Научное общество спеииалистов
лабораторной медициныАССОЦИАЦИЯ
МЕДИЦИНСКИХ
ОБЩЕСТВ
ПО КАЧЕСТВУИЗДАТЕЛЬСКАЯ ГРУППА«ГЭОТАР-Медиа»
АССОЦИАЦИЯ
МЕДИЦИНСКИХ
ОБЩЕСТВ
ПО КАЧЕСТВУКЛИНИЧЕСКАЯ
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАНАЦИОНАЛЬНОЕ РУКОВОДСТВОВ двух томах
Том IIГлавные редакторы
д-р мед. наук В.В. Долгов,
чл.-корр. РАЕН, д-р мед. наук В.В. МеньшиковПодготовлено под эгидой Научно-практического
общества специалистов лабораторной медицины
и Ассоциации медицинских обществ по качествуМоскваИЗДАТЕЛЬСКАЯ ГРУППА«ГЭОТДР-Медиа»2012
УДК 616-07(035)ББК 53.4Я81
К49Национальное руководство рекомендовано
Наугно-практигеским обществом специалистов лабораторной медицины
и Российской медицинской академией последипломного образования
Минздравсоцразвития РФ в кагестве угебного пособия
для последипломной подготовки врагейК49 Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. - Т. II /
иод ред. В.В. Долгова, В.В. Меньшикова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. - 808 с.ISBN 978-5-9704-2131-4 (т. II)ISBN 978-5-9704-2127-7 (общ.)Национальное руководство по клинической лабораторной диагностике разработано и
рекомендовано Научно-практическим обществом специалистов лабораторной медицины.
В издании отражены все разделы клинических лабораторных исследований, представлен¬
ные вед}тцими специалисі'ами научных, обра.ювательных и лечебно-профилактических
учреждений Центрального. Северо-Западного, Уральского, Сибирского, Северо-Кав¬
казского федеральных административных округов.В том II включены наз^ные и практические материалы по акт\'альным проблемам
клинической имм)тнологии, бактериологии, вирусологии, микологии, паразитологии.
Представлены сведения как о повседневно применяемых аналитических технологиях,
так и о новых эффективных способах идентификации микроорганизмов и определения
их чзгвствительносги к антимикробным агентам.В отдельных главах представлены современные данные по иммуногематологии и
методам, применяемым в службе крови, по диагностике азтоиммупиых заболеваний, а
также сведения о новом классе агентов межклеточной регуляции — цитокинах, и о роли
их определения при различных формах патологии.Представленные сведения основаны на данных современной научной литературы,
рекомендациях профессиональных обществ специалистов, стандартах медицинской
помощи, многолетнем научно-практическом опыте авторов глав,Р>т<оводство предназначено для сотрудников клинико-диагностических лабораторий,
представителей различных клинических дисциплин, ст>жнтов медицинских образова¬
тельных учреждений. Материалы руководства могут быть использованы как для базово¬
го медицинского образования, так и для последипломной подготовки.УДК 616-07(035)
ББК 53.4Я81Авторы, редакторы и издатели рз'^ководава предприняли максимум усилий, чтобы
обеспечить точность представленной информации, в том числе дозировок лекарствен¬
ных средств. Учитывая постоянные изменения, происходящие в медицинской науке, мы
рекомендуем уточнять дозы лекарственных средств по соответствующим инструкциям.
Пациенты не могут использовать эту информацию для диагностики и самолечения.Права на данное ипдание принадлежат ООО Издательская группа «ГЭОТАР-Медиа».
Воспроизведение и распространение в каком бы то ни было виде гасти или целого издания не
могут быть осуществлены без письменного разрешения ООО Издательская группа «ГЭОТАР-
Медиа»-.© Коллектив авторов, 2012© ООО Издательская гр>ттпа «ГЭОТАР-Медиа», 2012
15В\ 978-5-9704-2131-4 (т, П) © ООО Издательская группа «ГЭОТАР'Медиа»,ISBN 978-5-9704-2127-7 (общ.) оформление, 2012
ОГЛАВЛЕНИЕУчастники издания	6Список сокращений	12Глава 16. Лабораторная иммунология К.П. Кашкин, Ф.Ю. Тариб, Л.М. Скуинь ...17Врожденные факторы иммунной защиты	17Приобретенный иммунитет	25Патология иммунной системы	35Иммунная система и воспаление	48Алгоритм лабораторного исследования иммунной системы	61Глава 17, Диагностика аутоиммунных заболеваний С.В. Лапин,Арег А. Тотолян	66Критерии, классификация и эпидемиология аутоиммунных заболеваний	66Антитела и аутоиммунные заболевания	70Лабораторные показатели при аутоиммунных заболеваниях	74Диагностика ревматических заболеваний			146Заключение	174Глава 18. Иммуногематология ОА. Тарасенко, О.Я. Волкова	176Антигены эритроцитов	177Иммуногематологическая безопасность трансфузионной терапии	179Иммуногематологические патологические состояния	185Иммуногематологические лабораторные исследования	189Глава 19. Цитокины в лабораторной диагностике A.C. Симбирцев,Арег А. Тотолян			193Общие представления о цитокинах	194Методы оценки функционирования системы цитокинов	198Роль цитокинов в патогенезе заболеваний человека	217Диагностическое значение отдельных цитокинов	220Заключение	228Глава 20, Бактериологические исследования. Под редакцией А.Б, Жебруна	230Значение лабораторной диагностики в инфектологии А.Б. Жебрун	230Задачи бактериологической диагностики А.Б. Жебрун	232Этиологическая диагностика бактериальных инфекций A.L Бойцов	234Принципы бактериологического исследования отдельных видов
биологического материала и интерпретации их результатовA.Г.	Бойцов, A.B. Елисеев, Л.А. Кафтырева, Е.А. Оришак, Л.Ю. Нилова	239Принципы идентификации бактерий А.А. Парии, А.Г. Бойцов	283Индикация антигенов возбудителей А.А. Норин, А.Г. Бойцов	287Молекулярно-генетическая индикация бактерий О.В. Нарвская,С.А. Егорова, М.А. Макарова, Л.А. Кафтырева	291Индикация специфических антител Л.А. Кафтырева, М.А. Макарова,С.А. Егорова	295Определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратамB.Д.	Бадиков	300Глава 21. Частная микробиология. Под редакцией А.Б. Жебруна	312I.	ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ	312Хламидии ДБ. Куляиюва, ЛЛ. Березина, A.B. Закревская, А.Б. Жебрун,В.А, Исаков	312Бордетеллы H.H. Курова, Г.Я. Ценева	323
4	ОГЛАВЛЕНИЕЛегионеллы КС, Тартаковский	329КоксиеллыЯХ Токаревых, O.A. Фрейлихман	335Энтеробактерии Л А. Кафтырева, А.Г. Бойцов, М.А. Макарова	342Иерсинии Г.Я. Ценева, ЕЛ. Воскресенская, Г.И. Кокорина,Е.А. Богумильгик, О А. Бургасова	365Гемофильные бактерии А.Б. Жебрун	375Неферментирующие бактерии А.Г. Бойцов, О.Д. Васильев	380Кампилобактеры АЛ, Порин., З.Н. Матвеева	388Хеликобактеры А.Б. Жебрун, А.В. Сварваль, Л.Б. Гонгарова, P.C. Ферман	394II.	ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ	406Стафилококки К.Г. Косякова	406Стрептококки Артем А. Тотолян, ЛЛ. Бурова, А.В. Дмитриев, АЛ. Суворов.... 417Пневмококковый стрептококк А.Б. Жебрун	435Менингококк А.Б, Жебрун	438Листерии И.С. Тартаковский	445Клостридии А.Г. Бойцов, Л.А. Кафтырева	451Лептоспиры H.A. Стоянова, А.Н. Ваганова	460Коринебактерии Г.Я. Ценева, Л.А. Краева, Г.И. Беспалова, Е.А. Алексеева	468Глава 22. Некоторые инфекционные заболевания	484Микобактерии М.В. Шульгина, Б.И. Вишневский, Т.Ф. Оттен	484Трепонемы А.М. Савигева, Е.В. Соколовский, Т.В. Красносельских,Е.В. Шипицина	496Гонококк А.М. Савигева, Е.В. Соколовский, А.В. Игнатовский, Е.В. Шипицина.... 519
Франсиселлы И.С. Мещерякова	530Глава 23. Вирусологические исследования Под редакцией А.Б. Жебруна	542Задачи диагностики вирусных инфекций А.Б. Жебрун	542Организация работы лаборатории по диагностике вирусныхзаболеваний С.С. Вашукова	545Общие сведения о вирусах И.Н. Лаврентьева, С.Я, Сухобаевская,Л.Ф. Литвингук, А.Ю. Антипова	548Классические методы выделения и идентификации вирусовС.П. Сухобаевская, Л.Ф. Литвингук, А.К. Сироткин, A.B. Семенов,В.Н. Вербов, И.Н. Лаврентьева	561Молекулярно-биологические методы A.B. Семенов, Л.Б. Гонгарова	613Преаналитический этап при вирусологических исследованияхИ.Н. Лаврентьева	627Обеспечение качества при вирусологических исследованиях А.В. Семенов	633Глава 24. Частная вирусология. Под редакцией А.Б. Жебруна	641Аденовирусы И.Н. Лаврентьева	641Астровирусы В.М. Малышев, Д.А. Макаров	644Вирус бешенства И.И. Яровая, П.В. Колотвина, М.А. Кохновиг, С.В Грибенга	645Вирус гриппа С.С. Вашукова, Л.Б, Гонгарова	649Вирус иммунодефицита Г.И. Коровина	653Вирус клещевого энцефалита С С. Вашукова, И.Н, Лаврентьева,А.Ю. Аптипова	656Вирус кори М.А. Бигурина	659Вирус краснухи ИЛ. Лаврентьева, А.Ю. Антипова	663Вирус парагриппа Л. Л. Сухобаевская	665Вирус эпидемического паротита Е.О. Контарова, Н.В. Юминова	667Вирусы — возбудители геморрагических лихорадок И.И. Яровая,Л.А. Автушенко, Ф.С. Носков, Б.В. Вершинский, А.Б. Жебрун	669
ОГЛАВЛЕНИЕ	5Вирусы-возбудители гепатитов С.Л. Мукомолов	673Герпес-вирусы В.А. Исаков, A.B. Закревская	680 ■Калицивирусы А.К. Сироткин	691Коронавирусы Л.Б. Гонгарова	694Респираторно-синцитиальный вирус И.Н. Лаврентьева, Л.П. Сухобаевская	699Риновирусы Л.Я. Сухобаевская, А.Ю. Антипова	700Ротавирусы Л.Б. Лшина, А,Н Афанасьева	702 |Парвовирус В19 А.Ю. Антипова	706Папилломавирусы 0,ß. Нарвская	708Полиовирусы НИ. Романеикова, М.А. Бигурина	714Энтеровирусы НИ. Романенкова, М.А. Бигурина	720Глава 25. Микологические исследования Е.В. Липова, И.И. Глазко,М.А. Мозжерова, В.Е. Колупаев	726Систематика и классификация грибов	726Преаналитический этап лабораторной диагностики микозов	729Макроскопические исследования	735Микроскопические исследования	736Культуральное исследование	754Определение антифунгеальной чувствительности	„760Лабораторная диагностика поверхностных микозов	767Критерии диагностики системных микозов	767Глава 26. Лабораторная диагностика паразитарных болезней A.C. Довгаяев,А.Е. Беляев, Т.Н. Константинова, ЮЛ. Горбунова, Т.И. Авдюхина,Т.М. [узеева	771Кровепаразиты	773Паразиты в костном мозге	778Паразиты в ликворе	778Паразиты в лимфатических узлах	780Исследования паразитов в кале	781Паразиты в дуоденальном содержимом	791Паразиты в моче	792Паразиты мокроты	793Паразиты отделяемого мочеполовых путей	794Паразиты в биоптатах тканей	795Методы иммунодиагностики паразитарных заболеваний	797Предметный указатель	801
1«УЧАСТНИКИ ИЗДАНИЯГЛАВНЫЕ РЕДАКТОРЫДолгов Владимир Владимирович — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой
клинической лабораторной диагностики ГОУ ДПО «Российская медицинская ака¬
демия последипломного образования», МоскваМеньшиков Вадим Владимирович — д-р мед. наук, профессор, заслужен-
ный деятель науки РФ, член-корреспондент РАЕН, зав. лабораторией проблем
клинико-лабораторной диагностики НИЦ ГОУ ВПО «Первый Московский госу¬
дарственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» и экстремальной
хирургии, вице-президент ассоциации ортопедов и травматологов РФ.АВТОРЫ И СОСТАВИТЕЛИАвдюхина Татьяна Николаевна - канд. мед. наук, доцент кафедры тропи¬
ческих и паразитарных болезней ГОУ ДПО «Российская медицинская академия
последипломного образования», МоскваАвтушенко Лариса Александровна — канд. мед. наук, врач-вирусолог ФГУЗ
«Северо-Западная противочумная станция» Роспотребнадзора, Санкт-Петербург
Алексеева Елена Андреевна — зам. зав. бактериологической лабораторией
Центра Госсанэпиднадзора Вологодской области, ВологдаАнтипова Анастасия Юрьевна — мл. научн. сотр. ФГУН «Санкт-Петербург¬
ский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора
Афанасьева Анна Николаевна — вед. специалист-эксперт Управления
Федеральной службы в сфере защиты прав потребителя и благополучия человека
по Санкт-Петербург}^Бадиков Владимир Дмитриевич — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой
микробиологии и микологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная
медицинская академия им. И.И. Мечникова»Беляев Андрей Евгеньевич - канд. мед, наук, доцент кафедры тропических
и паразитарных болезней ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последи¬
пломного образования», МоскваБерезина Людмила Александровна — канд. биол. наук, ст. научн. сотр.
лаборатории иммунологии ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и
микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораБеспалова Галина Ивановна — канд. мед. наук, доцент кафедры микробио¬
логии и микологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская
академия им. И.И. Мечникова»Бичурина Майна Александровна, д-р мед. наук, заслуженный деятель
науки РФ, зав. лабораторией этиологии и контроля вирусных инфекций ФГУН
«Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»
РоспотребнадзораБогумильчик Елена Александровна — мл. научн. сотр, лаборатории бактери¬
альных капельных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии
и микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораБойцов Алексей Геннадьевич - д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой
микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская
государственная медицинская академия им. И.И, Мечникова»Бургасова Ольга Александровна — канд. мед. наук, доцент кафедры инфек¬
ционных болезней и эпидемиологии Московского государственного медико¬
стоматологического университетаБурова Лариса Александровна — д-р мед. наук, вед. научн. сотр. отдела
молекулярной микробиологии НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-
Петербург
УЧАСТНИКИ ИЗДАНИЯ	7Ваганова Анастасия Николаевна — биолог, сотр. лаборатории зооантропо-
нозных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микро¬
биологии имени Пастера» РоспотребнадзораВасильев Олег Дмитриевич — канд. мед. наук, доцент кафедры микробиоло¬
гии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государствен¬
ная медицинская академия им. И.И. Мечникова»	\ '
Вашукова Светлана Степановна — канд. биол. наук, врач клинической лабо¬
раторной диагностики СПб ГУЗ «Городской консультативно-диагностический
центр (вирусологический)»Вербов Вячеслав Николаевич — канд. хим. наук, руководитель отдела новых
технологий ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии
имени Пастера» РоспотребнадзораВершинский Борис Васильевич — канд. мед. наук, лауреат Государственной
премии СССР. Последняя должность — ст. науч. сотр. лаборатории зооантропоноз-
ных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробио¬
логии имени Пастера» РоспотребнадзораВишневский Борис Израилевич — д-р мед. наук, профессор, зав. лаборатори¬
ей микробиологии туберкулеза ФГУ «Санкт-Петебургский научно-исследователь¬
ский институт фтизиопульмонологии»Воскресенская Екатерина Александровна — канд. биол. наук, ст. научн. сотр.
лаборатории бактериальных капельных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский
НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораГлазко Ирина Ивановна — канд. мед. наук, доцент курса лабораторной диа¬
гностики и лабораторной микологии кафедры дерматовенерологии и клинической
микологии ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного обра¬
зования», МоскваГончарова Лариса Борисовна — канд. биол. наук, зав. вирусологическим
отделением СПб ГУЗ «Городской консультативно-диагностический центр (виру¬
сологический)»Горбунова Юлия Петровна — ст. лаб. кафедры тропических и паразитарных
болезней ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образо¬
вания», МоскваГрибенча Сергей Васильевич — д-р мед, наук, профессор, зав. лабораторией
иммунологии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, МоскваГузеева Татьяна Михайловна — канд. мед. наук, доцент кафедры тропических
и паразитарных болезней ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последи¬
пломного образования», МоскваДмитриев Александр Валентинович - д-р биол. наук, зав. лабораторией
функциональной геномики и протеомики микроорганизмов отдела молекулярной
микробиологии НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург
Довгалев Анатолий Семенович — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой
тропических и паразитарных болезней ГОУ ДПО «Российская медицинская акаде¬
мия последипломного образования», МоскваЕгорова Светлана Александровна — канд. мед. наук, научн. сотр. лаборато¬
рии кишечных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и
микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораЕЗгасеев Алексей Викторович — врач-бактериолог бактериологической лабо¬
ратории клинической больницы имени Петра Великого, Санкт-ПетербургЖебрун Анатолий Борисович — член-корреспондент РАМН, профессор, д-р
мед. наук, директор ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микро¬
биологии имени Пастера» Роспотребнадзора
8	УЧАСТНИКИ ИЗДАНИЯЗакревская Анна Васильевна — канд. мед. наук, вед. научн. сотр. лаборатории
иммунологии ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиоло¬
гии имени Пастера» РоспотребнадзораИгнатовский Андрей Викторович — канд. мед. наук, ассистент кафедры дер¬
матовенерологии с клиникой ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный
медицинский университет им. акад. И.П, Павлова?»Исаков Валерий Александрович — д-р мед. наук, академик РАЕН, профес¬
сор кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии с курсом ВИЧ-медицины
ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет
им. акад. И.П. Павлова», вед. науч. сотр. лаборатории иммунологии ФГУН
«Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»
РоспотребнадзораКафтырева Лидия Алексеевна — д-р мед. наук, зав. лабораторией кишеч¬
ных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробио¬
логии имени Пастера» Роспотребнадзора, главный специалист по бактериологии
Департамента здравоохранения Санкт-Петербурга, профессор кафедры ГОУ ДПО
«Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования».Кашкин Кирилл Павлович — д-р мед. наук, профессор, академик РАМН, зав.
кафедрой иммунологии ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последи¬
пломного образования», МоскваКокорина Галина Ивановна — врач-бактериолог отделения диагностики и
профилактики гепатитов ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и
микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораКонстантинова Татьяна Николаевна — канд. мед. наук, доцент кафедры тро¬
пических и паразитарных болезней ГОУ ДПО «Российская медицинская академия
последипломного образования», МоскваКонтарова Елена Олеговна — мл. научн. сотр. УРАМН «НИИВС имени
И.И. Мечникова» РАМНКоровина Галина Ивановна — канд. биол. наук, врач клинической лаборатор¬
ной диагностики Республиканской клинической инфекционной больницы, Санкт-
Петербург, Усть-ИжораКосякова Карина Георгиевна - канд. мед. наук, ст. преподаватель кафедры
микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская
государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова»Кохнович Милана Анатольевна — мл. научн. сотр. ГУ НИИ вирусологии
им. Д.И. Ивановского, МоскваКраева Людмила Александровна — канд. мед. наук, ст. научн. сотр. лабора¬
тории бактериальных капельных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ
эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораКрасносельских Татьяна Валерьевна — канд. мед. наук, доцент кафедры дер¬
матовенерологии с клиникой ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный
медицинский университет им. акад. И.П, Павлова»Куляшова Лидия Борисовна — канд. мед. наук, вед. научн. сотр, лаборатории
иммунологии ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиоло¬
гии имени Пастера» РоспотребнадзораКурова Наталья Николаевна - канд. мед. наук, ст. научн. сотр. лаборатории
бактериальных капельных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпиде¬
миологии и микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораЛаврентьева Ирина Николаевна — д-р мед. наук, зав. лабораторией детских
вирусных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микро¬
биологии имени Пастера» РоспотребнадзораЛапин Сергей Владимирович — канд. мед. наук, зав. лабораторией диа¬
гностики аутоиммунных заболеваний НМЦ по молекулярной медицине ГОУ
УЧАСТНИКИ ИЗДАНИЯ	9ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад.И.П, Павлова»	■Лилова Елена Валерьевна — д-р мед. наук» профессор, зав. курсом лабора¬
торной диагностики и лабораторной микологии кафедры дерматовенерологии и
клинической микологии ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последи¬
пломного образования», МоскваЛитвинчук Людмила Филипповна — канд. биол. наук, вед. научн. сотр. ГУН
НИИ гриппа СЗО РАМН, Санкт-ПетербургЛялина Людмила Владимировна — д-р мед. наук, зав, отделом эпидемиоло¬
гии ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени
Пастера» РоспотребнадзораМакаров Дмитрий Александрович — мл, научн. сотр. ФГУН «Санкт-
Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»
РоспотребнадзораМакарова Мария Александровна — канд. мед. наук, научн. сотр. лаборатории
кишечных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микро¬
биологии имени Пастера» РоспотребнадзораМалышев Владимир Васильевич — д-р мед. наук, руководитель группы
охраны окружающей среды ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и
микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораМатвеева Зоя Николаевна — канд. мед. наук, ст. научн. сотр. лаборатории
кишечных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микро¬
биологии имени Пастера» РоспотребнадзораМещерякова Ирина Сергеевна — д-р биол. наук, руководитель Центра
Минздравсоцразвития России по туляремии, НИИ эпидемиологии и микробио¬
логии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. МоскваМукомолов Сергей Леонидович — д-р мед. наук, профессор, зав. лаборато¬
рией вирусных гепатитов ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и
микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораМозжерова Марина Анатольевна — канд, мед. наук, ассистент курса лабора¬
торной диагностики и лабораторной микологии кафедры дерматовенерологии и
клинической микологии ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последи¬
пломного образования», МоскваНарвская Ольга Викторовна — д-р мед, наук, зав, лабораторией молеку¬
лярной микробиологии ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и
микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора, профессор кафедры медицин¬
ской экологии и эпидемиологии человека имени Г.В. Хлопина ГОУ ДПО «Санкт-
Петербургская медицинская академия последипломного образования»Нилова Людмила Юрьевна — канд. мед. наук, ст. преподаватель кафедры
микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская
государственная медицинская академия им, И.И. Мечникова»Носков Фридрих Савельевич — д-р мед. наук, профессор, заслуженный
деятель науки РФ. Директор НИИЭМ имени Пастера (1992-1994 гг.). Последняя
должность ~ главный научный сотрудник ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ
эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораОришак Елена Александровна ~ канд. мед. наук, доцент кафедры микро¬
биологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государ¬
ственная медицинская академия им. И.И. Мечникова»Оттен Татьяна Фердинандовна — д-р мед. наук, вед. научн, сотр. лабо¬
ратории микробиологии туберкулеза ФГУ «Санкт-Петербургский научно-
исследовательский институт фтизиопульмонологии»
10 УЧАСТНИКИ ИЗДАНИЯПорин Александр Арнольдович - канд. мед. наук, доцент кафедры микро¬
биологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государ¬
ственная медицинская академия им. И.И. Мечникова»Романенкова Наталия Ивановна — канд. мед. наук, вед. научн. сотр. ФГУН
«Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»
РоспотребнадзораСавичева Алевтина Михайловна — д-р мед. наук, профессор, руководитель
лаборатории микробиологии НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО
РАМН, Санкт-ПетербургСварваль Алена Владимировна — научн. сотр. лаборатории иммунологии
ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени
Пастера» РоспотребнадзораСеменов Александр Владимирович — канд. биол. наук, зав. центральной
клинико-диагностической лабораторией ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпи¬
демиологии и микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораСимбирцев Андрей Семенович — д-р мед. наук, профессор, зав. лабораторией
фармиммунологии Государственного НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА
России, Санкт-ПетербургСироткин Алексей Константинович — канд. биол. наук, вед. научн. сотр.
ГУН НИИ гриппа СЗО РАМН, доцент Санкт-Петербургского государственного
университетаСкуинь Людмила Михайловна — канд. мед. наук, доцент кафедры иммуно¬
логии ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образова¬
ния», МоскваСоколовский Евгений Владиславович - д-р мед. наук, профессор, зав. кафе¬
дрой дерматовенерологии с клиникой ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государ¬
ственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова»Стоянова Наталья Александровна — канд. мед. наук, научн. сотр. лаборато¬
рии зооантропонозных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемио¬
логии и микробиологии имени Пастера» РоспотребнадзораСуворов Александр Николаевич - д-р мед. наук, профессор, зав. лаборато¬
рией молекулярной генетики патогенных микроорганизмов отдела молекулярной
микробиологии НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург
Сухобаевская Лариса Петровна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. ФГУН
«Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»
РоспотребнадзораТартаковский Игорь Семёнович — д-р биол. наук, профессор, зав. лаборатори¬
ей легионеллеза, УРАМН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи
РАМН, МоскваТокаревич Николай Константинович — д-р мед. наук, зав. лабораторией
зооантропонозных инфекций ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиоло¬
гии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора, профессор кафедры
медицинской экологии и эпидемиологии человека имени Г.В. Хлопина ГОУ ДПО
«Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования
Минздравсоцразвития РФ»Тотолян Арег Артемович — д-р мед. наук, профессор, зам. директора ФГУН
«Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»
РоспотребнадзораТотолян Артем Акопович — д-р мед. наук, профессор, академик РАМН, руко¬
водитель отдела молекулярной микробиологии НИИ экспериментальной медици¬
ны РАМН, Санкт-Петербург
УЧАСТНИКИ ИЗДАНИЯ Ц'Ферман Раиса Семеновна — мл. научн. сотр. лаборатории иммунологии
ФГУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени
Пастера» РоспотребнадзораЦенева Галина Яковлевна — д-р мед. наук, профессор, заслуженный дея- {¡¡¡{'^
тель науки РФ, зав. лабораторией бактериальных капельных инфекций ФГУН
«Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»
Роспотребнадзора	<1ЩсШипицина Елена Васильевна — канд. биол. наук, ст. научн. сотр. лаборато-
рии микробиологии НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН,
Санкт-ПетербургШульгина Марина Владимировна - д-р биол, наук, вед. научн, сотр. отдела
стандартизации и контроля качества клинической лабораторной диагностики ФГУ
ГНИЦ профилактической медицины, зам, генерального директора по развитию
НП «Центр внешнего контроля качества», МоскваЮминова Надежда Васильевна — д-р биол. наук, зам. директора по научной
работе УРАМН «НИИ ВС имени И.И. Мечникова» РАМНЯровая Ирина Ильинична — зав. вирусологической лабораторией ФГУЗ
«Северо-Западная противочумная станция» Роспотребнадзора, Санкт-Петербург
isrfсписок СОКРАЩЕНИЙАБК — антитела к бокаловидным клеткам
Аг — антиген
^ АГМА — антигладкомышечные антитела
II АЕ — агглютинирующие единицы
Щ АЗП — аутоиммунные заболевания печени
1^ АИГ — аутоиммунный гепатитАИЗ — аутоиммунные заболевания
АКА — антикератиновые антитела
АКЛА — антикардиолипиновые антитела
AMA — антимитохондриальные антителаАМЦВ — антитела к модифицированному цитруллинированному виментинуАНА — антинуклеарные антителаАНФ — атинуклеарный факторАнФА — антифилаггриновые антителаАНЦА — антинейтрофильные цитоплазматические антителаАОК — антитела к островковым клеткамАПКЖ — антитела к париетальным (обкладочным) клеткам желудкаАПФ — антиперинуклеарный факторАСИТ — антиген-специфическая иммунотерапияАт — антителоАФА — антифосфолипидные антитела
АФП — а-фетопротеин
АФС — антифосфолипидный синдром
АхР — ацетилхолиновый рецептор
АЦА — антицитруллиновые антителаАЦЦП — антитела к циклическому цитруллин-содержащему пептидуАЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое времяАЭА — антиэндомизиальные антителаАЭТА — антиэндотелиальные антителаБАЛ — бронхоальвеолярный лаважБНМ — белки наружной мембраныБТШ — белок теплового шокаВА — волчаночный антикоагулянтВГЧ-6 (HHV-6) — вирус герпеса человека 6-го типаВИЧ — вирус иммунодефицита человекаВКК — внутрилабораторный контроль качестваВКЭ — вирус клещевого энцефалитаВПГ — вирус простого герпесаВПЧ (HPV) — вирус папилломы человекаБРПВ — вакцинно-родственные полиовирусыВТД — внутритиповая дифференцияВЭБ (EBV) — вирус Эпштейна-БаррГБ — синдром Шйена-БарреГВ — гранулематозный васкулитГВИ — герпес-вирусные инфекцииГДК — глутаматдекарбоксилазаГИ — герпетическая инфекцияГЛПС — геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
ДБСТ — диффузные болезни соединительной ткани
две — диссеминированное внутрисосудистое свертывание
ДК — дендритные клетки
список СОКРАЩЕНИЙ 13ДКВ - дискоидная красная волчанка
ДМ/ПМ — дерматомиозит/полимиозит
ИА — индекс авидности
ИБ - иммуноблотИППП - инфекции, передающиеся половым путемИФА — иммуноферментный анализИФМ — флюоресцентная (люминесцентная) микроскопияИХТ - иммунохроматографический тестИЭМ — иммуноэлектронная микроскопияКГЛ - крымская геморрагическая лихорадкаККГЛ - крымская-Конго геморрагическая лихорадкаКОЕ — колониеобразующая единицаКУМ — кислотоустойчивые микобактерииЛПС - липополисахаридМ — молярностьМАК - мембраноатакующий комплексМАт — моноклональные антителаМБК — минимальная бактерицидная концентрацияМВТ — микобактерии туберкулезаME — международные единицыМИА — мультиплексный иммунный анализМИК - минимальная ингибирующая концентрацияМКТВ — Международный комитет по таксономии вирусовМПК — минимальная подавляющая концентрацияМПО — миелопероксидазаМР - методические рекомендацииМФА - микроскопический флюоресцентный анализНГОБ — неферментирующие грамотрицательные бактерииНМФА — непрямой метод флюоресцирующих антителНРИФ — непрямая реакция иммунофлюоресценцииНЯК — неспецифический язвенный колитОКИ — кишечные инфекцииос/дсДНК - одно/двуспиральная ДНКОТ - обратная транскрипцияПБА — патогенные биологические агентыПБЦ — первичный билиарный циррозПИР — пирролидонил аминопептидазаПИФ — реакция прямой иммунофлюоресценцииПМФА - метод флюоресцирующих антителПР-3 — протеиназа 3ПТИ — пищевая токсикоинфекцияПТО - посттрансфузионное осложнениеШДР — полимеразная цепная реакцияПЭП — полиэндокринопатияРА ~ ревматоидный артритРАИЛ - рецепторный антагонист интерлейкина-1PB — реакция ВассерманаРГА - реакция гемагглютинацииРИА — радиоиммунный анализРИФ — реакция иммунофлюоресценцииРМА — реакция мйкроагглютинацииPH - реакция нейтрализацииРИГА - реакция непрямой гемагглютинации
14список СОКРАЩЕНИЙРПГА - реакция пассивной гемагглютинацииРС — рассеянный склерозРСВ — респираторно-синцитиальный вирусРСК — реакция связывания комплементаРТГА - реакция торможения гемагглютинациирТТГ — рецептор тиреотропного гормонаРФ — ревматоидный факторСГВ - стрептококки группы ВСД ~ сахарный диабетСЗСТ — смешанное заболевание соединительной ткани (синдром Шарпа)СКВ — системная красная волчанкаСНЖ — спинномозговая жидкостьСП — санитарные правилаСС — системный склерозСШ — синдром ШегренаТВП - тест волчаночной полоскиТГ — тиреоглобулинТКИД — тяжелый комбинированный иммунодефицитТкТГ — тканевая трансглутаминазаТОРС — тяжелый острый респираторный синдромТП — тромбопоэтинТПО — тиреоидная пероксидазаТСЛП — тимический стромальный лимфопоэтинТТГ — тиреотропный гормонТЦД — тканевая цитопатогенная дозаУВЧ — электрическое поле ультравысокой частотыФВК — фосфовольфрамовая кислотаФГА — фитогемагглютининФГУП — федеральное государственное унитарное предприятиеФСВОК — федеральная система внешней оценки качестваЦИК — циркулирующие иммунные комплексыЦМВ — цитомегаловирусЦНС — центральная нервная системаЦПД — цитопатическое действиеЦПЭ — цитопатогенный эффектЭГДС - эзофагогастродуоденоскопияЭДТА — этилендиаминтетраацетатЭН А — экстрагируемые нуклеарные (ядерные) антигеныЭП — эпидемический паротитЭПО — эритропоэтинЮРА - ювенильный ревматоидный артрит
ASCA - антитела к Saccharomyces cerevisiae
BCG — BaciUe Calmette-Guáin\ БЦЖBMP — bone morphogenetic proteins\ костные морфогенетические белкиCARS — compensatory anti-injlammatory response syndrome; синдром компенсаторногоантивоспалительного ответаCD — cluster of differentiation) кластер дифференцировки
CDC — Центр контроля заболеваемостиCREST-синдром — Calcinosis, Raynauld’s phenomenon, Esophagitis, Scleroáactyly,
Telangiectasia — разновидность системного склероза, объединяющая подкожные
кальцинаты, синдром Рейно, нарушения моторики пищевода, склеродактилию и
телеа н гиоэкта зииCSF — colony-stimulationgfactor, колониестимулирующий фактор
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 15EGF — epidermal growth factor, эпидермальный фактор роста
ELISA — enzyme-linked immunosorbent assay; анализ твердофазный иммунофермеыт-
ныйELIS РОТ — enzyme linked immunospot, твердофазный иммуноферментный анализ
синтеза цитокинов единичными клетками	' tFGF ~ fibroblast growth factor, фибробластный фактор роста
G-CSF — колониестимулирующий фактор для гранулоцитов
GM-CSF — колониестимулирующий фактор для гранулоцитов и моноцитов
HLA - human leucocyte antigen-, человеческий лейкоцитарный антиген
IFN — интерферон
IL — интерлейкинLC-I — антитела к цитозольному антигену печени
LKM — антитела к микросомам печени-почекM-CSF— колониестимулирующий фактор для моноцитов/макрофагов
МНС — главный комплекс гистосовместимости
MLST — мультилокусное генотипирование
КК(-клетки) — natural killer, естественный убийцаPDGF — platelet-derived growth factor, фактор роста, продзщируемый тромбоцитами
РТХЗ — пентраксин 3RT-PCR — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
sICAM-1 — растворимая форма межклеточной адгезионной молекулы 1
SIL-2R — растворимая форма рецептора IL-2SNP — single nucleotide polymorphism-, полиморфизм вследствие замены единичных
нуклеотидовTCR — антигенраспознающие рецепторыTGFp — 1гапфгт1п^ growth factor beta', трансформирующий фактор роста—	Т-лимфоциты-хелперы
TisiF — tumor necrosis factor, фактор некроза опухоли
Глава 16
Лабораторная иммунологияИммунная система защищает внутреннюю среду организма от
чужеродных и собственных антигенов, приобретающих призна¬
ки чужеродности в силу различных обстоятельств. Способность
поддерживать собственные антигены жидкостей, клеток и тканей
позволяет человеку сохранить свою антигенную (иммунохимиче-
скую) индивидуальность. В защите от «чужого» участвуют клетки
органов и систем, а также гуморальные продукты жизнедеятельно¬
сти этих клеток. Факторы иммунной защиты подразделяют на две
категории: врожденные (антиген-неспецифические) и приобретен¬
ные (антиген-специфические).ВРОЖДЕННЫЕ ФАКТОРЫ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ
Клетки врожденного иммунитетаВрожденные механизмы иммунитета препятствуют проникнове¬
нию чужеродных антигенов в организм, нейтрализуют, разрушают и
выводят из организма чужеродные для него субстанции и клетки, не
«запоминая» их строения и не «узнавая» при повторных контактах
с ними. Врожденный иммунитет обеспечивается клетками фагоци¬
тарной системы, соединительной и пограничных тканей, тромбо¬
цитами, тучными, ЫК-клетками и т.д. В его поддержании участвуют
гуморальные факторы защиты; белки (острофазные, катионные и
системы комплемента), медиаторы воспаления, цитокины, рецепто¬
ры клеток и др. Врожденные факторы иммунной защиты вызывают
ранние реакции на чужеродные агенты при первичных и даже вто¬
ричных контактах с ними. По изменению их содержания и активно¬
сти судят о ранней реакции организма на чужеродные агенты.Увелигение в крови содержания полиморфноядерных лейкоцитов и
накопление юных форм этих клеток — ранняя реакция фагоцитов
на инфекционные агенты. Возрастает функциональная активность,
которую оценивают по фагоцитарной способности, а также по
изменению активности некоторых ферментов (миелопероксидаза,
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа) и увеличению концентрации в
крови белков, продуцируемых полиморфноядерными лейкоцитами
(лизоцим, прокальцитонин и др.). Полиморфноядерные лейкоциты
особенно значимы в качестве антимикробных агентов при инфек¬
циях, вызываемых бактериями и грибами, а также при защите от
18ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯкапсульных микроорганизмов и возбудителей пиогенных инфекций. При дефектах
развития нейтрофильных лейкоцитов меняется их содержание в крови, возника¬
ют морфологические и функциональные нарушения (табл. 16-1 и 16-2). В основе
отклонений — ферментопатии, нарушения созревания клеток, синтеза адгезивнь[х
молекул, разнообразных рецепторов и др.Таблица 16-1. Основные заболевания и состояния, сопровождающиеся нейтрофилией {количе¬
ство нейтрофилов превышает 8х10®/л крови)Основные причиныИ>гтерпретациА измененийВлияние различных раздражителей
(спортивные упражнения: адреналин:
анестезия: пароксизмальная тахи¬
кардия; гипертермия)Быстрый переход гранулоцитов из краевого прилежания в циркули¬
рующую кровь за счет нейтрофилов, расположенных маргинально
вдоль стенок мелких кровеносных сосудов или секвестрированных
в селезенкеВведение различных ядовСвязь со степенью тканевого распадаЛекарства и токсины (экстракты
наперстянки, свинец, ртуть, бензол)Связь со степенью тканевого распадаВведение ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ или 1ЛХ
избыточная продукция в организме
(болезнь Иценко-Кушинга)Нейтрофилия — следствие перехода нейтрофилов из краевого
прилежания в сосудах в циркулирующую кровь в ответ на выбросы
адреналина и адренокортикоидовОстрая бактериальная инфекцияСтимуляция выброса нейтрофилов из костного мозга и их усилен¬
ная продукцияНеинфекционное воспаление (уре¬
мия, подагра)Гранулоцитоз вторичен по отношению к воспалительному процессу,
связанному в одном случае с азотемией, в другом — с отложением
кристаллов солейЗлокачественные опухолиНекроз бьютрорастущих опухолей при недостаточности их кро¬
воснабжения. Некоторые опухоли (карциномы молочной железы,
легких, почек, фибро- и липосаркомы) вырабатывают субстанцию,
стимулирующую развитие нейтрофилии. Паранеопластический
синдром при солидных опухолях может вызвать нейтрофилию за
счет секреции нейтрофил-стимулирующего фактора ростаВосстановление костного мозга
после агранулоцитозаФеномен превышения, характеризующийся гранулоцитозом (напри¬
мер, при лечении мегал области ой анемии)Первичные гематологические забо¬
левания (например,хронический
миелолейкоз)Автономная продукция нейтрофиловСпленэктомияНейтрофилия вследствие нарушения секвестрирования гранулоци¬
тов в селезенкеЛейкемоидная реакцияДиагноз исключения. Может сопровождать острые и хронические
инфекции, интоксикации, злокачественные новообразования,
включая метастазы в костный мозг (карцинома молочной и пред¬
стательной железы). Синдром Дауна может сопровождаться особой
лейкемоидной реакцией, при которой картина крови и костного
мозга неотличимы от характерных для острого миелолейкозаТаблица 16-2. Основные заболевания и состояния, сопровождающиеся нейтропенией (количе¬
ство нейтрофилов в крови менее 1,5х10®/л)Основные причиныИнтерпретация измененийЛекарственные пре¬
паратыДозозависимая супрессия костного мозга (бензол, антиметаболиты, антраци-
клины) или идиосинкразическая реакция (антитиреоидные. противосудорожнью,
антигистаминные препараты, фенотиазиды. сульфаниламиды и транквилизаторы)Ионизирующее излу¬
чениеДозозависимая супрессия костного мозгаВирусные инфекцииГрипп, корь, ветряная оспа, краснуха, инфекционный гепатит, ВИЧ-инфекцияБактериальные инфек¬
цииТифоидная и паратифоидная лихорадка, туляремия, иногда бруцеллез, септице¬
мияКоллareнозыСистемная красная волчанка; синдром Фелти, характеризующийся поражением
суставов (ревматоидный артрит), спленомегалией и нейтропенией
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 19
Окоинаные табл. 16-2Основные причиныИнтерпретация измененийАутоиммунная нейтро-
пенияСледствие образования антинейтрофильных антителНарушения гемопоэзаТяжелая недостаточность витамина и фолиевой кислоты приводит к нару¬
шению созревания нейтрофилов в костном мозге. В периферической крови при
этом встречаются большие гиперсегментированные нейтрофилыЗаболевания кровиАпластическая анемия, острый лейкоз, миелодиспластический синдромВрожденная патологияСемейная нейтропения с аутосомно-доминантным типом наследования; цикличе¬
ская нейтропения с неясной этиологией; хроническая идиопатическая нейтропе¬
ния и синдром Костмаина, при котором задерживается созревание нейтрофилов
в костном мозгеУвелигение в крови колигества эозинофилов и накопление продуктов их мета¬
болизма (главный основной и эозинофильный катионный белок, эозинофильные
нейротоксин и пероксидаза) характерно для аллергических заболеваний, пара¬
зитарных инфекций и опухолей (табл. 16-3). Эозинофилы при этой патологии
активно осуществляют свои эффекторные функции.Таблица 16-3. Основные заболевания и состояния, при которых возможна эозинофилия (количе¬
ство эозинофилов в крови превышает 0,45x107л)Заболевания и состоянияКомментарииАллергические заболе¬
ванияБронхиальная астма, крапивница, ринит, атопический дерматит, лекарственная
аллергия, поллиноз и др.Инфекционные заболе¬
ванияИнфекции, сопровождающиеся стимуляцией Thj-зависимого иммунного ответа;
гельминтозы (аскаридоз, стронгилоидоз, трихинеллез, токсокароз, филяриоз,
шистоматоз и др.}, лротозоонозы (вызванные только Dienimoeba fragilis и
Isospora belli), микозы (аспергиллез, кокциоидоз), вирусные инфекции (ВМЧ-
инфекция, HTLV-1-инфекция)Последствия медикамен¬
тозной терапии;-генерализованные реак¬
цииЛекарственные препараты, стимулирующие продукцию IL-3, IL-5 и GM-CSF,
усиливая эозинофилопоэз в костном мозге; нестероидные противовоспали¬
тельные препараты; антимикробные агенты; цитокины 1L-2 и GM-CSFпоражение легкихЛекарственно индуцируемый легочный эозинофильный инфильтратпоражение почекОстрый интерстициальный нефрит, сопровождается эозинофилией и эозино-
филурией (вызывают препараты бензатина бензилпенициллина и его произво¬
дные, сульфаниламиды, рифампицин, каптоприл, аллопуринол, ципрофлокса-
цин и др.)поражение сердцаОстрый некротизирующий эозинофильный миокардит может развиться как
реакция на препараты ранитидин или клозапинМиелоидная эозино¬
фильная лейкемияСимптомы заболевания сходны с миелопролиферативной патологией (высокая
концентрация витамина В,^, спленомегалия, анемия, миелоидная дисплазия,
цитогенетические нарушения)ГиперэозинофильныйсиндромЗаболевание связано с дефектом генов а-рецептора к тромбоцит-зависимому
ростовому фактору (хромосома 4) и сцепленным с Х-хромосомой дефектом
развития эозинофилов. Синдром диагностирован у больных с генетически опо¬
средуемой высокой экспансией CD4^GD3‘ Thj-подобных лимфоцитов, выраба¬
тывающих IL-5; сопровождается гематологическими нарушениями, поражением
кожи, сердечно-сосудистой и нервной системы, легких и др. органовНеопластические заболе¬
вания (Т- и В-лимфомы,
лимфома Ходжкина,
миелоидные лейкемии,
карциномы, аденокарци¬
номы и др.)При лимфоме Ходжкина и Т-клеточных лимфомах эозинофилия коррелирует с
гиперпродукцией IL-5
20ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯОкончание табл. 16-3Заболевания и состоянияКомментарииРазнообразные пораже¬
ния легкихПатология легких на вредных производствах сопровождаете» эозинофильной
инфильтрацией легких и эозинофилиейОстрая и хроническая
эозинофильная пнев¬
монияНеясного генеза эозинофильная инфильтрация альвеол и интерстиция легких,
эозинофилия. Вызывают лекарственные препараты, аллергены, табакокурение,
высокая концентрация в воздухе химических вредностей и металловМоноциты крови и тканевые макрофаги участвуют в противоинфекционной
защите при хронических инфекционных процессах, а также при инфекциях, воз¬
будители которых облигатные или факультативные внутриклеточные паразиты
(вирусы, хламидии, риккетсии, микоплазмы и др.). Для этих заболеваний харак¬
терно увеличение концентрации в крови моноцитов, возрастание их фагоцитарной
активности, способности в больщих количествах продуцировать цитокины, оксид
азота, неоптерин и др. медиаторы воспаления (табл. 16-4),Таблица 16-4. Основные заболевания и состояния, сопровождающиеся моноцитозом {количество
моноцитов в крови более 0,75x10^/л)Основные лричиныИнтерпретация измененийИнфекцииХарактерно для инфекций с гранулематозом (туберкулез, подострый бактери¬
альный эндокардит, сифилис, бруцеллез, висцеральные микозы, саркоидоз,
инфекционный мононуклеоз) и на фоне нейтропенииГематологические забо¬
леванияМиелоидная метаплазия, лейкоз, множественная миелома, лимфомаКоллагенозыРевматоидный артрит, системная красная волчанка, узелковый периартериит,
полимиозитЗаболевания желудочно-
кишечного трактаЯзвенный колит, региональный энтерит, тропическая энтеропатия, паразитозыЛекарственные средстваВысокие дозы глюкокортикоидовДендритные клетки (ДК) миелоидного происхождения находятся в погранич¬
ных тканях (клетки Лангерганса, интерстициальные-дермальные ДК) — важный
фактор врожденного иммунитета. Наряду с фагоцитарными функциями, они
способны обрабатывать захваченные антигены иг представлять их фрагменты Т- и
В-лимфоцитам, NKT-клеткам, запуская антиген-специфический иммунный ответ.
Антиген-представляющие ДК могут стимулировать лимфоциты, направлять диф-
ференцировку антиген-активированных лимфоцитов в хелперные и регуляторные
клетки разных типов. Таким образом, ДК определяют характер иммунного ответа
на антиген (клеточный и/или гуморальный иммунный ответ).Рецепторы фагоцитов реагируют на макромолекулы чужеродных клеток.
Лиганды для этих рецепторов — консервативные макромолекулы, синтезируемые
вирусами и клетками микроорганизмов, грибов и простейших. Они широко рас¬
пространены среди представителей мира микроорганизмов, но отсутствуют на
клетках высших животных и человека. Антитела, комплемент, пентраксины и дру¬
гие лиганды, к которым у «профессиональных» фагоцитов имеются соответствую¬
щие рецепторы, обеспечивают избирательную активность клеток фагоцитарной
системы. Различные дефекты фагоцитов приводят к нарушению функции этого
звена врожденного иммунитета.NK-клетки (англ, natural killer — естественный убийца) обладают цитотокси-
ческой активностью в отношении антигенно измененных собственных клеток.
Морфологически они представлены большими гранулярными лимфоцитами.
Количество N К-клеток в крови у взрослых достигает 15% лимфоцитов; они при¬
сутствуют в костном мозге, лимфоидных органах, печени, легких и др.Среди NK-клеток различают две субпопуляции: классические NK-клетки и
NKT-клетки. NKT-клетки имеют антигенраспознающий рецепторный комплекс
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ21(TCR CDj), сходный с таковым у Т-лимфоцитов. Набор антигенов, с которыми
могут взаимодействовать NKT-клетки, ограничен липидными и липопротеидны-
ми антигенами микроорганизмов. NK- и NKT-клетки способны продуцировать
TNF-a, IFN-y, GM-CSF, IL-12, они же индуцируют апоптотическую гибель клеток-
мишеней,NK-клетки с высокой цитотоксической активностью отличаются большим
содержанием мембранных CD16 белков, а продуцирующие цитокины — экспрес¬
сией CD56 поверхностных молекул. Цитотоксическая активность NK-клеток в
норме подавлена, активируются они при утрате ингибирующих их активность сиг¬
налов. Пролиферацию, дифференцировку и функцию NK-клеток поддерживают
IL-15, IL-12, IL-2, IL-18, TNF-a, IFN-7 и др. цитокины, а подавляют IL-10 и TGF-p.
Содержание В- и NK-клеток с учетом возраста представлено в табл. 16-5.Таблица 16-5. Содержание В-лимфоцитов и NK-клеток в крови лиц разного возрастаВозраст0-3 мес3-6 мес6-12 мес1-2 года2-6 лет6-12 лвт12-18 летС019*В-клетки%6-3211^114-3716-3514-3313-276-23х107л0,30-2,000,43-^.000,61-2,600,72-2,600,39-1,400,70-0,860,11-0,57C037CD16-56* классические NK-клетки%4-183-143-153-154-174-173-22х10®/Л0.17-1,100,17-0,830.16-0.950,18-0,920,13-0,720,10-0.480,07-0,48Дефицит содержания или функциональная несостоятельность NK-клеток харак¬
теризуется высокой чувствительностью человека к вирусам и тяжестью течения
таких вирусных инфекций, как цитомегаловирусная, опоясывающий лишай, про¬
стой герпес, инфекционный мононуклеоз и др.ШЩрйГуморальные факторы врожденного иммунитетаБелки системы комплемента — важный гуморальный фактор врожденного
иммунитета. Эти белки присутствуют в сыворотке крови в неактивной форме и
приобретают иммунобиологическую активность в результате последовательной
активации компонентов системы комплемента. Образующиеся при этом комплек¬
сы из нескольких белков системы комплемента и фрагменты белковых молекул
способны не только лизировать клетки микроорганизмов, паразитов, вирусные
частицы, соматические и др., но и в качестве эффекторных и регуляторных фак¬
торов участвуют в воспалительных реакциях и антиген-специфическом иммунном
ответе.Отдельные белки системы комплемента обозначают латинской буквой С и циф¬
рами (С1, С2), субъединицы белков и продукты их расщепления или активации —
дополнительно малыми латинскими буквами (например, Clq, С1г, СЗа).Известны три главных пути активации системы комплемента: классический,
альтернативный и лектиновый (маннан-опосредованный).При классическом пути активация системы инициируется Clq субкомпонен¬
том комплемента в результате взаимодействия Clq с Fc-фрагментом конформа-
ционно измененных IgM и IgG или с пентраксинами. В естественных условиях
конформационные изменения Fc-фрагментов IgM и IgG возникают при взаимо¬
действии иммуноглобулинов с антигенами. Фиксированный на Ag-IgM и Ag-IgG
комплексах Clq взаимодействует с С1г и Cls субкомпонентами комплемента.
Последний активируется и, обладая активностью эстеразы, расщепляет С4 и С2.
Образующиеся С4Ь и С2а фрагменты в виде димернь[х молекул фиксируются на
If^l 22 ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯиммунных комплексах и как протеазы способны взаимодействовать с СЗ плаз¬
мы, а затем и расщеплять его на СЗа и СЗЬ субкомпоненты. Трехкомпонентный
комплекс С4Ь2аЗЬ способен взаимодействовать с С5 плазмы и, благодаря пеп-
тидазной активности, расщеплять С5 на субкомпоненты С5а и С5Ь. С образова¬
ния С5Ь запускается активация компонентов, атакующих мембраны клеток. Эти
белки комплемента, последовательно взаимодействуя друг с другом, образуют
мультимолекулярный мембраноатакующий комплекс (МАК), способный атако¬
вать липидные мембраны разнообразных клеток и, встроившись в них, нарушать
целостность клеточных мембран и соответственно вызывать лизис клеток. Сборка
МАК начинается с С5Ь. Фиксированная на мембране клетки молекула С5Ь имеет
участок, взаимодействующий с белком Сб. В результате такого взаимодействия
образуется эквимолекулярный комплекс С5ЬС6, который взаимодействует с С7,
образуя трехмолекулярный комплекс С5ЬС6С7. С7 плазмы крови характеризуется
амфофильными свойствами, и при взаимодействии с С5ЬС6 гидрофобный участок
С7 обеспечивает прочную фиксацию всего трехмолекулярного комплекса на фос¬
фолипидах наружной клеточной мембраны.Фиксированный на клетке С5ЬС6С7 трехмолекулярный комплекс служит рецеп¬
тором для циркулирующего в крови С8. В результате фиксации на мембране клетки
С8 приобретает способность связывать циркулирующие в крови С9 и неэнзима¬
тически катализировать их полимеризацию, после чего изменяется конформация
молекул этого белка, увеличивается число участков взаимодействия комплекса с
фосфолипидами мембраны и образуется полимерная белковая структура, по форме
напоминающая воронку или цилиндр. Такой цилиндр погружается в липидный
бислой наружной мембраны клетки-мишени. Снаружи стенки цилиндра образова¬
ны гидрофобными, а внутренняя его сторона — преимущественно гидрофильными
аминокислотами полипептидов комплекса. Благодаря этому, вода смачивает вну¬
треннюю поверхность стенок цилиндра и через отверстие в нем может легко посту¬
пать из окружающей среды внутрь клеток, вызывая их гибель.Мишенями для МАК комплемента могут быть клетки бактерий, грибов и про¬
стейших, вирусные частицы, липосомы и другие структурированные образования,
а также собственные соматические клетки организма. Для активации комплемента
классическим способом против поверхностных антигенов клеток и частиц необхо¬
димы иммунные или естественные антитела в виде иммуноглобулинов класса IgG
и IgM.Лектиновый путь активации комплемента отличается от классического лишь
начальным инициирующим этапом. В крови у людей и животных циркулирует
протеин, способный взаимодействовать с маннозой гликопротеинов и полиса¬
харидов (англ. MBL — mamóse binding lectin). Манноза в больших количествах
содержится в полисахаридах и гликопротеинах микроорганизмов и растений. При
внедрении микроорганизмов в макроорганизм MBL фиксирз^ется на маннозных
остатках поверхностных полисахаридов и гликопротеинов, С иммобилизирован¬
ным MBL взаимодействует сериновая протеаза крови, получившая название MBL-
ассоциированная протеаза (MASP). Протеаза в комплексе с MBL активируется и
приобретает способность расщеплять С4 и С2. В дальнейшем активация системы
комплемента осуществляется в той же последовательности и с образованием тех
же продуктов, что и при классическом пути.Альтернативный путь активации системы комплемента также отличается
начальными этапами. Активация альтернативным способом осуществляется без
участия антител. Инициаторными молекулами выступают компоненты поверх¬
ностных структур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов,
липополисахариды, тейхоевые кислоты клеточных стенок, полисахариды и кле¬
точные стенки дрожжей и грибов, некоторые вирусы и вирус-инфицированные
клетки, клетки простейших.
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 23СЗ — компонент комплемента, который инициирует альтернативную актива¬
цию всей системы и может подвергаться медленному спонтанному гидролизу тио-
эфирной связи молекулы. СЗ с измененной тиоэфирной связью не расщепляется на
СЗа и СЗЬ субкомпоненты, но приобретает свойства, делающие его тождественным
СЗЬ, Гидролизованный СЗ (СЗ-гидро), как и СЗЬ, взаимодействует с поверхност¬
ными структурами чужеродных клеток.Взаимодействие СЗЬ с клетками отличается определенной избирательностью и
легко осуществляется благодаря высокому сродству СЗЬ к поверхностным структу¬
рам микроорганизмов, липополисахаридам клеточных стенок бактерий, зимозану
клеточных стенок дрожжей, полисахаридам чужеродных клеток. Высокое содер¬
жание сиаловых кислот на мембране клеток человека и других млекопитающих
защищает соматические клетки от фиксации на их поверхности СЗЬ и альтерна¬
тивной активации комплемента. Избирательность в фиксации СЗЬ на мембранах
чужеродных клеток, сопровождающаяся активацией системы комплемента аль¬
тернативным способом, обеспечивает в организме примитивное распознавание
чужеродных (микробных) антигенов.Каждый из путей активации системы комплемента регулируется в организме
относительно самостоятельно. Регуляцию активности системы осуществляют
молекулы, способные связать или инактивировать отдельные белки системы ком¬
племента или. напротив, пролонгировать их пребывание в организме в активном
состоянии (пропердин).в процессе активации системы комплемента образуется множество субкомпо¬
нентов — продуктов расщепления отдельных белков. Эти субкомпоненты, оста¬
ваясь на мембране клетки или поступая в циркуляцию, обладают высокой имму¬
нобиологической активностью. Рецепторы к субкомпонентам белков системы
комплемента есть в основном у клеток, участвующих в воспалительных процессах
и в иммунном ответе на антигены. Таким образом, образующиеся при активации
комплемента белковые субмолекулы — важные эндогенные регуляторы иммунно¬
го ответа,У новорожденных гемолитическая активность комплемента НС50 и содержание
СЗ и С4 составляет 50-75% взрослых людей, однако содержание в крови С8 и С9
не превыщает 10% взрослых. К 3-месячному возрасту гемолитическая активность
комплемента в крови сопоставима с таковой у взрослых.Врожденные или приобретенные дефекты синтеза отдельных компонентов ком¬
племента характеризуются высокой чувствительностью к пиогенным и капсуль¬
ным инфекциям и склонностью к возникновению аутоиммунных заболеваний.
Аутоиммунные заболевания при дефиците С4, С2 и СЗ компонентов развиваются
из-за нарушения выведения из циркуляции иммунных комплексов, в том числе
комплексов аутоантиген-аутоантитело (табл. 16-6). Повышенная активность ком¬
племента, обусловленная дефектом ингибитора первого компонента комплемента
(С1;^^^), проявляется развитием ангионевротического отека, решающим фактором
в патогенезе которого служат накапливающиеся в результате гиперактивации ком¬
племента СЗа и С5а анафилатоксины.Таблица 16-6. Заболевания, ассоциирующиеся с недостаточностью белков системы комплемента
и их рецепторовБелкиКлиничеахие проявленияС1дСистемная красная волчанка и сходные синдромы, уртикарные васкулитыС|Г-С18Системная красная волчанка и сходные синдромы, васкулитыС2Системная красная волчанка и сходные синдромы, гломерулонефриты, дерматиты, васку-
ЛЙТЫ
24ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯОкончание табл. 16-6БелкиКлинические проявленияСЗАутоиммунные гломерулонефриты, коллагенозы, рецидивирующие пиогенные инфекцииС4Системная красная волчанка и сходные синдромыС5Частые нейссвриальные инфекции, системная красная волчанка и сходные синдромыС6; С7; С8; С9Рецидивирующие нейссериальные инфекцииПропердинРецидивирующие пиогенные инфекции, молниеносное течение менингококкового сепсисаФактор DРецидивирующие пиогенные инфекцииС1.Псеедоаплергический ангионевротический отек, склонность к аутоиммунным заболева¬
ниямФактор НСистемная красная волчанка и сходные синдромы, гломерулонефритыФактор IРецидивирующие пиогенные инфекции и синдромы, подобные системной красной вол¬
чанкеCR1Системная красная волчанка и сходные синдромыCR3Позднее отпадение пупочного канатика, рецидивирующие пиогенные инфекции, лейко¬
цитозDAF; HRF; CD59ГемолизНарушения синтеза таких ингибиторов системы комплемента, как DAF (англ.
decay accelerating factor - фактор, ускоряющий разрушение), HRF^g и HRF^^ (англ.
homology restriction factor — фактор гомологической рестрикции), приводят к повы¬
шенной активности комплемента в отношении аутологичных эритроцитов, что
клинически фиксируют у больных ночной пароксизмальной гемоглобинурией.
Именно поэтому лабораторное исследование белков системы комплемента реко¬
мендуют проводить у лиц с системными аутоиммунными заболеваниями, при
хронических инфекциях, отеках и васкулитах неясного генеза.С~реактивный белок и декамерный протеин РТХЗ — пентраксины, являются
представителями гуморального врожденного иммунитета. С-реактивный белок —
представитель «коротких)> белков семейства пектраксинов (М.м. 115 кОа), его
синтезируют гепатоциты под влиянием провоспалительных цитокинов IL-6,
IL-1, TNF-a. С-реактивный белок накапливается в крови и тканевых экссудатах
больных при острых и хронических инфекциях, травмах и других заболевани¬
ях. У практически здоровых людей содержание С-реактивного белка в крови
не превышает 4 мг/л; при остром воспалении его уровень быстро возрастает
в течение первых часов. При бактериальном сепсисе, легионеллезе и тяжелых
васкулитах концентрация С-реактивного белка в крови превышает 300 мг/л; при
бактериальных инфекциях, острых васкулитах, некоторых лимфомах уровень
С-реактивного белка в крови варьирует в пределах 100-300 мг/л. При инфекцион¬
ном мононуклеозе, цитомегаловирусной, герпетической и аденовирусной инфек¬
циях, артритах, ревматоидной полимиалгии и большинстве лимфом содержание
С-реактивного белка в крови не превышает 100 мг/л. При большинстве вирусных
инфекций уровень С-реактивного белка в крови больных существенно не меня¬
ется. Концентрация С-реактивного белка в крови больных отражает изменения в
развитии болезни за последние 6-8 ч.С-реактивный белок способен взаимодействовать с остатками фосфорилхоли-
на в молекулах полисахаридов, лецитина, сфингомиелина, а также со свободной
ДНК разного происхождения, образуя мультимолекулярные комплексы. В них
С-реактивный белок взаимодействует с Clq компонентом комплемента и активи-
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ25рует комплемент классическим способом, а также опсонизирует объекты фагоци¬
тоза и стимулирует активность NK-клеток.РТХЗ — представитель длинных пектраксинов, декамерный протеин с М.м.
440 kDa, продуцируется активированными моноцитами и дендритными клетками,
способен взаимодействовать с маннозой гликопротеинов микробного и иного про¬
исхождения. РТХЗ обладает опсонизирующей активностью, фиксируясь на объ¬
ектах фагоцитоза, а также в комплексе с полисахаридами взаимодействует с Clq
белком комплемента и активирует комплемент классическим путем.Таким образом, клеточные и гуморальные факторы врожденного иммуни¬
тета обладают разнообразными средствами, позволяющими им противостоять
чужеродным агентам и участвовать в защите от внедрения, размножения и рас¬
пространения в организме «чужого». Клетки врожденного иммунитета активно
взаимодействуют друг с другом и с клетками приобретенного иммунитета, что
делает процесс защиты высокоэффективным и надежным. Гуморальные факторы
врожденного иммунитета нейтрализуют и разрушают чужеродные агенты, способ¬
ствуя их быстрому выведению из крови и организма.приобретенный иммунитетГпавные исполнители антиген-специфического иммунного ответа — лимфоци¬
ты (гетерогенная популяция клеток). Они, не различаясь морфологически, суще¬
ственно отличаются набором мембранных белков и функциональной активностью.
Количество их в крови может существенно меняться в зависимости от патологии
(табл. 16-7). Лимфоциты подразделяют на три большие популяции: Т-лимфоциты
(тимусзависимые), В-лимфоциты (костномозговые или бурсальные) и NK (нату¬
ральные киллерные клетки).Таблица 16-7. Основные заболевания и состояния, сопровождающиеся лимфоцитозомОсновные причиныИнтерпретация измененийВирусные инфекцииИнфекционный мононуклеоз (в мазках крови обнаруживают атипичные монону-
клеары). Инфекционный гепатит. Лимфоцитоз часто определяют при инфекциях,
вызываемых вирусом Эпштейна-Барр, простого герпеса 2 типа, краснухи, адено- и
цитомегалозирусомБактериальныеинфекцииЛимфоцитоз наблюдают при коклюше, хронических инфекциях (туберкулезе, бру¬
целлезе)Заболевания кроеиЛимфаденопатия и спленомегалия сопровождают лимфому, хронический лимфо-
пейкоз, волосатоклеточный лейкозПоспрансфузионныйсиндромСопровождает лихорадка и спленомегалия. Причиной этого синдрома считают
цитомегаловирус, передающийся через лейкоциты донорской кровиПримечание. Количество лимфоцитов в норме имеет воарастные особенности. После второго
«возрастного» перекреста в лимфоцитарной формуле за лимфоцитоз принимают увеличение
абсолютного числа лимфоцитов в крови от 4,0х10ул и более. Абсолютный лимфоцитоз бывает
значительно реже относительного, встречающегося при гранулоцитопении.СИСТЕМА Т-ЛИМФОЦИТОВСреди Т-лимфоцитов различают клетки Т-хелперные (ТЬ), Т-регуляторные
(Тг) и Т-цитотоксические (Тс). Они фенотипически могут быстро меняться и
трансформироваться в Т-клетки с разными функциями. Тг обеспечивают регуля¬
цию антиген-специфического иммунного ответа и функциональной активности
иммунной системы в целом. Эти клетки, продуцируя множество цитокинов, отве¬
чают за взаимодействие иммунной системы с другими системами организма.Современные методы идентификации Т-лимфоцитов и определения их принад“
лежности к тем или иным субпопуляциям основываются на исследовании мем¬
бранных белков. Мембранные белки, иммунохимически охарактеризованные в
26ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯкачестве маркеров тех или иных клеток, получили обозначение CD (от англ. cluster
of differentiation — скопление дифференцировочных детерминант). Различные суб¬
популяции Т“лимфоцитов отличаются друг от друга и от В-лимфоцитов набором
CD-протеинов, многие из которых — рецепторы клеток к различным лигандам.
Отдельные CD-протеины обозначают цифрами, например CD1, CD2, CD3 и т.д.Распознавание антигенов Т-клетками происходит с помощью рецепторов,
способных специфически взаимодействовать с антигенными детерминантами и
одновременно с молекулами HLA, в комплексе с которыми находятся антигенные
детерминанты. В зависимости от строения антигенраспознающих рецепторов
(TCR), все Т-лимфоциты подразделяют на две субпопуляции: а|ЗТ- (90-95%) и
у5Т-клетки (5%). По расчетным данным, набор антигенных детерминант, с кото¬
рыми могут взаимодействовать а(ВТ-клетки, достигает 10^® вариантов молекул:
убТ-лимфоциты могут реагировать на антигенные детерминанты относительно
ограниченного репертуара (белки теплового шока, некоторые антигены микро¬
организмов),Т-клетки не реагируют на свободно циркулирующие антигены и могут взаимо¬
действовать с ними только в том случае, если антигены подверглись обработке в
других клетках, а отдельные олигопептиды (детерминанты) обработанного анти¬
гена представляются Т-лимфоцитам на поверхности вспомогательных клеток
(дендритных, макрофагов, В-лимфоцитов и др.). Фрагменты антигена на мембра¬
не вспомогательных клеток представляются Т-клеткам посредством белков глав¬
ного комплекса гистосовместимости (МНС) I класса для цитотоксических лим¬
фоцитов или II класса для хелперных-регуляторных лимфоцитов (МНС-белки
от англ. major histocompatibility complex). У человека белки МНС обозначены как
HLA-белки (англ. human leukocyte antigens). Таким образом, Т-лимфоциты челове¬
ка реагируют на чужеродные антигены, только если эти антигены ассоциированы
с HLA-белками на мембранах любых клеток организма.Кроме ар или у5 полипептидных цепей, специфически взаимодействующих
с антигенной детерминантой, в построении антигенраспознающих рецепторов
Т-клеток участвует также несколько дополнительных полипептидых цепей. Их
принято обозначать как CD3 рецепторный комплекс. CD3 белки в антигенраспоз-
нающем рецепторе Т-лимфоцитов выполняют несколько вспомогательных функ¬
ций, в том числе проводят сигнал от взаимодействующего с антигеном рецептора
клетки в ядро Т-лимфоцита. Принадлежащие к разным клонам Т-лимфоциты
отличаются строением наружных концевых участков у а|3 и у6 гетеродимеров, что
позволяет каждой Т-клетке с помощью TCR взаимодействовать лищь с определен¬
ной. чаще какой-либо одной, антигенной детерминантой. Принципиально важно,
что в доантигенной дифференцировке Т-лимфоцитов в тимусе формируется TCR с
широким спектром специфичностей к антигенам, с которыми, вероятно, встретят¬
ся Т-клетки на периферии,В процесс контакта Т-клеток с антигеном с помощью TCR-CD3 рецепторного
комплекса вовлекаются также другие мембранные белки клетки, обозначаемые
как корецепторы CD4 и CD8. У зрелых Т-клеток экспрессия этих белков альтер¬
нативная. клетки либо CD4*CD8" или CD4‘CD8^. CD4* белки обнаруживаются у
хелперных и регуляторных Т-лимфоцитов, CD8* молекулы — у цитотоксических
Т-клеток. CD4 белок на мембране Th-лимфоцитов способствует более прочному
связыванию антигенраспознающего рецептора лимфоцита с нагруженными анти¬
геном белками II класса HLA (HLA-D, -DR, -DP, -DQ) вспомогательных клеток.
Белки II класса HLA в достаточных количествах, а также В-лимфоциты, экспресси¬
руются преимущественно на мембранах антигенпредставляющих клеток иммунной
системы (дендритные клетки, макрофаги). Они фагоцитируют чужеродные анти¬
гены, в эндосомах клеток расщепляют их до олигопептидов из 13-18 аминокислот
и образуют комплексы из олигопептидов антигена и белков HLA II класса. Такие
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 27комплексы затем встраиваются в мембрану вспомогательных клеток и, обладая
высокой иммуногенностью, представляются CD4 Т-лимфоцитам.Полипептид CDS'" обеспечивает более прочное взаимодействие антиген-
специфического рецептора Тс-лимфоцитов с антигеном, расположенным на
поверхности какой-либо соматической клетки в ассоциации с белками HLAI	класса (HLA-A, -В, -С). Поскольку белки HLA-A, -В, -С как трансплантаци¬
онные антигены находятся на мембранах практически всех клеток организма,
любая клетка может представить антиген CD8^ Т-лимфоцитам в виде комплекса
из олигопептида антигена и белков HLA-A, -Б, -С. В этом случае расщепление
молекулы (частицы) антигена до олигопептидов происходит в протеосомах
цитоплазмы любой инфицированной антигеном соматической клетки. Там же, в
цитоплазме, образуется высокоиммуногенный комплекс из коротких пептидов
антигена (8-10 аминокислотных остатков) и белков HLAI класса. На поверхности
ядросодержащих клеток содержание белков HLA I класса достигает 10^ молекул,
так что каждая соматическая клетка может представлять множество антигенных
олигопептидов и вызывать против этих детерминант и себя ответ цитотоксических
CDS Т-лимфоцитов.Таким образом, в антигенной активации CD4^ и CD8"^ субпопуляций
Т-лимфоцитов участвуют разнообразные клетки организма. Показано, что взаи¬
модействие CDS'" или CD4^ на поверхности Т-лимфоцитов соответственно с HLA
белками I или II класса вспомогательных клеток способствует образованию на
мембранах Т-лимфоцитов полимерных комплексов из TCR-CD3 белков и про¬
ведению сигнала для активации Т-клеток. Несмотря на большое принципиальное
сходство в строении TCR-CD3 белков, у а(ЗТ- и yST-клетки эти субпопуляции
существенно различаются функционально. У большинства у5Т-клеток редко или
вовсе не экспрессированы белки CD4 и CD8. Эти клетки могут распознавать анти¬
ген в комплексе с белком CD1 на поверхности антигенпредставляющей клетки. У
человека описано пять вариантов белков CD1, которые способны образовывать
комплексы и представлять у5Т-лимфоцитам ограниченные наборы антигенов.
убТ-клетки цитотоксически активны, в качестве интраэпидермальных и интраэпи-
телиальных лимфоидных клеток в наибольших количествах представлены в коже,
слизистой оболочке тонкого кишечника и урогенитального тракта.У Т-лимфоцитов имеются разнообразные адгезивные молекулы и рецепторы к
хемокинам. Посредством этих молекул клетка получает сигналы для направленной
миграции и взаимодействует с белками внеклеточного матрикса, с эндотелиальны¬
ми клетками сосудов лимфатических узлов и мукозных лимфоидных органов, с
клетками крови и белками комплемента. Адгезивные молекулы и рецепторы к
хемокинам обеспечивают накопление Т-лимфоцитов в очагах воспаления (грану¬
лемы), лимфоклеточную инфильтрацию тканей, взаимодействие лимфоцитов друг
с другом и с клетками и молекулами врожденного иммунитета.Большинство циркулирующих в крови Т-лимфоцитов находится в состоя¬
нии покоя, но при контакте с соответствующим антигеном или под влиянием
других стимулов они активируются. Активированные лимфоциты отличаются
от покоящихся клеток возросшим содержанием в цитоплазме свободных ионов
Са”, возросшим кислородным метаболизмом, повышенным синтезом РНК и бел¬
ков, появлением на мембранах клеток новых белков и изменением содержания
ранее представленных. Все это приводит к превращению покоящегося малого
лимфоцита в бластную клетку, которая затем делится 4-5 раз, воспроизводя все
фенотипические особенности исходной материнской клетки. При этом дочерние
клетки приобретают высокую иммунобиологическую активность, проявляя себя
в качестве регуляторных или эффекторных Т-клеток. Мембранные маркеры акти¬
вированных Т-клеток — CD25, CD54 (ТСАМ-1), CD69, CD70, CD71, белки HLAII	класса и некоторые другие молекулы. При активации на поверхности Т-клеток
28ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯувеличивается содержание CD2 и CD3. Из характерных для активированных
Т-лимфоцитов молекул выделяют: CD25 — а-цепь рецептора к IL-2, CD54 — инте-
грин, обеспечивающий взаимодействие активированного Т-лимфоцита с другими
клетками иммунной системы, CD69 — ранний маркер активации разнообразных
лейкоцитов, CD71 — рецептор к сывороточному трансферрину.Накопившиеся после антигенной активации иммунные лимфощггы по набо¬
ру мембранных белков отличаются от так называемых наивных покоящихся
Т-клеток, которые, поступив из тимуса в кровь и лимфоидные органы, еще не
имели контакта с соответствующими антигенами. Маркеры наивных CD4" или
CD8^ Т-лимфоцитов — экспрессированные на мембране клеток CD45RA и CD62-L
белки. Белок CD45RA — изоформа тирозин-фосфатазы с М.м. 205-220 kDa. У
иммунных Т-лимфоцитов другая изоформа фермента — CD45RO с М.м. 180 kDa.
Важную роль в антигенной активации Т-клеток играет CD45, поскольку при его
отсутствии на поверхности клеток Т-лимфоциты не способны отвечать на анти¬
генный стимул,CD62L — L-селектин — обеспечивает узнавание наивными Т-лимфоцитами
вторичных лимфовдных органов и накопление их там. При антигенной активации
наивных Т-лимфоцитов важны костимулирующие сигналы, подаваемые клетке
через CD28 мембранный белок, посредством имеющихся белков CD80 и CD86 у
антигенпредставляющих клеток. Наивные Т-клетки без антигенной активации
редко делятся, а продолжительность их жизни составляет от нескольких недель до
10 лет. Содержание субпопуляций Т-лимфоцитов в крови с учетом возраста пред¬
ставлено в табл. 16-8.Таблица 16-8. Содержание в крови Т-лимфоцитов основных фенотипов у лиц разного возрастаВозрастСОЗ^общий пул)CD4^ (хелперы/регуляторы)CD8^ (киллеры/супрессоры)%xlOVn%xlOVfl%xlOVr0-3 мес53-842,5^,535-641,6-4,012-280,56-1,73-6 мес51-772,5-5,635-561.8Ч012-230,59-1,66-12 мес49-761,9-5,931-561,4^,312-240,5-1,71-2 года53-752.1-6,232-511.3^,314-300,62-2,02-6 лет56-751,4-3,728-470,7-2,216-300,49-1,36-12 лет60-761,2-2,631-470,65-1,518-350,37-1.112-18 лет56-84I.Û-2,231-520,53-1,318-350,33-0,92При антигенной активации наивных и иммунных Т-лимфоцитов связывание
антигена с TCR-CD3 белками лимфоцита должно быть дополнено сигналами,
подаваемыми Т-клетке через дополнительные костимулирующие рецепторы. У
наивных Т-лимфоцитов такой рецептор представлен CD28, а также рецепторами
к цитокинам и некоторым другим лигандам. Эти дополнительные команды могут
усиливать или угнетать пролиферацию Т-лимфоцитов или регулировать направ¬
ление их дифференцировки.Популяция CD4* Т-лимфоцитов человека неоднородна, ее подразделяют на
несколько субпопуляций регуляторных и хелперных Т-клеток. Среди последних,
в зависимости от их способности продуцировать те или иные наборы цитокинов,
различают ThO-, ТЫ- и Th2-, Th-17 и Tfh-клетки.В крови у здоровых и неиммунизированных людей среди Th-лимфоцитов
антиген-специфического клона преобладают ThO-клетки, При вакцинации наи¬
вные ThO-клетки быстро превращаются в иммунные эффекторные ТЫ- или Th2-
лимфоциты. Маркерными цитокинами Thl-клеток служат продуцируемые ими
IFN-y и IL-2, а ТЬ2-лимфоцитов — IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13. Дифференцировку
ThO-клеток в ТЫ- или ТЬ2-клетки определяют многие факторы и условия взаи¬
модействия наивных ThO-лимфоцитов с антигеном. Важнейшее значение этой
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 29дифференцировки придают цитокинам, в особенности IL-12. Он определяет
дифференцировку ThO-клеток в ТЫ-лимфоциты, лишь в его отсутствие возмож¬
на дифференцировка клеток в ТЬ2-лимфоциты. Продуцирование ТЫ- и Th2-
лимфоцитами тех или иных цитокинов определяет роль этих клеток в регуляции
антиген-специфического ответа,Thl-лимфоциты ответственны за клеточный антиген-специфический иммун¬
ный ответ и функцию клеток фагоцитарной системы и NK-клеток, участвуют в
регуляции экспрессии генов IgM и IgGj в В-клетках. Цитокины, продуцируемые
ТЬ2-лимфоцитами, поддерживают в организме биосинтез IgE и некоторых дру¬
гих иммуноглобулинов, участвуют в аллергическом воспалении, активируя туч¬
ные клетки (IL-9) и эозинофилы (IL-5). Синтезируемый ТЫ-лимфоцитами IFN-y
подавляет функцию и продукцию цитокинов ТЬ2-клетками, а продуцируемые
ТЬ2-лимфоцитами IL-4 и IL-5 угнетают синтез цитокинов ТЫ-лимфоцитами и
макрофагами. Таким образом, эти две популяции Th-лимфоцитов находятся в
реципрокных отношениях, каждая из них, поддерживая один оптимальный вари¬
ант антиген-специфического ответа, угнетает другой.В противовес ТЫ- и ТЬ2-лимфоцитам в крови обнаруживают несколько попу¬
ляций Т-лимфоцитов, негативно регулирующих функцию врожденных и приоб¬
ретенных клеточных факторов иммунной системы. Тг-клетки угнетают пролифе¬
рацию CD4* Т-лимфоцитов. Супрессия достигается как при прямом контактном
взаимодействии Тг-лимфоцитов с клетками, так и благодаря способности этих
клеток продуцировать иммуносупрессорные цитокины (TGF-p, IL-10). Тг-клетки,
наряду с лимфоцитами, угнетают функцию дендритных клеток и других клеток
врожденного иммунитета. Среди Тг-клеток различают две субпопуляции. Первая
представлена натуральными клетками тимического происхождения (пТг), вто¬
рая — адаптивными Т-клетками (аТг),Тг-лимфоциты подавляют иммунный ответ на аутоантигены, опухолевые,
трансплантационные и некоторые инфекционные антигены. При их недостаточ¬
ности в организме развиваются аутоиммунные заболевания (рассеянный склероз,
аутоиммунный полигландулярный синдром, диабет I типа и др.), аллергии и
лимфо-пролиферативная патология.К эффекторным Т-клеткам крови относят Тс. Они вызывают лизис любых кле¬
ток организма, несущих на поверхности антигенные детерминанты, к которым у
Тс-клеток имеется рецепторный комплекс TCR CDЗ^ Среди Тс-лимфоцитов пре¬
обладают CD4‘, CD8^ и арТ-лимфоциты. Количество их в крови у взрослых людей
может достигать 25% общего числа Т-лимфоцитов крови.Около 4% CD4'CD8" Т-лимфоцитов крови имеют TCR-молекулы, построенные
с участием у- и 5-пептидных цепей. Эти клетки также обладают цитотоксической
активностью, но представление антигена клетками-мишенями в этом случае осу¬
ществляется посредством CD1 белков. yôT-клетки способны быстро синтезировать
цитокины, вызывающие воспалительную реакцию.При антигенной активации цитотоксических Т-лимфоцитов вторые подтверж¬
дающие активационные сигналы — сигналы, подаваемые Тс-лимфоцитам через
рецептор к IL-2. Источником IL-2 в этом случае служат участвующие в иммун¬
ном ответе на этот же антиген Th-лимфоциты (того же антиген-специфического
клона). Именно поэтому Тс-лимфоцитам для своей активации необходимо взаи¬
модействие с Th-клетками. При получении активирующих и костимулирующих
сигналов антиген-специфический клон Тс-лимфоцитов вступает в пролиферацию
и приобретает способность в качестве эффекторных клеток убивать клетки-
мишени, несущие антиген. Такой механизм иммунного цитолиза важен для проти¬
вовирусного иммунитета, поскольку обеспечивает гибель любых клеток, несущих
на мембране вирусы или вирусные антигены в ассоциации с белками МНС I класса
или CD1 мембранными белками клеток.
>30 ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯЦитотоксические лимфоциты активно участвуют в противоопухолевом и транс¬
плантационном иммунитете, а также в защите от собственных клеток, несущих
белки теплового шока или гликолипидные микробные антигены. Тс-лимфоциты
осуществляют гибель клеток-мишеней путем выделения в их сторону цитоток¬
сических белков (лимфотоксинов). к таким лимфотоксинам относят перфо-
рин (цитолизин) и некоторые сериновые протеазы. Перфорины напоминают
белки мембрано-атакующего комплекса комплемента: встраиваясь в мембрану
клетки-мишени, они образуют в ней поры, через которые в клетку-мишень из
Тс-лимфоцитов постзшают гранзимы, активирующие каспазы. Последние раз¬
рушают внутриклеточные мембраны, активируют эндонуклеазы и индуцируют
гибель клетки-мишени путем апоптоза.Таким образом, для системы Т-лимфоцитов характерно исключительное раз¬
нообразие образующих ее клеток, которые отличаются не только структурой
антигенраспознающих рецепторов, но и наборами ассоциированных с мембрана¬
ми белков и рецепторов, спектром продуцируемых цитокинов и многими другими
признаками, а следовательно, разнятся функционально.Показано, что набор экспрессируемых Th-лимфоцитами фенотипических мар¬
керов может быстро меняться (при культивировании in vitro через 3-4 сут), клетки
могут нести фенотипические маркеры оппозитной популяции Th-клеток. Поэтому
при лабораторном анализе лимфоидной системы больных возрастает необхо¬
димость проведения повторных анализов и осуществления иммунологического
мониторирования пациентов.СИСТЕМА В-ЛИМФОЦИТОВДифференцировка В-клеток происходит в костном мозге и предназначена для
формирования антигенсвязывающего рецептора В-лимфоцитов (BCR). BCR состо¬
ит из двух тяжелых и двух легких полипептидных цепей, образующих молекулу
мембранного иммуноглобулина (mig). На мембране клетки с молекулами raig
связаны по две молекулы Iga- и IgP-полипептидных цепей, предназначенных для
проведения сигнала от BCR в ядро клетки после контакта с антигеном. BCR рас¬
познает только одну антигенную детерминанту. Весь пул В-клеток обладает широ¬
ким диапазоном специфичностей к антигенам (до 10‘^ антигенных детерминант).
Главный механизм формирования разнообразия специфичностей BCR — реаран¬
жировка (перестановка) вариабельных и константных участков генов тяжелых и
легких цепей иммуноглобулинов, постоянно происходящих у незрелых В-клеток
в костном мозге. Случайная реорганизация генов иммуноглобулинов приводит
к появлению рецепторов, специфичность которых направлена против не только
чужеродных антигенов, но и собственных молекул. Удаление таких аутореак¬
тивных В-клеток происходит посредством апоптоза в костном мозге в процессе
негативной селекции, когда незрелые В-лимфоциты взаимодействуют с аутоанти¬
генами организма.Каждый этап дифференцировки клеток гемопоэтического ряда, в том числе
В-лимфоцитов, сопровождается экспрессией или исчезновением функциональных
молекул, которые могут служить маркерами стадии дифференцировки клеток
и их состояния. Важный маркер всех клеток-предшественников и перифериче¬
ских В-лимфоцитов — CD 19 (на плазматических клетках он отсутствует) (см.
табл. 16-5). Он участвует в активации и пролиферации В-клеток. CD 19 экспресси¬
руется на всех неопластических клетках при острых лейкозах В-клеточного про¬
исхождения.В-лимфоциты способны непосредственно взаимодействовать с антигенами.
Индуцируемая таким взаимодействием пролиферация и дифференцировка зрелых
В-клеток происходит в фолликулах и герминативных центрах вторичных лимфо¬
идных органов, а также в лимфоидных тканях слизистых оболочек. После контак-
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 31та с антигеном в процессе размножения антиген-специфических В-лимфоцитов
повышается специфичность антигенсвязывающих рецепторов, а затем и переклю¬
чение клеток с биосинтеза антигенраспознающих рецепторов в виде молекул IgM и
IgD на иммуноглобулиновые рецепторы иных классов (IgG, IgA, IgE), Антигенная
специфичность рецепторов возрастает. Переключение В-клеток на синтез рецеп¬
торов в виде иммуноглобулинов иных классов осуществляется под влияни¬
ем различных цитокинов, продуцируемых Th-лимфоцитами при кооперации с
В-клетками. Так, IFNy обеспечивает синтез В-клетками IgG^ или IgG,, TGFp — IgA,
IL-4 — IgE. В дальнейшем при дифференцировке лимфоцитов в плазматические
клетки сохраняется способность продуцировать те же иммуноглобулины, что и их
клетки-предшесгвенники. Б большинстве случаев плазматические клетки живут в
течение 2-3 нед, хотя описана популяция долгоживущих плазматических клеток,
сохраняющих жизнеспособность в течение года.Среди зрелых В-клеток различают две субпопуляции. В,-клетки маркированы
CD5* белками, а на В2-клетках CD5 отсутствует. В^-клетки по своим характери¬
стикам близки к клеткам врожденного иммунитета. Они локализуются в брюшной
и плевральной полостях и слизистых оболочках. Bj-клетки составляют основной
пул циркулирующих в кровотоке и пребывающих в периферических лимфоидных
органах В-лимфоцитов.Активированные антигеном В-лимфоциты способны дифференцироваться не
только в плазматические клетки, но и в В-клетки — носители иммунологической
памяти. Они могут сохраняться в организме в течение 8-10 лет.С возрастом внутри пула периферических В-клеток происходит снижение числа
наивных В-лимфоцитов с пропорциональным увеличением В-клеток памяти
(CD27^). В связи с этим ответ антител на новый антиген у лиц П0Ж1'Ш0Г0 и стар¬
ческого возраста оказывается слабым и непродолжительным. По мере старения
в крови у людей возрастает спектр разнообразных аутоантител, представленных,
однако, в невысоких титрах.Иммуноглобулины и Fc-рецепторыИммуноглобулины — белки, обладающие активностью антител, сходные по хими¬
ческой структуре и по иммунохимической специфичности. Птавными клетками-
продуцентами иммуноглобулинов считают плазматические клетки. Активность
антител выражена в способности иммуноглобулинов к высокоспецифичному
взаимодействию с антигеном с образованием мультимолекулярных комплексов
«антиген-антитело». Антитела обладают вторичными иммунобиологическими
свойствами и способны фиксироваться на клетках, взаимодействовать с белками
системы комплемента, усиливать активность макрофагов и цитотоксическое дей¬
ствие NK-клеток, регулировать функцию лимфоцитов и др. Эндотелиальные клет¬
ки, циркулирующие и резидентные макрофаги (в особенности печени и селезенки)
активно выводят из циркуляции, захватывают и разрушают комплексы «антиген-
антитело», Взаимодействуя с антигенами, токсинами и ферментами, антитела
блокируют их активные центры, нейтрализуют токсичность и угнетают энзимати¬
ческую активность этих молекул. Микроорганизмы и паразиты с фиксированными
на них антителами утрачивают подвижность, если антитела взаимодействуют с их
жгутиками. Антитела против возбудителей препятствуют их прикреплению и вне¬
дрению в различные клетки макроорганизма, в том числе в клетки пограничных
тканей, обеспечивая устойчивость к инфекционному заражению. Антительная
агрегация возбудителей на поверхности пограничных тканей препятствует перено¬
су инфекта через слизистые покровы, В большинстве случаев антитела оказывают
на возбудителей микробостатическое действие. Иммобилизованные на антигене
антитела изменяют свою конформацию, что позволяет им фиксировать и активи¬
кяМшшiif ■^ЩШ- <-.Ш^Ш^Ш32ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯровать белки системы комплемента, стимулировать активность фагоцитов и цито¬
токсичность NK-клеток. Фиксированные на тканевых клетках антитела при взаи¬
модействии с антигеном обеспечивают подачу клеткам активационных сигналов,
вовлекая соответствующие клетки в реакцию, направленную против чужеродного
агента. Фактически антитела в организме человека обеспечивают избирательное
разрушение и нейтрализацию различными факторами иммунитета чужеродных
антигенов — молекул и клеток.Иммуноглобулины человека подразделяют на пять групп или классов, обозна¬
чаемых IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Иммуноглобулины разных классов различаются
содержанием углеводов, молекулярной массой, первичной структурой, электрофо¬
ретической подвижностью, продолжительностью жизни и скоростью обновления
в организме, способностью к трансплацентарному переносу, иммунобиологиче¬
ской активностью (табл. 16-9).Таблица 16-9. Некоторые свойства иммуноглобулинов человекаИммуноглобулиныIgGIgMIgAIgDIgEМолекулярное строение:Н-полипептидные цепиу1, у 2, уЗ, у4а5еL-полипептидные цепикХкккХкЯ.кХ.Молекулярная масса, kDa150900160180190Содержание в крови у взрослых
людей, г/л6,0-13,56,0-1,50,7^,10,03-0,151,53-114 Ш/млТ,^ — полупериод обновления,
сут23562,82.5Трансплацентарный перенос+----Антибактериальная активность+++++--Антивирусная активность+++++--Антипаразитарная активностьщ--+++++Иммуноглобулины классов G, D и Е представлены в крови мономерными моле¬
кулами. IgM — молекула, состоящая из пяти мономерных молекул, удерживаемых
вместе посредством специальной полипептидной)-цепочки. IgA могут быть в виде
двух молекулярных форм — мономерной и димерной, в последнем случае две
молекулы IgA удерживаются вместе также посредством J-полипептидной цепочки.
Несмотря на различия в свойствах, все мономерные иммуноглобулины и субъе¬
диницы в полимерных молекулах характеризуются единообразием организации.
Все они симметричны и состоят из двух тяжелых — «Н» {heavy — тяжелый) и
двух легких — «L» (light - легкий) полипептидных цепочек, удерживаемых друг
с другом посредством дисульфидных связей. Тяжелые полипептидные цепочки у
иммуноглобулинов разных классов обозначены соответствующими греческими
буквами: у-цепочки у IgG, ц-цепочки у IgM.Отличающиеся строением вариабельные домены (VH- и VL-домены) у различ¬
ных молекул иммуноглобулинов не только взаимодействуют с разными антигена¬
ми, но и сами несут признаки аутоантигенной специфичности. Именно поэтому
против иммуноглобулинов могут накапливаться аутоантитела, реагирующие с
VH- и VL-доменами других антител как с новыми для организма антигенными
детерминантами. Под влиянием протеаз мономерные молекулы иммуноглобули¬
нов расщепляются на три фрагмента. Два из них идентичны и образованы легкими
цепями и частью тяжелой цепи молекулы (Fab-фрагменты), а третий образован
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 33дисульфидными остатками тяжелых цепей иммуноглобулина (Fc-фрагмент).
Исследование активности фрагментов иммуноглобулинов, полученных при их
ферментативном расщеплении, позволило выявить роль отдельных фрагментов и
доменов молекулы в обеспечении различных проявлений иммунобиологической
активности антител. Так, за способность антител взаимодействовать с антигеном
ответственен Fab-фрагмент молекулы. Строение и доступность для взаимодей¬
ствий Fc-фрагмента молекулы определяет цитофильную активность антител, их
способность опсонизировать и фиксировать белки системы комплемента, активи¬
ровать NK-клетки и В-лимфоциты.Способность нативных иммуноглобулинов к вторичной иммунобиологи¬
ческой активности возрастает при конформационных изменениях структуры
Fc-фрагмента, когда скрытые константные участки доменов тяжелой цепи оказы¬
ваются на поверхности молекулы и доступны для взаимодействия. Таю^е конфор¬
мационные изменения иммуноглобулинов в естественных условиях возникают в
результате взаимодействия их Fab-фрагментов с соответствующими антигенами. В
комплексах с антигеном иммуноглобулины приобретают способность к побочной
иммунобиологической активности, стимулируя различные клетки организма и
взаимодействуя с разнообразными гуморальными факторами иммунитета.Клетки, взаимодействующие с Fc-фрагментами иммуноглобулинов, имеют
соответствующие Fc-рецепторы (Fc-R). Описано три варианта клеточных рецеп¬
торов к Fc-фрагментам IgG, которые представлены на разных клетках человека
и отличаются молекулярной массой и регуляторными свойствами. У моноцитов-
макрофагов обнаружен Fcy-RI-гликопротеин (CD64). Этот рецептор с высокой
аффинностью может взаимодействовать с субклассами IgG, и IgG^ и менее активно
с IgG^, не взаимодействует с IgG^.Fcy-RII (CD32) обнаруживают у макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов,
В-лимфоцитов и тромбоцитов. Этот рецептор эффективно взаимодействует только
с конформационно измененными Fey-фрагментами преимущественно IgGj^ и IgGj.
Сигналы через этот рецепторный белок усиливают фагоцитарную активность,
агрегацию и дегрануляцию тромбоцитов и подавляют пролиферацию и дифферен¬
цировку В-лимфоцитов. Fc-RII нейтрофилов взаимодейств)тот не только с IgG, но
и с IgA.Fcy-RIII (CD16) — гликопротеин, который определяют у NK-клеток, нейтро¬
фильных лейкоцитов, макрофагов и Т-лимфоцитов. У этого рецептора низкая
аффинность, он взаимодействует преимущественно с IgG^ и IgGj. Показано участие
Fcy-RIII в усилении фагоцитарной активности клеток и в реакциях антителозави¬
симого цитолиза. Генетические нарушения экспрессии этого рецептора на клетках
описаны у больных с пароксизмальной ночной гемоглобинурией, что, как полага¬
ют, приводит к сниженной активности соответствующих клеток и к повышенной
чувствительности больных к инфекции и к замедленному удалению из крови
иммунных комплексов.у взрослых при вторичном иммунном ответе основные антитела — IgG, состав¬
ляющие 75% сывороточных иммуноглобулинов. Они наиболее медленно обнов¬
ляемые: период полураспада их в крови составляет 23 сут. IgG человека подраз¬
деляют на четыре субкласса (обозначают IgGj, IgGj, IgG, и IgG^), отличающиеся
первичной структурой Н-цепей в шарнирной области. Способность IgG разных
субклассов фиксировать комплемент классическим путем убывает в следующей
последовательности: IgGj > IgG, > IgG^. IgG^ могут активировать комплемент аль¬
тернативным путем, а не классическим.В ответ на белковые антигены разного происхождения вырабатываются анти¬
тела субкласса IgG, и в меньшей степени IgGj и IgG^. Полисахаридные антигены
(например, капсульные полисахариды микроорганизмов) вызывают образование
34ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯантител преимущественно субкласса IgG^. Вирусы вызывают образование антител
преимущественно субкласса IgG^ и IgG.^, а антигены паразитов — IgG^-антитела.Врожденные дефекты биосинтеза иммуноглобулинов у людей могут распро¬
страняться как на весь класс IgG, так и на отдельные субклассы. Дефект биосин¬
теза IgGj у детей выражается отсутствием или низким уровнем антител против
полисахаридов капсульных микроорганизмов, в результате чего для них харак¬
терны хронические рецидивирующие инфекции дыхательных путей, возбудители
которых — микроорганизмы, образующие полисахаридные капсулы (в частности,
пневмококки и Haemophilus influenzae).Содержание IgM в крови взрослых достигает 10% общего количества иммуно¬
глобулинов. Антитела класса IgM накапливаются преимущественно при первичном
иммунном ответе, в начале продукции антител. Комплекс «IgM-антиген» наибо¬
лее активно взаимодействует с Clq и эффективно активирует систему комплемента
классическим путем. IgM И1рают важнз^ю роль в антибактериальном иммунитете.Синтез IgM зависит от кооперации В-клеток с Th-лимфоцитами в меньшей сте¬
пени, чем при продукции иммуноглобулинов других классов. Мономерные моле¬
кулы IgM, будучи встроенными в мембраны В-лимфоцитов, служат, наряду с IgD,
антигенраспознающими рецепторами наивных В-клеток.Содержание IgD в крови составляет 0,1-0,2% сывороточных иммуноглобули¬
нов. Показано, что антитела против некоторых аутоантигенов (нуклеопротеины,
антигены щитовидной железы) - IgD, которые являются протективньши анти¬
телами при некоторых паразитарных инфекциях.Содержание IgA в крови составляет 2,0 г/л (0,3 г/кг массы тела). В различ¬
ных секретах и в смывах с неповрежденной кожи доминируют секреторные IgA
(sIgA). Основную массу IgA, циркулирующих в крови, продуцируют плазмати¬
ческие клетки в костном мозге, а с секретами выделяются синтезируемые плаз-
моцитами в лимфоидных органах подслизистых желудочно-кишечного тракта
и дыхательных путей. Все внутриклеточные, мембранные и большинство цир¬
кулирующих в крови молекул IgA представлены в мономерной форме, а секре-
тируемые слизистыми оболочками IgA представлены димерными молекулами
(150-600 kDa). Секреторный фрагмент в sIgA не только обеспечивает трансэпите¬
лиальный перенос полимерных IgA из подслизистых в полости, но в дальнейшем
защищает их от действия протеаз хозяина и микробных протеаз на поверхности
слизистых оболочек.у IgA описаны два субкласса — IgA, и IgA^. Первый составляют около 80%
циркулирующих IgA, они преобладают среди sIgA, секретируемых эпителиальны¬
ми клетками слизистых оболочек дыхательных путей легких и верхних отделов
желудочно-кишечного тракта. Большую их концентрацию наблюдают в секрете
слизистых оболочек генитального тракта женщин и дистального отдела ЖКТ.Содержание IgE в крови у здоровых индивидуумов составляет около 0,004%
общего количества сывороточных иммуноглобулинов. Базофильные лейкоциты
и тучные клетки обладают высокоаффинными рецепторами к Fc-фрагменту IgE,
поэтому даже при низком содержании IgE в крови эти клетки несут на поверхности
IgE, удерживаемый Fce-R. При контакте фиксированных на клетках IgE с соответ¬
ствующим антигеном конформационно изменяется структура IgE, агрегируются
рецепторы к ним, что обеспечивает раздражение и дегрануляцию несущих IgE базо-
филов и тучных клеток. При этом освобождаются гистамины и другие компоненты
содержимого гранул — медиаторы аллергических реакций. IgE участвуют в антипа-
разитарном иммунитете, накапливаются при гельминтозах и других паразитозах.Поликлональные иммунные сыворотки и различные препараты нормальных
иммуноглобулинов давно и успешно используют в клинической практике. Так,
гомо- и гетерологичные иммунные сыворотки (антитела) применяют для лечения
и профилактики интоксикаций и инфекций, вызываемых различными микробами
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 35И вирусами. Внутривенно вводимые препараты иммуноглобулинов оказались неза¬
менимыми при терапии врожденных или приобретенных дефектов их синтеза, при
острых и хронических бактериальных и вирусных инфекциях, развивающихся на
фоне нарушений функций иммунной и кроветворной систем. Иммуноглобулины,Iназначаемые внутривенно в особенно высоких дозах, проявляют иммунорегуля-Жторную активность. Они оказались эффективным средством лечения некоторых
аутоиммунных заболеваний (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура,
а\тоиммунная гемолитическая анемия, полиомиозит, апластическая анемия),
гиперактивации макрофагальной системы (эндотоксический шок, токсическое
воспаление).Таким образом, приобретенные факторы иммунитета накапливаются и активи¬
руются при поступлении в организм соответствующих антигенов. Приобретенные
факторы иммунной защиты отличаются исключительно высокой специфично¬
стью и обеспечивают реакции иммунной системы строго на определенные анти¬
генные детерминанты. Приобретенный иммунитет может сохраняться в течение
8-10 лет, для его пожизненного поддержания необходима персистенция антигена
в организме или реиммунизация. Формирование приобретенного иммунитета осу¬
ществляется кооперативно при взаимодействии вспомогательных клеток (клетки
врожденного иммунитета) с Т- и В-лимфоцитами. Поэтому недостаточность
приобретенного иммунного ответа может быть связана не только с дефицитами
антиген-специфических клонов Т- и/или В-лимфоцитов, но и с нарушениями
кооперативного взаимодействия между клетками иммунной системы. Иммунная
система саморегулируется, для достижения ее нормального функционирования
крайне важны соотношение и активность не только эффекторных, но и регулятор¬
ных антиген-специфических клеток.ПАТОЛОГИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
Первичные иммунодефицитыПервичными иммунодефицитами называют дефекты иммунной системы, воз¬
никающие вследствие генетических поломок, в Международной классификации
болезней вьщелено в качестве нозологических единиц 36 первичных иммуноде¬
фицитов. Вместе с тем. по данным ВОЗ, существует более 70 первичных иммуно-
дефицитных состояний. Для многих из них определен молекулярно-генетический
дефект. Членами Консультативного совета и Европейского общества по иммуноде-
фицитным заболеваниям ESID были разработаны и одобрены к распространению
рекомендации по первичным иммунодефицитным состояниям.Настораживающие признаки:•	частые заболевания отитом (не менее 6-S раз в течение 1 года);•	несколько подтвержденных серьезных синуситов (не менее 4-6 раз в течение
1 года);•	более двух случаев подтвержденных пневмоний;•	повторные глубокие абсцессы кожи или внутренних органов;•	потребность в длительной терапии антибактериальными препаратами для
купирования инфекции (2 мес или дольше);•	потребность во внутривенном вливании антибактериальных препаратов для
купирования инфекции;•	не менее двух инфекций (таких, как менингит, остеомиелит, абсцессы
подкожно-жировой клетчатки, сепсис);•	отставание ребенка грудного возраста в росте и развитии;•	персистирующая молочница или грибковое поражение кожи у детей в воз¬
расте старше 1 года;
36 ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ•	наличие у родственников первичных иммунодефицитов, ранних смертей от
тяжелых инфекций или одного из вышеперечисленных симптомов.Первичные иммунодефициты — обычно очень серьезные заболевания, но
далеко не всегда фатальны, в большинстве случаев их лечение возможно. Диагноз
первичного иммунодефицита можно поставить только при специальном обследо¬
вании с использованием иммунологических, генетических и молекулярных мето¬
дов анализа. Это очень важно сделать как можно раньше, чтобы предотвратить
тяжелые последствия заболевания.Основные синдромы иммунодефицитов:•	инфекционный;•	аллергический;•	аутоиммунный;•	пролиферативный.Инфекционный синдром характеризуется тяжелыми рецидивирующими муль¬
тифокальными инфекциями, не отвечающими адекватно на проводимое лечение.
Это М0Г5ПГ быть инфекции, вызванные бактериями, вирусами, грибами и парази¬
тами. Входными воротами инфекции служат кожа, слизистые оболочки верхних
дыхательных путей, желудочно-кишечного и урогенитального трактов.Аллергигеский синдром характеризуется кожными поражениями по типу экс¬
судативного диатеза, атопического дерматита, нейродермита, повторными брон¬
хитами с астматическим компонентом. При аутоиммунном синдроме характерны
симптомы ревматоидного артрита, васкулита, склеродермии и других системных
заболеваний соединительной ткани, аутоиммунной тромбоцитопении, аутоим¬
мунного тиреоидита, сахарного диабета.Пролиферативный синдром встречается в виде лимфо- и миелопролифератив-
ных заболеваний. Он связан с опухолевой трансформацией клеток иммунной
системы (лимфомы, лимфосаркомы, лимфогранулематоз, острый и хронический
лимфолейкоз).НАРУШЕНИЯ ВРОЖДЕННОГО КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТАНедостаточность фагоцитов составляет 10-15% всех первичных иммунодефи-
цитов. Она обусловлена нарушением пролиферации, дифференцировки, хемотак¬
сиса нейтрофилов и макрофагов и собственно нарушением процесса фагоцитоза
(табл. 16-10). Клинически недостаточность фагоцитов отмечают со 2-го года
жизни, но может впервые диагностироваться существенно позже. Выраженная
недостаточность полиморфноядерных лейкоцитов приводит к развитию генера¬
лизованной бактериальной инфекции. Больные с дефектом системы фагоцитов
нуждаются в длительном антибактериальном, противомикотическом и симптома¬
тическом лечении.Первичные дефекты Т-лимфоцитовИзолированный дефект Т-системы иммунитета составляет 5-10% всех первич¬
ных иммунодефицитов. Характерны вирусные и микотические инфекции, которые
отмечают с первых дней жизни. Лечебные мероприятия при Т-клеточном иммуно¬
дефиците определяются ведущим синдромом. Трансплантацией фетального тимуса
и введением тимических факторов корригируют Т-клеточные нарушения, связан¬
ные с гипотрофией тимуса. В обобщенном виде патогенез, клиническая картина,
иммуно- и дифференциальная диагностика представлены в табл. 16-11 и 16-12.
Таблица 16-10. Некоторые врожденные нарушения клеток фагоцитарной системыНаименованиеиммунодефицитногосостоянияОсновные патогенетические факторыКлиническая картинаРезультаты иммунологического исследо¬
ванияХроническая грануле¬
матозная болезнь. Тип
наследования аутосомно-
рецессиеный (40%) и
Х-сцепленный (60%)Нарушения метаболизма кислорода в гра¬
нулоцитах и моноцитах, а также образова¬
ния продуктов оксидативного взрыва и, как
следствие, неспособность осуществлять
киллинг захваченных микроорганизмовРецидивирующие инфекционные заболевания, обуслов¬
ленные грибами и микроорганизмами, продуцирующими
каталазу. При заражении обычно возникает чрезмерная
воспалительная реакция. Характерны гнойные лимфаде¬
ниты, абсцессы печени, остеомиелит, поражение кожи и
подкожно-жировой клетчатки, гранулемы 	Анемия, лейкоцитоз, высокая СОЭ, гипо-
гаммаглобулинемия, нарушение функцио¬
нальной активности фагоцитов (НСТ-тест
снижен)Синдром Чедиака-Хигаси.
Тип наследования
аутосомно-рецессивныйНарушение хемотаксиса нейтрофилов,
внутриклеточного транспорта протеинов
(нарушение слияния фагосом с лизосома-
ми), приводящее к неспособности клеток
лизировать бактерии и длительной перси-
стен ци и возбудителя внутри клеткиИнфекции, вызываемые возбудителями Staphylococcus
aureus, Escherichia, Pseudomonas, a также грибами рода
Aspergillus и Candida. Часто частичный или полный альби¬
низм, светобоязнь, гипергидроз, тромбоцитопения, приво¬
дящая к кровотечениямЛейкопения или панцитопения, нарушение
хемотаксиса, фагоцитоза и внутрикле¬
точного киллинга бактерий, снижение
уровня лизосомально-катионных белков
нейтрофилов. Количество и функция Т- и
В-лимфоцитов, уровень С1-компонента
комплемента в нормеГипер-ІдЕ-синдром. Тип
наследования неизвестенНарушение хемотаксиса нейтрофилов
из-за повышенной продукции IgE и осво¬
бождения гистамина при снижении продук¬
ции Th-1-зависимых цитокиновПовторные холодные абсцессы кожи, мягких тканей,
легких, почек, печени, экзема, поражение костей (остео¬
миелит) на фоне нарушения обмена кальция и высокого
уровня IgE в крови		Высокое содержание в крови IgE и tgD,
эозинофилия, нейтрофилия, повышенная
продукция IL-4. нарушение хемотаксиса
гранулоцитовСиндром «ленивых»
лейкоцитов. Тип насле¬
дования аутосомно-
рецессивныйДефект рецепторов адгезии фагоцитов
CD11b, CD11c и CD11a вследствие наруше¬
ния биосинтеза CD18; отсутствие у нейтро¬
филов рецептора для Е-селектина (CD15)Поражения пародонта, рецидивирующие пиогенные
инфекции кожи, пазух носа, дыхательного тракта, некро¬
тические инфекции мягких тканей, септицемияЛейкоцитоз, нарушение хемотаксиса ней¬
трофилов и макрофаговТаблица 16-11. Некоторые первичные иммунодефициты Т-лимфоцитовИммунодефицигное состояниеОсновные патогенетические факторыКлиническая картинаВрожденная аплазия тимуса
(синдром Ди Джорджи, имму¬
нодефицит с гипопаратиреои-
дизмом). Тип наследования
неизвестенНарушение эмбрионального развития
(неправильное формирование органов,
происходящих из III и IV фарингиальных
карманов) до 12 недели гестации. Тимус
редуцирован или полностью отсутству¬
ет, аномальное его расположениеХроническая инфекция вирусной, бактериальной, микотической и паразитарной этиологии; гипопара-
тиреоз (гипокальциемия); пороки строения лица (низкопосаженные уши, рыбообразный рот, гипертв-
лоризм, выемка ушного бугорка, микрогнотия); пороки сердца, дуги аортысо
Окончание табл. 16-11м00Иммунодефицитное состояниеОсновные патогенетические факторыКлиническая картинаХронический кандидоз кожи
и слизистых оболочек. Тип
наследования неизвестенСелективный дефицит ответа Т-клеток
на антигены CandidaПоражение грибами рода Candida слизистых оболочек рта, гениталий, кожи лица, волосистой части
головы, туловища, конечностей, ногтей, ногтевых валиков. Молочница становится похожей на
плоскую или эрозивную лейкоплакию. Язык утолщается, становится скротальным, формируется
макрохейлит. В углах рта появляются трещины, покрытые налетами с инфильтрацией. I вариант —
заболевание начинается с хронической кандидозной инфекции. II вариант — заболевание начинается
с идиопатической зндокринопатии (гипопаратирвоз, гипокальциемия, тетания. Аддисонова болезнь,
диабет сахарный, пврницитозная анемия), а инфекция присоединяется позже 	Таблица 16-12. Дифференциальная диагностика первичных иммунодефицитов Т-лимфоцитовИммунодефицитноесостояниеРезультаты иммунологического исследованияДифференциальная диагностиказаболеванияотличительные признакиВрожденная аплазия тимуса
(синдром Ди Джорджи, имму¬
нодефицит с гипопаратиреои-
дизмом)Количество лимфоцитов значительно снижено, Т-лимфоцитов
резко снижено, или Т-клетки отсутствуют, реакция бласиранс-
формации лимфоцитов на фитогемагглютинин снижена, реакция
на аллогенные клетки снижена, количество В-лимфоцитов и обра¬
зование антител в норме или снижено, кальций в сыворотке крови
резко снижен, фосфор в сыворотке крови повышен, активность
естественных киллеров в нормеТяжелые врожденные пороки
сердцаНет Т-клеточного иммунодефицита, гипокальциемия
транзиторнаяТяжелая комбинированная
иммунологическая недостаточ¬
ностьПри одинаковых изменениях Т-клеточного иммуни¬
тета не характерны гипокальциемия, врожденные
пороки лица и сердцаФетальный алкогольный
синдромАнамнестические данныеХронический кандидоз кожи и
слизистых оболочекКоличество Т-пимфоцитоа в норме, реакция бласттрансформации
лимфоцитов на фитогемагглютинин в норме, реакция на аллоген¬
ные лимфоциты и антигены в норме (кроме антигенов Candida),
гиперчувствительность замедленного типа на Candida снижена
или отсутствует, образование 1\ЛИФ на антигены Candida снижено,
количество Тс-лимфоцитов снижено, В-лимфоцитов — в норме,
иногда IgA снижены или отсутствуют, нейтрофильный хемотаксис
снижен, дефект макрофагов, концентрация кальция в сыворотке
крови резко снижена, фосфора повышена, паратираоидных гор¬
монов сниженаСиндром Ди ДжорджиРазвивается а раннем возрасте, в отличие от хрониче¬
ского кандидоза кожи и слизистых оболочек, имею¬
щего постепенно прогрессирующий характер теченияДругие микотические пораже¬
ния кожи (хроническая трихо¬
фития, микоз, обусловленный
Trichophyton гиЬгит)Определяются другие возбудителиСистемная красная волчанкаОпределение специфических показателей
(1Е-клетки, антинуклеарный фактор, антитела к
нативной ДНК и др.)Энтеропатический акродер-
матитСопровождается блефароспазмом и фотофобией,
нарушениями стула (стеаторея). В крови — дефицит
цинка. Быстрое исчезновение симптоматики при
получении препаратов цинкаСиндром Ядассона-
Левандовского (многоформ¬
ный кератоз)Наследственный характер заболевания, семейный
анамнез
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ39Нарушения врожденного гуморального иммунитетаНедостаточность системы комплемента выражена в дефектах эффекторных
контролирующих белковых систем, характерно нарушение опсонизации фагоци¬
тоза и разрушение микроорганизмов. Клиническая картина дефектов комплемен¬
та — иммунокомплексные заболевания, повышенная чувствительность организма
к гнойным инфекциям, а также особая предрасположенность к инфекциям, вызы¬
ваемым двумя видами Neisseria (N. gomtrhoeae и N. meningitidis). Наиболее тяжелые
последствия при нарушении функции комплемента (связано с недостаточностью
ингибитора С1 компонента комплемента), развивается наследственный ангионев¬
ротический отек (табл. 16-13).Таблица 16-13. Некоторые наследственные дефекты белков системы комплементаИммунодефицитное состояниеОсновные пато¬
генетические
факторыКлиническая картинаРезультаты иммуно¬
логического иссле¬
дованияНедостаточность компонента
комплемента Clq, г, s, компо¬
нентов комплемента С2 и С4.
Тип наследования аутосомно-
рецессивныйНарушение
способности
элиминировать
иммунные ком¬
плексыПоражение кожи как при
системной красной волчанке,
васкулиты, дерматомиозит,
полимиозит, гломерулонефрит,
рецидивирующие гнойные
инфекцииКоличество компле¬
мента по 50% гемо¬
лизу нормальное или
снижено, количество
отдельных компо¬
нентов комплементаНедостаточность СЗ компонен¬
та комплемента. Тип наследо¬
вания аутосомно-рецессивныйНарушение алЬ'
термативного и
классического
пути активации
комплемента,
опсонизации и
фагоцитозаРецидивирующие гнойные
инфекцииснижено или отсут¬
ствует, количество С1
ингибитора в нормеНедостаточность С5-С9
компонентов комплемента.
Тип наследования аутосомно-
рецессивныйГенетическийдефектмембрано¬атакующегокомплексакомпонентовкомплементаРецидивирующая инфекция,
вызываемая патогенами семей¬
ства NeisseriaНедостаточность компонента
комплемента фактора Н (тип
наследования аутосомно-
рецессивный): фактора Д (тип
наследования аутосомно-
доминантный и аутосомно-
рецессивный), недостаточность
пропердина (Х-сцепленный тип
наследования)Нарушение аль¬
тернативного
пути активации
комплементаРецидивирующие гнойные
инфекции, менингококковая и
гонококковая инфекции, сеп¬
тицемияНедостаточность С1 ингибитораАктивация С2 и
С4 компонентов
комплемента,
приводящая к
образованию
кининов и
повышению
сосудистой про¬
ницаемостиАнгионевротический отек —
ограниченный по площади,
плотный, без ассоциации с
крапивницей, особенно опасен
при локализации на слизистой
оболочке верхних дыхательных
путей1 вариант — количе¬
ство С1 ингибитора
снижено, его функци¬
ональная активность
в норме; II вари¬
ант — количество С1
ингибитора в норме,
его функциональная
активность сниженаНарушения адаптивного гуморального иммунитетаНедостаточность гуморального иммунитета составляет около 60% всех пер¬
вичных иммунодефицитов и характеризуется нарушением продукции антител.
Клинические проявления Б-клеточных иммунодефицитов отмечают со второйшшШш
40ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯполовины первого года жизни, когда утрачиваются трансплацентарные IgG мате¬
ри, Больные с общим дефектом В-клеточной функции подвержены рецидивирую¬
щим пиогенным инфекциям (табл. 16-14 и 16-15) и нуждаются в пожизненной
заместительной терапии антителосодержащими препаратами иммуноглобулинов
для внутривенного введения, которую проводят как в дозе насыщения, так и в
режиме поддерживающей иммунотерапии.Комбинированные (В- и Т-клеточные) иммунодефицитные состоянияКомбинированная недостаточность гуморального и клеточного иммунитета
составляет 20-25% всех первичных иммунодефицитов. Дефекты функциониро¬
вания Т-клеток могут быть причиной развития группы заболеваний, получившей
общее название «Тяжелые комбинированные иммунодефициты». Многогранное
участие Т-лимфоцитов в специфическом реагировании делает их ведущим компо¬
нентом всей иммунной системы. Именно поэтому поражение Т-клеток приводит
к особо тяжелым формам иммунодефицита, при котором иммунная система не
способна сформировать адекватную специфическую защиту ко многим инфекци¬
онным агентам. Больные с комбинированным иммунодефицитом обычно погиба¬
ют в первые два года жизни. В табл. 16-16 и 16-17 систематизированы данные по
патогенезу, клинике, диагностике и дифференциальной диагностике комбиниро¬
ванных иммунодефицитов.Таблица 16-14. Первичные нарушения созревания и функций В-лимфоцитовИммунодефицитноесостояниеПатогенетические факторыКлинические проявленияСцепленная с
Х-хромосомой а(гипо)
гаммаглобулинемия
(болезнь Брутона).
Тип наследования
Х-сцепленныйБлокада дифференцировки
преВ-лимфоцитов из-за
мутации гена, кодирующего
тирозинкйназуРецидивирующие бактериальные инфекции
(отиты, бронхиты, пневмонии, менингиты,
хронические конъюнктивиты, дерматиты),
поражение десен, синдром мальабсорбции,
развитие ГЗТ. До возраста 9-12 мес болезнь не
проявляетсяОбщий вариабельный
иммунодефицит. Тип
наследования аутосомно-
рецессивный, аутосомно-
доминантныйБлокада дифференцировки
В-лимфоцитов в плазматиче¬
ские клетки из-за генетиче¬
ских дефектовРецидивирующие инфекции носовых пазух,
легких, бактериальные конъюнктивиты, синдром
мальабсорбции, лямблиоз, холелитиаз, аутоим¬
мунные заболеванияИммунодефиците
гипериммуноглобули-
немией м. Тип наследо¬
вания Х-сцепленный и
аутосомно-рецессивныйДефицит гена, коди¬
рующего молекулу С0401 на
Т-лимфоцитахВызываемые капсульными микроорганизмами
рецидивирующие бактериальные инфекции.
Характерны гиперплазия небных миндалин и
периферических лимфатических узлов, гепаго-
спленомегалия, отставание в физическом раз¬
витии, артриты, агранулоцитозСелективный дефицит
IgA. Тип наследования
разныйБлокада дифференцировки
зрелых В-лимфоцитов в 1дА-
предуцирующие плазматиче¬
ские клетки из-за снижения
костимуляции со стороны
Т-лимфоцитов и клеточного
микроокружения, а также
дефицита Т6-Р|5 и 11-15, спо¬
собствующих выработке 1дАРецидивирующие инфекции слизистых обо¬
лочек, хронические отиты, бронхо-пневмонии,
заболевания желудочно-кишечного тракта
{энтериты, язвенный копит), аутоиммунные
заболевания (ревматоидный артрит, системная
красная волчанка, тиреоидит, пернициозная
анемия, целиакия), онкологические заболевания
(тимома, ретикуло-клеточная саркома, плоско¬
клеточный рак пищевода и легких)Селективный дефицит
субклассов IgG. Тип
наследования неизвестенДелеция генов, отвечающих
за константную часть тяже¬
лых цепей 1дРецидивирующие инфекции респираторного
тракта, повторные пиогенные инфекции носо¬
вых пазух и легких, аутоиммунные заболеванияТранзиторная гипогам-
маглобулинемия у детей
раннего возраста. Тип
наследования неизвестенЗадержка дифференцировки
В-лимфоцитов в плазматиче¬
ские клетки при нарушенииРецидивирующие бактериальные инфекции
Таблица 16-15. Дифференциальная диагностика врожденных нарушений адаптивного гуморального иммунитетаИммунодефицитноесостояниеРезультаты иммунологического исследованияДифференциальная диагностиказаболеваниеотличительные признакиСцепленная с
Х-хромосомой а(гипо)
гаммаглобулинемия
(болезнь Брутона)Снижение общего уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови
(до 2 г/л) и всех классов 1д, снижен первичный и вторичный
ответ на антигенную стимуляцию и уровень нормальных анти¬
тел, В-лимфоциты отсутствуютПролонгированная
физиологическая гипо-
гаммаглобулинемияПри исследовании в динамике уровень иммуноглобулинов
повышаетсяЭнтвропатия с лотерей
белкаПри интестинальной биопсии в кишечнике и других лим¬
фоидных тканях определяют нормальное количество
В-лимфоцитов и внутриклеточного иммуноглобулинаЮвенильный ревматоид¬
ный артритуровень иммуноглобулинов повышенОбщий вариабельный
иммунодефицитОбщий уровень иммуноглобулинов ниже 3 г/л. уровень IgG ниже
2,5 г/л, IgA и IgM снижен до 0 г/л или определяют е следовых
количествах, нормальных антител снижен, изогемагглютинины
отсугствуют или резко снижены, снижена способность выраба¬
тывать антитела на специфическую иммунизацию, количество
В-лимфоцитов снижено или в норме, гиперчувстеительность
замедленного типа снижена или отсутствует, реакция бласт¬
трансформации лимфоцитов на фитогемагглютинин снижена,
количество Т-лимфоцитов снижено, снижена выработка in vitro
IL-2, IL-4, iL-5, соотношение CD4/CD8 снижено, активность есте¬
ственных киллеров в нормеСцепленная с
Х-хромосомой а(гипо)
гаммаглобулинемияв интестинальном тракте и в периферических лимфоузлах
отсутствуют плазматичские клетки, содержащие иммуно¬
глобулины, количество В-лимфоцитов резко сниженоЭнтеропатия с потерей
белкаОтсутствие дефицита альбуминов, количество
В-лимфоцитов нормальное. Диагностика затруднена, если
энтеропатия сопровождается снижением интестинальных
лимфоидных клеток (обычно они в нормальном количе¬
стве)Аутоиммунные заболе¬
ванияУровень иммуноглобулинов в норме или повышенХроническое неспецифи¬
ческое заболевание
легкихПроводить исследования на кистозный фиброз, хрониче¬
скую аллергию, дефицит а1-антитрипсинаВИЧ-инфекцияПровести лабораторную диагностику ВИЧ-инфекцииИммунодефицит с
гипериммуноглобули-
немией МРезко повышен уровень IgM до 10,0 г/л, резко снижен уровень
IgG и IgA, есть ответ на специфическую иммунизацию, титры
изогемагглютининов снижены, Т-клеточный иммунитет 8 норме■
Окончание табл. 16-15 ¡j^ИммунодефицитноесостояниеРезультаты иммунологического исследованияДифференциальная диагностиказаболеваниеотличительные признакиСелективный дефи¬
цит IgAСнижено количество IgA (<0,05 vtn), уровень IgG, IgM, IgD в
норме или снижен, иногда снижен уровень IgGj, есть ответ на
специфическую иммунизацию, в секрете уровень IgA снижен
или равен 0, IgM секреторный повышен, образуются антитела
против IgA. количество Т- и В-лимфоцитов в норме (иногда
количество Т-лимфоцитов снижено), гиперчувствительность
замедленного типа, реакция бласирансформации лимфоцитов
на фитогемагглютинин и аллогенные лимфоциты в нормеАтаксия-тел еангиэктазияНарушен клеточный иммунитетХронический кандидоз
кожи и слизистых обо¬
лочекПреобладает специфический дефект клеточного иммуни¬
тета (на антиген Candida нет ответа Т-лимфоцитов и пода¬
влена выработка МИФ, выработка антител против Candida
повышена)Клеточный иммунодефи¬
цит с аномальным синте¬
зом иммуноглобулинов
(синдром Незепофа)Дефект Т-клеточного иммунитета, нет выработки антител
на специфическую иммунизациюСелективный дефицит
IgG,Нет способности отвечать на полисахаридный антиген при
нормальном ответе на белковые антигеныЛекарственный IgA-
дефицит (прием противо-
судорожных препаратов)Анамнестические данные о приеме лекарствСелективный дефи¬
цит субклассов IgGОбщий уровень иммуноглобулинов в норме или повышен,
общий уровень IgG в норме или снижен, снижен уровень
отдельных субклассов IgG (IgG^, IgGj, IgGJ, ответ на иммуниза¬
цию — от нормы до неспособности отвечать на полисахаридный
антиген (IgG,). Т-клеточный иммунитет в нормеАтаксия-телеантизктазияНарушен клеточный иммунитетСелективный дефицит
IgAУровень IgA резко снижен, иногда определяют анти-lgA-
антителаТранзиторная гипо-
гаммаглобулинемия
у детей раннето воз¬
растаСнижен уровень IgA и IgM, существенно снижен уровень IgG,
низкий титр изогемагглютининов, снижена способность отве¬
чать на иммунизациюСцепленная с
Х-хромосомой а(гипо)
гаммаглобулинемияКоличество В-лимфоцитов резко снижено, в интестиналь¬
ном тракте и периферических лимфоузлах отсутствуют
плазматические клетки, содержащие иммуноглобулины
Таблица 16-16. Основные комбинированные (В* и Т-клеточные) иммунодефицитные состоянияИммунодефицитное состояниеОсновные патогенетические факторыКлинические проявленияТяжелые комбинированные иммуно¬
дефицитные нарушения. Тип насле¬
дования аутосомно-рецессивный или
Х-сцепленныйДефект на уровне стволовых клеток. Возможен
врожденный дефект тимуса, отсутствие цитоки¬
нов или факторов дифференцировкиТяжелые хронические инфекции вирусной, бактериальной, микотической и прото-
зойной природы (хроническая диарея, пневмонии, персистирующий кандидоз, отиты,
сепсис). Гибель на первом году жизниДефекты проведения Т-клеточных
мембранных сигналов и синтеза цито¬
киновВрожденный дефект на уровне Т-кпеточных
рецепторов, дефицит продукции IL-2Рецидивирующие инфекции различной степени тяжестиКлеточный иммунитет с нарушением
синтеза иммуноглобулинов (синдром
Незелофа, алимфоцитоз). Тип насле¬
дования аутосомно-рецессивныйНарушение IL-2 рецепторов с вторичным нару¬
шением развития тимусаПредрасположенность к рецидивирующим микотическим, паразитарным, бактериаль¬
ным. вирусным инфекциям. Признаки лимфаденопатии и гепатоспленомегалииИммунодефицит с атаксией-
телеангиэктазией (синдром Луи-Бар).
Тип наследования аутосомно-
рецессивныйДефект в хромосоме в локусе llqjj_23{atm),
дефекты репарации ДНКТелеангиэктазии, мозжечковые нарушении и нистагм, неврологическая симпто¬
матика поражения зкстрапирамидных путей задних столбов спинного мозга.
Рецидивирующие инфекции дыхательного тракта. В пубертатном периоде развитие
зндокринопатии (сахарный диабет). Позже — зпокачественные новообразования
(карцинома желудка, печени, яичников, лейкемия, неходжкинская лимфома)Иммунодефицит с тромбоцитопенией,
экземой, рецидивирующей инфекцией
(синдром Вископа-Олдрича). Тип
наследования Х-сцепленныйНарушения в гене WAS в локусе Хр„ корот¬
ком плече Х-хромосомы, приводящие к ограни¬
чению экспрессии CD23 на поверхности клеток
и аберрантному протеолизу СО23; дефицит гли¬
копротеина сиапофорина (CD43), приводящий к
быстрому старению клетокОбнаруживают а основном у мальчиков. Склонность к рецидивирующим бактериаль¬
ным инфекциям (инфекции ЛОР-органов, дыхательного тракта, мочеполовой систе¬
мы, кожи, ЖКТ), экзема, геморрагический синдром, связанный с тромбоцитопениейИммунодефицит с тимомой (синдром
Гуда). Тип наследования неизвестенОбнаруживают в основном у взрослых. Иммунодефицитное состояние может предше¬
ствовать возникновению тимомы или возникает после ее обнаружения. Характерны
рецидивирующие инфекции (носовых пазух, легких, мочеполовой системы, хрониче¬
ская диарея, дерматит, стоматит, септицемия), тимома, апластическая анемия, тром¬
боцитопения, сахарный диабет, амилоидоз, хронический гепатит, миастенияИммунодефиците карликовостью
из-за коротких конечностей. Тип
наследования неизвестенПредрасположенность к бактериальной, вирусной, микотической и протозойной
инфекции. Прогрессирующая вакцинальная инфекция, повышенная чувствительность
к инфекциям носовых пазух и легких, фатальной ветряной оспе. Короткие конечно¬
сти, гипоплазия хрящей и вопос (тонкие светлые волосы)
Окончание табл. 16-16Иммунодефицитное состояниеОснанные патогенетические факторыКлинические проявленияИммунодефицит вследствие дефи¬
цита ферментов. Тип наследования
аутосомно-рецесси в ныйДефицит аденозиндезаминазы и пуриннуклео-
зидфосфорилазы приводит к нарушению ката¬
болизма пуринов с накоплением промежуточ¬
ных продуктов обмена. Повышенная активность
этих продуктов обмена ингибирует функцию
лимфоцитовКоррелируют с уровнем нарушения активности ферментов. В 85% случаев клини¬
ческая картина сходна с симптомами при тяжелых комбинированных иммунодефи-
цитных нарушениях. Сочетается с патологией ребер, поперечных отростков и тел
позвонков, изменениями в костях таза. При дефиците пуриннуклеозидфосфорила-
зы — фатальные вирусные и вакцинальные инфекцииДефицит 5'-нукл0Отидазы как дифференци-
ровочного маркера В-лимфоцитов. Как след¬
ствие — нарушение созревания В-лимфоцитов
в периферической крови или снижение их
количестваДефицит 5'-нуклеотидазы описан в связи с приобретенной гипогаммаглобулинемией,
Х-сцепленной гипогаммаглобулинемией, синдромом Вискотта-Олдрича, селективным
дефицитом 1дА. Клинические проявления соответствуют данным заболеваниямДефицит транскобаламина II и витамин
В-несущего протеина приводит к нарушению
транспорта витамина В в клетки, в результате
чего развивается гипогаммаглобулинемияПри дефиците транскобаламина II и витамин В-несущего протеина отмечают сим¬
птомы макроцитарной анемии, гранулоцитопении, тромбоцитопении, лимфопении;
синдром мальабсорбцииДефицит биотин-зависимой карбоксилазыКандидоз кожи и слизистых оболочек, атаксия, эпизоды сепсисаСиндром «голых» лимфоцитов. Тип
наследования аутосомно-рецессивныйОтсутствие или значительное снижение экспрес¬
сии антигенов 1 и/или II класса HLA. Считают,
что дефект связан с нарушением трансакти¬
вации регуляторного гена II класса HLA или с
дефектом в ДНК-связывающем протеине, регу¬
лирующим транскрипцию генов !1 класса HLAОппортунистические инфекции, хроническая диарея, рецидивирующие вирусные
инфекции, вирусная инфекция ЦНС, апластическая анемия
Таблица 18-17. Дифференциальная диагностика комбинированных (В- и Т-клеточные) иммунодефицитных состоянийИммунодефицитныесостоянияРезультаты иммунологического исследованияДифференциальная диагностиказаболеваниеотличительный признакТяжелые комбиниро¬
ванные иммунодефи¬
цитные нарушенияЛимфопения, количество Т-лимфоцитов резко снижено, реакция бласпранс-
формации лимфоцитов на фитогемагглютинин отсутствует, число субпопуляций
Т-пимфоцитов нарушено, нет ответа на Т-зависимые антигены, количество
В-лимфоцитов снижено или отсутствует, активность МК в норме или снижена.
При биопсии лимфатических узлов нет корково-медуллярной дифференциров¬
ки, фолликулов, лимфоциты угнетены, при биопсии кишечника нет плазмати¬
ческих клетокДефект преимущественно Т- или
В-лимфоцитовСтрадает и Т-, и В-клеточный иммунитетКомбинированный иммунодефицит
лри дефиците аденозиндезаминазыИсследование активности аденозиндезами¬
назы позволяет провести дифференциаль¬
ную диагностикуСиндром Летгерера-ЗивеИммунологические показатели в нормеСиндром ОменнаИммунологические показатели в нормеДефекты проведения
Т-клеточных мем¬
бранных сигналов,
дефицит продукции
цитокиновЭкспрессия Т-клеточных рецепторов снижена, реакция бласттрансформации
лимфоцитов на фитогемагглютинин и антигены снижена, продукция 11-2,11-3,
11-4,11-5 сниженаТяжелые комбинированные имму¬
нодефицитные нарушенияПри стимуляции лимфоцитов in vitro нет
экспрессии Т-клеточных рецепторов или не
вырабатываются интерлейкиныКлеточный иммунитет
с нарушением синтеза
иммуноглобулинов
(синдром Иезелофа)Лимфопения или нормальное количество лимфоцитов, количество
Т-пимфоцитов снижено, реакция бласпрансформации лимфоцитов на фито¬
гемагглютинин и антигены снижена или отсутствует, ответ Т-лимфоцитов на
аллогенные лимфоциты снижен или отсутствует (иногда в норме), количество
В-лимфоцитов в норме, нет выработки антител на специфическую иммуни¬
зацию. изогемагглютинины — отсутствуют или в норме. В лимфоузлах при¬
сутствуют плазматические клетки (при биопсии), В увеличенных лимфоузлах
гранулемы с гистиоцитами и макрофагамиАтаксия-телеангиэктазияа-Фетопротеин (АФП) повышен с первого
года жизниСиндром Вископа-ОлдричаТромбоцитопения с рожденияТяжелые комбинированные имму¬
нодефицитные нарушенияПолное отсутствие Т- и В-лимфоцитовИммунодефицит при дефиците
аденозиндезаминазыОтсутствие или резкое снижение уровня
аденозиндезаминазыИммунодефицит с карликовостьюХарактерные клинические и рентгенологи¬
ческие данныеСиндром Ди ДжорджиЭндокринопатияКандидоз кожи и слизистых обо¬
лочекСинтез антител в нормеСПИДОбнаружение вируса или антител к немуИммунодефицит
с атаксией-
телеангиэктазией
(синдром Луи Барр)Реакция бласттрансформации лимфоцитов на фитогемагглютинин, смешанная
культура лимфоцитов, Т-лимфоциты — в норме или снижены; лимфопения,
ГЗТ отсутствует, количество В-лимфоцитов е норме, IgGj, IgG^, IgA снижено,IgE — снижено или отсутствует (у некоторых пациентов), выработка антител
на специфические антигены снижена, активность NK в норме, АФП повышен,
уровень 17-глюкокортикоида снижен, а ФС гормона повышен, определяются
цитотоксические антитела к мозговой ткани и тимусуСиндром НезелофаНет высокой концентрации АФПЧастичная церебральная атаксияНет иммунологических нарушенийСелективный дефицит IgAКонцентрация АФП в нормесл
Окончание табл. 16-17 йИммунодефицитныесостоянияРезультаты иммунологического исследованияДифференциальная диагностиказа13олеваниеотличительный признакИммунодефицит с
тромбоцитопенией,
экземой, рецидиви¬
рующей инфекцией
(синдром Вискотта-
Олдрича)Тромбоцитопения, количество В-лимфоцитов и IgG в норме, IgM снижено, IgA
и IgE повышено, изогемагглютинины отсутствуют или снижены, нет выработки
антител на полисахаридный антиген, Т-клеточный иммунитет сначала в норме,
затем снижаетсяИдиопатическая тромбоцитопенияУровень всех иммуноглобулинов и изоге¬
магглютининов, выработка антител на поли¬
сахаридные антигены — в норме, крупные
размеры тромбоцитовЭкзема с рецидивирующей инфек¬
цией у мальчиковИммунологические показатепи в норме при
повышенных IgE, IgA, количество тромбо¬
цитов в нормеИммунодефицит с
тимомой (синдром
Гуда)Количество иммуноглобулинов снижено, выработка антител на специфическую
иммунизацию снижена или отсутствует, реакция бласттрансформации лимфо¬
цитов на фитогемагглютинин снижена, гиперчувстеительность замедленного
типа снижена, супрессорная активность лимфоцитов повышена, тромбоцитопе¬
ния, гранулоцитопения, анемияЭритроцитарная аплазия, миасте¬
ния грависВосстановление иммунитета после удаления
тимусаИммунодефицит с
карликовостью из-за
коротких конечностей1 вариант; снижено количество Т- и В-лимфоцитов. нет их функциональной
активности. 11 вариант; снижены количество и функциональная активность
Т-лимфоцитов. В-клеточный иммунитет в норме. Ill вариант: иммунитет
Т-клеточный в норме, В-клеточный — отсутствуетИммунодефицит
вследствие дефицита
ферментовУровень аденозиндезаминазы снижен, или фермент отсутствует, Т- и
В-клеточный иммунитет (количественный и функциональный) снижен или
отсутствуетТяжелые комбинированные имму¬
нодефицитные нарушенияУровень аденозиндезаминазы в нормеУровень пуриннуклеозидфосфорилазы снижен, Т-клеточный иммунитет снижен,
В-клеточный иммунитет в нормеТяжелые комбинированные имму¬
нодефицитные нарушенияУровень пуриннуклеозидфосфорилазы в
нормеУровень 5'-нуклеотидазы снижен, количество и функциональная активность
В-лимфоцитов сниженыХ-сцепленная гипогаммаглобули¬
немияНет снижения уровня 5'-нуклеотидазыСиндром Вискотта-ОлдричаНет снижения уровня 5'-нуклеотидазыСелективный дефицит 1дАНет снижения уровня 5'-нуклеотидазыУровень транскобаламина II снижен, количество В-лимфоцитов и 1д снижено,
тромбоцитопения, анемия, гранулоцитопенияСПИДВыявляют специфический вирус или анти¬
тела к немуВ „-дефицитная анемияМикроцитарная анемияУровень биотин-зависимой карбоксилазы снижен, Т- и В-клеточный иммунитет
(количественный и функциональный) сниженХронический кандидоз кожи и сли¬
зистых оболочекНет дефицита биотин-зависимой карбок¬
силазыАтаксияНет эффекта от лечения биотином, нет
дефицита биотин-зависимой карбоксилазыСиндром «голых»
лимфоцитовСнижение экспрессии HLA (II или обоих классов), лимфопения, количество и
функциональная активность Т- лимфоцитов снижены, ответ на антигены сни¬
жен, на митогены — в норме, количество В-лимфоцитов в норме или повышеноТяжелые комбинированные имму¬
нодефицитные нарушенияПри типировании HLA экспрессия антигенов
1 и/или II классов не снижена
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 47Вторичные иммунодефицитыВторичные иммунодефициты обуаговлены экзогенными факторами, харак¬
теризуются стойкими клиническими и лабораторными признаками нарушения
функций иммунной системы, количественными и функциональными нарушения¬
ми гуморального и клеточного иммунитета.По клиническим признакам и лабораторным показателям вторичные и пер¬
вичные иммуно дефициты сходны. Принципиальное различие в том, что дефект
иммунной системы при вторичных иммуно дефицитах — приобретенный.
Причины вторичных иммунодефицитов,•	Физиологический иммунодефицит;❖	новорожденных;❖	пубертатного периода;■0^ при беременности;❖	пожилых людей.•	Патологические:инфекционные:-	вирусные инфекции (острые и хронические персистирующие, ВИЧ);-	бактериальные инфекции;-	микотические инфекции;-	паразитарные инфекции;^ неинфекционные:-	нарушение питания (дефицит белка, витаминов и микроэлементов);-	хронические неинфекционные заболевания;-	злокачественные новообразования;-	аутоиммунные заболевания;-	интоксикации (эндогенные и экзогенные);-	нарушения метаболизма, дефицит энергопластического обеспечения
и нарушение регуляторных процессов (ожирение, кахексия, сахарный
диабет, тиреотоксикоз);-	стрессорные воздействия (травмы, операции, психические травмы,
спортивные перегрузки и др.);-	воздействие лекарственных препаратов (иммуносупрессоры, глюкокор-
тикоиды, антидепрессанты, химиотерапия);-	ожоговая болезнь;-	кровотечения;-	экологическое неблагополучие (воздействие неблагоприятных факто¬
ров внешней среды — радиация, ксенобиотики).Вторичные иммунодефициты разделяют по степени тяжести:•	компенсированные (с повышенной восприимчивостью к возбудителям
инфекций):•	субкомпенсированные (со склонностью к хронизации инфекционных про¬
цессов);•	декомпенсированные (происходит развитие генерализованных инфекций,
индуцированных условно-патогенной флорой и злокачественными новооб¬
разованиями).Инфекционный синдром в «чистом виде» встречают в 50% случаев вторич¬
ного иммунодефицита. Инфекционный анамнез ориентирован на определение у
пациента:•	упорно рецидивирующих вирусных и бактериальных инфекций ЛОР-органов,
респираторного и урогенитального тракта, ЖКТ;•	персистирующих вирусных инфекций;•	внутриклеточных бактериальных инфекций;1Р
48ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ•	микотических инфекций;•	упорно рецидивирующих пиогенных инфекций кожи, подкожно-жировой
клетчатки и др. локализаций;•	генерализованных или тяжелых форм вирусных или бактериальных инфек¬
ций;•	нарушений микробиоценоза открытых и закрытых слизистых оболочек.Клинико-лабораторное обследование пациентов помогает оценить количе¬
ственные и качественные характеристики, отражающие состояние иммунной
системы, выявить иммунодефицит и определить степень тяжести нарушений в
иммунной системе. Однако окончательный диагноз базируется, прежде всего, на
клинических проявлениях. Выбор лечения и прогноз его эффективности зависит
от комплексного подхода к такой патологии, как иммунодефицит.ИММУННАЯ СИСТЕМА И ВОСПАЛЕНИЕВ инфекционной клинике иммунологические обследования больных использу¬
ют в основном с целью:•	диагностики инфекционного заболевания;•	прогнозирования характера течения и исхода болезни;•	определения у пациентов высокой степени риска возникновения инфекцион¬
ных заболеваний;•	оценки эффективности проводимой терапии.При благоприетном течении заболевания у больных формируется защитный
иммунитет. Динамика его выработки и роль факторов иммунной защиты при
разных инфекциях {и даже на разных этапах болезни) существенно различаются.
Именно поэтому схемы и объем иммунологического обследования больных раз¬
ными инфекциями должны отличаться.АНТИГЕН-НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫАнтиген-неспецифические факторы иммунной защиты представлены клетками
пограничных тканей (кожа, слизистые оболочки дыхательных путей, пищевари¬
тельного и урогенитального тракта), резидентными клетками разных органов и
тканей, эндотелиоцитами, а также клетками крови, различными циркулирующи¬
ми и выделяемыми с секретами водорастворимыми молекулами. Характеристика
основных врожденных антиген-неспецифических факторов иммунной защиты
представлена в табл. 16-18.Таблица 16-18. Антиген-неспецифические факторы иммунитета в противоинфекционной защитеКомпоненты иммун¬
ной системыИммунобиологическая активностьКлетки пограничных
тканей (эпителий
слизистых оболочек,
кератоциты й др.}Препятствие на пути проникновения инфекционных агентов в организм; про¬
дукция слизи, микробиотических и микробицидных веществ; перенос антигенов
в подслизистые оболочки кишечника и дыхательных путей; транспорт IgA и IgM
из подслизистых оболочек в просвет дыхательных путей и кишечника, в секрет
слизистых, слюнных, молочных желез; представление лимфоцитам антигенов в
высокоиммунной формеДендритные клетки
тканей и лимфоид¬
ных органовЗахват и умерщвление инфекта; ферментативная обработка, транспортировка и
представление антигенов лимфоцитам; депонирование антигена; инициация пер¬
вичного иммунного ответа; регуляция клеточного и/или гуморального иммунного
ответаТучные клеткиИнициация, поддержание и регуляция воспаления {в особенности аллергического)
и репарационных процессов; зкзоцитоз; продукция цитокинов и др. медиаторов
воспаления
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ49Окончание табл. 16-18Компоиекты иммун¬
ной системыИммунобиологическая активностьКлетки разных тканей
и органовПродукция цитокинов и гуморальных антиген-неспечифических факторов иммун¬
ной защиты {белки системы комплемента и острофазные, лизоцим и др.); удале¬
ние антигенов из циркуляции в организме; репарация повреждений; представление
антигена Тс-лимфоцитамБелки системы ком¬
плементаЦитолиз; опсонизация; анафилатоксический и хемотаксический эффекты; регуля¬
ция воспаления и иммунного ответа; выведение из циркуляции в крови иммунных
комплексовС-реактивный белокАктивация комплемента; опсонизация; взаимодействие с фосфорил-холиновыми
производными полисахаридов и удаление их из кровиНейтрофильные лей¬
коцитыФагоцитоз внеклеточных инфектов; зкзоцитоз; участие в остром воспаленииБазофильные лей¬
коцитыЗкзоцитоз; поддержание и регуляция воспаления (особенно аллергического)Эозинофильные лей¬
коцитыФагоцитарная и экзоцитарная антипаразитарная и противоопухолевая активность;
участие в аллергическом воспалении; разрешение воспаления		МоноцитыФагоцитоз инфицированных соматических клеток; захват, обработка и представ¬
ление антигенов лимфоцитам; инициация антиген-специфического иммунного
ответа: продукция цитокинов и других медиаторов воспаления и иммунного ответа;
образование гранулем; удаление циркулирующих иммунных комплексов; репара¬
ция повреждений 	 	 	NK-клетки (есте¬
ственные киллеры)Антителозависимая клеточная цитотоксичность; продукция цитокиновЭритроцитыСорбция циркулирующих антигенов и удаление их и циркулирующих иммунных
комплексов из кровиТромбоцитыУменьшение кровотока и ускорение свертывания крови в очагах воспаления, регу¬
ляция воспаления и репарации; удаление циркулирующих иммунных комплексовНеповрежденные пограничные ткани — надежная преграда на пути про¬
никновения инфектов внутрь организма. В слое эпителия слизистых оболочек
дыхательных путей и ЖКТ обнаружены М-клетки (от англ. microfold — микро¬
загонщики), способные захватывать из слизи кишечника или дыхательных путей
водорастворимые антигены, вирусы и бактерии и в неизменном виде переносить
их в подслизистые. М-клетки со стороны подслизистых оболочек экспрессируют
на мембране переносимые антигены и обеспечивают взаимодействие с ними ден¬
дритных клеток и макрофагов подслизистых. В свою очередь, последние не только
захватывают чужеродные антигены и микроорганизмы, но и убивают их, под¬
вергают ферментативному расщеплению до олигопептидов, образуют комплексы
пептидов с внутриклеточными белками и представляют комплексы лимфоцитам
в высокоиммуногенной форме, при первичном попадании антигенов в организм
дендритные клетки захватывают и убивают инфекционных агентов. Захват анти¬
гена стимулирует дифференцировку дендритных клеток и их миграцию из погра¬
ничных тканей с током лимфы к ближайшим лимфатическим узлам.Таким образом, дендритные клетки осуществляют не только внутриклеточную
обработку антигенов, но и доставку их из пограничной ткани в лимфоидные орга¬
ны. При первичном иммунном ответе в лимфоидных органах дендритные клетки
представляют антиген-специфическим наивным Т- и В-лимфоцитам низкомоле¬
кулярные фрагменты процессированного антигена в ассоциации с белками HLA
П класса, инициируя антиген-специфический иммунный ответ.Проникновение микроорганизмов через пограничные ткани активирует рези¬
дентные клетки, которые включаются в локальный воспалительный процесс и
продуцируют хемотаксические вещества, цитокины, эйкозаноиды и другие медиа¬
торы воспаления, запуская каскад воспалительных реакций.
50 ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯтШІ-На ранних этапах развития воспаления с инфекционными агентами и продукта¬
ми их жизнедеятельности взаимодействуют антиген-неспецифические гумораль¬
ные факторы. Образующиеся при активации системы комплемента субкомпоненты
служат важными эндогенными эффекторами и регуляторами иммунной системы.
Фрагменты молекул белков системы комплемента — эндогенные опсонины, уси¬
ливающие захват и завершенность фагоцитоза. Субкомпоненты комплемента Cls,
СЗа, С4а и С5а способны активировать тучные клетки и базофилы, вызывая их
дегрануляцию, активацию синтеза и секрецию медиаторов аллергического вос¬
паления. Субкомпоненты СЗа и С5а вызывают сокращение гладкой мускулатуры
и повышают проницаемость сосудистой стенки, что позволяет называть их анафи-
лотоксинами.Все клетки крови в той или иной степени у^іаствуют в защите от чужого в каче¬
стве эффекторных факторов иммунных реакций. Фагоцитарная система крови
представлена гранулоцитами и моноцитами. Среди гранулоцитов фагоцитарная
активность особенно выражена у нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов.
Нейтрофилы способны захватывать, убивать и переваривать разнообразные вне-
клеточно размножающиеся инфекционные агенты. Умерщвление захваченных
гранулоцитами и моноцитами микроорганизмов осуществляется за счет прямого
действия на них радикалов кислорода и множества дезинфектантов, образующих¬
ся в фагоцитах при кислом pH и в присутствии галогенов хлора и йода с участи¬
ем миелопероксидазы (хлорноватистая кислота, надйодная кислота, хлорамин
и др.). Для гранулоцитов характерна также экзоцитарная активность, в результате
которой лейкоциты выделяют в сторону микробной клетки и других объектов
содержимое внутриклеточных гранул, в их гранулах содержатся разнообразные
антимикробные продукты и активные гидролитические ферменты, а также гиста¬
мин (базофилы), цитокины и другие медиаторы воспаления. Способность базофи-
лов продуцировать и при дегрануляции выделять гистамин, а также наличие у них
рецепторов к TgE делают базофилы, как и тучные клетки, важнейшими участника¬
ми аллергического воспаления.Моноциты определяют исход хронического воспаления и освобождают орга¬
низм от внутриклеточно паразитирующих микроорганизмов. В отличие от поли¬
морфноядерных лейкоцитов моноциты фагоцитируют инфицированные микро¬
бами соматические клетки, прерывая размножение внутриклеточных инфектов.
Например, при хламиди иной инфекции первая реакция иммунной системы в месте
внедрения возбудителя обязана нейтрофильным лейкоцитам, а в случае хрониза¬
ции инфекции уничтожение возбудителя осуществляют моноциты, фагоцитирую¬
щие инфицированные клетки. Недостаточность фагоцитарной активности моно¬
цитов — главная причина хронического течения хламидийных инфекций. При
вирусных инфекциях решающая роль в уничтожении инфицированных вирусами
клеток также принадлежит моноцитам.При хронических гранулематозных инфекциях моноциты крови в инфициро¬
ванных органах дифференцируются в многоядерные эпителиоидные клетки, кото¬
рые образуют вокруг возбудителя гранулемы. Гранулема ограничивает размно¬
жение возбудителя, удерживает его в одном локусе и препятствует диссеминации
инфекта в организме. Нарушение способности моноцитов образовывать гранулему
(в частности, при ВИЧ-инфекции) делает больного беззащитным в отношении
микобактериальных инфекций.Повышенное общее количество нейтрофильных лейкоцитов, появление в
крови юных форм этих клеток свидетельствует об остром воспалительном про¬
цессе. Выявление нейтрофилов с токсической зернистостью или патологически
измененных клеток в крови больных указывает на серьезные изменения и даже
на несостоятельность этого важного механизма иммунной защиты. Увеличение в
крови содержания моноцитов может быть связано с вирусной или какой-либо дру¬
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ51гой инфекцией, вызываемой внутриклеточными паразитами, и может свидетель¬
ствовать о хроническом патологическом процессе. Для диагностики врожденных
заболеваний фагоцитарной системы (например, хроническая гранулематозная
болезнь) или для прогнозирования течения гнойных инфекций информативным
считают исследование миелопероксидазной активности фагоцитов — тест с гра¬
нулами нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Активность фагоцитарной системы
крови зависит от опсонизирующей или, наоборот, угнетающей фагоцитоз способ¬
ности сыворотки крови больного. Накопление в крови эозинофилов может быть
следствием аллергической патологии, гельминтозов, онкологического процесса,
аутоиммунных заболеваний, врожденных иммунодефицитов и др.К антиген-неспецифическим факторам иммунной защиты относят NK-клетки
крови. Основные мишени для них — клетки, инфицированные вирусами, опухо¬
левые клетки, клетки с размножающимися внутриклеточно микробами. У таких
клеток-мишеней подавлена экспрессия и изменена пространственная конфигура¬
ция ассоциированных с мембранами антигенов HLA (трансплантационные анти¬
гены), что и активирует против них NK-клетки. Участие NK-клеток в защите от
инфекции особенно значимо в первые дни заболевания, когда у больного еще не
сформировались антиген-специфические иммунные реакции. Для оценки функ¬
ции NK-клеток разработаны специальные тесты, получившие название реакций
антителозависимого клеточного цитолиза. Б этой реакции цитолитическую гибель
клеток-мишеней осуществляют NK-клетки, а также соучаствующие в реакции
моноциты, эозинофилы и нейтрофилы, несущие Fc-R к IgG.АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ИММУНИТЕТААнтиген-специфические факторы иммунитета распознают и запоминают осо¬
бенности молекулярной структуры чужеродных антигенов и, благодаря этому,
узнают антиген при повторных контактах с ним. Антиген-специфические ком¬
поненты иммунной системы — Т- и В-лимфоциты и антитела. Именно они обе¬
спечивают формирование приобретенного иммунитета к инфекционным агентам.
Из всех клеток иммунной системы только лимфоциты способны распознавать
антиген, взаимодействовать с ним и обеспечивать формирование иммунологи¬
ческой памяти. Антигенная активация лимфоцитов предполагает обязательное
взаимодействие нескольких клеток разного типа — антиген-представляющих
(А-клетки), Т- и В-лимфоцитов. При первичном иммунном ответе в качестве
А-клеток выступают дендритные клетки, эффективное взаимодействие имму-
нокомпетентных клеток происходит только во вторичных лимфоидных органах
(лимфатические узлы, селезенка, миндалины, пейеровы бляшки и др.). В первич¬
ном ответе )^аствуют наивные Т- и Б-лимфоциты, ранее не имевшие контакта с
антигеном и потому весьма требовательные к условиям, в которых осуществляется
представление антигена и ответ на него. В результате взаимодействия с антигенами
и пролиферации наивных лимфоцитов соответствующего клона накапливаются
иммунные лимфоциты, которые затем распределяются по всему организму. При
повторной иммунизации они могут взаимодействовать и отвечать на антиген не
только во вторичных лимфоидных органах, но и в любых других органах и тка¬
нях. Всякий раз большая доля клеток размножившегося клона лимфоцитов спустя
некоторое время погибает апоптозом, но часть из них может дифференцироваться
в малые лимфоциты (клетки — носители иммунологической памяти), способные
без деления сохраняться в организме в течение нескольких лет. Вся последующая
иммунизация стимулирует быструю дифференцировку и деление соответствую¬
щих иммунных антиген-специфических лимфоцитов и поддерживает сохранение
в организме иммунных лимфоцитов антигенреактивного клона (табл. 16-19).
Приобретенный иммунитет сохраняется до тех пор, пока имеется повышенное
содержание малых Т- и В-лимфоцитов антигенреактивного клона.тШ0ш
52ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯТаблица 16-19. Иммунобиологическая активность антиген-специфических компонентов иммун¬
ной системы (приобретенные факторы иммунной защиты)Компоненты иммунной
системы защитыИммунобиологическая активностьШЛимфоциты:CD8' Т-клеткиЦитотоксическая активность е отношении антиген-специфических клеток-
мишеней (вирус-инфицированные, опухолевые, клетки трансплантатов, парази¬
тов, с поверхностными чужеродными антигенами)CD4* Т-клеткиКонтактная и опосредованная цитокинами регуляция функций клеток иммунной
системы, участвующих в воспалении и антиген-специфическом клеточном и/или
гуморальном иммунном ответеCD19*. С020*. CD21*
В-клеткиПредшественники секретирующих антитела плазматических клеток; продукция
цитокинов; зндоцитоз, процессинг и представление антигена ТЬ-лимфоцитам, а
особенности лри вторичном иммунном ответе1д разных классов и
субклассовНейтрализация и удаление антигена, агрегация водорастворимых и корпускуляр¬
ных антигенов, опсонизация, инициация С- и NK-зависимого цитолиза, инициация
аллергического воспаления (IgE), регуляция иммунного ответаПопуляция Т-лимфоцитов исключительно гетерогенна. Различают CD4-Th- и
CD8-TC-лимфоциты. Тс-лимфоциты имеютрецепторы к антигенам. Взаимодействие
с ними активирует Т-лимфоциты и стимулирует их пролиферацию и дифференци-
ровку. Активированные Тс-лимфоциты, как и NK-клетки, выделяют в сторону
клетки с антигеном перфорины и гранзимы, в результате чего в клетке-мишени
образуются отверстия или включается программа их самоубийства (апоптоза).
Для накопления в организме Тс-лимфоцитов необходимо определенное время,
поэтому они включаются в процесс уничтожения инфицированных клеток позд¬
нее, чем NK-клетки или другие антиген-неспецифические факторы иммунной
защиты. Именно эти клетки обеспечивают высокоспецифическую иммунную реак¬
цию Т-лимфоцитов при вторичном иммунном ответе.Т-лимфоциты прямым взаимодействием со вспомогательными клетками и
с другими лимфоцитами, а также посредством продуцируемых ими цитокинов
управляют иммунным ответом. Популяция CD4^ Т-лимфоцитов также весьма
неоднородна. В зависимости от того, какие наборы цитокинов они продуцируют,
среди Th-лимфоцитов различают субпопуляции клеток ThO, ТЫ, Th2 и Thl7 (Tri)
и Тг-лимфоциты. Дифференцировка ThO в иной тип Th-клеток зависит от многих
условий: свойств клеток, представляющих антиген Th-лимфоцитам; соотношения
антигенпрезентирующих А-клеток и Th-клеток; количества антигена на поверх¬
ности А-клеток; набора цитокинов, воздействующих на Th-клетку; характера
костимулирующих сигналов, передаваемых Th-клеткам; клеток микроокружения
при взаимодействии А-клеток и Th-лимфоцитов.Антигенная активация В-лимфоцитов приводит к их пролиферации и диф¬
ференцировке в плазматические клетки или малые В-лимфоциты памяти.
Плазматические клетки живут в течение 2-3 нед. Плазматическая клетка может
продуцировать иммуноглобулины любого, но только какого-либо одного клас¬
са. Исключение — начальный этап дифференцировки наивных В-лимфоцитов в
плазмоциты, когда клетки вначале синтезируют IgM, а затем переключаются на
синтез IgG. Некоторое время такие плазматические клетки могут одновременно
синтезировать антитела против того же антигена, но классов IgM и IgG. Выбор
класса иммуноглобулинов, которые будет продуцировать плазматическая клетка,
определяют Th-лимфоциты, секретирующие разные иммунорегуляторные цито¬
кины. Эти цитокины воздействуют на В-лимфоциты, включая в них гены, контро¬
лирующие синтез какого-либо определенного класса иммуноглобулинов.
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 53При инфекционных заболеваниях накапливающиеся в крови антитела облада¬
ют множественной иммунобиологической активностью (табл. 16-20). Антитела
при взаимодействии с микробными или иными антигенами-токсинами способны
нейтрализовать их токсичность, а также обезвредить другие факторы патоген¬
ности бактерий и вирусов. Взаимодействуя с чужеродными антигенами, антитела
способны образовывать мультимолекулярные иммунные комплексы из антигена и
антител, которые быстро выводятся из циркуляции.Таблица 16-20. Участие антител в противоинфекционном иммунитетеКласс 1дМеханизмы ззщктыВозбудктели инфекцийIgG, IgMОпсонизацияВирусы, микроорганизмы, грибыIgG, IgM, igA*CНейтрализацияВирусыIgAПодавление адгезииМикроорганизмы, грибыIgG, IgM^CЦитолизВирусы, микроорганизмы, паразитыIgGНейтрализация токсиновМикроорганизмы, грибыIgGПодавление активности ферментовВирусы, микроорганизмыIgG, IgAАнтителозависимый клеточный ЦИТОЛІІЗВирусы, грибы, паразитыЮЕАктивация тучных клетокПаразитыIgA, IgGМикробостатическое действиеМикроорганизмы, микоплазмыОСОБЕННОСТИ ПРОТЕКТИВНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ НЕКОТОРЫХ ИНФЕКЦИЯХВ зависимости от свойств возбудителя, количества микроорганизмов, их способ¬
ности размножаться и противостоять механизмам противоинфекционного иммуни¬
тета исход заболевания определяет прежде всего активность эффекторных факторов
иммунной защиты, играющих при данной инфекции решающую роль. Так, уничто¬
жение возбудителей гнойных инфекций, патогенов, размножающихся внеклеточно,
осуществляют, главным образом, нейтрофильные полиморфноядерные лейкоциты
(табл. 16-21). Нейтрофильные лейкоциты играют решающую роль в уничтожении
большинства капсульных микроорганизмов. Полисахариды капсул, в свою очередь,
угнетают фагоцитарную активность микро- и макрофагов и, таким образом, позво¬
ляют микробам-возбудителям избегать фагоцитоза и гибели в организме хозяина.
Нейтрализовать ингибирующую фагоцитоз активность капсульных полисахаридов
могут антитела к ним. Однако исключительное разнообразие строения капсульных
полисахаридов, даже у микроорганизмов одного и того же вида, затрудняет способ¬
ность антител защищать макроорганизм от различньгх серовариантов возбудителя.
Именно поэтому активность нейтрофильных лейкоцитов и опсонизирующих фак¬
торов сыворотки (антитела, комплемент, С-реактивный белок и др.) определяет
эффективнзто защиту от размножающихся внеклеточно инфектов.Таблица 16-21. Факторы иммунитета, играющие решающую роль в исходе инфекционных забо¬
леванийФакторыпримеры инфекцийГранулоцитыСтафилококковая, стрептококковая, пневмококковая, мвнингококко*
вая инфекции, гонореяМоноциты, антитела и опсониныХламидиозы, риккетсиозы, микоплазменная инфекцияАнтителаТоксикоинфекции (анаэробные, дифтерия, холера)Моноциты, антитела,
Т-лимфоциты, NK-клеткиКандидоз, сифилис, сальмонеллез, листериоз. вирусные инфекцииМоноциты, Т-лимфоцитыТуберкулез, лепра, кокцидиоидоз
54ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯВозбудители группы внеклеточных патогенов с помощью разнообразных меха¬
низмов угнетают фагоцитоз, даже при захвате микроорганизмов фагоцитами
противостоят действию микробицидных факторов лейкоцитов. Так, поверх¬
ностный М-беЛОК и продуцируемые стрептококками А-стрептоЛИЗИНЫ о и S
угнетают фагоцитарную активность лейкоцитов, а лишенные М-белка штаммы
стрептококков отличаются низкой вирулентностью, у некоторых экзотокси¬
нов стафилококков проявляются свойства суперантигенов, они могут активиро¬
вать 5-25% Th-лимфоцитов крови больного. Такая олигоклональная активация
Th-лимфоцитов приводит к гиперпродукции цитокинов и последующей гиперак¬
тивации моноцитов, что клинически выражено симптомокомплексами токсиче¬
ского шока.Антитела и другие опсонины играют важную роль в защите от внеклеточных
возбудителей инфекций, при нейссериальных инфекциях антитела к поверхност¬
ным белкам и капсульным полисахаридам обеспечивают опосредованную компле¬
ментом гибель микроорганизмов. За благоприятный исход пневмоний, бронхитов
и диссеминированных инфекций, вызываемых Haemophilus influenzae, во многом
ответственны антитела против полисахаридных капсул. Чувствительность к инфек¬
ции обратно коррелирует с уровнем бактерицидных антител. Наследственные
дефекты синтеза IgG^ создают условия для возникновения хронических инфекций
респираторного тракта.Многие патогенные микроорганизмы (нейссерии, гемофильная палочка),
чтобы уменьшить антибактериальную активность антител, продуцируют про*
теазы, расщепляющие IgA-молекулы. Псевдомонады вырабатывают эластазу,
которая инактивирует СЗа и С5а, снижая локальное воспаление. Важную роль в
регуляции функциональной активности клеток пограничных тканей и нейтро¬
фильных лейкоцитов крови играют лимфоциты ТЫ 7, продуцирующие IL-17.
Несостоятельность CD4* Thl7 может способствовать высокой чувствительности
больных к возбудителям инфекций и хроническому течению заболевания.Таким образом, при пиогенных и других инфекциях, вызываемых внеклеточно
паразитирующими возбудителями, прогноз развития заболевания и его исход
определены активностью нейтрофильных лейкоцитов, уровнем антимикробных
антител и комплемента и других сывороточных опсонинов. В этих случаях целе¬
сообразно исследовать приведенные факторы иммунной защиты.Вторую группу инфекций составляют риккетсиозы, хламидиозы, легионелле¬
зы, микоплазмозы. Возбудители этих инфекций размножаются внутриклеточно
и, поступая в разных формах из инфицированных клеток в окружающую среду,
инфицируют новые клетки. При заражении защиту от инфекции в местах внедре¬
ния возбудителя осуществляют нейтрофильные лейкоциты. Однако при ее недо¬
статочности возбудитель распространяется и накапливается в соматических клет¬
ках. Уничтожение инфицированных клеток и находящихся в них возбудителей
осуществляют в основном циркулирующие и тканевые макрофаги. Оказавшиеся
в макрофагах возбудители стремятся выжить, подавляя у фагоцитов образование
фаголизосом (риккетсии, хламидии) и продукцию супероксида (хламидии). При
несостоятельности макрофагальной системы возбудители этой группы инфекций
размножаются в фагоцитах. Все это приводит к развитию хронического инфек¬
ционного процесса. Микробные Т-суперантигены способны фиксироваться на
поверхности вспомогательных клеток с помощью HLA-белков И класса и одно¬
временно взаимодействовать с р-полипептидной цепью антиген-распознающих
рецепторов Th-лимфоцитов. Взаимодействие Th-лимфоцитов с Т-суперантигенами
антиген-неспецифично, с каждым Т-суперантигеном могут реагировать 5-
25% клонов Th-клеток. Следствие такой активации — повышенная продукция в
организме Th-цитокинов, которые, в свою очередь, вызывают гиперактивацию с
накоплением у больных провоспалительных цитокинов. Клинически это выраже¬
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 55но синдромом токсического шока. Олигоклональная активация Th-лимфоцитов
может приводить к развитию аутоиммунных процессов (синдром Рейтера) или к
апоптотической гибели активированных лимфоцитов. Свойствами Т-клеточных
суперантигенов обладают не только белки микоплазм, хламидий, иерсиний, но и
пирогенные экзотоксины стрептококков и стафилококков, а также вируса бешен¬
ства и Эпштейна-Барр, цитомегаловируса.Некоторые микробные белки способны взаимодействовать с иммуноглобули¬
нами человека (но не с активным центром антител). Такие белки были названы
В-суперантигенами. Взаимодействуя с фиксированными на соматических клетках
иммуноглобулинами (тучные клетки, базофилы), В-суперантигены активируют
их и стимулируют синтез и высвобождение из этих клеток IL-4, IL-13, которые
обеспечивают дальнейшее развитие аллергического воспаления (например, кра¬
пивницы). Свойствами В-суперантигенов обладают белок gp^^^ ВИЧ, L-протеин
клеточных стенок Peptostreptococcus magnus, А-белок стафилококков. Вирусы гепа¬
тита А, Б, С и Е индуцируют в гепатоцитах синтез и секрецию сиалопротеина FV,
который может взаимодействовать с Н- и L-цепями иммуноглобулинов разных
классов. Связывание FV-белка с фиксированными на тучных клетках и базофилах
IgE приводит к освобождению из клеток гистамина и других медиаторов аллерги¬
ческого воспаления и имитирует развитие у больных аллерген-опосредованных
реакций. Способность возбудителей инфекций продуцировать В-суперантигены
привносит в клиническую картину заболевания симптомы, характерные для
аллергического воспаления.При инфекциях, возбудители которых активно продуцируют экзотоксины
(анаэробные инфекции, дифтерия), течение и исход заболевания зависят от спо¬
собности лимфоидной системы продуцировать антитоксические антитела. Такие
антитела, главным образом класса IgG, нейтрализуют токсины и обеспечивают
благоприятный исход заболевания. Однако формирование антитоксического
иммунитета не гарантирует освобождение макроорганизма от носительства,
поскольку для устранения бактерионосительства необходимо формирование
специфического иммунитета к поверхностным структурам бактерий, ответствен¬
ным за их колонизацию.Спирохеты, некоторые патогенные грибы и бактерии способны паразитировать
как внутриклеточно, так и внеклеточно. Вирусы размножаются только внутри¬
клеточно, но MorjT- длительное время пребывать и снаружи, и внутри клеток, не
оказывая цитопатогенного действия. У некоторых вирусов обнаружены гены,
продукты которых обладают антиапоптотическим свойством и способствуют дли¬
тельной переживаемости инфицированных клеток и продукции вирусных частиц.
В уничтожении возбудителей инфекций этой группы участвует весь арсенал как
врожденных, так и приобретенных факторов иммунной защиты. Значимость
антиген-специфических механизмов противоинфекционного иммунитета возрас¬
тает по мере прогрессирования заболевания, без участия эффекторных антиген-
специфических Th- и Тс-лимфоцитов выздоровление не наступает.Особую группу заболеваний представляют инфекции, хроническое течение кото¬
рых сопровождается образованием гранулем вокруг жизнеспособных возбудителей.
К таким гранулематозным инфекциям относят туберкулез, лепру, кокцидиоидный
микоз и др. Эти инфекции отличает длительная, часто пожизненная персистенция
возбудителей внутри образующихся гранулем. Стенки гранулем образованы эпи-
телиоидными или многоядерными клетками и препятствуют диссеминации воз¬
будителя. Предшественники эпителиоидных клеток гранулем — активированные
макрофаги. Возбудители инфекций, будучи захваченными макрофагами, не поги¬
бают, поскольку способны подавлять образование фаголизосом и противостоять
действию микробицидных агентов в макрофагах. В стенке гранулемы в больших
количествах представлены активированные Thl- и Тс-лимфоциты. Цитокины,
56 ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯпродуцируемые Th^-лимфоцитами (INF-y, IL-12) и макрофагами (IL-12), под¬
держивают высокую активность антиген-специфического Т-клеточного имму¬
нитета и обеспечивают ремиссию заболевания. Несостоятельность макрофагов и
Т-лимфоцитов сопровождается обострением инфекции, диссеминацией возбуди¬
телей и стимуляцией антиген-специфического гуморального иммунного ответа.
Антитела при этом выступают в основном как свидетели контакта иммунной
системы хозяина с возбудителем, не оказывают протективного действия и мало
влияют на течение и исход заболевания. При кокцидиоидном микозе снижение
активности Т-клеточного иммунитета (положительные пробы в реакции повы¬
шенной чувствительности замедленного типа с кокцидоидином) и накопление
циркулирующих антетел против гриба служат предвестниками скорой смерти
больного. При обследовании больных гранулематозными инфекциями прогно¬
стическое значение имеют показатели клеточного иммунного ответа: количество и
активность антиген-специфических Th^- и Тс-лимфоцитов, содержание локальных
и циркулирующих Th^-цитокинов, активность NK-клеток и макрофагов.При острой инфекции первую линию защиты образуют антиген-неспецифические
механизмы иммунитета. Так, при вирусной инфекции активное размножение
вируса обеспечивает быстрое накопление вирусных частиц в крови (виремия),
предшествующее противовирусной реакции иммунной системы. При ранней реак¬
ции иммунной системы характерна активация в инфицированных клетках синтеза
INF-a/p, которые поступают в кровь и обеспечивают защиту еще не инфицирован¬
ных клеток. В эти же сроки в крови накапливаются активированные NK-клетки,
способные к умерщвлению соматических клеток, несущих на своей поверхности
измененные вследствие нападения вирусов HLA-антигены I класса. Накопление в
крови антиген-специфических Тс-лимфоцитов и противовирусных антител наблю¬
дают позднее, их максимальное вовлечение в противовирусную защиту по времени
совпадает с уменьшением виремии или даже с полным исчезновением вируса. При
благоприятном исходе заболевания через 2,5-3 мес после заражения количество
Тс-лимфоцитов в крови снижается до исходного уровня, тогда как противовирус¬
ные антитела могут определяться еще в течение нескольких месяцев.При многих острых бактериальных и вирусных инфекциях антиген-
специфические резидентные и циркулирующие клеточные и гуморальные факторы
обеспечивают устойчивость к заражению, тогда как исход возникшего заболевания
зависит от активности формируемого приобретенного антиген-специфического
иммунного ответа.При вирусном гепатите С и ВИЧ-инфекции хороший прогностический пока¬
затель — накопление в остром периоде заболевания Т-лимфоцитов, специфич¬
ных в отношении многих эпитопов поверхностных и внутренних белков вируса.
Накопление Т-клеток, даже в очень больших количествах, но реагирующих с
ограниченным числом эпитопов белков возбудителя, наоборот, свидетельствуето	недостаточности противовирусной защиты и предвещает хроническое течение
болезни.Высокая иммунная реакция при вакцинации делает организм устойчивым к
заражению. Эффективность вакцинации возрастает, если применяют вакцины,
вызывающие формирование необходимого для данного заболевания клеточного
и/или гуморального иммунного ответа. Современные молекулярно-генетические
вакцины, в которых использ)тотся носители, доставляющие протективные антиге¬
ны и активирующие определенные популяции регуляторных лимфоцитов, откры¬
вают новые возможности для специфической профилактики и лечения инфекци¬
онных заболеваний.Таким образом, при различных заболеваниях и на разных стадиях инфекцион¬
ного процесса прогностическое значение имеют исследования состояния опреде¬
ленных антиген-неспецифических и антиген-специфических факторов иммунной
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ57защиты, а их оценка в динамике позволяет контролировать эффективность прово¬
димой терапии.Активность эффекторных механизмов иммунной защиты при инфекциях может
нарушаться не только вследствие их собственной несостоятельности, но и в
результате дисфункции регуляторных механизмов. Иммунная система располагает
множеством ауторегуляторных механизмов* Существенную роль среди них имеют
регуляторные Th-лимфоциты и дендритные клетки, представляющие им анти¬
гены. Посредством цитокинов и прямыми межклеточными взаимодействиями
Th-лимфоциты обеспечивают развитие антиген-специфического клеточного и/
или гуморального иммунного ответа, а также регулируют активность и участие
в противоинфекционном иммунитете разнообразных антиген-специфических
факторов. Особенности представляющих антиген дендритных клеток и условия
их взаимодействия с Th-лимфоцитами определяют тип первичного иммунно¬
го ответа на соответствующие антигены (клеточный или гуморальный). При
повторном контакте с антигеном в ответе участвуют ранее накопившиеся Thl- или
ТЬ2-лимфоциты памяти. Представление антигена Th-клеткам при вторичном
иммунном ответе может осуществляться не только дендритными клетками, но и
любыми клетками, экспрессирующими белки HLA П класса.Таким образом, при лабораторном обследовании больных инфекционны¬
ми заболеваниями прежде всего необходимо оценить состояние эффекторных
антиген-неспецифических и антиген-специфических механизмов иммунитета,
играющих решающую роль в уничтожении возбудителей данной инфекции. Лишь
после этого исследуют содержание и активность регуляторных клеток и набор
продуцируемых ими цитокинов. Для прогнозирования течения инфекционно¬
го процесса важно не однократное, а мониторинговое обследование больного с
оценкой состояния тех компонентов антиген-неспецифической и/или антиген-
специфической иммунной защиты, которые при данном заболевании на данном
этапе болезни играют решающую роль в уничтожении и выведении из организма
возбудителей инфекции.ГИПЕРИММУННЫЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫБ воспалительных процессах разной этиологии участвуют как антиген-
неспецифические, так и антиген-специфические факторы иммунной защиты.
Обычно иммунный ответ при воспалениях протекает субклинически и обеспе¬
чивает нейтрализацию антигена и удаление его из организма без формирования
клинически выраженных повреждений. В некоторых случаях характер и сила
иммунной реакции на антиген могут не соответствовать патогенетической актив¬
ности антигена, при поступлении в организм абсолютно безвредных антигенов
формирующаяся антиген-специфическая иммунная реакция может приводить к
развитию тяжелых воспалительных процессов, сопровождающихся локальными
и генерализованными повреждениями тканей. Такие варианты гиперергических
воспалительных процессов принято называть иммунными воспалениями. За пато¬
генез таких воспалений ответственны как антитела разных классов, так и эффек¬
торные Т-лимфоциты. Различают четыре типа иммунопатологических процессов,I	тип гиперергических иммунопатологических реакций обязан накапливающимся
у пациентов IgE антителам к антигенам-аллергенам. От иммуноглобулинов дру¬
гих классов IgE отличает высокая цитофильность. IgE фиксируются на клетках,
взаимодействуя с IgE-специфическими Fce-R, Описано два типа таких рецепто¬
ров, отличающихся аффинностью взаимодействия с IgE. Если молекулы антигена
взаимодействуют с фиксированными на клетках несколькими молекулами IgE, то
происходит агрегация рецепторов к IgE, их конформация, активация связанных с
рецепторами протеинтирозинкиназ, которые, в свою очередь, фосфорилируют и
этим активируют внутриклеточные сигнальные молекулы.
58ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯВ развитии IgE-опосредованных реакций гиперчувствительносги I типа разли¬
чают две фазы — раннюю и позднюю. Ранняя реакция развивается сразу после вве¬
дения антигена-аллергена и обязана высвобождению из активированных тучных
клеток гистамина, триптазы и других медиаторов. При локальной аллергической
реакции через 4-6 ч после контакта с аллергеном развивается поздняя фаза реак¬
ции (происходит инфильтрация очага воспаления эозинофилами, нейтрофилами
и, в меньшей степени, моноцитами, лимфоцитами и базофилами). Симптоматика
поздней реакции обязана медиаторам, высвобождаемым из активированных
эозинофилов и других клеток крови. При бронхиальной астме поздняя фаза про¬
должается в течение 1-3 сут. Активированные эозинофилы играют ключевую
роль в симптоматике поздней фазы аллергического воспаления. В это время
количество эозинофилов в инфильтрате достигает 30% всех локально аккумули¬
рованных клеток крови. Под влиянием хемотактического фактора тучных клеток,
цитокинов и других медиаторов эозинофршы активируются, экспрессируют Fc-R к
IgE и IgG, рецепторы к цитокинам, компонентам комплемента и другим медиато¬
рам. Активированные эозинофилы синтезируют и секретируют свойственные им
основные белки, ферменты, цитокины и другие молекулы. Активное вовлечение
эозинофилов в поздней фазе аллергического воспаления I типа придает реакции
некоторые специфические особенности, обязанные повреждению клеток тех
или иных тканей продуктами жизнедеятельности активированных эозинофилов.
Наряду с эозинофилами в патогенезе поздней фазы реакции участвуют нейтрофи¬
лы, количество которых может достигать 30% клеток инфильтрата. Накопление
нейтрофилов обязано хемотактическому действию на них нейтрофильного хемо¬
тактического фактора и IL-8, продуцируемых активированными тучными клетка¬
ми. В свою очередь нейтрофилы становятся источником разнообразных гидролаз,
лейкотриенов, цитокинов и других биологически активных молекул.при бронхиальной астме наблюдаемые на ранней фазе вазодилатация и отек
обязаны гистамину, PGD^ и LTD^; бронхоконстрикция и секреция слизи — LTC^
и PGD2, высвобождаемые, главным образом, при дегрануляции тучных клеток.
Инфильтрация слизистых оболочек бронхов клетками крови в поздней фазе реак¬
ции происходит в результате активации эндотелиальных клеток интерлейкинами
1Ц, TNF-a, LTC^. Миграцию лейкоцитов из сосудов в слизистые оболочки вызыва¬
ют PAF, IL-5, IL-8, LTB^, а активацию клеток в инфильтрате — IL-4, IL-5 и TNF-a.
Источником всех этих медиаторов поздней фазы служат как тучные клетки, так и
активированнь[е эпителиоциты, эндотелиоциты и лейкоциты.Накапливаемые в очагах гиперактивности лимфоциты представлены преиму¬
щественно Т-клетками, причем главным образом ТЬ^-фенотипа. Взаимодействие
активированных В-лимфоцитов с антигеном, опосредованное IgE, фиксирован¬
ными на Fce-RII (CD23), усиливает эндоцитоз антигена и способность В-клеток
представлять антиген Т-лимфоцитам, но угнетает пролиферацию В-клеток и
синтез IgE. Фагоциты активно синтезируют оксид азота при взаимодействии CD23
молекул лимфоцитов с CDll^,^моноцитов.При протеолизе CD23 внеклеточная часть рецептора может циркулировать в
крови в виде солюбилизированного sFce-RII, который сохраняет способность вза¬
имодействовать с CD21 и mIgE на мембране В-лимфоцитов, Такое взаимодействие
стимулирует пролиферацию В-клеток, в особенности клонов клеток, продуци¬
рующих IgE. Таким образом, сигналы, подаваемые клеткам через низкоаффинные
рецепторы к IgE, оказывают регуляторное воздействие на лимфоциты и клетки
фагоцитарной системы.Опосредованная IgE гиперреактивность клинически может проявляться в
виде локальных и генерализованных патологических процессов. Пример генера¬
лизованной реакции I типа — анафилактические реакции. IgE-опосредованные
анафилактические реакции возникают в результате взаимодействия с антигеном-
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ59аллергеном имеющихся у пациентов IgE-антител против некоторых медикаментов,
чужеродной сыворотки крови, морских продуктов, орехов, яда пчел, продуктов
ужаливания ос, шершней, москитов, и т.д. Генерализованные анафилактические
реакции характеризуются сосудистым коллапсом, изменением тонуса гладкой
мускулатуры бронхов, сосудов, сфинктеров, отеками и в случае запоздалого или
неправильного лечения могут привести к летальному исходу.Примерами локальных IgE-опосредованных гиперергических реакций I типа
могут служить атопические риниты, бронхиальная астма, экзема, пищевая аллер¬
гия. Антигенами (аллергенами), вызывающими при этих заболеваниях продукцию
антител класса IgE, выступают белки и ферменты пыльцы растений, некоторые
экзотические пищевые продукты, метаболиты малопатогенных грибов и микро¬
организмов, белки насекомых и др. Накапливаемые IgE фиксируются на Fce-RI
тучных клеток, особенно в пограничных тканях. При повторном поступлении
антигена через кожу и слизистые оболочки дыхательных путей и пищеварительно¬
го тракта аллергены взаимодействуют с фиксированными на тучных клетках IgE,
что приводит к активации и дегрануляции тучных клеток.Иммунное воспаление II типа обязано накоплению в организме антетел, спо¬
собных запускать процессы цитотоксического повреждения собственных клеток
организма. Примерами такого типа иммунных повреждений могут служить лекар¬
ственная гемолитическая анемия и посттрансфузионные реакции при переливании
несовместимых эритроцитов. Некоторые антибиотики (бензилпенициллин, стреп¬
томицин, цефалоспорины) в организме адсорбируются на эритроцитах, вызывая
против себя гуморальный иммунный ответ с продукцией антител класса IgM и
IgG. Антитела взаимодействуют с лекарственным препаратом на поверхности эри¬
троцитов, образовавшиеся иммунные комплексы фиксируют и активируют белки
системы комплемента. В результате происходит опосредованный комплементом
лизис эритроцитов (гемолитическая анемия). Повторный контакт пациента с
теми же или антигенно сходными веществами поддерживает сформировавшийся
иммунно-патологический процесс.Антигены, аналогичные группоспецифическим антигенам эритроцитов, часто
присутствуют у микроорганизмов кишечника человека. Против них у человека
вырабатываются антитела, чаще класса IgM, взаимодействующие с группоспе-
цифическими антигенами эритроцитов. Против антигенов собственных эри¬
троцитов, даже если микроорганизмы кишечника несут аналогичные антигены,
иммунный ответ не развивается, сохраняется иммунологическая толерантность.
При переливании эритроцитов несовместимой группы крови циркулирующие изо¬
гемагглютинины пациента взаимодействуют с ними и обеспечивают комплементо-
посредованный гемолиз. Повторные трансфузии могут усиливать иммунный ответ
и стимулировать накопление изогемагглютининов класса IgG.Клинически посттрансфузионные реакции могут развиваться немедленно или
отсроченно — через 2-6 сут. Немедленные реакции обычно обязаны анти-АВО
группе-специфическим IgM антителам. Отсроченные реакции обычно связаны с
иммунным ответом против других эритроцитарных антигенов и обеспечиваются
изогемагглютининами класса IgG. При немедленных реакциях лизис эр^ггроцитов
происходит в просвете сосудов, сопровождаясь гемоглобинурией и накоплением в
крови свободного гемоглобина. Отсроченные реакции, в которых участвуют анти-
эритроцитарные антитела класса IgG, менее активно связывают комплемент, чем
антитела IgM, поэтому лизис эритроцитов не бывает столь катастрофическим и
может сопровождаться фагоцитозом частично поврежденных эритроцитов во вне-
сосудистых пространствах. Гемолитическая болезнь новорожденных, развивающа¬
яся в результате вынашивания резус-негативной матерью резус-положительного
плода, также обязана антиэритроцитарньш антителам класса IgG.шш%ш
60ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯТретий тип иммунопатологических процессов формируется в результате образо¬
вания в организме иммунных комплексов «антиген-антитело», Б зависимости от
массы, размера агрегируемых в комплексы молекул, а также от места депонирова¬
ния комплексов в организме могут развиваться локальные или генерализованные
патологические процессы. Антитела в иммунных комплексах способны фиксиро¬
вать и активировать белки системы комплемента, приводить к гиперпродукции
СЗа, С4а, С5а, С5Ь и других субкомпонентов комплемента. Некоторые из этих
продуктов обладают активностью анафилотоксинов и способны повышать про¬
ницаемость сосудов, другие активируют эндотелиоциты и оказывают хемотакси-
ческое и активирующее действие на нейтрофильные лейкоциты, в результате зоны
фиксации иммунных комплексов оказываются инфильтрированными нейтрофи¬
лами, которые, в свою очередь, фагоцитируют иммунные комплексы, выделяют в
окружающую среду гидролитические ферменты и цитотоксические продукты. При
поступлении антигена через пограничные ткани иммунные комплексы образуются
в субмукозном и дермальном слое, так что активация там комплемента приводит к
вовлечению в патологический процесс тучных клеток.Циркулирующие иммунные комплексы могут оседать на базальных мембранах
кровеносных сосудов и гломерул почек. Более мелкие по размерам иммунные
комплексы проникают через базальные мембраны и локализуются в суббазальных
слоях. При фиксации иммунных комплексов базальные мембраны подвергаются
атаке активированными нейтрофилами и комплементом. Это приводит к повреж¬
дению как клеток базальных мембран, так и близлежащих тканевых клеток.
Активация комплемента может индуцировать агрегацию тромбоцитов, высвобож¬
дение факторов свертывания крови и образование микротромбов.Подкожное или внутрикожное введение антигена, против которого присутству¬
ют циркулирующие антитела в высоких титрах, сопровождается образованием в
месте введения иммунных комплексов с развитием в течение 4-6 ч местного вос¬
паления (феномен Артюса). Тяжесть воспаления может варьировать от локальной
гиперемии и отека до некроза тканей, Піперергическая реакция типа феномена
Артюса может развиться в легких при поступлении антигенов (споры грибов и
бактерий, протеины животных и птиц) с вдыхаемым воздухом, В этом случае
воспаление затрагивает альвеолы и приводит к развитию аллергического альвео-
лита.Поступление в кровь антигена вызывает образование в больших количествах
циркулирующих иммунных комплексов. Циркулирующие комплексы антиген-
антитело накапливаются на синовиальных мембранах суставов, в стенках сосудов
и гломерул ах почек. Клинические проявления — васкулиты, артриты и гломеру¬
лонефриты. В качестве антигенов, вызывающих продукцию антител в высоких
титрах и образование иммунных комплексов, выступают микроорганизмы, про¬
стейшие, аутологичные и чужеродные белки и нуклеиновые кислоты. Именно
поэтому генерализованные иммунопатологические процессы ПІ типа характерны
для аутоиммунных заболеваний (системная красная волчанка, ревматоидный
артрит), лекарственной аллергии (например, к бензатина бензилпенициллину и
сульфаниламиду), инфекционных заболеваний (гепатиты, инфекционный моно¬
нуклеоз, менингит, малярия) и сывороточной болезни. Сывороточная болезнь
развивается у пациентов, которым с лечебной целью вводили лошадиные имму¬
ноглобулины против микробных токсинов. Внутримышечно введенные белки
чужеродной сыворотки поступают в кровь, где взаимодействуют с имеющимися
или вновь синтезируемыми антителами. В последнем случае заболевание может
развиться через 6-14 сут после пассивной иммунизации пациента. Для сыворо¬
точной болезни характерны повышение температуры, лимфоаденопатия, эритема,
артриты, генерализованные васкулиты и отеки, иногда гломерулонефриты.
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ 81В отличие от предыдущих вариантов иммунопатологических процессов, IV тип
гиперреактивности обязан формированию в организме клеточного иммунного
ответа против антигена, в частности накоплению антиген-специфических Thl- и	.CD8' Тс-лимфоцитов. В местах повторного поступления в организм антигена
накапливаются и активируются иммунные антиген-специфические Т-лимфоциты.
Активированные Thl клетки продуцируют и секретируют IL-2, IFN-y, факторы,
ингибирующие миграцию макрофагов, и другие цитокины. Под влиянием цито¬
кинов в очаге накапливаются и активируются макрофаги, в свою очередь секрети¬
рующие ферменты, N0, цитотоксические продукты и др. медиаторы воспаления.
Высвобождение этих продуктов приводит к локальному повреждению и некрозу
клеток тканей. Эта иммуновоспалительная реакция развивается через 48-72 ч,
поскольку требуется время для инфильтрации места введения антигена иммун¬
ными лимфоцитами и моноцитами и для их активации. В отличие от гиперерги¬
ческих реакций III типа, в патогенезе которых участвуют нейтрофилы, реакции
IV типа обязаны в основном мононуклеарным клеткам. Реакции IV типа имеют
особое значение в защите организма от внутриклеточно размножающихся микро¬
организмов, вирусов и паразитов. В случае если макрофаги и Тс-лимфоциты не в
состоянии уничтожить инфицированные клетки и самих возбудителей, моноциты
в очаге могут трансформироваться в эпителиоидные клетки (основной клеточный
элемент гранулем).Гиперергические реакции IV типа лежат в основе патогенеза контактных
дерматитов, развивающихся в результате повторных контактов пациентов с
различными химическими веществами и растительными белками (формаль¬
дегид, тринитрофенол, никель, лаки для волос, компоненты косметических
средств и др.). Будучи малыми молекулами, эти вещества поступают транс-
кутанно, образуют комплексы с белками кожи, захватываются дендритными
и другими иммуно-вспомогательными клетками и вызывают Т-клеточную
антиген-специфическую иммунную реакцию. Повторное поступление этих
молекул в организм вызывает инфильтрацию места их введения иммунными
Т-лимфоцитами и макрофагами.При внутрикожном введении антигена развитие замедленной (через 24-96 ч)
гиперергической реакции свидетельствует о наличии у пациента антиген-
специфических Т-лимфоцитов, т.е. пациент ранее уже имел контакт с соот¬
ветствующим антигеном и ответил на него клеточной иммунной реакцией.
Внутрикожные тесты с микробными белками используют в клинике для выяв¬
ления инфицированных ими ранее иммунизированных пациентов и для оценки
антиген-специфического клеточного иммунитета у больных.АЛГОРИТМ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУННОЙ
СИСТЕМЫОбъем и качество иммунологического лабораторного обследования больных
должны быть достаточными для подтверждения диагноза, прогнозирования раз¬
вития заболевания и контроля эффективности проводимой терапии.Наиболее широко диагностические иммунолабораторные тесты используют для
выявления в биологических материалах от больных патогенетически значимых
антигенов или для оценки специфической реакции иммунной системы пациента
(накопление антиген-специфических лимфоцитов и антител на такие антигены,
как опухолевые, трансплантационные, аллергены, рецепторы, гормоны и др.).При первичном контакте с инфекционным антигеном в крови пациентов нака¬
пливаются антитела - IgM. При повторном контакте с инфекционным агентом
накапливаемые в крови антитела — IgG,
щЩй62ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯМетоды определения антигенов и антител к ним отличаются исключительно
высокой специфичностью и чувствительностью, что позволяет в биологических
материалах выявлять исследуемые молекулы, представленные в пико- и нанограм-
мовых количествах. Простота и относительная дешевизна серологического обсле¬
дования больных обеспечили в современной клинике широкое распространение
лабораторных методик. Динамика накопления в крови антител к различным анти¬
генам возбудителей инфекций позволяет прогнозировать течение заболевания и
его исход.Наиболее трудоемко и объемно исследование состояния и диагностика заболе¬
ваний самой иммунной системы. Алгоритм проведения таких исследований опре¬
деляют клиническая картина заболевания и симптомокомплексы, характерные
для тех или иных нарушений функций иммунной системы. На первом этапе таких
обследований целесообразны скрининговые исследования, позволяющие выявить
количественные и качественные отклонения в состоянии основных компонентов
врожденного и приобретенного иммунитета больного (табл. 16-22).Таблица 16-22. Скрининговые иммуно-лабораторные тесты в диагностике нарушений иммунной
системыКомпоненты иммун¬
ной системыТестыСистема комплементаОпределение активности комплемента в свежей сыворотке крови (СН^„)Фагоцитарная системаОпределение в крови содержания и морфологическая характеристика моноцитов
и гранулоцитов разного типа (нейтрофильные, эозинофильные, базофильные)Естественные килле¬
ры (NK-клетки)Определение содержания в крови NK-клетокСистемаТ-лимфоцитовОпределение в периферической крови содержания Т-лимфоцитов и их субпопуля-
ций с маркерами; CD3*, С04* и CD8*СистемаВ-лимфоцитовОпределение в периферической крови содержания В-лимфоцитов. Определение
в крови концентрации IgM, IgG, IgA и fgE. Определение в периферической крови
содержания изогемагглютининов, антител, специфичных к антигенам вакцин,
ранее использованных для иммунизации пациента, а также циркулирующих
иммунных комллексовПо данным клиник США, эффективность скрининговых исследований заболева¬
ний иммунной системы достигает 75%, при этом стоимость их проведения и трудо¬
вые затраты намного ниже, чем при осуществлении дополняющих исследований.Иммунная система рано реагирует на самые разнообразные, особенно неблаго¬
приятные воздействия на организм. Именно поэтому у больных степень участия
в реакции отдельных врожденных или приобретенных компонентов иммунной
защиты способствует постановке диагноза и прогнозированию развития патоло¬
гического процесса (табл. 16-23).Таблица 16-23. Факторы иммунитета, исследуемые при различных клинических проявлениях
нарушений иммунной системыЗаболеванияФакторы врожденного иммунитетаФакторы антиген-специфического
(адаптивного) иммунитетаклеточныегуморальныеклеточныегуморальныеВирусныеинфекцииСодержание в крови
NK-клеток и моно¬
цитовСодержание в крови
интерферонов и
неоптериновСодержание 8 крови
лимфоцитов, субпопу¬
ляций Т-лимфоцитое;
исследование мар¬
керов активации
Т-клеток и проли-
феративного ответа
Т-лимфоцитов ка
митогены и антигеныСодержание
IgM, !gG, ІдАи
антивирусных
антител
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ63Продолжение табл. 16-23ЗаболеванияФакторы врожаеннаго иммунитетаклеточныегуморальныеФакторы антиген-специфического
(адаптивного) иммунитетаклеточныегуморальныеБактериальныеинфекцииСодержание и
морфология ней¬
трофилов, моно¬
цитов, фагоцитарная
активность нейтро¬
филов {хемотаксис,
бактерицидность),
признаки активации
нейтрофилов (хеми-
люминесценция, НСТ-
тест); исследование
адгезинпозитивных
клеток (CD11/CD18)Гемолитическая актив¬
ность комплемента,
содержание СЗ и С4,
опсонизирующая
активность сыворотки
крови; содержание в
крови и биоматериа¬
лах провоспапитель-
ных и антивоспали-
тельных цитокинов,
прокальцитонииа,
дефензиновСодержание в
крови лимфоцитов,
Т-лимфоцитов разных
субпопуляций; иссле¬
дование маркеров
активации Т-клеток
и пролиферативного
ответа Т-лимфоцитов
ка митогены и анти¬
гены: содержание
В-лимфоцитовСодержание в
крови IgM, IgG:
IgA; субклассов
IgG. изогемаг¬
глютининов и
антибактериаль¬
ных антителМикотическиеинфекцииСодержание в крови
нейтрофилов, моно¬
цитов и МКТ-клеток;
фагоцитарная актив¬
ность нейтрофилов
(хемотаксис, бактери-
цидность), признаки
активации нейтрофи¬
лов (хемилюминес-
ценция, НСТ-тест)Содержание в крови
дефензинов, гемо¬
литическая актив¬
ность комплемента,
содержание СЗ и С4.
опсонизирующая
активность сыворотки
крови; содержание
провоспалительных
цитокинов в биома¬
териалеСодержание в
крови лимфоцитов.
Т-лимфоцитов разных
субпопуляций; иссле¬
дование маркеров
активации Т-клеток
и пролиферативного
ответа Т-лимфоцитов
на митогены и анти¬
геныСодержание
антител и имму¬
ноглобулинов
разных классовПаразитарныеинфекцииСодержание в крови
эозинофиловСодержание в крови
эозинофильных про¬
теиновСодержание в крови
лимфоцитов, субпопу-
ляций Т-лимфоцитов,
маркеры активации
Т-клетокСодержание
IgM, IgG, IgA;
содержание в
крови общего
и антиген-
специфического
IgEАллергическиезаболевания*Содержание в крови
и биоматериалах
эозинофилов, базо-
филов, аллерген-
индуцированная
активация-
дегрануляция базо-
филовСодержание в крови
и биоматериалах и
освобождение из кле¬
ток медиаторов аллер¬
гического воспаления
(гистамин, триптаза,
эйкозаноиды, основ¬
ные белки эозинофи¬
лов, цитокины — 1-4,
11-5,11-13)Содержание в
крови лимфоцитов,
Т-лимфоцитов разных
субпопуляций;иссле¬
дование маркеров
активации Т-клеток
и пролиферативного
ответа Т-лимфоцитов
на митогены и аллер¬
геныСодержание в
крови общего
и антиген-
специфического
IgEАутоиммуннаяпатологияСодержание ней¬
трофилов (нейтро-
филез — признак
острой фазы вос¬
паления, нейтро¬
пения — признак
аутоиммунного пора¬
жения нейтрофилов)Гемолитическая актив¬
ность комплемента,
содержание СЗ и С4
компонентов компле¬
мента; содержание
цитокиновСодержание в
крови лимфоцитов,
Т-лимфоцитов разных
субпопуляций; иссле¬
дование маркеров
активации у Т-клеток
и пролиферативного
ответа Т-лимфоцитов
на митогены и специ¬
фические антигеныСодержание
антител к раз¬
нообразным
аутоантигенам;
исследование
циркулирующих
иммунных ком¬
плексов
64ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯОкончание табл. 16-23ЗаболеванийПролифера-
тивные заболе¬
ванияФатгоры врожденного иммунитетаклеточныеСодержание эозино¬
филов, нбйтрофипов,
моноцитов; имму-
нофенотипироеание
лейкоцитовгуморальныеСодержание опухоле¬
вых маркеров в био¬
логическом материалеФакторы антиген-ояе14ифического
(адаптивного) иимрипгетаклеточныеСодержание в крови
лимфоцитов. Т- и
6-лимфоцитов и их
субпопуляций,иссле¬
дование маркеров
активации, проли¬
феративного ответа
лимфоцитов на мито¬
гены и специфические
антигены: иммунофе-
нотипированиегуморальныеСодержание
иммуноглобули¬
нов, М-протеина
и парапротеинов
8 крови; иссле¬
дование белка
Бенс-Джонса е
моче*	Для диагностики аллергических заболеваний также оценивают реакции больного на различные
аллергены.О вовлечении иммунной системы в острый процесс можно судить уже при рас¬
смотрении результатов общего клинического анализа крови. На это указывает
увеличение в крови количества полинуклеарных лейкоцитов, повышение доли
юных клеток и ускоренная реакция оседания эритроцитов. Повышение в крови
содержания С-реактивного белка и других белков острой фазы, лизоцима, про-
кальцитонина также указывает на острое воспаление, причем накопление в крови
прокальцитонииа особенно характерно для системных бактериальных инфекций
и бактериального сепсиса.На вирусную природу острого воспаления указывает увеличение в крови содер¬
жания NK-клеток и моноцитов, при котором моноциты отвечают на вирусы еще и
накоплением в крови неоптерина. Хронические инфекции, в особенности вызыва¬
емые внутриклеточно размножающимися микроорганизмами или возбудителями
гранулематозных инфекций, также сопровождаются активацией и накоплением
моноцитов.При наличии у больных симптомокомплексов, характерных для нарушений
приобретенного иммунитета, лабораторное обследование больных начинают со
скрининговых исследований, включающих оценку у больного общего количества
лимфоцитов, а также исследование содержания Т- и В-клеток. На скрининговом
уровне достаточно исследовать в крови у больных содержание Т-клеток с фено¬
типическими маркерами CD3*, CD4~ (хелперные и регуляторые клетки), CD8*
(цитотоксические клетки).О	состоянии В-клеточного звена иммунитета можно судить косвенно по содер¬
жанию в сыворотке крови обследованных иммуноглобулинов, изогемагглютини¬
нов и антител к антигенам вакцин, ранее вводимых обследуемому.Для уточнения причин и механизмов нарушения функций иммунной систе¬
мы больного необходимо проведение аналитических диагностических тестов.
Анализы этого уровня предполагают оснащение лаборатории оборудованием и
обеспечение реагентами, позволяющими в автоматическом режиме исследовать
клетки крови больного по многим показателям и осуществить функциональные
тесты, оценивающие активность соответствующих клеток.Аналитические исследования позволяют оценить у больного не только содер¬
жание клеток определенного фенотипа, охарактеризовать их функциональную
активность, но и определить состояние центральных органов иммунной системы
и ассоциированной со слизистыми оболочками лимфоидной ткани (выход в кровь
наивных Т- и В-лимфоцитов) (табл. 16-24).
ЛАБОРАТОРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ65Таблица 16-24. Аналитические тесты в диагностике нарушений иммунной системыПоказателиТестыСистема ком¬
плементаОпределение в сыворотке крови содержания и активности компонентов комплемента
(в особенности СЗ и С4) и ингибиторов комплемента (С..,)ШФагоцитарнаясистемаИсследование микробицидной активности нейтрофилов и мононоцитов в крови;
качественное и количественное исследование восстановления гранулоцитами и моно-
ноцитами (НСТ-тест); количественное исследование отдельных этапов фагоцитарной
активности лейкоцитов (подвижность и хемотаксис, адгезия, захват, образование фаго¬
лизосом, внутриклеточный киллинг, дегрануляция); исследование в очагах воспаления
и в крови цитокинов — эффекторов и регуляторов воспаления; исследование аллерген-
индуцированного высвобождения гистамина или лейкотриенов базофилами крови;
исследование в крови эозинофильных протеинов (основного эозинофильного белка,
катионного нейротоксина, эозинофильной пероксидазы, эозинофильного катионного
белка)				Естественныекиллеры(NK-клетки)Исследование общего количества NK-клеток и отличающихся вьюокой цитотоксичностью
по отношению к клеткам миелоидной линии К-562 (CD\b*bhght CD56'rtm), или активно
продуцирующих цитокины (CD16'rf/n7 CD56^brigh)		СистемаТ-лимфоцитовОпределение в периферической крови содержания субпопуляций С04^ и С08^ Т-клеток,
различающихся функционально (активированные, наивные, иммунные, зрелые, незре¬
лые, памяти, апоптотические, с антигенраспознающими рецепторами типов у6 и а|3
и др.); исследование содержания регуляторных Т-клеток (CD4", CD25*, foxp^), Тг, клеток,
Th1, Th2, Th17 и др. субпопуляций); исследование функциональной активности Т-клеток
крови и их субпопуляций (пролиферативная шивность, продукция цитокинов, цитоток¬
сическая активность и др.); исследование содержания и функциональной активности
антйгенореактивных (в том числе аутореактивных) Т-лимфоцитов периферической крови;
исследование в крови определенных цитокинов и растворимых цитокиновых рецепторовСистемаВ-лимфоцитовОпределение в периферической крови содержания функционально отличающихся
субпопуляций В-лимфоцитов (наивные, иммунные, активированные, зрелые, незрелые,
памяти, апоптотические, несущие поверхностнью иммуноглобулины разных классов);
исследование функциональной активности В-лимфоцитов, парапротеинов и криоглобули¬
нов; определение в сыворотке крови содержания IgG и IgA разных субклассов. аллерген-
специфических IgE; определение в секретах и смывах содержания секреторного IgA и
иммуноглобулинов иных классов				При углубленном (аналитическом) исследовании лимфоидной системы оцени¬
вают содержание в крови наивных и иммунных, покоящихся и активированных
клеток, хелперных, регуляторных и цитотоксических лимфоцитов, долгоживущих
клеток памяти и клеток, реализующих программу апоптоза.При лабораторном исследовании лимфоидной системы возможно не только
определить содержание соответствующих клеток в крови и других биоматериалах,
но и оценить выраженность экспрессии на клетках соответствующих маркеров.
Оба этих показателя исследуют при анализе пула клеток с помощью набора моно¬
клональных антител против мембранных молекул клеток с использованием про¬
точного цитофлюориметра.Уточнение причин и механизмов врожденной и приобретенной несостоятельно¬
сти иммунной системы больного может потребовать постановки in vitro функцио¬
нальных клеточных тестов, в которых оценивают способность различных клеток
иммунной системы реагировать на митогены, антигены и др. агенты, активируясь,
пролиферируя и дифференцируясь, продуцируя цитокины, хемокины, адгезивные
молекулы и экспрессируя разнообразные рецепторы к ним.
Глава 17
Диагностика ариммунных
заболеванийКРИТЕРИИ, КЛАССИФИКАЦИЯ И ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙВедущий патогенетический механизм развития аутоиммунных
заболеваний - иммунный ответ по отношению к компонентам нор¬
мальной человеческой ткани и органов. Для классификации ауто¬
иммунных процессов применяют медико-биологические критерии
(табл. 17-1), но их сложно использовать в клинической практике,
поскольку для их понимания требуется большой объем научныхТаблица 17-1. Основы критериев аутоиммунных заболеваний (Rose-Bona,1993)	Прямые свидетельства	Антитело-опосредованные	•	Аутоантитело в крови, влияющее на функции органа	’ Аутоантитело, фиксированное в ткани	«Иммунный комплекс, локализованный в ткани	•	Воспроизведение заболевания при пассивном переносе lg		Клеточно-опосредованные	•	Перенос Т-клеток в SCID-мышь с тканевым имплантатом	»Цитотоксичность аутоагрессивных Т клеток in vitro		Непрямые свидетельства	Экспериментальная иммунизация	Иммунизация антиидиотипическим антителом	Экспериментальная дизрегуляция иммунной системы у животных		Дополнительные свидетеяьства	Аутоантитела в крови	Ассоциация с другими аутоиммунными заболеваниями	Ассоциация с Н1А-генотипом	Лимфоцитарная инфильтрация органа	Ответ на иммуносупрессивную терапию	Примечание. SCID — severe combined irnmmod^dency (англ. — «тяжелый комби¬
нированный иммунодефицит»).данных, В то же время аутоиммунные заболевания (АИЗ) обладают
рядом четких клинических характеристик, к которым относятся
следующие:
*ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ67❖	процессы неизвестной этиологии с хроническим системным/локальным вос¬
палением;❖	возникают у лиц с набором генов иммунного генеза (генов системы HLA);
заболевания поддаются терапии иммуносупрессивными препаратами;❖	в крови и биологических жидкостях обнаруживают аутоантитела.
Аутоантитела, направленные против собственных молекул организма, зачастуюне связаны с непосредственным повреждением ткани. Чаще всего они являются
«свидетелями» аутоиммунного процесса. Поэтому определение аутоантител при
аутоиммунных заболеваниях служит важным инструментом в установлении и
последующем ведении потенциальных пациентов. Особое значение приобретает
обнаружение аутоантител на ранних этапах заболевания, когда морфологические
признаки разрушения ткани еще отсутствуют.Наиболее известная классификация подразделяет АИЗ на органонеспецифи¬
ческие и органоспецифические (табл. 17-2). Специфические АИЗ поражают кон¬
кретные органы или ткани, это происходит при тиреоидите Хашимото или сахар¬
ном диабете I типа. Органонеспецифические иммунные реакции могут поражать
несколько систем органов, как это происходит при ревматических заболеваниях.
В последнем случае нередко клиницисты определяют аутоиммунный ответ как
«системный», примером которого служит системная красная волчанка (СКВ).Таблица 17-2. Классификация аутоиммунных заболеванийОрганоспецифические заболеванияРассеянный склероз
Зоб Хашимото
Первичная микседема
Тиреотоксикоз (болезнь Грейвса)Пернициозная анемия
Первичный билиарный цирроз
Аутоиммунный гепатит
Сахарный диабет I типа
Болезнь Крона
Язвенный колитАутоиммунная гемолитическая анемия
Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпураОрганонеспецифические заболеванияСистемная красная волчанка
Гранулематоз Вегенера
СклеродермияСмешанное заболевание соединительной ткани
Дермато миозит
Ревматоидный артритПо мере понимания механизмов развития аутоиммунных заболеваний эта клас¬
сификация постепенно утрачивает свое значение, так как не отражает современно¬
го представления об АИЗ.АИЗ относят к редким патологиям, хотя их встречаемость достигает 10-20%
всех общетерапевтических заболеваний. К частым АИЗ, которые поражают
0,1-1% популяции, относят диффузный токсический зоб, тиреоидит, ревмато¬
идный артрит, аутоиммунный гастрит, псориаз. Более редкие АИЗ встречаются
у 0,001-0,01% популяции: системные ревматические заболевания, первичные
гломерулонефриты, рассеянный склероз, витилиго, миастения, аутоиммунные
заболевания печени, аутоиммунная тромбоцитопения, пернициозная и гемоли¬
тическая анемия, инсулин-зависимый диабет, саркоидоз, идиопатические увеиты.
Ряд клинических синдромов с классическим аутоиммунным патогенезом отме¬
чают менее чем у 0,001% населения. Последняя группа представлена болезнью
Аддисона, синдромом Гудпасчера, синдромом Гийена-Барре.АИЗ могут возникать в любом возрасте, хотя для каждой нозологической формы
имеются свои пики заболеваемости. Отдельно выделяют синдромы, которые воз¬
68 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙникают у новорожденных от матерей с АИЗ, обусловленные трансплацентарным
переносом патогенных аутоантител из организма матери. К таким транзиторным
состояниям относят врожденный гипертиреоз, неонатальную миастению и неона¬
тальную красную волчанку. Примечательно, что женщины чаще болеют АИЗ,
составляя, по разным оценкам, более 75% всех больных. Несмотря на множество
существующих теорий, причина выраженной половой предрасположенности оста¬
ется малопонятной.Определение термина «аутоантитело» и роль аутоантител
при аутоиммунных заболеванияхДать строгое определение термину «аутоантитело» далеко не так легко, как
кажется. Это связано с тем, что как направленность аутоиммунной реакции,
вызывающей синтез аутоантител, так и методы обнаружения аутоантител имеют
ряд условностей. С иммунологической точки зрения, «аутоантителами» являются
иммуноглобулины человека, способные специфически связывать антигенные эпи¬
топы молекул собственного организма. Иммунный ответ, который лежит в основе
этой реакции, направлен на антигены вирусов, бактерий, экзогенных веществ, а
эпитопы собственных молекул становятся мишенями лишь в силу антигенного
сходства. Таким образом, сложно точно отделить аутоиммунный ответ от есте¬
ственных реакций иммунной системы.Данный парадокс еще больше усложняется тем фактом, что для обнаружения
аутоантител в лаборатории в большинстве случаев используют антигены, отли¬
чающиеся от антигенов человеческого происхождения. Так, в качестве антиген¬
содержащего субстрата применяют ткани или очищенные антигены животных,
перевиваемые клеточные линии и рекомбинантные белки, полученные на основе
человеческих генов в различных системах экспрессии белка. По своей антигенной
структуре рекомбинантные антигены значительно отличаются от нативных белков
тканей человека. Это обусловлено их третичной структурой, гликозилированием,
а также присутствием аминокислотных последовательностей для эффективного
синтеза белка и его очистки. Именно поэтому одновременно с «аутоантителами»
при применении иммунологических методов часто определяют и иммуноглобу¬
лины, реагирующие с чужеродными эпитопами. Более совершенным подходом
при выявлении аутоантител считают использование модельных «дизайнерских»
антигенов, структура которых основана на изучении иммунодоминантных моле¬
кул аутоантигенов человека. В этом случае они могут сильно отличаться от
исходных мишеней. Наиболее революционным примером служит создание цикли¬
ческого цитруллинированного пептида для диагностики ревматоидного артрита.
Используемый в качестве антигена цитруллиновый пептид был выбран в ходе
скрининга слз^айных пептидных библиотек, которые не имели ничего общего с
исходной последовательностью белка филлагрина, изучение которой позволило
установить характеристики иммунодоминантного эпитопа антицитруллиновых
антител. Для создания тест-системы все шире используют рекомбинантные
модельные белки, аминокислотная последовательность которых состоит из чере¬
дования иммунодоминантных эпитопов антигена, Б этом случае серологическая
реакция иммуноглобулина человека с таким «модельным» исскусгвенным анти¬
геном уже не является аутоантителом в полном смысле этого слова. Поэтому
термин «аутоантитело» подразумевает определенную «серологическую» реакцию,
присущую тому или другому аутоиммунному заболеванию. Результат этой серо¬
логической реакции зависит от используемых лабораторных методов, каждый из
которых имеет свои особенности и ограничения.
ДИАГН ОСТИКА АУТОИ М МУНН ЫХ ЗАБОЛ ЕВАНИЙ 69Благодаря тому, что аутоантитела связываются с молекулами сходной структу¬
ры или молекулами в составе одной ткани, клетки, органеллы или молекулярного
комплекса, их подразделяют на семейства. В большинстве случаев АИЗ, сопро¬
вождающиеся образованием аутоантител одного семейства, имеют сходную кли¬
ническую симптоматику и патогенез. Например, семейство антител к антигенам
цитоплазмы нейтрофилов направлено на разнородные по структуре и свойствам
белки гранул цитоплазмы лейкоцитов. В то же время большинство конкретных
разновидностей аутоантител этого семейства встречаются при системных васку¬
литах. Наличие аутоантител на фоне АИЗ указывает на участие аутоантител в
механизмах аутоиммунной реакции. Однако прямое участие аутоантител в раз¬
витии патофизиологических процессов, характерных для данного АИЗ, не всегда
представляется доказанным. В таком случае принято говорить об аутоантителах
как «свидетелях» иммунологических реакций.Большинство разновидностей аутоантител сравнительно часто может быть
обнаружено у клинически здоровых лиц. к аутоантителам, которые могут стать
случайной находкой у клинически здоровых лиц, относят антинуклеарный фактор
(3%), ревматоидный фактор (3%), антитела к тиреопероксидазе (4%), антитела
к кардиолипину (1%), антитела к миокарду (5%), антитела к скелетной муску¬
латуре (3%). Частота встречаемости многих аутоантител нарастает с возрастом.
Аутоантитела образуются на фоне инфекций, травмы и при новообразованиях,
которые не сопровождаются аутоиммунными проявлениями. В этом случае ауто¬
антитела могут нести самостоятельную иммунную функцию, например участво¬
вать в клиренсе тканевых антигенов. Антинуклеарный фактор часто диагностиру¬
ют при болезни «трансплантат против хозяина» и солидных опухолях, что можно
объяснить аллоиммунным или противоопухолевым иммунным ответом. Это
доказывает, что в определенном смысле аутоантитела — компонент естественного
ИММЗТ1НОГО ответа, участвующий в удалении из системы циркуляции «состарен¬
ных» белков.Высокое содержание аутоантител не всегда сопровождается высокой клиниче¬
ской активностью АИЗ. Это указывает на то, что ряд характеристик аутоантител,
в том числе аффинность, количество, присутствие тканевого воспаления и других
реакций иммунной системы, крайне важны для проявления патогенетического
действия аутоантител. С другой стороны, при АИЗ может наблюдаться ситуация,
при которой антитела постепенно исчезают из сыворотки с увеличением длитель¬
ности болезни. Так, антитела к островковым клеткам поджелудочной железы у
большинства больных сахарным диабетом I типа исчезают через 1 год после кли¬
нического дебюта заболевания.Для доказательства принципиальной роли аутоантител в развитии АИЗ необ¬
ходимо соблюдение ряда формальных условий. Предполагают, что в пораженной
ткани можно обнаружить иммунные комплексы, состоящие из аутоантитела и
соответствующего аутоантигена. При моделировании заболевания на экспери¬
ментальных животных сыворотка из организма больного животного или челове¬
ка, перенесенная здоровому животному, или аутоантитело, полученное иммуни¬
зацией аутоантигеном, приводит к изменению структуры и функции, схожему с
таковыми при оригинальном АИЗ. Аутоантитело должно оказывать действие на
клетки клеточных культур или изолированной ткани ех vivo. И, наконец, должна
существовать корреляция между титрами аутоантитела и активностью заболева¬
ния. Далеко не для всех аутоантител могут быть соблюдены все эти требования.
Изученные механизмы участия аутоантител в иммунопатогенезе АИЗ представ¬
лены в табл. 17-3.
70ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙтТаблица 17-3. Патогенетические механизмы действия аутоантител при аутоиммунных заболева¬
нияхМеханизмВзаимодействие с белковыми системами
крови и биологических жидкостейВзаимодействие с рецептором (слущивание,
блокада или стимуляция)Комплемент-опосредованное разрушение ком¬
понентов клеток и тканиПерекрестное связывание молекул и актива¬
ция клеткиОтложение иммунных комплексов с реактив¬
ным воспалениемТрансплацентарный перенос с возникнове¬
нием транзиторной врожденной клинической
картины заболеванияОпсонизация, фагоцитоз и изменение клирен¬
са молекул и клетокОсновные аутоантителаВолчаночный антикоагулянтАнтитела к C1q и C1INHАнтитела к внутреннему фактору КаслаАнтитела к ацетилхолиновому рецептору
Антитела к рецептору тиреотропного гормона
Антитела к ионным каналамАнтитела к эритроцитамАнтитела к антигенам десмосомАнтитела к антигенам базальной мембраны кожиАнтитела к базальной мембране клубочкаАнтитела к ганглиозидамАнтинейтрофильные цитоплазматические антителаАнтитела к дсДНК и нуклеосомам
Ревматоидный факторОтложения полимерного 1д и комплемента в меэангии
клубочка и стенках сосудов почки при 1дА-нефропатииАнтитела к 88А при СКВАнтитела к рецептору тиреотропного гормонаАнтитела к десмосомамАнтитела к ацетилхолиновому рецепторуАнтатела к гли ко протеи нам 11Ь/111а
Антитела к окисленным липопротеинамАНТИТЕЛА И АУТОИММУННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯРяд особенностей отличают методы обнаружения аутоантител от оцен¬
ки содержания других биологических молекул в биологических жидкостях.
Аутоантитела представляют собой иммуноглобулины классов IgG, IgA, IgM,
специфически связывающиеся с антигенными эпитопами молекул человеческого
организма. Образование аутоантител представляет собой нормальный биологи¬
ческий феномен, а связывание иммуноглобулинов с собственными антигенами
можно зафиксировать в сыворотке любого человека. В норме существует оха¬
рактеризованная популяция В-клеток, синтезирующая полиреактивные
низкоаффинные иммуноглобулины, способные связываться со многими антиге¬
нами. Роль аутоантител в норме и причина их появления изучена недостаточно.
Вероятнее всего причиной образования аутоантител является перекрестная реак¬
тивность иммуногенных эпитопов между антигенами инфекционных агентов и
собственными молекулами организма. Спектр антигенных стимулов, окружаю¬
щих человека, постоянно меняется, что ведет к образованию низкоаффинных
непатогенных аутоантител.Аутоантитела обнаруживают при инфекционных и онкологических заболева¬
ниях, воспалительных процессах различного генеза, хронических интоксикациях
(алкоголизме) либо на фоне приема лекарственных препаратов. Наличие ревма¬
тоидного фактора при вирусном гепатите С, антимиокардиальных антител при
вирусных миокардитах указывает на большое значение инфекции в генезе аутоим¬
мунных процессов. Встречаемость АНА несколько возрастает у пациентов с онко¬
логическими заболеваниями, причем индукция АНА на фоне опухоли указывает
на лучший прогноз у онкологических больных. Встречаемость ряда аутоантител,
в частности ревматоидного и антинуклеарного фактора, нарастает в пожилом воз¬
расте. Однако титры аутоантител, присутствующих в норме, низки и сравнительно
нестойки.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 71Возможность использования конкретной разновидности аутоантител в качестве
диагностического показателя определяется их встречаемостью при аутоиммунном
заболевании. Встречаемость тех аутоантител, которые используются для клини¬
ческой диагностики, обычно составляет более 60-70% при патологии, менее 1%
в норме и при других заболеваниях. Хорошие клинико-лабораторные параметры
многих разновидностей аутоантител позволяют рассматривать их в качестве
лабораторных маркеров этих заболеваний, т.е. высокоспецифичных лаборатор¬
ных тестов, обладающих исключительной диагностической информативностью.
Высокоспецифичными серологическими маркерами называют те разновидности
аутоантител, которые встречаются исключительно при этом заболевании. Так, к
высокоспецифичным серологическим маркерам относят анти-дсДНК и анти-5т
при СКВ, антитела к 8с1-70-антигену при склеродермии. Некоторые аутоантитела
могут быть высокоспецифичными маркерами одновременно нескольких групп
заболеваний. Например, антитела к цитоплазме нейтрофилов образуются как при
гранулематозных васкулитах, так и при воспалительных заболеваниях кишечни¬
ка. Ряд аутоантител, характерных для аутоиммунных заболеваний, сравнительно
часто регистрируют у здоровых лиц без признаков аутоиммунного заболевания,
что значительно ограничивает их диагностическое использование. К примеру,
клиническое использование антител к скелетным мышцам при миастении или
антител к миокарду ограничено, поскольку они могут часто встречаться в норме
либо при неиммунных заболеваниях.Обычно появление высоких титров специфических аутоантител у клинически
здоровых лиц рассматривается в качестве фактора риска развития аутоиммунного
заболевания. Аутоантитела в сыворотке крови могут обнаруживаться за несколько
месяцев до первых клинических проявлений заболевания. Так, при ревматоид¬
ном артрите антицитруллиновые антитела могут быть обнаружены за 1,5 года до
дебюта артрита, обнаружение антинейтрофильных антител предваряет развитие
гломерулонефрита на несколько месяцев.Клиническое значение обнаружения аз^оантител отчасти зависит от титров
содержания аутоантител в сыворотке обследуемого. Обычно высокое содержа¬
ние антител указывает на высокую аффинность последних. Это, в свою очередь,
характеризует специфичность и выраженность иммунного ответа. Обнаружение
высоких титров антител, как правило, указывает на аутоиммунное заболевание, в
то время как низкие титры часто отмечаются в норме и не специфичны, В отсут¬
ствие иммуносупрессивного лечения при аутоиммунных заболеваниях содержа¬
ние аутоантител обычно сохраняется на высоком уровне в течение длительного
времени. При наличии антител на фоне инфекции или неиммунного воспаления
титры антител обычно нестойки. Аутоантитела могут быть индуцированы вос¬
палительным, инфекционным, онкологическим процессом или спровоцированы
назначением определенных препаратов. Для того, чтобы отличить транзиторную
индукцию аутоантител от хронического присутствия аутоантител при аутоиммун¬
ном заболевании, может потребоваться проведение повторного исследования.
Учитывая, что время полужизни сывороточных иммуноглобулинов составляет
около 3 мес, минимальное время между повторными исследованиями должно пре¬
вышать полгода.В то же время продукция аутоантител при аутоиммунных заболеваниях не
является постоянной величиной. Встречаемость аутоантител может нарастать с
увеличением длительности аутоиммунного заболевания, как это происходит при
ревматоидном артрите, или снижаться ниже порога детекции в течение первого
года заболевания при сахарном диабете. Аутоантитела синтезируются в составе
нормального пула иммуноглобулинов сыворотки крови плазмоцитами костно¬
го мозга, лимфатических узлов и селезенки, однако в ходе иммунного ответа
при аутоиммунном процессе продукция антител в очаге воспаления может при¬Ш0ШЬш
72 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙобретать особые характеристики, например может измениться клональность
иммуноглобулинов. Например, при рассеянном склерозе отмечается выраженное
увеличение местного синтеза антител и иммунный ответ в ликворе становится
олигоклональным, а при смешанной криоглобулинемии в состав криоглобулинов
сыворотки входит моноклональный ревматоидный фактор.Хотя большинство аутоантител служат свидетелями аутоиммунного воспале¬
ния и их содержание не коррелируют с активностью заболевания, обнаружение
определенных типов аутоантител при ревматических заболеваниях указывает на
характерные особенности клинического течения. Так, у пациентов, имеющих в
сыворотке специфический набор антител, наблюдается особенное течение заболе¬
вания, отличное от симптоматики больных, не имеющих этих антител. При СКВ,
сопровождающейся образованием антител к Ro/SS-A, гломерулонефрит встреча¬
ется реже, чем у больных, имеющих высокий титр антител к дсДНК, но имеется
определенный риск развития поражений кожи и склонность к повышенной фото-
чувствительности. В связи с этим определение антинуклеарных антител (АНА)
позволяет врачу предсказать, а иногда и предотвратить развитие осложнений.
Динамика титра определенных видов антител в ходе заболевания имеет прогно¬
стическое значение. Увеличение концентрации антител к дсДНК предшествует
вспышке СКВ, и ранняя патогенетическая терапия может уберечь больного от
развития клинических симптомов или уменьшить их остроту.Выделение больных с тем или иным типом аутоантител в отдельную, часто
клинически гомогенную, группу подтверждается обнаружением определенно¬
го HLА-генотипа у больных с конкретным типом АНА. К примеру, пациенты с
дерматомиозитом, у которых в сыворотке крови обнаруживают антитела к Jo-1,
характеризуются исключительно HLA-DR3 (DRwl7) и НЬА-ОК\у52-генотипом.
Таким образом, результаты исследования содержания аутоантител и их спектра
указывают на особенности функционирования иммунной системы и отражают ее
особую предрасположенность к формированию аутоиммунных ответов.Благодаря единому патогенетическому механизму индукции аутоантител, кон¬
кретные их разновидности могут быть сгруппированы в семейства, реагирующие
с мишенями одного рода. Например, все представители семейства АНА реагируют
с рибонуклеопротеиновыми антигенами ядер; аутоантитела, относящиеся к семей¬
ству антинейтрофильных цитоплазматических антител, реагируют с набором
антигенов, локализованных в азурофильных гранулах цитоплазмы нейтрофилов.
Каждая разновидность аутоантител, даже направленная к одному антигену, пред¬
ставляет собой поликлональную популяцию антител, представленную молекулами
иммуноглобулинов с разными физико-химическими свойствами. Это обусловлено
тем, что поликлональные антитела реагируют с разными эпитопами на поверх¬
ности молекулы-антигена, причем сила связи каждой молекулы антитела с анти¬
геном (аффинность) различна. Естественно, что в идеале иммунологический лабо¬
раторный метод должен позволять установить не одну разновидность молекул
(как это происходит в большинстве традиционных лабораторных тестов), а спектр
аутоантител, направленных на разные антигены. Причем каждое антитело значи¬
тельно отличается от других по заряду, молекулярной массе и силе связывания
с антигеном, которая зависит от условий реакции. Такого идеального метода не
существует. На практике для точного описания спектра аутоантител используют
несколько методов, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки. В
результате интерпретация результатов исследования одного лабораторного пока¬
зателя зависит от метода, с помощью которого он определен.Особенности обнаружения аутоантител приводят к тому, что один тест может
иметь до 10 вариантов ответов, включающих наличие аутоантитела, его титр, а
также несколько разнообразных типов связывания антител с субстратом. Обычно
на первом этапе тестирования применяют метод, обладающий максимальной
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ73чувствительностью, в котором присутствует максимально широкий спектр анти¬
генов. Уточнение специфичности обнаруженных аутоантител возможно при
использовании подтверждающих тестов, назначенных по результатам первичного
тестирования.Еще одной особенностью практического обнаружения а)т)антител, вьггекаю-
щей из биологической природы этого феномена, является то, что не существует
абсолютно корректного подхода к измерению содержания аутоантител. Дело
в том, что большинство иммунологических тестов построено на связывании
аутоантитела и антигена-мишени. Результат теста зависит как от концентрации
аутоантител, так и от аффинности аутоантитела и антигена. При аутоиммунных
заболеваниях специфические антитела обычно обладают большой аффинностью.
Однако большая концентрация низкоаффинных аутоантител может дать сигнал
более сильный, чем малая концентрация высокоаффинных специфических ауто¬
антител. У больных с СКВ, у которых в результате поликлональной активации
В-клеток синтезируется большое количество полиспецифичных антител, наблюда¬
ют ложноположительные реакции в серологических тестах для обнаружения анти¬
тел к вирусу гепатита С. В то же время при волчаночном нефрите с нефротическим
синдромом в результате неселективной протеинурии утрачивается сывороточный
IgG, В результате при низком содержании IgG тесты по обнаружению аутоантител
могут быть ложноотрицательны. Обнаружение неспецифического и перекрестного
связывания аутоантител в некоторых иммунологических тестах, наличие низких
титров аутоантител в норме нередко требует выделения «серой зоны», или «зоны
сомнительных результатов».в случае невысоких титров аутоантител, которые могут быть обусловлены
неспецифическим связыванием аутоантител или присутствием специфических
серологических маркеров, но в низкой концентрации, интерпретация результата
зависит от постановки клинической задачи. Если речь идет об исключении ревма¬
тической природы заболевания в дифференциальной диагностике неревматиче¬
ской патологии, то результат может быть интерпретирован как отрицательный. В
случае, когда тест используют для подтверждения ревматического заболевания у
больного с другими клиническими признаками ревматической патологии, резуль¬
тат теста должен рассматриваться как положительный.Несмотря на определенные трудности в интерпретации результатов имму¬
нологического обследования, а также большой объем информации, который
необходимо принимать во внимание при анализе результатов обследования,
информативность иммунологических тестов очень высока. Особенности поста¬
новки диагностической задачи и планирования иммунологического обследования
приведены в табл. 17-4,Таблица 17-4. Постановка и решение задач лабораторной диагностики аутоиммунных заболева¬
ний с помощью иммунологических методовКлинический вопросДиагностическая задачаНазначение обследованияКак исключить диагноз?Ранняя диагностика и
оценка рискаСкрининговый тест, обладающий вьюокой
чувствительностьюКак подтвердить диагноз?Дифференциальная диа¬
гностикаПодтверждающий тест, обладающий вьюокой
специфичностьюГраницы нормы и патологии?Классификация заболе¬
ванияУстанавливаются индивидуально на основа¬
нии опыта лаборатории и результатов контро¬
ля качестваЧто значит для больного
результат обследования?Прогноз исхода заболе¬
ванияДанные литературы при анализе больших
когорт больныхКак часто повторять тест?Контроль терапииУчитывать время клиренса исследуемых
молекул
74ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙПланирование серологического обследования зависит от клинической задачи,
которую требуется решить клиницисту, в свою очередь, назначение конкретных
тестов зависит от их клинико-лабораторных параметров.Для скрининга используют тесты, отрицательный результат которых с большой
вероятностью позволяет исключить заболевание. Обычно такими параметрами
обладают методы, позволяющие одновременно определять антитела к антигенам
одного семейства. Так, назначение антинуклеарного фактора (АНФ) целесообраз¬
но на этапе скрининга ревматических заболеваний, поскольку обычно диффуз¬
ные заболевания соединительной ткани сопровождаются обнаружением АНА.
Отрицательный результат выявления АНФ делает диагноз СКВ или системной
склеродермии маловероятным.Часто уже на этапе скрининга необходимо выполнять комбинации тестов,
параллельное назначение которых значительно снижает вероятность ошибочно¬
го исключения диагноза. К примеру, в диагностике ревматоидного артрита уже
в дебюте этого заболевания рационально назначать определение ревматоидного
фактора (РФ) и антицитруллиновых антител.Дифференциальная диагностика требует проведения тестов, обладающих боль¬
шей специфичностью. Например, при обнаружении низких титров АНФ выявление
антител к дсДНК указывает на диагноз СКВ. Не менее важен вопрос о результатах
тестов, которые находятся в «серой зоне». В случае скринингового теста результат,
находящийся в «серой зоне», следует интерпретировать как неспецифический, в
то время как у пациента с уже определенным диагнозом тот же результат следует
отнести к низкой, но значимой концентрации аутоантител. При решении задач
дифференциальной диагностики комбинации тестов делают результат обследова¬
ния более убедительным. Так, диагностика антифосфолипидного синдрома (АФС)
с помощью антифосфолипидных антител должна расширяться за счет параллель¬
ного обследования для диагностики СКВ.Комбинированное тестирование несомненно улучшает информативность обсле¬
дования пациентов. Комбинированное тестирование, включающее параллельный
скрининг разных аутоиммунных заболеваний, имеющих общие черты, крайне
информативно при дифференциальной диагностике системных ревматических
заболеваний. Такой подход позволяет рекомендовать наборы тестов и комплекс¬
ные алгоритмы обследования, что в итоге приводит к росту числа диагностических
находок.ЛАБОРАТОРНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ
ПРИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХВыявление LE-клетокВ диагностике аутоиммунных заболеваний к функциональным тестам относят
те, при которых измерение аутоантител основано на влиянии аутоантител на био¬
логическую реакцию. Присутствие биологической активности антител представ¬
ляет собой объективный показатель, в меньшей степени подверженный артефак¬
там иммунометрических тестов. Недостатком функциональных методов является
плохая стандартизация и низкая воспроизводимость, трудоемкость и короткий
срок годности компонентов тест-системы. В результате практически всегда функ¬
циональные тесты с течением времени заменяются на более простые и надежные
иммунометрические и серологические методы.Классическим функциональным тестом детекции аутоантител считают обнару¬
жение АНА с помощью метода выявления LE-клеток (клеток красной волчанки).
LE-клетки представляют собой лейкоциты крови, фагоцитировавшие ядра лимфо¬
шшДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 75цитов. в основе этого феномена при СКВ лежит несколько механизмов. Прежде
всего при СКВ лимфоциты периферической крови претерпевают ускоренный
апоптоз, который рассматривается как попытка восстановления утраченной имму¬
нотолерантности при этом заболевании. Фагоцитоз ядер лимфоцитов лейкоцитам
обусловлен наличием АНА в сыворотке крови больных, которые опсонизируют
фрагменты ядер лимфоцитов для их поглощения лейкоцитами. Присутствие в 0^1
тесте сыворотки больного, содержащей АНА, является принципиальным для
обнаружения LE-клеток, что позволяет рассматривать этот тест среди других мето-
дов диагностики АНА.Еще в начале XX в. в пунктатах костного мозга больных с СКВ были описаны
гиалиновые тельца в цитоплазме фагоцитирующих клеток и лейкоциты перифе¬
рической крови, нагруженные клеточным материалом. Этот феномен был смо¬
делирован in vltrv, что привело к созданию лабораторного теста по определению
LE-клеток. Учет LE-клеток осуществлялся в мазке крови с помощью светового
микроскопа и гематологических красителей. За счет простоты и дешевизны со
временем этот метод получил широкое распространение. Однако не существует
единого рекомендуемого протокола обнаружения LE-клеток; из-за низкой чув¬
ствительности и сложности стандартизации не рекомендуется его выполнение в
клинических целях. Учитывая низю1е аналитические параметры метода, отсут¬
ствие LE-клеток при повторных анализах не может рассматриваться в качестве
повода для исключения возможного диагноза диффузной болезни соединительной
ткани. Выявление АНА с помощью АНФ полностью исключает необходимость
использования этого устаревшего теста.В середине прошлого века был описан сывороточный фактор, ответственный
за образование LE-клеток и стимулирующий фагоцитоз ядер клеток монону-
клеарами крови. Активность фактора наблюдалась во фракции гаммаглобули-
нов сыворотки крови. Это позволило для выявления АНА применить реакцию
непрямой иммунофлюоресценции или метод Кунса с использованием тканей
человека в качестве субстрата. Этот модифицированный тест на сегодняшний
день считают основным методом обнаружения АНФ в клинической практике.
Несмотря на то, что в аутоиммунной диагностике используют единичные функ¬
циональные тесты, их роль остается значительной в исследовании патогенетиче¬
ского действия аутоантител.Антинуклеарный факторОпределение АНФ — самое часто выполняемое лабораторное исследование
в практических иммунологических лабораториях, что отражает его значение
для диагностики аутоиммунных заболеваний. АНФ — семейство аутоантител,
связывающихся с рибонуклеиновыми кислотами и ассоциированными с ними
белками. Они встречаются более чем у 90% больных с диффузными болезнями
соединительной ткани, такими как СКВ, системный склероз (СС), смешанное
заболевание соединительной ткани (СЗСТ), синдром Шегрена (СШ) (табл. 17-5).
Представители этого семейства аутоантител могут быть обнаружены при инфек¬
ционных, воспалительных и онкологических заболеваниях. Разнообразие пато¬
логий, сопровождающихся появлением АНФ, заставляет заподозрить единство
иммунологических реакций в их патогенезе. В то же время встречаемость АНФ
достигает 1-5% у клинически здоровых лиц и несколько возрастает в пожилом
возрасте.
76ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙТаблица 17-5. Краткий перечень заболеваний, сопровождающихся наличием антинуклеарного
фактораЗабапеванияВетречаемость АНФ, %Системная красная волчанка95Системный склероз95Синдром Шегрена95Дерматомиозит, полимиозит30-50Смешанное заболевание соединительной ткани100Дискоидная красная волчанка50-60Локализованная склеродермия50Ревматоидный артрит30-40Юношеский ревматоидный артрит (олиго- и полиартритная форма)50-90Аутоиммунный гепатит95-100Первичный билиарный цирроз95-100Узелковый полиартериит10-20Злокачественные заболевания10-20Хроническое невынашивание беременности10-15Пожилые (>65 лет)10Здоровые женщиныобщее содержание АНА в сыворотке крови больных обозначается как «анти-
нуклеарный фактор». Учитывая высокую чувствительность метода обнаружения
АНФ, нередко проводят равенство между присутствием АНА в крови больных
определенными заболеваниями и положительным результатом обнаружения
АНФ. Однако традиционно под названием «АНФ» подразумевают положитель¬
ный результат иммунофлюоресцентного теста для обнаружения АНА. Другие
методы обнаружения АНА, например ИФА, значительно уступают непрямой
иммунофлюоресценции по чувствительности. Не рекомендуется называть терми¬
ном «антинуклеарный фактор» показатели, определяемые другими методами.Основным механизмом индукции АНА, по-видимому, является патологиче¬
ский апоптоз кератиноцитов, лимфоцитов и других клеток, который возникает
при диффузных заболеваниях соединительной ткани. Апоптотические тельца,
содержащие в своем составе антигены АНА, напоминают по структуре вирусные
частицы и способны индуцировать специфические иммунные ответы. Антитела
могут иметь патогенетическое значение, что показано по отношению к антителам
к дсДНК при СКВ с поражением почек, но большинство разновидностей АНА
является, скорее, вторичным феноменом по отношению к деструкции ткани при
аутоиммунных заболеваниях.К настоящему времени описано более 100 разновидностей АНА, направленных
против нуклеиновых кислот, гистонов, белков ядерной мембраны, компонентов
сплайсосомы, рибонуклеопротеинов, белков ядрышек и центромер. Антитела к
цитоплазматическим антигенам, диагностируемые при поли- и дерматомиозите
взрослых, также причисляют к АНА, так как они направлены против рибопро-
теиновых структур, и в их возникновении предположительно участвуют сходные
патогенетические механизмы. Разнообразие типов АНА и уточнение клинико¬
лабораторных корреляций позволило использовать АНА как показатель, позво¬
ляющий клиницисту уточнить прогноз, течение и, зачастую, предупредить обо¬
стрение заболевания.Для обнаружения АНА применяют ряд показателей, которые могут измеряться
при помощи разных методов (табл. 17-6).
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ77Таблица 17-6. Показатели и методы определения антинуклеарных антителПоказательОпределениеМетодЦель определенияLE-клеткиОпсонизирующие АНА
к ядрам клетокфункциональный тестСкрининг АНААНФАНА против нераство¬
римых и конформаци¬
онных антигенов ядраНепрямая иммунофлюорес¬
ценцияСкрининг АНААнтитела к экстрагируе¬
мому ядерному антигенуАНА против раствори¬
мых антигенов, выде¬
ленных из клеткиДвойная иммунодиффузия,
контрэлектрофорез, ИФАСкрининг АНААнтитела к дсДНКАНА против нуклеино¬
вых кислотИФА, непрямая иммуно¬
флюоресценция, радиоиммун¬
ный анализОпределение кон¬
кретных разновид¬
ностей АНААнтитела к рибонуклео-
протеинамЯдерные мишени АНА:
Sm, RNP. SS-A, SS-B,
Jo-^, SC/-70 и др.Двойная иммунодиффузия,
контрэлектрофорез, ИФА, имму-
ноблопинг, радиоиммунный
анализОпределение кон¬
кретных разновид¬
ностей АНАПрисутствие в сыворотке крови АНФ обусловливает обнаружение в крови кле¬
ток красной волчанки (LE-клеток). Таким образом, LE-клетки можно рассматри¬
вать в качестве вторичного показателя, указывающего на наличие АНА, Низкая
чувствительность и плохая воспроизводимость тестов, используемых для обнару¬
жения LE-клеток, не позволяет им конкурировать с АНФ, постепенно эти тесты
полностью вытесняются серологическими методами обнаружения АНА.АНТИНУКЛЕАРНЫЙ ФАКТОР И ТИПЫ СВЕЧЕНИЯ ЯДРАОпределение АНФ — основной метод обнаружения АНА. Результатом опреде¬
ления АНФ является факт присутствия аутоантител в диагностическом титре,
конечный титр разведения сыворотки, отражающий аффинность и концентрацию
аутоантител, а также тип свечения ядра клетки. Характеристики конкретной мето¬
дики зависят от субстрата, который может варьировать от криосрезов (крысиных
печени или почки) до культивируемых пролиферирующих клеточных линий (КЬ,
HeLa), а также метода фиксации ткани, который может влиять на сохранность
ряда ядерных антигенов АНА,Криосрезы тканей крысы в качестве субстрата непрямой иммунофлюоресцен¬
ции для обнаружения АНФ позволяют получить полуколичественный результат,
определяющий максимальный титр разведения сыворотки пациента, при котором
сохраняется свечение ядер. Это основной тест, который использовался для обнару¬
жения АНА в клинической практике в течение многих лет, наряду с обнаружением
LE-клеток. Основным недостатком использования данного метода считают отсут¬
ствие в тканях грызунов ряда антигенов человека, что снижает чувствительность
теста. В последнее время его вытеснил ИФА.Последующая модификация метода обнаружения АНФ связана с использова¬
нием в качестве субстрата человеческой перевиваемой эпителиоидной клеточной
линии НЕр-2. Эта клеточная линия, полученная из аденокарциномы гортани
человека, представляет собой крупные полиплоидные неороговевающие плоские
эпителиоциты, образующие монослой на пластике и стекле. Крупные ядра и при¬
сутствие человеческих антигенов сделали метод непрямой иммунофлюоресценции
с использованием перевиваемой клеточной линии НЕр-2 основным методом обна¬
ружения АНФ. В англоязычной литературе отсутствует единое название для этого
метода, иногда его для краткости обозначают как EANA (Fluorescent AntiNuclear
Antibody detection), в нашей стране сохраняется название этого показателя —
АНФ.В качестве субстратов могут применяться и другие человеческие клеточные
линии, однако благодаря хорошей морфологии и удобству культивирования
шW78 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙименно линия НЕр-2 стала общепризнанным субстратом непрямой иммунофлюо¬
ресценции. Ее применение улучшает чувствительность теста за счет яркой флюо¬
ресценции даже при значительных разведениях сыворотки больного, а большое,
богатое эухроматином ядро позволяет точно описать тип свечения. Кроме того,
Щ применение клеточной линии НЕр-2 способствует обнаружению антител Ro/
SS-A, а также антител к антигенам ядрышка, которые не выявляются при исполь¬
зовании ткани лабораторных животных. Среди преимуществ НЕр-2 — высокая
частота деления клеток, позволяющая определять антитела к антигенам, экс¬
прессирующимся только при делении клетки, и отсутствие клеточного матрикса
ткани, затрудняющего визуализацию специфического свечения, что характерно
для гистологических срезов.при использовании тканей лабораторных животных диагностический титр
АНФ составляет 1:8-1:10, в случае применения клеточной линии НЕр-2 реко¬
мендуется использовать исходный титр 1:40-1:80, При работе с такими титрами
частота встречаемости слабоположительных результатов у клинически здоровых
лиц составит не более 5% и в то же время не позволит пропустить значимые титры
АНА у больных диффузными болезнями соединительной ткани. На фоне обостре¬
ния ревматических заболеваний отмечают титры АНФ более 1:640, при ремиссии
титры снижаются до 1:160-1:320.Существуют рекомендации по балльной оценке результатов выявления АНФ,
указывающей содержание «в крестах». Это позволяет лабораториям экономить
реактивы и уменьшить трудозатраты на выполнение исследований. Однако
конечный титр имеет более важное значение по сравнению с количеством связав¬
шихся с субстратом аутоантител, так как непосредственно связан с аффинностью
их взаимодействия с антигеном. Желательно установить конечный титр у всех
«положительных больных», что позволяет уточнять присутствие в сыворотке
высокоаффинных аутоантител, которые более тесно связаны с активностью про¬
цесса. Необходимо определять АНФ класса IgG, поскольку выявление АНФ, пред¬
ставленных другими классами иммуноглобулинов, не имеет самостоятельного
диагностического значения.Тип свечения ядра клетки значительно увеличивает информативность выявле¬
ния АНФ. Использование клеток линии НЕр-2 позволяет охарактеризовать более
20 различных вариантов окрашивания ядра, которые зависят от спектра АНА,
присутствующих в исследуемой сыворотке. Однако для практической лаборатории
достаточно различать 6 основных вариантов свызывания аутрантител с антигенсо¬
держащими структурами клетки.Выделяют гомогенный, периферический, гранулярный (мелко-/крупно-),
ядрышковый, центромерный и цитоплазматический тип свечения ядра. Каждому
типу свечения присущи характерные признаки, которые позволяют отличить один
вариант от другого, а также набор антигенов, с которыми реагируют аутоантитела
в сыворотках больных. Описание типов свечения представляет ценную клини¬
ческую информацию само по себе, кроме того, тип свечения может указывать на
необходимость проведения определенных лабораторных тестов в дальнейшем
(табл. 17-7).Гомогенный тип свечения — аутоантитела реагируют с теми антигенами, кото¬
рые распределены в ядре диффузно, т.е. входят в состав хроматина. Характерно,
что при обнаружении гомогенного типа свечения в делящихся клетках ярко окра¬
шиваются конденсированные хромосомы. Основными структурными единицами
хроматина являются нуклеосомы — комплексы ДНК и гистонов. Таким образом,
гомогенный тип свечения предполагает наличие антител против нуклеосом, дсДНК
и антител к гистонам. Он встречается у больных с СКВ и лекарственной волчанкой.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ79а также у больных со склеродермией. Обычно обнаружение высокого титра АНФ
с гомогенным типом свечения свидетельствует о диагнозе СКВ.Таблица 17-7. Тип свечения при непрямой иммунофлюоресценции и наличие антинуклеарных
антителТил свеченияСпецифичностьантителаХарактеристика антигенаЗаболеваниеГомогенный/перифе¬дсДНКДНК хроматинаСКВрическийГистоныН,„НзИН,Лекарственная СКВАтипический гомо¬
генныйЛамины ядраЛамины А, В, САутоиммунныйгепатитгранулярныйSmБелки В’, В, D, Е, F, связанные с
и,-и, RNPМаркер СКВRNPБелки А и С, связанные с U, RNPСКВ, СЗСТPCNA/Ga36 кДа-белок, связанный с ДНК-
полимеразой 5СКВАтипический грану¬
лярныйRo/SS-A52, 60 кДа-белок. связанный с Y1-Y5
РНКСШ. СКВLa/SS-B48 кДа, связан с РНК-полимеразой 3СШScl-7070 кДа-антиген склеродермииССPCNAБелок, ассоииированный с ДНК
полимеразой 6СКВЦентромерныйАнтицентромерныйCENP А, В, СCRESTЯдрышковыйКрупногранулярныйФибрилляринССМелкогранулйрныйРНК-полимераза 1ССМелкогранулярныйРМ-1 (PM/ScI)ПМ/ДМ, ССЯдрышковый, в зави¬
симости от клеточного
циклаKuБелки ядерного матрикса 70 и
80 кДаСКВЦитоплазматическийASMF-актинАутоиммунныйгепатитAMAПируват-декарбоксилазный ком¬
плексПервичный билиар¬
ный циррозАнти-Jo-I, PL-7, PL-12
и др.тРНК-синтетазыПМ/ДМПериферический тип свечения часто выделяют отдельно, хотя он являет¬
ся разновидностью гомогенного типа свечения. Его обнаружение — артефакт
фиксации клеток, который приводит к перераспределению хроматина в ядре
на периферию. Важно отличать периферический тип свечения от окрашивания
ядерной мембраны, которое встречается при аутоиммунных заболеваниях печени.
Периферический тип свечения характерен для больных с антителами к двуспи¬
ральной ДНК и отмечается преимущественно у больных с СКВ.Гранулярный тип встречается наиболее часто, но он неспецифический. Иногда
этот тип свечения называют «крапчатым» или «сетчатым». Название «грануляр¬
ный» более точно отражает этот феномен, поскольку в этом случае аутоантитела
реагируют с гранулами в ядре, представляющими надмолекулярные нуклеопроте-
иновые комплексы. Такие комплексы белков и нуклеиновых кислот осуществляют
в ядре ряд функций, необходимых для нормальной жизнедеятельности клетки,
к таким комплексам, в частности, относят сплайсосомы, которые осуществляют
посггранскрипционную перестройку мРНК, необходимую для синтеза белка на
рибосомах. В составе присутствует множество различных нуклеопротеинов, что
обусловливает многообразие антигенных мишеней при обнаружении грануляр¬
ного типа свечения. К основным аутоантигенам, антитела к которым приводят кШWlIL
80ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙвизуализации гранулярного типа свечения, относят Sm, U^-RNP, SS-A, SS-B анти¬
гены и PCNA. Клетки в процессе деления утрачивают большинство сформирован¬
ных нуклеопротеиновых комплексов, поэтому митотические фигуры в клеточной
линии при гранулярном типе свечения не окрашиваются.Гранулярный тип свечения ядра отмечается у больных СКВ, СШ, СС, ДМ/ПМ,
РА и при ряде других аутоиммунных заболеваний. Низкие титры АНФ с грануляр¬
ным типом преобладают в сыворотках крови у клинически здоровых лиц с АНФ
без признаков системного заболевания.Ядрышковый тип флюоресценции бывает в тех случаях, когда антигены
ядрышка выступают в качестве мишеней АНА. Ядрышковый тип свечения харак¬
терен для склеродермии и ее разновидностей. Ядрышковый тип флюоресценции
определяется у больных при наличии антител к компонентам ядрышка, таким как
РНК-полимераза 1, NOR, U.,RNP, PM/ScLЦентромерный тип флюоресценции наблюдают при образовании анти¬
тел к центромерам хромосом, он обнаруживается только в делящихся клетках.
Присутствие данного типа флюоресценции характерно при CREST-варианте скле¬
родермии.Цитоплазматический тип свечения указывает на антитела к тРНК-синтетазам,
в частности к Jo-1, которые образуются при полимиозите. Кроме того, он выявля¬
ется у больных с АНА, направленными против других компонентов цитоплазмы
клетки: антитела к актину при аутоиммунном гепатите, антитела к митохондриям
при первичном билиарном циррозе.Нередко может встречаться сочетание нескольких типов свечения, к примеру
мелкогранулярного и ядрышкового, что характерно для антител к Scl-70. Более
того, часто в низких разведениях преобладает один тип свечения, например грану¬
лярный, а при дальнейших разведениях проявляется гомогенный или центромер¬
ный тип флюоресценции, что свидетельствует о наличии в сыворотке больного
различных видов АНА. Хотя тип свечения дает врачу определенные данные в
пользу того или иного диагноза, необходимо принимать во внимание сравнитель¬
но низкую его специфичность и разнообразие встречающихся феноменов, что
требует проведения дальнейшего лабораторного обследования.Обнаружение АНФ — основа для использования других лабораторных тесгов,
уточняющих спектр АНА в крови больных. Учитывая крайнюю информативность
этого теста, дальнейшее тестирование и анализ результатов последущего обсле¬
дования должны интерпретироваться в зависимости от результатов оценки типа
свечения и титра АНФ.При использовании тканей лабораторных животных, таких как почка или
печень крысы, у 10% больных СКВ АНА не определяются или титры их очень
низки. Этих больных условно относят к группе «АНФ-негативной СКВ», для
уточнения диагноза у таких больных требуется дальнейшее обследование, прежде
всего определение антител к SS-A антигенам. Эти антигены обладают хорошей
растворимостью и могут утрачиваться из ядер клеток. Применение в качестве
субстрата клеточной линии НЕр-2 сокращает численность данной категории паци¬
ентов, но не более чем на 5%. Необходимо учитывать, что при использовании тра¬
диционной метанол-ацетоновой фиксации клеточной линии SS-A-антиген может
диффундировать в цитоплазму клетки, в результате чего титры АНФ значительно
снижаются.Для устранения этих недостатков была создана трансгенная клеточная линия
НЕр-2000, в генотип которой был искусственно внесен ген SS-A антигена. За счет
этого в ее ядре отмечается гиперэкспрессия S5-А-антигена, что несколько уве¬
личивает чувствительность выявления АНА. Однако даже использование транс¬
генных клеточных линий не позволяет окончательно избавиться от проблемы
«АНФ-негативной СКВ». Даже при максимально скрупулезном обследовании до
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 812-3% пациентов с клинически очевидной СКВ не имеют диагностических концен¬
траций АНФ.Антинуклеарные антителаНоменклатура конкретных разновидностей АНА зависит как от ядерных мише¬
ней аутоантител, так и от методов, с помощью которых их определяют. Отдельно
выделяют АНА, реагирующие с нуклеиновыми кислотами, прежде всего ДНК;
антитела к водорастворимым антигенам, которые могут быть экстрагированы
водно-солевыми растворами, ~ антитела к экстрагируемому ядерному антигену
(ЭНА); антитела к нерастворимым в воде антигенам, а также конформационные
антигены, которые разрушаются при препаративном выделении из ядра клетки.
Уточнение антигенных мишеней АНА зависит от антигенного субстрата, который
применяется в иммунологических тестах. Антигенсодержащий субстрат может
быть нативным, т.е. полученным при минимальной очистке, либо высокоочищен-
ным. Белки-антигены могут быть получены методами генной инженерии либо
получены химическими методами пептидного синтеза. Использование того или
другого метода очистки или синтеза аутоантигена зависит от его биохимической
природы и особенностей связывания с ним аутоантител. Рекомбинантные белки и
синтетические пептиды более удобны в работе, так как методы их получения легко
стандартизируются. Однако чем менее очищен антиген, тем больше он сохраняет
третичную структуру, поэтому взаимодействие аутоантитела более приближено к
условиям взаимодействия in vivo.Большинство видов АНА направлено к сложным комплексам рибонуклеиновых
кислот и белков. Изучение АНА зачастую опережало открытие функциональных
белков и рибопротеиновых комплексов, что привело к возникновению двойной
номенклатуры при описании некоторых видов АНА, включающей как общепри¬
нятое название аутоантитела, так и указание конкретного ядерного белка. Обычно
тип АНА получал название, в основе которого лежит имя пациента, у которого
данная разновидность АНА была впервые обнаружена. В основе более совре¬
менной номенклатуры лежат клеточные мишени аутоантител, с которыми они
взаимодействуют. Так, антитела к антигену Ro/SS-A (Ro — по фамилии больного,
Robair, 5S-A — Sjogren’s Syndrome А antigen) направлены против белков массой 52
и 60 кДа, связанных с Y^-Y^ РНК в составе сплайсосомы, а антитела к антигену
La/SS-B (La — по фамилии больного, Lapiere, Sjogren's Syndrome В antigen) направ¬
лены против белка, связанного с РНК-полимеразой 3. Номенклатура аутоантител,
основанная на фамилиях пациентов, постепенно уходит в прошлое, в современной
литературе доминирует название антигенов с указанием молекулярной массы,
например SS-A антиген молекулярной массы 52 и 60 кДа.Может сложиться ситуация, что в одной сыворотке одновременно обнаружи¬
вают антитела разных специфичностей, направленные к нескольким антинукле-
арным антигенам. Некоторые антитела часто определяются совместно, например
антитела к SS-A и SS-B либо U^-RNP и Sm-антигенам. Эти ассоциации обуслов¬
лены тем, что антигены входят в состав одного белкового комплекса, с которым
реагируют аутоантитела. Некоторые разновидности АНА могут часто встречаться
совместно за счет того, что они имеются при одном заболевании или при пере¬
крестных синдромах.Антитела X экстрагируемому нуклеарному антигенуВ состав ЭНА входит фракция растворимых ядерных белков, которые могут
быть получены из ядра клетки. В его состав входит 6 основных рибонуклеопро-
теиновых антигенов АНА, таких как SS-A, SS-B, Sm, U^-RNP, Scí-70 и Jo-1, а также
ряд других минорных антигенов.
82 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙИспользование ЭНА в методах «двойная иммунодиффузия» и «контрэлектро¬
форез» может быть применено для скрининга этих специфичностей аутоантител.
Скрининговые методы с использованием ЭНА низкочувствительны и при сопо¬
ставлении с АНФ позволяют диагностировать только 50-60% положительных
сывороток. Тем не менее высокая специфичность методов позволяет использовать
их в качестве методов сравнения по отношению к другим, более чувствительным
тестам.Обычно обнаружение антител к ЭНА проводят совместно с определением АНФ
для того, чтобы не пропустить случаев «АНФ-негативной СКВ». Необходимо
отметить, что ИФА тест-системы позволяют проводить скрининговое обследо¬
вание для обнаружения антител к ЭНА у ревматологических больных. Отличие
тест-систем для скрининга состоит в том, что в инкубационную лунку помещается
смесь антигенов, и положительный результат теста указывает на наличие у боль¬
ного одной или одновременно нескольких разновидностей АНА.С учетом большой чувствительности метода ИФА в целом его применение более
оправдано для скрининга АНА, однако необходимо помнить о большой частоте
развития неспецифических реакций при его применении. Существует 2 основные
разновидности ИФА для скринингового обнаружения антител к ЭНА, В одном
случае в лунку вносят тотальный ядерный экстракт, а в другом — смесь реком¬
бинантных очищенных белков, представляющих собой основные разновидности
рибонуклеопротеиновых антигенов. Использование смеси рекомбинантных бел¬
ков делает обследование более специфичным и улучшает стандартизацию выявле¬
ния аутоантител. В то же время далеко не все антигены АНА могут быть нанесены
на ИФА-планшет, в результате чего комбинированные тесты пропускают до 40%
положительных результатов.Антитела к двуспиральной ДНКпри СКВ антитела к двуспиральной ДНК (дсДНК) могут быть обнаружены у
40-50% больных, они характеризуются гомогенным типом свечения ядра НЕр-2-
клеток при выявлении АНФ. Причиной их образования служит сенсибилизация
к компонентам ядерного материала, высвобождающегося из ядер клеток в ходе
апоптоза. Обнаружение антител к дсДНК способно «предсказать» развитие СКВ
еще до проявления развернутой картины заболевания. Так, при проспективном
наблюдении СКВ развивается в течение одного года после обнаружения антител
к дсДНК в радиоиммунном тесте у 70% пациентов, и только 15% таких пациентов
остаются здоровыми через 5 лет.Антитела к дсДНК направлены на фосфодиэфирный скелет молекулы, связыва¬
ние антител не зависит от ее конформации и нуклеотидной последовательности.
Взаимодействие основано на электростатических связях, которые чрезвычайно
чувствительны к pH и концентрации солей в растворе. В то же время антитела
к дсДНК (нативной) перекрестно реагируют с осДНК (денатурированной), что
затрудняет интерпретацию результатов теста, если в качестве антигена выступает
дсДНК, загрязненная осДНК. Низкоспецифичные антитела к осДНК, встречающи¬
еся при различных аутоиммунных и инфекционных заболеваниях, включая СКВ,
лекарственную волчанку, ревматоидный артрит, хронический активный гепатит
и инфекционный мононуклеоз, распознают денатурированные одноцепочечные
фрагменты дсДНК. Их способность связываться со свободными пуриновыми и
пиримидиновыми основаниями в составе дсДНК приводит к тому, что антитела
к осДНК нередко определяют в тестах, направленных на определение антител к
дсДНК. Поэтому для обнаружения антител к дсДНК, которые встречаются только
при СКВ и входят в число наиболее специфичных маркеров этого заболевания,
требуется использовать тесты, которые позволили бы выявлять связывание анти¬
тел только с дсДНК.
т
шДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ83Для определения антител к дсДНК методом ИФА сложно сохранить нативную
структуру молекулы. Молекула дсДНК несет отрицательный заряд и не может быть
непосредственно нанесена на отрицательно заряженный пластик иммунофермент-
ного планшета. Для того, чтобы нанести дсДНК на дно лунок, необходимо исполь¬
зовать положительно заряженный белок протамин. С другой стороны, облучение
дсДНК позволяет сделать ее более реактоспособной и сенсибилизировать ИФА-
планшеты. Оба этих метода сенсибилизации приводят к деспирализации дсДНК
с образованием значительного числа односпиральных молекул. Это приводит к
тому, что большинство твердофазных иммуноферментных систем для обнаруже¬
ния антител к дсДНК оказываются относительно неспецифичными. Практическим
ревматологам необходимо знать об этой особенности выявления антител к дсДНК
и с осторожностью интерпретировать низкие титры данного показателя.Для решения проблемы специфичности обследования были разработаны мето¬
ды НРИФ и радиоиммунный метод, которые обладают значительно более высо¬
кой специфичностью.Метод НРИФ основан на использовании клеток простейшего жгутикового
микроорганизма Crithidia ¡исШае, которые содержат неизмеренную молекулу
дсДНК. Этот микроорганизм относится к роду трипаносом, он неприхотлив и
хорошо поддается культивированию в лабораторных условиях. В основании жгу¬
тика имеется кинетопласт, состоящий из гигантской митохондрии, содержащей
плотно упакованную кольцевую ДНК. Эта молекула митохондриальной дсДНК без
ассоциированной РНК и нуклеопротеинов идеальный субстрат для непрямой
иммунофлюоресценции. При наличии у больного антител к дсДНК определяется
яркая флюоресценция в основании жгутика. Наличие гистонов в составе ДНК
кинетопласта может привести к ложноположительному результату у больного,
имеющего антитела к гистонам. Как и другие иммунофлюоресцентные методы,
тест с использованием С. lucilia позволяет получить только полуколичественный
результат, поэтому его целесообразно комбинировать с методом ИФА.Наилучшим методом обнаружения антител к дсДНК считают метод радиоим-
мунного анализа, известного как тест Фарра (Farr test). Метод Фарра относится к
классическим методам, с помощью которых исследуют аффинность связывания
антитела с антигеном. Реакция связывания антител с дсДНК, меченной радиоак¬
тивным изотопом, протекает в растворе, что позволяет предотвратить деспирали-
зацию ДНК. Образовавшиеся иммунные комплексы дсДНК и анти-дсДНК-антител
осаждаются с помощью насыщенного раствора сульфата аммония. Преципитат
многократно отмывается, и содержание радиоактивной метки считывают в счет¬
чике радиоактивности. Результат теста выражают либо в процентном отношении
связывания дсДНК, либо в единицах радиоактивности. Благодаря высокой точ¬
ности, тест Фарра применяют в качестве «золотого стандарта» количественного
определения антител к дсДНК. Большая часть исследований, указывающих на
роль концентраций антител к дсДНК в мониторинге активности заболевания,
выполнена с помощью радиоиммунного теста Фарра, но не всегда эти результаты
могут быть полностью подтверждены при использовании других тестов.Новое поколение ИФА тест-систем для выявления антител к дсДНК позволяет
отчасти преодолеть проблему деспирализации молекул. К примеру, для сенсибили¬
зации планшетов используют биотинилирование кольцевых плазмидных дсДНК,
в то время как дно планшетов покрывают авидином. Другой подход заключается
в обработке планшетов S^-экзонуклеазой, разрушающей односпиральные участки
ДНК. Эти подходы позволяют добиться специфичности, близкой к 90-95%. Методы
ИФА имеют чувствительность около 45%, в то время как положительный тест
Фарра отмечается у 30% обследуемых, а НРИФ на С. lucilia положителен менее чем
у 20% пациентов. Ряд практических лабораторий использует ИФА для скрининга
аутоантител, а специфичность связывания подтверждается посредством НРИФ.■Щ-ш1ш
84ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙАнтитела к дсДНК участвуют в патогенезе развития волчаночных васкулитов
и люпус-нефрита. Титры антител к дсДНК тесно коррелируют с концентрацией
IgG-содержащих циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке
крови больных СКВ. Исследования элюатов из почечных клубочков больных,
умерших от СКВ, указывают на большую концентрацию антител к дсДНК в
элюате по сравнению с их концентрацией в сыворотке. Это позволило заподо¬
зрить значение иммунных комплексов, содержащих антитела к дсДНК, в патоге¬
незе поражения почек при СКВ. Обнаружение способности дсДНК связываться
с базальной мембраной клубочка способствовало укреплению теории об имму-
нокомплексном поражении почки при СКВ, приводящем к образованию иммун¬
ных комплексов в клубочке in citu с активацией комплемента, потреблением его
сывороточных резервов и формированием воспалительных инфильтратов. У
большинства больных с активными почечными формами СКВ имеются антитела
к дсДНК. Для определения риска поражения почек рекомендуется обследование
всех больных СКВ на предмет выявления антител к дсДНК и гипокомплементе-
мии.Аффинность антител к дсДНК в сыворотке представляет собой постоянно
меняющуюся величину. Так, при обострении гломерулонефрита содержание
высокоаффинных антител в сыворотке больного весьма незначительно, однако
в элюатах из почечных клубочков содержание высокоаффинных антител очень
высоко. Во время ремиссии титры высокоаффинных антител к дсДНК в сыворотке
постепенно возрастают, их уровни максимальны непосредственно перед вспышкой
гломерулонефрита. Поэтому динамике концентрации антител к дсДНК придают
большее прогностическое значение даже по сравнению с их абсолютным содер¬
жанием, Нарастание титра антител к дсДНК (удвоение титра в течение 3 мес) и
гипокомплементемия предшествуют развитию гематурии и протеинурии в 90%
наблюдений. При выполнении биопсии почек у таких больных почти всегда обна¬
руживают наличие значительных иммуноопосредованных изменений даже при
отсутствии клинических признаков обострения. Увеличение титра анти-дсДНК-
антител в течение нескольких недель служит предвестником вспышки СКВ. Раннее
распознавание таких состояний и активная стероидная/иммуносупрессивная тера¬
пия играют существенную роль в снижении смертности и инвалидизации среди
больных с поражением почек при СКВ.У пациентов с СКВ с высоким содержанием низкоаффинных антител в методе
ИФА чаще отмечается поражение центральной нервной системы.Антитела к односпиральной ДНКАнтитела к осДНК встречаются при СКВ даже чаще, чем антитела к дсДНК,
и могут быть обнаружены приблизительно у 70% больных с СКВ. Хотя они
неспецифичны для СКВ, их обнаружение в элюатах больных, умерших от гломе¬
рулонефрита, может свидетельствовать о роли антител к осДНК в патогенезе пора¬
жения почек при волчаночном нефрите. При других заболеваниях соединительной
ткани их наличие диагностируют с похожей частотой. Антитела к осДНК могут
быть обнаружены при множестве других патологических состояний, массивной
травме, инфекциях и у клинически здоровых лиц. Высока встречаемость антител
к осДНК у онкологических пациентов, получающих цитотоксическую терапию.
Неспецифичность обнаружения этих аутоантител в значительной степени ограни¬
чивает их применение в клинической практике.Определение в сыворотке больного антител к осДНК класса IgM имеет зна¬
чение для диагностики дискоидной красной волчанки. При кожной форме вол¬
чанки, сопровождающейся образованием антител к осДНК, отмечается высокая
частота развития системного заболевания в виде генерализованной формы СКВ.
Приблизительно 20% больных с кожной формой волчанки, негативных по АНФ при
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ85проведении непрямой иммунофлюоресценции, имеют значительный титр антител к
осДНК класса IgM. Таких пациентов относят к группе «АНА-негативной СКВ».Антитела к гистонамЭти антитела реагируют с протеиновыми составляющими нуклеосом ДНК-
протеиновых комплексов. Антитела к гистонам реагируют с хроматином, диф¬
фузно распределенным в ядре клетки, что приводит к гомогенному типу свече¬
ния ядра при использовании клеток линии НЕр-2. Каждая нуклеосома состоит
приблизительно из 140 пар оснований ДНК, обернутой вокруг ядра, из белков-
гистонов Н^д, Н25, Н^ и Н^; Н^ покрывает ДНК в промежутках между нуклеосомами,
У 70% больных СКВ аутоантитела направлены на гистоны Н^ и H^g, в то время как
АНА к другим типам гистонов встречаются значительно реже.Высокие титры антител к гистонам характерны для лекарственной волчанки,
хотя эта зависимость не абсолютная. Они могут быть обнарз^жены совместно с
антителами к осДНК и использованы в целях ее диагностики, однако опреде¬
ление антител к гистонам не входит в число распространенных лабораторных
тестов. Лекарственно-индуцированная волчанка является результатом побочного
действия фармацевтических препаратов. Список препаратов, при которых была
описана лекарственная волчанка, достаточно широк. Наиболее часто синдром
лекарственной волчанки отмечается на фоне приема фенитоина, хинидина,
гидралазина, метилдопы, прокаинамида, хлорпромазина и изониазида. Синдром
характеризуется развитием люпоидноподобного заболевания с лихорадкой и
полисерозитом. Лекарственно-индуцированная волчанка протекает, как правило,
без поражения почек. Лишь при приеме D-пенициллинамина^^ описано развитие
гломерулонефрита, поражение кожи и появление антител к дсДНК. Для больных
лекарственной СКВ характерны очень высокие титры АНА, и почти у всех паци¬
ентов имеются антитела к гистонам. Отмена лекарственного препарата приводит
к постепенному снижению титров аутоантител и их исчезновению из сыворотки
крови в течение 6 мес. Это позволяет рекомендовать при дифференциальной диа¬
гностике лекарственной СКВ исследование парных титров АНФ в течение полу-
года после отмены препарата. Необходимо учитывать, что проявления васкулита
при лекарственных реакциях также могут быть обусловлены индукцией антиней¬
трофильных цитоплазматических антител (АНЦА).Антитела к гистонам в высоком титре диагностируют у больных со склеродер¬
мией, а также у пациентов с аутоиммунным гепатитом. В низких титрах возможно
их обнаружение при ревматоидном и юношеском артрите, первичном билиарном
циррозе, инфекции вирусом Эпштейна-Барр, шизофрении, сенсорных нефропа¬
тиях, моноклональных гаммапатиях и злокачественных новообразованиях. Они
часто встречаются у пожилых людей. Клинических особенностей у больных с этой
разновидностью АНА не обнаружено.Антитела к нуклеосомамНуклеосомы представляют собой универсальные структуры хроматина и явля¬
ются основной формой хранения эукариотической ДНК. Значительное содержа¬
ние циркулирующих нуклеосом обнаруживается у больных с онкологическими
заболеваниями при цитостатической терапии, при септических состояниях, а
также у больных СКВ. Предполагается, что в основе этого явления лежит индук¬
ция клеточного апоптоза. При СКВ установлен факт избыточного апоптоза ряда
клеток, в частности лимфоцитов периферической крови, эндотелиальных клеток и
кератиноцитов. При апоптозе эндонуклеазы разрывают ДНК в промежутках между
нуклеосомами, последние выделяются в кровоток. Свободная дсДНК обнаружи¬
вается в периферической крови только в составе нуклеосом. Б настоящее время
нуклеосомы рассматривают в качестве основного иммуногена, стимулирующего
1рЩ|
I86ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙиммунный ответ Т- и В-клеток при СКВ. Из пула лимфоцитов периферической
крови больных можно выделить CD'*^ клоны Т-клеток, специфичные к нуклео-
сомальным антигенам. Установлен ряд иммунодоминантных пептидов в составе
гистонов, индуцирующих пролиферативные ответы и секрецию цитокинов в куль¬
турах лимфоцитов из крови больных СКВ. При контакте антиген-специфичных
CD'^^ лимфоцитов с В-клетками в культурах in vitro наблюдается продукция
специфических антинуклеосомальных антител и антител к дсДНК. Антигены
некоторых вирусов способны ассоциироваться с нуклеосомами с образованием
иммуногенных комплексов, которые могут индуцировать бласттрансформацию
в культурах лимфоцитов периферической крови больных СКВ. Иммунизация
нуклеосомами лабораторных животных приводит к образованию АНА, антител к
ДНК, антифосфолипидных антител и появлению ряда морфологических призна¬
ков волчаночного нефрита.Антитела к нуклеосомам встречаются у 70% больных СКВ. Сравнительно редко
их обнаруживают у больных СШ и при СЗСТ (5-8%). Этот тип АНА не диагно¬
стируют у больных другими заболеваниями соединительной ткани и здоровых
доноров, что позволяет отнести антинуклеосомные антитела в разряд высокоспе¬
цифических маркеров СКВ. Высокие титры антинуклеосомных антител характер¬
ны исключительно для больных активной СКВ, сопровождающейся нефритом, их
уровень положительно коррелирует с показателями активности заболевания. При
мониторинге их содержания было установлено, что титры антител к нуклеосомам
увеличиваются непосредственно перед вспышкой заболевания параллельно с раз¬
витием гломерулонефрита. Нуклеосомы, находящиеся в крови, обладают высокой
аффинностью к гепарансульфату базальной мембраны клубочков и способны
откладываться на ней, приводя к связыванию антинуклеосомальных антител и
антител к дсДНК с последующим развитием гломерулонефрита.При использовании ИФА тест-систем к нуклеосомам чувствительность состав¬
ляет 50-60% при специфичности более 95%. Для диагностики СКВ у больных с
высокими титрами АНФ можно рекомендовать сочетанное обнаружение антител
к дсДНК и антител к нуклеосомам.Антитела к рибонуклеопротеинамАнтитела к рибонуклеопротеинам (реагируют с комплексами полипептидов и
РНК) представляют собой подсемейство АНА, включающие анти-5ш, тти-snRNP
(U^-RNP), анти-/?о/55-А, анти-Ia/SS-B. Все эти белки входят в состав сплайсо-
сом — надмолекулярных комплексов, осуществляющих перестройку мРНК. Эти
разновидности АНА суммарно встречаются при СКВ чаще, чем антитела к дсДНК.
Для всех АНА к рибонуклеопротеинам характерен гранулярный тип свечения
АНФ на клетках линии НЕр-2.Концентрация антител к рибонуклеопротеинам в сыворотке больных диф¬
фузными болезнями соединительной ткани (ДБСТ) необычайно высока. Если
антитела к дсДНК выявляются высокочувствительными методами, такими как
иммунофлюоресценция, радиоиммунопреципитация и иммуноферментный метод,
то антитела к рибонуклеопротеинам определяются специфичными, но нечувстви¬
тельными методами иммуно диффузии и контрэлектрофореза. В сыворотке боль¬
ных антитела к рибонуклеопротеинам могут присутствовать как изолированно,
так и наряду с антителами к дсДНК. Клиническое значение антител к рибопротеи-
нам сложно переоценить в связи с их прогностическим значением. Они определя¬
ют группу больных СКВ, у которых ведущим клиническим симптомом является
поражение кожи. Хотя поражения почек у этих больных не исключены, но частота
волчаночного гломерулонефрита в этой группе больных гораздо ниже, чем при
анти-дсДНК позитивной волчанке. Обнаружение рибонуклеопротеиновых АНА
при СШ указывает на вероятность экстрагландулярных симптомов заболевания.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ87а наличие U^-RNP позволяет отнести пациентов в группу смешанного заболевания
соединительной ткани.Антитела к 5л7'антигенуВ 1966 г. Тап и Kunkel описали систему S/и-антигенов, реагирующих с антитела¬
ми из сыворотки больной с фамилией Smith, 5/я-антиген образует около 9 белков,
составляющих ядро snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) — рибопротеиновых
комплексов, включающих молекулы малой ядерной РНК (snRNA), и 10 ассоции¬
рованных белков. Ядро комплекса, в которое входит 5/к-антиген, покрыто белками
U^-RNP-атшет. Антитела к белкам Sm-антигена (В/В’, D) встречаются изолиро¬
ванно, Б то время как антитела к белкам U^-RNP (70 кДа, А, С) могут встречаться
совместно с антителами к Sm. Как для антител к Sm, так и антител к UfRNP харак¬
терен гранулярный тип свечения АНФ, который требует определения конкретных
мишеней АНА с помощью уточняющих тестов.Антитела к Sm-антигену представляют высокоспецифичный, но сравнитель¬
но редко встречающийся маркер СКВ (20-30% больных СКВ). Антитела к Sm
обнаруживают у 30-40% пациентов — представителей африканской и азиатской
расы, в европейской популяции встречаемость среди больных СКВ не выше 20%.
Важность обнаружения антител к Sm-антигену при СКВ обусловлена их абсолют¬
ной специфичностью, что явилось причиной включения этой разновидности АНА,
наряду с антителами к дсДНК и LE-клетками, в классификационные критерии СКВ
Американской ассоциации ревматологов. Клиническими признаками, связанными
с наличием Sw-антител, являются прежде всего более агрессивное течение забо¬
левания, поражение ЦНС, волчаночные психозы и относительная сохранность
функции почек. Вопрос о необходимости мониторинга для прогнозирования обо¬
стрения заболевания окончательно не решен, но в связи с низкой встречаемостью
антител к Sm практически не выполняется.Антитела к snRNP {U^~RNP)Антитела к snRNP направлены против белков А, С и 70 кДа, входящих в состав
рибонуклеопротеина, содержащего Ц-малую ядерную РНК. Антитела к snRNP
встречаются приблизительно у 30% больных СКВ (табл. 17-8), причем они обычно
встречаются совместно с антителами к Sm-антигену. Изолированное обнаружение
высоких титров этих антител характерно для гетерогенной группы больных с при¬
знаками прогрессивного СС, СКВ и дерматомиозита. Это заболевание носит назва¬
ние СЗСТ {mixed connective tissue disease) или синдром Шарпа. Клиническая картина
при СЗСТ представлена разнообразными признаками склеродермии, включая
синдром Рейно, склеродактилию, нарушением моторики пищевода и фиброзирую-
щим поражением легких, миозитом, напоминающим таковой при полимиозите,
недеформирующим артритом и полисерозитом. СЗСТ характеризуется редкостью
поражения ЦНС и сохранностью функции почек, хорошим ответом на низкие
дозы глюкокортикоидов и, в целом, благоприятным прогнозом. СЗСТ представля¬
ет собой частный случай так называемых перекрестных синдромов, сочетающих
клиническую картинз»^ различных заболеваний соединительной ткани.Таблица 17-8. Диагностическое значение антител к sn-RNP {U.^-RNP)Популяция больныхКомментарийСЗСТСочетание миозита, склеродермии и волчанкиСКВЧасто развивается синдром Рейно, реже — поражение почекСиндром врожденной красной волчанки
(/^И-6локада)Ребенок от 5Я/?Л/Р-позитивной материСклеродермияОколо 5% больных позитивныПолимиозитОколо 10% больных $;?ЯЛ/Р-позитивнышщщшillшШШШ
88 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙСуществует несколько диагностических критериев СЗСТ, основным из которых
является обнаружение антител к snRNP в сыворотке крови. Однако большинство
исследователей склоняются к тому, что клинические признаки большей части
больных с антителами к snRNP удовлетворяют классификационным критериям
СКВ, однако у них наблюдаются своеобразные клинические формы ее течения.
Характерно, что у 30-50% больных СЗСТ отмечается позитивный тест волчаноч¬
ной полоски (ТВП) при иммунофлюоресцентном обследовании биопсий кожи.
Этот тест высокоспецифичен для СКВ, что лишний раз подчеркивает родство СЗСТ
и классической СКВ. У больных СКВ с антителами к snRNP обычно присутствует
синдром Рейно, признаки миозита и склеродактилия. Приблизительно у 5-10%
больных с классическими признаками прогрессивного СС и некоторых больных
с полимиозитом также присутствуют антитела к snRNP. У 5«1?^Р-позитивных
матерей наблюдается высокий риск рождения ребенка с кожными признаками
врожденного люпоидного синдрома и врожденной AV-блокады. Поражение почек
также может встречаться у больных СКВ с антителами к snRNP, хотя ее встречае¬
мость значительно ниже, чем частота поражения почек, у больных с антителами
кдсДНК.По всей видимости, СЗСТ ~ некий этап в развитии заболевания, после чего про¬
исходит трансформация в определенную клиническую форму. Антитела к snRNP
могут встречаться у больных с клинической картиной диффузной склеродермии
или полимиозита. Так, при воспалительных миопатиях антитела к snRNP обна¬
руживают приблизительно у 10% больных. У этих пациентов заболевание может
начаться с субфебрилитета, артрита и синдрома Рейно, в дальнейшем наблюдается
постепенная его прогрессия с развитием полимиозита. Схожая картина наблюда¬
ется у больных ПМ при наличии антител к Ro/SS-A, что сопровождается клиниче¬
ской картиной полимиозита, несущего черты СКВ и СШ.В свою очередь, у больных с диагнозом СЗСТ имеются антитела к осДНК, гисто¬
нам и антикардиолипиновые антитела с частотой, соответствующей таковой при
СКВ. РФ встречается приблизительно у 30% этих пациентов.Тесты, направленные на обнаружение антител к snRNP, следует выполнять всем
больным, позитивным в иммунофлюоресцентном тесте, особенно с крупнограну¬
лярным типом свечения. Поскольку нет данных, свидетельствующих об изменении
их концентрации при обострении заболевания, определение их титра в динамике
не имеет важного клинического значения. Совместно с антителами к snRNP в 50%
случаев выявляются РФ и реже — антитела к другим рибонуклеопротеинам, таким
как Sm, SS-A и SS-B, а также антитела к дсДНК и к центромерам хромосом.Антитела к snRNP способны проникать внутрь живых клеток и связываться
с внутриклеточными мишенями in vivo. При использовании метода проточной
цитометрии было показано, что антитела к snRNP способны проникнуть в ядра
половины живых клеток периферической крови, причем этот процесс не является
обычным захватом сывороточного IgG и зависит от сохранности Fc-фрагмента
молекулы иммуноглобулина. Аутоантитела могут проникать внутрь клетки путем
нарушения проницаемости клеточной мембраны либо в результате микропи-
ноцитоза иммуноглобулинов, связавшихся с антигенами, экспонированными
на поверхности клетки. В любом случае этот еще не изученный механизм про¬
никновения антител в живые клетки, доказанный также в отношении антител к
топоизомеразе-1 при склеродермии, по-видимому, играет определенную роль в
иммунопатогенезе ДБСТ.Антитела к Ro¡SS-AСывороточный фактор у больных с СШ, связывающийся с экстрактами слюн¬
ных и слезных желез, был идентифицирован под названиями Ro и La, в соответ¬
ствии с именами больных, у которых антитела были впервые выделены. Согласно
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ89современной номенклатуре, эти разновидности антител получили названия 5S-A
и SS-B (Sjogren’s syndrome А and В antigens). Антитела i?o/55-A направлены против
ядерных рибонуклеопротеинов 60 и 52 кДа, с которым связаны цитоплаз-
матические РНК, транскрибируемые РНК-полимеразой IIL Антиген SS-A при¬
сутствует в большинстве клеток человеческого организма, однако в наибольших
количествах в лимфоидных тканях, таких как тимус и селезенка. Антитела к Ко/
SS-A могут быть диагностированы всеми стандартными тестами, применяемыми
для обнаружения АНА. Контрэлектрофорез превосходит другие методы по чув¬
ствительности (в том числе ИФА) и специфичности, которая достигает 100%, и
представляет собой оптимальный метод для выявления этой разновидности АНА в
клинической практике. Если субстратом для определения АНФ служат криосрезы
печени или почек крыс, то большинство больных с антителами к iio/55-A будут
негативны при проведении непрямой иммунофлюоресценции, что входит в поня¬
тие «АНФ-негативная СКВ».Антитела к Ro/SS-A имеются приблизительно у 50% больных СКВ, 70% боль¬
ных дискоидной красной волчанкой (ДКВ), 60% больных с СШ и примерно
30-40% больных РА, Диагностически значимые титры этих антител могут встре¬
чаться у 1% здоровых женщин в возрасте 20-45 лет. Антитела к антигену массой
60 кДа сравнительно чаще вьивляют у больных СКВ, тогда как при СШ определя¬
ют антитела против обоих антигенов массами 60 и 52 кДа.Антитела к Ro/SS-A обычно встречаются в популяции больных СКВ с выра¬
женной симптоматикой фотосенситивных кожных проявлений, близких ДКВ, что
обусловливает целесообразность активного поиска антител к i?o/55-A при обсле¬
довании больных с предполагаемой СКВ с выраженными проявлениями фото¬
чувствительности (табл. 17-9). Часто такие больные описывают ожоги «сквозь
оконное стекло», что свидетельствует о фоточувствительности к низкоэнергетиче¬
ским длинноволновым ультрафиолетовым волнам. Клинические проявления при
классической СКВ, сопровождающейся присутствием антител к Ro/SS-A, включа¬
ют симптомы фоточувствительности, вторичный СШ у 10% больных, поражение
легких, лимфопению, реже — нефрит, тромбоцитопению и наличие РФ. Отмечено,
что антитела к Ro/SS-A встречаются при сравнительно позднем начале развития
СКВ после 50 лет, протекающей с вторичным СШ. Эта разновидность заболевания
характеризуется поражением легких, нейропсихическими проявлениями и реак¬
циями фоточувствительности на фоне нормальной функции почек.Таблица 17-9. Клинические формы системной красной волчанки, сопровождающиеся образова¬
нием антител к Ro/SS-A массой 60 кДаКлиническая формаКомментарийАНА-негативная волчанкаПри прицельном обследовании 75% этих больных имеют антитела к
Ro/SS-AПодострая кожная волчанкаХарактерна выраженная фоточувствительностьДо 70% больных Яо/55-Л-позитиены, нередко отмечается симптома- -тика СШВолчаноподобный синдром, свя¬
занный с недостаточностью фак¬
торов комплемента С, или С,50-75% больных flo/SS-Л-позитивны, часто обнаруживают фоточув-
ствительные поражения кожи, низкая частота встречаемости антител
кдсДНКСКВ с поздним началомНачало волчанки в возрасте 55 лет, почти 90% больных Ro/SS-A-
позитивны. Характерны кожные, нейропсихические и легочные про¬
явления СКВСКВ с СШКлинические признаки СКВ и СШ, низкая частота поражения почек,
часто — выраженная фоточувствительность и кожные высыпанияВрожденная красная волчанкаАнтитела к Ro/SS-A обнаруживают у 100% матерейМиозитУ 5% больных с поли миозитом имеются антитела к Ro/SS-A
90ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙПри классической ДКВ антитела к Ro/SS-A обнаруживают в 75% наблюдений.
У таких пациентов поражения кожи располагаются преимущественно в местах,
подвергшихся инсоляции. Они представляют собой небольшие эритематозные
папуллы или бляшки, либо замкнутые циркулярные эритематозные высыпания, У
больных ДКВ отмечают наличие мышечно-суставного синдрома, проявляющегося
артралгиями либо артритом.Антитела к Ro/SS-A определяют у 98% матерей, дети которых страдают син¬
дромом врожденной волчанки. В основе этого заболевания лежит проникновение
в кровь новорожденного через плаценту антител к Ro/SS-A. Основным признаком
врожденной волчанки является дерматоз, напоминающий ДЛЕ, и множество
системных и гематологических синдромов, включающих врожденную поперечную
AV-блокаду, гепатит, гемолитическую анемию и тромбоцитопению. Среди клини¬
ческих манифестаций врожденная атриовентрикулярная блокада — самое тяжелое
и необратимое осложнение, требует установки искусственного водителя ритма
непосредственно после рождения ребенка. Другие внесердечные проявления носят
транзиторный характер и разрешаются после 6 мес, что соответствует времени
истощения пула материнского IgG в крови ребенка. В эксперименте человеческий
иммуноглобулин, содержащий антитела Ro/SS-A, обладает прямым кардиотоксич-
ным действием в животных моделях ех vivo.Около половины матерей детей с врожденной волчанкой обычно асимптомны
во время рождения ребенка или лишь изредка имеют проявления СШ, СКВ или
СЗСТ. После рождения детей у большинства асимптомных матерей через некото¬
рое время разворачивается картина того или иного заболевания соединительной
ткани. Таким образом, все беременные с подозрением на системное заболевание
соединительной ткани должны бьггь лабораторно обследованы для выявления
группы риска врожденной красной волчанки.Установлено, что у больных СШ, имеющих антитела к Ro/SS-A, больных с позд¬
ним началом СКВ, сопровождающимся наличием Ro/SS-A-антител и признаками
вторичного СШ, а также у больных с подострой кожной волчанкой отмечается
повышенная частота встречаемости определенных аллельных форм генов главно¬
го комплекса гистосовместимости, в частности HLA-B8. DR3, DQ1/2, что может
указывать на общность генеза этих заболеваний.Антитела к La!SS-BАнтитела к 55-В-антигену встречаются приблизительно у 10-15% больных
с СКВ и примерно у 50% больных с СШ. Антитела к La/SS-B направлены на
белки массой 48 и 43 кДа, связанные с транскриптами РНК-полимеразы 3. La/
55-В-макромолекула связывает i^o/SS-A-ассоциированные РНК, т.е. в ряде
случаев La/SS-B и Ro/SS-A представляют собой один антиген. Для антитела к La/
SS-B характерен крупногранулярный тип флюоресценции АНФ на линии НЕр-2.
Антитела к La/SS-B в подавляющем большинстве случаев наблюдаются совместно
с антителами к Ro/SS-A, в то время как последние могут встречаться изолирован¬
но. Совместное обнаружение этих видов АНА является основой лабораторной
диагностики СШ и обладает высокой специфичностью при данном заболевании.СШ ~ ревматическое заболевание, поражающее слюнные и слезные железы,
приводящее к ксеростомии и ксерофтальмии. Его встречаемость у лиц 50-70-
летнего возраста достигает 5% всей популяции, в подавляющем большинстве СШ
поражает женщин. Часто СШ сопровождается экстрагландулярными проявле¬
ниями, такими как васкулиты, а также на его фоне нередко отмечается развитие
лимфом. Первичный СШ встречается изолированно, но признаки СШ обнару¬
живаются при РА, СКВ и других аутоиммунных заболеваниях в виде сочетания
ксеростомии и ксерофтальмии.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 91Предполагается, что антигены Ro/SS-A и La/SS-B концентрируются на поверх¬
ности клеток эпителия конъюнктивы и желез у больных СШ. Сходное распреде¬
ление этих антигенов отмечается в клетках перевиваемых линий, пораженных
ретровирусами, что позволяет с определенной уверенностью предполагать вирус¬
ную этиологию данного заболевания. У больных с антителами к La/SS-B отмечает¬
ся выраженная инфильтрация слюнных желез иммуноглобулин-секретирующими
В-клетками, синтезирующими аутоантитела. Хотя данных за непофедственное
цитопатическое действие АНА при СШ не получено, слюнные железы, без сомне¬
ния, являются основным местом продукции аутоантител, участвующих в образо¬
вании ЦИК и развитии иммунокомплексной патологии.Если антитела к i?o/55-A встречаются при разных аутоиммунных заболеваниях,
то La/SS-B обычно указывают на наличие у больного СШ. Антитела к La/SS-B
крайне редко встречаются при СКВ, протекающей с выраженными проявлениями
вторичного СШ и сравнительной сохранностью функции почек. Комбинация Ro/
SS-A и La/SS-B нередко отмечается в сочетании с высокими титрами РФ, гипер-
гаммаглобулинемией и криоглобулинемией. Для больных с антителами к Ro/
SS-A и La/SS~B характерно раннее начало и большая длительность заболевания,
выраженное увеличение околоушных слюнных желез и значительная степень
лимфоцитарной инфильтрации слюнных желез. Титр антител к Ro/SS-A и La/SS-B
коррелирует со степенью лимфоцитарной инфильтрации малых желез. Их обнару¬
жение у больного СШ может прогнозировать развитие таких экстрагландулярных
проявлений заболевания, как васкулит, лимфаденопатия, спленомегалия, анемия
и лейкопения. Таким образом, антитела к Ro/SS-A и La/SS-B отражают выражен¬
ность патологического процесса при СШ и риск развития экстрагландулярных
проявлений. Однако обнаружение Ro/SS-A и La/SS-B при СШ характеризуется
сравнительно низкой чувствительностью.Существенное значение в диагностике СШ играет определение антител к про¬
токам слюнных желез, которые встречаются у 50-90% больных СШ. Эти антитела
реагируют с цитоплазмой эпителиальной клетки. Для их обнаружения применяют
метод НРИФ с использованием в качестве субстрата аутопсийных человеческих
тканей. Обычно у больного СШ, наряду с антителами к протокам, имеются анти¬
тела к Ro/SS-A, La/SS-B, РФ и другие разновидности АНА.Среди признаков аутоиммунного процесса при СШ характерно наличие антител
к париетальным клеткам слизистой оболочки желудка, нейтрофильным цитоплаз¬
матическим антигенам и антител к митохондриям, что связано с поликлональной
активацией В-клеточного звена иммунитета, индуцирующей образование аутоа¬
грессивных клонов плазмоцитов. Пшерстимуляция В-клеток при СШ является
причиной частого возникновения лимфопролиферативной патологии. Признаки
моноклональной В-клеточной пролиферации в виде образования моноклональ¬
ного иммуноглобулина отмечают у 60% больных с экстрагландулярными прояв¬
лениями СШ и практически у всех больных обнаруживают свободные легкие цепи
иммуноглобулинов в моче.Антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA)Антитела к PCNA-1 (proliferating cell nuclear antigen 1) взаимодействуют с белком
циклином массой 36 к Да, участвующим в контроле клеточного цикла. Этот белок
появляется в клетке перед митозом и подвергается деградации после деления.
Антитела при СКВ дают характерное гранулярное окрашивание митотических
клеток и характерную линию иммунопреципитации в геле. В экспериментах in vitro
антитела к PCNA способны ингибировать синтез ДНК в митотических клетках, что
указывает на их возможное патогенетическое значение при СКВ.Данную группу антител обнаруживают у 3-5% больных СКВ. Они могут встре¬
чаться при РА, при других ревматических заболеваниях их не диагностируют.
