УЧЕБНИК
Л.В.АНТИПОВА, И.А.ГЛОТОВА, И.А.РОГОВ
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
УЧЕБНИКИ И УЧЕБНЫЕ ПОСОБИЯ ДЛЯ СТУДЕНТОВ ВЫСШИХ УЧЕБНЫХ ЗАВЕДЕНИЙ
Л. В. АНТИПОВА, И. А. ГЛОТОВА, И. А. РОГОВ
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
Допущено Министерством образования Российской Федерации в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихя по специальности «Технология мяса и мясных продуктов» и направлению подготовки дипломированных специалистов «Технология сырья и продуктов животного происхождения»
©
МОСКВА «КОЛОС» 2001
УДК 637.07(076.5)
ББК 36-1:36.92я73
А72
Редактор Куркина Н. В.
Рецензенты: кафедра технологии мяса и мясных продуктов Северо-Кавказского ГТУ (канд. техн, наук С. И. Постников, канд. техн, наук Ю. И. Куликов), кафедра аналитической химии Воронежского государственного университета (д-р техн, наук, проф. В. Ф. Селеменев)
Антипова Л. В., Глотова И. А., Рогов И. А.
А72 Методы исследования мяса и мясных продуктов. — М.: Колос, 2001. — 376 с.: ил. (Учебники и учеб, пособия для студентов высш. учеб, заведений).
ISBN 5-10-003612-5.
Приведены теоретические основы и различные физические, химические, физико-химические, биохимические и микробиологические методы анализа состава, функционально-технологических и структурномеханических свойств, показателей качества и безвредности мясного сырья и продуктов.
Для студентов вузов, обучающихся по специальности «Технология мяса и мясных продуктов» и направлению «Технология сырья и продуктов животного происхождения».
УДК 637.07(076.5)
ББК 36—1:36.92я73
ISBN 5-10-003612-5
© Издательство «Колос», 2001
ОГЛАВЛЕНИЕ
Глава 1. Анализ химических компонентов мяса и мясных продуктов..................9
1.1.	Белки, пептиды	и	аминокислоты..........................................9
1.2.	Липиды .............................................................. 34
1.3.	Углеводы............................................................. 43
1.4.	Фосфорорганические соединения.........................................47
1.5.	Вода................................................................. 49
Лабораторная работа № 1. Определение суммарных белков в тканях животных ускоренным фотометрическим методом на основе минерализации проб......... 55
Лабораторная работа №2. Определение белков в тканях животных фотометрическими методами без минерализации проб................................. 60
I.	Определение массовой доли белка методом Лоури...................... 63
2.	Определение массовой доли белка биуретовым методом................. 64
3.	Определение массовой доли белка методами, основанными на связывании красителей............................................................ 65
4.	Определение массовой доли белка методами УФ-спектрофотометрии...... 67
Лабораторная работа № 3. Анализ фракционного состава белков на основе их растворимости.............................................. 69
Лабораторная работа № 4. Количественное определение актомиозина......... 71
Лабораторная работа №5. Количественное определение коллагена............ 73
1. Определение коллагена в мясе по методу В. Г. Воловинской........... 76
2. Определение коллагена на основе предварительного гидролиза......... 77
Лабораторная работа № 6. Определение гемоглобина крови.................. 80
1.	Выделение кристаллов гемоглобина................................... 82
2.	Определение гемоглобина по качественной реакции на гемовую группу (проба Тейхмана)...................................................... 83
3.	Количественное определение растворенного гемоглобина в плазме крови. 83
Лабораторная работа № 7. Определение форм гемоглобина (пигментов) на основе спектральных характеристик.................................... 84
1.	Определение оксигемоглобина ....................................... 86
2.	Определение гемоглобина............................................ 86
3.	Определение метгемоглобина......................................... 86
Лабораторная работа № 8. Количественное определение гемоглобина и органического железа в крови................................................ 87
Лабораторная работа № 9. Количественное определение пигментов мяса...... 89
1. Определение общего содержания пигментов.............................91
2. Определение форм миоглобина (пигментов) на основе спектральных характеристик мяса.................................................... 92
Лабораторная работа № 10. Количественное определение аминного азота .... 92
1.	Медный способ ..................................................... 95
3
2.	Нингидриновый способ............................................... 96
3.	Способ формольного титрования...................................... 97
Лабораторная работа AL1 II. Количественное определение триптофана ....... 98
Лабораторная работа № 12. Количественное определение пролина ............101
Лабораторная работа АЗ 13. Определение белков и белковых веществ меюдом гель-фильтрапии..........................................................104
Лабораторная работа № 14. Анализ белков методами ионообменной хроматографии ................................................................109
1. Разделение белков сыворотки крови	на ДЭАЭ-целлюлозе................111
2. Разделение белков сыворотки крови	на КМ-иеллюлозе.................112
Лабораторная работа № 15. Анализ аминокислот на автоматическом аминокислотном анализаторе....................................................113
Лабораторная работа №° 16. Анализ аминокислот методом бумажной хроматографии ................................................................118
Лабораторная работа № 17. Определение аминокислот методом тонкослойной ионообменной хроматографии на пластинах..................................123
Лабораторная работа № 18. Определение экстрактивных веществ..............128
1.	Определение карнозина в безбелковом экстракте	по диазореакции......129
2.	Определение дипептидов хроматографией на бумаге....................131
3.	Определение дипептидов с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках «Силуфол»..................................................133
Лабораторная работа № 19. Количественное определение суммарных липидов в животных тканях........................................................134
1.	Гравиметрический метод в аппарате Сокслета.........................135
2.	Гравиметрический метод в пленочном испарителе .....................136
3.	Колориметрический метод............................................137
Лабораторная работа №20. Определение фракционного состава жиров .........138
1. Фракционирование пищевых топленых жиров кристаллизацией............140
2. Определение температуры плавления фракций .........................140
Лабораторная работа №° 21. Определение фосфолипидов......................141
1. Качественная реакция на лецитин....................................142
2. Хроматографическое разделение фосфолипидов..........................142
Лабораторная работа №° 22. Определение холестерина.......................144
1.	Получение кристаллов холестерина...................................147
2.	Цветные реакции на холестерин......................................148
3.	Количественное определение холестерола.............................150
Лабораторная работа №23. Определение жирнокислотного состава животных жиров...........................................................152
Лабораторная работа №° 24. Количественное определение гликогена в животных тканях........................................................157
Лабораторная работа №°25. Количественное определение молочной кислоты..................................................................161
1. Метод определения содержания молочной кислоты по цветной реакции с вератролом .......................................................163
2. Метод определения содержания молочной кислоты по цветной реакции с ««уш-оксидифенилом................................................166
Лабораторная работа № 26. Количественное определение пектина в мясных продуктах................................................................169
1. Определение пектина термогравиметрическим методом по пектату кальция.............................................................170
2. Определение пектина фотометрическим методом по реакции с карбазолом..........................................................172
4
Лабораторная работа ЛЬ27. Количественное определение целлюлозы ......... 173
1. Определение массовой доли целлюлозы в модификации А. И. Ермакова .. 174
2. Определение массовой доли целлюлозы в модификации И. С. Лурье .....175
Лабораторная работа ЛЬ 28. Определение фосфорорганических соединений и их производных..............................................................177
1. Определение массовой доли	АТФ.......................................178
2. Определение массовой доли	креатинфосфата ...........................180
Лабораторная работа ЛЬ 29. Определение массовой доли влаги в мясе и мясных продуктах................................................................181
1.	Определение массовой доли влаги высушиванием при температуре (103 ±2) °C ..........................................................183
2.	Определение массовой доли влаги высушиванием при температуре (150 • 2) С ..........................................................183
3.	Определение массовой доли влаги высушиванием в аппарате САЛ.........184
4.	Определение массовой доли влаги высушиванием в устройстве Я10-ФВУ..184
Лабораторная работа Ns 30. Определение активности воды...................185
Контрольные вопросы и задания......................................188
Глава 2. Физические, физико-химические и структурно-механические свойства мяса и мясных продуктов.............................................................190
2.1.	Физические свойства...................................................191
2.2.	Теплофизические свойства .............................................196
2.3.	Функционально-технологические свойства ...............................199
2.4.	Структурно-механические свойства......................................202
Лабораторная работа № 1. Определение цветности мяса и мясных продуктов..204
Лабораторная работа Ns 2. Определение цветности твердых животных жиров..209
Лабораторная работа Ns 3. Определение акустических свойств мяса и мясных продуктов................................................................211
Лабораторная работа Ns 4. Исследование теплофизических характеристик мяса и мясных продуктов ......................................................215
Лабораторная работа Ns 5. Определение	микроструктурных показателей мяса.223
Лабораторная работа Ns 6. Определение влагосвязывающей способности (ВСС) мяса...............................................................230
1.	Метод прессования ..................................................231
2.	Метод центрифугирования.............................................232
Лабораторная работа Ns 7. Определение основных функционально-технологических свойств мясных фаршей ........................................233
1.	Определение влагоудерживающей способности...........................234
2.	Определение жироудерживающей способности............................234
3.	Определение эмульгирующей способности и стабильности эмульсии.......236
4.	Определение влаго- и жироудерживающей способностей и устойчивости
фаршевой эмульсии в одной навеске (метод Р. М. Салаватулиной и др.) .236
Лабораторная работа Ns 8. Определение гелеобразующей способности животных и растительных белков....................................................238
1. Получение гелей.....................................................240
2. Определение физических показателей студней..........................241
Лабораторная работа Ns 9. Определение структурно-механических свойств мяса и мясных продуктов ......................................................245
1.	Определение усилий среза............................................252
2.	Определение сдвиговых свойств на коническом пластомере .............252
3.	Определение предельного напряжения сдвига и эффективной вязкости на ротационном вискозиметре РВ-8М.....................................254
5
4.	Определение предельного напряжения сдвига и эффективной вязкости на ротационном вискозиметре типа «Реотест».............................256
5.	Определение вязкости на вискозиметре Энглера........................259
6.	Определение адгезионных свойств модельных фаршей ...................261
Контрольные вопросы н задания........................................263
Глава 3. Биохимические свойства животных тканей................................265
3.1.	Механизм автолиза и автолитические превращения мышечной ткани.........266
3.2.	Биохимические свойства крови..........................................271
3.3.	Биохимическая активность животных тканей .............................274
Лабораторная работа Ns 1. Оценка глубины и характера автолитических превращений мышечной ткани методами биохимического анализа небелковых веществ..................................................................282
1.	Определение pH .....................................................286
2.	Количественное определение гликогена и молочной кислоты в мышечной ткани................................................................. 287
3.	Определение АТФ.....................................................287
4.	Количественное определение глюкозы в вытяжке мышечной ткани по методу Бертрана.....................................................287
Лабораторная работа Ns 2. Определение активности катепсинов мышечной ткани....................................................................288
Лабораторная работа №3. Определение компонентов системы свертывания крови....................................................................293
1. Действие кальция на систему свертывания крови и ее фракций..........294
2. Определение тромбина................................................294
Лабораторная работа Ns 4. Определение молокосвертываюшей активности пепсина..................................................................296
Лабораторная работа № 5. Определение инсулина поджелудочной железы.......297
1. Качественные реакции на инсулин.....................................298
2. Количественное определение инсулина.................................299
Лабораторная работа Ns 6. Определение гормонов шитовидной железы и надпочечников ..............................................................302
1.	Определение тиреоидина	по	качественной реакции с иодидом калия.305
2.	Определение адреналина	надпочечников................................305
Контрольные вопросы.................................................306
Глава 4. Пищевая ценность и качество мяса и мясных продуктов ..................308
4.1.	Пищевая ценность......................................................310
4.2.	Качество..............................................................325
Лабораторная работа Ns 1. Органолептическая оценка мяса и мясных продуктов................................................................348
Лабораторная работа Ns 2. Определение показателей биологической ценности расчетным методом........................................................354
Лабораторная работа Ns3. Определение переваримости мяса и мясных продуктов................................................................358
Лабораторная работа Ns 4. Определение качественных показателей животных жиров....................................................................360
1.	Органолептический анализ............................................363
2.	Определение массовой доли влаги.....................................364
3.	Определение кислотного числа........................................365
4.	Определение степени окислительной порчи жира........................366
Лабораторная работа Ns 5. Определение биологической ценности животных жиров....................................................................374
1. Анализ ненасыщенных жирных кислот спектрофотометрическим методом .............................................................377
6
2. Определение содержания витаминных примесей в пищевых животных жирах..................................................................382
Лабораторная работа Ар 6. Определение свежести мяса и мясных продуктов .385
I.	Органолептический анализ ..........................................388
2.	Физико-химический анализ...........................................389
3.	Определение свежести мяса по микроструктурным показателям .........395
Лабораторная работа 7. Определение степени кулинарной готовности мяса и мясных продуктов .....................................................399
Контрольные вопросы и задания.......................................402
Глава 5. Контаминанты мяса и мясных продуктов ................................404
5.1.	Общая характеристика контаминантов мяса и мясных продуктов...........404
5.2.	Методы контроля безопасности мяса и мясных продуктов ................415
Лабораторная работа Ns 1. Определение микробных контаминантов в мясе......425
1.	Приготовление и бактериологический анализ препаратов.................438
2.	Приготовление посевов и определение физиолого-биохимических и культуральных признаков микроорганизмов....................................439
3.	Ускоренное обнаружение бактерий на основе люминесцентно-серологических методов.........................................................450
Лабораторная работа Ns 2. Определение микробных контаминантов в колбасных изделиях и продуктах из мяса........................................454
1.	Определение общего количества микроорганизмов в 1 г продукта.......458
2.	Определение бактерий группы кишечной палочки в 1 г	продукта........459
3.	Определение бактерий из рода Salmonella............................461
4.	Определение протея.................................................462
5.	Определение коагулазоположительных стафилококков...................463
6.	Определение сульфитредунируюших клостридий.........................464
Лабораторная работа Ns 3. Определение антибиотиков......................466
Лабораторная работа № 4. Определение гормонов...........................468
Лабораторная работа Ns 5. Определение пестицидов........................471
1. Определение хлорорганических пестицидов методом ТСХ................472
2. Определение ФОП энзимохроматографическим методом...................475
Лабораторная работа Ns 6. Определение фенолов в копченых мясных продуктах.478
1. Определение границ проникновения фенолов...........................480
2. Количественное определение фенолов в колбасных изделиях............480
Лабораторная работа № 7. Определение бенз(а)пирена в копченых мясных продуктах...............................................................483
1. Качественное определение бенз(а)пирена.............................485
2. Количественное определение бенз(а)пирена...........................485
Лабораторная работа Ns 8. Определение нитратов и нитритов...............486
1. Определение нитрат- и нитрит-ионов ионометрическим методом.........488
2. Определение нитритов и нитратов фотометрическим методом............490
Лабораторная работа Ns 9. Определение токсичных элементов...............498
1.	Реакции качественного обнаружения токсичных элементов..............506
2.	Качественное и количественное определение мышьяка по Зангер—Блеку....509
3.	Количественное определение свинца нефелометрическим методом .......510
4.	Определение массовой доли свинца, кадмия, меди, цинка методом атомноабсорбционной спектроскопии...........................................512
5.	Количественное определение токсичных элементов полярографическим методом ...............................................................519
6.	Количественное определение токсичных элементов колориметрическими методами..........................................................527
7
Лабораторная работа № 10. Экспресс-определение радионуклидов методами радиометрии.............................................................541
1. Экспресс-определение объемной и удельной активности у-излучаюши.х нуклидов с помошыо радиометра СРП-68-01 ........................... 543
2. Экспресс-определение объемной и удельной активности [З-излучаюши.х нуклидов методом прямого измерения толстых проб.....................544
Лабораторная работа № 11. Определение удельной суммарной р-радиоактив-ности мяса, костей и мясных продуктов по удельной активности зольных остатков................................................................545
Лабораторная работа 12. Определение радионуклидов радиохимическими методами................................................................551
1.	Определение стронция-90 фосфатным методом .........................555
2.	Определение цезия-137 с предварительным концентрированием в виде ферроцианида никеля-цезия.............................................558
3.	Определение цезия-137 сурьмяно-иодидным методом....................562
Контрольные вопросы.................................................565
Рекомендуемая литература .....................................................566
Предметный указатель..........................................................568
Г л а в a 1 АНАЛИЗ ХИМИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
Пищевые продукты представляют собой сложный комплекс химических веществ, в состав которых входят белки, липиды, углеводы, витамины, минеральные соли и вода. Каждая группа веществ выполняет свои определенные функции в жизнедеятельности организма. В процессе приготовления пищи входящие в нее ингредиенты подвергаются биохимическим и физико-химическим превращениям, создавая структуру, вкус, цвет и запах пищевых продуктов.
1.1. БЕЛКИ, ПЕПТИДЫ И АМИНОКИСЛОТЫ
Поступающие с пищей белки в организме человека выполняют важнейшие функции, многие из которых незаменимы. Известно, что белковое голодание в течение нескольких дней приводит к серьезным заболеваниям, а длительное отсутствие в пище белков вызывает смерть человека. Белки содержатся *во всех продуктах питания, но массовая доля их весьма различна. Например, в мясе — 18—22 мае. %, рыбе — 17—20, яйце — 20—36, молоке — 3,5, ржаном хлебе — 7,8 мае. %.
Важность информации о количественном содержании белков связана с определением потенциальных возможностей продуктов питания в покрытии физиологических потребностей организма человека, норма которых составляет около 100 г белка в сутки.
Белки сами по себе не являются незаменимыми компонентами пищи человека. Для нормального питания и поддержания здоровья необходимы содержащиеся в них незаменимые аминокислоты, обязательность наличия которых в пищевых рационах связана с тем, что они не синтезируются животными организмами. В связи с этим весьма важно их качественное и количественное соотношение. Белки, содержащие все незаменимые аминокислоты, называют полноценными. Если в белке нет хотя бы одной незаменимой аминокислоты, то он считается неполноценным. Постоянная нехватка полноценного белка в пище ведет к возникновению анемии, отечности тканей, развитию дегенеративных изменений почек, печени и поджелудочной железы,
9
нарушению умственных способностей, вызывает тяжелые необратимые нарушения физиологических функций.
Большинство белков мяса относится к полноценным, что делает их обязательным компонентом пищи.
Количественное содержание и физико-химические свойства белков определяют поведение пищевых систем под воздействием воды, электролитов, pH среды, окислителей и восстановителей, нагревания и т. д., что имеет весьма важное значение в формировании заданных функционально-технологических и органолептических свойств сырья, полуфабрикатов и готовых мясных продуктов, включая формирование коагуляционно-денатурационной структуры фаршевых изделий, сваривание и гидротермический распад коллагена при доведении продуктов до кулинарной готовности.
Уникальные биологические функции и технологическое значение белков в производстве мясных продуктов тесно связаны с особенностями их химического строения и пространственной структуры, отличающихся разнообразием, динамичностью и наличием внутримолекулярных взаимодействий, способностью изменяться под воздействием внешних факторов в водно-солевых растворах и водных растворах полярных растворителей, восстанавливать исходное состояние, вступать в различные реакции, включая биока-талитические процессы.
В состав мяса и мясопродуктов входят простые и сложные белки, в том числе водо-, соле- и щелочерастворимые, обеспечивающие, например, такие важные функции, как удержание воды, набухаемость и растворимость, а также сложные белки-пигменты, отвечающие за цвет продукта. Белки различаются не только химическим и пространственным строением, но и размерами частиц, а также формой молекул. Последняя включает две группы — фибриллярные и глобулярные, отличающиеся физико-химическими свойствами, прежде всего растворимостью в воде, водно-солевых растворах и водных растворах полярных растворителей, а также способностью к денатурации, гидролизу и другим превращениям.
Белки мяса и мясопродуктов принято разделять по морфологическому признаку клеток мышечных тканей животных (рис. 1.1). Саркоплазматические, миофибриллярные белки и белки стромы обеспечивают функциональность пищевой системы в получении мясопродуктов, а группа ядерных белков самостоятельного технологического значения не имеет.
Фракция суммарных белков саркоплазмы составляет 20—25 % количества всех мышечных белков. Установлено, что белки саркоплазмы способны образовывать гель, особенно в присутствии АТФ. При высоких концентрациях Са2+ гель разжижается. Это связано с присутствием в саркоплазме фрагментов саркоплазматического ретикулума. Очищенные от примесей белки саркоплазмы способность желировать утрачивают.
10
Белки клетки мышечной ткани животных
Рис. 1.1. Белки клетки мышечной ткани животных
Миоген представляет собой комплекс миогенов А, В и С, различающихся кристаллической формой. Обычно под миогеном подразумевается вся миогеновая фракция. Миоген составляет около 20 % всех белков мышечного волокна. Он растворяется в воде, образуя гомогенные растворы небольшой вязкости с массовой долей 20—30 %. Температура денатурации свободного от солей миогена 55—60 °C, изоэлектрическая точка (ИЭТ) лежит в интервале pH 6,0—6,5. С течением времени часть миогена переходит в нерастворимое состояние.
Миоальбумины составляют около 1—2% белков мышечного волокна. Растворимы в воде и нерастворимы в кислой среде, так как имеют изоэлектрическую точку около pH 3,0—3,5; температура денатурации 45—47 °C.
Глобулин X составляет около 20 % общего количества белковых веществ мышечного волокна. Растворим в солевых растворах даже очень низкой концентрации, температура денатурации при pH 6,5 около 50 °C, при pH 7,0 — около 80 °C, изоэлектрическая точка лежит в интервале pH 5,0—5,2.
Миоглобин — хромопротеид, составляющий в среднем 0,6—1,0 % общего количества белков. Он состоит из белковой части — глобина и простетической группы — гема. На одну молекулу миоглобина приходится одна группа гема. В миоглобине не обнаружено цистина. Миоглобин хорошо растворим в воде. Температура денатурации около 60 °C. Денатурация миоглобина сопровождается отщеплением простетической группы. Миоглобин способен присоединять оксид азота, сероводород и кислород за счет дополнительных связей. В последнем случае образуется оксимиоглобин светло-красного цвета, который переходит с течением времени в метмиоглобин коричневого цвета. При этом железо отдает один
И
(коричневый) Fe3*
Рис. 1.2. Взаимопревращения пигментов мяса
электрон. При действии восстановителей метмиоглобин снова образует миоглобин. Последний окрашен в пурпурно-красный цвет и обусловливает естественную окраску мышечной ткани, интенсивность которой зависит от его содержания и соотношения форм пигментов белка. Изменение цветности мяса и мясопродуктов (рис. 1.2) происходит под влиянием микрофлоры, теплового воздействия, посола, света и других факторов. Количество пигментов, глубина их превращений и образование форм соответствующей окраски играют значительную роль в получении продуктов высокого качества. При переходе миоглобина в метмиоглобин пурпурно-красная окраска мяса меняется на коричневую. Она наиболее заметна, когда в мет-форму переходит более 50 % миоглобина. Это свойство широко используется для определения сроков хранения мяса путем выявления соотношения различных спектральных форм миоглобина, а также при регулировании цветности мясопродуктов.
Миозин — фибриллярный белок с асимметрией молекулы 10:1, составляет около 40 % белков клетки мышечной ткани. Гетеро-генен. Обычно под миозином подразумевается вся миозиновая фракция. Миозин — полноценный, хорошо переваримый белок. Совершенно чистый миозин растворим в воде и образует вязкий раствор с массовой долей до 4 % белка. Растворы солей щелочных металлов небольшой молярной концентрации (0,25— 0,04 моль/дм3) осаждают миозин из его растворов; в солевых растворах повышенной молярной концентрации (до 0,6 моль/дм3) он растворяется. Температура денатурации миозина около 45— 50 °C (у птицы около 51 °C); изоэлектрическая точка определяется при pH 5,4. Биологические функции миозина связаны с координированным движением живых организмов и автолитическими превращениями мышечных тканей после убоя животных.
Актин составляет 12—15% всех мышечных белков и является основным компонентом тонких нитей. Этот белок существует в двух формах — глобулярной (Г-форма) и фибриллярной (Ф-фор-ма). В растворах с низкой ионной силой актин существует в виде мономера с относительной молекулярной массой около 47 000.
12
при повышении ИОННОЙ UK1J1D1 pav 1	ztv- 1|7H JNU^ V! r<
уровня Г-актин полимеризуется в Ф-актин, очень похожий на нить. Г-актин представляет собой одну полипептидную цепочку, сложенную в глобулу. Быстрая полимеризация актина происходит также при добавлении ионов Mg2*. При этом образуется двунитчатая спираль, каждая составляющая в которой напоминает нить бус, закрученных одна вокруг другой. Актин относится к полноценным и легкоусвояемым белкам.
Актомиозин — это сложный комплекс, который формируется при добавлении раствора актина к раствору миозина и сопровождается увеличением вязкости раствора. Поскольку цепь Ф-актина содержит много молекул Г-актина, каждая нить Ф-ак-тина может связывать большое число молекул миозина. Рост прекращается при добавлении АТФ или в присутствии ионов Mg2+. Содержание актомиозина указывает на глубину автолитических превращений в процессе трупного окоченения и позволяет опосредованно судить о функциональности мясного сырья в процессе технологической обработки.
Тропомиозин — белок палочковидной формы с относительной молекулярной массой около 70 000, постоянно присутствующий в структуре тонких (актиновых) филаментов. Биологическая роль тропомиозина сводится к регулированию взаимодействия актина и миозина в процессе мышечного сокращения. Массовая доля тропомиозина составляет 10—12 % всех белков миофибрилл или 2,5 % белков мышц. Растворим в воде, но из мышечной ткани водой не извлекается. Изоэлектрическая точка определяется при pH 5,1.
Тропонин представляет собой сферическую молекулу с относительной молекулярной массой 76 000, включающей три субъединицы, аминокислотный состав которых полноценен.
Весьма важной группой сложных белков являются нуклеопротеиды, играющие первостепенную роль в жизнедеятельности организма, в частности в явлениях наследственности. Простети-ческой группой нуклеопротеидов служат нуклеиновые кислоты. Они нерастворимы в воде, но растворяются в щелочах. В их состав входит простой белок, как правило протамин или гистон. При полном гидролизе нуклеопротеидов образуются ос-аминокислоты, рибоза и дезоксирибоза, фосфорная кислота и азотистые основания (пуриновые и пиримидиновые). Массовая доля нуклеопротеидов в мышечной ткани составляет 0,207—0,245 %, где они входят в состав рибосом и саркоплазматического ретикулума. В основном это рибонуклеопротеиды, функции которых связаны с синтезом белков. Нуклеопротеидами богаты ткани мозга, где они представлены нейроглобулином (дезоксирибонуклеопротеидом) и нейро-стромином (рибонуклеопротеидом). Нуклеопротеиды являются полноценными белками, однако, как отмечалось выше, самостоятельного технологического значения не имеют и входят в состав мышечных клеток.
13
В состав перечисленных белков входят все аминокислоты, включая важнейшую из них — триптофан, что послужило основой для оценки количественного содержания полноценных белков в сырье и продуктах.
Из белков стромы важная роль отводится коллагену, эластину и ретикулину, по наличию которых судят о прочностных свойствах соединительных тканей. Это протеиноиды, являющиеся фибриллярными белками упроченной структуры, нерастворимые в обычных растворителях.
Уникальными свойствами обладает коллаген. Фибриллы коллагеновых нитей состоят из субъединиц, называемых тропоколлагеном, в котором /^-группы всех аминокислот находятся на внешней стороне молекулы и мало участвуют в стабилизации структуры. Характерным признаком коллагена является высокое содержание пролина и нестандартной аминокислоты — гидроксипролина (рис. 1.3, а), сумма которых составляет около 21 %. На определении 4-гидроксипролина (оксипролина) основаны многие методы количественного анализа коллагена. Нестандартная аминокислота — гидроксилизин (рис. 1.3, б) также может служить средством идентификации коллагенов.
Коллаген способен сильно набухать в водных растворах, при этом масса его увеличивается в 1,5—2 раза. По этому свойству он уступает лишь миозину мышечной ткани. Высокая гидратация коллагена связана с содержанием в его структуре значительных количеств диамино- и аминодикарбоновых кислот. При смещении pH в кислую или щелочную сторону от НЭТ на-бухаемость коллагена резко увеличивается, при этом масса белка в состоянии полного набухания может достигнуть от 400 до 1000 % к массе сухого белка. Способность коллагена к набуханию имеет большое значение для мясного, желатинового и кожевенного производств.
Вторым важным белком стромы мышечных волокон и соединительных тканей является эластин. Это, по существу, многокомпонентная система, представленная сложными белками —
он
I з
НС,---СНэ
ls 3  1
н2с; ^сн-соон
H а
ОН
H,N-СН,-СН-СН,-СН,-CH-COON 6'|	4'3’2	1
ОН
Рис. 1.3. Структурные формулы нестандартных аминокислот, входящих в состав коллагена:
а — гидроксипролин; б— гидроксилизин
14
гликопротеинами. Подобно коллагену эластин ooiai иищии^» .. аланином. Тропоэластин отличается от тропоколлагена большим содержанием лизина, но малым — пролина. Суммарное содержание глицина, аланина, валина и пролина в эластине составляет почти 70 %. Из-за малого содержания кислых и основных аминокислот молекула эластина практически неполярна. В водной среде цепи эластина принимают форму глобул. Гидрофобные цепи аминокислот, образующие соответствующие связи, спрятаны внутри молекулы, окруженной водой. В результате свободная энергия системы минимальна. Точная структура эластина, к сожалению, пока не идентифицирована. В то же время установлено, что он очень устойчив: не растворяется в холодной и горячей воде, солевых растворах, разбавленных растворах кислот и щелочей. Даже концентрированная серная кислота оказывает на него слабое воздействие. Он не образует желатин, практически не расщепляется пищеварительными ферментами.
Ретикулин также входит в состав стромы мышечных волокон и соединительных тканей. Подобно коллагену и эластину он является гликопротеином, неполярен, очень устойчив, плохо усваивается организмом.
Таким образом, группа соединительнотканных белков имеет общие свойства и структурные признаки. Именно они используются в исследовательской практике для оценки пищевой ценности сырья и продуктов путем их количественного анализа, например, при определении сорта мяса, а также пищевой ценности по соотношению триптофана и оксипролина.
В соответствии с современной теорией питания роль соединительнотканных белков пересмотрена. Установлено положительное влияние ингредиентов соединительной ткани на процесс пищеварения. Показано, что коллаген и эластин обладают свойствами пищевого волокна, проявляют радиопротекторные свойства, активно стимулируют секреторную и двигательную функции желудка и кишечника, оказывают благоприятное действие на состояние и функцию полезной кишечной микрофлоры. На основе коллагена и других белков соединительной ткани создаются биологически ценные пищевые продукты и добавки с лечебно-профилактическим эффектом. Для рационального использования сырьевых ресурсов и создания биологически полноценных продуктов, обеспечивающих здоровье человека, весьма важно дозированное введение соединительных тканей в рецептурные композиции, что возможно лишь на основе количественного анализа соответствующих ингредиентов.
Гистидинсодержащие дипептиды являются специфической составной частью скелетной мускулатуры. Из мышечной ткани животных и человека они были выделены в начале века русским биохимиком В. С. Гулевичем. Установлено, что эти вещества выполняют ряд важных функций в процессе обмена веществ и энергии
15
при жизни, участвуя в процессах окислительного фосфорилирования, происходящих в мышцах при образовании макроэргических фосфатных соединений (АТФ и креатинфосфата). Входя в состав мышечной ткани, гистидинсодержащие дипептиды стимулируют секреторную функцию пищеварительных желез. К ним относятся: карнозин — дипептид, состоящий из остатков р-аланина и гистидина, и ансерин — гомолог карнозина, р-аланил-1-метилгистидин (метилированный карнозин).
р==^---СНэ-СН-СООН
N. NH NH I co-(ch2)2-nh2
Карнозин
р: —:  СН2-СН-СООН
N^^N-СНз NH
CO-(CH2)2-NH2
Ансерин
В скелетных мышцах убойных животных содержание карнозина и ансерина колеблется в пределах 0,014—1,000 %.
Кровь — жидкая соединительная ткань животного организма, которая циркулирует в артериях, венах и капиллярах. Представляет собой непрозрачную жидкость красного цвета со слабощелочными свойствами (pH 7,3—7,5), специфического запаха и солоноватого вкуса. На долю крови приходится в среднем у крупного рогатого скота 7,5 % живой массы, у свиней — 4,5, у овец — 7 и у птицы — 8 %. Кровь вместе с лимфой и тканевой жидкостью, окружающей клетки, является внутренней средой организма, которая объединяет органы с тканями и выполняет ряд весьма важных прижизненных функций (доставка молекулярного кислорода и питательных веществ к клеткам организма, освобождение тканей от углекислоты и продуктов распада). Дыхательная, питательная, выделительная, защитная, регуляторная функции крови обеспечиваются определенными ее компонентами, а в целом кровь представляет собой сложную многокомпонентную систему. После убоя животных кровь частично остается в капиллярах и потому является неотъемлемой составляющей мяса. В настоящее время кровь приобретает огромное значение и как самостоятельное сырье для производства антианемических продуктов, фракции крови используются для структурирования пищевых систем, придания окраски продуктам, получения эмульсий, обогащения продуктов органическим железом, которое в 4—6 раз быстрее усваивается организмом по сравнению с другими источниками. В связи с вышеизложенным анализ веществ и компоентов крови необходим для расширения спектра максимального и рационального использования этого важного сырья.
16
Кровь состоит из жидкой части — плазмы и взвешенных в ней форменных элементов. К форменным элементам относятся: эритроциты (красные кровяные тельца), лейкоциты (белые кровяные тельца), тромбоциты (кровяные пластинки, бляшки). В крови разных видов животных массовая доля форменных элементов неодинакова: в среднем у крупного рогатого скота 33 %, у мелкого — 28, у свиней — 43,6 % к массе крови.
Кровь, лишенная форменных элементов (например, центрифугированием с соблюдением мер предосторожности против свертывания), представляет собой плазму. На долю растворимых веществ плазмы крови приходится 9—10 % ее массы, из них около 7 % составляют белки, остальная часть состоит из липидных компонентов, азотистых и безазотистых экстрактивных и минеральных веществ.
Плазма крови, из которой выделен белок фибриноген (предшественник фибрина), называется сывороткой.
Белки крови как пищевое сырье эффективнее, чем другие белки, могут восстанавливать белки плазмы и гемоглобин в организме. В связи с этим среди пищевых белков одно из первых мест принадлежит именно им. Массовая доля белков в цельной крови зависит от вида, возраста, упитанности, условий предубойного содержания животных и в среднем составляет: у крупного рогатого скота 17,41 %, баранов — 16,59, свиней — 2,25 %. При этом в среднем 6,8—7,3 % белков находится в плазме, 30,3—32,7 % — в форменных элементах. Основная масса белков крови представлена альбуминами, глобулинами, фибриногеном и гемоглобином.
По аминокислотному составу наиболее полноценным является фибриноген, в структуре которого содержится 3,5 % триптофана, 7,0 % фенилаланина, 2,6 % метионина.
Фибриноген — основной компонент системы свертывания крови. Он нерастворим в воде, но хорошо растворим в разбавленных растворах нейтральных солей и щелочах, осаждается сульфатом магния и хлоридом натрия ранее, чем наступает полное насыщение. Таким образом, фибриноген близок по своим свойствам к глобулинам. Фибриноген быстро усваивается.
Сывороточные альбумин и глобулин также содержат полный набор незаменимых аминокислот, хотя и в меньшем количестве. Особенно мало содержание триптофана в сывороточном альбумине. Гемоглобин нельзя отнести к полноценным белкам, так как в нем отсутствует изолейцин. Однако содержание других незаменимых аминокислот в нем довольно высокое. Поэтому в сочетании с другими белками крови £го можно рассматривать как важнейший источник жизненно необходимых аминокислот.
17
Рис. 1.4. Схема гема
таким ооразом, пищевая и биологическая ценность крови тесно связана с наличием природного пигмента — гемоглобина. Это сложный белок, состоящий из окрашенной простети-ческой группы гема (рис. 1.4) и бесцветной белковой части — глобина. Молекула гемоглобина по своей форме приближается к сфере диаметром около 5,5 нм, относительная молекулярная масса 64 500, ИЭТ при pH 5,5. Гемоглобин в кислой и щелочной средах диссоциирует на гем и глобин. Так, если добавить раствор гемоглобина к смеси ацетон — НС1, то глобин осаждается, а гем остается в растворе.
Особенно полезна информация о количестве гемоглобина как
источника органического железа, усвояемость которого прямо пропорциональна содержанию гемовых пигментов (табл. 1.1).
Таблица 1.1
Формы железа и его усвояемость для различных видов мяса
Мясо и мясопродукты	Массовая доля железа, %		Коэффициент усвояемости железа, %
	гемового	негемового	
Говядина	20,2	79,8	18
Свинина	15,3	84,7	16
Баранина	18,3	81,7	17
Птица	18,3	81,7	17
Печень	28,0	72,0	14
Кровь	69,3	30,7	31
Концентрация гемоглобина в крови зависит от вида животного и количества эритроцитов. Гемоглобин разных животных разнится аминокислотной последовательностью. Гемоглобин выполняет функцию дыхательного белка — переносчика кислорода. При воздействии на гемоглобин окислителей железо гема переходит в трехвалентную форму и образует подобно миоглобину метгемоглобин. Изменение валентности связано с изменением цвета продукта от ярко-алого до коричневого, что имеет прямое технологическое значение. Некоторые фракции белков плазмы крови обладают желирующими свойствами. Сывороточный альбумин спосо
18
бен желировать плазму. с>тот факт открываем huddiv использования крови для пищевых целей, особенно при получении структурированных продуктов, и ставит перед технологами задачу отработки и внедрения методов исследования компонентов крови.
Использование крови и ее фракций для пищевых целей, в том числе для создания нетрадиционных лечебно-профилактических и специальных продуктов, актуально для решения задач рационального использования ресурсов, организации безотходных технологий на мясокомбинатах, улучшения экологических условий производства.
В аналитической практике известно достаточно много методов определения белков. Наиболее распространены метод Кьельдаля и его известные модификации, основанные на минерализации проб и количественном определении азота.
Получившие в последнее время распространение ускоренные фотометрические методы (рис. 1.5) имеют существенные преимущества по сравнению с классическим методом Кьельдаля. Основные из них — простота и быстрота выполнения — позволяют использовать эти методы для массовых анализов и проведения оперативного контроля качества сырья и готовой продукции по содержанию белка.
Эти методы весьма перспективны, особенно для однородных систем, и основаны на непосредственном фотометрирова-нии пробы.
Метод Лоури основан на реакции взаимодействия фенольного реактива Фолина—Чокалтеу с щелочными растворами белков, приводящей к образованию продуктов реакции синего цвета. Интенсивность окраски зависит от содержания в исследуемом белке тирозина и триптофана. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют при длине волны 750 нм. Метод рекомендуется для определения массовой доли белка в сильно разбавленных растворах, при наблюдении за ходом ферментативных процессов, для определения белков сыворотки крови, яичного альбумина, белков молока, фракционированных растительных белков, белков митохондриальных фракций и мембран.
Рис. 1.5. Экспресс-методы определения белков в мясе и мясных продуктах
19
,____х.с. w|jdJuiidHnn сине-фиолетовой
окраски при воздействии на белки сульфата меди в присутствии щелочи. Природа белка почти не влияет на формирование окрашенного биуретового комплекса, который возникает за счет присоединения ионов меди к пептидным связям белка. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют при длине волны около 540 нм. Преимущества метода — возможность применения стандартного белка, например сывороточного альбумина, для построения калибровочного графика, воспроизводимость и точность.
Методы определения массовой доли белка по связыванию красителей основаны на способности белков при pH ниже изоэлектрической точки (pH 2—4) присоединять кислые красители с образованием нерастворимых комплексов, после удаления которых измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора (фильтрата):
Белок + Краситель —> Белок-краситель (осадок) +
+ Краситель (раствор несвязавшегося красителя).
Оптическая плотность фильтрата уменьшается с увеличением массовой доли белка. Методы рекомендуются для количественного определения белка в образцах сырого мяса, а также в продуктах кулинарной степени готовности после различных видов технологической обработки (варки, запекания, копчения и т. д.).
Методы УФ-спектроскопии основаны на способности белковых растворов поглощать свет при длине волны около 280 нм благодаря присутствию в структуре белков аминокислот триптофана, тирозина и фенилаланина. Результаты определения прямо пропорциональны содержанию этих аминокислот в белках. Преимущества метода — малая трудоемкость, несложная подготовка проб, быстрота и простота анализа; предел чувствительности 10— 20 мкг/см3. Методы рекомендуются для количественной оценки содержания белков в элюатах после разделения белковых смесей методом электрофореза или хроматографии, определения белков в мясных, яичных и бобовых продуктах.
К высокоточным методам относятся хроматографические.
Хроматография — метод разделения смесей газов, жидкостей, растворенных веществ путем сорбции в динамических условиях. В простейшем варианте разделение происходит при прохождении потока анализируемой смеси через колонку, содержащую сорбент. Вследствие различной сорбируемости компонентов смеси достигается их разделение по высоте сорбента при повторяющихся циклах сорбция — десорбция.
Известно несколько подходов к классификации методов хроматографии с использованием различных признаков:
20
по средам, в которых проводится разделение (жидкостная, газожидкостная, газовая);
по механизму разделения (молекулярная или адсорбционная, ионообменная, осадочная, комплексообразовательная, окислительно-восстановительная);
по форме проведения процесса (колоночная, капиллярная, хроматография на бумаге и в тонком слое);
по способу проведения процесса (фронтальная, вытеснительная, проявительная).
В табл. 1.2 хроматографические методы систематизированы по подвижным и неподвижным фазам, форме проведения процесса и принципу разделения.
Таблица 1.2
Классификация методов хроматографии по принципу разделения
Методы хроматографии	Подвижная фаза (ПФ)	Неподвижная фаза (НФ)	Форма неподвижного слоя	Принцип разделения
Жидкостная:				
твердо-жидкостная	Жидкость	Твердая	Колонка	Адсорбционный
жидкостно-жидкостная	»	Жидкость	»	Распределительный
ионообменная	»	Твердая	»	Ионный обмен
Газовая:				
газоадсорбционная	Газ	»	»	Адсорбционный
газожидкостная	»	Жидкость	»	Распределительный
Гель-хроматография	»	»	»	По размерам молекул
Хроматография в тонком слое	»	Твердая	Тонкий слой	Адсорбционный
Хроматография на бумаге	»	Жидкость	Хроматографическая бумага	Распределительный
Аффинная	»	Лиганд	Колонка	Адсорбционный
По области применения хроматографические методы делятся:
на аналитические (установление качественного и количественного составов смесей);
неаналитические (исследование физико-химических характеристик сорбатов — давления пара, теплоты растворения, коэффициентов активности);
21
v1	чемие веществ в чистом и особо чис-
том виде);
промышленные (получение индивидуальных веществ, например лекарственных препаратов, в больших количествах).
Каждый хроматографический метод по мере развития сопровождался возникновением новых вариантов. Например, адсорбционная и распределительная хроматография осуществляется на колонках (колонки могут иметь различную форму и конструкцию), фильтровальной бумаге и в тонком слое сорбента, нанесенном на стеклянную пластинку. В зависимости от этих факторов различают следующие варианты: колоночная, хроматография на бумаге, хроматография в тонком слое.
Жидкостная хроматография (ЖХ) — метод разделения и анализа сложных смесей, в котором подвижной фазой является жидкость. Метод ЖХ характеризуется более широким кругом анализируемых объектов, чем газовая хроматография, поскольку большинство веществ не обладает достаточной летучестью, многие неустойчивы при высоких температурах (особенно высокомолекулярные соединения) и разлагаются при переходе в газообразное состояние. В методе ЖХ разделение проводят, как правило, при комнатной температуре. Особенности различных вариантов ЖХ обусловлены физико-химическими свойствами жидкой подвижной фазы.
Газовая хроматография (ГХ) — метод разделения и определения летучих соединений. Компоненты анализируемой смеси распределяются между неподвижной фазой (твердое вещество или жидкость) и газом-носителем (подвижная фаза).
Твердая неподвижная фаза применяется в газоадсорбционной хроматографии (ГАХ). Разделение обусловлено адсорбционными свойствами наполнителя колонки по отношению к разделяемым соединениям, преимущественно газам. Распространенные адсорбенты — силикагель, активированный уголь, молекулярные сита и цеолиты.
Жидкая неподвижная фаза применяется в газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Она распределяется в виде тонкой пленки на поверхности инертного твердого носителя. Большой выбор жидких фаз, позволяющий работать в широком температурном диапазоне (20—400 °C), делает ГЖХ наиболее селективным хроматографическим методом разделения не только жидких, но и некоторых твердых соединений. Низкие пределы обнаружения, экс-прессность, точность и простота операций обеспечили методу ГЖХ широкое применение для анализа сложных объектов.
Гель-хроматография — метод разделения веществ, основанный на различии размеров их молекул. Метод известен под названиями «гель-проникающая», «эксклюзионная» и «молекулярно-ситовая хроматография». Последнее название наиболее полно отражает сущность метода, однако более распространен термин «гель-проникающая хроматография».
22
В качестве неподвижной фазы применяют гели, имеющие определенный размер пор; подвижной фазы — водные иди органические элюенты. Наиболее простое объяснение механизма разделения в гель-хроматографии состоит в том, что молекулы анализируемых веществ распределены между неподвижным растворителем в порах сорбента и элюентом, протекающим через слой неподвижной фазы. Молекулы с размером, позволяющим проникать в поры сорбента при движении вдоль колонки, задерживаются в порах. Молекулы, имеющие размеры большие, чем поры, не проникают в сорбент и вымываются из колонки со скоростью движения элюента. Молекулы, проникающие в поры всех размеров, движутся наиболее медленно. Снижение скорости движения компонентов вдоль колонки прямо связано с количеством пор, в которые способны диффундировать распределяемые частицы.
Таким образом, методом гель-хроматографии можно разделять смеси веществ в зависимости от размеров их молекул. Выход компонентов из колонки происходит в порядке снижения их молекулярных масс. Вытекающие из колонки растворы анализируют различными методами, например спектрофотометрическим, фотометрическим, титриметрическим.
Наиболее широкое распространение среди носителей для гель-хроматографии белков получили сорбенты, приготовленные на основе декстрана (сефадексы, сефакрилы, молселекты), полиакриламида (биогели Р, акрилексы), агарозы (сефарозы, биогели А) и др. Набухая в воде, они образуют гели.
Номер в маркировке сефадекса означает его пористость. Выбор определенной марки сефадекса определяется молекулярной массой исследуемого белка (чем больше соответствие размеров молекул и величины пор, тем выше селективность), а степень зернения зависит от поставленной задачи. Для обессоливания растворов белков и их концентрирования обычно используют сефадексы G-25 и G-50 (грубый или средний). При разделении же смеси белков пользуются сефадексами тонкого или сверхтонкого зернения. Чем мельче частицы геля, тем эффективнее происходит разделение, но тем меньше скорость протекания раствора через колонку.
Гели готовят путем насыщения водой или элюентом в течение 5—20 ч соответствующего гелеобразователя (сефадекс, полиакриламид и др.). Продолжительность и температура насыщения указаны на упаковке препарата.
Ионообменная хроматография основана на динамическом стехиометрическом обмене ионов между анализируемым раствором и ионообменником (ионитом). Этот метод широко применяется при анализе, разделении и очистке органических и неорганических соединений, ионизирующих в водных и неводных растворителях. Объем удерживания зависит от изменения свободной энергии реакции ионного обмена. Соотношение концентраций
23
ооменивающихся ионов в растворе и в фазе сорбента определяется ионообменным равновесием.
При фракционировании белков методом ионообменной хроматографии большое внимание уделяют выбору ионообменника (природе материала и емкости ионита) и буферного раствора (величине pH и ионной силы, природе буфера и буферной емкости), при котором осуществляется сорбция веществ.
При работе с белками в качестве сорбентов используют иониты, обладающие высокой степенью гидрофильности.
Белки могут быть разделены как на катионитах, так и на анионитах. Выбор типа ионита определяется изоэлектрическими точками хроматографируемого материала и устойчивостью белка в определенной зоне значений pH.
Эффективная сорбция белков происходит при значениях pH, отстоящих от р! не менее чем на единицу. В области pH < pl — 1 белки можно исследовать на катионитах, а в области pH > pl + 1 — на анионитах. Изменение pH в направлении к ИЭТ способствует десорбции белков. При работе с белками используют буферные растворы с низкой ионной силой, но высокой буферной емкостью. Для этого пользуются буферными растворами, рК которых отстоит от величины pH, используемой в эксперименте, не более чем на 0,3—0,5 единицы pH. Хроматографию на анионитах ведут в таких системах, где диссоциируемым компонентом является катион (буферы: трис, пиридин, имидазол и др.), а для катионитов — анион (ацетатный, фосфатный, бикарбонатный буфер и др.).
При ионообменной хроматографии смесь белков сорбируется в верхней части колонки и затем вытесняется веществами, уменьшающими их сорбцию на ионите. Понижение сорбции осуществляют повышением ионной силы раствора и (или) изменением его pH. Изменение pH и ионной силы элюирующего буферного раствора можно проводить путем создания ступенчатого или градиентного элюирования.
Разделение аминокислот методом ионообменной хроматографии проводят обычно на синтетических смолах — катионитах, представляющих собой сополимеры стирола с дивинилбензо-лом. Роль ионогенных группировок в них играют сульфогруппы (—SO3H). Такие смолы являются сильными электролитами и диссоциируют при любых значениях pH на БО3-ионы, прочно связанные со смолой, и противоионы Н+, переходящие в раствор. Во избежание закисления буферных растворов, окружающих смолу, ионы Н+ в ней замещают на ионы Na+, т. е. используют смолу в форме SO3Na. Для того чтобы осуществить сорбцию аминокислот на смоле путем обмена с ионами Na, их переводят в форму Na-катионитов. С этой целью аминокислоты помещают обычно в Na-цитратный буферный раствор при pH 2,2.
24
При этом значении pH все аминокислоты несут положительный заряд и находятся в виде катионов
NHt
R\
соон
Степень прочности сорбции и десорбция на смоле разных аминокислот, определяемая главным образом величинами зарядов молекул, различна. Наиболее прочно на смоле сорбируются диаминокислоты и наименее прочно — дикарбоновые аминокислоты. Разделение аминокислот при ионообменной хроматографии происходит при десорбции их со смолы элюирующими буферными растворами, отличающимися от исходного буферного раствора большими величинами pH и (или) ионной силы. Обычно для элюирования кислых и нейтральных аминокислот используют Na-цитратные буферные растворы с pH 3,25 и 4,25. Для десорбции со смолы наиболее прочно связанных (основных) аминокислот используют более щелочной Na-цитратный буферный раствор со значением pH 5,28 и более высокой ионной силой (0,35 моль/дм3).
Разделение аминокислот на колонках в настоящее время проводят автоматически в специальных приборах, называемых анализаторами аминокислот. Погрешность определения на этих приборах для многих аминокислот достигает 0,1 %. Для работы на этих анализаторах требуется 0,3—1 мг белка.
Метод широко используется при определении состава свободных аминокислот и связанных в структуре белков и пептидов.
Хроматография в тонком слое (ХТС) — один из простейших методов хроматографического анализа, разделение компонентов при котором происходит при перемещении подвижной фазы через нанесенный на подложку (пластинку) тонкий слой сорбента. Продвижение элюента (подвижная фаза) по сорбенту (неподвижная фаза) обеспечивается капиллярными силами.
Хроматография в тонком слое основана на принципах распределительной и адсорбционной хроматографии.
В качестве носителей при тонкослойной хроматографии чаще всего используют измельченный силикагель или порошок целлюлозы, а также оксид алюминия, кизельгур, крахмал, сефадекс и др. В последнее время широкое распространение получил метод разделения аминокислот на пластинках, покрытых ионообменной смолой. В качестве растворителей используют системы с органическими растворителями различной степени полярности. Тонкослойная хроматография имеет ряд преимуществ по сравнению с хроматографией на бумаге: она характеризуется быстротой разделения (30—60 мин в зависимости от размеров пластинки), большей чувствительностью метода (при-
25
мерно в 1U раз) и устойчивостью слоя сорбента по отношению к агрессивным проявителям и нагреванию.
Хроматографию на пластинках проводят в закрытых стеклянных камерах, предварительно насыщенных парами растворителя, восходящим способом, при комнатной температуре или при нагревании, одномерным или двухмерным способом. Последний (второй растворитель движется по пластинке в направлении, перпендикулярном к первому) используют для повышения эффективности метода. Часто тонкослойную хроматографию сочетают с электрофорезом (метод пептидных карт). В этих случаях пробу наносят в виде небольшого пятнышка (<У~2—Змм) в один из углов пластинки на расстоянии 20 мм от ее краев. При одномерном хроматографировании пробы наносят на пластинку в виде полос.
Многие коммерческие сорбенты для тонкослойной хроматографии содержат флуоресцентные красители, что позволяет идентифицировать разделяемые соединения, поглощающие электромагнитные волны в ультрафиолетовой области спектра.
В настоящее время разделение аминокислот (гидролизатов белков) методом тонкослойной хроматографии осуществляют на пластинках, покрытых тонким слоем ионообменной смолы полистирольной природы с сульфокислотными группировками (типа Дауэкс 50x8) или ионообменной целлюлозой. Такие пластинки выпускаются промышленностью, например «Фикси-он 50 х 8» (Венгрия), или могут быть приготовлены непосредственно в лаборатории.
Сочетание процессов ионообменной и тонкослойной хроматографии при разделении на пластинках «Фиксион 50 х 8» обусловливает высокую разрешающую способность этого метода.
Пластинки могут быть использованы для разделения аминокислот, олигопептидов, аминов и др.
Метод хроматографического разделения на бумаге основан на различной растворимости разделяемых веществ в двух мало смешивающихся жидкостях, одна из которых удерживается бумагой, а другая подвижна. Неподвижной фазой служат полосы фильтровальной бумаги, которые, будучи помещенными во влажную камеру, удерживают до 20—22 % влаги, оставаясь внешне сухими. В качестве подвижной фазы обычно используют органический растворитель, насыщенный влагой. Чем больше растворимость аминокислот или пептидов в неподвижной фазе, тем медленнее они движутся при продвижении органического растворителя по бумаге и наоборот. Скорость движения будет определяться коэффициентом распределения, характерным для вещества в данной системе растворителей:
где сНф, <?пф — соответственно концентрация в неподвижной и подвижной фазе. 26
Следовательно, относительное расположение анализируемых веществ на хроматограмме для данной системы растворителей постоянно и характеризуется величиной коэффициента скорости движения.
у п расти
’	(1-2)
° фр
где 5р1СТВ — расстояние. пройденное растворенным соединением; 5фр — расстояние, пройденное фронтом растворителя.
Тем не менее следует учитывать, что воспроизводимость значения Rf зависит от качества бумаги, постоянства температуры, степени чистоты растворителей, однотипности процедур и аппаратуры и т. д.
При разделении аминокислот и пептидов обычно пользуются трехкомпонентными системами: к насыщенному влагой органическому растворителю добавляют кислоты, основания, некоторые спирты, кетоны и др. Это приводит, во-первых, к повышению растворимости воды в подвижной фазе (увеличению гидрофильности системы), во-вторых, к изменению диссоциации кислых и основных групп разделяемых соединений. Вследствие этого кислоты замедляют движение оснований, а основания — кислот.
На практике для разделения аминокислот и пептидов основного характера используют системы, содержащие фенол и крезол, для нейтральных — смеси с бутиловым спиртом и уксусной кислотой или с амиловым спиртом, а для кислых аминокислот и пептидов — системы, содержащие соединения основного характера (обычно пиридин). Если соединение плохо растворимо в подвижной фазе и остается на стартовой линии, следует увеличить гидрофильность системы, например, добавив муравьиную кислоту, метанол или формамид. Если же вещество хорошо растворимо в подвижной фазе и движется вместе с фронтом растворителя, следует использовать органический растворитель с более выраженными гидрофобными свойствами, например изоамиловый, бензиловый спирты и др.
Для лучшего разделения соединений с близкими значениями Rf> а также для увеличения величин часто проводят хроматографирование в нескольких (обычно двух) системах растворителей, пропуская второй растворитель в том же направлении, что и первый. Это приводит к уплотнению пятен разделяемых соединений в направлении, перпендикулярном к пропускаемому растворителю, и способствует их лучшему разделению. Более полного разделения аминокислот и пептидов можно добиться при двухмерной хроматографии (второй растворитель пропускают в направлении, перпендикулярном к первому) или при сочетании хро-
27
монографии (одно направление) и электрофореза (второе взаимно перпендикулярное направление). Последний метод носит название метода «пептидных карт» или «отпечатка пальцев».
При повторном разделении в системах растворителей положение пятна на хроматограмме устанавливают путем определения значений коэффициента относительной скорости движения
у
г> _ рас гв
(1.3)
kJCI
где 5 в — расстояние, пройденное растворенным соединением; 5СТ —расстояние. пройденное стандартным веществом (смесью).
В качестве стандартного можно использовать одно из веществ разделяемой смеси. Получаемые значения Аст являются более воспроизводимыми, чем величина R?.
Разделение веществ методом бумажной хроматографии проводят в специальных камерах. Для получения одномерной хроматограммы на полоску хроматографической бумаги шириной 1,5—5 см и длиной 20—70 см наносят исследуемый раствор (0,005—0,007 см3) на расстоянии нескольких сантиметров от верхнего края бумаги, который погружают в растворитель (нисходящая хроматограмма), или исследуемый раствор наносят на расстоянии нескольких сантиметров от нижнего края бумаги, который погружают в ванночку с растворителем, а верхний конец закрепляют (восходящая хроматограмма).
При получении нисходящей хроматограммы (рис. 1.6) лист бумаги подвешивают в камере, погрузив верхний край в кювету с растворителем. Под действием силы тяжести и капиллярных сил растворитель продвигается сверху вниз и по достижении края листа стекает на дно камеры. Чтобы поток был равномерным, нижний край листа нарезают зубцами.
Восходящую хроматограмму (рис. 1.7) вследствие слабой механической прочности бумаги подвешивают на специальных держателях. Растворитель поднимается до верхнего края листа бумаги за счет капиллярных сил. При этом все компоненты анализируемой смеси остаются в пределах листа. Это особенно важно в том случае, когда разделяют вещества с неизвестной подвижностью. Тогда по полученной хроматограмме можно определить
Рис. 1.6. Камера для получения нисходящей хроматографии:
я —общий вид камеры; б— расположение листа бумаги; 7 — кювета для растворителя; 2— стеклянная палочка для фиксации листа бумаги; 3— антисифонная палочка; 4— подставка; 5 — лист бумаги; 6 — камера; 7 — зуб-
а	б	цы на бумаге
28
коэффициент распределения Rf всех компонентов смеси.
Как только растворитель достигает намеченного рубежа, лист извлекают из камеры, отмечают положение фронта растворителя и высушивают. Поскольку большинство веществ лишено окраски, их положение на хроматограмме выявляют подходящим способом. Например, вещества, несущие радиоактивную метку, выявляют при помощи счетчиков импульсов; вещества, имеющие собственную флуоресценцию, выявляют при облучении УФ-светом (365 нм). Остальные вещества обычно обнаруживают
Рис. 1.7. Камера для выполнения восходящей хроматографии:
а. б — способы фиксации бумаги в держателе; в, г—способы размещения бумаги в камере
по окрашенным продуктам, которые образуются под действием специфических реагентов. Так, аминокислоты и полипеп-
тиды образуют с нингидрином хромофор, имеющий фиолетовую окраску.
Аффинная хроматография основана на установлении обратимых молекулярных взаимодействий, присущих биологически активным веществам. Этой способностью обладают иммунные,
ферментные и гормональные системы; белки, которые могут переносить различные малые молекулы (витамины, жирные кислоты и др.) после связывания этих молекул за счет сродства, и нуклеиновые кислоты, способные соединяться между собой или с
некоторыми белками.
В аффинной хроматографии используют нерастворимый носитель, на котором иммобилизуется соединение, называемое лигандом. Он особым образом связывает подлежащий очистке продукт, находящийся в подвижной, обычно жидкой фазе. Лиганд удерживается за счет ковалентных связей, иногда пользуются ионным обменом, адсорбцией, микроинкапсулированием и др.
Аффинная хроматография — разновидность адсорбционной, при которой связывание происходит в соответствии со специфическими свойствами двух молекул. Она основана на разных взаимодействиях: ионных, водородных, гидрофобных и других в зависимости от конформации и размера молекул.
В любом случае методы хроматографии основываются на всех возможных различиях молекул. Поскольку эти методы требуют соответствующего материально-технического оснащения, при вы-
29
к^пкрс! hoi о варианта или способа следует обращать внимание на доступность оборудования, стоимость и дефицитность реактивов.
Для практики анализа белковых веществ хроматографическими методами рекомендуется использовать данные табл. 1.3, которые дают информацию о предпочтительности того или иного метода при определении белков, пептидов, аминокислот.
Таблица 1.3
Краткое руководство к выбору методов хроматографии
Хроматографический метод	|	Белки	Пептиды	Аминокислоты
1. Распределительная на бумаге	—	4-	+
2. Адсорбционная в тонком слое	—	4~ 4~	4—f-
3. Проникающая	+++	4-	—
4. Газожидкостная		—	4—h
5. Ионообменная	+	4-4-	+++
6. Аффинная	4-4-4-	+	—
Примечание: «—» — не применяются; «+» — применяются, «++» — достаточно часто применяются; «+++» — часто применяются, наиболее предпочтительны.
С развитием современной теории питания, необходимостью разработки биологически полноценных белковых пищевых продуктов на основе комбинирования и имитации знания и практический навык в анализе белковых веществ имеют огромное значение для решения актуальных задач отрасли. В настоящее время существует множество подходов и методов хроматографии, однако лишь некоторые из них доступны и нашли достаточно широкое распространение.
Для создания продуктов с заданным составом аминокислот, расчета показателей биологической ценности необходима информация о полном составе аминокислот, т. е. их сумме в составе белков, пептидов и свободных аминокислот.
Путем анализа свободных аминокислот можно прогнозировать свойства готовых изделий, так как многие из них являются сильными вкусообразователями. Экстрактивные азотистые вещества, присутствующие в мясе, по химической природе большей частью пептиды, также участвуют во вкусообразовании.
Таким образом, возникает необходимость общего и дробного анализов белковых веществ.
Наибольшее распространение получила колоночная хроматография для проведения проникающей или ионообменной хроматографии, а также распределительная хроматография на бумаге и адсорбционная в тонком слое.
30
Простейшее устройство для хроматографического разделения на колонках изображено на рис. 1.8.
Колонки — полые стеклянные трубки, размер которых зависит от цели работы и способа разделения. В основание колонки припаивают пористую стеклянную пластинку или перфорированный диск. Необходимо следить за тем, чтобы «мертвое» пространство под диском, между ним и основанием колонки, а также внутренний диаметр шлангов, по которым выходящий из колонки элюат поступает в коллектор фракций, было минимальным. В противном случае произойдет смешивание уже разделенных веществ. Коммерческие колонки снабжены специальными приспособлениями — концевыми адапторами переменной длины, которые позволяют регулировать длину колонки и сводят к минимуму перемешивание элюируемых фракций.
Заполнив колонку до нужной высоты, закрывают нижний кран (зажим) и дают суспензии осесть, не допуская «высыхания» наполнителя в колонке (для этого над верхним слоем сорбента всегда должен находиться слой растворителя). Следят также за тем, чтобы верхний слой наполнителя имел гладкую горизонтальную поверхность. Для уменьшения взмучивания верхнего слоя при внесении в колонку образца над ним иногда помешают кружок фильтровальной бумаги или поролона. Колонку закрывают пробкой с отводом или со стеклянной трубкой и присоединяют к ре-
Рис. 1.8. Принципиальная схема устройства для колоночной хроматографии:
1 — сосуд с раствором высокой концентрации; 2— сосуд-смеситель; 3— магнитная мешалка; 4— перистальтический насос; 5— колонка; 6— УФ-детектор; 7— коллектор фракций
31
зервуару, содержащему элюирующий раствор. Для поддержания постоянного давления и сохранения постоянной скорости тока жидкости через колонку используют склянку Мариотта или насосы различных конструкций.
Образец можно вносить в колонку несколькими способами. Самый простой из них заключается в следующем: осторожно удаляют жидкость с поверхности наполнителя, оставляя слой в 1—2 мм; при помощи пипетки осторожно вносят образец и, открыв нижний кран, дают ему впитаться; остатки образца над сорбентом смывают небольшой порцией элюента; после того как он впитается поверхностью наполнителя, добавляют новые порции элюирующего раствора, создавая слой в 5—10 см. Другой способ внесения образца, при котором избыток жидкости не удаляют из колонки, заключается в увеличении плотности раствора образца путем добавления сахарозы до концентрации 0,5 моль/дм3. Раствор образца при этом спускают под слой растворителя, в результате чего он быстро впитывается в верхний слой наполнителя.
После нанесения образца колонку соединяют с верхним резервуаром, путем изменения рабочего давления устанавливают необходимую скорость истечения элюирующего раствора и с помощью коллектора начинают сбор фракций. Собирать фракции элюата необходимо с момента нанесения образца на колонку. Фракции можно собирать в пробирку по объему (с помощью сифонов), по определенному количеству капель или через определенные промежутки времени.
Элюирование с колонок, как правило, проводят растворами, изменяя pH, ионную силу (концентрацию) или оба показателя одновременно. При этом градиент pH и ионной силы может быть ступенчатым или непрерывным (плавным). При создании ступенчатого градиента пользуются серией буферных растворов, пропускаемых через колонку последовательно один за другим. При этом виде элюирования каждый из буферных растворов пропускают через колонку до тех пор, пока концентрация белка в вытекающем из колонки элюате, пройдя через максимум, не снизится почти до исходных фоновых значений.
При непрерывном градиенте элюирования изменение ионной силы и (или) pH элюирующего раствора происходит постепенно, по линейной или нелинейной зависимости от объема протекающей жидкости. Линейное изменение ионной силы или pH элюирующего раствора происходит тогда, когда эти параметры изменяются пропорционально объему протекающей жидкости. Получить линейный градиент можно с помощью прибора, состоящего из двух соединенных между собой одинаковых сосудов, установленных на одном уровне (рис. 1.9, а). В сосуде 1 находится буферный раствор с определенным значением ионной силы (или pH), которое должно быть достигнуто к концу опыта, в сосуде 2, из которого раствор поступает непосредственно в колонку, вначале находится исходный буферный раствор в том же объеме. Часто приме-
32
в
Рис. 1.9. Приборы для создания градиента концентрации: а — линейного; б — «выпуклого»; в — «вогнутого»
няют «выпуклый» или «вогнутый» градиенты, при которых ионная сила раствора увеличивается или уменьшается соответственно экспоненциальной зависимости. Форму этих градиентов легко получить с помощью простых устройств, изображенных на рис. 1.9, б, в.
33
Рис. 1.10. Установка для колоночной хроматографии с автоматическим сбором фракций:
1 — микроиасос; 2—пульт управления; 3колонка; 4— вращающийся коллектор — сборник фракций
Стекающий из колонки растворитель собирают небольшими порциями через определенные промежутки времени с помощью специальных автоматических коллекторов — сборников фракций (рис. 1.10). Содержимое каждой пробирки подвергают анализу, определяя концентрацию компонентов смеси (чаще всего определяют оптичес-
кую плотность раствора). По полученным данным строят график зависимости концентрации компонента (или оптической плотности) от объема прошедшего через колонку раствора.
1.2. ЛИПИДЫ
К липидам относятся природные органические соединения, нерастворимые в воде и растворимые в органических растворителях (хлороформе, эфире, бензоле и др.). В организме животного липиды выполняют важнейшие биологические функции: входят в состав клеточных мембран и других биологически активных структур, служат энергетическим материалом, выполняют защитную роль, а некоторые из них — функции светочувствительных пигментов, гормонов и т. п.
Название одной из групп липидов, а именно жиров (от греч. «липос» — жир), взято для обозначения класса в целом. Липиды — сборная группа химических соединений, не имеющая единой химической характеристики. В целом их можно рассматривать как класс органических соединений, большинство из которых принадлежит к сложным эфирам многоатомных или специфически построенных спиртов и высших жирных кислот.
Существуют различные классификации липидов. В зависимости от состава, строения и роли в организме сложилась следующая классификация липидов.
34
Простые липиды. Представлены двухкомпонентными веществами — сложными эфирами высших жирных кислот с глицерином, высшими или полициклическими спиртами. К ним относятся: жиры (триглицериды) — сложные эфиры высших жирных кислот и трехатомного спирта — глицерина; воски — сложные эфиры высших жирных кислот и высших спиртов и стериды — сложные эфиры высших жирных кислот и полициклических спиртов — стеролов.
Сложные липиды. Состоят из многокомпонентных молекул, компоненты которых соединены химическими связями различного типа. К ним относятся: фосфолипиды, состоящие из остатков высших жирных кислот, глицерина или других многоатомных спиртов, фосфорной кислоты и азотистых оснований различной природы; гликолипиды, в состав которых наряду с многоатомным спиртом и высшей жирной кислотой входят также углеводы.
Неомыляемая фракция липидов. В нее входят свободные высшие жирные кислоты, высшие спирты и полициклические спирты (стеролы), производные стеролов — стероиды, жирорастворимые витамины, высшие гомологи предельных углеводородов и другие соединения.
Из простых липидов наибольшее практическое значение имеют нейтральные жиры, широко встречающиеся в биологических объектах. В некоторых органах и тканях животных их массовая доля достигает 90 %. Животные жиры более разнообразны по набору высших жирных кислот по сравнению с растительными. В их составе чаще встречаются высшие жирные кислоты с числом углеродных атомов от 20 до 24.
Наиболее часто и в большей пропорции в животных жирах (табл. 1.4) встречаются олеиновая (в жирах ее более 30 %) и пальмитиновая кислоты (от 15 до 50 %).
Таблица 1.4
Массовая доля основных жирных кислот в животных жирах, %
Кислота	Говяжий	Бараний	Свиной	Куриный
Пальмитиновая	27,0-29,0	25,0-27,0	25,0-35,0	24,0-37,0
Стеариновая	24,0-29,0	25,0-31,0	12,0-16,0	4,0-7,0
Миристиновая	2,0-2,5	2,0-4,0	1,0	0,1
Олеиновая	43,0-44,0	36,0-43,0	41,0-51,0	37,0-43,0
Линолевая	2,0-5,0	3,0-4,0	3,0-11,0	18,0-23,0
Линоленовая	0,3-9,7	0,4-0,9	0,3-0,6	—
Арахидоновая	0,09-0,2	0,27-0,28	До 2,0	0,3
Животные липиды имеют различную температуру плавления (табл. 1.5), которая зависит от степени непредельности входящих в их состав жирных кислот.
35
Г а б л и ц а 1.5
Температура плавления и иодное число некоторых животных жиров
Жир	Температура плавления. С '	Полное число
Бараний Говяжий Свиной Гусиный Конский Коровье масло	44-55	31—46 40—50	33-47 28—40	46—66 26-34	- 30—43	71-86 28-30	25-27
Животные жиры представляют собой смесь однокислотных (или простых) и разнокислотных (или смешанных) триглицеридов, представленных в разных соотношениях. В них также присутствует небольшая доля ди- и моноглицеридов, а также свободных жирных кислот.
Триглицериды образуют оптические и геометрические изомеры, так как во многих случаях имеют асимметричный углеродный атом в остатке глицерина и одну или несколько двойных связей в радикалах кислотных остатков. Характерно, что непредельные высшие жирные кислоты в триглицеридах находятся, как правило, в цис-конфигурации, что сказывается на форме молекулы (рис. 1.11).
Кроме нейтральных триглицеридов в состав животных жиров входят липоиды, качественный состав которых представлен фосфатидами, стеридами и стероидами.
Фосфатиды или глицерофосфолипиды — сложные эфиры глицерина, высших жирных кислот, фосфорной кислоты и азотистого основания.
Остаток линолевой кислоты
Остаток стеариновой кислоты
Остаток арахидоновой кислоты
Остаток глицерина
• Атом углерода
 Атом кислорода
•—• Простая связь
•Z» Двойная связь
Рис. 1.11. Структура и форма молекулы триглицерида
36
В зависимости от характера азотистого основания среди фосфатидов различают фосфатидилхолин (лецитины), фосфатидил-коламин (кефалины), фосфатидилсерин и фосфатидилтреонин:
СНэ-О-СО-(СНД14-СН;
I
С Н - о - С О - (С Н 2) I (, - с Н;
ch2-o-p-o-ch2-ch2-n+-4:H;
\г	\н3
Лецитин (фосфатидилхолин)
С Н 2 -О -С С) - (С Н 2) и.-С Н;
СН-О-СО-(СНЛ14-СН;
I
CH2-O-P-O-CH2-CH2-NH3
Кефалин (фосфатидилколамин)
СНэ-О-СО-(СНР16-СН,
I
СН-О-СО-(СН2)7-СН=СН-(СН2)7-СН3
СН2—О—Р—О—СН2—СН—СООН
°	0 NH;
Фосфатидилсерин
СН2-0-С0-(СН2)22-СН3
СН-О-СО-(СН2)7-СН=СН-(СН2)7-СН3
CH,-O-P-O-CH-CH-COOH
' </ V I
и 0 СН3 NH3
Фосф атидилтре онин
Лецитины наиболее распространены в природе. Некоторые фосфатиды, открытые сравнительно недавно, не содержат азотистого основания, место которого в молекуле в этом случае занимают глицерин и его производные:
ch2-o-co-r сн2он
СН—О—СО—R СНОН
I	/
СНэ-О-Р-О-СН2 // \ о он
Фосфатидилглицерин
\ /0Н
CH2-O-CO-R СН2—О—Р—О—сн2
СН—О—СО—R' СНОН	СН—О—СО—R
СН2-О-Р-О-СН2	CH2-O-CO-R
0^ Х0Н
Дифосфатидилглицерин (кардиолипин)
37
Обладая асимметричным строением (2-й углеродный атом остатка глицерина всегда асимметричен), фосфатиды оптически активны и образуют соответствующие стереоизомеры. Вместе с тем им свойственна изомерия за счет перестановки остатков высших жирных кислот из а- в [3-положение или наоборот.
Фосфатиды — важная группа липидов, которые обязательно следует включать в рацион питания. Они способствуют лучшему усвоению жиров, препятствуют ожирению печени, необходимы для профилактики атеросклероза. Потребность человека в фосфолипидах составляет 5 г в сутки. Из продуктов животного происхождения ими богаты печень, мозги, желтки яиц, сливки; из растительных — нерафинированное подсолнечное масло и бобовые.
В «сыром» жире также содержатся стероиды, которые широко распространены в природе, многочисленны (до 20 тыс. соединений) и выполняют разнообразные функции в организме. В основе их строения лежит циклическая группировка атомов, состоящая из восстановленного фенантрена (полностью восстановленный фенантрен называют пергидрофенантреном) и циклопентана. Эта циклическая группировка называется циклопентанопергидрофенантреном или стераном. Общий углеродный каркас стероидов имеет следующий вид:
где X— ОН или OR.
Стероиды делят на две группы: высокомолекулярные циклические спирты — стеролы и их сложные эфиры — стериды.
С химической точки зрения стеролы — полициклические, одноатомные, ненасыщенные спирты гидроароматического ряда. Стериды — сложные эфиры специфически построенных циклических спиртов (стеролов) и высших жирных кислот, относятся к группе простых липидов и входят в их омыляемую фракцию.
Массовая доля стеролов в жирах, как правило, относительно невелика и составляет менее 0,5 % к массе жира (табл. 1.6), иногда достигая 1 %.
38
Г а б л и ц а 1.6
Массовая доля стеролов в животных жирах, %
Жир	Общие	j	Свободные	Эте р । к|) 11 ц 11 ро ван н ые
Свиной	0.07-0.12	0,07-0.12	Следы
Говяжий	0.07	0.07	—
Бараний	0.03	0.03	—
Коровьего молока	0.07	0.07	—
Печени трески	0,52	0.27	0.25
Основным стеролом жиров животных и человека является холестерин (3{3-оксихолестен или Д^-холестен-Зр-ол), тривиальное название происходит от греч. chole — желчь и stereos — твердый.
Структурная формула холестерина
Холестерин присутствует во всех животных липидах, в крови и яичном желтке и отсутствует (содержится в незначительном количестве) в липидах растений. Холестерин является структурным компонентом клетки, участвует в обмене желчных кислот, а также гормонов. В организме человека в печени и других тканях синтезируется 70—80 % холестерина от его общей массы (250 г на 65 кг массы тела) и около 20 % поступает с пищей. Массовая доля холестерина в некоторых животных продуктах приведена ниже.
Продукт
Массовая доля холестерина, %
Масло сливочное
Яйца
Сыр
Мясо
Рыба
0,17—0,21 0,57
0,28-1.61 0,06-0,10 0,03-0,06
Холестерин представляет важную медико-биологическую проблему в развитии и предотвращении патологических процессов в
39
организме. Средняя концентрация холестерина в плазме крови составляет от 1.9 до 2,1 г/дм1. Повышенный уровень холестерина в крови (более 2.6 г/дм-') приводит к гиперхолестеринемии, к развитию атеросклероза, поражающего внутренние стенки сосудов. Наиболее опасные его формы — ишемическая болезнь сердца и нарушение мозгового кровообращения. Нарушение липидного обмена происходит при диабете и связано также с гиперхолестеринемией. Многочисленными исследованиями установлена четкая корреляция между ожирением, связанным, как правило, с перееданием, и повышенным синтезом холестерина в организме. Еще одна неприятность, связанная с уровнем холестерина, — желчно-каменная болезнь. Пересыщение желчи холестерином ведет к образованию камней (преимущественно холестериновых) в желчном пузыре и желчных протоках. Исследования последних лет показали, что в этом случае не столько важен общий уровень холестерина в желчи, сколько изменение ее фазового состава.
Однако и значительное падение содержания холестерина в плазме крови также может привести к заболеваниям, но уже другого характера. Для взрослого человека допустимой низшей границей, принятой за норму, считается 1,5 г/дм3. С дальнейшим уменьшением концентрации холестерина возрастает риск таких заболеваний, как повышение активности щитовидной железы, поражение коры надпочечников, истощение и т. д.
На уровень холестерина в организме человека заметное влияние оказывает состав пищевых жиров. Если в рационе много растительных масел, то уровень холестерина уменьшается; употребление животных жиров в большом количестве ведет к повышению концентрации холестерина в плазме крови. Чтобы его нейтрализовать, необходимо включать в диету 2 г ненасыщенных жиров на 1 г насыщенных. Нельзя злоупотреблять салом, сливочным маслом, сливками и тому подобными продуктами. Насыщенные жиры, входящие в их состав, не должны превышать 10 % рациона.
В целом массовая доля липоидов, входящих в состав животных жиров, включая фосфатиды, стерины и стероиды, невелика и составляет десятые и сотые доли процента.
Окраска животных жиров зависит от наличия каротиноидов — пигментов, окрашивающих жиры в желтый цвет и одновременно служащих провитаминами. Массовая доля каротинов в жирах зависит от условий кормления животных, достигая максимума к осени при пастбищном откорме. В жирах присутствуют такие жирорастворимые витамины, как A, D, Е и К, однако массовая доля двух последних незначительна. Суммарная доля витаминных примесей служит показателем пищевой ценности жиров.
Соотношение триглицеридов, липоидов и свободных жирных кислот в составе мясных продуктов зависит от сырьевого источника (табл. 1.7).
40
Г а б л и ц а 1.7
Массовая доля липидов в мясе различных животных, г на 100 г съедобной части
Мясо	Триглицериды (алкилгли-иериды)	। Фосфо-| липиды	Холестерин	Полиненасышейные жирные		
				линоле- : вая	КИСЛОТЫ	
					линоленовая	арахидоновая
Говядина	13,10	0,80	0,07	0,35	0.12	0,017
Баранина	15,30	0,88	0,07	0.33	0,14	0,016
Свинина	32,00	0,84	0,07	3,28	0,22	0,14
Роль липидов в		технологии мясопродуктов			многофункцио-	
нальна. Они могут использоваться как самостоятельный продукт питания (шпик), как пищевые животные жиры, как добавка в вареные колбасы в виде шпика и белково-жировых эмульсий; могут входить в состав самостоятельных пастообразных продуктов повышенной пищевой ценности на основе эмульсий, а также использоваться в качестве смесей для внутрикишечного зондового питания, источник липидов в которых тонко эмульгирован.
В связи с необходимостью сбалансированного питания исследование жира сводится не только к определению его массового содержания, но и к анализу жирно-кислотного состава, пищевой, биологической ценности и других показателей.
Методы количественного определения суммарных липидов в сырье и пищевых продуктах разнообразны и отличаются способами анализа, приемами экстракции, применяемыми экстрагентами, подготовкой образцов к анализу, продолжительностью и условиями экстрагирования и т. д.
По способам анализа методы делятся на две группы: методы определения массовой доли жира непосредственно в объекте и методы, связанные с предварительным извлечением липидов или жира.
К первой группе относятся методы ядерного магнитного резонанса, инфракрасной спектроскопии, турбидиметрии, ультразвуковые и др.
Во вторую группу входят методы, в которых липиды или жир сначала переводят в органическую фазу с последующим их количественным определением гравиметрическим или другим способом.
Полное извлечение липидов из клеток или тканей представляет собой довольно трудную задачу, поскольку они являются весьма гетерогенной группой соединений, находящихся в клетках как в свободном, так и в связанном состоянии. Причем в последнем случае липиды образуют более или менее прочные комплексы с гидрофильными компонентами клетки (белками, углеводами и др.). В образовании этих комплексов участвуют ван-дер-
41
ваальсовы силы, гидрофобные взаимодействия, водородные и ковалентные связи. Преобладание того или иного типа связей обусловливает различную экстрагируемость связанных липидов из биологического материала.
В зависимости от степени экстрагируемости из клеток липиды условно разделяют на свободные, связанные и прочносвязанные. Свободные липиды легко переходят в слабополярные растворители (петролейный и диэтиловый эфир, хлороформ, бензол и др.), способные разрушать комплексы, образованные с помощью гидрофобных взаимодействий и ван-дер-ваальсовых сил. Для извлечения связанных липидов, удерживаемых в комплексах водородными связями (например, в липопротеидах мембран), применяют более полярный растворитель (метанол или этанол) в смеси со слабополярными. Прочносвязанные липиды, удерживаемые ковалентными связями, выделяют после гидролиза комплекса слабыми растворами кислот или щелочей в органическом растворителе.
По приемам экстракции и полноте извлечения липидов или жира эти способы можно разделить на три подгруппы:
методы экстракции «сырого» жира из измельченного обезвоженного материала неполярным или слабополярным растворителем;
методы экстракции «сырого» жира из измельченного невысу-шенного материала полярным растворителем или его смесью со слабополярным или полярным растворителем;
методы экстракции «сырого» жира из бесклеточного или полностью разрушенного (гидролизом, гидродинамической кавитацией) клеточного материала полярным растворителем или его смесью со слабополярным растворителем.
Отличительной особенностью методов 1-й подгруппы является извлечение главным образом только свободных липидов, которые сорбированы и механически удерживаются гелевой частью клетки. Применяя эти методы, как правило, используют специальные приборы и аппараты, в том числе аппарат Сокслета.
Главная особенность методов 2-й подгруппы — обеспечение оптимальных условий для максимального извлечения липидов из клеточного материала, не подвергнутого разрушению химическим или физическим способом. Однако отсутствие специальных экстракторов приводит, как правило, к потере экстракта при отделении липидов от нелипидной части и других операциях.
Методы 3-й подгруппы можно условно отнести к приемам, обеспечивающим практически полное выделение липидов, в том числе и прочносвязанных. Условность связана с тем, что химическое разрушение клеточного материала при гидролизе изменяет фракционный состав выделяемых липидов, а физическое — не 42
затрагивает липиды, связанные с белками ионной связью, в том числе через ионы двухвалентньпх металлов. К методам 3-й подгруппы относятся методы концентрирования жира в бутиромерах с помощью поверхностно-активных веществ. В последнее время при оценке полного содержания липидов, а также количества прочносвязанных липидов в различных пищевых продуктах и биологических объектах используют метод динамической кавитации.
1.3. УГЛЕВОДЫ
К классу углеводов относят органические соединения, содер-. о	лу
жашие альдегидную R—или кетонную R—группу и н	сн2он
несколько спиртовых гидроксилов. Их элементарному составу соответствует общая формула СотН7/гО;;, однако название класса и эмпирическая формула не отражают химический характер и особенности строения этих соединений, обусловливающие многообразие свойств углеводов. Это предопределяет характер участия углеводов в процессах жизнедеятельности и построении тканей животных и растений. Основными физиологическими функциями углеводов являются структурная, энергетическая и метаболическая.
Как правило, в животных организмах большинство углеводов играют роль энергетических субстратов, при окислении которых выделяется энергия, необходимая для протекания химических реакций, и используются как резервные. Наряду с этим промежуточные продукты окисления углеводов используются для синтеза многих других органических соединений.
Углеводы делят на две группы: простые и сложные. Простые углеводы не подвергаются гидролизу, сложные гидролизуются с образованием простых углеводов.
Среди сложных углеводов выделяют группы олигосахаридов и полисахаридов. Олигосахариды — сахароподобные сложные углеводы, характеризуются сравнительно невысокой молекулярной массой, хорошей растворимостью в воде, легкой кристаллизацией и, как правило, сладким вкусом.
Полисахариды — высокомолекулярные сложные углеводы с молекулярной массой порядка сотен тысяч — отличаются друг от друга химической природой повторяющихся моносахаридных единиц, степенью разветвления и длиной цепи. Полисахариды не содержат свободных редуцирующих групп, поэтому не обладают восстанавливающей способностью. Полный гидролиз полисахаридов в присутствии кислот или специфических ферментов приводит к образованию моносахаридов, обладающих редуцирующими свойствами.
43
Различают гомополисахарилы, содержащие остатки монополисахарида одного вида, и гетерополисахариды, состоящие из остатков моносахаридов двух или более видов, регулярно или нерегулярно чередующихся в молекуле.
Полисахариды либо нерастворимы в воде, либо образуют растворы, по свойствам напоминающие коллоидные, что обусловлено высокой молекулярной массой растворенных частиц. Полисахариды не образуют явно оформленных кристаллов, лишь некоторые из них обладают псевдокристаллическим строением. Сладкий вкус для них не характерен.
К числу наиболее важных природных гомополисахаридов принадлежат крахмал, гликоген, клетчатка, декстран и хитин.
Гликоген, содержащийся в мясе и мясопродуктах, служит резервным питательным веществом, вследствие чего за ним сохранилось название «животный» крахмал. Массовая доля гликогена в печени животных достигает 20 %, в мышцах — 4 %. Содержание углеводов зависит от степени упитанности животного. В мышцах плохо откормленных, истощенных, голодных и больных животных гликогена в 2—3 раза меньше, чем в мышцах животных нормального физиологического состояния.
Гликоген имеет много общих свойств с крахмалом. Например, гликоген дает цветную реакцию с иодом. При взаимодействии крахмала и гликогена с иодом образуются комплексные адсорбционные соединения, окрашенные в реакции с крахмалом в синий, а с гликогеном — в красно-бурый цвет. Различие в цвете комплексов обусловлено некоторыми особенностями химической структуры крахмала и гликогена.
Гликоген сравнительно хорошо растворяется в горячей воде с образованием сильно опалесцирующих растворов. Как и крахмал, гликоген высаливается из коллоидного раствора при 33 °C сульфатом аммония или сульфатом натрия, подобно белкам осаждается двойным объемом спирта и эфиром в виде белого хлопьевидного осадка.
Промежуточными продуктами гидролиза гликогена являются декстрины и мальтоза, конечным — D-глюкоза. Гликоген оптически активен, причем удельное вращение его растворов близко к таковому для крахмала.
Структурная формула гликогена (рис. 1.12) идеально удовлетворяет его прижизненным функциям как глюкозное депо, служащее источником энергии. При интенсивной работе, когда доступ кислорода к тканям затруднен, быстрое окисление с выделением энергии протекает по анаэробному пути (гликогенолиз). При этом дефицит энергии восполняется за счет отщепления и окисления фосфорного эфира глюкозы сразу с нескольких ветвей молекулы гликогена.
При жизни организма образовавшийся в результате гликогенолиза лактат с помощью регуляторных механизмов снова вовлекается в метаболизм по схеме (рис. 1.13).
44
Рис. 1.12. Структурная формула гликогена
Гликоген»*			Глюкоза
2 АТоЦ 2 Лактат	Кровь	6 АТФ 	2 Лактат
		
