, major nod gene inducers fron seeds of a black-seeded common bean (Phaseolus vulgaris L) // Plant Physiol 1991. Vol. 9/ P. 751.
Hungria M., Joseph CM., Phillips DA. Rhizobium nod gene inducers exuded naturally from roots of common bean (Phaseolus vulgaris L.) // Ibid. 1991. Vol. 97. P. 759.
Ishikura N„ Hayashida S., Tazaki K. Biosynthesis of gallic and ellagic acids with 14C-labelIed compounds in Acer and Rhus leaves // Bot. Mag. 1984. Vol. 97. P. 255
Izawa S , Winget GJ)., Good N.E. Phlorizin, a specific inhibitor of phosphorylation and phosphorylation-coupled electron transport in chloroplasts // Biochem. and Biophvc Res. Commun. 1966. Vol. 22. P. 223.
Jensen R A. The shikimate/arogenate pathway. Link between carbohydrate metabolism and secondary metabolism // Physiol, plant 1986. Vol. 66. P. 164.
Jensen RA., Morris P., Bonner C„ Zamir L.O. Biochemical interface between aromatic amino acid biosynthesis and secondary metabolism // Plant cell wall polymers: Biogenesis and biodegradation. Wash. (D.C.): Amer. Chem. Soc., 1989. P. 89-107.
Kamisaka S„ Takeda S„ Takahashi K. et al. Diferulic and ferulic acid in the cell wall of Avena coleoptiles - their relationship to mechanical properties of the cell wall // Physiol, plant. 1990. Vol. 78. P. 1.
Kleissig D.F., Malamy J. The salicylic acid signal in plants 11 Plant. Mol. Biol. 1994. Vol. 26. P. 1439.
Kollatukudy P.E. Biochemistry and function of cutin and suberin // Canad. J. Bot 1984. Vol. 62. P. 2918.
Krogmann D.W., Sutler ML. A naturally occuring cofactor for photosynthetic phosphorylation // Biochem. and Bibphys. Res. Commun. 1962. Vol. 7. P. 46.
Langcake P., Pryce RJ. The production of resveratrol and the viniferins by grapevines in responce to ultraviolet irradiation // Phytochemistry. 1977. Vol. 16. P. 1193.
Leon J., Shulaev V., Lauton MA. et al. Benzoic acid 2-hydroxylase, a putative cytochrome P-450, catalizes the biosynthesis of salicylic acid // Plant Physiol. 1994. Vol. 105, suppl. P. 15.
Leslie CA., Ramani R J. Inhibition of ethylene biosynthesis by salicylic acid // Ibid. 1988. Vol. 88. P. 833.
Lewis N.G., Yamamoto E. Lignin: occurence, biogenesis and biodegradation // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. VoL’41. P. 339.
Li J., Ou-Lee T„ RabaR. et al. Arabidopsis flavonoid mutants are hypersensitive to UV-B irradiation // Plant Cell. 1993. Vol. 5. P. 171.
Lojfelhardt W.. Ludwig В , Kindi H. Thylakoid-gebundene L-phenylalanin-ammonia-lyase // Hoppe-Seyler's Ztschr. physiol. Chem. 1973. Vol. 354. P. 1006.
Lynn D.G., Chang M. Phenolic signals in cohabitation: Implications for plant development // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. Vol. 41. P. 497.
Maxwell CA., Hertwig UA., Joseph C.M. et al. A chaicone and two related flavonoids released from alfalfa roots induce nod genes of Rhizobium meliloti Ц Plant Physiol. 1989. Vol. 91. P. 842.
Melhers L.S., Regensburg-Tuink A J., Schilperoort et al. Specificity of signal molecules in the activation of Agrobacterium virulence gene expression // Mol. Microbiol. 1989. Vol. 3. P. 969.
Melis A ., Nemson J A., Harrison MA. Damage to functional components and partial degradation of photosystem II reaction center proteins upon chloroplast exposure to ultraviolet-B radiation // Biochim. et biophys. acta. 1992. Vol. 110. P. 312.
Metraux J.P., Signer H., Ryals J. et al. Increase in salicylic acid at the onset of systemic acquired resistance in cucumber//Science. 1990. Vol. 250. P. 1004.
Mo Y.f Nagel C., Taylor L.P. Biochemical complementation of chaicone synthase mutants defines a role for flavonols in functional pollen // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1992. Vol. 89. P. 7213.
Moerschbacher B. Lignin biosynthesis and the resistance of wheat to stem rust // Phytoparasitica. 1988. Vol. 16. P. 153.