92ДИАГНОСТИКА АШИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙУ больных СКВ с антителами к PCNA, наряду с типичными признаками волчан¬
ки. выявляется диффузно-пролиферативный гломерулонефрит, поражение ЦНС
и тромбоцитопения. Характерно, что у больных с нейропатией и антителами
к PCNA-1 нет антител к дсДНК. Мониторинг содержания антител показал, что
увеличение титра антител к PCNA-1 сопутствует обострению гломерулонефрита,
стероидная терапия снижает их титр. У больных волчанкой отмечают увеличение
экспрессии PCNA-1 на мононуклеарах крови, преимущественно на сЬ"^' и CD®^-
клетках. Процентное соотношение PCNA-1-позитивных клеток коррелирует с
активностью заболевания.Антитела к рибосомам и рибосомальному белку Р (RiboP)Рибосомы являются цитоплазматическими органеллами, однако антитела к ним
причисляют к семейству АНА. Рибосомы — органеллы, состоящие из комплексов
белков и нуклеиновых кислот, их основная функция заключается в синтезе белка
на основании последовательности матричной РНК. При СКВ основными антиге¬
нами служат фосфопротеиновые компоненты рибосом, прежде всего рибосомаль-
ные белки Рц, Р^ и Pj. Антитела к рибосомам могут выявляться при использовании
флюоресцентного теста и характеризуются типичным свечением цитоплазмы
клетки. Иногда цитоплазматическое свечение может быть пропущено, больные
могут попадать в группу «АНФ-негативной СКВ», что требует более детального
обследования для обнаружения этой разновидности АНА.Антитела к рибосомальному белку Р высокоспецифичны для СКВ, имеются у
10-20% больных. Антитела к рибосомам часто встречаются совместно с антитела¬
ми к Sw-антигену. Антирибосомальные антитела обнаруживают преимущественно
у больных с обострением СКВ, с поражением ЦНС, особенно при волчаночном
психозе и депрессии, встречаемость антирибосомальных антител при этих состоя¬
ниях составляет 50-80%. В диагностике поражения ЦНС при СКВ выявление
антител к рибосомальному белку Р целесообразно дополнять исследованием
ликвора для обнаружения олигоклонального IgG, который отражает иммуноо-
посредованное воспаление в ЦНС. Определение этих антител позволяет отличить
поражение ЦНС на фоне СКВ от психоза, вызванного приемом высоких доз кор¬
тикостероидных гормонов.Другие клинико-лабораторные взаимосвязи между обнаружением антител к
рибосомам и клинической картиной СКВ включают развитие дискоидных высы¬
паний, фоточувствительность и афтозный стоматит, поражение печени у пациен¬
тов с высокими титрами антирибосомальных антител.Антитела к Ки/Кі и антитела к МАт-антигенуАнтитела к Ки (Ki) взаимодействуют с белками ядерного матрикса массой 70 и
80 к Да, Они были впервые обнаружены у больных с перекрестным синдромом с
проявлениями полимиозита и склеродермии. Эти антитела встречаются у 10-40%
населения европейской популяции больных СКВ, причем в высоких титрах, пре¬
вышающих 1:10 ООО. Их наличие диагностируют при СЗСТ, склеродермии и зна¬
чительно реже ~ при полимиозите, РА, СШ, болезни Грейвса (30%) и первичной
легочной гипертензии (20%). Антитела к МАт направлены на н)Т{леарный кислый
антиген, чувствительный к протеолизу под воздействием трипсина, но устойчивый
к РНКазе и ДНКазе. Эта разновидность АНА встречается у 3-18% больных СКВ,
возможно, у больных с более активным течением заболевания.Антитела к антигену Scl-70 (топоизомеразе-1)При СС основной разновидностью АНА являются аутоантитела против анти¬
гена 5с/-70, Эти антитела имеют основной мишенью топоизомеразу-І массой
70 к Да. Топоизомераза представляет собой один из ферментов, участвующих в
механизмах деспирализации суперскрученной ДНК, необходимой для транс¬
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 93крипции генов. Антигенная структура топоизомеразы хорошо изучена, основным
антигеном, который используют в методах ИФА и иммуноблота, является реком¬
бинантный белок. Любой метод, применяемый для обнаружения антител к Scl-70,
может быть подтвержден непрямой иммунофлюоресценцией на клетках НЕр-2,
благодаря характерному двойному типу свечения, включаюш1ему мелкогрануляр¬
ный и ядрышковый тип флюоресценции. Это обусловливает целесообразность
определения АНФ в качестве скринингового теста перед определением антител к
Scl-70.Антитела к Scl-70 представлены иммуноглобулинами классов IgG и IgA, однако
рутинные лабораторные тесты позволяют обнаружить преимущественно антитела
класса IgG. Антитела к топоизомеразе встречаются при диффузной склеродермии
с поражением внутренних органов (СС), однако их наличие не исключает присут¬
ствия перекрестных синдромов склеродермии с СКВ или СШ. Антитела к Scl-70
присутствуют у 70% больных СС, у 30% больных диффузной склеродермией и у
10% больных с локализованными формами этого заболевания. В единичных слу¬
чаях могут встречаться у онкологических больных без признаков СС или склеро¬
дермии. У больных с диффузной склеродермией с антителами к Sc/-70 чаще встре¬
чаются рубцовые изменения на коже пальцев, развитие центрального склероза и
поражение почек и сердца.Антитела к центромерамОсновным антигеном является центромерный белок CENP-B, который входит
в состав центромер — частей хромосомы эукариот, необходимых для образования
веретена деления при митозе. Ткани лабораторных ж^гаотных слабо экспресси¬
руют антигены центромерных антител, поэтому АНФ на клеточной линии НЕр-2
является основным методом обнаружения этих антител в клинической практике.
Антитела к центромерам хорошо визуализируются на HEp-2-клегках благодаря
свечению в делящихся клетках, в которых хромосомы компактны. Если хромосомы
находятся в стадии спирализации, в ядре клетки флюоресцируют мелкие гранулы
либо наблюдается картина веретена деления, подчеркнутого свечением центро¬
мер. Антицентромерные антитела обнаруживают в высоких титрах при использо¬
вании линии НЕр-2, для которых типична большая частота клеточных делений.
Иммуноблотгинг имеет лишь незначительные преимущества в связи с большей объ¬
ективизацией результатов теста. Антитела к центромерам и антитела к Scl-70 редко
встречаются совместно, Иммуноблотгинг показывает, что в 10% случаев у больных
с Scl-70 также имеются антицентромерные антитела. Часто у этих больных диагно¬
стируют Ro/SS-A и La/SS-B, PM-Scl, антимитохондриальные антитела.Антитела к центромерам являются серологическим маркером CREST-синдрома,
представляющего собой сравнительно доброкачественную форму диффузной
склеродермии, которая характеризуется подкожными кальцинатами, синдромом
Рейно, эзофагитом, склеродактилией и телеангиэктазиями на коже туловища.
Титры антител к центромерам не отражают активности заболевания. Антитела
к центромерам выявляют у 50% больных с CREST, у 20% больных с СС и у
10% больных с изолированным синдромом Рейно. В этой группе пациентов
присутствуют типичные клинические признаки CREST-синдрома: отсутствие
рубцовых контрактур пальцев, более выраженный отек пальцев (по сравнению
со склерозом), кальциноз фасций и сухожилий. Больные с антителами к центро¬
мерам старше, длительность заболевания у них обычно больше, чем у больных со
склеродермией без этих антител. Это связывают с тем, что у таких больных реже
отмечается поражение внутренних органов, реже встречаются атрофические про¬
цессы на коже, но часто присутствует кальциноз и ишемическая гангрена пальцев
кисти. Практически у всех больных с антицентромерными антителами имеется
выраженный синдром Рейно.
94 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙАнтицентромерные антитела присутствуют в сыворотке 20% больных с идио-
патическим синдромом Рейно, сопровождающимся артралгиями. У половины
из них через несколько лет развивается полная клиническая картина склеродер¬
мии. Таким образом, антицентромерные антитела могут служить предвестником
склеродермии и могут быть использованы при дифференциальной диагностике
синдрома Рейно. Антицентромерные антитела не выявляют у здоровых лиц даже в
низких титрах, что позволяет рассматривать их обнаружение как предиктор разви¬
тия заболевания. Патогенетическая роль аутоантител при склеродермии остается
под вопросом, изменения их титра не отражаются на активности аутоиммунного
процесса, однако указывают на определенные клинические проявления этого
заболевания.Антитела к центромерам изредка встречаются при ряде других заболеваний,
сопровождающихся синдромом Рейно: СКВ, РА, тиреоидите Хашимото, первич¬
ном билиарном циррозе.Антитела к PM-Sei и другим антигенам ядрышкаАНА, направленные против компонентов ядрышка, таких как PM-Scl, U^-RNP
(фибрилларин), РНК-полимераза I, A?OjR90,часто обнаруживают при СС. Основным
методом обнаружения этих разновидностей АНА является прицельное определе¬
ние АНФ с ядрышковым типом свечения.Антитела к PM-Scl-шттеиу обнаруживают при сочетании клинических
признаков СС и ПМ, Эта разновидность АНА направлена к антигенной системе
ядрышка, включающей более 16 белков с молекулярным весом от 20 до 110 кДа.
В случае наличия антител к PM/Scl приблизительно у 50% больных имеет место
сочетание миозита и СС, реже антитела встречаются на фоне классической кар¬
тины ПМ или СС. Это сочетание получило название «склеромиозит», характе¬
ризующийся миозитом и миалгиями в сочетании с кожными признаками дерма-
томиозита (периорбйтальным отеком и папулами Готрона), наряду с синдромом
Рейно, склеродактилией и интерстициальным пневмонитом. У больных с анти¬
телами к PM-Scl высок риск идиопатической легочной гипертензии, что приводит
к быстрой декомпенсации пациентов, поэтому такие больные требуют особого
внимания при оценке функции легких.Антитела к РНК-полимеразам I, II и III встречаются у 20% больных с СС,
CREST и другими перекрестными синдромами. В иммунофлюоресцентном тесте
отмечают своеобразный точечный ядрышковый тип свечения. Их обнаруживают
изолированно, без антител к центромерам и Scl-70. Антитела к полимеразам свя¬
заны с диффузным поражением кожи и внутренних органов, в том числе сердца и
почек.Антитела к фибриллярину {U.^snoRNP) — одному из основных ядрышко¬
вых рибонуклеопротеинов — диагностируют у 6-8% больных склеродермией.
Иммунофлюоресценция фиксирует антйядрышковый тип свечения со значитель¬
ной конденсацией и интенсивным свечением хроматина в клетках, находящихся в
процессе митоза. Антитела к фибриллярину встречаются у больных с агрессивным
прогрессирующим системным склерозом с вовлечением внутренних органов, в
том числе с поражением тонкого кишечника, легочной гипертензией, миозитом, и
указывают на неблагоприятный прогноз.Антитела к РНКазе {RNAse MPR, Th snoRNP) направлены на один из ядрыш¬
ковых рибонуклеопротеинов, связанных с процессингом митохондриальной РНК.
Они встречаются у 4-11% больных склеродермией. Их присутствие в сыворотке
типично для поражения тонкого кишечника, гипотиреоза, артрита и локализован¬
ной кожной формы склеродермии.Антитела к NOR90 взаимодействуют с белком массой 90 кДа, компонентом
ядрышкового организатора, участвующим в сборке ядрышка после митоза. При
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ95выявлении АНФ в ядре обнаруживают 10-20 мелких дискретных точек, причем
интенсивность окраски меняется в зависимости от фазы жизненного цикла клетки.
Этот тип АНА неспецифичен при склеродермии и встречается при СКВ, РА, неко¬
торых формах онкологических заболеваний.Миозит-специфические антинуклеарные антитела: антитела к тРНК-синтетазам
(анти-Jo-1, PL-7, PL-12, EJ и 0J), антитела к Mi-2 антигену, SRP и р56Заболевания, характеризующиеся воспалительным миозитом, представляют
полиморфную группу, характеризующуюся цитотоксическим ответом к компонен¬
там поперечнополосатой мускулатуры. Их часто объединяют под названием «вос¬
палительные миопатии». Среди наиболее часто выявляемых заболеваний, отно¬
сящихся к воспалительным миопатиям, вьвделяют классический дерматомиозит,
миозит в рамках перекрестных синдромов, полимиозит и паранеопласгический
полимиозит, а также миозит с внутриклеточными включениями.Конкретные разновидности АНА при ПМ/ДМ условно подразделяют на миозит-
специфичные и миозит-ассоциированные, т.е. АНА, которые встречаются также
при других формах ДБСТ в рамках перекрестных синдромов. 1Слассификация
аутоантител при миозите приведена в табл. 17-10. При воспалительных миопа¬
тиях миозит-специфические антитела могут быть обнаружены в 40% случаев, в
то время как миозит-ассоциированные АНА обнаруживают у 20-30% больных.
Общая частота встречаемости АНА даже при развернутых формах с классической
картиной полимиозита не превышает 60%.Таблица 17-10. Классификация антинуклеарных антител при воспалительных миопатияхРазновидности АНА% обнару¬
женияКомментарийМиозит-специфическиеантителаАнтитела к тРНК-
синтетазам (Jo-1. PL-7,
PL~^2. EJ \л 0J)25Маркеры «антисинтетазного синдрома»,
сочетающего характерные кожные и систем¬
ные проявленияАнтитела к белку Mi-210Встречаются при классическом дерматомио¬
зите с выраженными кожными проявлениямиАнтитела к компонентам
сигналраспознающей
частицы SRP3Характерно тяжелое течение полимиозита с
поражением дыхательных мышц и миокар¬
дитомМиозит-ассоциированныеантителаАнтитела к PM-Scl10Встречаются у больных с перекрестным син¬
дромом, объединяющим признаки диффуз¬
ной склеродермии и полимиозитаАнтитела к U^-HNP10Маркер СЗСТАнтитела к SS-Л30К семейству миозит-спефицифических АНА относят 3 основные разновидности
аутоантител: антитела к аминоацил-тРНК-синтетазам, антитела к белку М-2 и
антитела к компонентам сигнал-распознающей частицы SRP.Алтисинтетазные антитела — наиболее обширное семейство миозит-
специфических аутоантител, насчитывает 5 основных представителей; Jo-1, PI-7,
PL-12, EJ и OJ, которые совместно встречаются у 20-30% больных ДМ/ПМ.
Антитела, взаимодействующие с /о-1-антигеном, обнаруживают в несколько раз
чаще, чем другие антисинтетазные антитела. Эти антитела реагируют с гистидил-
тРНК-синтетазой; остальные антисинтетазные антитела направлены против
4-х различных типов тРНК-синтетаз: треониновой, аланиновой, глициновой, изо-
лейциновой. Антитела Jo-1 выявляют при использовании контрэлектрофореза и
ИФА, что позволяет широко применять определение этого типа АНА в лабора¬
торной практике. Контрэлектрофорез обладает достаточной чувствительностью и
специфичностью для рутинной работы. Хотя антисинтетазные антитела не вклю¬
чены в классификационные критерии ДМ, их обнаружение при соответствующей
96ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙклинической картине с высокой достоверностью подтверждает диагноз и, в ряде
слз^аев, делает ненужной биопсию ткани. Поскольку антитела к тРНК-синтетазам
обладают низкой чувствительностью при ДМ/ПМ, их отсутствие не может опро¬
вергнуть диагноз ДМ или ПМ. Антитела к Jo-1 имеются у 15-20% больных ДМ/
ПМ, Предполагают, что более широкое внедрение тестирования в отношении дру¬
гих антисинтетазных антител может удвоить эту цифру.У всех больных с антисинтетазными антителами наблюдают очень сходную
клиническую картину, что привело к выделению особой клинико-лабораторной
рубрики — так называемого антисинтетазного синдрома, одной из разновидностей
перекрестных синдромов. Он характеризуется клинической картиной дермато¬
миозита, но протекает более активно и требует назначения активной иммуносу-
прессивной терапии. Около 90% больных с антисинтетазным синдромом страдают
симметричным полиартритом, часто отмечается синдром Рейно. Для этих боль¬
ных характерна особая форма поражения кожи, так называемая рука механика, с
гиперпигментацией, гиперкератозом и трещинами по латеральным и пальмарной
поверхностям пальцев, напоминающая забитые грязью складки на коже рабочего.
Интерстициальное поражение легких или фиброзирующий альвеолит присут¬
ствуют у 50-75% больных с антителами к тРНК-синтетазам. Приблизительно у
1/5 больных с антисинтетазными антителами отмечают признаки другого забо¬
левания соединительной ткани. Больные с антисинтетазными антителами хуже
поддаются терапии, и у них чаще возникают обострения при снижении доз имму-
носупрессивных препаратов.Антитела к Mi-2-антигену реагируют с ядерным антигеном, входящим в
состав ЭНА. Антитела к Mi-2 являются наиболее специфичным серологическим
маркером ДМ, а также встречаются при ювенильном ДМ. Эта разновидность АНА
может быть обнаружена благодаря гомогенному типу свечения АНФ. Данный тип
АНА обнаруживают у 10-20% больных ДМ с выраженными признаками пораже¬
ния кожи. У таких больных наблюдают в целом благоприятное течение заболева¬
ния и хороший ответ на иммуносупрессивную терапию.Антифосфолипидные антителаЛОЖНОПОЛОЖИТЕЛЬНАЯ РЕАКЦИЯ ВАССЕРМАНА ПРИ АНТИФОСФОЛИПИДНОМ
СИНДРОМЕПервым методом обнаружения антифосфолипрщных антител стал серологи¬
ческий тест для диагностики сифилиса, который был разработан Вассерманом в
1906 г. Основным антигеном экстракта бычьих сердец, требуемым для проведе¬
ния реакции Вассермана (РВ), является фосфолипид, который выделен и назван
кардиолипином. Активное внедрение РВ для серодиагностики сифилиса приве¬
ло к тому, что была вьщелена категория пациентов с положительной реакцией,
однако признаков сифилиса у них не отмечалось. В то же время у этой категории
лиц с ложноположительным серологическим тестом была отмечена повышенная
частота встречаемости аутоиммунных заболеваний, прежде всего ДБСТ и СШ.
Этот феномен получил название «биологически ложноположительный тест на
сифилис«».Одновременно с ложноположительной РВ при СКВ в крови этих пациентов был
обнаружен сывороточный фактор, который препятствовал свертыванию крови и
получил название «волчаночный антикоагулянт». Волчаночный антикоагулянт
(ВА) отсутствовал в плазме больных сифилисом и часто отмечался у пациентов с
СКВ, У больных с В А был установлен характерный набор клинических признаков,
среди которых ведущими являются тромбозы артерий и вен, повторные выкиды¬
ши и тромбоцитопения, составляющие симптомокомплекс ант1^фосфолипидного
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИИ 97синдрома (АФС). Интерес к диагностике этого аутоиммунного заболевания зна¬
чительно возрос в связи с разработкой тестов для выявления антифосфолипидных
антител (АФА).АНТИТЕЛА К ФОСФОЛИПИДАМ И АНТИТЕЛА К КАРДИОЛИПИНУАФС представляет собой аутоиммунное нарушение коагуляции, составляющее
основную причину тромбозов у молодых людей и одну из ведущих причин при¬
вычного невынашивания беременности. В основе АФС лежит образование АФА,
представляющих собой гетерогенную популяцию иммуноглобулинов, взаимодей-
ствзгющих с отрицательно заряженными, реже — с нейтральными фосфолипидами.
Эти антитела in vitro нарушают образование протромбинового комплекса (про-
тромбиназы), который состоит из фактора X, фактора V, фосфолипидов и кальция,
что приводит к гипокоагуляции и удлинению времени основных коагуляционных
тестов. При этом in vivo у больных АФС имеет место усиленное тромбообразование.Нарушение функции протромбинового комплекса ведет к развитию тромбо¬
тического состояния с изменением сосудисто-тромбоцитарного гемостаза и хро¬
ническим потреблением факторов коагуляции, напоминающего ДВС-синдром.
При АФС тромбоз происходит на фоне обезвоживания, инфекции или венозного
застоя. Помимо коагулопатии, АФС сопровождается нарушениями микроциркуля¬
ции, проявляющимися язвами кожи, микроангиопатией почек, кожным ливедо.Название «антифосфолипидные антитела» не отражает самой сущности взаи¬
модействия антифосфолипидных антител со своими антигенами, в котором наряду
с фосфолипидами важную роль играют белковые кофакторы этих аутоантител,
одним из которых является |3^-ГЛИК0Пр0ТеИН-1 (fij-rn). Другими белковыми
кофакторами фосфолипидов могут быть протромбин, тромбомодулин, протеи¬
ны С и S, фактор XI, аннексии V, кининоген, мембранные белки тромбоцитов
и эндотелиоцитов. кроме того, антикардиолипиновые антитела (АКЛА) пере¬
крестно реагируют с фосфатидилсерином и другими отрицательно заряженными
фосфолипидами, антителами к тромбоцитам, антителами к окисленным липопро-
теидам низкой плотности и с протромбином. Таким образом, АФА реагируют с
гетерогенной грз'^ппой фосфолипидов и белковых антигенов сосудистого русла.Предпочтительным тестом для обнаружения АКЛА служит метод ИФА. При
детекции АКЛА обязательным является наличие в тестируемом фосфолипидном
субстрате Рз'ГП, который представляет собой белковый кофактор. Обычно он при¬
сутствует в составе буферов для разведения сыворотки больных. С методической
точки зрения, метод определения АКЛА для диагностики АФС более корректно
было бь[ называть с[З^-ГП-зависимые антикардиолипиновые антитела^», поскольку
действительной мишенью аутоантител является неоантиген, образующийся при
взаимодействии кардиолипина и р^-ГП,АКЛА имеют несомненное патогенетическое значение в развитии коагулопатии.
В культурах АКЛА стимулируют выработку внутреннего фактора макрофагами.
АКЛА реагируют с тромбоцитами с их активацией, являются причиной тромбоци-
топений у большинства больных АФС. АКЛА активируют эндотелиальные клетки
с экспрессией факторов адгезии. Под действием АКЛА снижается антикоагулянт-
ная активность протеина С. Наконец, АКЛА увеличивают частичное тромбопла¬
стиновое время ш vitro — феномен, известный под названием «волчаночный анти¬
коагулянт». В качестве антигена могут быть использованы другие отрицательно
заряженные фосфолипиды, в частности фосфатидилсерин или фосфатидилино-
зитол. Кардиолипин (дифосфатидил-глицерол) имеет значительную структурную
гомологию с другими фосфолипидами, поэтому в случае, если отсутствуют АКЛА,
обычно отсутствуют другие АФА. Целесообразность определения антител к другим
представителям фосфолипидов (фосфатидилэтаноламину и протромбину) в прак¬
тической диагностике пока не доказана.
98 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙОпределение АКЛА более стандартизовано по сравнению с другими АФА; соз-
даны стандарты сывороток, содержащих АКЛА. Иногда эти стандарты называют
стандартами Harris, по имени ученого, который разработал единицы GPL для
АКЛА класса IgG и единицы MPL для АКЛА IgM. Одна единица представляет
связывающую активность 1 мкг аффинно очищенных поликлональных АКЛА.
Вторичный стандарт калибруется против первичных стандартов. Аутоантитела
каждого класса можно определять независимо друг от друга. Результаты обследо¬
вания интерпретируют с помощью градации на низкие (менее 40 единиц), средние
(от 40 до 80 единиц) и высокие (более 80 единиц) титры антител. АКЛА могут
быть обнаружены как в сыворотке, так и в плазме крови. Положительный резуль¬
тат определяется при среднем или высоком их титре, т.е, при титре более 40 GPL
и MPL единиц. Наличие гетерогенных поликлональных АКЛА от различных
пациентов в стандартах приводит к различиям между коммерческими наборами.
Инактивация комплемента нагреванием может приводить к получению ложно¬
положительных результатов, а повторное замораживание приводит к снижению
титров аутоантител. Согласно лабораторным классификационным критериям
АФС, пациент должен быть «положительным» как минимум по одному из тестов
(кардиолипину, (З^-ГП-Х или В А) при повторном определении по меньшей мере
через 12 нед. Наличие постоянно повышенных АКЛА в титре более 60 GPL может
предсказать присутствие у пациента В А и положительных результатов при иссле¬
довании на наличие антител к Р2'ГП-1.Подавляющее число тест-систем для обнаружения АКЛА на отечественном
рынке по-прежнему калибровано в единицах Harris. Очевидны недостатки единиц
Harris для стандартизации тест-систем. Фактически реактивы разных производи¬
телей представляют собой разные методы, результаты которых сложно сопоста¬
вить друг с другом. Для преодоления этих расхождений были предложены новые
стандарты АЮ1А, основанные на моноклональных очеловеченных антителах
HCAL и EY2C9.АКЛА в низких и средних титрах определяют у 30-40% пациентов с СКВ, что
позволяет использовать их в качестве одного из серологических маркеров этого
заболевания. Их выявление не коррелирует с возрастом больных, длительностью
заболевания или особыми чертами его течения, включая наличие полиартрита,
серозита или васкулита. В то же время наличие высоких титров АКЛА указывает
на риск развития вторичного АФС у больного СКВ. Однако СКВ не единственное
ревматологическое заболевание, сопровождающееся АКЛА. Сравнительно часто
АКЛА диагностируют у больных СС, васкулитами и васкулитоподобными состоя¬
ниями, например при синдроме Бехчета и болезни Крона. При отсутствии ДБСТ
заболевание рассматривают как первичный АФС.АКЛА, относящиеся к изотипу IgG2, как правило, имеют максимальный титр
непосредственно перед развитием тромбоза и несколько снижаются сразу после
его возникновения, что свидетельствует об их потреблении в процессе К0аГ}ШЯЦИИ.
Увеличение титра АКЛА при развитии клинической картины тромбоза указывает
на АФС. В то же время АКЛА являются одними из наиболее распространенных
аутоантител, присутствующих у клинически здоровых лиц. Частота их обнару¬
жения значительно выше частоты обнаружения АФС. Значимые концентрации
АКЛА возникают на фоне широкого ряда инфекционных заболеваний. Среди
наиболее частых индукторов АКЛА известны инфекции вирусами гепатита С,
ВИЧ, Эпштейна-Барр, парвовирусом В^^,, аденовирусом, стрептококком, спирохе¬
тами, хеликобактером, сальмонеллами, лептоспирами, токсоплазмой. Обычно при
инфекциях появляются АКЛА класса IgM в низком титре, который плавно сни¬
жается после выздоровления. Это требует повторных определений АКЛА с пере¬
рывом в 1,5 мес, что соответствует времени обновления пула иммуноглобулинов
сыворотки. Онкологические заболевания, хронические интоксикации, в том числе
«iДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 99алкоголизм, индуцируют образование АКЛА, что обусловливает сложность интер¬
претации этого показателя. При этом не находят антител к З^-ГП-! и не бывает
зафиксировано тромбозов.АНТИТЕЛА К Р^-ГЛИК0ПР0ТЕИНУ-1Pj-rn-l представляет собой гликозилированный белок плазмы крови, содержа¬
ние которого в норме составляет 150-300 мкг/мл. Он обладает антикоагулянтной
активностью, способен связываться с апоптотическими тельцами и у^1аствует в их
клиренсе из кровотока. Определение антител к Pj-rn-l было в 2006 г, включено
в лабораторные классификационные критерии АФС. рд-ГП-Х обладает непрямой
антикоагулянтной активностью за счет ингибирования протромбинового ком¬
плекса и подавления активации тромбоцитов. Большую роль отводят р^-ГП-1 в
фагоцитозе апоптотических клеток и окисленных липопротеинов. При иммуни¬
зации лабораторных животных р2"ГП происходит образование АФА, в результате
часто возникает резорбция плода, тромбоцитопения и увеличение активированно¬
го частичного тромбопластинового времени (АЧТВ).Антитела к p.-FH-l распознают исключительно человеческий белок и встреча¬
ются у 70-80% больных с АФС. Антитела к p^-rü-l низкоаффинны, их содержа¬
ние обычно невелико. Связывание Р,-ГП-1 на пластике ИФА-планшета приводит к
экспозиции скрытых эпитопов. Одной из основных проблем использования этого
маркера являются недостаточно сопоставимые результаты обследования, связан¬
ные с отсутствием стандартизованных калибраторов. Коммерческие наборы кали¬
бруются собственными калибраторами производителей, и результаты выражаются
в произвольных единицах. Несмотря на отс}'тсгвие стандартизации, в выявлении
антител к Pj-rn наблюдается лучший межлабораторный консенсус относительно
точности этой методики по фавнению с определением АКЛА. На сегодняшний
день определение антител к р^-ГП-1 — полноправный лабораторный метод диа¬
гностики АФС.ВОЛЧАНОЧНЫЙ АНТИКОАГУЛЯНТАФА индуцируют тромбозы in vivo, но in vitro они приводят к замедлению
фосфолипид-зависимых коагуляционных тестов, прежде всего АЧТВ, и, в меньшей
степени, протромбинового времени. Выявление ВА — функциональный тест, кото¬
рый позволяет оценить действие антител на каскад коагуляции, которые, в свою
очередь, предупреждая коагуляцию in vitro, сами ассоциируются с тромбозом.Коагулогические тесты для обнаружения ВА подразделяют на скрининговые,
коррекционные и подтверждаюш[ие. Крайне важно соблюдение точности на преа-
налитическом этапе методики, поскольку присутствие тромбоцитов в исследуемой
плазме (они являются эндогенным источником фосфолипидов) может привести к
получению ложноотрицательных результатов теста.в качестве скрининговых тестов используют АЧТВ с фосфолипид-зависимым
субстратом, коалиновое время свертывания и тест с ядом гадюки Рассела.
Положительным результатом считают удлинение фосфолипид-зависимого вре¬
мени свертывания крови свыше нормы. Необходимо использование, по крайней
мере, двух коагуляционных тестов. В случае, если оба или хотя бы один из них ука¬
зывает на наличие ВА, необходимо выполнить коррекционный (смешанный) тест,
т.е. повторить тест с добавлением плазмы здорового донора в соотношении 1:1.Если удлинение времени свертывания есть результат недостаточности факторов
коагуляции, оно будет скорректировано до нормальных значений, в то время как
при наличии ВА коррекции не произойдет. Отсутствие коррекционного действия
плазмы здорового донора на время свертывания позволяет отличить действие ВА
от дефицита факторов свертывания.
100 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙПрисутствие у больного специфического ВА, зависимого от фосфолипидов,
и отсутствие в сыворотке других ингибиторов коагуляции проводят подтверж¬
дающим тестом с добавлением избытка фосфолипидов, в качестве источника фос¬
фолипидов применяют разрушенные повторным замораживанием-оттаиванием
отмытые тромбоциты, либо модифицированный аРТТ-реагент, в котором содер¬
жится нейтральный фосфолипид в гексагональной форме, специфически связы¬
вающий ВА.Имеются значительные межлабораторные вариации в выполнении данного
типа исследований, поэтому референсные значения должны быть установлены
для каждого метода определения ВА и для каждого коагулометра. Независимо
от выбранных методов тестирования при определении ВА важно проведение
внутреннего лабораторного контроля качества с положительным и отрицатель¬
ным ВА-контролем для каждой партии реагентов. Стандартизация определения
ВА — насущная потребность, которую предполагается решить с разработкой моно¬
клональных антител либо приготовлением референтных стандартов из лиофи-
лизированной плазмы больных. Как и в случае обнаружения АКЛА, необходимо
подтвердить стойкое присутствие ВА в сыворотке больного АФС во времени, так
как ВА может появляться на фоне вирусных и бактериальных инфекций либо под
действием ряда лекарственных препаратов.Проводимая терапия антикоагулянтами, прежде всего гепарином*, ведет к
удлинению АЧТВ и других скрининговых тестов. Это затрудняет выявление ВА у
пациентов, у которых антикоагулянтная терапия была начата по жизненным пока¬
заниям. В данном случае большую специфичность при диагностике АФС имеют
серологические тесты, основанные на определении анти-р2-ГП-1-(зависимый ВА).
Этот тест признают в качестве наиболее перспективного подхода для оценки риска
тромбоза по сравнению с классическими методами определения ВА.Ревматоидный факторПри РА может быть обнаружено до 50 различных видов а>’тоантител, кото¬
рые встречаются с различной частотой (табл. 17-11). Первой разновидностью
аутоантител, обнаруженных при РА, стал РФ. Основной мишенью РФ является
эпитоп Ga, расположенный в С^^'^уз Районе тяжелой цепи молекулы IgG под¬
классов IgGp IgGj, IgG^, недалеко от сайта связывания со стафилококковым про¬
теином А. К РФ причисляют антитела против IgG, представленные основными
классами иммуноглобулинов — IgG, IgM и IgA. Хотя РФ может быть представлен
любым классом иммуноглобулинов, однако турбидиметрические и агглютина-
ционные тесты помогают обнаружить в основном IgM-РФ. В латексном тесте
агрегированный человеческий IgG прикреплен к латексным частицам, которые
агглютинируют в присутствии РФ, Это быстрый легковыполнимый тест, однако
он дает большое количество ложнопозитивных результатов. Среди агглюти-
национных тестов классический тест Ваалера-Розе, основанный на пассивной
гемагглютинации с использованием эритроцитов барана, покрытых антиэритро-
цитарной сывороткой крови кролика, до сих пор не утратил своего значения. По
сравнению с латексным и другими агглютинационными тестами положительный
тест Ваалера-Розе является более специфичным для РА, поскольку аллотипиче-
ские антитела, образующиеся при беременности или после гемотрансфузий, не
взаимодействуют с кроличьим IgG. В ряде случаев, тем не менее, гетерофильные
антитела к эритроцитам барана, встречающиеся при инфекционном мононуклео-
зе и ряде других острых инфекций, способны привести к получению ложнополо¬
жительного результата этого теста.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 1Q1Таблица 17-11. Аутоантитела в лабораторной диагностике ревматоидного артритаНазваниеИсточник антигенаМишень антителаРевматоидный факторИммуноглобулин IgGGa-эпитоп в Fc-фрагментеАНАКлетки линии НЕр-2Анти-SS-yii (52 кДа)Антикератиновые антителаОроговевающий слой эпите¬
лия пищеводаПрофилаггрин крысыАнтиперинуклеарный факторКератогиалиновые гранулыФилаггрин человекаАнтифилаггриновые антителаРекомбинантныйФиллагрин человекаАнтитела к циклическому цитруллин-
содержащему пептиду (АЦЦП)Пептидный синтезЦитруллинированный кольцевой
пептидЦитруллинированные пептидыПептидный синтезНесколько линейных пептидовМодифицированный цитруллиниро-
ванный 8ИМ6НТИН (MCV)РекомбинантныйЦитруллинированный виментинАнтитела к RA33РекомбинантныйРибонуклеопротеины ядраНефелометрическое и турбидиметрическое определение РФ — наиболее точ¬
ный аналитический метод. Рассеивание света на формирующихся комплексах
«антиген-антитело» позволяет установить их концентрацию в сыворотке крови.
Этот тест является наиболее стандартизированным среди всех иммунологических
тестов, его применение позволяет быстро и точно ПОЛЗ^ИТЬ результат в ш/мл.
Результаты нефелометрического определения РФ хорошо согласуются с традици¬
онным латексным тестом. Точное определение класса иммуноглобулинов, которым
представлен РФ, может быть выполнено с помощью метода ИФА. Убедительных
данных о целесообразности определения классов РФ в клинической практике нет.
Тем не менее отмечают, что IgG-РФ встречается при васкулитах, сопутствующих
РА и синдрому повышенной вязкости крови, поскольку он может участвовать в
образовании самоассоциирующихся иммунных комплексов. Для больных с IgA-
РФ характерно быстро прогрессирующее течение заболевания.Для стандартизации тестов по обнаружению РФ ВОЗ разработан междуна¬
родный стандарт сыворотки WH01066, содержащий 100 Ш/мл (international
units) РФ. Существующие стандарты сыворотки учитывают РФ класса IgM, таким
образом, в международных единицах (Ш/мл) может быть получен ответ для РФ,
представленного этим классом антител. В качестве популяционной нормы реко¬
мендовано рассматривать концентрации РФ ниже 20 Ш/мл. Частота встречаемо¬
сти концентраций РФ, превышающих 20 Ш/мл, у здоровых людей среднего воз¬
раста составляет около 3% и увеличивается до 10-15% у пожилых старше 65 лет.
Концентрация РФ в сыворотке крови больного, превышающая 40 Ш/мл, должна
рассматриваться как высокая и является высокоспецифичной для диагностики
РА. Обнаружение титров РФ более 40-50 Ш/мл указывает на высокий риск раз¬
вития эрозивного артрита. У тех лиц, у которых был обнаружен высокий титр РФ,
отмечают значительный риск развития РА, так как обнаружение диагностических
титров РФ может предшествовать на несколько лет клин№1еским проявлениям
заболевания.Определение РФ до сих пор является основным лабораторным методом диа¬
гностики РА и служит основанием для выделения двух его основных клинико¬
иммунологических разновидностей: серонегативного и серопозитивного РА. Более
того, отсутствие РФ при ряде воспалительных артритов позволяет выделить кли¬
ническую группу серонегативных спондилоартропатий.РФ обладает достаточно высокой чувствительностью и имеется у 60-80% боль¬
ных РА. Однако в дебюте заболевания, на раннем этапе, РФ обнаруживают менее
чем у 25% больных, что существенно снижает его значение для ранней диагности¬
ки этого заболевания. Однократного определения РФ на ранней стадии РА с отри¬
цательным результатом недостаточно для того, чтобы исключить серопозитивную
||1|Ш1|5;1^Ш	102ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙклинико-иммунологическую форму РА. Если диагноз РА подозревают или даже
он клинически подтвержден, при отрицательном результате теста по определению
РФ требуются повторные определения его титра каждые 6 или 12 мес. Этот срок
приблизительно соответствует времени обновления пула плазматических клеток,
способных синтезировать аутоантитела. Если же будет получен положительный
результат, то нет реальных предпосылок повторять определение РФ с течением
времени, поскольку титры аутоантител плохо отражают активность заболевания.
Значение повторных определений содержания РФ для контроля над течением
заболевания имеет несравненно меньшее значение, чем мониторинг острофазо¬
вого ответа. Снижение титра РФ в плазме крови при успешной терапии может
отчасти объясняться цитостатическим эффектом применяемых препаратов. Тем не
менее у больных РА возможна сероконверсия как в одну, так и в другую сторону в
зависимости от активности и длительности заболевания, а также от проводимого
лечения. Сероконверсия из серопозитивной в серонегативную группу встречается
редко и обычно сопутствует полной клинической ремиссии заболевания.Кроме низкой встречаемости РФ в дебюте заболевания, очевидным недостатком
РФ в качестве маркера РА является его сравнительно низкая специфичность, кото¬
рая не превышает 60% (табл. 17-12). Фактически это означает, что каждый 3-4-й
положительный тест обнаруживается у больного без РА. Так, частота выявления
концентраций РФ, превышающих 20 МЕ/мл, у здоровых людей среднего возраста
составляет около 3% и увеличивается до 10-15% у пожилых лиц старше 65 лет.
Диагностические уровни РФ часто встречаются при СШ, гранулематозе Вегенера,
аутоиммунных поражениях печени, СКВ, криоглобулинемии, реже — при других
аутоиммунных заболеваниях, а также при хронических инфекциях (подостром
септическом эндокардите, туберкулезе, вирусном гепатите С). Хотя РФ входит в
классификационные критерии РА, его обнаружение не позволяет доказать нали¬
чия РА при атипичной клинической картине, а отсутствие РФ в сыворотке боль¬
ного не позволяет исключить диагноз РА.Таблица 17-12. Частота встречаемости ревматоидного фактора при различных заболеванияхЗаболеваниеПриблизительная частота', %Ревматоидный артрит80Синдром Шегрена70Смешанная криоглобулинемия70Системная красная волчанка30Полимиозит20Системный склероз20Подострый септический эндокардит40Цирроз печени25Инфекционный гепатит25Туберкулез15Саркоидоз10Сифилис10Здоровый контроль<5Старость (>70 лет)15' — более 25 МЕ/мл.Антицитруллиновые антителаАнтицитруллиновые антитела (АЦА), или антитела к циклическому цитруллин-
содержащему пептиду (АЦЦП), направлены против антигенных эпитопов, содержа¬
щих аминокислоту цитруллин, которые возникают в белках синовиальной оболочки
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЮЗПОД действием воспалительных ферментов нейтрофилов. Это семейство активно
расширяется, что обусловлено эффективностью АЦЦП для диагностики РА.Антифилаггриновые антитела!ШАнтифилаггриновые антитела (АнФА) исторически выделяют среди АЦА, ккоторым относят антиперинуклеарный фактор (АПФ) и антикератиновые анти-
тела (АКА), — показатели, определение которых основано на НРИФ. Основной
антигенной мишенью АнФА является белок профилаггрин, который синтезирует-
ся в виде фосфорилированного полипептида, содержащего около 10 филаггрино-	''вых повторов. Белок хранится в гранулах и подвергается ограниченному протео¬
лизу, после чего положительно заряженные полипептиды филаггрина участвуют
в сборке цитокератинового скелета эпителиоцита. АнФА связываются с разными
антигенными мишенями, содержащими аминокислоту цитруллин, образующуюся
при дезаминировании аргинина с помощью фермента пептидиларгининдезамина-
зы (ПАД). К таким мишеням относят филаггрин, виментин, а также Sa-антиген,
выделенный из ткани плаценты, антитела к которому также причисляют к семей¬
ству АЦА. Высокая активность ПАД наблюдается в воспаленной синовиальной
оболочке, что было показано при исследовании ее биоптатов у больных РА и на
моделях этого заболевания у лабораторных животных. Основным источником
ПАД в синовиальной оболочке могут быть полиморфноядерные лейкоциты,
содержащие этот фермент в цитоплазме, которые в значительном количестве
появляются в синовиальной жидкости при РА. Их разрушение приводит к высво¬
бождению свободного фермента и его активации в присутствии ионов кальция.Наличие цитруллинированных белков особенно характерно для воспалительно-
измененной синовиальной оболочки при РА, где они выступают и в качестве
основной мишени АЦА. В качестве основного индуктора образования АЦА рас¬
сматривают а- и р-цепи дезиминированного фибрина, которые в большом коли¬
честве накапливаются в воспаленной синовиальной оболочке и локализуются с
отложениями цитруллинированных белков.Антиперинуклеарный фактор (АПФ) был первым исследованным аутоан¬
тителом, относящимся к семейству АФА. Эта разновидность аутоантител получила
название из-за способности к связыванию с кератогиалиновыми гранулами в
цитоплазме клеток эпителия щеки человека, расположенными перинуклеарно.Основным методом выявления АПФ служит НРИФ. Оптимальным тест-субстратом
для обнаружения АПФ считают эпителиальные клетки слизистой оболочки щеки
человека, в которых присутствует специфическое свечение крупных округлых
гранул (3-8 на клетку), расположенных вокруг ядра. Выявление АПФ сопряжено
с рядом технических сложностей, что ограничивает широкое практическое при¬
менение этого метода. Прежде всего, лишь около 5-10% здоровых лиц обладают
достаточным содержанием кератогиалиновых гранул в клетках эпителия щеки, и
для стандартизации метода необходим подбор подходящего донора. Кроме того,
кератогиалиновые гранулы быстро утрачивают свою антигенность при длитель¬
ном высушивании клеток, большинстве типов химической фиксации, обработке
ферментами и детергентами.Антикератиновые антитела (АКА) — другой представитель семейства анти-
филаггриновых антител. Их также определяют при помощи НРИФ, они реагиру¬
ют с роговым слоем многослойного плоского ороговевающего эпителия средней
трети пищевода крысы. При использовании пищевода крысы в НРИФ выявляется
несколько типов окрашивания эпителия. Может визуализироваться окрашивание
клеток базального слоя эпителия, наблюдаться сетчатое окрашивание неорого-
вевающих слоев эпителия, а также гранулярное окрашивание stratum сотеит.Для АКА характерен особый, линейный, тип окрашивания ороговевающих слоев
эпителия пищевода крысы, в то время как остальные типы окрашивания специфи-
УТЛ- У'шш104 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙческого диагностического значения не имеют. Необходимо учитывать, что на
пищеводе могут быть также обнаружены аутоантитела к десмосомам и антитела
к базальной мембране, которые являются специфическими маркерами буллезных
дерматозов. Эти антитела также способны интерферировать с выявлением АКА и
должны быть дифференцированы от АКА.Со времени первого описания АКА при РА, их диагностическое значение неод¬
нократно подтверждалось. Встречаемость АКА в сыворотке крови больных РА
составляет около 45% при серопозитивном и 30% при серонегативном результате,
при специфичности, близкой к 100%. Несколько чаще обнаруживается АПФ, его
встречаемость составляет 45-61%. По сравнению с РФ для АКА и АПФ характер¬
на более высокая специфичность, которая составляет 88-99%, при более низкой
чувствительности, не превышающей 60%. Полагают, что АПФ менее специфичен
по сравнению с АКА и чаще встречается при других ревматологических заболева¬
ниях. Содержание АКА и АПФ у больных РА не коррелирует с титрами РФ, что
позволяет рассматривать эти антитела в качестве независимых серологических
маркеров заболевания. АФА встречаются у пациентов с серонегативным РА, что
значительно сокращает группу больных РА, у которых не выявляются специфиче¬
ские серологические маркеры заболевания.При РА описаны еще 2 представителя АФА — антитела к очищенному филаггри-
ну и антитела к Sa-антигену.Антитела к филаттрину могут быть определены при помощи иммуноблот-
тинга с использованием нативных экстрактов человеческого или животного
филаггрина. Однако содержание цитруллина в антигенных экстрактах филаггрина
значительно различается, что обусловливает их антигенную гетерогенность и не
позволяет стандартизировать тесты для выявления АФА.Антитела к Sa-антигену встречаются при РА приблизительно у 40% больных.
Их специфичность составляет 98%, что сближает их с АКА. 5а-антиген пред¬
ставляет собой белок с молекулярной массой 48-50 кДа, встречается в экстракте
человеческой плаценты, а также в тканях селезенки и ревматоидного паннуса.
Установлено, что Sa-антигену соответствует цитруллин-содержащая форма вимен-
тина — компонента цитоскелета клетки. В связи с этим антитела к Sa-антигену
стали относить к группе антицитруллиновых антител.Антитела к циклическому цитруллиновому пептидуЗначительным достижением в изучении роли цитруллин-содержащих антиге¬
нов при РА стало описание линейных иммунодоминантных пептидов филаггрина,
содержащих цитруллин. Всего было проанализировано 40 цитруллинированных
пептидов, результат исследований позволил выделить основной иммунодоминант-
ный пептид cfcl, в состав которого входит 19 аминокислот (306-324, Argjj^j-n^Cit).
За счет замены серина на цистеин был создан cfcl-cyc — пептид, содержащий
цистеиновый мостик, или циклический цитруллинированный пептвд (cyclic citml-
linated peptide — ССР), более точно отражающий конформационную структуру
нативного белка, что увеличило сродство АЦЦП к этому антигену. Это позволило
использовать данный «неоантиген» для обнаружения АЦЦП. Этот случай стал
одним из первых примеров разработки диагностических антигенов для сероди¬
агностики. В действительности циклический цитруллиновый пептид в организме
больного РА отсутствует, однако аутоантитела из сыворотки больного связыва¬
ются с ним in vitro. Второе поколение тест-систем было создано с использованием
случайных пептидных библиотек, которые облегчили отбор цитруллинированно¬
го антигена с улучшенными свойствами. Эти исследования позволили разработать
иммуноферментную тест-систему для выявления АЦЦП.Иммуноферментные тест-системы второго поколения стали золотым стандартом
определения АЦА в клинических лабораториях. Особенностью всех тест-систем для
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 1Q5обнаружения АЦЦП служит то, что антиген доступен коммерчески. Это стандарти¬
зирует выявление АЦЦП, результаты международных программ внешнего контроля
качества, а также исследования, посвященные сопоставлению тест-систем АЦЦП
разных производителей, указывают на высокую сходимость параметров.Метод второй генерации для выявления АЦЦП практически не уступает по
чувствительности РФ и позволяет обнаружить антитела у 70-75% пациентов с РА.
Таким образом, по чувствительности этот метод сопоставим с определением РФ,
однако он значительно превосходит последний благодаря специфичности, состав¬
ляющей около 95%. Специфичность АЦЦП крайне высока, так как при других
воспалительных артропатиях и ревматических заболеваниях АЦЦП встречается
не чаще чем в 2-3% случаев. Среднее содержание у здоровых доноров крови в
10 раз меньше, чем рекомендуемая производителем граница нормы в 5 U/мл.Большим преимуществом АЦА является их образование до клинических симпто¬
мов заболевания. Популяционные исследования, посвященные времени появления
аутоантител АЦЦП в ходе РА, показали, что АЦЦП могут быть обнаружены задолго
до развития клинических симптомов заболевания. Этот феномен был впервые
отмечен для АКА и позже подтвержден для АЦЦП. До появления клинических сим¬
птомов заболевания в 34% случаев были обнаружены АЦЦП, У 19% здоровых на
момент обследования людей был обнаружен РФ класса IgM, причем в нескольких
случаях наличие антител предсказывало РА за 20 лет до появления первых симпто¬
мов заболевания. Частота обнаружения антител значительно нарастала к момен¬
ту, соответствующему 1,5 годам до постановки диагноза РА. После определения
минимального диагностического титра содержание антител обычно увеличивалось
вплоть до срока постановки диагноза. Ко времени постановки диагноза раннего РА
частота обнаружения АЦЦП и IgM-РФ сравнялась и достигла 70%. АЦЦП не только
обнаруживаются на ранних стадиях РА, но и отмечаются у больных РА с быстрым
рентгенологическим прогрессированием. АЦЦП позволяют предсказать развитие
деструкций приблизительно у 80% пациентов с РА и в сочетании с РФ представляют
важный инструмент для раннего распознавания больных РА с неблагоприятным
прогнозом заболевания >'же на этапе постановки диагноза.Антитела к модифицированному виментинуОсновным конкурентом АЦЦП в лабораторной диагностике РА является дру¬
гой представитель семейства АЦА — антитела к модифицированному цитрулли¬
нированному виментину (АМЦВ), или anti-MCV. Тесты основаны на рекомби¬
нантном белке виментине, одном из промежуточных цитофиламентов клетки.
Цитруллинирование виментина ш vitro приводит к образованию большого коли¬
чества иммунодоминантных эпитопов, число которых теоретически обеспечивает
лучшее связывание аутоантител и большую чувствительность тест-системы.Тест-системы для обнаружения АМЦВ имеют чувствительность для выявления
РА 85%, что несколько превосходит чувствительность выявления РА с использо¬
ванием АЦЦП. Последующие исследования различных групп ревматологических
больных с использованием АМЦВ обнаружили, что данные антитела встречаются
у 15-25% больных с системными заболеваниями, отмечаются у 5-10% больных
псориатическим артритом, могут встречаться у 20% пожилых лиц без признаков
РА. Таким образом, реальная специфичность при исследовании смешанных попу¬
ляций для АМЦВ составляет не более 85-90%. Проблему низкой специфичности
можно отчасти решить при увеличении границы нормы тест-системы до 25-30 U/мл
при заявленной производителем норме в 20 U/мл. При таком изменении специ¬
фичность обследования возрастает до 90-92%, однако чувствительность снижает¬
ся до 60-70%. Таким образом, по основным клинико-лабораторным параметрам
anti-MCV близки АЦЦП, однако несколько менее специфичны, чаще встречаются
при других формах артритов.
жрПІіШІРвВВі106 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙАНТИТЕЛА К RA-ZZДля антител к RA-33 антигеном являются белки гетерогенных ядерных рибону¬
клеопротеинов (hnRNP). Эти белки входят в состав сплайсосом наряду с антигена¬
ми других рибонуклеопротеиновых АНА, в частности Sm и RNP. Антитела к RA-33
встречаются при РА в 30% случаев, а также отмечаются при СКВ и СЗСТ с частотой
10-15%. При СКВ и СЗСТ практически всегда они присутствуют совместно с анти¬
телами к U^~RNP. При других ревматических заболеваниях антитела к RA-33 прак¬
тически не обнаруживают. В НРИФ при использовании клеток НЕр-2 они обычно
характеризуются мелкогранулярным окрашиванием ядра, неотличимым от других
разновидностей АНФ. Определение АНФ не является надежным методом обнару¬
жения данных аутоантител, так как антитела к ЙА-33 часто имеются в сыворотках,
в которых АНФ отсутствует. Оптимальным методом диагностики антител к iiA-33
считают иммуноблоттинг, причем этот тип АНА содержится в сыворотке крови
больных в невысоких титрах (1:100), однако данные антитела могут быть выявле¬
ны с помощью ИФА с использованием очищенного антигена.Они присутствуют в сыворотке крови приблизительно у 20-30% больных с
серонегативным РА независимо от других серологических маркеров. Антитела к
RA-33 отмечаются на этапе раннего РА, могут встречаться до появления клини¬
ческих признаков РА. При РА наличие этой разновидности АНА не зависит от
длительности заболевания, возраста и пола больных, а также от эффективности
проводимой терапии. Имеются данные, что у больных РА с антителами к RA-33
заболевание течет менее агрессивно и характеризуется лучшим прогнозом, что
позволяет использовать присутствие этих антител в прогнозировании исхода РА.Аутоиммунологические показатели при васкулитахПод аутоиммунными васкулитами понимают заболевания, связанные с вос¬
палительным процессом в сосудистой стенке, без инфекционной или токсической
причины. Васкулиты подразделяют на первичные и вторичные, которые воз¬
никают на фоне другого аутоиммунного заболевания. Общепринятой является
международная классификация первичных васкулитов, которая дала определение
10 формам первичных васкулитов и подразделила их в соответствии с калибром
поражаемых сосудов (табл. 17-13).Таблица 17-13. Классификация васкулитов Chapel-Hill Consensus Conference (1994)Тип васкулитаОпределениеВаскулиты крупных сосудовГигантоклеточный (височ¬
ный) васкулитгранулематозный васкулит аорты и ее основных ветвей с поражением вет¬
вей наружной а. carotis. Больные старше 50 лет.Характерен выраженный острофазовый ответБолезнь ТакаясуГранулематозное воспаление аорты и ее основных ветвей. Больные младше
50 летВаскулнты сосудов среднего калибраУзелковый полиартериитНекротизирующее воспаление артерий среднего и мелкого калибра, не
сопровождающееся гломерулонефритомБолезнь КавасакиАртериит, поражающий артерии всех калибров. Характерно поражение
коронарных сосудов. Чаще всего болеют детиВаскулиты мелких сосудовГранулематоз ВегенераГранулематозное воспаление, поражающее респираторный тракт и сопрово¬
ждающееся некротическим васкулитом мелких сосудов. Характерен некро¬
тизирующий гломерулонефритСиндром Черджа-СтроссБогатое эозинофилами гранулематозное воспаление, поражающее респи¬
раторный тракт. Картина легочного некротизирующего васкулита, астмы и
эозинофилии
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 107
Окончание табл. 17-13Тип васкулитаОпределениеМикроскопический поли-
ангиитНекротизирующий васкулит с поражением мелких сосудов. Реже —
признаки некротизирующего артериита с поражением мелких артерий.
Некротизирующий гломерулонефрит VI пульмонарный капилляритПурпура Шенлейна-ГенохаВаскулит с отложениями 1дА, поражающий мелкие сосуды. Поражает кожу,
суставы, ЖКТ и почки		Эссенциальный криоглобу-
линемический васкулитВаскулит, сопровождающийся появлением криоглобул и нов в сыворотке.
Поражения кожи и почек			Кожный лейкоцитокластиче-
ский васкулитИзолированный кожный ЦИК-васкулит без системных и почечных проявле¬
нийПатогенез васкулитов крупных и средних сосудов опосредован преимуще¬
ственно Т-клетками, абсолютно специфических серологических маркеров при
этих заболеваниях не описано. Антиэндотелиальные антитела с различной часто¬
той встречаются при аортоартериите Такаясу и болезни Кавасаки, а также при
ряде васкулопатий, таких как гемолитико-уремический синдром, тромботическая
тромбоцитопеническая пурпура, болезнь Бехчета. Васкулиты крупных и средних
сосудов сопровождаются выраженным воспалением, выявление которого пред¬
ставляет основную задачу лабораторных методов диагностики.В соответствии с иммунопатогенезом васкулиты мелких сосудов могут быть
подразделены на гранулематозные и иммунокомплексные.Гранулематозные васкулиты мелких сосудов, включающие синдром
Вегенера, микроскопический полиангиит, синдром Черджа-Стросс, имеют ряд
общих черт, к которым относят поражение почек по типу олигоиммунного экстра-
капиллярного гломерулонефрита с полулуниями, полиневрит и легочный капилля¬
рит. Основным методом серологической диагностики гранулематозных васкулитов
является обнаружение АНЦА. Антитела этого семейства реагируют с белками азу¬
рофильных гранул нейтрофильных гранулоцитов. Значение АНЦА в патогенезе и
диагностике гранулематозных васкулитов позволило выделить отдельную группу,
обобщенную под названием «АНЦА-ассоциированные васкулиты». К ним относят
гранулематоз Вегенера, синдром Черджа-Стросс, микроскопический полиартери¬
ит, быстропрогрессирующий гломерулонефрит с полулуниями. К этой группе забо¬
леваний иногда причисляют синдром Гудпасчера, так как АНЦА могут отмечаться
у 10-15% пациентов с этим заболеванием, совместно с антителами к базальной
мембране клубочка, выявление которых — основной лабораторный метод его
диагностики. Хотя синдром Гудпасчера не относится к системным васкулитам, он
характеризуется геморрагическим альвеолитом и быстропрогрессирующим гломе¬
рулонефритом, который сложно отличить от АНЦА-ассоциированного поражения
почек. В связи с этим определение АНЦА и антител к базальной мембране обычно
используют совместно.Иммунокомплексные васкулиты обусловлены образованием иммунных ком¬
плексов между аутоантителами и их антигенами в крови и сосудистой стенке.
Иммунные комплексы, которые можно обнаружить в сыворотке крови, называют
циркулирующими иммунными комплексами (ЦИК). Предполагается, что сниже¬
ние растворимости ЦИК приводит к их отложению в сосудистой стенке и разви¬
тию воспаления. Снижение растворимости при замедлении скорости кровотока и
температуры приводит к тому, что иммунными комплексами поражаются преиму¬
щественно капилляры, прежде всего капилляры кожи. Криоглобулинемический
васкулит сопровождается появлением в крови особой разновидности ЦИК, кото¬
рая требует особых методических подходов для их обнаружения.Отдельно вьщеляют методы, позволяющие обнаружить отложения иммунных
комплексов и комплемента непосредственно в пораженной ткани. Обнаружение
отложений иммунных комплексов позволяет объективизировать иммуноком-
'	^ 108 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ¡¿^. плексный процесс и обладает большей достоверностью по сравнению с методами
определения ЦИК.АНТИЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛААнтиэндотелиальные антитела (АЭТА) составляют гетерогенную группу анти¬
тел, направленных к антигенным детерминантам эндотелиальных клеток. АЭТА
были впервые обнаружены у больных СКВ при использовании метода непрямой
иммунофлюоресценции на тканях лабораторных животных. При СКВ частота
встречаемости АЭТА составляет от 30 до 80%, в зависимости от используемого
метода и категорий больных. Методология обнаружения АЭТА далека от стан¬
дартизации. Основные методы: непрямая иммунофлюоресценция на кратковре¬
менных культурах клеток эндотелия пуповины (НЦУЕС), а также методы ИФА и
иммуноблот.АЭТА были обнаружены при многих первичных васкулитах и васкулопатиях.
Сравнительно часто их выявление связывают с болезнью Кавасаки, гранулематоз¬
ными васкулитами, пурпурой Шенлейна-Геноха и вторичными васкулопатиями, в
частности с облитерирующим тромбангиитом (болезнь Бюргера), гемолитической
тромбоцитопенической пурпурой, антифосфолипидным синдромом. Наличие
АЭТА сравнительно неспецифично для определенной формы васкулита и рассма¬
тривается в качестве общего диагностического маркера васкулитов и васкулопа¬
тий. Целесообразность детекции АЭТА в клинической практике определяется их
выявлением только на фоне выраженной клинической активности заболевания
что позволяет ориентироваться на их содержание для определения фазы заболе
вания. Они могут играть определенную роль в патогенезе васкулитов в связи с тем
что способны модулировать экспрессию эндотелиальных молекул адгезии и фак
торов воспаления. АЭТА, обнаруженные в сыворотке крови больных СКВ, способ
ны усиливать высвобождение 1Ь-6 из эндотелиоцитов, таким способом участвуя в
патогенезе системной воспалительной реакции.АЭТА имеются у большинства больных с активной формой АНЦА-
ассоциированных васкулитов. У детей с пурпурой Шенлейна-Геноха наличие
АЭТА класса IgA коррелирует с частотой поражения почек. Показано, что АЭТА
служат надежным маркером активности процесса при облитерирующем тромбан-
гиите. При синдроме Бехчета они встречаются у 50% больных, особенно у боль¬
ных с выраженным кожным васкулитом.Васкулиты и васкулопатии на фоне системных заболеваний соединительной
ткани также сопровождаются высокими титрами АЭТА. У больных СКВ при
выявлении высоких титров АЭТА чаще отмечают кожные признаки васкулита
и тяжелый синдром Рейно. У большинства больных с волчаночным нефритом и
гипокомплементемией имеются высокие титры АЭТА, что, по всей видимости,
обусловлено способностью ароантител непосредственно взаимодействовать с
эпителиальными клетками почечного клубочка. Содержание АЭТА снижается при
успешной иммуносупрессивной терапии.Склеродермия обычно сопровождается признаками генерализованной васку¬
лопатии. Предполагают, что одной из причин развития микроангиопатии
при склеродермии могут являться АЭТА, отмечающиеся у 40-60% больных.
Антиэндотелиальные антитела при диффузных формах склеродермии ассоции¬
рованы с высоким риском поражения легких, характеризующимся развитием
интерстициального фиброза и легочной гипертензии, У больных с АЭТА часто
отмечается выраженная ишемия пальцев и сосудисто-некротические изменения
кожи кисти.Существует определенная связь между антифосфолипидными и антиэндоте-
лиальными антителами. АЭТА часто диагностируют у больных с АФС, невына¬
шиванием беременности и идиопатическим ливедо. Антигены АКА, в частности
ЙЩ|ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 109комплексы фосфолипидов и ß^-ГП-І, способны связываться с поверхностью эндо-
телиальных клеток, что ведет к повреждению эндотелия, у женщин с повторными
выкидышами в анамнезе и предполагаемым АФС также обнаруживают АЭТА.Наличие АЭТА характерно для вторичных ангиопатий: диабетической микроан-
гиопатии, сосудистого отторжения трасплантата.Таким образом, АЭТА могут служить неспецифическим маркером ангиопатий
различного генеза, мониторинг их содержания в сыворотке крови больного с тече¬
нием времени позволяет установить активность патологического процесса.АНТИНЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛАВпервые в цитоплазме нейтрофилов антитела были обнаружены у больного с
быстропрогрессирующим гломерулонефритом. Затем АНЦА были идентифици¬
рованы в качестве наиболее специфичного и чувствительного лабораторного мар¬
кера гранулематоза Вегенера, что привело к активному изучению этого семейства
аутоантител и определению клинического значения их выявления при системных
васкулитах. Было обнаружено, что в качестве антигенов АНЦА выступают фер¬
менты азурофильных гранул нейтрофилов. К известным антигенным мишеням
АНЦА относят протеиназу-3, миелопероксидазу, лактоферрин, эластазу, белок ВРІ
и катепсин G.Хотя механизм индукции АНЦА остается неизвестным, доказано, что связыва¬
ние антинейтрофильных антител с соответствующими мишенями на активирован¬
ных гранулоцитах приводит к преждевременной дегрануляции клеток. Это нару¬
шает трансэндотелиальную миграцию лейкоцитов из сосудистого русла и ведет к
образованию воспалительной гранулемы, составляющей основу морфологической
картины гранулематозных васкулитов.Основным методом определения АНЦА является метод непрямой иммуноф¬
люоресценции с использованием нейтрофилов донора, фиксированных этанолом,
что позволяет дифференцировать основные типы свечения аутоантител. По ана¬
логии с диагностикой АНФ, при флюоресцентной микроскопии для обнаружения
АНЦА можно отметить несколько типов свечения цитоплазмы клеток. Каждому
из типов свечения соответствуют свои антигенные мишени. Диагностическим
титром АНЦА считают обнаружение антител при разведении сыворотки 1:40 и
более. Учитывая, что содержание АНЦА коррелирует с активностью заболевания,
в методе непрямой иммунофлюоресценции должен быть определен конечный
титр. При обострении гранулематозных васкулитов обычно отмечаются титры
АНЦА, превышающие 1:320. Одновременно с титром должен быть установлен тип
свечения цитоплазмы клетки.Выделяют два основных типа свечения АНЦА - цитоплазматический и перину-
клеарный. Цитоплазматический тип АНЦА (цАНЦА) получил название благодаря
флюоресценции гранул, локализующихся в цитоплазме клетки между долями ядра
лейкоцита. При выявлении перинуклеарного типа свечения (пАНЦА) свечение
как бы очерчивает доли ядра лейкоцита, оставляя неокрашенным ядро клетки.
Обнаружение пАНЦА представляет собой последствие фиксации нейтрофилов
этанолом, которая ведет к прераспределению гранул в цитоплазме клетки, в
результате чего положительно заряженные антигены гранул притягивают отрица¬
тельно заряженную ДНК ядра. Похожее свечение обнаруживается в присутствии
АНА, прежде всего антител к дсДНК и гистоновых белков. Нейтрофилы обладают
большинством антигенов АНА и являются субстратом для обнаружения АНФ.Для того, чтобы отличить АНФ от специфического свечения АНЦА, необходимо
параллельно тестировать все сыворотки, положительные по антинейтрофильным
антителам в отношении АНФ, что обеспечивает большую специфичность выявле¬
ния антинейтрофильных аутоантител. Кроме двух основных типов свечения могут
быть отмечены атипичные варианты окрашивания клетки, которые обозначают
Шіу ' ->><= ^ <110 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙкак Х'АНЦА. Обнаружение атипичных вариантов свечения АНЦА используют
в диагностике воспалительных заболеваний кишечника. Атипичные варианты
АНЦА описаны при язвенном колите (70%), болезни Крона (10%), аутоиммунном
гепатите (50%), первичном склерозирующем холангите (40%), первичном били¬
арном циррозе (5%) и васкулитах при РА (5-10%).Антигенная специфичность АНЦА может быть установлена не во всех сыво¬
ротках, содержащих антинейтрофильные антитела, обнаруженные при помо¬
щи непрямой иммунофлюоресценции, в соответствии с рекомендациями
Интернационального консенсуса (Savige, 1999), целесообразно определение спец¬
ифичности АНЦА только после определения аутоантител с помощью непрямой
иммунофлюоресценции, что обеспечивает максимальную чувствительность опре¬
деления антинейтрофильных антител (табл. 17-14).Таблица 17-14. Антигенная специфичность основных типов антинейтрофильных цитоплазматиче¬
ских антител и приблизительная частота их обнаруженияцАНЦАпАНЦАхАНЦАПротеиназа-3МиелопероксидазаБелок BPIМиелопероксидазаЛактоферринЭластазаКатепсин 6Протеи наза-3ЛактоферринЭластаза90%5%4%70%10%5%2%10%10%Неуточненные антигеныАнтитела к протеиназе 3 (ПР-3) преимущественно обнаруживаются при
цАНЦА-типе свечения. ПР-3 представляет собой сериновую протеиназу массой
29 к Да, которая локализуется в азурофильных гранулах нейтрофила наряду с
другими сериновыми протеиназами. Редко при выявлении цАНЦА-типа све¬
чения отмечаются антитела к другим ферментам гранул, прежде всего к белку
ВРІ. цАНЦА/анти-ПР-3 антитела являются основной разновидностью антиней¬
трофильных антител в сыворотке больных гранулематозом Вегенера. При этом
заболевании титр цАНЦА связан с его клинической активностью, и успешная
иммуносупрессивная терапия гранулематоза приводит к снижению содержания
антител ниже порога детекции.Антитела к миелопероксидазе (МПО) определяются при перинуклеар-
ном типе иммунофлюоресценции. МПО — основной микробииидный фермент
азурофильных гранул, генерирующий кислородные радикалы. МПО обладает
выраженным положительным зарядом, что обусловливает ее перераспределение к
ядру при фиксации нейтрофилов этанолом. Кроме того, при перинуклеарном типе
флюоресценции часто отмечают образование АНЦА, направленных против других
ферментов нейтрофильных гранул, таких как лактоферрин, эластаза и катепсин G.
Антитела к МПО были впервые описаны у больных с идиопатическим быстро¬
прогрессирующим о лигоиммунным гломерулонефритом с полулуниями, который
представляет собой клиническую разновидность микроскопического полиангиита.
В отличие от антител к ПР-3, пАНЦА/анти-МПО не обладают высокой специ¬
фичностью для диагностики какого-либо конкретного васкулита и выявляются
при всех АНЦА-ассоциированных васкулитах и родственных им заболеваниях.
Антитела к МПО встречаются у большинства больных идиопатическим некро-
тизирующим васкулитом с полулуниями, при микроскопическом полиангиите, а
также при герпесвирусах без антител против ПР-З/цАНЦА.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 11 fПри СКВ, благодаря высокой аффинности ДНК к МПО, циркулирующие в
крови рибонуклеиновые кислоты из разрушенных клеток способны связываться с
МПО-субстратом в иммуноферментных тестах для определения пАНЦА, что при¬
водит к высокой частоте ложноположительных результатов.Антинейтрофильные антитела к BPI {bactericidal permeability increasing protein)
диагностируют у 60% пациентов с муковисцидозом, при иммунофлюоресценции
они обладают цАНЦА-типом свечения. В качестве основного индуктора антител к
BPI рассматривают псевдомонадную инфекцию, которая часто сопутствует муко-
висцидозу.Антитела к лактоферрину и катепсину G встречаются при васкулитах на фоне
РА, СКВ и при васкулитах при хроническом гранулематозном воспалении в случае
заболеваний кишечника. Высокая встречаемость антител к лактоферрину наблю¬
дается у больных с аутоиммунными заболеваниями печени, такими как аутоим¬
мунный гепатит и первичный билиарный цирроз, АНЦА, которые встречаются у
30-40% больных с первичным склерозирующим холангитом, обусловлены при¬
сутствием антител к лактоферрину.Антитела к нейтрофильной эластазе обнаруживают при СКВ, особенно при
неврологических проявлениях этого заболевания, а также они имеются у больных
РА и у больных с неспецифическим язвенным колитом,АНТИТЕЛА К БАЗАЛЬНОЙ МЕМБРАНЕ КЛУБОЧКААнтитела к базальной мембране клубочка направлены против неколлагеново-
го участка а^-цепи коллагена IV типа, антиген которого может быть обнаружен
в почках, легких, хрусталике, улитке, мозге и яичке. Коллаген IV типа является
основным компонентом базальных мембран альвеол и клубочка почки, что обу¬
словливает специфическую клиническую картину синдрома Гудпасчера, сочетаю¬
щую гломерулонефрит и геморрагический альвеолит. Поражение почек обычно
преобладает в клинической картине, что позволяет выделять лимитированную
форму синдрома іудпасчера, сопровождающуюся развитием быстропрогресси¬
рующего гломерулонефрита.Антитела к базальной мембране непосредственно участвуют в патогенезе
поражения почек при этом заболевании, их введение лабораторному животному
приводит к развитию экстракапиллярного гломерулонефрита. Их высокие титры
могут быть обнаружены в элюатах из почек, а содержание антител в сыворотке
коррелирует с клинической активностью заболевания. При иммунофлюоресцент¬
ном исследовании биопсий почек при синдроме Гудпасчера аутоантитела могут
быть обнаружены в виде линейных отложений иммуноглобулинов на базальной
мембране клубочков.Основным методом определения антител к базальной мембране является ИФА
с использованием очищенного антигена. Обнаружение антител является диагно¬
стическим для этого заболевания и позволяет дифференцировать от других при¬
чин легочных кровотечений и гломерулонефрита. Раннее обследование больных с
синдромом Гудпасчера крайне важно для прогноза больных с этим заболеванием,
поскольку только назначение специфической терапии позволяет сохранить функ¬
цию почек, а зачастую предотвратить гибель больного. Высокие титры антител к
базальной мембране могут сохраняться на этапе клинической ремиссии и посте¬
пенно снижаются в течение нескольких месяцев. Пересадка почки может быть
рекомендована только серонегативным пациентам, так как при сохранении зна¬
чимых титров антител к базальной мембране сохраняется высокий риск рецидива
заболевания в трансплантате.Антитела к базальной мембране почки могут сочетаться у пациентов с анти¬
телами к МПО; клинически — с быстропрогрессирующим гломерулонефритом и
системными васкулитами.
s**112 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙЦиркулирующие иммунные комплексыКожа, благодаря ее обильной васкуляризации и мелкому калибру сосудов, пора¬
жается иммунокомплексными, лейкоцитокластическйми васкулитами, названны¬
ми васкулитами гиперчувствительности. Морфологическими признаками лей-
коцитокластического васкулита являются фибриноидный некроз стенок сосуда
с инфильтрацией полиморфноядерными нейтрофилами, которые разрушаются с
образованием характерного ядерного дебриса. Разновидность лейкоцитокласти-
ческих васкулитов — лимфоцитокластический вариант, при котором преобладает
лимфоцитарная инфильтрация.Обычно лейкоцитокластический васкулит развивается на фоне другого ауто¬
иммунного заболевания или представляет собой реакцию гиперчувствитель*
ности в отношении экзогенного агента. Все эти состояния характеризуются
появлением в сыворотке крови больного ЦИК, оседающих на стенках мелких
сосудов. Образование иммунных комплексов — часть нормальных процессов
взаимодействия антитела с антигеном. Появление экзогенного антигена в крови
и гуморальный иммунный ответ служат основной причиной формирования ЦИК.
В то же время иммунные комплексы могут состоять исключительно из иммуно¬
глобулинов, например, при криоглобулинемиях и болезни Шенлейна-Геноха, что
обусловлено нарушением синтеза антител при этих заболеваниях.Связывание экзогенного антигена со специфическими антителами приводит к
образованию иммунных комплексов, которые могут захватываться рецепторами
к Рс-фрагментам молекул иммуноглобулинов и к комплементу на клетках рети-
кулоэндотелиальной системы, обеспечивающих клиренс иммунных комплексов.
Иммунокомплексный васкулит может быть следствием образования избыточного
количества ЦИК, нарушения нормального клиренса ЦИК, а также сниженной
растворимости образующихся иммунных комплексов. В результате этого ЦИК
откладываются в стенке мелких сосудов, что приводит к активации системы ком¬
племента, синтезу анафилотоксинов и цитокинов и к последующему образованию
лейкоцитарного инфильтрата.Существует много лабораторных тестов, направленных на обнаружение ЦИК
(табл. 17-]5), но оптимального пока не существует. Это связано с полиморфизмом
иммунных комплексов, состав, масса и заряд которых непостоянны. Кроме того,
стандартизация ряда биологических тестов затруднена, в связи с чем чаще исполь¬
зуют менее информативные физико-химические и биохимические методы. Хотя
выявление ЦИК признано полезным дополнительным лабораторным параметром
при СКВ и РА, использование конкретных тестов затруднено из-за их плохой
воспроизводимости, трудоемкости и низкой специфичности, в нашей стране в
подавляющем числе лабораторий применяют метод осаждения ЦИК при помо¬
щи полиэтиленгликоля. Это грубый тест, позволяющий установить присутствие
в сыворотке комплексов большой молекулярной массы. Наилучшим тестом для
обнаружения ЦИК считают реакцию связывания Clq-кoмпoнeнтa комплемента.Таблица 17-15. Методы определения циркулирующих иммунных комплексовОснова методаТестФизико-химические свойстваКриопреципитацияПреципитация полиэтилен гликолемУльтрацентрифугированиеМорфология и размерНепрямой фагоцитоз гранулоцитамиСвязывание комплементаСвязывание C1qСвязывание конглютининаАнтикомплементарная активность
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 113
Окончание табл. 17-15Основа методаТестСвязывание с антиглобулиномИнгибирование активности РФСвязывание рецепторами клеток крови (через Fc)Активация тромбо цитовСвязывание с рецепторами культур клеток (через Рс и
рецептор комплемента)Тест на клетках Raj іНедостаточная надежность методов определения ЦИК в сыворотке приводит к
определенному скепсису использования этих методов. Кроме того, высокое содер¬
жание ЦИК может обнаруживаться у клинически здоровых людей.Альтернативным вариантом определения ЦИК является морфологическое
исследование биоптата ткани с помощью прямой иммунофлюоресценции для
обнаружения отложений иммуноглобулинов и компонентов комплемента. Если
в развитии заболевания подозревается иммунокомплексный процесс, то следует
рекомендовать проведение биопсии ткани с прямым иммунофлюоресцентным
исследованием.КРИОГЛОБУЛИНЫОпределение криоглобулинов стоит особняком среди других методов обнару¬
жения ЦИК, поскольку является надежным методом диагностики криоглобулине-
мий с развитием иммунокомплесного васкулита.Криоглобулины представляют собой ЦИК, состоящие исключительно из имму¬
ноглобулинов и способные образовывать нерастворимые конъюгаты при темпе¬
ратурах ниже температуры ядра человеческого тела. Их преципитация в мелких
сосудах кожи приводит к клинической картине криоглобулинемии, характеризую¬
щейся геморрагическим васкулитом на конечностях, слабостью и артралгиями.
Реже при криоглобулинемиях наблюдается гломерулонефрит, лимфаденопатия
и спленомегалия, периферическая нейропатия и синдром Рейно. Наиболее часто
этот вид патологии встречается у 40-50-летних людей, причем женщины болеют
в 3 раза чаще мужчин.Определение криоглобулинов следует проводить в сыворотке, а не в плазме
крови, чтобы избежать возможной ошибки при обнаружении криофибриногена,
особого типа фибриногена, коагулирующего при низких температурах. Кровь
должна быть получена от больного непосредственно в лаборатории для того, чтобы
не допустить ее охлаждения; образование кровяного сгустка и центрифугирование
осуществляют при температуре 37 X. Для обнаружения выпавшего криопреци¬
питата в сыворотке крови требуется более 48 ч. Преципитация криоглобулинов
3 типа может занять до 5 дней. Поскольку даже нормальная сыворотка способна
за такое время образовывать нерастворимые преципитаты, то после обнаруже¬
ния криопреципитата необходимо достичь его растворения путем повторного
нагревания до 37 °С, Результат преципитации криоглобулинов не всегда очевиден.
Агрегация криоглобулинов может происходить с образованием кристаллов белка,
хлопьев, геля. Для унификации содержания криоглобулинов после образования
осадка, преципитат необходимо отцентрифугировать в стандартных условиях, что
позволяет полуколичественно оценить объем криоглобулинов в виде криокрита.
Оценка криокрита может быть использована при контроле эффективности тера¬
пии криоглобулинемии.Выделяют 3 типа криоглобулинемий. Криоглобулины первого типа характеризу¬
ются присутствием в плазме моноклонального иммуноглобулина, обычно IgM или
IgG. Основными причинами его возникновения являются лимфопролифератив-
ные заболевания, прежде всего миелома, макроглобулинемия Бальденстрема, хро¬
нический лимфоцитарный лейкоз и различные формы лимфом. Криоглобулины
имеются у 40% больных с миеломой, однако только у половины больных с
114 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙкриоглобулинемией первого типа отмечают клинические проявления, связанные
прежде всего с увеличением вязкости крови, такие как головные боли, нарушения
зрения, геморрагии сосудов сетчатки и синдром Рейно,Щу')	при втором типе описывают криоглобулины смешанного состава, включающие^ моноклональный компонент, обычно РФ класса IgM, и поликлональный IgG. Этот
о" тип криоглобулинемий часто встречается изолированно, представляя собой эссен-
lllW циальную (смешанную) криоглобулинемию. Реже смешанная криоглобулинемия
является вторичной находкой у больных с вирусными инфекциями, заболеваниями
соединительной ткани, лимфопролиферативными процессами и скрытыми инфек¬
циями. Основным инфекционным агентом, приводящим к развитию смешанной
криоглобулинемии, является гепатит с. среди больных вирусным гепатитом С с
экстрапеченочными проявлениями значимые титры криоглобулинов обнаружива¬
ются у 42% больных, у подавляющего большинства из них в сыворотке отмечают¬
ся диагностические титры РФ, Криоглобулины диагностировали преимуществен¬
но у больных с цирротической стадией вирусного гепатита. У 50% обследуемых с
криоглобулинемией отмечали клинические признаки геморрагического васкулита,
у 10% больных — мочевой синдром. Таким образом, смешанная криоглобулине¬
мия характеризуется тяжелыми клиническими проявлениями, напоминающими
системный васкулит с триадой, сочетающей разнообразные поражения кожи — от
пурпуры до геморрагического некроза кожи, боли в суставах и гломерулонефрит,
встречающийся у 50% больных с криокритом, превышающим 3%.Криоглобулинемия третьего типа является наиболее часто встречающейся раз¬
новидностью данной патологии и представлена смешанными иммунными ком¬
плексами поликлональных криоглобулинов, в составе которых обычно отмечается
поликлональный РФ класса IgM. Третий тип встречается у больных с ДБСТ, в
частности с СКВ, РА, СШ, аутоиммунными заболеваниями ЖКТ, постстрептокок-
ковым гломерулонефритом, подострым бактериальным эндокардитом, цитоме-
галовирусными инфекциями, инфекционным мононуклеозом. Особенно часто ее
обнаруживают у больных с хроническими вирусными гепатитами. Картина васку¬
лита, сопровождающаяся обнаружением криоглобулинов третьего типа, может
стать первым симптомом этого заболевания.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТЛОЖЕНИЙ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ В БИОПТАТАХ КОЖИ И ТЕСТ
ВОЛЧАНОЧНОЙ ПОЛОСКИПрямая иммунофлюоресценция позволяет обнаруживать отложения иммунных
комплексов в ткани органов-мишеней. В диагностических целях наиболее часто
используют биопсию почек и/или биопсию кожи. Исследование биоптатов ткани
имеет четкое диагностическое значение и зачастую оказывается единственным
методом подтверждения диагноза при неоднозначной клинической и серологи¬
ческой картине. При прямом иммунофлюоресцентном исследовании биоптатов
кожи при диффузной болезни соединительной ткани (ДБСТ) наблюдают 3 основ¬
ных типа отложений иммуноглобулинов и комплемента: АНА in vivo, волчаноч-
ную полоску и отложения в стенках сосудов дермы. Феномен обнаружения АНА,
фиксированных непосредственно в ткани, обозначают как «антинуклеарные анти¬
тела in vivo». AHA in vivo обычно представлены иммуноглобулинами класса IgG,
окрашивают ядра клеток эпидермиса кожи. Постоянно этот феномен встречается
при СКВ и СС.В основе АНА in vivo лежит способность проникновения аутоантител в живую
клетку, что характерно именно для рибонуклеопротеиновых аутоантител. По ана¬
логии с выявлением АНФ может бьггь исследован тип флюоресценции. Тип флюо¬
ресценции дает дополнительные сведения: гранулярный тип свечения отмечается
при всех аутоиммунных заболеваниях, нуклеолярный тип свечения отмечается
только при склеродермии, а гомогенный тип свечения наблюдают преимуществен-
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 115НО при СКВ. Обнаружение АНА в эпидермисе обычно связано с присутствием
антител к рибонуклеопротеинам, но не антител к дсДНК. При СШ характерный
тип нуклеарных/цитоплазматических депозитов IgG сопровождается наличием
аутоантител к Ro/SS-A и La/SS-B. Несмотря на то, что определение АНА в ткани
позволяет заподозрить СКВ, встречаемость этого феномена очень низка и не пре¬
вышает 10% при исследовании биоптатов кожи.Другим крайне характерным и постоянным признаком, который может быть
обнаружен при иммунофлюоресцентном исследовании биоптатов кожи, являются
крупно-гранулярные отложения иммуноглобулинов и комплемента под базаль¬
ной мембраной эпидермиса. Обнаружение этого феномена в материале биопсий
клинически здоровой кожи больных СКВ носит название «тест волчаночной
полоски(от англ. lupus band test) и отмечается только при СКВ. Благодаря частой
встречаемости и высокой специфичности ТВП прямое иммунофлюоресцентное
исследование биоптатов кожи при СКВ рекомендуется широко использовать для
диагностики этого заболевания.ТВП представляет собой накопление иммунных комплексов in situ. Апоптоз
кератиноцитов при СКВ рассматривают в качестве источников иммуногенно-
го апоптотического материала, вызывающего гуморальный иммунный ответ.
Апоптотические тельца, которые образуются при разрушении базальных слоев
кератиноцитов, через базальную мембрану эпителия поступают в дермз^ где они
связываются с аутоантителами, циркулирующими в крови. При окрашивании
ткани античеловеческой антисывороткой к иммуноглобулинам и факторам ком¬
племента, меченной флюоресцентной меткой, при микроскопии выявляется яркая
прослойка крупных гранул иммунных комплексов.Набор иммуноглобулинов в составе ТВП варьирует, более часто фиксируют
отложения IgM, реже — IgG и IgA. Факторы комплемента, прежде всего С3 ком¬
понент, отмечаются чаще с отложениями IgM. Выраженность результатов ТВП
непостоянна и неоднородна на разных з^астках кожи. Частота выявления положи¬
тельного ТВП выше при биопсии кожи открытых участков тела, подвергающихся
действию солнечных лучей, таких как предплечье, плечо и грудь. Рекомендуется
биопсировать неизмененную кожу, поскольку воспаление и рубцевание затрудня¬
ют описание ТВП.Положительный ТВП чаще отмечается у больных СКВ, и его чувствитель¬
ность достигает 98% в диагностике тяжелых системных форм этого заболевания.
Выраженность депозитов IgG коррелирует с общей тяжестью заболевания, титром
антител к дсДНК и поражением почек. При дискоидной волчанке и формах СКВ с
преимущественным поражением кожи частота встречаемости ТВП ниже и состав¬
ляет 50-60%, что превышает частоту обнаружения АНФ при дискоидной волчан¬
ке. Морфологическая достоверность, легкость получения материала и высокая
специфичность этого метода делают его очень привлекательным для клинического
использования. При диагностике ДКВ ТВП оказался более чувствительным по
сравнению с обнаружением АНФ. В 70% случаев основным иммуноглобулином,
который составляет ТВП, оказывается IgM, реже выявляют IgG и IgA.Наличие ТВП в редких случаях следует отличать от специфических отложений
IgA при герпетиформном дерматите Дюринга, который представляет собой раз¬
новидность буллезных дерматозов и отмечается преимущественно у пациентов
с целиакией. При этом заболевании имеют место гранулярные отложения IgA
под базальной мембраной эпидермиса, располагающиеся на вершине сосочков
дермы.При исследовании биоптатов кожи при ревматических заболеваниях могут
быть обнаружены гранулярные отложения иммуноглобулинов в стенках сосудов,
которые могут располагаться как в поверхностных, так и в глубоких сосудах.
Отложения иммуноглобулинов и факторов комплемента в сосудах дермы возмож-
116 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙНЫ при пурпуре Шенлейна-Геноха, герпетиформном дерматите Дюринга, лейко-
цитокластическом и криоглобулинемическом васкулите, СКВ и дерматомиозите.При дерматомиозите метод прямой иммунофлюоресценции позволяет обна¬
ружить отложения мембраноатакующего комплекса (МАК) комплемента, пред¬
ставленного отложениями терминальных компонентов системы комплемента
(C,j,_,) в микроциркуляторном русле кожи. По диагност№їеской значимости МАК
в капиллярах кожи под базальной мембраной может сравниться с ТВП при СКВ,
обладая специфичностью, достигающей 90% при сопоставимой чувствительности.
Сходные отложения МАК при дерматомиозите определяют в сосудах скелетных
мышц. Гистологическая картина поражения мышечной ткани при дерматомиозите
характеризуется выраженным васкулитом с периваскулярными инфильтратами,
состоящими из СВ''~-лимфоцитов. Некроз миоцитов происходит по периферии
мышечных волокон и возникает на фоне поражения сосудов. В мышечной ткани
отложения МАК характерны для зон с сохраненной гистологической структурой
мышечной ткани, в которой протекает активный воспалительный процесс. В
районах тотального фиброза мышцы отложения МАК не выявляются. По всей
видимости, разрушение капилляров под действием компонентов комплемента
приводит к склерозированию и разрушению мышечной ткани. Причиной образо¬
вания МАК при дерматомиозите в сосудах кожи и мышц могут быть комплемент-
связывающие антиэндотелиальные антитела, которые диагностируют у 50%
больных дерматомиозитом. Образование МАК и антиэндотелиальных антител с
антигенами на поверхности эндотелиоцитов ведет к развитию васкулита в сосудах
кожи и мышц.ДРУГИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ВАСКУЛИТАХПомимо АЭТА, в качестве неспецифического маркера васкулитов разной этио¬
логии применяют исследования факторов, продуцируемых поврежденной клеточ¬
ной стенкой в ответ на иммунное поражение. С этой целью используют монитори-
рование содержания фактора VHI (фактора Виллебранда), тромбомодулина и
фибронектина — сывороточных белков, синтезируемых эндотелиоцитами в ответ
на повреждение. Практически у всех больных с активными формами васкулитов
отмечают повышенные уровни этих маркеров, что позволяет использовать их с
диагностической целью, нарастание их содержания в плазме крови свидетельству¬
ет об активности васкулита.Содержание фактора Виллебранда отражает непосредственное повреждение
эндотелиальных клеток. Однако результаты его определения у больных с васкули¬
тами оказались неопределенными. Показано, что высокие уровни отмечаются при
активном заболевании и могут сохраняться в последующем, несмотря на клиниче¬
ское улучшение. Последующие эксперименты in vitro показали, что фактор высво¬
бождается как поврежденными, так и интенсивно делящимися эндотелиоцитами.
Это в какой-то степени объясняет неоднозначные клинические результаты.Фибронектин представляет собой высокомолекулярный гликопротеин
матрикса соединительной ткани, включающийся в состав иммунных комплексов
и участвующий в их клиренсе. Его высокое содержание фиксируют при васкули¬
тах, связанных с РА, СКВ, синдроме Кавасаки, васкулите при синдроме Бехчета,
оно отражает разрушение сосудистой стенки. Содержание фибронектина плазмы
снижено при эссенциальной смешанной криоглобулинемии, что говорит о его свя¬
зывании в составе криоглобулинов.Тромбомодулин — мембранный гликопротеин эндотелиоцита, и его выделе¬
ние в кровоток сопутствует повреждению сосудистой стенки, в качестве маркера
активности СКВ тромбомодулин превосходит растворимые молекулы адгезии,
SIL-2R, сывороточные IL-6, IL-10, антитела к дсДНК, острофазовые белки, СОЭ,
комплемент и иммуноглобулины, креатинин и АНА. Его высокое содержание в
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 117плазме крови отмечается при пурпуре Шенлейна-Геноха, СЧШ и других АНЦА-
ассоциированных васкулитах.Растворимые формы адгезионнЕдх молекул являются также продуктами
эндотелиальных клеток. Они выделяются при активации эндотелиальных клеток
при воспалении и потенциально могут использоваться в качестве показателей
активности васкулитов и близких васкулитам состояний. ICAM-1 — одна из
основных межклеточных молекул адгезии, осуществляющих взаимодействие лей¬
коцитов и эндотелиоцитов. Ее экспрессия на мембране эндотелиоцита индуциру¬
ется при воспалении. Кроме того, при активации клетки происходит слущивание
этих молекул с мембран клеток, приводящее к образованию растворимой формы
sICAM-1. Повышенные уровни sICAM-1 в сыворотке наблюдают при височном
васкулите, пурпуре Шенлейна-Геноха, АНЦА-ассоциированных и лейкоцито-
кластических васкулитах, активной СКВ, синдроме Бехчета, септическом шоке,
злокачественных новообразованиях и инфаркте миокарда. Васкулит, сопрово¬
ждающий системные заболевания соединительной ткани, также приводит к уве¬
личению содержания sICAM-1. У больных РА диагностируют значительно увели¬
ченное содержание sICAM-1 в сыворотке крови, особенно высокие концентрации
sICAM-1 наблюдались у больных с клинической картиной иммунокомплексного
васкулита.Серологические маркеры при аутоиммунных
поражениях печениАНТИТЕЛА К ГЛАДКИМ МЫШЦАМ (Р-АКТИНУ)Антитела к гладким мышцам (АГМА) реагируют с миофиламентами в цито¬
плазме гладкомышечных клеток. Существует несколько видов антител к гладким
мышцам, в том числе к фибриллярному (F) актину, тубулину и десмину. Среди
них только антитела к F-актину являются маркером аутоиммунного гепатита, в
то время как антитела к тубулину, десмину и виментину встречаются при ревма¬
тических заболеваниях и вирусных инфекциях и самостоятельного клинического
значения не имеют.Актин — глобулярный белок массой 46 кДа, который относят к микрофила-
ментам. Актин может существовать как в мономерной (М), так и в полимеризо-
ванной фибриллярной (F) форме. Связывание аутоантител зависит от конформа¬
ции эпитопов в составе F-формы, поэтому выделение Р-актина в нативном виде
затруднено. Это объясняет необходимость использования в НРИФ минимально
фиксированных криосрезов и сложность в разработке иммунохимических методов
для выявления аутоантител.Стандартом выявления АГМА служит НРИФ на тройном субстрате, вклю¬
чающем криосрезы желудка, почки и печени крысы. Антитела к актину окра¬
шивают цитоплазму мышечных волокон, включая наружные мышцы желудка,
lamina muscularis mucosae, межгландулярные мышечные пучки слизистой оболочки,
стенки сосудов в подслизистом слое и почке, мезангиальные клетки клубочков.
Характерно, что антитела к актину обычно представлены классом IgG и встреча¬
ются в титре, равном или более 1:80. Актиновые филаменты плохо экспрессиро¬
ваны в НЕр-2 клетках, поэтому цитоплазматический тип свечения при наличии
антител к актину определяют редко. В отличие от него, филаменты виментина и
десмина обычно видны на НЕр-2 клетках и встречаются в титрах 1:20-1:40.Для подтверждения антигенной специфичности антител к актину могут быть
использованы дополнительные субстраты, в том числе культуры фибробластов
или фибробластоподобных клеточных линий, обработанных винбластином, кото¬
рый разрушает «неактиновые» филаменты.
118 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙАнтитела к гладким мышцам с помощью НРИФ были обнаружены у пациентов
с хроническим активным гепатитом; у этих больных часто выявляют и другие
маркеры системных заболеваний — LE-клетки, АНФ, гипергаммаглобулинемию.
Определение АГМА позволило отделить эту форму гепатита от системных ревма¬
тических заболеваний и дать название «аутоиммунный гепатит». На сегодняшний
день АГМА, направленные против Р-актина, рассматривают в качестве наиболее
чувствительного маркера аутоиммунного гепатита I типа, хотя их встречаемость
при этом заболевании составляет только 55-70%.АНТИТЕЛА К МИКРОСОМАМ ПЕЧЕНИ-ПОЧЕКАнтитела к микросомам печени/почек {liver-Mdney microsomal autoantibodies —
LKM) образуются на фоне аутоиммунного гепатита II типа. Эта разновидность
аутоантител реагирует с проксимальными канальцами почки и цитоплазмой
гепатоцитов. Б зависимости от антигенной мишени и связи с заболеванием LKM
разделяют на 3 типа, хотя в подавляющем большинстве случаев необходимым и
достаточным является определение основных аутоантител 1 типа. Антигенной
мишенью LKM-1 служит микросомальный цитохром системы р450 2D6. Антитела
2 и 3 типов крайне редко встречаются при лекарственно-индуцированных и вирус¬
ных гепатитах и самостоятельного клинического значения не имеют. Их антиген¬
ными мишенями также являются цитохромы и микросомальные ферменты.Рекомендуемый метод обнаружения LKM-1 — НРИФ на тройном субстрате,
включающем криосрезы почки, печени и желудка крысы. На тканевом субстра¬
те крысы LKM-1 антитела связываются с проксимальными канальцами почки и
клетками печени, однако, в отличие от митохондриальных антител, не реагируют
с эпителиальными клетками слизистой оболочки желудка и не окрашивают дис¬
тальные канальцы почки. Кроме того, при сравнении с антителами к митохондри¬
ям LKM-1 более выраженно связываются с тканью печени. Существуют методы
определения LKM-аутоантител с помощью ИФА и иммуноблоттинга.Антитела к LKM-1 — основной серологический маркер аутоиммунного гепа¬
тита II типа, которым болеют преимущественно дети старше 1 года и подростки.
АИГ-2, в отличие от АИГ I, чаще отмечается у девочек, заболевание протекает
более активно, чаще ведет к циррозу и нередко сопровождается другими ауто¬
иммунными заболеваниями, в том числе диабетом, витилиго и аутоиммунными
тиреопатиями. Нередко фиксируют фульминантное начало, течение с периодами
обострения и затухания, в течение 2 лет развивается цирроз. В анализах крови
характерно умеренное повышение трансаминаз, снижение IgA сыворотки.По сравнению с другими аутоантителами, которые используют для диагностики
аутоиммунных заболеваний печени, антитела к LKM-1 встречаются сравнительно
редко. Крайне редко антитела к LKM встречаются при вирусном гепатите С (1-4%)
и гепатите D. Совместно с антителами к LKM-1 при аутоиммунном гепатите II типа
обнаруживают антитела к цитозольному антигену печени (LC-1). Эти антитела
направлены к одному из белков цитоплазмы гепатоцита массой 230 кДа, Для их
определения может использоваться НРИФ на тройном субстрате тканей крысы,
однако антитела против LC-1 очень сложно обнаружить на фоне высоких титров
анти-LKM-l антител. Для диагностики этой разновидности аутоантител в практи¬
ческой работе целесообразно использовать метод ИФА и иммуноблоттинг.Для диагностики АИГ используют еще один редко встречающийся, но очень
специфичный серологический маркер, который представляет собой антитела к
растворимому печеночному антигену {soluble liver antigen — SLA). Аутоантитела к
SLA отмечаются в 10-20% всех случаев АИГ, при их наличии АИГ хуже поддается
иммуносупрессивному лечению.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 119АНТИТЕЛА К МИТОХОНДРИЯМАутоантитела к митохондриям — семейство антимитохондриальных антител,
направленных против ферментов окислительного фосфорилирования внутренней
мембраны митохондрий, впервые описаны при первичном билиарном циррозе
(ПБЦ). Основным антигеном является Е^-субъединица 2-оксодегидрогеназного
комплекса, который участвует в цикле трикарбоновых кислот и синтезе жир¬
ных кислот. Большинство митохондриальных аутоантигенов расположено на
внутренней митохондриальной мембране эукариотических и прокариотических
клеток. В процессе эволюции ферменты окислительного каскада не изменялись,
что позволяет использовать антигены крысы и скота в тестах для определения
антимитохондриальных антотел (AMA). Субъединица — общая для нескольких
гликолитических ферментов (РОС, BCOADC, OGDC), в ее аминокислотной после¬
довательности выделено 3 линейных иммунодоминантных эпитопа AMA, харак¬
терных для ПБЦ. Пируват-декарбоксилазный комплекс осуществляет расщепление
липидов и подвержен действию многих гепатотоксичных веществ. Его антигенная
модификация играет ведущую роль в развитии аутоиммунного ответа при ПБЦ, В
то же время роль AMA в патогенезе заболевания не установлена, так как иммуни¬
зация антигеном лабораторных животных не приводит к развитию ПБЦ,Основным методом определения AMA является НРИФ на тройном субстрате,
включающем почку, желудок и печень крысы. При использовании тройного тка¬
невого комплекса митохондриальные антитела окрашивают все богатые митохон¬
дриями структуры — клетки канальцев почки и слизистой оболочки желудка, а
также цитоплазму гепатоцитов. Обработка мочевиной срезов слизистой оболочки
желудка уничтожает антигены митохондрий, что позволяет дифференцировать
AMA от антител к обкладочным клеткам желудка, которые также реагируют со
слизистой оболочкой.Цитоплазма Яф-2-клеток богата митохондриями, поэтому уже на этапе выяв¬
ления АНФ можно заподозрить присутствие AMA. Гранулярный тип свечения
АНФ отмечается у 30% больных с ПБЦ и может затруднять обнаружение цитоплаз¬
матического свечения. Для определения антигенной специфичности AMA исполь¬
зуют ИФА и иммуноблот.Исторически выделяют 9 разновидностей аутоантител к антигенам митохон¬
дрий, причем каждая разновидность обладает особенностями связывания с гисто¬
логическими структурами на тройном тканевом субстрате (табл. 17-16). Антигены
митохондриальных антител разнообразны по природе. Так, AMA-Mj представля¬
ют собой АФА, которые реагируют с внутренней мембраной митохондрий, богатой
кардиолипином.Для первичного билиарного цирроза наиболее характерны антитела к М^, М^,
Mjj и Mg. Среди них АМА-М2 отмечаются у большинства больных билиарным
циррозом, поэтому обнаружение других антител представляет только научный
интерес. АМА-М^ обычно определяется в высоких титрах. Высокая диагностиче¬
ская специфичность AMA обеспечивается их редким обнаружением при других
аутоиммунных заболеваниях, причем при ревматических процессах титры AMA
не превышают 1:80. АМА-М_ встречаются при миокардитах.Существует ряд минорных серологических маркеров ПБЦ, которые относят к
семейству АНА, в том числе splOO и PML, а также gp210. Антитела к splOO и PML
являются антигенами АНФ со свечением точек в ядре, которые часто отмечаются
при ПБЦ. Антитела к gp210 реагируют с порами ядерной мембраны, в методе
НРИФ на НЕр-2 клетках обусловливают периферический тип свечения ядра. Эти
аутоантитела имеются у 10-30% больных ПБЦ.
120 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Таблица 17-16. Антитела к митохондриямРазновидностьАМДОсновной антигенОсобенности при проведении НРИФ
на тройном субстратеНозологическая формаКардиолипинТолько дистальные канальцы почкиАФС. СКВ и другие ревма¬
тические заболеванияЕ2-субъединицапируват-декарбоксилазного
комплекса (РОС-Е,)Проксимальные и дистальные
канальцы и слизистая оболочка
желудкаПервичный билиарный
циррозНе уточненКлубочки, канальцы почки и слизи¬
стая оболочка желудкаЛекарственная СКВСульфит-окоидазаНеотличим от М,Первичный билиарный
циррозНе уточненТолько проксимальные канальцыАФС и др. ревматические
заболеванияМонами н-оксидаза ВСвязывается с клетками петли ГенлеЛекарственно-
индуцированный гепатитСаркозин-дегидрогеназаОкрашивает канальцы почки, но не
связывается со слизистой оболоч¬
кой желудкаМиокардит и кардиомио-
патииНе уточненПреимущественно реакция со слизи¬
стой оболочкой желудкаПервичный билиарный
цирроз	Гликоген-фосфорилазаРеакция только со слизистой обо-
лочкой желудкаПервичный билиарный
циррозСерологические маркеры при аутоиммунных
поражениях желудочно-кишечного трактаАНТИТЕЛА К ОБКЛАДОЧНЫМ (ПАРИЕТАЛЬНЫМ) КЛЕТКАМ ЖЕЛУДКА И ФАКТОРУ
КАСТЛААутоиммунный гастрит (тип А) относится к частым аутоиммунным заболе¬
ваниям ЖКТ. в 30% случаев он сопутствует аутоиммунным процессам в щито¬
видной железе, алопеции и витилиго, хотя может встречаться самостоятельно.
Аутоиммунный гастрит протекает субклинически и редко является поводом
для обращения пациентов к врачу. В его основе лежит аутоиммунная реакция,
направленная против обкладочных (париетальных) клеток желудка. Обкладочных
клеток больше в теле желудка, поэтому обычно аутоиммунный гастрит характери¬
зуется атрофией фундальных отделов по сравнению с антральным гастритом при
хеликобактерной инфекции. Антитела к обкладочным клеткам желудка (АПКЖ)
отмечаются у 90% больных с атрофическим гастритом и пернициозной анемией.Обкладочные клетки желудка вырабатывают соляную кислоту и внутрен¬
ний фактор Кастла, необходимый для всасывания витамина ® кишечнике.
Аутоантитела являются комплемент-фиксирующими и непосредственно уча¬
ствуют в разрушении популяции обкладочных клеток и развитии атрофического
гастрита. Уничтожение популяции обкладочных клеток ведет к гипоацидному
гастриту, мальабсорбции, железодефицитной и пернициозной анемиям. Не отме¬
чается взаимосвязи между обнаружением аутоантител к париетальным клеткам
желудка и антральным гастритом. Титры аутоантител не коррелируют с тяжестью
атрофии слизистой оболочки желудка, поэтому их мониторинг нецелесообразен.Для выявления АПКЖ используют метод НРИФ на криосрезах фундальной
части желудка крысы или мыши. Антитела реагируют только с обкладочными
клетками желудка и проявляются характерным цитоплазматическим окрашивани¬
ем, которое соответствует расположению внутриклеточных канальцев. Основной
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 121антиген АПКЖ — (3-субъединица Н", К‘-АТФазы, которая участвует в закислении
содержимого желудка. Рекомендуется использовать начальный титр сыворотки
1:40. Слизистая оболочка желудка богата митохондриями, поэтому она окраши¬
вается антимитохондриальными антителами. Для дифференцировки АПКЖ и
AMA целесообразно параллельно использовать в качестве субстрата почку крысы,
с которой связываются только AMA, Существует метод с использованием 2М рас¬
твора мочевины, которая, разрушая антигены AMA, позволяет дифференцировать
их от АПКЖ на слизистой оболочке желудка крысы.Внутренний фактор (фактор Кастла) представляет собой гликопротеин массой
72 кДа, который секретируется в просвет желудка и служит для связывания и
транспорта в стенку кишки витамина В^^- Аутоантитела к внутреннему фактору
способны вызывать нарушение его функции за счет блокады его связывания с
витамином, таким образом препятствуя адсорбции комплекса в тонком кишеч¬
нике. Антитела к внутреннему фактору являются более специфичными по срав¬
нению с АПКЖ при диагностике пернициозной анемии и дефицита витамина B^j.
Основным методом определения антител к внутреннему фактору является ИФА.АНТИТЕЛА К ЭНДОМИЗИЮ И ТКАНЕВОЙ ТРАНСГЛУТАМИНАЗЕАнтитела к эндомизию (АЭА) используются при диагностике целиакии; это
основной метод серологической диагностики целиакии, более надежный, чем
определение антител к глиадину. Основным антигеном АЭА сл)^жит тканевая
трансглутаминаза (ТкТГ), которая представляет собой кальций-связывающий
фермент. Основной функцией ТкТГ является образование перекрестных связей
между белками за счет реакции между глутамином в одном белке и лизином — в
другом. Существует 8 изоформ этого фермента, которые различаются по тканевой
локализации. В желудке преимущественно экспрессируется 2 тип ТкТГ. Мишенью
антител при герпетиформном дерматите, который тесно связан с целиакией, явля¬
ется 3 тип ТкТГ, который экспрессируется в коже. В норме активность этого фер¬
мента максимальна в клетках базального слоя кишечного эпителия, а также в под¬
слизистом слое. У больных целиакией отмечается повышенная экспрессия ТкТГ во
всех слоях слизистой оболочки кишечника. а-Глиадин на 60% состоит из амино¬
кислоты глутамина, который подвергается дезаминированию под действием ТкТГ,
Дезаминирование глиадина приводит к образованию неоэпитопов, содержащих
отрицательно заряженную аминокислоту глутамат и имеющих высокое сродство к
HLA-DC^ и DQg, носительство которых предрасполагает к развитию целиакии. Тем
не менее генотип HLA-DC^ присутствует у 25-30% европейцев, однако далеко не у
всех развивается целиакия.ТкТГ дезаминирует ряд белков соединительной ткани в составе эндомизиаль-
ных и ретикулиновых волокон. Таким образом, иммунный ответ на экзогенный
антиген ведет к образованию антител к а-глиадину, а также аутоантител против
аутоантигенов эндомизия, ретикулина и ТкТГ.АЭА могут быть определены с помощью НРИФ на множестве антигенсодер¬
жащих субстратов. Могут использоваться криосрезы пищевода, печени, желудка,
стенки мочевого пузыря обезьяны, крысиные почки и тонкая кишка. Еще одним
субстратом для обнаружения АЭА являются криосрезы человеческой пуповины.
Стандартным субстратом для НРИФ считают криостатные срезы пищевода обе¬
зьяны. Обычно используют разведение сыворотки 1:5 и антисыворотку класса
IgA. Сыворотки с высокими титрами АЭА дают типичное окрашивание, которое
напоминает пчелиные соты. Первоначально в ИФА-системах для определения
антител к ТкТГ использовали антигены животных. Однако низкий уровень очист¬
ки белка, а также наличие видоспецифичных эпитопов снижали специфичность
теста. Второе поколение ИФА было основано на рекомбинантной ТкТГ человека.
За счет высоких аналитических параметров эти И ФА-тесты в значительной сте¬жщМ'шш
шщщ.122 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙпени вытеснили метод НРИФ для диагностики АЭА. Высокая чувствительность
ИФА тест-систем улучшает диагностику целиакии, однако тест-системы многих
производителей имеют низкую специфичность, особенно при дифференциальной
диагностике целиакии и других заболеваний ЖКТ. Изучение антигенной структу¬
ры молекулы ТкТГ показало, что основной эпитоп антител при целиакии является
конформационным и образован ядром молекулы фермента. Аутоантитела к ТкТГ,
характерные для целиакии, подавляют активность фермента. В то же время анти¬
тела к ТкТГ, встречающиеся у больных с аутоиммунным гепатитом, циррозом,
вирусными инфекциями, направлены к внешним доменам молекулы ТкТГ, Этим
может объясняться меньшая специфичность антител к ТкТГ по сравнению с
определением АЭА.Для лабораторной диагностики целиакии применяют определение антител к
ТкТГ классов IgA и IgG. Наиболее специфичен тест для выявления антител к ТкТГ
класса IgA, которые имеются у 95% больных с дебютом целиакии. Аутоантитела
класса IgA могут быть обнарз^жены в крови, а также в других биологических жид¬
костях, в том числе в слюне и желчи. Определение аутоантител класса IgG менее
специфично, так как они встречаются при других воспалительных заболеваниях
ЖКТ, однако они могут быть использованы для диагностики целиакии у лиц с
селективных дефицитом IgA.АНТИТЕЛА К А-ГЛИАДИНУ КЛАССОВ IgG И IgAАнтитела к глиадину были основным методом иммунологической диагностики
целиакии. Строго говоря, глиадин не является аутоантигеном, однако иммунная
реакция против глиадина запускает каскад иммунных реакций, в результате кото¬
рых образуются аутоантитела и развивается аутоиммунное заболевание.Глиадин представляет собой алкогольрастворимую фракцию глютена, кото¬
рый, в свою очередь, является компонентом глютенопектина злаковых. Глютен
обеспечивает эластичность мучного теста и, благодаря этому свойству, широко
используется для приготовления многих пищевых продуктов, в состав глютена
злаковых входит более 50 различных глиадиновых белков, которые подразделя¬
ются на а-, р-, у- и со-фракции. В связи с высоким содержанием пролина глиадины
сравнительно устойчивы к энзиматическому разрушению в ЖКТ. Изучение моле¬
кулярной структуры белков в составе глютена привело к идентификации общей
для них линейной иммунодоминантной аминокислотной последовательности
QPEQPFP. Последний остаток глутамина в этой структуре служит мишенью для
фермента тканевой трансглутаминазы, под действием которой он превращается в
глутамат. Изменение заряда молекулы приводит к лучшему связыванию ее с HLA-
и стимуляции иммунного ответа.Для определения антител к глиадину используют метод ИФА. Антиген пол}^а-
ется из алкогольрастворимой фракции глютена зерновых культур. В состав этой
фракции входит множество различных белков и последовательностей глиадина.
Значительные вариации в белковом составе, а также разнообразие антигенов объ¬
ясняют отличия тест-систем различных производителей и низкую специфичность
этих тестов. Это ведет к тому, что антитела к глиадину значительно уступают по
клинико-лабораторной информативности АЭА и антителам к тканевой транс-
глутаминазе. Для диагностики целиакии применяют определение антител к глиа¬
дину классов IgA и IgG. Антиглиадиновые антитела класса IgG чувствительны, но
очень неспецифичны, и их можно рассматривать как показатель, отражающий
воспаление в ЖКТ. Антитела класса IgA имеются у 30-40% больных с целиакией.
Концентрация антител к а-глиадину прогрессивно снижается после назначения и
соблюдения безглютеновой диеты.сравнительно недавно появились коммерческие тест-системы, основанные на
«модельном» антигене, содержащем многократно повторенные линейные имму-
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ f 23нодоминантные последовательности глиадина. Предполагается, что такой подход
значительно повысит диагностическую специфичность антител к глиадину и улуч¬
шит стандартизацию определения этого показателя.Антитела к Saccharomyces cerevisiaeв основе патогенеза болезни Крона лежит утрата толерантности к антигенам
пищи, в результате чего развивается иммунный ответ на антигены пищи и антиге¬
ны содержимого кишки. Для диагностики болезни Крона используют определение
антител к пекарским дрожжам Saccharomyces cerevisiae (ASCA), которые являют¬
ся естественным антигеном. Помимо антител к антигенам пекарских дрожжей,
при болезни Крона образуются антитела к мембранному белку ОтрС кишечной
палочки и Pseudomonas ßuorescens. При болезни Крона обнаруживают антитела
к полисахаридным последовательностям, входящим в состав клеточной стенки
многих организмов. Полисахаридные антитела называют ALCA, АМСА и АССА.
Их объединяют термином «антигликановые антитела». Встречаемость каждого
из этих маркеров не превышает 20%, поэтому их использование в диагностике
болезни Крона малоэффективно.Основными иммуногенными эпитопами ASCA являются также компоненты
полисахаридов, в том числе маннотетроза и маннотриоза. Наличие ASCA может
объясняться перекрестной реакцией с распространенным дрожжевым грибком
С. albicans. Характерно, что С. albicans чаще высевают у больных воспалительными
заболеваниями кишечника и членов их семей. Основным методом определения
ASCA служит НРИФ на клетках дрожжей, хотя также могут быть использованы
тест-системы, основанные на методе ИФА.Независимо от географического района и расовой принадлежности обследуе¬
мых антитела к дрожжевым грибкам выявляют при болезни Крона с одинаковой
частотой, составляющей около 50% (40-70%). Характерно, что антитела к ASCA
чаще встречаются у родственников больных воспалительными заболеваниями
кишечника (20-25%), по сравнению с частотой показателя в здоровой популя¬
ции (0-5%), и больных с неспецифическим язвенным колитом (НЯК) (10-15%).
Антитела могут быть представлены IgG или IgA, обладая общей специфичностью
93%. При болезни Крона у пациентов с ASCA заболевание протекает тяжелее, что
связано с частыми эпизодами кишечной непроходимости, а также лучше отвечает
на терапию блокаторами TNF-a,Антитела к бокаловидным клеткамАнтитела к бокаловидным клеткам (АБК) являются серологическим маркером
НЯК. Бокаловидные клетки кишечника производят муцин, который состоит из
осевого белка, покрытого полисахаридами. Его функция заключается в увлажне¬
нии слизистой оболочки и обеспечении водно-солевого баланса. Муцин — основ¬
ной антиген АБК, причем иммунодоминантные эпитопы обнаружены как в поли¬
сахаридных остатках, так и в осевом белке муцина.Антитела могут играть определенную роль в патогенезе НЯК, так как распро¬
странение воспалительного поражения кишечника при НЯК отражает анатомиче¬
ское распределение бокаловидных клеток в кишечнике. Их число минимально в
двенадцатиперстной кишке и увеличивается по направлению к прямой кишке, где
их число максимально. НЯК поражает прямую кишку и распространяется вверх
при увеличении активности заболевания. В норме бокаловидные клетки преоб¬
ладают в криптах кишечника, а именно — в абсцессах крипт, очень характерных
для этого заболевания. В то же время АБК отмечаются не у всех больных НЯК,
поэтому их рассматривают как вторичный феномен.Стандартным методом диагностики АБК считают НРИФ на тонком кишечнике
приматов или новорожденных обезьян. Применение тонкого кишечника крысы
шч"	124 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ'ïs^	более чувствительно, однако приводит к увеличению числа ложноположительных" Сч '	результатов. Характерное окрашивание проявляется дымчатыми «облачками» на>?	фоне слизистой оболочки кишечника, В качестве антигена может использоватьсяс	перевиваемая клеточная линия муцин-продуцирующих бокаловидных клеток^><Гх	HT29-18-N.Встречаемость АБК при НЯК составляет 30-60% в зависимости от типа суб-
с' ^страта. При использовании совместно с АНЦА диагностическая чувствительностьI	достигает 60-70%.Серологические маркеры при аутоиммунных эндокринопатияхАНТИТЕЛА К ПЕРОКСИДАЗЕ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫТиреоидная пероксидаза (ТПО) — основной фермент гормоногенеза щитовид¬
ной железы, изначально описана под названием «микросомальный антиген». До
сих пор существует название «антитела к микросомальной фракции щитовидной
железы», которое интерпретируется как антитела к слабо очищенной ТПО, хотя
микросомальная фракция содержит также белки митохондрий и ряд цитоплазма¬
тических разновидностей АНА. В современных тест-системах используют высо-
коочищенный белок или рекомбинантную ТПО.Пероксидаза находится на апикальной поверхности тиреоидных фолликуляр¬
ных клеток. Она представляет собой основную антигенную мишень при тиреои¬
дите Хашимото, против которой направлено большинство клеточных ответов при
этом заболевании.До развития клинической картины заболевания в щитовидной железе можно
обнаружить выраженную клеточную инфильтрацию. Мононуклеарные инфильтра¬
ты содержат большое количество В-клеток, Т-клеток и макрофагов. Формирование
инфильтратов сопровождается постепенной деструкцией этих фолликулов и
«попытками» железы регенерировать, что приводит к ее диффузному или узлово¬
му увеличению и появлению зоба. Показана связь между антителами к ТПО и кли¬
ническими особенностями заболевания: антитела чаще обнаруживают у субъектов
с узлами по сравнению с пациентами без узлов щитовидной железы.Характерно, что аутоантитела к ТПО продуцируются главным образом лим¬
фоцитарными инфильтратами щитовидной железы и только в малой степени —
клетками регионарных лимфатических узлов и костного мозга. Именно поэтому
аутоантитела к ТПО коррелируют с гистологической тяжестью тиреоидита и
увеличенными размерами железы на ранних стадиях заболевания. У больных с
высокой активностью аутоантител отмечается склонность к гипотиреозу. Титр
аутоантител к ТПО соотносится с продукцией в воспалительном инфильтрате
классических провоспалительных цитокинов, таких как IFN-y и TNF-a, которые
могут быть связаны с повреждением щитовидной железы. Большинство антител к
ТПО относится к IgGj-субклассу, который считают хорошим активатором компле¬
мента; продемонстрирована комплементопосредованная цитотоксичность на изо¬
лированных тиреоидных клетках. Найдены отложения компонентов комплемента
в щитовидной железе больных, обусловленные его активацией под действием
антител к ТПО.В подавляющем числе лабораторий для определения аутоантител к ТПО
используют ИФА и иммунохимические методы. Основным показанием к обследо¬
ванию считают диагностику аутоиммунных заболеваний щитовидной железы. По
сравнению с антителами к тиреоглобулину антитела к ТПО более чувствительны и
специфичны, поэтому существует мнение, что дополнительное выявление антител
к тиреоглобулину только увеличивает цену обследования, не добавляя диагности¬
ческой информативности. Антитела присутствуют у 75-90% пациентов с тиреои-
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 125дитом Хашимото, у 60% пациентов с послеродовым тиреоидитом и примерно у
75% пациентов с болезнью Грейвса. Поскольку ТПО-антитела обнаруживают при
всех формах аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, то они не могут
быть использованы для дифференциальной диагностики аутоиммунного тиреои¬
дита и болезни Грейвса.Другим показанием к определению этих антител является исключение ауто¬
иммунного гипотиреоза во время беременности. Примерно 2% беременностей
протекает при пониженной тиреоидной функции. Беременность может «предъ¬
являть» повышенные требования к тироксину, поэтому субклинический гипоти¬
реоз обычно проявляется на ее фоне. Повышение уровня тиреостимулирующего
гормона или понижение свободного во время I триместра беременности может
сочетаться с нарушением нейропсихологического развития плода. Присутствие
антител к ТПО во время беременности указывает на увеличение риска развития
клинически значимого гипотиреоза и может рассматриваться как показание к
выполнению повторных измерений тиреостимулирующего гормона. Наличие
аутоантител к ТПО также увеличивает риск послеродовой тиреоидной дисфунк¬
ции. Послеродовой гипотиреоз наблюдается примерно у 5% рожениц и характери¬
зуется наличием аутоантител к ТПО. Это нарушение обычно наблюдают в первые
месяцы после родов, часто оно начинается с тиреотоксической фазы, сменяемой
пролонгированным гипотиреозом. Он может персистировать в течение многих
месяцев и примерно в 30% случаев может стать перманентным. Женщины с анти¬
телами к ТПО во время беременности имеют 50% вероятность развития послеро¬
довой тиреоидной дисфункции в сравнении только с 2% вероятностью у женщин
с негативными результатами исследования. Если антитела к ТПО выявляют
в Ш триместре беременности, то риск послеродовой тиреоидной дисфункции уве¬
личивается и достигает 80%.Достаточно противоречиво определение аутоантител для оценки субклиниче-
ского тиреоидита и гипотиреоза. Так же, как другие часто встречающиеся аутоан¬
титела, например АНФ или РФ, антитела к ТПО часто обнаруживают у клинически
здоровых лиц, преимущественно у женщин среднего и пожилого возраста. Частота
таких находок варьирует в зависимости от возраста, географического и демогра¬
фического состава популяции. Ряд исследователей указывают на встречаемость
аугоантител у 20% женского населения. Этот феномен предлагается использовать
для выявления лиц с предрасположенностью к тиреоидиту и гипотиреозу. Наличие
антител к ТПО у клинически здоровых лиц может быть использовано как показа¬
ние для обследования с целью диагностирования субклинического гипотиреоза,
характеризуемого повышенным уровнем тиреостимулирующего гормона при
нормальной концентрации свободного Т^. Имеются результаты популяционных
исследований, указывающих на то, что ежегодный риск развития гипотиреоза у здо¬
ровых субъектов значительно увеличивается в присутствии аутоантител к ТПО. Эти
индивидуумы могут иметь повышенный риск развития явного гипотиреоза и/или
кардиоваскулярных болезней. В связи с этим нужно проводить регулярное исследо¬
вание функции щитовидной железы у лиц с высоким содержанием антител к ТПО.Методов первичной профилактики тиреоидита не существует, а целесообраз¬
ность регулярных гормональных обследований у лиц без клинических признаков
гипотиреоза представляется сомнительной с финансовой точки зрения, учитывая
естественную динамику функции щитовидной железы с течением времени.Антитела к ТПО часто находят у больных другими аутоиммунными забо¬
леваниями, такими как СКВ, РА, сахарный диабет I типа и болезнь Аддисона.
Гипофункция щитовидной железы присутствует примерно у 15% больных, полу¬
чающих кордарон, и наличие антител к ТПО увеличивает риск развития гипо¬
тиреоза. Кроме того, наличие антител к ТПО является фактором риска развития
гипотиреоза на фоне терапии литием.
^	126 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙАНТИТЕЛА К ТИРЕОГЛОБУЛИНУИсследования аутоиммунной реакции против тиреоглобулина (ТГ) в значитель-
ной степени определили понимание патогенеза всех аутоиммунных эндокринных
заболеваний. Доказано, что иммунизация кроликов, морских свинок или собак
очищенным ТГ того же вида или даже того же животного способна вызывать лим¬
фоцитарный тиреоидит и образование аутоантител к ТГ. Аутоантитела к тирео¬
глобулину были найдены у больных с болезнью Грейвса, тиреоидитом Хашимото,
раком щитовидной железы, некоторыми другими аутоиммуными заболеваниями,
а также они были обнаружены у значительного числа здоровых людей.ТГ — главный компонент коллоида фолликул щитовидной железы. Он играет
основную роль в фиксации железой атомарного йода и синтезе йодированных
тиреоидных гормонов тироксина (Т^) и трийодтиронина (Т.,). В норме йодируется
не более 25% тирозиновых остатков в составе тиреоглобулина.Доказано, что йод пищи играет роль в модулировании аутоиммунного тире¬
оидита, что базируется на клинических и эпидемиологических доказательствах
и экспериментальных исследованиях на животных, склонных к тиреоидиту.
Содержание йода в тиреоглобулине зависит от его поступления с пищей. У экспери¬
ментальных животных повышенное содержание йода в диете увеличивает тяжесть
тиреоидита. Роль йода в качестве одного из факторов развития аутоиммунного
процесса связана с его способностью менять конформационную структуру белка.
Высокойодированный ТГ представляется более антигенным, чем тиреоглобулин с
меньшим количеством йода.Аутоантитела к ТГ рассматривают как непатогенные, главным образом, пото¬
му, что введение сыворотки больных лабораторным животным не приводит к
тиреоидиту. Титр антител к тиреоглобулину обычно не коррелирует со степенью
тиреоидной дисфункции. В то же время сыворотка, содержащая антитела к ТГ,
может переносить заболевание лри специальных условиях. Инъекция иммунной
сыворотки в щитовидную железу здоровых кроликов способна переносить ауто¬
иммунный тиреоидит. По всей видимости, разрушение части клеток под действием
антителозависимой цитотоксичности способно привести к аутоиммунизации орга¬
низма собственным тг.Аутоантитела к ТГ представлены иммуноглобулином ígG и распределены
среди всех его 4 субклассов. Антитела класса IgG2 доминируют при тиреоидите
Хашимото, в то время как антитела класса IgG^ в большем объеме представлены
при болезни Грейвса, нетоксическом зобе и дифференцированной карциноме
щитовидной железы. Исторически антитела к ТГ измеряли многими иммунологи¬
ческими методами, однако в настоящее время иммунохимические тесты и прежде
всего ИФА вытеснили все другие подходы.Аутоантитела к ТГ чаще всего используют для подтверждения клинического
подозрения на тиреоидит Хашимото, их обычно определяют вместе с антитела¬
ми к ТПО. Антитела к ТГ менее постоянны и ниже титром, чем антитела к ТПО.
Поскольку у всех больных тиреоидитом Хашимото в присутствии антител к ТГ
отмечаются и антитела к ТПО, последние являются наилучшим тестом для диа¬
гностики тиреоидита. Чувствительность метода составляет 95-98%, поэтому
негативные результаты имеют высокое отрицательное предсказательное значение
и позволяют исключить диагноз тиреоидита.Антитела к ТГ обладают низкой специфичностью. Они присутствуют в 40-50%
случаев болезни Грейвса, 20% случаев нетоксического зоба и при раке щитовидной
железы, а также у здоровых индивидуумов, особенно у пожилых женщин, у кото¬
рых встречаемость аутоантител доходит до 10% случаев. Антитела были найдены
при нетиреоидных аутоиммунных болезнях, таких как СШ, миастения, целиакия,
сахарный диабет I типа. Косвенно эти данные подтверждают, что тиреоидная
аутоиммунность — более распространенное явление, чем тиреоидит Хашимото.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 127Действительно, антитела к ТГ могут позволить оценить риск развития аутоим¬
мунного тиреоидита. Когортное 20-летнее исследование, проведенное в Англии,
показало, что наличие тиреоидных антител является ведущим фактором риска при I»
идентификации лиц, которые имеют риск тиреоидита. Риск заболевания тиреои- -
дитом в случае наличия аутоантител составляет около 3-5%. Кроме того, антитела
к ТГ полезны для определения риска развития послеродового тиреоидита.Узкой областью клинического применения исследования на наличие антител к \ ^
ТГ является постоперационный мониторинг пациентов с дифференцированным
раком щитовидной железы. После тиреоидэктомии и абляции радиоактивным
йодом больных рецидив заболевания сопровождается увеличением свободного
тиреоглобулина в сыворотке. Поскольку тиреоглобулин — тканеспецифичный
белок, экспрессируемый исключительно тиреоидными клетками, повышенная
концентрация тиреоглобулина после операции указывает на рецидив рака или
метастазы. В этом случае антитела к ТГ приводят к заниженным концентрациям
свободного тиреоглобулина.АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТОРУ ТИРЕОТРОПНОГО ГОРМОНАРецептор тиреотропного гормона (рТТГ) экспрессируется преимущественно
на поверхности тиреоидных фолликулярных клеток, но также на лимфоцитах,
адипоцитах и фибробластах. Тиреотропный гормон (ТТГ) является регулятором
активности щитовидной железы. Сигнал от рТТГ запускает продукцию тиреоид¬
ных гормонов и рост тиреоидных фолликулярных клеток. Избыточная активация
рТТГ при болезни Грейвса объясняет наличие тиреотоксикоза и зоба при этом
заболевании. Молекула рТТГ состоит из двух (А и Б) субъединиц гликопротеина.Эффект связывания аутоантител с рТТГ может быть разнонаправленным. Так,
экстрацеллюлярная А-субъединица рецептора распознается тиреоидными стиму¬
лирующими антителами, в то время как антитела, распознающие субъединицу Б,
локализованную вблизи клеточной поверхности, действуют как функционально
блокирующие антитела.Стимулирующие антитела составляют основу болезни Грейвса — диффузно¬
го токсического зоба. Блокирующие антитела связываются с рецептором, но не
вызывают его конформационных изменений, требуемых для сигнальной транс-
дукции. Они препятствуют связыванию ТТГ с рецептором, в результате чего воз¬
никает снижение тиреоидной функции. Блокирующие антитела были обнаружены
у пациентов с атрофическим тиреоидитом Хашимото и у больных с болезнью
Грейвса, протекающей с офтальмопатией. Блокирующая активность аутоанти¬
тел может отчасти объяснить колебания тиреоидной функции, наблюдаемой у
пациентов с болезнью Грейвса, и отсутствие корреляции между титром антител к
рецептору тиреотропина и тиреоидной функцией. Блокирующие антитела могут
проходить сквозь плаценту и вызвать транзиторный врожденный гипотиреоз.
Наконец, установлены нейтральные аутоантитела к рТТГ, которые связываются
с рецептором, но блокируют связывание тиреотропина или других рецепторных
антител. Нейтральные антитела определяют у пациентов с болезнью Грейвса. Их
патогенетическое значение остается неустановленным.Нет сомнения в том, что антитела к рецептору являются патогенетически зна¬
чимыми. Действительно, болезнь Грейвса — одно из немногих аутоиммунных
заболеваний, при котором имеются прямые доказательства его аутоиммунной
природы. Эти доказательства происходят от способности аутоантител переносить
болезнь. D.D. Adams, который обнаружил эти антитела, продемонстрировал повы¬
шение функции собственной щитовидной железы после инъекции себе плазмы от
пациентов с болезнью Грейвса. Опосредованный перенос болезни Грейвса анти¬
телами доказан также в перинатальном периоде, когда матери, страдающие болез-
128 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙНЬЮ Грейвса, передавали ее новорожденным, у которых транзиторно развивались
зоб и тиреотоксикоз.Для определения аутоантител к рТТГ применяют радиоиммунный, ИФА и
иммунохимический методы. Ни один из этих методов не позволяет уточнить
присутствие в сыворотке крови стимулирующих или блокирующих антител.
Для этой цели был разработан функциональный тест на культурах тиреоцитов
животных, ШІИ 1АГ5-тест (от англ. long acting thyroid stimulator), В его основе
лежит увеличение концентрации цАМФ в тиреоцитах под действием сыворот¬
ки больного, добавляемой в культуральную среду. В связи с трудоемкостью и
сложностью стандартизации метод LÁTS используют только в исследовательских
лабораториях.Существует 4 возможных клинических показания для определения антител к
рецептору тиреотропина:❖	диагностика транзиторной тиреоидной дисфункции у новорожденных
от матерей с тиреотоксикозом и прогнозирование неонатальной болезни
Грейвса;❖	определение антител аутоиммунного генеза у больных с изолированной
офтальмопатией без классических тиреоидных признаков (эутиреоидная
болезнь Грейвса);^ предсказание рецидива тиреотоксикоза после прекращения 12-месячного
цикла антитиреоидной терапии;❖	определение причины послеродового тиреотоксикоза.Антитела к рТТГ высокоспецифичны, они крайне редко встречаются у здоровых
людей. Клиническая чувствительность составляет около 80%, то есть негативный
результат определения аутоантител не позволяет исключить заболевание. Низкая
чувствительность методов связана с тем, что аз^тоантитела к рецептору присутству¬
ют в сыворотке в очень малой концентрации, на несколько порядков ниже, чем
уровни аутоантител к ТГ и ТПО.АНТИТЕЛА К ОСТРОВКОВЫМ КЛЕТКАМАнтитела к островковым клеткам (АОК) были впервые обнаружены у боль¬
ных сахарным диабетом I типа (СД I) методом НРИФ на криостатных срезах
аутопси йной поджелудочной железы человека с О группой крови. Этот метод для
определения антиостровковых антител (от англ. islet cell antibodies — ICA) имеет
хорошую чувствительность и специфичность для СД I, но значительную межла-
бораторную вариацию. Поэтому был разработан стандарт сыворотки JDF (Juvenile
Diabetes Foundation), которъш стали использовать для стандартизации всех методов
выявления АОК.АОК представляют собой гетерогенную группу антител, реагирующих с раз¬
личными аутоантигенами в островковых р-клетках. Антигенами АОК является
обширная группа мембранно-ассоциированных и цитоплазматических белков
островковых клеток, причем ряд антигенов — общие для эндокринной и нерв¬
ной ткани. В семействе АОК изучено несколько основных антигенов, таких как
глутамат-декарбоксил аза (ГДК), эндогенный инсулин, тирозиназа (IA-2), и около
20 минорных антигенов.Непосредственная роль АОК в разрушении островковых клеток при сахарном
диабете остается спорной, однако была подтверждена способность антител фик¬
сировать комплемент на островковых клетках, а также нарушать высвобождение
инсулина. В то же время АОК могут быть обнаружены у 0,5-2% контрольной
популяции. Терапевтический плазмаферез не оказывает действия на выработку
эндогенного инсулина в дебюте диабета. У новорожденных от матерей, больных
СД I, в крови которых присутствуют АОК, диабет не развивается.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 129Определение АОК — наиболее чувствительный серологический тест в диагао-
стике впервые выявленного СД I. Островковые антитела находят в 75-85% слу-
чаев СД I во время установления диагноза. Встречаемость значительно снижается
с увеличением возраста дебюта заболевания. Примерно 5-10% пациентов с сим¬
птоматикой СД II могут иметь АОК на фоне инсулинозависимой формы диабета
взрослых, которая является разновидностью аутоиммунного диабета.АОК могут служить важным предиктором заболевания для родственнников
первой степени больных СД I. Среди них 2-5% оказываются положительными по
АОК, в то время как в контроле всего 0,4% испытуемых. Риск заболевания брата
или сестры максимален в течение 5 лет от момента заболевания пробанда.АУТОАНТИТЕЛА К ИНСУЛИНУ И ТИРОЗИНАЗЕ1А-2Антитела к инсулину у пациентов с СД I, не получавших экзогенный инсулин,
долгое время казались случайной находкой. Для диагностики СД I они были
впервые использованы у детей с впервые выявленным СД I до начала инсулиноте-
рапии. Антитела к инсулину у больных, уже получающих препараты инсулина, не
являются специфичными для СД I, поскольку в этом случае антигенные эпитопы
эндогенного и экзогенного инсулина несколько отличаются. Экзогенный челове¬
ческий инсулин — плохой иммуноген, однако рекомбинантный инсулин, который
вводят в смеси с протамином или цинком, выраженно иммуногенен и быстро
вызывает образование антител.Аутоантитела, определяемые до назначения препаратов инсулина, т.е. к эндо¬
генному инсулину, присутствуют у 20-40% больных с клиническим дебютом СД I.
Титр антител обратно пропорционален возрасту и уменьшается по мере разруше¬
ния р-клеток. В отличие от других аутоантител к островковым антигенам, значе¬
ние антител к инсулину максимально в возрасте до 10 лет, после чего аутоантитела
обнаруживают крайне редко. Антитела к инсулину присутствуют у большинства
детей до 5 лет, но только у 4% при начале СД I после 19-летнего возраста. Высокий
титр у малолетних детей связывают с тем обстоятельстом, что у них заболевание
протекает более агрессивно, с быстрым развитием зависимости от экзогенного
инсулина. При прогнозировании заболевания у близких родственников больных
отмечается слабая корреляция между определением антител к инсулину и риском
развития СД I, но она увеличивается, если они выявляются в комбинации с други¬
ми антителами к островковым антигенам. Антитела к инсулину находят при ауто¬
иммунных полиэндокринопатиях, при других аутоиммунных заболеваниях и при
назначении препаратов, содержащих тиоловое кольцо, таких как пеницилламин.Долгое время основным методом обнаружения антител к инсулину был радио¬
иммунный метод. Широкое внедрение ИФА привело к разработке соответ¬
ствующих тест-систем, однако результаты сравнения методов показали, что
радиоиммунный метод имеет значительные преимущества, благодаря сохранению
нативной конформации белков.Нейроэндокринный антиген 1А-2 (1СА512) стал последним из обнаруженных
островковых антигенов, аутоантитела к которому используют в диагностике и про¬
гнозировании сахарного диабета. Распространенный в нейроэндокринной ткани
белок 1А-2 и его гомолог 1А-2р (белок фогрин) принадлежат к энзиматически
неактивным представителям семейства тирозинфосфатазы, участвующим в регу¬
ляции секреции инсулина. Обе молекулы локализуются в секреторных гранулах
нейроэндокринных клеток и регулируют секрецию инсулина. Определение анти¬
тел к 1А-2 используют в прогнозировании развития СД I у родственников больных.
Основным методом выявления аутоантител к 1А-2 служит иммунопреципитация с
^^5-метионин-меченого рекомбинантного человеческого 1А-2 или конкурентный
радиоиммунный анализ. Метод ИФА малоспецифичен и не рекомендован для
клинического применения.4,.шш
<}|||| 130 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙАНТИТЕЛА К ГЛУТАМАТ-ДЕКАРБОКСИЛАЗЕАутоантитела к глутамат-декарбоксилазе (ГДК) были впервые обнаружены у
пациента с редю^м неврологическим заболеванием и СД I. Это неврологическое
заболевание носит название «синдром скованного человека» (англ. stІff~personsyndrome). Оно характеризуется прогрессирующей ригидностью нижних конеч-
шМЩЩШ ностей. Болезненные спазмы мышц при этом синдроме вызываются внезапнымистимулами, 10% больных страдают эпилепсией. Методом иммунопреципитации
антитела к ГДК были обнаружены в сыворотке у больных СД I, а также у экспе¬
риментальных животных с диабетом. Антитела к ГДК были найдены при других
неврологических заболеваниях, таких как церебральная атаксия, рефрактерная к
лекарствам эпилепсия, небный миоклонус и болезнь Баттона. Кроме того, антите¬
ла к ГДК обнаружили при тиреоидите Хашимото и диффузном токсическом зобе,
целиакии, болезни Аддисона и аутоиммунных полиэндокринопатиях.Глутамат-декарбоксил аза — фермент, участвующий в синтезе у-оксибутировой
кислоты, которая контролирует высвобождение инсулина из секреторных гранул
(3-клеток поджелудочной железы. ГДК не является специфичной для р-клеток
поджелудочной железы, поскольку присутствует в нервной системе и семенных
железах. Фермент присутствует в организме в двух изоформах: растворимая
форма — ГДК 67 (67 кДа) — распространена главным образом в нейронах, а нерас¬
творимая — ГДК 65 (65 кДа) — присутствует в р-клетках поджелудочной железы.ГДК65 — основная мишень аутоантител у пациентов с СД I, латентным аутоим¬
мунным диабетом у взрослых, диабетом беременных и при синдроме скованного
человека. Помимо того, что она вызывает развитие гуморального иммунного
ответа, ГДК65 является мишенью для Т-клеточных ответов, обнаруживаемых как
у заболевших людей, так и на экспериментальных моделях диабета. Деструкция
р-клеток при диабете обусловлена активностью цитотоксических Т-клеток, чьи
антигенспецифичные рецепторы распознают р-клеточные пептиды, происходя¬
щие из ГДК65.В начале заболевания (при ювенильном начале) СД I 70-90% пациентов поло¬
жительны по антителам к ГДК65. Распространенность антител к ГДК при диабете
беременных составляет 0-50% в разных исследованиях. Встречаемость аутоан¬
тител в общей популяции составляет 1-2%, при этом у детей без клинических
признаков СД встречаемость аутоантител составляет до 4%. Определение антител
к ГДК в сыворотке может быть применено для идентификации лиц с риском раз¬
вития СД I и для дифференциальной диагностики СД I и СД П.Остается неясным, действительно ли наличие антител к ГДК у пациентов с СД И
влияет на клиническое течение заболевания. В некоторых исследованиях не было
найдено связи между антителами к ГДК и диабетическими осложнениями, в том
числе со стадией или тяжестью ретинопатии. Несколько исследований пациентов
с СД I и латентным аутоиммунным диабетом взрослых показали, что антитела к
ГДК после начала заболевания сохраняются в крови заболевших в течение 12 лет
и более. Снижение титров антител с течением времени отражает прогрессивную
потерю функции островковых клеток и снижение аутоиммунной реакции. Низкий
уровень аутоантител указывает на большую давность заболевания с меньшей
агрессивностью аутоиммунного процесса. Высокая концентрация антител к ГДК65
у пациентов с латентным аутоиммунным диабетом указывает на высокий риск раз¬
вития инсулиновой зависимости. Предсказательное значение антител для диагно¬
за инсулиновой зависимости в пределах 6 лет наблюдения от начала заболевания
варьировало от 34% у лиц старше 55 лет до 84% у лиц моложе 34 лет. У родствен¬
ников первой степени больных СД I частота обнаружения антител к ГДК65 варьи¬
рует от 4 до 13%. В то же время предсказательное значение выявления аутоантител
при определении риска развития СД I не очень надежно: у родственников первой
степени родства оно варьирует от 20 до 60%. В крайнем варианте за 12-летнее
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 131наблюдение за неидентичными близнецами в случае обнаружения антител к
ГДК65 риск развития СД I составил 88%.Идентификация и молекулярное клонирование ГДК65 привели к разработке
метода определения антител к ГДК, который был стандартизован под руковод¬
ством Immunology of Diabetes Society (IDS) и Centers for Disease Control and Prevention
(CDC). Разработан стандарт сыворотки ВОЗ для сравнения результатов в разных
лечебных учреждениях. Наилучшие параметры имеет конкурентный радиоиммун¬
ный метод, использующий или ’2^1-меченую человеческую рекомбинантную
ГДК65; появились конкурентные иммунометрические системы для определения
антител к ГДК.АУТОАНТИТЕЛА К КОРЕ НАДПОЧЕЧНИКОВ И К СТЕРОИДНОЙ 21-ГИДРОКСИЛАЗЕАутоиммунная болезнь надпочечников может развиваться как изолированная
форма болезни Аддисона или быть частью аутоиммунного полиэндокринного син¬
дрома. Серологическим маркером поражения надпочечников являются аутоанти¬
тела, реагирующие с ферментами стероидогенеза коры надпочечников. Ферменты
стероидогенеза относят к микросомальной фракции. Они обеспечивают окисление
гормональных предшественников и локализуются в цитоплазме клеток всех трех
слоев коры надпочечников. Основным методом определения антител к коре над¬
почечников является НРИФ на нефиксированных криостатных срезах надпочеч¬
ников человека и животных. Эти антитела представлены иммуноглобулинами IgG
и способны фиксировать комплемент. Мишенью антител к коре надпочечников
является 21-гидроксилаза. Инкубация сыворотки пациентов с болезнью Аддисона
с очищенной рекомбинантной 21-гидроксилазой человека приводит к потере
реактивности аугоантител к коре надпочечников. Разработаны методы радио¬
иммунопреципитации и иммуноблоттинга, однако их использование ограничено
исследовательскими лабораториями, а для клинической диагностики их результа¬
ты сопоставимы с результатами НРИФ. Чувствительность серологического иссле¬
дования при болезни Аддисона в зависимости от длительности заболевания оце¬
нивают примерно в 60-80%, а специфичность — в 98-100%. Определение антител
к стероидной 21-гидроксилазе у больных с дебютом болезни Аддисона чаще дает
положительный результат, чем у больных с длительным течением заболевания.
Кроме того, антитела к коре надпочечников и антитела к 21-гидроксилазе выявля¬
ют при аутоиммунных полиэндокринопатиях 1 и 2 типа.При применении НРИФ аутоантитела к коре надпочечников встречаются в 61%
наблюдений среди пациентов с аутоиммунной болезнью Аддисона разной дли¬
тельности заболевания, у 6,7% пациентов с надпочечниковой недостаточностью в
результате туберкулеза и у 0,6% здоровых людей.Особое значение имеет определение аутоантител у пациентов с полиэндокри-
нопатиями для прогнозирования развития надпочечниковой недостаточности.
Может быть рекомендовано выявление аутоантител к коре надпочечников у боль¬
ных СД I моложе 10 лет, у родственников первой степени родства лиц, страдаю¬
щих болезнью Аддисона, и у больных с первичной недостаточностью яичников.
Повышенный титр аутоантител к коре надпочечников, наличие хронического кан¬
дидоза кожи и слизистых оболочек и/или гипопаратиреоза указывают на высокий
риск ра.звития надпочечниковой недостаточности как компонента полиэндо-
кринопатии 1 или 2 типа. У этих пациентов необходимо регулярно обследовать
функцию коры надпочечников с интервалами каждые 6-12 мес для того, чтобы
предупредить жизнеугрожающие адреналовые кризы и вовремя начать замести¬
тельную терапию.||||‘
Ш ’
шжж132 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙАУТОАНТИТЕЛА К СТЕРОИДПРОДУЦИРУЮЩИМ КЛЕТКАМ ЯИЧКА, ЯИЧНИКА И
ПЛАЦЕНТЫАутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам — это иммуноглобулины
класса IgG, реагирующие с цитоплазматическими микросомальными антигенами
Ш стероидпродуцирующих клеток. Окислительные ферменты, которые участвуют
в метаболизме стероидных гормонов, состоят из различных субъединиц цитох¬
рома р450. Всего выделяют 3 фермента, которые являются мишенями аутоан¬
тител: р450с21 (21-гидроксилаза), а также р450с17 (17-гидроксилаза) и p450scc
(табл. 17-17).Таблица 17-17. Основные аутоантитела к ферментам стероидогенеза в эндокринных тканяхФерментр450с17р450с21p450sccКора надпочечниковгломерулярныйслойретикулярныйслойКлетки
Лейдига
в яичкеКлеткифопликуловяичникаПлацентаЗаболеваниеГилогонадизм у жен¬
щин, ПЭП 1Болезнь Аддисона,
ПЭП 2Гипогонадизм у мужчинАз^гоантитела к стероидпродуцирующим клеткам могут играть определенную
роль в патогенезе аутоиммунных эндокринопатий. Так, сыворотки пациентов с
аутоиммунной боленью Аддисона, содержащие аутоантитела к сгероидпродуци-
рующим клеткам, способны вызвать комплемент-зависимую цитотоксичность при
воздействии на текальные клетки яичников in vitro. Гистологическое исследование
яичников пациентов с аутоантителами к стероидпродуцирующим клеткам позво¬
ляет обнаружить оофорит с лимфоцитарными инфильтратами.Аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам реагируют с цитоплазмой
Лейдиговских клеток яичек, текальных клеток яичников, синцитиотрофобластами
плаценты, а также с желтым телом. Все позитивные сыворотки реагируют также с
корой надпочечников, которая содержит все разновидности стероидных фермен¬
тов.Антитела к стероидпродуцирующим клеткам находят в 100% случаев у боль¬
ных с нормальным хромосомным набором и первичной аменореей (гипергонадо-
тропный гипогонадизм) или вторичной аменореей в сочетании с аутоиммунной
болезнью Аддисона. Аутоантитела можно изредка обнаружить у лиц с вторичной
аменореей без признаков болезни Аддисона. Однако у этих больных обычно
выявляют аз^оантитела к коре надпочечников, которые указывают на высокий
риск развития аутоиммунной болезни Аддисона. Аутоантитела к стероидпродуци¬
рующим клеткам у мужчин, направленные к p450scc, применяют для диагностики
аутоиммунной тестикулярной недостаточности и задержки полового развития.Основным подходом к определению аутоантител к стероидпродуцирующим
клеткам в практических лабораториях является НРИФ. Методом точной иденти¬
фикации молекулярной мишени аутоантител служит радиоиммунопреципитация и
вестерн-блот. Оба этих метода используют преимущественно в научных лаборато¬
риях. Помимо р450с17 и p450scc был описан ряд других аутоантител к антигенам
половых желез, но ни одно из них не имеет клинического или диагностического
значения.При отсутствии болезни Аддисона у больных с идиопатической первичной недо¬
статочностью яичников аутоантитела к стероидпродуцирующим клеткам опреде¬
ляются крайне редко. Если они определяются, то это может служить предиктором
развития болезни Аддисона в дальнейшем. Кроме того, антитела к р450с17 связаны
с типом 1 полиэндокринопатий, протекающих с болезнью Аддисона, гипопарати-
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ f 33роидизмом и слизистокожным кандидозом. Антитела к р450с21 присутствуют при2	типе полиэндокринопатии, клиническая картина которого включает поражение
щитовидной железы, надпочечниковую недостаточность и аутоиммунный сахар¬
ный диабет. Антитела к р4505сс являются общим маркером задержки полового
развития и гипергонадотропного гипогонадизма. Обнаружение аутоантител у лиц
в грз'^ппах риска позволяет использовать аутоантитела к стероидпродуцирующим
клеткам для оценки риска развития зндокринопатии. У больных с различными
эндокринными заболеваниями, у которых были обнаружены аутоантитела к
стероидпродуцирующим клеткам надпочечника, имеется высокий риск развития
недостаточности половых желез и болезни Аддисона. У 35-40% женщин при обна¬
ружении аутоантител к р450с17 и р4508сс развивается недостаточность функции
яичников, что требует определения гормонсинтетической функции половых желез
в динамике.СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПРИ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХРассеянный склероз (РС) — наиболее частое аутоиммунное заболевание ЦНС.
В основе его патогенеза лежит выраженная активация забарьерной иммунной
системы, которая приводит к появлению фокусов инфильтрации в белом веществе
головного и спинного мозга с демиелинизацией нервных проводников и глио-
зом (склерозом). Очаги глиоза могут быть обнаружены магнитно-резонансной
томографией. Заболевание имеет разнообразную клиническую симптоматику,
типичным признаком которой является быстрая динамика неврологических про¬
явлений, по мере прогрессирования процесса нарастает необратимый неврологи¬
ческий дефицит. Системная воспалительная реакция при РС отсутствует, поэтому
для оценки иммунного воспаления необходим анализ цереброспинальной жид¬
кости (СМЖ). Особенностью воспаления при демиелинизирующих заболеваниях
является то, что оно протекает за гематоэнцефалическим барьером (интратекаль-
но). Интратекальный иммунный ответ сопровождается рядом иммунологических
феноменов, в том числе изолированным синтезом иммуноглобулинов, появлением
неспецифических серологических реакций против распространенных вирусов, а
также синтезом олигоклонального иммуноглобулина.Анализ СМЖ явлется основой для диагностики аутоиммунных и воспалитель¬
ных заболеваний ЦНС (табл 17-18). Анализ СМЖ должен быть проведен в срок до3	ч с момента взятия биоматериала. Для полноценной иммунологической оценки
необходимо получение парной пробы СМЖ и периферической крови.Таблица 17-18. Лабораторные показатели при иммунологическом анализе цереброспинальной
жидкостиПоказатель (единицы)Общий цитоз,
кл/иклДифф. подсчет
(Л/М/Н/П-)Альбумин,Местный синтез lg,
% обнаруженияОлиго IgG,
% обнару¬
женияНорма<5Л >м<800Рассеянный склероз5-^0л>м >п<107098Бактериальный менингит1000-30000г »M, л50-10000Туберкулезный менингит50-2000л = г = м20-1002525Нейроборрелиоз50-1000л >м >п5^05050Вирусный энцефалит
(HSV, VZV)10-300л >м >п<201010Ишемия2-10л>м<1000СКВ, болезнь Бехчета,
нейросаркоидоз50-200л>м >п5-505050‘Л/М/Н/П — тип преобладающих клеток в ликворе (лимфоциты, моноциты, неЙ1'рофилы, плаа-
матические клетки).
134 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙОЦЕНКА ИНТРАТЕКАЛЬНОГО ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЮЩИХ
ЗАБОЛЕВАНИЯХПервым признаком наличия интратекального воспаления считают умеренное
увеличение общего белка СМЖ, обусловленное увеличением местной продукции
иммуноглобулинов. Увеличение количества общего белка нередко не превышает
верхней границы нормы (>900 мг/л), поэтому требует использования более чув-
ствительных диагностических методов.Поликлональная и олигоклональная активация синтеза иммуноглобулинов
является одной из форм подострого иммунного ответа, однако при большинстве
аутоиммунных заболеваний (СКВ, СШ и т.д.) она имеет системный характер.
При РС продукция иммуноглобулинов обусловлена неспецифической стимуля¬
цией в-клеток, значительное содержание которых отмечают при цитологической
оценке состава СМЖ. Важным признаком, отражающим локальную индукцию
гуморального ответа в СМЖ при РС, является одновременное образование IgG-
антител к антигенам распространенных вирусов. Для обнаружения этой реакции
используют определение антител к антигенам вируса кори, герпеса зостер и вирусу
ветряной оспы. Этот феномен получил название «М2У-реакцйя» (от первых букв
английских названий вирусов). Эти агенты могут рассматриваться в качестве
этиологической причины РС, однако одновременное появление антител против
них при отсутствии вирусов в организме указывает на анамнестическую реакцию
иммунной системы при неспецифической активации. Обнаружение ЛíZV-peaкции
многими исследователями рассматривается в качестве наиболее специфичного
лабораторного теста при РС, который положителен у 94% больных. Для оценки
MZУ-peaкции рекомендовано одновременное определение инфекционной серо¬
логии в парных пробах СМЖ и сыворотки периферической крови, что позволяет
рассчитать индекс активности антител. Положительный результат оценивают как
индекс, указывающий на преобладание антивирусных антител в СМЖ по сравне¬
нию с сывороткой (>1,5). Сложности интерпретации реакции как положительной
могут возникать, если обнаруживаются антитела лишь к одному возбудителю.
Несмотря на ценность данного теста, сложности в его выполнении и интерпрета¬
ции затрудняют его широкое распространение для практической диагностики, он
остается вспомогательным методом даже в высокоспециализированных лабора¬
ториях.Более простой и надежный метод оценки неспецифической активации интрате¬
кального гуморального ответа - определение относительных параметров секреции
иммуноглобулинов СМЖ. Метод изучения интратекальной продукции иммуно¬
глобулинов СМЖ основан на общих иммунологических принципах исследования
проницаемости гематотканевых барьеров, определяющих местный иммунитет.Для оценки состояния гематоэнцефалического барьера применяют изме¬
рение альбумина ликвора и сывороточной его концентрации. Коэффициент про¬
ницаемости 0^^, д определяют как отношение содержания альбумина в СМЖ к его
концентрации в сыворотке крови. Использование расчетного коэффициента обу¬
словлено необходимостью нормализации концентраций альбумина СМЖ в связи
со значительной биологической вариацией уровней альбумина сыворотки. Этот
коэффициент позволяет оценить проницаемость тканевых барьеров и стандар¬
тизировать определение локального синтеза других молекул воспаления, прежде
всего иммуноглобулинов. Нормальное значение этого показателя зависит от воз¬
раста, составляет менее 5x10 в возрасте 20 лет и увеличивается до 8x10"^ в 60 лет.
Для РС изменения проницаемости гематоэнцефалического барьера не характерны,
и не превышает 10x10'^. Увеличение показателя 0^,^^ отмечают при ряде вос¬
палительных заболеваний, таких как гнойный бактериальный менингит, острый
нейроборрелиоз, синдром Гийена-Барре, Умеренное увеличение проницаемости
характерно для вирусных менингитов и полинейропатий.
иДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 135В отличие от альбумина, иммуноглобулины могут синтезироваться как внутри
ЦНС, так и вне ее. Для определения интратекального синтеза иммуноглобулинов
используют расчет коэффициентов для основных классов иммуноглобулинов
(Q{gG’ OigA’ QigM) основе их концентраций в сыворотке крови и СМЖ. На прак- „ '
тике достаточным является определение в то время как определение других ^ -
индексов самостоятельного значения не имеет. Для оценки локального синтеза
IgG применяют номограммы зависимости и основанные на математиче- |||||
ской модели проницаемости гематоэнцефалического барьера. Номограмма позво¬
ляет отнести результаты определения 0^^^ и к одному из 4 вариантов, которые
соответствуют норме, локальному синтезу IgG, нарушению функции барьера и
комбинации нарушений. РС обычно сопровождается выраженным увеличением
локального синтеза IgG при сохранности функций гематоэнцефалического барье¬
ра. Выраженный локальный синтез IgG можно обнаружить у 70% больных с РС.
Очевидным преимуществом этого подхода к оценке местного иммунитета ЦНС
является его доступность для практических биохимических лабораторий, осна¬
щенных анализаторами с возможностью турбидиметрии и нефелометрии.Олигоклональный IgG и другие маркеры иммунного
воспаления центральной нервной системыПо мере хронизации любой специфический иммунный ответ из поликлональ¬
ного становится олигоклональным, что отражает клональную природу иммунной
системы с увеличением аффинности иммуноглобулинов по мере персистенции
антигена. Большая концентрация иммуноглобулинов плазмы крови маскирует
олигоклональные иммуноглобулины в периферической крови, хотя очевидно, что
олигоклональный синтез возникает при всех вариантах хронического или подо¬
строго воспаления. В редких случаях олигоклональный IgG можно обнаружить
в у-фракции при электрофорезе белков крови при появлении трех и более моно¬
клональных пиков.Значительно чаще олигоклональный иммунный ответ обнаруживают при ана¬
лизе биологических жидкостей с низкой концентрацией иммуноглобулинов. Так,
он может быть идентифицирован в слезной жидкости и в слюне больных с СШ, в
синовиальной жидкости при реактивных артритах. Сужение спектра иммунного
ответа возникает под действием хронической аутоантигенной стимуляции на фоне
аутоиммунного воспаления. Антигенная направленность олигоклональных имму¬
ноглобулинов остается плохо изученной.Метод изоэлектрофокусирования с последующим иммуноблоттингом — золо¬
той стандарт иммунологической диагностики РС, признанный большинством
международных экспертов. Хорошие аналитические параметры этого теста делают
его наиболее }^добным и надежным методом диагностики демиелинизирующих
заболеваний. В его основе определения клональности иммуноглобулинов СМЖ
методом электрофоретического изофокусирования лежит разделение белков в
соответствии с их изоэлектрической точкой в градиенте амфолитов — веществ,
которые под действием электрического тока формируют непрерывный градиент
pH. Молекулы фокусируются в формируемом градиенте, что позволяет отличить
молекулы одной молекулярной массы с небольшой разницей в заряде. Молекулы
человеческого IgG обладают зарядом в пределах от 6 до 9 единиц pH, который
определяется количеством остатков сиаловых кислот на Рс-домене молекулы.
Поскольку молекулы IgG, синтезируемые одним клоном плазмоцитов, идентичны,
они накапливаются в одной тонкой полосе. При олигоклональном или монокло¬
нальном синтезе количество идентичных молекул настолько велико, что полоску
можно различить на поликлональном фоне. Для детекции фокусированного
тшшЩшмтйіИІ;136 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙIgG применяют метод иммуноблота с окраской антисывороткой к IgG человека.
Иногда для лучшей визуализации типа синтеза может быть использована окраска
на к- и ^-легкие цепи.Результат выявления олигоклонального IgG при рассеянном склерозе с помо¬
щью изоэлектрофокусирования: в сыворотке крови определяется нормальный
поликлональный IgG, в ликворе отмечается выраженный олигоклональный
иммунный ответ, сопровождающийся синтезом олигоклонального IgG.Тест является качественным, так как подсчитать число полос при олигоклональ¬
ном типе крайне затруднительно, но это число не имеет клинического значения.
Важной дополнительной информацией может служить изучение парной пробы
сыворотки крови. Результат оценивают на основании описания типа синтеза в
каждой из парных проб. Всего выделяют 5 вариантов синтеза иммуноглобулинов.
Для РС наиболее характерен 2-й тип синтеза, в то время как 3-й тип может встре¬
чаться на фоне других аутоиммунных заболеваний, затрагивающих ЦНС, с мини¬
мальной системной продукцией олигоклонального IgG (табл. 17-19).Таблица 17-19. Типы синтеза IgG в цереброспинальной жидкости и сыворотке в дифференциаль¬
ной диагностике демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системыТипсинтезаСинтезеликвореПоли-Опиго-Олиго-Олиго-Моно-Синтез в сывороткеПоли-Поли-Олиго-(меньше
полос)Олиго-{идентично
ликвору)Монс-Нозологическая формаНорма или острое воспалительное заболеваниеРС в 85-95% случаев в дебюте заболеванияРС, реже — СКВ, постинфекционные энцефалиты, саркоидозГенерализованные процессы с вовлечением ГЭБ: боррелиоз,
нейросифилис, синдром Гийена-Барре, ВИЧ, грибковый менин-
гоэнцефалиг		 	Моноклональные гаммапатииПримечание. РС - рассеянный склероз, СКВ - системная красная волчанка, ГЭБ — гематоэн-
цефалический барьер.Олигоклональный IgG имеется у 93-98% больных с РС, его отсутствие с высо¬
кой вероятностью исключает диагноз. Особенностью феномена олигоклонального
IgG является его стабильность. Ни характер, ни число олигоклональных полос не
меняются с течением времени, поэтому мониторинг не требуется. Тест может быть
отрицательным у единичных больных с глубоким залеганием очагов демиелини-
зации. Олигоклональный IgG обнаруживают у органиченного числа больных с
другими заболеваниями ЦНС.АНТИТЕЛА К НЕЙРОНАМ ПРИ ПАРАНЕОПЛАСТИЧЕСКИХ ЭНЦЕФАЛИТАХПаранеопластические энцефалиты — группа редких синдромов, при которых
онкологические процессы (рак яичника, легкого) приводят к иммуноопосредо-
ванному энцефалиту, не связанному с объемным процессом и протекающему как
мозжечковая атаксия, энцефалит, радикулоневропатия. Хотя эти заболевания
редки, эффективная их диагностика позволяет обнаружить опухоль на ранних
стадиях развития. У 70% больных неврологическая симптоматика опережает
диагноз онкологического заболевания. В основе образования аутоантител при
опухоли лежит перекрестная экспрессия опухолью антигенов нервной ткани.
Аутоантитела синтезируются местно, за гематоэнцефалическим барьером, поэто¬
му в дебюте заболевания титры аутоантител в СМЖ выше, чем в сыворотке крови.
Антитела обладают цитотоксическим действем, с чем может быть связано выявле¬
ние инфильтратов нервной ткани, а также дистрофия мозжечка и других отделов
мозга. В то же время экспрессия невральных антигенов в опухоли далеко не всегда
сопровождается паранеопластическим синдромом, что указывает на наличие дру-
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 137гих факторов, определяющих аутоиммунную реакцию. Так, антитела к клеткам
Пуркинье мозжечка (¥о-1) присутствуют только у женщин.Среди аутоантител к нейронам наиболее часто встречаются Yo, Ни и
аутоантитела (табл. 17-20). К другим часто встречающимся «паранеопла¬
стическим» антителам относят антитела к кальциевым каналам при синдроме
Ламберта-Итона и антитела к скелетным мышцам при миастении на фоне опухоли
тимуса.Таблица 17-20. Аутоантитела к нейронам при паранеопластических нейропатияхАутоантителоНеврологическая симптоматикаОпухолиАнти Yo-1 (62 кДа)Мозжечковая дегенерация (атаксия), болеют
исключительно женщиныЯичник, молочная железаАнтитела к клеткам
Пуркинье (не Y0'1)Мозжечковая дегенерация, мягко выраженная,
мужчины поражаются чаще		Лимфогранулематоз ХоджкинаАнти-НиСенсорная невропатия, кишечная непроходимость,
энцефаломиелит, чаще болеют женщины	Мелкоклеточный рак легкогоАнти-RiЭнцефалит ствола мозгаМолочная железа, мелкоклеточ-
ный рак легкого	Антй-CV,Хорея, атаксия, невропатияРак бронха, тимомаАнти-Ма,Энцефалит ствола мозга, атаксияСеминомаАмфифизинСиндром «ригидного человека»Молочная железаДля определения нейрональных антител используют НРИФ либо иммуно-
гистохимическую технику на криосрезах мозжечка обезьяны. Антитела диффе¬
ренцированно связываются с нейронами разных отделов нервной системы. Так,
антитела к ядрам нейронов 1 типа (анти-Ни) направлены против ядер нейронов
центральной и периферической нервной системы, однако не окрашивают ядрыш¬
ко и не реагируют с ядрами астродендроглии. Антитела к ядрам нейронов 2 типа
(анти-Ri) очень похожи на анти-Ни, однако реагируют только с ядрами нейронов
центральной нервной системы. Антитела к Yo-1-антигену окрашивают цитоплазму
гигантских грушевидных нейронов мозжечка (клеток Пуркинье).Для комплексной оценки паранеопластических аугоантител рекомендуется
использовать тканевой комплекс, включающий мозжечок обезьяны, желудок и
печень крысы. При оценке окрашивания желудка необходимо обращать внимание
на реакцию аутоантител с клетками мезентериального нервного сплетения, кото¬
рая очень характерна для Ни-антител. Печень крысы используется для выявления
АНА, которые затрудняют исследование антител к ядрам нейронов.После получения положительного результата НРИФ-теста можно рекомендо¬
вать выполнение иммуноблота, который позволяет подтвердить наличие пара¬
неопластических аутоантител. Анти-Ни-антитела реагируют с РНК-связывающим
белком HuD. Мишенью анти-Ri-антител является белок массой 55 кДа — Nova-
антиген. Антигеном Yo-1 антител служит гидрофобный цитоплазматический белок
массой 62 кДа, однако при лимфогранулематозе образуются антитела к цитоплаз¬
ме клеток Пуркинье, направленные против других белков цитоплазмы (не Yo-1).АНТИТЕЛА К ГАНГЛИОЗИДАМ ПРИ ПОЛИНЕЙРОПАТИЯХГликолипидная оболочка миелинизированных нервных волокон служит мише¬
нью антител к ганглиозидам, которые являются серологическими маркерами вос¬
палительных полиневритов (табл. 17-21), Антитела к ганглиозидам направлены
против гликофосфолипидов, состоящих из липида церамида и полисахаридной
части 1-5 остатков гексоз, хотя бы одна из которых несет остаток сиаловой кис¬
лоты, Именно остаток сиаловой кислоты позволяет отнести данный гликолипид к
ганглиозидам. Церамид заякорен в мембране клетки, в то время как гидрофильная
полисахаридная часть направлена кнаружи от клеточной мембраны. В организ-
ШШШШіШ^тitiill
1ШЙ138 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙме человека насчитывается 15 основных разновидностей ганглиозидов. Спектр
ганглиозидов разный в ЦНС и периферических нервах. Ганглиозиды GM^ и GD^^
экспрессированы на моторных нервах и аксонах. На черепно-мозговых нервах
много ганглиозида GQ^^, сенсорные нервы богаты GD^j^. Ганглиозиды выполняют
множество функций, кроме того, они служат рецепторами для ряда микроорганиз¬
мов, в том числе для токсина холеры (GM^), энтеротоксина Campylobacter (GM^),
Haemophilus influenzae (GA^/GMj).Таблица 17-21. Антитела к ганглиозидам при острых и хронических демиелинизирующих пораже¬
ниях периферической нервной системыЗаболеваниеОстрая воспалительная демиелинизирующая нейро¬
патия (синдром Гийена-Барре)Острая моторно-аксональная и острая моторно¬
сенсорная аксональная нейропатияСиндром Миллера-ФишераХроническая воспалительная демиелинизирующая
невропатияМультифокальная моторная невропатияХроническая сенсорная невропатияПарапротеинемическая сенсорная невропатияАнтигенGM,GM„ GO.,GD,, ь- СУЛЬ-
фатидGD1b, Glib, GQ1bMAG/SGPG, сульфа-
тид, GMj, GD,,^Частота встре¬
чаемости а^гоан-
тител, %204090205010070Класс 1дIgGIgMНесмотря на значительный объем экспериментальных данных, вопрос об
участии антител к ганглиозидам в патогенезе нарушений нервной проводимости
остается открытым. Далеко не у всех больных с типичной клинической картиной
полиневритов и изменениями при нейромиографии обнаруживают антитела к ган¬
глиозидам, иногда антитела мог^т выявляться у лиц без полинейропатии. Тем не
менее значение серологического ответа в патогенезе острых полирадикулоневри-
тов подчеркивается клинической эффективностью плазмафереза и использования
человеческого иммуноглобулина для лечения при этом заболевании. В экспери¬
ментальных моделях аутоантитела к ганглиозидам блокируют проводимость в
изолированных препаратах нервов.Синдром Гийена-Барре относится к группе острых воспалительных полира-
дикулоневропатий, часто разрешающихся спонтанно. Это заболевание развива¬
ется на фоне или после перенесенной респираторной или кишечной инфекции в
течение 10-14 дней с момента ее начала, поэтому образование аутоантител часто
рассматривают как компонент первичного иммунного ответа против возбудителя
инфекции. После достижения ремиссии заболевания титры антител постепенно
снижаются и нарастают в случае повторного обострения.Синдром Гийена-Барре характеризуется демиелинизацией и аксональной деге¬
нерацией моторных, сенсорных, автономных нервов и нервных корешков спинно¬
го мозга. В него включают острую воспалительную демиелинизирующую полиней¬
ропатию, острую моторно-аксональную нейропатию и острую моторно-сенсорную
аксональную нейропатию. Синдром Миллера-Фишера часто выделяют из группы
синдрома Гийена-Барре по причине особых клинических проявлений, включаю¬
щих атаксию, арефлексию и офтальмоплегию. Аутоантителами чаще сопровожда¬
ются аксональные нейропатии и синдром Миллера-Фишера, в то время как при
классической демиелинизирующей форме антитела диагностируют редко.При острых полирадикулоневропатиях и синдроме Миллера-Фишера выявля¬
ют антитела к ганглиозидам GMj и GQ^^, класса IgG. Антитела класса IgM могут
встречаться, однако их титры низки. Предполагается, что в силу особенностей
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 1 $9иммунного ответа возникает переключение классов тяжелой цепи иммуноглобу¬
линов с синтезом патогенного IgG. Исследование генов тяжелых цепей иммуно¬
глобулина G, направленных против GM^-ганглиозида, показало высокую частоту
соматических мутаций, что указывает на антигенспецифическую дифференциров¬
ку иммунного ответа.В качестве основной причины сенсибилизации иммунной системы к антигенам
ганглиозидов при острых полинейропатиях предполагается перекрестная иммун¬
ная реакция с липополисахаридам и бактерий ЖКТ. Синдрому Гийена-Барре часто
предшествует энтерит, вызванный Campylobacter jejuni. Липополисахарид С, jejuni
содержит ганглиозидподобную структуру, напоминающую по структуре моле¬
кулу ганглиозида GMj, которая способна стимулировать аутоиммунные ответы.
Другими известными индукторами синдрома Гийена-Барре являются цитомегало¬
вирус, вирус Эпштейна-Барр, Mycoplasma pneumoniae и Haemophilus influenzae.При хронических периферических нейропатиях антиганглиозидные антитела
представлены преимущественно IgM. Часто аутоантитела входят в состав моно¬
клонального IgM-компонента на фоне «моноклональной гаммапатии неясного
значения». Моноклональный компонент может не обнаруживаться с помощью
электрофореза белков сыворотки, однако может быть определен при использова¬
нии более чз'^вствительного изоэлектрофокусирования.Так называемый парапротеинемический нейропатический синдром, возни¬
кающий на фоне парапротеинемии IgM, характеризуется клинической картиной
сенсорной полиневропатии с атаксией и офтальмоплегией. Невропатия является
основным клинически значимым признаком «моноклональной гаммапатии неяс¬
ного значения» и может отмечаться у 5-20% больных. Хроническая сенсорная
невропатия при этом заболевании схожа с симптоматикой синдрома Миллера-
Фишера. При пapaпpoтeинeм^íчecкoй невропатии отмечается присутствие в сыво¬
ротке моноклонального IgM, направленного против ряда ганглиозидов, включая
GDjj,, GQ^^ и GT,^, других гликолипидов, а также против миелин-ассоциированного
гликопротеина. Парапротеинемическая невропатия может сочетаться с парок¬
сизмальной ночной гемоглобинурией, обусловленной образованием антител к
сиаловым остаткам гликолипидных антигенов эритроцитов (холодовыми агглю¬
тининами).Мультифокальная моторная невропатия с блоком проведения также относится
к редким хроническим полинейропатиям и сопровождается антителами к ган-
глиозиду GM, класса IgM в 50% случаев. Характеризуется асимметричным поли¬
невритом с характерной нейромиографической картиной фокального нарушения
проводимости по моторным нервам.Хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (CIPD)
представляет собой аналог хронического синдрома Гийена-Барре и только
в 20% случаев сопровождается антителами к GM^-ганглиозиду класса IgM.Основным методом детекции антител к ганглиозидам является ИФАг. В каче¬
стве более точного исследовательского метода может применяться тонкослойная
хроматография. Определение антиганглиозидных антител характеризуется низкой
чувствительностью, причина кроется в составе антигена. Примеси жирных кислот
в препаратах ганглиозидов повышают чувствительность тестов. Общепризнанных
стандартов антигена и стандартов аутоантител не существует, поэтому тесты раз¬
личаются между собой.Антитела к ганглиозидам можно рассматривать как одну из разновидностей
«антител к гликолипидам». Гликолипиды (точнее, гликосфинголипиды) представ¬
ляют собой обширное семейство мембранных молекул. Гликолипиды имеют мно¬
жество функций, в том числе ими представлены антигены групп крови, факторы
адгезии клеток, упаковка структуры миелина. Среди этой большой группы антиге¬
нов при полиневритах обнаруживают антитела к сульфатированному глюкуронил-
ш
шI140ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙпараглобозиду (SGPG), сульфатиду и галактоцереброзиду, которые не являются
ганглиозидами по химическому строению. Антитела к сульфатиду встречаются
при диабетической нейропатии, хронической воспалительной демиелинизирую¬
щей полинейропатии и парапротеинемической сенсорной нейропатии. Антитела к
SGPG класса IgM встречаются при парапротеинемической сенсорной нейропатии.
По структуре полисахаридного остатка 5GPG близок к миелин-ассоциированному
гликопротеину (MAG), поэтому антитела к двум молекулам часто диагностируют
вместе при парапротеинемической нейропатии.Системные аутоиммунные заболевания — немаловажная причина развития
воспалительных полиневритов. Среди них выделяют системные ревматические
заболевания, васкулиты, АФС, а}ггоиммунные зндокринопатии, аутоиммунный
гастрит, парапротеинемии. Лабораторная и серологическая диагностика основно¬
го заболевания — один из методов постановки диагноза.АНТИТЕЛА К АЦЕТИЛХОЛИНОВОМУ РЕЦЕПТОРУНарушение нервно-мышечной передачи при миастении обусловлено аутоанти¬
телами, которые связываются с рецептором ацетилхолина на постсинаптической
мембране нервно-мышечного окончания (моторной пластинки). Никотиновый
(N-) ацетилхолиновый рецептор (АхР) является олигомерным трансмембранным
ионным каналом, который состоит из 6 субъединиц. При связывании ацетилхо¬
лина на двух а-субъединицах рецептора открывается ионный канал, который
позволяет катионам (прежде всего натрию) пост^шать внутрь мышечной клетки.
Ток ионов обеспечивает возбуждение мембраны клетки, снижение трансмембран¬
ного потенциала, открытие кальциевых каналов и, в конечном итоге, сокращение
мышечного волокна.При миастении антитела непосредственно участвуют в патогенезе заболевания.
Введение сыворотки, содержащей антитела к АхР, лабораторному животному
воспроизводит клиническую картину миастении. У ряда лабораторных живот¬
ных можно воспроизвести заболевание путем их иммунизации очищенным АхР,
Новорожденные от матерей, больных миастенией, в большинстве случаев перено¬
сят транзиторную неонатальную форму заболевания, которая проходит в течение
месяца после истощения пула материнских антител к АхР,Антитела к АхР снижают количество АхР нервно-мышечного окончания за счет
нескольких механизмов. Отмечается комплемент-опосредованный лизис пост¬
синаптической мембраны со снижением числа моторных пластинок на мышце.
Под действием антител происходит димеризация и интернализация рецептора,
что сокращает его мембранный пул. В небольшой степени аутоантитела способ¬
ны связываться с а-субъединицей АхР, приводя к его функциональной блокаде.
Эпитоп антител к АхР является конформационным, и хотя он локализован на
а-субъединице, только небольшое число аутоантител направлено на сайт связы¬
вания ацетилхолина.Основным методом определения антител к АхР служит радиоиммунопреципи¬
тация, основанная на способности меченного ^^^1 а-бунгаротоксина связываться
с ацетилхолиновым рецептором скелетной мышцы. Источником человеческого
АхР является оперативный материал или клетки перевиваемых клеточных линий
рабдомиосаркомы ТЕ671, которая содержит фетальный АхР. Несмотря на значи¬
тельную гомологию гена АхР, достаточную чувствительность тестов обеспечивает
использование АхР человека или высших приматов. Тесты, основанные на методе
ИФА, не обеспечивают нативную укладку АхР, а потому недостаточно чувстви¬
тельны.У 15% больных миастенией антитела к АхР не обнаруживают, В то же время у
большинства серонегативных больных плазмаферез и иммуносупрессия оказы¬
ваются высокоэффективными. Несмотря на отсутствие антител к АхР, введение
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 141сыворотки крови этих больных лабораторным животным приводит к проявле¬
ниям миастении. Это позволяет предположить присутствие в этих сыворотках
еще не изученных аутоантител, также влияющих на нервно-мышечную передачу.
Сравнительно недавно была обнаружена новая мишень аутоантител при сероне¬
гативной миастении — М1/5Х-рецептор. Аутоантитела к М[/5К-рецептору явля¬
ются показателем выбора при подозрении на серонегативную миастению. Для их
определения применяют метод радиоиммунного анализа.Миастения - аутоиммунное заболевание, имеет два возрастных пика, один
из которых приходится на 15 лет, а другой начинается после 40. В 15% случаев
отмечается окулярная форма миастении, которая редко прогрессирует в генера¬
лизованную форму. Б остальных 85% случаев течение заболевания варьирует от
окулярной до генерализованной формы. Нередким симптомом миастении явля¬
ются миастенические кризы, возникающие в результате инфекции или приема
препарата, с развитием острой мышечной слабости.Антитела к АхР диагностируют у 80-85% больных миастенией, они обладают
высокой специфичностью. Содержание аутоантител к АхР снижается параллельно
эффективной терапии, уменьшение на 50% обычно соответствует выраженному
клиническому улучшению, у больных в стадии ремиссии могут сохраняться титры
антител выше диагностических. У 15% пациентов можно обнаружить опухоль
тимуса, а гиперплазия тимуса отмечается в 30-40% случаев. Тимэктомия является
операцией выбора при миастении в случае плохого ответа на иммуносупрессивную
терапию и в большинстве случаев улучшает клиническое течение заболевания.
Более 95% больных с тимомой имеют антитела к АхР, кроме того, в 30-50% из
них можно обнаружить антитела к скелетным мышцам. При рецидиве тимомы
отмечается нарастание титров антител к АхР и скелетным мышцам.Еще одним нервно-мышечным заболеванием, имеющим паранеопластиче-
ский генез, является миастенический синдром Ламберта-Итона. Как и миасте¬
ния, это заболевание характеризуется мышечной слабостью, сухостью во рту,
однако, в отличие от миастении, при нагрузке наблюдается «врабатывание» с
уменьшением мышечной слабости. Основной причиной развития этого миасте¬
нического синдрома являются опухоли легких, молочной железы и яичников.
Нарушение нервно-мышечной проводимости обусловлено образованием анти¬
тел к вольтажзависимым кальциевым каналам нервной ткани на пресинапти-
ческой стороне нервно-мышечного окончания. Вольтажзависимые кальциевые
каналы относят к трансмембранным белкам, состоящим из нескольких субъе¬
диниц. Выделяют несколько субтипов и классов кальциевых каналов. При син¬
дроме Ламберта-Итона имеют место антитела к Р/(^-типам каналов, которые
контролируют высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечном окончании,
а также каналам М-типа, которые участвуют в нейротрансмиссии в пределах
ЦНС. Последние встречаются почти исключительно на фоне мелкоклеточного
рака легкого.Антитела к Р/С^-каналам — маркер синдрома Ламберта-Итона, который обла¬
дает чувствительностью около 95%. Они замедляют выделение ацетилхолина в
нервно-мышечном окончании, что нарушает работу моторной пластинки. Метод
определения антител к кальциевым каналам — радиоиммунный анализ экстрактов
нервной ткани с лигандом, меченным радиоактивной меткой. Техническая слож¬
ность метода ограничивает его клиническое применение.Антитела к ионным каналам могут встречаться совместно с другими паранео-
пластическими антителами. В 20-30% случаев антитела к кальциевым каналам
P/Q-типa обнаруживают при боковом амиотрофическом склерозе, однако их роль
при этом заболевании не установлена.
ІРШІР142 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙАНТИТЕЛА к СКЕЛЕТНЫМ МЫШЦАМ И МИОКАРДУХотя антитела к скелетным мышцам и миокарду обнаруживают при разных
патологических процессах, основными антигенами выступают сократительные
белки и поверхностные рецепторы поперечнополосатой мускулатуры. Обе раз¬
новидности аутоантител обладают выраженной перекрестной реактивностью и
требуют сочетаного определения.Антитела к скелетным мышцам при миастении были впервые описаны как
комплемент-фиксируюш,ие антитела, направленные против сократительных эле¬
ментов скелетной мышцы. Исследование молекулярных мишеней аутоантител
показало их значительную гетерогенность. Аутоантитела связывают множество
сократительных белков, включая актин, актинин, миозин, титин (коннектин), а
также рианодиновый рецептор, представляющий собой кальциевый канал сарко-
плазматического ретикулума.Появление аутоантител к скелетной мышце связано с аутоиммунной реакцией
против клеток тимуса. Поликлональные сыворотки и моноклональные антитела,
синтезированные на основе антительного спектра при миастении, связываются
как с антигенами скелетных мышц, так и с миоэпителиальными клетками тимомы.
Эта разновидность низкодифференцированных клеток тимуса сохраняет миоид-
ные элементы в цитоплазме, а также экспрессирует фетальный АхР. Экспрессия
а-субъединицы АхР возрастает при тимоме, причем ее синтез отмечается в кор¬
тикальных эпителиальных клетках, окруженных незрелыми тимоцитами. Именно
нарушение цитоархитектоники тимуса с дефектом негативной селекции незрелых
СіЗ’" Т-клеток и их постоянный контакт с миоэпителиальными клетками могут
лежать в основе возникновения аутоиммунных ответов при тимоме.Основным методом определения антител к скелетным мышцам является НРИФ
на криосрезах мышц грызунов или человека. Другие методы обнаружения аутоан¬
тител не позволяют охватить широкий спектр антигенов, поэтому используются
лишь для подтверждения. Определение конкретных мишеней аутоантител в кли¬
нической диагностике в настоящее время не применяют. Показано, что антитела
к титину являются наиболее специфичным маркером пара неопластической миа¬
стении, а антитела к рианод и новому рецептору указывают на тяжелое течение и
плохой прогноз заболевания.Антитела к скелетным мышцам диагностируют методом НРИФ у 30-40% боль¬
ных с классической миастенией, при паранеопластической миастении и на фоне
тимомы они встречаются у 70-80% пациентов. Результат теста является положи¬
тельным при обнаружении характерного окрашивания сократительных элементов
скелетной мышцы в титре более 1:20.В пожилом возрасте встречаемость аутоантител постепенно нарастает, в то время
как у молодых больных миастенией антитела к скелетным мышцам регистрируют
редко (<10%). Поскольку при миастении существует надежный и чувствительный
серологический маркер, такой как антитела к АхР, то антитела к скелетным мыш¬
цам имеют вспомогательное значение и используются только в серодиагностике
тимомы. Высокая чувствительность этих аутоантител позволяет использовать
их для диагностирования тимомы на фоне миастении. Отрицательный результат
серологического теста позволяет с большой вероятностью исключить тимому у
лиц в возрасте 20-60 лет. Антитела к скелетным мышцам обнаруживают у части
пациентов с хронической болезнью «трансплантат против хозяина» при пересадке
костного мозга.Антитела к миокарду отмечаются при поствирусных миокардитах, дилата-
ционной кардиомиопатии, синдроме Дресслера и ревмокардите. Спектр антиге¬
нов антимиокардиальных антител по своей широте сопоставим с разнообразием
антигенов и антител к скелетным мышцам. Основными антигенами являются
а- и р-изоформы тяжелой цепи сердечного миозина, тропомиозин, ряд митохон¬
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 143дриальных антигенов, в том числе белок-переносчик аденина (ANT) и ферменты
синтеза жирных кислот (BCKD). Рецепторный аппарат миокарда также становится
мишенью антител. Выявляют антитела к р, -адренорецепторам и М2-мускариновым
рецепторам.Ведущая роль вирусной инфекции в патогенезе аутоиммунного поражения мио¬
карда многократно подтверждена. Помимо результатов множества клинических
исследований, посвященных определению нуклеиновых кислот и антигенов в мио¬
карде, разработано несколько животных моделей вирусиндуцированного миокар¬
дита и дилатационной кардиомиопатии. Классическая модель миокардита, вызы¬
ваемого вирусом Коксаки В,, сопровождается индукцией аутоантител к миозину.
При ряде бактериальных инфекционных заболеваний, таких как болезнь Чагаса
и стрептококковая инфекция, наблюдают образование перекрестно-реагирующих
антител к соединительной ткани и миозину сердца.Участие аутоантител в патогенезе миокардитов и миокардиопатии остается
спорным. Большая часть антигенов аугоантител является внутриклеточными,
поэтому они недосягаемы для циркулирующих аутоантител. Вероятным пато¬
генетическим механизмом представляется стимуляция кардиомиоцитов через
|3,-адренорецептор, что приводит к нарушению их сократительной функции и раз¬
витию тахиаритмий. Частота встречаемости антител к р^-адренорецептору выше у
носителей HLA-DR4, носительство которого ассоциировано с развитием идиопа-
тической дилатационной кардиомиопатии.Основным клиническим методом обнаружения антител к миокарду счита¬
ют непрямую иммунофлюоресценцию на миокарде грызунов или человека.
Выявление титров более 1:20 указывает на наличие клинически значимых ауто¬
антител. Аутоантитела по-разному реагируют с миокардиальной тканью, поэтому
выделяют 2 типа окрашивания: сарколеммный и миофибриллярный. Антитела к
скелетной мышце, часто встречающиеся у пожилых лиц, при НРИФ также реагиру¬
ют с сократительными белками миокарда и неотличимы от антимиокардиальных
антител. Целесообразно параллельное использование двух субстратов (мышцы и
миокарда) для дифференцировки этих специфичностей.Аутоантитела к миокарду встречаются часто, чувствительность при дилата¬
ционной кардиомиопатии достигает 90%. Однако встречаемость аутоантител у
здоровых доноров крови может достигать 10-20%, что затрудняет использование
аутоантител к миокарду в качестве подхода к дифференциальной диагностике
миокардиопатий.Отсутствие коммерчески доступных тест-систем для определения антител к
миокардиальному миозину, ANT и р-адренорецептору не позволяет использовать
эти потенциально более специфичные маркеры в клинической практике.Серологические маркеры при аутоиммунных поражениях кожиАУТОАНТИТЕЛА ПРИ ПУЗЫРЧАТКЕРазличают простую (вульгарную), листовидную, эритематозную и вегети¬
рующую форму пузырчатки, В основе заболеваний этой группы пузырчатки
лежит образование внзтгриэпидермальных пузырьков, причиной которых явля¬
ется антитело-опосредованное разрушение десмосом — межклеточных структур,
которые объединяют между собой клетки кожи. Десмосомы представляют собой
плотные межклеточные контакты, разрушение которых приводит к образованию
интраэпителиальных полостей и отделению клеток друг от друга (акантолитиче-
ские клетки). Особенностью аутоантител при пузырчатке является способность
активировать систему комплемента, в результате чего антитела имеют прямое
цитотоксическое действие.
Jf144 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙПри выполнении прямой РИФ в биоптатах кожи отмечаются интраэпидермаль-
ные отложения IgG и С.^-компонента комплемента по межклеточным контактам
(десомомам) эпителиоцитов базальных слоев. Эти отложения напоминают ячейки
рыболовной сети, они обычно линейные, на большом увеличении можно отметить
мелкую гранулярность, которая соответствует морфологическому распределению
«плотных контактов» эпидермиса. Прямая РИФ является золотым стандартом,
поскольку позволяет обнаружить аутоантитела у всех пациентов с пузырчаткой,
в то время как НРИФ имеет чувствительность, не превышающую 90%. Биопсию
целесообразно проводить в области непораженной кожи на границе или рядом с
высыпным элементом, в биоптатах клинически не пораженной кожи часто отме¬
чают интраэпидермальные полости с акантолитическими клетками, цитоплазма
которых особенно ярко окрашена иммуноглобулином.Среди антигенов антидесмосомальных антител наиболее хорошо изучены гли¬
копротеины десмосом: десмоглеин 1 и 3. Пациенты с листовидной пузырчаткой
имеют антитела против десмоглеина 1. При вульгарной пузырчатке и при ее гипер-
пролиферативном варианте (вегетирующая пузырчатка) образуются аутоантитела
к десмоглеину 3. Отличия в морфологии и клинической картине листовидной и
вульгарной пузырчатки обусловлены различиями в экспрессии двух основных
антигенов. Так, локализация пузырьков между верхними слоями эпидермиса при
листовидной и нижними слоями при вульгарной пузырчатке обусловлена экспрес¬
сией десмоглеина 3 в преимущественно верхних слоях эпидермиса. В то же время
десмоглеин 1 отсутствует в эпидермисе слизистых оболочек, что обусловливает
отсутствие высыпаний на них при листовидной пузырчатке.При пузырчатке выявляют широкий спектр аутоантител других специфично¬
стей, в том числе десмоколлины 1-3, десмоплакины I и II, плакоглобин, аннек-
сины, Е-кадхерин и коллаген XVII. Перспективными аутоантигенами при пузыр¬
чатке могут быть ацетилхолиновые рецепторы кератиноцитов. Ряд исследований
показывает принципиальную роль этих антител в воспроизведении эксперимен¬
тальных моделей пузырчатки.Два редких пузырных заболевания кожи связаны с интраэпителиальными отло¬
жениями IgA, К ним относят субкорнеальный пустулярный дерматоз и интраэ-
пидермальный нейтрофильный дерматоз. При этих заболеваниях основными
антидесмосомальньши антигенами являются десмоглеины 1, 3 и десмоколлин 1.
Антитела класса IgA могут быть выявлены с помощью НРИФ на пищеводе обе¬
зьяны в 50% случаев.АУТОАНТИТЕЛА ПРИ БУЛЛЕЗНОМ ПЕМФИГОИДЕПемфигорщ представляет собой группу буллезных заболеваний кожи, включаю¬
щую собственно буллезный пемфигоид, а также пемфигоид слизистых оболочек,
пемфигоид беременных, IgA-пемфигоид, в отличие от пузырчатки, при пемфигои-
де образуются антитела к гемидесмосомам базального слоя. Эти структуры связы¬
вают между собой эпидермис и дерму. Как и при пузырчатке, антитела обладают
способностью фиксировать комплемент, в результате при разрушении гемидес-
мосом полости образуются на границе эпидермиса и дермы. Поскольку структуры
эпидермиса не нарушены, акантолитические клетки отсутствуют.При прямой РИФ в биоптатах кожи отмечаются линейные отложения IgG по
базальной мембране кожи. Основными антигенами служат 2 белка гемидесмосом
массой 230 и 180 кДа, которые получили название BPAG1 и BPAG2 (от англ. bullous
pemphigus antigen). Вопрос о патогенетическом значении аутоантител не решен,
хотя показана возможность пассивного переноса пемфигоида животным с помо¬
щью введения аутоантител человека. Тем не менее для образования субэпидер-
мальных полостей необходимо нейтрофильное воспаление с синтезом протеазных
ферментов. Вероятно, основной ролью аутоантител к антигенам гемидесмосом
'MillДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 145является привлечение воспалительных клеток. Антитела к базальной мембране
кожи не коррелируют с активностью заболевания, поэтому их мониторинг не осу- J
ществляется.Для определения антител в сыворотке крови применяют метод НРИФ на
криосрезах пищевода обезьяны. Положительное окрашивание базальной мем¬
браны кожи проявляется в виде яркой линии под клетками базального слоя.
Серологически обнаруживаются антитела у 75% больных с пузырными дерматоза¬
ми, в то время как у большинства больных с начальными формами и поражением
слизистых оболочек антитела в крови отсутствуют.Основной класс иммуноглобулинов при пемфигоиде — IgG (IgG^ и IgGj. При
более редкой разновидности — линейном IgA буллезном пемфигоиде — основным
классом является IgA. При этой форме редко можно обнаружить аутоантитела в
крови, поэтому основой диагностики стало исследование биоптатов кожи.АУТОАНТИТЕЛА ПРИ ДРУГИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ КОЖИОтложения IgG отмечаются при буллезной форме многоформной эритемы.
Антигенными мишенями являются белки гемидесмосомы десмоплакины. Они
служат основными конститутивными элементами десмосом и образуют внутри¬
клеточную плотную десмосомальную пластину. Больные с антителами к десмопла-
кинам страдают от повторных высыпаний на слизистой оболочке рта и гениталий,
а также от обострений конъюнктивита. Антитела реагируют с эпитопом белка,
ответственным за связь с цитокератинами клетки.При многоформной эритеме циркулирующие антитела обнаруживают не более
чем в 50% случаев: биопсия кожи является основой диагностики. Для уточнения
характера отложений используют «расщепление» кожи под действием высокой
концентрации NaCl (ЇМ). При многоформной эритеме отложения IgG остаются на
эпидермальной части эпидермиса.Буллезный эпидермолиз является заболеванием с преимущественным пора¬
жением слизистых оболочек. Основной антиген — коллаген VII типа, который
связывает плотную пластинку гемидесмосом базального слоя эпидермиса с глу¬
бокими слоями дермы, в сыворотке аутоантитела встречаются нечасто, поэтому
для диагностики применяют биопсию кожи. При использовании «солевого рас¬
щепления» отложения иммуноглобулинов при буллезном эпидермолизе остаются
на дермальной части эпидермиса.Герпетиформный дерматит (болезнь Дюринга) обычно характеризуется везику¬
лопустулезной сыпью на фоне скрытых форм целиакии. При выполнении прямой
РИФ отмечают крупногранулярные отложения IgA в вершинах сосочков кожи.В отличие от других буллезных дерматозов, при которых характер окрашенных
структур идентичен при прямой и непрямой РИФ, при герпетиформном дерматозе
при проведении НРИФ не выявляют антитела к антигенам кожи, но определяют
антитела к эндомизию и ретикулину. Еще одной специфической мишенью аутоан¬
тител при герпетиформном дерматите служит эпидермальная трансглутаминаза,
антитела к которой могут иметь перекрестную специфичность с другими транс-
глутаминазами.Витилиго — еще одно распространенное аутоиммунное заболевание кожи,
сопровождающееся появлениями аутоантител против антигенов кожи. Поскольку
витилиго часто сочетается с рядом аутоиммунных эндокринопатий, при этом забо¬
левании можно обнаружить также аутоантитела к антигенам щитовидной железы,
надпочечникам, обкладочным клеткам желудка.Аутоантитела к меланоцитам, циркулирующие в крови больных витилиго,
обладают цитотоксическим действием на культуры меланоцитов и способны
активировать комплемент. Установлен ряд мишеней аутоантител, среди них наи¬
большее значение имеет 40 кДа-антиген витилиго (VIT40) и тирозиназа (69 кДа),
WmM146 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙучаствующая в синтезе меланина. Учитывая очевидную клиническую картину
этого заболевания и простоту постановки диагноза, серологическая диагностика
витилиго не разработана.ДИАГНОСТИКА РЕВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Диффузные болезни соединительной тканиОсновной серологический тест в иммунологическом обследовании больных с
подозрением на заболевание соединительной ткани — определение АНФ с помо¬
щью метода НРИФ. При подозрении на ДБСТ на первом этапе лабораторного
обследования должен быть определен титр АНФ на перевиваемой клеточной
линии НЕр-2. Более чем у 95% пациентов с обострением ДБСТ отмечают диагно¬
стические титры этого показателя. Хотя встречаемость АНФ варьирует при диа¬
гностике конкретных системных заболеваний, она превышает 90% при СКВ, СШ
и диффузных формах склеродермии, включая CREST-синдром. Несколько реже
АНФ обнаруживают при дискоидной красной волчанке, кожных формах склеро¬
дермии. Частота встречаемости АНФ при воспалительных миопатиях, таких как
дерматомиозит и полимиозет, не превышает 50%.При диагностике СКВ, СЗСТ, СШ и склеродермии отсутствие диагностических
титров АНФ или низкие титры, составляющие 1:40-1:80, делают диагноз ДБСТ
маловероятным. Принимая во внимание особенности метода обнаружения АНФ,
необходимо учитывать, что ряд распространенных антигенов АНА, прежде всего
антигены 55-А-антител, могут утрачиваться из ядра клетки в ходе фиксации.
Поэтому рекомендуется дополнительное обследование антител к экстрагируемому
ядерному антигену методом ИФА или диффузии в геле. В качестве альтернативно¬
го варианта можно использовать селективные тесты, направленные на выявление
антител к 5S-A антигену.За счет высокой чувствительности ИФА-методов обнаружения антител к ЭНА
при совместном использовании с АНФ отрицательный результат такого тестиро¬
вания позволяет исключить диагноз СКВ, СШ и диффузных форм склеродермии с
вероятностью около 98%.Определение АНФ на клеточных линиях позволяет уточнить тип свечения
ядра клетки. Выявление высоких титров АНФ с гомогенным типом свечения ядра
клетки в большинстве случаев указывает на диагноз СКВ. Основиьш антигеном
при гомогенном типе свечения является дсДНК. Гомогенный тип свечения может
отмечаться при диффузной склеродермии и часто обусловлен наличием антител
к Sd-70 антигену. Титры гомогенного свечения АНФ при склеродермии обычно
ниже титров, отмечающихся при обострении СКВ.Среди всех типов свечения при выявлении АНФ у лиц, обследуемых по поводу
ДБСТ, преобладает гранулярный тип. Он отмечается при СКВ, СШ, СЗСТ, склеро¬
дермии, РА и других артропатиях. При СКВ и СЗСТ преимущественно устанавли¬
вают крупногранулярный тип свечения ядра, связанный с обнаружением антител
к рибонуклеопротеиновым антигенам, таким как Sm и RNP. Поскольку СКВ и СШ
характеризуются выраженной гипергаммаглобулинемией, титры АНФ с грануляр¬
ным типом свечения обычно выше, чем при других заболеваниях. Обнаружение
умеренных титров АНФ с гранулярным типом свечения может отмечаться у лиц
без признаков ДБСТ.Наличие ядрышкового и центромерного типа окрашивания ядра характерно
для различных форм склеродермии. Антитела к центромерам, которые являются
маркером CREST-синдрома, отмечают в очень высоких титрах, обычно превыша¬
ющих 1:2560. Диффузные формы склеродермии, протекающие с поражением вну¬
тренних органов, практически в 100% случаев сопровождаются высокими титрами
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 147АНФ. При локализованной склеродермии АНФ встречается у 30% больных, чаще
отмечается на фоне линейной склеродермии (40%), преимущественно у детей. При
бляшечной склеродерме встречаемость диагностических титров АНФ составляет
только 15%, причем антитела обнаруживают преимущественно у взрослых.Цитоплазматический тип свечения описывают реже других, обычно он при¬
сутствует в невысоких титрах. Нередко ложноотрицательные результаты опреде¬
ления антител к антигенам цитоплазмы связаны с тем, что цитоплазматический
тип свечения имеет место наряду с более выраженным окрашиванием ядра клетки.
Большинство антигенов, определяющих цитоплазматический тип окрашивания
ядра, в частности рибосомы, диффузно распределены в ядре клетки, что затруд¬
няет их обнаружение. Большинство положительных результатов обнаружения
цитоплазматического типа свечения обусловлено антителами к митохондриям,
которые представляют собой крупные органеллы, хорошо различимые среди дру¬
гих структур цитоплазмы.Тестирование на определение конкретных разновидностей АНА целесообразно
проводить только при іюлучении положительного результата выявления АНФ
или антител к экстрагируемому ядерному антигену. Вероятность обнаружения
диагностических титров конкретных разновидностей АНА при отсутствии или
низких титрах АНФ очень низка. Основными разновидностями АНА, которые
отмечаются при низких титрах АНФ, являются антигены 55-А и S5-B. Таким обра¬
зом, использование уточняющих тестов целесообразно только при обнаружении
высоких титров АНФ (более 1:160) и/или антител к ЭНА, которые указывают на
присутствие антител к SS-A и SS-B.Среди всего многообразия АНА у больных ДБСТ рекомендуется определение
антител к наиболее часто встречающимся разновидностям АНА, выявление кото¬
рых имеет четкое диагностическое значение. Минимальный набор включает 55-Л,
SS-Б, Sm, U^-RNP, Sc/-70 и Jo-1.Наиболее объективные и специфичные результаты обследования мог>т быть
получены при использовании двойной иммуно диффузии и контрэлектрофореза.
Однако эти методы крайне трудоемки и требуют хорошо обученного персонала.
Метод ИФА для обнаружения этих разновидностей АНА является очень чувстви¬
тельным, что может приводить к получению ложноположительных результатов. За
счет своей дешевизны, простоты и надежности в большинстве иммунологических
лабораторий метод лайн-блота постепенно вытеснил другие методы обнаружения
АНА. Определение антител к дсДНК может быть рекомендовано только пациен¬
там с СКВ, причем вероятность обнаружения этих антител выше при гомогенном
типе свечения АНФ. При других системных заболеваниях обнаружение антител к
дсДНК не показано. Учитывая высокую встречаемость АКА у больных СКВ, обна¬
ружение низких титров АФА может быть использовано в качестве дополнительно¬
го диагностического маркера при этом заболевании.Все пациенты с ДБСТ должны хотя бы однажды быть обследованы для уточне¬
ния спектра АНА. Титры всех аутоантител не являются постоянной величиной и
могут значительно меняться с течением времени, что справедливо по отношению
к АНА, присутствующих в сыворотке больных ДБСТ. Повторное обследование
для обнаружения АНФ и других АНА рекомендовано только при СКВ. При дру¬
гих ревматических заболеваниях титр АНФ не коррелирует с активностью их
течения; данных, свидетельствующих о целесообразности повторных измерений
АНФ у больных с другими ДБСТ, не существует. Даже если у больного с типичной
клинической картиной ДБСТ был обнаружен высокий титр АНФ, то совсем не
обязательно, что дальнейшее иммунологическое обследование позволит устано¬
вить конкретную разновидность АНА. Это связано с разнообразием АНА и несо¬
вершенством используемых методов их определения.
■шшшщщШ148ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙСреди всех форм ДБСТ реже всего АНА встречаются при воспалительных мио¬
патиях. Отсутствие АНФ не исключает наличия антител к синтетазам и другим
цитоплазматическим мишеням АНА. Результаты выявления АНФ при подозре¬
нии на воспалительные миопатии следует интерпретировать с осторожностью.
Независимо от результатов обнаружения АНФ всем пациентам с ПМ/ДМ необхо¬
димо провести специфические тесты, направленные на выявление антисинтетаз¬
ных и других характерных разновидностей АНА.Практически у 25% больных с диагнозом ДБСТ клиническая картина не укла¬
дывается в классическое описание конкретного заболевания, и у них одновре¬
менно отмечают признаки нескольких заболеваний соединительной ткани. Такие
заболевания рассматривают как перекрестные синдромы, которые не могут быть
классифицированы на основании клинических критериев. Их прототипом явля¬
ется СЗСТ или синдром Шарпа, речь о котором шла при обнаружении антител к
U^-RNP и который сочетает признаки всех основных заболеваний соединительной
ткани. Обнаружение у больного совокупности разнородных клинических при¬
знаков в сочетании с выявлением одновременно иммунологических маркеров
нескольких ревматологических заболеваний заставляет предположить диагноз
перекрестного синдрома.Тот факт, что при наличии определенных разновидностей АНА с большой
частотой отмечаются определенные клинические признаки и формы системных
заболеваний, послужил толчком к пересмотру определений и классификации
ряда нозологических форм. Существующие исследовательские данные однознач¬
но указывают на то, что аутоантитела связаны с иммунопатогенезом системных
заболеваний и отражают особенности иммунного ответа. Это позволяет более
точно очерчивать клинические синдромы, характеризующиеся единым патогене¬
зом. Так, на серологических показателях основано выделение ряда перекрестных
синдромов, в частности антисинтетазного синдрома, склеромиозита (табл. 17-22).
В основе современной классификации воспалительных миопатий лежит определе¬
ние миозит-специфичных аутоантител.Таблица 17-22. Серологические маркеры перекрестных синдромов в ревматологииПризнаки ДБСТ в клинической картинвОсновной серологический маркерСШ/СКВ {СС/РА)Ro/SS-A, La/SS-BСЗСТи,-RNPсс/пмPM-Scl, KuРА/СШРФ, Ro/SS-AАнгиосинтетазный синдром (ПМ/ДМ/интерстициальный пнев-
монит/полиартрит)Jo-1, другие антисинтетазные антителаСистемные заболевания соединительной ткани, сопровождающиеся образо¬
ванием АНА, представляют собой единое поле, объединяющее специфическую
клиническую симптоматику, иммунопатогенез и серологические маркеры. Это
характерно и для других аутоиммунных заболеваний, в частности аутоиммунных
эндокринопатий, при которых часто обнаруживается общность клинической
картины и совпадают иммунологические маркеры. В то же время АНА могут
обнаруживаться при заболеваниях как имеющих ревматическую природу, так
и не имеющих таковой. К последним относятся заболевания печени, вирусные
гепатиты, шизофрения, васкулиты, аутоиммунные тиреоидиты и болезнь Грейвса,
поликистоз, РС, пурпура Шенлейна-Геноха, юношеский РА, атопический дерма¬
тит, миастения, паранеопластические синдромы, гиперэозинофильный синдром,
беременность, вирусные и бактериальные инфекции.Таким образом, системные заболевания соединительной ткани объединяются
иммунологическими и, нередко, клиническими проявлениями с другими ауто¬
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 149иммунными заболеваниями, что позволяет проследить единые патогенетические
закономерности аутоиммунной патологии.Иммунологическая диагностика системной красной волчанкиВстречаемость СКВ составляет 1:5000 женщин от 15 до 45 лет, что делает ее
одним из наиболее частых ДБСТ. Полиморфная клиническая картина, отсутствие
абсолютно патогномоничных морфологических и инструментальных критериев
этого заболевания позволяют рассматривать иммунологическое обследование в
качестве основного метода подтверждения диагноза СКВ. При использовании кле¬
точной линии НЕр-2 АНФ выявляет АНА более чем у 98% больных с этим заболе¬
ванием, что позволило использовать обнаружение АНФ в качестве самостоятель¬
ного классификационного критерия СКВ. Серологические показатели, в том числе
антитела к дсДНК и антитела к S/и-антигену, благодаря высокой специфичности
также являются критерием этого заболевания.При применении человеческих клеточных линий в качестве субстрата для обна¬
ружения АНА почти у всех больных СКВ фиксируют значительные титры АНА
(>1:160). При обострении отмечают крайне высокие титры АНФ на клеточной
линии НЕр-2, составляющие в среднем 1:1280-1:2540. Зачастую у больных СКВ
титры могут превышать 1:100 ООО. При успешной терапии титры АНФ снижаются,
составляя в среднем 1:320-1:640.Отсутствие значимых титров АНФ у отдельных больных, имеющих типичные
клинические симптомы СКВ, является «яблоком раздора» между ревматологами
и сотрудниками лаборатории, что заставляет выделять условную группу пациентов
с «АНФ-негативной СКВ». При использовании тканей лабораторных животных,
таких как почка или печень крысы, до 10-15% больных, удовлетворяющих кри¬
териям для диагноза СКВ, не имеют диагностических титров АНФ в сыворотке
крови. Одной из основных разновидностей АНА, которые обнаруживают у таких
пациентов, являются антитела к 55-А-антигенам. Эти антигены обладают хорошей
растворимостью и могут утрачиваться из ядер клеток.Хотя применение в качестве субстрата клеточной линии НЕр-2 значительно
сокращает численность этой категории пациентов, серонегативными остаются до
5% больных. Необходимо учитывать, что при использовании метанол-ацетоновой
фиксации HEp-2-клеток SS-A-антиген может диффундировать в цитоплазму клет¬
ки, в результате чего титры АНФ значительно занижаются.Для устранения этих недостатков была создана трансгенная клеточная линия
НЕр-2000, в генотип которой был искусственно внесен ген 55-А-антигена. За счет
этого в ее ядре отмечается гиперэкспрессия SS-A-антигена, что увеличивает чув¬
ствительность выявления АНА. Однако даже использование трансгенных клеточ¬
ных линий не позволяет окончательно избавиться от проблемы «АНФ-негативной
СКВ». Ложноотрицательные результаты определения АНФ могут быть получены
в присутствии АНА к антигенам цитоплазмы — рибосомальным антигенам и
антисинтетазным антигенам 0о-1), а также в случае присутствия антител к фос¬
фолипидам. Существует еще одна группа больных СКВ, у которых не отмечается
АНФ. Люди с врожденной недостаточностью компонентов комплемента (С^ и CJ
могут страдать кожным волчаночноподобным заболеванием с выраженной фото-
чувствительностью. При лабораторном обследовании у них отсутствуют сколько-
нибудь значимые титры АНФ и антитела к дсДНК, хотя в ряде случаев у них могут
быть обнаружены антитела к Ro/SS-A.Определение типа свечения АНФ играет большую роль в определении прогно¬
за при СКВ. Встречаемость конкретных типов свечения зависит от обследуемых
контингентов пациентов. При обследовании смешанных популяций, включающих
шmm150 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙкак кожные, так и системные формы заболевания, гомогенный и гранулярный тип
свечения отмечаются с одинаковой частотой.Гомогенный тип свечения обусловлен присутствием антител к дсДНК и характе¬
ризуется более агрессивным течением и большей вероятностью поражения почек.
Наряду с антителами к дсДНК, при гомогенном типе свечения обнаруживают
антитела к нуклеосомам и антиэндотелиальные антитела, которые также участву¬
ют в патогенезе волчаночного нефрита.Выделяют 2 основные разновидности гранулярного типа свечения у больных
СКВ. Крупногранулярный тип свечения присутствует у пациентов с антителами к
компонентам сплайсосом Sm и RNP. Наличие этих вариантов АНА сопровожда¬
ется тяжелым течением заболевания с большой вероятностью поражения ЦНС,
цитопениями, выраженным синдромом Рейно. Мелкогранулярный тип свечения
обусловлен присутствием антител к SS-A и SS-B-антигенам, характеризуется
преимущественно кожными формами заболевания с выраженной фоточувстви¬
тельностью.Тест волчаночной полоски высокоспецифичен для системных форм СКВ и
преимущественно отмечается у пациентов с поражением почек и вторичным АФС.
В то же время обнаружение антител к фосфолипидам при СКВ не всегда сопут¬
ствует клинической картине АФС. Низкие титры АКА зафиксированы у 40-50%
больных СКВ и представляют собой дополнительный диагностический критерий
этого заболевания.Для оценки активности заболевания могут быть использованы титры АНФ,
антител к дсДНК, антител к нуклеосомам, антиэндотелиальных антител, содер¬
жание сывороточных иммуноглобулинов и гаммаглобулинемия, содержание ком¬
понентов системы комплемента, изменение уровней ЦИК и СОЭ, В отличие от
других заболеваний, концентрации С-реактивного белка при СКВ обычно лежат
в пределах нормы. Увеличение концентраций С-реактивного белка при СКВ ука¬
зывает на присоединение инфекционного процесса и требует активного поиска
очагов скрытой инфекции.Диагностика антифосфолипидного синдромаАФС — аутоиммунное заболевание, поражающее преимущественно женщин
молодого возраста, проявляется рецидивирующими тромбозами, привычным
невынашиванием беременности, тромбоцитопенией и стойким наличием анти¬
фосфолипидных антител. Диагноз АФС устанавливают на основании соответ¬
ствия клинических и лабораторных находок диагностическим критериям этого
заболевания. В Сиднее в 2006 г. произошел последний пересмотр критериев этого
заболевания. На основе австралийских критериев в настоящее время строится
практическая диагностика АФС (табл. 17-23).Таблица 17-23. Критерии антифосфолипидного синдрома, 2006 г.Антифосфолипидный синдром может быть диагностирован, если у больного подтвержден один из клини-
	ческих и один из лабораторных критериев заболевания*		Клиничеше критерии	» Сосудистый тромбоз“			Один или несколько эпизодов’" артериального, венозного тромбоза или тромбоза мелких сосудов"” в
любой ткани или органе. Тромбоз должен быть подтвержден КТ/МРТ, допплеровским исследованием или
морфологически. При морфологическом исследовании тромбоз не должен сочетаться с воспалительными
изменениями стенки сосуда		•	Невынашивание беременности 	❖	Одна или более смерть плода от 10 и более нед беременности, подтвержденная нормальной
морфологией плода при ультразвуковом исследовании или морфологически
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 151
Окончание табл. 17-23Одни или более преждевременные роды морфологически нормального новорожденного на сроке от
34 нед беременности в результате тяжелой преэклампсии, эклампсии или плацентарной недостаточно-
сти'^*"						Три или более необъяснимых спонтанных аборта на сроке до 10 нед беременности при исключении ана-
томі^ческих. гормональных и генетических причин невынашиванияЛабораторные критерии*•	Волчаночный антикоагулянт, обнаруженный два или более раз, с промежутком между исследованиями
не менее 12 нед с помощью комплекса из скринингового, подтверждающего и корректирующего коа-
гулогических тестов в соответствии с требованиями Международного общества изучения тромбозов и
гемостаза	•	Антикардиолипиновые антитела классов IgG и/или IgM в сыворотке или плазме в среднем или высоком
титре (т.е. >40 GPL или MPL, или более 99 перцентиля здоровой популяции), повторно обнаруженные не
менее чем через 12 нед, выявленные при помощи стандартизованной ИФА тест-системы	*	Антитела к ^^-гликопротеину классов IgG и/или IgM в сыворотке или плазме в титре более 99 перценти-ля здоровой популяции, обнаруженные при помощи стандартизованной ИФА тест-системы	Примечания экспертов к тексту критериев*	Необходимо избегать установки диагноза АФС, если положительные лабораторные результаты
и клинические проявления разделяют менее 12 нед или более 5 лет.** Присутствующие врожденные или приобретенные факторы риска тромбоза не являются при¬
чиной исключения АФС у больного. Однако рекомендуется выделять отдельные группы паци¬
ентов в зависимости от (а) отсутствия и (Ь) наличия дополнительных факторов риска тромбоза.
Такими факторами риска являются возраст (>55 у мужчин, >65 у женщин), наличие любых уста¬
новленных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний (гипертензии, диабета, повышен¬
ного холестерина ЛНП или низкого холестерина ЛВП, курения, наследственности, указывающей
на раннее начало сердечно-сосудистых заболеваний в семье, индекса массы тела более 30 кг/м^,
микроальбуминурии, снижения СКФ, врожденных тромбофилий, приема пероральных контра¬
цептивов, нефритического синдрома, опухоли, иммобилизации и хирургической патологии).*** Эпизод тромбоза в прошлом может рассматриваться как положительный критерий, если он
был объективно подтвержден клинически.**** Тромбоз поверхностных вен не включен в клинические критерии.***** Общепринятые признаки плацентарной недостаточности включают (1) отрицательные при¬
знаки жизнедеятельности плода, (2) плозше формы кривой допплерограммы сосудов, указываю¬
щие на признаки гипоксемии плода. (3) олигогидрамнион с индексом амниотической жидкости
менее 5 см, (4) постнатальный вес плода менее 10 перцентиля срока гестации.****** Эксперты рекомендуют отдельно классифицировать больных АФС на следующие катего¬
рии: (1) присутствует более 1 лабораторного критерия в любой комбинации, (2а) изолирован¬
ный волчаночный антикоагулянт, (2Ь) только антитела к кардиолипину, (2с) только антитела к
Р.-ГП,Выделяют несколько классификационных форм АФС. Прежде всего это первич¬
ный или идиопатический АФС, возникающий у лиц моложе 45 лет. После этого
возраста большинство случаев АФС рассматривают как вторичный процесс по
отношению к основному заболеванию. Вторичный АФС развивается на фоне СКВ,
СШ, склеродермии, опухолей, ВИЧ и ВГС, приема лекарственных препаратов.
Еще одной разновидностью заболевания является катастрофический АФС, кото¬
рый протекает как первая фаза ДВС с развитием полиорганной недостаточности.
В случае катастрофического ДВС диагноз часто ставят посмертно, в результате
обнаружения крайне высоких титров АКЛА. В то же время серонегативный АФС
характеризуется отсутствием АКЛА при характерной клинической картине. В слу¬
чае перенесенного эпизода тромбоза целесообразно проводить измерение АКЛА и
антител к ^2'ГП через 3 нед, поскольку тромботический эпизод может бьггь связан
с потреблением больших количеств аутоантител.Основу клинических признаков АФС составляют повторные венозные тромбо¬
зы, локализуемые наиболее часто в глубоких венах голеней, что может ослож¬
няться тромбоэмболией легочной артерии. Однако тромбозы могут развиваться
также в поверхностных венах и в любом другом венозном бассейне. Артериальные
тромбозы проявляются гангреной конечностей, инсультами, окклюзией аорты с
ШШШшш152 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙасептическим некрозом головок бедренной кости, инфарктом миокарда, почек и
других внутренних органов. Тромбы могут образоваться на клапанах и в полостях
сердца. Кожные проявления заключаются в язвах на голенях, кровоизлияниях
в подногтевом ложе и сетчатом ливедо. Сетчатое ливедо в виде поверхностной
синеватой венозной сеточки на голенях и бедрах особенно хорошо видно после
охлаждения.Необъяснимые спонтанные аборты на ранних сроках или внутриутробная
гибель плода во П-Ш триместрах могут возникнуть при АФС без или на фоне
тяжелой преэклампсии. Тромбоцитопения при АФС умеренная, редко приводит
к осложнениям и не требует назначения лечения. Однако идиопатическая тром¬
боцитопения, как и гемолитическая анемия, служат показанием к назначению
лабораторных тестов, направленных на выявление антифосфолипидных антител.
Клинический спектр симптомов, которые связывают с АФС, достаточно широк
(табл. 17-24), большинство их них не были включены в итоговые критерии диа¬
гностики АФС (2006), но активно обсуждаются в литературе.Таблица 17-24. Клинические признаки антифосфолипидного синдромаПроявления АФСПериферический тромбозНевынашивание беременностиРевматические жалобыНеврологические проявленияКожные проявленияГематологияСердечные проявленияЛегочные проявленияСимптоматикаТромбоз глубоких вен.
тромбоз артерий/венРанний/поздний выкидыш, ранние родыАртралгия, артритМигрень, инсультLivedo reticularis, язвы ногТромбоцитопения
Гемолитическая анемияУтолщение клапанов
Инфаркт миокардаТЭЛА, легочная гипертензияВстречаемость, %6463686640302720Отдельную клиническую форму АФС представляет собой катастрофический
АФС, или синдром Асерсона {Asherson’s syndrome), характеризующийся острой
полиорганной недостаточностью из-за внезапного развития множественных
тромбозов в микроциркуляторном русле различных органов. Опасность развития
катастрофического синдрома выше у женщин с патологией беременности во время
инфекционных заболеваний, травм, в том числе после даже нетяжелых хирур¬
гических вмешательств. Летальность при катастрофическом синдроме достигает
50% и существенно выше при таких осложнениях, как синдром диссеминирован¬
ной коагуляции и/или системный воспалительный ответный синдром, которые
наблюдают в 15-20% случаев при данной форме заболевания. В терапии катастро¬
фического синдрома используют прямые антикоагулянты, обменные переливания
замороженной плазмы, введение иммуноглобулина, высокие дозы стероидов,
антибиотиков, анти-СВ20 моноклональные антитела. Для профилактики ослож¬
нений при хроническом АФС назначают непрямые антикоагулянты, главным
образом варфарин. для поддержания МНО в пределах 2,0-3,0, что уменьшает риск
развития рецидивирующего венозного тромбоза на 80-90% независимо от нали¬
чия антифосфолипидных антител. У лиц, перенесших инсульт, с единственным
положительным тестом ацетилсалициловая кислота и варфарин оказались одина¬
ково эффективны в предупреждении повторных инсультов. Риск развития новых
тромбозов умеренно увеличен до 10% в год у женщин с повторными потерями
плода и оказывается более 10% у пациентов с венозными тромбозами, прекратив¬
ших принимать антикоагулянты.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 153Серодиагностика АФС остается сложной проблемой. Положительные резуль¬
таты определения АКЛА нередко отмечаются у клинически здоровых лиц, в том
числе пожилого возраста, при нормально протекающей беременности и при воспа¬
лительных заболеваниях. В подавляющем большинстве подобных случаев присут¬
ствие антител в невысоком титре — преходящий феномен, не ведущий к формиро¬
ванию АФС, в этих случаях эпитоп отличен от эпитопа, типичного для АФС. Тесты
АКЛА. антитела к ^2"ГП 1 и ВА предпочтительно выполнять совместно, так как
в случае положительного результата всех тестов увеличивается прогностическая
значимость обследования в отношении повторных тромбозов. Строгая значимая
связь обнаружена в нескольких ретроспективных исследованиях между тромбо¬
зом и положительными результатами всех тестов (АКЛА, антитела к Рз'Г'П 1 и
ВА) по сравнению с больными, которые оказались положительными в отношении
одного или двух тестов. Кроме того, имеются наблюдения, что пациенты с поло¬
жительными результатами нескольких тестов сохраняют повышенные значения
при повторных исследованиях, что повышает вероятность у них диагноза АФС.
Проблема современной лабораторной диагностики заключается в том, что не все
тесты в равной степени стандартизованы и чувствительны, недостаточно и каче¬
ство межлабораторных и внутрилабораторных стандартов. Назначение антикоа¬
гулянтов препятствует обследованию пациентов. Так, АЧТВ нельзя использовать
для скрининга ВА, если больной получает антикоагулянты по поводу имеющегося
тромбоза.Для иммунологического подтверждения АФС требуется в каждом случае про¬
ведение более одного теста, уровень антител должен был высоким, эти значения
должны сохраняться при повторном исследовании через 12 нед. Однако имеются
исключения. Так, при привычном невынашивании беременности с прогностиче¬
ской целью достаточно определения антител к кардиолипину. Важно, что, согласно
существующим критериям диагностики АФС, для подтверждения этого аутоим¬
мунного заболевания требуется обязательное сочетание хотя бы одного иммуно¬
логического и одного клинического признака.Обнаружение антител к фосфолипидам и развитие вторичного АФС — срав¬
нительно частое явление у больных СКВ. До 50% больных с волчанкой в стадии
обострения имеют повышенное содержание АФА в крови. Высокие титры АФА
обнаруживают у 20% больных СКВ, их присутствие сопровождается клиниче¬
скими проявлениями АФС: повышенной частотой тромботических осложнений,
значительным риском развития неврологических проявлений заболевания, син¬
дрома Рейно и сетчатого ливедо. У больных СКВ, имеющих положительный ВА
и АКЛА, наблюдают высокую частоту выкидышей, венозных и артериальных
тромбозов, тромбоцитопении и анемии, легочной гипертензии и эндокардита
Либмана-Сакса, сетчатого ливедо с или без кожных изъязвлений. Высокие титры
АФА служат основой включения больного СКВ в группу риска по развитию тром¬
ботических осложнений.В подавляющем числе случаев серологические маркеры АФС обнаруживают
при СКВ, они относятся к случаям вторичного АФС при системных заболеваниях.
Распространенность первичного АФС в популяции до настоящего времени не уточ¬
нена и должна бьггь скорректирована в связи с неспецифичностью обнаружения
АФА. У некоторой части пациентов формирование АФС может предшествовать
появлению признаков первичного соединительнотканного заболевания, как СКВ,
так и склеродермии, смешанного соединительнотканного заболевания, РА, Нужно
включать определение АНФ в качестве обязательного серологического теста при
обследовании пациентов с предполагаемым АФС. Частота поражения органа зре¬
ния при соединетельнотканных заболеваниях требует включить в обследование на
АФА для исключения данного синдрома больных с внезапными тромботическими
поражениями сосудов глаз. Однако даже позитивные результаты выявления АФА
154 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙтребуют исключения других причин тромбоза, особенно в случае наличия других
факторов риска, в том числе курения, гиперлипидемии, атеросклероза, варикозной
болезни, приема пероральных контрацептивов.Диагностика ревматоидного артритаРА представляет собой наиболее часто встречающееся воспалительное заболе¬
вание суставов. В североевропейской популяции его встречаемость достигает более
1%. РА представляет системное аутоиммунное заболевание, основным признаком
которого является воспаление синовиальных оболочек суставов, характеризуется
неумолимым прогрессирующим течением, хотя периоды ярких клинических про¬
явлений чередуются с периодами относительного улучшения. Последствиями РА
является деградация суставного хряща с последующей эрозией кости, приводящие
к значительному разрушению сустава с потерей его функции. Помимо клинической
картины деформирующего артрита, у 20% больных отмечают внесуставные прояв¬
ления заболевания. Диагноз РА устанавливают на основании клинических данных,
иммунологические тесты включены в качестве одного из 7 пунктов классификаци¬
онных критериев РА Американского колледжа ревматологов (табл. 17-25).Таблица 17-25. Классификационные критерии ревматоидного артрита 1988 г.Утренняя скованностьАктивный артрит более 3 суставов на момент обследования	Артрит суставов кисти	Симметричное поражение суставов	Ревматоидные узелки	Наличие ревматоидного фактора в сывороткеРентгенологические признаки периартикулярных поражений кости	Классификация основывается на 7 критериях. Для постановки диагноза РА требуется 4 из 7 пере¬
численных критериев. Критерии 1-4 должны персистировать не менее 6 мес.Иммунологическое обследование особенно актуально на ранних стадиях болез¬
ни, когда оно является единственным доступным методом объективизации кли¬
нических предположений. Часто нетипичная клиническая картина в начале
заболевания, например олигоартрит и отсутствие костных эрозий, несмотря на
длительность жалоб пациента, а также тот факт, что применение активной терапии
в дебюте заболевания может замедлить быстрое развитие деформаций суставов,
делает лабораторные тесты чрезвычайно ценным инструментом дифференциаль¬
ной диагностики. Корректный диагноз РА, поставленный на раннем этапе, служит
основой эффективной иммуносупрессивной терапий.Дешевизна и доступность определения РФ по-прежнему делают его первым
серологическим тестом в обследовании пациентов с заболеваниями суставов.
Определение РФ в клинических лабораториях основано на использовании методов
латексагглютинации и турбидиметрии. Хотя турбидиметрия представляет собой
более чувствительный метод, однако ее сравнительно высокая чувствительность
снижает специфичность обследования. Целесообразно использовать в качестве
скрининга латексный метод определения РФ, что значительно удешевляет обсле¬
дование больных. При этом чувствительность латексного теста должна составлять
не более 20-25 МЕ/мл. Положительные результаты латексных тестов необходимо
подтвердить количественными турбидиметрическими методами.Отсутствие РФ при первом обследовании не исключает диагноза серонегатив¬
ного РА, Однократного определения РФ на ранней стадии РА, принесшего отри¬
цательный результат, недостаточно для того, чтобы исключить ранний РА. Если
диагноз РА подозревают или он даже клинически подтвержден при отрицательном
результате теста по определению РФ, требуется повторное определение его титра
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 155через 12 мес для определения серопозитивной формы этого заболевания. Этот
срок приблизительно соответствует времени обновления пула плазматических
клеток, способных синтезировать аутоантитела. Если же будет получен положи¬
тельный результат, то нет реальных предпосылок повторять определение РФ с
течением времени.Благодаря высокой специфичности наи лучшими параметрами для ранней диа¬
гностики обладают АЦЦП, так как их выявление имеет высокий фактор риска,
т.е. обнаружение повышает вероятность заболевания в 13 раз. В то же время мак-
симальной чувствительностью обладают АМЦВ, поэтому они могут быть реко¬
мендованы для скрининга РА и исключения диагноза при неясной клинической
картине.Хотя данные о применении ДАЗЗ в прогнозировании мягкого течения РА тре¬
буют дальнейшего подтверждения, антитела к RA33 могут быть использованы
для диагностики серонегативного РА. Совместное использование антител RA33 и
АМЦВ при серонегативном РА позволяет добиться чувствительности 81%.Для оценки прогноза используют определение АКА, которые «предсказывают»
развитие деструктивного процесса в суставах. Пациенты с высокими титрами АКА
требуют более активной иммуносупрессивной терапии. Среди других методов
оценки прогноза РА — исследование РФ класса IgA методом ИФА. Большое время
полужизни сывороточного иммуноглобулина, а также постоянство иммунных
ответов не позволяет использовать серологические маркеры для мониторинга
течения заболевания.ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ИСХОДОВ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТАИсходом РА является прогрессирующее снижение функциональной способ¬
ности суставов, инвалидизация и сопутствующее снижение продолжительности
жизни пациентов. Средняя продолжительность жизни больных РА, не получавших
эффективного лечения, значительно меньше средней продолжительности жизни в
сопоставимой популяции. В то же время агрессивность и скорость прогрессирова¬
ния РА широко варьируют. Общепризнано, что это заболевание весьма гетероген¬
но - оно может протекать щадяще, в течение десятилетий не приводя к значимым
деструкциям, у одних больных, в то время как у других анкилоз суставов и инвали-
дизирующие деструкции развиваются за несколько первых лет заболевания.На утрату функции сустава влияет степень местного воспаления и возникно¬
вение признаков деструкции суставов. Персистирующее воспаление в суставной
полости является основной причиной развития костных изменений. Важным
прогностическим фактором считают раннее назначение базисной терапии, пода¬
вляющей специфические иммунные ответы и местное воспаление в суставах, а
также препятствующее формированию органических изменений. Характерно, что
с течением времени лабораторная и клиническая активность заболевания снижа¬
ются у большинства больных, в то время как выраженность костных изменений в
суставах нарастает.Причина такой гетерогенности определяется генетическими факторами и
связана с определенным набором генов иммунной системы. Среди больных с РА
отмечается высокая частота встречаемости гомозигот по HLA-DR4 и DRl-аллелям
МНС, особенно В1*0401. Было обнаружено, что в генах HLA, ассоциированных с
развитием РА, присутствует определенная последовательность аминокислот, так
называмый общий эпитоп {shared epitope), которая входит в вариабельную петлю3	(VR3) р-цепи HLA П, Определение этого эпитопа может быть использовано в
диагностике РА. Появление специфических аутоантител при РА определяется осо¬
бенностями иммунной системы пациента и тесно связано с HLA-генотипом боль¬
ного. Имеется тесная взаимосвязь между встречаемостью аллелей HLA-DR (DR4)
и выявлением РФ, АЦЦП и антифилаггриновых антител. Аллель HLA-DRB104*01
156 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙобладает высокой аффинностью к цитруллинированным эпитопам филаггрина,
что указывает на тесную связь между генотипом МНС и образованием АФА.В то же время патогенетическая роль аутоантител при РА остается спорной.
Существование серонегативных форм заболевания, значительные вариации в
содержании аутоантител у больных не позволяют сделать однозначного заключе¬
ния об их значении в поражении суставов. Тем не менее гуморальный иммунитет
тесно связан с патогенезом РА, аутоантитела отражают определенные особенности
патогенеза заболевания. Одним из наиболее «элегантных*^ доказательств важ¬
ности гуморального иммунитета в патогенезе РА стал успешный опыт лечения
больных РА с помощью ритуксимаба (МАБТЕРА) — терапевтического гумани-
зованного антитела, направленного против СВ^-маркера В-клеток. Элиминация
В-клеток вызывает клинико-лабораторную ремиссию у 60% больных РА. Кроме
того, наблюдалось снижение уровней аутоантител (РФ и АФА) в сыворотке крови,
что тесно коррелировало с динамикой и активностью заболевания, и рецидив
заболевания сопровождался увеличением титров сывороточных аутоантител.Этот факт указывает на важность определения сывороточных концентраций
аутоантител для оценки клинических и иммунопатогенетических особенностей
заболевания. Наличие аутоантител при РА может отражать специфическую
реактивность иммунной системы, серологический статус больного может опреде¬
лять особенности заболевания и указывать на его исход. Это делает возможным
использование аутоантител для выделения группы больных с неблагоприятным
прогнозом.Общепризнано, что серопозитивный по РФ РА характеризуется более тяжелым
поражением суставов и чаще сопровождается экстрасуставными проявлениями по
сравнению с серонегативным РА. Обнаружение РФ при РА в концентрации более
40 Ш/мл в дебюте заболевания — один из факторов неблагоприятного прогноза
РА, связанный с более ранним развитием суставных деструкций и инвалидизацией
пациента, в то время как у серонегативных больных заболевание протекает более
легко. Ревматоидные узелки и другие проявления васкулита отмечают исключи¬
тельно у серопозитивных пациентов. Более того, инвалидизация и смертность от
РА выше именно в группе серопозитивных больных. Все же частая встречаемость
деструктивного полиартрита у пациентов без РФ указывает на недостатки исполь¬
зования РФ в качестве единственного маркера тяжести течения РА.АЦЦП, по-видимому, присущи основные характеристики антифилаггриновых
антител: они обнаруживаются на ранних стадиях РА и в целом более типичны для
подгруппы больных с быстрым рентгенологическим прогрессированием. АЦЦП
позволяют предсказать развитие деструкций приблизительно у 2/3 пациентов с
деструктивным процессом и в сочетании с РФ представляют важный инструмент
для распознавания больных РА с неблагоприятным прогнозом заболевания уже на
этапе постановки диагноза.Другим важным фактором является раннее назначение базисной терапии,
получившее название «перевернутой терапевтической пирамиды», при которой
более активные препараты назначают раньше. Время начала базисной терапии
от момента возникновения симптомов заболевания является одним из основных
факторов, влияющих на дальнейшее формирование деструкций суставов. Ранняя
«агрессивная» терапия невозможна без достоверной диагностики РА. Базисные
препараты небезопасны, их назначение связано с большим числом побочных
эффектов. В то же время традиционно используемые критерии РА Американского
колледжа ревматологов недостаточно чувствительны для диагностики раннего РА.
Высокая встречаемость и прогностическое значение АЦЦП позволили включить
их в разрабатываемые критерии раннего РА. Применение этих критериев позволя¬
ет как поставить диагноз РА, так и установить прогноз развития деструкций суста¬
вов, причем антитела к циклическому цитруллин-содержащему пептиду обладают
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 157наибольшим удельным весом для диагностики эрозивного артрита. Таким обра¬
зом, серологические тесты — одна из основных возможностей объективизации
диагноза, они могут служить основой для раннего назначения высокоэффектив¬
ной базисной терапии.Другие формы воспалительных артритовЮвенильный ревматоидный артрит (ЮРА) представляет отдельную группу
ревматических заболеваний. Основными маркерами ЮРА, особенно поли- и оли-
гоартикулярной формы, служат РФ и АНФ. Серопозитивная по РФ полиартрити-
ческая форма ЮРА наиболее близко напоминает РА взрослых. При полиартрити-
ческой форме ЮРА диагностические титры АНФ отмечают у 25% больных.При олигоартикулярной форме ЮРА, особенно при раннем начале заболевания,
АНФ встречается гораздо чаще, и его встречаемость достигает 70-80%. Эта форма
заболевания возникает преимущественно у младенцев женского пола и сопро¬
вождается артритом и высоким риском развития аутоиммунного иридоциклита.
Определение АНФ может быть использовано при дифференциальной диагностике
гематогенного остеомиелита и олигоартикулярной формы ЮРА. Если увеличение
сывороточных уровней острофазовых маркеров С-реактивного белка в сочетании
с выраженной лихорадкой свидетельствует, скорее, о септическом поражении
сустава у детей, то затяжное течение артрита с низким острофазовым ответом
является показанием к определению АНФ. Наряду с АНФ и РФ при подозрении на
ЮРА необходимо определять иммуноглобулины сыворотки, поскольку гипергам-
маглобулинемия является независимым маркером ЮРА.Спондилоартропатии представляют группу заболеваний, характеризующуюся
поражением суставов осевого скелета. Совокупная встречаемость этих заболева¬
ний в популяции составляет около 2%, что позволяет отнести их к одним из наи¬
более часто встречающихся ревматических заболеваний. Спондилоартропатии у
детей и взрослых требуют иммуногенетического обследования для обнаружения
антигена НЬА-В27. Наиболее тесно ассоциированы с НЬА-В27 анкилозирующий
спондилит (95%), синдром Рейтера (80%) и недифференцированные спондилоар¬
тропатии (70%). При артритах на фоне воспалительных заболеваний кишечника,
псориатическом артрите и реактивном артрите встречаемость Н1А-В27 не превы¬
шает 30%.Большинство спондилоартропатий возникает на фоне воспалительного пора¬
жения слизистой оболочки и кожных покровов, что ведет к увеличению объемов
антигенного материала, поступающего из внешней среды. В основе иммунопато¬
генеза всех состояний лежит нарушение иммунологической толерантности при
презентации антигенов, опосредованной Н1А-В27. Присутствие генетической
предрасположенности к заболеванию приводит к возникновению аутоиммунного
артрита даже тогда, когда индуцирующий фактор уже перестал действовать.Аутоиммунные васкулитыПод аутоиммунными васкулитами понимают заболевания, связанные с некро-
тизирующим воспалительным поражением сосудистой стенки без инфекционной
или токсической причины. Васкулиты подразделяют на первичные и вторичные,
которые возникают на фоне другого аутоиммунного заболевания. Хотя существует
ряд удобных клинических классификаций васкулитов, общепринятой является
международная классификация первичных васкулитов, разработанная в Чапелл-
Хилл в 1994 г. Эта классификация дала определение 10 формам первичных
васкулитов и подразделила их в соответствии с калибром поражаемых сосудов
(см. табл. 17-13).
158 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙОднако, помимо морфологического значения, данная классификация предо¬
ставляет ключ к диагностике этих заболеваний с помощью иммунологических
тестов (рис. 17-1). До недавнего времени отсутствие других диагностических
подходов, кроме клинических и морфологических, в значительной мере затруд¬
няло их выявление. Это нередко приводило к диагностическим ошибкам в связи
с полиморфной клинической картиной и сходством симптоматики с системными
заболеваниями соединительной ткани и другими неревматическими заболева¬
ниями. Проведение иммунологического обследования на раннем этапе позволяет
сократить время постановки окончательного диагноза и избавить от анализа зача¬
стую неоднозначных клинических данных.Рис. 17-1. Алгоритм использования иммунологических тестов в диагностике системных ваСКУ'
литов.Абсолютно специфических серологических маркеров при этих заболевани¬
ях не описано. Патогенез васкулитов крупных и средних сосудов опосредован
преимущественно Т-клетками. Антиэндотелиальные антитела с различной часто¬
той встречаются при аортоартериите Такаясу и болезни Кавасаки, а также при
ряде васкулопатий, таких как гемолитико-уремический синдром, тромботическая
тромбоцитопеническая пурпура, болезнь Бехчета. Васкулиты крупных сосудов
сопровождаются выраженным воспалительным ответом, установление которого
представляет основу лабораторных методов их диагностики, наряду с морфоло¬
гическим и инструментальным обследованием. Васкулиты сосудов среднего кали¬
бра, прежде всего узелковый полиангиит, являются инфекционно-зависимыми и
не сопровождаются образованием специфических аутоантител. В соответствии с
иммунопатогенезом васкулиты мелких сосудов могут быть подразделены на грану¬
лематозные и иммунокомплексные.Гранулематозные васкулиты мелких сосудов, включающие синдром Вегенера,
микроскопический полиангиит, синдром Черджа-Стросс, имеют ряд общих черт, к
которым относят поражение почек по типу олигоиммунного экстракапиллярного
гломерулонефрита с полулуниями, полиневрит и легочный капиллярит. Основным
методом серологической диагностики гранулематозных васкулитов служит обна¬
ружение АНЦА. Антитела этого семейства реагируют с белками азурофильных
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ159гранул нейтрофильных гранулоцитов. Значение АНЦА в патогенезе и диагностике
гранулематозных васкулитов позволило вьщелить отдельную группу, обобщенную
под названием «АНЦА-ассоциированные васкулиты». К ним относят гранулема¬
тоз Вегенера, синдром Черджа-Стросс. микроскопический полиартериит, быстро-
прогрессирующий гломерулонефрит с полулуниями. К этой группе заболеваний
иногда причисляют синдром Гудпасчера, поскольку АНЦА могут отмечаться у
10-15% пациентов с этим заболеванием совместно с антителами к базальной
мембране клубочка, определение которых — основной лабораторный метод его
диагностики. Хотя синдром Гудпасчера не является системным васкулитом, он
характеризуется геморрагическим альвеолитом и быстропрогрессирующим гломе¬
рулонефритом, который сложно отличить от АНЦА-ассоциированного поражения
почек. В связи с этим обнаружение АНЦА и антител к базальной мембране почек
обычно используют совместно.Иммунокомплексные васкулиты обусловлены образованием иммунных ком¬
плексов между аутоантителами и их антигенами в крови и сосудистой стенке.
Иммунные комплексы, которые можно обнаружить в сыворотке крови, называют
ЦИК. Предполагается, что снижение растворимости ЦИК приводит к их отложе¬
нию в сосудистой стенке и развитию воспаления. Снижение растворимости при
замедлении скорости кровотока и температуры приводит к тому, что иммунными
комплексами поражаются преимущественно капилляры, прежде всего капилляры
кожи. Криоглобулинемический васкулит сопровождается выходом в кровь особой
разновидности ЦИК, которая требует специальных методических подходов для их
обнаружения.Отдельно выделяют методы, позволяющие обнаружить отложения иммунных
комплексов и комплемента непосредственно в пораженной ткани. Определение
отложений иммунных комплексов позволяет объективизировать иммуноком¬
плексный процесс и обладает большей достоверностью по сравнению с методами
выявления ЦИК.-ЧтШ
	іftІЩршшФжЫВаскулиты крупных сосудовВ основе патогенеза васкулитов крупных сосудов, к которым относят аортоар-
териит Такаясу и височный артериит, а также ревматическую полимиалгию, лежит
поражение сосудистой стенки, что обусловливает большую площадь вовлеченно¬
го эндотелия. Синтез эндотелием провоспалительных цитокинов, прежде всего
TNF-a и IL-6, приводит к формированию выраженного острофазового ответа,
исследование которого используют в диагностике васкулитов крупных сосудов.
Так, при аортоартериите Такаясу, височном артериите и ревматической полими¬
алгии отмечают чрезвычайно высокие уровни С-реактивного белка и значительно
повышенные значения СОЭ.Диагноз ревматической полимиалгии и гигантоклеточного артериита
ставят на основе обнаружения значительно повышенной СОЭ (до 100 мм/ч)
при использовании метода Вестергрена и увеличения С-реактивного белка более
40 мг/мл. При височном артериите и ревматической полимиалгии только у 1%
больных, не получавших специфической терапии, СОЭ и С-реактивный белок
находятся в пределах нормы. СОЭ больше 30 мм/ч имеет место у 95% больных в
активную фазу этих заболеваний и у 20% больных вне активности заболевания.
На фоне иммуносупрессивной терапии уменьшение значений острофазовых реак¬
тантов происходит с различной скоростью, К примеру, при лечении височного
артериита кортикостероидными гормонами уровни фибриногена и С-реактивного
белка снижаются быстрее всего, у 70% больных они достигают нормальных зна¬
чений в течение 2 нед от начала терапии. Изменение СОЭ происходит значительно
медленнее, у половины больных этот показатель нормализуется через 2 нед после
160 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙначала лечения. Нормальные значения СОЭ наблюдают через 5 нед у 75% боль¬
ных, Скорость снижения СОЭ наиболее точно соответствует снижению активностивисочного артериита и ревматической полимиалгии, что позволяет использоватьзначения СОЭ для мониторинга активности заболевания и контроля терапии.Узелковый полиартериит - редкая форма системных васкулитов. Он может
развиться в течение 1 года после перенесенного вирусного гепатита В. Обычно
происходит самоизлечивание, рецидивирует заболевание крайне редко. Несмотря
на то что морфологически узелковый полиартериит проявляется гранулематозным
воспалением, сходным с гранулемами при микроскопическом полиангиите, АНЦА
и другие специфические серологические маркеры при классическом узелковом
полиартериите отсутствуют. Обычно его обострение сопровождается гипокомпле¬
ментемией, а также увеличением концентраций острофазовых белков. В сыворот¬
ке крови пациентов обычно обнаруживают признаки текущей ВГВ-инфекции в
виде HBsAg и HBeAg.Болезнь Кавасаки поражает преимущественно детей до 10 лет. Клинические
симптомы включают лихорадку, лимфаденопатию, кожную сыпь, характерное
покраснение языка и слизистой оболочки рта, а также васкулит, поражающий
коронарные артерии. Большая часть случаев болезни Кавасаки возникает спора¬
дически, однако описаны вспышки этого заболевания, которые указывают на ее
инфекционный характер. Антиэндотелиальные антитела при этом заболевании
отмечаются сравнительно часто и коррелируют с его активностью.Гранулематозные васкулиты и быстропрогрессирующий
гломерулонефритГранулематозные васкулиты - группа заболеваний, морфологическая карти¬
на которых представлена образованием тканевых гранулем, ассоциированных
с мелкими сосудами, а также поражением клубочка в виде некротизирующего
олигоиммунного гломерулонефрита с полулуниями. Тесная взаимосвязь между
обнаружением АНЦА и основными формами гранулематозных васкулитов и
значение АНЦА в их патогенезе позволили обобщить их в виде группы АНЦА-
ассоциированных васкулитов.Цитоплазматический тип свечения АНЦА, обусловленный образованием
антител к протеиназе-3, является чувствительным и специфичным маркером
гранулематозного васкулита (ГВ), тяжелого заболевания, проявляющегося триа¬
дой с гранулематозным поражением носоглотки, дыхательных путей, легких и
почек. Высокие титры антител к ПР-З/цАНЦА встречаются у 95% больных с
развернутой картиной активного ГВ с поражением почек, в то время как лока¬
лизованные формы ГВ, поражающие верхние дыхательные пути, реже сопрово¬
ждаются аутоантителами. Встречаемость АНЦА при локализованных формах ГВ
не превышает 50-60%. Несмотря на высокую специфичность выявления АНЦА
при ГВ, цАНЦА могут встречаться при паранеопластическом и лекарственном
васкулите.Титры цАНЦА при ГВ являются клинически значимыми и коррелируют с актив*
ностью заболевания. Высокий титр служит основанием для патогенетической
иммуносупрессивной терапии. Титр антител увеличивается в среднем за месяц до
начала очередного обострения заболевания. У больных в фазе ремиссии титры
антител очень низки или вообще не определяются. Ежемесячный мониторинг
содержания цАНЦА может быть использован для предсказания рецидива забо¬
левания, и патогенетическая терапия может предупредить развитие заболевания.
Показано, что терапия, проводимая на основании мониторинга цАНЦА, способна
эффективно предотвращать возникновение рецидивов ГВ.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 101Снижение титра аугоантител может занять до полугода, С-реактивный белок
лучше отражает уменьшение активности аутоиммунного воспаления на фоне
эффективной терапии. У пациентов с ГВ, у которых сохраняются высокие титры
АНЦА, несмотря на проводимую иммуносупрессивную терапию, высок риск
повторного обострения заболевания.Преобладаюш;ей формой васкулитов у больных с пАНЦА/анти-МПО считают
микроскопический полиангиит. По гистологической картине микроскопический
полиангиит сходен с узелковым полиартериитом, но не сопровождается образова¬
нием гранулем и поражает сосуды мелкого калибра. Клинически он характеризу¬
ется сочетанным поражением легких и почек, представленным легочным капи л-
ляритом и экстракапиллярным гломерулонефритом с полулуниями. Кроме того,
приблизительно у 1/3 больных с антителами к МПО отмечается изолированный
олигоиммунный гломерулонефрит с полулуниями, который не сопровождается
внепочечными проявлениями.Как и в случае ГВ, титр пАНЦА/анти-МПО максимален во время активно про¬
текающего гломерулонефрита. Затихание процесса или подавление активности
васкулита при эффективной цитостатической терапии приводит к элиминации
антител у 95% больных, причем у 75% больных сероконверсия происходит в тече¬
ние ближайших 6 мес после достижения клинической ремиссии процесса.другая клиническая форма гранулематозных васкулитов, которая сопровожда¬
ется пАНЦА/анти-МПО, - это синдром Черджа-Стросс. Клиническая симптома¬
тика этого заболевания представлена легочным васкулитом с эозинофильными
инфильтратами, астмой и гиперэозинофилией. Антитела к МПО выявляют у 75%
больных. Помимо АНЦА, при этом заболевании часто обнаруживают антиэндо¬
телиальные антитела и повышенные уровни эозинофильных катионных белков
(ЕСР) в сыворотке крови.Изолированный быстропрогрессирующий васкулит без признаков внепочеч-
ной патологии представляет отдельное заболевание в структуре гранулематозных
васкулитов. Его следует дифференцировать от гломерулонефрита при синдроме
Гудпасчера, при котором отсутствует образование гранулем.Морфологически эти две формы полулунного гломерулонефрита очень схожи,
однако при синдроме Гудпасчера присутствуют линейные отложения IgG по
базальной мембране почек, которые соответствуют отложениям антител к базаль¬
ной мембране клубочка. При АНЦА-ассоциированном гломерулонефрите, напро¬
тив, отложений иммуноглобулинов в клубочке не наблюдается, поэтому его назы¬
вают олигоиммунным. АНЦА обнаруживают приблизительно у 75% пациентов с
изолированным быстропрогрессирующим гломерулонефритом и у 15% больных
также отмечают антитела к базальной мембране клубочков.Как пАНЦА/МПО, так и цАНЦА/ПР-3 встречаются при быстропрогресси¬
рующем гломерулонефрите с приблизительно одинаковой частотой. У небольшой
категории больных с олигоиммунным гломерулонефритом с полулуниями антител
к МПО и ПР-3 не обнаруживают, однако могут встречаться антитела к нейтро¬
фильной эластазе.Основным показанием для определения АНЦА в ревматологической и нефро-
логической практике принято считать подозрение на системный гранулематозный
васкулит. Совокупная частота обнаружения основных разновидностей АНЦА при
васкулитах представлена в табл. 17-26,т
162 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙТаблица 17-26. Частота обнаружения антинейтрофильных цитоплазматических антител при гра¬
нулематозных васкулитахЗаболеваниеВстречаемость цАНЦА/
аити-ПРЗ, °/йВстречаемость пАНЦА/
анти-МПО, %Идиопатический гломерулонефрит с полулуниями5050Микроскопический полиангиит1070Г ранулематоз Вегенера9010Синдром Черджа-Стросс1075Классический узелковый полиартериит515Синдром Гудпасчеран.Д.10Очевидно, что не существует абсолютной специфичности того или иного типа
АНЦА при конкретных формах васкулитов. Замечено, что изолированные формы
быстро прогрессирующего гломерулонефрита, сопровождающегося антителами
к ПР-3, в целом протекают более агрессивно. В частности, наблюдается более
быстрое снижение функции почек, чаще диагностируют экстраренальные прояв¬
ления васкулита, в том числе образование тканевых гранулем. Также чаще отмеча¬
ют обострения заболевания.Показания к обследованию на АНЦА представлены в табл. 17-27.Таблица 17-27. Диагностический алгоритм по применению определения антинейтрофильных
цитоплазматических антител в клинической практикеИмиунофлюоресцентный тест для определения АНЦА необходимо выполнять при следующих состояниях•	Наличие видимых признаков васкулита — пурпуры, некрозы кончиков пальцев и т.д.	•	Наличие более или менее типичных признаков синдрома Вегенера, Черджа-Стросс и других АИЗ, сопро-
вождающихся образованием АНЦА	•	Быстропрогрессирующий гломерулонефрит (совместно с антителами к базальной мембране клубочка)•	Признаки воспалительной реакции (лихорадка, миалгии, увеличение СОЭ ипи появление С-реактивногобелка) без видимой причины или покализации воспалитепьного процесса	После получения положительного ответа в методе непрямой иммунофлюоресценции должен
быть выполнен иммуноферментный тест для установления конкретной специфичности АНЦА.
Целесообразно одновременное исследование на АНФ и АНЦА, в случае высоких титров АНФ
нужно проводить диффереіщиальную диагностику ДБСТ.Развернутое серологическое обследование пациентов должно включать опреде¬
ление АНЦА, АНФ, а также антител к базальной мембране клубочка. При обнару¬
жении АНЦА во флюоресцентном тесте необходимо выполнить подтверждающие
тесты, включающие обнаружение антител к МПО и ПР-3. Обследование на АНФ
позволяет избежать получения ложноположительных результатов пАНЦА, а
также исключить наличие системного ревматического заболевания. Определение
антител к БМК у больного с быстропрогрессирующим гломерулонефритом с изме¬
нениями на рентгенограмме легких или гемофтизе позволяет поставить диагноз в
пользу синдрома гудпасчера и назначить патогенетическую терапию.Существует два возрастных пика развития быстропрогрессирующего гломе¬
рулонефрита, на 3-й и 7-й декаде. Синдром Гудпасчера с одинаковой частотой
поражает женщин и мужчин, однако поражения легких чаще отмечают у мужчин.
Среди больных с синдромом Гудпасчера 10-15% пациентов имеют пАНЦА.Выявление аутоантител во многом определяет как терапевтическую тактику
ведения пациентов с быстропрогрессирующим гломерулонефритом, так и общий
прогноз заболевания. Худший прогноз относительно сохранности функции почек
имеет место при обнаружении АНЦА к ПР-3, сравнительно лучший — при обна¬
ружении антител к МПО.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 163Поскольку все гранулематозные васкулиты протекают с продромальным перио¬
дом, который длится от нескольких месяцев до одного года, диагностика АНЦА,
АНФ и антител к БМК должна входить в число лабораторных тестов для диффе¬
ренциальной диагностики лихорадок неясного генеза. На продромальном этапе в
клинической картине гранулематозных васкулитов лидирует полиневрит, который
обнаруживают у 70-80% пациентов. Быстрое развитие почечной недостаточности
и кровохарканье составляют основу клинической картины при обострении систем¬
ных васкулитов и синдроме Гудпасчера. Часто клиническая симптоматика может
развиваться более смазанно, включая появление легочных инфильтратов, гемату¬
рии, анемии и одышки. У пожилых пациентов отмечают плавное нарастание уре¬
мии. У больных с почечно-легочными синдромами необходимо проводить диф¬
ференциальную диагностику с другими формами вторичных гломерулонефритов,
таких как постстрептококковый гломерулонефрит, пурпура Шенлейна-Геноха,
СКВ и смешанная криоглобулинемия.Возможно использование быстрых тестов для обнаружения антител к БМК,
МПО и ПР-3 методом лайн-блота. Ряд хроматографических тестов позволяет
получить результат в течение 15 мин непосредственно у постели больного. Эти
тесты предназначены только для исключения заболевания в сомнительных
случаях. Недостаточные показатели их специфичности и чувствительности тре¬
буют использования независимого развернутого лабораторного тестирования.
Целесообразность их использования определяется важностью раннего нача¬
ла терапии, так как в отсутствие лечения системных васкулитов и синдрома
Гудпасчера смертность превышает 75%. В случае развития олигурии почечная
функция восстанавливается редко, даже несмотря на эффективную иммуносу¬
прессивную терапию. Быстрая диагностика синдрома Гудпасчера позволяет рано
назначить плазмаферез, который является основой лечения этого заболевания.
Если удалось добиться ремиссии синдрома Гудпасчера и исчезновения антител к
базальной мембране клубочка, то заболевание редко рецидивирует. Среди паци¬
ентов с легочно-почечным синдромом менее чем в 20% случаев обнаруживают
антитела к базальной мембране клубочка, у большинства определяют антитела к
МПО и ПР-3.ИММУНОКОМПЛЕКСНЫЕ ВАСКУЛИТЫИммунокомплексные васкулиты поражают ткани с наибольшим капиллярным
руслом, прежде всего капилляры кожи. При патоморфологическом исследовании
при иммунокомплексных васкулитах имеет место выраженная лейкоцитарная
инфильтрация дермы, что обычно описывается морфологами как лейкоцитокла¬
стический васкулит. Наиболее часто лейкоцитокластический васкулит характери¬
зуется геморрагической пурпурой, разрешающейся с образованием характерной
пигментации кожи, которая позволяет отличить ее от других разновидностей кож¬
ных высыпаний. Другой формой иммунокомплексных кожных высыпаний явля¬
ется панникулит, или васк5шит, протекающий в подкожной жировой клетчатке.
Эта форма проявляется узловатой эритемой, ревматическими узелками, узелками
Рандю-Ослера, Габердена.Первичные иммунокомплексные васкулиты представлены тремя основными
нозологическими формами, в том числе п)’рпурой Шенлейна-Геноха, криогло-
булинемическим васкулитом и лейкоцитокластическими васкулитами. Большая
часть лейкоцитокластических васкулитов является вторичной, возникает на фоне
заболеваний, сопровождающихся поступлением в кровяное русло больших коли¬
честв экзогенного антигена. Этиологические причины лейкоцитокластических
васкулитов чрезвычайно разнообразны (табл. 17-28).
шштш	ІІШШШ164 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙТаблица 17-28. Основные причины вторичных иммунокомплексных васкулитов> Лекарственные васкулиты (пенициллины, сульфаниламиды, аллопуринол, тиазиды, ретиноиды)•	Сывороточная болезнь (сыворотки, моноклональные антитела, цитокины, стрептокиназа)	•	Хронические бактериальные инфекции (подострый септический эндокардит, бронхоэктатическая
болезнь)	•	Вирусные инфекции (ВГС, ВГВ, ВИЧ, ЦМВ)		Паранеопластические процессы при солидных опухоляхГематоонкология (миелома, лимфомы)•	Системные заболевания соединительной ткани' Аутоиммунные заболеваний (воспалительные заболевания кишечника)' Эссенциальная криоглобулинемия•	Пурпура Шенлейна-Геноха и IgA-нефропатия (болезнь Берже)Поражение микроциркуляторного русла кожи иммунокомплексными васку¬
литами обусловлено медленным кровотоком в капиллярах кожи, механической
нагрузкой и снижением температуры. Все эти факторы способны нарушать рас¬
творимость иммунных комплексов и приводят к их преципитации на стенке сосу¬
дов. Иммунокомплексные васкулиты часто поражают сосуды нервов, что ведет к
MOHO- или полиневриту. В тяжелых случаях может развиться поражение почек,
причиной которого является избыточное содержание ЦИК в крови. Классические
формы иммунокомплексного поражения почек — IgA-нефропатия при пурпуре
Шенлейна-Геноха и мезангиокапиллярный гломерулонефрит при эссенциальной
криоглобулинемии. при обследовании больших контингентов больных с острым
иммунокомплексным васкулитом было установлено, что у 40% из них отмечаются
изменения в мочевом осадке, у 30% — артралгии, у 5% — абдоминальный син¬
дром. Воспалительная симптоматика, включая лихорадку и миалгии, присутствует
только у 10% больных.Пурпура Шенлейна-Геноха поражает преимущественно детей и подростков,
однако ее признаки могут появиться в любом возрасте. Основным патогенетиче¬
ским механизмом в развитии этого заболевания служит синтез аномального IgA,
обладающего способностью к самоагрегации. В результате в мезангии клубочка и
стенках мелких сосудов почки наблюдают выраженные отложения полимерного
иммуноглобулина и комплемента. Обнаружение ЦИК при данном заболевании
неинформативно. Основной метод диагностики пурпуры Шенлейна-Геноха —
анализ биоптатов ткани с иммунофлюоресцентным исследованием, которое
позволяет обнаружить отложения иммунных комплексов. В биоптате іючки
отмечается мембранозный гломерулонефрит с мезангиальными отложениями IgA
и СЗ-компонента комплемента. Исследования биоптата кожи позволяют обнару¬
жить гранулярные отложения IgA в стенках сосудов дермы.Чаще всего выраженный лейкоцитокластический васкулит отмечается при
эссенциальной смешанной криоглобулинемии, связанной с появлением в сыворот¬
ке крови криоглобулинов 2-го типа с активностью РФ. Основная причина эссенци-
альной криоглобулинемии — гепатит С, который часто протекает субклинически.
Частота развития криоглобулинемии у больных гепатитом С составляет 10-15%.
Персистенция вируса гепатита С в клетках ретикулоэндотелиальной системы ведет
к поликлональной стимуляции иммунной системы и синтезу аутоантител. При
эссенциальной смешанной криоглобулинемии РФ практически всегда присут¬
ствует в составе криопреципитата, как правило, в высоких титрах. Это позволяет
использовать выявление РФ в качестве метода скрининга криоглобулинемии.При эссенциальной криоглобулинемии имеется поражение кожи в виде пурпу¬
ры, преимущественно локализованной на коже нижних конечностей. Классическим
клиническим признаком криоглобулинемии является триада Мельтцера, которая
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 165включает пурпуру, артралгию и слабость, к ним нередко присоединяется гломеру¬
лонефрит и периферическая невропатия. Выраженность клинических признаков не
зависит от абсолютного содержания криоглобулинов, так как даже незначительное
количество криоглобулина может приводить к характерной клинической симпто¬
матике. Динамика содержания криоглобулинов позволяет оценить эффективность
проводимой патогенетической терапии, которая включает иммуносупрессивные и
противовирусные препараты. Плазмаферез снижает количество криоглобулинов
однако не может быть использован в качестве монотерапии.В диагностике иммунокомплексных васкулитов применяют и другие иммуноло¬
гические тесты, в том числе определение содержания иммуноглобулинов сыворот¬
ки, компонентов комплемента и острофазовых реактантов. Нормальные показате¬
ли этих тестов не позволяют исключить диагноз иммунокомплексного васкулита.Наблюдение за динамикой содержания ЦИК может быть использовано при
оценке клинической активности иммунокомплексных заболеваний, поэтому долж¬
но выполняться периодически, наряду с определением СОЭ, С-реактивного белка.
При СКВ и РА содержание ЦИК достоверно коррелирует с активностью процесса
и может применяться с целью мониторинга состояния пациента. Одновременно с
содержанием ЦИК необходимо выполнять тесты, оценивающие систему компле¬
мента, такие как СН50, СЗ и С4, Потребление комплемента, наряду с увеличением
содержания ЦИК, служит признаком текущей активности иммунокомплексного
васкулита и требует принятия активных мер.Диагностика аутоиммунных поражений печениХотя аутоиммунные заболевания печени (АЗП) встречаются реже, чем вирус¬
ные гепатиты, вероятность наличия АЗП необходимо предполагать у каждого
пациента, у которого 0тс}т'ствуют серологические маркеры вирусных гепатитов
или отмечается тяжесть клинической симптоматики, которая не характерна для
обычной клинической картины вирусного гепатита. Другой причиной обследова¬
ния для обнаружения серологических маркеров АЗП является дифференциальная
диагностика с другими невирусными заболеваниями печени, в том числе с мета¬
болическими поражениями и онкологическими заболеваниями желчевыводящих
путей.Основным серологическим методом диагностики АЗП принято считать НРИФ
с использованием «тройного субстрата», который включает криосрезы печени-
почки-желудка крысы. В иностранной литературе его часто назвают LK5-субстрат,
по первым буквам английских названий органов «liver-kidney-stomach». Нередко
поставщики предлагают все три субстрата для НРИФ в одном криосрезе, что
облегчает визуализацию положительных реакций.Комбинированный метод IXS-субстрата позволяет провести в одной реак¬
ции скрининг наиболее часто встречающихся аутоантител, поэтому может быть
использован для первичного обследования больных с разными АИЗ. В случае при¬
менения этого метода в одной реакции можно выявить, включая АНФ, антитела к
гладким мышцам, антитела к митохондриям, антитела к LKM и антитела к обкла¬
дочным клеткам желудка. Другой причиной использования комбинированного
субстрата является удобство идентификации аутоантител. Действительно, анти¬
тела к митохондриям и антитела к обкладочным клеткам желудка практически
идентично реагируют со слизистой оболочкой желудка. В то же время антитела к
митохондриям реагируют с богатыми митохондриями клетками канальцев почки
и гепатоцитами, а антитела к обкладочным клеткам эти клетки не окрашивают
(табл. 17-29). Тестирование на LKS-субстрате целесообразно дополнять другими
серологическими тестами для определения аутоантител (рис. 17-2).
166 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙШФ-ЩІшйшвт-$ШгШШПодозрение на аутоиммунное заболевание печенинРИФ на LKS-субстрате
+АНФ на НЕр2 клеткахДополнительное тестирование
на редкие антигены
SLA/LP, LC1,
др210, PML, sp100Обследование на АНЦАтАИГ 1-го типаАИГ 2-г о типаАГМА, АНФ,
SLA/LP,Г IgGAMLKM, LC1.
АНФПБЦAM А М2,
АНФдр210,
PML зрЮОпсхАНЦА,АНФГастрит типа ААПКЖ, антитела
к фактору КаслаРис. 17-2. Алгоритм обследования больных с подозрением на аутоиммунное заболевание печени.Таблица 17-29. Использование криосрезов Ш-субстрататканей крысы в методе непрямой имму¬
нофлюоресценции для обнаружения аутоантител при аутоиммунных заболеваниях печениЗаболеваниеТип аутоантатепТканевой субстратжелудокпочкапеченьАЗП, СКВ или
другое АИЗАНФСвечение ядер
клетокСвечение ядер кпетокСвечение ядер клетокАутоиммунный
гепатит 1 -го
типаАнтитела к гладким
мышцам (F-актин)Свечение собствен¬
ной пластинки сли¬
зистой оболочкиСвечение стенки
сосудов и мезан гн¬
ал ьных клетокСвечение стенок
сосудов и протоков
печениАутоиммунный
гепатит 2-го
типа (детский)Антитела к микро¬
сомам печени-
почки (LKM)Нет окрашиванияСвечение цитоплаз¬
мы клеток канальцев
почкиСвечение центро-
лобулярных гепато¬
цитовПервичныйбилиарныйциррозАнтитела к мито¬
хондриям АМА-М2Свечение цитоплаз¬
мы клеток слизистой
оболочки желудкаСвечение цитоплаз¬
мы клеток канальцев
почкиСвечение 0 цитоплаз¬
ме гепатоцитовАутоиммунный
гастрит (тип А)Антитела к обкла¬
дочным клеткам
желудкаСвечение цитоплаз¬
мы кпеток слизистой
оболочки желудкаНет окрашиванияНет окрашиванияАутоиммунный гепатит (АИГ) 1-го типа — редкое заболевание с популя¬
ционной частотой около 0,01%, встречается у лиц возраста 15-40 лет, носителей
HLA-B8 и DR3, несколько чаще — у женщин. Иногда АИГ сочетается с другими
аутоиммунными заболеваниями, в том числе с НЯК, РА, вторичным «сухим син¬
дромом» и аутоиммунными полиэндокринопатиями. АИГ 1-го типа протекает с
выраженной поликлональной активацией иммунной системы, которая встречает¬
ся при ограниченном числе заболеваний, включая СКВ и СШ, Иммунологическая
диагностика основана на определении АНФ, АГМА и повышенных концентрациях
IgG сыворотки. Поскольку эти маркеры встречаются чаще всего, их выявление
называют «диагностической триадой» АИГ (табл. 17-30).
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 167Таблица 17-30. Диагностические критерии аутоиммунного гепатитаКритерийАНФ или АГМААНФ или АГМА или LKM или
SLA'IgG (турбидиметрия)IgG (турбидиметрия)Гистологий печениОтсутствие маркеров вирусных
гепатитовДиагностическая граница>1:40>1:80>1:40Выявлены в ИФА или лайн-блоте>Верхняя граница нормы ря используемой тест-системы>Превышени8 ка 1,1 верхней границы нормы для используе¬
мой тест-системыГепатит, сопоставимый с морфологией АИГТипичный АИГМаркеры отсугствуютБаллы1Сумма баллов >6 — диагноз АИГ вероятен
Сумма баллов >7 — диагноз АИГ установлен’ - при выя[влении хотя бы одного аутоантитела в титре выше диагностической границы при¬
сваивается 2 балла.Клиническая картина этого заболевания развивается постепенно, с появлением
дурноты, слабости, потери аппетита, миалгиями, желтухой и кожными высы¬
паниями. Клинические симптомы сопровождаются значительным увеличением
активности трансаминаз и высокими иммуноглобулинами сыворотки крови. В
гистологической картине АИГ 1-го типа присутствует лимфоцитарная инфильтра¬
ция портальных трактов, некрозы в центре печеночных долек. Характерно хро¬
ническое течение с частыми обострениями, которые без лечения приводят к раз¬
витию цирроза. Обычно АИГ быстро и эффективно контролируется стероидными
гормонами, поэтому при ранней диагностике имеет хороший прогноз. На фоне
адекватной иммуносупрессивной терапии титры АГМА постепенно снижаются,
однако мониторинг этого показателя не рекомендован.ПБЦ поражает женщин в 10 раз чаще, чем мужчин, причем частота забо¬
левания растет с увеличением возраста. В связи с отсутствием эффективной
терапии и быстрой прогрессией заболевания ПБЦ остается основной причиной
пересадки печени в европейских странах. У подавляющего числа больных ПБЦ
(95%) в сыворотке крови можно обнаружить АМА-М2, направленные к пируват-
декарбоксилазному комплексу. Очень небольшое количество больных ПБЦ явля¬
ются серонегативными, что делает AMA одним из наиболее надежных методов
диагностики этого заболевания. Урсодезоксихолиевая кислота (Урсофальк), кото¬
рую используют для лечения ПБЦ, несколько снижает титры AMA, АНФ опреде¬
ляют у 60-80% больных ПБЦ, причем в 1/3 случаев он обладает характерным
типом свечения «точек в ядре». Антигенами этой разновидности АНФ являются
белковые антигены splOO и PML.Первичный склерозирующий холангит (ПСХ), в отличие от ПБЦ, пора¬
жает преимущественно мужчин среднего возраста. Нередко холангит развивается
на фоне НЯК, что роднит оба заболевания. Как и при язвенном колите, при ПСХ
обнаруживают АНЦА, которые можно зафиксировать у 60-70% пациентов. Для
диагностики ПСХ может быть использовано выявление АНФ и АНЦА, которые
отмечаются у 50-60% больных.Использование метода НРИФ на тройном IíTS-субстрате позволяет также выяв¬
лять случаи аутоиммунного гастрита, который сопровождается аутоиммунными
эндокринопатиями. Обнаружение антител к фактору Кастла у больного с высоким
титром антител к париетальным клеткам желудка может указывать на высокий
риск развития В^2‘Д#ицита с характерными гематологическими и неврологиче¬
скими признаками.
168 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙСерологическая диагностика целиакииЦелиакия — иммуноопосредованная непереносимость а-глиадина — белка,
который является основным белком клейковины злаковых культур. Наряду с
дефицитом лактазы и пищевыми аллергиями целиакия является наиболее частой
причиной пищевой непереносимости. Целиакия сопровождается рядом кожных
проявлений, в том числе герпетиформным дерматитом.Высокая чувствительность ИФА тест-систем для определения антител к ТТГ
позволила значительно улучшить диагностику целиакии, особенно ее асимпто-
матичных форм. Популяционные исследования показали, что в Северной Европе0,5-1% населения имеют стертые признаки этого заболевания. Действительно, у
многих больных целиакией отсутствует типичная клиническая картина, включаю¬
щая диарею, повышенное газообразование, запор, однако большинство проблем
связано с мальабсорбцией, в том числе с железодефицитом, остеопенией, плохой
эмалью зубов и рядом других расстройств метаболизма. С повышенной частотой
целиакия отмечается у больных с эндокринными заболеваниями, такими как СД I,
аутоиммунный тиреоидит, а также при селективном IgA-дефиците и синдроме
Дауна.Для первичной диагностики целиакии рекомендуется сочетанное выявление
анти-ТТГ класса IgA, а также определение сывороточной концентрации IgA для
установления лиц с IgA-дефицитом. В связи с большей специфичностью АЭА
после положительного результата анти-ТТГ IgA теста целесообразно определение
АЭА. Положительный результат обоих тестов почти со 100% вероятностью ука¬
зывает на целиакию. В случае отрицательного АЭА-теста результат рассматривают
как сомнительный, и может быть рекомендовано определение генотипа HLA-
DQ2/8. Определение антител к ТТГ класса IgG целесообразно только у больных с
IgA-дефицитом, так как у лиц с нормальным уровнем IgA в крови результаты этого
теста малоспецифичны. У большинства лиц с предрасположенностью к целиакии,
не ограниченных в потреблении глиадин-содержащих продуктов, появление анти¬
тел к ТТГ происходит в возрасте 4-5 лет.Антитела к глиадину IgA/G остаются тестом резерва, поскольку обладают боль¬
шим числом ложноположительных результатов. Одним из вариантов их клиниче¬
ского использования может бьггь диагностика целиакии в возрасте моложе 5 лет,
до образования антител к ТТГ и АЭА.После серологической оценки у серопозитивных пациентов необходимо выпол¬
нение биопсии тонкого кишечника. У небольшого числа лиц с анти-ТТГ и АЭА
признаки хронического воспаления могз^т отсутствовать, что служит основанием
для диагностики у них «скрытой целиакии» и долгосрочного мониторинга. У
большинства серопозитивных людей аутоантитела могут быть обнаружены за
несколько лет до развития клинической симптоматики.Безглютеновая диета остается основным методом лечения целиакии. Ее соблю¬
дение в течение года приводит как к исчезновению симптоматики, так и к выра¬
женному снижению титров аутоантител.Контроль диетотерапии несколько удобнее проводить с помощью аТТГ,
поскольку тесты имеют количественный результат. Целесообразность определе¬
ния антител класса IgG диктуется высокой частотой встречаемости целиакии у
лиц с селективным дефицитом продукции IgA. в этой группе (1:400-1:1000 попу¬
ляции) снижена или отсутствует продукция IgA, поэтому необходимо определение
антител других классов.Герпетиформный дерматит представляет собой заболевание, часто возникаю¬
щее на фоне целиакии. Его ведущим симптомом являются зудяшзие везикулярные
высыпания на разгибательных поверхностях. При выполнении пРИФ на биопта¬
тах кожи больных герпетиформным дерматитом отмечают отложения IgA на вер-
ll-ЙДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 169ЩЩщшинах сосочков кожи. В сыворотке крови больных герпетиформным дерматитом
можно обнаружить все характерные для целиакии антитела, включая глиадино-
вые, ретикулиновые, эндомизиальные и антитела к тканевой трансглутаминазе.Аутоиммунный сахарный диабетМеждународной диабетической федерации (1DF), в настоящее время 194 млн
(5,1%) взрослых лиц 20-79 лет страдают диабетом, и к 2025 г. это число возрас¬
тет до 280 млн человек. Наибольшая распространенность зафиксирована в США
(7,9%) и Европе (7,8%). СД II типа (СД II) составляет 85-95% всех случаев диа¬
бета. Примерно 49 млн больных имеют СД I, в том числе дети и подростки. Эти
данные определяют огромную важность лабораторной диагностики и определения
прогноза этого тяжелого заболевания. Хотя основное внимание фокусируется на
росте заболеваемости СД II, параллельно растет и число случаев СД I. Зачастую
дифференциальная диагностика между СД I и СД II не представляет проблемы.
Однако, наряду с типичными проявлениями СД I в виде острого начала и похуда¬
ния, чаще отмечается стертая картина у полных людей и пациентов с медленным
развитием симптоматики. Распространение ожирения в развитых странах приво¬
дит к росту заболеваемости СД II как у подростков, так и у детей. Именно поэтому
клиническое значение диабетических аутоантител с течением времени только
нарастает.Клинические признаки СД I являются исходом аутоиммуно-обусловленного
разрушения Р-клеток без видимых повреждений соседних эндокринных островко¬
вых клеток, к началу заболевания уже разрушено 80-90% р-клеток. При диабете
концентрации всех разновидностей аутоантител максимальны к моменту клиниче¬
ского дебюта. Встречаемость аутоантител значительно снижается в течение 1 года
заболевания, что соответствует прогрессивной аутоиммунной деструкции остров¬
ков. Феномен исчезновения аутоантител с прогрессией заболевания при сахарном
диабете уникален для всех АИЗ, при которых титры аутоантител обычно повыша¬
ются с увеличением активности и длительности заболевания. Этот феномен плохо
исследован, и исчезновение аутоантител сложно объяснить. Несомненно, что сни¬
жение титров АОК характеризуется снижением остаточной функции р-клеток. В то
же время на фоне заболевания показана способность островков к саморегенерации
и синтезу небольшого количества эндогенного инсулина в течение заболевания у
большинства больных.Аутоиммунный диабет имеет выраженный наследственный компонент. Так,
риск развития диабета у однояйцевого близнеца составляет 30%, риск развития
диабета при заболевании близкого родственника — 10%. Использование аутоан¬
тител позволяет уточнить риски развития заболевания и является основой иссле¬
дований для предупреждения развития СД I.Для прогнозирования развития диабета применяют комбинированное опреде¬
ление АОК, ГДК65, IA-2 и инсулина. Аутоантитела против островковых аутоан¬
тигенов имеют специфичность около 100% с ч>'Бствительностью 60-80%, в зави¬
симости от исследуемой популяции и возраста. В отличие от других аутоантител,
встречаемость островковых аутоантител выше у детей и подростков и значительно
снижается к 20-летнему возрасту. Более чем у 95% детей находят, по меньшей
мере, одну разновидность аутоантител в дебюте диабета, и более 90% из них
имеют несколько типов аутоантител. Обнаружение у ребенка нескольких разно¬
видностей островковых аутоантител прогнозирует приблизительно на 50% риск
развития СД I в пределах 5 лет и 80% в пределах 10 лет.Наиболее широко используемой скринирующей стратегией для уточнения
риска у родственников больного СД I — сестер, братьев и детей — являетсяШРаспространение диабета в развитых странах быстро растет. Согласно даннымШё
170 ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙопределение у последних аутоантител к ГДК65 и 1А-2. Если один из этих скри-
нирующих тестов оказывается позитивным, определяют антитела к инсулину
и островковые аутоантитела, а также толерантность к глюкозе. Такой подход
позволяет предсказать развитие СД I с точностью до 90% в пределах 5-10 лет.
Было показано, что родственники первой линии, позитивные только по одно¬
му аутоантителу, имели риск развития СД I примерно 10-20% в течение 5 лет.
Б исследовании 0РТ-1 98% родственников первой степени родства, у которых
развился СД I, имели одно антитело или более, и 80% имели два и более типа
аутоантител. Таким образом, 2 обнаруженных аутоантитела свидетельствуют о
5-летнем риске около 70%, а 3 аутоантитела указывают на 100% 5-летний риск
развития СД I.Островковые аутоантитела, определяемые при родах у женщин, уточняют риск
развития СД после родов. Риск СД I после родов прогрессивно увеличивается с
17% для одного типа аутоантител до 61% для двух и, наконец, до 84% для трех
типов аутоантител. На ранних стадиях заболевания обнаруживают антитела к
ГКД65 и инсулину.Успешный метод исследования для предупреждения развития СД I пока не обна¬
ружен. На сегодняшний день нет успешных результатов превентивного лечения
СД I у человека, несмотря на разработку ряда эффективных методов в экспери¬
ментах на животных. Продолжаются исследования, направленные на первичную
профилактику диабета у ближайших родственников. Работа в этом направлении
также должна помочь установить факторы внешней среды и предложить превен¬
тивные мероприятия для всех АИЗ.Аутоиммунные полиэндокринопатииПолиэндокринопатии (ПЭП) представляют собой сочетание одной аутоим¬
мунной зндокринопатии с другой или с ассоциированным аутоиммунным забо¬
леванием. Выделяют несколько типов ПЭП, которые иногда делят на ПЭП детей
(1 тип) и ПЭП взрослых (2 и 3 типы). В основе ПЭП 1-го и 2-го типов лежит ком¬
бинация недостаточности коры надпочечников с тиреопатией или СД I. Однако
ПЭП 1 и ПЭП 2 отличаются между собой по возрасту дебюта (до 20 и после 20 лет
соответственно), комбинации синдромов и типов наследования. Эти заболевания
также носят название синдромов Шмидта и Карпентера. Наиболее частый, 3 тип,
ПЭП включает другие сочетания эндокринопатий между собой и эндокринопатий
с другими аутоиммунными заболеваниям, такими как целиакия, витилиго, алопе¬
ция, аутоиммунный гастрит, АИГ. Характерно, что их реальная частота в десятки
раз превосходит расчетную, основанную на случайном сочетании эндокринопа¬
тий. Так, встречаемость антител к тиреопероксидазе у больных СД I составляет
около 10%, с ежегодным риском развития тиреоидита — 10-20%.Помимо поражения надпочечников, СД I и тиреопатии, ПЭП 1 характеризу¬
ется клинической картиной кандидоза, гипопаратиреоидизма и гапогонадизма.
Иммунодефицит, который приводит к рецидивирующему кандидозу слизистых
оболочек, обычно дебютирует первым, после чего присоединяется гипопарати-
реоидизм.До 1% людей в европейской популяции имеют ПЭП, преимущественно 3 тип
заболевания. Пик заболеваемости ПЭП 2 и 3 приходится на 3-4-ю декаду жизни,
и преобладают они у женщин. При ПЭП взрослых дебюты отдельных эндокрино¬
патий могут быть разделены несколькими годами, что затрудняет клиническую
диагностику.Существует выраженная наследственная предрасположенность к развитию всех
типов ПЭП, которая связана с генами иммунного ответа. Хотя ПЭП взрослых
имеет полигенный характер, гены HLA играют основную роль в наследовании
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 171ЭТОГО заболевания. В отличие от взрослой формы, ПЭП 1-го типа является моно-
генным заболеванием с аутосомно-рецессивным вариантом наследования.Наиболее часто синдромы ПЭП диагностируют на фоне СД I. Среди больных
СД I до 1/4 пациентов имеют клинические признаки другого эндокринного или
аутоиммунного заболевания. Наиболее частые сочетания эндокринопатий пред¬
ставлены СД I и тиреопатиями (15%), тиреопатиями, витилиго и аутоиммунным
гастритом (10%). Реже отмечаются сочетания СД I и витилиго, тиреопатий и над¬
почечниковой недостаточности, гипогонадизма и алопеции и, наконец, СД и над¬
почечниковой недостаточности.Диагностика синдромов ПЭП основана на серологическом исследовании и
оценке функции соответствующих эндокринных желез, обнаружение аутоан¬
тител у пациентов, а также их родственников с любой формой эндокринопатий
позволяет предсказать развитие заболевания и уточнить группы риска. Повторное
тестирование каждые 3-5 лет позволяет обеспечить достаточную уверенность.
Перечень серологических маркеров для клинического использования приведен в
табл. 17-31.Таблица 17-31. Лабораторное обследование при аутоиммунных полиэндокринопатияхЗаболеваниеАутоактигенТканевой/клеточныйсубстратДругие тестыСахарный диабет 1 типаГДК, IA-2, инсулин, АОК(3-КлеткиГлюкоза натощакДиффузный токсиче¬
ский зобрПГТиреоцитыПГ, свободный Т^ТиреоидитТПО, ТГТиреоцитыТТГ, свободный TjГ ипопаратиреоидизмСа-зависимый рецепторПаратиреоидная железаПаратгормонНадпочечниковая недо¬
статочностьР450с21,Р450с17,P450SCCКора надпочечниковУтренний кортизол, АКТГГипогонадизмР450С17, P450SCCКлетки Лейдига/текиФСГ, ЛГ, тестостеронАутоиммунный гастритИ*, К*-АТФазаОбкладочные клетки
желудкаВитамин B^j, железо,
ОЖССПернициозная анемияФактор КастлаБелокВитамин В,^, железоЦелиакияТканевая трансглутами¬
наза. а-глиадинТонкий кишечник,
пищеводЭндоскопия с биопсией
слизистой оболочкиАутоиммунный гепатитF-актин, LKM-1Печень/почка/желудокАЛТ, ACT, ГГТП, билирубинАлопецияТирозингидроксилазаВолосяные фолликулы-ВитилигоТирозиназаМеланоциты кожи-Примечание. ТТГ — тиреотропный гормон, АКТГ — адренокортикотропный гор¬
мон, ФСГ — фолликулостимулирующий гормон. ЛГ ~ лютеинизирующий гормон, ПТП —
у-гл}'таматтранспептидаза.Диабет дебютирует до надпочечниковой недостаточности. Детей с СД I целе¬
сообразно обследовать на предмет наличия антител к тканевой трансглутаминазе
и эндомизию, чтобы уточнить наличие субклинической формы целиакии. При
надпочечниковой недостаточности целесообразно повторное тестирование на
антитела к ТПО, ГДКА65, АОК. В случае обнаружения аутоантител к островковым
антигенам может быть рекомендовано проведение глюкозотолерантного теста
даже при нормальных показателях глюкозы натощак. Встречаемость антител к
обкладочным клеткам желудка отмечается у больных с тиреоидитом и составляет
20-40%, что позволяет использовать этот тест для скрининга ПЭП у больных с
аутоиммунными эндокринопатиями.
172 ДИАГНОСТИКА АЯОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙНеврологические заболеванияДля иммунологической диагностики заболеваний, поражающих разные отде¬
лы нервной системы, используют широкий спектр тестов (табл. 17-32). РС и
другие демиелинизирующие поражения ЦНС обусловлены иммунной реакцией,
протекающей за гистогематическим барьером. В этом случае иммунный ответ
протекает местно, что делает невозможным его обнаружение в периферической
крови. При этом заболевании наблюдается повышенный синтез иммуногло¬
булинов за гистогематическим барьером, кроме того, вновь синтезируемые
иммуноглобулины приобретают новые свойства, прежде всего они становятся
олигоклональными, что отличает их от поликлональных иммуноглобулинов,
синтезирующихся в норме или при остром воспалительном ответе. Выявление
олигоклонального IgG в СМЖ позволяет проводить дифференциальную диа¬
гностику демиелинизирующих заболеваний центральной нервной системы.
Иммунологический анализ СМЖ — основа диагностики воспалительных про¬
цессов за гематоэнцефалическим барьером.Таблица 17-32. Диагностика аутоиммунных неврологических заболеванийПаранеопласгический энцефалитАнтитела к Ни, Yo-1, Ri, Ма2, CV2, амфифизинуДемиелинизирующие поражения ЦНСОлигоклональный IgG в ликворе и сывороткеДемиелинизирующие поражения нервовАнтитела к ганглиозидам GM„ GQ,„, GD,^ПолиневритыАНФ, дсДНК, АНЦА, АКЛА, криоглобулиныПолимиозитАНФ, лайн-блот с определением анти-Jol, RNP, PM-Scl, Mi-2, KuМиастенияАнтитела к скелетным мышцамАнтитела к нейронам встречаются в системной циркуляции при редких пара¬
неопластических поражениях ЦНС. Б этом случае за счет перекрестной реакции
системный противоопухолевый иммунный ответ поражает нервную ткань. Другим
вариантом аутоантител, направленных против компонентов нервной ткани, явля¬
ются антитела к ганглиозидам. Разрушая миелиновую оболочку нервов, они
приводят к развитию демиелинизирующих полирадикулоневропатий и перифе¬
рических полиневритов. При обследовании пациентов с полиневритами следует
использовать иммунологические тесты для диагностики ДБСТ и васкулитов, так
как ревматические заболевания нередко дебютируют с картины периферического
MOHO- или полиневрита.Миастения — нервно-мышечное заболевание, при котором аутоантитела к АхР
и другим антигенам скелетной мышцы приводят к нарушениям нервно-мышечной
передачи. В отличие от миастении, при воспалительных миопатиях в циркуляции
можно обнаружить ряд АНА.Заболевания кожиСреди аутоиммунных состояний с пораженим кожи можно выделить 4 основные
группы (табл. 17-33): системные заболевания с преимущественным поражением
кожи, реакции против интраэпидермальных антигенов, буллезные дерматозы с
реакциями против антигенов базальной мембраны кожи, заболевания с реакциями
против антигенов дермы.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 173Таблица 17-33. Классификация аутоантител при поражениях кожи на фоне аутоиммунных забо¬
леванийФормаНозологическая формаОсновные аутоантигеныСистемные АИЗ с
преимущественным
поражением кожиСКВ, кожные формы КВдсДНК, нуклеосомы, Sm, SS-A (52 и 60 кДа),
SS-B, U^-RNP. 01 q, фосфолипиды	ДерматомиозиттРНК-синтетазы (Jo-1 и др.), Mi-2, KuСистемный склерозCENT-B, SC/-70, PM-SclВаскулитыКриоглобулины, PR3, МРО, РФ, зндотелио-
циты и т.д.АИЗ с ответом против
внутриэпидермальных
антигеновВульгарная пузырчаткаДесмоглеины 3Листовидная пузьфчаткаДесмоглеины 11дА-пузьфчаткаДесмоглеины 1 и 2, ДеСМОКОЛИН 1ВитилигоVIT40, тирозиназаАИЗ с ответом против
антигенов базальной
мембраны кожибуллезный пемфигоид, пемфигоид
слизистых оболочек, герпес бере¬
менных230 кДа-белок {BPAG 1) и 180 кДа-белок
(BPAG 2)Многоформная эритемаДесмоплакины I и IIАИЗ с отаетом против
дермальных антигеновБуллезный эпидермолизКоллаген VII и ламин-аГерпетиформный дерматитЭпидермальная трансгулатминаза, глиадин,
эндомизийПримечание. BPAG ЪиШт pemphigoid antigen (англ.) - антиген буллезного пемфигоида.Из-за большой поверхности кожи и ее богатого сосудистого русла поражения
кожи возникают при многих АИЗ и васкулитах. Кожа часто поражается при вол¬
чанке, склеродермии, дерматомиозите и васкулитах. Апоптоз клеток кожи являет¬
ся одним из индукторов аутоиммунных реакций, связанных с образованием АНА.
Именно поэтому большинство разновидностей АНА при системных заболеваниях
имеют взаимосвязь с различными кожными проявлениями.Большую группу заболеваний кожи составляют пузырные дерматозы. Деление
на пузырчатку (pemphigus) и пемфигоид основано на локализации пузырьков в
толще эпидермиса или по базальной мембране, что обусловливает ряд морфо¬
логических и клинических феноменов, характерных для этих заболеваний. К
буллезным дерматозам с субэпидермальной везикуляцией причисляют также
многоформную эритему, буллезный эпидермолиз и herpes gestationis, который
представляет собой кожное проявление целиакии. Еще одно аутоиммунное забо¬
левание, сопровождающееся изолированной иммунной реакцией против эпители¬
альных клеток, — это витилиго.Аутоантитела встречаются при всех АИЗ с поражением кожи, что определяет
их значение в диагностике. В состав лабораторно-клинического обследования
больных с кожными заболеваниями должна входить биопсия кожи с прямой РИФ
(пРИФ). Благодаря легкости получения материала и четкому морфологическому
строению, изучение отложений иммуноглобулинов и факторов комплемента в
биоптатах кожи очень информативно и должно проводиться в комплексе с серо¬
логическим исследованием.пРИФ биоптатов непораженной кожи в диагностике пузырных дерматозов
обладает почти 100% чувствительностью и является золотым стандартом обсле¬
дования. Оно весьма информативно, так как позволяет обнаружить изменения,
характерные для основных АИЗ кожи. Исследуют уже существующие отложения
иммуноглобулинов и комплемента в структурах кожи. В отличие от морфологиче¬
ской оценки высыпного элемента с помощью световой микроскопии, для пРИФ
необходим участок с полностью сохраненной морфологией кожи. Рекомендуется
взятие биопсии при помощи одноразовых дерматологических «пробойников»
диаметром 3-4 мм, при использовании которых косметический дефект мини-
174ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙмален. Биопсию доставляют в лабораторию в специальной транспортной среде
Михаэлиса, содержащей стабилизаторы иммуноглобулинов.При иммунофлюоресцентном исследовании биопсии кожи могут быть обна*
ружены антитела к межклеточным контактам (пузырчатка), базальной мембране
(пемфигоид, пемфигоид беременных, линейный IgA-дерматоз, пемфигоид сли¬
зистых оболочек, буллезный эпидермолиз), IgA в сосочках при герпетиформном
дерматите Дюринга, «волчаночная полоска» IgM/IgG по базальной мембране,
отложения IgA в сосудах дермы при пурпуре Шенлейна-Геноха. Основные диа¬
гностические находки при биопсии кожи перечислены в табл. 17-34.Таблица 17-34. Основные диагностические феномены при проведении реакции прямой иммуно¬
флюоресценции биоптата кожиСтруктура кожиФорма отложений 1дЗаболеваниеЭпидермисМежклеточные отложения IgG и разрывы в
верхних слояхЛистовидная пузырчаткаМежклеточные отложения IgG и разрывы в
глубоких слояхВульгарная пузырчаткаМежклеточные отложения IgAИнтраэпидермальный пустулярный дер¬
матозФлюоресценция ядер клетокАНА in vivoДермо-Линейные отложения IgGПемфигоидэпидермальныиЛинейные отложения IgAЛинейный IgA-пемфигоидСТЫКОтложения на эпидермальной стороне при
солевом расщепленииПемфигоид, многоформная эритемаОтложения на дермальной стороне при соле¬
вом расщепленииБуллезный эпидермолизГранулярные отложения всех классов, чаще
IgM«Волчаночная полоска» при СК8Гранулярные отложения IgA в сосочках кожиГерпетиформный дерматитСосуды дермыIgA-отложения в стенках сосудовПурпура Шенлейна-ГенохаIOG-отложения в стенках сосудовКожный васкулит, криоглобулинемия,
системные заболеванияЗАКЛЮЧЕНИЕЛабораторные иммунологические тесты охватывают весь спектр клинических
задач, касающихся вопросов диагностики, назначения терапии и прогноза аутоим¬
мунных заболеваний (табл. 17-35). Однако ни один тест, как клинический, так и
лабораторный, не может рассматриваться изолированно, в отрыве от совокупной
клинико-лабораторной картины заболевания.Информативность и надежность данных иммунологического теста во многом
зависят от взаимодействия клинициста и сотрудника лаборатории. Врач должен
знать основы лабораторных методов, их недостатки и преимущества. Тесная связь
между клиницистом и врачом клинической лабораторной диагностики позволяет
улучшить точность диагностики, установить «слабые места» лабораторной служ¬
бы и способствовать их устранению. Только активное сотрудничество с иммуноло¬
гической лабораторией способно обеспечить клиницисту надежные, осознанные
результаты анализов и повысить эффективность их использования в клинической
практике.
ДИАГНОСТИКА АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 175
Таблица 17-35. Клиническое применение иммунологических лабораторных тестовКлиническая задачаПример тешСкрининг аутоиммунного заболеванияАНФПодтверждение диагнозаОпределение АЦЦП при артритеОпределение прогноза заболеванияИсследование спектра АНА при системных забо¬
леванияхРиск развития заболеванияОпределение антител к антигенам островковых
клеток у родственников больных сахарным диа¬
бетом 1 типаКонтроль активности заболеванияАНЦА при гранулематозных васкулитахОснование для терапии с целью профилактики обо¬
стренияМониторинг титров антител к дсДНК у больных
СКВКонтроль эффективности иммуносупрессивной тера-
лииИзменение С-реактивного белка, СОЭ, биомаркерыДифференциальная диагностика обострения основно¬
го заболевания и сопутствующих осложненийКомпоненты комплемента, С-реактивный белок,
прокальцитонин
Глава 18
ИимуногеиатологияИммуногематология — учение об антигенах клеток крови и
антителах к ним. Клетки крови и плазма характеризуются огром¬
ным разнообразием антигенов: антигены лейкоцитов, тромбоцитов,
эритроцитов, нейтрофилов, плазменных белков; набор у каждого
человека строго индивидуален. Поэтому в клинических ситуациях,
подразумевающих возможность контакта человека с чужеродны¬
ми для него антигенами других людей, иммуногематологические
знания необходимы. Антигенную совместимость надо учитывать
в трансфузиологии при переливании крови или гемокомпонентов,
в трансплантологии — при пересадке органов и тканей, в акушер¬
стве — при беременности.Абсолютно идентичных индивидуз'мов не бывает (исключение —
однояйцовые близнецы), поэтому любая трансфузия, трансплан¬
тация, беременность сопровождаются сенсибилизацией теми или
иными антигенами. Конечный результат сенсибилизации — выра¬
ботка антител к чужеродным антигенам. Взаимодействие антител и
антигенов приводит к активации, инактивации или гибели клеток,
несущих соответствующие антигены. Клиническими проявления¬
ми подобных реакций являются посттрансфузионные реакции и
осложнения, отторжение трансплантата, гемолитическая болезнь
плода и новорожденного и другие патологические состояния.
В связи с этим выполнение любого вида гемокомпонентной терапии
или аллогенной трансплантации органов и тканей должно сопро¬
вождаться соответствующими иммуногематологическими иссле¬
дованиями крови доноров и реципиентов. Такие же исследования
необходимо выполнять при каждой беременности и родах для
крови матери и ребенка.Полный спектр антигенов клеток крови определить невозможно,
что вносит ограничения для иммуногематологической апробации
крови донора и реципиента, включающей только те антигены и
антитела, клиническим значением которых пренебречь невозмож¬
но. Прежде всего это антигены эритроцитов, несовместимость по
которым может стать причиной серьезных гемолитических кон¬
фликтов — мать-плод или реципиент-донор.
ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ177АНТИГЕНЫ ЭРИТРОЦИТОВИззд1ение антигенов эритроцитов и анализ иммуногенных свойств показали их
различную способность к сенсибилизации в процессе трансфузий или при бере¬
менности. Расположив частоту встречаемости антител к антигенам эритроцитов
в убывающем порядке, получили шкалу иммуногенности антигенов эритроци¬
тов, которую также можно назвать шкалой приоритета трансфузионно опасных
эритроцитарных антигенов. В настоящее время шкала с учетом только основных
клинически значимых антигенов систем АБО, Резус и Келл выглядит следующим
образом; А, B>D>K>c>C>E>e.СИСТЕМА ABOСистема ABO состоит из двух основных компонентов — антигенов А и В, пред¬
ставленных на эритроцитах как по одному, так и вместе — группы А (II), В (III),
АВ (IV); отсутствие антигенов на мембране эритроцитов обозначают символом
«О» — группа О (I). Уникальное свойство системы АБО — наличие в норме анти¬
тел к отсутствующим антигенам. Эти антитела называют изогемагглютининами
анти-А, анти-В (или устаревшее обозначение а и Р). Сочетание антигенов А и В на
эритроцитах и антител к ним в сыворотке крови человека определяет его принад¬
лежность к четырем основным группам крови (табл. 18-1).Таблица 18-1. Основные группы крови человека системы ABOГруппа кровиАнтигены системы ABOАнтитела системы ABOпо системе ABOАВАнти-ААнти-ВА (II)+--+В (III)-++-АВ (IV)++--0(1)--++Антигены А и В представляют собой неоднородные структуры, определяющие
наличие большого количества вариантов антигенов системы АБО. Так, структуру
антигена А описывают более чем 30 вариантами: Aj, А^, А^ Aj^, А^, А^^^ и др.