Гликолиз
Гликогенолиз
Рис. 1.13. Схема взаимодействия скелетных мышц и печени в процессе интенсивной мышечной работы
В период восстановления лактат, поступивший из мышц в кровь, превращается в печени в глюкозу крови. На образование одной молекулы глюкозы из двух молекул лактата расходуется шесть молекул АТФ. Глюкоза поступает с кровью обратно в мышцы и откладывается в запас в виде гликогена. В послеубой-ный период лактат накапливается в мышцах и выступает фоном для развития автолитических превращений мышечной ткани, формирования предшественников букета вкуса и аромата, присущего созревшему мясу. В связи с небольшой массовой долей гликогена в мясе и мясопродуктах основные нормы потребления углеводов в питании человека восполняются растениями. Однако в технологии переработки и хранения мяса он играет весьма существенную роль по ряду причин:
1. Полисахарид гликоген непосредственно влияет на формирование функционально-технологических характеристик мясного сырья (ВУС, ЖУС, ВСС, липкость, эмульгирующая способность, структурно-механические свойства), так как его автолитические превращения в послеубойный период являются пусковым механизмом для развития автолиза мяса, сопровождающегося конформационными и гидролитическими изменениями мышечных и соединительнотканных белков, что оказывает решающее влияние
45
па консистенцию мяса и мясных продуктов, приобретение нежности и сочности, накопление химических предшественников вкуса и аромата кулинарно обработанного созревшего мяса (свободных аминокислот, нуклеотидов, низкомолекулярных пептидов, органических кислот и других соединений).
2. Продукты распада гликогена — моносахариды (глюкоза, декстроза и др.) наряду с поваренной солью и нитритом натрия являются важными ингредиентами посолочных смесей при производстве колбасных и деликатесных цельномышечных изделий для достижения эффекта стабилизации окраски продуктов.
В связи с этим анализ гликогена, определение глубины его распада и образующихся продуктов необходимо проводить в технологических целях.
С развитием технологии значительно возрос ассортимент мясных продуктов, включая традиционные и комбинированные. Для образования мясных структурированных систем, придания им специфических свойств и вкуса, повышения выхода все шире используются различные полисахариды и другие углеводы, не характерные для мяса.
Особого внимания заслуживает применение в рецептурных композициях мясопродуктов физиологически полезных балластных веществ. Это главным образом структурные (целлюлоза, гемицеллюлоза, пектин и т. д.) и неструктурные (альгинаты, камеди и т. д.) вещества. Полисахариды растений в соответствии с современной научно обоснованной теорией адекватного питания должны строго дозироваться.
Целлюлоза — прочное, волокнистое, водонерастворимое соединение, фибриллы которого образуют каркас растительных клеток. Этот внеклеточный структурный полисахарид — самый распространенный в природе биополимер. Линейная неразвет-вленная цепь целлюлозы состоит из 10 000 и более остатков £>-глюкозы, связанных друг с другом (1-4)-гликозидными связями в p-конфигурации. Такой вид соединения мономеров не гидролизуется а-амилазой и другими ферментами желудочно-кишечного тракта.
Полисахариды гемицеллюлоз относятся к гетерополимерам разной степени ветвления. В их состав входят ксиланы, ксилоглюканы, арабинаны, различные галактаны и маннаны. Углеводный состав гидролизатов гемицеллюлоз пищевого и непищевого сырья в основном идентичен. Он включает гексозы (глюкозу, галактозу, маннозу, глюкуроновую и галактуроновую кислоты) и пентозы (ксилозу, арабинозу и рамнозу).
Пектин также относится к группе полисахаридов. Его макромолекулы представляют собой цепь, построенную из остатков Д-галактуроновой кислоты, соединенных по месту 1,4-углеродных атомов a-связью. В состав молекул входят свободные и метилированные карбоксилы, частично нейтрализованные кальцием и маг-46
нием. Пектиновые вещества содержатся в срединной пластинке клеточной стенки и выполняют роль связующего компонента Водные растворы этих веществ обладают желирующими и геле образующими свойствами. В цементирующий матрикс растительных клеток входит также полимер лигнин, обладающий хорошими сорбционными свойствами.
Свойствами балластных веществ обладают и негидролизуюшп-еся в кишечнике гликозоаминогликаны (мукополисахариды), содержащиеся в межклеточном веществе животных тканей. Наибольшее количество этих структурных полисахаридов содержится в соединительной ткани, легких и крови.
К балластным веществам животного происхождения относят нерастворимый полисахарид хитин. Из него состоят панцири омаров, крабов, а также многих насекомых. В некоторых странах уже освоено производство этого биополимера.
Ряд ученых считают физиологически полезными веществами и отдельные продукты реакции Майяра. Образующиеся в процессе тепловой обработки белков и редуцирующих сахаров меланоидины резистентны к действию пищеварительных ферментов.
Получило развитие производство синтетических биополимеров, которые при употреблении в пищу могут выполнять функции балластных веществ. К ним относятся многие фармацевтические препараты, а также различные виды модифицированной целлюлозы, применяемой в качестве пищевой добавки.
Анализ этих веществ необходим при расчете сырья рецептурных композиций, для придания продуктам лечебно-профилактических свойств, обеспечения физиологических норм питания и поддержания здоровья человека.
1.4. ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ
Фосфорорганические соединения при жизни животных играют роль запасников энергии. После убоя животных многие фракции этих веществ участвуют в образовании специфического вкуса мясных продуктов. Особая роль отводится креатинфосфату (КрФ), аденозинтрифосфорной кислоте (АТФ) и их производным.
Креатин (метилгуанидинуксусная кислота) является обязательной составной частью поперечнополосатой мускулатуры. Содержание креатина в скелетных мышцах достигает 400— 500 мг%, в сердечной мышце креатина в 2—3 раза меньше. Креатин присутствует также в ткани мозга (около 100 мг%) и в значительно меньших количествах в паренхиматозных органах (10—50 мг%).
47
о мышечной ткани креатин содержится как в свободном виде, гак и в виде фосфорилированного производного (креатинфосфа-га. фосфокреатина) — макроэргического соединения, представляющего собой источник легкоутилизируемой энергии:
NH2
C=NH
N—CH}
I
CH2
COOH
Креатин
NH~P=O
C=NH
OH
N —CH;
CH2
COOH
Креатинфосфат
Креатинфосфат участвует в обратимом переносе фосфорилированного остатка с креатинфосфата на АДФ, реакция катализируется креатинкиназой (АТФ: креатинфосфотрансфераза, КФ 2.7.3.2):
Креатинкиназа
Креатинфосфат + АДФ	Креатин + АТФ
Это единственная ферментативная реакция, протекающая с участием креатинфосфата.
Соотношение количеств свободного креатина и креатинфосфата в мышечной ткани зависит от физиологического состояния мышцы. При сокращении происходит распад АТФ, но за счет креатинкиназной реакции при наличии креатинфосфата происходит ее регенерация, что в итоге приводит к увеличению свободного креатина и уменьшению креатинфосфата. В покое синтез АТФ превалирует над распадом и приводит к синтезу и накоплению в ткани креатинфосфата.
Креатинфосфат, являясь источником энергии для мышечных сокращений, представляет собой важнейший компонент мышечной ткани. По сравнению с АТФ креатинфосфат характеризуется более высоким потенциалом переноса высокоэнергетических фосфатных групп. Если имеющееся в мышце количество АТФ может поддерживать ее сократительную активность на протяжении долей секунды, то в целом резерва энергии АТФ 48
И крсатш [фосфат я хватает на Н)--Д2с мышечной рабты Далпнсп шее понижение шергстичсскш о шнснниаиа мьпишл пршюжы >-стимулированию еликони за и i лhkoiенолиза, иикла карбоноььо КИСЛОТ и ОКИСЛИ 1СЛЫ101 о фосфорилирования. В среднем КОН центрация креатинфосфата в скелетных мышцах позвоночных >. 4—5 раз превышав! концентрацию АТФ.
Уровень креатинфосфата зависит от упитанности животною в степени тренированности мыши. Определение крсатинфосфага п мышцах имеет большое значение лля выявления уровня физичсс кого развития и физиологическою состояния животною. Масео вая доля крсатинфосфата в мышцах больных живошых. как пре» вило, значительно снижается.
Аденозинтрифосфорная кислот (А ГФ)
являясь универсальным источником энергии для биохимичес ких реакций, занимает центральное место в обмене веществ. Гак, организм человека для гликолитических реакций расходует около 0,5 кг АТФ в сутки. При дефосфорилировании 1 моль АТФ освобождает 33,6—42,0 кДж энергии.
Массовая доля АТФ в мышцах составляет в среднем 30,0— 45,0 мг%. Уровень АТФ является также показателем физического и физиологического состояния животного, снижаясь при мышечном утомлении и дегенеративных процессах. В послеубойный период эти вещества вносят существенный вклад в формирование вкуса мяса при созревании.
1.5. ВОДА
Вода — важнейший компонент всех пищевых продуктов. Воду нельзя рассматривать просто как инертный компонент или универсальный растворитель для пищевых веществ. Она является не только преобладающим компонентом большинства пищевых продуктов, но и оказывает предопределяющее влияние на многие их качественные характеристики, особенно на сроки хранения.
Массовая доля влаги в мясе и мясных продуктах колеблется в широких пределах (табл. 1.8).
49
I a b j i! н ;t !
Массовая доля влаги в некоторых пищевых продуктах
Массовая толя влаги. Ч |	Продукт
40—70	Копчености. свежие сосиски, ветчина, окорок, ливерная
колбаса и немецкие колбаски
50—60	Жирное мясо
70—S0	Свежие бобовые (фасоль, бобы, горох) и мясо (говядина,
баранина, конина, птина). Рыбные продукты (рыба, моллюски. ракообразные)
Интенсивные исследования структуры пока еще не привели к созданию удовлетворительной модели, которая объясняла бы все свойства воды, водных растворов и содержащих влагу твердых тел, в частности пищевых продуктов. Вода в пищевых продуктах может находиться в свободной и связанной форме.
Согласно классификации П. А. Ребиндера, в основу которой положена энергия связи, связь влаги с продуктом может быть:
химической;
физико-химической (адсорбционной, осмотической, структурной);
механической (влага в микро- и макрокапиллярах, средний радиус которых соответственно 10~7 м и менее и более 10-7 м, а также влага смачивания, находящаяся на поверхности).
Влага смачивания и влага макропор имеет весьма непрочную связь с продуктом и может быть удалена механическими способами (отжатием на прессах или под действием центробежной силы в центрифугах). Такая влага называется свободной. Свободную влагу также можно удалить путем высушивания или вымораживания.
Свободная влага, являясь растворителем органических и неорганических соединений, участвует во всех биохимических процессах, протекающих при хранении и переработке мясного сырья.
По величине энергии связи различают следующие формы связи влаги; химически связанная и физико-химически связанная (адсорбционно-связанная, осмотически-связанная, капиллярно-связанная).
Химически связанная влага наиболее прочная и представляет собой воду гидратов, связанную в виде гидроксильных ионов, и конструкционную воду кристаллогидратов, связанную значительно слабее. Химическое связывание влаги в строго определенных молекулярных соотношениях происходит при химической реакции (гидратации). При этом вода входит в состав образованного вещества. При кристаллизации из раствора вода входит в структуру кристалла целыми молекулами. Для нарушения
50
этой связи сушка недостаточно эффективна, необходимо применить прокаливание или химическое воздействие.
Связь влаги в продуктах часто осуществляется межмолекулярными силами (ван-дер-ваальсовы силы). По данным Б. В. Дерягина и И. И. Абрикосовой, ван-дер-ваальсовы силы взаимодействия имеют место на расстоянии до 0,1 —1,2 мкм. т. е. значительно большем самих молекул. Энергия ван-дер-ваальсового взаимодействия колеблется в пределах 0,42—4,20 кДж/моль.
Особым видом межмолекулярного взаимодействия является водородная связь. Она проявляется между ковалентно связанным атомом водорода и электроотрицательными атомами (кислород, фтор, азот), которые принадлежат к той же или другой молекуле. Энергия водородной связи равна 21,0— 29,4 кДж/моль, что лишь на один порядок меньше энергии химического взаимодействия.
Формы физико-химической связи разнообразны. Адсорбционно-связанная влага обусловлена взаимодействием молекул адсорбента и молекул воды и удерживается у поверхности раздела коллоидных частиц с окружающей средой. Обладая большой поверхностью, коллоидные структуры имеют высокую адсорбционную способность. Большую часть адсорбционно-связанной влаги в животных тканях мясопродуктов составляет влага, которая образует сольватную оболочку молекул белковых веществ и гидрофильных коллоидов. Часть адсорбционной влаги входит в состав сольватных оболочек гидрофобных коллоидов. Адсорбция вл-ши сопровождается выделением теплоты, которая называется теплотой гидратации.
Осмотически связанная влага является свободной в том смысле, что ей соответствует весьма малая энергия связи. Влага присоединяется без выделения теплоты и сжатия системы. Осмотически связанная влага диффундирует внутри тела в виде жидкости через стенки клеток благодаря разности концентрации внутри и вне клеток.
К капиллярно-связанной относится влага микрокапилляров. Эта часть воды находится в капиллярах (порах), средний радиус которых 10-7 м и менее. Капиллярная влага перемещается в теле как в виде жидкости, так и в виде пара. Различают два состояния капиллярной влаги: стыковое, когда влага разобщена в виде манжеток (защемленная вода), и канатное состояние, когда клинья жидкости соединены между собой, образуя непрерывную жидкую пленку, обволакивающую дисперсные частицы тела.
Связанная влага по своим свойствам значительно отличается от свободной: она не замерзает при низких температурах (вплоть до минус 40 °C); не растворяет электролиты, имеет плотность, вдвое превышающую плотность свободной воды, не всегда удаляется из продукта при высушивании (химически связанная) и т. д. Связанная влага в отличие от свободной недоступна микроорганизмам.
51
। iv ммм_\ .i.i>t in).uiiiiciui>i развитии микрофлоры в нишевых про лукгах свободную волу полностью удаляют или переводят в свя ванную, добавляя влагосвязывающие компоненты (соли, функии-опальные добавки. полисахариды и г. л.).
Для характеристики состояния влаги в продукте все шире применяют показатель активности волы ьш являющийся интегральной характерноiикой. Активность волы влияет на жизнедеятельность микроор!анпзмов, на биохимические, физико-химические реакции и процессы, протекающие в продукте. От величины активности волы зависят сроки хранения мяса и мясопродуктов, стабильность мясных консервов, формирование цвета и запаха, а также потери в процессе термообработки и хранения. Из общего количества волы, содержащейся в пищевом продукте, бактерии, плесени, дрожжи могут использовать для своей жизнедеятельности лишь определенную «активную» часть. Термин «активность воды», введенный Скоттом в 1953 г. в отношении пищевых продуктов, позволил установить взаимосвязь между состоянием слабосвязанной влаги продукта и возможностью развития в нем микроорганизмов.
Активность воды определяется как отношение парциального давления водяного пара над поверхностью продукта к давлению насыщенного водяного пара при той же температуре:
-Р/Р, = РОВ/100,	(1.4)
где р — парциальное давление; д0 — давление насыщенного водяного пара: РОВ — равновесная относительная влажность.
Активность воды — это характеристика самого продукта, обусловленная химическим составом и его гигроскопическими свойствами, РОВ — характеристика окружающей среды, находящейся в гигротермическом равновесии с продуктом. Активность воды служит качественной характеристикой связи влаги в продукте. Так, энергия связи влаги с материалом равна
Е= -RT\n(p/p^ = -ДТ1пфо,	(1.5)
где R— газовая постоянная; Т — температура. К.
Чем прочнее связана влага с материалом, тем меньше величина р, и наоборот, для свободной воды р достигает значения р0 и становится равным 1, а энергия связи Е равна 0.
Зависимость активности воды от влагосодержания продукта	при постоянной температуре носит название изо-
термы (рис. 1.14). При удалении влаги из продукта (десорбции) и получении влаги продуктом (адсорбции) изотермы совпадают только в начальных точках, т. е. имеет место сорбционный гистерезис.
52
При изменении содержания воды происходят глубокие изменения в специфических свойствах пишевой системы, что отражается на ряде показателей.
Для каждого вида микроорганизмов существуют максимальное, минимальное и оптимальное значения активности воды. Удаление аы от оптимального значения приводит к торможению жизненных процессов, присущих микроорганизмам. При достижении определенной максимальной или минимальной величины активности воды прекращается жизнедеятельность микроорганизмов, что не говорит о гибели клетки. Минимальные значения активности воды для различных микроорганизмов приведены ниже.
Рис. 1.14. Пример зависимости равновесной влажности продукта от относительной влажности воздуха:
/ — десорбция: 2— адсорбция
Микроорганизмы
Грамотри нательные палочки
Большинство кокков и лактобацилл
Большинство дрожжей
Большинство плесеней
Большинство галофильных бактерий
Ксерофильные плесени
Осмофильные дрожжи
Активность воды а,,
1,00—0,95 0.95-0,91 0.91-0.88
0.88-0,80
0.80-0.75
0.75-0,65
0,65-0,60
За 1,0 принимается активность дистиллированной воды. Активность воды для свежего мяса равна 0,99. Активность воды имеет большое практическое значение. В табл. 1.9 приведены ее числовые значения для некоторых мясопродуктов.
Таблица 1.9
Значения активности воды для некоторых мясопродуктов
Продукт	Массовая доля влаги, %	Активность воды
Мясо Колбасы:	70-74	0,96-0,99
вареные	62-72	0.96-0,98
полукопченые	40-55	0.94-0,97
варено-копченые	40-43	0,90-0.93
сырокопченые	24-30	0,78-0,85
53
/Активность воды можно изменять, подоирая сырье и рецептуры с учетом используемого количества поваренной соли и жира. Создание оптимальных условий обезвоживания колбас в процессе созревания является еще одной возможностью регулирования активности воды. В созревших колбасах рост нежелательных микроорганизмов сдерживается сочетанием низкой активности воды, анаэробной среды, низкого значения pH. наличием хлорида и нитрата натрия и молочнокислой микрофлоры.
При использовании пищевых добавок степень их воздействия на активность воды уменьшается в следующем порядке: поваренная соль, полифосфат, цитрат, аскорбиновая кислота, глю-козо-5-лактон, ацетат, тартрат, глицерин, лактоза, молочный белок, жир. При этом микромолекулы с большей степенью диссоциации приводят к большему снижению активности воды, чем макромолекулярные вещества.
Для определения активности воды в мясопродуктах применяют различные методы. В гравиметрических методах выходной величиной является изменение массы пробы или вспомогательного гигроскопического материала за счет сорбции им влаги. В гигрометрических методах определяют изменение физических или электрофизических параметров гигроскопического материала (геометрические размеры, электропроводность, диэлектрическую проницаемость). Все эти методы являются косвенными. К прямым относится манометрический метод непосредственного измерения давления водяного пара с помощью манометров (жидкостных, емкостных и др.). Этот метод является основным при проведении исследовательских работ и принят за эталонный.
У нас в стране и за рубежом разработан ряд приборов, предназначенных для определения активности воды. В МГУПБ разработана вакуумная установка, с помощью которой определяют активность воды (рис. 1.15, а). Методика работы на установке следующая: в колбу помещают измельченный исследуемый продукт массой (40—50)10~3 кг. В другую колбу наливают (30—50)10 6 м3 дистиллированной воды. После закрепления колб на установке при открытых кранах для удаления воздуха и растворенных газов из влажного продукта и дистиллированной воды производят вакуумирование (120—180 с). Затем краны закрывают и установку тер-мостатируют. После термостатирования перемещение жидкости в камере прекращается и устанавливается равновесие давлений паров над дистиллированной водой и продуктом, разница между которыми (Ар) определяется U-образным манометром. Активность воды рассчитывают по формуле
аа = Ри/Ро = (Ро~ &Р)/Р^	(1 -6)
где — равновесное давление паров над продуктом; р0— равновесное давление паров над дистиллированной водой.
54
Рис. 1.15. Устройства для определения активности воды в пищевых продуктах:
я — конструкции И. А. Рогова и У. Ч. Чоманова; I — U-образный манометр; 2—колба с дистиллированной водой; 5 —термопары; 4—вакуумные краны; 5 —ловушка; 6 — колба с исследуемым продуктом; 7 — воздушный термостат; 8 — вакуум-насос; о—конструкции И. А. Рогова, В, Д. Косого. В. П. Кулагина: 1 — U-образный манометр; 2 — трубка с рабочей жидкостью; 3— емкость с исследуемым продуктом; 4~ термопара; 5 — потенциометр для замера и фиксации температуры; 6~ соленоидные клапаны; 7— вакуум-насос; 8 — потенциометр; 9 — мостовая схема; Ш- емкостный датчик; // — эбонитовая втулка
С помощью установки в течение 7—9 мин определяют величину активности воды в мясных продуктах. Для измерения равновесного давления паров воды над продуктом применяют жидкостный манометр с кремнийорганической жидкостью ПФМС-2/5 л. Недостатками данной установки являются недостаточная надежность и точность замера, продолжительное время достижения равновесного давления, невозможность использовать ее при повышенных температурах и непосредственно в цехах.
В настоящее время эти недостатки устранены благодаря тому, что все показания измерения активности воды снимаются при помощи емкостного датчика, вмонтированного в одно из колен U-образного манометра (рис. 1.15, б).
Имеются и другие конструкции приборов и их модификации. Перспективны в определении активности воды хроматографические и ЯМР-методы.
Лабораторная работа № 1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНЫХ БЕЛКОВ В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ УСКОРЕННЫМ ФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ НА ОСНОВЕ МИНЕРАЛИЗАЦИИ ПРОБ
Цель работы. Освоить ускоренный фотометрический метод определения общего белка в мясе и мясопродуктах на основе проведения предварительной минерализации проб.
55
Задачи. Провести предварите.!иную минерализацию проб и рассчитать массовую долю общею белка в анализируемых образцах. Определить массовую .толю суммарных белков в образцах органов и дкатieii убойных животных.
Объекты исследования. Образцы мышечной, соединительно!! юани, внутренних органов или кровь убойных животных.
Материалы, реактивы и оборудование. Серная кислота плотностью 1840 кг/м3; раствор соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3; пероксид водорода; сульфат аммония; хлорат кальция; гидроксид натрия; фенол; нитропруссид натрия; тиосульфат натрия; гипохлорит или дихлоризоцианурат натрия; иолид калия; карбонат натрия; установка Кьельдаля; фотоэлек-гроколориметр.
Приготовление реактивов. Р е а к т ив 1. 10 г фенола и 0,05 г нитропруссида натрия растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1000 см3 и объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.
Реактив 2.5 г гидроксида натрия растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1000 см3. После охлаждения добавляют исходный раствор гипохлорита натрия из расчета достижения его массовой концентрации 0,42 г/дм3 или 0,2 г дихлоризоцианурата натрия. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.
Приготовленные растворы хранят в темной посуде в холодильнике не более 2 мес.
Исходный раствор гипохлорита натрия. В стакане вместимостью 500 см3 перемешивают 150 г хлорной извести с 250 см3 дистиллированной воды. В другом стакане растворяют 105 г карбоната натрия в 250 см3 дистиллированной воды. Оба раствора сливают в одну емкость при постоянном перемешивании. Полученную суспензию оставляют на 1— 2 сут для отстаивания, затем надосадочную жидкость сливают и отфильтровывают. Массовая доля активного хлора в полученном реактиве находится в пределах 6—10 %. Его можно хранить в склянке из темного стекла до 1 года. Для точного определения массовой доли активного хлора 1 см3 прозрачного фильтрата разбавляют в конической колбе вместимостью 100 см3 до объема 40—50 см3, прибавляют 2 г иодида калия и 10 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм-5. Образовавшийся иод оттитровывают раствором тиосульфата натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм3, приготовленным из фиксанала, до исчезновения вишневой окраски (1 см3 раствора тиосульфата натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 соответствует 0,00355 г хлора).
Определение гипохлорита натрия в исходном растворе. Перед приготовлением реактива 2 необходимо определить массу гипохлорита натрия в исходном растворе, учитывая неустойчивость его при хранении. По объему из-56
расходованного на титрование тиосульфата натрия определяют объем раствора гипохлорита натрия, необходимый для приготовления реактива 2.
Пример расчета. Объем раствора тиосульфата натрия молярной концентрацией ОД моль/дм5. израсходованный на титрование 1 см5 исходного раствора гипохлорита натрия, составляет 12.09 см5. Эквивалентная масса гипохлорита натрия равна половине относительной молекулярной массы гипохлорита натрия 74,4:2 = 37.2 г. Масса гипохлорита натрия в исходном растворе составляет 1,209 • 37,2 = 44.97 г.
Необходимый объем (см5) исходного раствора гипохлорита натрия
%= (1000 • 0.42)/44,97 = 9.4.
Методические указания. Контроль и оценка качества мяса и мясных изделий по массовой доле белка как при проведении научно-исследовательских работ, так и в условиях производственных лабораторий требуют наличия ускоренных, нетрудоемких и достаточно точных методов анализа.
Классическим методом определения массовой доли белков в мясе и мясопродуктах является метод Кьельдаля, предложенный для определения общего азота в различных материалах в 1883 г. Почти за целое столетие его применения появилось много модификаций, во многих из которых сохранились все основные стадии оригинального метода Кьельдаля — минерализация, отделение аммиака дистилляцией и титрование.
Минерализацию проводят нагреванием навески с концентрированной серной кислотой в присутствии катализатора (ртутно-кадмиевая соль, сульфатная смесь или пероксид водорода). Выделившийся аммиак вступает в реакцию с избытком концентрированной серной кислоты с образованием сульфата аммония:
2NH3 + H2SO4 -э (NH4)2SO4.
Для выделения аммиака сульфат аммония разлагают концентрированным гидроксидом натрия:
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + 2Н2О + Na2SO4.
Выделившийся аммиак поглощается титрованными растворами серной кислоты:
2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4.
Метод проводят на специальной установке, представленной на схеме (рис. 1.16).
Избыток серной кислоты оттитровывают гидроксидом натрия и по количеству связанной кислоты вычисляют количество поглощенного аммиака или соответствующее ему количество азота.
57
Рис. 1.16. Установка для отгонки аммиака:
I — парообразователь; 2 — каплеуловитель; воронка; 4- отгонная колба; 5— холодильник; 6 —приемная колба
Используемые на практике методы количественного определения белков основаны на анализе составных частей макромолекул или исследовании некоторых физических свойств их растворов, которые находятся в прямой зависимости от концентрации.
В связи с этим определенный интерес представляют фотометрические методы, которые отличаются высокой чувствительностью и точностью, требуют значительно меньших затрат времени, чем классический метод Кьельдаля. Для фотометрического анализа применяют различные типы фотоэлектроколо
риметров и спектрофотометров, которые удобны в работе и выпускаются отечественной промышленностью.
В группе методов определения суммарных белков в животных тканях на основе минерализации проб основное время занимает минерализация пробы, продолжительность которой благодаря подбору эффективных катализаторов составляет 2—2,5 ч. Последующее проведение цветной реакции и фотометрирование не превышают 30—40 мин, при этом одновременно можно анализировать серию проб.
Часто массовую долю белка в тканях и продуктах определяют по массовой доле азота, которая является характерным показателем элементарного состава белков. Массовая доля азота для многих белков близка к 16 %, поэтому массовое содержание белковых веществ вычисляют, умножая полученную массу азота на коэффициент 6,25, который получают путем деления: 100: 16 = 6,25. Для определения массового содержания белков соединительной ткани пользуются коэффициентом 5,62, принимая во внимание, что массовая доля азота в коллагене 17,8 %. При использовании метода небелковый азот продуктов не учитывается.
Подгототовка проб к анализу. Исследуемые образцы тщательно измельчают (ножом или на мясорубке). В колбу Кьельдаля вместимостью 50 см3 вносят 0,2 см3 сыворотки крови или взвешивают на аналитических весах 0,15—0,20 г ткани (мышц, сухожилий, почек, печени и др.). При помощи кусочка стекла навеску опускают на дно колбы. Добавляют 1—2 см3 концентрированной серной кислоты, 1 г смеси сульфата меди и сульфата калия в качестве катализатора. Содержимое колбы нагревают в вытяжном шкафу. Когда смесь приобретает коричневую окраску, колбу снимают с
58
огня, охлаждают при комнатной температуре, добавляю! 2—3 см' раствора пероксида водорода с массовой долей 30 % и продолжаю! нагревать до получения бесцветного минерализата. Последний используют для количественного определения белка.
Порядок проведения анализа. Минерализат охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3. объем доводят до метки дистиллированной водой, содержимое перемешивают.
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 5 см3 полученного раствора минерализата, повторно доводят объем до метки дистиллированной водой. Для проведения цветной реакции 1 см3 вторично разбавленного минерализата вносят в пробирку, добавляют последовательно 5 см3 реактива 1 и 5 см3 реактива 2, содержимое пробирки перемешивают. Одновременно готовят контрольный раствор, используя при этом контрольный минерализат (проба с использованием дистиллированной воды). Через 30 мин определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром. Измерение проводят в сравнении с контрольным раствором.
Построение калибровочного графика. Для построения графика используют стандартный раствор сульфата аммония, для приготовления которого берут 0,236 г сульфата аммония, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 60 °C, вносят в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки. Этот раствор является стандартным и содержит 0,1 мг азота в 1 см3.
В мерные колбы вместимостью по 100 см3 вносят следующие объемы стандартного раствора (см3): 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0. После доведения объемов растворов в колбах дистиллированной водой до метки получают серию рабочих растворов концентрацией 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мкг азота в 1 см3.
Для проведения цветной реакции в пробирки помещают по 1 см3 рабочего раствора, добавляют 5 см3 реактива 1 и 5 см3 реактива 2, перемешивают и через 30 мин измеряют величину оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 625 нм или на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром с толщиной поглощающего свет слоя 1 см по отношению к контрольному опыту. Опыт повторяют три раза. Для каждого определения готовят новый стандартный раствор.
По полученным средним данным из трех стандартных растворов строят калибровочный график (рис. 1.17), откладывая на оси абсцисс концентрацию азота (с, мкг/см3), а на оси ординат — соответствующую ей оптическую плотность (Д) при длине волны 750 нм. Калибровочный график должен проходить через начало координат.
По полученной величине оптической плотности с помощью калибровочного графика определяют концентрацию азота.
59
Массовая доля белка (%)
Рис.1.17. Вид калибровочного графика для определения белка фотометрическим методом
Х= [с -250- 100/(ш -5 - 1  106)](100 -6.25),	(1.7)
где с — концентрация азота, найденная по калибровочному графику, мкг/см3; 250 — объем минерализата после первого разведения, см3; 100 —объем минсрали-зата после вторичного разведения, см3; т~ масса навески, г; 5 — объем разбавленного минерализата для вторичного разведения, см3; 1 — объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см3; 106 — множитель для перевода микрограммов в граммы; 100 — коэффициент для перевода в проценты; 6,25 — коэффициент для пересчета на белок.
Полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы, форма которой приведена ниже.
Объект исследования	Оптическая плотность раствора	Концентрация азота по калиб-ровочному графику, мкг/см'	Массовая доля в образце, %	
			азота	белка
				
На основании анализа результатов делают выводы и заключение по работе.
Лабораторная работа Ns 2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ ФОТОМЕТРИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ БЕЗ МИНЕРАЛИЗАЦИИ ПРОБ
Цель работы. Освоить ускоренные фотометрические методы определения общего белка в мясе убойных животных, птицы, мясном фарше, мясных изделиях, готовых к употреблению, без предварительной минерализации проб.
Задачи. Определить массовую долю суммарных белков в образцах органов и тканей убойных животных и рассчитать массовую долю общего белка в объектах исследования.
60
Объекты исследования. Образцы мышечной ткани разных видов убойных животных и птицы, мясных фаршей, мясных изделий, ш-товых к употреблению (колбаса, окорок, печеночный наш тез и г. л.)
Материалы, реактивы и оборудование. Бумажные фильтры; расг-вор тартрата калия-натрия молярной концентрацией 1 моль/дмраствор гидроксида натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3: биуретовый реактив (0.9 г тартрата калия-натрия: 3.0 i сульфата мели и 5,0 г иодила калия в ЮООсм3 раствора гидроксила натрия молярной концентрацией 0.2 моль/дм3): дистиллированная вода: сывороточный альбумин кристаллический: раствор красителя амидочерного 10В (0,6 г амидочерного ЮВ, 21 г лимонной кислоты и 2,5 см3 пропионовой кислоты в ЮООсм3 дистиллированной воды): раствор мочевины молярной концентрацией 8 моль/дм3; раствор гидроксида натрия молярной концентрацией 2 моль/дм3; раствор карбамила, содержащий гидроксид натрия (480,48 г карбамида и 80,0 г гидроксида натрия растворяют в ЮООсм3 дистиллированной воды); раствор лимонной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм3; раствор красителя оранжевого кислого 12; мерные колбы вместимостью 100 см3; пипетки вместимостью 0,1—5,0 см3; мерные цилиндры вместимостью 100—250 см3; колбы Эрленмейера вместимостью 100 см3: центрифуги лабораторные; спектрофотометр.
Методические указания. Перед выполнением работы следует внимательно ознакомиться с основами фотометрических методов, изложенных в теоретической части настоящей главы. Рекомендуется освоить несколько фотометрических методов без предварительной минерализации проб, основанных на соответствующих цветных реакциях. При фотометрировании в УФ-области спектра следует учесть, что при длинах волн 240—300 нм светопоглоще-ние белков почти полностью определяется ароматическими аминокислотами (триптофаном, тирозином и фенилаланином), при 205 нм — пептидными связями. В табл. 1.10 показана доля поглощения отдельных хромофоров «среднего» белка в общем спектре при различных длинах волн.
Таблица 1.10
Доля поглощения отдельных хромофоров «среднего» белка в общем спектре
Хромофоры	Доля поглощения, %, при длине волны			
	205 нм	220 нм	250 нм	280 нм
Пептидная группа	78,0	32,0	2,9	0.0
Аргинин	2.0	0.0	0,0	0.0
Цистин	0.6	1,0	11,8	2,3
Цистеин	0,1	0,1	о,о	0.0
Метионин	0,6	0,8	0.0	0,0
Гистидин	2.4	7,1	0,0	0,0
Фенилаланин	6,5	3.7	9.4	0,0
Тирозин	4.3	20,0	15,0	31.9
Триптофан	5,5	36,0	61.0	65,7
61
Рис. 1.18. Спектр поглощения альбумина бычьей плазмы крови при pH 7,5
Рис. 1.19. УФ-спектры белков мяса:
/ — свиного (Ащах = 242 нм); 2 — крупного рогатого скота (лп1;1Х = 240 нм)
Для количественного анализа наиболее часто используют поглощение при 280 нм, так как в этом случае белки имеют максимум поглощения, обусловленный содержанием в них ароматических аминокислот — триптофана и тирозина. На рис. 1.18 показан спектр поглощения типичного белка — альбумина бычьей плазмы крови. Для количественного определения белков спектрофотометрическим методом предварительно строят калибровочный график с использованием раствора чистого белка концентрацией от 0,05 до 2,00 мг/см3.
УФ-спектры белков мяса показаны на рис. 1.19.
Подготовка проб к анализу. 1. При определении массовой доли белка в образцах мышечной ткани, мясных фаршах, мясных изделиях методом Лоури, биуретовым методом или методом, основанным на связывании красителей белками, образец предварительно тщательно измельчают сначала ножом на часовом стекле или на мясорубке, а затем на гомогенизаторе.
Для приготовления щелочного экстракта 15 г гомогенизированного образца взвешивают в колбе Эрленмейера вместимостью 100 см3, прибавляют 20 см3 дистиллированной воды и 10 см3 раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3. С помощью воды суспензию переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки дистиллированной водой и хранят 12 ч в холодильнике. После этого 75 см3 экстракта (из верхней части колбы) фильтруют через смоченный дистиллированной водой бумажный фильтр диаметром 15 см, удаляя первые 15 см3 фильтрата.
2. При определении массовой доли белка в образцах мышечной ткани убойных животных, соленых мясных фаршей методами 62
УФ-спектрофотометрии образны предварительно тшазельно измельчают сначала ножом на часовом стекле ичи на мясорубке, а затем на гомогенизаторе.
1.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА МЕТОДОМ ЛОУРИ
1.1.	МЕТОД ЛОУРИ В МОДИФИКАЦИИ ДЭВЕНИ И ГЕРГЕЙ (1976 г.)
Приготовление реактивов. Реактив А. Раствор Na,СО-, массовой долей 2 % в растворе NaOH молярной концентрацией 0,1 моль/дм3.
Реактив В. Раствор CuSO4 • Н,0 массовой долей 0,5 % в растворе тартрата натрия с массовой долей 1 %.
Реактив С. Получают смешиванием 60 см3 реактива А и 1 см3 реактива В (готовят непосредственно перед определением).
Реактив Д. Непосредственно перед использованием реактив Фолина—Чокалтеу титруют по фенолфталеину раствором гидроксида натрия известной молярной концентрации и по полученным результатам разбавляют до концентрации раствора 1 моль/дм3 (приготовление реактива Фолина см. главу III, лаб. раб. № 2).
Порядок проведения анализа. К 0,2 см3 исследуемого раствора, содержащего 5—100 мкг белка, прибавляют 1 см3 реактива С, смешивают и через 10 мин быстро вносят 0,1 см3 реактива Д, встряхивают и оставляют при температуре (20 ± 5) °C на 30 мин, а затем снимают показания на спектрофотометре при Л == 750 нм.
Построение калибровочного графика. Содержание белка в растворе определяют по калибровочному графику, который строят с использованием раствора тирозина известной концентрации. Для приготовления стандартного раствора 20 мг кристаллического тирозина растворяют в 200 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,2 моль/дм3. Калибровочный график строят, используя растворы тирозина с рекомендуемой массовой концентрацией:
Содержание тирозина, мкг	Объем раствора тирозина. см;	Объем раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,2 моль/дм’, см;	Значение экстинкции
10	0,1	0,9	0,113
20	0,2	0,8	0,208
30	0,3	0,7	0,316
40	0.4	0,6	0,401
50	0,5	0,5	0,511
60	0,6	0,4	0,614
70	0,7	0,3	0.706
80	0.8	0,2	0,817
90	0,9	0,1	0,900
63
Рис. 1.20. Калибровочный график для определения белка по метолу . Гоури в модификации Дэвешь Гергей
По результатам определения строят калибровочный трафик (рис. 1.20). откладывая на оси абсцисс концентрацию стандартных растворов (мкг/смЛ тирозина, а на оси ординат — значения оптической плотнос-
ти при 750 нм. По графику находят концентрацию тирозина, которая соответствует найденной оптической плотности.
1.2.	МЕТОД ЛОУРИ В МОДИФИКАЦИИ ЛАСТЫТЬ (1978 г.)
Приготовление реактивов. Реактив А. Смесь растворов: Na2CO3 молярной концентрацией 1 моль/дм3, NaOH молярной концентрацией 1 моль/дм3 и CuSO4 с массовой долей 0,5 % (содержит 1 % тартрата калия-натрия) в соотношении 10:5:1.
Порядок проведения анализа. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 2—5 см3 щелочного экстракта белков образца, приготовленного в соответствии с прописью подготовки проб, прибавляют 15 см3 раствора тартрата калия-натрия молярной концентрацией 1 моль/дм3 и доводят объем дистиллированной водой до метки. В зависимости от массового содержания азота для фотометрического определения используют 0,2 см3 (или более) приготовленного раствора. Объем доводят до 10 см3 с помощью реактива А. По истечении 30 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при Л = 750 нм. Для определения содержания азота строят калибровочный график.
2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ
Приготовление реактивов. Биуретовый реактив. 0,9 г тартрата калия-натрия, 3,0 г сульфата меди и 5,0 г иодида калия растворяют в 1000 см3 раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 0,2 моль/дм3.
Порядок проведения анализа. Щелочной экстракт белков объемом 2 см3 смешивают с 15 см3 биуретового реактива. После 64
Рис. 1.21. Калибровочный график для определения белка биуретовым мето
ДОМ
i I
30 мин инкубирования смеси при 37 СС светопоглошсние измеряют на спектрофотометре при к = 550 нм.
Контрольный опыт готовят аналогично, используя вместо образца 1 см3 дистиллированной волы.
Построение калибровочного графика. Для построения i рафика готовят ряд последовательных разведений стандартного раствора белка, в качестве которого используют кристаллический сывороточный альбумин: 0,01 г белка растворяют в 100 см3 дистиллированной воды, отбирают 1 см3 и доводят объем до 10 см? и т. д.
С пробами из каждого разведения белка проводят биуретовую
реакцию в условиях, соответствующих описанию метода, и измеряют оптическую плотность окрашенных растворов. Затем строят график	пример которого приведен на рис. 1.21.
3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА МЕТОДАМИ, ОСНОВАННЫМИ НА СВЯЗЫВАНИИ КРАСИТЕЛЕЙ
3.1.	МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АМИДОЧЕРНОГО 10В
Приготовление реактивов. Раствор красителя амидочерного 10В. 0,6 г амидочерного 10В, 21г лимонной кислоты и 2,5 см3 пропионовой кислоты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды.
Порядок проведения анализа. Смешивают 2 см3 щелочного экстракта, содержащего мясные белки, с 25 см3 раствора красителя амидочерного 10В.
После проведения цветной реакции в течение 1 ч раствор центрифугируют в течение 10 мин при 100 с~1. Абсорбцию прозрачного супернатанта определяют на спектрофотометре при л = 615 нм. Массовую долю белка определяют по калибровочному графику.
3.2.	МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОРАНЖЕВОГО КИСЛОГО 12
Приготовление реактивов. Раствор красителя оранжевого кислого 12.1,300 г очищенного красителя раство; ряют в фосфатном буфере молярной концентрацией 0.05 моль/дм3 и доводят объем до 1 дм3.
65
Ф о с ф a i н ы й б у ф с р м о л я р н о if к о н и с н 1 р а -и и е if 0,05 моль/дм' (pH 1.8—1.9). 3.4 г КНфО ,. 3.4 см ; Н.РО4 (массовой долей <35 Ф). 6()см' уксусной кислочы. 1 см; пропионовой кислоты и 2 г щавелевой кислоия растворяют в ' 800 см3 Н?О и затем доводят водой до 1 дм'. Щавелевую кислоту и КН->РО4 предварительно растворяют отдельно в горя чей воде.
Порядок проведения анализа. К навеске пробы, содержащей около 4 г белка, добавляют из мерной колбы 250 см3 раствора лимонной кислоты концентрацией 0.1 моль/дм3 и гомогенизируют в течение 2—3 мин. Лимонная кислота, употребляемая для эмульгирования белков мяса, облегчает связывание кислого красителя белками.
Взвешивают 2—4 г разбавленного образца с точностью до 0,01 г в 50-миллилитровые поликарбонатные центрифужные пробирки, добавляют воду до 5 г, применяя градуированную пипетку, а затем 25 см3 раствора красителя, закрывают пробкой и энергично встряхивают. Оставляют на 30 мин или дольше для взаимодействия красителя с белком и агрегации образовавшихся комплексов. Если смесь мутная, то ее центрифугируют и фильтруют. Определяют концентрацию свободного несвязав-шегося красителя, измеряя абсорбцию при 2. = 475 нм. Анализ удобно проводить в специальной проточной кювете с толщиной светопоглощающего слоя 0,75 мм. Для расчета используют стандартный график, который строят на основе анализа мяса методом Кьельдаля того же состава, что и анализируемый образец. Это связано с тем, что содержание ионогенных групп аминокислот в разных белках различно.
Как видно из рис. 1.22, между содержанием белка, определенным по методу Кьельдаля, и концентрацией свободного красителя наблюдается линейная зависимость. Рекомен-
Содержание протеина (по Кьельдалю), мг /см
дуемый предел концентраций свободного красителя составляет 0,3—0,6 мг/см3. Следует подчеркнуть, что конечный объем, а также количество добавляемого красителя должны быть постоянными.
Рис. 1.22. Отношение содержания свободного красителя к общему содержанию белка в образце свиной колбасы, определенному по методу связывания красителя
66
4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА МЕТОДАМИ УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ
4.1.	МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В ГОВЯДИНЕ
Порядок проведения анализа. Образец массой 15 г гомогенизируют с 250 см3 раствора лимонной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 в гомогенизаторе в течение 2—3 мин.
К гомогенизированной порции (в пробирке) прибавляют 9,5 см3 раствора мочевины молярной концентрацией 8 моль/дм3 в растворе гидроксида натрия молярной концентрацией 2 моль/дм3, встряхивают, центрифугируют при частоте вращения 83 с"1 в течение 7 мин для отделения жира и измеряют оптическую плотность при X = 243 нм.
Массовую долю белка определяют, используя калибровочный график или уравнение регрессии, для чего предварительно определяют массовую долю белка по методу Кьельдаля.
Уравнение регрессии, например, для соленой говядины имеет вид
у= 17,32л-+ 1,025,	(1.8)
где у — массовая доля белка, %; х — оптическая плотность (х = D при Л = 243 нм).
4.2.	МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В МЯСЕ ПТИЦЫ
Порядок проведения анализа. При определении массовой доли белка в курином мясе методами УФ-спектрофотометрии предварительно тщательно измельченный образец массой 1,5 г суспендируют в гомогенизаторе в течение 5 мин со 100 см3 раствора лимонной кислоты, затем с помощью пипетки вносят 0,5 см3 суспензии в центрифужную пробирку, добавляют 9,5 см3 раствора карбамида, содержащего гидроксид натрия, и после осторожного перемешивания центрифугируют в течение 3 мин при частоте вращения 116—117 с . Заполняют кварцевую кювету с толщиной светопоглощающего слоя 1 см прозрачной жидкостью и измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при к = 241 нм.
В качестве контрольного раствора используют смесь из 0,5 см3 раствора лимонной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 и 9,5 см3 щелочного раствора мочевины.
Массовую долю белка определяют, используя калибровочный график или приведенное выше уравнение регрессии (1.8). Пробы с различной массовой долей белка рекомендуется готовить путем смешивания гомогенизированного куриного мяса со свиным жиром в различных соотношениях.
67
-4.3 МЕ70Д ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА В СВИНИНЕ И ГОВЯДИНЕ
Порядок проведения анализа. Анализ проводится ио той же методике (см. и. 4.2). но с использованием других длин волн и других калибровочных графиков. Возможно также использование уравнении регрессии:
для свинины
у =—13.7282 + 63.8762а;	(1.9)
для говядины
у = 6,9999 + 34,8326х.	(1.10)
Результаты определения массовой доли белка в объектах исследования с использованием метода Лоури, биуретового метода и метода связывания красителей белками рекомендуется оформить в виде таблицы, форма которой приведена ниже.
Объект исследования	Оптическая плотность раствора	Концентрация азота по калибровочному графику, мкг/см’	Массовая доля белка в образце, %
	1		
Результаты определения массовой доли белка в объектах исследования с использованием методом УФ-спектрофотометрии рекомендуется свести в таблицу;
Объект исследования (наименование образца)
Оптическая плотность раствора
Массовая доля белка, %
По результатам предварительной теоретической подготовки и проведенных определений делают выводы и составляют общее заключение по работе. На базе литературных данных и результатов собственных исследований рекомендуется дать сравнительную характеристику сырья и продуктов по содержанию белка, а также прокомментировать преимущества и недостатки предлагаемых модификаций фотометрических методов анализа белков мяса и мясопродуктов.
68
Лабораторная работа № 3
АНАЛИЗ ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА БЕЛКОВ НА ОСНОВЕ ИХ РАСТВОРИМОСТИ
Цель работы. Определить фракционный состав белков .мяса и мясопродуктов на основе их способности к растворению.
Задачи. Провести предварительное выделение фракций методами экстракции и количественно определить белки в экстрактах.
Объекты исследования. Мышцы различных видов животных (говядина, свинина, баранина) аналогичных анатомических участков, образцы соединительнотканных образований и внутренних органов.
Материалы, реактивы и оборудование. Дистиллированная вода: солевой раствор Вебера; раствор гидроксида натрия массовой долей 10%; сывороточный альбумин; биуретовый реактив; фотоэлектроколориметр (ФЭК-56М); настольная центрифуга; часовое стекло; пипетки; пробирки; технические весы; мерные цилиндры вместимостью 10 см3.
Приготовление реактивов. Биуретовый реактив. 1,5 г CuSO4 5Н2О и 6,0 г NaKC4H4O6 • 4Н2О растворяют в 500 см3 воды, при постоянном перемешивании добавляют 300 см3 раствора гидроксида натрия массовой долей 10 %. Общий объем доводят дистиллированной водой до 1000 см3.
Методические указания. Белки мяса и мясопродуктов можно разделить на растворимые в воде (белки саркоплазмы), в солевых растворах (белки миофибрилл) и нерастворимые в водно-солевых растворах, условно называемые белками стромы.
Водорастворимые белки саркоплазмы включают миоген, миоглобин (природный пигмент), миоальбумин, глобулин X.
К солерастворимым (миофибриллярным) белкам относятся миозин, актин, тропомиозин, тропониновый комплекс.
Фракция стромы включает белки, входящие в состав сарколеммы и внутримышечной соединительной ткани, которая связывает мышечные волокна в пучки, а также белки ядер. Фракция стромы объединяет белки: коллаген, эластин, ретикулин, а также гликопротеиды — муцины и мукоиды. Последние представляют собой слизистые белки, выполняющие защитные функции и облегчающие скольжение мышечных пучков. Все эти белки можно извлечь щелочными растворами. На практике их часто называют щелочерастворимой белковой фракцией мышечной ткани.
Количественное соотношение различных фракций, их состояние определяют не только технологические свойства сырья и продуктов, но и их биологическую ценность.
Для анализа белковых веществ используют много методов, включая различные модификации метода Кьельдаля, фотометрические методы с использованием спектрофотометров и фотоэлектроколориметров.
69
Среди ускоренных фотометрических методов большое признание получила биуретовая реакция, достоинства которой уже были отмечены в лабораторной работе J\g 2 при анализе белков.
На основе информации о количественном соотношении белковых фракций можно провести реальное прогнозирование функционально-технологических свойств сырья, особенно при получении продуктов заданного качества.
Подготовка проб к анализу. Мышцы различных животных (говядина, свинина, баранина) аналогичных анатомических участков тщательно освобождают от жира и прирезей соединительной ткани. Навеску массой 3—4 г тщательно измельчают ножом на часовом стекле. К навеске измельченного сырья приливают дистиллированную воду в соотношении I : 6 (по массе) и ведут экстракцию на холоде при О °C в течение 30 мин. Затем центрифугированием при частоте вращения 83 с3 в течение 5 мин отделяют осадок. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и используют для количественного определения белков.
Осадок количественно переносят в фарфоровую ступку, растирают с песком и приливают солевой раствор Вебера в соотношении 1 : 6 к первоначальной навеске мышечной ткани. Экстракцию проводят при 0 °C в течение 20 мин. По истечении указанного времени экстракт отделяют центрифугированием в течение 10 мин при частоте вращения 83 с-1. Надосадочную жидкость декантируют и используют для количественного определения солерастворимых белков, а осадок подвергают обработке.
Далее осадок количественно переносят в термостойкую пробирку, добавляют 10 см3 раствора гидроксида натрия массовой долей 10 % и нагревают на водяной бане температурой до 96 °C. Полученный раствор после охлаждения центрифугируют при частоте вращения 83 с-1 в течение 5 мин. Надосадочную жидкость декантируют и используют для количественного определения белков стромы.
Порядок проведения анализа. Для проведения цветной реакции к 1 см3 исследуемых растворов белков (фракции: водорастворимая, солерастворимая и щелочерастворимая) добавляют 4 см3 биуретового реактива. Смесь оставляют в покое при температуре (20 ± 5) °C в течение 30 мин. По истечении времени образования окрашенного комплекса измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 540—560 мкм на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром.
Для того чтобы определить содержание белка в любой из фракций мышечной ткани, нужно снять показания оптической плотности Р1? найти это значение на оси ординат калибровочного графика и определить соответствующую концентрацию на оси абсцисс. Построение калибровочного графика — см. лабораторную работу № 2.
70
Массовую долю воло-. соле- и щелочерас гворимых белковых фракций (сс) определяют ио формуле
А'^ 100(с V )/т.	(1.11)
где с — концентрация белка, найденная по калибровочному графику. мг,/см': Г— объем пробы после экстрагирования соответствующей белковой фракции, см': /и —масса навески мышечной ткани, мг.
Подготовив образцы мышечной ткани определенного вида животных, проведя фракционирование, измерив оптическую плотность, выполняют расчеты и оформляют результаты в виде таблицы:
После заполнения таблицы рекомендуется проанализировать данные для мяса от одного и от нескольких видов животных, различных тканей и сформулировать заключение по данной работе.
Лабораторная работа № 4
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТОМИОЗИНА
Цель работы. Приобрести практический навык количественного анализа белков актомиозинового комплекса в образцах мышечной ткани различных видов убойных животных и птицы.
Задачи. Экстрагировать солерастворимую белковую фракцию мышечной ткани, осадить белки, гравиметрически определить и рассчитать массовую долю актомиозинового комплекса.
Объекты исследования. Образцы мышечной ткани одного или различных видов убойных животных и птицы на различных стадиях автолиза, полученные от аналогичных анатомических участков.
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор Вебера; ацетатный буферный раствор (pH 4,8); раствор СН3СООН массовой долей 1 %; сушильный шкаф; лабораторный потенциометр — pH-метр; весы аналитические; стаканчик для титрования; беззольные фильтры; ступка охлажденная.
Методические указания. Количественное соотношение различных белковых фракций мышечной ткани характеризует степень И глубину автолитических превращений. С одной стороны, количественное содержание актомиозина свидетельствует о степени
71
i рунного окоченения, ограничивающею применение мясного сырья. с другой лас г информацию о необходимости использования дополнительных средств, расширяющих его технологические возможности.
В свежей мышечной ткани растворимость миофибриллярных белков максимальна, поскольку актин и миозин существуют в виде отдельных фракций. Мышца в результате этого расслаблена, имеет высокую гидрофильность. С развитием автолитических процессов в период посмертного окоченения актин и миозин образуют комплекс, и мышца укорачивается, теряет влагу.
Актомиозин, извлекаемый из мышцы солевыми растворами, выпадает в осадок при диализе или разведении экстрактов, имеет изоэлектрическую точку при pH 5,5 и составляет около 55 % всех белков мышцы.
Количественное соотношение различных фракций, их состояние во многом определяют как технологические свойства сырья, так и его биологическую ценность.
Миофибриллярные белки мышечной ткани на различных стадиях автолиза определяют по методу Баленовича — Штрауба. Белки актомиозинового комплекса осаждают из супернатанта солерастворимых белков, полученных при экстрагировании навески ткани раствором Вебера путем снижения молярной концентрации хлорида калия до 0,05—0,06 моль/дм3 при определенных значениях pH раствора.
Для снижения молярной концентрации солей применяется десятикратное разведение супернатанта охлажденной до 0 °C дистиллированной водой.
Подготовка проб к анализу. Навеску мышечной ткани массой 3—4 г тщательно измельчают ножом на часовом стекле. К навеске измельченного сырья добавляют дистиллированную воду в соотношении 1 : 6 (по массе) и ведут экстракцию на холоде при 0 °C в течение 30 мин. Затем центрифугированием при частоте вращения 83 с'1 в течение 5 мин отделяют осадок. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и удаляют.
Осадок количественно переносят в фарфоровую ступку, растирают с песком и добавляют солевой раствор Вебера в соотношении 1 : 6 к первоначальной навеске мышечной ткани. Экстракцию проводят при 0 °C в течение 20 мин. По истечении указанного времени экстракт отделяют центрифугированием в течение 10 мин при частоте вращения 83 с-1. Надосадочную жидкость декантируют и используют для количественного определения актомиозинового комплекса миофибриллярных белков.
Порядок проведения анализа. 1. Для снижения концентрации солей в экстракте белков солерастворимой фракции к их экстракту объемом 2 см3 добавляют дистиллированную воду температурой 0 °C в соотношении 1 : 9.
72
2. Исследуют две зоны осаждения белков актомиозинового комплекса: при pH 5,2 и 7,0.
В первом случае к разведенному раствору добавляют из расчета на каждый I см3 экстракта солерастворимых белков (в данном случае 2 см3) по 0,5 см3 ацетатного буфера pH 4,8, контролируя и доводя pH раствора по лабораторному потенциометру — pH-метру до 5,2,
Во втором случае разведенный охлажденной дистиллированной водой раствор центрифугата осторожно по каплям нейтрализуют раствором уксусной кислоты массовой долей I %, доводя pH раствора по потенциометру — pH-метру до 7,0.
Осажденный актомиозин после некоторого уплотнения в растворе при отстаивании на холоде отделяют фильтрованием через предварительно высушенный до постоянной массы и взвешенный с точностью до 0,0001 г фильтр. Массу осадка определяют после его высушивания на фильтре при 105 °C до постоянной массы.
Массовую долю фракции актомиозина (%) рассчитывают по формуле
Х= 100[(m1-m0)H]/2w,	(1.12)
где /И] — масса фильтра с сухим остатком, г; т0 — масса высушенного фильтра, г; К—объем раствора Вебера, добавленный для экстрагирования, см3; 2 — объем экстракта белка, взятый для осаждения, см3; т — масса навески образна ткани, г.
Полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы:
Образец	Сроки и условия хранения (при исследовании образцов мышечной ткани на разных стадиях автолиза)	Массовое содержание актомиозиновой фракции	
		мг/г	%
			