Monties B. Presence de composes polyphenpliques dans les chloroplastes d'angiospermes // Bull. Soc. fr. physiol, veget 1969. Vol. 15. P. 29.
Morris J.W., Morris R.O. Identification of an Agrobacterium tumefaciens virulence gene induced from the pinaceous gymnosperm Pseudotsuga menziesii // Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1990. Vol. 87. P. 3614.
Nicholson R.L., Kollipara S.S., Vincent J.R. et al. Phytoalexin synthesis by the sorghum mesocotyl in response to infection by pathogenic and nonpathogenic fungi // Ibid. 1987. Vol. 84. P. 5520.
Pearce RB., Ride J.B. Specificity of induction of the lignification response in wounded wheat leaves//Physiol. Plant Pathol. 1980. Vol. 16. P. 197.
Peters N.K., Lang S.R. Alfalfe root exudates and compounds which promote or inhibit induction of Rhizobium meliloti nodulation genes // Plant Physiol. 1988. Vol. 88. P. 396.
Phillips DA. Flavonoids: Plant signals to soil microbes // Phenolic metabolism in plants. N.Y.: Plenum press, 1992. P. 201-231.
Pollak P.E., Vogt T., Mo Y. et al. Chaicone synthase and flavonol accumulation in stigmas and anthers of Petunia hybrida // Plant Physiol. 1993. Vol. 102. P. 925.
Postius C„ Kindi H. The occurence of phenylalanine ammonia-lyase and cinnamic acid p-hydro-xylase on the endoplasmic reticulum of cell suspension cultures of Glycine max // Ztschr. Naturforsch. C. 1978. Bd. 33. S. 65.
Prasad S., Ellis B.E. In vivo characterization of catechol ring cleavage in cell cultures of Glycine max//Phytochemistry. 1978. Vol. 17. P. 187.
Price RJ., Langcake P. a-Viniferin: An antifungal resveratrol trimer from grapevines // Ibid. 1977. Vol. 16. P. 1452.
Raskin 1. Role of salicylic acid in plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. Vol. 43. P. 439.
Raskin /., Turner 1.М., Melander VP J?. Regulation of heat production in the inflorescens_of an Arum lily by endogenous salicylic acid //Proc. Nat. Acad. Sci. US. 1989. Vol. 86. P. 2214.
Rassmussen JB., Hammerschmidt R., Zook M.N. Systemic induction of salicylic acid accumulation in cucumber after inoculation with Pseudomonas syringae pv syringae // Plant Physiol. 1991. Vol. 97. P. 1342.
Ravanel P., Tissut M., Douce R. Effects of kaempferol on the oxidative properties of intact plant mitochondria // Ibid. 1982a. Vol. 69. P. 375.
Ravanel P., Tissut M., Douce R. Uncoupling activities of chaicones and dihydrochalcones on isolated mitochondria from potato tubers and mung bean hypocotyls // Phytochemistry. 1982b. Vol. 21. P. 2845.
Ravanel P., Tissut M., Douce R. Platanetin: A potent natural uncoupler and inhibitor of the exogenous NADH dehydrogenase in intact plant mitochondria // Plant Physiol. 1986. Vol. 80. P. 500.
Rhodes MJ.C. Physiological significance of plant phenolics // The biochemistry of plant phenolics. Oxford: Clarendon press, 1985. P. 99-118.
Robberecht R„ Caldwell M.M. Protective mechanisms and acclimation to solar ultraviolet-B radiation in Oenothera stricta // Plant Cell Environ. 1983. Vol. 6. P. 477.
Ruis H., Kindi H. Distribution of ammonia-lyases in organelles of castor bean endosperm // Hoppe-Seyler's Ztschr. physiol. Chem. 1970. Vol. 351. P. 1425.
Sasaki Y.F., Imanishi H., Ohta T. et al. Suppresing effect of tannic acid on UV and chemically induced chromosome aberration in cultured mamalian cells // Agr. Biol. Chem. 1988. Vol. 52. P. 2423.
Saunders J A., McClure J.W. The localization of flavonoids and phenolic enzymes in barley plastids // Amer. J. BoL 1972. Vol. 59. P. 673.
Saunders J A., McClure J.W. The distribution of flavonoids in chloroplasts of twenty five species of vascular plants // Phytochemistry. 1976. Vol. 15. P. 809.
Schmid J., Schaller A., Leibinger U. et al. The in vivo synthesized tomato shikimate kinase precursor is enzymatically active and is imported and processed to the nature enzyme by chloroplasts // Plant J. 1992. Vol. 2. P. 375.