На эритроцитах могут бьггь представлены только некоторые из перечисленных
вариантов антигена; при этом возможна выработка антител к отсутствующим
частям антигенной мозаики. Наиболее иммуногенна часть А^; при ее обнаружении
на эритроцитах человека говорят о второй А(П) или четвертой AB(IV) группе
крови. Диагностика подгруппы А^ возможна только при использовании специаль¬
ного реагента — анти-А^. В случаях наличия антигена А без выявления варианта
Aj — обобщенный вариант А^, обозначается подгруппой А2(П) или A^B(IV) соот¬
ветственно, Выявляемые антитела к отсутствующим частям антигена А(А^) назы¬
вают экстрагглютининами и обозначают как анти-А^ или а^.Возможное присутствие у реципиентов с подгруппой А экстрагглютинина
анти-А^ обусловливает назначение им гемокомпонентов с odязaтeльным исклю¬
чением антигена А. Реципиентам с А2(П) назначают эритроцитсодержащие гемо¬
компоненты группы 0(1), а реципиентам с A2B(IV) — группы В(III) или 0(1). При
невозможности выбора указанных гемокомпонентов трансфузии эритроцитсо¬
держащих сред группы крови А(П) или AB(IV) проводят, только используя метод
индивидуального подбора,СИСТЕМА РЕЗУССистема состоит из 75 антигенов, каждый из которых имеет различное кли¬
ническое значение. Выделяют 5 наиболее важных антигенов системы Резус (Rh):
D, С, с, Е, е. Самый сильный иммуноген системы — антиген D. Термины «резус-
пол ожительный» и «резус-отрицательный» относят к наличию или отсутствию■
ШЫШшж178 ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯшшшантигена D на мембране эритроцита индивидуума. Распространенность антигена
Rh (D) в европейской популяции составляет 85%. Rh(D)-отрицательное население
1§1Щ1 России составляет 15%. В связи с тем что антиген D системы Резус обладает силь-
iíífcl ными антигенными свойствами, его определение обязательно как для доноров,
^ реципиентов гемокомпонентов, наряду с определением группы крови
системы ABO. в отличие от системы ABO, в норме к отсутствующим антигенам
системы Резус (в том числе и антигену D) антитела не вырабатываются. Для выра-
IIS ботки антител обязательно должен произойти контакт клеток иммунной системы
с чужеродным антигеном (сенсибилизация), что возможно при трансфузии несо¬
вместимой по этому антигену крови или антиген-конфликтной беременности.
При повторном контакте с антигеном, вызвавшим сенсибилизацию, вырабатыва¬
ются антитела, приводящие к серьезным гемолитическим посттрансфузионным
осложнениям и гемолитической болезни плода и новорожденного. Реципиентам
с антигеном D обычно переливают Rh(D)-положительные гемокомпоненты,
хотя с учетом всех клинически значимых антигенов системы Резус (С, с, Е, е)
возможно использование и Rh(D)-отрицательных трансфузионных сред. Rh(D)-
отрицательным реципиентам для предотвращения иммунизации и последующих
тяжелых осложнений назначают трансфузии только Rh(D)-отрицательных гемо¬
компонентов.Несмотря на то, что определение антигена D в клинической практике исполь¬
зуют уже давно, в некоторых случаях возможны затруднения. Обычно такие
отклонения в определении антигена D обозначают специальным термином O'".
Основные причины появления антигена D": несовершенство реагентов и методов
определения, генетически обусловленная неоднородность антигена.Эпитопы нормального антигена D:❖	все эпитопы присутствуют у Rh(D)-положительных индивидуумов;O' все эпитопы отсутствуют у Rh(D)-отрицательных индивидуумов;<> в некоторых случаях у индивидуумов отсутствует один или несколько эпито¬
пов — частичный D (partial D).В некоторых случаях анти-О-антитела находят у небольшого числа Rh(D)-
положительных субъектов; показано, что в таких ситуациях эритроциты несут
только часть эпитопов антигена D. При этом к утраченным эпитопам могут
вырабатываться антитела; анти-D-аллоантитела реагируют практически со всеми
эритроцитами НЬ(0)-положительных индивидуумов, имеющих нормальный
(полный) антиген D. Продукция анти-О-антител индивидуумами с частичным
антигеном D — достаточно редкие случаи, тем не менее это является причиной
серьезных клинических осложнений, включая гемолиз после гемотрансфузии и
тяжелую гемолитическую болезнь новорожденных. Соответственно все варианты
антигена D“ должны быть обнаружены в слу^иях, когда его присутствие может
вызвать иммунологическую угрозу.Доноры гемокомпонентов. Гемокомпоненты доноров с антигеном D^‘ мар¬
кируют как Rh(D)-положительные в связи с тем, что при их переливании Rh(D)-
отрицательным индивидуумам может произойти стимуляция выработки анти¬
тел и развиться посттрансфузионные осложнения. В то же время при внесении
данных о групповой (ABO) и резус-принадлежности в документ донора с анти¬
геном D" рассматривают как потенциального реципиента, в связи с чем его резус-
принадлежность Б этом случае маркируют как Rh(D)-отрицательную.Беременные. Определение антигена D" следует проводить для беременных,
одновременно выполняя скрининг антител. Женщины, имеющие слабый антиген D,
не нуждаются в дородовых и послеродовых инъекциях иммуноглобулина анти¬
резус (D).Новорожденные Rh(D)-отрицательных матерей. Определение антигена D'*
должно быть выполнено у новорожденных Rh(D)-отрицательных матерей. Если
ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ179новорожденный имеет антиген D^', то КЬ (В)-отрицательной матери назначают
иммунопрофилактику иммуноглобулином анти-резус. Определение антигена О“
для беременных и новорожденных КЬ(В)-отрицательных матерей связано исклю¬
чительно с назначением иммуноглобулина анти-резус (В). Как реципиентов гемо¬
компонентов их считают ЕЬ(В)-отрицательными. Для реципиентов определение
антигена В“ необязательно. Если КЬ (О)-принадлежность больного определена как
КЬ (В)-отрицательная стандартными методами, то тест для выявления антигена В''
не проводят, так как переливать будут КЬ (В)-отрицательные гемокомпоненты.
Это предотвращает сенсибилизацию по антигену В, но не является гарантией
безопасности по другим эритроцитарным антигенам.ИММУНОГЕМАТОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ
ТРАНСФУЗИОННОЙ ТЕРАПИИВ стандартных случаях нет необходимости в широком типировании антигенов
эритроцитов для доноров и реципиентов гемокомпонентов. В норме к антигенам
всех эритроцитарных систем, за исключением системы ABO, антител быть не
должно. По этой при»шне принцип безопасности трансфузий эритроцитсодержащих
гемокомпонентов возможно осуществлять за счет выявления предшествующей
сенсибилизации, что достигается обязательным для всех доноров и реципиентов
скринингом антиэритроцитарных антител. Антитела к антигенам эритроцитов
принято классифицировать с учетом их клинического значения. Под клини¬
чески значимыми антителами подразумевают антитела, способные вызывать
in vivo разрушение эритроцитов, имеющих на мембране соответствующий анти¬
ген. С существованием этих антител связаны механизмы развития гемолити¬
ческой болезни новорожденных, посттрансфузионных гемолитических реак¬
ций, осложнений или укорочение времени выживания перелитых эритроцитов.
При отсутствии антител у реципиента (отрицательный результат скрининга)
эритроцитсодержащие среды выбирают только с учетом группы крови по системе
ABO и Rh (В)-принадлежности. Положительный результат скрининга говорит об
«опасном» реципиенте; трансфузии гемокомпонентов осуществляют только по
индивидуальному подбору, с обязательным исключением антигена, к которому
выявлена сенсибилизация.Реципиентам с запланированными многократными трансфузиями гемоком¬
понентов (пациенты гематологических и онкологических стационаров, на гемо¬
диализе, реципиенты органов и тканей) целесообразно выполнять типирование
эритроцитов по антигенам С, с, Е, е системы Резус, антигену К системы Келл и
другим для точных рекомендаций по выбору гемокомпонентов для трансфузий.
Индивидуальный подбор таким реципиентам проводят не только с учетом выяв¬
ления предшествующей сенсибилизации, но и с обязательным учетом фенотипа
эритроцитов для исключения при выборе гемокомпонентов антигенов, способных
стать причиной появления клинически значимых антител,РЕАГЕНТЫ И МЕТОДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУППЫ КРОВИ ПО СИСТЕМЕ ABO,
РЕЗУС(0)-ПРИНАДЛЕЖН0СТИДля определения антигенов системы ABO изначально использовали реагенты,
полученные из сыворотки крови доноров с установленной групповой принадлеж¬
ностью. Это были проверенные и специальными способами окрашенные поли¬
клональные реагенты, содержащие антитела к отсутствующим у данного донора
антигенам системы ABO. Такие диагностикумы называют стандартными изогемаг-
глютинирующими сыворотками. Для получения реагента, по.зволяющего опреде¬
лять резус(В)-принадлежность, долгое время использовали поликлональные
реагенты, приготовленные из сыворотки крови резус(В)-отрицательных доноров-
180 ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯдобровольцев, иммунизированных резус(В)-положительными эритроцитами дру¬
гих доноров, в конце 80-х гг. XX в. альтернативой реагентам, полученным из крови
человека, стали моноклональные антитела - продукт биотехнологического произ¬
водства, позволивший получить стандартные реагенты к антигенам эритроцитов.
Моноклональные антитела выпускают под различными торговыми названиями
(наиболее распространены в РФ «Цоликлоны», «Медиклоны», «Трансклоны»).
Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки и моноклональные антитела
работают в реакции прямой агглютинации, образуя с эритроцитами, несущими
соответствующий антиген, агглютинаты — комплексы, видимые невооруженным
глазом. Для поликлональных антител при определении резус(О)-принадлежности,
как правило, необходимы дополнительные реагенты для проявления результатов
неспецифического (33% раствор полиглюкина, 10% раствор желатина) или специ¬
фического (антиглобулиновый реагент) взаимодействия антигенов и антител.Для полноценного определения группы крови по системе ABO необходимо,
наряду с определением антигенов, выявлять существующие в норме антитела к
отсутствующим антигенам. Для определения антител используют консервиро¬
ванные стандартные эритроциты доноров грзшпы А (II) и В (ÍII). Определение
антигенов эритроцитов системы ABO стандартными изогемагглютинирующими
сыворотками или моноклональными антителами называют прямой реакцией
для определения группы крови. При применении совместно с ними стандартных
эритроцитов (обратная реакция) говорят о перекрестном методе определения.
Диагностика подгруппы возможна только с использованием специального реа¬
гента анти-А^.Определение резус(D)-принадлежности с поликлональными и моноклональны¬
ми реагентами проводят различными методами. При этом выявление вариантов
антигена D“ требует дополнительного тестирования.Наиболее точный метод диагностики антител к антигенам эритроцитов —
непрямой антиглобулиновый тест (НАГТ), Важная составляющая адекватного
скрининга антител — использование образцов стандартных эритроцитов группы
О (I), типированных по всем клинически значимым системам эритроцитов,В настоящее время, наряду с серологическими методами диагностики антигенов
эритроцитов и антиэритроцитарных антител (самый точный из которых — метод
агглютинации в геле), используют и молекулярно-биологическую диагностику.
Применение этих методов ограничено ввиду трудоемкости и высокой стоимости.ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ИММУНОГЕМАТОЛОГИЧЕСКОЙ АПРОБАЦИИ
КРОВИ ДОНОРОВДля всех доноров крови или ее компонентов, необходимы иммуногематологиче¬
ские исследования; при их проведении всех исследуемых рассматривают как доно¬
ров гемокомпонентов, при внесении данных о групповой и резус-принадлежности
в удостоверение личности или иной документ донора рассматривают как реципи¬
ента гемокомпонентов.1.	Первично перед донацией группу крови по системе ABO определяют простой
реакцией (используя стандартные изогемагглютинирующие сыворотки или моно¬
клональные антитела). Результат записывают в карту донора с обязательным ука¬
занием серий используемых реагентов и даты определения. Для кадровых доноров
при повторных донациях данную процедуру можно не проводить.2.	Во время донации с применением закрытых систем взятия крови необходим
контрольный образец крови донора для выполнения иммуногематологических
исследований. Для апробации используют пробирки с активатором свертывания
крови или антикоагулянтом на основе ЭДТА или цитрата Na объемом не менее
5 мл (требования к образцу крови определяет лаборатория, в которой проводят
исследования). Пробирку маркируют одновременно с заготовленной гемопродук¬
ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ181цией и передают с направлением на исследование, имеющим аналогичную марки¬
ровку, в едл.3.	Б КДЛ врач, прошедший специальную подготовку по иммуногематологии, у
переданного образца крови донора выполняет определение группы крови (АБО)
перекрестным методом, резус-принадлежности (D), типирование по антигенам С,
с, Е, е системы Резус и антигена К системы Келл, исследование на наличие алло-
иммунных антиэритроцитарных антител. Результаты определения фиксируют в
рабочем журнале, электронной картотеке и выносят на лицевую сторону карты
донора с датой и подписью врача.4.	Наличие слабой агглютинации при выявлении антигена А и/или экстраг¬
глютинина анти-Aj требует дополнительной верификации подгруппы антигена А
(А^) с реагентами анти-А, и анти-Н. При выявлении экстрагглютинина анти-А,
учреждение службы крови не выдает для переливания консервированную кровь
или полученные из этой дозы крови плазму, криопреципитат и концентрат тром¬
боцитов.5.	Обязательно определение слабых вариантов антигена D (D") у доноров. При
наличии слабых вариантов антигена D (О'’) резус-принадлежность донора считают
положительной.6.	Типирование антигенов эритроцитов С, с, Е, е, К систем Резус и Келл у доно¬
ров обязательно; проводят исследование 3 раза (однократно при каждой донации)
различными сериями типирующих реагентов или различными реагентами. При
совпадении результатов Резус/Келл (Rh/Ю фенотип считают установленным и
при последующих донациях не определяют. При использовании гелевой техноло¬
гии для типирования указанных антигенов допускают двукратное исследование.
Аналогично осуществляют типирование антигенов эритроцитов других систем,
выполняемое по мере необходимости.7.	Полученные данные о групповой (АБО) принадлежности с учетом подгруп¬
пы А^, резус-принадлежности (D), Rh/К-фенотипе эритроцитов донора выносят
на этикетку эритроцитсодержащего гемокомпонента. Резус-принадлежность гемо-
компонентов маркируют как положительную при наличии антигенов D (или D")» С
или Е системы Резус или как отрицательную при их отсутствии. Данные о полном
типировании антигенов С, с, Е, е системы Резус и антигена К системы Келл должны
быть представлены в Rh/К-фенотипе.8.	Скрининг антиэритроцитарных аллоантител обязателен для всех доноров
гемокомпонентов, независимо от групповой и резус-принадлежности крови.
Исследование проводят при каждой донации. При обнаружении антиэритроци¬
тарных аллоантител в образце донорской крови учреждение службы крови не
выдает для переливания консервированную кровь или полученные из этой дозы
крови плазму, криопреципитат и концентрат тромбоцитов. Допускается донорство
эритроцитов. Плазма доноров с аллоантителами может быть использована для
изготовления препаратов и иммуногематологических диагностикумов,9.	Для выяснения специфичности антител проводят их идентификацию.
Идентификацию антител считают завершенной при соответствии результатов
реакций с панелью эритроцитов результатам типирования антигенов.10.	Справку о наличии антиэритроцитарных антител с указанием их специфич¬
ности и рекомендаций по выбору гемокомпонентов для переливания выдают на
руки донору для предъявления при госпитализации. В рекомендациях указывают,
что данному человеку в дальнейшем как реципиенту для переливания необходимо
выбирать эритроцитсодержащие гемокомпоненты только с отсутствием антигена,
к которому выявлены антитела, даже если антитела повторно не выявляют. Такая
справка должна всегда быть при доноре для обеспечения безопасности трансфу¬
зий, в том числе при экстренных госпитализациях.
182ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ ИММУНОГЕМАТОЛОГИЧЕСКОЙ АПРОБАЦИИ КРОВИ
РЕЦИПИЕНТОВВсем пациентам, которым может потребоваться переливание крови или ее ком¬
понентов, должны быть выполнены иммуногематологические исследования.•	Первично группу крови по системе ABO определяет лечащий (или дежурный)
врач простой реакцией (стандартными изогемагглютинирующими сыворот¬
ками или моноклональными антителами). Результат записывают в медицин¬
ской карте больного и направлении в КДЛ с обязательным указанием серий
используемых реагентов, даты и фамилии врача, проводившего определение.
В направлении указывают также фамилию, имя и отчество больного, возраст,
отделение, номер палаты и номер медицинской карты.•	При использовании закрытых систем взятия крови должен быть взят кон¬
трольный образец венозной крови для выполнения иммуногематологиче¬
ских исследований. Для апробации могут быть использованы пробирки с
активатором свертывания крови или антикоагулянтом объемом не менее
5 мл (требования к образцу крови определяет лаборатория, в которой про¬
водят исследования). Пробирку маркируют и передают с направлением на
исследование в КДЛ.•	В КДЛ врач, прошедший специальную подготовку по иммуногематоло¬
гии, определяет группу крови (ABO) перекрестным методом и резус-(D)-
принадлежность, исследует на наличие аллоиммунных антител к антигенам
эритроцитов в переданном образце крови больного. Результаты определения
фиксируют в рабочем журнале и направлении на исследование (при нали¬
чии информационных систем результат анализа вьщают на специальном
бланке лаборатории). Выдача ответа КДЛ возможна лишь в случае совпа¬
дения результатов первичного и повторного определения. Если результаты
не совпадают, проводят повторные исследования из вновь заготовленного
образца крови больного.•	Наличие экстрагглютинина анти-А^ и/или слабой агглютинации при выявле¬
нии антигена А требует дополнительной верификации подгруппы антигена А
(Аз) с реагентами анти-А^ и анти-Н.•	При наличии слабых вариантов антигена D (D") резус-принадлежность реци¬
пиента считают отрицательной.•	Скрининг аллоиммунных антител к антигенам эритроцитов обязате¬
лен для всех реципиентов гемокомпонентов при плановых трансфузи¬
ях (независимо от групповой (ABO) и резус-(D)-принадлежности крови).
Исследование выполняют в КДЛ перед каждой вновь назначаемой транс¬
фузией. Обнаружение антиэритроцитарных аллоантител ~ основание для
назначения реципиенту индивидуального подбора по антигенам эритроцитов
при трансфузиях эритроцитсодержащих гемокомпонентов.•	Для выяснения специфичности антител образец крови реципиента передают
в референсную (экспертную) лабораторию, где проводят идентификацию
антител.•	Справку о наличии антител с указанием их специфичности, фенотипа эритро¬
цитов и рекомендаций по выбору гемокомпонентов для переливания выдают
на руки реципиенту для предъявления при последующих госпитализациях. В
рекомендациях указывают, что данному человеку в дальнейшем как реципи¬
енту для переливания необходимо выбирать эритроцитсодержащие гемоком¬
поненты только с отсутствием антигена, к которому выявлены антитела, даже
если антитела повторно не выявляют. Такая справка находится у пациента и
предъявляется для обеспечения безопасности трансфузий, в том числе при
экстренных госпитализациях.
ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ ЮЗ❖	После получения ответа из КДЛ лечащий врач выносит данные о группе
(ABO) и резус-принадлежности крови на лицевую сторону медицинской
карты больного, проставив дату вынесения и свою подпись. Бланк ответа
вклеивают в медицинскую картз? пациента.❖	Если больной не относится к категории «опасных» реципиентов или реци¬
пиентов группы риска по данным анамнеза и отсутствуют аллоантитела к
антигенам эритроцитов (отрицательный результат скрининга антител), то
эритроцитсодержащие гемокомпоненты переливают с учетом совместимо¬
сти по группе крови (ABO) и резус-принадлежности (D). Перед трансфузией
обязательно определение врачом группы крови (ABO) донора и реципиента и
постановка проб на совместимость,❖	При экстренных показаниях к трансфузии гемокомпонентов и отсутствии
возможности выполнения иммуногематологического исследования в КДЛ
(ночное время, выходные и праздничные дни) исследование групповой
(ABO) и резус-принадлежности (D) проводит дежурный врач; при этом в обя¬
зательном порядке заготавливают образец крови больного до трансфузии,
который передают в КДЛ в часы ее работы.ИНДИВИДУАЛЬНЫЙ ПОДБОР ПО АНТИГЕНАМ ЭРИТРОЦИТОВИндивидуальный подбор эритроцитсодержащих гемокомпонентов — это
предтрансфузионные пробы на совместимость сыворотки (плазмы) крови реци¬
пиента с эритроцитами донора (или доноров) гемокомпонентов, выполненные
в условиях специализированной лаборатории адекватными методами. Такой
подбор может быть рекомендован всем реципиентам гемокомпонентов. Группы
пациентов, для которых индивидуальный подбор эритроцитсодержащих гемо¬
компонентов обязателен при каждой плановой трансфузии эритроцитсодержа¬
щих гемокомпонентов:реципиенты с отягощенным акушерским и трансфузионным анамнезом;
реципиенты с положительным результатом скрининга антител;❖	сенсибилизированные реципиенты (по данным анамнеза), независимо от
выявления антител в настоящий момент;новорожденные;❖	пациенты педиатрических стационаров;<!- беременные, роженицы, родильницы;реципиенты с многократными трансфузиями в анамнезе;❖	пациенты при неэффективности трансфузий эритроцитсодержащих гемоком¬
понентов;^ пациенты гематологических и онкологических стационаров;❖	пациенты отделений гемодиализа;
реципиенты органов и тканей.Индивидуальный подбор осуществляют из совместимых с реципиентом по
группе крови (ABO), резус-принадлежности (D) образцов крови доноров, отри¬
цательных по антигену, к которому в данный момент или ранее были выявлены
антитела у пациента.Исследования образцов крови доноров и реципиента при выполнении индиви¬
дуального подбора в специализированной лаборатории:повторное определение групповой (ABO) и резус-принадлежности (D);❖	скрининг и идентификация антиэритроцитарных аллоиммунных антител у
реципиента;❖	проба на совместимость сыворотки (плазмы) крови реципиента и эритро¬
цитов каждого образца крови доноров гемокомпонентов в непрямом анти-
глобулиновом тесте (НАГТ) для выявления несовместимости, вызванной
клинически значимыми антителами.
184 ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯРезультаты исследований фиксируют в журнале индивидуального подбора
крови. Ответ выдают на бланке индивидуального подбора с обязательным ука¬
занием фамилии, имени и отчества, группы крови (ABO), резус-принадлежности
(D), специфичности выявленных и ранее обнаруженных антител реципиента.
Также в нем отражают сведения об идентификационных номерах, группах крови
(ABO), резус-принадлежности (D) и фенотипе по соответствующему антигену всех
подобранных образцов крови доноров гемокомпонентов с обязательным указа¬
нием методов индивидуального подбора, даты и подписи врача, осуществлявшего
исследование.Для трансфузий используют только гемокомпоненты, совместимые по антиге¬
нам эритроцитов. Несовместимость в ходе индивидуального подбора — противо¬
показание к трансфузии гемокомпонента от данного донора. Бланк индивидуаль¬
ного подбора передают в ЛПУ вместе с гемокомпонентом и вклеивают в историю
болезни реципиента при осуществлении трансфузии данного гемокомпонента.Перед трансфузией гемокомпонентов по индивидуальному подбору врач, осу¬
ществляющий трансфузию, обязательно определяет групповую принадлежность
крови доноров и реципиента. Убедившись в том, что они совпадают с данными
истории болезни и бланка индивидуального подбора, врач проводит биологиче¬
скую пробу на совместимость и осуществляет трансфузию гемокомпонентов.ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ ПОСТТРАНСФУЗИОННЫХ РЕАКЦИЯХ
ГЕМОЛИТИЧЕСКОГО ТИПАЛабораторные исследования при подозрении на посттрансфузионное осложне¬
ние (ПТО) должны быть направлены, с одной стороны, на подтверждение диагноза
гемолитической реакции, с другой — на выявление причин и подбор совместимых
гемокомпонентов для последующих трансфузий.к первой группе относят тесты, подтверждающие гемолиз: определение кон¬
центрации гемоглобина и гематокрита. Показатели острого внутрисосудистого
гемолиза — гемоглобинурия, гемоглобинемия и гипербилирубинемия за счет
неконъюгированного билирубина.Вторая группа тестов направлена на выяснение причины иммуногематологиче¬
ской несовместимости, приведшей к ПТО. Здесь необходимо тщательное исследо¬
вание образцов крови донора и реципиента, причем для реципиента дополнитель¬
но изучают образец крови, взятый до переливания. Во всех трех образцах крови
проводят повторное определение групповой (ABO) и резус(О)-принадлежности,
фенотипирование эритроцитов, скрининг и идентификацию аллоантител. Для
этих исследований используют НАГТ, непрямую реакцию Кумбса. Кроме этого, из
образца крови больного после трансфузии проводят прямой антиглобулиновый
тест (ПАГТ, прямую пробу Кумбса); исследование используют для выявления
антител или компонентов комплемента, фиксированных на поверхности эритро¬
цитов.Проведение прямой пробы Кумбса показано при следующих состояниях:❖	аутоиммунный гемолиз;-о* гемолитическая болезнь новорожденных;❖	лекарственная иммунная гемолитическая анемия;❖	гемолитические посттрансфузионные реакции и осложнения.Для определения специфичности антител используют элюат с поверхности сен¬
сибилизированных эритроцитов. Если в образце крови больного, взятом до пере¬
ливания, обнаружены антитела, их специфичность совпала с полученной в элюате.
при этом у больного не выявлен антиген (или антигены), к которому определены
антитела, то диагноз ПТО подтвержден и причина установлена (специфичность
антигена). В случае подозрения на посттрансфузионное осложнение гемолитиче¬
ского типа для последующих трансфузий такому реципиенту необходимо выби-
ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ 185рать эритроцитсодержащие гемокомпоненты только по индивидуальному подбору
в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямой реакции Кумбса) с обязательным
исключением в донорской крови антигена — причины ПТО.ИММУНОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ СОСТОЯНИЯ
Лабораторная диагностика гемолитической болезни плода
и новорожденногоГемолитическая болезнь плода или новорожденного — патологическое состоя¬
ние, обусловленное несовместимостью матери и плода (новорожденного) по
антигенам эритроцитов. Подобная несовместимость может быть вызвана практи¬
чески любым антигеном, унаследованным ребенком от биологического отца, при
условии отсутствия этого антигена у матери. Выработка антител (за исключением
антител к антигенам системы ABO) происходит при контакте чужеродного антиге¬
на с клетками иммунной системы матери, что возможно только при беременности
или трансфузии. При этом сенсибилизация происходит при первой беременности
(трансфузии), а антитела вырабатываются при повторном контакте с данным
антигеном. По этой причине первая беременность обычно протекает без клини¬
ческих признаков конфликта. Механизм иммунизации чужеродным для матери
антигеном запускается в результате трансплацентарных геморрагий, характерных
для любой беременности и обычно составляющих не более 1 мл. Количество крови
плода, достаточное для иммунизации, может попасть в кровь матери в момент
родов или при плодоразрушающих процедурах. Риск иммунизации высок при
амниоцентезе или кордоцентезе. В процессе внутриутробного развития антиге¬
ны эритроцитов формируются довольно рано; так, антигены системы ABO плода
полностью сформированы уже к 8-9-й неделе беременности. При несовместимо¬
сти по антигенам системы ABO гемолитическая болезнь новорожденных может
возникнуть даже во время первой беременности в связи с тем, что антитела к этим
антигенам постоянно присзтствуют в крови матери.Гемолитическая болезнь плода наиболее вероятна для конфликта мать-плод по
антигену D системы Резус. Для несовместимости по другим антигенам эритроцитов
характерно развитие гемолитической болезни новорожденного. Клиническая кар¬
тина болезни определяется интенсивностью гемолиза эритроцитов. У плода разви¬
вается гемолитическая анемия, в тяжелых случаях приводящая к сердечной недо¬
статочности, водянке и внутриутробной гибели. Снижение гематокрита в образце
крови плода до 18% и менее, а также совокупность других критериев оценки его
состояния — показание для внутриутробного переливания эритроцитсодержащих
гемокомпонентов. Для переливания в этом случае выбирают отмытые, лейко¬
фильтрованные и облученные эритроциты группы 0(1), совместимые по антигенам
эритроцитов с сывороткой крови матери в непрямом антиглобулиновом тесте, при
необходимости такие трансфузии повторяют каждые 2-3 нед.Гипербилирубинемия у плода, как правило, не возникает, так как билирубин
свободно проникает через плаценту и выводится организмом матери. У новорож¬
денного, напротив, наибольшую опасность представляет гипербилирубинемия,
поскольку она может привести к билирубиновой энцефалопатии.При несовместимости по антигенам эритроцитов сразу после рождения опреде¬
ляют группу крови (ABO), резус(В)-принадлежность, уровень гемоглобина и
билирубина в пуповинной крови. После внутриутробного заменного переливания
резус-принадлежность крови новорожденного может быть определена как Rh(D)-
отрицательная из-за присутствия в кровеносном русле большого количества
перелитых донорских эритроцитов. С эритроцитами новорожденного проводят
жшжт186ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯпрям)то пробу Кумбса; при положительной пробе определяют, к каким эритро¬
цитарным антигенам направлены антитела. При гипербилирубинемии (уровень
билирубина более 20 мкмоль/л у доношенных и 12-16 мкмоль/л у недоношен-
ных) применяют светолечение и заменное переливание крови. Для светолечения
используют ультрафиолетовый спектр, способствующий превращению билируби¬
на в водорастворимые продукты. Эритроциты, покрытые антителами, в некоторых
случаях разрушаются медленно, что может привести к анемии при отсутствии
гипербилирубинемии даже через 3-6 нед после рождения.Гемолитическая болезнь новорожденных, вызванная несовместимостью по
антигенам системы ABO, может возникнуть даже у ребенка, рожденного от первой
беременности. Иногда в первые сутки жизни появляется желтуха, причем гемолиз
бывает выражен интенсивнее, чем при несовместимости по антигенам системы
Резус. Прямая проба Кумбса с эритроцитами новорожденного отрицательна или
слабо положительна. Антитела, элюированные с эритроцитов новорожденного,
агглютинируют эритроциты доноров с группами крови А (П) или В (П1) и АВ (IV).
В мазке крови новорожденного выявляют сфероциты, иногда фрагментированные
эритроциты. Гемолитическую болезнь новорожденных, вызванную несовмести¬
мостью по антигенам системы АБО, бывает трудно отличить от наследственного
микросфероцитоза. Если необходимо заменное переливание, то используют эри¬
троцитсодержащие гемокомпоненты группы о (I), индивидуально подобранные по
сыворотке крови матери, и плазму группы АВ (IV). Интенсивное раннее лечение
позволяет снизить риск осложнений.Риск иммунизации антигеном D системы Резус в процессе беременности
существенно снижается, если резус-отрицательной матери с отсутствием анти¬
тел вводят иммуноглобулин анти-резус(В). Первично его назначают в конце
II триместра беременности, второй раз — в первые 72 ч после рождения резус(П)-
положительного ребенка. Антирезусный иммуноглобулин также необходимо вво¬
дить после аборта и амниоцентеза.Иммуногематологические исследования в акушерстве и неонатологии играют
большую роль как для обеспечения безопасности гемокомпонентного лечения,
так и для диагностики гемолитических процессов. Их правильное и своевременное
выполнение дополнит и подтвердит клинический диагноз, а также позволит про¬
контролировать адекватность лечебных мероприятий. Все беременные должны
проходить плановые иммуногематологические исследования с целью выявления
конфликта по эритроцитарным антигенам между матерью и плодом, определе¬
ния риска развития гемолитической болезни плода и новорожденного и воз¬
можной профилактики резус-сенсибилизации. Определение группы крови по
системе ABO перекрестным методом и резус(О)-принадлежности выполняют
два раза в процессе беременности (рис. 18-1). Обязательно выявление слабых
вариантов антигена D (D“). При обнаружении слабых вариантов антигена D“
резус-принадлежность беременных считают отрицательной, но назначение имму¬
ноглобулина анти-резус (D) противопоказано. Скрининг аллоиммунных анти¬
тел к антигенам эритроцитов производят независимо от резус-принадлежности
беременной не реже 1 раза в триместр. Скрининг антиэритроцитарных аллоан¬
тител проводят в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямой реакции Кумбса),
Обязательно проведение скрининга антител перед назначением иммуноглобули¬
на анти-резус КЬ(В)-отрицательным женщинам, как в процессе беременности,
так и после родов и абортов. При обнаружении антител специфичности анти-D
назначение иммуноглобулина анти-резус (D) противопоказано. Обнаружение
антиэритроцитарных аллоантител — показание к определению их титра и назна¬
чению повторных исследований (не реже 1 раза в месяц) в течение беременности
для определения динамики титров антител и прогноза развития гемолитической
болезни плода и новорожденного. Если обнаружена несовместимость крови бере¬
ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ187менной и биологического отца ребенка по антигенам системы ABO и есть указания
на наличие гемолитической болезни новорожденного по системе ABO в анамнезе,
то целесообразно определение титров иммунных антител (IgG) системы ABO в
динамике по аналогичной схеме (см. рис. 18-1). Важно учитывать, что гемолити¬
ческая болезнь новорожденного при несовместимости по системе ABO характерна
не только для новорожденных от матерей группы О (I), но и от матерей группы
А (II) и В (III). При несовместимости, когда мать и отец имеют группу А (II) и В
(III), отмечают преобладание тяжелых степеней гемолитической болезни ново¬
рожденного, требующих срочного заменного переливания для лечения.Наличие антиэритроцитарных аллоантител — признак возможного конфликта
матери и плода по антигенам эретроцитов, а увеличение титра антител определен¬
ной специфичности в динамике с большой вероятностью указывает на иммуноло¬
гический конфликт при данной беременности. При этом необходимо учитывать
не абсолютную величину титра антител, а только динамику. Титром антител
называют последнее разведение сыворотки, в котором обнаруживают антитела.
Соответственно такие разведения, полученные в различных лабораториях и раз¬
личными методами, могут существенно различаться. Это зависит прежде всего
от чувствительности и специфичности используемых лабораторных методик.
Сравнивать можно только значения титра, полученные в одном и том же мето¬
де определения, но с учетом того, что определенная ошибка может находиться
и в пределах погрешности метода. По этой причине достоверным изменением
величины титра принято считать его снижение или увеличение более чем на две
ступени.в случае выявления аллоиммунных антител, при выполнении заменных транс¬
фузий индивидуальный подбор по антигенам эритроцитов необходим беременной
и плоду (новорожденному), при необходимости внутриутробных переливаний
плоду выбирают эритроцитсодержащие гемокомпоненты группы О (I), совмести¬
мые в индивидуальном подборе по антигенам эритроцитов с сывороткой матери,Рис. 18-1. Антенатальный скрининг антител.
1эШ188ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯдаже если предварительному исследованию на группу крови (АБО) подвергался
образец крови плода, полученный методом кордоцентеза. Антитела системы ABO
у новорожденных могут частично или полностью отсутствовать, Б этих случаях
заключение о групповой принадлежности делают по антигенам эритроцитов.
Верификацию подгруппы антигена А у детей до 18 мес не производят. При обнару¬
жении слабых вариантов антигена А у новорожденных для трансфузий выбирают
эритроцитсодержащие гемокомпоненты без антигена А.Во избежание ошибок при определении групповой (ABO) и резус-принадле¬
жности новорожденных из образца пуповинной крови необходимо исключить
химеризм по антигенам эритроцитов (наличие двух популяций эритроцитов, одна
из которых принадлежит матери, а другая — ребенку). Если выявляют химеризм,
то определение необходимо повторить из образца крови, взятого непосредственно
у новорожденного. Определение антител, фиксированных на эритроцитах (прямая
реакция Кумбса), выполняют новорожденным при подозрении на гемолитиче¬
скую болезнь. Положительный результат прямой реакции Кумбса подтверждает
гемолитический конфликт, отрицательный же его не исключает. Скрининг алло¬
иммунных антител к антигенам эритроцитов проводят для установления причин
гемолитической болезни и разработки точных рекомендаций по выбору гемо-
компонентов для возможных трансфузий. Одновременно необходимо определять
антитела в сыворотке крови матери. Обнаружение антиэритроцитарных аллоан¬
тител — показание к определению их специфичности (идентификации), В этом
случае новорожденный нуждается в индивидуальном подборе эритроцитов для
заменных переливаний по сыворотке матери и собственной сыворотке крови.Иммунные гемолитические анемииВ норме время жизни эритроцитов составляет 90-120 дней. При гемолизе,
связанном с повреждением эритроцитов, оно укорачивается. Причинами гемо¬
лиза могут быть как дефекты эритроцитов, так и внешние воздействия. Диагноз
гемолитической анемии основан на совокупности клинических данных и лабо¬
раторных показателей: содержание гемоглобина; гематокрит; количество рети-
кулоцитов; морфология эритроцитов; концентрация билирубина, гаптоглоби-
на; активность лактатдегидрогеназы; определение времени жизни эритроцитов.
Иммуногематологические исследования помогают определить, имеет ли гемолиз
иммунную природу, а при ее подтверждении отнести иммунную анемию к опреде¬
ленному типу. Иммунный гемолиз обусловлен выработкой антител к эритроци¬
тарным антигенам с последующим разрушением эритроцитов фагоцитозом или за
счет активации комплемента. Иммунный гемолиз может быть вызван антителами
как аллогенной, так и аутологичной природы, а в некоторых случаях — антитела¬
ми к лекарственным препаратам. Другие причины гемолиза, которые важны при
дифференциальной диагностике иммунных гемолитических анемий: врожденные
дефекты мембраны эритроцитов; механическое повреждение эритроцитов (напри¬
мер, при микроангиопатии); инфекции; врожденная недостаточность ферментов
эритроцитов (гемоглобинопатии). Типичные примеры аллоиммунных гемолити¬
ческих анемий — посттрансфузионные реакции и осложнения гемолитического
типа, гемолитическая болезнь плода и новорожденного.Аутоиммунные гемолитические анемии — заболевания, при которых аутоан¬
титела к антигенам эритроцитарной мембраны укорачивают время жизни как
собственных, так и перелитых эритроцитов. Причины выработки аутоантител к
эритроцитам:❖	фиксация гаптена (например, лекарственного средства) или высокомолеку¬
лярных антигенов (например, бактериальных) на эритроцитах;❖	нарушение функции Т-супрессоров;
íliMiИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ189❖	изменение структуры эритроцитарных антигенов;^ перекрестные реакции между бактериальными и эритроцитарными антиге¬
нами;❖	нарушение функции В-лимфоцитов, характерное для гемобластозов и колла-
генозов.Б зависимости от антиэритроцитарных аутоантител выделяют три группы этого
заболевания; тепловую аутоиммунную гемолитическую анемию, болезнь холодо-
вых агглютининов и пароксизмальную ночную гемоглобинурию.В лабораторной диагностике аутоиммунных процессов большую роль играют
иммуногематологические исследования, связанные с выявлением и определением
характеристик аутоантител. Эти исследования, конечно, не могут объяснить при¬
роду аллоиммунизации, но их с успехом в течение многих лет применяют совмест¬
но с клиническими данными для определения типа аутоиммунной гемолитической
анемии и выбора оптимальной тактики лечения. В табл. 18-2 обобщены основные
виды иммуногематологических исследований, применяемых для диагностики
аутоиммунного гемолиза.Таблица 18-2. Иммуногематологические особенности аутоиммунных гемолитических анемийТип аутоиммунной гемолитической анемииОсобенноститепловаяболезнь ХОЛОДОВЫХ
агглютининовпароксизмальнаяночнаягемоглобинурияОптимальная температу¬
ра выявления ІП vitro37 ”С0-4 °С0-4 °с — фиксация
антител;37 "С — гемолизКласс иммуноглобу¬
линовПреимущественно IgG,
редко IgA, IgMIgMIgGРезультат ПАГТigG, реже СЗ0303Специфичность антиге¬
нов, к которым выявля¬
ются антителаСистемы Резус, Келл, LW,
и, Еп», Wr'1РТип антителНеполные. Чаще поликло¬
нальные. реже монокло¬
нальныеАгглютинины, иногда гемо¬
лизины. Моноклональные
при первичной форме
болезни, поликлональные —
при вторичнойДвухфазныегемолизины.ПоликлональныеНаиболее характерные
иммуногематологиче¬
ские особенностиНаличие ауто- и алло¬
антител. Трудности
индивидуального подбора
эритроцитовСпонтанная холодовая
агглютинация эритроцитов в
образце кровиАнтитела Доната-
ЛандштейнераИММУНОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
Методы исследования антигенов эритроцитов
и антиэритроцитарных антителПри выполнении иммуногематологических исследований обязателен ежеднев¬
ный внутрилабораторный контроль качества, а также участие во внешнем контро¬
ле качества выполняемых исследований.Определение группы крови по системе ABOПрямая реакция с моноклональными антителами (изогемагглютинирующими
сыворотками).
190ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯПерекрестный метод с моноклональными антителами (изогемагглютинирую¬
щими сыворотками) и стандартными эритроцитами В, 0.Прямая и/или перекрестная реакция в гелевом тесте.Прямая и/или перекрестная реакция в микропланшетной технологии.Определение резус-принадлежности (антиген D)Реакция прямой агглютинации с моноклональными антителами анти-D.
Реакция с универсальным реагентом анти-резус (D).Реакция конглютинации с 10% раствором желатина.Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса).Реакция с моноклональными антителами в гелевом тесте.Реакция с моноклональными антителами в микропланшетной технологии.Типирование антигенов эритроцитовРеакция прямой агглютинации с моноклональнь[ми антителами соответствую¬
щей специфичности.Реакция конглютинации с 10% раствором желатина и антителами соответ¬
ствующей специфичности.Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса).Реакция с моноклональными антителами в гелевом тесте.Реакция с моноклональными антителами в микропланшетной технологии.Скрининг аллоиммунных антиэритроцитарных антителНепрямой антиглобулиновый тест (пробирочная или гелевая методика) с
панелью стандартных эритроцитов, состоящей не менее чем из трех видов кле¬
ток, типированных по всем клинически значимым антигенам. Применение пула
(смеси) случайных образцов эритроцитов для скрининга антиэритроцитарных
антител не допускается.Идентификация аллоиммунных антиэритроцитарных антителНепрямой антиглобулиновый тест (пробирочная или гелевая методика) с пане¬
лью стандартных эритроцитов, состоящей не менее чем из десяти видов клеток,
типированных по всем клинически значимым антигенам,Типирование антигена (или антигенов) эритроцитов реципиента, к которому
предположительно обнаружены антитела.Идентификацию антител считают завершенной при соответствии результатов
реакций с панелью эритроцитов результатам фенотипирования эритроцитов
исследуемого образца крови.Определение иммунных антител системы ABOНепрямой антиглобулиновый тест (пробирочная или гелевая методика) со
стандартными типированными эритроцитами А^ и/или В после разрушения есте¬
ственных антител 5% раствором унитиола или прогреванием при 70 '“С.Определение аутоантителПрямой антиглобулиновый тест (пробирочная или гелевая методика).ИММУНОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТЕРАПИИ КОНЦЕНТРАТОМ
ТРОМБОЦИТОВТромбоциты — носители антигенов системы ABO, системы HLA {Human Leukocyte
Antigens) I класса, a также специфических тромбоцитарньгх антигенов системы
НРА {Human Platelet Antigens).HLA-система человека — комплекс гликопротеиновых молекул, которые экс¬
прессируются на поверхности большинства ядросодержащих клеток; это наиболее
полиморфная из всех известных антигенных систем. HLA-антигены локализованы
жИММУНОГЕМАТОЛОГИЙ191на гликопротеинах клеточной мембраны, кодированных тесно сцепленными гена¬
ми, расположенными в сегменте р21,3 короткого плеча хромосомы 6. Комплекс
состоит из нескольких классов, разделенных более чем на 250 локусов (генов и
псевдогенов), 21 из которых прямо связаны с трансплантацией. Локусами кодиру¬
ются около 900 аллелей I и II классов. Антигены HLA играют важнейшую роль в
регуляции иммунного ответа на чужеродные антигены и сами являются сильными
антигенами.В настоящее время широко используют две номенклатуры системы HLA:
старая основана на результатах иммунологических реакций, таких как серологи¬
ческое типирование или смешанная культура лейкоцитов in vitro', новая исполь¬
зует молекулярно-биологические данные о специфических последовательностях
нуклеотидов в аллелях.Иммунологическая номенклатура включает название системы (HLA); локус, к
которому принадлежит данный антиген, обозначают большими буквами латин¬
ского алфавита (А, В, С, DR, DP, DQ); цифра обозначает непосредственно антиген
(HLA-A^, HLA-B,).Подобрать донора, полностью совместимого с реципиентом по антигенам
системы HLA, очень сложно, поскольку число комбинаций, составленных более
чем из 100 антигенов этого семейства, чрезвычайно велико. Вероятность найти
полностью совместимого донора составляет от 1:1000 до 1:1 ООО ООО в зависимо¬
сти от распространенности того или иного антигена HLA. Вероятность подбора
полностью совместимого донора среди родных братьев и сестер составляет 1:4; это
связано с тем, что гены HLA наследуются по законам Менделя.Система НРА диаллельна; имеет аллели «а*^ и «Ь» и состоит из 16 локусов —
HPA-1-HPA-14W, 15,16w. В настоящее время изучено молекулярное строение всех
32 генов НРА, входящих в новую номенклатуру, в то время как антигенов системы
НРА открыто только 22. Это связано с тем, что в локусах HPA-6w-HPA-14w, 16w
серологически можно определить только редко встречающиеся антигены аллеля
«Ь»; к часто встречающимся антигенам аллеля «а» антисыворотки до настоящего
времени не получены. Расшифровка молекулярной структуры генов НРА стала
возможной благодаря использованию метода полимеразной цепной реакции
(ПЦР).Популяционные различия людей по антигенам систем HLA и НРА способствуют
аллоиммунизации пациентов при проведении трансфузионного лечения компо¬
нентами крови, прежде всего тромбоцитами. Переливание концентрата тромбоци¬
тов — эффективный метод лечения и профилактики геморрагических осложнений,
обусловленных снижением числа тромбоцитов в периферической крови вслед¬
ствие аплазии кроветворения или их дисфункцией. Отсутствие скорректирован¬
ного посттрансфузионного прироста тромбоцитов через 18 ч после их трансфузии
называют рефрактерностью. Рефрактерность может быть обусловлена как имму¬
нологическими, так и неиммунологическими причинами. Неиммунологическая
рефрактерность связана с повышенным потреблением тромбоцитов, неадек¬
ватно пополняемым при их переливании, что происходит при кровотечениях
различной локализации, лихорадке, тромбофлебите, сепсисе, спленомегалии.
Иммунологическая рефрактерность к трансфузиям концентрата тромбоцитов обу¬
словлена антителами, выработанными в результате несовместимости по антигенам
систем ABO, HLA и НРА реципиентами в ответ на переливание соответствующих
антигенов доноров. Аллоиммунизация пациентов, являясь основной причиной
развития иммунологических реакций негемолитического типа, в том числе и
иммунологической рефрактерности, может привести к полному отсутствию кли¬
нического эффекта от переливания тромбоцитов. К счастью, состояние иммуноло¬
гической рефрактерности возникает редко.
192ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯОсновной метод профилактики — соблюдение принципа совместимости кон¬
центрата тромбоцитов с реципиентом по системе ABO. При этом желательно
учитывать также резус(О)-принадлежность крови, из которой были получены
тромбоциты. Наличие в тромбоконцентрате примеси эритроцитов может привести
к аллоиммунизации и выработке антител к антигену D. Наибольшую роль в разви¬
тии рефрактерности отводят антигенам системы HLA. Полагают, что возникнове¬
ние признаков рефрактерности при переливании ABO-совместимых тромбоцитов
обусловлено в первую очередь аллоантителами специфичности анти-HLA (А) или
(В). При этом обеспечение реципиента концентратом тромбоцитов от доноров,
совместимых по этим антигенам, позволяет добиться желаемого эффекта от транс¬
фузий. Достаточно часто встречают и сочетанную аллоиммунизацию антигенами
систем HLA и НРА. Лишь малая толика в развитии иммунологической рефрактер¬
ности к трансфузиям концентрата тромбоцитов принадлежит несовместимости
собственно по антигенам тромбоцитов системы НРА.Ввиду трудности подбора совместимых доноров при развитии рефрактерности
к трансфузиям концентрата тромбоцитов целесообразно осуществлять плановое
HLA- и НРА-типирование доноров тромбоцитов для создания банков данных.
Подобные данные являются подчас единственной возможностью для больного с
рефрактерностью найти совместимого донора концентрата тромбоцитов.
Глава 19Цитокины в лабораторной
диагностикеОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ЦИТОКИНАХЦитокины — эндогенные полипептидные и белковые медиато¬
ры межклеточного взаимодействия, регулирующие эмбриональное
развитие, некоторые нормальные физиологические функции орга¬
низма, защитные реакции при внедрении патогенов и при развитии
опухолей, формирование аллергических, аутоиммунных и иных
иммунопатологических процессов и восстановление поврежденных
тканей при травмах. Именно поэтому совершенно очевидно, что
цитокиновая регуляция имеет огромное значение и в норме, и при
патологии. Известно более 200 индивидуальных веществ, принад¬
лежащих к семейству цитокинов: интерфероны, интерлейкины с
исторически сложившимися порядковыми номерами, ростовые и
колониестимулирующие факторы, хемокины, медиаторы из группы
фактора некроза опухолей, трансформирующие ростовые факторы
и некоторые другие молекулы.Учение О цитокинахСовременное учение о цитокинах имеет четыре независимых
источника.Первый и наиболее важный источник - учение о лимфокинах.
Это направление активно развивалось в середине 1960-х гг., когда
было показано, что белки, продуцируемые лимфоцитами, регули¬
руют рост и функцию различных лейкоцитов. Начало учению о
лимфокинах было положено исследованиями, демонстрирующими
способность супернатантов, полученных от сенсибилизированных
лимфоцитов после их стимуляции специфическим антигеном, угне¬
тать миграцию нормальных макрофагов. Фактор, ответственный за
это, был назван фактором угнетения миграции макрофагов (mac¬
rophage migration inhïbîtory factor), В дальнейшем был введен термин
«лимфокин», означающий растворимые клеточные факторы, кото¬
рые продуцируются сенсибилизированными лимфоцитами во время
их взаимодействия со специфическим антигеном и ответственны за
развитие клеточно-опосредованных иммунологических реакций.
Примером классического лимфокина может быть интерлейкин-2
(IL-2), играющий центральную роль в регуляции роста и функции
Т-клеток. Затем показано, что лимфоциты могут продуцировать
194 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕодин или несколько митогенных факторов для дрз^'их лимфоцитов. Так, митоген-
активированные мононуклеары человека продуцируют фактор, поддерживающий
Т-лимфоцитов. Этот фактор в настоящее время известен как IL-2. Однако
вскоре выяснилось, что моноциты также являются источником белков (моно-
кинов), которые могут модулировать функции лейкоцитов. Первый цитокин
моноцитарно-макрофагального происхождения — фактор некроза опухоли {tumor
necrosis factor - TNF). Кроме прямого цитотоксического эффекта по отношению к
некоторым опухолевым клеткам in vitro, TNF обладает множеством других биоло¬
гических эффектов в отношении различных лейкоцитов и тканевых клеток. Среди
первых цитокинов моноцитарного происхождения был описан фактор актива¬
ции лимфоцитов {lymphocyte activating factor), известный в настоящее время как
интерлейкин-1 (IL-1). Другие исследователи описали этот же фактор под такими
названиями, как митогенный белок, лейкоцитарный пироген, эндогенный пиро-
ген, фактор, активирующий Б-клетки, эндогенный медиатор лейкоцитов и др.Второй источник — учение об интерферонах. Интерферон впервые был описан
как фактор, который продуцируется вирусиндуцированными клетками, способ¬
ными вызывать клеточную резистентность к вирусным инфекциям. Затем был
открыт вирус-ингибирующий белок {interferon gamma — IFN7), продуцируемый
митоген-активированными Т-лимфоцитами, IFN7, продуцируемый Т-клетками
и естественными киллерами, по структуре полностью отличается от большого
семейства IFNa/ß, продуцируемого множеством различных клеток: моноцитами,
естественными киллерами, В-лимфоцитами, различными негемопоэтическими
клетками. Интерфероны были определены как факторы роста и дифференцировки
клеток иммунной системы и клеток других систем организма человека. В резуль¬
тате граница между лимфокинами/монокинами и интерферонами стала размытой,
сегодня понятно, что интерфероны — это цитокины.Третьим источником являются факторы роста гемопоэтических клеток (коло¬
ниестимулирующие факторы; colony-stimulationgfactors — CSF). Их основной функ¬
цией является обеспечение пролиферации и дифференцировки гемопоэтических
клеток, а название отражает способность формировать гранулоцитарные или
моноцитарные колонии. Эти факторы также регулируют некоторые функции зре¬
лых клеток, что размывает границы между ними и лимфокинами/монокинами.Наконец, четвертым источником являются факторы роста негемопоэтических
клеток: фактор роста, продуцируемый тромбоцитами (platelet-derived growth fac¬
tor — PDGF), эпидермальный {epidermal growth factor — EGF) и фибробластный
{ßbroblast growth factor — FGF) факторы роста, трансформирующий фактор роста
{tran^>rming growth factor ^ — TGFß).Как упоминалось выше, лимфокинами называют продукты сенсибилизиро¬
ванных лимфоцитов при воздействии на них специфического антигена. Однако
в связи с тем, что со временем способность продуцировать аналогичные факторы
была обнаружена и у других типов клеток, термин «лимфокины» было предложе¬
но заменить на «цитокины». Кроме того, в 1979 г. на Втором международном сове¬
щании по лимфокинам был утвержден термин «интерлейкины» для растворимых
белков, обеспечивающих взаимодействие между различными популяциями лейко¬
цитов. В качестве первого шага на Совещании были приняты IL-1 и IL-2, которые
ранее имели множество различных названий. Несмотря на то, что множество
цитокинов относятся к семейству интерлейкинов, часть факторов сохраняют свои
старые названия, отражающие лишь одну из функций этих плейотропных агентов:
CSF, IFN, TNF и т,д. Таким образом, цитокины — регуляторные белки, секретируе-
мые лейкоцитами крови и другими клетками организма человека, плейотропные
эффекты которых включают регуляцию клеток иммунной системы и модуляцию
воспалительной реакции.
шшЦИТОКИНЫ в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 195Цитокины имеют ряд общих биохимических И функциональных характери¬
стик, отличающих их от других классов регуляторных молекул, среди которых
важнейшими считаются следующие: характерные биохимические свойства (цито¬
кины представляют собой белки или полипептиды с молекулярной массой от 5 до
50 кДа), проявление биологической активности в пикограммовых концентрациях,
отсутствие тканевой и антигенной специфичности, плейотропность и взаимозаме¬
няемость биологического действия, проведение сигнала путем взаимодействия со
специфическими клеточными рецепторами, формирование цитокиновой сети. В
связи с этим цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему
регуляции, существующую наряду с нервной и эндокринной системами поддержа¬
ния гомеостаза, причем все три системы тесно взаимосвязаны и взаимозависимы.ШёХарактерные признаки цитокинов•	В основном цитокины — простые белки или гликопротеины с молекулярной
массой до 30 кДА; лишь некоторые цитокины являются олигомерами с высо¬
кой молекулярной массой.•	Продукция цитокинов регулируется разли’шыми индукторами на уровне
транскрипции или трансляции.•	Продукция цитокинов кратковременна, а радиус действия обычно короткий
(типичное действие аутокринное или паракринное, но не эндокринное).•	Цитокины реализуют свои эффекты через специфические высокоаффинные
рецепторы с К(1=10'’-10^^ м.•	Фенотипически действие цитокинов приводит к повышению (или к сниже¬
нию) скорости клеточной пролиферации, к изменению клеточной дифферен¬
цировки и проявлению различных функций соматических клеток.•	Хотя набор биологических эффектов различных цитокинов может разли¬
чаться, мишенями для большинства цитокинов являются гемопоэтические
клетки.В табл. 19-1 представлены отличительные признаки гормонов и цитокинов.Таблица 19-1 Отличительные признаки гормонов и цитокиновХарактеристикаГормоныЦитокиныКлетки-продуцентыСпециализированныеРазличные типы клетокЭффектыХарактерные для каждого
гормонаСтруктурно различные цитокины обладают сходными
биологическими эффектамиКлетки-мишекиСтрого определенныеДля одного цитокина различные типы клетокРадиус действияБольшой (эндокринный тип
действия)Короткий (аутокринный или паракрииный тип дей¬
ствия)Как следует из вышесказанного, цитокины и гормоны имеют много общего,
однако между ними есть существенные отличия. Классические гормоны про¬
дуцируются специализированными клетками: например, инсулин продуцируется
р-клетками поджелудочной железы, гормон роста — гипофизом, паратгормон —
паращитовидными железами и т.д. Цитокины, наоборот, выделяются менее специ¬
ализированными клетками. Кроме того, различные типы клеток могут синтезиро¬
вать один и тот же црггокин. Например, IL-1 продуцируют моноциты, макрофаги,
мезангиальные клетки, естественные киллеры (NK-клетки), Т- и В-лимфоциты,
нейтрофилы, эндотелиальные клетки, мышечные клетки, фибробласты, астроци-
ты, клетки микроглии. Однако существуют исключения: IL-2, IL-5 и лимфотоксин
продуцируются исключительно Т-лимфоцитами. Одно из основных отличий цито¬
кинов от гормонов — это наличие у цитокинов. имеющих структурное сходство,
принципиально различных биологических эффектов (например, TNF-a и TNF-p;
ш1 196 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ1Ь-1[3 и 1Ь-1р). Кроме того, один и тот же цитокин проявляет многообразные био¬
логические эффекты по отношению к различным клеткам-мишеням (табл. 19-2).Таблица 19-2. Основные характеристики действия цитокиновХарактеристикаПлейотропностьИзбыточность эффектовСинергизм/антагонизмЦитокиновый каскадМодуляция рецепторовКомментарииБольшинство цитокинов имеют много клеток-мишенейОдин цитокин имеет множество биологических эффектовОдновременное влияние на клетки двух или нескольких цитокинов может при¬
вести к качественно различным эффектамЦитокины могут повысить (или снизить) продукцию других цитокиновЦитокины могут повысить (или снизить) экспрессию рецепторов для других
цитокиновНесмотря на некоторые различия, цитокины, факторы роста и гормоны форми¬
руют большое семейство внеклеточных сигнальных молекул со сходным механиз¬
мом действия. Так, рецепторы для некоторых цитокинов и гормонов [IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий
фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF),
эритропоэтин, про л актин, гормон роста] имеют сходную структуру. Также струк¬
турная гомология была описана для рецепторов к PDGF и макрофагальному коло¬
ниестимулирующему фактору (M-CSF). Более того, сходные механизмы обеспечи¬
вают передачу сигнала от рецепторов (к гормонам, факторам роста, цитокинам) к
клеточному ядру и приводят к сходным биологическим эффектам.Роль цитокинов в регуляции функций организма может быть разделена на
4 основные составляющие:•	регуляция эмбриогенеза, закладки и развития органов, в том числе органов
иммунной системы;•	регуляция отдельных нормальных физиологических функций;•	регуляция защитных реакций организма на местном и системном уровне;•	регуляция процессов регенерации тканей.Экспрессия генов отдельных цитокинов происходит стадиоспецифически на
определенных этапах эмбрионального развития. Факторы стволовых клеток,
трансформирующие ростовые факторы, цитокины семейства TNF и хемокины
регулируют дифференцировку и миграцию различных клеток и закладку органов
иммунной системы. После этого синтез некоторых цитокинов может не возобнов¬
ляться, тогда как другие продолжают регулировать нормальные физиологические
процессы или участвуют в развитии защитных реакций.Несмотря на то, что большинство цитокинов являются типичными индуци-
бельными медиаторами и в постнатальном периоде не синтезируются клетками
вне воспалительной реакции и иммунного ответа, некоторые из этих веществ не
подпадают под это правило, В результате конститутивной экспрессии генов часть
из них синтезируется постоянно и в достаточно больших количествах находится
в циркуляции, регулируя пролиферацию и дифференцировку отдельных типов
клеток в течение всей жизни, примером такого типа физиологической регуляции
функций цитокинами может быть постоянно высокий уровень эритропоэтина и
некоторых CSF для обеспечения гемопоэза.Цитокины, в первую очередь, регулируют развитие местных защитных реак¬
ций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соедини¬
тельной ткани и эпителиев. На тканевом уровне цитокины ответственны за
развитие воспаления, а затем регенерации тканей. При развитии системной
воспалительной реакции (острофазового ответа) цитокины оказывают влия¬
ние практически на все органы и системы организма, участвующие в регуляции
гомеостаза. Попадание цитокинов в циркуляцию, безусловно, означает, что мест¬
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 197ная защита не справилась с патогеном, требуется включение системной воспали¬
тельной реакции для предотвращения его распространения и развития сепсиса.
Регуляция защитных реакций организма цитокинами происходит не только в
рамках иммунной системы, но и на уровне целостного организма, где цитокины
осуществляют связь между иммунной, нервной, эндокринной, кроветворной
и другими системами и служат для их вовлечения в организацию и регуляцию
единой защитной реакции.Цитокины играют ключевую роль в регуляции врожденного иммунитета. Не
менее важное значение цитокины имеют в формировании и развитии реакций
специфического иммунитета, прежде всего связанных с регуляцией пролиферации
и дифференцировки Т- и Б-лимфоцитов. Сейчас не вызывает сомнения разделе¬
ние популяции Т-лимфоцитов на два принципиально разных класса: Т-хелперы
и цитотоксические Т-лимфоциты. Благодаря дальнейшим исследованиям функ¬
ций активированных антигеном Т-лимфоцитов хелперов выяснилось, что эта
популяция клеток также неоднородна и может быть разделена на подклассы по
функциональной активности. Эта активность связана, главным образом, с син¬
тезируемыми цитокинами. Оказалось, что Т-хелперы различаются между собой
именно набором продуцируемых цитокинов. Активация ТЫ, секретирующих IL-2
и IFNy, ведет к стимуляции, главным образом, функций Т-лимфоцитов и макро¬
фагов и к развитию клеточного типа ответа, тогда как синтез Th2 IL-4, IL-5, IL-10
и IL-13 стимулирует преимущественно гуморальное звено иммунитета. Защита
организма от внутриклеточных патогенов происходит с помощью формирования
клеточного иммунитета, зависимого от ТЫ, тогда как внеклеточные патогены
нейтрализуются и выводятся из организма благодаря гуморальному иммунитету,
поддерживаемому Th2.Направление антигензависимой дифференцировки Т-лимфоцита хелпера
зависит от присутствия в межклеточном пространстве цитокинов, синтезируе¬
мых, главным образом, антигенпредставляющими клетками и определяющими
путь дифференцировки активированных антигеном наивных Т-лимфоцитов в
разные типы Th клонов. У человека описаны, по крайней мере, 3 типа Th-клонов,
из них клоны Thl и Th2 почти полностью соответствуют аналогичным клонам
Т-лимфоцитов мышей. Дифференцировка ТЫ индуцируется IL-12, который син¬
тезируется макрофагами и дендритными клетками после взаимодействия моле¬
кулярных структур патогенов с толл-подобными рецепторами {toll-like receptors)
данных клеток. IL-12 взаимодействует со своими специфическими рецепторами
на ThO и запускает активацию сигнального пути с участием транскрипционного
фактора T-bet, являющегося основной внутриклеточной молекулой для диффе¬
ренцировки Thl.Th2 дифференцируются, главным образом, под действием IL-4, который может
синтезироваться базофилами и тучными клетками в ответ на проникновение в
ткани аллергенов, а также под действием цитокина ТСЛП (тимический стромаль¬
ный лимфопоэтин), синтезируемого эпителиальными клетками в коже и легких и
активирующего функции миелоидных дендритных клеток (ДК), в свою очередь
активирующих Th2. Интересно, что сам IL-4, синтезируемый Th2. является основ¬
ным фактором в определении дифференцировки стимулированных антигеном
наивных CD4+ (CD — cluster of differentiation) Т-клеток в Th2.Изучение активации Т-лимфоцитов хелперов человека привело к появлению
более сложной схемы развития Th-клонов. Выяснилось, что IL-23, еще один цито¬
кин семейства IL-12, ответственен за дифференцировку особого типа Th-клонов,
продуцирующих IL-17 и получивших название Thl7. Вместе с IL-23 в дифферен¬
цировке ТЫ? принимают участие IL-6, IL-la и IL-1|3. Цитокины семейства IL-17
стимулируют синтез ряда провоспалительных цитокинов макрофагами и за счет
этого усиливают воспалительную реакцию, изначально вызванную патогеном.
198 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕв последнее время описаны также клоны Th человека, дифференцирующиеся под
действием третьего члена семейства IL-12 — IL-27 и синтезирующие преимуще¬
ственно IL-10. Значение дифференцировки этих клонов при встрече с антигеном
может заключаться в негативной регуляции активации клонов Thl, Th2 и Thl7 и в
подавлении воспалительной реакции любого типа. Кроме того, существуют клоны
Th, относящиеся к естественно встречающимся регуляторным Т-лимфоцитам, экс¬
прессирующим поверхностные маркеры CD4, CD25 и транскрипционный фактор
РохРЗ. Дифференцировка этого типа Th, по-видимому, происходит в тимусе под
влиянием тимического стромального лимфопоэтина, секретируемого клетками
эпителия медуллярной зоны тимуса, а также IL-2, синтезируемого как в тимусе, так
и на периферии, хотя окончательная ясность в схеме дифференцировки регулятор¬
ных Т-лимфоцитов отсутствует.МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯСИСТЕМЫ цитокиновИзучение системы цитокинов как гп vivo, так и in vitro проводится в зависимости
от конкретных задач, стоящих перед лабораторией, и включает следующие основ¬
ные подходы.•	Генетический анализ на предмет отсутствия мутаций в генах цитокинов, их
рецепторов и белков внутриклеточных сигнальных систем запуска синтеза и
передачи сигнала.•	Анализ полиморфизма генов цитокинов.•	Изучение экспрессии генов цитокинов.•	Изучение уровня продукции цитокинов клетками в культуре.•	Определение концентраций цотокинов в биологических жидкостях.•	Изучение синтеза цитокинов на уровне отдельных клеток.•	Изучение синтеза цитокинов в тканях.Все перечисленные методы могут быть разделены на три основные группы,
появившиеся в следующем порядке по мере развития исследований системы цито¬
кинов и развития методологических подходов в целом:1)	методы оценки биологической активности цитокинов;2)	иммунохимические методы;3)	молекулярно-биологические методы.Биологические методыПервые эксперименты, приведшие к открытию и начальной характеристике
цитокинов, были связаны с изучением их биологической активности. Так, на
основании изучения противовирусной активности в культурах зараженных виру¬
сами фибробластов, был открыт интерферон. Несомненно, биологические мето¬
ды измерения уровня цитокинов являются очень ценными для исследователей.
Эти методы отличаются достаточно высокой чувствительностью и, с биологиче¬
ской точки зрения, являются более правильными, поскольку измеряют только
биологически активные формы цитокинов, а следовательно, наиболее адекватно
отражают работу системы цитокинов in vivo. В связи с этим уже в первые годы
изучения цитокинов были разработаны несколько тестов с использованием
первичных культур клеток для оценки разнообразных биологических функций.
Однако определение биологической активности цитокинов с использованием
первичных культур клеток не соответствовало одному из главных требований —
стандартизации методик анализа. Именно поэтому вскоре для биологического
тестирования многих цитокинов были получены длительно культивируемые
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 199трансформированные линии клеток, отвечавших на действие цитокинов изме¬
нением пролиферации, дифференцировки или функциональной активности
(табл. 19-3). Тем не менее во всех случаях стандартизация обеспечивается
сравнением биологического действия изучаемого цитокина с международными
стандартными образцами, выпускаемыми Международной лабораторией биоло¬
гических стандартов ВОЗ в Национальном инстит}?те биологической стандарти¬
зации и контроля (Великобритания), которая выпускает и рассылает по запросу
охарактеризованные по биологической активности стандартные образцы цито¬
кинов человека.Таблица 19-3. Клеточные линии и первичные культуры клеток для оценки биологической актив¬
ности ЦИТОКИНОВ (Meager, 2006, с дополнениями)ЦитокиныКлеточные линииТканевое проис¬
хождениеСпособ оценки актив¬
ностиДругие цитокины, актив¬
ные в данном тестеlL-1Первичные куль¬
турыТимоциты мышиПролиферацияIL-2,1L-6; 1L-4, TNF, видо¬
специфично0105ЛимфомаПролиферацияIL-2IL-2CTLL-2ЛимфомаПролиферацияIL-15, TGFßIL-3ТР-1Костный мозгПролиферацияIL-4, 5,9,13, GM-CSFIL-4CTLL-2ЛимфомаПролиферация, видо¬
специфичноIL-15, TGFßIL-6Б9МиеломаПролиферацияIL-11, IL-13IL-72Е8ЛимфомаПролиферация-IL-8Первичные куль¬
турыНейтрофилыМиграцияНекоторые CXC хемокиныIL-12К1Т-225Т-лимфомаПролиферацияIL-2, 4, 7,15, 21lL-18К6-1МиелолейкемияСинтез 1РМуIL-12, IL-21TNFL929ФибробластыЦитотоксичностьЛимфотоксинGM-CSFТР-1ЭритролейкемияПролиферацияIL-3, 4. 5. 9.13. ЭПОIFNaПервичные куль¬
турыФибробласты пупо¬
вины человекаАнтивирусная актив¬
ностьДругие типы IFN. видо¬
специфичноА-549, 209. Оаис11Карцинома легких,
глиобластома, лим¬
фомаАнтивирусная актив¬
ность, продукция белка
МхАIFN7А-549Карцинома легкихАнтивирусная актив¬
ностьДругие типы IFN,видо¬
специфичнотогКарцинома толстой
кишкиПодавление пролифе¬
рации-Как следует из табл. 19-3, большинство используемых в биологических тестах
клеточных линий не обладают строгой специфичностью в отношении одного
цитокина, а могут отвечать на действие еще некоторых медиаторов, что существен¬
но снижает специфичность определения биологической активности цитокинов
в культуральных средах и биологических жидкостях, где обычно одновременно
содержится несколько десятков цитокинов. в то же время эти клеточные линии
могут быть идеальным инструментом для оценки биологической активности
рекомбинантных цитокинов. Во многих лабораториях производят искусственные
клеточные линии, отвечающие на отдельные цитокины, путем трансфекции кле¬
ток генами рецепторов данных цитокинов. Трансфецированные клетки приобрета¬
ют способность специфически отвечать на действие низких концентраций нужных
цитокинов. Однако многие клетки экспрессируют рецепторы большого числа
цитокинов, поэтому метод не в состоянии обеспечить абсолютную специфичность
тестирования.ІІМжVi
шШшт.Л200 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕКлеточные линии, используемые для оценки уровня цитокинов человека,
имеют различное происхождение. Большинство таких линий получены от паци¬
ентов с лейкемией либо при лабораторно индуцированной лейкемии. Некоторые
цитокины человека не являются видоспецифичными, и для их изучения можно
использовать клеточные линии мышиного происхождения, уровень цитокинов
в образцах оценивается в основном по их способности стимулировать или инги¬
бировать пролиферацию клеток. Существует несколько способов измерения про¬
лиферации клеток:1)	подсчет клеток;2)	оценка синтеза ДНК по включению радиоактивно меченного тимидина.Альтернативой радиоизотопным методам служат методы оценки клеточногометаболизма как индикатора пролиферации, основанные на восстановлении раз¬
личных солей тетразолия.Кроме измерения пролиферативной активности для оценки уровня некоторых
цитокинов, таких как TNF, используют методы, основанные на цитотоксической
активности цитокинов. Здесь с помощью витальных красителей оценивают цито-
токсический эффект по отношению к некоторым клеточным линиям. Для оценки
интерферонового статуса используют методы, основанные на антивирусной актив¬
ности интерферонов. При этом используются различные клетки-мишени, зара¬
женные вирусом, на которых оценивается антивирусная активность интерферонов
путем визуальной оценки жизнеспособности клеток или с помощью витальных
красителей. Для оценки биологической активности хемокинов, в частности IL-8,
применяют методы хемотаксиса, где определяют их способность привлекать
клетки, измеряя при этом количество клеток, мигрировавших через мембрану
Бойдена, либо длину пробега клеток в агаре.В целом все методы оценки биологической активности цитокинов in vitro могут
быть объединены в 5 основных групп.1.	Оценка пролиферативной активности клеток (стимуляция или подавление).2.	Оценка цитотоксичности.3.	Определение экспрессии мембранных рецепторов, синтеза других цитоки¬
нов.4.	Оценка влияния на функциональную активность клеток, что всегда зависит
от типа клеток и от изучаемого цитокина, например оценка хемотаксиса либо
оценка завершенности фагоцитоза.5.	Оценка противоинфекционного действия, как в случае интерферона.Несмотря на очевидные достоинства, биологические методы имеют и ряд суще¬
ственных недостатков;❖	они являются трудоемкими и сложными в исполнении;требуют значительно больше времени до получения конечного результата;<)■ требуют особых стерильных условий и оборудования для постановки;❖	являются менее специфичными, чем иммунохимические методы.Иммунохимические методыБиологическая оценка активности цитокинов обладает целым рядом ограни¬
чений в области специфичности, воспроизводимости и точности (табл. 19-4).
в связи с этим определение уровней цитокинов в различных биологических
средах чаще всего проводят с использованием иммунохимических методов,
основанных на применении поликлональных, а в настоящее время, главным
образом, моноклональных антител, специфически взаимодействующих с моле¬
кулами цитокинов.
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 201Таблица 19-4. Сравнительный анализ методов определения цитокиновХарактеристикаБиологические методыИммунохимические методыЧто выявляетТолько биологически активные молекулыЧисло доступных эпитопов (биологиче-
ски активные и неактивные молекулы)СпецифичностьНедостаточная (биологические активности
различных цитокинов интерферируют):
необходимо подтверждать с помощью ней-
трализующих антителОчень высокаяИнтерференцияСпецифические и неспецифические натив¬
ные ингибиторы цитокинов, антицитокино-
вые антителаБелки сыворотки крови, компоненты
комплемента, антицитокиновые анти¬
тела. ревматоидный факторЧувствительностьВысокаяОчень высокаяТочностьНизкая (СУ может достигать 100%)Высокая (СУ в пределах 5-10%)Длительность1-4 дняНесколько часовИммунохимические методы чрезвычайно разнообразны и представлены сле¬
дующими видами методик количественного определения концентрации раство¬
римых цитокинов в различных биологических жидкостях.•	Иммуноферментный анализ в различных модификациях (ИФА; Enzyme-
linked Immunosorbent Assay — ELISA).•	Радиоиммунный анализ (РИА). Чувствительность метода достаточно высо¬
ка, но в последние годы радиоиммунологические методы используются все
реже и заменяются ИФА, чтобы избежать работы с изотопами и уйти от
использования дорогостоящих счетчиков радиоактивности.•	Мультиплексный иммунный анализ (МИА), позволяющий с помощью моно¬
клональных антител одновременно определять до 100 белков с использо¬
ванием флюоресцентных и других меток, в том числе с применением тех¬
нологии микрочастиц или микрошариков, покрытых антителами, а также
микрочипов {Bioplex, Multiplex analysis, Biochip Array Technolog). В этом
варианте несколько цитокинов анализируют с использованием одного био¬
чипа одновременно, что существенно экономит время и реагенты, однако
стоимость оборудования для проведения такого анализа пока еще слишком
высока.•	Цитофлюориметрические методы для анализа экспрессии поверхностных
молекул клеток (мембранных форм цитокинов и рецепторов цитокинов) и
определения цитокинов в цитоплазме клеток.•	Метод оценки продукции цитокинов единичными клетками в культуре
(ELISPOT).•	Иммуноцитохимия и иммуногистохимия для оценки содержания цитокинов
в цитоплазме клеток на мазках и на срезах тканей.ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗНаибольшее распространение получили иммуноферментные диагностические
тест-системы, позволяющие проводить количественный анализ содержания цито¬
кинов в любых биологических жидкостях и обладающие достаточно высокой
чувствительностью для определения уровней цитокинов у человека и живот¬
ных. Принцип работы большинства современных тест-систем заключается в
использовании «сэндвич*»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа
(рис. 19-1). Для реализации этого варианта используют два моноклональных
антитела с различной эпитопной специфичностью к определяемому цитокину.
Первое из этих антител иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверх¬
ность лунок) 96-луночного пластикового микропланшета стандартного формата
для постановки ИФА. На первом этапе анализа исследуемый образец вносится в
лунки, где происходит специфическое связывание определяемого антигена (цито-
IMfHтшШІИІІІ202 цитокины в лабораторной диагностикеRF-lgMa-animal IgGТвердая
фаза ИФАФлуоресцентно-
меченная
микрочастица
для МИАНормальная Ложноположительная Угнетение
реакция	реакция	реакцииРис. 19-1. Базовые принципы «сэндвич»-анализа на твердой фазе: А — слева ИФА, справа
микрочастицы: В — слева нормальная реакция, посередине — ложноположительная реакция
вследствие интерференции с ревматоидным фактором IgM класса, справа — угнетение реакции
путем блокирования сайтов связывания иммуноглобулинами животных.кина) моноклональными антителами, сорбированными на поверхности лунок.
После этого производится отмывка всего несвязавшегося с антителами материала
буфером с детергентом. Этот важный этап позволяет удалить все неспецифически
связывающиеся молекулы, но не влияет на специфическое высокоаффинное взаи¬
модействие антител с определяемым цитокином. На второй стадии анализа свя¬
завшийся цитокин взаимодействует со вторыми антителами, конъюгированными с
биотином. При этом количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально
количеству цитокина в исследуемом образце. На последней стадии анализа в лунки
вносят авидин'пероксидазу, взаимодействующую с биотином на вторых анти¬
телах. После этого в лунки вносят особый субстрат для фермента пероксидазы,
меняющий цвет под действием фермента, например тетраметилбензидин, в резуль¬
тате чего происходит ферментативная реакция и окрашивание раствора в лунках.
Возможно также использование наборов из трех антител, когда вторые антитела
(например, поликлональные кроличьи антитела к цитокину) на последнем этапе
взаимодействуют с антивидовыми антителами, конъюгированными с ферментом.
В результате образуется «сэндвич» из двух или трех антител и молекулы антигена
между ними.Количественную оценку концентрации цитокина в пробах проводят, сравнивая
результаты с калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора
от концентрации стандартного образца цитокина. Иммуноферментные методы
высокоспецифичны, быстры (время постановки иммуноферментного анализа
составляет менее 5 ч) и относительно просты в исполнении. Порог чувсгвительно-
сти для таких тест-систем достигает 0,5 пкг/мл. В настоящее время в России широ¬
ко доступны коммерческие варианты иммуноферментных систем для определения
широкого спектра цитокинов.Большинство иммуноферментных тест-систем адаптированы для работы с
любыми биологическими жидкостями. Для измерения уровней цитокинов на
системном уровне используют сыворотку или плазму крови. Несмотря на короткий
(минуты) период жизни и индуцибельный тип синтеза большинства цитокинов, в
сыворотках крови здоровых доноров иногда определяются незначительные уров¬
ни цитокинов. Обычно их концентрации находятся на пределе чувствительности
иммуноферментного метода, но при различных заболеваниях, связанных с острой
или хронической продукцией цитокинов, сывороточные уровни цитокинов ста¬
новятся значительно выше. Однако, поскольку цитокины являются локальными
медиаторами, более целесообразно измерять их уровни в интересующих исследо¬
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 203вателя тканях после экстракции тканевых протеинов in vitro или в биологических
жидкостях, при развитии воспаления, аллергии или аутоиммунных процессов зна¬
чимые уровни цитокинов мог^т быть определены в слезной жидкости, жидкости
десневых карманов, смывах из полостей, моче, спинномозговой жидкости и даже
в конденсате вьщыхаемого воздуха.Анализ данных определения цитокинов показывает, что благодаря исполь¬
зованию различных реагентов в ИФА и различиям в протоколах исследования,
в разных лабораториях могут получаться не вполне сопоставимые результа¬
ты, даже если при этом используют одни и те же международные стандарты.
Подобные различия можно объяснить использованием в тест-системах разных
пар антител. Используемые в ИФА тест-системах антитела могут связываться
с одними и теми же цитокиновыми молекулами, однако антитела могут не рас¬
познавать фрагменты цитокиновых молекул или их формы-предшественники.
Для создания антител обычно используют рекомбинантные формы цитокинов,
которые могут отличаться от естественных форм. Это может приводить к раз¬
личиям в аффинитете связывания определяемых молекул с разными антителами.
И хотя, как считается, ИФА является «золотым стандартом» для определения
цитокинов, в настоящее время возможность определения таких сигнальных
молекул с помощью этого метода ограничена. Это, прежде всего, касается одно¬
временного исследования уровней большого числа цитокинов для более полной
характеристики цитокиновой регуляции различных биологических процессов в
норме и при патологии.Таким образом, основными достоинствами ИФА являются:❖	высокая специфичность;высокая чувствительность (низкий предел детекции);❖	хорошая воспроизводимость;❖	относительно низкая себестоимость анализа;❖	достаточно большой срок годности наборов.С другой стороны, к основным недостаткам ИФА следует отнести:^ возможность исследования только одного параметра;достаточно большой объем исследуемого образца (100-200 мкл и в дублях —
200-400 мкл);❖	относительно продолжительную процедзфу выполнения анализа (протокол
опыта включает достаточно большое число этапов инкубации, отмывок, при
этом ручной труд способствует повышению вероятности погрешностей в
постановке ИФА тест-систем);❖	сложности, связанные с динамическим рядом определения параметров
(калибровочные кривые) и с интерпретацией данных, превышающих разре¬
шающую способность калибровочного графика.МУЛЬТИПЛЕКСНЫЙ ИММУННЫЙ АНАЛИЗДля оценки уровней цитокинов в различных биологических жидкостях наи¬
более распространенными методами мультиплексного иммунного анализа (МИА)
являются мультиплексные методы, в основе которых лежит «сэндвич»-метод в
разных комбинациях — FAST Quant, Search Light и xMAP. Каждый из этих методов
имеет некоторые различия по ряду параметров: определение доступных аналитов,
возможность использования новых аналитов, динамический ряд оценки, чувстви¬
тельность метода, стоимость оборудования, цена расходных материалов.Все эти критерии следует учитывать при выборе метода исследования уровней
цитокинов. Поскольку результаты определения биологически активных веществ
в каждом методе могут существенно различаться, считается, что проводить ста¬
тистический анализ данных, полученных с помощью разных методов, нецеле¬
сообразно. Для каждого отдельного исследования следует выбирать только одну
204 цитокины в лабораторной диагностикекакую-нибудь технологию для того, чтобы полуденные данные и выводы были
репрезентативными и соответствовали требованиям доказательной медицины.Измерение уровня одного какого-либо цитокина для характеристики различ¬
ных процессов, протекающих в организме, является абсолютно недостаточным,
так как не позволяет получить более или менее объективную информацию о
комплексных биологических взаимодействиях на клеточном уровне как в норме,
так и при патологии. В этой связи совершенно очевидно, что роль повышения или
снижения уровня одного какого-либо цитокина в межклеточных взаимодействиях
необходимо рассматривать с учетом изменения уровней других цитокинов, при-
сзтствующих в этом же исследуемом биологическом образце.В табл. 19-5 приведен сравнительный анализ характеристик МИА и ИФА мето¬
дов определения цитокинов.Таблица 19-5. Сравнительные характеристики ИФА и МИА методов определения цитокиновСравниваемые параметрыИФАМИАЧувствительностьВысокая —<10 пг/млВысокая — несколько пг/млОпределениеКоличественноеКоличественноеСпецифичностьВысокаяВысокаяВыявлениеБиологически активных и неактивных
молекулБиологически активных и неактив¬
ных молекулВремя проведения анализаОтносительно небольшое (день)Более быстрый анализ {часы)Коэффициент вариации5-10%1М5%ИнтерференцияОтсутствуетОтсутствуетПротокол исследованияОтносительно простойПростойОбьем образцаОтносительно большой {100-200 мкп
на 1 определение)Небольшой (50 мкл на все определе¬
ния — до 100 параметров)Стимуляция детекцииОтсутствуетПрисутствуетСрок хранения гест-системыНебольшойБолее продолжительныйРазрешающая способностьОпределение 1 цитокина в одной
биопробеОдновременное определение до 100
цитокинов в 1 биопробеОГРАНИЧЕНИЯ И КРИТИЧЕСКИЕ МОМЕНТЫ В ОПРЕДЕЛЕНИИ ЦИТОКИНОВ
С ПОМОЩЬЮ ОСНОВНЫХ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
Сбор и хранение биопробВ зависимости от задач клинической лабораторной диагностики цитокины
определяют в различных биологических жидкостях (сыворотке крови, церебро¬
спинальной жидкости, амниотической жидкости, в экссудатах, жидкости бронхо-
альвеолярного лаважа, смывах, мокроте и др.). Особое внимание следует уделять
условиям сбора и хранения биологических образцов, поскольку на этом этапе
возможны грубые ошибки, которые в дальнейшем могут привести к неправиль¬
ным результатам оценки и соответственно неверной интерпретации полученных
данных. При повторных циклах размораживания-замораживания биопроб в
результате действия протеиназ молекулы цитокинов подвержены разрушению.
При неправильном сборе биологического материала не исключена возможность в
условиях ех vivo освобождения цитокинов из клеток либо связывания их с клеточ¬
ными рецепторами, что может повлиять на полученные результаты. Если центри¬
фугирование крови для получения сыворотки не выполнить за короткий срок, на
результаты оценки цитокинов может существенно повлиять способность тромбо¬
цитов, как во время процесса свертывания крови, так и при центрифугировании,
освобождать целый ряд цитокинов и хемокинов, включая IL-1, IL-6, CXCL8/IL8,
CCL5/RANTES.
цитокины Б ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 205При анализе цереброспинальной, амниотической, синовиальной, жидкости
бронхоальвеолярного лаважа. а также супернатантов клеток, перед заморажива¬
нием образцов необходимо избавиться от клеток. Связывание цитокинов с их рас¬
творимыми рецепторами также может повлиять на полученные результаты оценки
уровней цитокинов в биопробах и не отразить истинную концентрацию цитокинов
в анализируемых образцах. Этот эффект может происходить при специфическом
связывании IL-1 и IL-6 с их растворимыми рецепторами. Не исключена возмож¬
ность связывания цитокинов, например IL-1, IL-6, TNFa аутоантителами, что
также может приводить к получению неверных, искаженных результатов.Гетерофильные антителапри анализе уровней цитокинов в сыворотке и плазме крови наибольшее число
ложноположительных результатов можно объяснить присутствием в этих биоло¬
гических жидкостях гетерофильных антител. Эти антитела вырабатываются про¬
тив неизвестных, недостаточно полно охарактеризованных антигенов и обычно
обладают низкой авидностью. Такие низкоавидные антитела могут взаимодей¬
ствовать с различными иммуноглобулинами и присутствуют у 40% здоровых лиц,
а при различных аутоиммунных заболеваниях (например, у больных ревматоид¬
ным артритом) их количество существенно возрастает. Гетерофильные антитела
могут включать антитела IgG, IgM и IgE и присутствуют в сыворотке и плазме
крови, а также в других биологических жидкостях, в которых обычно проводится
определение уровней цитокинов с помощью «сэндвич»-методов, используемых
как в ИФА, так и в МИА-технологиях. Поскольку эти гетерофильные антитела
могут связываться с компонентами иммуноанапитических систем, перекрестное
связывание может приводить к ложноположительным результатам, реже — к
ингибиции связывания (см. рис. 19-1).Для того чтобы исключить интерференцию с гетерофильными антителами, в
настоящее время разработан ряд подходов. Поскольку гетерофильные антитела
могут связываться с антителами разных видов животных, можно проводить пре-
инкубацию образца со смесью сывороток разных видов животных, лишь после
этого ставить методы оценки уровней цитокинов. Выбор сывороток животных
зависит от используемых в тест-системах антител (антитела мыши, кролика, овцы
и других животных). Однако при таком подходе возможны и другие осложнения:
в смеси сывороток крови животных разнь[х видов антитела могут взаимодей¬
ствовать друг с другом, что может приводить к неэффективному связыванию с
гетерофильными антителами человека в исследуемых образцах. Таким образом,
этот подход имеет ограничения. У больных ревматоидным артритом или у детей
с ювенильным идиопатическим артритом в сыворотке крови в больших количе¬
ствах могут присутствовать IgM- и IgG-аутоантитела, в частности ревматоидный
фактор. Существуют методы, позволяющие снизить уровни ревматоидного факто¬
ра в исследуемых образцах крови таких больных. Для этого используют протеин L.
В противоположность протеину А или протеину G, этот протеин обладает способ¬
ностью к высокоаффинному связыванию с IgM и IgG и меньшей аффинностью
связывания с IgA.Гетерофильные антитела также могут взаимодействовать с компонентами
супернатантов клеток, а именно с компонентами сыворотки крупного рогатого
скота или аутологичной сыворотки человека, так как эти сыворотки обычно
добавляют в культуральную среду, что способствует росту и дифференцировке
культивируемых клеток.Общее содержание белка и pHВремя достижения равновесия на разных этапах анализа зависит от концентра¬
ции белков, например более низкое содержание белка может приводить к более
206цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕвысокой интенсивности люминесценции. Если определение цитокинов проводит¬
ся в биологических жидкостях с высоким содержанием белка (например, в цере¬
броспинальной жидкости, амниотической, синовиальной и других), стандартные
кривые необходимо строить с использованием буфера с сопоставимым содержа¬
нием белка. Кроме концентрации белка, pH исследуемых образцов также может
влиять на результаты анализа уровней цитокинов. Например, низкие уровни pH
мочи могут приводить к конформации молекул цитокинов, причем некоторые
молекулы менее устойчивы к таким изменениям среды (например, структура моле¬
кулы TNFa подвергается конформации при низких pH), в то время как молекулы
других цитокинов (например, IFNy) остаются достаточно устойчивыми в широком
диапазоне pH — от 4,8 до 9,5.Перекрестное связываниеСуществу'^ет определенная степень гомологии между молекулами антител и
цитокиновыми молекулами, поэтому можно предположить, что при проведении
анализа антитела могут распознавать не только молекулы цитокинов, но и другие
белковые молекулы, присутствующие в биопробе. Причем при мультиплексном
анализе, в котором используют очень большое число всевозможных антител,
вероятность такого перекрестного связывания значительно выше, чем при ИФА.Стандартные кривые и вычисления результатовСреди прочих факторов, влияющих на точность количественной оценки уров¬
ней цитокинов, важную роль играют используемые стандартные образцы и
соответственно стандартные кривые. Обычно такие кривые состоят из серии
определений с известными количествами рекомбинантных цитокинов (от 3 до
12 определений). В ИФА часто используют модель линейной регрессии. Если
уровни исследуемых цитокинов находятся в пределах линейного ряда стандартной
кривой, такая модель линейной регрессии является приемлемой для вычисления
результатов. Однако, если полученные данные выходят за пределы линейной части
стандартной кривой, образцы следует разбавлять и анализировать повторно, учи¬
тывая их разведение.Предел детекции в МИА ниже, чем в ИФА, даже если в обеих технологиях
используются одни и те же пары антител, а динамический ряд измерения —
шире. Более широкий динамический ряд определений (3-4-логарифмическая
шкала) в МИА позволяет минимизировать число биологических проб, для кото¬
рых необходимо проводить повторное определение уровней цитокинов (в ИФА
обычно используют 1-2-логарифмическую шкалу). Поскольку ряд определений
в стандартной кривой достаточно широк, линейная модель не всегда приемлема,
и поэтому для вычисления уровней цитокинов в биопробах чаще используется
нелинейная регрессионная модель.Определение цитокинов в клинической практикеОпределение цитокинов в различных биологических жидкостях обычно
используют для оценки активности воспаления, определения степени поляриза¬
ции иммунного ответа, оценки эффективности проводимой терапии и прогноза
заболевания. В ряде случаев уровни отдельных цитокинов могут коррелировать
с тяжестью течения заболевания и прогнозом. Классическим примером может
служить уровень интерлейкина-6 в плазме крови больных с тяжелыми травмами:
высокие уровни IL-6 являются предикторами развития полиорганной недоста¬
точности. Другим примером может служить определение высоких уровней IL-8
в цереброспинальной жидкости больных с лептоменингиальными метастазами
солидных опухолей — как предиктора скорой гибели больного.Однако при большинстве заболеваний определение одного какого-либо цитокина
обычно является совершенно недостаточным для диагностики или оценки прогноза
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 207заболевания. Для оценки состояния иммунной системы у таких больных необходи¬
мо определять достаточно большой спектр цитокинов, позволяющий оценить осо¬
бенности цитокиновой регуляции в каждом конкретном компартменте.Благодаря сложным механизмам регуляции синтеза цитокинов, изменение экс¬
прессии одного какого-либо цитокина обычно приводит к изменениям уровней
других цитокинов. причем скорость синтеза цитокинов может быть различной
и зависит от целого ряда физиологических характеристик организма благодаря
тесной кооперации трех основных адаптационных систем: нервной, эндокринной
и иммунной. Б этой связи определение различных цитокинов в биологических
образцах лучше проводить одновременно, в мультиплексном режиме оценки,
чтобы избежать возможных ошибок в интерпретации полученных данных.Определение продукции ЦИТОКИНОВ клеткамиОпределение продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови ш
vitro как при стимуляции, так и без нее является альтернативой определения плаз¬
матического уровня цитокинов. Мононуклеары периферической крови служат в
качестве удобной модели для оценки продукции цитокинов в основном из-за их
доступности, при активации in vitro такими агентами, как фитогемагглютинин
(ФГА) или бактериальный липополисахарид (ЛПС), мононуклеары перифериче¬
ской крови секретируют в культуральную среду целый спектр провоспалительных
цитокинов: IL-1, IL-6, IL-8, TNF и другие. Измерение уровня цитокинов в био¬
логических жидкостях дает возможность оценить уровень цитокинов, синтезиро¬
ванных клетками организма, в норме или при развитии патологии. Определение
уровня цитокинов в супернатантах мононуклеаров периферической крови обеспе¬
чивает надежную оценку способности клеток продуцировать цитокины. Этот тест
можно считать одним из важнейших методов оценки функционального состояния
клеток иммунной системы. Он стоит в одном ряду с оценкой бластной трансфор¬
мации лимфоцитов или определением фагоцитарной активности клеток.Определение синтеза цитокинов изолированными клетками в культуре может
бьггь легко стандартизовано, так как в тесте используют стандартные препара¬
ты индукторов синтеза цитокинов, культуральные среды и другие реагенты, а
сама оценка уровня цитокинов в культуральной среде может бьггь проведена как
биологическими методами, так и стандартизованными иммуноферментными
тест-системами, а также и их комбинациями. Более того, в супернатантах клеток,
стимулированных одним либо двумя стандартными индукторами, может быть
измерен одновременно целый ряд разнообразных цитокинов, позволяющих не
только оценить общий уровень синтеза цитокинов индивидуума, но и определить
цитокиновые профили, например поляризацию Т-хелперных клонов по харак¬
терному профилю синтезируемых цитокинов, соотношение синтеза агонистов и
антагонистов и т.д. Кроме того, в культуре клеток можно оценить синтез цитоки¬
нов в ответ на специфический антиген, что может иметь неоценимое значение в
диагностике силы и развития иммунного ответа при ряде инфекционных заболе¬
ваний, при вакцинации, аллергической сенсибилизации и других патологических
состояниях, в культуре имеется возможность определения продукции цитокинов
у предварительно криоконсервированных клеток, полученнь[х либо от разных
доноров, либо в разное время и собранных вместе для более удобного, экономич¬
ного и надежного серийного мониторинга при клинических испытаниях.Методика определения синтеза цитокинов изолированными клетками доста¬
точно проста и заключается в следующем. Свежую венозную кровь, взятую в
емкость с гепарином (20 МЕ/мл), тщательно перемешивают и разводят в 5 раз
средой RPMI 1640 с добавлением 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина,
обычно к 0,6 мл крови добавляют 2,4 мл среды RPMI1640. В качестве индуктора
208 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕсинтеза группы провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF), IL-10, IFNa и
хемокинов могут быть использованы препараты ЛПС в концентрации 1-10 мкг/
мл, например отечественный ЛПС-содержащий препарат продигиозан*. Б каче¬
стве индукторов синтеза IL-2, IL-4, IFNy и других Т-клеточных цитокинов может
быть использован ФГА-М (Sigma*) в конечной концентрации 50 мкг/мл. ФГА
является универсальным индуктором и может быть использован также и для
индукции синтеза провоспалительных цитокинов. В 96-луночный планшет для
культивирования клеток (^COSTAR» или аналогичный) вносят индуктор по
100 мкл на лунку, в контрольные лунки (для оценки спонтанной продукции)
вносят по 100 мкл среды RPMI 1640, затем во все лунки добавляли по 100 мкл
разведенной, как описано выше, крови. Культивирование проводят при 37 “С в
5% СО2В течение 24 ч, после чего осторожно отбирают супернатанты и проводят
исследование содержания цитокинов в биологическом или иммуноферментном
тесте, у больных подсчитывают количество лейкоцитов и формулу крови по
стандартным методикам. Полученные данные о концентрациях цитокинов в
супернатантах пересчитывают на 1 млн лейкоцитов либо мононуклеаров, лим¬
фоцитов или других интересующих клеток в 1 мл с учетом произведенных раз-
ведений крови. При необходимости супернатанты могут храниться при -20 °С до
6 мес при однократном замораживании.Многие провоспалительные цитокины в норме не должны циркулировать в
крови. Тем не менее описаны случаи увеличения уровней провоспалительных
цитокинов, в частности IL-1, в плазме крови при стрессовых ситуациях и тяжелой
физической нагрузке. По-видимому, присутствие невысоких уровней этих цитоки¬
нов в плазме крови здоровых доноров можно объяснить следующими причинами.
Во-первых, они могут появляться в циркуляции в результате некоторых нормаль¬
ных физиологических процессов жизнедеятельности организма, либо под влияни¬
ем стрессорных факторов неинфекционной природы. Во-вторых, в ряде случаев
данные уровни цитокинов могут являться проявлением вяло текущих скрытых
воспалительных процессов, а также иммунопатологических состояний, включая
ранние стадии аутоиммунных и аллергических заболеваний еще до появления
клинических проявлений. Наконец, ряд цитокинов в плазме крови могут быть свя¬
заны с белками переносчиками и различными ингибиторами. При этом цитокины
могут не обладать биологической активностью, но выявляться иммунохимически
с помощью специфических антител.Определение уровней цитокинов в сыворотке крови имеет ряд сложностей из-за
наличия неспецифических факторов связывания, которыми являются различные
сывороточные белки. Цитокины IL-1, IL-2 и другие могут взаимодействовать с
аз-макроглобулином, образуя комплексы, которые могут маскировать иммуно¬
реактивность цитокинов. Наряду с неспецифическим связыванием существует и
специфическое. Уровни ципгокинов, измеренные иммуноферментным методом,
могут быть неинформативными из-за присутствия растворимых рецепторов для
цитокинов. В этих случаях специфическое взаимодействие цитокина с рецептором
ведет к кажущемуся исчезновению его из крови. Циркулирующие аутоантитела к
цитокинам являются другими специфическими ингибиторами, присутствующими
в сыворотке некоторых индивидуумов, например у лиц, получавших цитокиновую
терапию.Уровни цитокинов в плазме периферической крови отражают текущее состоя-
ние работы иммунной системы и развития защитных реакций, то есть синтез
цитокинов клетками организма ш vivo. Определение уровней продукции цитоки¬
нов изолированными клетками in vitro показывает их функциональное состояние.
Спонтанная продукция цитокинов в культуре свидетельствует о том, что клетки
уже активированы in vivo в результате развития воспаления или иммунопатологи¬
ческих процессов. В то же время активация клеток может произойти вследствие
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 209манипуляций в процессе выделения. Иногда это происходит из-за несоблюдения
стерильности при заборе крови или при использовании культуральных сред и
растворов реагентов, загрязненных ЛПС. Индуцированная продукция цитокинов
позволяет оценить потенциальные возможности активации клеток, что очень
важно для оценки иммунологической реактивности. Сниженная индуцированная
продукция цитокинов in vitro может служить одним из признаков иммунодефи¬
цитного состояния. Именно поэтому оба варианта изучения уровней цитокинов в
циркуляции либо продукции лейкоцитами важны с точки зрения характеристики
работы иммунной системы.Преимущество метода индукции синтеза цитокинов в культурах цельной крови
имеет ряд преимуществ по сравнению с индукцией цитокинов в культурах клеток,
вьщеленных на градиенте плотности. В первую очередь это простота и связанная
с этим более высокая степень стандартизации процедуры. Во-вторых, стимуляция
клеток происходит в присутствии собственной плазмы и лучше отвечает задаче
наиболее полного воспроизведения условий синтеза цитокинов в организме. Тем
не менее в ряде случаев разделение клеток на фракции позволяет более точно
определить продукцию цитокинов определенными популяциями лимфоцитов,
моноцитов или гранулоцитов.в этой связи одним из наиболее перспективных современных методов анализа
продукции цитокинов изолированными клетками является метод ELISPOT, пред¬
ставляющий собой своеобразный гибрид метода индукции синтеза цитокинов
в культуре и обычного иммуноферментного анализа. Суть метода заключается
в том, что выделенные клетки культивируют в присутствии индуктора синтеза
цитокинов в микропланшетах, дно которых покрыто антителами к интересующе¬
му цитокину, как это делается на первом этапе ИФА. В процессе культивирования
клетки, находящиеся на дне планшета, синтезируют цитокины, которые тут же
связываются с сорбированными на пластике антителами. Таким образом, оказы¬
вается, что цитокин соединяется с сорбированными антителами в тех местах, где
его синтезировали клетки. Дальнейшие этапы анализа проводятся, как в стандарт¬
ном варианте ИФА, с той лишь разницей, что при постановке ELISPOT исполь¬
зуется нерастворимый цветной субстрат ферментативной реакции, выпадающий
в осадок там, где цитокин связался с сорбированными антителами. В результате
на дне планшета образуются окрашенные пятна, соответствующие местам, где
происходил синтез цитокинов клетками. Отсюда и произошло название метода —
ELISPOT как комбинация метода ELISA с конечным формированием окрашенного
пятна {spot). Пятна легко видны под малым увеличением микроскопа, их количе¬
ство относительно исходного числа клеток и разный размер позволяют оценить
интенсивность синтеза цитокинов на уровне отдельных клеток. В настоящее время
разработаны варианты метода с использованием субстратов разных цветов для
оценки синтеза 2-3 цитокинов одновременно и созданы приборы для автомати¬
ческого подсчета и анализа размеров пятен, что очень важно для стандартизации
метода ELISPOT.Наиболее точную характеристику отдельных клеток, продуцирующих цитокины,
дает метод цитоплазматического окрашивания цитокинов в варианте цитофлюо-
риметрического анализа. Мембранные формы цитокинов и рецепторы цитокинов
легко определяют на поверхности клеток с помощью меченных флюорохромами
антител в обычном варианте цитофлюориметрии аналогично другим поверхност¬
ным молекулам клеток. Для выявления цитоплазматических цитокинов требуется
достижение состояния проницаемости или пермебиализация мембран для обе¬
спечения проникновения антител в клетки. Для этой цели используется сапонин в
сочетании с блокаторами обратного транспорта (брефелдин А или монензин) для
предотвращения экскреции антител из цитоплазмы клеток. Метод выгодно отли¬
чается от метода ELISPOT возможностью дополнительной характеристики клеток
210 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕпо размеру и экспрессии мембранных маркеров, что позволяет проводить более
точную идентификацию цитокин-продуцирующих клеток.Рецепторы цитокинов представляют собой трансмембранные белки, а некото¬
рые цитокины могут существовать в виде мембранной формы. В обоих слу^шях
экстраклеточные домены цитокинов и их рецепторов представляют собой поверх¬
ностные антигенные детерминанты различных клеток человека. Мембранные
рецепторы и мембранные формы цитокинов, распознаваемые соответствующими
моноклональными антителами, включены в единую классификацию поверхност¬
ных молекул клеток (СВ) и получили свои порядковые номера (табл. 19-6), Это
позволяет изучать количество и типы клеток, экспрессируюищх рецепторы и мем¬
бранные формы цитокинов, с помощью цитофлюориметрии, а также использовать
клеточные сортеры для выделения клеток, имеющих на мембранах определенные
типы цитокинов или их рецепторов.Таблица 19-6. Рецепторы и мембранные формы цитокинов, включенные в СО классификацию
поверхностных молекул лейкоцитов человекаРецепторы н мембран¬
ные формы цитокиновСоответствующие
CD антигеныЭкспрессирующие клеткиРецепторы китокинов, регулирующих созревание и функции Т-лимфоцитовIL-2 RaCD25Активированные лимфоцитыlL-2 RpCD122Т-лимфоциты, МК-клеткиIU2 RyCD132T-, В-лимфоциты, NK-клетки1L-4/IL-13 RaCD124Т-. В-лимфоциты, другие типы клетокIL-13 Ra1CD213a1В-лимфоциты, моноциты, фибробласты, зндотелиальные
клеткиlL-13Ra2CD213a2В-лимфоциты, моноцитыiL-5 RaCD125Эозинофилы, базофилыIL-7 RaGDI 27предшественники Т- и В-ЛЙМфОЦИТОВIL-6 RaCD126В-лимфоциты, плазматические клеткиLIFRCD118Эпителиальные клеткиgp130CD130Многие типы клетокIL-10 RCDw210Т-, В-лимфоциты, 1\1К-клетки, моноцитыIL-12 R(51CD212Активированные Т-лимфоциты и NK-клеткиIL-17 RCD217Многие типы клетокРецепторы цитокинов, стимулирующих кроветворениеG-CSF RCD114Гранулоциты, моноциты и их предшественникиM-CSF RGD115Моноциты, тканевые макрофагиGM-CSF RaGD116Моноциты, нейтрофилы, эозинофилыФактор стволовых кле¬
ток R (c-kit)CD117предшественники гемопоэзаFitsGD135Предшественники гемопоэзаIL-3 RaGDI 23Предшественники гемопоэза, гранулоциты, мегакариоци-
ты, моноцитыIL-3,5, GM-CSF RpCD131Миелоидные клеткиРецепторы цитокинов семейства iL-1 и ФРФIL-1 RICD121aТ-лимфоциты, фибробласты, эндотелиальные клеткиIL-1 RIICD121bВ-лимфоциты, моноциты, макрофагиIL-18RaCD218aЛимфоциты, нейтрофилы, ДКIL-18RPGD218bЛимфоциты, нейтрофилы, ДКФРФ R1GD331Фибробласты, эпителиальные кпеткиФРФ R2CD332Фибробласты, эпителиапьные клетки
*цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 211
Окончание табл. 19-6Рецепторы и мембран¬
ные формы цитокиновСоответствующие
CD антигеныЭкспрессирующие клеткиФРФ R3CD333Фибробласты, эпителиальные клеткиФРФ R4CD334Фибробласты, эпителиальные кпеткиЦитокины и рецепторы семейства TNFTNF WGDI 20aМоноциты,гранулоцитыTNF RIICD120bМоноциты, гранулоциты, лимфоцитыFasCD95Апоптотические клеткиFas лигандGDI 78Активированные Т-лимфоциты0X40GDI 34Активированные Т-лимфоциты0X40 лигандCD252Активированные В-лимфоциты, ДК, эндотелиальные
клетки4-1ВВGDI 37Т-лимфоцитыCD30 лигандCD153Активированные Т-лимфоцитыCD40 лигандCD154Активированные Т-лимфоциты, базофилы, тучные клеткиTRAILGD253Активированные Т-, В-лимфоциты, моноцитыTRAIL R1CD261Лейкоциты, опухолевые клеткиTRAIL R2CD262Многие типы клетокTRAIL R3CD263Многие типы клетокTRAIL R4CD264Многие типы клетокTRANCE, RANKLGD254Активированные Т-лимфоциты, остеобласты, стромальные
клеткиRANK. TRANCE-RCD265Многие типы клетокAPRILCD256Миелоидные клеткиBlyS, BAFFCD257Миелоидные клеткиLIGHTCD258Активированные Т-пимфоциты, незрелые ДКTWEAK-RCD266НиУЕСBAFF-RGD268' Т-, В-лимфоциты;<■Рецептары хемокиновGGR1С0191Т-лимфоциты, моноциты, стволовые клеткиGCR2GD192Моноциты, Т-, В-лимфоциты, базофилы, эндотелиальные
клеткиGCR3GD193Эозинофилы, базофилы, Т-лимфоциты, ДКGCR4CD194Т-лимфоциты, базофилы, моноциты, тромбоцитыCCR5GD195Моноциты, Т-лимфоцитыCCR6CD196Т-. В-лимфоциты, ДКCGR7CD197Т-лимфоцитыCCR8CDW198Т-лимфоциты, моноцитыCCR9GDW199Т-лимфоцитыCXCR1GDI 81Нейтрофилы. Т-лимфоцитыCXCR2CD182Моноциты, гранулоциты, Т-лимфоцитыGXCR3CD183Актиаированные Т-лимфоциты и NK-клеткиCXGR4CD184Моноциты, Т-, В-лимфоциты, эндотелиальные клетки, ДКCXCR5GDI 85Т-, В-лимфоцитыGXCR6CD186Т-лимфоциты
212 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ АИАГНОСТИКЕОпределение уровней цитокинов в тканяхНесмотря на ТО что определение уровня цитокинов В сыворотке ИЛИ плазме
является более простым в исполнении, определение уровня цитокинов в тканях
может дать дополнительную информацию о состоянии местного иммунитета.
Так как цитокины — это локальные медиаторы, то методы определения уровня
цитокинов в месте воспаления или органного повреждения и репарации могут
быть более биологически значимыми, чем определение их уровня в перифериче¬
ской крови. Однако все эти методы требуют получения биопсии ткани и являются
трудоемкими. Простейший подход — это диссоциация ткани и приготовление
тканевого экстракта, который затем тестируется методом ИФА. Однако этот метод
не дает информации о том, какие клетки продуцируют цитокины и где они локали¬
зованы в ткани. Кроме того, для корректной интерпретации результатов требуется
нормальная ткань в качестве контроля.ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОДШироко распространенными методами детекции цитокинов в тканях являются
иммуногистохимические методы с использованием специфических поликлональ¬
ных или моноклональных антител к цитокинам. С помощью этих методов цитоки¬
ны могут быть обнаружены в цитоплазме клеток — в мазках клеточных суспензий,
приготовленных разными способами на предметных стеклах в виде обычного
гематологического мазка, с помощью цитоцентрифуги, способом тонкой капли и
другими методами. Кусочки тканей, полученные с помощью биопсии или во время
операции, обычно глубоко замораживают в жидком азоте, а затем готовят срезы
толщиной 4-6 мкм в криостате при температуре -20 °С. Приготовленные и высу¬
шенные мазки или срезы тканей фиксируют этанолом, метанолом или пара¬
формальдегидом (4% раствор в натрий-фосфатном буфере, pH 7,2-7,4) 20 мин
при +4 “С, затем отмывают в PBS (pH 7,2-7,4), в течение 10 мин, высушивают и
хранят при +4 °С до проведения реакции.Чаще всего изучение локализации цитокинов в клетках проводят методом
непрямой иммуногистохимии с использованием специфических антител к цито¬
кинам, а на втором этапе — антивидовых антител, меченных флюорохромами
для люминесцентной микроскопии или ферментами для световой микроскопии.
Важно, что в случае флюоресцентных меток антитела к цитокинам могут быть
использованы для их выявления с помощью цитофлюориметра, причем в дан¬
ном варианте возможно выявление как цитоплазматических цитокинов. так и их
мембранных форм. В случае ферментов используют биотинилированные анти-
видовые антитела, а на последнем этапе комплексы стрептавидин-пероксидаза
либо стрептавидин-щелочная фосфатаза. При проведении цветной реакции при¬
меняют нерастворимые субстраты, выпадающие в осадок в месте взаимодействия
антител с цитокинами, то есть в месте локализации цитокинов в клетках. В случае
световой микроскопии препараты могут быть докрашены гематоксилином и неко¬
торыми другими красителями, что позволяет достаточно хорошо различать струк¬
туру ткани. Кроме того, существуют методы иммуногистохимического выявления
отдельных цитокинов на парафиновых срезах, дающих наиболее полное сохране¬
ние морфологической структуры исследуемых тканей.Молекулярно-биологические методы изучения цитокиновОпределение экспрессии генов цитокинов в клетках-продуцентах по накопле¬
нию мРНК служит еще одним подходом к оценке их синтеза. Появление мРНК в
клетках или тканях обычно детектируется путем гибридизации со специфически¬
ми олигонуклеотидными зондами, длина которых варьирует от нескольких нукле-
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 213отидов до целой кДНК, соответствующей гену искомого цитокина. Эти зонды
содержат радиоактивные, флюоресцентные или ферментные метки, в зависимости
от метки применяют соответствующий метод для выявления тканевой локализа- |
ции мРНК. При использовании метода гибридизации in situ на свежих криосрезах
тканей или мазках клеток для выявления локализации мРНК цитокинов могут
использовать комплементарные РНК зонды для РНК-РНК гибридизации. Метод
позволяет определять количество и тип клеток, экспрессирующих цитокины.
Недостатком метода является тот факт, что в ряде случаев наличие мРНК совсем
необязательно отражает присутствие соответствующего полипептида цитокина в
клетке: процессы транскрипции и трансляции могут регулироваться независимо.
Накопление большого количества мРНК может не сопровождаться последова¬
тельным синтезом белка. Если мРНК не транслируется, что часто бывает при ряде
патологических состояний, то искомый цитокин будет отсутствовать. Кроме того,
возможно появление различных изоформ мРНК в результате альтернативного
сплайсинга. Таким образом, для получения более полной информации о содержа¬
нии цитокинов в тканях необходимо, видимо, использовать комбинацию методов,
позволяющих оценить как экспрессию мРНК, так и синтез данного цитокина в
клетке.	^Новейшим количественным методом для определения цитокиновой мРНК явля¬
ется метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR).Этот метод отличается очень высокой чувствительностью и специфичностью, как
и все тесты, основанные на методике ПЦР. В настоящее время разработаны многие
модификации метода, такие как ПЦР в реальном времени {real-time PCR), микро-
чипы {microarray), позволяющие анализировать одновременно несколько сотен
генов, и другие. Гибридизация с олигонуклеотидными зондами, комплементарны¬
ми участкам единичных нуклеотидных замен в генах цитокинов, с использованием
амплификации методом ПЦР применяется и для анализа аллельного полимор¬
физма. Одной из последних разработок является использование аптамеров — оли¬
гонуклеотидов, полученных по технологии SELEX, для количественной оценки
уровней цитокинов. Существует модификация ИФА, где вместо антител в качестве
распознающих цитокины молекул используются аптамеры,РОЛЬ ЦИТОКИНОВ в ПАТОГЕНЕЗЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА
Врожденные нарушения цитокиновой регуляцииМутации генов цитокинов и регуляторных молекул в большинстве случаев при¬
водят к снижению функциональной активности цитокинов и нарушению развития
защитных реакций организма. Наследственные нарушения в системе цитокиновой
регуляции затрагивают многие ключевые медиаторы и их рецепторы, приводя к
тяжелым клиническим проявлениям разнообразных видов иммунодефицитных
состояний, в то же время отдельные мутации могут приводить к повышенному
синтезу цитокинов либо нарушению регуляторных взаимодействий в цитокиновой
сети и к возникновению связанных с этим аутоиммунных, аутовоспалительных и
лимфопролиферативных состояний.Одним из ярких примеров цитокин-зависимого первичного иммунодефицита
служит наследственный дефект гена 7-цепи рецептора IL-2. Отдельные субъе¬
диницы рецепторного комплекса IL-2 являются общими для IL-2 и некоторых
других цитокинов. Так, у-цепь служит общей субъединицей рецепторов для IL-2,IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21. У человека мутации в гене у-цепи рецептора IL-2
(делеции аминокислотных остатков 62 и 81) связаны с развитием сцепленного с
Х-хромосомой синдрома тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД).Это заболевание характеризуется отсутствием или значительным падением содер¬
214цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕтшш:жания Т-лимфоцитов и резко сниженными показателями клеточного и гумораль¬
ного иммунитета.Клинически ТКИД является гетерогенной группой заболеваний, связанных с
нарушением функционирования Т-лимфоцитов, сочетающегося с различными
вариантами дефицита В-лимфоцитов, NK-клеток и других типов лейкоцитов.
Кроме ТКИД, развивающегося как следствие дефекта у-цепи рецептора IL-2,
известны как минимум еще два варианта этого заболевания, вызванных дефекта¬
ми генов JAK3 и а-субъединицы рецептора IL-7. Клинические симптомы ТКИД,
связанного с дефицитом киназы JAK3, неотличимы от проявлений иммунодефи¬
цита, связанного с дефектом у-цепи. Это объясняется участием киназы JAK3 в
проведении внутриклеточного активационного сигнала от у-цепи рецепторного
комплекса IL-2. По сути два описанных генетических дефекта нарушают один и
тот же путь активации лимфоцитов на разных уровнях, что, естественно, приводит
к одинаковым функциональным нарушениям и клиническим проявлениям имму-
нодефицитных состояний. Дефицит а-субъединицы рецептора IL-7 приводит к
несколько иной картине ТКИД. У больных с этим генетическим дефектом наблю¬
далось снижение количества Т-лимфоцитов, но отмечены нормальные уровни
В-лимфоцитов и NK-клеток. В данном случае нарушения касаются проявлений
функциональной активности только одного цитокина, IL-7, стимулирующего
созревание предшественников лимфоцитов. Однако отсутствие зрелых Т-клеток
оказывается достаточной причиной для развития тяжелых проявлений ТКИД.
У детей с клиническими проявлениями ТКИД дифференциальная диагностика
дефектов в системе цитокинов молекулярно-биологическими методами может
иметь важное значение для правильной постановки диагноза.Нарушения в системе IL-12, IL-23, IFNy и их рецепторов составляют другое
врожденное нарушение цитокиновой регуляции, связанное с дефектом врожденно¬
го иммунитета. В результате взаимодействия с патогенами макрофаги и дендрит¬
ные клетки начинают синтезировать несколько разных групп цитокинов, включая
цитокины семейства IL-12 (IL-12, IL-23, IL-27), нужные для запуска дифференци¬
ровки незрелых Т-лимфоцитов. Синтез IL-12 параллельно с представлением анти¬
гена стимулирует дифференцировку Т-клеток в направлении Т-лимфоцитов хел¬
перов 1 типа, приводящую к началу экспрессии генов цитокинов, среди которых
одним из главных регуляторов клеточного иммунитета является IFNy. Нетрудно
представить, что любые сбои в функционировании этой последовательной систе¬
мы развития защитных реакций могут привести к серьезным нарушениям имму¬
нитета, в первую очередь связанным с защитой от микобактерий. В приведенном
пути регуляции начальных этапов развития защитных реакций известны пять раз¬
личных генетических дефектов, затрагивающих цитокины, их рецепторы и моле¬
кулы сигнальных путей активации клеток. Это ген субъединицы р40, являющейся
одной из двух субъединиц гетеродимерных цитокинов IL-12 и IL-23, ген р-1 цепи
рецептора IL-12, служащей общей субъединицей рецепторов для IL-12 и IL-23,
гены субъединиц 1 и 2 рецептора IFNy и ген внутриклеточной сигнальной молеку¬
лы STAT1 {signal transducer and activator of transcription I), участвующей в передаче
сигнала от рецепторов IFNy.Описано более 50 пациентов с полным рецессивным вариантом дефицита
рецептора IL-12, приводящего к отсутствию нормальной экспрессии этой рецеп¬
торной субъединицы, резкому снижению ответа на IL-12 и IL-23 и продукции
IFNy. Клинически это проявлялось повышенной восприимчивостью к инфекциям,
вызываемым микобактериями и сальмонеллами, и частично могло быть компен¬
сировано назначением препаратов IFNy. Нарушения продукции IFNy со сходными
клиническими проявлениями наблюдались у детей с дефектами гена субъединицы
р40 IL-12/IL-23, этот иммунодефицит дозозависимо корректировался назначени¬
ем рекомбинантного IL-12. При правильной оценке цитокиновой недостаточности
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 215И адекватной терапии клинический прогноз у детей с такими дефектами достаточ¬
но благоприятный, особенно в случаях вторичных инфекций, протекающих менее
тяжело. Наследственные иммунодефицитные состояния, связанные с дефектами
генов рецепторов IFNy, подразделяются на полные дефициты рецепторов, которые
приводят к полному отсутствию ответа на этот цитокин, частичные рецессивные
и частичные доминантные дефициты рецепторов, возникающие в результате раз¬
личных мутаций и делеций генов рецепторов 1 и 2 к IFNy. Тяжесть клинических
проявлений иммунодефицита во всех этих случаях различна, однако всегда связа¬
на с развитием инфекций, вызванных микобактериями, реже сальмонеллами или
Listeria monocytogenes.ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ цитокинов КАК ВАРИАНТ РАЗВИТИЯ
НАСЛЕДСТВЕННЫХ НАРУШЕНИЙ ЦИТОКИНОВОЙ РЕГУЛЯЦИИМутации в генах цитокинов приводят к серьезным нарушениям иммунитета.
У человека подобные мутации встречаются достаточно редко, что может свиде¬
тельствовать о важнейшей роли цитокинов в осуществлении защитных реакций,
Тем не менее накапливается все больше данных о выявлении функционального
полиморфизма генов цитокинов, связанного с заменами единичных нуклеотидов
(полиморфизм вследствие различия единичных нуклеотидов; single nucleotide poly¬
morphism - SNP), вызывающих количественные изменения функционирования
соответствующих генов, в отличие от мутаций, полностью выключающих функции
кодируемых ими белков. SNP являются наследственными генетическими измене¬
ниями. Накапливается все больше данных о том, что эти изменения могут оказы¬
вать достаточно серьезное влияние на протекание защитных реакций. В отличие
от мутаций в генах цитокинов, SNP не удаляются естественным отбором, а боль¬
шей частью сохраняются в популяции, что делает их важными диагностическими
маркерами, которые могут быть определены с использованием молекулярно¬
биологических методов, в последнее десятилетие опубликовано огромное коли¬
чество данных о выявлении полиморфизма генов цитокинов человека, их рецеп¬
торов и регуляторных молекул. Часть выявленных аллельных вариантов генов
обусловливает снижение либо увеличение проявлений биологической активности
кодируемых белков, что позволяет говорить именно о функциональном поли¬
морфизме. Связь обнаруженных изменений с конкретной патологией у человека
можно проиллюстрировать следующим примером.Для гена TNF описано несколько различных SNP, два из которых связаны с раз¬
нонаправленными изменениями уровня прод>тсции биологически активного TNF.
Это нуклеотидные замены в положениях -308 (G->A) и —238 (G-^A) в нетранс-
лируемой области гена в зоне промоутерных участков. Наличие полиморфного
аллеля (-308А) приводит к увеличению эффективности транскрипции гена и уве¬
личению продукции TNF в 2-5 раз, по сравнению с нормальным вариантом. Связь
функционального полиморфизма гена TNF с развитием патологии прослеживает¬
ся при изучении распределения аллелей этого гена среди африканцев, болеющих
малярией. При обследовании более 1000 человек оказалось, что полиморфный
аллель (-308А), связанный с повышенной продукцией TNF, в 4 раза чаще встре¬
чается у больных с наиболее тяжело протекающей церебральной формой маля¬
рии с более сильным развитием системного воспалительного ответа и в 7-8 раз
чаще у больных с развившимися впоследствии тяжелыми нарушениями нервной
системы. Более широкое изучение распределения аллелей гена TNF среди жителей
эндемичных по малярии регионов Африки привело к поразительным результатам,
показавшим, что среди африканцев частота носительства данного полиморфного
аллеля составляет лишь 5%, тогда как среди белых европейского происхождения
она достигает 30%. Данные говорят в пользу того, что высокопродуцирующий
аллель гена TNF в случае заболевания малярией приводит к повышенному синтезу
шшш216 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕTNF и более выраженному развитию системной воспалительной реакции, чаще
приводящей к гибели заболевших или к тяжелым осложнениям. По-видимому,
в данном случае имеет место результат давления определенного патогена на
популяцию за счет механизма естественного отбора, происходит это за счет суще¬
ствования наследственных вариантов гена одного из главных провоспалительных
цитокинов. Естественно, что диагностическое определение наличия указанного
полиморфного аллеля гена TNF может дать очень важную информацию для про¬
гноза и своевременного назначения адекватной терапии больных с инфекционны¬
ми заболеваниями и гнойно-воспалительной патологией.Функциональный полиморфизм генов цитокинов обусловливает индивиду¬
альные наследственные колебания уровня их продукции, которые влияют на раз¬
витие и исход инфекционных заболеваний и иммунопатологических процессов.
Именно поэтому полиморфизм генов цитокинов может считаться вариантом
наследственных иммунодефицитных состояний. Безусловно, обнаружение SNP
свидетельствует лишь о предрасположенности индивидуумов к тому или иному
заболеванию, однако их определение позволяет прогнозировать риск развития
патологии и подбирать адекватную терапию. Подобные изменения в перспективе
должны заноситься в генетический паспорт индивидуума.Изменения цитокинов при сепсисаКлинические проявления сепсиса связаны с развитием системного воспали¬
тельного ответа организма на инфекцию. Это послужило основой для введения
термина «синдром системного воспалительного ответа» {systemic inflammatory
response syndrome), применимого к обозначению воспалительного ответа на уровне
организма при различных состояниях, включая сепсис с бактериемией, а также
состояниях без определяемой бактериемии, например травма и острые воспали¬
тельные заболевания отдельных органов (острый панкреатит).Синтез большинства цитокинов, участвующих в регуляции воспаления, возрас¬
тает при развитии сепсиса и коррелирует с уровнями других лабораторных тестов
(С-реактивный белок и другие), тяжестью клинических проявлений и исходом
заболевания. Лабораторные данные определения уровней цитокинов свидетель¬
ствуют о том, что чем выше были уровни цитокинов при поступлении больных с
диагнозом «сепсис» в отделение интенсивной терапии, тем выше оказался уровень
смертности, причем это относилось как к группе провоспалительных цитокинов
(TNF, IL-1, IL-6, IL-8), так и к антивоспалительным цитокинам, таким как IL-10
и рецепторный антагонист интерлейкина-1 (РАИЛ). По-видимому, в начале
развития сепсиса происходит активация различных типов лейкоцитов и других
синтезирующих цитокины клеток и индукция или увеличение уровня экспрессии
генов нескольких цитокинов без избирательной активации синтеза только про¬
воспалительных медиаторов или только цитокинов, ограничивающих развитие
воспаления.Тем не менее именно провоспалительные цитокины обусловливают развитие
патологических изменений при сепсисе, в высоких концентрациях они способны
вызывать нейроэндокринные изменения, нарушения терморегуляции, активацию
эндотелия, приводящую к увеличению выхода жидкости в ткани, расширению
сосудов и падению артериального давления (коллапс), диссеминированному
внутрисосудистому свертыванию крови, полиорганной недостаточности и гибели
больного. Среди провоспалительных цитокинов более всего перечисленные пато¬
логические изменения способен вызывать TNF, часто называемый «медиатором
смерти». Уровень IL'ip также повышен в плазме крови больных сепсисом, однако
это обнаружено не во всех исследованиях. Самые высокие уровни IL-lp выявлены
у больных с менингококковым сепсисом, у них концентрации IL-ip коррелируют
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 217С выраженностью бактериемии, тяжестью клинических проявлений и развитием
септического шока. Дрзтой представрггель семейства IL-1 — IL-1S также повы¬
шается у больных с сепсисом, его уровень коррелирует с клиническими проявле¬
ниями сепсиса. Наиболее высокая степень корреляции с клинической картиной
сепсиса получена при исследованиях уровней IL-6 и IL-10. Именно концентрация в
плазме крови IL-6 соответствовала клинической картине сепсиса по шкале тяжести
состояния критических больных (APACHE II) и могла быть критерием для про¬
гнозирования исхода заболевания. Уровень этого цитокина также коррелирует с
другими маркерами септического процесса: С-реактивным белком, компонентом
комплемента СЗа, лактатом и TNF.Если в кровотоке количество цитокинов повышается, то их продукция изо¬
лированными лейкоцитами больных сепсисом снижена по сравнению с уровнем
продукции тех же медиаторов лейкоцитами здоровых доноров. Это касается про¬
воспалительных цитокинов и хемокинов, а также цитокинов Т-лимфоцитов хелпе¬
ров и первого, и второго типов: IL-2, IFNy, IL-5, IL-10, т.е. сниженной оказывается
продукция большинства цитокинов. Вероятно, это связано с общими явлениями
анергии после интенсивного синтеза, так как такое падение продукции цитокинов
описано не только при бактериальном сепсисе, но и после травм и массивных ожо¬
гов, когда в первые дни после ожога происходит очень интенсивный синтез этих
веществ в ответ на травму («цитокиновый шторм»), а затем наступает резкое паде¬
ние уровней их продукции. Эти данные ставят вопрос об источнике повышенного
уровня цитокинов в плазме крови больных сепсисом, так как период существова¬
ния большинства цитокинов в циркуляции обычно очень короткий (например,
период полужизни IL-1 в плазме крови составляет всего 7,5 мин), а повышенные
уровни цитокинов у больных сохраняются несколько суток.Важно, что антивоспалительные цитокины (IL-10, РАИЛ и TGFß) и раствори¬
мые рецепторы TNF и IL-6 тоже синтезируются в повышенных количествах при
сепсисе. Средние уровни IL-10 и РАИЛ выше при септическом шоке по фавнению
с сепсисом и выше у умерших больных по сравнению с выжившими. Наиболее
высокие уровни IL-10 выявляют у больных с неблагоприятным течением сепсиса и
плохим прогнозом, причем чем выше соотношение уровней IL-10 и TNF, тем хуже
прогноз. Данные о гиперпродукции антивоспалительных цитокинов у больных
сепсисом привели к появлению понятия «синдром компенсаторного антивос¬
палительного ответа» {compensatory anti-inflammatory response syndrome — CARS).
Считают, что CARS развивается вслед за системной воспалительной реакцией,
выполняя функции ограничения гиперпродукции воспалительных цитокинов и
системного воспаления, но у некоторых больных это может приводить к иммуно¬
супрессии. Экспериментальные данные не полностью подтверждают эту гипотезу,
так как провоспалительные и антивоспалительные цитокины у большинства боль¬
ных синтезируются одновременно, а их функции трудно оценивать однозначно.
Цитокины в низких концентрациях необходимы для правильного формирования
местного воспаления, более высокие дозы вызывают развитие системной воспали¬
тельной реакции, но патологически высокие концентрации приводят к состоянию
септического шока и гибели организма.ÉРОЛЬ цитокинов в РАЗВИТИИ АУТОИММУННОЙ ПАТОЛОГИИпри развитии иммунопатологических процессов нарушения в работе иммун¬
ной системы и клинические проявления во многом зависят от баланса клонов
Thl и Th2, а также ТЫ7, основанном на соотношении продукции регуляторных
цитокинов. Хроническая несбалансированность активации Т-хелперных клонов
приводит к развитию иммунопатологических состояний, в частности связанных
с проявлениями аутоиммунитета. Главным образом, аутоиммунные нарушения
218 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕразвиваются при избыточной активации воспалительной реакции и клеточного
иммунитета. Однако роль различных Т-хелперных клонов в развитии аутоиммун¬
ных заболеваний гораздо сложнее. При ряде аутоиммунных процессов в области
поражения тканей доминирует продукция цитокинов ТЫ, а симптомы аутоиммун¬
ного воспаления могут быть подавлены с помощью введения животным цитоки¬
нов, продуцируемых Th2. В то же время при других аутоиммунных расстройствах
в развитии патологического процесса важную роль играет гиперактивация не
только ТЫ, но и Th2.Ревматоидный артрит (РА) — аутоиммунное заболевание, поражающее,
главным образом, синовиальную оболочку, хрящевую и костную ткань суставов.
Цитокины являются одними из главных медиаторов развития патологических
изменений в ткани суставов при РА, выступая в роли посредников между актива¬
цией иммунной системы в результате индукции аутоиммунитета, развитием хро¬
нического воспалительного процесса и деструкцией суставов.У больных РА в синовиальной оболочке обнаружены плазмоцитоидные и мие¬
лоидные дендритные клетки, которые вместе с синовиальными макрофагами син¬
тезируют широкий спектр цитокинов, способных индуцировать дифференцировку
наивных Т-лимфоцитов в любом направлении. В синовиальной жидкости при ана¬
лизе экспрессии генов цитокинов по уровню мРНК и при иммуноцитохимическом
анализе показано, что клетки синовиальной оболочки синтезируют IL-12 и IL-18,
направляющие дифференцировку Т-лимфоцитов в сторону ТЫ, IL-4 — в сторону
Th2, а IL-1, IL-6, IL-23 - в сторону Thl7. В отличие от экспериментов на живот¬
ных, где доказана патогенетическая роль ТЫ7 в развитии артрита, у больных РА
пока отсутствуют убедительные доказательства преимущественной активации
одного из типов Т-хелперов,Ключевыми медиаторами развития воспаления в области суставов у больных РА
служат провоспалительные цитокины, в первую очередь TNF и IL-1. Повышенная
экспрессия TNF практически всегда обнаруживается в синовиальной оболочке
воспаленных суставов у этих больных. TNF вызывает функциональную активацию
синовиальных фибробластов, эндотелиальных клеток и привлеченных в ткань
сустава лейкоцитов, синтез цитокинов и других медиаторов, развитие воспаления
и ремоделирование ткани сустава с развитием патологических изменений и нару¬
шением функции. Не менее важна также и роль цитокинов семейства IL-1 (IL-la и
IL-1[5), экспрессия которых тоже обычно повышена у больных РА.Увеличение экспрессии провоспалительных цитокинов при РА сопровождается
снижением продукции антивоспалительных и регуляторных цитокинов, еще боль¬
ше усугубляя нарушение нормального баланса медиаторов с разной направленно¬
стью действия, у больных РА отмечено снижение экспрессии РАИЛ, IL-10, IL-4,
IL-2, помимо прочего участвующего в генерации регуляторных Т-лимфоцитов, а
также растворимых рецепторов для TNF 1 типа и для IL-11 типа, способных свя¬
зывать избыток этих цитокинов. Среди других цитокинов в развитии воспаления
активное участие принимают IL-6, IL-15, IL-18 и IL-32. Их роль в патогенезе РА
доказана в экспериментальных исследованиях, и эти цитокины считаются одними
из потенциальных мишеней для проведения антицитокиновой терапии у больных
этим заболеванием.Повышенный синтез цитокинов в области воспаленного сустава может приво¬
дить к увеличению их концентрации в крови. Уровни провоспалительных цитоки¬
нов, например IL-1(3, в сыворотке крови больных РА коррелируют с клиническими
проявлениями заболевания и могут служить достаточно информативными диа¬
гностическими маркерами, появление которых иногда опережает развитие сим¬
птомов поражения суставов. Органные проявления РА также сопровождаются зна¬
чительными изменениями синтеза провоспалительных цитокинов в затронутых
аутоиммунным процессом тканях. При многих аутоиммунных состояниях возрас¬
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 219тание концентрации провоспалительных цитокинов в кровотоке ведет к развитию
системных проявлений их биологического действия, в этом случае значение оцен¬
ки уровня цитокинов связано с тем, что хроническое увеличение уровня IL-1, TNF
и IL-6 в циркуляции приводит к развитию нарушения метаболизма костной ткани
на уровне организма, ведущего к появлению клинических признаков остеопороза
трубчатых костей. Так, IL-6 стимулирует синтез острофазовых белков в печени, а
TNF вмешивается в метаболизм липидов, вызывая кахексию. Хронически высокий
уровень провоспалительных цитокинов также вызывает центральные нарушения,
связанные с развитием депрессии и снижением познавательной активности.Цитокины и аллергияАллергические состояния (аллергический конъюнктивит, пищевая аллергия,
IgE-ассоциированный атопический дерматит, аллергический ринит и астма) явля¬
ются генетически детерминированной группой заболеваний, характеризующихся
повышенной способностью В-лимфоцитов синтезировать антитела класса Е (IgE),
направленные против особой группы антигенов, называемых аллергенами. IgE вза¬
имодействуют с высокоаффинными мембранными FceRl-рецепторами базофилов
и тучных клеток, что приводит к дегрануляции и выбросу Базоактивных аминов, в
первую очередь гистамина, а также хемокинов и провоспалительных цитокинов,
индуцирующих развитие аллергического воспаления. Попадающие в организм
аллергены приводят к преимущественной активации клонов Т-лимфоцитов,
синтезирующих набор цитокинов, характерных для Т-хелперов 2 типа. Развитие
иммунного ответа с преимущественным синтезом антител класса IgE регулируется
Tj^2 путем синтеза и секреции IL-4, IL-5 и IL-13.Однако первый источник цитокинов при развитии аллергического воспаления
в тканях — тучные клетки, которые содержат цитокины IL-4, IL-13, TNF в грану¬
лах. Эти цитокины попадают в межклеточное пространство при дегрануляции в
первые минуты после контакта связанного тучными клетками IgE с аллергеном.
Они обладают провоспалительной активностью, вызывают усиление продукции
хемокинов и усиление экспрессии молекул адгезии на эндотелии, что ведет к
активному привлечению в ткани эозинофилов, базофилов и Т-лимфоцитов. В
дальнейшем источником цитокинов в тканях могут быть базофилы, тучные клет¬
ки и другие лейкоциты, активация которых сопровождается экспрессией генов,
синтезом и секрецией IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, TNF и GM-CSF. В периферической
крови больных различными формами аллергии существенно выше число клонов
Т-лимфоцитов, синтезирующих цитокины. CD4'-лимфоциты больных аллергией
продуцируют IL-4 и IL-5 в ответ на бактериальные антигены, которые у здоровых
людей обычно вызывают развитие типичного ответа по типу активации Thl. По
мере развития заболевания аллергенспецифические Т-лимфоциты все более нака¬
пливаются в органах, где происходит развитие аллергического воспаления.Лимфоциты периферической крови и лимфоциты бронхоальвеолярных лава-
жей, полученные от больных бронхиальной астмой, секретировали повышенные
количества цитокинов Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), концентрации которых коррели¬
ровали с выраженностью клинических симптомов, сывороточными уровнями
IgE и содержанием эозинофилов в крови и бронхоальвеолярном лаваже. Таким
образом, у больных с бронхиальной астмой и в периферической крови, и в ткани
легких продемонстрирована активация Th2 с увеличением уровней секретируемых
ими цитокинов.у детей, склонных к аллергии, сразу после рождения не наблюдается усиления
продукции цитокинов Th2, но впоследствии происходит активация их синтеза. У
детей с генетическим анамнезом аллергии (наличие аллергических заболеваний
у ближайших родственников) наблюдают повышение уровней продукции IL-4,
220 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕIL-5 и IL-13, постепенно нарастающих от момента рождения к 1-2 годам, такое
повышение служит ранним прогностическим фактором развития клинических
симптомов аллергии в возрасте 2-6 лет. С другой стороны, показано, что снижен¬
ные уровни IFNy у детей трехмесячного возраста ассоциированы с более высокой
частотой клинических проявлений астмы в годовалом возрасте, а аллергенспе-
цифическая продукция IFNy лимфоцитами в культуре снижена у детей с атопией.
Обнаружение IFNy в пуповинной крови во время родов связано с низким риском
развития астмы и других вариантов аллергии при наблюдении за этими детьми
вплоть до шестилетнего возраста. Приведенные данные подтверждают роль поля¬
ризации Т-хелперных клонов в сторону гиперактивации Th2 в патогенезе аллергии
и свидетельствуют о том, что повышенная продукция цитокинов ты может иметь
защитное значение от развития аллергических заболеваний. Определение уровней
и продукции цитокинов у детей раннего возраста может быть важным элементом
диагностики предрасположенности к развитию аллергических заболеваний.ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВУникальная роль системы цитокинов в регуляции функций организма и их уча¬
стие в патогенезе широкого круга заболеваний делают перспективным использо¬
вание определения их синтеза как маркера развития инфекционных, иммунодефи¬
цитных заболеваний, иммунопатологических процессов и рака. Диагностическая
ценность цитокинов связана с несколькими факторами. Прежде всего большин¬
ство цитокинов являются растворимыми циркулирующими медиаторами, их
концентрацию легко оценить в плазме крови и других биологических жидкостях.
Многие цитокины появляются при активации иммунитета, который, в свою оче¬
редь, можно оценить по уровню этих цитокинов. Синтез цитокинов сопровождает
развитие защитных реакций. Во врожденном иммунитете это ответ клеток на
патоген-ассоциированные молекулы, в приобретенном иммунитете — это ответ на
антиген, показатель активации лимфоцитов. Изменение синтеза различных групп
цитокинов на местном уровне позволяет оценить развитие инфекционного, аллер¬
гического и аутоиммунного типов воспаления. Изменение уровней цитокинов в
плазме крови позволяет оценить развитие системной воспалительной реакции и
работу иммунной системы в целом. Определение синтеза цитокинов отдельных
семейств позволяет оценить практически все ключевые процессы работы иммун¬
ной системы, а также диагностировать нарушения кроветворения, состояние
противоопухолевой резистентности, отклонения нормального эмбрионального
развития, процессы обмена веществ и другие параметры. Ниже приводятся дан¬
ные по диагностическому значению определения синтеза и уровней отдельных
цитокинов, играющих наиболее важную роль в регуляции нормальных физиоло¬
гических функций организма, защитных реакций и в развитии иммунопатологии.
Нормальные значения концентраций цитокинов приведены в табл. 19-7.Таблица 19-7. Нормы содержания цитокинов в сыворотке и уровни их продукции клетками пери¬
ферической крови здоровых людейЦитокиныКонцентрация в сывороткеПродукция клетками крови в культуре, пг/млКр08И, пг/млспонтаннаяиндуцированнаяIL-1a0-500-50100-1000IL-100-500-501000-5000РАИЛ300-7000-5001000-5000IL-2002-10 Ед/млIL-40-5030-50100-400IL-60-5030-501000-3000IL-80-5030-1001000-5000
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 221
Окончание табл. 19-7ЦитокиныКонцентрация в сыворотке
крови, лг/млПродукция клетками крови в культуре, пг/млспонтаннаяиндуцированная11-100-5030-501000-3000ТМР-а0-530-50500-30001РМ-а0-5030-50100-5001РП-у0-1010-1001000-50006-С8Р10-10030-501000-5000М-С8Р1800-7000н.Д.Н.Д.6М-С5Р10-100н.Д.н.Д.ЭПО10-50 МЕ/лН.Д.н.Д.ТПО50н.Д.Н.Д.Интерлейкин-1 бетаВ плазме крови большинства здоровых людей не удается обнаружить 1Ь-1.
Однако примерно у трети здоровых людей в плазме могут появляться незначи¬
тельные количества этого цитокина (0-50 пг/мл), так же как и некоторых других
провоспалительных цитокинов. Причины появления малых количеств провос¬
палительных цитокинов в плазме крови здоровых людей не совсем понятны.
Возможно, это связано с присутствием биологически неактивных либо связанных
с белками-переносчиками молекул цитокинов, которые определяются иммуно-
химическими методами. Определить биологическую активность цитокинов в
плазме или сыворотке крови чрезвычайно сложно из-за присутствия большого
количества различных биологически активных веществ, как стимуляторов, так и
ингибиторов, мешающих проведению анализа. Увеличение уровня 1Ь-1^ отмечают
при стрессовых ситуациях и тяжелой физической нагрузке.1Ь'1р является одним из основных провоспалительных цитокинов, поэтому
повышение уровня его спонтанной или индуцированной продукции клетками в
культуре либо повышение уровня 1Ь-1р в сыворотке крови может свидетельство¬
вать об активации клеток или развитии воспаления. В связи с этим возрастание
уровня 1Ь-1р является признаком заболеваний, имеющих в своей основе вос¬
паление, причем независимо от типа воспаления. Так, рост концентрации 1Ь-1[3
наблюдается при инфекционных заболеваниях, где острота процесса коррели¬
рует с содержанием 1Ь-1р и на местном, и на системном уровнях. Повышенная
концентрация 1Ь-1 обнаружена в эпителиальных смывах при локальных острых
вирусных инфекциях, в содержимом полости абсцессов и флегмон. На примере
изучения продукции 1Ь-1 у больных с пневмонией показано, что уровень этого
вещества в сыворотке и его продукция мононуклеарами крови возрастают в острой
фазе болезни, но оба показателя были ниже у пациентов пожилого возраста.
По-видимому, с возрастом продукция 1Ь-1 может снижаться, что может являться
одной из причин более низких показателей иммунитета в старости. При выра¬
женном инфекционном процессе, сопровождающемся изменениями показателей
острофазового ответа, концентрация 11-1 коррелирует с подъемом температуры
тела, повышением уровня других цитокинов и достигает наивысшего значения
у лихорадящих септических больных. Таким образом, развитие инфекционных
заболеваний у человека может сопровождаться повышением уровня 1Ь-1, синтез
которого, очевидно, связан с развитием защитных механизмов.Концентрация 1Ь-1 может также повышаться при развитии иммунопатологи¬
ческих состояний. Увеличение уровней 1Ь-1р отмечено при аллергии, в том числе
при обострении бронхиальной астмы, и при аутоиммунной патологии, например
при диабете 1-го типа, при болезни Крона, ревматоидном артрите. Высокие титры
222 цитокины в лабораторной диагностике1Ь-1 обнаружены в суставной полости при активных формах ревматоидного артри¬
та, а содержание ІЬ-ір в плазме коррелирует с выраженностью поражения суставов
и возрастает в случаях осложнений заболевания. Следовательно, развитие ряда
хронических иммунопатологических процессов у человека может сопровождаться
повышением уровня 1Ь-1 вследствие активации иммунной системы.Рецепторный антагонист интерлейкина-1Рецепторный антагонист интерлейкина-1 (РАИЛ) уникален среди цитокинов
семейства 1Ь-1 тем, что он в норме присутствует в плазме периферической крови в
достаточно высоких концентрациях, иногда до 1 нг/мл. Это связано с конститутив¬
ной экспрессией гена РАИЛ и его постоянным синте.'їом тканевыми макрофагами
и гепатоцитами. По-видимому, присутствие РАИЛ в циркуляции выполняет роль
своеобразного буфера, блокирующего действие эндогенного 11-1 и защищающего
организм от резкого увеличения уровня 1Ь-1 в плазме крови в результате развития
воспалительных процессов в тканях, которые в той или иной степени эпизодиче¬
ски возникают при попадании в организм патогенов. Несмотря на поддержание
постоянного уровня синтеза, при развитии воспаления происходит усиление экс¬
прессии гена РАИЛ и существенное повышение его продукции. Индукция синтеза
РАИЛ происходит под действием тех же стимулов, ^ггo и 11-1, однако регуляция
продукции 1Ь-1 и РАИЛ существенно различается. Уровень РАИЛ характеризует
антивоспалительный ответ, что может иметь значение при развитии сепсиса. В то
же время показано, что соотношение продукции ІЬ-Ір и РАИЛ может быть изме¬
нено в стороны увеличения уровней РАИЛ при вторичных иммунодефицитных
состояниях, связанных с развитием гнойно-воспалительной патологии.Интерлейкин-2В норме в плазме крови существуют ингибиторы биологической активности
ІІ-2, что практически исключает его определение методом биологического тести¬
рования. Использование иммунохимических методов анализа более предпочти¬
тельно, но также имеет свои особенности. Дело в том, что природный и рекомби¬
нантный 1Ь-2 отличаются по расположению эпитопов, узнаваемых антителами к
данному цитокину. В природном 1Ь-2 вследствие гликозилирования происходит
экранирование иммунодоминантного эпитопа, к которому в основном вырабаты¬
ваются антитела при иммунизации рекомбинантным негликозилированным 11-2.
В результате эти антитела очень плохо распознают природный 1Ь-2 при его иссле¬
довании иммунохимическими методами. В современных иммуноферментных
тест-системах это обязательно учитывается, и в них используют только монокло¬
нальные антитела, распознающие другие общие для обоих вариантов молекулы
эпитопы. При развитии патологии уровень 1Ь-2 в плазме периферической крови
повышается незначительно. Гораздо более информативные данные получают при
изу^іении изменений его спонтанной и индуцированной продукции изолирован¬
ными лимфоцитами в культуре, в том числе в культурах клеток цельной крови.Повышение спонтанной продукции 1Ь-2 может бьггь при лимфопролифератив¬
ных и аутоиммунных заболеваниях. Снижение индуцированной продукции 11-2
клетками крови может быть следствием иммунодефицитных состояний разной
этиологии, в первую очередь Т-клеточного иммунодефицита. Развитие СПИДа
характеризуется неуклонным снижением количества Т-хелперных лимфоцитов с
постепенным развитием тяжелой иммунологической недостаточности. Одним из
важных проявлений иммунодефицитного состояния является падение продукции
11-2, которое на фоне снижения синтеза и других цитокинов Т-лимфоцитов ведет
к серьезным нарушениям функций всех звеньев иммунной системы.
цитокины в лабораторной диагностике 223Интерлейкин-4В крови здоровых людей 1L-4 практически не определяется. Появление IL-4 ^
в сыворотке крови сопровождает развитие аллергических реакций и активацию
противоинфекционного иммунитета по типу преимущественного развития Т^2. 'tV
Так, у пациентов, страдающих гельминтозами, обнаружено повышение уровня
IgE, который коррелирует с повышенной секрецией IL-4. Дисрегуляция секреции
IL-4 является ключевой в развитии аллергической патологии. Стимулированная
продукция IL-4 мононуклеарами периферической крови у пациентов с атопией и
лимфоцитами бронхоальвеолярных лаважей, полученных от больных бронхиаль¬
ной астмой, значительно выше, чем у здоровых субъектов. Уровень IL-4 (так же
как уровни IL-5 и IL-13) коррелировал с выраженностью клинических симптомов
бронхиальной астмы, сывороточными уровнями IgE и содержанием эозинофилов
в крови и лаважах. Однако при длительно текущих хронических аллергических
процессах может наблюдаться снижение продукции IL-4 лимфоцитами, причем
иногда эти изменения сочетаются со снижением общего IgE в сыворотке крови.Интерлейкин-13IL-13 во многом повторяет биологическую активность IL-4. Оба цитокина
являются продуктами Т^2 и участвуют в развитии аллергии, но в настоящее время
считается, что IL-13 в большей степени, чем IL-4, связан с развитием тяжелых
симптомов аллергии у человека. Повышение концентрации IL-13 обнаружено в
бронхоальвеолярных лаважах, а экспрессия гена IL-13 — в биопсийном материале
из легких больных бронхиальной астмой. Уровни IL-13 падали при проведении
аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) и при терапии глюкокортикои-
дами и коррелировали с клинической картиной заболевания.Интерлайкин-5При аллергических заболеваниях у человека количество эозинофилов повыше¬
но в системном кровотоке, и в органах-мишенях развивается аллергическое вос¬
паление, например в коже при атопическом дерматите или в легких при бронхи¬
альной астме. Это коррелирует с усилением продукции IL-5 Т^2 и увеличением его
концентрации в тканях. При аллергии биологическое действие IL-5 заключается
в усилении дифференцировки костномозговых предшественников эозинофилов и
увеличении числа зрелых эозинофилов, стимуляции хемотаксиса эозинофилов, их
функциональной активации и замедлении апоптоза. В связи с этим IL-5 считается
одним из основных цитокинов, участвующих в иммунопатогенезе аллергии.У человека описан идиопатический гиперэозинофильный синдром, характери¬
зующийся увеличением количества циркулирующих эозинофилов, эозинофиль¬
ной инфильтрацией органов, развитием асептического воспаления и связанной с
этим мультиорганной недостаточностью, в тяжелых случаях приводящей к гибели
больного. Это заболевание связано, главным образом, с гиперпродукцией IL-5 —
основным фактором, стимулирующим созревание и активацию эозинофилов, а
также других лигандов общей бета-цепи рецептора: IL-3 и GM-CSF, принимающих
участие в развитии эозинофильного ростка кроветворения,Интерлейкин-6в норме отмечают лишь минимальный уровень экспрессии гена и накопления
мРНК IL-6 в органах, и его практически не удается обнаружить в плазме крови.
Экспрессия гена IL-6 происходит под влиянием попадающих в организм вирусов.
...шш
шш^Шіімйшіїт224 цитокины в лабораторной диагностикебактерий и их продуктов, а также провоспалительных цитокинов. 1Ь-6 является
типичным ранним индуцибельным цитокином, быстро накапливающимся в цир¬
куляции при встрече с патогенами. В ряде исследований показано, что гиперпро¬
дукция 1Ь-6 у человека ведет к патологии, связанной с развитием аутоиммунных
и воспалительных процессов. Повышенные уровни 1Ь-6 обнаружены в синовиаль¬
ной жидкости больных ревматоидным артритом, увеличение его синтеза отмечено
при миксоме сердца и у больных с миеломной болезнью. Видимо, главное диа¬
гностическое значение 11-6 связано с тем, что именно его уровень наиболее точно
коррелирует с тяжестью клинических проявлений при сепсисе.Интерлейкин-7Биологическая активность 1Ь-7, главным образом, связана с его действием в
качестве ростового фактора для предшественников В- и Т-лимфоцитов. 1Ь-7 в
небольших количествах продуцируется стромальными клетками костного мозга,
эпителием тимуса, кератиноцитами и клетками фетальной печени. ІІ-7 синте¬
зируется стромальными клетками костного мозга и тимуса конститутивно, обе¬
спечивая постоянное созревание и обновление Т-лимфоцитов. Возможно, в орга¬
низме существует гомеостатический механизм регуляции числа Т-лимфоцитов
на периферии, построенный по механизму отрицательной обратной связи. У
больных с ВИЧ-инфекцией уровни 1Ь-7 в плазме отрицательно коррелировали с
числом Т-лимфоцитов периферической крови, возрастая при падении количества
Т-клеток. Отмечено также у-величение концентрации 1Ь-7 в циркуляции при дру¬
гих заболеваниях, сопровождающихся лимфопенией.Интерлейкин-8У здоровых людей в сыворотке крови IL-8 выявляется крайне редко. Спонтанная
продукция IL-8 мононуклеарами крови наблюдается у 61,5%, индуцированная ~
у 100% здоровых доноров. Увеличение уровня IL-8 в биологических жидкостях
описано при различных заболеваниях, сопровождающихся нейтропенией и/
или нейтрофильной инфильтрацией тканей очага воспаления. В случае введения
в организм ЛПС в плазме крови увеличивается уровень циркулирующего IL-8.
То же наблюдается после введения добровольцам IL-1 или TNF, а при сепсисе
титры сывороточного IL-8 положительно коррелируют с тяжестью заболевания
и летальным исходом. IL-8 может быть важен в модуляции некоторых органных
дисфункций. При многих заболеваниях легких, сопровождающихся воспалением
в легочной ткани, хемокины активно синтезируются альвеолярными макрофагами
и находятся в повышенной концентрации в лаважной жидкости. При респира¬
торном дистресс-синдроме взрослых IL-8 обнаруживается в бронхоальвеолярной
лаважной жидкости, его концентрация прямо пропорциональна количеству ней¬
трофилов и смертности у пациентов. Высокие уровни IL-8 и других хемокинов в
легочной ткани и лаважах описаны при бронхиальной астме и фиброзе легких.IL-8 определяется в больших количествах в области псориатических бляшек.
Кроме IL-8, в области бляшек обнаружены и другие СХС-хемокины: GROa и
IP-10. Основным источником IL-8 и указанных хемокинов служат кератиноци-
ты. Кроме того, хемокины синтезируются эндотелиальными клетками и самими
привлеченными в очаг воспаления нейтрофилами. Повышенная продукция хемо¬
кинов приводит к еще большему привлечению лейкоцитов и формированию хро¬
нического очага асептического воспаления. При ревматоидном артрите высокие
уровни IL-8 определяются в суставной жидкости и коррелируют с активностью
процесса и с количеством нейтрофилов и других клеток в жидкости. Источником
IL-8 в полости сустава служат, главным образом, синовиальные клетки. По мере
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 225прогрессии заболевания в сыворотках пациентов появляются аутоантотела к IL-8,
относящиеся к IgG классу.Интерлейкин-10В клинических исследованиях продемонстрировано, что у больных с аллергией
снижена частота встречаемости клонов Т-хелперных лимфоцитов, синтезирую¬
щих IL-10, и снижены уровни IL-10 в сыворотке крови. Более того, обнаружены
инверсные взаимоотношения между уровнем IL-10 и тяжестью клинических про¬
явлений астмы и других типов аллергии. В настоящее время есть данные о том, что
при АСИТ успех терапии коррелировал со снижением аллергенспецифического
Th2 ответа и появлением аллергенспецифических Т-лимфоцитов, секретирующих
IL-10.ШШИнтерлейкин-15IL-15 синтезируется различными типами клеток во многих органах. У чело¬
века IL-15 синтезируется моноцитами/макрофагами, эпителиальными клетками
стромы костного мозга и другими эпителиальными клетками, но мРНК IL-15 не
обнаружена в активированных Т- и В-лимфоцитах. Синтез IL-15 активируется под
действием IFN 1 типа, IFNy, двухцепочечной РНК, ЛПС и других производных
патогенов. Экспрессия мРНК IL-15 выявлена во многих типах клеток, но IL-15
крайне редко обнаруживается в супернатантах клеточных культур или в плазме
крови. Для IL-15 человека описано несколько вариантов мРНК, образующихся в
результате альтернативного сплайсинга. Все эти варианты транслируются в одина¬
ковые формы зрелого IL-15, но скорость трансляции и варианты продукции белка
отличаются.Фактор некроза опухолиДля определения уровня TNF в биологических жидкостях следует учитывать,
что биологически активная молекула этого цитокина состоит из трех одинаковых
полипептидных субъединиц, объединенных в гомотример. Только такая трехмер¬
ная структура биологически активна, и только она должна определяться специфи¬
ческими моноклональными антителами, используемыми в современных диагно¬
стических системах. Часть антител к TNF могут связывать и мономерные формы,
которые могут находиться в плазме и биологических жидкостях в достаточно
высоких концентрациях, не проявляя биологической активности. Определение
общей концентрации мономеров вместе с биологически активными тримерами
TNF приводит к ложным заключениям о значительном повышении уровня TNF
в исследуемых образцах, хотя иногда очевидно, что неправильно определенные
высокие уровни TNF просто несовместимы с жизнью пациента. Б связи с этим
для оценки уровня TNF следует использовать только те диагностические системы,
которые позволяют определять именно биологически активный цитокин.в сыворотке крови здоровых доноров биологически активный TNF определяет¬
ся в очень низких концентрациях (0-5 пг/мл), однако выделенные мононуклеары
способны продзщировать TNF в больших количествах. У пациентов с сепсисом
TNF определяется в плазме крови, и его концентрация коррелирует с тяжестью и
исходом заболевания, У пациентов с бактериальными менингитами тяжесть забо¬
левания коррелирует с концентрацией TNF в цереброспинальной жидкости, хотя
высокие концентрации TNF не коррелируют с его высокими системными концен¬
трациями. в ряде случаев повышение уровня TNF и других провоспалительных
цитокинов в плазме крови позволяет заподозрить заболевания, прямо не свя-
226 цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ|| занные с нарушениями иммунитета или с инфекционной патологией. Например,
ÉÍ повышение уровня TNF наблюдается при инфаркте миокарда, длительное уве-
Щ личение уровней TNF, IL-lß и IL-6 в плазме периферической крови может быть
II предвестником остеопороза.Некоторые цитокины, члены семейства TNF, используются для диагностики
рака. Определение концентрации растворимого Fas вместе с анализом других
антигенов применяется в диагностике рака мочевого пузыря. В целом в диагности¬
ке рака все больше начинают использоваться методы, позволяющие одновременно
определять сразу несколько цитокинов. Это связано с тем, что в диагностике все
большее значение приобретает анализ не единичных факторов, включая цитоки¬
ны, а изучение паттернов изменений десятков и более медиаторов. В случае цито¬
кинов это особенно важно с учетом формирования в организме цитокиновой сети.
Сейчас такие методы широко применяют для исследования наиболее значимых
среди цитокинов диагностических маркеров рака, для изучения молекулярных
механизмов патогенеза рака, эффективности действия противораковых препара¬
тов, в том числе во время клинических испьгганий.Интерферон-альфаУчастие IFNa в патогенезе множества вирусных заболеваний не вызывает
сомнений. С развитием терапии рекомбинантным IFNa приобрели большую диа¬
гностическую ценность исследования интерферонового статуса, который отра¬
жает характер течения вирусной инфекции, позволяет прогнозировать исход
заболевания и эффективность лечения. При изучении роли IFNa в патогенезе
гриппа показана зависимость между сывороточным уровнем IFNa и тяжестью и
продолжительностью гриппозной инфекции, у больных гриппом, осложненным
пневмонией, и при затяжном течении гриппа наблюдалось значительное сниже¬
ние уровня IFNa к периоду ранней реконвалесценции, что связывают с развитием
астенического синдрома и что указывает на целесообразность применения средств
с иммуномодулирующей активностью в этом периоде. Снижение продукции IFNa
отражает наличие нарушений противовирусной защиты организма.Особую значимость приобретают исследования уровня IFNa для изучения
фармакокинетики препаратов рекомбинантного IFNa. После типичной внутри¬
мышечной или подкожной инъекции от 3 млн до 50 млн единиц рекомбинант¬
ного pIFNa пиковая концентрация от 100 до 1000 ед/мл достигается через 4-6 ч.
Однако индивидуальные различия в уровне эндогенного IFNa, времени пиковой
концентрации и времени полужизни препаратов этого цитокина делают необходи¬
мыми исследования фармакокинетики препарата у каждого отдельного пациента
для обеспечения оптимальной схемы терапии.Интерферон-гаммаОценка уровня IFNy в культуре клеток крови имеет значение для определения
поляризации иммунного ответа по типу активации клонов Tj^l. Этот тип иммунно¬
го реагирования характерен для клеточного ответа, вызванного так называемыми
внутриклеточными патогенами. В последнее время разработаны два теста, позво¬
ляющие на основании уровня продукции IFNy в культуре клеток периферической
крови оценить наличие туберкулезной инфекции. Принцип метода состоит в акти¬
вации синтеза интерферона двумя специфическими антигенами из Mycobacterium
tuberculosis, которые отсутствуют в вакцинном штамме БЦЖ (ВасШе Calmette-
Qu rin - BCG) и других микобактериях. Одна модификация метода основана на
выявлении синтезирующих IFNy клеток методом ELISPOT, в другом варианте
уровень IFNy в супренатанте клеток оценивается методом ИФА. Клинические дан-
цитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 227ные указывают, что оба теста более специфичны, чем стандартный кожный тест,
так как исключают перекрестную реактивность, обусловленную предшествующей
вакцинацией. По чувствительности метод ИФА сравним с кожным тестом, а метод
ELISPOT его значительно превосходит.Гранулоцитарный колониестимулирующий фактору здорового человека уровень G-CSF в плазме крови очень низок, но при разви¬
тии инфекционных заболеваний его концентрация резко возрастает. Повышенные
уровни G-CSF также наблюдают при наследственной нейтропении и лекарствен¬
ной аплазии костного мозга, что указывает на существование механизма обрат¬
ной связи между количеством нейтрофилов на периферии и уровнем продукции
G-CSF. Исключение составляет аутоиммунная нейтропения у детей, где уровень
G-CSF не отличался от уровня у здоровых доноров, хотя количество лейкоцитов в
периферической крови было значительно снижено.Моноцитарный колониестимулирующий факторM-CSF находится в плазме периферической крови в очень высокой для цитоки¬
нов концентрации — от 1,8 до 7,1 нг/мл. Кроме того, он постоянно присутствует в
моче, спинномозговой и амниотической жидкости. Повышение уровня эндогенно¬
го M-CSF наблюдается при травмах, инфекционных заболеваниях, беременности
и некоторых формах рака.г ранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий
факторВ норме GM-CSF синтезируется в незначительных количествах и практически
отсутствует в плазме периферической крови. При развитии воспаления он начина¬
ет активно синтезироваться Т-лимфоцитами, макрофагами, эндотелиальными и
эпителиальными клетками в ответ на компоненты клеточной стенки патогенов и
провоспалительные цитокины. Уровень GM-CSF может бьггь повышен в области
очага воспаления, хотя при сепсисе с развитием синдрома системной воспалитель¬
ной реакции концентрация GM-CSF редко оказывалась повышенной в отличие от
G-CSF, уровень которого значительно возрастал у септических больных. Клетки
некоторых типов злокачественных опухолей кроветворной системы секретируют
все разновидности CSF, IL-3 и фактор роста стволовых клеток. Концентрации этих
цитокинов могут быть повышены у больных с гематологическими формами рака
и служить диагностическими маркерами стадии развития опухолей и ответа на
терапию.ЭритропоэтинРегуляция дифференцировки и поддержания функциональной активности
красного ростка кроветворения является важнейшей функцией, связанной с
обеспечением жизнедеятельности организма. В нормальных физиологических
условиях экспрессия гена эритропоэтина (ЭПО) происходит конститутивно.
Цитокин постоянно находится в плазме крови в невысоких концентрациях в
пределах 10-15 МЕ/л. Это обеспечивает поддержание нормального гемопоэза, в
ходе которого из костного мозга в периферическую кровь за одну минуту выходят
1,8x10^ ретикулоцитов, что требуется для поддержания концентрации 25x10^^ цир¬
кулирующих эритроцитов. Период существования эритроцитов составляет около
4i 228 цитокины в лабораторной диагностике120 сут, после чего происходит их утилизация в основном с помощью макрофагов
селезенки. Такая высокая скорость образования эритроцитов может увеличивать¬
ся еще в 10-12 раз при серьезных кровопотерях; это сочетается с возрастанием
уровня экспрессии гена ЭПО в клетках продуцентах и с ростом его концентрации
в плазме до 10 ООО МЕ/л. Период полужизни ЭПО в плазме человека составляет
от 6 до 10 ч. В норме ЭПО выводится через почки и обнаруживается в неизменен¬
ном виде в моче, попадая туда из плазмы, а не путем прямой почечной экскреции
после синтеза в почечной ткани. Определение уровня ЭПО в плазме крови либо в
моче используется для мониторинга его концентрации при анемиях различного
генеза; при почечной недостаточности, травмах, при анемиях у беременных и у
недоношенных детей, уровень ЭПО может быть диагностическим критерием для
полицитемии (polycythemia vera), у больных с этим диагнозом концентрация ЭПО
(метод ИФА) ниже границы нормального значения в 3,3 МЕ/л.ТромбопоэтннОсновная биологическая функция тромбопоэтина (ТП) заключается в уско¬
рении созревания предшественников тромбоцитопоэза, тогда как для усиления
пролиферации этих клеток требуется его совместное действие с другими гемо-
поэтическими факторами. Основным местом продукции ТП является печень,
высокий уровень экспрессии мРНК ТП обнаружен также в почках и селезенке.
ТП может синтезироваться и мегакариоцитами; тромбоциты имеют депо ТП в
своих гранулах. При активации тромбоцитов в процессе свертывания крови ТП
высвобождается из гранул, его концентрация возрастает у больных с синдромом
внутрисосудистого свертывания крови. Это может служить механизмом активации
тромбоцитарного ростка кроветворения для образования новых тромбоцитов.
Тромбоцитопении, часто сопутствующие циррозу печени и почечной недостаточ¬
ности, не всегда связаны с недостатком выработки ТП, у этих больных уровень
ТП в плазме периферической крови практически не отличается от его концентра¬
ции в плазме крови здоровых доноров, составляющей около 50 пг/мл. В других
исследованиях показано, что уровень ТП повышен в случае тромбоцитопении при
циррозе печени, осложненном миелодиспластическим синдромом или возникшем
как следствие вирусного гепатита.Трансформирующий ростовой фактор ßTGFß может быть выделен из нормальных тканей, например из тромбоцитов
или плаценты человека и из опухолевых клеток. TGFß, а также другие члены этого
обширного семейства, костные морфогенетические белки (Ъопе morphogenetic pro¬
teins — BMP) и активины экспрессируются в эндометрии, секретируются в полость
матки и принимают участие в регуляции имплантации и постимплантационном
развитии плода, а также регулируют синтез плацентарных гормонов. Во время
беременности ингибины и активины синтезируются клетками плаценты и могут
служить маркерами плацентарной патологии, включая преэклампсию и угрозу
выкидыша.ЗАКЛЮЧЕНИЕТаким образом, в настоящее время не вызывает сомнения, что цитокины слу¬
жат важнейшими мишенями иммунодиагностики широкого круга заболеваний
человека. Цитокины являются антиген-неспецифическими факторами. Именно
поэтому специфическая диагностика инфекционных, аутоиммунных и аллергиче¬
ских заболеваний с помощью определения уровня тех или иных цитокинов невоз-
ШЙцитокины в ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ 229можна. Тем не менее оценка содержания цитокинов в биологических жидкостях и а
изучение их продукции клетками дает неоценимую помощь для характеристики ^
состояния иммунной системы организма. Изучение уровней цитокинов позво-
ляет получить информацию о функциональной активности различных типов
иммунокомпетентных клеток; о тяжести воспалительного процесса, его перехо¬
де на системный уровень и прогнозе (например, уровень некоторых цитокиновкоррелирует с тяжестью клинических проявлений и летальностью при сепсисе);
о соотношении процессов активации типов Т-хелперов, что очень важно при
дифференциальной диагностике ряда инфекционных и иммунопатологических
процессов; о стадии развития ряда аллергических и аутоиммунных заболеваний,
когда, например, повышение уровня IL-1 в плазме крови опережает клинические
проявления при ревматоидном артрите и системной красной волчанке. В диагно¬
стическую практику все более входят методы молекулярно-биологического ана¬
лиза, позволяющие выявлять первичные генетические дефекты и полиморфизм
по единичным нуклеотидам в системе цитокинов, связанные с патогенезом целого
ряда заболеваний, в том числе таких широко распространенных, как туберкулез.
Такие же примеры можно привести по использованию любого из перечисленных
выше методов анализа состояния системы цитокинов. Каждый метод по-своему
хорош, и его использование определяется конкретной задачей диагностического
исследования.В настоящее время очевидно, что цитокины являются важнейшими фактора¬
ми патогенеза инфекционных заболеваний и иммунопатологических процессов.
Поэтому определение уровней синтеза эндогенных цитокинов и их концентраций
в биологических жидкостях можно использовать для целей иммунодиагностики,
изучения патогенеза заболеваний, адекватного назначения иммунотерапии. Все
это говорит о том, что оценка функционирования системы цитокинов позволяет
по-новому подойти к изучению состояния иммунной системы организма в клини¬
ческой практике.СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫКетлинский С.А., Симбирцев A.C. Цитокины. — СПб.; Фолиант, 2008. — 552 с.Румянцев А.г., Морщакова Е.Ф., Павлов А.Д. Эритропоэтин. — М.; ГЭОТАР-мед, 2002. -
399 с.Сесь Т.П., Тотолян A.A. Возможности мультиплексных технологий, основанных на при¬
менении микрочастиц, в кчинической лабораторной диагностике. Лабораторная диагности¬
ка России 2007/2008: Справочник. - СПб.: Человек, 2007. - С. 51-56.Тотолян A.A., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. - СПб.: Наука, 1999, - 231 с.Фрейдлин И,С., Тотолян A.A. Клетки иммунной системы. — СПб.: Наука, 2001. — 309 с.
Глава 20БактериологическиеисследованияЗНАЧЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
В ИНФЕКТОЛОГИИОсновной принцип диагностики инфекционных болезней —
единство трех составляющих: клинической диагностики, эпидемио¬
логической диагностики и инструментально-лабораторной диагно¬
стики.Методы инструментальной и лабораторной диагностики, в свою
очередь, могут быть подразделены на общие (анализы крови и
мочи, рентгенография, ультразвуковое исследование) и специфи¬
ческие (бактериологические, вирусологические, серологические,
молекулярно-биологические), позволяющие раскрыть природу
заболевания, характер его течения и прогноз, обосновать стратегию
и тактику лечебных и профилактических мер.Значение лабораторной диагностики в инфектологии неуклонно
возрастает в силу трех объективных причин:•	эволюции инфекционных агентов;•	прогресса молекулярной биологии и молекулярной медици¬
ны;-V’ быстрого развития средств и методов лабораторного анализа.Эволюция инфекционных болезней носит глобальный характер,
ее отличают контрастные тенденции в динамике различных групп
заболеваний.•	Инфекции, контролируемые средствами вакцинопрофилак-
тики и санитарно-гигиеническими мерами, теряют массо¬
вый характер. В стадии ликвидации находятся полиомиелит,
корь, минимизирована заболеваемость дифтерией, коклюшем,
брюшным тифом, малярией, устойчиво снижается частота
шигеллезов, сальмонеллезов и эшерихиозов.•	В структуре заболеваемости классическими инфекциями уве¬
личивается относительное число стертых, атипичных и суб-
клинических форм.•	На фоне успехов в борьбе с инфекциями сохраняется риск
возврата массовых инфекционных болезней вследствие недо¬
работок в прививочной работе, генетического дрейфа пато¬
генов, распространения антибиотике- и химиорезистентных
штаммов микроорганизмов.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 231❖	Ускоряется процесс выявления новых патогенов (около 50 видов за послед¬
ние 40 лет), вызывающих болезни с малоизученной клинической картиной.❖	Угроза возникновения пандемий «в любом месте и в любое время», по заклю- ||
чению экспертов воз, становится постоянной вследствие глобализации
миграционных потоков населения и появления «новых» патогенов (напри¬
мер, пандемия ВИЧ-инфекции).❖	Продолжается или нарастает неблагополучие по социальнозначимым инфек¬
циям (ВИЧ-инфекции, ИППП, туберкулезу, вирусным гепатитам), которым
свойственны длительный латентный период и, часто, скрытое течение, кото-
рое эпидемиологически и прогностически столь же опасно, как и манифест¬
ное.❖	По мере вовлечения в эпидемический процесс новых для России движущих
факторов (наркомании, рискованного социального поведения, коммерче¬
ского секса) обостряется проблема множественной инфекции — смешан¬
ной, сочетанной, суперинфекции (ВИЧ-инфекция и ВИЧ-ассоциированные
инфекции, вирусные гепатиты и ИППП), которые могут маскировать друг
друга и требуют полной этиологической расшифровки.Перечисленные особенности придают новый смысл специфической лаборатор¬
ной диагностике. Из средства подтверждения она все более превращается в инстру¬
мент первичного выявления инфекционных заболеваний и состояний (латентной
инфекции, бессимптомной инфекции, носительства). Наряду со специфической
диагностикой по клиническим показаниям все большее значение придается доно-
зологической диагностике инфекций, а также сходным направлениям — прена¬
тальной, перинатальной и постнатальной диагностике.Прогресс молекулярной биологии и молекулярной медицины обогащает спец¬
ифическую лабораторную диагностику новыми подходами и критериями для
идентификации патогенов и оценки состояния больных. Сиквенс генома возбу¬
дителей болезней и широкий фронт молекулярно-биологических исследований
позволяют:❖	получить новые данные о генетическом разнообразии бактерий и вирусов;❖	использовать в клинической и лабораторной практике генотипическую
систему классификации микроорганизмов;❖	пополнить знания о географическом распределении различных генотипов
микроорганизмов;❖	выделить генетические маркеры патогенности, химио- и антибиотикорези-
стентности;-O' определить молекулярные маркеры фаз инфекционного процесса, в том
числе более ранние признаки инфекции, чем IgM;❖	выявить важную для диагностики динамику созревания иммунного ответа.Объектом определения все чаще становятся не только сами бактерии, вирусы,их антигены или токсины, но и специфические элементы генома патогенов (ДНК,РНК). В связи с этим впервые возникла возможность быстрой детекции некуль-
тивируемых и труднокультивируемых микроорганизмов прямо в патологическом
материале, а также возможность быстрого определения антибиотикорезистентно-
сти бактерий с помощью выявления характерных мзтаций в их геноме. Развитие
средств и методов лабораторного анализа в инфектологии носит комплексный и
системный характер;^ быстро расширяется реагентная база в результате создания и внедрения
новых рекомбинантных продуктов, моноклональных антител и специфиче¬
ских праймеров;❖	непрерывно совершенствуются методики, основанные на принципах ИФА,
иммуноблоттинга, ПЦР и технологии биологических микрочипов;
232БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯшмш❖	создаются и обновляются высокопроизводительные автоматизированные и
компьютеризированные приборы и оборудование.Общий результат новых разработок:❖	повышение чувствительности и специфичности тестов;<> стандартизация и улучшение воспроизводимости методов;❖	минимизация требуемого объема исследуемого материала;о- возможность поточной обработки большого числа образцов.По быстроте получения результата современные методы, основанные на молеку¬
лярных подходах, превосходят классические методы бактериологического и виру¬
сологического исследований. Используя некоторые модификации ПЦР, можно
обнаружить от 1 до 10 нуклеиновых кислот бактерий или вирусов в исследуемом
образце, что приближается к величине заражающей дозы патогенов. Достижение
и преодоление подобного порога чувствительности — давняя стратегическая цель
прогресса в лабораторной диагностике.ЗАДАЧИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИОтмеченное выше многообразие проблем современной инфектологии и возрас¬
тающие методические возможности формируют разнообразие и многоплановость
задач современной диагностики бактериальных инфекций. Задачи лабораторной
диагностики бактериальных инфекций состоят в:❖	этиологической расшифровке инфекционного заболевания;❖	идентификации биологического вида бактерии-возбудителя;❖	идентификации и дифференциации вирулентных (патогенных) вариантов
возбудителя (С. diphíheriae, Cl d^cile, Е. coli, Y. enterocotiticá)",<=• генотипировании, субтипировании, риботипировании, VNTR-типировании,
сполиготипировании и другой детальной характеристике бактерий в целях
идентификации эпидемических штаммов и клонов, госпитальных штаммов
(М. tuberculosis, S. typhi, С. diphtheriae, Е. coli, Salmonella spp.);^ установлении клинических фаз инфекции, выявлении острой (ранней) инфек¬
ции, дифференциации инфекции и состояния поствакцинального иммуните¬
та (при коклюше, иерсиниозе, бруцеллезе, туляремии, боррелиозе);^ контроле эффективности лечения и эрадикации инфекции (при туберкулезе,
сифилисе, дифтерии, острых кишечных инфекциях, сальмонеллезах, брюш¬
ном тифе, инфекции, вызванной Я. pylorí)-,<• выявлении и дифференциации суперинфекции, рецидива, реинфекции (при
туберкулезе, инфекции, вызванной Я. pylori, других хронических инфекци¬
ях);<> выявлении ВИЧ-индикаторных инфекций (ВИЧ-ассоциированных инфек¬
ций у ВИЧ-инфицированных пациентов);❖	выявлении оппортунистических инфекций у больных на фоне иммуносу¬
прессивной терапии после трансплантации органов и тканей и у пациентов с
хроническими вирусными гепатитами;❖	контроле антибиотикорезистентности (первичной, вторичной) штаммов воз¬
будителей бактериальных инфекций.Специальные задачи исследований по клиническим показаниям включают:
исследование фекалий на дисбактериоз;❖	исследование биоценоза влагалища.Основными задачами донозологической диагностики бактериальных инфекций
являются:❖	скрининговые и профилактические исследования по выявлению сифилиса:-	обследование лиц, направляемых на стационарное лечение, на работу в
эпидемиологически значимые коллективы и производства;
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 233-	обследование лиц, относящихся к группам риска (согласно действующим
федеральным и местным нормативным документам);скрининговые и профилактические исследования по выявлению больных
дифтерией и носителей с йірШЬегіае:-	обследование лиц, направленных в детские дома, дома ребенка, интернаты
психоневрологического профиля, противотуберкулезные детские санато¬
рии, а также лиц, поступающих на работу в такие учреждения;-	обследование больных с подозрением на дифтерийную инфекцию при
ларингитах, ларинготрахеитах, крупе, ангинах, заглоточном абсцессе,
инфекционном мононуклеозе;❖	профилактические исследования на острые кишечные инфекции:-	обследование работников предприятий молочной, мясной, пищевых
отраслей промышленности, общественного питания, торговли, водоснаб¬
жения, водоотведения и очистки населенных мест, детских и подростко¬
вых учреждений всех профилей;-	обследование лиц, направляемых в учреждения и отделения психоневро¬
логического (психосоматического) профиля, дома престарелых, интерна¬
ты и другие типы закрытых учреждений с круглосуточным пребыванием;-	обследование эпидемически значимых контингентов на брюшной тиф и
носительство 5. гурЬп^ обследование на носительство патогенного стафилококка лиц, поступающих
на работу в детские молочные кухни, предприятия пищевой промышленно¬
сти.Задачи пренатальной, перинатальной и постнатальной диагностики инфекци¬
онных заболеваний сводятся к:❖	выявлению или исключению ТОКСН-комплекса (токсоплазмоза, краснухи,
цитомегаловирусной инфекции, герпеса) и других инфекций (вирусных гепа¬
титов Б и С, ВИЧ-инфекции, сифилиса, хламидиоза, гонококковой инфек¬
ции, листериоза) у беременных;определению иммунной защищенности беременных против инфекций
ТОКСН-комплекса;❖	определению группы риска перинатальной инфекции ТОКСН-комплекса;❖	выявлению внутриутробного инфицирования плода;о- обоснованию медицинских показаний для искусственного прерывания бере¬
менности в связи с выявлением инфекционных заболеваний беременных и
перинатальной инфекции;выявлению рисков интранатального инфицирования плода;❖	дифференциации перинатальной, интранатальной и постнатальной инфек¬
ции новорожденных.Лабораторное заключение по результатам бактериологического, серологиче¬
ского или молекулярно-биологического исследования все шире используется в
качестве основания для постановки окончательного диагноза инфекционного
заболевания или состояния (латентной инфекции, бактерионосительства). Это
становится возможным при интеграции лабораторной диагностики с другими
медицинскими дисциплинами, правильной постановке задачи и выборе эффектив¬
ного алгоритма обследования.К обязательным условиям успешной работы также относятся;❖	использование адекватных методов исследования;❖	наличие системы внутрилабораторного и внешнего контроля качества;❖	взаимодействие лабораторных служб учреждений лечебно-профилакти¬
ческого и санитарно-эпидемиологического профиля;❖	готовность лабораторий к постоянной модернизации методической базы и
приборного обеспечения.
234 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙОсновные задачи клинической микробиологии:❖	выявление этиологии инфекционного процесса;^ выбор рациональных средств этиотропной терапии.|1|Й^	Эти .эадачи тесно связаны между собой, и без успешного решения первой невоз-можно решение второй.Диагностический процесс в клинической микробиологии складывается из четы¬
рех основных этапов:❖	формулировки задачи и выбора метода исследования;выбора, взятия исследуемого материала, его хранения и транспортировки;о проведения исследований;❖	анализа полученных результатов.Важно, что из четырех указанных этапов только один (и то не во всех слу¬
чаях) полностью выполняется в лаборатории. Формулировка задачи исследо¬
вания - прерогатива лечащего врача. В выборе метода исследования, вида иссле¬
дуемого материала функции врача-микробиолога сугубо консультативные. Взятие
и транспортировку материала чаще осуществляет персонал лечебного учреждения
и только в особых случаях персонал лаборатории. Анализ полученных результа¬
тов лечащий врач проводит совместно с врачом-микробиологом, однако право и
обязанность постановки этиологического диагноза принадлежат первому из них.
Именно поэтому ответственность за успех микробиологического исследования
не может быть возложена исключительно на лабораторию. Достоверность и кли¬
ническая значимость получаемой информации определяется согласованностью
действий лечащего врача и врача-микробиолога. Эффективное взаимодействие
возможно только на основе взаимопонимания, когда обе стороны учитывают
потребности друг друга и трудности, которые возникают при решении поставлен¬
ных задач перед каждым из них.Формулировка задачи исследования подразумевает создание рабочей гипотезы
о возможной этиологии патологического процесса у данного больного. Задача
исследования определяет как выбор метода исследований, так и вид исследуемого
материала и отражается в бланке направления, который прикладывается к матери¬
алу, доставляемому в лабораторию. Многообразие патогенных микроорганизмов
определяет многообразие методов, используемых для диагностики инфекционных
заболеваний. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки, но идеаль¬
ного метода, одинаково эффективного при диагностике любого патологического
процесса, не существует. Также ни один из существующих методов не позволяет
определять в исследуемом материале все микроорганизмы одновременно. Именно
поэтому врач-микробиолог, который, как правило, не видит больного, должен
получить представление о предполагаемой этиологии патологического процесса,
определенной на основании клинических и эпидемиологических данных.Для лабораторной диагностики заболеваний инфекционной природы применя¬
ют следующие методы:❖	методы, основанные на выявлении инфекционных агентов (бактерий, виру¬
сов, грибов, простейших):-	микроскопические методы (в том числе бактериоскопический), базирую¬
щиеся на прямой визуализации возбудителя в патологическом материале
с помощью различных приемов микроскопии;-	культуральные методы (в том числе бактериологический), главная состав¬
ляющая которых — культивирование возбудителя на питательных средах,
в организме лабораторных животных или в культурах тканей с целью
выделения его чистой культуры и последующей идентификации;
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 235-	методы, позволяющие обнаружить в исследуемом материале продукты,
синтезированные микроорганизмами (например, летучие жирные кис¬
лоты при диагностике инфекций, обусловленных неспорообразующими
анаэробами, или токсин при диагностике ботулизма);-	иммунологические методы индикации антигенов возбудителей в исследуе¬
мом материале;-	генетические методы, основанные на обнаружении нуклеиновых кислот
возбудителя в исследуемом материале;методы выявления активного иммунного ответа — чаще всего по нарастанию
титра антител к антигенам возбудителя (серодиагностика) или сенсибилиза¬
ции (аллергодиагностика);❖	неспецифические лабораторные тесты, по характеру отклонения которых
можно заподозрить патологические изменения, характерные для инфекци¬
онных процессов определенной этиологии (например, изменение активности
трансаминаз при вирусных гепатитах).Успех выделения чистой культуры микроорганизма определяется правильно¬
стью выбора питательной среды и условий культивирования. Универсальной пита-
тельной среды, использование которой гарантирует выделение любого микро¬
организма, не существует. Обнаружение возбудителей в исследуемом материале,
содержащем значительное количество сопутствующей микрофлоры (например,
фекалиях), требует применения элективных питательных сред, предназначенных
для выделения конкретных видов микроорганизмов. Для некоторых бактерий
необходимы особые условия культивирования (микроаэрофильные — для кампи-
лобактеров, анаэробные — для клостридий и бактероидов, атмосфера, обогащен¬
ная углекислым газом, — для нейссерий). Все это следует учитывать при направле¬
нии материала в лабораторию, так как успех исследования во многом определяется
правильностью предварительного диагноза лечащего врача и, следовательно,
правильностью поставленной перед лабораторией задачи. Например, если лабо¬
раторию не просили специально выполнить дополнительные исследования фека¬
лий на Campylobacter spp. или Cl difficile, ответ «патогенные микроорганизмы не
обнаружены» может означать, что необходимые исследования не проводили и
указанные виды бактерий не искали.Метод исследования необходимо выбирать с учетом всего комплекса диагности¬
ческих и лечебных процедур, проводимых данному больному. Например, исполь¬
зование бактериологического метода на фоне антибиотикотерапии будет заведомо
малоэффективным. Методы, не позволяющие дифференцировать живые и «убитые»
микроорганизмы (ПЦР, РИФ), следует с осторожностью использовать при контроле
результатов лечения. Подобные исследования необходимо проводить не ранее, чем
через несколько недель после окончания этиотропной терапии, так как погибшие
микробные клетки или их антигены могут длительное время сохраняться в органи.^-
ме и выявляться с помощью указанных методов. Постановка кожной аллергической
пробы в интервале между взятием двух парных сывороток при проведении серо*
диагностики может привести к увеличению титра антител, которое обусловлено не
развитием заболевания, а экзогенным введением аллергена.Выбор вида исследуемого материала зависит от конкретного заболевания и
преимущественной локализации возбудителя на данном этапе развития патологи¬
ческого процесса. Классический пример, подтверждающий значение обоснованно¬
го выбора материала в зависимости от этапа патогенеза болезни, ~ брюшной тиф.
При этой инфекции на различных этапах бактериологического анализа сначала
исследуют кровь, а затем фекалии.Важно осуществить взятие проб в оптимальные сроки. Например, при сальмонел¬
лезе вероятность вьщеления возбудителя из фекалий на 2-й неделе заболевания в
2 раза, а на 3-й в 6,8 раза меньше, чем при обследовании на 1-й неделе. При коклюшеШШ
ж236 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯвероятность обнаружения возбудителя в носоглоточной слизи на 1-й неделе заболе¬
вания составляет 95%, на 4-й — 50%, а на 5-й приближается к нулю.Процедуры отбора проб для бактериологического исследования зачастую
достаточно сложны технически, а правильность их выполнения имеет решаю¬
щее значение. Например, нар>1пение правил взятия крови ведет к контаминации
пробы микроорганизмами с кожи или из окружающей среды и может стать при¬
чиной ошибочного этиологического диагноза.Сложность процедуры должна оправдывать ценность получаемой информации.
Наиболее эффективный способ получения мочи для бактериологического иссле¬
дования, максимально гарантирующий отсутствие контаминации посторонней
микрофлорой, — надлобковая пункция мочевого пузыря. Однако на практике
такой способ используют редко из-за травматичности для пациента, ограничива¬
ясь исследованием средней порции свободно выпущенной мочи.в большинстве случаев время от момента взятия материала до начала иссле¬
дования ограничено (часто оно не должно превышать 2 ч). Если существует
необходимость увеличения времени от момента взятия материала до начала
исследования в лаборатории, при использовании некоторых методов диагностики
материал можно консервировать, В случаях, когда условия его доставки не могут
быть выполнены, следует отказаться от использования данного исследования и
попытаться найти метод, в меньшей степени зависящий от особенностей транс¬
портировки.Проведение исследований в лаборатории регламентировано национальными
стандартами и инструкциями фирм-изготовителей реагентов и диагностикумов.
Строгое соблюдение правил, определяющих технологию диагностических про¬
цессов, обеспечивает унификацию исследований и возможность сопоставления
данных, полученных в различных учреждениях.Анализ результатов исследований включает оценку:
достоверности результатов;^ полноты полученной информации;❖	этиологической значимости обнаруженных микроорганизмов.Достоверность результатов анализов обеспечивает осуществление в лабо¬
раториях работ по внешнему и внутреннему контролю качества исследований.
Внешний контроль осуществляют с помощью внешних инспекций, включающих
решение диагностических задач. По результатам таких проверок лаборатории про¬
ходят лицензирование на право проведения диагностических исследований.Внутренний контроль качества должен непрерывно проводиться в лаборатории
и призван оградить пациента и лечащего врача от получения ложноположитель¬
ных или ложноотрицательных результатов, возникающих из-за допущенных в
ходе работы ошибок. Его осуществляют с помощью входного контроля реактивов
и питательных сред, использования эталонных штаммов микроорганизмов, иссле¬
дования заведомо положительных и отрицательных проб. В некоторых случаях
контрольные образцы исследуют одновременно с каждой пробой. При этом учет
результатов теста осуществляют только при получении ожидаемого результата
контролей.Достоверность результатов определяется не только качеством работы лабо¬
ратории, но и соблюдением правил взятия материала и его доставки. К сожа¬
лению. далеко не всегда с помощью лабораторных методов удается выявить
ошибки, допущенные на данном этапе исследований, но иногда это возможно.
Например, обнаружение в пробе мокроты при микроскопии буккального эпителия
и отсутствия лейкоцитов указывает на примесь значительного количества слюны.
Бактериологическое исследование такого образца нецелесообразно.Анализ полноты полученной информации подразумевает решение вопроса о
достаточности результатов выполненных тестов для постановки этиологического
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 237диагноза и необходимости проведения дополнительных исследований. В ряде слу¬
чаев дополнительные исследования могут быть проведены без повторного взятия
материала. Например, могут быть определены факторы вирулентности выделен¬
ного возбудителя или поставлены дополнительные серологические реакции при
исследовании плазмы крови. В других случаях план дальнейших исследований
должен быть согласован с лечащим врачом.Точная этиологическая диагностика многих форм инфекционной патологии
(Ку-лихорадка, гастроэнтероколиты) крайне затруднена или даже невозможна без
комплекса лабораторных исследований. В то же время результат лабораторного
анализа не является «истиной в последней инстанции» и окончательный диа¬
гноз больному ставит лечащий врач на основании всего комплекса клинических
данных, включающего результаты объективных методов исследования, жалобы
больного, анамнестические данные и т.д.При оценке диагностической значимости бактериологического исследования
необходимо помнить о неравнозначности положительного и отрицательного резуль¬
татов. Если обнаружение микроорганизма в исследуемом материале однозначно
свидетельствует о его присутствии в организме больного в момент исследования, то
отрицательный результат не всегда свидетельствует об отсутствии микроорганиз¬
ма. В ходе специального эксперимента на волонтерах, зараженных вирулентными
штаммами шигелл и заболевших дизентерией, возбудитель удалось выделить толь¬
ко в 70% случаев. Причины, по которым возбудитель не удается вьщелить от боль¬
ного определенным инфекционным заболеванием, многообразны. К ним относятся
неравномерность распределения микроорганизмов в общей массе исследуемого
материала и изменение интенсивности выделения возбудителей из организма боль¬
ного по времени. Поэтому вероятность обнаружения патогенных микроорганизмов
резко возрастает при увеличении кратности обследования больного и увеличении
числа исследованных видов материала. Так, для выявления возбудителя у больных
острым трихомониазом необходимо трехкратное исследование нативных и окра¬
шенных препаратов, а при хронических формах — пятикратное.Таким образом, отрицательный результат бактериологического исследования,
особенно однократного, не является достаточным основанием для исключения
инфекционного заболевания. Факт обнаружения патогенного микроорганизма без
связи с конкретными обстоятельствами не всегда является достаточным основани¬
ем для постановки конкретного диагноза. Это обусловлено широким распростра¬
нением бактерионосительства при ряде нозологических форм. Значимость факта
обнаружения патогенного микроорганизма во многом определяется видом иссле¬
дуемого материала. Например, выявление возбудителей брюшного тифа в крови,
соскобе из розеол или моче имеет большую диагностическую ценность, чем изо¬
ляция S. typhi из фекалий или желчи. В последних двух случаях вероятно наличие
другого инфекционного заболевания на фоне носительства S. typhi.Наибольшую сложность представляет трактовка результатов бактериологиче¬
ского исследования в случае обнаружения условно-патогенных микроорганизмов,
многие из которых являются представителями нормальной микрофлоры. При
этом следует говорить о доказательстве этиологической роли выделенного микро¬
организма как об особом этапе диагностического исследования. Универсальные
критерии для оценки диагностической значимости факта обнаружения тех или
иных условно-патогенных микроорганизмов отсутствуют. Наиболее часто прини¬
мают во внимание следующие обстоятельства:❖	количество микроорганизмов данного вида в исследуемом материале;
отсутствие в исследуемом материале патогенных микроорганизмов;❖	выделение данного микроорганизма в монокультуре или в ассоциации;❖	частота находок данного микроорганизма в том же исследуемом материале у
здоровых лиц;
238 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ^ повторное выделение одного вида микроорганизмов на протяжении всего
заболевания и его исчезновение по мере выздоровления;ШМЖ	^ выявленное с помощью серологических исследований нарастание титраантител к данному виду микроорганизма;❖	одновременное обнаружение определенного вида микроорганизмов у ряда
пациентов со сходной клинической картиной и аналогичным источником
(фактором) заражения.Не менее сложна оценка результатов серологических исследований. Только в
немногих случаях (сифилис, вирусные гепатиты) диагностическое значение имеет
сам факт обнаружения антител определенной специфичности. Чаще диагноз ста¬
вят с помощью одного из двух диагностических критериев — диагностического
титра или нарастания титра антител. Диагностический титр — условная величи¬
на титра антител в сыворотке крови к конкретному возбудителю, превышение
которой может быть расценено как признак заболевания. Величину диагности¬
ческого титра устанавливают эмпирически для каждого заболевания и каждой
серологической реакции. При этом в случае применения для диагностики одного
заболевания нескольких серологических реакций, величины диагностических
титров для каждой из них могут не совпадать, так как тесты отличаются по своей
чувствительности. Также различия в величинах диагностических титров возмож¬
ны при применении одной и той же реакции с использованием разных диагности¬
ческих препаратов, поскольку в этом случае могут выявляться антитела к разным
антигенам. Величина диагностического титра приведена в инструкции-вкладыше,
которая имеется в каждой коробке с диагностическим препаратом. Для определе¬
ния нарастания титра антител необходимо исследовать две сыворотки больного,
взятые с интервалом в 7-10 дней. Важно помнить, что обе сыворотки необходимо
исследовать в одной и той же серологической реакции. Таким образом, для оценки
результата врачу недостаточно знать абсолютную величину титра антител, также
необходима информация о виде поставленной серологической реакции. Данная
информация еще более важна, если учесть, что динамика изменения титра анти¬
тел, определяемая в различных тестах, при некоторых заболеваниях не совпадает.
Например, при сыпном тифе с помощью РИГА антитела удается выявить в высоких
титрах на ранних сроках заболевания и в период его разгара, но не после выздо¬
ровления. В РСК, напротив, титр антител нарастает медленнее, но сохраняется
высоким длительное время после выздоровления. Таким образом, сопоставляя
данные, полученные с помощью различных серологических реакций, врач в ряде
случаев может получить ценную дополнительную информацию.Современные методы серодиагностики позволяют определить концентрацию
в плазме крови иммуноглобулинов отдельных классов определенной специфич¬
ности. После первого контакта с микроорганизмом индуцируется образование
специфических IgM. Титры IgM быстро нарастают и достигают максимума, а затем
относительно быстро снижаются. IgG появляются позже, но дольше сохраняют¬
ся в высоких титрах. При повторном контакте с тем же антигеном (вторичный
иммунный ответ) IgM вырабатываются в незначительном количестве, реакция
гуморального иммунитета проявляется увеличением титров IgG. В связи с этим
по соотношению IgM и IgG можно отличить первичный иммунный ответ (острое
заболевание) от вторичного (рецидив или повторное заражение). О различиях в
характере иммуноглобулинов, образуемых при первичном и вторичном иммунных
ответах, следует помнить при оценке результатов, полученных с помощью неко¬
торых современных иммунологических методов (например, ИФА). Большинство
выпускаемых тест-систем ИФА для серодиагностики позволяют определить титр
IgM или IgG. Соответственно и лаборатория предоставляет врачу информацию не
о титре антител вообще, а о титре иммуноглобулинов соответствующего класса.
В зависимости от конкретной клинической ситуации интерпретация факта обна-
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 239ружения высоких или низких титров IgM и IgG будет отличаться, в частности,
низкие титры или отсутствие IgM не всегда можно расценивать как факт, свиде¬
тельствующий об отсутствии заболевания.ПРИНЦИПЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
ОТДЕЛЬНЫХ ВИДОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
И ИНТЕРПРЕТАЦИИ ИХ РЕЗУЛЬТАТОВ*1
ii#шшКровьПоказаниями к проведению бактериологического исследования крови служат:•о клиническая картина сепсиса;❖	лихорадочные состояния неустановленной этиологии;❖	пневмонии;<> подозрение на инфекционные заболевания — брюшной тиф и паратифы,
сальмонеллезы, бруцеллез, возвратный тиф, лептоспирозы, малярию, эпи¬
демический менингит, пневмококковые инфекции, ПТИ (при наличии лихо¬
радки), стафилококковые и стрептококковые инфекции, сибирскую язву,
туляремию, чуму.Количество независимо отбираемых проб крови и время их взятия определя¬
ется лечащим врачом в зависимости от особенностей клинического состояния
больного (табл. 20-1). Как правило, от пациентов берут не менее 2-3 проб крови
из разных сосудов или разных участков одного сосуда. Это необходимо для диффе¬
ренциации истинной бактериемии от случайной контаминации крови.У больных, получающих антибактериальные препараты, пробы необходимо
собирать непосредственно перед введением (приемом) следующей дозы препара¬
та. При наличии лихорадки оптимально взятие крови на фоне повышения темпе¬
ратуры тела (не на пике лихорадки!).Таблица 20-1. Рекомендуемое число отбираемых проб крови в зависимости от клинической
ситуацииКлиническое состояниеКоличествопробПримечанияОстрый сепсис, менингит, остеомиелит,
артрит, острые пневмонии и пиелонеф¬
рит2Из 2 сосудов или 2 участков кровеносного сосуда
перед началом антибактериальной терапииЛихорадка неясного генеза42 пробы из разных кровеносных сосудов (разных
участков сосуда), через 24-36 ч — еще 2 пробыИнфекционный эндокардит в период
обострения2Из 2 участков сосудов {2 различных сосудов)
в течение первых 1-2 ч лихорадки (не на пике
лихорадки!) и до начала антибактериальной
терапииПодострый или вялотекущий инфекци¬
онный эндокардит3-6Сначала 3 пробы с интервалом 15 мин и более,
если все пробы отрицательные, на 2-е сутки —
еще 3 пробыИнфекционный эндокардит на фоне
антибактериальной терапии6По 2 отдельные пробы в каждый из 3 дней с
положительной клинической динамикой антибак¬
териальной терапииВялотекущий сепсис на фоне антибакте¬
риальной терапии66 проб в течение 48 ч; пробы необходимо
собирать непосредственно перед введением
(приемом) следующей дозы антибактериального
препарата
240 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯВзятие проб кровипробы для определения наличия в крови биологических агентов получают
пункцией периферических вен, артерий или из пятки (у новорожденных детей),
с этой целью можно пользоваться стерильными одноразовыми или стеклянны¬
ми шприцами объемом 20 мл (для взрослых пациентов) или 10 мл (для детей).
Применение вместо них вакуумных пробирок, представляющих собой стерильные
полностью закрытые системы, гарантирует от посторонней контаминации проб
во время их взятия, транспортировки и хранения. Сбор проб из постоянного
внутривенного или внутриартериального катетеров допускается только в случа¬
ях подозрения на возникший катетерный сепсис или отсутствия возможности ее
получения венопункцией.Выбранный для пункции кровеносного сосуда участок кожи дезинфицируют
тампоном, смоченным 70% этиловым спиртом, а затем другим тампоном, смочен¬
ным 1 -2% раствором йода или другим дезинфектантом, круговыми движениями,
начиная от центра, в течение 30 с. Нельзя пальпировать сосуд после обработки
кожи перед введением иглы. Пункцию сосуда проводят после полного высыхания
обработанного участка кожи. После взятия пробы и извлечения иглы место ее
вкола обрабатывают 70% этиловым спиртом.Пробы крови в вакуумные пробирки берут в следующем порядке:❖	короткий конец двойной иглы для вакуумных пробирок освобождают от пла¬
стиковой защиты и укрепляют иглу в держателе;<0^ снимают пластиковую защиту с длинного конца иглы и пунктируют сосуд;<> вакуумную пробирку вводят в держатель до прокола крышки пробирки «про¬
бирочным» концом двойной иглы;❖	по окончании вакуумной аспирации крови снимают пробирку с иглы и поме¬
щают в штатив для немедленной транспортировки в лабораторию для посева;❖	извлекают иглу из вены, демонтируют из держателя при помощи демон¬
тажного профиля специальной емкости для отходов (в отсутствие тако¬
вой — вручную, предварительно осторожно закрыв иглу пластиковой
защитой).После пункции кровеносного сосуда (независимо от того, какими средствами
ее проводили), для предотвращения возможного раздражения (ожога) с участка
кожи пациента стирают остатки йода с помощью тампона, смоченного 70% эти¬
ловым спиртом.При использовании флаконов промышленного изготовления со средой и реа¬
гентами, нейтрализующими антибиотики и разрушающими форменные элементы
крови, или без них, отечественного и импортного производства, у взрослых полу¬
чают с помощью шприца 10-20 мл крови, у детей — в зависимости от возраста
(табл. 20-2).Таблица 20-2. Рекомендуемый для проведения бактериологического исследования объем проб
крови детейВозраст, летОбъем крови, вносимой в 2 флакона, мл<222-586-1012>1020Исследование материалаСразу после взятия кровь засевают на питательные среды в соотношении 1:10-
1:60 для устранения бактерицидного действия крови посредством ее разведения.
Техника посева зависит от вида используемых питательных сред.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 241На среды лабораторного приготовления, расфасованные во флаконы с ватными
пробками, посев проводят следующим образом:❖	снимают иглу со шприца;❖	открывают флакон над пламенем спиртовки;❖	вносят половину пробы крови из шприца во флакон;■ф' обжигают горлышко и пробку флакона в пламени спиртовки;о- закрывают флакон пробкой;❖	осторожно, чтобы не замочить пробку, перемешивают содержимое флакона
круговыми движениями;❖	повторяют указанные операции со вторым флаконом.Флаконы со средами промышленного изготовления с резиновыми либо пласти¬
ковыми пробками засевают кровью согласно инструкции производителя:❖	при наличии на флаконах защитных колпачков их удаляют (отгибают), не
открывая при этом пробки;❖	пробки флаконов обрабатывают 70% этиловым спиртом (использование
йодной настойки определяеп'ся рекомендациями производителя питательных
сред);кровь в равных объемах вносят в аэробную и анаэробную питательные
среды, прокалывая пробки флаконов.Посевы крови, сделанные вне лаборатории, немедленно доставляют в послед¬
нюю, оберегая от охлаждения.Бактериоскопию крови широко применяют для диагностики инфекционных
заболеваний, сопровождающихся бактериемией (например, возвратных тифов).
Кровь для бактериоскопического исследования при правильном типе лихорад¬
ки берут за 2 ч до ее предполагаемого наступления, при неправильном типе — в
вечернее время.Для бактериоскопического исследования готовят мазок и препарат толстой
капли.❖	Для приготовления мазка каплю крови диаметром 2-3 мм наносят на обе¬
зжиренное предметное стекло вблизи от торца. Перед каплей крови ставят
под углом 45° стекло со шлифованным краем и плавным движением равно¬
мерно распределяют материал по поверхности. Применение специального
пластикового шпателя с микрофибрами позволяет получать одинаковые по
толщине мазки и избегать случайного травмирования кожи медицинских
работников при проведении данной процедуры.❖	Для приготовления препарата толстой капли на стекло наносят каплю крови
диаметром около 5 мм и распределяют ее с помощью иглы или пипетки с
образованием диска диаметром 10-15 мм. Толщина капли должна позволять
видеть через нее газетный шрифт.❖	Иногда мазок и толстую каплю готовят на одном стекле. Для этого на поверх¬
ность приготовленного, как описано выше, мазка до его высыхания наносят
еще одну каплю крови, которая, как правило, сама растекается в правильный
диск необходимой толщины.❖	Препараты высушивают (толстая капля сохнет в течение 2-3 ч) и доставляют
в лабораторию с соблюдением необходимой осторожности.Бактериологическая лаборатория при исследовании посевов крови выдает
ответ с отрицательным результатом, если рост микроорганизмов отсутствовал в
течение 10 дней инкубации. При подозрении на наличие у больного внутрисосуди-
стой инфекции или бруцеллеза, что должно отмечаться в направлении на исследо¬
вание, возникает необходимость пролонгированной до 1 мес инкубации посевов.
Рутинный посев крови не обеспечивает выявления ряда микроорганизмов. Их
перечень, а также способы выявления приведены в табл. 20-3.
242 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯТаблица 20-3. Микроорганизмы, обнаружение которых в крови требует применения специальных
диагностических приемовМикроорганизмСпециальные приемы выявленияBorrelia spp.В. recurrentis, в. pérsica, В. latyschewwii (возбудители возвратных тифов) —
бактериоскопия мазкое крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе
В. burgdorferi — посев на специапьные среды (на практике не применяется)Brucella spp.Применение специальных питательных сред, инкубация в атмосфере с
5-10% угпекислого газаCardiobacterium hominisИнкубация 8 атмосфере, обогащенной углекислым газом,пересев с жидких питательных сред на плотные, содержащие в своемсоставе дрожжевой экстрактLegionella spp.Пересев с обычных аэробной и анаэробной сред для первичного посева
крови на угольно-дрожжевой агар дня легионеплLeptospira spp.Микроскопия препаратов цитратной крови, посев крови (по 5 капель) в
3-5 пробирок с дистиллированной водой или специальной питательной
средой, постановка биопробыMycobacterium spp.*Посев осадка центрифугированной пизированной крови, использование
автоматических бактериологических анализаторовBartonella (Hochaiimaea) spp.Применение специальных методов предпосевной обработки крови, пита¬
тельных сред и приемов инкубацииStreptobacillus moniliformisМикроскопия препаратов цитратной крови, применение специальных мето¬
дов предпосевной обработки крови, инкубация в атмосфере с повышенным
содержанием углекислого газа’ Исследование крови целесообразно проводить у больных с иммунодефицитом при подозрении
на ('енерализованную инфекцию, обусловленную атипичными микобактериями.Существуют автоматизированные системы для индикации микробного роста в
посевах крови. Их применение позволяет ускорить получение результата и спо¬
собствует более раннему назначению адекватного лечения. Детекцию микробного
роста осуществляют по продукции углекислого газа, изменению pH, электропро¬
водности, окислительно-восстановительного потенциала или мутности питатель¬
ной среды (одновременно могут учитываться несколько параметров).Спинномозговая жидкостьПоказанием к проведению исследования СМЖ служит подозрение на нейроин¬
фекцию.При подозрении на гнойный менингит в лабораторию направляют;❖	СМЖ для первичного посева, бактериоскопии и иммунологических исследо¬
ваний в количестве не менее 1,0 мл;О' СМЖ в 0,1% полужидком сывороточном агаре (среда «обогащения?>);❖	препарат «толстой капли» крови для бактериоскопии;❖	посев крови (см. выше);❖	пробу крови в объеме не менее 2,0 мл для серологических исследований
(РПГА, ВИЭФ, латекс-агглютинация и др.).Взятие проб СМЖПробы СМЖ берут посредством люмбальной пункции, которую целесообразно
проводить при поступлении больного в стационар или до начала лечения.Для выполнения этой врачебной манипуляции необходимы специальная под¬
готовка и допуск. Пункцию и взятие материала проводят с соблюдением правил
асептики, медперсонал работает в масках и стерильных перчатках.Следует придерживаться следующего порядка получения проб СМЖ.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 243❖	Больного укладывают на бок на кровать, у которой максимально опущена
передняя сторона. Голову пациента прижимают к его груди, а ноги — к живо¬
ту, спина должна быть максимально согнута.о- Определяют анатомические ориентиры, необходимые для выбора места
пункции. Пункцию проводят между поясничными	и пояснично-крестцовыми (I^-Sj) позвонками.❖	Обрабатывают область пункции раствором антисептика, а затем 70% этило¬
вым спиртом.❖	Пальпируют точку пункции и вводят в эту область раствор анестетика;❖	Проводят пункцию иглой со вставленным мандреном до возникновения ощу¬
щения «провала в пустоту».<• Извлекают мандрен.^ Первую порцию СМЖ (1 мл) собирают в обычную пробирку для проведения
общего ликворологического исследования.<> Вторую порцию СМЖ (1,0 мл), предназначенную для бактериологического
исследования (бактериоскопии, посева на питательные среды и иммуноло¬
гических тестов), собирают в стерильную одноразовую пробирку с плотно
закрывающейся крышкой.^ Третью порцию СМЖ (0,5 мл) засевают в 5,0 мл подогретого в термостате 0,1%
полужидкого сывороточного агара непосредственно у постели больного.При необходимости проведения ПЦР берут четвертую пробу СМЖ (0,2 мл) в
специальную одноразовую пробирку.❖	При проведении упомянутых выше манипуляций нельзя касаться руками
краев канюли, иглы, пробирки, класть пробку.❖	Материал доставляют в бактериологическую лабораторию немедленно после
забора в теплом виде (при температуре 37 “С в термосумках или термокон¬
тейнерах).^ При невозможности немедленной доставки допускается хранение проб СМЖ
в термостате (при 37 °С) в течение не более 18 ч.❖	При необходимости проведения дополнительных вирусологических иссле¬
дований пробы СМЖ помещают в холодильник при температуре 2-8 “С или
замораживают.Исследование материалаМикроскопия - один из важнейших методов исследования СМЖ, позво¬
ляющий максимально быстро получить необходимую информацию. Прозрачную
СМЖ перед исследованием центрифугируют при 2500-3000 об./мин (1500xg)
в течение 15-20 мин и ] отовят мазки из осадка. Из мутной СМЖ мазки можно
готовить без центрифугирования. Высушенные мазки фиксируют в пламени спир¬
товки и окрашивают метиленовым синим и/или по Граму, а при подозрении на
туберкулез — по Циль-Нильсену. Препараты микроскопируют с помощью иммер¬
сионного объектива. При обнаружении М. tuberculosis на основании микроскопии
выдается окончательный ответ, во всех остальных случаях — предварительный,
предполагающий уточнение по результатам применения культурального метода
диагностики туберкулеза.Для выявления Criptococcus neoformans на предметном стекле смешивают одну
бактериологическую петлю осадка СМЖ с индийскими чернилами, накрывают
препарат предметным стеклом и микроскопируют с помощью объектива х40.
Криптококки под микроскопом выглядят как инкапсулированные, сферические,
почкующиеся дрожжевые формы. Результаты микроскопического исследования
немедленно сообщают лечащему врачу.В лаборатории посевы инкубируют при температуре 37 "С в течение 24-48 ч в
атмосфере, содержащей 5-10% углекислого газа. При наличии роста на плотных
питательных средах проводят оценку культуральных свойств колоний, готовят
244 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯмазок и окрашивают его по Граму, определяют оксидазную и каталазную актив-
||Ш^' ность и, в зависимости от полученного результата, проводят дальнейшую иден-
Ш'Щ!' тификацию возбудителя и определение чувствительности к антимикробным пре-
паратам.При наличии признаков роста в 0,1 % полужидком сывороточном агаре проводят
высев на чашки с шоколадным агаром. Дальнейшая работа по выделению чистой
ШШЩ культуры, ее идентификации и определению чувствительности к антибиотикам
строится в зависимости от характеристик обнаруженных микроорганизмов.подозрении на туберкулезный менингит по капле осадка засевают как
минимум в 3 пробирки со средой Левенштейна-Йенсена. Пробирки затыкают
резиновыми пробками или парафинируют ватно-марлевые пробки. Посевы инку¬
бируют в течение 6 нед с ежедневным просмотром.Оценка результатовСМЖ в норме стерильна, поэтому диагностически значимо обнаружение
любого микроорганизма. Необходимо учитывать возможность случайной кон¬
таминации, которую можно заподозрить при отрицательных результатах бакте¬
риоскопического исследования СМЖ и отсутствии роста на плотных питательных
средах в сочетании с ростом на жидких питательных средах. При подозрении на
контаминацию исследование следует повторить. Диагностически значимо повтор¬
ное выделение того же вида микроорганизмов.Превалирующие этиологические агенты при менингитах меняются в зави¬
симости от возраста больных и сопутствующих обстоятельств. У новорожден¬
ных бактериальный менингит чаще всего вызывают стрептококки групп В и D,
L. monocytogenes, энтеробактерии, а у детей первых 3 мес жизни также N. meningiti¬
dis, Str. pneumoniae и Я. influenzae. У детей старше 3 мес наиболее важными этио¬
логическими агентами являются N. Meningitidis, Str. pneumoniae и Я. influenzae. Для
взрослых N. meningitidis и Str. pneumoniae сохраняют этиологическое значение, а
Я. influenzae в старших возрастных группах вызывает менингиты только при нали¬
чии предрасполагающих факторов — алкоголизма, наркомании, иммунодефицита.
Важно, что листерии также могут вызывать менингиты в старших возрастных
группах. В начальном периоде листериоза СМЖ серозная, а на поздних сроках
заболевания — гнойная. При серозных менингитах следует в первую очередь
исключить туберкулез. Менингит, возникший после травм и нейрохирургических
операций, могут вызывать различные условно-патогенные микроорганизмы —
S. aureus, S. epidermidis, Str. Pyogenes, R aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae, Serratia
marcescens.Раневое отделяемое, аспират и биоптаты кожи
и подлежащих тканейПоказанием к проведению исследования служит выявление у пациента при¬
знаков гнойно-воспалительного процесса в ране, на коже и в прилегающих к ней
тканях.Взятие исследуемого материалаВзятие материала осуществляет врач, как правило, при проведении перевязки
или операции. Технология взятия образца для микробиологического исследова¬
ния во многом определяется клинической ситуацией и не может быть унифициро¬
вана. Исследуемым материалом может служить экссудат, аспират из раны, мазки
(тканевая жидкость, пропитавшая тампон), биоптаты. Направление на исследова¬
ние гноя или струпов нецелесообразно.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 245Пробы берут с соблюдением правил асептики. Кожу вокруг раны или над оча¬
гом воспаления обрабатывают 70% этиловым спиртом и 1-2% настойкой йода
(обязательно необходимо смыть 70% этиловым спиртом во избежание ожогов)
или другим разрешенным антисептиком. При необходимости удаляют с помощью
стерильной салфетки некротические массы, детрит, гной. Использовать растворы
антисептиков для снятия повязки или обработки раневой поверхности до взятия
материала нельзя.Взятие материала из ранОтбор проб проводят после обработки раны вышеописанным способом. Для
взятия материала, предназначенного для бактериологического и микроскопи¬
ческого исследований, пользуются стерильными зондами-тампонами (предпо¬
чтительнее промышленного изготовления, а не самостотельно изготовленными,
вискозными или да кроновыми, а не ватными).Прокатывают каждым зондом-тампоном по раневой поверхности от центра к
периферии в течение 5-10 с; тампон должен равномерно пропитаться тканевой
жидкостью; манипуляцию необходимо проводить максимально осторожно, не
травмируя ткани, появление даже следов крови недопустимо, так как кровь обла¬
дает бактерицидными свойствами.Взятие материала для микроскопии обязательно, так как в ряде случаев она
более информативна по фавнению с бактериологическим исследованием; зонд-
тампон, предназначенный для микроскопического исследования, помещают в
пустую пробирку.Зонд-тампон с материалом для бактериологического исследования помещают в
пробирку с транспортными средами Эймса или Стюарта.Взятие раневого отделяемого из дренажейПри наличии в ране дренажей отделяемое из них собирают стерильными шпри¬
цем или одноразовой пастеровской пипеткой в объеме 1-2 мл и помещают в сте¬
рильную пробирку или пробирку с транспортными средами Эймса или Стюарта.Можно пропитать отделяемым из дренажа стерильный зонд-тампон и погру¬
зить его в пробирку с транспортной средой.Взятие аспирата:о материал забирают после обработки кожи;^ после высыхания дезинфектанта врач с помощью одноразового шприца
объемом 3-5 мл и иглы №22 или №23 берет аспират из глубины раны;
если имеется везикула, берется жидкость и клетки у основания дефекта;❖	если попытка взятия аспирата не удалась, подкожно вводят стерильный
0,9% раствор натрия хлорида и повторно пытаются взять аспират;если и эта попытка оказывается неудачной, через иглу в шприц набирают
жидкую питательную среду или 0,9% раствор натрия хлорида в небольшом
количестве, ополаскивают иглу и используют полученную жидкость в каче¬
стве исследуемого материала;<0- при наличии в ране дренажей из них забирают шприцем 1-2 мл отделяемого;*0* аспират из шприца, сняв иглу, переливают в пробирку с транспортной средой
Эймса, Стюарта или другой питательной средой, обеспечивающей сохране¬
ние неспорообразующих анаэробов;❖	можно пропитать аспиратом стерильный тампон и погрузить его в транс¬
портную среду;❖	если гарантирована немедленная доставка материала в лабораторию, допу¬
скается транспортировать материал непосредственно в шприце с иглой, надев
на нее защитный колпачок.Взятие биоптатов:❖	при сборе материала в процессе операции кусочки ткани (3-5 мл) помещают
в стерильные контейнер или стеклянную емкость;
246 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ❖	необходимо добавить 3-5 мл 0,9% раствора натрия хлорида для предотвра¬
щения высыхания материала.Подозрение на анаэробную инфеюцию возникает при наличии неприятного
гнилостного запаха раневого отделяемого, некроза тканей, глубоких абсцессов,
газа в тканях или клинической картины газовой гангрены, черного окрашивания
экссудата. В таких случаях материал для бактериологического исследования соби-
рают:❖	во флаконы или в пробирки с агаровой основой и анаэробной атмосферой с
индикатором для ее контроля, в которых доставляют аспирационный мате¬
риал;в специальный мешок или систему пробирок, из которых удален кислород;
транспортную систему для анаэробов со стерильным зондом-тампоном.Для доставки материала, собранного тампоном, можно использовать пробирку
с агаровой основой и анаэробной атмосферой с индикатором для ее контроля, про¬
бирку с катализатором, генерирующим анаэробную атмосферу после введения там¬
пона в пробирку, пробирку с анаэробной атмосферой и редуцированной средой.При отсутствии специальных систем и сред допустимо использование пробирок
и других контейнеров с редуцированной тиогликолевой средой, тиолевым бульо¬
ном, а также со средами, содержащими гемин и менад иол. Контейнеры с материа¬
лом должны быть плотно закрыты пробками или крышками.Исследование материалаМатериал, взятый с помощью одного из зондов-тампонов, используют для
приготовления мазка, который окрашивают по Граму. При микроскопии мазка
оценивают количество микробных клеток и характеризуют их морфологические и
тинкториальные свойства. Микроскопия мазков из раны — ценный диагностиче¬
ский прием, позволяющий быстро получить представление о наиболее вероятной
этиологии процесса, а также осуществить выбор оптимальных питательных сред
для дальнейшего бактериологического исследования. Выполнение данной про¬
цедуры должно стать неотъемлемой частью ведения инфекционного больного.
Микроскопическое исследование позволяет обнаружить труднокультивируемые
микроорганизмы, выявление которых при бактериологическом исследовании
маловероятно или требует длительной инкубации.Материал, взятый другим зондом-тампоном, используют для посева на 5%
кровяной агар, среду для контроля стерильности и сахарный бульон, а в случае
исследования на анаэробные инфекции — на специальные среды (среду Китт-
Тароцци, агар и бульон Шедлера, тиогликолевую среду, анаэробный кровяной
агар с амикацином или гентамицином и др.). Посев на чашку Петри проводят
методом «тампон-петля». Тампоном проводят по поверхности питательной среды
дорожку от одного края чашки Петри до другого (через ее центр), а затем вторую
параллельно первой. После этого материал рассевают бактериологической петлей
штрихами, перпендикулярными дорожкам. Посевы инкубируют при температуре
37 °С в течение 18-24 ч в аэробных и/или анаэробных условиях в зависимости
от предполагаемого типа инфекции. При отсутствии роста в 1-е сутки инкубацию
продолжают. При отсутствии роста в посевах на 5-е сутки дают отрицательный
ответ.Оценка результатовОценка количества микроорганизмов в раневом отделяемом важна для прогно¬
зирования течения процесса. Установлено, что при зфовне микробной обсеменен-
ности раны выше 10* КОЕ на 1 г ткани или 1 мл раневого отделяемого нагноение
развивается даже в жизнеспособных тканях. При наличии в ране некротизиро-
ванных тканей, гематом и инородных тел развитие гнойного процесса возможно
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 247И при более низких уровнях обсемененности. кроме того, при уровне обсеменен-
ности раны, превышающем 10^ КОЕ на 1 г ткани, резко возрастает угроза развития
сепсиса. Однако большинство существующих методов количественной оценки
трудоемки и недоступны практическим лабораториям.При одновременном обнаружении в материале нескольких видов микроорга¬
низмов ведущее значение имеют виды, обнаруженные в наибольшем количестве.Отделяемое верхних дыхательных лутейПоказания к взятию и исследованию проб: воспалительные заболевания верх¬
них дыхательных путей.Взятие материалаОтделяемое верхних дыхательных путей берут с помощью стерильных зондов-
тампонов.Исследование материалаПосев на кровяной или шоколадный агар без элективных добавок проводят
зондом-тампоном, которым была взята проба. Сначала материал втирают в пита¬
тельную среду, поворачивая тампон вокруг своей оси на участке размером 2x1 см.
Затем частыми непрерывающимися штрихами засевают оставшуюся поверхность.Стандартная схема исследования отделяемого верхних дыхательных путей
предусматривает посев материала из глотки, носа и ротовой полости только на
5% кровяной агар. Основной возбудитель бактериальных инфекций верхних
дыхательных путей, включая скарлатину, тонзиллиты, фарингиты, — Str. pyogenes.
К сожалению, большинство практических лабораторий используют 5% кровяной
агар, приготовленный с применением не овечьей, а человеческой крови. На данной
питательной среде стрептококки растут крайне плохо, что делает исследование
малоэффективным. Кроме того, Str. pyogenes сохраняют чувствительность к пени-
циллинам и цефалоспоринам, что делает в большинстве случаев излишним опре¬
деление чувствительности вьщеленных штаммов к антимикробным препаратам. В
настоящее время доступны готовые питательные среды в чашках Петри и пробир¬
ках стандартно высокого качества, в том числе кровяной агар, приготовленный с
применением овечьей крови.о необходимости выявления таких видов микроорганизмов, как N. meningitidis,
С. dipktheriae Н. influenzae, врач должен уведомить лабораторию заранее. В этом
случае для посева будут использованы специальные питательные среды.Диагностику некоторых специфических форм ангин осуществляют прежде всего
с помощью бактериоскопического исследования. Микроскопия мазков необходи¬
ма при диагностике ангины Людвига (тяжелая гнилостно-некротическая флегмона
полости рта полимикробной этиологии) и ангины Симановского-Плаута-Венсана
(некротическая ангина, вызываемая симбиозом Fusobacterium spp. и Treponema
vincenUî).Оценка результатовОценка этиологической значимости обнаруженных в дыхательных путях микро¬
организмов осложняется обилием нормальной микрофлоры и широким рас¬
пространением носительства патогенных микроорганизмов. Нормальная микро¬
флора полости рта и глотки характеризуется высокой степенью разнообразия и
включает Streptococcus spp. (включая Str. viridans и Str. pneumoniae). Neisseria spp..
Staphylococcus spp., Corynebacterium spp., Haemophilus spp., Lactobacillus spp., Candida
spp., Mycobacterium spp.. Treponema spp. У лиц преклонного возраста и пациентов с
иммунодефицитом в составе микрофлоры ротоглотки возрастает количество гра¬
мотрицательных микроорганизмов, включая Е. соИ, Klebsiella spp., Acinetobacter spp.,
Pseudomonas spp.
248БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯСреди болезней верхних дыхательных путей бактериальной этиологии лиди¬
рующее положение занимают ангины. В этиологии бактериальных ангин ведущая
роль принадлежит стрептококкам группы А. Почти в 80% случаев ангины бакте¬
риальной этиологии вызывает Str. pyogenes, реже — стафилококки (самостоятельно
или в ассоциации со стрептококками).В этиологии эпиглоттитов у детей ведущая роль принадлежит К influenzae,
а у взрослых — Str. pyogenes и Str. pneumoniae. Ларингиты в 90% случаев имеют
вирусную этиологию, но могут быть обусловлены Str. pyogenes, а у взрослых также
Moraxella catarrhalis.Возможная причина острых ларингобронхитов — Mycoplasma pneumoniae.С особой осторожностью следует подходить к диагнозу «гонококковый фарин¬
гит». Данный диагноз может быть поставлен только с помощью бактериоло¬
гического метода при условии точной видовой идентификации N. gonorrhoeae.
Это обусловлено присутствием значительного числа сапрофитных видов нейс¬
серий в составе нормальной микрофлоры полости рта. Их дифференциация от
N. gonorrhoeae по морфологии невозможна, а с помощью ПЦР и других современ¬
ных методов — не всегда достоверна.Рецидивирующие заболевания верхних дыхательных путей могут вызывать
штаммы S. aureus, продуцирующие ß-лактамазы, Н. irfluenzae и B.fi'agilis.При оценке результатов бактериологического исследования необходимо учиты¬
вать, что часто первичные поражения респираторного тракта вызывают вирусы,
а секундарные бактериальные инфекции осложняют их течение.Мазок со слизистых оболочек полости носа для диагностики носительстваS. AureusПоказания к взятию и исследованию проб: диагностика носительства золоти¬
стого стафилококка, S, aureus распространен повсеместно, колонизирует у чело¬
века слизистую оболочку носа, брюшную полость и кожу подмышечной области
(уровень носительства среди клинически здоровых лиц составляет 15-30%);
обычно длится несколько недель или месяцев, принимая хронический характер
у персонала медицинских учреждений и людей, которым часто делают инъекции.
При обострении инфекции регистрируют появление на коже гнойников, осложне¬
ние заживления ран, бактериемию, эндокардит, пневмонию, артриты, остеомие¬
лит, перитонит, поражения мочевыводящего тракта, синдромы ошпаренной кожи
и токсического шока, пищевые токсикоинфекции.Взятие материалаМатериал берут у пациента одним зондом-тампоном из двух носовых ходов,
доставляя в лабораторию в кратчайшие сроки (он должен быть засеян на пита¬
тельные среды в течение 2 ч).Исследование материалаДля посева материала используют желточно-солевой агар, агар Байрда-Паркера,
колумбийский CNA агар и другие элективные и селективные среды для стафило¬
кокков. Посев проводят зондом-тампоном, которым забирали материал. При
посеве тампон многократно поворачивают вокруг своей оси.Оценивают биохимическую активность изолятов. При необходимости дополни¬
тельно определяют ферментацию маннита в анаэробных условиях или ДНКазную
активность. Для дифференциации транзиторного и злостного (резидентного)
носительства оценивают чувствительность выделенной культуры к фузидовой
кислоте.Оценка результата5.	aureus в течение 18-24 ч образует на плотных средах крупные (диаметром
2-5 мм), выпуклые, гладкие колонии с ровными и более светлыми по сравнению с
центральной частью краями; они чаще окрашены в желтый цвет (он может варьи¬
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 249ровать от белого до оранжевого). Если выделенная культзфа обладает лецитовети-
лазой и плазмокоагулазой, ее идентифицируют как S. aureus. Резидентные штаммы
бактерии идентифицируют по устойчивости к фузидовой кислоте.Соскоб со слизистых оболочек передних отделов полости носа для выявления
клебсиеллПоказания к взятию и исследованию проб: диагностика озены и риносклеромы.Взятие материалаВ случае инфильтрационной формы риносклеромы материал берут с помо¬
щью бактериологической петли и носового или носоглоточного зеркала прямо с
инфильтрированной слизистой оболочки, слегка повреждая ее.У больных озеной или атрофической формой риносклеромы взятие материала
проводят петлей или стерильным зондом-тампоном, причем предпочтительнее
последний. При всех видах и формах клебсиеллезной инфекции одновременно
берут материал из обеих половин носа и глотки, а при локализации процесса в
гортани, трахее и бронхах — также методом кашлевых пластинок.Исследование материалаОзену и риносклерому диагностируют по результатам обнаружения их возбуди¬
телей в мазках взятого материала. В сомнительных случаях прибегают к изоляции
бактерий на питательных средах (Эндо, Левина, Плоскирева, Мак-Конки и др.)
с последующей их идентификацией по культуральным, морфологическим и био¬
химическим признакам.Оценка результатаОбнаружением в мазках и посевах К, pneumoniae spp. ozaenae (палочка Абеля)
и К. pneumoniae spp. rhinoscleromatis (палочка Фриша-Волковича) с последующей
идентификацией изолятов по биохимической активности, а палочки Фриша-
Волковича в реакции связывания комплемента подтверждают диагноз озены или
риносклеромы соответственно, однако следует учитывать возможность носитель¬
ства.Слизь из носоглотки и носа при подозрении на дифтериюПоказания к взятию и исследованию проб: подозрение на дифтерию.Взятие материала•	Материал берут натощак или через 3-4 ч после еды. При антибиотикотера¬
пии исследование проводят не ранее чем через 3 дня после отмены антибак¬
териального препарата.•	Материал с миндалин и из носа берут разными стерильными зондами-
тампонами: один предназначен для приготовления мазков, а другой — для
посева на питательные среды. Если имеются налеты, материал забирают с
границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном.•	Материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 3 ч (в транспорт¬
ной среде) или сразу после взятия. Б холодное время года при транспорти¬
ровке материал следует оберегать от замораживания. При транспортировке
на дальние расстояния допускается использование тампонов, пропитанных
5% раствором глицерина в дистиллированной воде и простерилизованных
автоклавированием.Исследование материалаМазки окрашивают по Граму и Нейссеру. Первый из названных методов
неспецифичен, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные корине¬
бактерии, располагающиеся в виде палисада или китайских иероглифов. Окраска
по Нейссеру выявляет типичные зерна Бабеша-Эрнста. При проведении рутинных
исследований ограничиваются бактериоскопией.
250БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯв сомнительных случаях прибегают к выделению чистой культуры (это делают
только в лабораториях, имеющих разрешение на работу с данным возбудителем).
Для первичного посева используют среду Клауберга II, кровяной теллуритовый
агар (или другие среды с теллуритом), хинозольную среду Бучина. Рекомендуется
одновременно высевать материал на обычный кровяной агар, так как не все штам¬
мы бактерии способны расти на упомянутых выше средах.Чашки со средой предварительно согревают при комнатной температуре или в
термостате (в течение 15-20 мин). Чашки с посевом исследуемого материала или
пробирки с транспортной средой можно поместить для подращивания в термостат
при температуре 37 “С на 15-18 ч, после чего доставить в лабораторию.Посев проб, взятых от одного пациента, проводят на одну чашку - на половину
чашки засевают материал из ротоглотки, на другую половину — материал из носа.
Для посева мазка с кожи или проб, взятых из других мест, используют еще одну
чашку. Материал сначала втирают в питательную среду со всех сторон тампона
на участке площадью 2x1 см^, а затем этим же тампоном засевают оставшуюся
поверхность половины чашки частыми неперекрывающимися штрихами, не отры¬
вая тампон от поверхности питательной среды и не изменяя его положения.На средах с теллуритом возбудитель дифтерии формирует серовато-черные
колонии с ровными или изрезанными краями, которые постепенно приобретают
металлический блеск. Диаметр колоний различных типов бактерии различен:
1,5-2,5 мм (тип gravis), 1,5-2,0 мм (тип mitis) и 0,5-0,75 мм (тип întermedius).Токсигенность возбудителя раньше определяли биопробой на морских свинках
и в реакции преципитации (тесте Илека-Оухтерлони); в настоящее время с этой
целью пользуются ПЦР, позволяющую выявлять ген tox.Оценка результатов исследованийИнфекцию диагностируют в большинстве случаев на основании результатов
бактериологического исследования, в сомнительных случаях прибегают к куль¬
туральному методу. Этиологически значимо обнаружение только токсигенных
штаммов С. diphtheriae.Слизь с задней стенки носоглотки при подозрении на менингококковую инфекциюПоказания к взятию и исследованию проб: подозрение на менингококковую
инфекцию. Носительство N. meningitides широко распространено (до 30% здоро¬
вых людей, а во время вспышек этот показатель возрастает в 2-3 раза). Входными
воротами инфекции служит носоглотка.Взятие материалаДля диагностики менингококковой инфекции берут слизь с задней стенки носо¬
глотки пациента натощак или через 3-4 ч после еды. При взятии проб предпочти¬
тельнее пользоваться не ватными, а вискозными зондами-тампонами.•	Шпателем надавливают на корень языка, что ведет к подниманию небной
занавески.•	Зонд-тампон заводят за мягкое небо и 2-3 раза проводят по задней стенке
носоглотки.•	При извлечении зонд-тампон не должен касаться зубов, слизистой оболочки
щек и языка,•	Помещают зонд-тампон в пустой или содержащий транспортную среду
Стюарта контейнер.Исследование материала
При наличии такой возможности материал сразу же засевают на предваритель¬
но подогретые питательные среды (сывороточный агар, сывороточный агар с
линкомицином, кровяной агар, шоколадный агар с ростовыми добавками, среду
Мюллера-Хинтона с овечьей кровью, селективную среду Тайера-Мартина). При
посеве на чашки Петри материал втирают на поверхности небольшого участка
'Щ.ШБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 251(1x2 см) питательной среды всеми сторонами тампона, затем этим же тампоном
засевают штрихами (с отрывом) всю поверхность среды.При транспортировке посевов или взятого материала в лабораторию пользуются
термосумками. Если время транспортировки материала в лабораторию превышает
3 ч, то зонд-тампон с материалом помещают в транспортную среду Стюарта. При
отсутствии готовой транспортной среды можно использовать стерильную пептон-
ную воду с линкомицином (0,5 мг/100 мл).Оценка результатаИсследование носоглоточной слизи позволяет выявлять потенциальные источ¬
ники инфекции. Для диагностики гнойного менингококкового менингита следу¬
ет исследовать СМЖ и кровь. О каждом случае заболевания менингококковой
инфекцией, подозрении на заболевание или носительство менингококка врачи
всех специальностей, медицинские работники лечебно-профилактических, дет¬
ских, подростковых и оздоровительных организаций, независимо от ведомствен¬
ной принадлежности и организационно-правовой формы, а также медицинские
работники, занимающиеся частной медицинской деятельностью, в течение 2 ч
сообщают по телефону и затем в течение 12 ч посылают экстренное извещение
по установленной форме в территориальный центр государственного санитарно-
эпидемиологического надзора по месту регистрации заболевания (независимо от
меаа проживания больного).Слизь с задней стенки носоглотки при диагностике коклюшаПоказания к взятию и исследованию проб: диагностика коклюша.Обследованию подлежат дети и сотрудники детских учреждений, кашляющие
более 7 дней без установленной причины или контактировавшие с источником
инфекции.Взятие материалаИсследуемым материалом могут служить мазки с задней стенки глотки или
слизь, полученная методом кашлевых пластинок.♦	Мазки с задней стенки глотки берут с помощью изогнутых под прямым углом
зондов-тампонов с металлическим стержнем. Одновременно рекомендуется
использовать два зонда-тампона — сухой и увлажненный. Сначала материал
забирают сухим тампоном, а затем смоченным забуференным 0,9% раство¬
ром хлорида натрия. Материал, взятый сухим тампоном, нужно сразу засеять
на питательные среды (казеиново-угольный агар, молочно-кровяной агар,
среду Борде-Жангу и др.). Посев материала, взятого влажным тампоном, на
перечисленные среды можно провести в лаборатории.•	Для диагностики коклюша, помимо исследования мазков из носоглотки,
пользуются методом кашлевых пластинок. С этой целью открытую чашку
Петри с питательной средой удерживают в вертикальном положении на рас¬
стоянии 5-10 см ото рта в течение 5-6 кашлевых толчков.Исследование материалаВозбудителя коклюша можно обнаружить в мазках клинического материала в
реакции иммунофлюоресценции. В рутинной практике лабораторной диагностики
коклюша большее значение придают изоляции В. pertussis яа питательных средах с
последующей идентификацией по морфологическим и культуральным свойствам,
а также в реакции агглютинации.Оценка результатов исследованийБактериологическая диагностика коклюша эффективна только в первые 1-2
недели заболевания при условии отсутствия антибиотикотерапии. При получении
отрицательного результата для подтверждения диагноза можно использовать
ПЦР, а начиная с 3-4-й недели — серологические методы.
252 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯОтделяемое нижних отделов дыхательных путейМокротаПоказания к взятию и исследованию проб: воспалительные заболевания ниж-
них отделов дыхательных путей, сопровождающиеся отделением мокроты.
Взятие материалаПредпочтительно исследование утренней порции мокроты. Перед сбором мокро¬
ты больному предлагают почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой, а
также предупреждают о недопустимости попадания в мокроту слюны и носовой
слизи. Мокроту собирают в стерильный широкогорлый контейнер или «карман¬
ную плевательницу».Особенности взятия мокроты для бактериоскопической диагностики
туберкулезаМокроту собирают трижды: в 1-й день — в присутствии медработника, на 2-й
день — проинструктированным пациентом самостоятельно, на 3-й день пациент
приносит собранный во 2-й день материал и мокроту забирают в третий раз в при¬
сутствии медработника,❖	Пациента заранее предупреждают о важности получения именно мокроты, а
не слюны или носовой слизи, а также о необходимости перед сбором мате¬
риала почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой.❖	Медработник в маске, резиновых перчатках и резиновом фартуке распола¬
гается за спиной пациента, таким образом, чтобы направление движения
воздуха было от него к пациенту, снимает крышку с контейнера для сбора
мокроты и передает его пациенту.Пациенту рекомендуют держать контейнер как можно ближе к губам и сразу
же сплевывать в него мокроту по мере ее откашливания; кашель может быть
индуцирован с помощью нескольких глубоких вдохов.-о- По завершению сбора мокроты медработник оценивает ее качество, плотно
закрывает контейнер и заполняет направление на исследование.❖	Срок хранения материала в холодильнике без добавления консервирующих
средств не должен превышать 48-72 ч.При отсутствии мокроты накануне вечером или рано утром в день, намечен¬
ный для сбора материала, пациенту назначают отхаркивающее средство или
раздражающие ингаляции.Усилить отделение мокроты можно с помощью ингаляции, для проведения
которой используют раствор следующего состава: в 1 л стерильной дистиллиро¬
ванной воды растворяют 150 г хлорида натрия и 10 г натрия бикарбоната. Больной
должен вдохнуть 30-60 мл подогретого до 43-45 "С раствора в течение не менее
10-15 мин.Собранный таким образом материал не подлежит консервации и должен быть
исследован в тот же день. В направлении обязательно отмечают, что материал был
получен после ингаляции.Исследование материалаДля приготовления мазка из мокроты, распределенной тонким слоем по
дну чашки Петри, с помощью двух игл или пинцета выбирают и переносят на
середину предметного стекла слизистые или гнойные комочки. Затем, согласно
классическому методу «двух стекол», берут второе стекло и накладывают поверх
первого. Комочки мокроты растирают между двумя стеклами до тех пор, пока не
получится достаточно тонкий мазок. При этом во избежание инфицирования рук
работающего и на первом, и на втором стеклах мазки не должны занимать более
1/2-2/3 поверхности. Препараты высушивают и фиксируют над пламенем. Один
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 253из мазков окрашивают по Ц)аму, второй микроскопируют неокрашенным для
выявления друз актиномицетов или мицелия грибов.Данная техника сопряжена с высоким риском для медперсонала, особенно в
случаях туберкулеза. При подозрении на туберкулез рекомендуется пользоваться 1
для приготовления мазков мокроты деревянной палочкой, которую перед рабо-
той разламывают пополам. С помощью сломанных концов палочки из разных
участков образца мокроты выбирают 2-3 наиболее плотных небольших гнойных
комочка, переносят их на стекло, при необходимости разминают и равномерно
распределяют тонким слоем в центре стекла на поверхности приблизительно раз¬
мером 1x2 см в виде овала. Использованные палочки сбрасывают в контейнер с
дезинфицирующим раствором.При использовании для приготовления мазка бактериологической петли или
игл существует риск формирования аэрозоля мокроты при их обжигании в пла¬
мени после использования. Для предупреждения формирования аэрозоля инстру¬
мент предварительно очищают от остатков мокроты 2-3-кратным погружением
в банку с песком, залитым этиловым спиртом, и только после этого прожигают в
пламени горелки. Песок длительно остается пригодным для этой цели при условии
периодического обновления раствора этилового спирта с таким расчетом, чтобы
его уровень превышал уровень песка не менее чем на 3 см.Приготовленные мазки помещают на 15-30 мин на лотки (подносы) и высу¬
шивают при комнатной температуре. Фиксация влажных мазков недопустима.Для фиксации мазок трижды медленно проводят через верхнюю треть пламени
горелки. Продолжительность пребывания мазка в пламени не должна превышать3-5 с.В зависимости от задач исследования готовят несколько мазков, которые окра¬
шивают по Граму, Цилю-Нильсену или микроскопируют в нативном виде для
выявления мицелия грибов и друз актиномицетов. При исследовании большого
количества образцов (более 30 в день) вместо окраски по Цилю-Нильсену для
выявления кислотоустойчивых микроорганизмов (КУМ) целесообразно исполь¬
зовать окраску флюоресцентными красителями с последующей люминесцентной
микроскопией.Первоначально препарат мокроты микроскопируют под малым увеличением
микроскопа (объектив х10) для оценки правильности взятия материала и степени
его загрязнения слюной, а затем проводят микроскопию мазка под большим уве¬
личением (иммерсионный объектив х90 или хЮО) для обнаружения бактерий.Бактериологическое исследование мокроты проводят качественным или коли¬
чественным методом.При использовании качественного метода мокроту выливают в чашку Петри и с
помощью игл и пинцета выбирают 2-3 гнойных комочка. Комочки мокроты трех¬
кратно в 3 чашках Петри отмывают стерильным 0.9% раствором хлорида натрия
для удаления сопутствующей микрофлоры, наслоившейся в верхних дыхательных
путях и полости рта. Затем их переносят на питательную среду и тщательно равно¬
мерно растирают шпателем по ее поверхности. Посевы инкубируют при темпе¬
ратуре 37 "С. Промывные воды бронхов засевают аналогичным образом, но без
предварительной отмывки гнойных комочков.В основе количественного метода исследования лежит высев на плотные пита¬
тельные среды разведений, приготовленных из гомогената мокроты. Из много¬
численных методов гомогенизации мокроты наиболее удобный и безопасный
для медперсонала — использование муколитика ацетилцистеина. В этом случае
в неметаллический сосуд вносят равные объемы мокроты и 0,5% раствора аце¬
тилцистеина и тщательно перемешивают пипеткой с резиновой грушей в течение1-2 мин. Ацетилцистеин не только не угнетает рост Str. pneumoniae и Я, influenzae,
но и стимулирует развитие последней из-за устранения ингибирующего действия
lilt	ШШ254БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯмуцина. Посев гомогената мокроты может быть проведен по методу Gold, анало¬
гично посеву мочи.Оценка результатов исследованийОбнаружение при микроскопировании под малым увеличением микроскопа в
препарате мокроты большого количества эпителиальных клеток, особенно при
отсутствии гранулоцитов, свидетельствует о том, что материал был взят непра¬
вильно (с примесью слюны).Для повышения объективности оценки может быть использована одна из при¬
веденных ниже шкал. Использование каждой из них предполагает микроскопию
окрашенного по Граму мазка из гнойной части мокроты под малым увеличением
(объектив х10). При использовании шкалы Barlett просматривают 20-30 полей
зрения, давая каждому оценку и суммируя баллы (табл. 20-4). Затем рассчитывают
средний балл — складывают все начисленные баллы и делят сумму на количество
просмотренных полей. Если полученный результат равен О или меньше, вероят¬
ность воспаления мала или мокрота, вероятно, контаминирована в ротовой поло¬
сти. Такие образцы не подлежат бактериологическому исследованию, и взятие
мокроты необходимо повторить.Таблица 20-4. Схема Barlett оценки правильности взятия мокротыТип клетокКоличество клеток 9 поле зрения при микроскопии с объ¬
ективом х10БаллНейтрофилы<10010-25+1>25+2присутствие слизи+1Эпителиальные клетки10-25-1>25-2При оценке мокроты по Murray Washington принадлежность образца к опреде¬
ленной группе устанавливается по табл. 20-5. При этом бактериологическому
исследованию подлежат только образцы, принадлежащие к 4-5-й группе.Таблица 20-5. Схема Murray Washington оценки правильности взятия мокротыГруппаКоличество клеток в поле зрения при микроскопии с объективом х10эпителиальные клеткилейкоциты1251022510-2532525410-25255<1025Если образец мокроты значительно контаминирован слюной, то взятие мокро¬
ты необходимо повторить.При бактериоскопии мазков мокроты в первую очередь оценивают общую кар¬
тину микрофлоры: наличие скоплений грамположительных кокков {Staphylococcus,
Micrococcus), цепочек грамположительных кокков {Streptococcus), мелких ланце¬
товидных, окруженных зоной неокрасившейся капсулы (S. pneumoniae), грамо¬
трицательных кокков (Neisseria), грамотрицательных палочек с закругленными
концами, окруженных капсулой в виде светлого ореола (Klebsiella и др.), фамотри-
цательных палочек (Е. соИ, Р. aeruginosa и др.); мелких грамотрицательных палочек
в виде скоплений (Haemophylus), микобактерий.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 255По морфологическим и тинкториальным признакам при микроскопии мазка,
окрашенного по Г]раму, можно ориентировочно идентифицировать следующие
микроорганизмы, присутствующие в мокроте:❖	скопления грамположительных кокков — Staphylococcus spp.. Micrococcus spp;❖	цепочки грамположительных кокков — Streptococcus spp\
ланцетовидные грамположительные диплококки, окруженные капсулой, —
Str. pneumoniae',грамотрицательные диплококки — Neisseria spp.;<>■ грамотрицательные палочки — Enterobacteriaceae, Pseudomonasspp., Haemophilus
spp., неспорообразующие анаэробы;❖	грамотрицательные палочки с закругленными концами, окруженные капсу¬
лой, — Klebsiella spp.;мелкие полиморфные грамотрицательные палочки в виде скоплений —
Haemophilus spp.;❖	обрывки тонкого несептированного ветвящегося мицелия фиолетового цвета,
споры темно-фиолетового цвета и друзы розового цвета — Actinomyces spp.Для острой инфекции характерно наличие в мокроте 1-2 видов бактерий, рас¬
положенных вблизи гранулоцитов. Микроорганизмы-контаминанты, попавшие в
мокроту из ротовой полости, чаще расположены вблизи эпителиальных клеток.
Диагностически значимо обнаружение трех и более пневмотропных микроор¬
ганизмов в большинстве полей зрения. Анализ результатов микроскопии мазка
мокроты в сочетании с клинико-рентгенологическими особенностями течения
заболевания позволяет поставить ранний клинико-бактериологический диагноз
более чем у 80% больных острой пневмонией или. по крайней мере, облегчает
эмпирический выбор антибактериального препарата на основании преобладания
грамположительной или грамотрицательной микрофлоры.Необходимо подчеркнуть важность бактериоскопического исследования
мокроты при деструктивных пневмонитах (абсцесс легкого, гангрена легкого).
Опытный микробиолог на основании морфологии микроорганизмов, выявляемых
при бактериоскопии, может высказать более точное суждение об этиологии про¬
цесса, чем это возможно при анализе результатов рутинного бактериологического
метода. Это связано с тем, что посев на питательные среды, обычно применяемые
в настоящее время в практических лабораториях, не всегда позволяет обнаружить
облигатные анаэробы, играющие ведущую роль при данной патологии. Кроме
того, результаты целенаправленного бактериологического исследования на неспо-
рообразующие облигатно анаэробные микроорганизмы можно получить только
на 7-8-й день.На основании первичного осмотра посевов ориентировочно оценивают числен¬
ность микроорганизмов в мокроте, пользуясь следующими критериями:❖	I степень— очень скудный рост — рост единичных колоний (до 10);<0* П степень — скудный рост — рост 10-25 колоний;П1 степень — умеренный рост — рост множества сосчитываемых колоний (не
менее 50);❖	IV степень — обильный рост — сплошной рост несосчитываемых колоний.I	и II степени роста свидетельствуют о загрязнении исследуемого материала или
бактерионосительстве, а III и IV - об этиологической значимости данного микро¬
организма.Изоляты бактерий, выделенные из мокроты в посевах на питательных средах,
идентифицируют по культуральным, морфологическим, тинкториальным, биохи¬
мическим свойствам и в ряде случаев по антигенной структуре.
ШмМiWM.у„^-	■256 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯМатериал из бронховПоказания к взятию и исследованию проб: воспалительные заболевания ниж¬
них отделов дыхательных путей при отсутствии мокроты.Взятие материалаИз бронхов для исследований берут смывы, соскобы и биоптаты.Концентрация микроорганизмов в смывах в 10-1000 раз ниже, чем в мокроте,
поэтому их бактериологическое исследование имеет меньшую диагностргческую
ценность.Наиболее просто получить трахеобронхиальный смыв следующим методом:
гортанным шприцем с помощью аппарата Боброва вводят в трахею около
10 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия и при кашле собирают тра¬
хеобронхиальный смыв;❖	маленьким детям в трахею вводят через катетер 5-10 мл 0,9% раствора хло¬
рида натрия и затем шприцем аспирируют трахеобронхиальный смыв.С помощью бронхоскопии удается получить:❖	бронхоальвеолярный лаваж (предпочтительно);■о- смыв с бронхов (низкая чувствительность при диагностике пневмоний);❖	соскоб с бронхов (более значим, чем смыв);
биоптаты.Смыв с бронхов или бронхоальвеолярный лаваж выполняют, вводя шприцем
через биопсийный канал бронхоскопа стерильный 0,9% раствор хлорида натрия
отдельными порциями объемом 5-20 мл. Перед введением каждой следующей
порции аспирируют шприцем жидкость и переносят в стерильный контейнер.
При этом для каждой новой порции используют новый контейнер. По решению
лечащего врача можно объединить отдельные смывы, взятые в различных участ¬
ках легких, в направлении указывают общий объем введенного 0,9% раствора
хлорида натрия.Для получения соскоба с бронхов через биопсийный канал бронхоскопа вво¬
дят телескопический двойной катетер с обработанным полиэтиленгликолем или
другим соответствующим реактивом дистальным концом для предотвращения
контаминации пробы. Материал помещают в пустой стерильный контейнер и в
пробирку с тиогликолевой средой (средой СКС) или специальный консервант для
облигатных анаэробов.Биоптаты доставляют в лабораторию в пробирках типа «Эппендорф», запол¬
ненных стерильным 0,9% раствором хлорида натрия или тиогликолевой средой.Исследование материалаДелают посев взятого материала на кровяной агар, шоколадный агар, желчно¬
солевой агар, среды Эндо, Сабуро и другие, выбор которых определяется предпо¬
лагаемой этиологией болезни.Оценка результатовОценку результатов бактериологического исследования материала, взятого из
бронхов, проводят на основании анализа информации о видовом составе микро¬
флоры (по данным бактериоскопического и бактериологического исследований),
численности отдельных видов микроорганизмов, стабильности их выделения во
времени, клинических данных и результатах лечения.При оценке результатов бактериологического исследования необходимо при¬
нимать во внимание определяющее значение некоторых видов микроорганизмов
в типичных клинических ситуациях;❖	крупозная пневмония — Str. pneumoniae’,^ лобарная пневмония — Sir. pneumoniae, Klebsiella spp,. Staphylococcus spp.;❖	очаговые пневмонии — Str. pneumoniae, H. influenzae, энтеробактерии, P. aerug¬
inosa;
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 257❖	первичная атипичная пневмония — микоплазмы, легионеллы или хлами¬
дии:❖	пневмония на фоне хронического бронхита — Н. influenzae. Streptococcus spp:,<!' пневмония на фоне гриппа — Staphylococcus spp., Str. pneumoniae, К influenzae;❖	аспирационная пневмония — энтеробактерии, Р. aeruginosa, анаэробы;❖	пневмония на фоне иммунодефицита — энтеробактерии. Staphylococcus spp.Госпитальная пневмония у новорожденных (в первые 7 дней жизни) чащеобусловлена Streptococcus spp., Е. coli, реже — S. aureus. Chlamydia trachomatis,
Pseudomonas spp.У больных муковисцидозом в бронхах и легких наиболее часто обнаруживают
Р. aeruginosa. Основную роль в этиологии острых инфекционных заболеваний лег¬
ких играют неспорообразующие анаэробы и Staphylococcus spp.Острые бронхиты и бронхиолиты вызываются, как правило, вирусами или
микоплазмами, но со 2-3-го дня заболевания осложняются присоединением бакте¬
риальной инфекции, чаще всего обусловленной Str. pneumoniae или Я. influenzae.Главную роль в этиологии внебольничных пневмоний играет Str. pneumoniae.С помощью количественного посева проб можно уточнить этиологию острой
пневмонии, пользуясь следующими критериями:<>- обнаружение монокультуры Str, pneumoniae в крови или в плевральном экс¬
судате;❖	выделение Sir pneumoniae или И. influenzae в трахеобронхиальном смыве в
титре 10^ КОЕ/мл;обнаружение в трахеобронхиальных смывах небольшого количества (менее
10^или Ю"* КОЕ/мл) Str. pneumoniae при обследовании больных острой пнев¬
монией на поздних сроках болезни и на фоне этиотропной антибактериаль¬
ной терапии с последующим снижением содержания Str, pneumoniae не менее
чем в 100 раз;❖	выделение в 2-3 последовательных исследованиях трахеобронхиальных
смывов, взятых с интервалом 2-5 дней, одного и того же вида условно-
патогенных бактерий в титре Ю"* КОЕ/мл (при возникновении вторичного
инфекционного процесса в сочетании с выявлением местной или системно¬
иммунологической реакции организма на данный микроорганизм).Пневмококкозную этиологию пневмонии подтверждает обнаружение пневмокок¬
кового антигена в крови, плевральном экссудате или моче, обнаружение в реак¬
ции непрямой иммунофлюоресценции специфических сывороточных антител в
титре 1:320 (дети в возрасте 0-3 лет) или 1:640-1:1280 (взрослые), установление4-кратного или более значительного нарастания первоначального титра антипнев-
мококковых антител.Этиологию внебольничных пневмоний с помощью стандартных методов лабо¬
раторного исследования не удается установить в 30-50% случаев. Это может быть
обусловлено следующими причинами:❖	невозможностью обнаружения ряда инфекционных агентов {Mycoplasma
pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumoniae) рутинными методами;❖	трудностью дифференциации возбудителей болезни от резидентной микро¬
флоры;❖	проведением этиотропного лечения ряда больных до начала бактериологи¬
ческого исследования.ЖелчьПоказания к проведению исследования:диагностика брюшного тифа и брюшнотифозного хронического бактерионо¬
сительства;
шштыШШШШщЩ'258 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ<* воспалительные заболевания желчного пузыря и желчных протоков (холе-
циститы, холангиты, желчнокаменная болезнь).Взятие материалаЖелчь получают с помощью зондирования или во время операции при пункции
желчного пузыря.при зондировании над пламенем спиртовки собирают в стерильные пробирки
3 порции желчи (по 10-12 мл) — для бактериологического исследования пред¬
почтительна средняя порция, пробы должны быть доставлены в лабораторию в
течение 1-2 ч.При наличии у больного дренажа собирают из него пробу шприцем, предвари¬
тельно тщательно обработав участок пункции. Нельзя собирать пробу желчи из
дренажного мешка.Пробы желчи, а также гноя и аспирата из печеночных абсцессов также можно
собирать во время операции. Материал из очага воспаления направляют в лабора¬
торию в контейнере с транспортной средой для анаэробов или в полностью запол¬
ненном шприце, надев на него стерильную иглу с защитным чехлом.Исследование материалапри бактериологическом исследовании по 0,1 мл каждой порции желчи засева¬
ют на кровяной агар, по 0,5 мл — на среду Эндо.Для выделения сальмонелл желчь засевают в соотношении 1:9 в селенитовый
бульон, а также инкубируют в термостате нативную желчь. Затем в течение 3 дней
ежедневно производят высев как с селенитового бульона, так и с нативной желчи
на висмут-сульфитный агар и другие среды, предназначенные для культивирова¬
ния S. enteritidis.Для выделения анаэробов желчь высевают в 1 пробирку со средой для контро¬
ля стерильности или в 2 пробирки со средой Китта-Тароцци. Одну из засеянных
пробирок со средой Китта-Тароцци прогревают на водяной бане для уничтожения
неспорообразующих микроорганизмов. Наблюдение за посевами ведут в течение5	дней.Оценка результатовв норме желчь стерильна. Полученная в результате дуоденального зондиро¬
вания, она практически всегда содержит микроорганизмы, попавшие в нее из
ротовой полости и верхних отделов пищеварительного тракта. На контаминацию
желчи микрофлорой полости рта указывает обнаружение в ней нейссерий и дрож¬
жеподобных грибов. Стафилококки и стрептококки значительно чаще обнаружи¬
вают в желчи, полученной при зондировании, чем в образцах, взятых при пункции
желчного пузыря. Поэтому наиболее достоверны результаты бактериологического
исследования проб желчи, полученных во время операции.При инфекциях из желчи в 70-80% случаев высевают Е. coli, Entewcoccus spp.,
несколько реже К. pneumoniae, Enterobacter spp., а также сальмонеллы (при
временном и хроническом бактерионосительстве). Из анаэробных микроорга¬
низмов вьщеляют С/, perfringens, в 10-20% случаев желчнокаменной болезни —
Peptococcaceae spp. В отдельных случаях встречается смешанная аэробная и анаэ¬
робная инфекция.При оценке результатов необходимо учитывать количество микроорганизмов
в материале. При планируемом оперативном вмешательстве прогностически
неблагоприятным считается обнаружение в желчи бактерий (энтеробактерий,
псевдомонад, бактероидов) в титре выше 10^ КОЕ/мл. Выделение значительных
количеств S. aureus может свидетельствовать о печеночном или поддиафрагмаль-
ном абсцессе.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 259МочаПоказания к проведению исследования:❖	установление этиологии болезней мочевой системы;^ выявление бактерионосителей.Взятие материалаМочу для бактериологического исследования берут при естественном мочеиспу¬
скании, катетером, из участка подвздошной кишки, использованной для создания
искусственного пузыря, надлобковой пункцией мочевого пузыря, билатеральной
катетеризацией мочеточника с использованием цистоскопа и другими методами,
при которых сведена к минимуму возможность контаминации проб посторонней
микрофлорой.Независимо от способа получения мочи ее следует высевать на питательные
среды не позднее чем через 2 ч после сбора. При отсутствии такой возможности
пробы хранят не более 24 ч в холодильнике (4 “С) или консервируют борной
кислотой. Следует помнить, что моча — прекрасная питательная среда для многих
бактерий, поэтому чем позднее после ее сбора проводят посев на питательные
среды, тем менее достоверным будет результат бактериологического исследова¬
ния.Взятие средней порции мочи при естественном мочеиспусканииПоказания к проведению;<> подозрение на воспалительные заболевания почек и мочевого пузыря;❖	диагностика брюшного тифа (с конца 2-й недели заболевания), лептоспиро-за.Взятие материалаВ стерильную посуду собирают среднюю порцию свободно выпущенной мочи
в объеме 3-5 мл. Женщинам рекомендуется сдавать 2-3 порции мочи в течение2-3 дней. Перед взятием проб мочи больной должен совершить тщательный туа¬
лет наружных половых органов. Это редкая ситуация, когда медработник не может
контролировать соблюдение правил сбора материала. Поэтому важно подробно
объяснить пациенту правила сбора мочи. Целесообразно напечатать инструкции
на обратной стороне бланка направления.Инструкция для мужчин:❖	тщательно вымыть руки;^ тщательно вымыть половой член теплой водой с мылом и высушить стериль¬
ной салфеткой;❖	обнажить головку полового члена и выпустить небольшую порцию мочи;<>■ прервать мочеиспускание и выпустить порцию мочи в стерильный контей¬
нер;❖	закрыть контейнер и передать в лабораторию.Инструкция для женщин:тщательно вымыть руки;❖	вымыть половые органы, используя стерильные марлевые салфетки и теплую
мыльную воду, в направлении спереди назад;❖	промыть половые органы еще раз теплой водой и вытереть стерильной сал¬
феткой; отверстие влагалища желательно закрьггь стерильным ватным там¬
поном;❖	на протяжении всей процедуры держать половые губы раздвинутыми;❖	помочиться, выпустив первую порцию мочи;❖	выпустить порцию мочи в стерильный контейнер;
закрыть контейнер и передать в лабораторию.•Ш
Ш:-1М|1260 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯИнструкция для лиц, собирающих мочу маленьких детей:❖	дать ребенку выпить воды или другой жидкости;
вымыть руки с мылом, сполоснуть водой, высушить;-	у мальчиков — тщательно промыть половой член и оттянуть крайнюю
плоть, область заднего прохода вымыть теплой водой с мылом и сполос¬
нуть теплой водой, высушить стерильной марлевой салфеткой;-	у девочек - тщательно промыть отверстие мочеиспускательного канала, а
также промежность и область заднего прохода теплой мыльной водой или
жидким мылом, сполоснуть теплой водой, высушить стерильной марлевой
салфеткой;❖	усадить ребенка на колени помощника;-	у мальчиков — при мочеисп^таании держать крайнюю плоть оттянутой
для предотвращения контаминации пробы мочи;-	у девочек — держать наружные половые губы на расстоянии друг от друга
в процессе мочеиспускания;❖	спустить небольшое количество мочи в специальную посуду для утилиза¬
ции;собрать среднюю порцию мочи (10-15 мл) в специальный одноразовый кон¬
тейнер с завинчивающейся крышкой.Взятие мочи катетеромПоказания к проведению;❖	отсутствие возможности получения мочи естественным путем;<> большая вариабельность получаемых результатов;❖	необходимость дифференциации очага инфекции (мочевой пузырь или
почки).Взятие материалаЕсли мочевой пузырь заполнен, перед катетеризацией пациент должен
частично его опорожнить.❖	Проводят туалет наружных половых органов теплой водой с мылом и высу¬
шивают их стерильными марлевыми салфетками, затем ВВ0Д5ГГ катетер в
мочевой пузырь,“0^ Собирают из катетера первые 15-30 мл мочи в специальную посуду для ути¬
лизации, после чего заполняют на 1/3-1/2 стерильную емкость, в которой
мочу доставляют в лабораторию.Для уточнения локализации инфекции мочевой пузырь опорожняют кате¬
тером, промывают раствором антисептика и через 10 мин забирают пробы
мочи (при инфекциях мочевого пузыря моча остается стерильной).Билатеральная катетеризация мочеточника под контролем цистоскопииПоказание к проведению — определение очага инфекции в мочевыводящих
путях.Взятие материала^ Перед проведением цистоскопии пациент должен освободить заполненный
мочевой пузырь.❖	Следует обработать наружные половые органы, области промежности и
заднего прохода, как указано выше.Ввести цистоскоп в мочевой пузырь и собрать 5-10 мл мочи в стерильный
одноразовый контейнер.❖	Маркировать стерильный одноразовый контейнер символом
КМП (Катетерная Моча Пузыря), затем оросить пузырь стерильным физио¬
логическим раствором.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 261❖	После орошения пузыря и введения катетера собрать истекан>щ;ую жидкость,
держа концы обоих катетеров над открытым контейнером.❖	Тщательно промаркировать контейнер символом ПЖП (Промывная
Жидкость Пузыря).❖	Провести мочеточниковые катетеры к среднему отделу каждого мочеточника
или почечных лоханок без дополнительного введения жидкости; открыть
цистоскоп, чтобы освободить мочевой пузырь.❖	Не использовать для анализа первые 5-10 мл мочи из каждого катетера в
мочеточнике.<0- Собрать 4 последующих пары проб (5-10 мл каждая) прямо в стерильный
одноразовый контейнер или соответствующие стерильные специальные
емкости.❖	Тщательно промаркировать емкости с материалом символами ПП-1, ЛП-1,
ПП-2, ЛП-2, где ПП — Правая Почка, ЛП — Левая Почка. Все пробы передать
в лабораторию на посев.Сбор мочи из участка подвздошной кишки, использованной для создания
искусственного пузыряПоказания к проведению:❖	жалобы больного на недомогание;❖	лихорадка.Взятие материала❖	Отсоединяют мочеприемное устройство и опорожняют его.❖	Осторожно очищают отверстие тампоном, смоченным 70% этиловым спир¬
том, а затем 1-2% раствором йода или другого дезинфектанта, разрешенного
к применению для данных целей.❖	Удаляют избыток йода 70% этиловым спиртом для предотвращения ожога
тканей.❖	Вводят катетер и собирают мочу в стерильную емкость.Надлобковая пункция мочевого пузыряПоказания к проведению:❖	острая задержка мочи;получение проб мочи у новорожденных и маленьких детей.Взятие материалаЭтим способом могут быть полз^ены наиболее достоверные результаты. Однако
процедура сопряжена с опасностью для здоровья больного, и ее проводят только
по клиническим показаниям.Техника надлобковой пункции:❖	перед пункцией пациент, если это возможно, должен освободить пузырь, так
как имеющаяся в нем жидкость снижает титр микроорганизмов в моче;❖	дезинфицируют кожу над лобком (лучше после бритья);❖	через небольшой разрез, сделанный в эпидермисе, шприцем с иглой аспири¬
руют мочу (10-15 мл) из пузыря;❖	переносят мочу из шприца в стерильный одноразовый контейнер, отправляе¬
мый в лабораторию.Исследование материалаРешение о необходимости выполнения бактериологического исследования
мочи может быть принято на основании скрининговых методов, позволяющих
относительно быстро определить количество микроорганизмов в моче, к их числу
относят микроскопию мазков мочи и химические тесты.Микроскопическое исследование мазков мочи, окрашенных по Граму, позволяет
выявить бактериурию при концентрациях микроорганизмов 10^ КОЕ/мл и выше.м
шттйШЖI ^^ I»М1>|262 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯНаличие одного или более лейкоцитов в поле зрения — характерный признак
инфекции мочевыводящих путей, присутствие в мазках мочи, взятых у женщин,
большого количества слущенного эпителия может быть признаком контаминации
мочи влагалищной микрофлорой и указывает на необходимость повторного сбора
материала.Препарат для микроскопии готовят из нативной мочи. На предметное стекло
наносят с помощью пипетки каплю мочи (50 мкл). Для ускорения высыхания пре¬
парата, без существенной потери чувствительности, объем капли можно уменьшить
до 10 мкл и использовать для ее нанесения калиброванную петлю. Высушенные
препараты фиксируют в пламени и микроскопируют с масляной иммерсией, про¬
сматривая не менее 50 полей зрения по диаметру капли. Положительным считает¬
ся результат, при котором в среднем в одном поле зрения присутствуют 2 и более
КОЕ.Химические тесты основаны на выявлении ферментов микроорганизмов или
лейкоцитов в моче. В нашей стране рекомендованы к применению два ускоренных
метода исследования мочи, основанных на регистрации активности микробных
ферментов, — нитритный тест и ТТХ-тест.Нитритный тест основан на выявлении с помощью реактива Грисса нитритов,
которые образуют из нитратов микроорганизмы семейства Enterobacteriacea.
Появление красного окрашивания при добавлении к 1 мл мочи 1 мл реактива
свидетельствует о присутствии бактерий в количестве не менее 10^ КОЕ/мл. Для
повышения эффективности теста до его постановки в мочу добавляют нитраты и
инкубируют в термостате при температуре 37 ‘’С в течение 2-4 ч.ТТХ-тест основан на преобразовании хлористого тринитрозолия под действием
микробных ферментов в красный нерастворимый в воде трифенилформазан. При
постановке теста к 2 мл мочи добавляют 0,5 мл рабочего раствора ТТХ. Смесь
инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 4 ч. Появление красно¬
го осадка на дне пробирки свидетельствует о присутствии бактерий в количестве
более 10^ КОЕ/мл,Применение упомянутых скрининговых методов позволяет снизить затраты на
расходные материалы, однако значительно увеличивает трудоемкость исследова¬
ния.Для опенки степени бактериурии пользуются методом секторных посевов.
Калиброванной бактериологической петлей диаметром 2 мм, емкостью 0,005 мл
берут каплю мочи и делают 30-40 штрихов на сектор А чашки Петри. Прожигают
петлю и производят 4 штриха через сектор А в сектор I. Аналогичным образом
из сектора I засевают сектор II, а из сектора II — сектор III (рис, 20-1). Чашкиинкубируют при температуре 37 "С в течение
24 ч. Посев проводят на питательный агар,
5% кровяной агар, среды Эндо, СЬЕВ или
хромогенный агар (Шзекс! и др.). При отсут¬
ствии признаков бактериального роста инку¬
бацию посевов увеличивают до 3 сут. Учет
результатов проводят по специальной таблице
(табл. 20-6).Альтернатива методу штрихового посева —
посев с помощью пипетки, в этом случае на
центр чашки с питательной средой наносят
каплю мочи объемом 10 мкл и распределя¬
ют 4 штрихами бактериологической петли
от центра к периферии. Затем всю поверх¬
ность питательной среды равномерно засе-
Рис. 20-1. Секторный посев мочи.	вают частыми штрихами. После инкубации
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 263проводят оценку результатов — при росте на чашке 10-100 колоний концентрация
бактерий в моче 10^ КОЕ/мл. 101-1000 колоний - Ю'* КОЕ/мл, более 1000 коло¬
ний — 10^ КОЕ/мл.Таблица 20-6. Учет результатов посева мочи секторным методомКоличество колонийКоличество микроорганизмов в
исследуемом материале, КОЕ/млА1IIш1-6---<10008-20---300020-30---500030-60---10 00070-80---50 ООО100-1505-10--100 ОООНевозможно под¬
считать20-30--500 ОООНевозможно под¬
считать40-60--1 ООО ОООНевозможно под¬
считать100-15010-20-5 ООО ОООНевозможно под¬
считатьНевозможно под¬
считать30-40-10 000 ОООНевозможно под¬
считатьНевозможно под¬
считать60-80Единичныеколонии100 ООО ОООЗа рубежом широкое распространение получили дипслайды — пластинки с
питательными средами, погружаемые в мочу. На две стороны пластинки могут
наноситься разные питательные среды: обычно одна служит для оценки титра
бактерий в моче, а другая для их идентификации (по ферментации глюкозы, экс¬
прессии ферментов, образованию индола, морфологии колоний и другим призна¬
кам). Это позволяет идентифицировать наиболее важные уропатогенные бактерии
(в сомнительных случаях проводят дополнительные биохимические анализы
изолятов, выросших на средах пластинки). Основным недостатком дипслайдов
служит невозможность оценки степени бактериурии, когда титр бактерий в моче
превосходит 10^ КОЕ/мл — в этом случае часто отмечают газонный рост бактерий.
Этот недостаток устранен в дипстрике — аналогичном приспособлении, в котором
посев осуществляется не погружением пластинки со средами в мочу, а штриховым
дозированным методом с помощью пластикового кольца с зубцами. Внедрение
подобных систем позволяет перенести значительную часть работы из лаборатории
в кабинет врача, где проводится посев, инкубация и первичная оценка результатов.
Посевы, в которых количество бактерий меньше диагностически значимой вели¬
чины. уничтожают, а оставшиеся направляют в лабораторию для точной иденти¬
фикации микроорганизмов и определения их чувствительности к антимикробным
препаратам.Оценка результатовВ норме в мочевом пузыре моча стерильна, однако во время прохождения через
нижнюю треть уретры происходит ее контаминация нормальной микрофлорой.
Поэтому при оценке результатов исследования на первый план выходят количе¬
ственные критерии, позволяющие дифференцировать бактериурию, связанную с
1Щй
ышштШ264БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯпатологаческим процессом, от естественной контаминации. У мужчин достаточно
исследовать одну пробу мочи. У женщин вследствие высокого риска случайной
контаминации целесообразно исследовать серию из 2-3 проб — достоверность
положительного результата 1 пробы составляет 80%, 2 проб — 90%, 3 проб —
100%, при условии, что результаты всех проб одинаковы. При оценке диагности¬
ческой значимости результата в России используются критерии, предложенные
Е.Х. Кассом в 1960 г.:<> титр микроорганизмов, не превышающий 10^ КОЕ/мл, — естественная кон¬
таминация мочи;❖	титр бактерий от 10^ до 10^ КОЕ/мл — сомнительный результат, необходимо
повторение исследования;❖	титр бактерий, равный или превышающий 10^ КОЕ/мл, — диагностический
уровень.В настоящее время эти нормы пересматриваются, так как они занижены и
служат причиной недовыявления большого числа инфекций мочевого тракта. В
соответствии с «Европейским руководством по анализу мочи» (2000 г.) диагности¬
ческими уровнями бактериурии следует считать:❖	при изоляции монокультуры Е. coli и S. saprophyticus —> 10^ КОЕ/мл;❖	при изоляции монокультуры {Enterobacter spp., Enterococcus spp., Klebsiella spp.,
P. mirabilis, P. aeruginosa, Citrobacter spp., M. morganii, P. vulgaris, Serratia spp.,
S. aureus, C. urealyticum, Haemophilus spp.. Pneumococci spp.) — > lO** КОЕ/мл;
при изоляции смешанной культуры двух бактерий — > 10^ КОЕ/мл.Изоляцию 3 и большего числа микроорганизмов считают результатом случай¬
ной контаминации тестируемых проб мочи. При оценке результатов этого этапа
бактериологического анализа делают поправку на способ, которым была получена
моча, и наличие или отсутствие у пациента симптоматики (табл. 20-7)Таблица 20-7. Оценка диагностической значимости бактериурии (по Norrby S.R.)Инфекции мочевыводящих лутейДиагностическое значение
(количество бактерий, КОЕ/мл)Острый неосложненный цистит у женщинграмотрицательные бактерии>10^Staphylococcus spp.>10'Острый неосложненный пиелонефритг рамотрицательные бактерии>10^Staphylococcus spp.>1œОсложненные инфекции и инфекции у мужчин>10'Пациенты с бессимптомной бактериурией>10^ в двух пробахВ отдельных случаях воспалительные процессы в мочевыводящей системе могут
протекать и при низких уровнях бактериурии. например на фоне форсированно¬
го диуреза (низкий удельный вес мочи), антибиотикотерапии или при низких
(менее 5) значениях pH мочи. В этом случае постановке диагноза помогает анализ
видового состава микрофлоры. Обнаружение Е. coli, S. saprophyticus, Enterobacter
spp., Enterococcus spp,, Klébsiella spp., P. mirabilis, P. aerug^nosa расценивают как небла¬
гоприятный признак. Выявление инфекции менее патогенных и непатогенных
бактерий не служит основанием для постановки этиологического диагноза.
Щ€ШШшБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 265Пробы из мочеполовых органовТвердый шанкр, папулы, розеолыПоказания к взятию и исследованию проб; диагностика сифилиса.Взятие материала•	Если до обследования пациент применял дезинфицирующие или прижигаю¬
щие средства, перед взятием материала для бактериологического анализа ему
рекомендуют в течение 12-24 ч прикладывать примочки с 0,9% раствором
хлорида натрия.•	За 2-3 ч до исследования на поверхность эрозии или язвы накладывают на
15-20 мин примочку с гипертоническим (10%) раствором хлорида натрия, а
затем — с 0,9% раствором хлорида натрия.•	Поверхность эрозии, язвы, эрозированной папулы или бляшки дважды осто¬
рожно протирают ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9% раствором
хлорида натрия.•	Осторожно массируют поверхность очага прокаленной и остуженной бактерио¬
логической петлей, шпателем или ложкой Фолькмана до появления прозрачной
или слегка опалесцирующей тканевой жидкости. Можно осторожно сдавить края
эрозии или язвы руками в перчатках для увеличения объема жидкости.•	При возникновении кровотечения его останавливают с помощью марлевого
тампона, увлажненного 0,9% раствором хлорида натрия, и операцию повторя¬
ют. В пробе не должно быть даже следов крови!•	Из папул и розеол при скарификации с помощью скальпеля получают тканевый
сок.•	Небольшую каплю тканевой жидкости бактериологической петлей переносят
на чистое обезжиренное предметное стекло без царапин, накрывают покровным
стеклом и сразу же микроскопируют с помощью темнопольного микроскопа.
Исследование материалаВзятый материал исследуют посредством темнопольной микроскопии, реакции
иммунофлюоресценции, а также методами молекулярной диагностики на наличие
Т. pallidum (детальное описание этих методов приведено в главе 26).Оценка результатовОбнаружение трепонем с характерной морфологией и типом движения свиде¬
тельствует в пользу диагноза сифилиса. Дифференцировать Г. pallidum от сапро¬
фитных трепонем, входящих в состав нормальной микрофлоры, можно в реакции
иммунофлюоресценции или ПЦР,Материал из уретрыПоказания к проведению исследования;❖	острые и хронические заболевания уретры;❖	острые и хронические заболевания половых органов;<0* бесплодие.Взятие материала•	Перед взятием материала необходимо вымыть половые органы теплой водой
или 0,9% раствором хлорида натрия, удалить с помощью ватного тампона
свободно стекающие выделения.•	Материал для микроскопического исследования берут с помощью бакте¬
риологической петли, желобоватого зонда, стеклянной глазной палочки или
маленькой ложки Фолькмана. В последние годы широкое распространение
получили специальные одноразовые зонды с ворсистой головкой, позво¬
ляющие отбирать материал качественно и с минимальной травматизацией
слизистой оболочки.
" ,1266 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯШШ•	При обильном отделяемом материал собирают с помощью стеклянной
палочки или края шлифованного стекла и сразу готовят мазки на предмет-
ных стеклах. В лабораторию нужно направлять не менее 2 мазков от одного'^'УхіГк'>	больного.•	При скудном отделяемом больному предлагают до исследования не мочиться
в течение 4-8 ч, а затем массируют уретру, стараясь выдавить собравшийся в
глубине секрет.^"Л	• Материал для бактериологического исследования забирают с помощью' '	бактериологической петли. Для предупреждения его контаминации сапро¬фитной микрофлорой, в большом количестве присутствующей в дистальном
отделе уретры, в мочеиспускательный канал вводят стерильную ушную
воронку, через которую бактериологической петлей собирают отделяемое из
глубоких отделов уретры.•	Если планируется посев с целью выделения N. gonorrhoeae, необходимо
использовать вискозные, дакроновые и альгинатно-кальциевые зонды-
тампоны, поскольку хлопковая вата может быть токсичной для этой бак¬
терии. Зонд-тампон осторожно вводят в уретру и оставляют на 10 с. После
извлечения его помещают в транспортную среду (например, среду Эймса с
углем). Материал должен быть доставлен в лабораторию в течение 12 ч. Не
допускается его охлаждение ниже 30 °С.При подозрении на трихомоноз наиболее эффективно исследование смывов из
уретры, получаемых с помощью пипетки или стеклянной трубки, снабженной
резиновой грушей.•	На стерильную стеклянную трубку (пипетку) надевают резиновый баллон¬
чик и набирают в нее 0,5-1,0 мл стерильного теплого раствора Рингера.
Трубку вставляют в наружное отверстие уретры, раствор несколько раз вво¬
дят в канал и аспирируют в трубку. Затем материал переносят в стерильную
пробирку типа «Эппендорф» и используют для приготовления препаратов
или посева на питательные среды.Исследование материала
Методы, применяемые для исследования взятого материала, зависят от предпо¬
лагаемого возбудителя заболевания и могут включать бактериоскопию, посевы
на питательные среды, иммунологические и молекулярные лабораторные тесты,
предназначенные для обнаружения микроорганизмов, их антигенов или нуклеи¬
новых кислот.Оценка результатовОценка этиологической значимости выделенных микроорганизмов при уретри¬
тах сопряжена со значительными сложностями, особенно при уретритах негоно¬
рейной этиологии.Полиэтиологичность уретритов диктует необходимость проведения целого
комплекса лабораторных исследований, направленных на выявление возможно
более широкого круга микроорганизмов — потенциальных этиологических аген¬
тов. Этиологическую диагностику в большинстве случаев может обеспечить при¬
менение следующих методов:-<?- микроскопии мазков, окрашенных метиленовым синим и по Граму; для обна¬
ружения N. gonorrhoeae, Gardnerelia vaginalis, Trichomonas vaginalis и грибов
рода Candida spp.;•	посева отделяемого из уретры и секрета половых желез для выявления
N. gonorrhoeae и условно-патогенных бактерий, трихомонад и грибов;•	цитологического исследования соскобов из уретры, окрашенных по
Романовскому-Гимзе, для выявления внутриэпителиальных включений хла¬
мидий.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 287В настоящее время для выявления хламидий применяют также реакщ^ю имму¬
нофлюоресценции и ПЦР, а для обнаружения уреаплазм — культуральный метод
или количественный вариант ПЦР.•	Существует возможность развития смешанной инфекции, когда одновремен¬
но этиологически значимы несколько возбудителей. Поэтому обследование
больного нельзя прекращать после обнаружения одного вида патогенов, не
исключив одновременного присутствия других.•	Чувствительность используемых в лабораториях методов выявления пато¬
генных микроорганизмов из уретры недостаточно высока. Например, при
трихомонозе у 3-20% больных возбудитель удается обнаружить только
после 5-кратного обследования. В связи с этим для уверенности в отрица¬
тельном результате исследования необходимо выполнять неоднократно и. по
возможности, с параллельным использованием нескольких методов.•	Обнаружение уреаплазм, Candida spp. и условно-патогенных бактерий не
всегда свидетельствует об их этиологической роли, так как данные микро¬
организмы часто входят в состав нормальной микрофлоры уретры.Для оценки этиологической роли уреаплазм были предложены следующие кри¬
терии:•	обнаружение возбудителя в титре выше 10"^ КОЕ/мл в секрете предстатель¬
ной железы или более 10^ КОЕ/мл в моче;•	обнаружение в посевах уреаплазм при одновременном отсутствии других
патогенных микроорганизмов и нарастании титра соответствующих антител
при исследовании парных сывороток.При оценке этиологической роли Candida spp. учитывают их титр в первой пор¬
ции мочи — его диагностический уровень составляет 10^ КОЕ/мл.Уретриты, вызванные условно-патогенными бактериями, встречаются крайне
редко. Диагностика этих заболеваний основана на сведениях о титре бактерий в
исследованном материале, постоянстве видового состава микрофлоры и ее моно¬
морфизме, наличии и выраженности фагоцитарной реакции и отсутствии других
инфекционных агентов. Эти критерии можно использовать только в комплексе,
при отсутствии хотя бы одного из них диагноз сомнителен,уретрит у мужчин и женщин — полиэтиологичное заболевание. Его причиной
могут быть как патогенные, так и условно-патогенные микроорганизмы, входящие
в состав нормальной микрофлоры.Гонококковый уретрит может быть с уверенностью диагностирован с помощью
бактериоскопического метода при обнаружении в мазках грамотрицательных
диплококков с характерной морфологией, расположенных внутри лейкоцитов
(незавершенный фагоцитоз). При отсутствии внутриклеточно расположенных
N. gonorrhoeae точность диагностики снижается. В этих случаях для подтверждения
диагноза необходимо использовать бактериологический метод и ПЦР. У девочек
(до наступления менархе) и женщин (в менопаузе) диагноз гонореи устанавливают
только на основании бактериологического исследования.Эффективность диагностики можно повысить с помощью «провокаций» перед
взятием исследуемого материала.Бактериоскопический метод малоэффективен для диагностики трихомонадных
уретритов. В данном случае оптимально проведение культурального исследова¬
ния смывов из уретры, которое по числу находок более результативно, чем ПЦР.
Уретриты, вызванные С. trachomatis, широко распространены, проявляются, как
правило, скудной клинической симптоматикой, однако могут сопровождаться и
признаками острого воспаления, сходными с симптомами гонореи.Если хламидии обнаружены с помощью флюоресцирующих антител, в том числе
моноклональных (ПИФ, РИФ), результат следует подтвердить с помощью ПЦР.
Целесообразность выполнения культурального исследования дискутабельна.
268 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯЯзвы половых органовПоказания к взятию и исследованию проб: изъязвления на коже и слизистой
оболочке полового члена, за исключением подозрения на твердый шанкр.Язвенные поражения гениталий могут быть обусловлены Haemophilus ducreyeyi
(шакроид), С trachomatis серологических типов L1-L3 (венерическая лимфогра-
нулема, четвертая венерическая болезнь), Calymmatobacterium granulomatis (доно-
ваноз, паховая гранулема).Взятие материала•	Очищают поверхность язвы с помощью стерильного тампона, смоченного
0,9% раствором хлорида натрия. Стерильной марлевой салфеткой обтирают
поверхность язвы до появления тканевой жидкости. Следует избегать появ¬
ления крови!•	Первую порцию жидкости удаляют салфеткой, затем руками в перчатках
сдавливают язву у основания до появления прозрачной или слегка опалесци¬
рующей тканевой жидкости.•	Тканевую жидкость аспирируют одноразовым шприцем с иглой, закрывают
иглу защитным колпачком и как можно быстрее направляют в лаборато¬
рию.Исследование материалаДля выявления я, ducreyeyi тканевую жидкость засевают на шоколадный агар
или кровяной агар с овечьей кровью, а также готовят мазки, окрашенные по
Граму.С. trachomatis серологических типов L1-L3 выявляют с помощью культурально¬
го метода, ПЦР, РИФ. ИФА.Для выявления Calymmatobacterium granulomatis необходимо исследовать окра¬
шенные по Райту и Гимзе мазки грануляционной ткани или биоптаты.Оценка результатовВ пользу шанкроида свидетельствует обнаружение в мазке грамотрицательных
палочек овоидной формы, расположенных параллельными цепочками («железно¬
дорожные пути»), группами («стайки рыб») или парами, однако бактериоскопиче¬
ский метод недостаточно чувствителен и, если имеется такая возможность, следует
пользоваться для постановки окончательного диагноза культуральным методом и
ПЦР.При диагностике венерической лимфогранулемы культуральный метод считают
«золотым стандартом». Однако он трудоемок и требует специальной подготовки
исследователей, а также особых условий проведения работы. Поэтому в настоящее
время им практически не пользуются для рутинной диагностики инфекции С. tra¬
chomatis, отдавая предпочтение другим диагностическим методам, особенно ПЦР.Для выявления Calymmatobacterium granulomatis необходимо исследовать мазки
грануляционной ткани или биоптатов. В препаратах, окрашенных по Райту и
Гимзе, удается обнаружить биполярно окрашенные цитоплазматические включе¬
ния — тельца Донована, что служит основанием для диагностики паховой грану¬
лемы.Материал из простатыПоказание к проведению исследования — установление этиологии хронических
простатитов.Взятие материалаНепосредственное взятие проб из предстательной железы возможно лишь при
хирургической операции, что во многих случаях неприемлемо. Поэтому для диа¬
гностики бактериальных простатитов и установления их этиологии, как правило,
собирают 1-ю и 2-ю порции мочи, с помощью массажа получают секрет предста¬
тельной железы, а затем собирают 3-ю порцию мочи.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 269❖	Перед взятием материала для исследований пациент должен провести тща¬
тельный туалет наружных половых органов с помощью теплой воды, мыла и
стерильных марлевых салфеток.❖	Больному предлагают помочиться в стерильный контейнер. Собрав 10-20 мл
мочи, он должен продолжить мочеиспускание в емкость для сброса. Контейнер
помечают как пробу №1.❖	Не опорожняя полностью мочевой пузырь, пациент собирает 10-20 мл мочи
в другой стерильный контейнер, который помечают как пробу №2.❖	Врач проводит массаж простаты через задний проход и, если удается полу¬
чить сок простаты, готовит из него мазок на стекле.❖	Больной собирает первые 10 мл мочи в третий стерильный контейнер, кото¬
рый помечают как пробу №3.Исследование материала
Из полученного материала готовят мазки, которые исследуют под световым
микроскопом в нативном виде и после окраски. При обнаружении в пробах бак¬
терий проводят посев материала на соответствующие питательные среды с после¬
дующей идентификацией выделенных изолятов.Оценка результатовПервая проба мочи характеризует состояние микрофлоры уретры, вторая —
мочевого пузыря, третья — простаты.На наличие у пациента хронического бактериального простатита указывают:
обнаружение лейкоцитов в моче после массажа простаты в количестве более
10 в 1 мл и в соке простаты более 10 в поле зрения;❖	увеличение количества бактерий в 3-й пробе мочи более чем в 10 раз по срав¬
нению со 2-й пробой;❖	обнаружение в 3-й пробе микроорганизмов, отсутствовавших в 1 -й и 2-й про¬
бах.Наиболее вероятная причина хронических бактериальных простатитов — гра¬
мотрицательные уропатогенные бактерии {Е. coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp),
менее вероятная — грамположительные бактерии (E.faecalis, Staphylococcus spp.).Широко дискутируется роль хламидий в этиологии простатитов. Также в каче¬
стве возможных кандидатов на роль этиологических агентов в различных публи¬
кациях упоминаются облигатно-анаэробные бактерии, уреаплазмы, пропионобак-
терии, хеликобактеры и даже лактобактерии.Отделяемое женских половых органовПоказания к проведению исследования:❖	диагностика инфекций женских половых органов;❖	обследование женщин, у половых партнеров которых диагностирован уре¬
трит.Взятие материалаМинимальная схема обследования женщины должна включать бактериоскопи-
ческое исследование мазков проб, полученных из:❖	уретры (диагностика ИППП);❖	заднего свода влагалища (оценка состояния влагалищного биоценоза, диа¬
гностика вагинозов и вагинитов);о	цервикального канала (диагностика ИППП).Если все три мазка направляют в лабораторию на одном стекле, они должны
быть четко промаркированы.При необходимости, дополнительно отбирают пробы для культурального
исследования и ПЦР.При воспалении бартолиниевых желез проводят их пункцию.
лшш.ЛШ270 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯИз вульвы И влагалища материал забирают зондами-тампонами. В последнем
случае придерживаются следующих правил.•	Материал для анализа получают до проведения мануального влагалищного
исследования.•	Зеркало и подъемник вводят во влагалище и с помощью стерильной салфетки
убирают избыток вьщелений и слизи,•	Материал собирают с заднего свода или с патологически измененных участ¬
ков влагалища двумя стерильными зондами-тампонами.•	Первый зонд-тампон возвращают в пробирку-тубсер или помещают в сте¬
рильную пробирку и как можно быстрее доставляют в лабораторию для про¬
ведения бактериологического исследования,•	Второй зонд-тампон используют для приготовления мазка. Мазок наносят
на 2 предметных стекла. Если одновременно планируется исследование мате¬
риала из цервикального канала или уретры все 2-3 мазка можно сделать на
одном стекле (в лабораторию в этом случае доставляют 2 стекла, на каждом
из которых находятся мазки из всех обследуемых биотопов). Мазки марки¬
руют, высушивают на воздухе и, поместив в чашки Петри или специальные
транспортные контейнеры, доставляют в лабораторию.Из цервикального канала материал забирают следующим образом:•	Обнажают шейку матки с помощью зеркала (лучше стерильного одноразо¬
вого), убирают избыток выделений и слизи стерильной марлевой салфеткой
или ватным шариком, смоченными стерильным 0,9% раствором хлорида
натрия или дистиллированной водой, и высушивают стерильной сухой мар¬
левой салфеткой,•	Если предполагается бактериологическое исследование (на гонорею, хла-
мидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз и т,д.), пользуются тонким стерильным
зондом-тампоном (цервикальной щеточкой). Его аккуратно вводят в цер¬
викальный канал на глубину 1,0-1,5 см, вращают в течение 10 с, не касаясь
стенок влагалища, и сразу же погружают в транспортную среду (среду Эймса
с углем).При подозрении на трихомоноз материал должен быть доставлен в лабораторию в
кратчайшие сроки, а на гонорею — в течение 12 ч; при подозрении на эти инфекции
не допускается охлаждение проб, В остальных случаях при отсутствии возможно¬
сти быстрой доставки проб в лабораторию допускается их хранение в холодильни¬
ке (4-8 "С) 24-48 ч. Для проведения ПЦР материал помещают в микропробирку с
лизирующим буфером или 0,9% раствором хлорида натрия.Материал из матки получают с помощью специального инструмента — шприца-
аспиратора. После прохождения зондом цервикального канала в полости матки рас¬
крывают наружную оболочку зонда и аспирируют шприцем содержимое матки.Взятие для исследования материала из придатков матки проводят во время опе¬
ративного вмешательства.Исследование материалаСхема исследования отделяемого женских половых органов должна соответ¬
ствовать предполагаемой этиологии болезни.Состояние влагалищной микрофлоры оценивают 3 методами:•	бактериоскопическим;•	полуколичественным бактериологическим;•	количественным бактериологическим,В рутинной лабораторной практике обычно пользуются первыми двумя мето¬
дами.Оценка результатовОсновные критерии оценки состояния бактериальной микрофлоры получен¬
ных результатов приведены в табл. 20-8.
ШШІБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 271
Таблица 20-В. Микроскопическая характеристика биоценоза влагалищаСостояниебиоценозаОписание признаковНозологические формыНормоценозпреобладание лактобацилл, отсутствие грамотрицательных
бактерий, спор, мицелия, псевдогифов, лейкоцитов, единичные
«чистые» эпителиальные клеткиТипичное состояние
нормального биотопа
влагалищаПромежу¬
точный типУмеренное или незначительное количество лактобацилл, наличие
грамположительных кокков, грамотрицательных палочек, обна¬
ружение лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных клетокЧасто наблюдается
у здоровых женщин,
редко сопровождается
жалобами и клинически¬
ми проявлениямиДисбиозвлагалищаНезначительное количество или полное отсутствие лактобацилл,
обильная, полиморфная грамотрицательная и грамположитель-
ная палочковая и кокковая микрофлора, обнаружение ключевых
клеток, количество лейкоцитов вариабельно, отсутствие или
незавершенность фагоцитоза, полимикробная картина мазкаБактериальный вагинозБольшое количество лейкоцитов, макрофагов, эпителиальных
клеток, выраженный фагоцитозНеслецифическийвагинитВагинитОбнаружение N. gonorrhoeaeг онореяОбнаружение Trichomonas vaginalisТрихомониазОбнаружение мицелия, псевдогифов, спорМикотический вагинитБактериальный вагиноз, или дисбиоз влагалища, — нарушение состояния вла¬
галищной микрофлоры, характеризующееся избыточным развитием ряда микро¬
организмов (Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp., Prevotella spp., Mycoplasma hominis)
и замещением ими лактобактерий.Развитию бактериального вагиноза могут способствовать различные эндоген¬
ные и экзогенные факторы:-0“ изменение гормонального статуса;о- снижение иммунологической реактивности;❖	предшествующая антибактериальная терапия:
воспалительные заболевания мочеполового тракта.Диагноз бактериального вагиноза ставят на основании совокупности клиниче¬
ских и лабораторных данных (критерии Амсела):<0- обильные гомогенные вьщеления, прилипающие к стенкам влагалища;❖	pH влагалищного секрета более 4,5;рыбный запах вагинальных выделений непосредственно или после добавле¬
ния нескольких капель 10% гидроксида калия (аминный тест);«Ф” обнаружение диагностически значимых клеток.Для постановки диагноза «бактериальный вагиноз» достаточно наличия 3 из 4
указанных признаков.Факт обнаружения в материале из влагалища Gardnerella vaginalis с помощью
бактериологического метода или ПЦР не является основанием для постановки
диагноза «гарднереллез», так как данный микроорганизм входит в состав нор¬
мальной микрофлоры влагалища. Использование бактериологического метода
или ПЦР целесообразно только на этапе планирования беременности при наличии
выкидышей в анамнезе, так как некоторые метаболиты гарднерелл могут прово¬
цировать бесплодие.Истинный гонорейный вагинит развивается у беременных, женщин в период
менопаузы и до полового созревания (при щелочной реакции влагалищного секре¬
та и при истончении эпителия влагалища). При этом обнаружение N. gonorrhoeae
при бактериоскопическом исследовании влагалищных мазков осложняется отсут¬
272БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯствием ключевого признака — внутриклеточного расположения грамотрица¬
тельных диплококков. Поэтому для подтверждения диагноза предпочтительно
использование ПЦР и бактериологического метода. У девочек (до наступления
менархе) и женщин (в менопаузе) диагноз гонореи устанавливают только на осно¬
вании бактериологического исследования.Трихомониазный вагинит может быть диагностирован с помощью микро¬
скопического метода (предпочтительна микроскопия нативного неокрашенного
препарата), культурального метода и ПЦР, Наиболее высокой чувствительностью
обладает культуральный метод, однако его исследование затруднено при одновре¬
менном присутствии во влагалищной слизи трихомонад и Candida spp.Наиболее частая причина кандидозного вагинита — С. albicans, реже — С. glabrata,
еще реже — С. tropicalis. Прочие виды Candida spp. (С crusei, C. parapsilosis) вызы¬
вают вагинит очень редко. В подавляющем большинстве случаев для диагностики
кандидозного вагинита достаточно бактериоскопического исследования (микро¬
скопия нативного неокрашенного препарата или мазка, окрашенного по Граму).