По результатам проведенных определений делают выводы и формулируют общее заключение по работе.
Лабораторная работа № 5
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА
Цель работы. Приобрести навык в определении количественного содержания коллагеновых белков в образцах различных видов тканей убойных животных и птицы.
Задачи. Экстрагировать коллаген и количественно определить его на основе минерализации, а также путем гидролиза коллагено
73
вых iio.iiiueiiiидов с последующим проведением качественной реакции на оксипролин и фотометрированием.
Объекты исследования. Образцы мышечной и соединительной ткани убойных животных и птицы.
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор соляной кислоты молярной концентрацией 12 моль/дм3: хлорид олова (II); растворы гидроксида натрия молярной концентрацией 2,5 и 6 моль/дм3; насыщенный раствор карбоната натрия; раствор сульфата меди молярной концентрацией 0,01 моль/дм3; раствор пероксида водорода массовой долей 6 %; раствор серной кислоты молярной концентрацией 3 моль/дм3; раствор пара-л и метил аминобензальдегида в пропиловом спирте массовой долей 5 %; спиртовой раствор фенолфталеина массовой долей 1 %, растворы гидроксида натрия массовой долей 0,1 и 0,2 %; раствор уксусной кислоты массовой долей 20%; лед; универсальный индикатор; бумажные фильтры; вата; воронка Бюхнера; водяная баня; ступки фарфоровые; центрифуга лабораторная; центрифужные пробирки; стеклянные стаканы; стеклянные колбы вместимостью 100 и 200 см3; установка для минерализации проб; колба Кьельдаля со шлифом из стекла пирекс или молибденового; обратный шариковый холодильник; колбонагреватель; стеклянные ампулы; стеклянные палочки; пластинка из молочно-белого стекла; спектрофотометр или фотоэлектроколориметр; автоклав.
Методические указания. Количественное определение коллагена в животных тканях проводят либо по методу В. П. Воло-винской, основанному на экстрагировании фракции коллагеновых белков и последующем определении в экстрактах белкового азота (см. лабораторную работу № 1), либо по количественному содержанию аминокислоты оксипролина, специфической для коллагена (см. лабораторную работу № 10). Метод основан на предварительном гидролизе коллагеновых полипептидов с последующим проведением качественной цветной реакции на оксипролин и фотометрированием. Включает следующие основные операции; гидролиз ткани соляной кислотой в присутствии хлорида олова, нейтрализацию кислоты и удаление олова, окисление оксипролина, развитие цветной реакции с шз/ш-диметил-аминобензальдегидом, измерение интенсивности окраски фотометрированием.
Результаты, полученные по этому методу, приведены в табл. 1.11.
Расчет количества белка ведут на основании известного массового содержания оксипролина (23 % к сумме аминокислот) в коллагенах.
Для выделения оксипролина мышечную ткань подвергают гидролизу с применением кислоты или щелочи. Продолжительность гидролиза имеет большое значение: недостаточная приводит к неполному освобождению оксипролина, а избыточная — к частичному его разрушению.
74
Таблица 1.11
Массовая доля (%) оксипролина и соединительнотканных белков в разных видах тканей
Образен	Оксипролин	Соедините/! ьноткан ныс белки
Поясничная мышца свиней
0.046	0.371
Шейная часть туши крупного рога-	0.322	2.600
того скота Филей крупного рогатого скота	0.220	1,800
Сырые связки убойных животных	10.56	85.200
Добавление хлорида олова II (не менее 3/4 количества белка в навеске) необходимо для предотвращения образования гуминовых веществ.
При нейтрализации и подщелачивании гидролизата используют карбонат натрия, чтобы предотвратить образование ионов олова в щелочной среде и облегчить его удаление в виде гидрата олова.
Окисление оксипролина пероксидом водорода в щелочной среде приводит к образованию продуктов, дающих с /шрд-диметил-аминобензальдегидом цветную реакцию. Следы пероксида водорода могут понизить интенсивность окраски или придать раствору неспецифический оттенок, поэтому его избыток разрушают нагреванием на водяной бане при 80 °C. При этом рекомендуется добавлять мочевину, образующую довольно стойкое соединение с пероксидом водорода CO(NH2)2H2O2.
Интенсивность образовавшейся розовой окраски измеряют спектрофотометрически или колориметрически. Окраска устойчива к течение 60—90 мин. В пределах до 25 мкг оксипролина поглощение подчиняется закону Бугера—Ламберта—Бера. Специфичность реакции очень высока.
Из всех аминокислот, содержащихся в кислотном гидролизате белков мяса, определению мешает только тирозин. По данным Е. Вербицкого и Ф. Е. Деасраджа, окраска тирозина составляет 1,3 % окраски, развиваемой оксипролином. Поэтому используется поправка на тирозин — 0,072 единицы оптической плотности на 1 см3 кислотного гидролизата, соответствующего 40 мг мяса:
211112 0^928 40 00() =	2
20 100 100
Полная поправка с учетом окраски самого гидролизата, соответствующей 0,01 ± 0,003, составляет 0,082 единицы оптической плотности на 40 мг мяса в 1 см3 гидролизата.
75
Для проведения цветной реакции в зависимости от ожидаемого содержания соединительной ткани в продукте следуе т брать разные объемы испытуемого раствора. Если, например, на анализ взята препарированная длиннейшая спинная мышца свиньи, то объем исследуемого раствора может быть равен 1 см3 (при разведении гидролизата до 100 см3). Массовая доля соединительной ткани в указанной мышце составляет 0,2—0.4 %. Если же взят образец, содержащий больше соединительной ткани, то на цветную реакцию нужно значительно меньше испытуемого раствора. Объем раствора доводят до 1 см3 дистиллированной водой.
Подготовка проб к анализу. Ткани животных предварительно режут на маленькие кусочки и взвешивают согласно нижеприведенным рекомендациям в соответствии с принятым методом определения.
1.ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА В МЯСЕ ПО МЕТОДУ В. П. ВОЛОВИНСКОЙ
Порядок проведения анализа. Измельченный образец ткани массой Ю г растирают с 50 см3 раствора хлорида натрия массовой долей 0,6 %. Полученную смесь переносят в центрифужную пробирку, ополаскивая ступку и пестик 50 см3 того же раствора. Смесь экстрагируют в течение I ч, затем центрифугируют в течение 15 мин при частоте вращения 33—50 с-1. Жидкую фракцию удаляют, а к осадку прибавляют 100 см3 раствора гидроксида натрия массовой долей 0,2 %. Через 12—24 ч после тщательного перемешивания жидкую фракцию отделяют центрифугированием. Остаток ткани обрабатывают щелочью еще 2 раза, каждый раз добавляя по 50 см3 раствора гидроксида натрия массовой долей 0,2 %.
Остаток ткани из пробирки количественно переносят в стакан, смывая раствором гидроксида натрия массовой долей 0,1 % (объем раствора гидроксида натрия 100 см3). Содержимое стакана нагревают при умеренном кипении в течение 30 мин, по возможности сохраняя объем жидкости в стакане периодическим добавлением горячей воды. Затем частицам ткани дают возможность осесть на дне стакана и в горячем виде жидкость осторожно декантируют с осадка в мерную колбу вместимостью 200 см3 через воронку с небольшим количеством ваты, предварительно проверенной на содержание азота.
Остаток в стакане вместе с ватой, через которую проводилось фильтрование, при кипении обрабатывают водой, для чего в стакан наливают 100 см3 горячей дистиллированной воды и при умеренном кипении раствор сгущают за 1,5—2,0 ч до 1/3 первоначального объема. Сгущенный раствор через 15—20 мин декантируют с осадка через вату в ту же мерную колбу вместимостью 200 см3.
76
Аналогично при кипении остатки ткани обрабатывают водой еше два раза. После последней экстракции ваду промываю! водой и промывные воды присоединяют к общему объему эксдрак га.
Собранный в мерную колбу экстракт подкисляют раствором уксусной кислоты массовой долей 20 % до pH 4,8. нагревают до 50 °C и после охлаждения доводят водой до метки. При подкисле нии выпадает небольшое количество белков, од которых освобождаются фильтрованием через бумажный фильтр. Из фильтра берут 20 см3 и после минерализации определяю! азот согласно описанию лабораторной работы № 1.
Массовую долю азота в коллагене (%) вычисляют по формуле
N = (а  200 100)/(20ш),
(1.13)
где а —массовая доля азота в 20 см3 фильтрата, %: т - масса навески ткани, г.
Коэффициент пересчета азота на коллаген равен 5,62.
2.ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА НА ОСНОВЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО ГИДРОЛИЗА
Порядок проведения анализа. Навеску мяса массой 4 г вносят в колбу Кьельдаля вместимостью примерно 100 см3 со шлифом для присоединения обратного холодильника. К навеске добавляют 7см3 воды, 10см3 соляной кислоты молярной концентрацией 12 моль/дм3 и 0,7 г хлорида олова (II).
К колбе присоединяют пришлифованный шариковый холодильник и включают воду. Нагревание ведут на воздушной или песчаной бане. Для воздушной бани удобно использовать колбо-нагреватель (электроплитку с коническим углублением). С момента закипания жидкость нагревают ровно 7 ч, после чего плитку выключают и отставляют от колбы. Еще теплую колбу отсоединяют от холодильника и содержимое переносят, смывая дистиллированной водой, в мерную колбу вместимостью 100 см3. Исходную колбу несколько раз ополаскивают водой (общий объем промывных вод должен быть не более 2/3 объема колбы).
Для ускорения процесса гидролиз проводят в автоклаве. Навеску мяса массой 4 г вносят в ампулу вместимостью 25 см3 через расширенную часть горлышка (обрезают запаянный конец пустой ампулы так, чтобы образовалась воронка). К навеске добавляют 7 см3 воды, 10 см3 концентрированной соляной кислоты и 0,7 г хлорида олова (II). Ампулы запаивают на горелке и помещают в автоклав температурой 112—114 °C на 3,5 ч, после чего их можно хранить длительное время.
Содержимое ампулы переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, остатки смывают дистиллированной водой (общий объем промывных вод должен быть не более 2/3 объема колбы).
77
(.'одержимое мерной колбы независимо от способа гидролиза нейтрализуют раствором гидроксида натрия молярной концентрацией 6 моль/дм3. а затем доводят насыщенным раствором карбоната натрия до pH 8.0—8.2. После образования белого осадка начинают контролировать pH. используя pH-метр со стеклянным электродом или универсальный индикатор и фенолфталеин.
При работе по последнему способу из колбы отбирают тонкой стеклянной палочкой одну каплю жидкости и помещают ее на пластинку из молочно-белого стекла. Добавляют несколько капель дистиллированной воды и одну каплю универсального индикатора. После того как по универсальному индикатору pH жидкости будет близок к 7,5. добавляют несколько кубических сантиметров раствора карбоната натрия. Обработка считается законченной, если капля раствора, смешанная с водой, окрасится в чуть заметный розовый цвет (по фенолфталеину).
Колбу с жидкостью быстро охлаждают, объем доводят до метки дистиллированной водой и оставляют в покое в течение 30 мин. Затем осадок отфильтровывают через плотный бумажный фильтр на воронке Бюхнера при слабом разрежении.
Если фильтр мутный, его вторично фильтруют через тот же самый фильтр. Фильтрат светло-желтого цвета должен быть совершенно прозрачным. Одновременно гидролизуют, а затем нейтрализуют и фильтруют несколько проб.
В пробирки отмеряют пипетками по 1 см3 растворов в указанном порядке: исследуемый фильтрат, раствор сульфата меди молярной концентрацией 0,01 моль/дм3, раствор гидроксида натрия молярной концентрацией 2,5 моль/дм?, раствор пероксида водорода массовой долей 6%. Одновременно проводят три контрольных опыта, в которых исследуемый фильтрат заменяют 1 см3 дистиллированной воды.
Растворы в пробирках перемешивают, периодически встряхивая, в течение 5 мин. Затем пробирки помещают на водяную баню при 80 °C на 5 мин, часто и энергично встряхивая их. При этом пробирки должны быть глубоко погружены в воду. По окончании нагревания пробирки охлаждают на водяной бане со льдом и добавляют в каждую при перемешивании 4 см3 раствора серной кислоты молярной концентрацией 3 моль/дм3, а затем при сильном перемешивании 2 см3 раствора идря-диметиламинобензальдегида.
Далее пробирки помещают на водяную баню при 70 °C на 16 мин, после чего охлаждают водопроводной водой (под краном) и измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 560 нм или фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром. Измерения сравнивают с контрольным опытом. Предварительно измеряют оптическую плотность двух контрольных растворов (одного относительно другого). Третий контрольный раствор служит запасным, его используют только в случае расхождения в показаниях первых двух растворов.
78
Построение калибровочного графика. Рас 1 воры оксинролина концентрацией 0.5—25.0 мкг/см подвергают всем операциям согласно описанию метода, начиная с гидролиза, так как 15 процессе последнего некоторое количество оксипролина разрушается (рис. 1.23).
По калибровочному графику находят концентрацию оксипролина в объеме жидкости, находящейся в пробирке после добавления /ш/м-диметиламино-бензальдегида (10 см3).
Массовую долю оксипролина в исследуемом образце (мг
D
Рис. 1.23. Калибровочный график для определения оксипролина:
/ -- без гидролиза; 2 -- после кислотною гидроди м
рассчитывают но формуле
с 100 100
Ут
(1Л4)
где с — концентрация оксипролина в 10 см3 окрашенного раствора, определенная по калибровочному графику, мг; 100 —объем раствора, полученный после нейтрализации. см3; 100 — множитель для перевода в проценты; И—объем раствора, взятый для цветной реакции, см3; т — масса навески мяса, г.
Предварительно из величины оптической плотности, отнесенной к 1 см3 гидролизата, соответствующего 40 мг мяса, вычитают поправку, равную 0,082 единицы оптической плотности.
Количество оксипролина пересчитывают на белки соединительной ткани, умножая на коэффициент 8,07.
При содержании оксипролина до 25 мкг в 10 см3 окрашенного раствора в исследуемом образце можно работать без калибровочного графика, пользуясь следующей формулой:
Р-0,01  100 100 0,164 Ут
(1.15)
где D — оптическая плотность; 0,01 — количество оксипролина, соответствующее 0,164 оптической плотности; 100 —объем раствора после нейтрализации; 100 — множитель для перевода в проценты; 0.164 — величина оптической плотности, полученная для чистого оксипролина; И—объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см3; т — масса навески мяса, г.
Величина оптической плотности до 0,3—0,4 единицы пропорциональна концентрации оксипролина.
79
Для пересчета содержания соединительнотканных белков в .нас товые доли от общею содержания белков используют уравнение
где 8.07 — коэффициент пересчета оксипродина на бедки соединительной ткани: д —массовая доля оксипролина. %; 6.25 — коэффициент пересчета на белки: .У — массовая доля общего азота в мясе, %.
Оформление результатов. Полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы:
Образец или вид ткани
азота
Массовая доля, %
коллагена
По результатам экспериментальных исследований формулируют выводы и делают общее заключение по работе. При этом рекомендуется сравнить полученные данные с литературными, а также указать преимущества и недостатки используемых подходов в анализе коллагена.
Лабораторная работа № 6
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА КРОВИ
Цель работы. Освоить методы определения гемоглобина крови убойных животных на основе его биохимических свойств.
Задачи. Получить и изучить кристаллы гемоглобина из крови убойных животных. Провести качественные реакции на гемовую группу гемоглобина крови. Определить концентрацию растворенного гемоглобина в плазме крови.
Объекты исследования. Стабилизированная кровь и ее фракции от различных видов животных, полученные в условиях производства; цельная кровь и плазма, выделенная в лабораторных условиях или при промышленной переработке крови.
Материалы, реактивы и оборудование. Физиологический раствор (раствор хлорида натрия массовой долей 0,85 %); ацетатный буфер pH 4,6 (4,9 см3 раствора CH.COONa • ЗН2О молярной концентрацией 0,2 моль/дм3 и 5,1 см3 раствора СН3СООН молярной концентрацией 0,2 моль/дм3); раствор пероксида водорода массовой долей 0,3 %; спиртовой раствор бензидина массовой долей 0,1 %; этанол 96 об.%; ледяная уксусная кислота; кристаллический хлорид натрия; стеклянные палочки; пробирки; пипетки; капельницы; штатив для проби
80
рок: фо i оэлектроколориме i р. часы, микроскоп: предметы^ стекла: покровные стекла.
Методические указания. Работ состоит из ipex этапов. каждый из которых может быть использован в экспериментальной практике самостоятельно.
Гемоглобин разных животных различается белковой частью — глобином, который характеризуется различным сочетанием и соотношением аминокислот, поэтому форма кристаллов гемоглобина неодинаковая.
Метод определения кристаллов гемоглобина основан на предварительном водном гемолизе эритроцитов с последующим осаждением кристаллического гемоглобина раствором этилового спирта.
Гемоглобин — сложный белок, который состоит из белка глобина и простетической группы — гема. Последний, в свою очередь, является сложным органическим соединением, содержащим четыре пиррольных кольца и двухвалентное железо.
Присутствие кристаллов гемина говорит о наличии гемоглобина в исследуемом объекте (рис. 1.24).
В основу количественного определения растворенного в плазме крови гемоглобина положена его способность окислять в присутствии пероксида водорода бензидин в окрашенное соединение (л-хинондиимид). Интенсивность окраски среды прямо пропорциональна содержанию гемоглобина и определяется фотометрированием.
сн3 сн=сн? СН, сн=сн?
СН3 СН?	СН? СН,
I	I
СН?	СН?
I	I 
соон соон
Рис. 1.24. Хлоргемин:
а — структурная формула; б— кристаллы (х 500)
81
иищслпнИЬ КРИСТАЛЛОВ ГЕМОГЛОБИНА
Подютовка проб. Сiабилизированную кровь живошых (10 см ') центрифугируют в зсчсние 5- X .мим при частоте вращения 25—42 с Плазму (налосадочиую жидкость) осторожно отбирают пинеткой и переносят в чистую сухую пробирку (ее можно использовать для выполнения и. 3 данной работы). Осадок эритроцитов используют для выделения кристаллов гемоглобина.
Порядок проведения анализа. В сухие чистые пробирки предварительно помещают но 1.5 см3 дистиллированной воды. а затем добавляют ио 0,5 см3 эритроцитов и смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой. В результате происходит гемолиз эритроцитов — нарушение целостности оболочки. К гемолизованным эритроцитам добавляют 10 капель этанола 96 об.% и охлаждают (для этого используют смесь льда и хлорида натрия) в течение 40—60 мин. После этого каплю смеси наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют (используя объектив с увеличением в 40 раз). Аналогичные операции проводят е кровью всех видов животных.
Оформление результатов. При нагревании гемоглобина в кислой среде небелковая группа — гем отщепляется и в присутствии солей (NaCl) переходит в геми н, в котором железо трехвалентно.
= N4 N =	—N4	,N —
'fZ W— ci / s	г X
/ X	z X
N	N—	N	N —
II	II	I	II
Результаты наблюдений фиксируют в виде зарисовок с указанием объекта и применяемого увеличения (пример представ-
лен на рис. 1.25).
После сопоставления рисунков студенты самостоятельно делают заключение по работе, акцентируя внимание на форме, размерах и количестве кристаллов.
Рис. 1.25. Кристаллы гемоглобина морской свинки (8x40)
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА ПО КАЧЕСТВЕННОЙ РЕАКЦИИ НА ГЕМОВУЮ ГРУППУ(ПРОБА ТЕЙХМАНА)
Подготовка проб. В качестве проб используют стабилизированную кровь убойных животных без постороннего запаха, цвета и коагулянтов.
Порядок проведения анализа. На предметное стекло наносят каплю крови и высушивают при температуре не выше 60 ЭС. К подсушенной крови прибавляют несколько кристаллов хлорида натрия и 1—2 капли ледяной уксусной кислоты, перемешивают, затем накрывают покровным стеклом и осторожно нагревают до начала кипения (но не кипятят).
После охлаждения гемин выделяется в виде коричневых ромбоидальных кристаллов, которые рассматривают под микроскопом при кратности увеличения не менее х500. Операции проводят с кровью всех видов животных.
Результаты наблюдений фиксируют в виде зарисовок с указанием объекта и применяемого увеличения.
После сопоставления рисунков студенты самостоятельно делают заключение по работе, отмечая особенности строения кристаллов.
3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСТВОРЕННОГО ГЕМОГЛОБИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
Подготовка проб. Для выполнения всех этапов работы используют плазму после отделения форменных элементов из цельной крови в соответствии с рекомендациями (см. п. 1) либо свежую плазму, полученную путем сепарирования крови в производственных условиях.
Порядок проведения анализа. В две пробирки вносят по 4 см3 ацетатного буфера, 2 см3 раствора пероксида водорода, 2 см3 раствора бензидина. В одну из пробирок (проба) добавляют 0,04 см3 плазмы крови, а в другую (контроль) — 0,04 см3 физиологического раствора. Смеси в пробирках перемешивают и спустя 3 мин фотометрируют при 680 нм.
При наличии гемоглобина интенсивность синего окрашивания возрастает в течение 4—5 мин, поэтому оптическую плотность необходимо измерить два раза и записать максимальную величину. Через 5—6 мин после фотометрирования окрашивание приобретает лилово-бурый цвет, и величина оптической плотности при 680 нм уменьшается.
Массовую концентрацию гемоглобина в плазме крови находят с помощью калибровочного графика.
Построение калибровочного графика. Исходя из того, что в крови содержится в среднем 16,5 мг/см3 гемоглобина, для приготовления
83
основного сщнларгною раствора к 0.1см' крови добавляю! 16.4см’ дистиллированной волы. В 1 см? этого раствора со* держичся i mi гемо!лобина. Его используют, разбавляя дистиллированной водой, перед каждым построением калибровочного графика для приготовления рабочих растворов крови с содержанием гемоглобина 0.51 1,0: 2.5: 5.0: 10: 20: 30 мг/см3. По 0.04 см3 каждого рабочего раствора переносят в отдельные пробирки, куда добавляют все необходимые реактивы для количественного определения гемоглобина. Фотометрирование проводят так же, как и в случае пробы с плазмой крови и физиологическим раствором. По результатам измерений строят калибровочный график — зависимость оптической плотности рабочих растворов крови от массовой концентрации гемоглобина в этих растворах.
Для определения концентрации гемоглобина вычисляют разность между оптической плотностью опытной (Рф и контрольной (Dq) проб. По величине полученной разности находят соответствующее значение массовой концентрации гемоглобина на калибровочном графике.
Номер опыта, измерения	Наименование и характеристика образца плазмы крови (вид убойных животных, возраст, физиологическое состояние, способ первичной обработки крови и т. д.)	Оптическая плотность		Разность оптической плотности пробы и контроля	Массовая концентра ция гемоглобина, мг/см’
		пробы (плазмы крови)	контроля (физиологического раствора)		
					
По окончании работы студенты самостоятельно делают выводы и формулируют заключение к работе. При этом дают сравнительную характеристику экспериментальным данным, оценивают возможности и ограничения используемых подходов и методов.
Лабораторная работа № 7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМ ГЕМОГЛОБИНА (ПИГМЕНТОВ) НА ОСНОВЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК
Цель работы. Приобрести практический навык определения пигментов крови убойных животных на основе спектроскопических методов анализа.
Задачи. Получить дериваты (формы) гемоглобина (оксигемоглобин, метгемоглобин, карбоксигемоглобин); снять спектры поглощения гемоглобина и его дериватов и идентифицировать формы гемоглобина путем изучения характеристических полос поглощения в соответствующих спектрах.
84
В с	Г)	Г	В	Г
| Красный	Желтый	Зелены))		Фиолеювын ; —		н
)	1	1	II	1 II	1	II	1 1	1	1	II	1 II	1	II	1				
Рис. 1.26. Спектры поглощения:
7— солнечный спектр; 2 — оксигемоглобин; 3 — гемоглобин; 7 — метгемоглобин (нейтральный); В, С, D, Е, F-- характеристические линии спектра
Методические указания. Гемоглобин и его производные (формы) обладают способностью поглощать излучение различной длины волны и давать характерные спектры поглощения. Если между источником света и спектроскопом поместить сосуд с водным раствором гемоглобина или его производных, то эти вещества будут поглощать часть лучей определенной длины волны, в результате чего в этих местах появятся черные полосы (рис. 1.26), идентификация которых позволит судить о наличии соответствующих пигментов.
Спектроскопическое исследование пигментов крови можно проводить с помощью карманного спектроскопа.
Объекты исследования. Стабилизированная кровь убойных животных различных сроков хранения, получаемая в условиях производства.
Материалы, реактивы и оборудование. Свежеприготовленный раствор K3[Fe(CN)6] массовой долей 5 %; реактив Стокса; пробирки; пипетки; спектроскоп (спектрофотометр).
Приготовление реактивов. Реактив Стокса.1 часть сульфата железа и 2 части виннокаменной кислоты растворяют в 15 частях дистиллированной воды; перед употреблением добавляют аммиак до слабощелочной реакции. Раствор должен быть прозрачным и окрашен в зеленый цвет.
85
1.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОКСИГЕМОГЛОБИНА
Порядок проведения анализа. При идентификации оксигемоглобина в пробирку к капле крови прибавляют 2 см3 дистиллированной воды и полученный раствор желтовато-розового цвета рассматривают в спектроскопе, помещая пробирку между источником света и спектроскопом. О наличии оксигемоглобина судят по двум тонким полосам поглощения в желто-зеленой части спектра между так называемыми фраунгоферовыми линиями D и £, т. е. в областях с длинами волн 578,1 и 541,7 нм.
2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА
Порядок проведения анализа. При идентификации гемоглобина к раствору крови (см. п. 1) прибавляют 5—8 капель свежеприготовленного раствора K3[Fe(CN6)] (реактив Стокса). Двухвалентное железо, входящее в состав реактива Стокса, в этих условиях окисляется, переходит в трехвалентное, в результате чего образуется гемоглобин. Светло-синий цвет жидкости становится более темным, с фиолетовым оттенком, а в спектре появляется одна широкая полоса между линиями Z) и Е. Наиболее темная ее часть соответствует длине волны 555—558 нм.
3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТГЕМОГЛОБИНА
Порядок проведения анализа. При идентификации метгемоглобина (МНЬ) к раствору крови (см. п. 1) прибавляют 5—7 капель свежеприготовленного раствора K3[Fe(CN)6] массовой долей 5 % и взбалтывают. Жидкость приобретает бурую окраску. При этом обнаруживаются три полосы поглощения: две тонкие в желто-зеленой части спектра между линиями D и Е и третья (наиболее характерная) в красной части спектра между линиями С и D с длиной волны 630 нм.
Оформление результатов. Данные по изучению спектров гемоглобина и его производных рекомендуется оформить в виде таблицы:
Пигменты (цвет)	Форма гемоглобина	Характеристика спектров поглощения
		
По результатам экспериментальных исследований формулируют выводы и делают заключение по работе.
86
Лабораторная работа № 8
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА И ОРГАНИЧЕСКОГО ЖЕЛЕЗА КРОВИ
Цель работы. Фотометрирование крови убойных животных и фракции форменных элементов.
Задачи. Определить и рассчитать массовые доли гемоглобина и органического железа в цельной крови и фракции форменных элементов крови убойных животных.
Объект исследования. Стабилизированная кровь различных видов животных, полученная в условиях производства.
Материалы, реактивы и оборудование. Ацетонциангидрин (3 ампулы по 0,5 см3 или 0,47 г); смесь реактивов (3 флакона по 1,2 г), в том числе в каждом флаконе: калия гексацианоферрата (II) тригидрат — 0,2 г, натрия гидрокарбонат — 1,0 г, стандартный раствор (СО) гемиглобинцианида; спектрофотометр; фотоэлектроколориметр; пипетки с делениями вместимостью 0,02 и 5см3; колба мерная вместимостью ЮООсм3; пробирки; штатив для пробирок.
Приготовление реактивов. Общее количество стандартного набора реактивов рассчитано на приготовление Здм3 трансформирующего раствора (600 анализов). Используя 1/3 набора, можно готовить 1,0 дм3 трансформирующего раствора для проведения 200 анализов.
Трансформирующий раствор (1 дм3). Содержимое одной ампулы с ацетонциангидрином и одного флакона со смесью калия гексацианоферрата (II) тригидрат с гидрокарбонатом натрия количественно переносят в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до 1,0 дм3. Содержимое осторожно перемешивают, избегая образования сильной пены. Раствор желтого цвета, прозрачный.
Раствор стабилен при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. При появлении осадка или при обесцвечивании раствор непригоден к употреблению.
Стандартный раствор (СО) гемиглобинцианида. Представляет собой стерильный прозрачный раствор оранжево-красноватого цвета. Окраска раствора зависит от содержания гемиглобинцианида. Концентрация гемиглобинцианида в растворе находится в диапазоне 0,6—1,0 г/дм3, что соответствует при разведении крови в 251 раз концентрации гемиглобинцианида в крови 150,6—251,0 г/дм3.
Методические указания. Метод основан на взаимодействии гемоглобина крови с железосинеродистым калием и окислении его в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с анто-циангидрином окрашенный комплекс гемиглобинцианида. Ин-
87
।снсивность окраски гемиглооинпианила пропорциональна кони чес гну гемоглобина.
Относительная молекулярная масса гемоглобина точно установлена, известна также масса железа в молекуле. В связи с этим количество органического железа можно легко рассчитать, зная массовую концентрацию гемоглобина в растворе.
Порядок проведения анализа. В пробирку с 5.0 см3 трансформирующего раствора добавляют О,О2см3 свежей стабилизированной крови убойных животных (разбавление в 251 раз). Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют на 10—20 мин. Затем проводят измерение оптической плотности раствора на любом из вышеуказанных приборов при длине волны 540 нм (520— 560 нм) в кювете толщиной слоя 1 см против контрольной пробы (трансформирующего раствора).
Массовую концентрацию гемоглобина (НЬ) в крови (г%) определяют по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору гемиглобинцианида.
Построение калибровочного графика. Ампулы с раствором СО гемиглобинцианида предварительно термостатируют при (20,0 ± ± 0,5) °C в течение 30 мин, после чего их встряхивают и готовят 5 стандартных растворов при помощи градуированной пипетки с делениями 1-го или 2-го класса точности вместимостью 5,0 см3 в соответствии с данными приведенной ниже таблицы.
Номер пробирки	Объем, см;		Фактор разведения	Массовая концентрация гемоглобина в крови, г/дм'
	СО гемиглобинцианида	трансформирующего раствора		
1	1	4	0,2	0,2 х СО* х 251
3	2	3	0,4	0,4 х СО* х 251
3	3	2	0,6	0,6 х СО* х 251
4	4	1	0,8	0,8 х СО* х 251
5	5	—	1,0	СО* х 251
* СО — массовая концентрация гемиглобинцианида в растворе стандартного образца, г/дм3; 251 — коэффициент разведения.
Максимальная погрешность приготовления стандартных растворов по описанной методике составляет: 1,5 % при использовании пипетки 2-го класса и 0,94 % при использовании пипетки 1 -го класса точности.
Измерение оптической плотности растворов проводят по мере возрастания их концентрации против контрольной пробы в условиях, аналогичных измерениям опытной пробы.
По полученным данным строят калибровочный график в координатах: по оси абсцисс — массовая концентрация гемоглобина, а по оси ординат — оптическая плотность раствора СО ге-
88
миглобинцианида. При смене партии реактивов калибровочный график строят заново.
Массовую концентрацию гемоглобина (г%) можно также определить по формуле
X = Е^-СК 0.001, Е
(1-17)
где Е . £—экстинкции соответственно опытной пробы и стандартного раствора; Ф—концентрация гемиглобинцианида в стандартном растворе, мг%; к—коэффициент разведения крови; Л7=251; 0,001 — коэффициент пересчета количества гемоглобина из мг% в г%.
Относительная молекулярная масса гемоглобина 64 000, в его структуре имеется один атом железа (атомная масса 56). После количественного определения гемоглобина рассчитывают концентрацию органического железа путем составления простой пропорции.
Полученные экспериментальные и расчетные данные сводят в таблицу:
Наименование образца, вид убойных животных
гемоглобина
Массовая доля, %
органического железа
По результатам экспериментальных исследований формулируют выводы и делают общее заключение по работе.
Лабораторная работа № 9
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПИГМЕНТОВ МЯСА
Цель работы. Приобрести практический навык при определении общего количества и различных форм пигментов в мясе и мясопродуктах.
Задачи. Экстрагировать пигменты и измерить светопоглоще-ние растворов с последующим расчетом общего содержания пигментов в образцах и соотношения пигментов по светопоглоще-нию проб.
Объекты исследования. Мышечная ткань разных видов животных или мясо с различным содержанием мышечной ткани, а также субпродукты I категории.
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор ацетона объемной долей 94 % (к 470 см3 ацетона добавляют 30 см3 дистиллированной воды); раствор хлорацетона (СН3СОСН2С1) объемной до-
89
ien SO ('< (к 400 см’ апсгона добавляю!' 00 см' .шспшироваинои воды и 11) см' коннсн i рирова! и юи соляной кислоты): концентрированная соляная кислота: спектрофотометр: пипетки мерные вместимостью 1 см’: колбы плосколонные вместимостью 50см\ бумажные фильтры: чашки Петри.
Методические указания. Пигменты мяса и мясопродуктов хорошо растворимы в воде и органических растворителях и легко экстрагируются, придавая соответствующим растворам определенный цвет. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству пигментов. Измерив светопоглощение. легко определить концентрацию пигментов но калибровочному графику или используя рекомендуемые в конце работы расчетные формулы.
Принцип получения спектров поглощения окрашенных веществ, в частности пигментов мяса и крови, состоит в том, что световая энергия, проходя через раствор пигмента, поглощается этим раствором. Происходит абсорбция (поглощение света), которую можно визуально обнаружить спектроскопически.
Формы миоглобина (Mb, МЬО2 и MetMb) можно идентифицировать при определении спектральных характеристик образца с помощью спектрофотометрических методов анализа.
Например, водный раствор Mb характеризуется специфическим спектром поглощения в видимой области. Максимум поглощения находится при длине волны 555 нм. Переход Mb в МЬО2, MetMb или какую-либо другую форму сопровождается изменением спектра и в целом сдвигом максимума в сторону большей или меньшей длины волны (рис. 1.27).
Использование метода отражения позволяет анализировать формы миоглобина непосредственно в образце мяса без предварительной экстракции, что обеспечивает сохранение соотно-
Рис. 1.27. Спектры поглощения производных миоглобина:
1 — оксимиоглобин; 2 — миоглобин; 3 — мет-миоглобин
шения пигментных производных.
Измерив поглощение монохроматического пучка света и получив процент отражения, рассчитывают коэффициенты поглощения (К) и рассеивания (S). Относительные количества пигментов мяса определяют из отношения К/S при соответствующих длинах волн:
X = 525 нм — максимум поглощения для трех форм пигмента: дезокси-, окси- и мет-миоглобина;
90
X — 572 нм —- максимум поглощения для лсзоксимио)до би на (Mb):
X — 474 нм — максимум поглощения для окси-(МЬОЗ и мет-миоглобина (MetMb).
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ ПИГМЕНТОВ
Подготовка проб. При количественном определении общего содержания пигментов из образцов разных видов мяса одного и того же срока хранения вырезают кусочки массой 5,000 ±0,001 г.
Порядок проведения анализа. Подготовленные образцы мяса помещают в стеклянные пробирки, заливают водным раствором ацетона объемной долей 94 % и гомогенизируют в течение 2 мин. В каждую пробирку к гомогенату добавляют 0,5 см3 концентрированной соляной кислоты, пробирки встряхивают, закрывают пробкой и выдерживают в темном месте в течение 2 ч, периодически перемешивая смесь. После этого растворы отфильтровывают через бумажный фильтр в колбу вместимостью 50 см3, а осадок промывают раствором хлорацетона объемной долей 80 %, доводя объем дистиллированной водой до метки.
Светопоглощение полученного раствора определяют на спектрофотометре при длине волны 540 нм. В качестве контрольной пробы используют хлорацетон. Для определения массовой доли пигментов в исследуемом образце пользуются калибровочным графиком.
Построение калибровочного графика. Используют готовые очищенные препараты миоглобина либо свежие мышцы убойных животных. Подготовку образцов к количественному определению общего содержания пигмента ведут аналогично описанию метода, нарезая для экстрагирования кусочки мышц фиксированной массы от 1 до Юг. Количественное содержание миоглобина оценивают, исходя из известных данных о среднем содержании миоглобина (мг в 1 г) в мышцах крупного рогатого скота и свиней:
Мышцы крупного рогатого скота:
Мышцы свиней:
скелетные	3,7
сердца	2,1
скелетные:
красные	1,44
белые	0,79
сердца	0,92
Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс массовую концентрацию миоглобина (мг/см3 раствора), а по оси ординат — светопоглощение раствора при длине волны 540 нм.
91
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОРМ МИОГЛОБИНА (ПИГМЕНТОВ) НА ОСНОВЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК МЯСА
Подготовка проб. Каждый из исследуемых образцов мяса и мясопродуктов нарезают ломтиками толщиной 4—5 мм перпендикулярно к направлению мышечных волокон, а затем вырезают кусочки в соответствии с размерами кювет используемого прибора.
Порядок проведения анализа. Вырезанные кусочки помещают в соответствующие по размеру кюветы измерительного прибора (спектрофотометра СФ-10, СФ-17 или другой марки). Снимают показания спектрофотометра по поглощению монохроматического пучка света и проценту отражения. Соотношение пигментов и содержание относительных количеств пигментов мяса определяют расчетным путем.
Относительные количества метмиоглобина (^MetMb) и дезоксимиоглобина (XMb) определяют по формулам:
^ме.мь = K/S5n : K/S525;	(1.18)
An, = K/sm  к/^-	(119)
где К—коэффициент поглощения; 5—коэффициент рассеивания при соответствующих длинах волн.
Полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы:
Образец	Исходный цвет	Массовая доля (%) пигментов мяса и мясопродуктов при длине волны			
		суммарных (540 нм)	МЬО, (474 нм)	Mb (572 нм)	MctMb (650 нм)
					