Shimazaki K„ Igarashi T., Kondo N. Protection by the epidermis of photosynthesis against UV-C radiation estimated by chlorophyll a fluorescense//Physiol, plant 1988. Vol. 74. P. 34.
Snyder BA., Nicholson R.L. Synthesis of phytoalexins in sorghum as a site-specific responce to fungal ingress //Science. 1990. Vol. 248. P. 1637.
Spencer PA., Towers G.H.N. Specificity of signal compounds detected by Agrobacterium tume-faciens Ц Phytochemistry. 1988. Vol. 27. P. 2781.
Spencer PA., Towers GH.W. Virulence-inducing phenolic compounds detected by Agrobacterium tumefaciens H Plant cell wall polymers. Wash. (D.C.): Amer. Chem. Soc., 1989. P. 383-398.
Spencer PA., Towers G.H.W. Restricted occurence of acetophenone signal compounds // Phytochemistry. 1991. Vol. 30. P. 2933.
Stafford HA. Compartmentation in natural product biosynthesis by multienzyme complexes // The biochemistry of plants. L.: Acad, press, 1981. Vol. 7. P. 118-137.
StaffordHA. Flavonoid metabolism. Florida: CRC press, 1990.298 p.
Stapleton A.E., Walbot V. Flavonoids can protect maize DNA from the induction of ultraviolet radiation damage//Plant Physiol. 1994. Vol. 105.P.881.
Stenlid G. On the physiological effects of phloridzin, phloretin and some related substances upon higher plants // Physiol, plant 1968. Vol. 21. P. 882.
Stenlid G. Flavonoids as inhibitors of the formation of adenosine triphosphate in plant mitochondria//Phytochemistry. 1970. Vol. 9. P. 2251.
Tiller SA., Parks A.D., Edwards R. Changes in the accumulation of flavonoid and isoflavonoid
conjugates associated with plant age and nodulation in alfalfa (Medicago sativa) // Plant. Physiol, plant. 1994. Vol. 91. P. 27.
Towers G.H.N., Abeysekera B. Cell wall hydroxycinnamate esters as UV-A receptors on photo-trophic responces of higher plants - a new hypothesis // Phytochemistry. 1984. Vol. 23. P.951.
Vet nooij N., Friedrich L„ Mirse A. et al. Salicylic acid is not the translocated signal responsible for inducing systemic acquired resistance but is required in signal transduction // Plant Cell. 1994. Vol. 6. P. 959.
Wagner A.M., Wagner MJ. Measurement of in vivo ubiquinone reducion levels in plant cells // Plant Physiol. 1995. Vol. 108. P. 277.
Weissenbock G., Plesser A , Trinks H. Flavonoidgehalt und Enzymaktivitaten isolierter Hafechloroplasten (Avene sativa L.) // Ber. DL bot Ges. 1976. Bd. 89. S . 457.
Weissenbock G., Tevini M., Reznik H. Uber das Vorkommen von Flavonoiden in Chloroplasten von Impatiens balsamina L. // Ztschr. Pflanzenphysiol. 1971. Bd. 64. S. 274.
Zaprometov M.N. The metabolism of flavonoids in higher plants // Flavonoids and bioflavonoids / Ed. L. Farkas et al. Budapest: Akad. Kiado, 1977. P. 257-270.
Zaprometov M.N. Enzymology and regulation of the synthesis of polyphenols in cultured cells // Frontiers of plant tissue culture: IV Intern, congr. plant tissue cell cult / Ed. T.A. Thorpe. Calgary, 1979. P. 334-344.
Zaprometov M.N. Regulation of phenolic compounds metabolism in plants // C.r. Joum6es Intern. Groupe Polyphenols. 1985. Vol. 12. P. 18.
Zaprometov M.N. Proanthocyanidins and catechins // Cell culture somatic cell genetics of plants. San Diego: Acad, press, 1988. Vol. 5. P. 77-88.
Zaprometov M.N. The formation of phenolic compounds in plant cell and tissue cultures and possibility of its regulation // Adv. Cell Cult. 1989. Vol. 7. P. 201-270.
Zaprometov M.N., Zagoskina N.V., Elkin V.V. Comparative study of lignins produced by the teaplant and by tea-plant derived callus tissues // Phytochemistry. 1993. Vol. 32. P. 709.
Yalpani N„ Enyedi AJ., Leon J. et al. Ultraviolet light and virus resistance in tobacco // Planta. 1994. Vol. 193. P. 372.
Ylstra В , Touraev A., Moreno R.M.B. et al. Flavonols stimulate development, germination, and tube growth of tobacco pollen // Plant Physiol. 1992. Vol. 100. P. 902.