При этом следует помнить, что Candida spp. входит в состав нормальной микро¬
флоры влагалища и обнаружение отдельных клеток при отсутствии клинической
симптоматики не является основанием для назначения этиотропного лечения.
К культуральному исследованию прибегают для подтверждения диагноза при
отрицательном результате микроскопии и наличии симптомов заболевания, а
также для видовой идентификации возбудителя при подозрении на нетипичную
этиологию кандидоза. Диагностически значимо обнаружение Candida spp. в титре
не менее 10 ООО КОЕ/мл. В связи с этим информативность качественных модифи¬
каций ПЦР сомнительна.Пробы из органов слухаОтделяемое наружного слухового прохода, среднего и внутреннего ухаПоказания к взятию и исследованию проб: воспалительные заболевания уха.Взятие материалаИз наружного слухового прохода•	Обрабатывают кожу 70% этиловым спиртом и промывают стерильным 0,9%
раствором хлорида натрия.•	Тампоном, смоченным стерильным 0,9% раствором хлорида натрия^ удаляют
соринки и корки из ушного канала.•	Материал для исследования берут зондом-тампоном, интенсивно (но осто¬
рожно, чтобы не повредить барабанную перепонку!) вращая его в наружном
слуховом проходе.•	Зонд-тампон помещают в пробирку с транспортной средой (например, сре¬
дой Эймса с углем), а при ее отсутствии — в пустую стерильную пробирку. В
последнем случае материал доставляют в лабораторию немедленно.•	При подозрении на отомикозы предпочтительнее взятие соскоба стерильным
аттиковым зондом или костной ложкой. Материал помещают между двумя
обезжиренными предметными стеклами.•	Если гнойное отделяемое имеет густую сливкообразную консистенцию, то к
нему добавляют несколько капель 30% гидроксида калия и оставляют под
покровным стеклом на 1-2 ч.Из среднего и внутреннего уха•	Берут пробы (пунктаты и другой материал) во время операций. Пунктаты
доставляют в лабораторию в закрытом шприце с предварительно удаленным воз¬
духом, а образцы ткани — в транспортной среде Кэри-Блейр или в стерильном
одноразовом контейнере с завинчивающейся крышкой.
шшБАКТЁРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 273Парацентез барабанной перепонки проводят для микробиологической диагно¬
стики инфекций среднего уха только в случаях, когда лечение отита неэффективно
или катаральное воспаление среднего уха имеет торпидный характер.•	Если целостность барабанной перепонки не нарушена:❖	очиш;ают наружный канал с помощью тампона, смоченного 70% этиловым
спиртом, с последующей обработкой стерильным 0,9% раствором хлорида
натрия;■0^ аспирируют шприцем жидкость из барабанной полости;переносят материал в пробирку с консервантом или доставляют материал
в шприце, удалив из него воздух и надев на иглу защитный колпачок.•	Если целостность барабанной перепонки нарушена, материал собирают с
помощью стерильного ушного зеркала и зонда-тампона. Зонд-тампон со взя¬
тым материалом помещают в транспортную среду или в пустую стерильную
пробирку. В последнем случае материал должен быть доставлен в лаборато¬
рию немедленно.Исследование материала
В зависимости от задач исследования выполняют микроскопию препаратов (при
увеличении в 100, 200 и 400 раз), окрашенных по Романовскому-Гимзе, Граму и
другими методами, посев на питательные среды (кровяной агар с овечьей кровью,
шоколадный агар, среду Сабуро, тиогликолевую среду и др.), идентификацию
выделенных изолятов бактерий и оценку их чувствительности к антимикробным
препаратам.Оценка результатовВоспаление наружного уха могут вызывать бактерии 5. aureus, Str. pyogenes,
P. aeruginosa, энтеробактерии, T. pallidum, M. tuherculosi, a также грибы родов
Aspergillus, Pénicillium, Mucor, Candida spp.Возбудители острого среднего отита чаще всего — Str. pneumoniae и Я. influenzae,
значительно реже — Moraxella catarrhalis, S. aureus, Str. pyogenes, иногда — Mycoplasma
pneumoniae, Chlamydia trachomatis и CMamydophila pneumoniae.При проведении дифференциально-диагностических исследований следует
учитывать, что воспаление наружного и среднего уха нередко вызывают вирусы.При хроническом гнойном среднем отите выделяют р. aeruginosa, грамотрица¬
тельные палочки семейства Enterobacteriaceae, S. aureus.У пациентов с хроническим гнойным средним отитом, протекающим с разви¬
тием внутричерепных осложнений, важный этиологический фактор — анаэробная
микрофлора, преимущественно Bacteroides spp.А'ШшшщШшшПробы из глазПоказания к взятию и исследованию проб: воспалительные заболевания глаз.Взятие материалаЗа 6-8 ч до сбора материала отменяют проводимое лечение.Отделяемое собирают стерильными зондом-тампоном или стеклянной палоч¬
кой.•	Несколько раз проводят этими приспособлениями по слизистой оболочке
нижней переходной складки, края век.•	При язве собирают материал с роговицы после обезболивания,•	При «уголковом конъюнктивите» собирают материал с уголков век.•	При блефарите гнойные корочки снимают пинцетом и собирают отде¬
ляемое из язвочек у основания ресниц, с внутренней поверхности нижнего
века (движением в направлении от наружного к внутреннему углу глазной
щели). Пациент должен придерживать веки руками, чтобы при моргании
ресницы не касались тампона. При скудном отделяемом тампон предва¬
274 бактериологические исследованиярительно смачивают стерильным физиологическим раствором. Избыток
влаги отжимают о внутреннюю поверхность емкости, после чего собирают
материал.•	Отделяемое из слезного мешка получают выдавливанием после осторожного
массажа.При пресептальном целлюлите (флегмоне век) обрабатывают кожу 70% этило¬
вым спиртом и 1-2% раствором йода, йодоформом или другим дезинфектантом,
разрешенным к применению в установленном порядке. Затем проводят сбор мате¬
риала;при отсутствии открытой раны — после прокола или надреза скальпелем
верхнего или нижнего век;•	при наличии открытой раны — шприцем с иглой.При эндофтальмите проводят пункцию глаза, объем отбираемого внутриглаз¬
ного содержимого - 0,3-0,5 мл.У пациентов, у которых воспаление роговицы развилось на фоне применения
контактных линз, целесообразно взять смывы с последних.•	Больной снимает контактные линзы, не прикасаясь руками к их внутренней
поверхности, и укладывает их на дно стерильной чашки Петри внутренней
поверхностью вверх.•	Смывы забирают с помощью стерильного тампона или зонда-тампона,
увлажненного 0,9% раствором хлорида натрия,•	Тампон/зонд-тампон помещают в пробирку с транспортной средой или
немедленно доставляют в лабораторию в стерильной пробирке.Более корректную информацию о возбудителе воспалительного процесса полу¬
чают при микробиологическом анализе соскобов, а не смывов.•	Перед получением соскоба ."Закапывают в глаз 1-2 капли пропаракаина
гидрохлорида или другого анестетика.•	Несколькими резкими движениями в одном направлении с помощью специ¬
ального стерильного шпателя делают соскоб с конъюнктивы или роговицы.
При проведении манипуляции глаз должен быть открыт. Надо внимательно
следить за тем, чтобы при сборе пробы не касаться ресниц.При бактериальном эндофтальмите (гнойном воспалении сосудистой и сетча¬
той оболочки глаз с формированием абсцесса в стекловидном теле) пробу сте¬
кловидного тела (1-2 мл) собирают с помощью тонкоигольной аспирации или
получают при проведении витректомии (удалении патологически измененного
стекловидного тела). Предварительно берут соскоб с конъюнктивы для контроля
возможной контаминации образца сопутствующей микрофлорой. Пробу можно
транспортировать, поместив в транспортную среду или непосредственно в шприце,
удалив воздух и иглу, а затем закрыв шприц стерильной резиновой пробкой или
надев на иглу защитный колпачок.При каналикулите (воспалении малых протоков, через которые происходит
отток слез с конъюнктивы в слезный мешок) прижимают внутреннюю часть века,
чтобы получить гной.в месте взятия упомянутых выше материалов из них готовят мазки (не менее 2
из каждой пробы).•	Наносят материал на чистое обезжиренное предметное стекло круговыми
движениями на площадь диаметром 1 см,•	После подсыхания на воздухе мазки фиксируют в течение 5 мин в 95%
метиловом/этиловом спирте или посредством нанесения од мл ацетона до
полного испарения. Стекло с фиксированным мазком можно хранить при
температуре -10 “С не более 7 сут.•	Окрашивают препараты по Романовскому-Гимзе.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 275Полученные любым из описанных выше методов пробы предпочтительнее
доставлять в лабораторию в пробирках с транспортной средой или, в крайнем слу¬
чае, в пустых стерильных пробирках. Пробирки с материалом маркируют инфор¬
мацией о том, из какого глаза он был взят. Параллельно из полученного материала
готовят мазки. Также материал может быть непосредственно после взятия засеян
на кровяной и шоколадный агар, тиогликолевую среду, агар Сабуро — для этого
лучше пользоваться федами в пробирках или чашках Петри промышленного про¬
изводства. Засеянный материал вместе с приготовленными мазками передают для
дальнейших исследований в лабораторию.Исследование материалаВ лаборатории проводят бактериоскопию мазков (если они не были сделаны в
месте обследования пациента, то их готовят из доставленных проб), посев на пита¬
тельные среды, идентификацию изолятов бактерий по морфологическим, тинкто¬
риальным, культуральным, биохимическим свойствам (а в ряде случаев по анти¬
генной структуре), оценку их чувствительности к антимикробным препаратам.Оценка результатовРезультаты лабораторных анализов оценивают с учетом данных анамнеза, кли¬
нических проявлений заболевания и видов выделенных микроорганизмов.Определенное представление о вероятной этиологии конъюнктивита можно
составить на основании цитологического исследования соскобов с конъюнктивы,
окрашенных по Романовскому-Гимзе (табл. 20-9).Таблица 20-9. Зависимость результатов цитологического исследования от этиологии конъюн¬
ктивитаКлетки или включенияприрода конъюнктивитааллергическийбактериальныйвирусныйхламидийныйНейтрофилы-+++Эозинофилы+---/+Лимфоциты+-++Плазматические клетки---+Включения в цитоплазме---+Включения в ядре-+ (герпес)-Поражение конъюнктивы может быть обусловлено бактериями, вирусами, гри¬
бами или простейшими.Наиболее частая причина бактериальных конъюнктивитов — Staphylococcus spp.
(при остром конъюнктивите чаще всего обнаруживается 5. aureus, при хрониче¬
ском — S. epidermidis). S. aureus поражает и другие отделы глаза. У новорожденных
один штамм стафилококков часто вызывает одновременно заболевания глаз,
пупка, полости рта и носа.N. gonorrhoeae — причина конъюнктивита у детей всех возрастных групп, а не
только новорожденных. Среди коринебактерий наиболее тяжелые формы конъ¬
юнктивитов, при которых в патологический процесс может вовлекаться роговица,
вызывают С. diphtheriae.Энтеробактерии {Klebsiella spp., Proteus spp., E. coït), a также P. aeruginosa — воз¬
можная причина конъюнктивитов как у взрослых, так и у новорожденных.
У взрослых конъюнктивиты данной этиологии развиваются, как правило, после
химического или механического повреждения конъюнктивы, а у новорожден¬
ных — при инфицировании во время родов.Moraxella lacunata вызывает острый эпидемический конъюнктивит Коха-Уикса.
При диагностике этого заболевания вследствие сложности культивирования
моракселл можно ограничиться обнаружением грамотрицательных диплобакте¬
рий в мазках.
ш||276 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯНа фоне длительной антибиотикотерапии может наблюдаться колонизация
конъюнктивы Candida spp. и Aspergillus. Необходимо учитывать возможность
профессионального носительства Candida spp., например у пекарей и молочни¬
ка^ ков. Причиной заболеваний глаз также могут быть и другие грибы - Nocardia,
РсшсШит, Uucor.Распространенность хламидийных конъюнктивитов среди отдельных групп
населения может достигать 30%. Чувствительность микроскопического метода
диагностики хламидийного конъюнктивита невелика. Это заболевание вызывают
серовары, Е, F, G, Н, I, Y. К Chlamydia trachomatis, т.е. серовары, которые вызыва¬
ют урогенитальный хламидиоз. Б связи с этим для диагностики хламидийного
конъюнктивита могут быть использованы те же методы, что и для диагностики
урогенитального хламидиоза, в первую очередь ПЦР. Помимо соскобов с конъюн¬
ктивы, целесообразно также исследовать материал из половых органов.Чаще всего развитие бактериальных кератитов обусловлено Staphylococcus spp..
Streptococcus spp., Pseudomonas spp. При этом наиболее тяжелые поражения с образо¬
ванием язв вызывает Р. aeruginosa. Реже причиной кератитов становятся грамотрица¬
тельные микроорганизмы родов Escherichia, Neisseria, Proteus, Moraxella. Вялотекущие
хронические эндофтальмиты могут быть обусловлены Propionobacterium acnés, а
эндофтальмиты у наркоманов, внутривенно вводящих героин, — Bacillus cereus.
В спорадических слу^1аях кератиты вызывают Nocardia spp.Возбудители эндофтальмита — Staphylococcus spp.. Streptococcus spp., Pseudo¬
monas spp. и другие грамотрицательные палочки. Причиной посттравматических и
эндогенных эндофтальмитов также могут быть Clostridium spp. и Bacillus spp.Иридоциклиты в настоящее время чаще всего связаны с герпетической инфек¬
цией (вирус простого и опоясывающего герпеса), но также могут быть обусловле¬
ны Г. pallidum.Развитие дакриоцититов чаще всего обусловлено Str. pneumoniae, S. aureus иH.	influenzae.Воспаление протоков слезных желез может быть обусловлено анаэробными
микроорганизмами — Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Peptostreptococcus spp. или
Actinomyces spp.Заболевания глаз, связанные с ношением контактных линз, могут быть вызваны
Bacillus spp., Serratia spp., Acanthamoeba spp.При пресептальном целлюлите этиологическое значение имеют S. aureus,
S. pyogenes, H. influenzae, y детей в возрасте от 6 мес до 1,5 лет — Я. influenzae, при
травмах — Clostridium spp.При орбитальном целлюлите (системная инфекция глубоких тканей глазницы)
аспират из зоны поражения пол)^ают с помощью шприца и исследуют, как описа¬
но выше. Параллельно целесообразно провести исследование крови на гемокуль-
туру.При послехирургических инфекциях чаще выделяют 5. aureus, при инфекциях
вследствие панофтальмита — 5. aureus, Str. pneumoniae, P. aeruginosa, при проник¬
новении инфекции из околоносовых пазух — Н. influenzae, S. aureus, Str. pyogenes,
Str. pneumoniae.При дакриоадените (воспалении слезной железы) берут мазок с конъюнктивы
без пунктирования слезной железы. Основные возбудители дакриоаденита —
S. aureus, Str. pyogenes, Str. pneumoniae.При дакриоцистите (воспалении слезного мешка) материал собирают тампоном
с конъюнктивы, после чего для получения экссудата сдавливают слезный мешок и
собирают материал тампоном или шприцем. Материал помещают в транспортную
среду или сразу засевают на кровяной и шоколадный агар и в тиогликолевую среду,
а также используют для приготовления мазков. Наиболее частая причина дакрио-
Щ1стита — 5. aureus, Str pyogenes, Str. pneumoniae, H. influenzae.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 277Основные возбудители каналикулита — Actinomyces israelii, Propionobacterium
propionicus, Moraxella spp„ дифтероиды и зеленящие стрептококки.ФекалииПоказания к взятию и исследованию проб;<> острые и хронические кишечные инфекции любой этиологии;<!► дисбактериоз.Взятие исследуемого материалаСбор фекалий после дефекации•	Судно тщательно моют для удаления следов дезинфектантов.•	На его дно помещают лист чистой плотной бумаги.•	Больного просят совершить акт дефекации, предварительно предупредив о
нежелательности попадания в фекалии мочи.•	Пробу фекалий отбирают сразу после акта дефекации. При наличии патоло¬
гических примесей необходимо выбрать участки, содержащие слизь, гной,
хлопья, но без следов крови. Образцы жидких фекалий отбирают с помощью
стеклянной трубки с резиновой грушей.•	Полученный материал помещают:❖	в пустой стерильный контейнер и доставляют в лабораторию в течение 2 ч:-	объем забираемого материала должен составлять не менее 2 г;-	при оформленном стуле оптимально взятие материала в объеме грец¬
кого ореха, при жидком стуле его слой в посуде должен быть не менее2	см;в консервант (пробы для диагностики острых кишечных инфекций, вызы¬
ваемых условно-патогенными бактериями, и дисбактериоза забирают и
транспортируют без консерванта в транспортной среде) (табл. 20-10):-	объем забираемого материала не должен превышать 1/3 объема консер¬
ванта;-	фекалии должны быть тщательно гомогенизированы в консерванте с
помощью проволочной петли или стеклянной палочки;-	образцы могут храниться в холодильнике в течение 1 сут.Наиболее подходящей емкостью для сбора фекалий является стерильный одно¬
разовый контейнер с широким горлом и завинчивающейся крышкой, содержащий
пластиковую ложечку-шпатель, вмонтированную в крышку контейнера.Если фекалии жидкие (например, профузная диарея), их собирают:•	стерильной одноразовой серологической или пастеровской пипеткой с широ¬
ким носиком и пипетора;стерильным катетером со стерильным стеклянным наконечником с одной
стороны и грушей, предварительно простерилизованной или обработанной
70% этиловым спиртом и тщательно ополоснутой стерильным физиологиче¬
ским раствором, - с другой.Жидкими фекалиями контейнер заполняют не более чем на 1/3 объема для
предохранения от разбрызгивания материала при вскрытии емкости в лаборато¬
рии, Если фекалии оформленные, плотные, то в контейнер помещают 3-4 ложечки
(1,5-2 г). Материал, собранный с несвежего белья, анализу не подлежит.В случае отсутствия в лаборатории одноразовой посуды порцию фекалий поме¬
щают в специально подготовленную стерильную емкость.
ітвшЖЙ278 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯТаблица 20-10. Консерванты (транспортные среды), наиболее часто используемые для транс¬
портировки фекалийНазвание консервантаГлицериновая смесьБоратно-буферный растворФосфатная буферная смесь0,9% раствор хлорида натрия0,1% лептонная водаТиогликолиееая среда (среда СКС)Среда Кэри-БлеерДля каких бактерий применяютЭнтеробактерии, кроме иерсиний; предпочтительна для транспор¬
тировки шигелл				ЭнтеробактерииЭнтеробактерииЭнтеробактерии, кампилобактерииКампилобактерииКампилобактерииЭнтеробактерииПри вынужденном удлинении сроков доставки материала в лабораторию
жидкими фекалиями пропитывают полоску промокательной бумаги или другого
гигроскопичного материала и герметично упаковывают в пластиковый пакет для
предотвращения высыхания. На таких полосках холерные вибрионы способны
сохраняться в течение 4-5 нед или более.Взятие ректальных мазков•	Ректальные мазки берзт одноразовыми зондами-тампонами на металличе¬
ском или пластиковом стержне, вмонтированными в сухие стерильные про¬
бирки или пробирки с транспортной средой. Использование многоразовых
петель из алюминия, стали, титана или других нержавеющих материалов,
выдерживающих стерилизацию, допускается только в экстремальных усло¬
виях (реанимационные больные, маленькие дети).•	Больного просят лечь на бок с приведенными к животу ногами и ладонями
развести ягодицы.•	Тампон вводят в задний проход на глубину 4-5 см и, аккуратно вращая его,
собирают материал с крипт ануса.•	Осторожно извлекают тампон и погружают его в консервант или транспорт¬
ную среду. Транспортировка тампона без этих сред не допускается.Для забора материала у больных с обильным водянистым стулом пользуются
резиновым катетером, один конец которого вводят в прямую кишку, а другой опу¬
скают в банку. Жидкие фекалии стекают в сосуд свободно или при легком надавли¬
вании на переднюю брюшную стенку.При обследовании беременных женщин на носительство стрептококка группы В
{Str. agalactiae) материал берут из влагалища и прямой кишки двумя разными
зондами-тампонами. Затем оба тампона могут быть погружены в 1 пробирку с
транспортной федой типа Эймса или Стюарта.Взятый материал переносят во флакон или пробирку с 1% пептонной водой.В сопроводительном документе указывают, для каких исследований направлен
материал в лабораторию. Если цель исследований не указана или указана не кон¬
кретно, в лаборатории будет выполнена совокупность исследований, позволяющая
выделить и идентифицировать только шигеллы, сальмонеллы, энтеропатогенные,
энтеротоксигенные и энтероинвазивные эшерихии.Для исследования на дисбактериоз материал доставляют в лабораторию в тече¬
ние 4 ч при условии забора его в большом объеме и транспортировки при низкой
температуре.Исследование материалаВ лаборатории проводят бактериоскопию мазков (если они не были сделаны в
месте обследования пациента, то их готовят из доставленных проб), посев на пита¬
тельные среды, идентификацию изолятов бактерий по морфологическим, тинкто¬
риальным, культуральным, биохимическим свойствам (а в ряде случаев по анти¬
генной структуре), оценку их чувствительности к антимикробным препаратам.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 279Оценка полученных результатовОбнаружение в фекалиях даже патогенных микроорганизмов не всегда свиде¬
тельствует о наличии заболевания и может быть обусловлено бактерионоситель¬
ством. Поэтому оценка результатов должна проводиться с учетом клинической
картины. Для установления наличия острой кишечной инфекции, обусловленной
условно-патогенными микроорганизмами, необходимо учитывать следующие
критерии:❖	отсутствие специфических признаков заболевания, обусловленного патоген¬
ными микроорганизмами;обнаружение условно-патогенного микроорганизма в фекалиях в титре выше
10' КОЕ/г;❖	повторное обнаружение того же микроорганизма в возрастающей концентра¬
ции;^ исчезновение условно-патогенного микроорганизма из фекалий или сниже¬
ние его титра на фоне проводимого лечения;❖	нарастание титра антител к данному условно-патогенному микроорганизму
более чем в 4 раза при одновременном присутствии его в фекалиях в концен¬
трации выше 10^ КОЕ/г.Вопрос о диагностической ценности исследования микрофлоры толстой кишки
в настоящее время широко дискутируется, а существующие руководства по диагно¬
стике дисбактериоза кишечника нередко содержат противоречивую информацию,
особенно в вопросах сбора и транспортировки материала, техники исследования
и трактовки результатов. Очевидно, что и результаты исследований, полученные
разными лабораториями, могут различаться. Существует множество причин
расхождения результатов, одна из которых — невозможность соблюдения регла¬
ментированных сроков доставки в условиях практического здравоохранения.
Считается, что исследование должно начинаться не позднее 2 ч с момента забора
материала. Нормирование времени доставки материала обусловлено тем, что
вскоре после акта дефекации состав микрофлоры в силу нестандартных условий
может изменяться. При интерпретации результатов, полученных при анализе дли¬
тельно сохранявшихся проб, необходимо учитывать возможность размножения
условно-патогенных микроорганизмов в образце.Для адекватной трактовки цифр, приводимых в ответе, необходимо иметь
представление о точности данного метода. Ответ, выдаваемый лечащему врачу,
не содержит информации о погрешности измерений, что может послужить при¬
чиной как гипердиагностики дисбиотических состояний, так и неправильной
оценки динамики изменений состояния биоценоза кишечника в ходе лечения.
Титрационный посев в полужидкие среды, используемый большинством лабора¬
торий для определения количества бифидобактерий (а часто и лактобактерий) в1	г фекалий, характеризуется невысокой точностью.При использовании традиционного однорядного метода для высева каждого раз¬
ведения доверительный интервал рассчитывается с помощью умножения (верхняя
граница) и деления (нижняя граница) наиболее вероятного числа на коэффициент
14,45. Например, если наиболее вероятное число составляет 10^ КОЕ/г, истинное
количество бифидобактерий находится в интервале от 6,9x10'^ до 1,4x10^*^ КОЕ/г.
Повысить точность метода можно с помощью увеличения числа рядов титрова¬
ния, что применяется в санитарной микробиологии. При этом число рядов титро¬
вания достигает 10, а расчет наиболее вероятного числа осуществляют по таблице
Мак-Креди, разработанной на основании методов вариационной статистики. При
использовании трехрядного метода значение упомянутого коэффициента снижа¬
ется с 14,45 до 4,68. На практике это означает, что исследование, проведенное в
разных лабораториях, или повторное исследование в одной и той же лаборатории
может привести к расхождениям в количестве бифидобактерий или лактобакте¬
280 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯрий, которое могут трактовать как признак динамики патологического процесса.
Для предотвращения подобных ситуаций необходимо иметь представление о точ¬
ности используемого метода, и при наличии расхождений в 1 или даже 2 порядка
рассматривать их как несущественные. При необходимости максимально точного
определения количества бифидо- и лактобактерий можно рекомендовать исполь¬
зование трехрядного метода, что особенно актуально при контроле эффективно¬
сти проводимого лечения. Однако трехрядный метод не может рассматриваться
как рутинный вследствие значительного повышения стоимости исследования и
существенного увеличения трудозатрат. Именно поэтому только согласованная
работа лечащих врачей и врачей-микробиологов позволяет скорректировать так¬
тику исследования и выбор методик в каждом конкретном случае. Сотрудничество
специалистов на различных уровнях лечебного процесса — один из залогов адек¬
ватной трактовки получаемых результатов.Если лаборатория работает только с плотными питательными средами и
анаэробной техникой, необходимо принимать во внимание возможное снижение
титров анаэробных микроорганизмов в силу особенностей использования плотных
питательных сред. Однако ошибка метода в данном случае также уменьшается.В фекалиях здоровых людей идентифицируют, по меньшей мере, 15 групп
микроорганизмов — бифидобактерий, лактобактерий, бактероидов, энтерококков,
фузобактерий, эубактерий, пептострептококков, клостридий, типичных Е. соН,
лактозонегативных Е. соИ, гемолитических £. соИ, других условно-патогенных
энтеробактерий (Klebsiella spp., Enterobacter spp., Hcçfnia spp., Serratia spp., Proteus spp.,
Morganella spp., ^ovidencia spp., Citrobacter spp.), S. aureus, сапрофитного и эпидер¬
мального стафилококков, Candida spp., неферментирующих бактерий (Pseudomonas
spp., Acinetobacter spp.). Приходится констатировать слабость позиций традицион¬
ных представлений о микрофлоре кишечника вследствие неполной информации
о микробиоценозе. Очевидно, что 15 групп микроорганизмов недостаточно для
описания всего многообразия микрофлоры кишечника. Например, количество
метанобразующих архебактерий из рода Methanohrevibacter в фекалиях достига¬
ет 10^ КОЕ/г, что сопоставимо с численностью бифидобактерий и бактероидов.
Нельзя исключить присутствия в составе кишечной микрофлоры и некультиви-
руемых in vitro видов бактерий. Дать исчерпывающую характеристику состава
нормальной микрофлоры кишечника невозможно даже в научных, а тем более
в пракп^ческих лабораториях. Можно надеяться, что по мере расширения круга
научных знаний станет возможно установить конкретные клинические показа¬
ния для определения отдельных групп бактерий. Например, при обследовании
больных с дисбиозами на фоне антибиотикотерапии обязательно выявление ток¬
синов Cl décile. Однако вряд ли имеется необходимость бесконечно расширять
круг определяемых микроорганизмов, поскольку исследование на дисбактериоз
носит прикладной, а не описательный характер. По-видимому, следует уделять
внимание только тем группам бактерий, количество которых в той или иной сте¬
пени влияет на тактику лечения. Такими показательными микроорганизмами для
взрослых являются гемолитические бактерии, условно-патогенные энтеробакте¬
рии, Staphylococcus spp. и Candida spp. У детей в возрасте до 1 года на первый план
выходят Staphylococcus spp. и условно-патогенные энтеробактерии.В существующих руководствах часто избыточной детализации подвергает¬
ся описание Е. coli. Рекомендуется определять общее количество эшерихий,
количество эшерихий с выраженной и со сниженной ферментативной активно¬
стью, количество лактозонегативных, гемолитических, неподвижных эшерихий.
Однако, учитывая тот факт, что получаемые результаты статистически недосто¬
верны, а изучение данных свойств весьма трудоемко, целесообразно объединение
всех критериев, описывающих атипичные свойства Е. coli, в один — «кишечные
палочки со сниженной ферментативной активностью» или «кишечные палочки с
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 281измененными свойствами». Гемолитические £. соИ при этом выносят в отдельную
графу — «гемолитические микроорганизмы».Учить[вая сомнительность разделения бактерий родов Lactococcus и Lactobacillus
только на основании морфологии и трудности идентификации Lactobacillus spp,
из-за слабой выраженности многих тестовых реакций и зависимости их от соста¬
ва питательной среды и условий культивирования, целесообразно объединение
критериев «молочнокислые палочки» и «молочнокислый стрептококк» в один —
«лактобактерии».Подобные разночтения весьма несущественны, однако их следует принимать во
внимание, трактуя результаты, полученные при исследовании на дисбактериоз, в
разных лабораториях.Рвотные массы и промывные водыПоказания к взятию и исследованию проб: подозрение на пищевые отравления,
холеру, сальмонеллез.Взятие исследуемого мапгериала•	Рвотные массы отбирают в количестве 50-100 мл (если это невозможно, то в
меньшем количестве), промывные воды — в объеме 100-200 мл.•	Материал должен быть доставлен в лабораторию в кратчайшие сроки.•	После рвоты больному дают прополоскать рот теплой водой, тяжелым или
ослабленным больным очищают полость рта ватным тампоном, смоченным
водой или слабым раствором гидрокарбоната натрия или перманганата
калия.Исследование материалаПроводят теми же методами, что и фекалий.Оценка диагностической значимости полученных результатовПри расследовании пищевых отравлений параллельно с исследованием рвот¬
ных масс исследуют остатки пищевых продуктов. Окончательное заключение
делают на основании сопоставления пол)?ченных результатов.Аутопсированный материалПоказания к взятию и исследованию проб; исключение бактериальных инфек¬
ций как возможных причин смерти.Взятие исследуемого материалаМатериал для бактериологического исследования необходимо забирать в тече¬
ние 12 ч после смерти больного, достоверность исследований материала, полу¬
ченного позже 24 ч, резко снижается. Для взятия проб целесообразно привлекать
врачей-бактериологов. Выбор исследуемого материала зависит от предполагаемо¬
го диагноза (табл. 20-11).Таблица 20-11. Объекты для исследования при подозрении на смерть от бактериальных заболе¬
ванийЗаболеваниеОбъв1сг исследованияАнтона Плаута-ВенсанаПленки и отделяемое с пораженных участков слизистых оболочек (зева, носа,
полоеых органов, глаз) и кожи, кровьБруцеллезКровь, моча, внутренние органы (печень, селезенка), мокрота, гной, экссудат из
пораженных тканей и органов, молочнью железы (у женщин)Брюшной тиф
ПаратифыКровь из сердца, желчь, внутренние органы (печень, селезенка, легкие, почки,
головной мозг), мезентериальные лимфатические узлы, содержимое толстой и
тонкой кишкиВозвратный тифКровь, внутренние органы (селезенка, печень, головной мозг), СМЖ, моча
282 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯПродолжение табл. 20-11Ш.ЗаболеваниеОбъект исследованияГазовая гангренаКусочки ткани из области ран и пораженных тканей и органов, перитонеальная
жидкость, секрет шейки матки, кровь, внутренние органы, а также инородные
тела в случае их обнаруженияГемофильная инфекцияСлизь носоглотки, мокрота, кровь, гной, моча. СМЖ, внутренние органы (лег¬
кие). плевральный экссудатГнойно-септические
инфекции (инфек¬
ции, вызванные
Staphylococcus spp.,
Streptococcus spp.,
P. aeruginosa]Гной, экссудат, кровь, участки пораженных тканей и органов, соскобы со слизи¬
стой оболочки зева, региональные лимфатические узлыГонококковая инфекцияОтделяемое уретры, внутренние органы (прямая кишка), экссудат суставов и
брюшиныВнутренние органы (предстательная железа) (у мужчин), внутренние органы
(влагалище, шейка матки, придатки матки) (у женщин)ДизентерияСодержимое нижних отделов толстой кишки, кровь, моча, внутренние, мезенте¬
риальные лимфатические узлыДифтерияПленки и отделяемое с пораженных участков слизистых оболочек (зева, носа,
половых органов, глаз), кожи, кровьКлебсиеллезная инфек¬
цияСлизь носоглотки, мокрота, кровь, гной, моча, СМЖ, внутренние органы (лег¬
кие), плевральный экссудатКоклюшСлизь носоглотки, внутренние органы (легкие)ЛептоспирозКровь, внутренние органы (селезенка: печень, головной мозг), СМЖ, мочаЛистериозКровь, внутренние органы (селезенка, печень, мозг)МенингококковаяинфекцияСМЖ, мозговые оболочки, кровь, слизь из зева, тканевая жидкость, гнойОрнитозВнутренние органы (кусочки легких из пневмонических очагов, селезенка), плев¬
ральный экссудатПневмококковаяинфекцияСлизь носоглотки, мокрота, кровЬ: гной, моча, СМЖ, внутренние органы (лег¬
кие), плевральный экссудатСалКусочки кожи и слизистой оболочки в изъязвленных участках, лимфатические
узлы, кусочки мышечной ткани в области абсцессов, внутренние органы, кровьСибирская язваПораженные участки кожи и других тканей, лимфатические узлы, кровь, СМЖ,
костный мозг, экссудат, внутренние органыСифилисОтделяемое слизистых оболочек, кусочки тканей в области поражения, кровь,
СМЖ, внутренние органыСтолбнякГной, кусочки ткани из пораженных областей, старых рубцов, кровь, внутренние
органы (печень, селезенка), инородные тела в виде кусочков орудия травмыСылной тифКровь, кусочки кожи с элементами сыпи, внутренние органыПищевые токсикоин¬
фекции, вызванные
Е. callСодержимое тонкой кишки, кровь из сердца, внутренние органы (печень, селе¬
зенка, легкие, почки), мезентериальные лимфатические узлыПищевые токсикоин¬
фекции, вызванные
Salmor)ella spp.Кровь из сердца, внутренние органы (печень, селезенка, легкие, почки), содер¬
жимое желудка и тонкой кишки, мезентериальные лимфатические узлыПищевые токсикоин¬
фекции, вызванные
Proteus spp.Содержимое тонкой и толстой кишкиПищевые токсикоин¬
фекции, вызванные
Staphylococcus spp.Содержимое тонкой и толстой кишкиПищевые токсикоин¬
фекции, вызванные
CI. perfringensСодержимое тонкой кишки (200-300 мл), перитонеальная жидкость, внутренние
органы (печень), мезентериальные лимфатические узлы, кровь из сердцаПищевые токсикоин¬
фекции, вызванные
CI. botulinumКровь, внутренние органы (печень, отрезки тонкой кишки, желудок с содержи¬
мым, головной мозг)
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 283
Окончание табл. 20-11ЗаболеваниеОбьект исследованияТуберкулезМокрота, мазки из гортани, кусочки легких и других внутренних органов (в зави¬
симости^	ТуляремияСлизь зева, мокрота, кровь, кусочки пораженной кожи, СМЖ, лимфатические
узлы (бубоны), костный мозг, внутренние органы (селезенка, печень, легкие)ХолераВнутренние органы (3 отрезка тонкой кишки, желчный пузырь, печень, селезен-
ка), лимфатические узлы	Трупную кровь берут из сердца до извлечения головного мозга. Пробы крови
получают из желудочка сердца. Выбранный участок дезинфицируют, протирая
стерильной салфеткой, смоченной 3% раствором перекиси водорода. Антисептик
удаляют стерильной салфеткой, смоченной 0,9% раствором хлорида натрия, или
с помощью прижигания ткани шпателем. Затем стерильным шприцем аспирируют
не менее 10 мл крови, которую немедленно засевают на питательные среды, как
было описано выше. Если в полости сердца кровь свернулась или отсутствует, ее
берут с соблюдением тех же условий из полой, бедренной или яремной вены.Изъятие проб внутренних органов проводят после прижигания их поверхности
раскаленным шпателем. Кусочки легких, печени, головного мозга и других органов
вырезают размером 1x1x2 см (3-5 см^). Кусочки головного мозга следует вырезать
до извлечения его из полости черепа. Кусочки легких вырезают из прикорневой
области и из середины каждой доли (не сяедует брать кусочки из гипостатических
участков). Кусочки печени вырезают из каждой доли. Желчный пузырь изымают
целиком с содержимым после наложения лигатур. Для исследования содержимого
кишечника берут 2-3 отрезка тонкой кишки длиной 15-20 см между предвари¬
тельно наложенными двойными лигатурами. Гной из вскрытых полостей, СМЖ
и другие жидкости отбирают и транспортируют, как описано в соответствующих
разделах.Исследование материалаИз взятых проб в первую очередь изготавливают мазки и мазки-отпечатки.
Их высушивают на воздухе. Мазки фиксируют в пламени спиртовки, если пред¬
полагаемый метод исследования не предполагает другого. При необходимости
бактериоскопический анализ дополняют посевом проб на питательные среды с
последующей изоляцией и идентификацией бактерий.ПРИНЦИПЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙИдентификация выделенной чистой культуры бактерий в лабораториях, как
правило, предполагает ее видовую идентификацию. Для решения эпидемио¬
логических вопросов необходимо проведение внутривидового типирования. В
настоящее время для этого обычно используют серотипирование, фаготипирова-
ние, хемотипирование и генотипирование. Однако в некоторых случаях вполне
достаточно определения рода микроорганизмов или их принадлежности к опреде¬
ленной группе. Для доказательства этиологической роли выделенного микроорга¬
низма в отдельных случаях также требуется постановка дополнительных тестов.
Например, при обнаружении С. diphtheriae, необходимо дополнительно опреде¬
лить токсигенность выделенного штамма.Основное условие правильной идентификации бактерий, независимо от исполь¬
зуемого метода, — наличие чистой культуры. Именно поэтому отколу колонии и
последующей макро- и микроскопической проверке чистоты культуры необходи¬
мо уделять особое внимание. Следует избегать откола сразу нескольких колоний
даже при их кажущейся однотипности. Рекомендуется использовать одноразовую
стерильную бактериологическую петлю с маленькой головкой. Если пользуются
многоразовыми металлическими бактериологическими петлями или иглами, то их
284 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯрекомендуется охлаждать после прожигания в пламени прикосновением к пита¬
тельной среде в зоне, где нет признаков роста.В отдельных случаях даже откол отдельно лежащей колонии не гарантирует
получения чистой культуры. Например, колонии слизеобразующих бактерий
могут содержать клетки других микроорганизмов, захваченные вместе со сли¬
зью. Культуры актиномицетов и представителей Bacillus spp. могут содержать
контаминанты в пространствах между цепочками клеток. При раннем отборе
колоний с селективной питательной среды загрязнение может быть обусловле¬
но захватом контаминантов, находящихся в подавленном, но жизнеспособном
состоянии. Даже на неселективных питательных средах откол колонии не сле¬
дует проводить слишком рано из-за возможного наличия медленно растущих
микроорганизмов.Работа по идентификации бактерий начинается до вьщеления чистой культу¬
ры с изучения культуральных свойств — характера роста микроорганизмов на
питательной среде. Культуральные свойства бактерий, выращенных на плотной
питательной феде, включают форму и размер колоний, наличие пигмента, спо¬
собность к росту при определенной температуре и концентрации углекислого газа
и кислорода на среде определенного состава. Помимо культуральных свойств, до
выделения чистой культуры иногда определяют морфологические и тинкториаль¬
ные свойства (например, с помощью микроскопии мазка из колонии, окрашенного
по Граму), некоторые биохимические свойства (например, наличие оксид азы и
каталазы), антигенные свойства (например, с помощью РА или РИФ) и некото¬
рые другие признаки. В отдельных случаях этого бывает достаточно для выдачи
предварительного ответа о виде обнаруженного микроорганизма, но чаще всего
изучение указанных признаков позволяет только наметить путь дальнейших
исследований, которые выполняют с чистой культурой.Решающее значение при идентификации большинства видов бактерий имеет
изучение их ферментативной активности. В классическом варианте с этой целью
пользуются набором дифференциально-диагностических сред. Однако в послед¬
ние годы все чаще для идентификации бактерий применяют коммерческие тест-
системы, обеспечивающие высокую точность исследований и сокращение времени
на получение результата.Существует несколько подходов к идентификации бактерий. Традиционный,
сложившийся еще в начале века способ предусматривал постепенное приближение
к ответ}'^ по ветвям дихотомического информационного дерева.При таком подходе применяется ограниченное количество пробирочных
(чашечных) тестов. Одними и теми же тестами можно пользоваться неоднократно
на разных ветвях информационного дерева. Очень важным при таком подходе
оказывается ранжирование тестов по их значимости и выбор ключевых тестов.
Это связано со следующими обстоятельствами:❖	изучаемый признак должен встречаться (или отсутствовать) у всех штаммов
данного вида, т.е. в 100% случаев, в противном случае атипичные по данному
признаку штаммы никогда не будут правильно идентифицированы;❖	воспроизводимость всех тестов должна приближаться к 100%.Вторая система идентификации, построенная на принципах нумерической
(числовой) таксономии, получила широкое распространение в связи с развити¬
ем вычислительной техники, а также разработки коммерческих тест-систем, что
позволило реализовать эту систему на уровне диагностических лабораторий.Нумерическая таксономия базируется на следующих принципах:❖	необходимо изучить максимально возможное количество признаков (в совре¬
менных коммерческих тест-системах их число может достигать 25-30);-о- все изучаемые признаки имеют равное диагностическое значение;
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 285❖	результат идентификации выглядит как коэффициент соответствия свойств
выделенной культуры свойствам эталонных штаммов.Характеристика некоторых тест-систем для биохимической идентификации
бактерий представлена в табл. 20-12.Таблица 20-12. Системы биохимической идентификации бактерийИдентифицмруемыемикроорганизмыТест-системаКоличествотестовВремя
инкуба¬
ции, чФирма-производитель12345ЭнтеробактерииПБДЭ2018-24НПО «Диагностические систе¬
мы», Нижний НовгородММТ Е-1.ММТ Е-224 (12+12)24НПО «Аллерген», СтавропольEnterotube II1518-24Becton Dickinson, СШАMicro-ID154Organon Teknika, СШАAPI Rapid 20E214BioMerieux, ФранцияЭНТЕРО-тест 1 и 22418-24Lachema, ЧехияЭнтеробактерииНГОБ’API 20Е2124-48BioMerieux, ФранцияGN-IDENT294-13BioMerieux, ФранцияCrystal E/NFЗО18-20Becton Dickinson, СШАНГОБ'НЕФЕРМ-тест1248Lachema. ЧехияAPI NFT2024^8BioMerieux, ФранцияRapID NF Plus174Innovative Diagnostic Systems,
СШАГрамотрицательныебактерииCrystal Rapid Stool/
EntericЗО1&-20Becton Dickinson, СШАOxi/Ferm924-48Becton Dickinson, СШАNEG ID Type 23415-42Baxter Diagnostics, СШАRapid NEG ID 2362Baxter Diagnostics, СШААнаэробыАНАЭРО-тест1248Lachema, ЧехияAN-IDENT284“BioMerieux, ФранцияAPI 20A2124BioMerieux, ФранцияRapID ANA II184-6-Innovative Diagnostic Systems.
СШАRapid Anaerobe244"Baxter Diagnostics, СШАStreptococcus spp. и
Enterococcus spp.СТРЕПТО-тест1224Lachema, ЧехияAPI 20 Strep204-24BioMerieux, ФранцияStaphyiococcus spp.
и Micrococcus spp.ПБДС2024НПО «Диагностические систе¬
мы», Нижний НовгородСТАФИ-тест824Lachema, ЧехияAPI Staph-IDENT105BioMerieux, ФранцияAPI Staph2024BioMerieux, ФранцияNeisseria spp. и
Moraxella spp.НЕЙССЕРИЯ-тест824Lachema, ЧехияNeisseria Enzyme Test30,5Carr-Scarborough, СШАQuadFERM +42BioMerieux, ФранцияNeisseria spp. и
Haemophilus spp.NH-IDENT154BioMerieux, ФранцияRapID NH134(1)-Innovative Diagnostic Systems,
СШАГрамположительные
кокки и листерииPos ID2718^8Baxter Diagnostics, СШАКоринебактерииAPI Coryne2024BioMerieux, Франция* НГОБ - неферментирующие грамотрицательные бактерии.
*■ Инкубация е аэробных условиях.Для N. gonorrhoeae.
>>
< <286 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯСуществует два основных типа таких систем.Наиболее широкое распространение получили индивидуальные системы, рас¬
считанные на идентификацию одной культуры. К ним относятся отечествен¬
ные тест-системы ПБДЭ, ПБДС производства НПО «Диагностические системы»
(Нижний Новгород), семейство систем API производства фирмы BioMerieux
(Франция) и многие другие.Второй тип систем идентификации основан на использовании многорядных
планшетов, в которых каждый ряд лунок позволяет идентифицировать одну
культуру. Как правило, используют стандартные 96-луночные полистироловые
планшеты, аналогичные тем, какие применяются в ИФА. К системам данного
типа относятся наиболее широко распространенные в нашей стране тест-системы
фирмы Lachema (Чехия), а также идентификационные наборы ММТ Е производ¬
ства НПО «Аллерген» (Ставрополь).Идентификация выделенной культуры состоит из следующих этапов:
приготовления суспензии и инокуляции лунок;
инкубации;учета результатов тестов;❖	оценки результатов.Для приготовления суспензии, как правило, используют стерильный 0,9%
раствор хлорида натрия, однако в некоторых случаях необходимо использовать
специальные буферы или инокуляционные среды, входящие в состав набора.
Концентрацию микроорганизмов в суспензии определяют по оптическому стан¬
дарту м5^ности. Неправильное приготовление суспензии (слишком высокая или
низкая концентрация микроорганизмов, использование старой культуры) может
привести к некорректному срабатыванию системы.В зависимости от конструктивных особенностей диагностического набора для
инокуляции могут быть использованы градуированные пипетки, микродозаторы,
пастеровские пипетки. В некоторых тест-системах инокуляция осуществляется
методом погружения или при помощи специального инокулирующего стержня.
Инкубацию тест-систем проводят в обычных термостатах или в специальных тер-
мостатирз'^емых устройствах, входящих в комплект некоторых автоматизирован¬
ных систем идентификации. При идентификации анаэробных микроорганизмов
обычно требуется создание бескислородной атмосферы, однако некоторые тест-
системы, основанные на выявлении предсинтезированных ферментов, инкубиру¬
ют в аэробных условиях. Температура и время инкубации, указанные в инструкции
фирмы-изготовителя, должны выдерживаться максимально точно. Несоблюдение
этих параметров — одна из наиболее частых причин неправильной идентифика¬
ции культуры.Учет результатов осуществляют визуально или с помощью специальных считы¬
вающих устройств — «ридеров». Их использование позволяет избежать субъек¬
тивизма при оценке реакции и в итоге повышает достоверность идентификации.
В некоторых случаях (реакция Фогеса-Проскауэра, тесты на нитратредуктазу,
фосфатазу, индол) перед учетом результата теста в лунку необходимо добавить
специальные проявляющие реактивы. При этом необходимо использовать только
реактивы, входящие в состав диагностического набора.После учета всех тестов производится кодирование результатов, В простейшем
случае каждый положительный признак обозначают знаком «+s>, а отрицатель¬
ный — знаком «-». Такое кодирование без использования компьютера делает
заключительный этап идентификации весьма продолжительным и трудоемким.
В современных системах идентификации для определения «профиля» (кода)
культуры используемые тесты разбивают на триады. Положительный результат
каждого из тестов, входящих в триаду, оценивается как 2", где п = 2, 1 или О, т.е.
положительный результат первого теста в триаде кодируется цифрой 4 (2^), вто-
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 287poro — цифрой 2 (2^), третьего — цифрой 1 (2”). Отрицательный результат теста
всегда обозначается цифрой 0. При сложении результатов тестов в триаде получа¬
ют значение от О (все тесты в триаде отрицательны) до 7 (все тесты в триаде поло¬
жительны). Каждая триада дает одну цифру «профиля» (табл. 20-13). Полученный
«профиль» может быть использован для последующей компьютерной обработки
или для ручной идентификации с помощью кодовой книги.Таблица 20-13. Профиль культурыСТАФИ-тестГЛИСАХТРЕМАНАЦФРезультаты тестаЦифровые значенияПрофиль	 637 ^ S, epidermidis	ГЛИ - глицерин, САХ — сахароза, ТРЕ - трегалоза, МАН - манит, У — уреаза, АЦ
Ф — фосфатаза. Н - нитраты, К - каталаза.Производители тест-систем для биохимической идентификации микроорга¬
низмов, как правило, разрабатывают и специальное программное обеспечение
для компьютерной обработки результатов. Основу таких программ составляет
база данных, содержащая частотную матрицу признаков для идентифицируе¬
мых микроорганизмов. Фирменные программы можно применять только с той
тест-системой, для которой они разработаны. Однако существуют различные
программы-оболочки, позволяющие пользователю самостоятельно вносить
частотные характеристики признаков. Примером может служить бесплатно рас¬
пространяемая программа IdBact 1.1, которая доступна на сервере Каролинского
университета (Швеция) по адресу http://www.ki.se/labraed/clim.ИНДИКАЦИЯ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙВыявление в клиническом материале антигенов бактерий являются одним из
основных способов диагностики инфекционных болезней, а обнаружение специ¬
фических антигенов у изолятов микроорганизмов позволяет идентифицировать
их на родовом, видовом и серотиповом уровнях. Для рещения этих задач применя¬
ют разнообразные тесты. В современной лабораторной практике наиболее широ¬
кое применение из них получили иммунофлюоресцентный, иммуноферментный
и иммунохроматографический анализы, а также различные варианты реакции
агглютинации.ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗПринцип метода основан на использовании антител, конъюгированных с флюо¬
ресцентным красителем (в отечественной практике чаще всего — флюоресцеин
изотиоцианатом). Учет результатов реакции осуществляют визуально, с помощью
люминесцентного микроскопа или специальных приборов — флюориметров.
Варианты метода при учете результатов с помощью люминесцентного микроскопа
в различных модификациях под разными названиями — реакция иммунофлюорес¬
ценции (РИФ), прямой иммунофлюоресцентный анализ (ПИФ), метод флюорес¬
центного анализа (МФА) — широко применяются в клинической микробиологии.Популярность РИФ объясняется экономичностью, производством широкого
спектра диагностических наборов и быстротой получения ответа. В данном тесте
применяют как поликлональные сыворотки, так и моноклональные антитела.
Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патоло¬
гическом материале. Б этом случае из тестируемого материала готовят мазок на
предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют мети¬■ацстоин,
288БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯШШ
'ШЩй?ловым спиртом, ацетоном или другим химическим реагентом, иногда входящим в
состав диагностического набора. На поверхность фиксированного мазка наносят
меченные флюоресцеин изотиоцианатом сыворотки или моноклональные анти¬
тела. При непрямой РИФ препарат сначала обрабатывают сывороткой против
искомого антигена, а затем мечеными антителами к иммуноглобулинам, исполь¬
зованным на первом этапе теста. Поскольку непрямая РИФ — разновидность гете¬
рогенного анализа, один этап реакции отделяют от другого промыванием. Если
прямая РИФ применима для обнаружения антигенов, то непрямая РИФ — как для
обнаружения антигенов, так и для серологической диагностики инфекций (напри¬
мер, сифилиса).Основной недостаток РИФ — субъективность.Классические критерии специфичности РИФ:о-	характерная морфология, размеры и расположение возбудителя в мазке;
периферический характер свечения объекта;
цвет флюоресценции;
интенсивность флюоресценции.При исследовании крупных объектов (например, трихомонад и гарднерелл)
данные критерии позволяют получить достоверный результат. Однако элемен¬
тарные тельца хламидий и микоплазмы имеют размеры, находящиеся на пределе
разрешающей способности люминесцентного микроскопа. При этом оценка мор¬
фологии микроорганизмов затруднена, а свечение теряет периферический харак¬
тер. Остающихся критериев явно недостаточно для уверенной идентификации
наблюдаемого микроорганизма. Именно поэтому субъективный характер учета
реакции предъявляет особые требования к квалификации проводящего исследова¬
ния медицинского персонала.Альтернатива субъективному визуальному методу учета результатов — аппарат-
ный метод учета.ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗИммуноферментный анализ (ИФА) — одно из наиболее бурно развивающихся
направлений прикладной иммунологии, В основе данного метода лежит присоеди¬
нение к антителам ферментной метки, что позволяет учитывать результат реакции
антиген-антитело по появлению ферментативной активности или изменению ее
уровня.Предложены десятки вариантов реакций, основанных на данном принципе,
однако наиболее широкое распространение в диагностике инфекционных заболе¬
ваний получил твердофазный гетерогенный ИФА. Чаще всего для его осуществле¬
ния применяют 96-луночные полистироловые планшеты, так как на полистироле
можно легко адсорбировать антитела, а с помошью специальной обработки — и
различные антигены.При использовании ИФА для поиска антигена на стенках лунок адсорбиру¬
ют соответствующие антитела. Исследуемый материал вносят в лунку, при этом
антиген, взаимодействз^я с антителами, фиксируется в ней. Лунки тщательно про¬
мывают буферным раствором для удаления неадсорбировавшихся веществ. Затем
в лунки вносят антитела против искомого антигена, меченные ферментом. Чаще
всего в качестве фермента-метки используют пероксидазу хрена. После инкуба¬
ции лунку снова промывают, чтобы удалить избыток меченых антител, если они
не удерживаются комплексом антиген-антитело, образовавшимся на предыдущем
этапе. На заключительном этапе в лунки вносят хромогенный субстрат (напри¬
мер, о-фенилендиамин). Ферментативное расщепление субстрата приводит к
образованию окрашенных продуктов реакции. Таким образом, изменение окраски
содержимого лунки свидетельствует о положительном результате (произошло
взаимодействие антигена и антитела).
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 289При серологической диагностике используют полистироловые планшеты, на
стенки лунок которых заранее с помощью тех или иных методов адсорбируют
антиген. Для предотвращения неспецифического связывания антител с полисти¬
ролом оставшаяся свободной поверхность полистирола подвергается специальной
обработке. Исследуемую сыворотку вносят в лунку планшета. При этом гомоло¬
гичные антигену антитела прикрепляются к нему. Неприкрепившиеся антитела
удаляют промыванием. Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов
человека, меченные ферментом. Если в исследуемой сыворотке присутствовали
искомые антитела, то на данном этапе они выступают в роли антигенов, с кото¬
рыми реагируют меченые антитела. Добавление после промывки хромогенного
субстрата позволяет провести учет реакции по развивающемуся окрашиванию в
лунках.Несомненное преимущество ИФА перед классическими иммунологически¬
ми реакциями (РА, РСК, РНГА) — возможность количественного анализа без
использования метода серийных разведений. Интенсивность окраски в лунке
пропорциональна количеству фермента и, следовательно, количеству искомого
ингредиента (антигена или антител). Измеряя оптическую плотность жидкости
в лунке и сравнивая ее с контролем, можно определить концентрацию искомого
компонента. В этом случае для учета результатов применяют специальные прибо¬
ры («ридеры»), представляющие собой спектрофотометры с вертикальным ходом
луча, специально приспособленные для работы со стандартными полистиролевы¬
ми планшетами.Планшеты с «нагрз^женными» на их поверхность антигенами или антителами
служат основой коммерческих диагностических наборов для ИФА. 96-луночные
панели получили очень широкое распространение. Для работы в данном формате
разработаны специальные многоканальные автоматические пипетки, позволяю¬
щие вносить реактивы одновременно в несколько лунок панели, а также автома¬
тические и полуавтоматические устройства для промывания лунок. Существуют и
специальные автоматы, позволяющие осуществить все этапы анализа практически
без участия человека.Использование 96-луночных планшетов экономически целесообразно при про¬
ведении массовых исследований в крупных иммунологических лабораториях. При
единичных исследованиях такой формат невыгоден, поскольку проведение тестов
в отдельных лунках планшета не позволяет использовать многоканальные пипет¬
ки, промывающие устройства и другие приспособления, облегчающие проведение
анализа. Разведенные реагенты имеют ограниченный срок годности, поэтому все
более широкое распространение получили планшеты, состоящие из стрипов —
полосок по 8 или 12 лунок, собираемых в формат 96-луночного планшета в про¬
извольном порядке. При этом можно задействовать только часть из 96 позиций и
параллельно выявлять различные антигены (антитела).Указанных недостатков лишена разновидность ИФА, получившая название
йо1-ЕиЗА. При этом варианте антигены, необходимые для выявления антител
в плазме крови больного, адсорбированы не в лунках, а на зубцах пластиковой
гребенки. Для проведения исследования необходимо отломить необходимое
количество зубцов, а тестируемые сыворотки внести в первый ряд лунок специ¬
альной панели, входящей в состав диагностического набора. Изначально лунки
панели, содержащие все необходимые компоненты в готовом к употреблению
виде, герметично закрыты фольгой, прокалывая фольгу и последовательно пере¬
нося гребенку из одного ряда лунок в другой, выполняют все этапы реакции. С
помощью описываемой системы удается провести ИФА даже вне лаборатории при
отсутствии высококвалифицированного персонала и дорогостоящего оборудова¬
ния. Продолжительность исследования составляет от 45 мин до 1,5 ч. Учет резуль¬
татов возможен без применения специальных приборов с помощью прилагаемой
Щщф290БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯК набору цветной шкалы-компаратора. Еще одно несомненное достоинство опи¬
сываемого диагностического набора — наличие системы внутреннего контроля.
Тест-системы ImmunoCorab — быстрые и простые тесты для диагностики многих
инфекционных болезней, в том числе хламидиоза и хеликобактериоза.Наиболее полно возможности ИФА раскрываются при использовании для его
постановки моноклональных антител. Это позволяет достигать высокой чувстви¬
тельности в сочетании с исключительной специфичностью по сравнению с други¬
ми серологическими реакциями.Еще одно достоинство ИФА при серологической диагностике — возможность
определения классов специфических антител (IgG, IgM, IgA), что имеет значение
при определении фазы инфекционного процесса и его остроты.ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗИммунохроматографию также можно отнести к группе реакций с мечеными
антителами. При этом в качестве метки используют окрашенный латекс или части¬
цы коллоидного золота. В реакции применяют антитела к выявляемому антигену,
адсорбированные на микрочастицах, и антитела к тому же антигену, иммобилизо¬
ванные в виде полосы на хроматографической бумаге. В данной реакции существу¬
ет внутренний контроль (антивидовые антитела, закрепленные в виде полосы на
хроматографической бумаге).Иммунохроматография может использоваться как для экспресс-индикации
антигенов в пробе, так и для идентификации выделенных чистых культур.На рынке имеется значительный ассортимент хроматографических систем как
отечественного, так и импортного производства, позволяющих диагностировать
большое количество бактериальных болезней, в том числе гонорею, хеликобакте-
риоз, стрептококкозы.Тест-системы, основанные на иммунохроматографическом принципе, обладают
высокой специфичностью, позволяют получить результат в течение 5-10 мин и
могут быть использованы не только в лабораториях, но и при первичном обсле¬
довании пациента. Поэтому их основное назначение — скрининг. Однако чувстви¬
тельность ряда таких тестов недостаточно высока, чтобы обеспечить выявление
всех инфицированных определенным возбудителем пациентов без применения
дополнительных методов лабораторной диагностики.РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИРазличные варианты реакции агглютинации (РГА) широко применяются в
лабораторной практике благодаря простоте постановки и учета результатов реак¬
ции, возможности получения последних в течение короткого времени (от 30 с
до нескольких минут), отсутствию необходимости в применении какой-либо аппа¬
ратуры.Наиболее часто РГА проводят на предметном стекле, смешивая небольшие
объемы тестируемого материала и содержащего специфические антитела реагента.
После их перемешивания смесь становится мутной и остается такой при отсутствии
в пробе антигенов, реагирующих со специфическими антителами. Положительная
реакция проявляется выпадением агглютинатов на фоне просветления смеси. Учет
результатов теста проводят невооруженным глазом или с помощью лупы.РГА пользуются для выявления антигенов возбудителей чумы, бруцеллеза,
холеры, коклюша, клостридиозов, менингококкового менингита, иерсиниозов и
ряда других болезней. Данный тест остается «золотым стандартом» серотипирова-
ния энтеробактерий. Особенно сложна и важна пробема серотипирования сальмо¬
нелл, поскольку в настоящее время число известных серотипов подвида Enteritidis
превысило 2,5 тыс. Определение антигенной формулы изолята сальмонелл в реак¬
ции агглютинации предоставляет обширную информацию как для клиницистов.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 291так и для эпидемиологов, поскольку позволяет судить не только об опасности для
пациента выделенного возбудителя, но и установить потенциально возможные
источники инфекции и проследить всю эпидемиологическую цепочку. Благодаря
этому, появляется возможность прерывания последней, что предотвращает воз¬
никновение новых вспышек сальмонеллеза. Для серотипирования S. enteritidis по
схеме Кауфмана-Уайта применяют диагностические наборы, в состав которых
входят сыворотки, полученные от иммунизированных кроликов. Для устранения
неспецифической реактивности сыворотки сорбируют гетерогенными культурами
сальмонелл. Такая технология эффективна, но не лишена недостатков (невозмож¬
ность получения специфических антисывороток к ряду антигенов, достаточно
высокий уровень перекрестной реактивности с гетерогенными антигенами ряда
сорбированных сывороток и др.). Поэтому наряду с гипериммунными сорбиро¬
ванными сыворотками в настоящее время применяют моноклональные антитела,
специфичность и авидность которых значительно выше.Часто в лабораториях пользуются одним из вариантов реакции агглютинации-
реакцией латексагглютинации. Его впервые использовали в 1956 г. для диагности¬
ки ревматоидного артрита, а сейчас отечественные и зарубежные фирмы выпу¬
скают наборы реагентов для диагностики в реакции латексагглютинации свыше
100 инфекционных болезней. Принцип метода такой же, как и других вариантов
реакции агглютинации. При использовании данного теста для обнаружения анти¬
генов микроорганизмов применяют латексные частицы, покрытые специфически¬
ми антителами. Чтобы легче было учитывать результаты теста без применения
автоматической аппаратуры, частицы латекса должны иметь достаточно большой
диаметр. В противном случае пользуются латексными частицами, окрашенными
обычными или флюоресцирующими красителями.МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНДИКАЦИЯ БАКТЕРИЙВ клинической лабораторной диагностике инфекционных болезней все шире
применяют молекулярно-генетические методы, основанные на выявлении фраг¬
ментов генома микроорганизмов.Наибольшее распространение получили методы амплификации н^тслеиновых
кислот, в число которых входит и ПЦР. Разработаны многочисленные варианты и
форматы постановки ПЦР, позволяющие добиться оптимального результата при
решении различных диагностических задач. В условиях клинической диагности¬
ческой лаборатории для проведения ПЦР применяют диагностические наборы
коммерческих фирм, которые включают необходимые реагенты и растворы для
проведения всех этапов ПЦР в зависимости от ее разновидности и формата.Существуют следующие разновидности ПЦР:❖	ПЦР с «горячим» стартом;❖	мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР;
гнездовая ПЦР;❖	ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР);❖	ПЦР в режиме реального времени.ПЦР в режиме реального времени проводят в следующих форматах:❖	с применением интеркалирующих флюоресцентных красителей;❖	с использованием меченных флюоресцентными красителями олигонуклео-
тидных зондов, комплементарных участку ампликона (гибридизационно-
флюоресцентная детекция).Формат исследования может быть качественным или количественным.ПЦР в режиме реального времени позволяет использовать одновременно
несколько зондов, меченных разными флюоресцентными красителями. Данный
вариант ПЦР в режиме реального времени получил название мультиплексного.
292БАКТЕРИОЛОГИНЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯПри этом возможна одновременная детекция нескольких продуктов ПЦР в одной
пробе. Например, в пробе фекалий пациента с клиническими проявлениями остро¬
го кишечного заболевания возможно выявление ДНК разнообразных возбудите¬
лей (набор АмплиСенс ОКИ обеспечивает идентификацию шигелл, сальмонелл,
кампилобактерий, ротавирусов группы А, норовирусов генотипа 2, астровирусов и
аденовирусов группы Р).Внедрение в повседневную практику клинико-диагностических лаборато¬
рий молекулярно-генетических методов исследования позволяет проводить
экспресс-диагностику инфекционных заболеваний и, в некоторых случаях, диф¬
ференциальную диагностику и контроль эффективности проводимого лечения.
Высокая чувствительность и относительная простота исполнения позволяет
широко использовать методы амплификации нуклеиновых кислот микроорга¬
низмов 1-1У групп патогенности в клинической микробиологии для решения
различных задач:<> как метод экспресс-диагностики при исследовании биологического материа¬
ла, взятого от человека, с целью выявления ДНК (РНК) микроорганизмов1-1У групп патогенности и их количественной оценки;❖	как метод специфической индикации патогенньпс биологических агентов в
объектах окружающей среды и пищевых продуктах;❖	как ускоренный предварительный тест при выполнении культурального и
биологического методов исследования и для идентификации чистой культу¬
ры;❖	для определения эпидемиологической значимости изолятов на основании
выявления генетических маркеров вирулентности и патогенности, а также
маркеров устойчивости к антимикробным препаратам;для таксономической характеристики штаммов на основании выявления
специфических видовых, родовых и других маркеров;❖	для генотипирования штаммов с целью определения их происхождения;❖	для прогнозирования течения инфекционного заболевания и оценки эффек¬
тивности проводимого лечения.По результатам качественного или количественного анализа вьщают ответ
о наличии в пробе специфических фрагментов ДНК или РНК, гомологичных
определенному участку генома возбудителя инфекционного заболевания, а также
о присутствии в пробах генетических маркеров или генетически модифицирован¬
ных ДНК.Для некоторых бактерий использование традиционных культуральных методов
диагностики проблематично в силу различных причин;о чувствительности к условиям забора и транспортировки клинического мате¬
риала;❖	необходимости дополнительных специальных факторов роста;
медленного роста на питательных средах.Идентификация микроорганизмов традиционными методами (как правило, с
использованием различных биохимических тестов) может приводить к получению
ошибочных данных вследствие недостаточной стандартизации условий тестирова¬
ния и субъективности интерпретации результатов. Использование молекулярно¬
генетических тестов позволяет избежать этих проблем.Наиболее распространенный подход — применение специфических прайме¬
ров, комплементарных определенной последовательности ДНК, характерной
только для данного вида микроорганизмов. Также возможно использование
универсальных праймеров для амплификации ДНК, присутствующей у всех
микроорганизмов определенной таксономической группы. Дальнейший анализ
амплифицированной ДНК с помощью различных методов (секвенирование,
метод полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, метод одноцепочеч-
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 293НОГО конформационного полиморфизма) позволяет провести молекулярную II
идентификацию бактерий.Детекция генов, ответственных за продукцию факторов вирулентности раз¬
личных микроорганизмов, особенно актуальна при идентификации условно-
патогенных бактерий для подтверждения их этиологической роли в возникнове¬
нии заболевания.В настоящее время проблему отсутствия полного набора сывороток для клас¬
сического типирования эшерихий по О- и Н-антигенам можно решить с помощью г^|
ПЦР для детекции факторов вирулентности, наличие которых свидетельствует об
этиологической роли данного микроорганизма. Например, обнаружение у эшери¬
хий генов, кодирующих инвазивность, продукцию энтеротоксинов или веротокси-
нов, позволяет отнести выделенный изолят к определенному патотипу.Использование ПЦР для определения чувствительности или устойчивости
микроорганизмов к антимикробным препаратам, а также определение меха¬
низмов и выявление генетических маркеров резистентности необходимо в тех
случаях, когда невозможно использовать традиционные фенотипические методы
(М. tuberculosis) или необходимо подтвердить механизм резистентности, выявлен¬
ный фенотипическими методами (MRSA, БЛРС-продуцирующие энтеробактерии,
МБЛ-продуцирующие Pseudomonas spp.). Как правило, для анализа используют
ДНК возбудителя, вьщеленного в чистой культуре, однако в некоторых случаях
можно исследовать образец клинического материала,В настоящее время рекомендовано использовать ПЦР для подтверждения и
выявления генетических маркеров резистентности при идентификации следую¬
щих клинически значимых микроорганизмов:стафилококков, устойчивых к оксациллину (детекция гена тесА, кодирующе¬
го дополнительный пенициллин-связывающий белок 2а);
энтерококков, устойчивых к ванкомицину (детекция генов vanA, vanB, vanC,
vanD, обусловливающих синтез модифицированной полипептидной цепи
пептидогликана);❖	энтеробактерий, устойчивых к цефалоспоринам HI-IV поколения [детекция
Ыа генов, кодирующих продукцию р-лактамаз расширенного спектра дей¬
ствия (например, СТХ-М), и выявление мутаций в генах |3-лактамаз ТЕМ-,SHV- и ОХА-типа, расширяющих спектр активности данных ферментов];❖	энтеробактерий, включая возбудителя брюшного тифа, а также и грампо¬
ложительные кокки, устойчивые к хинолонам [детекция точечных мутаций
в хромосомных генах субъединиц А и в ДНК-гиразы (гены gyrA и gyrB) и
субъединиц С и Е топоизомеразы IV (гены рагС и рагЕ)\\НГОБ, устойчивых к карбапенемам (детекция генов, кодирующих продук¬
цию основных типов металло-р-лактамаз — VIM, IMP, SPM, GIM, SIM).Ограничения использования ПЦР для определения механизма резистентно¬
сти — отсутствие данных о конкретных механизмах резистентности или наличие
одновременно нескольких механизмов резистентности.Данные о механизме резистентности, полученные с помощью ПЦР, позволя¬
ют прогнозировать эффективность антимикробных препаратов без определения
чувствительности возбудителя фенотипическими методами. Например, штаммы
S. aureus, имеющие ген тесА (MRSA), устойчивы ко всем р-лактамным антибио¬
тикам.Примеры использования ПЦР для выявления генетических механизмов разви¬
тия резистентности к антибактериальным препаратам представлены в
табл. 20-14.
pliiplUmtß^e||ЩШШ|ёШШшItÄиш294 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯТаблица 20-14. Генетические маркеры резистентности к антимикробным препаратамМикроорганизмАнтимикробныйпрепаратГенетические маркеры резистентностиMRSAОксациллинНаличие гена теса, кодирующего дополнительный пени-
циплинсзязывающий белок 2аЭнтерококки (f. faecalis,
f. faecim)ВанкомицинНаличие генов vana, vanb, vane или vand, обусловливаю¬
щих синтез модифицированной полипептидной цепи
пептидогликанаЭнтеробактерии, проду¬
цирующие (5-лактамазы
расширенного спектра
действия (£ coli, Klebsiella
pneumoniae)Цефалоспорины
III-IV поколенияНапичие генов bla, кодирующих продукцию ß-лактамаз
расширенного спектра действия (например, СТХ-М),
выявление мутаций в генах ß-лактамаз ТЕМ-, SHV- и
ОХА-типа, расширяющих спектр активности данных
ферментовНГОБ (P. aeruginosa,
acinetobacter spp.)КарбапенемыНаличие генов, кодирующих продукцию основных типов
металло-р-лактамаз (vim, imp, spm, gim, sim)Энтеробактерии (включая
возбудителя брюшного
тифа) и грамположительные
коккиХинолоныНаличие точечных мутаций в хромосомных генах субъе¬
диниц А и В ДНК-гиразы (гены дуга и дугЬ) и субъединиц
С и Е топоизомеразы IV (гены parc и pare)ИзониазидМутаций в гене каталазы-пероксидазы {katg), реже в
генах inha и зЛрсРифампицинМутации в гене ß-субъединицы РНК-полимеразы (гроЬ)М. tuberculosisЭтамбутолМутации в гене embb, кодирующем синтез арабинога-
лактанаСтрептомицинМутации в генах 16S ррнк [rrs) и рибосомного белка S12
{rpsi)ПиразинамидМутации в гене пиразинамидазы {рпса)ФторхинолоныМутации в гене субъединицы А ДНК-гиразы {дуга)Выпускаются коммерческие тест-системы для анализа образцов различных
биологических материалов на наличие ДНК возбудителей различных инфекци¬
онных заболеваний. Исследумые микроорганизмы разделяют в зависимости от их
принадлежности на разные группы патогенности:•	I группа патогенности — Y. pestís]•	II группа патогенности — В. anthracis, Brucella spp., P. pseiidomallei, Francisella
tularensis. Vibrio choler'ae',•	III группа патогенности — Bordetella pertussis, C. diphtheria, возбудители
острых кишечных инфекций (С/, difficile, Е. coli 0157:Н7 и другие группы диа¬
реегенных эшерихий, Salmonella spp.. Shigella spp., Campylobacter spp,, H, pylori,
астровирусы, ротавирусы, калицивирусы), L. pneumophila, Leptospira inter¬
rogans, L. monocytogenes, M. tuberculosis complex, N. gonorrhoeae, N. meningitidis,
Т. pallidum, Y. pseudotuberculosis',•	IV группа патогенности — Bacteroides spp. (возбудители сепсиса и гной¬
ных инфекций), Haemophilus spp. (возбудители менингита, пневмоний и
ларингитов), возбудители ИППП (Ureaplasma spp., Chlamydia trachomatis,
N. gonorrhoeae, T. pallidum, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium,
Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis).Перечень инфекционных заболеваний и микроорганизмов, для выявления
которых используют молекулярно-генетические методы диагностики, представ¬
лен в табл. 20-15.
•N-'/ІІШБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 295Таблица 20-15. Бактериальные инфекции и возбудители, для выявления которых используют
молекулярно-генетические методы диагностикиИнфекционное заболеваниеУрогенитальные инфекцииИнфекции респираторного
трактаТуберкулезНейроинфекцийКишечные инфекцииОсобо опасные и природно-
очаговые инфекцииВозбудителиChlamydia trachomatis
N. gonorrhoeae
T. pallidumTrichomonas vaginalis
Mycoplasma genitalium
Mycoplasma hominis
Ureaplasma spp.
Gardnerella vaginalis
Candida abicansC. diphtheria
Streptococcus spp.
L. pneumophilaM. tuberculosis complexN. meningitidis
Neisseria spp.
Haemophilus spp.
Listeria monocytugenesCampylobacter spp. (термофильная группа)H. pyloriShigella spp. и энтероинвазивные штаммы E. coli
Salmonella spp.Y. enterocolitica
Y. pseudotuberculosis
Cl. difficileVibrio choleras
B. anthracis
Brucella spp.Leptospira spp.Borrelia burgdorferi sensu lato [B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii)ИНДИКАЦИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛВыявление антител к антигенам микроорганизмов в сыворотке крови и ликво-
рах (спинномозговом и др.) пациентов является одним из основных способов диа¬
гностики инфекционных заболеваний. При заболеваниях бактериальной природы
определяют наличие у пациентов антител к антигенам и токсинам возбудителей. В
ряде случаев с помощью серологической диагностики можно оценивать эффектив¬
ность проводимого лечения или вакцинации. С помощью серологических тестов
возможно выявление переболевших лиц и бактерионосителей, пациентов со
стертыми и субклиническими формами заболевания, что обеспечивает получение
более полной и обоснованной информации для оценки активности инфекционно¬
го и эпидемического процессов.ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯДля серологических исследований чаще всего используют сыворотку, которая
должна быть прозрачной, без примеси эритроцитов и следов гемолиза. Кровь заби¬
рают натощак или не ранее чем через 6 ч после еды, при условии, что больной не
употреблял жирной пищи, включая яйцепродукты. В противном случае сыворотка
может быть мутной (хилезной) и непригодной для исследования. Кровь собирают
с соблюдением правил асептики в стерильную посуду. После образования сгустка
его обводят и оставляют на несколько часов в холодильнике (2-4 °С) для более
полного отделения сыворотки. Взятие проб можно проводить в вакуумные одно¬
разовые пробирки (пустые или с ускорителями свертывания крови). Полученную
298БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯсыворотку можно хранить при температуре 2-8 X в течение 2-3 дней. Для более
длительного хранения сыворотки замораживают при температуре -20 °С и ниже.
Следует избегать их многократного размораживания и замораживания.При диагностике некоторых заболеваний (например, сифилиса) и необходи¬
мости длительной транспортировки материала в лабораторию допускается высу¬
шивание сыворотки. Для РСК сыворотки высушивают на поверхности сложенной
вдвое вощеной бумаги или целлофана. На полосу (8x10 см) такой подложки
в 4 места вносят по 0,5 мл сыворотки и по 3 капли 40% раствора сахарозы,
оставляя подсыхать при комнатной температуре. На краю подложки указывают
Ф.И.О. пациента, объем сыворотки и дату. Носитель складывают в виде аптеч¬
ного пакетика, помещают в конверт и направляют в лабораторию. Такие высу¬
шенные пробы необходимо исследовать в течение 5 дней в теплое время года и в
течение 10 дней — в холодное.Известно большое количество серологических тестов, которыми диагностируют
инфекционные болезни. Техника их постановки описана в инструкциях по приме¬
нению соответствующих тест-систем и диагностикумов.при выборе серологической реакции принимают во внимание:❖	доступность необходимых реагентов и оборудования для ее постановки;❖	сроки получения ответа;❖	ее чувствительность и специфичность.в ряде случаев применение определенной реакции в конкретной ситуации —
следствие своеобразного компромисса. Отсутствие идеальной серологической
реакции диктует необходимость в некоторых случаях использовать для диагно¬
стики не один, а несколько тестов, в том числе скрининговые, диагностические и
экспертные. Например, реакция микропреципитации, используемая для сероло¬
гической диагностики сифилиса, обладает невысокой специфичностью, однако
она дешева и удобна в постановке. Наиболее специфичная и чувствительная при
сифилисе серологическая реакция (РИФ-абс), напротив, сложна в постановке и
требует применения малодоступных реагентов. В связи с этим реакцию микро¬
преципитации используют как скрининговую, и выявленные в ней положительные
результаты подлежат подтверждению в более специфических реакциях, таких как
ИФА и РНГА. Если результаты используемых реакций неоднозначны или не соот¬
ветствуют клиническим данным, используют РИФ-абс как экспертную реакцию.
К постановке дополнительных реакций, подтверждающих достоверность получен¬
ного положительного результата, также приходится прибегать при диагностике
ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов.Диагностические критерииСам факт обнаружения антител в сыворотке больного не является достаточным
основанием для постановки диагноза. Только в немногих случаях (например, при
сифилисе) диагностическое значение имеет сам факт обнаружения антител опреде¬
ленной специфичности. Постоянно контактируя с различными антигенами, в том
числе и с антигенами возбудителей инфекционных заболеваний, организм чело¬
века насыщен огромным разнообразием антител. Поэтому клиническая интер¬
претация результатов серологических тестов во многом зависит от результатов
повторных исследований. Данное обстоятельство подчеркивает необходимость
серологического исследования парных сывороток, полученных в острой стадии
заболевания и в период вьЕздоровления. У любого пациента с неясным диагнозом
взятую в начале болезни сыворотку замораживают, чтобы при необходимости
провести параллельное исследование с сывороткой, полученной в более поздние
сроки, для оценки динамики антительного ответа.Для постановки этиологического диагноза на основании показаний серологиче¬
ских тестов, как правило, пользуются одним из двух диагностических критериев:
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 297❖	выявление так называемого диагаостического титра при однократном иссле¬
довании сыворотки — количество антител должно быть не ниже определен¬
ного (дискриминантного) значения;^ достоверное нарастание (в 4 раза и более) титра антител в парных пробах
сыворотки крови, взятых у пациента с интервалом в 7-14 дней.Первый из указанных критериев — статический показатель, превышение
которого расценивают как признак инфекционного заболевания. Величина диа¬
гностического титра устанавливается эмпирически для каждого заболевания и
для каждой серологической реакции. При использовании для диагностики одно¬
го заболевания нескольких серологических тестов, величины диагностических
титров для каждого из них могут не совпадать, так как разные серологические
реакции различаются своей чувствительностью. Различия в величинах диагности¬
ческих титров также возможны при применении одной серологической реакции,
в результате использования разных диагностических препаратов, так как в этом
случае могут выявляться антитела к разным антигенам. Величину диагностиче¬
ского титра обычно указывают в инструкции-вкладыше, которая имеется в каждой
упаковке с диагностическими тест-системами или диагностическим препаратом.
Часто величину диагностического титра устанавливают эмпирически в процессе
создания каждой новой серологической тест-системы. Его значение зависит от
вида заболевания и типа серологической реакции. Кроме того, он может разли¬
чаться в тест-системах, изготовленных разными фирмами.При ряде заболеваний (шигеллезы, сальмонеллезы) значение диагностического
титра в определенной степени условно, так как зависит не только от перечисленных
выше объективных причин, но и от конкретной эпидемиологической ситуации,
когда риск заражения возбудителями и широта их распространения в популяции
варьируют, что приводит к уменьшению или повышению титра соответствующих
антител у здоровых лиц (так называемые фоновые или анамнестические антитела)
и, следовательно, к разной оценке диагностического титра.Диагностический титр антител может быть выявлен в сыворотке здоровых
людей и обусловлен профилактической вакцинацией, перенесенной в прошлом
инфекцией в любой форме или иммунизацией антигенами, которые могут попа¬
дать в организм с загрязненными пищей или водой. В зависимости от эпидемиче¬
ской ситуации величина диагностического титра различна на разных территориях.
Ее нужно устанавливать на каждой территории по результатам титрования сыво¬
роток 100 здоровых лиц. Большое значение имеет определение диагностического
титра IgG, поскольку их наличие свидетельствует о значительном специфическом
антигенном стимуле и более позднем сроке заболевания.Более достоверен второй критерий (нарастание титра антител), позволяющий
проследить развитие иммунного ответа у конкретного пациента. В этом случае
диагноз заболевания можно установить даже при аномально низком уровне
иммунного ответа, что, в свою очередь, связано с индивидуальными особенностя¬
ми некоторых больных, у таких людей при постановке серологической реакции
уровень антител не достигает диагностического титра, однако будет зафиксирова¬
но нарастание титра антител при исследовании парных сывороток.При некоторых заболеваниях (микоплазмоз) достоверное нарастание титра
антител регистрируют редко, что делает проблематичным возможность их сероло¬
гической диагностики. Диагностически достоверным считается нарастание титра
антител в 4 раза и более. Нарастание титра в 2 раза, как правило, в расчет не при¬
нимается, поскольку может быть связано с ошибкой постановки реакции (ошиб¬
ки, допущенные при разведении сыворотки, несоблюдение объемов реагентов,
нарушение температурного режима, инкубация реакционной смеси и др.). В таких
случаях тест необходимо провести повторно.
IP298 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯНедостаток этого диагностического критерия — относительно большой срок,
необходимый для получения ответа. Как правило, при его использовании диагноз
подтверждают (или отвергают) к концу 2-3-й недели заболевания. В некоторых
случаях такая диагностика носит ретроспективный характер.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ РАЗНЫХ КЛАССОВБольшое диагностическое значение имеет определение соотношения спец¬
ифических иммуноглобулинов разных классов. Это позволяет определить
стадию заболевания и, в некоторых случаях, прогнозировать его течение и воз¬
можный исход. Современные методы серологической диагностики позволяют
определить концентрацию иммуноглобулинов отдельных классов определен¬
ной специфичности. Когда первый контакт с микроорганизмом индуцирует
иммунный ответ, первыми появляются IgM. Их титры быстро нарастают и
достигают максимума, а затем относительно быстро снижаются. IgG появля¬
ются позже, но дольше сохраняются в высоких титрах. При повторном кон¬
такте с тем же антигеном (вторичный иммунный ответ) IgM вырабатываются
в незначительном количестве, реакция гуморального иммунитета проявляется
прежде всего увеличением титров IgG. Именно поэтому по соотношению IgM
и IgG можно отличить первичный иммунный ответ (острое заболевание) от
вторичного (рецидив или повторное заражение). О различиях в характере
вырабатываемых иммуноглобулинов при первичном и вторичном иммунном
ответе следует помнить при оценке результатов, полученных с помощью неко¬
торых современных иммунологических методов, например ИФА. Большинство
выпускаемых тест-систем для серодиагностики с помощью ИФА позволяют
определить титр IgM или IgG. Соответственно и лаборатория сообщает врачу
не титр антител вообще, а титр иммуноглобулинов соответствующего класса.
В зависимости от конкретной клинической ситуации интерпретация высоких
или низких титров IgM и IgG будет различаться. В частности, низкие титры
или отсутствие IgM не всегда можно расценивать как факт, свидетельствующий
в пользу отсутствия заболевания.Наличие специфических IgM в сыворотке — ранний маркер инфекции, свиде¬
тельствующий о развитии острой фазы заболевания. IgM можно выявить на 3-5-й
день болезни, пик их нарастания приходится на 2-ю неделю от начала болезни,
затем происходит снижение титра антител. Специфические IgG можно определять
через 7-10 дней после начала заболевания и позже. Их наличие отражает общую
картину положительного иммунного ответа при острой, хронической или перене¬
сенной инфекции, причем часто после выздоровления на протяжении многих лет
IgG могут сохраняться в крови в низких титрах. Увеличение и снижение их титров
происходит медленнее по сравнению с IgM. Обнаруживаемые у новорожденных
детей IgG, как правило, имеют колостральное происхождение.В настоящее время раздельное определение иммуноглобулинов различных
классов (IgM, IgG, IgA) используют достаточно часто. Достоверно можно выявить
титр IgG, используя редуцирующие вещества, например меркаптаны (меркаптоэ-
танол, меркаптопурин), цистеин и димеркаптопропансульфонат натрия, которые
избирательно инактивируют IgM. Различия в величинах титров антител в натив¬
ной и обработанной таким реактивом сыворотке позволяют судить о наличии или
отсутствии IgM. Полное исчезновение антител в пробах сывороток, обработан¬
ных редуцентом, свидетельствует о присутствии IgM и острой фазе заболевания.
Отсутствие IgM в отдельных сыворотках не является основанием для исключения
инфекционного процесса. В этом слз^чае необходимо дополнительно исследовать
парные пробы сывороток в динамике заболевания. В сыворотках, после обработки
которых не снижается титр антител, доминируют IgG, что свидетельствует о более
поздних сроках заболевания. Уменьшение титра антител в несколько раз после
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 299обработки редуцентом свидетельствует о том, что антитела представлены смесью
IgM и IgG.Поэтому для подтверждения специфичности результатов, получаемых при
исследовании одной сыворотки, необходима постановка данной реакции в дина¬
мике заболевания с последующим определением выраженных серологических
сдвигов в титрах специфических IgG. Необходимо одновременно исследовать
парные сыворотки, из которых первая взята в остром периоде заболевания (не
позднее 3-5-ГО дня болезни), а вторая — через 7-10 дней. Диагноз ставят на осно¬
вании увеличения титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой в 4
раза и выше.Современные диагностические наборы, основанные на «сандвич-методе», зна¬
чительно упростили данную процедуру. Используемые в таких наборах монокло¬
нальные антитела взаимодействуют только с иммуноглобулинами определенного
класса (IgM, IgG, IgA).Определение IgGНаиболее простой и доступный способ дифференциации IgM и IgG — метод раз¬
рушения IgM редуцирующими веществами. Однако он не позволяет количественно
определить IgM, если их содержание в сыворотке меньше или равно концентрации
IgG. Метод определения IgG основан на избирательном разрушении редуцирую¬
щими веществами макроглобулиновых антител, к которым относятся молекулы
IgM. IgM под действием редуцентов расщепляются с разрывом дисульфидных
связей молекул белка, диссоциируя при этом на 6-8 мономеров, не обладающих
иммунной активностью. IgG под действием данных веществ не разрушаются.Обработка сыворотки цистеиномДля такой обработки сывороток готовят ех tempore раствор солянокислого
или «свободного» цистеина из расчета 15,0 мг цистеина на 1,0 мл растворителя.
Раствор цистеина можно хранить не более 30-60 мин, поэтому сначала готовят
необходимые разведения сывороток. Исследуемую сыворотку в разведении 1:5
(в 0.9% растворе хлорида натрия) прогревают на водяной бане при температуре
56 “С в течение 30 мин и делят на 2 одинаковые по объему порции. К первой из
них добавляют равный объем раствора цистеина, ко второй — равный объем 0,9%
раствора хлорида натрия. Вещества смешивают в стерильных пробирках, которые
плотно закрывают воздухонепроницаемыми пробками. Объем пробирок должен
быть таким, чтобы между содержимым и пробкой оставалось минимальное сво¬
бодное пространство для предотвращения инактивации цистеина кислородом воз¬
духа. Пробирки с обработанными и необработанными сыворотками выдерживают
в термостате при температуре 37 ‘’С в течение 18-20 ч. Затем обе пробы сыворотки
исследуют в серологических реакциях с диагностикума ми по общепринятой мето¬
дике, начиная с разведения 1:10.Обработка сыворотки димеркаптопропансульфонатом натрияДля обработки сывороток 5% раствор димеркаптопропансульфоната натрия
разводят в 4 раза 0,9% раствором хлорида натрия до полу^1ения концентрации1,25. Полученный 1,25% раствор димеркаптопропансульфоната натрия можно
хранить в стерильной стеклянной посуде с хорошо притертой воздухонепрони¬
цаемой пробкой при температуре 4 “С в течение недели. Исследуемую сыворотку в
разведении 1:5 (в 0,9% растворе хлорида натрия) прогревают на водяной бане при
температуре 56 X в течение 30 мин и делят на 2 равные порции. К первой порции
добавляют равный объем 1,25% раствора димеркаптопропансульфоната натрия,
ко второй — равный объем 0,9% раствора хлорида натрия. Вещества смешивают
в стерильных пробирках, которые плотно закрывают воздухонепроницаемыми
пробками. Обе порции сыворотки оставляют на 18 ч при комнатной температуре.
300 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯа затем исследуют с диагностикумами по общепринятой методике, начиная с раз¬
ведения 1:10. Возможно сокращение срока инактивации IgM до 2 ч, однако в этом
случае необходимо инкубировать сыворотки в термостате при температуре 37 °С.Оценка результатовРезультаты серологических тестов необходимо интерпретировать с учетом
дополнительной информации о пациенте, включая данные о предшествующей
иммунизации, перенесенных заболеваниях, вероятности контакта с определенны¬
ми возбудителями или их антигенами. Ни один метод лабораторной диагностики
не может заменить клинической оценки заболевания лечащим врачом. Например,
при тифо-паратифозных заболеваниях даже при самом тщательном серологиче¬
ском обследовании в 20-25% случаев получают отрицательные результаты (отсут¬
ствие диагностически значимых титров антител и их нарастания) при наличии
бактериологического подтверждения диагноза. Отрицательные серологические
реакции (серореверсия) могут наблюдаться на фоне этиотропной терапии, напри¬
мер при использовании антибактериальных препаратов. Поэтому отрицательные
результаты серологического исследования при наличии специфических клини¬
ческих симптомов не являются основополагающим критерием для отмены диа¬
гноза,ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ
К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМПОНЯТИЕ О ТИПАХ И СТЕПЕНИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ
К АНТИБИОТИКАМПриродная устойчивость — генетически обусловленное отсутствие чувствитель¬
ности микроорганизма к антимикробным препаратам. При этом точки приложе¬
ния действия препарата («мишени») в микробной клетке отсутствуют или недо¬
ступны для него. Пример природной устойчивости — резистентность микоплазм
и псевдомонад к бензилпенициллину или резистентность бактерий к антигрибко-
вым препаратам. Природная устойчивость не требует рутинного лабораторного
подтверждения.Приобретенная устойчивость обусловлена изменением генома микробной
клетки в результате мутаций или связана с получением новой генетической
информации при конъюгации (передача генетического материала в результате
своеобразного «полового» процесса у микроорганизмов), трансдукции (пере¬
дача генетического материала х помощью фагов) или трансформации (непосред¬
ственная передача фрагмента ДНК донора реципиентной клетке) с последующей
селекцией устойчивых штаммов. Данный термин применяют в том случае, когда в
чувствительной к определенному антимикробному препарату популяции микро¬
организмов обнаруживают устойчивые штаммы.Уровень природной устойчивости к антимикробным препаратам у «диких»
штаммов микроорганизмов может быть достаточно точно предсказан на основа¬
нии видовой идентификации, а наличие и уровень приобретенной устойчивости
у «госпитальных» штаммов могут быть установлены только после выявления
определенными методами чувствительности возбудителей к антибиотикам.По степени чувствительности к антимикробным препаратам микроорганизмы
принято разделять на три группы:❖	чувствительные микроорганизмы;❖	промежуточные микроорганизмы;❖	устойчивые (резистентные) микроорганизмы.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 301Существует два подхода к интерпретации этих понятий — клинический и
микробиологический.в соответствии с клиническим подходом, основанным на оценке эффективности
антибактериальной терапии, к чувствительным относятся возбудители, рост кото¬
рых в организме больного прекращается при введении обычных терапевтических
доз антибиотика. В группу промежуточных входят штаммы, для угнетения роста
которых требуется назначение максимально допустимых доз антимикробного пре¬
парата. Хороший лечебный эффект в отношении возбудителей с промежуточной
чувствительностью можно получить при применении обычных терапевтических
доз препарата в том случае, если очаг инфекции локализуется в тканях, в которых
антибиотик накапливается в высоких концентрациях. К устойчивым относятся
микроорганизмы, для подавления роста которых требуются чрезвычайно высо¬
кие концентрации химиопрепаратов, недостижимые в организме из-за опасно¬
сти проявления их токсических свойств. Таким образом, с точки зрения врачей,
чувствительными к антибиотику считаются такие микроорганизмы, на которые
он оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие в концентрации,
достигаемой в очаге инфекции.Микробиологический подход к разделению чувствительных, промежуточных
и устойчивых микроорганизмов основан на анализе эффективности подавления
антибиотиком роста исследуемых штаммов в питательной среде (выявление
«пограничных» концентраций антимикробных препаратов, изучение диаметров
зон задержки роста бактерий вокруг дисков с химиопрепаратами).При оценке чувствительности возбудителей следует иметь в виду, что клиниче¬
ская и микробиологическая эффективность антимикробных препаратов совпада¬
ют далеко не всегда.КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАММетоды, применяемые в микробиологической лаборатории для определения
чувствительности (устойчивости) возбудителей к антимикробным препаратам,
принято разделять на несколько групп.•	Методы серийных разведений антимикробных препаратов в питательной
среде:❖	метод серийных разведений антибиотика в жидкой питательной среде;❖	метод серийных разведений препарата в плотной питательной среде;❖	макрометод (в пробирках);❖	микрометод (в планшетах).•	Метод «пороговых» («пограничных») концентраций.•	Диффузионные методы:❖	диско-диффузионный метод;<> Е-тест (эпсилометрический),•	Метод выявления толерантности микроорганизмов к антимикробным пре¬
паратам.•	Специальные методы обнаружения устойчивости микроорганизмов к анти¬
микробным препаратам:❖	метод выявления ß-лактамаз микроорганизмов с использованием нитро-
цефинового диска;❖	специальные методы обнаружения устойчивости Staphylococcus spp. к окса¬
циллину и ванкомицину;<> специальные методы обнаружения устойчивости Enterococcits spp. к амино-
гликозидам и ванкомицину;
о специальные методы обнаружения устойчивости Str. pneumoniae к бензил¬
пенициллину;
ш302 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯметоды выявления [5-лактамаз расширенного спектра действия у энтеро¬
бактерий;❖	выявление продукции металло-р-лактамаз у грамотрицательных бактерий
методом двойных дисков с ЭДТА.Методы определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным
препаратам позволяют проводить выбор оптимального антибиотика для лечения
конкретного больного, а также разрабатывать тактику эмпирической антимикроб¬
ной терапии для отдельных нозологических форм инфекционной патологии на
основании микробиологического мониторинга за уровнем антибиотикорезистент¬
ности в конкретных регионах или медицинских учреждениях.Основные параметры, влияющие на выбор метода оценки антибиотикоре¬
зистентности микроорганизмов, — точность и воспроизводимость результатов
исследования, а также трудоемкость и стоимость метода. Результаты исследования
во многом зависят от состава и pH питательной среды, величины посевной дозы,
возраста культуры, условий культивирования и некоторых других факторов.Необходимое условие получения точных и воспроизводимых результатов —
максимальная стандартизация выбранного метода исследования. В некоторых
странах (США, Германия, Франция) для определения чувствительности микро¬
организмов к антибиотикам существуют собственные (национальные) стандарты,
однако в большинстве стран мира в настоящее время используют методы, раз¬
работанные Институтом клинических и лабораторных стандартов США {Clinical
and Laboratory Standards Institute, CLST), который ранее назывался Национальным
комитетом по клинико-лабораторным стандартам {National Committee for Clinical
Laboratory Standards, NCCLS). В странах Евросоюза существует Европейский
комитет по определению чувствительности к антибиотикам {European Committee
for Antimicrobial Susceptibility Testing, EUС AST), созданный Европейским обще¬
ством по клини^іеской микробиологии и инфекционным болезням {European
Society for Clinical Microbiology and Infectious Diseases, ESCMID). В 2004 г, главным
государственным санитарным врачом РФ утверждены и введены в действие
«Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к
антибактериальным препаратам» (МУК 4.12.1890-04), в основе которых лежат
стандарты CLSI {NCCLS).Отсутствие единых международных критериев при определении чувствитель¬
ности микроорганизмов к антимикробным препаратам приводит к тому, что
штаммы, оцениваемые по одним стандартам как чувствительные, по другим стан¬
дартам оказываются резистентными. Для целого ряда патогенов методы изучения
чувствительности к антимикробным препаратам не стандартизированы, а обосно¬
ванные критерии оценки полученных результатов отсутствуют. Проводить изуче¬
ние чувствительности таких микроорганизмов к антибиотикам не рекомендуется.
Штаммы возбудителей с необычным типом резистентности, не описанным в науч¬
ной литературе (например, резистентность Str. pyogenes к бензилпенициллину),
требуют проведения повторной тщательной идентификации и отправляются для
проверки в специализированные лаборатории.ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ
Методы серийных разведений антимикробного препарата в питательной средеМетоды серийных разведений антимикробных препаратов в питательной
среде — количественные, они позволяют определить минимальную ингибирую¬
щую концентрацию (МИК) и минимальную бактерицидную концентрацию (МБК)
антибиотика, которые измеряются в ЕД/мл или в мкг/мл. В качестве синонима
МИК нередко используют термин «минимальная подавляющая концентрация»
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 303(МПК). в зависимости от объема питательной среды выделяют методы серийных
макро- и микроразведений (в бактериологических пробирках и в пластиковых
микропланшетах соответственно), а в зависимости от ее состава — методы серий¬
ных разведений в жидкой и плотной питательных средах.Для выявления МИК определенную концентрацию изучаемой культуры засе¬
вают на питательные среды, содержащие 2-кратные разведения исследуемого
антимикробного препарата, после инкубации посевов в термостате учитывают
результат. Величину МИК определяют по максимальному разведению антибиоти¬
ка, задерживающему рост возбудителя в питательной среде. Для выявления МБК
из пробирок с отсутствием видимого роста микроорганизмов производят высев
на плотные или жидкие питательные среды. За величину МБК принимают наи¬
меньшую концентрацию антибиотика в пробирке, высев из которой не дал роста
культуры вследствие гибели исследуемых микроорганизмов (рис. 20-2).Контроль	Концентрация антибиотиков (мкг/мл), О 0,25 0.5 1 2	4 81И I pUJ IDV.16 32Рост микроорганизмаРоста нетМИКРис. 20-2. Схема определения чувствительности возбудителей к антимикробным препаратам
методом серийных разведений антибиотика в жидкой питательной среде.Особенность методов серийных разведений — недостаточно точное выявление
значения МИК. На самом деле истинная величина МИК находится в промежутке
между ее величиной, определенной во время опыта, и величиной, уступающей ей в2	раза и не вызвавшей задержки роста исследуемого микроорганизма. Например,
если замедление роста возбудителя произошло при концентрации антибиотика
64 мкг/мл, то HCTiiHHoe значение МИК будет находиться в промежутке между 32
и 64 мкг/мл. Для более точного определения величины МИК следует провести
дополнительные исследования в указанном диапазоне концентраций антибио¬
тика.Для эффективной антимикробной терапии бактериальных инфекций требуется
создать в очаге воспаления концентрацию антибиотика, превышающую МИК (для
получения бактериостатического эффекта) или превышающую МБК (для полу¬
чения бактерицидного эффекта). Если при назначении максимально допустимых
(терапевтических) доз препарата его концентрация в очаге воспаления окажется
меньше выявленной in vitro МИК, то возбудитель инфекции следует отнести к
категории устойчивых, а для лечения больного подобрать другой антибиотик.
Таким образом, сведения о величине МИК антибиотика позволяют лечащему
Bpa^iy грамотно рассчитать дозы и режимы введения антимикробного препарата.
Как показывает практика, для получения хорошего терапевтического эффекта
концентрация антимикробного препарата в крови должна в 5-10 раз превышать
его МИК в отношении возбудителя. Методы серийных разведений антибиотиков в
жидких и плотных питательных средах — одни из самых информативных, однако
они весьма трудоемки и дороги.
304 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯМетод «пороговых» концентрацийДостаточно простой и экономичный способ определения чувствительности
микроорганизмов к антимикробным препаратам - метод «пороговых» концен¬
траций. В его основе лежит представление о двух «пороговых» («пограничных»)
концентрациях антибиотика, разделяющих штаммы микроорганизмов на три
категории — чувствительные, промежуточные и устойчивые (табл. 20-16).Таблица 20-16. Разделение штаммов микроорганизмов на чувствительные, промежуточные и
резистентные в соответствии со значениями «пороговых» концентраций антимикробных пре¬
паратов (4 и 64 мкг/мл)1 мкг/мл 2 мкг/мл 4 мкг/мл8 мкг/мл 16 мкг/мл 32 мкг/мл64 мкг/мл 128 мкг/мл 256 мкг/млчузствительныепромежуточныеRрезистентныепри этом меньшая концентрация (в данном примере — 4 мкг/мл) разграничи¬
вает чувствительные и промежуточные штаммы, а большая (в данном примере —
64 мкг/мл) — промежуточные и устойчивые штаммы возбудителей. При выборе
значений пограничных концентраций для антимикробных препаратов учитывают
микробиологические, клинические и фармакологические факторы. Для каждого
антибиотика установлены свои «пороговые» концентрации в отношении опреде¬
ленного микроорганизма. Эти концентрации не являются постоянными величина¬
ми и периодически пересматриваются в специальных комитетах (CLSI, EUCAST)
по мере изменения чувствительности популяций возбудителей, а результаты
публикуются в соответствующих нормативных документах.Метод «пороговых» концентраций в большинстве случаев предполагает исполь¬
зование готовых коммерческих тест-систем, в основу которых заложен принцип
микрообъемных технологий. Тест-система представляет собой планшет с двумя
рядами лунок, в каждой из которых содержатся лиофилизированные растворы
антибиотиков в питательной среде в объеме 0,1 мл (рис. 20-3). При этом каждый
антибиотик представлен двумя лунками (верхней и нижней), в которых содержат¬
ся соответствующие «пороговые» концентрации.Результаты определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным
препаратам методом «пороговых» концентраций можно учитывать невооружен¬
ным глазом или использовать специальные автоматизированные системы. В зави¬
симости от типа применяемых панелей учет результатов и анализ проводят через
18-24 ч или через 4-6 ч инкубации.Диффузионные методыДиско-диффузионный методНаиболее простой и доступный для большинства практических бактериологи¬
ческих лабораторий способ оценки чувствительности возбудителей к антимикроб¬
ным препаратам - диско-диффузионный метод.Принцип метода основан на способности антимикробных препаратов диффун¬
дировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду и угнетатьРис. 20-3. Микрообъемная панель дня определения чувствительности стафилококков к анти¬
микробным препаратам методом «пороговых» концентраций.
тБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3Q5рост колоний бактерий. Сопоставление полученных в результате исследования
величин диаметров зон задержки роста возбудителей вокруг дисков с антибио¬
тиками с табличными данными, изложенными в соответствующих нормативных
документах, позволяет отнести исследуемые штаммы микроорганизмов к катего¬
риям чувствительных (S), промежуточных (I) или устойчивых (R) к соответствую¬
щим антимикробным препаратам. При этом величина диаметра зоны задержки
роста исследуемой культуры тесно связана со значениями МИК тестируемого
антибиотика для S, I и R штаммов. Таким образом, диско-диффузионный метод
позволяет не только определить чувствительность возбудителя к антимикробным
препаратам, но и помочь врачу в выборе режима дозирования антибиотика с уче¬
том его МИК.Чаще всего диско-диффузионный метод используют для определения чув¬
ствительности к антибиотикам микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae,
Р. aeruginosa, Acinetobacter spp,, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Haemophilus spp.,
N. gonorrhoeae, Streptococcus spp. Применяют диски только с теми антимикробными
препаратами, которые обладают клинически подтвержденной эффективностью в
отношении соответствующих возбудителей инфекции.Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам с помощью
диско-диффузионного метода включает следующие этапы:
выделение чистой культуры возбудителя;❖	приготовление рабочей суспензии исследуемого микроорганизма (иноку-
лята);❖	посев стандартной суспензии возбудителя на плотную питательную среду;^ наложение дисков с антимикробными препаратами на поверхность плотной
питательной среды с помощью стерильного пинцета или диспенсера;^ инкубация посевов в термостате в течение 18-48 ч;измерение диаметра зон задержки роста исследуемого микроорганизма
вокруг дисков с антибиотиками с последующей интерпретацией полученных
данных.Важно, что для выявления устойчивости возбудителей к антимикробным пре¬
паратам стандарт CLSI предусматривает определенный набор питательных сред —
агар Мюллера-Хинтона, бульон Мюллера-Хинтона, гемофилезную среду (НТМ).
Выбор этих прггательных сред обусловлен целым рядом обстоятельств — хоро¬
шими ростовыми качествами, высокой воспроизводимостью и точностью резуль¬
татов исследования, оптимальной концентрацией различных ионов (кальция,
магния), низким содержанием ингибиторов антимикробных препаратов, а также
большим опытом тестирования на них различных микроорганизмов во многих
странах мира. Эти среды можно готовить самостоятельно из сухих, однако лучше
применять готовые среды, качество и стандартность которых гарантированы про¬
изводителем.Следует учитывать, что диско-диффузионный метод не дает надежных результа¬
тов при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирую¬
щим в питательную среду полипептидным антибиотикам (полимиксины, гликопеп-
тиды). Именно поэтому при использовании этих препаратов для лечения больных
с генерализованной инфекцией для определения чувствительности необходимо
применять методы серийных разведений или «пороговых» концентраций.Опыт работы с врачами-бактериологами лечебно-профилактических учрежде¬
ний и центров гигиены и эпидемиологии свидетельствует о наличии типовых оши¬
бок при постановке и учете результатов диско-диффузионного метода, в том числе:❖	несоблюдение режимов хранения картриджей и флаконов, содержащих
диски с антимикробным препаратом;❖	использование чашек с неадекватным (большим или меньшим) объемом
питательных сред;
РШШ306 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯотсутствие во многих бактериологических лабораториях адекватного стан¬
дарта мутности, эквивалентного 0,5 по стандарту МакФарланда и соответ¬
ствующего плотности посевной дозы 1-2x10® КОЕ/мл;
о неадекватный подбор дисков с антимикробными препаратами, неравномер¬
ное распределение их на поверхности питательной среды и увеличение их
оптимального количества на одной чашке (не более 6 дисков на чашке диа¬
метром 90-100 мм);
несоблюдение трех «правил 15 минут»;-	посев стандартной взвеси микроорганизмов на чашку с плотной питатель¬
ной средой не позднее 15 мин с момента приготовления инокулята;-	подсушивание засеянной чашки с питательной средой не более 15 мин при
комнатной температуре;-	помещение засеянной чашки в термостат не позднее 15 мин после нанесе¬
ния дисков с антибиотиками;отсутствие или нарушение адекватного контроля воспроизводимости и точ¬
ности результатов определения чувствительности к антибиотикам с исполь¬
зованием референтных штаммов микроорганизмов;❖	слабое знание нормативных документов и литературы по методам определе¬
ния чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.
Эпсилометрический метод (Е-тест)Разновидность диффузионного метода определения чувствительности микро¬
организмов к антибиотикам — эпсилометрический метод (Е-тест), позволяющий
точно и быстро определять МИК антимикробных препаратов.Вместо бумажного диска в Е-тесте предусмотрено использование полимер¬
ной полоски размером 5x50 мм, откалиброванной в соответствии с градиентом
концентрации антибиотика. Концентрация антимикробного препарата в полоске
может варьировать в зависимости от исследуемого антибиотика в следующих диа¬
пазонах — от 0,02 до 32 мкг, от 0,016 до 256 мкг и от 0,064 до 1024 мкг.Полоски с антибиотиками укладывают на засеянную поверхность плотной
питательной среды, после инкубации посевов в термостате учитывают резуль¬
тат. Значение МИК антибиотика определяют в том месте, где эллипсовидная
зона задержки роста вплотную подходит к полимерной полоске (рис. 20-4).
Достоинства метода — возможность быстрого выявления МИК антибиотиков и
простота выполнения, недостатки — высокая стоимость полимерных полосок.Метод выявления толерантности бактерий к антимикробным препаратамВпервые понятие «толерантность» появилось в медицинской литературе после
выделения мутантного штамма Str. pneumoniae, который, в отличие от типового
штамма, не терял жизнеспособности при воздействии концентрации бензилпени¬
циллина, в несколько раз превышающей МИК, По существу, бензилпенициллин
действовал на данный штамм Str. pneumoniae как бактериостатический препарат.Рис. 20-4. Полимерная полоска для определения чувствительности микроорганизмов к анти¬
микробным препаратам с помощью зпсилометрического метода (Е-теста).
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3Q7Толерантность — утрата чувствительности микроорганизмов к бактерицидному
действию антибиотика при сохранении чувсгвшельности к бактеряостатическому
действию. В настоящее время феномен толерантности к антибиотикам описан у
нескольких десятков видов бактерий, большинство из которых грамположительны.
Для выявления феномена толерантности микроорганизма к антимикробным
препаратам определяют МИК и МБК антибиотика методом серийных разведений
в жидкой питательной среде. Если МБК превышает МИК в 32 раза и более, микро¬
организм считают толерантным к исследуемому антимикробному препарату.
Поскольку данный препарат не обладает клинической эффективностью, для лече¬
ния больного подбирают другой антибиотик.Специальные методы обнаружения устойчивости бактерий к антимикробным
препаратамНеобходимость разработки и внедрения в практику микробиологических лабо¬
раторий специальных методов обнаружения устойчивости микроорганизмов к
антимикробным препаратам связана с тремя основными причинами:о диско-диффузионный метод не обладает 100% чувствительностью и не
позволяет выявить все антибиотикорезистентнь[е штаммы возбудителей;❖	сроки определения антибиотикорезистентности микроорганизмов с помо¬
щью диско-диффузионного метода часто не удовлетворяют врачей;
из-за трудоемкости методы серийных разведений антимикробных пре¬
паратов не получили широкого распространения в лабораториях лечебно¬
профилактических учреждений.Метод выявления ß-лактамаз микроорганизмов с использованием
нитроцефинового дискаТест с нитроцефином^' используют для быстрого выявления ß-лактамаз у
Staphylococcus spp., Haemophilus spp,, Enterococcus spp., N. gonorrhoeae, Moraxella
catarrhalis и некоторых других бактерий. Возбудители, продуцирующие
ß-лактамазы, гидролизуют содержащийся в бумажном диске хромогенный цефа-
лоспорнновый антибиотик нитроцефин*^, в результате происходит изменение
цвета диска. Положительный результат теста указывает на наличие у исследуемых
микроорганизмов ß-лактамазы и свидетельствует об устойчивости возбудителей к
пенициллинам. Отрицательный результат указывает на отсутствие у исследуемых
штаммов бактерий ß-лактамазы, однако не всегда свидетельствует о чувстви¬
тельности к пенициллинам. Это объясняется тем, что устойчивость возбудите¬
лей к ß-лактамным антибиотикам может быть связана с другими механизмами
резистентности (например, с изменением структуры пенициллин-связывающих
белков). Достоинства метода — быст1)0та получения результатов, высокая чув¬
ствительность и специфичность. Основной недостаток метода, препятствующий
широкому внедрению его в лабораторную практику, — высокая стоимость ком¬
мерческих дисков.Специальные методы обнаружения устойчивости Staphylococcus spp. к
оксациллину и ванкомицинуСкрининговые тесты определения чувствительности S. aureus к оксациллину
и ванкомицину основаны на использовании плотных питательных сред (среда
MRSA, представляюш;ая собой агар Мюллер-Хинтона с 4% хлорида натрия и6	мкг/'мл оксациллина, агар на сердечно-мозговой вытяжке с 6 мкг/мл ванкоми-
цина соответственно), Появление роста исследуемых штаммов стафилококков на
этих селективных средах свидетельствует об устойчивости к соответствующему
антимикробному препарату.Диско-диффузионный метод не позволяет выявлять штаммы стафилококков с
пониженной чувствительностью к ванкомицину, поэтому применение его с этой
целью не предусмотрено стандартами CLSI (2009).
шт308 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯДля быстрого выявления оксациллин-резистентных стафилококков (ORS)
разработаны тесты, позволяющие обнаруживать ген тес А в ПЦР, а также
пенициллин-связывающий белок 2а в реакции латексагглютинащ1и (находящий¬
ся в клеточной стенке ORS дополнительный пенициллин-связывающий белок 2а
кодируется геном тес А и обладает низким аффинитетом к ß-лактамам).Специальные методы обнаружения устойчивости Enterococcus spp. к
аминогликозидам и ванкомицинуСкрининговые тесты для выявления уровней резистентности Enterococcus spp.
к аминогликозидам включают диско-диффузионный метод (с использованием
дисков, содержащих 120 мкг гентамицина или 300 мкг стрептомицина), а также
чашечный и планшетный методы (на чашках Петри с сердечно-мозговым агаром
и в лунках полистиролового планшета с сердечно-мозговым бульоном соответ¬
ственно). Концентрация антибиотиков в плотных и жидких питательных средах
составляет 500 мкг/мл для гентамицина и 1000-2000 мкг/мл для стрептомицина.
Наличие роста исследуемых штаммов энтерококков вокруг дисков с гентамици¬
ном (стрептомицином) или на указанных питательных средах свидетельствует
о наличии у возбудителей высокого уровня резистентности к аминогликозидам.
Энтерококки с низким уровнем устойчивости считают потенциально чувстви¬
тельными к синергическим комбинациям пенициллинов и аминогликозидов (при
отсутствии высокого уровня резистентности к пенициллинам), а штаммы с высо¬
ким уровнем резистентности к аминогликозидам устойчивы к данным комбина¬
циям.Достаточно простым и чувствительным способом выявления ванкомицин-
резистентных энтерококков (VRE) является скрининговый тест на сердечно¬
мозговом агаре с 6 мкг/мл ванкомицина. Рост 2 и более колоний исследуемых
штаммов энтерококков в месте посева расценивают как предварительный положи¬
тельный результат на наличие VRE, однако необходимо подтверждение (диффе¬
ренциация с обладающими низким уровнем резистентности к этому антибиотикуЕ.	gallinarum, Е. casselißavus, E.ßavescens).Специальные методы обнаружения устойчивости Str. pneumoniae к бен¬
зилпенициллинуНесмотря на то, ''гго практически повсеместно отмечают рост устойчивости
Str. pneumoniae к ß-лактамным антибиотикам, бензилпенициллин остается одним
из наиболее важных антимикробных препаратов для лечения пневмококковой
инфекции. Основной механизм устойчивости пневмококков к бензилпенициллину
и другим ß-лактамам заключается в появлении мутантной ДНК в генах, кодирую¬
щих пенициллин-связывающие белки.Для выявления чувствительности Str. pneumoniae к бензилпенициллину исполь¬
зуют диски с оксациллином (1 мкг), поскольку диски с бензилпенициллином не
всегда позволяют определить штаммы с промежуточным уровнем резистентности.
Sfr. pneumoniae с зоной задержки роста вокруг диска с оксациллином >20 мм счита¬
ют чувствительными к бензилпенициллину и другим ß-лактамным антибиотикам
(ампициллину, амоксиклаву, цефотаксиму, имипенему) и не тестируют с данными
дисками. При выявлении колоний Str, pneumoniae с диаметрами зон задержки
роста вокруг дисков с оксациллином <19 мм необходимо определить чувстви¬
тельность к бензилпенициллину, меропенему и цефалоспоринам 1П поколения
(цефотаксиму или цефтриаксону) методом серийных разведений, поскольку такая
зона задержки роста характерна как для устойчивых, так и для промежуточных и
чувствительных штаммов.Методы выявления ß-лактамаз расширенного спектра действия у энте¬
робактерийß-Лактамазы — группа бактериальных ферментов, способных расщеплять
ß-лактамные антибиотики, содержащие в структуре циклическую амидную связь.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3Q9 ЩВнедрение в клиническую практику цефалоспоринов III поколения привело к
появлению и широкому распространению в лечебных учреждениях нового класса
(5-лактамаз расширенного спектра действия (Extended Spectrum Beta-Lactamases,Е8ВЕ). Характерные особенности этих ферментов:способность расщеплять пенициллины и цефалоспорины (за исключением
цефамицинов);ШШ❖	чувствительность к ингибиторам (клавулановая кислота, сульбактам, тазо- *1,
бактам);эпидемический характер распространения (локализация генов резистентно¬
сти в плазмидах).В настоящее время описано свыше 200 различных ß-лактамаз расширенного
спектра действия. Продукция ESBL у госпитальных штаммов микроорганизмов
ведет к формированию резистентности ко всем пенициллинам, цефалоспоринам
и монобактамам, что является причиной клинической неэффективности этих пре¬
паратов. Бактерии, продуцирующие ß-лактамазы расширенного спектра действия,
нередко проявляют ассоциированную устойчивость к антибиотикам других групп
(мультирезистентность). Например, резистентность данных микроорганизмов к
гентамицину в некоторых лечебных учреждениях достигает 80%, а к ципрофлок-
сацину — 40-60%. В данной ситуации карбапенемы — практически единственные
антибиотики, сохраняющие клиническую эффективность в отношении этих муль-
тирезистентных возбудителей,общепринятых рекомендаций в отношении подлежащего тестированию на
ESBL перечня микроорганизмов в настоящее время не существует. Чаще всего
исследования на наличие этих ферментов проводят у госпитальных штаммов
Klebsiella spp., E. coli и некоторых других энтеробактерий, у которых выявлена
пониженная чувствительность (МИК >2 мкг/мл или соответствующее умень¬
шение диаметра зоны задержки роста) хотя бы к одному из цефалоспоринов
III поколения. Эффективность выявления ESBL с помощью традиционного
диско-диффузионного метода остается крайне низкой. В связи с этим разра¬
ботаны специальные фенотипические методы их обнаружения, основанные
на эффекте подавления активности ß-лактамаз в присутствии клавулановой
кислоты (метод двойных дисков, обнаружение ESBL с помощью Е-теста, тест
Oxoid, метод CLSI). Однако следует подчеркнуть, что ни один из данных мето¬
дов не обеспечивает 100% детекцию ESBL у грамотрицательных аэробных
бактерий.Выявление продукции металл о-ß-лактамаз у грамотрицательных бак¬
терийОдна из частых причин устойчивости неферментирующих грамотрицательных
бактерий (Acinetobacter spp., Pseudomonas spp,) к ß-лактамным антибиотикам ~
образование металло-ß-лактамаз.Meтaллo-ß-лaктaмaзы принадлежат к молекулярному классу В и содержат в
активном центре фермента ионы двухвалентного цинка (Zn^*). В настоящее время
описано 5 генетических типов приобретенных металло-р-лактамаз — GIM, ШР,SIM, SPM и VIM. У госпитальных штаммов грамотрицательных бактерий чаще
всего обнаруживают типы ШР и VIM. Металло-ß-лактамазы обладают высокой
каталитической активностью и разрушают практически все ß-лактамные анти¬
биотики, включая цефалоспорины III-IV поколения и карбапенемы. Металло-ß-
лактамазы способны быстро распространяться в условиях лечебного учреждения,
поскольку кодирующие их гены локализованы внутри подвижных генетических
элементов. Сцепление в микробной клетке генов металло-ß-лактамаз с другими
детерминантами резистентности приводит к появлению мультирезистентных
штаммов грамотрицательных бактерий.
ш'ШШшш¥ШШ310 БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯПриобретенные металло-р-лактамазы чаще всего обнаруживают у НГОБ и
значительно реже — у энтеробактерий. Stenotrophomonas maltophiUa и Burkholderia
cepacia продуцируют видоспецифические металло-р-лактамазы, обусловливающие
природную резистентность данных микроорганизмов к карбапенемам.Активность металло-ß-лактамаз не подавляется классическими ингибитора¬
ми сериновых ß-лактамаз (клавулановая кислота, сульбактам, тазобактам), для
их инактивации требуется применение этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) или2-меркаптопропионовой кислоты. Для выявления металло-ß-лактамаз исполь¬
зуют метод двойных дисков с ЭДТА или ПЦР. Наиболее значимый маркер про¬
дукции металло-ß-лактамаз — пониженная чувствительность или резистентность
грамотрицательных бактерий к карбапенемам.Метод двойных дисков с ЭДТАМетод двойных дисков с ЭДТА основан на выявлении синергизма между
ß-лактамными антибиотиками (цефтазидимом, имипенемом и меропенемом) и
ЭДТА, который связывает ионы цинка в активном центре металло-ß-лактамаз и
подавляет действие этих ферментов в отношении ß-лактамов. При определении
чувствительности грамотрицательных бактерий диско-диффузионным методом
в присутствии ЭДТА отмечают расширение зон задержки роста микроорганизмов
вокруг дисков с цефтазидимом, имипенемом и меропенемом. Использование дис¬
ков с несколькими ß-лактамными антибиотиками повышает чувствительность
метода» поскольку некоторые штаммы грамотрицательных бактерий могут про¬
являть синергизм только с одним из перечисленных выше антимикробных пре¬
паратов.Чистую культуру исследуемого микроорганизма доводят до мутности 0,5 по
стандарту МакФарланда и с помощью тампона засевают на среду Мюллера-
Хинтона в чашке Петри, После подсыхания инокулума в центр чашки помещают
пустой диск, а на расстоянии 15 мм между центрами дисков укладывают диски с
цефтазидимом (30 мкг), имипенемом (10 мкг) и меропенемом (10 мкг). На пустой
диск наносят 5 мкл 0,5 М раствора ЭДТА (pH 8,0). Посевы инкубируют в термо¬
стате при температуре 35 “С в течение 16-18 ч. Параллельно с исследованием
испытуемых культур проводят анализ контрольных штаммов микроорганизмов.
Расширение зоны подавления роста бактерий между хотя бы одним из дисков с
ß-лактамными антибиотиками и диском с ЭДТА указывает на продукцию металло-
ß-лактамаз у исследуемого штамма (рис. 20-5).Чувствительность и специфичность обнаружения металло-ß-лактамаз методом
двойных дисков с ЭДТА составляет 96,4 и 99,1% соответственно.Рис. 20-5. Выявление продукции металло-р-лактамаз у грамотрицательных бактерий методом
двойных дисков с ЭДТА. А и Б — отсутствие металло-р-лактамаз у исследуемых штаммов бак¬
терий.
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗЦРис. 20-5. Окончание. В и Г — наличие металло-р-лактамаз у исследуемых штаммов бактерий.Выявление металло-р-лактамаз с помощью мультиплексной ПЦРОбнаружение металло-р-лактамаз с помощью ПЦР основано на выявлении наи¬
более распространенных типов генов (ШР и VIM), кодирующих эти ферменты. В
реакции используют 2 пары праймеров к внутренним участкам генов и
Продукты амплификации детектируют с помощью электрофоретического анализа,
а также в режиме реального времени. Метод мультиплексной ПЦР для выявления
металло-р-лактамаз грамотрицательных бактерий обладает 100% чувствительно¬
стью и специфичностью.
Глава 21
Частная микробиологияI. ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ
ХЛАМИДИИТАКСОНОМИЯХламидии относятся к семейству Chîamydiaceae а-протеобакте-
рий. Ранее хламидии подразделяли на 3 вида: Chi trachomatis (воз¬
будитель трахомы-лимфогранулемы, урогенитального хламидиоза
и ряда других болезней человека), СЫ. psittaci (возбудитель орни-
тоза и хламидиозного аборта овец), СМ. pneumoniae (возбуди¬
тель пневмонии человека). Сравнение 16S и 23S рибосомальной
РНК, биохимических, серологических и экологических свойств
этих видов привело к изменению классификации. Стали выделять9	видов, разделенных на 2 рода: Chlamydia (СМ. trachomatis, Chi muri-
darum и СЫ suis) и Chlamydophila (Chi abortus, Chi. caviae, Chlfelus,
Chi pecorum, Chi pneumonia и Chi psittaci).В этом разделе приведена детальная информация о СЫ. trachoma¬
tis, а также о принципах и методах ее диагностики.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА CHL TRACHOMATISСЫ. trachomatis — грамотрицательная бактерия, являющаяся
облигатным вн)Т'риклеточным паразитом человека. Биологическим
своеобразием хламидий, которое заключается в энергозависимом
паразитизме и уникальном цикле развития, определяется самостоя¬
тельное положение данных микроорганизмов в системе прокариот.Хламидии имеют сходную структуру с липополисахаридным
антигеном и распознаются моноклональными антителами, специ¬
фичными к трисахаридному фрагменту alphaKdo-(2-8)-aIphaKdo-
(2-4)-alphaKdo липополисахарид (ЛПС). Именно поэтому многие
из них в ПИФ и серологических тестах идентифицируются как
СЫ. trachomatis. СЫ trachomatis имеет 2 биовара и 15 сероваров,
вызывает трахому, урогенитальные заболевания, некоторые формы
артрита, конъюнктивит и пневмонию новорожденных. Возбудитель
урогенитального хламидиоза — СЫ trachomatis сероваров D, Da, Е,F,	G, Н, I,la,J, К.Хламидии отличаются от других бактерий уникальным жиз¬
ненным циклом, который включает последовательную смену двух
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 313высокоспециализированных форм, адаптированных для внутри- и внеклеточного
существования.Элементарные тельца — внеклеточная инфекционная форма хламидий.
Элементарные тельца имеют размер 250-500 нм, овальную форму, окружены
ригидной малопроницаемой клеточной стенкой и содержат плотный нуклеотид
и обезвоженный протопласт, что обеспечивает резистентность к факторам внеш¬
ней среды при переносе от клетки к клетке и от одного хозяина к другому. Цикл
развития хламидии происходит только внутри вакуолей, связанных с мембраной
клетки-хозяина, где элементарные тельца последовательно преобразовываются в
более крупные — ретикулярные.Ретикулярные тельца обладают полиморфизмом и могут иметь округлую,
овальную, полулунную форму, не имеют постоянного размера (величина варьиру¬
ет от 300 до 1000 нм), не обладают инфекционными свойствами, не имеют нуклео¬
тида, проницаемы для трипсина и разрушаются ультразвуком. Ретикулярные
тельца — так называемая вегетативная внутриклеточная форма, способная к росту
и делению.в клинических исследованиях показано, что одни антибактериальные средства
могут действовать на стадии превращения элементарных телец в ретикулярные,
другие — во время бинарного деления ретикулярных телец. Элементарные тельца
обычно локализуются в крупных внутриклеточных включениях, ретикулярные —
в образованиях, ограниченных мембраной.Инкубационный период хламидиоза длится 5-30 дней с момента заражения (в
среднем 10-14 дней). Первый этап инфекционного процесса — адсорбция элемен¬
тарных телец хламидий на плазмалемме чувствительной клетки организма хозяи¬
на под действием электростатических сил. Внедрение хламидии происходит путем
эндоцитоза в течение 7-10 ч. При этом элементарные тельца, внедряясь в клетку,
используют для роста и размножения клеточную АТФ и через 6-8 ч превращаются
в peтиí(yляpныe тельца. Хламидии способны синтезировать в небольших количе¬
ствах собственную АТФ, отдельные аминокислоты, накапливать гликоген, однако
в основном они существуют за счет макроергических соединений и биологиче¬
ских субстратов клетки хозяина. В процессе роста и деления ретикулярных телец
образуются микроколонии — хламидийные включения (тельца Гальберштадтера-
Провачека). В течение 18-24 ч развития они локализуются в цитоплазматическом
пузырьке, образованном из мембраны клетки-хозяина.Вступая во взаимодействие с чувствительными клетками, хламидии являются
активными паразитами, используя различные факторы патогенности. Проникнув
в клетку, жизнеспособные хламидии проявляют строго специфическую актив¬
ность, направленную против лизосом с окружающей их фагоцитарной вакуолью,
ограниченной участком цитоплазматической мембраны клетки-хозяина, отде¬
лившимся при поглощении фагоцитом возбудителя инфекции. Таким образом,
они выключают важнейший защитный механизм клетки хозяина — фагоцитоз,
обеспечивая себе возможность дальнейшего размножения в цитоплазматическом
включении клеток макроорганизма. В патогенезе урогенитальных хламидиозов,
помимо непосредственного действия возбудителя на инфицированные клетки
эпителия, выстилающего мочеполовые пути, повреждения окружающих тканей
гидролитическими лизосомальными ферментами, выбрасываемыми из инфици¬
рованных клеток в период размножения микроорганизма, и токсического влияния
продуктов аутолиза разрушенных клеток, существенное значение имеет токсиче¬
ская активность, свойственная всем хламидиям. В микроколониях может содер¬
жаться от 100 до 500 элементарных телец. Процесс созревания и трансформации
ретикулярных телец путем превращения в элементарные тельца занимает 36-42 ч.
Полный цикл репродукции происходит за 48-72 ч и завершается разрушением
пораженной клетки. Хламидии могут высвобождаться из инфицированной клетки
314ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯШШШпутем экзоцитоза, сохраняя ее жизнеспособность, что приводит к бессимптомному
течению хламидийной инфекции.При неблагоприятных биохимических условиях продолжительность жизненно¬
го цикла хламидий может значительно увеличиваться. В результате размножения
Chi trachomatis в инфицированных эпителиальных клетках развивается воспали¬
тельный процесс, выраженность которого зависит от состояния местного и обще¬
го специфического и неспецифического иммунитета. После инвазии хламидий
образуется комплемент, который приводит к стимуляции гранулоцитов. Эта вос¬
палительная реакция сопровождается локальной гибелью клеток и разрушением
ткани, что дополняется высвобождением фосфолипазы А2 и простагландинов, что
приводит к отеку и гиперемии слизистой оболочки, нарушению целостности эпи¬
телиального слоя с частичной десквамацией эпителия. Превращение ретикуляр¬
ных телец в элементарные не только требует энергии, но и зависит от присутствия
биологических субстратов, среди которых важнейшее место занимает триптофан.
В процессе воспаления лимфоциты выделяют цитокины, в том числе у-ИФН,
который индуцирует внутриклеточную индоламиндиоксигеназу, разрушающую
триптофан. Снижение содержания триптофана приводит к гибели хламидий или
замедлению процессов репликации, при этом в эпителиальной клетке начинают
накапливаться неинфекционные, неделящиеся ретикулярные тельца. Цикл раз¬
вития хламидий приостанавливается, однако, несмотря на неблагоприятные усло¬
вия, ретикулярные тельца сохраняют свою жизнеспособность (персистируют).
Дальнейшее развитие и исход данного состояния зависят от уровня содержания
триптофана. Уменьшение содержания у-ИФН и увеличение внутриклеточного
пула триптофана приводит к редифференцировке персистирующих форм хлами¬
дий в инфекционные элементарные тельца, их выходу из клетки и продолжению
инфекционного процесса.Клеточная стенка хламидий состоит из двух двойных мембран — внутренней
(цитоплазматической) и наружной, что обеспечивает прочность клеточной стенки.
Антигенные свойства хламидий определяются внутренней мембраной, которая
представлена липополисахаридами. ЛПС имеют две антигенные детерминанты.
Первая — родоспецифическая детерминанта, реактивная половина которой пред¬
ставлена 2-кето-З-дезоксиоктановой кислотой, используется при диагностике
заболевания иммунофлюоресцентными методами с применением специфических
антител. Вторая — антигенная детерминанта — дает перекрестные реакции с неко¬
торыми грамотрицательными бактериями.Во внутреннюю мембрану интегрированы так называемые белки наружной
мембраны (ОМР). На основной белок наружной мембраны (МОМР) приходится
60% общего количества белка. Остальная антигеннная структура представлена
белками наружной мембраны второго типа — ОМР-2 (насыщенным цистеином
белком с молекулярной массой 60 кДа). МОМР и ОМР-2 определяют видо- и
типоспецифичность хламидий, хотя из-за наличия участков с высоким сход¬
ством внутри рода возможны перекрестные реакции между различными видами
(табл. 21-1).Таблица 21-1. Антигены Chi. trachomatis (по Mardh P.A., 1990)АнтигенХимический составпримечанияОбщий для разных хламидийЛПСТри различных антигенных доменаВидоспецифическийБелокБолее 18 различных компонентов 155 кДа у
Chi. trachomatis, эпитопы в белке 40 кДа, белок
теплового шока hsp'60ТипоспецифическийБелокЭпитопы в 40 кДа протеине (МОМР), протеине
30 кДа у серотипов А и В
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 315МОМР и богатые цистеином белки соединены дисульфидными СВЯЗЯМИ-
Обнаружено 5 генов дисульфидсвязанных изомераз, играющих роль при диф¬
ференциации элементарных телец в ретикулярные, у chi trachomatis выявлено9	генов, кодирующих ОМР. МОМР считается первичным местом взаимодействия
с Т-лимфоцитами у СЫ. trachomatis. Соответственно гуморальный иммунный ответ
направлен против вариабельных поверхностно-экспонированных доменов дан¬
ного белка. Присутствие МОМР СЫ. trachomatis в ткани маточных труб женщин
связывают с бесплодием и хроническим сальпингитом, а также с билатеральной
окклюзией маточных труб. Средний титр антихламидийных IgG значительно
выше у пациентов с МОМР по сравнению с больными, у которых данный анти¬
ген не выявлялся. ОМР-2 СЫ. trachomatis также является участком связывания с
иммунной системой, Инвазивность хламидий связывают со строением углеводной
части главного ЛПС их внешней мембраны. Выявлены токсичность и спермицид-
ные свойства ЛПС клеточной стенки хламидий для сперматозоидов.В составе хламидий имеется белок теплового шока (БТШ), который по анти¬
генному составу гомологичен БТШ человека, Персистирующие формы хламидий
способствуют образованию высокоиммуногенного БТШ с молекулярной массой
60 кДА (БТШ-60). При развитии инфекционного процесса значительно повыша¬
ется синтез БТШ хламидий для защиты от внешних иммунологических механиз¬
мов. Иммунный ответ организма хозяина на БТШ может быть как защитным, так
и патологическим.Существует мнение, что образуемые в организме хозяина противохламидий-
ные антитела одновременно являются аутоантителами к собственному БТШ-60,
который представляет собой один из первых белков, синтезируемых в организме
женщины эпителиальными клетками decidua bazalis после оплодотворения. На
ранних стадиях беременности у женщины с хронической хламидийной инфекцией
экспрессия БТШ-60 может реактивировать лимфоциты, сенсибилизированные
хламидийным БТШ>60, что приводит к отторжению эмбриона. Данный механизм
может иметь существенное значение в патогенезе женского бесплодия. Доказано
наличие клинических и гистологических корреляций иммунореактивности к
СЫ. trachomatis и эпитопам БТШ-60 у женщин с эктопической беременностью и
женщин с самопроизвольными выкидышами, У них регистрировались специфи¬
ческие антитела к 13 синтетическим пептидам, соответств}тощим главным эпи¬
топам БТШ-60. Сальпингит был обнаружен примерно у половины пациенток с
внематочной беременностью, его наличие коррелировало с выявлением антител
к двум эпитопам БТШ-60, Пациентки с эктопической беременностью имели боль¬
ший уровень антихламидийных IgG по сравнению с больными с внутриматочной
локализацией беременности. Б группе инфицированных Chi trachomatis женщин,
у которых выявлялись специфические антитела к эпитопам БТШ-60, отмечалась
большая частота возникновения сальпингита и спаечного процесса в области при¬
датков матки. Пациентки, у которых выявлялись специфические антитела только
к СЫ. trachomatis, не отличались от серонегативных женщин по данным катего¬
риям, поэтому полагают, что индукция спаечного процесса в области придатков
матки в присутствии СЫ. trachomatis определяется наличием специфических анти¬
тел к БТШ-60.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИСЫ trachomatis вызывает у человека ряд заболеваний: трахому, паратрахому,
венерическую лимфогранулему, урогенитальный хламидиоз, конъюнктивит и
пневмонию новорожденных.Резервуаром инфекции служит человек (животные в естественных условиях к
этой хламидии невосприимчивы). Около 5% мужчин и 10% женщин являются
бессимптомными носителями.ш
316 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯОсновные пути передачи — половой, перинатальный и бытовой (при близких
контактах с источником инфекции).Трахома и паратрахома. Заболевание распространено повсеместно: ежегодно
в мире заболевает до 400-500 млн человек, из которых у 10-20 млн трахома ста¬
новится причиной потери зрения. В нашей стране заболеваемость резко снизилась
после массовых профилактических мероприятий в 20-30-х гг.Инкубационный период колеблется от 8 до 16 дней. Чаще поражаются оба
глаза. Болезнь носит хронический характер и протекает постадийно:•	на первой стадии резко выражено воспаление, на фоне гиперемии и инфиль¬
трации конъюнктивы в области переходных складок и век появляются круп¬
ные фолликулы и сосочки;•	на второй стадии часть фолликулов распадается, часть сливается друг с дру¬
гом, что придает конъюнктиве студенистый вид, появляются рубцы. На этой
стадии больные наиболее контагиозны;•	на третьей стадии превалирующим становится процесс рубцевания конъ¬
юнктивы, хотя сохраняются признаки воспалительного процесса, роговица
мутнеет, может формироваться заворот век;•	на четвертой стадии конъюнктива имеет белесый вид, с большим количе¬
ством звездчатых по форме рубцов, признаки воспаления отсутствуют.Интенсивность симптоматики может варьировать в широких пределах, а
описанные выше клинические проявления в ряде случаев бывают стертыми и
труднораспознаваемыми. Одну из форм болезни с наиболее доброкачественным
течением принято называть паратрахомой. Этот синдром, вызываемый уроге¬
нитальными сероварами возбудителя, начинается с острого конъюнктивита, для
которого характерны резкая гиперемия конъюнктивы век и переходных складок,
ее отек и инфильтрация. Типично появление крупных рыхлых фолликулов, рас¬
положенных рядами в нижнем своде; в дальнейшем фолликулы могут сливаться,
образуя горизонтально расположенные валики. Однако, в отличие от трахомы,
фолликулы конъюнктивы полностью исчезают без образования рубцов. Болезнь
протекает остро, изредка принимая подострое или хроническое течение.Урогенитальный хламидиоз. Урогенитальный хламидиоз проявляется двумя
основными формами:•	уретритом, который начинается незначительным зудом, дизурией, умерен¬
ным появлением серозных, реже серозно-гнойных выделений из )'ретры.
Первоначально поражается передний отдел уретры, в последующем инфек¬
ция может распространяться восходящим путем, поражая предстательную
железу. Симптоматика этой формы инфекции может значительно меняться
при смешанном течении хламидиоза с другими венерическими болезнями
(в первую очередь трихомонозом), поскольку трихомонады фагоцитируют
Chi trachomatis, перенося в непораженные отделы уретры;•	цервицитом, проявляющимся серозно-гнойным воспалением задней части
влагалища и шейки матки.Урогенитальный хламидиоз нередко вызывает осложнения со стороны мочепо¬
ловой и других систем органов. Из таких осложнений наиболее часто регистрируют
эпидидимит, орхоэпидидимит (способен вызывать бесплодие), реже стриктуру уре¬
тры, геморрагический цистит и системные поражения, в том числе синдром Райтера.
Последний характеризуется последовательным развитием у больного уретрита,
поражений глаз (конъюнктивита, иридоциклита, увеита) и реактивного артрита.Клиническая картина разных форм урогенитального хламидиоза и их ослож¬
нений неспецифична, напоминает симптоматику ИППП другой этиологии. Кроме
того, инфекция нередко протекает бессимптомно. Это диктует необходимость
использования лабораторных методов диагностики для постановки окончатель¬
ного диагноза.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ317Перинатанальный хламидиоз новорожденных. Возникает в результате
заражения детей во время родов. Может протекать бессимптомно (чаще всего
возбудитель локализуется в носоглотке). При остром течении инфекции у детей
в первые несколько суток после рождения развивается конъюнктивит (данный
синдром часто называют бленнореей с включениями). Прогрессирующая коло¬
низация носоглотки может вызывать у младенцев в течение первых 3 мес жизни
пневмонию.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАЛабораторная диагностика инфекции СМ. trachomatis включает выявление
антигенов хламидий в реакции иммунофлюоресценции (РИФ) и одноэтап¬
ном иммунохроматографическом тесте (ИХТ), выделение их на лабораторных
моделях перевиваемых клеточных культур, обнаружение генома хламидий
молекулярно-биологическими методами и выявление специфических антител в
крови.Диагноз хламидиоза считается подтвержденным при положительном резуль¬
тате метода культуры клеток или двух других методов. Важно выбрать из них
надежные, которые позволят правильно поставить диагноз и своевременно прове¬
сти и проконтролировать специфическое лечение, в спорных случаях предлагают
использовать еще один дополнительный метод — арбитражный.Для того чтобы правильно выбрать способ диагностики инфекций, ассоцииро¬
ванных с СЫ. trachomatis, необходимо сравнить методы, которыми пользуется каж¬
дая конкретная лаборатория, оценить их чувствительность, специфичность, про¬
гностическую значимость положительного и отрицательного результата. Первое
требование к эффективному исследованию при подозрении на хламидиоз — выбор
надежных диагностических тестов. В табл. 21-2 представлены различные методы
лабораторной диагностики хламидийной инфекции, рекомендуемые ECDC, указа¬
ны их достоинства и недостатки.Таблица 21-2. Методы диагностики хламидиозаДиагностические методыПреимуществаНедостаткиТесты амплификации нуклеи¬
новых кислот
{ПЦР, 80А. ТОА)Высокая чувствительность (90-95%),
возможность использования для
исследования образцов мочи и вуль¬
вовагинальных смывов, в том числе
взятых лациентками самостоятельно,
при экстрагенитальной локализации
хламидиоза, в частности ректальнойВысокая стоимость, возможны
ложноположительные результаты,
не лицензированы для экстраге-
нитальной локализацииИФАМожет быть адаптирован для единич¬
ных исследований, низкая стоимостьНизкая чувствительность
(40-70%), не подходит для иссле¬
дования образцов мочи и само¬
стоятельно взятых образцовКультуральный методВозможность использования для
исследования всех типов образцов,
высокая специфичностьНизкая чувствительность
(60-50%), высокая стоимость,
трудоемкость, требует высокой
квалификации исследователя, не
подходит для массовых иссле¬
дованийРИФВозможность использования для
исследования всех типов образцов,
быстрое получение ответаНизкая чувствительность при
исследовании образцов мочи,
трудоемкость, необходимость
подтвержденияОписаны новые варианты СЫ. trachomatis, которые могут не определяться стан¬
дартными методами. В этих случаях необходимо повторное исследование образца
с использованием нескольких методов.
<318 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯВзятие материала для исследованийЭффективность диагностики хламидийной инфекции зависит от правильности
взятия клинического материала, условий его доставки в лабораторию и исполь¬
зования высококачественных диагностических тестов. Для обнаружения хлами-I	дий исследуют различный клинический материал, чаще всего мазки-соскобы со
^	слизистой оболочки уретры у мужчин и из цервикального канала и слизистойоболочки уретры у ЖЄНЩИН. С внедрением методов молекулярной биологии стало
>	возможным получение неинвазивных клинических образцов, таких как свободновыпущенная моча у мужчин и отделяемое влагалища у женщин. При необходимо¬
сти материал для исследования берут из прямой кишки, носоглотки, конъюнктивы
нижнего века. У детей исследуют отделяемое конъюнктивы нижнего века, задней
стенки глотки, вульвы у девочек. По клиническим показаниям возможно иссле¬
дование биопсийных и операционных материалов. Материал можно получать с
помощью ложечки Фолькманна, специальной щеточки или дакронового зонда-
тампона.Качество полученного клинического материала зависит от общего состояния
пациента на момент взятия мазка. Наиболее информативен клинический матери¬
ал, полученный при условиях, когда:•	исследование проводилось при клинических признаках заболевания;•	пациент не использовал лекарственные средства местного применения в
последние 48-72 ч;•	больной не принимал антибактериальные препараты в последние 3-4 нед;•	у женщин при исследовании отделяемого или мазков'соскобов из урогени¬
тального тракта взятие образцов проводилось приблизительно в середине
менструального цикла (если заболевание не имеет явных проявлений) или в
дни, когда отсутствовали кровянистые выделения (при обострении инфекци¬
онного процесса);•	у мужчин взятие образцов из уретры проводилось при задержке мочеиспу¬
скания в течение 1,5-2 ч.Несоблюдение этих условий может влиять на качество исследования и искажать
его результаты.Для исследования материалов, полученных из цервикального канала, уретры,
прямой кищки, носоглотки, конъюнктивы, а также биопсийных и операционных
материалов, чаще пользуются культуральным методом, ПИФ, ПЦР и ИФА. Для
исследования первой порции мочи и отделяемого влагалища применяют только
ПЦР.При взятии материала для этих исследований рекомендуют придерживаться
приводимых ниже рекомендаций.Взятие материала для РИФ и ИХТ. У мужчин при наличии выделений из уре¬
тры поверхность головки полового члена и область наружного отверстия уретры
должны быть очищены с помощью марлевого тампона, а крайняя плоть отведена
назад для предупреждения контаминации материала посторонней микрофлорой.
Специальную цитощеточку вводят на 1,5-2 см в уретру, вращают в течение 15 с и
выводят.У женщин образец из уретры берут так же, как и у мужчин. При большом количе¬
стве выделений наружное отверстие уретры должно быть предварительно очищено
с помощью ватного тампона. Образец из шейки матки берут с помощью влагалищ¬
ного зеркала и дакронового зонда-тампона, одноразовой цервикальной щеточки
или ложечки Фолькманна. Необходимо тщательно очистить наружное отверсгае
цервикального канала от влагалищных выделений с помощью большого марлевого
тампона, что предотвратит контаминацию проб посторонней микрофлорой. После
введения в цервикальный канал на 1-2 см зонд-тампон вращают несколько раз.
Исследуемый материал переносят с зонда-тампона на предметное стекло.
ш-штяЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 319Для взятия мазка с конъюнктивы необходимо провести зондом-тампоном по
нижнему веку.	ШДля взятия мазка из носоглотки специальным тампоном проводят по задней
стенке глотки.Взятый материал помещают на обезжиренное предметное стекло вращатель¬
ным движением, при этом цитощеточкой прокатывают по стеклу.Препараты высушивают на воздухе при комнатной температуре.Взятие материала для культурального исследования. Клинический мате¬
риал, предназначенный для изоляции хламидий в культуре клеток, помещают
в стерильные контейнеры со специальной транспортной средой для хламидий.Правила взятия материала аналогичны приведенным выше. Для забора материала
используют цитощеточки и зонды-тампоны, которые помещают в специальные
пробирки с транспортной средой. При отсутствии транспортной среды промыш¬
ленного производства ее готовят из среды ЕРМ1-1640, в которую добавляют 5%
фетальной сыворотки или сыворотки крови крупного рогатого скота, антибио¬
тики (бензилпенициллин, стрептомицин, гентамицин, канамицин) и преднизолон
(3 мкг/мл). Среды, не предназначенные для этой цели, могут быть токсичными
для клеток, что приводит к ложноотрицательным результатам исследования.Взятие материала для молекулярно-биологических исследований.
Клинический материал для молекулярно-биологических исследований собирают
в пробирки типа «Эппендорф» с транспортной средой, рекомендуемой произво¬
дителем тест-системы.Первую порцию свободно выпущенной мочи в количестве 5-10 мл собирают
после тщательного туалета гениталий в стерильную сухую пробирку.Взятие крови для серологического исследования. Для серологического
исследования в сухую пробирку без консерванта берут капиллярную или венозную
кровь объемом 1,0-1,5 мл. Предпочтительнее пользоваться специальными ваку¬
умными пробирками, предотвращающими заражение проводящего венепункцию
персонала и гемолиз отбираемых проб. С этой целью можно применять вакуумные
пробирки без наполнителей или с ускорителями свертывания крови.Транспортировка материала. Материалы, предназначенные для культураль¬
ной диагностики, необходимо хранить в холодильнике при температуре 4-6 "С и
в течение 4 ч доставить в лабораторию. Пробы доставляют в лабораторию по воз¬
можности в течение 1,5-2 ч после забора или хранят при 2-6 '"С в течение 1 сут.При необходимости их можно заморозить при температуре -20 °С и доставить в
лабораторию в течение 48 ч, обложив льдом. Исследование требует сохранения
живых хламидий, поэтому колебания температуры при транспортировке могут
сыграть решающую роль в получении достоверного результата. Во избежание
этого транспортировку проб осуществляют в термосумках; с помощью специаль¬
ных индикаторов можно судить об изменениях в них температуры.Препараты, предназначенные для исследования иммунолюминесцентными
методами, необходимо в тот же день доставить в лабораторию. В случае необходи¬
мости препараты, фиксированные в течение 1-2 мин холодным ацетоном, можно
хранить при температуре 6 '’С в течение 3 дней, а при температуре -20 °С — 1 мес.Образцы с материалом для ПЦР можно хранить не дольше 3 дней до отправки
в лабораторию при температуре 4 X.Пробы мочи должны быть доставлены в лабораторию не позднее 24 ч после
сбора. При необходимости данные образцы можно хранить в течение 1 мес при
температуре -20 "С.Кровь для серологического исследования доставляют в лабораторию в течение
4 ч. После отделения плазмы крови материал хранят в течение 3-4 мес при темпе¬
ратуре -20 °С.
320ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯОбнаружение возбудителя в клиническом материалеЛюминесцентной микроскопией выявляют хламидии в мазках клинического
материала и зараженных культур клеток, приготовленных на предметных стеклах.
Высушенные на воздухе препараты фиксируют охлажденным до 4 X ацетоном
в течение 10 мин. Затем их обрабатывают специфическими моно- или поликло¬
нальными антителами, меченными флюоресцеином. Дальнейшую обработку
препаратов, учет и оценку результатов проводят в соответствии с инструкцией к
диагностической тест-системе.Чувствительность и специфичность РИФ при анализе клинического материала
на наличие хламидий составляют 80-90 и 98-99% соответственно. Однако он не
предназначен для исследования материалов, полученных из прямой кишки, носо¬
глотки, а также проб мочи. Для его проведения нужны дорогостоящие реактивы
(иммунофлюоресцирующие антитела) и специальная аппаратура.Одноэтапные хроматографические тесты находят все более широкое при¬
менение в медицинской практике. Их преимущества состоят в простоте, низкой
стоимости, возможности получения результата в течение 5-10 мин (это дает воз¬
можность использовать их непосредственно у постели больного или во время его
первичного осмотра в поликлинике). Разработаны такие тесты и для диагностики
инфекции СЫ. trachomatis. На нитроцеллюлозных тест-полосках сорбирован конъ¬
югат частиц коллоидного золота с моноклональными антителами к липополисаха¬
ридному антигену бактерии. При наличии в тестируемом клиническом материале
мочи, смывов из половых органов и уретры конъюгат формирует цветную полосу.
Данный метод не позволяет дифференцировать инфекции разных хламидий,
поскольку их липополисахариды дают перекрестные реакции. Другой существен¬
ный недостаток выпускаемых в настоящее время тест-систем PIXT состоит в их
невысокой чувствительности, что позволяет использовать их преимущественно
для скрининга: отрицательный результат ИХТ не доказывает отсутствия у пациен¬
та хламидиозной инфекции и нуждается в подтверждении результатами исследо¬
вания проб другими методами.Изоляция и идентификация возбудителяОдин из наиболее объективных методов лабораторной диагностики инфекции —
выделение СЫ. trachomatis из пораженных тканей в культуре клеток. Он трудое¬
мок и длителен — для получения ответа требуется от 7 до 14 дней. В то же время
культуральный метод уступает другим методам в чувствительности, которая при
исследовании одного образца из цервикального канала составляет 75-80% по
сравнению с РИФ и 40-60% по сравнению с ПЦР. Изоляты, выделенные в культу¬
ре клеток, идентифицируют в РИФ или ИФА.Клеточные культуры перевиваемых линий (МсСоу, L929) первоначально выра¬
щивают во флаконах из нейтрального стекла или пластика в питательной среде
RPMM640 с добавлением 10% фетальной сыворотки и антибиотиков. После фор¬
мирования на стенке флакона клеточного монослоя питательную среду полностью
удаляют, клетки промывают раствором Хенкса, покрывают подогретым до 37 '’С
раствором Версена и помещают флакон в термостат при температуре 37 '’С на
несколько минут до набухания клеток. Затем раствор Версена полностью удаляют
и вносят свежую питательную среду. Количество вносимой питательной среды
должно быть в 4 раза меньше ростовой. Клетки тщательно суспендируют и под¬
считывают концентрацию с помощью камеры Горяева. Посевная концентрация
клеток составляет 150 000-200 ООО клеток в 1 мл. Суспензию клеток разливают по2	мл в стеклянные флакончики с пластинкам и-подложками из покровных стекол.
Инкубируют клетки в термостате при 37 °С в наклонном положении под углом
7-10“ до образования клеточного монослоя.Перед заражением все флаконы просматривают под малым увеличением инвер¬
тированного микроскопа, отбраковывая те из них, которые не имеют сплошного
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ321клеточного монослоя. Из флаконов с клеточными культурами, предназначен¬
ных для выделения хламидий, полностью удаляют питательную среду. Каждый
исследуемый материал вносят не менее чем в 2 флакона в таком объеме, чтобы
пластинка с клетками была полностью покрыта (не менее 0,3 мл). Пробирки
на 1,5-2 ч помещают в термостат для адсорбции хламидий, затем исследуемый
материал удаляют, монослой клеток однократно промывают раствором Хенкса и
вносят во флаконы поддерживающую среду без антибиотиков с 2% сывороткой
и 3 мкг/мл преднизолона. Флаконы помещают в термостат при 36 ‘'С на 72 ч.
После окончания срока инкубации пластинки извлекают из флаконов, промывают
0,9% раствором NaCl, высушивают, приклеивают к предметному стеклу клеем БФ-2
клеточным монослоем вверх и фиксируют в охлажденном ацетоне. Выявление
хламидий в препаратах клеточных культур проводят с помощью ПИФ.Выделение СЫ trachomatis в культуре клеток позволяет не только диагностиро¬
вать инфекцию, но и определить чувствительность выделенного изолята к антими¬
кробным препаратам, что необходимо для выбора наиболее эффективных средств
лечения пациента. С этой целью проводят 2 слепых пассажа клинических образцов
на клеточных культурах с увеличением числа заражаемых флаконов в первом
пассаже до 4, во втором — до 10. Перед заражением культуры клеток исследуемый
материал подвергают предварительному замораживанию и оттаиванию для более
полного выхода возбудителя в питательную среду. После третьего пассажа из
одного флакона вынимают пластинку-подложку и проводят оценку степени нако¬
пления хламидий с помощью иммунофлюоресцентного анализа. Из оставшихся9	флаконов готовят смешанную пробу. При накоплении хламидий в контрольной
пробирке более чем на 3+ проводят анализ на антибиотикорезистентность.Для этого флаконы с культурой клеток засевают изолятом хламидий и поме¬
щают в термостат при температуре 36 °С, Начиная с первых суток в них вносят
антибиотики в среде RPMI-1640 в трех концентрациях — среднетерапевтической,
в 2 раза большей и в 2 раза меньшей. Например, при среднетерапевтической суточ¬
ной дозе доксициклина 0,1 г тестируют разведения 50,100 и 200 мкг/мл. На каж¬
дое из них берут не менее 2 флаконов. Через 5 сут пластинки-подложки извлекают
из флаконов, промывают 0,9% раствором NaCl, высушивают, закрепляют на пред¬
метном стекле, фиксируют, окрашивают люминесцирующей сывороткой и оце¬
нивают антибиотикорезистентность с помощью люминесцентной микроскопии,о	чувствительности хламидий к антибиотикам судят по отсутствию в препарате
люминесцирующих морфологически типичных элементов.Молекулярная диагностикаНаиболее перспективными и высокочувствительными методами обнаружения
хламидий являются молекулярно-биологические — ПЦР, реакция гибридиза¬
ции, РНК-детекция, SDA, NASBA. ПЦР, проводимая в режиме реального вре¬
мени (ПЦР-РВ), позволяет совместить амплификацию с детекцией накопления
ее продуктов в период проведения реакции, в реакционную смесь добавляют
флюоресцентно-меченые зонды (ФМ-зонды), при появлении специфического
продукта амплификации зонды гибридизуются с ним, вызывая увеличение уровня
флюоресцентного сигнала, который считывается флюориметрическим детекто¬
ром; обработка сигнала ведется с помощью программного обеспечения прибора.
Применение ПЦР-РВ не предполагает постамплификационный анализ продуктов
реакции и извлечение контаминационно опасного содержимого пробирок. Общее
время исследования позволяет получить результат уже через 1,5-2 ч после посту¬
пления клинического материала в лабораторию. Данный метод обеспечивает
количественную оценку содержания ДНК микроорганизма в клинической пробе,
так как установлена прямая зависимость исходного количества амплифицируемой
ДНК от начала регистрации флюоресцентного сигнала. На основании этого были
разработаны протоколы определения концентрации ДНК-возбудителей.
<!'?	322 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯСуществует корреляция между выраженностью клинических проявлении при
хламидийной инфекции и концентрацией СЫ. trachomatis в отделяемом урогени-
тального тракта. При анализе причин неудачи лечения некоторых пациентов с
хламидиозом было выдвинуто предположение о возможной связи между исхо-
ШШР'	высокой плотностью колонизации хламидиями и формированием гетероти-пической устойчивости хламидий к антибактериальным препаратам. Возможно,
определение исходной концентрации ДНК СЫ. trachomatis позволит прогнозиро-
вать ответ на антибактериальную терапию и выбирать наиболее оптимальную
схему лечения. Выявление низкой концентрации ДНК СМ. trachomatis в отделяе¬
мом урогенитального тракта позволит более объективно оценивать и объяснять
несовпадающие результаты амплификационных и неамплификационных методов
диагностики хламидийной инфекции.В качестве альтернативы ПЦР, в основе которой лежит принцип удвоения
генетического материала при делении клеточных систем, предложен метод, моде¬
лирующий in vitro репликацию ретровирусов, где мишенью для амплификации
сл)^жит одноцепочечная молекула РНК. Метод, названный Self-Sustained Sequence
Replication, или 3SR, базируется на конкурентном действии 3 ферментов, участвую¬
щих в ретровирусной репликации, — обратной транскриптазы, рибонуклеазы Н
(РНКазы Н) и ДНК-зависимой РНК-полимеразы, Реакция протекает с участием
cпeцифичecкIix праймеров при постоянной температуре. В результате реакции
амплификации за 60-90 мин образуется до 10^-10^^ копий РНК. На основе мето¬
дики 3SR была разработана технология ПЦР под названием Nucleic Acid Sequence-
Based Amplification (NASBA). В настоящее время NASBA — запатентованное назва¬
ние технологии, на базе которой выпускаются коммерческие наборы реагентов с
торговой маркой «NucliSens» («bioMerieuxs»^, Франция), Особенности технологии
NASBA имеют преимущество перед ПЦР при диагностике инфекционных агентов,
в том числе и хламидий, так как мишенью для ЗЗК-амплификации в отличие от
ПЦР служит молекула РНК, а использование при диагностике бактериальных
инфекций рибосомной РНК может давать некоторые преимущества.•	Количество копий рибосомной РНК может варьировать от нескольких сотен
до нескольких десятков тысяч в одной клетке, обеспечивая даже при мини¬
мальной концентрации бактериальных клеток в пробе достаточно высокую
концентрацию мишеней для амплификации.•	РНК — гораздо менее стабильный по сравнению с ДНК материал, и результа¬
ты диагностики на основе NASBA могут более адекватно отражать эффектив¬
ность проводимой антибактериальной терапии.Поскольку ДНК СЫ. trachomatis благодаря своей стабильности может доста¬
точно долго выделяться из урогенитального тракта после успешно проведенного
лечения, контроль излеченности рекомендуют проводить через 3-4 нед после его
окончания, в то же время РНК достаточно быстро деградирует при гибели и раз¬
рушении клетки, именно поэтому на основании РНК-диагностики можно более
точно судить о наличии или отсутствии жизнеспособных возбудителей и текущей
хламидийной инфекции. Результаты при изучении возможности использования
NASBA как инструмента контроля эффективности лечения показали, что РНК
СЫ. trachomatis не определялась ни у одного больного через неделю после окон¬
чания лечения, в то время как ДНК обнаруживали у некоторых больных на про¬
тяжении 2-3 нед. Таким образом, NASBA позволяет не только добиться высокой
чувствительности при обнаружении СЫ. trachomatis, но и выявлять жизнеспособ¬
ные микроорганизмы.Серологическая диагностикаСерологические исследования относят к вспомогательным методам диагности¬
ки хламидиоза. Они позволяют определить стадию и характер течения заболева-
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ323ния. Это особенно важно при восходящей и персистирующей инфекции, которая
поддерживает хроническое течение болезни на протяжении многих месяцев и лет
и повреждает или разрушает ткани и органы. Методы ретроспективной диагности¬
ки инфекции незаменимы при затруднениях взятия материала для обнаружения
антигена (например, у детей). В их основе лежит выявление специфических анти¬
тел, которые накапливаются в крови и секретах в процессе иммунного ответа на
внедрение возбудителя инфекционного заболевания.Специфическую реактивность в отношении к хламидиям проявляют 3 класса
антител — IgM, IgG и IgA. Накопление каждого из них происходит через раз¬
личные промежутки времени от начала иммунного ответа и зависит от характера
инфицирования (первичного или вторичного). При первичном инфицировании
сначала появляются IgM, затем IgG и в последнюю очередь IgA. По мере угасания
иммунного ответа снижение концентрации антител каждого из классов проис¬
ходит в той же последовательности.Иммунный ответ при вторичном инфицировании характеризуется быстрым
нарастанием титра IgG и IgA и практически полным отсутствием IgM. Таким обра¬
зом, при остром инфекционном процессе у больных можно обнаружить IgM или
быстронарастающие титры IgG и IgA. При хронической инфекции выявляются
специфические IgG и IgA, концентрации которых не изменяются на протяжении
длительного времени, в ряде случаев («3%) при хронически протекающих инфек¬
циях образованию специфических IgG предшествует регистрация невысоких
титров IgA в течение нескольких недель, у больных с бессимптомным течением
заболевания определение IgA в постоянно низких титрах в течение длительного
времени свидетельствует о персистенции микроорганизма. Низкие постоянные
титры специфических IgG указывают на давно перенесенную хламидийную
инфекцию.При острой инфекции диагностическое значение имеет обнаружение специфи¬
ческих IgM, при хронических формах хламидиоза следует определять IgA и IgG.
При интерпретации полученных данных необходимо помнить, что обнаружение
специфических антител однозначно не свидетельствует об инфицированности
хламидиями, так же как и отрицательные результаты серологических тестов не
исключают наличия текущей или перенесенной хламидийной инфекции. Для того
чтобы оценить динамику изменений титров антител различных классов, в клини¬
ческой практике часто исследуют парные пробы сыворотки крови, полученные от
пациента с интервалом 2-3 нед.В процессе лечения 2-3-кратное снижение титров IgG и IgA указывает на его
эффективность.Существующие коммерческие тест-системы позволяют определять специфиче¬
ские IgM-, IgA-, IgG-антитела к хламидиям в сыворотке крови. Серологические
методы могут быть рекомендованы для обследования детей, при осложненном
течении инфекционного процесса у взрослых, когда другие методы выявления
возбудителя или его антигена неприемлемы (например, при локализации возбуди¬
теля в маточных трубах), а также при проведении массовых эпидемиологических
исследований.БОРДЕТЕЛЛЫТАКСОНОМИЯВозбудитель коклюша, В. pertussis, относится к роду Bordetella, который вклю¬
чает еще 8 видов — В. ansorpii, В. avium, В. bronchiseptica, В. hinzii, В. holmesii,
В. parapertussis, В. petrii, В. trematum.Род Bordetella входит в состав ß-протеобактерий.
I324ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОРДЕТЕЛЛБактерии рода ßordetellae — мелкие (0,2-0,5х0,5-2,0 мкм) грамотрицательные
коккобациллы. В мазках часто биполярно окрашенные, одиночные или в парах,
реже в цепочках.Все бордетеллы, за исключением В. petrii, строгие аэробы, требовательные к
условиям роста.Основные биохимические свойства бордетелл, которые используются в прак¬
тической работе при изучении вьщеленных культур, представлены в табл. 21-3.В.	pertussis наименее активна ферментативно (стабильно положительный тест на
оксидазу). В. parapertussis вырабатывает ферменты тирозиназу и уреазу, не образу¬
ет оксидазы. Наиболее активна В. bronchiseptica — вырабатывает уреазу, оксидазу,
утилизирует цитраты, восстанавливает нитраты до нитритов.Таблица 21-3. Дифференцирующие признаки видов рода Bordeteilaо.•Эо.CQ0QС5,CQРост на кровяном
агареРост на агаре Мак-
КонкиОксидазаВосстановлениенитратовУреаза(24%)(4 ч)ПодвижностьАНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА В. PERTUSSISКоклюшный токсин является важнейшим фактором патогенности В. pertus¬
sis. Это экзотоксин, белок с молекулярной массой 117 ООО Да, состоящий из двух
функциональных частей (А и В) и пяти структурных субъединиц. Участок А соот¬
ветствует субъединице S1 и обладает ферментативной активностью, ингибирует
клеточную аденилатциклазу. Участок В состоит из субъединиц S2-S5, отвечает за
присоединение токсина к рецепторам клеток-мишеней. Токсин обладает высокой
иммуногенностью, в инактивированной форме включен в состав всех бесклеточ-
ных коклюшных вакцин. Определение антител к коклюшному токсину методом
ИФА применяют для диагностики коклюша и контроля эффективности вакцина¬
ции.Филаментозный гемагглютинин - поверхностный белок, учасгвующий в
адгезии, обладает протективными свойствами. Включен в состав бесклеточных
коклюшных вакцин. В ряде коммерческих ИФА-тест-систем для диагностики
коклюша предлагают определять уровень антител различных классов к антиген¬
ному комплексу, в состав которого входят гемагглютинин и коклюшный токсин.
В отличие от токсина, гемагглютинин не строго специфичен для В. pertussis, присут¬
ствует также у В. parapertussis, может давать перекрестные реакции с Я. influenzae,С.	pneumoniae и рядом других бактерий.Пертактин — белок наружной мембраны, относится к системе адгезинов, про¬
дуцируемых бактериями при попадании в человеческий организм. Обладает про¬
тективными свойствами, входит в состав ряда бесклеточных коклюшных вакцин.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 325Аденилатциклаза-гемолизин — комплекс экзофермента аденилатциклазы с
токсином гемолизином. Фермент при попадании в клетки катализирует образова¬
ние цАМФ. Токсин — основной фактор патогенности, действутощий на начальном
этапе инфекции, также с ним связывают протективные свойства комплекса.Агглютиногены — поверхностные белки, ответственные за выработку агглю¬
тинирующих антител. У бордетелл выделено 16 агглютиногенов. Седьмой агглю-
тиноген — общеродовой, а первый — основной видовой для В. pertussis. Б зависи¬
мости от наличия в бактериальной клетке 2-го и 3-го агглютиногена выделяют
четыре серотипа В. pertussis — 1.2.0,1.0.3,1.2.3 и 1.0.0. Также у В. pertussis выделяют
4,5,6,13,15 и 16-й агглютиногены. Видовой агглютиноген для В. bronchiseptica -
12-й, для В. parapertussis - 14-й, а 8-й, 9-й и 10-й агглютиногены - общие для
В. bronchiseptica и В. parapertussis, 11-й — встречается у В. bronchiseptica.Понятие об агглютиногенах тесно связано с фимбриями (Fim). Выделяют Fim 2,
Fim 3, Fim X. Фимбрии включены в состав некоторых бесклеточных коклюшных вак¬
цин. Серотипирование В. pertussis основано на агглютинации бактериальных клеток:
в отечественной практике — монофакторными сыворотками (антителами к агглю-
тиногенам) в РГА на стекле, в зару^жной — моноклональными антителами к фим-
бриальным антигенам в реакции агглютинащ^и в микропланшете. Для диагностики
коклюша в России проводят РГА с цельноклеточным диагносгикумом, в которой
определяются агглютинирующие антитела в первую очередь к агглютиногенам.Липополисахарид — в его состав входят два липида — А и X. С Х-фракцией
связана биологическая активность липополисахарида. Он обладает множествен¬
ными функциями, в том числе выраженной иммуногенностью. Также с ним связы¬
вают реактогенность клеточной вакцины.Трахеальный цитотоксин — фрагмент пептидогликана клеточной стенки.
Проявляет разнообразные биологические свойства — пирогенность, адъювант-
ность, артритогенность, стимуляцию продукции ил-1. Токсин поражает тра¬
хеальные эпителиальные клетки и вызывает цилиостаз. При этом нарушается
мукоцилиарный клиренс (первая линия защиты) и создаются условия для перси-
стирования возбудителя инфекции.Дермонекротизирующий токсин обладает сосудосуживающей активностью,
у экспериментальных животных вызывает снижение прироста массы тела, атро¬
фию селезенки, ишемические поражения или некроз кожи. Его роль в развитии
заболевания остается неясной.Все вышеперечисленные факторы присутствуют у свежевыделенных штаммов
В. pertussis. Однако при хранении на искусственных питательных средах прояв¬
ляется изменчивость возбудителя. Установлено, что в процессе сапрофитизации
В. pertussis проходит четыре фазы — свежевыделенный микроб (гладкий штамм),
обладающий высокими вирулентными и иммуногенными свойствами, относится к1-й фазе. По мере перехода к 4-й фазе постепенно утрачиваются иммуногенность,
вирулентность, изменяются культурально-биологические свойства.РАСПРОСТРАНЕНИЕ И ЭПИДЕМИОЛОГИЯВ.	pertussis патогенна для человека и является возбудителем коклюша,В.	parapertussis вызывает у людей паракоклюш — коклюшеподобное заболевание.В.	bronchiseptica - возбудитель заболеваний дыхательных путей у многих мле¬
копитающих (в том числе собак и свиней), встречается также бессимптомное
носительство. у человека В. bronchiseptica редко вызывает заболевание, однако
описаны случаи, когда у пожилых людей, заразившихся от домашних животных,В.	bronchiseptica вызывала длительный кашель. В. avium — возбудитель ринотра-
хеита птиц. В. ansorpii, В. hinzii, В. holmesii, В. trematum редко вызывают заболевания
у людей, главным образом у пациентов с иммунодефицитом. Возможно также бес¬
симптомное носительство В. hinzii у домашней птицы. Единственный представи¬
тель рода, выделенный из окружающей среды (из речного осадка), — В, petrii.
326ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯКЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИКоклюш — заболевание, длящееся не менее 2 нед, без явлений интоксикации и
повышения температуры тела. Протекает циклично со сменой ряда периодов.Инкубационный период продолжается от 3 до 14 дней (в среднем 7-8 дней).Предсудорожный период протекает от 3 до 14 дней, проявляется сухим навязчи¬
вым кашлем на фоне нормальной температуры тела.Период судорожного кашля (ПСК) продолжается от 2-3 до 6-8 нед и более, харак¬
теризуется типичными приступами судорожного кашля. Приступ кашля представ¬
ляет следующие друг за другом дыхательные толчки на вьщохе, прерываемые сви¬
стящим судорожным вдохом (репризой), возникающим при прохождении воздуха
через суженную вследствие ларингоспазма голосовую щель. Заканчивается приступ
отхождением вязкой, стекловидной мокроты или рвотой. Приступу кашля может
предшествовать аура (чувство страха, беспокойство, чихание, першение в горле).
Приступы могут быть кратковременными или продолжаться 2-4 мин. Возможны
пароксизмы — концентрация приступов кашля в течение короткого периода вре¬
мени. При типичном приступе кашля больной приобретает характерный вид: лицо
краснеет, затем синеет, становится напряженным, набухают вены шеи, лица и
головы, отмечается слезотечение. Язык высовывается до предела, кончик его под¬
нимается кверху. В результате трения уздечки языка о зубы и ее чрезмерного растя¬
жения происходит надрыв или образование язвочки — патогномоничный симптом
коклюша. При гладком течении заболевания температура тела остается нормаль¬
ной. Характерно постепенное развитие симптомов заболевания с максимальным
учащением и утяжелением ПСК на 2-й неделе болезни. Возможно присоединение
специфических осложнений на 3-й неделе и неспецифических осложнений на фоне
развития вторичного иммунодефицита — на 4-й неделе ПСК.Период обратного развития (ранней реконвалесценции) — от 2 до 8 нед, на фоне
улучшения самочувствия кашель становится реже и постепенно теряет типичный
характер.Период реконвалесценции (поздней) продолжается от 2 до 6 мес и характеризу¬
ется состоянием гиперреактивности с возможным развитием приступообразного
кашля при интеркуррентных заболеваниях или эмоциональных нагрузках.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАСхема лабораторной диагностики коклюша представлена в табл. 21-4.Таблица 21-4. Рекомендуемая схема лабораторной диагностики коклюша1-2 нед от начала заболевания3-4 недБолее 4 недОбследуемыебез антибио¬
тикотерапиина фоне анти-
биотикотералиибез антибио¬
тикотерапиина фоне аити-
биотикотералиибез антибиоти¬
котерапии или
на ее фонеНепривитые дети
до 1 годаБМ*, ПЦРПЦРБМ,ПЦРПЦРсерологияСерологияНепривигые дети
старше 1 годаБМ, ПЦРПЦРПЦРсерология(БМ")Серология(ПЦР)СерологияПривитые детиПЦР, БМПЦРПЦРсерология(БМ)Серология(ПЦР)СерологияПодростки, взрос¬
лыеПЦР, БМПЦРПЦРсерология(БМ)Серология(ПЦР)Серология* БМ — бактериологический метод.** Эффективностъ метода, указанного в скобках, у данной группы пациентов существенно сни¬
жается.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 327Изоляция и идентификация возбудителяБактериологическое исследование следует проводить в ранние сроки заболева¬
ния (не позднее начала 3-й недели) двукратно ежедневно или через день. Позднее
высеваемость возбудителя на питательные среды резко снижается. Она зависит от
следующих факторов:•	срока обследования;•	кратности исследования;•	соблюдения правил взятия, транспортировки и посева материала;•	качества используемых материалов и сред.Взятие материала. Материал забирают со слизистой оболочки задней стен¬
ки глотки зондом-тампоном (поскольку вата может действовать на возбудителя
коклюша бактерицидно, лучше пользоваться вискозным или дакроновым зондом-
тампоном). Назофарингеальные мазки получают с помощью мягкого тонкого
зонда, который вводят по ходу нижней носовой раковины и штриховым движени¬
ем собирают материал с задней стенки глотки. Ретрофарингеальные мазки бер>т
с задней стенки глотки через рот, опуская тампон как можно ниже, не касаясь
миндалин, неба и языка. Материал можно забирать методом кашлевых пластинок.
Оптимально высевать пробы на питательные среды сразу после их взятия.Питательные среды. Для выделения бордетелл пользуются плотными
питательными средами — картофельно-глицериновым (среда Борде-Жангу) и
казеиново-угольным (КУА) агаром. Оптимально добавление в среды лошадиной
или овечьей крови: в среду Борде-Жангу — 20%, в КУА — 10%. Добавление чело¬
веческой крови или эритроцитарной массы дает худшие результаты, их можно
частично или полностью заменить плазмой крови крупного рогатого скота (5%).
Также можно добавить питательную среду № 199 (1%).Для ингибирования посторонней флоры используют цефалексин (40 мг/л
среды). В отличие от бензилпенициллина, цефалексин не подавляет рост В. pertus¬
sis и более эффективен в отношении сопутствующей флоры.Посевы инкубируют при температуре 35-37 °С без добавления углекислого газа
в условиях повышенной влажности.общая продолжительность бактериологического исследования составляет
5-7 дней:•	1-й — прямой посев на плотную среду с добавлением антибиотика;•	2-3-й - осмотр посевов;•	4-6-й - идентификация бордетелл.Бордетеллы формируют:•	на среде Борде-Жангу — выпуклые, гладкие, блестящие колонии серебряно¬
го цвета, напоминающие капли ртути, окруженные зоной гемолиза;•	на КУА — выпуклые, гладкие колонии серого цвета с жемчужным, желтова¬
тым или беловатым оттенком, маслянистые, легко снимаются петлей.В.	parapertussis за счет образования пигмента вызывает потемнение питательных
сред, содержащих кровь, образует бурую подложку. Температура выращивания
бордетелл 35-37 °С, при этом колонии разных видов бордетелл формируются в
различные сроки; более продолжительный рост наблюдается у В. pertussis.При обнаружении на среде подозрительных колоний проводят выделение
чистой культуры путем отсева изолированных колоний на чашку Петри с одной
из упомянутых выше сред (без анп^биотика), используя отдельные ее сектора
(вместо обычных чашек Петри можно использовать 2- или 4-секционные). При
обнаружении нескольких однотипных колоний делают мазки, окрашивают по
Граму и микроскопируют. Возможно проведение РГА на стекле со специфиче¬
скими видовыми неадсорбированными сыворотками, по возможности — с адсор¬
бированными монорецепторными сыворотками к агглютиногенам 1 и 14. При
значительном числе колоний можно поставить пробу Заксе на наличие уреазы. На
тШш328 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯосновании данных изучения колоний, морфологии бактерий в мазках, положи¬
тельного результата РГА на 3-и сутки можно выдать предварительный ответ. При
отсутствии роста подозрительных колоний на плотной среде посевы помещают в
термостат еще на 24-48 ч.Видовую принадлежность выделенных культур устанавливают на основании
комплекса типичных морфологических, биохимических, антигенных и других
свойств.Для оценки биохимических свойств проводят посевы чистой культуры на среду
с тирозином (определение наличия тирозиназы), пробой Закса или посевом на
бульон Хоттингера определяют наличие уреазы. При выделении чистой культурыВ.	bronchiseptica определяют утилизацию цитратов на среде Симмонса и подвиж¬
ность путем посева в полужидкий агар (0,5% агар-агар). В табл. 21-3 приведен
набор биохимических тестов, позволяющих дифференцировать различные виды
бордетелл.Серовар коклюшного микроба определяют в РГА на стекле с монорецепторны¬
ми сыворотками к агглютиногенам (факторам) 2 и 3.На основании изучения морфологии колоний и клеток чистой культуры, а
также результатов биохимических тестов и РГА с монорецепторными сыворотка¬
ми дают окончательный положительный ответ или спустя 6 сут исследования при
отсутствии подозрительных колоний — отрицательный.Исследование атипичньк штаммов. Бордетеллы способны существовать
в 4 фазовых состояниях, переходя из одной фазы в другую и изменяя свои
культурально-морфологические свойства. Такие штаммы образуют более круп¬
ные колонии с плоской поверхностью, западающим центром, имеют беловатый,
бурый, желтоватый или слегка розоватый и зеленоватый цвет, маслянистую
консистенцию. В мазках обнаруживают более длинные или раздутые овоидные
палочки, палочки с ослизненным концом, формы в виде стрептобацилл. Чистая
культура, выделенная из таких колоний, обладает типичными биохимическими
и серологическими свойствами. В ряде случаев могут быть выделены грамотри¬
цательные бактерии, сходные по морфологии и биохимическим свойствам, но не
агглютинируемые монорецепторными сыворотками и хорошо растущие на про¬
стых питательных средах. Учитывая наличие атипичных штаммов коклюшного
микроба, рекомендуют при выделении чистой культуры проводить отсев с пита¬
тельной среды не менее пяти колоний.Молекулярная диагностикав условиях высокого охвата детей прививками против коклюша снижается
эффективность бактериологического исследования и возрастает роль ПЦР как
быстрого (в течение 4-6 ч) метода, позволяющего обнаружить ДНК возбудителя
у привитых детей на более поздних стадиях заболевания и на фоне антибиоти¬
котерапии, ПЦР может давать положительный результат при наличии мертвых
и нежизнеспособных клеток возбудителя, поэтому подтверждение диагноза дан¬
ным методом после антибиотикотерапии не является основанием для назначения
повторного курса антибактериальных препаратов. ДНК может обнаруживаться
приблизительно в течение 1 мес после успешного лечения антибактериальными
препаратами и на фоне клинического выздоровления, поэтому ПЦР не реко¬
мендуют использовать для подтверждения эффективности лечения вскоре после
завершения курса антибиотикотерапии, как это принято при бактериологическом
исследовании. Существует методика обнаружения путем амплификации нуклеи¬
новых кислот только живых микроорганизмов (NASBA), но в настоящее время
тест-системы для диагностики коклюша в данном формате не разработаны.Для анализа используют мазки с задней стенки носо- или ротоглотки или
носоглоточный аспират. Мазки берут сухим стерильным одноразовым тампоном
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ329(оптимальный материал — дакрон, можно использовать хлопок или вискозу, осно¬
вание — алюминий или пластик) в индивидуальной пластиковой пробирке. После
взятия материала тампон помещают обратно в пробирку. До анализа материал
можно хранить в течение 3 сут при температуре 2-8 °С или в течение месяца при
температуре -18-24 °С (без размораживания). Транспортируют при температуре
2-8 X.Для анализа тампон погружают в одноразовую пробирку типа «Эппендорф» с
1,5 мл транспортной среды, вращают его в течение 10-15 с, избегая разбрызгива¬
ния раствора, затем отжимают избыток жидкости, прижимая к стенке пробирки,
тампон вынимают, пробирку закрывают и центрифугируют. Если тампон хранили
при температуре -18-24 *С, перед исследованием его необходимо разморозить
при комнатной температуре в течение 30 мин. ПЦР проводят в соответствии с
инструкциями к наборам реагентов.Серологическая диагностикав условиях массовой вакцинопрофилактики существенно снизилось количество
тяжелых форм заболевания, участились случаи позднего обращения за медицин¬
ской помощью, нередко уже на фоне проводимой антибиотикотерапии. При этом
возросло значение серологических тестов как средств поздней (ретроспективной)
диагностики. Необходимо учитывать, что у привитых детей может быть повышен
уровень антител к В, pertussis или его компонентам (поствакцинальный имму¬
нитет). Именно поэтому серологическое исследование не следует применять в
течение одного года после вакцинации против коклюша. Также не рекомендуют
использовать серологические методы диагностики у детей в возрасте до 6 мес, так
как у них могут сохраняться материнские антитела.РГА — классический метод серологической диагностики. Реакцию проводят
в агглютинационных пробирках. Положительным результатом считают нарас¬
тание титра специфических антител в 4 раза и более — первую пробу сыво¬
ротки берут не менее чем через 2 нед после начала заболевания, вторую — не
менее чем через 2 нед после первой. РГА по чувствительности уступает ИФА.
Использование корпускулярных диагностикумов может приводить к перекрест¬
ным реакциям с антителами к возбудителю паракоклюша, а также некоторым
другим бактериям.ИФА. Метод более чувствителен, чем РГА. Позволяет определять антитела
различных классов (IgM, IgA, IgG). В различных тест-системах выявляют анти¬
тела к разным антигенам либо к их комплексам — корпускулярному комплексу,
КТ и ФГА, только КТ. Наиболее специфично определение антител к коклюшному
токсину. За положительный результат принимают выраженную серокон версию по
IgG или IgA (повышение или понижение уровня иммуноглобулинов при повтор¬
ном исследовании через 2-4 нед не менее чем в 4 раза, если в инструкции к тест-
системе нет других указаний). Определять IgM к В. pertussis в плазме крови можно
у непривитых больных для быстрой серологической диагностики коклюша без
исследования парных сывороток.ЛЕГИОНЕЛЛЫТАКСОНОМИЯLegionella является единственным родом семейства LegioneUaceae, относящимся к
у-протеобактериям. Общепринятая классификация рода имеет генетическую осно¬
ву. Штаммы легионелл относят к одному виду, если уровень гибридизации ДНК
между ними при оптимальных условиях превышает 70%. В частности, гомология
штаммов L. pneumophila составляет 82-99%, а некоторых других видов легионелл —
40-70%. Для видовой идентификации легионелл используют рестрикционный
330 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯШ1^ С/1анализ, амплификацию и секвенирование ДНК, анализ состава клеточной стенки
и серологические методы. Большинство данных методов доступно только для
специализированных референс-лабораторий. Биохимические тесты имеют крайне
. ограниченное значение, так как легионеллы не ферментируют углеводы.:4^ШиУ'	^ настояш;ее время известно около 50 видов легионелл, 22 из которых игра-роль в инфекционной патологии человека. Более 95% случаев легионеллеза
у< ассоциировано с видом I. pneumophila. Другие виды легионелл (I. micdadei, L. long-
tfS/ЩУ' beachae, L. dumoffii, L. bozemanii), как правило, вызывают заболевание при наруше¬
ниях клеточного иммунитета или на фоне сопутствующей патологии.Вид L. pneumophila включает 16 серогрупп. Чаще всего легионеллез вызывают
серогруппы 1, 4 и 6, причем превалирует серогруппа 1, с которой связано свыше
80% регистрируемых случаев легионеллеза (серогруппы 4 и 6 выявляют в 5-10%
случаев болезни).ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕГИОНЕЛЛЛегионеллы — грамотрицательные палочки диаметром 0,5-0,7 мкм, длиной2-5 мкм. Иногда встречаются нитевидные формы длиной до 20-25 мкм. Не обра¬
зуют эндоспор, микроцист и капсул; аэробы. Подвижны вследствие наличия одно¬
го, двух или большего числа жгутиков. Не ферментируют углеводы, разжижают
желатин, не образуют уреазу, не восстанавливают нитраты, каталазоположитель-
ны, оксидазовариабельны.Легионеллы не растут на обычных питательных средах (кровяном агаре, среде
Мак-Конки), что связано с потребностью возбудителя в L-цистеине и растворимом
пирофосфате железа. Для выделения легионелл используют модификации буфер¬
ного угольно-дрожжевого агара, содержащего L-цистеин, растворимый пирофос¬
фат железа и а-кетоглютаровую кислоту (среда BCYE-a).Все виды легионелл растут во влажной атмосфере при температуре 35 °С. Рост
некоторых видов стимулируется наличием в атмосфере 2,5-3% углекислого газа.
Колонии легионелл вырастают при первичном выделении в течение 3-6 сут.
Молодые колонии обычно имеют вросший центр, гранулярную или блестящую
поверхность.в лабораторных условиях чувствительность L. pneumophila к стандартным
дезинфицирующим и антисептическим препаратам не отличается от большинства
неспорообразующих бактерий. 3% раствор хлорамина вызывает гибель возбуди¬
теля через 10 мин при его концентрации в суспензии 10^ КОЕ/мл. L. pneumophila не
кислотоустойчива, не окрашивается по Цилю-Нильсену.Несмотря на то что микроорганизм высокочувствителен к действию различных
химических и физических агентов и требователен к температуре и pH питательной
среды, в подходящих условиях водной среды I. pneumophila способна сохраняться
достаточно долго. В природной водной среде значительно расширяется диапазон
физико-химических и биологических условий существования микроорганизма. Об
этом свидетельствует выделение возбудителя из водоемов с различными физиче¬
скими, химическими и биологическими характеристиками.ЭПИДЕМИОЛОГИЯПрошло 35 лет со времени первой зарегистрированной эпидемической вспышки
данного заболевания в Филадельфии (США). Тогда, летом 1976 г., из 4400 участ¬
ников конгресса организации «Американский легион» у 221 (5%) развилась тяже¬
лая пневмония. Из них умерли 34 (15,4%) человека. Первый штамм легионелл,
выделенный от умершего пациента, был принят за типовой штамм Legionella pneu¬
mophila в разрабатываемой классификации легионелл как новый род бактерий.
В названии бактериального агента увековечены первые жертвы инфекции и обо¬
значена пневмотропность возбудителя.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ331в целом уровень заболеваемости легионеллезом в мире невелик, однако спора¬
дические случаи и десятки эпидемических вспышек болезни ежегодно выявляют в
различных странах мира.Типичные примеры:•	аукцион цветов в Голландии (1999) — 188 человек заболели, зарегистрирова¬
но 16 летальных исходов;•	дельфинарий в Австралии (1999) — 98 заболевших, 9 летальных исходов;•	гостиничный комплекс в Норвегии (2001) — 28 заболевших, 7 летальных
исходов;•	общественные здания в Испании (2002) - 470 заболевших, 9 летальных
исходов;•	промышленные предприятия во Франции (2004) — 86 заболевших;•	промышленные предприятия в Норвегии (2005) — 55 заболевших, 10 леталь¬
ных исходов.Крупные вспышки легионеллеза за последнее время отмечались в следующих
регионах:•	Верхней Пышме Свердловской области, Россия (2007) — более 100 заболев¬
ших, 5 летальных исходов;•	Ульме, Германия (2010) — 65 заболевших, 5 летальных исходов.Механизм передачи легионеллезной инфекции — аспирационный, путь переда¬
чи — воздушно-капельный, основной фактор передачи — мелкодисперсный аэро¬
золь, Легионеллез — типичный пример техногенных инфекций, обусловленных
активным использованием в промышленности и быту циркулирующих замкнутых
водных систем, источников бактериального аэрозоля. Практически все крупные
эпидемические вспышки и многие спорадические случаи легионеллеза связаны
с распространением мелкодисперсного аэрозоля, содержащего легионеллы и
генерируемого бытовыми, медицинскими или промышленными водными систе¬
мами. Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источниками
мелкодисперсного аэрозоля позволяет возбудителю попасть в респираторные
отделы легких человека, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в
которых вирулентные штаммы возбудителя активно размножаются. При анализе
эпидемической заболеваемости установлено, что у людей, находившихся в зоне
действия мелкодисперсного аэрозоля, содержащего легионеллы, пневмония раз¬
вивается в 5-10%, а лихорадка Понтиак — в 80-100% случаев.При спорадическом легионеллезе и отдельных нозокомиальных вспышках
заболевания возможна аспирация воды, контаминированной легионеллами, без
образования аэрозоля. Спорадический легионеллез выявляют, как правило, у
пациентов среднего и пожилого возраста на фоне действия факторов риска (куре¬
ния, сопутствующих заболеваний, иммуносупрессивной терапии, первичных и
вторичных иммунодефицитов).Легионеллы вызывают 2-6% всех пневмоний и до 10-15% атипичных пнев¬
моний, У детей легионеллез выявляют редко, обычно на фоне сопутствующей
патологии.Легионеллез распространен повсеместно, его выявляют круглогодично, однако
пик заболеваемости приходится на летние месяцы.В последние годы особое значение стали придавать проблеме легионеллеза,
возникающего во время путешествий и диагностируемого, как правило, по воз¬
вращении. Более 30% случаев спорадического легионеллеза и многочисленные
эпидемические вспышки в гостиницах, нередко с летальным исходом, послужили
основой для создания единой международной системы эпидемиологического над¬
зора за случаями легионеллеза, связанного с путешествиями.Риск возникновения внутрибольничного легионеллеза определяется не только
возможностью контаминации легионеллами систем водоснабжения, кондициони¬ш
вшш
Шшшшшф332ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯрования, но и наличием восприимчивых к инфекции пациентов с нарушениями
клеточного иммунитета. В онкологических отделениях или отделениях транс¬
плантации органов при контаминации легионеллами водных систем доля легио¬
неллеза в этиологической структуре внутрибольничных пневмоний составляет
15-20%, летальность при данной инфекции — 30-40%. Помимо L. pneumophila,
внутрибольничную инфекцию нижних дыхательных путей часто вызывает вид
L. micdadei.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИИзвестны две клинические формы легионеллеза — болезнь легионеров и лихо¬
радка Понтиак. Ведущая клиническая форма легионеллеза — болезнь легионеров.
Эта форма характеризуется четко очерченной клинической картиной воспаления
легочной ткани. Инкубационный период обычно составляет 2-10 дней. Высокая
лихорадка сопровождается ознобом, интенсивными болями в груди. Одышка на
фоне массивной воспалительной инфильтрации легочной ткани и вовлечения в
патологический процесс плевры появляется в 1-й день болезни и прогрессирует
при неадекватном лечении. У 20-30% заболевших легионеллезом развивается
острая дыхательная недостаточность, требующая респираторной поддержки.
В ряде случаев возникают инфекционно-токсический шок и острая почечная недо¬
статочность. Лихорадка продолжается 12-15 дней. Симптомы поражения верхних
дыхательных путей отмечают редко. Кашель первоначально малопродуктивный,
но с течением времени может приобретать продуктивный характер с отделением
слизисто-гнойной мокроты, у 25% больных наблюдают симптомы поражения
желудочно-кишечного тракта.При общем клиническом анализе крови выявляют относительную или абсо¬
лютную лимфопению на фоне умеренного лейкоцитоза, увеличение СОЭ до
60-80 мм/ч. При биохимическом анализе крови отмечают цитолиз, диспротеине-
мию со снижением содержания альбуминов, гипонатриемию, гипофосфатемию.При рентгенографии органов грудной клетки в 60-70% случаев уже на ранней
стадии болезни визуализируются односторонние пневмонические инфильтра¬
ты. В дальнейшем отмечается прогрессирование инфильтративных изменений с
вовлечением в патологический процесс новых сегментов легких. Летальность при
болезни легионеров составляет 8-25%. У пациентов с иммунологическими нару¬
шениями летальность может достигать 60%.Другая клиническая форма легионеллеза — респираторная лихорадка — впер¬
вые описана у служащих и посетителей Департамента здравоохранения в Понтиаке
(США). Данный ОРЗ-подобный синдром, называемый также лихорадкой Понтиак,
характеризуется 1-2-дневной лихорадкой, сухим кашлем, катаральными явле¬
ниями в носоглотке, головными и мышечными болями. При нахождении в зоне
распространения аэрозоля, содержащего легионеллы, заболевание развивается в
90-100% случаев. Инкубационный период лихорадки Понтиак обычно состав¬
ляет 36-48 ч. Болезнь протекает, как правило, в нетяжелой форме и завершается
выздоровлением в короткие сроки (2-7 дней). Летальный исход при лихорадке
Понтиак не регистрировался. Носительство и персистенция легионелл в организме
человека не описаны.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАДля микробиологов легионеллез — труднодиагностируемая инфекция.
Возможно, относительно невысокий уровень выявляемой заболеваемости связан
с несовершенством методов лабораторной диагностики и высокой стоимостью
реагентов для эффективной изоляции легионелл.ВОЗ рекомендует для лабораторной диагностики болезни легионеров три груп¬
пы методов. Диагноз легионеллеза при острой инфекции нижних дыхательных
wЬМшЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 333путей (клинически и рентгенологически подтвержденной пневмонии) считается
установленным:•	при выделении легионелл из отделяемого респираторного тракта или легоч¬
ной ткани;•	4-кратном или большем нарастании титра антител к L. pneumophila, выявляе¬
мых в реакции непрямой иммунофлюоресценции;•	определении специфического растворимого антигена легионелл в моче
иммунохроматографическим методом или с помощью ИФА.При отсутствии первой пробы сыворотки, взятой в ранние сроки болезни,
выявление высокого уровня антител к L. pneumophila (1:128 и выше) в одиночной
пробе сыворотки методом непрямой иммунофлюоресценции позволяет поставить
предположительный диагноз легионеллеза. Остальные методы применяют как
вспомогательные.Для диагностики легионеллеза исследуют клинический материал, взятый в
стерильных условиях до 7-го дня болезни (отделяемое, полученное при бронхо¬
скопии, плевральный экссудат, биопсийный или аутопсийный материал). Около
1-2 мл плеврального экссудата или отделяемого, полученного при бронхоскопии,
помещают в стерильную пробирку, плотно закрытую резиновой пробкой, и хранят
при 4 “С не более суток. Биопсийный или аутопсийный материал помещают в сте¬
рильные флаконы, плотно закрытые пробками, и хранят или транспортируют при
температуре 4 Т в течение суток. Длительное (до года) хранение проб возможно
только при температуре -70 °С.Изоляция и идентификация возбудителяДля выделения легионелл из клинического материала применяют буферный
угольно-дрожжевой агар с р-кетоглютаровой кислотой (среда BCYE-a), кото¬
рая оптимальна для выделения и культивирования легионелл в соответствии со
стандартом IS011731E. Эту среду также можно приготовить непосредственно в
лаборатории, используя следующие компоненты: дрожжевой экстракт - 10 г;
активированный уголь —2 г; L-цистеин — 0,4 г; пирофосфат железа растворимый —
0,25 г; ACES-буфер — 10 г; агар — 15 г; р-кетоглютаровую кислоту — 0,25 г; дис¬
тиллированную воду — 980 мл.Все компоненты среды, кроме L-цистеина и пирофосфата железа, добавляют
к 980 мл дистиллированной воды, растворяют и доводят pH до 6,95 с добавле¬
нием 1 N раствора гидроксида калия. Среду автоклавируют в течение 15 мин при
температуре 121 “С. Затем ее охлаждают до 50 X на водяной бане и добавляют
свежеприготовленные растворы L-цистеина (0,4 г в 10 мл дистиллированной
воды) и растворимого пирофосфата железа (0,25 г в 10 мл дистиллированной
воды), профильтрованные через мембранный фильтр (величина пор — 0,3 мкм).
Питательную среду быстро разливают в чашки Петри, слегка взбалтывая флакон
для равномерного распределения активированного угля. Разлитую питательную
среду хранят в пластиковых или металлических контейнерах в холодильнике не
более 2 нед.Легионеллы на среде ВСУЕ-а инкубируют при температуре 35 X в атмосфере,
содержащей 2,5% углекислого газа, при влажности около 65% в течение 2 нед.Рост колоний в посевах клинического материала проявляется не ранее чем через4-5 сут. Максимальное количество видимых колоний отмечается на 8-10-е сутки.
Подозрительные колонии пересевают на ту же питательную среду и на среду,
не поддерживающую рост возбудителя (контрольную), в качестве контрольной
среды обычно используют среду BCYE-a без добавления L-цистеина и пирофос¬
фата железа или соответствующей ростовой добавки фирмы-производителя.
Наличия роста во втором пассаже на среде BCYE-a при отсутствии роста на кон¬
трольной среде обычно достаточно для подтверждения выделения бактерий рода
М|Щ 334 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯLegionella. Если отмечается рост на контрольной среде, определяемый микроорга-
низм не относится к роду Legionella.Легочная ткань часто бывает контаминирована микрофлорой, быстрый рост
которой при посеве на питательные среды не позволяет выделить чистую культуру
легионелл. Для ингибирования роста посторонней микрофлоры в питательную
среду добавляют цефамандол (4 мкг/мл), полимиксин В (80 ЕД/мл) и анизо-
I мицин (8 мкг/мл). Цефамандол можно заменить ванкомицином (0,5 мкг/мл).
I Цефамандол по сравнению с ванкомицином подавляет рост некоторых видов
легионелл, не продуцирующих а-лактамазы, включая L. micdaäei. В отличие от
стандартной ростовой добавки, обязательно содержащей L-цистеин и пирофосфат
железа, антимикробная добавка, подавляющая рост посторонней микрофлоры,
может различаться по составу у различных фирм-производителей, а также в зави¬
симости от степени контаминации исследуемого материала.Также существуют другие методы подавления роста посторонней микрофлоры
в клиническом материале:•	прогревание на водяной бане в течение 30 мин при температуре 50 “С;•	5-минутная экспозиция НС1/КС1 буфером (pH 2,2) (используют для выделе¬
ния легионелл из сильно контаминированных образцов).Поскольку морфология легионелл типична для грамотрицательных бактерий, а
методы окраски неспецифичны, окраска по Граму или Романовскому-Гимзе мало¬
информативна.Легионеллы обладают оксидазой и каталазой, разжижают желатин, вызыва¬
ют гидролиз гиппурата натрия, не ферментируют углеводы, не восстанавливают
нитраты до нитритов, не обладают уреазной активностью. В лабораторной прак¬
тике в последние годы для идентификации выросших колоний используют реак¬
цию латекс-агглютинации, проводимую с помощью соответствующих наборов,
или реакцию иммунофлюоресценции. Выпускают несколько вариантов наборов,
позволяющих выявить колонии L. pneumophila серогруппы 1 и серогрупп 2-14,
а также родоспецифический антиген, характерный для колоний других видов
легионелл. Этого вполне достаточно для быстрой идентификации возбудителя в
клинической лаборатории. Постановка РГА на стекле с суспензией предполагае¬
мой колонии легионелл занимает не более 15 мин.Серологическая диагностикаПомимо бактериологических, для диагностики легионеллеза широко применя¬
ют иммуносерологические методы. Антигенная структура легионелл достаточно
сложна. Специфичность серогрупп обусловлена липополисахаридным антигеном.
Разработанные в настоящее время методы иммунодиагностики основаны на обна¬
ружении в плазме крови больных специфических антител, а моче или отделяемом
респираторного тракта — антигена легионелл.Наиболее распространенный и доступный практическим лабораториям метод —
выявление специфических антител в плазме крови методом непрямой иммуноф¬
люоресценции. Плазму крови пациентов с подозрением на легионеллез берут в
первые дни и на 14-21-й день болезни. Кровь из вены в количестве 3-5 мл поме¬
щают в стерильную пробирку, после свертывания крови сгусток отслаивают от
стекла пастеровской пипеткой и пробирку вьщерживают при комнатной темпера¬
туре в течение 5-6 ч. Отделившуюся плазму помещают в стерильную пробирку и
хранят при температуре 4 ‘‘С.Диагноз на легионеллез подтверждается, если наблюдается не менее чем 4-крат¬
ное нарастание титров антител в реконвалесцентных сыворотках по сравнению с
первой сывороткой, взятой в острый период заболевания. Если проанализировать
динамику изменения титров антител не представляется возможным, предвари¬
тельный диагноз ставят по уровню специф№1еских антител (1:128) в одиночной
сыворотке. В качестве контроля используют положительную (титр антител —
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 335не менее 1:256) и отрицательную (титр антител 1:16) плазму крови человека.
Качество антигена может быть проверено в реакции непрямой иммутюфлюорес-
ценции с разведениями плазмы крови кролика, иммунизированного антигеном
L pneumophila.Экспресс-диагностикаДля экспресс-диагностики легионеллеза применяют ИФА, позволяющий выяв¬
лять растворимый антиген легионелл в моче в острый период заболевания (первые10	дней). В международных испытаниях, проводимых в 1998-1999 гг. под эгидой
Европейской рабочей группы по легионеллезу, доказаны высокие чувствитель¬
ность и специфичность данного метода при инфекции серогруппы 1 L. pneumophila,
В результате ИФА был включен в стандарты диагностики легионеллеза в качестве
достаточного для окончательного подтверждения диагноза инфекции, вызванной
L. pneumophila серогруппы 1. В настоящее время в 90% случаев первичный диагноз
легионеллеза ставят на основании обнаружения легионеллезного антигена в моче.
При определении антигенов I. pneumophila других серогрупп чувствительность и
специфичность ИФА несколько ниже. Для других видов легионелл ИФА не при¬
меняют.Разработан иммунохроматографический метод для быстрого определения
антигена легионелл в моче. Метод практически не уступает по специфичности и
чувствительности ИФА, не требует специального оборудования и широко при¬
меняется клиническими микробиологами при диагностике тяжелых пневмоний.
К достоинствам иммунохроматографического метода можно отнести и наличие
аналогичной тест-системы для быстрого выявления в моче растворимого антигена
Str. pneumoniae, что позволяет быстро провести дифференциальную диагностику
тяжелой пневмонии.КОКСИЕЛЛЫТАКСОНОМИЯв течение длительного времени коксиелл считали родственными риккетсиям,
относящимся к а-протеобактериям. В восьмом издании «Определителя бактерий»
Берджи род Coxiella отнесен к порядку Rickettiales, семейству Rickettsiaceae, трибе
Rickettsiaea вместе с родами Rickettsia и Rochalimaea. Однако данная классификация
отражает только фенотипические характеристики. Согласно современной таксо¬
номии прокариотических организмов, основанной на анализе строения генома,
филогенетическое положение Coxiella humetii определено иначе: род Coxiella отне¬
сен к у-протеобактериям, в который входят и легионеллы [10J.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА С. BURNETIIС.	burnetii — облигатный внутриклеточный паразит. Это маленькая грамо¬
трицательная бактерия (размером 0,2-0,4х0,4-0,1 мкм). Может размножаться
в фаголизосомах эукариотических клеток в кислой среде, имеет сложный цикл
развития, включающий споровые и вегетативные формы. У вегетативных форм в
период роста и размножения бактерий при электронной микроскопии выявляют
трехслойную оболочку, в неблагоприятных для роста и размножения условиях
коксиеллы переходят в стадию покоящихся форм, которые характеризуются
уплотнением всех элементов бактериальных клеток и утолщением их оболочек.
Присутствие данного микроорганизма не оказывает выраженного повреждающего
действия на клетки хозяина, что способствует длительной персистенции коксиелл
и хроническому течению инфекции. Для коксиелл характерна высокая резистент¬
ность к физическим и химическим воздействиям, например к облучению ультра¬
фиолетовыми лучами или действию дезинфицирующих растворов. Они выдер¬
336ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯживают нагревание до 90 “С более 1 ч и стандартные процедуры пастеризации
молока (гибель коксиелл достигается лишь при его кипячении не менее 10 мин), В
молочнокислых продуктах и свежем мясе зараженных животных, хранящихся при
температуре 4 °С, коксиеллы сохраняют жизнеспособность в течение месяца, а в
замороженном мясе — в течение более длительного срока.С.	burnetii могут находиться в различных фазовых состояниях аналогично
энтеробактериям. В естественных условиях (в организме клещей и животных)
коксиеллы находятся в 1-й фазе, при длительном лабораторном культивирова¬
нии в развивающихся куриных эмбрионах или в клеточных культурах переходят
во 2-ю фазу. Это сопровождается мутационными изменениями поверхностных
липополисахаридов. Биологические свойства коксиелл, находящихся в разных
фазовых состояниях, существенно различаются. Например, коксиеллы 2-й фазы
менее вирулентны и обладают меньшей протективной активностью по сравнению
с коксиеллами 1-й фазы.Геном С. burnetii характеризуется рядом особенностей, которые обусловливают
как специфику выбора нуклеотидных последовательностей-мишеней для моле¬
кулярной диагностики, так и методов типирования данного возбудителя. Длина
генома С. burnetii в зависимости от штамма колеблется от 1,6 до 2,4 млн п.н. Геном
включает хромосому, имеющую циркулярное строение, и плазмидную последова¬
тельность, организованную в плазмиду или представленную плазмидоподобными
участками в хромосоме.В целом геном С. burnetii характеризуется наличием многочисленных генов,
ассоциированных с адгезивностью, инвазивностью, способностью к модуляции
клеток хозяина, детоксикации бактериальной клетки С. burnetii Данные гены
обладают высокой видовой специфичностью.Важная особенность генома С. burnetii, которая определяет его пластичность, —
наличие большого количества мобильных элементов. Они представлены встра¬
ивающимися последовательностями (IS), неравномерно распределенными по
хромосоме, и включают 21 копию изотипа IS110, 1 копию IS1111, 5 копий IS30
и 3 копии ISAsl, а также 3 дегенеративных транспозазных гена. Одна из их важ¬
нейших особенностей IS в геноме С. burnetii — фланкирование так называемых
островков патогенности.Организация части генома, кодирующей транспорт и метаболизм у коксиелл,
характеризуется высоким содержанием транспортеров, что определяется образом
жизни возбудителя. Более 25% транспортеров у коксиелл задействованы в систе¬
ме лекарственного выброса, по сравнению с другими протеобактериями их доля
значительно увеличена.Гены синтеза компонентов, обеспечивающих функции липополисахарида —
липида А и 2-кето-З-деоксиоктулосонических кислотных компонентов липопо¬
лисахаридов, расположены в разных участках хромосомной ДНК, а гены синтеза
олигосахаридного ядра липополисахарида и наружных повторяющихся единицО-антигена, напротив, компактно локализованы в двух регионах. Гены, кодирую¬
щие синтез белков данной группы, обладают высокой видовой специфичностью.У коксиелл отмечены многочисленные гены, близкие по функции к эукариоти¬
ческим: ген, кодирующий гомолог десатуразы жирных кислот, и две стеролредук-
тазы, вовлеченные в синтез холестерола у эукариот. Возможно, данные ферменты
способствуют ткане- и органотропизму, которыми обладает С. burnetii.Важнейшую роль в обеспечении жизненного цикла коксиеллы играют гены,
кодирующие факторы патогенности возбудителя. Адгезивность и инвазивность —
определяющие факторы успешного размножения коксиелл. Хотя у коксиелл
отсутствуют гены, кодирующие типичные структуры адгезии, регистрируются
гены, кодирующие 13 анкирин-повторсодержащих белков, которые могут быть
вовлечены в процесс прикрепления к клетке организма-хозяина.
тшшёЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ337У коксиелл идентифицировано четыре типа плазмид, которые могут быть пред¬
ставлены в геноме, — QpHl, QpRS, QpDV и QpDG и выделена группа бесплазмид-
ных штаммов, у которых плазмидоподобные нуклеотидные последовательности
интегрированы в хромосому. В ра.зделении плазмид на типы участвуют «ядро
плазмидного сиквенса» с неопределенной функциональной ролью и уникальные
регионы. Данные регионы содержат, в частности, ген cbhE, предположительно
кодирующий штаммоспецифичный фактор вирулентности С, burnetii.КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕКоксиеллы характеризуются выраженной полиадаптивностью. Они обитают в
организме разных видов беспозвоночных и позвоночных животных, в том числе
далеко отстоящих друг от друга в систематическом плане. Наиболее существен¬
ное значение для экологии коксиелл и эпидемиологического проявления очагов
данной инфекции имеет связь возбудителя с иксодовыми клещами, дикими и
сельскохозяйственными животными. Животные являются главными источни¬
ками коксиеллезной инфекции, с. burnetii в большом количестве содержатся в
плаценте и вьщеляются при окоте или отеле с околоплодной жидкостью, молоком
и экскрементами. Крупные вспышки ку-лихорадки в большей степени связаны с
мелким, чем с крупным рогатым скотом. Домашняя птица, собаки, кошки и серые
крысы также сравнительно широко вовлечены в цепь циркуляции коксиелл. Эти
животные довольно часто являются источником спорадических заболеваний или
небольших вспышек ку-лихорадки. Напротив, непосредственная роль природ¬
ных очагов коксиеллеза в качестве источника инфекции для людей ограничена.
Заболевания ку-лихорадкой редко связаны с посещением естественных угодий
и нападением кровососущих клещей. Больной человек, как правило, не является
источником коксиелл. Однако заражение возбудителем ку-лихорадки возможно
при переливании донорской крови или внутривенном употреблении наркотиков,
что аргументирует необходимость большего внимания в отношении коксиеллез¬
ной инфекции у данных групп населения.Ведущее значение при заражении коксиеллами имеют аспирационный кон¬
тактный и алиментарный пути. Весьма часто вспышки ку-лихорадки обусловлены
вдыханием полевых частиц, инфицированных С. burnetii, при этом заражение
людей может произойти на значительном расстоянии от источника инфекции.С.	burnetii способны проникать в организм человека через поврежденную кожу
или слизистые оболочки глаз (например, при уходе за животными или обработке
сырья животного происхождения), через желудочно-кишечный тракт при упо¬
треблении молока и молочных продуктов, реже — загрязненной воды, овощей и
фруктов.Высокая патогенность для людей и устойчивость коксиелл к воздействию внеш¬
ней среды позволяют рассматривать этот микроорганизм в качестве потенциаль¬
ного агента для биологического терроризма.Ку-лихорадку регистрируют у людей в течение всего года. Подъем заболеваемо¬
сти отмечают в весенне-летние месяцы, что связано с сезоном окота и отела сель¬
скохозяйственных животных. Мужчины болеют несколько чаще, чем женщины,
к «угрожаемым» в отношении ку-лихорадки профессиям относятся сельскохо¬
зяйственные рабочие, пастухи, чабаны, доярки, зоотехники, ветеринары, рабочие
шерстеобрабатывающих и меховых фабрик. В последнее время среди заболевших
ку-лихорадкой увеличивается доля лиц, не относящихся к этим профессиям,
поскольку все больше людей проводят свободное время за городом и содержат
домашних животных.Заболевания ку-лихорадкой людей или природные и хозяйственные очаги
данной инфекции выявлены во всех регионах мира, ее диагностируют во всех
странах, где проводятся соответствующие клинические исследования. В Европе
338 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯмногочисленные вспышки ку-лихорадки были зарегистрированы во Франции,
Испании, Швейцарии, Великобритании, Германии, Словакии, Болгарии. В России
ку-лихорадка выявлена более чем в 50 субъектах Федерации.По официальным данным, с 1957 г. (начало регистрации) в России заболели
ку-лихорадкой около 13 ООО чел. В разные годы количество больных существенно
различалось, при этом прослеживается тенденция к снижению регистрации случа¬
ев ку-лихорадки. В настоящее время в России имеются реальные предпосылки для
расширения очагов ку-лихорадки и увеличения заболеваемости. К важнейшим из
них относятся:•	ликвидация специализированных животноводческих комплексов с налажен¬
ной системой ветеринарного контроля;•	выпас домашних животных на неблагополучных в отношении ку-лихорадки
территориях;•	ослабление в последние годы контроля за ку-лихорадкой животных;•	бесконтрольная миграция скота из пораженных коксиеллами хозяйств:•	расширение круга лиц, занимающихся разведением сельскохозяйственных
или домашних животных непрофессионально или участвующих в переработ¬
ке сырья животного происхождения.Неблагоприятная ситуация усугубляется отсутствием оценочно-прогности¬
ческой информации о природных и антропогенных факторах, способствующих
формированию и эпидемическому проявлению очагов ку-лихорадки.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИКлиническая диагностика спорадических случаев ку-лихорадки весьма слож¬
на из-за выраженного полиморфизма клинических проявлений и отсутствия
патогномоничных симптомов болезни. У большинства инфицированных кокси¬
еллами людей болезнь протекает со слабовыраженными симптомами или в лег¬
кой форме. Как правило, при спорадических заболеваниях коксиеллезная этио¬
логия инфекции остается нераспознанной. Легкое течение болезни не исключает
возможность ее перехода в хроническую форму и возникновения осложнений.
Среднюю и тяжелую формы болезни регистрируют у 6-8% больных, как прави¬
ло, именно этих больных госпитализируют. Средняя и тяжелая формы болезни
характеризуются лихорадкой, сопровождающейся сильной головной болью,
ознобом, общей слабостью, мышечными и суставными болями, нередко пораже¬
нием легких и печени.Инкубационный период варьирует от 3 до 39 дней, однако наиболее часто он
составляет 10-21 день. Начало болезни при тяжелом и среднем течении, как пра¬
вило, острое, с внезапным ознобом и повышением температуры тела до 39-40 °С в
1-й день заболевания. В течение дня происходят значительные колебания темпе¬
ратуры. У больных с отягощенным преморбидным фоном, например поражением
сердечных клапанов, а также у пациентов с неадекватным или поздно начатым
лечением ку-лихорадка может перейти в хроническую форму. Эндокардит — самое
частое и самое тяжелое клиническое проявление хронической формы заболева¬
ния.Для лечения острой формы ку-лихорадки используют тетрациклины (доксици-
клин), фторхинолоны, а при противопоказаниях к этим препаратам — макролиды
и сульфаниламиды (ко-тримоксазол). Антикоксиеллезная активность многих
лекарственных препаратов значительно возрастает при использовании лизосо-
мальных агентов, повышающих pH в фаголизосомах, в которых персистируют
коксиелль[. Для этиотропного лечения коксиеллезного эндокардита целесообраз¬
но длительное комбинированное применение доксициклина и гидроксихлорохи-
на. После выписки из стационара реконвалесцент должен находиться под диспан¬
серным наблюдением не менее года.
iliipЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 330ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАЛабораторная диагностика ку-лихорадки строится на изоляции и идентифика¬
ции возбудителя, его антигенов и/или фрагментов генома, а также обнаружении
специфических антител.Изоляция и идентификация возбудителяГТрямое подтверждение инфицирования коксиеллами — изоляция возбудителя.
Клиническим материалом как для выделения, так и для обнаружения коксиелл
служат кровь, моча, СМЖ, мокрота, а при хроническом течении болезни — био¬
птаты печени, сердечных клапанов. Взятие биологического материала для выде¬
ления возбудителя при осгром течении болезни желательно проводить на высоте
лихорадки до назначения антибиотиков, обладающих антикоксиеллезной актив¬
ностью, или в первые дни нормализации температуры.В целях вьщеления коксиелл за рубежом проводят комплекс микробиологиче¬
ских исследований:•	биопробу на морских свинках массой 250+25 г;•	исследование плазмы крови инокулированных биологическим материалом
морских свинок иммунологическими методами для обнаружения антител
к С. burnetii, а также органов этих животных на наличие коксиелл (методы
описаны ниже);•	заражение развивающихся куриных эмбрионов или культуры клеток;•	идентификацию выделенной культуры микроорганизмов.Выделение С. burnetii для диагностики ку-лихорадки у людей в России практи¬
чески не применяют. Это обусловлено тем, что, с одной стороны, все исследования
с материалом, подозрительным на заражение коксиеллами, могут осуществляться
лишь в специализированных лабораториях, имеющих разрешение на работу с
возбудителями II группы патогенности, с другой стороны, их трудоемкостью и
длительностью, в некоторых странах, например во Франции, выделение коксиелл
из организма больного применяют для определения чувствительности данного
микроорганизма к различным антибиотикам и оптимизации этиотропного лече¬
ния хронических форм коксиеллезной инфекции (как правило, коксиеллезного
эндокардита). В России такие исследования пока не проводятся.Выявление антигенов возбудителейв соответствии с методическими рекомендациями «Серологические методы
диагностики риккетсиозов» (1988), коксиеллы в биологических объектах, в том
числе в клиническом материале, выявляют прямым методом флюоресцирующих
антител (ПМФА) или в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с эритроци¬
тарным иммуноглобулиновым диагностикумом. Однако их применение в наших
лабораториях затруднено из-за отсутствия отечественных диагностикумов.в настоящее время для обнаружения в клиническом материале антигеновС.	burnetii может быть использована разработанная в НИИЭМ им. Л. Пастера
иммуноферментная тест-система. В ней использованы поликлональные анти¬
тела, сорбированные на поверхности лунок стрипов. Образующийся комплекс
«антитело-антиген* выявляют с помощью пероксидазного конъюгата на основе
поликлональных антител по изменению окрашивания содержимого лунок на
этапе ферментного превращения субстратного раствора. Иммуноферментная тест-
система позволяет выявлять 10-50 нг/мл корпускулярного антигена С. burnetii1-й фазы, что составляет 3,78x10^-1,89x10'^ клеток возбудителя в 1 мл. Ее чув¬
ствительность превосходит чувствительность ПМФА более чем в 6-12 раз, а чув¬
ствительность РНГА — более чем в 16-32 раза. Это позволяет выявить С. burnetii в
организме экспериментально зараженных животных как в первые дни заражения,
так и в течение более длительного периода.К' I
340 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
Молекулярная диагностикаМолекулярно-биологические методы для определения с ЪигпеШ имеют ряд
преимуществ перед иммунобиологическими методами:•	большие чувствительность и специфичность;•	относительно короткое время получения результата (1-3 ч);•	отсутствие повышенных требований к лаборатории по показателю инфекци-
Ц|)|5 онной защиты после стадии выделения ДНК;•	возможность диагностики ку-лихорадки на ранних сроках заболевания;' ■	• возможность обнаружения целевой ДНК в материале даже в случае гибеливозбудителя;•	универсальность результатов.Возможности молекулярно-биологических методов значительно расширились
вследствие распространения практики секвенирования генома микроорганизмов
с возможностью свободного доступа к этим данным в сети Интернет, благодаря
банку генотипов «GenBank» и другим базам данных нуклеотидных последователь¬
ностей. Наиболее широко применяют ПЦР для мониторинга распространения
С bumetii в организме и контроля эффективности проводимого лечения, а также
для санитарно-гигиенической проверки продуктов питания и источников воды,
идентификации возбудителя во внешней среде и выявления его переносчиков и
естественных резервуаров. К настоящему времени известен ряд праймеров, при¬
меняемых для выявления с, bumetii в различных клинических образцах, в том
числе парафинированных, включая материал из сердечных клапанов, сосудистой
аневризмы, мокроты, СМЖ, биоптата печени, молока, плаценты, ткани плода и
плодной жидкости, крови. Выделение ДНК проводят стандартными методами
(фенол-хлороформной экстракцией, сорбцией), в том числе с использовани¬
ем стандартных коммерческих наборов, предназначенных для выделения ДНК
из соответствующего типа биологических образцов. В качестве мишени для
амплификации используют многочисленные нуклеотидные последовательности.
Во многих лабораториях для диагностики ку-лихорадки применяют праймеры
IS1111, амплифицирующие ген транспозазы, который входит в состав инсерцион-
ного домена высокой копийности (19-31 повторов на хромосому). Применение
праймеров к данному гену позволяет увеличить выход продукта амплификации
и значительно повысить чувствительность ПЦР. Используют также праймеры к
генам 16S tRNA, 23S гРНК, внутреннему транскрибируемому спейсеру 16S-23S
гРНК, генам супероксиддисмутазы (sod), CbbE, rpoB, соті и гену изоцитратдеги-
дрогеназы (icd).Наиболее эффективный молекулярно-биологический метод выявления кок¬
сиелл Бернета — ПЦР в формате реального времени (ПЦР-РВ). Данный метод
обладает не только большей чувствительностью по сравнению со стандартной
ПЦР, но и позволяет установить соотношения между концентрацией целевой
ДНК и количеством ПЦР-продукта, вырабатываемого в процессе амплификации.
ПЦР-РВ проводят в двух модификациях, различающихся принципом генерации
репортерной флюоресценции. В соответствии с первым принципом в качестве
интеркалирующих красителей используют SYBR Creen I, SYT0-13, РОРО-3 и др.
Второй принцип предполагает использование технологий (например, «TaqMan»,
«Molecular Beacons» и «LightCycler»), основанных на применении меченных
флюорофорами о лигонуклеотидных последовательностей. Б настоящее время
для выявления с. bumetii с помощью ПЦР-РВ в качестве мишени для праймеров
используют различные гены ~ sod, сот 1, icd, ген транспозазы IS1111.Серологическая диагностикаВыявление антител к С. ЪитеШ, равно как и непосредственное выделение дан¬
ного возбудителя, возможно только в лабораториях, имеющих специальное разре-
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 341шение, что 9^1цественно ограничивает круг практических лабораторий, выполняю¬
щих эти исследования. Напротив, серологические исследования, предназначенные
для выявления антител к С. bumetii в плазме крови больных, не требуют особых
условий и могут осуществляться во многих лабораториях. Для лабораторной диа¬
гностики случаев острого заболевания ку-лихорадкой исследование плазмы крови
целесообразно проводить на самых ранних сроках заболевания. Отрицательные
результаты серологических реакций или низкие титры антител к коксиеллам2-й фазы диктуют необходимость повторного исследования плазмы крови, полу¬
ченной от больного, через 7-10 дней после забора первой пробы и сравнения
результатов одновременного исследования двух проб. Появление антител к С. bur¬
netii 2-й фазы или нарастание титров этих антител во второй пробе в 4 раза и более
свидетельствуют о коксиеллезной природе заболевания.Для выявления антител к С. bumetii используют реакцию связывания ком¬
племента (РСК), реакцию агглютинации (РГА) в различных модификациях и
непрямой метод флюоресцирующих антител (НМФА), при этом параллельное
применение антигенов из коксиелл 1-й и 2-й фаз существенно повышает эффек¬
тивность серологического исследования. С помощью РСК, как правило, не удается
обнаружить антитела к С bumetii в ранний период заболевания. Именно поэтому
однократное обследование больных в данной серологической реакции во время
лихорадки или в период ранней реконвалесценции в большинстве случаев оказы¬
вается недостаточно эффективным. Для более ранней серологической диагности¬
ки целесообразно применение РГА и НМФА.Для повышения эффективности серологической диагностики ку-лихорадки в
НИИЭМ им. Л. Пастера была разработана тест-система для ИФА. Ее особенность
заключается в том, что за счет химической модификации коксиеллезного анти¬
гена 1-й фазы удалось существенно повысить активность твердофазного сорбента.
При этом обеспечивается выявление антител к различным детерминантам, так
как происходит пространственная демаскировка антигена С. bumetii 2-й фазы при
сохранении или даже активации антигена коксиелл 1-й фазы. Разработанная тест-
система ИФА обладает значительно большей чувствительностью по сравнению с
другими серологическими тестами. С ее помощью удается обнаружить антитела
к С, bumetii как на ранних стадиях болезни, так и на протяжении нескольких лет
после выздоровления.Способность серологических тестов обнаруживать антитела к С. burnetii в
течение нескольких лет после перенесенной ку-лихорадки обосновывает необ¬
ходимость дифференцировать следовые иммунологические реакции от недав¬
него антигенного раздражения. С этой целью постановку РСК целесообразно
проводить одновременно с антигенами С. burnetii, находящимися в разных
фазовых состояниях. Антитела к С. bumetii 2-й фазы выявляются раньше, чем кС.	burnetii 1-й фазы, и определяются при остром течении болезни, как правило,
за более длительный период времени. Именно поэтому выявление в РСК анти¬
тел к С. bumetii 1-й фазы на ранних сроках болезни (первые 2-3 нед) с высокой
степенью вероятности свидетельствует об инфицировании данным возбудителем
в прошлом.Дифференциация антител по классам иммуноглобулинов также позволяет
ориентировочно судить о сроках, прошедших с момента заражения С. bumetii.
Обнаружение IgM к С. bumetii 2-й фазы с помощью НМФА на ранних стадиях
заболевания, как правило, позволяет серологически распознать коксиеллезную
этиологию инфекции без повторного исследования плазмы крови в динамике.
Обнаружение в данной реакции высоких титров IgG (1:800 и выше) к С. bumetii1-й фазы — показатель хронической инфекции.Г
342ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОгаЯ■ЭНТЕРОБАКТЕРИИБолее 100 лет представители данного семейства находятся в центре внимания
медицинской микробиологии. Первоначально интерес к энтеробактериям был
обусловлен принадлежностью к ним ведущих возбудителей острых кишечных
инфекций (дизентерии, эшерихиозов, брюшного тифа, паратифов и других саль¬
монеллезов), а также чумы, псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. На про¬
тяжении последних десятилетий знания об этиологической роли энтеробактерий
в патологии человека претерпели существенные изменения. Установлено значение
широкого спектра представителей семейства в этиологии гнойно-септических
внутрибольничных и респираторных заболеваний, инфекций мочевыводящих
путей. Отмечается неуклонный рост доли грамотрицательных микроорганизмов,
в том числе энтеробактерий, в этиологической структуре бактериемий, гнойно¬
септических и внутрибольничных инфекций.ХАРАКТЕРИСТИКА СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAEСемейство Enterobacteriaceae включает 44 рода у-протеобактерий (жирным
шрифтом вьщелены роды, имеющие медицинское значение).AfsenoßhonusBrenneriaBucfmeraBudviciaButtíauxeUaCalymmatobacteriumCitrobacterCedeceaDickeyaEtiwarüsieüaEnterobacterErwmiaEseherfchiaEwingellaHafniaKlebsiellaHiuyveraLeclercialemfnoretlaMoellereliaMorganellaOtiesambacterlumPantoeaPectobacteriumPhotorhabdusPlesiomonasPragfaProteusProvidenciaRahnellaRaouttellaSaccharobacterSalmoneilaSamsonisSerratiaShigellaSodalisTatumeflaThorselliaTrabulslellaWigglesworthiaXetiorhabdusYersiniaYokenellaПредставители семейства Enterobacteriaceae — грамотрицательные, не обра¬
зующие спор и микроцист тонкие палочки среднего размера, не содержащие
включений, имеющих диагностическое значение, обладающие и не обладающие
капсулой, подвижные перитрихи (за исключением Tatumeüa) или неподвижные.
Некислотоустойчивы. Факультативные анаэробы, хорошо растут на обычных
питательных средах. По способности расти на питательных средах минимально¬
го состава принадлежат к прототрофам (используют глюкозу как единственный
источник углерода) и ауксотрофам, требующим для роста в качестве добавок
витамины или аминокислоты. Питание осуществляют за счет органических соеди¬
нений. Энергию получают путем мембранного и дыхательного фосфорилирова¬
ния. Каталазоположительны, за исключением Shigella dysenteriae и Xenorhabdus
nematophilus. Оксидазонегативны, за исключением Plesiomonas shigelloides.
Проявляют ферментативную активность в отношении углеводов (ферментируют
их до кислоты или до кислоты и газа), многоатомных спиртов, органических
кислот и их солей, аминокислот. Нитраты редуцируются в нитриты, за исключе¬
нием некоторых штаммов Erwinia и Yersinia. Ферментативные реакции положены в
основу дифференциации энтеробактерий на роды, виды и подвиды.Энтеробактерии обладают следующими антигенами:•	соматическим 0-антигенным комплексом;•	Н-антигенами (подвижными бактериями);•	поверхностными, капсульными антигенами {Klebsiella spp., E. coli, S. typhi)',•	общим антигеном энтеробактерий (CA), за исключением Erwinia chrysan-
themi.Представители многих родов характеризуются различными факторами виру¬
лентности (адгезинами, инвазинами, токсинами), которые кодируются генами.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 343локализованными в островках патогенности (расположены в хромосоме), или
генами, локализованными в плазмидах, бактериофагах и других мобильных гене¬
тических элементах.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИЭнтеробактериями вызываются разнообразные заболевания. Клиническое зна¬
чение различных представителей семейства Enterobacteriaceae неравнозначно.
Шигеллами, сальмонеллами, диареегенными эшерихиями, иерсиниями вызыва¬
ются инфекционные заболевания, способные к широкому эпидемическому рас¬
пространению (острые кишечные инфекции, псевдотуберкулез, чума, брюшной
тиф), практически все энтеробактерии могут вызывать пищевые токсикоин¬
фекции (ПТИ) из-за способности размножаться в пищевых продуктах. Многие
представители семейства Enterobacteriaceae нередко являются причиной инфекций
мочевьюодящих путей, респираторных заболеваний, послеоперационных ослож¬
нений, сепсиса, менингитов. Они способны вызывать тяжелые внутрибольничные
инфекции, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом, детей раннего
возраста и недоношенных. Энтеробактерии также могут вызывать аппендицит,
поражение суставов. Данные заболевания часто обусловлены представителями
родов Citrobacter, Enterobacter. Esherichia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia,
Serratia,Два представителя энтеробактерий — E. coli и K. pneumoniae — входят в число
бактерий, являющихся индикаторами развития резистентности к антимикробным
препаратам в Европе. Определение этиологической значимости условно патоген¬
ных энтеробактерий основано на количественной характеристике выявляемого
микроорганизма.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
Преаналитический этапМатериалом для бактериологического исследования служат кровь, слизь из зева
и носа, гной, экссудат, раневое отделяемое, пунктат различных органов, отделяе¬
мое цервикального канала, мокрота, желчь, моча, фекалии, СМЖ.Пробы крови, как правило, засевают на питательные среды непосредственно
у постели больного. Для взятия и транспортировки проб, исследуемых на нали¬
чие энтеробактерий, следует использовать стерильные тубсеры, зонды-тампоны,
одноразовые стерильные емкости (пробирки) с герметично завинчивающейся
крышкой.Если материал нельзя доставить в лабораторию немедленно после взятия пробы,
для сохранения жизнеспособности энтеробактерий целесообразно использовать
специальные транспортные системы с питательной средой. Выбор транспортной
среды с учетом вида материала, цели исследования и технических возможностей
осуществляют сотрудники лаборатории. К числу наиболее универсальных транс¬
портных сред относятся среды Стюарта и Эймса (с углем или без него). Для транс¬
портировки фекалий также допустимо использовать среду Кэри-Блеер, глицери¬
новую (за исключением бактерий рода Yersinia) и фосфатную буферную смесь,
боратно-буферный раствор или 0,9% раствор натрия хлорида. Транспортировка
материала должна осуществляться в максимально короткие сроки, как правило, в
течение 1,5-2 ч.Каждая проба должна иметь четкую маркировку, а также направление, содер¬
жащее информацию, необходимую для получения адекватного результата и его
правильной интерпретации (вид и цель исследования, дата и время получения
материала).
344ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯАналитический этапБактериологическое исследование доставленного в лабораторию материала на
наличие в нем энтеробактерии обычно включает:•	посев проб на питательные среды и выделение чистой культуры;•	идентификацию выросших колоний по биохимическим (ферментативным)
свойствам (определение рода, вида, биовара);•	идентификацию патогенных энтеробактерий (шигелл, сальмонелл, эшери¬
хий) по антигенной характеристике (определение серогруппы, серовара);•	определение чувствительности к антимикробным препаратам и выявление
клинически значимой резистентности к препаратам выбора для лечения.Большинство видов энтеробактерий нетребовательны к питательным средам и
хорошо растут на простом питательном агаре, кровяном агаре и других питатель¬
ных средах. Энтеробактерии образуют круглые, слегка выпуклые, средней вели¬
чины, влажные, блестящие, прозрачные в проходящем свете колонии с ровными
краями (гладкие 5-формы) или более плоские, сухие, с неровными волнистыми
краями (шероховатые К-формы). Диссоциация на 5- и К-формы чаще проявляется
спонтанно на питательных средах, содержащих углеводы.Выделение энтеробактерий из материалов, богатых собственной микрофлорой,
может быть затруднено и требует применения специальных дифференциально¬
диагностических, обогащенных, элективно-дифференциальных, хромогенных
и других питательных сред. Наиболее широкое распространение получили
дифференциально-диагностические питательные среды с лактозой в качестве
дифференциального фактора. Они универсальны, позволяют выделить подавляю¬
щее большинство видов энтеробактерий, дифференцируя выросшие колонии по
отношению к лактозе.в настоящее время разные авторы предложили многочисленные варианты про¬
писей подобных питательных сред, отличающиеся друг от друга применяемым
индикатором pH, питательной основой и технологией приготовления. Широкое
распространение получили три среды данного класса — Эндо, Левина и Мак-
Конки.•	Среда Эндо — слабоселективная дифференциально-диагностическая пита¬
тельная среда с лактозой, фуксином и сульфитом натрия. Последние два
компонента, помимо функции индикатора, обладают слабым ингибирующим
действием по отношению к грамположительным микроорганизмам.•	Среда Левина (эозин-метиленблау-лактоза-агар) отличается от среды Эндо
индикатором, в качестве которого используются эозин и метиленовый синий.
Данная питательная среда также обладает слабым ингибирующим действием
по отношению к грамположительным бактериям.Существует разновидность — дифференциально-диагностическая питательная
среда, называемая агаром с эозин-метиленовым синим (ЭМС). В ее состав, кроме
лактозы, входит сахароза. Это необходимо учитывать, так как в литературе ее
часто некорректно идентифицируют со средой Левина. К числу выпускаемых за
рубежом дифференциально-диагностических сред с лактозой относится агар с
бромкрезол-фиолетовым, отличающийся от среды Левина типом индикатора.•	Агар Мак-Конки отличается от среды Эндо индикатором, в качестве кото¬
рого используется нейтральный красный, и наличием желчных солей. Данная
дифференциально-диагностическая питательная среда обладает более выра¬
женными элективными свойствами по сравнению со средой Эндо, однако
спектр вырастающих на ней микроорганизмов достаточно широк. Кроме
энтеробактерий, на этой питательной среде растут энтерококки, стафилокок¬
ки, псевдомонады, аэробактер и некоторые другие устойчивые к желчи бак¬
терии. Во многих странах данная дифференциально-диагностическая среда
широко используется при исследовании на энтеробактерии, энтерококки, а
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 34§также для дифференциации некоторых видов микроорганизмов, например
пастерелл.Разработаны и выпускаются различными фирмами многочисленные варианты
среды Мак-Конки с более узкой целевой направленностью, что необходимо учи¬
тывать при проведении исследований.Агар Мак-Конки с сорбитом применяют для целенаправленного поиска
Е. соИ 0157:Н7 — основного представителя группы энтерогеморрагических
эшерихий. Штаммы Е. соИ 0157:Н7 не ферментируют сорбит и на этой среде
образуют бесцветные или бледно-розовые колонии, в отличие от большин¬
ства эшерихий, у которых вследствие ферментации сорбита колонии на
этой среде имеют розовый цвет, а на среде Эндо — лактозоположительны.
Использование данной среды повышает частоту обнаружения Е. coli 0157:Н7,
поскольку сорбитотрицательных штаммов эшерихий значительно меньше,
чем лактозоположительных.Для выделения отдельных родов (видов) энтеробактерий разработаны узко¬
специализированные элективные среды, производится селективная среда для
выделения микроорганизмов родов Proteus, Providencia и Morganella, содержащая
хлоргидрат алкилэтилглицина (поверхностно-активное вещество), который пода¬
вляет рост других энтеробактерий.•	Висмут-сульфит агар - высокоселективная дифференциально-диагно-
стическая среда для выделения сальмонелл. Входящие в ее состав брилли¬
антовый зеленый и висмут ингибируют рост грамположительных бактерий,
а также многих энтеробактерий. Дифференцирующее действие основано на
том, что образуемый сальмонеллами сероводород из сульфата железа вызы¬
вает почернение индикатора (сульфита висмута), именно поэтому бактерии,
продуцирующие сероводород, формируют черные колонии с металлическим
блеском, а среда вокруг колоний окрашивается в черный цвет. Бактерии, не
продуцирующие сероводород, могут вырастать в виде мелких бесцветных,
зеленоватых или коричневых колоний.Висмут-сульфит агар выпускают в сухом виде. Предпочтительнее включать в
исследование питательную среду, выдержанную перед посевом при температуре4	“С в течение не менее 24 ч. Посевы инкубируют в термостате при температуре
37 °С с ежедневным просмотром через 24 и 48 ч.•	Среда Плоскирева — селективная питательная среда для вьщеления шигелл
и сальмонелл. Входящие в состав феды желчные соли, бриллиантовый
зеленый и йод полностью подавляют рост грамположительных бакте¬
рий и способность роения протея, а также задерживают рост эшерихий.
Дифференцирующий фактор — лактоза.Жидкие среды обогащения применяют до посева на плотные питательные
среды для увеличения первоначального количества энтеробактерий в биоматериа¬
ле. Их принцип действия состоит в подавлении химическими веществами (тетра-
тионатом натрия, кристаллвиолетом, малахитовым зеленым), входящими в состав
среды, роста Е. coli при отсутствии воздействия на патогенные энтеробактерии.
При подавлении конкурирующего действия сопутствующей микрофлоры патоген¬
ные энтеробактерии развиваются быстрее.Наиболее распространены среды обогащения для выделения сальмонелл.
Компоненты, определяющие избирательный рост сальмонелл, — соли селенистой
кислоты, желчь и соли желчных кислот (преимущественно дезоксихолат натрия),
соли магния, препараты йода, а также некоторые красители (бриллиантовый зеле¬
ный).•	Среда Мюллера относится к числу признанных сред, способствующих пре¬
имущественному накоплению сальмонелл. При добавлении к тетратионато-
вому бульону тиосульфата натрия и раствора Люголя образуется тетратионат
346 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯнатрия, который является ингибитором для эшерихий и другой микрофлоры
кишечника, но не влияет на развитие большинства сероваров сальмонелл.
Питательная среда готовится ех tempore,•	Селенитовый бульон обеспечивает избирательный рост сальмонелл за счет
действия гидроселинита натрия.•	Магниевая среда содержит селективный фактор — соли магния. Питательная
среда имеет ряд модификаций, однако ингибирующий эффект основан на
дегидратирующем действии магния хлорида. Также селективность среды
усиливают введением в ее состав малахитового зеленого.•	Желчный бульон и среда Раппопорта являются средами обогащения, в
них используются свойства желчи, их, как правило, применяют для посева
крови при лабораторной диагностике брюшного тифа и паратифов А, В и С.•	Среда Кауфмана сочетает ингибирующие свойства желчи и бриллиантового
зеленого.Приготовленные в лаборатории жидкие питательные среды обогащения долж¬
ны подвергаться внутрилабораторному контролю для оценки ростовых и инги¬
бирующих свойств, в настоящее время отечественным лабораториям доступны и
готовые питательные среды для энтеробактерий, обладающие стандартно высо¬
ким качеством.Холодовое обогащение используют для обнаружения иерсиний — посевы инкуби¬
руют в забуференной пептонной воде или пептонно-калиевой среде в условиях холо¬
дильника. Для вьщеления у. enterocolitica производится ряд элективных питательных
сред с селективными добавками, содержащими цефазолин, иргазан и новобиоцин.
Дифференциацию бактерий проводят по ферментации маннита. Выпускаются сла¬
боэлективные среды, в которых содержится, в частности, один только иргазан; они
пригодны для выделения как Y. enterocolitica, так и У. pseudotuberculosis.В последние годы все более широкое распространение для идентификации энте¬
робактерий получили хромогенные среды. Принцип действия данных сред осно¬
ван на выявлении специфических или уникальных ферментов микроорганизмов.
Большинство хромогенных сред содержат селективные добавки, подавляющие
рост посторонней микрофлоры. Использование хромогенных сред позволяет уско¬
ренно (в течение суток) выделять и одновременно идентифицировать наиболее
частые и значимые в клинической практике виды энтеробактерий, практически
без проведения дополнительных тестов (или используя 1-2 теста, выполняемых в
течение нескольких часов в пределах первых суток).Разработаны и выпускаются хромогенные среды для колиформных бактерий и
видовой идентификации Е. coli (хромогенная среда для выявления ß-глюкуронидазы
и ß-галактозидазы), Salmonella spp. (хромогенная среда с пропиленгликолем) и др.НИИЭМ им. Л. Пастера производит две хромогенные питательные среды для
одноэтапного выделения и прямой идентификации бактерий — среду «Протеус
ППМ» для выявления родов Proteus, Providencia и Morganella (принцип действия
основан на выявлении специфичной для данного вида энтеробактерий триптофан-
деза миназы), а также среду «Klebsiella 5-АСК» для идентификации рода Klebsiella
(принцип действия основан на обнаружении уникального фермента клебсиелл —
5-аминосалицилатдекарбоксилазы).ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЗНТЕРОБАКТЕРИЙ ПО БИОХИМИЧЕСКИМ СВОЙСТВАМДля доказательства принадлежности микроорганизма к семейству Entero¬
bacteriaceae достаточно поставить три теста — на оксидазу, редукцию нитратов и
OF-тест (среда Хью-Лейфсона). Энтеробактерии — оксидазоотрицательны (кроме
Plesiomonas shigelloides), редуцируют нитраты и ферментируют глюкозу.Для ориентировочной межродовой дифференциации осуществляют дальней¬
шую идентификацию выросших колоний по ферментативным свойствам с приме¬
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ347нением полиуглеводных питательных сред (среда Клиглера, Олькеницкого, трех¬
сахарного железного агара, лизин-железного агара, среды Ресселя с мочевиной).
Данные многофункциональные питательные среды позволяют судить о микро¬
организме сразу по нескольким признакам. Как правило, они предназначены
для дифференциации энтеробактерий по способности ферментировать глюкозу,
лактозу, а также образовывать газ и сероводород.При расщеплении углеводов образуется кислота, что приводит к изменению
цвета индикатора. Соотношение углеводов в питательных средах подобрано таким
образом, что при ферментации глюкозы изменяет цвет на желтый только столбик
среды. Пожелтение скошенной части среды свидетельствует об утилизации лак¬
тозы или сахарозы. Если при ферментации углеводов образуется газ, то в толще
среды появляются разрывы.Также в состав питательных сред входит тиосульфат, который под действием
микробной тиосульфатредуктазы (ею обладают Salmonella, Proteus, Citrobacter)
восстанавливается в сульфит с образованием сероводорода. Входящие в состав
среды соли железа вступают с сероводородом в реакцию, приводя к образованию
сульфида железа в виде преципитата черного цвета. Именно поэтому при образо¬
вании сероводорода среда чернеет.Более сложный состав имеет среда Олькеницкого (вариант трехсахарного агара
с мочевиной). Присутствие в среде мочевины позволяет определить наличие у
бактерий уреазы.С помощью полиуглеводных питательных сред ориентировочно определяют
родовую принадлежность и намечают ход дальнейшего анализа (табл. 21-5).Удобнее использовать среды Клиглера и с мочевиной (по Кристенсену) или
среду Олькеницкого, однако на последней при ферментации мочевины изолятами
затруднен учет других биохимических свойств.Тесты, используемые для дальнейшей межродовой дифференциации клиниче¬
ски значимых и малоизученных родов семейства Enterobacteriaceae, представлены
в табл. 21-6 и 21-7.Из числа сложных питательных сред, которые предназначены для применения
с этой целью, следует упомянуть двухфазную среду «Энтеро Плюс» (ее название и
состав запатентованы компанией «Новамед», Израиль), Она позволяет одновременно
определять подвижность изолятов энтеробактерий и наличие у них способности:•	расщеплять орто-нитрофенил галактозидазу на глюкозу и орто-нитрофенил;•	ферментировать глюкозу;•	образовывать сероводород;•	образовывать индол:•	образовывать газ;•	разлагать мочевину.Для точной видовой идентификации энтеробактерий требуется выполнение
многочисленных биохимических тестов, нередко с использованием дорогостоящих
химических субстратов. С этой целью применяют специальные диагностические
тест-системы. Принцип действия большинства из них одинаков: об утилизации
или расщеплении возможно минимизированного объема субстрата в питательной
среде судят по изменению цвета специального индикатора.Таблица 21-5. Первичная дифференциация родов семейства Enterobacteriaceae на полиуглевод¬
ных средахЭнтеробактерииГлюкоза (газ)ЛактозаСахарозаПродукциясероводородаEnterobacter cloacae subsp. cloacae
Citrobacter spp.Klebsiella spp.Raoultella spp.+++-
і*sp*ptiш'Шштщ348ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯОкончание табл. 21-5ЭнтеробактерииГлюкоза (газ)ЛактозаСахарозаПродукциясероводородаCitrobacter spp.
Proteus myxofactens+-+-Morganella spp.
Citrobacter spp.+---Citrobacter spp.++--Proteus vulgaris+-++Proteus mirabilis+--+Yersinia enterocolitica--+-Yersim'a pseudotuberculosis----Budvica aquatica---+Buttiauxella spp.
Citrobacter spp.
Edwardsiella ictaiuri
Enterobacter taylorae
Escherichia spp.Hafnia alvei
Salmonella paratyphi A
Yoiíenella regensburgei+---Buttiauxella agrestis
Citrobacter spp.Enterobacter nimipressuralis
Escherichia coli++--Enterobacter sakazakii
Escherichia coli
Klebsiella mobilis
Kluyvera spp.Rahnella aquatitis
Serratia rubiöaea+++-Edwardsiella hoshinae
Enterobacter hormaechei
Serratia spp.+-+-Salmonella spp.
Leminorella grimontii
Citrobacter spp.+--+Budvica aquatica
Hafnia alvei биовар 1
Edwardsiella ictaiuri
Escherichia coli неактивная
Obesumbacterium proteus биогруппа 1
Plesiomonas shigelloides
Shigella spp.Yersinia pestis
Yersinia ruckeri
Ewingella americana----Ewingella americana-+--Moellerelia wisconsensis-++Edwardsiella hoshinae
Enterobacter hormaechei
Pantoea dispersa
Serratia spp.Tatumelia ptyseos--+-Leminorella richardii
Pragia fontium
Salmonella typhi
Budvica aquatica---+Примечание. «+í> — положительная реакция; — отрицательная реакция.
Таблица 21-6. Биохимическая дифференциация клинически значимых родов cemv\ciBdi EnterobacteriaceaeТест или субстрат.«51•ЭS§■S511§1в•ЭiА11&€л5•511•551f■5"е1•Э1'SФерментация глюкозыКГ, кк’кгкгкг'кгкгкг, ккг, ккгкгкгккОбразование кислоты из лак¬
тозы+-/(+)-+-/+++++----+Образование сероводорода--++----+----Образование индола++-/+--/+---±++-/+-/+Цитрат (среда Симмонса)---++++++±+--+Фенилаланиндезаминаза---------+++--Лизиндекарбоксилаза±+-++-/+++-----Орн итиндекарбокс илаза-/+-+-/+--+++--++-Проба с метиловым красным+++++-^+--/++++++±Реакция Фогеса-Проскауэра_----++-/++-----/+Ферментация адонитола-/+---1+-+-/+---/+_--Ферментация инозита+_--/+-+-/+--/+-----Ферментация сорбита+--++++-+--/+-+-Ферментация рамнозы+-+++++---/+--/++Подвижность+-+++-+++++++Гидролиз мочевины-----(+)(+)--+-/+++5-/+юПримечание:«кг» — кислота-газ; «к» — кислота; «+«* или «-/+» — разные биовары или виды рода; «(+)*■ — замедленная или слабовыраженная реакция.
' Кроме S.ßexneri 6.^ Kpo^5e S. typhi.^ Кроме некоторых редко встречающихся серовариантов.'• При темнера ч'уре 25 “С.^ Кроме Y. pestis.
Таблица 21-7. Биохимическая дифференциация малоизученных родов семейства Enterobacteriaceaeо>СПТест или субстрат1■Эi1•S1-Sä'Si211<5"55i■511■51Образование индола--++-------Проба с метиленовым красным+++++-/+++--+Реакция Фогеса-Проскауэра++--~+-+---Цитрат (среда Симмонса)+++-+4++--+Образование сероводорода------/++----Гидролиз мочевины-----------Фенилаланиндезаминаза------_++--Лизиндекарбоксилаза--+------+Орнитиндекарбоксилаза-/+-+---/+~---+Подвижность-/+++-++--++Ферментация глюкозы с выделением таза+-++---+--+Ферментация адонитола---++------Ферментация инозита------/+-----Ферментация лактозы-/+-/++++--+---Ферментация маннита++++++-+--+Ферментация рамнозы--++-+-+--+Ферментация сахарозы+-+-/+++-+---Ферментация сорбита-/+--/+----+---Ферментация целлобиозы+-++-±-+--+Ферментация мальтозы+-++++-+_-+Пигмент---ж-Ж---К, ж, 0-Примечание. «Ж*- — желтый; «К» — коричневый; «О» — оранжевый.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 351с технической точки зрения, доступные тест-системы можно разделить на три
группы.•	Тест-системы, содержащие высушенную смесь «субстрат-индикатор-среда»
в специальном планшете. Таких тест-систем большинство. Суспензию тести¬
руемого микроорганизма вносят в лунки планшета. Преимущество данных Щ
тест-систем — высокая технологичность, недостаток — невозможность выбо¬
ра отдельных тестов, планшет всегда расходуется полностью.•	Тест-системы, содержащие жидкую смесь «субстрат-индикатор-среда»,
которая раскапывается в лунки планшета непосредственно перед примене¬
нием. Преимущество данных тест-систем — экономичносгь, так как набор
тестов для каждой культуры может варьировать по мере необходимости,
недостаток — увеличение трудозатрат.•	Тест-системы, в которых смесью «субстрат-индикатор-среда» пропитаны
бумажные диски. Перед применением диски в асептических условиях рас¬
кладывают пинцетом в пробирки, содержащие взвесь исследуемого микро¬
организма. Для данных тест-сист'ем характерны максимальные трудозатраты
при возможности неограниченно варьировать набор тестов.По времени учета результатов все тест-системы можно разделить на две
группы:•	позволяющие пол>^ить результат через 4-5 ч инкубации;•	требующие инкубации в течение 18-24 ч.Первая промышленная тест-система, сохранившая свое значение в качестве
«золотого стандарта» для идентификации энтеробактерий, — тест-система «АР1
32Е» («Bio Merieux»). Она позволяет в течение 18 ч определить с помощью одной
панели результаты 20 тестов. Дополнительно определяют цитохромоксидазу,
окисление и ферментацию глюкозы, подвижность. Объектом идентификации
может быть изолированная колония со среды первичного посева. Фирма про¬
изводит тест-систему «Rapid 32Е?> для идентификации энтеробактерий, которая
позволяет получить результат в течение 4 ч.Тест-системы «Enterotest 16», «Энтеротест 24», «ЭнтероСкрин» и «Энтеро-
Рапид24>> («Эрба-Лахема с.р.о.») включают тесты для родовой идентификации
энтеробактерии — определения уреазы, р- и D-галактозидазы, липазы, фенила-
ланиндезаминазы, орнитиндекарбоксилазы, лизиндекарбоксилазы, образования
индола, сероводорода, ацетоина, ферментации маннитола, цитрата и инозитола,
адонитола, эскулина, малоната натрия, рамнозы, целлобиозы, сахарозы, сорбита,
глюкозы, дульцитола и трегалозы, а также определения аргининдегидролазы.
Система «Enterotest 16» («Эрба-Лахема с.р.о.») предназначена для идентификации
наиболее значимых в клинической практике энтеробактерий в течеиие 18-24 ч с
помощью проведения 16 тестов — определения уреазы, фенилаланиндезаминазы,
лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, образования индола, сероводо¬
рода, ферментации цитрата, эскулина, малоната, инозитола, адонитола, целлобио¬
зы, сахарозы, сорбита, маннитола и трегалозьт.В настоящее время наряду с импортными выпускаются и многочисленные оте¬
чественные тест-системы для идентификации энтеробактерии, в том числе ММТЕ1	и ММТЕ 2 (НПО «Аллерген, Ставрополь), СИБ-набор № 2 (НПО «Микроген»
предприятие «ИмБио», Нижний Новгород), ПБДЭ (НПО «Диагностические
системы». Нижний Новгород), «РАПИД-ЭНТЕРО-200» и «РАПИД"ЭНТЕРО-50»
(НИИЭМ им, Л. Пастера, Санкт-Петербург).Способ идентификации культуры по биохимическим тестам зависит от тех¬
нических возможностей лаборатории. Следует отметить, что существующие диа¬
гностические таблицы позволяют идентифицировать только основные, хорошо
известные роды энтеробактерий. Использование диагностических ключей (осо¬
бых графических схем) дает возможность сократить трудоемкость, но иногда за
шІІІІШ352ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯсчет снижения точности. Наиболее современные способы идентификации — кодо¬
вые книги и компьютерные программы.Новые возможности быстрой идентификации микроорганизмов, включая
энтеробактерии. с одновременным определением чувствительности к антибак¬
териальным препаратам открываются при использовании автоматизированных
микробиологических анализаторов. Высокая пропускная способность и авто¬
матизация основных этапов работы снижают трудоемкость и значительно рас¬
ширяют спектр идентифицируемых микроорганизмов, В табл, 21-8-21-13 при¬
ведены тесты для меж- и внутриродовой идентификации клинически значимых
энтеробактерий.Таблица 21-8. Внутриродовая дифференциация рода CitrobacterТест или субстратС. freundiiс. dfversusС. amalonaticusОбразование сероводородаЫ--Образование индола-++Малонат натрия-+-0 рнити ндекарбоксилазан++Образование кислоты из адонита-+-Таблица 21-9. Внутриродовая дифференциация рода EscherichiaТест или субстрат£ со//£ hermanii£ vufneris£ fergusoni£ blattaeОбразование индола++-+-0 рн ити ндекарбоксилазаd-ь-++Ферментация дульцитаdI-]-d-Ферментация адонита---+-Ферментация сорбита+----Ферментация целлобиозы-+++-Использование малоната--[+]d4Образование желтого пигмента-+d--
Таблица 21-10. Внутриродовая дифференциация рода SerratiaТестJS1!со.31■S1io1«01«0<4 ^^ e1CO¿1
CO E11toРвакиия Фогеса-Пооскауэоаd_d44d4i+l[+}4Лизиндекаобоксилаза+444444dАогининдекаобоксилаза_+__-_--Оонитиндекарбоксилаза_+4444_4-Гидролиз желатина-1-+++++4d44Ферментация малоната—[+1__----4Образование газа из 0-глюкозыf+14i4ld_i-1d4dФерментация О-адонита—+_ddd--+Ферментация 1-арабинозы++44_4+4+4Ферментация целлобиозы+___44[±14Ферментация дульцита____---Ферментация лактозы+___d4I+l_+Ферментация мелибиозыd+4i4l_+44+4Ферментация рафинозыd44I+l_4_44+Ферментация Ьрамнозыd[+1i-1.44_d_Ферментация 0-сорбита+444+4+di+l..-Ферментация сахарозы++H+44+-4+4Ферментация О-ксилозыd+f4l4+_4++44Ферментация метил-О-глюкозида_+-_d__Дезоксирибонуклеаза++_4[+144++44Липазаt-1[+1_4i+l4ddd4+Пигмент (красный, розовый, оран¬
жевый)---d--d-+примечание:«-» — 0-10% штаммов положительны;
«[-]» — 11-25% штаммов положительны;
«й» — 26-75% штаммов положительны;
«[+]» ~ 76-89% штаммов положительны;
«+» - 90-100% штаммов положительны.сослW
Таблица 21-11. Биохимическая дифференциация родов Proteus, Providencia и Morganella morganiiТестProteusMorganellamorganiiProvidenciamirablHsmyxofa-cienspeftnerivulgarisafkali-faciensheim-bacltaerettgerimsttgianiisiuartiiРеакция Фогеса-Проскауэраd+_-----Цитрат (среда Симмонса)d+[-1_+-+j-i+Образование сероводорода+-d+__---Образование индола_-+++_+++Образование газа из О-глюкозы++■ df+1+f+1 1__d-Гидролиз мочевины+++++_+-dОрнитиндекарбоксилаза+_+____.Гидролиз желатина++d+-_____Ферментация О-адонита__-+++__Ферментация О-арабита_--_++--Ферментация глицеринаd+ddf-i .-d_dФерментация миоинозита-__d+-+Ферментация мальтозы+++-d-_Ферментация О-маннозы_+++++Ферментация метил-О-глгакозида+f+id_-____Ферментация ирамнозы_-+d__Ферментация сахарозыhi+++t-1.-f-1d6Ферментация трегалозы+dd_-_-+Ферментация О-ксилозы+++___-Дезоксирибонуклеазаd+df+1__-_-Липаза++d[+] _-___--Просветление среды с тирозином+_+++++++Роение++d+------примечание:—	- 0-10% штаммов положительны;
«|-]» — 11-25% штаммов положительны;—	26-75% штаммов положительны;
«[+]» - 76-89% штаммов положительны;—	90-100% штаммов положительны.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 355
Таблица 21-12. Дифференциальная характеристика видов и подвидов SalmonellaВид5, enterica$. bongoriПодвидentericssaÉamaearizonaediarizonaehoutenaeindicaОбозначениеIIIIllalllbIVVIVХарактеристикаДульцит++---df|3-Галактозидаза--++-d+Малонат-+++---Желатин-+++++-Сорбит+++++-+Рост с кем----+-+0 (1)-тартрат+------Галактуронат-+-++•1-+у-Глютамип-трансфераза++-+++р-Глюкоронидазаdd-+-d-Мукат+++- (70%)-++Салицин----+--Лактоза--- (75%)+ (75%)-d-Лизис фагом 01++-+-+dЕстественныйрезервуарТеплокровныеживотныеХладнокровные животные и окружающая средаПримечание:«+» - 90% или более положительных реакций;- 90% или более отрицательных реакций;«d» — разные серовары дают различные реакции.Таблица 21-13. Внутриродовая дифференциация рода KlebsiellaТестKt. oxytocaKL pneumoniaesubsp.ozaenaesubsp. pneu¬
moniaesubsp. rhinosclero¬
matisОбразование индола+~--Проба с метиленовым красным[-]i-1+Гидролиз мочевины+-+-Лизиндекарбоксилаза+d+-Использование малоната+-++Образование газа из О-глюкозы+d+-Образование кислоты из 5-кетоглюконата+---Образование кислоты из О-сорбозы+---ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЗНТЕРОБАКТЕРИЙ ПО АНТИГЕННОЙ ХАРАКТЕРИСТИКЕДля энтеробактерии один из этапов идентификации — изучение антигенной
структуры вьщеленного микроорганизма (серологическая идентификация).В настоящее время достаточно глубоко изучено антигенное строение многих
энтеробактерий, однако диагностические препараты для серологической иденти¬
фикации разработаны только для бактерий родов Salmonella, Shigella, Escherichia
и Yersinia. Штаммы трех видов шигелл (5. dysenteriae, S.ßexneri, S. boydif) диффе¬
ренцируются на серовары в зависимости от типовых антигенов. Штаммы S.flex-
neri дифференцируются на подсеровары в зависимости от групповых антигенов
(табл. 21-14).
Ш	И^шш§ШШ-356 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯТаблица 21-14. Классификационная схема бактерий рода ShigellaГруппаDВидShigells dysenteriaeShigella flexneriShigella boydiiShigella sonneiСеровар1-15Х-вариантY-вариант1-19Подсероварla, 1b2a, 2b3a, 3b4a, 4b5a, 5bСерологическую классификацию сальмонелл проводят на основе междуна¬
родной схемы Кауфмана-Уайта, включающей названия и антигенную струк¬
туру известных к настоящему времени серологических вариантов сальмонелл.
Серогруппа штамма определяется по комплексу О-антигенов, серовар внутри
каждой серогруппы — по наличию Н-антигенов.У эшерихий серогруппа устанавливается по сочетанию О- или OK-антигенов, а
по комплексу содержания ОН или ОКИ-антигенов определяется серовар щтамма.Серологическая идентификация, как правило, начинается с изучения выделен¬
ной культуры в РГА на стекле с поливалентными О-сыворотками. Для сальмонелл
промышленно выпускаются поливалентные адсорбированные О-сыворотки к
сальмонеллам групп А, В, С, Д, Е и редких групп. Стали доступны моноклональные
антитела, позволяющие идентифицировать сальмонелл на родовом, групповом и
серотиповом уровнях. Некоторые из этих моноклональных антител уникальны,
поскольку к выявляемым им антигенам сальмонелл (особенно жгутиковым) не
удается получить специфичные гипериммунные сорбированные сыворотки.Для шигелл выпускаются сыворотки для определения S. dysenteriae, S. flex¬
neri + S. sonnei, S. boydii.При серотипировании эшерихий вначале используют поливалентные сыво¬
ротки (ОКА, ОКВ, ОКС, ОКД и ОКЕ), а затем проводят РГА с моновалентыми
О-сыворотками (или иммуноглобулинами), входящими в состав поливалентной
смеси, давшей положительный результат. Для эшерихий выпускается дополни¬
тельная панель моновалентных ОК-сывороток.Разработаны сыворотки для дифференциации иерсиний — иерсиниозные (03;
04,32; 04,33; 05,27; 06,30; 06.31; 07,8; 09; 013,7), псевдотуберкулезные (серо-
типы 1 и 3), а также сыворотка к вирулентным иерсиниям, позволяющая диффе¬
ренцировать патогенные и непатогенные Y. enterocolitica в РГА. Серологическую
идентификацию культ}ф проводят строго по инструкции производителя.КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОТДЕЛЬНЫХ РОДОВ ЗНТЕРОБАКТЕРИЙВ настоящее время клиническая значимость некоторых родов и видов, недавно
включенных в семейство Enterobacteriaceae, еще не огфеделена и требует уточне¬
ния.•	Род Budvicia {В. aquatica). Сероводородпродуцирующие водные бактерии.
В медицинской практике встречаются крайне редко. Обитают в незагрязнен¬
ной воде поверхностных водоемов. Имеются единичные сообщения о выде¬
лении из крови и мочи пациентов с иммунодефицитом.•	Род Buttiauxella (В. agrestis, В. Ьгеппегае, В. ferragutiae, В. gaviniae, В. izardii,В.	noackiae, В. wannholdiae). Чрезвычайно редко встречаемые в медицинской
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 357практике бактерии. Обнаружены у моллюсков и улиток, в том числе съедоб¬
ных. Имеются сообщения об обнаружении в клиническом материале - моче
и раневом отделяемом.Род Cedecea (С. davisae, С. lapagei, С. neteri, С. speciesS, С. speciesS). Выделяют
в основном из дыхательных путей человека. Оппортунистические инфекции ш
вызывают редко. Дифференцируют с представителями родов Ewingella и
Serratia.Род Citrobacter [С. amalonaticus, С. freundii, С. koseri (diversus), C. farmeri,C.	sedlakii, C. rodentium, C. youngae, C. braakii, C. werkmanii, C. gillenii, C. murt-
iniae]. Обнаруживают в фекалиях и моче человека, воде водоемов и других
объектах окружающей среды. Могут быть отнесены к представителям нор¬
мальной микрофлоры кишечника. Описаны многочисленные случаи острых
кищечных инфекций (спорадических и вспышек), обусловленных данными
микроорганизмами. Заболевания протекают по типу гастроэнтеритов, дис¬
пепсий. Бактерии рода Citrobacter выделены в качестве этиологического
агента при инфекциях моче- и желчевыводящих путей, отитах, остеомие¬
литах, Используя короткий ряд биохимических тестов, бактерии данного
рода сложно отличить от эшерихий и сальмонелл. На практике достаточ¬
но часто приходится дифференцировать от сальмонелл. При этом важно
помнить, что цитробактеры имеют ряд общих антигенов с сальмонеллами.В дифференциации сальмонелл и цитробактеров особое значение имеет
отсутствие у сальмонелл лизиндекарбоксилазы. Мультирезистентные штам¬
мы S. typhimurium, вызывавшие внутрибольничные инфекции в 1977-1982 гг.
в ряде территорий РФ, нередко давали отрицательный результат на средах с
лизином. Цитробактеры подразделяются по 0-антигену на 42 серогруппы,
внутри которых возможна дифференциация по отдельным О- и Н-антигенам.Однако серотипирование данных микроорганизмов в лабораторной практи¬
ке в настоящее время не применяют.Род Edwardsieüa (Е. hoshinae, Е. ictaiuri, Е, tarda, Е. tarda биогруппы 1).Наиболее широко распространены в тропических и экваториальных странах.Часто выделяют от рептилий. Е. tarda патогенны для рыб. Вопрос о патоген¬
ности данных микроорганизмов для людей остается спорным. Имеются дан¬
ные о большей частоте обнаружения бактерий данного рода у больных с диа-
рейным синдромом, по сравнению со здоровыми лицами. Описаны случаи их
выделения при абсцессах печени, эмпиеме плевры, сепсисе новорожденных,
гнойно-септических осложнениях.Род Enterobacter (Е cloacae subsp. cloacae, E. cloacae subsp. dissolvens, E. amni-
genus биогруппы 1, E. amnigenus биогруппы 2, E. asburiae, E. gergoviae, E. hor¬
maechei, E. sakazakii, E. intermedius, E. nimipressuralis, E. taylorae, E. cancerogenus,E.pyrinus, E. kobeiy E. aerogenes). Первоначально были описаны как возбудите¬
ли инфекций насекомых, в частности саранчи. Вопрос о патогенности энте-
робактеров для человека долгое время оставался открытым. Однако в послед¬
ние годы накоплен значительный материал, свидетельствующий, что данные
микроорганизмы могут вызывать острые кишечные инфекции, инфекции
моче- и желчевыводящих путей, сепсис новорожденных; энтеробактеры
рассматриваются как важный возбудитель нозокомиальных инфекций. Б
некоторых регионах по частоте вьщеления от госпитализированных боль¬
ных данные микроорганизмы уступают только эшерихиям и клебсиеллам.Наиболее часто у человека обнаруживают Е. aerogenes. Описаны госпиталь¬
ные вспышки, обусловленные Е. cloacae. Е. sakazakii - возбудитель паренте¬
ральных инфекций у детей раннего возраста. В последние годы нередко реги¬
стрировались эпидемиологически документированные спорадические случаи
и вспышки септических инфекций и некротизирующего энтероколита у детей
вщР11Ш|358 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯпервого года жизни, в первую очередь недоношенных, новорожденных с
г ж	низкой массой тела или иммунодефицитом. У детей регистрировали такжеменингиты и бактериемию (летальность в ряде сл>^аев достигала 80%), Все<гс <случаи заболеваний были связаны с употреблением детских молочных сме¬
сей, контаминированных Е. sakazakii При этом установлено, что в первую
очередь Е. sakazakii может попадать в сухие молочные смеси с контаминиро-
-	ванными ингредиентами, добавляемыми после сушки, или из окружающейсреды в процессе упаковки готового продукта. Идентификацию проводят
по совокупности морфологических, биохимических и других признаков,
определяющих принадлежность к виду Е. sakazakii. Принадлежность изолята
к Е. sakazakii осуществляют на основании его развернутых биохимических
характеристик штаммов. Дифференциацию следует проводить с близкород¬
ственными представителями энтеробактерий — Е. cloacae и Р. agglomerans.
Ведущие дифференциальные признаки Е. sakazakii — способность к образо¬
ванию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при
температуре 25 °С и отсутствие ферментации D-сорбита. Для дифференциа¬
ции £, sakazakii от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом
представителей рода Р. agglomerans используют тест разжижения желатина.
В качестве дополнительного теста при идентификации Е. sakazakii возможно
определение а-глюкозидазной активности на хромогенных питательных сре¬
дах, содержащих 4'Нитрофенил-а-В-глюкопиранозид или 5-бромо-4-хлоро-З-индолил-а-О-глюкопиранозид.•	Род Escherichia (Е. coli, Е. hermannii, Е, vulneris, EJergusonii, E. blattae). Данный
род объединяет обширную гетерогенную группу энтеробактерии, различаю¬
щихся по биологическим, серологическим и морфологическим свойствам,
антагонистической активности, продукции энтеро- и цитотоксинов, патоген¬
ности и другим признакам. Эшерихии — представители облигатной микро¬
флоры кишечника человека.Клиническое значение имеют конкретные серологические варианты и биовары
Е. соИ, способные вызывать острые кишечные инфекции, внекишечные формы
эшерихиозов, протекающие в форме менингита, сепсиса, пиелонефрита, цистита,
пневмонии и других заболеваний. Полиморфизм клинической картины обуслов¬
лен наличием разнообразных факторов вирулентности. Е. соИ относится к наи¬
более часто встречаемым возбудителям внутрибольничных инфекций, вызывая
гнойно-септические осложнения в послеоперационном периоде, бактериемию,
инфекции ЦНС, диарею. В санитарной микробиологии Е. соИ — санитарно¬
показательный микроорганизм, свидетельствующий о фекальном загрязнении
окружающей среды. Результаты лабораторной диагностики, основанной на огра¬
ниченном количестве фенотипических тестов, не позволяют с уверенностью оце¬
нить этиологическую значимость штаммов £ coli даже с учетом их принадлежно¬
сти к определенной серологической группе.Антигенная структура Е. coli сложна. Для построения антигенно-диагностических
схем и серологической идентификации наиболее важное значение имеют 0-, К- и
Н-антигены. Остальные антигенные комплексы представляют интерес в основном
для установления механизмов патогенеза, вьшвления факторов вирулентности эше¬
рихий в генетических исследованиях. По сочетанию О- или ОК-антигенов все эше¬
рихии разделяют на серологические группы (серогруппы), а по спектру содержания
ОН- или ОКН-антигенов — на серологические варианты (серовары). К настоящему
времени известно 175 0-, 56 Н- и 100 К-антигенов, однако это еще не предел, так как
постоянно выделяют штаммы, которые не идентифицируются диагностическими
сыворотками, содержащими антитела к известным 0-, Н- и К-антигенам.Для эшерихий характерно сходство антигенных связей по 0-антигену между
серогруппами, а также с другими патогенными и условно патогенными энтеробак-
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 359териями (Shigella spp.. Salmonella spp., Klebsiella spp.). Трудности при идентификации
эшерихий связаны с тем, что схемы их серотипирования неполны и несовершен¬
ны. Типирование также затруднено необходимостью использования большого
набора диагностических сывороток, что, в свою очередь, связано с высокими эко¬
номическими затратами.Серологическая идентификация основана на выявлении О- или ОК-антигенов в
РГА развернутой или на стекле.Среди диареегенных эшерихий особое значение имеет Е. cali 0157:Н7, проду-
цируюш[ая энтеротоксины, которые вызывают гемоколиты с возможными ослож¬
нениями в виде гемолитико-уремического синдрома, почечной недостаточности
и тромбоцитопенической пурпуры. Данные энтеротоксины представлены двумя
разновидностями (I и II) и по структуре и активности напоминают энтеротоксин,
продуцируемый S. dysenteriae 1 (именно поэтому данные энтеротоксины называют
шигаподобными). В настоящее время выпускается одноэтапный иммунохромато¬
графический тест, предназначенный для скрининга на наличие в фекалиях Е. coli
0157:Н7. Он позволяет получить результат в течение 5-10 мин.В медицинской микробиологии в зависимости от вызываемых заболеваний и
наличия определенных факторов вирулентности патогенные эшерихии разделяют
на две большие группы:•	эшерихии, обусловливающие развитие острых кишечных инфекций;•	эшерихии, вызывающие развитие инфекций внекишечной локализации.Эшерихии, обусловливающие развитие острых кишечных инфекций (диарее¬
генные эшерихии), подразделяют на шесть условных групп:•	ЕРЕС - энтеропатогенные эшерихии (Е. соИ 018ас, 020, 025, 026, 044,055,
075, 086, 091, 0111, 0114, 0119, 0125, 0126, 0127, 0128, 0142, 0158);
перечисленные 0-группы включают 38 сероваров;•	EIEC — энтероинвазивные эшерихии (в основном неподвижные Е. cali 028ас,
029, 0112, 0121, 0124, 0136, 0143, 0144,0152, 0159, 0164, 0167);•	ЕТЕС — энтеротоксигенные эшерихии (£. coli 06:Н16, 08:Н9, 011:Н27,
015:Н11, 020:Н-, 025:Н42, 025:Н-, 027:Н7, 078:Н11, 078:Н12, 0128ас:Н7,
0148:Н28, 0149;Н10, 0159:Н20, 0173:Н-);•	ЕНЕС — энтерогеморрагические эшерихии (Е. со//0157:Н7,0157:Н- 026:Н11,
0103;Н2, 0111:Н-, 0113:Н21, а также более 100 сероваров групп 01-0172);•	ЕАЕС — энтероаггрегативные эшерихии (Е. соН 07:Н-, 077;Н18, 086:Н-,
0126;Н27, 0127:Н2);•	DAEC — диффузно-аггрегативные эшерихии.Каждая группа диареегенных эшерихий принадлежит к определенным серо-
варам, характеризуется индивидуальными генетическими детерминантами виру¬
лентности и специфическими клиническими проявлениями вызываемой острой
кишечной инфекции,Эшерихий, вызывающие инфекции внекишечной локализации, так же как и
диареегенные эшерихии, подразделяют на 3 патогруппы:•	MENEC ~ менингиальные;•	SEPEC — септицемические;•	UPEC — уропатогенные.Накопленные данные свидетельствуют о необходимости пересмотра принципов
лабораторного типирования эшерихий — включение на первом этапе определения
маркеров вирулентности (генетических детерминант) с последующим серотипиро-
ванием для обоснования этиологической роли.Значительный прогресс в лабораторной диагностике энтеробактерий, в том
числе эшерихий, может быть связан с внедрением быстрого и надежного метода
(RFLP) на основе анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции амплифи-
цированных генов ф ußiC, контролирующих синтез ЛПС О-антигена и флагел-
ЩЩШ 360 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯлина жгутиков соответственно. Данный метод получил название «молекулярное
серотипирование», так как он поддерживает, уточняет и углубляет общепринятую
классификацию серотипирования микроорганизмов, а также унифицирует и уде-
шевляет определение серологической принадлежности штаммов с помощью сыво-
роток. Используя данный метод, можно провести серологическую идентификацию
неподвижных и находящихся в К-форме штаммов.Острые кишечные инфекции диареегенных эшерихий характеризуются преиму-■"111щественным поражением желудочно-кишечного тракта с развитием интоксика-
^ диарейного синдрома, реже — генерализацией патологического процесса.
Возбудители острых кишечных инфекций отличаются от штаммов непатогенных
Е. соИ наличием определенных факторов патогенности, их генетической детерми¬
нацией, принадлежностью к конкретному серологическому варианту и особен¬
ностями патогенеза и клинико-эпидемиологических проявлений вызываемых
.заболеваний.•	Род Ewingella (Е. americana). Выделяют из мокроты, отделяемого ран,
крови человека. Возможный возбудитель оппортунистических инфекций.
Дифференцируют от бактерий рода Cedecea.•	Род Haßtia (Н, alvei, Н. alvei биовар 1). Гафнии нередко обнаруживают у мле¬
копитающих, включая человека, в пищевых продуктах, особенно в молочных,
а также в объектах окружающей среды. Вопрос об их значении в патологии
человека нуждается в дальнейшем изучении. Имеются данные о возможной
роли данных микроорганизмов при диарейных заболеваниях, сепсисе, в том
числе неонатальном.•	Род Klebsiella (К oxytoca, К. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. pneumoniae
subsp. ozaenae, K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis, K. granulomatis). Главная
отличительная особенность клебсиелл — наличие капсулы. Классификация
этих микроорганизмов неоднократно пересматривалась, в настоящее время
в род Klebsiella входят 4 вида, причем 3 первоначально входивших в этот род
вида (К. pneumoniae, К. rhinoscleromatis и К. ozaenae) теперь считают 3 под¬
видами К. pneumoniae. В последние годы представления о роли клебсиелл, в
первую очередь К. pneumoniae, в патологии человека значительно углубились.
Клебсиеллы — возбудители внутрибольничных инфекций, различных забо¬
леваний новорожденных. В клиническую практику введен особый термин —
«клебсиеллез» для обозначения заболеваний, протекающих по типу острого
сепсиса или с локальным поражением отдельных органов. Клебсиеллы широ¬
ко распространены в окружающей среде, что связано с высоким уровнем
устойчивости к антибиотикам. Для них характерна более высокая устойчи¬
вость к действию дезинфектантов. Для родовой иденггификации клебсиелл
НИИЭМ им. Л. Пастера выпускает хромогенную среду «Klebsiella 5-АСК»,
на которой только эти микроорганизмы образуют зоны черно-коричневой
окраски вокруг колоний.•	Род Kluyvera (К ascorbata, К. cryocrescens, К. intermedius, К. cochleae, К. geor¬
giana). К. cochleae выделяют из улиток и слизней. Несколько видов обна¬
ружены в пищевых продуктах, почве, сточных водах, а также в соста¬
ве нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека. Эти
микроорганизмы выделяются из патологического материала, преимуще¬
ственно из дыхательных, мочевыводящих путей, фекалий, эпизодически из
крови. Оппортунистические инфекции вызывают редко.•	Род Leclercia (I. adecarboxylata). Встречаются в пище, воде. Выделены из
мокроты, слюны, крови человека. Описана этиологическая роль данных
микроорганизмов при септицемиях, пиелонефритах, раневых инфекциях,
септических артритах. Могут продуцировать ß-лактамазы широкого спектра
действия.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 361Род Leminorella (L, grífnontii L richardii). Выделяют из фекалий и мочи чело¬
века, Могут вызывать инфекции мочевыводящих путей, раневые инфекции,
первичную бактериемию, перитонит, инфекции дыхательных путей.Род Moellereüa (М. wisconsensis). Малоизученный род энтеробактерий.
Обнаруживают в воде, пищевых продуктах, ротовой полости животных.
У человека выделены из фекалий, крови, бронхиального аспирата, желчи.
Род Morganella (М. morganii subsp. morganii, М. morganii subsp. sibonii, M. mor¬
ganii биовар 1). До 1984 г. Ai. morganii принадлежала к роду Proteus (P. mor¬
ganii), M. morganii — условно патогенный микроорганизм, входящий в состав
нормальной микрофлоры кишечника. Может вызывать различные инфекци¬
онные процессы — сепсис, абсцесс головного мозга, эндоофтальмит, менин¬
гит, раневые инфекции. Также может быть причиной внутрибольничных
инфекций.Род Obesumbacterium (О. proteus биогруппы 2). Малоизученные энтеро¬
бактерии. Возможный контаминант пивных дрожжей и сусла. Клиническая
значимость неизвестна.Род Pantoea (Р. agglomerans-, синонимы: Enterobacter agglomerans, Erwinia
herbicoía, Erwinia miUeUae, P. dispersa). P. agglomerans (ранее E. agglomerans) —
частая причина экзогенных инфекций. Данные микроорганизмы широко
распространены у растений и часто бывают причиной загрязнения ваты.
Интенсивно размножаются при температуре 4 °С, в том числе в инъекцион¬
ных растворах и препаратах крови, хранящихся в холодильнике.Род Plesiomonas (Р. shigelloides). Плезиомонады — частая причина гастроэн¬
теритов у пациентов, связанных с морской водой и употреблением морепро¬
дуктов, в частности устриц. Также могут вызывать бактериемию, септический
артрит, остеомиелит, менингит, эндокардит, целлюлит, перитонит, холеци¬
стит, панкреатит. Описано возникновение инфекции у пациентов, находя¬
щихся на перитониальном диализе.Род Pragia (Р. fontium). Малоизученные энтеробактерии. Выделяются из
воды, фекалий. Значение в патологии человека неизвестно.Род Proteus (Р. mirabilis, Р. myxofaciens, Р. penneri, Р. vulgaris). Характерная осо¬
бенность данного рода — высокая подвижность и способность к ползучему
росту на плотных средах. В наибольшей степени роение присуще двум видам —
Р. vulgaris и Р, mirabilis, однако этот феномен может быть индуцирован и у
других видов. Наиболее надежный тест для определения принадлежности к
роду Proteus — определение фенилаланиндезаминазы.Род Providencia (Р. alcalifaciens, Р. heimhachae, Р. rettgeri, Р. rustigianii, Р. stu-
artii). У людей выделены из мочи, фекалий, крови, а также из ротоглотки,
промежности, подмышечной впадины, отделяемого ран, Р. stuartii или реже
Р rettgeri — частая причина инфекций мочевыводящих путей у пациентов
с длительно установленным катетером. Р. alcalifaciens, Р. rettgeri и Р. stuartii
могут вызвать диарею. Представители данного рода могут быть причиной
внутрибольничных инфекций, часто обладают множественной лекарствен¬
ной устойчивостью.Род Rahnella {R. aquatilis). Широко распространены во внешней среде (воде,
почве). R. aquatilis обнаружена в мясе, пресноводной рыбе, пиве, паренте¬
ральном питании и молочных продуктах. Размножение в рыбе может вести к
накоплению в ней опасных концентраций гистамина. У человека выделены из
крови, отделяемого послеоперационных ран, мочи, мокроты, бронхиальных
смывов, фекалий. R. aquatilb необходимо дифференцировать от Е. agglomerans
вследствие сходства их биохимических свойств.Род Raoultella (R. planticola, R. terrigena, R. omithinolytica) — данные бактерии,
размножаясь в рыбе, так же как и микроорганизмы рода Rahnella, способны
щSíSSÍ 	IIIIÄI 362 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯli^r	преобразовывать гистидин в гистамин, что может приводить к пищевымотравлениям.•	Род Salmoneüa (S. enterica, S. bongori). S. enterica подразделяют на 6 подви-
ШШШ- Клиническое значение для человека имеют представители вида S. enter-ica subsp. enterica, который является самым многочисленным. Сальмонеллы
подразделяются на серогруппы по О-антигенам и на серовары — по О- и
Н-антигенам. Современная схема Кауфмана-Уайта насчитывает 2557 серова-
ров, объединенных в 67 серогрупп. Заболевание у людей вызывают не более
сероваров, а широко распространены не более 20 из них.Сальмонеллезы — типичные зооантропонозы, за исключением брюшного тифа
и паратифов. В последние 20 лет наиболее часто сальмонеллез у людей вызывается
5. enteritidis. Заболевания связаны с контаминированными продуктами промыш¬
ленного птицеводства (мясом птицы, яйцами). Другие серовары (S. typhimurium,
S. derhy, S. infantis, S. london, S. kaifa) также могут вызывать спорадические заболе¬
вания и парентеральные инфекции. Мультирезистентные штаммы многих серова¬
ров способны вызывать внутрибольничные инфекции с контактно-бытовым путем
передачи.Сальмонеллы — подвижные микроорганизмы, продуцирующие сероводород,
индолотрицательные. Для их выделения разработаны специальные среды обо¬
гащения (селенитовая среда, среды Мюллера, Кауфмана), которые увеличивают
частоту положительных находок. Для посева используют висмут-сульфит агар,
SS-arap. Промышленно выпускается поливалентный А-, В-, С-, Д-, Е-бактериофаг,
который может бьггь использован как подтверждающий тест при диагностике
сальмонеллезов.•	Род Serratia (S. entomophila, S.ßcaria, S.fonticola, S. grimesii, S. Uquefaciens,
S. marcescens, S. marcescens биовар 1, S. odorifera биогруппы 1, S. odorifera био¬
группы 2, S. plymuthica, S. proteamaculans, S. rubidaea). Наиболее характерная
особенность бактерий рода Serratia — способность образовывать характер¬
ный красный пигмент — продигозин. Однако наличие пигмента наблюдают
не у всех представителей этого рода. Продукция пигмента во многом опреде¬
ляется условиями культивирования. Именно поэтому при исследовании
клинического материала и объектов внешней среды нередко встречаются
беспигментные серрации, идентификация которых сопряжена со значитель¬
ными трудностями. Наиболее значимые для медицинской микробиологии
виды — S. marcescens и S. liqu^ciens. Описаны случаи сепсиса, обусловленного
S. odorifera биогруппы 1. S. marcescens может вызывать инфекции мочевыво¬
дящих и дыхательных путей, бактериемию, конъюнктивит, эндокардиты,
раневую инфекцию. Вирулентность серраций обусловлена наличием плазмид,
кодирующих факторы патогенности (цитотоксины, гемолизины), а также
определяющих устойчивость к антимикробным препаратам. S. liqu^ciens —
наиболее частая причина бактериемии и гнойно-септических осложнений в
центрах гемодиализа.•	Род Shigella (S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei). Бактерии данного
рода трудно отличить от неподвижных, лактозоотрицательных анаэроген-
ных эшерихий. Для достоверной идентификации необходимо проведение
серологического типирования по о-антигенам в РГА на стекле. Для всех
представителей рода Shigella характерна высокая частота резистентности к
антибактериальным препаратам. Идентификация шигелл включает биохи¬
мическое и серологическое типирование.Шигеллы — возбудители острых кишечных инфекций человека, а также бак¬
териальной дизентерии. Характерный признак дизентерии — диарея с кровью,
однако в 50% случаев шигеллы вызывают острую диарею без крови, которую кли¬
нически невозможно отличить от диареи, вызванной другими энтеробактериями.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 363Тяжелое, длительное течение заболевания и летальные случаи отмечаются при
дизентерии, вызванной S. dysenteriae 1 (дизентерия Григорьева-Шига), и дизенте¬
рии Флекснера.•	Род Tatumeüa (Г. ptyseos). Редко встречаемые энтеробактерии. У людей чаще с||
всего обнаруживают в мокроте. Клиническая значимость требует уточнения.•	Род Yersinia (Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii,Y. mollaretii, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. rohdei, Y. ruckeri).Медицинское значение имеют следующие виды:•	Y. pestis — возбудитель чумы (относится к 1-й группе опасности, диагностику
в обычных лабораториях не проводят);•	Y. pseudotuberculosis — возбудитель псевдотуберкулеза (дальневосточной
скарлатиноподобной лихорадки или экстраинтестинального иерсиниоза по
МКБ-10);•	Y. enterocolitica — подразделяется по биохимическим свойствам на 6 биова-
ров, из которых биовар 1А считается непатогенным, биовары 1В-5 вызыва¬
ют кишечный иерсиниоз (энтерит, вызванный Y. enterocolitica, по МКБ-10).Иерсинии биовара 1А расщепляют салицин за 24 ч, обладают пиразинамида-
зой (положительный ПИР-тест). Тест на гидролиз эскулина вариабелен, у пато¬
генных штаммов всегда отрицателен. По 0-антигену иерсинии подразделяют на
29 сероваров. Заболевания вызываются сероварами 03 и 09, редко 08, 05,27 и
некоторыми другими. Для выделения Y. enterocolitica производят ряд элективных
сред, используют холодовое обогащение — посевы инкубируют в холодильнике в
забуференной пептонной воде или пептонно-калиевой среде. Высевы проводят на2-3,5 и 7-й день.Нативный материал или среда обогащения могут быть подвергнуты дополни¬
тельно щелочной обработке: 1 петлю диаметром 3-4 мм обогатительной среды
вносят в 0,2 мл свежеприготовленного раствора гидроксида калия (9,5 мл 0,5%
раствора натрия хлорида + 0,13 мл 40% раствора гидроксида калия) на 1-2 мин,
затем проводят высев на плотную питательную среду (среду Эндо или специаль¬
ные элективные среды для иерсиний).•	Род Yokenella (Г. regensburgei, синоним: Koserella trabulsii). Редко встречае¬
мый род семейства Enterobacteriaceae. Y. regensburgei выделены из кишечника
насекомых, воды, крови, мочи, фекалий и суставной жидкости человека. По
биохимическим свойствам практически идентичны бактериям рода Hafnia.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЗНТЕРОБАКТЕРИЙ К АНТИМИКРОБНЫМ
ПРЕПАРАТАМЗаключительный этап лабораторного исследования — определение чувстви¬
тельности выделенных и идентифицированных бактерий к антимикробным пре¬
паратам. Хотя в целом энтеробактерии чувствительны ко многим антимикробным
препаратам, микроорганизмы некоторых родов {Enterobacter, Proteus, Klebsiella,E. coli) характеризуются природной устойчивостью к ряду ß-лактамных анти¬
биотиков, которая связана с продукцией хромосомно кодируемых ß-лактамаз.
Сочетанная резистентность к антимикробным препаратам разных групп нередко
встречается у патогенных и условно-патогенных энтеробактерии.Внутрибольничные инфекции чаще обусловлены мультирезистентными к анти¬
биотикам штаммами различных энтеробактерий. Появление и распространение
приобретенных механизмов устойчивости определяет необходимость тестирова¬
ния выделенных возбудителей к набору антимикробных препаратов. Выбор кон¬
кретных препаратов для лечения пациента зависит не только от вида выделенного
микроорганизма, но и от локализации инфекционного процесса.В табл. 21-15 указан перечень препаратов для тестирования штаммов энтеро¬
бактерий, выделенных при инфекциях различной локализации.
тт364ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯТаблица 21-15. Рекомендуемый перечень антибактериальных препаратов для определения чув¬
ствительности бактерий семейства Enterobacteriaceaeпрепараты первого рядаДополнительные препаратыЭнтеробактерии, выделенные при внекишечных инфекцияхАмпициллинИнгибиторзащищенные пенициллины {ампицил¬
лин + сульбактам или амоксициллин + клавулановая
кислота)Цефалоспорины III поколения {цефотаксим или
цефтриаксон)ЦефтазидимГентамицинФторхинолоны (норфлоксацин. ципрофлоксацин
или офлоксацин)Карбапенемы (имипенем или меропенем)
ЦефепимЦефоперазон + сульбактам
Тикарциллин + клавулановая кислота
Второй цефалоспорин III поколения (цефтриаксон
или цефотаксим)ЦефокситинАмикацинЦефуроксимОральные цефалоспорины II-III поколенияЭнтеробактерии, выделенные при кишечных инфекцияхАмпициллинКо-тримоксазолХинолоны (налидиксовая кислота)Фторхинолоны (норфлоксацин, ципрофлоксацин
или офлоксацин)Цефалоспорины III гоколения (цефотаксим или
цефтриаксон)ХлорамфениколТетрациклины (тетрациклин или доксициклин)Энтеробактерии, выделенные при внебольничных инфекциях мочевыводящих путейАмпициллинИнгибиторзащищенныё пенициллины (амоксицил-
лин + клавулановая кислота)Ко-тримоксазолФторхинолоны (норфлоксацин, ципрофлоксацин
или офлоксацин)ФосфомицинНитрофурантоинЦефуроксимЦефалоспорины III поколения (цефотаксим или
цефтриаксон)ГентамицинАмикацинНеобходимость такого разделения связана с особенностями фармакокинетики
отдельных антимикробных препаратов в желудочно-кишечном тракте и мочевы¬
водящих путях, а также различиями в их клинической эффективности.Два вида энтеробактерий (£ coli и К. pneumoniae) входят в число семи видов
микроорганизмов, принятых в качестве индикаторов развития антимикробной
резистентности в Европейской системе надзора и контроля за антимикробной
резистентностью (EARSS),В настоящее время нередко штаммы Е. соИ и К. pneumoniae продуцируют
ß-лактамазы расширенного спектра, что обеспечивает данным штаммам высокую
резистентность к цефалоспоринам II1-IV поколения. Сочетанная резистентность
таких штаммов к фторхинолонам создает серьезные трудности выбора эффектив¬
ной этиотропной терапии.СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫДжонсон д.р., Каплан Э. Лабораторная диагаостика инфекций, вызванных стрептокок¬
ком группы А. — М.: Медицина, 1998. — 118 с.Долгих Т.И. Краткая характеристика возбудителей хламидиоза // Яковлев В.М.,
Новиков А.И. Сосудистый эндотелий и хламидийная инфекдия. - М.: Медицина, 2000. —С.	127-153.Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым
путем. — М.; Медлит, 2004. — 272 с,Жебрун А.Б. Инфекция Helicobacter pylori. — СПб.: Феникс, 2006. — 380 с.Методики клинотеских лабораторных исследований: Справочное пособие; Т. 3 / Под ред.
В.В. Меньшикова. — М.: Лабора, 2009. — 880 с.Методические указания М^ 4.2.1887-04 «Лабораторная диагностика менингококковой
инфекции и гнойных бактериальных менингитов». Утверждены главным государственным
санитарным врачом Российской Федерации 4 марта 2004 г.
І5ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 3$5 і?МУК 4.2.22-17-07 «Методические указания по выявлению бактерий legionellapneumophila І
в объектах окружающей среды». - 2007.	|Определитель бактерий Берджи; В 2 т.; Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, I
П. Снита и др. - М., 1997. - Т. 1. - С. 195-196,211-Ш. 255-258.	jТартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии; роль в инфекционной патоло- I
ГИИ человека и лабораторная диагностика. — М., 2002.	IТимченко В.Н., Бабаченко И.В., Ценева Г.Я. и др. Эволюция коклюшной инфекции у І
детей. - СПб.; ЭЛБИ-СПб., 2005. - 192 с.Тотолян A.A., Суворов А.Н., Дмитриев A.B. Стрептококки группы Б в патологии челове¬
ка. — СПб.; Человек, 2009. — 212 с.Фтизиатрия: Национальное руководство / Под ред. М.И. Перельмана. — М.: ГЭОТАР-
Медиа, 2007. - 512 с.Черкасский Б.Л. Частная эпидемиология. — М., 2002.Шурыгина И.А., Чеснокова М.В., Климов В.Т. и др. Псевдотуберкулез. — Новосибирск;
Наука, 2003. - 319 с.Этиологическая роль хламидий при заболеваниях репродуктивной сферы; Аналитический
обзор СПб. НИИЭМ им. Л. Пастера / Под ред. А.Б. Жебруна. - СПб., 2007. —56 с.Якубович А.И., Корепанов А.Р. Урогенитальный хламидиоз. - Иркутск, 2006. -108 с.Malfertheiner Р., Megraud F., Moran C. Guidelines for the management of the H. pylori infec-
tion. European Gastroenterology Review. — 2005.ИЕРСИНИИТАКСОНОМИЯРод Yersinia относится к семейству Enterobacteriaceae и включает 14 видов, из
которых 3 — 7. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica — являются возбудителя¬
ми инфекционных болезней. Род Yersinia назван в честь французского микробио¬
лога А. Йерсена, открывшего в 1894 г. возбудителя чумы {Y. pestis).Возбудитель псевдотуберкулеза — Y. pseudotuberculosis — вызывает у лаборатор¬
ных животных в условиях экспериментального заражения патологоанатомические
изменения внутренних органов, сходные с наблюдаемыми при туберкулезе, поэто¬
му бактерию назвали псевдотуберкулезной иерсинией. У человека она вызывает
заболевание, сопровождаемое энтеритами, энтероколитами и тяжелой генера¬
лизованной инфекцией с множественными поражениями отдельных органов и
систем.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Y. ENTEROCOLITICA И У. PSEUDOTUBERCULOSISИерсинии — грамотрицательные, не образующие спор палочки, кокки или ово-
иды, обладающие перитрихиальными жгутиками. При культивировании Y. entero¬
colitica и У. pseudotuberculosis в течение 48 ч при температуре 37±1 ""С в культурах
обнаруживают бактерии без жгутиков, что коррелирует с потерей подвижности.