По окончании работы и оформления результатов студенты самостоятельно делают выводы и формулируют заключение, акцентировав внимание на соотношении отдельных пигментов, сопоставляя данные с цветом образцов, сроками их хранения, видом мяса.
Лабораторная работа № 10
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИННОГО АЗОТА
Цель работы. Освоить титриметрические и фотометрические методы количественного определения суммарных аминокислот в тканях убойных животных.
Задача. Определить суммарное количество аминного азота.
92
Объекты исследования. Ткани животных (свежие или после хранения в рекомендуемых режимах); образцы мышечной ткани убойных животных на разных стадиях автолиза; гидролизаты белков крови, мышечной, соединительной ткани, кератинсодержа-шего сырья, комбинированных белковых систем.
Методические указания. Необходимость количественного определения аминокислот возникает в ходе аминокислотного анализа белков, изучения свободных аминокислот, определения активности протеолитических ферментов и в других случаях. Предлагаемые способы определения могут быть использованы при анализе биологических материалов животного или растительного происхождения, отдельных аминокислот или их смесей, а также белковых гидролизатов.
При определении количества аминного азота используют различные способы.
Медный способ. Основан на способности аминокислот образовывать с ионами Сп2+ прочные растворимые комплексы, в которых каждый ион меди связан с двумя молекулами аминокислот;
NH,	^0
/ о-с^
R-СН	^CH-R
\ / / о=с-о	nh2
Количество меди, вошедшей в состав таких комплексов, определяют затем иодометрически. При выполнении анализа к определенному объему раствора аминокислоты прибавляют при слабощелочной реакции избыток суспензии фосфата меди в боратном буфере, в результате чего после взбалтывания в раствор переходят медные соли большинства аминокислот. Избыток фосфата меди удаляют фильтрованием, к прозрачному фильтрату прибавляют уксусную кислоту и иодид калия. Образовавшийся при этом ацетат меди восстанавливают иодидом калия.
2Cu(CH3COO)2 + 4KJ -> 2CuJ + 4СН3СООК + J2.
Выделившийся иод титруют раствором гипосульфита натрия:
К + 2Na?S?0, -э 2NaJ + Na?S4O,.
Z	z Z 3	Z 4	0
Таким образом, количество гипосульфита натрия, пошедшего на титрование, пропорционально исходному содержанию аминокислот в растворе. При этом 1 см3 раствора Na?S2O3 молярной концентрацией 0,01 моль/дм3 соответствует 0,28 мг аминного азота.
93
Небольшое количество аммиака и высокие концентрации мочевины не мешают определению аминного азота медным способом.
Нингидриновый способ. Нингидрин, являющийся сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование аминокислоты, приводящее к образованию диоксида углерода, соответствующего альдегида, воды и конденсированного соединения («пурпура Руэмана») сине-фиолетового цвета с максимумом поглощения около 580 нм.
Аминокислота Нингидрин	СН	«Пурпур Руэмана»
О
Поскольку оптическая плотность при этой длине волны практически линейно зависит от числа исходных аминогрупп, на основе нингидриновой реакции разработан удобный колориметрический способ количественного определения аминного азота. При нагревании с органическими растворителями альдегиды не образуются, а радикалы аминокислот входят в состав производных «пурпура Руэмана», присоединяясь к атому азота. Таким образом, в этом случае цвет образующихся окрашенных продуктов зависит от природы аминокислоты. Пролин и оксипролин (иминокислоты) в процессе реакции с нингидрином образуют продукты ярко-оранжевого цвета с максимумом поглощения около 440 нм.
Способ формольного титрования. Основан на способности аминокислот реагировать с нейтральным раствором формальдегида с образованием метиленаминокислот. Этот метод применяется для определения карбоксильных групп аминокислот, которые титруют раствором щелочи, предварительно блокировав аминогруппы формальдегидом. В ходе реакции с формальдегидом аминогруппа теряет основные свойства, при этом образуется метиленаминокислота, которая оттитровывается щелочью:
R	Н	R
H-C-NH2 + СО -► H-C-N=CH2 + Н2о ;
СООН Н	СООН
R	R
I	I
Н—С—N=CH2 + NaOH —► H-C-N=CH2 + Н2О
СООН	COONa
94
Определяя количество карбоксильных грхнн пированием, можно одновременно определи|ь и количество о-аминогрупп, так как количество карбоксильных групп эквивалентно количеству а-аминогрупп. связанных формальдегидом. При организации лабораторного практикума можно использовать один или несколько методов.
Подготовка проб. При использовании в качестве объектов исследования животных тканей готовят водяную вытяжку белковых фракций. Ткань освобождают от жира и прорезей соединительной ткани. Навеску массой 3—4 г тщательно измельчают ножом на часовом стекле. К навеске измельченного сырья приливают дистиллированную воду в соотношении 1 : 6 (по массе) и ведут экстракцию на холоде при О °C в течение 30 мин. Затем центрифугированием при частоте вращения 83 c J в течение 5 мин отделяют осадок. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и используют для количественного определения аминокислот.
При использовании в качестве объектов исследования белковых гидролизатов их фильтруют, фильтраты используют для количественного определения аминокислот.
1.	МЕДНЫЙ СПОСОБ
Материалы, реактивы и оборудование. Суспензия фосфата меди: раствор тимолфталеина: 0,25 г в 100 см3 раствора этанола массовой долей 50%; раствор NaOH молярной концентрацией 1 моль/дм3; ледяная уксусная кислота; раствор KJ массовой долей 15 %; раствор Na2S2O3 молярной концентрацией 0,01 моль/дм3; раствор крахмала массовой долей 1 %.
Приготовление реактивов. Суспензия фосфата меди. Непосредственно перед использованием к одному объему раствора А добавляют два объема раствора Б, тщательно перемешивают и прибавляют два объема раствора В. Хранят не более 2—3 дней.
Раствор А: 27,3 г хлорида меди (I) растворяют в 1 дм3 воды.
Раствор Б: 64,5 г двузамещенного фосфата натрия растворяют в 500 см3 воды, добавляют 7,2 г NaOH и затем доводят объем водой до 1 дм3.
Раствор В (боратный буфер pH 8,6—8,8): 57,21 г буры (Na2B4O7 • ЮН2О) растворяют в 1,5 дм3 воды, добавляют 100 см3 раствора НО "молярной концентрацией 1 моль/дм3 и доводят объем водой до 2 дм3.
Порядок проведения анализа. В мерную колбу вместимостью 25 см3 помещают либо 2 см3 нейтральной вытяжки, либо 2 см3 гидролизата белка, либо 2 см3 раствора аминокислоты, 1—2 капли раствора тимолфталеина и по каплям добавляют раствор NaOH до светло-голубого окрашивания (pH около 9). Затем в колбу приливают 10 см3 хорошо перемешанной суспензии фосфата меди и
95
объем доводят водой до метки. Содержимое мерной колбы тщательно перемешивают и оставляют на 5—10 мин при комнатной температуре, а затем фильтруют через плотный фильтр в сухую коническую колбу вместимостью 50 см3. Если фильтрат окажется мутным, повторно проводят фильтрование, иначе результаты определения будут завышены. 10 см3 прозрачного фильтрата отбирают в сухую колбу, добавляют 0,4 см3 ледяной уксусной кислоты и 4 см3 раствора K.J массовой долей 15%. Выделившийся иод титруют раствором гипосульфита натрия до светло-желтой окраски, прибавляют 1—2 капли раствора крахмала и осторожно титруют до исчезновения сине-фиолетовой окраски. Определения проводят в двух повторностях и вычисляют среднее значение объема гипосульфита натрия (Иоп), пошедшего на титрование. Параллельно при тех же условиях обрабатывают контрольную пробу, содержащую вместо раствора аминокислоты 2 см3 воды. Контроль проводят для определения возможного наличия растворимых соединений меди в используемой суспензии. Объем раствора гипосульфита натрия, пошедшего на титрование контроля, обозначают Йк.
Содержание аминного азота (мг) в 2 см3 исследуемого раствора определяют по формуле
С=0,28(Еоп- Гк)К-2,5,	(1.20)
где К— коэффициент пересчета на раствор гипосульфита натрия молярной концентрацией 0,01 моль/дм3.
Если исследуемый раствор содержит только одну аминокислоту (например, глицин), то для определения ее массовой доли величину С умножают на коэффициент М/14, где М— молекулярная масса данной аминокислоты (для глицина М = 75).
2.	НИНГИДРИНОВЫЙ СПОСОБ
Материалы, реактивы и оборудование. Фосфатный буфер (pH 6,5; 0,5 моль/дм3); абсолютный ацетон; смесь абсолютных ацетона и этанола (1:1 по объему); раствор нингидрина массовой долей 0,5 % в д-бутаноле; насыщенный раствор бариевой воды.
Порядок проведения анализа. В пробирку с пришлифованной пробкой помещают 0,1см3 исследуемой пробы, 0,1см3 буфера, 1,5 см3 смеси ацетона со спиртом и 2 см3 нингидрина. Содержимое пробирки перемешивают и закрывают пробкой. Пробирки помещают на 15 мин на водяную баню при температуре кипения. Затем пробирку охлаждают под струей воды, объем окрашенной 96
жидкост доводят ацетоном но !<> см ". нсрсмспшвакм п вонори-мегрирую! при .тмине воины 5Ы) нм iipoiHi> кошрояя. содержаще-го вместо пробы 0.1 см? воны.
Содержание аминного азота иди аминокислот рассчи i ыванн по калибровочному i рафику.
Построение калибровочного графика. Используют стандартный раствор глицина с содержанием 1 мг/см?. Из него готовят ряд разведений: 1 см? раствора внося ! в мерную пробирку вместимостью 10 см3 и доводят объем дистиллированной водой до метки, затем проводят окрашивание в соответствии с описанием метода и строят график зависимости отической плотности от концентрации глицина. Чувствительность метола от 5 до 25 мкг аминного азота в пробе (0.1 см3). что соответствует приблизительно 20—120 мкг глицина.
3.	СПОСОБ ФОРМОЛЬНОГО ТИТРОВАНИЯ
Материалы, реактивы и оборудование. Складчатый бумажный фильтр; сухой хлорил бария; спиртовой раствор фенолфталеина массовой долей 0.1 %; раствор соляной кислоты (0.01 моль/дм3); раствор гидроксида калия (0,05 моль/дм3); формольная смесь; колбы мерные вместимостью 100 см3; капельницы; воронка стеклянная; бюретка; часы; насыщенный раствор бариевой воды.
Приготовление реактивов. Формольная смесь. К 50 см3 раствора формальдегида объемной долей 40 % добавляют 10 капель раствора фенолфталеина массовой долей 0,1 % и по каплям раствор гидроксида калия молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 до образования слабо-розовой окраски.
Порядок проведения анализа. К 25 см3 исследуемой пробы в колбе прибавляют 1 г хлорида бария, 10 капель раствора фенолфталеина и перемешивают. К смеси приливают насыщенный раствор бариевой воды до появления едва заметного розового окрашивания. Колбу закрывают и оставляют на 15 мин. Затем разбавляют водой до объема 100 см3 и фосфаты и карбонаты бария отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр. Готовят две колбы вместимостью по 100 см3. В одну вносят 40 см3 фильтрата, что соответствует 10 см3 раствора аминокислот, во вторую — 40 см3 дистиллированной воды. Прибавляют по 10 капель раствора фенолфталеина и раствор соляной кислоты (осторожно) до окрашивания растворов (контроля и пробы) в едва заметный розовый цвет. Затем в обе колбы вносят по 10 см3 формольной смеси и титруют из бюретки раствором гидроксида калия до появления едва заметной розовой окраски. Цвет контроля и пробы должен быть одинаковым.
97
Co. ic ржи 11 и с амиши,! v u и) i ti Lor,см ) рассчи i biiMioi по формхле
c - ( 1- I (,)W/ I.
где (, и Г -обьсмы раствора гидроксида кадия, затраченные соотвекч вснно на шарование пробы и контроля. им’: А— коэффициент пересчета на раствор шдро-ксида калия молярной концешрацией 0.05 моль/дм': С—масса аминокислот, эквивалентная 1см5 (0.05 .моль/дм’) раствора гидроксида калия (0.7 мг): Р - объем исследуемой пробы, взятой для анализа, см’.
Оформление результатов. Полученные экспериментальные и расчетные данные рекомендуется оформить в виде таблицы:
Обье кт ис ел слова н ия
Ciюсоб О1 (ределення принцип метода
Содержание аминного азота, мг/см’
Затем следует самостоятельно их проанализировать и сформулировать выводы по данной работе. Следует отметить трудоемкость и точность методов, сравнить экспериментальные данные, полученные различными способами, между собой и с данными литературы.
Лабораторная работа №11
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИПТОФАНА
Цель работы. Приобрести навык количественного определения триптофана в тканях и мясе животных и птицы.
Задачи. Освоить методы подготовки проб, провести качественную реакцию на триптофан и рассчитать его количество.
Объекты исследования. Образцы мышечной ткани или мяса животных и птицы, колбасные изделия, полуфабрикаты.
Материалы, реактивы и оборудование. Ацетон (х. ч.); раствор гидроксида натрия молярной концентрацией 3 моль/дм3; раствор пя/ш-диметиламинобензальдегида массовой долей 2,5 % в растворе серной кислоты массовой долей 10 %; раствор нитрата натрия массовой долей 2 %; соляная кислота концентрированная; раствор этанола (50 об.%); универсальный индикатор; спиртовой раствор фенолрота массовой долей 0,1 %; кристаллический триптофан (х. ч.); дистиллированная вода; раствор H2SO4 массовой концентрацией 3 моль/дм3; центрифуга лабораторная; водяная баня; спектрофотометр или фотоэлектроколориметр; стеклянные пипетки; колбы; стаканы; ампулы; стеклянные палочки.
98
Методические указания. Зршпофан г> юс га iочно оо. п>шом количестве содержится в белках животного происхождения. Триптофан инее! гетероциклическую структуру, содержит иминогруппу (— N Н —):
----1 — СН2-СН-СООН
nh2
н
В основу метода определения триптофана положена цветная реакция между продуктами его распада, образующимися при обработке триптофана концентрированной соляной кислотой и пара-диметиламинобензальдегидом в присутствии нитрата натрия.
Для выделения триптофана обезжиренную мышечную ткань подвергают щелочному гидролизу. В процессе кислотного гидролиза и в присутствии жира при щелочном гидролизе триптофан разрушается. Метод определения триптофана в мясе состоит из следующих основных операций: обезжиривания навески мяса, гидролиза обезжиренной мышечной ткани гидроксидом натрия, нейтрализации гидролизата и фильтрования, окисления триптофана и развития цветной реакции с ипра-диметиламинобензальдегидом, фиксации окраски этанолом и измерения ее интенсивности.
При количественном определении триптофана в образцах используют калибровочный график.
Подготовка проб. Образец измельченного мяса или ткани массой (4,000 ± 0,0002) г помещают в центрифужный стакан вместимостью не менее 100 см3, добавляют 4 см3 дистиллированной воды и тщательно растирают. Для обезжиривания заливают ацетоном, доводя до объема 40 см3, и перемешивают. Смесь выдерживают 30 мин при температуре (20 ± 5) °C и центрифугируют в течение 20 мин при частоте вращения 41,7 с-1. Жидкость сливают с осадка и нагревают при 80 °C на водяной бане, перемешивая осадок стеклянной палочкой.
Остаток количественно переносят в стеклянную пробирку с пришлифованной пробкой или ампулу, смывая остатки дистиллированной водой (4 см3). Затем приливают 20 см3 (3 моль/дм3) раствора гидроксида натрия. Пробирку закрывают пробкой, а ампулу запаивают, подписывают каждый образец и гидролизуют в течение суток при температуре 112—114 °C.
Для ускорения процесса гидролиза можно использовать автоклавирование при 0,1 МПа в течение 2—3 ч.
Порядок проведения анализа. Полученные гидролизаты охлаждают и количественно переносят в колбу вместимостью 100 см3, доливая дистиллированную воду до 2/3 объема. Раствор нейтрали
99
зуют сначала небольшим объемом (3 моль/'дм?) раствора H-,SO4. а затем более разбавленными ее растворами. Нейтрализацию ведут в присутствии индикаторов (универсальной индикаторной бумаги или фенол фтал е и н а).
Колбу охлаждают, объем доводят до метки, а смесь фильтруют через бумажный фильтр (гидролизат должен быть совершенно прозрачным!).
Для проведения цветной реакции в мерную посуду вместимостью 100 см3 с пришлифованной пробкой приливают пипетками растворы в последовательности: I см3 исследуемого фильтрата, 0,5 см3 раствора /znpn-диметиламинобензальдегида (при встряхивании!), 0,2 см3 раствора NaNO? массовой долей 2 % (при встряхивании!) и 28 см? концентрированной соляной кислоты (под тягой). Растворы оставляют при температуре (20 ± 5) °C на 30 мин для развития окраски, а затем доводят до метки раствором этанола массовой долей 50 %.
Одновременно проводят два основных и два контрольных определения. В последних исследуемый фильтрат заменяют 1 см3 дистиллированной воды.
Интенсивность синей окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 610 нм или на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром в отношении контрольного раствора.
Концентрацию триптофана в объеме жидкости, взятой для цветной реакции (1 см3), определяют по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Для построения графика готовят растворы, содержащие известное количество триптофана. Три навески химически чистого триптофана массой по 50 мг растворяют в 20 см3 раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 3 моль/дм3. Растворы триптофана гидролизуют в условиях, аналогичных опыту, и фильтруют, доводя предварительно объем до 50 см3, 1 см3 полученного раствора содержит 1 мг триптофана. Затем готовят ряд стандартных растворов в соответствии с приведенными ниже рекомендациями, проводят цветную реакцию, измеряют оптическую плотность и строят график зависимости оптической плотности раствора от массового содержания триптофана.
Рекомендуемые объемы стандартного раствора триптофана для построения калибровочного графика:
Содержание триптофана, мкг	Объем, см5		Содержание триптофана, мкг	Объем, см3	
	стандартного раствора	ВОДЫ		стандартного раствора	воды
100	0,1	0,9	400	0,4	0,6
200	0,2	0,8	500	0,5	0,5
300	0,3	0,7	600	0,6	0,4
100
По средним данным трех серий опытов строят калибровочный график (рис. 1.28).
Массовую долю триптофана (мг%) в исследуемом образце рассчитывают по формуле
„ с 50 100
где с — концентрация триптофана, найденная по калибровочному графику, мкг/см’; 50 — объем раствора, полученный после нейтрализации и разведения, см3: 100 — коэффициент пересчета в проценты; V— объем раствора, взятый для цветной реакции, см3; т — масса навески мяса, г.
Рис. 1.28. Калибровочный график для определения триптофана:
1 — без гидролиза; 2 — после щелочного гидролиза
Оформление результатов. Полученные экспериментальные и расчетные данные рекомендуется оформить в виде таблицы:
Объект исследования
Концентрация триптофана по калибровочному графику, мкг/см’’
Содержание триптофана в образце, мг%
При формулировании выводов по работе следует сравнить полученные данные с литературными, а также сделать сравнительный анализ результатов для различных видов мяса.
Лабораторная работа № 12
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЛИНА
Цель работы. Приобрести практический навык в определении пролина (оксипролина) в образцах мышечной ткани или мяса разных видов убойных животных, а также в мясопродуктах, готовых к употреблению.
Задачи. Получить гидролизат белков в анализируемых пробах; провести качественную реакцию на оксипролин и фотометриро-вание с последующим расчетом его массовой доли.
Объекты исследования. Мышечная или соединительная ткань, мясо различных сортов, а также мясопродукты.
Материалы, реактивы и оборудование. Бумага индикаторная универсальная; кипятильные камни; бумага фильтровальная лабораторная или фильтры бумажные; фольга алюминиевая; хлорамин Т; хлорамин Б; раствор соляной кислоты молярной кон-
101
иен I paunei'1 6 моль/дмраствор гидроксила мафия молярной концентрацией К) моль/лм?: пропанол: кислота лимонная: кислота уксусная, ацетат натрия: /ш/^-лиметиламинобензальлегит: кислота хлорная объемной долей не менее 40 %: вода дистиллированная: стандартный препарат оксипролина: мясорубка или электромясорубка бытовая с отверстиями решетки диаметром от 3 до 4 .мм; весы лабораторные; баня водяная и песчаная; колба стеклянная гидролизная вместимостью до 300 см3: холодильники стеклянные водяные или воздушные; электронагревательное устройство с песчаной баней; колбы мерные вместимостью 100 и 250 см3: воронки стеклянные; пробирки стеклянные; пипетки мерные вместимостью 2, 5 и 10 см3; спектрофотометр или фотоэлектроколориметр с интерференционным фильтром (рабочая длина кювет 30—50 мм, зеленый светофильтр).
Приготовление реактивов. Реактив для окисления. 1,41 г хлорамина Т или Б растворяют в 10 см3 воды и последовательно добавляют 10 см3 пропанола и 80 см3 буферного раствора. Раствор должен быть свежеприготовленным.
Цветной реактив: Юг Аш/гя-диметиламинобензальде-гида растворяют в 35 см3 хлорной кислоты, непрерывно перемешивая. Полученный раствор смешивают с 65 см3 пропанола. Раствор следует готовить в день использования.
Буферный раствор (pH 6,0): 50 г лимонной кислоты; 12 см3 уксусной кислоты массовой долей 96 %; 120 г ацетата натрия; 34 г гидроксида натрия растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 см3 и доводят до метки дистиллированной водой. Полученный раствор смешивают с 200 см3 воды и 300 см3 пропанола.
Методические указания. Определение оксипролина предусмотрено нормативной документацией на ряд мясных продуктов, так как этот показатель позволяет судить о пищевой ценности мяса и изделий из него.
Метод основан на выделении оксипролина при кислотном гидролизе пробы продукта, проведении цветной реакции с продуктами ее окисления и спектрофотометрическом измерении интенсивности развивающейся окраски. После определения рассчитывают массовую долю пролина. В качестве объектов исследования рекомендуется использовать ткани и мясо различных анатомических участков туш животных, колбасы разных сортов и различные полуфабрикаты.
Подготовка проб. Образец мышечной или другой ткани мяса, мясопродуктов массой не менее 50 г пропускают через мясорубку не менее двух раз до тонкого измельчения и тщательно перемешивают.
В коническую колбу вместимостью 300 см3 помешают около 4 г продукта, взвешенного с точностью не менее ± 0,0002 г. Добавляют 100 см3 (6 моль/дм3) раствора соляной кислоты и кипятильные 102
камни для равномерного кипения. Колбу соединяют е воздушным или водяным холодильником и нагревают на песчаной бане в течение 7 ч при гидролизе проб вареных и полукопченых мясных продуктов, в течение 8 ч — при гидролизе проб мяса и сырокопченых мясных продуктов.
Теплый гидролизат фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 см3. смывая гидролизную колбу и фильтр дистиллированной водой. Объем колбы доводят водой до метки и смесь тщательно перемешивают.
Порядок проведения анализа. Гидролизаты мясных продуктов разбавляют, доводя концентрацию оксипролина до 1—4 мкг/см3. Для этого 4—10 см3 гидролизата (в зависимости от предполагаемого содержания оксипролина в испытуемом продукте) вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и нейтрализуют раствором гидроксида натрия молярной концентрацией 10моль/дм? по индикаторной бумаге до pH 6,0. Объем доводят водой до метки и перемешивают. Переносят 4 см3 этого раствора в пробирку и добавляют 2 см3 реактива для окисления, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Затем добавляют 2 см3 цветного реактива, перемешивают и пробирку закрывают алюминиевой фольгой. Одновременно готовят два контрольных раствора, используя вместо фильтрата дистиллированную воду. Пробирки быстро переносят на водяную баню температурой (60 ± 0,5) °C и нагревают в течение 15 мин, затем их охлаждают в течение 3 мин водой или льдом и не позднее чем через 30 мин измеряют оптическую плотность опытного раствора на спектрофотометре при длине волны 558 нм относительно контрольного. Предварительно измеряют оптическую плотность контрольных растворов одного относительно другого.
Построение калибровочного графика. Для построения графика готовят основной раствор оксипролина. 100 мг стандартного препарата оксипролина растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 см3, добавляют каплю раствора соляной кислоты молярной концентрацией 6 моль/дм3 и доводят водой до метки. В день использования берут 1 см3 основного раствора в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки, тщательно перемешивая. 1 см3 этого раствора содержит 0,01 мг оксипролина.
Затем готовят четыре стандартных раствора путем разбавления 5, 10, 20 и 30 см3 основного раствора оксипролина водой в мерных колбах вместимостью 100 см3 для получения соответственно растворов следующих концентраций: 0,5; 1; 2 и 3 мкг/см3.
Далее измеряют оптическую плотность стандартных растворов оксипролина при длине волны 558 нм. Всю операцию повторяют, используя для определения по 4 см3 четырех разбавленных стандартных растворов оксипролина.
По полученным средним данным строят калибровочный график, откладывая на оси ординат величины оптической плотности,
103
л ни осп абсцисс коицсн i paiHHo оксинро.нша. По 01 меченным точкам проводят прямую линию.
Массовую долю оксипролина (б ) вычисляю! iso формуле
с  250 100  100 mV  106
(1.23)
где с — концентрация оксипро.гина. найденная по калибровочном) графи-к\. мт/см'; 250 — общий объем гидролизата, ем': 100 —объем гидролизата после нейтрализации, см’: 100 — коэффициент пересчета в проценты; т — масса навески образца, взятая для анализа, г; И—объем гидролизата, взятый для нейтрализации. см’; 106 — коэффициенг пересчета мкг в г.
Полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы:
Объе кт 11 седелованим
Оптическая плот- । ность раствора ,
Концентрация окси прол и на по катибровочному iрафику, мкг/см'
Массовая доля оксипролина в образце, сг
По результатам проведенных исследований делают выводы и общее заключение по работе. При этом расчетные данные рекомендуется сравнить с данными литературы, провести оценку и сравнение содержания оксипролина в различных сырых образцах и продуктах.
Лабораторная работа № 13 ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И БЕЛКОВЫХ ВЕЩЕСТВ МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ
Цель работы. Приобрести практический навык при анализе белков мяса методом гель-фильтрации.
Задачи. Подготовка проб к анализу; калибрование хроматографической колонки и разделение веществ с выделением белковых фракций.
Объекты исследования. Мясо и мясопродукты.
Материалы, реактивы и оборудование. Стеклянные пипетки; фильтровальная бумага; лед; натрий-фосфатный или калий-фосфатный буфер (растворы молярной концентрацией 0,05 моль/дм3, содержащие раствор КС1 молярной концентрацией 0,05, pH 6,5); сефадекс G-100; белки известной молекулярной массы: яичный альбумин 45 000 Да или бычий сывороточный альбумин 68 000 Да; раствор НСЮ4; раствор КОН молярной концентрацией 5 моль/дм3; этанол 80 и 96 об.%; водяная баня; хроматографическая колонка; коллектор фракций; колбы вместимос
104
тью 20U—500 см ': юмоюнизатор: стеклянные пробирки: члпкп Петри: центрифуга лабораторная: фарфоровые чашки: стеклянные палочки.
Методические указания. В анализе белков наибольшее применение нашел метод гель-фильтрации. Для успешного использования метода необходимо правильно подготовить колонку с исследуемым для разделения материалом.
Сухой сефадекс суспендируют в 200-кратном объеме воды и оставляют на 48 ч при комнатной температуре для полного набухания. Процесс набухания можно ускорить, проводя его на водяной бане при температуре кипения в течение 5 ч.
В колонку (размером 1,5x50 см) вносят относительно густую суспензию полностью набухшего геля. Для предотвращения образования пузырьков воздуха в слое геля в колонке суспензию сефадекса перед заполнением колонки можно деаэрировать с помощью водоструйного насоса в колбе Бунзена или вносить его в колонку при температуре, значительно превышающей комнатную (50—60 °C). Сефадексу в колонке дают отстояться, затем с целью уравновешивания и достижения постоянной высоты столба геля колонку промывают 3—5 объемами буферного раствора. Гидростатическое давление для сефадекса G-100 не должно превышать 50 см при высоте столба жидкости в колонке 20—50 см (давление при разделении образца и при заполнении колонки должно быть одинаковым). Для проверки равномерности заполнения через колонку можно пропустить раствор окрашенного белка, например цитохрома с, или голубого декстрана. При этом окрашенная зона должна быть компактной и двигаться по колонке параллельно ее основанию.
Сначала определяют свободный объем колонки (Ио). Для этого через колонку пропускают 1 см3 (1 мг/см3) раствора голубого декстрана в растворе сахарозы (0,5 моль/дм3). В качестве растворителя как для голубого декстрана, так и для исследуемых белков применяют тот же буферный раствор, которым уравновешена колонка. Им же элюируют белки с колонки после нанесения анализируемой смеси. Следует заметить, что поскольку положительно заряженные частицы могут частично взаимодействовать с сефадексом (за счет имеющихся карбоксильных групп), то для элюирования обычно используют растворы с ионной силой выше 0,02.
Вытекающий из колонки буферный раствор собирают в пробирки порциями по 1—3 см3. Регистрацию объема элюата, прошедшего через колонку, начинают с момента нанесения образца на колонку. Многократное использование колонки с сефадексом приводит к замедленному протеканию жидкости через нее. В этом случае гель извлекают из колонки, отмучивают его от мелких частиц, а колонку заполняют заново.
Сефадексы можно хранить в виде суспензии или порошка.
105
Суспензию сефадекса следует хранить в холодильнике вместе с антисептиками: азидом натрия массовой долей 0.02 С. мсртиола-том или хлороформом. Для перевода геля в сухое состояние сефадекс сначала промывают водой для удаления солей, а затем выдерживают несколько минут в 2-кратном объеме этанола (50 об. %): после фильтрования через воронку Бюхнера сефадекс выдерживают в 2-кратном объеме этанола (96 об.%). обработку последним повторяют несколько раз. Затем осадок высушивают в термостате при 60-80 °C.
Подготовка проб. Пробы можно готовить следующими способами:
1. Навеску мышечной ткани массой 3—5 г или какого-либо другого образца тщательно освобождают от жира, соединительной ткани и измельчают ножницами на холоде. К кашице добавляют 5 объемов раствора НС1О4 молярной концентрацией 0,5 моль/дм3. ткань гомогенизируют или тщательно растирают в ступке (примерно 30 мин). Суспензию центрифугируют, центри-фугат сливают, а остаток вновь суспендируют в 1 — 1,5 объема раствора НСЮ4. Промывные воды соединяют с основным центри-фугатом и для удаления НС1О4 добавляют раствор КОН молярной концентрацией 5 моль/дм3. Необходимый объем щелочи рассчитывают и после нейтрализации проверяют pH по универсальному индикатору. Для более полного осаждения перхлората калия цент-рифугат охлаждают (можно оставить на ночь в холодильнике). Осадок КС1О4 удаляют центрифугированием или фильтрованием и промывают очень небольшим объемом хорошо охлажденной воды, фильтрат упаривают досуха на роторном испарителе (температура 40 °C) или водяной бане (температура бани не более 50— 60 °C). Сухой остаток используют в качестве пробы.
2. Экстракт получают при дополнительной обработке ткани спиртом. Это дает возможность получить экстракт, не содержащий солей, которые ухудшают качество хроматограмм. Способ сводится к следующему. Около 5 г сырья или продукта помещают в чашку Петри, стоящую во льду, очищают от жира, соединительной ткани и кровеносных сосудов. Навеску ткани массой 2—3 г измельчают ножницами на холоде до состояния грубой кашицы. Последнюю переносят с 5 объемами этанола (96 об.%) в гомогенизатор, стоящий во льду. Содержимое гомогенизатора перемешивают стеклянной палочкой и гомогенизируют в течение 10 мин. Гомогенат сливают в центрифужный стакан. Гомогенизатор ополаскивают 5 см3 этанола (96 об.%) и промывные воды присоединяют к основному гомогенату. Последний оставляют при комнатной температуре на 20 мин, затем центрифугируют в течение 8—10 мин при частоте вращения 50 с-1. Надосадочную жидкость сливают в мерную колбу вместимостью 200 см3, а осадок трижды промывают 15 см3 этанола (80 об.%), каждый раз сливая промывные воды в мерную колбу. К спиртовому экстракту, находящемуся в колбе,
106
приливают 160- -]SOcm? хлороформа так. чюбы мениск жнл.коси! был на I.5--2см ниже края горлышка колбы. Колбу закрывали пробкой (лучше стеклянной), встряхиваю! в течение 10—15 мни. помешают в холодильник и оставляют там до тех нор. пока четко не обозначится граница между водным и сииртохлороформным слоями. Водный (верхний) слой жидкости, содержащий аминокислоты. отбирают пипеткой с загнутым конном, используя резиновую грушу, и переносят в фарфоровую чашку. В колбу добавляют дистиллированную воду (2—3 см3). а в случае необходимости хлороформ, чтобы уровень жидкости в колбе был на 1,5—2 см ниже края горлышка колбы. Содержимое колбы встряхивают и оставляют для расслаивания. Верхний слой жидкости отсасывают и присоединяют к жидкости, находящейся в фарфоровой чашке. Эту операцию повторяют еще 2 раза. Содержимое фарфоровой чашки упаривают на роторном испарителе при температуре около 40 °C или водяной бане (температура бани 50—60 °C). В дальней шем оба способа обработки ткани совпадают.
Порядок проведения анализа. Перед использованием подготовленной к работе колонки с сефадексом проводят ее калибрование, т. е. пропускают через нее смесь двух окрашенных компонентов — высокомолекулярного с коэффициентом разделения К = 0 и низкомолекулярного 0^=1. При этом преследуют две цели: определить параметры колонки (Ин. Ив) и проверить качество ее заполнения. Параметры определяют по форме и степени компактности окрашенных зон. В качестве высокомолекулярного окрашенного вещества обычно используют голубой декстран — линейный водорастворимый полиглюкан молекулярной массой около 2 000 000 Да, несущий ковалентно присоединенные хромофорные группы. Низкомолекулярным окрашенным соединением служит какая-либо соль, содержащая окрашенные катионы (кобальт, никель) или анионы (бихромат).
Калибрование проводят следующим образом. Открывают кран колонки так, чтобы жидкость вытекала медленно (5—7 капель в минуту), и дают раствору, находящемуся над поверхностью геля, почти полностью впитаться. Под колонку помещают мерную пробирку для сбора элюата. На поверхность геля наносят 0,2—0,3 см3 водного раствора голубого декстрана и окрашенной соли. Наслаивание проводят осторожно, по каплям, по всей поверхности геля. Затем открывают кран и дают раствору проникнуть в гель. Кран закрывают и на поверхность геля осторожно наслаивают 0,2 см3 элюента и опять, открывая кран, дают войти этому раствору в гель. Операцию повторяют еще два раза. Как только окрашенные зоны начнут передвигаться по столбику сефадекса, свободную часть колонки заполняют элюентом, а затем в ходе элюирования его уровень поддерживают примерно постоянным, заполняя колонку почти доверху. Поддерживая с помощью крана низкую скорость элюирования (5—10 капель в минуту), собирают элюат пор-
107
киями ио 2 см-' в пронумерованные мерные пробирки. В процессе элюирования визуально оценивают качество заполнения колонки; при однородном заполнении и сохранении горизонтальной поверхности геля окрашенные соединения (особенно голубой декстран) перемещаются по столбику сефадекса в виде компактных не-перекрываюшихся зон.
По окончании элюирования всех окрашенных веществ кран колонки закрывают и проводят колориметрирование окрашенных фракций элюата: фракции, содержащие голубой декстран, — с красным светофильтром, а фракции, содержащие бихромат, — с зеленым. Затем строят график элюирования при калибровании колонки, откладывая на оси абсцисс номера фракций (или объем в см3), а на оси ординат — значения экстинкций. На графике отмечают величины и Ив.
Для разделения белков на колонке с сефадексом подготовленную пробу осторожно, с учетом вышеприведенных рекомендаций наносят на колонку пипеткой и отмечают время начала опыта. После проникновения пробы в среду сефадекса подключают элюирующий раствор.
Вытекающий из колонки буферный раствор собирают в пробирки порциями по 1—3 см3. Объем элюата, прошедший через колонку, регистрируют, начиная с момента нанесения образца на колонку.
Содержание белка во фракциях определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм.
По окончании анализа колонку промывают несколькими объемами буферного раствора. Строят профиль элюирования отдельных белковых фракций (рис. 1.29). При этом на оси абсцисс откладывают номера пробирок (фракций) или объем прошедшей через колонку жидкости, а на оси ординат — значения оптической плотности фракций. Белки, принадлежащие к одной фракции (пик на профиле элюирования), объединяют. О числе белковых фракций судят по количеству пиков на графике. Количественное определение белка ведут по калибровочному графику.
Рис. 1.29. Пример графика элюирования при фракционировании белков: с J по XI — белковые фракции
108
Построение калибровочного графика. Для количественного определения белка спектрофотометрическим методом предварительно строят калибровочный график с использованием раствора чистого белка концентрацией от 0.05 до 2,00мг/см3, пример которого приведен на рис. 1.30.
Полученные результаты рекомендуется оформить в виде графика элюирования (см. рис. 1.29) и таблицы результатов, форма которой приведена ниже.
Рис. 1.30. Пример калибровочного графика для определения концентрации белка в растворе спектрофотометрическим методом
Образен
Масса навески
Количество белковых фракции
Массовое содержание белков
суммарное
каждой из фракций
После этого студенты делают самостоятельные выводы и заключение по работе, акцентируя внимание на полученных экспериментальных данных и их сравнительной оценке с данными литературы.
Лабораторная работа № 14 АНАЛИЗ БЕЛКОВ МЕТОДАМИ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Цель работы. Приобрести практический навык при анализе белков методами ионообменной хроматографии.
Задачи. Подготовка проб, ионообменной смолы и хроматографической колонки к анализу, разделение белков, расчет количества белка в анализируемых материалах.
Объекты исследования. Кровь и ее фракции, а также мясо различных видов животных и птицы, мясопродукты.
Методические указания. Перед использованием ионитов для хроматографического разделения белков их предварительно обрабатывают. Иониты промышленного изготовления после набухания, во-первых, фракционируют по размеру частиц (однородность частиц сорбентов по размеру — одно из важных условий успешной хроматографии) и, во-вторых, подвергают «циклиза-
109
шш  - И'.-рсво.1\ и\ и ; о. шои формы в лр\т у К). Kai iioihi 1 ы персы > ДЯ1 115 Nj -форМи Г Н  форМХ 11.111 наоборот. <1 аниониты - из <'1 -формы в Oil -формх или наоборот. В процессе обработки стабилизируется структура ионита, и функциональные группы становятся более доступными. Одновременно ионит освобождается от примесей.
Ионообменники можно использовать многократно. Поэтому ио окончании работы их следует регенерировать. Для этого к использованному сорбенту добавляют 30-кратный объем раствора NaOH молярной концентрацией 0,2—0,5 моль/дм'. перемешивают до получения однородной суспензии и фильтруют на воронке Бюхнера. Обработку щелочью проводят дважды. После этого ионит промывают водой до нейтральной реакции фильтрата. Регенерированный ионообменник уравновешивают соответствующим буферным раствором.
Ионообменники на основе целлюлозы можно хранить во влажном состоянии непродолжительное время. Аниониты лучше хранить в солевой форме (не в ОН -форме), а катиониты — в солевой и в Н+-фор ме. При хранении набухших ионообменников рекомендуется добавлять толуол. При добавлении толуола (несколько капель на 1 дм3) следует помнить, что толуол поглощает электромагнитные волны при 280 нм, а растворимость его в некоторых буферных растворах, например в трис-буфере, достаточно высока.
В целом же следует отметить, что ионообменная хроматография белков менее предпочтительна, чем гель-фильтрация.
В работе в качестве ионита рекомендуется использовать диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу) и (или) кар-боксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлозу ). ДЭАЭ-целлюлоза благодаря своим функциональным группам — диэтиламиноэтиль-ным остаткам [—СН2 — СН2 — N = (С2Н5)2] в водном растворе обладает свойствами слабого анионита; используется для хроматографического фракционирования кислых и нейтральных белков. Фракционирование белков сыворотки крови можно проводить с использованием градиентного или ступенчатого элюирования. Сорбцию белков на колонке осуществляют при pH 5,65. При этом значении pH белки сыворотки крови могут сорбироваться на слабых анионитах.
Карбоксиметилцеллюлоза — слабый катионит, содержащий в качестве ионогенных групп карбоксиметильные остатки СН2 — СОО , связанные с гидроксильными группами целлюлозы эфирными связями. Используется для разделения основных и нейтральных белков.
Фракционирование белков сыворотки крови на КМ-целлюлозе рекомендуется проводить путем создания ступенчатого элюирования. Это обусловлено достаточно большими различиями в сродстве отдельных белковых фракций к иониту. Сорбция белков на НО
колонке ос\шееib.imcгея при pH -1.6 рсырюы.ш буферщ При гя ком значении pH белки сыворотки крови сорбируются на слабых катионитах.
Подготовка проб. Для подготовки рекомендуется использовать следующие способы. Для получения сыворотки 2—3 см? кротят помешают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 0.5—1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку. С целью удаления солей ее диализируют против исходного буферного раствора. Для этого сыворотку разводят два раза исходным буферным раствором, помещают в специальный мешок и диализируют против того же буфера в течение не менее 12 ч (можно оставлять на ночь); при использовании в качестве объекта мяса белки предварительно экстрагируют согласно описи методов, указанных в лабораторной работе № 3.
1	.РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА ДЭАЭ-ЦЕЛЛЮЛОЗЕ
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор НО молярной концентрацией 0,5 моль/дм3; раствор NaOH молярной концентрацией 0,5 моль/дм3; ДЭАЭ-целлюлоза; натрий-ацетатный буфер — растворы молярной концентрацией 0,02; 0,1 и 0,5 моль/дм3 (pH 5,6); раствор NaCl молярной концентрацией 0,3 моль/дм3, приготовленный на натрий-ацетатном буфере молярной концентрацией 0,02 моль/дм3; раствор NaCl молярной концентрацией 0,5 моль/дм3, приготовленный на натрий-ацетатном буфере молярной концентрацией 0,5 моль/дм3.
Порядок проведения анализа. Для подготовки сорбента берут около 10 г ДЭАЭ-целлюлозы, обрабатывают и переводят в ОН~-фор-му. После удаления мелких и крупных частиц ДЭАЭ-целлюлозу суспендируют дважды в избытке натрий-ацетатного буферного раствора (0,1 моль/дм3, pH 5,65), выдерживая каждый раз в буфере по 30 мин. Избыток жидкости удаляют декантацией. После второго суспендирования смесь вносят в колонку.
Рекомендуемый размер колонки 1,5x20 см. По окончании заполнения колонки ионит уплотняют либо поршнем, либо давлением воздуха до получения постоянной высоты столба геля. Затем колонку уравновешивают исходным элюирующим буферным раствором — натрий-ацетатным буфером молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 (pH 5,6), медленно пропуская его через колонку (при данных размерах колонки 5—6 капель в 1 мин) до тех пор, пока pH выходящего из колонки раствора не будет равен исходному. Объем раствора, необходимого для уравновешивания, составляет около 8 общих объемов колонки. Затем на колонку наносят 50—100 мг белка в объеме 1—3 см3. Пробу вводят микропипеткой
111
пли микрошприцем. :пя чего отсоединяю! капельную воронку, но кран воронки нс закрывают, чтобы не прекратить ноток жидкости. Смесь разделяемых веществ подают в колонку' в гот момент, когда сдой растворителя над сорбентом опустится до верхней его границы. Затем сверху осторожно наливают растворитель на высоту 1—2 см над поверхностью сорбента и поддерживают этот уровень. Колонку промывают исходным буферным раствором до тех пор. пока оптическая плотность элюата не станет равной примерно 0.05, после чего переходят к фракционированию белков.
Скорость протекания белков через колонку не должна превышать 15—20 см3/ч. Элюат собирают порциями по 3 см3. Элюирование белков с колонки проводят буферными растворами с линейным градиентом NaCl, меняя молярную концентрацию последнего от 0 до 0,3 моль/дм3. Прибор для создания линейного градиента представлен на рис. 1.9, а. В смеситель помещают 250 см3 натрий-ацетатного буфера (0,02 моль/дм3, pH 5,6), а в сосуд 1—250 см3 этого же раствора, но содержащего раствор NaCl молярной концентрацией 0,3 моль/дм3. Наиболее прочно адсорбированные белки дополнительно элюируют раствором NaCl молярной концентрацией 0,5 моль/дм3 в ацетатном буфере (0,5 моль/дм3, pH 5,6).
Элюаты в пробирках анализируют на спектрофотометре при длине волны 280 нм. На основании данных, полученных при определении содержания белка в отдельных порциях элюата, строят профиль элюирования, определяют число белковых фракций и рассчитывают массовое содержание белка (см. лабораторную работу № 2).
2	. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА КМ-ЦЕЛЛЮЛОЗЕ
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор НС1 молярной концентрацией 0,5 моль/дм3; раствор NaOH молярной концентрацией 0,5 моль/дм3; КМ-целлюлоза; натрий-ацетатный буфер — растворы молярной концентрацией 0,02 (pH 4,6), 0,05 (pH 5,2) и 0,08 моль/дм3 (pH 6,0); фосфатный буфер — раствор молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 (pH 7,0); фосфатный буфер-раствор молярной концентрацией 0,1 моль/дм3, приготовленный на растворе поваренной соли молярной концентрацией 0,5 моль/дм3 (pH 8,3).
Порядок проведения анализа. Для подготовки сорбента берут около 10 г КМ-целлюлозы, обрабатывают и переводят в Н+-фор-му. Гранулярную или волокнистую КМ-целлюлозу рекомендуется отмывать после обработки кислотой или щелочью фильтрованием на воронке Бюхнера или центрифугированием, сферическую — декантацией в химическом стакане. В случае необходимости КМ-целлюлозу фракционируют по размеру частиц.
112
1 Io. ti o i овка и >а i I о. 1 не н 11 с колонки 'щымсром 1.5  i(l е\: описл ны в п. ]. .чанной работы. Использую г исминыи t <-с цниовыию буферный раствор — натрин-алic iа 1 шип отфыр полярной концентрацией 0.02 моль/дм-' (pH 4.6).
На колонку наносят 70—100 хи белка в объеме 1 — 3 см'. Колонку промывают исходным буферным рас, вором до гсх пор. пока оптическая плотность o.noaiа нс станет равной 0.02.
Фракционирование бе jkob сыворотки крови на КМН осуществляют с помощью ступенчатого элюирования (см. рис. 1.8). подавая на колонку последовательно следующие растворы: натрип-апетатный буфер («стартовый буфер») (0.02 моль/дм'. pH 4,6); натрий-ацетатный буфер (0.05 моль/дм'. pH 5.2): натрий-ацетатный буфер (0.08 моль/дм5, pH 6.0): фосфатный буфер (0,1 моль/дм5, pH 6,0) и фосфатный буфер (0.1 моль/дм3. pH 8,3), содержащий раствор NaCl молярной концентрацией 0,5 моль/дм'. Каждый новый раствор полаю) на колонку только после того, как полностью элюируется пик. вымываемый предыдущим раствором. Скорость тока приблизительно составляет 50 см'/ч. Элюат собирают порциями по 2—3 см ’.
Элюаты в пробирках анализируют спсктрофотомстрически при длине волны 280 нм. На основании данных, полученных при определении содержания белка в отдельных порциях элюата, строят профиль элюирования, определяют число белковых фракций и рассчитывают массовое содержание белка фотометрически (см. лабораторную работу № 2).
Полученные результаты используют для построения профиля элюирования белков и расчетов количества белка в пиках. После этого рекомендуется самостоятельно сформулировать выводы и заключение по работе, акцентируя внимание на полученных экспериментальных данных и сравнивая их с данными литературы.
Лабораторная работа № 15
АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ НА АВТОМАТИЧЕСКОМ АМИНОКИСЛОТНОМ АНАЛИЗАТОРЕ
Цель работы. Приобрести практический навык определения состава аминокислот в белках мяса и мясопродуктов на автоматическом аминокислотном анализаторе.
Задачи. Изучить конструкцию прибора и принципы его работы; провести гидролиз анализируемых образцов; получить аминограммы после разделения смеси аминокислот с последующим расчетом их количества.
Объекты исследования. Мясо и мясопродукты.
Материалы, реактивы и оборудование. Соляная кислота молярной концентрацией 6 моль/дм3; буферные растворы pH 2,2; 3,28;
ИЗ
4.25. 5.28: смесь муравьиной, уксусной кис.101 и воды в сосн-nuLiicHHit 7:5: 15; аминоанааизатор: водяная баня, иснаршсль; стеклянные пинетки: стеклянные палочки: стаканы; фарфоровая чашка.
Приготовление реактивов. Буферный раствор для нанесения образна (pH 2,2). 11.6 г хлорида натрия и 0.8 см3 концентрированной соляной кислоты растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды.
Буферные растворы для э л ю и р о в а н и я а м и -нокислот (pH 3,28; 4,25; 5.28). Количественное соотношение компонентов указано в таблице, приведенной ниже.
Состав буферных растворов	-V2S ±	pH	
		4,25	5.2S
Лимонная кислота одноводная, г	70.5	2S2.5	123,0
Соляная кислота (плотность 1190 г/см3), см3	61,6	167.5	32,5
Гидроксид натрия, г	40,0	160,0	70,0
Этанол, см3	200,0	—	—
Детергент (барий 35). г	10,0	10,0	10,0
Вода, см3	До 5000	До 5000	До 5000
Методические указания. Состав аминокислот в белках различных мясных продуктов определяют методом ионообменной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-881 (Чехия) или на каком-либо другом. Для разделения аминокислот применяют хроматографическую колонку, заполненную катионообменной смолой, со ступенчатым элюированием тремя натрий-цитратными буферными растворами с различным значением pH (3,28; 4,25; 5,28).
Метод включает обязательный предварительный гидролиз белков кислотой или щелочью с целью получения свободных аминокислот. Их затем определяют с помощью ионообменной хроматографии на колонках, заполненных твердым носителем, химически соединенным с заряженными группами, которые обеспечивают электростатическое взаимодействие с исследуемым объектом.
Аминокислоты исследуемого раствора обратимо связываются ионообменником, а затем элюируются буферным раствором, вызывая десорбцию аминокислот. Для элюирования аминокислот используют буферные растворы, pH и ионная сила которых постепенно повышаются. При этих условиях аминокислоты выходят на колонки в следующем порядке: кислые, нейтральные и основные.
114
Рис. 1.31. Схема автоматического аминокислотного анализатора:
] — cncie.Ma подачи образца: 2. 2', 2" — сосуды с буферным и растворами; 3. 6—насосы; 4 — ионообменная колонка; 5- сосуд с раствором нингидрина; 7 — смеситель; <S’ — капилляр; 9 — спектрофотометр; 10 — самописец
Принципиальная схема аминокислотного анализатора представлена на рис. 1.31.
Выходящий из колонки элюат поступает в смеситель, содержащий нингидрин, который подается насосом. Для развития цветности в результате качественной реакции смесь проходит через специальный капилляр, погруженный на водяную баню температурой 100 °C. Окрашенный раствор пропускают через спектрофотометр с длиной волны 570 нм для измерения интенсивности окраски, которая фиксируется самописцем в виде пиков. По расположению пиков судят о наличии индивидуальных аминокислот в гидролизате, а по площади пиков — об их содержании. Пример хроматограммы аминокислот (аминограммы) приведен на рис. 1.32. Для расчетов необходимо предварительно получить стандартную аминограмму.
Рис. 1.32. Хроматограмма аминокислот
115
Подютовка проб. При oi i pc.ic.i с я и 11 суммарных ампнокпс.ин (свободных и связанных) проводя! пиролиз OC/IKOB !1 пептидов, содержащихся в мясе. Для этого образен измельченного мяса массой 150—250 мг (белка должно быть не менее 25—50 мг) помешаю! в стеклянные ампулы или термостойкие пробирки с пришлифованными пробками и добавляю! 25 см' раствора соляной кислоты молярной концентрацией 6 моль/дм3. Затем ампулы запаивают (или плотно закрывают пробирки пробками) и выдерживают термостате при 114—115 С is течение суток. При этом необходимо помнить, что при кислотном гидролизе триптофан разрушается полностью, серин и треонин — на 5 — 10%, цистин, цистеин, метионин — частично. Перед гидролизом образцы следует пометить. Приготовленные пробы устанавливают в термостат и оставляют под наблюдение и контроль лаборанта до следующего занятия.
На втором этапе но окончании гидролиза образец фильтруют через стеклянный фильтр, испаряют избыток соляной кислоты. Для этого 5 см3 гидролизата помещают в роторный испаритель и упаривают досуха при температуре 40 °C. После этого в сухой остаток приливают 1,5 см3 дистиллированной воды и снова упаривают, повторяя операцию дважды. Освобожденный от соляной кислоты остаток растворяют в 10 см3 буферного раствора (pH 2,2).
При определении только свободных аминокислот предварительно получают безбелковые экстракты тканей или продуктов.
Экстракт мышечной ткани получают в соответствии с описанием, указанным в лабораторной работе № 2. После упаривания на роторном испарителе сухой остаток растворяют в смеси НСООН-СН3СООН-Н2О в соотношении 7:5:13с таким расчетом, чтобы 1 см3 раствора соответствовал 1,5—2,0 г ткани.
При определении аминокислот в жидких материалах, например в крови убойных животных и ее фракциях, к 1—2 см3 образца добавляют равный объем раствора СН3СООН молярной концентрацией 0,04 моль/дм3, нагревают на водяной бане, доводят до кипения и кипятят 2—3 мин, охлаждают и осадок белка отделяют центрифугированием. Центрифугат сливают и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 0,1—0,2 см3 смеси муравьиной, уксусной кислот и воды (7:5:13), нерастворившийся осадок отбрасывают.
Порядок проведения анализа. Раствор анализируемого материала объемом 0,5 см3 вручную или с помощью насоса вводят в колонку и запускают систему. Продолжительность собственно анализа 5—6 ч (время регламентируется конструкционными особенностями аминокислотного анализатора). Строят аминограмму.
Построение стандартной аминограммы. Перед хроматографическим разделением опытных образцов для получения стандартной хроматограммы проводят анализ стандартной смеси аминокислот. Причем смесь аминокислот готовят так, чтобы молярная концентрация каждой аминокислоты была равна 1 ммоль/дм3. Для этого 116
навеску каждый аминоквелоi ы (\п) бер\ i в кыдичес i не. численно равном се молекулярной массе. Кроме юю. бср\ г coo i ветствую-шую навеску хлорила аммония лля получения сiакларi но, о пика аммиака, который образуется в гидролизате в результате распада амидов, содержащихся в белках.
Приготовление стандартного раствора аминокислот рекомендуется проводить в соответствии с данными таблицы:
							
	Огностельная	; Массовая доля	 Содержание в !	1 см расIвор;), mi
Аминокискна	молекулярная	1 a so'i а. с<	- - 		1
	масел	\		аминокпело! ы	!	азом I
Лизин	146.13	19.17	0.14613	0.02801
Гистидин	155.19	27.10	0.15519	0.04206
Аргинин	174.24	32.18	0.17424	0.05604
Аспарагиновая кис-	133.12	10,53	0.13312	0.01402
лота				
Треонин	119,12	1 1.75	0.11912	0.01400
Серин	105.09	13.33	0,10509	0.01401
Глутаминовая кис-	147.12	9.52	0.14712	0.01401
лота				
Пролин	115.12	12,17	0.11512	0.01401
Глицин	75.05	18.67	0.07505	0.01401
Аланин	89.12	15,73	0,08912	0.01402
Цистеин	121.15	11.56	0.12115	0.01389
Валин	117,09	11.96	0.11709	0.01401
Метионин	149,20	9.39	0.14920	0,01401
Изолейцин	131,20	10.60	0.13120	0.01401
Лейцин	131,20	10.60	0.13120	0,01401
Тирозин	181.19	7,74	0,18119	0.01403
Фенилаланин	165.19	8.48	0,16519	0.01403
Хлорид аммония	53.49	26,16	0.53449	0,01401
Изучают полученную аминограмму. Измеряют площади пиков с помощью потенциометра или вычисляют путем умножения высоты пика на его ширину, взятую на половине его высоты.
Массовую долю аминокислот рассчитывают по формуле
X=(SnM-5Q- 10-?)/(5>),
(1.24)
где 5П — площадь пика соответствующей аминокислоты на полученной аминограмме, см2; М — молекулярная масса аминокислоты. Да; 50 — объем раствора, полученный после кислотного гидролиза, см3; 10”3—концентрация аминокислоты в стандартном растворе, моль/дм3; 5СТ —площадь пика стандартного раствора аминокислоты, см , т — масса навески образца, г.
117
Содержание аминокислот в мышечной ткани выражают в микромолях. миля и грам м - процент ах на влажную массу ткани или в процентах к небелковому или общему азоту, в сыворотке крови — в микромолях, миллиграмм-процентах или в процентах к небелковому азоту.
Полученные экспериментальные и расчетные данные сводят в таблицу, форма которой приведена ниже.
Наименование и характеристика образна
Содержание аминокисло! в образце
мкмоль/дм!
Сравнив данные с действующими научно обоснованными нормами питания, полезно проанализировать потенциальные возможности сырья или продуктов для покрытия суточной потребности в незаменимых аминокислотах, дать рекомендации по рациональному их использованию.
Лабораторная работа №16
АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Цель работы. Приобрести практический навык анализа аминокислот мяса и мясопродуктов методами бумажной хроматографии.
Задачи. Подготовить хроматографические камеры и пробы для хроматографирования, проявить бумагу и идентифицировать аминокислоты.
Объекты исследования. Мясо, мясопродукты, кровь и ее фракции.
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор НСЮ4 молярной концентрацией 0,5 моль/дм3; раствор КОН молярной концентрацией 5 моль/дм3; раствор нингидрина в ацетоне массовой долей 0,2 %; стандартные растворы аминокислот молярной концентрацией 0,025 моль/дм, этанол (на 50 см3 этанола добавляют 0,02 см3 насыщенного раствора CuSO4); раствор изопропанола массовой долей 10 %; диазореактив; хроматографические камеры; бумага; пульверизатор; ножницы; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр.
Приготовление реактивов. Бутанолуксусная смесь. Смесь нормального бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5 (верхний слой) и 8:3:1 (нижний слой) тщательно встряхивают в делительной воронке и после расслаивания используют верхний слой.
118
Д и а ’> о р е а к г и в: смешиваю! о ши обьсм рас i вора сульфаниловой кислоты (к 0.9 г кислоты прибавим-. 9 см' концентрированной НС1 и 90 см' 1LO) и пять объемов свежеприготовленного раствора NaNO. массовой долей 5 сс. объем доводят водой до 50 см3.
Методические указания. Метод основан на распределении соединения между двумя жидкими фазами. Хроматографическая бумага обладает свойством поглощать воду из атмосферы и задерживать ее между своими целлюлозными волокнами. Эту воду можно рассматривать как один из растворителей (как неподвижную фазу). Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем, и наоборот.
Как правило, при бумажной хроматографии неподвижная фаза является водной, а в качестве подвижной используются органические растворители.
Метод хроматографического разделения на бумаге уступает колоночным методам по ряду показателей, однако имеет в ряде случаев определенное преимущество.
Определение свободных аминокислот сводится к хроматографическому анализу безбелковых фильтратов на бумаге и определению аминокислот после обработки хроматограмм нингидрином.
В присутствии нингидрина отдельные аминокислоты проявляются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый, желтый или другой цвет (в зависимости от химической структуры аминокислоты).
Идентификацию аминокислот в смеси проводят путем сопоставления распределения известных аминокислот (стандартов).
Подготовка проб. 1. Суммарные аминокислоты получают путем предварительного гидролиза (см. лабораторную работу № 15).
2. Свободные аминокислоты извлекают из образцов раствором спирта (75—80 об.%), нагретого до температуры 60—70 °C на водяной бане. Полученную смесь тщательно растирают в течение 15 мин и фильтруют через вставленный в воронку складчатый фильтр в чашку для выпаривания, которую используют в качестве приемника.
Порядок проведения анализа. Для анализа используют хроматографическую бумагу ватман № 1, FN № 3 (можно № 2) и др. Вырезают полосы длиной около 50 см и шириной 18—50 см (размер бумаги определяется размером исследуемых проб и величиной хроматографической камеры). В 5—10 см от конца полоски (зависит от высоты лодочки) простым карандашом проводят стартовую линию и отмечают точки нанесения раствора в 3 см от краев хроматограммы и в 2,5 см одна от другой. Для лучшего разделения об-
119
1.33 Форма Фмажнои по.юсы. обеспечивающая .пч шее |чн имение аминокис.101 (размеры даны в мм):
разной с большим набором аминокислот край бумаги, на который наносят гидролизат. вырезают. как это показано на рис. 1.33.
Чашку с экстрактом помешают на водяную баню при температуре кипения и полностью выпаривают спирт. Полученный сухой остаток растворяю! в растворе изопропанола массовой долей 10 % с таким расчетом, чтобы 1 см3 раствора соответствовал 1,5—2 г ткани. Раствор наносят на .хроматограмму в количестве, эквивалентном 30—50 мг ткани. На ту же хроматограмму рядом с исследуемым раствором наносят растворы известных аминокислот — «свидетелей». Стандартные растворы глутаминовой кислоты и аланина (или любых других аминоотдельные точки (обычно 3—5 точек) в строго
в
кислот) наносят определенном количестве. По этим точкам строят стандартные калибровочные графики для количественного определения аминокислот в экстракте ткани.
Построение калибровочного графика. Для каждой аминокислоты строят свой калибровочный график. В ряд точек хроматограммы наносят стандартные растворы аминокислот в количестве 0,05; 0,1; 0,15 и 0,2 мкмоль каждой. В качестве стандартных растворов удобно пользоваться смесями аминокислот известного состава, хорошо разделяющимися в данных условиях и содержащими определенные количества аминокислот. Стандартные смеси готовят из стандартных растворов отдельных аминокислот молярной концентрацией 0,025 моль/дм3, приготовленных на растворе изопропилового спирта массовой долей 10%, смешиванием по 1 см3 (0,5 см3) раствора каждой аминокислоты. Стандартные растворы аминокислот наносят на ту же хроматограмму, что и опытные пробы. Если размеры хроматограммы не позволяют этого, полоски бумаги, используемые для хроматографии стандартных и опытных растворов, вырезают из одного и того же листа хроматографической бумаги.
После проявления хроматограммы окрашенные участки обводят простым карандашом, вырезают, измельчают ножницами и помещают в пробирки. Окрашенный продукт элюируют 5 см3 перегнанного метанола (предварительно к 500 см3 метанола добавляют 0,2 см3 насыщенного раствора нитрата меди) или 5 см3 этилового спирта (в этом случае вместо нитрата меди добавляют суль
120
фат мс/нп. Пробы до колориметрирования необходимо не риодически встряхивать и держать в темноте. Элюаты начинаю! колориметрировать, котла в раствор перейдет краска из наиболее интенсивно окрашенных пятен (обычно через 30—60 мин). Определение проводят на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (500 нм) в кювете толщиной 0.5—1.0 см. Для контроля вырезают чистый участок хроматограммы на том же уровне, что и проявленные пятна, и обрабатывают его так же. как и опытные пробы.
Калибровочный график строят, откладывая на оси абсцисс концентрацию аминокислоты, а на оси ординат — величины оптической плотности.
Исследуемый раствор наносят микропипеткой с оттянутым в капилляр и изогнутым концом вместимостью 0,1 см3, полуавтоматической пипеткой или калиброванным капилляром. Диаметр наносимых пятен не должен превышать 0,3—0,5 см (объем каждой капли около 0,003—0,005 см3). При нанесении раствора в одну и ту же точку бумаги соответствующее место каждый раз подсушивают током теплого воздуха. Если расстояние между точками нанесения превышает 2,5 см, раствор можно наносить в виде полосы.
Для идентификации аминокислот в исследуемом гидролизате наряду с опытными пробами (или предварительно, до анализа опытных проб) на хроматограмму наносят растворы аминокислот — «свидетелей». После установления местоположения пятен отдельных аминокислот — «свидетелей» в дальнейшем последние можно наносить на хроматограмму в виде смесей. Смеси должны иметь известный состав и хорошо разделяться при данных условиях хроматографирования. Этим требованиям удовлетворяют смеси аминокислот следующего состава:
1. Цистеиновая кислота, гистидин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, аланин, триптофан, метионин, фенилаланин, лейцин.
2. Цистеиновая кислота, лизин, аргинин, серин, треонин, аланин, пролин,тирозин, валин, изолейцин.
Смеси «свидетелей» помещают в крайние точки стартовой линии хроматограмм по 0,05—0,1 мкмоль каждой аминокислоты в пятно.
В качестве растворителей для хроматографии аминокислот обычно используют последовательно две системы: д-бутанол — уксусная кислота — вода в соотношении 4:1:5 (верхний слой) и д-бутанол — уксусная кислота — вода в соотношении 8:3:1.
Для лучшего разделения сложной смеси аминокислот, имеющих близкие величины Rf, каждый растворитель пропускают по хроматограмме несколько раз (обычно дважды). В этом случае фронт каждого последующего растворителя должен продвигать
121
ся несколько ъгшшс. чин нрелылушсго. Перед использованием кажло! о следующею раствори геля хрома i oi раммы вынимаю! из камеры и сушат на воздухе.
Хрома I or рам му проявляю! раствором нингидрина массовой долей 0.2 Сс. приготовленным на nepci нанном ацетоне. К раствору нингидрина прибавляют 4 см? воды и I см?ледяной уксусной кислоты. Этот раствор готовят непосредственно перед проявлением. Раствор наливают в ванночку и равномерно пропитывают им хроматограмм}'. Затем ее сушат под тягой и выдерживают в темноте при комнатной температуре около 12 ч. В этих условиях с нин-тдрином реагируют все сх-аминокислоты (все другие аминокислоты дают реакцию при более высокой температуре — около 100 °C). Проявление хроматограмм при качественной хроматографии можно ускорить, помещая последние на 10—15 мин в термостат при 60 °C. Окраска, полученная при проявлении аминокислот нингидрином, неустойчивая. Ее можно закрепить, опрыскивая проявленную хроматограмму из пульверизатора раствором ацетона, содержащим нитрат меди. К 100 см3 ацетона прибавляют 1 см3 насыщенного раствора Cu(NO3X и 0,02 см3 концентрированной азотной кислоты.
Сопоставляя положение аминокислот гидролизата с положением аминокислот — «свидетелей», определяют аминокислотный состав гидролизата.
Наряду с нингидриновым реактивом существуют и другие реактивы, дающие цветные продукты с некоторыми аминокислотами. Это свойство избирательного окрашивания часто используют в хроматографии для идентификации отдельных аминокислот. Так, для определения соединений с гуанидиновой группой (аргинин) используют реакцию Сакагуши. Хроматограмму смачивают раствором 8-оксихинолина в ацетоне с массовой долей 0,1 % и после ее подсушивания на воздухе слегка опрыскивают из пульверизатора раствором гипобромита (1см3 брома в 500 см3 раствора NaOH молярной концентрацией 0,5 моль/дм3). Наблюдается оранжевое окрашивание.
Реакция Эрлиха. Производные индола и оксииндола (триптофан, 5-окситриптофан, 5-окситриптамин, 5-оксииндолуксусная кислота) с реактивом Эрлиха дают лиловую окраску. Хроматограмму погружают в раствор, содержащий диметиламинобензальдегид массовой долей 10 % в концентрированной НО с четырьмя объемами ацетона. Окраска появляется через 20 мин при комнатной температуре.
Реакция Паули. Соединения, содержащие имидазольное кольцо (гистидин, метилгистидин, гистамин, карнозин), а также тирозин дают красно-оранжевое окрашивание после обработки диазореактивом. Хроматограмму из пульверизатора слегка опрыскивают сначала диазореактивом, а затем раствором Na2CO3 массовой долей 10 %. Окраска устойчивая.
122
I 1еречислснные реакции можно примеичи. nocic нроявленю-; хроматограммы нингидрином.
Для обнаружения материала, имеющего пептидные связи, id не лающего нингидриновую реакцию (например, циклические пентилы), применяют реакцию Райдона и Смита. С этой целью .хорошо высушенную хроматограмму смачивают в смеси спирта и эфира (1 : I). Избыток растворителя удаляют фильтровальной бумагой. Влажную хроматограмму помешают в замкнутое пространство над свежеприготовленной смесью раствора НО массовой долей 10% и раствором КМпО4 массовой долей 1 % (в соотношении 1 : 1) на 5—15 мин. Затем хроматограмму погружают в смесь раствора KJ молярной концентрацией 0.05 моль/дм3 и насыщенного раствора о-толуидина (или бензидина) в уксусной кислоте массовой долей 2 % (1 : 1). На месте пептидов и белка появляются синие пятна. Через 1—3 мин хроматограмму промывают раствором СН.СООН массовой долей 2 % и высушивают на воздухе. Окраска устойчивая. Для пептидов эта реакция более чувствительна, чем нингидриновая. Реакцию дают также пуриновые и пиримиди новые основания, нуклеозиды, нуклеотиды и др.
Количественное содержание аминокислот рассчитывают по калибровочным графикам, построенным после хроматографирования стандартных растворов аминокислот, взятых в различных количествах.
Содержание аминокислот в мышцах рассчитывают в микромолях, миллиграмм-процентах на массу ткани или процентах к небелковому или общему азоту.
Полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы. Самостоятельно анализируют их и формулируют выводы по работе.
Наименование и характс-ристика образца _____
Качественный состав аминокислот
Количество аминокислот
Лабораторная работа №17
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА ПЛАСТИНАХ
Цель работы. Приобрести практический навык количественного определения аминокислот методом тонкослойной ионообменной хроматографии на пластинах.
Объекты исследования. Мясо и мясопродукты.
Материалы, реактивы и оборудование. Хроматографические пластины, уравновешивающий буферный раствор (pH 4,1); разде-
123
ляюнше оуфсрныс расiворы (pH 3.5: 5.23; 6.0); кадмин-ннщиа-риновый прояви 1ель: хрома ioi рафическая камера; пульверизатор; микропицстки: сушильный шкаф.
Приготовление реактивов. У’ р а в н о в с ш и в а ю ш и it б у -ф е р н ы й р а с т в о р м о л я р н о й к о н ц е и т р а п и е и 0.02 моль/лм?. 1,4 г кристаллической лимонной кислоты. 0.8 i NaOH. 1.2 см3 концентрированной НС1 и 70.0 см3 этанола растворяют в воде и доводят объем до 1 дм? (pH 4.1).
Разделяю щи й буфе р и ы й р а с т в о р м о л я р-ной концентра ц и е й 0.4 моль/дм3. 84,0 г кристаллической лимонной кислоты, 16,0 г NaOH и 4,0 см3 концентрированной НС1 растворяют в воде и доводят объем до 1 дм3 (pH 3,5).
Р а з д е л я ю щ и й б у ф е рн ый раствор для основных и а р о м атических аминокислот м о -л я р н о й концентра ц пей 0,3 моль/дм3. 24,6 г лимонной кислоты, 14 г NaOH и 6,5 см3 концентрированной НО растворяют в 1 дм3 Н2О (pH 5,23).
Р а з д’е л я ю щ и й б у ф е р н ы й раствор для обнаружения триптофана молярной концентрацией 1,5 моль/дм3. 7,0 г лимонной кислоты, 4,0 г NaOH. 81,9 NaCl, 100 см3 метилцеллозольва растворяют в воде и доводят объем до 1 дм3 (pH 6,0).
К а д м и й-н и н г и д р и н о в ы й проявитель. Раствор А; 1 г перекристаллизованного нингидрина растворяют в смеси ацетона (100 см3) и ледяной уксусной кислоты СН.СООН (10 см3).
Раствор В: 1 г ацетата кадмия растворяют в 100 см3 раствора сн.соон массовой долей 50 %.
Йеред проявлением смешивают 100 см3 раствора А и 20 см3 раствора В.
Методические указания. При хроматографии аминокислот в тонком слое в качестве ионообменника обычно используют сильнокислый сульфополистирольный катионит «Дауэкс 50 х 8» или близкие к нему типы смол в №+-форме. Подготовленную к работе смолу наносят тонким слоем на инертную подложку (тонкослойный вариант), а затем на поверхность слоя ионообменника на пластинке наносят анализируемую смесь аминокислот в буферном растворе с низкой ионной силой и pH не выше 3,0, при котором все протеиногенные аминокислоты заряжены положительно. При нанесении аминокислот в форме катионов они связываются с сулъфополистиролом, замещая часть ионов натрия. Прочность удержания аминокислот на ионообменике зависит от их основности: наиболее прочно связываются лизин, гистидин, аргинин, наименее прочно — аспарагиновая и глутаминовая кислоты. После нанесения смеси пропускают элюирующий буферный раствор через тонкий слой смолы. Для элюирования используют цитратный буфер с более высокой ионной силой и pH выше 3,0. В этих условиях происходят постепенная нейтрализация положительного
124
заряда и ослаолснис ионных взаимолсисгвии: кроме того. \вели ченпс концентрации попов натрия в элюир\тотем растворе гакжс приволпт к вытеснению катионов аминокислот из связей с ионо-обменником. Таким образом, в процессе ионообменной хроматографии аминокислоты сразу же разделяются на три большие группы: наиболее быстро через слои смолы движутся кислые аминокислоты. затем нейтральные и наиболее медленно — основные По мере протекания через ионообменник элюирующего раствора происходит постепенное разделение нейтральных аминокислот-, поскольку на прочность взаимодействия с катионитом оказывают влияние не только ионные, но и гидрофобные взаимодействия. Полистирольная (гидрофобная) матрица ионообменника достаточно избирательно взаимодействует с радикалами нейтральных аминокислот, поэтому все они, несмотря на близость величин заряда их молекул, разделяются в процессе хроматографии. Из всех нейтральных аминокислот наиболее прочно сорбируются на матрице те, которые содержат бензольные кольца, т. е. тирозин и фенилаланин. По окончании процесса хроматографии аминокислоты выявляют с помощью нингидринового проявителя.
Для тонкослойной ионообменной хроматографии аминокислот используют пластинки «Фиксион 50x8» (Венгрия), в которых слой катионита «Дауэкс 50x8» толщиной 0.25 мм закреплен на пластмассовой подложке. Хроматография на пластинках «Фиксион 50x8» позволяет сочетать принцип ионного обмена с преимуществами тонкослойного варианта и отличается высокой чувствительностью, быстротой разделения и простотой процедуры. Она незаменима при сравнительных анализах следовании свободных аминокислот, изучении первичной . структуры пептидов.
Пластинки проявляют в а темноте при комнатной темпе- W ратуре или в термостатах при 105 °C в течение 10 мин.
На пластинках «Фиксион 50 х 8» при однократном пропускании растворителя может быть разделено 14—16 амино-кислот, входящих в состав бел-ка (рис. 1.34, а). В случае недо- 9 статочно хорошего разделения
белковых гидролизатов, ис-
Асп
Тре+сер
Тли
Цис Гли Ала
(Про)
Вал

4
♦

Рис.1.34. Разделение стандартной смеси аминокислот на пластинках «Фиксион 50x8»: а — одномерное; б — димерное
Мет
Иле Лей
Тир Фен
Гис Лиз Арг
б
а
125
смеси аминокисло! одномерным способом прибегают к димерной хроматографии, пропуская тот же иди другой растворитель в направлении, перпендикулярном предыдущему. На практике поступают следующим образом. В две точки стартовой линии хроматограммы помешают исследуемый раствор. После одно
кратного пропускания растворителя пластинку сушат, отрезают от нее часть, соответствующую крайней стартовой точке хроматограммы, и проявляют нингидрином. В случае плохого разделения оставшуюся большую часть пластинки поворачивают на 90° и снова помещают в тот же самый или другой растворитель. Проводят повторное хроматографирование во втором направлении. После высушивания пластинку также проявляют нингидрином (рис. 1.34, б).
Для оценки количественного содержания аминокислот в исследуемом образце белка наряду с гидролизатом в отдельные точ-
ки хроматограммы наносят растворы аминокислот — «свидетелей». Стандартные растворы аминокислот наносят в несколько (4—6) точек хроматограммы из расчета 0,01—0.06 мкмоль в пятно, триптофан — до 0,1 мкмоль.
pH образца должен быть ниже 3,0 (обычно его доводят до 2,0). Часто образец наносят на пластинку в натрий-цитратном или фосфатно-цитратном буфере pH 2,2. Для этого гидролизат или экстракт белка (= 1 мг) растворяют в 1 см3 смеси, состоящей из двух частей этанола 96 об.% и 1 части фосфатно-цитратного буфера (pH 2,2).
Подготовка проб. Пробы мяса и мясопродуктов готовят в соответствии с рекомендациями по подготовке проб, описанными в лабораторной работе № 15.
Для обнаружения триптофана предварительно проводят щелочной гидролиз белка. Гидролизат разбавляют водой и подкисляют концентрированной НС1 до pH 5,0.
Порядок проведения анализа. Ионообменную смолу пластинок перед употреблением уравновешивают соответствующим буфером. Для этого пластинку накладывают обратной стороной на стекло того же размера. На верхний край пластинки с помощью
стеклянных палочек (или резинового кольца) прикрепляют 4 слоя фильтровальной бумаги, сложенной так, чтобы короткая часть (1,5—2 см) прикрывала слой смолы, а длинная была загнута на обратную сторону, т. е. к стеклу (рис. 1.35). Пластинку
Рис. 1.35. Уравновешивание пластинки «Фиксион 50 х 8» буферным раствором:
/ — пластинка; 2—стекло; 3 — фильтровальная бумага; 4 — стеклянная палочка (или резиновое кольцо)
126
вместе со стеклом пометают в камеру для восходящей хроматографии так. чтобы нижний край пластинки был погружен в буферный раствор на 1 — 1.5 см. Пластинка должна быть расположена в камере под углом к поверхности буфера.
Уравновешивание пластинок проводят в закрытой камере при комнатной температуре в течение 15—18 ч буферным раствором pH 3,28 молярной концентрацией 0,02 моль/дм3 следующего состава:
Лимонная кис.юта	1.4 г
NaOH	0.8 г
НС1 (37%-ная)	1.2 см3
Вода	До 1 дм’
Все буферные растворы следует готовить на деионизированной воде.
По окончании уравновешивания пластинки вынимают из камеры, снимают фильтровальную бумагу и сушат их на воздухе. Пластинки можно хранить неограниченно долгое время.
Для разделения аминокислот исследуемый образец наносят на пластинку капилляром (следует избегать повреждения слоя смолы) на стартовую линию, расположенную в 2—3 см от нижнего края в виде пятна или полосы. В случае необходимости на пластинку наряду с опытной пробой наносят стандартные растворы аминокислот в том же буфере в количестве 0,01 — 0,03 мкмоль каждой аминокислоты на пятно. Пластинку с нанесенным образцом помещают в хроматографическую камеру, на дно которой слоем 1 см наливают буферный натрий-цитратный раствор (pH 3,28).
Разделение аминокислот проводят в закрытой камере, насыщенной парами растворителя, восходящим способом при температуре 50 °C. После окончания хроматографии (60—90 мин) растворитель должен подняться по пластинке примерно на 18 см. Пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе и проявляют раствором нингидрина. Для проявления пластинку осторожно опрыскивают из пульверизатора раствором нингидрина в ацетоне массовой долей 0,1 %. Для получения стойкой окраски хроматограмму можно проявлять нингидриновым реактивом, содержащим кадмий.
Идентификацию аминокислот в исследуемых образцах проводят, руководствуясь порядком расположения на хроматограмме стандартных аминокислот. Порядок расположения аминокислот при одномерной хроматографии на пластинках «Фиксион 50 х 8» в направлении от старта к фронту: аргинин, лизин, гистидин, фенилаланин, тирозин, лейцин, изолейцин, метионин, валин, пролин (пятно желтого цвета), аланин, глицин, цистеин, глутаминовая кислота, треонин + серин, аспарагиновая кислота.
127
\рОМ<1 Н Н рЯММЫ ШрИСОВЫ BJ1O Г. О1МСЧЛЯ расположение ВСС\ !•; > 4 В В.'! 3 И I! Ы X ЛМИНОКИСЛО Г. И Bl f >\ал в н о с ра В Н 11 ва К) I 1ПЛро.!П!а : ь; pa зличных образцов мяса и мясопродуктов по содержанию аминокисло г.
Для количественного определения аминокислот после проявления нингидрином полосу .хроматограммы, cootbciствуюшую каждой из аминокислот (is кислой среде растворителей лучше других разделяются пятна лизина, аргинина и валина), вырезают и сканируют на денситометре при 510 нм. Результаты сканирования оценивают либо по площадям полученных пиков, которые рассчитывают путем умножения высоты пика на его ширину на уровне половины высоты, либо по массам пиков. Для этого пики переводят на кальку. Пики на кальке вырезают и взвешивают. Для определения количества аминокислот строят калибровочный график зависимости площади пика (или его массы) от содержания аминокислоты (мкмоль) для стандартных растворов аминокислот.
Построение калибровочного графика. Для построения калибровочного графика используют стандартный раствор аминокислот, который готовят в соответствии с рекомендациями, приведенными выше (см. лабораторную работу № 15).
Результаты экспериментов и расчетов сводят в таблицу. Самостоятельно формулируют выводы и заключение по работе.
Наименование и характеристика образца
Перечень идентифицирован н ых а м и и о кислот
Сол е р жа н и е а м и н о к и ел оты
в образце, мг/г
Лабораторная работа № 18
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКСТРАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Цель работы. Освоить различные методы количественного определения некоторых специфических азотсодержащих экстрактивных веществ мышечной ткани убойных животных (гистидин-содержаших дипептидов — карнозина и ансерина).
Задачи. Получить безбелковый экстракт пептидов из мышечной ткани и определить количество гистидинсодержащих дипептидов на основе фотометрических и хроматографических методов.
Объекты исследования. Образцы мышечной ткани различных видов сельскохозяйственных животных и птицы.
Методические указания. Карнозин и ансерин хорошо растворимы в воде, осаждаются этанолом, обладают буферным действием, в растворе дают щелочную реакцию, оптически активны. Карнозин дает цветную реакцию с диазореактивом.
Гистидинсодержащие дипептиды определяют в безбелковом мышечном экстракте по цветной реакции с нингидрином после
128
разделения их методом хроматографии на бумаге иди ионообменной хроматографии. Карнозин, кроме юго. может быть определен непосредственно в безбелковом мышечном экстракте или на бумажной хроматограмме по цветной реакции Паули с диазотированной сульфаниловой кислотой. Часто колориметрическому определению дипептидов предшествует выделение их из безбелково-го мышечного экстракта в виде ртутного осадка.
Метод характеризуется более высокой чувствительностью по сравнению с хроматографией на бумаге и может быть использован также для микроопределения дипептидов после их модификации с помощью флуоресцентной метки — 7-хлор-4-нитро-2-окси-1,3-ди-азолия (НБД-хлорида). НБД-хлорид ковалентно связывается с аминогруппами аминокислот и пептидов и образует производное желтого цвета. Реакция протекает по следующей схеме:
Все вышеперечисленные методы применяются для анализа экстрактивных веществ и могут быть использованы самостоятельно или в сочетании в зависимости от цели и технического оснащения лаборатории.
1.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРНОЗИНА В БЕЗБЕЛКОВОМ ЭКСТРАКТЕ ПО ДИАЗОРЕАКЦИИ
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор сульфаниловой кислоты; свежеприготовленный раствор NaNO2 массовой долей 5 %; раствор диазотированной сульфаниловой кислоты; карбонат натрия безводный и его раствор массовой долей 10 %; карнозин — стандартный раствор 0,5 мг/см3; пипетки; пробирки; стеклянные стаканы.
Приготовление реактивов. Раствор сульфаниловой кислоты. 0,9г сульфаниловой кислоты растворяют в 9см3 концентрированной НС1 и доводят объем дистиллированной водой до 100 см3.
Раствор диазотированной сульфаниловой кислоты. В мерную колбу вместимостью 100 см3, стоящую во льду, помещают 6 см3 раствора сульфаниловой кислоты, приливают 6 см3 свежеприготовленного раствора NaNO2 массовой до-
129
леи 5 ч. перемешиваю! и оставляют на 5 мин. Прибавляю! при перемешивании еще 24 см ’ раствора \a.\O массовой долей 5 с< и через 5 мин доводят объем водой до 100 см'. Каждый раз !огов>н свежий раствор (на льду хранится в шчение 5—6 ч).
Подготовка проб. При определении пептидов но диазореакиии предварительно готовя т безбелковые экстракты.
Экстракты мышечной ткани освобождают оз белков хлорной кислотой или этанолом. Во втором случае безбелковый мышечный экстракт не содержит солей.
При осаждении хлорной кислотой навеску мышечной ткани массой 3—5 г освобождают от жира, соединительной ткани и измельчают ножницами на холоде. К кашице добавляют 5 объемов охлажденного раствора НС1О4 молярной концентрацией 0.5 моль/дм3, гомогенизируют и тщательно растирают в ступке. Суспензию центрифугируют it течение 20 мин, надосадочную жидкость собирают, осадок вновь суспензируют в 1 — 1,5 объема хлорной кислоты. Промывные воды соединяют с центрифу-гатом. Хлорную кислоту удаляют в виде перхлората калия. Полученный центрифугат упаривают на роторном испарителе при температуре 40—45 °C.
При осаждении белков этанолом навеску мышечной ткани массой 2—3 г, измельченную ножницами на холоде, переносят в гомогенизатор с 5 объемами охлажденного этанола 96 об.%; гомогенат сливают зз центрифужный стакан, оставляют при комнатной температуре на 20 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 3000 с -1. Надосадочную жидкость сливают в колбу с узким горлом (при обработке 2—3 г мышц объем колбы 200 см3, при получении экстракта из большой навески можно пользоваться делительной воронкой), осадок трижды промывают 15 см3 раствора этанола 80 об.%, сливая центрифугат в колбу. К спиртовому экстракту приливают хлороформ (так, чтобы верхняя граница жидкости была в узкой части колбы), встряхивают в течение 15 мин и оставляют для отстаивания. Когда четко обозначится граница между водным и спиртохлороформным слоями, водный слой отсасывают шприцем, а в колбу доливают воду (до прежнего уровня), встряхивают и оставляют для расслаивания. Водный слой отсасывают и присоединяют к первому. Эту операцию повторяют еще два раза. Объединенный водный раствор упаривают на роторном испарителе.
Порядок проведения анализа. Безбелковый экстракт после упаривания на роторном испарителе растворяют в 1—2 см3 воды. Отбирают различные объемы этого раствора, доводят водой до 2 см3, приливают 3 см3 диазореактива, тщательно перемешивают и оставляют на 5 мин. Затем добавляют 3 см3 раствора карбоната натрия массовой долей 10 %, перемешивают и через 10 мин колориметрируют при длине волны 490 нм. Следует убедиться в том, что интенсивность образующейся окраски пропорциональна количеству исследуемого раствора, взятого для определения.
130
Г одержанне карноита в обьск но, июле, н >в?.цця ia j ра ж a 101 в микромолях п ш \iii । шграмм-процсн га\ на ! г 'i канн и опрсдсля-юге помощью калибровочною i рафика.
Построение калибровочного графика. Ioiobmi оанааршыи раствор. содержащий or U.05 до 0.5 мкмоль карношна toi 10 до 100 мк1) в пробе. Производят окрашивание но описанию соогвет-ствующею меюда и снимаю! показания эксiинкиии. Cipoai i рафик функции I) - /(с). 1 де с - копией 1 рання карнозина.
2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИПЕПТИДОВ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
НА БУМАГЕ
Материалы, реактивы и оборудование. Фенол перегнанный. водонасыщенный; кислота соляная концентрированная; ацетон: раствор нингидрина в ацетоне массовой долей 0,5 %; хроматографическая бумага: стандартные расгворы карнозина и ансерина молярной концентрацией 0.01 моль/дм3; смесь для элюирования (раствор NaHCO, молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 смешивают с этанолом в соотношении 1:1); диазотированная сульфаниловая кислота; растворы Na2CO. массовыми долями 20 и 1 %; стеклянные пипетки; воронки;" стаканы; пробирки; хроматографические камеры.
Подготовка проб. При определении карнозина и ансерина методом хроматографии навеску мышечной ткани массой 3—5 г обрабатывают точно так же, как это описано для определения сво бодных аминокислот (см. лабораторную работу № 15).
При исследовании карнозина непосредственно в безбелковом экстракте ткани или в случае осаждения дипептидов в виде ртутных солей этот метод несколько изменяют; водный экстракт после стадии осаждения упаривают не досуха, а до объема 1—2 см3.
Порядок проведения анализа. Дипептиды и составляющие их аминокислоты хорошо разделяются методом бумажной хроматографии в водонасыщенном феноле или системе д-бутанол — пропанол — раствор аммиака массовой долей 20 % в соотношении 2 ; 2 ; 1. Хроматограмму обрабатывают раствором нингидрина или диазотированной сульфаниловой кислотой (для выявления карнозина и гистидина).
На дно хроматографической камеры помещают кристаллизатор или чашку Петри с водонасыщенным раствором фенола. Туда же ставят стаканчик со смесью концентрированной НО и воды в соотношении 3:1, камеру закрывают и оставляют для насыщения парами растворителя.
Для проведения хроматографического разделения на листе хроматографической бумаги нужного размера на расстоянии 4 см от нижнего края проводят стартовую линию, на которую наносят исследуемый раствор, содержащий дипептиды. Безбелко-
131
вый экстрак! ткани после упаривания на роторном испарите ле чате всею растворяю! в смеси НСООН — СН.СООН — НХ) в соотношении 7:5: 13 пли в растворе изопропанола массовой долей 10 С/с. чтобы 1 с.м? раствора соответствовал 1.5—2 г ткани, после чего нанося! на хроматограмму небольшими порциями (0.01—0.03 см3). подсушивая бумагу теплым воздухом. На эту же хроматограмму наносят стандартные растворы карнозина и ансерина, содержащие по 0.03—0.05 мкмоль в пятне. Бумагу сшивают в виде цилиндра (следят, чтобы края не соприкасались) и помещают в хроматографическую камеру в строго вертикальном положении. Когда фронт растворителя дойдет до верхнего края бумаги, хроматограмму вынимают и высушивают под тягой в течение 2—3 сут. Следы фенола на хроматограмме удаляют горячим ацетоном. Для этого сухую хроматограмму сворачивают трубочкой, перевязывают ниткой, помещают в цилиндр, заливают ацетоном при температуре кипения и оставляют на 10—15 мин; промывание повторяют 2—3 раза, а затем высушивают под тягой.
К 9 см3 раствора нингидрина в ацетоне массовой долей 0,5 % прибавляют 1 см^ воды. Раствор наливают в ванночку и равномерно пропитывают им хроматограмму. Затем ее сушат под тягой и помещают в термостат при 110—120 °C на 5—10 мин. При этом пятна карнозина и ансерина приобретают серо-голубую окраску.
Количественное определение дипептидов можно проводить либо путем сопоставления интенсивности и размера проявленных пятен опытной пробы с пятнами стандартных растворов (в случае их несоответствия определение повторяют, изменяя соответственно количество взятых растворов), либо путем элюирования окрашенных пятен с последующим фотометрическим определением окраски элюатов аналогично количественному определению аминокислот. В этом случае окрашенные пятна элюируют в темноте в течение 2—3 ч смесью раствора NaHCO3 молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 и этанола в соотношении 1 : 1, а затем колориметрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 582 нм.
При проявлении на хроматограмме карнозина диазореактивом хроматограмму обрабатывают из пульверизатора диазотированной сульфаниловой кислотой, для чего слегка влажную хроматограмму опрыскивают раствором Na2CO3 массовой долей 20 %. Пятна карнозина приобретают интенсивную оранжевую окраску, окрашенные пятна элюируют раствором карбоната натрия массовой долей 1 %, колориметрируют при длине волны 500 нм. Пользуясь калибровочными графиками, рассчитывают содержание дипептидов в исследуемой пробе.
132
3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИПЕПТИДОВ С ПОМОЩЬЮ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ НА ПЛАСТИНКАХ «СИЛУФОЛ»
Материалы, реактивы и оборудование. Пластинки «Силу-фол»: изопропанол: концентрированный NH4OH: спиртовой раствор НБД-хлорида массовой долей 0,8 %: насыщенный раствор CH3COONa в этаноле: хроматографические камеры: раствор нингидрина массовой долей 1 %: спектрофотометр.
Подготовка проб. Подготовка колонки для бумажной хроматографии и пластинок «Силуфол» — см. лабораторные работы № 16, 17.
Порядок проведения анализа. Безбелковый экстракт ткани в количестве 5—10 мкл наносят на пластинки «Силуфол» на расстоянии 1,5—2 см от краев и 1,5 см между пятнами, а также наносят стандартные растворы дипептидов (5—10 нмоль/дм3). Проводят восходящую хроматографию в системе изопропанол — аммиак — вода (7:2: 1). Камеру предварительно насыщают парами растворителя. Пластинки сушат под тягой. Пятна дипептидов выявляют, опрыскивая пластинку раствором нингидрина. Затем пластинки сушат в струе теплого воздуха и выдерживают при 70 °C в течение 10 мин. Пятна аминокислот проявляются при комнатной температуре, пятна дипептидов — при нагревании. Окраску сканируют.
Для получения НБД-производных дипептидов к 0,23 см3 спиртового экстракта ткани добавляют 0,05 см3 смеси НБД-хлорида и насыщенного раствора CH3COONa в соотношении 4:1. Пробу инкубируют в течение 20 мин при 75 °C, охлаждают и наносят аликвоты (4—10 мкл) на пластинку «Силуфол». Хроматографию проводят в системе изопропанол — вода (7 : 2). Сканируют при длине волны 470 нм, сравнивая показания с растворами с известным содержанием пептидов.
Содержание специфических дипептидов (карнозина, ансерина) в мышечной ткани выражают в микромолях и (или) в милли-грамм-процентах на влажную массу ткани.
Полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы.
Наименование и харак-________________Содержание дипептидов в образце
теристика образца	мкмоль/дм’	мг?
После обобщения экспериментальных данных самостоятельно делают выводы и заключение по работе.
133
Лабораторная работа № 19
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНЫХ ЛИПИДОВ В ЖИВОТНЫХ ТКАНЯХ
Цель работы. Освоить методы количественно!о определения суммарных липидов в животных тканях.
Задачи. Провести экстракцию липидной фракции в аппарате Сокслета и определить массовую долю суммарных липидов гравиметрически и (или) колориметрически.
Объекты исследования. Мясо различных видов убойных животных аналогичных анатомических участков или одного животного от разных отрубов мясной туши, субпродукты I и II категорий, яичный желток, жировые ткани.
Материалы, реактивы и оборудование. Петролейный или диэтиловый эфир: смесь хлороформа, метанола и воды (2:1: 8); безводный бензол; хлороформ; концентрированная серная кислота; прокаленный песок; фильтровальная бумага; водяная баня; термометр; часовое стекло; аппарат Сокслета; сушильный шкаф; бюксы; пленочный испаритель, колбы; аналитические весы; магнитная мешалка; центрифуга лабораторная; фосфованилиновый реактив.
Приготовление реактивов. Фосфованилиновый реактив. 400 мг ванилина, перекристаллизованного из хлороформа или этанола, растворяют в 40 см3 воды и доводят объем до 200 см3 раствором Н3РО4 массовой долей 85 %. Получают раствор ванилина молярной концентрацией 0,013 моль/дм3 в растворе фосфорной кислоты молярной концентрацией 11,8 моль/дм3. Реактив можно длительно хранить в темной склянке при комнатной температуре.
Методические указания. Большинство липидов легко окисляются вследствие наличия в их структуре двойных связей, поэтому для их экстракции следует применять более чистые органические растворители, не содержащие следов окислителей. Склянки с растворителями хранят в металлических шкафах, вдали от нагревательных приборов, в темноте.
Для экстракции и хранения растворов липидов используют посуду из темного стекла. Колбы, делительные воронки и другую посуду при работе с липидами закрывают только пришлифованными стеклянными пробками.
Для экстракции липидов применяют смесь из двух-трех растворителей. Суммарные липиды извлекают чаще всего смесью хлороформа и метанола в объемных соотношениях 2 : 1, 1 : 1 и 1 : 2 или этанола и диэтилового эфира 3:1, 1:1. Наиболее распространенным способом является метод Фолча — экстракция смесью хлороформа и метанола (2: 1), позволяющий извлекать 90—95 % всех клеточных липидов. Преимуществом метода Фолча является то, что используемая смесь растворителей не проявляет селективности по отношению к тем или иным группам липидов.
134
Рис. 1.36. Аппарат Сокслета:
/ — приемная кояба: 2— ipyoKa лая 110с 1 \ иления паров рас i вори ic.ia in колбы в экс:р;1кюр. о - .хололилвник. 4 — аксчрактор: 5 -- сифоппа;! трубка. 6—б\ма/кпая гичьы с навеской исслел\емого материала
Для определения массовой доли суммарных липидов предварительно обезвоженный образец ткани экстрагируют петролейным эфиром, диэтиловым эфиром или смесью эфира и этанола. Полное извлечение липидов из тканей достигается путем многократной экстракции летучим растворителем в аппарате Сокслета (рис. 1.36). Все части аппарата плотно соединяют между собой при помощи шлифов. Пары эфира из экстракционной колбы при нагревании поднимаются по трубке экстрактора и попадают в холодильник. Здесь они охлаждаются, сгущаются и каплями стекают в экстрактор, где в бумажной гильзе находится исследуемый материал. Гильза постепенно наполняется эфиром, который экстрагирует жир из ткани. Когда уровень эфира поднимется выше верхнего колена сифонной трубки, эфир вмес-
те с растворенным в нем жиром стечет в нижнюю часть аппарата — экстракционную колбочку. Жир остается в колбочке, а пары эфира вновь поднимаются и экстрагируют новую порцию жира. Исследуемое вещество, подвергаясь многократной повторной экстракции, полностью обезжиривается. Жир перемещается в колбочку.
Массовую долю экстрагированных липидов определяют гравиметрически или колориметрически.
1.	ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД В АППАРАТЕ СОКСЛЕТА
Подготовка проб. Образец мяса тщательно измельчают ножом на часовом стекле, взвешивают навеску массой (3,0000 ± 0,0002) г и помещают в тарированный бюкс с прокаленным до постоянной массы песком.
Стеклянной палочкой перетирают мясо с песком и высушивают в сушильном шкафу при 100—105 °C до постоянной массы. Вычисляют массовую долю влаги в исследуемом образце. Сухой остаток используют для определения суммарных липидов.
Порядок проведения анализа. Сухую пробу количественно переносят в предварительно взвешенную гильзу из фильтровальной бумаги, гильзу повторно взвешивают и помещают в экстрактор аппарата Сокслета.
В экстракционную колбу аппарата наливают эфир и соединяют все части прибора. Прибор помещают на водяную баню. Холо-
135
лильник соединяют с водопроводным краном, включают волу и нагревают баню до 45—50 °C. Ориентировочная продолжительность экстра! ирования 4—6 ч. Конец экстрагирования определяют. поднося к экстрактору часовое стекло, куда стекает немного эфира. Экстрагирование считается законченным, если после испарения эфира на стекле не остается налета жира.
По окончании экстрагирования гильзу вынимают из экстрактора, высушивают до постоянной массы и вычисляют массовую долю липидов в исходной навеске по формуле
Л, = 100(/ш - т4)/(т} - /д0),	(1.25)
где т. — масса гильзы с навеской до обезжиривания, г; т4 — масса гильзы с навеской после обезжиривания, г; — масса бюкса с песком и навеской до высушивания. г: /»0 — масса бюкса с песком, г.
• Массовую долю липидов (% к массе абсолютно сухого вещества) определяют по формуле
Х2 = 1ОО(л7?3 - т4)/(т3 — т5),	(1-26)
где т5 — масса гильзы, г.
2.	ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД В ПЛЕНОЧНОМ ИСПАРИТЕЛЕ
Подготовка проб. Навеску массой 100 г очищенной от жира и пленок сердечной мышцы или печени измельчают при температуре 2—4 °C и гомогенизируют в органическом растворителе с частотой вращения 116,6—133,3 с-1 при комнатной температуре 1—2 мин. Гомогенат переносят в колбу с притертой пробкой и заливают тремя объемами смеси хлороформ — метанол в соотношении 2:1. Экстракцию липидов проводят при комнатной температуре при постоянном перемешивании с помощью механической или магнитной мешалки в течение 30 мин.
Суспензию центрифугируют с частотой вращения 33,3 м~’ в течение 15—20 мин, органическую фазу отделяют, а остаток переносят в прежнюю колбу и повторяют экстракцию еще 2 раза в тех же условиях. Объединенные экстракты упаривают в вакууме, остаток липидов растворяют в 5—10 см3 смеси хлороформ — метанол — вода (6:3: 0,45).
Для удаления нелипидных примесей используют сефадекс G-25, который предварительно освобождают от мелких частиц и высушивают, суспендируют в трех объемах смеси хлороформ — метанол — вода (6:3: 0,45) и оставляют набухать в течение 10—12 ч. Набухшим сефадексом заполняют колонку размером 2x15 см, на дно которой предварительно помещают промытую 136
стекловату. После заполнения на поверхность сефадекса также кладут стекловату и готовую колонку промывают одним объемом смеси. Для очистки на колонку наносят экстракт липидов (20-30 %) и элюируют их 1,5—2 объемами той же смеси. В элюате содержатся практически все липиды, нелипидные примеси остаются на колонке и могут быть смыты с нее смесью хлороформ — метанол (I : 1).
Очищенный от нелипидных примесей экстракт переносят в колбу пленочного испарителя, растворитель отгоняют, к остатку добавляют 10 см3 безводного бензола, тщательно перемешивают и отгоняют бензол. Липиды, освобожденные от следов воды, растворяют в небольшом объеме свежеперегнанного бензола, переносят в пробирку с притертой пробкой и хранят в темноте на холоде.
Порядок проведения анализа. Круглодонную колбу для пленочного испарителя доводят до постоянной массы, помещают в нее отмеренный объем липидного экстракта, содержащий 10—20 мг липидов, и растворитель упаривают в токе азота или в пленочном испарителе. Колбу с осадком липидов доводят до постоянной массы в вакуум-эксикаторе над КОН. Сухую массу липидов рассчитывают по разности постоянной массы колбы с осадком и пустой колбы. Взвешивание проводят на аналитических весах.
3.	КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Подготовка проб. К одному яичному желтку добавляют 50 см3 смеси хлороформа, метанола и воды (2:1: 0,8) и экстрагируют при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки в течение 30 мин. Центрифугируют 20 мин с частотой вращения 33,3 с-1 и отделяют органическую фазу, содержащую липиды. Остаток заливают новой порцией растворителя и операцию повторяют еще несколько раз. Липидные фракции объединяют.
Для освобождения от нелипидных примесей экстракт переносят в делительную воронку, добавляют 20 % воды от его объема, перемешивают и после разделения водной и органической фаз последнюю переносят в колбу пленочного испарителя и отгоняют растворитель в вакууме. Для высушивания к остатку добавляют 5—7 см3 безводного бензола, перемешивают и отгоняют бензол, процедуру повторяют несколько раз. Осадок липидов растворяют в точном объеме (5—10 см3) свежеперегнанного хлороформа, переносят в пробирку с притертой пробкой и хранят в темноте на холоде.
Порядок проведения анализа. В пробирку с пришлифованной пробкой помещают 50 нм3 липидного экстракта (для контроля в пробирку берут 50 нм3 хлороформа) и испаряют на водяной бане. Добавляют 0,2 см3 концентрированной H2SO4 и нагревают на во-
137
ляной оане при icMiicpaiypc кипения в течение 10 мин. Пробирки охлаждают, добавляют в них но 2.5 см-’ фосфованилинового реактива, перемешивают и выдерживают при 37 °C в течение 15 мин: колориметрируют против контроля при длине волны 540 нм. Содержание липидов рассчитывают по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. В качестве стандартного используют раствор высокоочишенного абрикосового или оливкового масла в хлороформе. Берут аликвотное количество стандартного раствора и готовят разведение в соответствии с чувствительностью метода от 10 до 120 мкг. Затем проводят качественную реакцию согласно описанию метода и колориметрируют при длине волны 540 нм против контроля. После снятия показаний оптической плотности для всех концентраций строят график D = f[c), где с — концентрация липидов.
Студенты выполняют расчеты в соответствии с экспериментальными данными. Результаты оформляют в виде таблицы.
Наименование и источник образце!	Массовая доля суммарных липидов	
	% к массе образца	% к массе абсолютно сухого вещества
		
Экспериментальные данные сравнивают с литературными и полученными разными методами, самостоятельно делают выводы и формулируют заключение.
Лабораторная работа № 20
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА ЖИРОВ
Цель работы. Установить состав и массовую долю фракций животных жиров на основе их способности к кристаллизации и
плавлению.
Задачи. Выделить низко-, средне- и высокотемпературные фракции пищевых топленых жиров разных видов и сортов; определить температуры плавления фракций жира и рассчитать их
массовые доли.
Объекты исследования. Пищевые животные жиры разных видов и сортов.
Материалы, реактивы и оборудование. Капилляр, открытый с двух концов' термометр; штатив с кольцом; стакан вместимостью 500 см , мешалка; вакуум-насос; колба Бунзена; термостат; весы аналитические; прибор для определения температуры плавления.
138
Методические указания. Ирл мг.неипо'ч их-Ш/Ьчении жиры способны крис галлизова 1 ься. -Ую свойство лсжт. например, в основе получения маргарина. Tpniпиперины жирных кисло! в расплавленном состоянии нс имеют nisei а. вкуса и запаха. На способности различных жировых фракции плави i вся. кристаллизоваться при определенной температуре основан .метод их разделения.
Пониженная усвояемость и высокая температура плавления ограничиваю! применение говяжьего и бараньего жиров в качестве пищевых продуктов. Значительная часть них жиров используется на технические пели. Повышения потребительских свойств говяжьего и бараньего жиров можно достигнуть за счет разделения их на фракции, содержащие различные по температуре плавления триглицериды.
Переход в капельно-жидкое состояние совершается не мгновенно, а в пределах некоторого интервала температур, в котором плавятся отдельные компоненты смеси. У насыщенных жирных кислот температура плавления возрастает с увеличением молекулярной массы. У ненасыщенных жирных кислот на температуру плавления влияют не столько двойные связи, сколько их положение в цепи и пространственное расположение отдельных частей молекулы. Определенное влияние на изменение температуры плавления оказывает полиморфизм.
Методы определения температуры плавления заключаются в постепенном нагревании твердого жира до момента расплавления, который характеризуется по прозрачности, подвижности, освет-ленности и т. п. На практике температура плавления устанавливается по температуре, при которой жир становится подвижным.
Существует два метода определения температуры плавления: по сползанию капли жира в капилляре с расширением и по поднятию жира в открытом капилляре.
При разделении жировых фракций на основе кристаллизации используют различные подходы.
Классический метод проведения процесса фракционирования животных жиров заключается в медленном охлаждении расплавленного жира, в результате чего из говяжьего и бараньего жиров получают легкоплавкую фракцию — олео-маргарин или олео-ойл, из свиного — лярд-ойл, а также твердую фракцию — олео-стеарин.
Олео-маргарин имеет цвет от светло-желтого до желтого, приятный вкус, напоминающий сливочное масло, его можно использовать в домашних условиях, для производства высококачественной маргариновой продукции, в хлебопечении. Костный жир, полученный из цевок крупного рогатого скота, фракционируют с целью выделения легкоплавкой фракции для производства смазочных масел, не замерзающих при низкой температуре.
Обнаружение и расчет массы фракций весьма полезны при оценке биологической ценности жиров.
139
Подготовка проб. Образцы пищевых гонленых жиров мае сой по 35—40 г помещают в предварительно высушенные и взвешенные пробирки и нагревают в камере ультратермостата UTU-2. защищенной от естественного света, до температуры 65—70 °C. Первую стадию кристаллизации проводят при температуре 40—45 °C в течение 24 ч для наиболее полного разделения твердой и жидкой фракций. Для обеспечения равномерной кристаллизации содержимое пробирок рекомендуется периодически плавно перемешивать.
1. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ПИЩЕВЫХ ТОПЛЕНЫХ ЖИРОВ КРИСТАЛЛИЗАЦИЕЙ
Порядок проведения анализа. Оставшуюся жидкой при температуре 40—45 °C жировую фракцию отфильтровывают вакуум-насосом в колбу Бунзена, помещают в высушенную и взвешенную пробирку и термостатируют далее, снизив температуру в термостате на Ю °C.
Операции по разделению фракций жира повторяют, ступенчато проводя снижение температуры до 20—22 °C. Продолжительность каждой стадии кристаллизации 30—40 мин.
Выход каждой фракции жира определяют гравиметрически.
Массовый выход фракций жира (%) определяют по формуле
М ~~ |(ш2 — /?73)/ш1]1ОО,	(1-27)
где т2 — масса пробирки с соответствующей фракцией жира, г; /и, — масса пустой пробирки, г; т} — масса исходной пробы жира, взятой на фракционирование, г; 100 — коэффициент для перевода в проценты.
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ПЛАВЛЕНИЯ ФРАКЦИЙ
Порядок проведения анализа. Пробу исследуемой фракции жира, полученной по п. 1, нагревают в пробирке на водяной бане до полного расплавления. Чистую сухую, открытую с двух концов капиллярную трубочку из тонкого стекла с внутренним диаметром 1,0—1,2 мм (длина капилляра 50—60 мм) погружают одним концом в расплавленный жир так, чтобы высота его в капилляре была равна 10 мм. Затем капилляр с жиром выдерживают на льду в течение 10 мин.
После этого капилляр прикрепляют к термометру с ценой деления шкалы 0,1 °C тонким резиновым кольцом так, чтобы столбик жира находился на одном уровне с ртутным шариком термометра. Термометр с капилляром опускают в стакан с дистиллированной водой на глубину 3—4 см. Начальная температура воды в стакане должна быть 15—18 °C. Следят, чтобы в незаполненный конец ка-
140
Рис. 1.37. У становка для определения температуры плавления в открытом с двух концов капилляре.
1 -- механическая или магнитная мешалка: 2 — термометр: л — капилляр
пилляра не попала вода. При непрерывном перемешивании магнитной мешалкой воду в стакане нагревают сначала со скоростью приблизительно 2°С/мин, а по мере приближения к ожидаемой температуре плавления —- не более чем 1 °С/мин. Общий вид установки показан на рис. 1.37.
В качестве температуры плавления фиксируют ту, при которой жир в капилляре начинает подниматься. Эксперимент повторяют не менее двух раз, за результат принимают среднее арифмети
ческое двух параллельных опытов, результаты которых должны отличаться не более чем на 0,5 °C.
Результаты экспериментов оформляют в виде таблицы.
Вил жира	Число фракций	Выход фракций!, %	Температура, °C	
			плавления фракции	кристаллизации
				
Затем самостоятельно анализируют полученные результаты, формулируют выводы и заключение по работе.
Лабораторная работа № 21
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ
Цель работы. Освоение методов выделения и фракционирования фосфолипидов на примере яичного желтка.
Задачи. Провести качественную реакцию на лецитин; освоить методы фракционного осаждения и хроматографического разделения фосфолипидов; охарактеризовать фосфолипидную фракцию анализируемого материала.
Объект исследования. Яичный желток.
Материалы, реактивы и оборудование. Фильтровальная бумага; химические стаканы; пробирки; капельницы; воронки; водяная баня; пипетки; этанол; ацетон; метанол; хлороформ; петролейный эфир; «-бутанол; фосфорномолибденовая кислота; ледяная уксусная кислота; нингидрин; AI2O3; хроматографическая колонка; тонкослойная пластина.
141
Mei одические указания. В qv нь. д ломы .
ЖПТСЯ 99- -94.? ' г 1 pill .1И11ирИ Ю.н О, । .; ь ; КГ;| >|..К!; |фИ\г и фосфатиды (фосфоЛИНИЛЫ ) С общ?!!
(:•
(II " С R
I -	()
I //
( Н -()-( к
I он
I	/
(НО р О
X о в
где О-С— R.J и О—С— R, — остатки радикалов жирных кислот (линолевой, линоленовой, пальмитиновой, стеариновой и т.д.); В — остаток азотистого основания или аминокислоты серина.
Методы их определения основаны на специфичности физико-химических свойств.
Работа состоит из двух этапов, каждый из которых рекомендуется изучить и освоить практически.
1	.КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ЛЕЦИТИН
Подготовка проб. Для осуществления качественной реакции на лецитин яичный желток выпаривают досуха на водяной бане при температуре кипения. Сухой остаток используют для анализа.
Порядок проведения анализа. В химический стакан вносят 200—300 мг высушенного и растертого яичного желтка, прибавляют 15 см3 горячего этанола и все перемешивают. Через 10—15 мин смесь охлаждают и фильтруют в сухую пробирку. В другую сухую пробирку наливают 2—3 см3 ацетона и по каплям добавляют полученный фильтрат. Наблюдают появление мути, а затем выпадение осадка лецитина, что указывает на нерастворимость лецитина в ацетоне. Если в пробирку к 2—3 см3 фильтрата прибавлять по каплям дистиллированную воду, то образуется стойкая эмульсия, что позволяет выделить лецитин из смеси липидов.
2	. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ
Подготовка проб. Для хроматографического анализа фосфолипидов яичные желтки тщательно отделяют от белка, добавляют 400 см3 ацетона и смесь гомогенизируют в течение 10 мин. Гомогенат оставляют в холоде на ночь. Осадок отделяют центрифуги
142
рованием с частотой вращения 50 с 'в геченне 20 мин. суспендируют в 400 см' ацетона и снова отделяют иенiрифегировани-ем. Обработку ацетоном повторяют. Затем осадок наносят тонким слоем на фильтровальную бумагу и сушат до исчезновения запаха ацетона в течение 1 — 2 ч.
Высушенный порошок заливают 200 см3 смеси хлороформ — метанол (1:1). Экстрагирование фосфолипидов проводят в течение 30 мин на вибровстряхивателе. Раствор центрифугируют с частотой вращения 50 с"1 в течение 20 мин. Центрифугат отделяют и сохраняют. Обработку осадка повторяют. Если центрифугирование не дает полного просветления надосадочной жидкости, проводят фильтрование на воронке Бюхнера. Цен-трифугаты (фильтраты) объединяют и выпаривают на роторном испарителе.
После выпаривания смесь фосфолипидов растворяют в 50 см3 петролейного эфира и добавляют 20-кратный объем (1000 см3) ацетона. Перемешивают и оставляют на ночь. Затем осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера, растворяют в 50 см3 петролейного эфира и вновь повторяют осаждение. Растворы в пет-ролейном эфире обычно бывают мутными. После повторного осаждения и фильтрования осадок промывают 200 см3 ацетона прямо на фильтре.
2.1	. РАЗДЕЛЕНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ НА КОЛОНКЕ С А12оз
Порядок проведения анализа. Колонку диаметром 2,5 см и высотой не менее 50 см заполняют за 1—2 сут до разделения фосфолипидов. На дно помещают плотный слой стекловаты толщиной 1 см, затем наливают суспензию, состоящую из 170— 190 г А12О2 в смеси с метанолом и хлороформом (1 : 1). При заполнении следует слегка постукивать по колонке деревянной палочкой для оседания и получения равномерного слоя адсорбента.
Сверху можно положить бумажный фильтр.
Полученную смесь фосфолипидов (10—15 г) растворяют в смеси метанол — хлороформ (1 : 1) и наносят на колонку. Фосфатидилхолин с примесью лизофосфатидилхолина и сфингомиелина вымывается 500 см3 смеси метанол — хлороформ (1 : 1). Первые 150 см3 и последние 100 см3 отбрасывают. После выхода фосфа-тидилхолина колонку промывают 100 см3 той же смеси. Фосфа-тидилэтаноламин с примесью фосфатидилсерина отмывается 50 см3 смеси этанол — хлороформ — вода (5:2: 2). Первые 200 см3 отбрасывают. Оба элюата упаривают на роторном испарителе досуха и получают приблизительно 5 г лецитина (фосфатидилхолина) и 2,5 г кефалина (фосфатидилэтаноламина).
143
2.2	АНАЛИЗ ФОСФОЛИПИДОВ С ПОМОЩЬЮ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Порядок проведения анализа. Для тонкослойной хроматографии применяют пластинки «Силуфол» (150 x150 мм) и стандартные камеры. В качестве растворителя используют смесь хлороформ — метанол — вода в соотношении 65 : 25 : 4.
На две пластинки на расстоянии 1,5 см от их узкого края микропипеткой наносят хлороформные растворы фракций фос-фатидилхолина (в одно пятно) и фосфатидилэтаноламина (в другое пятно) в количестве 1—5 мкмоль. Пластинки помещают в камеру (предварительно за 2—3 ч для насыщения камеры в нее помещают растворитель). После разделения одну пластинку проявляют спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты массовой долей 5 % (с фосфатидилхолином образуются синие пятна на желтом фоне), другую — раствором нингидрина на //-бутаноле массовой долей 0,3 %, содержащем уксусную кислоту массовой долей 3 %. Все фосфолипиды, содержащие NH2-rpynny (фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилэтанола-мин, фосфатидилсерин), проявляются в виде розовых пятен на сером фоне.
Студенты фиксируют в тетради условия и эффект, полученный от реакций, включая качественную реакцию на лецитин и разделение фосфолипидов, анализируют экспериментальные данные, формулируют выводы и составляют отчет о работе.
Лабораторная работа № 22 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА
Цель работы. Приобрести практический навык определения холестерина в мясопродуктах (мозг, шпик, колбасные изделия и т. д.).
Задачи. Провести подготовку к анализу; получить и исследовать кристаллы холестерина; определить содержание холестерина в объектах исследования.
Объекты исследования. Ткань головного мозга, желчь, яичный желток, сыворотка или плазма крови убойных животных.
Методические указания. Холестерин нерастворим в воде, разбавленных кислотах и щелочах, но растворим в жирах и их растворителях: эфире, хлороформе и бензоле. Холестерин кристаллизуется из этанола в виде пластинок с перламутровым блеском, жирных на ощупь. Кристаллы содержат одну молекулу воды, имеют
144
температуру плавления it, (. и о 111 ос >п с я к числ\ наиболее термос габиаьпых органических вещешв. Иг и’рира. хлороформа и бензола холестерин кристаллизуется в виде безводных тонких игл с шелковистым блеском. Растворы холестерина в хлороформе и эфире оптически активны, - -31,59.
В то время как эфиры холестерина не абсорбируют воду, свободный холестерин может поглотить ее массу, в 500 раз превышающую собственную. Высокая массовая доля воды в мозге связана с высокой массовой долей холестерина в этом органе.
Холестерин является хорошим изолятором электрического тока. Уменьшение содержания холестерина в организме ниже физиологической нормы приводит к анестезии и ряду нервных и психических расстройств. Он является фактором воспроизводства, увеличивающим плодовитость животных, обладает способностью связывать яды и токсины, в связи с чем играет важную роль в формировании иммунитета; предупреждает гемолиз эритроцитов, вызываемый лецитином.
Вместе с тем химическая стойкость холестерина и практически полная нерастворимость в тканевых жидкостях приводят с возрастом к аккумулированию его в организме, что является фактором риска ряда заболеваний, в связи с этим требуется контроль его уровня в продуктах питания и пищевых рационах.
Для обнаружения холестерина применяется ряд качественных цветных реакций, химизм которых связан с переводом его из вторичного спирта в непредельный углеводород путем дегидратирования.
Для получения растворов холестерина в хлороформе к сухим остаткам холестерина, выделенного из образцов нервной ткани и желчи на этапе подготовки пробы, добавляют обезвоженный хлороформ из расчета получения раствора холестерина с массовой долей 0,3 %.
При действии концентрированной серной кислоты стеролы дегидратируются и окисляются с образованием смеси сложных продуктов.
Раствор холестерола в хлороформе дает с уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой красное окрашивание, переходящее затем в синее и зеленое. Таким образом, при наличии серной кислоты происходят дегидратация и окисление холестерола. В результате две молекулы холестерола, потерявшие две молекулы воды, соединяются между собой по третьему атому углерода. Образовавшиеся непредельные углеводороды с сопряженными двойными связями дают различные производные с серной кислотой и уксусным ан-
145
i и.ipi’.lo\i i’Oi ,iacno схеме
После обработки хлороформенного раствора холестерола равным объемом серной кислоты массовой долей 92 % он окрашивается в кроваво-красный цвет, переходящий затем в пурпурный. Отстоявшийся слой серной кислоты приобретает слабо-зеленую флуоресценцию. Чувствительность реакции 0,001 мае.%.
В результате дегидратации холестерина реакция с уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой приводит к образованию окрашенной в зеленый цвет сульфокислоты — хо-лестерилена.
Смесь раствора холестерина в хлороформе с уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой окрашивается в быстро исчезающий красный цвет, затем в синий и, наконец, в более стойкий зеленый цвет. При незначительной массовой доле холестерина в растворе сразу образуется зеленое окрашивание.
146
CJi
(CH;COM)
- CH;CO()H
сщ-соо
- СН;-СООН
Эта цветная реакция служит и для количественного определения холестерина в крови или сыворотке крови.
При проведении лабораторного практикума рекомендуется ознакомиться и освоить все рекомендуемые методы определения холестерина.
1.	ПОЛУЧЕНИЕ КРИСТАЛЛОВ ХОЛЕСТЕРИНА
Материалы, реактивы и оборудование. Гипс; этанол 96%-ный; эфир; фарфоровая ступка; стеклянная пластинка размером 10 х хЮсм, сушильный шкаф; термометр; микроскоп; предметное стекло; пипетка.
Подготовка проб. При анализе тканей тщательно растирают 3—5 г ткани в фарфоровой ступке с 6—Юг гипса до гомогенной массы, которую распределяют стеклянной палочкой или скальпелем тонким слоем по стеклянной пластинке и высушивают в сушильном шкафу при 60 °C.
Порядок проведения анализа. К сухому остатку неочищенного холестерина добавляют спиртоэфирную смесь (соотношение спирта и эфира 1 : 2 по объему) из расчета получения раствора массовой долей холестерина 2 %.
На предметное стекло наносят пипеткой 1—2 капли эфирно-спиртового раствора холестерина и испаряют до выпадения кристаллов.
147
Рис. 1.38 Крист i.ibi \o.ieciepnna (8x40)
Кристаллы холестерина микроскопиру-ют, используя объектив с увеличением х 40. Операции выполняют с холестерином, взятым из нервной ткани различных видов животных. Результаты наблюдений оформляют
в виде зарисовок с указанием объекта и применяемого увеличения. Пример показан на рис. 1.38.
2.	ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА ХОЛЕСТЕРИН
Материалы, реактивы и оборудование. Концентрированная серная кислота; раствор серной кислоты массовой долей 92 % (плотность 1,76 г/см3); формалин; уксусный ангидрид; безводный хлороформ; пробирки с притертыми пробками; штатив.
Подготовка проб. Высушенную мозговую ткань с гипсом в соответствии с методикой подготовки проб (см. п. 1) соскабливают скальпелем со стекла и измельчают в ступке. К сухому порошку в пробирке добавляют 5—6 см3 хлороформа и экстрагируют в течение 5—10 мин. Для лучшей экстракции содержимое пробирки периодически встряхивают. Полученный экстракт в хлороформе фильтруют в сухую пробирку и используют для проведения качественных реакций на холестерол.
При использовании в качестве объекта исследования желчи пробу объемом 20 см3 выпаривают досуха на водяной бане при температуре кипения. К сухому остатку добавляют 5—10 см3 эфира, тщательно перемешивая стеклянной палочкой. Эфирный экстракт фильтруют, испаряют досуха и используют для проведения качественных реакций на холестерин.
При анализе яичного желтка его выпаривают досуха на водяной бане при температуре кипения. Для получения хлороформенного экстракта к 1 г сухого остатка добавляют 5—6 см3 хлороформа и экстрагируют в течение 5—10 мин. Для лучшей экстракции содержимое пробирки периодически встряхивают. Полученный экстракт в хлороформе фильтруют в сухую пробирку и используют для проведения качественных реакций.
2.1.	РЕАКЦИЯ С СЕРНОЙ КИСЛОТОЙ (РЕАКЦИЯ ЗАЛКОВСКОГО)
Порядок проведения анализа. В 2 пробирки с притертыми пробками вносят по 2 см3 полученного из разных источников раствора холестерина в хлороформе массовой долей 0,3 %, добавляют по 148
2см? раствора серной кислоты массовой .имей (11.101 нос 1 ью 1,76 г/см-) и встряхиваю!.
После разделения слоев хлороформа и серной кислоты фиксируют изменение окраски.
2.2.	РЕАКЦИЯ СО СМЕСЬЮ ФОРМАЛИНА И КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ СЕРНОЙ КИСЛОТЫ
Порядок проведения анализа. В пробирку с притертой пробкой помещают 2 см3 раствора холестерина в хлороформе массовой долей 0,3 %, добавляют 2 см3 смеси концентрированной серной кислоты с формалином (на 50 г концентрированной серной кислоты 1 г формалина) и встряхивают. После разделения слоев хлороформа и серной кислоты фиксируют изменение окраски.
2.3.	РЕАКЦИЯ С УКСУСНЫМ АНГИДРИДОМ И КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ СЕРНОЙ КИСЛОТОЙ (РЕАКЦИЯ ЛИБЕРМАНА —БУХАРДА)
Порядок проведения анализа. В пробирку с притертой пробкой помещают 2 см3 раствора холестерина в хлороформе массовой долей 0,3 %, добавляют 5—10 капель уксусного ангидрида и несколько капель концентрированной серной кислоты. Фиксируют изменение окраски смеси.
После выполнения экспериментальной части работы студенты кратко описывают в тетради условия и эффект качественных реакций, самостоятельно анализируют экспериментальные данные, формулируют выводы и заключение по работе. Наблюдения рекомендуется представить в виде таблицы:
Реакция	Источник холестерина	Полученный эффект	Выводы
Реакция с серной кислотой (реакция Залковского)			
Реакция со смесью формалина и концентрированной серной кислоты			
Реакция с уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой (реакция Либермана — Бухарда)			
149
3.	КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРОЛА
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор хлорного железа (0,125 г FeCl; • бН-,0 растворяют в 100 см3 ледяной уксусной кислоты); этилацетат "(СН;—СОО—С2Н5); уксусный ангидрид; хлороформ; стандартный раствор (1,8 г/дм3) холестерола (180 мг холестерола растворяют в 100 см3 этилового этанола); реактив А; штатив с пробирками; пипетки; микропипетки; цилиндры; колба; термостат (37 °C); фотоэлектроколориметр.
3.1.	РЕАКЦИЯ С ХЛОРНЫМ ЖЕЛЕЗОМ
Подготовку проб см. п. 2 настоящей работы.
Порядок проведения анализа. Метод основан на взаимодействии хлорного железа со стеролами с образованием продукта пурпурного цвета в присутствии этилацетата и серной кислоты.
В пробирку с пришлифованной пробкой помещают I см3 раствора стеролов в хлороформе, приливают 2 см3 этилацетата, затем 2 см3 раствора хлорного железа, перемешивают и добавляют 3 см3 концентрированной H2SO4, смесь снова осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Окрашенный раствор колориметрируют при длине волны 540 нм. Количество холестерина определяют по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. В качестве стандартных используют растворы эргостерола или холестерола в хлороформе с содержанием этих веществ от 10 до 100 мкг, проводят качественную реакцию в соответствии с описанием метода, колориметрируют при длине волны 540 нм и строят график D где с — концентрация холестерола (эргостерола).
3.2.	МЕТОД ЛИБЕРМАНА —БУХАРДА
Подготовку проб см. п. 2 настоящей работы.
Порядок проведения анализа. Стеролы в присутствии дегидратирующего агента (серной кислоты) реагируют с уксусным ангидридом, образуя конденсированные продукты зеленого цвета.
В пробирку с пришлифованной пробкой помещают 1 см3 раствора стеролов в хлороформе, прибавляют 0,7 см3 уксусного ангидрида и 0,1 см3 концентрированной H9SO4. Содержимое пробирки перемешивают, доводят его объем до 5 см3 хлороформом и оставляют на 15—20 мин в темноте. Окрашенный раствор колориметрируют против контроля при длине волны
150
610 нм. Содержание стеронов определяю! по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. В качестве стандартного используют растворы эргостерола или холестерола в хлороформе с содержанием этих веществ от 50 до 250 мкг. Затем проводят цветную реакцию согласно описанию метода, колориметрируют при длине волны 610 нм и строят график D
3.3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРОЛА В ПЛАЗМЕ (СЫВОРОТКЕ) КРОВИ
Подготовка проб. Плазму или сыворотку крови получают центрифугированием или сепарированием с частотой вращения 25—42 см1 соответственно стабилизированной или дефибриниро-ванной крови убойных животных в течение 5—8 мин.
Приготовление реактивов. Реактив А: смесь ледяной уксусной кислоты (30 см3), уксусного ангидрида (150 см3) и концентрированной серной кислоты (30 см3) в соотношении 1:5:1 необходимо готовить при постоянном охлаждении. Серную кислоту следует добавлять в последнюю очередь, очень медленно, постоянно перемешивая. Хранить реактив А следует в холодильнике в посуде из темного стекла с притертой пробкой.
Порядок проведения анализа. В сухую пробирку вносят 0,1 см3 плазмы (сыворотки) крови, быстро добавляют 2,1 см3 реактива А, немедленно перемешивают, 10 раз встряхивают и помещают в термостат при 37 °C. Через 20 мин смесь в пробирке окрашивается в зеленый цвет. Фотометрируют против воды при использовании красного светофильтра.
Молярную концентрацию холестерола в исследуемой пробе определяют по оптической плотности с помощью калибровочного графика.
Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора холестерола (1,8 мг холестерола в 1 см3) отбирают по 0,05; 0,1; 0,15; 0,20; 0,25 см3 и добавляют реактив А до объема 2,2 см3 в каждой пробирке. При этом в пробах будет содержаться соответственно 0,09; 0,18; 0,27; 0,36; 0,45 мг/см3 холестерола. После добавления реактива А пробирки энергично встряхивают и помещают в термостат при 37 °C, через 20 мин смесь фотоколориметрируют с использованием красного светофильтра. Строят график D=flc).
Молярную концентрацию холестерола в плазме (сыворотке) крови (ммоль/дм3) определяют по формуле
М = с- 1000-0,0258,	(1.28)
где с — концентрация холестерола в пробе, найденная по калибровочному графику, мг/см3; 1000 — коэффициент пересчета на объем пробы 1дм2; 0,0258 — коэффициент пересчета в систему СИ.
151
Ргл'чьпиы ж/неримсн гальныч нес. iv.iob.ihhi! фиксирую i. с? \i ОС i i) Ч i С.Ч Ь । b ) (j)(';[1	. 1 И jj\ К > i ВЫВОДЫ И juK.ikHciilk' НО paoo'lC. _)к<
периmcii’i\uiijn>iс чанные сводят в чаблицх;
I IjioteiiooiHiic и к -
СрИСПЦО ojpj'ilki
Оптическая птюгност!. пробе
I
Концентрация холестерина к. пробе по ю.тброг,очному график) . мг/см ’
Молярная КОНЦиНГра пня чолежерина в Не еле чуемом обра/це. ммоль/лм
Лабораторная работа № 23
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ЖИВОТНЫХ ЖИРОВ
Цель работы. Приобрести практический навык при анализе жирнокислотного состава животных жиров.
Задачи. Провести подготовку проб методом экстракции и путем переэтерификации глицеридов в метиловые эфиры жирных кислот, проанализировать жирные кислоты методом газожидкостной хроматографии и идентифицировать эфиры жирных кислот.
Объекты исследования. Образцы мяса различных видов и сортов, субпродукты 1 и II категорий различных животных, шпик и жир-сырец с различных анатомических участков, жиропродукты.
Материалы, реактивы и оборудование. Абсолютный метанол; хлороформ; раствор гидроксида калия массовой долей 10 % в абсолютном метаноле; гексан; раствор фенолфталеина в этаноле массовой долей 1 %; диэтиловый эфир; безводный сульфат натрия; раствор метилата натрия массовой долей 5 %; колба с воздушным холодильником; делительная воронка; конические колбы вместимостью 50 см3; склянка с притертой пробкой; песчаная баня; вакуум-сушильный шкаф и газовый хроматограф.
Методические указания. Важным показателем пищевой ценности жиров является их жирнокислотный состав. Такие полинена-сыщенные жирные кислоты, как линолевая (С18.2) и линоленовая (С18.3), не синтезируются в организме. Линолевая кислота является предшественником образующейся в организме арахидоновой кислоты (С20.4). Полиненасыгценные жирные кислоты относятся к незаменимым компонентам пищи. Они обладают витаминной активностью, принимают участие в регуляции многих процессов в организме и образовании клеточных мембран.
Хроматография — физико-химический метод разделения жидких или газообразных смесей, который основан на различии в распределении разделяемых веществ между двумя фазами. При анализе жиров методом хроматографии в качестве подвижных фаз используют жидкости или газы. Особую популярность получили газожидкостные хроматографы. Разделение анализируемых соеди-152
нении основано на различной рас i воримосги комионенюв газо вой смеси в жидкой неподвижной фазе, которая нанесена на твердый носитель, заполняющий колонку.
Исследуемые вещества движутся по колонке с помощью газа-носителя (азот, аргон, гелий). нс вступающего в реакцию с компонентами анализируемой пробы и не растворяющегося в жидкой фазе. Газ подается из баллонов постоянно и поддерживается на определенном уровне при помощи специального игольчатого вентиля. Скорость подачи газа измеряют, определяя время истечения заданного объема. Жидкая фаза в ГЖХ должна быть нелетучей, устойчивой к температуре, при которой производят анализ, иметь невысокую вязкость, хорошо растворять компоненты разделяемой смеси. В качестве жидкой неподвижной фазы часто используют органические соединения с высокой температурой кипения. Выбор фазы зависит от природы исследуемого вещества. При разделении соединений с равной полярностью и различными точками кипения используют неполярную жидкую фазу — сквалан, высоковакуумные смазки апиезон L и апиезон М. Для разделения веществ с различной полярностью (жирных кислот, спиртов) применяют полярные жидкости — полиэтиленгликоли, сложные эфиры углеводов и производные этилендиаминов.
Неподвижную жидкую фазу закрепляют на инертном гранулированном твердом носителе и помещают в узкую стальную или стеклянную колонку, через которую пропускают подвижную фазу. Хроматографическая колонка представляет собой спиральные трубки диаметром 0,2—1 см и длиной 1—20 см.
Твердый носитель жидкой фазы должен быть химически инертным по отношению к анализируемому веществу, обладать относительно большой поверхностью (оптимальная поверхность носителя 5—20 м2/г). Чаще всего в качестве носителей используют природные алюмосиликаты, цеолит-545, силикагель (хромо-сорб), силоцел С-22 в форме шариков или пластинок.
Схема газожидкостного хроматографа приведена на рис. 1.39.
Рис. 1.39. Схема газожидкостного хроматографа:
1 — пламенно-ионизационный детектор; 2—усилитель; 3 —самопишущий потенциометр; 4— интегратор; 5 — газовый баллон с носителем; 6 — хроматографическая колонка; 7—регулятор температуры в термостате; 8— термостат
153
Гак как образец должен поступать в козонку в iазообразном виде, то между дозатором и колонкой устанавливают подогреватель. обеспечивающий мгновенное испарение образца, температура в котором поддерживается на 30—50 °C выше, чем температура в колонке.
Ввиду того что скорость продвижения компонентов смеси но хроматографической колонке зависит от температуры, колонку помещают в термостат (жидкостный, паровой, воздушный). Чаше всего используется воздушный термостат, позволяющий работать в области высоких температур.
Образующаяся газовая смесь попадает в верхнюю часть колонки и перемещается вдоль нес газом-носителем. Температура колонки поддерживается на уровне, обеспечивающем газообразное состояние анализируемой смеси. Выходящие из колонки компоненты попадают в детектор и регистрируются в виде полос на ленте самописца.
Сущность метода состоит в том, что каждый компонент разделяемой смеси при определенной температуре в парообразном состоянии с определенной скоростью с помощью газа-носителя перемещается по колонке, заполненной порошкообразным носителем, пропитанным неподвижной фазой (нелетучей жидкостью).
Хроматограмма смеси представляет собой кривую в виде ряда пиков, число которых соответствует числу разделяемых компонентов. Чем больше площадь пика, тем больше содержится данного вещества в пробе. Последовательность выхода компонентов зависит в основном от коэффициентов их распределения между жидкой неподвижной и газообразной подвижной фазами.
Количество вещества определяют по площади (иногда по высоте) пика на диаграммной ленте самописца. Площадь пика измеряют планиметрическим способом либо умножением высоты пика h на ширину Ь, которую он имеет на половине высоты (рис. 1.40). Некоторые газожидкостные хроматографы (ГЖХ) снабжены интегратора-
Рис. 1.40. Измерение площади пика
ми, которые измеряют относительное время удержания и определяют площади пиков.
При анализе смесей жирных кислот их переводят в метиловые эфиры, которые являются более летучими, чем свободные жирные кислоты, и не обладают способностью димеризоваться. Кроме того, при хроматографировании эфиров облегчается разделение насыщенных жирных кислот и ненасыщенных с тем же числом углеродных атомов. Эфиры насыщенных жирных кислот с прямой цепью углеродных атомов выходят из колонки в порядке повышения их температуры кипения. При постоянных условиях работы время и порядок выхода кислот из колонки всегда одинаковы.
154
Этот метод основан на предварительном кипячении пробы липидов в абсолютном метаноле с метилатом назрия с последующим экстрагированием полученного продукта диэтиловым эфиром.
При анализе глицерилов получают метиловые эфиры методом переэтерификации.
Подготовка проб. Сначала проводят предвари iельную экстракцию липидов. Для этого 40 г измельченного образна помешают в колбу с герметически закрывающейся пробкой, добавляют 130 см3 метанола, перемешивают и измельчаю! на гомогенизаторе в течение 1—2 мин до получения однородной массы. Затем к гомогенату добавляют 65 см3 хлороформа и встряхивают в течение 10 мин, после чего к смеси добавляют еще 65 см3 хлороформа и вновь встряхивают, но уже в течение 5 мин. К полученной смеси приливают 65 см3 дистиллированной воды и встряхивают в течение 30 с. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр под небольшим разрежением на воронке Бюхнера. Во время фильтрации желательно подавать струю диоксида углерода или азота на гомогенат, находящийся в воронке.
Остаток вместе с фильтром и небольшим кусочком фильтровальной бумаги, которым вытирают воронку, переносят в ту же смесительную колбу и повторно экстрагируют 100 см3 хлороформа в течение 10 мин. Смесь фильтруют в общую колбу. Колбу и остаток промывают 50 см3 хлороформа и весь фильтрат собирают в мерный цилиндр вместимостью 500 см3. Слои разделяют в делительной воронке, отбирают нижний хлороформный слой, выпаривают на роторном испарителе и получают жир, подлежащий дальнейшему анализу. Для этого жирные кислоты переводят в свободное состояние и получают их метиловые эфиры по одному из описаний, предложенных ниже.
1. Пробу липидов массой 0,5 г помещают в колбу вместимостью 150 см3, добавляют 10 см3 абсолютного метанола, вводят 0,05 см3 раствора метилата натрия массовой долей 5 %, присоединяют воздушный холодильник и кипятят на песчаной бане при температуре 75—80 °C в течение 1,5 ч. Затем отгоняют избыток этанола, содержимое колбы переносят в делительную воронку, ополаскивая колбу 2 раза 5 см3 диэтилового эфира. В воронку добавляют 2 см3 воды и 3 раза экстрагируют метиловые эфиры диэтиловым эфиром, каждый раз используя по 10 см3. Эфирные вытяжки промывают водой до нейтральной реакции по фенолфталеину, сушат безводным сульфатом натрия и фильтруют. Растворитель отгоняют, эфиры сушат в вакуум-сушильном шкафу при комнатной температуре, а затем хранят в герметически закрытых склянках на холоде в темноте.
2. Пробу липидов массой 0,1 г помещают в толстостенную колбу с притертой пробкой, добавляют 5 см3 абсолютного метанола и 0,22 см3 раствора гидроксида калия в абсолютном метаноле массовой долей 10 %. Колбу закрывают пробкой, которую прочно при-
155
кручпваюг медной проволокой, помешают на водяную оаню при температуре кипения и нагревают в течение 5—7 мин. После охлаждения в колбу добавляют 10см? воды. Полученную эмульсию количественно переносят в делительную воронку и метиловые эфиры экстрагируют гексаном (трижды по 20 см3). Объединенный гексановый экстракт промывают несколько раз водой порциями по 20 см3 до нейтральной реакции но фенолфталеину.
При метилировании жирных кислот в реакционную смесь можно добавить гидроксид калия из расчета 1.1 см3 раствора гидроксида калия в абсолютном метаноле массовой долей 10% на 0,1 г жира и содержимое нагреть в аналогичных условиях в течение 1 мин.
Порядок проведения анализа. В хроматограф вводят образец. Для этого пробу метиловых эфиров набирают в инъекционный шприц, прокалывают им колпачок дозатора и вводят содержимое. Момент ввода пробы фиксируется на нулевой линии.
Самописец прибора вычерчивает хроматограмму. Если в смеси отсутствует та или иная жирная кислота, то на хроматограмме будет отсутствовать соответствующий ей пик.
Для качественной идентификации параллельно при тех же условиях (скорость движения ленты, скорость газа-носителя, температура и т. д.) вычерчивают хроматограмму известной стандартной кислоты, чаще всего пальмитиновой.
В случае проведения анализа на хроматографе с плазменноионизационным детектором метиловые эфиры жирных кислот разделяют при следующих условиях: колонку длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм заполняют 15%-ным полиэтиленгли-кольсукцинатом на цеолите-545 с размером зерна 60—80 меш (число отверстий сита в одном квадратном дюйме), скорость газа-носителя (азота) 30 см3/мин. Разделение осуществляют в режиме линейного программирования температуры при скорости нагревания 4 °С/мин от 80 до 202 °C и в изотермическом режиме — при 202 °C. Пробу объемом 1—2 мкл вводят в хроматограф микрошприцем на 10 мкл.
Качественный анализ компонентов смеси метиловых эфиров жирных кислот липидов проводят, используя метчики идентифицированных эфиров чистых кислот. Количество каждого компонента в данной пробе определяют следующим образом. На хроматограмме проводят базовую линию, соединяющую основания всех пиков. Затем измеряют высоту каждого пика и его ширину на половине высоты. После этого вычисляют площадь пика (чаще по площади треугольника, можно использовать и другие способы расчета площадей пиков). Сумму площадей всех пиков метиловых эфиров кислот принимают за 100%. Зная, сколько образца было введено в колонку хроматографа, можно рассчи-156
тать количесзво каждой кислоты, содержащейся в данном образце. но формуле
(1.29)
где 5(1 — площадь пика определяемого компонента; Z5tl —сумма площадей пиков всех компонентов.
Полученные экспериментальные данные фиксируют в тетради, анализируют результаты, формулируют заключение по работе. Экспериментальные данные рекомендуется оформить в виде таблиц, формы которых приведены ниже.
Образец, источник получения	Жирная кислота	Формула	Массовая доля, % к сумме
			
Жирные кислоты, % к сумме	Объекты исследования					
	1	2	3	4	5	6
Насыщенные (И)
Мононенасыщенныс (М) Полиненасыщепные (П) Соотношение Н : М : П Неидентифицированные компоненты
Лабораторная работа № 24 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛИКОГЕНА В ЖИВОТНЫХ ТКАНЯХ
Цель работы. Приобрести практический навык количественного определения гликогена в животных тканях.
Задачи. Получить гликоген из анализируемых образцов тканей; провести качественную реакцию с антроновым реактивом; определить светопоглощение окрашенных растворов с последующим определением концентрации гликогена по калибровочному графику.
Объекты исследования. Мышечная ткань и печень крупного рогатого скота.
Материалы, реактивы и оборудование. Растворы гидроксида калия массовыми долями 30 и 50 %; растворы этанола массовыми
157
.юлями 9>. 9(1. (я) и 80 с'(: э<|)ир: концентрированная Н-,80, (х. я.): антрон; микоген (или глюкоза); свежеприготовленный раствор антрона; центрифуга лабораторная; сифон; стеклянные пипетки; водяная баня, стеклянные пробирки; дел; спектрофотометр или фото эл е кт р о к о л о р и м е т р.
Приготовление реактивов. Р а с г в о р а н г р о н а: 0,2 г антрона помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют и доводят до метки раствором серной кислоты массовой долей 95 %. После выдержки в течение 1 ч раствор готов к применению.
Методические указания. Количество гликогена в свежих мышцах указывает на упитанность животного, а динамика количественного изменения гликогена в процессе хранения и переработки свидетельствует о глубине автолитических превращений.
Количество гликогена легко определить по цветной реакции с антроном. Метод сравнительно легкий и пригоден для массовых определений.
Метод состоит из следующих основных операций: гидролиза белков щелочью, выделения гликогена из раствора этанолом, промывания гликогена и его растворения, реакции с антроном (развитие окраски) и измерения интенсивности окраски.
При нагревании образцов тканей с концентрированным раствором щелочи происходит гидролиз белков, при этом гликоген выделяется из клеток. Гликоген не растворяется в этаноле, он выпадает в осадок при добавлении довольно большого его объема. Добавление нескольких капель концентрированной серной кислоты способствует осаждению гликогена вследствие образования сульфата аммония.
Нагревание промытого осадка гликогена с антроном (высокоспецифичным реактивом на углеводы), растворенным в концентрированной серной кислоте, приводит к гидролизу гликогена до глюкозы вследствие каталитического действия серной кислоты и к развитию окраски при реакции между глюкозой и антроном по схеме
По интенсивности окраски судят о количестве глюкозы. Развившаяся окраска пропорциональна количеству взятой глюкозы в пределах от 10 до 100 мкг в пробе.
158
Окрашенный от зеленого ло сине-зеленого цвета продукт реакции имеет максимум поглощения при длине волны 620 нм. Интенсивность окраски раствора измеряют на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре с красным светофильтром с максимумом пропускания при той же длине волны.
Подготовка проб. При использовании в качестве объекта исследования мышечной ткани в центрифужные пробирки размером 25 х 160 мм вносят 5 см3 раствора гидроксида калия массовой долей 50 % и около 2.5 г пробы, взвешенной на технических весах с точностью до ± 0,01 г. Пробирки помещают в специальный штатив, вместе с которым их ставят в водяную баню при температуре кипения. После образования однородного раствора (после того как все частички мяса растворились) пробирки охлаждают, добавляют 5 см3 дистиллированной воды, осаждают гликоген 40 см3 этанола 96 об.% и вносят несколько капель концентрированной серной кислоты.
При анализе печени крупного рогатого скота в пробирку из молибденового стекла (или стекла пирекс) размером 20 х 150 мм помещают навеску тщательно измельченного образца массой 1,0 г, добавляют 30 см3 раствора гидроксида калия массовой долей 30 % и нагревают на сильно кипящей водяной бане в течение 20 мин.
По истечении времени пробирку охлаждают в холодной воде, содержимое количественно переносят в мерную колбу и доводят объем дистиллированной водой до метки. Вместимость мерной колбы подбирают в зависимости от возможного содержания гликогена в печени. Если анализируют измельченную при охлаждении печень только что убитого животного, то выбирают колбу вместимостью 200—500 см3, для анализа печени, хранившейся длительное время, используют колбу вместимостью 25— 50 см3. Гидролиз ведут в течение 24 ч.
Порядок проведения анализа. По истечении 24 ч содержимое пробирок центрифугируют в течение 30 мин при частоте вращения 50 с-1, жидкость над осадком сливают тонким сифоном или осторожно удаляют пипеткой. Осадок последовательно промывают 15 см3 раствора этанола с объемными долями 60, 80 и 96 %, а затем эфиром.
Для отделения промывных жидкостей пробирки с содержимым центрифугируют 30 мин. После каждого центрифугирования жидкость над осадком сливают, пользуясь вышеуказанным приемом. При обработке эфиром центрифугирования не требуется, после 10 мин настаивания эфир сливают из пробирки, а его следы удаляют на водяной бане.
Каждую порцию промывной жидкости добавляют не сразу, а в два приема. Сначала вносят небольшую часть жидкости и тщательно распределяют в ней осадок, перемешивая его стеклянной палочной, а затем добавляют оставшийся объем, тщательно смывая в пробирку приставшие к палочке частицы.
159
После удаления следов эфира к остатку юбавлякн 5см? юрячси волы, раствор перемешивают вращательным движением пробирки и нейтрализуют соляной кислотой по лакмусу (сначала двумя каплями концентрированной H0SO4, а затем H2SO4 массовой долей 2 %).
Из пробирки раствор гликогена переносят в мерную колбу соответствующей вместимости (см. подготовку проб). Для проведения цветной реакции в две пробирки молибденового стекла размером 30x200 мм помещают аликвотные части раствора гликогена (например, 0,5 и 1,5 см3), доливают до 5 см3 дистиллированной водой и погружают в водяную баню со льдом. Осторожно, непрерывно помешивая, приливают тонкой струей 10 см3 свежеприготовленного раствора антрона. Затем жидкости еще раз осторожно перемешивают вращательным движением и пробирки помещают на 10 мин в сильно кипящую водяную баню. По окончании нагревания пробирки быстро охлаждают в воде со льдом и измеряют оптическую плотность по отношению к контрольному раствору. Образовавшаяся зеленая окраска при использовании реактивов высокой чистоты устойчива в течение 4—5 ч.
Контрольный опыт проводят при аналогичных условиях, помещая в пробирку 5 см3 дистиллированной воды и 10 см3 раствора антрона.
Оптическая плотность контрольного раствора, измеренная относительно серной кислоты, не должна превышать 0,08.
Построение калибровочного графика. Готовят стандартный раствор на основе тщательно очищенного и высушенного в эксикаторе гликогена, полученного из тканей только что убитого кролика, или пользуются химически чистым препаратом глюкозы. Для перевода глюкозы в гликоген результаты определения делят на 1,11.
Навеску гликогена массой 16 мг растворяют в теплой дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 200 см3, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем до метки и тщательно перемешивают. 1 см3 стандартного раствора содержит 0,08 мг гликогена. Из раствора готовят серию рабочих растворов для построения калибровочного графика. Рекомендуемые объемы стандартного раствора гликогена для построения калибровочного графика приведены ниже.
Масса гликогена, мг	Объем,см’		
	раствора гликогена |	воды	антрона
0.01	0,125	4,875	10,0
0,02	0,25	4,75	10,0
0,04	0,50	4.50	10,0
0,06	0,75	4,25	10,0
0,08	1,00	4,00	10,0
0,12	1,50	3,50	10,0
0,16	2,00	3,00	10,0
0,20	2,50	2,50	10,0
160
Для построения калибровочного графика необходимо провести не менее трех серий определении, используя каждый раз вновь приготовленный раствор гликогена или пчюкозы.
При помощи калибровочного графика находят концентрацию гликогена во взятом на цветную реакцию растворе, а затем пересчитывают на содержание его в мясе (мг %) по формуле
а -25 100
Ут
(1.30)
где а — содержание гликогена по калибровочному графику, мг: 25 - - вместимость мерной колбы, в которой был растворен осадок гликогена; 100— множитель перевода в проценты; И—объем исследуемого раствора, взятого на цветную реакцию, см’: т — масса навески мяса. г.
Полученные экспериментальные и расчетные данные сводят в таблицу:
Образец	Используемый метод определения	01 п плеская плотность раствора	Содержание гликогена ио калибровочному графику	Массовая доля гликогена в образце, %
				