Инкубирование культур в течение 24-48 ч при температуре ниже 30 “С (26±2 °С)
ведет к восстановлению подвижности бактерий.В мазках из бульонных культур Y. pseudotuberculosis может располагаться цепоч¬
ками по 2-5 клеток, У. enterocolitica цепочек не образует. Размеры отдельных
бактерий при культивировании на искусственных питательных средах составляют
0,8-1,2 мкм в длину и 0,5-0,8 мкм в ширину. Иерсинии хорошо окрашиваются
всеми анилиновыми красителями. В молодых культурах, выращенных при темпе¬
ратуре 26±2 “С, преобладают кокковидные бактерии, в старых отмечается тенден¬
ция к полиморфизму, особенно при температуре 37±1 °С на различных плотных
питательных средах (например, агаре Эндо).К настоящему времени по 0-антигену выделяют 21 серотип Y. pseudotuberculosis.Чаще всего заболевания вызываются всемирно распространенными штаммами,
принадлежащими к серотипу 0:3 (биотипу 4), 0:5,27 (биотипам 2 и 3), 0:9 (био¬
типу 2) и «американскими» штаммами 0:8 (биотипом 1В). Антигенное родствот
шшщШЩ" 366 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯШіМІ(по 0-антигену) Y. pseudotuberculosis и большинства серотипов Y. enterocolitica
ІШШ выражено довольно слабо. Однако выявлено значительное сходство в антиген-
ной структуре У. pseudotiiberculosis серотипа 1 и У. enterocolitica «американских»
штаммов серотипов 0:8, 0:18 и 0:21. Наиболее выраженнь[ антигенные связи
между представителями различных серотипов внутри вида У. enterocolitica, а
pMfMit также между У. enterocolitica серотипа 0:9 и бруцеллами благодаря сильному
ШШШЬ сходству в строении о-специфических полисахаридных цепей липополисахарида.Описано антигенное сходство У. enterocolitica и других представителей семейства
Enterobacteriaceae {Salmonella, Citrobacter, Escherichia, Shigella, Klebsiella, Enterobacter,
Serratia). Перекрестные реакции между данными видами могут затруднять получе¬
ние строго специфичных диагностических препаратов,В составе наружной мембраны патогенных иерсиний определены БНМ, коди¬
руемые как хромосомными генами, так и генами, расположенными на плазмиде
вирулентности pYV 42-48 МДа. БНМ — факторы защиты возбудителя от действия
иммунной системы макроорганизма.Иерсинии продуцируют каталазу, не продуцируют оксидазу и ферментируют
глюкозу, как и другие представители семейства Enterobacteriaceae. Их основные
биохимические свойства, учитываемые в практике рутинных лабораторных иссле¬
дований, представлены в табл. 21-16.У. pseudotuberculosis не ферментируют лактозу, сахарозу, раффинозу, целло-
биозу, дульцит, инозит, сорбит, адонит, инулин и D-арабинозу, не продуцируют
фенилаланиндезамидазу, орнитин- и лизиндекарбоксилазу, не образуют индол и
ацетилметилкарбинол (реакция Фогеса-Проскауэра). Ферментируют до кислоты
глюкозу, галактозу, а-арабинозу, левулезу, маннозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу,
трегалозу, маннит; редуцируют нитраты, метиленовый синий; вступают в реакцию
с метиленовым красным, образуют каталазу, гидролизуют мочевину и эскулин.У. enterocolitica не ферментируют лактозу, рамнозу, раффинозу, не продуцируют
фенилаланиндезаминазу, лизиндекарбоксилазу и аргининдегидролазу. Реакция
Фогеса-'Проскауэра положительная при 26±2 "С и отрицательная при 37±1 “С.
Гидролизуют мочевину, продуцируют орнитиндекарбоксилазу, ферментируют
сахарозу и мальтозу. По способности ферментации сорбита, ксилозы, салицина,
образованию индола и наличию липазы У. enterocolitica делится на 6 биотипов.Другие виды рода Yersinia выделяют из фекалий, смывов с окружающей среды,
органов и тканей грызунов. Они, как У. enterocolitica и У. pseudotuberculosis, хоро¬
шо растут на питательных средах для выделения иерсиний. Их также необходи¬
мо дифференцировать, используя основные биохимические тесты и субстраты
(табл. 21-16).Иерсинии — гетеротрофные факультативно-анаэробные микроорганизмы. Они
неприхотливы, растут не только на обычных питательных средах, но и на средах
с обедненным составом (пептонной воде) или «голодных» средах (синтетических
средах, фосфатно-буферном растворе, 0,9% растворе NaCl). Температурный фак¬
тор — один из важнейших, определяющих изменчивость микробов и устойчивость
их во внешней среде. Температура культивирования иерсиний влияет на размеры
клеток, темпы размножения, скорость метаболических процессов; оптимальная
температура роста составляет 26±2 Х. Способность иерсиний к более высоким
темпам размножения при низких температурах позволила на практике использо¬
вать холодовое обогащение для их выделения из материала, контаминированного
сопутствующей микрофлорой, особенно колиформными бактериями, в жидкой
среде (питательном бульоне, пептонной воде, синтетических средах) иерсинии
образуют равномерное помутнение среды, иногда нежную пленку (У. pseudotu¬
berculosis) или нежное пристеночное кольцо (У. enterocolitica). При дальнейшем
культивировании, особенно при 37 X, среда просветляется и образует слизистый
и крошковидный осадок. На плотных средах иерсинии образуют колонии типов
Таблица 21-16. Основные биохимические свойства бактерий рода Yersinia, дифференцирующие их внутри рода и от других представителей семейства
EnterobacteriaceaeТест или субстрат&1 .аY. enterocolftlca11,51:к.'1ь.;g1Биотипы1IIIIIIVV1АIBГидролиз мочевины-+++++++[+1i+li+l-i+1вІ-1ВОбразование индола—++В---++в---(22-24 “0++++++++++в++++Подвижность(37 °С)_______-------Реакция Фогеса-(22-24 X)_++++•++++--+---Проскауэра(37 °С)___-------------Фенилаланиндезаминаза____-_-_--------Орнитиндекарбоксилаза_+++++в++++ВІ-1І+1І+1Лизиндекарбоксилаза-_---------в~-Липаза (твин-80)_++_--вн-в----Цитрат Симмонса (22-24 '‘С)—_______в+-++---Гидролиз эскулина (24 ч)В+f+1-_-_[+1+-----[-1Образование кислоты лри ферменткровании углево;:DBD-ксилоза++++++-В++[+1-ВВв+Мальтоза[+1+++++++++++--в+D-маннитол+++++++++++f+1+++Мелибиоза[-1в___-_--i+l--в--L-рамнозав______++------Рафиноза_н-_-_-_вв_--в--Салицин (24 ч)в[-1+_-_-_++Н---[-1f-1Сахароза_+++++в++-i-1+++D-сорбитБ_+++■++-+++вв++Трегалоза+++++++-++++ІЧ+++Примечание:- положительная реакция у 90% штаммов и более; «[+]» — положительная реакция у 76-89% штаммов: «В*> — положительная
«[-]» — положительная реакция у 11-25% штаммов; «-» - отрицательная реакция у 90% штаммов и более.мовреакция у 26-75% штам- №
368 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯS	(гладкий), R (шероховатый) и SR (переходный). Например, Y. pseudotuberculosis
при пониженной температуре растут в S-форме, но накопление культуры происхо¬
дит медленно, а при повышенной (более 28 “С) активно диссоциируют в R-форму;
в посевах наблюдается полиморфизм колоний по размеру, форме и цвету.Y. pseudotuberculosis и некоторые представители У. enterocolitica имеют большое
сходство, проявляющееся в их инвазивности, способности к внутриклеточному
размножению, что коррелирует с генерализацией инфекционного процесса. Для
большинства выделенных от больных штаммов У. enterocolitica характерны адге¬
зия, колонизация на поверхности кишечного эпителия и энтеротоксигенность с
образованием больших количеств термостабильного энтеротоксина. Патогенные
У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica обладают широким набором факторов пато¬
генности, детерминируемых хромосомными и плазмидными генами. Способность
Y. pseudotuberculosis к адгезии и инвазии в клетки эпителия кишечника зависит
от экспрессии хромосомного шу-гена, кодирующего белок наружной мембра¬
ны инвазин с молекулярной массой 108 кДа. Системная диссеминация микро¬
ба в организме хозяина связана с функционированием системы поглощения
ионов железа, названной иерсиниабактином. Хромосомный сегмент, содержащий
гены иерсиниабактина, называется островом высокой патогенности {the High
Pathogenicity Island - HPI). Установлено, что HPI содержат штаммы, циркулирую¬
щие в Европе, Австралии, Северной Америке. Они, как правило, обусловливают
гастроинтестинальные проявления псевдотуберкулезной инфекции. Показано, что
У. pseudotuberculosis синтезируют суперантиген {Yersinia Pseudotuberculosis-derived
Mitogen — YPM), ответственный за поликлональную активацию Т-лимфоцитов,
и гиперпродукцию провоспалительных цитокинов. Около 98% штаммов, выделен¬
ных от больных на Дальнем Востоке, в Японии и Корее, содержат суперантиген,
вызьшающий системное поражение органов и тканей. Патогенные У. enterocolitica
имеют белки наружной мембраны (БНМ), обеспечивающие им адгезивные и инва¬
зивные свойства. Один из них — инвазин — имеет молекулярную массу 92 кДа и
кодируется хромосомным ш^-геном. Другой хромосомный ш7-ген кодирует белок
адгезии и инвазии All с молекулярной массой 17 кДа. Гены HPI не выявлены у непа-
тогенных У. enterocolitica биотипа 1А и у низкопатогенных штаммов биотипов 2-5,
однако они определяются у всех высокопатогенных штаммов биотипа 1В.
Энтеротоксигенность У. enterocolitica биотипов 1В и 2-4 связана с экспрессией
хромосомного ysiA-гена. У непатогенных представителей биотипа 1А обнаружен
ysifß-ген.Плазмидой вирулентности иерсиний pYV 42-48 МДа обладают штаммы
У, pseudotuberculosis и У. enterocolitica. Плазмида вирулентности кодирует белок
наружной мембраны Yad А, являющийся ведущим адгезином иерсиний, а также
белки наружной мембраны Yop и аппарат их секреции III типа Ysc {Yop secretion),
которые представляют собой комплекс факторов, участвующих в нейтрализации
иммунного ответа макроорганизма. Аппарат секреции III типа Ysc включает не
менее 28 белков и позволяет иерсиниям вводить синтезируемые белки в цитоплаз¬
му клетки-мишени при тесном контакте без проникновения в нее.Плазмида с молекулярной массой 82 МДа обнаружена только у У, pseudotubercul
osiScepoTHna 1. Показано, что штаммы, имеющие плазмиду pVM 82 МДа, вызывают
более тяжелое течение псевдотуберкулеза.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ У. ENTEROCOLITICA
И У. PSEUDOTUBERCULOSISУ. enterocolitica вызывают гастроэнтерит, илеит, энтероколит, псевдоаппенди¬
цит. Нарушения деятельности пищеварительного тракта сопровождаются диареей,
болями в животе и лихорадкой. Иногда при этой инфекции развиваются узловатая
эритема и острый артрит.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ369Псевдотуберкулез регистрируют в спорадических случаях. Он проявляется
брызжеечным аденитом и аппендицитоподобным синдромом.Полиморфизм и неспецифичность клинической картины обоих иерсиниозов
диктует необходимость их дифференциации от широкого круга инфекционных,
паразитарных и неинфекционных заболеваний, в том числе скарлатины, кори,
краснухи, энтеровирусной инфекции, лептоспироза, вирусных гепатитов, три¬
хинеллеза, брюшного тифа, острых кишечных инфекций различной этиологии
(сальмонеллеза, кампилобактериоза, шигеллеза), инфекционного мононуклеоза,
бруцеллеза, туляремии, геморрагических лихорадок, острого аппендицита. Иногда
иерсиниозы приходится дифференцировать от менингококковой инфекции, грип¬
па, сыпного тифа, ревматизма, геморрагического васкулита. Нередко при подо¬
зрении на иерсиниоз приходится исключать наличие у пациентов лимфосаркомы,
опухолей толстой кишки, внелегочного туберкулеза.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАОкончательный диагноз иерсиниозов ставят на основании результатов лабо¬
раторных исследований — выделения на питательных средах и идентификации
возбудителя, обнаружения в клиническом материале антигенов, а также генома
Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, антигенов, выявления у пациентов серокон-
версии.Изоляция и идентификация Y. pseudotuberculosis и Y. enterocoliticaОдно из важнейших условий качественного бактериологического исследова¬
ния — правильный сбор материала и его подготовка к исследованию. Правила
взятия и подготовки исследуемого материала представлены в табл. 21-17.Таблица 21-17. Материалы для исследования и их подготовкаВид исследуемого
материалаКоличество,срокиПравила взятия, подготовка
к исследованию бактериологиче¬
ским методом и методом ИФАПравила взятия,
подготовка к ПЦРМатериал от больныхФекалии'0,5-1,0 г на
протяжении
всего периода
заболеванияСтерильной палочкой из судна или
зондом-тампоном из прямой кишки.
Помещают в 5 мл среды накопления
(ПК)В одноразовый стерильный
контейнер с 5 мл забуфе-
ренного 0,9% физраство¬
ра (ЗФР) — pH 7,2-7,4,
ложечкой, прилагаемой к
контейнеруМоча'20-30 мл
средней пор¬
ции утренней
мочи в первые
7 дней болез¬
ниЗасевают осадок после центрифуги¬
рования или отстаивания. Дпя ИФА
осадок исследуют нативно, затем
помещают в 5 мл среды накопленияВ одноразовый стерильный
контейнерСмыв из зевав первые
3 дня болезниНатощак с задней стенки глотки
и корня языка зондом-тампоном,
смоченным в 0,9% растворе натрия
хлорида. Зонд-тампон помещают
в 5 мл среды накопленияЗонд-тампон помещают е
одноразовую стерильную
пробирку с 5 мл ЗФРКровь5-10 мл 8
первые 3 дня
болезниСтерильно из локтевой вены; сгу¬
сток измельчают, помещают 1 мл
крови в 5 мл среды накопленияВ одноразовую стерильную
пробиркуОперационный или секционный материалЧервеобразный1-2 гСтерильно измельчают, 1 млВ одноразовую стерильнуюотростоксуспензии помещают в 5 мл средыпробирку с 5 мл ЗФРнакопленияшшшЧшшы
ШіШші370ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯОкончание табл. 21-17Вид исследуемого
материалаКоличество,срокиПравила взятия, подготовка
к исследованию бактериологиче¬
ским методом и методом ИФАПравила взятия,
подготовка к ПЦРМезентериальные
лимфоузлы, сино¬
виальная оболочка и
другие органы и ткани1-2 гСтерильно измельчают, 1 мл
суспензии помещают в 5 мл среды
накопленияВ одноразовую стерильную
пробирку с 5 мл ЗФРСиновиальная жид¬
кость1-2 млСтерильно из суставной сумки, 1 мл
помещают в 5 мл среды накопленияВ одноразовую стерильную
пробирку с 0,5 мл ЗФРЖелчь1-2 млСобирают в стерильную пробирку
0,&-1,0 мл, помещают в 5 мл среды
накопленияКишечное содер¬
жимое0,5-1.0 гСобирают в стерильную пробирку
0,5-1,0 мл, помещают в 5 мл среды
накопленияВ одноразовую стерильную
пробирку с 5 мл ЗФРСгусток крови0,5-1,0 млСтерильно измельчают. 1 мл поме¬
щают в 5 мл среды накопленияВ одноразовую стерильную
пробирку с 5 мл ЗФР■ Высеваемость иерсиний наиболее высока в первые 3-5 дней болезни и до назначения анти¬
бактериальных препаратов.Схема бактериологического исследования включает oбoгa□i;eниe исследуе¬
мого материала при низкой температуре, использование дифференциально¬
диагностических сред для выделения и идентификации культур, определение их
биотипа, серотипа, патогенности.Несмотря на низкую эффективность, прямой посев нативного материала на плот¬
ные питательные среды проводят, как правило, при подозрении на инфицирован-
ность иерсиниями продуктов питания или при групповых заболеваниях, вызванных
употреблением инфицированных продуктов. Для этой цели целесообразно исполь¬
зовать дифференциально'диагностическую среду для выделения иерсиний с бром-
тимоловым синим (СБТС),При холодовом обогащении исследуемый материал в пептонно-калиевой среде (ПК)
помещают в холодильник и вьщерживают в нем до первого положительного посева, но
не более 10 дней. Высев на плотные питательные среды проводет со среды ПК на 2-3,5-7 и 10-е с}тки. Его проводят петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхно¬
сти). Перед посевом содержимое пробирок не взбалтывают. При использовании среды
Эндо или исследовании сильно контаминированных посторонней микрофлорой проб
проводят щело^шую обработку (в 0,2 мл исследуемого материала вносят 0,2 мл свеже¬
приготовленного 0,72% раствора гидроксида калия в 0,5% растворе натрия хлорида,
перемешивают, выдерживают в течение 1-1,5 мин и высевают на плотную питатель¬
ную среду). Методика щелочной обработки основана на относительной резистентно¬
сти иерсиний к щелочам по сравнению с другими микроорганизмами.Для первичной изоляции и культивирования иерсиний чаще всего используют спе¬
циальную дифференциально-диагностическую среду для иерсиний (СБТС), а также
среды Хоттингера, Эндо, Олькеницкого, цефсулоидин-иргазан-новобиоциновый агар.
Посевы на этих средах инкубируют при температуре 26+2 Т и осматривают еже¬
дневно (со вторых суток), регистрируя появление подозрительных по внешнему виду
колоний (табл. 21-18).Видовую принадлежность выделенных культур устанавливают на основании
комплекса типичных морфологических, культуральных, биохимических и анти¬
генных свойств. Для предварительного отбора используют стабильный биохи¬
мический признак — наличие уреазы. Положительный уреазный тест позволяет
отличить иерсинии от других видов патогенных кишечных бактерий — шигелл,
сальмонелл, эшерихий. Отсев подозрительных колоний проводят на скошенный
столбик среды Олькеницкого штрихом и уколом в столбик.
Таблица 21-18. Характеристика колоний иерсиний на плотных питательных средахВидСреда Хоттингера24 ч48 чСреда Эндо24 ч48 чСБТС24 ч48 чСреда ОлькеницкогоСтолбикСкошеннаячастьПримечаниеУ. pseudo-
tuberculosisКолонии диаме¬
тром 0,1-0,2 мм,
голубовато-белые,
полупрозрачные,с
ровными краями,
слизистые, со
слабоприпод¬
нятым центром
(при осмотре под
микроскопом
имеют вид пира¬
мид или со сходя¬
щимися к центру
гранями)Колонии
диаметром
0,2-0,5 мм,
прозрачные,с
ровным краем.В полиморфной
популяции —
часть колоний
бугристая, с
неровными
фестончатыми
краямиКолонии мел¬
кие (росинча-
тые) круглые,
выпуклые,
блестящие,
бесцветныеКолонии
диаметром
о,1-0,2 мм,
выпуклые,
блестящие,
с ровными
краями, бес¬
цветныеКолонии
мелкие кру¬
глые, могут
иметь слегка
желтоватую
окраскуКолонии диа¬
метром 1-2 мм,
голубовато¬
зеленые, с фестон¬
чатыми краями,
выпуклые, с при¬
поднятым центром
и суховатой мато¬
вой поверхностью
на синем фоне
средыМалиновыйМалиновыйY. enterocoliticaКолонии диа¬
метром от 0,1-0,2
до 0,5 мм, кру¬
глые, выпуклые,
с ровным краем,
полупрозрачные,
с голубоватым
опенком мягкой
консистенцииКолонии диа¬
метром 0,3-
0,5 мм, более
выпуклые, с
ровным краем,
прозрачныеТакие жеТакие же, но
с розоватым
опенкомКолонии диа*
метром 2-4 мм,
голубовато¬
зеленые, выпу¬
клые, сухие, с
матовым налетомМалиновый, слег¬
ка желтоватый
в самой нижней
части столбикаМалиновыйНа СБТС через
48 ч колонии
Е. соН —
ярко-желтые,
диаметром
2-3 мм, сочные,
выпуклые;Sh. flexneri —
желтые, диа¬
метром 1-2 мм
сочные, плоскием
372 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯВыделение антигенов возбудителейМетоды, направленные на выявление антигенов иерсиний, наиболее пер¬
спективны для ранней диагностики их инфекций. Основные их преимущества —
быстрота получения результатов, возможность обнаружения антигенов погибших
микробов, что особенно важно при обследовании больных, которым проводили
антибиотикотерапию.Материал для исследования, сроки и правила его взятия представлены в
табл. 21-17. Исследование проб проводят в 1-е сутки их получения и затем на 3-5-е
сутки после подращивания при температуре 4 "“С в среде ПК. Непосредственно
перед исследованием материал инактивируют 30 мин при 56±1 "С, центрифугиру¬
ют при 3000 об./мин 15 мин и берут для исследования надосадочную жидкость.Для выявления антигенов иерсиний в различных субстратах применяют реак¬
цию ко-агглютинации (РКоА) и иммуноферментный анализ (ИФА).РКоА. Реакция предназначена для выявления микробных антигенов в материале,
взятых у пациентов в течение первой недели болезни, а также связанных анти¬
генов в составе иммунных комплексов. Тест основан на способности белка А
золотистого стафилококка соединяться с Fc-фрагментом IgG. Именно поэтому в
таких антительных диагностикумах свободные, ориентированные наружу Fab-
фрагменты иммуноглобулинов соединяются со специфическими антигенами иер¬
синий. Реакцию учитывают визуально.ИФА. Принцип теста основан на образовании комплекса «антиген-антитело»,
выявляемого с помощью второго антитела, меченного пероксидазой хрена (конъ¬
югата). Имеются коммерческие иммуноферментные тест-системы для выявления
антигенов иерсиний псевдотуберкулеза на основе антител к синтетическим олиго¬
пептидам — фрагментам инвазина (белка наружной мембраны) Y.pseudotuberculosis,
ответственного за адгезию и инвазию возбудителя на начальных этапах инфекци¬
онного процесса.РГА. Реакцию проводят ка стекле со свежевыделенными культурами бактерий,
выращенными на среде Хоттингера при температуре 37±1 и 26±2 X (по 18-24 ч
при каждом температурном режиме). Для экспресс-индентификации pYV+ штам¬
мов используют сыворотку к вирулентным иерсиниям (СВИ), а для серотипиро¬
вания — диагност№1еские сыворотки к у. enterocolitica серотипов 0:3, 0:4, 0:4,32;
0:4,33; 0:5, 0:5,27; 0:6,30; 0:6,31; 0:7,8; 0:9, 0:13, 0:13,7 и серотипы I и III
У. pseudotuberculosis.Молекулярно-генетическая диагностикаПозволяет выявлять иерсинии в тестируемых пробах на основании обнаруже¬
ния определенных участков генома этих бактерий. Наибольшее применение нашла
ПЦР. При диагностике псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза ПЦР позволя¬
ет выявить специфические участки генов, локализованных на плазмиде вирулент¬
ности иерсиний pYV или хромосоме, кодирующих ряд факторов патогенности.
Основная трудность ПЦР заключается в том, что при исследовании клинического
материала реакция может ингибироваться биологическими продуктами деграда¬
ции тканей, ферментами, полисахаридами и другими компонентами исследуемого
образца. Именно поэтому перед постановкой реакции необходимо подготовить
пробы к исследованию описанными ниже способами.Кровь. 50 мкл нативной крови смешивают со 100 мкл лизирующего буфера
(10 мМ Трис-НС1, pH = 8,0,0,5% Твин-20,100 мкг/мл протеиназы К) и инкубиру¬
ют в течение 1 ч при температуре 56 °С, затем протеиназу К инактивируют нагрева¬
нием до 95 °С 10 мин, смесь центрифугируют 3 мин при 5000 об./мин. Для анализа
в ПЦР достаточно 2-3 мкл надосадочной жидкости.Моча. 10-20 мл мочи центрифугируют 10 мин при 2000 об./мин. К осадку
добавляют 300 мкл стерильной дистиллированной воды и прогревают в течение
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ37310	мин до 100 "С. Центрифугируют при 5000 об./мин. Для исследования в ПЦР
берут 1-3 мкл надосадочной жидкости.Фекалии. Подготовка фекалий основана на щелочной обработке, при которой
большая часть посторонней микрофлоры погибает и удаляется как супернатант
при центрифугировании, а относительно устойчивые к щелочи иерсинии выжива¬
ют, что обеспечивает снижение концентрации ингибиторов в пробе:•	исследуемый материал суспендируют в ФБР в соотношении 1:10 и центри¬
фугируют при 500-1000 об./мин в течение 1,5-2 мин для осаждения грубых
частиц или отстаивают в течение 2-3 ч при комнатной температуре;•	0,2-0,5 мл верхней фазы переносят в лунку полистиролового планшета для
серологических реакций и смешивают с таким же объемом 0,72% раствора
гидроксида калия;•	после 25-30 с экспозиции проводят посев материала на СБТС и сразу же в
лунки планшета добавляют 0,2-0,5 мл бульона Хоттингера для прекращения
действия щелочи как селективного агента;•	материал из лунки переносят в пробирку типа «Эппендорф» и центрифугиру¬
ют на микроцентрифуге при 10 000-12 ООО об./мин в течение 3-5 мин;•	надосадочную жидкость удаляют, осадок дважды промывают дистиллиро¬
ванной водой;•	к осадку добавляют 20 мкл деионизованной воды, прогревают в течение10	мин до 100 ®С, центрифугируют при 12 ООО об./мин в течение 2 мин.Для ПЦР используют 1-3 мкл надосадочной жидкости. Для выделения ДНК
из операционного или секционного материала применяют комплект реагентов
«ДНК-сорб-В» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.ПЦР дает возможность получить сигнальный результат в течение первых суток
исследования, тогда как наиболее короткий срок бактериологического выделения
культуры и идентификации иерсиний составляет 5-8 сут.ПЦР-анализ можно использовать при 3-этапном варианте бактериологического
исследования (рис, 21-1).Двукратно отрицательные результаты ПЦР позволяют прекратить дальнейшее
бактериологическое исследование.Серологическая диагностикаАнтитела к возбудителям псевдотуберкулеза и энтероколитного иерсиниоза
появляются в крови уже на 1-й неделе болезни, а существенное повышение их
концентрации до диагностических уровней происходит к началу 3-й недели забо¬
левания. Этими сроками регламентировано обязательное исследование парных
сывороток крови. Достоверным считается 4-кратное и большее нарастание титра
антител при исследовании парных проб сыворотки. Через 2 мес начинается сни¬
жение концентрации антител, а через 6 мес они присутствуют в крови пациентов
в минимальных количествах. Наиболее выраженная динамика антителообразова-
ния наблюдается у больных с заболеванием средней тяжести. При легком течении,
особенно при гастроэнтеритической форме, динамика антител выражена слабо, их
начинают регистрировать в диагностических титрах с конца 2-й недели заболева¬
ния.Кровь для серологических исследований берут натощак, с соблюдением правил
асептики. Плазму крови получают общепринятыми методами. Парные сыворотки
желательно исследовать одновременно, поэтому первую сыворотку до постановки
следует разделить на несколько объемов и заморозить. Замораживать и размора¬
живать сыворотки можно однократно, так как при повторной разморозке антитела
разрушаются.Серологическую диагностику иерсиниозов проводят в РНГА, ИФА и иммуноблот-
тинге.
374ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯРис. 21-1. ПЦР при З-этапном варианте бактериологического исследования.РНГА. Наиболее часто применяемый в лабораториях метод серологической диа¬
гностики иерсиниозов. Для постановки теста пользуются лиофилизированными
эритроцитарными диагностикумами, в частности псевдотуберкулезным — для
выявления антител к Y. pseudotuberculosis серотипа 1 и кишечноиерсиниозным —
для выявления антител к Y. enterocolitica серотипов 0:3 и 0:9 (производства ФГУП
«Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток
и предприятие по производству бактерийных препаратов»). Эти диагностикумы
представляют собой формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизиро¬
ванные специфическими полисахаридными антигенами иерсиний. Агглютинация
эритроцитов происходит в результате взаимодействия специфических антител
исследуемой сыворотки и антигенов, иммобилизованных на поверхности эри¬
троцитов. Диагностикумы выпускают в комплекте с несенсибилизированными
эритроцитами барана для оценки специфичности реакций с исследуемыми сыво¬
ротками и специфическими кроличьими сыворотками для контроля активности
диагностикумов. Постановку РНГА проводят макро- и микрометодами. Для про¬
ведения реакции макрометодом используют полистироловые пластины с лунками
вместимостью 2 мл. Для постановки РНГА микрометодом удобны одноразовые
микропланшеты с U-образными лунками. Перед постановкой исследуемые сыво¬
ротки прогревают при температуре 56 ‘’С в течение 30 мин для устранения неспе¬
цифических гемагглютининов.ИФА, Для постановки ИФА используют тест-системы, предназначенные для
выявления IgA, IgM и IgG к БНМ иерсиний, кодируемым плазмидой вирулентно¬
сти pYV и ответственным за проявление патогенных свойств иерсиний. Высокие
чувствительность и специфичность метода достигаются благодаря использова¬
нию в качестве антигенов, сорбированных в лунках полистироловых планшетов.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ375комбинации рекомбинантных БНМ иерсиний (УорО, УорН, УорЕ, УорМ). Тест-
системы представляют собой многокомпонентные наборы реагентов для поста¬
новки непрямого ИФА на твердофазном носителе.Иммуноблоттинг. Позволяет выявлять антитела классов А и С к отдельным
антигенам У. егЛегосоИНса путем постановки ИФА на нитроцеллюлозных мембра¬
нах. В качестве антигенов используют БНМ иерсиний (УорМ, УорН, УорО, УорЫ,
УорР, УорЕ, ЬсгУ), специфичных для вирулентных штаммов. Очищенные БНМ раз¬
деляют по молекулярной массе методом электрофореза в полиакриламидном геле
и переносят на нитроцеллюлозную мембрану тестовых стрипов в виде отдельных
полос. При постановке ИФА стрипы инкубируют с образцом разведенной сыво¬
ротки или плазмы крови пациента. Если образец положительный, специфические
антитела будут связываться с антигенами. Для визуализации комплекса «антиген-
антитело» проводят инкубацию с использованием ферментного конъюгата — при
наличии антител на мембране видны полосы различной интенсивности. Метод
имеет высокую специфичность и применяется для диагностики хронических форм
иерсиниозов.ГЕМОФИЛЬНЫЕ БАКТЕРИИТАКСОНОМИЯРод Haemophilus относится к семейству Pasteurettaceae у-протеобактерий. Он
включает не менее 15 видов, 8 из которых могут быть выделены из организма
человека.Эпидемиологическое значение имеют следующие виды гемофильных бактерий:—	Я. Influenza — поражает детей, вызывая гнойный менингргг, острые отит и
синусит, пневмонию, хронический бронхит, гнойный конъюнктивит, эндо¬
кардит, сепсис;—	я ducreyi - возбудитель мягкого шанкра;—	Я parainfíuenzae — обостряет течение хронического бронхита, выделяется
при подостром инфекционном эндокардите;—	Я. aphrophilus — достаточно редко изолируют из абсцессов, крови, плевраль¬
ной жидкости и СМЖ. Встречается в материале из ротовой полости, верхних
дыхательных путей;—	Я, segnis — встречаются при раневой инфекции, могут быть выделены из
крови и плевральной жидкости;Данный раздел посвящен 2 видам гемофильных бактерий — Я. ducreyi и Я. Influ¬
enza, инфекции которых имеют наибольшее клиническое значение для человека.Н. influenzaeОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАЯ. influenzae — грамотрицательная, факультативно-анаэробная, неподвижная,
не образующая спор коккобацилла, имеющая размеры 0,3-0,4х1-1,5 мкм. Она
склонна к полиморфизму и может трансформироваться в вытянутые (нитевидные)
формы. Некоторые штаммы (по оценке разных авторов — от 5 до 30%) образуют
капсулу. По капсульному антигену различают 6 серотипов (а, Ь, с, d, е, f). Их иден¬
тифицируют в РГА. Довольно часто встречаются и нетипируемые в данном тесте
изоляты.Я influenzae способна расти в значительном диапазоне температуры — от 23
до 43 °С, оптимальная температура культивирования — 37 "С. Для размножения
требует присутствия в питательной среде гемина (фактора X) и никотинамидаде-
ниндинуоклеотида (фактора V).
376 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯНе ферментирует сахара, кроме глюкозы: ее он разлагает до янтарной, молоч¬
ной и уксусной кислот.ЭПИДЕМИОЛОГИЯН. influenza распространена повсеместно, а в ряде стран эта инфекция эндемич¬
на. В большинстве случаев воротами инфекции и местом персистенции бактерии
в организме человека служит носоглотка. Возбудитель передается воздушно-
капельным и контактным путями.Наиболее опасен серотип Ь (Hib), способный вызывать у детей сепсис, менингит,
пневмонию, эпиглотгит. Этот серотип занимает третье место (после ЛГ. meningiti¬
dis и Str. pneumoniae) в структуре этиологических факторов гнойных менингитов.
В связи с этим разработана и включена в национальный календарь прививок
вакцинация против НіЬ-инфекции, Наиболее подвержены НіЬ-инфекции дети в
возрасте от 2 мес до 5 лет, у которых генерализованная форма инфекции сопро¬
вождается высокой летальностью (в довакцинальный период она составляла 30%,
по данным ВОЗ). Тяжелые формы НіЬ-инфекции встречаются и у взрослых людей
(в нашей стране заболеваемость взрослой части населения в 4-5 раз ниже, чем
детей), хотя чаще взрослые являются носителями Я. influenzae.Я. influenzae биовара aegypticus вызывает гнойный конъюнктивит и синдром
бразильской пурпурной лихорадки.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИХарактер клинических проявлений зависит от локализации инфекции.Острый эпиглотгит начинается у детей остро и внезапно. Характерный при¬
знак — увеличенный, гиперемированный и отечный надгортанник. Заболевание
протекает тяжело и часто завершается летальным исходом вследствие прогрес¬
сирующей асфиксии (дети погибают, если не удается своевременно провести им
трахеостомию).Менингит развивается вследствие диссеминации инфекции по лимфатической
системе при бессимптомном носительстве. у выздоровевших детей нередко оста¬
ются стойкие неврологические нарушения (умственная отсталость, гидроцефалия,
слепота).Распространение инфекции по респираторному тракту и ЛОР-органам ведет к
развитию острых отитов и синуситов, пневмонии и хронического бронхита.Гнойный конъюнктивит протекает у детей тяжело и проявляется системными нару¬
шениями (повышением температуры, лимфаденопатией, невралгией, бессонницей).
При легком конъюнктивите (синдроме розовых глаз) появляются незначительные
серозные истечения, которые со временем становятся серозно-гнойными. При тяже¬
лом конъюнктивите отмечают сильное раздражение глаз, слезотечение, отек век со
слизисто-гнойным или фибринозно-гнойным отделяемым, зетобоязнь.Синдром бразильской пурпурной лихорадки — тяжелая септицемия, клиниче¬
ски напоминающая менингококцемию. Характерны системные поражения, обу¬
словленные интоксикацией, и сыпь (без петехий). Летальность достигает 70%.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАДля постановки окончательного диагноза в лабораторию отсылают материал,
соответствующий клинической форме инфекции, — СМЖ, кровь, плевральную
жидкость, СЖ, перикардиальную жидкость, отделяемое из гайморовых и других
пазух, мокроту, гной из абсцессов, соскоб со дна язв при мягком шанкре.Бактериологический анализ должен влючать бактериоскопию мазков проб, их
посев на питательные среды, определение чувствительности вьщеленных изолятов
я influenzae к антибактериальным препаратам. В последнее время все чаще для
диагностики инфекции стали применять экспресс-методы обнаружения антигенов
Я. influenza и ПЦР.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 377в лабораторию клинический материал доставляют в транспортных средах.
Для транспортировки носоглоточной слизи подходит 2% пептонная вода (pH =
7,2-i-7,4) с линкомицином (1 мг/мл). Зонд-тампон со слизью погружают в среду,
закрывают пробирку пробкой и доставляют в лабораторию, где тампон отжимают
о стенки пробирки и проводят посев на чашку с сывороточным агаром.Бактериоскопияв препаратах толстой капли СМЖ или крови после окраски водно-спиртовым
раствором метиленового синего выявляют мелкие полиморфные бактерии (кок¬
ковидной, овальной или нитевидной формы), расположенные в лейкоцитах или в
свободном виде и формирующие цепочки различной длины.в мазках мокроты, окрашенных по Граму, выявляют полиморфные грамотрица¬
тельные бактерии внутри полиморфноядерных нейтрофилов или вне клеток. Для
учета результатов необходимо уточнить, действительно ли исследуемый материал
является мокротой, а не слюной или отделяемым носоглотки (в мокроте в боль¬
ших количествах должны присутствовать альвеолярные макрофаги).Изоляция возбудителяПосевы исследуемого материала инкубируют в течение 24 ч при температуре
37 °С и повышенной влажности в атмосфере, содержащей 5-10% углекислого газа.На шоколадном агаре Я, influenzae образует серые, слизистые, блестящие
мелкие колонии диаметром 0,2-2,0 мм. Часто определяется характерный запах
индола (мышиный). Колонии R-форм Я 1?фиепгае очень мелкие, серовато-белого
цвета, зернистые, с неровными краями.На полужидком питательном (0,1% сывороточном) агаре признаки роста гемо¬
фильных палочек отсутствуют, хотя они способны сохраняться на данной среде
до 48 ч.На сывороточном агаре Я influenzae не растет в отличие от N. meningitidis и
Str. pneumoniae.При посевах крови на двухфазную питательную среду признаки роста гемо¬
фильных бактерий в жидкой фазе среды отсутствуют, тогда как на плотной фазе
отмечается формирование колоний.При бактериоскопии колоний Я influenzae в мазках, окрашенных по Граму,
выявляют грамотрицательные полиморфные палочки (от овальных кокковидных
до типичных тонких палочек), различные по длине и образующие нитевидные
цепочки. Нередко отмечают наличие капсулы.Подозрительные на Я. influenzae колонии тестируют на сахаролитическую и
ферментативную активность. Коммерческие наборы позволяют провести биохи¬
мическую идентификацию в течение 2 ч.Также из колоний, подозрительных на Я. influenzae, делают пересев на чашки
с шоколадным агаром для получения чистой культуры. Потребность бактерий в
факторах роста определяют посредством посева чистых культур на сывороточный
агар. После посева на поверхность агара накладывают диски с V и X факторами
роста (расстояние между дисками — 5 мм). Колонии Я influenzae растут только в
пространстве между дисками с V и X факторами.Экспресс-диагностикаЭкспресс-метод определения я. influenzae — реакция латекс-агглютинации.
Материал для исследования — нативная СМЖ или кровь. Идентификацию
Я. influenzae серотипа Ь осуществляют с помощью реакции латекс-агглютинации
с соответствующим латекс-диагностикумом. Для дифференциальной диагностики
Hib-инфекции с инфекцией, вызванной другими гемофильными и морфологиче¬
ски сходными бактериями, используют различия культурально-биохимических
свойств (табл. 21-19, 21-20).
Таблица 21-19. Биохимические свойства различных видов рода HaemophilusВидГемолиз*КаталазаОксидазаПорфирино-
вый тестПотребность в
факторах ростаФерментацияглюкозыфруктозысахарозылактозыманнозыН. influenzae-++-v,x+----Н. parainfíuenzae-+++V+++-+Н. haemoiiiicus+++-v,x++---Н. parahaemoliticus++++V+++--Н. apropNlüs---+-+++++И. paraprophilus-++V+++++И. segnis-+-+V+++--Н. ducreyi-++-X-----о»оо* На кровяном агаре с эритроцитами лошади.Таблица 21-20. Дифференциальная диагностика гемофильных бактерий с другими морфологически сходными микробамиМикробРост на простых пита¬
тельных средахМорфологияКаталазаОксидазаРедукциянитратовУреаза^-Галактозидаза
(тест с ONPG)ГемолизН. influenzae-Мелкие палочки+-++--Н. t}aemolitícus-Мелкие палочки+-+_++Н. parainfíuenzae-Мелкие палочки+-+-+-N. meningitidis-Кокки++----N. mucosa+Кокки+++---N. sicca+Кокки++----N. subflavaКокки++----N. perflava+Кокки+++--+Moraxella catarrhalis+Кокки+++---Acinetobacter spp.+Палочки+-----Str. pneumoniae-Кокки----++
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ379Существуют коммерческие наборы для определения специфических фрагмен¬
тов генома Н. influenzae типа b в СМЖ и крови больного методом ПЦР.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМОсобенность анализа — особые требования к питательной среде (обязатель¬
ное наличие V и X факторов роста). Хорошо зарекомендовала себя питательная
среда НТМ {Haemophilus Test Medium). Ее готовят в лаборатории из бульона и агара
Мюллера-Хинтона. После растворения основы в нее добавляют дрожжевой экстракт
(до конечной концентрации 5 мг/мл) и раствор гематина (до конечной концентра¬
ции 15 мг/л). Сначала готовят основной раствор гематина: 50 мг порошка вносят в
100 мл 0,01 N раствора гидроксида натрия (0,01 моль/л) и нагревают, тщательно
перемешивая до полного растворения. В подготовленную для автоклавирования
среду на 1 л вносят 30 мл основного раствора гематина. После автоклавирования в
охлажденную до 48-50 °С питательную среду асептически вносят раствор никоти-
намидадениндинуклеотида до конечной концентрации 15 мг/л. Раствор никотина-
мидадениндинуклеотида стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с
размером пор 0,45 мкм. При определении чувствительности к сульфаниламидам и
триметоприму в охлажденную до 48-50 'С питательную среду асептически вносят
раствор тимидинфосфорилазы до конечной концентрации 0,2 ЕД/мл.Для контроля антибиотикорезистентности используют диско-диффузионный
метод или Е-тест.Н. ducreyiОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАН. ducreyi — факультативный аэроб, требующий для своего роста фактор X, а не
V. Бактерия оксидазоположительна и каталазоотрицательна. Уреазной и орнитин-
декарбоксилазной активностью не обладает, глюкозу не ферментирует, индол не
образует.ЭПИДЕМИОЛОГИЯМягкий шанкр в течение последних десятилетий в России практически не
регистрируют (за исключением случаев заражения за рубежом). Инфекция рас¬
пространена в Африке, странах Ближнего Востока и Юго-Восточной Азии, а также
Центральной и Южной Америки. Кроме того, мягкий шанкр регистрируют в пор¬
товых городах Великобритании, Португалии, Италии и США.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИИнкубационный период составляет 3-10 дней, однако через 12-18 ч после зара¬
жения на месте внедрения возбудителя образуется красное пятно. Через 2-5 дней
оно превращается в изъязвленную папулу, а затем пустулу (язву). Язва мягка на
ощупь и болезненна, что отличает ее от сифилитического твердого шанкра. Она
имеет тонкие, неровные, подрытые края, а ее дно покрыто желтоватым сальным
налетом и обильно кровоточит. Первоначально язва по размерам соответствует
зерну чечевицы, но в течение 3 нед ее диаметр увеличивается до 2 см. Мягкие шан¬
кры могут быть множественными, в этом случае они часто сливаются, формируя
гигантские ползучие язвы. Одновременно развивается регионарный лимфаденит,
сопровождаемый в 40% случаев нагноением пораженных лимфатических узлов.
В неосложненных случаях язвы спонтанно заживают в течение 1-2 мес.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
БактериоскопияПри типичной клинической картине лабораторная диагностика заключается в
бактериоскопии отделяемого язвы. Мазки окрашивают по Граму, Цилю-Нильсену
KtipfSIcтшш380ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯИЛИ метиленовым синим, при обнаружении в мазках грамотрицательных палочек
с типичным расположением группами («косяки рыб«>) или параллельными цепоч¬
ками («железнодорожные пути») диагностируют мягкий шанкр. В сомнительных
случаях (при характерной симптоматике и отрицательном результате бактерио¬
скопии) проводят посев клинического материала на питательные среды в целях
изоляции возбудителя болезни. Также в сомнительных случаях больному прово¬
дят провокационный тест: инокулируют подозреваемому в заражении Я, ducreyi
убитую вакцину, приготовленную из этой бактерии. Такая инъекция при мягком
шанкре индуцирует появление нового очага поражения. Ранее тест проводили,
используя вместо вакцины отделяемое язвы, взятое у того же больного.Изоляция возбудителяВ качестве обогатительной среды используют полужидкий 0,1% сывороточный
агар. При его приготовлении сыворотку инактивируют прогреванием при темпе¬
ратуре 56 “С.Нативный (отделяемое язв) или обогащенный материал на среды с обяза¬
тельным содержанием Х-фактора, посевы инкубируют в атмосфере, содержащей
5-10% углекислого газа, при повышенной влажности. Лучше всего применять
шоколадный агар с 5% овечьей сыворотки крови.Я. ducreyi формирует колонии плотной консистенции, трудноотделяемые от
поверхности плотных питательных сред.НЕФЕРМЕНТИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИТАКСОНОМИЯ и ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАНеферментиругощие грамотрицательные бактерии (НГОБ) - нетаксономи¬
ческая группа микроорганизмов, неспособных к продукции кислоты на трехса¬
харном агаре, не ферментирующих глюкозу в 0-/Р-тесте, не растущих или плохо
растущих в анаэробных условиях. Она включает разнообразные роды бактерий, не
связанных между собой филогенетически или генетически. Причины ее формиро¬
вания носят скорее утилитарный, чем биологический характер. Скудность инфор¬
мации о фенотипических признаках многих из этих бактерий создает проблемы
как при идентификации, так и при определении таксономического положения
НГОБ. Наиболее достоверные результаты могут быть получены при использова¬
нии молекулярно-генетических методов или при хромотографическом исследова¬
нии состава клеточных жирных кислот. На практике для первичной идентифика¬
ции НГОБ целесообразны изучение морфологических и тинкториальных свойств
(мазок по Г^аму), проведение 0-/Р-теста на среде Хью-Лейфсона, выявление
подвижности, анализ культуральных свойств на плотных средах (табл. 21-21).
Для углубленной идентификации в условиях практических лабораторий наиболее
рационально применение коммерческих идентификационных систем [«НЕФЕРМ-
тест 24» («Lachema»), API 20 NE («BioMerieux») или аналогичных].Таблица 21-21. Критерии первичной идентификации НГОБРодO'/F-тестПиг¬ментОкси-даэаНитрат-редук-тазаПодвиж¬ностьРостнаМПАРост на
SS-arapeAchromobacter В, Е, F/Ochrobactrum
anthropi0-++±++Acidovorax delafieldii0++++-Acinetobacter0 или ND----+Agrobacterium0±4++--
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 381
Окончание табл. 21-21Рпд0-/F-TecTПиг¬ментОкси¬дазаНитрат-редук-тазаПодвиж¬ностьРостнаМПАРост на
SS-arapeAlcaligenesN0’-+++4-±Chryseomonas luteola0+-+++Comamonas spp.N0+++++Flavimonas oryzihabitans0+--++±Flavobacterium0=++-+-KingellaP-++---MoraxellaN0-+-/+--V+OligellaN0-++-+-Pseudomonas0++-++•fXanthomonas maltophilia0+-++++Примечание:О - окисление глюкозы на среде Хью-Лейфсона.N0 - отсутствие реакции.F — ферментация.«+» — наличие признака.«-» — отсутствие признака.«-/+«► и ± — признак вариабелен у отдельных видов или штаммов.^ Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidaiis — О.^ Flavobacterium odoratum — N0.^ Строго говоря, ферментирующие глюкозу кинтеллы не относятся к НГОБ, но, учитывая, что,
во-первых, к. kingae ранее входила в род Могахейа, а во-вторых, невозможность выявления фер¬
ментации глюкозы на трехсахарном агаре, данный род включен в настоящую таблицу.Род Achromobacter подразделяют на три биовара — В, Е, R Биовары А, С, D сегод¬
ня рассматривают как биовары нового вида Ochrobactrum anthropi. Представители
рода — грамотрицательные подвижные палочки. Ферментируют глюкозу, ксилозу,
сахарозу, мальтозу (реакции могут протекать медленно). Растут на среде Мак-
Конки и селективном агаре для сальмонелл и шигелл. На плотных федах образуют
колонии, напоминающие колонии энтеробактерии, но более мелкие. Оксидазо-,
каталазо- и уреазоположительны. Утилизируют цитрат на среде Симонса, гидроли¬
зуют эскулин, восстанавливают нитрат. Индол не образуют. Ochrobactrum anthropi
обладают сходными свойствами и могут бьггь дифференцированы по морфо¬
логии жгутиков и отсутствию способности ряда штаммов к гидролизу эскули¬
на. Эскулинположительные штаммы Ochrobactrum anthropi дифференцируют от
Achromobacter только по составу клеточных жирных кислот с помощью хромото-
графии. В связи с этим, с практической точки зрения, уместно говорить об условной
группе - Achromobacter и Ochrobactrum anthropi. Данные микроорганизмы могут
быть обнаружены в различных видах клинического материала, включая кровь.
Чувствительны к хлорамфениколу, ципрофлоксацину, гентамицину и тобрамицину.Acidovorax spp, — грамотрицательные подвижные палочки, требовательные к
питательным средам. Плохо растут или вообще не растут на среде Мак-Конки.
Ферментируют глюкозу, оксидазо- и каталазоположительны. Встречаются в почве.
Описаны случаи выделения из центрального венозного катетера (Л. delcfteïdii),
мочи, отделяемого раны (Л. temperans).Род Acinetobacter семейства Neisseriaceae объединяет неподвижные аспорогенные
короткие грамотрицательные палочки. В стационарную фазу роста и на неселек¬
тивных агаровых средах доминируют коккобактерии. Оксидазоотрицательны,
каталазоположительны. Это единственный оксидазоотрицательный род семейства
Neisseriaceae. Хорошо растут на простых питательных средах, образуя гладкие оваль¬
ные колонии, напоминающие колонии энтеробактерий, но меньшего размера.
рі*«ртїФР'І?а§к«!--382 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯДо недавнего времени в составе данного рода выделяли один вид — А. сакоа-
сейсыБ с несколькими биоварами. В настоящее время с помощью геносистемати-
ки род подразделен на 17 геновидов, часть из которых получила наименования
прежних биоваров, а часть осталась безымянной (табл. 21-22). Дифференциация
отдельных геновидов недоступна для практических лабораторий. В нашей стране,
согласно приказу М3 СССР № 535 от 22.04.1985 «Об унификации микробиоло¬
гических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-
диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений», преду¬
смотрена идентификация двух видов - А. сакоасеЫсиз и А. 1шо0И (табл. 21-23).Таблица 21-22. Геновиды рот АсШоЬас1егНомергеновида8/91011121314151617НаименованиеА. calcoaceticusА. ШтаппИА. haemoliticiisA.juniiА. johnsoniiА. IwofiiОкислениеглюкозы10095100526610033100100ОГемолиз100100100100100100Желати»100100100100100100100TeMneparsfpa роста, “С37100100100100100100100100100100891010075100411001009044100Таблица 21-23. Дифференциация бактерий Acinetobacter, согласно приказу Ns 535 М3 СССРпризнакА. calcoaceticusА. fwofiiОксидаза--Каталаза++Глюкоза+-Лактоза+10% лактоза+-Достаточно подробно изучена антигенная структура А. calcoaceticus — выявле¬
ны капсульные. К- и 0-антигены. По К-антигену различают 33 серологические
группы, по 0-антигену - 28 сероваров. Обнарз'жены сходные (перекрестнореаги-
рующие) антигены с некоторыми видами Moraxella, стрептококками групп В и С,
пневмококком типа 20, хламидиями. Описано 34 серовара А. ЬаитаппН и 26 серо¬
варов генетического вида 3. Однако на практике серотипирование данных микро¬
организмов не проводят.Acinetobacter spp. широко распространены в водоемах, сточных водах и почве.
Устойчивы в окружающей среде, способны выживать на сухой поверхности до
4 нед. Входят в состав микрофлоры тела человека, чаще колонизируя кожу между
пальцами ног и в паховой области (особенно у проживающих в жарком и влаж¬
ном климате), желудочно-кишечный тракт, уретру. Acinetobacter spp. могут быть
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ383причиной госпитальных инфекций. Часто вызывают пневмонии, особенно у
больных, находящихся на искусственной вентиляции легких, реже - первичные
бактериемии и септицемии, менингиты, эндокардиты, абсцессы головного мозга
и легких, эмпиему плевры, медиастиниты, урологические катетерные инфекции и
перитониты у диализных больных. В настоящее время особое внимание уделяют
А. ЬаитаппН. В основном это связано с раневыми инфекциями у пострадавших во
время боевых действий.Чувствительность отдельных штаммов Acinetobacter к антибактериальным
препаратам варьирует, но большинство из них подавляются гентамицином,
тобрамицином, амикацином и уреидопенициллинами, такими как пиперациллин.
Чувствительность к тетрациклинам непредсказуема, большинство штаммов устой¬
чивы к бензилпенициллину, ампициллину, цефалоспоринам, эритромицину и хло¬
рамфениколу. При тяжелых системных инфекциях следует применяют антибио¬
тики из группы аминогликозидов. При локализованных абсцессах, вызываемых
данными микроорганизмами, необходимо хирургическое лечение.В зарубежной литературе появились многочисленные сообщения о широ¬
ком распространении мультирезистентных штаммов А. ЬаитаппН. На 45-й
Междисплинарной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии
(ICAAC) эти штаммы получили название «грамотрицательные MRSA». Также
существует мнение, что инфицирование ран А. ЬаитаппН может способствовать
последующему развитию инфекции, обусловленной MRSA.Agrobacterium spp. — прямые или слегка изогнутые палочки. Расположены одиноч¬
но или попарно. Нетребовательны к питательным средам. Оксидазоположительны,
синтезируют уреазу, не образуют индол. Некоторые виды патогенны для расте¬
ний - вызывают опухолевые образования у растений. Вследствие способности
А. tumefaciens трансформировать растительные клетки данная бактерия активно
используется для привнесения генетического материала с целью генетической
модификации растений. А. radiobacter — единственный вид, который не вызывает
тканевых разрастаний на стеблях растений. В редких случаях эти бактерии способ¬
ны вызывать инфекции у пациентов с иммунодефицитом (особенно при наличии
постоянного катетера).Alcaligenes — короткие палочки или коккобактерии, перетрихий, спор и капсул
не образуют. Строгие аэробы, однако некоторые штаммы могут существовать в
анаэробных условиях в присутствии нитратов или нитритов. Продуцируют ката¬
лазу и оксидазу. Индол не образуют, углеводы не ферментируют. К питательным
средам нетребовательны, хорошо растут на простых средах, образуя колонии,
сходные с колониями энтеробактерий. Широко распространены в природе.
Встречаются в воде, почве, пищевых продуктах. Подразделяются на две группы —
несахаролитические и сахаролитические.Из числа несахаролитических видов наибольшее медицинское значение имеет
А. faecalis (фекальный щелочеобразователь). Входит в состав микрофлоры кишеч¬
ника. При посеве фекалий образует на дифференциальных питательных средах
лактозонегативные колонии, сходные с колониями патогенных энтеробактерий.
От последних А. faecalis легко отличить по росту на трехсахарном агаре, сопрово¬
ждаемом защелачиванием столбика и скошенной части среды.А,	odorans черезвычайно схож с А. faecalis, что заставляет некоторых авторов рас¬
ценивать его в качестве биовара, в связи с чем название микроорганизма часто заклю¬
чают в кавычки - «А. odorans^. Отличается от А. faecalis способностью к вьщелению
фруктового запаха при росте на плотных питательных средах и формированием зеле¬
ной зоны вокруг колоний при росте на кровяном агаре. К данной группе также при¬
надлежит А. denitr'fîcam. Эти микроорганизмы нередко обнаруживают в различных
видах исследуемого материала при септицемиях, инфекциях желче- и мочевыводя¬
щих путей. Однако чаще всего они являются случайными контаминантами.
384 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯIf*1к числу сахаролитических видов принадлежит Alcaligenes xylosoxidans subsp.
Ш xylosoxidans. Они способны ферментировать глюкозу и ксилозу, но не окисляют
мальтозу. Через сутки кзшьтивирования образуют на плотных средах очень мелкие
колонии, которые резко увеличиваются в размере через 48 ч вследствие продукции
слизи. Alcaligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidans рассматривают как относительно
частый этиологический агент при внутрибольничных септицемиях. Причина
больничных вспышек — инфузионные растворы, датчики давления и растворыантисептиков. Эти микроорганизмы обычно чувствительны к пиперациллину и
цефтазидиму и резистентны к аминогликозидам, ципрофлоксацину и цефепиму.Chryseomonas luteola — грамотрицательные, подвижные, оксидазоотрицатель-
ные палочки. Нетребовательны к питательным средам. Образуют гладкие или
шероховатые колонии, иногда колонии желтого цвета, прикрепленные к среде.
Трехсахарный агар при росте не изменяют. Широко распространены в окру¬
жающей среде. Часто могут быть вьщелены из различных объектов в стацио¬
нарах. Их связывают с инфицированием катетеров, сепсисом и перитонитом на
фоне перитониального диализа, а также возникновением смешанных инфекций.
Чувствительны к широкому кругу цефалоспоринов, аминогликозидов, тетраци¬
кл инов и хинолонов.Comamonas spp. — грамотрицательные палочки, подвижные благодаря поляр¬
но расположенным жгутикам. Обладают оксидазой активностью, редуцируют
нитраты, но без образования газообразных продуктов. Не продуцируют кислоту
из глюкозы и других углеводов (С acidovorans ферментирует фруктозу и маннит на
среде Хью-Лейфсона, чем отличается от прочих видов). С. acidovorans и С. testos-
teroni способны к росту на минеральной среде с ацетатом в качестве единственного
источника углерода. С. terrigena нуждаются в факторах роста — метионине и нико-
тинамиде. Сапрофиты, обитатели воды и почвы. Однако могут бьггь выделены из
пищевых продуктов, госпитальной среды, клинических образцов, но, как правило,
не имеют самостоятельного этиологического значения. Описаны отдельные слу¬
чаи септицемии, эндокардитов, внутрисосудистой инфекции, связанные с данны¬
ми микроорганизмами.Flavimonas oryzihabitans — грамотрицательные подвижные палочки. Нетре¬
бовательны к питательным средам. На плотных средах образуют колонии желтого
цвета. Трехсахарный агар при росте не изменяют. Оксидазоотрицательны. Эскулин
не гидролизуют. Нитрат, как правило, не восстанавливают. Возможно, имеют
этиологическое значение при ассоциированных с применением катетеров инфек¬
циях, перитонитах на фоне перитониального диализа. Чувствительны к широкому
кругу цефалоспоринов, аминогликозидов, тетрациклинов и хинолонов. Широко
распространены во внешней среде. Могут быть выделены из различных видов кли¬
нического материала, включая кровь, мочу и отделяемое слизистых оболочек глаз.
В условиях стационаров F. oryzihabitans связывают с инфицированием катетеров,
сепсисом и перитонитом на фоне перитониального диализа, а также возникнове¬
нием смешанных инфекций. Чувствительны к широкому кругу цефалоспоринов,
аминогликозидов, тетрациклинов и хинолонов,Flavobacterium/Chryseobacterium — таксономическое положение многих видов
микроорганизмов, входящих в состав семейства Flavobacteriaceae, в настоящее
время пересмотрено. Представители рода Flavobacterium, имеющие клиническое
значение, включены в состав нового рода, получившего название Chryseobacterium.
Наибольшее медицинское значение имеют виды С. meningosepticum и С, indologenes,
меньшее — С. balustinum, С. gleum, С. indoltheticum и С. scophthalmum.Chryseobacterium spp. — грамотрицательные, неподвижные, длинные, тонкие,
немного изогнутые палочки. Каталазо- и оксидазоположительны, гидролизуют
желатин и эскулин. Все штаммы Chryseobacterium spp. дают слабоположительную
реакцию на индол, в связи с чем для их выявления следует использовать метод
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 385Эрлиха как наиболее чувствительный. Chryseobacterium хорошо растут на про¬
стых питательных средах, кровяном и шоколадном агаре, образуя колонии уже
в течение 24 ч при температуре 35-37 °С, образуя желтый или оранжевый пиг¬
мент различной интенсивности. Колонии С. meningosepticum крупные (диаметром1-2 мм), с гладкой поверхностью, чаще имеют бледно-желтую окраску. Колонии
С. indologenes — насыщенного темно-желтого цвета. Способность к росту на средах
с желчью и желчными кислотами вариабельна. Гемолитическая активность раз¬
лична, При росте на трехсахарном агаре могут вызывать закисление среды через3-7 сут.Микроорганизмы рода Chryseobacterium широко распространены в окружающей
среде (их обнаруживают в почве, воде), а также в различных пищевых продуктах
(сыром мясе, молоке). В стационарах они контаминируют различные объекты и
поверхности. Присутствие Chryseobacterium в клиническом материале, как прави¬
ло, представляет собой колонизацию, а не инфекцию, однако они могут быть при¬
чиной инфекционного процесса, в первую очередь у ослабленных больных.Исключение составляет С. meningosepticum, вызывающий менингит у новорож¬
денных. преимущественно недоношенных детей, в первые 2 нед жизни. Описаны
нозокомиальные вспышки менингита у новорожденных, находящихся в отделе¬
ниях реанимации и интенсивной терапии. С. meningosepticum может вызывать у
взрослых бактериемию, которая чаще всего имеет транзиторный характер, однако
крайне редко у госпитализированных взрослых пациентов С. meningosepticum
может вызывать эндокардит (особенно у больных с протезированными клапана¬
ми), целлюлит, раневые и интраабдоминальные инфекции, эцдофтальмит, синусит
и бронхит.Chryseobacterium обладают природной устойчивостью к аминогликозидам,
пенициллинам, цефалоспоринам, карбазепамам, тетрациклину, хлорамфениколу,
чувствительны к ванкомицину, рифампицину, клиндамицину.Kingella — род, объединяющий короткие кокковидные палочки, расположенные
парами или в цепочках, неподвижные. Ферментируют глюкозу (к среде реко¬
мендуют добавить 1-2 капли кроличьей сыворотки на 3 мл среды). К. kingae, в
отличие от К. denitrißcans, также ферментируют мальтозу. Оксидазоположительны,
каталазоотрицательны. Требовательны к питательным средам. На кровяном агаре
К. kingae, как правило, дают гемолиз. К. denitrificans часто образуют ямки в агаре.
Кингеллы часто обнаруживают в мазках из зева. К. denitrificans клинического зна¬
чения не имеют. К kingae — условно патогенный микроорганизм, представляющий
опасность прежде всего для маленьких детей. Большинство штаммов чувствитель¬
ны к различным антибактериальным препаратам, включая бензилпенициллин.Moraxella, род семейства Neisseriaceae, — грамотрицательные палочко- или кок¬
ковидные неподвижные бактерии, расположены в мазках парами или короткими
цепочками. Отдельные ввды (Ai, catarrhalis) имеют фимбрии, что обеспечивает
«дергающую» подвижность. Все моракселлы образуют капсулу. На кровяном и
шоколадном агаре растут в виде очень мелких гладких или шероховатых колоний
с зоной гемолиза или без нее, Сахара не ферментируют, индол и сероводород не
образуют. Синтезируют каталазу и оксидазу. Для моракселл характерна высокая
чувствительность к ß-лактамам, за исключением М. catarrhalis, продуцирующих
ß-лактамазу. Межвидовая дифференциация моракселл достаточно сложна, тру¬
доемка и длительна (табл. 21-24). Бактерии рода Moraxella — представители нор¬
мальной микрофлоры слизистых оболочек верхних дыхательных путей человека
и некоторых животных, однако в ряде случаев могут быть причиной различных
заболеваний.М. catarrhalis вызывает гнойный отит, острые синуситы, хронические бронхиты,
внебольничные пневмонии. Микроорганизм часто выделяют из мокроты больных
с хронической обсгруктивной болезнью легких и рассматривают как одну из воз¬
ш386 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯможных причин его обострения. Описаны случаи менингитов и эндокардитов,
вызываемых М. catarrhalis.М. lacunata вызывает конъюнктивит наружных углов глаза (конъюнктивит
Коха-Уикса).Таблица 21-24. Свойства видов рода Moraxella, встречаемых у человекаВидУреаза
на среде
Кристен¬
сенаУтилизация
цитрата
на среде
СиммонсаФенил¬аланиндезами-назаЖелати-назаРедукциянитра¬товнитри¬товРост в
присут¬
ствии
5%
желчиГемолизм. lacunata-/+-1+М. Hncolnil-/+М. nonliquefaciensМ. phenylpyruvicaМ. osloensisМ. atlantaeМ. catarrhalis-/+Oligella - мелкие грамотрицательные кокковидные палочки. О. ureolytica под¬
вижна, О. urethralis неподвижна и плохо обесцвечивается при окраске по Граму.
Сахара не ферментируют. Оксидазо- и каталазоположительны. Гемолитическая
активность варьирует у разных штаммов. Oligella spp. выделяются из мочи и поло¬
вых органов, при этом Oligella ureolytica наиболее часто обнаруживают у мужчин
(предполагается участие этой бактерии в патогенезе уретритов).Род Pseudomonas объединяет грамотрицательные, подвижные, не образую¬
щие спор и капсул, оксидазо- и каталазопозитивные палочки. Аэробы, однако в
некоторых случаях способны использовать нитрат в качестве акцептора электро¬
нов и, следовательно, расти в анаэробных условиях. Большинство псевдомонад
нетребовательны к питательным средам и не нуждаются в органических факторах
роста. Некоторые виды — факультативные автотрофы, способные использовать в
качестве источника энергии водород и углекислый газ. Многие псевдомонады спо¬
собны к синтезу пигментов, из которых наиболее известен пиоцианин — пигмент
синегнойной палочки. Микроорганизмы данного рода чрезвычайно широко рас¬
пространены в природе. Многие из них — представители аутохтонной микрофло¬
ры почвы. Среди них встречаются бактерии, патогенные для растений, животных
и человека. Род Pseudomonas объединяет свыше 20 видов, многие из них способны
вызывать заболевания у людей. Однако наибольшее медицинское значение имеет
Р. aeruginosa — возбудитель синегнойной инфекции. Остальные псевдомонады,
которые могут бьггь выделены при различных формах патологических процессов,
принято называть необычными (см. ниже).Р, aeruginosa — грамотрицательная палочка с одним, реже двумя жгутиками,
расположена в мазках из чистой культуры одиночно, парами или короткими
цепочками. Капсула отсутствует, однако при определенных условиях культивиро¬
вания способна вырабатывать капсулоподобное вещество — внеклеточную слизь,
которая тонким слоем окружает микробную клетку. Из мокроты часто выделяют
мукоидные штаммы, образующие повышенное количество слизи независимо от
условий культивирования. Внеклеточная слизь — один из факторов патогенности
Р. aeruginosa. Как и многие псевдомонады, Р. aeruginosa по потребностям в пита¬
тельных веществах приближается к олигокарбофилам. Растет при минимальных
количествах органических веществ. Р. aeruginosa способна размножаться в раз¬
личных растворах медицинского назначения, а также длительно сохраняться
в некоторых видах антисептических растворов, например фурацилина. Однако
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 387синегнойная палочка высокочувствительна к высушиванию, действию высокой
температуры и хлорсодержащих дезинфектантов.Наиболее важная биологическая особенность Р. aeruginosa — способность к
продукции водорастворимого сине-зеленого пигмента — пиоцианина. Также пода¬
вляющее большинство штаммов Р. aeruginosa синтезируют флуоресцин — пигмент,
флюоресцирующий в ультрафиолетовых лучах. В отличие от пиоцианина способ¬
ностью к синтезу флуоресцина обладают и другие псевдомонады, что снижает диа- Щ
гностическую ценность данного признака. Отдельные штаммы Р. aeru^nosa могут Щ
вырабатывать и другие пигменты — красный (пиорубин), черный (пиомеланин),
желтый (а-оксифеназин) либо не синтезировать пигменты вообще. Отсутствие
пигмента, а также нетипичные пигменты резко затрудняют диагностику. Доля
беспигментных штаммов Р. aeruginosa составляет до 18%, атипичные пигменты
образуют 6-37% штаммов. Для усиления способности Р. aeruginosa к продукции
пигментов используют специальную питательную среду «Кинг А», в состав кото¬
рой входят пептон, глицерин, агар и минеральные соли. Некоторые штаммы синег¬
нойной палочки образуют на этой среде пигмент красного цвета. На поверхности
жидких питательных сред Р. aeruginosa образует серовато-серебристую пленку.На плотных средах синегнойная палочка образует колонии 5 типов:•	плоские колонии неправильной формы;•	ищерихиоподобные колонии;•	складчатые колонии («цветок маргаритки»);•	слизистые, редко дающие пигментацию при первичном выделении, образую¬
щие слизистый налет, со временем приобретающие зеленую окраску;•	карликовые, которые проявляются только через 18 ч.На среде Эндо Р. aeruginosa образует колонии бледно-розового цвета, небольших
размеров. На кровяном агаре ее колонии окружены зоной гемолиза. Очень часто
можно наблюдать феномен «радужного лизиса» культур, который характеризу¬
ется наличием нежного блестящего металлического налета и зон лизиса. Данный
феномен настолько специфичен для Р. aeruginosa, что его можно использовать
для ее идентификации. Отдельные штаммы отличаются друг от друга по виду зон
«радужного лизиса», что делает данный феномен полезным для внутривидового
типирования. Посевы синегнойной палочки имеют специфический запах, который
сравнивают с запахом земляничного мыла, жасмина или карамели.На селективном псевдомонадном агаре с иргазаном Р. aeruginosa образует в
первые 18 ч инкубации зеленоватые колонии, которые в последующем становятся
сине-зелеными.На агаровых средах с цетримидом (бромидом цетилтриметиламмония) усили¬
вается образование синегнойной палочкой пиоцианина, что облегчает идентифи¬
кацию ее колоний по желто-зеленому или синему цвету.Синегнойная палочка обладает низкой сахаролитической активностью, фер¬
ментируя только глюкозу. Протеолитическая активность, напротив, сильно выра¬
жена. Р. aeruginosa имеет сложную антигенную структуру, обладает О-антигеном, а
также жгутиковым Н-антигеном. В целях стандартизации методов серотипирова¬
ния была разработана международная схема, предусматривающая подразделение
Р. aeruginosa по 0-антигену на 17 серогрупп. Р. aeruginosa — один из основных воз¬
будителей гнойно-воспалительных процессов, особенно в условиях стационара.
Инфекции, вызываемые Р. aeruginosa, потенциально опаснее вызванных другими
условно патогенными бактериями. Они развиваются у пациентов с ожогами,
острым лейкозом, муковисцидозом, находящихся по разным причинам на искус¬
ственной вентиляции легких. Инфекция обычно локализуется в местах скопления
и застоя жидкости: в трахеостомах, нижних отделах легких, постоянных катетерах
мочевого пузыря, мокнущих ранах. Актуальна проблема колонизации Р. aeruginosa
сосудистых катетеров. При любой локализации первичного очага инфекции, обу-i-.-,
Mi
388ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯсловленной р. aeruginosa, возможно развитие бактериемии. Инфекции, вызванные
синегнойной палочкой, плохо поддаются лечению вследствие множественной ее
резистентности, передаваемой R-плазмидами.Необыгные псевдомонады. Отличаются от описанных выше тем, что могут вызы¬
вать инфекцию у людей только при значительном снижении уровня естественной
резистентности, к их числу относятся р.ßuorescens, р. stutzen и р. maltophilia.Клиническое значение Р, ßuorescens определяется двумя обстоятельствами —
способностью размножаться при температуре 4 "“С и колонизировать кожу здо¬
ровых людей. Возможна случайная контаминация Р. ßuorescens донорской крови.
При этом количество бактерий в крови будет увеличиваться, несмотря на хранение
в холодильнике, что может привести к токсическому шоку при гемотрансфузии.
Однако в большинстве случаев обнаружение Р, ßuorescens следует расценивать
как случайную контаминацию. Одновременное обнаружение в крови нескольких
пациентов R ßuorescens или Р. stützen может свидетельствовать о контаминаций
инъекционных растворов в стационаре.Р. stützen — редкая причина заболеваний человека. Описаны случаи обнару¬
жения этого микроорганизма при бактериемии у больных с иммунодефицитом,
пневмониях у алкоголиков и пациентов, находящихся на гемодиализе вследствие
контаминации им воды аппаратов.Р. maltophilia — вторая по распространенности, после синегнойной палочки,
псевдомонада. Встречается в воде, почве, на овощах. Яв.пяется частым контамина-
том дистиллированной воды и растворов, в том числе некоторых дезинфектантов.
В госпитальных условиях часто выделяется от больных на фоне антибиотикоте¬
рапии. Обычно ее обнаруживают при исследовании отделяемого из дыхательных
путей, влагалища, мочи, гноя, крови в ассоциации с другими микроорганизмами.
Считают, что патогенетическое значение Р. maltophilia сомнительно.К основным группам антибактериальных препаратов, обладающих клинически
значимой антипсевдомонадной активностью, относятся ß-лактамы, аминоглико-
зиды и фторхинолоны.Xantomonas (Stenotrophomonas) maltophilia. Систематическое положение данного
вида бактерий неоднократно подвергалось пересмотру. Первоначально он был
отнесен к роду Pseudomonas (Pseudomonas maltophilia). Позже его переместили в род
Xantomonas на основании данных ДНК-гибридизации. Однако из-за существенных
отличий в биологических свойствах (лофотрих, не имеющий желтого пигмента
ксантомонанедина, непатогенен для растений, растет при 37 "С) предложено
выделить его в отдельный род Stenotrophomonas. X. maltophilia — короткие прямые
палочки с полярным пучком жгутиков. Формируют большие гладкие колонии с
неровными краями. На плотной среде с тирозином образуют коричневый водо¬
растворимый пигмент, на кровяном агаре под зоной роста появляется зеленовато-
обесцвеченная зона. Рост большинства штаммов нуждается в метионине. Для изо¬
ляции X maltophilia применяют селективные среды с имепенемом.КАМПИЛОБАКТЕРЫТАКСОНОМИЯСемейство Campylobacteraceae объединяет е-протеобактерии двух родов:
Arcobacter и Campylobacter. Наиболее значимы в патологии человека термофиль¬
ные кампилобактеры — С. jejuni, С. coli и С. lari, входящие в состав последнего из
названных родов.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАКампилобактеры представляют собой тонкие, изогнутые (от легкого загиба до
спиралеобразной формы) грамотрицательные бациллы. Концы бактериальных
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 389клеток обычно утончены, в мазках культур они расположены одиночно, в цепоч¬
ках зигзагообразной или спиральной формы разной длины, а также парами в
форме буквы S или крыльев летящей чайки. При контакте с воздухом, воздействии
повышенной температуры и старении культур бактерии округляются. Размер бак¬
териальных клеток С. jejuni и С coli составляет 0,5-5,0 х 0,2-0,5 мкм. Они имеют Щ
на одном или обоих полюсах по жгутику, обеспечивающих им стремительное
перемещение в жидких средах по винтообразной траектории.	Щ.Кампилобактеры — микроаэрофилы и капнофилы. С, jejuni, С. соИ и С lari
относят к группе термофильных кампилобактеров, так как они лучше растут при
температуре 37-43 а при 25 °С их рост прекращается.ЭПИДЕМИОЛОГИЯПриродный резервуар термофильных кампилобактеров — различные живот¬
ные и птицы, в том числе сельскохозяйственные. Частота обнаружения С. jejuni у
кур колеблется от 70 до 100%, и в экономически развитых странах именно куры
рассматриваются как основной источник инфекции. В странах с низким уровнем
жизни на первом месте находится водный П5ггь передачи инфекции. Отсутствие
достоверной информации не позволяет сделать какие-либо выводы о характере
эпидемического процесса в России, но отмечается выраженная гиподиагностика
кампилобактериоза.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИИнфекция термофильных кампилобактеров наиболее часто проявляется у
человека колиэнтеритом. Непатогномоничность его симптоматики не позволя¬
ет поставить окончательный диагноз на основании результатов клинического
обследования пациента. В то же время некоторые симптомы являются безуслов¬
ным показанием к проведению целенаправленных исследований для выявления
данной группы микроорганизмов. К ним относится обнаружение крови и слизи
в фекалиях, то есть симптомы гемоколита. Обычно кампилобактериозный энте¬
роколит протекает благоприятно и заканчивается полным выздоровлением.
Генерализация процесса как одно из грозных осложнений встречается редко (как
правило, у детей и пожилых пациентов). У пациентов с ослабленным иммунитетом
инфекция может приобретать генерализованную форму и вызывать системные
клинические нарушения.Другой тип осложнений, регистрируемых при инфекциях термофильных кам¬
пилобактеров, — аутоиммунные процессы, в основном синдром Гийена-Барре
(прогрессирующий восходящий обратимый паралич, связанный с демиелиниза¬
цией нервных волокон).ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАОкончательный диагноз кампилобактериозов ставят на основании обнаруже¬
ния в клиническом материале возбудителя и/или его антигенов, а также участков
генома методами, которые описаны ниже. Серологическая диагностика при этих
инфекциях низкоэффективна.Сбор и транспортировка исследуемого материалаДля исследований в лабораторию направляют пробы фекалий, мазки и смывы
из прямой кишки пациента. Последние получают с помощью зонда-тампона.
Учитывая микроаэрофильность кампилобактеров и, следовательно, их низкую
выживаемость в присутствии кислорода, зонд-тампон с пробой необходимо
погружать в транспортную среду даже при непродолжительной транспорти¬
ровке, Наилучшей транспортной средой для кампилобактеров является среда
Кэри-Блэйра. Практически аналогичными свойствами обладают среды Стюарта
и Эймса. Тиогликолевая среда и 0,1% пептонная вода не являются транспортны-
390 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯми средами, поскольку содержат питательные вещества, которые могут привести
к нежелательному размножению контаминантов в процессе транспортировки и
сделать невозможным выделение кампилобактеров. Сторонники использования
тиогликолевой среды для транспортировки в качестве аргумента приводят данные
об эффективности Campylo thioglycollate medium, однако данная среда содержит
селективную добавку Блейзер-Вонг и предназначена для транспортировки и
последующего селективного обогащения кампилобактеров.Если материал доставляют в лабораторию в течение 2-4 ч, нативные фекалии
можно транспортировать в контейнере без консерванта.БактериоскопияБактериоскопический метод диагностики кампилобактериозного колиэнтерита
упоминается в различных руководствах, хотя его вряд ли можно рекомендовать
диагностическим лабораториям. Препараты, в которых кампилобактеры в иссле¬
дуемом материале находятся в виде чистой культуры, — скорее исключение, чем
правило.Обнаружение антигена хламидий в клиническом материалеДля обнаружения кампилобактеров в фекалиях можно использовать одноэтап¬
ные иммунохроматографические тесты (ИХТ). Хотя они не позволяют диффе¬
ренцировать выявляемые кампилобактеры на видовом уровне, их применяют для
скрининговых целей. Материалом для исследования служит суспензия фекалий.
Отрицательный результат ИХТ не исключает наличия у пациента кампилобакте-
риозной инфекции, для подтверждения этого необходимы дополнительные иссле¬
дования другими тестами.Изоляция и идентификация возбудителяДлительное время кампилобактеры относили к некультивируемым бактериям,
однако после определения оптимальных для них состава питательных сред и усло¬
вий культивирования бактериологический метод диагностики стал основным.Во многих зарубежных лабораториях на первом этапе бактериологического
исследования кампилобактериозов применяют обогатительные среды (Джефри,
Абейта-Ханта-Барка, обогатительный бульон с оксиразой, бульоны Болтона,
Весли, Пресли).Выделение чистой культуры проводят с использованием одного из трех мето¬
дических подходов:•	посева на селективные питательные среды;•	посева на неселективную потательную среду с помощью фильтров;•	подвижного роста на полужидкой питательной среде.Последний способ выделения чистой культуры не нашел широкого применения
при культивации кампилобактеров.Для ингибиции роста контаминантов в селективные среды добавляют цефо¬
перазон, цефалотин, цефазолин, эритромицин, колистин, бацитрацин, поли¬
миксин В, новобиоцин, колимицин, ванкомицин, рифампицин, амфотерицин В,
циклогексемид. Поскольку некоторые виды с. jejuni и с. соН проявляют высокую
чувствительность к цефалотину, колистину и полимиксину в, в предназначенные
для работы с ними среды эти антибиотики не добавляют. Создано несколько удач¬
ных селективных смесей, которые выпускаются микробиологическими фирмами
(табл. 21-25, 21-26).Селективные среды удобны в использовании, но не в одинаковой мере при¬
годны для разных кампилобактеров. Это делает актуальным, с одной стороны,
поиск новых селективных добавок, а с другой — развитие альтернативных методов
выделения кампилобактеров.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 391Альтернатива селективных сред — фильтрационная техника выделения. Описано
использование мембранных и ядерных фильтров с диаметром пор 0,45-0,55 мкм.
Мембранные фильтры хорошо работают при высоких концентрациях кампило¬
бактеров и резко уступают селективным средам по чувствительности при иссле¬
довании реконвалесцентов и пациентов с легкими и субклиническими формами
заболевания. Это связано с особенностями работы данных фильтров и их высокой
сорбционной способностью. Попытка повысить эффективность за счет увеличе¬
ния размера пор (до 0,65 мкм), как правило, сопровождается снижением селек¬
тивности и обильным ростом сопутствующей микрофлоры. Ядерные мембраны
лишены недостатков, присущих мембранным фильтрам. Они имеют стандартные
по диаметру короткие прямые поры, не обладают сорбционной способностью и
более эффективно фракционируют бактерии по размеру. Однако они могут сильно
электризоваться, что затрудняет работу с ними. Ядерные мембраны изготавли¬
ваются на заказ и поступают в виде полотна, которое в лаборатории необходимо
нарезать, упаковать и стерилизовать.Независимо от типа используемых фильтров технология посева одинакова. На
неселективную среду накладывают стерильный фильтр. На поверхность филь¬
тра стеклянной палочкой или пипеткой наносят капли суспензии исследуемого
материала в транспортной среде или стерильном 0,9% растворе натрия хлорида
(1:5-1:10). Через 30 мин фильтры аккуратно удаляют, не допуская попадания
исследуемого материала на питательнз^ю среду.Таблица 21-25. Свлективные добавки дпя кровяного агара для кампилобактеровДобавкаSklrrowBlaser-WangButzlerPrestonПолимиксин в, МЕ/л250025005000Колистин, МЕ/л10 000Цефалотин, мг/л15Цефазолин, мг/л15Ванкомицин, мг/л1010Бацитрацин, МЕ/л25 ОООРифампицин, мг/л10Триметоприм, мг/л10Амфотерицин в, мг/л1010Таблица 21-2Б. Селективные добавки дпя угольных сред для кампилобактеровДобавкаCCDACATKarmaliЦефоперазон, мг/л32832Тейкопланин, мг/л4Ванкомицин, мг/л20Амфотерицин В, мг/л101010В качестве ростовых сред применяют содержащие (например, среду Скирроу) и
не содержащие (среды Кармаля, Болтона и др.) кровь.Наиболее перспективны угольные среды, поскольку их применение позволяет
отказаться от использования дорогостоящей и дефицитной овечьей крови.Другая альтернатива кровяных сред - хромогенные среды, разработка которых
активно ведется многими фирмами.Оптимальная газовая среда для кампилобактеров содержит 5-7% кислорода,
10% углекислого газа и 83-85% азота. В некоторых руководствах рекоменд)тот
добавлять до 10% водорода, но для возбудителей кишечных форм кампилобак¬
териоза в этом нет необходимости. Для создания указанной атмосферы широко
т392ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯПрименяют газогенерирующие пакеты различных конструкций. В зарубежной
практике используются каталитические системы с гидроборидом натрия в каче¬
стве источника атомарного водорода, который затем соединяется с кислородом
воздуха на катализаторе, или бескаталитические сухие системы на основе аскор¬
биновой кислоты. Данные газогенераторы не нашли в нашей стране широкого
применения из-за их высокой стоимости. Отечественные газогенерирующие паке¬
ты, работающие по принципу пирогаллолового поглотителя, позволяют добиться
хорошего результата при существенно меньших затратах.Использование химических газогенераторов позволяет обойтись упрощенными
микроанаэростатами, не имеющими манометров и клапанов. Такие устройства
очень удобны в работе, они надежно и легко герметизируются, долговечны и зна¬
чительно дешевле классических анаэростатов.Температура инкубации зависит от поставленных задач и используемой среды.
Температура 37 “С теоретически позволяет выделить не только термофильные
кампилобактеры. С другой стороны, при температуре 42-43 "С достигается допол¬
нительный селективный эффект и упрощается последующая идентификация выде¬
ленных кампилобактеров. Инкубацию на среде Кармали следует проводить при
температуре 42 “С, в то время как на CCDA-arape кампилобактеры лучше растут
при температуре 37 °С. Обычно время инкубации составляет 48 ч, однако иногда
рекомендуют просматривать посевы первый раз через 24 ч. Такая тактика повы¬
шает стоимость исследования, поскольку требует использования дополнительного
газогенерирующего пакета.Кампилобактеры могут образовывать на плотных средах два типа колоний.
Нежные, влажные, неправильной формы крупные колонии, имеющие тенденцию
к слиянию и напоминающие капли конденсата, легко различимы даже на фоне
обильного роста сопутствующей микрофлоры. Они образованы типичными по
морфологии клетками кампилобактеров. Их обнаружение на специальной среде,
инкубируемой в специальных условиях, позволяет с очень большой долей вероят¬
ности уже на данном этапе говорить о выделении бактерий рода Campylobacter, а
если инкубация проводилась при 42 ""С — о термофильных кампилобактерах.Возможно образование и колоний другого типа. Мелкие, выпуклые правильной
округлой формы колонии образованы в основном кокковидной формой кампило¬
бактеров. В мазке можно обнаружить небольшое количество типичных по мор¬
фологии бактериальных клеток и сделать вывод о выделении кампилобактеров.
Как правило, закончить идентификацию в данном случае не удается, поскольку
невозможно провести субкультивирование таких штаммов.Для изучения морфологических свойств хорошо подходит окраска фуксином,
приготовленным из карболового фуксина Циля путем разведения его водой в
соотношении 1:3-1:5. Вместо окраски по Граму с успехом применяют КОН-тесг.
Иногда при обильном росте колоний прямо в чашке Петри с первичным посевом
можно поставить оксидазный и каталазный тесты общепринятым методом. Для
завершения идентификации необходимо пересеять культуру на неселективный
агар. Здесь предпочтительнее использовать кровяной агар (пусть даже с донорской
кровью), поскольку угольная среда не всегда пригодна для субкультивирования.
Например, гемин и пируват, входящие в состав среды Кармали, находятся не в
основе среды, а в селективной добавке. Лучше, если кровяной агар разлит и ско¬
шен в пробирках, однако приготовление скошенного кровяного агара не является
обычной лабораторной практикой и поэтому чаще пересев проводят на сектора
в чашке Петри (с этой целью удобно пользоваться полисекционными чашками).
Не рекомендуют делить чашку более чем на 6 секторов. Штрихи желательно рас¬
полагать близко друг к другу, чтобы по крайней мере в начале сектора получить
обильный сливной рост. После получения культуры можно продолжить иденти¬
фикацию. Поскольку в большинстве случаев первичные посевы инкубируются при
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 39342 “С, в температурном тесте нет необходимости. Ключевой идентификационный
тест — тест на гидролиз гиппурата. На нем необходимо остановиться подробно,
поскольку в последнее время был выпущен ряд документов, в которых выполне¬
ние данного теста описано неправильно.Для выполнения теста необходимо приготовить 1% раствор натрия гиппурата
в 0,9% растворе натрия хлорида. Полученный раствор разливают в пробирки по
0,4 мл. Пробирки закрывают пробками и замораживают в морозильной каме¬
ре бытового холодильника (-18 "С). Герметично закрытые пробирки можно
хранить до года. Большое значение имеет выбор пробирок. Это должны быть
узкие пробирки, очень удобно использовать полипропиленовые пробирки типа
«Эппендорф». По мере надобности пробирки размораживают и используют для
выполнения теста. Для этого в растворе гиппурата суспендируют испытуемую
культуру. Необходимо получить густую суспензию (как правило, достаточно
2 петель культуры). Пробирки помещают в термостат при температуре 37 '’С на 2 ч.
Пока идет инкубация, готовят проявляющий раствор нингидрина. По окончании
инкубации на суспензию бактерий в водном растворе гиппурата надо очень осто¬
рожно наслоить 0,2 мл нингидринового реактива. Верхний и нижний слой нельзя
перемешивать! Пробирки помещают в термостат и инкубируют в течение 10 мин.
В случае положительного результата наблюдается интенсивное фиолетовое окра¬
шивание верхней (неводной) фазы. Если окрашивания нет, результат оценивают
как отрицательный. При слабом окрашивании рекомендуют повторить тест,
увеличив плотность бактериальной суспензии. Окрашивание всего содержимого
пробирки свидетельствует об очень высокой активности фермента или о ложно¬
положительном результате реакции из-за перемешивания растворов. Для диффе¬
ренцировки данных вариантов рекомендуют после наслаивания нингидринового
реактива просматривать пробирки через 3, 5 и 10 мин. При ложноположительной
реакции окраска развивается сразу во всем объеме раствора, а при резко положи¬
тельном результате сначала появляется окраска в виде кольца и лишь затем это
кольцо, расширяясь, распространяется на весь объем раствора. Показания цветовой
реакции неспецифичны, поскольку нингидрин взаимодействует не только с глици¬
ном, продуктом расщепления гиппурата, но и с любой другой аминокислотой.Положительный тест с гиппуратом свидетельствует о выделении с. jejuni.
в случае отрицательного результата необходимо продолжить исследование для
дифференцировки гиппуратотрицательных термофильных кампилобактеров —
С. соН и С. îari. Для их идентификации используют тест гидролиза индоксилаце-
тата. Применяемое в прошлом определение устойчивости к налидиксовой кислоте
утратило свою актуальность из-за распространения резистентных к данному пре¬
парату штаммов С. соН.Таким образом, для идентификации термофильных кампилобактеров в боль¬
шинстве случаев достаточно всего нескольких простых тестов, доступных любой
лаборатории (табл. 21-27).Таблица 21-27. Дифференциация термофильных кампилобактеровТестыС. jejunfC. coliC.larissp. jejunissp. doyieiГидролиз гиппурата++--Устойчивость к налидиксовой кислотеsSSRRУстойчивость к цефалотинуSRSRГидролиз индоксилацетата+++-Используемые для идентификации кампилобактеров тесты основаны на выяв¬
лении конституциональных (пресинтезированных) ферментов. Это облегчает
идентификацию, поскольку не требует длительной инкубации.
вwmmШ.394ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯКоммерческие тест-системы для идентификации кампилобактеров не нашли
широкого применения. Api Campy — практически единственный пример таких
систем. Он состоит из двадцати микропробирок, собранных в стрип обычного для
систем Арі-формата. Стрип разделен на две части. Первая часть содержит обыч¬
ные тесты для определения ферментативной активности (уреаза, нитратредуктаза,
индоксил эстераза, гиппураза, гамма глютамил трансфераза, ТТХ-редуктаза, пиро-
лидонил ариламидаза, аргинин ариламидаза, аспартат ариламидаза, щелочная
фосфатаза, продукция сероводорода), вторая — ассимиляционные тесты и тесты
на резистентность (ассимиляция глюкозы, сукцината, ацетата, малата, пропиона-
та, цитрата, чувствительность к налидиксовой кислоте, цефалотину и эритромици¬
ну), Такой широкий спектр определяемых свойств позволяет надежно идентифи¬
цировать практически любую культуру кампилобактеров. Однако в большинстве
случаев получаемая информация избыточна, учитывая высокую стоимость тест-
системы, ее вряд ли можно рекомендовать практическим лабораториям.Экспресс-иммунодиагностикаСуществующие тест-системы, принцип действия которых основан на обнару¬
жении антигена кампилобактеров в исследуемом материале, можно разделить на
2 группы:•	тест-системы для ИФА в классическом формате;•	одноэтапные иммунохроматографические тесты.ИФА не нашел широкого применения из-за его невысокой чувствительности при
обнаружении антигена кампилобактеров в фекалиях. Иммунохроматографические
тест-системы также малоприменимы, когда необходимо прямое исследование
фекалий. Однако данные тест-системы очень хорошо зарекомендовали себя при
обнаружении антигена в среде обогащения и широко применяются в санитарно¬
бактериологических исследованиях пищевых продуктов.МолекулАрно-генетичесхая диагностикаВ последние годы в качестве ускоренного метода диагностики различных
инфекционных процессов все чаще рекомендуют использовать генетические мето¬
ды (ПЦР, NASBA). При расследовании вспышек данные методы могут оказаться
незаменимыми, в перспективе не исключается их применение в повседневной диа¬
гностической практике.Серологическая диагностикаМетоды серологической диагностики никогда широко не применялись при
диагностике кампилобактериозов. Основными препятствиями служат большое
антигенное разнообразие возбудителей, быстрое и доброкачественное течение
заболевания, отсутствие достоверного нарастания титров антител у значительной
части больных.Исполь.эуемые в серологической диагностике кампилобактериоза тест-системы
для ИФА или непрямой РИФ позволяют определять как общее содержание анти¬
тел, так и количество различных их классов (IgG, IgM, IgA). Поскольку основной
возбудитель компилобактериоза — С. jejuni, диагностические наборы рассчитаны
на обнаружение антител именно к данному возбудителю, реже — суммарно к
С. jejuni и С. СОІІ.ХЕЛИКОБАКТЕРЫТАКСОНОМИЯСогласно последней редакции руководства «Bergey^s Manual of Systematic
Bacteriology» (2009), семейство Campylobacteraceae, так же как и семейство
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 305Hdicobacteraceae, относится к е-протеобактериям. Семейство Helicobacteraceae
включает рода Helicobacter и WoUnella. Из всех видов рода Helicobacter только
H.pylorimvi^OKO распространен феди населения (хотя имеются отдельные сообще¬
ния о случаях инфекции у людей и других видов бактерий данного рода).Род Helicobacter включает 23 зарегистрированных биологических вида бакте¬
рий, в том числе Н. pylori. Наряду с официально признанными видами в различных
базах данных представлены еще десятки неклассифицированных штаммов, жду¬
щих определения своего места в систематике бактерий.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Н. PYLORIН. pylori — грамотрицательная бактерия, имеющая вид палочки слегка изо¬
гнутой, спиралевидной или S-образной формы, длиной до 3 мкм и диаметром
0,5“1,0 мкм. При электронной микроскопии наружная стенка выглядит гладкой.
Группа жгутиков (как правило, не больше 5) расположена на одном из концов
бактерии. Жгутики покрыты чехлом, имеют концевое утолщение (луковицу).
Наличие жгутиков обеспечивает подвижность Я, pylori в жидких и гелеобразных
средах. Наряду с палочковидной формой существует кокковая, которую микро¬
организм принимает при старении культуры, ее хранении и воздействии неблаго¬
приятных факторов внешней среды.ЭПИДЕМИОЛОГИЯИнфекция, вызванная Н. pylori, — одна из самых распространенных инфек¬
ций человека. Она вызывает развитие хронического гастрита, является важ¬
нейшим фактором патогенеза язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной
кишки, лимфомы желудка низкой степени злокачественности (мальтомы), а также
некардиального рака желудка. Уничтожение (эрадикация) Н. pylori приводит к
исчезновению воспалительного инфильтрата в слизистой оболочке желудка, зна¬
чительному снижению частоты рецидивов язвенной болезни желудка и двенадца¬
типерстной кишки, гистологической ремиссии мальтомы желудка и, возможно, к
существенному уменьшению риска возникновения рака желудка.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИЯ. pylori играет ключевую этиопатогенетическую роль при язвенной болезни
желудка и двенадцатиперстной кишки и хронических гастритах.Два заболевания внежелудочной локализации этиопатогенетически связаны с
Я. pylori — идиопатическая тромбоцитопения и железодефицитная анемия неяс¬
ной этиологии. При этих патологиях имеются показания к диагностике и эрадика¬
ции И, pylori (3-є Маастрихтское соглашение).Широко обсуждалась связь инфекции, вызванной Я pylori, с другими нозологиче¬
скими синдромами, однако она не доказана. Воспалительные заболевания кишечни¬
ка, аденома толстой кишки, вероятно, не связаны с инфицированием Я pylori.Пациенты с синдромом раздраженного кишечника, язвенным колитом и болез¬
нью Крона, как правило, реже инфицированы И. pylori по сравнению с общей
популяцией.Заболевания сердечно-сосудистой системы, реактивный артрит, ряд кожных
заболеваний (узловатое пруриго, крапивница, некоторые формы экземы) слабо
коррелируют с инфекцией, вызванной Я. pylori.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАНи один метод не является самостоятельным «золотым стандартом» для диа¬
гностики инфекции Я. pylori. Предлагают использовать сочетание выделения
чистой культуры Н. pylori и гистологического исследования биоптата слизистой
оболочки желудка, что соответствует рекомендациям Европейской рабочей груп¬
пы по исследованиям Я, pylori.
396ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯМетоды диагностики инфекции принято подразделять на инвазивные [требую¬
щие проведения эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС) с биопсией слизистой обо¬
лочки желудка или двенадцатиперстной кишки] и неинвазивные (не требующие
бипсии). По характеру исследования тесты могут быть сгруппированы следующим
образом.•	Определение микроорганизма, его генома или продуктов жизнедеятельности
в биоптатах слизистой оболочки и других материалах от больных:❖	бактериологическое исследование;<5^ гистологическое исследование;определение антигенов Я. pylori в фекалиях;^ быстрые уреазные тесты;
дыхательный уреазный тест;❖	ПЦР-детекция элементов генома Я. pylori.•	Серологическая диагностика — определение специфического иммунного
ответа:❖	определение антител в плазме крови;❖	иммуноблоттинг (выявление антител к CagA- и Vac А-антигенам Я. pylori)',
<> определение антител в выделениях и секретах (моче, слюне).Изоляция и идентификация возбудителяСамый достоверный метод лабораторной диагностики Я. pylori включает вьще-
ление и идентификацию возбудителя. Бактериологический метод позволяет не
только идентифицировать штамм Я, pylori, но и уточнить его чувствительность
к антибиотикам, что позволяет выбрать наиболее эффективную схему лечения
пациента. Это особенно важно в тех странах, где высока частота выявления
штаммов, резистентных к метронидазолу. Широкое применение метронидазола
для лечения язвенной болезни в России в качестве «препарата с репаративной
активностьюпривело к формированию крайне высокой резистентности Я, pylori
к данному препарату.Бактериологическому исследованию подлежат биоптаты слизистой оболочки
желудка и двенадцатиперстной кишки, а также материал, полученный во время
оперативных вмешательств по поводу язвенной болезни желудка и двенадцати¬
перстной кишки. Биоптаты берут во время эндоскопии в условиях строгой асепти¬
ки. Пробы резецированных органов берут сразу после операции в области тела и
антрального отдела желудка, луковицы двенадцатиперстной кишки. Биопсийный
материал помещают в пробирку типа «Эппендорф» со стерильным 20% раствором
глюкозы и хранят до отправки в холодильнике при 4 '’С. Необходимо следить за
тем, чтобы биоптат был полностью погружен в раствор глюкозы, так как прили¬
пание его к стенке пробирки может привести к потере жизнеспособности микроба,
в растворе глюкозы Я pylori сохраняет жизнеспособность в течение 3-4 ч, В тече¬
ние этого времени биопсийный материал должен быть доставлен в лабораторию
для посева.в качестве транспортных сред можно использовать 0,9% раствор NaCl, тиогли¬
колевую среду для контроля стерильности, транспортную сухую среду для кампи-
лобактерий. Важно помнить, что время транспортировки и обработки биопсийно-
го материала всегда ограничено и является серьезным фактором, лимитирующим
успешность выделения я. pylori.Биопсийный материал подлежит обработке и посеву сразу после доставки в
лабораторию. Наи лучшие результаты получают при посеве не позднее 2-4 ч после
взятия биоптата. При увеличении интервала времени между взятием материала и
посевом до 5-6 ч успешность выделения Я. pylori уменьшается в несколько раз.В стерильную фарфоровую ступку вносят 100-200 мкл стерильного 0,9% рас¬
твора NaCl; стерильной микробиологической петлей или пастеровской пипеткой
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 397переносят в ступку биоптат из пробирки с транспортной средой. Тщательно расти¬
рают биоптат пестиком, распределяют полученный гомогенат по имеющимся чаш¬
кам Петри и втирают в агар шпателем (тщательно, но не пересушивая). Остатки
биоптата переносят в пробирку с реактивом для определения уреазной активно¬
сти. Каждый биоптат высевают параллельно на две чашки Петри с питательной
средой, не содержащей и содержащей антибиотики соответственно. В первую из
упомянутых сред добавляют следующие антибиотики: ванкомицин (6 мкг/мл),
триметоприм (2 мкг/мл, в форме спиртового раствора) и амфотерицин В или
налидиксовую кислоту (2-10 мкг/мл).В качестве основы питательных сред для выделения и культивирования Н. pylori
используют колумбийский и сердечно-мозговой агар. Перед использованием в них
добавляют 5-7%, сыворотки или дефибринированную кровь лошади, а также 1%
раствор «IsoVitalex». Применение других питательных сред менее эффективно.Инкубацию посевов осуществляют в микроаэрофильных условиях при концен¬
трации кислорода около 5%. Для этих целей удобно использовать анаэростаты
системы «GasPaclOO» (вмещает до 12 пластмассовых чашек Петри однократного
применения) или «GasPaklSO» (вмещает до 36 чашек Петри). После загрузки анаэ¬
ростаты размещают в термостате при 37 ®С, оптимальной для роста Н. pylori.Срок формирования колоний при первичном высеве составляет 5-7 сут. На
кровяной питательной среде на 5-7-е сутки Я. pylori формирует мелкие, круглые,
гладкие, прозрачные, влажные колонии диаметром около 1 мм. При необходи¬
мости дальнейшего изучения первичные колонии пересевают на кровяной агар,
содержащий ростовые добавки и антибиотики, и инкубирз'^ют в микроаэрофиль¬
ных условиях в течение 4-6 сут при температуре 37 ®С. Колонии Я. pylori, полу¬
ченные в результате первичного посева биопсийного материала, используют для
приготовления мазков и окраски их по Г^аму, а также для выполнения уреазного,
оксидазного и каталазного тестов.Решение вопроса о принадлежности выделенной культуры к роду Helicobacter
выносят на основании характерной морфологии вьщеленных колоний, а также
микроскопии культуры в мазке, окрашенном по Граму, и наличия характерных
биохимических свойств (продукции уреазы, каталазы и оксидазы).Окрашенные по Граму мазки микроскопируют под иммерсией обычным спосо¬
бом. При микроскопии Я. pylori выглядят как тонкие, изогнутые, нежно-розовые
палочки. На 6-8-е сутки культивирования и при многократных пассажах мог)Т'
появиться признаки старения культуры — появляются менее изогнутые палочки,
кокковые формы.Тест на способность к продукции каталазы выполняют следующим образом:
материал агаровой культуры суспендируют в капле 3% раствора перекиси водоро¬
да на поверхности предметного стекла, через 3-5 с во взвеси каталазопозитивной
культуры происходит образование пузырьков газа. Положительным контролем
может служить суточная агаровая культура Е, соИ, отрицательным — любой стреп¬
тококк.Тест на способность к продукции цитохромоксидазы выполняют следующим
образом: каплю 1% водного раствора тетраметилпарафенилендиамина гидрох¬
лорида наносят на исследуемые колонии непосредственно на поверхности агара в
чашке Петри. Через 20-30 с оксидазопозитивные колонии окрашиваются в тем¬
ный цвет. Этот же тест можно выполнять на фильтровальной бумаге, на которую
петлей наносят агаровую культуру и сверху каплю реактива. Через 5-10 с пози¬
тивная культура приобретает пурпурную или черную окраску. Контролями служат
суточные агаровые культ}фы Е. coli (отрицательный контроль) и псевдомонад
(положительный контроль).Тест на присутствие уреазы в биоптате или в агаровой культуре выполняют с
помощью реактивов, содержащих мочевину и индикатор. В присутствии уреазы
щт398ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯпроисходит гидролиз мочевины до аммиака, pH среды сдвигается в щелочную сто¬
рону и при этом изменяется цвет индикатора. Стандартной средой для определе¬
ния уреазной активности является бульон с 2% мочевины по Кристенсену. На этой
питательной среде реакция становится положительной через 6-24 ч. Для ускоре¬
ния реакции предложен ряд модификаций: замена бульона фосфатным буфером,
увеличение содержания мочевины до 6%, использование в качестве основы гелео¬
бразных субстратов. Это позволяет сократить время исследования до 15-20 мин
у 75% больных с бактериологически документированным хеликобактериозом.
В остальных случаях реакция становится положительной в течение 4-18 ч. Более
поздние реакции рассматривают как сомнительные.Совпадение результатов бактериологического метода и уреазного теста
при исследовании биоптатов отмечают в подавляющем большинстве случаев.
Изменение цвета реактива при внесении живой культуры Н. pylori наступает
быстро — от 5-30 с до 3 мин в зависимости от количества взятых на исследование
колоний. Более медленно, как правило, в данном тесте реагируют кокки, протеи
и другие уреазоположительные бактерии, Уреазный тест с изучаемой культу¬
рой можно ставить в пробирках для микропроб типа «Эппендорф«» с крышками
объемом 1,5 см или в ячейках микропланшетов для иммунологических реакций.
При использовании пробирок типа «Эппендорф» крышки необходимо закрывать
сразу же после выполнения реакции, а ячейки планшетов для иммунологических
реакций заклеивают прозрачной клейкой лентой. Нельзя оставлять пробирки
открытыми и закрывать ячейки планшетов общей крышкой, так как в этом случае
аммиак, вьщеляющийся в воздух из материала положительной пробы, будет рас¬
творяться в жидкости соседних пробирок или ячеек, изменяя pH среды. В каждое
исследование включается контроль чистого реактива для оценки изменения его
цвета в течение срока учета уреазного теста.При ясной клинической картине, в случаях, когда морфология выделенных
колоний и результаты окрашивания мазков по Граму не вызывают сомнений, для
решения вопроса о принадлежности выделенной культуры к Я. pylori можно огра¬
ничиться только выполнением уреазного теста.Определение чувствительности к антибиотикамВопрос эрадикационной терапии инфекции, вызванной Я pylori, является
актуальным. Одна из основных причин неудач при эрадикации — резистентность
Я. pylori к применяемым антибактериальным препаратам. Описана резистент¬
ность Я. pylori ко всем группам антибиотиков, которые используются в схемах
противохеликобактерной терапии, - макролидам, производным нитроимидазола,
ß-лактамам, тетрациклинам и нитрофуранам. Основное внимание уделяется рези¬
стентности к кларитромицину как основному антибиотику, используемому для
эрадикации инфекции, вызванной Я. pylori. Согласно Маастрихтскому соглаше¬
нию, определение резистентности к кларитромицину рекомендуют, если устойчи¬
вость Н. pylori к данному антибиотику в популяции достигает 15-20%, а также при
неэффективности двух курсов эрадикации. Механизм развития резистентности
Я. pylori к кларитромицину заключается в точечных хромосомных мутациях, при¬
водящих к замене нуклеотидов в различных участках 23S рРНК, что приводит к
нарушению связывания антибиотика с клетками-мишенями. В настоящее время
описано более 20 мутаций, определяющих резистентность Н. pylori к кларитроми-
цину.При определении чувствительности к антибиотикам применяют классические
методы исследования чистой культуры я. pylori и молекулярно-биологические
методы. Бактериологические методы определения чувствительности к антибиоти¬
кам подразделяют на методы серийных разведений (в агаре или бульоне) и диффу¬
зионные (диско-диффузионный и метод Е-тестов). Методы серийных разведений
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ399и Е-тесты позволяют определить минимальн)то ингибирующую концентрацию
антибиотика. Наиболее прост и удобен в использовании диско-диффузионный
метод, который основан на регистрации диаметра зон подавления роста Я. pylori
вокруг бумажного диска с антибиотиком. Диско-диффузионный метод — полуко¬
личественный и позволяет подразделить штаммы Я. py/ori на три группы — чув¬
ствительные, слабочувствительные и устойчивые. Оценку результатов проводят
с использованием критериев, разработанных на основе корреляции значений
диаметров зон подавления роста и минимальной ингибирующей концентрации
антибиотика. Метод агаровых разведений и Е-тест имеют сходные результаты при
анализе чувствительности к различным антибиотикам, однако оба метода непри¬
годны для контроля резистентности штаммов Я. py/ori к метронидазолу. Только
метод определения чувствительности с помощью бумажных дисков оказался при¬
емлемым для исследования чувствительности к макролидам и метронидазолу.Молекулярные методы включают тесты, основанные на амплификации 23S
рРНК и гибридизации (FISH-анализ). Они позволяют быстро получить ответ,
однако имеют ряд недостатков. В ряде случаев были получены результаты, рас¬
ходящиеся с диско-диффузионным методом. Результаты молекулярного иссле¬
дования направлены на поиски именно той мутации, которая изучается в данной
работе. Полученные данные могут не отражать реальный уровень конкретных
мутаций, ответственных за возникновение резистентности. Оценивая чувствитель¬
ность Я py/ori к кларитромицину молекулярными методами, следует учитывать,
что не всегда существует прямая зависимость между выявленной мутацией, ответ¬
ственной за резистентность к кларитромицину, и фенотипическим проявлением
данной мутации-Дифференциальная диагностикаНаиболее важна дифференциация Я, pybri от С. Jejuni. Другие представители
рода Helicobacter крайне редко выделяются от человека. В отличие от кишечного
патогена С. jejuni, который способен расти при высоких концентрациях желчи (до
10%), Я. pylori чувствителен к желчи. Его размножение задерживается на несколь¬
ко логарифмов при наличии в составе питательной среды 0,5% желчи и полностью
прекращается при наличии 10% желчи. Я. pylori, как правило, не размножается
в присутствии 1% глицерина, его рост ингибируется при небольшом увеличении
концентрации NaCl (до 1,5%), большинство штаммов резистентны к хлориду три-
фенилтетрозолия в концентрациях до 1 мг/мл.Дифференциальные признаки Я. pylori, Я mustelea, С. jejuni представлены в
табл. 21-28.Таблица 21-28. Биохимические и культуральные характеристики Н. pylori, И. mustelea, С. jejuniСвойстваН. pyloriН. mustelaeС. jejuniОксидаза+++Каталаза+++Уреаза++-Гидролиз гиппурата--+Редукция нитратов-++Гаммаглютамилтранспептидаза++-Щелочная фосфатаза+f+Подвижность в бульоне+++Подвижность в агаре--+Рост в микроаэрофильных условиях при температуре 25 °С---Рост в микроаэрофильных условиях при температуре 30-37 °С+++Рост в микроаэрофильных условиях при температуре 42 °С-++
400ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯОкончание табл. 21-28СвойстваН. pyloriИ. mustelaeС. jejuniРост при содержании в атмосфере 10% угпекислого газаРост в анаэробных условияхТолерантность к 3,5% раствору натрия хлоридаТолерантность к 0,5% глицинаТолерантность к 1% глицинаТолерантность к 1% желчиЧувствительность к налидиксовой кислотеЧувствительность к цефалотинуЧувствительность к метронидазолуГистологическое исследованиеМетод гистологического исследования биоптатов широко применяют для диа¬
гностики заболеваний желудочно-кишечного тракта. Открытие Я. pylori значи¬
тельно увеличило количество ЭГДС с гистологическим исследованием слизистой
оболочки желудка во всем мире. При комплексной морфологической оценке
гистологической картины патолог может определить наличие Я. pylori на поверх¬
ности эпителиального слоя, в подслизистом пространстве и слизи, основываясь
на типичной морфологии данного микроорганизма. Успех диагностики во многом
зависит от правильного выполнения биопсии. Одиночный образец, взятый на рас¬
стоянии 2-3 см от привратника в области малой кривизны, обеспечивает чувстви¬
тельность определения я. pylori не менее 90%, два образца (из слизистой оболочки
антрального отдела и тела желудка) значительно повышают точность результата,
4 биоптата делают ее практически 100%.Гистологическое исследование — субъективный метод, что может приводить к
ошибкам при выявлении и идентификации Я. pylori. Однако опытные патологи,
используя шкалу оценок, предусмотренную усовершенствованной Сиднейской
классификацией гастритов, достигают специфичности определения Я. pylori на
уровне 95-98%,Существующие методы окраски тканевых срезов по Бартину-Старри, Еимзе,
Генте обеспечивают примерно равные результаты по чувствительности и специ¬
фичности определения я. pylori. Достаточно широко применяют иммуногисто-
химический метод обработки срезов со специфическими мечеными антителами к
Я. pylori. Его предлагают считать «золотым стандартом» диагностики инфекции,
вызванной Я. pylori. Однако в сравнительных исследованиях показано, что более
простые методы окраски, в частности модифицированная окраска по Гимзе, мало
уступают иммуногистохимическому методу, более практичны и доступны.Иммунологическая экспресс-диагностикаМетодом ИФА с использованием поликлональных антител к Я. pylori можно
выявлять антигены Я. pylori в фекалиях. Его чувствительность в долечебный
период, по обобщенным данным клинических центров мира, составляет 92,4%,
специфичность — 91,9%, а в постэрадикационный период наблюдения за пациен¬
тами — 88,8 и 94,5% соответственно. Этот метод применяют как для первичной
диагностики инфекции, вызванной Я. pylori, так и для контроля эрадикации.Б настоящее время выпускается несколько тест-систем, основанных на прин¬
ципах ИФА и иммунохроматографии. В этих тест-системах использованы моно¬
клональные антитела к Я. pylori, сорбированные на твердой фазе, что позволило
гювысить чувствительность и в еще большей степени специфичность.При диагностике этими тест-системами инфекции, вызванной Я. pylori у паци¬
ентов с атрофическим гастритом, получают результаты, сопоставимые с сероло¬
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 401гическим и гистологическим исследованиями, однако по чувствительности они
уступают уреазному дыхательному тесту.iC числу факторов, снижающих чувствительность экспресс-методов иммуно¬
логической диагностики инфекции, относятся кровотечение из верхних отделов
желудочно-кишечного тракта, прием ингибиторов протонного насоса, антибио-
тикотерапия, атрофия и метаплазия слизистой оболочки желудка.Ускоренные уреазные тестыЭкстраординарная активность уреазы Н. py/ori послужила основанием для
разработки быстрого и селективного определения этой бактерии в биоптатах.
Принцип метода заключается в том, что выделяемая микробом уреаза расщепляет
мочевину, которая содержится в смеси реагентов, куда помещают биоптат; выде¬
ляющийся при этом аммиак сдвигает pH среды в щелочную сторону и изменяет
цвет индикатора (фенолового красного). Существует много коммерческих наборов
для быстрого уреазного теста. Чувствительность и специфичность уреазного теста
ощутимо различны в до- и постэрадикационный период. До лечения чувстви¬
тельность достигает 80-95% (ложноотрицательные ответы составляют 5-20%),
специфичность — 95-100% (ложноположительные ответы составляют 0-5%).После курса эрадикации Я, py/ori чувствительность уреазного теста явно недо¬
статочна для обнаружения остаточной инфекции. Именно поэтому уреазный тест
непригоден для документирования факта эрадикации возбудителя.Другое ограничение применения уреазного теста — состояние ахлоргидрии и
прием антисекреторных препаратов. В данных условиях тест ндостаточно чувстви¬
телен вследствие подавления активности уреазы Я pylori в среде с высоким pH.Третье серьезное ограничение для использования уреазного теста — кровотече¬
ние из верхних отделов желудочно-кишечного тракта, при котором чувствитель¬
ность теста резко снижается. Кровотечение мало влияет на точность дыхательного
уреазного теста с мочевиной, меченной изотопом.Чувствительность уреазного теста снижается (как и бактериологического и
гистологического методов и дыхательного уреазного теста) при распространенной
атрофии и метаплазии слизистой оболочки желудка из-за сокращения или полно¬
го прекращения колонизации Я. pylori.Несмотря на наличие нескольких коммерческих вариантов уреазного теста,
многие лаборатории готовят реактивы для его выполнения самостоятельно.
Наиболее прост в приготовлении и удобен для работы с Я pylori реактив следую¬
щего состава: мочевина — 2 г, 0,5% раствор феноловый красный — 10 мл, 0,01 М
фосфатный буферный раствор (pH = 6,0) — до конечного объема 100 мл. Реактив
хранят при температуре 4-8 “С в темноте (в посуде из темного стекла) не более2	нед. Для ускорения реакции концентрация мочевины может быть увеличена до6	г. Цвет реактива должен быть темно-желтым.Перед исследованием реактив по 3-5 капель разливают в пробирки для микро¬
проб или ячейки планшета для иммунологических реакций, затем туда помещают
биоптаты или бактериологической петлей вносят выделенные культуры Я. pylori.
Учет реакции проводят в течение 18 ч. Реакция идет при комнатной температуре,
причем каждая пробирка или ячейка должны быть закрь[ты во избежание выхода
образующегося аммиака в окружающую среду и растворения его в соседних про¬
бах.Тесты, основанные на определении уреазы, особенно полезны в тех случаях,
когда требуется быстрый метод диагностики инфекции, вызванной Я pylori.
В настоящее время зфеазный тест — один из самых дешевых и простых. С помо¬
щью уреазных тестов обычно удается идентифицировать до 75-80% Я pylori-
позитивных больных. Таким пациентам при необходимости можно назначить
лечение в течение 1 ч после проведения ЭГДС.
<í402 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯуреазный дыхательный тестУреазный дыхательный тест (Urea Breath Test — UBT) основан на регистра¬
ции активности фермента уреазы Н. pylori. В норме ткани желудка не содержат
уреазы. Пациент принимает внутрь слабый раствор или таблетку уреазы (75-
100 мг), меченной изотопом углерода или При наличии Н. pylorí бакте¬
риальная уреаза расщепляет мочевину до аммиака и углекислого газа, которые
всасываются в кровь, углерод выводится с выдыхаемым воздухом, в котором
регистрируют наличие изотопа углерода или ^'^С, Радиоактивный изотоп
применяют все реже, так как существуют ограничения даже для малых доз
радиоактивного излучения в послеоперационном периоде, во время беременно¬
сти. при детском возрасте пациентов, а также во время приема антисекреторных
препаратов. Изотоп лишен радиоактивности и определяется методом масс-
спектрографии, который широко используется в зарубежных исследованиях
в целях эпидемиологической и клинической диагностики благодаря высокой
точности. Чувствительность и специфичность уреазного дыхательного теста
достигают 95%.На чувствительности уреазного дыхательного теста отрицательно сказывает¬
ся любое лечение, подавляющее или ограничивающее рост Я. pylori. Результаты
существенно занижаются и могут быть ложноотрицательными при применении
ингибиторов протонного насоса. Именно поэтому необходимо прекратить прием
антисекреторньЕХ препаратов как минимум за 2 нед до теста. Распространенная
метаплазия и атрофия слизистой оболочки желудка при далеко зашедшей инфек¬
ции, вызванной К pylori, снижают чувствительность уреазного дыхательного теста,
как и других методов, основанных на определении микроорганизма и продуктов
его жизнедеятельности. Кровотечение из верхних отделов желудочно-кишечного
тракта не влияет на результаты уреазного дыхательного теста.Эмпирически было установлено, что прием лимонной кислоты перед тестом
повышает выделение меченого углекислого газа с выдыхаемым воздухом.
Показано, что тот же эффект дает прием яблочного сока и стандартного раство¬
ра соляной кислоты с pH = 3,0 (умеренно кислая среда оптимизирует активность
уреазы). Помимо ложноотрицательных, могут регистрироваться и ложноположи¬
тельные результаты из-за наличия сопутствующей микрофлоры. Такие ситуации
редки, однако они возможны при уреазоположительной микрофлоре в полости
рта и ротоглотке, Именно поэтому рекомендуют тщательное полоскание рта
и горла перед проведением ^-^С-дыхательного теста. Коммерческие препараты
‘^С-мочевины в последние годы стали изготовлять в дозированных упаковках —
капсулах или в виде инкапсулированных таблеток. Это способствует стандартиза¬
ции теста и воспроизводимости его результатов.Молекулярная диагностикаМетоды молекулярной биологии все шире внедряются в клиническую практику,
успешно конкурируя с бактериологической диагностикой Я. pylori. Биологический
материал для проведения ПЦР — биоптаты слизистой оболочки желудка или
двенадцатиперстной кишки, фекалии, слюна, зубной налет и желудочный сок
(последние 4 вида патологического материала непригодны для бактериологиче¬
ского исследования).Тесты, основанные на ПЦР, высокочувствительны и способны определять от 10
до 100 клеток Я. pylori. Объект детекции — участки уникальных генов Я. pylori —
cagA, vacA Ъ ген уреазы. ПЦР позволяет в относительно короткий срок установить
факт инфицированности пациента и установить генотип штаммов Я. pylori —
CagA+ или CagA- для принятия решения о тактике лечения, а также сделать
выводы о прогнозе заболевания. Процесс канцерогенеза наиболее интенсивно
происходит при инфицировании Я. pylori с генотипом sl/ml VacA. Разработаны
ilЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 403модификации ПЦР для прямого определения cagA- и vacA-генов К pylori в образ¬
цах биопсийного материала, а также в образцах, залитых парафином.Генотипирование с помощью ПЦР дает возможность типировать и диффе¬
ренцировать штаммы Н. pylori, что позволяет осуществить их эпидемиологи¬
ческое изучение, отличать случаи реинфицирования от рецидива инфекции.
Разработанный недавно метод FRET-ПЦР {Fluorescence Resonance Energy Tranter)
позволяет обнаруживать H. pylori в желудочных биоптатах и фекалиях с чувстви¬
тельностью и специфичностью до 98%. Модификация данного теста использована
для прямого определения резистентности я. pylori к кларитромицину в образцах
биопсийного материала.Серологическая диагностикаДлительное персистирование Я, pylori в организме человека приводит к нако¬
плению специфических антител, которые могут быть выявлены с помощью
многих серологических тестов, наиболее часто применяют ИФА. Долгое время
серологическим методам диагностики инфекции, вызванной Я. pylori, придавали
ограниченное значение, основная сфера их применения - эпидемиологические
исследования и массовый скрининг. Однако классический ИФА для выявления
в плазме крови больных специфических антихеликобактерных иммуноглобули¬
нов (IgG, IgM, IgA) совершенствуется и его чувствительность и специфичность
в настоящее время достигают 80-90%. Результатом этого стало более широкое
использование ИФА для первичной диагностики инфекции, вызванной Я. pylori.
К недостаткам данного метода можно отнести 1-2-суточный интервал между
моментом взятия крови у пациента для исследования и временем получения
ответа, а также отсутствие возможности контролировать результаты лечения
сразу же после его окончания, так как в случае эрадикации Я. pylori необходим
определенный (достаточно длительный) промежуток времени, в течение которого
концентрация специфических антихеликобактерных иммуноглобулинов в плазме
крови достоверно снизится. Можно говорить о своеобразной «инерционности»
гуморального звена иммунной системы, когда возбудителя в организме уже нет,
а специфические антитела к нему в крови обнаруживают в диагностически зна¬
чимом титре. Оптимальный вариант исследования в таком случае — сравнение
титров специфических антихеликобактерных антител до лечения и через 2-3 мес
после его окончания. Однако при первичной диагностике инфекции, вызванной
Я. pylori, при положительном результате серологического теста и ясной клини¬
ческой ситуации (эндоскопически выявленная язвенная болезнь желудка или
двенадцатиперстной кишки, эрозивный гастрит) информативно и однократное
исследование.Ложноотрицательные результаты серологических тестов могут быть обусловле¬
ны отсутствием иммунологической компетентности (больные, в организме которых
не синтезируются антитела к антигенам Я pylorí), ранней стадией инфицирования
или недостаточной чувствительностью используемого серологического теста.Твердофазный ИФА — наиболее распространенный метод серологической диа¬
гностики инфекции, вызванной Я. pylori, — неинвазивный, простой, чувствитель¬
ный и специфичный тест.в практических целях чаще всего при проведении ИФА в качестве антигенов
используют суммарную смесь антигенов Я pylori, но есть и специализированные
варианты ИФА для определения антител к CagA-белку, VacA-цитотоксину, уреазе
Я. pylori. Наиболее широко применяется метод определения IgG антител к CagA-
белку.Обнаружение антител к Я. pylori свидетельствует об инфицированности дан¬
ным возбудителем и может указывать на хронический гастрит типа В, язвенную
болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки. Серопозитивны до 95% взрослых
404 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯбольных с хеликобактерной инфекцией (у детей данный показатель ниже, поэто¬
му серологический метод ограниченно применим при обследовании пациентов
детского возраста). Напряженность иммунного ответа, как правило, коррелирует с
массивностью обсеменения слизистой оболочки желудка Н. pylori и патоморфоло¬
гической картиной процесса. Имеется корреляция и с клиническими проявления¬
ми патологии, однако она менее выражена. Одно из преимуществ серологических
тестов — возможность выявления факта инфицирования не только при манифест¬
ных, но и при субклинических формах, а также в стадии ремиссии заболевания.
Целесообразность применения серологических тестов для первичного обследова¬
ния больных или проведения скрининга (сероэпидемиологических исследований)
не вызывает сомнений. Однако лечение инфекции, вызванной Н. pylori, не следует
назначать только на основании данных серологической диагностики, рекоменду¬
ют проведение ЭГДС для уточнения диагноза, в том числе и у детей.Ограничения при оценке показателей серологических тестов:•	тесты положительны у новорожденных вследствие трансплацентарной пере¬
дачи антител, хотя ребенок может быть и не инфицирован Я. pylori (серопо-
зитивность сохраняется приблизительно до 6-месячного возраста);•	тесты остаются положительными в течение 2-6 мес после санации (эрадика¬
ции возбудителя и при достоверном отсутствии его в тканях по результатам
бактериологического исследования);•	тесты отрицательны на ранних стадиях инфекции (до 60-го дня после зара¬
жения), пока гуморальный ответ еще не развился.Иммуноблоттинг. Западный блоттинг использовали при создании наборов
реагентов для детекции антител к CagA- и VacA-белкам К pylori (Recombinant
ImmunoBlot Assay — RIBA, Western Blot, Helicoblot и др.). Методы сочетают электро¬
форетическое разделение антигенов Я. pylori и последующую встречную преципита¬
цию в геле с антителами исследуемой сыворотки. Коммерческие тест-системы для
иммуноблоттинга обеспе^чивают более высокую точность диагностики инфекции,
вызванной Я. pylori, по сравнению с обычным ИФА. Частота выявления Я pylori у
больных достигает 97,5%, Особенно ощутимы преимущества иммуноблоттинга в
случаях ретроспективной диагностики инфекции, вызванной Я, pylori, у больных с
отрицательным результатом стандартного ИФА - при атрофическом гастрите, раке
желудка в ассоциации с гастритом и раке желудка без признаков гастрита.Определение антител в слюне, моче и капле крови. В некоторых зарубеж¬
ных странах разработаны и выпускаются ИФА-тест-системы для определения
антител к Я pylori в слюне, моче и капле крови. Сообщения об информативности
данных тестов крайне противоречивы, их использование в клинической практике
не рекомендовано Маастрихтскими соглашениями по лечению инфекции, вызван¬
ной Я pylori.КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ
Первичная диагностика (доэрадикационный период)Международный (Маастрихтский) консенсус по лечению инфекции, вызванной
Я. pylo?i, определил «строго рекомендуемые» показания к антихеликобактерной
терапии:•	язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки (как в фазе обостре¬
ния, так и ремиссии), включая осложненную язвенную болезнь;•	MALT-лимфома;•	атрофический гастрит;•	состояние после резекции желудка по поводу рака;•	наличие родственников первой степени родства с диагностированным раком
желудка;•	желание пациентов (после подробной консультации лечащего врача).
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ405В 3-м Маастрихтском соглашении указывается на необходимость дифференци¬
рованного подхода к эрадикационной терапии при неисследованной и исследован¬
ной диспепсии. Пациентам с неисследованной диспепсией рекомендуют стратегию
«test-and-treat» («выявить и лечить»). Пациентам с инфекцией, вызванной Н,pylori,
и исследованной неязвенной (функциональной) диспепсией также рекомендуют
эрадикацию Я. pylori. Подчеркивается, что «test-and-treat» — стратегия выбора у
всех взрослых пациентов с функциональной диспепсией в популяции с высокой
распространенностью Я. pylori, в то время как эффективность данной стратегии
при низкой распространенности Я. pylori (<20%) невысока. В таких случаях пред¬
почтение отдают более дешевой эмпирической антисекреторной терапии.Назначению эрадикационной терапии должно предшествовать лабораторное
подтверждение инфицирования Я pylori. У пациентов с эндоскопически выяв¬
ленной патологией или с известным диагнозом заболеваний, ассоциированных с
Я. pylori (язвенной болезни, карциномой, лимфомой), берут биоптаты слизистой
оболочки с последующим лабораторным исследованием с применением гисто¬
логического и бактериологического методов, а также быстрого уреазного теста.
Допускается, что положительный результат быстрого уреазного теста с биоптатом
может быть основанием для начальной терапии инфекции, вызванной Я. pylori,
даже при отсутствии предыдущего тестирования неинвазивными методами.Неинвазивные тесты выполняют в тех случаях, когда биопсию не проводили,
но они могут быть использованы и в дополнение к гистологическому, бактериоло¬
гическому исследованиям биоптата при возможностях лаборатории или при кли¬
нических показаниях. Взгляды относительно приемлемых неинвазивных тестов
диагностики инфекции, вызванной Я. pylori, претерпели значительные изменения
с момента выхода 1-го Маастрихтского соглашения. В соглашении 1996 г. для
первичной диагностики инфекции, вызванной Я. pylori, были рекомендованы
дыхательный уреазный тест и определение IgG в плазме крови с помощью ИФА
(ELISA). Тесты с каплей цельной крови отклонены, как малочувствительные.
Во 2-м Маастрихтском соглашении (2000) внесены существенные коррективы,
которые сохраняют свое значение и сегодня. Подтверждена строгая рекомендация
использовать дыхательный уреазный тест, а в качестве альтернативного метода
рекомендуют тест на выявление антигенов Я. pylori в фекалиях. ELISA-тест на
антитела Я. pylori в плазме крови, с поправками на его недостаточную чувстви¬
тельность, рекомендован для стран с высокой распространенностью Я, pylori.
В 3-м Маастрихтском соглашении (2005) регламентируются следующие специаль¬
ные случаи, когда необходимо серологическое исследование: кровоточащая язва,
атрофия слизистой оболочки желудка, лимфома MALT-типа и лечение ингибито¬
рами протонного насоса и антибиотиками. В этих случаях частично ингибирована
жизнедеятельность Н.pylori или же инфекция самокупирована, и основные тесты —
дыхательный уреазный тест и тест на выявление антигенов Я. pylori в фекалиях —
часто дают ложноотрицательные результаты. Тесты на антитела в слюне и моче
неприемлемы для первичной диагностики инфекции, вызванной Я. pylori.Постэрадикационный периодРекомендации о проведении специфической диагностики инфекции, вызванной
Я. pylori, в постэрадикационном периоде были выработаны после серьезных дис¬
куссий. Во 2-м Маастрихтском соглашении введено положение о целесообразно¬
сти контроля эрадикации в постэрадикационном периоде. Это было обусловлено
накоплением данных о нередких случаях неэффективности лечебных схем с после¬
дующими рецидивами основного заболевания.В качестве контрольных тестов на наличие инфекции, вызванной Я. pylori, в
постэрадикационном периоде Маастрихтские соглашения рекомендуют два мето¬
да — дыхательный уреазный тест или тест на антигены Я. pylori в фекалиях, осно-
406 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯванный на определении моноклональных антител. Специально оговаривается, что
серологические тесты неприемлемы для контроля излеченности пациентов от инфек¬
ции, вызванной Н. pylori. Это обусловлено длительной циркуляцией специфических
Щ| антител даже после полной ликвидации инфекционного процесса в организме.Контрольные тесты — дыхательный тест или тест на антигены в фекалиях —
мог>т быть проведены не ранее чем через 4 нед после прекращения эрадикацион-
ного лечения. Как минимум за 1 нед до выполнения тестов должны быть отменены
антисекреторные препараты.При выполнении ЭГДС л о клиническим показаниям в постэрадикационном
периоде и в любом случае при осложненной язвенной болезни, раке желудка, лим¬
фоме MALT-типа, локальной резекции раннего рака желудка рекомендуют взятие
биоптатов слизистой оболочки из антральной части и тела желудка и выполнение
гистологического и бактериологического исследований для выявления Я, pylori.В 3-м Маастрихтском соглашении (2005) контроль антибиотикорезистентности
Я. pylori в постэрадикационном периоде рекомендуют при отс>тствии эффекта
после двух курсов антибиотикотерапии. Рекомендации Маастрихтских соглаше¬
ний по поводу специфической диагностики инфекции, вызванной Я. pylori, дают
хорошую основу для стандартизации подходов, но в то же время требуют клини¬
ческого мышления и рациональных решений при различной патологии.II. ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ
СТАФИЛОКОККИТАКСОНОМИЯСогласно второму изданию «Руководства по систематической бактериологии
(Берги) [cBergey’s Manual of Systematic Bacteriology» (2009)], род Staphylococcus
исключен из семейства Micrococcaceae и вместе с родамиJeotgalicoccus, Macrococcus
и SaUnicoccüs выделен в новое семейство — Staphylococcaceae, в котором к стафило-
коккам относятся 32 вида и 12 из них имеют подвиды.В медицинской микробиологии стафилококки принято подразделять на две
большие группы — коагулазоположительные и коагулазоотрицательные. Первая
группа имеет наибольшее медицинское значение.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАСтафилококки — неподвижные грамположительные кокки, которые вследствие
деления в нескольких плоскостях в мазках расположены в виде беспорядочных
скоплений, иногда напоминающих виноградные грозди. Спор не образуют, но
MOiyr образовывать капсулы in vitro и in vivo. Подавляющее большинство стафило*
кокков — факультативные анаэробы, за исключением S. saccharolyticus и S. aureus
subsp, anaerobius.Стафилококки — хемоорганотрофы, каталазоположительны, содержат цитох-
ромы, но обычно оксидазоотрицательны. Облатют выраженной биохимической
активностью — восстанавливают нитраты до нитритов или газообразного азота,
гидролизуют белки, гиппурат, жиры, твины, расщепляют большое количество
углеводов в аэробных условиях с образованием уксусной кислоты и незначитель-
ных количеств СО^. Однако эскулин и крахмал, как правило, не гидрол11зуют,
индол не образуют. Стафилококки лизируются под действием лизостафина, но
устойчивы к лизоциму.Температурный оптимум — 30-37 °С, но могут расти в широком температур¬
ном диапазоне — от 6,5 до 45 °С при pH = 4,2-9,3 и в присутствии 40% желчи.
шшЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 407Стафилококки нетребовательны к питательным средам, обладают галотолерант-
ностью и хорошо растут в присутствии 5-10% раствора NaCl, что широко исполь¬
зуется при целенаправленном их выявлении в различных видах материалов от
больных и из объектов внешней среды.ЭПИДЕМИОЛОГИЯСтафилококки широко распространены в окружающей среде: их постоянно
обнаруживают на предметах обихода, в воздухе и воде, в составе нормальной
микрофлоры кожи и слизистых оболочек, в фекалиях людей и ряда животных.
На поверхности кожи и слизистых оболочек человека встречается до 15 видов
стафилококков (в том числе 5, aureus), локализованных более чем в 20 биотопах,
основными из которых считают слизистую оболочку нижних носовых ходов, зева,
кожу подмышечных впадин и паховой области. Количество видов, имеющих меди¬
цинское значение, несколько больше, так как причиной заболеваний в ряде слу¬
чаев являются стафилококки, паразитирующие у животных. К числу таких видов
относят S. schleifen и S. intermedius, которые обнаруживают у хищных животных и
могут вызывать инфекции у человека при укусах. Виды, встречаемые у травоядных
животных, — S. hyicus, S. chromogenes, S. sciuri, S. lentus, S. vitulus, S. caseolyticus —
выявляют в молочных и мясных продуктах.Особое значение имеют стафилококки, и особенно S. aureus, как возбудите¬
ли внутрибольничных инфекций. Эпидемиологическая ситуация осложняется
широким распространением в стационарах и появлением во внебольничной среде
клинических изолятов S. aureus, которые способны вызывать разнообразные кли¬
нические формы внутрибольничных инфекций, включая бактериемию, внутри¬
больничную пневмонию, синдром септического шока, септический артрит, остео¬
миелит, требующие длительного и дорогостоящего лечения. S. aureus используют
при санитарно-микробиологических исследованиях для оценки биологической
безопасности многих объектов окружающей среды — воздуха, воды, почвы, пище¬
вых продуктов, фармацевтической и косметической продукции.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИКоагулазоположительные стафилококки. Золотистый стафилококк,
5, aureus, традиционно относят к числу патогенных микроорганизмов. Тем не
менее данный вид чрезвычайно широко распространен в популяции людей и
может быть обнаружен у 15-30% здоровых лиц. Особенно часто выявляют у пер¬
сонала медицинских учреждений.S. aureus вызывает у человека различные виды гнойно-септических инфекций
(ГСИ): кожные гнойничковые и раневые инфекции, сепсис, эндокардиты, вне¬
больничные пневмонии, артриты, остеомиелиты, перитониты, инфекции моче¬
выводящих путей. Многообразие клинических форм обусловлено наличием у ста¬
филококков различных факторов вирулентности, таких как токсины, в том числе
гемолизины, ферменты, факторы адгезии и защиты от фагоцитоза. Клинические
проявления ГСИ обычно неспецифичны, диагноз следует подтверждать бакте¬
риологическим исследованием материала от больных и при необходимости из
объектов окружающей среды в целях выделения и идентификации чистой куль¬
туры возбудителя. Кроме ГСИ, S. aureus может вызывать особые нозологические
формы, обусловленные главным образом наличием у данного вида экзотоксинов:
синдромы «ошпаренной кожи» и «ошпаренных младенцев», пищевые токсикоин¬
фекции (ПТИ), синдром токсического шока (СТШ).Синдром «ошпаренных младенцев» (болезнь Риттера фон Риттерштайна,
эпидемическая пузырчатка новорожденных) возникает у младенцев, инфициро¬
ванных штаммами, продуцирующими токсины — эксфолиатины А и В. Это осо¬
бые экзотоксины белковой природы, обладающие узконаправленным действием
408 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯна десмосомы клеточных мембран, которыми клетки скреплены друг с другом.
Заболевание высококонтагиозно и может приводить к летальному исходу.Синдром «ошпаренной кожи», описанный у детей старшего возраста и взрос¬
лых, также характеризуется эритемой, образованием пузырей и общей интокси¬
кацией организма.СТШ обусловлен штаммами 5. aureus, продуцирующими особый экзотоксин
(TSST-1), д«еханизм действия которого основан на стимуляции Т-лимфоцитов,
усилении продукции ФНО и ИЛ-1. СТШ встречается, в первую очередь, у молодых
женщин, использующих определенные типы влагалищных тампонов с высокой
сорбционной способностью. Однако описаны случаи данного заболевания у жен¬
щин вне менструаций и у мужчин, например, при тампонаде раны.ПТИ связаны с действием стафилококковых энтеротоксинов — экзотоксинов
белковой природы, которые по антигенным свойствам подразделяются на 6 серо¬
варов. Одно из важнейших свойств энтеротоксинов стафилококков — термоста¬
бильность (устойчивость к воздействию температуры 100 ®С), особенно экзоток¬
синов в и с. Несмотря на описанные в литературе многочисленные биологические
эффекты энтеротоксинов, механизм их действия остается неизвестным.Особая форма инфекционного процесса — носительство S. aureus на слизистой
оболочке носа и зева, которое у персонала лечебных учреждений может явиться
причиной внутрибольничного инфицирования пациентов.Коагу.чазоотрицательные стафилококки вызывают инфекционные заболева¬
ния значительно реже. S epidermidis может быть причиной сепсиса, эндокардитов,
артритов, глазных инфекций и инфекций мочевыводящих путей. Данные микро¬
организмы вызывают значительную часть кардиоваскулярных инфекций, связан¬
ных с длительной установкой внутривенных катетеров и операциями на открытом
сердце, а также перитонитов в отделениях перитониального диализа.S. saprophyticus, являясь представителем нормальной микрофлоры кожи и
слизистых оболочек человека, имеет этиологическое значение при заболеваниях
мочевыводящих путей, особенно у молодых, сексуально активных женщин, и
негонококковых уретритов и простатитов у мужчин. Описаны случаи раневых
инфекций и сепсиса, вызванных S. saprophyticus.S. haemolyticus может вызывать эндокардиты, перитониты, септицемии, инфек¬
ции мочевыводящих путей и раневые инфекции.Существуют данные о возможной этиологической значимости при различных
патологических состояниях S, hominis, S. wameri, S. capitis, S. simulans, S. cohnii,
S. xylosus, S. saccharolyticus, S. lugdunensis, S. schleiferi, как правило, на фоне иммуно¬
дефицита различной природы и выраженности.MRSA- и MRSE-ассоциированные инфекции могут начинаться на фоне лечения
антибактериальными препаратами, в том числе аминогликозидами и цефалоспо-
ринами, а неадекватная антибиотикотерапия при тяжелых внутрибольничных
инфекциях значительно ухудшает прогноз заболевания. Природа резистент¬
ности к антибиотикам пенициллинового ряда выяснена неокончательно, но,
по-видимому, связана с изменениями, возникающими в специфических пени-
циллинсвязывающих белках клеточной стенки стафилококков. Резистентные
стафилококки, обладая всеми характерными морфологическими, культураль¬
ными, физиологическими и биохимическими свойствами вида, имеют свои био¬
логические особенности.•	Уникальный биохимический механизм резистентности обеспечивает устой¬
чивость ко всем полусинтетическим пенициллинам и цефалоспоринам.•	Такие штаммы способны «аккумулировать» гены антибиотикорезистентно¬
сти и именно поэтому нередко обладают устойчивостью к нескольким клас¬
сам антибактериальных препаратов одновременно, тем самым значительно
затрудняя лечение пациентов.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 409Чаще всего препаратом выбора в таких сл)^аях является ванкомицин, однако в
последние годы появились сообщения о ванкомицинрезисгентных штаммах сна¬
чала среди S. haemolyticus, а затем среди S. epidermidis.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАИсследование на стафилококки включает:•	прямую микроскопию биоматериала;•	посев материала на питательные среды и выделение чистой культуры;•	идентификацию выделенных микроорганизмов по морфологическим, тин¬
кториальным, культуральным и биохимическим признакам (определение
рода и вида);•	внутривидовое типирование по антигенным свойствам или лизабельности
типовыми стафилококковыми бактериофагами;•	выявление носительства S. aureus',•	иммунологическую или биологическую индикацию стафилококковых экзо¬
токсинов;•	определение чувствительности/резистентности к антимикробным препара¬
там и выявление метициллинрезистентных штаммов.МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕБактериоскопическим методом исследуют СМЖ, аспират из суставов, отделяе¬
мое из ран, абсцессов. Следует помнить, что при титре стафилококков в материале
менее 10^-10'^ КОЕ/мл данный метод неприемлем.Изоляция стафилококковСтафилококки нетребовательны к питательным средам и могут культивиро¬
ваться на большинстве питательных сред общего назначения, используемых при
посеве клинического материала. Для выделения этих микроорганизмов разрабо¬
тан ряд специальных элективных и элективно-дифференциальных питательных
сред. В качестве элективного фактора в составе питательных сред для стафилокок¬
ков используют гипертонический раствор NaCl. Примеры таких сред — солевой
агар и солевой бульон,Желточно-солевой агар используют для выделения стафилококков чаще других
элективно-дифференциальных сред. Для ее приготовления в расплавленный и
остуженный до 45-50 °С 10% солевой агар вносят желточную взвесь. Желточную
взвесь чаще всего готовят в лабораториях путем смешивания 1 желтка куриного
яйца, взятого в асептических условиях, с 200 мл стерильного 0,9% раствора NaCl
и взбалтывания содержимого с соблюдением правил асептики. Колонии микро¬
организмов, обладающих лецитовителлазой активностью, на данной питательной
среде окружены зоной опалесценции — «радужного венчика».Молочно-солевой и молочно-желточно-солевой агары позволяют выявить про-
теолитическую активность стафилококков.Солевой агар с маннитом, широко используемый за рубежом, содержит 7,5%
раствор NaCl, маннит и феноловый красный. Коагулазопозитивные стафилококки
образуют на данной среде колонии, окруженные желтой зоной, коагулазонегатив-
ные — красной или пурпурной.Стафилококковая среда № 110 — элективно-дифференциальная среда, содер¬
жащая 7,5% раствор NaCl, желатин, маннит, лактозу и индикатор pH. Колонии
коагулазопозитивных стафилококков на данной среде желтого цвета, окружены
зоной разжижения желатина.Среда Байрда-Паркера содержит хлорид лития и глицин в сочетании с теллу¬
ритом натрия, а также эмульсию куриного желтка в качестве дифференциального
фактора. Данная питательная среда высокоспецифична для изоляции коагулазо-
410ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯПОЗИТИВНЫХ стафилококков из пищевых продуктов и, в отличие от многих других
сред, обеспечивает выделение стафилококков в течение 24 ч.Бульон Джилотти-Сантони предназначен для выделения S. aureus из пищевых
продуктов. Содержит факторы роста (пируват натрия и маннит) и элективные
добавки (хлорид лития и глицин в сочетании с теллуритом натрия). Для предупре¬
ждения роста микрококков на поверхность среды после посева наливают масло.Агар Кранера — высокоэлективная питательная среда для выделения стафи¬
лококков из пищевых продуктов. Содержит элективные факторы — тиоционат
натрия, маннит, лития хлорид, актидион и азид натрия.Солевой агар с маннитом обеспечивает селективную изоляцию S. aureus за счет
высокого (7,5%) содержания в этой среде натрия хлорида.На неселективных питательных средах стафилококки в течение 24 ч инку¬
бации образуют колонии диаметром 1-3 мм, а при продолжении инкубации до3	сут — диаметром до 3-8 мм. У пигментообразующих видов колонии могут быть
окрашены в золотистый, кремовый или желтый цвет. Наиболее интенсивно пиг-
ментообразование проявляется на питательных средах, обогащенных белками
(молочном, желточном, сывороточном агарах). Пигмент стафилококков нераство¬
рим в воде, поэтому окрашивается только сама колония, а не среда вокруг нее.Идентификация стафилококковНа практике идентификация вьщеленных стафилококков, как правило, сводит¬
ся к дифференциации трех видов — S. aureus, S. epidermidis и 5. saprophyticus, при
этом сначала первый вид дифференцируют от двух оставшихся, а затем прово¬
дят дифференцировку коагулазоотрицательных стафилококков. На практике для
дифференциации стафилококков используют небольшое количество признаков —
пигмент, лецитовителлазу, плазмокоагулазу, ДНКазу, ферментацию или окисление
маннита, фосфатазу. Схема идентификации представлена на рис. 21-2.Указанная схема идентификации в подавляющем большинстве случаев вполне
удовлетворяет потребностям лечащих врачей, однако носит несколько условный
характер. При необходимости более точной видовой дифференциации следует
использовать дополнительные тесты и ключи, преимущественно в соответствии
с «руководством по систематической бактериологии (Берги) [«Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology» (2009)].Выделение из патологического материала коагулазоотрицательных стафило¬
кокков не может являться безусловным основанием для признания их этиоло¬
гической значимости. В пользу этиологической роли данных микроорганизмов
свидетельствуют:Коагулаза (+),
лецитовителлаза и/или пигмент (+)S. aureusАКоагулаза {+),
лецитовителлаза и пигмент (-)Коагулаза (-),
лецитовителлаза и/или пигмент (+)N.Маннит анаэробно
или
ДНКаза[+1НКоагулаза (-),
лецитовителлаза и/или пигмент {-)Тесты на:-► устойчивость к навобиоцину.фосфатазу и окисление маннитаРис. 21-2. Схема идентификации S. aureus.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ411•	выделение чистой культуры микроорганизма (для случайной контаминации
более характерны смешанные культуры);*	повторное выделение тех же штаммов или их комбинации в течение заболе¬
вания.Тесты, используемые для доказательства принадлежности к роду Staphylococcus,
представлены в табл. 21-29.Таблица 21-29. Дифференциация грамположительных аэробных и факультативно-анаэробных
кокковпризнак! Staphyiococeas Sbeptococcus MmocoecasРасположение клетокГруппы, парыПодвижностьКаталазаРост в присутствии 10%
раствора натрия хлоридаАнаэробная фермента¬
ция маннитаАэробная фермёнтамия
глицеринаЦепочки, парыNDNDГруппы, тетрадыStomatocoecusГруппы, иногда пары.
обычно в капсулахNDПримечание«+» - 90% положительных по данному свойству штаммов.•«-» - 90% отрицательных по данному свойству штаммов.•«ds> - 11-89% положительных по данному свойству штаммов.«ND» — тест не имеет значения для дифференциации вида.Для внутривидовой дифференциации стафилококков используют несколько
тестов, из которых наиболее актуальный — коагулазный. Данное исследование —
ключевое при идентификаций стафилококков в практических лабораториях. Для
выявления плазмокоагулазы могут быть использованы два метода: пробирочный
тест, с помощью которого выявляют свободную плазмокоагулазу, и тест на стекле,
с помощью которого определяют клампинг-фактор (слайд-тест). Данные тесты
неодинаковы по своему значению. При идентификации S. aureus пробирочный тест
следует расценивать как окончательный, а слайд-тест — как быстрый ориентировоч¬
ный. Слайд-тест рекомендуют использовать при идентификации новых видов ста¬
филококков S. lugdunensis и S. schleiferi, которые не обладают свободной коагулазой.Для определения плазмокоагулазы используют пробирочную реакцию плаз-
мокоагуляции. Для ее выполнения необходима цитратная лиофилизированная
кроличья плазма, которую перед использованием разводят согласно указаниям
на этикетке. Для выполнения реакции одну петлю агаровой культуры суспенди¬
руют в небольшом количестве плазмы и инкубируют пробирки в термостате при
температуре 37 °С. Учет реакции проводят через 1,2,4 и 18 ч. Появление сгустка
в течение первых 4 ч расценивается как положительный результат, отсутствие в
течение 18 ч — как отрицательный. В качестве контролей используют тест с заве¬
домо положительной культурой и пробирку с неинокулированной плазмой.Выявление связанной коагулазы (клампинг-фактора) проводят в основном с
помощью нагрузочных реакций, наборы для которых выпускают многие фирмы-
производители. Преимущество данных реакций — быстрота получения ответа,
однако отрицательный результат не является полностью достоверным, так как
лишь 97% штаммов продуцируют одновременно свободную и связанную коагула-
зу. Для повышения достоверности отрицательного результата используют особые
комбинированные тесты. Также могут наблюдаться ложноположительные резуль¬
таты при тестировании культур, выращенных на питательных средах, содержащих
гипертонический раствор NaCl.шшт
412ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ«Термостабильная нуклеаза (ДНКаза) — фермент, расщепляющий фосфодиэ-
фирные связи как РНК, так и ДНК. Учет ДНКазной активности проводят на плот¬
ной питательной среде с добавлением высокополимерной ДНК. Вокруг колоний
штаммов, продуцирующих ДНКазу, наблюдается просветление феды.Для оценки способности ферментировать маннит в анаэробных условиях при¬
меняют предварительно регенерированную среду Хью-Лейфсона под слоем вазе¬
линового масла; наблюдение за посевами ведут в течение 5 дней.Ферментацию маннита в аэробных условиях (окисление) определяют на плот¬
ной питательной среде с индикатором ВР или среде Хью-Лейфсона, содержащих
1% маннита, через 24 ч инкубации при 37 “С. На ферментацию маннита указывает
появление желтого окрашивания вокруг колонии.Тест на фосфатазу основан на изменении окраски какого-либо фосфорорга-
нического соединения под действием данного фермента. Реагенты, чаще всего
динатриевую соль паранитрофенилфосфата или фенолфталеинфосфат, вводят в
состав питательного агара, на поверхность которого в виде бляшек или штрихов
засевают испытуемые культуры. При использовании соли паранитрофенилфос¬
фата непосредственно после инкубации вокруг колонии появляется интенсив¬
ное желтое окрашивание. При добавлении фенолфталеинфосфата дополнитель¬
но используют раствор аммиака, который приводит к розовому окрашиванию
колоний.В настоящее время широко представлены наборы для биохимической иден¬
тификации стафилококков, позволяющие одновременно дифференцировать
выделенные культуры от других грамположительных кокков, например такие,
как СТАФИ-тесты 16 и 24 («Эрба-Лахема»). Набор содержит стрипованные
панели с высушенными питательными средами и субстратами для 16 или 24
биохимических тестов и позволяет провести идентификацию при визуальном
или фотометрическом считывании. Системы дополнены ускоренными тестами
для определения продукции ацетоина, пирролидонилариламидазы и выявле¬
ния цитохромоксидазы в виде диагностических полосок. После инкубации при
температуре 37 “С в течение 24 ч инокулированных стрипов СТАФИ-теста 16 и
добавления реактивов проводят учет результатов по цветовой таблице интер¬
претации. При использовании СТАФИ-теста 24 добавления реактивов после
инкубации не требуется. При окончательной идентификации следует учитывать
всю дополнительную информацию: данные микроскопии, характер колоний,
наличие пигмента, гемолиз.Интерпретация результатов биохимической дифференцировки коагулазополо-
жительных и наиболее значимых коагулазоотрицательных стафилококков пред¬
ставлена в табл. 21-30, 21-31.Внутривидовое типирование стафилококков проводят по антигенным свой¬
ствам или фаготипированию типовыми стафилококковыми бактериофагами.
Типирование по антигенным свойствам можно проводить с помощью реакции
агглютинации, однако ни одна из предложенных к настоящему времени схем не
получила широкого распространения, что связано главным образом с трудностью
приготовления типовых адсорбированных сывороток и отсутствием единого под¬
хода к принципу серотипирования и способам его осуществления.Фаготипирование — наиболее доступный и широко используемый метод вну¬
тривидового типирования S. aureus. Фаготипирование стафилококков имеет свои
особенности:•	штаммы стафилококков, как правило, лизируются несколькими фагами,
поэтому термин «фаготип» означает штамм, взаимодействующий с одним
или несколькими типовыми фагами;•	стафилококки, выделенные в различных географических широтах, значи¬
тельно лучше типируются так называемыми местными фагами;
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ413•	стафилококки, выделенные от людей и животных, различаются по фаготи-
пам, поэтому существуют особые наборы фагов применительно к стафило¬
коккам, полученным из разных источников.В нашей стране для фаготипирования S. aureus используют Международный
набор из 23 типовых стафилококковых фагов, выпускаемый Инсгитутом эпиде¬
миологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, который следует дополнять бакте¬
риофагами из местных коллекций.Мазок или смыв из передних отделов носа и зева засевают на желточно¬
сывороточный агар, после инкубации проводят количественный учет и идентифи¬
кацию 5. aureus. Выделенные штаммы фаготипируют для определения категории
носительства.Для выделения чистой культуры стафилококка с персистентными свойствами
предлагают использовать элективную питательную среду с фузидином и изучать
наиболее информативные признаки — антилизоцимную, антиинтерфероновую и
антикомплементарную активность. Описана методика балльной оценки получен¬
ных результатов с помощью диагностической модели по формуле дискриминант¬
ной функции. Представленный метод и способы диагностики стафилококкового
носительства позволяют провести однократное исследование и повысить эффек¬
тивность диагностики на 15-20%.Выявление носительства S. aureus у медицинского персонала не является обя¬
зательным, однако данное исследование регламентируется как один из разделов
микробиологического мониторинга возбудителей внутрибольничных инфекций.Обнаружение стафилококковых экзотоксиновДиагностика СТШ основана на выявлении TSST-1 токсина с помощью РИА,
ИФА или реакции латекс-агглютинации. Стафилококковый энтеротоксин выявля¬
ют одним из двух методов — биологическим или иммунологическим.Биологический метод определения энтеротоксинов основан на заражении котят4-8-недельного возраста. Взрослые кошки, а также щенки менее восприимчивы.
Биопробу на котятах проводят путем скармливания подозрительного продукта
или 5-суточной молочной культуры 2-3 котятам натощак или реже на взрослых
кошках путем внутривенного введения водного экстракта питательного агара, на
котором в течение 48 ч выращивалась испытуемая культура. При положительном
результате через 0,5-5 ч наблюдается возникновение рвоты.Иммунологические методы выявления энтеротоксинов и предложенные для
этого реакции преципитации, РНГА используют для качественного определения
стафилококковых энтеротоксинов в продовольственном сырье и пищевых продук¬
тах животного происхождения. Твердофазовый ИФА имеет предел обнаружения
стафилококковых энтеротоксинов в диапазоне массовых концентраций от 0,2 до
2 мкг/кг (в зависимости от типа энтеротоксина и вида продукта), это ниже уровня
стафилококкового энтеротоксина типа А, чаще всего обусловливающего развитие
ПТИ у человека. Метод позволяет обнаруживать стафилококковые энтеротоксины
типа А или Б при раздельном определении, а также энтеротоксины типов А, В, С, D
и Е при одновременном определении с помощью различных наборов реагентов.Определение чувствительности к антимикробным препаратамПроводят методом стандартных дисков. При оценке чувствительности выде¬
ленных штаммов стафилококков в первую очередь необходимо тестировать пре¬
параты, имеющие основное клиническое значение, — ß-лактамы, макролиды,
фторхинолоны, аминогликозиды и ванкомицин.Препараты выбора для лечения стафилококковых инфекций — ß-лактамные
антибиотики. Определение чувствительности к ß-лактамам должно включать
выполнение двух тестов:
414 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ•	определение чувствительности к бензилпенициллину или выявление продук¬
ции ß-лактамаз (пенициллиназ);•	определение чувствительности к оксациллину или выявление ПСБ2а или
кодирующего его гена тесА.При интерпретации результатов следует принимать во внимание, что;•	штаммы стафилококков, лишенные механизмов резистентности, чувстви¬
тельны ко всем ß-лактамным антибиотикам;•	ß-лактамазы стафилококков способны гидролизовать пр1'фодные и полусин-
тетические пенициллины, за исключением оксациллина;•	штаммы стафилококков, обладающие ПСБ2а, клинически устойчивы ко всем
ß-лактамным антимикробным препаратам, маркером наличия ПСБ2а явля¬
ется устойчивость к оксациллину.Лабораторные методы идентификации и типирования MRSA можно разделить
на фено- и генотипические. Фенотипические методы позволяют изучить характе¬
ристики, экспрессируемые микроорганизмами, генотипические методы направ*
лены на исследование структуры ДНК. Основанием к проведению исследований
служат как данные клинического мониторинга внутрибольничных инфекций,
эпидемиологического мониторинга за уровнем внутрибольничных инфекций,
вызванных 5, aureus, так и данные микробиологического мониторинга, отражаю¬
щие чувствительность клинических изолятов к антибактериальным препаратам.Идентификацию MRSA проводят:•	диско-диффузионным методом с использованием дисков, содержащих 1 мкг
оксациллина;•	с помощью скрининг-теста на агаре Мюллера-Хинтона, содержащего 4%
раствор хлорида натрия и 6 мг/л оксациллина (MRSA-скрининговый агар).Оба метода имеют свои недостатки. В первом случае к категории метициллин¬
резистентных штаммов могут бьггь ошибочно отнесены клинические изоляты
с гиперпродукцией ß-лактамазы, то есть стафилококки с пограничным уровнем
резистентности, минимальная подавляющая концентрация (МПК) оксациллина
для которых колеблется в пределах 1,0-2,0 мкг/мл. Во втором случае возникают
трудности при идентификации MRSA, относящихся к первому классу по фенотипу
гетерорезистентности. Скрининг на агаре — высокочувствительный и специфич¬
ный метод, легко выполнимый в обычных бактериологических лабораториях.
Тест проводят с использованием особой селективной питательной среды, содержа¬
щей 4% раствор NaCl, 6 мг/л оксациллина, 1% маннита и индикатор pH. На среду
проводят массивный посев, так как в материале может содержаться небольшое
количество MRSA. Резистентными считают штаммы, для которых МПК оксацил¬
лина составляет 4 мг/л и более.Популяции резистентных стафилококков гетерогенны по профилю лекар¬
ственной устойчивости, и резистентные микроорганизмы, которые растут мед¬
леннее, могут остаться незамеченными. Данный факт диктует необходимость
использования специальной элективной среды и особых технических приемов
при определении чувствительности к антибактериальным препаратам. Удобством
использования отличаются хромогенные среды, в которых используются особые
субстраты, специфически расщепляемые штаммами MRSA, что придает колониям
характерное окрашивание. Дополнительно в состав таких сред входят специаль¬
ные ингибиторные добавки для подавления сопутствующей микрофлоры, а также
ростовые добавки для стафилококков, такие как пируват натрия.Идентификация резистентности возможна путем определения продукции ПСБ2а
методом латекс-агглютинации с помощью готовых тест-систем, В случае получе¬
ния сомнительных результатов при использовании данного метода необходимо
прямое определение гена тесА с использованием ПЦР, являющейся «золотым
стандартом» для идентификации MRSA.
Таблица 21-30. Дифференциация коагулазоположительных стафилококковВиды стафило¬ПипиентРост анаэ¬РостКоагулазаХлопьяТермо-ГемолизФосфа-АцетоинПродукция кислоты в анаэробных условияхкокковробноаэробнонуклеазатаза(ФП)маннитмальтозатрегалозаманнозаS. aureus suösp.
aureus+++++++++++++S. aureus subsp.
anaerobius-+-+-+++-ND+--S. intermedius_+++d+d+-(d)(+)++S. hyicus-+++-+-+---++S. schleiferisubsp.coagualns-+++-++++V--+S. delpf)ini-+++--++-{+)+-+Примечание:—	90% пOw^oжитeльныx по данному свойству штаммов.«-?> — 90% отрицательных по данному свойству штаммов.—	11-89% положительных ло данному свойству штаммов.
«N0» — тест не имеет значения для дифференциации вида.О — характеристика выполняется в большинстве случаев.V — высокая вариабельность.СЛ
Таблица 21-31. Дифференциация клинически значимых коагулазоотрицательных стафилококковВиды стафило¬ПигментРост анаэ¬Рост аэробноКоагулазаГемолизФофатазаНовобиоцинПродукция кислоты в анаэробных условияхкокковробноманнитмальтозатрегалозаманнозаS. epidermidis-++(d)+S-+-+S. warnerid++-(d)-S+++-S. ftaemo/if/cusd++-+-Sd++-S. homiriis
subsp. hominisd++---S-+d-S. hom/n/s
subsp. hominis
novobiosepticus--+---R-+--S. saprophyticus
subsp.saprophyticusd~+---Rd+-Примечание;«+» — 90% положительных по данному свойству штаммов.«-«> — 90% отрицательных по данном)' свойству штаммов.«(!» — 11-89% положительных по данному свойству штаммов.
«N0» — тест не имеет значения для дифференциации вида.«5 чувствительны.«к» — резистентны.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 417Показания к проведению молекулярно-генетической идентификации MRSA:•	сомнительные результаты при определении чувствительности к оксациллину
с помощью фенотипических методов;•	тяжелые случаи внутрибольничных инфекций (бактериемия, сепсис), а
также случаи низкой клинической эффективности при использовании окса¬
циллина или антибиотиков цефалоспоринового ряда при лечении осложне¬
ний, вызванных S, aureus;•	вьщеление клинических изолятов S. aureus, устойчивых к 2-3 антибактери¬
альным препаратам, помимо ß-лактамов, но чувствительных к оксациллину
при определении диско-диффузионным методом;•	увеличение частоты внутрибольничных инфекций, вызванных 5. aureus.Полученные при определении чувствительности к антимикробным препаратамрезультаты следует трактовать следующим образом:•	штаммы стафилококков, чувствительные к бензилпенициллину, считаются
чувствительными ко всем ß-лактамным антибиотикам, препараты выбора —
природные и аминопенициллины;•	при выявлении продукции ß-лактамаз и чувствительности к оксациллину
микроорганизм считается резистентным к природным и полусинтетическим
пенициллинам, препараты выбора — оксациллин, ингибиторзащищенные
пенициллины и цефалоспорины I-II поколения.Эпидемиологический надзор за MRSA — составная часть эпидемиологического
надзора за внутрибольничными инфекциями, центральное звено которого —
молекулярно-генетический мониторинг. Основанный на его данных эпидемиоло¬
гический анализ позволяет не только правильно оценивать, но и прогнозировать
эпидемические ситуации, посредством заблаговременных противоэпидемических
мероприятий предотвращать вспышки внутрибольничных инфекций, вызванных
MRSA.СТРЕПТОКОККИТАКСОНОМИЯСтрептококки формируют род Streptococcus из семейства Streptococcaceae (поря¬
док Lactobacillales типа Firmicutes).В молекулярном анализе показано, что видовое распределение стрептококков
по гемолитической активности, размеру колоний, наличию групповых и типовых
антигенов не всегда согласуется с данными анализа их геномов. По фенотипу
стрептококки подразделяют на ß-гемолитические и He-ß-гемолитические. Первая
группа включает пиогенные виды — Str. pyogenes, Str, agalactiae, Str. dysgalactiae, Str,
equi и Str. canis. Видовое обозначение более точное, поскольку пиогенные стреп¬
тококки включают и отдельные He-ß-гемолитические виды (например, Str. dysga¬
lactiae, подвид dysgalactiae), близкие к Str. anginosus, который отнесен к зеленящим
стрептококкам.Ангинозные стрептококки на плотных питательных средах формируют срав¬
нительно мелкие колонии (<0,5 мм) в отличие от пиогенных стрептококков, фор¬
мирующих более крупные колонии (>0,5 мм). Пиогенные. или ß-гемолитические,
стрептококки группируются по Лэнсфилду в соответствии со свойствами поли¬
сахаридных антигенов. Однако, если группа В по Лэнсфилду ограничена лишь
видом Str, agalactiae, групповой полисахарид А по Лэнсфилду обнаруживают как у
Str. pyogenes, так и у Str. dysgalactiae подвида equisimilis и Str, anginosus. Связь между
видовой принадлежностью штаммов и другими антигенами по Лэнсфилду еще
более сложная (табл. 21-32).
Таблица 21-32. Фенотипическая характеристика Р-гемолитических стрептококков [Manual of Clinical Microbiology (Editor in chief: Patrick R. Murray). — 9’^ ed.
Washington; ASM Press, 2007. — Vol. 1. — P. 412-429]ВидыГруппа по
ЛэнсфилдуРазмер
колонии, ммХозяинТест на
бацитрацинСАМР-тестПИР-тестОбразованиеацетона(VP-тест)ГидролизгиппуратаОбразованиетрегалозысорбитолаStr. pyogenesА>0,5Человек+-+--+-Str. agalactiaeВ>0,5Человек,корова-+--+В-Str. dysgalactiae, подвид.
dysgalactiaeА, С. G, L>0,5Животные-----+ВStr. dysgalactiae, подвид
eguisimilisС>0,5Чеповек-----+-S. equi, подвид equiG>0.5Животные-------S. equi, подвид
zooepidemicusА, С, G, F>0,5Животные,человек------+S. canisЕ. Р, и, V>0.5Собака, чело¬
век-+---В-S. anginosusНе группируемые<0.5Человек---+-+-S. porcinusНегруппируемые>0.5Свинья, чело¬
век-+++В++CDПримечание:«-«> — отрицательный результат;— положительный результат:
«В» — вариабельный результат.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ419Вторая группа — непиогенные виды, в основном а-гемолитические и негемоли¬
тические, но к ним также относят отдельные виды [5-гемолитических стрептокок¬
ков. Данное заключение сделано на основании анализа нуклеотидных последова¬
тельностей, кодирующих гены 16S рРНК. К непиогенным стрептококкам относят
Str. mitis, Sír anginosus, Str. mutans, Str. salivarius и Str. bovis.Среди а-гемолитических видов отдельную группу составляет Str. pneumoniae,
отличающийся от других зеленящих стрептококков по чувствительности к оптохи-
ну и растворимости в желчи. В группу Str. an^nosus входят три вида — Str. anginosus,
Str. constellatus и Str. intermedius.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАБактерии рода Streptococcus грамположительны и каталазоотрицательны, имеют
диаметр около 2 мкм и способны к росту в виде цепочек различной длины в жидких
питательных средах. Строение клеточной стенки типично для грамположитель¬
ных бактерий. В ее состав входят пептидогликан, содержащий глюкозаминовую и
мураминовую кислоты, и галактозамин в качестве вариабельного компонента.Стрептококки — факультативные анаэробы. Для роста видов, относящихся к
Str viridians и Str. pneumoniae, необходима инкубация в атмосфере, содержащей
5% углекислого газа. Температурный оптимум роста — 37 X. Для быстрого роста
стрептококков в питательную среду добавляют кровь или сыворотку. Добавление
глюкозы и других углеводов в жидкую питательную среду усиливает рост стрепто¬
кокков, но снижает pH среды. Именно поэтому следует применять забуференные
питательные среды.ЭПИДЕМИОЛОГИЯСтрептококки распространены повсеместно. Отдельные виды являются ком¬
менсалами и нормальными компонентами микрофлоры кожи. При высокой виру¬
лентности стрептококки могут колонизировать различные ткани без видимых
клинических проявлений. Во многих случаях возбудитель обнаруживали даже
при бессимптомном течении заболевания. В то же время их инфекции могут про¬
являться как высоколетальные инвазивные болезни. Трудно найти человека, кото¬
рый в течение жизни не перенес ту или иную форму стрептококковой инфекции.
Вызываемые стрептококками инфекции значимы с медицинской точки зрения,
по объему социально-экономического ущерба вызывают потери, которые пре¬
восходят потери от других нозологических форм. Не существует органов и систем
организма человека, которые не поражаются стрептококками. Они политропны и
именно поэтому актуальны для многих разделов медицины. В XX в. человечество
дважды сталкивалось с крупными вспышками эпидемически значимых заболева¬
ний: в 1920-е гг. в Юго-Восточной Азии произошла вспышка «стрептококковой
гангрены», унесшей миллионы жизней, а 1986-96 гг. ознаменовались вспышками
инфекций, вызванных стрептококками групп А и В (так называемымиflesh eating),
в Америке, Западной Европе и Скандинавии. Эти заболевания регистрируют в
настоящее время в виде спорадических случаев во многих странах мира, напоми¬
ная об угрозе стрептококковой инфекции, а наблюдаемая смена циркулирующих
типов возбудителей указывает на возможность нового роста заболеваемости.Стрептококковые инфекции не являются классическими зоонозами, хотя для
большинства видов характерен определенный хозяин. Описаны случаи передачи
инфекции от животного к человеку (Str. suis, Str. agalactiae). Однако гено- и фено¬
типический анализ штаммов животного и человеческого происхождения пока¬
зал, что штаммы, вызывающие инфекцию у человека, отличаются от штаммов,
вызывающих инфекцию у животных. Анализ штаммов группы В (Sír. agalactiae)
выявил существенные генетические различия между изолятами различного про¬
исхождения, Человеческие штаммы стрептококков групп С и G принадлежат к Str.Ш'Ш-ШшщШ1
Рт$Ш420ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯdysgalactiae, подвиду equisimilis, в то время как штаммы от животных, относящиеся
к тем же серогруппам, принадлежат к Str. dysgalactiae, подвиду dysgalactiae, Str. canis,
Str. equi, подвиду equi и Str. equi, подвиду zooepidemicus. Резервуаром для штаммов
Str. dysgalactiae подвида equisimilis является человек, и передача инфекции осущест¬
вляется только внутри человеческой популяции.Заражение стрептококками происходит различными путями. Для патогенных
видов {Str. pyogenes и Str. pneumoniae) характерен воздушно-капельный и контакт¬
ный пути передачи. Передача кариогенных Str. mutans осуществляется от матери к
ребенку в младенческом возрасте через слюну. Данный путь типичен и для неона¬
тальной инвазивной инфекции, вызываемой Str. agalactiae. Часто заражение про¬
исходит гематогенным путем или во время родов. Описан контактный путь пере¬
дачи неонатальной инвазивной инфекции ребенку от медперсонала родильного
отделения. Причиной эндогенных инфекций могут быть зеленящие стрептококки,
являющиеся частью нормальной микрофлоры слизистой оболочки полости рта.Проблема разнообразия факторов патогенности стрептококков остается акту¬
альной, является предметом организованного регулярного и периодического
мониторинга заболеваемости, в том числе и с помощью методов молекулярной
диагностики. В странах Евросоюза в настоящее время действуют единые програм¬
мы по мониторингу стрептококков и вызываемых данными микроорганизмами
заболеваний. Концепция надзора за инфекционной патологией и заболеваемо¬
стью обычно строится на показателях распространенности возбудителя инфек¬
ции, уровнях заболеваемости, инвалидизации и смертности и размере ежегодно
наносимого стране ущерба. Ошибки в данном подходе приводят к искажениям
и недооценке регистрируемых показателей. В России из большого количества
вызываемых стрептококками заболеваний официально регистрируется только
скарлатина. Б США ежегодно регистрируется до 25 млн больных стрептококкоза-
ми, затраты на лечение оцениваются в 1 млрд долларов в дополнение к еще боль¬
шему ущербу от трудовых потерь. Если экстраполировать эти данные на Россию,
то ежегодно следует ожидать до 13-15 млн больных при развитии осложнений
в 0,45 млн случаев. На основании специфики и особенностей стрептококкозы
следует отнести к инфекциям, для которых социальный и экономический ущерб
достаточно выражен.Заболеваемость инфекциями стрептококковой этиологии находится в поле
зрения ВОЗ: в мире постоянно повышаются уровни лабораторной диагностики,
технологии лечебных и профилактических вмешательств, изучаются вопросы
патогенеза и молекулярной эпидемиологии, значительный прогресс достигнут
в исследовании генетики стрептококков. В настоящее время несколько стран
приступили к созданию рекомбинантных вакцин на основе белковых факторов
патогенности стрептококков групп А и В. Заболеваемость стрептококкозами фор¬
мируется преимущественно за счет инфекций, вызываемых стрептококками групп
А и В, и в меньшей степени — стрептококками групп С, F и G.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИ
Стрептококки группы А {Str. pyogenes)У человека Str. pyogenes колонизируют преимущественно слизистую оболочку
полости рта и кожу, что приводит к формированию первичных очагов, являю¬
щихся резервуарами передачи инфекции. Str. pyogenes могут быть причиной как
поверхностных, так и глубоких поражений, обусловленных патогенными и токси¬
ческими свойствами данного микроорганизма, Str. pyogenes вызывают тонзиллофа-
рингиты, импетиго, скарлатину, синдром токсического шока, бактериемию, сепсис
и поражение мягких тканей (рожистое воспаление, некротизирующий фасциит,
миозит). Помимо перечисленных заболеваний, Str. pyogenes могут вызывать остео¬
миелит, септические артрит, пневмонию, менингит, эндокардит и перикардит.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 421Осложнениями стрептококковой инфекции являются острый гломерулонефрит,
ревматическая лихорадка и хорея. Доминирующие М-типы стрептококков, вызы¬
вающих данные нозологические формы, — штаммы серотипов М1 и М3. Наиболее
часто поражаются дети и пожилые пациенты. В группу риска входят больные
сахарным диабетом, вирусными инфекциями, пациенты с хроническими сердечно¬
сосудистыми и легочными заболеваниями, иммунодефицитом, наркоманы.Стрептококки группы в {Str. agalactiae)Str. agalactiae известен в качестве причины неонатальных инфекций, описанных
в двух клинических проявлениях, а именно как ранняя неонатальная инфекция
(сепсис, пневмония), развивающаяся в первые 7 дней жизни новорожденного, и
более поздняя отсроченная инфекция (менингит, сепсис), развивающаяся между
7-м днем и 3-м месяцем жизни ребенка. Фактор риска неонатального инвазивно¬
го заболевания — колонизация урогенитального тракта и толстой кишки матери
Str. agalactiae, выявляемая у 10-35% беременных. У взрослых инвазивная форма
инфекции протекает в виде пневмонии, бактериемии, эндокардита, инфекций
мочеполового тракта, поражений кожи и мягких тканей, остеомиелита. Данные
заболевания развиваются в послеродовом периоде, а также у пациентов с сахар¬
ным диабетом, злокачественными новообразованиями, иммунодефицитом.Стрептококки групп с и G {Str. dysgalactiae, подвид equisimilis)Str. dysgalactiae, подвид equisimilis, вызывает инфекции, схожие с инфекциями,
вызываемыми Str. pyogenes. Str. dysgalactiae, подвид equisimilis, ассоциирован с инфек¬
циями дыхательных njnreft, кожи и мягких тканей и инвазивными инфекциями,
такими как некротизирующий фасциит, синдром токсического шока. Описаны слу¬
чаи постстрептококкового гломерулонефрита и острой ревматической лихорадки,
связанные с Str. dysgalactiae подвида equisimilis и Str. equi подвида zooepidemicus.Группа Str. anginosusСтрептококки видов Str. anginosus, Str. constellatus и Str. intermedius входят в состав
нормальной микрофлоры глотки, урогенитального и кишечного тракта. С этими
стрептококками связывают развитие абсцессов головного мозга, носоглотки и
брюшной полости. Str. constellatus подвида pharyngis — причина фарингитов. По
групповому антигену штаммы группы 5. anginosus относят к серогруппам А. С, F, G
и нетипируемым.Группа Str. mitisСтрептококки данной группы (Str. mitis, Str. sanguinis, Str. parasanguinis, Str gor-
donii, Str. cristatus, Str. oralis, Str. infantis, Str. peroris и Str. pneumoniae) входят в состав
нормальной микрофлоры слизистой оболочки полости рта, кишечного тракта и
наружных родовых путей женщин. Их обнаружение в крови при отсутствии кли¬
нических проявлений заболевания не требует антибактериальной терапии вслед¬
ствие транзиторного характера бактериемии. Данные микроорганизмы могут
также входить в состав нормальной микрофлоры кожи. Стрептококки данной
группы часто становятся причиной эндокардитов, сепсиса или пневмонии на фоне
иммуносупрессорной химиотерапии.В этой группе Str. pneumoniae занимают особое место среди зеленящих стрепто¬
кокков по своему клиническому значению и отличию от стрептококков str. mitis.
Именно поэтому детальная характеристика Str. pneumoniae должна быть описана
отдельно, с учетом их высокой эпидемиологической и клинической значимости.
str. pneumoniae чаще всего вьщеляют из дыхательных путей. Данные микроор¬
ганизмы — возбудители пневмоний, менингитов, отитов, синуситов и в редких
случаях перитонитов. Колонизация дыхательных путей нередко сопровождается
длительным носительством str. pneumoniae у детей.ЩЩ
422 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОПОГИЯГруппа Str. salivariusСтрептококки группы Str. salivarius включают Str. salivarius и Sfr. vestibulaiis, Str.
salivarius могут вызывать бактериемию, эндокардит и менингит. Sir. vestibularis не
связьгвают с конкретной патологией. Их выделение из крови в значительной сте-
\ пени коррелирует с интерсти]щальной неоплазией.к Группа Str. mutansStr. mutans и Str. sobrinus обычно выделяют из полости рта. Sfr. mutans - этиоло¬
гический агент зубного кариеса, Str. criceti и Sfr. ratti крайне редко обнаруживают
у человека, в то время как Str. downei, Str. férus, Str. macacae и Str. hyovaginalis встре¬
чаются только у животных.Г руппа Str. bovisДанная группа стрептококков включает Str. equinis, Str. gaïlolyticus, Str. infantarius
и Str. alactolyticus, которые обнаруживают в крови пациентов с бактериемией,
сепсисом и эндокардитом, а также при интерстициальных новообразованиях (Sir.
gaïlolyticus, подвид gaïlolyticus) и менингите {Str. gaïlolyticus, подвид pasterianus).
Наибольшие таксономические изменения произошли именно в этой группе стреп¬
тококков.Другие стрептококки, обнаруживаемые в патологическом материалеНекоторые виды, исходно являющиеся патогенными для животных, время от
времени обнаруживают у людей, имеющих тесный контакт с животными. Str. suis,
Str. porcinus и Str. iniae относятся к данной категории микробов. Str. suis — патоген
свиней, однако в некоторых случаях встречается у больных людей при менингите
и бактериемии. Str suis может быть положительным по антигенам R, S или Т. Str.
porcinus (группы Е, Р, и или V ло Лэнсфилду) также является патогеном свиней.
Sir. iniae патогенен для рыб и не относится ни к одной из серогрупп по Лэнсфилду.
Данный вид выявляют при инфекции мягких тканей, эндокардите и менингите у
людей, занятых обработкой рыбы.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАЛабораторная диагностика стрептококковых инфекций человека строится на
традиционных принципах бактериологии, предусматривающих обнаружение воз¬
будителя в клиническом материале (с этой целью применяют бактериоскопию,
изоляцию на питательных средах, выявление антигенов стрептококков иммуно¬
логическими тестами и их генома методами молекулярной диагностики) и выяв¬
ление у пациентов специфической сероконверсии.Особенности лабораторной диагностики стрептококковых инфекций обуслов¬
лены многообразием этих бактерий, что диктует необходимость применения
различных методов их идентификации и типирования. На заключительном этапе
лабораторных исследований встает задача определения чувствительности выде¬
ленного стрептококка к антимикробным препаратам для выбора оптимальной
схемы лечения пациента.БактериоскопияПоскольку стрептококки хорошо воспринимают анилиновые красители, для
окраски мазков клинического материала используют обычные методы (в первую
очередь, окрашивание по Граму).Обнаружение стрептококков в клиническом материалев качестве экспресс-методов диагностики инфекций стрептококков групп А и
В в настоящее время ряд фирм производит одноэтапные иммунохроматографи¬
ческие тесты. Они позволяют быстро (в течение 5-10 мин) проводить исследова-
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 423ние клинического материала, высокоспецифичны и чувствительны. Основное их
назначение — скрининг. Получение в этих тест-системах отрицательного резуль¬
тата не исключает наличие у обследуемого пациента стрептококковых инфекций
(это необходимо подтвердить другими лабораторными методами диагностики).Изоляция и идентификация возбудителяГемолитические стрептококки весьма требовательны к питательным средам.
В качестве стандартных сред обычно используют бульон Тодда-Хевитта и колум¬
бийский кровяной агар. При выращивании стрептококков группы А для их
М-типирования к бульону Тодца-Хевитта добавляют неопептон, который пода¬
вляет активность ферментов, гидролизующих М-белок. Добавление к бульону
Тодда-Хевитта 2-5% экстракта дрожжей стимулирует рост бактерий. Культуры
стрептококков из очагов с вероятным присутствием грамотрицательной флоры
лучше растут в присутствии антибиотиков. Колумбийский кровяной агар, содержа¬
щий колистин (10 мкг/мл) и налидиксовую кислоту (15 мкг/мл), не поддерживает
рост грамотрицательных бактерий, но на нем хорошо растет стафилококки или
коринебактерии. При замене налидиксовой кислоты на оксолиновую (5 мкг/мл)
подавляется рост грамотрицательных бактерий, стафилококков и коринебакте¬
рий. Считается, что комбинация триметоприма (1,25 мкг/мл) и сульфаметоксазо-
ла (23,76 мкг/мл) в кровяном агаре способствует улучшению роста стрептококков
группы А. Сочетание неомицина с полимиксином В не оказывает существенного
влияния на рост стрептококков группы А, но подавляет размножение других
бактерий, часто присутствующих в материале, собранном из верхних дыхательных
путей. Добавление в жидкую питательную среду гентамицина (8 мкг/мл) и нали¬
диксовой кислоты (15 мкг/мл) улучшает рост стрептококков группы В.При посеве исследуемого материала с тампона на чашку с кровяным агаром сле¬
дует прокатать тампон по участку размером 3x3 см у края чашки. От этого места
материал следует распределить петлей в разных направлениях для пол>^ения
изолированных колоний. Проколы петлей внутрь агара позволяют получить рост
в глубине, что усиливает р-гемолиз штаммов стрептококков, которые в аэробных
условиях слабо экспрессируют гемолизин. Глубинный гемолиз характерен для
стрептолизина-0, чувствительного к кислороду, при попытке выделения бактерий
из «скудного» материала, кроме первичного посева, желательно выполнить парал¬
лельный посев на жидкие селективные питательные среды или среды обогащения.
При обследовании здоровых носителей использование среды обогащения увели¬
чивает частоту выявления стрептококков на 15-20% по сравнению с результатами
первичных посевов.Піой из абсцессов, жидкость из зоны рожистого воспаления или другой иссле¬
дуемый материал с предположительно низким содержанием возбудителя можно
сразу посеять в обогащенную жидкую питательную среду. При инфекции глотки
посевы слюны могут содержать гемолитические стрептококки, однако более
достоверные результаты дают посевы материала из глотки.Если ставится задача выделения из исследуемого материала только гемолити¬
ческого стрептококка, лучше использовать посев на кровяной агар с кристаллвио¬
летом, который угнетает рост стафилококков. Селективные питательные среды,
содержащие антибиотики, подавляют рост всех грамотрицательных микроорга¬
низмов, не оказывая нежелательного эффекта на формирование колоний стреп¬
тококков. Благодаря угнетению роста конкурирующих микробов селективные
питательные среды повышают частоту выделения гемолитических стрептококков
в работе с исследуемым материалом, содержащим незначительное количество
гемолитических стрептококков.Инкубация материала при 35-37 °С в течение 12 ч в аэробных условиях на
чашках с кровяным агаром (предпочтительнее использовать кровь овцы или
■Ж****»•ШШ&Ф 424 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯлошади) — общепринятый стандарт вьщеления гемолитических стрептококков
ШЙщ^< групп А, в, с, Р и С. Скорость роста стрептококков групп А и В можно увеличить,
инкубируя засеянные чашки в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа, или в
анаэробных условиях. Анаэробная среда стимулирует рост стрептококков и ока¬
зывает угнетающее действие на стафилококки, гемофил ьную палочку и Корине-бактерии. При этом ускоряется формирование зон гемолиза вследствие продукциигтпоптптил'илча-П Чаттгн и »глтот-ту ттпгяр 1 7 и мнтг'ийатлм птг^гггтрц/тпт ппнчняк"иmiстрептолизина-0. Чашки, в которых после 12 ч инкубации отсутствуют признаки
г? W-V' роста стрептококка, рекомендуют инкубировать еще 24-48 ч.Большинство типичных колоний стрептококка группы А имеют округлую
форму с ровным краем и диаметром 0,5-2 мм и более.Существуют три типа колоний стрептококков — слизистые, матовые и бле¬
стящие. Слизистые колонии обычно более крупные по размеру, часто сливаются
и выглядят как капельки воды. Такие колонии характерны для штаммов, про¬
дуцирующих большое количество гиалуроновой кислоты для построения кап¬
сулы. Матовые колонии, иногда называемые под слизистыми, часто являются
результатом подсыхания слизистых колоний, плоские, с неровной поверхностью.
Блестящие колонии имеют меньший размер и куполообразны.Размер колоний обычно варьирует у штаммов разных групп. р-Гемолитические
стрептококки пиогенной группы (Str. pyogenes, str, agalactiae, Str. dysgalactiae под¬
вида equisimilis) образуют при росте на плотной питательной среде колонии раз¬
мером более 0,5 мм после 12-часовой инкубации. Для р-гемолитических форм
Str. anginosus характерны колонии размером менее 0,5 мм, обладающие специфи¬
ческим запахом ириски или карамели из-за продукции диацетила. Str. agalactiae
образуют более крупные колонии с относительно малой зоной гемолиза в отличие
от остальных р-гемолитических стрептококков пиогенной группы. Встречаются
не гемолитические формы str. agalactiae, схожие с энтерококками. Размер зоны
гемолиза вокруг колоний Str. pyogenes обычно превышает диаметр колонии в2-4 раза. У некоторых штаммов зона гемолиза шире, у других представлена узким
кольцом.Большинство р-гемолитических стрептококков пиогенной группы вызывают
полный лизис эритроцитов. Однако вокруг колоний некоторых штаммов появ¬
ляется зеленая окраска, напоминающая а-гемолиз. У таких штаммов полный
лизис эритроцитов происходит после длительной инкубации или инкубации в
анаэробных условиях. При изучении гемолитических и морфологических свойств
стрептококков следует учитывать влияние компонентов сред, толщину агара, кон¬
центрацию и происхождение крови, атмосферу инкубации. Использование крови
человека не рекомендуют, так как она часто содержит антитела к стрептококкам и
отрицательно влияет на их инкубацию.Негемолитические серые колонии типичны для Str. bovis и str. salivarius.
Тщательное исследование морфологии и гемолитических свойств колоний
важно для подтверждения диагноза стрептококковой инфекции и выделения
штаммов. Для дифференциации стрептококков от других гемолитических бакте¬
рий следует прибегать к микроскопии окрашенных по Г^аму мазков из выросших
колоний. С этой же целью применяют тест на каталазу (стрептококки каталазоо¬
трицательны).Идентификация и типированиегрупповая идентификация стрептококков по ЛэнсфилдуГруппоспецифический антиген большинства стрептококков — полисахарид,
локализованный в их клеточной стенке. Его можно определить посредством
группоспецифической сыворотки с помощью реакции преципитации, РГА, имму¬
нофлюоресценции и ИФА. Существуют разные методы экстракции групповых
полисахаридов, в том числе соляной и азотистой кислотами, формамидом, авто-
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 425 Щклавированием взвеси стрептококков в 0,9% растворе NaCl, а также с применени¬
ем ферментов и фаг-ассоциированного лизина.Реакция преципитации имеет ряд вариантов: кольцепреципитацию, преци¬
питацию в капиллярах, реакцию двойной встречной диффузии или иммуноэ¬
лектрофореза в геле. Реакция агглютинации может быть выполнена как прямая
агглютинация, коагглютинация или латекс-агглютинация (с применением взвеси
нагруженных группоспецифическими антителами стафилококков, содержащих
белок А, либо калиброванных частиц латекса). Групповой антиген В по Лэнсфилду
встречается только в штаммах Str. agalacticae. Групповой антиген F позволяет иден¬
тифицировать штаммы, принадлежащие к Str. an^msus. Групповые антигены А, С
и G указывают на необходимость дальнейшей видовой идентификации штаммов с
использованием молекулярно-генетического анализа.В настоящее время существует много видов экспресс-анализа для дифференциа¬
ции стрептококков в зависимости от обнаружения группового антигена непосред¬
ственно в первичном материале. Наиболее применимы тесты, в которых исполь¬
зуют группоспецифическе IgG, фиксированные на частицах калиброванного
латекса или на взвеси клеток S. aureus, несущих на поверхности белок А в качестве
рецептора для IgG. При этом время, необходимое для диагностики, сокращается до
10-20 мин, что играет важную роль при своевременном назначении эффективной
антибиотикотерапии.Фенотипическая идентификация стрептококковОписываемые ниже фенотипические тесты служат дополнением к групповой
идентификации стрептококков.A.	Бацитрациновый тест. Stn pyogenes, в отличие от других ß-гемолитических
стрептококков, обладает высокой чувствительностью к бацитрацину. Тест на
бацитрацин можно использовать для идентификации Str. pyogenes, поскольку
ß-гемолитические штаммы других видов стрептококков, которые могут содержать
групповой антиген А, устойчивы к бацитрацину. Считается, что если вокруг дисков
с бацитрацином (0,04 МЕ), помещенных на поверхность агара, отсутствует рост
ß-гемолитических стрептококков, испытуемый штамм относится к Str. pyogenes.
Размер зоны задержки роста вокруг диска не имеет значения. Оптимальна инкуба¬
ция чашек в течение 18-20 ч при 36 “С в атмосфере, содержащей 5% углекислого
газа. Существуют коммерческие диски с бацитрацином. Однако необходимо иметь
в виду, что опубликованы данные по обнаружению в Европе бацитрацинрези-
стентных изолятов Str, pyogenes.Б. ПИР-тест. Метод определения групповой принадлежности Str. pyogenes
основан на способности стрептококковой пирролидониламинопептидазы (ПИР)
гидролизовать 1-пирролидонил-р-нафтиламид до ß-нафтиламина, который в при¬
сутствии специального реагента окрашивается в красный цвет. Около 98% штам¬
мов Str. pyogenes дают положительную ПИР-реакцию. Хотя Str. iniae и Str. porcinus
также ПИР-позитивны, они крайне редко встречаются в клиническом материале,
поскольку являются видами, ассоциированными с патологией животных. Ряд
бактерий каталазоотрицательных родов (Enterococcus, Aerococcus, AbiotropMa,
Gemeîla, Lactococcus) также дают положительную ПИР-реакцию. Однако они не
могут помешать определению Str. pyogenes из-за своей характерной морфологии.
Широкий спектр ПИР-положительных нестрептококковых бактерий ограничи¬
вает применение данного теста. Существует ряд коммерческих вариантов ПИР-
теста, имеющих одинаковые чувствительность и специфичность, которые можно
использовать в бактериологической диагностике.B.	Гиппурат-гидролизный тест. Способность к гидролизу гиппурата — допол¬
нительный тест для идентификации Str. agalactiae. При его выполнении суспензию
бактериальных клеток в 1% растворе гиппурата натрия выдерживают в течение 2 ч
при температуре 35 ""С. Продукт гидролиза гиппурата определяют по появлению
ШШ!426 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯпурпурного цвета после добавления нингидринового реагента. Помимо Stn agalac¬
tiae, гидролизовать гиппурат способны некоторые зеленящие стрептококки.Г. Тест Фогеса-Проскауэра. Тест выявляет образование ацетона при фер¬
ментации глюкозы штаммами Str. anginosus с групповыми антигенами А, С или
G по Лэнсфилду и позволяет дифференцировать их от штаммов с идентичными
групповыми антигенами, но принадлежащими к другим видам стрептококков,
Тестируемый штамм инокулируют в 2 мл VP-среды и инкубируют при 35 °С в
течение 6 ч. Затем в пробирку добавляют 5% раствор а-нафтола и 40% раствор
гидроксида калия и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.
Положительный результат определяют по появлению розово-красного цвета.Д. [5-Глюкуронидазный тест. Выявление р-глюкуронидазной активности у
штаммов Str dysgalactiae подвида equisimilis, содержащих групповой антиген С или
С по Лэнсфилду, позволяет дифференцировать их от штаммов Str anginosus с теми
же групповыми антигенами. Для выполнения экспресс-теста используют коммер¬
ческие наборы.Е. Оптохиновый тест. Тест используют в основном для идентификации опто-
хинчувствительных штаммов Str pneumoniae. Наряду с чувствительными к опто-
хину штаммами регистрируются и резистентные штаммы Str. pneumoniae, а также
оптохинчувствительные изоляты Str mitis. Диски с оптохином наносят на поверх¬
ность кровяного агара и инкубируют в течение 18-20 ч в атмосфере, содержащей
5% углекислого газа. Оптохинчувствительные изоляты образуют зоны подавления
роста не менее 14 мм с 6-миллиметровым диском, содержащим 5 мкг оптохина,
или зоны подавления роста не менее 16 мм с 10-миллиметровым диском. При
размере зоны подавления роста 9-13 мм с 6-миллиметровым диском необходимо
повторное тестирование штамма с использованием чистой культуры. Для выпол¬
нения теста используют коммерческие диски с оптохином.Ж. Колориметрический тест StrepSwift. Представляет собой карточку с 3
тестовыми окошками для выявления у тестируемой культуры пироглютаматами-
нопептидазы, лейцинаминопептидазы и эскулиназы. По наличию этих ферментов
можно определить принадлежность изолята к грамположительным каталазонега-
тивным коккам и провести их первичную дифференциацию. Результаты оценивают
через 10 мин после внесения суспензии исследуемой культуры в тестовые окошки.Серотипирование стрептококковСеротипирование стрептококков группы А, Типирование стрептококков
существенно при изучении нефрито- и ревматогенности штаммов группы А и
эпидемиологическом надзоре за вспышками инфекции. Разделение Str. pyogenes на
серотипы основано на идентификации белковых антигенов, известных как Т-, 0F-
и М-белки. Наиболее важен М-белок — высокоспецифичный антигенный маркер
и ведущий фактор вирулентности Str pyogenes. Постинфекционный иммунитет к
стрептококкам группы А связан с формированием типоспецифических антител
к М-белку. Некоторые М-типы стрептококков продуцируют и другое типоспеци¬
фическое вещество, названное фактором опалесценции. Поскольку антигенная
специфичность М-белка и фактора опалесценции коррелируют у 30% типов стреп¬
тококков, оба белка важны для диагностики,А.	Т-типирование. Т-типирование проводят в реакции РГА на стекле, исполь¬
зуя набор анти-Т-сывороток, как пулированных (Т, U, W, X, Y, Z), так и моно¬
валентных. Производятся коммерческие наборы обоих вариантов сывороток.
Однако область их применения достаточно узка. Для реакции применяют ста¬
бильные суспензии стрептококков. Спонтанно агглютинирующие культуры сле¬
дует предварительно обработать трипсином. Существует около 20 вариантов
Т-антигенного паттерна штаммов.Б, Типирование с использованием реакции опалесценции сыворотки.
Наличие или отсутствие фактора опалесценции (ОР-фактора) — постоянная
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 427характеристика любого М-типа Str. pyogenes. Все М-типы можно разделить на Л
OF-положительные и OF-отрицательные. Фактор опалесценции выявляют в надо-
садочном слое бульонной культуры и в экстрактах из культур стрептококков, полу- %
ченных обработкой соляной кислотой или додецилсульфатом натрия. В качестве
субстрата для активности OF-фактора применяют лошадинз^ю, бычью или свиную
сыворотку. OF-типирование основано на специфическом подавлении реакции
опалесценции сыворотки анти сывороткой, содержащей типоспецифичные анти-
OF-антитела.Существуют различные методы OF-типирования: агаровый, пробирочный и
микропланшетный. В клинической практике OF-типирование не используют, так
как для определения данного фактора необходимо поддерживать коллекцию из
30 анти-ОР-сывороток, что под силу только высокоспециализированным центрам.К недостаткам OF-типирования относится и невозможность применения метода
для идентификации наиболее распространенных OF-отрицательных штаммов Str,
pyogenes.В.	М-типирование. Серотипирование, основанное на антигенных различиях
М-белков, связанных с гетерогенностью аминокислотной последовательности их
N-терминальной области, стало основным (особенно в эпидемиологии) методом
внутривидовой классификации штаммов Str pyogenes. В настоящее время известно
более 130 М-серотипов Str pyogenes. Недостатки этого метода: необходимость
большого количества типовых сывороток высокого качества, невозможность
типирования штаммов, слабо экспрессирующих М-белок и экспрессирующих
М-белок неизвестного типа.М-типирование осуществляют с помощью нескольких подходов.•	Реакцию преципитации в геле между М-антигеном и типоспецифической
антисывороткой используют для идентификации М-типа Str pyogenes.
Реакция считается положительной, если солянокислый экстракт стрепто¬
коккового штамма дает четкую полосу преципитации в геле с единственной
адсорбированной М-типоспецифической антисывороткой.Этот метод позволяет использовать и неадсорбированные М-антисыворотки
(при наличии соответствующих контрольных проб), что является одним из преи¬
муществ реакции преципитации в агаровом геле.•	Бактерицидный тест, основу которого составляют антифагоцитарный эффект
М-белка стрептококка и его нейтрализация типоспецифическими антитела¬
ми.Существует два типа бактерицидного теста.Непрямой тест служит для идентификации или подтверждения М-типа иссле¬
дуемого штамма. Для его постановки используют нормальную кровь человека,
максимально свободную от типовых антител, а добавляемая гипериммунная анти-
М-сыворотка должна опсонизировать исследуемый штамм, то есть способствовать
фагоцитозу клеток.В прямом тесте не используются типовые сыворотки. По способности исследуе¬
мого штамма размножаться в нормальной крови при отсутствии типоспецифиче¬
ских анти-М-антител определяют содержание М-белка. С помощью данного теста
можно резко увеличить количество М-белка в штаммах Str. pyogenes с исходно
малым его содержанием.Постановка бактерицидного теста довольно трудоемка и занимает много вре¬
мени. Его используют при особых обстоятельствах, например для верификации
новых М-типов стрептококков. Важная сфера применения бактерицидного теста —
отбор штаммов для производства типовых анти-М-сывороток.С ростом количества постоянно обнаруживаемых новых М-серотипов (к насто¬
ящему моменту обнаружено более 130 иммунологических вариантов М-белка) в
мире не осталось практической лаборатории, способной выполнить полноценную
428ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯсеродиагностику штаммов Str. pyogenes по М-белку. Более привлекательными ста¬
новятся методы молекулярно-генетического типирования, поскольку их выпол¬
нение не требует широкой панели иммунных сывороток, подготовки стандартных
инокулюмоБ, хранения при температуре -70 °С, подбора универсальных доноров,
не имеющих антител к большинству серотипов стрептококков, как для выполне¬
ния бактерицидного теста.Серотипирование стрептококков группы в. Если для отнесения штамма к
стрептококкам группы В (СГВ) достаточно обнаружение у него группового анти¬
гена, то для внутривидовой идентификации штаммов СГВ используют особен¬
ности наружной капсулы, которая рассматривается в качестве основного фактора
вирулентности. Среди СГВ долгое время выделяли три серотипа — I, II, III, затем
девять серотипов — 1а, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII. Недавно был обнаружен новый
антиген, обозначенный номером IX. Капсула всех известных типов СГВ включает
остатки глюкозы, галактозы и N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоты; в кап¬
суле присутствует N-ацетилглюкозамин, за исключением типов VI и VIII. Рамноза
обнаружена в капсуле серотипа VIII. На антигенные свойства типового полисаха¬
рида влияет не только состав, но и порядок соединения компонентов в полимер¬
ную структуру, а также их соотношение. Например, в составе капсулы клинически
значимого типа V глюкоза, галактоза, N-ацетилглюкозамин и сиаловая кислота
присутствуют в соотношении 3:2:1:1, а в составе капсулы типа II — те же компо¬
ненты, но в соотношении 2:3:1:1.Рутинные методы для внутривидового типирования — серологическая иденти¬
фикация штамма СГВ нейтрализацией в капиллярах или преципитацией в агаре.
Эти методы просты в выполнении, однако имеют недостатки, обусловленные
необходимостью получения очищенных моноспецифических сывороток ко всем
или как минимум к основным типам, — такая диагностика возможна только в про¬
филированных научных учреждениях. Увеличение числа серотипов СГВ еще более
осложняет возможности серотипирования.В диагностике СГВ можно использовать определение белковых антигенов.
Ранее у СГВ были обнаружены два поверхностных пептида, ß- и а-антигены.
Исходно ошибочное представление, что данные антигены представляют собой
антигенные варианты одного и того же белка (белка С), привело к обозначению
штаммов разных серотипов как С^ или Ср. Генотипированием доказано, что эти
антигены самостоятельные, генетически независимые белки. Белок С^ встречается
в виде набора как минимум пяти различных иммунологических вариантов, к кото¬
рым, помимо самого а-антигена, относятся а- и й^б-подобные белки, а-Антигены
семейства представлены у 70-80% штаммов СГВ. ß-Антиген — рецептор иммуно¬
глобулинов А, иммунологически однороден и встречается лишь у 30-40% штам¬
мов, преимущественно принадлежащих к серотипам I и II.Молекулярно-генетические методы диагностикиПоявление новых молекулярных методов внутривидовой диагностики стреп¬
тококков, таких как етет-типирование, мультиплексное типирование по генам
капсульных полисахаридов и MLST-типирование, вероятно, снизит в ближайшем
будущем диагностическое значение типирования стрептококков, основанного на
детекции поверхностных белков иммунологическими методами.Emm-генотипирование Str. pyogenes. Антигенные различия М-белков
обусловлены гетерогенностью аминокислотной последовательности их
N-терминальной области. Это свойство определяется гетерогенностью нуклеотид¬
ной последовательности 5’-конца кодирующего М-белок гена етт. В связи с этим
для классификации штаммов Str. pyogenes разработан метод ewra-типирования,
основанный на анализе нуклеотидной последовательности 5’-конца гена етт. Для
его выполнения из изучаемого штамма экспресс-методом или традиционной фенол-
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 429Праймер етт seq2 ет/тт-тип emm-подтипПраймер №1Секвенирование
Праймер №25’-Сигнальныйпептид90 пар нуклеотидов60 парПЦР//-3'Рис. 21-3. Схема определения emm-типа и ет/п-подтипа.хлороформенной экстракцией выделяют геномную ДНК. Затем с помощью прай¬
меров 5’-TATT(C/G)GCTTAGAAAATTAA-3’ и 5'-GCAAGTTCTTCAGCTTGTTT-3’
(праймеры № 1 и № 2) амплифицируют фрагмент гена етт (рис. 21-3). С помо¬
щью праймера 5’-TATTCGCTTAGAAAATTAAAAACAGG-3’ (праймера етт seq2)
осуществляют секвенирование гипервариабельного участка на 5’-конце гена етт.Для е/гат-типирования используют 150 п.н. амплификата, кодирующие фрагмент
М-белка, начиная с его первой аминокислоты. Полученную последовательность
(150 п.н.) сравнивают с имеющимися в базе даннык (ftp://ftp.cdc.gov/pub/infectious_
diseases/biotech/tsemm) последовательностями етт-тшоъ. Для вьшода о принадлеж¬
ности штамма определенному етт-тпу достаточна последовательность гена етт
длиной 90 п.н., кодирующая первые 30 аминокислот зрелого М-белка (см. рис. 21-3).
Если гомология данного у^шстка с последовательностями известных ет»г-генотипов
менее 92%, Центр контроля заболеваемости присвоит штамму новый етт-тенотш.Етт-тдтш определяют по последовательности с 91-го по 150-й нуклеотид
амплификата. Любые мутации и единичные нуклеотидные замены в данной после¬
довательности — основание для присваивания нового ет/л-подтипа. Например,
аббревиатура «етт4.1ь означает, что штамм Str. pyogenes относится к типу етт4 и
подтипу етт4.1.Стандартизованность метода е«г»г-типирования и воспроизводимость результа¬
тов позволяют проводить надежный мониторинг генотиов Str. pyogenes, вьщелен¬
ных в разные периоды времени в разных регионах. В Африке наиболее распро¬
странены штаммы Sir. pyogenes emml2 и етт75, в Азии — ernml и етт!2. Наиболее
инвазивные штаммы Str. pyogenes в Азии и Латинской Америке — ernml и етт12,
в США на второе место выходят штаммы типа еттЗ. С кожными заболеваниями
в Азии чаще ассоциированы штаммы emml и етт2, в Африке — emmSO, еттЮО,
етт28 и етт74, в Латинской Америке — еттЗЗ и етт53. В России проведены
обследования детских учреждений и воинских коллективов. В частности, обна¬
ружено, что доминирующими е/тгт-типами Str. pyogenes, выделенными от детей
в Санкт-Петербурге, являются еттЗ (31%), етт!2 (19%), етт4 (18%) и emml
(17%). Подобная информация позволяет в определенной мере оценить эпидемио¬
логическую ситуацию и циркуляцию возбудителей различных типов.Технологию е»гт-типирования применяют в основном для щтаммов Str. pyo¬
genes. Однако в базу данных emm-iimo^ внесен и ряд етт-шть стрептококков
серогрупп С и G, технология анализа которых аналогична. Данные о типировании
стрептококков групп С и G разрознены и не систематизированы, основной массив
данных доступен только для штаммов Str. pyogenes.Генотипирование стрептококков группы В. Генетические структуры, детер¬
минирующие синтез капсулы, компактно локализуются в одном участке генома
СГВ и представлены 16-18 однонаправленными генами. Большинство генов
характеризуются высокой консервативностью. Типичный капсульный локус имеет
следующую структуру:•	регуляторные гены;
430ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ•	гены, кодргр>тощие длину полимерной цепи и ее экспорт;•	гены, кодирующие ферменты, определяющие сборку компонентов капсулы
(гликозилтрансферазы);•	гены, кодирующие ферменты, определяющие полимеризацию (полимеразы);•	гены, кодирующие белки, отвечающие за транспорт и синтез моносахаров.В средней части капсульного регулона локализуются наиболее гетерогенные
участки — гены cspG до cspK, кодирующие ферменты, в основном гликоэилтранс-
феразы, отвечающие за межсгруктурные связи компонентов капсулы и опреде¬
ляющие их антигенные различия.Генетические различия между серотипами позволили разработать молекулярно¬
диагностические подходы, основанные на мультиплексной ПЦР, которая пред¬
ставляет собой стандартную ПЦР с одновременным использованием набора
праймеров к генам, кодирующим различные капсульные антигены. Праймеры
подбирают таким образом, чтобы по размеру продукта ПЦР было возможно сде¬
лать заключение о принадлежности исследуемого штамма к определенному серо-
гипу. Этот подход основан на применении двух наборов праймеров. Первая смесь
содержит праймеры на серотипы 1а, Ib, П, П1 и IV, а вторая — на серотипы V, VI,
Vn и VIII. Праймеры dltS'Fíí dItS-R на ген ältS, специфичные для СГВ, предлагают
использовать в качестве положительного контроля (табл. 21-33). Таким образом,
для определения типа штамма СГВ достаточно выполнения трех ПЦР, что доступ¬
но любой современной диагностической лаборатории.Мультилокусное типирование стрептококков. Один ÍÍ3 наиболее признан¬
ных в настоящем приемов молекулярной диагностики — мультилокусное генотипи¬
рование (MLST). Этот метод заключается в сравнительном анализе нуклеотидных
последовательностей наиболее гетерогенных фрагментов ДНК штаммов одного
вида. В настоящее время известны базы данных MLST (btíp://www.mlst.net, http://
pubmlst.org), позволяющие проводить эпидемиологический мониторинг штаммов
многих патогенных микроорганизмов. MLST обладает многими преимуществами
по сравнению с другими методами типирования. Для него характерны высокие
специфичность и достоверность, абсолютная воспроизводимость результатов,
практически полная стандартизованность. Метод MLST информативен и надежен
для эпидемиологического анализа любых микроорганизмов. В базы данных для
анализа включена информация о нуклеотидных последовательностях для Str. pyo¬
genes, Str. agalactiae, Str. pneumoniae, Str, oralis, Str. uberis, Str. suis и Str. zooepidemicus.Для каждого вида обычно выбирают по 1 маркерных генов. В целях сравнения
штаммов конкретные фрагменты данных генов (размером 400-500 п.н.) амплифи¬
цируют с помощью ПЦР и секвенируют. По установленной нуклеотидной последо¬
вательности каждого гена определяют его аллель, а суммарным набором аллелей7	генов для каждого из штаммов характеризуется его мультилокусный генотип
(MLST-тип, ST-тип или ST-sequence genotype). Например, если штамм Str. pyogenes
характеризуется набором аллелей 7 генов 1-1-1-I-1-1-1, то такой набор аллелей
соответствует ST-типу № 1, а если штамм имеет набор аллелей 15-14-7-7-19-3*1,
то его относят к ST-типу № 73. Обнаружение каждого нового аллеля любого из
маркерных генов автоматически приводит к регистрации нового ST-типа.Таблица 21-33. ДНК-праймеры и предполагаемые продукты ПЦР для типирования штаммов СГВПраймерПоследовательность праймеровГенРазмеры ампли¬
кона, П.Н.Номер GenBankla-Fla-RGGTCAGACTGGATTAATG6TAT6CGTAGAAATAGCCTATATACGTTGAATGCcpsiaHcpslaH521 \л 1826АВ028896Ib-FIb-RTAAACGAGAATGGAATATCACAAACCGAATTAACTTCAATCCCTAAACAATATCGcpslbJcpslbK770АВ050723ll-Fll-RGCTTCAGTAAGTATTGTAAGACGATAGnCTCTAGGAAATCAAATAAnCTATAGGGcps2Kcps2K397AY375362
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 43t
Окончание табл. 21-33праймер11-Fal-RaIV-FIV-RV-FV-RVl-FVl-RVll-FVll-Rll-F!I-RditS-FdItS-RПоследовательность праймеровTCCGTACTACAACAGACTCATCCAGTAACCGTCCATACATTCTATAAGCGGTGGTAATCCTAAGAGT6AACTGTCCTCCCCAATTTCGTCCATAATGGTGAGGCCAATCAGTTGCACGTAAAACCITCTCCTTCACACTAATCCTGGACTTGAGATGGCAGAAGGTGAACTGTCGGACTATCCTGATGAATCTCCCTGGAGAGAACAATGTCCAGATGCTGGTCGTGATnCTACACAAGGTCAACCACTATATAGCGATCnCAAATTCCGCTGACTTAGGAATACCAGGGGATGAACCGATTGCTCTAATTCTCCCCTTATGGCГенCßSla/2/ЗІcps1a/2/3Jcps4Ncps4NCps50cps50cps6lcps6icps7Mcps7Mcps8Jcps8J(fitsditsРазмеры ампли¬
кона, П.Н.1,826578701487371282952Номер СелВапкAF163833AF355776AF349539AF337958AY376403AY375363AL766853В табл. 21-34 приведены маркерные гены и соответствующие праймеры,
используемые для мультилокусного типирования трех наиболее патогенных для
человека видов стрептококка — Str, pyogenes, Str. agalactiae и Str. pneumoniae. Для
каждого вида существует свой специфический набор генов и праймеров. В отличие
от Str. pyogenes и Str. pneumoniae, для маркерных генов Str, agalactiae используют по
две пары праймеров — внешнюю, позволяющую амплифицировать относительно
протяженный участок гена (от 589 до 859 п.н.), и внутреннюю, с помощью которой
происходит секвенирование искомых последовательностей (от 459 до 501 п.н.) на
матрицах ДНК, полученных с использованием внешней пары праймеров.К началу 2010 г. в базах данных зарегистрировано 569 MLST-типов для Str. pyogenes,
482 MLST-типа для Str. agalactiae и 4586 MLST-типов для Str. pneumoniae. Например,
инвазивные штаммы Str, pyogenes генотипа emml часто характеризуются типом ST-28,
а инвазивные штаммы генотипа еттЗ — типом ST-15. Среди штаммов Str. agalactiae
наиболее часто встречаются типы ST-1, ST-9, ST-17, ST-19 и ST-23, что указывает на
наличие неизвесгных селективных преимуществ для адаптации к организму человека.
Высокая стандартизация метода MLST позволяет сравнивать друг с другом штаммы,
выделяемые в различных регионах и в разные годы. При этом становится возможным
оценивать уровень эпидемиологического контроля за циркуляцией штаммов.Серологическая диагностикаВыявление стрептококковых антител — диагностический показатель, позво¬
ляющий отличать активную инфекцию и бактерионосительство. Это важно для
постстрептококковых заболеваний, таких как ревматическая лихорадка и гломеру¬
лонефрит, которые почти всегда сопровождаются увеличением содержания анти-
стрептококковых антител в плазме крови. Считается, что 4-кратное повышение
титров антистрептококковых антител свидетельствует о перенесенной стрептокок¬
ковой инфекции. Наиболее показательно выявление антител к стрептолизину-О и
ДНКазе Б.Уровень антител к каждому из этих антигенов определяют с помощью реак¬
ции нейтрализации. Концентрация антител к стрептолизину-О (ASO) достигает
максимума в течение 3-6 нед от начала заболевания. Обычно увеличение содер¬
жания ASO наблюдают при инфекции верхних дыхательных путей, вызванной
Str. pyogenes, в то время как стрептодермия не приводит к их повышенной про¬
дукции. Штаммы Str. dysgalactiae подвида equisimilis также способны к продукции
стрептолизина-О, однако при вызванных ими инфекциях уровень ASO не повы¬
шается и, следовательно, не является диагностическим критерием.ш
Таблица 21-34. Праймеры, используемые для мультилокусного типированияГенКодируемый белокПрямой праймер (5-3')Обратньгй праймер (б’-З')Размер амгли-кона, П.Н.§Streptococcus pyogenesgkiГлюкозокиназа6GCATTGGAATGGGATCACCTCTCCTGCTGCTGACAC498gtrБелок транспорта глутаминаGAGGTTGTGGTGATTATTGGGCAAAGCCCATTTCATGAGTC450таг/ГлутаттрацвтзаTGCTGACTCAAAATGTTAAAATGATTGGATGATAATTCACCGnAATGTCAAAATAG438mutSБелок репарации неправильно
спаренных нуклеотидовGAAGAGTCATCTAGTHAGAATACGATAGAGAGTrGTCACTTGCGCGTTTGATTGCT405recPТранскетолазаGCAAATTCTG6ACACCCAGGCTTTCACAAGGATATGTTGCC459xptКсантинфосфорибо-зилтрансферазаTTACTTGAAGAACGCATCTTAATGAGGTCACTTCAATGCCC450yiqLАцетил-КоА-ацетилтрансферазаTGCAACAGTAT66ACrGACCAGAGAACAAGAT6CCAAGGTCTGGTGAAACCGCTAAAGCCTGAG434Streptococcus agalactiSBadhPАлкогольдегидрогеназаGTTGGTCATGGTGAAGCACT(GGTGTGTGCCATACTGATTT)actgtaggtccagcacgaac(ACAGCAGTCACAACCACTCC)672(498)pt\eSФеиилаланил-тРНК-синтетазаGATTAAGGAGTAGTGGCACG(ATATCAACTCAAGAAAA6CT)ttgagatcgccgattgaaat(TGATGGAATTGATGGOTATG)723(501)atrБелок транспорта глутаминаCGATTCTCTCAGCTTTGTTA(AIGGTTGAGCGAATTATnG)AAGAAATCTCTTGTGCGGAT(GGTTGGTCAACAATAATGGC)627(501)gInAГлутамин синтетазаCCGGCTACAGATGAACAATT(AATAAAGCAATGTTTGATGG)CTGATAATTGCCATTGCACG{GGATTGTTCCCTTCATTATC)589(498)sdt)AСериндегидратазаAGAGCAAGCTAATAGCCAAC(AACATAGCAGAGCTGATGAT)atatcagcagcaacaagtgc(GGGACTTCAACTAAACCTGC)646(519)gIcKГлюкозокиназаctcggaggaaggaccattaa(GGTATCTTGACGCnGAGGG)cttgtaacagtatcaccgtt(ATCGCTGCTTTAATGGCAGA)607(459)tktТранскетолазаccaggctttgatttagttga(ACACTTCATGGTGATGGTTG)AATAGCTTGTTGGCTTGAAA(TGACCTAGGTGATGAGCTTT)859(480)
Окончание табл. 21-34ГенКодируемый белокПрямой праймер (5-3’)Обратный праймер (5-3’)Размер ампли¬кона, Л.Н.Streptococcus pneumoniaeагоЕШикиматдегидрогеназаGCCTTTSAGGCGACAGCТССА6ТТСА(С/А}АААСАТ(АЯ)ТТСТАА405gdhГлюкозо-6-фосфатдегидрогеназаATGGACAAACCAGC(G/AЯ/C)AG(CЯ)TTGCTTGAGGTCCCAT(G/A)CT(G/AЯ/C)CC459gkiГлюкозокиназаGGCATTGGAATGGGATCACCTCTCCCGCAGCTGACAC483гесРТранскетолазаGCCAACTGAGGTCATCCAGGTGCAACCGTAGCATTGTAAC448spiСигнальная пептидаза 1TTATTCCTCCTGATTCTGTCGTGATTGGCCAGAAGCGGAA472xptКсантинфосфорибо-зилтрансферазаTTATTAGAAGAGCGCATCCTAGATCTGCCTCCTTAAATAC486ddlО-аланин-О-аланинл игазаТ6С(СЯ)САА6ТТССТТАТ6Т66САСТбебТ(6/А)АААСС(АЯ)66САТ441-иОСТ1Sо:=1оСОсо
ж434 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ'ШЩо1	Среди четырех продуцируемых стрептококками ДНКаз наиболее значим иммун-18ШЙ	ответ организма на ДНКазу В. Концентрация этих антител достигает макси-мума только через 6-8 нед, однако их уровень сохраняется дольше по сравнению
^ уровнем ASO, что свидетельствует о перенесенной инфекции.Повышение титров антител к продуктам стрептококков можно расценивать как
результат недавнего инфицирования. Однако их однократное определение может
’éj>0¡f¡¡ ввести в заблуждение. Повышенная концентрация ASO определяется только у
80-85% больных ревматизмом, Одновременное определение антител к ДНКазе
в увеличивает чувствительность этого подхода до 97%. Прием антибиотиков в
острую фазу инфекции значительно снижает выраженность иммунного ответа,
увеличение концентрации антител может быть гораздо ниже. Нормальное значе¬
ние титров антител зависит от возраста пациента. Здоровые лица после перенесен¬
ной инфекции могут иметь титр антител выше нормальных величин. Длительное
наблюдение за концентрацией антистрептококковых антител после достижения
пикового значения малоинформативно в диагностическом и прогностическом
плане независимо от того, сохраняется титр на высоком уровне или снижается.
Для отслеживания тенденции титров к возрастанию более информативно опреде¬
ление антител одновременно в нескольких образцах плазмы крови, взятых с
недельным интервалом. При каждом определении концентрации антител следует
использовать контрольные сыворотки с известным титром или стандарт антител.
Сравнение титров возможно между лабораториями, использующими одинаковые
стандарты или идентичные контрольные сыворотки.Определение чувствительности стрептококков к антимикробным препаратамБензилпенициллин остается препаратом выбора при лечении большинства стреп¬
тококковых инфекций. Пенициллинрезистентных штаммов ß-гемолитических
стрептококков не зарегистрировано ни в одной из стрептококковых референс-
лабораторий ВОЗ. Однако с учетом довольно высокой аллергии на бензилпени¬
циллин, обнаруживаемой более чем у 10% пациентов, суи1;ествуют альтернативные
антибактериальные препараты для лечения стрептококковой инфекции —
макролиды. Необходимо отметить, что частота формирования резистентности к
макролидам среди клинических изолятов Str. pyogenes и Str. agalactiae значительно
возрастает как в США, так и в странах Европы, что коррелирует с их широким
использованием в клинической практике в последние годы. У ß-гемолитических
стрептококков и Str. pneumoniae неизвестна устойчивость к ванкомицину. Однако
имеются данные о ванкомицинрезистентности изолята, принадлежащего к Str.
bovis.В связи с формированием резистентности к бензилпенициллину у Str. pneumo¬
niae и других а-гемолитических стрептококков не рекомендуют использовать дан¬
ный антибиотик при начале лечения. Бензилпенициллин применяют для лечения
инфекций, вызванных данными стрептококками, только при их установленной
чувствительности. Имеются сообщения о высокой частоте пенициллинрезистент¬
ных штаммов среди изолятов, принадлежащих к видам Str mitis и Str. salivarius.
Применение фторхинолонов для лечения инфекций, вызванных Str. pneumoniae,
привело к формированию резистентности данного вида к фторхинолонам.Для определения чувствительности стрептококков к антибактериальным пре¬
паратам используют следующие методы:•	определение чувствительности с использованием коммерческих дисков с
определенной концентрацией антибиотика — диско-диффузионный метод;•	метод серийных разведений антибиотика в бульоне, позволяющий опреде¬
лить его минимальную подавляющую концентрацию;•	метод Е-тестов с использованием пластиковой полоски размером 5x50 мм с
нанесенным градиентом концентрации антибиотика.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 435при тестировании чувствительности к антибактериальным препаратам предпо¬
чтительнее использовать агар Мюллера-Хинтона с добавлением 5% дефибрини-
рованной бараньей крови. Толщина слоя кровяного агара в чашке Петри должна
быть 4 мм. Имеет значение качество дисков с антибиотиками. Зону задержки роста
после инкубации чашки в течение 18-20 ч при 36-37 °С измеряют с помощью
линейки, причем необходимо измерять диаметр зоны подавления роста. По вели¬
чине зоны задержки роста интерпретируют полученные результаты. Обязательно
использование контрольных штаммов. Этот подход применяют в бактериологиче¬
ских лабораториях мира в качестве рутинного.ПНЕВМОКОККОВЫЙ СТРЕПТОКОККТАКСОНОМИЯПневмококковый стрептококк (Str. pneumoniae) относится к роду Streptococcus, так¬
сономическое положение которого приведено выше, в разделе «Стрептококки».ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАStr. pneumoniae — грамположительная мелкая бактерия, клетки которой раз¬
мером 0,5-2,0 мкм имеют овальную или ланцетовидную форму. Неподвижные,
расположены попарно или цепочками, спор не образуют, большинство штаммов
имеют капсулу, легко переходят в L-форму.Биохимическая активность Str. pneumoniae сходна с активностью зеленя¬
щих стрептококков других видов. Ферментируют глюкозу, лактозу, мальтозу и
сахарозу до кислоты. Также ферментируют инулин, не ферментируют маннит,
салицин и сорбит. Ферментация углеводов ведет к образованию молочной кис¬
лоты, газ не выделяется. Каталазоотрицателен, способен лизировать эритроциты.
Факультативный анаэроб. На искусственных питательных средах способен расти
при температуре 22-45 °С (оптимум — 37 'С).Продуцирует токсины — гемолизин, лейкоцидин. М-белок Str. pneumoniae обла¬
дает антинейтрофильной активностью. Полисахаридная капсула защищает бакте¬
рию от фагоцитоза и опсонизирующего действия антител. Продукция ферментов —
гиалуронидазы и пептидазы — способствует распространению возбудителя в ткани
пораженного органа.Известно свыше 90 серотипов Str. pneumoniae, различающихся по строению
антигенов полисахаридной капсулы (не менее 40 серогрупп). Повсеместно выяв¬
ляются нетипируемые изоляты, поэтому серотипирование Str. pneumoniae не полу¬
чило распространения в клинической диагностике.Str. pneumoniae чувствительны к физическим и химическим факторам окружаю¬
щей среды, в том числе к дезинфектантам. Способны длительно сохранять жизне¬
способность при низких температурах,КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИStr. pneumoniae вызывает ряд патологических процессов, которые объединены
общим понятием пневмококковой инфекции:•	пневмонию (до 70% внебольничных пневмоний);•	острый средний отит (до 25% отитов);•	гнойный менингит (5-15% бактериальных менингитов);•	бактериальный эндокардит (около 3% инфекционных эндокардитов);•	плеврит:•	артрит;•	конъюнктивит.Нередко пневмококковая инфекция развивается как осложнение других,
как правило вирусных, заболеваний. Пневмококки могут быть выявлены в
436 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯматериале из носоглотки у практически здоровых детей и взрослых — бакте¬
рионосителей.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАЛабораторная диагностика пневмококковой инфекции включает следующие
этапы:•	бактериоскопию;•	посев материала на питательные среды;•	серологическую диагностику;•	экспресс-диагностику;•	молекулярную диагностику;•	биологическую пробу (введение патологического материала внутрибрюшин-
но белым мышам).При гнойных менингитах необходима дифференциальная диагностика с менин¬
гококковой, гемофильной инфекцией и другими бактериальными менингитами.При пневмонии проводят дифференциальную диагностику с инфекционными про¬
цессами, вызванными Я. influenzae. Mycoplasma pneumoniae, М. catarrhalis, S. aureus,
L pneumophila, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa. Chlamydia pneumoniae, a также энте¬
робактериями, ацинетобактериями, анаэробами и патогенными грибами.Материалы для лабораторных исследованийПри гнойных менингитах исследуют СМЖ и кровь.При пневмонии и других клинических формах пневмококковой инфекции
материалом для исследования служат мокрота, аспираты из бронхов, плевральная
жидкость, кровь, отделяемое из среднего уха, СЖ.В некоторых странах при поступлении пациента в стационар рекомендуют
брать пробы крови для серологического исследования и хранить сыворотку в
замороженном виде. При тяжелом течении пневмонии и неэффективности анти¬
биотикотерапии, а также по эпидемическим показаниям через 7-10 дней получа¬
ют повторный образец крови и проводят серологическую диагностику атипичных
пневмоний — легионеллезной, микоплазменной, хламидийной, коронавирусной.
В тех же целях используют дополнительные методы — ПЦР, определение легио¬
неллезного антигена в моче.Для проведения ПЦР материал (СМЖ, кровь и мокроту) собирают в стерильные
емкости с плотно закручивающейся крышкой без транспортной среды. Хранение
и транспортировка этих проб при комнатной температуре допускаются в течение4	ч, при температуре 4 X — в течение суток.Бактериоскопияпри бактериоскопии мазка нативной СМЖ или препарата толстой капли, окра¬
шенных водно-спиртовым раствором метиленового синего, выявляют диплококки
ланцетовидной или овальной формы, как правило, окруженные общей капсулой.
Бактерии могут располагаться в виде коротких цепочек.Мазки мокроты окрашивают по Граму и микроскопируют с иммерсионным
объективом. При их просмотре обращают внимание на наличие альвеолярных
макрофагов, всегда обнаруживаемых в мокроте, и гранулоцитов, появляющихся
в значительных количествах при воспалительных процессах в нижних отделах
дыхательного тракта. Отсутствие гранулоцитов и альвеолярных макрофагов
и большое количество эпителиальных клеток указывают на примесь слюны в
исследуемом материале и необходимость повторения исследования. Str. pneu¬
moniae быстро перевариваются фагоцитами, именно поэтому более вероятно их
расположение вблизи гранулоцитов, а не внутрилейкоцитарно. Str. pneumoniae в
мазках мокроты имеют вид грамположительных, мелких ланцетовидных клеток,
окруженных зоной неокрасившейся капсулы.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ437Изоляция возбудителяStr. pneumoniae растет на питательных средах, обогащенных углеводами, содер¬
жащих кровь, сыворотку, асцитическую жидкость.СМЖ высевают на среду обогащения (0,1% сывороточный агар) и шоколадный
агар, кровь — на двухфазную среду.Учитывая возможность возникновения при пневмониях транзиторной бактерие¬
мии, исследуют кровь методом гемокультуры. Гнойные комки мокроты, аспират из
бронхов и тому подобный патологический материал высевают в чашки Петри на 5%
кровяной или шоколадный агар. Высеваемость пневмококков из мокроты возрас¬
тает при использовании селективных питательных сред, содержащих ингибиторы
роста сопутствующей микрофлоры (среды с гентамицином в его конечной концен¬
трации 5 мг/л или колумбийского агара с колистином и налидиксовой кислотой).Посевы инкубируют при 37 °С и содержании в атмосфере 5-10% углекислого
газа. После 18-24 ч инкубации посевы просматривают под стереомикроскопом
или под лупой. Учитывают количество и морфологию выросших колоний, готовят
мазки и окрашивают их по Г^аму.При наличии Str. pneumoniae в исследуемом материале через сутки инкубации
при температуре 37 “С и содержании в атмосфере 5-10% углекислого газа:на 0,1% сывороточном агаре рост пневмококков начинается в верхней
части среды, постепенно распространяясь вниз;на двухфазной среде через 24 ч отмечается помутнение жидкой части
среды и образование мелких, не склонных к слиянию колоний на поверх¬
ности плотной фазы;на сывороточном агаре определяются нежные, мелкие, не сливающиеся
колонии, часто уплощенные, с углублением в центре;
на шоколадном агаре наблюдаются мелкие, не сливающиеся колонии,
окруженные гемолитической зоной желто-зеленого цвета;
на кровяном агаре определяются мелкие, плоские, не сливающиеся коло¬
нии с зоной зеленящего гемолиза.Если в мазках из подозрительных на Str. pneumoniae колоний определяются
грамположительные диплококки, из таких колоний делают отсевы на сывороточ¬
ные или кровяные среды для получения чистой культуры.При достаточном количестве колоний, выросших на сывороточном или шоко¬
ладном агаре, допускается их отсев на дифференциально-диагностические среды.
Колонии, подозрительные на Str. pneumoniae, отсевают на сектора чашек с кро¬
вяным агаром. Выросшие культуры используют для контроля чувствительности
к желчи и антибиотикорезистентности. Если колоний мало, проводят отсев на
чашку с сывороточным или шоколадным агаром для накопления чистой культуры,
с которой выполняют дальнейшую идентификацию бактерий.Если на чашках с прямыми посевами патологического материала рост отсут¬
ствует, проводят высевы из среды обогащения (0Д% сывороточного агара) на
шоколадный или сывороточный агар, повторяя высевы в течение 5 дней инкуба¬
ции или до появления первых признаков роста.На 3-й день исследования учитывают характер гемолиза на секторах с кровяным
агаром, готовят мазки и окрашивают их по Граму. При сплошном росте на секторах
уже в этот день может быть выполнена проба на чувствительность к желчи: на агар
с выросшими колониями помещают диски, пропитанные 20% раствором желчи,
через 1-2 ч инкубации при температуре 37 °С колонии пневмококков вокруг дис¬
ков лизируются и образуется зона просветления шириной 1-2 мм.Биохимическое исследованиеДифференциацию Str. pneumoniae от других видов стрептококков проводят с
помощью проб с оптохином и дезоксихолатом.✓
Проба с оптохином. Выполняют газонный посев исследуемой культуры
на чашку с кровяным агаром. Таким же образом высевают контрольные тест-
культуры — положительный контроль (Str, pneumoniae) и отрицательный контроль
(Str. salivarius). Затем на поверхность агара помещают диски, содержащие 5 мкг
оптохина.Через 18-24 ч инкубации посевов, содержащих Str. pneumoniae, при температуре
37 вокруг дисков с оптохином проявляется зона отсутствия роста диаметром
более 14 мм при диаметре диска 6 мм и более 16 мм при диаметре диска 10 мм.
Ингибирования Str. salivarius вокруг дисков не наблюдается.Чувствительность подозрительных на Str. pneumoniae культур к желчным кисло¬
там контролируют желчным тестом или дезоксихолатной пробой.Проба с дезоксихолатом. В 0,85% растворе NaCl готовят суспензию иссле¬
дуемой культуры с мутностью 1 по стандарту мутности и вносят по 0,5-1,0 мл в
две пробирки, в одну из пробирок (тест) добавляют 0,15 мл 10% раствора дезок-
сихолата натрия, в другую пробирку (контроль) — 0Д5 мл 0,85% раствора NaCL
Содержимое перемешивают, выдерживают при 35 X в течение 1-2 ч и сравнивают
мутность суспензий в обеих пробирках.Просветление суспензии в тест-пробирке указывает на принадлежность куль¬
туры к Str. pneumoniae (дезоксихолат активизирует аутолиз бактериальных клеток
пневмококков, что не свойствено стрептококкам других видов). Важно помнить,
что около 15% штаммов Str. pneumoniae не лизируются в данных условиях или
лизируются не полностью.Экспресс-диагностикаРеакцию латекс-агглютинации рекомендуют в качестве одного из методов обна¬
ружения Str. pneumoniae при гнойных менингитах. Встречный иммуноэлектрофо¬
рез, ИФА, иммунофлюоресцентный анализ применяют для определения пневмо¬
кокков или их антигенов в патологическом материале в качестве дополнительных
методов диагностики пневмококковой инфекции.Молекулярно-генетические методы диагностикиВ качестве основного метода молекулярной диагностики используют ПЦР.
В ней исследуют СМЖ, кровь и мокроту.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМИсследование проводят методом серийных разведений (в бульоне или агаре)
или диско-диффузионным методом. В качестве жидкой питательной среды исполь¬
зуют бульон Мюллера-Хинтона с добавлением лизированной крови лошади.
В качестве плотной питательной среды (для метода серийных разведений и диско¬
диффузионного метода) используют агар Мюллера-Хинтона, содержащий 5%
дефибринированной крови барана,МЕНИНГОКОККТАКСОНОМИЯМенингококк (Neisseria meningitides) — бактерия рода Neisseria, семейства
Neisseriaceae. Помимо N. meningitidis, род включает N. gonorrhoeae^ и непатогенные
виды — N. sicca, N. mucosa, N. subflava, N.flavescens, нередко выделяемые из носо¬
глоточной слизи, а также N. lactamica, которая в редких случаях вызывает гнойные
отиты, синуситы. Различают серогруппы менингококка — А, В, С, D, Н, I, К, L, X,
Y,Z, 29Еи W-135.438 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯштё.^ Информация по этой инфекции приведена в следующей главе.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 439ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАN. meningitidis — грамотрицательный диплококк, неподвижный, образующий
капсулу, аэроб. Проявляет слабую биохимическую активность — ферменти¬
рует только глюкозу и мальтозу с образованием кислоты без газа, оксидазо-,
каталазоположителен, желатин не разжижает. Во внешней среде неустойчив.В носоглоточной слизи сохраняется до 2 ч, погибает при температуре 50 '"С в "
течение 5 мин, при температуре 10 °С — в течение 2 ч. Оптимальная температура
размножения менингококка — 37 “С, при температуре 35 “С развитие бактерий ш
резко замедляется.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИN. meningitidis — безусловный патоген, возбудитель менингококковой инфек¬
ции, которая может протекать в следующих клинических формах:•	генерализованная менингококковая инфекция:❖	гнойный бактериальный менингит;❖	менингоэнцефалит;❖	менингококцемия;•	локализованная инфекция:❖	назофарингит;> носительство менингококка;•	редкие формы:❖	артрит:❖	эндокардит;❖	иридоциклит;^ пневмония.Наибольшую опасность представляет генерализованная менингококковая
инфекция, которая примерно в 30% случаев протекает в гипертоксической форме
с высокой частотой летальных исходов.В этиологической структуре спорадических случаев гнойных бактериальных
менингитов (ГБМ) менингококковая инфекция занимает первоеместо. Следующие
по частоте этиологические факторы ГБМ — Str. pneumoniae, Н. influenzae серо¬
типа Ь, М. tuberculosis. У новорожденных и детей в возрасте до 1 мес ГБМ, как
правило, обусловлены стрептококками группы В, эшерихиями, листериями. При
черепно-мозговых травмах, нейрохирургических и челюстно-лицевых операциях
возможно возникновение ГБМ как осложнения основного заболевания. В этих
случаях ведущая роль принадлежит Str. pneumoniae, стафилококкам, колиформ-
ным бактериям и Р. aeruginosa, однако возможно развитие молниеносных форм
менингококковой инфекции при недиагносгированном менингококковом назофа-
рингите или носительстве менингококка. Следовательно, незамедлительная иден¬
тификация возбудителя необходима для выбора этиотропной терапии больных
ГБМ. В этнологической структуре генерализованной менингококковой инфекции
более 90% случаев обусловлены менингококками серогрупп А, В и С.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
Материалы для лабораторных исследованийОсновной патологический материал для исследований при генерализованных
формах менингококковой инфекции и других ГБМ — СМЖ, кровь и моча. Для
бактериологического подтверждения менингококкового назофарингита и носи¬
тельства менингококка необходимо исследование носоглоточной слизи.Тяжелый симптомокомплекс клинических проявлений в первые дни болезни
указывает на необходимость экстренного незамедлительного проведения иссле¬
дований по определению этиологии заболевания с обязательным использованием
методов экспресс-диагностики.
440 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯДанное исследование включает;•	микроскопию препарата толстой капли крови и СМЖ;•	первичный бактериологический посев СМЖ и крови с последующей иден¬
тификацией нейссерий и определением чувствительности к антимикробным
препаратам;Ш	• Реакцию латекс-агглютинации для обнаружения полисахаридного (группо¬специфического) антигена менингококка в СМЖ, крови и моче;•	встречный иммуноэлектрофорез для определения антигенов менингококка в
СМЖ или плазме крови;•	ИФА для определения антигенов менингококка в СМЖ или плазме крови;•	ПЦР для выявления генетического материала менингококка в СМЖ или
плазме крови;•	серологическое исследование для обнаружения группоспецифических анти¬
тел к менингококкам в сыворотке крови больных с помощью РНГА (РПГА)
или ИФА.СМЖ получают методом люмбальной пункции или пункции желудочков мозга
и распределяют следующим образом:•	1 мл направляют на ликворо- и цитологическое исследование;•	1 мл направляют на бактериологический посев (если он не выполнен у посте¬
ли больного), бактериоскопию, реакцию латекс-агглютинации, встречный
иммуноэлектрофорез, ИФА для определения антигенов менингококков;•	0,5 мл высевают на чашку с шоколадным агаром непосредственно у постели
больного;•	0,5 мл вносят в пробирку со средой обогащения (5 мл 0Д% полужидкого
сывороточного питательного агара) в момент выполнения люмбальной
пункции;•	0,2 мл в пробирке типа «Эппендорф» незамедлительно направляют на
молекулярно-генетическое исследование (допускается хранение образцов
материала при температуфе 4 Т не более 3 сут).Кровь отбирают методом венепункции. Взятую пробу распределяют следую¬
щим образом:•	для препарата толстой капли;•	5-10 мл крови у взрослых (2,0-2,5 мл — у детей, 1-2 мл — у новорожденных)
направляют на бактериологическое исследование для выделения и иденти¬
фикации чистой культуры и определения чувствительности к антимикроб¬
ным препаратам;•	3-5 мл крови направляют в лабораторию для получения сыворотки и
выполнения встречного иммуноэлектрофореза, реакции латекс-агглю¬
тинации, ИФА для определения антигенов менингококков и серологиче¬
ских реакций (РНГА, ИФА) на наличие антител к менингококкам серо¬
групп А, В, С.Носоглоточную слизь берр натощак стерильным зондом-тампоном (предпо¬
чтительнее вискозным или дакроновым, так как ватные тампоны часто бывают
токсичными для менингококка). Зонд-тампон заводят за мягкое небо в носоглотку
и проводят несколько раз по ее задней стенке. Взятые пробы доставляют в лабо¬
раторию в транспортных средах с линкомицином, Стюарта, Кэри-Блэйр, Эймса
(если срок транспортировки превышает 3 ч).Материал, предназначенный для бактериологического исследования на менин¬
гококковую инфекцию, доставляют в лабораторию незамедлительно в контейне¬
рах или термосумках, поддерживая в них температуру 37 ""С. До момента посева
материала допускается его хранение при 37 °С не более 12 ч.Нативную СМЖ для реакции латекс-агглютинации, встречного иммуноэлек¬
трофореза и ПЦР допускается хранить при температуре 4 "С в течение суток.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ441Остатки СМЖ и плазмы крови хранят при температуре 4 “С в течение недели на
случай дополнительных исследований.Материалы (СМЖ, кровь), хранившиеся при комнатной температуре или в
холодильнике, как правило, непригодны для культивирования менингококков.Бактериологическое исследованиеСпинномозговая жидкость. Немедленно после доставки в лабораторию
СМЖ центрифугируют при 2500-3000 об./мин (1500 g) в течение 10-15 мин.
Надосадочную жидкость осторожно отсасывают стерильной пипеткой и затем
используют для проведения реакции латекс-агглютинации или встречного имму¬
ноэлектрофореза, позволяющих выявить группоспецифические антигены менин¬
гококка.Толстую каплю СМЖ наносят на предметное стекло, дают свободно растечься
и высушивают при 37 “С или при комнатной температуре. Препарат окрашивают
без предварительной фиксации водно-спиртовым раствором метиленового синего
в течение 2-3 мин и осторожно промывают водой, затем просушивают и микро¬
скопируют, просматривая при необходимости не менее 20 полей зрения. Отмечают
наличие и характер расположения (внеклеточно, внутрилейкоцитарно), морфоло¬
гию и тинкториальные свойства бактерий.Затем проводят посев на питательные среды (если он не был выполнен у постели
больного): примерно по 2 капли осадочной фракции СМЖ стерильной пипеткой
высевают на чашку с предварительно прогретым в термостате шоколадным агаром
и в пробирку с предварительно подогретым 0,1% полужидким сывороточным ага¬
ром (среда обогащения).Если СМЖ получена в недостаточном количестве (1-2 капли) из нее готовят
толстую каплю, а к остатку материала в пробирке добавляют 1 мл подогретого
до 37 °С питательного бульона, перемешивают и сеют на шоколадный и в 0,1%
полужидкий агар. Чашки и пробирки с посевами немедленно помещают в термо¬
стат и инкубируют при 37 “С и содержании в атмосфере 5-10% углекислого газа.
Через 24 и 48 ч посевы проверяют на наличие роста бактерий. При его наличии на
чашках с агаром готовят мазки и окрашивают по Граму. Определяют каталазную
и оксидазную активность, делают посев на сывороточный агар для получения
чистой культуры.При наличии роста на 0,1% полужидком сывороточном агаре с него проводят
высев на шоколадный агар и продолжают работу по выделению чистой культуры
и идентификации возбудителя, как описано выше.На 3-й день исследования контролируют чистоту культур, выросших на сыворо¬
точном агаре, учитывают наличие или отсутствие пигментообразования, выполня¬
ют посев на желточную среду (для более точного контроля пигментообразования),
делают контрольный посев на бессывороточную среду и посевы на сахаролитическую
активность. При достаточном количестве чистой культуры уже в этот день может быть
вьшолнена РГА группоспецифическими менингококковыми антисыворотками.На 4-й день учитывают результаты посевов предыдущего дня — чистоту куль¬
туры, наличие или отсутствие пигментообразования на желточной среде, наличие
или отсутствие роста на бессывороточной среде, сахаролитическую активность,
выполняют окончательную идентификацию серогруппы менингококка в РГА.По результатам контролей выдают окончательный ответ. Чистую культу¬
ру менингококка используют для контроля антибиотикорезистентности.
Исследование первичных посевов на среду обогащения завершают на день позже
(на 5-й день).Кровь. Толстую каплю крови готовят у постели больного нанесением 1 капли
крови на середину предметного стекла, распределяя ее так, чтобы диаметр
составлял примерно 1 см. Высушивают на воздухе и доставляют в лабораторию.
тїф442 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯОкрашивают, не фиксируя, водно-спиртовым раствором метиленового синего
в течение 2-3 мин, осторожно промывают водой и подсушивают на воздухе.
Просматривают под иммерсией не менее 20 полей зрения, регистрируя внеклеточ¬
но и внутриклеточно расположенные бактерии.Ш!	Посев крови проводят во флаконы с двухфазной питательной средой в соотно-шении 1 часть крови на 10 частей жидкой фазы среды. Б настоящее время доступ -тны готовые двухфазные среды, содержащие факторы роста V, X и витамины.Флаконы с посевами инкубируют при температуре 37 °С в течение 5 сут,
ежедневно контролируя микробный рост (наличие помутнения, хлопьевидного
осадка, образования газа, пленки, колоний на плотной фазе питательной среды).
Независимо от наличия или отсутствия признаков роста через 48 ч инкубирования
проводят посев жидкой фазы среды на шоколадный агар.При признаках роста готовят мазки из бульона двухфазной среды и колоний,
выросших на агаре под жидким слоем, окрашивают по Г^аму в модификации
Калины, а также проводят посев на шоколадный агар. Если в мазках, окрашенных
по Граму. обнаруживают бактерии, отличающиеся от менингококков, пневмокок¬
ков и гемофильных палочек, помимо посева на шоколадный агар проводят посев
на элективные питательные среды.Из колоний, выросших на шоколадном агаре, готовят мазки, окрашивают по
Граму, определяют оксидазную и каталазную активность, осуществляют отсев на
сывороточный агар для пол>^ения чистой культуры. Затем исследование ведут,
как описано выше (3-й, 4-й день исследования).Носоглоточная слизь. Посев проб носоглоточной слизи выполняют неза¬
медлительно после доставки в лабораторию. Материал, содержащийся на зонде-
тампоне, втирают на % площади чашки с сывороточным агаром и У* чашки с селек¬
тивным агаром (содержащим линкомицин). Оставшиеся площади агара на чашке
засевают штриховым методом с помощью бактериологической петли, начиная
штрихи с места посева тампоном.Чашки инкубируют при температуре 37 “С, через 22-24 ч их просматривают.
При наличии роста оценивают характер колоний, предварительно дифференцируя
колонии N. meningitidis и непатогенных нейссерий. На сывороточном агаре и агаре
с линкомицином менингококки формируют через 24 ч роста плоские или слегка
выпуклые, нежные, голубовато-опалесцирующие колонии диаметром 1 мм с ров¬
ными краями.N. subflava и N.flavescens образуют более крупные (1-2 мм в диаметре) колонии
желтого цвета, окраска которых усиливается при выдержке на свету.N. mucosa образует мутно-белые, слизистые колонии диаметром 1-2 мм.N. sicca формирует мелкие, сухие, плохо снимающиеся колонии желтоватого
цвета.N. lactamica образует круглые колонии желтоватого цвета с ровными краями,
диаметром 1-1,5 мм.М. catarrhalis формирует круглые, выпуклые колонии беловатого цвета, диа¬
метром 1,5-2 мм.Из колоний, подозрительных на менингококк, осуществляют отсевы на сектора
чашек или пробирки с сывороточным агаром для получения чистой культуры и
дальнейшей идентификации. Параллельно проводят посев на бессывороточный
питательный агар, на котором растут сапрофитные виды Neisseria и не растут
N. meningitidis и N. gonorrhoeae.Идентификация JV. meningitidis. Идентификацию менингококка проводят
на основании исследования морфологических, тинкториальных, культуральных,
ферментативных и антигенных свойств чистой культуры изолята.При бактериоскопии толстой капли крови или СМЖ, окрашенной метиленовым
синим, на голубом фоне выявляются кокки и диплококки бобовидной формы,
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ443обращенные друг к другу вогнутыми сторонами. Весьма характерно внутрилейко-
цитарное расположение бактерий, но часто встречается и внеклеточное располо¬
жение или их сочетание в различной степени.На чашках с шоколадным агаром менингококки образуют нежные, полупро¬
зрачные, сероватые колонии диаметром 1-2 мм, маслянистой консистенции
(легко снимаются петлей), не изменяют цвета среды.На 0,1% полужидком сывороточном агаре вызывают интенсивное помутнение
верхней части питательной среды.На двухфазной питательной среде вызывают помутнение ее жидкой фазы и
развитие полупрозрачных колоний на поверхности плотной фазы. На чашках с
сывороточным агаром менингококк формируют плоские или слегка выпуклые,
нежные, голубоватые колонии с ровными краями и гладкой поверхностью.На питательных средах без добавления сыворотки или крови животных менин¬
гококки в первых генерациях не растут.Для окрашивания мазков культур менингококка рекомендуют использование
метода Грама в модификации Калины. Его проводят следующим образом: на обе¬
зжиренное стекло наносят каплю 0,15 М раствора натрия хлорида, в ней суспенди¬
руют исследуемую бактериальную культуру, затем в каплю суспензии вносят каплю
спиртового раствора бриллиантовой зелени. Препарат подсушивают и фиксируют
над пламенем, затем наливают основной краситель на 1,5-2 мин. Краску сливают,
препарат промывают водой, затем отмывают спиртом до видимого отхождения
краски и немедленно промывают водой. После этого докрашивают препарат
водным раствором фуксина в течение 2 мин, промывают водой, просушивают и
просматривают под иммерсией при большом увеличении. Грамотрицательные
бактерии окрашиваются в ярко-розовый цвет, грамположительные — в сине-
черный.В мазках, окрашенных по Граму, менингококки, как и другие нейссерии, выде¬
ленные на искусственных питательных средах, грамотрицательны, полиморфны
по размерам и форме (округлая или овальная форма, размеры 0,6-1 мкм). Парное
классическое расположение и форма в виде диплококков бобовидной формы,
обращенных вогнутыми сторонами друг к другу, характерны только для изолятов
менингококка, выделенных из СМЖ или крови.Культуры менингококков, выращенные на сывороточном или шоколадном
агаре, оксидазо- и каталазоположительны. Сахаролитическая активность различ¬
на у разных видов нейссерий (табл. 21-35), что позволяет провести внутривидовую
идентификацию менингококков.Таблица 21-35, Сахаролитическая активность нейссерийВидУглеводыглюкозамальтозалактозасахарозаN. meningitidis++--N. gonorrhoeae+---М. ubflava++-+М. sicca++-+N. flavescens----N. lactamica+++-N. mucosa++-+N. catarrhalis----В настоящее время имеются коммерческие системы биохимической идентифи¬
кации нейссерий, которые могут заметно ускорить и упростить исследование.Внутривидовую идентификацию — определение серогруппы менингококка —
выполняют в РГА чистой культуры возбудителя с помощью агглютинирующих
шщ444ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯсывороток серогрупп А, в, с, X, Y, Z, W-135, 29Е или с помощью группоспецифи¬
ческих тест-систем для ИФА.Экспресс-диагностикаДля ускоренного обнаружения антигенов (капсульных полисахаридов) менин¬
гококка в биологическом материале (СМЖ и крови) применяют;•	реакцию латекс-агглютинации;•	встречный иммуноэлектрофорез;. ИФА.На фоне антибиотикотерапии экспресс-тесты могут быть более эффективны,
чем бактериологическое исследование, так как регистрируют в исследуемом пре¬
парате не только жизнеспособные, но и разрушенные бактерии.Для выполнения экспресс-тестов применяют коммерческие тест-системы, заре¬
гистрированные Б России в установленном порядке.Реакцию латекс-агглютинации ставят на стекле, смешивая капли надосадочного
слоя СМЖ, прогретой до 100 "С в течение 5 мин, со специфическими реагентами
(серогрупп А, В, С, Y, W-135). Учет реакции проводят через 2 мин после смеши¬
вания компонентов. Тест позволяет получить ответ в течение 5-15 мин с момента
выполнения люмбальной пункции.Встречный иммуноэлектрофорез выполняют по общепринятой методике в 1%
агаре на мединал-вероналовом буферном растворе (pH = 8,6). В качестве материа¬
ла для исследования используют СМЖ (цельную, осадок или надосадочную жид¬
кость), а также плазму крови. Коммерческие группоспецифические антименинго-
кокковые преципитирующие антисыворотки вносят в лунки со стороны анода, а
исследуемый материал — со стороны катода. Продолжительность исследования
составляет 20-30 мин, что позволяет (с учетом подготовительных процедур) полу¬
чить ответ через 1-1,5 ч.ИФА для определения антигенов менингококков предпочтительнее выполнять
с осветленной СМЖ или плазмой крови больного в соответствии с инструкциями
к ИФА-тест-системам. Продолжительность ИФА составляет не менее 2 ч.Молекулярно-генетические методы диагностикиОпределение участков генома менингококка в ПЦР — более чувствительный
метод диагностики по сравнению с бактериологическим исследованием, не требует
присутствия жизнеспособных микробных клеток в исследуемом материале и, сле¬
довательно, пригоден для диагностики на фоне антибиотикотерапии.Материалом для исследования служат СМЖ, кровь, носоглоточная слизь,
аутопсийные материалы, наиболее целесообразно исследование СМЖ и крови.
Пригодны образцы сразу же после их получения, а также хранившиеся при тем¬
пературе 4 “С в течение 3 сут, при температуре -20 °С — в течение нескольких
месяцев, температуре -70 “С — неограниченно долго.Для выполнения теста необходимо стандартное оборудование для ПЦР или
ПЦР в режиме реального времени и коммерческие наборы реагентов. Выполнение
процедур и учет результатов должны строго соответствовать инструкциям по
применению соответствующих наборов для ПЦР-диагностики менингококковой
инфекции. Существуют коммерческие отечественные ПЦР-наборы для диагно¬
стики менингококковой инфекции и дифференциальной диагностики гнойных
менингитов, вызванных менингококками, пневмококками (Str. pneumoniae) и
гемофильными палочками (Н. influenzae).Серологическая диагностикаСерологические тесты (РНГА, ИФА) выполняют функцию вспомогательных
методов диагностики менингококковой инфекции. При отрицательных показани¬
ях других тестов (например, на фоне антибиотикотерапии) они, тем не менее, могут
дать полезную информацию при исследовании парных сывороток, полученных в
шшШЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 445первые 3 сут и затем на 10-12-е сутки болезни. Антитела при менингококковой
инфекции группоспецифичны, появляются в крови на 5-7-е сутки заболевания, их
высокий уровень сохраняется в течение месяца и более.При оценке результатов серологического исследования необходимо учитывать,
что в Российской Федерации и ряде других стран существуют вакцины против
менингококков серогрупп А и с, которые могут применяться по эпидемическим
показаниям.Интерпретация результатов лабораторных исследованийобнаружение менингококков, их антигенов или генома в СМЖ или плазме
крови больных указывает на генерализованную менингококковую инфекцию.Обнаружение менингококков, их антигенов и генома только в материале из
носоглотки пациента не является достаточным доказательством менингококковой
этиологии менингита, менингоэнцефалита или сепсиса у больного и расценивается
как свидетельство локализованной формы менингококковой инфекции или носи¬
тельства менингококка.Присутствие антител к менингококкам в плазме крови может бьггь результа¬
том перенесенного менингококкового назофарингита, бактерионосительства или
предшествовавшей вакцинации менингококковыми вакцинами (последнее отно¬
сится к антителам против менингококков серогрупп А и С).Четырехкратное и более нарастание антител в РНГА, а также сероконверсия по
данным ИФА при исследовании парных сывороток — ретроспективное доказа¬
тельство менингококковой инфекции.Определение чувствительности к антибактериальным препаратамМенингококки высокочувствительны к бензилпенициллину, который остается
препаратом выбора для лечения менингококкового менингита и менингоэнцефа¬
лита. В зарубежной литературе имеются сообщения о появлении пенициллинрези-
сгентных штаммов менингококков. При менингококковом сепсисе (менингокок-
цемии) необходимы и другие схемы антибиотикотерапии.Контроль антибиотикорезистентности менингококков осуществляют мето¬
дами серийных разведений в агаре или бульоне или методом Е-теста. Диско¬
диффузионный метод не рекомендзтот.Для выполнения Е-теста требуется агар Мюллера-Хинтона с добавлением 5%
овечьей крови, взвесь чистой суточной культуры менингококка с мутностью 0,5 по
стандарту мутности, стрипы Е-тестов бензилпенициллина, цефотаксима, цефтри-
аксона, хлорамфеникола, доксициклина, рифампицина и триметоприма (возмож¬
ны другие стрипы по показаниям). В суспензии менингококка смачивают ватный
тампон, слегка отжимают его о стенку пробирки и проводят посев тампоном на
чашку со средой, тщательно втирая бактериальную взвесь для равномерного рас¬
пределения по всей площади чашки. Затем на поверхность агара помещают стрипы
Е-тестов (на чашку диаметром 90 мл необходимо 2 стрипа, 150 мм — 5 стрипов).Посевы инкубируют при температуре 37 “С и содержании в атмосфере 5%
углекислого газа в течение 24 ч. Результаты учитывают согласно инструкции по
применению Е-тестов.ЛИСТЕРИИТАКСОНОМИЯВ 9-м издании определителя Берджи род Listeria относят к 19-й группе микро¬
организмов — грамположительные, неспорообразующие палочки правильной
формы. Анализ гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК листерий и
близких к ним микроорганизмов показал, что листерии филогенетически наибо-
446ЧАСТНАЯ ткровтпошялее близки к роду Brochotrix и вместе с данным родом занимают промежуточное
положение между бациллами и лактобациллами, несколько более удалены от
лЩ стрептококков, а также родов Kurthica, Gemella и Erysepelothrix. Из шести извест-
НЫХ в настоящее время видов листерий (I. monocytogenes, L seeligeri, L welshimeri,
P'fqp'J L- innocua, L ivanovii, L gray) только L. monocytogenes патогенна для человека и
животных, а I. ivanovii — только для животных.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАЛистерии — грамположительные короткие палочки с закругленными концами,
иногда почти кокки, одиночные или в коротких цепочках (0,4-0,5х0,5-2,0 мкм),
реже образуют длинные нргги. Ферментируют глюкозу, каталазоположительны,
оксидазоотрицательны, образуют цитохромы. Оптимальная температура роста
составляет 30-37 "С, могут расти как при температуре 20-25 °С, так и при темпера¬
туре 4 °С. При температуре 20-25 X листерии подвижны за счет немногочислен¬
ных перитрихиальных жгутиков. При температуре 37 "С жгутики, как правило, не
образуются и листерии неподвижны. Не кислотоустойчивы, не образуют споры и
капсулу, факультативные анаэробы, хемоорганотрофы.Литстерии терморезистентны в связи:•	с внутриклеточным паразитизмом, снижающим чувствительность к теплово¬
му воздействию;•	феноменом теплового шока, когда короткая экспозиция при 44-48 X повы¬
шает устойчивость бактерий к термообработке в бульоне, молоке и мясе.Для полного восстановления частично инактивированных повышенной темпе¬
ратурой листерий важное значение имеет инкубация в течение 6-9 ч в неселектив¬
ной питательной среде при температуре 20-40 X. Более низкая температура (5 и
12 “С) снижает уровень восстановления. Такие компоненты питательной среды,
как углеводы, соли, глицерин или маннит, способствуют восстановлению клеток,
тогда как фруктоза и хлорид аммония ускоряют их деградацию.Высокая устойчивость к изменениям pH, концентрации солей, а также способ¬
ность к росту в аэробных условиях позволяют листериям размножаться в пищевых
продуктах с длительным сроком хранения.ЭПИДЕМИОЛОГИЯL. monocytogenes распространена повсеместно и представляет собой зооноз с
природной очаговостью и многочисленными источниками инфекции. Основной
природный резервуар — грызуны, насекомоядные, птицы и жвачные.Основные пути передачи инфекции — контактный (через кожу и слизистые
оболочки), алиментарный, аэрогенный, трансмиссивный (через кровососущих
насекомых).В связи с низкой патогенностью возбудителя заболеваемость носит спорадиче¬
ский характер.Для листериоза характерна сезонность — пик заболеваемости приходится на
зимне-весенний период.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИL. monocytogenes протекает у человека остро, подостро, хронически и абортивно,
вызывая ряд синдромов:•	ангинозно-септический (с мононуклеозом);•	окулогландулярный;•	септико-тифозный;•	нервный;•	листериоз беременных;•	аборт и рождение мертвых детей;•	септико-гранулематозный (сепсис новорожденных);
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ447•	менингит новорожденных;•	зфетральный.Прогноз при листериозе серьезный: у взрослых он в 30% случаев заканчивается
летально (а у людей с иммунодефицитом этот показатель вдвое выше).Особую опасность представляет внутриутробное заражение плодов, обычно
приводящее к аборту или рождению мертвых детей вследствии интенсивного
поражения (образования абсцессов и гранулем) в легких, печени и ЦНС. У выжив¬
ших внутриутробно инфицированных листериями новорожденных в течение 3 нед
после родов развивается менингит, приводящий в 50-90% сл)^аев к летальному
исходу.у взрослых людей с иммунодефицитом и алкоголиков инфекция наиболее часто
проявляется менингитом (55%), септицемией (25%) и эндокардитом (7%).ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАДля диагностики листериоза применяют иммунологические, бактериологи¬
ческие и серологические методы. ПЦР используют в качестве дополнительного
метода при исследовании клинического материала и для быстрой идентификации
изолятов листерий.Материалы для лабораторных исследованийПри подозрении на листериоз исследованию подвергают:•	кровь и СМЖ — при сепсисе, менингите и менингоэнцефалите;•	меконий — при заболеваниях новорожденных;•	околоплодную жидкость, плаценту, отделяемое родовых путей.При отягощенном акушерском анамнезе, патологическом течении беременно¬
сти, воспалении яичников и шейки матки исследования на наличие листерий —
обязательный компонент расширенного обследования генитального тракта. При
аутопсии мертворожденного или погибшего в первые дни жизни ребенка бакте¬
риологическому исследованию подвергают кусочки головного мозга, печени и
селезенки, при клинических формах листериоза исследуют содержимое абсцесса,
экссудат, СМЖ, перитонеальную и перикардиальную жидкости, отделяемое глаз и
носоглотки. Исследование фекалий, за исключением случаев развития гастроэнте¬
ритов, имеет скрининговое, а не диагностическое значение.Биологический материал для микробиологической диагностики листериоза сле¬
дует забирать в максимально стерильных условиях, тщательно соблюдая правила
асептики. Пробы для посева на питательные среды необходимо брать до начала
антибиотикотерапии или в интервалах между приемом антибактериальных пре¬
паратов (не менее 12 ч). Отобранный материал должен быть в кратчайшие сроки
доставлен в микробиологическую лабораторию.Обнаружение листерий в клиническом материалес помощью одноэтапного иммунохроматографического теста (ИХТ) можно
проводить скрининг клинического материала на наличие листерий. Он позволяет
получить результат в течение 5-10 мин, прост и недорог. Основным недостатком
теста является его недостаточно высокая чувствительность, поэтому получение
отрицательного результата не служит доказательством отсутствия инфекции и тре¬
бует подтверждения результами исследования клинического материала, взятого от
того же пациента, другими лабораторными методами. Кроме того, в выпускаемой в
настоящее время тест-системе ИХТ можно исследовать только фекалии.Изоляция и идентификация возбудителяВажнейший элемент современных схем выявления листерий — применение
селективных питательных сред. Эти среды повысили эффективность выделения
листерий из клинического материала и продуктов питания по фавнению с ранее
448 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯприменяемыми кровяным агаром, мясопептонным агаром или агаром Хоттингера
с теллуритом калия и полимиксином В.Наибольшее распространение в качестве элективных сред для выделения листе¬
рий получили среды «Оксфорд«^ и «Палкам».На среде «Оксфорд» через 24 ч инкубации посевов появляются мелкие (диа¬
метром 1 мм) сероватые колонии, окруженные черным ореолом. Через 48 ч инку¬
бации колонии становятся более темными, около 2 мм в диаметре, черный ореол
сохраняется.На среде «Палкам» через 24 ч инкубации регистрируются мелкие, серозато- или
оливково-зеленые колонии диаметром 1 мм, часто с черным центром. Колонии
также окружены характерным черным ореолом на красном фоне агара. Через 48 ч
инкубации отмечаются колонии до 1,5-2 мм в диаметре с характерным вогнутым
центром, зеленоватая окраска и черный ореол сохраняются.Последующий анализ характерных колоний, утилизирующих эскулины, позво¬
ляет на основании ограниченного числа тестов идентифицировать культуру
I. monoqftogenes.Посев на селективные питательные среды выполняют как непосредственно
из клинического материала, так и после предварительного накопления микро¬
организмов с помощью питательной среды обогащения. Посевы инкубируют в
течение 48 ч при температуре 30 °С. Раст листерий сопровождается утилизацией
эскулина, что вызывает почернение среды. Для последующего анализа подозри¬
тельные на патогенные листерии полупрозрачные небольшие колонии (2-3 мм в
диаметре) с черным ореолом пересевают на питательные среды, рекомендуемые
для идентификации листерий. Для пересева выделенньгх колоний рекомендуют
использование триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом следующего соста¬
ва; триптон — 17 г, пепсиновый гидролизат сои — 3 г, дрожжевой экстракт — 6 г,
декстраза — 2,5 г, NaCl — 5 г, гидрофосфат калия — 2,5 г, агар — 15 г.После селекции выбор питательных сред для пересева вьщеленных колоний
уже не имеет принципиального значения, для культивирования листерий можно
использовать достаточно широкий спектр традиционных питательных сред.
Предполагаемые колонии листерий, выросшие на селективных дифференциально¬
диагностических питательных средах, для дальнейшей идентификации высевают
на триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом, мясопептонный агар с 1%
глюкозой или ЛФГА, Посевы инкубируют при температуре 30 ‘’С в течение 24 ч.
На триптон-соевом агаре с дрожжевым экстрактом колонии листерий выпуклые,
бесцветные, непрозрачные, росинчатые, диаметром 1-2 мм, легко снимаются с
поверхности агара и образуют гомогенную суспензию при переносе в солевой рас¬
твор.На мясопептонном агаре с 1% глюкозы и ЛФГА колонии листерий образуют
мелкие, сероватые, полупрозрачные, росинчатые колонии.На этапе идентификации используют совокупность методов, позволяющих;•	окончательно подтвердить принадлежность выделенной культуры к Listeria
spp.;•	установить принадлежность выделенной культуры Listeria spp. к патогенному
для человека виду L. monocytogenes^ используя тесты для идентификации дан¬
ного вида и его дифференциации от непатогенных листерий.Первая группа методов включает;•	окраску по Граму и микроскопию колоний;•	выявление каталазной активности;•	определение подвижности культуры при температуре 22 и 37 °С.При окраске по Г]раму 16-24-часовой культуры листерии выглядят как короткие
грамположительные палочки. В старых культурах морфология листерий часто
вариабельна (бактерии могут приобретать форму диплококков или дифтероидов).
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 449Именно поэтому результаты окраски по Граму мазков-отпечатков из клинического
материала не отличаются высокой степенью достоверности.Для оценки каталазной активности на поверхность колонии наносят кашпо
3-5% свежего водного раствора перекиси водорода. Появление пузырьков газа
указывает на наличие каталазы. Все виды Listeria spp. каталазоположительны.Для идентификации Listeria spp. информативен тест на подвижность, в котором
используется высокая подвижность клеток при температуре 22-25 "С и неподвиж¬
ность или слабая подвижность при 37 ’’С. Для исследования берут колонии с чашек,
инкубированных при температуре не выше 30 °С. Для определения подвижности
используют висячую или раздавленную каплю, которую микроскопируют с помо¬
щью масляного иммерсионного или фазово-контрастного объектива. Листерии,
выросшие при температуре 22 °С, выглядят как тонкие короткие палочки с враща¬
тельной или подпрыгивающей активностью.В последние годы для определения подвижности листерий чаще используют
посев уколом в полужидкий агар. При температуре 22 ‘'С для подвижной культуры
листерий характерен специфический рост в форме зонтика. Помимо полужидких
модификаций мясопептонного агара или триптон-соевого агара существуют спе¬
циальные коммерческие среды {«Listeria Motility medium») для определения под¬
вижности листерий.Вторая группа методов, необходимых для видовой идентификации I. monocy¬
togenes, включает определение восстановления нитратов до нитритов; фермента¬
цию трех углеводов — маннита, ксилазы и рамназы; определение способности к
|3-гемолизу; выполнение КАМП-теста, выявление лецитиназной активности на
средах с активированным углем и без него,В качестве дополнительных методов используют серотипирование, ПЦР с прай¬
мерами на листериозин или лецитиназу, биопробу на мышах.Серологическая диагностикаВ лабораторной диагностике листериоза используют два серологических
метода — РСК с инактивированным цитоплазменным антигеном и РНГА с эритро¬
цитарным антигенным диагносгикумом. Однако серологические реакции недоста¬
точно специфичны для диагностики данного заболевания. Первичный диагноз с
помощью одних только серологических реакций ненадежен. Их можно проводить
для выявления больных с бессимптомным течением заболевания и бактерионо¬
сителей в неблагополучных по листериозу хозяйствах, где наличие заболевания
установлено с помощью клинико-эпизоотологических и бактериологических
исследований. Это связано с тем, что большинство случаев листериоза наблюда¬
лось именно в неблагополучных животноводческих хозяйствах у людей, контак¬
тировавших с больными животными, Б последнее время в условиях длительного
хранения и транспортировки продукты питания часто контаминированы листе¬
риями, основным путем передачи листериозной инфекции стал пищевой (сыры,
мясные и куриные полуфабрикаты, копчености, морепродукты). В организме
человека происходит нарастание титров антител к L. monocytogenes при отс)ггствии
клинических проявлений, причем антитела могут длительно сохраняться после
элиминации листерий из организма. Именно поэтому серологические методы
можно использовать для постановки предполагаемого диагноза. Окончательное
подтверждение диагноза листериоза у людей возможно только после выделения
чистой культуры возбудителя из клинического материала.Наиболее перспективны для серологической диагностики листериоза имму¬
ноферментные тест-системы, высокая специфичность которых основывается
на определении антител к рекомбинантным белкам — секретируемому фактору
патогенности листерий (листериозину-0) или другим белковым антигенам
(JrpA, JnlB). Для оценки эффективности диагностики листериоза с помощью
450 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯданного метода необходимо сравнение с результатами бактериологического
метода.Критерии постановки диагноза листериозаДиагностика листериоза представляет значительные трудности в связи с много¬
образием клинических проявлений инфекции и их сходством с рядом других,
более распространенных заболеваний. Именно поэтому диагноз листериоза не
может быть установлен только на основании характерной клинической картины.
Немаловажное значение имеют эпидемиологические и анамнестические данные.
Следует также >'читывать особенности производственной деятельности и быта
больных, которые могут оказывать влияние на частоту встречи с источником
листериоза. При обследовании женщин (особенно беременных) следует обращать
внимание на патологию беременности и предшествующих родов. Не меньшую роль
играют анамнестические указания, а также обнаружение клинико-лабораторных
признаков заболеваний и состояний, позволяющих отнести обследуемого к группе
ловышенного риска развития листериоза. Однако характерные анамнестические
и эпидемиологические данные даже в сочетании с типичной клинической кар¬
тиной позволяют поставить только предположительный диагноз. Вероятность
диагноза возрастает, если при типичном поражении ЦНС при микроскопии СМЖ,
полученной при диагностической люмбальной пункции, обнаруживают грамполо-
жительные палочки или на 2-й неделе болезни в плазме крови пациента уровень
специфических антител превышает диагностический титр.Окончательный диагноз листериоза ставят, если характерная эпидемиологи¬
ческая и клиническая картина сочетается с обнаружением i. monocytogenes в био¬
логических жидкостях организма, которые в норме стерильны (крови, СМЖ, СЖ,
плевральной жидкости). Выделение L, monocytogenes из фекалий и мочи имеет
меньшую диагностическую ценность, так как листерии нередко обнаруживают у
здоровых лиц и инфекция имеет условно-патогенный характер. При доказанной
эпидемиологической связи типичной клинической картины заболевания с уста¬
новленным источником инфекции положительные результаты бактериологиче¬
ского исследования также служат основанием для подтверждения окончательного
диагноза листериоза.Большую диагностическую ценность при листериозе беременных и новорож¬
денных приобретает выделение L. monocytogenes из секретов половых органов,
амниотической жидкости и плацентарной ткани. При летальных исходах и невоз¬
можности прижизненного выделения возбудителя принимают во внимание типич¬
ные патоморфологические изменения. Особенно характерно обнаружение в раз¬
личных органах признаков листериозного ромбзнцефалита и другой специфичной
для листериоза патологии. Выявление листерий в трупкых' материалах успешно
далеко не всегда и имеет ретроспективное значение.Спектр заболеваний, с которыми проводят дифференциальную диагностику
листериоза, широк, что объясняется многообразием клинических форм листери-
озной инфекции. Наиболее распространены у взрослых листериозные менингиты
и менингоэнцефалиты, их следует дифференцировать от инфекций, вызываемых
Str. pneumoniae, N. meningitidis, М. tuberculosis и другими бактериями. Листериозные
менингиты и менингоэнцефалиты чаще регистрируют у пожилых пациентов.
В отличие от менингитов нелистериозной этиологии, у больных гораздо чаще
наблюдаются судороги, нарушение координации, тремор и психические расстрой-
ства.Листериоз новорожденных дифференцируют от врожденной цитомегалии, ТОК'
соплазмоза, сифилиса, стрептококкового сепсиса, гемолитической болезни ново-
рожденных, внутричерепной родовой травмы. Для листериоза характерны диссе¬
минированные узелковые экзантемы, фебрильная лихорадка и прогрессирующее
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ451нарушение кровообращения. Учитывают анамнестические данные о клинических
признаках заболевания матери в последнюю треть беременности, которая окончи¬
лась преждевременными родами, а также обнаружение специфических гранулем
в плаценте. Листериоз беременных необходимо дифференцировать от острых
респираторных инфекций и вялотекущего пиелонефрита (пиелоцисгита) нелисте¬
риозной этиологии.Гастроинтестинальная форма листериоза отличается от острых кишечных
инфекций другой этиологии относительно более тяжелым течением, выражен¬
ностью лихорадки, интоксикацией, нередким исходом в специфический сепсис,
менингит или менингоэнцефалит.Септическую форму листериоза дифференцируют от сепсиса, вызываемого
другими, чаще грамотрицательными бактериями. Вследствие быстрого развития
заболевания и отсутствия патогномоничных признаков решающее значение в
постановке правильного диагноза отводится результатам бактериологических
исследований. Определенную роль также играют анамнестические и эпидемиоло¬
гические данные.КЛОСТРИДИИТАКСОНОМИЯРод Clostridium принадлежит к семейству Chstridiaceae и объединяет более
150 видов, точная идентификация которых требует применения специальных
методов и возможна только в специализированных лабораториях.Клиническая классификация этих бактерий предполагает разделение их на3	группы:•	нейротоксигенные;•	энтеротоксигенные;•	гистолитические.Такая классификация имеет ряд недостатков (например, одни и те же виды бак¬
терий могут в соответствии с ней относится к разным группам), однако ее удобно
использовать в практических целях.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАКлостридии — крупные, грамположительные (в молодых культурах), обра¬
зующие споры, облигатно анаэробные, подвижные (перитрихии) или неподвижные
палочки с закругленными или заостренными концами. Некоторые из них в орга¬
низме человека способны образовывать капсулу. Диаметр спор превышает диаметр
бактериальной клетки, поэтому при центральном расположении споры палочка
приобретает форму веретена, а при дистальном — теннисной ракетки или барабан¬
ной палочки. Отдельные виды рода Clostridium под влиянием различных факторов
могут приобретать кокковидную, спиралевидную и даже нитевидную форму. В маз¬
ках клостридии чаще расположены попарно или короткими цепочками. Способны
продуцировать сильные экзотоксины. Многие штаммы спорулируют слабо, дают
слабую положительную окраску по Граму. Такие культуры могут быть ошибочно
отнесены к родам Eubacterium, Bifidobacterium, Bacteroides или Fusobacterium,КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИПатогенные для человека клостридии способны вызывать газовую гангрену,
столбняк, ботулизм, псевдомембранозный энтероколит и другие заболевания, свя¬
занные с поражением различных органов и систем. Некоторые виды клостридий
могут быть причиной пищевых токсикоинфекций. Патогенность представителей
рода Clostridium обусловлена продукцией экзотоксинов. Этиологический диагноз
устанавливают на основании клинических и микробиологических данных.
452 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯГазовая гангрена относится к группе раневых анаэробных инфекций, возни¬
кает в результате травм и ранений. Этиология газовой гангрены разнообразна.
В зависимости от патогенных свойств клостридий заболевание может быть вызва¬
но одним из возбудителей (наиболее вирулентные виды — а. petfringens, ci novyi,
Cl. septicum; менее вирулентные — Cl. histolyticum. Cl. bifermentans. Cl sporogenes,
ClfaUax). Слабовирулентные виды, такие как Cl tertium. Cl sordellii. Cl hutiricum,
неспособны самостоятельно вызвать газовую гангрену, однако, присоединяясь к
более вирулентным видам, они значительно ухудшают течение болезни.CL difficile вызывают два типа заболеваний, возникающих на фоне интенсив¬
ной и продолжительной антибиотикотерапии, ~ антибиотикоассоциировакную
диарею и псевдомембранозный колит (ПМК). В течение первого года жизни
Cl difficile обнаруживают у 50% новорожденных, затем их распространенность
снижается, у детей старше 2 лет их выявляют менее чем в 4% случаев, так как при
отсутствии селекционного давления антибиотиков они вытесняются нормальной
микрофлорой кишечника. На фоне антибиотикотерапии количество Cl décile
резко возрастает, особенно у пациентов, находящихся в стационаре. Фактор, пред¬
располагающий к развитию заболевания, — противоопухолевые и антимикробные
препараты. Особенно часто развитие данных заболеваний связано с применением
пенициллинов широкого спектра действия (ампициллина, амоксициллина), клин-
дамицина, цефалоспоринов. Возможно носительство С/, difficile среди взрослых,
в том числе среди медицинских работников. Патогенез заболеваний обусловлен
действием двух экзотоксинов возбудителя — А и в (токсин А — энтеротоксин, ток¬
син В — цитотоксин). Большинством токсигенных штаммов продуцируются оба
токсина, однако описаны штаммы, вырабатывающие только один из токсинов.Некротические энтероколиты клостридиальной этиологии регистрируются
у новорожденных и расцениваются как госпитальные инфекции. Чаще болеют
недоношенные или дети, родившиеся с малой массой тела. У взрослых заболе¬
вание известно под названием «кишечная гангрена». Описаны вспышки данной
инфекции. Причина заболевания — С/, perfringens типа С. Патогенез заболевания
обусловлен действием ß-токсина Cl perfringens типа С. Токсин обладает леталь¬
ным действием и вызывает очаговый паралич, отек, геморрагии и сегментарный
гангренозный некроз кишечной стенки. У новорожденных клиническая картина
некротического энтероколита проявляется вздутием живота, отказом от кормле¬
ния, появлением крови в испражнениях. Заболевание прогрессирует до развития
перфораций, перитонита и сепсиса.ПТИ вызывают Cl perfringens типа А. Способность вызьшать заболевание обу¬
словлена наличием энтеротоксина. Как правило, заболевания связаны с употре¬
блением мясных блюд и развиваются через 7-30 ч после употребления пищи, ПТИ
проявляется болями в животе и диареей (часто пенистой). Заболевание возникает
при попадании в организм человека около 10® живых Cl perfringens типа А, кото¬
рые в щелочной среде тонкого кишечника образуют споры. Процесс споруляции
сопровождается высвобождением энтеротоксина.Cl botulinum вызывает ботулизм, который подразделяют на четыре категории:•	классический (пищевой), протекающий как ПТИ, при котором накопление
токсина С/, botulinum происходит в пищевом продукте;•	новорожденных, при котором ботулотоксин вьфабатывается в кишечном
тракте младенца;•	раневой - редчайшая форма, обусловленная продукцией токсина возбуди¬
телем, размножающимся на поверхности раны; описаны случаи развития
ботулизма после внутривенных инъекций;•	неопределенно классифицированный, когда развитие заболевания не удается
связать ни с одним из указанных факторов (раневой инфекцией, пищевым
продуктом); возникает у взрослых и детей старше 1 года.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ453Во всех случаях ведущее звено патогенеза — ботулотоксин. По антигенным
свойствам различают 7 типов ботулотоксина, обозначаемых латинскими буквами
А, В, С, D, Е, F, G. Наиболее опасен ботулотоксин типа А, наименее — типа Е. Кроме
С1 botuUnum, ботулотоксин или подобные ему нейротоксины могут вырабаты¬
вать и некоторые другие виды клостридий; С1. butyricum — ботулотоксин типа Е,
С1 ЪагаШ — ботулотоксин типа ЕВозникновение столбняка обусловлено попаданием спор С/, tetani в рану из
почвы или объектов внешней среды. Столбняк новорожденных возникает при
инфицировании во время родов вне ЛПУ или при перерезке и перевязке пупоч¬
ного канатика нестерильным инструментом или материалом. Патогенез обуслов-
лен способностью возбудителя к продукции двух очень сильных экзотоксинов —
тетаноспазмина (разрушает эритроциты) и тетанолизина (вызывает спастиче¬
ский паралич, действуя на синапсы мотонейронов спинного мозга, поражает
ЦНС).Виды рода Clostridium, имеющие медицинское значение, представлены в
табл. 21-36,Таблица 21-36, Клостридии, имеющие медицинское значение, и заболевания, вызываемые имиГруппа клостридийЗаболеваниеВозбудителиНаиболее патогенные; CI. perfringens типа А.
CI. septicum, Cl. novyiГистолитическиеГазовая гангренаМенее патогенные: Cl. t)istolyticum. Cl. bifermentans.
Cl. sporogenes, Cl. fallaxЧасто вызывают заболевание в ассоциации;
CI. tertium, Ct. butiricm, CI. sordelliiпродуценты нейроток¬СтолбнякCI. tetaniсиновБотулизмCI. t)OiuiinumПищевые токсикоинфекцииCI. perfringens типа АПродуценты энтероток-гиилвНекротические энтероко¬
литыCl. perfringens типа СиппиоПсевдомембранозный энте¬
роколитCl. difficileЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАЛабораторная диагностика клостридиозов включает два параллельных направ¬
ления:•	выделение возбудителя и его видовую идентификацию (в ряде случаев необ¬
ходима количественная оценка содержания бактерий в пробе);•	выявление токсинов возбудителей.Первый этап бактериологического исследования включает микроскопию натив¬
ного материала, посев его на питательные среды и биологическую пробу на лабо¬
раторных животных. При микроскопии оценивают морфологические особенности
и тинкториальные свойства микроорганизмов, наличие спор и их расположение
в бактериальной клетке (окраска по Граму). Подвижность определяют при иссле¬
довании висячей капли, наличие капсулы — при окраске мазков по Бури или по
Бури-Гинсу.На втором этапе бактериологического исследования проводят оценку культу¬
ральных свойств выросших на питательных средах микроорганизмов и повторную
микроскопию чистой культуры.На третьем этапе бактериологического исследования продолжают изучение
биологических свойств (культуральных и ферментативных), а также выявляют
токсинообразование.ilh
т
тш454 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯІІМІ Материалы для лабораторных исследованийПри подозрении на инфекции клостридий в лабораторию отсылают раневое
отделяемое, гной, кусочки пораженных тканей, кровь, фекалии, секционный мате-
(кусочки пораженных тканей, пунктаты лимфатических узлов, отделяемое
из раны, кровь из полостей сердца), хирургические инструменты, перевязочныйШ-и шовный материал, пищевые продукты. При подозрении на газовую гангрену
исследуют кусочки патологически измененных тканей, отобранные на границе создоровой тканью, раневое отделяемое и экссудат, венозную кровь. При некротиче¬
ских энтероколитах, ПТИ и ботулизме новорожденных исследуют фекалии, полу¬
ченные с помощью клизмы, при пищевом ботулизме исследованию подлежат про¬
мывные воды желудка, плазма крови, при раневом ботулизме — плазма крови.При столбняке взятие материала после заживления раны сопряжено с трудно¬
стями. Если место ранения известно, исследуют отделяемое раны, кусочки тканей.
Когда входные ворота инфекции неизвестны, материал берут из царапин, ссадин,
старых, длительно незаживающих ран. При столбняке, развившемся после родов
или аборта, исследуют отделяемое из влагалища и матки, при пупочном столбня¬
ке — отделяемое из пупочного канатика. На секции отбирают кусочки тканей из
предполагаемого очага, а также кровь, кусочки печени и селезенки.Материал для исследования собирают в стерильную посуду или контейнеры
с плотными пробками и не позднее 3 ч доставляют в лабораторию, В качестве
транспортных сред могут быть использованы питательные среды, содержащие
редуцирующие агенты (тиогликолят натрия, цистеин). Материал, помещенный в
транспортную систему, должен быть доставлен в лабораторию в течение 12-18 ч.
При необходимости материал можно сохранять в замороженном состоянии в
течение 1-2 дней.Для микроскопического и бактериологического исследования материал заби¬
рают отдельно.Изоляция клостридийв питательные среды для выделения клостридий для понижения окислительно¬
восстановительного потенциала входят различные редуцирующие факторы —
кусочки паренхиматозных органов (среда Китта-Тароцци), тиогликолевая кисло¬
та или ее соли (тиогликолевая среда, СКС).В плотные агаровые среды вносят различные дифференциально-диагности¬
ческие добавки — кровь для выявления гемолиза (среда Цейсслера), яичный жел¬
ток для выявления лецитиназы, молоко, сыворотки, углеводы, мочевину и другие
вещества для выявления различных ферментативных свойств. Посевы на плотных
средах (в чашках Петри) инкубируют в бескислородной среде, использз^я гермети¬
чески закрывающиеся сосуды (анаэростаты), в которые помещают специальные
химические поглотители кислорода, выпускаемые промышленностью, — газоге-
нерируюшие пакеты (Gaz-Pack).Полужидкие среды разливают в пробирки высоким столбиком, сверху на среды
наносят вазелиновое масло слоем 4-5 мм. Перед посевом среды, разлитые высо¬
ким столбиком, регенерируют прогреванием на кипящей водяной бане в течение
10-15 мин для удаления кислорода, затем остужают до 40-45 °С.Для обеспечения роста и проявления токсигенных свойств большинства пато¬
генных клостридий в основном применяют культивирование при 37 "'С и значени¬
ях pH = 7,0н-7,4.Биохимическая идентификацияПатогенные клостридии характеризуются различными биохимическими свой¬
ствами и отличаются по сахаролитической и протеолитической активности.
Некоторые виды отличаются высокой сахаролитической активностью, другие
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 455обладают большой протеолитической активностью. Некоторые патогенные кло¬
стридии малоактивны в биохимическом отношении. Биохимические свойства
определяют на полужидких средах, разлитых в пробирки высоким столбиком и
содержащих различные тест-субстраты, или в коммерческих индикаторных тест-
системах. Дифференциальная характеристика клинически значимых видов кло¬
стридий представлена в табл. 21-37.Диагностика газовой гангрены, вызванной CI. perfringensА.	Экспресс-диагностика. Включает световую микроскопию (мазков, окра¬
шенных по Граму и Бури, препарата висячей капли), иммунофлюоресцентный
метод (проводят с применением специфической люминесцирующей сыворотки
« Антиперфрингенс»).Экспресс-анализ позволяет получить ориентировочный положительный ответ
через 1,5-2 ч после поступления материала в лабораторию. Основанием для
него служит выявление неподвижных крупных грамположительных палочек с
обрубленными краями, обладающих капсулой, а также регистрация флюорес¬
цирующего желто-зеленого свечения после обработки мазка люминесцирующей
сывороткой «Антиперфрингенс».Ускоренная диагностика. Ускоренный анализ предусматривает применение
подращивания и получение предварительного результата через 4-6 ч культи¬
вирования при температуре 42 ‘’С. Для этого пробу биологического материала
подращивают на мясном или печеночном бульоне с 0,08% цистеина, лакмусовом
молоке с цистеином или на тиогликолевой среде с последующей идентификацией
возбудителя с помощью микроскопии. На лакмусовом молоке (по Минкевичу)
через 2-4 ч культивирования проб, содержащих С/, perfringens, при температуре
42 '’С в результате бурной ферментации молока и разложения лакмуса в кислой
среде отмечаются характерные изменения — кирпично-красный, пронизанный
пузырьками газа творожистый (губкообразный) сгусток казеина и прозрачная
сыворотка. На среде Вильсона-Блера через 4-6 ч инкубации отмечается почерне¬
ние среды и появление множественных разрывов агара вследствие интенсивного
газообразования, что свидетельствует о росте Cl perfringens.Стандартная диагностика. Полная схема бактериологического исследова¬
ния осуществляется параллельно с экспресс- и/или ускоренной диагностикой.
Кровь в соотношении 1:10 засевают на специальные жидкие питательные среды,
предназначенные для анаэробов. Другие жидкие пробы засевают в количестве
5-10 капель на дно пробирок с питательными средами. Каждый образец засевают
в 3 пробирки. Одну пробирку перед инкубацией в термостате (при температуре
37 “С) прогревают до 75-80 X в течение 20 мин (данная процедура позволя¬
ет избавиться от присутствующих в пробе вегетативных форм сопутствующей
микрофлоры). Вторую (непрогретую) пробирку инкубируют при температуре
37 “С, третью — при температуре 42 “С. Инкубация при 42 °С позволяет выявить
С/, perfringens через 1-2 ч. Исследование прогретого и непрогретого материала в
дальнейшем выполняют параллельно.При посеве в пробирки с высоким столбиком агара для получения роста
отдельных колоний исследуемый материал запаянной пастеровской пипеткой
(тампоном) последовательно погружают в 5-8 пробирок с питательной средой,
тщательно перемешивая содержимое каждой. Плотные материалы гомогенизиру¬
ют с небольшим количеством среды и засевают на плотные и жидкие питательные
среды. Дополнительно в жидкие среды можно внести кусочки исследуемого мате¬
риала.В качестве плотной питательной среды может быть использована среда
Цейсслера (кровяной агар с глюкозой). Посевы на плотные среды в чашках Петри
инкубируют в анаэробных условиях 24-48 ч при температуре 37 “С. Посевы на
Таблица 21-37. Биологические свойства некоторых видов клостридийВиды клостридийПоложениеспорПодвиж¬ностьРеакция с яичным
(на агарежелткомФерментацияВосстано¬влениенитратовГидролизИндоллецитк-назалипазапротеолизглюкозаманнитлактозаэскулинжелатинказеинCI. botulinum типа АCT+_+++---+++-CI. botulinum типа ВCT+-+-+---+++-CI. difficileСТ/ТV---++--+±--Cl. histolyticumCT+-------++-Cl. novyi тт ACT+++-+---V+--Cl. perfringens(CT)-+--+-++V+±-CI. septicumCT+---+-++++--Cl. sordelliiCT++-++----+++Cl. sporogenesCT-+++---+++-Cl. tetaniT+-+------+-Vсяо>Примечание:«СТ» — субтерминальное положение спор.«(СТ)» - субтерминальное положение спор наблюдается редко.
«Т» — терминальное положение спор,«+» — тест положительный.—	тест отрицательный.—	тест вариабельный.—	реакция проявляется у 11-25% штаммов.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ457жидкие питательные среды начинают просматривать через 2 ч инкубации. При
признаках роста на жидких средах проводят высев на плотные среды с последую¬
щим изучением колоний. Откол колоний со столбиков агара проводят прокалыва¬
нием среды пастеровской пипеткой или предварительно извлекают столбик агара
из пробирки в чашку Петри. Для этого, удерживая пробирку в наклонном положе¬
нии над чашкой Петри, подогревают ее конец, что приводит к расплавлению агара
и выталкиванию среды из пробирки его парами.Клостридии идентифицируют по культуральным, морфологическим и био¬
химическим свойствам, а при возможности — дополнительно путем постановки
реакции нейтрализации на лабораторных животных.Характерные признаки Cl perfringens:•	быстрый рост на питательных средах;•	черный цвет колоний с почернением среды вокруг них на железосульфитной
среде Вильсона-Блера через 4-6 ч инкз^бации;•	позеленение колоний на плотных питательных средах по мере пребывания на
воздухе;•	створаживание молока с просветлением сыворотки и образованием губкоо¬
бразного сгустка оранжево-красного цвета, содержащего пузырьки газа, на
лакмусовом молоке по Минкевичу через 1-3 ч после посева.На кровяном агаре колонии Cl perfringens нередко окружены двумя зонами гемо¬
лиза, что обусловлено гемолитическим действием гетерогенных а- и р-токсинов.
Биологические свойства основных возбудителей газовой гангрены и столбняка
представлены в табл. 21-38.Таблица 21-38. Биологические свойства основных возбудителей газовой гангрены и столбнякаВидыклостридийКапсулаПодвижностьЛецитиназаИндолФерментацияЛЭ1СТ03ЫсахарозыманнитаCI. perfringens+-+-+++Cl. novyi типа A-++----Cl. septicum-+--+--Cl. tetani-+-+---Принципы диагностики газовой гангрены и определения токсигенности кло¬
стридий представлены на рис. 21-4, 21-5. Для определения чувствительности к
антибактериальным препаратам следует использовать метод серийных разведений
или Е-тест, поскольку критерии оценки для диско-диффузионного метода не раз¬
работаны.Диагностика некротического энтероколита, вызванного CI. perfringensЛабораторная диагностика основана на выделении Cl perfringens С m фека¬
лий, при летальном исходе -- из секционного материала.Диагностика пищевой токсикоинфекции, вызванной CI. perfringensЛабораторная диагностика клостридиозной ПТИ включает следующие этапы;
^ экспресс-анализ на наличие энтеротоксина А Cl perjnngens в фекалиях
больных в коммерческих тест-системах;микробиологический анализ, проводимый в целях обнаружения
Cl perfringens типа А в подозреваемом пищевом продукте и фекалиях
больных, оценка энтеротоксигенности выделенных cl perfringens.Важно выявление спор Cl perfringens в количестве более 10^ клеток/г в пробах
фекалий, взятых в течение первых 24 ч с момента начала заболевания.Готовят десятикратные разведения пробы с последующим высевом на питатель¬
ные среды и подсчетом выросших колоний. Это необходимо, так как выделение
458ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯИсследуемый материалБактериоскопияОкраска по Граму
Окраска по Бури (капсула)
Висячая капля {подеижность)ПосевtИнкубация
под вазелиновымСреда Китт-Тароцци ипи СКС
{2 пробирки, одну из них
прогревают 20 мин при 80 °С)ИнкубацияСредаВильсона-БлераКровяной агар
с глюкозойИнкубацияв анаэробных
условиях 24 ч, 37 °Спод вазелиновым
маслом 1-3 ч, 42 *0 маслом 24 ч, 37 °СiОпределение
чувствительности к АБПОткол колоний на жадкие среды, инкубация под вазелиновым масломIИнкубация 6-18 ч, 37 'СОпределение токсина биохимические свойстваPH на белых	Реакциямышах с лецитовителлиномРис. 21-4. Принцип диагностики газовой гангрены.токсина происходит при споруляции. Для данного исследования пробу перед
титрованием прогревают для уничтожения вегетативных форм.Диагноз ставят на основании выделения из фекалий больных СЬ perfringens
типа А с энтеротоксигенными свойствами и обнаружения в них энтеротоксина А
Cl perfringens.Диагностика инфекции, вызванной Ci. difficileОсновные диагностические критерии ПМК:•	клиническая картина колита;•	присутствие в фекалиях токсина;•	наличие в слизистой оболочке толстой кишки псевдомембран слизево¬
лейкоцитарной структуры, внешне похожих на фибринозные мембраны при
дифтерии.Токсин cl difficile можно выявить:•	по специфическому цитопатогенному эффекту в культ}фе клеток челове¬
ческих легочных фибробластов, который нейтрализуется антитоксином к
С/, sordellii или Cl difficile;•	методом ИФА или встречного иммуноэлектрофореза (данные методы менее
чувствительны и специфичны по сравнению с тестом на культуре тканей);
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ459|в■гФРлшРис. 21-5. Принцип выявления токсигенности возбудителей газовой гангрены.•	иммунохроматографическим методом (простая процедура анализа, дост^ш-
ная для воспроизведения в кабинете врача).Принцип действия иммунохроматографического метода основан на взаимодей¬
ствии токсина с соответствующими моноклональными антителами, находящимися
в тест-полоске, что проявляется изменением цвета в месте реакции. Не требуется
дополнительного оборудования, тесты могут храниться при температуре от 2 до
30 X длительное время. С помощью выпускаемых в настоящее время иммуно-
хроматографических тест-систем можно выявить токсин А или одновременно
токсины А и в.Бактериологический метод имеет вспомогательное значение и применяется
главным образом для эпидемиологических целей. В случае выделения Cl difficile
из фекалий необходимо определить наличие продукции токсина одним из вышеу¬
казанных методов.Диагностика ботулизмаДиагностика ботулизма основана на выявлении и идентификации ботулоток¬
сина. Основной метод диагностики — биопроба на белых мышах. Исследование
материала от больных регламентировано «Инструкцией о порядке расследова¬
ния, учета и проведения лабораторных исследований в учреждениях санитарно-
эпидемиологической службы при пищевых отравлениях» № 1135-73. Исследование
пищевых продуктов выполняют в соответствии с ГОСТ 10444.7-86 «Продукты
пищевые. Методы выявления ботулинических токсинов и а botuîinum».
460ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯштéiWIтвШРис. 21-6. Принцип лабораторной диагностики столбняка.Диагностика столбнякаЛабораторные исследования при столбняке проводят в двух направлениях —
для обнаружения столбнячного токсина и возбудителя.Исследуемый материал растирают в ступке со стерильным песком, добавляют
двойной объем 0,9% раствора натрия хлорида и полученную суспензию разделяют
на две части; первую оставляют при комнатной температуре для экстрагирования
токсина, вторую засевают на бульон Мартена или Вейнберга и кровяной агар.
Посевы инкубируют Б анаэробных условиях в течение 10 дней, через каждые 2 дня
делают мазки, окрашивают по 1раму и микроскопируют. При появлении роста
на бульоне проводят высев на кровяной агар. На поверхности кровяного агара
С/, tetani дает нежные, прозрачные колонии в виде капель росы, которые быстро
распространяются и покрывают всю чашку слегка заметной сетчатой пленкой.
Перед посевом на половину чашки можно нанести антитоксическую сыворотку.