Опираясь на теоретические знания, самостоятельно делают выводы и формулируют заключение.
Лабораторная работа № 25 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ
Цель работы. Приобрести практический навык определения количества молочной кислоты.
Задачи. Выделить молочную кислоту из мышечной ткани методом экстракции; провести качественные реакции; определить оптическую плотность окрашенных растворов и рассчитать массовое содержание молочной кислоты в исследуемом образце.
Объекты исследования. Мясо или мышечная ткань различных видов животных разных сроков хранения.
Методические указания. В аналитической практике применяются различные методы определения молочной кислоты, наиболее распространенными среди которых являются методы, основанные на качественных реакциях с последующим фотометрированием.
Метод определения по цветной реакции с вератролом является сравнительно быстрым и пригодным для массовых определений. Он состоит из следующих основных операций: осаждения белков, углеводов, нагревания с серной кислотой, развития цветной реакции с вератролом, измерения интенсивности окраски.
161
Белки осаждаю] раствором митафосфорнол кислота массовой долей 5/с. Промежуточные продукты распада белков мсгафос форной кислотой не осаждаются.
Для осаждения углеводов и отчасти промежуточных продуктов, распада белка применяют сульфат меди и гидрат окиси кальция, углеводы осаждаются в виде сахаратов.
При нагревании с концентрированной серной кислотой молоч ная кислота превращается в ацетальдегид:
СН;	СН;
СНОН + H2SO4 —► с = о
соон	н
Образовавшийся ацетальдегид при реакции с вератролом дает соединение красного цвета.
Окрашенный в красный цвет продукт реакции имеет максимум поглощения при длине волны 520 нм. Интенсивность окраски раствора измеряют на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре со светофильтром с максимумом пропускания при вышеуказанной длине волны (зелено-желтый или зеленый).
Фильтрат должен быть прозрачным. Для того чтобы убедиться в полном удалении белков, можно поместить несколько кубических сантиметров фильтрата в пробирку и добавить к нему равный объем раствора сульфосалициловой кислоты массовой долей 20 % (в присутствии следов белка появляется муть).
Метод количественного определения молочной кислоты с л-оксидифенилом основан на измерении интенсивности окраски соединения, образующегося в процессе реакции ацетальдегида с л-оксидифенилом в присутствии серной кислоты.
Белки удаляют осаждением трихлоруксусной кислотой, а углеводы — гидроксидом кальция в присутствии сульфата меди; уксусный альдегид, образующийся из молочной кислоты при нагревании с серной кислотой, дает в присутствии меди цветную реакцию с л-оксидифенилом (окрашивается в фиолетовый цвет).
Ацетальдегид образуется при нагревании молочной кислоты с минеральными кислотами. При его взаимодействии с двумя молекулами «-оксидифенила образуется 1,1-ди(оксидифенил)этан, который в присутствии H2SO4 окисляется в продукт фиолетового цвета с максимумом поглощения при длине волны 574 нм. Состав окрашенного производного неизвестен.
162
СНа'НОШ'ООН
СЖСНО + 2НО
1,1 - - дп(окспд11феш i.i )эт;ш
Метод позволяет определить молочную кислоту в количествах от 0.03 до 0,2 мкмоль в пробе.
1. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ ПО ЦВЕТНОЙ РЕАКЦИИ С ВЕРАТРОЛОМ
Материалы, реактивы и оборудование. Свежеприготовленный раствор метафосфорной кислоты массовой долей 5 %; насыщенный на холоде раствор медного купороса и затем разведенный водой в соотношении 1:1; растертый в порошок гидроксид кальция; раствор вератрола массовой долей 0,125 % в растворе этанола 96 об.%; концентрированная серная кислота (пригодность последней устанавливают по отсутствию желто-зеленой окраски при стоянии в течение нескольких минут смеси, состоящей из 3 см3 кислоты с 0,1 см3 спиртового раствора вератрола массовой долей 0,125 %); молочная кислота или лактаты (цинка, лития) для построения калибровочного графика; раствор сульфосалициловой кислоты массовой долей 20%; спиртовой раствор а-нафтола массовой долей 10%; колбы Эрленмейера вместимостью 50 см3; бумажные фильтры; стеклянные пробирки; штатив; микропипетки; спектрофотометр.
Подготовка проб. Мясо или мышечную ткань предварительно измельчают и помещают в стакан или бюкс с притертой крышкой. Навеску образца берут из стакана или бюкса по разнице масс с точностью до ±0,1 г и помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, в которую добавляют 40 см3 дистиллированной воды, закрывают пробкой и встряхивают в течение 5 мин для равномерного распределения мяса и жидкости. Затем в ту же колбу добавляют 10 см3 раствора свежеприготовленной метафосфорной кислоты массовой долей 5 %, хорошо встряхивают, доводят объем водой до метки и через 15 мин фильтруют.
163
Порядок проведения анализа. Фильтра! обьемом 10 см? помешают в колбочку Эрленмеиера вместимостью примерно 50см? и добавляю! к нему 2.5 см3 раствора медного купороса и 3 г растертого в порошок гидроксида кальция. Смесь должна приобрести интенсивный бирюзовый цвет. При зеленовато-голубой окраске, указывающей на недостаточную щелочную реакцию, добавляют еще небольшое количество гидроксида кальция. Смесь оставляют на 1 ч.
время от времени взбалтывая.
По истечении 1 ч жидкость отфильтровывают от осадка через бумажный фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. С целью проверки полноты осаждения углеводов проводят реакцию с а-нафтолом. Для этого несколько кубических сантиметров фильтрата помещают в пробирку, добавляют одну каплю раствора а-нафтола массовой долей 10% и наслаивают 1 см3 концентриро-
ванной серной кислоты, в присутствии сахара на границе появляется красно-фиолетовое кольцо. В случае положительной реакции измеряют количество фильтрата и вновь повторяют осаждение, используя уже половину объема раствора медного купороса и полови
ну гидроксида кальция по отношению к первоначальным объемам. Избыток медного купороса влияет на устойчивость окраски.
Для реакции с серной кислотой берут пипеткой точно отмеренный объем фильтрата, переносят в пробирку размером 30 х 200 мм из молибденового (или термоустойчивого) стекла. Как правило, берут 0,05—0,5 см3 фильтрата в зависимости от содержания мо-
лочной кислоты в мясе. Небольшие объемы фильтрата (0,05— 0,1 см3) отбирают микропипеткой. Если исследуют парное мясо, то для реакции можно использовать 0,5 см3 фильтрата если исследуют мясо после суточного созревания — 0,05—0,1 см3.
Если для анализа взято менее 0,5 см3 фильтрата, то его доводят дистиллированной водой до объема 0,5 см3. Пробирки помещают в
ледяную воду и по каплям при встряхивании приливают из микробюретки 3 см3 концентрированной серной кислоты. Затем пробирки помещают в водяную баню при температуре кипения на 4 мин (по секундомеру), после чего охлаждают в ледяной воде 2 мин.
Пробирки ставят в штатив и в каждую микропипеткой добавляют 0,1 см3 вератрола. По прошествии 20 мин измеряют оптическую плотность раствора, окрашенного в розовый цвет, на спектрофотометре при длине волны 520 нм по отношению к воде в кювете с толщиной слоя 1 см. Контрольный раствор готовят одновременно с опытным, заменяя фильтрат, содержащий молочную кислоту, соответствующим объемом воды. Измерение проводят также по отношению к воде.
Одновременно можно проводить анализ 5—6 проб мяса, что составит с параллельными определениями 10—12 пробирок.
Цветная реакция с вератролом достаточно устойчива. Фильтраты после осаждения белков можно хранить в холодильнике при 4 °C в течение нескольких дней.
164
При расчете из величины оптической плотности опытною раствора вычитают величину оптической плотности контрольного раствора. Затем по калибровочному графику находят концентрацию молочной кислоты в 3,6 см3 опытного раствора.
Построение калибровочного графика. Готовят стандартный раствор на основе молочной кислоты или ее солей (лактата лития или цинка), содержащий 0.25 мг молочной кислоты в 1 см3. Каждую из солей берут из расчета на молочную кислоту, например, при использовании лактата цинка (CH3CHOHCOO)?Zn навеску массой 169 мг растворяют в воле в мерной колбе вместимостью 500 см3.
Для построения графика готовят серию растворов. Рекомендуемые объемы раствора молочной кислоты для построения калибровочного графика приведены ниже.
Maccci молочной кислоты, мг	Объем, ем' расгвора молочной	|	oj, киоють1 кислоты	|
0,100	0,40	0,10	3,0
0,080	0.32	0,18	3,0
0.060	0,24	0,26	3,0
0,040	0.16	0,34	3,0
0,020	0,08	0,42	3.0
0,010	0,04	0,46	3,0
Опыты повторяют три раза. Каждый раз готовят новый стандартный раствор. Для всех растворов в пробирках каждой серии получают величины оптической плотности, по которым после вычитания показаний контрольного опыта (все спектральные измерения делают в сравнении с водой) строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации.
Содержание молочной кислоты (мг %) рассчитывают по формуле
п-12,5-100-100
V  10m
(1-31)
где а — содержание молочной кислоты в 3,6 см3 опытного раствора, мг; 12,5 — объем раствора, обработанный гидроксидом кальция, см3; 100 — объем, в кото-Ром содержится навеска мяса и лге/иа-фосфорная кислота; 100 — коэффициент перевода в проценты; V— объем фильтрата после осаждения углеводов, взятый на цветную реакцию, см3; 10 —объем фильтрата после осаждения белков л/е/иа-фосфорной кислотой, взятый на осаждение углеводов, см3; т — масса навески мяса, г.
165
2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ ПО ЦВЕТНОЙ РЕАКЦИИ С ЛАРА-ОКСИДИФЕНИЛОМ
Материалы, реактивы и оборудование. /7щ9<7-оксидифснил; гидроксид натрия (х. ч.); реактив /ш/л7-оксидифенила; растворы тиосульфата меди массовыми долями 4 и 20%; порошок гидроксида кальция; концентрированная серная кислота (х. ч.); водный раствор трихлоруксусной кислоты массовой долей 10 %; лактат цинка (или лития) или титрованная молочная кислота; центрифуга лабораторная; пробирки стеклянные; водяная баня; микробюретки; спектрофотометр (фотоэлектроколориметр).
Приготовление реактивов. Реактив пар a-о к с и д и ф е -н и л а: раствор лд/?«-оксидифенила массовой долей 1,5 % в растворе гидроксида натрия массовой долей 0,5 %.
Подготовка проб. При использовании качественной реакции с //я/>я-оксидифенилом в ступку вносят 10 см3 раствора трихлоруксусной кислоты массовой долей 10% и 2—4 г измельченного мяса и растирают его в течение 10 мин. Образовавшуюся суспензию переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, используя для этого сначала 20 см3 раствора трихлоруксусной кислоты массовой долей 10%, а затем несколько кубических сантиметров дистиллированной воды.
Колбу оставляют на 30 мин при комнатной температуре, встряхивая через каждые 10 мин, затем объем доводят дистиллированной водой до метки, колбу закрывают пробкой, хорошо перемешивают содержимое, переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют с частотой вращения 50 с-1 в течение 10—15 мин. Центрифугат сливают в сухую колбу, отбирают 25 см3 прозрачной жидкости, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и объем доводят дистиллированной водой до метки.
Порядок проведения анализа. Для осаждения углеводов к 2 см3 разбавленного центрифугата прибавляют 1 см3 раствора сульфата меди массовой долей 20 %, дистиллированной водой доводя объем жидкости до 10 см3, приливая воду пипеткой или из бюретки, добавляют 1 г растертого в порошок гидроксида кальция, энергично встряхивают, оставляют в покое на 30 мин, время от времени встряхивая, а затем центрифугируют. Центрифугат сливают в колбу.
Для проведения цветной реакции аликвотную часть (например, 1 см3 центрифугата) переносят в пробирку из молибденового стекла (или стекла пирекс) размером примерно 25 x 200 мм, добавляют 1 каплю раствора сульфата меди массовой долей 4 % и ставят в ледяную воду (обычно проводят ряд определений). При помешивании добавляют из микробюретки 6 см3 концентрированной серной кислоты, помещают пробирку на 5 мин в водяную баню при температуре кипения, после чего охлаждают в холодной воде до 20 °C.
166
В пробирку добавляют 0.1 см? раствора /ш/лт-оксидифенила. очень тщательно и осторожно перемешивают, после чего ставят пробирку на 30 мин в водяную баню при 30 °C. изредка слегка встряхивая. По прошествии этого срока пробирку помещают в сильно кипящую водяную баню на 90 с. затем охлаждают в холодной воде и измеряют интенсивность окраски, пользуясь спектрофотометром или фотоэлектроколориметром. В первом случае измерения проводят при длине волны 560 нм. во втором — со светофильтром с минимумом поглощения при той же длине волны. Прибор должен быть включен заранее, измерение проводят по отношению к контрольному раствору. Толщина кюветы 1 см.
Контрольный опыт с реактивами проводят, начиная с момента осаждения углеводов, для чего используют вместо 2 см3 центрифугата мышечной ткани 0,3 см3 раствора трихлоруксусной кислоты и 1,7 см3 дистиллированной воды. Строят калибровочный график.
Построение калибровочного графика. Для приготовления стандартного раствора можно пользоваться титрованным раствором молочной кислоты или растворами ее солей (цинковой, литиевой или другой). При использовании лактата лития навеску массой 133,3 мг переносят в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в 5 см3 серной кислоты, разбавленной в соотношении 1 : 10, объем доводят дистиллированной водой до метки (раствор № 1). 1 см3 раствора № 1 содержит 0,250 мг молочной кислоты. 20 см3 этого раствора пипеткой переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3, и объем доводят дистиллированной водой до метки (раствор № 2). 1 см3 раствора № 2 содержит 0,020 мг молочной кислоты.
Для построения графика готовят серию растворов. Рекомендуемые объемы раствора № 2 для построения калибровочного графика приведены ниже.
Масса молочной кислоты, мкг	Объем, см:	
	раствора № 2	воды
2	0,10	0,90
4	0,20	0,80
6	0.30	0,70
8	0,40	0,60
10	0,50	0,50
12	0,60	0,40
0	0	1.00
0	0	1,00
0	0	1,00
167
C ирт отопленными растворами проводят цветную реакцию. Измерение оптической плотности проводят но отношению к дистиллированной! воде. Среднюю арифметическую величину оптической плотности растворов последних трех пробирок (см. табл.) вычитают из величины оптической плотности каждого основного раствора. Данные наносят на миллиметровую бумагу, соединяя точки прямой линией.
По калибровочному графику находят концентрацию молочной кислоты в объеме раствора, взятом на цветную реакцию.
Содержание молочной кислоты в мясе (мг%) определяют по формуле
v_ с 10 100 -50 100
'	1.2.25,».100 ’	<'.32)
где с -- концентрация молочной кислоты, найденная по калибровочному графику в соответствии с полученной оптической плотностью, мг/см3; 10 —объем раствора при осаждении углеводов, см3; 100 — объем разбавленного центрифугата. см3; 50 — объем смеси при осаждении белков трихлоруксусной кислотой, см3; 100 — коэффициент перевода в проценты; 1 — объем раствора после осаждения углеводов, взятый для проведения цветной реакции, см3; объем разбавленного центрифугата, взятый для осаждения углеводов, см’; 25 — объем разбавленного центрифугата, взятый для разбавления, см3; т — масса навески мяса, г; 1000 — множитель для перевода в миллиграммы.
Ошибка метода составляет примерно ± 5 %.
Если точно следовать указанной методике, то можно пользоваться упрощенной формулой
Х= —-100.	(1.33)
т
Полученные экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы:
Объект	Метод определения	Оптическая плотность	Концентрация молочной кислоты по калибровочному графику, мг/см3	Содержание молочной кислоты, мг%
				
Проанализировав результаты, студенты должны сделать выводы о длительности хранения и глубине созревания мяса, сформулировать общее заключение по работе.
168
Лабораторная работа № 26
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕКТИНА В МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ
Цель работы. Приобрести практический навык определения пектина в мясопродуктах (или растениях).
Задачи. Получить и количественно определить растворимый пектин методом осаждения или фотометрически на основе качественной реакции.
Объекты исследования. Комбинированные (или лечебно-профилактические) мясопродукты, содержащие пектиновые вещества, а также различные источники пектиновых веществ (свекла, морковь, тыква, кабачки и т.д.).
Методические указания. В связи с актуальностью проблемы контроль количества балластных веществ, особенно при производстве комбинированных продуктов питания, приобретает особое значение.
В основе химической структуры пектиновых веществ лежит высокомолекулярная полигалактуроновая кислота, которая состоит из остатков галактуроновой кислоты, связанных кислородным мостиком между первым и четвертым углеродными атомами.
В растениях пектиновые вещества содержатся в виде протопектина, химическая природа которого еще недостаточно изучена. Полагают, что пектин связан с арабаном клеточной стенки, с целлюлозой и с ионами металлов; нерастворимый протопектин переходит в растворимый под влиянием разбавленных кислот или фермента протопектиназы. Растворимый пектин представляет собой сложный эфир полигалактуроновой кислоты и метилового спирта следующего строения:
СООСН,	СООСН;	соосн,
I	I	I
Растворимый пектин расщепляется разбавленными щелочами или при каталитическом воздействии фермента пектинэстеразы (пектазы). В результате гидролиза отщепляются метанол и пектиновая (полигалактуроновая) кислота. Пектиновая кислота расщепляется ферментом полигалактуроназой, в результате гидролиза которой образуется галактуроновая кислота.
169
В настоящей работе предлагается воспользоваться одним in двух методов определения пектина: путем осаждения по пектату кальция: по характерной для урановых кислот реакции с карбазолом в концентрированной серной кислоте. В первом случае предварительно проводят гидролиз пектиновых веществ с последующим осаждением полигалактуроновой кислоты в виде пектата кальция. Второй метод предусматривает действие концентрированной H2SO4 на пектиновые вещества с образованием фурфурола, который вступает во взаимодействие с карбазолом и образует окрашенное соединение. Применение бората способствует быстрому развитию окраски, повышая ее стабильность (сохраняется 16 ч), снижая влияние различных окислителей. Перед реакцией пектиновых веществ с карбазолом необходимо проводить деметоксилирование их раствором гидроксида натрия, что значительно повышает воспроизводимость и чувствительность анализа.
1.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕКТИНА ТЕРМОГРАВИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ПО ПЕКТАТУ КАЛЬЦИЯ
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор цитрата аммония массовой долей 10%; раствор NaOH молярной концентрацией 0,1 моль/дм3; раствор уксусной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3; раствор хлорида кальция молярной концентрацией 2 моль/дм3; раствор AgNO3 молярной концентрацией 0,1 моль/дм3; колбы Эрленмейера вместимостью 250 и 500 см3; фарфоровая ступка; мерные колбы вместимостью 500 см3; водяная баня; шюттель-аппарат; центрифуга; обратный холодильник; бумажные фильтры; бюксы; сушильный шкаф; аналитические весы.
Подготовка проб. 25 г свежего материала растирают с битым стеклом в ступке до совершенно однородной массы и переносят в колбу Эрленмейера, заливают 100 см3 воды, нагретой до 45 °C (не выше), и выдерживают (при периодическом взбалтывании) 30 мин при указанной температуре на водяной бане. Затем колбу плотно закрывают каучуковой пробкой и энергично взбалтывают в течение 15—20 мин в шюттель-аппарате. После этого содержимое колбы центрифугируют и собирают прозрачный раствор пектина, который исследуют на желеобразуюшую способность. В плотном остатке определяют количество нерастворимого пектина (протопектина). При определении протопектина плотный остаток подвергают дополнительной двукратной обработке водой; второй раз заливают 75 см3 дистиллированной воды, третий — 50—60 см3. Промывные воды используют для добавочного извлечения из них растворимого пектина. Растворимый пектин определяют пектатным методом. В остатке определяют протопектин.
170
Промытый плотный остаток количественно переносят в коническую колбу с 50 см' раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0.3 моль/дм'. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают в течение 30 мин на водяной бане при температуре кипения. Гидролизат центрифугируют. плотную часть промывают горячей водой. Центрифугат и промывные воды собирают в мерную колбу вместимостью 500 см3.
Твердый остаток вместе с фильтром количесгвенно переносят в коническую колбу и заливают 50—70 см3 цитрата аммония массовой долей 10 % и помещают на 30 мин в водяную баню при температуре кипения. Фильтруют в ту же мерную колбу (вместимостью 500 см3). осадок промывают горячей водой и охлаждают. Содержимое колбы доводят водой до метки. Полученная вытяжка содержит протопектин и используется для количественного анализа.
Порядок проведения анализа. В колбу Эрленмейера или химический стакан вместимостью 500 см3 отмеряют пипеткой Мора 25 см3 фильтрата и приливают 100 см3 раствора NaOH молярной концентрацией 0,1 моль/дм3. оставляют на 30 мин. За это время происходит омыление растворимого пектина, который переходит в натриевую соль пектиновой кислоты. Затем добавляют 50 см3 раствора уксусной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3 и получают свободную пектиновую (полигалактуро-новую) кислоту.
К полученной таким образом пектиновой кислоте через 5 мин прибавляют 50 см3 раствора хлорида кальция молярной концентрацией 2 моль/дм3 и оставляют на 1 ч. За это время выпадает осадок пектата кальция. Осадок промывают горячей водой на взвешенном фильтре до тех пор, пока не исчезнет реакция на хлор с каплей раствора AgNO3. Осадок вместе с фильтром помещают в бюкс и доводят до постоянной массы в сушильном шкафу при 100 °C.
При расчете массу осадка уменьшают на 8 %, т. е. вносят поправку на содержание в нем кальция. Содержание пектиновой кислоты (%) вычисляют по формуле
лИ-92 mV\
(1.34)
где а — масса пектата кальция. г; И—объем водного гидролизата протопектина (начальный объем водной вытяжки), см3; 92 — коэффициент пересчета в проценты (с поправкой на содержание кальция в пектате); т — масса навески исследуемого растительного материала, г; Г — объем фильтрата, взятого для омыления и осаждения в нем пектата кальция, см3.
Пример. Навеска моркови массой 50 г измельчена, перенесена в мерную колбу вместимостью 250 см3 и доведена водой до метки, т. е. получен объем И Для определения взято 25 см3 фильтрата (объем Г]). Масса пектата кальция после доведения до постоянной массы равна 0,0256 г.
171
Для определения массовой .толп пектина ('< ) полученные маннам лол--; линяю 1 в формулу
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕКТИНА ФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ПО РЕАКЦИИ С КАРБАЗОЛОМ
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор соляной кислоты молярной концентрацией 0,3 моль/дм3; раствор цитрата аммония массовой долей I %; раствор NaOH молярной концентрацией 0,05 моль/дм3; раствор НС1 молярной концентрацией 0,05 моль/дм3; концентрированная H?SO4; раствор карбазола массовой долей 2 % в абсолютном этаноле; галактуроно-вая кислота; ступка фарфоровая; колбы конические вместимостью 100—250 см3; мерные колбы вместимостью 25, 250, 500 см3; водяная баня; пробирки стеклянные; сосуды со льдом; спектрофотометр.
Подготовка проб. Навеску свежего продукта (плодов, овощей) массой 10 г тщательно растирают со стеклом в ступке до однородной массы, переносят водой в коническую колбу или центрифужные пробирки, добавляют около 100 см3 нагретой до 50 °C воды и оставляют на 30 мин на водяной бане (лучше энергично взбалтывать в течение 15—20 мин, после чего центрифугировать), сливают жидкость через фильтр в мерную колбу вместимостью 250 см3. Остаток повторно заливают водой, промывают фильтр и полученный фильтрат доводят водой до метки. Получают вытяжку водорастворимых пектиновых веществ.
Остаток из центрифужных пробирок переносят раствором НО молярной концентрацией 0,3 моль/дм3 в коническую колбу вместимостью 50 см3, закрывают пробкой с обратным холодильником и помещают на 10 мин в водяную баню при температуре кипения. После этого смесь фильтруют через складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 250 см3, остаток промывают несколькими порциями воды. Фильтр и осадок переносят в экстракционную колбу, заливают 50 см3 раствора цитрата аммония массовой долей 1 % и выдерживают 30 мин на водяной бане при температуре кипения. Затем все смывают водой в ту же мерную колбу, фильтрат охлаждают и доводят водой до метки. При этом получается вытяжка, которая содержит нерастворимый протопектин и пектиновую кислоту.
В дальнейшем оба раствора анализируют одинаково.
Порядок проведения анализа. Для метоксилирования отбирают по 10 см3 вытяжки в мерную колбу вместимостью 50 см3, добавля-172
ют 10 см' раствора NaOH молярной концентрацией 0,05 моль/дм? и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. после чего добавляют Нем- раствора НС1 молярной концентрацией 0,05 моль/дм3 и доводят водой до метки.
В три пробирки вместимостью 10 см3. помешенные в сосуды со льдом, отбирают по 0,5 см3 исследуемого экстракта и осторожно по каплям приливают 3 см3 концентрированной H2SO4 (не допуская перегрева смеси). Затем пробирки нагревают в течение 6 мин на водяной бане при температуре кипения и снова охлаждают льдом. В две пробирки добавляют по 0,1 см3 раствора карбазола массовой долей 2 % и все пробирки помещают на 10 мин в водяную баню при температуре кипения. После охлаждения измеряют оптическую плотность растворов в кювете слоем 0,5—1,0 см при длине волны 535 нм.
Контролем служит проба без карбазола.
Содержание пектиновых веществ рассчитывают по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Готовят стандартный раствор галактуроновой кислоты и используют для получения разведений, обеспечивающих концентрацию от 0,5 до 50 мкг/см3. Затем проводят окрашивание каждого из разбавленных растворов в условиях, описанных в методе, измеряют оптическую плотность при длине волны 532 нм в кювете слоем 0,5—1,0 см и строят график D
Полученные расчетные и экспериментальные данные рекомен- • дуется свести в таблицу:
Образец
Метод определения
Массовая доля молочной кислоты, %
Затем студенты должны самостоятельно сделать выводы и сформулировать заключение.
Лабораторная работа № 27
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ
Цель работы. Приобрести практический навык определения целлюлозы в комбинированных мясных продуктах и растительных материалах.
Задачи. Выделить целлюлозу (клетчатку) из образцов и рассчитать массовое содержание целлюлозы.
Объекты исследования. Мясорастительные продукты или растения.
Методические указания. Массовую долю целлюлозы определяют термогравиметрическим методом в двух вариантах.
173
Первый ; них (Bupnaii 1 А. И. Ермакова) основа!! на окис.киши и paciBopciiiii! ра личных bcihcci в. сон\ 1с гвуюпшх клетчатке. обработанных азо! нои кислоюй в л анонс и водным раствором щелочи. От.шчаен'я простотой. скоростью выполнения и достаточной точностью.
Сущность inoporo (вариант И. С. Лурье) сосюит в удалении кислого- и щелочерастворимых веществ и количественном определении остатка, который условно принимается за сырую клетчатку. Последняя содержит часть лигнина, гемицеллюлоз и пентозаны. В этом методе на результат анализа влияют многие факторы, поэтому для получения воспроизводимых результатов следует строго придерживаться описания метода.
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В МОДИФИКАЦИИ А. И. ЕРМАКОВА
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор гидроксида натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм3; раствор уксусной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3: раствор хлорида кальция молярной концентрацией 2 моль/дм3: смесь четырех объемов этанола с одним объемом азотной кислоты (относительной плотностью 1,4); эфир серный; раствор гидроксида натрия или калия массовой долей 1,25%.
Подготовка проб. При определении клетчатки в колбы вместимостью 200—300 см3 взвешивают по 1—3 г измельченного растительного продукта. Массу навески изменяют в зависимости от содержания в исследуемом материале целлюлозы. Если в растительном продукте массовая доля клетчатки 10—20 %, то берут навеску от 1,5 до 2 г, 40—50 % — от 1 до 1,3 г, менее 10 % — от 2,5 до 3 г.
Порядок проведения анализа. К навеске добавляют по 50 см3 смеси этанола и азотной кислоты, колбы соединяют с обратным холодильником на резиновой пробке и помещают на водяную баню при температуре кипения на 1 ч. Колбы в воду не погружают, кипение должно быть равномерным. По окончании нагревания дают осесть осадку, раствор декантируют на стеклянный фильтр, на поверхность которого насыпают 1—2 см3 мелкого толченого стекла и отсасывают. Фильтр вместе со стеклом перед фильтрованием предварительно просушивают. Жидкость декантируют очень осторожно, чтобы не взмутить осадка. К осадку, оставшемуся в колбе, прибавляют еще 50 см3 смеси этанола с кислотой и вновь нагревают в течение 30 мин. После вторичной декантации через тот же стеклянный фильтр осадок в колбе промывают маленькими порциями этанола (96 об.%). Затем к промытому осадку в колбе прибавляют 50 см3 гидроксида натрия массовой долей 1,25 % и смесь нагревают на плитке. Щелочной раствор вместе с осадком переносят на стеклянный фильтр, отсасывают и промы
174
вают два раза но 10— 15 см-1 горячей дистиллированной водой и 1—2 раза этанолом (96 об.9с). Стеклянный фильтр с чистой белой клетчаткой сушат до постоянной массы при 105 °C (обычно в течение 2 ч). Для ускорения сушки осадок после промывания этанолом рекомендуется промыть еще серным эфиром.
Массовую долю целлюлозы определяют по формуле
X = т1~ -юо.
т
где т, — масса сухого фильтра со стеклом и осадком целлюлозы, г; /ъ() •-- масса сухого фильтра со стеклом, г: т — масса навески объекта исследования, г.
Фильтрование следует вести в горячем состоянии, иначе образуются очень вязкие растворы. При замедлении фильтрования перемешивают стеклянный слой, который снимает с фильтровальной пластинки труднопроницаемый слой. Необходимо предотвращать просасывание воздуха через осадок, поэтому на фильтре всегда должен быть слой жидкости. Как только вся жидкость прошла через фильтр, отсасывание тотчас же прекращают. С целью наиболее полного удаления лигнина при обработке навески исследуемого материала к азотной кислоте добавляют раствор уксусной кислоты массовой долей 80 % и кристаллическую трихлоруксусную кислоту.
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В МОДИФИКАЦИИ И. С. ЛУРЬЕ
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор серной кислоты массовой долей 1,25 %; раствор гидроксида натрия или калия массовой долей 5 %; раствор соляной кислоты массовой долей 10 %; этанол ректификованный; эфир этиловый; стеклянные пипетки; водяная баня; фильтры бумажные; колбы Эр-ленмейера; стаканы; электрическая плита; водоструйный насос; стеклянная воронка.
Подготовка проб. При определении массовой доли сырой клетчатки навеску растительного препарата массой 2—3 г берут с точностью ± 0,01 г и помещают в стакан вместимостью 500 см3, на котором отмечен уровень 200 см3.
Порядок проведения анализа. В стакан с пробой помещают 200 см3 раствора серной кислоты массовой долей 1,25 %, ставят на плитку и содержимое доводят до кипения. Суспензию кипятят при постоянном перемешивании стеклянной палочкой в течение 30 мин. По мере выкипания жидкости уровень в стакане поддерживают приблизительно постоянным, периодически добавляя кипящую дистиллированную воду. Затем суспензии
175
дают отстояться. Далее, собрав установку (рис. 1.41). с помощью водоструйного насоса отсасывают еще горячую жидкость.
Стеклянную воронку 6 диаметром около 5 см обтягивают шелковой сеткой 7и наклеивают на нее смоченный в горячей воде кружок фильтровальной бумаги, равный диаметру воронки. Изогнутой стеклянной трубкой 4 и толстостенной резиновой трубкой 5 воронку соединяют с колбой 3 для фильтрования, которую, в свою очередь, присоединяют к водоструйному насосу 7 толстостенной резиновой трубкой 2. Как только фильтр плотно пристанет к шелковой сетке, воронку переворачивают фильтром вниз и осторожно вводят в
Рис.1.41. Установка для определения массовой доли клетчатки
стакан до соприкосновения с поверхностью горячей жидкости. Жидкость отсасывают до тех пор, пока ее высота над осадком не будет равна примерно 10 мм. После этого пинцетом снимают фильтр с воронки, переносят его на внутреннюю стенку стакана и струей горячей дистиллированной воды промывают фильтр и стенки стакана от приставших к ним частиц осадка. Удалив из стакана промытый фильтр, в стакан до метки наливают горячую дистиллированную воду, размешивают в ней осадок, дают отстояться и отсасывают воду через фильтр еще раз. Операцию отмывания горячей дистиллированной водой повторяют еще три раза, каждый раз меняя фильтр.
В стакан с промытым осадком отмеривают 50 см3 раствора гидроксида натрия или калия массовой долей 5 %, доливают кипящей дистиллированной водой до метки и кипятят в течение 30 мин. За
тем жидкость над осадком отсасывают и промывают еще два раза дистиллированной водой. После последнего отсасывания воды осадок переносят с помощью дистиллированной воды, подкисленной 2—3 каплями раствора соляной кислоты, на высушенный при температуре 100—105 °C и взвешенный фильтр. Осадок на фильтре промывают последовательно дистиллированной водой, этанолом и эфиром до тех пор, пока фильтрат не станет бесцветным. Фильтр с осадком высушивают в предварительно взвешенном бюксе в сушильном шкафу при температуре 100—105 °C до постоянной массы.
Массовую долю целлюлозы — клетчатки (%) рассчитывают по формуле
К = т{  100/т,	(1.36)
где /??] — масса остатка на фильтре, г; т — масса навески объекта исследования, г.
176
Полученные эксперимснзальные и расчетые данные рекомендуется представить в виде таблицы:
Образец
1 Ктюльлемый ж-тол
Массовая лота целлюлозы. сс
i
Затем студентам необходимо самостоятельно сформулировать выводы и сделать общие заключения по работе.
Лабораторная работа № 28 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ
Цель работы. Приобрести практический навык и освоить методы определения фосфорорганических соединений в мышечной ткани.
Задачи. Экстрагировать и определить массовую долю фосфорорганических соединений в анализируемых образцах на основании фотометрических методов.
Объекты исследования. Образцы мышечной ткани разных видов животных аналогичных анатомических участков на разных стадиях автолиза.
Методические указания. После убоя животного в мышечной ткани под воздействием ферментов органические фосфаты распадаются, в связи с чем уменьшается содержание органического фосфора и увеличивается количество более простых азотистых продуктов и неорганических фосфатов.
Фосфорорганические соединения входят в группу экстрактивных веществ и в технологии мясных продуктов являются пищевыми добавками, отвечающими за вкус. Важнейшими из них являются креатин, креатинфосфат и креатинин:
ОН
NH2
C=NH
N-CH3
СН2
СООН
Креатин
NH-Р=О
C=NH °Н
N—СН3
СН2
СООН
NH---
C=NH
N—СН3
сн2
со---
Креатинфосфат
Креатинин
177
К группе фосфорорганических соединении oiiiocaioi 1акжс АТФ и ее производные: АДФ. АМФ.
Принципы .методов определения фосфорсодержащих органических соединений основаны на способности неорганического фосфата давать цветные реакции.
Модифицированный кол ори.метрически и .метод Фиске — Су-барроу применяется при определении АТФ. креатининфосфата и других соединений.
Метод основан на измерении нарастания массовой концентрации неорганического фосфора в безбелковом фильтрате после кислотного гидролиза.
Неорганический фосфор определяют колориметрически. Суть метода состоит в том, что при обработке раствора, содержащего фосфор, молибдатом аммония в кислой среде образуется фосфор-номолибденовая кислота Н7| Р(Мо,О7)6].
Н3РО4 + ]2(NH4)MoO4 дй H7[P(Mo2O7)6| + (NH4)?SO4 + Н2О.
При взаимодействии с восстановителем фосфорномолибдено-вая кислота образует смесь комплексов, содержащих молибден в различных валентностях. Смесь растворима в воде и называется молибденовой синью.
Интенсивность синей окраски пропорциональна концентрации фосфора в растворе и может быть измерена фотоколориметрически.
Модификации метода связаны с применением различных восстановителей (амидола, аскорбиновой кислоты и др.) при соответствующей кислотности среды.
Приготовление реактивов. Раствор эйконогена массовой долей 0,25 % в 100 см3 воды растворяют 15 г NaHCO3, 0,5 г Na2CO3 и 0,25 г эйконогена. Раствор фильтруют, перед использованием разбавляют в 4 раза дистиллированной водой.
Подготовка проб. Образцы мышечной ткани помещают на 15— 20 мин в охлажденных металлических чашках в морозильную камеру холодильника, регулятор которого за 20—30 мин до начала опыта устанавливают на максимальный холод.
Из замороженной ткани готовят навески массой (1,0000 ± ± 0,0002) г и быстро растирают в предварительно охлажденных фарфоровых ступках с охлажденным кварцевым песком в соотношении 1 : 1(по массе). Гомогенат используют для определения АТФ и креатинфосфата.
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ АТФ
Материалы, реактивы и оборудование. Фарфоровая ступка с пестиком или гомогенизатор; кварцевый песок; штатив; пробирки центрифужные и мерные вместимостью 10 см3; настольная цент-178
рифуга: водяная баня: фотоэлскгроколоримшр: раствор зрихлор-уксусной кислоты (ТХУ) массовой долей 10 X; растворы ацетата ртути массовой долей 0.5 и 20 сс\ растворы соляной кислоты молярной концентрацией 0.1 и 2,0 моль/лмД спиртовые растворы фенолфталеина массовой долей 0.5 и 1 ci: раствор молибдата аммония массовой долей 2.5 % в растворе серной кислоты молярной концентрацией 2.5 и 5 моль/см3; раствор аскорбиновой кислоты массовой долей 0,1 %.
Порядок проведения анализа. Подготовленный образец помешают в мерную пробирку, доводят объем раствором трихлоруксусной кислоты массовой долей 10 % до метки, перемешивают, выдерживают 30 мин при (20 ± 5) °C и фильтруют через бумажный фильтр. В центрифужную пробирку помещают 2 см3 фильтрата, добавляют 0,5 см3 раствора ацетата ртути массовой долей 20 %, тщательно перемешивают и через 15 мин центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 50 с-1.
Надосадочную жидкость осторожно сливают, а осадок дважды промывают, добавляя по 2 см3 раствора ацетата ртути массовой долей 0,5 %. Полученный осадок растворяют в 1 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,1 моль/дм3, доводят дистиллированной водой до объема 3 см3 и тщательно перемешивают.
По 1 см3 полученной смеси помещают в две мерные пробирки вместимостью 10 см3. Первую пробирку используют для определения легкогидролизуемой фракции фосфора (ЛГФ), вторую — для определения неорганического фосфора (НФ). В первую пробирку добавляют I см3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 2 моль/дм3 и нагревают на водяной бане при температуре кипения в течение 7 мин, охлаждают, добавляют каплю фенолфталеина и нейтрализуют раствором гидроксида натрия молярной концентрацией 5 моль/дм3 до появления едва заметного розового окрашивания.
В обе пробирки вносят по 1,2 см3 раствора молибдата аммония массовой долей 2,5 % в растворе серной кислоты молярной концентрацией 2,5 моль/дм3 и по 1 см3 раствора аскорбиновой кислоты массовой долей 0,1 % (в методе Фиске—Субарроу в качестве восстановителя применяется 1-амино-2-нафтол-4-сульфоновая кислота или эйконоген), доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Через 20 мин содержимое каждой пробирки колориметрируют в фотоэлектроколориметре против каждой из контрольных проб при красном светофильтре (А. = 670 нм). Полученные значения оптической плотности фиксируют. Для расчета используют значения оптической плотности, соответствующие диапазону наибольшей чувствительности шкалы прибора. Количество АТФ определяют по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. Готовят стандартный раствор однозамещенного фосфата калия, 1 см3 которого содер-
179
Ain 0,025 Mi фосфора (0.1 u99 г КП JJ()4 помещаю! в мерную колбу вместимостью 1 дм1 и доводят объем дистиллированной водой до метки). В каждую из зрех мерных пробирок вместимостью Юсм; помещают 0,5; 1,0 и 2,0 см3 стандартного раствора КН?РО4 и проводя! те же реакции, что и для исследуемых проб. После развития специфического окрашивания растворы колориметрируют и строят график зависимости оптической плотности от концентрации н е о р г а н и ч е с к о г о ф о с ф о р а.
Массовую долю АТФ (мг%) рассчитывают по формуле
X = 10( £лгф« Ио ПЖЕнфШ V2K),	(1.37)
где 10 — коэффициент пересчета в мг%; £ЧГФ и £Нф — экстинкции проб при определении фракций соответственно лсгкогйдролизуемого и неорганического фосфора; а — масса фосфора в 10 см3 стандартного раствора, мкг; ф ~ объем исследуемого раствора, см3; ф — 10 см3; И, — объем исследуемого раствора после растворения осадка, см3; К = 3 см3; т — масса навески мышечной ткани, г; К, —объем исследуемого раствора, взятого для осаждения АТФ. см3; И2 = 2см3; И) — объем исследуемого раствора, взятый для колориметрирования, см3; К = 1 см3.’
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ КРЕАТИНФОСФАТА
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор ацетата ртути массовой долей 25 % в растворе уксусной кислоты массовой долей 2 %; раствор ТХУ массовой долей 6 %; раствор NH4OH массовой долей 10%; стандартный раствор КН2РО4, содержащий 2 мг фосфора в 1 см3 раствора (перед использованием разбавляют дистиллированной водой в 100 раз); раствор эйконогена массовой долей 0,25 %. Материалы и оборудование см. в п. 1 настоящей работы.
Порядок проведения анализа. В центрифужную пробирку помещают 2 см3 раствора ацетата ртути массовой долей 25 %, приготовленного на растворе уксусной кислоты массовой долей 2 %, и охлаждают ледяной смесью или в холодильнике.
К гомогенату мышечной ткани в охлажденной ступке добавляют 20 см3 охлажденного раствора ТХУ массовой долей 6 %, содержимое ступки перемешивают и выдерживают 5—7 мин.
Раствор фильтруют в предварительно охлажденные пробирки, 2 см3 прозрачного фильтрата переносят в подготовленную центрифужную пробирку с охлажденным раствором ацетата ртути, добавляют 1—2 капли раствора фенолфталеина и содержимое пробирки нейтрализуют раствором NH4OH массовой долей 10 % до появления слабого розового окрашивания, избегая добавления избытка аммиака. Пробирку оставляют на 15 мин в ледяной смеси (или холодильнике), периодически помешивая содержимое стеклянной палочкой, которую не вынимают из пробирки.
Параллельно готовят контрольную пробу в которой вместо трихлоруксусного фильтрата используют 2 см3 раствора ТХУ массовой долей 6 %.
180
Через 15 мин содержимое опытной и кон [рольной пробирок центрифугируют при частоте вращения 50 с 1 в течение 20 мин.
Надосадочную жидкость переносят в мерные колбы вместимостью 50 см3 и используют для определения креатинфосфата. В мерную колбу с надосадочной жидкостью из контрольной пробирки вносят 2 см3 стандартного раствора КН2РО4. Затем в обе колбы (опыт и контроль) одновременно добавляют по 2 см3 раствора молибдата аммония массовой долей 2,5 %, приготовленного на^ растворе серной кислоты концентрацией 5 моль/дм3, и 0,5 см3 раствора эйконогена (1 -амино-2-нафтол-сульфоновой кислоты).
Содержимое колб доводят дистиллированной водой до метки и через 30 мин фотоколориметрируют с красным светофильтром при А,= 670 нм против дистиллированной воды.
Массовую долю креатинфосфата (мг%) определяют по формуле
JT = (Пк2б - 100  20)/(Z)on/77 • 2),	(1.38)
где DK и Don — оптическая плотность соответственно контрольной и опытной проб; b — масса неорганического фосфора в 2 см3 стандартного раствора, мг; Ь = 0,04 мг; 100 — коэффициент для пересчета в мг%; 20 — объем раствора ТХУ. см3; т — масса исходной навески мышечной ткани, мг; 2 — объем фильтрата, взятый для исследования, см3.
После измерения оптической плотности окрашенных растворов фосфорорганических соединений выполняют расчеты, а результаты оформляют в виде таблицы. Самостоятельно формулируют выводы и общие замечания по работе.
Образец
Массовая доля в мышечной ткани, мг%		Выводы
АТФ	креатинфосфата	
		
Лабораторная работа № 29 ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ В МЯСЕ И МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ
Цель работы. Приобрести навык в освоении экспресс- и арбитражного методов определения массовой доли влаги в мясе и мясных продуктах
Задачи. Определить массовую долю влаги в мясе и мясных продуктах термогравиметрическим методом.
Объекты исследования. Мясо и мясные продукты различных ассортиментных групп, включая копченые, варено-копченые, вареные, фаршированные колбасы, мясные хлеба, сосиски, сардель
181
ки. продукты из свинины, оаранииы. говядины, мяса и гиды, других видов скота, зельцы. студни, паштеты, фаршевые консервы и т. д.
Материалы, реактивы и оборудование. Этанол: электрическая мясорубка с диаметром отверстий решетки от 3 до 4 мм: шкаф сушильный электрический с терморегулятором: сушильный аппарат САЛ; весы лабораторные: баня водяная: стаканчики для взвешивания (бюксы) или бюксы металлические диаметром 50 мм и высотой 25—35 мм: эксикатор; палочки стеклянные: предварительно обработанный песок речной или кварцевый; устройство Я10-ФВУ.
Методические указания. Влажность продуктов — весьма важный показатель при оценке качества мясных продуктов, который влияет на сохранность, выход, консистенцию и другие технологические характеристики. В аналитической практике применяются различные методы и их модификации, в основе которых лежит гравиметрическое определение.
Приготовление песка. Песок просеивают сначала через сито с диаметром отверстий 1,5 мм, а затем через сито с диаметром отверстий 0,3 мм, промывают водопроводной водой до тех пор, пока вода перестанет мутнеть. Затем песок заливают двойным объемом разбавленной (1:1) соляной кислоты и выдерживают в течение суток, периодически перемешивая. После обработки кислотой песок промывают водой до нейтральной реакции промывных вод на лакмус, высушивают при 150—160 °C до постоянной массы и хранят в закрытой склянке.
Подготовка проб. Пробы продуктов освобождают от оболочек и измельчают.
Пробы колбасных изделий, вареных, варено-копченых, копчено-запеченных, запеченных и жареных продуктов, фаршевых консервов, а также соленого бекона два раза измельчают на бытовой или электрической мясорубке и тщательно перемешивают.
Пробы сырокопченых колбас дважды измельчают на электрической мясорубке или нарезают острым ножом на круглые ломтики толщиной не более 1 мм, после чего их режут на полоски и рубят ножом так, чтобы размер частиц пробы не превышал 1 мм, все тщательно перемешивают.
Пробы паштетов, студней и зельцев измельчают на бытовой или электрической мясорубке один раз и тщательно перемешивают.
Подготовленную пробу помещают в стеклянную банку с притертой пробкой вместимостью 200—400 см3, заполнив ее полностью, и хранят при температуре от 3 до 5 °C в течение 24 ч.
182
1.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ (103 ±2) С
Порядок проведения анализа. В бюкс помешают песок в количестве. примерно в 2—3 раза превышающем навеску продукта, стеклянную палочку длиной немного большей диаметра бюкса (чтобы она нс мешала закрыть бюкс крышкой) и высушивают в сушильном шкафу в открытом бюксе при температуре (ЮЗ ± 2) °C в течение 30 мин. Затем бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Во взвешенный бюкс с песком вносят навеску продукта массой 5 г и повторно взвешивают. К содержимому приливают 5 см3 этанола и перемешивают стеклянной палочкой.
Помещают бюкс на водяную баню (80—-90 °C) и, помешивая палочкой, нагревают до исчезновения запаха этанола. Затем пробу высушивают в течение 2 ч в сушильном шкафу при температуре (103 ± 2) °C, охлаждают в эксикаторе и взвешивают.
Высушивание продолжают до постоянной массы. Каждое повторное взвешивание проводят после высушивания в течение 1ч при температуре (103 ±2) °C. Результаты двух последовательных взвешиваний не должны отличаться более чем на 0,1 % массы навески. Взвешивание проводят на весах с погрешностью не более ± 0,001 г. Массовую долю влаги рассчитывают по разнице массы проб:
где тх, т2 — масса бюкса с песком, стеклянной палочкой и навеской соответственно до и после высушивания, г; in — масса бюкса с песком и стеклянной палочкой после высушивания, г.
2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ (150 ±2) °C
Порядок проведения анализа. В бюкс помещают песок в количестве, примерно в 2—3 раза превышающем навеску продукта, стеклянную палочку и высушивают в сушильном шкафу при температуре (150 ±2) °C в течение 30 мин. Затем бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Далее в бюкс с песком вносят навеску продукта 3 г, взвешивают повторно, тщательно перемешивают с песком стеклянной палочкой и высушивают в сушильном шкафу в открытом бюксе при температуре (150 ± 2) °C в течение I ч. Затем бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Взвешивание проводят на весах с погрешностью не более 0,0002 г.
183
3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ В АППАРАТЕ САЛ
Порядок проведения анализа. Перед началом работы сушильный аппарат САЛ прогревают в течение 10—15 мин при напряжении 150—200 В. После прогрева ламп устанавливают напряжение 100—105 В. что обеспечивает температуру в зоне сушки 135-140 °C.
В бюкс помещают песок в количестве, примерно в 2—3 раза превышающем навеску продукта, стеклянную палочку длиной несколько большей диаметра бюкса (чтобы она не мешала закрыть бюкс крышкой) и высушивают в сушильном аппарате САЛ при температуре 135—140 °C в течение 10 мин. Затем бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Во взвешенный бюкс с песком вносят навеску продукта 2 г, повторно взвешивают и перемешивают стеклянной палочкой. Затем бюкс помешают в аппарат САЛ и высушивают при температуре 135—140 °C в течение 20 мин, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Взвешивание проводят на весах с погрешностью не более ± 0,0002 г.
Расчет ведут по формуле (1.39).
4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ В УСТРОЙСТВЕ Я10-ФВУ
Порядок проведения анализа. Во взвешенный со стеклянной палочкой бюкс вносят навеску продукта массой от 1,8 до 2,2 г, добавляют от 1,8 до 2,2 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают стеклянной палочкой, равномерно распределяя содержимое по дну бюкса. Открытый бюкс с пробой устанавливают в держателе 10 блока высушивания 8 устройства Я10-ФВУ (рис. 1.42) и высушивают 16—18 мин при температуре (163 ± 2) °C и скорости движения воздуха (3,6 ±0,1) м/с. Затем бюкс извлекают из блока высушивания, закрывают крышкой, помещают в одну из секций блока охлаждения 12, охлаждают в потоке воздуха комнатной температуры в течение 5—7 мин при скорости движения воздуха (5 ± 1) м/с и взвешивают. Результаты фиксируют с точностью до четвертого десятичного знака.
Массовую долю влаги (%) вычисляют по формуле
(тх — т2)  100 т} — т0
(1-40)
где Wj —масса бюкса с песком, палочкой и навеской до высушивания, г; т2 — масса бюкса с песком, палочкой и навеской после высушивания, г; /и0 — масса бюкса с песком и палочкой, г.
184
Рис. 1.42. Общий вид (я) и устройство аппарата Я10-ФВУ (б):
/ — таймер; 2—сигнальная лампа; 3, б. 7—тумблеры вентилятора и регуляторов температуры и электрической сети; 4, 5—регуляторы вентилятора и температуры; 8— блок высушивания; 9— нагреватель; I0--держатель бюкса в блоке высушивания; /7 —бюкс; 12— блок охлаждения; 13 — вентиляторы; 14— изолирующая перегородка; 75—диффузор
За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.
Расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 0,5 %. Окончательный результат вычисляют с точностью до 0,1 %.
Экспериментальные данные оформляют в виде таблицы, анализируют полученные результаты и формулируют заключение по работе.
Образец, источник получения
Способ и условия определения показателя
Массовая доля влаги, %
Лабораторная работа № 30
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ВОДЫ
Цель работы. Освоить метод определения активности воды (аы) в мясе и мясных продуктах.
Задачи. Закрепить представления о роли воды как важнейшего компонента биосистем мяса и мясопродуктов; экспериментально определить величину показателя аы для разных образцов мясного сырья, вторичных продуктов убоя, мясных продуктов.
185
3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ В АППАРАТЕ САЛ
Порядок проведения анализа. Перед началом работы сушильный аппарат САЛ прогревают в течение 10—15 мин при напряжении 150—200 В. После прогрева ламп устанавливают напряжение 100—105 В. что обеспечивает температуру в зоне сушки 135—140 °С.
В бюкс помещают песок в количестве, примерно в 2—3 раза превышающем навеску продукта, стеклянную палочку длиной несколько большей диаметра бюкса (чтобы она не мешала закрыть бюкс крышкой) и высушивают в сушильном аппарате САЛ при температуре 135—140 °C в течение 10 мин. Затем бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до комнатной температуры и взвешивают. Во взвешенный бюкс с песком вносят навеску продукта 2 г, повторно взвешивают и перемешивают стеклянной палочкой. Затем бюкс помешают в аппарат САЛ и высушивают при температуре 135—140 °C в течение 20 мин, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Взвешивание проводят на весах с погрешностью не более ± 0,0002 г.
Расчет ведут по формуле (1.39).
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ ВЫСУШИВАНИЕМ В УСТРОЙСТВЕ Я10-ФВУ
Порядок проведения анализа. Во взвешенный со стеклянной палочкой бюкс вносят навеску продукта массой от 1,8 до 2,2 г, добавляют от 1,8 до 2,2 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают стеклянной палочкой, равномерно распределяя содержимое по дну бюкса. Открытый бюкс с пробой устанавливают в держателе 10 блока высушивания 8 устройства Я10-ФВУ (рис. 1.42) и высушивают 16—18 мин при температуре (163 ± 2) °C и скорости движения воздуха (3,6 ±0,1) м/с. Затем бюкс извлекают из блока высушивания, закрывают крышкой, помещают в одну из секций блока охлаждения 12, охлаждают в потоке воздуха комнатной температуры в течение 5—7 мин при скорости движения воздуха (5 ± 1) м/с и взвешивают. Результаты фиксируют с точностью до четвертого десятичного знака.
Массовую долю влаги (%) вычисляют по формуле
(тх — т2)  100 т} — т0
(1-40)
где /г?) — масса бюкса с песком, палочкой и навеской до высушивания, г; — масса бюкса с песком, палочкой и навеской после высушивания, г; /и0 — масса бюкса с песком и палочкой, г.
184
Рис. 1.42. Общий вид (я) и устройство аппарата Я10-ФВУ (б):
/ — таймер; 2—сигнальная лампа; 3, б. 7—тумблеры вентилятора и регуляторов температуры и электрической сети; 4, 5—регуляторы вентилятора и температуры; 8— блок высушивания; 9— нагреватель; I0--держатель бюкса в блоке высушивания; /7 —бюкс; 72—блок охлаждения; 13 — вентиляторы; 14— изолирующая перегородка; 75—диффузор
За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.
Расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 0,5 %. Окончательный результат вычисляют с точностью до 0,1 %.
Экспериментальные данные оформляют в виде таблицы, анализируют полученные результаты и формулируют заключение по работе.
Образец, источник получения	Способ и условия определения показателя	Массовая доля влаги, %
		
Лабораторная работа № 30
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ВОДЫ
Цель работы. Освоить метод определения активности воды (аы) в мясе и мясных продуктах.
Задачи. Закрепить представления о роли воды как важнейшего компонента биосистем мяса и мясопродуктов; экспериментально определить величину показателя аы для разных образцов мясного сырья, вторичных продуктов убоя, мясных продуктов.
185
Сравнивают полученные результаты для различных видов мясных продуктов, самостоятельно формулирую! выводы и заключение по работе.
Контрольные вопросы и задания
1.	В чем состоят биологические функции белков'.’
2.	Какова технологическая функциональность белков в производстве мясных продуктов?
3.	Как разделяют белки мяса и мясопродуктов по морфологическому признаку клеток животных тканей?
4.	Охарактеризуйте фракционный состав белков мышц.
5.	Какие белки мышечной ткани относятся к водорастворимым, солерастворимым, щелочерастворимым?
6.	Каковы физико-химические свойства и структурные признаки белков различных фракций? Чем обусловлены их прижизненные функции и каково их пищевое значение?
7.	Какие функции выполняют миофибриллярные белки?
8.	Какова роль соединительнотканных белков в рационах?
9.	Как можно разделить основные белковые фракции мышечной ткани?
10.	Какие гистидинсодержащие дипептиды являются специфической составной частью скелетной мускулатуры? В чем заключаются их технологическое значение и влияние на пищевую ценность мяса и мясопродуктов?
11.	Каков морфологический и химический состав крови?
12.	Дайте биохимическую характеристику крови.
13.	Какое пищевое значение имеет кровь?
14.	Дайте характеристику гемоглобина.
15.	Каким способом можно выделить гемоглобин из крови?
16.	Какие методы определения белков применяют в аналитической практике? Дайте их сравнительную оценку, укажите преимущества и недостатки.
17.	Перечислите хроматографические методы определения белков и белковых веществ.
18.	В чем сущность анализа белков методами гель-хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии на бумаге, тонкослойной хроматографии?
19.	Какими методами можно определить свободные аминокислоты и связанные в структуре белков и пептидов?
20.	Каковы особенности подготовки проб для количественного определения аминокислот?
21.	Каковы биологические функции липидов?
22.	Охарактеризуйте методы практического определения суммарных липидов в животных тканях.
23.	В чем состоит принцип определения суммарных липидов методом Сокслета?
24.	Какова химическая природа холестерина? Ответ подтвердите структурной формулой, уравнениями реакций.
25.	В чем состоит сущность определения холестерина в животных тканях?
26.	Перечислите качественные реакции, характерные для холестерина.
27.	Охарактеризуйте физиологические функции стеролов (на примере холестерина).
28.	Почему необходимо контролировать содержание холестерина в рационах?
29.	Каковы прижизненные функции и технологическое значение гликогена и продуктов его распада?
30.	На чем основаны методы качественного и количественного определения гликогена, молочной кислоты?
188
31.	Назовите полисахариды. перспективные пая применения в технологии мясных продуктов обшего и специального назначения в качестве функциональных и физиологически активных добавок.
32.	Назовите важнейшие фосфорорганические соединения животных тканей. Какова их роль при жизни и в послсубойный период?
33.	Какими методами определяют фосфорорганические соединения?
34.	Перечислите и охарактеризуйте формы связи влаги в мясных продуктах.
35.	Какими методами можно определить массовую долю влаги в мясе и мясных продуктах?
36.	Что такое показатель активности воды9
37.	Как показатель активности воды можно использовать для прогнозирования стабильности свойств мяса и мясных продуктов при хранении?
Глава 2
ФИЗИЧЕСКИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНО-МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
В технологических процессах продукты подвергаются внешним воздействиям, интенсивность которых зависит от сопротивляемости сырья, т. е. его физических характеристик. Величины сопротивляемости особенно важны при проведении процессов с использованием высококонцентрированных источников энергии (инфракрасный и высокочастотный нагревы, высокоскоростная механическая обработка, ультразвук, обработка давлением и др.).
Характеристика продукта складывается из комплекса физических свойств. Отдельные свойства, например электропроводность, не отражают поведения материала даже в простейшем процессе электроконтактного нагрева. Поэтому для эффективного решения технологических задач необходимо знание динамики изменения структурно-механических, биохимических и других свойств продукта.
Всестороннее изучение свойств сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, т. е. одновременное исследование структурно-механических, физико-химических, электрофизических, биохимических, микробиологических, гистологических и других характеристик, необходимо при обязательной оценке пищевой ценности. Только путем сопоставления и совместного рассмотрения полученных данных можно получить ответ на вопрос о возможности применения на практике новых способов обработки животного сырья, имеющего столь сложный состав и пищевое назначение.
Комплексное исследование свойств мясопродуктов необходимо при обосновании новых физических способов обработки, позволяющих интенсифицировать, а в некоторых случаях и механизировать пассивные технологические процессы.
Особо важное значение приобретает изучение взаимосвязи и взаимовлияния, казалось бы, различных на первый взгляд характеристик. Так, нежность мяса принято характеризовать совокупностью механических свойств. В то же время изменение механических параметров мяса при его хранении зависит от тангенса угла диэлектрических потерь при частотах порядка 104— 105 Гц. Установлена взаимосвязь между структурно-механическими и электрофизическими (tgS и е) свойствами животного жира. При этом
190
наблюдается иодная аналогия характерных точек фазовых превращении при изменении температуры. Такие аналогии значительно облегчают исследование комплексных характеристик продукта, так как позволяют на основе знаний одних свойств делать прогнозы о характере изменения других, а также создавать приборы контроля и управления с обратной связью, основываясь. например, на измерении неэлектрических величин электрическими способами.
Использование комплекса физических методов позволяет по-новому решать ряд технологических проблем на более высокой ступени организации и интенсификации процессов, получить новые высококачественные продукты.
Физические свойства мясопродуктов лежат в основе разработки моделей взаимодействия энергетического поля с продуктом, создания безотходных технологий, высокопроизводительного оборудования, гибких автоматизированных производств, а также систем автоматического проектирования (САПР). Значительные различия численных значений физических величин обусловлены чрезвычайной сложностью строения и состава мяса, а также их нестабильностью вследствие биологического происхождения (порода, пол, возраст животного, степень автолиза, введение в мясопродукт различных ингредиентов при последующей обработке и т. д.). Эти различия достаточно велики. Они проявляются в ходе технологического процесса, когда продукт также претерпевает большие изменения. Так, пластические свойства мясного фарша в процессе термической обработки в результате коагуляционно-денатурационных изменений становятся упругими, в процессе посола резко увеличивается электропроводность и т. д.
Очень важно установить закономерности между численными значениями свойств и качественными показателями продукции как на конечных, так и на отдельных стадиях технологического процесса, применяя соответствующие методы исследования.
2.1.	ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Мясо и мясопродукты в связи со сложностью микроструктуры имеют большую оптическую плотность. Поглощение и рассеивание излучения определяются в основном четырьмя процессами: резонансным поглощением излучения молекулами сухого вещества, а также молекулами структурной и связанной влаги; рассеиванием излучения, обусловленным флуктуациями плотности вещества, а также рассеиванием излучения на молекулах белков, полисахаридов, ионах, на взвешенных коллоидных частицах, клетках, частицах пигментов на оптических неоднородностях — капиллярах и порах.
191
Оптические характеристики могут быть спектральными и интегральными. В первом случае они характеризуют явления, происходящие при определенной длине волны излучения л. во втором—для длин волн л = 0 - Для аналитических целей используют спектральные характеристики, для инженерной практики — интегральные.
Структура пищевых продуктов в большинстве случаев такова. что отражение от них является в основном диффузным (рассеянным во все стороны). Отражательную способность продукта можно изучать при помощи коэффициента отражения рл, который показывает отношение светового потока /у, отраженного исследуемым образцом, к световому потоку F\~ упавшему на образец:
рХ=С2//ф	(2.1)
Таким образом, определение коэффициента отражения сводится к определению отношения двух отсчетов по шкале измерительного прибора (гальванометра).
При исследовании диффузно отражательных образцов в качестве эталонов используют диффузно отражательные поверхности с известным спектральным коэффициентом отражения, например свеженапыленный оксид магния (полный коэффициент отражения 0,97—0,98).
Оптические свойства мяса играют весьма важную роль в оценке цветности. Объективно измерение цвета мяса служит для оценки его пригодности как сырья для переработки; качества готового продукта; правильности хода технологических процессов; дополнения или контроля правильности органолептических оценок.
В технологических исследованиях объективное измерение цвета чаще всего применяют в качестве второй по важности (после измерения активной кислотности) качественной проверки испытуемого образца. В исследованиях процессов, связанных с сохранением окраски (например, посол мяса), оно выдвигается на первое место.
Мясо имеет специфический цвет благодаря пигменту миоглобину. Все нормальные мышцы содержат миоглобин, но в разном количестве. Большая реактивность миоглобина проявляется в посмертный период, вследствие чего он может давать производные различного цвета. Схема этих превращений представлена на рис. 2.1.
Кроме миоглобина и его производных на цвет мяса влияет ряд других факторов, таких, как системы ахроматические и слабо поглощающие светлые лучи (внутритканевый жир, соединительная ткань); кислотность, изменяющаяся в период посмертного окоченения; поверхностная дегидратация и т. п.
192
Рис. 2.1. Схема взаимопревращений дериватов миоглобина
Для определения цвета продуктов в отраженном монохроматическом свете используют универсальный монохроматор УМ-2 и спектрофотометры. Измерение коэффициентов отражения при длинах волн 627, 635 и 650 нм дает возможность установить образование метмиоглобина.
Отношение оптических плотностей при определенных длинах волн ^545 /^650 и D582 /Z>652 в некоторых случаях (хранение в неправильных условиях, например смена температур) может указывать на изменения в окраске мяса. Величины D545 и Z)582 являются мерой интенсивности окраски мяса.
По отражению поверхности образца можно определить интенсивность окраски различных видов мяса, а также некоторых колбасных и других продуктов.
Неоднородность в строении мышечных волокон мяса ведет к различному поглощению звука отдельными элементами, т. е. наблюдается анизотропия затухания звука. Основными характеристиками акустического поля являются частота колебаний, скорость звука, амплитуда, волновое и удельное акустическое сопротивление среды, звуковое давление, интенсивность звука.
Удельное акустическое сопротивление является важным пара
193
метром — харакшри nei своишва срслв; но ошошснию к проходящей через нее волне:
рс~=р/и.	(2.2)
где р —плотность среды, кг/м-': с —скорость ивка, м/с; /> — jhvkoboc давление. МПа; и -- колебательная скорость, м/с.
Энергия звуковых колебаний, проходящая нормально к поверхности продукта через единицу площади за 1 с. является интенсивностью звука:
/=/>2/рг	(2.3)
Интенсивность звука оценивают по отношению к величине предела слышимости человеческого уха, г. е. определяют силу звука (дБ).
1 дБ = 101g (//ф),	(2.4)
где /п — предел слышимости, Вт/м2 (/ = 10~12 Вт/м2).
Поглощение звука в жидкостях обусловлено вязкостью среды, а также теплопроводностью. Полный коэффициент поглощения
а = аг+ае,	(2.5)
где щи щ — коэффициенты поглощения, обусловленные соответственно вязкостью и теплопроводностью среды.
Распространение звуковых волн в среде сопровождается потерями на рассеивание, которые внешне проявляются в повышении температуры среды (табл. 2.1).
Т а б л и ц а 2.1
Относительное повышение температуры продуктов при распространении звуковых волн
Продукт	Относительное повышение температуры, °C	Продукт	Относительное повышение температуры, °C
Яичный:		Жир	12,5
альбумин	1,0	Печень	4.5
коагулированный	1,0	Мозги	4,75
белок	—		
желток	5,5		
Примечание. Относительное повышение температуры яичного белка принято за единицу. Продолжительность обработки продуктов ультразвуком 30 с; /= 750 кГц; 100 Вт.
194
Аномальные отклонения коэффициент поглощения обнаружены при ультразвуковой обработке ряда органических и биологических жидкостей. Эти отклонения вызваны объемной вязкостью, являющейся функцией изменения объема в местах сжатия и расширения жидкости. При этом характер молекулярного поглощения энергии зависит от продолжительности восстановления равновесия молекулярных процессов за один полупериод колебания. Исключение составляет костная ткань, которая в диапазоне частот 500 кГц — 2 МГц не дает отклонений от классической теории.
Показатели поглощения и глубина проникновения для некоторых животных тканей при обработке частотой 1 МГц приведены в табл. 2.2.
Таблиц а 2.2
Акустические характеристики животных тканей
Продукт	а, м	1/с/, м	Продукт	(X. М’1	1/а, м
Вода	0,03	30,0	Печень	17	0,06
Плазма крови	0,7	1,3	Почки	22	0,05
Кровь	2.0	0,5	Жировая ткань	13	0,08
Скелетные мышцы	20-25	0,045	Костная ткань	302	0,0033
			(при частоте		
			800 кГц)		
Коэффициент поглощения зависит от частоты ультразвукового поля: линейно возрастает с увеличением частоты независимо от вида ткани, а при облучении суспензий линейно возрастает с увеличением концентрации. Кроме того, он зависит от диаметра частиц суспензии. Характерно, что наиболее резкое затухание колебаний наблюдается при размерах частиц 1 —Юмкм. Анизотропия поглощения ультразвука особенно сильно проявляется у тканей, состоящих из чередующихся слоев с различными свойствами (шкура, жировые прослойки и др.). В этом случае затухание акустической энергии зависит от направления ультразвука — вдоль или поперек слоев. Акустические характеристики различных животных тканей представлены в табл. 2.3.
Таблица 2.3
Удельное акустическое сопротивление животных тканей
Образец	Температура. °C	Скорость звука с 10’. м/с	Плотность р. кг/м’’	Удельное акустическое сопротивление р  с. Па  с/м
Ткань:				
мышечная (говядина)	16-20	1,575-1,578	1033-1048	1,79
жировая (свинина)	16-20	1,444	930	1,32
мозговая (свинина)	16-20	1,506	1026	1,55
Печень	16-20	1,553	1064	1,63
Кость (плотная масса)	16-20	3,37	185	6,23
195
2.2.	ТЕПЛОФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Аналитическая теория теплопроводности представляет собой теорию распространения теплоты в различных неравномерно нагретых телах, которые рассматриваются как сплошные среды, непрерывно заполняющие пространство, без учета молекулярного строения и молекулярных свойств вещества.
В соответствии с этим тела характеризуются так называемыми макросвойствами. К ним относятся коэффициенты теплопроводности и температуропроводности, удельная теплоемкость, объемная масса, вязкость вещества, коэффициенты диффузии и т. д.
Коэффициент температуропроводности а является основным тепловым параметром при неустановившемся во времени режиме. В этом случае наряду с коэффициентом теплопроводности X на распределение температуры в теле существенное влияние оказывают удельная теплоемкость с и плотность р, связанные между собой соотношением
«=V(cpp),	(2.6)
которое показывает, что коэффициент температуропроводности характеризует соотношение между двумя тепловыми свойствами тела: способностью проводить и аккумулировать теплоту.
Теплофизические свойства различных тел зависят от их химического состава, микроструктуры, пористости, влажности, предварительной термообработки, температуры и т. д.
Зависимость тепловых свойств веществ от большого количества взаимно связанных факторов делает эксперимент практически единственным источником получения данных для определения этих свойств. Одновременно с этим эксперимент является источником дополнительной информации о поведении веществ, что позволяет углубить существующие физические представления о механизмах переноса теплоты, поскольку они относятся обычно не к реальным телам, а к их идеализированным моделям. Модельные представления о веществе дают возможность построить соответствующие расчетные методы для определения некоторых тепловых свойств (рис. 2.2).
Рис. 2.2. Расчетные методы для определения тепловых свойств веществ
196
Большинство экспериментальных методов основывается на наблюдении за температурным полем в исследуемом теле при нагревании (охлаждении). Применительно к стационарным условиям используют закон Фурье
(2.7)
и дифференциальное уравнение теплопроводности для одномерного температурного поля
справедливое для тел, физические свойства которых не зависят от температуры,
где к — константа, численные значения которой определяются геометрической формой исследуемого тела; £=1.2, 3 соответственно для пластины, цилиндра и шара; г —температура; г—текущая координата; // — нормаль к изотермической поверхности.
Приведенные уравнения справедливы для твердых тел. Для жидкостей и газов они могут быть использованы, если отсутствуют другие способы переноса теплоты (конвекцией, излучением и т.д.). Эти уравнения не имеют общего решения. Получены их частные решения применительно к телам определенной геометрической формы при конкретно заданных условиях однозначности, которые и используются при постановке экспериментов.
Решив уравнения (2.7) и (2.8) для тел простой геометрической формы при граничных условиях первого рода, можно найти коэффициент теплопроводности из соотношения
где	—температуры на изотермических поверхностях, соответствующих
этим диаметрам; К— коэффициент формы, который выражается в виде зависимостей соответственно для неограниченных плоского и цилиндрического слоев исследуемого вещества. Его можно определить из соотношений:
(2.Ю)
(2.И)
где 5 —толщина плоского слоя, м; 5 = г2 — /^ (или 5 = .v2-.v1); Ер — расчетная
поверхность, нормальная к направлению теплового потока, м2; ф и ф — соответственно внутренний и наружный диаметры цилиндрического слоя исследуемого вещества, м; / — длина цилиндрического слоя, м.
197
При исследовании тепловых параметров методом нестационарного теплового потока используются решения дифференциальных уравнении, которые имеют вид
dQ
Эт
а/ J э2г к + \ c)t}
Ср — — л —~—г --------- —
Р Эт Э/-2 Г дг
(2.13)
На основной стадии процесса теплопроводности изменение температуры во времени приобретает упорядоченный характер и математически описывается более простыми функциями, чем на начальной стадии, так как изменение температуры в каждой точке тела перестает зависеть от начальных условий.
Теория теплопроводности на начальной стадии процесса позволяет из эксперимента найти одновременно несколько тепловых свойств. Теория теплопроводности на основной стадии процесса позволяет построить методики исследования для отдельных тепловых свойств и для их комплекса. Решения для этой стадии имеют различный вид в зависимости от рода граничных условий.
Метод нестационарной теплопроводности позволяет в ряде случаев проводить измерения при непрерывном изменении температуры до желаемого ее значения. Это дает возможность получить сразу непрерывный ряд значений измеряемого теплового параметра в широком диапазоне температур, в то время как во всех стационарных методах такой ряд может быть получен из отдельных опытов, соответствующих различным стационарным тепловым режимам, число которых обычно ограничено. Измерения тепловых параметров различных веществ проводят при относительно небольших перепадах температур, что приближает их средние значения к истинным. Поэтому нестационарные методы предпочтительны для исследования тепловых параметров влажных материалов.
К недостаткам нестационарных методов относятся трудности получения точно регулируемого во времени изменения температуры, а также учета соответствия действительных граничных условий эксперимента принятым в теории. Учесть подобное обстоятельство очень трудно, но более важно, чем в стационарных методах.
Методы исследования тепловых свойств при установившихся и неустановившихся тепловых режимах позволяют на основании одного опыта найти какой-либо один тепловой параметр. Если необходимо иметь данные по ряду физических свойств, то такой 198
комплекс физических параметров может быть получен путем комбинации двух пли нескольких приборов. Это связано с использованием нескольких образцов из исследуемого материала и трудностями сохранения идентичности свойств при их изготовлении, с увеличением погрешностей, а также затрат времени на проведение измерений. Поэтому в настоящее время стараются одновременно получить данные нескольких тепловых свойств из одного опыта, на одной установке и одном образце. Такие методы получили название комплексные, дающие наиболее полное представление о тепловых свойствах и поведении исследуемого вещества, кроме того, они позволяют сократить время на проведение экспериментов. Они могут базироваться на теориях начальной и основной стадий процессов нестационарной теплопроводности, на их совокупности, а также на процессах теплопроводности, протекающих в условиях установившихся тепловых режимов.
2.3.	ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Мясное сырье многокомпонентно, вариабельно по составу и свойствам, что значительно сказывается на качестве готовой продукции. В связи с этим особенно важное значение приобретает информация о функционально-технологических свойствах различных видов основного сырья и его компонентах, влиянии вспомогательных материалов и внешних факторов на характер их изменения.
Под функционально-технологическими свойствами (ФТС) мясного сырья понимают совокупность показателей, характеризующих уровни эмульгирующей, водосвязывающей, жиро-, водопоглощающей и гелеобразующей способностей, структурно-механические свойства (липкость, вязкость, пластичность и т. д.), сенсорные характеристики (цвет, вкус, запах), величину выхода и потерь при термообработке различных видов сырья и мясных систем. Перечисленные показатели имеют приоритетное значение при определении степени приемлемости мяса для производства пищевых продуктов.
Под функциональными свойствами изолированных белков принято понимать широкий комплекс физико-химических характеристик, определяющих их поведение при переработке и хранении, обеспечивающих желаемую структуру, технологические и потребительские свойства готовых продуктов.
Физическая структура и свойства не подвергнутого термической обработке мясного фарша близки к классическим эмульсиям.
В классическом определении под эмульсией понимают дисперсные системы с жидкой дисперсионной средой и жидкой дисперс-
199
Рис. 2.3. Типы водно-жировых’эмульсий: а — прямяя; б — обратная
ной фазой, диспергированные в коллоидном состоянии. Жир— неполярное вещество и плохо (на 0,5 %) растворимо в воде. Однако при определенных условиях (наличие эмульгаторов и стабилизаторов, высокие температуры, ультразвуковые и импульсные воздействия) в системах жир — вода могут образовываться водно-жировые эмульсии прямого (жир в воде) и обратного (вода в жире) типа (рис. 2.3).
Стойкость эмульсий во многом зависит от наличия в системе эмульгаторов — веществ, в состав которых входят полярные и неполярные группы.
В мясной эмульсии, образованной в результате интенсивного механического измельчения тканей, дисперсная система состоит из дисперсной фазы — гидратированных белковых мицелл и жировых частиц различных размеров и из дисперсионной среды — раствора белков и низкомолекулярных веществ. В мясной эмульсии белок и вода образуют матрицу, которая окружает жир, т. е. колбасный фарш — эмульсия жира в воде, при этом солерастворимые белки являются эмульгаторами и стабилизаторами эмульсии (рис. 2.4). Белки мышечных волокон по убыванию величины эмульгирующей способности (ЭС) располагаются в последовательности: актин (без NaCl), миозин, актомиозин, саркоплазматические белки, актин в растворе соли молярной концентрацией 0,3 моль/дм3.
Рис. 2.4. Схематическое изображение мясной эмульсии
200
Мясные эмульсин подобного рода относятся к коагуляционным структурам, частицы которых связаны силами межмолекулярного взаимодействия в единую пространственную сетку (каркас). Сопоставление ЭС различных высокомолекулярных веществ показывает, что во всех случаях они стабилизируют эмульсии, образуя трехмерные сетчатые структуры с близкими геометрическими свойствами. Стабилизация эмульсий, обусловленная особыми структурно-механическими свойствами адсорбционных межфазных слоев, может привести к повышению устойчивости этих дисперсных систем вплоть до полного фиксирования. Такая стабилизация носит универсальный характер и необходима при получении высокоустойчивых (особенно концентрированных) эмульсий.
При технологической обработке мясного сырья со свойствами белков связаны следующие взаимодействия: белок —белок (гелеобразование); белок —вода (набухание, водосвязывающая и жироудерживающая способности), а также поверхностно-активные свойства — образование и стабилизация пен и эмульсий.
Мясной фарш — сложная гетерогенная система, функциональные свойства которой зависят от соотношения тканей, содержания в них специфических белков, жиров, воды и морфологических компонентов.
В составе мяса мышечная ткань оказывает значительное влияние на ФТС, так как состоит из комплекса белков, имеющих структурные отличия. При получении мясопродуктов от функциональных свойств мышечных белков зависит эффективность образования мясных эмульсий. Количественное содержание белка в системе, его качественный состав, условия среды предопределяют степень стабильности получаемых мясных систем, влияют на уровень водосвязывающей, жиропоглощающей и эмульгирующей способности, структурно-механические и органолептические характеристики.
Количественное содержание наиболее важного функционального белка — миозина в мышечной ткани составляет 54—60 %. Его молекулы имеют выраженную ферментативную активность, легко взаимодействуют между собой и актином, обладают высокой водосвязывающей, гелеобразующей и эмульгирующей способностями.
На характер взаимодействия в системе белок — вода оказывают влияние такие факторы, как растворимость белковых систем, концентрация, вид, состав белка, степень нарушения нативной конформации, глубина денатурационных превращений, pH системы, наличие и концентрация солей в системе. Знание и направленное использование особенностей связывания влаги различным белок-содержащим сырьем позволяют прогнозировать и регулировать выход, уровень потерь влаги при термообработке и органолептические характеристики продукта.
201
Влагоудерживающая способность (ВУС). как и растворимость, одновременно зависит от степени взаимодействий как белков с водой, так и белка с белком, а также от конформации и степени денатурации белка. В связи с этим тепловая обработка оказывает сильное влияние на влагоудерживающую способность белков, что, в свою очередь, сказывается на массовом выходе готовых изделий.
В реальных многокомпонентных мясных системах поведение белка как основного стабилизирующего компонента рецептуры рассматривают во взаимосвязи как с другими компонентами (жир, вода, минеральные вещества, морфологические элементы), так и с изменяющимися в процессе технологической обработки сырья условиями среды.
При изготовлении вареных колбас, сосисок, сарделек, мясных хлебов для направленного регулирования ФТС мясных фаршевых систем кроме поваренной соли используют пищевые фосфаты — смеси различных солей фосфорной кислоты в количестве 0,3—0,4 % к массе фарша. Фосфаты действуют как синергисты поваренной соли, вызывая изменение величины pH среды, повышая ионную силу растворов и связывая ионы кальция в системе актомиозинового комплекса, обеспечивают интенсивное набухание мышечных белков, увеличивают уровень водосвязывающей, влагоудерживающей и эмульгирующей способностей.
Особенно эффективно использование фосфатов при переработке размороженного и тощего мяса, сырья с нарушениями нормального хода автолиза. В последние годы в связи с увеличением объемов мясного сырья с нарушениями нормального хода автолиза возникла необходимость расширения диапазона pH фосфатных препаратов, используемых в отечественной промышленности, с 6,9 до 9,0.
Экспериментально установлено, что вареные колбасы имеют в среднем приемлемое качество и удовлетворительную органолептическую оценку при устойчивости фаршевой эмульсии не ниже 85 %, влагоудерживающей способности — приблизительно 85 % общего содержания влаги в фарше, или около 90—92 % связанной влаги в сыром фарше, и жироудерживающей способности — на уровне 95 % содержания жира в фарше.
2.4.	СТРУКТУРНО-МЕХАНИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Структурно-механические (реологические) свойства характеризуют поведение мяса и мясопродуктов в условиях напряженного состояния, основными показателями которого при приложении силы являются напряжение, величина и скорость деформации. В зависимости от характера приложения усилий свойства делятся на сдвиговые (касательные напряжения), компрессионные
202
(нормальные напряжения растяжения -- сжатия) и поверхностные на границе раздела с другим магсриа.юм (нормальные и касательные).
В реальных условиях имеет месю сочоание всех свойств, в то же время в зависимости от направленности процесса превалирует одно из них.
Сдвиговые реологические свойства: предельное напряжение сдвига 0О (Па), вязкость эффективная (Па - с) и пластическая р (Па • с), период релаксации т (с) — наиболее полно отражают внутреннюю сущность объекта, поэтому их принято считать основными. С их помощью рассчит ывают течение продуктов в трубах, рабочих органах машин и аппаратов, определяют необходимые усилия для перемещения продукта, оценивают качество продукта, обосновывают оптимальные технологические условия процесса.
К основным компрессионным (объемным) свойствам относятся модуль упругости Е (Па), равновесный модуль ER (Па), период релаксации деформации при постоянном напряжении тф (с), относительная деформация е. Эти параметры необходимы для расчета процессов шприцевания, формования, дозирования и течения по трубопроводам пластично-вязких продуктов. Обьемные свойства можно также использовать для оценки качества пластично-вязких (фарши) и унругоэластичных (колбасные изделия) продуктов.
Особое место среди структурно-механических характеристик занимают поверхностные свойства (адгезия, коэффициент внешнего трения и др.). Они характеризуют усилие при взаимодействии между поверхностями контакта при нормальном отрыве или сдвиге. Для пищевых материалов различают три основных вида отрыва: адгезионный, когезионный и адгезионно-когезионный, или так называемый смешанный отрыв.
Поверхностные характеристики необходимы для выбора и разработки новых видов контактирующих материалов с продуктом для оборудования, тары, трубопроводов и т. д., поверхности которых должны обладать малой адгезией и минимальным сопротивлением при движении продукта. Кроме того, величины поверхностных свойств частично могут характеризовать консистенцию продукта.
Структурно-механические свойства отражают внутреннее строение (структуру) и состав вещества. Наиболее полно они характеризуют структуру, которая может быть коагуляционной и конденсационно-кристаллизационной. Для мясопродуктов наиболее распространен коагуляционный тип структуры, которая является следствием взаимодействия между частицами вещества на основе сил Ван-дер-Ваальса через дисперсионную среду. Структурам такого типа присуща тиксотропия, т. е. способность восстанавливать свои свойства после снятия напряжения или даже после
203
разрушения. Очевидно, что структурно-механические свойства коагуляционных систем значительно зависят от содержания воды, размеров частиц и прослоек, их физико-химических свойств. Для технологии особенно важна зависимость структурно-механических свойств от изменения размеров частиц, например при измельчении мяса в процессе приготовления колбасного фарша, и других факторов. С помощью приборов и оценки структурно-механических свойств мясных фаршей можно контролировать любую технологическую стадию и управлять качеством продукции.
Лабораторная работа № 1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦВЕТНОСТИ МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
Цель работы. Приобрести практический навык определения цветности мяса и мясных продуктов.
Задачи. Освоить методику определения цветности на монохроматоре путем снятия спектральных характеристик и расчета оптической плотности по коэффициенту отражения.
Объекты исследования. Образцы мышечной ткани различных анатомических участков разных видов животных и птицы неодинаковых сроков хранения, мясные продукты кулинарной готовности.
Материалы, реактивы и оборудование. Миллиметровая бумага; монохроматор УМ-2 (или спектрофотометр); ртутно-кварцевая лампа СВДШ-250.
Методические указания. Для исследования цветности мяса и мясных продуктов в отраженном свете используют монохроматор УМ-2 с лампой накаливания напряжением 12 В, мощностью 40 Вт и ахроматическим конденсором с фокусным расстоянием 90 мм. Напряжение стабилизируют феррорезонансным или электронным стабилизатором.
Монохроматор при снятии спектров отражения используют в комплекте со специальной приставкой, снабженной кольцевым селеновым фотоэлементом, эталоном сравнения и кюветами для измеряемых образцов диаметром 30 мм. Селеновый фотоэлемент воспринимает отраженный свет от эталона или измеряемого образца. Возникший поток измеряется зеркальным гальванометром.
Оптическая схема монохроматора приведена на рис. 2.5.
Свет, прошедший через входную щель, попадает на объектив коллиматора и параллельным пучком проходит через диспергирующую призму. Под углом 90° к падающему пучку света размещают выходную трубу монохроматора. При повороте призменного сто-
204
8
7
6 5 4
3
2 1
Рис. 2.5. Оптическая схема монохроматора:
/ — источник света; 2 — защитное стекло кожуха лампы; 3— конденсор; 4— защитное стекло входной щели; 5—призма сравнения; 6 —щель; 7—объектив коллиматора; 8 — диспергирующая призма; 9— объектив зрительной трубы; 10— съемная выходная щель; 11 — защитное стекло выходной щели
лика на различные углы относительно падающего пучка света в выходной щели получают свет различной длины волны, проходящий через призму при минимуме отклонения.
Патрубок со щелью можно заменить патрубком зрительной трубы со сменными окулярами. Первый патрубок применяют для выполнения измерений, второй — для градуировки прибора.
Фокусное расстояние объектива для каждой длины волны изменяется при помощи маховичка. Зависимость фокусировки от длины волны приведена в аттестате прибора.
Сменные фильтры в револьверной оправе предназначены для того, чтобы освещение указателя при работе в каждой области спектра производилось светом той же длины волны.
В качестве источника света при исследовании используют лампу накаливания; при градуировке применяют неоновую и ртутную лампы, прилагаемые к монохроматору.
Для измерений в отраженном свете к монохроматору необходимо присоединить специальное приспособление. Это может быть фотометрическая сфера или приставка с кольцевым селеновым фотоэлементом, которая более проста в изготовлении.
В качестве эталона для построения градуировочного графика и проведения анализа используют молочное стекло с известным коэффициентом отражения, откалиброванное по оксиду магния, или свежеприготовленный оксид магния.
Построение градуировочного графика. После крепления и установки на рельсы к монохроматору подсоединяют плато. Через трансформатор, находящийся на плато, подают питание лампочкам для освещения шкалы и указателя в патрубке зрительной трубы. На рельс перед входной щелью монохроматора устанавливают
205
Рис. 2.6. Градуировочный график к монохроматору
неоновую лампу мощностью 40 Вт и перед нею для проектирования источника света на щель монохроматора — ахроматический конденсор с фокусным расстоянием 90 мм.
('троят градуировочный график (рис. 2.6) на миллиметровой бумаге размером примерно 40x40 см. Графиком или таблицей. составленной по этому графику, пользуются при измерении исследуемых образцов.
Для построения градуировочного графика источник света рекомендуется установить на расстоянии 410 мм от плоскости щели, а первую плоскость конденсора -- на расстоянии 256 мм. Неоновую лампу включают в сеть переменного тока 127 В (в случае необходимости через трансформатор).
Ставят диафрагму в боковое продольное отверстие коллиматора, ограничивая высоту щели 2 мм. Наблюдают за тем, чтобы свет лампы хорошо заполнил входную щель, ширина которой должна быть 0,01—0,02 мм. Коллиматорную трубу монохроматора приводят в положение, указанное в аттестате прибора при длине волны 585,2 нм.
Для проведения градуировки в выходную трубу монохроматора вставляют патрубок зрительной трубы с одним из сменных окуляров. Указатель освещают через оранжевый светофильтр. В этой области спектра наблюдают линию неона (585,2 нм). Вращая барабан измерительного механизма и наблюдая в окуляр спектроскопа, приводят спектральную линию неона (585,2 нм) в центральное по
ложение, совместив ее с указателем в окуляре.
Если отсчет совпадает с данными, приведенными в аттестате монохроматора, то градуировочный график можно построить по аттестату. При расхождении результатов градуируют заново. Для этого после нескольких отсчетов неоновую лампу выключают и снимают, а на ее место ставят ртутно-кварцевую лампу евдш -250, подключают ее к плато и зажигают. Обращаться с включенной лампой нужно осторожно, так как давление в ней достигает 2,9 • 106 Па. Ширина входной щели должна быть приблизительно 0,01—0,02 мм, высота 2 мм. Центрируют источник света на рельсе без конденсора, затем устанавливают конденсор по центру так, чтобы объектив коллиматора был равномерно заполнен светом. За линиями ртути наблюдают через окуляр спектроскопа. Вращая барабан, приводят нужную спектральную линию в центральное положение, совмещая ее с указателем в окуляре. Для освещения указателя применяют соответствующий светофильтр. При подводе линии пользуются данными ат
206
тестата и дополнительно при необходимости справочной литературой. выбирая только сильные линии.
Подготовка проб. При определении цвета на монохроматоре УМ-2 мышечную ткань разрезают на ломтики толщиной 4—5 мм перпендикулярно направлению мышечного волокна. Из нарезанных ломтиков остро отточенным пробником вырезают образцы. Диаметр пробника должен быть равен диаметру кюветы (30 мм). Вырезанные образцы помещают в чашки Петри, закрывают и выдерживают в темноте не менее 10 мин. Небольшая выдержка образцов на воздухе необходима для превращения миоглобина в оксимиоглобин, а гемоглобина — в оксигемоглобин. В пределах от 10 мин до 4 ч пробы пригодны для измерения.
Для определения интенсивности окраски из каждой пробы мяса делают 4—5 срезов. В последующем среднеарифметическое измерение 4—5 срезов от каждый пробы является окончательным результатом определения. Для выполнения измерения образцы осторожно, не касаясь поверхности, переносят в кюветы, которые закрепляют в приставке.
При работе на спектрофотометре образцы готовят аналогично, используя пробник диаметром 48—50 мм (диаметр кювет 48 мм). Образцы помещают в металлические кюветы для измерения отражения.
Порядок проведения анализа. Для снятия спектральных кривых, характеризующих цветность исследуемого образца, измерения проводят в широкой области спектра через 2—3 нм в участках, где наблюдаются характерные изменения спектральной кривой, и через 5—10 нм в менее характерных участках. Для определения интенсивности окраски измерение проводят при одной, двух или трех длинах волн.
Ширину входной и выходной щелей можно изменять для разных длин волн, подбирая наиболее пригодные. Однако определенные затруднения в работе связаны с тем, что измерения на монохроматоре проводят в темном помещении. Постоянные щели значительно упрощают работу: приемлемая ширина выходной щели 0,1 мм и входной 0,2 мм при работе с приставкой с кольцевым селеновым фотоэлементом высотой 12 мм.
За 10 мин до начала определений включают источник света (лампу накаливания), лампочку осветителя гальванометра и осветительные лампочки на корпусе монохроматора. Перед выходной щелью устанавливают кювету с эталоном, снимают отсчет по шкале гальванометра. Затем на место кюветы с эталоном ставят кювету с испытуемым образцом и снова делают отсчет. После определения при одной длине волны микрометрическим винтом поворачивают барабан, устанавливают нужную длину волны и снова определяют отражение света эталоном и образцом.
При работе с шаровой приставкой и фотоэлектронным умножителем удобнее всего использовать ширину входной щели
207
Рис. 2.8. Кривые отражения некоторых мясных продуктов, снятые на спектрофотометре СФ-10:
1,2— копченая и вареная колбасы; 3 — яичный порошок; 4 — сыр Российский
Рис. 2.7. Кривые отражения среза мышечной ткани, снятые на спектрофотометре СФ-10:
1 — в процентах отражения; 2 — в единицах оптической плотности
0,1 мм, а выходной такую же или меньше. Последнюю подбирают после включения блока питания с гальванометром и установки эталона против отверстия шара.
В зависимости от отклонения светового указателя гальванометра ширину щели увеличивают, начиная примерно с 0,02 мм, до тех пор, пока указатель гальванометра не остановится на делении шкалы примерно 60—68. При вычислении коэффициента отражения предварительно из показаний, полученных для образца и эталона, вычитают показание, полученное для черного тела.
На основании характера спектральной кривой того или иного продукта выбирают 2—3 длины волны, при которых в дальнейшем измеряют интенсивность окраски (например, интенсивность окраски говяжьего мяса определяют при длинах волн 545, 582 и 650 нм).
Коэффициент отражения рх вычисляют путем деления числа, полученного при измерении образца, на число, полученное при измерении эталона для одной и той же длины волны и одних и тех же условий измерения. Коэффициент отражения получают по отношению к эталону. Зная отражение эталона, вводят поправку. Например, если коэффициент отражения эталона равен 0,85, то поправочный множитель будет 1,176.
Коэффициенты отражения, выраженные в процентах, переводят в оптическую плотность по формуле
П-1 100
й-lg—	(2.14)
208
Результаты оптической плотности выражают при длине волны 545 нм (D545) и 582 нм (Z)-82), а также в виде отношений
А45	As2
-----14 -----
Д55О	Дз50
(2.15)
Результаты оформляют в виде кривых отражения (или изменений оптической плотности), примеры которых показаны на рис. 2.7 и 2.8. Затем делают вычисления и по результатам составляют заключение по работе, сопоставляя данные с визуальной оценкой продуктов.
Лабораторная работа № 2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦВЕТНОСТИ ТВЕРДЫХ ЖИВОТНЫХ ЖИРОВ
Цель работы. Приобрести практический навык определения цветности животных жиров в отраженном свете на фотометре ФТ-2.
Задачи. Измерить отражательную способность образцов твердых животных жиров.
Объекты исследования. Твердые животные жиры разных видов.
Материалы, реактивы и оборудование. Спектрофотометр ФТ-2 или других аналогичных конструкций; лопатки из плексигласа.
Методические указания. Метод основан на фотометрическом измерении отражательной способности образцов жира. Перед началом работы фотометр включают в сеть для прогрева (примерно на 10 мин), после чего проверяют коэффициент яркости градуировочной пластины, являющейся промежуточным эталоном (если коэффициент яркости пластины был установлен не более чем за 3 дня до опыта, то пользуются имеющимися данными; если перерыв больше, то вновь делают проверку). Затем заполняют кювету исследуемым жиром и проводят определение.
В этом методе белизна образцов условно характеризуется величиной монохроматического коэффициента яркости в зеленой части спектра, т. е. в области высокой видимости (измерение со светофильтром с длиной волны 510 нм). Второе число показывает отношение отражения в двух участках спектра и как бы характеризует желтизну образца. Чем меньше отношение и выше показание при 510 нм, тем белее образец.
Пример. У образца 1 отражение света при светофильтре ^эф = 410 нм равно 47,1 %, при ^эф — 510 нм — 57,4 %, отношение отражений 1,22; у образца 2 — соответственно 72,2 %; 73,5 % и 1,02. Следовательно, образец 2 обладает большей белизной, чем образец 1.
209
Рис. 2.9. Кювета (7) и вкладыш (2) для измерения цветности жира
Подготовка проб. При определении цветности твердых животных жиров в отраженном свете на фотометре ФТ-2 образец жира должен иметь температуру около 20 °C. Его помещают в кювету (глубина кюветы 6 мм, диаметр 30 мм) из плексигласа (рис. 2.9) и лопаточкой из того же материала выравнивают поверхность. Если за 1—3 приема поверхность становится ровной, жир удаляют из кюветы и заменяют новой порцией того же образца. Многократное выравнивание поверхности в некоторых случаях может повлиять на достоверность результатов.
Если исследуют легкоплавкий жир, который при указанной температуре име
ет жидкую консистенцию, можно с некоторой степенью погрешности наполнить кювету жиром непосредственно после охлаждения в холодильнике. Все операции необходимо выполнять очень быстро.
Порядок проведения анализа. При измерении цветности свиного жира подготовленную кювету с исследуемым образцом помещают в кассету для отражающих образцов. Ручку «светофильтра» ставят против цифры, соответствующей светофильтру с эффективной длиной волны 410 нм, и проводят определение так, как это указано для отражающих образцов. После записи отсчета ручку переводят на цифру, соответствующую светофильтру с эффективной длиной волны 510 нм, и аналогично снимают показания, устанавливая прибор на нуль по показаниям градуировочной пластины для светофильтра с длиной волны 510 нм, снова снимают и записывают данные шкал трех правых ручек прибора.
Результаты, характеризующие цветность свиного жира, записывают в виде двух чисел, одно из которых является результатом измерения отражательной способности образца со светофильтром с эффективной длиной волны 510 нм, другое представляет собой отношение отражательной способности образца, измеренной со светофильтром ХЭф = 510 нм, к отражательной способности образца, определенной со светофильтром Лэф = 410 нм.
Поскольку в процессе хранения в холодильнике говяжий жир иногда приобретает зеленоватую окраску, дополнительно опреде
ляют интенсивность окраски как естественного, так и позеленев
шего жира.
При определении интенсивности окраски говяжьего жира измерение проводят со светофильтром с эффективной длиной волны 460 или 475 нм.
Кювету из плексигласа с образцом жира помещают в кассету для отражающих образцов. Ручку «светофильтра» ставят против
210
цифры, соответствующей светофильтру с эффективной длиной волны 460 нм, или против ручки, соответствующей светофильтру ХЭф = 475 нм, и измеряют, как указано выше. Полученный на шкалах трех правых ручек отсчет характеризует интенсивность окраски образца.
Различные образцы говяжьего жира характеризуются примерно следующими величинами отражения (%): интенсивно-желтый — 38, желтый — 47, светло-желтый — 54.
Для определения наличия в образце зеленоватого оттенка измерения проводят с двумя светофильтрами: с ХЭ()) = 460 нм и ХЭф = 440 нм или ХЭф = 475 нм и Хэф = 440нм. Метод определения такой же, как для свиного жира.
Полученные результаты выражают отношением показаний, полученных со светофильтрами 460/440 или со светофильтрами 475/440. В первом случае образцы жира с зеленоватым оттенком характеризуются отношением > 1, а желтые <1, во втором случае — зеленоватые образцы > 1,10, желтые < 1,10.
В табл. 2.4 приведены возможные показания при определении зеленоватого оттенка в ряде образцов говяжьего жира.
Таблица 2.4
Пример определения цветности говяжьего жира
Образец жира	Р4«/Рд4(|	Р4-5/Р440
Желтый	0,98	1,07
Желтый со слабым зеленоватым оттенком	1,01	1,И
Зеленый	1,05	1,15
После снятия спектральных кривых и расчетов делают выводы и формулируют заключение, сопоставляя данные с результатами визуальной оценки анализируемых жиров.
Лабораторная работа № 3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКУСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
Цель работы. Приобрести практический навык определения акустических свойств мяса и мясных продуктов.
Задачи. Подготовить пробы и определить скорость распространения и коэффициент поглощения ультразвука для мяса, мясных продуктов, вторичных продуктов убоя.
Объекты исследования. Образцы мышечной ткани различных анатомических участков разных видов убойных животных и птицы, вторичных продуктов убоя и мясопродуктов.
211
Материалы, реактивы и оборудование. Установка для определения акустических характеристик; нож.
Методические указания. Ультразвуковые и звуковые колебания представляют собой механические колебания упругой среды, распространяющиеся с определенной скоростью и обладающие известной энергией. Ультразвуками называются звуковые волны с частотами от 2 • 104 до 1013 Гп. Ультразвуки генерируются механическими и электромеханическими излучателями. Длина волны является важной характеристикой ультразвука и определяется расстоянием между двумя следующими друг за другом сгущениями или разрежениями при распространении акустических волн в среде.
Звуковые и ультразвуковые колебания нетождественны, так как с повышением частоты изменяются свойства упругих колебаний и соответственно их воздействие на вещество. Характерными свойствами ультразвуковых волн являются отражение, фокусирование и способность образовывать лучи. Ультразвуковые колебания обладают большой механической энергией, которая и определяет эффект их применения в промышленности.
Ультразвук применяется для интенсификации ряда технологических процессов в пищевой, в том числе мясной, промышленности: для эмульгирования, экстракции, диффузии и др.
Ультразвук перспективно применять для контрольно-измерительных целей. Изучение ультразвуковых свойств животных тканей также открывает перспективы применения ультразвука для комплексного (неразрушающего) контроля качества мяса и мясных продуктов на основе экспрессного получения информации об их химическом составе, структуре, механических и термодинамических свойствах. Применяемое излучение безвредно для продуктов, оборудование надежно, выполнено в портативном виде и доступно по цене.
К основным физическим величинам, измеряемым опытными образцами приборов, относятся скорость распространения и коэффициент поглощения ультразвука. Поглощение звука — явление необратимого перехода энергии звуковой волны в другие виды энергии, в частности тепло. Коэффициент поглощения звука а определяется как обратная величина того расстояния, на котором амплитуда звуковой волны падает в е раз.
Зависимость скорости распространения ультразвука в мясных продуктах от температуры, структуры, физиологического состояния и состава мышечной ткани открывает разнообразные возможности для исследования ряда показателей: массовой доли влаги и ее фазового состава, липидов, соотношения белок : жир и т. д.
Изучение эффекта ослабления ультразвука в животных тканях и сравнительная оценка коэффициента ослабления ультразвука, коррелирующего с его частотой, позволяют судить о диаметре мышечных волокон и других структурных характеристиках мяса и мясных продуктов.
212
3
Рис. 2.10. Принципиальная схема устройства для определения акустических характеристик продуктов:
/— генератор опорного сигнала; 2—юнератор сигнала низкой частоты; 3 — частотомер; 4 и б— соответственно излучающий и приемный электроакустические преобразователи; 5 — измерительная камера; 7— измеритель разности фаз (фазовый детектор)
Скорость распространения и коэффициент поглощения ультразвука в мясе и мясопродуктах измеряют с помощью устройства, принципиальная схема которого представлена на рис. 2.10.
Физическая сущность метода определения акустических свойств состоит в расчете скорости распространения ультразвука по сдвигу фаз между опорным сигналом и сигналом с приемного электроакустического преобразователя (рис. 2.11). С практической точки зрения удобно фиксировать не сдвиг фаз, а частоту, которая с большой точностью может быть определена частотомером. Подбором соответствующей частоты добиваются того, чтобы по длине измерительной ячейки /укладывалась одна волна (рис. 2.12), т. е. смещение фазы в точке В было бы равно нулю.
Рис. 2.11. Сдвиг фаз между опорным сигналом и сигналом с приемного электроакустического преобразователя:
с, — степень деформации; х, У — координаты
Рис. 2.12. Волновой процесс в измерительной ячейке:
с, — степень деформации; х — координата; / — длина ячейки; л —длина волны
213
Длина волны л связана со скоростью ультразвука v и его частотой v известным соотношением
(2.16)
Если длина измерительной ячейки прибора / = Л, то скорость ультразвука легко рассчитать, экспериментально определив его частоту и длину измерительной ячейки прибора, по формуле
V = V/.
(2.17)
Для практического определения коэффициента поглощения ультразвука в мясе и мясных продуктах используют зависимость длины волны ультразвука от коэффициента его поглощения в животных тканях, согласно которой коэффициент поглощения ос связан с величиной девиации частоты 5^ соотношением
5/п +в
(2.18)
где л—длина волны; В — постоянная, которая характеризует потери энергии, нс обусловленные поглощением ультразвука в исследуемом продукте.
Подготовка проб. Вырезают образцы мышечной ткани (вдоль и поперек волокон), субпродуктов, вторичных продуктов убоя в соответствии с размерами измерительной ячейки экспериментальной установки.
Порядок проведения анализа. Подготовленный образец помещают в измерительную ячейку прибора. Меняя частоту звуковых волн, определяют акустические характеристики исследуемых образцов мяса и мясопродуктов: рассчитывают скорость ультразвука v по формуле (2.17) и коэффициент поглощения ос по формуле (2.18).
Постоянную величину В определяют путем калибровки прибора по средам с известной скоростью ультразвука.
Результаты измерения и расчетов представляют в виде таблицы:
Наименование, краткая характеристика образца	Частота ультразвука, Гц (кГц)	Скорость ультразвука, м/с	Коэффициент поглощения ультразвука, м-'
			
214
Лабораторная работа № 4 ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕПЛОФИЗИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
Цель работы. Освоить методы и практически определить некоторые теплофизические свойства (теплопроводность, теплоемкость, температуропроводность) мяса и мясных продуктов.
Объекты исследования. Образцы мяса разных видов и сортов, вторичных продуктов убоя и мясных продуктов.
Материалы, реактивы и оборудование. Лабораторная установка для определения тсплофизических показателей: нож.
Методические указания. Рассмотрим систему тел, состоящую из полуограниченного цилиндра В (теплоприемника) и плоскопараллельных пластин Л/р А и Л/э (рис. 2.13). Начальная температура системы равна Го, температура'нагревателя /н постоянна. Один из спаев дифференциальной термопары помещен в теплоприемник, другой — в нагреватель. При этом начальное показание /Vo гальванометра (7, включенного в цепь термопары, соответствует разности температур tl{ -- Zo.
При соприкосновении нагревателя со свободной поверхностью системы температура в точке О системы начинает увеличиваться и показания гальванометра будут уменьшаться с течением времени т так, как это изображено на рис. 2.14. Изменение показаний N гальванометра G со временем т связано с изменением относительной температуры 6 в точке О системы соотношениями
где г— температура в точке О системы; tit — температура нагревателя.
Рис. 2.13. Схема измерительного стенда Для определения теплофизических характеристик
Рис. 2.14. График изменения разности температур нагревателя и теплоприемника в точке О
215
Если на рис. 2.13 h} = //2 = 0. т. е. система состоит юлько из одной исследуемой пластины А и теплонриемника В. то метод носит название метод двух временных точек.
Наиболее простое выражение для уравнения
О =./т.	(2.21)
описывающего процесс изменения относительной температуры 0 в точке О системы, будет получено в том случае, если точка О помещена на границе сред А и В. В этом случае уравнение (2.21) примет следующий вид:
0 = Z//H = (1 + сс) [ erfc (у) — aerfc (Зу) + ... | = В (а, у).	(2.22)
В уравнении (2.22)
= УГ«'	<2-24>
дУ’	<2'25)
у = WX	(2'26)
erfc (у) = 1 — erf (у),	(2.27)
где а — коэффициент температуропроводности исследуемого образца; с — безразмерный параметр, который определяют при помощи рабочих таблиц; /. — коэффициент теплопроводности исследуемого образца; т —время: 2 Г _ 2
erf(y) = -г )е  dy — интеграл Гаусса; — коэффициент теплопроводности ул о
теплонриемника; ah — коэффициент температуропроводности теплоприемни-ка; Л —толщина слоя исследуемого образца; Ь~ тепловая активность или теп-лоусвояемость,
b = x/Ja = jCX = Cja.	(2.28)
Как видно из рис. 2.13, один из спаев дифференциальной термопары размещен внутри системы, а другой — в нагревателе постоянной температуры /н. При этом показание NQ гальванометра G, включенного в цепь термопары, соответствует разности тем
216
ператур /и - г(|. При соприкосновении с нагревателем температура системы увеличивается, и показания гальванометра 6'уменьшаются. Измерение теплофизических характеристик сводится к фиксированию двух промежутков времени: Дт^т, —т, и Дт2 = т2 —т,_ соответствующих двум заданным изменениям показаний ’гальванометра: Л/V] = /V] — и ДЛ'2 = /Vj — Ли (см. рис. 2.14).
Полученные значения Ат, и Дт2 позволяют найти все теплофизические характеристики исследуемого материала.
Лабораторная установка (рис. 2.15) состоит из трех основных узлов: теплоприемника с исследуемым объектом, нагревателя и измерительной схемы, включающей термопару, гальванометр и реостат.
Теплоприемниками могут служить цилиндры из оргстекла, эбонита, резины, цемента, мрамора и т. д. Боковая поверхность теплоприемника должна иметь хорошую тепловую изоляцию.
Нагреватель должен обеспечивать постоянство температуры соприкасающейся с ним поверхности системы тел на протяжении всего эксперимента. Возможно применение различных типов нагревателей: закрытого водяного, открытого водяного, электрического и радиационного.
Закрытый водяной нагреватель представляет собой цилиндр, дно которого выполнено из меди толщиной 2—3 мм (рис. 2.16). Диаметр дна нагревателя должен быть несколько больше диаметра
Рис. 2.15. Схема экспериментальной установки:
7, 5—соответственно водяной и воздушный термостаты;
2 — теп.топриемник; 4 — исследуемый образен; 5— нагреватель; 6 — дифференциальная термопара; 7—гальванометр;
8 — реостат
217
те пл о приемника. Постоянство
4
Рис. 2.16. Закрытый водяной нагреватель
температуры в нем поддерживается струей воды, подаваемой из гермостата. Температура воды в термостате устанавливается на 10—15 °C выше температуры окружающей среды с помощью контактного термометра и поддерживается с точностью ± 0,05 °C. Найденные значения теплофизических характеристик в таком узком температурном интервале можно считать независящими от температуры.
Вода из термостата по трубе 7 поступает внутрь цилиндра и отдает свое тепло медному дну 6 нагревателя, затем выдавлива
ется через отверстия 5 в перегородке 4 и возвращается по трубе 3 обратно в термостат. Спай термопары расположен в закрытом патрубке 1. Прижимное устройство 2 обеспечивает тепловой контакт между соприкасающимися плоскостями системы.
Электрическая измерительная схема состоит из дифференциальной термопары, гальванометра и реостата, включенного последовательно с гальванометром и служащего для установления начального деления NQ прибора. Один спай дифференциальной термопары расположен в точке О системы, другой — в нагревателе постоянной температуры.
Подготовка проб. Для определения теплофизических характеристик используют образцы из мяса разных видов и сортов, вторичных продуктов убоя, мясных продуктов. Для подготовки проб вырезают образцы, форма и размер которых соответствуют размерам поверхности контакта теплоприемника в лабораторной установке.
Порядок проведения анализа. В кювету теплоприемника лабораторной установки помещают исследуемый образец мяса (мясопродукта). Выводят нагреватель на рабочий режим. С помощью секундомера фиксируют два промежутка времени:
Ati=t2~~ti	(2.29)
и
Дт2 = т3-Т1,
(2.29а)
соответствующие двум заданным изменениям показаний галь-218
ванометра:
Л/Vj = Л'! - N\
(2.30)
и
AN2 = N\~
Пользуясь полученными значениями Ат, и Ат9, рассчитывают теплофизические характеристики исследуемого образца.
Коэффициент температуропроводности
а —-------
4рАТ]
(2.32)
Коэффициент теплопроводности
bzh	bh Г
2у/рМ1	2
(2.33)
Объемная теплопроводность
X _ 2Ь^рМ^ а
h
Теплоусвояемость, или тепловая активность,
= Ье, 4а
(2.34)
(2.35)
где £ —постоянная теплоприемника. характеризующая его тепловую активность; р и е — безразмерные параметры, которые берут из рабочих таблиц, выражающих зависимость р и е от найденных в опыте значений АТ] и Дт2.
Рабочие таблицы составляются для фиксированных значений Nx/N0, N2/Nq, N./Nq и имеют вид
Лт2
Ат,
= /1(П
(2.36)
Дч
Ат,

(2.37)
Измеряя промежутки времени Ат, и Ат2 в соответствии с рабочей таблицей, т. е. в соответствии с фиксированными выбранны
219
ми значениями Л^/Л^, M,//Vo и Лп/Л^. находят значения параметров р и е, входящих в расчетные формулы.
Рекомендации по определению тепловой активности b теплоприемника и рабочие таблицы для определения безразмерных параметров р и е приведены ниже.
Определение тепловой активности теплоприемника. Формула для вычисления коэффициента температуропроводности не содержит постоянных, характеризующих прибор. Таким образом, метод определения коэффициента температуропроводности относится к абсолютным методам. В формулу, по которой вычисляется коэффициент теплопроводности, входит величина Ь, характеризующая тепловую активность теплоприемника. Для экспериментального определения постоянной величины b необходимо иметь эталонную пластинку, для которой известны либо значение ее коэффициента теплопроводности Хо, либо значение ее объемной теплоемкости Со = (ср)0, либо значение ее тепловой активности
(2.38)
Поместив в прибор эталонную пластинку А толщиной h и проводя измерения величин ДТ[ и Дт2 в соответствии с рабочей таблицей, пример которой приведен ниже, вычисляют искомое значение постоянной по одной из следующих формул:
b = 2Хох/рДт1  е/г	(2.39)
= (cl)oA • 2ел//?Дт1 b = Ь0/г.	(2.40) (2.41)
Таблица 2.5
Зависимости к г - /г(К); р = ft(K) для N}/No = 0,90; N2/N0 = 0,75;	= 0,50
к	£	Р	К	£	Р	К	£	Р
3,46	3,00	2,22	3,53	2,66	2,13	3,60	2,37	2,05
3,47	2,95	2,21	3,54	2,61	2,12	3,61	2,33	2,04
3,48	2,90	2,19	3,55	2,56	2,11	3,62	2,30	2,025
3,49	2,85	2,18	3,56	2,52	2,10	3,63	2,27	2,012
3,50	2,80	2,17	3,57	2,48	2,08	3,64	2,24	2,00
3,51	2,75	2,15	3,58	2,44	2,07	3,65	2,21	1,99
3,52	2,71	2,14	3,59	2,40	2,06	3,66	2,18	1,98
220
Продолжение
к	.  X. " .		. х	х. L ...		 ...		L _	К	Е	Р
3,67	2,17	1.97	4.12	1,40	1,615	4,96	0.909	1,20
3.68	2,12	1.96	4.13	1.39	1.61	4.98	0.902	1,195
3,69	2.09	1.95	4.14	1,38	1,60	5,00	0,895	1,185
3,70	2.08	1,94	4.15	1.37	1.59	5,02	0,888	1,18
3,71	2.03	1,93	4,16	1,36	1,59	5,04	0,881	1,17
3,72	2.00	1,92	4.17	1,35	1,58	5,06	0,874	1,16
3,73	1,97	1,91	4,18	1,34	1.575	5,08	0,867	1,16
3,74	1,95	1,90	4,19	1,33	1,57	5,10	0,860	1,15
3.75	1,92	1,89	4,20	1,32	1,56	5,12	0,854	1,14
3,76	1,90	1,88	4,22	1,30	1,55	5,14	0,84	1,135
3,77	1,88	1,87	4.24	1,29	1,54	5,16	0,842	1,13
3,78	1,86	1,86	4,26	1,27	1,53	5,18	0,836	1,12
3,79	1,84	1,85	4,28	1,26	1,52	5,20	0,83	1,115
3,80	1,82	1,84	4,30	1,25	1,51	5,22	0,824	1,01
3,81	1,80	1,83	4,32	1,23	1,49	5.24	0,818	1,10
3,82	1,79	1,825	4,34	1,2	1,48	5,26	0,812	1,09
3,83	1,77	1,82	4,36	1,20	1,47	5,28	0,806	1,09
3,84	1,75	1,815	4,38	1,19	1,46	5,30	0,800	1,08
3,85	1,74	1,81	4,40	1,18	1,45	5,32	0,792	1,07
3,86	1,72	1,80	4,42	1,17	1,44	5,34	0,784	1,06
3,87	1,71	1,79	4,44	1,16	1,43	5,36	0,776	1,05
3,88	1,70	1,78	4,46	1,15	1,42	5,38	0,766	1,039
3,89	1,68	1,775	4,48	1,14	1,42	5,40	0,760	1,032
3,90	1,67	1,77	4,50	1,13	1,41	5,42	0,756	1,027
3,91	1,66	1,765	4,52	1,12	1,40	5,44	0,752	1,021
3,92	1,65	1,76	4,54	1,10	1,39	5,46	0,748	1,015
3,93	1,63	1,75	4,56	1,09	1,38	5,50	0,740	1,005
3,94	1,62	1,74	4,58	1,08	1,37	5,52	0,736	1,00
3,95	1,60	1,735	4,60	1,07	1,36	5,54	0,732	0,995
3,96	1,59	1,73	4,62	1,06	1,35	5,56	0,728	0,99
3,97	1,58	1,725	4,64	1,05	1,34	5,58	0,724	0,98
3,98	1,57	1,72	4,68	1,03	1,32	5,60	0,720	0,97
3,99	1,55	1,71	4,70	1,02	1,31	5,62	0,715	0,97
4,00	1,54	1,70	4,72	1,00	1,30	5,64	0,710	0,96
4,01	1,53	1,69	4,74	1,00	1,29	5,66	0,705	0,96
4,02	1,52	1,68	4,76	0,99	1,28	5,68	0,700	0,95
4,03	1,50	1,675	4,78	0,98	1,27	5,70	0,695	0,942
4,04	1,49	1,67	4,80	0,97	1,26	5,72	0,691	0,94
4,05	1,48	1,66	4,82	0,962	1,25	5,74	0,687	0,93
4,06	1,47	1,65	4,84	0,954	1,245	5,76	0,683	0,93
4,07	1,45	1,64	4,86	0,946	1,24	5,78	0,679	0,92
4,08	1,44	1,635	4,88	0,938	1,23	5,80	0,675	0,91
4,09	1,43	1,63	4,90	0,93	1,22	5,82	0,671	0,91
4,10	1,42	1,625	4,92	0,923	1,22	5,84	0,667	0,90
4,11	1,41	1,62	4,94	0,916	1,21	5,86	0,663	0,89
221
Прода/жение
_ Л J		Р	.LE.	! Л .	!	К	.... [.... Е	! 	.1.	Р
5.88	0.659	0.89	6.50	0,540	0.71	7.35	0,392	0.45
5.90	0,655	0.88	6.55	0.530	0.69	7.40	0.385	0.44
5.92	0.651	0.88	6.60	0.520	0.67	7.45	0.378	0.42
5,94	0.647	0,87	6.65	0.510	0.66	7.50	0.37	0.41
5,96	0,643	0.86	6.75	0.490	0.63	7.55	0,36	0.40
5,98	0,639	0,86	6,80	0.485	0.62	7.60	0.35	0.38
6.00	0,635	0.85	6,85	0,477	0,60	7.65	0,345	0.37
6,05	0.625	084	6,90	0,470	0.59	7.70	0,34	0.36
6.10	0,615	0,82	6,95	0,460	0,57	7.75	0,33	0.35
6.15	0,608	0.81	7,00	0,450	0,55	7,80	0,32	0,33
6.20	0,600	0,80	7,05	0,440	0,54	7,85	0,31	0.31
6,25	0,590	0,78	7,10	0,430	0,52	7,90	0,30	0,29
6,30	0,580	0,77	7,15	0,425	0,51	7.95	0,29	0,28
6,35	0,570	0,75	7.20	0,420	0,50	8,00	0,28	0.26
6,40	0,560	0,74	7,25	0,410	0,48			
6,45	0,550	0,72	7,30	0,400	0,46			
Отметим, что если в качестве эталонной пластинки взять тонкий слой дистиллированной воды, объемную теплоемкость которой с достаточной степенью точности можно принять равной 4,19 • 106 Дж/(м3 • град), то определение коэффициента теплопроводности также является абсолютным.
Для вычисления коэффициента теплопроводности можно пользоваться зависимостью
р f Ат
г = 4= = Л Р = fy{K).	(2.42)
Результаты экспериментов оформляют в виде таблицы:
Наименование и характеристика образца	Номер опыта				Т..С	T2, с	Т„ С
							
Результаты расчетов оформляют также в виде таблицы рекомендуемой формы:
Наименование и характеристика образца	Дт,, с	Ат„ с	К — Ат,/Ат,	Е	р	а  10s. м2/с	X, Вт/(м • град)
							
222
Сопоставляют и анализируют полученные значения тепло-физических характеристик образцов мяса, субпродуктов I и II категорий и мясопродуктов; самостоятельно формулируют выводы по работе.
Лабораторная работа № 5
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОСТРУКТУРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МЯСА
Цель работы. Приобрести практический навык определения микроструктуры мяса на основе оптических методов.
Задачи. Подготовка ультратонких срезов мяса и прямое микроскопирование входящих в него тканей.
Объекты исследования. Образцы мышечной ткани разных видов убойных животных и птицы с фиксированным сроком хранения (рекомендуемые режимы хранения — температура 4 °C, относительная влажность воздуха 80 %).
Материалы, реактивы и оборудование. Нейтральный раствор формалина; спирт-ректификат объемной долей 50, 70, 96 % и абсолютный (безводный) этанол, смесь этанол — эфир (1:1); растворы целлоидина массовой долей 2, 6, 12 %, приготовленные на смеси спирта с эфиром; обезвоживающая жидкость; хлороформ; пихтовый бальзам; гематоксилин Эрлиха; водный (или спиртовой) раствор соляной кислоты массовой долей 1 %; раствор нашатырного спирта объемной долей 20—25 %; водный раствор эозина массовой долей 1 %; карбол-ксилол; смесь Ван-Гизона; судан III или IV; колбы или широкогорлые пробирки; банки с широкими горлами и притертыми пробками; деревянные кубики-колодки для наклеивания пропитанного целлоидином материала; микротом; микроскоп; фильтровальная бумага; предметное стекло; яичный белок с глицерином; препаровальная игла; покровное стекло.
Приготовление реактивов. Нейтральный раствор формалина. Для нейтрализации формалин наливают в стеклянную банку с притертой крышкой, на дно банки насыпают порошкообразный мел или магнезию (100 г на 1 дм3 формалина). Содержимое сосуда несколько раз взбалтывают. Через сутки формалин приобретает нейтральную реакцию. На практике исходный нейтральный раствор формалина принимают за 100%-ный и из него непосредственно перед фиксацией готовят необходимые рабочие растворы массовой долей 10 и 20% в соответствии с описанием метода. В качестве растворителя при этом используют водопроводную воду.
Растворы этанола (50 и 70 об.%). Чтобы получить раствор этанола с необходимой объемной долей спирта, исходный
223
спирт-ректификат (96 об.%) разбавляют дистиллированной водой до объема 100 см3. Необходимый для разведения объем исходного спирта определяют по формуле
где а — необходимая объемная доля спирта; b — исходная объемная доля спирта
Абсолютный спирт (безводный). Готовят из этанола объемной долей 96 % путем извлечения из него воды с помощью обезвоженного сульфата меди (выход абсолютного спирта составляет 70 %). Для обезвоживания кристаллический сульфат меди прокаливают в фарфоровой чашке, постоянно помешивая, до приобретения им белого цвета (можно пользоваться готовым безводным сульфатом меди). Прокаленный остывший сульфат меди засыпают в банку с широким горлом с раствором этанола (96 об.%) небольшими порциями (5 % к объему этанола), а затем подсыпают его в небольшом количестве ежедневно в течение 3—4суг до тех пор, пока сульфат меди перестанет менять цвет (останется белым). Приготовленный этанол хранят на осадке сульфата меди. Контроль проводят по признакам: порошок сульфата меди в абсолютном спирте не синеет, а при добавлении ксилола спирт остается прозрачным.
Растворы целлоидина массовой долей 4—6 и 8—12 %. Готовят из смеси абсолютного этанола и чистого (медицинского) эфира в соотношении 1:1. Используют отмытую от эмульсии кино- или рентгеновскую пленку на нитроцеллулоид-ной основе, которая почти не оставляет зольных остатков, после смывания с нее эмульсия прозрачна, имеет слегка желтоватый цвет и хорошо горит.
Для заливки материала в целлоидин в лаборатории необходимо иметь набор одинаковых банок с широкими горлами и притертыми пробками. Из них составляют рабочую батарею с растворами этанола объемными долями 50, 70, 96 и 100 %, со смесью спирта с эфиром, растворами целлоидина I (массовая доля 4—6 %) и II (массовая доля 8—12 %).
Деревянные кубики-колодки для наклеивания пропитанного целлоидином материала. Готовят, как правило, из березы или бука. Колодки подвергают предварительной обработке с целью извлечения дубильных и красящих веществ для обеспечения длительного хранения блоков с наклеенным материалом в растворе спирта объемной долей 70 %. Для этого колодки сначала в течение нескольких часов вываривают в растворе соды массовой долей 2 %, затем в течение нескольких недель или месяцев выдерживают в растворе этанола (70—96 об.%), периодически меняя его до тех пор, пока он не перестанет окрашиваться, и сушат в термостате.
224
Гематоксилин Эр л и х а. 20 см-1 раствора гематоксилина массовой долей 10 % в растворе этанола объемной долей 96 %, 80 см3 раствора этанола объемной долей 96 %, 100 см3 -глицерина, 100 см-1 дистиллированной воды. 3 см3 ледяной уксусной кислоты, 3 г алюмокалиевых квасцов помещают в банку с широким горлом вместимостью не менее 500 см3, завязывают марлей и оставляют на свету для созревания в течение недели.
Раствор эозина (массовой долей 0,25—0,5 %). Сухой эозин растворяют в воде или растворе этанола объемной долей от 40 до 70 %.
К а р б о л-к с и л о л. В теплом сосуде смешивают 1 часть кристаллической карболовой кислоты (температура плавления 42 °C) с 4—5 частями ксилола (или скипидара).
Смесь В а н-Г изона. Смесь гематоксилина Вейгарта с пикрофуксином.
Гематоксилин Вейгарта: смеси Вейгарта I и Вейгарта II.
Вейгарт I: раствор гематоксилина массовой долей 1 % в растворе этанола (96 об. %).
Вейгарт II: 4 см3 раствора FeCl^ • 6НЭО массовой долей 50 %, 1 см3 концентрированной соляной кислоты плотностью 1,15— 1,19 г/см3 и 9 см3 дистиллированной воды.
Судан III (IV). К 0,5 г сухого Судана прибавляют 100 см3 смеси, состоящей из раствора этанола (70 об.%) и ацетона, в соотношении 1:1, настаивают несколько дней при комнатной температуре, изредка взбалтывая, фильтруют и хранят в стеклянной таре.
Обезвоживающая жидкость. Может иметь один из рекомендуемых составов (см3): 1) раствор этанола (96 об.%) — 50; ацетон — 30; хлороформ — 10; эфир — 5; ледяная уксусная кислота —5; 2) этанол абсолютный — 60; ацетон — 20; хлороформ — 10; эфир — 10.
Методические указания. Метод разработан Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности и рекомендован как ускоренный при анализе мяса, который в сочетании с органолептическими показателями позволяет в течение 40—60 мин получить полное представление о состоянии, степени свежести и созревания мяса. В настоящее время внедрен ГОСТ 50372—92 «Мясо. Метод гистологического исследования». Он позволяет раньше, чем физико-химические и биохимические методы, судить об изменениях, происходящих в тканях мяса в процессе прижизненных изменений, технологической обработки и хранения. Результаты гистологического анализа отличаются высокой достоверностью и в ряде случаев могут быть дополнены данными физико-химических, биохимических, органолептических, микробиологических или других исследований.
Процесс гистологического исследования включает в себя следующие основные этапы: фиксацию образцов; подготовку проб к
225
изготовлению срезов тканей: изготовление срезов (микротоми-рование): окраску и помещение срезов под покровное стекло: микроскопию готовых препаратов и обработку результатов исследования.
Фиксация — обработка материала с целью сохранения тканевой структуры такой, какой она была во время отбора образца, и предотвращения ее дальнейших изменений. Чаще всего для этой цели используют формалин (раствор формальдегида массовой долей 40 %).
При фиксации материал промывают проточной водой. Это необходимо для удаления формалина перед дальнейшей обработкой, что обеспечивает равномерность дальнейшего окрашивания срезов.
Микротомирование необходимо для придания анализируемому материалу однородности и скрепления тканей. Обычно для этого используют замораживание (уплотняющая среда — замерзающая вода) или целлоидин. Заключение материала в целлоидин дает возможность получать более тонкие срезы, а также исследовать рыхлые, распадающиеся ткани.
Заключение срезов под покровное стекло предполагает предварительное окрашивание с целью оптического дифференцирования структурных элементов клеток и тканей. Для этого применяют различные красители, контрастные по цвету и избирательные к различным тканевым структурам. Различают два подхода к окрашиванию — прогрессивный (срезы обрабатывают красителем до момента их достаточного окрашивания) и регрессивный (срезы сначала перекрашивают, а затем избыток красителя удаляют). В практике чаще применяют регрессивный способ окраски. Окрашенные срезы исследуют под микроскопом.
Подготовка проб. Образцы размером 30x 30x 30 мм и массой 35—40 г берут от мясной туши, полутуши или ее части. Во время отбора образцов одновременно оценивают органолептическое состояние исследуемого мяса и фиксируют данные в тетради.
Образец вырезают острым ножом перпендикулярно поверхности (в глубь мышц), чтобы одна из сторон образца была наружной поверхностью туши или ее части, а другая — поверхностью разруба или разреза. При этом избегают сдавливания мышц, обмывания и очистки этих поверхностей, а также прикосновения к ним посторонних предметов или пальцев рук. Каждый образец подлежит маркировке.
Для быстрой фиксации материала вырезанные из образцов пробы помещают в небольшую колбу или широкую пробирку, заливают четырьмя или пятью объемами нейтрального водного раствора формалина (объемной долей 10—20 %) и подогревают на пламени горелки, не доводя до кипения. При появлении пузырьков воздуха подогрев прекращают, содержимое осторожно встряхивают и снова подогревают до появления пузырьков воздуха. Так
226
повторяют трижды (в течение 1—2 мин). Критерием окончательной фиксации проб служит одинаковый серый цвет кусочков как на поверхности, так и в центре. При комнатной температуре для полной фиксации требуется 18—24 ч.
Порядок проведения анализа. Из фиксированного материала вырезают небольшие кусочки размером 10x5x4 мм. толщина проб не должна превышать 4 мм, а объем обезвоживающей жидкости должен составлять не менее 15—20 см3 на одну пробу.
Последовательно обезвоживают пробы в растворах этанола объемными долями 50, 70, 96 % (два раза) и абсолютном спирте в течение 24 ч, а затем пропитывают раствором целлоидина массовой долей 4—6 % (I) в течение 6—10 сут или 8 — 12 % (II) — 3—5 сут.
По окончании пропитывания пробы наклеивают на кубики и уплотняют в парах хлороформа или эфира. Для этого материал из густого целлоидина переносят непосредственно на деревянные кубики (целлоидин берут с избытком) и помещают в эксикатор, куда одновременно ставят одну-две открытые банки с хлороформом. По окончании уплотнения (4—6 ч) блоки переносят для хранения в раствор спирта (70 об.%). Изготавливать срезы из материала, заключенного в целлоидин, желательно через 10—24 ч, но не раньше 3—4 ч после помещения блоков в спирт.
Для ускорения процесса пробы исследуемых материалов толщиной 2 мм фиксируют и одновременно обезвоживают при 37 °C последовательно в жидкостях: I — 1 ч, II—1,5 ч; в абсолютном спирте — 3 ч (первая порция — 1,5 ч, вторая — 1,5 ч), в смеси спирта и эфира — 30 мин. Затем пробы при той же температуре погружают в растворы целлоидина массовыми долями 2, 6 и 12 % на 18 ч каждый. Далее пробы наклеивают на деревянные кубики, подсушивают на воздухе в течение 20—40 мин и погружают для уплотнения в хлороформ на 30—40 мин. Хранят блоки в растворе спирта (70 об.%)
Для изготовления тонких срезов применяют специальный прибор-микротом, который состоит из станины, микроматричного устройства, держателей пробы и ножа. Микротом закрепляют на краю стола, слева устанавливают баллон с диоксидом углерода вертикально вентилем вниз. Перед началом резки открывают вентиль баллона. Держатель ножа перемещают в направлении к себе до отказа и опускают микротомный столик при помощи рукоятки микрометрического винта. Зафиксированную и промытую в воде пробу мяса кладут на столик микротома и обильно смачивают водой из пипетки. В держателе закрепляют микротомный нож и при помощи микрометрического винта поднимают предметный столик до соприкосновения образца мяса с ножом. Нож отводят от себя, прижимая образец к столику, и начинают его замораживать, выпуская диоксид углерода небольшими порциями. Объект замораживают до появления металлического звука при постукивании
227
по нему пинцетом или скальпелем. Краем ножа с одновременной подачей предметного столика при помощи микровинта вверх выравнивают поверхность образца. Затем нож возвращают в рабочее положение. Разрезание должно производиться средней частью лезвия ножа. Установив регулятор в положение 15 или ЗОмкм. приступают к изготовлению срезов в плоскости, параллельной продольной оси мышечных волокон.
Полученные срезы снимают с ножа кисточкой или пальцем в направлении к лезвию и переносят в кристаллизатор с водопроводной водой на несколько секунд для расправления. Под неповрежденный срез быстро подводят предметное стекло, обработанное яичным белком с глицерином для наклеивания, и извлекают срез из воды, удерживая его на середине стекла препаровальной иглой. Затем срез накрывают плотной сухой фильтровальной бумагой (три-четыре слоя) и, проглаживая бумагу ребром ладони, наклеивают срез на предметное стекло. Затем срезы окрашивают, обезвоживают, осветляют и заключают в бальзам под покровное стекло.
При использовании санного микротома целлоидиновый блок фиксируют на предметном столике специальным зажимом (продольная ось пробы должна располагаться параллельно продольной оси микротома). Нож устанавливают в держателе под острым углом микротома (обычно угол 13—15°). Предварительно рекомендуется выровнять поверхность целлоидинового блока. Нож и пробу во время разрезания постоянно смачивают раствором спирта (70 об.%). Полученные срезы кисточкой расправляют на микротомном ноже, перемещают его к краю и, подхватывая снизу, переносят в раствор спирта (70 об.%).
Для быстроты и экономии реактивов при окрашивании используют 8 биологических стеклянных стаканов вместимостью 40 см3 и высотой 85—90 мм с крышками, закрепленными в штативе. Переносить предметные стекла с наклеенными срезами следует аккуратно, чтобы не перенести раствор из одного стакана в другой. В ходе окраски срезы промывают водой в больших чашках-кристаллизаторах.
Срезы, фиксированные целлоидином или замороженные, окрашивают по одной схеме. При этом важно выдерживать последовательность и время обработки (мин): гематоксилин Эрлиха — 3—5; водопроводная вода — 1—2; водный или спиртовой (объемная доля этанола 70 об.%) раствор соляной кислоты массовой долей 1 % — 5—30; подкисленная аммиаком водопроводная вода (одна капля раствора нашатырного спирта объемной долей 10— 25 % на 100см3 воды—до приобретения срезом синего оттенка) — 2; водный раствор эозина массовой долей 1 % — 1; дистиллированная вода — 1; раствор спирта объемной долей 50 % — 1, 70 % — 1, 96 % — 1; карбол-ксилол — 1; ксилол — 1.
228
Окрашенные препараты микроскопируют. При этом фиксируют: ядра окрашены в темно-синий, светло-синий или лиловый цвет, мышечные волокна и соединительнотканные прослойки принимают различные тона красного или розового цвета.
При необходимости подробного изучения микроструктуры соединительных и жировой тканей используют избирательные методы окрашивания по Ван-Гизону и Судану (III или IV). Схемы представлены ниже.
Для соединительных тканей (метод Ван-Газона)'.
гематоксилин Вейгерта (Эрлиха) водопроводная вода смесь Ван-Гизона	3—5 мин 1 мин 5—10 мин
дистиллированная вода этанол (96 об.%) карбол-ксилол ксилол	1 мин 1 мин 1 мин 1 мин
Окрашенные срезы помещают под покровное стекло в пихтовый бальзам. В поле зрения наблюдают коллагеновые волокна, окрашенные в красный, протоплазму — в желтый, ядра — в коричневый или темно-синий цвет.
Для жаровой ткани'.
этанол (70 об.%)	0,5—1,0мин
судан III или IV	5,0—20,0 мин
Окрашенные срезы промывают водопроводной водой (10— 30 мин), помешают в гематоксилин Эрлиха или Майера (2— 3 мин).
Перекрашенные в гематоксилине срезы дифференцируют в водном растворе соляной кислоты массовой долей 1 % (до розового цвета) и промывают в водопроводной воде (20—30 мин), перекладывают в дистиллированную воду (3—5 мин), извлекают на предметное стекло, наносят капли глицерина или глицерин-жела-тина и накрывают покровным стеклом.
В результате окраски жир приобретает оранжево-красный цвет, ядра — темно-синий.
Исследование препарата начинают с его просмотра при небольшом увеличении, а затем применяют большее увеличение.
Наблюдая в микроскоп, устанавливают параллельно шкалы объект- и окуляр-микрометров и совмещают их нулевые отметки. Затем определяют, сколько делений объект-микрометра точно совпадает с делениями окуляр-микрометра.
229
Цену деления окуляр-микрометра определяют по формуле
ас т
Л/ =
(2.44)
где г/— отсчи! ан ное число деления по шкале объскт-микромс1ра: (.--известное значение одного деления шкалы объект-микрометра (Юмкмк /?---соответствующее число деления шкалы окуляр-микрометра.
П р и м с р. В 32 делениях объект-микрометра полностью укладывается 16 делений окуляр-микрометра: значение одного деления шкалы объект-микрометра известно: 0.01 мм или 10 мкм. Цена деления шкалы окуляр-микрометра составит
,, 3210 _А
М = -	=20 мкм.
16
Зная цену одного деления окуляр-микрометра при заданном увеличении, приступают к измерению объектов. При этом соответствующее длине измеряемого объекта число делений окуляр-микрометра необходимо умножить на 20 мкм (цена одного деления).
Составляют протокол гистологических исследований, в котором приводят зарисовки и характеристику микроструктуры проб. При этом обращают внимание на состояние мышечных волокон, клеточных ядер, соединительнотканных образований, выраженность исчерченности мышечного волокна. Полученные данные сопоставляют с данными органолептической оценки.
Лабораторная работа № 6
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛАГОСВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ(ВСС) МЯСА
Цель работы. Приобрести практический навык определения способности мяса и мясного сырья связывать воду.
Задачи. Подготовить модельный мясной фарш и определить его способность связывать воду методами прессования и центрифугирования.
Объекты исследования. Образцы мышечной ткани убойны,х животных (птицы) разных видов и сортов. В качестве объектов сравнения рекомендуется использовать образцы имеющих технологическое значение жировой, соединительной тканей с различных анатомических участков туши животных, вторичного мясного сырья (субпродукты II категории, мясо механической дообвалки и т. д.).
Материалы и оборудование. Груз массой 1 кг; планиметр; полиэтиленовые пробирки; центрифуга лабораторная; фильтровальная бумага; стеклянные палочки; стеклянные (или плексигласовые) пластинки.
230
Методические указания. На практике ВСС чаше всего определяют с помощью прессования или центрифугирования.
Метод прессования основан на выделении волы испытуемым образцом при легком его прессовании, сорбции выделяющейся воды фильтровальной бумагой и определении количества отделившейся влаги по плошали пятна, оставляемого ею на фильтровальной бумаге. Достоверность результатов обеспечивается трехкратной повторностью определений.
Метод центрифугирования основан на выделении жилкой фазы под действием центробежной силы из исследуемого объекта, находящегося в фиксированном положении. Количество последней зависит от степени взаимодействия влаги с «каркасной фазой» объекта. Метод условен. Достоверность результатов может быть обеспечена при грех-четырехкратной повторности определений.
По заданию преподавателя рекомендуется составить модельные композиции фарша из различных видов сырья.
Подготовка проб. Пробы мышечной ткани животных разных видов и сортов массой по 200—250 г отбирают в колбасном цехе на участке обвалки и жидовки мяса или жилуют в соответствии с нормируемыми показателями массового содержания соединительной ткани и жира.
При жиловке говядину любой упитанности разделяют на три сорта в зависимости от массовой доли соединительной ткани и жира. К высшему сорту относят мышечную ткань без жира и соединительной ткани; к I сорту — мышечную ткань, в которой допускается наличие соединительной ткани в виде пленок не более 6 % к массе мяса; ко II сорту — мышечную ткань, содержащую до 20 % соединительной ткани и жира.
При жиловке свинину разделяют в зависимости от массового содержания жировой ткани на три сорта: нежирную, содержащую не более 10% жировой ткани; полужирную — 30—50 % жировой ткани; жирную — более 50 % жировой ткани.
Пробы субпродуктов I и II категорий массой по 50—100 г отбирают в цехе обработки субпродуктов или на соответствующих участках цеха первичной обработки скота.
Жилованную говядину, свинину, субпродукты I и II категорий тщательно измельчают на волчке или мясорубке с диаметром отверстий решетки 2—3 мм; гомогенизаторе. Замороженное мясо механической обвалки (или дообвалки) предварительно размораживают.
1. МЕТОД ПРЕССОВАНИЯ
Порядок проведения анализа. При определении ВСС этим методом навеску мясного фарша массой 0,3 г взвешивают на торзионных весах на кружке из полиэтилена диаметром 15—20 мм (диаметр кружка должен быть равен диаметру чашки весов),
231
после чего ее переносят на беззольный фильтр, помещенный! на стеклянную или плексигласовую пластинку так. чтобы навеска оказалась под кружком.
Сверху навеску накрывают такой же пластинкой, что и нижнюю. устанавливают на нее груз массой 1 кг и выдерживают в течение 10 мин. После этого фильтр с навеской освобождают от груза и нижней пластинки, а затем карандашом очерчивают контур пятна вокруг спрессованного мяса.
Внешний контур вырисовывается при высыхании фильтровальной бумаги на воздухе. Площади пятен, образованных спрессованным мясом и адсорбированной влагой, измеряют планиметром.
Размер влажного пятна (внешнего) вычисляют по разности между общей площадью пятна и площадью пятна, образованного мясом. Экспериментально установлено, что 1 см2 площади влажного пятна фильтра соответствует 8,4 мг влаги.
Массовую долю связанной влаги в образце вычисляют по формулам
л-j = (Л7 — 8,45)  100/т(),	(2.45)
х2 = (./И- 8,45)  100/Л/,	(2.46)
где А'] —- массовая доля связанной влаги в мясном фарше, % к массе мяса: лз — го же, % к обшей влаге; М — общая масса влаги в навеске, мг; S — площадь влажного пятна, мг; /и0 —масса навески мяса, мг.
2. МЕТОД ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ
Порядок проведения анализа. При определении ВСС данным методом образцы мяса массой около 4 г помещают в полиэтиленовую пробирку с перфорированным вкладышем, укрепленным таким образом, чтобы был обеспечен необходимый зазор для стекания жидкости. Пробы центрифугируют в течение 20 мин при частоте вращения 100 с-1. После центрифугирования пробы взвешивают и к массе пробы добавляют массу веществ, содержащихся в отделенной центрифугированием жидкости. Эту массу веществ определяют высушиванием при 105 °C до постоянной массы. Для расчета количества связанной влаги необходимо иметь данные о содержании влаги в объекте.
Массовую долю связанной влаги (%) рассчитывают по формуле х= (//?, + т3 — т2)  1ОО//ио,	(2.47)
где т0, /«] — масса навески соответственно до и после центрифугирования, г;
— масса сухого остатка выделившейся жидкости, г; т2 — масса сухого остатка в навеске, г.
232
Экспериментальные данные рекомендуется оформить в виде таблицы:
Образец
Состав модельного фарша
ВСС. определенная по методу
прессования  центрифугирования
Сравнивая компонентный состав мясных фаршей, делают выводы и самостоятельно формулируют заключение по работе.
Лабораторная работа № 7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНЫХ ФАРШЕЙ
Цель работы. Приобрести практический навык определения ВУС, ЖУС, ЭС и СЭ в мясных системах.
Задачи. Подготовить модельные мясные фарши и определить ВУС, ЖУС, ЭС и СЭ гравиметрическими и рефрактометрическими методами.
Объекты исследования. Мясные фарши, составленные из различного мясного и немясного сырья в произвольных пропорциях.
Материалы, реактивы и оборудование. Молочный жиромер; стеклянные палочки; бюкс; сушильный шкаф; бумажный фильтр; фарфоровая ступка; прокаленный песок; а-монобромнафталин; складчатый бумажный фильтр; рефрактометр; консервные банки; водяные бани.
Методические указания. Влагоудерживающая способность мясного фарша определяется как разность между массовой долей влаги в фарше и количеством влаги, отделившейся в процессе термической обработки, а жироудерживающая способность — как разность между массовой долей жира в фарше и количеством жира, отделившимся в процессе термической обработки.
Отношение объема эмульгированного масла к общему его объему в системе называют эмульгирующей способностью. В это определение входит и понятие стабильности эмульсии, проявляющейся за промежуток времени, начиная от окончания эмульгирования до момента измерения при фиксированных условиях проведения эксперимента.
Устойчивость фарша характеризуется количеством влаги и жира, связанных фаршевой эмульсией, и определяется отношением массы выделившегося в процессе тепловой обработки бульона и жира к массе фарша, взятого на исследование.
Возможность последовательного определения в одной навеске нескольких функциональных показателей (метод Р. М. Салавату-
233
линой и др.) позволяет снизить погрешность за счет неоднородности химическою состава и лабильности свойств сырья. При этом определение и расчет устойчивости фаршевой эмульсии, ВУС и ЖУС по массе фактически связанных компонентов фаршевой эмульсии производится в условиях, максимально приближенных к производственным. Мегодика отличается просто!ой и высокой воспроизводимостью результатов.
Подготовка проб. Осуществляется в соответствии с рекомендациям!! к лабораторной работе № 6.
1.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЛАГО УДЕРЖИВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ
Порядок проведения анализа. Навеску тщательно измельченного мяса массой 4—6 г равномерно наносят стеклянной палочкой на внутреннюю поверхность широкой части молочного жиромера. Его плотно закрывают пробкой и помещают узкой частью вниз на водяную баню при температуре кипения на 15 мин, после чего определяют массу выделившейся влаги по числу делений на шкале жиромера.
Влагоудерживающая способность мяса (%)
ВУС=В-ВВС,	(2.48)
влаговыделяющая способность мяса (%)
ВВС^ши-1 • 100,	(2.49)
где В — общая массовая доля влаги в навеске, %; а — цена деления жиромера: а = 0,01 смп — число делений на шкале жиромера; т — масса навески, г.
2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРОУДЕРЖИВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ
Порядок проведения анализа. Предварительно рассчитывают ВВС по п. 1, находят массу мяса, оставшегося в жиромере, с точностью ± 0,0001 г. Мясо помещают в бюкс и высушивают до постоянной массы при температуре 150 °C в течение 1,5 ч. После высушивания берут навеску массой (2,0000 ± 0,0002) г, помещают в фарфоровую ступку, куда добавляют 2,5 г (1,6 см3) мелкого прокаленного песка и 6 г (4,3 см3) а-монобромнафталина. Содержимое ступки тщательно растирают в течение 4 мин и фильтруют через складчатый бумажный фильтр.
Испытуемый раствор (3—4 капли) равномерно наносят стеклянной палочкой на нижнюю призму рефрактометра. Призмы закрывают, скрепляют винтом. Луч света направляют при по-234
моши зеркала на призму рефрактометра, устанавливая зрительную трубу так. чтобы были отчетливо видны пересекающиеся нити (алиала). Алиалу передвигают io iex пор. пока граница между освещенной и темной частями нс совпадет с точкой пересечения нитей, отсчитывают показатель преломления. Одновременно определяют показатель преломления а-мо-нобромнафталина.
Определения повторяют несколько раз. используя при расчете средние данные.
Жироудерживающая способность мяса (О)
ЖУС -	 100.	(2.50)
где у, — массовая доля жира в навеске после термообработки. '7; g, - ю же. до термообработки, Ы.
Массовая доля жира в навеске (%)
у --- 11 04(x(/7j - //-,)/??[| /т.	(2.51)
где а — коэффициент, характеризующий такое содержание жира в растворителе, которое изменяет показатель преломления на 0.0001 %; /у и //, -- показатели преломления соответственно чистого растворителя и испытуемого раствора; — масса 4,3 см3 о.-монобромнафталина, г; ш — масса навески, i.
Коэффициент о. устанавливают опытным путем при сопоставлении результатов определения массовой доли жира методами Сокслета и рефрактометрическим.
а = £ф/(104Д<	(2.52)
уф = (т • 100)/тр,	(2.53)
где £ф — массовая доля жира в фильтрате. %; Ал — разность между показателями преломления чистого растворителя и испытуемого фильтрата; т — масса жира в навеске, определенная в аппарате Сокслета, г; /?/ —масса навески растворителя, г.
Коэффициент о. для некоторых продуктов приведен ниже.
Продукт Мясной порошок Сосиски: свиные русские Колбаса ливерная	Коэффициент а 0,0470 0.0375 0.0369 0,0394 235
3.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭМУЛЬГИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ И СТАБИЛЬНОСТИ ЭМУЛЬСИИ
Порядок проведения анализа. Навеску измельченного мяса массой 7 г суспензируют в 100 см3 воды в гомогенизаторе (или миксере) при частоте вращения 66,6 с~' в течение 60 с. Затем добавляют 100 см3 рафинированного подсолнечного масла и смесь эмульгируют в гомогенизаторе или миксере при частоте вращения 1500 с-1 в течение 5 мин. После этого эмульсию разливают в 4 калиброванные центрифужные пробирки вместимостью по 50 см3 и центрифугируют при 500 с 1 в течение 10 мин. Далее определяют объем эмульгированного масла.
Эмульгирующая способность (%)
ЭС = уЬ100,	(2.54)
где И,—объем эмульгированного масла, см3; И—общий объем масла, см3.
Стабильность эмульсии определяют путем нагревания при температуре 80 °C в течение 30 мин и охлаждения водой в течение 15 мин. Затем заполняют эмульсией 4 калиброванные центрифужные пробирки вместимостью по 50 см3 и центрифугируют при частоте вращения 500 с-1 в течение 5 мин. Далее определяют объем эмульгированного слоя.
Стабильность эмульсии (%)
СЭ = ~-100,	(2.55)
где И, — объем эмульгированного масла, см3; И2 — общий объем эмульсии, см3.
4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЛАГО- И ЖИРОУДЕРЖИВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТЕЙ И УСТОЙЧИВОСТИ ФАРШЕВОЙ ЭМУЛЬСИИ В ОДНОЙ НАВЕСКЕ (МЕТОД Р. М. САЛАВАТУЛИНОЙ и др.)
Порядок проведения анализа. Образцы фарша массой 180—200 г, помещенные в герметично закрытые консервные банки № 3, взвешивают и подвергают тепловой обработке при режимах, соответствующих производственным (варка в водяной бане при температуре 78—80 °C в течение 1 ч, охлаждение в проточной воде до температуры 12—15 °C).
Затем консервные банки вскрывают, выделившийся бульон и скопившийся жир переносят в предварительно взвешенные алюминиевые бюксы. После удаления бульона и жира фарш промокают фильтровальной бумагой и взвешивают.
236
Бюксы с бульоном помещают в сушильный шкаф и сушат до постоянной массы при 103—105 °C. Определяют массовую долю влаги, выделившейся при тепловой обработке фарша, и влагоудерживающую способность фарша.
Из бюксов с остатками бульона и жира экстрагируют жир 10— 15 см3 растворителя (смесь хлороформа с этанолом в соотношении 1 : 2). Экстрагирование жира проводят в течение 3—4 мин с трехчетырехкратной повторностью. Установив массовую долю оставшегося жира после тепловой обработки фарша, рассчитывают жироудерживающую способность.
Устойчивость фаршевой эмульсии (% к массе фарша)
т — птг.,
УЭ = .	-100;	(2.56)
т
т
УЭ = —-100;	(2.57)
т
т = т6н-тб;	(2.58)
(2.59) где т — масса навески фарша, г; —масса всего отделившегося бульона с жиром, г; /пс — масса сгустка фарша после термообработки, г; /ибн — масса герметизированной консервной банки с навеской фарша, г; — масса консервной банки, г.
Влагоудерживающая способность (% к массе фарша)
тк
ВУС = W -	• 100,	(2.60)
т
где W— массовая доля влаги в фарше. %; та — масса в исследуемом бульоне, г; тб2 — масса исследуемого бульона с жиром, г.
Жироудерживающая способность фарша (% к массе фарша)
Я7б1 /иж
жус = ж,,,- Тжж.	(2 61)
/Ид т
где Жф — массовая доля жира в фарше, %; /иж — масса жира в исследуемом бульоне, г.
Экспериментальные данные для различных вариантов модельных фаршей оформляют в виде таблицы:
Массовая доля компонентов в составе модельного фарша, %	ВУС. % •	ЖУС, %	эс, %	сэ, %
				