Это позволяет ориентировочно идентифицировать культуру по угнетению гемоли¬
за. Решающий фактор при идентификации — обнаружение столбнячного токсина.
С этой целью может быть использован одноэтапный иммунохроматографический
тест. Внутривидовая дифференциация основана на определении антигенных
свойств вырабатываемого токсина в реакции нейтрализации на лабораторных
животных.Принцип лабораторной диагностики столбняка представлен на рис. 21-6.ЛЕПТОСПИРЫТАКСОНОМИЯLeptospira interrogans sensu lato — возбудитель лептоспироза людей и животных.
Она относится к роду Leptospira, принадлежащему к самостоятельному семейству
Leptospiracea в порядке Spirochaetales. Род Leptospira включает также Leptospira biß-
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ461еха sensu lato — сапрофитические лептоспиры, свободно живущие преимуществен¬
но в водной среде и не способные вызвать заболевания людей и животных.Систематика и номенклатура лептоспир включает две различные классифика¬
ционные системы — серологическую и генотипическую.в серологической систематике таксономическим критерием служит антигенный
состав. Основным таксоном является серовар. В качестве стандартного метода
определения сероваров используют реакцию микроагглютинации (РМА) с пере¬
крестной абсорбцией антител. Серологическая классификация имеет большое
практическое значение, так как иммунитет при лептоспирозе серовароспецифи-
чен. Идентифицировано более 268 серовариантов патогенных лептоспир, объеди¬
ненных по серологическим связям в 25 серогрупп. Из этого обширного количе¬
ства Leptospira interrogans наибольшее значение имеют возбудители серогрупп
Icterohaemorrhagiae, Canicola, Grippotyphosa, Pomona, Tarassovi, Sejroe, Australis.В генетической систематике лептоспир выделено 8 геномовидов лептоспир —
I. interrogans, L. alexanderi, L. kirschneri, L. borgpetersenii, L. weiUii, I, noguchii, L. santa-
rosai, L. genomospecies 1, из которых наиболее распространены три — I, interrogans,
L. kirschneri, L. borgpetersenii.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАЛептоспиры занимают особое положение в иерархии эубактерий, отличаясь
уникальной архитектоникой клетки и своеобразным способом движений, позво¬
ляющим идентифицировать их на надродовом уровне исключительно на основа¬
нии морфологических критериев.Лептоспиры — спирохеты диаметром 0,1-0,16 мкм и длиной от 6 до 20 мкм,
имеют характерную спиралевидную конфигурацию и специфические локомотор¬
ные органеллы. С помощью электронной микроскопии выделены три основных
структурных элемента:•	осевая нить (аксистиль);•	цитоплазматический цилиндр, винтообразно закрученный на осевой нити;•	наружная оболочка.Оболочка лептоспир типична для грамотрицательных бактерий, в том числе
и других спирохет, имеет цитоплазматическую мембрану и слой пептидогли¬
кана, ассоциированного с наружной мембраной. В состав осевой нити входят
два периплазматических жгутика, закрепленных на разных полюсах клетки и
направленных к ее центру навстречу друг другу. Осевая нить расположена между
наружной оболочкой и цитоплазматическим цилиндром и выполняет локомотор¬
ную функцию, напоминая этим жгутики других бактерий. В клетке прис)'тствуют
ламеллярные мембранные органеллы, а также включения, различающиеся по виду
и функции (гликоген, полифосфаты).Нуклеотид расположен эксцентрично. Геном лептоспир состоит из двух кольце¬
вых хромосом, имеющих размер 4500 и 350 т.п.н. В геноме лептоспир обнаружены
гены, кодирующие факторы патогенности, такие как способность к быстрой инва¬
зии и диссеминации, устойчивость к фагоцитозу, адгезивность, опосредованную
белками, входящими в состав наружной мембраны лептоспир, и последующую
колонизацию поверхности гепатоцитов и нефротелия, цитотоксичносгь. Роль
цитотоксического фактора, имеющего существенное значение в патогенезе леп¬
тоспироза, играет липопротеин LipL32. Присутствие LipL32 усиливает процесс
гемолиза, осуществляемого вьщеляемой патогенными лептоспирами сфинго-
миелиназой Н (SphH). У всех патогенных лептоспир обнаружен ген, кодирую¬
щий сфингомиелиназоподобный протеин LK73.5, обладающий цитотоксической
активностью по отношению к эндотелиальным клеткам. Выявлены гены, коди¬
рующие ферменты, отвечающие за синтез липополисахарида, обладающего вос¬
палительным и цитотоксическим эффектом. Эти гены формируют кластер rfb.Ш1Шш
462 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯРМ;Изменчивость локуса гй) и различия в составе геномов семейства degT, которые
также принимают участие в синтезе липополисахарида, обусловливают его вариа¬
бельность, с чем, в свою очередь, связано существование большого количества
серогрупп и сероваров лептоспир.Лептоспиры слабо окрашиваются анилиновыми красителями. Неокрашенные
клетки при светлопольной микроскопии не видны, но хорошо заметны в темном
поле или при фазово-контрастной микроскопии. При микроскопии в темном поле
лептоспиры имеют вид тонких серебристых нитей с крючками на одном или обоих
концах и обладают разнообразными формами подвижности. Активная подвижность
способствует проникновению возбудителя в организм животных или человека.Лептоспиры — облигатные аэробы, хемоорганотрофы. Источник углерода и
энергии для них — жирные кислоты с длинными углеродными цепями. Они могут
утилизировать неорганические соли аммония как главный источник азота, а также
пуриновые азотистые основания.Являясь типичными гидрофилами, лептоспиры способны длительное время
выживать во внешней среде при повышенной влажности, Б воде открытых водо¬
емов они сохраняют жизнеспособность от 7 до 30 дней, во влажной почве — до
270 дней, а на пищевых продуктах — от нескольких часов до нескольких дней.Лептоспиры быстро погибают под воздействием прямых солнечных лучей, а
нагревание до 56-58 °С убивает их в течение 25-30 мин. К низким температурам
данные микроорганизмы устойчивы и сохраняют жизнеспособность после дли¬
тельного замораживания. 0,1% раствор соляной кислоты и 0,5% раствор фенола
инактивируют лептоспиры в течение 20 мин, а активный хлор в дозе 0,3-0,8 мг/л —
после двухчасовой экспозиции. Для обеззараживания чистых культур лептоспир
рекомендуют 2% раствор соляной кислоты с экспозицией 24 ч, а патологического
материала — 5% раствор фенола с экспозицией 2 ч.ЭПИДЕМИОЛОГИЯЛептоспироз относится к зооантропонозам, распространенным повсеместно
среди многих видов диких и домашних животных. Наиболее высокий уровень
заболеваемости людей отмечается в странах с влажным субтропическим и тропи¬
ческим климатом. Основными источниками лептоспирозной инфекции для людей
являются дикие мелкие млекопитающие — грызуны (полевки, мыши, крысы) и
насекомоядные (ежи, землеройки), домашние животные — крупный и мелкий
рогатый скот, свиньи, лошади, собаки, а также пушные звери, содержащиеся в
клетках, — лисицы, песцы, нутрии. Инфекционный процесс у большинства живот¬
ных протекает в хронической форме с длительным и интенсивным выделением
лептоспир с мочой (от нескольких месяцев до года).Патогенным лептоспирам свойственна гостальная (хозяинная) специфичность.
Возбудители отдельных сероваров циркулируют преимущественно в популяциях
одного или ограниченного количества видов животных, являющихся их основ¬
ными резервуарами. Животные-лептоспироносители выделяют возбудителей во
внешнюю среду, инфицируя воду открытых водоемов, почву, корма, пищевые про¬
дукты и другие объекты внешней среды. В организм человека лептоспиры прони¬
кают через поврежденный кожный покров и неповрежденные слизистые оболочки
глаз, носа, полости рта, желудочно-кишечного и мочеполового трактов. Основной
путь передачи инфекции — водный, меньшее значение имеют контактный и пище¬
вой. Больной человек — «биологический тупик» для возбудителя лептоспирозной
инфекции и не имеет эпидемиологического значения как ее источник. Территории,
на которых выявлены заболевания или носительство лептоспир среди диких или
домашних животных, носят название очагов лептоспироза и потенциально опасны
для человека. Их подразделяют на природные, хозяйственные (антропургические)
и смешанные.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ463КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИЛептоспироз — зооантропонозная инфекция, протекающая у человека в виде
острой лихорадки с выраженной интоксикацией, поражением почек, печени, ЦНС,
развитием геморрагического синдрома. Лептоспироз относится к категории тяже-
лопротекающих инфекций с высокой частотой летальных исходов при некоторых
этиологических формах {Icterohaemorrhagiae, Canicola) и нередкими отдаленными
клиническими последствиями.Клиническое течение лептоспироза имеет выраженную цикличность, опреде¬
ляемую пятью фазами развития инфекционного процесса.•	Первая фаза — внедрение лептоспир в месте входных ворот (через повреж¬
денную кожу и слизистые оболочки), проникновение их в лимфатическую, а
затем в кровеносную систему, кратковременная бессимптомная лептоспире-
мия и дальнейшая паренхиматозная диффузия, преимущественно в печень,
почки, надпочечники, селезенку и легкие. В паренхиматозных органах
происходит интенсивное размножение лептоспир. Клинически данная фаза
соответствует инкубационному периоду, который продолжается от 3 дней до3	нед.•	Вторая фаза — повторный выход лептоспир в кровь с последующим нако¬
плением продуктов их метаболизма и распада. Из крови лептоспиры вновь
попадают в ткани, проявляя тропизм к печени, почкам, надпочечникам и
оболочкам головного мозга. Длительность второй фазы составляет 3-7 дней,
клинически она соответствует начальному периоду заболевания и проявляет¬
ся выраженной интоксикацией.•	Третья фаза — максимальное развитие токсемии и поражение внутренних
органов. Развиваются генерализованный капилляротоксикоз, синдром дис¬
семинированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) с возникновением
кровотечений и кровоизлияний во внутренние органы. Клинически третья
фаза патогенеза соответствует периоду разгара заболевания (конец 1-й —
начало 3-й недели болезни).Гемодинамические нарушения и действие токсинов лептоспир, образуемых
в результате их гибели под влиянием накапливающихся антител, ведут к пора¬
жению печени и почек. В тяжелых случаях развивается острая почечная недо¬
статочность (ОПН). Дегенеративные изменения гепатоцитов, холестаз, гемолиз
эритроцитов — причины появления желтухи. При глубоких органных поражени¬
ях возникает сочетанная острая почечно-печеночная недостаточность (ОППН),
являющаяся наряду с инфекционно-токсическим шоком (ИТШ) основной при¬
чиной смерти при лептоспирозе. Неблагоприятные исходы могут быть связаны
с развитием респираторного дистресс-синдрома взрослых (РДСВ), геморраги¬
ческого синдрома, пневмонии, менингита, а также полиорганной недостаточ¬
ности.•	Четвертая фаза — нестерильная стадия иммунитета. Количество специфи¬
ческих антител в плазме крови нарастает, но лептоспиры еще сохраняются в
органах, чаще всего в почках. По времени данная фаза соответствует 3-4-й
неделе болезни.•	Пятая фаза — формирование серовароспецифического иммунитета, соот¬
ветствует 5-6-й неделе болезни, клинически определяют период реконвалес¬
ценции.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАРезультаты лабораторного исследования играют решающую роль для под¬
тверждения лептоспирозной этиологии заболевания, так как дифференциальная
диагностика лептоспироза представляет значительные затруднения вследствие
полиморфизма клинических проявлений.
464ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯЛабораторная диагностика лептоспироза основана на комплексе микробиоло¬
гических, иммунологических и молекулярно-генетических методов. Успех лабора¬
торной диагностики лептоспироза в значительной степени зависит от правильного
и оптимального по срокам взятия материала от больного, для чего необходимо
ориентироваться на особенности патогенеза данной инфекции.Материалы для исследования — кровь, моча и спинномозговая жидкость
(СМЖ) больного, а при летальных исходах “ паренхиматозные органы, транс¬
судат грудной и брюшной полостей.На 1-й неделе болезни на высоте лихорадки (в период лептоспиремии) целесоо¬
бразно использовать методы, направленные на выявление возбудителя; микроско¬
пию цитратной крови, посев крови, определение ДНК лептоспир в крови методом
ПЦР и заражение лабораторных животных (метод биопроб).С конца 1-й и в начале 2-й недели определяют специфические антитела, кото¬
рые можно выявить с помощью иммунологических реакций, — РМА, макроагглю¬
тинации на стекле (РГА), иммуноферментного анализа (ИФА). Начиная со 2--й
недели болезни при менингеальных симптомах в целях обнаружения лептоспир
исследуют СМЖ, с 3-й недели — мочу.БактериоскопияМикроскопируют кровь, мочу, СМЖ, паренхиматозные органы, транссудат.
Поскольку лептоспиры плохо воспринимают окраску анилиновыми красителями,
проводят микроскопию живых возбудителей в темном поле. Из исследуемого
материала готовят раздавленную каплю, для чего наносят его на предметное стек¬
ло и сверху накрывают покровным стеклом. На верхнюю линзу конденсора микро¬
скопа наносят каплю дистиллированной воды. Микроскопию производят с приме¬
нением темнопольного конденсора, объектива х40, окуляра х10 и осветителя.Для бактериоскопического исследования 2 мл венозной крови больного непо¬
средственно после ее взятия смешивают с 4 мл 1,5% раствора натрия цитрата. Смесь
центрифугируют при 3000 об./мин в течение 15 мин для осаждения эритроцитов.
Надосадочную жидкость центрифугируют при 10 ООО об./мин в течение 30 мин.
Полученный осадок микроскопируют, просматривая 15-20 полей. Микроскопия
крови — простой и доступный для любой лаборатории способ быстрой и ранней
диагностики лептоспироза. Однако отрицательные результаты не исключают леп-
тоспирозную этиологию заболевания.Мочу и СМЖ исследуют либо в нативном виде, либо после центрифугирова¬
ния в том же режиме, что и кровь. Ткань паренхиматозных органов массой 1-2 г
измельчают в ступке с 3-4 мл 0,9% раствора натрия хлорида и отстаивают 1-2 ч
при 4 °С или центрифугируют при 3000 об./мин в течение 15 мин. Надосадочную
жидкость микроскопируют.Изоляция и идентификация возбудителяДля выделения лептоспир от больного — кровь, мочу (среднюю порцию), СМЖ
в количестве 5-15 капель засевают последовательно в 3 пробирки с 5 мл питатель¬
ной среды, желательно непосредственно у постели больного. При посеве тканей
трупа во избежание загрязнения посевов разогретым на спиртовке шпателем
осторожно прижигают поверхность органа. Затем в этом месте проводят прокол
пастеровской пипеткой на глубину до 0,5 см, забирают межтканевую жидкость с
элементами ткани и последовательно переносят в 3 пробирки с питательной сре¬
дой, При посеве необходимо соблюдать правила асептики. Посевы помещают в
термостат и культивируют при температуре 28-30 “"С.Лептоспиры относятся к медленнорастущим микроорганизмам. Период инку¬
бации для их максимального накопления составляет в среднем 6-14 дней, но
может достигать 4 нед и более. Размножаясь в питательной среде, лептоспиры не
изменяют ее внешнего вида. Среда остается прозрачной и слегка опалесцирующей.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 465Для выявления роста лептоспир через 4-5 дней из содержимого каждой про¬
бирки готовят раздавленную каплю и микроскопируют. При обнаружении роста
лептоспир проводят их пересев (по 0,5 мл) на свежую питательную среду для
последующего накопления и идентификации выделенных культур. Пробирки, где
рост лептоспир не выявлен, вновь помещают в термостат и подвергают повторно¬
му анализу через каждые 10 дней. При отсутствии роста в течение 3 мес посевы
считают отрицательными.Идентификацию выделенных штаммов до серогруппы проводят с помощью
набора групповых агглютинирующих сывороток. Определение серовара выделен¬
ных лептоспир осуществляют с помощью перекрестной РМА. Для этого необходи¬
мо располагать гипериммунными сыворотками против испытуемого и эталонных
штаммов сероваров, входящих в серогруппу. В связи со сложностью и трудоемко¬
стью данного исследования выделенные штаммы следует направлять для иденти¬
фикации в Сотрудничающий центр ВОЗ и Минздрава России по лептоспирозам на
базе лаборатории лептоспирозов ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.Молекулярно-генетическая диагностикаПЦР наиболее перспективна для обнаружения ДНК лептоспир в биологических
жидкостях и органах.Кровь для исследования берут при венепункции в сухие стерильные пробирки
или вакуумные системы в количестве не менее 1 мл без добавления каких-либо
веществ. Для получения плазмы после взятия крови необходимо оставить закры¬
тую пробирку в вертикальном положении в течение 15-20 мин. Отбор следует
проводить из фракции плазмы крови или из пограничного слоя между плазмой и
осевшими форменными элементами.Для взятия мочи в стерильный контейнер собирают среднюю порцию свободно
выпущенной мочи в количестве 3-5 мл.СМЖ получают при люмбальной пункции в стерильные сухие пробирки в коли¬
честве не менее 1 мл.Для исследования трупного материала берут кусочки паренхиматозных органов
(печени, почек) размером 1x1x0,5 см. Каждый кусочек помещают в отдельную сте¬
рильную банку с притертой пробкой или пласптмассовой крышкой или стерильную
чашку Петри. Следует избегать загрязнения горлышка банок инфицированным
материалом и строго следить за тем, чтобы дезинфекционные растворы не попали
на кусочки органов или в банку.Отбор проб из образцов любого вида желательно проводить не позднее чем
через сутки после взятия материала от больного. До этого момента образец сле¬
дует хранить при температуре 4 °С. Отбирают пробы в сухие чистые одноразовые
пробирки типа «Эппендорф». Отобранную пробу можно хранить до момента
выделения ДНК не более 24 ч при температуре 4 °С, а при необходимости более
длительного хранения	20 “С,ПЦР характеризуется высокими специфичностью, чувствительностью (от 10
до 1000 клеток в пробе) и диагностической эффективностью на первой неде¬
ле заболевания (начиная с первых суток) даже на фоне антибиотикотерапии.
Именно поэтому данный тест можно рекомендовать как метод ранней экспресс-
диагностики лептоспироза. При тяжелом течении инфекции на фоне отсроченно¬
го синтеза специфических антител ПЦР является методом выбора для быстрого
лабораторного подтверждения клинического диагноза.Отрицательный результат ПЦР не должен быть основанием для прекраще¬
ния диагностического поиска. Диагностическая чувствительность лабораторных
исследований при лептоспирозе может быть значительно повышена за счет парал¬
лельного использования серологического теста (РМА) и ПЦР независимо от фазы
заболевания.
ШШкш#
Щ0ШfwШШ.Я466ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯСерологическая диагностикаОсновное место в лабораторной диагностике лептоспироза у людей занимает
серологический метод исследования, осуществляемый в основном с помощью
реакции микроагглютинации (РМА) с живыми культурами лептоспир. Данный
тест, несмотря на его трудоемкость, необходимость работать с живыми культурами
лептоспир нескольких серогрупп и проводить учет реакции под микроскопом, до
сих пор остается «золотым стандартом» в мировой практике благодаря высоким
чувствительности и специфичности. РМА позволяет не только определить уровень
антител к лептоспирам, но и установить серогруппу возбудителя, что важно для
эпидемиологического анализа.Для серологического скрининга можно использовать более простые тесты
(иммуноферментный анализ, РНГА, реакцию слайд-агглютинации) с родоспеци¬
фическими антигенами лептоспир. Антитела к лептоспирам появляются в крови
больных в конце первой — начале второй недели болезни и достигают максималь¬
ного накопления на 14-17-е сутки. Иногда при тяжелом течении инфекционного
процесса, особенно при интенсивной антибиотикотерапии, у больных развивается
иммуносупрессия. В таких сл>^аях при явной клинической картине лептоспироза
антитела могут не выявляться или обнаруживаться через 2-3 мес после начала
болезни.Кровь больного необходимо исследовать на наличие антител к лептоспирам
не менее 2 раз — при поступлении больного в стационар (даже если это 1-й день
болезни) и через 7 дней. При необходимости исследование следует повторить на
3-4-й неделе заболевания. Если при типичной клинической картине лептоспироза
и характерном эпидемиологическом анамнезе результат серологического иссле¬
дования отрицательный, необходимо повторить исследование перед выпиской и
через 2 мес после выписки из стационара в период диспансерного наблюдения за
реконвалесцентом.Реакция микроагглютинации. Для постановки РМА используют живые куль¬
туры лептоспир с хорошей подвижностью клеток, без спонтанной агглютинации
и посторонних примесей (осадка, контаминации посторонней микрофлорой), с
накоплением 5x10^ клеток в 1 мл (50-100 лептоспир в поле зрения микроскопа
при увеличении в 400 раз). Каждую сыворотку исследуют со всеми референтными
штаммами, представляющими серогруппы патогенных лептоспир, циркулирующих
в данной местности. Для диагностики лептоспироза на территории Российской
Федерации рекомендуют стандартный набор из 13 штаммов, принадлежащих к
10 серогруппам (табл. 21-39).При реакции микроагглютинации сыворотку больного разводят в 10 и 50 раз
0,9% раствором натрия хлорида (1:10 и 1:50 соответственно) для исключения
феномена прозоны. В сл>"чае положительной реакции сыворотку титруют для
определения конечного разведения, в котором обнаруживают агглютинаты.Таблица 21-39. Набор эталонных штаммов лептоспир для РМА. рекомендуемый для диагности¬
ческих исследований на лептоспироз в Российской Федерации (Методические указания. — М.;
Минздрав России, 2002)СерогруппаСероварЭталонный штаммIcterohaemorrhagiaeCopenhagen!M20JavanicaRoiFoiНапкаНапка'CanicolaCanicolaHond Utrecht IV
(Каширский)"AutumnalisAutumnalisAkiyami AAustralisAustralisBallico
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ467Окончание табл. 21-39СерогруппаPomonaGrippotyphosaSejroeBataviaeTarassoviСероварPomonaMozdokGrippotyphosaSaxkoebingWornDjalziTarassoviЭталонный штаммPomonaП.О. 5621Moskva VМиз 243705HS26Перепепицин' Циркуляция лептоспир серовара Напка установлена только в природных очагах Приморского
края, поэтому соответствующий штамм рекомендуют для включения в диагностическую панель
только на данной терретории." В скобках указан отечественный аналог.Разведенную сыворотку и живые культуры лептоспир смешивают в равных
объемах по 50 мкл в лунках полистироловых планшетов. Контроль — культуры
лептоспир. смешанные с равным объемом физиологического раствора. После экс¬
позиции в течение 30 мин при комнатной температуре проводят учет реакции. Для
этого из каждого разведения сыворотки готовят раздавленную каплю и микроско¬
пируют в темном поле при увеличении в 200 или 400 раз. Вследствие добавления к
испытуемой сыворотке равного объема культуры лептоспир разведение сыворотки
удваивается, то есть сыворотка, разведенная 1:10 с культурой, становится разве¬
денной 1:20. Феномен агглютинации проявляется образованием различных форм
агглютинатов — в виде паучков, клубочков, кос. Реакцию оценивают по условной
3-балльной шкале:•	«4-» — Уз лептоспир агглютинированы (по сравнению с контролем);•	«-Н-» — Уг лептоспир агглютинированы;•	«+-Н-» — агглютинированы почти все лептоспиры.Для серологаческого исследования в РМА используют нативную сыворотку.
Доказательство лептоспирозной этиологии заболевания — нарастание и-ггров
антител даже в невысоких разведениях (при первом исследовании антитела не
обнаружены, при втором — титр 1:20). Во время вспышки лептоспироза при
выявлении у больных антител в титрах 1:100 и выше достаточно однократного
исследования.При исследовании сывороток крови больных в 60% испытуемых образцов,
особенно на 1-2-й неделе заболевания, наблюдаются межгрупповые реакции
(сыворотка реагирует с лептоспирами нескольких серогрупп), что затрудняет
установление этиологического агента. В таких случаях следует считать, что
заболевание обусловлено лептоспирами той серогруппы, к которой определяют¬
ся антитела в наиболее высоком разведении сыворотки. Исследование парных
сывороток также помогает установить серогруппу возбудителя, так как на более
поздних сроках заболевания специфические антитела синтезируются только к
нему.Реакция макроагглютинации (слайд-агглютинация). Для предварительно¬
го тестирования сывороток больных с подозрением на лептоспирозную инфекцию
и для массового скрининга можно использовать реакцию макроагглютинации на
стекле (слайд-агглютинацию). В данной реакции используют родоспецифический
антиген, позволяюш[ий выявлять антитела к различным серогруппам лептоспир.
Сыворотку, дающую положительную реакцию агглютинации, в дальнейшем
исследуют в РМА. Для диагностики лептоспироза используют тесты, основанные
на реакции непрямой гемагглютинации. Система, включающая эритроциты, свя¬
занные с антигеном, полученным путем разрушения клеток лептоспир, позволяет
выявлять антитела к различным серовариантам лептоспир. Использование вместоШ
тш468ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯЩмэритроцитов синтетических микрокапсул и латексных частиц позволяет создавать
более доступные системы диагностики, в основе которых лежит тот же принцип,
что и в случае реакции непрямой гемагглютинации, Преим>тцесгво синтетических
микрокапсул перед эритроцитами заключается в их химической стабильности.
Латексные гранулы обладают теми же преимуществами, что и синтетические
микрокапсульк В различных системах, основанных на агглютинации латекса, в
качестве антигена используют молекулы липопротеина LipL41, выделенные из
рекомбинантного штамма лептоспир, или клетки лептоспир, разрушенные термо¬
лизом.Нитроцеллюлозные тест-полоски для выявления антител к лептоспирам с нане¬
сенным антигеном лептоспир применяют в том числе и для скрининговых иссле¬
дований. Они не требуют особых условий хранения и высокого уровня подготовки
персонала. В качестве антигена можно использовать термически разрушенные
клетки лептоспир.Иммуноферментный анализ. В конструировании тест-систем для ИФА при¬
меняют антигены различного состава, в том числе разрушенные термолитически
или ультразвуком клетки патогенных лептоспир. Со.зданы специфичные системы
на основе рекомбинантных белков для определения содержания IgM, IgG и IgA.
В состав таких систем входят молекулы липопротеина LipL32, консервативный
домен иммуноглобулиноподобных белков LigA и LigB, белков поверхностной
мембраны MPL17 и MPL21, а также рекомбинантной белковой молекулы, вклю¬
чающей эпитопы порина OmpLl и липопротеинов LipL21, LipL32, LipL41, LipL45.
Применение фрагмента молекулы LigA и порина OmpLl в качестве антигенов
для ИФА делает диагностику более точной, поскольку при вакцинации антитела
к данным антигенам не вырабатываются в отличие от антигенов, выявляемых в
РМА, титры антител к которым могут достигать уровня, сопоставимого с титром
антител при острой инфекции. Антитела к LigB также ассоциированы с острым
течением лептоспироза, их содержание в плазме крови в период реконвалесценции
снижается быстрее, чем содержание антител, выявляемых в РМА. Недостаток диа¬
гностических систем, основанных на выявлении антител к LipL32 и LipL41, — воз¬
можность перекрестной реакции с плазмой крови больных сифилисом и болезнью
Лайма, а также вирусным гепатитом.КОРИНЕБАКТЕРИИТАКСОНОМИЯРод Corynebacterium входит в состав семейства Corynebacteriaceae, относяще¬
гося к порядку Actinomycetaïes. Наиболее значимые виды рода Corynebacterium —
С. diphtheriae, С. uîcerans, С. pseudotuberculosis, С. striatum, С. minutissimum, С. xerosis,
С. pseudodiphtheritîcum, С. glucuronolytîcum, С. renale, С. cistitidis.Основной признак систематики коринебактерий — биохимический состав
клеточной стенки (наличие коротких цепей миколовой кислоты с 32-36 атомами
углерода и мезодиаминопимелиновой кислоты в качестве диаминокислоты пепти¬
догликана).ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАКоринебактерии — грамположительные, неравномерно окрашиваемые пря¬
мые или слегка изогнутые палочки размером 1,5-8хО,3-0,8 мкм. Многие из них
способны формировать внутриклеточные гранулы волютина (полиметафосфаты).
Спор не образуют, но имеют микрокапсулу. Неподвижны. Кислотонеустойчивы.
Каталазоположительны. Обладают смешанным (бродильным и дыхательным)
метаболизмом. Факультативные анаэробы.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 469ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИКоринебактерии широко распространены. Большинство из них — облигатные
паразиты слизистых оболочек человека и животных.С. diphtheriae. Вызывает у человека классическую дифтерию верхних дыха¬
тельных путей, сопровождаемую тяжелой интоксикацией. В 1884 г. Леффлер не
только установил этиологргческую роль данного возбудителя, но и доказал воз¬
можность бактерионосительства без клинических симптомов.Входные инфекции — чаще всего слизистые оболочки миндалин, реже — слизи¬
стые носа и гортани, очень редко — конъюнктива глаз, наружные половые органы,
поврежденная кожа. Клинические симптомы дифтерии обусловлены воздействием
дифтерийного экзотоксина и проявляются в виде местных и общих нарушений.
Наибольшая выраженность действия токсина наблюдается при формах дифтерии,
протекающих с развитием тяжелых осложнений (миокардите, полирадикулонев-
ритах).Инкубационный период при дифтерии составляет от 3 до 7 дней. Клиническая
картина болезни разнообразна. Классификация дифтерии основана на локали¬
зации и распространенности местного поражения (налета) и оценке тяжести
заболевания по выраженности интоксикации или степени нарушения функции
пораженного органа (стеноза гортани). В зависимости от локализации различа¬
ют дифтерию зева, носа, гортани, глаза, уха, половых органов, кожи; выделяют
комбинированные формы дифтерии с локализацией местного поражения в двух
и более органах (дифтерию зева и носа, зева и гортани). Диагностика атипичных
форм дифтерии основывается на данных лабораторного исследования (выделении
дифтерийных палочек из материала, взятого из места поражения) и обнаружении
частых параллельных симптомов поражения зева или носа.С. uîcerans. Является одним из возбудителей мастита у коров. У людей, ухажи¬
вающих за инфицированным скотом, может вызывать дифтериеподобное заболе¬
вание.С. pseudotuberculosis. Бактерия известна как возбудитель ряда заболеваний
мышей, овец, лошадей и других теплокровных животных. У человека в редчайших
случаях может вызывать абсцесс глотки.С. minutissimum. Возбудитель эритразмы, бактериемии, эндокардита чело¬
века.С. striatum. Представитель нормальной микрофлоры слизистой оболочки
глотки, но может выделяться и из молока коров, больных маститом. Двадцати¬
четырехчасовая культура детальна для мышей при внутривенном введении.
У человека может вызывать плевральные и легочные абсцессы,С. xerosis. Нормальный обитатель кожи и слизистых оболочек человека, впер¬
вые был изолирован из материала, взятого из слезного канала. У человека в редких
случаях вызывает вялотекущий конъюнктивит, эндокардит, пневмонию и раневую
инфекцию. Последние регистрируют у больных с тяжелыми сопутствующими
заболеваниями или принимавших глюкокортикоиды.с. pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка). Нормальный обита¬
тель слизистых оболочек человека, однако у пациентов с ослабленным иммуни¬
тетом может вызывать эндокардит, лимфаденит, кожные поражения, инфекцию
мочевыводящих путей.с. ^ucuronolyticum. Выделена от людей с заболеваниями мочеполовой систе¬
мы (в том числе простатитом и уретритом).С, renale. Часто обнаруживают на коже вымени здоровых коров, может вызы¬
вать у жвачных цистит и пиелит. Могут вызьшать цистит и пиелонефрит у челове¬
ка, чаще у женщин. У людей обычно поражает почки.С cistitidis. Обнаруживают в моче здорового крупного рогатого скота.
Может вызывать геморрагические циститы и инфекции препуция. У человека
470ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯнаиболее часто колонизирует кожу и слизистые оболочки, особенно в обла¬
сти промежности. Чаще выделяют у женщин. Вызывает повышение pH мочи и
образование камней в мочевыводящих путях. Является одним из возбудителей
геморрагического цистита, пиелонефрита и бактериемии у пациентов старшего
возраста, имеющих в анамнезе урологическую патологию, перенесенное опе¬
ративное вмешательство или длительный прием антибактериальных препара¬
тов широкого спектра действия. Отмечены случаи госпитальных бактериемий
и пневмоний.Сведения об отдельных видах недифтерийных коринебактерий, этиологическая
роль которых в возникновении патологических состояний является доказанной,
приведены в табл. 21-40.Таблица 21-40. Пейзаж недифтерийных коринебактерий, выделенных при различных заболева¬
ниях (Краева Л.А., 2000)N»ДиагнозИсследуемый материалКоринебактерии1Дифтерия зеваСлизь из зеваС. xerosisс. paurmetabolicum2Дифтерия наружных
половых органовСоскоб из влагалищаС. urealyticum3НазофарингитСлизь из зева и носаС. pseudodiphtheriticum
С. auris
С. xerosisС. paurumetaboiicum
С. uîcerans4РинитСлизь из носаС. pseudodiphtheriticum
С. aurisС. haamolyîicum
С. uîcerans5ТонзиллитСлизь из зеваС. pseudodiphtheriticum
С. xerosisС. paurumetaboiicum
С. uîceransС. pseudotuberculosis6БронхитМокротаС. striatum
С. auris
С. xerosis7ПневмонияМокротаС. pseudotuberculosis
С. xerosis8Аллергический дерматитСмыв с поверхности кожиС. pseudodiphtheriticum
С. minutissimum9ДерматозСмыв с поверхности кожиС. minutissimum
С. haemoiyticum10ОфтальмитМазок из глазаС. macginleyi11АднекситМазок из влагалищаС. xerosis12ВульвовагинитМазок из влагалищаС. glucuronolyticum
С. urealyticum13УретритМочаС. glucuronolyticum
С. urealyticum14ПиелонефритМочаС. urealyticum15Незаживающая ранаОтделяемое раныС. pilosum16ОтитОтделяемое из ухаС. minutissimum
С. aurisВсего1614 видов рода Corynebacterium
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 471ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
Материалы для лабораторных исследованийДля хорошей высеваемости С. diphtheriae большое значение имеют правиль¬
ные взятие и доставка материала. Выполнять данные действия должен специ¬
ально обученный медперсонал. Исследование проводят с диагностическими
и профилактическими целями, а также по эпидемиологическим показаниям,
От больных с подозрением на заболевание дифтерией материал забирают как
можно скорее, не позднее 12 ч с момента обращения в ЛПУ. Для исследования
берут пленки и слизь с миндалин, слизистой оболочки зева и носа. При подо¬
зрении на дифтерию редкой локализации (глаз, ухо, кожа, рана, влагалище)
забирают отделяемое с пораженных участков и одновременно со слизистой обо¬
лочки зева и носа. При видимых поражениях материал рекомендуют брать на
границе здоровой и пораженной ткани, слегка нажимая зондом-тампоном. Если
видимые поражения отсутствуют, следует взять как можно больше материала с
миндалин. Взятие проб проводят натощак или через 2 ч после еды, перед этим не
следует пить и полоскать рот. Материал со слизистой оболочки зева и носа соби¬
рают отдельными зондами-тампонами, при подозрении на дифтерию редкой
локализации дополнительно используют еще один зонд-тампон. Если доставка
материала в лабораторию будет осуществлена быстро (менее чем за 3 ч), исполь¬
зуют сухие стерильные зонды-тампоны. Если время доставки больше, возможны
следующие варианты:•	забирают материал зондом-тампоном, смоченным в 5% растворе глицерина в
0,9% растворе натрия хлорида и простерилизованным при 0,5 атм в течение
30 мин;•	взятие материала осуществляют сухим зондом-тампоном, который погружа¬
ют в транспортную среду.Использование в качестве транспортной среды питательного бульона с добавле¬
нием сыворотки позволяет применять экспресс-методы выявления дифтерийного
токсина — ИФА или РНГА.В случае исследования трупного материала целесообразно взять пробу с мин¬
далин, слизистой оболочки гортани и полостей носа. Локализация возбудителя во
внутренних органах встречается крайне редко. В осенне-зимний период весь мате¬
риал доставляют в лабораторию в термосумках или термоконтейнерах. Каждая
пробирка должна быть пронумерована с указанием источника исследуемого мате¬
риала (слизистая оболочка зева, носа, отделяемое раны). В прилагаемом списке
соответсгвенно номеру указывают Ф.И.О., возраст и домашний адрес больного,
название учреждения, отправившего материал, цель исследования (диагности¬
ческое, по эпидпоказаниям, профилактическое), дату и время взятия материала,
Ф.И.О. медицинского работника, взявшего материал, и подпись врача.Изоляция и идентификация возбудителяСхема бактериологического исследованияПервый день. Материал от одного лица засевают на чашку с дифференциально¬
диагностической средой (кровяно-теллуритовым агаром, Клауберга II и др.) и
чашку с кровяным агаром, используя при этом половину чашки для посева мате¬
риала со слизистой оболочки носа, а вторую половину — со слизистой оболочки
зева. Если проба взята из очага редкой локализации, добавляют еще одну чашку с
кровяно-теллуритовой средой. Необходимо следить за тем, чтобы чашки не были
холодными.При посеве материал втирают в питательную среду, поворачивая и обжимая
тампон со всех сторон на площади 2x1 см, а затем частыми непрерывными движе¬
ниями штрихуют всю поверхность, не меняя положения тампона (не поворачивая
его). Такая методика позволяет получать изолированные колонии, которые можно
472 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯиспользовать для дальнейшей идентификации, что сокращает длительность ана¬
лиза.Засеянные чашки и пробирки с транспортной средой помещают в термостат. Из
транспортной среды на следующие сутки проводят высев на среды для первичного
выделения (на практике такой высев делают через 6-8 ч).На обезжиренных стеклах готовят несколько мазков, поворачивая тампон раз¬
ными сторонами, высохшие мазки фиксируют в пламени и окрашивают щелочной
метиленовой синькой Леффлера. При микроскопии просматривают как можно
больше полей зрения (до 100). Если материал был взят с пораженных участков,
бактерии, подозрительные на принадлежность к роду Corynebacterium, удается
обнаружить в 40-50% случаев. Особенно целесообразно использовать бактерио¬
скопию первичного материала при подозрении на дифтерию раны, так как в этом
случае первичный посев может дать отрицательный результат из-за местного при¬
менения лекарственных средств.Морфологические признаки, характер расположения микроорганизмов не
позволяют установить видовую принадлежность, но дают возможность предпо¬
ложительно отнести выделенную культуру к роду коринебактерий.Второй день. Начинают с просмотра чашек с первичным посевом. Проводить
его лучше с помощью стереомикроскопа, чтобы не пропустить подозрительные
колонии, которые следует отобрать для дальнейшей идентификации по всем
тестам. Подозрительные на принадлежность к С. diphtheriae колонии на кровяно-
теллуритовых средах выпуклые, круглые (1-2 мм), черно-серого цвета, на кровя¬
ном агаре - круглые, непрозрачные, слабого кремового оттенка.Микроскопию мазков из типичных колоний не проводят, но из сомнительных
колоний препараты готовят обязательно, окрашивая их щелочной метиленовой
синькой Леффлера. Коринебактерии, выросшие на средах с ингибитором, могут
быть полиморфными, однако сохраняют присущее им характерное расположение.
При обнаружении на чашках только стафилококков, дрожжей и споровых палочек
дальнейшее исследование прекращают.При работе следует пользоваться бактериологической петлей небольшого диа¬
метра (1-2 мм). Дальнейший ход исследования зависит от того, какое количество
подозрительных колоний выросло на средах первичного посева.•	Если выросла только одна подозрительная колония, ее засевают на среду
для определения токсигенности и, не обжигая петли, в столбик среды Пизу
для определения цистиназной активности. Дальнейшее из)гчение культуры
можно проводить из «бляшки», выросшей на среде для определения токси¬
генности.•	Если выросло много подозрительных колоний, приступают к изучению ток¬
сигенных свойств, используя при этом как можно больше колоний (не менее
10), из)гчая как чистые культуры из изолированных колоний, так и смешан¬
ные по 5-6 культур в одной «бляшке?>. при этом важно, что в исследуемом
материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные
штаммы С, diphtheriae.При обнаружении на чашках первичного посева большого количества подо¬
зрительных колоний в столбик среды Пизу вносят 5-6 однотипных колоний.
Положительный результат — почернение по ходу укола и образование коричне¬
вого «облачка» сульфида свинца — учитывается через 3-6 ч при использовании
модифицированной среды Пизу.Дополнительно можно выполнить тест на ферментацию мочевины (по методу
Заксе или с использованием индикаторного диска) с 5-6 однотипными коло¬
ниями. Результат учитывают через 30 мин-2 ч инкубации при температуре 37 °С.
Подозрительные колонии отсевают на сывороточный бульон и после 5-24 ч под¬
ращивания используют РНГА или ИФА для определения дифтерийного токсина.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 473 ^Культуру из изолированной колонии засевают на среду накопления (косячок |
сывороточного агара).	|По характерной морфологии клеток, виду колоний, положительной пробе на |
цистиназу, отрицательной на уреазу, положительному результату ИФА или РНГА |
можно выдать предварительный ответ об обнаружении культуры, подозрительной |
на С diphtheriae.	\Чашки с первичным посевом вновь помещают в термостат еще на сутки.	|Третий день. Просматривают чашки с посевами на токсигенность в проходя- I
щем свете и на темном фоне, с лупой и без нее. Выделенная культура считается
токсигенной, если образовавшиеся линии преципитации контрольного и иссле¬
дуемого штаммов, сливаясь концами, плавно переходят одна в другую. Если испы¬
туемый штамм дал несколько преципитационных линий, специфической следует
считать наиболее четкую.При отсутствии преципитационных линий чашки дополнительно инкубируют
еще 24 ч, но не больше, так как на более поздних сроках возрастает вероятность
появления линий неспецифической преципитации.При наличии линий специфической преципитации, положительной пробе на
цистиназу и отрицательной на уреазу выдают документированный предваритель¬
ный ответ, что выделена культура токсигенного штамма С. diphtheriae.Культуру, выросшую на сьшороточном косячке или на среде Пизу, после про¬
верки чистоты засевают на среды с мочевиной, пиразинамидом и углеводами
(глюкозой, сахарозой и крахмалом), а также нитратную среду.Просматривают повторно чашки с первичными посевами. Если отсутствует рост
колоний, подозрительных на С. diphtheriae, выдают окончательный отрицательный
ответ. Если в сопроводительном документе было указано, что материал был взят от
больного с клинической картиной дифтерии, исследование необходимо повторить.к настоящему времени существуют данные о том, что рост С. diphtheriae из пато¬
логического материала иногда можно наблюдать через 72 ч и более после посева.
Именно поэтому к срокам выдачи отрицательного ответа через 48 ч, определен¬
ным в нормативных документах, следует относиться осторожно.Четвертый день. Повторно просматривают чашки с посевами на токсиген¬
ность. Учитывают результаты ферментации углеводов, характер изменения сред с
мочевиной, пиразинамидом и нитратами.При отсутствии специфических преципитационных линий через 48 ч инкуба¬
ции, но положительной пробе на цистиназу, ферментации глюкозы до кислоты,
отрицательными тестами на уреазу и пиразинамидазу, сахарозу, выделенную куль¬
туру идентифицируют как нетоксигенный штамм С. diphtheriae.Если предварительный ответ о выделении токсигенного штамма уже был выдан
на 3-й день, то на основании учета результатов всех биохимических тестов окон¬
чательный ответ с указанием биовара выдается на 4-й или 5-й день исследования
в зависимости от использованного варианта теста на ферментацию крахмала.
Последний на среде Гисса занимает 48 ч, а с использованием индикаторного диска —24 ч. Предварительный ответ может быть изменен после окончания бактериоло¬
гического исследования.В 1997 г. были опубликованы данные, которые могут привести к переоценке
значимости цистиназного теста для идентификации С. diphtheriae. Впервые было
выделено 4 штамма, которые не обладали цистиназной активностью. При этом у
всех культур токсигенные свойства были выявлены только на 2-е сутки. По всем
другим тестам они имели типичные свойства, характерные для С. diphtheriae gravis.При проведении ПЦР принадлежность данных культур к С. diphtheriae была под¬
тверждена.Дифференциацию других видов проводят на основании оценки результатов
биохимических тестов с использованием прилагаемых таблиц и схем.Ш
ШШ474ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯКультурально-морфологические особенности коринебактерийНиже приведены культурально-морфологические особенности наиболее часто
встречаемых у человека коринебактерий.С. diphtheriae. По морфологии колоний, выросших на кровяно-теллуритовых
средах, морфологии палочек в мазках, отношению к ферментации крахмала и
редукции нитратов С diphtheriae делят на четыре культурально-биохимических
варианта — gravis, mitis, intermedius, beîfanti.С. diphtheriae gravis на кровяно-теллуритовых средах через 24 ч вырастают в
виде черно-серых сухих колоний, крошащихся под бактериологической петлей.
Диаметр колоний 1,5-2,0 мм. В микроскопических препаратах, приготовленных
из этих колоний ^ видны короткие полиморфные палочки с небольшим количе¬
ством волютина. Ферментируют крахмал.С. diphtheriae mitis на кровяно-теллуритовых средах через 24 ч роста формируют
черные круглые выпуклые гладкие колонии диаметром 1,5-2,0 мм. В мазках —
длинные изогнутые палочки с большим количеством волютина. Крахмал не фер¬
ментируют.С. diphtheriae intermedius на кровяно-теллуритовых средах через 24 ч выраста¬
ют в виде серо-черных нежных круглых плоских колоний размером 0,5-1,0 мм.
В мазках — длинные, бочкообразной формы палочки с небольшим количеством
волютина. Крахмал не ферментируют.С. diphtheriae belfanti на кровяно-теллуритовых средах через 24 ч формируют
черно-серые округлые гладкие колонии среднего размера — 1-2 мм. Крахмал не
ферментируют, в отличие от других вариантов С, diphtheriae не редуцируют нитра¬
ты.В настоящее время на кровяно-теллуритовых средах признаки дифференци¬
рованного роста и различия по морфологии палочек в мазках не выявляются.
Остается только один четкий дифференцирующий тест — ферментация крахма¬
ла. По данному признаку С, diphtheriae intermedius не отличается от С. diphtheriae
mitis, к тому же этот вариант практически отсутствует в естественной циркуляции.
Именно поэтому описание С. diphtheriae intermedius из многих официальных доку¬
ментов исключено. С diphtheriae belfanti также относится к редко встречаемым
вариантам.С. uîcerans. На кровяно-теллуритовых средах через 1 сут вырастает в виде коло-
ний, похожих на С. diphtheriae. В микроскопических препаратах — мелкие овоиды
и коккоподобные палочки.С. pseudotuberculosis. Палочки размером 0,5-0,6x1-3 мкм с метахроматиче-
скими гранулами. На кровяном агаре через 24 ч формируют колонии кремового
цвета, с матовой поверхностью и небольшой зоной гемолиза. В микроскопических
препаратах — палочки размером 0,5-0,6x1-3 мкм с метахроматическими грану¬
лами.С, minutissimum. На плотных питательных средах через 24 ч формируют глад¬
кие блестящие колонии размером 1 мм. Если колонии выросли на сывороточном
агаре, то под лампой Вуда (длина волны 365 нм) они светятся розовым светом. В
мазках — палочки (0,3-0,6x1-2 мкм) с перешейком на одном из сужающихся кон¬
цов с метахроматическими гранулами.С. striatum. На кровяном агаре через 48 ч формируют мелкие, блестящие, кру¬
глые колонии со слабой зоной гемолиза в глубине. Некоторые штаммы продуци¬
руют зеленовато-желтый пигмент, диффундирующий в среду. В микроскопических
препаратах — палочки кокковидной формы (0,25-0,5x2-3 мкм) с небольшим
количеством волютина.С. xerosis. На плотных питательных средах через 1 сут формируют мелкие
(1 мм) колонии с гладкой или шероховатой поверхностью. Колонии могут быть
окрашены в разные оттенки желтого цвета.
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ475С. pseudodiphtheriticum. Хорошо растут на питательных средах без добавления
крови и сыворотки. На плотных средах через 1 сут формируют серовато-белые или
кремовые колонии слизистой консистенции с блестящей поверхностью, в микро¬
скопических препаратах — палочки правильной формы, размером 0,3-0,5х0,5-
2 мкм, с небольшим количеством волютина.С. glucuronolyticum. На агаре с кровью через 24 ч вырастают в виде желтоватых
выпуклых колоний диаметром 1,0-1,5 мм без зоны гемолиза.С. rénale. Хорошо растут на средах с сывороткой, на агаре с кровью дают зону
гемолиза, окружающую желтовато-прозрачные колонии.С. cistitidis. Даже на сывороточном агаре растут скудно, давая белые колонии.
В микроскопических препаратах — мелкие прямые или слегка изогнутые палочки,
с характерным расположением.Идентификационные биохимические свойства коринебактерийПри идентификации выделенных культур коринебактерий основными призна¬
ками служат тесты:•	на цистиназу;•	пирамидазу;•	уреазу;•	нитратредуктазу;•	ферментацию углеводов (глюкозы, сахарозы, крахмала).С. diphtheriae не расщепляют мочевину, редуцируют нитраты (за исключением
С. diphtheriae beîfanti), продуцируют цистиназу, не обладают пиразинамидазной
активностью, ферментируют глюкозу и мальтозу до кислоты. С. diphtheriae gravis
ферментируют крахмал. Подавляющее большинство штаммов не ферментируют
сахарозу. Имеются сведения о выделении штаммов С. diphtheriae, не обладающих
цистиназой.Выпускаются коммерческие диски с мочевиной и сахарами, тест-системы
для биохимической идентификации С. diphtheriae, определения биохимических
свойств и дифференцирования коринебактерий внутри рода и другие изделия для
микробиологической идентификации С. diphtheriae и определения антимикробной
активности.Информация о биохимических тестах представлена ниже и в табл. 21-41, 21-42.Выявление цистиназы. Культуры, принадлежащие к С. diphtheriae, продуциру¬
ют цистиназу. Активность этого фермента оценивают в модифицированной среде
Пизу.2,7 г АГВ-агара вносят в 90 мл дистиллированной воды и кипятят до полного
растворения. Готовят 10 мл 5% раствора натрия гидрокарбоната, в него вносят
0,1 г L-цистина и кипятят, пока навеска не растворится. 2 мл кипящего раствора
цистина вливают в 90 мл АГВ-агара, доводят pH до 7,7, стерилизуют при 0,5 атм в
течение 10 мин, охлаждают до 50 “С и последовательно добавляют 10 мл лошади¬
ной сыворотки, 1 мл 10% раствора уксуснокислого свинца и 1,5 мл 10% раствора
гипосульфита натрия (готовят непосредственно перед использованием в стериль¬
ных пробирках, растворяя вещества в стерильной дистиллированной воде и про¬
гревая на водяной бане при температуре 90 X в течение 30 мин).Среду разливают в узкие пробирки столбиком высотой 3-4 см. Посев проводят
уколом. Результаты учитывают через 3-5 ч инкубации. В процессе роста культуры,
продуцирующей цистиназу, цистин расщепляется, а образующийся сероводород
вступает в реакцию с уксуснокислым свинцом, образуя сернистый свинец черно¬
коричневого цвета. При этом наблюдается почернение среды по ходу укола и
появление коричневого «облачка» в радиусе 1 см от него. Выполнение положи¬
тельного и отрицательного контроля обязательно.Выявление пиразинамидазы. В нашей стране тест широко не используется (в
отличие от зарубежных лабораторий). Наряду с тестом на цистиназу он позволяет
476 МАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯдифференцировать три потенциально токсигенных вида (С. diphtheriae, С. uîcerans,
С. pseudotuberculosis) от других коринебактерий.2	г пиразинамида растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Стерилизуют,
пропустив через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Хранят при тем¬
пературе -20 °С. В порошкообразном состоянии пиразинамид токсичен, поэтому
не следует допускать его контакта с кожей и попадания на слизистую оболочку
верхних дыхательных путей.Раствор сульфата аммонийного железа в присутствии пиразинамида бесцветен.
В качестве реактива используют 20% раствор сульфата аммонийного железа в сте¬
рильной дистиллированной воде, хранят при температуре -20 °С.Б 0,25 мл раствора пиразинамида вносят несколько капель густой взвеси суточной
бактериальной культуры. Инкубируют при температуре 37 X в течение 4-24 ч, после
чего в каждую пробирку прибавляют по одной капле 20% раствора сульфата аммоний¬
ного железа. При наличии пиразинамидазы в пробирке появляется красно-оранжевое
окрашивание, при отсутствии фермента среда остается бесцветной или слегка желтеет.
Выполнение положительного и отрицательного контроля обязательно.Выявление уреазы. Пробу на наличие у изолята уреазы осуществляют
несколькими способами:•	методом Заксе;•	методом индикаторных дисков.Метод ЗаксеРаствор А: 2 г мочевины растворяют в 2 мл 96% этилового спирта, добавляют4	мл дистиллированной воды.Раствор Б: 0,1 г КН^РО^ + ОД г К^НРО^ + 0,5 г натрия хлорида + 1 мл 0,25% рас¬
твора фенолового красного + до 100 мл дистиллированной воды.Раствор Б автоклавируют при 0,5 атм в течение 30 мин.Перед исследованием берут 1 часть раствора А и 19 частей раствора Б, смеши¬
вают и разливают по ОД мл в стерильные агглютинационные пробирки. Вносят
1-2 петли исследуемой культуры и помещают пробирки в термостат при темпе¬
ратуре 37 X на 30 мин. При наличии уреазы среда приобретает ярко-малиновое
окрашивание.Метод индикаторных дисковВ 0,3 мл густой взвеси суточной культуры в 0,9% растворе натрия хлорида (pH =
7,3±0,1) вносят диск с мочевиной и индикатором, инкубируют при 37 °С, учитывают
результаты через 40 мин-2 ч. При наличии уреазы мочевина расщепляется, образу¬
ющийся аммиак подщелачивает среду и белый цвет диска меняется на малиновый.Выявление нитратредуктазы. Способность С. diphtheriae восстанавливать
нитраты в нитриты — дополнительный тест, позволяющий дифференцировать ее
от С, uîcerans. Исследуемую культуру инкубируют в течение 24 ч в питательном
бульоне с 0,1% раствором нитрата натрия, после чего добавляют 2-3 капли реак¬
тива Грисса. В случае образования нитритов среда окрашивается в красный цвет.Реактив Грисса состоит из двух растворов: № 1 — 0,8 г сульфаниловой кисло¬
ты растворяют в 100 мл 30% раствора уксусной кислоты при слабом нагревании;
№ 2 — 0,6 г а-нафталамина растворяют в 100 мл 30% раствора уксусной кислоты.
Растворы хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой, перед использо¬
ванием смешивают в равных объемах.Оценка ферментации углеводов. Густую взвесь суточной культуры
в 0,9% растворе натрия хлорида (pH = 7,3±0,1) разливают в пробирки по 0,3 мл.
В каждую пробирку вносят соответствующий диск (с глюкозой, сахарозой, крах¬
малом). Инкубируют при температуре 37 °С. При ферментации глюкозы и сахаро¬
зы диски меняют цвет через 5-6 ч. Для учета ферментации крахмала через 18-24 ч
инкубации в пробирку дополнительно вносят индикаторный диск с йодом. При
отсутствии амилазы он интенсивно синеет через 1-2 мин.
Таблица 21-41. Дифференциальные признаки видов рода Corynebacterium по биохимическим тестамВид микроорганизмаГлюкозаМальтозаМаннозаСахарозаКрахмалУреазаТирозинФосфатазаПиразинМ.К.НитратыС. accotens+-XX-X+С. afermentans------+-С. атусоШт+(+)+d-d-+С. arger)toratense+----+-С. auris---+-С. bovis++-----++--С. callunae++++-++-С. cystiîidis+--++--+--С. diptitlienae belfanti++--------С. dipiytfieriae gravis++--+----+С. dipbttieriae intermedius++-------+С. diphtfjeriae mitis++-------+С. glucuronolyticum+X-+X+XС. glutamicum++++-+++С. flavescens+-+-----+-С. jeikeium+d-------С. kutscheri++++++--+-+С. macginleyi+-X+--+С. matruct}otii+++-d-+-+С. minutissimum+d+--++--С. mycetoides+---+_-С. paurometabolicm~-----++--С. pilosum+++-++-+-+С. propinquum----X+С. pseudodiptitheriticum----+--+-+С. pseudotuberculosis+++d-+---+d4^
Окончание табл. 21-41Вид микроорганизмаГлюкозаМальтозаМаннозаСахарозаКрахмалУреазаТирозинФосфатаза IПиразинМ.К.НитратыС. renale+---++-С. striatum+++-+-+++-С. ulcerans++--+--С. urealyticum----++-С. vitarumen++++-+-+++С. xerosis+-++----+-+*vjсоПримечание:—	позитивная реакция.«-» — негативная реакция.«{+)» - 80-89% штаммов позитивны.
«(3» — 21'79% штаммов позитивны.
«X*- — данные отсутствуют.МК — проба с метиленовым красным.Таблица 21-42. Биохимические свойства возбудителя дифтерии, других патогенных и часто встречаемых коринебактерийТестС. diptitherlae
gravis 11 С. фЫШае millsС. iHplitheriae
intermeiifusС. liiptHherlae
belfantiС. ulceransС. pseudo¬
tuberculosisс. xerosisс. pseudodipti-
theriticumФерментацияГлюкоза+++++++-Мальтоза+++++++-Сахароза-----+-Крахмал+----{5%)--Активность ферментовУреаза---+++-+Цистиназа+++++--Нитратредуктаза+++-+ (1%)+Пиразинамидаза----++
ШШЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ479Выявление дифтерийного токсинаПри использовании классических лабораторных методов выделения и иден¬
тификации С. diphtheriae получение ответа возможно через 48-72 ч от начала
исследования. Это обусловливает необходимость внедрения новых подходов к
диагностике дифтерии, особенно при определении основного фактора патоген¬
ности микроорганизма — дифтерийного токсина, что позволяет сократить время
иса1едования, а также использовать более чувствительные и специфичные методы
диагностики. С этой целью предложены генотипические, фенотипические и био¬
логические методы индикации дифтерийного токсина:•	тестИлека;•	иммуноферментный анализ;•	реакция пассивной гемагглютинации;•	иммунохроматографический тест;•	полимеразная цепная реакция.Тест ИлекаВ основе теста лежит реакция встречной иммунодиффузии в агаровом геле: анти¬
ген (дифтерийный токсин) и антитоксин, нанесенные на полоску фильтровальной
бумаги или бумажные диски, диффундируют навстречу друг другу. В месте, где они
встречаются, формируется полоса преципитации в виде белой линии, или «усов*>.
Для того чтобы не затруднять диффузию токсина и антитоксина, а образуемые
линии преципитата хорошо визуализировались, питательный агар должен быть
не очень плотным (не более 1,5%) и прозрачным. Поскольку длительная термиче¬
ская обработка ухудшает качество питательной среды, стерилизовать агар следует
однократно текучим паром в течение 30 мин.Обязательно выполнение параллельных контролей с тест-штаммами С. diph¬
theriae tox+ (NCTC № 10648), С. diphtheriae tox± (NCTC № 3984), C. diphtheriae
tox- (NCTC № 10356). B качестве контрольных не следует брать производствен¬
ные штаммы, так как они могут давать ярко выраженные линии неспецифической
преципитации, трудноотличимые от специфических. При выполнении теста лучше
применять диагностический антитоксин, очищенный от примесей ферментолизом
и специфической сорбцией. Диагностическая антитоксическая сыворотка менее
специфична. В ней, помимо антител к дифтерийному токсину, содержатся антите¬
ла к другим компонентам микробной клетки, что может привести к образованию
неспецифических линий преципитации. Последние обычно слабее специфических,
однако затрудняют учет реакции.С помощью трафарета «бляшки» культур располагают на одинаковом рас¬
стоянии не более 0,5-0,7 см от диска или антитоксин-стрипов (полосок филь¬
тровальной бумаги, пропитанных антитоксином). Линии преципитации мог>т
отсутствовать и у токсигенных штаммов, если они засеяны далеко от диска или
антитоксин-стрипов.Приготовление чашек со средой. Основой среды могут служить бульон
Хоттингера, мартеновский бульон, специальная сухая среда «Коринетоксагар».
Среду однократно стерилизуют текучим паром в течение 30 мин, охлаждают до
50 °С и добавляют 20% лошадиной сыворотки или 30% сыворотки крупного рога¬
того скота. Разливают в стерильные чашки Петри. Хранят в холодильнике не более
суток.Приготовление бумажных дисков с дифтерийным антитоксином. Диски
из фильтровальной бумаги стерилизуют при 2 атм в течение 30 мин, подсушива¬
ют и пропитывают антитоксином, разведенным по инструкции: 1 мл стерильной
дистиллированной воды на 500 МЕ сухого антитоксина, что достаточно для про¬
питки 80-100 дисков. Затем диски повторно подсушивают в термостате в течение
18-24 ч и хранят в холодильнике в плотно закрытом флаконе с влагопоглотителем
до 1 года.
480 ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯНа поверхность среды в чашке Петри раскладывают стерильным пинцетом4	диска с антитоксином, при необходимости исследования большого количества
культур в центр чашки можно поместить 5-й диск. Вокруг каждого диска на рас¬
стоянии 6-7 мм засевают «бляшки» размером 6-7 мм из 24-часовых культур
(2 «бляшки» контрольные и 3 испытуемые из одного анализа, 2 «бляшки» испы¬
туемых культур из отдельных колоний, 3-я — смесь 5-6 колоний).Приготовление антитоксин-стрипов. Полоски фильтровальной бумаги раз-
мером 0,7x8 см стерилизуют при 2 атм в течение 30 мин, подсушивают и пропиты-
антитоксином из расчета 0,25 мл (125 МЕ) на одну полоску. Подсушивают в
термостате в течение 18-24 ч и хранят в холодильнике в плотно закрытом флаконе
с влагопоглотителем до 1 года.Антитоксин-стрип берут стерильным пинцетом и помещают на поверхность
питательной среды в центр чашки Петри. Культуру засевают в виде «бляшек» диа¬
метром 7-8 мм по обе стороны от полоски на расстоянии 5 мм. Расстояние между
«бляшками» — 7-8 мм. На одну чашку засевают не более 10 «бляшек» — 4 кон¬
трольные и 6 испытуемых культур. Испытуемые культуры состоят из изолирован¬
ных колоний и смеси 5-6 колоний.Учет результатов. Результаты теста учитывают через 24-48 ч.Испытуемая культура С. diphtheriae токсигенна, если линия преципитации,
образованная ею, сливается со специфической линией преципитации контрольно¬
го штамма или плавно переходит в нее. Испытуемая культура не токсигенна, если:•	отсутствует линия преципитации, образованная испытуемой культурой, при
наличии специфической линии преципитации у контрольного штамма;•	линия преципитации, образованная испытуемой культурой, перекрещивает¬
ся с линией преципитации контрольного штамма;•	линия преципитации, образованная испытуемой культурой, перекрещивает¬
ся со специфической линией преципитации и сливается с неспецифической
линией преципитации контрольного штамма.Последний вариант можно наблюдать при использовании противодифтерийной
сыворотки через 48 ч инкубации.Хранение контрольных культур. Для постановки основных тестов при
идентификации С. diphtheriae обязательно применяют контрольные штаммы. Для
этой цели используют С. diphtheriae gravis (токсигенный NCTC № 10648+, слабо-
токсигенный NCTC № 3984± и нетоксигенный NCTC № 10356-). Штаммы могут
быть получены из лаборатории бактериальных инфекций НИИЭМ им. Л. Пастера
(Санкт-Петербург) или Национального центра, НИИЭМ им. Габричевского
(Москва). Культуру в течение 24 ч инкубируют на 0,1-0,2% питательном агаре
с 10% сыворотки. При росте заливают слоем стерильного вазелинового масла.
Хранят культуру в холодильнике. Пересевают 1 раз в 3 мес. При выполнении тестов
используют суточные культуры. При снижении токсигенных свойств контрольные
штаммы пассируют 3-4 раза через полужидкий питательный агар с добавлением
0,2% глюкозы и 10% крови. Хорошие результаты дает пассаж культур через 199-ю
среду с добавлением 20% сыворотки крупного рогатого скота.
Иммуноферментный анализНа первом этапе реакции моноклональные антитела к концевому участку
В-фрагмента дифтерийного токсина (МкАт) сорбируют в лунках полистироловой
панели в течение 2 ч при температуре 37 “С и в течение 18-24 ч в холодильнике.
Затем трижды промывают 0,05% раствором «Твин-20» в 0,9% растворе натрия
хлорида. Промывную жидкость из лунок каждый раз тщательно удаляют. Данный
раствор используют и для приготовления разведений исследуемых проб, конъю¬
гата и анатоксина.В сенсибилизированные лунки вносят исследуемые и контрольные пробы.
В качестве контролей используют дифтерийный анатоксин, токсигенную и неток-
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ 481сигенную культуры с. diphtheriae. Исследуемый материал, положительный и отри¬
цательный контроль готовят накануне или за 5-6 ч до проведения ИФА. Тампоны
с исходным материалом или 2-3 колонии с чашек первичного посева инкубируют
в сывороточном бульоне в течение 18 ч. при необходимости время инкубации
можно сократить до 5-6 ч. Параллельно на сывороточном бульоне инкубируют
и контрольные штаммы. Культивирование бактерий в полужидком питательном
агаре при постановке ИФА и РНГА не проводят. В лунки полистироловой панели
вносят по ОД мл верхнего слоя среды культивирования, инкубируют при 37 “С
в течение 1 ч, после чего лунки трижды тщательно промывают. При наличии в
пробе дифтерийный токсин взаимодействует с МкАт, образуя иммунный ком¬
плекс. Затем вносят антитоксический конъюгат, меченный пероксидазой хрена
(ПкАт), и инкубируют в течение 1 ч при 37 °С, при этом свободные антигенные
детерминанты дифтерийного токсина взаимодействуют с ним. Образуется ком¬
плекс «МкАт-дифтерийный токсин-ПкАт», который проявляют индикаторной
субстратной смесью, состоящей из перикиси водорода и 5-аминосалициловой
кислоты (хромогенного субстрата, растворимого в воде). ПкАт восстанавливает
перекись водорода до воды, при этом выделяется кислород, который окисляет
хромогенный субстрат, приобретающий коричневый цвет. Окраска может варьи¬
ровать от красновато-коричневой в положительных пробах до бесцветной или
желтовато-золотистой — в отрицательных. Реакцию можно ставить в качествен¬
ном и количественном варианте.Высокие чувствительность и специфичность метода позволяют выявить дифте¬
рийный токсин в концентрации 4-8 нг/мл. Преимущество ИФА — обнаружение
токсина в жидкой питательной среде после первичного накопления материала,
минуя выделение чистой культуры.Реакция непрямой гемагглютинацииРНГА ставят с антительным эритроцитарным дифтерийным диагностикумом
(эритроцитами, на поверхности которых сорбированы антитела к дифтерийному
токсину). Тампоны с исходным материалом или 2-3 колонии с чашек первичного
посева инкубируют в сывороточном бульоне в течение 18 ч, при необходимости
можно сократить время инкубации до 5-6 ч. Хорошие результаты дает пересев
колоний с чашек первичного посева на среду 199 с добавлением 20% СКРС.В случае положительного результата, после того как антиген (дифтерийный
токсин) вступит в реакцию с антителами, сорбированными на эритроцитах, в
лунке реакционной панели образуется «зонтик» из склеенных эритроцитов. При
отсутствии специфического антигена эритроцитарный диагностикум осаждается
на дне лунки в виде плотной капли («пуговки»).С учетом чувствительности эритроцитарного диагностикума, входящего в
комплект для постановки реакции (равного, как правило, 0,03 Lf/мл токсина),
и стандартности препарата токсигенность у исследуемых штаммов С. diphtheriae
можно определить количественно. Вьшолнение РНГА обязательно сопровождает¬
ся контролями — с дифтерийным анатоксином и токсигенными и нетоксигенными
культурами с. diphtheriae, выращенными аналогично исследуемым культурам.
Чувствительность метода не уступает ИФА, но он значительно проще в выполне¬
нии.Применение ИФА и РНГА для индикации дифтерийного токсина позволяет на
1-2 сут сократить время выдачи ответа, а также выявить штаммы с низким уров¬
нем токсинообразования.Иммунохроматографический тест (ИХТ)ИХТ — тест с иммунохроматографическими полосками относится, как и ИФА,
к быстрым фенотипическим методам. Сущность ИХТ заключается в том, что
при наличии в образце дифтерийного токсина происходит его взаимодействие с
поликлональными специфическими антителами, фиксированными на нитроцел-
шШ482ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯлюлозной мембране. На следующем этапе образовавшийся комплекс вступает в
соединение с моноклональными антителами к А-фрагменту дифтерийного токси¬
на, меченными коллоидным золотом, при положительной реакции на мембране
образуется полоска красного цвета, отсутствующая в образцах с отрицательным
контролем. Результаты оцениваются через 15 мин.В исследованиях показано совпадение результатов, полученных с использова¬
нием теста Илека и ИХТ. Однако, используя последний, можно получить ответ
через 3 ч после отбора колоний, то есть в течение рабочего дня. Для этого доста¬
точно инкубировать подозрительные колонии или мазки из зева в оптимальной
питательной среде (ГРМ бульон + 20% сыворотки) в течение 3 ч и опустить туда
нитроцеллюлозную полоску.Огандартизация посевной взвеси и время инкубации — необходимые условия,
особенно для слаботоксигенных штаммов. Если готовят взвесь с чашек первичного
посева, она должна содержать 1x10® КОЕ/мл. Одночасовая (для ИФА) и 3-часовая
(для ИХТ) инкубация в жидкой питательной среде позволяет избежать ложноо¬
трицательных результатов.Для прямого определения токсигенности при исследовании мазков время инку¬
бации на оптимальной питательной среде необходимо увеличить до 6-18 ч.Полимеразная цепная реакцияПЦР относится к молекулярно-генетическим методам исследования. Она дает
возможность получить более быстрый и легко интерпретируемый ответ по срав¬
нению с фенотипическими тестами. Основной недостаток метода — получение
информации о наличии в хромосоме С. diphtheriae ¿ол:-гена, при отсутствии данных
о типе гена (экспрессируемый или «молчащий»).Выполнение ПЦР со специфическими праймерами проводят в режиме ампли¬
фикации, описанном в инструкции по применению тест-системы для выявле¬
ния ДНК токсигенных и потенциально токсигенных штаммов С. diphtheriae,
Амплифицируется участок А-фрагмента гена дифтерийного токсина. Исходным
материалом служат бактерии, выращенные на плотной питательной среде, или
мазки из зева и носа. Методика включает предварительную подготовку образцов с
последующим включением в циклы ПЦР.Отрицательный результат ПЦР используют для быстрого исключения неток-
сигенных штаммов, тогда как положительный результат требует дополнительных
фенотипических тестов (Илека, ИФА, РНГА), которые дадут окончательный ответ
о токсинопродукции, что приводит к задержке получения окончательного ответа.Серологическая диагностикаДля определения антитоксических противодифтерийных антител (АТ-Ат) в
нашей стране используют реакцию непрямой (пассивной) гемагглютинации.
В большинстве стран мира титр АТ-Ат определяют в ИФА, который имеет ряд
преимуществ перед РНГА. В практическом применении этот метод удобен тем, что
позволяет оценивать титр АТ-Ат в международных единицах (МЕ/мл), что соот¬
ветствует международному стандарту.При выполнении ИФА с диагностической целью у больных определяют сум¬
марные АТ-Ат. За положительный результат принимают 3-4-кратное их нараста¬
ние. В случаях бактерионосительства уровни АТ-Ат существенно не изменяются.
Дополнительное преимущество ИФА — возможность одновременного определе¬
ния на одном планшете как суммарных АТ-Ат, так и высокоавидных (истинных,
протективных) антител. Чем выше авидность антител, тем выше способность
антител нейтрализовывать определенные вирусы или бактерии. Принцип опреде¬
ления авидности антител заключается в разрушении слабых связей между анти¬
геном и антителом с помощью различных химических агентов и последующем
определении оставшихся после обработки комплексов АГ-АТ. При определении
ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ483высокоавидных противодифтерийных АТ-Ат в качестве агента для удаления низ-
коавидных антител используют раствор роданистого калия.Высокоавидными считаются антитела, индекс авидности которых выше 30%.
Индекс авидности определяют по формуле;индекс авидности =	х 100%,ОП(А)где ОП (Е) — оптическая плотность в лунке, обработанной роданистым калием;
ОП (А) — оптическая плотность в лунке, обработанной обычным промывочным
раствором, используемым в тест-системе.СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫДжонсон Д.р., Каплан Э. Лабораторная диагностика инфекций, вызванных стрептокок¬
ком группы А. — М.: Медицина, 1998. — 118 с.Долгих Т.И. Краткая характеристика возбудителей хламидиоза // Яковлев В.М..
Новиков А.И. Сосудистый эндотелий и хламидийная инфекция. — М.; Медицина, 2000. —
С. 127-153.Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым
путем. - м.: Медлит, 2004. — 272 с.Жебрун А.Б. Инфекдия Helicobacter pylori. — СПб.: Феникс, 2006. - 380 с.Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие: Т. 3 / Под ред.В.В- Меньшикова. - М.; Лабора, 2009. - 880 с.МУК 4.2.1887-04 «Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных
бактериальных менингитов». Утверждены Главным государственным санитарным врачом
Российской Федерации 4 марта 2004 г.МУК 4.2.22'17-07 «Методические указания по выявлению бактерий Le^omllapneumophila
в объектах окружающей среды», — 2007.Определитель бактерий Берджи: В 2 т.: Пер. с англ. / Под ред, Дж. Хоулта, Н. Крита,
П. Снита и др. - М., 1997. - Т. 1. - С. 195-196, 227-229,255-258,Тимченко В.Н., Бабаченко И.В., Ценева Г.Я. и др. Эволюция коклюшной инфекции у
детей. - СПб.: ЭЛБИ-СПб., 2005. - 192 с.Тотолян А.А., Суворов Л.Н., Дмитриев А.В. Стрептококки группы В в патологии челове¬
ка. - СПб.: Человек. 2009. - 212 с.Фтизиатрия: Национальное руководство / Под ред. М.И. Перельмана. — М.: ГЭОТАР-
Медиа, 2007. - 512 с.Шурыгина И.А., Чеснокова М.В., Климов В.Т. и др. Псевдотуберкулез. - Новосибирск;
Наука, 2003. - 319 с.Энтеробактерии / Под. ред. В.И. Покровского. - М.: Медицина, 1985. — 320 с.
Этиологическая роль хламидий при заболеваниях репродуктивной сферы: Аналитический
обзор СПб. НИИЭМ им. Л. Пастера / Под ред. А.Б. Жебруна. - СПб., 2007. - 56 с.
Якубович А.И., Корепанов А.Р. Урогенитальный хламидиоз. — Иркутск, 2006. —108 с.
European Guidelines for Control and Prevention of travel associated Legionnaires Disease, —
2002.Garrity, G.M., Bell J. A., Lilburn T. Family II Helicobacteraceae fam. nov. — 2nd ed. — New York;
Springer, 2005.Legionella and the prevention of Legionellosis. - WHO, 2007.Malfertheiner P„ Megraud F„ Moran C. Guidelines for the management of the H. pylori infec¬
tion. — European Gastroenterology Review, 2005.Manual of Clinical Microbiology (Editor in chief: Patrick R.Murray). — 9th ed. — Washington:
ASM Press, 2007. - P. 412-429.Manual of clinical microbiology / Editor in chief P.R. Murray. — 9th ed. — Washington; ASM
Press, 2007. - P. 688-697.ШШmШФШШ'А
Глава 22
Некоторые инфекционные
заболеванияМИКОБАКТЕРИИТуберкулез — инфекционное заболевание. Это заболевание,
являвшееся одной из основных причин смертности в средние века,
широко распространено в мире и в наши дни.Обнаружение в 1882 г Р. Кохом бациллы, признанной возбуди¬
телем туберкулеза, легло в основу лабораторной диагностики этого
заболевания.ТАКСОНОМИЯРод Mycobacterium входит в состав семейства Mycobacteriaceae,
которое совместно с семейством Corynebacteriaceae относится к
порядку Actinomycetaïes.Определяющие свойства микобактерий — кислото- и щело-
чеустойчивость, высокое содержание липидов в клеточной стенке
[воска, входящие в состав клеточной стенки, содержат растворимые
в хлороформе миколовые кислоты с длинными разветвленными
цепями углерода (от 60 до 90 атомов)], а также высокое (62-70%)
содержание нуклеотидных пар «гуанин + цитозин» в составе ДНК.По своему биохимическому составу микобактерии приближают¬
ся к другим микроорганизмам, способным синтезировать миколо¬
вые кислоты, — Nocardia, Rodococcus и Corynebacterium. В настоящее
время данный род насчитывает около 100 видов микобактерий.
Большинство из них — сапрофиты, широко распространенные в
окружающей среде.В клинической микробиологии для классификации патогенных
микобактерий используют понятие «комплекс», объединяющее
виды микобактерий с одинаковой клинической значимостью, когда
более тонкая дифференциация несущественна. Виды микобакте¬
рий, вызывающие туберкулез у человека и животных, объединены
в комплекс м. tuberculosis {М. tuberculosis complex), включающий
М. tuberculosis, М. bovis, М. microti, М. africanum и М. canettii, а также
М. саргае и М. pinnipedii, филогенетически родственные М. bovis и
М. microti. С помощью молекулярно-генетических методов установ¬
лена генетическая неоднородность глобальной популяции М. tuber¬
culosis, которая представлена многочисленными генетическими
линиями (семействами) — Beijing, LAM, Haarlem, Г.Другие микобактерии, вызывающие различные микобактериозы,
отнесены к группе нетуберкулезных микобактерий (НТМБ), вклю-
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ485чающей следующие комплексы: М. avium (М. avium, М. intracellulare и М. scrofu-
laceum), M.fortuitum {М. fortuitum и М, chelonae), М. terrae (М. terrae, М. triviale и
М. nonchromogenicum). К роду Mycobacterium относят также возбудителя проказы —
М. leprae — и возбудителя язвенных поражений Бурули — М. ulcerans. Для иден¬
тификации видов микобактерий используют биологические, биохимические и
молекулярно-генетические методы.На основе различий в культуральных свойствах выделяют четыре группы мико¬
бактерий.•	Группа I — фотохромогенные микобактерии (потенциально патогенные —
М. asiaticum, М. kansasii, М. таггпит, М. simiae). Колонии микобактерий дан¬
ной группы, не пигментированные при инкубации в темноте, приобретают
ярко-желтую или желто-оранжевую окраску после выдерживания на свету.
Растут медленно (кроме М. marinum).•	Группа II — скотохромогенные микобактерии (от греч. skotos — стем-
нота»). В темноте образуют пигмент, скорость роста — 30-60 дней. Данная
группа включает сапрофитные микобактерии М. aquae и М. gordonae, обнару¬
живаемые в водоемах, и условно-патогенные микобактерии М. scrofulaceum,
вызывающие поражение лимфатических узлов и легких у детей,•	Группа III — нефотохромогенные микобактерии. Не образуют пигмент
или имеют бледно-желтую окраску колоний, которая не усиливается на свету.
Растут от 2-3 до 5-6 нед. К данной группе относят условно-патогенные мико¬
бактерии М. avium, М. intracellulare, М. xenopi, сапрофитные микобактерии
М. terrae, а также М. gastri, М. kattey и М. bruiiense. М. avium (микобактерии
птичьего типа), обнаруживаемые в воде и почве, могут быть патогенны для
человека, лабораторных и домашних животных (например, свиней),•	Группа IV — быстрорастущие микобактерии. Не образуют пигмента на
свету. Растут быстро (до 10 дней). К данной группе относят широко рас¬
пространенные в природе условно-патогенные микобактерии М. fortuitum и
сапрофитные микобактерии М. phlei и М. smegmatis.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАМикобактерии — тонкие, слегка изогнутые или прямые палочки размером1-10x0,2-0,6 мкм, иногда ветвящиеся наподобие мицелия. Микобактерии —
аэробы, спор не образуют, неподвижны. Клеточная стенка микобактерий имеет
строение и химический состав, характерные для грамположительных бактерий.
Пептидогликан клеточной стенки содержит мезодиаминопимелиновую кислоту,
аланин, глутаминовую кислоту, глюкозамин, мурамовую кислоту, арабинозу и
галактозу. Однако высокое содержание липидов не позволяет использовать для
окрашивания микобактерий обычные анилиновые красители, поэтому применя¬
ют специальные методы, способствующие проникновению красителя в клетку.
Окрашенные микобактерии не обесцвечиваются при последующей обработке
кислотой и спиртом, при окраске карболовым фуксином микобактерии тубер¬
кулеза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек малиново-красного цвета с
зернистой структурой.Продолжительность роста микобактерий на плотных питательных средах
варьирует от 2 до 60 сут. Оптимальная температура инкубации — 30-45 X.
Колонии могут быть шероховатыми, плотными (R-форма) или гладкими, влажны¬
ми (S-форма). На жидких питательных средах микобактерии растут на поверхно¬
сти в виде сухой пленки. Диффундирующий пигмент встречается редко. Колонии
некоторых видов имеют пигментацию от слабо-желтого до оранжевого цвета.
Фотохромогенным видам микобактерий требуется экспозиция на свету для обра¬
зования пигмента, скотохромогенные виды образуют пигмент независимо от
действия света.
■486 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯЭПИДЕМИОЛОГИЯМикобактерии широко распространены в окружающей среде, многие из них
являются сапрофитами, а остальные способны вызывать заражение человека и/
или животных. Особенно опасны для человека микобактерии группы М. tuber¬
culosis. Резервуаром последних служит больной человек. Заражение происходит
чаще всего аэрогенным путем, реже через кожу и слизистые оболочки. В спо¬
радических случаях регистрируют трансплацентарное инфицирование плода.
Заражение туберкулезными микобактериями не всегда влечет за собой развитие
патологического процесса. Большое значение при этом играют условия жизни и
трудовой деятельности, полноценность питания, состояние иммунной системы
людей.По данным ВОЗ, в 2003 г. в мире выявлено 8,4 млн новых случаев туберкулеза;
ежегодно от туберкулеза умирают 2-3 млн человек, или 5000 человек ежедневно.
Около трети населения нашей планеты инфицированы микобактериями туберку¬
леза. Сегодняшний этап характеризуется нарастанием распространенности тубер¬
кулеза. вызванного лекарственно-устойчивыми штаммами микобактерий, а также
увеличением количества иммунодефицитных состояний. По статистическим дан¬
ным, риск возникновения т^еркулеза у ВИЧ-инфицированных увеличивается
примерно в 170 раз. Большинство летальных случаев больных СПИДом проис¬
ходит от сочетанной с ним туберкулезной инфекции.Заболеваемость туберкулезом россиян превышает 80 на 100 тыс. человек, при¬
чем в Дальневосточном, Сибирском и Уральском федеральных округах она, по
данным Минздравсоцразвития РФ, на 25-50% выше. Не менее 2,5 млн наших
соотечественников больны туберкулезом, а смертность от него составляет полови¬
ну всех летальных исходов, вызываемых инфекционными болезнями.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИТуберкулез может проявляться легочной и нелегочными формами, что обуслов¬
лено тем, каким путем произошло заражение. Локализацией инфекции определя¬
ется характер клинической картины болезни.Вследствие медленных роста и размножения микобактерий, а также иммунного
ответа на них организма клинические проявления туберкулеза часто регистрируют
спустя длительное время после заражения.Термином «латентный туберкулез» принято обозначать стадию или форму
туберкулезной инфекции, характеризуемую отсутствием клинических проявлений
инфекции и относительно свободной диссеминацией микобактерий по организму.
У подростков и взрослых с ослабленным иммунитетом такая диссеминация может
вести к развитию милиарного туберкулеза, характеризуемого образованием грану¬
лем в разных органах. Наиболее часто генерализация туберкулезных поражений
происходит после прорыва содержимого гранулем в кровоток.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАМикробиологические исследования проводят в целях выявления больных
туберкулезом, для верификации диагноза, контроля эффективности и коррекции
химиотерапии, оценки эффективности лечения.Лабораторные исследования для диагностики туберкулеза можно разделить на
две группы:^ для постановки или подтверждения диагноза «туберкулез»;
для характеристики выделенного возбудителя заболевания.Классический микробиологический метод диагностики туберкулеза включает
микроскопию и культуральное исследование. К числу дополнительных современ¬
ных ускоренных методов относят культивирование микобактерий туберкулеза в
автоматизированных системах и молекулярно-генетические исследования. Кроме
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 4$7ТОГО, достигнуты определенные успехи в серологической диагностике туберкулеза,
так как стали доступны тест-системы, предназначенные для скрининга.К первой группе относятся прямые методы, позволяющие выявить непо¬
средственный этиологический агент заболевания. К прямым методам относятся
традиционные методы микробиологической диагностики (микроскопия и посев)
и ПЦР-диагностика, позволяющая определять наличие ДНК-возбудителя в диа¬
гностическом материале.Косвенные методы, направленные на выявление последствий воздействия этио¬
логического агента на организм больного, имеют относительно низкое распростра¬
нение при лабораторной диагностике туберкулеза. К этим методам можно отнести
иммуноферментный метод определения уровня иммуноглобулина G, который все
шире применяют в странах с низким уровнем заболеваемости туберкулезом.Исследования, относящиеся ко второй группе, направлены на характеристику
выделенного возбудителя: определение его видовой принадлежности (доказа¬
тельство принадлежности к микобактериям туберкулезного комплекса) и спектра
лекарственной чувствительности. В настоящее время для характеристики клини¬
ческих штаммов микобактерий туберкулеза применяют как традиционные микро¬
биологические и биохимические, так и современные молекулярно-биологические
методы.Для обеспечения сравнимости эпидемиологических показателей в различных
регионах страны и мира необходима стандартизация процедур исследований,
формы представления и регистрации результатов. В связи с этим в Российской
Федерации разработаны и утверждены унифицированные методы микробиологи¬
ческих исследований для диагностики туберкулеза, обязательные для применения
в клинических лабораториях всех уровней и любого ведомственного подчинения.
Дополнительно регламентируются формы регистрации микроскопических иссле¬
дований для диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза.Материалы для лабораторных исследованийЛаборатория противотуберкулезной службы должна быть готова получить
любой биологический материал на исследование в соответствии с приложением 1
к приказу Минздравсоцразвития № 690 от 02.10.2006, учетная форма № 05-ТБ/у.Мокрота. Чаще всего для диагностики туберкулеза исследуют мокроту боль¬
ного. У пациента с продуктивным кашлем получение мокроты не представляет
трудностей.Диагностический материал при внелегочном туберкулезеАсептигески собранные жидкости. Биологические жидкости (ликвор, пери-
кардиальну'ю, синовиальную, асцитическую, кровь, костный мозг) следует соби¬
рать в асептических условиях в стерильный контейнер, к жидкостям, имеющим
склонность к свертыванию, добавляют стерильные гепарин (0,2 мг/мл) или окса-
лат калия (0,01-0,02 мл 10% нейтрального оксалата на 1 мл материала). Материал
доставляют в лабораторию немедленно.Асептиггски собранные ткани помещают в стерильные контейнеры без
добавления консервантов, В случае длительной транспортировки ткани необходи¬
мо поместить в стерильный физраствор, обложить сухим льдом или охладить при
температуре 4-15 “С. Следует немедленно доставлять материал в лабораторию.Заведомо контаминированные материалыMoza. Мочу (среднюю часть или всю утреннюю порцию) собирают в стериль¬
ную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Анализ мочи
на микобактерии должен предусматривать обязательное троекратное исследова¬
ние. В лаборатории мочу центрифугируют, используя метод накопления осадка.
Особенностью существования М. tuberculosis в жидкостях является способность их
долгое время находиться во взвешенном состоянии, в связи с этим рекомендуют
488 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯцентрифугирование при 3000 g всего материала, а не его донной фракции, полу¬
чаемой после отстаивания в естественных условиях.Сбор суточной мочи для бактериологического исследования не практикуется.
Установлено, что при хранении мочи более 1 ч после ее сбора количество микроб¬
ных клеток неспецифической гноеродной и гнилостной микрофлоры увеличива¬
ется в несколько раз. Ферменты жизнедеятельности этой флоры могут угнетать
способность микобактерий к росту. Не следует проводить микроскопигеские иссле¬
дования моги из-за гастой встрегаемости в ней кислотоустойгивых сапрофитов.Менструальная кровь. Исследование менструальной крови требует особого
методического подхода. Наличие в этом материале большого количества про-
теолитических, фибринолитических и других ферментов обусловливает необ¬
ходимость незамедлительной доставки материала в лабораторию и тщательной
его обработки, так как менструальная кровь, с одной стороны, является весьма
подходящим материалом для развития гноеродной и гнилостной флоры, а с дру¬
гой — благодаря обилию ферментов неблагоприятно влияет на жизнеспособность
микобактерий. Менструальную кровь следует собирать не тампоном, а вакуумным
отсосом или колпачком Кафки. Исследуют ее так же, как кровь или другие мате¬
риалы с примесью крови.Исследованию подлежат следующие виды диагностического материала: мокро¬
та, отделяемое верхних дыхательных путей после аэрозольных ингаляций, про¬
мывные воды бронхов, бронхоальвеолярные смывы, материал, получаемый при
бронхоскопии и биопсии, экссудат, моча, кровь, СМЖ, резецированные ткани,
мазки.Материал следует собирать с соблюдением правил инфекционной безопасности
в стерильные флаконы с плотно завинчивающимися крышками. Флаконы объе¬
мом 40-50 мл (диаметр отверстия — не менее 30 мм) должны быть изготовлены
из ударостойкого материала, легко расплавляться при автоклавировании, быть
удобными в обращении, прозрачными или полупрозрачными.Чаще всего материалом для вь[деления туберкулезных микобактерий служит
мокрота. Для повышения эффективности исследования необходимо проводить
сбор материала до начала химиотерапии, утреннего приема пищи и лекарствен¬
ных препаратов. Желательно собрать не менее 3 проб утренней мокроты в течение3	дней подряд. Сбор мокроты следует проводить в специально выделенном для
этих целей отдельном, хорошо вентилируемом помещении (пункте сбора мокро¬
ты), оснащенном бактерицидными лампами и средствами дезинфекции, или на
открытом воздухе. Правильно собранная мокрота (3-5 мл) имеет слизистый или
слизисто-гнойный характер. Контейнер с порцией мокроты достаточного объема
(не менее 3-5 мл), содержащей уплотненные или гнойные комочки без слюны,
тщательно закрывают завинчивающейся крышкой, затем контейнер маркируют и
помещают в специальный бикс для транспортировки в лабораторию.Наилучшим вариантом является использование для сбора мокроты одноразо¬
вых пластиковых прозрачных контейнеров объемом 30-50 мл. Материал, из кото¬
рого изготовлен такой контейнер, должен расплавляться (деформироваться) при
автоклавировании (121 °С).При проведении исследования методом посева для повышения его эффектив¬
ности время между сбором любого материала и его обработкой в лаборатории не
должно превышать 24 ч. При отсутствии такой возможности материал хранят в
холодильнике (4-8 °С не более 72 ч). Добавление к пробам консервантов (10%
раствора трехзамещенного фосфата натрия, 1% раствора цетилпиридина хлорида,2-3% раствора борной кислоты) позволяет увеличить срок их хранения в холо¬
дильнике до 5-7 дней. Допускается замораживание пробы не более 1 раза.Ни один из указанных выше методов не является оптимальным, своевременная
доставка является единственным залогом сохранности материала.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 489В лаборатории должны быть разработаны и документально оформлены прави¬
ла выбраковки материала, включающие:❖	отказ от приема первичных проб без необходимой идентификационной доку¬
ментации и маркировки (недопустимо проведение исследований на основа¬
нии устного запроса, без соответствующего письменного направления);❖	поведение в отношении проб неудовлетворительного качества;❖	меры при обнаружении поврежденных или негерметично закрытых контей¬
неров.БактериоскопияЦелями бактериоскопии клинического материала являются обнаружение мико¬
бактерий при подозрении на туберкулез и оценка эффективности химиотерапии
больных им людей.в клинико-диагностических лабораториях общей лечебной сети, где проводят
только микроскопические исследования, используют метод прямой микроскопии
мазка непосредственно из клинического материала (мокроты, мочи, гноя). При
этом обнаружение микобактерий туберкулеза возможно с вероятностью 50%, если
в 1 мл мокроты содержится более 5000 микробных клеток. Если в тестируемой
пробе содержится менее 10“* микобактерий/мл, обнаружить их в мазке трудно.
Результативность микроскопии повышается при исследовании нескольких проб
мокроты, взятых от одного пациента, и при концентрировании диагностического
материала, например, центрифугированием. В последнем случае мазок готовят из
обогащенного осадка, подготовленного из деконтаминированного материала для
культурального исследования.Для того чтобы обеспечить выживание достаточной части микобактериальной
популяции, необходимо использовать щадящие методы обработки, позволяющие,
с одной стороны, подавить быстрорастущие гноеродные и гнилостные микроорга¬
низмы, а с другой — максимально сохранить жизнеспособность присутствующих
в материале микобактерий.Для унификации результатов исследования необходимо использовать для гомо¬
генизации и деконтаминации диагностического материала стандартные методы,
а для посевов на готовые жидкие среды — методы, рекомендуемые производите¬
лем.Следующие биологические жидкости и ткани не нуждаются в деконтами¬
нации, если они были взяты в стерильные флаконы с соблюдением правил
асептики:❖	спинномозговая, синовиальная и другие жидкости из закрытых полостей;❖	костный мозг;гной из холодных абсцессов;❖	резецированные ткани (за исключением материала аутопсии);пунктаты печени и лимфатических узлов, а также материалы биопсий (при
отсутствии свища).Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает диа¬
гноз туберкулеза, поскольку в мокроте может содержаться мало туберкулезных
микобактерий (это бывает связано с объективными факторами, например фор¬
мой, стадией и локализацией инфекции, а также с субъективными факторами —
неправильным взятием материала и плохой подготовкой мазка).Для обнаружения в мазке кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) использу¬
ют различные методы окрашивания, из которых в целях унификации процедуры
рекомендуют два: метод Циля-Нильсена и флюорохромные красители.При окраске методом Циля-Нильсена приготовленный на предметном стекле
мазок фиксируют над пламенем и окрашивают карболовым фуксином, который
§:%px<pШШШт„Mi^шШрщ#1ж490НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯПроникает в микробную клетку через клеточную стенку, богатую липидами и
восками, при одновременном воздействии нагревания и протравливающего
действия фенола. Последующая обработка мазка 25% раствором серной кисло¬
ты или 3% солянокислым спиртом приводит к обесцвечиванию всех некисло¬
тоустойчивых элементов мазка, которые докрашивают 0,3% раствором мети¬
ленового синего. КУМ, не воспринимающие обычные аналиновые красители,
окрашиваются в малиново-красный цвет, другие микроорганизмы, клетки и
прочие элементы — в голубой. Мазок высушивают при комнатной температуре
и микроскопируют.Для исследования мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену, используют свето¬
вой микроскоп с иммерсионным объективом (х90 или хЮО) и окуляром с 7- или
10-кратным увеличением. Исследуют 100 полей зрения (достаточно для выявле¬
ния единичных микобактерий), отмечая количество обнаруженных КУМ. При
отрицательном результате просматривают еще 200 полей зрения. Разрешающая
способность метода — 50 ООО микробных клеток в 1 мл материала.Результаты микроскопии оценивают полуколичественно (табл. 22-1).Таблица 22-1. Оценка результатов микроскопического исследования при окраске по Цилю-
НильсенуКаличестео КУМКоличества полей
зрения для просмотраФорма записи
результатаИнтерпретациярезультатаКУМ не обнаружены в
300 полях зрения300ОтрицательныйОтрицательный1-2 КУМ в 300 полях зрения300Следует повторить
исследованиеРезультат не оценивается1-9 КУМ в 100 полях зрения100— КУМ в 100 попях
зрения'Положительный10-99 КУМ в 100 полях
зрения1001+‘*Положительный1-10 КУМ в 1 попе зрения502+”Положительный10 КУМ в 1 поле зрения203+"Положительный‘ Указать точное количество КУМ.Соответствие градаций:точное количество - единичные КУМ в препарате;
«!+«► - единичные КУМ в поле зрения:^ «2+» — умеренное количество КУМ;<!* «3-» — значительное количество КУМ.Окраска флюорохромными красителями (аурамином или родамином) повы¬
шает эффективность микроскопии на 15%. Мазки для люминесцентной микро¬
скопии готовят из осадка, полученного путем обработки материала детергентом
(для освобождения микобактерий от окружающей их слизи), с последующими
отмыванием или нейтрализацией и центрифугированием при 3000 g. При ультра¬
фиолетовом облучении окрашенные клетки начинают светиться на темном фоне —
КУМ имеют вид золотистых палочек, сапрофитные микобактерии окрашены в
зеленый цвет. Яркость и контрастность изображения позволяют уменьшить сум¬
марное увеличение микроскопа в 4-10 раз, что способствует расширению поля
зрения и сокращению времени просмотра препарата. При этом люминесцентная
микроскопия позволяет обнаружить измененные клетки микобактерий, утра¬
тившие кислотоустойчивость под влиянием химиотерапии и не выявляемые при
окраске по Цилю-Нильсену.Качественная и эффективная окраска флюорохромными красителями требу¬
ет обязательного соблюдения кислотности (pH) мазка, а также освобождения
микобактерий от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению
НЕК0Т0РЬ1Е ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 491Красителя в микробную клетку. Несоблюдение этих условий приводит к снижению
эффективности люминесцентной микроскопии и получению ложноотрицатель¬
ных результатов исследования.Микроскопические методы обнаружения микобактерий широко применяют
для раннего выявления наиболее эпидемически опасных больных ~ бактериовы-
делителей. преимущества данного метода — высокая специфичность (89-100%),
быстрота получения результата (1-2 дня) и экономичность. Микроскопическое
исследование не позволяет провести идентификацию (выявление видовой принад¬
лежности) и определить лекарственную чувствительность выделенных КУМ.При отрицательном результате анализа мокроты ответ по форме 05-ТБ/у не
выдается, пока не проведено исследование всех трех (в крайнем случае двух) проб
мокроты.О положительном результате анализа лаборатория сообщает направившему на
исследование материал врачу немедленно.Изоляция микобактерийКультуральный метод, в отличие от микроскопического, имеет высокую чув¬
ствительность (с его помощью удается обнаруживать в пробах микобактерии,
когда их титр >10 живых бактерий/мл). Это способствует увеличению (более
чем на 15”20%) количества впервые выявленных больных на ранней стадии
заболевания, когда туберкулез еще относительно хорошо поддается лечению.
Получение чистой культуры позволяет осуществить идентификацию, определе¬
ние лекарственной чувствительности и из)^ение вирулентности туберкулезных
микобактерий.Существенные недостатки культурального метода — длительность (срок ожи¬
дания результатов посева на плотных питательных средах может достигать 3 мес),
более высокая стоимость и сложность обработки диагностического материала.Диагностический материал после гомогенизации и деконтаминации центрифу¬
гируют (обогащение осадка), подвергают нейтрализации и высевают на поверх¬
ность плотных питательных сред или вносят в пробирки с жидкими (полужид¬
кими) питательными средами. Из оставшейся части осадка готовят мазки для
микроскопии. Для достоверной клинической интерпретации результатов микро¬
биологического исследования необходимо параллельно проводить культуральное
и микроскопическое исследования из одной и той же пробы диагностического
материала.Инокулированные пробирки инкубируют в термостате при температуре 37 “С
в течение 2 сут в горизонтальном положении (для равномерного всасывания
материала в питательную среду), затем переводят в вертикальное положение, гер¬
метично закрывают резиновыми или силиконовыми пробками и выдерживают в
термостате при температуре 37 °С в течение 10-12 нед, осуществляя регулярный
еженедельный просмотр. При каждом просмотре регистрируют срок визуально
наблюдаемого роста со дня посева, интенсивность роста (количество КОЕ), загряз¬
нение посева посторонней микрофлорой (такие пробирки удаляют), отсутствие
видимого роста (пробирки оставляют в термостате). Отрицательный результат
регистрируют по окончании периода инкубации.Для культивирования микобактерий используют плотные, полужидкие и жид¬
кие питательные среды. Для повышения результативности посева рекомендуют
применять одновременно 2-3 питательные среды разного состава.В качестве стандартной питательной среды для первичного выделения воз¬
будителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности воз
рекомендует среду Левенштейна-Йенсена. В нашей стране, помимо нее, при
бактериологическом исследовании на туберкулез пользуются средой «Финн-2».
Это плотная яичная среда сложного состава, на которой рост микобактерий
шт1Щ&^шштШ£ЩШ^;Щш^ш492 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯПроявляется на 20-96-е сутки. Появившиеся в последние годы агаровые среды
Миддлбрука (агары 7Н10,7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост туберкулез¬
ных микобактерий (в течение 2-4 нед) и обеспечивают лучшие возможности для
изучения морфологии колоний, чем среды на яичной основе.Туберкулезные микобактерии формируют на плотных питательных средах
колонии с характерной морфологией. Например, М. tuberculosis на плотных пита¬
тельных средах обычно образуют шероховатые колонии (R-форма) различной
величины и формы — сухие, морщинистые, цвета слоновой кости или слегка
пигментированные. Под влиянием противотуберкулезного лечения изменяется
характер роста — появляются гладкие, влажные колонии (S-форма).Комплекс специальных исследований помогает отличить микобактерии тубер¬
кулеза от нетуберкулезных микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.Положительный ответ дают после обязательного микроскопического исследо¬
вания мазка из колоний, окрашенного по Цилю-Нильсену: микобактерии в пре¬
парате выглядят как ярко-красные палочки, расположенные одиночно или груп¬
пами, образующими скопления в виде жгутов и кос (рис. 22-1, см. цв. вклейку).В молодых культурах, особенно выделенных от больных, которым проводили
длительные курсы химиотерапии, микобактерий полиморфны (кокковидные,
удлиненные, напоминающие мицелий грибов).При выделении микобактерий количественно оценивают интенсивность их
роста:(+) — 1-20 КОЕ в пробирке — скудное бактериовыделение;(++) - 21-100 КОЕ в пробирке — умеренное бактериовыделение;^ (+++) — более 100 КОЕ в пробирке — обильное бактериовыделение.Ценное прогностическое значение при туберкулезе имеет характеристика жиз¬
неспособности возбудителя, которую оценивают по двум показателям — скорости
роста и времени, которое прошло от момента посева до выделения культуры
М. tuberculosis. Низкую степень жизнеспособности микробной популяции отме¬
чают при росте менее 20 КОЕ в пробирке при продолжительности роста более
30 дней, высокую — при росте 100 КОЕ и более в пробирке при продолжитель¬
ности роста менее 30 дней.преимущество культурального метода — выделение чистой культуры
м. tuberculosis, что позволяет провести идентификацию, определение лекарствен¬
ной чувствительности, вирулентности и жизнеспособности возбудителя.Культуральная диагностика в настоящее время претерпевает изменения, свя¬
занные с внедрением в практику автоматизированных систем культивирования
М. tuberculosis — «MGIT-BACTEC-960» и «MB/Bact». Преимущества систем на
основе жидких летательных сред — полная или частичная автоматизация, уско¬
ренное выявление роста микобактерий, возможность определения лекарственной
чувствительности к противотуберкулезным препаратам 1-го ряда и некоторым
противотуберкулезным препаратам 2-го ряда.В системе MGIT {Micobacteria Growth Indicating Tubé), предназначенной для
использования в приборе «ВАСТЕС-960», микобактерии культивируются в специ¬
альных пробирках с жидкой питательной средой на основе модифицированной
среды «Middlebrook-7H9», включающей пищевые добавки для стимуляции роста
микобактерий и смесь антибактериальных препаратов для подавления сторонней
микрофлоры. Рост М, tuberculosis на данной среде удается обнаружить уже через
1-2 нед в зависимости от исходного количества бактериальных клеток в исследуе¬
мом материале. Снижение концентрации кислорода в пробирке при размножении
М. tuberculosis вызывает усиление флюоресценции, которая становится видимой
при облучении пробирок ультрафиолетовым светом и регистрируется автомати¬
чески. Интенсивность свечения выражена в единицах роста (ЕР). Компьютерный
анализ кривых роста помогает оценить ростовые свойства различных видов мико¬
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 493бактерий, в том числе нетуберкулезных. Посев материала на жидкие питательные
среды обязательно должен сопровождаться посевом на среду Левенштейна-
Йенсена, которая играет роль дублера в тех редких случаях, когда на других средах
М. tuberculosis не дают роста.В результате внедрения автоматизированных систем культивирования время
появления роста микобактерий значительно сократилось и составляет 11 и
19 дней для «ВАСТЕС-960» и «MB/Bact» соответственно против 33 дней на стан¬
дартной плотной питательной среде.Наряду с очевидными преимуществами такие системы культивирования мико¬
бактерий имеют и ряд существенных недостатков, в том числе высокую стоимость
аппаратуры и повышенный риск заражения лабораторного персонала.Идентификация микобактерийПитательные среды, используемые для культивирования микобактерий, не
являются строго селективными, поэтому выделенная культура подлежит иденти¬
фикации (определению вида). Необходимость дифференциации микобактерий
обусловлена различиями в патогенезе, течении и исходе туберкулеза и микобакте¬
риозов, а также наличием у различных видов микобактерий природной устойчи¬
вости к некоторым противотуберкулезным препаратам. Актуальность дифферен¬
циации микобактерий увеличивается с ростом частоты регистрации случаев ВИЧ,
ассоциированных с микобактериозами.Для бактерий М. tuberculosis характерна совокупность культуральных призна¬
ков, отличающих их от нетуберкулезных микобактерий:❖	медленный рост (более 3 нед);
рост при температуре 35-37 ®С;❖	отсутствие пигментообразования (колонии имеют цвет слоновой кости);❖	кислотоустойчивость при окраске по Цилю-Нильсену;❖	положительный ниациновый тест;<> положительный нитратредуктазный тест;❖	отсутствие термостабильной каталазы (68 °С);❖	отсутствие роста на среде Левенштейна-Йенсена. содержащей 1000 мкг/мл
салициловокислого натрия, 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты, 5%
раствор натрия хлорида;❖	рост в присутствии 1-5 мкг/мл тиофен-2-карбоксиловой кислоты,В большинстве случаев для дифференциации М. tuberculosis и М. bovis достаточ¬
но использовать ниациновый тест на наличие нитратредуктазы и пиразинамида¬
зы. а также тест на способность роста на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида
тиофен-2-карбоксиловой кислоты (2 мкг/мл).Оценка лекарственной чувствительности туберкулезных микобактерийЛекарственную чувствительность туберкулезных микобактерий определяют в
следующем порядке:до начала лечения однократно для определения стратегии и тактики лечения
больного;при выделении от больного культур микобактерий из различных видов
материала (мокроты, бронхоальвеолярного лаважа, мочи, экссудатов, СМЖ)
исследуют все выделенные культуры;❖	в конце интенсивной фазы лечения при отсутствии клинико'рентгеноло¬
гической динамики;❖	при необходимости изменения схемы лечения в случае отсутствия негатива-
ции мокроты, повторного выделения культуры микобактерий после негати-
вации мокроты, резкого увеличения количества КУМ в мазке после первона¬
чального снижения.
494НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯОпределение лекарственной чувствительности микобактерий проводят с помо¬
щью микробиологических методов абсолютных концентраций (разведений на
плотной или жидкой питательной среде), пропорций, коэффициента резистент¬
ности. Из числа рекомендуемых Комитетом по химиотерапии ВОЗ в России в
качестве унифицированного метода определения лекарственной чувствительности
микобактерий наибольшее распространение получил непрямой метод абсолют¬
ных концентраций. При его использовании осуществляют дозированный посев
суспензии (10 млн микробных клеток) чистой культуры микобактерий в про¬
бирки с питательной средой Левенштейна-Йенсена, содержащие определенные
концентрации химически чистых субстанций противотуберкулезных препаратов,
контрольную пробирку с питательной средой без противотуберкулезных препа¬
ратов и пробирку с 1000 мкг/мл салициловокислого натрия или 500 мкг/мл пара¬
нитробензойной кислоты для выявления роста нетуберкулезных микобактерий.
Засеянные пробирки инкубируют в термостате при температуре 37 °С. Результат
регистрируют через 3-4 нед.Поскольку выделение возбудителя из диагностического материала на пита¬
тельных средах требует не менее 1-1,5 мес, результаты определения лекар¬
ственной чувствительности получают не ранее чем через 2-2,5 мес после посева
материала.Культура микобактерий считается чувствительной к определенной концентра¬
ции противотуберкулезного препарата в питательной среде, если число выросших
колоний микобактерий не превышает 20 при обильном росте в пробирке с пита¬
тельной средой без препаратов. Для различных лекарственных средств установле¬
на критическая концентрация, при которой наблюдается размножение критиче¬
ской доли популяции микобактерий (табл. 22-2).Таблица 22-2. Концентрации препаратов, используемые при определении чувствительности
микобактерий туберкулеза методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-
ЙенсенаПрепаратКонцентрация, мкг/млкритическая1 предельнаяПрепараты 1-го рядаДегидрострептомицин1025Изониазид110Рифампицин4080Этамбутоп25Препараты 2-го рядаКанамицин3050Протионамид (этионамид)3050Циклосерин3050Капреомицин3050Офлоксацин210Аминосалициповая кислота11Критерий устойчивости культуры микобактерий — рост 20 колоний и более на
питательной среде с препаратом в критической концентрации. Если число коло¬
ний приближается к 20, необходимо отметить пограничный характер результата
определения чувствительности исследуемой культуры микобактерий.Рекомендуемая критическая концентрация пиразинамида, который широко
используется в современной химиотерапии туберкулеза, составляет 200 мкг/мл.
Однако до сих пор не существует универсального метода определения лекарствен¬
ной чувствительности к данному препарату, поскольку его антибактериальная
J
ж"НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 495активность проявляется только в кислой среде (pH <6), препятствующей росту
большинства штаммов микобактерий.Критические концентрации препаратов существенно различаются при исполь¬
зовании различных методов определения лекарственной чувствительности. 11^
Для определения порога устойчивости противотуберкулезные препараты целе-
сообразно тестировать не только в критических, но и в дополнительных концен¬
трациях. Это дает возможность врачу варьировать дозы препаратов и режимы
химиотерапии за счет повышения дозы, изменения метода введения и исполь-
зования аддитивных и синергидных свойств различных комбинаций противо¬
туберкулезных средств.Альтернативные методы определения лекарственной устойчивости микобакте¬
рий (методы пропорций и коэффициента резистентности) позволяют установить,
какая часть популяции микобактерий в процентном отношении устойчива к дан¬
ному препарату при визуальной оценке роста. Данные методы, хотя и являются
более достоверными, особенно при оценке чувствительности к противотуберку¬
лезным препаратам 2-го ряда, значительно более трудоемки, поэтому в практиче¬
ской деятельности используются редко.Для ускорения исследований рекомендуют использование прямого метода
абсолютных концентраций, который заключается в одновременном посеве диа¬
гностического материала [бактериоскопически положрггельного с массивностью
бактериовыделения не менее (++)] на контрольные питательные среды и среды с
соответствующими противотуберкулезными препаратами.Перспективный метод определения лекарственной чувствительности микобак¬
терий — модифицированный метод пропорций с использованием автоматизиро¬
ванной системы «MGIT-BACTEC-960», которая позволяет проводить исследова¬
ние популяций микобактерий, выращенных на плотных питательных средах и в
пробирках MGIT. В последнем случае существенно сокращается время исследова¬
ния: данные о лекарственной чувствительности культурьг могут быть получены уже
через 3 нед с момента сбора диагностического материала по сравнению с 3 мес при
использовании традиционного метода абсолютных концентраций. Относительно
высокая стоимость исследования компенсируется своевременностью получения
результатов при интенсивной фазе химиотерапии.Молекулярно-генетические методы идентификации микобактерий
и оценки их лекарственной устойчивостиПЦР — быстрый и эффективный метод выявления микобактерий в биоло¬
гическом материале. Чувствительность ПЦР достаточно высока, теоретически
возможна детекция даже одной бактериальной клетки в образце. Отечественные
диагностические тест-системы для выявления ДНК туберкулезных микобактерий
в ПЦР позволяют исследовать образцы диагностического материала из мокроты,
бронхоальвеолярных смывов, плевральной и синовиальной жидкости, СМЖ,
мочи, аспирата из матки, биоптатов ткани легких, лимфатических узлов. В подоб¬
ных тест-системах используют праймеры, фланкирующие участок инсерционного
элемента IS6110, который присутствует в геноме всех видов микобактерий, входя¬
щих в состав комплекса М. tuberculosis.ПЦР чаще применяют для ускоренного (в течение суток) выявления микобакте¬
рий туберкулеза в образцах диагностического материала. Чувствительность ПЦР
при исследовании мокроты и промывных вод бронхов больных с подтвержденным
диагнозом туберкулеза легких, по данным литературы, составляет 92,6% против
88,9 и 52,4% при использовании культурального и микроскопического методов
соответственно. Специфичность всех методов составляет 99%. ДНК микобак¬
терий, вьщеленную при ПЦР, обнаруживают при эффективной химиотерапии в
496 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯтечение более длительного времени по сравнению с выявлением микобактерий
при люминесцентной микроскопии (в среднем на 1,7 мес) и бактериологическом
исследовании (на 2,5 мес). Высокие чувствительность и специфичность — большое
преимущество ПЦР, особенно при диагностике и дифференциации внелегочных
форм туберкулеза, при которых клинико-рентгенологические и бактериологиче¬
ский методы малоэффективны.Серологическая диагностикаАнтигенная структура туберкулезных микобактерий претерпевает значитель¬
ные изменения на разных стадиях инфекции и при разных формах болезни, что
влечет соответствующие изменения гуморального иммунного ответа у заражен¬
ных ими людей, в связи с этим длительно не удавалось разработать достаточно
чувствительные и специфичные методы серологической диагностики туберкулеза.
В настоящее время стали доступны одноэтапные экспресс-методы серологической
диагностики туберкулеза на основе иммунохроматографического и иммунофер¬
ментного анализов. Большинство современных тест-систем основаны на выяв¬
лении в сыворотке крови пациентов антител к иммуно доминантному антигену
микобактерий А60. Чувствительность теста близка к бактериоскопическому мето¬
ду диагностики туберкулеза, однако возможности серологического метода диа¬
гностики туберкулеза шире, так как он позволяет выявлять и нелегочные формы
туберкулезной инфекции, а также их доклиническую стадию.Принципы безопасности лабораторных исследований на микобактериозыЗаболеваемость туберкулезом медицинских работников значительно превы¬
шает показатели заболеваемости туберкулезом населения России, Опасность
заражения существует как среди медицинского персонала противотуберкулезных
стационаров, так и среди сотрудников бактериологических лабораторий, рабо¬
тающих непосредственно с возбудителем. Распространение и заражение тубер¬
кулезом в противотуберкулезных учреждениях происходит преимущественно
ингаляционным путем. Заражение восприимчивых лиц может происходить
при ингаляции всего 10 микробных клеток. Персонал противотуберкулезных
учреждений должен быть обучен работе с инфекционными больными и инфици¬
рованным материалом. Для предупреждения инфицирования существуют инди¬
видуальные средства защиты и технические приспособления, обеспечивающие
защиту работников лаборатории от контакта с микобактериями туберкулеза.
К индивидуальным средствам защиты относятся закрытый халат или моющийся
костюм с фартуком, маска или противопылевой и противодымовой респиратор,
защитные перчатки.В лаборатории любую манипуляцию с жидкой суспензией или культурой
микобактерий туберкулеза следует проводить в шкафу биологической защиты.
Необходимо избегать возникновения аэрозолей при работе с инфицированным
материалом. Для работы с микобактериями туберкулеза следует использовать
ламинарные боксы биологической защиты 1-го и 2-го класса, защищающие
лаборанта от заражения при условии правильного обращения с оборудованием
(аэрозоли обеззараживаются и устраняются с помощью вытяжной вентиля¬
ции).ТРЕПОНЕМЫТАКСОНОМИЯТрепонемы относятся к порядку Spirochaetales, семейству Treponemataceae, роду
Treponema. У человека вызывают инфекцию Г. pallidum, Т. carateum и Т. vincentii.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 497Ранее к опасным для человека видам трепонем относили Г. pertenue и Т. bgel, одна¬
ко на основании изучения генома эти бактерии отнесли к подвидам Т. pallidum.В этом разделе приведена детальная информация о Т. pallidum подвида pal¬
lidum — возбудителе сифилиса.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАТ. pallidum подвида pallidum — тонкий спиралевидный микроорганизм, имею¬
щий длину от 6 до 20 мкм и диаметр в поперечном сечении 0,2 мкм. Спирохета
имеет обычно 8-14 равномерных завитков с закругленными вершинами и острым
углом между соседними завитками, амплитуда завитков уменьшается по направ¬
лению к концам. Это грамотрицательный микроорганизм, плохо окрашиваемый
анилиновыми красителями (за что трепонема и получила название «бледная»).
Неокрашенные, нефиксированные трепонемы из-за малого диаметра не видны в
обычном световом микроскопе.Основным способом размножения трепонемы является поперечное деление.
Делится она сравнительно медленно: каждые 30-32 ч. При усиленном размноже¬
нии трепонема может делиться не только пополам, но и на большее количество
сегментов вплоть до одного завитка.При неблагоприятных для существования условиях, например под воздействи¬
ем антибиотиков, антител, фагоцитов и т.д., бледная трепонема из спириллярной
формы патогенного существования переходит в устойчивые формы выживания.
Их образование — не только способ сохранения возбудителя в организме в тече¬
ние длительного времени, но и метод размножения инфекции, в случае благо¬
приятного изменения условий существования трепонема получает возможность
вновь реверсировать в патогенную форму. К устойчивым формам выживания
бледной трепонемы относят цисты, L-формы, зерна (гранулы) и полимембранные
фагосомы.Бледная трепонема является тканевым, внутриклеточным паразитом, которого
активно фагоцитируют клетки организма-хозяина. Особенностью фагоцитоза при
сифилисе является то, что он осуществляется не только макрофагами и нейтро-
фильными лейкоцитами, но и «непрофессиональными» фагоцитами — лимфо¬
цитами, плазматическими клетками, фибробластами, шванновскими клетками,
перицитами нервных волокон, эндотелиоцитами капилляров. Однако фагоцитоз
бледной трепонемы обычно остается незавершенным: фагоцитированные бакте¬
рии не только сохраняют жизнеспособность, но и даже способны к внутриклеточ¬
ному и внутриядерному паразитированию (эндоцитобиозу).Бледная трепонема является факультативным анаэробом, поэтому она преиму¬
щественно тропна и активно размножается в нервной, лимфоидной и соедини¬
тельной тканях. Кровь не является благоприятной средой для жизнедеятельности
трепонем, но их можно обнаружить в крови, особенно в определенные периоды
заболевания, характеризуемые массовым размножением и диссеминацией воз¬
будителей (периоды «трепонемного сепсиса»), Трепонема имеет сложный анти¬
генный состав. Описано более 20 разнообразных антигенов, сконцентрированных
главным образом в клеточной стенке и цитоплазматической мембране, К каждому
из этих антигенов на разных этапах течения сифилиса вырабатываются антитела
различных классов. Наибольшее значение для практики имеют белковые и липид¬
ные антигены, поскольку серологическая диагностика сифилиса основана преиму¬
щественно на выявлении антител именно к этим антигенам.При посеве материала, полученного от больного, на искусственные питательные
среды роста бледной трепонемы получить не удается: при культивировании она
утрачивает патогенность. Кроме того, культуральные трепонемы имеют морфоло¬
гические и антигенные отличия от Т. pallidum подвида pallidum.
498 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯВне организма бледная трепонема очень чувствительна к внешним воздействи¬
ям. Оптимальной для ее жизнедеятельности является температура тела человека
(37 °С). Она плохо переносит нагревание, воздействие ультрафиолетового облуче¬
ния, быстро погибает при высушивании. Г. pallidum подвида pallidum устойчива к
f^fil низкой температуре; даже после глубокого и длительного замораживания содер-
жаш;ие ее биологические субстраты сохраняют заразность для экспериментальных
lllli животных. Бледная трепонема устойчива также во влажной среде вне организма,
например в нативном препарате она может сохранять подвижность в течение
нескольких суток. Бактерия очень чувствительна к традиционным антисептикам,
кислотам и щелочам, мылам, солям тяжелых металлов.ЭПИДЕМИОЛОГИЯЗаболевание регистрируют повсеместно, особенно высока его инцидентность в
развивающихся странах. В прошлом веке рост заболеваемости сифилисом отме¬
тили в 30-40-х гг., а затем он снижался до конца 80-х гг. В последующий период
повсеместно (в том числе и в России) происходил рост заболеваемости сифили¬
сом.Резервуаром инфекции служит больной человек. Возбудитель болезни переда¬
ется в большинстве случаев половым, реже контактным путем. Наибольшую опас¬
ность в плане распространения инфекции представляют люди, находящиеся на
первых 2 стадиях болезни, а в последующем они практически теряют инфекцион-
ность. Возможно внутриутробное заражение плодов (с 5-го месяца беременности),
а также заражение детей во время родов.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИБледная трепонема вызывает у человека сифилис. Это заболевание в большин¬
стве случаев передается половым путем и характеризуется хроническим волно¬
образным течением с периодами обострений, чередующихся с длительными
периодами бессимптомного течения инфекции.Первичный сифилис. Инкубационный период сифилиса длится от 9 до
90 дней. Первичная стадия заболевания характеризуется следующим комплексом
клинических симптомов: первичной сифиломой, регионарным склераденитом,
специфическим лимфангитом, специфическим полиаденитом, продромальными
явлениями.Первичная сифилома ~ первое клиническое проявление заболевания, воз¬
никающее на месте инокуляции бледных трепонем (в области входных ворот
инфекции). Первичная сифилома (первичный аффект, твердый шанкр) — чаще
единичная эрозия или язва, безболезненная, без признаков воспаления вокруг,
фавнительно плохо васкуляризирована, имеет в основании четко ограниченный
инфильтрат. Возникновению эрозивного или язвенного дефекта предшествует
появление небольшого гиперемического воспалительного пятна, которое вскоре
превращается в папулу. Эти изменения протекают бессимптомно и, как прави¬
ло, остаются незамеченными ни пациентом, ни врачом. Вскоре после появления
папулы покрывающий ее эпидермис (эпителий) подвергается распаду и формиру¬
ется эрозия или язва (первичная сифилома). Піубина дефекта при этом зависит от
выраженности и характера тканевой реакции на внедрение возбудителя.Наиболее частые локализации первичной сифиломы у мужчин: в венечной
борозде, на внутреннем и наружном листках крайней плоти, на головке полового
члена, в области уздечки, наружного отверстия уретры и на слизистой оболочке
уретры, реже — на стволе и у основания полового члена, на мошонке. На половых
органах женщин первичные сифиломы чаще всего локализуются на малых и боль¬
ших половых губах, в области задней спайки, клитора, на шейке матки.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 499Первичный аффект может остаться незамеченным при локализации в прямой
кишке, внутри уретры. Он может иметь нетипичные клинические проявления
вследствие осложнения вторичной инфекцией. Первичный аффект спонтанно
регрессирует в течение 3-8 нед, обычно не образуя рубца. Первичная сифилома
часто сопровождается умеренным увеличением регионарных лимфатических
узлов, В случае локализации первичного аффекта в области наружных половых
органов отмечают билатеральное ограниченное увеличение паховых лимфатиче¬
ских узлов умеренной плотности (паховую лимфоаденопатию). Регионарный лим¬
фаденит возникает обычно спустя 5-8 дней после появления первичного аффекта
и является почти постоянным спутником последнего, у некоторых пациентов в
конце первичного периода развиваются полиаденит и продромальный синдром,
обусловленный интоксикацией в результате массовой гибели трепонем в крово¬
токе.Дифференциальную диагностику первичной сифиломы проводят с пузырько¬
вым лишаем, неспецифическими эрозиями и язвами различного генеза, изъяз¬
вивши мися злокачественными новообразованиями кожи и слизистых оболочек,
шанкриформной пиодермией, мягким шанкром или шанкроидом.Вторичный сифилис. Вторичный сифилис является наиболее контагиозной
стадией заболевания и характеризуется следуюш;им комплексом клинических
проявлений: пятнистым сифилидом (сифилитической розеолой), папулезным
сифилидом, папуло-пустулезным сифилидом, сифилитической алопецией (облы¬
сением), сифилитической лейкодермой.Высыпания появляются на коже и слизистых оболочках — розеолезный, папу¬
лезный, папуло-пустулезный, везикулезный варианты сифилидов. Сыпь обычно
равномерно распространена по всему телу, включая ладони рук и подошвы ступ¬
ней ног. На участках тела с повышенной влажностью (например, в паховой и
перианальной областях, в складках) папулезные высыпания могут образовывать
плоские вегетирующие бляшки, называемые широкими кондиломами, В некото¬
рых случаях на слизистых оболочках могут появиться папулезные высыпания с
мацерированной молочно-белой, опалесцирующей поверхностью. Эти слизистые
бляшки имеют тенденцию к слиянию. Элементы сыпи высокоинфекционны,
любой физический контакт (сексуальный или несексуальный) с высыпаниями на
коже и слизистых оболочках может привести к заражению. Сыпь обычно исчезает
без лечения через несколько недель или месяцев, кроме высыпаний отмечают
выпадение волос (очаговое или диффузное), нарушение пигментации (лейкодер¬
му). При вторичном сифилисе в ряде слз^аев появляются признаки поражения
нервной системы, внутренних органов и опорно-двигательного аппарата.Скрытый сифилис. Если пациент во вторичной стадии сифилиса не получает
лечения, все видимые проявления заболевания постепенно регрессируют, сифилис
переходит в раннюю скрытую стадию. На этой стадии он остается потенциально
заразным, так как трепонемы в его организме сохраняются. Примерно через год
после начала заболевания количество трепонем в организме снижается, пациент
вступает в следующую стадию сифилиса, известную как поздний скрытый сифи¬
лис. Выделение этих стадий имеет большое значение для диагностики и лечения
сифилиса. Часто невозможно определить точную продолжительность заболева¬
ния, и если есть сомнения относительно времени заражения, пациента следует
рассматривать как больного с поздним скрытым сифилисом.Третичный сифилис. После многих лет скрытого течения, при отсутствии
лечения заболевание переходит в наиболее деструктивную стадию — третичный
сифилис, при этом может наблюдаться поражение кожи и слизистых оболочек,
морфологической основой которого является гранулематозное воспаление, а
клинические проявления характеризуются бугорковыми и гуммозными высыпа¬
ниями. Помимо кожи и слизистых оболочек, могут поражаться сердце, печень,
500 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯнервная система, опорно-двигательный аппарат. Нейросифилис может протекать
как бессимптомно, так и проявляться в форме менинговаскуляркого сифилиса,
спинной сухотки или прогрессирующего паралича. Кардиоваскулярный сифилис
характеризуется мезаортитом, который вначале протекает бессимптомно, а затем
II осложняется недостаточностью аортального клапана, аневризмой аорты, главным
II образом восходящей, стенозом устьев коронарных артерий. Третичный сифилис
Щ протекает недоброкачественно и может приводить к летальному исходу.||	Сифилис беременных. При нелеченом сифилисе у беременных инфекцияможет передаваться плоду: в 25% случаев беременность заканчивается мертво-
рождением или ранней гибелью новорожденного; в 40-70% случаев рождаются
дети, больные врожденным сифилисом, который может протекать с симптомами
или бессимптомно.При постановке беременной на учет должно быть проведено скрининговое
обследование на сифилис, которое повторяют во II и в III триместрах беремен¬
ности. Если женщина не состояла на учете по беременности, обследование на
сифилис проводят во время родов. Новорожденных не выписывают из родильного
дома, пока не получен результат анализа на сифилис, особенно если во время анте¬
натального наблюдения серологический статус матери был сомнительным.Врожденный сифилис. Врожденный сифилис возникает в результате инфи¬
цирования плода во время беременности трансплацентарным путем от больной
сифилисом матери. Обычно внутриутробное заражение плода происходит на
четвертом-пятом месяце беременности. Бледные трепонемы проникают в орга¬
низм плода через пупочную вену, лимфатические щели пуповины или через
поврежденную плаценту. Беременность может закончиться мертворождением
либо рождением живого ребенка с проявлениями заболевания, возникающими
сразу после родов или несколько позднее.Как и приобретенная инфекция, врожденный сифилис подразделяется на
ранний и поздний. Некоторые дети с ранним врожденным сифилисом могут
иметь клинические проявления заболевания при рождении, но у больщинства
они развиваются в сроки от 2 нед до 3 мес после рождения. У некоторых ново¬
рожденных возможно скрытое течение инфекции. Клинические проявления при
раннем врожденном сифилисе: кожа морщинистая, серо-желтой окраски, со спец¬
ифическими высыпаниями, в том числе характерными только для врожденного
сифилиса (сифилитическая пузырчатка, диффузные папулезные инфильтрации).
К другим проявлениям раннего врожденного сифилиса относятся сифилитический
остеохондрит Вегнера, сифилитический ринит Гохзингера, лихорадка, увеличение
печени и селезенки, анемия и различные пороки развития. В дальнейшем (через
год и в более поздние сроки) могут развиться симптомы позднего врожденного
сифилиса, включающие поражение костей, зубов, органов зрения и слуха, мозга.
К признакам, патогномоничным для позднего врожденного сифилиса, относят
триаду Гетчинсона: паренхиматозный кератит, лабиринтную глухоту (специфиче¬
ский лабиринтит) и зубы Гетчинсона.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАОбщепринятые критерии лабораторной диагностики сифилиса представлены в
табл. 22-3.Материалы для лабораторных исследованийПробы для бактериоскопии. Для обнаружения Т. pallidum подвида pallidum
методами темнопольной микроскопии и прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) у
пациентов берут серозное отделяемое с поверхности эрозии, язвы, мацерирован¬
ной или экскориированной, эрозированной папулы или бляшки.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 5Q1Таблица 22-3. Лабораторные критерии диагностики сифилисаДиагнозМетодыОкончательныйВыявление Т. pallidum в клиническом образце с использованием темнопольной
микроскопии, ПИФ-ТР*, атакже валидированных МАНК* или эквивалентных им
методовПредварительныйВозможно использование двух видов серологических тестов: положительного
нетрепонемного (например, RPR, РМП, VDRL*), подтвержденного трепонемного(ТРНА, ТРРА, ИФА, РИФ-абс.*}	" ПИФ-ТР — прямая иммунофлюоресценция с антителами к Т. pallidum-, МАНК — методы ампли¬
фикации штклеиновых кислот: RPR — Kapid Plasma Reagin test (тест на быстрые реагины плазмы);
РМП — реакция микропреципитации; VDRL — Venereal Disease Research Laboratory test, TPHA —
Г. Pallidum Haemagglutination Assay (реакция пассивной гемагглютинации); ТРРА — Г. Pallidum
Passive Particle Agglutination assay (реакция пассивной агглютинации частиц); ИФА — иммунофер¬
ментный анализ; РИФ-абс. - реакция иммунофлюоресценции.Отбор проб осуществляют после тщательной и осторожной очистки поверх¬
ности поражений марлевым тампоном, смоченным физиологическим раствором.
Очистку проводят с целью механического удаления трепонем-комменсалов и дру¬
гих компонентов микрофлоры, которые могут затруднить исследование. Важно
при данной процедуре не травмировать ткани и не вызвать кровотечения, так как
присутствие в мазках лейкоцитов, эритроцитов и клеточного детрита значительно
усложняет обнаружение бледной трепонемы.Для получения тканевой жидкости используют несколько методов.•	Метод раздражения. Очаг поражения (твердый шанкр, мокнущая папу¬
ла, широкая кондилома и т.д.) тщательно очищают ватой или тампоном,
смоченным стерильным физиологическим раствором. Стерильной ложкой
Фолькмана или петлей делают осторожные, чтобы не вызвать кровотечения,
поглаживающие движения по поверхности очага поражения. Через некото¬
рое время его поверхность становится блестящей в результате просачива¬
ния тканевой жидкости. Она прозрачная или слегка опалесцирует. В случае
появления кровотечения его следует остановить, прижав ватный тампон к
поверхности элемента, после чего продолжать поглаживающие движения.
Небольшая примесь крови к тканевой жидкости допустима.•	Метод сдавливания. После очистки поверхности эрозию или язву сдавли¬
вают с боков пальцами в перчатках или пинцетом, при этом стимулируется
выделение серозного экссудата, который собирают с поверхности бакте¬
риологической петлей или путем аккуратного прикладывания к поверхности
эрозии/язвы покровного стекла. Полученное серозное отделяемое смешива¬
ют на предметном стекле с равным количеством физиологического раствора,
накрывают покровным стеклом.•	Метод скарификации. К этому методу прибегают при исследовании сухих
элементов (розеолы, лентикулярных папул, эпителизированных эрозий).
Поверхность исследуемого элемента скарифицируют, при этом неизбежно
появляется капиллярное кровотечение, которое останавливают марлевым
тампоном со стерильным физиологическим раствором. Посредством акку¬
ратного раздражения скарифицированной поверхности получают серозную
жидкость. Этот метод по эффективности значительно уступает предыд>’-
щим. Исследование может дать ложноотрицательный результат вследствие
применения пациентом местных антисептиков, антибиотиков или при
присоединении вторичной инфекции. В этом случае назначают примочки с
физиологическим раствором, после чего (на следующие сутки) исследова¬
ние повторяют. В некоторых случаях материал для микроскопической диа¬
гностики берут из увеличенного регионарного лимфатического узла, чаще
пахового.
уж502 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯйШШР	* Пункция лимфатического узла. Пунктируют плотный подвижный лим-фатический узел без признаков воспаления. Место прокола обрабатывают
йодом, узел фиксируют двумя пальцами левой руки, а правой вкалывают в
узел иглу» соединенную со шприцем, в котором находится небольшое коли-
чество стерильного физиологического раствора. Прокол проводят у одного
полюсов железы и проталкивают иглу по направлению к длинной оси
до противоположного полюса, при этом выпуская содержащийся в шприце
физиологический раствор. Затем иглу медленно выводят из узла, одновре¬
менно оттягивая поршень из шприца. Правильность проведения пункции
подтверждается наличием в пунктате лимфоцитов.Кровь. Пробы крови предпочтительнее брать с помощью вакуумных систем в
пустые пробирки или пробирки с ускорителем свертывания, пробирки с кровью
осторожно транспортируют в лабораторию в специальном закрытом контейнере
при комнатной температуре. При невозможности немедленного проведения ана¬
лиза пробирки с кровью хранят в холодильнике при 4-8 °С.В идеале образцы крови, полученные без ускорителя свертывания, инкубируют
в термостате при 37 °С или при комнатной температуре для образования сгустка
фибрина, затем помещают в холодильник при 4 °С на 30 мин. Пробы, взятые в
вакуумные пробирки с ускорителем свертывания, центрифугируют 10 мин при
скорости вращения ротора 3000 об./мин. Наличие в таких пробирках геля или
гранул создает барьер между сывороткой и остальными фракциями крови.При необходимости хранения в течение длительного срока сыворотку разлива¬
ют в несколько пробирок типа «Эппендорф» в объеме 0,5-1,0 мл и замораживают:
при -18-20 °С их можно хранить 1-1,5 мес, при -65-80 “С срок хранения проб
не ограничен. Не допускают оттаивания и повторного замораживания сыворотки
крови; при необходимости повторного исследования используют дублирующую
пробирку с образцом. Оттаивание сыворотки крови для проведения анализов про¬
водят при комнатной температуре или при температуре 8±2 °С,Перед исследованием сыворотки оттаивают (если пробы хранили в заморожен¬
ном виде), тщательно перемешивают и инактивируют прогреванием при 56 °С в
течение 30 мин.Спинномозговая жидкость. В норме СМЖ бесцветна и прозрачна. Изменения
цвета и прозрачносги СМЖ обусловлены примесями в ликворе (патологическими —
при заболеваниях, кровью — при травме кровеносных сосудов во время взятия
проб). СМЖ получают посредством спинномозговой пункции, которую выполня¬
ет врач-невролог. Показаниями к проведению исследования СМЖ при сифилисе
служат:❖	наличие неврологических симптомов на любой стадии болезни;
сифилитическое поражение органов зрения, сердечно-сосудистой системы;
третичный или врожденный сифилис;<>■ скрытые формы сифилиса.Спинномозговую пункцию обязательно следует проводить всем пациентам:❖	с ВИЧ-инфекцией и положительными серологическими реакциями на сифи¬
лис;❖	неврологическими симптомами при подозрении на возможную этиологиче¬
скую роль сифилитической инфекции в развитии этих симптомов.Спинномозговую жидкость подвергают следующим анализам;^ цитологическому;определению содержания белка;❖	исследованию в реакциях микропреципитации (РМП), пассивной гемаг¬
глютинации (РПГА), иммунофлюоресценции (РИФ-абс) и Venereal Disease
Research Laboratory test (VDRL).
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 5Q3Обнаружение возбудителя в клиническом материалеМикроскопия в темном поле. Исследование на бледную трепонему в темном
поле проводят с помощью светового микроскопа с конденсором темного поля.
Метод темнопольной микроскопии основан на известном феномене Тиндаля,
проявляющемся визуализацией светящихся пылинок в луче света. Необходимые
условия создают путем замены обычного конденсора микроскопа особым конден¬
сором, в котором центральная часть затемнена, проникновение лучей света про¬
исходит через узкую щель. При боковом освещении на темном поле достигается
отраженное свечение всех твердых частиц, в том числе бледной трепонемы. Для
получения темного поля необходим сильный источник света.Темнопольная микроскопия может быть использована для диагностики пер¬
вичного, вторичного и раннего врожденного сифилиса. Кроме отделяемого мок¬
нущих сифилидов, приготовить препарат для микроскопии можно из пунктата
регионарных лимфатических узлов, спинномозговой, амниотической жидкости.
Присутствие непатогенных трепонем-комменсалов Т. rфingers, Т. phagedenis (reit-
eri) в урогенитальном тракте, Г. denticola в полости рта делает затруднительным
и малодостоверным исследование с материалом, полученным с проявлений на
слизистой оболочке полости рта или прямой кишки, так как морфологически
эти трепонемы сходны с т. pallidum. При необходимости исследования мате¬
риала, полученного из этих локализаций, л)^іше отдать предпочтение ПИФ или
молекулярно-биологическим методам.На темном фоне можно также увидеть нейтрофильные лейкоциты (имеют
вид округлых, ярко светящихся зернистых образований), лимфоциты (серовато¬
темные, тускло светящиеся клетки округлой формы), клетки эпителия (круглые
или неправильной формы, значительно крупнее лейкоцитов и ярко светящиеся),
эритроциты (темные элементы круглой формы, окаймленные светящейся поло¬
ской размером чуть меньше лейкоцитов). Если эритроцитов много, поле становит¬
ся слишком светлым, трепонемы видны хуже, могут скрываться под эритроцита¬
ми. в этом случае материал лучше взять повторно.Требуется определенный опыт для распознавания в препарате Г. pallidum,
которая выглядит как очень тонкая спираль длиной 6-20 мкм и толщиной
0,13-0,15 мкм, с 8-12 равномерными завитками глубиной до 0,5-0,7 мкм и может
быть легко перепутана с микроорганизмами-комменсалами. Т. pallidum выполняет
различные виды движений, среди которых можно выделить характерные для
патогенной трепонемы: сгибательные, чаще всего посередине длины ее тела, и
маятникообразные (рис. 22-2). Морфологические характеристики и наличиеВиды движения бледной трепонемы
в нативном препаратеНепатогномоничные для т. palladium
АЛЛЛЛЛЛА/ ► поступательное2.	ЛЛЛЛЛАЛЛ/	вращательное3.	ЛАЛЛААЛЛ/	волнообразноеПатогномон ичные для т. palladium
4. сгибательное	5. маятникообразноетшVЛААЛЛЛЛЛ/Рис. 22-2. Виды движения бледной трепонемы в нативном препарате.
504 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИ0ННЬ1Е ЗАБОЛЕВАНИЯдвижений, характерных для бледной трепонемы, являются диагностическими
признаками Т. pallidum.Если после однократного исследования бледную трепонему обнаружить не уда¬
лось, поражение следует промьггь физиологическим раствором и затем провести
повторное исследование. Однако даже многократный отрицательный результат
такого исследования не позволяет исключить сифилис. В подобных случаях необ¬
ходимо провести серологическое исследование.Метод прямой иммунофлюоресценции. Метод ПИФ предусматривает
прямое выявление г. pallidum в образце при обработке клинического материала
конъюгатами специфических моноклональных антител с флюоресцирующими
красителями. Преимуществами метода являются возможность дифференциации
патогенных трепонем от непатогенных при исследовании проб, взятых со
слизистых оболочек полости рта и прямой кишки, фиксация препаратов перед
транспортировкой в лабораторию. Этим методом можно также исследовать
материал, полученный при биопсии или аутопсии.Препараты исследуют с использованием люминесцентного микроскопа при
увеличении х200, х400 и хЮОО, При этом клетки окрашиваются в красно¬
оранжевый или желтый цвет, бледная трепонема флюоресцирует ярко-зеленым
цветом, сохраняя все морфологические признаки спирохеты.Молекулярно-генетические методы. В настоящее время не существует
коммерческих тестов для выявления ДНК г. pallidum. Все самостоятельно
изготовленные тест-системы необходимо валидировать с помощью не менее
10 положительных образцов, полученных от серопозитивных пациентов с
поражениями, в которых наличие трепонем подтверждено методом темнопольной
микроскопии, а также 10 отрицательных образцов, полученных от серонегативных
пациентов.В ПЦР можно исследовать соскобы шанкров и других высыпаний (папул,
широких кондилом и т.д.), спинномозговую, амниотическую жидкость,
сыворотку крови. При проведении реакции необходим как отрицательный,
так и положительный контроль. В качестве положительного контроля можно
использовать суспензию трепонем, полученную из яичек инфицированного
кролика и разведенную до концентрации приблизительно 100 трепонем/мл,
тогда как препарат из яичек неинфицированного кролика можно использовать в
качестве отрицательного контроля. ПЦР служит хорошим методом для диагности¬
ки сифилиса при небольшом количестве трепонем в исследуемом материале. Этот
тест пока не нашел применения в практике рутинных лабораторных исследований
на сифилис, его применяют только в исследовательских целях. Он высокоспеци¬
фичен, чувствителен и дает воспроизводимые результаты при правильных прове¬
дении и подготовке образцов.Разработаны и другие неамплификационные молекулярно-генетические мето¬
ды диагностики сифилиса (в том числе гибридизация нуклеиновых кислот и дот-
гибридизация), однако они менее чувствительны, чем ПЦР.Методы, используемые для установления предварительного диагноза
А. Нетрепонемные тестыВ качестве антигена в нетрепонемных тестах применяют смесь кардиолипина,
лецитина и холестерина. Они позволяют проводить скрининг большого количе¬
ства людей, оценку эффективности терапии. В основном они основаны на фло-
куляции (выпадении хлопьев в реакционной смеси). Позволяют обнаруживать
IgG- и IgM-антитела к липидам клеточной стенки бледной трепонемы, которые
появляются в крови примерно через 1 нед после формирования твердого шанкра.
Достоинствами нетрепонемных тестов являются низкая стоимость, техническая
простота и скорость получения результата исследования. Возможность постанов-
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 505КИ реакции в количественном варианте с определением титра антител позволяет
использовать их в слз^ае реинфекции/рецидива и для оценки эффективности
терапии. Ограничением к применению являются довольно низкая чувствитель¬
ность и наличие ложноположительных результатов при скрининге популяций с
низкой инцидентностью заболевания.Информация, характеризующая наиболее часто применяемые нетрепонемные
реакции (РМП, RPR, тест VDRL), представлена в табл. 22-4.Таблица 22-4. Чувствительность и специфичность нетрепонемных методов серологической диа¬
гностики сифилисаТип реакцииЧувствительнасть при разных стадиях сифилиса, %первичныйвторичныйскрытый раннийскрытыйпозднийСпецифичность, %РМП81 {70-90}9194(88-100)70 (57-80)98 (93-99}VDRL78 (59-87)10095 (88-100)71 (37-94)98 (96-99)RPR86 (77-100)10098 (95-100)73 (57-85)98 (93-99)Примечание. РМП — реакция микропреципитации: VDRL - Venereal Disease Research Laboratory test,
RPR — реакция быстрых реагинов плазмы (Rapid Plasma Reagin Test).РМП является модификацией VDRL и применяется в большинстве стран
Содружества Независимых Государств (СНГ).Реакция микропреципитацииКачественный вариант. Для исследования используют плазму, инактивиро¬
ванную сыворотку или СМЖ. При добавлении к плазме, сыворотке крови или
ликвору больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена (холестерин-
кардиолипин-лецитинового комплекса) происходит агглютинация и образуется пре¬
ципитат (комплекс «антиген-антитело»), выпадающий в виде хлопьев белого цвета.РМП выполняют в лунках иммунологического планщета с округлым дном для
макротитрования или в лунках с плоским полированным дном планшетов, изго¬
товленных из органического стекла (плексигласа) толщиной 0,8-1,0 см. Реакция
протекает при постоянном перемещивании реакционной среды: при покачивании
планшета вручную или на платформе шейкера (орбитального ротатора). При
отсутствии антител в исследуемом образце внешний вид реакционной среды не
изменяется — она остается опалесцирующей.О наличии в образце биологического материала антител-преципитинов свиде¬
тельствует образование хлопьев преципитата, одновременно происходит просвет¬
ление реакционной среды. Величина частиц преципитата, оцениваемая визуально,
является мерой полуколичественного учета содержания антител и может быть
выражена в условных единицах — от одного до четырех плюсов (табл. 22-5).
При максимальной выраженности ответа (4+) дальнейшую полуколичественную
оценку содержания антител проводят путем тестирования последовательных раз-
ведений исследуемого образца патологического материала (титрование). Учет
проводят при боковом освещении планшета. Планшет держат в руках и слегка
покачивают; для более четкой регистрации под планшетом размещают лист чер¬
ной бумаги и применяют лупу двукратного увеличения.Полуколичественный вариант. Все образцы биологического материала,
давшие при скрининге положительный результат, необходимо исследовать в
полуколичественном варианте РМП. В лунках планшета проводят серию последо¬
вательных двукратных разведений каждого образца: от цельного биологического
материала к 1:2, 1:4 - до 1:128 (восемь разведений) или 1:512 (десять разведе¬
ний). Учет проводят по стандартной методике. При этом титром антител считают
последнее разведение, где сформировался преципитат.
M506 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯТаблица 22-5. Оценка результатов РМПРезультатОписаниеРезко положительный (4+)Крупные хлопья преципитата белого цвета распределяются равномерно по
всему объему лунки либо имеют тенденцию к расположению по перифе¬
рической части лунки, при этом реакционная среда практически полностью
прозрачнаяПоложительный (3+)Хлопья средней величины распределены по всему объему лунки, реакцион¬
ная среда имеет белесоватый оттенокСлабоположительный
(2+и 1+)Мелкие хлопья преципитата распределены по объему лунки, реакционная
среда имеет белесоватый опенокСомнительный (±)Наличие очень мелких хлопьев, сомнение в наличии преципитата; при пока¬
чивании планшета частицы антигена демонстрируют перламутровые перели¬
вы реакционной среды. При получении подобного результата рекомендуют
повторное исследование данного образца биологического материала в
цельном виде и в разведениях (для исключения феномена зоны) и нового
образца (парные сыворотки), полученного через 7-10 дней, для контроля
динамики процессаОтрицательныйПреципитата нет, реакционная среда непрозрачная, при покачиваний план¬
шета частицы кардиолипинового антигена перемещаются, формируя перла¬
мутровые переливы белого цвета в центре лункиИсточники ОШИБОК ПРИ ВЫПОЛНЕНИИ РМП•	Исключение из реакции контрольных сывороток крови, в частности слабопо¬
ложительных.•	Неравномерная концентрация антигена в эмульсии из-за недостаточного
перемешивания ее перед использованием.•	Бактериальное загрязнение эмульсии.•	Нарушение сроков и условий хранения плазмы и сыворотки крови, антигена
и его эмульсии, растворов.•	Использование при постановке реакций загрязненных пробирок, пипеток,
планшет, растворов.•	Нарушение техники взятия крови из пальца (изменение соотношения цитра¬
та Na и крови).•	Замена трехзамещенного цитрата натрия двухзамещенным.Эти погрешности могут приводить к появлению как ложноотрицательных, так
и ложноположительных результатов реакции.Тест на определение быстрых плазменных реагинов (RPR)При добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом суспензии
стабилизированного кардиолипинового антигена, адсорбированного на мелко¬
дисперсных угольных частицах, происходит образование комплексов «антиген-
антитело», собирающих частицы угля в более крупные агрегаты; при этом резуль¬
тат реакции можно учитывать невооруженным глазом.Тест RPR выполняют на специальных картонных или пластиковых карточках
одноразового использования, на которых выдавлены неглубокие лунки диа¬
метром 18 мм. Перед началом исследования проводят разметку карточек; руч¬
кой или карандашом надписывают номер исследуемого образца сыворотки или
плазмы крови в соответствии с записями в журнале регистрации результатов
RPR-теста. В лунки карточек вносят образцы исследуемой сыворотки или плазмы
крови и суспензию антигена. Для более эффективного образования комплексов
«антиген-антитело» содержимое лунок перемешивают в течение 8 мин при ком¬
натной температуре на платформе орбитального шейкера. При отсутствии анти¬
тел в исследуемом образце внешний вид реакционной среды не изменяется, она
остается гомогенной.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 507Качественный вариант определения быстрых плазменных реагинов.Учет результатов проводят при хорошем освещении, карточку располагают на
столе или держат в руках и слегка покачивают; для более четкой регистрации при¬
меняют лупу двукратного увеличения. О наличии в образце биологического мате¬
риала реагиновых антител свидетельствует образование частиц флокулята раз¬
личной величины, одновременно происходит просветление реакционной среды.
Принципы оценки результатов теста изложены в табл. 22-6,Таблица 22-6. Оценка результатов теста на определение быстрых плазменных реагиновРезультатПоложительныйСлабоположительныйОтрицательныйОписаниеКрупные и средней величины агрегаты угольных частиц черного цвета располо¬
жены по всему объему лунки либо имеют тенденцию к распопожению ближе к
периферической части лунки, при этом реакционная среда практически полно¬
стью прозрачнаяРедкие и мелкие агрегаты угольных частиц, хлопья преципитата распределены
по периферии реакционной лунки, реакционная среда имеет гомогенную струк¬
туру		Видимые агрегаты угольных частиц в пробе отсутствуют, реакционная среда
гомогенной структуры либо частицы угля собираются в центральной части
лунки, формируя пятно черного цвета		 	Образцы сыворотки или плазмы крови, показавшие при скрининге положи¬
тельные и слабоположительные результаты, исследуют полуколичественным
вариантом (титрованием).У некоторых пациентов с очень высоким содержанием антител возможно полу¬
чение слабоположительного ответа в RPR-тесте с неразведенным биологическим
материалом (проявление феномена прозоны); причина этого явления в том, что
переизбыток антител препятствует образованию крупных хлопьев преципитата.
В этих случаях рекомендуют исследование разведенных образцов биологического
материала.Полуколичественное определение быстрых плазменных реагинов. Полу¬
количественную RPR проводят посредством титрования проб и применяют в сле¬
дующих случаях:для исследования образцов сыворотки или плазмы крови, показавших при
скрининге положительные и слабоположительные результаты;❖	если данные RPR расходятся с результатами других тестов на сифилис;❖	в случае прямого указания лечащего врача.Исследуют серию разведений цельного биологического материала с 1:2 до 1:16
или до 1:512. Титром антител считают последнее разведение, показавшее положи¬
тельный результат при RPR-тестировании.Оценка диагностической значимости нетрепонемных тестов. Нетре¬
понемные тесты не являются строго специфическими реакциями на сифилис,
так как предназначены для выявления антикардиолипиновых антител. В сыво¬
ротке крови людей реагиновые антитела могут транзиторно обнаруживаться
при системных поражениях паренхиматозных органов (печени, почек, легких),
при миокардите, атеросклерозе, острых вирусных инфекциях, включая гепатит,
ветряную оспу и корь, при малярии, после вакцинации и во время беременности.
Хроническую персистенцию наблюдают при заболеваниях соединительной ткани,
лепре, онкологии, применении внутривенных наркотиков и в пожилом возрасте.
Количество ложноположительных результатов увеличивается при исследовании
образцов крови пожилых людей.Нетрепонемные тесты используют для первоначального скрининга, они стано¬
вятся положительными примерно на шестой неделе после инфицирования, поэто¬
му часть пациентов с положительными результатами темнопольной микроскопииfc
508 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯПервичныйРанний сифилис
ВторичныйПоздний сифилисРанний скрытыйПоеднийскрытыйНеле-ченныйОтрицательныестаноаятсяположи¬тельными	ВсегдаОбычноОбычно>положи¬►положи¬>положи¬>тельныетельныетельныеТретичныйОбычно
положи гель ные,
но станоаятся
отрицательными
	^Положительный
нетрепонемный
актительный тестОтрицательный
нетрепонемный
антительный тестРис. 22-3. Реактивность нетрепонемных серологических тестов В зависимости от стадии сифили¬
са и влияния проведенного лечения (схема),(до 40%) при первичном сифилисе могут быть серонегативными. Количественные
варианты тестов используют для определения эффективности терапии. После
адекватного лечения раннего сифилиса титры антител в нетрепонемных тестах
должны значительно снижаться или результаты тестов становиться отрицатель¬
ными. Тем не менее даже при адекватном лечении поздних стадий заболевания в
последующем титры антител могут стойко сохраняться, снижаться или персисти¬
ровать на прежнем уровне, но никогда не увеличиваться (рис. 22-3).Б. Трепонемные тестык трепонемньш реакциям относятся ИФА, РПГА или ее разновидность — метод
микрогемагглютинации Г, pallidum (МГА-ТР), реакция иммобилизации бледных
трепонем (РИБТ), РИФ, а также метод ИБ и тест с использованием хроматографи¬
ческих полосок [«анализ по месту лечения»- (point-of-care)]. В этих тестах применя¬
ют антиген бледной трепонемы (в реакциях РИФ, РИБТ), рекомбинантные белки,
полученные генно-инженерным способом, или искусственно синтезированные
пептиды (ИФА, РПГА, модифицированный иммуноблоттинг и иммунохромато¬
графический тест).трепонемные тесты используют для подтверждения результатов нетрепонем¬
ных тестов. Б популяции с низкой инцидентностью заболевания их можно исполь¬
зовать для скрининга, так как в настоящее время возможна автоматизации ИФА.Несомненные достоинства этих диагностичеких тестов — высокие чувстви¬
тельность и специфичность (табл. 22-7). Экспресс-тесты можно использовать в
местах оказания медицинской помощи. Однако трепонемные тесты непригодны
для контроля эффективности терапии, так как даже после выздоровления многихТаблица 22-7. Чувствительность и специфичность трепонемных методов серологической диа¬
гностики сифилисаТип реакцииЧувствительность при разных стадиях сифилиса, %Специфичность, %первичныйвторичныйскрытыйраннийскрытыйпозднийРИФ-абс.84 (70-100)10010096(93-100)97 (94-100)МГА-ТР76 (64-90)10097 (94-100)97(94-100)99 (98-100)примечание. РИФ-абс. - реакция имм>’нофлюоресценции; МГА-ТР — реакция микрогемагглю¬
тинации к т. pallidum.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 5Q9пациентов их сыворотка крови продолжает давать положительную реакцию на
протяжении длительного времени (иногда в течение всей жизни), и трепонемные,
и нетрепонемные тесты могут давать положительный результат при невенериче¬
ских трепонематозах.Иммунофлюоресцентные тесты (РИФ)Для серологической диагностики сифилиса применяют несколько вариантов
РИФ. Наиболее чувствительным из них («золотым стандартом*^) является РИФ с
абсорбцией (РИФ-абс.). По данным ВОЗ, чувствительность РИФ-абс.-теста равна
70-100% при первичном и 96-100% — при вторичном и позднем сифилисе, тогда
как его специфичность составляет 94-100%. РИФ-абс.-тест часто применяют для
подтверждения диагноза. Поскольку он относительно дорогой, трудоемкий и тре¬
бует наличия в лаборатории люминесцентного микроскопа, его не рекомендуют
применять в качестве скринингового теста.При его проведении исследуемую сыворотку разводят 1:5 и обрабатывают сор¬
бентом для удаления неспецифических антител.РИФ-абс.-DS-TecT отличается от РИФ-абс. тем, что к разбавителю сыворотки
добавляют краситель (обычно родамин) для создания контрастного фона ярко-
зеленым спиральным трепонемам.Для ранней диагностики врожденного сифилиса используют тесты на основе
флюоресцирующих антител, разработанные для детекции специфических IgM.
Большие молекулы IgM неспособны проходить через плаценту. Их обнаруживают
в крови плода только при нарущении плацентарного барьера или при активной
продукции инфицированным плодом. По этой причине выявление специфических
IgM-антител в сыворотке крови новорожденных детей считают свидетельством
врожденного сифилиса. К сожалению, специфичность данного тесга невысока,
так как может происходить неспецифическое связывание конъюгата. Разработано
несколько вариантов РИФ для выявления при сифилисе специфических IgM-
антител:<0- РИФ-абс.-IgM — выявляет антитела к специфическим IgM-антителам чело¬
века;<> 19S-IgM-РИФ-абс. — содержащиеся в исследуемой сыворотке антитела
разделяют на мини-колонке и исследуют в данном тесте фракцию 19S-lgM.Для теста РИФ-абс. необходимы:❖	исследз'^емая сыворотка;❖	антиген. Суспензию Т. pallidum (штамм Nichoí) получают из яичек инфици¬
рованного кролика через 7 дней после инокуляции. Кроме того, существуют
коммерческие препараты — предметные стекла с нанесенными на них трепо-
немами;<!► сорбент — готовят из культур непатогенных трепонем Рейтера без добавле¬
ния консерванта:конъюгат, меченный флюоресцеином. Сыворотку получают от животных,
иммунизированных фракцией иммуноглобулинов человека, и метят флюо¬
ресцеином;❖	фосфатный буфер.Тест проводят следующим образом. На тонких обезжиренных предметных сте¬
клах обводят окружности (по 10 на каждом стекле) диаметром 0,7 см. Суспензию
Г. pallidum наносят в центр каждого круга и равномерно распределяют по нему
вращательными движениями. Препараты антигенов сущат на воздухе и фиксиру¬
ют. Исследуемые инактивированные сыворотки разводят 1:5 сорбентом, который
разбавляют до заранее определенного титра. Разведенные сыворотки наносят на
антиген так, чтобы мазок был покрыт равномерно. Выдерживают препараты во
влажной камере инкубатора. После инкубации стекла дважды тщательно про¬
мывают в фосфатном буфере, после чего высушивают на воздухе. Затем на мазки
ШР 510 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯнаносят конъюгат, меченный флюоресцеином, и повторно инкубируют во влаж¬
ной камере. После инкубации образцы промывают в фосфатном буфере, высу¬
шивают на воздухе, наносят на мазок каплю монтирующей жидкости, накрывают
щ||| его покровным стеклом и исследуют с помощью люминесцентного микроскопа с
кварцево-ртутной лампой при увеличении х400. При учете реакции оценивают
степень флюоресценции трепонем;❖	4+ (зелено-желтая флюоресценция) — резко положительный образец;❖	3+ (яркая флюоресценция) — положительный;❖	2+ (слабая флюоресценция) — слабоположительный;❖	1+ (видимое окрашивание) — минимально-реактивный;
отсутствие флюоресценции — отрицательный.Учет результатов РИФ-абс. носит субъективный характер, следствием чего в
ряде случаев (особенно при отсутствии у специалиста, проводящего тест, доста¬
точного опыта) получают ложноположительные результаты. Неспецифическую
положительную реакцию могут давать также сыворотки крови пациентов с ауто¬
иммунными заболеваниями и лепрой.Для выявления антител в СМЖ при подозрении на нейросифилис предложена
модификация — РИФ-ц-тест. Используют те же антиген и конъюгат. Исследуемый
образец СМЖ не инактивируют и тестируют в неразведенном виде.Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)Для проведения теста применяют эритроцитарный диагностикум — формали¬
низированные и таннизированные эритроциты барана или птиц (чаще куриные),
которые сенсибилизировали обработанным ультразвуком антигеном Т. раШйит
или рекомбинантными белками бледной трепонемы (ТрЫ15, ТрК17, ТрЫ47).
Коммерческие тест-наборы для РПГА обычно включают эритроцитарный диа¬
гностикум, контрольные эритроциты, буфер для разведения, положительный и
отрицательный контроль и 96-луночные планшеты с О-образным дном.В лунки планшета вносят образцы исследуемой сыворотки крови и эритроци¬
тарный диагностикум. При наличии специфических антител в сыворотке крови
пациента происходит их взаимодействие с антигенами бледной трепонемы и обра¬
зование пространственных структур иммунных комплексов «антитело-антиген-
эритроцит», которые под действием силы тяжести постепенно опускаются вниз,
распределяются по всей поверхности дна лунки и формируют характерную кар¬
тину «перевернутого зонтика». Реакцию учитывают визуально через 60-120 мин.
При использовании более крупных эритроцитов птиц получают более четкую кар¬
тину, учет результатов проводят в более ранние сроки — через 45-60 мин.В зависимости от количества иммунных антител, содержащихся в исследуемом
образце, изображение «перевернутого зонтика» варьирует от максимального,
занимающего всю поверхность дна лунки, до небольшого участка в центральной,
самой низко расположенной его части, с просветлением в центре и формировани¬
ем более интенсивного кольца из осевших эритроцитов по периферии.При оценке результатов РПГА опираются на форму и характер осадка эритроци¬
тов на дне лунок иммунологического планшета (табл, 22-8).При отсутствии в образце специфических антител и при проведении реакции
с интактными эритроцитами (контроль) образования иммунных комплексов не
происходит: эритроциты постепенно оседают на дно лунки, формируя фигуру в
виде компактного пятна или «пуговки», иногда с незначительным просветлением
в центре.РПГА проста в выполнении, не требует специального оборудования и не занима¬
ет длительного времени; высокочувствительна и специфична. Реакция становится
положительной спустя 3-4 нед после появления твердого шанкра. В зависимости
от стадии заболевания чувствительность РПГА колеблется от 76% при первичном
до 100% при вторичном сифилисе и 94-97% при скрытых формах.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯТаблица 22-8. Оценка результатов РПГА для выявления Т. pallidum511РезультатРезко положительный (4+)Положительный (3+)Слабоположительный (2+)Неопределенный (1+ и ±)ОтрицательныйОписаниеЭритроциты расположены ровным слоем по всему дну лунки — высокое
содержание специфических антител в пробе 			Эритроциты расположены на большей части дна лунки, по периферии
осадка формируется заметное кольцо из эритроцитов	Эритроциты расположены на небольшой части дна лунки, в центральной
части формируется плотное кольцо из осадка эритроцитов с заметным
просветлением в центральной частиНаличие небольшого рыхлого осадка эритроцитов с нечеткими краями в
центральной части лунки, с незначительным просветом в центре на сво¬
бодном от эритроцитов окружающем фоне — такие образцы рекомендуют
исследовать повторно, иногда со свежей порцией сыворотки, полученной
через 1-2 нед				 	 	Компактный осадок в центральной части дна лунки на чистом окружаю¬
щем фоне		Антитела-агглютинины выявляют в крови переболевших сифилисом людей в
течение длительного времени, поэтому РПГА нельзя рекомендовать для диффе¬
ренциальной диагностики реинфекции или определения остроты инфекционного
процесса (рис, 22-4).Преимущества РПГА перед РИТ, РИФ состоят в дост}шности готовых тест-
систем, отсутствии надобности в живой патогенной бледной трепонеме, возмож¬
ности автоматизации реакции.Разновидностью РПГА является ТРРА, в которой используют несенсибилизи-
рованные и сенсибилизированные частицы латекса вместо эритроцитов (реакция
пассивной агглютинации с частицами латекса или ТРРА). Тест проводят так же,
как РПГА, но результаты оценивать легче. Реагенты для постановки ТРРА более
стабильны.Иммуноферментный анализ (ИФА)Принцип теста состоит в фиксации на поверхности лунок полистиролового
планшета иммунных комплексов, образующихся при взаимодействии антител
больного сифилисом с антигенами бледной трепонемы, с последующим выявлени¬
ем их в цветовой реакции с помощью специфических конъюгатов и соответствую¬
щих субстратно-хромогенных добавок.шш'ЧШЛРанний сифилисПоздний сифилисПервичныйВторичныйРанний скрытыйПозднийскрытыйНеле-ченныйі^^мцательньїе
рщановятся
||Щложитель-
ІІ^іми (рано)►Всегдаположи¬тельные>Всещаположи¬тельные►Всегдаположи¬тельные►Правильно.лроле-	иэнгнальноченный ^Штожительныв)?/ Остаются \
I положи- J
V тельными уТретичныйОбычно '■
положителье^^
но становятфПоложительный
трелонемный тестОтрицательный
трелонемный тестРис, 22-4, Реактивность трепонемных серологических тестов в зависимости от стадии сифилиса
и влияния проведенного лечения (схема).
512 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯДля выполнения теста применяют различные антигены:❖	обработанную ультразвуком суспензию Т. pallidum',о	рекомбинантные — получают генно-инженерными технологиями путем вне¬
дрения в геном бактериальной клетки (например, Е. colt) гена, ответственного
за синтез определенного антигена Г. pallidum, с последующим наращиванием
бактериальной массы продуцирующего микроорганизма, разрушением этих
клеток, выделением и очисткой антигена;❖	пептидные — получают в результате последовательного химического синтеза
антигенных эпитопов белков Г. pallidum. Наиболее пригодными для теста
оказались иммунодоминантные участки белков бледной трепонемы с моле¬
кулярной массой 15,17 и 47 кДа.Классический (непрямой) вариант ИФА•	Внутреннюю поверхность лунки иммунологического планшета сенсибилизи¬
руют антигенами бледной трепонемы.•	При внесении в лунки и инкубировании в них исследуемых сывороток
специфические антитела образуют иммунные комплексы, которые остаются
связанными после отмывания буферным раствором (I фаза).•	В реакцию добавляют конъюгат, представляющий собой антитела к иммуно¬
глобулинам человека, меченные ферментом (пероксидазой хрена) (И фаза).•	После повторного отмывания буфером наличие сложных иммунных
«сэндвич»-комплексов выявляют внесением в лунки раствора перекиси водо¬
рода (субстрата), расщепляемой ферментом конъюгата, и хромогена, кото¬
рый меняет цвет при взаимодействии с атомарным кислородом (1П фаза).•	Насыщенность цвета реакционной среды пропорциональна количеству реа¬
гирующих антител к Т. pallidum, что можно измерить фотометрически.Ловушечный вариант ИФАЕго применяют в основном для выявления антител различных классов:поверхность лунки иммунологического планшета сенсибилизируют аффин¬
но очищенными антителами к иммуноглобулинам человека определенного
класса (например, IgM, IgG или IgA);❖	содержащиеся в исследуемой сыворотке иммуноглобулины соответствую¬
щего класса связываются с антителами, сенсибилизированными на стенках
лунки иммунологического планшета (I фаза);^ присутствие среди иммобилизованных иммуноглобулинов специфических
антител определяют внесением антигенов бледной трепонемы, конъюгиро¬
ванных с ферментом (II фаза);<> результаты визуализируют добавлением в реакцию хромоген-субстратной
смеси (III фаза).Модифицированный двухфазный вариант ИФАЭтот вариант ИФА применяют для выявления суммарных антител, специфиче¬
ских к определенному антигену, независимо от их класса:❖	специфические сывороточные антитела взаимодействуют одновременно с
антигеном, фиксированным на поверхности лунок планшета для ИФА и тем
же антигеном, меченным ферментом, при совместном инкубировании испы¬
туемого образца и конъюгата (I фаза);❖	образование иммунных комплексов определяют с помощью субстрата
(II фаза).Оценка результатов ИФА. Результаты ИФА-тестов носят качественный
характер. Их учитывают автоматически по величине цифровых показателей
оптической плотности (ОП) в лунках с испытуемыми сыворотками. При каж¬
дом выполнении теста рассчитывают критическое значение ОП и серую зону
(интервал, лежащий в пределах критической ОП, ±10%), Результат теста счита¬
ют позитивным, если ОП исследуемой пробы располагается выше серой зоны;
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 5^3сомнительным, если ОП находится в пределах серой зоны; отрицательным, если
ОП ниже серой зоны.К сожалению, все тест-системы ИФА невозможно привести к единому стандар¬
ту. Один и тот же образец сыворотки может давать в разных тест-системах разный
уровень окрашивания раствора субстрата. Это зависит от конструкции самой гест-
системы, используемого антигена, концентрации конъюгата, а также величины
критической ОП.ИммуноблоттингДля диагностики сифилиса применяют несколько вариантов иммуноблоттин¬
га — западный блоттинг-тест «Iniiolia».Эти тесты дают легковоспроизводимые результаты. Они относительно просты
в выполнении и интерпретации результатов. Тем не менее они достаточно доро-
rfi, занимают много времени и требуют высокой квалификации лабораторных
работников. Позволяют определять наличие в тестируемых пробах антител сразу
к нескольким антигенам Т. pallidum. Применение высокоочищенных рекомбинант¬
ных и пептидных антигенов снижает до минимума неслецифическую реактив¬
ность сывороток. Применение иммуноблоттинга дает возможность отказаться от
трудоемких и субъективных методов, связанных с опасными для исследователя
манипуляциями (перевивка штаммов Г. pallidum, работа с патогенной бледной тре-
понемой при выполнении реакции). Всем этим определяется предпочтение имму¬
ноблоттинга другим трепонемньш тестам для диагностики сифилиса, в частности
РИФ и в особенности - РИБТ (см. ниже). Существуют технические возможности
для инструментальной оценки интенсивности окрашивания антигенных полос на
Стрипах (сканирование) с автоматизацией аналитического процесса.Западный блоттинг. Данный тесг проводят с применением коммерческих и
самостоятельно приготовленных тест-систем. Они представляют собой стрипы,
содержащие специфические компоненты экстракта Т. pallidum, которые разделя¬
ют электрофорезом. Стрип инкубируют с сывороткой пациента. При наличии в
ней специфических антител они связываются участками сгрипа, содержащими
гомологичные антигены возбудителя. Для выявления участка связывания стрипы
инкубируют с антителами к иммуноглобулинам человека, меченными пероксида¬
зой хрена. Наличие конъюгата (а следовательно, и антител к Т. pallidum) определя¬
ют по действию фермента на субстрат, дающий цветовую реакцию. В иммуноблот-
тинге можно выявлять специфические IgG- и IgM-антгггела.Модифицированный иммуноблоттинг (тест «Innolia»). Основу теста для
проведения линейного иммуноблоттинга in vitro в целях обнаружения специфи¬
ческих антител против Т. pallidum в образцах сыворотки или плазмы крови
человека представляют нейлоновые тест-полоски (стрипы), фиксированные на
подложке из нейтрального пластика. На каждый стрип в виде дискретных линий
нанесены антигенные детерминанты Г. pallidum: три рекомбинантных белка
(TpN47, TpN17 и TpNl5) и один синтетический пептид (ТтрА), Кроме того, на
каждом стрипе имеются четыре контрольные линии; одна антистрептавидиновая
и три калибровочные линии, по интенсивности окрашивания соответствующие
3-f, 1+, ± {cut-off). Калибровочная линия, соответствующая 3+, содержит иммо¬
билизованные антитела против IgG человека и одновременно служит контро¬
лем.Оценка результатов иммуноблоттинга. Для суждения о достоверности
(валидности) проведенного исследования учет реакции начинают с контролей:
на стрипе, инкубированном с положительным контролем, должно происходить
окрашивание всех 4 полос с трепонемными антигенами не менее чем на 1+, а на
стрипе, тестированном с отрицательным контролем, не допускается окрашивания
антигенных полос; возможно фоновое окрашивание слабее критического уровня.
Затем приступают к оценке испытуемых проб (табл. 22-9).
шш	i514 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯщш§Таблица 22-9. Оценка результатов модифицированного иммуноблотгинга (теста «Innolia»)§Ш<ШШ-im.РезультатОтрицательныйПоложительныйСомнительныйliiОписаниеВсе антигенные полосы на стрипе не окрашены или одна из полос окра¬
шена с интенсивностью «±»Две или более антигенные полосы на стрипе окрашены с интенсивно¬
стью «±» или вышеОдна антигенная полоса на стрипе окрашена с интенсивностью «1+» или
выше {при получении такого ответа рекомендуют повторное исследова¬
ние новой порции крови с интервалом в несколько недель)Одноэтапные иммунохроматографические тесты (ИХТ)Эти тест-системы предназначены для диагностики сифилиса на основании
исследования цельной капиллярной крови. Они недороги, выпускаются в виде
нитроцеллюлозных тест-полосок и позволяют получить результат в течение 5 мин
(его устанавливают по появлению на полоске цветовой полосы) и пригодны для
применения в месте первичного обследования пациента. Их рассматривают как
прорыв в диагностике, потому что они позволяют установить этиологию болезни
и назначить лечение во время первого визита пациента к врачу. К сожалению,
производимые в настоящее время одноэтапные ИХТ предназначены только для
серологической диагностики сифилиса, а это значит, что их положительный
результат свидетельствует о том, что человек в течение жизни болел сифилисом и
необязательно болен в момент исследования.Реакция иммобилизации бледных трепонемРИБТ является одним из классических тестов для определения специфических
трепонемных антител. Суспензию живых трепонем смешивают с тестируемой
сывороткой. При наличии в последней специфических антител трепонемы утра¬
чивают подвижность. Однако РИБТ — достаточно сложный, трудоемкий и
дорогостоящий анализ, требующий высокой квалификации персонала и наличия
вивария. Тест обладает низкой чувствительностью, особенно на ранних стадиях
сифилиса. К тому же РИБТ нельзя проводить при наличии в крови больного тре-
понемоцидных антибиотиков.В связи с этим не рекомендуют применение данного метода при рутинной диа¬
гностике сифилиса.Основные причины ошибочных показаний серологических тестов
А. Ложноположительные результатыОсновные причины ложноположительных результатов трепонемных тестов.•	Технические погрешности, допущенные при сборе, доставке, хранении проб
сыворотки крови, а также при выполнении тестов.•	Эндемичные трепонематозы, такие как эндемичный сифилис (вызываемый
Г. palladium var. endemicum), фрамбезия (Г. pertenue) и пинта (Г. carateum).
Пациентов с положительными серологическими реакциями на сифилис из
стран с эндемичными трепонематозами необходимо обследовать на сифилис
и получить противосифилитическое лечение в качестве профилактической
меры, если их раньше не подвергали такому лечению.В трепонемных тестах биологические ложноположительные реакции могут про¬
являться при аутоиммунных заболеваниях, ВИЧ-инфекции и во время беременно¬
сти (РИФ-абс. чаще, чем РПГА/микроРПГА). Ложноположительные результаты
ИФА и РПГА могут проявляться у пациентов с инфекционным мононуклеозом
(особенно на фоне высокого уровня гетерофильных антител). Существует опреде¬
ленная взаимосвязь между ложноположительными реакциями в РИФ-абс. и под¬
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 515твержденным диагнозом системной, дискоидной и лекарственной красной волчан¬
ки. В этих случаях иногда наблюдают атипичную («бисерную») флюоресценцию.
Для устранения этих типов ложноположительных реакций проводят абсорбцию
сыворотки на тимусной ДНК теленка для удаления анти-ДНК-антител.Ложноположительные результаты РИФ-абс. могут возникать из-за ошибки в
выборе сорбента, используемого в данном тесте для удаления перекрестно реаги¬
рующих антител к групповым, родовым или семейственным антигенам; абсорбция
сыворотки рейтеровской трепонемой необходима для снижения количества лож¬
ноположительных результатов.Б. Ложноотрицательные результатыОсновные причины ложноотрицательных серологических реакций при диагно¬
стике сифилиса следующие.•	Эффект «прозоны» — нетрепонемные агглютинационные тесты при вто¬
ричном сифилисе могут давать слабоположительную или отрицательную
реакцию, обусловленную избытком антител, когда нормальная реакция
«антиген-антитело» не завершается либо блокируется.•	Отрицательный результат серологических реакций на сифилис регистрируют
у ВИЧ-инфицированных пациентов или пациентов с признаками иммуноде¬
фицита другого происхождения.•	Эффект диагностического «окна» обусловлен отрицательными результатами
серологических реакций на сифилис, наблюдаемыми в период первичного
сифилиса, и запоздалой выработкой антител.Исследование СМЖ на наличие антител к Г раИШитДля обнаружения специфических антител в СМЖ пациентов, подозреваемых в
заражении Т. pallidum, используют РМП, РИФ-ц и ИФА, Тесты проводят с цельным
ликвором. РМП проявляет высокую специфичность, но при некоторых вариантах
нейросифилиса она недостаточно чувствительна.Показания к применению серологических реакцийСкрининговое обследование населения на сифилис рекомендуют проводить с
помощью РМП, ИФА или РПГА в зависимости от местной эпидемической ситуа¬
ции и возможностей местной лабораторной службы. При этом в популяциях с
низким уровнем инфекции (соматических стационарах, поликлиниках, кабинетах
медицинских осмотров) обследование предпочтительнее проводить с помощью
трепонемного теста, так как при этом можно сразу выделить группу больных или
пациентов, перенесших в прошлом сифилис. Результаты скрининга подтвержда¬
ются данными нетрепонемных тестов.Скрининговое обследование на сифилис группы лиц с высоким уровнем пре-
валентности инфекции в популяции (работников коммерческого секса, заключен¬
ных) целесообразно начинать с нетрепонемного теста, В каждом случае положи¬
тельного ответа для подтверждения необходимо проводить трепонемные тесты.Ввиду возможности выявления поздних форм сифилиса среди больных в
офтальмологических, психоневрологических, кардиологических стационарах
необходимо использовать РМП в сочетании с ИФА, РПГА, РИФ (любая из реак¬
ций на выбор) в зависимости от возможностей клинико-диагностических лабора¬
торий лечебно-профилактических учреждений.В связи с высоким уровнем заболеваемости сифилисом в Российской Федерации
беременных следует подвергать профилактическому обследованию на сифилис
трижды: при постановке на учет, на 18-20-й и 32-й неделе беременности.Лиц с клиническими проявлениями первичного сифилиса надо обследовать в РМП
(качественный и количественный вариант), РИФ или, при наличии такой возможно-
сги, в ИФА-IgM (если тесг-система зарегистрирована) либо 19S-IgM-FTA-abs.
516 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯЛица с клиническими проявлениями, подозрительными на наличие вторичного
сифилиса, должны быть обследованы с помощью РМП (качественный и количе¬
ственный вариант) в сочетании с РПГА, ИФА или РИФ (любым из трепонемных
тестов на выбор).Лиц с клиническими проявлениями, подозрительными на наличие позднего
сифилиса (третичного, висцерального, в особенности с поражением сердечно¬
сосудистой системы, опорно-двигательного аппарата и т.д.), обследуют с помощью
нетрепонемного теста, а также двух трепонемных тестов: ИФА или РИФ, а также
РПГА или РИБТ.Лиц без клинических проявлений заболевания, бывших в половом или тесном
бытовом контакте с больными заразными формами сифилиса, надо обследовать
как больных с подозрением на первичный сифилис.Лиц без клинических проявлений заболевания с подозрением на скрытый сифи¬
лис необходимо обследовать с помощью нетрепонемного, а также двух трепонем¬
ных тестов, при этом возможны следующие сочетания: ИФА или РИФ -i- РИБТ:
ИФА или РИФ + РПГА.Новорожденных от матерей, перенесших сифилис и не получивших адекват¬
ную терапию либо проходивших лечение от сифилиса во время беременности,
обследуют с помощью нетрепонемного теста, а также тестов на выявление ранней
инфекции — РИФ, 19S-IgM-FTA-abs или ИФА-IgM.Новорожденных от матерей, перенесших сифилис и прошедших полный курс
лечения, обследуют с помощью РМП (или RPR). При положительном результате
дополнительно применяют ИФА, IgG-ИФА, РИФ, 19S-IgM-FTA-abs или ИФА-
IgM,Детей при подозрении на поздний врожденный сифилис обследуют с помощью
РМП и двух трепонемных тестов: ИФА, РИФ + РПГА или РИБТ.Алгоритмы и критерии диагностики сифилиса. Достоверным диагностиче¬
ским лабораторным критерием сифилиса является обнаружение патогенной блед¬
ной трепонемы с помощью прямой микроскопии, ПИФ или ПЦР при клинических
симптомах ранней стадии сифилиса. Серологические методы при клинических
симптомах сифилиса также достаточно достоверно подтверждают диагноз.С осторожностью следует относиться к результатам серологического обследова¬
ния пациента, если клинические симптомы заболевания отсутствуют. Предлагают
следующий алгоритм обследования пациента, у которого диагноз сифилиса может
быть установлен впервые (на основании жалоб и объективных симптомов, сви¬
детельствующих о возможном сифилисе, либо у лица, обследуемого по контакту
с больным сифилисом). Если у пациента есть клинические проявления ранних
стадий заболевания, проводят исследования на бледную трепонему в темном поле,
ПИФ или ПЦР. При положительном результате диагностируют сифилис, при
отрицательном — исследования проводят повторно. Пациента обследуют серо-
логически по одной из предложенных выше схем. Если при этом скрининговый
метод (РМП или трепонемный тест) дает положительный результат, проводят под¬
тверждающий трепонемньш или нетрепонемный серологический тест и пациента
направляют к дерматовенерологу.Если у пациента скрьггая форма сифилиса, диагноз будет, скорее всего, установ¬
лен на основании результатов серологического исследования. В таком случае на
первом этапе необходимо провести количественный нетрепонемный тест, после
чего пациента направляют к дерматовенерологу для обследования, лечения и
наблюдения.Если у пациента выявлен скрытый сифилис при серологическом скрининге с
использованием трепонемного или нетрепонемного теста, применяют количе¬
ственный нетрепонемный тесг (или соотвтетственно трепонемный). Результаты
анализа (титр) фиксируют в карте больного и назначают ему лечение. Повторные
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 51 ^количественные серологические тесты проводят на 3, 6, 9 и 12-м месяце после
лечения.у пациентов, получивших лечение по поводу ранних стадий сифилиса (первич¬
ного, вторичного или раннего скрытого), регистрируют положительные реакции
при обследовании в трепонемных тестах и отрицательные ~ в нетрепонемных (в
случае успешного результата лечения).Рецидив заболевания может проявляться появлением сыпи на коже или слизи¬
стых оболочках на фоне возрастания титров нетрепонемных тестов.В случае реинфекции отмечают значительное (четырехкратное и большее)
повышение титров нетрепонемных тестов. Повторное обследование с использова¬
нием трепонемных тестов не имеет диагностического значения, так как они будут
положительными после первой инфекции.При подозрении на ранний врожденный сифилис у новорожденного обследу¬
ют мать и ребенка. Критерием подтвержденного раннего врожденного сифилиса
является обнаружение бледной трепонемы с помощью темнопольной микроско¬
пии, ПИФ или ПЦР в пробах, взятых у ребенка (кожные поражения, слизистая
оболочка носа, пупок), а также из плаценты.При отрицательных результатах темнопольной микроскопии о предполагаемой
врожденной инфекции свидетельствуют положительные результаты трепонемных
тестов на сифилис в крови ребенка (19S-IgM-FTA-abs, IgM-ИФА, IgM-РИФ) и зна¬
чительное (в четыре и более раз) превышение количества антител, выявляемых в
нетрепонемных тестах у ребенка в сравнении с матерью.После окончания лечения больного по поводу сифилиса проводят повторные
серологические исследования (обычно через 3, 6, 9 и 12 мес) в количественном
варианте РМП. Критерием успешно проведенного лечения является наступаю¬
щая в течение этого времени «негативация» нетрепонемного теста или снижение
титров антител не менее чем в 4 раза в сравнении с исходными. Необходимо пом¬
нить, что у пациентов с поздними стадиями сифилиса после проведенного лечения
высокие титры антител могут сохраняться и после 12 мес. Дополнительное лече¬
ние назначают только в случае выявления нетрепонемными тестами сероконвер¬
сии в этот период.По окончании лечения сифилиса пациент должен быть обследован с помощью
количественного нетрепонемного теста. При этом показателем эффективности
терапии считают снижение титра в 4 и более раз в течение 1 года наблюдения. Для
оценки эффективности лечения применяют тест-систему одного и того же произ¬
водителя.Интерпретация результатов серологических тестов на сифилис приведена в
табл. 22-10.список РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫДмитриев Г.А. Сифилис. Дифференциальный клинико-лабораторный диагноз. - М.:
Медицинская книга, 2004. — 363 с.Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention.
Sexually transmitted diseases treatment guidelines // MMWR. - 2006. - Vol. 55. ~ 94 p.Domeika M. Laboratory Diagnostics for Non-Viral Sexually Transmitted Infections in St.
Petersburg, Russia: Current Situation and Hallmarks for Improvements //J. Eur. Acad. Dermatol.
Venereol. (EADV), - 2008. - Vol. 22. - P. 1094-1100.Goh B.T., van Voorst Vader P.C. European guideline for the management of syphilis // Int. J,
STD AIDS. - 2001. - Vol. 12, - Suppi. 3. - P. 14-22.Herring A., Ballard R., Mabey D„ Peeling R.W. WHO^DR Sexually Transmitted Diseases
Diagnostics Initiative. Evaluation of rapid diagnostic tests: syphilis // Nat. Rev. Microbiol. -
2006. - Vol. 4, - N 2. - Suppl, - P. 33-40.Larsen S.A., Pope V., Johnson R.E,, Kennedy E.J. jr. A Manual of Tests for Syphilis. -
Washington: American Health Association, 1998.
шшТаблица 22-10. Интерпретация результатов серологических тестов на сифилисКлиническиепроявлениясифилисаДокументы
0 проведе¬
нии леченияИФА
(суммарные анти¬
тела - 1дМ + 1д6)1дМ-ИФА1дб-ИФАРПГАРМП(РРН)Интерпретация результатов1+-++---Первичный сифилис2--++---Инкубационный период или ЛПР3+-++/-+++Сифилис (стадия в соответствии с клинической картиной)4--++/-+++Скрытый сифилис5-+++/-+++Состояние после проведенного лечения. Серорезистентность?6-++-++-Состояние после проведенного лечения. Дальнейшему лечению и наблюдению
не подлежит7--+++-Скрытый сифилис, возможно, поздний или состояние после перенесенной в
прошлом инфекции8--++++-Скрытый сифилис9-+++++-Реинфекция или состояние вскоре после окончания лечения, или ЛПР на 1дМ10++++/-+++/-Реинфекция или клинический рецидив11-++-+/-+/--Состояние после проведенного лечения. Дальнейшему лечению и наблюдению
не подлежит12--+-*1-+/--Состояние после проведенного лечения или ЛПР13------+ЛПР14--++--+Инкубационный период или ЛПРсл09
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 519Lewis D.A., Young Н. Syphilis // Sex. Transin. Infect. — 2006. — Vol. 82. — Suppl. IV. —
P. 13-15.Palmer H.M., Higgins S.P., Herring A.J., Kingston M.A. Use of PCR in the diagnosis of early
syphilis in the United Kingdom // Sex. Transm, Infect. - 2003. — Vol. 79. — P. 479-483.Mabey D,, Peeling R.W., Ballard R. et al. Prospective, multi-centre clinic-based evaluation of
four rapid diagnostic tests for syphilis // Sex. Transm. Infect. — 2006. - Vol. 82. - Suppi. 5. —
P. 13-16.Ratnam S. The laboratojy diagnosis of syphilis // Can. J. Infect. Dis. Med. Microbial. — 2005. —
Vol. 16.-N1,-P. 45-51.ГОНОКОККТАКСОНОМИЯГонококк (Neisseria gonorrhoeae) — бактерия из рода Neisseria, относящегося к
семейству Neisseriaceae.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАN. gonorrhoeae — грамотрицательный аэробный диплококк, имеет форму кофей¬
ных зерен размером 1,25-1,6x0,7-0,8 мкм, обращенных вогнутой поверхностью
друг к другу. Образует капсулу, проявляющую иммуногенные и антифагоцитарные
свойства.N, gonorrhoeae продуцирует оксидазу и каталазу, в отличие от других представи¬
телей рода Neisseria ферментирует глюкозу и не ферментирует мальтозу, сахарозу
и лактозу. Ферментация глюкозы происходит с образованием кислоты без газа.
Измененные бактерии, в том числе L-формы, не ферментируют углеводы, не про¬
являют протеолитическую активность, не продуцируют аммиак, сероводород и
индол, не вызывают гемолиз на средах, содержащих кровь.N. gonorrhoeae малоустойчива к факторам внешней среды: гибнет при высушива¬
нии, в мыльной воде, под действием антисептиков и антибактериальных препара¬
тов, при нагревании выше 56 “С, под влиянием прямых солнечных лучей.ЭПИДЕМИОЛОГИЯГонорея — антропонозная инфекция. Вне организма человека возбудитель
быстро погибает. Основной путь заражения — половой. Различают генитальную
гонорею (поражение мочеполовых органов), экстрагенитальную (поражение пря¬
мой кишки, глотки, конъюнктивы) и метастатическую (диссеминированную) —
осложнение первых двух вариантов. Гонококковая инфекция может протекать без
осложнений или с осложнениями (табл. 22-11).Таблица 22-11. Основные клинические проявления неосложненной гонококковой инфекцииПациентыКлинические проявленияЖенщиныЦервицит, уретрит, бартолинитМужчиныуретрит, баланолоститМужчины и женщиныФарингит, конъюнктивит, проктитДетиУретрит, вагинит, конъюнктивит, арингит, проктитНоворожденные и младенцыОфтальмия новорожденных, вульвовагинитЗаражение от полового партнера с экстрагенитальной локализацией инфекции
при генитально-оральных контактах приводит к гонорейному тонзиллиту (тон-
зиллофарингиту), при генитально-анальных контактах — к гонорейному прокти¬
ту. Внеполовое заражение возможно при прямом контакте:при попадании или затекании отделяемого в глаза, на слизистую оболочку
полости рта или прямой кишки;при прохождении новорожденного через родовые пути матери.
тШ.Тічшш520 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯУ детей описаны случаи гонококкового менингита, которому нередко предшеству¬
ет конъюнктивит, а также сепсис и артрит новорожденных. В данных случаях зараже¬
ние могло произойти гематогенным путем или через инфицированные околоплодные
воды. Возможен интранатальный путь заражения. Непрямое внеполовое заражение
встречается редко при очень тесном бытовом контакте маленького ребенка с больной
матерью (девочек — через общие с матерью предметы личной гигиены).После выздоровления при новом контакте с источником инфекции возможно
повторное заражение — реинфекция. Помимо реинфекции, может возникать супе¬
ринфекция (обычно при изолированном хроническом очаге).КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИИнкубационный период составляет 1-14 дней. Затем во многих случаях гоно¬
кокковой инфекции возникает развернутая клиническая картина гонорейной
инфекции, основное проявление которой — гнойные выделения. N. gonorrhoeae,
распространяясь по слизистой оболочке (восходящий путь), лимфо- или гемато¬
генно, может вызывать поражение органов малого таза, брющной полости вплоть
до развития гонококкового сепсиса с септицемией и септикопиемией.В соответствии с МКБ-10 гонококковая инфекция встречается в следующих
формах:❖	А54.0 — гонококковая инфекция нижних отделов мочеполового тракта без
абсцедирования парауретральных и придаточных желез (например, уретрит,
цистит, вульвовагинит, цервицит);❖	А54.1 — гонококковая инфекция нижних отделов мочеполового тракта с
абсцедированием парауретральных и придаточных желез (например, гоно¬
кокковый абсцесс больших вестибулярных желез);❖	А54.2 — гонококковый пельвиоперитонит и другая гонококковая инфекция
мочеполовых органов (например, эпидидимит, орхит, простатит, воспали¬
тельные заболевания органов малого таза у женщин);❖	А54.3 — гонококковая инфекция глаз (например, конъюнктивит, иридоци¬
клит, гонококковая офтальмия новорожденных);А54.4 — гонококковая инфекция костно-мыщечной системы (например,
артрит, бурсит, остеомиелит, синовит, теносиновит);❖	А54.5 — гонококковый фарингит;А54.6 — гонококковая инфекция аноректальной области;❖	А54.8 — другие клинические проявления гонококковой инфекции (абсцесс
мозга, эндокардит, менингит, миокардит, перикардит, перитонит, пневмония,
сепсис, поражение кожи).Осложнения гонококковой инфекции многообразны — эпидидимит, аднексит,
артрит и др.В ряде слуачев инфекция N. gonorrhoeae протекает бессимптомно, при этом воз¬
будитель размножается только на поверхности слизистых оболочек, не внедряясь
в ткани и не вызывая воспаления.В табл. 22-12 представлены показания к обследованию на гонококковую инфек¬
цию.Таблица 22-12. Лица, подлежащие обследованию на гонококковую инфекциюПацментыМужчиныПоказания к обследованишЖалобы на гнойные или слизисто-гнойные выделения из уретры, зуд уретры, сим¬
птомы дизурии.Боли 0 области придатка яичка или яичка.Боли и выделения из прямой кишки; признаки проктита.Воспапительные изменения в области наружного отверстия уретры, парауретраль¬
ных ходов.Признаки воспаления предстательной железы
Признаки конъюнктивита
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 521Окончание табл. 22-12ПациентыПоказания к обследованиюЖенщиныВоспалительные заболевания мочеполовой сферы, гнойные или слизисто-гнойные
выделения из влагалища, проявления аднексита, проктита, вульвовагинита, церви-
цита.Жалобы на появившиеся субъективные расстройства в области половых органов
(зуд, жжение при мочеиспускании, боли в низу живота, усиление белей, кровяни¬
стые выделения).Признаки конъюнктивита.Эрозии шейки матки.Бесплодие, привычные выкидыши, преждевременные роды в анамнезе.
Направляемые на прерывание беременности.Беременных обследуют трижды:❖	1-е Обследование — при постановке на учет;О» 2-е обследование — при сроке 27-30 нед;❖	3-е обследование — при сроке 36-40 нед.Вне указанных сроков обследование беременных проводят по показаниям (появле¬
ние выделений из половых путей, субъективные жалобы),
в гинекологических стационарах обследуют всех женщин, не обследованных до
госпитализации, перед назначением антибактериального лечения,В родильных домах обследуют всех рожениц без обменных карт.родильниц с осложненным течением послеродового периода, лучше на 5-6-й деньпосле родов			Новорожденныес гнойным конъюнктивитом или вульвовагинитом.при подтверждении гонококковой этиологии конъюнктивита или вульвовагинита
необходимо обследование родителейДети (девочки)с симптомами вульвовагинита, вагинитаПациентыВступавшие в половой контакт с больным гонореей.Проходящие обследование на другие ИППП.С диагностированным трихомонозом, до и после лечения.Декретированных профессий при проведении обязательных предварительных {при
поступлении на работу) и периодических медицинских осмотров в соответствии с
утвержденными регламентирующими документами.Подвергшиеся сексуальному насилию	Группы риска, в которых целесообразно применение скрининга с использовани¬
ем ДНК-/РНК-методов, включают:❖	лиц, занимающихся коммерческим сексом;❖	мужчин-гомосексуалистов;❖	беременных;❖	лиц моложе 25 лет, имеющих многочисленных половых партнеров.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАДля лабораторной диагностики гонококковой инфекции применяют следующие
методы (табл. 22-13):^ микроскопический (бактериоскопия);❖	культуральный (бактериологический);❖	молекулярно-генетический.Таблица 22-13. Рекомендуемые методы диагностики гонококковой инфекцииОбласть взятия
материалаМетоды диагностикиКомментарииОтделяемое уретры (муж¬
чины),отделяемое эндоцервикса
или уретры (женщины)Бактериосколический с
окраской по ГрамуВыявление грамотрицательных диплококков, рас¬
положенных вне и внутри лейкоцитов, оценка тяже¬
сти воспаления.Не может быть использован в качестве единственно¬
го метода диагностики
522 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯОкончание табл. 22-13Область взятия
материалаМетоды диагностикиКомментарииКультуральный (бакте¬
риологический)Для выделения и идентификации Л/. gor)orrhoeae
и оценки чувствительности к антимикробным пре¬
паратам.Выделение N. gor)orrhoeae при культуральном иссле¬
довании — доказательство гонококковой инфекцииМолекулярно-
генетические (ПЦР)Метод скрининга. При выявлении ДНК/РНК
N. gonorrhoeae требуется подтверждение культураль¬
ным или альтернативным методом амплификации
нуклеиновых кислотМолекулярно-
генетические (NASBA)Метод используют при несовпадении результатов
обследования некультуральными методами (микро¬
скопией, ПЦР)Отделяемое ротоглотки,
отделяемое конъюнктивы,
отделяемое из прямой
кишкиБактериологическийДля выделения и идентификации N. gonorrhoeae
и оценки чувствительности к антимикробным пре¬
паратам.Основной метод диагностикиМолекулярно¬
генетические (ПЦР)Метод скрининга — при выявлении ДНКУРНК
N. gonorrhoeae требуется подтверждение культураль¬
ным или альтернативным методом амплификации
нуклеиновых кислотМоча (мужчины и жен¬
щины)Молекулярно¬
генетические (ПЦР,
МАЗВА)Метод скрининга — при выявлении ДНК/РНК
N. gonorrhoeae требуется исследование клиниче¬
ского материала, полученного у мужчин из уретры,
у женщин — из уретры и цервикального канала,
исследование клинического материала из других
анатомических областейВульва/вагина (девочки),
вагина (женщины после
экстирпации матки)КультуральныйДля выделения и идентификации N. gonorrhoeae
и оценки чувствительности к антимикробным пре¬
паратам.Основной метод диагностики.Бактериосколический метод с окраской по Граму не
применяютКровь при диссемини¬
рованной гонококковой
инфекцииКультуральныйКультуральное исследование крови и клинического
материала, полученного из уро- и экстрагенитальных
анатомических областейМолекулярно-гене-
тические (ПЦР, МАЗВА)При выявлении ДНК/РНК N. gonorrhoeae требуется
подтверждение культуральным методомВзятие материала для исследованийВ табл. 22-14 представлена информация о клиническом материале, направляе¬
мом в лабораторию для исследования на гонококковую инфекцию.Таблица 22-14 Взятие материала для диагностики гонококковой инфекцииТехника взятия
материалаЦервикальный каналДля взятия материала используют хлопковые или дакроновые зонды-тампоны, специ¬
альные щеточки, ложечки Фолькмана. Пациент не должен мочиться в течение 3 ч до
взятия материала. Места взятия образцов зависят от пола, возраста и сексуальной
практики пациента, а также от клинических проявлений инфекции. У женщин мате¬
риал берут из цервикального канала, уретры, реже из влагалища, прямой кишки и
ротоглотки. У мужчин материал берут из уретры, прямой кишки, ротоглотки.
Внимание! Посев на специальную питательную среду для выделения N. gonorrhoeae
следует проводить в момент взятия материала			Перед взятием образцов следует избегать применения антисептиков, анальгетиков
и мазей, так как они могут подавить N. gonorrhoeae, находящиеся в цервикальном
канале. Материал берут при исследовании в зеркалах. Наружный зев очищают от
слизи с помощью ватного шарика, инструмент вводят на глубину 1-2 см в церви¬
кальный канал и берут соскоб
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ §23Окончание табл. 22-14УретраПрямая кишкаКонъюнктиваВлагалищеРотоглоткаПредстательнаяжелезаТранспортировкаОбласть наружного отверстия мочеиспускательного канала очищают с помощью
марлевого тампона или шарика. У мужчин при отсутствии явных выделений слегка
массируют уретру в направлении к наружному отверстию, чтобы получить экссудат.
Если экссудат не получен, вводят уретральный зонд-тампон на глубину 1-2 см,
осторожно вращая, и оставляют зонд-тампон в уретре в течение 5-10 с. У женщин
при отсутствии явных вьщелений массируют уретру, прижимая ее к лонному сочле¬
нению и используя ту же технику, что и для мужчинВводят ватный тампон на глубину 3 см в прямую кишку и вращают его а течение
10 с, чтобы получить экссудат из крипт прямо внутри анального кольца. Если про¬
исходит фекальное загрязнение, тампон следует выбросить и взять другой для
получения пробыПроводят тампоном по внутренней поверхности конъюнктивы нижнего аекаВагинальные пробы следует брать у женщин, перенесших экстирпацию матки, и у
девочек [шдо). У девочек материал берут тампоном из преддверия влагалища.У женщин материал берут при осмотре в зеркалах с передней или боковой стенкиМатериал берут в утреннее время, пациенту не разрешают чистить зубы и прини¬
мать пищу до взятия материала. Материал берут зондом-тампоном из тонзилляр¬
ных крипт и задней стенки глоткиПациент должен помочиться перед взятием материала. Проводят ректальный мас¬
саж предстательной железы от периферии к центру. Собирают на тампон экссудат
из отверстия уретрыОбразцы следует направлять в лабораторию как можно быстрее (непосредственно
после посева). Материал необходимо транспортировать в лабораторию при темпе¬
ратуре не ниже 18 °С. При нарушении правил транспортировки вероятность вьщеле¬
ния N. gonorrhoeae резко снижаетсяПрименение любрикантов, шермицидных препаратов, спринцеваний и гор¬
мональных контрацептивов может отрицательно влиять на жизнеспособность
N. gonorrhoeae, а следовательно, и на результаты бактериологического исследова¬
ния проб, которые берут у пациентов, подозреваемых в заражении этой бактерией.
Тампоны для взятия материала могут обладать антибактериальными свойствами.
Вата, альгинат кальция, ненасыщенные жирные кислоты, находящиеся в ватных
волокнах, хлорсодержащие отбеливатели, смола, входящая в состав деревянных
палочек, клей, используемый для соединения тампонов с крышками, также ток¬
сичны для культуры N. gonorrhoeae, поэтому материал предпочтительнее брать
вискозными зондами-тампонами.Поскольку N. gonorrhoeae чувствительна к воздействию факторов внешней среды
(высушиванию, высокой температуре, кислороду), рекомендуют сразу проводить
посев материала, полученного от пациентов. Если это невозможно, материал
доставляют в лабораторию в транспортной среде (Стюарта, Эймса, Кэри-Блеера),
Взятые пробы в кратчайшие сроки доставляют в лабораторию и инокулируют в
питательные среды; посев должен быть проведен не позднее 24 ч (в исключитель¬
ных случаях — 48 ч) после сбора проб. Транспортировку материала осуществляют
при температуре не ниже 18 °С,БактериоскопияПри использовании микроскопического метода у женщин и детей устанавли¬
вают предварительный диагноз, у мужчин при исследовании проб из уретры —
окончательный.Преимущества бактериоскопического метода:❖	быстрота получения результата, простые условия транспортировки;<> несложность выполнения, низкая стоимоо'ь;❖	высокие чувствительность и специфичность для мазков из уретры мужчин
(референс-метод).шш
{мШШтШ 524 НЕКОТОРЫЕ инфекционные заболеванияЩШШ0Недостатки бактериоскопического метода:❖	субъективность оценки результата (зависит от опыта специалиста, проводя¬
щего микроскопическое исследование, качества взятия материала, окраски,
используемого микроскопа);^ низкая чувствительность для цервикальных проб (фарингеальные и ректаль-
ные пробы не подходят для микроскопического исследования);ШШШ	^ невозможность использования для решения юридических вопросов;^ низкая чувствительность при ранней диагностике, бессимптомном тече-
инфекции, а также при выявлении некоторых ауксотипов и вариантов
N. gonorrhoeae'.Если препарат доставляют в лабораторию нефиксированным, перед окрашива¬
нием его фиксируют 96% этиловым спиртом или троекратным проведением стекла
через пламя горелки.Фиксированные препараты можно хранить при комнатной температуре в тече¬
ние нескольких дней.Препараты окрашивают метиленовым синим и по Граму. Нельзя выносить
заключение по результатам просмотра мазков, окрашенных только одним из этих
методов. Окраска метиленовым синим позволяет сделать заключение о воспале¬
нии и морфологии бактерий.При окраске по Граму возможно выявление грамотрицательных диплококков.
При микроскопии препаратов оценивают наличие эпителия, количество лейко¬
цитов, эритроцитов, морфологию бактерий (лактобацилл, кокков, коккобацилл),
наличие вне- и внутриклеточно расположенных диплококков.Мазки, окрашенные метиленовым синим или по Граму, оценивают при увели¬
чениях в 100 и 1000 раз. При малом увеличении определяют адекватность взя¬
тия из соответствующего анатомического участка, наличие в тестируемой пробе
примесей, а также выбирают участок препарата для дальнейшего исследования.
Микроскопия при большом увеличении позволяет выявить и оценить воспали¬
тельную реакцию и наличие микроорганизмов. При микроскопировании с иммер¬
сией при увеличении в 1000 раз подсчет лейкоцитов следует проводить в 5 полях
зрения. При этом особое внимание уделяют поиску внутриклеточных диплокок¬
ков в лейкоцитах.Диагноз уретрита у мужчин ставят на основании обнаружения 4 лейкоцитов
и более в поле зрения микроскопа при увеличении в 1000 раз. При цервиците
количество полиморфноядерных лейкоцитов повышено (более 10 при увеличе¬
нии в 1000 раз). При клиническом исследовании следует принимать во внимание
наличие или отсутствие слизисто-гнойных цервикальных выделений (зеленовато-
желтого гноя со слизью на белом тампоне).При исследовании вагинального мазка у женщин необходимо помнить, что
количество лейкоцитов зависит от индивидуальных особенностей организма,
срока менструального цикла, наличия внутриматочной спирали. Именно поэтому
для диагностики слизисто-гнойного цервицита рекомендуют использовать оба
критерия, то есть наличие клинических проявлений и воспалительный характер
цервикального мазка.Диагноз уретрита у женщин подтверждается обнаружением более 10 лейкоци¬
тов в поле зрения при увеличении в 1000 раз. Если во влагалище или шейке суще¬
ствует патологический воспалительный процесс, при этом наблюдают обильные
выделения из влагалища, уретральный мазок всегда загрязнен материалом этих
вьщелений (клетками плоского эпителия, лейкоцитами, вагинальной микрофло¬
рой) и не годится для дальнейшей оценки, поскольку не имеет ничего общего с
содержимым уретры.Диагноз гонореи на основании бактериоскопии ставят по 3 признакам возбуди¬
теля болезни:
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 525форме бактериальных клеток;❖	их расположению;❖	окраске.Только наличие всех трех признаков позволяет поставить диагноз (табл. 22-15).
Если же отсутствует хотя бы один из них, переходят к культуральному исследова¬
нию.N, gonorrhoeae — диплококк, имеющий форму кофейного зерна и расположенный
попарно вогнутыми сторонами друг к другу. Решающее значение при микроскопи¬
ческой диагностике гонореи имеет расположение диплококков. N. gonorrhoeae в
основном находятся внутри лейкоцитов и эпителиальных клеток.На основании обнаружения диплококков, расположенных вне клеток, микро¬
скопический диагноз гонореи не может быть поставлен,N. gonorrhoeae окрашивается по Граму в красно-розовый цвет (грамотрицатель¬
ный диплококк), при этом ядра лейкоцитов и эпителиальных клеток окрашивают¬
ся в фиолетовый цвет.Таблица 22-15. Клиническая интерпретация результатов микроскопического исследованияПолИсточникисследуемогоматериалаМикробы и «ключевые»
клеткиЛейкоциты в поле зрения
микроскопа при увеличе¬
нии в 10D0 разДиагностическаягипотезаНе обнаружены5 и болееЗдоровМужскойУретраВнутриклеточные грам-
отрицательные дипло¬
кокки5 и болееГонококковый уретритДругие микроорганизмы5 и болееНегонококковыйуретритЛактобациллыКоличество зависит от
фазы менструального
цикла
Л;Э = 1;1ЗдороваЖенскийВлагалище«Ключевые» клеткиЛ;Э <1:1БактериальныйвагинозCandida spp.Л:Э>1:1Кандидозный вагинитТ. vaginalisЛ:Э >1:1ТрихомонадныйвагинитДругие микроорганизмыЛ:Э>1:1НеспецифическийвагинитВнутриклеточные грамо-
трицательные диплокок¬
ки не обнаружены<10ЗдороваЖенскийЦервикальныйканалВнутриклеточные грамо-
трицательные диллокок-
ки обнаружены10 и болееГонококковый цер-
вицит?Необходимо дальней¬
шее обследованиеДругие микроорганизмы>10Цервицит?Необходимо уточнение
этиологииВнутриклеточные грамо-
трицательные диплокок¬
ки не обнаружены<5ЗдороваЖенскийУретраВнутриклеточные грамо-
трицательные диплокок¬
ки обнаружены>5Гонококковый уретрит?
Необходимо дальней¬
шее обследованиеДругие микроорганизмы>5Уретрит?Необходимо уточнение
этиологиишт.
щшшш526 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯШШИзоляция и идентификация возбудителяшБактериологическое исследование на гонорею проводят по упомянутым выше
показаниям бактериоскопии и в следующих случаях:§ШШШЬ	^ у детей, так как у них встречается большое количество непатогенных нейссе-рий, особенно на слизистой оболочке полости рта, глотки и гениталий:^ У женщин, так как диагностическая чувствительность микроскопии гениталь¬
ных мазков у данной категории пациентов низкая;❖	у больных с бессимптомной и экстрагенитальной гонореей (глотки, прямой
кишки, гонорейным конъюнктивитом);у половых партнеров пациентов с доказанной гонореей (если при микроско¬
пии не удалось выявить возбудителя);пациентов с гонореей после окончания лечения (не ранее 10 дней) и при сня¬
тии с учета;с целью окончательной идентификации нейссерий;❖	для определения чувствительности нейссерий к антибиотикам;❖	при фенотипической или генотипической идентификации N. gonorrhoeae;^ в случае сексуального насилия при запросе следственных органов илисудебно-медицинских экспертов.Ответ по результатам посева при вьщелении чистой культуры и ее идентифика¬
ции выдается через 5 дней после взятия пробы.Принцип метода заключается в выделении чистой культуры N. gonorrhoeae с
использованием специальных питательных сред и последующей идентификацией
возбудителя по биохимическим и морфологическим признакам.Преимущества бактериологического метода:
высокие чувствительность, специфичность;❖	подходит большинство типов образцов;о- позволяет определять чувствительность к антимикробным препаратам.
Недостатки бактериологического метода:^ при нарушении технологии исследования снижаются чувствительность и
специфичность;❖	требует много времени по сравнению с методами, основанными на амплифи¬
кации ДНК/РНК;о- более высокая стоимость по сравнению с микроскопией, однако последняя не
может применяться для идентификации N. gonorrhoeae и постановки оконча¬
тельного диагноза гонореи (см. ниже).Быстрый посев на питательные среды рекомендуют для сокращения экспози¬
ции исследуемого материала с токсическими веществами и предотвращения его
высыхания.N. gonorrhoeae весьма требовательна к составу питательных сред. Она может
расти только на средах, содержащих определенные концентрации аминокислот,
пуринов и пиримидинов, а также усваиваемых бактерией источников энергии
(глюкозы, пирувата или лактата).В качестве селективных компонентов в питательные среды (агар Тайера-
Мартина и др.), предназначенные для изоляции N. gonorrhoeae, добавляют антибак¬
териальные препараты, подавляющие рост посторонней микрофлоры (линкоми¬
цин, ванкомицин, колистин, нистатин, амфотерицин В, триметоприм). Некоторые
ингредиенты питательных сред (крахмал, уголь, кровь, дрожжи) действуют как
адсорбирующие вещества и могут ингибировать рост N. gonorrhoeae.Полученный биологический материал необходимо посеять одновременно на
селективную и неселективную питательные среды, так как некоторые штаммы
ЛГ, gonorrhoeae чувствительны к ванкомицину и триметоприму, входящим в состав
селективной среды. Необходимо использовать эффективные селективные куль-
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 527туральные среды, которые должны быть валидированы и сертифицированы для
культивирования N. gonorrhoeae.Культивирование N. gonorrhoeae проводят на чашках Петри диаметром 90 мм сколичеством среды не менее 20 мл на чашку или диаметром 100 мм с количеством |щ|
среды 25 мл на чашку. Возможно также использование чашек диаметром 40-60 мм
с толщиной агара не менее 4,0-4,5 мм. Недопустимо использовать пробирки с
питательной средой для выделения и идентификации N. gonorrhoeae. После при¬
готовления чаши со средой помещают в термостат при температуре 36±1 °С на 1 ч
для удаления конденсата.Клинический материал от каждого пациента следует засевать на отдельную
чашку Петри. При использовании больших чашек (диаметром 90-100 мм) мате¬
риал из уретры и цервикального канала у женщин можно засевать на одну чашку в
разные ее секторы с соответствующей маркировкой (в этой ситуации удобно при¬
менять многосекционные чашки Петри), Материал из уретры мужчин засевают на
отдельную чашку.Исследуемый материал зондом-тампоном наносят на поверхность, равную при¬
мерно поверхности среды чашки или сектора. Затем стерильной бактериологи¬
ческими петлей или шпателем материал распределяют по оставшейся поверхности
питательной среды штриховыми движениями в 3-4 разных направлениях в целях
создания условий для роста отдельно расположенных колоний N. gonorrhoeae.Чашки немедленно помещают в анаэростат в атмосферу, содержащзто 5±2% угле¬
кислого газа и с влажностью 70%, который ставят в термостат при температуре
36±1°С.Посевы просматривают после 18-24 ч и повторно при отсутствии роста после 48
и 72 ч инкубации. При отсутствии признаков роста через 72 ч инкубации наблю¬
дение прекращают. При выявлении характерных колоний проводят первичную и
видовую идентификацию.Алгоритм культивирования N. gonorrhoeae с использованием коммерческой
культуральной системы:❖	дают агару нагреться до комнатной температуры;о- осторожно, стараясь не повредить слой агара, вынимают его из контейнера;<> наносят клинический материал на агар, вращая щеточку или тампон по
поверхности агара;❖	с помощью стерильного пинцета вынимают таблетку, генерирующую угле¬
кислый газ, и помещают ее в контейнер;❖	влажный воздух внутри контейнера инициирует процесс выделения углекис¬
лого газа, необходимого для успешного роста JV. gonorrhoeae,❖	при внесении агара в контейнер нельзя прикасаться к таблетке;•i- контейнер маркирз^ют;<> инкубируют при температуре 36±1 °С в течение 48 ч.При обнаружении колоний с типичной для гонококков морфологией проводят
предварительную идентификацию. При необходимости проводят подтверждаю¬
щую идентификацию для постановки окончательного диагноза гонореи.Первичную идентификацию нейссерий осуществляют посредством:❖	визуальной оценки вида колоний;❖	микроскопии подозрительных колоний, окрашенных по Граму;^ оксидазного теста.В течение 18-24 ч инкубации N. gonorrhoeae образует выпуклые прозрачные
колонии серо-белого цвета, диаметром 0,5-1,0 мм. При дальнейшей инкубации
колонии увеличиваются в размерах (до 3,0 мм) и уплощаются. Нередко на одной
чашке встречаются колонии различной морфологии.Большие трудности возникают при идентификации N. gonorrhoeae в посе¬
вах из ротоглотки, так как при этом часто наблюдается рост N. meningitidis и
528НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯнепатогенных нейссерий, колонии которых схожи с колониями N, gonorrhoeae.
Колонии N. meningitidis — голубоватые, непатогенных нейссерий — беловатые, а
N. gonorrhoeae — бесцветные, слизистые. Размер, цвет, морфология и консистенция
колоний могут варьировать в зависимости от применяемой питательной среды.
Идентифицировать возбудителя можно только при определении сахаролитиче-
ских свойств или с помощью других тестов, подтверждающих видовую принад¬
лежность микроорганизма.При рутинной диагностике обнаружение оксидазоположительных грамотрица¬
тельных диплококков считают достаточным для подтверждения их принадлеж¬
ности к виду N. gonorrhoeae. Для определения цитохромоксидазы используют один
из рекомендуемых ниже методов.•	На подозрительную колонию наносят каплю оксидазного реагента (1%
водный раствор тетраметил-р-фенилендиамина). Быстрое изменение цвета
реагента (обычно в течение 5-10 с) на сине-фиолетовый и его сохранение
дольше 30 с позволяет считать тест положительным. Реагент, используемый
в оксидазном тесте, убивает М gonorrhoeae, поэтому дальнейшая работа с
исследуемыми колониями невозможна.•	Полоску фильтровальной бумаги смачивают несколькими каплями реагента,
затем на нее бактериологической петлей помещают материал из подозри¬
тельной колонии. Данный способ позволяет сохранить колонию для прове¬
дения дальнейших исследований.•	Существуют коммерческие диски и полоски, содержащие диметил-/?-
фенилендиамина гидрохлорид. Платиновой петлей или стерильной стеклян¬
ной палочкой испытуемую колонию наносят на диск, предварительно слегка
смоченный дистиллированной водой. Темно-лиловое или синее окрашива¬
ние, появляющееся через 10-30 с, позволяет считать тест положительным,
отсутствие изменения цвета — отрицательным.Для учета результатов необходимо соблюдение временного интервала (10-
30 с). Высокая чувствительность оксидазного теста сочетается с низкой специфич¬
ностью. Оксидазоположительными могут быть и другие бактерии, выделяющие
цитохромоксидазу, поэтому необходимо проводить микроскопию оксидазополо¬
жительных колоний, окрашенных по Граму.Для микроскопии берут материал из подозрительной колонии, смешивают с
небольшой каплей 0,9% раствора NaCl на предметном стекле, высушивают на воз¬
духе, фиксируют в пламени и окрашивают по Граму.При исследовании мазков из культур учитывают морфологию, расположение и
окраску N. gonorrhoeae. После 18-24 ч культивирования N. gonorrhoeae представ¬
ляют собой скопления грамотрицательных кокков и диплококков, имеющих более
компактное расположение в центре и разреженное неравномерное распределение
по периферии.Наряду с интенсивно окрашенными в розово-красный цвет кокками встречаются
и бледно окрашенные формы. Более старые культуры (48 ч и более) часто тяжело
интерпретировать, так как отмечается большое количество полностью лизирован-
ных клеток. По мере старения культуры увеличивается полиморфизм бактерий.Для контроля качества окрашивания препарата необходимо оценить изменение
окраски в зависимости от толщины мазка. При правильной окраске наблюдает¬
ся изменение цвета от фиолетового к розовому. В первичной культуре наряду с
N. gonorrhoeae могут встречаться штаммы стафилококков и стрептококков, кото¬
рые легко теряют свою первоначальную фиолетовую окраску при обесцвечивании
спиртом и в процессе окраски по Г^аму приобретают розово-красный цвет. Б этом
случае они ошибочно могут быть приняты за N. gonorrhoeae.Препараты, в которых обнаруживают грамотрицательные кокки и диплококки
из культуры, необходимо хранить в лаборатории в течение 3 мес.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 529При выделении оксидазоположительных грамотрицательных диплокок¬
ков проводят видовую идентификацию иммунологическими и молекулярно'
генетическими методами на основании оценки их ферментативной активности.По ферментативной активности изоляты N. gonorrhoeae можно отличить от дру¬
гих нейссерий и схожих видов бактерий. Ферментативную активность N. gonorrhoeae
изучают с помощью ростозависимых и ростонезависимых тестов. При проведе¬
нии ростозависимых тестов углеводы и другие субстраты (например, феноловый
красный) вводят непосредственно в пигательную среду, на которой осуществля¬
ется рост исследуемой культуры, в настоящее время рекомендуют использование
ростонезависимых тестов, которые дают возможность получить более быстрый (в
течение нескольких часов) и специфический результат, позволяя идентифициро¬
вать исключительно N. gonorrhoeae и исключить другие непатогенные нейссерии.
Ростонезависимые тесты предназначены для определения ферментов N. gonorrhoeae
в концентрированном инокуляте, полу^1енном из чистых колоний.Иммунологические методы диагностики гонореи и идентификации Н. gonorrhoeaeВ настоящее время доступны одноэтапные хроматографические тест-системы
(ИХТ), которые в течение 5-10 мин позволяют идентифицировать N gonorrhoeae
в клиническом материале и суспензии чистой культуры. В первом случае их при¬
меняют для скрининга инфекции; полз^^чение положительного результата со 100%
вероятностью свидетельствует о наличии в тестируемой пробе гонококка. Однако
^гувствительность этих тестов недостаточно высока, чтобы исключить инфек¬
цию при получении отрицательного результата. При идентификации изолятов
N. gonorrhoeae такой недостаток ИХТ практического значения не имеет,РИФ и коагглютинации, а также ИФА проводят только в референс-лабораториях
для внутривидовой идентификации N. gonorrhoeae. Эти иммунологические тесты
высокочувствительны и специфичны, особенно при использовании реагентов,
приготовленных из моноклональных антител (к белку РгоВ наружной мембраны
и другим антигенам N. gonorrhoeae).Молекулярно-генетическая диагностика гонореи и идентификация №. gonorrhoeaeДля обнаружения N. gonorrhoeae в клиническом материале и идентификации ее
изолятов могут быть использованы молекулярно-биологические методы — ПЦР,
Strand Displacement Amplification (SDA), Transcription Mediated Amplification (TMA), a
также методы, основанные на гибридизации ДНК и РНК.Существуют коммерческие тест-системы, позволяющие выявлять N. gonorrhoeae
с высокими чувствительностью и, как правило, специфичностью. Однако резуль¬
таты, полученные при их использовании, следует оценивать с учетом данных
анамнеза, так как в некоторых случаях ДНК N. gonorrhoeae сохраняется в клиниче¬
ском материале в течение 2-3 нед после окончания лечения гонореи.Молекулярно-генетические методы оптимальны для исследования образцов,
полученных неинвазтным способом, однако их чувствительность и специфич¬
ность вариабельны. Чувствительность молекулярно-генетических методов обыч¬
но выше при исследовании мочи мужчин по сравнению с мочой женщин. Наличие
ингибиторов в некоторых пробах, а также отсутствие у ряда штаммов N. gonorrhoeae
нуклеотидной последовательности, являющейся мишенью для молекулярно¬
генетических методов, могут приводить к снижению их чувствительности.Известна недостаточная специфичность некоторых методов гибридизации
ДНК/РНК: они дают большое количество ложноположительных результатов
вследствие перекрестных реакций с условно-патогенными видами нейссерий
{N. îactamica, N. cinerea, N. subfîava).Высокую специфичность проявляет ПЦР, проводимая с праймерами, РогА-
псевдогена N. gonorrhoeae. Она позволяет дифференцировать N. gonorrhoeae и
N. meningitidis.
530 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯДля всех экстрагенитальных образцов или для определения чз'^вствительности к
антимикробным препаратам следует проводить культивирование с последующей
идентификацией нейссерий до вида. Б настоящее время не существует лицензиро¬
ванных молекулярно-биолошческих методов для исследования ректальных или
фарингеальных образцов. Методы гибридизации ДНК/РНК могут быть использо¬
ваны для видовой идентификации N. gonorrhoeae из выделенных культур.Оценка чувствительности изолятов Н. дотггШае к антимикробным препаратамВо всем мире увеличивается резистентность N. gonorrhoeae к большинству анти¬
бактериальных препаратов, что обусловлено мутациями в хромосомах и плазми¬
дах бактерии, определяющих резистентность к пенициллинам и тетрациклинам.
Однако существуют географические различия в резистентности N. gonorrhoeae.
Именно поэтому в алгоритме лечения следует учитывать данные национального
и местного мониторинга чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным пре¬
паратам. Необходимо постоянное проведение эпидемиологических исследований
референс-лабораториями для получения точной региональной и национальной
информации по антибиотикорезистентности гонококков.Показания к определению чувствительности к антимикробным препаратам:❖	эпидемиологическое тестирование, регулярно проводимое референс-
лабораториями, для оценки устойчивости N. gonorrhoeae к антимикробным
препаратам на местном, региональном и национальном уровнях;❖	отсутствие эффекта стандартной антибактериальной терапии при лечении
гонококковой инфекции;❖	мониторинг клинической эффективности стандартных рекомендуемых алго¬
ритмов лечения гонококковой инфекции;•0^ изучение антигонококковой активности новых антимикробных препаратов.Однако определение чувствительности N. gonorrhoeae к антибиотикам не реко¬
мендуют использовать в качестве рутинного исследования при лечении гонореи у
всех пациентов.Определение чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам
проводят с помощью:❖	диско-диффузионного метода;❖	метода серийных разведений в агаре;❖	Е-теста.Качественные тесты — диско-диффузионный и молекулярно-генетические,
позволяющие определить генетические маркеры, кодирующие резистентность
N. gonorrhoeae к определенным классам антибиотиков.Количественные тесты определения чувствительности — метод серийных раз-
ведений в агаре и Е-тест позволяют выявить МПК антибактериального препарата
(наименьшую концентрацию антибиотика, при которой подавляется видимый
рост исследуемого микроорганизма).Минимальный набор антибактериальных препаратов для определения анти-
биотикочувствительности N. gonorrhoeae должен состоять из наиболее характер¬
ных представителей различных групп антибиотиков, применяемых для лечения
гонореи (бензилпенициллин, цефтриаксон, ципрофлоксацин, спектиномицин,
азитромицин, тетрациклин).ФРАНСИСЕЛЛЫТАКСОНОМИЯВозбудитель туляремии — Francisella tularensis — относится к роду Francisella,
семейству FranciseUacae, подклассу у-протеобактерий. В настоящее время род
Francisella представлен двумя видами: Francisella tularensis и Francisella philomiragia.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 531В пределах вида Р. 1и1агет1$ четко выделяются четыре подвида: К пЛагепвгз поуг-с/^а, К Ш1агеп51$ Ыагеп5Ь (неарктический, американский или тип А), ¥. Магеп515 ШМmediasiatica (среднеазиатский), Р. ШЬгепзгз ко1агсИса (голарктический или тип В).Последний подвид включает три биологических варианта: японский биовар, био- ^^|||||
вар I Егу^ (эритромицинчувствительный) и биовар II Егу*^ (эритромицинрезистент- ШШ
ныи).Внутривидовая дифференциация возбудителя туляремии основана на раз ли-
чиях подвидов и биоваров по ряду фенотипических и генотипических признаков:
биохимической активности, составу высших жирных кислот, степени патоген-
ности для человека и животных, чувствительности к некоторым антибиотикам,
а также на особенностях экологии и ареале возбудителя. На территории России
распространен голарктический подвид К Ыагепзгз коЫгсИса, циркуляция которого
осуществляется главным образом грызунами и зайцеобразными, а также иксодо-
выми клещами и через воду.Для подвидов туляремийной бактерии характерны различные ареалы распро¬
странения. Р. Ы1агеп$1$ Ш1агеп515 известен только на территории Северной Америки,Р. Ыагеп$13 Но1агсИса — на территории стран Северного полушария, Р. tularensis
те<Иа51аИса — только в районе поймы рек Чу и Или (Казахстан) и в дельте реки
Амударьи (Узбекистан), К Ыагеп515 novicida — только на территории Северной
Америки.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯР. Ы1агеп$1$ представляет собой мелкие, грамотрицательные, кокковидные (или
эллипсоидные) плеоморфные палочки размером 0,2-0,7х0,2 мкм (для подвидов
ШагепзЬ, коШгсИса, те(11а$1аиса) и0,7х1,7 мкм (для подвидов novidda,philomiragia),
окруженные слизистым (капсульным) веществом, неподвижные, не образующие
спор. Морфология клеток типична в логарифмической фазе роста на жидких
средах, тогда как в инфицированных эукариотических клетках и в стационарной
фазе роста клетки часто вытянуты, могут иметь нитевидную форму, а их размер
не превышает 600 нм в диаметре. Клеточная стенка имеет гладкие контуры. Для
клеточной стенки и капсулоподобного вещества туляремийного микроба харак¬
терно повышенное, по сравнению с другими грамотрицательными бактериями,
содержание липидов.Р. ийагеп$1з относят к факультативным анаэробам. Оптимальный рост наблю¬
дается только в аэробных условиях. Температурный оптимум 36-37 “С. Бактерии
культивируют на сложных агаровых или желточных средах с добавлением ткане¬
вых экстрактов, цистеина, кроличьей дефибринированной крови и других пита¬
тельных веществ. Включение в питательную среду полимиксина В или пеницилли¬
на подавляет рост других микроорганизмов. Возбудитель туляремии не растет на
обычных питательных средах (мясопептонном агаре и бульоне), что служит одним
из признаков при идентификации культуры.Возбудитель туляремии обладает слабой биохимической активностью, фер¬
ментирует до кислоты глюкозу, мальтозу, левулезу и маннозу. Бактерия имеет
следующие ферменты: каталазу, глутаминазу, аспарагиназу, дез- и трансаминазу,
цитруллинуреидазу; индол не образует. Бактерия образует сероводород. Различия
в биохимической активности — один из признаков дифференциации подвидов
туляремийного микроба.Патогенность возбудителя туляремии зависит от его подвидовой принадлеж¬
ности, Наибольшей вирулентностью для человека и кроликов обладает Р. Ыагетгв
виЬзр. tularensis: для кроликов — 10^ м.к.; Р. tularensis 5иЬ5р. коЬгсйса и Р. Ша-
геп5(5 5иЬ$р. тей1а$1аИса характеризуются меньшей вирулентностью для человека и
кроликов: кроликов — более 10* м.к. Возбудитель Р. Ш1агепв(5 novicida обладает
пониженной вирулентностью: для кроликов — более 10^ м.к. Вирулентность
532 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯДЛЯ человека недостаточно известна. Различия в патогенности — один из призна¬
ков дифференциации подвидов туляремийной бактерии.Причина высокой патогенности R tularensis до сих пор неясна. Из числа воз¬
можных факторов вирулентности рассматривают ЛПС, белок размером 23 кДа,
ферменты циклов биосинтеза пуринов, белки теплового шока, белки патогенно-
регуляторные белки и другие факторы.^||	ЛПС туляремийной бактерии — основной иммунодоминантный антиген имишень специфического антительного ответа макроорганизмов на возбудитель.
На выявлении специфических туляремийных антител к эпитопам ЛПС основана
серологическая диагностика туляремии у человека и животных. Структура и анти¬
генная специфичность ЛПС F. tularensis трех основных подвидов (кроме F. tularensis
novicida) идентичны.Возбудитель туляремии проявляет значительную устойчивость во внешней
среде, особенно при низких температурах. Так, в речной воде при температуре1	°С он сохраняется до 9 мес, в замороженной воде (при температуре -5 “С) - до
10,5 мес. В зимний период сохраняет жизнеспособность в воде мелких проточных
водоемов не менее 5 мес. Во влажной почве при температуре 4 “С он сохраняется
свыше 4 мес, а при температуре 23-25 °С — до 2,5 мес. При подсыхании почвы
сроки сохранения бактерий сокращаются до 10 сут. В естественно инфицирован¬
ном иле при температуре 7 “С туляремийные бактерии остаются жизнеспособными
более 3 мес. Длительность инфицирования продуктов питания зависит от темпера¬
туры хранения: в молоке, сливках при температуре 8-15 °С сохраняется до 8 сут,
в замороженном молоке — более 3 мес. В молочнокислых продуктах бактерии
быстро отмирают. В условиях эксперимента туляремийные бактерии сохранялись
на зерне и соломе при температуре -5 “С — до 192 сут, при температуре 8-12 X —
до 56 сут, а при температуре 20-30 °С — 19 сут. В естественных условиях в зара¬
женной ржаной соломе (при эпизоотии на грызунах) наличие жизнеспособных
бактерий отмечалось с января по май, В замороженных трупах грызунов бактерии
сохраняются 4-6 мес, при комнатной температуре отмирание бактерий в них про¬
исходит в течение 5-10 сут. В высушенных шкурках инфицированных водяных
крыс туляремийные бактерии при температуре 15-20 °С могут сохраняться до
20 сут.При вьфаженной устойчивости в условиях низких температур возбудитель
туляремии весьма чувствителен к физическим и химическим факторам (солнеч¬
ным, ультрафиолетовым лучам, ионизирующей радиации, высокой температуре).
Он чувствителен к аминогликозидам, стрептомицину, гентамицину, канамицину,
тетрациклинам, хлорамфениколу и хинонам, но резистентен к пенициллинам,
цефалоспоринам и полимиксину.ЭПИДЕМИОЛОГИЯТуляремия — зоонозная природно-очаговая инфекция, по уровню регистрируе¬
мой заболеваемости занимает относительно скромное место в структуре инфекци¬
онной патологии человека в России. Однако природные очаги туляремии широко
распространены на большей части территории нашей страны и постоянно прояв¬
ляют эпидемиологическую активность.Актуальность проблемы обусловлена различными факторами и особенностями
эпидемиологического проявления инфекции, а также свойствами возбудителя.
Возбудитель туляремии — один из самых инфекционных патогенных микро¬
организмов; его относят к так называемым кротическим биологическим агентам
категории А — потенциальным агентам биологического оружия и биотерроризма.
Возбудитель туляремии обладает высокой патогенностью для человека: 10-50
бактерий при инокуляции или ингаляции приводят к развитию инфекционного
процесса при почти 100% восприимчивости организма человека к инфекции.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 533Заражение человека происходит в результате укусов инфицированными кро¬
вососущими членистоногими (комарами, клещами, слепнями); при употреблении
продуктов питания и воды, зараженной возбудителем; через кожные покровы и
слизистые оболочки при соприкосновении с больными или павшими грызунами и
зайцами, а также при раздавливании инфицированного насекомого на коже; при
вдыхании аэрозоля, образующегося в результате переработки зерна и корнеплодов
(свекла), перекладки сена и соломы, контаминированных выделениями больных
грызунов.КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИИТуляремия — острое лихорадочное заболевание токсико-аллергического, реже
септического характера. Широкий круг животных — источников инфекции и раз¬
нообразие путей заражения людей обусловливают полиморфизм клинических
проявлений этого заболевания.По Международной статистической классификации болезней (10-му пере¬
смотру ВОЗ, 1995) выделяются следующие клинические формы туляремии:
ульцерогландулярная (язвенно-бубонная, кожно-бубонная), гландулярная (бубон¬
ная), окулогландулярная (глазно-бубонная, офтальмическая), легочная (тора¬
кальная), ангинозно-гландулярная (ангинозно-бубонная), желудочно-кишечная
(абдоминальная), генерализованная и неуточненная. В последующем использова¬
на номенклатура клинических форм, указанная в скобках и применяемая в клини¬
ческой практике РФ.По тяжести инфекционного процесса различают легкие, средней тяжести и
тяжелые формы туляремии. По длительности течения различают острую, затяж¬
ную и рецидивирующую формы туляремии.От пути внедрения возбудителя в организм в значительной мере зависит после¬
дующее развитие той или иной клинической картины. Инкубационный период
при туляремии в среднем составляет 3-7 сут с отклонениями в большую или
меньшую сторону (от нескольких часов до 10-15 дней) в зависимости от дозы
заражения и входных ворот инфекции. Для туляремийной инфекции нехарактерно
наличие продромального периода. Независимо от клинической формы туляремия
характеризуется острым (редко постепенным) началом с познабливанием или
потрясающим ознобом и резким повышением температуры тела до 38-40 °С и
выше. Для начального периода заболевания характерны слабость, головная боль,
головокружение, снижение аппетита; язык обложен серовато-белым налетом,
наблюдаются мышечные боли разной локализации, нарушение сна, повышенная
потливость, отставание пульса от температуры (относительная брадикардия), тен¬
денция к снижению артериального давления.Продолжительность начального периода общих клинических проявлений
составляет 2-3 сут, затем обнаруживают признаки той или иной клиниче¬
ской формы. Длительность лихорадочного периода составляет 2-3 нед и более.
Продолжительность этого периода зависит от клинической формы, тяжести забо¬
левания и времени начала специфического лечения.Температура быстро нарастает спустя 2-3 сут после начала болезни.
Продолжительность лихорадки колеблется от 5-7 до 30 сут, в среднем составляя
2-3 нед. Фаза выздоровления сопровождается непостоянным субфебрилитетом.
Продолжительность болезни составляет в среднем от 16 до 30 сут. При преобла¬
дающем поражении лимфатической системы, то есть развитии бубонов, болезнь
затягивается до 2-3 мес. Лимфадениты занимают центральное место в клиниче¬
ской картине туляремии.Поскольку начальный период заболевания не имеет патогномоничных сим¬
птомов, для диагностики туляремии большое значение имеет тщательный эпиде¬
миологический анамнез. Для туляремии характерно отсутствие контагиозности, то
534 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯесть опасности заражения здоровых людей от больного человека. Это позволяет
госпитализировать больного в терапевтическое или другие специализированные
клинические отделения.Язвенно-бубонная форма туляремии. Эта форма туляремии развивается
в результате трансмиссивного заражения — укуса слепня, комара, клеща или
других кровососущих членистоногих. Для язвенно-бубонной формы характер¬
но наличие язвочки, или первичного аффекта, в месте внедрения возбудителя.
Трансмиссивный путь заражения типичен для летнего времени года. Образование
язвочки всегда сопровождается образованием лимфаденита — увеличением и
умеренной болезненностью лимфатических узлов. Локализация увеличенных
лимфатических узлов связана с местом внедрения возбудителя. Эта форма туляре¬
мии протекает обычно легко и значительно реже имеет среднюю степень тяжести.
Длительность заболевания обычно не превышает 2-3 нед, особенно при своевре¬
менном специфическом лечении.Бубонная форма туляремии. Лимфаденит при туляремии, как правило, раз¬
вивается в результате контактного заражения, то есть при обработке и разделке
тушек инфицированных животных. Чаще заражение происходит через кожу рук
с последующим вовлечением в воспалительный процесс группы локтевых и под¬
мышечных лимфатических узлов. Лимфаденит развивается через 2-3 сут после
начала болезни, лимфатические узлы постепенно увеличиваются и достигают мак¬
симальных размеров через 5-8 сут. Исход лимфаденита, как и при других клини¬
ческих формах, может быть различным — от полного рассасывания до нагноения
с последующим самопроизвольным или хирургическим вскрытием, заканчиваю¬
щимся рубцеванием.Глазно-бубонная форма туляремии. Развивается в результате заражения
через слизистую оболочку глаза. Характерен острый специфический конъюнкти¬
вит с сильным слезотечением, выраженной отечностью век, слизисто-гнойным
отделяемым. Специфическое поражение глаз при туляремии, как правило, одно¬
стороннее и сопровождается воспалительной реакцией со стороны предушных и
подчелюстных лимфатических узлов и формированием лимфаденита. Заражение
происходит при умывании водой из инфицированных источников, а также при
случайном внесении инфекции руками в глаз. Эта форма туляремии протекает
довольно тяжело. Длительность заболевания, возможные осложнения и исход
конъюнктивита зависят от своевременно начатого специфического лечения.Легочная форма туляремии (торакальная). Для легочной формы туляре¬
мии характерно развитие первичного воспалительного процесса в легких. Частота
развития пневмонии колеблется от 11 до 30%. Заражение происходит аспираци-
онным путем при обмолотах и других сельскохозяйственных работах (перекладке
ометов, скирд, стогов, подвозке кормов, обслуживании животноводческих ферм),
связанных с вдыханием инфицированной пыли. Такой путь заражения может
наблюдаться на предприятиях по переработке сельскохозяйственных продуктов
при использовании сырья, инфицированного выделениями больных грызунов или
загрязненного их трупами (мельницах, элеваторах, крахмально-паточных заводах
и т.п.). В редких случаях аспирационное заражение туляремией может произойти в
условиях специализированных лабораторий. В результате аспирационного зараже¬
ния патологический процесс развивается непосредственно в легких. Клиническая
картина при этом характеризуется пневмонией (очаговой, сегментарной, лобар-
ной, диссеминированной), бронхопневмонией, бронхитом. В отдельных случаях
процесс может ограничиться трахеитом. Наиболее тяжело протекает пневмониче¬
ский вариант, который характеризуется резким повышением температуры тела до
39-40 '’С. Лихорадочная реакция может протекать в виде двух волн, характерна
одышка. Наблюдается сухой кашель, позже выделяется небольшое количество
слизистой или слизисто-гнойной вязкой мокроты, а в последующем возможно
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 535появление примеси крови. Выражены общая интоксикация, состояние адинамии,
профузные поты, особенно в ночные часы. Нередко больных беспокоят загрудин-
ные боли, связанные с вовлечением в воспалительный процесс трахеобронхиаль¬
ных лимфатических узлов. Наблюдается увеличение печени, селезенки, ослабле¬
ние сердечной деятельности. Б периферической крови отмечается лейкоцитоз, а в
тяжелых случаях — лейкопения и ускорение оседания эритроцитов. Туляремийная
пневмония не характеризуется какими-либо патогномоничными симптомами,
поэтому в начальный период болезни постановка диагноза бывает затруднена.
Заболевание продолжается 4-6 нед и более. Продолжительность болезни зависит
от степени тяжести и сроков начала специфического лечения.Желудочно-кишечная форма туляремии (абдоминальная). Абдоминаль¬
ная форма возникает в результате алиментарного (орального) заражения при
употреблении продуктов, инфицированных выделениями больных грызунов,
недостаточно термически обработанного мяса зайца и при употреблении воды
из инфицированных источников. Развитие абдоминальной туляремии проис¬
ходит при массивной дозе заражения, так как желудочный сок с нормальным или
повышенным содержанием соляной кислоты — мощное препятствие на пути воз¬
будителя туляремии. Симптомы этой клинической формы — высокая температура
тела и боли в животе разной интенсивности и продолжительности. Язык обложен
суховатым серо-белым налетом, характерны тошнота, рвота, проявления общей
интоксикации, вовлечение в процесс мезентериальных лимфатических узлов в
стенке тонкого кишечника. Может наблюдаться увеличение печени и селезенки.
По сравнению с другими клиническими формами туляремии абдоминальная
форма протекает наиболее тяжело. Симптомы этой формы сходны с симптомами
брюшного тифа. Для дифференциальной диагностики решающее значение имеют
данные эпидемиологического анализа.Ангинозно-бубонная форма туляремии. Заражение происходит через рот
при употреблении продуктов, инфицированных больными грызунами, их выде¬
лениями в различных хранилищах, при употреблении воды из инфицированных
источников при попадании в них больных грызунов или их трупов. Ангинозно¬
бубонная форма развивается также при употреблении недостаточно термически
обработанного мяса зайца. Входными воротами инфекции служит слизистая
оболочка миндалин. Для этой формы характерна специфическая ангина, чаще
односторонняя. Одновременно с развитием ангины наблюдается увеличение под¬
челюстных, переднешейных лимфатических узлов. Продолжительность туляре¬
мийной ангины колеблется от 8 до 24 сут.Генерализованная форма туляремии (тифоидная, септическая).
Характеризуется тяжелым течением, развитием общих симптомов болезни.
Выражен токсикоз, иногда отмечаются потеря сознания, бред, адинамия, сильные
головные и мышечные боли. Лихорадка волнообразная, продолжительностью до
3 нед и более. На коже отмечаются высыпания, поражаются сосуды. Сыпь наблю¬
дается в течение 8-12 сут. Высыпание нередко сопровождается припухлостью
суставов (кистей, стоп), болезненностью, отечностью пальцев. Печень и селезенка
увеличены. Выздоровление наступает медленно, возможны рецидивы болезни.
Эта форма заболевания также возникает при внутрилабораторном заражении.ДИАГНОСТИКАтуляремию диагностируют на основании данных эпидемиологического анали¬
за клинического обследования пациента, аллергической пробы и лабораторных
исследований взятых у него материалов. Важную роль играет эпидемиологи¬
ческий анамнез, который должен быть детальным и исчерпывающим. Особое
внимание необходимо уделять информации о вакцинации против туляремии в
прошлом и ее сроках, данным о заражении этой инфекцией ранее, выяснению про-ШШ“'її
536 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯфессиональной занятости и ряду других факторов, которые необходимы для того,
чтобы в каждом отдельном случае подтвердить или исключить диагноз туляремии.
Последнее необходимо для определения тактики лечения, а также проведения
профилактических мероприятий. В случаях с наружно выраженными клиниче-
скими проявлениями (язвенно-бубонная, бубонная, глазно-бубонная, ангинозно-
бубонная формы) и наличием эпидемиологических данных диагноз туляремии не
должен вызывать затруднений. Однако при легочной и абдоминальной формах
туляремии большое значение имеют анамнестические данные и результаты лабо¬
раторного анализа.В ряде случаев при позднем начале лечения заболевание принимает затяжной
характер с возможными рецидивами. Рецидив может наступить как вскоре после
перенесенного заболевания (4-6 мес), так и через 2-6 лет и позже. Чаще всего
рецидив проявляется в виде воспаления лимфатических узлов на месте перво¬
начального регионарного лимфаденита. Воспаление лимфатических узлов при
рецидивах развивается постепенно, без повышения температуры тела и ухудше¬
ния общего состояния больного. Несколько позже развиваются субфебрилитет,
слабость, возможны потливость, нарушение сна. Лимфатические узлы обычно не
достигают таких размеров, как при первичном заболевании, болезненность их не
выражена. Исход лимфаденита при рецидивах может быть таким же, как и при
первичном заболевании, однако нагноение происходит значительно реже.Патогенез туляремийных рецидивов малоизучен, но предполагают, что их раз¬
витие обусловлено длительной персистенцией возбудителя в организме. В каждом
конкретном случае постановки диагноза «рецидив туляремии» необходимо устано¬
вить связь с ранее перенесенным заболеванием и исключить возможность повтор¬
ного заражения, а также проследить за наличием антител в крови и нарастанием их
титра. Имеются также немногочисленные данные, указывающие на возможность
хронического течения туляремии, но этот вопрос нуждается в уточнении.Спорадическая заболеваемость туляремией и полиморфизм клинических
проявлений создают затруднения при постановке диагноза. Особенно сложно
поставить диагноз в начальном периоде болезни, когда ее часто путают с грип¬
пом, брюшным или сыпным тифом, пневмонией и другими заболеваниями. На
более поздних сроках туляремию следует дифференцировать от сибирской язвы,
язвенно-некротической ангины, листериоза, гнойных лимфаденитов и лимфан¬
гоитов, паротита, бубонной формы чумы, бруцеллеза, доброкачественного лим-
форетикулеза и содоку.Бубонную форму туляремии следует отличать от бубонной формы чумы,
при чуме более выражен токсикоз, состояние больного значительно тяжелее.
Туляремийный лимфаденит отличается выраженными контурами, меньшей болез¬
ненностью по сравнению с чумными бубонами, относительно умеренным периа¬
денитом, отсутствием сильных осложнений и благоприятным исходом. Язвы при
туляремии также менее болезненны, чем при чуме. Для туляремийной пневмонии
характерно отсутствие кровавой мокроты (за редким исключением). Больные при
туляремии неконтагиозны.П1ойные банальные лимфадениты (стафилококковые и стрептококковые)
характеризуются резкой болезненностью, ранним нагноением по сравнению с
туляремией, развитием периаденита и лимфангоита. При туберкулезных лимфа¬
денитах начало болезни постепенное, с субфебрильной температурой, лимфати¬
ческие узлы плотные, болезненность их отсутствует. Как правило, лимфатические
узлы не достигают таких размеров, как при туляремии. Туляремийные лимфаде¬
ниты в отличие от лимфаденопатии, наблюдаемой при бруцеллезе, отличаются
строгой привязанностью к входным воротам инфекции.В отличие от дифтерии, ангина при туляремии характеризуется более острым
началом, обычно односторонней локализацией и нечастым распространением
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 537налетов за пределы миндалин. Туляремийные высыпания чаще симметричны и
более полиморфны по сравнению с брюшным или сыпным тифом.При паротите шейные лимфатические узлы увеличены незначительно.
Отмечаются резкая болезненность при надавливании на козелок уха и выражен- ^
ная отечность одной половины лица.Поскольку туляремию относят к острым лихорадочным заболеваниям, может
возникнуть необходимость дифференциальной диагностики с такими болезнями,
как малярия, ку-лихорадка, сепсис, сифилис, туберкулез и паротит.Нужно помнить, что трудность постановки диагноза туляремии на основании
клинических признаков обусловливает необходимость комплексной диагностики
с учетом данных эпидемиологического анализа, клинических наблюдений и лабо¬
раторного исследования.Аллергическая пробау больных туляремией кожно-аллергическая реакция становится положитель¬
ной обычно спустя 3-5 сут после начала болезни, реже — в более поздние сроки и
сохраняется в течение многих лет, поэтому аллергический метод служит основой
для ранней или ретроспективной диагностики. Этот метод строго специфичен.У привитых живой вакциной пациентов также возникает аллергическая реак¬
тивность, но она развивается медленнее (через 10-15 сут после вакцинации).
Аллергический ответ у вакцинированных пациентов сохраняется 5-6 лет, иногда
дольше и может служить методом определения сохранности поствакцинального
иммунитета. Кожную аллергическую реакцию выполняют как накожно, так и вну-
трикожно с соответствующим тулярином.Накожная туляриновая проба проста в исполнении и до сих пор используется
на практике. Однако введение даже убитого антигенного препарата небезопасно
для организма обследуемого, поэтому вместо нее в настоящее время все чаще при¬
меняют лабораторный метод оценки аллергической реактивности.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАЛабораторную диагностику туляремии проводят в соответствии с методиче¬
скими указаниями «Эпидемиологический надзор за туляремией» МУ 3.1.2007-05.Она основана на комплексном подходе, направленном на выявление как живых
бактерий, так и специфических антигенов или специфических антител против
туляремийного микроба. Основную роль играют серологические и аллергические
тесты, а также биопроба на лабораторных животных. Бактериологические методы
не всегда эффективны, что обусловлено особенностями течения инфекции у чело¬
века, малой обсемененностью органов и тканей возбудителем. Выделение возбуди¬
теля наиболее вероятно в течение первых 2-3 нед от начала заболевания и реже в
более поздние сроки. Его эффективность во многом зависит от правильности сбора
и доставки исследуемого материала.Для лабораторной диагностики от подозреваемых в заболевании туляремией
людей берут содержимое бубона, материал из зева, конъюнктивы глаза, отделяе¬
мое язвы, мокроту, кровь и сыворотку крови; постсмертно — увеличенные лимфа¬
тические узлы, измененные участки легких и селезенки.при эпизоотологических исследованиях материалом для лабораторных иссле¬
дований служат:пробы, полученные от диких млекопитающих, или их трупы, остатки трупов,
подснежные гнезда грызунов, продукты жизнедеятельности млекопитаю¬
щих, погадки птиц, помет хищных млекопитающих, а также солому, мякину,
талую воду и другие объекты, загрязненные выделениями грызунов, ВОД}'^ из
естественных водоемов и колодцев, гидробионтов, членистоногих (преиму¬
щественно иксодовых клещей), мелких эктопаразитов, собранных с млеко¬
питающих (вшей, гамазовых и краснотелковых клещей, блох);
Мж538 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ^ кровососущие двукрылые (комары, слепни и др.), отловленные в районах
вспышек болезни;❖	сыворотка крови домашних животных (при соответствующих эпизоотологи-
ческих и эпидемиологических показаниях).Серологическая диагностикаРГА. Самый распространенный и наиболее точный метод серологической диа¬
гностики туляремии. Реакцию применяют для постановки диагноза, а также для
изучения иммунологического состояния пациентов, привитых против туляремии.
при серологической диагностике туляремии у человека диагностическим считают
титр 1:100 и выше. При этом обязательно нужно прослеживать его нарастание.
При отрицательной или сомнительной реакции, а также при положительной
реакции только в низких разведениях сыворотки крови с подозрением в заболе¬
вании туляремией людей рекомендуют повторить исследование сыворотки через
7-10 сут. Нарастание титра сыворотки в 2-4 раза и выше служит основанием для
постановки окончательного диагноза туляремии.РПГА. Чувствительный метод серологической диагностики туляремии. Его
используют как для ранней, так и для ретроспективной диагностики, а также для
определения иммунологического состояния привитых пациентов, у больных
туляремией антитела обычно обнаруживают в конце первой или на второй неделе
заболевания. Через 1-1,5 мес титры РПГА достигают максимальных показате¬
лей - 1:10 000-1:20 ООО и выше, после чего снижаются и на уровне 1:100-1:200
сохраняются длительное время.У привитых пациентов антитела также обнаруживают постоянно, однако в более
низких титрах, не превышающих 1:2000-1:5000 через 1-1,5 мес после вакцинации.
Титры сохраняются в течение нескольких лет на низком уровне — 1:2-1:80.Антигеном для постановки РПГА служит туляремийный эритроцитарный
диагностикум, который представляет собой формалинизированные эритроциты
барана, сенсибилизированные туляремийным антигеном; выпускается в жидком
и сухом виде. Специфичность положительного результата, полученного в РПГА,
может быть проверена с помощью трехкомпонентной реакции торможения пас¬
сивной гемагглютинации.ИФА на твердофазном носителе. Метод используют для диагностики туля¬
ремии у больных и переболевших людей, а также для определения иммунитета
у вакцинированных против туляремии. У больных туляремией специфические
антитела обнаруживают в ИФА через 6-10 сут после начала болезни и достигают
максимальных показателей через 4-7 нед. Позже уровень антител снижается,
однако они сохраняются в крови в течение долгого времени после болезни (более
10 лет). ИФА обеспечивает более раннюю и эффективную по сравнению с РГА и
РПГА иммунологическую диагностику т^шяремии. Титры антител у больных и вак¬
цинированных колеблются в пределах от 1:400 до 1:40 ООО и выше и, как правило,
в 10-20 раз превышают таковые в РГА и РПГА.ИФА проводят в диагностической иммуноферментной тест-системе для опреде¬
ления специфических антител. Выявление последних в сыворотках людей проис¬
ходит за счет специфического взаимодействия антигена туляремийного микроба,
адсорбированного на планшете, с туляремийными антителами в исследуемой
сыворотке. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело» определяют с помо¬
щью антител против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой.В соответствии с назначением тест-система представляет собой набор ингреди¬
ентов для иммуноферментного анализа на твердофазном носителе. Она включает
туляремийный липополисахарид, антитела против иммуноглобулинов человека,
меченных пероксидазой, контрольную положительную, контрольную отрица¬
тельную сыворотку,, набор солей, необходимых для приготовления буферных рас-
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 539творов, субстрат 0-фенилендиамин; твин-20; бычий сывороточный альбумин и
планшеты для ИФА однократного применения.Непрямой метод флюоресцирующих антител (НМФА). При приме¬
нении НМФА для обнаружения антител к туляремийному микробу готовят
мазки 1-2-суточной агаровой культуры возбудителя из взвеси с концентрацией
1x10'’ м.к./мл. При исследовании сыворотки больного с подозрением на туляре- Щ
мию диагностическим считают титр не менее 1:40.	q<Тест оценки аллергической реактивности in vitro. Этот тест заслуживает Щ
внимания как эффективный и безопасный для пациента метод выявления и оцен-
ки гиперчувствительности. Он основан на феномене разрушения лейкоцитов сен¬
сибилизированного организма в присутствии специфического антигена. Реакция
лизиса лейкоцитов становится положительной в первые дни после вакцинации
или заболевания и удерживается в течение многих лет после выздоровления
или вакцинации (у переболевших — до 40 лет), а после вакцинации — не менее
5-7 лет.Изоляция и идентификация возбудителяБактериологические методы диагностики туляремии имеют второстепенное
значение и не всегда эффективны, что определяется особенностями течения
инфекции у человека с малой обсемененностью органов и тканей возбудителем.
Следует учитывать, что не в любом материале, взятом от больного, содержатся
живые туляремийные бактерии. Кроме того, выделение возбудителя наиболее
вероятно в течение первых 2-3 нед от начала заболевания и реже в более поздние
сроки. Именно поэтому лишь в редких случаях удается изолировать возбудителя
туляремии из патологического материала от больных людей (содержимого язвы
на коже, содержимого бубона и т,д.).Кроме того, изоляцию и идентификацию возбудителя туляремии можно про¬
водить только в специально оборудованных режимных лабораториях. Забор и
доставку патологического материала в лабораторию осуществляют с соблюдением
предосторожностей и правил работы с особо опасными инфекциями П группы
патогенности.Биопроба. Биопробу проводят на белых мышах и морских свинках. Это
самый чувствительный метод обнаружения К tularensis в любом исследуемом
материале, поскольку зараженные им лабораторные животные заболевают туля¬
ремией со смертельным исходом при подкожном введении единичных бактерий.Однако при обследовании больных даже биологический метод диагностики не
всегда надежен, так как не в любом образце материала, взятом от больного, име¬
ются жизнеспособные туляремийные бактерии. В отделяемом кожной язвы и в
пунктате из пораженного лимфатического узла возбудитель туляремии может
быть обнаружен в течение 3 нед от начала заболевания, реже позднее. Известны
случаи выделения возбудителя из мокроты, материала, взятого из зева (с мин¬
далин) или конъюнктивы глаза. В редких случаях удается выделить F. tularensis
из крови, но обычно не позднее первой декады болезни. Культуру туляремийных
бактерий от биопробных животных выделяют посевом на специальные пита¬
тельные среды.Изоляция в питательных средах. Для изоляции F. tularensis из патологи¬
ческого материала применяют специальные среды, в том числе свернутую жел¬
точную среду, желточно-агаровую среду, различные варианты агаровых сред,
содержащих цистеин, глюкозу, кровь и другие факторы роста. Скорость роста
бактерии в посевах зависит от ее титра в исследуемом материале: при посеве сла-
боинфицированного материала рост отдельных колоний возможен в отдаленные
сроки, поэтому посевы следует выдерживать в термостате при 37 Т в течение не
менее 10 сут.
540 НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯИдентификация. Идентификацию свежевыделенных туляремийных культур
осуществляют на основании совокупности следующих признаков:о- морфологии клеток и грамотрицательной окраски в мазках;о характера роста на желточной среде или специальных агаровых средах;❖	отсутствия роста на простых мясопептонных средах;■о- агглютинации туляремийной сывороткой;❖	специфического свечения в реакции иммунофлюоресценции;
способности вызывать гибель белых мышей и морских свинок при зараже¬
нии испытуемой культурой с характерными для туляремии патологоана¬
томическими изменениями в органах и выделением культуры возбудителя
туляремии — F. tularensis.В качестве дополнительного метода диагностики туляремии у человека реко¬
мендуют обнаружение специфической ДНК в патологическом материале методом
молекулярной биологии с использованием ПЦР. Перечень тест-систем для диа¬
гностики туляремии представлен в таблице 22-16.Оценка результатов лабораторных методов диагностики туляремии.
Диагноз туляремии устанавливают на основании сопоставления результатов
серологических исследований, представленных обычно реакцией РГА или РПГА.
Другие серологические методы, например ИФА, применяют в сомнительных
случаях, а также для подтверждения достоверности результатов, полученных
другими методами (РГА или РПГА). Выделение возбудителя от больного, как
было указано выше, не всегда эффективно и доступно только в специально осна¬
щенных лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое разрешение на
работу с возбудителем туляремии (II группа патогенности микроорганизмов).
Кожная проба может служить методом ранней диагностики, так как становится
положительной уже через 3-5 сут после начала болезни. Однако в случаях, когда
имеются противопоказания к применению накожного тулярина, прибегают к
методу аллергодиагностики in vitro - реакции лейкоцитолиза. Однако следует
иметь в виду, что методы аллергодиагностики не позволяют дифференцировать
свежие случаи заболевания от анамнестических реакций, поскольку специфиче¬
ская клеточная реактивность у переболевших и привитых пациентов сохраняется
многие годы.в связи с вышесказанным нецелесообразно основывать диагностику туляремии
на результатах алллергических и серологических методов диагностики.Выявление антител к туляремийной бактерии при первом обследовании боль¬
ного в титрах 1:50-1:100 при отсутствии нарастания титра при последующем
исследовании не дает основания для постановки окончательного диагноза туляре¬
мии. Именно поэтому кровь больного исследуют по крайней мере дважды: первый
раз немедленно после обращения больного за медицинской помощью и второй —
спустя неделю после первого исследования. Если при повторном исследовании
антитела не обнаружены или титр сыворотки остался без изменений, кровь боль¬
ного нужно исследовать в третий раз спустя неделю после второго исследования.
Нарастание титра антител в РГА и РПГА подтверждает диагноз туляремии, а его
отсутствие указывает на анамнестический характер реакции.Следует также учитывать, что раннее начало лечения с применением антибио¬
тиков (на первой неделе болезни) приводит к снижению титра антител у пациен¬
тов, вакцинированных против туляремии или ранее перенесших это заболевание.
Основанием для диагностики свежего случая туляремии может служить лишь
выраженное (в 2 раза и более) нарастание титров антител в сыворотке, а также
наличие характерных клинических проявлений болезни.Окончательный диагноз туляремии ставят на основании сопоставления результа¬
тов серо-аллергического обследования больного с клинико-эпидемиологическими
данными.
НЕКОТОРЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ 541Таблица 22-16. Перечень коммерческих претивотуляремийных препаратов и тест-систем, произ¬
водимых в Российской ФедерацииNs9НаименованиеВакцина туляремийная живая
сухаяАллерген туляремийный жидкий
для накожного применения
(тулярин)Диагностикум туляремийный для
объемной и кровяно-капельной
реакций агглютинации, жидкийСыворотка диагностическая туля¬
ремийная сухаяДиагностикум эритроцитарный
туляремийный иммуноглобули¬
новый сухойДиагностикум эритроцитарный
туляремийный антигенный
жидкийИммуноглобулины диагностиче¬
ские флюоресцирующие сухиеНабор реагентов для амплифика¬
ции ДНК F. tularensis holarcticaFT-агарСелективная добавка к ГТ-агаруНазначениеПрофилактика туляремииОпределение иммунологической
структуры населения, про¬
живающего на энзоотичных по
туляремии территорияхИдентификация возбудителя
туляремии; серологическая диа¬
гностика туляремииИдентификация возбудителя
туляремии; компонент диагно¬
стических тест-системВыявление туляремийных анти¬
генов и антител в различных
объектах окружающей средыСерологическая диагностика
туляремии; выявление туляре¬
мийных антигенов и антител в
различных объектах окружаю¬
щей средыИдентификация (индикация)
возбудителя туляремии	Идентификация возбудителя
туляремииДпя культивирования и выделе¬
ния туляремийного микробаДля культивирования и выделе¬
ния туляремийного микробаПроизводительФГУП НПО «Микроген» М3
РФ, г. ОмскТот жеТот жеФГУЗ «Иркутский госу¬
дарственный научно-
исследовательский противо¬
чумный институт Сибири и
Дальнего Востока»Научно-исследовательский
институт микробиологии МО
РФ, г. КировФГУЗ «Ставропольский
науч но-и сследовательски й
противочумный институт»НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи
РАМН (филиал «Медгамал»)Лаборатория «Изоген», РФ,
г. МоскваФГУН ГНЦ ПМБ, г. ОболенскФГУН ГНЦ ПМБ, г. ОболенскСПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫЛабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руковод¬
ство / Под общ. ред. Г.Г. Онищенко, В.Б. Кутырева. — М.: Медицина, 2009. — 472 с.Методические указания. Профилактика инфекционных болезней. Эпидемиологический
надзор за туляремией. МУ 3.1.2007-05. - М.. 2005. - 59 с.Мещерякова И.С. Таксономия, идентификация и иммунологическая диагностика возбу¬
дителя туляремии: Автореф. дис,... д-ра биол. наук. — М., 1990. — 47 с.Мещерякова И.С, Туляремия // Эволюция инфекционных болезней в России в XX веке /
Под общ. ред. В.И. Покровского, Г.Г. Онищенко, Б.Л. Черкасского, - М., 2003. — С. 432-450.Никифоров В.В., Кареткина Г.Н. Туляремия: от открытия до наших дней // Инфекционные
болезни. - 2007. - Т. 5. - № 1. - С. 67-76.Туляремия / Под общ. ред. Н.Г. Олсуфьева, Г.П. Руднева. — М., 1960. — 439 с.Dennis D.T., Inglesby T.V., Henderson D.A. et al. Tularemia as a Biological Weapon //JAMA. -
2001. - Vol. 285. - N 21. - P. 2763-2773.Ellis J., Oyston C.F., Green М., Titball R.W. Tularemia // Clin. Microb. Rev. - 2002, - Vol. 1. -
P. 631-646.Olsu^ev N.G., Meshcheryakova I.S. Subspecific Taxonomy of Francisella tularensis McCoy and
Chapin 1912 // International Journal of Systematic Bacteriology. — 1983. — Vol. 1. — P. 872-
874.Sjostedt F. Family XYII. Frandsellaceae, genus I. francisella. Bergey- s Manual of Systematic
Bacteriology / Brenner D J., ed. — New York, 2003. — P. 201-210.
Глава 23
Вирусологические исследованияЗАДАЧИ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙЛабораторная диагностика вирусных инфекций в последние годы
востребована практически при всех видах медицинской помощи.
Это обусловлено возрастанием удельного веса вирусных инфекций в
общей структуре инфекционной заболеваемости, прогрессом меди¬
цинской вирусологии и быстрым развитием технологий лаборатор¬
ной диагностики и лабораторной техники.Развитие глобального эпидемического процесса показывает, что
заболевания вирусной этиологии эволюционируют быстрее бакте¬
риальных. Б структуре 50 инфекций, возникших на земном шаре в
течение последних 40 лет, ведущее место занимают именно вирус¬
ные инфекции — 60%, тогда как новые заболевания бактериальной,
паразитарной и прионовой этиологии в совокупности составляют
лишь 40%,Риски новых пандемий, которые держат в постоянном напря¬
жении международные и национальные органы здравоохранения,
также обусловлены патогенами вирусной природы (ВИЧ, СПИД,
грипп, SARS и др.). Из социально значимых инфекционных болез¬
ней наименее управляемы и трудноизлечимы заболевания вирусной
этиологии: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты. Основная доля
острых кишечных инфекций неустановленной этиологии обуслов¬
лена вирусными агентами — энтеровирусами, норавирусами, астро¬
вирусами и др. Среди онкогенных инфекционных агентов также
преобладают вирусы — вирусы папилломы человека, гепатитов В и
С, Эпштейна-Барр, HTLV, ВИЧ и др.Большая распространенность и увеличивающееся разнообразие
вирусных заболеваний приводят к тому, что перечень нозологи¬
ческих форм, подлежащих обязательной этиологической расшиф¬
ровке, постоянно расширяется. Поскольку многие из вирусных
инфекций протекают в латентных и атипичных формах (которые
прогностически не менее опасны, чем манифестные), методы спец¬
ифической диагностики вирусных инфекций все шире проникают
в клиническую практику, становятся эффективным инструментом
скрининговых программ и массовых профилактических исследова¬
ний, иными словами, инструментом донозологической диагности¬
ки, а также пре-, пери- и постнатальной диагностики.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 543прогресс медицинской вирусологии приводит к быстрому накоплению и углу- 3
блению знаний о генетике вирусов и патогенезе вирусных инфекций. Работь[ по »
молекулярной генетике вирусов позволили охарактеризовать их внзтривидовую
гетерогенность, определить генотипы, субтипы, клоны, квазивиды, рекомбинанты
и более точные модификации вирусного генома. На базе этих знаний формируется
современная классификация вирусов, которая часто более эффективна, чем клас¬
сификация на основе серотипирования.Накапливаются знания о географическом распределении вирусных геноти¬
пов. Геном вирусов, обладающих потенциалом пандемического распространения,
детально исследуется лабораториями, аккредитованными ВОЗ. Информация и
сами штаммы вирусов доводятся до национального здравоохранения всех стран.Это открывает путь для идентификации вирусов, их географического происхожде¬
ния, путей и факторов передачи.Благодаря тому что геном наиболее актуальных вирусных агентов полностью
расшифрован, появилась возможность индикации и идентификации специфиче¬
ских элементов генома непосредственно в материале от больных, В дополнение к
трудоемким методам выделения вирусов в культурах клеток вирусологи получили
методы прямого определения вирусной ДНК или РНК в первичном патологиче¬
ском материале. Это, в свою очередь, стимулировало разработку целого семейства
диагностических методов на основе молекулярно-биологических подходов.Новые знания о молекулярных маркерах вирусных инфекций, их динамике в тече¬
ние инфекционного процесса дали возможность дифференцировать клинические
фазы заболевания — от латентной стадии до хронической инфекции или состояния
реконвалесценции. Характерные маркеры и их комбинации, а также период их при¬
сутствия в крови пациента могут быть использованы для контроля эффективности
лечения и прогнозирования клинического исхода инфекции. В дополнение к тради¬
ционному критерию острой стадии инфекции по IgM-иммyннoмy ответу найдены и
апробированы подходы, основанные на оценке авидности антител.Присутствие низкоавидных антител в сыворотке крови пациента используют в
качестве показателя острой краснушной, герпетической, ВЭБ-инфекции и др.Технологии специфической диагностики вирусных инфекций развивались
опережающими темпами по сравнению с другими видами лабораторной диагно¬
стики. Массовый характер клинических и скрининговых исследований потребовал
создания быстрых, точных, специфичных тестов высокопроизводительных авто¬
матизированных технических средств для их осуществления. Массовые исследова¬
ния по выявлению ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов стали двигателем общего
прогресса в области иммуноферментного анализа (ИФА) и методов, основанных
на полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время повсеместно идет
оснащение лабораторий современным оборудованием для ИФА и ПЦР. Б перспек¬
тиве — появление технических средств для компьютеризированной биочиповой
диагностики вирусных инфекций.Возрастающее многообразие вирусных инфекций и их клинических форм, с
одной стороны, и широкий круг доступных аналитических тестов — с другой,
усложняют алгоритм диагностики и в то же время позволяют решать постоянно
растущий перечень диагностических задач. Задачи лабораторной диагностики
вирусных инфекций.•	Этиологическая расшифровка инфекционного заболевания.•	Идентификация биологического вида вируса-возбудителя.•	Идентификация генотипа, субтипа, госпитального штамма.•	Идентификация онкогенных генотипов вируса.•	Идентификация вакцинных и «диких» вариантов вируса.•	Дифференциация острой (первичной), ранее перенесенной инфекции или
состояния постпрививочного иммунитета.
щшшт.544 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ•	Дифференциация клинических фаз инфекции.•	Дифференциация обострений и состояния ремиссии.•	Контроль эффективности лечения вирусных инфекций.•	Количественное определение вирусной нагрузки.•	Выявление СПИД-индикаторных и СПИД-ассоциированных инфекций.•	Выявление микст-инфекции.•	Выявление оппортунистических инфекций у пациентов после транспланта¬
ции органов и тканей.•	Прогноз клинического исхода инфекции.Задачи донозологической диагностики вирусных инфекций.•	Скрининговые и профилактические исследования по выявлению ВИЧ-
инфекции:❖	у доноров;
беременных;пациентов с заболеваниями, передающимися половым путем;❖	лиц, употребляющих наркотические вещества;❖	пациентов, обследуемых по клиническим показаниям;❖	лиц, обследуемых при эпидемиологических расследованиях;
лиц, находящихся в местах лишения свободы;❖	медицинского персонала;❖	иностранных граждан.•	Скрининговые и профилактические исследования по выявлению вирусных
гепатитов В и С в группах риска.Задачи лабораторной пре-, пери- и постнатальной диагностики инфекционных
заболеваний.•	Выявление или исключение инфекции TORCH-комплекса, вирусных гепати¬
тов В и С, ВИЧ-инфекции, сифилиса, хламидиоза, гонококковой инфекции,
листериоза у беременных.•	Определение иммунной защищенности беременных против инфекций
TORCH-комплекса (токсоплазмоза, краснухи, цитомегаловирусной инфек¬
ции, герпеса).•	Определение группы риска перинатальной инфекции TORCH-комплекса.•	Выявление внутриутробной инфекции,•	Обоснование медицинских показаний к искусственному прерыванию бере¬
менности в связи с выявлением инфекционных заболеваний беременных и
перинатальной инфекции.•	Выявление рисков интранатального инфицирования плода.•	Дифференциация пери-, интра- и постнатальной инфекции новорожденных.
Многообразие и сложность задач, которые решает современная лабораторнаядиагностика вирусных инфекций, свидетельствуют, что она давно перестала быть
средством подтверждения диагноза. В возрастающем числе случаев она становится
инструментом первичного выявления инфекции (в манифестной ее форме и тем
более в атипичной или субклинической). Более того, лабораторное заключение все
чаще становится основанием для окончательного медицинского диагноза. Следует
подчеркнуть, что в полной мере этого достигают при соблюдении ряда обязатель¬
ных условий, к числу которых относятся:•	интеграция лабораторной диагностики с другими клиническими дисциплинами;•	соблюдение правил организации диагностических лабораторий;•	наличие системы внутрилабораторного и внешнего контроля качества;•	взаимодействие лабораторных служб лечебно-профилактических и санитар¬
но-противоэпидемических учреждений;•	рациональное сочетание классических и новых лабораторных методик;•	готовность лабораторий к модернизации технологий и лабораторной техники.
Рис. 22-1. Характерное расположение М. tuberculosis в препарате в виде жгутов и кос (окраска по
Цилю-Нильсену).Рис. 23-12. Специфическая флюоресценция в клетках, инфицированных вирусами: а — герпеса
II типа; б — гриппа А (НдМ^).А	Б	ВРис. 23-14. Схема гибридизационного анализа в растворе с захватом гибридов «зонд-мишень»
моноклональными антителами: а — после тепловой денатурации образуются гибриды синте¬
тического РНК-зонда (красный) с молекулой-мишенью ДНК (синий); б — РНК-ДНК-гибриды
захватываются сорбированными на твердой фазе анти-РНК-ДНК-Ат; в — добавляют вторые
анти-РНК-ДНК-Ат, меченные щелочной фосфатазой, в реакционный объем приливают субстрат;
образующийся продукт выявляют хемилюминесцентной реакцией (технология 01депе Согр.,
01адеп Согр).
Твердая фаза
с иммобилизованным
зондом 1Мишень(ДНК/РНК)Самогибридизация
^	усиливающих^	зондовУсиливающие зонд 2
зондыРис. 23-18. Схема исследования по методу разветвленной ДНК (пояснения см. в тексте).
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 545ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИИ ПО ДИАГНОСТИКЕ
ВИРУСНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙРабота по лабораторной диагностике инфекционных вирусных заболеваний
подразумевает исследование клинического материала для диагностики, предупре¬
ждения и лечения болезни или оценки состояния здоровья человека, организация
работы лаборатории, осуществляющей лабораторную диагностику инфекционных
вирусных заболеваний, должна обеспечивать биологическ)оо безопасность для
персонала, окружающей среды и пациентов, а также качество исследований и ком¬
петентность персонала.Вопросы биологической безопасности лаборатории регламентируются
Санитарно-эпидемиологическими правилами, устанавливающими требования к
организационным, санитарно-противоэпидемическим мероприятиям при работе
с ПБА. Основные документы, регламентирующие деятельность лабораторий по
показателям безопасности для здоровья, принципам и методикам исследований:•	санитарные нормы (СН), санитарные правила (СП);•	государственные и отраслевые стандарты (ГОСТ, ОСТ);•	методические указания (МУ);•	методические рекомендации;•	методическое письмо;•	инструкции по применению;•	технические условия.Деятельность каждой лаборатории, каждого структурного подразделения
выстраивается в соответствии с используемой группой ПБА: І-ІІ или III-IV.Помещения лаборатории подразделяют на «заразную» зону, в которой осущест¬
вляют манипуляции с ПБА и их хранение, и «чистую», где не проводят работы с
ПБА. На границе «чистой» и «заразной» зон обязательно располагают санитарный
пропускник. Должны быть предприняты меры для предупреждения перекрестного
заражения. Соответствующим образом разделяют секции лаборатории, в которых
осуществляется деятельность несовместимых видов. Вход в лабораторию устраи¬
вают таким способом, чтобы несанкционированный доступ в помещения лабора¬
тории был невозможен. Система связи внутри лаборатории должна соответство¬
вать размеру и сложности устройства помещений и обеспечивать эффективную
передачу сообщений.Отводят специальные помещения и создают условия для хранения проб,
образцов, микроорганизмов (штаммов), реагентов и расходных материалов (цен¬
трализованно и на рабочих местах), регистрационных журналов и результатов
исследований (на бумажных и электронных носителях), необходимых для работы
документов, р>т(оводств, методических рекомендаций и др.Таким образом, устройство отдельных помещений и всей лаборатории в целом,
а также условия работы в лаборатории должны соответствовать выполняемым
задачам с учетом уровня ПБА.В лаборатории должное внимание следует уделять биологической безопасно¬
сти и удалению отходов. В каждой вирусологической лаборатории должна быть
программа производственного контроля, регламентирующая объем и перечень
лабораторных исследований на стерильность воздуха, рабочих поверхностей
и др., характер используемой воды и процедуры для проверки отсутствия отри¬
цательного влияния окружающей среды (температура в помещениях, влажность,
запыленность, электромагнитные помехи, радиация, уровень звука, вибрации
и т.п.) на проведение исследований и работу персонала. При отсутствии возмож¬
ности выполнения указанных исследований собственными силами следует при¬
влекать центры государственного санитарно-эпидемиологического надзора для
осуществления исследований и испытаний. В отношении хранения диагностиче¬
шШ546ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯских препаратов и реагентов в лаборатории необходимо разработать программу
«ХОЛОДОВОЙ цепи».Лабораторное оборудование должно соответствовать целям и задачам, включая
подготовку и обработку проб, спецификацию исследований различными методами и
хранение. При установке и повседневном применении оборудования строго выпол¬
няют эксплуатационные требования в соответствии с техническими паспортами.
Руководство лаборатории разрабатывает программы, обеспечивающие регулярную
поверку приборов, реагентов и аналитических систем, в том числе программы профи¬
лактического обслуживания приборов. Действующие инструкции по использованию
и эксплуатации приборов должны быть легкодоступны персоналу лаборатории.В лаборатории необходимо принимать адекватные меры для обеззараживания
оборудования перед использованием, восстановлением или списанием и после
них. При использовании компьютеров или автоматических анализаторов (для
регистрации, обработки, передачи, хранения или поиска данных исследований)
лаборатория должна обеспечить следующие условия:компьютерные программы, включая встроенные в оборудование, должны
быть документированы и оценены как пригодные к использованию;
необходимо разработать процедуры для защиты сохранности данных в
любое время;компьютерные программы следует эащища1ъ от несанкционированного
доступа, повреждений и разрушений случайными (необученными) лицами.Оборудование, включая компьютеры и компьютерные программы, стандартные
образцы, реагенты и аналитические системы необходимо защищать от поправок и
подделок, которые могут исказить результаты исследований.В лаборатории должна быть разработана и внедрена действенная система
управления качеством лабораторных исследований, включающая внутрилабора-
торный и внешний контроль качества. Все мероприятия по контролю качества
излагают в документе «Руководство по качеству», которое создают в каждой
отдельной лаборатории. Возможно назначение лица, ответственного за качество.
«Руководство по качеству» должно определять политику, процессы, процедуры,
инструкции, корректирующие действия при выявлении исследований, не соответ¬
ствующих требованиям.Принципы применения лабораторных методов
диагностики вирусных инфекцийЦель специфической лабораторной диагностики состоит в определении в кли¬
ническом материале возбудителя заболевания (его антигена, генома) и/или анти¬
тел к возбудителю инфекции в образцах периферической крови. Тестирование воз¬
будителя возможно на ранних сроках заболевания, сразу после инкубационного
периода, в то время как обнаружение антител (в плане диагностики) несколько
отсроченно, так как для их формирования должно пройти определенное время.
Основная задача — ранняя диагностика с целью этиологической расшифровки
заболевания для определения тактики лечения, проведения эпидемиологических
мероприятий в очаге и др. Для достижения указанной цели необходимо знать пато¬
генез заболевания, а также пути передачи инфекции и механизмы заражения.Для обнаружения возбудителя в клиническом материале используют сле¬
дующие методы диагностики:•	электронную микроскопию, позволяющую обнаруживать вирионы возбуди¬
теля в клиническом материале;•	выделение вируса, позволяющее выявить и накопить возбудитель; реализу¬
ется путем заражения клиническим материалом от больного чувствительных
культур клеток, куриных эмбрионов или лабораторных животных;
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 547метод флюоресцирующих антител (МФА), позволяющий напрямую опреде¬
лять возбудителя заболевания в нативных соскобах, секционном материале; Щ
метод иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющий идентифициро- §вать антигены возбудителя в клиническом материале;•	метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий обнаруживать
нуклеиновые кислоты (РНК, ДНК) генома возбудителя в клиническом мате-
риале.Выбор метода выявления возбудителя зависит от целей, задач и оснащенности
лаборатории.Электронная микроскопия имеет бесспорные преимущества в случае «новых»
заболеваний, для лабораторной диагностики которых не разработано диагности¬
ческих средств. Трудоемкий процесс выделения вируса требует больших мате¬
риальных затрат (заражение культуры ткани, куриных эмбрионов, содержание
вивария для заражения лабораторных животных) и времени. Оба указанных
метода, как правило, редко используют в диагностических лабораториях, чаще — в
крупных научно-исследовательских институтах.Такие методы, как МФА, ИФА и ПЦР, широко практикуются в различных диа¬
гностических лабораториях. Применение МФА, достаточно простого и быстрого
диагностического метода, ограничивается лишь методикой забора материала. От
правильного забора материала, который осуществляют, как правило, клиницисты,
зависит достоверность результата, так как для исследования необходимо доста¬
точное количество зараженного эпителия (носоглоточных соскобов при ОРВИ,
урогенитальных соскоблв при ИППП), Метод ИФА, позволяющий обнаружить
антиген, используют для диагностики тех заболеваний, которые характеризу¬
ются накоплением огромного количества возбудителя в клиническом материале
(например, HB5Ag в сыворотке крови или ротавирусов в фекалиях).Наиболее перспективным для определения возбудителя в биологических суб¬
стратах путем обнаружения его генома (РНК, ДНК) считают метод ПЦР, который
в настоящее время широко применяют в диагностике СПИДа, гепатитов, герпети¬
ческих, клещевых инфекций, инфекций, передаваемых половым путем (ИППП),
гриппа А/В, включая высокопатогенный грипп А птиц (Н5/Н7), грипп А свиней
(Hl-swme).Для определения специфических антител, формирующихся в организме
человека в течение болезни в целях элиминации возбудителя, используют раз¬
личные методы:•	эритроцитарные - РТГА, РПГА, РНГА, РСК (определение титров антител);•	иммуноферментного анализа (ИФА) (определение классов антител — IgM,
lgG, ЦА).Классические серологические эритроцитарные методы тестирования антител
базируются на титровании испытуемых сывороток и определении титров антител к
возбудителю в образцах крови пациентов. Лабораторный диагноз ставят на основа¬
нии диагностического титра антител (РСК) или нарастания (сероконверсии) титров
антител (четырехкратного и более) в парных образцах крови (РТГА, РСК и др.).В настоящее время серологические эритроцитарные методы используются все
реже из-за нестандартности основного компонента реакции — эритроцитов крови
различных животных: куриных — для диагностики гриппозной и парагриппозной
инфекций методом РТГА, морской свинки — для диагностики эпидемического
паротита, голубиных — для диагностики краснухи и т.д.По этой причине для получения достоверных результатов следует выполнять
два основных правила:исследовать парные сыворотки антител (забранные в остром периоде
болезни, при первичном обращении пациента и через 10-14 дней от взя¬
тия первого образца крови);
т548 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯобе сыворотки (первую и вторую, взятые с интервалом в две недели)
исследовать одновременно, после поступления в лабораторию второго
образца крови.Несмотря на некоторые недостатки (нестандартность эритроцитов, необхо-
Р димость предварительной обработки сывороток для разрушения неспецифиче-
|||i ских ингибиторов, отсроченность лабораторного диагноза из-за взятия второй
сыворотки, невозможность определения классов выявляемых антител), при ряде
^ Ш'! инфекций, например при диагностике гриппа и ОРВИ. РТГА до сих пор остает-
основным и единственным методом серологической диагностики указанных
заболеваний. Современный ИФА позволяет тестировать антитела лишь к вирусам
гриппа А, не различая их по штаммам, тогда как РТГА раздельно выявляет анти¬
тела к вирусам гриппа А — Aj (H^N^, H^N^, H^N^-swine), A.^ (НзМ^) и др., обнару¬
живает и более тонкие штаммовые различия циркулирующих вирусов гриппа А,
претерпевающих постоянные дрейфовые изменения.Метод ИФА, в отличие от эритроцитарных методов, позволяет определять
классы специфических антител (IgM- и IgG-антитела), что составляет его главное
преимущество и обеспечивает более быструю лабораторную диагностику по одно¬
му образцу крови. Кроме того, все компоненты системы ИФА стандартизованы.
Тем не менее для получения достоверных результатов серологической лаборатор¬
ной диагностики методом ИФА и его разновидностей (ИХЛ, ИХЭЛ) необходимо
придерживаться следующих правил.•	Для вьювления IgM-антител предпочтительнее использовать технологии
^-capture ((1-захвата) в целях снижения риска получения ложноположитель¬
ных результатов,•	Одновременно определять в сыворотке IgG- и IgM-антитела (для достовер¬
ности и снижения количества ложноположительных результатов тестирова¬
ния IgM-антител).•	Применять количественные методы оценки уровня IgG-антител (для выявле¬
ния стадии реактивации инфекционного процесса, особенно при отсутствии
IgM-антител, эффективности поствакцинального иммунитета).•	Использовать тест на авидность IgG-антител (в целях установления давности
заболевания и достоверности определения IgM-антител).ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ВИРУСАХ
Структурные компоненты и химический состав вирусовХарактеристика структуры и химического состава вирусов дана применительно
к вириону как наименьшей составляющей (элементарной частицы) вируса.Простые вирионы представлены двумя составляющими: нуклеиновой кислотой
и белком — капсидом. Термин «капсид» произошел от латинского capsa — «фут¬
ляр». Нуклеиновая кислота простых вирионов включена в капсид и непосред¬
ственно связана с ним, поэтому используют термин «нуклеокапсид». В состав
сложных вирионов, помимо капсида, входит двухслойная оболочка — фрагмент
мембраны клетки-хозяина.В составе вириона присутствует только один тип нуклеиновой кислоты. Вирусный
геном может быть представлен одно- или двухцепочечными (одно- или двухнитевы-
ми) молекулами РНК или ДНК. Нуклеиновые кислоты могут быть как линейными,
так и кольцевыми. Если геном вируса состоит не из одной, а из нескольких молекул
нуклеиновой кислоты, речь идет о сегментированном геноме.в структуре геномной ДНК присутствует несколько участков, функции которых
заключаются в обеспечении репликации, транскрипции и транспорта вирусной
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ §49
ДНК к месту ее упаковки в капсид. Основной репликативной формой ДНК служатдвухцепочечные кольцевые молекулы, что далеко не всегда совпадает с организа- |
цией вирионной ДНК. Вирионная форма ДНК содержит определенные последо¬
вательности, которые в результате рекомбинации переводят ее в репликативную
форму. Генетическая информация может быть сосредоточена последовательно
на одной кодирующей цепочке ДНК или мозаично — на двух цепях молекул.
Протяженность ДНК различных вирусов широко варьирует — от 2-3x10^ до
2,5x10^ нуклеотидных оснований.Размер вирусной РНК редко превышает 2-3x10'^ нуклеотидных основа¬
ний. РНК как носитель генетической информации — уникальная особенность
вирусов. РНК могут обладать положительной (позитивной) полярностью, что
обеспечивает синтез вирусспецифических белков на рибосомах клеток, либо
отрицательной (негативной) полярностью. В первом случае функцию инфор¬
мационной РНК выполняет сам геном вируса. Во втором случае для синтеза
вирусных белков необходимы комплементарные РНК-транскрипты, которые
являются информационными и синтезируются в процессе транскрипции (то
есть синтеза цепочек РНК, комплементарных геномной) при участии вирусной
транскриптазы.Особую группу составляют двухнитевые РНК-содержащие вирусы (семей¬
ство КеопШае), в частности ротавирусы. Вторичная структура РНК этой группы
вирусов представляет собой двойную спираль, основанную на комплементарных
взаимодействиях между цепями. Двухспиральные РНК обладают более высокой
термостабильностью, чем ДНК, что обусловливает устойчивость этой группы
вирусов к температурному фактору. Вторая их особенность — фрагментарность
генома. Так, геном ротавируса содержит 11 фрагментов.Особое положение занимают и представители семейства Ке1(гоут<}ае, имеющие в
составе генома две идентичные молекулы РНК (диплоидный набор).Генетическая информация, заложенная в ДНК или РНК вириона, может обеспе¬
чить формирование как единичных структурных белков (например, трех у вируса
краснухи), так и большого их количества (более 30 у вируса осповакцины).Укладка нуклеиновых кислот в вирионе строго упорядочена и осуществляется
путем образования комплексов с белком капсида.Капсид построен из белковых субъединиц, которые собраны строго определен¬
ным образом в соответствии с относительно простыми геометрическими принци¬
пами. Существуют два типа организации, при которой идентичные асимметричные
субъединицы, такие как молекулы белка, могут соединиться друг с другом таким
образом, чтобы находиться на равном расстоянии от некоего центра: спираль¬
ная сборка или формирование замкнутых белковых оболочек. Соответственно
существуют два вида капсидов: спиральные и замкнутые, то есть изометрические.
Капсиды всех вирусов относятся к одной из этих категорий.Спиральные капсиды без внешней оболочки содержатся в вирионах многих рас¬
тений и некоторых фагов. У представителей ряда семейств РНК-содержащих виру¬
сов позвоночных (РагатгхоуШае, КаЬйоутйае, СогопауШае и др.) спиральный
нуклеокапсид находится в полости, образованной в процессе почкования через
плазматическую мембрану клетки. Эта внешняя оболочка состоит из белковой и
липидной оболочек.Изометрические (квазисферические) капсиды по форме почти идентичны сфере.
Однако при электронной микроскопии показано, что капсиды подобной организа¬
ции представлены не сферой, а правильными многогранниками. Икосаэдрические
капсиды РНК-содержащих вирусов позвоночных семейств Astroviridae, СаНстпйае,
Ыойаутйае, ИсотоуШае не имеют липидной оболочки. У представителей семей¬
ства Щаутйае капсид окружен липидной оболочкой.
550 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯОсобая структура нуклеокапсида отмечается у вириона РНК-содержащего
вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1 (семейство Retroviridae). Он обладает
кубической симметрией и, согласно современным представлениям, имеет форму
усеченного конуса в отличие от других вирусов с икосаэдрической структурой
нуклеокапсида. Для ДНК-содержащих вирусов позвоночных характерен икосаэ-
дрический нуклеокапсид.Вирусспецифические белки разделяют на структурные, входящие в состав
вириона, и неструктурные, принимающие участие в репродукции вируса в инфи¬
цированной клетке, но не входящие в состав зрелого вириона.Структурные белки можно разделить на капсидные и суперкапсидные. Капси-
дные белки простых вирусов имеют низкую молекулярную массу (5-15 кДа) и обра¬
зуют в комплексе с нуклеиновой кислотой нуклеокапсид. Следующая группа капсид-
ных белков — среднего размера полипептиды (молекулярная масса — 15-40 кДа),
которые выполняют защитную для нуклеокапсидного комплекса функцию.Функции поверхностных гликопротеинов различны. Они могут обладать гемаг-
глютинирующей, нейраминидазной активностью, содержат эпитопы, ответствен¬
ные за выработку различных видов антител. Поверхностные белки обеспечивают
адсорбцию вируса на чувствительных клетках, а также участвуют в сборке зрелых
вирионов.Внешние оболочки сложных вирусов позвоночных формируются в составе
плазматической или ядерной мембраны клетки. Для обозначения липопротеино¬
вой оболочки вириона применяют термин «пеплос» (от греч. — «мантия»), а для
поверхностных белков (гликопротеинов), выступающих над поверхностью пепло-
са, — термин «пепломеры». Толщина двухслойной липидной мембраны составляет
в среднем 5-6 нм.Химический состав вириона определяется, помимо н}Т(леиновых кислот и бел¬
ков, наличием в его структуре липидов и полисахаридов. Липиды входят в состав
сложных вирусов, локализуются, как правило, в оболочке. Состав липидов отра¬
жает тип клеток, использованных вирусом для репродукции. В среднем липиды
различных вирионов обеспечивают 15-35% сухого веса вирусной частицы и пред¬
ставлены в основном фосфолипидами (до 60-70%). Основные функции липидной
оболочки — стабилизация структуры вириона и защита от воздействия факторов
внешней среды. Липиды также определяют конформацию поверхностных белков.
Обработка липидсодержащих вирусных суспензий органическими растворителя¬
ми приводит, за некоторым исключением (семейства Poxviridae, Hepadnoviridae), к
потере инфекционности вирусных частиц.Углеводный состав вириона определяется поверхностными гликопротеинами и
представлен преимущественно глюкозой, галактозой, маннозой, N-ацетилнейра-
миновой кислотой, N-ацетилглюкозамином, N-ацетилгалактозамином, фукозой.
Суммарная доля углеводов в вирионах различных вирусов может достигать
10-13%.Принципы классификации, таксономия вирусовПервые попытки классифицировать вирусы предпринимались в 1940-х гг, по
принципам, принятым в микробиологии в отношении бактерий. Эта система ока¬
залась несостоятельной. В 1966 г. на Международном микробиологическом кон¬
грессе в Москве был учрежден Международный комитет по номенклатуре вирусов
(МКНВ). В 1973 г. он был переименован в Международный комитет по таксоно¬
мии вирусов (МКТВ), или International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV).
MKTB кодифицирует и поддерживает систематику вирусов и таксономическую
базу данных — The Universal Virus Database (ICTVdB),
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 551Была выбрана следующая схема подразделения царства вирусов: отдел, класс,
порядок, семейство, подсемейство, род и вид.Порядок в настоящее время является высшим таксоном для вирусов. В поря-
док объединяются семейства, обладающие определенными общими свойства-
ми. Семейства выделяются на основании общности происхождения вирусов.
Таксономическую группу подсемейства можно использовать только при необхо-
димости решения иерархических задач. Семейство (или подсемейство) состоит
из родов. Род — группа родственных видов вирусов, обладающих сходными свой¬
ствами, часто различающихся только по кругу восприимчивых хозяев или уровню
патогенности.Порядок, семейство, подсемейство, род обозначаются одним словом, которое
пишется с заглавной буквы и заканчивается на -virales, -viridae, -virinae и -virus соот¬
ветственно. Наименование вида может содержать несколько слов, но не должно
состоять только из слова virus или названия хозяина. Первое слово названия вида
пишут с заглавной буквы.В основу классификации вирусов положены их морфологические, физико¬
химические, молекулярные и экологические особенности. Главными критериями
служат тип и структура нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), наличие липопро¬
теиновой оболочки, стратегия вирусного генома, размер и морфология вириона,
круг восприимчивых хозяев, географическое распространение, антигенные свой¬
ства.На основании перечисленных признаков до 2007 г. выделяли три порядка —
Caudovirales, Mononegavirales и Nidovirales. В 2008 г. были добавлены порядки
Herpesvirales и Picomavirales, а в 2009 г. — порядок Tymaviräles,Порядок Caudovirales образован тремя семействами: Myoviridae, Podoviridae и
Siphoviridae. Их представители являются патогенами архей и бактерий и содержат
одну молекулу линейной двухнитевой ДНК.Порядок Mononegavirales включает семейства Bornaviridae, Filoviridae,
Paramyxoviridae и Rhabdoviridae. Вирусы этого порядка имеют оболочку и линей¬
ную несегментированную однонитевую РНК негативной полярности.Три семей¬
ства — Coronaviridae, Arteriviridae и Roniviridae — объединены в порядок Nidovirales
и характеризуются линейной несегментированной однонитевой РНК позитивной
полярности. Поражают позвоночных животных.К порядку Herpesvirales относятся семейства Alloherpesviridae, Herpesviridae,
Malacoherpesviridae. Представители порядка содержат единственную несегмен¬
тированную линейную двухнитевую молекулу ДНК и имеют сложное строение
вирусной частицы.Порядок Picomavirales, по данным 2009 г., объединяет пять семейств: Dicistro-
viridae (два рода), Ißaviridae (один род), Mamaviridae (один род), Picornaviridae
(12 родов) и Secoviridae (7 родов). Общими для всех представителей этого порядка
являются отсутствие оболочки и однонитевая РНК позитивной полярности.К
порядку Tymovirales относятся четыре семейства: Alphaflexiviridae (6 родов),
Betaßexiviridae (7 родов), Gammqßexiviridae (один род), Tymoviridae (три рода).
Вирусы этого порядка поражают преимущественно растения.Ни в один из известных порядков не входит 66 семейств вирусов.База данных основных семейств и родов вирусов, представители которых
вызывают заболевания у позвоночных животных и человека, ICTVdB (2009)
(табл. 23-1), обновляется по мере накопления новых сведений, поэтому таксоно¬
мическое положение некоторых вирусов пересматривается. В частности, в 2008 г.
Нитап Coronavirus ОС43 и Human enteric Coronavirus относились к роду Coronavirus,
который в настоящее время получил статус подсемейства.