237
По результатам определений делают выводы о технолот-ческой функциональности сырья и формулируют обшее заключение по работе.
Лабораторная работа № 8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕЛЕОБРАЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ЖИВОТНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ
Цель работы. Приобрести практический навык определения ге-леобразуюшей способности.
Задачи. Получить гели (студни) миофибриллярных белков и проанализировать их.
Объекты исследования. Фракция миофибриллярных белков мышечной ткани; продукт гидролиза коллагена — пищевой желатин; плазма крови; образцы растительных белковых препаратов различной степени очистки и технологических форм на основе сои, чечевицы или других культур; агар (или агароид); пектин.
Материалы, реактивы, оборудование. Солевой раствор Вебера; поваренная соль; марлевый фильтр; сахар; плитка электрическая; воронки лабораторные; вата; приборы Валента и Тарр—Бейкера; ватерпас; стеклянный сосуд; прокаленный песок; грибовидная насадка; медицинский шприц; поршень; этанол; резервуар; груз (100—500 г).
Методические указания. В коллоидной химии гелями называют твердообразные дисперсные системы, внутри которых распределена жидкость. В отечественной литературе гели, образованные из растворов органических высокомолекулярных соединений, называют студнями. В соответствии с этими названиями иногда термин «структурообразование» заменяют на «гелеобразование», или «студнеобразование».
Склонностью к образованию коагуляционных структур обладают асимметричные (нитевидные или лентовидные) частицы с высоким, более 100, осевым соотношением (отношение длины к ширине). Даже в небольших концентрациях они способны образовывать сплошной рыхлый пространственный каркас в виде единого агрегата благодаря неравномерному распределению центров коагуляции по концам частиц. В петлях образующегося каркаса фиксируется дисперсионная среда. Такое структурообразование называется застудневанием, а образующаяся дисперсная система — лиогелем или студнем.
Переход жидкости в лиогель сопровождается изменением структурно-механических свойств системы; возникает жесткость, обусловленная наличием в системе непрерывного каркаса, в котором цепные частицы соединены локальными связями в центрах наибольшей лиофобности.
238
При напряжении выше предела прочности структурный каркас деформируется в результате смешения частиц относительно друг друга и контактов между ними, что внешне выражается в течение всей системы.
Эмульсионная природа мясных фаршей обусловливает высокую концентрацию белков в адсорбционных стабилизирующих слоях. Как правило, концентрация белка достаточно высокая и превышает критическую концентрацию гелеобразования. Это предопределяет возможность формирования гелевых структур в межфазных слоях и обусловливает физическую и химическую стабилизацию жира и влаги в мясопродуктах из тонкоизмель-ченного фарша, обеспечивая тем самым качество продукта. Готовые продукты приобретают свойства гелей, в которые включены капельки жира. При этом гелеобразование предусматривает формирование непрерывной белковой сетки, имеющей определенную степень упорядоченности.
Среди белков животных тканей основную роль в формировании структуры мясных эмульсий и последующем термотропном гелеобразовании играет миозин.
При достаточно высокой степени измельчения и под воздействием термообработки коллаген хорошо гидролизуется с образованием глютина и желатоз, которые обладают выраженной водосвязывающей и застудневающей способностью, что позволяет частично стабилизировать свойства готовых мясных изделий при использовании коллагенсодержащего сырья в виде белковых препаратов, эмульсий и гидролизатов.
Все белки плазмы крови способны образовывать гели при нагревании. Фибриноген имеет выраженную гелеобразующую способность, переходя под воздействием внешних факторов в фибрин и образуя пространственный каркас. Введение в плазму неплазменных белков, клетчатки, пектина существенно увеличивает прочность гелей.
Белки яйца обладают высокими гелеобразующими свойствами, особенно в присутствии альбуминов сыворотки крови и других компонентов.
Растительные белковые добавки в комбинированных пищевых системах проявляют свойства, аналогичные структурообразующим мышечным белкам нежирного мяса. Знания механизмов образования, способов практического получения и анализа свойств студней необходимы в технологической практике.
Работа состоит из двух этапов: получения гелей и исследования их свойств.
Экстракцию миофибриллярной фракции белков проводят солевым раствором Вебера или раствором поваренной соли эквивалентной молярной концентрации. Масса образца мышечной ткани 100 г.
239
Подготовка проб. Готовят исходный раствор образца желатина массовыми долями 10, 15 или 25 % в пересчете на обеззоленное сухое вещество (в соответствии с полученным заданием).
Массу навески желатина (г) для приготовления 1000 г исходного стандартного раствора заданной массовой долей абсолютно сухого обеззоленного вещества вычисляют по формуле
Х=т- 1000/1100 -(PTZ+3)|.	(2.62)
где Щ— массовая доля влаги. %: з — массовая доля золы в образце желатина, %.
Навеску, взвешенную с точностью +0,01 г, помещают в колбу с пришлифованной пробкой, приливают необходимый объем дистиллированной воды, плотно закрывают колбу пробкой и оставляют для набухания в течение 1—2 ч. Для полного растворения колбу с набухшим желатином помещают в термостат, повышая температуру от 40 до 75 °C, колбу с содержимым периодически встряхивают. Приготовленный раствор фильтруют через два слоя марли.
Плазму крови получают сепарированием или центрифугированием цельной стабилизированной крови в течение 5—8 мин при частоте вращения барабана 25—42 с”1. Плазму (надосадочную жидкость) отделяют декантацией.
Растворы агара готовят следующим образом: к навеске сухого агара массой 1,7 г (анфельция) или 2,5 г (фурцелларан), взвешенной с точностью ± 0,001 г, добавляют объем дистиллированной воды из расчета, чтобы общая масса раствора была 200 г, и оставляют для набухания не менее чем на 1 ч, после чего нагревают на водяной бане с обратным холодильником до полного растворения агара.
Для агара из фурцелларана готовят раствор с сахаром, добавляя в смесь после полного растворения агара 140 г сахара, и продолжают нагревать, доводя всю массу до кипения. Массу кипятят в течение 2—3 мин, затем взвешивают и продолжают нагревать до тех пор, пока масса агарно-сахарного раствора не будет доведена до 200 г.
Если раствор содержит нерастворимые примеси, его фильтруют в горячем состоянии через воронку с сухой ватой.
1.ПОЛУЧЕНИЕ ГЕЛЕЙ
Порядок проведения анализа. Для получения гелей миофибрил-лярных белков раствор миофибриллярных белков помещают в лабораторные стаканы и нагревают на водяной бане, визуально фиксируя температуру и время формирования геля.
Растворы желатина различной массовой долей (0,5—5 %) помещают в соответствующую лабораторную посуду, оставляют для гелеобразования при заданной температуре из рекомендуемого температурного интервала (0—10—20—30 °C). Через каждые 20—30 мин визуально фиксируют образование геля.
Готовят смесь из плазмы крови и натурального (морковного или тыквенного) сока с мякотью при соотношении компонентов 1 : 1 по 240
объему, оставляют для телеобразования при температуре 16—22 °C. Каждые 20—30 мин визуально фиксируют образование геля.
Приготовленный раствор агара, агароида или агаро-сахарный раствор разливают в подготовленные сухие стаканы, которые затем помещают в горизонтально установленный сосуд с плоским дном (например, кристаллизатор), заполненный водой температурой 20 °C. Затем стаканы с агаро-сахарным раствором термостати-руют при 30—60 °C. Причем уровень воды в сосуде должен быть немного выше уровня раствора в стаканах. Стаканы с раствором выдерживают в сосуде при температуре 20 °C, поддерживая ее добавлением холодной или теплой воды.
При использовании сухих растительных белковых препаратов их предварительно гидратируют в следующих условиях: соотношение белковый препарат — вода равно 1 : (2—2,5) для муки, 1 : 3 для концентрата, 1 :4 для изолята, температура воды 15—25 °C, продолжительность обработки в куттере или мешалке 1—3 мин.
Визуально фиксируют образование геля и промежуток времени, прошедший до гелеобразования. По результатам испытаний различных пищевых систем строят диаграмму, иллюстрирующую зависимость скорости гелеобразования от вида и состава дисперсионной среды.
2.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СТУДНЕЙ
Порядок проведения анализа. Для исследования образцов гелей берут пять стаканов диаметром 4,0—4,5 см вместимостью по 100 см3. На них наносят метки, соответствующие объему 30 см3, и
далее используют для определения прочностных характеристик на приборе Валента (рис. 2.17).
Для определения студнеобразующей способности образцов на приборе Тарр-Бейкера формование гелей проводят в стаканах конической формы объемом по 50 см3, а температуры плавления студней — в двух пробирках для каждого образца.
Рис. 2.17. Прибор Валента:
ватерпас; 2— штатив; 3 — сосуд для груза; 4— площадка для сосуда; 5— шток; 6— передвижной кронштейн; 7— насадка для испытуемого студня; 8— стакан; 9—основание; 10 — регулировочный винт
241
2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЧНОСТИ СТУДНЯ НА ПРИБОРЕ ВАЛЕНТА
Порядок проведения анализа. Стаканы с образовавшимся студнем ставят на основание прибора Валента, горизонтально установленного при помощи ватерпаса. На поверхность студня осторожно опускают грибообразную насадку. Площадь поверхности, на которую давит насадка, равна 2 см2. В сосуд, помещенный на площадку, медленно насыпают сухой промытый и прокаленный песок до тех пор, пока насадка, надавливая на студень, не прорвет его. Масса подвижной системы, состоящей из грибовидной насадки, штока, площадки и сосуда для груза, должна быть 90—100 г. Насадка должна быть изготовлена из антикоррозионного металла с полированной шаровой поверхностью. Нагрузку следует подавать равномерно, приблизительно по 10—12 г/с.
Перед опытом рекомендуется проверить равномерность подачи нагрузки. Для этого в стакан в течение 1 мин насыпают песок с принятой скоростью, затем взвешивают стакан с нагрузкой. При отклонении от рекомендуемых значений проверку повторяют, соответственно изменив скорость подачи груза (песка).
Прочность студня при измерении показателя на приборе Валента (г/см2)
CK = m/S,	(2.63)
где т — масса песка, сосуда и стержня с насадкой и площадкой, г; 5—площадь поверхности насадки; 5= 2 см2.
2.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТУДНЕОБРАЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ НА ПРИБОРЕ ТАРР—БЕЙКЕРА
Порядок проведения анализа. Основой метода является определение максимальной прочности студня на разрыв. Определение проводят на приборе Тарр—Бейкера (рис. 2.18), который состоит из стеклянного стандартного поршня 9, напорного сосуда с водой 4, буферного сосуда 8, манометра 5, заполненного четыреххлористым углеродом, подкрашенным иодом. Шкала манометра имеет диапазон от 0 до 90 см с ценой деления 1 см. Система прибора снабжена кранами 7, 2, 3, 6 и 7.
В качестве стандартного поршня используют обычный медицинский шприц. Основным рабочим органом является площадка поршня 10, размеры которой должны точно соответствовать указанным на рис. 2.18. Рабочая поверхность поршня должна быть 242
Рис. 2.18. Прибор Тарр—Бейкера:
Я — измерительная часть; Б — поршень; В— чашечка; /'—стакан
совершенно чистой. После каждого измерения поршень следует промыть этанолом и высушить. Поршень хранят в этаноле, а перед употреблением вытирают.
Перед анализом регулируют скорость подачи воды из напорного резервуара краном 3 так, чтобы при полностью открытом кране 2 столб четыреххлористого углерода поднимался примерно на 40 см за 1 мин. При дальнейшем анализе положение крана 3 не изменяют. Стандартный поршень обильно смазывают глицерином, чтобы на холостом ходу он свободно скользил по корпусу.
Стакан с желе устанавливают так, чтобы его центральная ось совпала с осью поршня, который осторожно опускают на поверхность желе. Закрывают кран 7 и открывают последовательно краны 6 и 2. В момент, когда поршень прорвет поверхность желе, кран 4 закрывают и отсчитывают высоту столба четыреххлористого углерода (см) по разности уровней в обоих коленах манометра. Затем кран 2 закрывают, а кран 7 открывают и восстанавливают положение поршня для последующего определения. Кран 7 используют для слива воды.
Студнеобразующую способность (°ТБ) находят по максимальному значению разницы уровня четыреххлористого углерода (табл. 2.6).
243
Т а блиц а 2.6
Студнеобразующая способность пищевых систем по Тарр—Бейкеру
Высота ; столба ;	Градусы ст\;		птсобразуюшей способност и			пищевых систем		при десятых долях.		СМ ’
CCL см"	0	1	)	з	•4	5	6 '	7	8	0
0	—	—	-—	83	96	107	117	125	133	142
10	149	156	162	168	175	180	186	192	197	202
20	207	212	227	221	225	229	233	237	241	246
30	250	254	258	262	265	268	272	276	280	284
40	287	290	293	296	299	302	305	308	311	314
50	318	321	324	327	329	335	338	341	344	344
60	347	350	352	354	357	360	363	365	368	370
70	372	375	378	381	383	386	388	390	392	394
80	396	398	401	404	406	408	410	412	414	417
90	419	421	424	426	428	430	431	433	436	438
2.3.'ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ПЛАВЛЕНИЯ СТУДНЯ
Порядок проведения анализа. Испытуемый раствор наливают в две пробирки приблизительно до половины их высоты и закрывают резиновыми пробками. Переводят находящийся в пробирках раствор или пищевую смесь в студень.
Пробирки со студнем устанавливают в стакан с водой температурой 20 °C и с погруженным в него термометром. Стакан помещают в водяную баню той же температуры. Баню подогревают так, чтобы повышение температуры воды в стакане на 1 °C происходило за 2—3 мин. Через каждые 3—5 °C повышения температуры одну из пробирок вынимают из стакана и, наклоняя ее, наблюдают, не расплавился ли студень. Температуру, при которой содержимое пробирки перейдет в жидкое состояние, отмечают как температуру плавления студня. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 1 °C.
Результаты исследований физических свойств гелей оформляют в виде таблицы:
Состав пищевых систем, характеристика дисперсной фазы и дисперсионной среды	Прочностные свойства		Температура плавления студня, °C
	прочность студня, г/см	студнеобразующая способность, °ТБ	
			
Сопоставляя полученные результаты, дают сравнительную оценку желирующих свойств различных белков и пищевых систем, формулируют выводы.
244
Лабораторная работа № 9
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРНО-МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
Цель работы. Приобрести практический навык определения прочностных, реологических и адгезионных свойств мяса, мясных фаршей и белковых систем вторичных ресурсов.
Задачи. Измерить и рассчитать усилия среза, предельного напряжения сдвига, эффективной, условной вязкости и липкости в различных объектах исследования.
Объекты исследования. Мясо (кусковое), мясные фарши, растворы клея и желатина, кровь и ее фракции.
Оборудование. Нож; мясорубка; конический пластомер; ротационный вискозиметр; вискозиметр Энглера; лабораторная установка для определения адгезионных свойств; прибор для определения липкости.
Методические указания. Лабораторная работа состоит из нескольких этапов, каждый из которых можно использовать независимо или в совокупности.
Усилие среза характеризует прочность и жесткость системы, которые тесно связаны с качественным составом белков в мясе и стадиями автолиза мышечной ткани.
Метод определения усилия среза основан на измерении давления, необходимого для разрушения образца путем среза в камере постоянного объема. Усилие среза определяют на приборе ПМ-3, принципиальная схема которого показана на рис. 2.19.
О реологических характеристиках мясных фаршей и готовых продуктов можно судить на основе определения предельного напряжения сдвига. Указанный показатель позволяет оценить прочность структуры и консистенцию продукта.
Сдвиговые свойства проявляются при касательном смещении слоев продукта, который может представлять собой жидкую или
Рис. 2.19. Схема прибора ПМ-3 для определения усилий среза:
7 — электромотор; 2—привод; 3— рейка; 4— смещающийся хомут;
5 — рабочий орган; 6 — тензобалка; 7—тензодатчик: 8— электронный потенциометр
245
твердообразную систему, а также твердое тело, т. с. неразрушенную структуру (целые ткани мяса, кость, сыр. твердый жир и ирд. Приборы для измерения величин сдвиговых свойств нишевых систем имеют определенную специфику.
Конические пластометры получили широкое распространение в реологических исследованиях из-за простоты устройства и надежности в работе. Устройство приборов такого типа показано на рис. 2.20 (а, б). Предельное напряжение сдвига Оо (Па) определяют по глубине погружения конуса.
В настоящее время насчитывается несколько сотен конструкций ротационных вискозиметров, которые можно разделить на две основные группы. К первой группе относятся приборы, имеющие постоянный момент вращения ротора при переменной частоте вращения, ко второй — приборы, имеющие постоянную частоту вращения ротора при переменном вращающем моменте.
В России и странах СНГ наибольшее распространение получили вискозиметры РВ-8 системы проф. Воларовича, относящиеся к первой группе, и вискозиметры «Реотест», относящиеся ко второй. При исследовании структурно-механических свойств с помощью ротационных вискозиметров особо важное значение приобретают правильный выбор и учет размеров рабочих органов прибора, а также математическая модель для обобщения экспериментальных данных.
Принципиальные схемы ротационных вискозиметров представлены на рис. 2.21. Их рабочие органы могут иметь одну геометрическую форму: коаксиальные цилиндры (см. рис. 2.21, а), сферы или полусферы (см. рис. 2.21, б), два конуса (см. рис. 2.21, в), две плоскопараллельные пластины (см. рис. 2.21, г), два плоских кольца (см. рис. 2.21, д') или два конических кольца (см. рис. 2.21,/с). Рабочий зазор или рабочий орган может быть комбинированным, т. е. состоять из нескольких различных поверхностей: цилиндр — диск (см. рис. 2.21, е), цилиндр — полусфера (см. рис. 2.21, ж), ко-
Рис. 2.20. Принципиальные схемы пенетрометров:
« — конический пластомер Воларовича: 1 — кювета с исследуемым продуктом; 2 — конус со штангой и поперечиной; 3— обойма для осевого перемещения штанги с фиксатором; 4— индикатор часового типа для измерения перемещения штанги; б — пластинчатый пластомер Жуховицкого и Гуткина: 7 —подставка с кронштейном; 2—плоский нож (200x 25 мм) со штоком; 3— индикатор или линейка для регистрации перемещений штока
246
г


д
M____
Рис. 2.21. Принципиальные схемы ротационных вискозиметров
нус — диск (см. рис. 2.21, з), цилиндр — конус (см. рис. 2.21, и), цилиндр — конус — диск (см. рис. 2.21, л) и пр. Между рабочими поверхностями находится исследуемый продукт. Измеряется сила сопротивления внутри продукта при вращении одной из поверхностей.
Вискозиметры различают по конструктивным особенностям и способу привода одного из цилиндров. На рис. 2.22 показана принципиальная схема прибора «Реотест-2» — структурного ротационного вискозиметра, который используется как для определения динамической вязкости ньютоновских жидкостей, так и для
проведения глубоких реологических исследований неньютоновских
жидкостей. Им можно измерить следующие показатели текучести: структурную вязкость, пластичность (предел текучести) и тиксотропию.
Ротационный вискозиметр «Реотест-2» (см. рис. 2.22) состоит из четырех основных узлов: станины с синхронным электроприводом, блока многоступенчатого редуктора с переклю-
Рис. 2.22. Ротационный вискозиметр «Реотест-2»:
1 — станина; 2 — термостатная емкость; 3— ротор; 4—стакан; 5—соединение измерительного вала с валом привода: 6—термометр; 7—измерительный вал; 8 — потенциометр; 9 — пружинный динамометр (торсион); 10 — вал привода; // — ступенчатый регулятор динамометра; 12 — частотомер; 13— шкала ло-гометра; 14— стопорные рукоятки фиксаторов; 15 — шкала ступени частоты вращения; 16 — рукоятка переключения ступени
247
чателем скоростей и измерительного блока, которые объединены в общем корпусе, а также измерительной головки, состоящей из
четырех сменных цилиндрических роторов, двух сменных стаканов со съемным дном и водяной! бани.
В полностью укомплектованный стенд для проведения исследований помимо прибора входят ультратермостат и самопишущий логометр.
Для измерения вязкости жидкостей используют капиллярные вискозиметры. Теория капиллярной вискозиметрии основана на том допущении, что поток в приборе ламинарный, скольжение на
стенке отсутствует, скорость сдвига в точке зависит от нагружения в той же точке.
Жидкообразные продукты не имеют предельного напряжения
сдвига, их течение начинается при сколь угодно малых напряжениях сдвига. Обычно, за исключением истинно вязких жидкостей, эти продукты имеют слабую структурную сетку и обладают аномалией течения. Один и тот же продукт в зависимости от интенсивности механического воздействия, массовой доли сухих веществ или температуры часто может переходить из одной группы в другую, например жидкообразные в твердообразные. Реологические свойства жидкообразных продуктов используются при расчете ма-
шин и аппаратов, а
Рис. 2.23. Вискозиметр Энглера
также в комплексе с другими показателями при оценке процессов, связанных с переработкой животного сырья и оценкой качества продуктов.
В лабораторной практике технохими-ческого контроля качества некоторых продуктов мясной и перерабатывающей промышленности, в частности растворов желатина, клея, получил распространение капиллярный вискозиметр Энглера.
Вискозиметр Энглера (рис. 2.23) состоит из двух вставленных один в другой металлических сосудов 3 и 7. Внешний сосуд 7 является термостатирующей баней, куда наливают воду или минеральное масло. Для равномерного поддержания температуры жидкость в сосуде 7 перемешивают мешалкой 5. Внутрь резервуара 3 опускают термометр 1. На внутренней поверхности резервуара имеются три указателя уровня 6, которые находятся в одной плоскости и служат отметкой для измерения объема жидкости и контроля вертикального положения прибора. Правильным считается положение, когда все три указателя уровня 6 будут едва видны над
248
поверхностью жидкости. В нижней части сосудов находится отверстие 8 для слива испытуемой жидкости, которое закрывается стержнем 2, проходящим через крышку 4 прибора. Для приема сливаемой жидкости предусмотрена измерительная колба 9 с двумя отметками: на 100 и 200 см3.
Метод основан на определении отношения времени истечения испытуемого продукта при заданной температуре ко времени истечения того же объема воды при 20 °C.
Измерение вязкости позволяет охарактеризовать реологические свойства клеевых и желатиновых растворов, которые зависят от молекулярной массы, формы молекул продуктов деструкции коллагена и степени их гидратации. Эти факторы влияют на процесс гелеобразования при охлаждении водных растворов желатина, прочность и температуру плавления студней.
Общим для всех приборов этого типа является наличие капилляра, устройства для измерения расхода или объема жидкости и системы, обеспечивающей создание гидростатического давления. Для измерения вязкости ньютоновских и не очень вязких неньютоновских жидкостей в качестве капилляра можно использовать трубку диаметром от долей до 2—3 мм. Получаемые результаты, как правило, инвариантны, т. е. не зависят от диаметра трубки.
Наиболее простые, традиционные и вместе с тем универсальные капиллярные вискозиметры Оствальда и Уббелоде имеют капилляр и два полых шарика для жидкости. Движущая сила процесса истечения (перепад давлений) в вискозиметре Оствальда обусловлена разностью высот жидкости, в вискозиметре Уббелоде — вакуумом или давлением в одном колене трубки. При измерениях приборы обычно помещают в водяную баню.
Имеются и другие конструкции вискозиметров такого типа.
Для точного измерения весьма важно правильно подготовить пробу, учитывая особенности конструкции и эксплуатации прибора.
Особое место среди структурно-механических свойств занимает такое поверхностное свойство, как липкость (адгезия). Оно характеризует усилие взаимодействия между поверхностями конструкционного материала и продуктом при нормальном отрыве или сдвиге. При этом для большинства мясных и молочных продуктов липкость обусловливает величину усилия внешнего трения.
Липкость — это физическое явление, возникающее при соприкосновении тел. Она возникает при разделении этих тел как усилие, противодействующее разделению (отрыву). Исследование липкости как характеристического свойства сырья и продуктов в технологии мяса имеет большое значение. Например, исследование липкости колбасного фарша позволяет определить оптимальное время куттерования. На практике это свойство мяса оценивают обычно по прилипаемости фарша к поверхности руки. Таким
249
же ооразом по состоянию поверхности мяса можно оценить его водосвязывающую способность. Липкость исследуют также объективными методами, измеряя усилие, необходимое для отрыва от испытуемой поверхности соответственно подобранной пластины. Мерой липкости является величина усилия, приходящаяся на единицу поверхности контакта. Липкость связана с другими явлениями и свойствами продуктов: адгезией, когезией, вязкостью и поверхностным трением. Адгезия проявляется в виде усилия, действующего на границе двух соприкасающихся фаз, и зависит от величины притяжения, действующего между частицами обеих фаз.
Качественно адгезию можно охарактеризовать двумя способами: нарушением контакта одновременно на всех участках площади (рис. 2.24, а, г, д') или же путем последовательного отрыва отдельных участков — расслаиванием, отдиранием (рис. 2.24. б, в). Оба способа определения адгезионной прочности нашли практическое применение. При первом способе разрушающую нагрузку прилагают в направлении как перпендикулярном плоскости контакта поверхностей, так и параллельном ей и обычно относят к единице площади поверхности контакта; при втором — определяют силу, необходимую для расслаивания склейки, и относят к единице длины. Очень часто адгезию, определяемую при расслаивании, характеризуют не силой, а работой, которую необходимо затратить на разделение фаз.
Подготовка проб. Для определения усилий среза образцов на приборе ПМ-3 на специальном устройстве для вырезания образцов (рис. 2.25) легким нажимом ломтика сырого или вареного продукта на вращающийся трубчатый нож вырезают ровный цилиндрический образец диаметром 10 мм. Полученный образец извлекают с помощью выталкивателя.
Для определения сдвиговых свойств мышечной ткани на коническом пластомере вырезают образцы ткани вдоль и поперек мышечных волокон, по форме и размеру соответствующие кювете прибора, на установках другого типа — образцы, соответствующие размерам кюветы используемой установки.
Для определения сдвиговых свойств мясных продуктов на ротационных вискозиметрах и адгезионных свойств на различных лабораторных установках готовят мясной фарш, последовательно измельчая мясо различных животных на волчке (мясорубке), куттере, гомогенизаторе или другой машине тонкого измельчения. Диаметр отверстий решетки и продолжительность тонкого измельчения задает преподаватель.
При исследовании реологических свойств крови убойных животных рекомендуется дать сравнительную оценку вязкости цельной крови и ее фракциям, для чего цельную стабилизированную кровь разделяют на фракции плазмы и форменных
250
Рис. 2.24. Принципиальные схемы приборов для измерения адгезионной прочности:
« — для нормального отрыва: / — адгезионный; 2 —когезионный; 3 — смешанный; 4— схема устройства для осуществления отрыва; б — для расслаивания жестких материалов: 1— внецентро-вое растяжение; 2— изгиб для плиточного и листового материалов; 3— центральный изгиб для листового материала; 7— консольный изгиб для листового материала; « — для расслаивания гибких материалов: 1—3— от жесткой подложки под углом 90°: 4 — от жесткой подложки под углом 180°; 5— от гибкой подложки; г — для сдвигового разрушения: 1 — при растяжении одностороннего соединения; 2—то же. двустороннего; 3— при сжатии соединения цилиндра со стержнем; д — для сдвигового разрушения при кручении: /—по торну цилиндров; 2—ио кольцевой поверхности торна полых цилиндров; 3— по боковой поверхности цилиндра и стержня
Рис. 2.25. Устройство для вырезания образцов: /—трубчатый нож; 2— выталкиватель; 3— привод электродвигателя
элементов сепарированием или центрифугированием в течение 5—8 мин при частоте вращения барабана 25—42 с !.
Для исследования реологических свойств клея и желатина готовят стандартные растворы: желатина — массовой долей 10%. клея — массовой долей 15 %.
1.ОПРЕДЕЛЕНИЕ УСИЛИЙ СРЕЗА
Порядок проведения анализа. Для определения усилий среза включают прибор ПМ-3 тумблером ВК в электросеть. Рукояткой выводят стрелку прибора на нуль и совмещают отверстия в пластине рабочего органа и смещающегося хомута (см. рис. 2.18). Подготовленный образец мяса осторожно помещают в образовавшееся цилиндрическое отверстие, вставляют прижимные пластины с ножевой поверхностью на конце в направляющие для срезания излишков мяса и фиксирования образца. Нажатием кнопки «Пуск» приводят в движение привод рабочего органа, смещающаяся пластина которого производит срез образца.
Усилие, необходимое для среза образца, передается тензо-балке и через тензодатчик фиксируется в виде пика на ленте потенциометра.
Экспериментально полученные данные оформляют в виде таблицы:
Наименование и характеристика образца	Усилие среза
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СДВИГОВЫХ СВОЙСТВ НА КОНИЧЕСКОМ ПЛАСТОМЕРЕ
Порядок проведения анализа. Прибор устанавливают по уровню с помощью трех винтов в станине. Готовят модельный материал соответствующей консистенции. Исследуемый образец помещают в кювету прибора. Выравнивают металлической линейкой поверхность модельного фарша так, чтобы масса в сосуде находилась на уровне с его краями. Кювету с исследуемым образцом устанавливают на столик прибора и поднимают вверх до соприкосновения поверхности с острием конуса. Для значительных перемещений ослабляют стопорный винт механизма подъема столика и свободно перемещают столик; для точной регулировки положения поверхности материала относительно острия конуса пользуются микрометрической гайкой. При необходимости контролируют и устанавливают нулевое положение индикатора. Нажимают пусковую кнопку, включают секундомер и, слегка придерживая в на-
252
чальныи момент штангу, опускают конус. Но мере погружения конуса в материал через каждую минуту фиксируют глубину погружения рифленого конуса по индикатору. Следует считать, что погружение заканчивается через 3—5 мин, так как по истечении этого времени конус опускается на незначительную глубину, чем практически можно пренебречь. Длительность погружения 180— 300 с соответствует наибольшему периоду релаксации используемых для исследования материалов.
Для каждого исследуемого образца следует выполнить 5—6 измерений.
Фиксируют величину угла 2а при вершине конуса, константу конуса К (м/кг), общую массу /иобш (кг) штанги, конуса и дополнительного груза при его наличии.
При использовании дополнительного груза строят тарировоч-ную кривую пружины индикатора в виде зависимости между массой грузов и вызываемых ими перемещений штока индикатора
<2'64)
Для каждого значения величины перемещения штока индикатора /?инд фиксируют соответствующую массу груза т . Расчетное значение массы грузов определяют из выражения
то6„, =	+ т«т-	<2-65)
Для каждого образца вычисляют значения предельного напряжения сдвига 0 (Па) при фиксированной длительности погружения:
к—й—	(166)
Находят среднеарифметическое значение предельного напряжения сдвига для каждого из вариантов исследуемых образцов
Z0,
ео----т~’	(2.67)
где / — количество измерений.
Для каждого варианта исследуемого образца строят график зависимости глубины погружения конуса прибора от длительности погружения.
Экспериментальные величины и расчетные данные вносят в таблицы рекомендуемых ниже форм:
253
Угол при вершине	Константе. кон\ ел	X.	Общая масс.: ш	 ьг 1	Масса дополните.п>-
конуса 2</. грал	У кг				ного груза ( . кг
у—
Чапменов iнi:е и характерна шка образна	/1.1 и тел вноси в погружения конуса, с	1 дубина потру жения h. м	1 Ipe.ie.iBHoe напряжение сдвига 6. Па	Среднеарифметическое значение предельного напряжения сдвига 0.. Па
1	30			
	60			
	120			
	180			
	240			
3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЕДЕЛЬНОГО НАПРЯЖЕНИЯ СДВИГА И ЭФФЕКТИВНОЙ ВЯЗКОСТИ НА РОТАЦИОННОМ ВИСКОЗИМЕТРЕ РВ-8М
Порядок проведения анализа. Методика измерения структурно-механических характеристик для ротационных вискозиметров системы Воларовича сводится к подготовке прибора, измерениям и разборке. Подготовка включает установку вискозиметра по уровню, определение силы трения в подшипниках, заполнение рабочего объема исследуемым материалом и его термостатирование. Для определения реологических характеристик исследуемый образец массой 15—17 г помещают в наружный цилиндр вискозиметра, находящийся в крайнем нижнем положении. В случае изучения зависимости реологических свойств исследуемых образцов от температуры включают термостат и материал обрабатывают в течение 20—30 мин при температуре, заданной преподавателем. Наружный цилиндр при помощи подъемного устройства приводят в рабочее положение и фиксируют с помощью винта. Излишки образца убирают скальпелем, шпателем или ножом. Конкретные условия определения сдвиговых свойств (масса грузов на блоке, число оборотов шкива) апробируют применительно к изучаемому объекту. Устанавливают фиксированный груз на блоке, освобождают шкив со стопора, одновременно включая секундомер. После остановки системы и прекращения вращения шкива секундомер выключают. Фиксируют массу груза т (г), число оборотов шкива п и время вращения шкива.
Во время измерений меняют массу грузов М (кг) и для каждого груза определяют частоту вращения ротора N (максимальная частота вращения может достигать 2—2,5 с-1). Каждый опыт состоит из 30—40 замеров, проводимых несколько раз с
254
постепенным увеличением и уменьшением массы грузов. Одновременно строят реограммы N = а{М).
После этого определяют константы опыта по формулам:
		;	(2.68)
Аф “ Лвк^А2^2/? + л2Яв2/4);		(2.69)
Ад	2лЯ2Л/(Д11К£);	(2.70)
Л2	= 1п(А„//?в) 2л	(2.71)
где g —ускорение свободного падения, м/с2; /?шк — радиус шкива, м; /^ — внутренний радиус стакана, м; Ки — радиус ротора, м; // — глубина погружения ротора в продукт, м.
Вычисляют эффективную вязкость для каждой опытной точки по уравнению
Ъф = Ш/Л/	(2.72)
По окончании измерений приводят прибор в исходное положение в следующем порядке: освобождают блок от нагрузки; подъемное устройство приводят в нижнее положение; освобождают внешний цилиндр с термостатирующим устройством от крепления и выгружают исследуемый образец; отмечают высоту контакта рифленой поверхности внутреннего цилиндра с исследуемым материалом h (см); тщательно моют и сушат оба цилиндра.
Строят график зависимости эффективной вязкости от окружной скорости со = 2nRKN в логарифмических шкалах. Через полученные экспериментальные точки проводят прямую линию так, чтобы она делила относительные отклонения расстояний между точками и прямой на равные части. Составляют уравнение этой прямой, определяют темп разрушения структуры т. Значение коэффициента эффективной вязкости определяют по формуле
Пэф = ^(со/со.Г2 = В^т,	(2.73)
где В — эффективная вязкость при фиксированном значении окружной скорости, Па с; СО] — фиксированное единичное значение окружной скорости боковой поверхности ротора коаксиально-цилиндрического вискозиметра (од = 1 м/с); со, — безразмерная окружная скорость (ее числовое значение).
После определения по полученным экспериментальным данным индекса течения п = 1 — т рассчитывают инвариантную для любых коаксиально-цилиндрических ротационных вискозимет
255
ров реологическую константу В,, по формуле
д; = в
| И„|1 - (Я„/Л„ )2 " ||”
'l	2(0,	I
(2.74)
учитывающей закон изменения градиента скорости.
Затем вычисляют реологические константы — предельное напряжение сдвига 0О и пластическую вязкость г|1П, ориентируясь на график зависимости N(M). При этом точки для вычислений берут непосредственно с кривой. 0О и определяют в следующей последовательности. Предельное напряжение сдвига 0О (Па) соответствует отрезку, отсекаемому кривой Л;(Л/), по оси абсцисс (Л/о). Его определяют по формуле
0О = £ОЛ/О.	(2.75)
Напряжение сдвига на поверхности ротора
е = к„М.	(2.76)
Пластическую вязкость в зависимости от того, распространяется ли сдвиг на всю толщину кольца продукта (в зазоре между ротором и стаканом), рассчитывают по одной из приведенных ниже формул.
Первый случай — сдвиг распространяется на всю толщину кольца, когда масса нагрузки MQ больше массы нагрузки Мх = /Cj0o. В этом случае пластическую вязкость определяют по формуле
рпл = (Ш-^20о)Ж	(2.77)
Все расчеты пластической вязкости, когда сдвиг распространяется на всю толщину кольца исследуемого продукта, рекомендуется сводить в таблицу:
Константа опыта к =	к,=
N	М	кМ		кМ -- к^	
4.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЕДЕЛЬНОГО НАПРЯЖЕНИЯ СДВИГА И ЭФФЕКТИВНОЙ ВЯЗКОСТИ НА РОТАЦИОННОМ ВИСКОЗИМЕТРЕ ТИПА «РЕОТЕСТ»
Порядок проведения анализа. Предварительно выбирают соответствующую измерительную головку, руководствуясь табл. 2.7 для определения сдвиговых характеристик того или иного про
256
дукта, затем фиксируют при помощи цангового зажима выбранный измерительный ротор на выходном валу измерительного блока.
Т а б а и ц а 2."
Пределы измеряемых реологических характеристик, соответствующих индексам измерительных головок
Индекс измерительных j ГОЛОВОК | 	1	Соотношения радиусов роторов и ста конто в RJ	Область, напряжений 0	Напряжение сдвига 0. Па	Скорость деформации ! . . тУ	Оффекшвная ’ (динамическая) 1 ВЯЗКОСТЬ )], Па с
ф	0.98	1	11 — 110	1.5-1310	0.01-75
		11	55—550	1.5-1310	0,05 — 375
ф	0.94	1	12-120	0.5-437	0,03-240
		11	60-600	0,5-437	0,15-1200
ф	0.81	1	16- 160	1/6-146	0,12-1000
		11	80-800	1/6-146	0,6-5000
и	0,81	I	60-600	1/6-146	0,4-3600
		II	ЗОО-ЗООО	1/6—146	2-18000
Для наполнения цилиндрического измерительного устройства в мерный бачок вносят рекомендуемый объем (массу) исследуемого образца:
Тип измерительной головки Объем (масса) образца, см3 (г)
5]	52	ф	Н
25	30	50	17
Константы выбранной измерительной головки определяют в зависимости от жесткости торсиона I—II (положение рукоятки на лицевой панели измерительного блока) из табл. 2.8.
Таблица 2.8
Константы измерительных головок
Тип измерительной головки
Константы роторов Z. Па/ел. шкалы
при жесткости торсиона I при жесткости торсиона II
Ф	1,19	5,92
Ф	1,23	6,16
Ф	1,69	8,45
н	5.89	29,29
Исследуемый продукт помещают в соответствующий стакан с герметично закрытым съемным дном и коаксиально ротору по направляющей при помощи винтового зажима фиксируют на измерительном блоке.
257
При необходимости выполнения измерений при различных значениях температуры стакан герметично фиксируют в водяной бане, которую подключают к ультратермостату, и продукт термо-статируют 10—20 мин до установления требуемой температуры.
Прибор подключают к сети напряжением 220 В. частотой 50 Гн Задают требуемую частоту вращения ротора, начиная с минимальной, с помощью переключателя скоростей за счет установки рычага в положение, соответствующее данным табл. 2.9.
Г а б л 11 и а 2 9
Определение частоты вращения ротора вискозиметра < Реотест-2» по ступеням
Ступень	Частота вращения .V. с ! (	Ступень	Частота вращения .V. с
1а	0,00926	1в	0.00463
2а	0.01660	2 в	0.00833
За	0,02778	Зв	0.01389
4а	0,05000	4в	0.02500
5 а	0,08330	5 в	0.04167
6 а	0,15000	6 в	0.07500
7а	0,25000	7 в	0.12500
8а	0.45000	8 в	0.22500
9а	0,75000	9 в	0.37500
10а	1,35000	1 Ов	0,67500
11а	2.25000	11в	1,12500
12а	4,0500	12в	2,02500
Для переключения от ступени 1 до ступени 12 требуется 2,5 оборота рукоятки. Промежуточные ступени соответствуют меньшему повороту и индицируются на табло блока многоступенчатого редуктора. Другую частоту вращения ротора можно установить в процессе измерений.
Отклонение показаний измерителя частоты, расположенного на измерительном блоке, от величины 50 Гц требует внесения поправки при расчете частоты вращения ротора по формуле
= Ж/50,
(2.78)
где N — действительная частота вращения ротора; N — частота вращения ротора (по табл. 2.9); /— индуцируемая частота переменного тока. Гц.
Измеряемое значение напряжения сдвига при различных скоростях вращения ротора выбранной измерительной головки в соответствии с жесткостью торсиона вычисляют по формуле
6 = Za,
(2.79)
где Z— константа ротора; а — показания стрелочного логометра. 258
Для построения реограммы — кривой течения N (0) обычно бывает достаточно 12 экспериментальных точек в диапазоне от минимальной до максимальной частоты вращения ротора.
Эффективную вязкость при каждой частоте вращения ротора рассчитывают по формуле
Ч.,ф = ^0/М.	(2.80)
где к - константа измерительном головки:
где соотношение	тля соответствующей измерительной головки берут
из табл. 2.7.
Все данные измерений заносят в журнал наблюдений:
Номер опыта	Напряжение сдвига 0. Па	Действительная частота вращения ротора Ду c-i	Окружная скорость вращения ротора со = 2кД АХ м • с‘1	Эффективная i -г ч _ вязкость п 1 П, . с ,'1’ 1 продукта t. С 1 1 (Л L
				
По окончании опыта измерительную головку отсоединяют от измерительного блока, разбирают, удаляют исследованный продукт, моют водой, сушат и окончательно обезжиривают при помощи спирта.
5.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЯЗКОСТИ НА ВИСКОЗИМЕТРЕ ЭНГЛЕРА
Порядок проведения анализа. Перед началом работы прибор устанавливают с помощью регулирующих винтов так, чтобы три указателя уровня 6 (см. рис. 2.23) находились в горизонтальной плоскости. Перед каждым определением прибор и его отверстие Для стока £ следует тщательно промыть спиртом, бензином и высушить продуванием воздуха.
С помощью вискозиметра Энглера устанавливают время истечения дистиллированной воды. Для этого в тщательно промытый и высушенный сосуд 3 для испытуемой жидкости при закрытом сточном отверстии 8 немного выше указателей уровня 6 наливают Дистиллированную воду температурой 20 °C. Нагревая термоста-тирующую баню 7, во внутреннем сосуде 3 в течение 10 мин поддерживают температуру 20 °C; затем слегка поднимают стержень 2 и выпускают немного воды. Таким образом, все сточное отверстие заполняется водой. Излишки воды отсасывают из сосуда пипеткой, чтобы уровень ее находился на высоте указателя уровня 6.
259
Под сточное отверстие прибора ставят измерительную колбу 9. Установив прибор, закрывают его крышкой 4, придерживая при этом рукой стержень 2, закрывающий сточное отверстие 8.
Убедившись, что температура воды равна 20 °C, быстро, не трогая прибора, поднимают рукой запирающий стержень 2 и по секундомеру точно отмечают время заполнения колбы 9 до черты, указывающей объем 200 см3. Это время должно быть равно не менее 50 и не более 52 с. Среднее для данного прибора время, принимаемое за единицу, определяют, исходя из трех последовательных измерений, разница между которыми должна быть не более 0,5 с. Такую проверку делают перед каждым новым опытом.
В сосуд 3 немного выше указателя уровня наливают испытуемый образец, подогретый на 2—3 °C выше температуры опыта.
В термостатирующую баню 7 наливают воду на 0,2—0,3 °C выше температуры опыта и поддерживают ее, перемешивая содержимое мешалкой 5.
Подняв немного стержень 2, дают стечь излишкам образца настолько, чтобы его уровень совпадал с верхними точками указателя уровня 6 и сточная труба б'была полностью заполнена. После этого прибор закрывают крышкой 4 и под сточное отверстие 8 ставят измерительную колбу 9.
Температуру испытуемого образца проверяют при перемешивании. Для этого вращают вокруг стержня 2 крышку прибора 4 с термометром 1. Когда будет достигнута требуемая температура, выдерживают еще 5 мин, а затем быстро поднимают стержень 2, закрывающий сточное отверстие 8, одновременно включив секундомер. Последний останавливают в тот момент, когда в измерительной колбе 9 уровень жидкости достигнет отметки 200 см3 (пена в расчет не принимается). Отметка 100 см3 на измерительной колбе служит ориентировочно для контроля времени истечения.
Вязкость в градусах Энглера вычисляют по формуле
°г 6
Е20’ = - ’	(2.82)
ч
где г2 — время истечения образца, с; — время истечения воды, с.
Для перевода градусов Энглера в Па • с пользуются эмпирической формулой
20е f к ото	5,9806 Л
г) = 6,92211о„-----— р,	(2.83)
k	r )
где в20 — вязкость, Па-с; г|оп — вязкость при температуре опыта, °Е; р — плотность жидкости при температуре опыта, г/см3.
Полученные экспериментальные данные оформляют в виде таблицы рекомендуемой формы:
260
Наименование и характеристика образна, условия эксперимента
Номер ; опьиа
Время ис течения образца.
Сре.тнеарифмесю ческое значение истечения образна, с
Время ис-  Сре.тнеарпфмсти-течения ческое значение волы, с ' истечения волы, с
Расчетные данные сводят в таблицу:
Наименование и характеристика образца
Условия эксперимент------
Вязкое п>
6.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ АДГЕЗИОННЫХ СВОЙСТВ МОДЕЛЬНЫХ ФАРШЕЙ
6.1.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПКОСТИ МЯСНОГО ФАРША НА ЛАБОРАТОРНОЙ УСТАНОВКЕ
Основным элементом лабораторной установки (рис. 2.26) являются технические весы 4, над одной из тарелок которых устанавливают скамеечку 1 так, чтобы они не соприкасались. На скамеечку помещают испытуемый образец 2 и прикрывают его измерительной пластинкой 3, которую прикрепляют к коромыслу весов прочной ниткой. На другой тарелке весов помещают химический стакан 6. Над весами 4 устанавливают бутыль Мариотта 5 с водой.
Испытуемый образец 2 помещают на скамеечку / лабора
торной установки и накрывают На пластину в течение заданного времени устанавливают груз определенной массы. Затем груз снимают, открывают кран бутыли Мариотта, наполняя стакан водой. Кран закрывают в момент отрыва пластины от поверхности образца. Далее уравновешивают весы, определяя массу воды в стакане.
Условия эксперимента (высоту слоя продукта, величину нагрузки, продолжительность ее воздействия, массовую долю влаги и жира в модельном фарше) фиксируют в тетради.
его измерительной пластиной.
Рис. 2.26. Лабораторная установка для определения липкости (по С. Тышкевичу)
261
Адгезия (Па) определяется как удельная сила нормального отрыва пластины от продукта
_ 9.81/77
(2.84)
гае сила отрыва. Н: 5’, — юометричсская площадь пдасгины. м2; di — масса груза. Ki.
Экспериментальные и расчетные данные оформляют в виде таблицы:
Образен	Массовая л влаги	ОЛЯ МОЛСЛЬНО! жира	о фарша, %	Условия эксперимента пищевых	Высота \ iMacCil Продолжптель- добавок 1 слояо°- , греза, кг ность действия 	уразиа, мм	гру;а, мин
6.2.	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИПКОСТИ МЯСНОГО ФАРША НА ПРИБОРЕ СОКОЛОВА—БОЛЬШАКОВА
Метод основан на определении величины усилия, необходимого для разделения двух поверхностей, связанных (склеенных) испытуемым фаршем.
Перед началом работы выдвигают рабочий орган / прибора (рис. 2.27) и включают прибор в электросеть. На нижнюю пластину 2 помещают испытуемый образец массой 2 г. Нажатием кнопки «Пуск» включают электродвигатель. При этом втулка 8 вместе
Рис. 2.27. Схема прибора Соколова—Большакова для определения липкости мясного фарша
262
со штоком 4. грузом 9 и верхней пластиной 3 с помощью приспособления /перемещается вниз. При достижении верхней пластиной 3 поверхности образца последний подпрессовывается в течение 30 с под действием груза 9 постоянной массы для данного исследуемого продукта.
По истечении установленного времени, регулируемого реле 5. электродвигатель автоматически включается на обратный ход. вследствие чего втулка 8 начинает двигаться вверх. Усилие, необходимое для отрыва верхней пластины от образца, фиксируется на электронном самопишущем приборе 6.
Конкретные условия определения липкости (масса груза, время пребывания образца под нагрузкой) должны быть предварительно апробированы применительно к изучаемому объекту.
Далее фиксируют условия проведения эксперимента и данные самопишущего устройства.
Контрольные вопросы и задания
1.	Для решения каких технологических задач требуется изучение физических характеристик мяса и мясопродуктов'.’
2.	Укажите основные физические характеристики мяса и мясопродуктов. Как они связаны с особенностями их макро- и микроструктуры?
3.	Какие физические свойства мяса играют важную роль в оценке цветности?
4.	Какое практическое значение имеет объективная опенка оптических свойств мяса9
5.	Чем обусловлена анизотропия затухания звука в мясе и цсльномышечных мясных продуктах?
6.	Каковы преимущества и перспективы применения ультразвука для анализа мяса и мясных продуктов?
7.	Как практически определить акустические характеристики мяса и мясопродуктов?
8.	Чем обусловлен эффект поглощения звука в животных тканях?
9.	Назовите основные теплофизические свойства мяса и мясопродуктов и методы их экспериментального исследования. В чем их преимущества и недостатки?
10.	Какие комплексные методы исследования тсплофизических свойств пищевых продуктов вы знаете9
11.	Что понимают под функционально технологическими свойствами мясного сырья9
12.	Что принято понимать под функциональными свойствами изолированных белков и белковых систем?
13.	Что такое эмульсия9
14.	Какие факторы влияют на функциональные свойства мясных фаршевых эмульсий?
15.	Охарактеризуйте способы стабилизации функциональных свойств мясных фаршей.
16.	Какие свойства относятся к структурно-механическим свойствам мяса и мясопродуктов?
17.	Дайте характеристику основных сдвиговых реологических, компрессионных свойств пластично-вязких продуктов. При расчете каких технологических процессов учитывают эти параметры?
18.	Какое практическое значение имеют поверхностные свойства мясопродуктов?
19.	Как можно практически определить цветность мяса и мясопродуктов, пищевых животных жиров?
263
20.	Какова сущность экспери.менгальных методов определения акустических свойств мяса и мясопродуктов?
21.	В чем состоит метод двух временных точек определения теплофизически.х характеристик'.’
22.	Какие основные этапы включает процесс гистологического анализа мяса? Каковы сто преимущества перед физико-химическими и биохимическими методами исследований'.’
23.	Каковы правила отбора и подготовки проб для определения микроструктурных показателей мяса'.’
24.	Какие приборы используют при получении срезов животных тканей для гистологических исследований9
25.	Какие методы используют при определении функционально-технологических свойств мяса? Каковы преимущества метода последовательного определения функциональных показателей в одной навеске'.’
26.	Как практически определить водосвязывающую, влагоудерживающую, жироудерживающую, эмульгирующую способности и стабильность фаршевых эмульсий?
27.	Охарактеризуйте способность различных белков животных ткано/! к образованию гелей.
28.	Какие приборы используют для определения физических показателей гелей?
29.	Как определить структурно-механические свойства мяса, мясопродуктов и вторичных продуктов убоя?
30.	Что такое вязкость жидкости?
31.	Как влияет температура на вязкость жидкости9
32.	Какие типы вискозиметров вы знаете?
33.	Каковы особенности капиллярных вискозиметров9
34.	Принцип действия конического пластомера.
35.	Устройство и принцип действия ротационных вискозиметров.
36.	Какие технологические факторы влияют на структурно-механические свойства мяса и мясных продуктов?
Глава 3 БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЖИВОТНЫХ ТКАНЕЙ
Рациональное использование животного сырья основано на знании не только химического состава, но и особенностей протекания биохимических процессов в органах и тканях при жизни животного, после его смерти и при технологической обработке.
Прижизненные процессы многообразны и управляемы, протекают в строгом взаимном соответствии. Большую роль в них играют биологически активные вещества -- ферменты и гормоны. Многие ткани животных синтезируют в той или иной мере эти вещества, обеспечивая жизнедеятельность организма. После убоя животных эти ткани служат источниками для получения биологически активных веществ и удаляются в процессе разделки туш, например поджелудочная железа, гипофиз, слизистые оболочки желудков и кишечника и др.
После смерти животного, с прекращением обмена веществ, основным биохимическим процессом при переработке сырья биологического происхождения является автолиз (от греч. autos — с