Таблица 23-1. Основные семейства и роды, представители которых вызывают заболевания у позвоночных животных и человека (ICTVdB, 2009)«лслгоГеномПОрЯАОКСемейство,подсемействоРодВирусы, патогенные для человекаДвухцепочечная ДНКHerpesviralesAlloherpesviridaeIctalurivirusBatrachovirusCyprinivifusIctalurivirusSalmonivirusHerpesviridae AlphaherpesvirinaelltovirusBetaherpesvirinaeGammaherpesvirlnaeUnassignedMaiacoherpesviridaeMardivirusSimplexvirusВирус герпеса человека 1. 2 (ВПП, ВПГ 2)VaricelloviriisHuman herpesvirus 3 (герпес-зостер, вирус герпеса челове-
ка 3)	UnassignedCytomegalovirusHuman herpesvirus 5 (цитомегаловирус, вирус герпеса чело¬
века 5-го типа)MuromegalovirusProboscivirusRoseolovirusHuman herpesvirus 6 (вирус герпеса человека 6-го типа)
Human herpesvirus 7UnassignedLymphocryptovirusHuman herpesvirus 4 (вирус Эпштейна-Барр, или вирус гер¬
песа 4-го типа) 		MacavirusPercavirusRhadinovirusUnassignedUnassignedOstreavirus
продолжение табл. 23-1ГеномПорядокСемейство,подсемействоРодВирусы, патогенные для человекаСемейства, не классифи¬
цированные по порядкуAdenoviridaeAsfarviridaeIridoviridaeMimivifidaePapillomaviridaeAtadenovirusAviadenovirusIchtadenovirusMastadenovirusHuman adenovirus A, B, C, D, E, F (аденовирус человека С,
аденовирусы человека 1-3, 7, 8,12,18, 31-го типов)SiadenovirusAsfivirusCMoriridovirusIridovirusLymphocystivirusMegalocytivirusRanavirusMimivirusAPMVAlphapapillomavirusHuman papillomavirus 2,6, 7,10,16,18,26, 32,34, 53,54,61,71
Human papillomavirus-cand 90BetapapillomavirusHuman papillomavirus 5, 9,49
Human papillomavirus-cand 92, cand 96DeitapapillomavirusEpsilonpapillomavirusEiapapillomavirusGammapapilloma virusHuman papillomavirus 4. 48, 50, 60, 88lotapapillomavirusKappapapillomavirusLambdapapilloma virusMupapillomavirusHuman papillomavirus 1, 63NupapillomavirusHuman papillomavirus 41СЛСПы
слГеномПорядокСемейство,подсемействоРодВирусы, патогенные для человекаPofyomaviridaePoxviridaeChordopQxvirinaeEntomopoxvirinaeOmicronpapillomavirijsPipapiilomavirusThetapapiHomavirusXipapiHomavifusZetapapi\Horr)avirusPolyomavirusHmar\ poiyomavirusAvipoxvir\isCapripoxvirusCervidpoxvtrusLeporipoxvifusMolluscipoxvirusOrthopoxvirusВирус осповакциныParapoxvirusВирус паравакциныSuipoxvirusYatapoxvirusUnassigr\edAlphaentomopoxvimsBetaentomopoxvirusGarr)maentorr)opoxvirusUnassigned
Продолжение табл. 23-1ГеномПорядокСемейство,РодВирусьц патогенные для человекаподсемействоОдноцепочечная ДНКСемейства, не классифи¬
цированные по порядкуCircoviridaeCircovirus-Cyrovirus-ParvoviridaeBrevidensovirus-DensovirínaeDensovirus-Iteraviws-Pefudensovirus-ParvovirmeAmdovirus-Boca virusБокавирусыDependovirus-ErythrovirusHuman parvovirus В1Э {парвовирус В19)Parvovirus-UnassignedAnellovirus-Двухцепочечная ДНК с
обратной транскриптазойСемейства, не классифи¬
цированные по порядкуHepadnaviridaeAvihepadnavirus-OrihohepadnavirusHepatitis В virus (вирус гепатита В человека)Двухцепочечная РНКСемейства, не классифи¬
цированные по порядкуBimaviridaeAquabirnavirus-Avibirnavirus-Blosnavirus-Efítomobirnavirus-ReoviridaeCardoreovirus-SedoreovirinaeMimoreovirus-Orbivirus-Pbytoreovirus-Rotavirus-Seadornavirus-Sслслсл
ГеномПорядокСемейство,РодВирусы, патогенные для человекаподсемействоSpinareovirinaeAquareovirus-Coltivirus-Cypov/rus-Dinomnavirus-Fijivirus-Idnoreovirus-Mycoreovirus-Orthoreovirus-Oryzavirus-Одноцепочечная РНК
негативной полярностиMononegaviralesBomavihdaeBornavirus-FiloviridaeEbolavirusВирус тамды
Вирус Заира (Эбола)MarburgvirvsВирус озера ВикторияParamyxoviridaeAvulavirus-ParamyxovirinaeHenipavirusВирус НинахВирус ХендраMorbillivirusMeasles virus (вирус кори)RespifovirusHuman parainfluenza virus 1 (вирус парагриппа 1-го типа)
Human parainfluenza virus 3 (вирус парагриппа 3-го типа)RubulavirusHuman parainfluenza virus 2Human parainfluenza virus 4 (вирусы парагриппа 2-го и 4-го
типа)Mumps virus (вирус эпидемического паротита)PnemovirinaeMetapneumovirusHuman metapneumovirus (метапневмовирусы)PneumovirusHuman respiratory syncytial virus (респираторно-
синцитиальный вирус человека)слOi
Продолжение табл. 23-1ГеномПорядокСемейство,подсемействоРодВирусы, патогенные для человекаfíhaódoviridaeСемейства, не классифи¬
цированные по порядкуArenaviridaeBunyavirídaeOrfhomyxoviridaeCytorhabdovírusEphemerovirusLyssavirusВирус бешенстваNovirhabdovirusNucleorhabdovirusVesiculovirusUrjassignedArenavirusВирус Мачупо (Боливийская лихорадка)Вирус Хунйн (Аргентинская лихорадка)Вирус Гуанарито (Венесуэльская лихорадка)Вирус Сабиа (Бразильская геморрагическая лихорадка)
Вирус лимфоцитарного хор и оме мин гита 	HantavirusВирус Хантаан, Пуумала, Добрава, Сеул, Син-НомбреNairovirusВирус крымской геморрагической лихорадкиOrttiobunyavirusВирусы Инко, Тягиня, зайца-белякаPI)lebovirusВирус лихорадки долины РифтTospovirusInfluenzavirus АInfluenza А virus (грипп А субтипов НІМІ, Н2М2, H3N2)оооInfluenzavirus ВInfluenza В virus (грипп В)influenzavirus СInfluenza С virus (грипп С)IsavirusThogotovirusЗслслІРІ «ти .
Продолжение табл. 23-1ГеномПорядокСемейство,РодВирусы, патогенные для человекаподсемействоОдноцепочечная РНК с
обратной транскриптазойСемейства, не классифи¬
цированные по порядкуReiroviridaeAlpharetrovirus-OrthoretrovirinaeBetaretrovirus-Deltaretrovirus_EpsilonretrovirusВирус саркомы кожиGammaretrovirus-LentivirusHuman immunodeficiency virus 1Human immunodeficiency virus 2 (вирусы иммунодефицитачеловека 1, 2)SpumaretrovirinaeSpumavirusПенящийся вирус человекаОдноцепочечная РНК
позитивной полярностиNidoviralesArteriviridaeArterivirus-CoronaviridaeCoronavirinaeAlpf^acoronavirusHuman Coronavirus 229Е
Human Coronavirus NL63BetacoronavirusHuman Coronavirus HKU1Gammacoronavirus-TorovirinaeBafinivirus-TorovirusHuman TorovirusRoniviridaeOkavirus-Dicistroviridae-PicomaviralesIfiaviridae-Mamaviridae-PicornaviridaeAptithovirus-Aviliepatovirus-CardiovirusВирус СырдарьиЭнцефаломиокардитслсл00гп1=1
Продолжение табл. 23-1ГеномПорядокСемейство,подсемействоРодВирусы, патогенные для человекаSecovinóaeAstrowióaeСемейства, не классифи¬
цированные по порядкуCaliciviridaeEnterovirusHuman enterovirus A, В, С, D
Human rhinovirus A, ВЕСНО-вирусы (31-й тип, наиболее актуальные — 11-й и 31-й)
Е70, Е71Коксаки А (23 типа, наиболее актуальные — 9,16, 24-й типы)
Коксаки В (6 типов)Полиовирусы
Полиомиелит 1-3-го типаErbovirusHepatovirusHepatitis А virusKobuvirusParechovirusHuman parechovirus (парэховирус человека)SapeiovirusSenecavlrusTeschovirusTremovirusAvastrovirusMamastrovirusHuman astrovirus (5 типов астра в и руса человека)LagovirusNebovirusNorovirusSapovirusVesivirusНорфолк (4 типа)Вслсл
Окончание табл. 23-1сло>ГеномПорядокСемейство,РодВирусы, патогенные для человекаподсемействоFlaviviiidaeFlavivirusВирус геморрагической лихорадки АлхурмаВирус желтой лихорадкиВирус киассанурской лесной болезниВирус Денге 4-го типаВирус омской геморрагической лихорадкиHepacivirusHepatitis С virus (гепатит С)Pestivirus-NodaviridaeAlphanodavirus-Betanodavirus-ТодатібаеAiphavirusВирус Карельской лихорадки
Вирус Чикунгунья
Semliki Forest virusRübiviwsRubella virus (вирус краснухи)HepeviridaeHepevirusHepatitis E virus (гепатит E)UnassignedDeltavirusHepatitis delta virus (дельтавирус)Sо
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 561Кроме крупных таксономических категорий, используют понятия «штамм»,
«изолят», свариант», «кластер» для разделения «особей» внутри вида. Для удоб¬
ства систематизации каждому вирусу присваивают цифровой код, состоящий из8	групп по одной, две или по три цифры в каждой. Первая группа обозначает поря¬
док, вторая — семейство, третья — подсемейство, четвертая — род, пятая — вид,
шестая — подвид, седьмая — серотип, восьмая группа цифр соответствует номеру
штамма или изолята (табл. 23-2).Таблица 23-2. Пример присвоения цифрового кода, по данным ICTVdB (2006)Influenza А virus, A/Puerto Ríco/g/34 (H^NJ isolate	Порядок00.Семейство00.046.OrthomyxovirídaeПодсемейство00.046.0.Род00.046.0.01.Influenzavirus AВид00.046.0.01.001.Influenza A virusПодвид00.046.0.01.001.00.Серотип00.046.0.01.001.00.001.М.Штамм или изолят00.046,0.01.001.00.001.001.A/Puerto Rico/8/34КЛАССИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ
И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕВ современной вирусологии животные продолжают играть важную роль при
изучении вопросов патогенеза и патоморфологии экспериментальных вирусных
инфекций, становления и развития иммунитета, а также при выделении и инди¬
кации вирусов. Для экспериментальных целей используют, как правило, чисто¬
породные линии мышей и других животных, свободных от многих латентных
инфекций и вь[сокочувствительных к экспериментальному заражению различны¬
ми вирусами.Латентньге инфекции, которые могут быть распространены среди лаборатор¬
ных животных, характеризуются тем, что возбудитель не проявляет себя кли¬
нически в привычных для животного условиях содержания, в случае снижения
резистентности организма возбудитель начинает активно размножаться, вызывая
манифестную форму заболевания. Заражение животных при вирусологических
исследованиях — тот стрессовый фактор, который способен вызвать переход
латентной инфекции в острую.в практике работы КДЛ манипуляции с лабораторными животными в настоя¬
щее время применяют крайне редко, если речь не идет о специализированных
лабораториях по диагностике высокопатогенных зооантропонозных инфекций,
например противочумных станциях или антирабических лабораториях.РАЗВИВАЮЩИЕСЯ КУРИНЫЕ ЭМБРИОНЫКуриные эмбрионы как система для культивирования вирусов известны
с 30-х гг. XX в. и до настоящего времени использ>тотся для первичного выделения
вирусов от больных и из объектов внешней среды для последующего культивиро¬
вания вирусов в лаборатории, идентификации вирусов и антител, приготовления
вакцин и диагностикумов.Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах имеет ряд преимуществ
по сравнению с культивированием на лабораторных животных. Данный метод
позволяет избежать трудностей, связанных с возможным спонтанным инфици-
щМШШг! 562 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ^ИШщ! рованием животных рядом вирусных инфекций. Кроме того, при использовании
куриных эмбрионов получают значительно большее количество вируса, чем от
1|Щ8ж1 лабораторных животных; потери эмбрионов вследствие гибели при заражении
незначительны и сводятся к минимуму при соблюдении правил асептики, опреде¬
ленном навыке работы и соблюдении условий инкубирования. Скорлупа и под-
скорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от микробного заражения
извне. Развивающиеся эмбрионы высокочувствительны к большому количеству
вирусов. Кроме того, куриные эмбрионы — легкодоступный материал в связи с
широким развитием промышленного птицеводства, не требуют ухода и кормления
в лабораторных условиях.Заражение эмбрионов проводят в асептических условиях. Скорлупу над воздуш¬
ным пространством обрабатывают йодированным спиртом или фламбируют, то
есть обрабатывают смоченным в спирте и горящим ватным тампоном. Пользуются
стерилизованными инструментами.Существуют различные способы заражения куриных эмбрионов. Чаще всего
материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, хорионаллантоиснуго
оболочку, реже — в желточный мешок. Выбор способа заражения, температура
и сроки инкубирования зависят от биологических особенностей вируса и цели
исследования. Вводят 0,1-0,2 мл инфекционного материала. Независимо от спо¬
соба заражения яйца помещают в специальные подставки тупым концом вверх и
ставят в термостат для дальнейшего культивирования.О наличии вируса в аллантоисной и амниотической жидкостях, полученных из
зараженных эмбрионов, судят по реакции гемагглютинации, которую ставят либо
капельным методом на стекле, либо титрованием путем двукратных разведений
вируссодержащей жидкости. Индикатором наличия вирусов в хорионаллантоис-
ной и амниотической оболочках служат фокусные специфические поражения или
выявление гемагглютинирующего антигена.В случае положительных результатов проводят серологическое типирование
выделенного вируса с помощью РТГА, нейтрализации в куриных эмбрионах или
РСК. При получении небольшого количества вируса выполняют дополнительные
его пассажи в тех же условиях с последующей индикацией. Если после трех после¬
дующих пассажей в эмбрионах вирус в исследуемых материалах не обнаруживает¬
ся, результат считают отрицательным.КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫОткрытие в конце 1940-х гг. Дж. Эндерсом, Т. Уэллером, Ф. Роббинсом воз¬
можности культивировать живые клетки вне организма и поддерживать в них
репродукцию вируса полиомиелита стало подлинно революционным собьггием
для науки в целом и для вирусологии в частности. Культура клеток до сих пор счи¬
тается наиболее совершенной лабораторной системой, предназначенной для куль¬
тивирования вирусов. Чаще всего в вирусологической практике клеточные куль¬
туры используют для обнаружения вирусов и их выделения из патологического
материала, а также для изготовления вакцин и диагностикумов, культивирования
эталонных и вновь выделенных вирусных штаммов в лабораториях и музейных
коллекциях, титрования вирусного материала и в качестве тест-объекта в реакции
нейтрализации.Для нормального существования и развития клеток вне организма требуются
сложный комплекс физико-химических факторов и вьшолнение ряда условий.
Первое условие — строгое соблюдение стерильности при работе, поскольку пита¬
тельные среды, используемые для культивирования клеток, служат таким же
питательным субстратом для различных микроорганизмов. Вследствие высокой
чувствительности клеток к солям тяжелых металлов и остаткам моющих средств
особое внимание следует уделять качеству воды и всех ингредиентов, составляю-
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 563щих основу солевых растворов и питательных сред, а также качеству и способам
обработки посуды, употребляемой для выращивания клеток.Растворы. Наиболее широко известные и чаще всего применяемые в работе с
клеточными культурами растворы Хенкса и Эрла готовят на бидистиллированной
воде с добавлением различных солей и глюкозы. Ряд государственных и частных
предприятий производит готовые стерильные растворы для работы с культурами
клеток.Сбалансированные солевые растворы обеспечивают сохранение pH, осмотиче¬
ского давления, концентрацию необходимых минеральных веществ. Кроме того,
их используют при приготовлении диспергирующих растворов для снятия клеток
с поверхности, на которой они культивируются:•	0,25% раствор трипсина на фосфатном буфере;•	раствор Версена - 0,02% раствор натриевой соли этилендиаминтетрауксус-
ной кислоты на растворе Хенкса.Питательные среды. Естественные питательные среды, состоящие из смеси
солевых растворов Хенкса или Эрла, сыворотки, гидролизатов лактальбумина и
крови животных и т.д., в настоящее время используются редко из-за невозмож¬
ности точно контролировать количество и качество их компонентов.в период 1950-1960-х гг. основные усилия исследователей были сосредото¬
чены на создании питательных сред и методик перевода клеток из организма в
культуру. Основная проблема заключалась в поиске факторов культивирования,
обеспечивающих жизнеспособность клеток и поддержание их пролиферативной
активности in vitro. Этот трудный и принципиально важный этап завершился в
1955 г. созданием первых синтетических питательных сред Игла и № 199. Эти
среды имели химически точную композицию, включающую более 60 компонен¬
тов (20 аминокислот, 17 витаминов, компоненты нуклеиновых кислот, источники
липидов, гормоны, минеральные соли и другие вещества). С добавлением 5-10%
сыворотки крови эти среды обеспечивали эффективный рост многих клеточных
культур. Состав этих сред оказался настолько удачно и точно подобранным, что
среды Игла и № 199 широко используют и в настоящее время.Наиболее часто применяемые питательные среды для культур клеток: основ¬
ная среда Игла — ВМЕ, минимальная среда Игла — МЕМ и MEMS, среда Игла
в модификации Далбекко — DMEM, среда № 199, среда RPMI 1640 и др. Во все
питательные среды и некоторые растворы добавляют индикатор pH феноловый
красный в концентрации, не оказывающей токсичного действия на клетки и виру¬
сы, но позволяющей определить факт закисления среды продуктами метаболизма
клеток и необходимость замены ее на свежую. Для предотвращения появления и
развития посторонней микрофлоры в среды добавляют антибиотики: пенициллин
и стрептомицин по 100 ЕД/мл или канамицин по 200 мкг/мл. Для предотвращения
роста плесени рекомендуют натриевую соль нистатина — 100 мкг/мл среды.Для культивирования клеток, особенно в первые дни роста, используют
ростовые питательные среды, содержащие 2-10% сыворотки крови животных
(чаще всего крупного рогатого скота). Это обязательный компонент ростовых
питательных сред, так как в состав сыворотки входит целый набор биологически
активных веществ, необходимых для роста клеток in vitro. Так, фракция альбу¬
минов и фетуин способствуют прикреплению клеток к поверхности стекла или
пластика. Кроме того, в сыворотке содержатся разнообразные ростовые факто¬
ры, способствующие активному распластыванию, росту и размножению клеток.
Особенно ценной добавкой к питательным средам служит сыворотка эмбрионов
коров и других животных, как правило, не содержащая противовирусных анти¬
тел в отличие от сывороток крови взрослых животных. Необходим строгий
контроль сывороток на стерильность и токсические свойства по отношению к
клеточным культурам.шшш
'564 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯв вирусологической практике применяют следующие виды культуры клеток:
первично-трипсинизированные;^ диплоидные;
перевиваемые.Первично-трипсинизированные культуры клетокИх можно получить практически из любого органа и ткани животных и птиц
(кур, кроликов, собак, коров, овец, свиней, хомяков, мышей, морских свинок, обе¬
зьян), а также из извлеченных у человека при операции. Чаще всего используют
почки, легкое, кожу, тестикулы, тимус и др. Поскольку способность к размно¬
жению клеток in vitro зависит от степени дифференциации тканей, лучше брать
эмбриональные органы. Клеточные культуры могут быть получены из нормаль¬
ных и злокачественно перерожденных тканей, состоящих из эпителиальных и
фибробластных, а также смешанных типов клеток. Выбор ткани для конкретно¬
го вирусологического исследования определяется чувствительностью ее клеток
in vitro к тестируемому вирусу.Для получения первичных клеток органы не позднее 3-4 ч после извлечения в
асептических условиях трипсинизируют.Куриные эмбрионы должны быть 7-10-дневного возраста, при использо¬
вании эмбрионов от лабораторных животных асептически извлекают матку.
Органы крупных взрослых животных берут при их забое на мясокомбинатах.
Обработанные дезинфицирующими растворами или спиртом, промытые физио¬
логическим раствором с большим количеством антибиотиков органы помещают в
чашки Петри для последующего диспергирования. Наиболее часто применяемый
метод диспергирования тканей — их обработка протеолитическими ферментами
(трипсином, панкреатином, коллагеназой и др.). Обычно используют метод трип-
синизации тканей.Ткань, подготовленную для трипсинизации, тщательно измельчают ножница¬
ми, переносят в стерильную колбу, отмывают физиологическим раствором или
буферным раствором для трипсинизации и заливают диспергирующим раствором
(например, подогретой до 37 X смесью 0,15% раствора трипсина и равных объе¬
мов фосфатного буфера с 0,02% раствором Версена; pH = 7,2-ь7,4). Трипсинизацию
проводят на магнитной мешалке. Через каждые 10-15 мин клеточную взвесь сли¬
вают и помещают в холодильник, а оставшуюся ткань заливают новой порцией
диспергирующего раствора. Процедуру повторяют до (юлного истощения измель¬
ченной ткани. Полученные сливы объединяют, фильтруют и центрифугируют при
600 об,/мин в течение 20 мин.Надосадочную жидкость сливают, осадок тщательно пипетируют в небольшой
порции ростовой среды, подсчитывают количество клеток в полученной взвеси в
камере Горяева. Для этого к 1 мл взвеси клеток в питательной среде добавляют
равный объем 0,1% раствора кристаллического фиолетового, приготовленного
на 0,1 М растворе лимонной кислоты, перемешивают. Подсчитывают количество
живых клеток (имеющих ядро и неповрежденную цитоплазму, вследствие чего они
не окрашиваются красителем) в двух камерах. Определяют среднее количество
клеток. Количество клеток в 1 мл (X) рассчитывают по формуле:Х= (Ах 2x1000)/0,9,где А — среднее количество клеток в камере.После подсчета количества клеток взвесь разводят ростовой питательной средой
до концентрации 200 000-300 ООО клеток в 1 мл и разливают в пробирки, матрасы
или роллерные флаконы. Значительная часть жизнеспособных клеток, получен¬
ных в результате ферментативного диспергирования, прикрепляется к субстрату
и начинает размножаться. На этом этапе культивируемые клетки определяются
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 5$5как первичные. В своем развитии клеточные культуры проходят фазы адаптации,
логарифмического роста, стационарную и старения (постепенной гибели клеток).В процессе роста и размножения клетки полностью покрывают ростовую
поверхность сосуда и формируют монослой. Он может быть однослойным, если
клетки при тесном соприкосновении друг с другом прекращают делиться (эффект
контактной ингибиции), или не строго многослойным, состоящим из нескольких
слоев, если клетки получены из злокачественно трансформированных тканей, для
которых не имеет критического значения феномен контактной ингибиции. Как
правило, монослой формируется через 3-5 дней, клетки сохраняют жизнеспособ¬
ность в течение 7-21 дня в зависимости от вида ткани и ряда других факторов.
Питательную среду меняют по мере ее загрязнения продуктами обмена веществ,
которые вызывают изменение pH и отрицательно влияют на нормальный метабо¬
лизм клеток, что может привести к их гибели. Для культивирования вируса исполь¬
зуют молодые клеточные культуры, только что сформировавшие монослой.Диплоидные культуры клетокОсновные сведения о специфике цитопатического действия многих вирусов
были получены на первично-трипсинизированных культурах. По мере расши¬
рения их ассортимента и внедрения в практику стали очевидными недостатки
первичных культур: трудоемкость изготовления, нестандартность различных
партий первичных клеток к тому или иному вирусу, относительно высокая частота
контаминации исходного материала. Первично-трипсинизированные культуры
не пересеваются и не масштабируются, это модели одноразового использования с
проблемами сохранения и транспортировки.При субкультивировании и пассировании клеток оказалось возможным в соот¬
ветствующих условиях формировать популяции фибробластоподобных клеток,
размножающихся с большой скоростью и сохраняющих более чем в 75% попу¬
ляции исходный набор хромосом. Эти клеточные культуры получили название
диплоидных клеточных культур. Как правило, это культуры фибробластов из сое¬
динительной ткани. Стали возможными их масштабирование, криоконсервирова¬
ние и контроль на отсутствие экзогенных контаминантов до начала вирусологи¬
ческих экспериментов. Существенный недостаток этих моделей — ограниченный
срок жизни. Количество генераций зависит от вида животного, из которого была
получена диплоидная клеточная линия. Например, для фибробластов эмбриона
человека срок жизни составляет 50±10 пассажей. Это значение может существенно
варьировать как в одну, так и в другую сторону у диплоидных линий от разных
эмбрионов.Широкое распространение в медико-биологических исследованиях и практиче¬
ской вирусологии получили уникальные по своим свойствам диплоидные линии
фибробластов легкого эмбриона человека \Vi-38 (1964) и МКС-5. Эти культуры
характеризуются широким спектром чувствительности к различным вирусам и
высокой пролиферативной активностью (табл. 23-3,23-4). Благодаря своевремен¬
ному созданию и сохранению посевных криобанков эти линии все еще остаются
актуальными и эффективными клеточными моделями, несмотря на то, что в соот¬
ветствии со своим происхождением они имеют ограниченный срок жизни.Таблица 23-3. Перечень клеточных линий согласно видовому и тканевому происхождениюМе п/пЛинияВидовое и тканевое происхождение1А-204Человек, рабдомиосаркома2А 549Человек, карцинома легких3АіехапсіегЧеловек, карцинома печени4ДиВЕК 11 Бык, почка
566 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯПродолжение табл. 23-3ШШN5 п/пЛинияВидовое и тканевое лроисхаждение5В 95-8Мармозетка, трансформированные вирусом Зпштейна-Барр
лейкоциты, продукция вируса Эпштейна-Барр6BALB/3T3 clone АЗІМышь, эмбрион, фибробпасты78GMАфриканская зеленая мартышка, почка8ВНК-21Сирийский хомячок, почка9ВНК-21 clone 13Клон линии ВНК-2110ВНК-21 (clone 13)VСублиния клона ВНК-21 clone 1311BSC-1Африканская зеленая мартышка, почка12Chang conjunctiveЧеловек, конъюнктива13Chang liverЧеловек, печень14CV-1Африканская зеленая мартышка, почка15CV-3Африканская зеленая мартышка, почка16FLVЧеловек, амнион,сублиния FL17FECH (ФЭЧ)Человек, эмбрион, фибробласты18FLECH 385/13 (ФЛЭЧ 385/13)Человек, эмбрион, фибробласты легкого19FRHK-4RМакака-резус, эмбрион, почка20GMK-AH-1Африканская зеленая мартышка, почка21HAKСирийский хомячок, понка22HeLaЧеловек, карцинома шейки матки23HeLa KD, HeLa S3, HeLa 229.
HeLaVСублинии HeLa24HEp-2Человек, эпидермоидная карцинома гортани25HL-60Человек, Т-клеточная лейкемия26HN (ГН)Человек, гипернефрома27IMR-32Человек, нейробластома28KBЧеловек, карцинома ротовой полости29KBVСублиния КВ30LLC-MK2Макака-резус, почка31L-41Человек, моноцитарная лейкемия32L-132Человек, эмбрион, легкое33L-929Мышь, соединительная ткань, клон линии L34MA-104Макака-резус, почка35Me CoyМышь, гепатома36MDBKБык, почка37MDCKСобака, почка38MEC (M3K)Кролик, эмбрион, мышцы39Molt-3Человек, Т-лимфобластная лейкемия40Molt-4Человек, Т-лимфобластная лейкемия41MRC-5Человек, эмбрион, фибробласты легкого42MT-4Человек, совместное культивирование лимфобластов крови
сердца и Т-клеток больного лейкемией43Ш 1LU (NBL-7)Норка, легкое44NamalvaЧеловек, лимфома Беркитта45NGUK-1 (НГУК-1)Крь/са, невранот46NIH/3T3Мышь, эмбрион, фибробласты47PEG (ПЭО)Овца, эмбрион, почка
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 567Окончание табл. 23-3Nsn/nЛинияВидовое и тканевое происхождение48PES (ПЭС)Свинья, эмбрион, почка49РК{15)Свинья, почка50РО-2 (ПО-2)Овца, почка51РО-ТК-50 (ПО-ТК-50)Гибридные культуры; овца, клетки почки и лимфоциты52PO-TK-xLO (ПО-ТК-хЛО)Гибридные культуры; овца, клетки почки и лимфоциты53PO-TK-xSO (ПО-ТК-хСО)Гибридные культуры, овца, клетки почки и спленоциты54PPES (ППЭС)Свинья, почка55PSСвинья, почка56RajiЧеловек, лимфома Беркитта57RAC X KMFCH (RAC x КМФЧ)Гибридная культура клеток: мышь RAC, опухоль и человек,
кожно-мышечные фибробласты58RDЧеловек, рабдомиосаркома59RH K-13/3Человек, почка, клон линии RH60RK-13Кролик, почка61RPMI 2650Человек, карцинома носовой перегородки62SEK (СЭК)Кролик, эмбрион, сердце63SPEV(СПЭВ)Свинья, эмбрион,почка64SirkКролик, роговица глаза65Taurus-1 (Taypyc-1)Теленок, почка66ТЕК (ТЭК)Крупный рогатый скот, эмбрион, тимус67T24Человек, карцинома мочевого пузыря68T98GЧеловек, глиобластома69T1387Человек, лимфобпастная лейкемия70VeroАфриканская зеленая мартышка, почка71Vero K19Клон линии Vero72Vero (V), Vero 76, Vero 01008Сублинии Vero73U-937Человек, гистиоцитарная лимфома74Wl-38Человек, эмбрион, фибробласты легкого75293Человек, эмбрион, клетки почки трансформированы ДНК адено¬
вируса типа 5 (Ad 5)764647Африканская зеленая мартышка, почкаТаблица 23-4. Перечень клеточных линий, рекомендуемых для культивирования вирусовВирусыКультура клетокВирусы гриппа: А (Н^Н,), А (НД),
А (Н,М,), А (Н,М,), В и СМДСК, Vero, MDBK, ВНК-21, SPEV (СПЭВ), WI-38. MRC-5, FLECH
385/13 (ФЛЭЧ 385/13), NIH-3T3, Chang Conjunk, HAKАденовирусы (1-31-го типа)HeLa, HEp-2, Vero. МДСК, GMK-AH-1, PK(15), HN (ГН), L-41.
A549, MAt-104, IMR-32 (12-Й тип), FLV, HelaKD (7-й тип), HeLaSj
(5-й тип), KB (3-й, 7-й типы), 293, BHK-21clone13, Chang liver.L 132, FLECH 385/13 (ФЛЗЧ 385/13)Пневмовирусы (респираторно¬
синцитиальные)Wl-38. MRC-5, FLECH 385/13 (ФЛЭЧ 385/13). MAt-104, HeLa,
HEp-2, Vero, L-41, FLV, BSC-1, HN (ГН), L 132, KBVВирусы парагриппа (1-4-го типа)Vero, L-41, MAt-104, HEp-2, HN (ГН). RD, L-929, A549, BSC-1,
Taurus-1 (Taypyc-1), FLECH 335/13 (ФЛЭЧ 385/13), FLVКоронавирусыWl-38, MRC-5, FLECH 385/13 (ФЛЭЧ 385/13), Vero, T98G,
BALB/3T3 Clone A31, SPEV (СПЭВ)РиновирусыHeLaV, BGM, Wl-38, MRC-5, FL V, KBV, AUBEK, LLC-MK2
568 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯОкончание табл. 23-4ВирусыКультура клетокМорбилливирусы (вирус кори)Hela, BSC-1, Vero, L-41, Molt-4, BGM, KBV, FLECH 385/13 (ФЛЭЧ
385/13)Вирусы эпидемического паротитаHeLa, KB, HEp-2, BGM, BSC-1, Molt-4Вирус простого герпеса человека
(1-го и 2-го типа)A549, RH K-13/3, HeLa, HEp-2, HW (ГН), MAt-104, L-41, Vero, KB,
WI-38, MRC-5, FLECH 385/13 (ФЛЭЧ 385/13), BHK-21, NIH/3T3,
RD. Vero (V). IMR-32, Chang liver, BSC-1, BALB/3T3 clone A31Вирус ветряной оспыRK-13, Vero. NIH/3T3. BHK-21. HEp-2, BSC-1. CV-1, BALB/3T3
clone A31,RD, MV1LU (NBL-7)ЦитомегаловирусWI-38, MRC-5. MV 1LU (NBL-7) Vero. HN (ГН). A549, RD. MAt-
104, Vero(V), MEK (МЭК), SEK (СЭК)Вирус Эпштейка-БаррBHK-21 СІОПЄІЗ, VeroПолиовирусы (1, 2, 3-го типа)HeLa, HEp-2, BSC-1, Vero, RD, Chang Conjn, GMK-AH-1, CV-1,
Chang liver. BGM, HN (ГН). L41, МАт-104, A549, KB, RPMI 2650.
WI-38, MRC-5, LLC-MK2, L132, FLECH 385/13 (ФЛЭЧ 385/13)Коксаки А (1-24-го типа)HeLa, HEp-2, RD, BGM. RK-13, FLVКоксаки В (1-6-го типа)HeLa, HEp-2, PK(15), МДСК, IMR-32, BGM, BHK-21 сІопеІЗВирусы ECHOHeLa, HEp-2, RD, Vero, BGM, RK-13, FLV, FLECH 385/13 (ФЛЭЧ
385/13)Гепатит АAlexander, Vero (V), CV-1, BSC-1,4647, T 24, LLC-MK2, FRHK-4RГепатит ВVero. CV-1, A549Вирус краснухиWI-38, FLECH 385/13 (ФЛЭЧ 385/13), Vero, GMK-AH-1. Sirk.
BHK-21, RK-13РотавирусыMAt-104, МДВК, 4647, RD. BGM. SPEV (СПЭВ)РеовирусBGM, PK(15), Vero, PS, MDCK, HeLa, SV-1, MV 1LU (NBL-7),
BHK-21 clonéisВирус везикулярного стоматитаWI-38, FLECH 385/13 (ФЛЭЧ 385/13), MRC-5, BSC-1, Vero, IMR-
32, LLC-MK2, Namalva, BHK-21 clone 13, RPMI 2650, BALB/3T3
clone A31, Chang llver, HeLaSj, HN (ГН), Alexander, MDCK, L 929,
RD, Me Coy, В 95-8БешенствоBHK-21 clone 13, BHK-21 (clone 13) V, MV 1LU (NBL-7), NGUK-1
(НГУК-І).ТЕК (ТЭК)ПсевдобешенствоBHK-21 clone 13, BHK-21 (clone 13) V, MV 1LU (NBL-7), NGUK-1
(НГУК-1), ТЕК (ТЭК)Вирус осповакциныRK-13, MAt-104, Hela, МДСК, RD. BGM. PK(15), MV 1LU (NBL-7)Вирус натуральной оспыWI-38, MRC-5, HAK, FECH (Ф9Ч)Аренавирусы: лимфоцитарного хориоме-
нингита, вирусы Пичинде, МачупаBHK-21, МДСК, Vero, Vero K-19Вирусы геморрагических лихора¬
док: Ласса, Эбола, Марбург, Хунин,
Карельской и Омской лихорадкиVero 76, Vero C1008Арбовирусы (L-вируоы): западный, вос¬
точный и венесуэльский энцефалиты,
лихорадки Чикуньгунья и леса СемликиPES (ПЭС), FLV, HeLaV, Vero, CV-3, SPEV (СПЭВ), L-929, Raji,
MAt-104, KBV. T-1387, Namalva, Molt-3, Molt-4. В 95-8, RHK-
13/3. BSC-1, LLC-MK2, MDCK. PSФлавивирусы: клещевой и японский
энцефалиты, лихорадка Денге, желтая
лихорадкаSPEV (СПЭВ), PPES (ППЭС), MAt-104, BSC-1, RHK-13/3, PEO
(ПЭО). Vero K-19, NGUK-1 (НГ7К-1), PES (ПЗС), FLECH 385/13
(ФЛЗЧ 385/13)Буньявирусы: калифорнийская лихорадкаBHK-21. A-549. LLC-MK2.VeroВирусы иммунодефицита человека 1 и 2HL-60, U-937 (1-й и 2-й типы), Molt-3, MT-4Лейковирусы, вирус Т-клеточкой лейке¬
мии человека, вирус SV-40MV 1LU (NBL-7), CV-1, BSC-1, Balb/3T3 clone 31, Vero, NIH/3T3,
HL-60, A-204, HN (ГН)ПрионыNGUK-1 (HrVK-1). PO-2 (П0-2), PO-TK-50 (ПО-ТК-50), PO-TK-
xLO (ПО-ТК-хЛО), PO-TK-xSO (ПО-ТК-хСО), RACXKMF4
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 569 IБольшинство диплоидных линий получено из тканей 5-6-месячных челове-
ческих плодов после искусственного аборта, а также из амниотической оболочки | g }
от рожениц при нормальных родах. В последнее время применение диплоидных
линий клеток человека обсуждается в специальной литературе с точки зрения меди- | ^
цинской этики. Это связано с рекомендациями, сформулированными Комитетом I
по биоэтике ЮНЕСКО в отношении исследований на человеческих эмбрионах, |
полученных позднее 14 сут эмбрионального развития. Некоторые положения |
этого документа применимы к исследованиям по выделению и использованию |
диплоидных линий клеток человека. Это в первую очередь наличие письменного '
информированного согласия женщины, подлежащей операции, отсз^тствие ком¬
мерческой заинтересованности со стороны медицинского персонала, проводящего
прерывание беременности, строго медицинские цели исследования.Перевиваемые культуры клетокОграниченный срок жизни диплоидных линий побудил исследователей к поис¬
ку новых клеточных культур. Были найдены постоянные клеточные линии с нео¬
граниченным сроком жизни. Фактическое «бессмертие«> этих моделей обусловле¬
но трансформацией генетического материала клеток. Линии, как правило, имеют
онкогенное происхождение или созданы вследствие спонтанной трансформации
нормальных клеток при культивировании in vitro. Получить перевиваемые куль¬
туры клеток можно как из здоровых, так и из опухолевых тканей животных путем
длительных пересевов первично-трипсинизированных клеток (характеризуемых
высокой активностью роста) в заданном режиме культивирования. Клетки пере¬
виваемых культур имеют гетероплоидный набор хромосом, одинаковую форму и
стабильность в условиях культивирования in vitro,В лабораториях перевиваемые культуры клеток поддерживают путем пересе¬
вов из одного сосуда в другой с обязательной заменой прггательной среды. После
удаления из сосуда для культивирования ростовой питательной среды клетки
монослоя снимают с поверхности стекла или пластика с помощью диспергирова¬
ния 0,02% раствором Версена, 0,25% раствором трипсина или смесью (1:1) этих
растворов. Диспергирующее действие раствора Версена обусловлено тем, что
он связывает двухвалентные катионы (Mg*^, Са^^), которые обеспечивают при¬
крепление клеток к стеклу и формирование монослоя. Под действием раствора
Версена клетки округляются и отслаиваются от стекла. Через 3-5 мин выдержива¬
ния монослоя под подогретым до 37 '’С диспергирующим раствором его удаляют,
оставляя небольшую порцию для последующего периодического омывания клеток
до момента их сползания. Далее во флакон добавляют небольшое количество
ростовой питательной среды, тщательно пипетируют сползший монослой и берут
пробу для подсчета клеток в камере Горяева. Полученную клеточную взвесь раз¬
водят ростовой питательной средой до необходимой концентрации (100-200 тыс.
клеток в 1 мл) и разливают в пробирки, матрасы или флаконы для последующего
культивирования при 37 ®С в течение 2-4 дней до образования сплошного моно-
слоя. Клетки можно не подсчитывать в камере Горяева, а рассевать их привычным
для данной культуры клеток коэффициентом от 1:2 до 1:8 и более.Клеточные культуры, как правило, культивируют в статических условиях,
используя для этого пробирки, матрасы и флаконы различной емкости, а также
специальные культуральные 6- и 96-луночные пластиковые планшеты. Для полу¬
чения больших количеств клеточной массы используют технику роллерного или
суспензионного культивирования.Перевиваемые клеточные культуры имеют ряд преимуществ по сравнению с
первичными. Они служат современной эффективной альтернативой биологиче¬
ским моделям (куриным эмбрионам, лабораторным животным), включая эти¬
ческий компонент исследований. Постоянные культуры и их клональные линии
570 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯобеспечивают стандартные условия размножения вирусов в отличие от первич¬
ных культур, представляющих смешанные популяции клеток. Это уникальная по
степени контролируемости система. Разработанные методы контроля клеточных
культур обеспечивают идентификацию практически любых экзогенных контами-
нантов. Благодаря относительной простоте приготовления перевиваемых культур
существенно экономятся труд и материальные средства.Перевиваемые клетки, как правило, обладают широким спектром чувствитель¬
ности к вирусам (см. табл. 23-4).Практика медицинских и биологических центров мира и многолетний опыт
работы с постоянными клеточными линиями показали, что для этих моделей
характерна межвидовая и внутривидовая контаминация, а также контаминация
микоплазмами и вирусами. В ряде работ описана подмена одних линий другими.
Появились публикации о проблемах селекции и возникновении множества субли¬
ний, различающихся между собой, но имеющих одно наименование.Стало очевидным, что надежное использование постоянных клеточных линий
невозможно без создания специализированных центров, основной задачей кото¬
рых являлось бы хранение линий, имеющих определенную характеристику
(паспорт). Эта проблема решена путем создания Национальных коллекций кле¬
точных культур. Создание Российской коллекции клеточных культур (РККК)
обусловило значительный прогресс в решении проблем стандартизации вирусоло¬
гических исследований.В настоящее время РККК объединяет 9 специализированных коллекций,
сосредоточенных в научно-исследовательских институтах. Сохраняется около
2000 клеточных линий, из которых 700 являются референтными, депонированны¬
ми в связи с патентованием, 170 — имеют промышленное значение.Основная сторона деятельности РККК — обеспечение эталонным клеточным
материалом научных, производственных и практических учреждений России
и зарубежья. Каждая линия в РККК охарактеризована согласно принятому
Международному стандарту, которого придерживаются все Национальные кол¬
лекции мира. Ниже приведен для примера образец паспорта коллекционной линии
MDCK — одной из важных и распространенных вирусологических моделей.Паспорт культуры клеток MDCK
Происхождение: собака, почка.Proc.Soc.Exp.BioI.Med. 1958. 98: 574.Морфология; эпителиоподобная.Способ культивирования: монослойный.Условия культивирования:
среда - ЕМЕМ, ВМЕ или DMEM;
сыворотка — эмбриональная бычья 10%;
другие компоненты — NEAA 1% (ЕМЕМ);процедура пересева — снятие клеток с использованием трипсина 0,25%, раство¬
ра Версена 0,02% (1:3);кратность рассева — 1:3-1:10, оптимальная плотность — 1-Зх10'^клеток/см2;
криоконсервация — ростовая среда (можно добавить 30% эмбриональной
бычьей сыворотки), 10% DMSO, 1x10^клеток/мл в ампуле.Жизнеспособность после криоконсервации: 90% (окраска трипановым
синим на нулевом пассаже).Контроль контаминации: бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены.
Контроль видовой идентичности: кариологический анализ.Кариология! 2п ^ 78, пределы изменчивости по количеству хромосом — 75-83,
модальное количество хромосом — 78-80, количество маркеров — 1-2, крупные
субметацентрические хромосомы, в некоторых клетках имеются 1-2 средние
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 571мета- или субметацентрические хромосомы (рутинная окраска), количество поли¬
плоидов - 0,6%.Эффективность клонирования: 35% (АТСС),Другие характеристики: чувствительность к вирусам — везикулярный стома-
тит; коровья оспа; Коксаки В-5; реовирусы 2, 3; аденовирусы 4, 5; грипп А, В, С;
чума собак; арбовирусы; аренавирусы; везикулярная экзантема свиней; инфекци- Ш1
онныи гепатит собак.Область применения; вирусология, биотехнология, клеточная биология.	ШйШ""Коллекции: АТСС ССЬ 34; ЕСАСС 84121903; 85011435; НИИ вирусологии
РАМН; ЕСКК; ИНЦ РАН.Микроскопические и культуральные методыПРЯМАЯ МИКРОСКОПИЯ ПРИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОКМикроскопическое исследование инфицированных тканей проводят в целях
выявления в них патологических изменений или обнаружения вирусного материа¬
ла. Группа микроскопических методов включает обычную световую микроскопию
(вирусоскопию и обнаружение внутриклеточных включений с помощью цитоло¬
гических методов) и микроскопию в ультрафиолетовом свете с использованием
феномена флюоресценции.Методы обычной световой микроскопии, как правило, достаточно просты,
однако в настоящее время они имеют ограниченное диагностическое значе¬
ние, поскольку могут быть применены при немногих вирусных заболеваниях.Основная задача этих методов — обнаружение в фиксированных и окрашенных
тканях патологических и патогномоничных изменений или вирусного антигена,
а в мазках или препаратах-отпечатках, изготовленных из материала тканей, жид¬
костей и экссудатов, — вирусного агента или его антигенных компонентов, телец-
включений и измененных клеток.ВИРУСОСКОПИЯТолько крупные вирусы, размеры которых превышают 150 нм, могут быть
обнаружены с помощью прямого микроскопического исследования. Для этого
используют окрашенные мазки и отпечатки. Одним из лучших способов окраски
препаратов считают серебрение по Морозову. Окраска позволяет увеличить раз¬
мер вируса с помощью осаждения на него частиц серебра. С помощью световой
микроскопии возможно обнаружение вирионов оспенных вирусов. Поскольку
они являются гигантами (достигая 300-390 нм) по сравнению с вирионами
других вирусов, их удается увидеть в световом микроскопе, хотя и на пределе
видимости.Вирусоскопия как быстрый ориентировочный метод лабораторной диагностики
вирусных заболеваний все же не является точным методом для установления при¬
роды возбудителя. Для этого требуются другие методы индикации и идентифика¬
ции вирусов,ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫЭти методы редко применяют в диагностике вирусных инфекций, но при ряде
инфекций они по-прежнему востребованы. При репродукции некоторых вирусов
в клетках формируются вирусные тельца-включения, которые могут быть вну¬
триядерными (как правило, у ДНК-содержащих вирусов) или цитоплазматиче¬
скими (у РНК-содержащих). Некоторые вирусы способны вызывать образование
телец-включений обоих типов. Появляются они в результате скопления в клетке
большого количества вирионов, изменения или дегенерации клеточного содержи¬
мого, избытка вирусных белков, не встроившихся по разным причинам в состав
572 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯвирионов. Размер телец-включений колеблется от едва различимого до величины
клеточного ядра, а количество — от одиночных до 10-12 на клетку.Для обнаружения телец-включений материалы аутопсии, биопсии, мазки и
отпечатки (посмертные или прижизненные), а также препараты культур клеток
подвергают специальной окраске с последующей микроскопией. Для включений,
образуемых разными типами вирусов, методы окраски различны. Среди множе¬
ства рецептов окраски можно выделить универсальные (обзорные), к которым
относится окраска гематоксилин-эозином.Цитоплазматические телъца-вклюгения Еабеша-Негри, формируемые вирусом
бешенства, при окраске любым методом визуализируются в гистологичесю1х срезах
головного мозга человека или животных; они настолько характерны, что позволяют
установить диагноз. Типичные изменения в ткани печени (полученной путем висцеро-
томии или на секции) указьшают на желтую лихорадку. При венерической лимфогра-
нулеме элементарные тельца можно обнаружить в гнойном материале из бубонов,В цитоплазме эпителиальных клеток в результате репродукции вируса оспы
птиц образуются тельца Боллингера,Внутриядерные включения обнаруживают в перевиваемых эпителиоидных
культурах клеток Ь или ЕЬ, выращенных на покровных стеклах и зараженных
вирусом болезни Ауески, окрашенных гематоксилин-эозином.Несколько сложнее искать такие включения в препаратах из кулыур эпителио¬
идных клеток, выращенных на покровных стеклах и зараженных оспой соответ¬
ствующего вида, после аналогичной окраски,В большинстве случаев обнаружение вирусных телец-включений служит вспо¬
могательным методом диагностики. При энцефалите, например, патогистологиче¬
скими методами нельзя точно установить этиологию, хотя возможно использовать
их для дифференцирования инфекционного и неинфекционного процессов или
некротического процесса и демиелинизации, наблюдающейся при поствакциналь-
ных энцефалитах. Именно поэтому патологоанатомам, берущим материал для
гистологического исследования, рекомендуют параллельно осуществлять сбор
материала для выделения вируса.МЕТОДЫ МИКРОСКОПИЧЕСКОЙ ИНДИКАЦИИ ВИРУСОВ в КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХСпособность вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток делает воз¬
можным использование культуры клеток в вирусологии для первичного обнару¬
жения и выделения вирусов из патологического материала (рис. 23-1 и 23-2). При
правильном подборе культур клеток, соблюдении условий заражения клеточного
монослоя и культивирования вирусов можно выявить их уже на первых пассажах.
Индикаторы наличия вируса в инфицированных культурах клеток:•	развитие специфической для исследуемого вируса дегенерации клеток и кле¬
точного монослоя;•	образование бляшек;•	выраженная интерференция вирусов;•	появление внутриклеточных включений;•	подавление метаболизма клеток (цветовая проба);•	положительная гемадсорбция;•	положительная гемагглютинация;•	иммунофлюоресцентные признаки наличия вируса или вирусных антигенов;•	электронно-микроскопические критерии наличия вируса.Индикация вирусов по цитопатическому действиюО размножении вируса в культуре клеток обычно судят по цитопатическому
действию (ЦПД), выражаемому морфологическими изменениями в зараженных
культурах клеток, которые наблюдают при ежедневном просматривании под
малым увеличением микроскопа (объектив — х8-19, окуляр — х7-10).
жВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 573Эти изменения (по сравнению с состоянием клеток в незараженных культурах)
могут охватывать весь монослой или отмечаться как разного размера очаги изме¬
ненных клеток на фоне нормального монослоя. Формы ЦПД зависят от биологи¬
ческих свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования
и т.д. Так, некоторые из аденовирусов проявляют ЦПД через 2-3 сут после зараже¬
ния, а респираторно-синцитиальный вирус — через 1-2 нед.Формы ЦПД можно сгруппировать в три наиболее различающихся между собой
варианта: фрагментация клеток, округление клеток и симпластообразование.Фрагментация — разрушение клеток на отдельные фрагменты, которые, теряя
связь с подложкой (стеклом или пластиком), попадают в культуральную жидкость
в виде клеточного детрита (вируса везикулярного стоматита).Округление — потеря клетками способности удерживаться на подложке,
вследствие чего они принимают округлую (шаровидную) форму, отделяются от
стекла или пластика и свободно плавают в культуральной среде, постепенно поги¬
бая (энтеровирусы, аденовирусы и др.).Симпластообразование — образование многоядерных гигантских клеток
в результате слияния цитоплазмы и амитотического деления клеток (от 3-5 до
нескольких десятков), при этом клеточные оболочки соседних клеток раство¬
ряются, их цитоплазмы сливаются, образуя большую клетку, в которой ядра либо
сосредоточиваются в центре, либо располагаются по периферии. Такие гигантские
многоядерные клетки называются симпластами. Механизм слияния клеток объ¬
ясняется нарушением процесса деления клеток под влиянием вируса или рас¬
творением клеточных оболочек под действием фермента лецитиназы некоторых
вирусов.Иногда в клеточных культурах может наблюдаться развитие очагов клеточной
пролиферации, состоящих из слоев интенсивно делящихся клеток. При неопла-Рис. 23-1. Нормальный монослой клеток перевиваемых клеточных кулыур MDCK, Таурус, HeLa,
ВНК-21.
574ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯРис. 23-2. Клетки фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) и почки эмбриона человека
(ПЭЧ), зараженные вирусами гриппа и герпеса или парагриппа типов 2 и 3.стической трансформации пораженных клеток в монослое возникают плотные
фокусы трансформации белого цвета, различных величины и формы (вирус сар¬
комы Рауса).Некоторые вирусы, размножаясь в клеточных культурах, не вызывают ЦПД,
что может быть обусловлено природой вируса или типом клеток, которые исполь¬
зовали для его культивирования (вирус бешенства, вирус краснухи в диплоидных
клетках человека и др.). Клетки остаются жизнеспособными, однако со временем
в них понижается интенсивность клеточного деления и несколько меняется мор¬
фология.Характерное для каждого типа исследуемых вирусов ЦПД может развиваться в
культурах клеток при заражении средними дозами вирусов (0,1-1,0 ТЦДзц/клет-
ка), когда инфицированные клетки не погибают сразу, а продолжают функцио¬
нировать еще некоторое время, достаточное для формирования специфических
образований. При больших дозах вирусов (>1,0 ТЦД^уклетка) клетки гибнут
достаточно быстро с возникновением генерализованной инфекции и полной
деструкции монослоя. При малых дозах заражения (<0,1 ТЦД^^/клетка) инфи¬
цирование клеток происходит медленно и вызывает медленно прогрессирующую
нетипичную дегенерацию клеток.Эпителиальные клетки, как правило, более чувствительны к цитопатическому
действию вируса, чем фибробластные, что и проявляется более ранним развитием
морфологических изменений и наступлением тотальной дегенерации.Цитопатическое действие вируса в культурах клеток необходимо дифферен¬
цировать от неспецифической дегенерации клеточного монослоя, которая может
быть обусловлена естественным старением клеток, токсическим действием ино-
кулируемого материала, контаминацией клеток посторонними вирусными и бак¬
териальными объектами.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 575Поскольку большинство вирусов способно оказывать ЦПД, такой метод инди¬
кации вируса в клеточных культурах применяют очень широко. Иногда в первом
пассаже ЦПД может отсутствовать вследствие репродукции незначительного
количества вируса, которое неспособно вызвать ярко выраженный цитопатиче-
ский эффект. Требуется несколько «слепых» пассажей для накопления достаточ¬
ного количества вируса или утверждения об его отсутствии в материале.ГемадсорбцияРеакцию гемадсорбции впервые обнаружили Фогель и Щелоков (1957) в куль¬
туре ткани, инфицированной вирусом гриппа. Суть явления заключается в том, что
вирусы, в вирионе которых присутствует гемагглютинин, обладают рецепторами,
комплементарными рецепторам эритроцитов некоторых животных (морской
свинки, обезьян) и человека группы крови 0. При репродукции вирусов в клеточ¬
ных культурах еще до проявления ЦПД находящиеся у поверхности клеток вирусы
и их фрагменты соединяются с рецепторами эритроцитов настолько прочно, что
последние не смываются питательной средой или буферным раствором и образуют
на монослое клеток скопления.Методика гемадсорбции; на 2-4-й день культивирования вируса в клеточной
культуре берут одну пробирку с зараженными клетками и одну контрольную, не
содержащую вируса. Культуральную жидкость из них удаляют, вносят 0,2 мл 0,5%
суспензии отмытых эритроцитов и оставляют на 15-30 мин при комнатной тем¬
пературе, 37 или 4 ‘'С. Затем эритроциты отмывают физиологическим раствором
и просматривают под малым увеличением микроскопа. В контрольной пробирке
эритроциты полностью отмываются физиологическим раствором или проплыва¬
ют свободно в поле зрения, в зараженной пробирке эритроциты остаются прикре¬
пленными к поверхности клеток, в этом случае реакция считается положительной,
в зависимости от типа вируса и вида клеток локализация эритроцитов может быть
различной. Так, при заражении клеток вирусом гриппа эритроциты, как правило,
расположены очагами и скоплениями, вирусом парагриппа — диффузно на слое
клеток, вирусом африканской чумы свиней ~ в виде ожерелья только по перифе¬
рии клеток.г емагглютинацияНекоторые вирусы могут агглютинировать эритроциты. Это явление впервые
обнаружил Херст в 194] г.В основе агглютинации лежит способность гемагглютинина, одного из
поверхностных вирусных белков, взаимодействовать с рецепторами на поверх¬
ности эритроцитов. Каждая вирусная частица содержит множество молекул
гемагглютинина, образующего шиповидные выступы, которые при доста¬
точно высокой концентрации вируса могут формировать крупные агрегаты с
эритроцитами, по структуре напоминающие сеть. Появление таких агрегатов
хорошо наблюдается в лунке с U-образным дном. Нормальные эритроциты при
оседании из взвеси образуют компактный осадок в виде диска на дне лунки, а
агглютинированные - «зонтик» из тонкой пленки равномерно склеившихся
эритроцитов.Для постановки реакции гемагглютинации (РГА) могут быть использованы
аллантоисная и амниотическая жидкости, суспензия хорионаллантоисных обо¬
лочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур клеток или органов
животных, зараженных вирусами. Последовательность постановки РГА:^ готовят 1% суспензию отмытых эритроцитов того вида животных или
человека, который способен агглютинировать исследуемый вирус;
готовят двукратно возрастающие разведения вируса в физиологическом
растворе;Шй
шш' 'ШМ576ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ✓^ смешивают разведения вируса с эритроцитами в равных объемах (напри¬
мер, по 0,4 мл), одновременно ставят контроль эритроцитов (смесь рав¬
ных объемов физиологического раствора и суспензии эритроцитов);
смеси выдерживают необходимое время при определенной температуре в
зависимости от свойств изучаемого вируса;
оценивают интенсивность гемагглютинации в крестах.Результаты РГА учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле.
Время их оседания может варьировать в зависимости от видовой принадлежности
эритроцитов, процентного содержания их во взвеси и температуры, при которой
проводится реакция.с помош,ью РГА нельзя определить в препарате точное количество вируса или
инфекционных единиц, однако ГАЕ служит удобной единицей для сравнения
вирусных препаратов. Кроме того, для любого конкретного штамма вируса можно
оценить соотношение между ГАЕ и другими единицами измерения количества
вируса (например, инфекционной активности).Более экономный метод постановки РГА — микровариант этой реакции, кото¬
рый проводят в микропланшетах для титрования. В этом случае необходимо учи¬
тывать, что 1 ГАЕ определяется как количество вируса в микрообъеме (0,05 мл),
агглютинирующее 50% эритроцитов в 0,05 мл 1% суспензии.Образование бляшекИз локальных повреждений, вызываемых вирусами, хорошо известны так
называемые бляшки в клеточных культурах или оспины на хорионаллантоисных
оболочках куриных эмбрионов, зараженных покс-вирусами и некоторыми дру¬
гими. Метод обнаружения вируса путем получения бляшек технически сложнее
других и применяется в основном для титрования вируса. Бляшки способны
образовывать вирусы везикулярного стоматита, полиомиелита, Коксаки, гриппа
и др.Принцип метода состоит в следующем. Однослойные культуры клеток, выра¬
щенные в культуральных планшетах, заражают цельной вирусной суспензией
(выделение, типирование вируса) или в последовательных десятикратных раз¬
ведениях (титрование вируса), обеспечивают контакт вируса с клетками в течение
необходимого для разных типов вирусов времени. Затем удаляют неадсорбиро-
вавшийся вирус, промывая несколько раз монослой клеток раствором Хенкса,
и покрывают его слоем специального питательного агара. Благодаря агаровому
покрытию размножение и распространение вируса ограничиваются только перво¬
начально инфицированными и соседними с ними клетками, в сплошном слое
живых клеток появляются ограниченные островки дегенерации клеток, погибших
в результате воздействия вируса. Эти островки визуализируются, так как содер¬
жащийся в агаровом покрытии или добавленный непосредственно перед учетом
результатов титрования нейтральный красный окрашивает только живые клетки,
поэтому в матрасе на ровном красновато-розовом фоне появляются бесцветные
пятна — бляшки. Каждая бляшка соответствует одной инфекционной частице
вируса. При небольшой плотности частиц, когда бляшки не могут сливаться или
перекрывать друг друга, эффект бляшкообразования можно использовать для
достаточно точного количественного определения инфекционности вирусов или
нейтрализующей активности антител.Цветовая пробаЦветовая проба основана на способности вирусов изменять метаболическую
активность зараженных клеток. Под влиянием метаболитов клеточных культур
pH питательной среды в незараженных культурах сдвигается в кислую сторону,
а в случае заражения вирусом сохраняется примерно на первоначальном уровне
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 577из-за гибели клеток под воздействием вируса. Колебания pH улавливаются по
изменению цвета фенолового красного, добавляемого в среду в качестве инди¬
катора. Для реакции используют клетки перевиваемых линий: HeLa, НЕр-2, FL,
СОЦ и др. Метод не отличается высокой достоверностью, и его редко применяют
на практике.Интерференция вирусовМетод, основанный на интерференции вирусов, предполагает, что одни из
вирусов, размножаемые в культуре клеток, способны снижать или блокировать
размножение других вирусов. Чаще всего этот метод используют для обнаружения
вирусов, не оказывающих ЦПД в клеточных культурах, или когда задержка раз¬
вития ЦПД обусловлена другими причинами. Применяют метод и при титровании
вирусов, не вызывающих отчетливого ЦПД.Клеточную культуру заражают испытуемым вирусом; по истечении нескольких
дней, достаточных для его репродукции, вводят стандартную дозу (100 ТЦД^^)
«индикаторного» вируса, обладающего выраженной цитопатогенностью или спо¬
собного вызывать гемадсорбцию. После инкубации зараженных культур в течение
времени, достаточного для проявления ЦПД ^^индикаторного» вируса, оценивают
наличие обусловленных им цитопатических изменений. Если в культуре клеток
не обнаруживают ЦПД, это означает, что имела место репродукция испытуемого
вируса. Если наблюдается выраженное ЦПД «индикаторного» вируса, то испытуе¬
мого вируса в клетках нет.Наиболее широко данный метод используют при работе с вирусом краснухи. На
роль «индикаторного» вируса в этом случае больще всего подходит вирус везику¬
лярного стоматита.Внутриклеточные включенияпри размножении многих вирусов в эпителиоподобных или фибробластопо-
добных клеточных культурах появляются особые внутриклеточные включения
в цитоплазме или ядре. Для выявления этих включений клетки выращивают на
покровных стеклах, в пробирках или специальных флаконах, заражают испытуе¬
мым материалом. Через необходимое для данного вируса время инкубации при
оптимальной температуре культивирования готовят препараты, окрашивая их
красителями или флюорохромами.Хорошо обнаруживаются тельца-включения в препаратах, окрашенных гемато¬
ксилин-эозином. Пэтовят препараты, предварительно фиксируя клеточный слой на
покровных стеклах в смеси Дюбока-Бразиля-Буэна, фиксаторе Карнуа, Ценкера
или в других фиксаторах, а затем окрашивая, чаще всего по Романовскому-Гимзе.
Эта окраска универсальна и в разных вариантах позволяет визуализировать все
виды внутриклеточных включений, которые обычно оксифильны и красятся в
розовый или сиреневый цвет. При окраске по Манну, также хорошо выявляющей
цитоплазматические и внутриядерные включения в клетках, зараженных различ¬
ными вирусами, цвет включений ярко-красный. Выбор окраски определяется в
значительной степени типом вируса, поражающего клетю«.В качестве флюорохрома для обнаружения внутриклеточных включений
используют акридиновый оранжевый. При этом можно работать как с нативными
препаратами, так и с фиксированными в течение 10-15 мин в ацетоне. Включения,
содержащие ДНК, дают голубовато-зеленое свечение на сероватом фоне цитоплаз¬
мы, РНК-содержащие включения — красновато-оранжевые.Как и при вирусоскопии, выявление внутриклеточных включений в культиви¬
руемых клетках служит только ориентировочным методом быстрой лабораторной
диагностики вирусных инфекций.
578ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯЭлектронная микроскопияОсобенности электронной микроскопии в сравнении с другими методами
диагностики вирусных инфекцийв 1960-1970-е гг. с изобретением метода негативного контрастирования с
помощью электронной микроскопии (ЭМ) были открыты сотни вирусов. Однако
с развитием молекулярных методов диагностики, таких как ИФА и ПЦР, сфера
применения ЭМ значительно сузилась. Снижение роли ЭМ в вирусологической
диагностике обусловлено рядом недостатков этого метода: относительно низкой
чувствительностью, невысокой производительностью и необходимостью исполь¬
зования дорогостоящего оборудования.Вместе с тем в крупных диагностических центрах развитых стран ЭМ практи¬
куется наравне с другими методами. В некоторых случаях ЭМ служит методом
выбора при определении этиологии новых, неизвестных ранее заболеваний. Так,
в середине 1990-х гг. с помощью ЭМ были открыты высоколетальные парамиксо-
вирусы Hendra и Nipah, в 2003 г. удалось выявить этиологический агент атипичной
пневмонии, впоследствии получивший название «коронавирус SARS».Основные npcHM^wcTBa ЭМ для диагностики вирусных инфекций следующие,•	Широкий спектр выявляемых вирусных агентов. Электронно-микроскопи¬
ческое исследование позволяет по морфологическим особенностям вирусных
частиц идентифицировать инфекционный агент до уровня семейства, иногда
до рода. В большинстве случаев этого достаточно для постановки диагноза.
Кроме того, можно определить серотип вируса по эффекту агрегации вирус¬
ных частиц в присутствии специфической сыворотки (иммуноэлектронная
микроскопия), с помощью ЭМ выявляют не только известные, но и новые
вирусные агенты, а также случаи сочетанных инфекций. Природная измен¬
чивость вирусов не влияет на результат электронно-микроскопического
исследования, в отличие от таких методов, как ИФА и ПЦР.•	Быстрота диагностики. Если материалом для исследования служит вируссо¬
держащая жидкость (экстракт фекалий, содержимое кожных везикул, культу¬
ральная среда), то для определения возбудителя обычно требуется не более
10-15 мин с момента получения материала.•	Достоверность положительных результатов. Обнаружение вирусных частиц
и возможность количественной оценки их содержания в препарате делают
ЭМ-диагностику особенно достоверной. Вирусологи сталкиваются как с лож¬
ноположительными, так и с ложноотрицательными результатами ИФА и ПЦР,
но положительные результаты ЭМ всегда воспринимаются с доверием. В силу
вьш1еуказанного ЭМ считается «золотым стандартом» диагностики. В настоящее
время в вирусологической диагностике ЭМ применяют в следующих случаях.А.	Идентификация новых и неизвестных вирусных агентов. К ним следует
отнести в первую очередь особо опасные вирусные инфекции, такие как гемор¬
рагические лихорадки, вызываемые вирусами семейства Filoviridae. Материалом
для исследования в данном случае служат инфицированные клеточные культуры
или секционный материал. Занос возбудителей подобного рода в северные страны
возможен с импортом экзотических животных или культур клеток животного про¬
исхождения. в последнее время участились сообщения о случаях инфищфования
людей поксвргрусами животных. Описано несколько случаев заражения людей пок-
свирусами от экзотических грызунов, содержащихся в неволе, а также от кошек и
других домашних животных. Материалом для исследования в данном случае может
быть содержимое кожных везикул, поскольку концентрация вирусных частиц в них
достаточно высока. Если была предпринята попытка вьщеления инфекционного
агента на клеточной культуре, материалом могут служить вируссодержащая культу¬
ральная среда или сами клетки.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 579Б. Диагностика вирусных кишечных инфекций человека. В данном слу¬
чае применение эм обусловлено тем, что при сходных клинических признаках
заболевание может быть вызвано несколькими (более 10) различными вирусами,
которые легко определяются Б фекалиях на основании морфологических призна¬
ков. Далеко не все агенты вирусных гастроэнтеритов можно идентифицировать с
помощью ИФА или ПЦР. Например, генетическая вариабельность норавирусов
настолько велика, что даже новейшие тест-системы ПЦР не в состоянии выявить
весь спектр циркулирующих генотипов. Некоторые агенты, например торовирз^сы
и кишечные коронавирусы человека, обнаруживают только с помощью ЭМ, так
как тест-системы к ним не разработаны.В.	Технологический контроль качества стандартизированных клеточ¬
ных линий и вакцинных препаратов. Клеточные линии могут быть контами-
нированы самыми различными вирусными агентами, внесенными с поддерживаю¬
щей средой, сывороткой животных, загрязненными реактивами и пр. В данном
случае ЭМ оказывается незаменимым методом, позволяющим идентифицировать
контаминацию и выявить источник заражения.Основные методы ЭМ-диагностики, применяемые на практике•	Позитивное контрастирование ультратонких. срезов применяют при иссле¬
довании биопсий, секционного материала либо инфицированной культуры
клеток. Изготовление ультратонких срезов требует времени (от нескольких
часов до нескольких суток) и навыка, поэтому в диагностической практике
этот метод используют редко.•	Негативное контрастирование — наиболее широко практикуемый метод.
Используют при исследовании вируссодержащих жидкостей, таких как
культуральная среда, моча, сыворотка крови, экстракт фекалий, содержимое
везикул, бронхолегочный лаваж, ликвор и т.д. (рис. 23-3-23-9). В настоящеешРис. 23-3. Интактные трехслойные частицы
ротавируса в фекалиях ребенка с острым
гастроэнтеритом. Вверху справа - частица с
проникшим внутрь контрастирующим веще¬
ством (негативное контрастирование, мас¬
штабный отрезок —100 нм).Рис. 23-4. Двухслойные вирионы ротавируса в
фекалиях ребенка с острым гастроэнтеритом
(негативное контрастирование, масштабный
отрезок —100 нм).
580ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ	Рис. 23-5. Скопление вирионов норовируса
в фекалиях ребенка с острым гастроэнтери¬
том. Отдельные частицы с проникшим внутрь
контрастирующим веществом имеют форму
ромба (вверху справа) (негативное контрасти¬
рование, масштабный отрезок — 100 нм).Рис. 23-7. Скопление частиц астровиру¬
са в фекалиях ребенка с гастроэнтеритом.
Некоторые частицы имеют звездообразную
структуру (негативное контрастирование, мас¬
штабный отрезок —100 нм).Рис. 23-6. Скопление частиц аденовируса в
фекалиях ребенка с острым гастроэнтеритом
(негативное контрастирование, масштабный
отрезок —100 нм).Рис. 23-8. Вирион коронавируса в фекалиях
ребенка 3 лет с острой диареей. Видны харак¬
терные для коронавируса крупные булавовид¬
ные пепломеры длиной около 20 нм (нега¬
тивное контрастирование ФВК, масштабный
отрезок —100 нм).
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 5$1Рис. 23-9. Вирионы энтеровируса в
фекалиях ребенка 2 лет с гастроэн¬
теритом (негативное контрастирование
ФВК, pH = 6,7, масштабный отрезок —
100 нм).время метод негативного контрастиро¬
вания в различных модификациях при¬
меняют в ведущих лабораториях мира.Для приготовления одного препарата
в целях просмотра требуется в среднем
5-7 мин.Каплю вируссодержащей суспензии поме¬
щают на поверхность парафильма в пла¬
стиковой чашке Петри. На каплю опускают
медную сетку с углеродной либо формвар-
углеродной подложкой. После адсорбции в
течение 15-60 с сетку отмывают в дистил¬
лированной воде. Препарат контрастируют
1,5% раствором калиевой или натриевой соли
фосфорно-вольфрамовой кислоты (pH = 6,7).Для выявления поксвирусов в качестве кон¬
трастирующего вещества следует применять
1% водный раствор уранилацетата, так как он
лучше сохраняет морфологические особен¬
ности их поверхности. Затем сетку с препара¬
том высушивают при комнатной температуре.Таким же способом готовят препараты на
подложках, модифицированных синтетиче¬
скими полимерами. Готовые препараты про¬
сматривают под электронным микроскопом
при инструментальном увеличении х10 000-50 ООО, при этом обращают особое внимание на скопления вирусных частиц.Этиологические агенты заболевания идентифицируются по морфологическим
признакам. Помимо формы частиц, большое значение имеет точное определение их
размера. Современные микроскопы снабжены цифровыми камерами и программа¬
ми, позволяющими измерять частицы непосредственно во время просмотра.Методы повышения чувствительности эмЧувствительность эм ниже в 10^-10^ раз, чем ПЦР, но уступает ИФА незна¬
чительно. На практике в большинстве случаев чувствительность ЭМ составляет
около 10^-10^ частиц на 1 мл, однако она может быть повышена путем концентра¬
ции вирусных частиц в образце либо непосредственно на подложке.Ключевой момент приготовления препаратов негативного контрастирования —
адсорбция вирусных частиц на сетках-подложках. Количество частиц в поле зре¬
ния и соответственно чувствительность диагностики можно увеличить двумя спо¬
собами: 1) повышением содержания вирусных частиц в препарате; 2) улучшением
сорбционных свойств подложки.Широко используемым методом повышения содержания частиц в едини¬
це объема препарата является ультрацентрифугирование. Плавучая плотность
вирионов лежит в пределах 1,2-1,4 г/мл, поэтому для концентрации вирус¬
ных частиц применяют их осаждение высокоскоростным центрифугированием.
Предварительно осветленную вирусную суспензию в количестве 2-10 мл осажда¬
ют при 80 000-120 ООО g в течение 1-1,5 ч, затем осадок ресуспендируют в неболь¬
шом объеме буферного раствора (50-100 мкл) и готовят препараты негативного
контрастирования. Таким образом достигается увеличение чувствительности ЭМ
в 50-100 раз.Содержание вирусных частиц в препарате можно повысить путем диффузии
жидкости в агар. В простейшей модификации метод диффузии применяют еле-
582 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯдующим образом. Каплю осветленной вирусной суспензии наносят на поверхность
агарового блока (1-2% агарозы) толщиной 2-3 мм и сверху на каплю помещают
сетку с подложкой. За 20-30 мин экспозиции жидкость впитывается в агар, в
результате чего концентрация вирусных частиц в образце возрастает в 10-15 раз.
шзш Непосредственно перед тем как вся жидкость впитается, сетку снимают с препара-отмывают водой и контрастируют.ШЩ0Ь	^ Другой модификации метода используют гибкие микропланшеты с лунками,залитыми агаром на три четверти. В этом случае сетку кладут в лунку поверх агара
лицевой стороной вверх, затем на сетку наносят препарат в количестве около
100 мкл так, чтобы заполнить лунку доверху, и выжидают 20-40 мин, пока жид¬
кость не впитается в агар. Сетку снимают, очищают нижнюю сторону от остатков
агара фильтровальной бумагой, отмывают в капле воды и контрастируют.в сравнительных исследованиях было показано, что ультрацентрифугирование
эффективнее метода диффузии в агар приблизительно в 1,3 раза, но диффузия
быстрее, экономичнее и безопаснее с точки зрения возможности заражения персо¬
нала. Кроме того, для метода диффузии требуется меньшее количество исходного
материала.Другое направление повышения чувствительности электронно-микроскопи-
ческой диагностики состоит в увеличении сорбционной способности подложек.
Классическими методами в этом плане служат иммуноэлектронная микроскопия
(ИЭМ) и обработка углеродных подложек в камере тлеющего разряда.Для концентрации вирусных частиц на подложке методом ИЭМ требуется сыво¬
ротка реконвалесцентов. Б классическом варианте каплю сыворотки в разведении
около 1:1000 смешивают с каплей вируссодержащей жидкости и инкубируют во
влажной камере (в закрытой чашке Петри) в течение получаса. Вирусные частицы
образуют комплексы с антителами и в виде агломератов оседают на подложку.
Такие агломераты гораздо легче обнаружить под электронным микроскопом, чем
отдельные вирусные частицы.Метод особенно эффективен при обнаружении мелких вирусов и был с успехом
применен для идентификации вируса гепатита А.Повышения адсорбционных свойств подложек по отношению к широкому спек¬
тру вирусных агентов достигают с помощью гидрофилизации подложек различ¬
ными методами. Свежеприготовленные углеродные подложки гидрофобны, из-за
чего вирусные частицы (обладающие, как правило, гидрофильными рецепторны¬
ми группами) плохо адсорбируются и распределяются на подложке крайне нерав¬
номерно. Описан способ повышения сорбционных свойств подложек с помощью
обработки слабым раствором полилизина, однако намного эффективнее вместо
полилизина использовать линейные поликатионы, в частности полиаллиламин.
Обработка подложек полиаллиламином позволяет увеличить чувствительность
ЭМ в среднем в 5-10 раз.Таким образом, электронная микроскопия остается одним из наиболее эффек¬
тивных методов в диагностике вирусных инфекций, так как позволяет одновре¬
менно выявлять все известные, а также новые вирусы.Метод иммунофлюоресценцииФлюоресцентная (люминесцентная) микроскопия (ИФМ) — широко приме¬
няемый метод лабораторной диагностики вирусных инфекционных заболеваний.
ИФМ позволяет выявить присутствие возбудителя в биологическом материале
пациента, а также определить антитела к нему. ИФМ осуществляют с помощью
специального микроскопического оборудования — флюоресцентного микроскопа
(рис. 23-10). Наиболее часто используют в ИФМ флюорофор флюоресцеинизо-
тиоцианат (ФИТЦ, или FITC).
ФильтрвозбужденияИсточник
возбуждающего
света(галогеновая
лампа)лВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 583
ОбъективФильтр эмиссии
4 (пропускает свет от флюорофора)Полупрозрачное зеркалоОбразецРис. 23-10. Принципиальное устройство люминесцентного (флюоресцентного) микроскопа.к сожалению, применяемые в настоящее время флюорофоры подвержены
эффекту светового выцветания: при многократном облучении возбуждающим
светом светимость препарата необратимо снижается вплоть до полного исчез¬
новения, что связано с взаимодействием возбужденных молекул флюорофора с
атомами кислорода. Консервация препарата в специальных бескислородных сре¬
дах помогает замедлить процесс выцветания, но не останавливает его. Вследствие
этого создание музея препаратов флюоресцентной микроскопии, подобно гисто¬
логическому музею, представляется весьма проблематичным. Один из вариантов
рещения проблемы - качественная фотофиксация образцов с формированием
цифрового архива.Современные флюоресцентные микроскопы оборудованы набором светофиль¬
тров, позволяющим использовать все основные флюорофоры, применяемые в
лабораторной диагностике методом ИФМ, Кроме того, флюоресцентный микроскоп
может работать как световой, что полезно при оценке морфологии препарата.Наиболее распространенный вариант ИФМ в клинической лабораторной диа¬
гностике вирусных инфекций — иммунофлюоресцентная микроскопия, когда для
визуализации используют не флюорохромы как красители, а антитела, конъюги¬
рованные с флюорохромом. Метод применяют в двух видах.•	Препарат окрашивают раствором антител, конъюгированных с флюорофо¬
ром (рис. 23-11), после чего подвергают микроскопическому анализу (пря¬
мой ИФМ).•	Препарат обрабатывают раствором антител против какого-либо антигена
возбудителя, отмывают в целях удаления несвязавшихся антител и повтор¬
но окрашивают раствором, содержащим конъюгированные с флюорофором
антитела (конъюгат) против первых антител. В большинстве протоколов реко¬
мендуют дополнительно обработать материал синькой Эванса для снижения
неспецифической флюоресценции. В некоторых коммерческих наборах синька
Эванса уже входит в состав лиофилизированного конъюгата. После этого пре¬
парат подвергают микроскопическому анализу (непрямой ИФМ).К достоинствам прямого варианта ИФМ следует отнести простоту выполнения
и относительную быстроту получения результатов. Однако прямой ИФМ имеет
ряд недостатков, в том числе меньшую чувствительность.Непрямой ИФМ более сложен (требуется несколько инкубаций и отмывок),
что повышает риск лабораторной ошибки и требует более высокой квалификации
584 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯПервичные Ат,
меченные ФИТЦОбразовавшиеся комплексы
Аг-Ат-конъюгат излучают
специфическое свечениеСхема прямого МФАПервичныеКонъюгатОбразовавшиеся комплексы
Аг-Ат-конъюгат излучают
специфическое свечениеСхема непрямого МФАРис. 23-11. Схема постановки прямого и непрямого микроскопического флюоресцентного ана¬
лиза.персонала. Вследствие увеличения количества этапов возрастает и общее время
исследования. Однако непрямой ИФМ обладает неоспоримым достоинством;
его чувствительность значительно выше, чем у прямого ИФМ, благодаря воз¬
можности одновременного связывания сразу нескольких антител конъюгата с
Рс-фрагментом первых антител. Вследствие такого мультисвязывания увеличива¬
ется сила флюоресцентного сигнала и, следовательно, чувствительность диагно¬
стического метода в целом.Методы прямого и непрямого ИФМ используют для непосредственного выяв¬
ления антигенов вируса в препаратах. Основу диагностикумов составляют полн¬
или моноклональные антитела, пол)гчаемые от иммунизированных животных
либо методом гибридомных технологий, в качестве примера типа диагностиче¬
ских наборов, зарегистрированных в РФ, можно привести наборы для диагности¬
ки герпеса I-II типа и цитомегаловируса в урогенитальных соскобах, наборы для
диагностики гриппа и наиболее значимых респираторных инфекций в мазках или
аспиратах из носоглотки, а также в секционном материале, наборы для выявления
антигенов вируса гепатита В в биоптате печени и т.п.С помощью непрямого ИФМ можно определять в качественном и количествен¬
ном вариантах специфические антитела к возбудителям инфекционных вирусных
заболеваний. Для установления присутствия в сыворотке крови антител к анти¬
генам вируса (например, возбудителя геморрагической лихорадки с почечным
синдромом) используются предварительно сорбированные на предметном стекле
клетки из клеточной культуры, зараженной вирусом. При инкубации с сывороткой
пациента, зараженного вирусом ГЛПС, содержащиеся в ней антитела связываются
с антигенами вируса. Не связавшиеся за время инкубации антитела и другие ком¬
поненты сыворотки удаляются при отмывке. Образовавшиеся комплексы «Аг-Ат»
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 585выявляются при инкубации с конъюгатом. В случае положительного результата
при микроскопическом анализе видны специфически светящиеся зернистые вну¬
триклеточные включения.При последовательном титровании сыворотки можно установить титр иссле¬
дуемых противовирусных антител по максимальному разведению, при котором
наблюдается специфическое свечение. Определение титра противовирусных анти¬
тел методом непрямого ИФМ в динамике (обычно через 2-3 нед после иссле¬
дования первой сыворотки) позволяет выявить нарастание титра при развитии
заболевания, снижение — завершении инфекционного процесса или постоянный
титр при наличии анамнестических антител.Таким образом, с помощью ИФМ можно обнаружить не только антигены виру¬
сов в микроскопируемом биологическом материале, но и антитела к исследуемым
вирусам, а также провести количественную оценку их содержания в динамике.Несмотря на очевидные достоинства метода (простоту исполнения, относи¬
тельную быстроту окрашивания, отсутствие повышенных требований к оснащен¬
ности лаборатории и т.п.), существует ряд факторов, ограничивающих широкое
использование ИФМ в лабораторной диагностике. Как все микроскопические
методы, ИФМ характеризуется субъективизмом интерпретации результата и тре¬
бует высокой квалификации персонала. При микроскопии разными операторами
даже одного и того же препарата можно получить противоречивые результаты.
Кроме того, повышенные требования предъявляются к взятию материала для
исследования. Например, неправильный забор клеток из носоглотки (недостаточ¬
ное количество или полное отсутствие эпителиальных клеток) ведет к получению
ложноотрицательного результата при ИФМ. Неверная оценка локализации све¬
чения (внеклеточное, а не внутриклеточное) может вызвать появление ложнопо¬
ложительных результатов, например при определении антител к вирусу ГЛПС в
сыворотке крови.Система внутрилабораторного контроля качества микроскопических иссле¬
дований методом ИФМ должна включать постановку положительных и отрица¬
тельных контролей, контролей чистоты антител и конъюгата, проверочные тесты
для оператора на панели арестованных препаратов. Подобные меры помогают
значительно снизить частоту неверных результатов и уменьшить субъективность
оценки препарата специалистом, проводящим микроскопический анализ методом
ИФМ.Методические аспекты иммунофлюоресцентного анализаДля метода ИФМ характерны простота постановки анализа и возможность
быстрого (1-2 ч) обнаружения широкого круга вирусных антигенов или опреде¬
ления титра специфических антител к какому-либо вирусу.ИФМ, как и многие другие методы твердофазного анализа, заключается в
последовательном проведении нескольких стадий. От методически правильного
выполнения каждой стадии анализа во многом зависит достоверность результатов,
а также чувствительность и специфичность метода.Для различных вариантов ИФМ (прямого, непрямого методов) можно выде¬
лить следующие общие этапы:забор и подготовку клинических материалов;^ приготовление фиксированных препаратов;формирование на фиксированных препаратах соответствующих иммуно-
химических комплексов, содержащих флюоресцентную метку;
удаление неспецифически связавшихся антител;
микроскопическую визуальную детекцию вирусных антигенов;^ интерпретацию результатов анализа.
■■586 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯшшшВзятие и подготовка клинических материалов к исследованию^	Объектом исследования в ИФМ могут быть клинические материалы из очаговпоражения: соскобы со слизистых оболочек и кожных покровов, носоглоточные
смывы, экссудаты, моча, мокрота, содержимое везикул, органы и ткани умерших
людей и животных, экспериментально зараженные культуры клеток. В практиче-
ММ1	здравоохранении ИФМ используют в основном для обнаружения вирусныхвозбудителей, вызывающих острые респираторные инфекции (ОРВИ), заболева¬
ния урогенитальной сферы и офтальмологические инфекции.Сроки взятия материала. Оптимальные сроки взятия материала при ОРВИ —
первые три дня от начала заболевания. На более поздних сроках происходит
элиминация вирусов в секреты дыхательных путей, что снижает их концентра¬
цию в пробах и тем самым значительно уменьшает результативность анализа.
Лабораторные исследования следует проводить до начала терапии или исключить
обработку зон поражения антисептиками за 1-2 сут до взятия материала.Особенности взятия материала. Важным условием получения достоверных
результатов ИФМ служит наличие в пробе достаточного количества интактных
клеток из очага поражения. Посторонние компоненты (слизь, кровь, гной, жир),
дающие интенсивную неспецифическую флюоресценцию, должны содержаться в
образцах в минимальных количествах.При диагностике ОРВИ соскобы берут со слизистых оболочек из задних, глу-
боколежащих отделов носоглотки, где находится основная диагностическая ткань
для детекции вирусов — цилиндрический мерцательный эпителий. Материал
может бьггь дополнен образцами из переднего отдела носа, выстланного плоским
эпителием, на котором возможна колонизация клеток бактериальной флорой.При конъюнктивитах соскобы берут из каждого глаза отдельно. Как правило,
количество эпителиальных клеток в этих образцах незначительно, поэтому образ¬
цы соскобов с конъюнктив сразу наносят на предметные стекла.При заболеваниях мочеполовой сферы делают соскобы со слизистой оболочки
уретры, заднего свода влагалища, канала шейки матки. При заболеваниях пред¬
стательной железы исследуют ее сок. При наличии везикул, эрозий на слизистых
и кожных покровах получают соскобы из оснований измененных участков тканей.
Для повышения достоверности диагностики следует брать образцы из нескольких
очагов поражения.Транспортировка и хранение клинигеских материалов. Возбудители вирусных
инфекций находятся внутри эпителиальных клеток. До фиксации клеток суспен¬
зию держат в пробирках с 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором (pH =
7,0-5-7,2 (ФСБ) не более 8-12 ч при температуре 4-6 Т). Замораживание образцов
не допускается.Приготовление клетогной суспензии. Пробирки с клеточной суспензией в ФСБ
встряхивают и концентрируют с помощью центрифугирования при 1000 об./мин
в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок клеток ресуспенди-
руют в минимальном объеме ФСБ.При необходимости следует предварительно оценить концентрацию клеток в
материале. Для этого готовят пробный мазок. 0Д"0,2 мл суспензии наносят на обе¬
зжиренное предметное стекло, высушивают, фиксируют спиртом в течение 5-10 мин
при комнатной температуре, окрашивают по Романовскому-П^мзе и микроско¬
пируют. При низком содержании клеток, что часто бывает в образцах соскобов из
уретры, сока простаты, слизистой оболочки носа у детей, материал концентрируют.
При высокой концентрации клеток (в гинекологическом материале, соскобах со
слизистой оболочки ротовой полости, языка) материал разбавляют ФСБ.
Приготовление фиксированных препаратовДля приготовления препаратов в ИФМ используют нефлюоресцирующие
стекла или полимерные слайды, покрытые поли-Ь-лизином. Если стекла имеют
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 587ободки лунок, полученные методом травления, стекла обезжиривают в 50% сер¬
ной кислоте в течение 1 ч, затем промывают 30 мин проточной водой и хранят в
дистиллированной воде. В тех случаях, когда ободки лунок на стеклах нанесены
нерастворимыми цветовыми полимерами, стекла обезжиривают замачиванием в
течение 1 ч в смеси Никифорова (50% спирта и 50% эфира по объему).В зависимости от конкретных задач клеточную суспензию наносят на стекло в
виде четко ограниченных капель объемом 15-20 мкл в количестве, соответствую¬
щем числу тестируемых антигенов. Если необходима более углубленная, уточняю- ■
щая диагностика при хронических и осложненных вирусных инфекциях, готовят
дублирующие мазки. Мазки-отпечатки из плотных проб получают, прикладывая
свежий срез исследуемого органа (ткани) к поверхности стекла. Для гистологиче¬
ских образцов используют нефиксированные криостатные срезы.При низкой концентрации клеток, наличии гноя, жировых включений и детри¬
та в клинических образцах для увеличения количества адсорбированных клеток
стекла предварительно обрабатывают раствором поли-Ь-лизина (молекулярная
масса 70-90 кДа), внося в каждую лунку по 10 мкл 1% раствора. Инкубируют не
менее 5 мин, промывают дистиллированной водой и высушивают.Мазки после высушивания фиксируют охлажденными органическими раство¬
рителями или обработкой сшивающими реагентами. Выбор способа фиксации
зависит от локализации определяемых антигенов. При фиксации органическими
растворителями (метанолом, метанолом/ацетоном 1:1, ацетоном) стекла с высу¬
шенными мазками погружают в заранее охлажденный до 10-20 °С органический
растворитель на 10-20 мин. Органические растворители должны бьггь высокой
степени очистки (хч, осч). Необходимо иметь в виду, что при этом частично уда¬
ляются растворимые и мембраносвязанные антигены.Для предотвращения вымывания антигенов вместо органических растворителей
используют сшивающие реагенты. Для этого на мазок наносят 15-20 мкл 1-4% рас¬
твора параформальдегида или раствор, содержащий 3% параформальдегида и
0,02% глутарового альдегида, с последующей 15-минутной инкубацией. Обработка
сшивающими реагентами позволяет увеличить чувствительность метода, что важно
в случае низкого содержания вирусных антигенов в клинических образцах.Зафиксированные мазки хранят при температуре 4-6 “С в течение 2-3 мес или
при -20 ‘'С ~ до года. Хранение препаратов в некоторых случаях важно для ретро¬
спективного анализа, контроля эффективности терапии и сохранения диагности¬
чески ценных, уникальных препаратов.Формирование на фиксированных препаратах иммунохимических ком¬
плексов, содержащих флюоресцентную меткуПри фиксации на каждый из мазков наносят по 25-50 мкл рабочих растворов
соответствующих специфических антител. В случае прямого варианта ИФМ мазки
обрабатывают антителами, содержащими флюоресцентную метку. При непрямом
варианте ИФМ обработку мазков проводят в две стадии. Сначала наносят анти¬
вирусные антитела или иммунную сыворотку, затем сформировавшийся комплекс
«антиген-антитело» выявляют с помощью специфического антивидового ФИТЦ-
конъюгата. Определяющим моментом на этих стадиях анализа служит специфич¬
ность реакций, характеризуемая величиной констант связывания комплекса
«антиген-антитело» и кинетикой процессов.Основной параметр, детерминирующий чувствительность и специфичность
ИФМ, — аффинность применяемых реагентов. Время этой стадии анализа во
многом зависит от скорости достижения равновесия в специфических реакциях
и, как правило, составляет 30-60 мин при комнатной температуре и 20-40 мин —
при температуре 36 С,В качестве флюоресцентной метки наиболее часто используют флюоресцеин.Его активная форма — флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ) — в физиологических
588 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯусловиях реагирует с аминогруппами специфических иммуноглобулинов, образуя
флюоресцентный конъюгат. Флюоресцеин имеет широкий спектр поглощения в
ультрафиолетовой и синей областях спектра и зеленый свет испускания. Это обу¬
словило его преимущество перед другими флюорохромами, так как зеленый свет
излучения редко наблюдается при аутофлюоресценции клеток тканей.Важная характеристика качества конъюгата — молярное соотношение ФИТЦ/
белок. В экспериментальных данных показано, что отношение значений опти¬
ческой плотности поглощения ФИТЦ (ОП — 490 нм) и оптической плотности
поглощения белка (ОП — 280 нм) должно быть 5-6 для конъюгатов, используе¬
мых в прямом варианте ИФМ, и 3-4 — для конъюгатов, применяемых в непрямом
варианте ИФМ.Удаление неспецифически связавшихся антителПосле каждого этапа инкубации раствора специфических антител на фиксиро¬
ванных мазках следует этап промывки с помощью раствора ФСБ. Ее цель заклю¬
чается в устранении неспецифических взаимодействий.Более результативная промывка обеспечивается добавлением в промывной
раствор неионных детергентов типа «Твин-20», что позволяет осуществлять
эффективную конкуренцию между белок-белковыми взаимодействиями и взаи¬
модействиями «белок-детергент». Поскольку все эти процессы равновесные, для
более полного устранения неспецифической сорбции необходима многократная
промывка мазков. Это способствует снижению уровня неспецифической и фоно¬
вой флюоресценции.Для уменьшения неспецифической сорбции из-за перекрестно реагирующих
антигенов в состав конъюгата вводят неспецифические иммуноглобулины, род¬
ственные антителам в конъюгате. Например, если конъюгат получен на основе
кроличьих антител, в состав конъюгата вводят до 1% нормальной кроличьей
сыворотки.Микроскопическая визуальная детекция вирусных антигеновУчет результатов ИФМ осуществляют с помощью люминесцентных микро¬
скопов, укомплектованных иммерсионным объективом (х90), сине-фиолетовыми
светофильтрами возбуждения и запирающим светофильтром, В качестве иммер¬
сионных жидкостей применяют 90% водный раствор глицерина с показателем
преломления 1,434, нефлюоресцирующее иммерсионное масло и диметилфталат.
Использование иммерсионных жидкостей позволяет повысить разрешающую спо¬
собность микроскопа, так как они имеют более высокий показатель преломления,
чем воздух. В результате регистрируемые лучи света, выходя из препарата, не рас¬
сеиваются и попадают в объектив микроскопа.При учете результатов ИФМ необходимо иметь в виду, что при длительном
освещении препарата имеет место снижение интенсивности специфической флюо¬
ресценции (выцветание) вследствие фотохимических реакций метки — ФИТЦ,
Этот процесс можно существенно замедлить, добавив на пробу 90% глицерина и
накрыв покровным стеклом. Рекомендуют проводить все стадии анализа после
добавления конъюгата при минимально возможном освещении.Для длительного хранения окрашенных эталонных или демонстрационных
препаратов следует каждый мазок накрыть покровным стеклом, края которого
загерметизировать лаком.Интерпретация результатов анализаПри интерпретации результатов ИФМ необходимо оценивать специфичность
флюоресценции и знать морфологические свойства изучаемого объекта.При гриппе и ОРВИ анализируют мазки из слизистой оболочки носоглотки.
Несмотря на клеточный полиморфизм, клетки легко типируются. Диагностически
значимы клетки цилиндрического эпителия: удлиненные, с мерцательным аппа¬
ратом и базально расположенным ядром, а также круглые и овоидные клетки с
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 589относительно большим ядром. Диагностически достоверно обнаружение в мазке
не менее трех клеток цилиндрического эпителия с характерной зеленой флюо¬
ресценцией. Не следует учитывать свечение в крупных полигональных клетках
плоского эпителия с небольшим, центрально расположенным ядром и в ярко све¬
тящихся лейкоцитах.Свечение антигенов вируса гриппа, адено- и герпес-вирусов наблюдается в ядре
и цитоплазме (рис. 23-12, см. цв. вклейку). Характерно многообразие свечений:
глыбчатое, гранулярное и диффузное; возможно тотальное свечение. Антигены
парагриппа, корона- и РС-вирусов локализуются в цитоплазме, при этом ядра
клеток остаются темными. При инфекциях, вызванных вирусами герпеса, пара¬
гриппа и РС-вирусом, возможно обнаружение многоядерных клеток (симпластов).
Интактные клетки не окрашиваются и имеют слабое свечение.При хронических инфекциях вирусные антигены определяются в стадии обо¬
стрения. При смешанных вирусно-бактериальных инфекциях в хронической
стадии вирусные антигены выявляются не всегда. Дополнительная информация о
возможной вирусной инфекции может быть получена при изучении рутинной мор¬
фологии мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Обнаруживают гигантские
одно- и многоядерные клетки, внутриядерные и цитоплазматические включения,
воспалительную инфильтрацию тканей при отсутствии или небольшом количестве
бактериальной флоры, деструктивные изменения, апоптотические клетки и клетки
со светлым ободком вокруг ядра — так называемые совиные глаза. Перечисленные
признаки могут свидетельствовать о цитопатогенном действии вирусных агентов
в исследуемых образцах. На основании цитологической патологии можно опреде¬
лить направление дальнейшего поиска вирусных антигенов: провести окрашива¬
ние дублирующих препаратов с помощью непрямого варианта ИФМ, имеющего
на порядок более высокую чувствительность, или осуществить исследование с
помощью других методов.Таким образом, высокая диагностическая ценность ИФМ может быть достигну¬
та при соблюдении следующих правил:•	образцы клинических материалов, полученные из очагов поражения, долж¬
ны содержать достаточное количество характерных для диагностируемых
тканей интактных клеток и минимум воспалительных и деструктивных ком¬
понентов ткани;•	техника взятия патологического материала должна быть безопасна для паци¬
ента и клинициста;•	доставку клинических образцов следует осуществлять в рекомендуемые
сроки (8-12 ч) с использованием специальных контейнеров и транспортной
среды при температурном режиме 4-8 “С;•	диагностические наборы и реагенты, применяемь1е в ИФМ, должны иметь
сертификаты;•	врач клинической лабораторной диагностики должен иметь соответствую¬
щую специализацию и опыт цитологической работы.Серологические методыТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ СЕРОДИАГНОСТИКИВ основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и анти¬
тела. Существуют две модификации серологических реакций.Обнаружение антител в сыворотке крови больногоВ этом случае из двух компонентов реакции неизвестным является сьшорот-
ка крови, содержащая антитела, поэтому для исследования требуется заведомо
известный антиген.
590ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯШШШ-Для диагностики вирусных инфекций в качестве антигенов традиционно исполь¬
зуют аллантоисную, амниотическую жидкости, суспензии хорионаллантоисных
оболочек и желточных мешков куриных эмбрионов, жидкую и клеточную (экс¬
тракты) фракции культур клеток, а также гомогенаты органов животных, содержа¬
щие определенные вирусы. Существуют коммерческие антигены для постановки
реакций торможения гемагглютинации (РТГА) и связывания комплемента (РСК).Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в сыворотке
крови антител, гомологичных используемому антигену. Отрицательный результат
указывает на отсутствие антител.Для получения достоверных результатов серологической диагностики необхо¬
димо изучать так называемые парные сыворотки крови больного, взятой в пер¬
вые дни и через определенный период времени (2-3 нед) от начала заболевания.
Четырехкратное и более увеличение титра антител во второй сыворотке по срав¬
нению с первой имеет диагностическое значение.Установление родовой, видовой и типовой принадлежности вирусаНеизвестный компонент реакции в этом случае — антиген. Исследование требу¬
ет постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками, которые
получают в результате длительной иммунизации животных (кроликов, морских
свинок, крыс, лошадей, ослов, баранов и др.) соответствующими, уже известными
антигенами. Иммунные сыворотки должны обладать специфичностью и высоким
содержанием антител. Уровень антител определяют в любой серологической реак¬
ции с разведениями антител или антигенов. Последнее из разведений, вызывающее
отчетливый положительный результат, называется титром сыворотки. Сыворотка
может быть специфичной в пределах рода, вида или типа и соответственно реаги¬
ровать с гомологичным антигеном и не реагировать с гетерологичным.Для серологической идентификации вирусов выпускают нативные сыворот¬
ки и адсорбированные. Неадсорбированные сыворотки отличаются высокими
титрами антител (до 1:12 500-1:25 ООО), но не свободны от антител к микробам
и неспецифических ингибиторов. Адсорбированные сыворотки обладают строгой
специфичностью, но низкими титрами и не подлежат разведению.РЕАКЦИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИМеханизм реакции прямой гемагглютинации (РГА) основан на природной
комплементарности участвующих в ней компонентов, а именно на способности
эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов. Реакция
не является серологической, так как протекает без участия иммунной сыворотки,
РГА используют для индикации вирусных агентов, титрования вируссодержащих
материалов и ориентировочной диагностики некоторых вирусных инфекций.
В серологических исследованиях РГА применяют при выборе рабочей дозы анти¬
гена, используемого в реакции торможения гемагглютинации.Для постановки реакции требуются: 1) растворимый антиген; 2) испытуемая
или стандартная иммунная сыворотка; 3) эритроциты; 4) изотонический раствор
натрия хлорида (физиологический раствор) (pH = 7,2^7,4); 5) пипетки градуиро¬
ванные и пастеровские; 6) пластинки с лунками из органического стекла.Используют эритроциты животных (барана, обезьяны, морской свинки), птиц
(петуха, гуся, голубя), человека — I (0) группы. Кровь собирают в стерильный
флакон со стеклянными бусами и дефибринируют, энергично встряхивая флакон в
течение 10-15 мин, или немедленно смешивают с равным объемом антикоагулянта
(2,5% раствором цитрата натрия или модифицированным раствором Алсевера —
2,5% глюкозы, 0,42% натрия хлорида, 0,83% цитрата натрия; pH = 6.4), Взвесь
эритроцитов в растворе антикоагулянта можно хранить 2-3 нед при 4 °С.Непосредственно перед применением осадок эритроцитов трижды отмывают,
каждый раз добавляя 10-кратные объемы физиологического раствора, перемеши¬
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 591шшвая и осаждая эритроциты путем центрифугирования при 1000 об./мин в течение
10 мин и затем сливая или отсасывая надосадочную жидкость и заменяя ее све¬
жим физиологическим раствором. Отмытые неразведенные эритроцить[ можно
использовать в течение 48 ч при условии хранения их на холоде, в виде 0,25-5,0%
взвеси в физиологическом растворе — в течение 1-7 дней. Нельзя допускать гемо¬
лиза или спонтанной агглютинации эритроцитов.Постановку реакции гемагглютинации осуществляют путем последовательного
двукратного разведения 0,2 мл антигена (вируса) физиологическим раствором в
лунках с округлым гладким дном панелей из плексигласа, начиная с 1:2 до 1:1024
или более вплоть до предполагаемого титра данного антигена. Затем в этот же ряд
лунок с разведенным антигеном добавляют по 0,2 мл физиологического раствора
и по 0,4 мл 0,25-1,0% взвеси эритроцитов. Одновременно осуществляют контроль
качества взвеси эритроцитов. Для этого к 0,4 мл физиологического раствора
добавляют 0,4 мл той же, что и в основном опыте, взвеси эритроцитов. Панели
энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре или при 4 X на
30-60 мин. Эритроциты кур оседают за 30 мин, эритроциты животньсх — медлен¬
нее, обычно в течение часа. В эти сроки и учитывают РГА.Результат оценивают в плюсах:«++++» — реакция положительная, образуется характерный осадок эритроци¬
тов в виде тонкой пленки с неправильными, слегка волнистыми краями, рас¬
пределяющийся равномерным слоем по всему дну, похожий на перевернутый
зонтик;«+++» — реакция положительная, осадок эритроцитов несколько менее широ¬
кий, но отчетливый, на дне лунки едва намечается кольцевая зона из осевших
эритроцитов;«++» — реакция неотчетливо положительная, «зонтик» эритроцитов заметно
меньше, на дне лунки формируется более плотная кольцевая зона;«+» — реакция слабоположительная, отмечается значительное оседание эри¬
троцитов на дне лунки в виде плотного диска с зернистой каймой;«-» — реакция отрицательная, на дне лунки образуется плотный осадок эритро¬
цитов в виде диска с ровными краями.Титром вируса считается то наибольшее его разведение, при котором еще
наблюдается полная агглютинация эритроцитов на 4 или 3 плюса. В контрольных
лунках эритроциты должны формировать плотный диск с ровными краями.РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИОдним из основных серологических методов, применяемых в вирусологиче¬
ской практике, считается реакция нейтрализации. Используют ее для диагностики
заболеваний вирусной этиологии, оценки противовирусных, профилактических и
диагностических препаратов.Реакция нейтрализации основана на способности антител, присутствующих в
иммунных сыворотках, предотвращать размножение вируса в различных чувстви¬
тельных системах: в организме животных, клеточных культурах, куриных эмбрио¬
нах. Применяют для типирования выделенных вирусов и титрования антител в
сыворотках переболевших.Для постановки реакции требуются:лабораторные животные, культуры клеток или развивающиеся куриные
эмбрионы;инфекционный вирус известного типа (при серологической диагностике
инфекции) или исследуемый (при идентификации выделенного вируса);
^ сыворотка исследуемая (при серологической диагностике инфекции) или
типоспецифическая (при идентификации выделенного вируса);
шприц объемом 1 мл;щв
1^1 592 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯпробирки и штативы к ним или 96-луночные полистироловые планшеты с
плоским дном для культивирования клеточных культур;
градуированные пипетки по 1 и 5 мл;изотонический раствор натрия хлорида или забуференный физиологиче¬
ский раствор для работы с клеточными культурами;
термостат с температурой 37 '’С или С02-инкубатор.Источником вируса для постановки реакции могут служить вируссодержащие
культуральные жидкости, а также экстракты из куриных эмбрионов и орга¬
нов зараженных животных. Вируссодержащий материал должен быть гомоген-
нь[М, освобожденным от крупных частиц путем центрифугирования при 1500-
3000 об./мин в течение 15 мин. Для постановки реакции нейтрализации необ¬
ходимо использовать вируссодержащий материал с известной активностью, чего
достигают предварительным его титрованием. Сроки хранения оттитрованной
вирусной суспензии зависят от типа вируса и указаны при описании лабораторной
диагностики каждой инфекции.Сыворотки для реакции нейтрализации в зависимости от цели постановки
реакции могут быть получены от специально вакцинированных животных либо от
людей, в чьих сыворотках необходимо определить содержание нейтрализующих
антител для верификации или постановки диагноза. Поскольку окончательным
подтверждением диагноза служит нарастание титра антител к вирусу, следует брать
сыворотки от больных в начале острого периода заболевания и спустя 1-2 нед (так
называемые парные сыворотки).Для постановки реакции нейтрализации с большинством вирусов сыворотки
не требуют специальной обработки, К некоторым же вирусам в сыворотках крови
человека и животных содержатся неспецифические термолабильные и термоста¬
бильные ингибиторы, нейтрализующие инфекционную активность вирусов. Для
инактивации неспецифических термолабильных ингибиторов сыворотки крови
человека, обезьян, лошадей, морских свинок прогревают 30 мин при температуре
56 "С, белых крыс и кроликов — при 60 “С, петухов — при 58 °С, (Методы высво¬
бождения сывороток от неспецифических термостабильных ингибиторов приве¬
дены при описании лабораторной диагностики каждой инфекции.) Обработанные
таким образом сыворотки используют сразу либо сохраняют в холодильнике при4-6 “С в течение 1-3 дней или в замороженном виде в течение более длительного
времени, необходимого для сбора парных сывороток.Возможны две модификации реакции, проводимой в асептических условиях:
возрастающие разведения суспензии, содержащей вирус, соединяют в рав¬
ном объеме с постоянной дозой сыворотки;^ возрастающие разведения сыворотки соединяют с постоянной дозой
вируса.Постановка реакции нейтрализации на лабораторных животныхПробирки расставляют в штативы параллельными рядами. Количество проби¬
рок в каждом параллельном ряду должно соответствовать числу разведений вируса
и превышать его биологический титр. Количество рядов должно соответствовать
числу взятых в опыт сывороток и контролей. Необходимыми контролями служат:
1) нормальная сыворотка; 2) активность вируса, взятого в опыт. Для первого
контроля в ряд пробирок вносят нормальную сыворотку, для второго — изотони¬
ческий раствор натрия хлорида по 0,5 мл каждого ингредиента в пробирку, сыво¬
ротки при этом не разводят или разводят 1:5.Во вспомогательном ряду готовят 10-кратные разведения вирусной суспензии,
наливая в каждую пробирку по 4,5 мл изотонического раствора натрия хлорида.
В первую пробирку добавляют 0,5 мл вирусной суспензии, осторожно спуская ее
по стенке пробирки и не касаясь пипеткой жидкости в проб11рке (это необходимо,
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 503чтобы не внести излишки вируса, остающиеся на стенках пипетки, и не исказить
истинное разведение вируса); пипетку сбрасывают в емкость с дезинфицирую¬
щим раствором. Другой пипеткой тщательно перемешивают содержимое первой
пробирки, набирают 0,5 мл суспензии и переносят ее во вторую пробирку и так
далее до последней пробирки ряда. Начиная с наибольшего разведения, вирусную
суспензию переносят в объеме 0,5 мл в соответствующие пробирки параллельных
рядов, содержащие в таком же объеме специфические сыворотки, нормальную
сыворотку или изотонический раствор хлорида натрия.Пробирки со смесями встряхивают и оставляют на 1-2 ч при комнатной тем¬
пературе или в термостате либо выдерживают 18-20 ч при 4 “С. По истечении
времени контакта смеси вводят лабораторным животным для индикации инфек¬
ционного вируса; на каждое разведение берется не менее четырех животных.
Способ введения, доза и время учета результатов варьируют в зависимости от
используемого животного и свойств вируса (приведены в описании лабораторной
диагностики каждой инфекции),О	наличии инфекционного вируса в смеси судят по гибели лабораторных
животных. Проводят учет результатов и рассчитывают по методу Рида и Менча
титры вируса в смеси с нормальной и в смеси с испытуемой сывороткой, за кото¬
рые принимают предельное разведение вирусной суспензии, вызвавшее гибель
50% зараженных животных. Это разведение рассматривают как одну дозуДля каждой исследованной иммунной сыворотки высчитывают индекс нейтра¬
лизации (максимальное количество летальных доз вируса, нейтрализованное дан¬
ной иммунной сывороткой по сравнению с контрольной, — Ш). Индекс нейтрали¬
зации вычисляют по разности логарифма титра вируса с нормальной и иммунной
сывороткой. Например: 5,22 - 1,77 = 3,45. По таблице антилогарифмов находят
соответствующее число, равное 28,18, которое выражает в нашем случае индекс
нейтрализации иммунной сыворотки, взятой в опыт. Ш от 1 до 10 принято считать
отрицательным, от 10 до 50 — сомнительным, выше 50 — положительным.При серологической идентификации выделенного вируса к различным, обычно
двукратным, разведениям известной типоспецифической сыворотки иммунизиро¬
ванных животных добавляют постоянное количество предварительно тщательно
оттитрованного вируса (обычно 100 Ь05д). В качестве контроля используют не
содержащую антител нормальную сыворотку, полученную от соответствующего
животного до иммунизации. Продолжительность контакта вируса с сывороткой и
температура инкубации варьируют в зависимости от исследуемого вируса. После
инкубации смесь вируса с сывороткой вводят животным. Нейтрализующую актив¬
ность сыворотки выражают ее титром, то есть тем наибольшим разведением,
которое предотвращает гибель половины инокулированных животных. Тип вируса
устанавливают по типоспецифической сыворотке, которая показала наивысший
индекс нейтрализации.При исследовании парных сывороток больного с целью ретроспективной диа¬
гностики инфекции каждую из сывороток исследуют с несколькими типами виру¬
сов. Контролем в реакции может служить сыворотка больного, взятая в острой
стадии заболевания. Возбудителем заболевания считают вирус того серологиче¬
ского типа, по отношению к которому вторая из парных сывороток показала наи¬
больший индекс нейтрализации.Постановка реакции нейтрализации в куриных эмбрионахРеакцию нейтрализации в куриных эмбрионах проводят двумя способами;^ с учетом результатов реакции по гемагглютинирующей активности;^ с учетом результатов по обнаружению морфологических изменений в
виде оспин на хорионаллантоисных оболочках.Соблюдают общие правила предварительного определения биологической
активности вируса, разведения вируса или сыворотки, соединения ингредиентов.Ушдаш
594 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯвремени контакта и температуры, при которой его осуществляют. Способ введе¬
ния полученных смесей зависит от тропизма вируса к тканям куриного эмбриона.
Так, вирус гриппа и Ньюкасла вводят в аллантоиснз^’ю полость, вирусы вакцины и
ЩЬ натуральной оспы — на хорионаллантоисную оболочку, ряд вирусов, вызываю-
щих энцефалиты, — в желточный мешок. На каждый вариант разведения берут по
эмбрионов, вносят по 0,1-0,2 мл смеси вируса и сыворотки.||||.	При постановке реакции первым способом используют 10-11 - дневные эмбрио¬ны. После 2-3 дней инкубации при 35-37 "С эмбрионы вскрывают и определяют
наличие вируса в аллантоисной жидкости каждого эмбриона с помощью реакции
гемагглютинации.Если в реакции используют постоянную дозу сыворотки и возрастающие раз¬
ведения вируса, то оценивают титры вируса в опыте и контроле, а затем индекс
нейтрализации испытуемых сывороток. За титр вируса принимают предельное
его разведение в смеси с сывороткой, вызвавшее у 50% зараженных эмбрионов
образование гемагглютининов при наличии их в аллантоисной жидкости эмбрио¬
нов, зараженных вирусом в смеси с физиологическим раствором или нормальной
сывороткой.Если же в реакции применяют постоянную дозу вируса (обычно 100 или
1000 ИД,о) и возрастающие разведения сыворотки, то нейтрализующую актив¬
ность последней выражают ее титром, то есть наибольшим разведением, предот¬
вратившим развитие гемагглютинации в половине инфицированных эмбрионов.Постановку реакции вторым способом осуществляют путем внесения по 0,1 мл
подготовленных суспензий на хорионаллантоисную оболочку 4-6 эмбрионов
12-дневного возраста. Через 48 ч инкубации при 37-39 “С эмбрионы вскрывают,
подсчитывают количество оспин (бляшек) на каждой хорионаллантоисной оболоч¬
ке и находят среднеарифметическое для каждого разведения сыворотки или вируса.
За титр вируса или антител сыворотки принимают предельное их разведение, в
котором наблюдается погашение 50% и более оспин, образуемых в контроле с рабо¬
чим разведением вирусной суспензии в смеси с физиологическим раствором.Постановка реакции нейтрализации в культурах клетокПри реакции нейтрализации в культурах клеток ход реакции такой же, как и при
постановке ее на лабораторных животных. Опыты проводят в строго асептических
условиях.В эксперименте могут быть использованы культуры различных линий переви¬
ваемых клеток, а также культуры первично-трипсинизированных тканей, но такие,
в которых вирус проявляет отчетливое цитопатическое действие. Источником
вируса могут служить культуральная жидкость или экстракт инфицированных и
дезинтегрированных культур клеток, подвергнутых повторному 3-5-кратному
замораживанию и оттаиванию.Инфекционный материал освобождают от клеточного детрита путем центрифу¬
гирования при 2000-3000 об./мин в течение 10-15 мин. Затем в поддерживающей
среде или физиологическом растворе готовят десятикратные разведения вирусной
суспензии в количестве, превышающем предельную биологическую активность
вируса на 1-2 разведения. По ОД мл каждого разведения вируса вносят в четыре
пробирки с однослойной культурой клеток, в которых предварительно заменяют
ростовую среду на поддерживающую.Зараженные культуры клеток инкубируют при 37 'С в течение 5-14 сут в
зависимости от типа вируса. Далее оценивают результаты по цитопатическому
действию вируса и рассчитывают одну ТЦД^^, то есть то предельное разведение
вируса, которое вызывает развитие ЦПД в 50% зараженных культур клеток.
В реакции нейтрализации используют 10 или 100 ТЦДдц, содержащиеся в 0,1 мл
вирусной суспензии.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 595Для серологической идентификации выделенного вируса постоянное его разве¬
дение в объеме 0,5 мл добавляют к равному объему двукратных разведений испы¬
туемых типоспецифических и нормальной сывороток. Параллельно ос^тцествляют
контроль активности вируса и токсичности сыворотки.Контроль активности вируса. То же рабочее разведение вируса соединяют
аналогичным образом с физиологическим раствором. Во второй модифика¬
ции постановки реакции нейтрализации в целях типирования выделенного
вируса и одновременной серологической диагностики инфекции для контро¬
ля правильности выбранного рабочего разведения вируса его разводят в 10,
100 и 1000 раз и каждое разведение вносят в объеме 0,1 мл в контрольные
пробирки с культурой клеток, добавляя по 0,9 мл поддерживающей питатель¬
ной среды или физиологического раствора.Контроль токсичности сыворотки. Сыворотку в исходном разведении соеди¬
няют с физиологическим раствором. Пробирки со смесями инкубируют при
37 °С или при комнатной температуре в течение 1-2 ч. В пробирках с культу¬
рами клеток того же типа, который использовался для титрования инфекцион¬
ной активности вируса, предварительно меняют ростовую среду на поддержи¬
вающую, добавляя по 0,8 мл в каждую пробирку. Оставляют четыре пробирки
с незараженными культурами клеток, внося в них по 1,0 мл поддерживающей
питательной среды (контроль состояния клеток в течение опыта).После инкубации каждую из опытных и контрольных смесей последовательно
вносят по 0,2 мл в четыре пробирки с культурами клеток, содержащими поддержи¬
вающую питательную среду. Инокулированные и контрольные культуры клеток
помещают в термостат при 35-37 °С и периодически проверяют состояние клеток
под микроскопом, в процессе относительно короткого (недельного) инкубирова¬
ния питательную среду можно не менять, при более длительном инкубировании
питательную среду заменяют на свежую. При развитии специфической дегенера¬
ции клеток в контрольных культурах, зараженных вирусом без добавления сыво¬
ротки, проводят учет результатов. Определяют предельное разведение сыворотки,
нейтрализовавшее цитопатическое действие вируса в 50% зараженных культур, и
принимают его за титр антител для каждой из испытуемых сывороток. Тип выде¬
ленного вируса соответствует типу той иммунной сыворотки, которая оказывается
специфической для выделенного вируса, то есть предупреждает развитие специфи¬
ческой дегенерации клеток в наиболее высоком титре.При постановке реакции нейтрализации с целью ретроспективной диагностики
заболевания используют вторую модификацию, когда предварительно определя¬
ют цитопатогенный титр всех серологических типов вирусов, которые необходимо
взять в реакцию для исследования парных сывороток. Приготовленных во вспо¬
могательном ряду двукратных разведений каждой сыворотки больного должно
быть достаточно для соединения со всеми типами вирусов. В пробирки каждого
ряда добавляют равные объемы вирусов в рабочей дозе, равной 100 ЦПД^^, вируса
в 0,1 мл. Одновременно ставят необходимые контроли активности примененных
доз всех типов вирусов, цитотоксичности сывороток и их разведений. Условия
проведения реакции аналогичны предыдущим. Об этиологическом значении одно¬
го из примененных типов вируса судят по наличию четырехкратного и большего
прироста титра антител во второй сыворотке больного по сравнению с первой.Реакция нейтрализации с учетом результатов по гемадсорбцииРеакцию нейтрализации гемадсорбции выполняют в культуре клеток, исполь¬
зуют при работе с гемадсорбирующими вирусами для типирования выделенных
вирусов и титрования антител в парных сыворотках больных.Вначале определяют гемадсорбирующий титр вируса, для чего 10-кратные
разведения вируса в поддерживающей питательной среде или физиологическом»1
596 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯрастворе вносят по 0,1 мл в пробирки с чувствительными к вирусу клеточными
культурами, после предварительной замены ростовой питательной среды на под¬
держивающую. Каждым разведением вируса заражают не менее двух лунок. Срок
и температура инкубации в термостате зависят от оптимальных условий культиви¬
рования того или иного вируса.Результаты титрования учитывают с помощью реакции гемадсорбции. Для этого
Р во все пробирки добавляют по 0,2 мл 0,4% взвеси отмытых эритроцитов, чувстви¬
тельных к гемагглютинирующему действию данного вируса гп vitro. Пробирки
выдерживают 20-30 мин при температуре, оптимальной для проявления гемаг¬
глютинирующей активности вируса. Затем монослой клеток 1-2 раза промывают
физиологическим раствором и, слегка покачивая или вращая, просматривают под
малым увеличением микроскопа.При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксируются на клетках, пора¬
женных вирусом, и образуют характерные скопления островкового типа или рас¬
пределяются диффузно, но не уплывают при покачивании пробирки. На поверх¬
ности клеток, не содержащих вируса, эритроциты не адсорбируются и свободно
проплывают в поле зрения. Предельное разведение вирусной суспензии, давшее
положительный результат гемадсорбции в половине зараженных культур, прини¬
мают за одну гемадсорбирующую единицу. В опыт берут 10-100 ТЦД^^ вируса.Сыворотки инактивируют 30 мин при 56 °С и готовят двукратные разведения
(от 1:10 до 1:1280 и далее по необходимости). К двукратным разведениям сыво¬
ротки в объеме 0,2 мл добавляют равный объем вирусной суспензии, содержащей
10 или 100 гемадсорбирующих единиц вируса. Смеси выдерживают 1-2 ч при
комнатной температуре или 18 ч — при 4 “С. Затем по 0,2 мл каждой смеси вносят
в две пробирки с культурами клеток того же вида, что и при определении гемад-
сорбирующего титра вируса. Контролируют также гемадсорбирующую активность
взятой в опыт дозы вируса, соединенной с поддерживающей питательной средой
или физиологическим раствором.Пробирки помещают в термостат и при появлении в отдельных контрольных
культурах, зараженных вирусом, четкого цитопатического эффекта в них вносят
по 0,2 мл 0,4% взвеси чувствительных к гемагглютинирующему действию виру¬
са эритроцитов, выдерживают 20-30 мин при той же температуре, при которой
определяли гемадсорбцию в контрольных культурах, и учитывают результаты
путем микроскопирования.При нейтрализации вируса специфическими антителами эритроциты не адсор¬
бируются на зараженных клетках. Положительная гемадсорбция наблюдается в
культурах клеток с контролем вирусной активности, а также в культурах, заражен¬
ных смесями, в которых вирус нейтрализован антителами частично или совсем не
нейтрализован. За титр антител в сыворотке принимают то ее предельное разведе¬
ние, которое нейтрализовало гемадсорбирующую активность взятой в опыт дозы
вируса в 50% зараженных клеточных культур.Типирование выделенных вирусов и исследование парных сывороток больных
для ретроспективной диагностики инфекций проводят так же, как во второй моди¬
фикации реакции нейтрализации по цитопатическому эффекту.РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИРеакцию торможения гемагглютинации (РТГА) применяют для диагностики
вирусов, обладающих способностью агглютинировать эритроциты. Соединение
вирусных антигенов с антителами иммунной сыворотки приводит к подавлению
этой способности, выражаемому в задержке (торможении) феномена агглюти¬
нации эритроцитов. С помощью РТГА проводят титрование вируссодержащих
материалов, идентификацию и типизацию вирусных антигенов, серологическую
диагностику вирусных инфекций.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 597Для постановки реакции используют:эритроциты человека (О группы), млекопитающих (чаще всего морской
свинки) или птиц (кур, гусей, голубей), трижды отмытые физиологиче¬
ским раствором и приготовленные в виде о,5-1,0% суспензии:^ антиген — вируссодержащий материал, полученный из инфицированных
куриных эмбрионов, культуры клеток или животных и освобожденный от
крупных частиц путем центрифугирования, отстаивания или фильтрова¬
ния;антитела — специфические иммунные сыворотки, освобожденные от
неспецифических ингибиторов вирусной гемагглютинации (способы уда¬
ления ингибиторов — см. «Ингибиторы гемагглютинации»);
обычный физиологический раствор или забуференный физиологический
раствор pH = 7,0^7,4. Последний готовят путем растворения 8,5 г NaCl,
0,56 г NaHPO^ и 0,14 г КН2?0^ в 1 л дистиллированной воды и используют
для разведения антигенов (кроме арбовирусных), иммунных сывороток и
приготовления суспензии эритроцитов необходимой концентрации.Для РТГА используют пластины из органического стекла с лунками. Вначале
титруют антиген в реакции гемагглютинации в целях выбора необходимого рабо¬
чего разведения, которое, как правило, должно содержать 4 агглютинирующие
единицы (АЕ) в 0,2 мл физиологического раствора. Для некоторых вирусных
антигенов используют 2 или 1 АЕ (вирус оспы, кори соответственно) или 8 АЕ
(арбовирусы). Антиген разводят физиологическим раствором так, чтобы полу¬
чить 4 АЕ в 0,2 мл. Число, соответствующее титру вируса 1:640, определенному в
объеме 0,2 мл, делят на 4 и получают: 640:4=160, то есть антиген нужно развести
в 160 раз.Подготовленное для РТГА рабочее разведение антигена контролируют допол¬
нительно, чтобы убедиться, что в 0,2 мл его содержится 4 АЕ. Для этого исполь¬
зуют два ряда по четыре лунки. Во вторую, третью и четвертую лунки первого и
второго ряда наливают по 0,2 мл физиологического раствора, а в первую лунку
второго ряда — 0,4 мл. В первую и вторую лунку первого ряда и в первую лунку
второго ряда вносят по 0,2 мл рабочего разведения антигена. Титруют его в первом
ряду, начиная со второй лунки ряда, путем переноса 0,2 мл перемешанного рас¬
твора в следующую лунку; из последней лунки 0,2 мл удаляют. В первой лунке
второго ряда смесь антигена и физиологического раствора перемешивают, 0,2 мл
смеси удаляют и титруют антиген, как в первом ряду. Затем во все лунки вносят по
0,2 мл физиологического раствора и по 0,4 мл 1% взвеси эритроцитов. В допол¬
нительные четыре лунки третьего ряда для контроля эритроцитов добавляют
по 0,4 мл физиологического раствора и по 0,4 мл взвеси эритроцитов. Пластины
встряхивают и оставляют при комнатной температуре до оседания эритроцитов в
контрольных лунках.При правильно приготовленном рабочем разведении антигена в первой, второй
и третьей лунках первого ряда, содержащих 4, 2 и 1 АЕ соответственно, а также
в первой и второй лунках второго ряда, содержащих 3 и 1,5 АЕ соответственно,
должна наблюдаться агглютинация эритроцитов. В остальных лунках агглютина¬
ция может быть незначительной или совсем отсутствовать. При ином характере
агглютинации в лунках необходимо внести коррективы в рабочее разведение
антигена, добавив необходимое количество антигена или физиологического рас¬
твора и заново перетитровав полученное разведение.Ингибиторы гемагглютинацииНеспецифические термолабильные и термостабильные ингибиторы агглютина¬
ции обладают способностью соединяться с вирусами и тормозить агглютинацию
эритроцитов. Ингибиторы агглютинации содержатся в сыворотках человека и
Шр
§598ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯвЖИВОТНЫХ или появляются при длительном хранении сывороток в жидком состоя¬
нии на холоде.От термолабильных ингибиторов освобождаются путем прогревания сыворо¬
ток в течение 30 мин при 56 °С или 20 мин при 60 ’С (при этом, чтобы избежать
возможного свертывания, цельную сыворотку перед инактивацией разводят
физиологическим раствором 1:10).Для устранения термостабильных ингибиторов используют методы обработки
сывороток углекислотой, перйодатом калия, каолином и эритроцитами, фильтра¬
том холерного вибриона.Обработка сывороток углекислотой. Обычно такой обработке подвергают
противогриппозные сыворотки. Цельную сыворотку разводят дистиллирован¬
ной водой 1:10 и пропускают через нее углекислый газ 5-7 мин до интенсивного
помутнения. Вместо газообразной кислоты можно использовать сухой лед, кото¬
рый небольшими кусочками опускают в дистиллированную воду в течение 10 мин
и затем этой водой, насыщенной углекислотой, разводят сыворотки 1:10.Обработанную и помутневшую сыворотку освобождают от образовавшихся
хлопьев белка, содержащих неспецифические ингибиторы, путем центрифугиро¬
вания при 1500 об./мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отсасывают
и добавляют 1/10 объема 8,5% раствора ЫаС1 для восстановления в сыворотке
изотонической концентрации хлорида натрия. Сыворотку, обработанную таким
образом, не нужно прогревать, так как она уже освобождена и от термостабиль¬
ных, и от термолабильных ингибиторов, при этом титр специфических антител
практически не снижается.Обработка сывороток перйодатом калия (КЮ^. Обычно этот способ обра¬
ботки применяют для противогриппозных сывороток. Готовят 0,05 М раствор
КЮ^ на дистиллированной воде. 1,15 г КЮ^ добавляют в 100 мл дистиллирован¬
ной воды и подогревают для лучшего растворения на водяной бане при 70-80 “С
в течение 2-5 мин. Хранить приготовленный раствор можно 6 мес при 4 ‘’С. Для
удаления осадка, образовавшегося при стоянии на холоде, раствор перйодата
калия повторно подогревают на водяной бане. Неразведенные сыворотки сначала
прогревают при 56 °С 30 мин, а затем смешивают с раствором перйодата калия в
равных объемах и оставляют для контакта на 2 ч при комнатной температуре. Для
нейтрализации активности перйодата к смеси добавляют 5% раствор глюкозы в
соотношении 1:1. При РТГА следует учитывать, что разведение сыворотки после
обработки соответствует 1:4.Обработка сывороток каолином и эритроцитами. Способ применяют для
обработки противокоревых, краснушных и парагриппозных сывороток. К 0,2 мл
сыворотки добавляют 0,8 мл физиологического раствора и 1 мл 25% взвеси као¬
лина в физиологическом же растворе. Смесь выдерживают 20 мин при комнатной
температуре, периодически встряхивая, и центрифугируют при 1000 об./мин
10 мин. Сыворотки отсасывают и на каждый миллилитр добавляют 0,1 мл 50%
взвеси эритроцитов. Смесь выдерживают 1 ч при 4 "С, эритроциты осаждают
центрифугированием при 1000 об./мин в течение 10 мин, сыворотку считают раз¬
веденной 1:10.РТГАРеакцию применяют для определения титра антител в сыворотках от больных
(по известному вирусу) или для установления вида или типа вируса (по известной
сыворотке). Готовят двукратные разведения испытуемых сывороток от больных
или типоспецифических иммунных сывороток в физиологическом растворе от
1:10 до 1:640 и выше (при ожидании более высокого титра антител) и разливают
по 0,2 мл в лунки плексигласовой панели. В каждую лунку добавляют по 0,2 мл
рабочего разведения антигена, содержащего 4 АЕ.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 599у/✓Одновременно ставят три контроля:^ контроль эритроцитов, для чего к 0,4 мл физиологического раствора
добавляют 0,4 мл используемой взвеси эритроцитов;
контроль используемой сыворотки на способность агглютинировать эри¬
троциты — к 0.2 мл исходного разведения сыворотки добавляют 0,2 мл
физиологического раствора и 0,4 мл взвеси эритроцитов;
контроль специфичности антигена (при ретроспективной диагностике
инфекций) со стандартной иммунной сывороткой — к 0,2 мл иммунной
сыворотки в разведении 1:10 добавляют 0,2 мл рабочего разведения анти¬
гена и 0,4 мл взвеси эритроцитов.Кроме того, ставят контроль титра рабочего разведения антигена, как описано
выше.Панели встряхивают, выдерживают в течение 30 мин-2 ч при комнатной тем-
перат}фе и вносят по 0,4 мл 0,25-1,0% взвеси эритроцитов, использованной для
определения гемагглютинирующего титра антигена. Панели снова встряхивают и
оставляют до оседания эритроцитов в контрольных лунках при той температуре,
при которой оценивали гемагглютинирующий титр антигена. Если используемая
сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов, ее обрабатывают одним из ука¬
занных выше способов в целях истощения гемагглютининов.Результаты РТГА учитывают по характеру оседания эритроцитов. В разведе¬
ниях сыворотки, содержащей высокую концентрацию специфических антител,
гемагглютинирующая активность антигена полностью подавляется, и эритроциты
оседают на дно лунки, образуя четкую точку, как и в контроле. По мере разведения
сыворотки количество антител в ней уменьшается и больше проявляется гемаг¬
глютинирующая активность антигена: появляется «зонтик» из склеивающихся
эритроцитов. За титр антител в сыворотке принимают предельное ее разведение, в
котором наблюдается полное подавление гемагглютинирующей активности анти¬
гена.При использовании РТГА для серологической диагностики вирусных инфек¬
ций парные сыворотки больных титруют одновременно с несколькими типовыми
антигенами, специфичность которых заранее проверена эталонными типоспе¬
цифическими сыворотками. Для каждого антигена предварительно определяют
гемагглютинирующий титр и готовят рабочее разведение, содержащее 4 АЕ в
0,2 мл. Ход реакции аналогичен. Четырехкратное и более увеличение титра анти¬
тел к одному из антигенов во второй сыворотке по сравнению с первой имеет
диагностическое значение и свидетельствует о том, что заболевание было вызвано
вирусом этого серологического типа.При использовании РТГА для определения вида или типа вируса по известной
иммунной сыворотке готовят двукратные разведения типоспецифических сыворо¬
ток, которые в объеме 0,2 мл соединяют с равным объемом рабочего разведения
антигена, содержащего 4 АЕ. Дальнейший ход реакции обычный. Типовую при¬
надлежность вьщеленного вируса устанавливают по его соответствию специфиче¬
ской иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр антител к этому вирусу.РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИРеакция непрямой гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты
животных и человека после обработки дубильной (таниновой) кислотой при¬
обретают способность адсорбировать на своей поверхности белковые молекулы
антигенов, которые затем агглютинируются специфическими иммунными сыво¬
ротками либо молекулами сывороточных белков, которые могут агглютиниро¬
ваться при взаимодействии с гомологичными антителами. По чувствительности
и специфичности РНГА часто превосходит другие серологические реакции, такие
как реакция связывания комплемента.
600 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯв лабораторной диагностике РНГА используют как для определения и иден¬
тификации неизвестного возбудителя заболевания, так и для ретроспективной
серологической диагностики путем обнаружения антител в парных сыворотках
больного.Методика постановки РНГА включает следующие основные этапы:приготовление взвеси эритроцитов, обработанных формалином и тани¬
ном;приготовление антигена и определение его рабочей дозы;^ сенсибилизацию эритроцитов антигеном и постановку основного опыта.Для реакции чаще всего используют эритроциты барана, обезьян или человека
группы крови 0. Предпочтительны формалинизированные эритроциты, поскольку
они не лизируются в присутствии танина и при адсорбции антигена.Необходимо приготовить следующие растворы:физиологический раствор (0,85% раствор ЫаС1);^ фосфатно-буферные растворы (ФБР) с pH = 7,2 и 6,4. Вначале готовят два
раствора: 26,85 г двузамещенного фосфата натрия (Ыа^НРО^) в 1 л воды;
20,4 г однозамещенного фосфата калия (КН^РО^) в 1 л воды.Эти растворы можно использовать в течение 7-10 дней при условии хранения
в холодильнике. Непосредственно перед постановкой реакции готовят забуфе-
ренные физиологические растворы. Для получения раствора с pH = 7,2 к 100 мл
физиологического раствора добавляют 7,61 мл раствора двузамещенного фосфата
натрия и 23,9 мл раствора однозамещенного фосфата калия. Для приготовления
физиологического раствора с pH = 6,4 к 100 мл физиологического раствора при¬
бавляют 32,3 мл раствора двузамещенного фосфата натрия и 67,7 мл раствора
однозамещенного фосфата калия.Формалинизирование эритроцитов. Кровь барана собирают асептически и
дефибринируют во флаконе со стеклянными бусами. Эритроциты трижды отмы¬
вают физиологическим раствором с pH = 7,2 и готовят из отмытого осадка 8%
суспензию. К одному объему 8% взвеси эритроцитов добавляют один объем 3%
формалина (pH = 7,2, который устанавливается с помощью 0,1н раствора NaOH в
физиологическом растворе). Колбу со смесью помещают в термостат при 37 “С на
18-20 ч, при этом первые 4-6 ч эритроциты перемешивают на магнитной мешал¬
ке. Затем их четыре раза отмывают и готовят 10% суспензию эритроцитов на
забуференном физиологическом растворе с pH = 7,2. К этой суспензии добавляют
мертиолят натрия до 1:10 ООО. Формалинизированные эритроциты разливают по
небольшим флаконам и сохраняют при 2-4 “С в течение 6 мес.Обработка эритроцитов танином. Раствор танина в физиологическом раство¬
ре с pH = 7,2 (1:20 ООО) готовят непосредственно перед обработкой эритроцитов;
танин должен обладать хорошей растворимостью, хранить его следует в темной
посуде в прохладном и сухом месте. Из осадка трижды отмытых физиологическим
раствором эритроцитов готовят 2,5% взвесь в ФБР с pH = 7,2. Смешивают равные
объемы взвеси эритроцитов и свежеприготовленного раствора танина и оставляют
на 15 мин при 37 °С в термостате или водяной бане или на 30 мин при комнатной
температуре. Затем смесь центрифугируют 10-20 мин при 1500-2000 об./мин,
надосадочную жидкость сливают, а осадок эритроцитов промывают тем же ФБР и
доводят до исходной концентрации 2,5%.Сенсибилизация эритроцитов. 1 мл обработанной танином 2,5% суспен¬
зии эритроцитов смешивают с 1 мл антигена и 4 мл буферной смеси (pH = 6,4).
Сенсибилизацию проводят в течение 2 ч при 37 “С. Затем эритроциты отмывают
два-три раза физиологическим раствором путем центрифугирования 1-2 мин при
1000-1500 об./мин. Разведение сенсибилизированных танинизированных эри¬
троцитов для основного опыта с испытуемой сьшороткой осуществляют нормаль¬
ной кроличьей сывороткой 1:100 (для стабилизации взвеси).
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 6Q1Реакция непрямой гемагглютинации для детекции уровня антител.Перед титрованием испытуемых сывороток необходимо определить рабочую дозу
антигена, способную при адсорбции на эритроцитах обеспечить максимальный
титр соответствующей иммунной сыворотки. Вначале сенсибилизируют антиген,
для чего его разводят ФБР фН = 7,2) и соединяют с эритроцитами, разведенными
тем же ФБР таким образом, чтобы получить четыре различных разведения анти¬
гена.Реакцию учитывают по четырехплюсовой системе через 2 ч инкубирования пла¬
стин при температуре, оптимальной для взаимодействия ингредиентов реакции:«++++» — реакция положительная, эритроциты равномерно распределены по
всей лунке пластины в виде зонтика с неровными краями;«+++» — реакция положительная, на фоне склеившихся в виде пленки эритро¬
цитов в центре имеется небольшое кольцо из осевших эритроцитов;«++» — реакция положительная, меньшая степень агглютинации с большим
количеством несклеившихся эритроцитов;«+» — реакция слабоположительная, наблюдается очень незначительная сте¬
пень агглютинации, почти все эритроциты оседают в виде небольшого
диска;— реакция отрицательная, как и в контроле, скопление эритроцитов имеет
вид плотного диска или пуговки.Рабочей дозой антигена считают дозу, при которой иммунная сыворотка реа¬
гирует в реакции гемагглютинации на «++» в самом большом разведении и при
полном отсутствии гемагглютинации в контролях.В каждом опыте следует контролировать все ингредиенты реакции. В связи с
этим в РНГА для исключения неспецифических реакций предусмотрены следую¬
щие контроли.Контроль специфичности реакции. Для этого реакцию ставят с заведомо
специфичными иммунными сыворотками, которые разводят нормальной
кроличьей сывороткой (1:100) от 1:10 до 1:1280 и разливают по 0,4 мл в
лунки пластин. К разведениям сыворотки добавляют по 0,2 мл эритроци¬
тов, сенсибилизированных рабочим разведением используемого антигена.
При учете результатов в этом контроле реакция должна быть положитель¬
ной.Контроль стабильности и отсутствия спонтанной агглютинации танини¬
зированных эритроцитов. Ставят в две лунки со взвесью сенсибилизиро¬
ванных и несенсибилизированных эритроцитов в разведенной нормальной
сыворотке. В этих лунках реакция должна быть отрицательной.Титром антител считают последнее разведение сыворотки, которое вызывает
склеивание эритроцитов при почти полном просветлении надосадочной жидко¬
сти (++).РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТАРеакция связывания комплемента (РСК) представляет собой достаточно высо¬
кочувствительный метод лабораторного исследования in vitro и применяется для
обнаружения соответствующих антител при бактериальных и вирусных инфекци¬
ях, а также для типирования вирусов,РСК - непрямая двухсистемная гетерологичная пятикомпонентная реакция,
В ней участвуют две системы «Аг-Ат» различной специфичности и система ком¬
племента. Первая система — «Аг-Ат» — опытная, вторая — «АГ1-АТ1» — инди¬
каторная.РСК основана на том, что при взаимодействии в опытной системе Аг и Ат (в
исследуемой сыворотке содержатся антитела, гомологичные антигену) образуется
специфический комплекс «Аг+Ат», который адсорбирует (связывает) комплемент.
1%;
1^'Л602 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯпри отсутствии специфического сродства между Аг и Ат (в сыворотке отсутствуют
антитела к соответствующему антигену) комплекс «Аг+Ат» не формируется и ком¬
племент остается свободным.Однако процесс взаимодействия комплемента с опытной системой является
невидимым, поэтому на втором этапе в реакцию вводят вторую, заведомо специ¬
фическую индикаторную систему «АГ1+АТ1» (так называемую гемолитическую
систему, представляющую собой смесь эритроцитов барана и гемолитической
сыворотки, содержащей антитела — гемолизины — против эритроцитов барана),
которая свидетельствует о результатах РСК.Если в первой системе связывание комплемента происходит (положительный
результат), в индикаторной системе не возникает задержки гемолиза эритроци¬
тов.Если адсорбции комплемента в опытной системе не наступает (отрицатель¬
ный результат РСК), комплемент вовлекается в реакцию между гемолитической
сывороткой и чувствительными эритроцитами. Вследствие этого в индикаторной
системе появляется гемолиз различной интенсивности вплоть до полного лизиса
эритроцитов, оцениваемый плюсами (от одного до четырех).РСК может быть использована для обнаружения в сыворотке больного спец¬
ифических антител с помощью известных антигенов (диагностика вирусных
инфекций и аутоиммунных состояний); для выявления и идентификации в мате¬
риале специфического антигена при тех же заболеваниях посредством иммунной
сыворотки, содержащей специфические антитела. Следует, однако, учитывать, что
комплементсвязывающие антитела образуются при некоторых инфекциях раньше
и исчезают быстрее, чем нейтрализующие антитела. В некоторых случаях при
заболеваниях легкой и средней тяжести комплементсвязывающие антитела могут
не обнаруживаться вовсе.Для постановки РСК требуются следующие материалы и ингредиенты:Аг, не обладающий антикомплементарностью и гемотоксичностью. Его
строго оттитровывают и берут в рабочей дозе;Ат — иммунная сыворотка, освобожденная от комплемента и лишенная
гемотоксичности;комплемент, взятый в рабочей дозе;АГ1 — эритроциты барана, отмытые в физиологическом растворе и взя¬
тые в опыт в виде 0,5-3,0% взвеси в том же или в специальном буферном
растворе, употребляемом при работе с данным типом вируса;АТ1 — гемолитическая (антиэритроцитарная) сыворотка, освобожденная
от комплемента;физиологический раствор с pH = 7,2-5-7,4;лабораторная посуда: градуированные пипетки, пробирки, цилиндры, ста¬
каны или колбы для разведений (употребляют только в РСК; не следует
использовать для иных целей); оборудование и аппаратура: центрифуга,
водяная баня, термостат, штативы.Постановка РСК требует большой предварительной работы. Накануне основно¬
го опыта готовят необходимые ингредиенты реакции, лабораторную посуду.Антиген. В качестве Аг в РСК может быть использован любой вируссодержа¬
щий материал, полученный из органов лабораторных животных, куриных эмбри¬
онов и клеточных культур, инфицированных различными вирусами. Антигенами
в РСК служат убитые вирусные агенты, очищенные различными способами и не
обладающие антикомплементарными свойствами, то есть неспособные фикси¬
ровать комплемент при отс>тствии специфической сыворотки. Для выявления
антикомплементарности антигена в предварительном опыте титруют комплемент
в присутствии этого антигена. Допускается употребление антигена, подавляющего
активность комплемента не более чем на 30%.
жВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ603Аг не должен обладать гемотоксическими свойствами. Двойная доза антигена
не должна давать даже следов гемолиза рабочего объема взвеси бараньих эритро¬
цитов.Антигены из аллантоисной и амниотической жидкостей инфицированных
эмбрионов являются высокоактивными и высокоспецифическими, не требуют
трудоемкой предварительной обработки. Перед постановкой РСК вируссодержа¬
щую жидкость осветляют путем центрифугирования и разводят 1:10 раствором,
который используют для постановки опыта с данным типом вируса, или физио¬
логическим раствором.Вируссодержащий материал, полученный при культивировании вируса в кле¬
точной культуре, после развития максимально выраженного цитопатического
эффекта подвергают троекратному замораживанию и оттаиванию, осветляют
путем центрифугирования в течение 15-30 мин при 1500-3000 об./мин, надоса¬
дочную жидкость используют в качестве антигена.Антигены хранят при 4 °С, в замороженном состоянии или лиофильно высу¬
шенными. Активность антигенов устанавливают в предварительных опытах
титрования со специфической сывороткой, избранной в качестве стандарта.Антитело. В РСК используют сыворотки животных и людей (больных и
реконвалесцентов). Проследить за динамикой титра антител позволяют парные
сыворотки.Для получения иммунной сыворотки у больного берут кровь из вены в объеме5-10 мл, обычно натощак или спустя 6 ч после приема пищи. Сыворотку инак¬
тивируют прогреванием при 56 °С в течение 30 мин. В результате разрушают
комплемент и добиваются необходимой стабилизации коллоидов сыворотки.
Инактивированную сыворотку хранят при 4 °С в течение 5-6 дней. При необхо¬
димости более длительного хранения (2-3 нед) к сыворотке после инактивации
добавляют 2% сухой борной кислоты. Длительно хранящиеся сыворотки перед
постановкой РСК снова инактивируют,Гкпериммунные сыворотки, содержащие комплементсвязывающие антитела, полу¬
чают путем иммунизации лабораторных животных (морских свинок, белых крыс,
кроликов, коз, обезьян и др.) по определенным схемам. Не существует общепринятых
схем иммунизации, для каждого типа вируса предлагаются специальные схемы.Существует ряд общих моментов, которые следует учитывать при использова¬
нии различных сывороток в РСК. Одно из затруднений, с которыми приходится
сталкиваться при постановке РСК, — антикомплементарность сывороток, то есть
способность связываться с комплементом при отсутствии антигена и тем самым
задерживать гемолиз. Антикомплементарность может быть обусловлена длительно¬
стью хранения сывороток или свойством, присущим сывороткам некоторых видов
животных, например кроликов. Перед постановкой реакции сыворотки инактиви¬
руют прогреванием на водяной бане в течение 30 мин: сыворотки морской свинки и
кролика — при 56 X, человека и обезьян — при 58 "С, крыс — при 60 X, собак — при
65 °С. В двух последних случаях перед прогреванием сыворотки разводят 1:2 или 1:3
дистиллированной водой или физраствором, чтобы избежать коагуляции белков.Если после прогревания сыворотки все же сохраняют антикомплементарные
свойства, их необходимо обработать одним из следующих методов:^ однократным замораживанием при -15...-20 “С с последующим удалени¬
ем образовавшегося флоккулята путем центрифугирования;^ разведением комплементом в соотношении: 1 часть комплемента +9	частей сыворотки; смесь выдерживают 18-20 ч при 4-6 ®С и инактиви¬
руют прогреванием;обработкой углекислотой методом, используемым для удаления неспец¬
ифических ингибиторов гемагглютинации, после чего сыворотки прогре¬
вают, как обычно.шт
ш*мЙК|604ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯВ сыворотках иммунизированных или переболевших животных наряду со спец¬
ифическими антителами образуются и антитела к тем тканям, из которых была
приготовлена вируссодержащая суспензия для иммунизации, особенно при много¬
кратных инъекциях антигена. При постановке РСК эти антитела могут приводить
к появлению ложноположительных результатов. Этого можно избежать, если для
иммунизации использовать антиген, полученный в одной инфицированной ткани,
а антиген для последующей РСК готовить в гетерологичной ткани. Иногда при¬
ходится прибегать к истощению сыворотки нормальной тканью, для чего к раз¬
веденной физиологическим раствором сыворотке (в соотношении 1:1) добавляют
20% гомогенизированной гомологичной ткани, выдерживают 2 ч при 37 °С, 18 ч
при 4-6 “С и центрифугируют при 3000 об./мин в течение 30 мин. Удаляют остаток
тканевого антигена путем обработки углекислотой по описанной выше методике и
полученную сыворотку прогревают при температуре 56 °С в течение 30 мин.Эритроциты. В РСК в качестве первого компонента гемолитической системы
могут бьггь использованы эритроциты любых животных и человека. Однако преи-
мущесгвенно применяются эритроциты барана. Их получают путем пункции ярем¬
ной вены здорового животного в возрасте от 2 до 5 лет. Кровопускание у баранов
можно проводить не чаще одного раза в 10 дней, до 200 мл, в течение 1-1,5 лет,
после чего нужно брать других животных.В реакции применяют 0,5-3,0% взвесь эритроцитов. При 4 °С эритроциты
могуг сохраняться 5-7 дней. Для хранения эритроцитов в течение более длитель¬
ного времени прибегают к их консервированию.Гемолитическая сыворотка. Второй компонент гемолитической системы
получают путем 3-4-кратной внутривенной иммунизации кроликов 50% взвесью
эритроцитов барана в количестве 2-5 мл с промежутками 2-3 дня. На 6-7-й день
после окончания иммунизации берут небольшое количество крови и проверяют
активность сыворотки (титр ее должен быть не ниже 1:1200).Титр гемолитической сыворотки определяют следующим образом. Готовят
основное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 0,9 мл физиологиче¬
ского раствора) и используют его для получения дальнейших разведений. В ряд
лунок пластины последовательно отмеривают по 0,2 мл разведений сыворотки,
начиная с 1:1000; добавляют в лунки 0,2 мл комплемента 1:10, затем по 0,2 мл
3% взвеси эритроцитов и доливают в каждую лунку по 0,4 мл физиологического
раствора. Смесь ингредиентов помещают в термостат на 1 ч при 37 'С. За титр
гемолитической сыворотки принимают ее разведение, которое вызывает полный
гемолиз эритроцитов.В реакции связывания комплемента следует использовать гемолитическую
сыворотку в трое- или четырехкратном титре; например, если титр получен¬
ной сыворотки 1:1200, то ее троекратный титр соответствует разведению 1:400.
Употребление гемолитической сыворотки в таком титре обеспечивает надежное
функционирование гемолитической системы, если учитывать, что реакция пяти¬
компонентная. При титре 1:1200 и выше проводят тотальное кровопускание.
Сыворотку прогревают при 56 “"С в течение 30 мин, для консервации добавляют
до 0,5% сухой борной кислоты, титруют, разливают по ампулам и хранят в холо¬
дильнике при 4 ®С, В настоящее время выпускают сухие стандартные препараты
гемолитической антибараньей сыворотю1 с титром 1:1200, 1:1500 и т.д. Сухие
препараты гемолитической сыворотки разводят стерильным физиологическим
раствором согласно инструкции и используют в работе.Для получения гемолитической системы смешивают равные объемы 3% эри¬
троцитов барана и разведенной до троекратного титра гемолитической сыворотки.
Их смешивают непосредственно перед добавлением гемолитической системы в
реакцию, делают это быстро, причем гемолитическую сыворотку приливают к
взвеси эритроцитов (а не наоборот) и некоторое время энергично перемешивают
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ $05полученную взвесь. Используют свежеприготовленную гемолитическую систему в
течение двух дней.Источник комплемента. В качестве комплемента — неспецифического термо¬
лабильного фактора, присутствующего в сыворотке свежей крови человека, боль¬
шинства млекопитающих и птиц, — в ряде иммунологических реакций используют
сыворотку морских свинок, поскольку в их крови комплемент обнаруживают чаще
и в наибольшем количестве, чем у других животных. Отечественные биофабрики
выпускают сухой препарат комплемента.В реакцию связывания комплемента берут свежую, полученную не более 48 ч
назад сыворотку крови 4-5 животных, самцов или небеременных самок. Сыворотку
можно хранить в замороженном состоянии. Для длительного (до 6 мес) сохране¬
ния комплемент в сыворотке морских свинок консервируют путем добавления на
каждые 10 мл сыворотки 0,4 г борной кислоты и 0,5 г сернокислого натрия. Сухой
(лиофилизированный) комплемент активен в течение нескольких лет.Титрование комплемента. Поскольку комплемент — очень лабильная суб¬
станция, чувствительная к солнечному свету, теплу и т.д., за день перед каждой
постановкой основного опыта РСК следует проводить его титрование, его осу¬
ществляют в том же объеме, в котором будут выполнять основной опыт РСК. Для
постановки реакции комплемент разводят основным раствором (физраствором
или специальным буферным раствором) 1:10 и соединяют последовательно коли¬
чества комплемента от 0,05 до 0,5 мл с интервалом 0,05 мл в каждой пробирке,
доводя общий объем в каждой из них до 1 мл.Одновременно осуществляют контроли всех ингредиентов, входящих в реак¬
цию:•	контроль комплемента (к 0,2 мл комплемента в соотношении 1:10 добавляют
0,2 мл 3% взвеси эритроцитов барана и 0,6 мл основного раствора);•	контроль эритроцитов (к 0,2 мл 3% взвеси эритроцитов добавляют 0,8 мл
основного раствора);•	контроль гемолитической сыворотки (к 0,2 мл сыворотки, разведенной до
троекратного титра, добавляют 0,2 мл 3% взвеси эритроцитов и 0,6 мл основ¬
ного раствора).В контрольных лунках не должен наступать гемолиз эритроцитов.За единицу комплемента принимают наименьшее его количество, которое спо¬
собно гемолизировать эритроциты в используемой гемолитической смеси. Полной
рабочей единицей комплемента для постановки основного опыта считают коли¬
чество его во второй пробирке с полным гемолизом (0,2 мл), то есть на 20-30%
больше по отношению к титру комплемента с учетом возможных антикомплемен-
тарных свойств антигенов. Для постановки РСК на холоде в качестве рабочей дозы
используют 1,5-2 полные дозы комплемента, то есть 3,5-4,0 мл комплемента,
разведенного 1:10, или 0,35-0,4 мл неразведенного.Далее рассчитывают количество комплемента, требуемое для всего опыта. Если
одна рабочая доза составляет, например, 0,4 мл неразведенного комплемента, а
использовать в опыте предполагается 100 лунок, необходимое количество соста¬
вит 4 мл. Поскольку ингредиенты берутся в реакцию в объеме 0,2 мл, на 100 лунок
потребуется 8 мл разведенного комплемента, то есть к объему самого комплемента
(4 мл) следует добавить еще 4 мл основного раствора, в котором ставится вся реак¬
ция. Для более корректной постановки РСК с учетом возможных антикомплемен-
тарных свойств антигенов и сывороток комплемент титруют в присутствии всех
используемых антигенов и сывороток.Затем устанавливают рабочую дозу антигена, для чего в три ряда лунок разли¬
вают по 0,2 мл возрастающих двукратно разведений антигена. К лункам первого
ряда прибавляют по 0,2 мл специфической сыворотки в разведении, соответствую¬
щем ее четырехкратному титру, к лункам второго ряда — по 0,2 мл нормальнойШ'
606 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯсыворотки в том же разведении (контроль антигена на специфичность) и в лунки
третьего ряда вносят по 0,2 мл основного раствора (контроль антигена на анти-
комплементарность). Дополнительно ставят контроль сыворотки (без антигена).
Во все лунки добавляют по 0,2 мл комплемента в двукратном титре, смесь поме-
ШШч щают на 1 ч в термостат при 37 “С или на ночь при 4 °С.Гемолитическую систему, приготовленную непосредственно перед использова¬
нием, предварительно выдерживают 30 мин при 37 °С, затем добавляют по 0,4 мл
во все лунки, пластины ставят в термостат на 30 мин и учитывают результаты
после наступления гемолиза эритроцитов в контролях.За единицу антигена принимают его наибольшее разведение, давшее с типо¬
специфической сывороткой задержку гемолиза на два плюса. В качестве рабочего
разведения антигена используют его наименьшее разведение (содержащее не
менее двух антигенных единиц), при котором он реагирует со специфической
сывороткой и не задерживает гемолиз в присутствии нормальной сыворотки и
основного раствора. Контрольный антиген применяют в РСК в том же разведении,
что и типовой.Методика проведения основного опыта. В соответствии с целями в реакции
связывания комплемента при выполнении основного опыта используют либо
известный стандартный антиген, либо известную стандартную сыворотку. В зави¬
симости от этого осуществляют контроли на антикомплементарность и гемоток¬
сичность соответственно испытуемых сывороток или минимальных разведений
неизвестного антигена.Схема выполнения основного опыта с испытуемой сывороткой:•	сыворотка в разведениях от 1:10 до 1:1280 и более по необходимости —
0,2 мл;•	антиген в рабочей дозе - 0,2 мл;•	комплемент в рабочей дозе — 0,2 мл;•	встряхивание, инкубирование при 37 '’С в течение 1 ч или при 4 "С 18-24 ч;•	гемолитическая система — 0,4 мл;•	встряхивание, термостат при 37 “С в течение 0,5-1 ч до наступления гемолиза
в контроле.Результаты учитывают по системе плюсов:«++++» — гемолиз эритроцитов отсутствует — надосадочная жидкость абсо¬
лютно прозрачная, эритроциты в осадке;«+++» — гемолиз эритроцитов составляет примерно 25% — надосадочная жид¬
кость слегка окрашена, осадок;«++» — гемолиз эритроцитов составляет 50% — надосадочная жидкость окра¬
шена интенсивно, но осадок ясно виден;«+» — гемолиз эритроцитов составляет 75% - надосадочная жидкость окраше¬
на интенсивно, осадок заметен, но слабо;«-» — полный гемолиз эритроцитов — отрицательная реакция.Титром испытуемой сыворотки считают наибольшее ее разведение, давшее
задержку гемолиза,Контролями к основному опыту служат:•	контроль сыворотки без антигена (0,2 мл сыворотки в наименьшем разведе¬
нии + 0,2 мл комплемента + 0,2 мл основного раствора + 0,4 мл гемолитиче¬
ской системы);•	контроль антигена без сыворотки (0,2 мл антигена + 0,2 мл комплемента +
0,2 мл основного раствора + 0,4 мл гемолитической системы).Взаимодействие антигена с антителом осуществляют либо при 37 °С в течение1	ч (горячий способ), либо при 4-6 °С в течение 18-24 ч. При холодовом способе
проведения реакции отмечена ее большая чувствительность.Схема выполнения основного опыта с испытуемым антигеном:
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 007•	типоспецифические и нормальная сыворотки в двукратных разведениях — по
0,2 мл каждого разведения:•	антиген в исходном разведении — по 0,2 мл;•	комплемент в рабочей дозе — 0,2 мл;•	встряхивание, инкубирование при 37 “С в течение 1 ч или при 4 °С в течение
18-24 ч;•	гемолитическая система — 0,4 мл;•	встряхивание, термостат при 37 °С в течение 0,5-1 ч до наступления гемолиза
в контроле.Контролируют все ингредиенты реакции аналогично предыдущему опыту,
условия проведения реакции те же- Результаты оценивают обычным способом.
Типовую принадлежность вьщеленного вируса устанавливают по специфической
сыворотке, показавшей наивысший титр антител к этому вирусу.При ретроспективной диагностике в РСК исследуют парные сыворотки от боль¬
ных с рядом типовых антигенов и контрольным антигеном. Каждый из исполь¬
зуемых антигенов должен быть проконтролирован предварительно на специфич¬
ность и оттитрован для выбора рабочего разведения. Дальнейший ход реакции
аналогичен ранее описанному, за исключением того, что для каждого из типовых
антигенов выбирают необходимое рабочее разведение комплемента.ШМИммуноферментный анализ: модификации методаИммуноферментный анализ (ИФА), или твердофазный иммуноферментный
анализ (тИФА), — метод клинической лабораторной диагностики, выявляющий
антигены возбудителей вирусных инфекционных заболеваний или антитела к ним.
Метод основан на специфическом взаимодействии «антиген-антитело» и после¬
дующей визуализации образовавшихся комплексов «Аг-Ат» с помощью фермен¬
тативной реакции, при которой конъюгированный с антителом или антигеном
фермент превращает добавленный в реакционную смесь субстрат в окрашенный
продукт. Скорость накопления окрашенного продукта ферментативной реакции
пропорциональна концентрации специфических комплексов «Аг-Ат» и учитыва¬
ется с помощью фотометра.Главными компонентами тест-систем для ИФА служат твердая фаза (композиция
антигенов или антител), закрепленная на подложке, конъюгат (один из распростра¬
ненных типов — антитело с ковалентно «пришитым» ферментом типа пероксидазы
хрена или иной пероксидазы), субстрат (хромоген) и промывочный буфер.Реакцию проводят в лунках полистироловых планшетов (наиболее распростра¬
нен формат 96-луночного планшета размерности 8x12, хотя существуют планшеты
и 384-луночного формата), где на дне каждой лунки (твердая фаза ИФА) сорби¬
рованы антитела к определяемым антигенам вируса или антигены вируса, если
устанавливают содержание антител к этим антигенам в биологическом образце.
Кроме планшетного формата твердой фазы, в автоматических ИФА-анализаторах
также применяют пробирочный формат, где Ат/Аг сорбируются на дно одиночной
пробирки, в которой проводится реакция, либо на поверхность полистиролового
шарика, вносимого в реакционную пробирку. Подобный подход удобен, посколь¬
ку позволяет выполнить исследование одиночного образца. Кроме того, площадь
поверхности сферы в четыре раза больше площади крута одинакового диаметра,
поэтому при одинаковых линейных размерах можно сорбировать на твердую фазу
в 4 раза больше Ат/Аг, что увеличивает чувствительность анализа.ИФА состоит из нескольких этапов. На первом этапе инкубируют исследуемые
сыворотки с предадсорбированными на твердой фазе (дно и стенки реакционной
емкости) антигенами (если определяют присутствие антител к вирусным белкам
в сыворотке). Несвязавшиеся Ат и другие компоненты сыворотки удаляют про-
в608 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯмывкой буферным раствором, а образовавшиеся комплексы «Аг-Ат» остаются в
реакционном объеме.На втором этапе добавляют конъюгированные с ферментом анти-Ат, специфич¬
ные против IgG человека (если определяют IgG-Aт, соответственно возможно
определение IgM-, IgA-, IgE-Aт). Несвязавшийся конъюгат также удаляют про¬
мывкой. Для выявления сформировавшихся комплексов добавляют субстрат.
В результате пероксидазной активности субстрат разлагается с образованием
окрашенного продукта. Колориметрическую реакцию останавливают добавлени¬
ем раствора кислоты. Окрашенный раствор фотометрируют.Последующее развитие метода ИФА привело к появлению ряда его модифи¬
каций. Разновидности тест-систем, применяемые в лабораторной диагностике
инфекционных вирусных заболеваний, можно разделить следующим образом:•	по схеме вь[полнения исследования:❖	непрямой ИФА,о- «сэндвич»-ИФА;❖	конкурентный ИФА;•	по сорбированной твердой фазе:❖	антительные (например, для выявления НВ5 Аг);
антигенные (например, для выявления НВ5 Ат);❖	комбинированные (например, для одновременного выявления антиге¬
на р24 и антител к ВИЧ);•	по типу сорбированного антигена:❖	лизатные (на твердую фазу сорбируется вирусный лизат из клеточной
культуры);рекомбинантные (используются генно-инженерные рекомбинантные
белки или фрагменты белков вирусов);-о* пептидные (сорбируются синтетические эпитопы вирусных антигенов);•	по специфичности конъюгата:<}' поликлональный (реагирует с антителами всех типов 1дМ, IgG, IgA);❖	моноклональный (реагирует только с одним типом антител);•	по формату твердой фазы:планшетные;пробирочные (для автоматических ИФА-анализаторов).Кроме того, отдельно следует упомянуть такие разновидности иммунологиче¬
ского качественного и количественного определения антигенов и антител вирусов,
как иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА) и иммуноэлектрохемилюми-
несцентный анализ (ИЭХЛА). Оба эти метода также близки к ИФА, поскольку в
их основе лежит тот же принцип взаимодействия антигена с антителом с исполь¬
зованием твердой фазы. Основное отличие заключается в замене ферментативной
реакции (для визуализации комплексов «Аг-Ат») люминесцентной меткой, что
значительно повышает чувствительность метода и снижает вероятность получения
ложноположительных результатов вследствие уменьшения количества конъюгата
в реакционном объеме.Метод прямого ИФА (рис. 23-13) используют в иммуногистохимических иссле¬
дованиях (например, при выявлении антигенов вируса гепатита В в биоптате пече¬
ни). При прямом ИФА требуется специальный субстрат, дающий нерастворимый
окрашенный продукт.Непрямой ИФА и «сэндвич»-ИФА — основные варианты метода в диагностике
инфекционных вирусных заболеваний. Возможности метода позволяют опреде¬
лять как антигены вирусных частиц (например, НВ5 Аг), так и антитела к ним
(см. рис. 23-13). Основное отличие заключается в композиции твердой фазы: для
выявления антител к вирусным белкам на подложку сорбируется Аг вируса, для
обнаружения вирусных антигенов — моноклональные Ат.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 609
СубстратСубстратСубстратНепрямой ИФА
(выявление Ат)Прямой ИФАРис. 23*13. Основные варианты иммуноферментного анализа.Непрямой ИФА
(выявление Аг)Сэндвич-ИФАСостав твердой фазы ИФА претерпел значительные изменения по мере разра¬
ботки новых вариантов анализа. Эволюция тИФА связана с методами получения
вирусных Аг: в тест-системах I поколения использовали лизатные Аг, П — реком¬
бинантные, III — пептидные.Лизатные антигены получали из клеточной культуры, зараженной вирусом.
Вирусные частицы накапливали, выделяли, очищали, инактивировали. Суспензию
инактивировали и наносили на подложку лунки. Такие тест-системы облада¬
ют невысокими чувствительностью и специфичностью, на сегодняшнй день их
используют в основном в научно-исследовательских лабораториях.С развитием генно-инженерньгх технологий молекулярного клонирования полу¬
чили распространение рекомбинантные тест-системы, в которых ген определяемого
белка вируса встраивается в геном бактериальной клетки (чаще всего Е. соЩ, что
позволяет синтезировать рекомбинантные белки практически в любых количе¬
ствах. Подобный подход сразу сделал метод тИФА доступным как с точки зрения
производства тест-систем, так и с точки зрения экономичности. Рекомбинантные
системы обладают более высокой чувствительностью по сравнению с лизатными,
поскольку возможно получение значительных количеств Аг для нанесения на под¬
ложку. Специфичность тоже повышается, так как на твердую фазу наносят не смесь
лизированных белков вируса, а единичный белок или его часть.Основная технологическая трудность связана с необходимостью очистки реком¬
бинантного белка от бактериальных белков, особенно если клонирование ведется
в Е. сой. Даже малейшая примесь бактериальных белков может привести к появ¬
лению ложноположительных результатов, поскольку антитела к белкам эшерихий
содержатся в сыворотке крови большинства людей.Получение более специфических антигенов возможно при применении баку-
ловирусных векторов, культивируемых в клеточных культурах насекомых, что
значительно снижает вероятность перекрестных реакций.Наиболее специфичны синтетические антигены, полученные путем химическо¬
го синтеза полипептидных цепочек, преимущество тест-систем на синтетических
пептидах состоит в возможности создания композиции из нескольких пептидов
к разным иммунодоминантным эпитопам одного антигена или нескольких анти¬
генов разных геновидов вируса. Подобный подход позволяет выявлять антитела
к вирусным белкам различных вариантов вируса (например, к разным генотипам
вируса гепатита С). Кроме того, синтетические пептиды не содержат примесей,
способных привести к ложноположительным результатам ИФА.
610ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯДля сокращения периода серологического «окна», что особенно важно для
максимально раннего установления факта инфицирования такими социально
значимыми инфекциями, как ВИЧ или гепатит С, были разработаны комбиниро¬
ванные тест-системы IV поколения. Твердая фаза комбинированных тест-систем
состоит не только из синтетических Аг поверхностных вирусных белков, но и из
сорбированных на подложке моноклональных антител к ранним вирусным бел¬
кам, циркулирующим в сыворотке до образования диагностических Ат в период
серологического «окна» (Аг р24 — у ВИЧ, core Аг у ВГС и т.п.), что дополнитель¬
но сокращает сроки выявления инфицированных лиц. Например, для лизатных
ИФА-тест-систем период серологического «окна» для ВГС-инфекции составлял
около 150 дней, для рекомбинантных — 80, для синтетических — 70 дней, а ком¬
бинированные иммунохемилюминесцентные тест-системы способны достоверно
устанавливать факт инфицирования уже через 60 дней.Отдельно стоит упомянуть тест-системы для определения антител класса IgM к
Аг вирусных частиц. Одна из существенных проблем ИФА-диагностики вирусных
инфекционных заболеваний состоит в специфическом и достоверном определении
антител класса IgM как маркеров ранней инфекции. К сожалению, при опреде¬
лении IgM-Ат высока частота ложноположительных результатов. Особенно эта
проблема актуальна при диагностике ВУИ (краснухи, цитомегалии, герпеса, пар-
вовируса В19) у беременных, онкологических больных.Причина низкой достоверности и специфичности выявления IgM-Ат заключа¬
ется в следующем: IgM-Ат имеют более низкую авидность по сравнению с IgG-Ат
(конкуренция за сайты связывания на твердой фазе, приводящая к получению
ложноотрицательных результатов), перекрестные реакции в присутствии ревма¬
тоидного фактора, гетерофильных аутоантител и т.п. Для специфического и досто¬
верного определения IgM-Ат, согласно рекомендациям ВОЗ и CDC, следует при¬
менять тест-системы с так называемым IgM-захватом {1^Ы-capture, или \i-capture).
Основное отличие этих тест-систем — состав твердой фазы, на которую сорбиру¬
ются не Аг, против которых определяются IgM-антитела, а анти-IgM-Ar (анти-р,-
Ат). Именно поэтому при более специфичном установлении IgM-Ат сначала про¬
исходит связывание всей фракции IgM-Ат на подложке твердой фазы, а уже потом
специфически выявляются IgM-антитела против определяемого антигена.Следующий важный компонент тИФА — конъюгат. Наиболее распространен¬
ным видом конъюгата, щироко применяемым в тест-системах для выявления
антител к антигенам вирусных частиц, служат анти-Ат, то есть антитела против
выявляемых Ат. Анти-Ат обычно видоспецифичны (например, мышиные про¬
тив IgG человека) и направлены на Fc-фрагмент определяемых Ат. В свою оче¬
редь, к анти-Ат ковалентно «пришит» фермент из семейства пероксидаз (чаще
пероксидаза хрена). Можно использовать иные высокоавидные белки, например
авидин-биотиновые или стрептавидин-биотиновые конъюгаты. Последний вари¬
ант предпочтительнее, поскольку позволяет значительно повысить чувствитель¬
ность тест-системы, в отличие от конъюгата Ат-пероксидазы, у стрептавидин-
биотинового комплекса на одно связанное меченое антитело приходится не одна,
а три молекулы фермента, что существенно усиливает специфический сигнал и,
как следствие, повышает чувствительность тест-системы для ИФА. Современные
конъюгаты обладают высокой стойкостью в окружающей среде и очень большой
активностью. Необходимо тщательно избегать загрязнения рабочей зоны конъю¬
гатом при выполнении ИФА, поскольку даже следовые его количества, попавшие в
реакцию, способны привести к появлению ложноположительных результатов.Следующий компонент ИФА-тест-систем — субстрат, необходимый для раз¬
вития окрашивания реакционного раствора. Первоначально для этих целей при¬
меняли ОФД (ортофенилендиамин), превращавшийся под действием пероксидазы
конъюгата в окрашенный продукт. Интенсивность окрашивания измеряли при
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ611длине волны фотометра 492 нм. Поскольку ОФД — нестойкий и высокотоксичный
субстрат с канцерогенным потенциалом, в современных вариантах ИФА в качестве
субстрата используют ТМБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин). Под действием перок¬
сидазы ТМЕ образует в растворе продукт голубого цвета. При остановке реакции
с помощью кислоты продукт реакции гидролизуется с развитием желтого окра¬
шивания с максимумом поглощения 450 нм. Интенсивность окрашивания прямо
пропорциональна количеству комплексов «Аг-Ат».Хемилюминесцентный (ХЛИА) и электрохемилюминесцентный (ИЭХЛА) ана¬
лизы, в отличие от иммуноферментного, не нуждаются в субстрате, поскольку
для выявления образовавшихся комплексов «Аг-Ат» используют не колориме¬
трическую, а люминесцентную реакцию. Вместо комплекса «анти-Ат-фермент»
конъюгатом служит комплекс «анти-Ат-люминофор». Этот комплекс может
быть достаточно сложным и включать антитела, конъюгированные, например, с
рутениевым комплексом «рутений-трис(2,2’бипиридил)-дихлорид», способным
испускать световые волны строго определенной длины (620 м) при пропускании
электрического импульса через раствор или при облучении раствора УФ-светом.
Поскольку на один фотон света, поглощенного рутениевым комплексом, прихо¬
дится один фотон испускаемого света, количество световых импульсов, детекти¬
руемых в ИЭХЛА, прямо пропорционально количеству связанных антител, что
позволяет вести значительно более точный учет связанных анти-Ат.Кроме того, люминесцентная детекция по чувствительности существенно пре¬
восходит колориметрическую, что дополнительно увеличивает чувствительность
метода. Измерение испускаемого иммунным комплексом света дает возможность
легко проводить количественный учет интенсивности свечения. К существенным
преимуществам указанных методов относится и более низкое по сравнению с
классическим вариантом анализа количество конъюгата, что снижает вероятность
ложноположительного результата.Учитывая, что интенсивность окрашивания раствора в лунке планшета для
ИФА прямо пропорциональна количеству образовавшихся комплексов «Аг-Ат»,
возможно исследование биологического материала методом ИФА как в качествен¬
ном, так и в количественном варианте. Качественный вариант ИФА позволяет
установить факт присутствия или отсутствия определяемого аналита (например,
HB^g) в материале. С помощью количественного варианта ИФА не только
определяют факт наличия или отсутствия аналита в материале, но и оценивают
его количество.Для некоторых маркеров вирусных инфекций достаточно качественного
определения, например, при установлении факта инфицирования (антитела к
ВИЧ или анти-ВГС-антитела), в других случаях целесообразно проводить коли¬
чественный ИФА (например, определение напряженности поствакцинального
иммунитета против гепатита В — анти-НВз-Ат или краснухи — анти-Rubella
IgG-Ат). Количественный ИФА требует измерения заранее охарактеризованных
калибраторов (контролей с аттестованными значениями аналита) в одном и
том же опыте, что и измерение исследуемого материала. Полученные аггесто-
ванные значения аналита используют для построения калибровочной кривой,
с помощью которой можно вычислить содержание исследуемого аналита в
образце. При проведении ИФА в ручном режиме калибровочную кривую строят
на специальной графической бумаге либо с использованием компьютерных про¬
грамм. При работе на ИФА-анализаторе эту функцию выполняет программное
обеспечение, управляющее анализатором. Достоверно определить количество
аналита методом ИФА можно только в тех линейных пределах, которые указаны
в инструкции к тест-системе и установлены производителем. Экстраполирование
данных за линейные пределы измерения, указанные в инструкции к тест-системе,
не допускается.
612 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯВыполнение ИФА при вирусологических исследованиях требует тщательного
соблюдения условий качественной работы, соответствующих санитарных норм
и правил, действующих нормативных документов, а также инструкции фирмы-
производителя к тест-системе. Этими нормативными документами и инструк¬
циями не только определяются основные требования к выполнению исследований
методом ИФА, но и регламентируются алгоритмы исследований и мероприятия по
внутрилабораторному контролю качества.Согласно основным методическим рекомендациям по проведению ИФА, изло¬
женным в отечественных и зарубежных руководствах, специализированных изда¬
ниях, к критическим параметрам, влияющим на конечный результат, следует отне¬
сти процесс пробоподготовки, лабораторное оборудование и приборы, качество
расходных материалов, культуру лабораторной работы, условия внешней среды в
помещениях, где выполняется анализ, и т.п.Например, при отборе проб следует избегать гемолизированных или гиперли-
пидемических сывороток, поскольку их исследование может дать ложноположи¬
тельные результаты. Нельзя использовать наконечники повторно при отборе или
разведении сывороток во время пробоподготовки, пользоваться стеклянными
пипетками и т.п. Если требуется предварительное разведение сывороток, дополни¬
тельный планшет следует применять только однократно.Пристальное внимание следует уделять точности автоматических пипеток
(погрешность не должна превышать 5%, в том числе по каналам многоканальной
пипетки), чистоте и стабильной работе автоматических промывателей (объем
дозируемых жидкостей по разным каналам промывания также не должен превы¬
шать 5%). Необходимо периодически проверять истинную температуру в термо¬
статах для инкубации и холодильниках, где хранятся тест-системы. Для этих целей
внутрь оборудования помещают отдельный термометр и ведут журнал контроля
температуры в термостате (холодильнике).Для точности измерения оптической плотности следует периодически прово¬
дить проверку планшетных спектрофотометров, своевременно заменять источник
света и следить за тем, чтобы погрешность измерения по разным каналам не пре¬
вышала 10% (оптимальная погрешность — 5%). Оптическую плотность измеряют
на спектрофотометре с прогретой не менее 30 мин лампой.Из расходных материалов и вспомогательного оборудования для приготовле¬
ния растворов конъюгата и субстрата следует использовать специально выделен¬
ные и помеченные стеклянные емкости. Употреблять их для других целей нельзя.
Исключается повторное применение пластиковых наконечников для автоматиче¬
ских пипеток.Необходимо тщательно контролировать качество дистиллированной воды в
лаборатории. Нормальной считается дистиллированная вода с pH = 5,5-г-6,5 и
удельной проводимостью не более 5 мкСим/см. Особенно важно качество воды
при работе с автоматическими ИФА-анализаторами. Для некоторых моделей ана¬
лизаторов качество получаемой в стандартных перегонных дистилляторах воды
может оказаться недостаточным, в таком случае рекомендуют установить систему
водоподготовки с применением дополнительных систем очистки воды.При постановке ИФА обязательно соблюдают инструкцию к тест-системе.
Всегда следует использовать реагенты одной серии или партии. Все реагенты долж¬
ны быть комнатной (18-25 “С) температуры, поэтому при хранении диагностиче¬
ских наборов в холодильнике необходимые компоненты следует предварительно
довести до рекомендуемой температуры. При выполнении анализа нельзя касаться
дна планшета руками, а дна и стенки лунок — наконечником пипетки. Следует
следить за тщательностью и равномерностью промывки всех лунок планшета, осо¬
бенно после инкубации с конъюгатом. При работе с растворами субстрата нужно
помнить, что применяемые в ИФА хромогены светочувствительны и длительная
ВИРУСОЛОГИНЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 613ЭКСПОЗИЦИЯ на свету может привести к неконтролируемому разложению субстрата.
Добавление стоп-реагента (чаще всего, это раствор серной или соляной кислоты)
не останавливает полностью процесс окисления, поэтому длительная инкубация
даже «остановленного» ИФА может исказить результаты анализа.При учете результатов спектрофотометрии всегда контролируют визуаль¬
но степень окрашивания и состояние фотометрируемых лунок и сверяют ее с
результатами измерения. Это поможет избежать искажения результатов при
появлении таких артефактов анализа, как пузыри воздуха в лунке или нали¬
чие посторонних предметов в лунке. Нельзя дотрагиваться до дна планшета,
поскольку даже малейшие следы от рук могут повлиять на результаты измерения
и увеличить значения ОП.При анализе результатов руководствуются критериями, изложенными в инструк¬
ции к тест-системе, и трактуют полученные результаты согласно ей. Учитывая
погрешности, вносимые средствами измерения (пипетками и спектрофотоме¬
тром), границами серой зоны считают 15% значения ОП критической {cut-off).
Все результаты, попадающие в серую зону, следует признавать сомнительными и
подвергать повторному исследованию.Соблюдение вышеперечисленных правил позволит пол)^ать достоверные и
надежные результаты при исследовании биологического материала на маркеры
вирусных инфекций.МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫВнедрение методов молекулярной биологии в повседневную диагностическую
практику в 90-е гг. XX в. - одно из наиболее революционных событий в клиниче¬
ской лабораторной диагностике, сопоставимое по значимости разве что с широким
внедрением тИФА в серологическую диагностику десятилетием раньше. Бурное
развитие молекулярной биологии на рубеже XX и XXI вв. позволило не только сде¬
лать эти методы доступными для большинства разделов клинической лаборатор¬
ной диагностики, но и включить их в большинство диагностических алгоритмов
вирусных инфекционных заболеваний.С помощью молекулярно-биологических методов возможны идентификация
инфекционных агентов, определение их количества в биологических жидкостях
(клетках организма), дифференциальная диагностика генетических вариантов
возбудителей, принятие решения о начале противовирусной терапии, подбор
оптимальной схемы терапии, контроль эффективности терапии, выявление мута¬
ций резистентности к противовирусным препаратам и т.п.К молекулярно-биологическим методам можно отнести все методы клиниче¬
ской лабораторной диагностики, используемые для идентификации возбудителей
вирусных инфекционных заболеваний определение специфических нуклеотид¬
ных последовательностей нуклеиновых кислот (ДНК/РНК) возбудителей. Как
следует из определения, все молекулярно-биологические методы — это методы
прямого выявления возбудителей, то есть положительный результат молекулярно¬
биологических исследований свидетельствует о выявлении самого возбудителя, а
не следов его контакта с иммунной системой организма.в основе всех молекулярно-биологических методов лежит способность двух¬
цепочечных молекул нуклеиновых кислот к взаимному комплементарному свя¬
зыванию, Вторая особенность нуклеиновых кислот — возможность синтеза ДНК/
РНК в условиях ш vitro практически неограниченное количество раз. Первая
особенность позволяет специфически идентифицировать генетический материал,
присущий только определяемому организму и никакому другому; вторая особен¬
ность — амплифицировать участок нуклеиновой кислоты, специфичный для дан¬
ного типа возбудителя, в количестве, достаточном для аппаратной (например, для
614 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯПЦР в режиме реального времени) или визуальной (для электрофоретического
варианта ПЦР) детекции.Молекулярно-биологические методы, как правило, состоят из трех основных
этапов:v' выделения препарата нуклеиновой кислоты из биологического образца;
проведения исследования;||||	детекции результатов и их интерпретации.Современные технологии позволяют значительно упростить и автоматизиро¬
вать наиболее трудоемкий первый этап исследования, связанный с выделением
тотального препарата нуклеиновой кислоты. К сожалению, этот ответственный
этап анализа автоматизируется значительно медленнее, чем этап проведения
исследования (максимально автоматизированный на данный момент) или этап
детекции и интерпретации результатов. Эволюция систем выделения ДНК/РНК
идет двумя путями:упрощением методов выделения нуклеиновых кислот путем снижения коли¬
чества операций, появлением систем для быстрого («экспресс») выделения
нуклеиновых кислот, повышением эффективности вьщеления и чистоты
нуклеиновых кислот;появлением автоматических станций для экстракции нуклеиновых кислот с
возможностью настраиваемых протоколов выделения.Эти процессы протекают параллельно, но следует отметить, что более пер¬
спективным считают внедрение автоматизированных систем экстракции нуклеи¬
новых кислот, значительно повышающее производительность лаборатории и
качество исследований. Особенно важно применять автоматизированные систе¬
мы экстракции нуклеиновых кислот с настраиваемыми протоколами выделения,
поскольку различные варианты молекулярно-биологических методов предъ¬
являют разные требования к материалу. Например, для ПЦР с амплификацией
длинных фрагментов нуклеиновых кислот вируса предпочтительнее исполь¬
зовать более мягкий вариант выделения тотального препарата нуклеиновых
кислот, поскольку при таких условиях получают больше высокомолекулярных
нуклеиновых кислот.Для большинства молекулярно-биологических методов достаточно относитель¬
но простых методов экстракции нуклеиновых кислот. Наибольшее распростране¬
ние имеют следующие методы выделения: гуанидинизотиоцианатный с сорбцией
на силикагеле и применение детергентов с высаливанием ДНК/РНК из водного
раствора в присутствии этанола или изопропанола. Обычно не применяют допол¬
нительные методы очистки или фракционирования препарата и для исследования
берут тотальный препарат РНК/ДНК.Наиболее часто в лабораторной диагностике инфекционных вирусных забо¬
леваний практикуют два подхода: методы молекулярной гибридизации и методы
амплификации нуклеиновых кислот.К методам гибридизации следует относить:^ гибридизацию в растворе или на твердом носителе;
гибридизацию in situ (ISH, FISH);
метод разветвленной ДНК {branch DNA).Методы амплификации нуклеиновых кислот:
полимеразная цепная реакция (PCR);^ лигазная цепная реакция (LCR);^ самопроизвольная репликация последовательностей (3SR);
транскрипционно-опосредованная амплификация (ТМА);
амплификация с замещением цепи (SDA);^ реакция транскрипционной амплификации (NASBA).
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВИНИЯ 615Гибридизационные молекулярно-биологические методыГибридизационная детекция нуклеиновых кислот вирусных частиц основана на
способности синтетических зондов связываться с гомологичными участками нукле¬
иновых кислот вируса, после чего образовавшиеся гибриды «зонд-нуклеиновые
кислоты» определяются. За время, прошедшее с внедрения в молекулярную био¬
логию гибридизационных методов исследования (в 70-х гг. XX в,), они получили
существенное развитие как в техническом, так и в методологическом аспектах.
Многие из гибридизационных методов утратили свое значение либо стали частью
иных, методически более совершенных способов клинической лабораторной диа¬
гностики. Например, гибриды «зонд-мишень» в современной диагностической
лаборатории выявляют либо с помощью гибридизационно-иммуноферментного
анализа, либо более чувствительным и перспективным иммунохемилюминесцент-
ным методом.Гибридизационным методом можно исследовать как клеточный материал
(мазок, соскоб), так и биологические жидкости (плазму крови, сперму, СМЖ
и т.п.). Молекулярные комплексы «зонд-мишень» формируются при реакции
гибридизации, при которой сначала молекулы нуклеиновых кислот подвергают
тепловой денатурации с последующим охлаждением до температуры образова¬
ния комплементарных связей (гибридов) между цепями нуклеиновых кислот. На
первом этапе из пробы выделяют тотальный препарат нуклеиновых кислот.В реакционный объем вносят тотальный препарат нуклеиновых кислот, выде¬
ленный из образца, и синтетические зонды, комплементарные к специфическо¬
му участку генома возбудителя (рис. 23-14, см, цв, вклейку). Смесь подвергают
денатурации нагреванием до 95 °С и охлаждению для образования гибридов
«зонд-мишень». П1бриды захватываются сорбированными на твердой фазе Ат.
Несвязавшиеся с зондами молекулы удаляют промывкой, а в реакционный объем
добавляют Ат к двухспиральным нуклеиновым кислотам (зонды могут быть как
РНК, так и ДНК), выполняющим роль конъюгата. Подобную технологию захва¬
та гибридов «зонд-ЫК» (hyЬrid^capture) применяют, например, для выявления
нуклеиновых кислот таких инфекционных агентов, как ВИЧ или ВПЧ высокого
канцерогенного риска.Практикуя подобный подход, можно достаточно быстро исследовать значи¬
тельное количество образцов, поскольку исследование в жидкой фазе позволяет
автоматизировать процесс и привести его в планшетный или иной высокопроиз¬
водительный формат.В случае гибридизационного исследования на твердой фазе один из ком¬
понентов реакции (зонд) сорбируется на поверхности реакционного объема
(рис. 23-15). В качестве твердой фазы наиболее часто выступают нитроцеллю-
лозная или нейлоновая мембрана, либо поверхность лунки планшета. В одном
из вариантов метода сначала проводят реакцию гибридизации с образованием
гибрида «зонд 1-мишень», затем в реакционную смесь добавляют зонд 2, ком¬
плементарный к соседнему участку мишени и имеющий определенную метку
(ферментную или флюоресцентную). После этого детектируют образовавшие¬
ся комплексы «зонд 1-мишень-зонд 2». Эта схема анализа носит название
«сэндвич»-гибридизации по аналогии с «сэндвич»-ИФА.Данный метод анализа с некоторыми модификациями применяют преиму¬
щественно на этапе детекции продуктов ПЦР, при исследовании методом ПЦР
с гибридизационно-иммуноферментной детекцией. Отличие этого метода от
«сэндвич»-гибридизации заключается в использовании на этапе выявления ком¬
плекса «зонд 1-мишень» не меченого зонда 2, а антител к двухцепочечным гибри¬
дам, конъюгированных со стрептавидин-биотиновым комплексом, меченным
ферментом (пероксидазой или щелочной фосфатазой).
616ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯДетектируемыйЕще одна интересная модификация гибридизационного анализа - технология
анализа линейных проб (LiPA — Line Probe Assay). UPA особенно эффективна при
анализе генетических мутаций, генотипировании вирусов (гепатита В и С, напри¬
мер), выявлении генетически обусловленной лекарственной резистентности (ВИЧ,
ВГВ и т.п.). В общих чертах метод анализа линейных проб заключается в гибри-
дизационном анализе предварительно амплифицированного продукта. Однако в
отличие от ПЦР, где амплифицируется преимзш^ественно консервативная область
генома, в LiPA для анализа мутационных замен или генетической гетерогенности
популяции (выявление генотипов) амплифицируется генетически гетерогенная
часть вирусного генома. Полученные в результате ПЦР биотинилированные
ампликоны гибридизируют с иммобилизованными на нитроцеллюлозном стрипе
олигонуклеотидными зондами (рис. 23-16), комплементарными различным гено¬
типам вируса. Несвязавшиеся ампликоны удаляют отмывкой. После связывания
конъюгата («щелочная фосфатаза-стрептавидин») и добавления субстрата в месте
нанесения специфического зонда появляется полоса, как и в иммунном блоте.По сравнению с иными технологиями обнаружения мутационных замен
(рестрикционным анализом полиморфных фрагментов, частичным секвениро-
ванием, пиросеквенированием), УРА позволяет относительно быстро и дешево
получить результаты. Ограничение метода заключается в возможности выявить
только уже охарактеризованные мутационные замены, в отличие, например,
от секвенирования.Следующим этапом развития гибридизационного анализа на твердой фазе стала
гибридизация in situ. Метод основан на проведении процессов гибридизации непо¬
средственно на срезе или в мазке с использованием меченых ДНК/РНК-зондов.
В зависимости от вида метки (ферментной или люминесцентной) различают
несколько видов гибридизации in situ, в том числе гибридизацию in situ с флюо¬
ресцентной детекцией (FISH — Fluorescent In Situ Hybridization). Метод применяют
преимущественно для выявления ДНК-содержащих вирусов, поскольку вирусная
РНК менее устойчива к разрушению, особенно на стадии пробоподготовки.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 617retftttlttleee
ееееее	1
ееееее	2
		3Генотип А *
	 5Генотип 7
Генотип с I оГенотип D IГенотип Е	IГенотип F	I
Генотип G *ítllliГенотипсРис. 23-1S. Метод анализа линейных проб (UPA): А — схема исследования; Б — образец гибри-
дизационных стрипов для генотипирования ВГВ (}ittp://wwwJnnogenetics.be).Метод позволяет установить наличие частиц вируса в фиксированных и заклю¬
ченных в формалин препаратах, пунктатах (биоптатах) ткани, что особенно важно
при патоморфологическом анализе либо просто в соскобе. Гибридизация ш situ
базируется на принципах твердофазной гибридизации и гибридизации в растворе.
Чувствительность метода гибридизации ш situ ограничена возможностью проникно¬
вения зондов внутрь клеток для связывания с искомой мишенью. По этой причине
после фиксации клеток соскоба (мазка, биоптата и т.п.) осуществляют разрушение
фиксированных клеток и высвобождение внутриклеточной ДНК (рис. 23-17). Процесс
гибридизации проходит в тканях, при этом зонд снабжен флюоресцентной меткой.
После промывки материала и удаления несвязавшихся молекул зондов приступают к
детекции, для чего мазок или срез анализируют в флюоресцентном микроскопе.С помощью гибридизации in situ наиболее удобно определять вирусные частицы
(которые представлены большим количеством копий) в инфицированных клет¬
ках, например, ВПЧ высокого канцерогенного риска в цервикальных соскобах,
либо выявлять оккультные формы гепатита В.
618 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯРис. 23-17. Схема гибридизационного анализа in situ с флюоресцентной детекцией (F1SH). На
первом этапе образец фиксируют на твердой фазе/предметном стекле (А); второй этап — раз¬
рушение клеточных мембран и высвобождение молекул ДНК (Б), после чего образец подвергают
денатурации (В) и гибридизации с меченными флюорохромом ДНК/РНК-зондами {Г, Д); специфи¬
чески связавшиеся зонды детектируют с помощью люминесценции (Е).к достоинствам методов гибридизационного анализа относят высокую спец¬
ифичность, крайне малый риск контаминации, универсальность методов для
любых типов микроорганизмов.Недостатками всех гибридизационных методов следует считать относительно
невысокую чз^встветельность (по сравнению с амплификационными методами
молекулярно-биологических исследований), сравнительно высокую стоимость
гибридизационных зондов (для повышения специфичности необходимо синтези¬
ровать длинные зонды), ограниченность применения для различных биологиче¬
ских субстратов или объектов внешней среды. Кроме того, большинство современ¬
ных методов исследования с использованием гибридизационного анализа требует
длительных инкубаций гибридизационной смеси, что значительно удлиняет время
исследования, а в некоторых случаях делает невозможным получение результата
в течение одного рабочего дня. Некоторые гибридизационные методы, такие как
гибридизация ш situ, методически сложны, требуют высокой квалификации пер¬
сонала и не могут применяться для скрининговых исследований большого коли¬
чества образцов.Многие из перечисленных выше недостатков устранены в методе разветвленной
ДНК с использованием принципа умножения сигнала (в отличие от амплификаци¬
онных методов, основанных на принципе умножения мишени).Схема исследования по методу разветвленной ДНК (рДНК) следующая
(рис. 23-18, см. цв. вклейку). Нетвердой фазе сорбируется зонд 1 (улавливающий),
комплементарный к ДНК/РНК-мишени (а). После реакции гибридизации (б) все
несвязавшиеся молекулы нуклеиновых кислот удаляются отмывкой, а в реакци¬
онную смесь добавляют зонд 2 (детектирующий), специфический к иному участку
мишени, чем зонд 1, и усиливающие зонды (в). Особенность усиливающих зон¬
дов — самокомплементарность и комплементарность к зонду 2, в результате чего
происходит многократная гибридизация усиливающих зондов самих на себя с
возникновением своеобразной структуры типа «дерево» (г). Усиливающие зонды
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 619связываются с молекулами люминофора (д). Благодаря явлению самогибридиза-
ции усиливающих зондов наступает эффект амплификации (умножения) сигнала.
На одну молекулу мишени приходится один детектирующий, один улавливающий
и многие тысячи и десятки тысяч усиливающих зондов, каждый из которых связан
с несколькими молекулами люминофора, что позволяет усилить детектируемый
сигнал от единственной молекулы-мишени, в ходе реакции детекции (люми¬
несцентной, хемилюминесцентной или иной) в реакционной смеси выявляют
специфическое свечение (е).Подобным методом можно идентифицировать ДНК/РНК различных возбуди¬
телей инфекционных заболеваний (ВИЧ, ВГВ, ВГС и др.). Поскольку величина
детектируемого сигнала прямо пропорциональна исходному количеству молекул-
мишеней, связавшихся с улавливающим зондом, при наличии охарактеризован¬
ных количественных стандартов, возможно не только качественное выявление
вирусных агентов инфекционных заболеваний методом рДНК, но и оценка их
количественного содержания в биологических образцах.Амплификационные молекулярно-биологические методыв амплификационных методах детекции используется принцип накопления
(амплификации) исходной матрицы (фрагмента мишени) до достижения опреде¬
ляемых значений положительного сигнала. Наибольшее применение в практике
лабораторной диагностики получила полимеразная цепная реакция (ПЦР).Полимеразная цепная реакцияЗа последние несколько лет метод ПЦР и его модификации стали занимать одно
из ведущих мест в современной лабораторной диагностике. Для ПЦР характерны
такие уникальные свойства, как высокие специфичность, чувствительность, уни¬
версальность и короткое время исследования.В медицине ПЦР применяют для диагностики инфекционных заболеваний,
в том числе вызванных агентами, трудноподдающимися культивированию, для
определения устойчивости микрофлоры к антибиотикам, пренатальной диагно¬
стики и диагностики наследственных заболеваний, тестирования донорской крови
на вирусные патогены, при различных видах генотипирования, определении
отцовства, для выявления мутаций и т.д.Высокие чувствительность и специфичность, непосредственное обнаружение
инфекционного агента и возможность проведения генотипирования определя¬
ют широту области применения метода ПЦР в клинической диагностике: для
ранней диагностики инфекционных заболеваний у серонегативных пациентов,
когда лечение наиболее эффективно; выявления персистирующих, латентных и
рецидивирующих форм инфекций; контроля эффективности лечения; разрешения
сомнительных результатов серологических исследований; эпидемиологических
исследований; диагностики оппортунистических инфекций, часто протекающих
на фоне иммунодефицита, вследствие чего постановка диагноза только по резуль¬
татам серологических исследований может быть затруднена.Санитарно-эпидемиологические службы применяют ПЦР для контроля микро¬
биологического загрязнения окружающей среды и продуктов питания, а также для
выявления генетически модифицированных источников пищи.Принцип метода основан на обнаружении в материале специфичных фрагмен¬
тов ДНК (РНК) различных биологических объектов, их избирательном синтезе до
концентрации, при которой их легко детектировать, и дальнейшем определении
продуктов реакции амплификации — ампликонов.Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — универсальный носитель генети¬
ческой информации у всех существующих на Земле организмов, за исключением
Б20 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯРНК-содержащих вирусов. Уникальное свойство ДНК заключается в ее способно¬
сти удваиваться после расплетения спирали и расхождения нитей ДНК. Удвоение
ДНК (репликация) осуществляется по принципу комплементарности ферментом
ДНК-полимеразой. Для того чтобы фермент начал свою работу, требуется нали¬
чие небольшого начального двухцепочечного фрагмента ДНК. Такой фрагмент
образуется при взаимодействии короткого одноцепочечного фрагмента ДНК,
называемого праймером, с комплементарным участком соответствующей цепи
родительской ДНК. Репликация протекает одновременно на двух нитях ДНК, но
наращиваются они в противоположных направлениях. В результате репликации
из одной двухцепочечной молекулы ДНК получаются две двухцепочечные, каждая
из которых содержит одну нить от материнской молекулы ДНК и вторую, дочер¬
нюю, — вновь синтезированную.Таким образом, цикл репликации ДНК включает три основные стадии:
расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурацию);
присоединение праймеров;^ достраивание дочерней цепи ДНК.В ПЦР эти процессы осуществляются в пробирке в циклическом режиме.
Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры
инкубационной смеси. Для ПЦР необходимы:два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной примерно по
20 нуклеотидов), комплементарные участкам ДНК из противоположных
цепей, фланкирующим последовательность-мишень (праймеры ограни¬
чивают фрагмент ДНК, который будет миллионы раз скопирован фермен¬
том Taq-ДHK-пoлимepaзoй, присоединяющейся к 3' -концам праймеров и
достраивающей их до заданной длины в несколько сотен пар оснований);
ДНК-мишень;термостабильная ДНК-полимераза, не теряющая активности при темпе¬
ратуре 95 °С;четыре дезоксирибонуклеотида;буферная система для эффективной работы ДНК-полимеразы, обязатель¬
но содержащая ионы магния.Основные этапы ПЦР:подготовка пробы биологического материала, которая заключается в
выделении ДНК или РНК;^ собственно полимеразная цепная реакция (ПЦР-амплификация);
детекция продукта ПЦР (амплифицированной нуклеиновой кислоты).Пробоподготовка (выделение ДНК или РНК из клинического материа¬
ла). На данном этапе образцы клинического материала подвергают специальной
обработке, во время которой происходят лизис клеток, устранение белковых,
полисахаридных, липидных компонентов. Для этого используют различные
методы [например, сорбентный метод, заключающийся в сорбции ДНК (РНК)
на сорбенте после лизиса клеток, многократной отмывке нуклеиновых кислот и
последующей элюции ДНК (РНК) буферным раствором и др.]. В результате такой
обработки получают раствор, содержащий всю ДНК и/или РНК из клинического
материала. Набор для вьщеления ДНК (РНК) обычно выбирают в зависимости от
вида клинического образца.Детально методики выделения ДНК (РНК) из клинических образцов описаны
в инструкциях, прилагаемых производителем к набору реагентов для выделения
нуклеиновых кислот.Полученный раствор ДНК можно хранить в течение недели при температуре2-8 '‘С и до года при температуре -60 “С. Раствор очищенной РНК хранению не
подлежит, его следует сразу направлять на исследование (пробы можно сохранять
только в виде полученных с помощью обратной транскрипции растворов кДНК).V>/
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 621Типичная ПЦР-амплификация состоит в многократном повторении следую¬
щих трех реакций: денатурации, ренатурации, синтеза.Денатурация. Первый этап ПЦР заключается в тепловой денатурации образца
ДНК вьщерживанием его при температуре 94-95 “С. Кроме ДНК, в реакционной
смеси содержатся в избытке два праймера, термостабильная ДНК-полимераза Тад
(выделяют из бактерий ТЫгтиз aqmticus) и четыре дезоксирибонуклеотида.Ренатурация. Температуру реакционной смеси понижают до 50-60 Х, при этом
праймеры габридизуются с комплементарными последовательностями ДНК (исхо¬
дной расплавленной ДНК-матрицы) с образованием коротких двухцепочечных
ДНК-фрагментов, необходимых для начала работы фермента полимеразы (отжиг
праймеров). Каждый из праймеров гибридизуется на одной из двух цепей ДНК-
матрицы таким образом, что концы праймеров, которые способны удлиняться,
направлены навстречу друг другу. Присоединившись к противоположным цепям
молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в
дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента,
который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов.Синтез. Температ}фу реакционной смеси повышают до 70-72 °С — величины,
оптимальной для работы ДНК-полимеразы Тад. Происходит синтез фрагмента
комплементарной (дочерней) цепи ДНК (в качестве строительного материала
используют находящиеся в смеси четыре дезоксинуклеотидтрифосфата). Синтез
фрагментов дочерних цепей ДНК протекает одновременно на обеих цепях мате¬
ринской ДНК.Далее цикл повторяется снова. Образовавшиеся в первом цикле амплифика¬
ции фрагменты цепей ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации,
фрагменты, образовавшиеся в первых двух циклах, — для третьего и т.д. Таким
образом, вновь синтезированные фрагменты служат матрицами для синтеза новых
цепей ДНК в следующем цикле амплификации — цепная реакция. В результате
количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии и про¬
исходит накопление ампликонов в растворе по формуле: 2п, где п — количество
циклов амплификации.Все реакции проводят в пробирках, размещенных в термостате. Разработка
программируемых термостатов (термоциклеров, или амгшификаторов), которые
по заданной программе осуществляют циклическую смену температур, создала
предпосылки для широкого внедрения метода ПЦР в практику лабораторной
клинической диагностики. Смену температурных режимов и их поддержание эти
приборы выполняют автоматически. Продолжительность каждого цикла обычно
составляет несколько минут.Для синтеза праймеров, специфичных в отношении исключительно ДНК-
мишени, нужно знать нуклеотидную последовательность ДНК предполагаемого
патогенного микроорганизма. Основным критерием подбора праймеров считают
комплементарность матрице. В этом случае в ходе ПЦР будет амплифицироваться
только специфический фрагмент ДНК, длина которого равна суммарной длине
двух праймеров и фрагмента ДНК между ними. Подбор оптимальной температуры
отжига праймеров на матрице - важный фактор, влияющий на эффективность и
специфичность амплификации.Модификация метода ПЦР — проведение обратной транскрипции на матрице
РНК. Обратная транскрипция (ОТ) — метод, позволяющий получать на матрице
РНК соответствующую цепь комплементарной ДНК (кДНК). ОТ-ПЦР используют
для выявления генетического материала РНК-содержащих возбудителей (напри¬
мер, вируса гепатита С). В реакции участвует фермент, синтезирующий кДНК на
матрице РНК, — обратная транскриптаза (ревертаза). В результате получается
раствор, содержащий ДНК-копию РНК-вируса. Затем кДНК включается в ампли¬
фикацию, то есть в этом случае анализ протекает в два этапа. ОТ-ПЦР можно
Б22 вирусологические исследованиявыполнять как в различных пробирках (в две стадии), так и в одной пробирке
(совмещенная ОТ-ПЦР) без существенной потери чувствительности.Детекция продуктов ПЦР-амплификации. Существуют различные способы
детекции результатов ПЦР.Присутствие специфических ПЦР-продуктов (ампликонов) определяют элек¬
трофоретическим разделением амплификационной смеси в окрашенном бро¬
мистым этидием агарозном геле. Бромистый эти дий связывается с фрагмента¬
ми двухцепочечных ДНК, которые проявляются в виде светящихся полос при
УФ-облучении геля {с длиной волны 290-330 нм). Для визуализации и ультрафио¬
летового подсвечивания полос ДНК используют специальный прибор — трансил¬
люминатор, а полученные результаты документируют фотографированием (реко¬
мендуют хранить в компьютерной базе данных не менее трех лет).Фрагменты ДНК в агарозном геле разделяют в зависимости от их молекулярной
массы (размера). Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтвержда¬
ется ее положением по отношению к маркерам молекулярной массы и положению
фрагмента положительного контроля амплификации. Дополнительные доказа¬
тельства специфичности ампликона можно получить методами рестрикционного
анализа, гибридизации и прямого секвенирования.К технологиям, альтернативным электрофоретическому способу детекции про¬
дуктов амплификации, относят модифицированные системы анализа с использо¬
ванием флюоресцентных красителей, при этом продукты реакции анализируют с
помощью флюориметрии. Пробирки из амплификатора поступают в детектор, где,
не открывая их, регистрируют флюоресценцию. Полученные результаты сохраня¬
ют в компьютерной базе данных. Уровни флюоресценции оказываются пропор¬
циональными количеству образовавшихся специфических продуктов ПЦР. В таких
вариантах анализа флюоресценцию регистрируют после окончания реакции, и поэ¬
тому метод не является количественным. Важно то, что результаты ПЦР фиксируют
по наличию флюоресценции в закрытых пробирках. Таким образом, решается одна
из основных проблем ПЦР — проблема контаминации ампликонами.Real-time PCR, Один из самых современных вариантов метода - ПЦР в режи¬
ме реального времени. В основе этого варианта лежит количественная детекция
флюоресцентного сигнала, который увеличивается пропорционально количеству
ПЦР-продукта. Результат реакции можно регистрировать и наблюдать на экране
монитора компьютера непосредственно в процессе ПЦР-амплификации,Для количественных вариантов исследований в режиме ПЦР в реальном време¬
ни требуются соответствующие стандарты, которые используют для построения
калибровочных кривых после проведения ПЦР. Используя эти кривые, можно
вычислить неизвестное исходное количество копий ДНК (РНК) в образцах.Преимущества ПЦР в реальном времени:•	регистрация интенсивности флюоресценции позволяет судить о количестве
инфекционного агента в пробе;•	исключается главная причина ложноположительных результатов — рассеи¬
вание продз^ктов амплификации с аэрозолями и персоналом в процессе гель-
электрофоретической детекции;•	требуется всего несколько часов для получения результата (быстрота анализа);•	наличие дополнительного специфического зонда, комплементарного вну¬
треннему участку амплифицируемого фрагмента, снижает риск получения
ложноположительных результатов и увеличивает чувствительность анализа;•	появляется возможность проводить множественную ПЦР — регистрировать
в одной пробирке наличие нескольких инфекционных агентов, используя
различные флюоресцентные красители;•	появляется возможность идентифицировать в продукте амплификации оди¬
ночные нуклеотидные замены.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 623Преимутцества ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний сле¬
дующие.Прямое определение налигия возбудителей. Выявление специфического участка
ДНК-возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя
инфекции. Многие традиционные методы диагностики, например иммунофер¬
ментный анализ, детектируют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизне¬
деятельности инфекционных агентов, что лишь опосредованно свидетельствует о
наличии инфекции.Высокая специфигность. В исследуемом материале идентифицируют уникаль¬
ный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность
задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что сводит к минимуму
риск получения ложных результатов в отличие от иммунологических методов ана¬
лиза, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.Высокая гувствительность. ПЦР-анализ позволяет обнаруживать возбудителей
инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммуноло¬
гическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.
Чувствительность ПЦР-анализа приближается к 10-100 клеткам в пробе.Универсальность процедуры выявления разлигных возбудителей. Материалом для
исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя, что позволяет диагности¬
ровать несколько возбудителей в одном образце (сходством химического состава
всех нуклеиновых кислот определяются унифицированные методы выделения
ДНК/РНК). Для ПЦР-диагностики практически всех инфекционных заболеваний
могут быть использованы один набор оборудования, универсальные процедуры
пробоподготовки и постановки анализа.Высокая скорость полугения результата. Для ПЦР-анализа не требуется вьще-
ления возбудителя в культуре, что значительно сокращает время исследова¬
ния. Унифицированные методы выделения нуклеиновых кислот, автоматизация
амплификации и детекции продуктов реакции дают возможность проведения
полного анализа в течение одного рабочего дня.Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.
Особенное значение метод ПЦР имеет для диагностики труднокультивируемых и
персистирующих микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться
при латентных и хронических инфекциях. ПЦР-диагностика также очень эффек¬
тивна в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью (напри¬
мер, вирусов гриппа).Ограничения метода ПЦР:амплифицируется ДНК как живых, так и неживых микроорганизмов, что
обусловливает определенные требования к интерпретации и срокам про¬
ведения исследований при контроле эффективности лечения (контроль
следует осуществлять спустя промежуток времени, в течение которого
происходит полная элиминация возбудителя);теоретически существует вероятность перекрестных реакций (например,
в результате неадекватного подбора праймеров), что может приводить к
появлению ложноположительных результатов.Взятие клинического материала. Взятие материала, его предварительная
обработка, хранение и перевозка, передача исследуемого материала в другие
организации осуществляются согласно инструктивно-методическим документам,
регламентирующим выполнение исследований для каждого вида возбудителя
инфекций, инстр)тсциям к наборам реагентов и в соответствии с действующими
Санитарными правилами (СП).В целях предотвращения разрушения нуклеиновых кислот рекомендуют
использовать специальные транспортные среды, разработанные и рекомендо¬
ванные производителями наборов реагентов в зависимости от вида материала.
щв 624 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯПеревозку и хранение материала следует осуществлять в условиях Холодовой цепи
с обеспечением контроля установленного температурного режима с помощью
термоиндикаторов. В зависимости от транспортной феды, вида материала и тем¬
пературного режима сроки перевозки и хранения материала могут варьировать.
Ввиду вероятности разрушения ДНК или РНК в клиническом материале сроки
хранения и транспортировки материала должны быть минимальными. При невоз¬
можности доставить образцы в ПЦР-лабораторию в течение требуемого времени
их замораживают (-20 “С). Допускается только однократное кратковременное
замораживание-оттаивание материала.Материалом для ПЦР может служить практически любой биологический обра¬
зец, Пробы крови (плазмы) используют в качественных и количественных иссле¬
дованиях, пробы сыворотки крови — только при качественном ПЦР-анализе. Для
исключения контаминации клинический материал необходимо забирать с помо¬
щью стерильных одноразовых инструментов (шприцев, соответствующих зондов,
пробоотборников и пр.) в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры
(например, пробирки типа «Эппендорф»).Клинические образцы следует хранить отдельно от реагентов.Организация работы ПЦР-лабораторииТребования к организации работ в ПЦР-лабораториях обобщены и сформули¬
рованы в нормативных документах и методических указаниях. Методическими
указаниями определяются принципы организации лаборатории и этапы выполне¬
ния анализа с использованием ПЦР: взятие проб, первичная обработка, хранение,
условия перевозки, обеззараживание материала, выделение нуклеиновых кислот,
проведение обратной транскрипции и/или амплификации, учет и регистрация
результатов исследования биологического материала, пищевых продуктов, материа¬
ла из объектов окружающей среды. Методическими указаниями регламентируется
деятельность персонала лабораторий при вьшолнении исследований с помощью
методов амплификации нуклеиновых кислот, проводимых с использованием заре¬
гистрированных Б установленном порядке наборов реагентов и оборудования.ПЦР-диагностика инфекций связана с проблемой, обусловленной высокой чув¬
ствительностью метода, — возможностью контаминации. Правильная организация
ПЦР-лаборатории имеет принципиальное значение для получения достоверных
результатов и существенно зависит от метода детекции продуктов амплификации.
При использовании метода горизонтального электрофореза этапу детекции следу¬
ет уделять большое внимание, поскольку он является основным источником кон¬
таминации. Помещение для электрофореза должно располагаться в месте, исклю¬
чающем попадание ампликонов в другие технологические зоны лаборатории.
Кроме того, необходимы отдельный сотрудник, тщательно продуманная система
вентиляции, отсутствие возможности перемещения пробирок, штативов и прочего
оборудования из комнаты для электрофореза в другие помещения.Сотрудник, занимающийся ПЦР-диагностикой, в своей работе сталкивается с
двумя видами контаминации:перекрестной контаминацией от пробы к пробе (например, в процессе
обработки клинических образцов), приводящей к появлению спорадиче¬
ских ложноположительных результатов;контаминацией продуктами амплификации (ампликонами), имеющей
наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапли¬
ваются в огромных количествах и служат идеальными продуктами для
реамплификации.Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических
пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или
даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению система¬
тических ложноположительных результатов.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 625Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно, ликви¬
дация контаминации требует значительных затрат времени и средств. Соблюдение
требований, предъявляемых к планировке помещений ПЦР-лабораторий и про¬
ведению самих анализов, исключает возможность контаминации и получения
ложноположительных результатов.В каждом помещении ПЦР-лаборатории должен быть набор реагентов, автома¬
тических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторно¬
го оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и
не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь
в каждой комнате соответствующим образом маркируют.При исследованиях с использованием методов амплификации нуклеино¬
вых кислот обязательно обеспечение поточности движения материала, проб
нуклеиновых кислот, продуктов амплификации. Работа в лаборатории должна
быть организована в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-
помещению.В лаборатории, использующей ПЦР в диагностических целях, осуществляют
внутрилабораторный контроль качества исследований с периодичностью, зави¬
сящей от объема работы и определяемой руководителем лаборатории, но не реже
одного раза в квартал. Лаборатория должна участвовать в установленном порядке
в мероприятиях (программах) по внешней оценке качества лабораторных иссле¬
дований по конкретным нозологическим формам не реже одного раза в год.Внутрилабораторный и внешний контроль качества лабораторных исследо¬
ваний осуществляют путем анализа шифрованных аттестованных контрольных
панелей, содержащих положительные и отрицательные пробы. В ходе внутрила¬
бораторного контроля качества используют аттестованные на наличие аналита
(его количества) панели производителей коммерческих наборов или внутрила-
бораторные аттестованные образцы, содержащие и не содержащие нуклеиновые
кислоты конкретных возбудителей в различной концентрации, стабильные в усло¬
виях хранения.Следует отметить, что широкое использование ДНК-диагностики ни в коей мере
не отменяет методы иммунохимических исследований (ИФА, ПИФ, РИФ и др.), а
дополняет их. Комплексное обследование пациента различными методами дает
врачу-клиницисту более полную информацию как о наличии инфекционного аген¬
та, так и об иммунном статусе, что позволяет более точно ставить диагноз, назна¬
чать соответствующее этиотропное лечение и вести его последующий контроль.БиочипыБиологические микрочипы — одно из наиболее быстроразвивающихся экспери¬
ментальных направлений современной молекулярной биологии и биотехнологии.
Биочипы, подобно электронным микрочипам, обрабатывающим огромные масси¬
вы цифровой информации, предназначены для получения и обработки больших
объемов молекулярно-биологической информации при проведении многопараме¬
трического анализа микрообразца биологического материала.Основа биочипов — матрица микроячеек на плоскости, каждая из которых
содержит молекулярные зонды, специфичные к одной из множества биологи¬
ческих молекул или их фрагментов (например, последовательностям ДНК или
РНК, белкам). Молекулярными зондами могут быть олигонуклеотиды, фрагмен¬
ты геномной ДНК, РНК, белки, полипептиды, антитела, лиганды, олигосахариды
и т.д.Применение биочипов позволяет оперативно обнаруживать микроорганизмы
и вирусы, выявлять мутации, лекарственно-устойчивые формы возбудителей
инфекционных заболеваний, идентифицировать индивидуальные генетические
626 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯособенности пациента, определять предрасположенность к наследственным и
онкологическим заболеваниям, переносимость некоторых курсов терапии и т.д.
Существенный момент при этом — возможность анализировать сотни и тысячи
образцов в кратчайшие сроки.Размеры ячеек современных микрочипов составляют примерно 10-100 микрон,
а значения концентраций анализируемых макромолекул находятся в пределах
около 1 пмоль-10 мкмоль. Общее число ячеек на чипе может колебаться от
нескольких сотен до 10^-10^ линейные размеры чипа — несколько квадратных
сантиметров,В поверхностных матричных биочипах молекулярные зонды иммобилизуют¬
ся на поверхности мембран или пластинок из стекла, пластика, полупроводника
или металла. В гелевых биочипах зонды иммобилизуются или в слое полиакри¬
ламидного геля толщиной около 20 микрон, нанесенного на специально обрабо¬
танную поверхность стекла (такие чипы производит фирма «Регк1пЕ1тег»), или
в полусферических гидрогелевых ячейках диаметром примерно 100 микрон (как
в чипах, разработанных в НИИ молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта
РАН).В основе принципа работы всех молекулярных биочипов с иммобилизованны¬
ми зондами лежит способность биологических макромолекул к молекулярному
узнаванию (высокоспецифичному избирательному связыванию с другими моле¬
кулами). Так, например, образование двухцепочечных ДНК подчиняется прави¬
лу комплементарности, а молекулы антител способны различать определенные
структуры на поверхности белка — антигенные эпитопы. Биологические микро¬
чипы прошли стадию лабораторных испытаний и применяются в диагностических
лабораториях.Время анализа при использовании биочипов сокращается с двух месяцев до
одного дня, что позволяет оперативно назначать резервные терапевтические
средства тем больным, у которых обнаруживают формы туберкулеза, устойчивые
к обычно применяемым антибиотикам. Впервые в мире метод быстрой идентифи¬
кации лекарственно-устойчивых форм туберкулеза, основанный на оригинальной
технологии биочипов, был сертифицирован для медицинского применения в
России. Как показали результаты анализа более 3000 пациентов, надежность мето¬
да превышает 90%. Созданная на основе биологических микрочипов тест-система
«ТБ-Биочип» с 2005 г. поставляется в противотуберкулезные центры России и
передана для проведения медицинских исследований и диагностики в Центр по
контролю над заболеваниями (США),Для выполнения анализа образец крови пациента или другой исследуемой
жидкости подвергают предварительной обработке, в процессе которой нахо¬
дящиеся в нем молекулы метят флюоресцирующим красителем. Затем образец
наносят на биочип, помещенный в специальную микрокамеру. Каждый тип
молекул образца взаимодействует со специфичными к ним зондами, локализо¬
ванными в индивидуальных ячейках микрочипа, что может быть зарегистриро¬
вано по интенсивности свечения соответствующей ячейки биочипа. По картине
свечения множества ячеек биочипа специальный прибор-анализатор определяет
количественно наличие характеристических последовательностей ДНК, РНК
или набора белков в образце.Миниатюрность, быстрота выполнения, экономичность расходования реаген¬
тов и биологических образцов, возможность выполнения сотен и тысяч исследо¬
ваний одновременно, характерные для новой технологии, определяют ее преиму¬
щества и перспективы дальнейшего развития.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 627ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЙ ЭТАП
ПРИ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХПравила сбора биологического материала для вирусологических исследований
и его транспортировка в микробиологические лаборатории регламентирована
действующими нормативными документами.Сбор материала следует проводить как можно раньше, при появлении первых
симптомов болезни, так как период вирусовыделения при многих острых инфекци¬
ях ограничен несколькими днями (3-5 сут). Сбор материала при аутопсии необхо¬
димо осуществлять по возможности в самые ранние сроки после смерти пациента.Все пробы должны быть получены с соблюдением правил асептики. Взятие
клинического материала выполняют стерильными одноразовыми инструментами.
Работу следует проводить в стерильных одноразовых перчатках. Каждый обра¬
зец помещают в отдельный стерильный одноразовый флакон или в контейнер с
завинчивающейся крышкой. Могут быть использованы стерильные конические
центрифужные пробирки с плотно закрывающимися пробками. Объем пробирки
должен быть достаточным для внесения 1-5 мл транспортной среды.Клинический материал для ПЦР-диагностики необходимо забирать в пробирки
с транспортной средой (если таковая необходима), предоставляемой фирмой-
производителем тест-систем или реагентов. Для сбора пробы зондом-тампоном
используют стерильные тампоны (вискозные или дакроновые) на пластиковой или
алюминиевой основе. Не допускается применение тампонов с алгинатом кальция и
деревянной осью. Жидкость везикул аспирируют туберкулиновыми шприцами.Кровь собирают в стерильные одноразовые или стеклянные пробирки с анти¬
коагулянтом (гепарином, ЭДТА, цитратом натрия). Сразу после взятия необходи¬
мо плотно закрыть флаконы, пробирки, контейнеры с биоматериалом, не касаясь
их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек, не допуская зазора
и смятия внутренней части крышки.Пробы биологического материала следует доставлять в лабораторию неза¬
медлительно; если такая возможность отсутствует, должно быть обеспечено хра¬
нение биоматериала в холодильнике. Температура хранения определяется видом
биоматериала. Транспортировку проб, хранившихся при температуре менее О °С,
осуществляют в термоконтейнерах, исключающих оттаивание биологического
материала; охлаждающие элементы перед транспортировкой клинического мате¬
риала следует замораживать до нужной температуры.При переносе клинического материала из пробирок, флаконов, контейнеров в
новые необходимо использовать отдельные одноразовые стерильные наконечни¬
ки с аэрозольными барьерами. Открывая флаконы, пробирки, контейнеры в про¬
цессе работы, нельзя выполнять резких движений во избежание разбрызгивания
и расплескивания клинического материала, что может привести к контаминации
проб и рабочих поверхностей.Для детекции нуклеиновых кислот вирусов следует использовать следующие
образцы биологического материала: кровь, мочу, отделяемое уретры и урогени¬
тального тракта, фекалии, цереброспинальную, слезную жидкость, отделяемое
конъюнктивы и т.д. (табл. 23-5), Эти же разновидности образцов могут быть
использованы для выделения вирусов.КровьВзятие крови следует проводить натощак или через 3 ч после приема пищи из
локтевой вены одноразовой иглой (диаметром 0,8-1,1 мм) в специальную вакуум¬
ную систему типа «УасиІеіГе®» с 6% ЭДТА. После взятия крови пробирку следует
несколько раз плавно перевернуть для перемешивания пробы с антикоагулянтом
и промаркировать.
628 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯТаблица 23-5. Образцы клинического материала для выделения и идентификации вирусовШШШПробаВирусы-возбудителиКровь цельнаяВИЧ, герпес-вирусы 1, 2, 3, 4, 5, 6-го типов, парвовирус В19, энтеро¬
вирусыКровь периферическая (клетки)ВИЧ, герпес-вирусы 1. 2, 3, 4, 5, 6-го типов, парвовирус В19, энтеро¬
вирусыКровь периферическая (плазма)Герпес-вирусы 3, 4, 5-го типов, вирусы гепатитов А, В, С, D, Е, G,
ККГЛ, краснухи, парвовирус 819, энтеровирусыКровь пуповиннаяГерпес-вирусы 1, 2, 3, 5. 6-го типов, вирус краснухи, парвовирус 819Соскоб из цервикального каналаГерпес-вирусы 1,2, 5-го типов, вирус папилломы человекаСоскоб из уретрыГерпес-вирусы 1. 2, 5-го типовСоскоб из эрозивно-язвенных
элементовГерпес-вирусы 1, 2, 3-гс типовМочаАденовирус, герпес-вирусы 1, 2, 5-го типов, вирус КраСНуХИ; полиови-
рус, вирус эпидемического паротитаАмниотическая жидкостьГерпес-вирусы 1, 2,3,4, 5. 6-го типов, вирус краснухи, парвови¬
рус В19Бронхоальвеолярный лаважГерпес-вирус 6-го типаМазок из носоглоткиАденовирус, вирусы гриппа А, В, краснухи, парагриппа 1, 2, 3-го
типов, респираторно-синцитиальный вирусМазок из ротоглоткиАденовирус, герпес-вирусы 1, 2,4, 6-го типов, вирусы гриппа А,
В, краснухи, парвовирус В19, вирусы парагриппа 1-4-го типа,
респираторно-синцитиальный вирус, SARSМокротаГерпес-вирус 5-го типа, вирусы гриппа А, В, парагриппа 1, 2,3-го
типов, респираторно-синцитиальный вирусОтделяемое конъюнктивыАденовирусПлацентаГерпес-вирусы 3, 4, 5,6-го типов, краснухи, парвовирус 819СлюнаАденовирус, вирус бешенства, герпес-вирусы 1, 2. 3,4, 5, 6-го типов,
вирус краснухи, парвовирус В19, вирус эпидемического паротита,
SARSСпинномозговая жидкостьГерпес-вирусы 1, 2.3,4, 5,6-го типов, вирусы краснухи, клещевого
энцефалита, парвовирус В19, энтеровирусы, вирус эпидемического
паротитаФекалииАденовирус группы F, вирус гриппа H5N1, астровирус, норавирус,
ротавируС; флавивирус, энтеровирусы, SARSАутопсийный материалАстровирус, вирусы гриппа А, В, HINIsw, H5IM1, герпес-вирусы 1, 2,3, 4, 5, 6-го типов, вирус краснухи, ККГЛ, парвовирус В19, норавирус,
ротавирус, флавивирус, энтеровирусы, вирус клещевого энцефалита,
SARSПредобработка. Плазму крови следует получать центрифугированием про¬
бирок с цельной кровью при 3000 об./мин (800-1600 g) в течение 20 мин при
комнатной температуре. После центрифугирования, используя наконечники с
аэрозольным барьером, необходимо отобрать не менее 1 мл плазмы в стерильные
пробирки типа «Эппендорф» на 2 мл.Клетки крови (лейкоцитарную фракцию цельной крови) следует отбирать после
центрифугирования цельной крови и удаления плазмы. С помощью наконечников
с аэрозольным барьером собирают лейкоцитарную массу с поверхности осадка
клеток в объеме 0,2 мл и переносят в стерильную пробирку типа «Эппендорф».Условия хранения. Образцы цельной крови хранят при температуре;•	20-25 "С — не более 6 ч с момента получения материала для количественно¬
го, в течение 12 ч — для качественного определения нуклеиновых кислот;•	2-8 °С — не более одних суток как для качественного, так и для количествен¬
ного определения нуклеиновых кислот.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 629Замораживание образцов цельной крови недопустимо.Образцы плазмы крови можно сохранять при температуре 2-8 °С в течение5	сут, -16...-20 X — в течение года.Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Образцы,
предназначенные для длительного хранения, необходимо квотировать в отдель¬
ные стерильные пробирки.Транспортировка. Осуществляют в специальном термоконтейнере с охлаж¬
дающими элементами или в термосе со льдом.Образцы крови транспортируют при температуре 2-8 '’С в течение 6 ч с момента
взятия материала для количественного; 12 ч — для качественного определения
нуклеиновых кислот.Образцы плазмы транспортируют при температуре 2-8 °С в течение 3 сут, в
замороженном виде — в течение 1 сут.Материал из урогенитального тракта женщинМатериал следует получать из нескольких точек: эпителия цервикального кана¬
ла (эндоцервикса), вагинального отделяемого; при необходимости — из уретры и
эрозивно-язвенных поражений.Перед забором материала необходимо удалить слизь с поверхности шейки
матки стерильным тампоном. Соскоб эпителия проводят отдельными для каж¬
дой локализации одноразовыми стерильными цервикальными цитощетками или
универсальными зондами. Рабочую часть цитощетки с собранным материалом
следует обломить в области насечки и оставить в пробирке.Отделяемое уретры получают с помощью универсального зонда. Рабочую часть
зонда с собранным материалом следует обломить в области насечки и оставить в
пробирке.Материал из разных локализаций помещают в отдельные пробирки с транс¬
портной средой. Для скрининга и диагностики папилломавирусной инфекции
материал собирают с помощью комбинированного цервикального зонда для одно¬
временного взятия материала из эндо- и экзоцервикса. Во всех случаях допустимо
присутствие примесей в виде слизи и крови,пробирки необходимо промаркировать.предобработка. Образцы, взятые в транспортную среду, тщательно пере¬
мешивают на вортексе до полного растворения слизи и образования гомогенной
суспензии клеток.образцы соскоба эпителия из эндо- и экзоцервикса, взятые в пробирку с транс¬
портной средой, следует тщательно перемешать на вортексе для растворения слизи
и получения однородной суспензии; затем, используя наконечник с аэрозольным
барьером, отобрать 0,5 мл образца, перенести в пробирку типа «Эппендорф»,
центрифугировать при 10-12 тыс. об./мин в течение 5 мин, удалить 0,4 мл надо¬
садочной жидкости, осадок перемешать с ОД мл оставшейся жидкости.Условия хранения. Клинический материал из урогенитального тракта хранят
при температуре 18-25 °С в течение 48 ч, 2-8 °С — в течение 14 сут, -70 "С — дли¬
тельно. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8 °С в течение 5 сут, в
замороженном виде — в течение 1 сут.Материал из урогенитального тракта мужчинПеред взятием материала следует обработать головку полового члена в области
наружного отверстия уретры тампоном, смоченным стерильным физиологическим
раствором. Отделяемое уретры получают с помощью специального зонда, который
вводят на глубину 1-2 см и несколькими вращательными движениями проводят
630 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯсоскоб эпителиальных клеток. Зонд переносят в пробирку со специальной транс¬
портной средой, обламывают рабочую часть в области насечки и оставляют в про¬
бирке. Допустимо присутствие примесей в виде слизи, крови и гноя.Предобработка. Образцы, взятые в транспортную среду, необходимо тщатель¬
но перемешать на вортексе до полного растворения слизи и получения гомогенной
суспензии клеток.Условия хранения. Клинический материал из урогенитального тракта хранят
при температуре 18-25 °С в течение 48 ч, 2-8 °С — в течение 14 сут.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8 "С в течение 5 сут, в
замороженном виде — в течение 1 сут.МочаЗабирают первую порцию утренней мочи в количестве 20-30 мл в специальный
сухой стерильный флакон объемом 50 мл с крышкой, маркируют.Условия хранения. Нативные пробы мочи хранят при температуре 18-25 "С
в течение 6 ч, 2-8 °С — Б течение 1 сут, предварительно обработанные образцы
мочи — при температуре 2-8 °С в течение 1 сут, -20 "С — в течение 7 сут, -70 "С —
длительно. Допускается однократное замораживание-оттаивание проб.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами при температуре 2-8 °С в течение 1 сут, в замороженном виде — в
течение 1 сут.ФекалииПробы отбирают из предварительно продезинфицированной емкости, из
нескольких мест, одноразовой лопаткой, прикрепленной к крышке флакона для
забора материала, маркируют.Предобработка. Для получения осветленного экстракта фекалий используют
нативные образцы водянистой консистенции или свежеприготовленную суспен¬
зию. или суспензию, подвергнутую замораживанию с глицерином.Приготовление фекальной суспензии осуществляют следующим образом, в цен¬
трифужные пробирки (объемом 1,5 мл) типа «Эппендорф», соответствующие
количеству образцов фекалий, вносят по 0,8 мл стерильного физиологического
раствора, после чего отдельными одноразовыми наконечниками (или одноразо¬
выми лопатками) в каждую пробирку добавляют по 0,1 мл образца и тщательно
перемешивают на вортексе до образования гомогенной суспензии. Ее осветляют
центрифугированием при 12 ООО об./мин (10 ООО g) в течение 5 мин. Супернатант
отбирают в отдельную емкость, смешивают с равным объемом отрицательного
контрольного образца и используют для выделения нуклеиновых кислот.Суспензию фекалий с глицерином готовят при необходимости длительного хра¬
нения материала. Для этого к 10-20% суспензии фекалий добавляют глицерин до
конечной концентрации 10-15%, тщательно гомогенизируют на вортексе и после
экспозиции с глицерином в течение 40 мин пробы замораживают.Условия хранения. Пробы фекалий хранят при температуре 18-25 °С в тече¬
ние 6 ч, 2-8 °С — в течение 3 сут.Фекальную суспензию с глицерином и осветленный фекальный экстракт хранят
при температуре -20 '’С в течение 7 сут, при температуре -70 °С — длительно.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами или в термосе со льдом.Образцы нативных фекалий транспортируют при температуре 2-8 °С в течение
6 ч.Фекальную суспензию с глицерином и осветленный фекальный экстракт транс¬
портируют в замороженном состоянии в течение 1 сут.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ $31Спинномозговая жидкостьСпинномозговую жидкость забирают с помощью одноразовых игл в одноразовые
пластиковые сухие пробирки в количестве не менее 1 мл. пробирки маркируют.Предобработка. Спинномозговую жидкость центрифугируют для концентри¬
рования содержащих вирусы клеток. Осадок и 100 мкл супернатанта используют
для выделения нуклеиновых кислот.Условия хранения. Пробы спинномозговой жидкости хранят при темпера¬
туре 18-25 “С в течение 6 ч, 2-8 ”С — в течение 1 сут, -20 °С — в течение 30 сут,
-70 “С — длительно. Допускается однократное замораживание-оттаивание проб.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами при температуре 2-8 “С в течение 6 ч, в замороженном виде — в
течение 1 сут.Слезная жидкостьМатериал объемом не менее 0,5 мл забирают с помощью одноразовых пласти¬
ковых пипеток в одноразовые сухие стерильные пластиковые пробирки (напри¬
мер, «Эппендорф»). Для усиления слезотечения проводят провокацию слезото¬
чивым веществом (например, нашатырным спиртом). Пробирки с материалом
маркируют.Условия хранения. Пробы слезной жидкости хранят при температуре 18-25 '"С
в течение 6 ч, 2-8 ‘'С — в течение 1 сут. -20 °С — в течение 7 сут, -70 °С - длитель¬
но. Допускается однократное замораживание-оттаивание проб.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами при температуре 2-8 °С в течение 6 ч, в замороженном виде — в
течение 1 сут.Отделяемое конъюнктивыМатериал получают под местной анестезией (2 капли раствора дикаина) с помо¬
щью зонда с сухим стерильным ватным тампоном. Оттягивая нижнее веко, прово¬
дят несколько раз по конъюнктиве, захватывая внешний и внутренний углы глаза.
Материал помещают в специальную пробирку с транспортной средой; нижнюю,
рабочую часть зонда обламывают, оставляя ее в пробирке. Пробы маркируют.Условия хранения. Пробы отделяемого конъюнктивы хранят при температуре
18-25 “С в течение 6 ч, 2-8 X - в течение 3 сут.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами при температуре 2-8 °С в течение 6 ч.Замороженный клинический материал транспортируют в специальном контей¬
нере с сухим льдом в течение 1 сут.Мазки со слизистой оболочки полости носаОтделяемое со слизистой оболочки полости носа следует забирать сухим сте¬
рильным ватным тампоном на пластиковой основе. Тампон вводят по наружной
стенке носа на глубину 2-3 см до нижней носовой раковины. После этого тампон
слегка опускают, вводят в нижний носовой ход, делают вращательное движение
и удаляют вдоль наружной стенки носа. Далее, погрузив рабочую часть зонда
в транспортную среду, помещенную в стерильную одноразовую пробирку типа
«Эппендорф», обламывают стержень, оставляя рабочую часть зонда в пробирке.
Пробы маркируют.Условия хранения. Мазки со слизистой оболочки полости носа хранят при
температуре 18-25 X в течение 6 ч, 2-8 '’С — в течение 3 сут. При необходимости
более длительного хранения температура не должна превышать -16 °С.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающими
элементами при температуре 2-8 X в течение 1 сут. Замороженный клинический
материал транспортируют в специальном контейнере с сухим льдом в течение 1 сут.
032 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯСмывы из полости носаВзятие материала осуществляют в положении больного сидя, с отклоненной
назад головой, В оба носовых хода с помощью одноразового шприца вводят по3-5 мл стерильного физиологического раствора. Промывную жидкость из обоих
носовых ходов собирают через стерильную воронку в одну стерильную емкость,
пробы маркируют.Условия хранения. Смывы из полости носа хранят при температуре 2-8 °С в
течение 6 ч, -20 '"С — в течение 7 сут. -70 “С — длительно.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами при температуре 2-8 °С в течение 6 ч, в замороженном виде — в
течение 1 сут.Мазки из ротоглоткиОтделяемое забирают сухим стерильным ватным тампоном на пластиковой
основе, делая вращательные движения по поверхности миндалин, небных дужек,
задней стенки ротоглотки. Далее, погрузив рабочую часть зонда в транспортную
среду, помещенную в стерильную одноразовую пробирку типа «Эппендорф», обла¬
мывают стержень, оставляя рабочую часть зонда в пробирке. Пробы маркируют.Условия хранения. Мазки из ротоглотки хранят при температуре 18-25 °С в
течение 6 ч, 2-8 "С — в течение 3 сут. При необходимости более длительного хра¬
нения температура не должна превышать -16 °С.Смывы из ротоглоткиПредварительно больной прополаскивает полость рта водой. После этого про¬
водит тщательное повторное полоскание с помощью 10 мл физиологического
раствора в течение 10-15 с. Жидкость собирают в стерильный флакон. Пробу
маркируют.Условия хранения. Смывы из ротоглотки хранят при температуре 18-25 °С в
течение 6 ч, 2-8 “С — в течение 3 сут. При необходимости более длительного хра¬
нения температура не должна превышать -16 “С.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8 °С в течение 6 ч, в
замороженном виде — в течение 1 сут.МокротаЗабирают в количестве не менее 1 мл в одноразовые стерильные флаконы с
широким горлом и завинчивающейся крышкой. Пробы маркируют.Условия хранения. Пробы мокроты хранят при температуре 18-25 "С в тече¬
ние 6 ч, 2-8 °С - в течение 3 сут. При необходимости более длительного хранения
температура не должна превышать -16 ""С.Слюнапредварительно больной троекратно прополаскивает полость рта физиологи¬
ческим раствором. Слюну в количестве не менее 1 мл собирают в сухие стерильные
одноразовые пробирки с завинчивающейся крышкой. Пробы маркируют.Условия хранения. Пробы слюны хранят при температуре 18-25 °С в течение6	ч, 2-8 °С — в течение 1 сут.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами при температуре 2-8 °С в течение 6 ч.Бронхоальвеолярный лаваж, или промывные воды бронховВзятие материала проводят в одноразовые, плотно завинчивающиеся пробирки
объемом 50 мл. Пробы маркируют.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 633Условия хранения. Предварительно обработанные пробы хранят при темпера¬
туре 2-8 °С в течение 1 сут, -20 °С — в течение 7 сут, -70 °С — длительно.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами или в термосе со льдом при температуре 2-8 °С в течение 6 ч, в
замороженном виде — в течение 1 сут.Биопсийный и аутопсийный материалМатериал следует забирать из зоны предполагаемого местонахождения воз¬
будителя инфекции, поврежденной ткани или из пограничной с поврежденным
участком зоны.Кусочки ткани диаметром не более 5 мм помещают в одноразовые стерильные
пробирки типа «Эппендорф», содержащие 0,5 мл специальной транспортной
среды. Пробирки маркируют.Условия хранения. Предварительно обработанные пробы хранят при темпе¬
ратуре 18-25 X в течение 6 ч, 2-8 X — в течение 3 сут. При необходимости более
длительного хранения температура не должна превышать -16 X.Транспортировка. Осуществляют в специальном контейнере с охлаждающи¬
ми элементами при температуре 2-8 X в течение 6 ч.Замороженный клинический материал транспортируют в специальном контей¬
нере с сухим льдом в течение 1 сут (только для материала, подозрительного на
наличие ДНК-содержащих вирусов).ОБЕСПЕЧЕНИЕ КАЧЕСТВА
ПРИ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХВысокое качество лабораторных исследований может бьггь обеспечено только
постоянным поддержанием работы системы контроля качества-проблемы контроля качества изучаются лабораторной квалиметрией — систе¬
мой научных и практических методов оценки качества лабораторных иссле¬
дований. Современная лабораторная квалиметрия предполагает применение в
клинико-диагностической лаборатории системы тотального контроля качества —
обеспечения качества. Суть подхода состоит в том, что в обеспечение качества
включен не только процесс измерения того или иного параметра (например,
определение антител к ВИЧ в сыворотке), но и все остальные компоненты и струк¬
туры лабораторного процесса, прямо или косвенно влияющие на достоверность
результатов.Система обеспечения качества — многокомпонентная структура, характеризую¬
щаяся следующими параметрами:организационной структурой учреждения;персоналом лаборатории (штатом, квалификацией специалистов, профес¬
сиональной подготовкой и переподготовкой и т.п.);
оборудованием (в том числе метрологическим контролем и техническим
обслуживанием);материально-техническим и кадровым обеспечением процесса контроля
качества;мероприятиями по контролю качества;информационной системой лаборатории и управлением данными;
системой документооборота;системой надзора за внештатными ситуациями и мероприятиями по
устранению возможных последствий подобных ситуаций;
системой обеспечения внедрения мер по контролю качества;
системой работы с ЛПУ и пациентами (потребителями лабораторной
услуги);✓
634 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯсистемой оценки качества работы лаборатории (внешней и внутренней);
^ мероприятиями по биобезопасности и организации труда специалистов на
рабочем месте.Только по результатам комплексной оценки всех компонентов системы обе¬
спечения качества можно объективно оценить качество клинико-диагностической
лаборатории. Все остальные подходы к оценке качества являются либо неполны¬
ми, либо субъективными.Описывая систему обеспечения качества клинической лаборатории, выпол¬
няющей исследования по диагностике заболеваний, вызванных вирусными инфек¬
циями, следует начать с организационной структуры лаборатории. В современном
крупном лабораторном учреждении при составлении организационно-штатной
структуры следует предусмотреть выделение ответственного за систему контроля
качества. В средних и малых клинико-диагностических лабораториях эту функ¬
цию может выполнять заместитель заведующего лабораторией. Функциональные
обязанности лица, ответственного за систему контроля качества, должны отражать
все аспекты деятельности, задачи, полномочия, механизм отчетности и контроля
деятельности, связанной с внедрением «тотального» контроля качества, а также
механизмы интегрирования системы контроля качества клинико-диагностической
лаборатории в систему контроля качества лечебно-профилактического учрежде¬
ния и/или местной системы здравоохранения.Несмотря на значительную автоматизацию клинико-диагностических лабора¬
торий. выполняющих исследования маркеров вирусных инфекций, важнейшая
роль в организации контроля качества принадлежит персоналу, непосредственно
воплощающему идеи организации системы контроля качества на своем рабочем
месте. Именно поэтому необходимо постоянно проводить занятия, семинары, пре¬
зентации. посвященные повышению качества лабораторных исследований, В этом
должны принимать участие все сотрудники лаборатории, включая врачебный,
средний, младший медперсонал, и работники вспомогательных подразделений
(регистратура, инженерно-технический и снабженческий персонал).Материально-техническое оснащение КДЛ, выполняющей вирусологические,
серологические и молекулярно-биологические исследования маркеров вирусных
инфекций, подразумевает наличие сложного аппаратно-приборного комплекса
с высокоточными системами измерения. Даже незначительные погрешности в
работе комплекса могут вызвать крайне серьезные лабораторные ошибки. Только
при поддержании лабораторного оборудования в исправном, полностью соот¬
ветствующем техническим параметрам анализа состоянии можно обеспечить
высококачественное выполнение лабораторных исследований. Система контроля
качества подразумевает постоянный мониторинг состояния средств измерения
в лаборатории, что должно включать не только быстрое устранение поломок
оборудования, но и их предотвращение. Для этого организуют регулярное про¬
филактическое обслуживание аппаратного комплекса внешними техническими
специалистами. Годовой (полугодовой, квартальный и т.п.) график профилактиче¬
ского обслуживания оборудования разрабатывают в каждой КДЛ и согласовывают
его с соответствующими техническими службами. Назначают ответственного за
соблюдение графика.Внедрение системы обеспечения качества в работу КДЛ требует финансовых
и материально-технических затрат. Сюда следует включать не только необходи¬
мость учитывать реактивы и расходные материалы, затрачиваемые на ежеднев¬
ный контроль качества, но и затраты на профилактику оборудования, обучение
персонала, организацию и совершенствование лабораторной информационной
системы, организацию документооборота, лабораторного процесса на каждом
рабочем месте и т.п. Эти необходимые расходы следует учитывать при планиро¬
вании бюджета КДЛ, составлении заявок на реактивы и расходные материалы.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 635планировании рабочего времени и т.п, В современных зарубежных лабораторных
учреждениях референсного уровня затраты на создание и поддержание системы
тотального контроля качества достигают 12-15% общелабораторного бюджета.Собственно мероприятия по контролю качества - центральная составляющая
системы. Мероприятия выполняют на двух уровнях — внешнем и внутреннем.Участие во внешней системе контроля качества обязательно, поскольку значи¬
тельная доля выполняемых в КДЛ исследований маркеров вирусных инфекций
связана с социально значимыми инфекциями (СПИДом, гепатитами, ИППП, ВУИ
и т.п.). Внешний уровень оценки необходим для определения степени сопостави¬
мости результатов разных лабораторий и соответствия их установленным нормам
точности. Количество программ Федеральной системы внешней оценки качества
(ФСБОК) постоянно возрастает и включает разделы, посвященные не только
идентификации серологических маркеров инфекционных заболеваний, обуслов¬
ленных вирусами, но и молекулярно-биологическим методам (например, детекции
ДНК и РНК вирусов гепатитов В, С и БИЧ). Любая КДЛ должна (при оптимальном
варианте развития системы контроля качества) стремиться участвовать в макси¬
мально возможном для учреждения количестве программ ФСВОК.Вн)гтренний уровень контроля качества (уровень учреждения) — система меро¬
приятий, принятая в лаборатории для постоянного слежения за всеми этапами
лабораторной работы и позволяющая оценивать качество измерений, выполняе¬
мых в КДЛ. Внутренние мероприятия обязательны для всех исследований, прово¬
димых в лаборатории, и необходимы для установления соответствия получаемых
результатов критериям их приемлемости. Внутрилабораторный контроль качества
(ВЛКК) — обязанность персонала КДЛ.Регулярная внешняя оценка качества и постоянный внутренний контроль каче¬
ства дополняют, но не заменяют друг друга. Задачи внешней оценки качества —
выявление систематических ошибок лабораторных методов и обеспечение един¬
ства и сопоставимости результатов измерений в системе здравоохранения в целом.
Задачи ВЛКК — обеспечение стабильности аналитической системы, обнаружение
и устранение случайных и систематических погрешностей.Для ряда выявляемых в КДЛ маркеров вирусных инфекций доступны охарактери¬
зованные контрольные материалы с заранее определенным количественным содер¬
жанием исследуемого аналита (HB^Ag, НВ^Ь, CMV IgG и т.п.). Производством таких
материалов занимаются как референтные научно-исследовательские центры, так и
производители тест-систем. Использование таких контрольных материалов позволя¬
ет в полной мере осуществлять все мероприятия по ВЛКК при проведении исследова¬
ний для диагностики инфекционных заболеваний, обусловленных вирусами.Подобный контрольный материал должен проходить валидацию в конкретных
условиях КДЛ, несмотря на то что определение исследуемого аналита в охаракте¬
ризованных контрольных материалах проводилось либо в референс-лаборатории,
либо производителем тест-систем. Таким образом, контрольный материал с уста¬
новленным (аттестованным) значением должен бьггь исследован в нескольких
повторах с применением тех тест-систем и анализаторов, которые используются в
повседневной практике КДЛ,При валидации контрольного материала в конкретной лаборатории возможно
получение результата, отличающегося от аттестованного. Причин такого отклоне¬
ния может быть несколько: дизайн тест-системы отличается от такового референс-
тест-системы (например, при измерении HBgAg в лунке планшета сорбированы
антитела к иным, чем в референсной тест-системе, эпитопам вирусного белка),
используется иной принцип измерения (например, не хемилюминесценция, при¬
меняемая во многих тест-системах референсного уровня, а тИФА) и т.п. Валидация
позволяет учесть систематическую ошибку измерения и внести соответствующий
поправочный коэффициент в результаты.
636 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯНеохарактеризованные контрольные материалы также проводятся вне КДЛ и
отличаются от охарактеризованных тем, что концентрация аналита в них неиз¬
вестна (например, высоко- или слабоположительная сыворотка) или установ¬
лена нереференсным методом и не подвергалась валидации по общепринятому
международному стандарту. Неохарактеризованные материалы в обязательном
порядке подлежат процедуре валидации в лаборатории с определением соб¬
ственной внутрилабораторной концентрации аналита. При этом установленная
концентрация аналита в таком контрольном материале может отличаться от
истинной, что обусловливается систематической ошибкой, вносимой исполь¬
зуемыми тест-системами и анализаторами. Тем не менее даже такой контрольный
материал позволяет проводить ВЛКК и эффективно выявлять случайные ошиб¬
ки, возникающие в процессе количественного измерения исследуемого аналита.
Однако применение неохарактеризованных контрольных материалов не дает воз¬
можности устранить систематическую погрешность количественных измерений,
выполняемых Б лаборатории.Третий тип контрольных материалов, применяемых при проведении мероприя¬
тий по ВЛКК, — так называемые домашние контроли, то есть пулированная сыво¬
ротка, собранная в лаборатории, охарактеризованная и аликвотированная для
ежедневного использования. Это наименее предпочтительный тип контрольных
материалов, поскольку при их приготовлении не исключается не только система¬
тическая ошибка измерения, но и вероятность случайной ошибки (использование
при пулировании ложноположительных или ложноотрицательных образцов).
Прибегать к домашним контролям следует только в том случае, когда недоступны
контрольные материалы первых двух типов.Основные требования, предъявляемые к домашним контрольным материалам:•	контрольный материал должен быть слабоположительным, то есть рабочее
разведение пулированной сыворотки проводят до получения слабоположи¬
тельного результата;•	количественное значение аналита должно быть меньше, чем у положитель¬
ного контроля, но больше ОП (cut-off); обычно применяют значение2	X ОП ;криг^•	значение измеряемого аналита должно находиться на линейном участке
калибровочной кривой.Для приготовления контрольного материала сначала определяют необходимое
количество контрольного материала исходя из прогнозируемых потребностей в
лабораторном анализе на длительный фок (от полугода до года). Затем вычис¬
ляют общее количество партий контрольного материала, которые будут извле¬
каться из хранилища (обычно длительное хранение контрольных материалов
для серологических исследований осуществляется при -20 °С, для молекулярно¬
биологических — при -70 °С и ниже). Для непосредственного использования в
течение нескольких дней допускается кратковременное хранение контрольных
материалов для детекции антигенов вирусных частиц или антител к ним при тем¬
пературе 4 "С в рабочей зоне (но не более 1 нед).На следующем этапе определяют рабочее разведение высокоположительной
пулированной сыворотки и приготавливают необходимое количество контроль¬
ного материала (разводить лучше негативной человеческой сывороткой/плаз¬
мой). Для предотвращения бактериального пророста в контрольный материал
следует вносить консервант (например, азид натрия).Следующий этап — валидация контрольного материала. Для этого прово¬
дят тесты на стабильность (измеряют содержание аналита после 1, 2, 3 и 4 нед
хранения в замороженном состоянии) и межсерийную вариацию (определяют
содержание аналита в разных партиях хранения). Удовлетворительными считают
недостоверное снижение содержания аналита при хранении не менее 4 нед и меж-
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 637серийную вариацию не более 20% (предпочтительно — не более 20%) в разных
партиях хранения. Валидированный домашний контрольный материал аликво-
тируют (размер аликвоты соответствует используемому в исследовании объему
анализируемой пробы), маркируют и хранят. Применяют домашний контрольный
материал, так же как и другие типы контрольных материалов, постоянно, прикаждой постановке анализа.Существенной проблемой ВЛКК остается отсутствие регламентирующих доку¬
ментов для контроля качества неколичественных методов исследования. Проблема
особенно остро стоит для клинических лабораторных исследований заболеваний,
обусловленных вирусными инфекциями, в отличие от иных разделов клинической
лабораторной диагностики (биохимии, гематологии и пр.), лабораторная диа¬
гностика инфекционных заболеваний, в том числе вирусных, основана (особенно
на этапе скрининга) на качественном методе измерения, поскольку достоверного
качественного определения аналита (например, антител к ВИЧ или ДНК папил-
ломавируса 16/18-го типа) достаточно для постановки лабораторного диагноза.
Однако даже получение положительного или отрицательного результата исследо¬
ваний позволяет применить математический аппарат лабораторной квалиметрии
для качественных методов исследования. Современные методы лабораторной
диагностики, такие как ИФА и ПЦР в режиме реального времени, используют
для учета результатов аппаратуру, выдающую их в количественном выражении.
При стабильной концентрации аналита и корректном выполнении качественного
варианта ИФА эти параметры будут одинаковыми (или близкими), что позво¬
ляет использовать их для построения контрольных карт и оценки по правилам
Вестгарта.Однако следует учитывать, что для статистического анализа следз^ет брать не
абсолютные значения полученных параметров, а относительные, например при
построении контрольной карты результатов качественного определения HB5Ag в
качестве численного значения берут коэффициент серопозитивности [КС — соот¬
ношение оптической плотности (ОП) контрольного материала и ОП^^^^. В даль¬
нейшем полученные данные анализируют так же, как и данные количественных
методов исследования, с применением аналогичных критериев интерпретации.Что позволяет оценить применение подобного подхода к ВЛКК? Так, если при
выполнении качественного исследования по данным контрольной карты получено
значение КС ниже среднего более чем на 25, можно предполагать, что в результате
случайной ошибки произойдет недовыявление слабоположительных образцов.
Соответственно следует внимательно проанализировать образцы со значениями
близкими, но ниже ОП^р^^, можно проанализировать их повторно. Если же при
качественном исследовании получено значение КС выше среднего более чем на 25
по данным контрольной карты, следует предполагать, что в результате случайной
ошибки произойдет выявление ложноположительных образцов.Таким образом, применение системы статистического анализа результатов
ВЛКК для количественных методов исследования позволяет повысить достовер¬
ность результатов и для качественных методов.Следующий компонент системы тотального контроля качества — система
управления данными в лаборатории. Правильно построенная работа с данными
позволяет существенно снизить количество ошибок на пре- и постаналитическом
этапах лабораторного процесса. Ключевым звеном этого компонента системы
обеспечения качества современного ЛПУ служит лабораторная информационная
система, ориентированная на работу с данными пациентов. Наиболее сложный
участок работы КДЛ с точки зрения управления данными — регистрация проб и
ввод данных пациентов. Правильно разработанная форма заявки на лабораторные
исследования, соблюдение требований к ее заполнению, переход к электронной
документации, штрих-кодирование образцов позволяют избежать множества кан-
тШШ 638 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯвшшцелярских ошибок при выполнении лабораторных исследований на преаналити-
ческом этапе. Доставка результатов исследования конечному потребителю (ЛПУ
или пациенту) в электронном виде снижает количество канцелярских ошибок
лабораторного процесса на постаналитическом этапе, сокращает полное время на
выполнение исследования и повышает качество лабораторных исследований.Правильно сконфигурированная лабораторная информационная система необ-
ходима как для рутинной лабораторной работы, так и для развития системы
контроля качества. Рационально организованная база данных пациентов позво¬ляет проводить адекватный статистический анализ выполненных исследований
и планировать мероприятия по ВЛКК на перспективу, в том числе с точки зрения
материально-технического обеспечения процесса. Разумеется, компьютеризация
лабораторного процесса предъявляет и повышенные требования к квалификации
персонала лаборатории. Таким образом, система обеспечения качества — много¬
компонентный процесс сетевого типа со сложными комплексными связями между
отдельными частями системы.Для своевременного информирования сотрудников о мероприятиях по обеспече¬
нию качества, об изменениях в работе лаборатории, для предотвращения дублирова¬
ния документов, их утраты или неверной адресации в КДЛ должна быть разработана
внутренняя система документооборота. Она должна регламентировать порядок изве¬
щения сотрудников и способ их ознакомления с тем или иным документом, опреде¬
лять порядок и сроки хранения лабораторной документации и лиц, за это ответствен¬
ных. Это также один из компонентов системы тотального контроля качества.Следующий компонент системы тотального контроля качества — система над¬
зора за внештатными ситуациями и мероприятиями по устранению возможных
последствий подобных ситуаций. К сожалению, невозможно избежать внештат¬
ных ситуаций в работе КДЛ (например, аварийное отключение электропитания,
поломка анализатора, сбой в работе сервера или рабочей станции и т.п.), но можно
подготовиться к ним и минимизировать их последствия. Для этого разрабатывают
систему надзора за возможными внештатными ситуациями. В целях обеспечения
качественной работы КДЛ в подобной ситуации необходим набор внутренних
регламентирующих документов, указывающих порядок действий во внештатных
ситуациях, лиц, ответственных за их устранение, предпочтительные варианты обе¬
спечения бесперебойной работы лаборатории и т.п.Следует учитывать, что даже правильно организованная система ВЛКК, обучен¬
ный персонал, разработанная система документации по системе обеспечения каче¬
ства будут чисто формальными признаками, если нет функционирующей системы
обеспечения внедрения мер по контролю качества. Необходимо четко определить
и неукоснительно вводить в повседневную работу КДЛ все компоненты системы
тотального контроля качества лабораторных исследований. Система обеспечения
внедрения мер по обеспечению качества регламентирует порядок внедрения меро¬
приятий по контролю качества, определяет ответственных за это лиц и устанавли¬
вает сроки исполнения мероприятий по внедрению мер.Любая диагностическая лаборатория — учреждение, оказывающее диагности¬
ческие услуги конечному потребителю. Как правило, качество работы КДЛ на
пре- и постаналитическом этапах определяется еще одним компонентом системы
обеспечения качества — системой работы с потребителями лабораторной услуги
(ЛПУ и пациентами). Все усилия персонала лаборатории на аналитическом этапе
легко могут быть сведены к нулю, если ответ не доходит до конечного потребителя
или доходит, но не к тому потребителю. Особенно это важно с точки зрения норм
законности и медицинской этики, поскольку часто результаты диагностических
исследований инфекционных заболеваний, обусловленных вирусами, имеют край¬
не важное социальное и психологическое значение (например, результат исследо¬
вания на ВИЧ, гепатиты В и С и т.п.).
ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 639При этом недостаточно только четко и достоверно выполнять лабораторные
исследования, необходимо делать их понятными врачу-клиницисту. Например,
при количественных исследованиях на определение IgG-aнтитeл к вирусным
инфекциям с нестерильным иммунитетом (герпесу 1-П типа, цитомегаловирусу
и т.п.) полезно указывать граничные значения искомой величины, их интерпрета¬
цию или лабораторный диагноз. Врач клиники может не знать граничные значе¬
ния, и тогда результат исследования потеряет для него ценность. Кроме того, КДЛ
должна активно взаимодействовать с ЛПУ: не только получать образцы и отсылать
ответы, но и проводить постоянную работу по повышению уровня осведомленно¬
сти сотрудников ЛПУ об особенностях клинической лабораторной диагностики
вирусных инфекционных заболеваний, появлении новых видов исследований,
особенностях интерпретации результатов исследований и т.п. В лаборатории
должны быть разработаны и утверждены нормативы сроков выполнения всех
видов исследований, порядок выдачи ответов, организации консультирования
сотрудников ЛПУ и пациентов по результатам исследования биологического
материала, присланного в лабораторию, и т.п. Этот компонент системы контроля
качества тесно взаимосвязан с системой управления данными и организационной
структурой учреждения.Мероприятием по оценке качества может быть периодическое тестирование
зашифрованных панелей образцов сотрудниками лаборатории. Внешнюю оценку
контроля качества могут проводить представители профессионального сообще¬
ства, имеющие высокую квалификацию, или сотрудники референс-лаборатории,
занимающиеся диагностикой инфекционных вирусных заболеваний. Подобные
проверки помогают выявить недочеты в работе системы качества КДЛ и своевре¬
менно их устранить.Мероприятия по биобезопасности и организации труда специалистов на рабочем
месте — еще один компонент системы обеспечения качества лабораторной работы.
Большинство исследований, проводимых при рутинной диагностике инфекцион¬
ных вирусных заболеваний, связаны с анализом потенциально инфекционного
материала, относящегося ко П-1У группе патогенности. Разумеется, коллектив
КДЛ обязан неукоснительно соблюдать все меры биобезопасности, стремясь при
этом к максимальной достоверности и точности исследований. Эффективная рабо¬
та системы обеспечения качества лабораторных исследований должна учитывать
требования санитарных норм и правил.Таким образом, современный подход к организации системы обеспечения каче¬
ства клинических лабораторных исследований для диагностики инфекционных
заболеваний должен быть тотальным, то есть повсеместным. В него включают
все стороны деятельности лабораторного учреждения. Контроль качества должен
быть непрерывным (ежедневным) и касаться всех видов исследований, проводи¬
мых в лаборатории. В работу по обеспечению качества должен быть вовлечен весь
персонал лаборатории.СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫВирусология. Методы, — м.: Мир, 1988. — 344 с.Вопросы общей вирусологии / Под ред. И.Н. Жилинской. - СПб.; Псков: Дом Печати,
2007. - 376 С.Методы культивирования клеток / Под ред. Г.П. Пинаева и Н.С. Богдановой. — СПб.;
Изд-во политехнического ун-та, 2008. — 278 с.Мирзабеков А.Д., Прокопенко Д.В., Чечеткин Б.Р. Применение матричных биочи¬
пов с иммобилизованной ДНК в биологии и медицине // Информационные медико-
биологические технологии / Под ред. В.А. Княжева и К.Б. Судакова. — М.: ГЭОТАР-МЕД,
2002. - С. 166-198.Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых
кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1У группы патогенности:
Методические указанР1я МУ 1.3.2569-09. — М.: Госсанэпиднадзор, 2009.
640 ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯПоздеев O.K. Медицинская микробиология / Под ред. В.И. Покровского. — М.: ГЭОТАР-
МЕД, 2002. - 765 с.Приказ М3 РФ № 45 от 07.02.2000 г. «О системе мер по повышению качества клинических
лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации».Приказ М3 РФ от 21.10.2002 г. № 322 «О применении в практике здравоохранения
иммуноферментных тест-систем для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В
(HBjAg) и антител к вирусу гепатита С (анти*ВГС) в сыворотке крови человека».Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами
ni-IV группы патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» СП
1.3.2322-08. — Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благо¬
получия человека, 2008.Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами1-П группы патогенности (опасности)» СП 1.3.1285-03. — Минздрав России, 2003.Санитарно-эпидемиологические правила «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологи¬
ческого заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных
заболеваний человека I-IV группы патогенности (опасности), генно-инженерно-модифи-
цированньши микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами»
СП 1.2.1318-03. — Минздрав России, 2003.Чандлер Д., Роберсон Р. Оптическая и электронная микроскопия в медицине и в биоло¬
гии: Пер. с англ. — М.; Интеллект, 2009. — 705 с.Чечеткин В.Р., Прокопенко Д.В., Макаров A.A., Заседателев A.C. Биочипы для медицин¬
ской диагностики // www.NANORF.RU Российские нанотехнологии. Исследования и раз¬
работки. - 2006. - Т. 1. - № 1-2. - С. 13-28.Edwards K., Logan J., Saunders N. Real-time PCR: An Essential Guide. — Wymondham:
Horizon Bioscience, 2004. - 346 p.
Глава 24
Частная вирусологияАДЕНОВИРУСЫ
ТаксономияСемейство Adenoviridae (аденовирусов) включает четыре рода:
Atadenovirus, Aviadenovirus, Mastadenovirus, Siadenovirus.Внутри родов представители семейства распределяются по груп¬
пам в зависимости от природного хозяина. Круг хозяев включает
пресмыкающихся, земноводных, птиц, млекопитающих, человека.
В одну группу могут быть объединены несколько подгрупп и серо¬
типов вируса.Аденовирусы, патогенные для человека, относятся к роду
Mastadenovirus и обозначаются аббревиатурой HAdV {Human
AdenoVims). Распределение аденовирусов человека по тканевому
тропизму в зависимости от подгруппы и серотипа вируса представ¬
лено в табл. 24-1.Таблица 24-1. Аденовирусы человекаПодгруппаСеротипыТропизмА12,18. 31-йКишечный и респираторный трактыВ3, 7,11,14,16, 21,34, 35, 50-йРеспираторный трактС1, 2. 5, 6-йРеспираторный и кишечный трактыD8-10,13,15,17,19, 20, 22-30.
32. 33, 36-39, 42-49, 51-йТкани глазаЕ4-йРеспираторный трактF40, 41-йКишечный трактРоль аденовирусов в инфекционной патологии человека различ¬
на. Вирусы подгрупп А (31-й серотип), В (7,11, 21, 34, 35-й сероти¬
пы), С (1, 2, 5-й серотипы) М01ут быть причиной тяжелых пневмо¬
ний, бронхитов и бронхиолитов у больных с иммунодефицитами
разной этиологии. Вирусы подгрупп В (3, 7,14, 21, 34, 35-й сероти¬
пы) и С (1, 2-й серотипы) могут вызывать острую респираторную
инфекцию. В развитии эпидемического кератоконъюнктивита веду¬
щая роль принадлежит аденовирусу 8-го серотипа (подгруппа О).
Представители подгрупп А, С и Р — возбудители острых кишечных
вирусных инфекций. Распространение аденовирусной инфекции
может осуществляться воздушно-капельным, алиментарным и кон¬
тактным путями.
шШ\щшШш.штШв.т642МАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯХарактеристика вирусаАденовирусы являются причиной около 8% всех клинически выраженных
вирусных инфекций человека. Строение вириона представлено на рис. 24-1.Вирион аденовируса не имеет липидной оболочки. Масса его 150-180 МДа.
Зрелый вирион состоит из капсида, фибрилл, сердцевины (coré) и связанных с
ними белков. Капсид аденовирусов имеет диаметр 70-90 нм и форму икосаэдра, от
12 вершин которого отходят нити — фибриллы длиной 9-78 нм. Капсид построен
из 252 капсомеров, 240 из них — гексоны, образующие 20 риангулярных граней;
еще 12 — пептоны. Гексон соседствует с шестью такими же субъединицами и состо¬
ит из трех одинаковых белковых молекул. Каждый пептон состоит из пяти белко¬
вых молекул и окружен перипентонными гексонами. Фибриллы состоят из трех
идентичных гликозилированных полипептидов, выполняющих функцию рецеп¬
торов, с помощью которых осуществляется адсорбция вируса на чувствительных
клетках. Тип симметрии капсида — кубический.Геном аденовируса представлен двухнитевой линейной ДНК. В процессе репро¬
дукции вируса синтезируются ранние (неструктурные) белки, необходимые для
репликации вирусной ДНК, и поздние — структурные белки вириона. Белок II
является структурной единицей гексона; белок III — структурная единица пентона;
белок Illa участвует в ассоциации перипентонных гексонов с пентоном; IV — гли-
козилированный полипептид, структурная субъединица фибриллы; IX — ассо¬
циирован с центральной частью триангулярной грани икосаэдра; белки VI и VIII
расположены с внутренней стороны капсида и являются структурами, повышаю¬
щими его устойчивость; белки сердцевины — V, VII, X — способствуют правильной
укладке вирионной ДНК внутри капсида. Молекулярная масса структурных бел¬
ков различна: от 10 (белок X) до 120 (белок II) кДа.Вирион обладает антигенной активностью, ассоциированной с белками гексона,
пентона и фибриллы. Антиген А (гексон) — родо- и группоспецифический анти-НехопРис. 24-1. Строение аденовируса. Нехоп {antigen /)) — гексон {антиген А). Penton base — основа¬
ние пентона. Penton {antigen В) — пентон (антиген Bj. Fibre {antigen С) — фибрилла (антиген С).
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ643ген, общий для всех представителей семейства Adenoviridae. Антиген В (пентон)
обладает эндонуклеазной активностью и обусловливает токсическое действие аде¬
новирусов. Антиген С (фибриллы) — типоспецифический антиген, обладающий
гемагглютинирующей активностью. Вируснейтрализующие антитела вырабатыва¬
ются против антигенных детерминант антигенов А и С.Аденовирусы относительно устойчивы к факторам внешней среды: время инак¬
тивации при температуре 56 “С составляет 30 мин. При температуре 36 “С вирус¬
ные частицы сохраняют активность в течение 7 сут; при 23 "'С — в течение 14 сут.
Аденовирусы хорошо переносят низкие температуры и лиофилизацию, устойчивы
к изменению pH и органическим растворителям (эфиру, хлороформу и др.).Лабораторные методы диагностикиЛабораторная диагностика аденовирусной инфекции основана:•	на детекции вирусных частиц, антигенов или вирусспецифической ДНК;•	определении вирусспецифических антител или регистрации их прироста.Материалами для исследований являются мазок из носоглотки, мазок из рото¬
глотки, отделяемое конъюнктивы, слюна, амниотическая жидкость, аутопсийный
материал. При подозрении на кишечную инфекцию аденовирусной этиологии
исследуют фекалии больного. Забор клинического материала следует проводить
как можно раньше, желательно при появлении первых клинических симптомов
заболевания, не позднее 3-4-го дня болезни. Аутопсийный материал следует полу¬
чать как можно раньше после смерти пациента. Для серологических исследований
используют следующие материалы.•	Одну сыворотку крови больного, полученную на 3-4-й день заболевания
(для определения 15М-фракции антител). Наличие IgM-aнтитeл, независимо
от их уровня, является показателем острой инфекции.•	Парные сыворотки крови больного, полученные в ранний период и на стадии
реконвалесценции. Четырехкратный прирост Ат свидетельствует о положи¬
тельном диагнозе.Аденовирус, его антигены и ДНК могут быть обнаружены в клинических образ¬
цах следующими методами.•	Просвечивающей ЭМ вирусных частиц.•	Выделением вируса на культуре клеток с последующей идентификацией в
иммунологических реакциях.•	Методом иммунофлюоресценции (МИФ).•	Иммуноферментным анализом для выявления вирусных антигенов (ИФА).•	Иммунохроматографией.•	ПЦР.Антитела к аденовирусу определяются в следующих серологических реакциях.•	Реакции связывания комплемента (РСК).•	Реакции нейтрализации.•	ИФА для выявления вирусспецифических антрттел.Алгоритм лабораторного исследования определяется тяжестью клинических
проявлений болезни. При развитии острой диареи у детей младшего возраста или
тяжелой бронхопневмонии у больных с иммунодефицитами, когда чрезвычайно
важно своевременное установление диагноза, предпочтение отдается методам
ранней диагностики. Как правило, это МИФ, ИФА для выявления антигенов виру¬
са, ИФА для выявления IgM-aнтитeл, ПЦР. В сомнительных случаях используют
подтверждающие тесты.Серологическую диагностику аденовирусной инфекции проводят, как правило,
в РСК с использованием парных сывороток больного, полученных с интервалом2-3 нед. В качестве, по сути, метода ретроспективной диагностики реакцию свя¬
644ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯзывания комплемента используют для диагностики клинически легких случаев
заболевания, проведения дифференциальной диагностики как подтверждающий
тест.Лабораторная диагностика аденовирусной инфекции может быть основана на
выделении вируса в культуре клеток HeLa или Нер-2 с последующим типирова-
нием в РСК или PH. Нужно иметь в виду, что выделение и последующая иденти¬
фикация вируса - процедура трудоемкая и длительная. Для накопления вируса
в количестве, достаточном для иммунологических реакций, зачастую требуется
несколько (2-3) последовательных (слепых) пассажей исходного клинического
материала в культуре клеток. Как правило, выделение аденовируса в культуре кле¬
ток используют как подтверждающий тест.Дифференциальная диагностикаДифференциальную диагностику следует проводить с другими острыми заболе¬
ваниями, обусловленными вирусами. Это респираторно-синцитиальная инфекция,
парагрипп 1,2,3-го типов, грипп А и В, а также острые гастроэнтериты, возбудите¬
лями которых являются астровирусы, калицивирусы, коронавирусы, ротавирусы,
торавирусы, энтеровирусы.Как и при других инфекциях, диагноз устанавливают по совокупности клиниче¬
ских, эпидемиологических данных и лабораторных тестов.АСТРОВИРУСЫАстровирусы — безоболочечные, икосаэдрической формы вирусы с одноните-
вой (информационной) РНК. Семейство Astroviridae подразделяется на два рода
в соответствии с решением Международного комитета по таксономии вирусов:
Mamastrovirus, который поражает млекопитающих, и Avastrovirus, поражающий
птиц.Размеры вириона составляют от 27 до 38 нм в диаметре и обладают уникаль¬
ными пяти- или шестиконечными звездами, различимыми под электронным
микроскопом на своей поверхности, которые и дали название семейству (от греч.
astron — «звезда»). Они содержат одну положительную нить РНК размером 7,2 кЬ,
которая содержит три открытые рамки считывания (ОРС): ОРС 1а и 1Ь, кодирую¬
щую неструктурные белки, и ОРС 2, кодирующую структурный белок. Описано
несколько вирусных белков, включая белок с молекулярной массой 87 кДа, кото¬
рый взаимодействует с моноклональными антителами, специфичными для вирус¬
ного капсида. Известны еще три структурных белка (около 30 кДа). Анализ вирус¬
ного генома позволил выделить астровирусы в новое семейство РНК-содержащих
вирусов — Astroviridae.На основе серологических данных было выделено восемь серотипов астровиру¬
сов человека {HAastV-1-HAastV-S), из которых доминирующим оказался первый.
Все восемь антигенных разновидностей были адаптированы к росту на клеточных
культурах, в которых используется трипсин как дополнение к питательной среде.
Была клонирована ДНК (cDNA) человеческого астровируса первого серотипа
(оксфордский штамм). Когда закрытый {capped) посредник, синтезированный
на основе этой ДНК, использовался для заражения культуры клеток СаСо-2, раз¬
вивалась инфекция. Небольшой размер астровирусного генома наряду с хорошим
ростом на тканевых культурах в экспериментах и пригодностью ДНК-клона для
исследований сделали человеческий астровирус первого серотипа подходящей
системой для изучения сборки вируса.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 645Устойчивость ВО внешней среде22Астровирусы относительно устойчивы к критическим изменениям pH и тем¬
пературы, к воздействию ультрафиолетового излучения и уровню хлора, обычно
определяемому в плавательных бассейнах. После двухчасовой экспозиции астро¬
вирусов в воде с концентрацией свободного хлора 1 мг/л наблюдается остаточная
инфекционность. Астровирусы характеризуются длительной жизнеспособно¬
стью в объектах окружающей среды (пористых и непористых поверхностях) в
температурном диапазоне от 4 до 20 °С и высокой влажности. По показателям
жизнеспособности в окружающей среде астровирусы превосходят полиовирусы и
аденовирусы, немного уступают рота вирусам и вирусу гепатита А. Таким образом,
контактно-бьгговой путь распространения астровирусов может играть существен¬
ную роль во вторичной передаче возбудителя.Методы диагностики заболеванияКлинический материал, используемый для диагностики, — фекалии больного.Для вирусологического исследования применяют ИФА или ПЦР, для чего
пробы фекалий собирают в стерильную стеклянную посуду. Если образцы фекалий
не берут сразу в работу, пробы фекалий для исследования на астровирусы необхо¬
димо хранить в морозильной камере.Методы исследования:•	ОТ-ПЦР — позволяет определять РНК всех 8 серотипов вируса.•	РНК-гибридизация.•	ИФА - для выявления антигенов вируса.Дифференциальная диагностикаРотавирус (группа А), кишечные аденовирусы, калицивирусы, энтеровирусы.
Алгоритм исследования: ИФА РНК-гибридизация ОТ-ПЦР электронная микро¬
скопия.ВИРУС БЕШЕНСТВА
ТаксономияВирус бешенства принадлежит к отряду Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae.
Семейство Rhabdoviridae представлено наиболее распространенными в природе
вирусами. Оно охватывает шесть родов и многочисленные неклассифицирован¬
ные вирусы, которые поражают позвоночных, беспозвоночных и растения. Среди
рабдовирусов наибольшее значение для патологии человека и животных имеют
лиссавирусы. Гиобальный характер распространения лиссавирусов, высокие пато¬
генность и летальность, отсутствие средств лечения развившихся заболеваний
выдвигают лиссавирусы на одно из первых мест по значимости для здоровья
человека и животных. На основании решения МКТВ от 2009 г. род Lyssavirus пред¬
ставлен 11 видами (табл. 24-2).Среди лиссавирусов существует перекрестная антигенная связь на уровне
нуклеопротеина. Уровень гомологии последовательности аминокислот достигает
78-93%. Это позволяет создавать общий для всех лиссавирусов диагностический
препарат (метод флюоресцирующих антител).
1011ВирусыВирус бешенства; дикие и
вакцинные ВБЛагос-Бат
МоколаДувенхагеЛиссавирус европейских
летучих мышей 1-го типаЛиссавирус евро лей ских
летучих мышей 2-го типаЛиссавирус австралийских
летучих мышейАраванЗаладнокавказский вирус
летучих мышейИркутХуджандИсточники выделенияМлекопитающиеПлотоядные, летучие
мыши, собаки, кошкиЗемлеройки,человек,
собаки, кошкиНасекомоядные, летучие
мыши, человекНасекомоядные, летучие
мыши, человекНасекомоядные, летучие
мыши, человекПлотоядные и насе¬
комоядные, летучие мыши,
человекНасекомоядные, летучие
мышиТо жеТожеТо жеАреал распространенияЕвропа, Азия, Америка (Северная,
Южная), Африка
Центральная и Южная АфрикаЦентральная и Южная АфрикаЮжная Африка, ЗимбабвеЕвропа, РоссияЕвропаАвстралия. ФилиппиныКыргызстанКавказский регионВосточная СибирьТаджикистанХарактеристика вирусаВирионы имеют пулевидную форму, их длина составляет около 180 нм, а диа¬
метр — 75 нм. Вирион состоит из несегментированного генома, представленного
одной молекулой спиралеобразно скрученной негативной РНК и пяти структур¬
ных белков; нуклеопротеина (N), фосфопротеина (Р), матричного белка (М),
гликопротеина (G) и РНК-зависимой РНК полимеразы или большого белка (L -
Large protein). Геномная РНК неинфекционна.Инфекционностью обладает нуклеокапсид, или рибонуклеопротеид, состоя¬
щий из геномной РНК, тесно скрученной с тремя внутренними белками (L, N, Р).
Нуклеокапсид «одет» мембранными белками (М, G) и бислойной липидной обо¬
лочкой, через которую проступают гликопротеиновые шипы длиной 8,3 нм.Низкие температуры консервируют вирус. Температура 23 “С инактивирует
его через 28-53 дня, 50 X — через 1 ч, 60 °С — за 5-10 мин, 70 “С — мгно¬
венно. Высушивание без вакуума инактивирует вирус в течение 10-14 дней.
В гниющем материале он гибнет через 15 дней. УФ-лучи убивают за 5-10 мин.
Дезинфицирующие вещества (растворы формальдегида, гидроксида натрия, хлор¬
ной извести) действуют на ВБ губительно. Вирус быстро инактивируется липидо-
растворителями (2% мыльным раствором) и 0,1% раствором трипсина.Все лиссавирусы, кроме Лагос-Бат, вызывают у людей летальные энцефалиты,
клинически неотличимые (за исключением вируса Мокола).Бешенство — острое нейровирусное заболевание, передаваемое человеку через
укус собаки, лисы, волка и других плотоядных животных, зараженных в природе, в
свою очередь, также через укус. Вирус бешенства — единственный из царства виру¬
сов, который поражает всех теплокровных млекопитающих, в том числе человека,
в глобальном масштабе с наивысшей летальностью (100%).Л|Быстрая и своевр
ных экспресс-метод•	для немедлеш
преждения раз•	оценки эпизо<
животных, а т;Диагностика беи
Прижизненная диа!•	на определен«
мешка) метод(•	обнаружении
образцах слк
ОТ-ПЦР;•	вьщелении ВИ{
броспинально]Эффективность г
поэтому перечисле*ПРЯМОЙ МЕТОД ФЛПрямой метод (
(нуклеопротеина)в
ных антител, расск
Феномен иммуноф
вирусный антиген-1
мечеными антитела
опротеина представ
иммуноглобулин к 1
ским для всех 11 вщ
также выявляют в]
теина в отпечатках
спинного мозга, а Т!Из каждого пре;
а из образцов, взят
стекла; их просмат
зрения микроскопг
зеленым цветом на
вают 25-50 полей,
до крупных овальк
Антигенспецифичн!
золотой аутофлюор
варьирует от 60 до <МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИПЦР и его моди4
тельные методы, о
диагностики бешен
ложноотрицательшСеквенированиеСеквенирование
идентификации ви]
в определенной Г0(
»л распространения^зия, Америка (Северная,
Африка	>ная и Южная Африка
>ная и Южная Африка
Фрика, Зимбабве
^оссия1Я. ФилиппинытанИЙ регион1я Сибирь
станэколо 180 нм, а диа-
ма, представленного
Ж и пяти структур-
ричного белка (М),
юльшого белка (Ь —леопротеид, состоя-
[И белками (Ь, N. Р),
йной липидной обо-
1р1иной 8,3 нм.23 “С инактивирует
мин, 70 X — мгно-
ечение 10-14 дней,
(ивают за 5-10 мин.
жсида натрия, хлор-
ппвируется липидо-
трипсина.альные энцефалиты,¡емое человеку через
1ЖеННЫХ в природе, в
яый из царства виру-
. том числе человека.ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ647Лабораторные методы диагностикиБыстрая и своевременная диагностика, основанная на надежных и своевремен¬
ных экспресс-методах, является критической:•	для немедленного оказания укушенному антнрабической помощи и преду¬
преждения развития у человека абсолютно смертельного бешенства;•	оценки эпизоотической ситуации по бешенству среди домашних и диких
животных, а также эффективности мер борьбы с бешенством животных.Диагностика бешенства у человека бывает прижизненной и постмортальной.
Прижизненная диагностика базируется:•	на определении антигена N-белка в криостатных срезах кожи (волосяного
мешка) методом иммунофлюоресценции;•	обнаружении РНК в криостатных срезах кожи (волосяного мешка), моче,
образцах слюны, слезной и цереброспинальной жидкостях методом
ОТ-ПЦР;•	выделении вируса in vivo и in vitro, а также определении антител в крови, цере¬
броспинальной жидкости невакцинированных пациентов.Эффективность прижизненной диагностики низка и варьирует от нуля до 45%,
поэтому перечисленные выше методы повторяют до установления диагноза.ПРЯМОЙ МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛПрямой метод флюоресцирующих антител (ПМФА) — детекция антигена
(нуклеопротеина) вируса бешенства с помощью флюоресцирующих моноклональ¬
ных антител, рассматривается как «золотой стандарт» диагностики бешенства.
Феномен иммунофлюоресценции дает возможность выявлять специфический
вирусный антиген-нуклеопротеин в инфицированных клетках при обработке их
мечеными антителами. Учитывая высокую степень гомологии нуклеотидов нукле¬
опротеина представителей рода лиссавируса, флюоресцирующий моноклональный
иммуноглобулин к нуклеопротеину вируса бешенства является высокоспецифиче¬
ским для всех 11 видов лиссавирусов. Методом флюоресцирующих антител (МФА)
также выявляют внутриклеточные цитоплазматические включения нуклеопро¬
теина в отпечатках или мазках головного мозга, микротомных срезах головного и
спинного мозга, а также в культуре клеток.Из каждого предназначенного для исследования образца готовят два стекла,
а из образцов, взятых от животных, нанесших укусы человеку, готовят двойные
стекла; их просматривают два опытных микроскописта-исследователя. В поле
зрения микроскопа наблюдаются включения, светящиеся интенсивным ярко-
зеленым цветом на фоне темного «неба». В каждом отпечатке-мазке просматри¬
вают 25-50 полей. Форма зеленых включений варьирует от мелких точечных
до крупных овальных, круглых или удлиненных образований (от 2 до 10 мк).
Антигенспецифичные зеленые включения легко отличаются от желтой, белой и
золотой аутофлюоресценции. Время, необходимое для постановки диагноза МФА,
варьирует от 60 до 80 мин.МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА И ИССЛЕДОВАНИЯПЦР и его модификации, в том числе ПЦР в реальном времени, высокочувстви¬
тельные методы, однако ПЦР не рекомендуется экспертами ВОЗ для рутинной
диагностики бешенства из-за возможности получения ложноположительных или
ложноотрицательных результатов.СеквенированиеСеквенирование генов N- и G-белков, а также полного генома используют для
идентификации вирусов группы бешенства и вариантов вирусов, циркулирующих
в определенной географической зоне, классификации вирусов по родам, видам
pip«.шш648ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯЩ}Ш(генотипам) и филогенетическим группам. Секвенирование не имеет отношения к
рутинной диагностике.Выделение вирусаВыделение вируса с последующей его идентификацией в МФА используют как
для прижизненной, так и для постмортальной диагностики бешенства.Выделение вируса in vivo проводят путем его культивирования в мозгу молодых
мышей или в культуре клеток. Для заражения используют мозг умершего челове¬
ка, павщих или гуманным способом забитых бешенных или подозрительных на
бешенство животных. Из кусочков мозга (аммонова рога, ствола мозга, мозжечка
и больших полушарий) готовят 10% взвесь, которую используют для заражения в
мозг 5-10 мышей или культуру клеток. За мышами наблюдают 30 дней на предмет
заболевания или гибели. Мозг заболевших или павших мышей немедленно иссле¬
дуют методом МФА для подтверждения диагноза бешенства. При наличии вируса
в инфекционном материале заболевание мышей наступает на 7-20-й день. Для
сокращения срока наблюдения используют семью новорожденных мышей и после5-го дня после заражения ежедневно забивают по одной-две мыши и исследуют
методом МФА.Выделение вируса гп vitro связано с труднопрогнозируемой продолжительно¬
стью инкубационного периода зараженных животных. Этот недостаток устраня¬
ется при инокуляции вируса бешенства в культуру чувствительных перевиваемых
клеток нейробластомы мыши или ВНК-21 (96- или 24-луночных планшетах) с
последующей детекцией антигена. Спустя 18 ч-7 дней в цитоплазме зараженных
клеток формируются включения нуклеопротеина, которые выявляются методом
МФА. Таким образом, метод выделения вируса бешенства в культуре клеток имеет
значительное (во времени) преимущество по сравнению с методом in vivo.Иммуноферментный анализИммуноферментный анализ (ИФА) может быть использован для диагностики
бешенства, однако риск получения неспецифических ложноположительных и
ложноотрицательных результатов делает его применение ограниченным, в осо¬
бенности когда касается укусов человека подозрительными на бешенство живот¬
ными,Постмортальная диагностикаПосмертная диагностика бешенства у человека высокоэффективна и базируется
на выделении вируса {in vivo или in vitro), детекции нуклеопротеина (антигена),
вирусной РНК или ее фрагментов. Для транспортировки аутопсийного материала
могут быть использованы низкие температуры (ниже нуля) и консервирование
головного мозга в 50% глицерине. К «золотым стандартам» относятся два метода:
выделение вируса (in vivo и in vitro) и детекция антигена (нуклеопротеина) вируса
бешенства прямым методом флюоресцирующих моноклональных антител (МФА).Прямой быстрый нммуногистохимический тестДругим, равным по качеству МФА, методом детекции антигена вируса бешенства
является прямой быстрый иммуногистохимический тест, основанный на взаимо¬
действии биотинконъюгированных моноклональных антител с нуклеопротеином
вируса бешенства. Для исследования используют кратковременно фиксированные
формалином (10 мин) отпечатки свежего, замороженного или сохранившегося в
глицерине головного мозга животных, больных бешенством. Для прямого быстро¬
го иммуногистохимического теста не требуется дорогостоящего оборудования,
достаточно светового микроскопа. В поле зрения выявляются вирусспецифиче¬
ские включения таких же размеров и формы, как и в МФА. Метод предназначен
для использования в вирусологических центрах, полевых условиях.Вирусы гриппа
имеют сегментирс
типа вируса грипп
соответственно). '
сительно стабиль]
матричного (М) б
антигенным свой(
нейраминидазы (}Вирус гриппа -
низмом передачи,
респираторного т)
наличие трех под1
и N2). Вирусы грн
антигенную форм
(НЗМ2). Вирусы г
НЗЫ2) ассоцииро!Вирусы гриппа
питающих (лоша;
Вирусы гриппа, ц
птиц, способны к
Однако межвидов
ным процессом и
вирусами гриппа
Возникновение а(
исходит через не
типа А; они вызы
мии: в 1918,1957Вирусы гриппа
гриппа С ассоции]
шими локальным!Частые мутаци)
гриппа А и В, пр»
работана междуна
получает свой код1	— обозначени2	“ географиче3	— порядковьпкультуры;4	— год выделе!5	— обозначениПримеры: шталштамм А/Сидней/Если вирус бш
вируса указываютВирионы вируо
100 нм, хотя ветре
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 649ВИРУС ГРИППА
ТаксономияВирусы гриппа {Mixovirus influenzae) относятся к семейству Orthomyxoviridae,
имеют сегментированный геном и подразделяются на типы/роды. Известны три
типа вируса гриппа: А, В и С (роды Influenzavirus А, Influenzavirus В, Influenzavirus С
соответственно). Тип вируса определяется антигенными свойствами двух отно¬
сительно стабильных внутренних структурных белков, нуклеопротеина (NP) и
матричного (М) белка. Подтипы/субтипы вируса гриппа А классифицируются по
антигенным свойствам поверхностных гликопротеинов, гемагглютинина (Н) и
нейраминидазы (N).Вирус гриппа — возбудитель острого заболевания с воздушно-капельным меха¬
низмом передачи, протекающего с явлениями общей интоксикации и поражением
респираторного тракта. У вирусов гриппа, вьщеленных от человека, установлено
наличие трех подтипов антигена Н (Н1, Н2, НЗ) и двух подтипов антигена N (N1
и N2). Вирусы гриппа, циркулирующие среди населения до 1957 г., имеют общую
антигенную формулу: А (H1N1), с 1957 по 1968 г. — А (H2N2), а с 1968 г. — А
(H3N2). Вирусы гриппа человека типа А трех данных субтипов (H1N1, H2N2 и
H3N2) ассоциированы с масштабными эпидемиями и пандемиями.Вирусы гриппа А инфицируют не только человека, но и многие виды млеко¬
питающих (лошадей, свиней и др.) и птиц, главным образом водоплавающих.
Вирусы гриппа, циркулирующие среди людей, домашних и диких животных и
птиц, способны к обмену генетическим материалом в процессе реассортации.
Однако межвидовая передача вируса гриппа А является сложным многофактор¬
ным процессом и происходит крайне редко (например, инфицирование людей
вирусами гриппа А птиц субтипов H.N^, в странах Юго-Восточной Азии).
Возникновение абсолютно новых субтипов вируса (антигенный «шифт») про¬
исходит через нерегулярные интервалы времени и только с вирусами гриппа
типа А; они вызывают пандемии гриппа (в XX в. зарегистрированы три панде¬
мии: в 1918,1957 и 1968 гг.).Вирусы гриппа В значительно реже вызывают масштабные эпидемии, а вирусы
гриппа С ассоциированы со спорадическими случаями заболевания или неболь¬
шими локальными вспышками.Частые мутации генов, кодирующих поверхностные гликопротеины вирусов
гриппа А и В, приводят к появлению новых вариантов, в связи с чем была раз¬
работана международная система кодировки, по которой каждый вариант вируса
получает свой код:1	— обозначение типа вируса (А, В или С);2	— географическое место выделения;3	- порядковый номер выделенного в данном году в лаборатории вируса/номер
культуры;4	” год выделения;5	— обозначение антигенного подтипа.Примеры: штамм А/Пекин/262/95 (H1N1), штамм А/Япония/305/57 (H^N^),
штамм А/Сидней/5/97 (HjNj); штамм В/Яманаши/166/98).Если вирус был выделен у животного (а не у человека), после указания типа
вируса указывают сокращенное название животного.Характеристика вирусовВирионы вирусов гриппа А и В имеют сферическую структуру и размер около
100 нм, хотя встречаются и нитевидные формы. В состав частиц вируса гриппа А
650 НАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯвходят порядка 1% РНК, 70% белков, 20% липидов и 5-8% углеводов. Вирионы
с молекулярной массой 250 МДа имеют липопротеидную оболочку. Три вирусных
белка (у вируса гриппа В — 4) пронизывают липидный слой и образуют внешнюю
поверхность вириона. Два из них - вирусные гликопротеиды: гемагглютинин
(НА) и нейраминидаза (NA). Они формируют поверхность вирусной частицы.
'ШШ Именно против НА и ЫА направлен антивирусный иммунитет.У вируса гриппа С в оболочке присутствует только один гликопротеид, НЕ,
совмещающий функции гемагглютинина и ацетилэстеразы.НА, МА и НЕ являются трансмембранными белками. Их гидрофобные транс¬
мембранные участки пронизывают липидный слой оболочки вируса. Третий
трансмембранный белок вирусной оболочки обозначен у вируса гриппа А как М2,
у вируса гриппа В - ВМ2, у вируса гриппа С — СМ2. Внутренняя оболочка вируса
образована белком М1, наиболее обильно представленным в вирусной частице (до
3000 молекул на вирион у вируса гриппа А). Нуклеокапсид у вирусов гриппа пред¬
ставлен рибонуклеопротеидными тяжами, содержащими вирусную РНК и белки.
Генетический материал вируса представлен одноцепочечной минус-цепью РНК,
состоящей из восьми фрагментов, кодирующих вирусные белки. Каждый сегмент
РНК кодирует один или два вирусных белка.Вирус гриппа обладает слабой устойчивостью к действию физических и хими¬
ческих факторов, разрушается при комнатной температуре в течение нескольких
часов (в воздухе погибает примерно через 4 ч, на поверхности предметов — через1-4 сут), в то время как при низких температурах (от -25 °С до -70 °С) сохраня¬
ется несколько лет. Благодаря устойчивости к низким температурам может сохра¬
няться во внешней среде до 3 нед. Вирус гриппа быстро погибает при нагревании
(профевание при температуре 50-60 ®С вызывает инактивацию вируса в течение
нескольких минут), высушивании, при воздействии небольших концентраций
хлора, озона, ультрафиолетовой радиации (во внешней среде вирус гриппа доволь¬
но быстро погибает под действием солнечного света). Вирус чувствителен к дей¬
ствию обычных дезинфектантов.Лабораторные методы диагностикиКЛИНИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯВ слизи, выделяемой больным ИЗ носоглотки при чихании и кашле, вирус
гриппа может сохраняться довольно длительное время. Для выделения виру¬
сов гриппа исследуемым клиническим материалом являются мазки из носа, зева
и задней стенки глотки, смывы из носовой части глотки, секционный материал
(фрагменты трахеи, бронхов, легких). Иногда для выделения вирусов используют
кровь и цереброспинальную жидкость. Оптимальным сроком забора клинического
материала являются первые 2-3 сут от начала заболевания. Для транспортировки
забранного материала в лабораторию используют среду с белковым стабилизато¬
ром, способствующим более длительному сохранению инфекционной активности
вируса гриппа. Это могут быть раствор Хенкса или среда № 199, среда Игла с 0,5%
бычьего сывороточного альбумина или с 0,5% желатина или даже с 0,5% снятого
(обезжиренного) молока. Можно применять забуференный физиологический рас¬
твор — 0,01 М фосфатно-буферный раствор, pH = 7,2+7,4 + 0,15 М натрия хлорида
с 0,5% бычьего сывороточного альбумина. Перед выездом за исследуемым матери¬
алом среду разливают в пробирки или флаконы по 0,5 мл. добавляют по 400 ЕД/мл
пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл неомицина, 100 мкг/мл
микостатина.Материалом для серологической диагностики гриппа служат одна или две (пар¬
ные) сыворотки крови.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ $5*1МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА)Метод флюоресцирующих антител (МФА) является достаточно простым мето¬
дом быстрой диагностики (2-3 ч от момента доставки клинического материала в
лабораторию), при котором вирусные включения обнаруживают в мазках эпите¬
лия слизистой оболочки носа в течение первых дней заболевания.Используют его и для выявления антигенов вируса гриппа в пробах секцион¬
ного материала путем исследования отпечатков кусочков ткани легкого, а также
трахеи и бронхов со специфическими гипериммунными люминесцентными сыво¬
ротками к вирусам гриппа А (HJNJ^), А (НзМ^) и В.МЕТОД ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗАМетод иммуноферментного анализа (ИФА), направленный на обнаружение
антигенов вирусов гриппа в клиническом материале носоглотки и верхних дыха¬
тельный путей, не получил широкого применения из-за недостаточной чувстви¬
тельности и ограниченной возможности тестирования подтиповых/штаммовых
различий вирусов гриппа А (Н1М1, НЗН1, НЗН2, Н5Н1 и т.д.). Именно поэтому
в целях поиска возбудителя при гриппозной инфекции метод ИФА был быстро
вытеснен методом ПЦР, преимуществом которого являются чувствительность,
специфичность, возможность быстрой диагностики гриппа и дифференциальной
диагностики штаммов.ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯПЦР является идеальным методом определения малых и сверхмалых количеств
РНК вирусов гриппа в различном клиническом материале (нативном — мазки из
носоглотки, ротоглотки, мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, секционном —
ткань легкого, трахеи).В случае выявления РНК-содержащих вирусов используют модификацию
метода — ОТ-ПЦР, когда на первой стадии исследования происходит фермента¬
тивный синтез копий комплементарной ДНК с матрицы РНК и полученные к ДНК
фрагменты используют для получения специфических копий. Продукты реакции
анализируют электрофоретически или с использованием флюориметрии.СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ТЕСТЫСерологические тесты основаны на способности вир}?са гриппа агглютинировать
человеческие или куриные эритроциты, а специфические антитела ингибируют
этот процесс. Именно поэтому основным серологическим методом для определе¬
ния противогриппозных антител является реакция торможения гемагглютинации
(РТГА), позволяющая различать подтипы и штаммы вирусов гриппа.Материалом для исследования служат парные образцы сывороток крови, взя¬
тые с интервалом 10-14 дней, которые исследуют одновременно. Лабораторный
диагноз ставят на основании сероконверсии — четырехкратного и более прироста
титров антител в парных образцах крови.Таким образом, оптимальный алгоритм лабораторного подтверждения кли¬
нического случая гриппа представляется следующим. В ранней стадии заболе¬
вания проводят прямую идентификацию вирусных антигенов в носоглоточных
мазках (соскобах) с использованием иммунофлюоресцирующих антител (МФА)
и/или с помощью метода ПЦР (путем амплификации выделенной вирусной РНК).
Инфицирование также может быть подтверждено демонстрацией специфическо¬
го серологического ответа при исследовании парных сывороток крови больного
методом РТГА.Что касается выделения вирусов гриппа из носоглоточных секретов и другого
клинического материала путем заражения культуры клеток или куриных эмбрио¬
нов, эти процедуры все реже применяют в диагностических лабораториях, но они
652 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯнеобходимы для накопления и изучения циркулирующих штаммов вируса гриппа
и используются, как правило, в научно-исследовательских институтах.Дифференциальная диагностикаДифференциальную диагностику гриппа необходимо проводить с острыми
респираторными заболеваниями, рядом других инфекций, которые по симптомам
интоксикации и катаральных явлений напоминают грипп. Это парагрипп, аде¬
новирусная инфекция, риновирусная инфекция, корь в продромальном периоде,
начальный (преджелтушный) период вирусного гепатита, паратиф А.Вирус гриппа H1N1 (swine 2009)ТАКСОНОМИЯВирус гриппа свиней типа А (H1N1), выделенный от больных в Мексике и
США весной 2009 г. (впервые в Калифорнии), получил официальное название
Калифорния/Н1Ы1/04/2009, он является новым вирусом гриппа А, который
ранее не выявлялся в Северной Америке. Этот вид вируса изначально называли
свиным гриппом, поскольку в лабораторном тестировании было показано, что
многие гены этого нового вируса схожи с вирусом гриппа, который обычно встре¬
чается у свиней Северной Америки. Анализ нуклеотидных последовательностей в
базе «GenBank» показал, что наибольшее сходство (95%) по гену гемагглютинина
он показал со штаммом вируса гриппа A/swine/Indiana/P^2439/®®(HlN2) — типич¬
ным представителем североамериканской линии свиного гриппа, циркулирующей
в США с 1999 г.Новый вирус включает гены вируса гриппа, свойственного свиньям в Европе и
Азии, а также гены птиц и человека, что позволяет назвать его трое-четырехкратным
реассортантом. Пандемия гриппа A/H1N1 (комбинация антигенов которого ранее
не встречалась у вирусов гриппа, вызывающих заболевания людей или свиней)
была объявлена ВОЗ 11 июня 2009 г. В соответствии с рекомендациями ВОЗ,
предпочтительным методом лабораторной диагностики нового пандемического
[риппа A/HlNl(sw2009) является ПЦР.КЛИНИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯДля лабораторного исследования у людей лучше всего подходят образцы, взя¬
тые из верхних дыхательных путей. Следует брать следующие образцы: из глуби¬
ны носовых отверстий (назальный мазок), носоглотки (носоглоточный мазок),
носоглоточный аспират, аспират из зева или бронхиальный аспират, секционный
материал. При взятии мазков из полости носа и ротоглотки для исследования
методом ПЦР на пандемический свиной грипп нельзя использовать зонды на
деревянной основе и с хлопковыми тампонами. Для данного вида исследования
рекомендуют совмещать мазки из полости носа и ротоглотки в первой пробирке
с транспортной средой (фосфатно-солевым буферным раствором, 0,1 моль/л) и
исследовать как один образец.Обязательному вирусологическому исследованию подлежит секционный мате¬
риал от умерших с диагнозом «пневмония» или «острая респираторная инфек¬
ция». При подозрении на пандемический грипп A/HlNl(sw2009) исследования
рекомендуют проводить в два этапа.•	Этап 1. Исследование биологического материала на присутствие вирусов А и
В методом ПЦР. При ползгчении положительного результата по обнаружению
вируса гриппа А на первом этапе образцы к ДНК, в которых была обнаружена
РНК Influenza virus А, исследуют далее.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ $53•	Этап 2. Для лабораторного подтверждения заболевания пандемиче¬
ским гриппом нового варианта A/HlNl(sw2009) (подобного штамму А/
Калифорния/04/2009) следует использовать набор реагентов для иденти¬
фикации вируса гриппа типа A/HlNl(sw) методом ПЦР с гибридизационно-
флюоресцентной детекцией.Подтвержденным случаем инфекции, вызванной вирусом гриппа типа А/
HlNl(sw), считается тот, при котором у человека имеет место острое респиратор¬
ное заболевание с лабораторно подтвержденной инфекцией, вызванной вирусом
гриппа свиней типа A(HINI), с помощью проведения одного или более из выше¬
перечисленных исследований. При отрицательных результатах после второго
этапа исследования для дальнейшего типирования следует использовать набор
реагентов для идентификации вирусов гриппа А, вызывающих сезонный грипп
человека H1N1 и H3N2. Если образец не типируется по одной из мишеней (НА
или NA), материал считается подозрительным на содержание нового антигенного
варианта вируса гриппа А и его следует направлять в референс-лабораторию для
дальнейшего исследования.БиобезопасностьДиагностическую лабораторную работу с клиническими образцами от пациентов,
подозреваемых на инфекцию, вызванную вирусом гриппа А (H1N1) свиного проис¬
хождения, следует проводить в условиях BSL-2 с использованием соответствующих
средств индивидуальной защиты. Все манипуляции с клиническими образцами
необходимо проводить внутри сертифицированного бокса биобезопасности.ВИРУС ИММУНОДЕФИЦИТА
ТаксономияСогласно данным Международного комитета по таксономии вирусов 2002 г.,
ВИЧ относится к семейству Retroviridae, подсемейству Orthoretrovirinae, роду
Lentivirus, Уникальной особенностью представителей семейства Retroviridae явля¬
ется наличие фермента — обратной транскриптазы, которая осуществляет синтез
ДНК на матрице геномной РНК. ДНК затем встраивается в геном клетки и назы¬
вается провирусом. Известно о двух типах ВИЧ: ВИЧ-1, получивший наибольшее
распространение в мире, и ВИЧ-2, встречающийся реже. Штаммы ВИЧ-1 в связи
со значительным генетическим разнообразием отнесены к трем группам: М — наи¬
более многочисленной и включающей девять субтипов от А до Н, а также N и О.Характеристика вирусаВирионы ВИЧ имеют округлую форму и диаметр 100-120 нм. Наружная мем¬
брана вириона, позаимствованная от клетки-хозяина, пронизана собственными
белками вируса. Их два — трансмембранный гликопротеин gp 41 и поверхностный
гликопротеин gp 120. Они связаны между собой нековалентной связью и форми¬
руют отростки на поверхности вирионов. Нуклеоид вируса имеет характерную
вытянутую форму. Оболочка нуклеоида построена из молекул белка, называемого
р24. Между наружной оболочкой вириона и нуклеоидом существует каркас тол¬
щиной 5-7 нм, состоящий из молекул белка — матриксного протеина р17. Внутри
нуклеоида содержатся две одноцепочные молекулы РНК, белок р7, связанный с
РНК, и комплекс ферментов (обратная транскриптаза, РНКаза Н, интеграза и про¬
теаза). Геномная РНК ВИЧ содержит структурные {gag, pal, env) и регуляторные
гены.
шшШ-íS54 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯШ'умВсе белки вириона ВИЧ способны вызывать иммунный ответ как в организме
человека, так и при иммунизации лабораторных животных. Наиболее иммуноген¬
ными белками вирусной частицы являются поверхностные гликопротеины gp 120
.'«7	^ ^	предшественник gp 160. Антитела к этим белкам появляютсяотносительно рано, выявляются у 98% инфицированных и более стабильны, чем
антитела к другим антигенам.ВИЧ-1 инактивируется следующими средствами: изопропиловым спиртом,
этиловым спиртом, гипохлоридом натрия, перекисью водорода, лизолом и др.
Считается, что для инактивации инфекционности ВИЧ для тестов in vitro доста¬
точно широко описанного прогревания вируссодержащего материала при 56 ®С
в течение 30 мин. Однако имеются данные об инфицировании ВИЧ 6 пациентов
с гемофилией, получивших в качестве заместительной терапии фактор VIII, при¬
готовленный из скринированной крови и прогретый при 60 °С в течение 30 ч.
Другими словами, в ситуации in vivo инфекционно опасными могут быть не только
полностью интактные вирионы ВИЧ, но и внутрикапсидный интеграционный
комплекс (то есть геномная РНК вируса и ферменты, обеспечивающие ее обрат¬
ную транскрипцию и интеграцию в геном).Методы диагностики ВИЧ подразделяются на две группы: прямые и непрямые.
В первом случае обеспечивается обнаружение либо самого возбудителя, либо его
структурных компонентов, к которым относятся белки и нуклеиновые кислоты —
РНК или ДНК. Во втором случае диагностика строится на ответной реакции орга¬
низма на вторжение возбудителя. К этой группе относятся серологические мето¬
ды, направленные на обнаружение специфических к возбудителю антител (Ат).
Исторически первыми были разработаны и применены в практике серологические
методы диагностики ВИЧ.Лабораторные методы диагностикиСЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫСерологические методы являются ведущими в диагностике ВИЧ. К ним отно¬
сятся иммуноферментный анализ (твердофазный ИФА) и иммуноблот (ИБ). ИФА
характеризуется очень высокой чувствительностью (практически 100%) и служит
для скрининга образцов. Для подтверждения серопозитивности используют ИБ,
так как специфичность этого теста превосходит ИФА.При использовании серологических методов (ИФА, ИБ) основной проблемой
является наличие серонегативного «окна» — периода от момента заражения до
появления Ат. с помощью ИФА-тестов I, II поколения обнаруживали Ат через6-12 нед. Применение современных тестов (III, IV поколения) позволило сокра¬
тить серонегативный период до 3-4 нед. Более того, тесты IV поколения позволя¬
ют одновременно выявлять суммарные антитела к ВИЧ-1 и антиген р24 ВИЧ-1 в
сыворотке (плазме) крови человека. Раннее появление р24 в крови (через 2 нед)
связано с активной репликацией вируса во время острой фазы инфекции. Когда
начинают обнаруживать Ат к ВИЧ, антиген р24 часто уже не выявляется в резуль¬
тате образования комплекса между Аг и Ат.Выявление Ат к ВИЧ-1 группы О и ВИЧ-2 осуществляют путем сорбции на
твердой фазе пептидов, воспроизводящих иммунодоминантные эпитопы белков
оболочки этих вирусов.По рекомендации ВОЗ, положительные результаты при ИФА-диагностике
ВИЧ-инфекции следует подтверждать методом ИБ, то есть иммуноферментным
анализом с выявлением антител к индивидуальным белкам вируса. В классиче¬
ском варианте ИБ иммуносорбентом служат полоски (стрипы) нитроцеллюлозной
мембраны с сорбированными на них методом электропереноса индивидуальными
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ655ИФА 1
(скрининг)ИФА 2
(скрининг)Иммуноблоттинг
(подтверждающий
	 тест)ДиагнозподтвержденКонсультирование и оценка недавнего
риска инфицирования ВИЧДиагноз исключенПовторное
обследование
в ИФА/иммуноблоте
через 1-3-6 мес
или проведение
ДНК ПЦРРис. 24-2. Алгоритм серодиагностики ВИЧ-инфекции.белками вируса. Вся совокупность нативных антигенов вируса распределена по
поверхности стрипа, занимая на нем зоны в соответствии с молекулярной мас¬
сой каждого антигена. При наличии в исследуемой сыворотке соответствующие
антитела связываются с антигенами в соответствующих зонах. Образовавшиеся
комплексы «Аг-Ат» выявляются с помощью стандартных приемов ИФА: связы¬
вания комплекса «Аг-Ат» с конъюгатом и затем ферментативного расщепления
субстрата с появлением окраски. В идеале необходимо присутствие Ат против всех
белков, но в реальности наблюдаются разные профили присутствия Ат: к одним
белкам они присутствуют, к другим — нет. в связи с этим имеются критерии оцен¬
ки результатов ИБ, которые приводятся в инструкции к тесту.Учитывая возможность с помощью тестов IV поколения выявлять антиген р24
ВИЧ-1, дополнительно появились тесты для подтверждения наличия р24 БИЧ-1.Алгоритм исследования на ВИЧ-инфекцию включает определение Ат методом
ИФА с последующим подтверждением в ИБ. Обобщенная диагностическая схема
представлена на рис. 24-2.МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫВ настоящее время уже трудно представить, чтобы лабораторное сопровождение
ВИЧ-инфицированных пациентов осуществлялось без применения молекулярных
методов, в первую очередь, это относится к полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Их широкое применение в отечественных лабораториях началось относительно
недавно (с 2004 г.). Они необходимы:•	для диагностики ВИЧ-инфекции у детей до года, рожденных ВИЧ-инфи-
цированными женщинами;•	количественного определения РНК ВИЧ в 1 мл плазмы крови (вирусная
нагрузка);•	определения лекарственной устойчивости ВИЧ.Диагностика ВИЧ-инфекции у детей до годаПрактически все дети, рожденные ВИЧ-инфицированными женщинами, явля¬
ются сер0[юзитивными в тесте на Ат к ВИЧ, при этом лишь 15-30% из них в
действительности инфицированы. Длительность циркуляции материнских Ат
в крови детей составляет в среднем 9-12 мес, и в этот период методы сероди¬
агностики неинформативны. Применение ПЦР-тестов, предназначенных для
качественного обнаружения провирусной ДНК ВИЧ в мононуклеарных клетках
периферической крови (МКПК), позволяет осуществить раннюю (<4 мес) диагно¬
стику ВИЧ-инфекции у детей. Алгоритм исследования предусматривает первичное
в656ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯтестирование в возрасте 1 мес. При отрицательном результате повторное тести¬
рование проводят в возрасте >4 мес. При положительном результате повторное
тестирование (подтверждение) осуществляют в максимально короткий срок после
первичного.КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РНК ВИЧ В 1 МЛ ПЛАЗМЫПоявление новых препаратов для лечения ВИЧ-инфекции требует быстрых
методов оценки эффективности лечения. Для достоверных изменений клини¬
ческих и иммунологических показателей требуется длительное время (годы).
Первые количественные методы были внедрены в практику в 1996-1997 гг.
Достаточно быстро было показано, что уровень вирусной нагрузки (ВН) является
прогностическим маркером прогрессирования заболевания и информативен при
оценке эффективности терапии. Это предопределило их быстрое и повсеместное
внедрение в практику для лабораторного мониторинга ВИЧ-инфицированных
пациентов. Был определен алгоритм обследования пациентов с целью своевремен¬
ного начала терапии и оценки ее эффективности (табл. 24-3).Таблица 24-3. Определениб ВН у ВИЧ-инфицированных пациентовЦельМониторинг естественного
теченияКонтроль эффективности тера¬пииОбследование беременныхСроки абследованияКаждые 3-6 месФончерез 1 мес,дапее каждые 3-6 мес24 нед36 недКритерии начала терапии
и оценки ее эффективности>50 ООО копий/млСнижение ВН ä1,5 lgСнижение ВН <50 копий/млВН определяет схему профилактикиСнижение ВН <50 копий/млОпределение лекарственной устойчивости ВИЧОсновной причиной неэффективности комбинированной антиретровирусной
терапии, включающей не менее трех препаратов, является формирование устойчи¬
вости ВИЧ к одному или более препаратам. Установить, какой препарат (препараты)
в данной схеме неэффективен, позволяет тест на резистентность. Его применение
фактически обеспечивает индивидуальный подход к лечению каждого пациента.
Принцип: методом секвенирования определяют нуклеотидную последователь¬
ность участка гена pol исследуемого образца ВИЧ, кодирующего два вирусных
фермента: обратную транскриптазу и протеазу. Именно против этих ферментов
направлено действие большинства лекарств. Прилагаемые программы позволяют
сравнить полученную последовательность ДНК с референс-последовательностью
для выявления генетических отличий (мутаций), оценить значение этих мутаций
для возникновения устойчивости к тому или иному препарату и сформировать
«отчет» о лекарственной устойчивости.ВИРУС КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
ТаксономияВирус клещевого энцефалита (ВКЭ) относится ко 2-й группе патогенности.
Основным переносчиком являются иксодовые клещи, возможно заражение людей
через употребление молока инфицированных животных.Вирус клещевого энцефалита, названный в международной классификации
<^Ткк-Ъогпе encephalitis virus$>, относится к роду Flavivirus, семейству Flavmridae.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ В57Является прототипным представителем одноименной серогруппы вирусов. Вирусы
этой группы характеризуются наличием типоспецифичных и серогруппспецифич-
ных антигенных детерминант. Типоспецифичные антигенные детерминанты вовле¬
чены в нейтрализацию, опосредованную антителами. Выделяют Дальневосточный
(или Восточно-Сибирский), Европейский (или Западно-Европейский) и Сибирский
генотипы ВКЭ.Вирион ВКЭ сферической формы, 50 нм в диаметре, состоит из липидсодержа¬
щей оболочки и нуклеокапсида, который имеет икосаэдрический тип симметрии,
30 нм в диаметре. Геном вируса представлен единственной несегментирован-
ной одноцепочечной линейной РНК позитивной полярности, длиной 10 488-
10 976 H.O., кодирующий один полипротеид-предшественник десяти белков, три
белка являются структурными. Полипротеиды Е и М образуют пепломеры —
выступы на поверхности липидной оболочки. Структурный полипептид с форми¬
рует капсид. Структурный белок Е отвечает за связывание вируса с клеточными
рецепторами, определяя тропизм и вирулентность, является основным антигеном
ВКЭ. Семь неструктурных белков: NS1, NS 2А, NS 2В, NS 3, NS 4А, NS 4В и NS 5 —
обеспечивают репликацию вируса в клетке. Кроме того, в процессе репродукции
вируса образуются три коротких полипептида: CTHD, Рги, 2К, которые обеспечи¬
вают транспортировку структурных белков и правильность сборки.Внутри-, межочаговая и региональная генетическая гетерогенность ВКЭ обу¬
словлена структурным разнообразием эпитопов каждого из антигенов вируса.Вирионы КЭ обладают гемагглютинирующей и комплементсвязывающей актив¬
ностью. Вызывает агглютинацию эритроцитов гусей.Характеристика вирусаВирион имеет молекулярную массу бОхЮ^’Да, Лиофилизированный, а также
замороженный вирусный субстрат сохраняет патогенные свойства в течение
нескольких лет, хотя при этом снижаются его вирулентные свойства. Вирус КЭ
хорошо переносит низкую температуру, при -60 “С сохраняется длительное время.
Малоустойчив к высоким температурам. При комнатной температуре (16-18 °С)
сохраняется в течение 10 дней, при 37 X — сутки, при 50 X инактивируется в
течение 20 мин. Вирус чувствителен к кислотам, лучше переносит слабощелочную
среду. Желудочный сок нормальной кислотности при 37 “С вызывает отчетлив^^’ю
инактивацию вируса через 30 мин и полную — через 2 ч, В коровьем молоке при
температуре холодильника вирус не снижает своей активности в течение 2 нед,
длительное время (не менее 2 мес) сохраняется в сметане.Инактивируется при воздействии дезинфицирующих веществ (5% хлорной
извести, 1% раствора квасцов, 3-5% раствора серной кислоты, 3-5% раствора
лизола) в течение нескольких минут, при воздействии прямых солнечных лучей,
ультрафиолетового излучения — в течение 10-15 мин.Лабораторные методы диагностикиВирусы вьщеляют из крови больных, взятой в первые дни болезни (идеаль¬
но — в первые 3 сут болезни), цереброспинальной жидкости, реже носоглоточно¬
го секрета и мочи, взятых в первые 5 дней. Пробы крови и ликвора целесообразно
заморозить для разрушения клеточных элементов. Выявление ВКЭ в суспензии
мозга возможно только при ранней гибели больного (не позднее 7 сут).Лабораторная диагностика клещевого энцефалита основана на обнаружении в
клиническом материале специфических антител, а также вируса КЭ, его антигенов
или нуклеиновой кислоты (РНК ВКЭ) в биологических субстратах.
шш*658 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯСЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫВ практической диагностике преобладает использование серологических мето-
ДОВ, то есть определение антител к ВКЭ в РТГА, РСК и иммунохимического —
в ИФА.До недавнего времени из-за простоты выполнения ведущими были эритроци-
тарные методы; РТГА и РСК. Известно, что гемагглютинирующие антитела при
КЭ появляются в первые дни заболевания, достигая максимальных значений на2-3-й неделе от начала заболевания. В крови реконвалесцентов их уровень сни¬
жается, но они сохраняются практически пожизненно. Комплементсвязывающие
(КС) антитела появляются в крови гораздо позже — лишь на 2-3 нед заболевания,
у части больных (до 60%) они отсутствуют до 4-5-й недели, наивысших пока¬
зателей достигают к 6-9-й неделе заболевания, Комплементсвязывающие анти¬
тела сохраняются в крови переболевших недолго — около года. По процентному
содержанию в популяции КС-антител с определенной долей вероятности можно
судить о популяционном иммунитете к инфекции (уровне «естественного проэпи-
демичивания» населения). Следует учитывать наличие среди циркулирующих в
природе штаммов вируса антигенно-дефектных вариантов, которые характеризу¬
ются отсутствием гемагглютинирующего и преципитирующего антигенов и слабой
иммуногенностью на фоне высокой инфекционной активности вируса,Эритроцитарные методы характеризуются рядом недостатков:•	нестандартностью методики из-за использования гусиных эритроцитов;•	необходимостью предобработки сывороток пациентов козлином и эритро¬
цитами для удаления ингибиторов гемагглютинации;•	отсроченностью лабораторного диагноза из-за необходимости исследования
парных сывороток, взятых в первые дни заболевания (или госпитализации)
и через 2 нед.Этих недостатков не имеет метод ИФА, главным преимуществом которого явля¬
ется возможность раздельного определения специфических IgM- и IgG-антител.
IgM-антитела появляются в крови в первые дни заболевания, со 2-3-й недели к
ним присоединятся IgG-антитела, которые постепенно замещают IgM-антитела
и остаются в крови пожизненно. Однократное определение вирусспецифических
иммуноглобулинов класса IgM следует считать достоверным свидетельством в
пользу диагноза клещевого энцефалита. Анализ Е-антигена ВКЭ используют для
определения инфицированности клеща, снятого с укушенных. Период циркуляции
вируса КЭ в крови больного обычно соответствует продолжительности лихора¬
дочного состояния. В этот период (особенно в первые 3-5 дней лихорадки) вирус
обнаруживают в крови, спинномозговой жидкости, в мозгу умерших.ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫДля выделения вируса применяют метод биопробы на беспородных белых
мышах и культивирование в культуре перевиваемых линий клеток СПЭВ, LLC-
МК, Vero, ВНК-21, Hela и др. Монослой клеток через 48-72 ч культивирования
изучают методом МФА. В цитоплазме инфицированных клеток обнаруживают
включения в виде зеленой массы или гранул.Для проведения биопробы вируссодержащий материал (образцы крови, СМЖ,
разведенной ФБР мочи) вводят интрацеребрально 2-6-суточным мышам.Вследствие чрезвычайной трудоемкости, длительности выделения и иденти¬
фикации возбудителя КЭ на мышах или культуре ткани, жестких требований к
хранению и доставке материала в лабораторию, а также соблюдения особых усло¬
вий противоэпидемического режима (ВКЭ относится к возбудителям II группы
патогенности) вирусологический метод выделения вируса КЭ из клинического
материала для диагностики используют все реже. Даже при соблюдении всех необ¬
ходимых предосторожностей и исследовании материала в первые 4 дня заболева-
шЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 059ния частота выделения вируса из крови и спинномозговой жидкости не превышает
40%.Существенным достижением последних лет стало использование метода ПЦР
для обнаружения РНК вируса КЭ в клиническом материале от пациентов: крови
и спинномозговой жидкости. Преимуществом метода является его высочайшая
чувствительность, а также возможность применения в клинико-диагностических
лабораториях.При дифференциальной диагностике следует учитывать возможность заболе¬
вания пациента японским энцефалитом, геморрагической лихорадкой с почечным
синдромом, энтеровирусным менингитом, клещевым риккетсиозом, болезнью
Лайма (боррелиозом) и др.ВИРУС КОРИ
Характеристика вирусаВирус кори относится к роду МогЪШтги5, семейству Рагатухоут4ае и является
близким родственником вируса чумы крупного рогатого скота и собак.Вирионы кори полиморфны и имеют размеры от 100 до 300 нм. Геном вируса
представлен несегментированной одноцепочечной РНК отрицательной полярно¬
сти, с молекулярной массой 4,5xl0^ состоит из шести генов, кодирующих восемь
белков. Порядок генов следующий: ЛГ-ген, кодирующий нуклеокапсидный белок;
Р-ген, кодирующий фосфопротеин Р, два неструктурных белка — С и V; М-ген,
кодирующий мембранный белок; Р-ген, с которого считывается белок слияния;
Я-ген, кодирующий гемагглютинин; 1-ген, кодирующий главный полимеразный
компонент — Ь-белок. Молекулярная масса вирусспецифических белков колеблет¬
ся в пределах от 21 (белок С) до 210 (белок Ь) кДа. Вирусная РНК, белки М, I и Р
формируют спиралевидный нуклеокапсид, окруженный липидной оболочкой, на
поверхности которой определяются два вида гликопротеинов: белки гемагглю¬
тинина (димеры Н-белка) и белки слияния (тетрамеры Р-белка), частично погру¬
женные в липидную мембрану. Длина каждого из гликопротеинов 22-24 нм.В слиянии с оболочкой вирионов принимает участие поверхностная мембрана
инфицированной клетки. Парамиксовирусы обладают повышенным сродством к
клеточным рецепторам, содержащим сиаловую кислоту.В целом у вируса кори стабильный геном. Вакцинные штаммы имеют незна¬
чительные отличия, а дикие вирусы более вариабельны. В настоящее время в
мире циркулирует несколько генетических вариантов этого вируса, которые были
определены методами молекулярной эпидемиологии в процессе изучения П)'тей
передачи возбудителя.Вирус кори термолабилен, чз^вствителен к действию детергентов, быстро инак¬
тивируется в кислой среде (pH = 2+4), При 56 "С инактивируется в течение 30 мин.
Сочетанная обработка твином-80 и эфиром позволяет получить более устойчивый
во внешней среде, лишенный инфекционности гемагглютинирующий антиген.Типичное течение кори сопровождается высокой температурой и сыпью.
Инкубационный период заболевания длится в среднем около 10 дней (от 7 до
18) с момента инфицирования дыхательных путей до повышения температуры.
Первоначальная репликация вируса происходит в эпителиальных клетках трахеи
и бронхов, затем вирус проникает в локальные лимфатические узлы. В дальней¬
шем инфекция через моноциты с кровотоком переносится в другие органы и ткани:
селезенку, тимус, легкие, печень, почки, соединительную ткань и кожу. Репликация
вируса продолжается в этих органах. В продромальной стадии заболевания вирус
обнаруживают в секреторных жидкостях из носа и глаз, в моче и крови.ШШ
660 ЧАСтндя ВИРУСОЛОГИЯИммунный ответ на натуральную инфекциюАнтитела впервые можно выявить в момент появления сыпи. После натуральной
инфекции они выполняют свои защитные функции в течение всей жизни. Сначала
вырабатываются IgM-антитела, затем IgG и IgA в сыворотке крови и секреторных
жидкостях. Как IgM-, так и IgG-антитела начинают вырабатываться практически
одновременно в момент появления сыпи. Однако максимальный уровень содер¬
жания IgM-антител приходится на 7-10-й день от момента появления сыпи, а
затем он начинает стремительно снижаться. Спустя 8 нед после появления сыпи
IgM-антитела выявляются только в исключительных случаях. В общем, наличие
IgM-антител свидетельствует о первичной инфекции диким или вакцинным виру¬
сом. Однако отсутствие IgM-антител в образце, особенно в первые 3 дня с момента
появления сыпи, не исключает инфицирования, а может свидетельствовать о
низкой чувствительности использованного теста. Уровень IgG-антител достигает
максимального значения спустя 2 нед после появления сыпи, затем он постепенно
снижается. В отличие от IgM-, IgG-антитела выявляются в течение долгих лет
после инфекции.Клинический материал для исследованияВирус кори можно выделить на продромальной стадии заболевания и на стадии
высыпания из мочи, назофарингеальных секретов и лимфоцитов периферической
крови. Интенсивность экскреции вируса быстро падает. Обнаружение и иденти¬
фикация вируса кори на культуре клеток могут занять несколько недель. Однако
выделение изолятов вируса кори позволяет в дальнейшем проводить их генети¬
ческий анализ и сравнивать штаммы, полученные из различных мест в разные
годы. Таким образом, можно получить исчерпывающую информацию об их про¬
исхождении и проследить пути передачи вируса. Именно поэтому для проведения
молекулярно-эпидемиологического анализа необходимо иметь коллекции мест¬
ных штаммов вируса из эндемичных стран.Для получения корректных результатов и облегчения их интерпретации боль¬
шое значение имеет правильно выбранное по отношению к появлению клиниче¬
ских симптомов кори время взятия образца. Поскольку IgM-ИФА-диагностические
тесты являются максимально чувствительными в промежутке между 4 и 28 днем
от момента появления сыпи, один образец крови, полученный в эти сроки, счита¬
ется адекватным для серологической диагностики кори. Забор повторного образца
сыворотки крови может понадобиться в случаях, если:•	первый образец крови, предназначенный для выявления IgM, был получен
в течение первых 4 дней от момента появления сыпи и показал при прове¬
дении ИФА отрицательный результат. Лаборатория может запросить взятие
повторного образца крови для исследования, поскольку предыдущий резуль¬
тат мог быть ложноотрицательным;•	клиницист нуждается в подтверждении окончательного диагноза у больного,
исследование сыворотки которого сначала показало отрицательный резуль¬
тат.Повторный образец крови для исследования можно взять в любой день в про¬
межутке между 4 и 28 днем с момента появления сыпи. Взятие повторного образца
через 10-20 дней позволяет провести не только повторное тестирование на нали¬
чие IgM-антител, но и количественный анализ увеличения титров IgG-антител.Стерильную сыворотку можно хранить в холодильнике при 4-8 °С не более7	дней, для более длительного хранения ее можно заморозить при -20 °С,
транспортировать в лабораторию с замороженными холодильными элементами.
Повторное замораживание и оттаивание сыворотки недопустимо.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 661Устойчивость ВО внешней средеВирус кори чрезвычайно чувствителен к повышению температуры, поэтому
образцы материалов, предназначенные для выделения вируса, должны быть
транспортированы в лабораторию как можно быстрее и в условиях строгого
соблюдения ХОЛОДОВОЙ цепи. Выделение вируса не рекомендуют использовать в
качестве метода первичной диагностики кори. Можно ограничиться выделением
вируса только в специализированных лабораториях для генетического анализа
полученных штаммов.Лабораторные методы диагностикиДля диагностики кори рекомендуют использовать серологические методы,
основанные на выявлении вирусспецифических антител в одной или парных
сыворотках. Однако вирус кори может быть вьщелен из различных клинических
образцов путем культивирования его на культурах клеток или с применением
методов молекулярной биологии. Методы, основанные на выделении вируса,
непригодны в качестве диагностических тестов. В основном их используют для
генетической характеристики вирусов кори в молекулярно-эпидемиологических
исследованиях,СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКАДля диагностики кори используют следующие серологические методы:•	выявление вирусспецифических IgM-антител;•	количественное определение специфических иммуноглобулинов в крови для
установления их значимого прироста при исследовании парных сывороток,
полученных от больного в остром периоде и на стадии реконвалесценции.Выявление вирусспецифических 1дМ'антителВирусспецифические IgM-антитела достоверно свидетельствует об острой све¬
жей инфекции. IgM-антитела также вырабатываются при первичной вакцинации,
и их уровень снижается быстрее, чем уровень IgM, вырабатываемых в ответ на
инфицирование диким вирусом. Вакцинные и дикие вирз^сспецифические IgM-
антитела не могут быть разделены посредством серологических исследований.
В этом случае для интерпретации полученных результатов следует обратиться к
истории вакцинации конкретного пациента. Для выявления вирусспецифических
IgM-антител к кори используют метод ИФА.Количественное определение суммарных специфических иммуноглобулиновРеакция нейтрализации вируса — реакция нейтрализации цитопатического
действия вируса кори (PH) — требует наличия двух парных образцов сывороток
крови, взятых от больного в остром периоде и на стадии реконвалесценции, пока¬
зывает 100% чувствительность по отношению к клинически подтвержденным
случаям. Этот тест требует высококвалифицированного персонала, имеющего
опыт работы с культурами клеток. Результаты анализа могут быть получены через
10 дней после получения сыворотки реконвалесцента.Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) требует наличия двух
парных образцов сывороток крови от больного в остром периоде и на стадии
реконвалесценции и показывает 98% чувствительность у вакцинированных. Этот
тест также не является легким в применении, поэтому требует высококвалифи¬
цированного персонала, имеющего опыт работы в области вирусной серологии,
наличие свежих эритроцитов обезьян. Результаты анализа могут быть получены
через 2 дня после получения сыворотки реконвалесцента.
ifpt662ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯАмплификацию РНК вируса кори после обратной транскрипции проводят толь¬
ко в специализированных лабораториях для решения специальных задач. ПЦР не
применяют в целях рутинной лабораторной диагностики.Алгоритм проведения лабораторной диагностики кори представлен в
табл. 24-4.Таблица 24-4. Лабораторная диагностика кори в клинических материалахТип тестаЦель исследования
и источник
материалаМетодПримечанияСерологические
методы иссле¬
дованияВыявление вирус-
специфических 1дМ-
антителНепрямой IgM-ИФА
IgM «двойной сэнд¬
вич» ИФАИФА для выявления
IgM в слюнеДля IgM-ИФА требуется только один
образец сыворотки; доступны коммерче¬
ские диагностические наборы
Вариант «двойного сандвича» является
более прогрессивной модификацией
непрямого ИФАОпределение IgM методом ИФА в слюне
обычно требует дополнительной стадии
концентрации в целях повышения чув¬
ствительности и специфичности реакции
до необходимого уровняВыявление вирус¬
специфических 1д6-
антителIgG-ИФАТребуется наличие парных образцов
сыворотки от одного больного с интерва¬
лом 10-14ДНЄЙ; доступны коммерческие
диагностические наборыВыявление сум¬
марных вирус¬
специфических
иммуноглобулинов
в сыворотке кровиРеакция нейтрализа¬
ции (PH)Реакция торможениягемагглютинации(РТГА)PH полезна для определения иммунитета
против кори; требуется техническое
обеспечение для работы с клеточными
культурами и парных образцов сыворот¬
ки; получение результата возможно через
месяцТребуется постоянное наличие свежих
эритроцитов обезьян и парных сыво¬
роток; попучение резупьтата возможно
через 3 недОба последних метода требуют больших
временных затратВыделениевирусаИз мочи, назофа¬
рингеальных секре¬
тов и лимфоцитов
периферической
кровиКультуры клеток и
иммунофлюорес¬
ценцияТребуются особая тщательность при
сборе и транспортировке образцов,
специальное оборудование для работы
с культурами клвток и иммунофлюорес¬
ценцииОбнаружение
и генетическая
характеристика
вирусной РНКИз мочи, назофа¬
рингеальных секре¬
тов и лимфоцитов
периферической
кровиИз изолятов дикого
вирусаПЦР с обратной
транскрипцией и сек¬
венирование {анализ
последовательностей
нуклеотидов)Требуется специальное оборудование;
опасность перекрестных реакций
Анализ последовательностей необходим
для генотипирования диких вирусовДля диагаостики кори ВОЗ рекомендует использовать метод иммуноферментного
анализа (ИФА), предназначенный для обнаружения вирусспецифических IgM-
антител.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ663ВИРУС КРАСНУХИ
Характеристика вирусаВирус Краснухи (Rubella virus) определен как единственный представитель рода
RuUvirus, семейства Togaviridae.Вирион диаметром 40-70 нм состоит из липопротеидной оболочки и нуклео-
капсида с однонитевой, линейной, несегментированной, инфекционной (плюс-
нить) молекулой РНК. Геном длиной 9960 нуклеотидов кодирует пять белков, из
них NS1 и NS2 — неструктурные белки. С, Е1 и Е2 —структурные белки вируса
краснухи. Капсид икосаэдрической формы собирается из молекул С-белка, свя¬
занного с геномной РНК. Из липидной мембраны клетки-хозяина со встроенными
оболочечными гликопротеинами Е1 и Е2, которые образуют пепломеры, форми¬
руется оболочка вириона. Белок Е1 является гемагглютинином и имеет эпитопы,
индуцирующие образование гемагглютинирующих и вируснейтрализующих анти¬
тел. Гликопротеид Е2 содержит эпитоп, индуцирующий образование вирусней¬
трализующих антител. Молекулярная масса зрелой вирусной частицы составляет
3500-5200 кДа.Вирус краснухи термолабилен: при температуре 56 ®С инактивируется через
30 мин, при 70 °С— через 4, а при 100 "С— через 2 мин. Наличие в среде белка
(альбумина, сыворотки) или сульфата магния повышает устойчивость вируса
к воздействию высоких температур. При -20 X вирус быстро разрушается, но
сохраняется несколько лет при температуре -60 °С и ниже, а также при лиофиль-
ном высушивании в присутствии стабилизатора.Во внешней среде вирус нестоек, быстро погибает при изменениях pH (<6,8 и
>8,0), под влиянием ультрафиолетовых лучей, эфира, формалина и других дезин¬
фицирующих веществ и детергентов. Обработка твином-80 защищает гемагглюти-
нины от действия эфира. В присутствии белка вирус можно повторно заморажи¬
вать и размораживать без потери инфекционных свойств.Вирус способен размножаться на многих клеточных культурах, но цитопа¬
тическое действие оказывает лишь на немногих, в частности на перевиваемых
культурах клеток ВНК-21, RK-13, Vero. Оптимальная температура культиви¬
рования — 35 “С. Вирус краснухи агглютинирует эритроциты голубей, гусей,
однодневных цыплят, людей с группой крови о (1), обладает гемолитическими
свойствами.Вирус является возбудителем острой антропонозной инфекции с воздушно¬
капельным механизмом передачи, характеризуемой лихорадкой, легкими ката¬
ральными явлениями, макулопапулезной сыпью, увеличением лимфатических
узлов. Размножается в слизистых оболочках носоглотки и заднешейных, затылоч¬
ных, заушных лимфатических узлах. Вирус обладает выраженным тератогенным
действием. Острая форма краснухи рассматривается как показание к прерыванию
беременности в I триместре. Клинический диагноз краснухи требует лабораторно¬
го подтверждения, так как инфекция характеризуется большим количеством бес¬
симптомных форм (30-50%). Несмотря на наличие 13 генотипов вируса краснухи,
образующих две филогенетические группы (клайд 1 и клайд 2), серологических
различий между штаммами не выявлено, выделяют один серотип. После краснухи
формируется пожизненный иммунитет.Клинический материал для лабораторного исследованияКлиническим материалом являются сыворотка крови, сухая капля крови, носо¬
глоточные смывы, мазки из зева, слюна, ликвор, моча, образцы биопсии и аутоп¬
сии. Вирус выделяется из носоглотки за 7-10 дней до появления сыпи, но вероят¬
шш664 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯность его выделения наиболее высока в первые 3 сут с момента появления сыпи.
Дети с врожденной краснухой могут выделять вирус с экскретами на протяжении
первого года жизни, но частота выявления вируса со временем снижается - от
80% (1-2 мес) до 11% (12 мес).Hoco- и ротоглоточные смывы и соскобы должны быть доставлены в лаборато¬
рию для исследования в течение 48 ч при температуре 2-8 ®С. Допускается транс¬
портировка при -20 °С. Если доставить образцы для исследования в указанные
сроки невозможно, их хранят в транспортной среде при —70 “С. При отсутствии
коммерческой транспортной среды можно использовать питательную среду для
культур клеток (DMEM, RPMI, Игла).Мониторинг циркулирующих штаммов предполагает генотипирование изолята.
Для этого предпочтительнее использовать носоглоточные смывы или цельную
кровь. Носоглоточные образцы могут быть взяты тремя способами, которые пред¬
ставлены в порядке уменьшения вероятности выделения вируса:•	аспирацией носового секрета физиологическим раствором;•	смывами из горла;•	носоглоточными или ротоглоточными соскобами.Рутинная диагностика инфекции основана преимущественно на определении
вирусспецифических антител.Иммунный ответ на инфекциюКак IgM-, так и IgG-антитела начинают вырабатываться практически одновре¬
менно в момент появления сыпи. Однако максимальный уровень содержания IgM-
антител приходится на 2-ю неделю от момента появления сыпи, а затем он быстро
снижается. Спустя 8-9 нед после появления сыпи IgM-антитела выявляются
только в исключительных случаях. Наличие IgM-антител свидетельствует о пер¬
вичной инфекции либо диким, либо вакцинным вирусом. Отсутствие IgM-антител
в образце, в особенности в первые 3 дня с момента появления сыпи, не исключает
инфицирования, а может свидетельствовать о низкой чувствительности исполь¬
зованного теста. Уровень IgG-антител достигает максимального значения спустя4-5 нед после появления сыпи, затем он постепенно снижается. IgG-антитела
выявляются в течение долгих лет после инфекции.Постановка лабораторного диагноза у больного основана:•	на выявлении IgM-антител, если сыворотка получена от больного в период4-28 сут от начала высыпания, за исключением случаев, когда больной полу¬
чил вакцину против краснухи в период до 8 нед, предшествующих забору
образца;•	сероконверсии (четырехкратном приросте) IgG-антител при условии, что
второй образец сыворотки крови получен спустя не менее 10 сут от первого,
полз^ченного в острой фазе болезни, за исключением случаев, когда больной
получал вакцину против краснухи в период до 8 нед, предшествующих забору
образца.Если сыворотка крови получена позднее 28 сут от начала заболевания, диагноз
устанавливают по высокому уровню IgG-антител. Если сыворотка от больного с
клиническим диагнозом «краснуха«> получена ранее 3 сут, в случае отрицатель¬
ного результата определения IgM-антител исследование следует повторить через
несколько суток.Для серодиагностики краснухи применяют и реакцию торможения гемагглю¬
тинации (РТГА). Однако для постановки реакции необходимы свежие эритроци¬
ты голубей или однодневных цыплят, реакция достаточно трудоемка и требует
использования парных сывороток, полученных с интервалом 2 нед.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ S65Дифференциальная диагностикаТребуется дифференциальная диагностика с корью, эпидемическим паротитом,
гриппом, парагриппом, аденовирусной, респираторно-синцитиальной инфекция¬
ми, скарлатиной, инфекционной эритемой, медикаментозными или аллергически¬
ми высыпаниями, сывороточной болезнью, энтеровирусными и другими инфек¬
циями, парвовирусом В19, вирусом герпеса человека 6-го типа, вирусом Экхо и
вирусом Коксаки, инфекционным мононуклеозом, розовым лишаем.Лабораторные методы диагностикиОсобую значимость имеет лабораторная диагностика краснухи у беременных.
Показаниями к лабораторному обследованию беременной являются:•	пренатальный скрининг беременных на БУИ, в том числе на краснуху;•	контакт беременной с больным краснухой или недиагностированным экзан¬
тематозным заболеванием.При скрининговом обследовании определяют уровень IgG-антител. Защитным
является титр 15 МЕ/мл, При высоком уровне IgG (более 100 МЕ/мл) женщина
считается защищенной от краснушной инфекции, при отсутствии IgG-антител —
относится к группе риска.При обследовании контактных по краснухе беременных следует проводить
лабораторную диагностику как можно раньше, желательно в первые дни контакта
или первый день обращения к врачу. Следует одномоментно исследовать сыво¬
ротку крови на наличие IgG- и IgM-фракции антител. Низкий или средний уро¬
вень IgG (до 100 МЕ/мл) свидетельствует о перенесенной в прошлом инфекции.
Высокий уровень IgG может свидетельствовать как о наличии инфицирования,
так и о «бустер-эффекте» в ответ на повторную встречу с вирусом. При отсутствии
IgM и IgG в сыворотке, полученной в первые дни контакта, женщину относят к
группе риска и обследуют повторно в конце инкубационного периода, продол¬
жительность которого не превышает 21 день. Наличие IgM-антител, высокий
уровень IgG свидетельствуют об инфекционном процессе. Необходимо учитывать,
что реактивные на IgM результаты обследования беременной могут являться
ложноположительными за счет ревматоидного фактора. Кроме того, гипердиаг¬
ностика может иметь место в случае тестирования лиц, инфицированных вирусом
Эпштейна-Барр, парвовирусом и др. Целесообразно применять ИФА, основанный
на определении индекса авидности специфических IgG-антител. Малоавидные
IgG-антитела — показатель острой инфекции, высокоавидные характерны для
анамнестических антител. Низкоавидные IgG-антитела сохраняются в течение
более длительного срока по сравнению с вирусспецифическими антителами класса
IgM. Фактором, подтверждающим наличие инфекционного процесса, является и
прирост IgG-антител в динамике. Для диагностики краснухи и диагностики СВК в
целях воспроизводимости и стандартности результатов при динамическом наблю¬
дении наиболее целесообразно использовать тест-системы одного производителя.ВИРУС ПАРАГРИППАХарактеристика вирусаВирусы парагриппа отнесены ко второму из пяти родов подсемейства
Paramyxovirinae, семейства Paramyxoviridae, порядка Mononegavirales, выделенному
на основании наличия у вирусов оболочки нуклеокапсида и единственной несег¬
ментированной, линейной (минус-нить), однонитевой молекулы РНК. Human
parainfluenza virus I и Human parainßuenza virus III включены в род Respirovirus.
666 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯHuman parainfluenza virus II и Human parainfluenza virus IV (4a и 4b) входят в род
Ruhulavirus.Вирион подсемейства Paramyxovirinae сферической или плеоморфной формы,
диаметром 120-300 нм, состоит из нуклеокапсида 12-17 нм в диаметре и обо-
л очки. Нуклеокапсид спиральной симметрии, имеющий свернутую шарообразную
форму, состоит из РНК и трех белков; белка N — основного белка нуклеокапсида,
белка Р - фосфопротеида, белка L — РНК-зависимой РНК-полимеразы, Белки Р и
L составляют полимеразный комплекс, отвечающий за инициацию транскрипции,
á: varíií Белок L, наиболее крупный из трех, осуществляет синтез РНК (инициацию, элон¬
гацию и терминацию). Наружная липопротеидная оболочка содержит два транс¬
мембранных белка: HN (или Н) — представлен тетрамерами, необходимыми для
прикрепления вирусной частицы к остаткам сиаловой кислоты в олигосахаридах
клетки-мишени; гликопротеин F — является тримером и обеспечивает слияние
вирусной оболочки с клеточной мембраной.Для рода Ruhulavirus характерно наличие гемагглютинина (Н), гликопротеина
слияния (F), негликозилированного трансмембранного белка (SH) и матриксных
протеинов.Известным в настоящее время четырем типам вирусов парагриппа, выделенных
от человека, несвойственна вариабельность антигенной структуры. Нет общих
антигенов, хотя некоторый уровень перекрестной реактивности возможен с
разными серотипами. Вирусы обладают гемагглютинирующей и комплементсвя¬
зывающей активностью. Парагриппозные вирусы агглютинируют эритроциты
человека (группы 0), кур, морских свинок, обезьян. Специфические иммунные
сыворотки тормозят реакцию гемагглютинации. Гемагглютинирующие и компле¬
ментсвязывающие антитела не являются строго специфичными.Вирусы парагриппа нестойки во внешней среде, при комнатной температуре
сохраняются не более 4 ч, полная их инактивация происходит при нагревании до
50 “С в течение 30-60 мин, при 56 °С — через 15-30 мин. Кислая среда действует
на них губительно, щелочная — способствует сохранению активности. Вирусы
чувствительны к действию обычных дезинфектантов.Парагриппозные вирусы репродуцируются в клетках эпителия дыхательных
путей, вызывая литическую инфекцию эпителиальных клеток. In vitro вирусы
парагриппа размножаются в первичных эмбриональных клетках почек обезьян,
диплоидных человеческих фибробластах, перевиваемых клетках LLC-MK2 с
добавлением трипсина (протеазы необходимы для репликации вируса пара¬
гриппа), в клетках НЕК вирусы парагриппа продуцируются без цитопатогенного
эффекта. Продукция вирусов парагриппа в клетках МК, HeLa, НЕр-2, Vero сопро¬
вождается формированием синцитиев. Наиболее интенсивным цитопатическим
действием (ЦПД) обладает вирус Сендай, который вызывает быструю и полную
дегенерацию клеточного монослоя. Остальные типы парагриппозных вирусов
вызывают медленно развивающиеся цитопатические, не приводящие к деструкции
всего монослоя изменения: округление, зернистое перерождение клеток или обра¬
зование вакуолизированных многоядерных симпластов.Вирусы парагриппа являются возбудителями острых респираторных заболе¬
ваний примерно у 20% взрослого населения и до 30% — у детей. Клинические
проявления варьируют от легких поражений верхних дыхательных путей до забо¬
леваний нижних отделов легких: ларингита, ложного крупа, бронхита, пневмоний.
Наиболее тяжело протекают заболевания, вызванные ВПГЧ-3, который является
этиологическим фактором 60-70% заболеваний нижних отделов дыхательных
пз^-ей у детей первых полутора лет жизни. Передача осуществляется воздушно¬
капельным путем. Вирусы типов I, II и III распространены повсеместно и вызыва¬
ют заболеваемость в любое время года. Тип IV вьщелен только в США.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 667Лабораторные методы диагностикиМатериалом для исследования являются мазки со слизистой оболочки, носо¬
глоточные мазки и смывы, мокрота, моча» кровь. Раннюю диагностику проводят
на основании обнаружения вирусспецифического антигена в эпителиальных клет¬
ках слизистой оболочки носа больных методом иммунофлюоресценции.СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКАСерологическую диагностику парагриппозной инфекции проводят в РТГА. РСК
и PH, используют парные сыворотки, взятые с интервалом 10-14 дней. Могут
быть перекрестные реакции с вирусами паротита и кори. В сомнительных случаях
диагноз устанавливают на основе подтверждающих тестов.Лабораторная диагностика парагриппозной инфекции может быть проведена
с помощью выделения вируса; в практических целях для этого используют пере¬
виваемые культуры клеток (преимущественно HeLa, НЕр-2). Для предварительной
индикации вируса может быть использован феномен гемадсорбции эритроцитов
морской свинки на зараженных клетках. При выраженной гемадсорбции в зара¬
женных культурах проводят последующее его типирование в РТГА, РСК или PH.
Выделение вируса парагриппа в культуре клеток используют как подтверждающий
тест.Парагриппозную инфекцию необходимо дифференцировать от аденовирусной,
респираторно-синцитиальной, гриппа А и Б, бактериальных инфекций респира¬
торного тракта. Окончательный диагноз устанавливают по совокупности клини¬
ческих, эпидемиологических данных и лабораторных тестов.ВИРУС ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПАРОТИТА
Характеристика вирусаЭтот вирус отнесен к семейству Paramyxoviridae, роду Rubulavirus. Геном вируса
эпидемического паротита (ЭП) — несегментированная одноцепочная РНК отри¬
цательной полярности, длиной в 15 384 нуклеотида. Геном вируса включает семь
генов. Гены вируса распределены в следующем порядке от 3’- к 5’-концу: NP, V\P, М,
¥, SH, HN, L Генами F и HN кодируются два поверхностных белка: гемагглютинин-
нейраминидаза (HN) и белок слияния (F), которые отвечают за прикрепление и
слияние вирусной оболочки с мембраной клетки. Кроме того, HN-белок обладает
и нейраминидазной активностью, которая позволяет образуемым вирионам отде¬
ляться от клеточной поверхности, предотвращать агрегацию вирусных частиц.
HN- и F-антитела обладают вируснейтрализующей активностью.Другие пять белков вируса ЭП расположены внутри вириона, образующие¬
ся к ним антитела не обладают протективной активностью. Нуклеокапсидный
NP-белок придает спиральную нуклеокапсидную структуру, контактируя с вновь
синтезированной геномной РНК. РНК-транскриптазная активность приписыва¬
ется как фосфопротеину (Р), так и большому полимеразному белку (L). Показано,
что матриксный (М) белок участвует в сборке вирусных частиц и отпочковании
вирионов от клеточной поверхности. Два неструктурных белка (V и I) кодируются
Р-геном и являются продуктами синтеза транскрипции матричной РНК. V-белок
ответственен за уход от интерферонопосредованного антивирусного ответа, бло¬
кируя сигналы интерферона и ограничивая его выработку. Роль 1-белка в репли¬
кации вируса пока неизвестна.SH — трансмембранный белок, отвечает, как и V-белок, за уход от антивирус¬
ного ответа хозяина, однако механизм ухода другой. SH-белок блокирует TNF-a-
опосредованный сигнал апоптоза.
668 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯВирионы вируса эпидемического паротита в подавляющем большинстве пред¬
ставляют собой сферические и нитевидные структуры, их диаметр колеблется в
диапазоне от 100 до 300 нм. Липидная оболочка обволакивает спиралевидную
нуклеокапсидную структуру, состоящую из РНК и белка. На поверхности вирио¬
на вируса ЭП присутствуют два поверхностных гликопротеина (НК- и Р-белки),
частично включенных в липидную мембрану, и, как в случае с вирусом кори, оба
или один из белков контактирует с белком М, выстилающим липидную оболочку
вируса изнутри. В свою очередь, М-белок контактирует с нуклеокапсид ной спира¬
левидной структурой.Вирус ЭП обладает гемагглютинирующей, нейраминидазной, гемолитиче¬
ской и симпластообразующей активностью. Культивирование вируса ЭП про¬
водят на развивающихся куриных эмбрионах и культурах клеток (первично-
трипсинизированных и клетках перевиваемых линий). Вирусом ЭП заражают
куриные эмбрионы в амниотическую или аллантоисную полость и инкубируют5	дней при температуре 33-35 °С.Вирус ЭП малоустойчив во внешней среде, полностью инактивируется при
55-60 °С (в течение 20 мин), а также под действием ультрафиолетового облучения,
0,1% раствора формалина, 1,0% раствора лизола, спирта и эфира. При хранении
при -4 °С инфекционность вируса ЭП снижается в течение нескольких дней,
при -20 °С — нескольких недель, а при -50-70 “С — в течение многих месяцев.В мире циркулирует 12 генотипов вируса ЭП: А, У/К. Р, В, С, а, В, С, Ь, Н и
вьщеленный в особую группу Ленинград-3. Различия в нуклеотидных последо¬
вательностях у разных штаммов составляют от 6 до 19%. Такая вариабельность
в нуклеотидной последовательности (определяется по 5Я-гену) диких штаммов
вируса ЭП может быть использована для дифференциации эндемичных и ввезен¬
ных штаммов, а также в случае учета поствакцинальных осложнений, таких как
серозные менингиты и энцефалиты.При заболевании ЭП противопаротитные антитела обнаруживают на 1-4-й день
после появления первых клинических признаков, концентрация их быстро нарас¬
тает и достигает максимального уровня к 40-50-му дню болезни. Первыми появ¬
ляются антитела класса М, с ними почти одновременно — низкоавидные антитела
С2-класса. К концу первого месяца антител класса М практически не обнаружива¬
ют, Большинство продуцируемых антител у человека — антитела к нуклеокапсиду
вируса, отсутствие этих антител — точный индикатор того, что человек не болел,
не болеет и не был привит, при ЭП в защите от первичной инфекции и реинфек¬
ции велика роль антител, которые образуются в ответ на поверхностные антигены
вируса, — антитела к поверхностным Н1Ч- и Р-белкам, а также секреторных анти¬
тел класса А, которые участвуют в защите от инфекции на уровне входных ворот.
Все эти антитела обладают вируснейтрализующей активностью.Диагностика эпидемического паротитаДиагностика ЭП включает исследование мочи, слюны, носоглоточных смывов
и/или крови. Оптимальным клиническим материалом для идентификации ЭП
являются носоглоточные смывы или слюна. В случае развития серозного менин¬
гита осуществляют взятие цереброспинальной жидкости (СМЖ) в объеме 2-3 мл.
Работа с СМЖ по выделению вируса ЭП должна начаться немедленно, в крайнем
случае допускается хранение при температуре -70 “С чуть более суток. Процедуру
получения клинических материалов при ЭП следует проводить либо в больнице,
либо в процедурном кабинете поликлиники, в особых случаях — на дому у паци¬
ента.В типичных случаях клинически поставить диагноз «эпидемический паротит»
нетрудно. Определенные трудности представляет диагностика легких (стертых
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 669и атипичных) и особенно инаппарантных (субклинических) форм паротитной
инфекции. Инаппарантные формы (25-40% всех заболевших) невозможно выя¬
вить без специфических лабораторных исследований.Необходимо дифференцировать ЭП от заболеваний, клиническим проявлением
которых могут быть отеки. Так, отеки могут бьггь следствием заражения вирусами
Коксаки, парагриппа или вирусом Эпштейна-Барр. Кроме того, очень часто боль¬
ных с подозрением на ЭП приходится проверять и на наличие вируса герпеса 6-го
типа, адено-, энтеро- и парвовирусов.Лабораторные методы диагностикиСреди лабораторных методов диагностики ЭП используют очень редко гисто¬
химический, чаш;е вирусологический и молекулярно-генетический, но предпо¬
чтение отдается серологическим. Лабораторная диагностика стала обязательной
составляющей системы эпидемиологического надзора за ЭП.Вирусологический метод основан на раннем выделении (при первых клиниче¬
ских признаках ЭП) возбудителя из лейкоцитов больного на различных культурах
клеток, например Vero, Л-41, Hela. Вирус ЭП также в первые 5 дней заболевания
обнаруживают в клинических образцах, таких как смывы входного отверстия сте¬
нового протока, слюна, моча, спинномозговая жидкость.Все чаще, особенно для верификации случая «эпидемический паротит», кроме
вирусологического используют молекулярно-генетические методы — ПЦР с обрат¬
ной транскрипцией или ПЦР в реальном времени и секвенирование (анализ после¬
довательностей нуклеотидов). Использование метода обратно-транскриптазной
ПЦР (ОТ-ПЦР) подтвердило его преимущество над чувствительностью имму¬
ноферментного (ИФ) метода для выявления IgM. С помощью ОТ-ПЦР и ПЦР в
реальном времени можно не только дифференцировать ЭП от других инфекций,
но и провести анализ последовательностей нуклеотидов для генотипирования вак¬
цинных штаммов (особенно при возникновении неврологических осложнений),
отслеживать циркуляцию, изменчивость вирусов ЭП, выявлять завозные штаммы,
подтверждать прекращение трансмиссии вируса на территории региона.Противопаротитные антитела определяют с помощью серологических методов:
реакции связывания комплемента (РСК), реакции нейтрализации (PH), которая
до сих пор является «золотым стандартом», реакции торможения гемагглютина¬
ции (РТГА) и др. Наиболее перспективным в последние годы считается иммуно¬
ферментный анализ (ИФА). В нашей стране для диагностики ЭП используют в
основном непрямой ИФА. Он улавливает весь спектр антител, высокочувствите¬
лен (чувствительность находится в пределах 15±5 нг), специфичен (100%), прост
и быстр в постановке. Воспроизводимость метода 99,5%. Особенно он оказался
удобным для экспресс-диагностики ЭП. Однако возможно пол)гчение ложнополо¬
жительных результатов, дальнейшая разработка новых ИФТС, новых подходов к
их конструированию очень актуальна.ВИРУСЫ - ВОЗБУДИТЕЛИ ГЕМОРРАГИЧЕСКИХ ЛИХОРАДОК
ТаксономияВирусы, вызывающие геморрагические лихорадки, принадлежат к разным
семействам и родам: ареновирусы — к семейству Arenovirídae (Хунин, Мачупо
Ласса), филовирусы — к семейству Filoviridae (Эбола, Марбург), флавовирусы
семейства Togaviridae (желтая лихорадка, ГЛ Денге), хантавирусы и найровирус —
к семейству Bungaviridae (ГЛ с почечным синдромом, крымско-конголезская ГЛ).
Вирусы отдельных семейств различаются строением, величиной и формой вирио-
1-И'^М' 670 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ}ф1Ш: нов, видом генома, скоростью репродукции, антигенными свойствами, патогенно-ШШШстью для людей и животных.«1	Вирусные геморрагические лихорадки — зоонозные (антропонозные) природно-очаговые, особо опасные инфекции, возбудители которых вызывают тяжелые
острые заболевания, протекающие с выраженным геморрагическим синдромом.
Эпидемиологические проявления этих инфекций, как правило, характеризу-
ются возникновением вспышек или эпидемий той или иной интенсивности.
Естественные механизмы распространения вирусных геморрагических лихо¬
радок обусловливают постоянный риск инфицирования сотен тысяч людей,
создавая серьезную угрозу здоровью и жизни населения, тяжелые социально-
экономические последствия.В соответствии с классификацией вирусов человека и животных, действующей
на территории Российской Федерации, возбудители вирусных геморрагических
лихорадок относятся к 1-П группе патогенности.Диагностические исследования материала, подозрительного на заражен¬
ность микроорганизмами 1-П группы патогенности, выполняют лаборатории,
имеющие санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведе¬
ния соответствующих работ и лицензию на деятельность, связанную с исполь¬
зованием возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний человека.
В Российской Федерации работа с патогенными для человека микроорганиз¬
мами регламентирована пакетом нормативных правовых актов, утвержденных
Главным государственным санитарным врачом, обязательных для выполнения
всеми учреждениями и организациями страны независимо от их ведомственной
принадлежности.Крымская геморрагическая лихорадкаТАКСОНОМИЯКрымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) - зоонозная природно-очаговая
арбовирусная инфекционная болезнь преимущественно с трансмиссивным и
контактным механизмами передачи возбудителя. Резервуаром и переносчиками
вируса являются более 3 видов иксодовых клещей.Клиническая картина КГЛ определяется поражением нервной и сосудистой
систем человека. Инкубационный период длится от 1 до 14 дней (чаще 2-7), В кли¬
ническом течении, как и при других геморрагических лихорадках, выделяются три
периода, последовательно сменяющих друг друга: предгеморрагический, геморра¬
гический, реконвалесцентный. Возможно инаппарантное течение инфекции.Возбудителем КГЛ является РНК-содержащий вирус крымско-конголезской
геморрагической лихорадки (ККГЛ), относящийся к семейству Випуаутйае, роду
]Яа1Г0у1гиз. В соответствии с принятой в России классификацией патогенных для
человека микроорганизмов вирус ККГЛ относится ко II группе патогенности.
Вирус ККГЛ содержит одноцепочечную РНК, имеет сферическую форму и внеш¬
нюю липопротеиновую оболочку, диаметр 90-100 нм. РНК вируса ККГЛ сег¬
ментирована и состоит из малого, среднего и большого сегментов, кодирующих
нуклеокапсидный белок, оболочечные гликопротеины и белки полимеразного
комплекса соответственно. Малый и большой сегменты РНК высококонсерватив¬
ны. Их нуклеотидные последовательности используют как для разработки тест-
систем, выявляющих РНК вируса ККГЛ в пробах различного происхождения, так
и для филогенетического анализа. Средний сегмент РНК вариабелен, даже в одной
генетической группе наблюдаются значительные различия в нуклеотидной после¬
довательности у различных штаммов вируса ККГЛ.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 671УСТОЙЧИВОСТЬ ВО ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ, К ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМ ФАКТОРАМВирус малоустойчив в окружающей среде. Инактивируется при кипячении момен¬
тально, при температуре 60 “С разрушается в течение 30 мин, при 37 °С — через 20 ч,
при 45 “С — через 2 ч. Лиофилизированная культура сохраняется до 2 лет. Вирус
чувствителен к ультрафиолетовому облучению и дезинфицирующим средствам.	к1||=ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ	н1|Лабораторная диагностика КГЛ основана на выявлении вируса или его структур-
ных компонентов, исследовании динамики титра антител и проводится с исполь¬
зованием вирусологических, иммунологических и молекулярно-генетических
методов. Для выявления вируса в организме больных людей берут кровь (на 5-7-й
день болезни для вирусологического и серологического исследований и на 10-14-й день для серологического исследования).Отбор проб материала от людей (трупов), а также подозрительных больных
осуществляется медицинским персоналом в соответствии с требованиями санитар¬
ных правил «Безопасность работь[ с микроорганизмами I-II групп патогенности».КЛИНИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛМатериалом для выделения вируса ККГЛ являются цельная кровь, плазма,
сгусток крови, секционный материал (печень, легкие, селезенка, почки, головной
мозг), полу'генный в ранние сроки от начала заболевания (до 7-го дня), то есть в
период вирусемии. Эффективность вирусологических исследований в этот период
очень высока и приближается к 100%. При нормализации температуры тела воз¬
можность выделения вируса резко снижается, а при появлении в крови вирусспе¬
цифических Ig класса G (10-14-й день) — становится невозможной.Вирус ККГЛ размножается в перевиваемых клетках линий LLC-MK2, ВНК-
21, Vero без цитопатического эффекта. При исследовании монослоя зараженных
клеток с помощью МФА через 24-48 (72) ч вирусный антиген выявляется в
цитоплазме клеток в виде светящихся мельчайших зернышек и гранул различной
величины, сливающихся в диффузную массу.Вирус довольно трудно адаптируется к лабораторным животным, у которых
инфекция часто протекает бессимптомно. Исследуемый материал вводят интраце-
ребрально двенадцатидневным сосункам белых мышей. Инкубационный период
при первичном заражении составляет 5-12 дней. Через 24 и 48 ч часть мышей
забивают и из мозга готовят мазки-отпечатки для МФА и суспензии для РНГА.При получении отрицательных результатов исследования этого материала за
оставшимися мышами наблюдают еще трое суток, после чего подвергают их мозг
такому же исследованию.СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯИсследования на обнаружение антигена или определение антител к вирусам
П группы патогенности в связи с отсутствием регламентированных методов инак¬
тивации вирусов проводят только в боксированном помещении или в боксе био¬
логической безопасности.Выявление вирусного антигена и специфических антител класса М (IgM) к виру¬
су ККГЛ в сыворотке (плазме) крови человека проводят с целью ранней дифферен¬
циальной диагностики КГЛ в клинических и эпидемиологических исследованиях.
Подтверждением диагноза является нарастание уровня антител класса G (IgG) в
парных сыворотках крови (интервал — 10-14 сут). Серодиагностику заболевания
осуществляют с помощью ИФА, РАО, РСК, РДПА, РТНГА и непрямого МФА.МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯДля выявления в исследуемом материале специфичной РНК вируса ККГЛ
используют метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
litщшл^ШЖ4672ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ(ОТ-ПЦР). Учет результатов проводят методом электрофореза в агарозном геле
или в режиме реального времени.ПЦР-диагностика в режиме реального времени позволяет не только определить
РНК вируса ККГЛ в крови, но и установить уровень и продолжительность вире-
мии, а также оценить эффективность противовирусной терапии.ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИВыявление РНК и/или антигена ККГЛ в исследуемом материале, взятом на
ранних сроках заболевания (до 5-7-го дня), свидетельствует об инфицирован-
ности больных и в совокупности с данными эпидемиологического анамнеза, кли¬
нической картины и результатами клинической лабораторной диагностики может
считаться основанием для постановки диагноза «КГЛ».IgM-антитела появляются на 5-7-й день от начала заболевания, достигая мак¬
симальных титров (1:20 ООО и более) на 2-3-й неделе, и постепенно исчезают к
90-м суткам. Специфические IgG-антитела появляются на 7-10-й день, достигая
пика к концу 2-го месяца, держатся в высоких титрах 6-8 мес, постепенно снижа¬
ясь к концу года, у некоторых больных сохраняются годами. Для постановки диа¬
гноза необходимо четырехкратное и более нарастание титра IgG при исследовании
парных сывороток. При обнаружении IgM в титре 1:800 и более и IgG в любом
титре диагноз «КГЛ» считается подтвержденным.Геморрагическая лихорадка с почечным синдромомГеморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) — зоонозная
природно-очаговая инфекционная болезнь с преимущественно аэрогенным
(воздушно-капельным и воздушно-полевым) механизмом заражения людей.
Возможно также алиментарное заражение при употреблении продуктов питания,
контаминированных экскрементами грызунов, и контактное — через поврежден¬
ные участки кожи.На территории России циркуляция хантавирусов отмечена в популяциях
47 видов животных, из них основные — рыжая полевка, полевая мышь, серая и
черная крысы, разные виды серых полевок.ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯВозбудитель ГЛПС относится к семейству Bunyavirídae, роду Hantavirus, сероти-
пы: Хантаан, Сеул, Пуумала, Добрава, Тула, Хабаровск, Топографов, возбудитель
геморрагической лихорадки с легочным синдромом. Вирионы хантавирусов сфе¬
рической формы, диаметром 90-120 нм, морфологически однородны. Хантавирус
имеет липидную оболочку, три фрагмента РНК-отрицательной полярности, два
поверхностных гликопротеина и нуклеокапсидный белок (NP). Малый сегмент (S)
генома хантавируса кодирует NP-белок, средний сегмент (М) кодирует два поверх¬
ностных гликопротеина: G1 и G2, а самый большой (L) — сегмент белка полиме¬
разы. NP-белок ответственен за продукцию антител и проявляет высокую кросс-
реактивность по отношению к другим штаммам хантавирусов. Поверхностные
белки гликопротеина индуцируют низкий иммунологический ответ, но проявляют
специфическую активность в отношении других штаммов.Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, ацетону, бензолу, ультрафиолетовым
лучам, дезинфицирующим веществам, обычно применяемым для уничтожения
вирусов.ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИВирус размножается в легких диких грызунов, не вызывая у них заболевания.
Методом выявления антигена вируса в суспензиях легких грызунов является
иммуноферментный анализ (ИФА).
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ $73Культивирование вируса осуществляют в перевиваемых культурах клеток кар¬
циномы легких человека или УегоЕб.Основой лабораторной диагностики ГЛПС является серологическая. Материалом
для исследования является сыворотка крови больных ГЛПС или подозритель¬
ных на это заболевание, взятая в разные сроки: на начальном этапе заболевания
и через 2-3 нед. Основным методом серодиагностики ГЛПС является непрямой
метод флюоресцирующих антител (МФА). Специфические иммуноглобулины в
диагностических титрах выявляются уже через 3 дня после начала заболевания,
достигая максимума на 8-25-й день болезни, регулярно обнаруживаются 3-4 мес,
сохраняются у реконвалесцентов от 6 мес до 2-3 лет.Выявление РНК хантавирусов в клинических и полевых материалах осу¬
ществляют методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
(ОТ-ПЦР). Для подтверждения диагноза «ГЛПС» все результаты серологической
и молекулярно-генетической диагностики должны быть сопоставлены с клиниче¬
скими и эпидемиологическими данными.ВИРУСЫ - ВОЗБУДИТЕЛИ ГЕПАТИТОВ
Вирус гепатита АТАКСОНОМИЯВирус гепатита А (HAV — Hepatitis А Virus) — возбудитель гепатита А челове¬
ка — относится к роду Hepatovirus, семейству Picornaviridae. Изоляты HAV подраз¬
деляются на шесть генотипов, которые обозначают римскими цифрами от I до VI.
Генотипы вируса I, II, III вызывают заболевание у человека, а генотипы IV, V VI — у
обезьян. Различия между изолятами HAV, вьщеленными в различных регионах
мира, по нуклеотидной последовательности геномной РНК составляют 15-25 и
7,5% на уровне генотипов и субтипов соответственно. При этом аминокислотные
последовательности изолятов HAV достаточно консервативны, чем объясняет¬
ся наличие всего одного серотипа данного ВВГ. Штаммы вируса, выделенные в
России, принадлежат к субтипам IA, 1В, IIIA.ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯМорфологически HAV представляет собой сферические частицы диаметром
27-30 нм, построенные по типу икосаэдрической симметрии и лишенные обо¬
лочки. Вирусный геном представлен линейной одноцепочечной РНК, состоящей
из приблизительно 7500 нуклеотидных оснований, с общей молекулярной массой
порядка 2,2 Md. В нем определяются: 5’ — нетранслируемая область; единичная
рамка считывания, кодирующая структурные и неструктурные белки, и короткая
3’ — нетранслируемая область, заканчивающаяся поли-А-трактом. Геном HAV
имеет положительную полярность, то есть вирусная РНК непосредственно выпол¬
няет матричные функции. Капсид HAV построен из множественных копий четы¬
рех структурных протеинов, обозначаемых как VP1, VP2, VP3 и VP4.HAV является одним из наиболее устойчивых вирусов человека к факторам
внешнего воздействия, при 60 °С он полностью сохраняется в течение 1 ч и лишь
частично инактивируется за 10-12 ч. однако кипячение приводит к разрушению
вируса за несколько минут. HAV остается инфекционным в течение, по крайней
мере, одного месяца после высушивания на твердой поверхности в условиях
обычного помещения (25 ‘’С и 42% влажности). Он устойчив к растворителям
жиров, таким как эфир, хлороформ и др. Эффективным методом стерилизации
материалов, содержащих HAV, является автоклавирование. Дезинфицирующие
средства также достаточно эффективны: хлорамин в концентрации 2,0-2,5 мг/л
полностью устраняет инфекционность ВГА за 15 мин, перманганат калия
wmi674 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ(30 мг/л) — за 5 мин, 3% формалин — за 5 мин (при 25 °С)« йодистые соединения
(3 мг/л) — за 5 мин.ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИСпецифическую лабораторную диагностику гепатита А осуществляют по выяв¬
лению вируса, антигена вируса, антител классов IgM и IgG, а также РНК HAV.
Клиническими образцами для лабораторной диагностики являются фекалии и
кровь больного. Вирус и его антиген могут быть выявлены в фекалиях с помощью
иммуноэлектронной микроскопии, твердофазного радиоиммунного, иммунофер¬
ментного и хемилюминесцентного анализа. В связи с тем что массивная экскреция
вируса имеет место до развития симптомов заболевания и быстро прекращается
после появления желтухи, методы определения вируса и его антигена для диагно¬
стики ГА используют сравнительно редко.Значительно большее применение в диагностике ГА имеют методы определения
антител классов IgM и IgG к вирусу в сыворотке крови. Выявление анти-HAV-IgM
является «золотым стандартом» лабораторной диагностики гепатита А. Эти анти¬
тела становятся определяемыми с конца инкубационного периода и продолжают
циркулировать до 3-6 мес. Диагноз ГА может основываться и на определении
антител класса IgG, но в этом случае необходимо исследовать сыворотку крови
больного дважды с интервалом не менее 2 нед. В случае увеличения титра анти-
HAV-IgG в четыре и более раз можно сделать заключение о наличии у пациента ГА,
Специфические антитела к вирусу ГА можно определить с помощью радиоиммун¬
ного, иммуноферментного или хемилюминесцентного анализа.В последние годы широкое распространение для диагностики ГА получила
полимеразная цепная реакция, которая позволяет выявить РНК вируса в образцах
фекалий или крови больного. В силу большего удобства работы с сыворотками
крови именно эти клинические образцы исследуют наиболее часто. РНК HAV в
сыворотке крови выявляется у 80% больных в течение первого месяца после появ¬
ления желтухи, а у некоторых пациентов — даже 2 мес и более.Вирус гепатита ВХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯВирус гепатита В (HBV— Hepatitis В virus) — возбудитель гепатита В, основной
представитель семейства гепаднавирусов.HBV (частица Дейна) — сферическая частица диаметром 42 нм, состоит из
ядра — нуклеоида, имеющего форму икосаэдра диаметром 28 нм, внутри которого
находятся двухцепочечная ДНК, концевой белок и фермент ДНК-полимераза.
В состав серцевинного белка — HBcAg входит HBeAg. Внешняя оболочка образо¬
вана поверхностным антигеном вируса гепатита В — HbsAg,Геном HBV представлен двухцепочечной кольцевой молекулой ДНК — наимень¬
шей из всех ныне идентифицированных ДНК. ДНК HBV состоит приблизительно
из 3 200 нуклеотидов. Наружная минус-цепь длиннее внутренней плюс-цепи на15-45%. Минус-цепь в двухнитевой части имеет разрыв в 5’-конце, к которому
ковалентно присоединен белок. ДНК HBV содержит четыре гена (S, С, Р, X) и
регуляторные последовательности, ответственные за синтез белков и репликацию
вируса. Открытые рамки считывания определенных генов частично перекрывают
друг друга, что обеспечивает высокую информационную емкость генома.Популяция HBV достаточно гетерогенна. Серологическими методами было
показано существование субтипов поверхностного антигена вируса — HBsAg. При
этом имеется одна общая детерминанта а, которая в комбинации с двумя дополни¬
тельными детерминантами d/y и w/r образует четыре субтипа HBsAg; adw, ayw, adr,
ayr. В настоящее время описаны новые варианты детерминант, и общее количество
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 670субтипов достигло девяти. На основе анализа нуклеотидных последовательностей
S-гена изоляты HBV, выделенные в различных регионах мира, объединили в
восемь основных генотипов, которые обозначили заглавными буквами латинско¬
го алфавита: А, В, С, D, Е, F, G и Н. Следует отметить, что полного соответствия
между генотипами HBV и серотипами HBsAg не установлено. Так, изоляты HBV,
относящиеся к четырем совершенно разным генотипам — А, В, С и F, могут иметь
один и тот же серотип adw2. В России доминирующим генетическим вариантом
HBV является генотип D, но в некоторых регионах страны от пациентов выделены
вирусы, относящиеся к генотипам А и С.При электронной микроскопии определяются две морфологические формы:
частицы, имеющие оптически плотное ядро, содержащие ДНК HBV, и неполные
частицы — без ДНК. Концентрация вирусных частиц в сыворотках крови с нали¬
чием HBsAg колеблется от 10 частиц в 1 мл до количеств, недоступных выявлению
с помощью электронной микроскопии. Некоторые сыворотки крови с наличием
HBV инфекционны даже в разведениях 10‘^-10Инфекционность HBV в сыворотке крови сохраняется при 30-32 “С в течение6	мес, при -20 °С — 15 лет, после прогревания до 60 °С — 4 ч, при 98 “С — в течение
1 мин сохраняется частично, а через 20 мин исчезает полностью, при обработке
сухим жаром (-Н60 °С) разрушается в течение 1 ч; обработка }3-пропиолактоном
в сочетании с ультрафиолетовым облучением снижает инфекционность HBV-
содержащей плазмы примерно в 10 млн раз. Частицы HBV чувствительны к эфиру
и неионным детергентам, которые разрушают внешнюю оболочку вириона, осво¬
бождая при этом нуклеокапсид.Многочисленные попытки культивирования HBV в различных клеточных куль¬
турах были неудачны.КЛИНИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛПоскольку вирус в огромных количествах содержится в крови больных остры¬
ми и хроническими формами гепатита В, основным клиническим материалом для
лабораторной диагностики инфекции является сыворотка крови. Серологические
маркеры вируса (HBsAg, HBeAg) и его геномный материал (ДНК HBV) могут
быть обнаружены в конце инкубационного периода, однако такая возможность
диагностики крайне ограничена, поскольку в этот период отсутствуют специфи¬
ческие симптомы поражения печени и больные не обращаются за медицинской
помощью.ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИСпецифическая лабораторная диагностка острых форм гепатита В основана на
выявлении в сыворотке крови антигенов HBV (HBsAg, HBeAg) и антител к серце¬
винному антигену вируса класса IgM (IgM анти-НВс) методами радиоиммунного,
иммуноферментного или хемилюминесцентного анализа. Эксперты ВОЗ считают,
что при лабораторной диагностике острых форм герпес-вирусов предпочтение
должно отдаваться определению IgM анти-НВс. Только при отсутствии возмож¬
ности детекции этого маркера лабораторный диагноз может опираться на данные
о наличии в сыворотке крови HBsAg. Обнаружение HBeAg в сыворотке крови
коррелирует с присутствием HBV ДНК. В случае выздоровления маркеры вируса
HBsAg, HBeAg и HBV ДНК перестают выявляться в сыворотке крови, а на смену
приходят серологические маркеры сероконверсии к антигенам вируса — анти-
HBcIgG, анти-НВе, анти-HBs. Протективной защитой обладают анти-HBs.В случае выявления HBsAg в течение 6 мес и более диагностируется хрони¬
ческая HBV-инфекция. Маркерами активно текущей хронической инфекции
являются HBeAg, HBV ДНК и IgM анти-НВс. Со временем у большинства боль¬
ных с хронической инфекцией происходит сероконверсия HBeAg в анти-НВе.
676 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯДлительная персистенция HBeAg является неблагоприятным фактором развития
цирроза печени. ДНК HBV может быть выявлена в сыворотке крови с помощью
технологий амплификации нуклеиновых кислот (полимеразной цепной реакции,
технологии разветвленной ДНК — bDNA, NASBA и др.).Вирус гепатита СХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСАВирус гепатита С (HCV — Hepatitis С Virus) — возбудитель гепатита С. Ранее
обозначали как вирус, вызывающий гепатит ни А, ни В, передающийся паренте¬
рально. Результаты клонирования и полного секвинирования РНК ВГС, а также
физико-химические характеристики вируса позволили отнести ВГС к семейству
Flaviviridae, выделив в отдельный род Hepacivirus.Определены следующие характеристики вируса: диаметр вириона — от 30 до
60 нм; чувствителен к действию хлороформа, коэффициент седиментации — не
менее 150 S. ВГС инактивируется при температуре 60 X — в течение 30 мин, а
при 100 “С — за 2 мин. Геном ВГС представлен однонитевой линейной молеку¬
лой РНК положительной полярности протяженностью около 9400 нуклеотидов.
Организация генома HCV подобна таковой геномов других флавивирусов. В РНК
HCV выделяют зоны, кодирующие структурные и неструктурные (функциональ¬
ные) белки. Структурные белки представлены нуклеокапсид ным белком (core —
С), двумя оболочечными белками (Е1 и Е2), считающимися гликопротеидами
внешней оболочки HCV (Env). Они играют роль в прикреплении и проникновении
вируса 8 клетку. Область РНК ВГС, кодирующая неструктурные белки, состоит из
следующих участков: NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a и NS5b. Все эти белки являются
необходимыми для процесса репродукции вируса. Они несут антигенные детерми¬
нанты, на которые вырабатываются антитела.HCV характеризуется самой высокой генетической вариабельностью генома
среди возбудителей вирусных гепатитов. Все изоляты HCV группируются в шесть
главных генотипов, обозначаемых арабскими цифрами от 1 до 6 с гомологией
нуклеотидных последовательностей в РНК между ними менее 72%. Внутри каж¬
дого генотипа выделяют субтипы, которые включают изоляты, состоящие из
квазивидов. На принадлежность изолята к определенному субтипу указывают
прописные латинские буквы, которые пишут вслед за арабской цифрой: HCVla,
HCVlb, HCVlc, HCV2a и т.д. В настоящее время известно более ста субтипов HCV.
Уровень гомологии между различными субтипами внутри генотипа 72-86%. При
генотипировании HCV, проведенном в различных регионах мира, установлено,
что наибольшее распространение имеют генотипы 1а, Ib, 2а, 2Ь и За. В России
наибольшее распространение имеют два субтипа — lb и За. Остальные субтипы
обнаруживают сравнительно редко.С точки зрения молекулярной эпидемиологии важно знать, что изоляты гено¬
типа IV доминируют в Северной Африке, генотипа V — в Южной Африке, гено¬
тип VI — в Юго-Восточной Азии.ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИЛабораторная диагностика ГС основана на определении антител к различным
белкам вируса и выявлении РНК вируса ГС.Серологическая диагностикаОпределение антител (анти-HCV) осуществляют с помощью (ИФА) тест-систем,
которые позволяют определясь антитела к широкому спектру белков вируса ГС
(core, NS3, NS4, NS5), и их специфичность достигает 99%. В связи с отсутствием
общепринятых стандартов четких данных о чувствительности различных тест-
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 677iiPсистем привеста нельзя. Тем не менее считается, что этот показатель достигает щ
97-98% при обследовании иммунокомпетентных лиц.В последние годы разработаны тесты для экспрессного определения анти-HCV,
основанные на иммунохимических и других принципах. Указанные тесты облада¬
ют значительно меньшими чувствительностью и специфичностью по сравнению
со стандартным ИФА, поэтому результаты, полученные при их применении, могут
считаться сугубо предварительными и подлежат обязательному подтверждению.Несмотря на высокую специфичность современных ИФА'Систем, они могут
показать ложноположительные результаты при тестировании образцов крови,
поэтому требуется использование подтверждающих тестов и методов. Одним из
признанных методов подгверждения присутствия антител является иммуноблот¬
тинг. Иммуноблоттинг (англ. blot — «пятно») основан на дифференцированном
определении антител к различным антигенам вируса (С, NS3, NS 4 и NS5), которые
в виде дискретных фракций (пятен) фиксируются на нитроцеллюлозных полосках
и после инкубации с исследуемой сывороткой проявляются мечеными антителами
так же, как в обычном ИФА. Результат считается положительным при выявлении
антител к двум и более антигенам.Молекулярно-биологическая диагностикаМолекулярно-биологическая диагностика (определение РНК HCV) включает
качественную, количественную характеристику РНК вируса и определение гено¬
типической принадлежности исследуемых изолятов вируса.Качественное определение РНК HCVКачественное определение РНК HCV ос>тцествляют с помощью классической
обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), ПЦР в реаль¬
ном времени или транскриптазоопосредованной амплификации. Диагностические
препараты, основанные на перечисленных технологиях, должны определять не
менее 50 МЕ/мл РНК HCV.Количественная характеристика РНККоличественная характеристика РНК может бьггь дана с помощью конкурент¬
ной ПЦР, ПЦР в реальном времени или технологии рДНК (bDNA).Стандартным (классическим) методом генотипирования вируса ГС является
прямое секвенирование NS5B- или Е1-регионов генома с последующим сравни¬
тельным анализом полученных последовательностей нуклеотидов с известными
(прототипными) последовательностями. Этот подход позволяет определить не
только генотип изолята, но и его субтиповую принадлежность и отличие (сход¬
ство) от других циркулирующих изолятов. Он является основой молекулярной
эпидемиологии ГС.в клинической практике достаточно определить генотип вируса. Это может
быть осуществлено с помощью коммерческих тестов, определяющих различия в
последовательностях нуклеотидов 5’-нетранслируемой области.Специфическая лабораторная диагностика острого гепатита СИспользование серологических и молекулярно-биологических методов осу¬
ществляют одновременно. На основании различных сочетаний анти-HCV и РНК
HCV выделяют четыре маркерных профиля.•	Положительный результат определения РНК HCV при отррщательном результа¬
те определения анти-HCV указывает на начало острой инфекции, когда антитела
еще не успели выработаться; они появятся через несколько дней/недель.•	Положительный результат определения РНК HCV и анти-HCV. В этом случае
сложно разделить острый ГС и обострение хронического ГС. Кроме этого
возможен острый гепатит иной этиологии на фоне хронического ГС.
шш678 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ•	Отрицательный результат при определении РНК HCV и анти-HCV, скорее
всего, свидетельствует, что у обследуемого пациента с клинической картиной
острого гепатита не подтверждается диагноз гепатита С.•	Отрицательный результат определения РНК HCV при положительном резуль¬
тате определения анти-HCV — такой маркерный профиль обычно нехаракте¬
рен для острого ГС. Пациенты должны быть повторно обследованы на РНК
через несколько недель, поскольку отсутствие РНК может быть временным
при развитии хронического процесса. Выявление анти-HCV при постоянно
отрицательных результатах определения РНК чаще всего является свиде¬
тельством перенесенного в прошлом ГС, завершившегося выздоровлением.
Кроме того, возможен постоянный ложноположительный результат исследо¬
вания на анти-HCV, причины которого не совсем ясны.Специфическую лабораторную диагностику хронического гепатита С также
проводят с помощью серологических и молекулярно-биологических методов. При
клинико-биохимических проявлениях хронического гепатита текущий хрониче¬
ский ГС документируется наличием в крови как анти-HCV, так и РНК HCV.У пациентов с хроническим ГС, который развился на фоне иммунодепрессив-
ных состояний (больные на хроническом гемодиализе, пациенты с агаммаглобу-
линемией и др.), результат определения антй-HCV может быть отрицательным.Важно отметить, что оба маркера ГС (анти-HCV и РНК HCV) не имеют прогно¬
стического значения, так как не коррелируют с выраженностью воспалительного
процесса в печени и фиброза печени.Антивирусную терапию назначают только при положительном результате
исследования на РНК HCV. Перед началом терапии определяют генотип вируса,
так как от этого зависят продолжительность лечения и дозы назначаемых препа¬
ратов. Для мониторирования эффективности лечения до начала лечения опреде¬
ляют количественную характеристику РНК вируса (вирусную нагрузку), которую
повторно контролируют на 12-й неделе лечения в случае лечения пациента с
генотипом 1.в случае лечения пациентов с генотипами 2 или 3, а также 4, 5 или 6 проводят
качественное определение РНК HCV перед началом и в конце лечения, а также
спустя 24 нед после завершения лечения для установления очищения от вируса.Вирус гепатита DТАКСОНОМИЯВирус гепатита D (HDV — Hepatitis Delta virus) — возбудитель гепатита D (дельта-
гепатита). HDV не принадлежит ни к одному из известных семейств вирусов
животных. По своим свойствам этот вирус наиболее близок к вироидам и сател-
литным вирусам растений. Он является частью трансмиссивного агента (6-агента,
или ВГВ), вызывающего гепатит, отличный от других вирусных гепатитов.ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯHDV - сферическая частица со средним диаметром 36 нм (с колебаниями
от 28 до 39 нм), состоящая из ядра (HDAg) и внешней оболочки, образованной
поверхностным антигеном вируса В (HBsAg). Геном ВГО представлен одноните¬
вой циклической молекулой РНК, состоящей приблизительно из 1700 нуклеоти¬
дов. Анализ нуклеотидных последовательностей РНК ВГО нескольких изолятов
выявил их частичную гетерогенность (от 72,1 до 92,0% гомологии). На этом осно¬
вании изоляты HDV были сгруппированы в три генотипа, обозначаемые римскими
цифрами I, П, П1.При нагревании ВГВ происходит укрепление связи HDAg с РНК, которая
становится устойчивой к действию мочевины, гуанидина или меркаптоэтанола.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ6795-Антиген устойчив к нагреванию, действию кислот и нуклеаз, но разрушается в
присутствии щелочей и протеаз. Он обладает антигенной активностью и может
быть использован для конструирования диагностических препаратов.Вирус гепатита D не может участвовать в развитии гепатитной инфекции без
одновременной репликации вируса гепатита В. Этим фактом определяются две
возможные формы их взаимодействия; одновременного инфицирования HBV и
HDV — коинфекция и инфицирования HDV носителя вируса гепатита В — супе¬
ринфекция. Характер взаимосвязи этих вирусов определяется не только исполь¬
зованием HBsAg для формирования внешней оболочки HDV, но и другими,
до конца не понятными взаимодействиями. Так, HDV ингибирует репликацию
HBV. приводя к уменьшению экспрессии HBcAg и HBsAg и угнетению актив¬
ности ДНК-полимеразной активности в течение острой инфекции. Одним из
возможных объяснений этого факта являются данные о стимуляции 6-вирусом
внутриклеточного синтеза интерферона, который вызывает ингибицию репли¬
кации HBV.5-Вирус может быть обнаружен в гепатоцитах и в крови больных с острой и
хронической 5-инфекцией. Маркерами, свидетельствующими о наличии 5-вируса
в исследуемом материале, служат 5-антиген и/или РНК HDV.Для обнаружения 5-антигена в биопсийном или аутопсийном материале при¬
меняют метод флюоресцирующих антител и иммунопероксидазные методы.
В сыворотке крови 5-антиген определяют с помощью иммуноферментного, хеми¬
люминесцентного или радиоиммунного анализа лишь только после того, как
исследуемый материал обрабатывают неионными детергентами (твином, трито¬
ном и др.), разрушающими наружную оболочку вируса, тем самым делая доступ¬
ными антигенные детерминанты HDAg. Кроме того, диагностическое значение
имеет выявление антител классов IgM и IgG к 5-антигену.Детекцию РНК HDV проводят с помощью обратно-транскриптазной полиме¬
разной цепной реакции, позволяющей выявлять до 10^ молекул РНК HDV.вВирус гепатита ЕТАКСОНОМИЯВирус гепатита Е (HEV — Hepatitis Е Virus) — возбудитель гепатита Е, ранее
известного как гепатит ни А, ни В, с фекально-оральным механизмом передачи.
По основным фенотипическим признакам HEV мог бы быть причислен к семей¬
ству калицивирусов, однако состав и организация его генома полностью исключа¬
ют эту таксономическую принадлежность. Можно лищь предполагать, что HEV в
единственном пока числе представляет отдельный род вирусов.ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯЧастицы ВГЕ — округлые образования диаметром около 32 нм (вариации от 27
до 34 нм), построенные из идентичных структурных элементов и лишенные обо¬
лочки. Вирусным геномом является одноцепочечная РНК позитивной полярности.
Клонирование генома вируса позволило характеризовать РНК HEV по химиче¬
скому строению и генным функциям. Полноразмерная РНК насчитывает около
7500 нуклеотидных оснований и включает три независимые открытые рамки
считывания (ОРС), каждая из которых кодирует синтез определенного белка или
группы белков.HEV хорошо сохраняется при температуре -20 “С и ниже, однако хранение при
температурах выше О “С и особенно последовательное замораживание-оттаивание
ведет к быстрому разрушению вируса. Он чувствителен к воздействию хлор- или
йодсодержащих дезинфектантов.
680 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИЛабораторная диагностика гепатита Е основана на определении антител к виру¬
су классов IgM и IgG.ГЕРПЕС-ВИРУСЫ
ТаксономияСемейство герпесвирусов (Herpesviridae — от греч. herpes — «ползучая») объеди¬
няют пантропность к органам и тканям, пожизненная персистенция в организме
человека и способность вызывать многообразные манифестные формы заболева¬
ния в условиях возникновения иммунодефицита. Вирусы семейства Herpesviridae
широко распространены в природе. В настоящее время выделено и классифици¬
ровано свыше 100 представителей этого семейства, вызывающих заболевания у
человека, диких и домашних животных, земноводных и пресмыкающихся. Все
герпес-вирусы ДНК-содержащие, сходные по морфологии, типу нуклеиновой
кислоты, способу репродукции в ядрах инфицированных клеток и размерам, а
также по способности индуцировать латентную, острую и хроническую инфекции
у человека.По решению Комитета экспертов по таксономии в настоящее время разработана
и принята классификация герпес-вирусов, где семейство герпес-вирусов подразде¬
ляют на три подсемейства — а, ß, у. В табл. 24-5 представлены и основные клини¬
ческие формы инфекции, обусловленные герпес-вирусами.Таблица 24-5. Герпес-вирусы человека и основные клинические формы инфекцийПодсемействоРодВирусыКлинические формы инфекцииАльфа-герпес-вирусы{Alph3herpes-virinae)Вирусы простогогерпеса(Simplexvirus)Вирус простого герпеса
1-го типаН. Simplex Virus type 1
(HSV-1)Лабиальный герпес.Герпес кожи и слизистых оболочек.
Офтальмогерпес.Пневмониты.Генитальный герпес.Герпетические энцефалитыВирусы простого герпеса
2-го типаИ. Simplex Virus type 2
(HSV-2)Генитальный герпес.
Неонатальный герпесВирусы ветряной
оспы — опоясы¬
вающего герпеса
(Varicellovirus)Вирусы ветряной оспы
Varicella Zoster Virus type 3
(VZV)Ветряная оспа.
Опоясывающий герпесБета-гер пес-вирусы{Betaherpes-Цитомегаловирус(Cytomegalovirus)Цитомегаловирус
Cytomegalovirus type 5
(CMV)Врожденные поражения ЦНС.
Ретинопатии, пневмониты.
Гепатиты, сиаладенитыvirinae)Вирусы, образую¬
щие розеолы
(Boseoloviws)Вирус герпеса человека
6A типаHuman HerpesVvirus type 6A
(HHV-6A)Лимфотропные вирусы (предпола¬
гают этиологическую связь ВГЧ-6В с
внезапной экзантемой)Вирус герпеса человека
6В типаHuman Herpesvirus type 6В
(HHV-6B)Вирус герпеса человека
7-го типаHuman HerpesVirus type
7(ИИ\/-7)Предполагают этиологическую связь
с синдромом хронической усталости
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ б$1Окончание табл. 24-5ПодсемействоРодВирусыКлинические формы инфекцииГамма-герпес-вирусы(Gammaherpes-virinae)Лимфогропныевирусы{Lymphocryptovirus}Вирус Эпштейна-Барр
Epsteina-Barr Virus type 4
(EBV)Инфекционный мононуклеоз.
Лимфома Беркитта.
Гемофагоцитарный синдром.
Лймфопролиферативные заболевания:
лимфогранулематоз;
неходжкинские лимфомы.Рак носоглотки, желудка, слюнных
желез, злокачественная лейкоплакия
полости рта.ЛейомиосаркомаВирус, ассоцииро¬
ванный с саркомой
Капош»
(ñhaóinovirus)Вирус герпеса человека
8-го типаНишп Herpesvirus
type В (HHV-8)Саркома Капоши у ВИЧ-
серонегативных людей.Саркома Капоши, ассоциированная с
ВИЧ-инфекцией и СПИДом.
Лимфопролиферативные заболе¬
вания;•	лимфома первичного экссудата;•	многоочаговое заболевание
Кастле манаПримечание: Н. — Herpes.АЛЬФА-ГЕРПЕС-ВИРУСЫАльфа-герпес-вирусы (Alphagerpesvirinaé) характеризуются коротким циклом
репродукции с цитопатическим эффектом в клетках инфицированных культур,
патогенны для большинства хозяев. Обычно персистируют в центральной нерв¬
ной системе — в сенсорных ганглиях, поддерживая латентную инфекцию, которая
нередко проявляется как периодически обостряющееся заболевание.БЕТА-ГЕРЛЕС-ВИРУСЫБета-герпес-вирусы (Bethaherpesvirinae) вызывают манифестную и латентную
инфекции в слюнных железах, почках и других органах. Могут быть причиной
генерализованных поражений у новорожденных и взрослых при иммунодефицит-
ных состояниях.ГАММА-ГЕРПЕС-ВИРУСЫГамма-герпес-вирусы {Gammaherpemrínae) характеризуются тропизмом к В-
или Т-лимфоцитам (но репродуцируются в основном в В-клетках), лимфоидным
клеткам, в которых они способны размножаться и длительно персистировать. Эти
вирусы нередко являются причинами тяжелых, смертельных лимфом и лейке¬
мий. Патогенные для человека вирусы — вирус Эпштейна-Барр (ВГЧ-4) и ВГЧ-8
(см. табл. 24-5).Характеристика вирусовРазмеры Зрелого вириона — 120-200 нм в диаметре (вирион цитомегаловиру¬
са — 150-300 нм), имеет сферическую форму, четыре структурных компонента:•	сердцевину — геном представлен вирусной ДНК — линейной двухнитевой
молекулой с коротким и длинным компонентами, различными по величине
и нуклеотидному составу, молекулярной массой от 80-100x10^' (ВПГ) до
145x10® (ЦМВ), в составе имеет до 80 генов, подгруппы — а, Ь, g;•	суперкапсид (внешнюю оболочку), пронизанный гликопротеиновыми шипа¬
ми, — это типоспецифические антигены, по которым определяют отдельные
серотипы герпес-вирусов;
Шщш-.жЩШ.682ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ•	внутреннюю оболочку (тегумен — покрытие) — расположена между супер-
капсидом и капсидом, толщина различна у разных вирусов, непробиваемая
для лучей электронного микроскопа:•	капсид - построен из 162 капсомеров, диаметр составляет 100-110 нм, орга¬
низован по типу кубической симметрии, представлен группоспецифическими
для каждого подсемейства антигенами, образованными белками нуклеокап¬
сида-В структуре вириона более 30 структурных белков (гликопротеинов - gp), семь
из которых (В, с, D, Е, F, G, X) находятся на поверхности и вызывают образова¬
ние вируснейтрализующих антител. Капсид содержит 6 белков (гликопротеидов),
неструктурные белки (их десятки), в том числе вирусспецифический фермент
тимидинкиназу (ТК), ДНК-полимеразу и белок, связанный с ДНК.Вирусная ДНК состоит из 80 генов, подгруппы — а, Ь, g:•	й-гены транскрибируются РНК-полимеразой и не требуют для транскрипции
присутствия синтезированных de novo белков;•	продукты ¿-генов — вирусспецифическая ДНК-полимераза и ТКаза, необхо¬
димые для биосинтеза ДНК вириона;•	g-гены - структурные белки вириона, представлены мембранными гликопро¬
теидами А, В, С, D, Е, F, G, которые играют важную роль в иммунопатогенезе
герпеса (проникновение ВПГ в клетку, феномен образования симпластов), а
также индуцируют формирование вируснейтрализующих и комплементсвя-
зывающих антител.ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ НЕКОТОРЫХ ГЕРПЕС-ВИРУСОВВирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) является представителем онкогенных ДНК-
содержащих вирусов, его капсид диаметром 120-150 нм окружен оболочкой,
содержащей липиды. В процессе репликации вируса экспрессируется свыше
70 различных вирусспецифических белков, однако к настоящему времени выделе¬
ны группы иммуногенных белков, определение антител к которым дает возмож¬
ность дифференцировать стадию инфекции, а именно:•	ЕА (Early Antigen) — ранний антиген, включает белки р54, р138;•	EBNA-1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen) — ядерный антиген, белок р72;•	VCA (Viral CapsidAntigen) — капсидный антиген (поздний антиген), включает
комплекс белков р150, р18, р23; к настоящему времени показано, что имму-
нодоминантными белками в этом комплексе являются р18 и р23;•	LMP (Latent Membrane Protein) — латентный мембранный белок (комплекс
продуктов ранних и поздних антигенов), gpl25.Знание сроков появления антигенов ВЭБ и антител к нему позволяет докумен¬
тировать латентную, острую и хроническую ВЭБ-инфекции. Известны два штамма
ВЭБ, неразличимые серологически: тип 1 (А) и тип 2 (В).Структура ВГЧ-6 расшифрована, молекулярно-биологическими и иммуноги-
стохимическими методами выделены два изолята (подтипы А и В) и обнаружена
гомологичность вируса с ЦМВ человека — более 50%. ВГЧ-6 имеет суперкап-
сидную липидсодержащую оболочку и электронно-плотный икосаэдрический
нуклеокапсид размером 95-105 нм, состоящий из 162 капсомеров, содержащих
геном вируса, представленный двухнитевой ДНК. Размер вируса — 160-200 нм, он
состоит из 25-29 полипептидов с молекулярной массой от 19 до 200 кДа, часть из
которых представлена клеточными белками. Специфические последовательности
групп А и В вируса используют для ПЦР-диагностики. ВГЧ-6 и ВГЧ-7 по своей
морфологической структуре схожи с другими герпес-вирусами, по составу ДНК
существенно отличаются от них. ВГЧ-7 и ЦМВ имеют общий фрагмент генома,ВГЧ-8 содержит последовательности, гомологичные двум известным онкогенным
герпес-вирусам — герпес-в^фусу саймири и ВЭБ.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ683Таким образом, гфпес-вирусы имеют общие признаки; наличие ДНК, сходство по
морфолоп-ш, способу репродующи, размерам, способность поражать лимфоидные
клетки и ткани, пантропность и персистенщ4[Ю в клетках различных органов и систем,
клинический полиморфизм инфекщ!онного процесса и индукции репродукции дру¬
гих вирусов, а также способность вызьюать мутационные процессы в соматических
клетках человека. В то же время каждый вирус достаточно отличается по антигенным
и биологическим свойствам, способности к репродукции в определенных тканях и
клетках организма, вызывая при этом различные клинико-патогенетические формы
заболевания.Устойчивость во внешней средеВПГ термолабильны, инактивируются при температуре 50-52 "С через 30 мин,
неустойчивы к действию физических и химических факторов, сравнительно
легко разрушаются под воздействием ультрафиолетовых и рентгеновских лучей,
разрушаются органическими растворителями, детергентами, протеолитическими
ферментами. Этиловый спирт, фосфатаза, желчь, эфир и др)тие детергенты быстро
инактивируют ВПГ При низких температурах (от -20 до -70 “С) вирус сохраняет¬
ся годами и десятилетиями. После лиофильного высушивания ВПГ не теряет своей
активности более 10 лет.Клинический материал для лабораторного исследованияИсследование на ГВИ проводят с учетом анамнеза, клинико-эпидемиологи¬
ческих данных. Материал для исследований может бьггь различным (табл. 24-6).
Помимо манифестных форм герпетической инфекции (ГИ), известны ее бессимптом¬
ные и скрытые формы (нераспознанный герпес атипичного течения — 60%, бессим¬
птомный герпес — 20%). Материалом для исследования при подозрении на нерас¬
познанный герпес являются соскобы клеток, СМЖ, аспираты, биоптаты, кровь.Таблица 24-6. Материалы, исследуемые при выделении герпес-вирусов в зависимости от лока¬
лизации пораженийЛокализацияпораженийСодержимоевезикулСоскоб клетокСМЖАспират из
бронховБиолтатКровь1234Кожа++Глаза++Гениталии+++Анус+++Рот+++ЦНС++++Легкие+Печень+Врожденныйгерпес+++++Соскоб клеток: 1 — со слизистой оболочки полости рта, зева; 2 — конъюнктивы; 3 — слизистой
оболочки влагалища, шейки матки; 4 - слизистой оболочки прямой кишки.Лабораторная диагностика герпес-вирусной инфекцииЛабораторные методы диагностики герпес-вирз'^сных инфекций в настоящее
время применяют только в тех случаях, когда необходимо уточнить этиоло-
684ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯГИЮ или оценить динамику заболевания. Наиболее часто уточнение этиологии
заболевания требуется при поражении органов зрения (увейте, конъюнктивите
и кератоконъюнктивите), ЦНС (серозном энцефалите и менингите) и половых
органов (наружных половых органов, цервиците, уретрите), так как не только
герпес-вирусы, но и довольно большое число других вирусов вызывают острые и
рецидивирующие заболевания этих органов. Важно лабораторно обследовать на
герпес-вирусы пациентов с неблагополучным акушерским анамнезом, подозрени¬
ем на микст-инфекции, пациентов со вторичной иммунологической недостаточно¬
стью, особенно при лимфаденопатии, длительной лихорадке. В подобных случаях
ошибка при выборе этиопатогенетических препаратов и их доз зачастую приводит
к серьезным негативным последствиям. Лабораторный контроль течения герпес¬
вирусных заболеваний необходим при диссеминации процесса, у беременных.
В этих ситуациях малоинформативны методы определения титров противогер-
петических антител, которые являются часто косвенным свидетельством актив¬
ности процесса и специфического иммунного ответа, в то время как для уточнения
этиологии, стадии и течения инфекционного процесса врачи должны располагать
сведениями о наличии или отсутствии самих герпес-вирусов или их антигенов.Вирусологический методВирусологический метод является «золотым стандартом» в диагностике ГВИ.
Отличительной особенностью данного метода является высокая степень досто¬
верности полученных результатов, а также высокие чувствительность (85-100%)
и специфичность (100%), возможность получения чистой культуры возбудителя
для его дальнейшего изучения, в частности испытания чувствительности к антиви¬
русным препаратам; недостаток — длительность проведения (от 2 до 5-14 дней).
Культивирование вируса осуществляют на чувствительной культуре клеток Vero.Ускоренный вирусологический методВ настоящее время используют и ускоренный вирусологический метод выяв¬
ления вируса. Сущность метода заключается в том, что материал, полученный от
больных, культивируют одновременно с культурой клеток Vero в течение 24 ч,
после чего клетки культуры фиксируют в холодном ацетоне. Далее проводят выяв¬
ление антигенов вируса в реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ).
На фиксированные препараты наносят моноклональные антитела (МКА) к ВПГ.
Затем препараты инкубируют во влажной камере в течение 1 ч при температуре
37 “С и промывают проточной водой. После промывки на препараты наслаивают
антивидовой конъюгат — меченные ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианатом) анти¬
тела против иммуноглобулинов мыши — и помещают на 30 мин при температуре
37 “С. Окрашенные препараты исследуют с помощью люминесцентного микро¬
скопа. При микроскопии определяют вирусспецифические включения в виде обра¬
зований с зеленой или желто-зеленой флюоресценцией в адре и/или цитоплазме
эпителиальных клеток. Включения могут иметь зернистую, гомогенную или
смешанную структуру. Ценность данного метода состоит в том, что он является
пока единственным методом, позволяющим выбрать антивирусный препарат для
лечения ГИ и оценить эффективность противовирусной терапии через 1,5-2 мес
после окончания лечения. Результаты лабораторного исследования готовы в тече¬
ние 2 сут.Методы прямой цитологической индикацииСамыми первыми методами диагностики ГВИ являлись методы прямой цито¬
логической индикации герпес-вирусов в образцах первичного патологического
материала. При наличии вируса в пораженных тканях цитологический метод
позволяет обнаружить гигантские округлые многоядерные клетки со специфиче¬
скими внутриядерными включениями; при ЦМВ — гигантские округлые клетки
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ685с ядром, занимающим почти всю цитоплазму, увеличенным за счет гомогенно¬
го включения («совиный глаз»). Показанием к проведению цитологического
метода исследования ГИ является бессимптомное течение, а также острая фаза
заболевания. Простота метода заставляет использовать его и до настоящего вре¬
мени, однако больщинство авторов признают его несовершенным и ненадежным.
Недостатки метода — невозможность дифференцирования первичной инфекции и
рецидивирующей, а также невозможность уточнения типа ВПГ, являющегося при¬
чиной заболевания. Кроме того, чувствительность и специфичность не превышают
75% по сравнению с методом выделения вируса в культурах тканей и зависят от
получения достаточного количества клеток для исследования, то есть правильного
забора материала.Иммунофлюоресцентный методИммунофлюоресцентный метод основан на обнаружении в образцах пер¬
вичного материала от больных светящихся комплексов антигена возбудителя
(липополисахарида или основного белка наружной мембраны) со специфиче¬
скими антителами с использованием люминесцентного микроскопа. При люми¬
несцентной микроскопии вирусы герпеса имеют специфическое интенсивное
изумрудно-зеленое свечение. Антиген вируса может быть обнаружен в ядре, ядре и
цитоплазме неизмененных клеток. Многие авторы считают результаты внутрикле¬
точной флюоресценции положительными при наличии не менее трех светящихся
антигенсодержащих клеток. Достоинствами РИФ являются невысокая стоимость,
высокие специфичность (90%) и чувствительность (55-75%), быстрота получения
результатов (в пределах 2 ч). а недостатком — зависимость результатов от качества
забора материала, стадии заболевания и квалификации врача-вирусолога.Методы лабораторной диагностикиСледует отметить, что для повышения надежности диагностики генитального
герпеса, особенно в случаях субклинических и маломанифестных форм герпеса,
рекомендуют использовать в работе два-три метода лабораторной диагностики,
особенно при обследовании беременных, женщин с неблагополучным акушерским
анамнезом, лиц с неуточненным гинекологическим диагнозом.В последние годы большое распространение приобрели диагностические тесты
для определения антигенов и антител к герпес-вирусам, основанные на принципе
ИФА, а также ПЦР-методики выявления в материале от больных ДНК герпес¬
вирусов.Определение противовирусных антителПротивовирусные антитела классов IgG, IgA, IgM в сыворотке крови опреде¬
ляют с помощью ИФА. Простота, высокие специфичность и чувствительность, а
также невысокая стоимость этого метода и возможность определения стадии забо¬
левания сделали его наиболее распространенным в диагностике ГИ. Недостатком
метода является возможность получения ложноположительных результатов за
счет перекрестных реакций с нормальными антителами.После внедрения вируса герпеса в организм человека начинается синтез спец¬
ифических иммуноглобулинов класса М (IgM), которые определяются на 4-6-й
день после инфицирования и достигают максимального значения к 15-20-м сут¬
кам. С 10-14-х суток начинается продукция специфических IgG, несколько позд¬
нее IgA. IgA-антитела сохраняются в организме человека недолго (3 мес), IgG-
антитела — в течение всей жизни. Диагностическое значение при первичной ГИ
имеет выявление IgM и/или четырехкратное увеличение титров специфических
иммуноглобулинов G (IgG) в парных сыворотках крови, полученных с интервалом
14-21 дней. Рецидивирующий герпес обычно протекает на фоне высоких пока¬
зателей IgG-антител, свидетельствующих о постоянной антигенной стимуляции
686 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯорганизма больного. Нередко диагностика активной фазы инфекции по четы¬
рехкратному приросту титра IgG-антител вызывает затруднения, поскольку титр
IgG-антител может увеличиваться достаточно быстро (в течение 1-2 сут) после
проявления симптомов заболевания. Б случае обнаружения IgG-антител любого
уровня рекомендуют тестировать сыворотки на IgM-антитела, особенно к ЦМВ.Определение низкоавидных антител при герпес-вирусных инфекцияхЕдинсгвенным способом, позволяющим сразу и достоверно диагностировать
первичную инфекцию, является определение индекса авидности (ИА) специфи¬
ческих антител. Тест на определение авидности IgG-антител позволяет установить
точный момент инфицирования и разграничить первичную, реинфекцию или
реактивацию инфекционного процесса. Авидность специфических IgG при серо¬
диагностике возбудителей инфекционных заболеваний определяют различными
методами: агглютинацией, радиоиммунным методом, РСК, ИФА, электроблоттин-
гом и электрофорезом.Чаще определяют показатель индекса авидности с помощью ИФА. Суть метода
заключается в следующем, В процессе инкубации образцов сыворотки крови с
адсорбированными на планшете антигенами образуются иммунные комплексы.
После промывания планшета в часть лунок добавляют раствор, который способ¬
ствует удалению «ранних» IgG с низкой авидностью (денатурирующее вещество).
Затем вносят антиглобулиновый конъюгат и контролируют его связывание с ком¬
плексом «антиген-антитело» с помощью раствора хромогена. После остановки
ферментативной реакции измеряют спектрофотометром оптическое поглощение
окрашенного раствора. Наличие в исследуемом образце вирусспецифических IgG-
антител с низкой авидностью определяется по снижению интенсивности окраши¬
вания в сравнении с лунками, обработанными раствором сравнения. В качестве
денатурирующего вещества используют диэтиламид, тиоционат калия, глюта-
ральдегид, мочевину. Показано, что обработка 8 М раствором мочевины является
самым простым методом измерения авидности IgG, однако этот метод менее чув¬
ствителен, чем с применением диэтиламида, так как он не позволяет определять
низкоавидные антитела спустя 3 мес после первичного инфицирования.Индекс авидности (ИА) антител сывороток рассчитывают по формуле:ил-оп,х1оо/оп,,где ОП^ — оптическая плотность в лунках с антигенами после обработки денатури¬
рующим агентом; ОП^ — оптическая плотность в лунках с той же сывороткой после
обработки раствором сравнения.Учет реакции: показатель ИА ниже 30-50% (в зависимости от особенностей
тест-системы) указывает на свежую первичную инфекцию. Показатель ИА,
равный или превышающий 50%, свидетельствует о присутствии в сыворот¬
ке высокоавидных антител — маркеров перенесенной в прошлом инфекции.
Показатель авидности антител в пределах 31-49% может свидетельствоватьо	поздней стадии первичной инфекции или недавно перенесенной инфекции
(ранней паст-инфекции) только при условии выявления высоких концентраций
антител. Интерпретировать результаты определения ИА необходимо в строгом
соответствии с рекомендациями фирмы-производителя, так как величина ИА
для одной и той же стадии заболевания может колебаться в широких пределах
в зависимости от способа разрушения иммунного комплекса и природы исполь¬
зуемого денатуранта.Таким образом, если в исследуемой сыворотке крови при наличии или отсут¬
ствии IgM-антител, обнаруживаются IgG-антитела с низкой авидностью, то это
свидетельствует о первичной (недавней) инфекции. Присутствие высокоавидных
антител IgG указывает на вторичный иммунный ответ в случае попадания возбу¬
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ687дителя в организм или обострения (реактивации) заболевания. Тест на авидность
прост в исполнении, доступен для большинства иммунологических лабораторий.Метод иммуноблотаМетод иммуноблота (WestembJot, Line-blot) — новое поколение подтверж¬
дающих тестов на инфекции. Представляет собой индивидуальный оценочный
шаблон, имеется возможность автоматизации исследования.Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых ВПГ 1-го и 2-го типа,
включает комплекс исследований по выявлению специфического иммунного отве¬
та (антител), определению вирусной ДНК и вирусных белков (антигенов), а также
подтверждению природы патогена культуральным методом (по цитопатогенному
эффекту вируса в перевиваемой культуре клеток).В серологических тестах на ВПГ, направленных на выявление антител против
ВПГ 1-го и 2-го типа, показана низкая диагностическая значимость из-за неодно¬
значности клинической трактовки. Нарастание титров антител к ВПГ происходит
медленно, в течение нескольких недель, при этом могут одновременно определяться
специфические антитела классов IgM и IgG. Впоследствии антитела к ВПГ класса М
могут циркулировать в крови от нескольких месяцев до нескольких лет. Этот фено¬
мен связывают с нарушением иммунитета у инфицированных ВПГ лиц. Кроме того,
в случае реактивации ВПГ в крови могут вновь появиться специфические антитела
класса М. С другой стороны, у иммунокомпрометированных пациентов при реци¬
дивах инфекции ВПГ антитела к вирусу (как IgM, так и IgG) могут не выявляться.
Ложноотрицательный результат теста на анти-ВПГ класса М может быть у новорож¬
денных. Тем не менее серологическое исследование необходимо проводить методом
парных сывороток (с интервалом 14-21 день). Отсутствие в первой и появление во
второй сыворотке противогерпетических IgM или нарастание титров специфиче¬
ских IgG в четыре раза и более могут быть показателем острой инфекции ВПГСхематически интерпретация результатов исследования сывороток на антитела
к ВПГ 1-го и 2-го типа может быть представлена следующим образом: низкий и
средний уровень IgG-антител — ремиссия, высокий уровень — обострение. Если
обнаружены высокие уровни IgG-антител к герпес-вирусам, рекомендуют допол¬
нительно тестировать сыворотки методом ПЦР, который может достоверно ука¬
зать на присутствие вируса в организме.Метод прямой иммунофлюоресценцииМетод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) с поли- или моноклональными
антителами против ВПГ-1 и ВПГ-2 при исследовании первичного материала от
больных дает представление о морфологических свойствах клеток и изменении
локализации антигенов ВПГ. Кроме прямых признаков поражения клеток вируса¬
ми герпеса (специфического свечения), имеются косвенные признаки герпетиче¬
ской инфекции по данным ПИФ:•	агрегация ядерного вещества, отслаивание кариолеммы;•	наличие так называемых ядер-дырок, когда от ядра клетки остается только
одна кариолемма;•	наличие внутриядерных включений — телец Каудри.При постановке ПИФ врач получает не только качественную, но и количествен¬
ную оценку состояния инфицированных клеток.Метод иммуноферментного анализапри ИФА определяют антигены с помощью антител, меченных ферментом.
Преимуществом ИФА по сравнению с РИФ являются большая степень чувстви¬
тельности, стандартизация и автоматизация исследований, снижение частоты
ложных, субъективных ошибок, связанных с квалификацией врача-лаборанта.
Чувствительность метода составляет 70-80%.
588 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯМетод полимеразной цепной реакцииВ настоящее время является основным диагностическим способом в практи¬
ческом здравоохранении для выявления ДНК вируса. При этом для вьщеления
ДНК ВПГ может быть использован любой биологический материал: клетки, био¬
логические жидкости, ткани и т.п. В настоящее время разработаны методы коли¬
чественного определения вирусной ДНК в тестируемом образце. На основании
полученных данных можно оценить форму инфекционного процесса. Так, если
количество ДНК превышает 1000 копий геном-эквивалента (г/э) на 10 лейкоци¬
тов периферической крови, это может свидетельствовать о развитии диссемини¬
рованной инфекции.Лабораторная диагностика ЦМВ-инфекцииЛабораторная диагностика ЦМВ-инфекции включает несколько под¬
ходов;•	выявление инфекционных вирусных частиц или антигенов;•	определение вирусной ДНК;•	определение иммунного ответа организма;•	выявление прямого цитопатического действия вируса, вьщеленного из биО'
логических субстратов пациента, на перевиваемую культуру клеток.Серологические тесты на ЦМВ являются основными для установления инфи-
цирования данным вирусом. Однако серопозитивность отнюдь не является осно-
ванием к заключению, что болезнь действительно вызвана ЦМВ. Показано, что
высокие титры анти-ЦМВ-антител обнаружены как у здоровых носителей, так и у
больных с острым течением инфекции. Селективное определение специфическ11х
антител против ЦМВ классов М и G также не позволяет с полной уверенностью
дифференцировать острую инфекцию от реактивации хронической. Именно
поэтому определение вирусных антигенов и ДНК ЦМВ становится необходимым
тестом для диагностики заболевания этим вирусом.Метод ПЦР широко используют для диагностики ЦМВ в любых биологиче¬
ских тканях и жидкостях, в том числе и биопсийном материале, фиксированном
формалином. Этот метод превышает по своей чувствительности все имеющиеся
аналоги. Для увеличения диагностической и прогностической значимости приме¬
няют количественные методы исследования для определения вирусной нагрузки
ЦМВ в крови методом ПЦР в формате реального времени, что позволяет оценить
эффективность противовирусной терапии.Лабораторная диагностика ВЭБ-инфекцииЛабораторная диагностика ВЭБ-инфекции базируется на цитологическом иссле¬
довании крови или костного мозга, серологических исследованиях (определении
гетерофильных и противовирусных антител) и ПЦР,Серологическая диагностика ВЭБ-инфекции представляет определенные труд¬
ности, Она основана на выявлении специфических антител к нескольким анти¬
генам вируса (УСА, ЕА, EBNA), однако не существует единого надежного теста,
позволяющего получать достоверную информацию для постановки окончатель¬
ного диагноза.На ранних стадиях развития инфекции в образцах сыворотки крови пациента
обнаруживают IgM и IgG к нуклеарному антигену (IgM-УСА и IgG-VCA). Активная
фаза инфекционного мононуклеоза также характеризуется продукцией низкоа¬
видных антител IgG к УСА и в большинстве случаев наличием IgG, специфичных к
комплексу ранних антигенов. IgM-антитела к нуклеарному антигену (EBNA) могут
служить индикатором острой инфекции. Однако ряд авторов отмечают частое воз¬
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ689никновение ложноположительных реакций вследствие неспецифической реактив¬
ности. Показано, что антитела к ядерному белку EBNA-1 р72 являются маркерами
только паст-инфекции.Появление IgM анти-УСА-антител может происходить с опозданием или вооб¬
ще не происходить, с другой стороны, IgM анти-УСА могут выявляться в течение
нескольких месяцев после первичного инфицирования, повторно появляться при
реактивации инфекции, а также при мононуклеозах иной этиологии (ЦМВ, токсо¬
плазмозе, гепатите А, ВИЧ).Возможны варианты интерпретации результатов серологического исследова¬
ния больных с ВЭБ-инфекцией с учетом качественных характеристик тест-систем
фирм-изготовителей (табл. 24-7).Таблица 24-7. Варианты интерпретации результатов серологического исследования больных ВЭБ*Стадии ВЭБ-инфекцииНизкоавкдиыеМаркеры ВЭБ-инфекцииантителаVCA-IgGVCA-IgMEA-IgGEBNA-IgGИнкубационный период или отсутствие
инфекции-----Предранняя первичная инфекция++---Ранняя первичная инфекция++4--Острая первичная инфекция (инфекци¬
онный мононуклеоз)++++-Поздняя первичная инфекция-++/-(<0,3)++ или -Хроническая инфекция-+-+-Атипичная первичная инфекция-++--Ранняя паст-инфекция-+-++Поздняя паст-инфекция-+--+Реактивация-++++Примечание. ЕА — ранний антиген: EBNA — ядерный антиген; VCA — капсидный антиген.«-i- — отсутствие антител.«+/-» — вероятное присутствие антител.«+» - присутствие антител.После положительного результата ИФА на антитела к ВЭБ ставят подтверж¬
дающую реакцию иммуноблоттинга, в которой определяют наличие антител к
отдельным маркерным белкам ВЭБ (р — протеины): р23, р54, р72 (наличие этого
белка указывает на возможность размножения ВЭБ), р138 и др. Выявление белка
УСА 125 указывает на раннюю фазу инфекции. В разгар болезни и на этапе завер¬
шения острого процесса появляются УСА 19. О поздней фазе свидетельствует
высокоспецифический маркер УСА 22, который выявляется самостоятельно или
одновременно с EBNA-1 (р79). Последний белок длительно присутствует у пере¬
болевших и свидетельствует о перенесенной инфекции.ПЦР-методы могут быть использованы для качественного и количественного
определения ДНК ВЭБ.Лабораторная диагностика инфекции, вызванной вирусом
герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6, ВГЧ-6А, ВГЧ-6Б)Серологические методы, используемые для диагностики герпетической инфек¬
ции этого типа, имеют целый ряд недостатков и редко помогают в диагностике
клинической манифестации. Определение титра специфических IgM используют
для диагностики острой инфекции или реактивации. Не у всех детей с первичной
шіІ690ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯинфекцией отмечается продукция антител IgM, примерно 5% здоровых взрос¬
лых имеют антитела IgM к ВГЧ-6. В связи с тем что практически у всех взрослых
выявляют IgG к ВГЧ-6, обнаружение специфических антител в одном образце не
значимо. К тому же, повышение их титра не указывает на новую инфекцию или
реактивацию. Возможно также выявление перекрестно реагирующих антител к
другим ДНК-вирусам, особенно ВГЧ-7. Доступные в настоящий момент сероло¬
гические тест-системы не позволяют дифференцировать варианты А и В ВГЧ-6.
У детей диагноз первичной инфекции ВГЧ-6 требует обнаружения виремии (изо¬
ляции ВГЧ-6 в моноядерных клетках периферической крови) и существенного
нарастания показателей серологических тестов. ВГЧ-6-виремия наблюдается
относительно редко у здоровых детей по сравнению с переносящими первичную
инфекцию. Изоляция ВГЧ-6 требует культивации со стимулированными клетка¬
ми крови пуповины и последующей идентификации на оборудовании, которое
доступно только исследовательским лабораториям. Трудны для диагностики пер¬
систирующая и латентная инфекции.ДНК ВГЧ-6 можно обнаружить в лимфоцитах периферической крови или в
других тканях методом ПЦР. Однако обнаружение ДНК ВГЧ-6 в этих тканях не
всегда указывает на первичную инфекцию, наиболее часто это является проявле*
кием персистирующей инфекции, развившейся после первичной инфекции и не
сопровождающейся виремией. Обнаружение ДНК ВГЧ-6 в плазме и определение
высокого титра вируса методом ПЦР в реальном времени — более чувствительный
метод для диагностики первичной инфекции (около 90%), однако это может сви¬
детельствовать и о реактивации инфекции ВГЧ-6.Лабораторная диагностика инфекции, вызванной вирусом
герпеса человека 7-го типа (ВГЧ-7)Множество различных заболеваний ассоциируется с ВГЧ-7-инфекцией, но
очень мало доказательств их причинной связи. ВГЧ-7 может быть кофактором, но
зачастую его присутствие — результат высокой частоты персистенции и особен¬
ностей выделения ВГЧ-7. Значительно чаще (до 85%) ВГЧ-7 может выделяться
из слюны здоровых индивидуумов, в активизированной пуповинной крови или
мононуклеарах периферической крови.Для серологической диагностики HHV-7 используют различные методы, наи¬
более часто применяют ИФА, разработаны также иммуноблоттинг и реакция ней¬
трализации. Для исключения перекрестной реактивности между ВГЧ-6 и ВГЧ-7
перекрестно реагирующие антитела ВГЧ-6 исключают адсорбцией с зараженными
ВГЧ-6 клеточными лизатами.ДНК ВГЧ-7 обнаруживают с помощью ПЦР в слюне, моноядерных клетках
периферической крови и других биологических жидкостях. Разработаны каче¬
ственные и количественные методы ПЦР. к сожалению, любое из этих исследова¬
ний в отдельности не позволяет дифференцировать первичную инфекцию ВГЧ-7
от реактивации и взаимодействия с другими вирусами герпеса. У детей изоляция
ВГЧ-7 из мононуклеаров периферической крови плюс сероконверсия обычно ука¬
зывают на первичную инфекцию. IgM к ВГЧ-7 не могут быть использованы для
диагностики первичной инфекции, поскольку их определяют у здоровых людей,
ранее перенесших инфекцию.Таким образом, хотя ВГЧ-7 близок с ВГЧ-6 по морфологии и геному, он отли¬
чается по биологической значимости как причинный фактор заболеваний у детей.
Возможно, наиболее интересными особенностями являются многообразное и
частое взаимодействие с другими герпес-вирусами и его потенциальная роль
как кофактора или модулятора ассоциированных болезней, например, у ВИЧ-
инфицированных и у пациентов с другими иммунодефицитами.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ ggtЛабораторная диагностика инфекции, вызванной вирусом
герпеса человека 8-го типа (ВГЧ-8)Для диагностики ВГЧ-8-инфекции преимущественно используют серологи¬
ческие исследования и ПЦР. ДНК ВГЧ-8 можно обнаружить в ткани саркомы
Капоши, мононуклеарах периферической крови. Для обнаружения антител про¬
тив антигенов ВГЧ-8 разработаны различные серологические методы, прежде
всего ИФА, иммуноблоттинг. Некоторые сыворотки от здоровых людей содержат
антитела, которые перекрестно реагируют с антигенами ВГЧ-8 и могут привести к
ложноположительным результатам.Диагностика множественной герпес-вирусной инфекцииВозможно одномоментное инфицирование несколькими вирусами семейства
Herpesviridae. Нередко этому подвержены пациенты с клинико-лабораторными
проявлениями вторичной иммунологической недостаточности (онкогематоло¬
гические, онкологические, ВИЧ-инфицированные). При этом прогностически
наиболее значимым можно считать комплексное одномоментное выявление ДНК
ВПГ-1,ЦМВиВГЧ-6.Для адекватной терапии ГВИ недостаточно только выявить возбудителя забо¬
левания. Необходимо иметь представление о характере течения инфекционного
процесса. Таким образом, диагноз ГВИ следует устанавливать по совокупности
анамнестических, эпидемиологических, клинических данных и доступных лабо¬
раторных методов исследования: цитоморфологического исследования мазков для
обнаружения многоядерных гигантских клеток и внутриклеточных включений;
выделения вируса на хорионаллантоисной оболочке куриных эмбрионов или в
культуре клеток; иммуноферментного анализа для определения титра специфиче¬
ских противовирусных антител (и антигенов вирусов); определения вирусной ДНК
с помощью ПЦР, подтверждающей реакции иммуноблота.КАЛИЦИВИРУСЫТаксономияКалицивирусы человека относятся к семейству Caiiciviridae. Генетическим
материалом калицивирусов является однонитевая плюс-нить РНК размером
около 7,5x10^ о.н. В состав семейства Caliciviridae входят роды Norovirus, Sapovirus,
Lagovirus и Vesivirus. В инфекционной патологии человека имеют значение только
представители родов Norovirus и Sapovirus. Ранее их называли Норуолк- и Саппоро-
подобными вирусами, в настоящее время они получили название норовирусов и
саповирусов соответственно. И те и другие вирусы вызывают острое кишечное
заболевание, причем норовирусы поражают все возрастные группы населения, а
саповирусы, как правило, только детей в возрасте до 5 лет. Норовирусная инфек¬
ция индуцирует слабый и нестойкий иммунный ответ, чем и объясняется широкое
распространение норовирусных инфекций во всех возрастных группах.Норовирусы и саповирусы отличаются высоким антигенным и генетическим
разнообразием. К настоящему времени идентифицированы норовирусы пяти раз¬
личных геногрупп, каждая из которых подразделяется на несколько генетических
кластеров. Норовирусы I, П и IV геногруппы вызывают заболевание у человека.
Наибольшее значение в эпидемиологии имеют норовирусы геногруппы GII, в осо¬
бенности кластера GII.4. Саповирусы также делятся на несколько геногрупп. Для
человека имеют значение саповирусы 4 групп: GI, GII, GIV и GV.
IPш
Щщ692ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯДо настоящего времени никому из исследователей не удалось культивировать
калицивирусы человека, поэтому их интенсивное изучение началось лишь в конце
XX — начале XXI в. с появлением методов обратной генетики. Секвенирование и
клонирование геномов калицивирусов позволило разработать тест-системы ПЦР
и наборы ИФА, направленные на выявление консервативных этитопов наружных
белков калицивирусов. Широкое применение новых диагностических методов в
значительной мере заполнило существующий ранее пробел в расшифровке этио¬
логии острых кишечных инфекций (ОКИ).Характеристика вирусовВирионы норовирусов — безоболочечные округлые частицы диаметром
26-32 нм, обладающие икосаэдрической симметрией. Значительный разброс
в размерах указывает на генетическое разнообразие и недостаточную изучен¬
ность норовирусов. В препаратах, полученных методом негативного контрасти¬
рования, вирусные частицы имеют неровную поверхность (feathery — «пуши¬
стый»), Норовирусы, принадлежащие к различным генетическим кластерам, могут
несколько различаться по морфологии. Например, вирус Торонто долгое время
был известен под названием мини-реовирус, что отражает особенности его мор¬
фологии. Детализированное изображение частиц норовирусов удалось получить
с помощью криоэлектронной микроскопии. Было показано, что капсид норови¬
русов состоит из 180 молекул белка VP1, кодируемого рамкой считывания 0RF2.
Белок VP1 формирует миниатюрные арки на поверхности вириона. Внутри вирус¬
ной частицы находится геномная РНК в комплексе с белком VPg и субгеномная
РНК, кодирующая белки капсида.Саповирусы человека по морфологии сходны с вирусом везикулярной экзан¬
темы свиней, послужившим прототипом для семейства Caliciviridae. Название
семейства происходит от латинского слова calix — «чаша, бокал». Подобно норо-
вирусам, частицы саповирусов представляют собой безоболочечные белковые
капсиды, содержащие РНК. Капсиды саповирусов также образованы белком
VP1 с молекулярной массой около 60 кДа. Частицы саповирусов под определен¬
ным углом зрения имеют вид звезды Давида с чашеобразными углублениями
(calix) на поверхности. Диаметр частиц в среднем составляет 30-34 нм. Пустые
вирусные капсиды, присутствующие в клинических образцах, не имеют столь же
характерной морфологии, как полные частицы, и могут быть ошибочно приняты
за капсиды норовирусов. Саповирусы содержат однонитевую плюс-РНК fss(+)
RNA], которая, так же как и у норовирусов, имеет три рамки считывания. Первая
рамка (0RF1) кодирует полипротеин, расщепляющийся на неструктурные белки,
в том числе РНК-зависимую РНК-полимеразу; 0RF2 кодирует мажорный белок
капсида VP1; 0RF3 кодирует минорный структурный РНК-связывающий белок.
В отличие от норовирусов, рамка считывания капсидного белка 0RF2 слита с рам¬
кой считывания неструктурных белков 0RF1.Вирионы калицивирусов не содержат липидов, поэтому они устойчивы к обра¬
ботке эфиром, органическими растворителями и слабыми детергентами. Вирусы
инактивируются прогреванием при 60 “С в течение 30 мин или кипячением при
100 ""С в течение 3-5 мин. При замораживании калицивирусы сохраняют инфек¬
ционную активность в течение длительного времени. Хлорирование и обработка
сильнодействующими окислителями и детергентами, четвертичными аммонийны¬
ми соединениями подавляют инфекционную активность калицивирусов.К настоящему времени установлено, что норовирусы ответственны за пода¬
вляющее большинство вспышек острого небактериального гастроэнтерита. По
различным оценкам, доля норовирусов в этиологии небактериальных ОКИ в
Европе и США составляет 80-95%. В России массовую диагностику калицивирус-
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ693ных инфекций не проводят, однако в выборочных исследованиях показано, что
норовирусы широко распространены в разных регионах нашей страны, причем в
циркуляции доминируют те же генотипы норовирусов, что и во всем мире. Б част¬
ности, в 2002-2008 гг. в России, как и во всем мире, доминировали норовирусы
кластера СП.4.В отличие от норовирусов, саповирусы поражают в основном детей в возрасте
до 5 лет, наиболее распространены в младшей возрастной группе от О до 6 мес.
Количество саповирусных гастроэнтеритов у детей в среднем в три-четыре раза
меньше норовирусных и варьирует от 1-10% в европейских странах до 30% в
Японии. Иногда отмечаются вспышки саповирусных гастроэнтеритов у взрос¬
лых, по-видимому, связанные с появлением антигенно отличающихся штаммов.
Основным источником саповирусных инфекций могут быть контаминированная
вода и пищевые продукты.Калицивирусная инфекция передается в основном фекально-оральным путем
и через предметы, загрязненные рвотными массами. В фекалиях и рвотных мас¬
сах больных содержится до 10^“ частиц на мл. В то же время инфекционная доза
крайне мала и составляет около 10-20 вирусных частиц. Источником инфекции
могут служить также контаминированные фекалиями пищевые продукты и вода.
Одним из наиболее загрязненных калицивирусами продуктов питания являются
двустворчатые моллюски, употребляемые в сыром виде.Клинический материал для лабораторного исследованияКлиническим материалом для диагностики служат фекалии пациентов, боль¬
ных калицивирусной инфекцией. Содержание частиц калицивирусов в фекалиях
наиболее высоко в первые дни заболевания, затем оно быстро падает. Для диа¬
гностики с помощью электронной микроскопии желательно обеспечить забор
материала в период острого заболевания, то есть в первые 2-3 дня. Поскольку
чувствительность тест-систем ПЦР много выше электронной микроскопии, для
анализа методом ПЦР достаточно провести забор материала в течение недели с
момента начала заболевания. Фекалии отбирают в стерильные пластиковые либо
стеклянные флаконы и хранят до исследования при 4 °С в течение 3-14 дней. При
необходимости более длительного хранения материал замораживают при темпе¬
ратуре ниже -20 “С и размораживают перед исследованием. Желательно избегать
повторного замораживания-оттаивания, так как это снижает количество вирусной
РНК в материале. Для диагностического исследования можно использовать также
рвотные массы.Лабораторные методы диагностикиКалицивирусная инфекция в среднем протекает легче, чем ротавирусная,
однако по клиническим признакам ее невозможно дифференцировать от про¬
чих вирусных ОКИ. Сходное по клинической картине заболевание у детей может
быть вызвано аденовирусами группы F, астровирусами, ротавирусами, корона-
вирусами и торовирусами. Примечательно, что для калицивирусной инфекции,
в особенности у взрослых, характерны внезапное начало и многократная рвота.
Продолжительность заболевания составляет 1-3 сут.В диагностике калицивирусных гастроэнтеритов наиболее широкое распро¬
странение во всем мире получили различные тест-ситемы ПЦР, в том числе ПЦР в
реальном времени (RT-PCR). Преимуществом тест-систем ПЦР являются высокие
чувствительность и специфичность. Однако в силу высокой изменчивости не все
калицивирусы удается выявить этим методом. По различным оценкам, от 5 до 20%
циркулирующих штаммов калицивирусов не выявляются методом ПЦР.
і	694 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ►і	Разработаны быстрые иммуноферментные тесты для вьивления норовируснойт	инфекции, в которых используют антитела к рекомбинатным белкам норовирусов.Щ	ИФА-тест-системы последнего поколения отличаются высокой специфичностью,I	но недостаточно высокой чувствительностью, поэтому они пригодны в основномI	для выявления этиологии вспышек ОКИ при наличии достаточно большого коли¬
чества образцов, взятых в период острого заболевания.КОРОНАВИРУСЫ
ТаксономияКоронавирусы — семейство Coronaviridae — РНК-содержащие вирусы, отли¬
чительным признаком которых при исследовании под электронным микро¬
скопом является наличие особых периферических короноподобных выростов,
Коронавирусы распространены повсеместно, инфицируют птиц и млекопитаю¬
щих, включая людей. Представители первых двух групп рода Coronavirus вызывают
заболевания у млекопитающих, третьей — только у птиц. Заражение происходит
воздушно-капельным и фекально-оральным путем. До 2003 г. эти вирусы не счита¬
лись особо патогенными для человека, хотя и отмечались случаи коронавирусной
пневмонии у людей с различными иммунодефицитными состояниями, при этом у
животных коронавирусы могут вызывать серьезные заболевания. Представители
семейства Coronaviridae имеют узкий спектр хозяев, однако, по-видимому, некото¬
рые из них способны преодолевать межвидовой барьер.Характеристика вирусовВирионы коронавирусов имеют сфероидную форму (80-200 нм) и снабжены
липидной оболочкой. Выступы на поверхности вириона (пепломеры) образованы
тримерами белка S, который расщепляется на две субъединицы: S1 и S2. У неко¬
торых представителей рода Coronavirus имеется дополнительный поверхностный
гликопротеид НЕ, обладающий гемагглютинирующей и эстеразной активностью.
Трансмембранные белки М и Е играют важную роль в сборке и стабильности
вирионов. Нуклеокапсид образован белком N, который при взаимодействии с
геномной РНК образует спиральный нуклеоид в центральной части нуклеокап¬
сида. Геном коронавирусов представлен одноцепочечной РНК размером 17,6-
31x10^ н.о. позитивной полярности, которая представляет собой инфекционную
мРНК.Основными клетками-мишенями коронавирусов являются эпителиальные
клетки и макрофаги, с рецепторами на поверхности которых связывается S-белок.
Сборка вирионов происходит в цитоплазме инфицированных клеток на мембра¬
нах эндоплазматического ретикулума. Основную роль в формировании зрелого
вириона играют трансмембранные белки М и Е.Инфицирование коронавирусами вызывает формирование антител против
эпитопов, расположенных на S-, М-, N- и НЕ-антигенах. Антитела против
М-белка выявляются в реакции связывания комплемента. S- и НЕ-белки содержат
основные эпитопы для нейтрализующих и антигемагглютинирующих антител.
Детерминанты клеточного иммунного ответа находятся в составе N-белка.В отношении резистентности коронавирусов, патогенных для человека, имеют¬
ся ограниченные сведения. Коронавирусы инактивируются средствами из группы
окислителей (хлор- и кислородсодержащими), спиртами, фенолами и их произ¬
водными, альдегидами, четвертичными аммониевыми соединениями. Известно,
что 5% раствор формальдегида и 70% этиловый спирт через 5 мин инактивируют
коронавирус.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 695Тяжелый острый респираторный синдромТяжелый острый респираторный синдром (ТОРС, атипичная пневмония) впер¬
вые был выявлен на юге Китая (в ноябре 2002 г.) и в течение нескольких месяцев
получил глобальное распространение, поразив более 30 стран мира. Проведенный
комплекс противоэпидемических мероприятий позволил остановить распростра¬
нение ТОРС.В апреле 2003 г. ВОЗ объявила, что этиологическим агентом ТОРС является
новый патоген — вирус SARS (SARS-CoV), относящийся к семейству коронавиру-
сов (Coronaviridae, род Coronavirus), но не родственный ни одному из известных
штаммов этого вируса.ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВК настоящему времени геном трех штаммов коронавируса, с которым связыва¬
ют развитие ТОРС, полностью расшифрован. Он представлен последовательно¬
стью из 29 727 нуклеотидов и включает одиннадцать открытых рамок считывания
(ORF), расположение которых в целом типично для коронавирусов. Однако пока¬
зано отличие нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих структурные
белки вируса от остальных представителей семейства Coronaviridae, позволяющие
провести четкую границу между вирусом ТОРС и другими коронавирусами. Кроме
того, в геноме TOPC-CoV не обнаружен ген НЕ, присутствующий у коронавирусов
второй и некоторых представителей третьей группы. Вопрос о происхождении
вируса ТОРС до сих пор остается открытым, потенциальный предшественник дан¬
ного вируса неизвестен.УСТОЙЧИВОСТЬ ВО ВНЕШНЕЙ СРЕДЕ И К ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИМ ФАКТОРАМВирус ТОРС сохраняет жизнеспособность на пластиковых поверхностях в
течение 48 ч после высушивания. Находящийся в фекалиях больных вирус ТОРС
сохраняет жизнеспособность на протяжении 1-2 дней (до 4 дней при диарее), а
в моче при комнатной температуре вирус стабилен, по крайней мере, в течение
1-2 дней. Вирус ТОРС более стабилен при комнатной температуре по сравнению
с другими коронавирусами, инфицирующими человека. Вирус чувствителен к дей¬
ствию ультрафиолетовых лучей, высоким температурам. Прогревание при 56 °С
инактивирует вирус.КЛИНИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯВирус ТОРС присутствует в фекалиях, отделяемом верхних дыхательных путей
и моче больных. Надежность лабораторных диагностических тестов для детекции
SARS-CoV-инфекции зависит от типа получаемого клинического образца, сроков
и способов его получения. Важным фактором является взятие материала хорошо
обученным персоналом. Полученные клинические образцы, согласно рекоменда¬
циям ВОЗ, должны бьггь аликвотированы на три образца:•	один образец исследуют в диагностической лаборатории;•	второй (не вскрывают) — в национальной референс-лаборатории;•	третий — сохраняют для передачи в ВОЗ, референс-лабораторию по верифи¬
кации SARS в случае, если возникнет такая необходимость.Вирус SARS отнесен ко II группе патогенности, и все работы, с ним связанные,
требуют обеспечения уровня безопасности BSL3. Сбор, транспортировку и подго¬
товку проб клинического и секционного материала от больных и подозрительных
на заражение вирусом SARS осуществляет медицинский персонал с соблюдением
правил противоэпидемического режима в строгом соответствии с требованиями
безопасности работ с микроорганизмами I-II группы патогенности.Сбор клинического материала и все последующие манипуляции с ним осущест¬
вляют стерильными одноразовыми инструментами в стерильные одноразовые
^	896 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯфлаконы, пробирки, контейнеры. Все виды работ проводят в одноразовых меди¬
цинских перчатках. Все материалы, доставляемые в лабораторию, должны быть
последовательно дважды упакованы.•	В транспортную емкость (плотно закрывающиеся пробирки или флаконы
с завинчивающимися крышками). Плотно закрытый верхний конец транс¬
портной емкости вместе с крышкой для надежности заклеивают и помещают
в пластиковый пакет подходящего размера вместе с небольшим количеством
любого адсорбирующего материала, например ваты. Пластиковый пакет сле¬
дует заклеить или запаять.•	Два или более образца от одного пациента могут быть упакованы в один пла¬
стиковый пакет. Не допускается упаковывать образцы материалов от разных
людей в один и тот же пакет.•	Заклеенные пакеты с образцами помещают внутрь дополнительного пла¬
стикового контейнера с завинчивающейся крышкой. Дважды упакованные
образцы материалов от разных пациентов могут быть транспортированы в
одном дополнительном контейнере.•	Описание особенностей конкретного образца, полную информацию и доба¬
вочные сведения, касающиеся образцов, а также способ транспортировки и
название лаборатории назначения приклеивают к наружной стенке дополни¬
тельного контейнера.•	Плотно закрытые пластиковые контейнеры с заклеенными крышками поме¬
щают в термоизолирующий контейнер, укомплектованный охлаждающими
термоэлементами.•	Каждую пробу материала сопровождают бланком направления, прикреплен¬
ным к наружной стенке контейнера.•	Транспортировку проб клинического материала в референс-лабораторию для
дальнейшего исследования в целях подтверждения результатов осуществляет
нарочный, информированный о правилах доставки материала.Материал для исследования методом ПЦР забирают в стерильные пробирки с
герметично завинчивающимися крышками. Консервант не добавляют.•	Забор крови проводят из локтевой вены в количестве 4,5 мл стерильным шпри¬
цем, в который предварительно вносят 0,5 мл стерильного 4% раствора натрия
цитрата и переносят в пробирку. Аккуратно перемешивают покачиванием.•	Мазки и смывы из носоглотки, бронхоальвеолярные смывы, плевральную
жидкость забирают в количестве 5 мл. Мазки забирают тампонами и поме¬
щают в стерильные пробирки с 5 мл физиологического раствора. Не реко¬
мендуют использовать тампоны на деревянной палочке, так как они могут
содержать субстраты, ингибирующие ПЦР.•	Секционный материал: исследуют легкие, сегментарные бронхи, кровь, печень,
селезенку. Кусочки органов массой 5-10 г помещают в стерильные, герметично
закрывающиеся емкости. Кровь, смывы с дыхательных путей хранят и транс¬
портируют в лабораторию для исследований при температуре -20 “"С.ВОЗ рекомендует проводить взятие мазков и смывов из носоглотки в течение
первой недели заболевания, в эти же сроки проводят забор образцов плазмы или
сыворотки для серологических исследований в острой фазе заболевания. Образцы
смывов с дыхательных путей и образцы фекалий для ОТ-ПЦР можно исследовать
в течение двух недель от начала заболевания. Повторный забор образцов крови
для серологических исследований проводят через 2-3 нед, парные сыворотки
исследуют одновременно.ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИКлинические случаи ТОРС у детей и взрослых подтверждают, что данное забо¬
левание не имеет специфических клинических признаков. Эксперты CDC (США,
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ $97Атланта) и ВОЗ сформулировали критерии, позволяющие при подозрении на
ТОРС сузить диагностический поиск.Вероятный случай ТОРС — наличие тяжелого респираторного синдрома неиз*
вестной этиологии и эпидемиологических критериев (контакта с лицами с подо¬
зрением на ТОРС, пребывание в регионе эпидемии): лабораторные критерии
могут быть подтверждающими, отрицательными, неопределенными. Случай,
подозрительный на ТОРС, — наличие умеренного респираторного синдрома
неизвестной этиологии и эпидемиологических критериев (контакта с лицами с
подозрением на ТОРС, пребывание в регионе эпидемии), лабораторные критерии
могут быть подтверждающими, отрицательными, неопределенными. В связи с
этим первоочередному обследованию при указанной клинической симптоматике
подвергаются лица, недавно посещавшие регионы, в которых регистрировались
случаи ТОРС. Лабораторные исследования в целях диагностики ТОРС следует
проводить также у лиц без клинических проявлений заболевания, при тесном кон¬
такте с подозреваемым на ТОРС больным.Вирусологические методы диагностикиВирусологические методы диагностики ТОРС — молекулярно-биологические
методы (ОТ-ПЦР) и выделение вируса в культуре клеток. В связи с существенны¬
ми трудностями культивирования и выделения коронавирусов наиболее эффек¬
тивные диагностические тесты, доступные в настоящее время, — тесты, которые
обеспечивают информацией о вирусном геноме, в частности ОТ-ПЦР или ПЦР в
режиме реального времени. Значение ПЦР-тестов заключается также в том, что их
можно использовать для относительно ранней диагностики заболевания (в l-^lO-e
сутки заболевания).Культура клеток является очень требовательным методом, однако и единствен¬
ным способом выявить наличие живого вируса.Серологические методыСерологические методы определения антител к вирусу ТОРС — непрямая реакция
иммунофлюоресценции (НРИФ) или ИФА (ELISA). Несмотря на то что у некоторых
пациентов антитела уже могут определяться во время острой фазы заболевания (то
есть в течение 14 дней после появления симптомов), окончательная интерпретация
результатов серологического исследования возможна только для образцов, полу¬
ченных после 21-го дня с момента появления симптомов. Следовательно, сероло¬
гические тесты не могут быть использованы для выявления заболевания на ранней
стадии инфекции, что особенно важно для предотвращения ее распространения.Первичное исследование материала от пациентов (умерших) методом ОТ-ПЦР
и ИФА проводят на базе учреждений Госсанэпиднадзора. При получении положи¬
тельных результатов исследований материал направляют в референс-лабораторию
для подтверждающего тестирования и депонирования. При этом получение отри¬
цательных результатов в подтверждающих тестах служит основанием для исклю¬
чения диагноза ТОРС.При получении положительных результатов подтверждающих тестов диагноз
ТОРС считают установленным. Результаты исследований в кратчайшие сроки
передают в соответствующие учреждения Госсанэпиднадзора, а материал для изо¬
ляции вируса и сыворотку крови переболевших направляют в Центр специальной
лабораторной диагностики и лечения особо опасных и экзотических инфекци¬
онных заболеваний. Полученную в ходе исследования комплементарную ДНК,
образуемую в результате реакции обратной транскрипции ДНК с участием фер¬
мента ревертазы, направляют в Центр молекулярной диагностики инфекционных
заболеваний (Центральный НИИ эпидемиологии, Москва) для проведения секве¬
нирования, которое обладает абсолютной информативностью при установлении
диагноза ТОРС.
698ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯШШшжШАЛГОРИТМ ИССЛЕДОВАНИЯПри обследовании пациента до 10-го дня от начала заболевания используют
метод ОТ-ПЦР двукратно с интервалом 5 дней. Для повышения результатив¬
ности анализа методом ОТ-ПЦР необходимо исследовать как минимум три вида
клинического материала: мазок из носоглотки (или смыв), мокроту и фекалии.
Дополнительно также может быть исследована плазма крови. Каждую пробу кли¬
нического материала тестируют троекратно.При получении хотя бы одного положительного результата пробу считают
первично-положительной. Дополнительное тестирование проб методом ИФА в
этом случае не проводят. Пробы материала и полученную кДНК отправляют в
референс-лабораторию.При отрицательных результатах ОТ-ПЦР проводят исследование методом ИФА
с тестированием сывороток, взятых на 10, 20 и 30-й день заболевания. Результат
считают положительным при выявлении сероконверсии или увеличении титра
антител в фазе реконвалесценции не менее чем в черыре раза по сравнению с
острой фазой. При получении положительного результата ИФА пробы клиниче¬
ского материала отправляют в референс-лабораторию.При начале обследования пациента после 10-го дня заболевания проводят
параллельное исследование материала методом ОТ-ПЦР двукратно с интервалом
5 дней и тестирование парных сывороток, взятых на 10, 20 и 30-й день заболева¬
ния методом ИФА. При получении положительного результата при любом методе
исследования пробы клинического материала и полученную кДНК отправляют в
референс-лабораторию.При двукратных отрицательных результатах ОТ-ПЦР с интервалом 5 дней и
отрицательных результатах ИФА на 10, 20 и 30-й день заболевания диагноз ТОРС
может быть исключен.Секционный материал (ткани легкого, сегментарные бронхи, кровь, образцы
фекалий), собранный в кратчайшие сроки после наступления смерти, тестируют
методом ПЦР, Каждый вид секционного материала тестируют троекратно. В случае
получения хотя бы одного положительного результата пробу считают первично¬
положительной и в кратчайшие сроки направляют в референс-лабораторию в
целях подтверждения (верификации).Полный перечень и характеристика тест-систем для диагностики ТОРС и
рекомендации к их использованию представлены на сайте ВОЗ: www.who. Use of
Laboratory Methods for SARS Diagnosis; www.who.Severe Acute Respiratory Syndrome
(SARS), Laboratory diagnostic tests,ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКАКлинические проявления (слабость, лихорадка, озноб и одышка) при SARS
принципиально не отличаются от симптомов ОРВИ или гриппа. Однако, в случае
наблюдения за пациентом с подобными симптомами, обязательно необходимо
учитывать эпидемиологические данные, например недавнее посещение районов
мира, эндемичных по SARS, таких как Китай, Япония, Вьетнам, Сингапур и другие
страны Юго-Восточной Азии. Также обязательно следует выяснить, находился ли
пациент в контакте с заболевшим SARS. Таким образом, для установления диагно¬
за SARS всегда необходимо принимать во внимание совокупность факторов, таких
как клинические симптомы заболевания, эпидемиологические данные и результа¬
ты лабораторных тестов.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 599РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНЫЙ ВИРУС
Характеристика вирусаРеспираторно-синцитиальный вирус (РСВ) человека был выделен от детей с
пневмонией и бронхиолитом. Два штамма вируса были изолированы на пере¬
виваемых культурах клеток КВ, Chang. Заболеванию подвержены дети раннего
возраста, у которых инфекция, вызванная респираторно-синцитиальным вирусом,
может послужить причиной смерти.РС-вирус относится к семейству Paramyxoviridae, подсемейству Pneumovirinae,
роду Pneumovirus, Помимо РСВ человека, к роду Pneumovirus относятся РС-вирус
крупного рогатого скота и вирус пневмонии мышей.Вирион имеет, как правило, шарообразную форму, размеры его колеблются в
диапазоне от 65 до 800 нм, встречаются нитевидные формы. Имеется наружная
липопротеиновая оболочка с двумя трансмембранными гликопротеинами, обра¬
зующими выступы длиной 12 нм. Геном вируса представлен линейной однонитевой
РНК отрицательной полярности, уложенной внутри нуклеокапсида спиральной
симметрии. Нуклеокапсид содержит геномную РНК и три белка: N, Р, L. РНК протя¬
женностью 15-19x10^ н.о. содержит десять генов, кодирующих одиннадцать белков,
при этом две открытые рамки считывания имеются в гене, кодирующем белок М2.
В процессе репродукции вируса, которая происходит в цитоплазме чувствительных
клеток, синтезируются ранние (неструктурные) и поздние (структурные) белки:•	неструктурные белки NS1 и NS2;•	белки нуклеокапсида: белок N и фосфопротеин Р, участвующие в транскрип¬
ции вирусной РНК; РНК-зависимая РНК-полимераза — белок L;•	матриксные белки М и М2, ассоциированные как с липидным слоем, так и
с нуклеокапсидом; М2 необходим также для осуществления транскрипции
вирусного генома;•	три поверхностных белка: F — белок слияния, G — поверхностный глико¬
протеин, белок SH. Поверхностные белки отвечают за слияние вирусной
оболочки и клеточной мембраны, проникновение вируса в клетку. Белок G
детерминирует иммунный ответ на РС-вирусную инфекцию.В состав зрелого вириона входят восемь белков.В отличие от других представителей семейства Paramyxoviridae, РС-вирус не
содержит ни гемагглютинина, ни нейраминидазы. Антигенная активность вируса
определяется его способностью стимулировать образование вируснейтрализую¬
щих и комплементсвязывающих антител. Существенных антигенных различий
между штаммами РСВ и группами А и В, различающимися по гликопротеиду G, не
выявлено; можно говорить о наличии одного серотипа вируса.РСВ характеризуется низкой устойчивостью к факторам внешней среды и
физико-химическим факторам. Вирус чувствителен к действию эфира, кислот и
детергентов, переносит однократное замораживание при -70 ®С. Вирионы инакти¬
вируются при 55 “С в течение 5 мин, при 37 “С — в течение 24 ч. Вирус полностью
разрушается при pH = 3,0, лучше переносит щелочную среду. Оптимальное значе¬
ние pH для сохранения инфекционности — 7,5.Лабораторная диагностикаДиагностика респираторно-синцитиальной инфекции основана:•	на детекции вирусных частиц, антигенов или вирусспецифической РНК;•	определении вирусспецифических антител или регистрации их прироста.Материалом для исследований I группы являются мазок из носоглотки, мазокиз ротоглотки, мокрота и аутопсийный материал. Взятие клинического материала
шШМ#700ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯследует проводить как можно раньше, желательно при появлении первых клини¬
ческих симптомов заболевания, не позднее 3-го дня болезни. Аутопсийный мате¬
риал след}^ет получать как можно раньше после смерти пациента.Для серологических исследований используют:•	одну (для определения IgM-фракции антител) сыворотку крови больного,
полученную на 3-4-й день заболевания;•	парные сыворотки крови больного, полученные в ранний период и на стадии
реконвалесценции.РСВ, его антигены и РНК могут быть обнаружены в клинических образцах сле¬
дующими методами:•	трансмиссионной электронной микроскопией вирусных частиц;•	выделением вируса в культуре клеток с последующей идентификацией в
иммунологических реакциях;•	методом флюоресцирующих антител;•	иммуноферментньш анализом для выявления вирусных антигенов;•	полимеразной цепной реакцией.Антитела к РСВ могут быть определены следующими серологическими мето¬
дами:•	реакцией связывания комплемента;•	реакцией нейтрализации;•	иммуноферментньш анализом.Лабораторную диагностику проводят для подтверждения клинического диа¬
гноза, дифференциации РС-инфекции от ОРВИ иной этиологии. Предпочтение
отдается методам быстрой диагностики: МФА, ПЦР и IgM-ИФА. Осуществляют
также определение нарастания титра специфических антител в процессе болезни в
РСК, а при необходимости — выделение вируса в клеточных культурах.РИНОВИРУСЫХарактеристика вирусовРиновирусы (HRVs) (от греч. rhinos — «нос») относятся к роду семейства
Picornaviridae, порядку Picomavirales. На основании сродства к определенным кле¬
точным рецепторам, устойчивости к антивирусным компонентам и генетического
родства выделяют три вида:•	Human rhinovirus А (мажорная группа, сродство к IСАМ-1-рецептору);•	Human rhinovirus В (минорная группа, сродство к LDL-рецептору);•	Human rhinovirus С. По структуре единственного типоспецифического антиге¬
на выделяют 113 иммуноразнородных групп. Группоспецифический антиген
отсутствует.Вирион состоит из нуклеокапсида икосаэдрической формы, диаметром 30 нм,
собран из двенадцати капсомеров, образованных четырьмя полипептидами: VP1,
VP2, VP3 и VP4. Геном, размером 7,2-8,5x10^ н.о. состоит из инфекционной
несегментированной одноцепочечной моноцистронной +РНК, кодирует один ген.
транслируемый белок обладает протеолитической активностью и разрезается на
три полипротеина: Р1, Р2 и РЗ. Белок Р1 — предшественник структурных полипро¬
теидов VP1, VP2, VP3 и VP4, Потомки Р2 способствуют синтезу вирусного белка
после выключения синтеза клеточных белков, а вирусная репликаза и ферменты,
образуемые из РЗ, необходимы для контроля генома клетки-хозяина. Репликация
пикорнавирусов происходит в цитоплазме, цикл репродукции очень короткий,
составляет примерно 8 ч. Риновирусы имеют общий рецептор ICAM-1, отвечаю¬
щий за тканевый тропизм.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 7Q1Риновирусы являются наиболее частой причиной острых нетяжелых респира¬
торных заболеваний, характеризуемых насморком, ангиной, реже кашлем и проте¬
кающих, как правило, без повышения температуры. Имеют воздушно-капельный
и орально-фекальный пути передачи. В большом числе случаев вызывают бессим¬
птомную инфекцию; доказаны случаи одновременной инфекции двумя, тремя и
даже четырьмя энтеровирусами.Риновирусы устойчивы к эфиру, дезоксихолату, различным детергентам.
Чувствительны к кислым значениям pH, действию ультрафиолетового облучения,
высушиванию. Обработка 0,3% формальдегидом, 0,1 N соляной кислотой или
свободным остаточным хлором в концентрации 0,3-0,5 мг/л ведет к быстрой
инактивации, однако присутствие органических веществ может оказывать защит¬
ное действие. Вирусы относительно термолабильны. Добавление к вирусной
взвеси хлористого магния в одномолярной концентрации сохраняет титр вируса
при 50 °С в течение часа. В замороженном состоянии энтеровирусы хранятся в
течение многих лет, при 4-6 ®С — несколько недель, при комнатной температу¬
ре — несколько дней, выдерживают многократное замораживание и оттаивание
без потери активности.По способности к репродукции в клетках приматов риновирусы разделяют на
две группы; Н и М. Риновирусы группы Н размножаются и вызывают цитопа¬
тические изменения в ограниченной группе диплоидных клеток человеческого
эмбриона (ФЛЭЧ) и специальной линии (R) клеток HeLa. Риновирусы группы М
размножаются и вызывают цитопатические изменения в клетках почек обезьян,
почек эмбриона человека и различных перевиваемых клеточных линиях челове¬
ческих клеток (HeLa, BGM). Оптимальная температура культивирования ринови-
русов составляет 33 °С.Лабораторная диагностикаОсновным клиническим материалом являются носоглоточные смывы, кровь,
содержимое синусов (носовых пазух). Возможны взятие различных тканей и жид¬
ких сред организма и сбор фекалий, как и для других энтеровирусов. Носоглоточные
смывы забирают в первые 3-4 дня от начала заболевания. Образцы крови заби¬
рают в остром периоде болезни и в стадии реконвалесценции. Парные сыворотки
исследуют в одном опыте.Лабораторную диагностику риновирусов проводят редко ввиду легкости тече¬
ния заболевания. Основными методами лабораторного подтверждения ринови-
русной инфекции являются:•	обнаружение РНК риновируса с помощью ПЦР;•	выделение вируса (в культуре клеток или на лабораторных животных).Детекция РНК риновирусов в назальных смывах, крови, цереброспинальнойжидкости и материалах из верхних дыхательных путей методом ОТ-ПЦР обла¬
дает большей чувствительностью, быстротой и позволяет выявлять вирусы, не
размножающиеся в культуре клеток. Имеется множество модификаций методи¬
ки, Используют праймеры для 5’-нетранслируемой области вирусного генома.
Молекулярное типирование риновирусов основано на определении нуклеотид¬
ной последовательности части генома, кодирующей белок капсида VP1. Серотип
исследуемого изолята определяют сравнением полученных последовательностей с
имеющимися в генном банке последовательностями прототипных энтеровирусов
человека. Этот метод несоизмеримо ускоряет типирование и может быть исполь¬
зован для идентификации изолятов. которые трудно или невозможно типировать,
используя обычные иммунологические и вирусологические методы. Метод особо
полезен для оценки родства штаммов во время вспышек.
702ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯВыделение вируса требует большего времени, но дает однозначный ответ на
вопрос об этиологии заболевания и позволяет использовать выделенный вирус
для последующих исследований. Для увеличения вероятности выделения вируса
из исследуемого материала целесообразно использовать не менее двух видов куль¬
тур клеток, одной из которых должна быть культура клеток RD, Риновирус может
быть выделен в клеточной культуре, Vero, через 2-7 сут после заражения с после-
дуюш[им определением специфических антител к выделенному штамму.СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКАДиагностика заболевания серологическими методами требует большого коли¬
чества исследований со всеми известными серотипами энтеровирусов, поэтому
ее предпринимают только при данных, позволяющих предполагать тип этиоло¬
гического агента (характерной клинической картине, вьщелении и идентифика¬
ции вируса от больного, вспышках заболевания, обусловленного установленным
типом вируса). Диагноз инфекции подтверждается значительным подъемом титра
специфических антител, диагностически значимым считают четырехкратный и
более подъем титра во второй пробе.При наличии диагностических типоспецифических иммунных сывороток воз¬
можны серологические исследования с помощью реакции нейтрализации, РИФ,
реакции связывания комплемента, реакции преципитации в агаре, метода имму¬
нофлюоресценции или подавления гемагглютинации. Наиболее чувствительным,
специфичным и распространенным способом идентификации является реакция
нейтрализации.РОТАВИРУСЫ
Характеристика вирусовРотавирусы относятся к семейству Reoviridae, роду Rotavirus, который объединя¬
ет большое количество сходных по морфологии и антигенной структуре вирусов,
вызывающих гастроэнтерит у человека, млекопитающих и птиц. Ротавирусная
инфекция имеет широкое распространение во всем мире. До начала программ вак¬
цинации против этой инфекции в развитых странах около 80% детей в возрасте до5	лет болели гастроэнтеритом ротавирусной этиологии. Ежегодно от ротавирусной
инфекции в мире умирают 500-600 тыс. детей в возрасте до 5 лет.Б составе ротавирусов обнаружены четыре антигена, основной из них — груп¬
повой антиген, обусловленный белком внутреннего капсида. С учетом группоспе¬
цифических антигенов все ротавирусы делятся на семь серогрупп: А, В, С, D, Е, F,
G, Ротавирусы одной группы имеют общий групповой антиген, который выявляют
иммунологическими методами: иммуноферментным анализом, иммунофлюорес¬
ценцией, иммунной электронной микроскопией и др. Большинство ротавирусов
человека и животных относятся к группе А. Внутри группы А существуют под¬
группы и серотипы. Гетерогенностью ротавирусов объясняются повторные забо¬
левания этой инфекцией. Вероятность повторного заражения на первом году
жизни составляет около 30%. К двум годам почти 70% детей болеют ротавирусной
инфекцией дважды, 40% — трижды, 20% детей — четыре раза. Известно, что при
последующих заражениях заболевание протекает легче или в виде бессимптомной
инфекции.Вирион имеет сферическую форму (от лат. rota — -«колесо»), диаметр от
65 до 75 нм. В вирионе выявляется электронно-плотный центр диаметром
38-40 нм (сердцевина) и две белковые оболочки: наружный и внутренний капси-
ды. Сердцевина содержит внутренние белки и генетический материал, представ¬
ленный двухнитевой фрагментированной РНК, которая составляет 14-22% массы
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ703вириона. Геном ротавирусов человека и животных состоит из одиннадцати сегмен¬
тов, которые могут быть разделены при электрофорезе в полиакриламидном геле
или агарозе. Сегментарность генома позволяет ротавирусам легко обмениваться
гомологичными участками РНК. Ротавирусы не имеют суперкапсидной липопро¬
теиновой оболочки и не содержат липидов.Наружный слой включает два структурных вирусных белка (УР): УР4 (расще¬
пленный протеазой белок, или Р-протеин) и УР7 (гликопротеин, или С-протеин).
Эти два белка определяют серотип вируса и считаются важными для разработки
вакцин, поскольку они являются основными антигенами, вовлеченными в про¬
цесс нейтрализации вируса для обеспечения защитного эффекта. Поскольку два
сегмента гена, кодирующих эти белки, могут расщепляться независимо, в практике
применяются методы исследования (ПЦР), позволяющие определить оба геноти¬
па - Р и О. В различных странах и в разные годы в одной стране могут быть рас¬
пространены вирусы, содержащие различные комбинации генотипов — Р и С: Р[8]
01, Р[4]С2, Р[8]СЗ, Р[8]04, Р[8]09, Р[61С9, Р[11]С10 и др.Ротавирусы относительно стабильны в окружающей среде. По устойчивости
к дезинфектантам и выживаемости во внешней феде ротавирусы приближаются
к энтеровирусам, они не погибают при обычном хлорировании воды в голов¬
ных водопроводных сооружениях, выживают в водопроводной воде до 60 дней,
на различных объектах внешней среды — от 10-15 до 30 дней (в зависимости
от температуры и влажности воздуха). В фекалиях ротавирусы сохраняются от
нескольких недель до 7 мес, на фруктах — 5-30 дней, на тканях из хлопка и шер¬
сти — 12-45 дней, на различных поверхностях — до 10 дней. Ротавирусы устой¬
чивы к эфиру, хлороформу, детергентам, воздействию ультразвука, гипохлорита,
они не разрушаются при многократном замораживании-оттаивании. Ротавирусы
быстро инактивируются фенольными соединениями, крезолом, формалином.
Для быстрой инактивации требуется 4-10% формальдегид. Самым эффективным
дезинфектантом для них является этиловый спирт. Вирус утрачивает инфекцион-
ность при кипячении, обработке сильными кислотами и щелочами (инфекционная
активность сохраняется в диапазоне pH = 3,0^9,0). Протеолитические ферменты
(панкреатин, трипсин, эластаза и др.) усиливают инфекционную активность виру¬
са, что используют для культивирования вируса в культурах клеток.Лабораторная диагностикаНаиболее информативным материалом для лабораторной диагностики
ротавирусной инфекции являются фекалии. В лабораторной диагностике при¬
меняют три основных подхода:•	непосредственное исследование материала на наличие вирусного антигена
или нуклеиновых кислот;•	изоляцию и идентификацию вируса из клинического материала;•	серологические исследования, основанные на установлении значительного
прироста антител в течение болезни.При любом выбранном подходе к диагностике инфекции одним из важнейших
факторов является качество исследуемого материала. Для прямого анализа образ¬
ца или для изоляции вируса исследуемый материал должен быть получен в самом
начале заболевания, когда возбудитель еще экскретируется в относительно боль¬
ших количествах и не связан антителами, а объем образца должен быть достаточен
для прямого исследования. Важную роль в успешной диагностике играет среда, в
которую забирают материал, а также условия транспортировки и хранения образ¬
цов.Методы лабораторной диагностики включают обнаружение ротавирусов с
помощью электронной микроскопии в первые 3 дня от начала болезни, а также
ш704 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯих антигенов в фекалиях больного на 4-5-й день болезни с помощью реакции
ко-агглютинации (твердофазной), латекс-агглютинации, иммуноферментного
анализа. Серологические методы — реакция нейтрализации вируса и реакция тор¬
можения гемагглютинации с ротавирусным антигеном — позволяют обнаружить
специфические антитела в крови со второй недели болезни. Определение антител к
ротавирусам класса IgM с использованием непрямого варианта иммуноферментно¬
го анализа позволяет получить результат более оперативно (в день исследования).Дифференциальную диагностику проводят с астровирусной, норовирусной,
аденовирусной инфекциями. Ротавирусы необходимо дифференцировать также
от частиц бактериофагов и бактериальных жгутиков, встречаемых в фекальном
материале.Прямые методы диагностикиПрямые методы диагностики — это методы, которые позволяют обнаружить
вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту непосредственно в
клиническом материале, они являются наиболее быстрыми (2-24 ч).ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯДля успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть
примерно 1x10^ частиц в 1 мл. Забор проб фекалий проводят в остром перио¬
де заболевания, желательно в течение первых трех суток от начала проявления
клинических признаков болезни, когда содержание вирусных частиц достигает
10^-10" в 1 мл. Важнейшее значение имеет соблюдение условий предохранения
материала от контаминации. В последующие дни заболевания, по мере нормали¬
зации стула, выделение вируса резко сокращается, поиск его затруднен, требуется
предварительное осаждение с помощью высокоскоростного центрифугирования с
последующим негативным контрастированием. Для диагностических исследова¬
ний готовят 10-20% суспензию фекалий в стерильном изотоническом растворе,
тщательно гомогенизируют и осветляют центрифугированием в течение 30 мин
при 3000 об./мин, добавляют антибиотики и хранят при -20 X до исследования.В препаратах при электронной микроскопии ротавирусы встречаются в виде
дву- и однокапсидных частиц. Диаметр двукапсидных частиц — 70 нм. Наружный
и внутренний капсиды соединены между собой короткими выростами, из-за чего
частица по внешнему виду напоминает колесо. Диаметр однокапсидных частиц —
60 нм. Они лишены сердцевины и ограничены лишь капсид ным слоем.ИММУННАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯОдним из вариантов ЭМ, используемым в диагностических целях, является
иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). В результате взаимодействия анти¬
тел с вирусами образуются комплексы, которые после негативного контрастирова¬
ния легче обнаружить. В присутствии иммунной сыворотки образуются компакт¬
ные агрегаты из 3-4 полных и пустых частиц. Также наблюдаются одиночные
частицы, покрытые слоем иммунных глобулинов.Иммуноэлектронная микроскопия более чувствительна, чем электронная.
Электронная микроскопия является стандартом для оценки специфичности и
чувствительности современных методов исследования и коммерческих тест-
систем.МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК РОТАВИРУСОВ
ЭлектрофорезПри электрофорезе в полиакриламидном геле или агарозе происходит распре¬
деление сегментов генома с образованием характерного профиля, состоящего из
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ705четырех классов генов. Картина распределения сегментов РНК на классы явля¬
ется уникальной именно для данной группы кишечных вирусов. Обнаружение
специфического профиля является прямым указанием на наличие ротавирусов в
исследуемом материале. Чувствительность метода составляет 97,6% по сравне¬
нию с методом электронной микроскопии, позволяет выявлять РНК в пробах с
разрушенными вирионами и дифференцировать электрофоретип РНК на уровне
штаммовых вариаций. По количеству сегментов внутри классов генов метод
электрофореза геномной РНК позволяет идентифицировать ротавирусы анти¬
генных групп А, В и С.Полимеразная цепная реакцияВыявление РНК ротавируса осуществляют методом ПЦР. Для разработки прай¬
меров была выбрана в достаточной степени консервативная область гена белка
NSP4, Для выявления РНК ротавирусов в клиническом материале и объектах
окружающей среды применяют, как правило, ПЦР с электрофоретической детек¬
цией продуктов амплификации в агарозном геле.Иммуноферментный анализИФА может быть использован как для определения антигена (на твердую
фазу — дно лунки полистиролового планшета — наносят антитела), так и для
определения антител (в этом случае на твердую фазу наносят антигень[). В усо¬
вершенствованных иммуноферментных тест-системах для исключения неспеци¬
фических ложноположительных результатов предусматривается возможность
подтверждающего теста.ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Иммуноцитохимическая детекция вирусаМетод основан на иммунохимическом определении вирусного антигена, обра¬
зуемого в клетках в результате их заражения вируссодержащим материалом.
Преимущество метода по сравнению с ИФА заключается в более высокой чувстви¬
тельности, а также возможности определить и количественно оценить инфекцион¬
ность исследуемой пробы.Опыт проводят на перевиваемых клетках почки зеленой мартышки в лунках
плоскодонных панелей. Тестируемый материал разводят в среде Игла-МЕМ,
активируют в течение 1 ч при 37 °С в присутствии 10 мкг/мл трипсина и вносят
в четыре лунки. Положительным контролем служат лунки, в которые внесен
материал, заведомо содержащий ротавирус. Отрицательные контроли — лунки
с незараженными клетками и лунки, в которые внесен материал, аналогичный
исследуемому, но заведомо не содержащий ротавируса. В лунки вносят иммунную
антиротавирусную сыворотку кролика. После отмывания панели в лунки вносят
меченные пероксидазой антитела против IgG-кролика (коммерческий препарат),
затем субстрат пероксидазы 3-амино-этилкарбазол. Учет реакции проводят под
световым микроскопом с малым увеличением. Лунки с отрицательными кон¬
тролями не должны содержать окрашенных клеток. Локальные скопления окра¬
шенных клеток представляют собой фокусы вирусной инфекции.Агглютинационные методыАгглютинационные методы основаны на способности частиц с адсорбирован¬
ными на них специфическими антителами образовывать комплексы (агглюти¬
наты) в присутствии антигена ротавирусов группы А. Образуемый агглютинат
позволяет проводить визуальную оценку результата анализа. Простота выпол¬
нения, скорость получения результата, низкая стоимость анализа привлекают к
этим методам большинство практических лабораторий.Шшшш
Шшщф^ ■■■
штж-
»2ЩШШШШШ2706ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯПАРВОВИРУС В19Характеристика вирусаПарвовирус В19 является возбудителем повсеместно распространенной антро-
понозной инфекции, обладает тератогенным действием, в 20% случаев инфици¬
рование беременных парвовирусом приводит к внутриутробной гибели плода или
сопровождается неиммунной водянкой плода.Human parvovirus Bl9 относится к семейству Parvoviridae (от лат. parvum —
«маленький»), подсемейству Parvovirinae (парвовирусы позвоночных), роду
Erythrovirus (от лат. erythros — «красный»). Это семейство не классифицировано по
порядку, характерными особенностями Parvoviridae являются организация генома
в виде однонитевой ДНК и небольшие размеры вирионов. Род Erythrovirus выделен
на основании генетической карты вируса и ввиду особого сродства к клеткам-
предшественникам эритроцитов.Вирион В19, диаметром от 22 до 24 нм, состоит из капсида с заключенной вну¬
три линейной однонитевой молекулой ДНК, не имеет оболочки. Для парвовируса
определен икосаэдрический тип симметрии. Зрелая вирусная частица имеет моле¬
кулярную массу 5,6x10^. Капсид состоит из 60 капсомеров, образованных двумя
белками: VP1 и VP2. Минорный белок VP1 имеет несколько консервативных
участков, обеспечивает транспорт и локализацию капсида в ядре клетки и пред¬
положительно функцию фосфолипазы А. VP2 является основным структурным
белком капсомеров, обеспечивает сборку вирионов. На N-терминальных концах
структурных белков VP1 и VP2 находятся антигенные сайты связывания с лим¬
фоцитами, индуцирующие образование вируснейтрализующих антител. Главный
неструктурный фосфорилированный белок NS1 з^аствует в сайтспецифическом
ДНК-связывании, обладает АТФазной, нуклеазной, транскрипционной и хели-
казной активностью, обеспечивает репликацию вирусного генома и контроль экс¬
прессии генов клетки-хозяина. В процессе репродукции вируса в чувствительных
клетках синтезируются еще три неструктурных белка. Их функция неизвестна.Геном парвовируса В19 представлен линейной одноцепочечной инфекционной
ДНК длиной 5596 н.о. Выделено три генотипа парвовируса человека В19. Генотип I
включает изоляты В19, А6, Au и Wi, ко U генотипу относятся LaLi и К71, а штамм
V9 принят за прототип III генотипа. Внутри генотипа I различие нуклеотидных
последовательностей геномов между штаммами не превышает 6%. Генотипы II и
III отличаются от первого составом белков капсида и патогенетическими свойства¬
ми. Несмотря на 3% дивергенцию аминокислотного уровня у разных штаммов В19
выделяют один серотип.В19 устойчив к эфиру, спирту, желчи, трипсину, изменению pH среды, сохраняет
инфекционную активность после прогревания при температуре 56 в течение
часа, термостабилен при 80 “С. Инактивируется кипячением, ß-пропиолактоном,
глутаральдегидом, гипохлоридом, у-излучением. Воздействие 0,1% формалина не
оказывает инактивирующего действия, но в 0,5% растворе формалина или щелочи
вирионы разрушаются в течение суток.Обладая высокой устойчивостью к физическим факторам феды, паровирус В19
представляет большую опасность в качестве контаминанта препаратов крови и транс¬
плантатов. В острой фазе инфекции может присутствовать в крови в очень высокой
концентрации — до 1012 ГЭ/мл. Кроме того, парвовирус В19 может длительно (до
года) сохраняться в крови при отсутствии каких-либо клинических симптомов.Лабораторная диагностикаИсследовать на наличие парвовируса В19 можно различные клинические образ¬
цы: сыворотку крови, носоглоточные смывы, амниотическую жидкость, кровь
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ707плода, образцы тканей, костный мозг, лейкоциты, клетки амниотической, плев¬
ральной жидкости и др.Правила забора, хранения и транспортировки наиболее часто используемых
клинических образцов не отличаются от традиционных для работы с вирусинфи-
цированным материалом. Взятие амниотической жидкости осуществляют в сте¬
рильную пробирку типа «Эппендорф» при проведении амниоцентеза по стандарт¬
ной методике. Полученный образец амниотической жидкости ресуспендируют.
Автоматическим дозатором с наконечником с аэрозольным барьером забирают1	мл материала в новую стерильную пробирку типа «Эппендорф» и центрифу¬
гируют при 8000-9000 g (12-13 тыс. об./мин) в течение 10 мин. Надосадочную
жидкость забирают, используя наконечник с аэрозольным барьером, оставляя над
осадком 200 мкл жидкости, и ресуспендируют материал на вортексе. Допускается
хранение амниотической жидкости и предобработанного материала в течение1	сут при температуре от 2 до 8 "С, 1 мес — не выше -16 “С. Амниотическую жид¬
кость можно длительно хранить при -70 °С.Лабораторная диагностика парвовирусной инфекции основана на использо¬
вании цитологических, вирусологических (идентификация вируса, его антигенов
или нуклеиновых кислот) и серологических методов.ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕЦитологическое исследование мазков крови или костного мозга показано у
пациентов с клинически значимой анемией или транзиторным апластическим
кризом. Проводят подсчет количества ретикулоцитов и определение изменений в
клетках миелоидного и мегакариоцитного рядов. Характерно появление гигант¬
ских пронормобластов (25-32 мкм) с эозинофильными внутриядерными включе¬
ниями, вакуолизацией цитоплазмы, выступами по типу «собачье ухо».ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫК вирусологическим методам диагностики парвовируса В19 относятся элек¬
тронная микроскопия, выделение вируса в культуре клеток, реакция гемагглюти¬
нации.Выделение вируса in vitro возможно на первичных культурах клеток человека и
обезьян: культурах клеток костного мозга, печени плода, пуповинной крови, пери¬
ферической крови, линии мегакариобластных клеток человека МВ-02 и UT-7/
Epo-Sl, линии клеток эритроидной лейкемии человека JK-1 и KU812Ep6. Заражать
следует монослой на стадии 30-50% или в момент пересева. Для инициации
репликации требуется присутствие эритропоэтина. Инфекция цитолитическая.Вирус может быть обнаружен в пробах с помощью электронной микроскопии,
реакции гемагглютинации. В Японии (Red Cross Blood Center) применяют метод
рецепторопосредованной гемагглютинации для скрининга вируса В19 в образцах
донорской крови. Тест занимает 3 ч, но чувствительность ниже чем 10^ копий/мл.Изоляцию вирусной ДНК осуществляют методами гибридизации in situ, част¬
ным случаем которой является прямая гибридизация, и ПЦР. Метод гибридизации
in situ успешно применяют для локализации специфических вирусных нуклеи¬
новых кислот внутри морфологически целых клеток. Он заключается в том, что
меченные дигоксигенином пробы иммунохимически обнаруживают вирусную
ДНК из клинического образца с помощью антидигоксигенин поликлональных
Рйй-фрагментов, меченных алкалин фосфатазой или пероксидазой хрена, при
добавлении хромогенного субстрата. В результате действия ферментов образу¬
ется окрашенный продукт. Чувствительность метода составляет от 1,5x10^ до
3x10'* копий генома/мл.Таким образом, можно исследовать аспират костного мозга у пациентов с апла¬
стическим кризом или гипопластической анемией, эмбриональные ткани, раз¬
личные клеточные линии. Можно использовать длительно хранящиеся образцы.Штits
ишш708 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ■шшкоторые были зафиксированы в 4% растворе параформальдегида, дегидратирова¬
ны в разведениях этанола, высушены и хранились при 4 “"С. Применение люми¬
несцентных субстратов в гибридизации гп situ позволило повысить чувствитель¬
ность метода. В случае прямой гибридизации, обычно в формате slot blot или dot
blot (точка-пятно), применяют пробу полноразмерной вирусной ДНК, меченной
дигоксигенином или биотином, и хемилюминесцентные субстраты. Анализ
занимает около 30 ч. Чувствительность этого метода составляет приблизительно
10^ копий генома/мл. %вствительность методов увеличивается в ряду: dot blot-
гибридизация — колориметрическая in 5гй/-гибридизация — люминесцентная in
-гибридизация. Таким образом, можно выявить все известные изоляты парво¬
вируса В19.СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКАОсновные методы серологической диагностики направлены на выявление
специфических антител к парвовирусу. Это МФА, иммуноэлектрофорез, РИА,
ИФА. Стандартным методом является ИФА на основе рекомбинантных антигенов
В19. IgM определяют с помощью тест-систем с сорбированным на твердую фазу
рекомбинантным структурным белком капсида VP2, а IgG — белком VP1. При
беременности IgM-тест может дать ложноположительные результаты. В этом слу¬
чае требуется подтверждение с помощью вестерн-блота.при выборе метода диагностики важно помнить, что только у 50% беременных
выявляется IgM к В19 во время постановки клинического диагноза водянки плода,
у пациентов с преходящими апластическими кризами IgM-антитела обнаружива¬
ют, а у больных с иммунодефицитом и хронической анемией специфических анти¬
тел нет, но выявляют вирусную ДНК.В случае низкого уровня виремии более чувствительным является метод ПЦР.
Рекомендуют одновременное использование нескольких пар праймеров, так
как не все праймеры могут выявить штаммы парвовируса трех генотипов. ПЦР-
исследование предполагает использование плазмы периферической и пуповинной
крови, амниотической жидкости, слюны, носоглоточных смывов и мазков из
зева.Для решения специальных задач возможно использование усовершенствован¬
ного метода ПЦР с защитой гибридизации (PCR-HPA). Суть метода заключается
в инкубировании продуктов ПЦР (праймеров к участку VP1-VP2) вместе с допол¬
нительными пробами, меченными acridinium ester. Учетывают люминесцентный
сигнал от акридиниума в люминометре. Для детекции вируса этим методом требу¬
ется сорок циклов амплификации и НРА. Таким способом может быть обнаружена
единственная копия ДНК парвовируса В19 в 10-^1 образца. Время исследования
составляет 6 ч.Дифференциальная диагностикаТребуется дифференциальная диагностика с корью, краснз^хой, скарлати¬
ной, внезапной экзантемой, энтеровирусными инфекциями, псевдотуберкулезом,
системными заболеваниями, токсико-аллергическими состояниями.ПАПИЛЛОМАВИРУСЫ
Характеристика вирусовPapillomaviridae — семейство ДНК-содержащих вирусов простого строения,
обычно именуемых папилломавирусами. Папилломавирусы адаптированы к опре¬
деленному виду хозяев. Несколько сотен видов (типов) папилломавирусов пора¬
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ709жают млекопитающих, птиц, рептилий, вызывая у них образование доброкаче¬
ственных опухолей - папиллом (бородавок).Вирус папилломы человека (ВПЧ, Human РарШота Virus — HPV) вызывает
широкий спектр повреждений эпителия кожи и слизистых оболочек аноурогени-
тальной области, верхних дыхательных путей, реже полости рта, пищевода, пря¬
мой кишки, конъюнктивы глаза у человека.Таксономически ВПЧ подразделяют на роды, обозначаемые греческими
буквами (а, ß, у и т.д.), виды (обозначают арабскими цифрами и буквой рода,
например, а9), типы (генотипы, обозначаемые арабскими цифрами, например
16, 18 и др.). В настояш;ее время идентифицировано более ста генотипов ВПЧ.
Большинство типов ВПЧ, вызывающих поражения слизистой оболочки аноуро-
генитальной области, относят к роду а (Alpha). Филогенетическая и эпидемио¬
логическая классификации ВПЧ, ассоциированных с карциномой шейки матки,
представлены в табл. 24-8.ВПЧ родов ß (beta) и у (gamma) тропны к ороговевающему эпителию.
Инфицирование ВПЧ рода ß чаще всего протекает бессимптомно, однако у
лиц, страдающих некоторыми наследственными болезнями (Epidermodysplasia
Verruciformis — EV) и иммунодефицитами, может привести к развитию добро¬
качественных и злокачественных опухолей плоского эпителия. Цитопатическое
действие ВПЧ других родов — у (gamma), (mu) и v (пи) — может проявляться в
виде доброкачественных разрастаний эпителия (папиллом, кондилом).Вирионы имеют относительно малые размеры, внешняя липидная оболочка
отсутствует. Геном ВПЧ представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу
ДНК протяженностью около 8000 пар нуклеотидов, покрытую белковым капси¬
дом. Капсид имеет форму икосаэдра и сформирован 72 пентамерами протеина L1,
с которым ассоциирован протеин L2, В составе ДНК имеется три функциональные
области: Early (Е), Late (L) и Upstream Regulatory Region (URR). Область E содержит
гены, кодирующие шесть «ранних» белков: El, Е2, Е4, Е5, Е6, Е7, которые участву¬
ют в репликации вирусной ДНК и формировании вирионов в инфицированных
клетках эпителия. Все гены расположены только на одной из цепей ДНК. Белки Е6
и Е7 определяют онкогенные свойства вируса, подавляя клеточные белки р53 и
pRb — супрессоры опухолей. Гены области L кодируют «поздние» структурные
белки вирусного капсида: L1 и L2. Кодирующие участки генома разделены неко¬
дирующей областью URR, которая регулирует экспрессию генов, репликацию ДНК
и сборку вирионов.Таблица 24-8. Филогенетическая и эпидемиологическая классификация ВПЧ. ассоциированных
с карциномой шейки маткиРод о, видыТилПлоскохлеточный рак, %Аденокарцинома, %Уровень рнскаА132. 42НизкийA361.С62, 72Низкий810,04Низкий830.04Низкий84Не определенЛ5260,22Высокий510,750,54Высокий690,26Не определен82Высокий<х630Не определен530.04Высокий561.09Высокий660.19Высокий
710ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯОкончание табл. 24-8Род о, видыТипПлоскоклеточный рак, %Аденокарцинома, %Уровень риска«718394559687011.270,825.211,050,3737.300,545,952,16Высокий
Высокий
Высокий
Высокий
Высокий
Не определена91631333552586754,383,822,061,272,251,7241.621,030.541,080,54Высокий
Высокий
Высокий
Высокий
Высокий
Высокий
Не определенМО6
11
13, 44
55
740.070.070.04Низкий
Низкий
Низкий
Низкий
Не определенА1134730.49ВысокийВысокийАІЗ54НизкийА1490НизкийЛ1571НизкийКлеточная пролиферация и дифференцировка, сопровождаемые репликаци¬
ей вирусного генома, транскрипцией и трансляцией вирусных белков и сборкой
вирионов, морфологически проявляются в виде койлоцитоза и появления визу¬
ально наблюдаемых папиллом и кондилом. Именно эти участки кожи опасны в
отношении контактного заражения. Инфекционные вирусные частицы попадают
в окружающую среду по мере слущивания клеток поверхностных слоев эпителия.
Это характерно для папиллом и для легкой степени повреждения (дисплазии) эпи¬
телия шейки матки, вызванных ВПЧ низкого и высокого канцерогенного риска,
Персистенция ВПЧ высокого канцерогенного риска обусловливает поврежде¬
ния плоского и железистого эпителия (особенно в зоне трансформации) шейки
матки. Встраивание вирусной ДНК в ДНК клетки сопровождается утратой способ¬
ности вируса к репликации при обязательном сохранении транскрипции генов Ев
и Е7. Взаимодействуя с клеточными белками (опухолевым супрессором р53 и др.),
белки — продукты генов Е6 и Е7 — нарушают стабильность клеточного генома,
процессы дифференцировки клеток и стимулируют их пролиферацию.Папилломавирусы термостабильны, устойчивы к эфиру, хлороформу, детерген¬
там, низким значениям pH и ультрафиолетовому облучению, инактивируются при
рентгеновском облучении.ВПЧ распространяется контактным путем (в том числе половым), поражая кож¬
ные покровы и слизистые оболочки (табл. 24-9). Типы ВПЧ, ассоциированные с
поражениями кожи и слизистых оболочек, представлены в табл, 24-9.Таблица 24-9. Типы ВПЧ, ассоциированные с поражениями кожи и слизистых оболочек (У11Пег8,
1989)Клинические проявленияТипы ВПЧПоражения кожиПодошвенные бородавки1,2.4Обычные бородавки2, 4, 26, 27, 29, 57Плоские бородавки3, 10, 28, 49
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 711
Окончание табл. 24-9Клинические проявленияТипы ВПЧБородавки Бютчера7Бородавчатая эпидермодисплазия5,8, 9,10.12,15,19, 36Небородавчатые кожные поражения37, 38Поражения слизистых оболочек гениталийОстроконечные кондиломы6, 11,42^4, 54Некондиломатозные поражения6,11,16,18, 30, 31. 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 51. 52, 55,56,57-59,61,64,67-70Карцинома16,18, 31. 33, 35, 39, 45, 51, 52. 56, 58, 59, 66, 70Экстрагенитальные поражения слизистых оболочекПапиллома гортани6,11,30Карцинома шеи, языка2, 6,11,16,18, 30Лабораторная диагностикаЛабораторная диагностика папилломавирусной инфекции основана на
молекулярно-генетических методах обнаружения фрагментов генома ВПЧ непо¬
средственно в цервикальных соскобах или биоптатах ткани. Методы культивиро¬
вания ВПЧ не разработаны.Среди высокоразрешающих технологий детекции нуклеиновых кислот самое
широкое распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР).ПЦР-тест-системы, обладающие высокими аналитической и диагностической
чувствительностью и специфичностью, используют не только для выявления, но и
для определения в исследуемом материале количественного содержания (вирусной
нагрузки) и дифференциации (генотипирования) ВПЧ ВКР основных клинически
значимых генотипов (16, 18, 31, 33. 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59), ответственных
более чем за 94% случаев тяжелых цервикальных дисплазий и рака шейки матки,
а также для обнаружения ВПЧ 6 и 1 ].Количественное определение содержания широкого спектра генотипов ВПЧ
ВКР обеспечивает возможность дифференцированной интерпретации лабора¬
торных данных с учетом показателя вирусной нагрузки (lg-кoличecтвa копий
ДНК вируса в 10^ клеток). Это позволяет прогнозировать характер течения ВПЧ-
инфекции (наличие транзиторной инфекции, развитие дисплазии или высокий
риск ее прогрессирования), оценивать эффективность терапии. Количество вируса
менее 3 lg-кoпий ДНК ВПЧ ВКР на 10^клеток считают клинически малозначимым,
ассоциированным с минимальным риском развития дисплазии и спонтанной эли¬
минацией вируса; 3-5 lg-кoпий ДНК на 10^ клеток — клинически значимое коли¬
чество вируса; 5 и более lg-кoпий ДНК на 10'’ клеток — повышенное количество
вируса, отражающее наличие дисплазии или высокий риск ее развития. Снижение
вирусной нагрузки более чем на 1 Іg за 6 мес рассматривают в качестве маркера
транзиторной инфекции.Генотипирование, направленное на выявление и дифференциацию ДНК ВПЧ
ВКР, имеет большое значение по ряду причин. Во-первых, выявление нескольких
генотипов вируса ассоциировано с более высоким риском длительной перси-
стенции возбудителя и менее благоприятным прогнозом течения заболевания.
Во-вторых, сохранение генотипа (спектра генотипов) ВПЧ ВКР через год после
первого тестирования свидетельствует о хронической (персистирующей) инфек¬
ций, поскольку повторное инфицирование тем же генотипом вируса практически
не встречается. Наконец, выявление ВПЧ генотипов 16 и 18, обладающих наибо¬
лее высокой онкогенностью, требует особой тактики ведения пациентов, которым
рекомендуют сразу проводить кольпоскопическое исследование.
'ШёШ% 712 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯу,%1|1ж	Существуют также неамплификационные (гибридизационные) методы выявле¬ния ДНК ВПЧ, которые пока не нашли широкого применения в России.Основной задачей диагностики папилломавирусной инфекции, обусловленной
ВПЧ высокого канцерогенного риска, является раннее выявление предраковых
изменений эпителия, для чего дополнительно используют цитологический и
гистологический методы, с помощью которых выявляют наличие характерных для
папилломавирусной инфекции изменений эпителия, дисплазий, рака. Выявление
ВПЧ в диагностическом материале особенно важно на стадии латентной инфек¬
ции, когда цитологическое и кольпоскопическое исследования неэффективны.
Вместе с тем установлено, что присутствие вируса даже без признаков дисплазии
эпителия сопровождается 300-кратным возрастанием риска развития карциномы
шейки матки.ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕИнформативность цитологического метода определяется качеством взятия и
обработки материала для исследования и уровнем подготовки врача-цитолога.
Материал для цитологического исследования следует брать с экзоцервикса, с
участка на границе многослойного плоского и цилиндрического эпителия церви¬
кального канала и из нижней трети эндоцервикса с помошью щетки-эндобраша
до гинекологического осмотра или кольпоскопии при условии отсутствия воспа¬
лительных заболеваний. Наносить материал следует тонким слоем на специально
обработанное обезжиренное стекло. Для получения адекватного результата мазок
должен быть немедленно обработан во избежание высыхания клеток, поскольку
их структура может необратимо деформироваться и трактовка такого материала
будет неправильной. Фиксированные препараты окрашивают разными способами,
но классической является окраска по Папаниколау. При микроскопии препара¬
тов. окрашенных этим методом, учитывают специфический комплекс признаков,
характеризующих ядро и цитоплазму клеток, а также их расположение (разроз¬
ненное, в виде пластов и др.).При папилломавирусном поражении эпителия в цитологических мазках выяв¬
ляют оксифильно и базофильно окрашенные клетки поверхностного и проме¬
жуточного слоев эпителия, двухъядерные клетки и многоядерные симпласты,
койлоциты и дискератоциты. Койлоциты представляют собой клетки много¬
слойного плоского эпителия промежуточного типа, имеющие одно или несколько
гиперхромных ядер неправильной формы, оптически светлую зону вокруг ядра,
цитоплазму в виде узкого ободка по периферии клетки. Среди типичных койлоци-
тов выявляют клетки, в которых наблюдают мелкие единичные вакуоли в околоя-
дерной зоне. Подобные клетки ассоциированы с легкой дисплазией.при тяжелой дисплазии обнаруживают дискератоциты — поверхностные клетки
многослойного плоского эпителия небольших размеров с гиперхромными ядрами
и эозинофильной цитоплазмой с различной степенью ороговения, которые чаще
расположены комплексами; двухъядерные клетки — клетки в состоянии амитоза,
многоядерные клетки.Интерпретация результатов цитологического исследования мазков с шейки
матки представляет большие сложности для практикующего врача в связи с
одновременным использованием сразу нескольких классификаций повреждений
эпителия шейки матки. Для лучшего понимания соотношения терминов, при¬
меняемых в различных классификационных схемах, предлагают использовать
нижеследующую таблицу (табл. 24-10).Самой распространенной классификацией при оценке результатов цитологиче¬
ского исследования является классификация Папаниколау:•	1-й класс — атипические клетки отсутствуют, нормальная цитологическая
картина;
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ713Таблица 24-10. Морфологические и цитологические классификации эпителиальных поражений
шейки маткиМорфологические классификацииморфологическая оценкаНорма, изменения отсут¬
ствуютНезначительные клеточные
измененияПлоскоклеточные поли¬
морфные изменения (воспа¬
ление, инфекция и т.п.)Папилломавирусные изме-
нения (койлоцитоз) 	Слабая дисплазияДисплазия средней степениДисплазий высокой степениCarcinoma in situ (CIS)Инвазивный РШМАтипия клеток железистого
(эндоцервикального) эпи¬
телияAdenocarcinomaCiN system (1966)НормаНезначительные клеточ¬
ные измененияПлоскоклеточные поли¬
морфные изменения (вос¬
паление, инфекция и т.п.)Папилломавирусные изме¬
нения (койлоцитоз)Ш11C1N IIICIN IIIИнвазивный РШМАтипия клеток железисто¬
го (эндоцервикального)
эпителияAdenocarcinomaЦитологические классификацииПапаниколау(1947)1'й класс2-й класс2'й класс2-й класс3-й класс3-й класс3-й класс4-й класс5-й классBethesda system (2001)Нормальная цитологическая
картинаДоброкачественные клеточ¬
ные изменения, воспаление.
Признаки различных инфек¬
ций. Радиационные, преактив-
ные, репаративные измененияASCUS (АПНЗ) плюс поли¬
морфные измененияLSIL (Н-ПИП)LSIL (Н-ПИП)HSIL (В-ПИП)HS1L (В-ПИП)HSIL (В-ПИП)Инвазивный РШМАтипия клеток железистого
эндоцервикального) эпителия
(AGUS)AdenocarcinomaПримечание. CIN — Cervical Intraepithelial Neoplasia\ ASCUS - Atypical Squamous Cells of
Undetermined Significance (АПНЗ — атипия плоскоклеточная неопределенной значимости); LSiL —
Low-Grade Squamous Intraepitelial Lesions (Н-ПИП — плоскоклеточное интраэпителиальное пора¬
жение низкой степени выраженности): HSIL — High-Grade Squamous Intraepitelial Lesions (В-ПИП -
плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени выраженности).•	2-й класс — незначительное изменение клеточных элементов (небольшое
увеличение ядра, появление клеток метаплазированного эпителия), обуслов¬
ленное воспалительным процессом во влагалище и/или шейке матки;•	3-й класс — единичные клетки с изменениями соотношения ядра и цитоплаз¬
мы, дискариоз (требуется повторение цитологического исследования или
гистологическое исследование биоптата);•	4-й класс — отдельные клетки с явными признаками озлокачествления
(увеличение ядер, базофильная цитоплазма, неравномерное распределение
хроматина);•	5-й класс — большое количество атипических (раковых) клеток. Диагноз
злокачественного новообразования не вызывает сомнений.Верификация злокачественных эпителиальных опухолей шейки матки возмож¬
на лишь при гистологическом исследовании, которое является «золотым стандар¬
том», но вторичным методом диагностики в силу инвазивности и трудоемкости.Цитологические критерии, позволяющие опытному врачу-цитологу прийти к
заключению о поражении цервикального эпителия ВПЧ, выявляют лишь в 30%
всех случаев инфицирования, исключая недоступную для морфологической диа¬
гностики латентную форму инфекции. Вместе с тем установлено, что присутствие
вируса даже без признаков дисплазии эпителия сопровождается 300-кратным воз¬
растанием риска развития карциномы шейки матки.В этой связи ВОЗ и многие международные организации по борьбе с онколо¬
гическими заболеваниями рекомендуют использовать молекулярно-генетические«OÍV-'Л'шш,.ШШШШ
714 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯисследования — тест на ВПЧ при первичном скрининге у женщин старше 30 лет
в сочетании с цитологическим исследованием или в качестве самостоятельного
теста в странах, где плохо организованы программы цервикального цитологиче¬
ского скрининга, а также для мониторинга лечения умеренной и тяжелой дис¬
плазии (CIN II и CIN III), карциномы in situ и инвазивного рака. Данный метод
весьма полезен и для разрешения сомнительных результатов цитологического
исследования как при первичном выявлении неопластических изменений, так и
у пациенток, получающих лечение по поводу дисплазии и рака. Контингенты и
кратность исследования на носительство ВПЧ высокого канцерогенного риска с
помощью ВПЧ-теста достаточно освещены в литературе.Использование цитологического исследования совместно с ВПЧ-тестом позво¬
ляет повысить выявляемость предрака и рака шейки матки до 96-99%, а также
увеличить интервалы между регулярными обследованиями до 5-7 лет у пациен¬
ток с отрицательным результатом ВПЧ-теста (включая группы ASC-US и CINI).
Однако использование этого метода как диагностического критерия для неопла¬
стических процессов шейки матки приводит к значительной гипердиагностике, так
как примерно в 80% случаев инфицирование имеет кратковременный характер и
заканчивается спонтанным выздоровлением и элиминацией вируса. Таким обра¬
зом, обнаружение ДНК ВПЧ не позволяет в большинстве сл)гчаев прогнозировать
развитие цервикального рака. Однако ВПЧ-тест имеет большую прогностическую
значимость, особенно если на фоне ВПЧ-инфекции уже имеется картина диспла¬
зии эпителия шейки матки.Верификация диагноза злокачественных эпителиальных опухолей шейки матки
возможна лишь при патоморфологическом исследовании, которое позволяет
также судить о степени поражения эпителия при клинической и субклинической
формах ВПЧ-инфекции по наличию цитопатического действия вируса.ПОЛИОВИРУСЫ
Характеристика вирусовПолиовирусы относятся к семейству Picornaviridae (от греч. pico — «малый» и
та — «содержащий РНК»), к роду Enterovirus. Существует три серотипа полио-
вирусов; тип I, тип II, тип III. Типовым представителем рода Enterovirus и семей¬
ства Picornaviridae является вирус полиомиелита — штамм Mahoney полиовируса
типа I.Вирусы полиомиелита принадлежат к числу самых мелких из известных
РНК-содержащих вирусов. Вирусные частицы круглой формы, диаметром
22-30 нм, с икосаэдрической симметрией, не имеют липидной оболочки.
Высокоструктурированная белковая оболочка полиовируса состоит из шестиде¬
сяти субъединиц, каждая из которых формируется из четырех различных поли¬
пептидных цепей, внутри нее расположен вирусный геном — одна молекула рибо¬
нуклеиновой кислоты (РНК). Геном вируса полиомиелита представляет собой
позитивную одноцепочечную РНК, состоящую примерно из 7500 нуклеотидов.
Четыре капсидных полипептида (VP1-VP4) являются продуктами протеолити-
ческого расщепления полипротеина-предшественника. З’-конец РНК полиадени-
лирован, а к 5’-концу ковалентно присоединен низкомолекулярный белок VPg.
Согласно трехмерной структуре полиовируса, большинство аминокислот, распо¬
ложенных на поверхности вирусной частицы, принадлежат белку VP1, белки VP2
и VP3 частично экспонированы, а белок VP4 является полностью внутренним
белком. Геномная РНК полиовируса инфекционна и служит матричной РНК для
синтеза вирусных белков. Большая часть РНК полиовируса, кроме двух нетранс-
лируемых областей на 3'- и 5’-конце, представляет собой одну протяженную
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 715открытую рамку считывания, кодирующую один большой белок — полипротеин,
который образуется в процессе трансляции в цитоплазме инфицированных кле¬
ток. Затем в результате каскада протеолитических расщеплений, катализируемых
двумя различными протеазами, из полипротеина образуются все функционально¬
активные структурные белки вирусного капсида (от VP1 до VP4) и неструктурные
белки, включая протеин 3D, функционирующий как РНК полимераза - фермент,
ответственный за репликацию геномной РНК.Механизм проникновения вируса в цитоплазму клетки и освобождение в ней
вирусного генома остаются неясными. Полиовирус связывается со специфическим
белком цитоплазматической мембраны — рецептором полиовируса (PVR; CD155),
относящимся к белковому суперсемейству иммуноглобулинов. Прикрепление к
рецептору обусловливает изменения в структуре капсида, необходимые для попа¬
дания генома в цитоплазму. Ни один другой пикорнавирус не способен использо¬
вать этот белок как клеточный рецептор.Высокая частота ошибок РНК-полимеразы при репликации РНК, составляющая
в среднем на одно основание, способствует появлению нуклеотидных замен
в геноме полиовируса, а отсутствие механизмов коррекции этих ошибок может
привести к накоплению точечных мутаций в процессе репликации полиовирусов.
Эволюция полиовирусов, помимо мутаций, связана также с феноменом молекуляр¬
ной рекомбинации. Введение в организм оральной полиомиелитной вакцины в виде
смеси полиовирусов трех серотипов обеспечивает возможность одновременного
инфицирования одной клетки кишечного эпителия вирусами разных серотипов, 'гто
ведет к реализации молекулярной рекомбинации между геномами полиовирусов
разных серотипов и появлению штаммов, являющихся межтиповыми рекомбинан¬
тами. Это является основой появления межтиповых рекомбинантных вакцинных
штаммов у больных с вакциноассоциированным паралитическим полиомиелитом.
Межтиповые рекомбинантные штаммы были обнаружены и у здоровых вакциниро¬
ванных детей. Феномен рекомбинации регистрируется также между вакцинными и
дикими штаммами полиовирусов одного серотипа (внутритиповые рекомбинанты)
у больных вакциноассоциированным паралитическим полиомиелитом.Полиовирусы сходны с энтеровирусами, но отличаются от других пикорнавиру¬
сов по физическим и химическим свойствам — плавучей плотности и устойчивости
к слабым кислотам. Частицы полиовируса имеют плавучую плотность 1,34 г/мл
и коэффициент седиментации 156 S. Они относительно устойчивы к нагреванию
(в присутствии катионов магния). В течение 1-3 ч полиовирусы устойчивы в
кислой среде (pH ^ 3,0-і-5.0). Жизнеспособны при pH = 3,0 и ниже; относительно
устойчивы к действию ряда детергентов и дезинфектантов, включая мыло, неион¬
ные детергенты, эфир, хлороформ и другие растворители жиров. Вирусы сохраня¬
ют жизнеспособность в течение нескольких недель при 4 °С и нескольких дней при
комнатной температуре, но быстро инактивируется под действием высушивания,
ультрафиолета, высокой температуры, формалина и свободного хлора.Клинический материал для лабораторного исследованияПоскольку полиовирусы размножаются в кишечном тракте в течение несколь¬
ких недель после инфицирования организма, пробы фекалий наиболее пригодны
для выделения вируса. Менее пригодны глоточные тампоны, так как полиовирусы
обнаруживают в глотке на протяжении 7-10 дней после начала болезни. Из цере¬
броспинальной жидкости полиовирусы вьщеляются редко.Эффективность вирусологической диагностики в большой степени зависит от
правильного и своевременного сбора клинических проб, а также от соблюдения
оптимальных условий их транспортировки в лабораторию. Пробы фекалий от
больных ОВП должны быть взяты в ранние сроки (до 14 дней) от начала паралича.
ЩШ 716 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯОт больного берут две пробы фекалий (около 8 г каждая) с интервалом 24-48 ч,Штак как содержание вируса в фекалиях может колебаться. Пробы помещают в
пластиковую пробирку с завинчивающейся крышкой. После сбора пробы следует
хранить в холодильнике, если их транспортируют в вирусологическую лаборато-
рию — сразу же после сбора. Если это невыполнимо, пробы следует заморозить
при -20 “С и пересылать в замороженном виде. Доставку проб осуществляют
||^^||| любым видом транспорта, обязательно в термоконтейнере с хладоэлементами.Срок доставки проб в лабораторию не должен превышать 72 ч от даты забора.>5 0	пробам прилагается направление, в котором обязательно отражается приви¬вочный анамнез ребенка (количество полученных доз вакцины и дата последней
прививки). В вирусологической лаборатории проверяют и регистрируют состоя¬
ние полученной пробы (достаточный объем, отсутствие протечки и нарушения
ХОЛОДОВОЙ цепи). Каждая проба получает идентификационный номер, который
вносится в рабочий журнал, в направление и этикетку на флаконе с крышкой.Лабораторная диагностикаВирусологические исследования материала от больных полиомиелитом и
острыми вялыми параличами (ОВП) осуществляют только аккредитованные ВОЗ
вирусологические лаборатории, входящие в глобальную лабораторную сеть ВОЗ
по диагностике полиомиелита. Семь лабораторий из глобальной сети находят¬
ся в Российской Федерации и образуют лабораторную сеть РФ по диагностике
полиомиелита. Это Национальная лаборатория по диагностике полиомиелита
в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН
(НЛ), которая одновременно является Региональной референс-лабораторией ВОЗ
(РРЛ). В лабораторную сеть РФ также входят субнациональные вирусологические
лаборатории, работающие в составе региональных центров эпидемиологического
надзора за полиомиелитом и ОВП в г. Москве, Хабаровском, Ставропольском краях.
Свердловской, Омской областях, Санкт-Петербургском НИИЭМ им. Л. Пастера.
Все вирусологические исследования проводят в соответствии с Руководством ВОЗ,
СП 3.1.2343-08 и МУК 4.2.2410-08 с соблюдением требований контейнмента -
обеспечения безопасного лабораторного хранения полиовирусов.Обработку поступивших для исследования проб фекалий проводят в ламинар¬
ном шкафу 2-го класса защиты с использованием хлороформа, к действию которо¬
го энтеровирусы устойчивы. Помимо бактерий и грибов хлороформ удаляет также
потенциально токсичные липиды и способствует диссоциации вирусных агрегатов.
Для приготовления 20% фекальной суспензии устойчивые к хлороформу полиэ¬
тиленовые центрифужные пробирки емкостью 50 мл маркируют в соответствии с
номером пробы, в каждую пробирку вносят 10 мл фосфатно-солевого буферного
раствора (ФСБ) с антибиотиками, 1 г стеклянных бусин и 1 мл хлороформа. В про¬
бирку вносят 2 г фекальной пробы. Плотно закрывают центрифужную пробирку и
тщательно встряхивают в течение 20 мин в механическом шейкере или вручную.
Центрифугируют 20 мин при 1500 g в центрифуге с охлаждением. Надосадочную
жидкость каждой пробы переносят в два маркированных флакона с винтовой
крышкой. Если жидкость непрозрачна, обработку хлороформом повторяют. После
обработки пробы надосадочную жидкость переносят в две пластиковые пробирки,
одну пробирку оставляют на хранение при -20 “С, другую используют для иссле¬
дования в культуре клеток.Для выделения и идентификации полиовирусов ВОЗ рекомендует 2 линии кле¬
ток: Г20В и КО. Ь20В — рекомбинантная линия мышиных клеток (1-клеток), соз¬
данная для селективного выделения вирусов полиомиелита. Мышиным клеткам
этой линии генно-инженерным путем придана способность экспрессировать чело¬
веческий рецептор полиовируса. КВ — клетки, полученные из рабдомиосаркомы
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ717человека. Третья линия клеток (Нер-2, Cincinnati), полученная из эпидермоидной
карциномы человека, ранее была рекомендована ВОЗ для работы в лабораторной
сети ВОЗ и продолжает использоваться для проведения серологического мони¬
торинга напряженности иммунитета к полиовирусам. Клетки L20B избирательно
чувствительны к полиовирусам, которые вызывают в них характерный цитопато¬
генный эффект (ЦПЭ). Клетки RD высокочувствительны к полиовирусам, которые
также хорошо размножаются на клетках Нер-2.Выделение и идентификацию полиовирусов и других энтеровирусов проводят
в соответствии с алгоритмом, описанным в Руководстве ВОЗ по лабораторным
исследованиям полиомиелита. Обработанную пробу фекалий вносят на клетки
L20B и RD, которые просматривают в течение 7 дней, при отсутствии ЦПЭ про¬
водят слепой пассаж и наблюдение продолжают еще 7 дней. Проба считается
отрицательной, если после двух пассажей ЦПЭ обнаружить не удалось. Общий
срок наблюдения за зараженными культурами должен быть не менее 14 дней. При
наличии ЦПЭ на линии клеток L20B в реакции микронейтрализации на этих же
клетках определяют серотип полиовируса, штамм направляют в РРЛ для внутри-
типовой дифференциации. Если вирус не типирован, его также направляют в РРЛ
для идентификации. При отсутствии ЦПЭ на клетках L20B, но наличии ЦПЭ на
клетках RD проводят пассаж на клетках L20B, Наличие ЦПЭ на этой клеточной
культзфе свидетельствует о возможном выделении полиовируса, и все последую¬
щие процедуры проводят, как описано выше. Если ЦПЭ наблюдается только на
клетках RD (RD+, а L20B-), следует определить тип энтеровируса в клетках RD.Идентификацию полиовирусов проводят с помощью реакции микронейтрали¬
зации с набором сывороток, специфичных к серотипам I, П и П1 полиовирусов,
В опыте по нейтрализации вирусную суспензию смешивают в равном объеме с
диагностическими сыворотками в лунках планшета для микронейтрализации,
инкубируют 1 ч при 36 °С, добавляют суспензию клеток, помещают в термостат,
проводят ежедневное микроскопирование до получения окончательного результа¬
та идентификации (как правило, в течение 5 сут).Подготовку рабочих разведений сывороток проводят в соответствии с инструк¬
циями производителя. Проведение теста микронейтрализации, интерпретацию
результатов выполняют в соответствии с Руководством воз по лабораторным
исследованиям полиомиелита.Типирование выделенного вируса проводят на той культуре, на которой он
выделен. Если вирус выделен и на клетках RD, и на клетках L20B, проводят иден¬
тификацию на обеих культурах, при этом в первую очередь исследуют штамм,
выделенный на L20B.Иммунные сыворотки с высокими титрами антител смешивают с 100 ККИД-^
выделенного штамма неизвестного вируса. Вирусная суспензия с ЦПЭ на «+++»
или «++++» содержит примерно 105-106 ККИД^^ в 50 мкл. В данном тесте исполь¬
зуют разведения 10“^ и 10 в целях экономии времени и материалов для предва¬
рительного титрования каждого штамма. Титрование штамма включают в каждый
тест. Если вирус выделен и на клетках RD, и на клетках L20B, штамм, выделенный
на L20B, исследуют первым, чтобы наиболее важный результат получить наиболее
быстро. Если полученный результат не убедителен, типируют штамм, выделенный
на клетках RD. Штамм, полученный на L20B, направляют в НЛ/РРЛ для дальней¬
ших исследований, в ходе которых;•	пассируют 2 раза, общее время наблюдений — не менее 14 дней;•	если в клетках L20B из проб, собранных в неэндемичных или недавно
эндемичных странах, выделяется нетипируемый вирус, об этом информируют
регионального координатора лабораторной работы и руководителя
национальной программы ликвидации полиомиелита;•	неполиомиелитные энеторовирусы типируют по запросу РПИ.
718ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯтпри интерпретации результатов реакции нейтрализации (табл. 24-11) важно
иметь в виду, что в лунках контроля клеток должен быть сплошной клеточный
монослой, а в лунках контроля вируса — полный ЦПЭ. Титрование должно под¬
твердить, что использованное в опыте количество вируса в каждом из разведений
было в пределах 32-320 ККИД^^ (то есть титр вируса составлял 10‘ ‘’-10^ У50 мкл,
что соответствует -10^’^в суспензии при выделении вируса). Результаты теста
следует оценивать по разведению, которое соответствует истинному титру вируса
в опыте. Смесь иммунных сывороток, которая подавляет развитие ЦПЭ, указы¬
вает тип вируса или типы вирусов в смеси. Неспособность вируса размножаться в
присутствий смеси иммунных сывороток является результатом его нейтрализации
одной из сывороток, входящих в смесь.Таблица 24-11. Интерпретация результатов реакции нейтрализации лри идентификации лопио-
вирусаПолио 1+2+3ОПолио1+2ОПолио1+3ОПопио 2+3Идентификация вирусаПолиовирус типа 1Полиовирус типа 2Полиовирус типа 3Смесь полиовирусов типов 1 и 2Смесь полиовирусов типов 1 и 3Смесь полиовирусов типов 2 и 3Смвсь 3 типов полиовирусовНеполиомиелитный вирус или смесь
полиовируса с другим энтеровирусомПримечание. -«+» — наличие ЦПЭ: «0^^ — отсутствие ЦПЭ.Все штаммы полиовирусов, выделенные из любых источников, должны пройти
внутритиповую дифференциацию с помощью двух методов — антигенного и одно¬
го молекулярного, поскольку важно определить, является ли он диким, вакцинным
или относится к вакцинно-родственным полиовирусам (ВРПВ). Установлена воз¬
можность длительной репликации в организме и длительной экскреции штаммов
ВРПВ всех трех серотипов полиовирусов, а также такая важная характеристика
ВРПВ, как их способность к длительной циркуляции за счет передачи от человека
к человеку. Вспышки острых вялых параличей, вызванные штаммами вакцинного
происхождения, которые циркулировали среди населения в течение нескольких
лет, наблюдали в разных географических зонах.Согласно определению ВОЗ, вакцинно-родственные полиовирусы, значительно
дивергировавшие от вакцинных предков, представляют собой «полевые» изо¬
ляты вакцинного происхождения, имеющие не менее 1% нуклеотидных отличий
от родительских вакцинных штаммов, выявленных при полном секвенировании
участка генома УР1. Трудно проследить во времени наблюдаемые антигенные
изменения этих штаммов. Все изоляты, у которых была проанализирована полная
нуклеотидная последовательность участка УР1 генома, можно четко разделить на
три категории. Штамм считается вакцинным, если он имеет менее 1% различий с
эталонным вакцинным штаммом Сэбина. Штамм расценивается как ВРПВ, если
он имеет от 1 до 15% различий с вакцинным штаммом Сэбина; как дикий, если
он имеет более 15% различий с вакцинным штаммом. Единственное исключение
составляют дикие родители вакцинных штаммов, которые, согласно этим опреде¬
лениям, являются вакцинными. Все «вакцинные» вирусы и большинство ВРПВ
расцениваются как вакцинные с помощью молекулярных методов ВТД. Некоторые
вакцинные вирусы, все ВРПВ и дикие вирусы расцениваются как невакцинные
с помощью антигенных методов внутритиповой дифференции (ВТД). Любой
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 719вирус, идентифицированный как вакцинный обоими методами, является вакцин¬
ным. Любой вирус, идентифицированный обоими методами как дикий, является
диким. Любой вирус, для которого получены противоречивые результаты двумя
методами ВТД, указывающие на принадлежность штамма к дикому или вакцинно¬
родственному полиовирусу, должен быть в течение 7 дней от момента получения
результатов охарактеризован с помощью секвенирования участка генома VP1,
Такие вирусы обычно являются вакцинными, но могут также оказаться ВРПВ.Проведение и интерпретацию результатов тестов выполняют в соответствии
с Руководством воз по лабораторным исследованиям полиомиелита. Методы
иммуноферментного анализа (ИФА) и диагностической ПЦР нашли наиболее
широкое применение.Метод ИФА является антигенным методом ВТД, основанным на использовании
перекрестно адсорбированных антисывороток. Этот метод применяют только
по отношению к монотипоспецифическим штаммам. В случае выделения смеси
полиовирусов двух или трех типов их необходимо предварительно разделить.
Принцип метода: титровальные планшеты с IgG-антителами (бычьей сывороткой,
иммунной к полиовирусам типов I, II и III) в лунках инкубируют после внесения
идентифицированного штамма полиовируса определенного серотипа, подготов¬
ленного для исследования. Затем инкубируют планшеты с внесенной типоспеци¬
фической перекрестно адсорбированной иммунной сывороткой кролика. Удаляют
промыванием несвязавшуюся сыворотку и добавляют меченные пероксидазой
IgG-антитела к иммуноглобулинам G кролика, чтобы выявить связанную кроли¬
чью сыворотку. Институт в Билтховене комплектует наборы реагентов, необходи¬
мых для проведения ИФА, и рассылает их по разнарядке ВОЗ.Метод диагностической ПЦР, разработанный в Центре контроля инфекци¬
онных болезней в США, относится к молекулярным методам ВТД. Принцип
метода — определение присутствия в образце РНК полиовируса. ПЦР прово¬
дят с идентифицированными штаммами полиовирусов определенного серотипа.
Интерпретация результатов•	Все праймеры (-) — не энтеровирус.•	Пан-энтеровирус (+), все другие (-) ~ энтеровирус (не полиовирус).•	Пан-энтеровирус (+), пан-полиовирус (+), 3 типа Сэбина (-), 1 или более
серотипов (+) — дикий полиовирус выявленного типа (типов).•	Пан-энтеровирус (+), пан-полиовирус (+), 1 или более типов Сэбина (+),
соответствующий серотип (серотипы) (+) — вакцинный полиовирус (полио¬
вирусы) выявленного типа (типов).•	Пан-энтеровирус (+), пан-полиовирус (+), 1 или более типов Сэбина (+),
больше серотипов (+), чем типов Сэбина, — смесь дикого и вакцинного
полиовирусов различных типов.При синтезе комплементарной ДНК и реакции ПЦР используют наборы олиго¬
нуклеотидных праймеров с различной специфичностью. Используют наборы прай¬
меров как специфические для энтеровирусной группы, так и типоспецифические
по отношению к каждому типу полиовирусов Сэбина. Дополнительно используют
праймеры, способные специфически амплифицировать все полиовирусы, а также
все известные штаммы каждого из трех типов по отдельности. Такие комбинации
праймеров, как специфические для всех энтеровирусов (PanEV), специфические
для всех полиовирусов (PanPV), специфические к каждому серотипу полиовируса
(Sero 1, Sero 2 и Sero 3), специфические к вакцинным штаммам каждого серотипа
(Sabin 1, Sabin 2, Sabin 3), дают полную характерютику штаммов полиовирусов и
подтверждают идентификацию типа каждого штамма. Центр контроля инфекци¬
онных болезней (Атланта, США) комплектует наборы реагентов (исключая фер¬
менты), необходимых для проведения ПЦР на полиовирусы. ВОЗ распространяет
их в сети полиомиелитных лабораторий.
720 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯМетод ВТД с моноклональными антителами является антигенным и основан
на реакции нейтрализации с использованием панели моноклональных анти¬
тел, разработанной в Институте им. Л. Пастера в Париже, Панель состоит из6	моноклональных антител (1о и 1о, 2о и По, Зо и П1о), специфичных к дикому
и вакцинному типам полиовирусов серотипов I, П и П1 соответственно. Рабочие
разведения моноклональных антител определяют в соответствии с результатами
нейтрализации эталонных штаммов полиовирусов. Принадлежность исследуемо¬
го штамма полиовируса того или иного серотипа к дикому или вакцинному типу
определяют на основании индекса нейтрализации, рассчитанного как разница
между логарифмами титров вируса, полученных в отсутствии и присутствии моно¬
клональных антител. Положительным считается индекс нейтрализации не менее
3. Исследуемый штамм классифицируется как вакцинный или как невакцинный в
зависимости от индекса нейтрализации, полученного в реакции нейтрализации с
соответствующими моноклональными антителами, специфичными к вакцинному
или дикому типу полиовируса- Штаммы, которые не удается нейтрализовать моно¬
клональными антителами ни к вакцинному, ни к дикому типу вируса, определяют
как не нейтрализуемые штаммы.Для окончательной идентификации штаммов полиовирусов необходимо исполь¬
зовать два метода внутритиповой дифференциации полиовирусов: антигенный и
молекулярный. Комбинация антигенного и молекулярного методов ВТД выбрана
для работы в сети полиомиелитных лабораторий ВОЗ, поскольку эти методы осно¬
ваны на различных принципах. Иммуноферментный анализ (антигенный метод,
основанный на использовании поликлональных перекрестно адсорбированных
иммунных сывороток) позволяет выявлять антигенные различия между дикими
и вакцинными полиовирусами. Диагностическая полимеразная цепная реакция
(молекулярный метод, основанный на использовании олигонуклеотидных прай¬
меров с разной специфичностью) позволяет выявлять различия в РНК полиови¬
русов.ЭНТЕРОВИРУСЫ
ТаксономияЭнтеровирусы относятся к семейству Picornaviridae (от pico — «малый» и та —
«содержащий РНК»), роду Enterovirus. Согласно последней классификации вирусов
(Международного комитета по таксономии вирусов, 2003), основанной на геном¬
ных характеристиках вирусов, неполиомиелитные энтеровирусы (НПЭВ) челове¬
ка объединены в четыре группы (вида): А, В, С, D (табл. 24-12). Различные серо¬
типы неполиомиелитных энтеровирусов отнесены к этим группам (табл. 24-13).
В филогенетическом плане энтеровирусы группы с и полиовирусы представляют
один вид энтеровирусов,Таблица 24-12. Семейство PicornaviridaeРод и входящие в него видыКоличество серотиповРод EnterovirusВирус полиомиелита3Энтеровирус человека А16Энтеровирус человека В52Энтвровирус человека С10Энтеровирус человека 03Обезьяний знтеровирус20Бычий знтеровирус2
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 721Окончание табл. 24-12Род и входящие в него видыКоличество серотиповСвиной энтеровирус А1Свиной энтеровирус в2Род HepatovirusВирус гепатита А человека (бывший энтеровирус 72)1Ви рус гепатита А обез ья нРод RhinovirusРиновирус человека А18Риновирус человека В3Неклассифицированные82Род CardiovirusВирус энцефаломиокардита мышей1Вирус Тейлера мышей2 или 3Род TeschovirusВирус Тешенской болезни свиней10Род AftovirusВирус ящура7Вирус ринита лошадей А1Род Parechovirus (бывшие вирусы ECHO 22 и ECHO 23)3Род ErbovirusВирус ринита лошадей1 1Род KobuvirusВирус крупного рогатого скота1Вирус Aichi1Примечание. Приведенная в таблице классификация основана на геномных характеристиках
вирусов. По-видимому, будут считаться отдельными родами еще несколько энтеровирусов живот¬
ных. Большое количество энтеровирусов (не менее 20, в том числе пронумерованные энтеровиру¬
сы человека типов 92, 93, 96-101) еще не классифицировано.Таблица 24-13. Таксономическая классификация неполиомиелитных энтеровирусов человекаГруппаКоличество серотиповОтносятся серотипыЗнтеровирус человека А16Коксаки А 2-8,10,12,14,16
Знтеровирус 71,76, 89-91Энтеровирус человека В62Коксаки А 9, Коксаки В 1-6,ECHO 1-7, 9.11-21, 24-27, 29-33
Энтеровирусы 69, 73-75, 77-88, 95Знтеровирус человека С10Коксаки А 1,11,13,15.17-21,24Энтеровирус человека D3Энтеровирусы 68, 70, 94В настоящее время определена полностью или частично нуклеотидная после¬
довательность геномов многих энтеровирусов. Все энтеровирусы оказались сход¬
ными по общей схеме организации генома, хотя и имеются различия у вирусов
разных видов и серотипов.Характеристика вирусовВирусные частицы энтеровирусов круглой формы, диаметром 22-30 нм,
имеют икосаэдрическую симметрию и не имеют липидной оболочки.
Высокоструктурированная белковая оболочка вируса состоит из 60 субъединиц,
каждая из которых формируется из четырех различных полипептидных цепей,■
ppfщИш
mm722 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯвнутри нее расположен вирусный геном — одна молекула рибонуклеиновой
кислоты (РНК). Геном вируса представляет собой позитивную одноцепочечную
РНК, состоящую примерно из 7500 нуклеотидов. Четыре капсидных полипептида
VP1-VP4 являются продуктами протеолитического расщепления полипротеина-
предшественника. 3’-конец РНК полиаденилирован. а к 5’-концу ковалентно
присоединен низкомолекулярный белок VPg. Большая часть РНК энтеровиру¬
сов, кроме двух нетранслируемых областей на 3’- и 5’-конце, представляет собой
одну протяженную открытз^ рамку считывания, кодирующую один большой
белок — полипротеин, который образуется в процессе трансляции в цитоплазме
инфицированных клеток. В результате каскада расщеплений, катализируемых
протеазами, полипротеин расщепляется на структурные белки капсида (от VP1 до
VP4) и неструктурные белки, включая протеин 3D, функционирующий как РНК
полимераза — фермент, ответственный за репликацию геномной РНК.Устойчивость во внешней средеЭнтеровирусы быстро погибают при температуре выше 50 °С (при 60 °С они
погибают в течение 6-8 мин, при 65 °С — 2,5 мин, при 80 °С — 0,5 мин, при
100 “С — мгновенно). Добавление к вирусной взвеси хлористого магния сохраняет
титр вируса при 50 “С практически неизменным в течение часа. Б заморожен¬
ном состоянии активность энтеровирусов сохраняется в течение многих лет, при
хранении в обычном холодильнике (4-6 °С) — в течение нескольких нед, а при
комнатной температуре — на протяжении нескольких дней. Они выдерживают
многократное замораживание и оттаивание без потери активности.Энтеровирусы быстро разрушаются под воздействием ультрафиолетового облу¬
чения, при высушивании, кипячении. Быстро инактивирует вирусы раствор йода.
Обработка 0,3% формальдегидом, 0,1 N HCl или свободным остаточным хлором
в концентрации 0,3-0,5 мг/л ведет к быстрой инактивации энтеровирусов, однако
присутствие органических веществ может оказывать защитное действие. Перекись
водорода в дозе 6,8 мг/л инактивирует энтеровирусы в воде за 30 мин. Этиловый
спирт (70% и более высокой концентрации) и формальдегид (0,3%) применя¬
ют для дезинфекции в отношении энтеровирусов при экспозиции не менее 3 ч.
Энтеровирусы устойчивы в кислой среде (pH = 3,0^5,0). Эфир, дезоксихолат и
другие детергенты, разрушающие ряд вирусов, не оказывают влияния на энтеро-
вирусы.Лабораторная диагностикаДля лабораторной диагностики энтеровирусной инфекции в зависимости от
особенностей клинической картины заболевания используют СМЖ (при клини¬
ческих показаниях для люмбальной пункции), смыв из ротоглотки/носоглотки,
отделяемое конъюнктивы, везикул, язв при герпангине, образцы фекалий. При
необходимости может быть исследован аутопсийный материал: ткани головного,
спинного, продолговатого мозга, печени, легких, миокарда, лимфоузлы, содержи¬
мое кишечника и ткань кишечной стенки (в зависимости от особенностей клини¬
ческой картины заболеваний).При клинических показаниях для взятия стерильных типов клинического мате¬
риала их следует включать в исследование в обязательном порядке.Эпидемиологический и вирусологический надзор за энтеровирусными инфекци¬
ями является важным направлением и видом дополнительного надзора в системе
мероприятий по профилактике полиомиелита. С 2006 г. в Российской Федерации
введена обязательная регистрация всех случаев энтеровирусной инфекции, в том
числе энтеровирусного менингита. Надзор за энтеровирусными инфекциями
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 723(ЭВИ) включает мониторинг заболеваемости ЭВИ, в том числе энтеровирусного
менингита (формы № 1 и № 2 федерального государственного статистического
наблюдения), и слежение за циркуляцией неполиомиелитных энтеровирусов
путем исследования материала от больных ЭВИ и проб из объектов окружающей
среды.Лабораторная диагностика базируется на классических вирусологических мето¬
дах: выделении неполиомиелитных энтеровирусов на чувствительных культурах
клеток и идентификации выделенных энтеровирусов Б реакции нейтрализации
на культурах клеток с помощью типоспецифических сывороток. Используются
молекулярно-биологические методы диагностики: полимеразная цепная реакция
для выявления РНК энтеровирусов в материале от больных и идентификация
энтеровирусов с помощью молекулярного типирования путем секвенирования
области вирусного генома, кодирующей белок капсида VP1.Вирусологические исследования материала от больных энтеровирусными
инфекциями осуществляют вирусологические лаборатории Центров гигиены и
эпидемиологии в субъектах Российской Федерации. Вирусологические исследова¬
ния материала от больных ЭВИ проводят так же, как при диагностике полиомие¬
лита.Для выделения и идентификации энтеровирусов ВОЗ рекомендует линию кле¬
ток RD — клетки, полученные из рабдомиосаркомы человека. Многие серотипы
вирусов ECHO и некоторые вирусы Coxsackievirus А вызывают ЦПЭ в клетках RD.
Линию клеток Нер-2 (Cincinnati), получешую из эпидермоидной карциномы чело¬
века, также используют для выделения энтеровирусов. На клетках Нер-2 хорошо
размножаются вирусы Coxsackievirus В, а также аденовирусы. Неполиомиелитные
энтеровирусы (Coxsackievirus А) могут размножаться в клетках L20B и вызывать
ЦПЭ. Ряд штаммов энтеровирусов могут быть выделены только in vivo с использо¬
ванием чувствительных лабораторных животных.Выделение и идентификацию неполиомиелитных энтеровирусов проводят в
соответствии с Руководством ВОЗ по лабораторным исследованиям полиомиели¬
та. поскольку при исследовании в целях поиска энтеровирусов возможно выде¬
лить полиовирусы (у детей, привитых против полиомиелита в течение последних2	мес). Используют три линии клеток, на которых можно вьщелить большинство
неполиомиелитных энтеровирусов: L20B и RD и Нер-2. Культуры после зараже¬
ния просматривают в течение семи дней, при отсутствии ЦПЭ проводят слепой
пассаж и наблюдение продолжают еще семь дней. Проба считается отрицательной
и культура подвергается уничтожению, если после двух пассажей ЦПЭ не обнару¬
жен. Общий срок наблюдения за зараженными культурами должен быть не менее
14 дней.При наличии ЦПЭ на линии клеток L20B в реакции микронейтрализации на
этих же клетках определяют серотип полиовируса, после чего штамм направляют
в РРЛ для внутритиповой дифференциации. Если вирус не типирован, его также
направляют в РРЛ для идентификации.При отсутствии ЦПЭ на клетках L20B, но наличии ЦПЭ на клетках RD, про¬
водят пассаж на клетках L20B. Наличие ЦПЭ на этой клеточной культуре свиде¬
тельствует о возможном выделении полиовируса, и все последующие процедуры
проводят, как описано выше. Если ЦПЭ наблюдается только на клетках RD (RD+,
а L20B-), следует определить серотип неполиомиелитного энтеровируса в реакции
нейтрализации.Для идентификации штаммов энтеровирусов используют реакцию микроней¬
трализации в культуре клеток с использованием иммунных сывороток к вирусам
ECHO и Coxsackievirus. Большое количество неполиомиелитных энтеровирусов
делает весьма трудоемкой постановку реакции нейтрализации с моноспецифиче-
скими сыворотками. Моноспецифические сыворотки к неполиомиелитным энте-ш
шш724 ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯровирусам производят в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов имени
М.П. Чумакова (Москва).В глобальной лабораторной сети ВОЗ по диагностике полиомиелита для иден¬
тификации неполиомиелитных энтеровирусов используются смеси иммунных
сывороток, приготовленных по перекрывающей схеме, которые позволяют иден¬
тифицировать большинство энтеровирусов, используя всего девять смесей (пулы
ВОЗ A-G). Смеси иммунных к большинству наиболее часто встречаемых вирусов
ECHO и Coxsackievirus производят в Национальном институте охраны здоровья и
окружающей среды в Бильтховене (Нидерланды) и рассылают в полиомиелитньїе
лаборатории ВОЗ.Каждый вирус исследуют со смесью сывороток к трем типам полиовирусов,
смесью антисывороток к вирусам Коксаки В1-В6 и с семью смесями (A-G) анти¬
сывороток к 20 типам вирусов ECHO и вирусу Коксаки А 9. Вирусы, которые не
типировались этим набором иммунных сывороток, возможно, присутствуют в
исследуемом материале в виде агрегатов, и полной нейтрализации не происходит.
Можно повторить типирование после обработки материала хлороформом (при¬
мерно 10% объема). Замораживание может привести к агрегированию вируса,
поэтому типирование проводят после обработки материала до замораживания.Идентифицируют вирус по результатам предотвращения ЦПЭ соответствующими
смесями сьгоороток. Интерпретации результатов помогает схема типичных для каж¬
дого энтеровируса итогов нейтрализации, которая прилагается к каждому набору.Наряду с классическими вирусологическими методами выделения энтеровиру¬
сов на культурах клеток и их идентификации в реакции нейтрализации с помощью
диагностических сывороток используют молекулярно-биологические методы —
ПЦР и секвенирование генома вирусов.Применение ПЦР для выявления РНК энтеровирусов в материале от больных
рекомендуют в следующих случаях.•	При необходимости проведения исследований большого количества образ¬
цов в случае развития вспышки энтеровирусной инфекции.•	При осуществлении эпидемиологического надзора за энтеровирусами как
элемента скрининга в сочетании с методиками молекулярного типирования
(определения серотипа) энтеровирусов и/или вирусологическими исследова¬
ниями.•	При оперативном надзоре за определенными серотипами энтеровирусов,
ассоциированными со вспышками заболеваний (EV71-HFMD), с примене¬
нием генотипоспецифических ПЦР-тест-систем или с последующим опреде¬
лением серотипа энтеровируса путем секвенирования генома вируса.•	В случае, когда энтеровирусы не вызывают ЦПЭ на культуре клеток. При
этом также необходимо определить серотип энтеровируса путем секвениро¬
вания генома.Молекулярно-диагностические работы осуществляют в соответствии с норма¬
тивными документами. Проведение и интерпретацию результатов реакции выпол¬
няют в соответствии с инструкцией производителя.ПЦР — анализ для выявления РНК энтеро вирусов в материале от больных —
проводят в несколько этапов: выделение РНК из исследуемого материала; получе¬
ние комплементарной ДНК в реакции обратной транскрипции; проведение ПЦР-
амплификации; детекция продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном
геле. Если используемая ПЦР-тест-система не позволяет идентифицировать энте¬
ровирусы до уровня серотипа, существует вероятность пропустить присутствую¬
щие в пробе полиовирусы. Именно поэтому при обнаружении РНК энтеровируса
методом обратной транскрипции и ПЦР необходимо провести выделение вируса
на культуре клеток и его идентификацию в реакции нейтрализации или провести
идентификацию энтеровируса молекулярными методами.
ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 725при выделении из исследуемой пробы полиовируса необходимо направить его
в аккредитованную ВОЗ вирусологическую лабораторию, входящую в лаборатор¬
ную сеть Российской Федерации по диагностике полиомиелита для подтвержде¬
ния результатов и проведения внутритиповой дифференциации.Молекулярное типирование энтеровирусов основано на определении нуклео¬
тидной последовательности в области генома, кодирующей белок капсида УР1.
Типирование энтеровирусов методом амплификации и прямого секвенированиянуклеотидных последовательностей участка вирусного генома УР1 обладает
высокими показателями специфичности и может проводиться с применением
лабораторных методик, не имеющих государственной регистрации на территории
РФ. Серотип и генотип энтеровируса определяют сравнением полученной нуклео¬
тидной последовательности с имеющимися в банке данных КСВ1 (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/) последовательностями прототипных штаммов энтеровирусов
человека.
Глава 25
Микологические исследованияСИСТЕМАТИКА И КЛАССИФИКАЦИЯ ГРИБОВПоследние два десятилетия характеризуются неуклонным ростом
распространенности микологических инфекций, отмечается увели¬
чение эпидемиологической роли видов с природной резистентно¬
стью к антифунгеальным препаратам, накопление штаммов с при¬
обретенной резистентностью,с точки зрения клинической лабораторной диагностики целе*
сообразно учитывать уровень патогенности/степень биологической
угрозы, которую представляет тот или иной гриб. Б России возбу¬
дителей инфекционных заболеваний классифицируют по группам
патогенности (I-IV по убыванию) в зависимости от степени их
социально-эпидемиологической опасности, В странах Европы и
США классифицируют возбудителей по степеням биологического
риска, который они представляют для людей.В клинической практике прогностическая значимость той или
иной микологической инфекции определяется риском разветия
системных патологических процессов. Наибольшее значение в кли¬
нической практике имеют грибы, относящиеся к трем родам:■Ф“ Aspergillus;❖	Cryptococcus;■о- Candida.На фоне широкого распространения этих микроорганизмов про¬
исходит развитие системных процессов. Смертность от системного
ка нд и доза, по данным многих исследователей, может достигать при
отсутствии своевременной диагностики и терапии от 55 до 70%,
Знание наиболее часто выявляемых в биоматериалах различных
локализаций возбудителей позволяет рационально планировать
этап лабораторной диагностики пациента с подозрением на микоз,
избежать дорогостоящих, но малоинформативных методов, сокра¬
тить время, затрачиваемое на обследование.Лабораторный мониторинг антифунгеальной чувствительности
наиболее распространенных возбудителей микологических инфек¬
ций позволяет сформировать систему обоснованной эмпирической
терапии максимальной эффективности.
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 727Физиология грибовГрибы — аэробные организмы, являющиеся гетеротрофами, неспособны к
фотосинтезу, неподвижны. Толстые клеточные стенки грибов препятствуют актив¬
ному поглощению питательных веществ, поэтому питание грибы осуществляют с
помощью абсорбции из окружающей среды. Такой тип питания предполагает рост
гриба на источнике питательных веществ или внутри него. Большая площадь вса¬
сывающей поверхности создается сетью гиф. Нерастворимые вещества, например
кератин, грибы переваривают с помощью экзоферментов за пределами клетки.
Азот, сера, фосфор и ионы магния и других металлов, составляя основу питания
гриба, могут поглощаться им в неограниченной форме. Интенсивность роста
грибов зависит от концентрации питательных веществ, часто рост лимитируется
источником углерода. Высокие температуры (до 60 "С) и сильный холод не исклю¬
чают присутствия грибов. В природе они преобладают над бактериями в средах
с более высокой концентрацией водорода (pH = 3,5н-6,5). Наряду с этим многие
грибы развиваются в чистых культурах при pH = 6,5-^-8,5 так же хорошо, а иногда
даже лучше, чем в кислой среде. Нейтральная или слабощелочная реакция среды,
как правило, способствует развитию их конкурентов, прежде всего бактерий.
Жизненный цикл гриба можно охарактеризовать следующими этапами:❖	прорастанием (заражением для грибов — абсолютных патогенов);распространением или размножением.Непосредственно после прорастания тело гриба состоит из нерасчлененного
протопласта (таллома, колонии) или сходных друг с другом, окруженных клеточ¬
ной стенкой единиц (гифов), которые питаются и размножаются в значительной
степени независимо друг от друга — вегетативная фаза. Процессы дифференци¬
ровки и формирования различных специализированных органов размножения
составляют репродуктивную фазу жизненного цикла гриба. Рост и развитие гриб¬
ной колонии изменяют окружающую среду. Она может обедняться питательными
веществами, высыхать или разжижаться; наряду со сдвигами pH, окислительно¬
восстановительного потенциала и осмолярности начинают влиять ингибирую¬
щие (антибиотики) и стимулирующие (ростовые факторы, гормоны) факторы.
Отклоняются от исходных значений концентрации кислорода и диоксида углеро¬
да. Выживанию грибов это обычно не угрожает, так как вследствие эволюционного
отбора у них сформировались реакции на изменяющиеся условия существования.
Физиологические ограничения (постепенное высыхание, дефицит отдельных ком¬
понентов питания и др.) вызывают переход от первичного метаболизма к вторич¬
ному, обычно к образованию покоящихся и репродуктивных органов.Если условия изменяются незначительно и постепенно, форма гриба (размер
клеток, толщина их стенки, степень агрегации гиф, образование хламидоспор
и т.д.) модифицируется также плавно, затрагивая лишь незначительные части
таллома. При глубоких или длительных изменениях среды происходят качествен¬
ные перестройки метаболизма. Вегетативная фаза завершается, и начинается
репродуктивное развитие. Внешне для разных таксономических групп грибов это
выражается в образовании воздушного мицелия, конидий, плодовых тел, К концу
такого развития в экстремальном случае все части вегетативной грибницы пре¬
вращаются в покоящиеся либо расселительные структуры или отмирают, то есть
ответной реакцией гриба на ухудшение условий окружающей среды становится
активное формирование «переживающих структур», а не перевод метаболизма в
«дремлющую» фазу. Вариабельность ответных реакций грибов на изменения раз¬
личных параметров среды обитания является источником многочисленных диа¬
гностических и прогностических ошибок, а также неправильной оценки эффек¬
тивности терапии.
728МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯВозбудители микозов, наиболее часто выявляемые
при исследовании биологических материаловДля правильной интерпретации результатов микологических исследований
одним из определяющих моментов является знание типичных биотопов различ¬
ных микромицетов в организме человека (табл. 25-1). Накопленный к настоящему
времени клинический опыт, знания о биологии и эпидемиологии грибов позво¬
ляют разделить получаемую с помощью лабораторных методов информацию о
нахождении грибов, их различных биосубстратов на три группы.•	Виды грибов, нахождение которых в любом биологическом материале явля¬
ется достоверным признаком микоза (дерматофиты, пневмоцисты, бласто-
мицеты).•	Грибы, нахождение которых в материале в норме стерильных биологических
жидкостей и тканей свидетельствует о заболевании с учетом данных клиники
и анамнеза пациента (криптококки, аспергиллы и другие плесневые грибы).•	Грибы-оппортунисты и комменсалы, имеющие представительство на несте¬
рильных субстратах (кожных покровах, слизистых оболочках), об этио¬
логической роли которых в возникновении заболевания свидетельствует
нахождение их в количестве, значительно превышающем обычные значения
(грибы рода Candida).Перед взятием образца важно понимать, какой материал должен быть взят и
что предполагается обнаружить.Таблица 25-1. Возбудители микозов, наиболее часто выявляемые при исследовании различных
биологических материаловВозбудительAspergillus spp.Candida spp.Cocciöioides immitisCryptococcus spp.Epidermohpyton spp.FusariumMalasse2la spp.Microsporum spp.Pneumocystis cariniiScedosporium apiospermumSporotrix schenckiTrichptiyton spp.Trichosporon spp.Г иалогифомицегыДерматофитыЗигомицетыФеогифомицетыИсследуемый биологический материал11ЦIIS'S
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 729ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЙ ЭТАП
ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ МИКОЗОВс учетом потенциальной опасности взятие любого исследуемого в лаборатории
биологического материала следует проводить с применением правил асептики.Сбор материалаКОЖАСбор материала с кожных поражений проводят с помощью соскоба, мазка,
отпечатка липкой лентой. Предварительно следует обработать пораженное место
тампоном, смоченным 70% этиловым спиртом, особенно если на этот участок
кожи были нанесены крем, пудра или иные косметические препараты. Такая обра¬
ботка позволяет уменьшить контаминацию исследуемого материала посторонней
бактериальной флорой.•	Соскоб — наиболее частый способ сбора материала с кожи. Для соскоба при¬
меняют тупые скальпели, кюретки (во избежание травм кожи), предметное
стекло. Взятие материала оптимально проводить с наружного края пораже¬
ний, так как здесь наиболее высоко содержание жизнеспособных, активно
размножающихся грибов. В случае пузырных высыпаний необходимо взять
для исследования покрышки свежих пузырьков, пузырей, обрывки мацери-
рованного эпидермиса.•	Мазок берут с участков кожи в области естественных складок, с мацериро-
ванных очагов, при выраженном воспалении. Взятие материала проводят
стерильным тампоном, смоченным водой, физиологическим раствором или
жидкой питательной средой.•	Отпегаток с помощью липкой ленты применяют при отсутствии видимого и
скрытого шелушения патологического кожного очага. Прозрачную липкую
ленту прижимают к очагу, затем удаляют и кладут липкой стороной на пред¬
метное стекло, тщательно расправляя ее.Собранные методом соскоба чешуйки кожи помещают в чашки Петри для транс¬
портирования соскобов с маркировкой дна чашки и доставляют в лабораторию.НОГТЕВЫЕ ПЛАСТИНКИПеред взятием материала поверхность ногтя обрабатывают тампоном, смочен¬
ным 70% этиловым спиртом. Сбор материала проводят скальпелем, лезвием брит¬
вы, маникюрными ножницами, кусачками, бором или фрезой бормашины.При поверхностной форме онихомикоза делают соскобы с пораженной части
ногтевой пластинки до здоровых слоев ногтя, не пораженных грибом. Оптимально
использовать для анализа средние слои ногтевой пластины.При локализации патологического процесса в дистально-латеральных зонах
ногтя для исследования берут срезы ногтевой пластинки. Желательно делать срез
во всю толщу ногтя и наиболее далеко от его свободного края. Кроме того, необ¬
ходимо исследовать подногтевые роговые гиперкератотические массы, по воз¬
можности захватывая наиболее проксимальные и глубою^е слои. Поверхностные
слои соскобов ногтевых пластин и гиперкератотических масс не используются в
исследовании из-за высокой контаминации бактериальной микрофлорой.В случае подногтевой локализации очага в проксимальной части ногтевой пла¬
стинки взятие материала проводят бормашиной. Ногтевую пластинку просверли¬
вают бором. Образующуюся пыль собирают с помощью отсоса.
штш730 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯволосыПеред взятием материала проводят выбор очага с помощью лампы Вуда. Волосы
эпилируют пинцетом. Коротко обломанные волосы из очагов можно извлечь
иглой. При фавусе взятие волоса проводят из центра скутулы, при микроспории,
инфилыративно-нагноительной трихофитии — с периферии очага.Собранный материал (соскобы и срезы ногтевых пластинок, волосы) помещают
в стерильные чашки Петри с маркировкой дна и транспортируют в лабораторию.ЯЗВЫ ВАРИКОЗНЫЕ, ИШЕМИЧЕСКИЕ И ДИАБЕТИЧЕСКИЕ. ПРОЛЕЖНИМазок с поверхности раны существенно менее информативен, чем проба, аспи-
рированная шприцем.Материал получают следующим образом:❖	очищают поверхность раны стерильной салфеткой, смоченной стерильной
дистиллированной водой;❖	используя лезвие скальпеля, получают соскоб с периферической границы
раны.Помещают материал в стерильный контейнер с завинчивающейся крышкой или
специально смонтированную стерильную стеклянную емкость, причем для предо¬
хранения пробы от высыхания добавляют в емкость 1-3 капли дистиллированной
воды и сразу же передают пробу в лабораторию.СЛИЗИСТЫЕ ОБОЛОЧКИ
Полость ртаСбор проб со слизистой оболочки ротовой полости проводят утром натошак до
приема пищи после полоскания рта теплой кипяченой водой. Взятие материала
проводят с помощью стерильных влажных тампонов соскобами с пораженной
поверхности. Пленки и налеты со слизистой оболочки снимают стерильной лож¬
кой Фолькмана, стоматологическим шпателем или бактериологической петлей.Слизистые оболочки урогенитального трактаПри воспалительной симптоматике урогенитального тракта образец из уретры
у мужчин берут бактериологической петлей объемом 1 мкл либо дакроновой щет¬
кой/тампоном; при выделениях из уретры поверхность головки полового члена и
область наружного отверстия уретры должны быть очищены с помощью марле¬
вого тампона, крайняя плоть отведена назад для предупреждения контаминации.
При отсутствии свободных выделений необходимо попросить пациента слегка
помассировать }фетру скользящими движениями от основания пениса к его голов¬
ке. После введения пластиковой петли в уретру на 1-2 см необходимо плоскость
«глазка» петли двигать к отверстию, слегка нажимая на стенки уретры. Не реко¬
мендуют вращать петлю во время процедуры взятия образца в связи с болезнен¬
ностью этой манипуляции для пациента. Образец из препуциального мешка берут
дакроновым тампоном.У женщин на исследование берут соскобы из уретры, цервикального канала, с
заднего и боковых сводов влагалища, свободно стекающие выделения из заднего
свода влагалища. Для получения проб со слизистых оболочек уретры, влагалища
(заднего свода), цервикального канала рекомендуют использовать одноразовый
стерильный инструментарий: уретральный пропиленовый зонд с синтетическим
ворсом — «сваб» (вискозой или дакроном), а также специальные щеточки-
браши — cervix brush и vola brush. Для получения полноценного материала из шейки
матки рекомендуют использовать одноразовый стерильный инструментарий,
например шпатель Айре; для беременных, женщин в менопаузе и после конизации
шейки матки — специальные браши, представляющие собой щеточки с множе¬
ственными щетинками, расположенными по спирали.
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 731После обнажения шейки матки в зеркалах тщательно очищают шейку от секре¬
тов вагины и слизи с помощью ватного тампона, смоченного стерильным физио¬
логическим раствором или стерильной водой. После этого щеточку (стерильный
зонд-тампон, или зонд-тампон транспортного коллектора со средой) осторожно
вводят в цервикальный канал на глубину 1,0-1,5 см, не касаясь стенок влагалища.
Вращая любой из перечисленных выше инстр5'’ментов несколько раз вокруг оси,
захватывают материал — клетки, экссудат по периметру цервикального канала.Сбор пробы из уретры у женщин осуществляют через 1 или 2 ч после мочеи¬
спускания. Стимулируют образование отделяемого легким массажем уретры через
влагалище, собирают образовавшееся отделяемое стерильным зондом-тампоном.Соскобы слизистой оболочки пищевода проводят при фиброгастродуоденоскопии.МОКРОТАСбор мокроты проводят утром сразу же после пробуждения, натощак. Пациент
должен предварительно почистить зубы и прополоскать полость рта кипяченой
водой, что позволяет механически удалить основн)^ю часть вегетирующей в рото¬
вой полости микрофлоры и остатки пищи. Предупреждают больного, чтобы он не
собирал в контейнер слюну или носоглоточное отделяемое. Пациенту предлагают
глубоко прокашляться; если кашель сухой, непродуктивный, можно попытаться
стимулировать появление мокроты с помощью ингаляций.Если же пациент не выделяет мокроту или выделяет ее только эпизодически и
в скудном количестве, накануне вечером и рано утром в день сбора мокроты сле¬
дует дать ему отхаркивающее средство или применить раздражающие ингаляции.
Последние провоцируют усиление секреции бронхов, кашель и отделение мокро¬
ты. Собранный таким образом материал не подлежит консервации, поэтому при¬
готовление мазков из такого материала необходимо проводить в день его сбора.Для аэрозольных ингаляций используют портативные или стационарные
аэрозольные ингаляторы. Для ингаляции рекомендуют использовать раствор,
віл которого содержится 150 г натрия хлорида (NaCl) и 30 г натрия бикарбо¬
ната (Ыа^СОз). Для предотвращения загрязнения раствора кислотоустойчивыми
сапрофитами, которые нередко содержатся в водопроводной воде и могут при¬
вести при микроскопическом исследовании к получению ложноположительного
результата, используют дистиллированную воду. Для провокации выделения
мокроты необходимо вдохнуть от 30 до 60 мл подогретого до 42-45 °С физиоло¬
гического раствора. Продолжительность ингаляции должна составлять не менее
10-15 мин.Поскольку вдыхаемый во время ингаляции раствор вызывает усиленную сали¬
вацию еще до появления кашля и отделения мокроты, в первые минуты после
завершения процедуры пациент должен сплюнуть слюну в специально приготов¬
ленный лоток с 5% раствором хлорамина или другого дезинфицирующего сред¬
ства и только после этого собрать мокроту для исследования. В связи с тем что
аэрозольная ингаляция вызывает выделение водянистого секрета, напоминающе¬
го по консистенции слюну, во избежание выбраковки материала в направлении и
на флаконе с материалом должна быть обязательная маркировка, указывающая на
то, что материал получен после аэрозольной ингаляции.Образцы мокроты должны быть исследованы не позднее 2 ч после сбора.
Допускается хранение образцов в холодильнике при 4 “С. Сзточная мокрота не
подлежит микологическому исследованию из-за быстрой контаминации бактери¬
альной микрофлорой.БРОНХОАЛЬВЕОЛЯРНЫЙ ЛАВАЖСбор лаважной жидкости проводят при промывании бронхов с помощью фибро-
бронхоскопа. Шприцем вводят через биопсийный канал бронхоскопа отдельными
732 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯпорциями стерильный небактериостатический (официнальный) физиологический
раствор (общий объем — от 5-20 до 100 мл).Перед введением следующую порцию физиологического раствора осторожно
отсасывают введенной частью шприца в стерильный одноразовый контейнер с
завинчивающейся крышкой или в стерильную одноразовую или стеклянную про¬
бирку с пробкой или оставляют в закрытом шприце, предварительно удалив из
него воздух (как правило, 50-70% введенного физиологического раствора нахо¬
дится в лаваже).Каждую отсасываемую порцию собирают в отдельную посуду.По окончании процедуры соединяют пробы, полученные из одного и того же
участка. Пробы из разных участков (например, правой верхней доли легкого и
правой нижней доли) следует соединять вместе только после консультации с леча¬
щим врачом.Транстрахеальная аспирация малоинформативна и чревата частыми осложне¬
ниями.МОЧАИсследуют среднюю порцию мочи, собранную утром у пациентов без катери-
зации мочевого пузыря. Перед сбором пробы необходимо тщательно промыть
наружные половые органы и область заднего прохода теплой кипяченой водой;
особое внимание при этом следует уделять обработке отверстия мочеиспуска¬
тельного канала у мужчин (преддверию влагалища — у женщин) для уверенности,
что при проведении процедуры проба не будет дополнительно контаминирована
микробами. Для обработки не допускается использование дезинфектантов, так как
при попадании в пробу они могут ингибировать рост микроорганизмов.Пробу передают в лабораторию не позднее чем через 2 ч с момента сбора. Для
культурального исследования используют осадок центрифугата мочи. Не допуска¬
ется использование пробы из суточной мочи.Для исследования не принимают мочу из мочеприемников, подкладного судна,
пеленок. У детей сбор мочи проводят методом надлобковой аспирации.КРОВЬПри подозрении на фунгемию с помощью венепункции периферических вен
(чаще вены локтевого сгиба) или из пятки у новорожденных в асептических
условиях берут 10 мл венозной крови (у детей — 5 мл) либо, при отсутствии
положительного результата исследования и нарастании симптоматики, исследуют
артериальную кровь.При подозрении на эндокардит и вялотекущий сепсис с маленькой (10-30 КОЕ/
мл) концентрацией возбудителя в циркуляции:при остром процессе собирают две пробы из двух участков различных сосу¬
дов в течение первых 1-2 ч подъема температуры тела (не на пике темпера¬
туры!) и до начала терапии;❖	при подостром или вялотекущем течении собирают в первый день три пробы
с интервалом 15 мин и более. Если все пробы отрицательны, на вторые сутки
после посева собирают еще три пробы;<0^ у пациентов с эндокардитами, получающими антибиотики, собирают по две
отдельные пробы в каждый из трех дней с положительной клинической дина¬
микой терапии;❖	у больных, в комплекс терапии которых включены антибиотики, собирают
шесть проб в течение 48 ч; пробы необходимо собирать непосредственно
перед введением (приемом) следующей дозы препарата;при наличии у больного лихорадки неясного генеза первоначально собира¬
ют две пробы из разных кровеносных сосудов (двух участков сосуда), затем
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 733через 24-36 ч еще две пробы на фоне повышения температуры тела (не на
пике температуры!).Все гемфлаконы с образцами венозной и/или артериальной крови, взятые у
пациентов с подозрением на фунгемию или сепсис, сохраняют при температуре
37 °С в течение 7-10 сут для выявления медленно растущих видов.Исследованию подлежат также постоянные центральные катетеры.ПРОБЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБСЕМЕНЕННОСТИ СОСУДИСТОГО КАТЕТЕРАПри подозрении на катетерассоциированную инфекцию материал собирают
следующим образом:❖	очищают кожу вокруг катетера стерильной марлевой салфеткой, смоченной
70% этиловым спиртом;❖	с соблюдением правил асептики удаляют катетер;■0^ стерильными ножницами отрезают около 5 см от дистального конца катете¬
ра;❖	помещают отрезанный кусок в сухую стерильную одноразовую пробирку с
пробкой, или стеклянную пробирку, или стерильный одноразовый контейнер
с завинчивающейся крышкой (для сбора мокроты);❖	немедленно передают материал в лабораторию, для предохранения от высы¬
хания можно добавить несколько капель стерильного физраствора.СПИННОМОЗГОВАЯ ЖИДКОСТЬПри люмбальной пункции собирают 3-5 мл ликвора. Сбор проб проводят мед¬
ленным заполнением трех пробирок тремя порциями материала для исследования
в лабораториях. Используют только стерильные пробирки с плотно закрывающи¬
мися крышками (одноразовые с пробкой или стеклянные со стерильной резино¬
вой пробкой).Из трех пробирок с материалом, полученным при люмбальной пункции, всегда
отправляют пробирку с самым мутным содержимым, как правило, это вторая про¬
бирка в процессе сбора пробы. Материал центрифугируют, полученный суперна¬
тант исследуют серологическими методами, а осадок микроскопируют или иссле¬
дуют культуру.ЖИДКОСТИ СТЕРИЛЬНЫХ ПОЛОСТЕЙ ОРГАНИЗМАПлевральную, внутрибрюшинную жидкости, собранные путем аспирации или
с помощью дренирования, собирают в стерильные пробирки с добавлением гепа*
рина в разведении 1:1000, Дренажную жидкость при перитонеальном диализе
собирают без добавки гепарина. Осадок центрифугата исследуют культуральными
методами.Минимальный объем жидкости, который необходимо направить в лаборато¬
рию для выявления грибов (кроме крови, ликвора, мочи), составляет 10-12 мл.
При этом следует иметь в виду, что больший объем пробы увеличивает возмож¬
ность обнаружения патогена.КОСТНЫЙ МОЗГПри подозрении на глубокий микоз (например, гистоплазмоз, криптококкоз)3-5 мл аспирата костного мозга помещают в стерильную пробирку с 0,5 мл сте¬
рильного раствора гепарина 1:1000. Посев материала на питательную среду про¬
водят сразу после взятия материала,гнойВзятие гноя из абсцессов кожи и свищевых ходов проводят стерильными шпри¬
цем и иглой. Из вскрывшихся абсцессов и с поверхности язв взятие материала
проводят бактериологической петлей, ложкой Фолькмана, пастеровской пипет-
II	734 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯкой. Если взятие материала осуществляют тампонами, что нежелательно, следует
ЙН<	погружать тампон как можно глубже. При наличии в гное зерен и сгустков их обя¬зательно берут на исследование.Отделяемое дренажей, используемых для активной аспирации полостей, отса¬
сывают стерильным шприцем с плотным поршнем в объеме 2-4 мл. Затем на
заполненный шприц надевают стерильную иглу, закрытую стерильным ватным
тампоном, удаляют из шприца избыток воздуха. Ватный тампон сбрасывают в
дезинфицирующий раствор. Конец иглы вкалывают в стерильную резиновую
пробку и в таком виде шприц с материалом доставляют в лабораторию.ЯЗВЫ и УЗЕЛКОВЫЕ УТОЛЩЕНИЯМазок с поверхности язвенного дефекта существенно менее информативен, чем
проба, выполненная методом кюретажа. Очищают поверхность язвы 70% этило¬
вым спиртом, затем дезинфицируют 1-2% раствором йода или другим дезинфек¬
тантом. Раствор йода удаляют после проведения процедуры стерильной салфет¬
кой, смоченной 70% этиловым спиртом, чтобы избежать ожога пациента.•	Сухой стерильной салфеткой удаляют некротические массы, детрит, гной.•	Кюретажной ложкой выскабливают основание язвы или узелкового утолще¬
ния.•	Помещают материал в стерильный контейнер.При наличии экссудата в язве или узелке рекомендуют собирать пробу с помо¬
щью шприца во избежание контаминации материала.БИОПТАТМатериал для патоморфологического исследования берут из середины и краев
очага поражения с соблюдением стандартных правил асептики. Пробы, получен¬
ные во время операции, помещают в емкость с анаэробной средой, в стерильную
пробирку с тиогликолевой средой, закрытую стерильной резиновой пробкой, либо
в стерильную сухую одноразовую пробирку типа «Эппендорф».Материал помещают в специальный штатив из материалов, подлежащих стери¬
лизации в автоклаве, и немедленно отправляют в лабораторию.В некоторых странах Евросоюза (Италии, Франции) при заборе биоптата при¬
нято использовать кроме флаконов со средами для аэробов и анаэробов также
отдельный флакон с жидкой средой Сабуро для выявления микологических
инфекций.ТранспортировкаМатериал, предназначенный для культурального исследования микологических
инфекций, можно хранить в транспортной среде или физрастворе при комнатной
температуре не более 4 ч, предохраняя от воздействия прямых солнечных лучей и
тепла.Материал для гистологического исследования можно хранить до 48-72 ч в
холодильнике при температуре 4-8 “С.Допускается пересылка материала в замороженном состоянии без консервации.
Недопустимо после размораживания повторное замораживание диагностического
материала, что ведет к нарушению структуры и тинкториальных свойств грибных
клеток. Исследуемый материал транспортируют в специальной таре или металли¬
ческих биксах.Каждая проба материала должна быть промаркирована, иметь соответствую¬
щее направление, на котором указываются фамилия, инициалы, возраст или год
рождения пациента, штрих-код или идентификационный номер истории болезни,
идентификационный номер образца, локализация и тип образца, дата и время
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 735взятия материала. На самом контейнере с образцом указывается идентификацион¬
ный номер образца или штрих-код. При отсутствии вышеназванной информации
образец не подлежит исследованию и выбраковывается.МАКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение грибов в нативных препаратах визуальноPiedrata. В случае поражения волос плесневыми грибами Trichosporon ovides и
Т. inkin, являющимися возбудителем белой пьедры, диагностику проводят методом
осмотра пораженных участков волос под лупой.Макроскопически обнаруживают:❖	мягкие гранулы, легко отделяющиеся от волоса:❖	«футляры» вдоль стенки волоса.Гриб поражает только кутикулу волоса и растет перпендикулярно поверхности
дистальной части волос.Определение грибов в нативных препаратах с лампой Вуда
(люминесцентное исследование)Методика основана на феномене люминесцентного свечения некоторых грибов
при воздействии ультрафиолетового излучения с длиной волны 290-320 нм.Исследование проводят в затемненном помещении с помощью лампы Вуда.
Метод эффективен для обнаружения в нативных образцах клинического материа¬
ла следующих видов грибов:❖	Maiassezia (Pityrosporum) — чешуйки кожи, роговой слой эпидермиса;❖	Microsporum - волосы;Trichpkyton schonleinii — волосы;❖	Trichphyton mentagrophytes — чешуйки кожи (свечение светло-зеленое или нет
флюоресценции).Перед исследованием очаги необходимо очистить от остатков мазей, корок;
проводимая перед исследованием мазевая терапия может служить источником
ложноотрицательных результатов.При поражении волос грибами рода Microsporum наблюдают ярко-зеленое све¬
чение, причем светятся как остистые, так и пушковые волосы. При исследовании
свежих очагов свечение может отсутствовать, что связано с незначительным по
площади поражением волоса. В таких случаях свечение волоса можно обнаружить
в прикорневой части после эпиляции. Погибшие волосы сохраняют способность к
свечению.Исследование дерматофитий с помощью лампы Вуда является вспомогатель¬
ным диагностическим методом и служит для определения распространенности
поражения волосяного покрова, оценки эффективности проводимой терапии,
эпидемиологического контроля контактных лиц, особенно при исследовании в
эпидемиологических очагах (детских коллективах), выявления инфекции или
миконосительства у животных.При обследовании пациентов с отрубевидным лишаем метод люминесцентного
свечения в лучах лампы Вуда используют для диагностики очагов поражения в
области волосистой части головы, которые могут не иметь клинической симпто¬
матики в виде шелушащихся желтовато-бурых пятен. Очаги имеют зеленовато-
желтое, желтовато-коричневое или красновато-желтое свечение, В этом случае
своевременное назначение терапии в области волосистой части головы предотвра¬
щает вероятность рецидива.
щш
ш736 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯМИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯМетод используют в клинико-диагностичесю1Х лабораториях при первичном
обследовании лиц с подозрением на заболевание микозом. Во многих случаях,
особенно при поверхностных микозах, микроскопическое исследование состав¬
ляет диагностический минимум, дополняя клинико-анамнестические данные
пациента. Однако следует помнить, что результаты микроскопии не могут быть
единственным основанием для постановки клинического диагноза. Клинический
материал для нативного микроскопического анализа возбудителей микозов пред¬
ставлен в табл. 25-2.Таблица 25-2. Клинический материал для нативного микроскопического исследования различных
возбудителей микозовДрожжевые и лрожжепадобиые грибыКлинический материалСапШаСтурЛо-сосшСео/п-сйш(Р{1уго-$роп1т)ЙЬобо-ЗассЬагО'тусе5сепгЫаТНсЬо-$рогопСоскобы с кожи+-++++-Соскобы с высыпаний+-+----Соскобы со слизистой
оболочки полости рта+-+----Нопевые пластинки+-+----Мокрота-+--Моча+++-+--Желчь+------Сок простаты+------Спинномозговая жид¬
кость++-----Пунктат из закрытых
полостей+------Шцелнапьные грибыКлинический материалдермато¬феошфо-гиалогисюмицетыаскомицетызигомицетыфитыиицетыАврегдШизРетсИИитР1еФага Ьо11а1Гной-+---+Волосы-----Отделяемое свищей+-----Соскобы с кожи++---+Ногтевые пластинки++++-+Мокрота-+++-+Пунктат из закрытых
очагов-++---Гной-++--+Волосы+---+-Отделяемое пазух носа-----+
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 737Окончание табл. 25-2Клинический материалДиморфные грибыBlastomycesdematitidisСосеШШевШтШ$LoboatoboiParaco¬ccidioidesbrasiliensfsSporotrixschenckiНеклассифици¬
рованные патоген¬
ные грибыRhioosporl-diumseberiСоскобы с высыпных
элементовОтделяемое язвОтдвляемов свищейОтделяемое абсцессовОтделяемое полипоо¬
бразных очаговМокротаЭкссудатыСпинномозговая жид¬
костьГнойМочаХотя микроскопическое исследование до настоящего времени является обяза¬
тельным, его информативная ценность в зависимости от нозологической формы
микоза и характера исследуемого биологического материала значительно разли¬
чается. В крови, спинномозговой жидкости, пунктатах костного мозга возбудитель
может присутствовать в очень малых количествах, недостаточных для визуализа¬
ции. Кроме того, особенности жизненного цикла возбудителей многих системных
микозов делают их пребывание в центральном кровотоке очень кратковременным
(«пульсирующие» выбросы), что также затрудняет верификацию диагноза мето¬
дом микроскопии.Резко различается трактовка результатов в случае обнаружения грибов — абсо¬
лютных патогенов и условно патогенной микофлоры, особенно в локализациях,
являющихся в норме нестерильными (кожа, слизистые оболочки). Микроскопия
может считаться качественным методом исследования при обнаружении грибов
в стерильных в норме биологических средах организма и в материале органов и
тканей.При исследовании нестерильных субстратов на условно патогенные грибы
трактовка результатов микроскопии более разноречива. Нахождение оппортуни¬
стической флоры в больших количествах, свидетельствующих о массивной коло¬
низации субстрата, можно считать основанием для проведения культурального
исследования. Микроскопия не позволяет осуществить родовую идентификацию
возбудителя, что негативно отражается на выборе тактики терапии, неадекватное
лечение, в свою очередь, может приводить к хронизации микоза, отбору и нако¬
плению резистентных штаммов в популяции.Преаналитические предосторожностиОбразцы, предназначенные для микроскопического исследования, должны
сопровождаться письменным направлением лечащего врача. По устной просьбе,
не подтвержденной соответствующими документами, исследования не проводят.
Не следует проводить исследование безымянных проб или проб с неправильно
оформленными направлениями.
738 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯБланки направлений должны быть правильно оформлены, а каждая получен¬
ная проба диагностического материала - правильно промаркирована. На бланке
направления на исследование необходимо отметить время доставки материала в
лабораторию и фиксировать любые задержки в поступлении проб, что имеет осо¬
бое значение при отрицательных результатах.Для предупреждения случаев внутрилабораторного заражения необходимо
свести к минимуму возможность образования аэрозолей. В лабораториях при
микроскопическом исследовании основным источником образования инфекцион¬
ных аэрозолей являются манипуляции по приготовлению мазков. Аэрозоли могут
образовываться в процессе следующих манипуляций;о	приготовления мазков путем нанесения материала на предметное стекло и
распределения его по поверхности стекла;❖	прожигания не очищенных от остатков материала бактериологических
петель, которые используют для переноса материала на стекло и приготовле¬
ния мазка;-о- попыток фиксировать над горелкой невысохший влажный мазок, что приво¬
дит к вскипанию и разбрызгиванию частичек материала;
незамеченном в процессе работы попадания капель материала на рабо¬
чую поверхность столов и отсутствия последующей дезинфекции рабочих
поверхностей,приготовление мазков из нативного материалаПри приготовлении мазка для микроскопического исследования необходимо
добиваться правильной его толщины. Если мазок слишком тонкий и содержит
мало материала, при микроскопическом исследовании можно получить лож¬
ноотрицательный результат. Если мазок слишком толстый, это затрудняет его
фиксацию, материал недостаточно плотно прикрепляется к стеклу и может быть
частично или полностью удален при окраске. Кроме того, толстый мазок плохо
просматривается при микроскопическом исследовании. Не рекомендуют готовить
мазки способом растяжки материала между двумя предметными стеклами. Такой
способ сопровождается образованием биологически опасного аэрозоля.Через правильно приготовленный неокрашенный мазок можно читать газетный
шрифт, расположенный позади стекла на расстоянии 5-10 см. Ограниченная пло¬
щадь мазка (около 1x2 см в центре стекла) значительно повышает безопасность
манипуляции и последующей микроскопии, так как периферические части и ребра
предметного стекла остаются не загрязненными инфекционным материалом.Микроскопия нативных препаратовПеред исследованием плотного биологического материала необходимо измель¬
чить крупные фрагменты и просветлить препарат.Жидкий биологический материал просматривают в неокрашенном состоянии в
воде, изотоническом растворе или с применением просветления.Просветляющие жидкости•	Спирто-глицериновая смесь;❖	этиловый спирт — 1 часть;
глицерин — 2 части;❖	дистиллированная вода — 2 части.•	Раствор Люголя:кристаллический йод — 1 г;<0- калия йодид — 2 г;❖	вода — 150 мл.
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 739Методика приготовления жидкого нативного препаратаНа предметное стекло пипеткой или петлей наносят каплю материала, затем2	капли просветляющей жидкости, накрывают покровным стеклом.
Микроскопируют сначала при увеличении х400, дающем возможность увидеть
скопления клеток, псевдомицелий, мицелий и другие элементы гриба, а затем —
при большом (хЮОО с масляной иммерсией), когда возможно характеризовать
отдельные клетки.Методики лросветления плотного нативного препаратаПри исследовании тканей с высоким содержанием кератина просветление
препарата осуществляют добавлением капли 10-20% раствора щелочи (КОН
или МаОН). Экспозиция чешуек кожи 2 ч, волос 30-40 мин, ногтей — 24 ч.
Подогревание патологического материала перед микроскопированием не реко¬
мендуют, так как это может привести к выпадению кристаллического осадка солей
кальция, затрудняющего исследование (микроскопически сходного со спорами), и
разрушению грибковых элементов.Для просветления можно использовать также смесь спирта с глицерином или
раствора Люголя двойной крепости (кристаллического йода — 1 г, йодистого
калия — 2 г, воды — 150 мл). На исследуемый инокулят (чешуйки, соскобы с кожи
и высыпаний, волосы) наносят каплю 10% КОН, или смеси спирта с глицерином
(спирта и глицерина — по 2 части, воды — 4 части), или раствора Люголя двойной
крепости (кристаллического йода ~ 1 г, йодистого калия — 2 г, воды — 150 мл).
Препарат накрывают покровным стеклом. Экспозицию проводят по указанным
временнь'гм интервалам.МЕТОДИКА ОБОГАЩЕНИЯЧешуйки кожи и срезы с ногтей, помещенные в центрифужную пробирку, зали¬
вают 20-30% раствором КОН на 10-12 ч для чешуек кожи и 24 ч — для ногтей.
Полученную гомогенную желеобразную массу тщательно перемешивают и поме¬
щают хорошо просветленный патологический материал на предметное стекло.
Критерием хорошей подготовки материала считается потеря им очертаний и рас¬
плющивание при сдавливании между предметным и покровным стеклом.При микроскопии нативных препаратов могут быть хорошо видны строение
мицелия, расположение спор и отдельные клеточные элементы грибов. Однако
при применении этого метода возможны серьезные ошибки, так как клеточные
элементы могут расцениваться как элементы грибов.Так, большую клетку с вакуолями в цитоплазме можно принять за сферулу кок-
цидиоидоза с эндоспорами, а округлую клетку с кажущимся двухконт^'рным очер¬
танием — за бластоспору дрожжевого гриба. Именно поэтому на основании только
нативного препарата ставить диагноз микоза нежелательно, его необходимо соче¬
тать с исследованием окрашенных мазков и микробиологическими тестами.Микроскопия окрашенного препаратаОкраски с одним красителем называются простыми, а с использованием
нескольких красителей и обесцвечивающих компонентов — сложными.МЕТОДЫ ОКРАСКИ ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ•	Метиленового синего водный раствор (2,5 г метиленового синего, 3 мл ледя¬
ной уксусной кислоты, 10 мл воды):смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего
со 100 мл 0,01% раствора гидроксида калия;❖	мазки окрашивают в течение 3-5 мин;
740 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ❖	ополаскивают в проточной воде:❖	дифференцируют Зев 0,5% растворе уксусной кислоты;❖	ополаскивают в проточной воде.•	Метиленового синего 1% спиртовый раствор (2,5 г метиленового синего,
100 мл 95% этанола), окрашивают мазки в течение 1-3 мин.•	Метиленового синего с лактофенолом раствор (0,05 г метиленового синего,
100 мл лактофенола), окрашивают препарат в течение 30-60 мин.•	Фуксина 1% водный раствор, окрашивают мазки в течение 0,5-1,0 мин.•	Генцианвиолета 1% спиртовой раствор окрашивают мазки в течение 2-3 мин:
^ смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианвиолета со100 мл 2,5% раствора фенола (смесь хранится долго);❖	мазки окрашивают в течение 2-5 мин через фильтровальную бумагу;
промывают в проточной воде, сушат;❖	исследуют при масляной иммерсии,МЕТОДЫ ОКРАСКИ ДЕРМАТОФИТОВ•	1% раствор хлоразола черного в диметилсульфоксиде,•	5% раствор метиленового синего в дистиллированной воде (1:9).•	0,3% раствор конго красного в 5% растворе лаурилсульфата натрия.ОКРАСКА С ИНДИЙСКОЙ ТУШЬЮ (ВЫЯВЛЕНИЕ СЯГРТОСОСШ МЕОРОЯМАНЗ В
спинномозговой ЖИДКОСТИ)к капле патологического материала добавляют каплю туши, смешивают и
накрывают покровным стеклом. При микроскопии на темном фоне под большим
увеличением наблюдают почкующиеся клетки криптококка, окруженные широ¬
ким светлым ободком.Поскольку сходную микроскопическую картину демонстрируют лейкоциты
(сегментоядерные, полиморфноядерные), этот метод окраски в настоящее время
применяют редко, чаще используя реакцию латекс-агглютинации на выявление
ксиломананового антигена криптококков в ликворе.ОКРАСКА ГЕМАТОКСИЛИН-ЭОЗИНОМИспользуемые реактивы:•	раствор Вейгерта I:1г гематоксилина;❖	100 мл 96% этилового спирта,•	раствор Вейгерта II:❖	4 мл раствора полуторахлористого железа (РеСІЗ);4-	1 мл концентрированной соляной кислоты;❖	95 мл дистиллированной воды.ЖЕЛЕЗНЫЙ ГЕМАТОКСИЛИН ВЕЙГЕРТАСоставляют по мере надобности из двух основных растворов.Перед применением смешивают оба раствора точно в равных объемах. Оба
основных раствора могут сохраняться длительное время. Смешанный раствор
можно применять лишь несколько дней.Методика окраски гематоксилин-эозином•	Смешивают растворы Вейгерта I и II.•	Окрашивают препараты 1-2 мин.•	Промывают водопроводной водой.•	Проводят дифференцировку препаратов путем отмывания избыточной кра¬
ски в 0,1% растворе солянокислого спирта.•	Тщательно промывают водопроводной водой.
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 741ОКРАСКА по ГРАМУМетод основан на способности микроорганизмов удерживать краситель кри¬
сталлический фиолетовый или обесцвечиваться в спирте в зависимости от химиче¬
ской структуры клеточной стенки. По результатам окрашивания микроорганизмы
подразделяют на две группы: грамположительные (после окраски генциановым
фиолетовым и связывания с йодом не обесцвечиваются в органических раство¬
рителях, оставаясь сине-фиолетовыми) и грамотрицательные (обесцвечиваются
за счет высокого содержания липидов и отсугствия тейхоевых кислот в клеточной
стенке; становятся розово-красными после подкрашивания сафранином или фук¬
сином).Используемые реактивыРаствор кристаллического фиолетового по Эрлиху: 1,2 г кристаллического
фиолетового растворяют в 12 мл 96% спирта и добавляют 100 мл свежеприготов¬
ленной анилиновой воды, полученной при смешивании 2 мл анилина со 100 мл
воды. Эта красящая смесь может храниться 2 нед. Генциановый фиолетовый, кри¬
сталлический фиолетовый и метиловый фиолетовый принадлежат к красителям
трифенилметанового ряда, что позволяет использовать их в равной степени при
окраске по методу Грама.Красящие смеси для грамположительных бактерий:<!► 10 г кристаллического фиолетового + 100 мл спирта;10 г генцианового фиолетового + 100 мл спирта;10 г метилового фиолетового + 100 мл спирта;1	мл насьщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового -ь
10 мл дистиллированной воды;❖	0,25 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового +
100 мл 5% раствора уксусной кислоты;^ 8-9 г метиленового синего 4-100 мл спирта;30 мл насыщенного раствора метиленового синего в спирте + 1 г гидроксида
калия + 99 мл дистиллированной воды.Красящие смеси для грамотрицательных бактерий:8-9 г основного фуксина + 100 мл 96% спирта;^ 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина + 10 мл дистилли¬
рованной воды;❖	1 г основного фуксина + 1 г фенола + 0,5 мл глицерина + 10 мл 96% спирта -ь
100 мл дистиллированной воды;^ 0,2-0,5% водный раствор сафранина либо 0,25% раствор сафранина в 10%
спирте.Методика окраски•	Наиболее распространенный в настоящее время метод фиксации мазков
над пламенем горелки потенциально опасен для персонала возможностью
образования аэрозолей инфицированного материала. Также возможно разру¬
шение структуры грибов, что приводит к ложноотрицательным результатам
исследования, поэтому рекомендуют фиксацию в парах формалина (в сосуде
Коплина) в течение 15 мин,•	Наливают на фиксированный мазок карболовый или анилиновый ген¬
циановый фиолетовый (или кристаллический фиолетовый) на 2-3 мин.
Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу. Очень
удобно работать с полосками фильтровальной бумаги, предварительно про¬
питанной 1% спиртовым раствором одного из вышеуказанных красителей и
затем высушенной (метод Синева). Такую окрашенную и высушенную бумагу
Í?HШЖ$Ш0^Ш: 742 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯнакладывают на мазок и смачивают 1-2 каплями дистиллированной воды.
Продолжительность окрашивания остается прежней (2-3 мин),•	Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу и быстро опо¬
ласкивают в водопроводной воде (15-30 с).•	Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или другим йодистым раство¬
ром, например по Г^аму (2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллиро¬
ванной воды, добавляют 1 г кристаллического йода, доливают до 300 мл, а по
Вейгерту — до 100 мл дистиллированной воды).•	Раствор сливают, мазок промывают водой,•	Дифференцируют 96% спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя
краска или наиболее тонкие участки препарата не станут бледно-серого цвета
(приблизительно 20-60 с). Во время дифференцировки препарат покачива¬
ют. Если вместо спирта использовать ацетон, то промывание продолжается
30 с. Можно дифференцировать смесью спирта и ацетона (1:1) 30 с.•	Промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.•	Дополнительно окрашивают (для выявления грамотрицательной группы
бактерий) либо 0,5% водным раствором нейтрального красного, либо раз¬
веденным (в 10 раз) карболфуксином Циля — 1-3 мин. Возможна доокраска
сафранином (0,2-0,5% водным раствором или 0,25% раствором в 10% спир¬
те), основным коричневым (бисмаркбрауном) либо пиронином J или Б (2-5
мин).•	Промывают в проточной воде 5 с и высушивают фильтровальной бумагой.В классической прописи при окраске по Граму не промывают мазки в воде нипосле окраски генциановым фиолетовым (кристаллическим фиолетовым), ни
после обработки раствором Люголя, ограничиваются лишь сливанием растворов.
Предлагаемое промывание в воде имеет целью только чистоту в работе и позволя¬
ет добиться лучшего контрастирования препарата.Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в иссиня-черный (темно¬
синий, сине-фиолетовый) цвет, грамотрицательные — в розовый, красный или
коричневый в зависимости от красителя: ядра клеток — ярко-красные, цитоплаз¬
ма — розовая, нейтрофилы, мононуклеарные клетки, эпителий и другие мате¬
риалы окрашиваются как грамотрицательные. При правильной окраске препарат
оранжево-красного цвета на тонких участках, лилово-фиолетового — на толстых.Дрожжеподобные грибы (псевдомицелий, дрожжевые клетки) грамотрицатель-
ны и окрашиваются в ярко-фиолетовый цвет.Во всех модификациях окраски по Граму лучше всего окрашиваются моло¬
дые (почкующиеся и ветвящиеся) формы гриба с рыхлой клеточной стенкой.
Нитчатые структуры видны менее отчетливо, а иногда и совсем не окрашиваются.
Кроме того, отрицательной чертой окраски по Г^аму является значительное коли¬
чество артефактов, в результате чего некоторые тканевые структуры (например,
фибрин в материале язвенного дефекта) могут быть приняты за грибы. Избежать
этой неоднозначности в интерпретации результатов микроскопии позволяет окра¬
ска препарата по Брауну-Бренну.ОКРАСКА ПО БРАУНУ-БРЕННУФиксация: 10% формалин.Методика окраски•	Мазки, отпечатки или депарафинированные срезы заливают 1 мл 1% раство¬
ра кристаллического фиолетового и добавляют 5 капель 5% раствора натрия
бикарбоната. Слегка перемешивают в течение 1 мин (растворы можно пред¬
варительно перемешать).•	Промывают проточной водой.•	Обработывают раствором Люголя в течение 1 мин.
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 743•	Прополоскивают в воде и просушивают фильтровальной бумагой.•	Обесцвечивают смесью равных частей эфира и ацетона до отхождения кра-
ски.•	Обесцвечивают рабочим раствором основного фуксина в течение 1 мин.•	Промывают водой и ополаскивают в ацетоне,•	Окрашивают 0,1% раствором пикриновой кислоты в ацетоне, пока препарат
не станет желто-розового цвета.•	Быстро ополаскивают в ацетоне, потом в смеси «ацетон-ксилол», затем в
ксилоле.•	Заключают препарат в бальзам.Грамположительные микроорганизмы — лилово-синие, грамотрицательные —
красные. Ядра клеток красно-коричневого цвета. Другие тканевые структуры
желтого цвета.Наиболее употребительными в рутинной лабораторной практике являются
методы окраски метиленовым синим и по Граму. Такой выбор оправдан простотой
методики, отсутствием многоэтапной длительной процедуры окрашивания, чет¬
кости и контрастности получаемого микроскопического препарата, небольшими
трудозатратами на проведение исследования.При просмотре препаратов, содержащих большое количество фибрина, богатый
клеточный материал, желательно применение окраски по Брауну-Бренну и ШИК-
реакции.В практике исследования биоматериала из бронхолегочного тракта (мокроты,
бронхоальвеолярного лаважа) рекоменд}ТОт дополнительную окраску РА5-методом
(ШИК-реакцией) для выявления истинных грибов-эумицетов и окраску по Цилю-
Нильсену или модификацию по методу Киньона для выявления кислотоустойчи¬
вых микроорганизмов, в первую очередь микобактерий туберкулеза, возбудителей
лепры - микобактерий Хансена, нокардий и спорообразующих дрожжей.При микроскопическом исследовании препаратов — отпечатков органов, цен-
трифугатов, гистологических срезов рекомендуют осуществлять окраску биологи¬
ческого материала тремя методами:•	окраской РА5-методом (ШИК-реакцией);•	окраской по Г^)аму или модификациями по Граму-Вейгерту, Боголепову,
методом Брауна-Бренна для выявления сопутствующей бактериальной
микробиоты, актиномицетов и нокардий;•	окраской по Цилю-Нильсену или модификацией по методу Киньона для
выявления кислотоустойчивых микроорганизмов, нокардий и спорообра¬
зующих дрожжей.ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗЕГотовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из рас¬
чета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают
20-25 мин при 37 '’С во влажной камере. После окрашивания мазки промывают в
проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краси¬
тель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг
красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше
его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая,
добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление краси¬
теля часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использо¬
вать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают
свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100% этиловый
спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плот¬
но закрытом сосуде.
744МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯМетодика окраски•	Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл
готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дис¬
тиллированной воды) в течение 40-120 мин. Используют фосфатный буфер,
но pH буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга — 5,8-6,0, для
мазка крови — 6,4-6,5.•	Ополаскивают в дистиллированной воде.•	Высушивают и исследуют при иммерсии.Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в
голубой, ядра — в красный.ШИК-РЕАКЦИЯ И ОКРАСКА НА НЕЙТРАЛЬНЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫЭти методы окраски основаны на выявлении в стенках грибов нейтральных
полисахаридов при окислении гликалиевых групп углеводов йодной или хромовой
кислотой. В стенках всех эумицетов (истинных грибов) в той или иной концен¬
трации имеется глюкан-маннановый комплекс. При окраске материала, содер¬
жащего грибы, фуксинсернистой кислотой (PAS-реакция, реакция шифф-йодная
кислота — ШИК) происходит окрашивание стенки гриба в пурпурно-красный
или фиолетовый цвет. Считают, что в основном окрашивается маннам, глюкан
PAS-отрицателен, а хитин дает слабую непостоянную окраску. Благодаря высокой
концентрации полисахаридов в клеточных стенках грибов их окраска значительно
ярче, чем окружающих их биологических сред человеческого организма.Эумицеты PAS-положительны и хорошо окрашиваются, причем как вегети¬
рующие, так и дегенеративные, в том числе и фагоцитированные элементы гриба.
Прокариоты являются PAS-отрицательными.В лабораторной практике используют модификации PAS-метода: окраску по
Хочкиссу-Мак-Манусу и окраску по Шабадашу.Методика окраски по Хочкиссу-Мак-Манусу•	Стекла помещают в раствор йодной кислоты на 5-10 мин.•	Ополаскивают в дистиллированной воде 3-4 мин.•	Помещают препараты в фуксинсернистую кислоту на 10-30 мин, затем про¬
мывают в дистиллированной воде.•	Тщательно промывают в сернистой воде.•	Окрашивают гематоксилином Гарриса, затем дифференцируют 1% водным
раствором соляной кислоты и промывают в щелочной воде (для восстанов¬
ления синеватой окраски ядер).Этапы окраски 1, 3 и 4 целесообразно проводить в затемненной оранжевой
посуде (реактивы подвержены быстрому разложению на свету).Значительным недостатком модифицированной методики PAS-реакции по
Хочкиссу-Мак-Манусу является быстрое разложение йодной кислоты. Этого
недостатка лишена методика окраски на полисахариды по Шабадашу с примене¬
нием перйодата калия.Методика окраски по Шабадашу•	Стекла помещают в раствор перйодата калия на 5-10 мин.•	Ополаскивают в дистиллированной воде 3-4 мин.•	Помещают препараты в фуксинсернистую кислоту на 10-30 мин, затем про¬
мывают в дистиллированной воде.•	Тщательно промывают в сернистой воде.•	Окрашивают гематоксилином Гарриса, затем дифференцируют 1% водным
раствором соляной кислоты и промывают в щелочной воде (для восстанов¬
ления синеватой окраски ядер).
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 745при окраске этими методами грибы окрашиваются в красно-фиолетовый
или пурпзфный цвет, ядра клеток синевато-серого цвета, общий фон бледно¬
фиолетовый. Недостатком этой методики является интенсивное окрашивание
тканевых элементов, наиболее выраженное в очагах распада.Методика окраски по Гридли10% формалин.•	Предметные стекла с исследуемым материалом (мазками, отпечатками или
депарафинированными срезами) опускают на 1 ч в 4% хромовую кислоту,
затем промывают 5 мин в проточной воде.•	Погружают препараты в реактив Фельгена, приготовленный по Колеману
(растворяют 1 г основного фуксина в 200 мл кипяченой воды, отфильтро¬
вывают и прибавляют 2 г K^S^Og — мета бисульфита калия и 10 мл нормаль¬
ного раствора соляной кислоты). Дают обесцветиться в течение суток, затем
добавляют 0,5 г активированного угля, встряхивают и фильтруют через бума¬
гу. Правильно приготовленный раствор должен быть бесцветным.•	Стекла ополаскивают в сернистой кислоте 3 раза по 2 мин (10% метабисуль¬
фат натрия — 6 мл, нормальная серная кислота — 5 мл, дистиллированная
вода — 100 мл), после этого промывают в проточной воде.•	Погружают препараты на 15 мин в альдегидно-фуксиновый раствор (фук¬
син основной — 1 г, этиловый спирт 70% — 200 г, паральдегид — 2 мл,
соляная кислота — 2 мл). Раствор оставляют на 3 дня для вызревания.
Приготовленный раствор должен быть синего цвета.•	Смывают избыток краски этиловым спиртом и промывают водой.•	Подкрашивают метаниловым желтым в течение 2-5 мин (метаниловый жел¬
тый — 0,25 г, ледяная уксусная кислота — 0,25 г. дистиллированная вода —
100 мл).•	Промывают препараты в воде, обезвоживают 96% этиловым спиртом, про¬
светляют в ксилоле и заключают в бальзам.При окраске по Гридли удается получить яркое контрастное окрашивание
грибов, в том числе и грамотрицательных. Нити окрашиваются в темно-голубой
цвет, споры приобретают оттенки от темно-розового до пурпурного, общий фон
желтый. Лучше всего окрашиваются псевдомицелий и стенки эндоспор. Плохо
окрашивается мицелий аспергилл, лучше всего — старые клетки.Преимуществом окрасок по Шабадашу и Гридли является равномерное окраши¬
вание грибов, четко выявляются фагоцитированные элементы грибов; окрашива¬
ются также и их мертвые частицы.Окраска по Шабадашу и Хочкиссу-Мак-Манусу хорошо выявляет молодые
формы грибов, особенно эндоспоры и бластоспоры, что позволяет успешно диф¬
ференцировать вид возбудителя. Однако в дегенеративно измененных формах
некоторых грибов (например, криптококков) содержание полисахаридов снижа¬
ется, количество PAS-реакций резко падает, и поэтому окраска на полисахариды
не всегда дает положительные результаты.Почти не выявляются по этим методикам возбудители мукороза.Поскольку при этих методиках окрашиваются как тканевые элементы, так и
бактерии, богатые полисахаридами, необходимо параллельно окрашивать пре¬
параты гематоксилин-эозином, чтобы дифференцировать грибы от тканевых
элементов.РЕАКЦИЯ СУЛЬФАТИРОВАНИЯОсновой метода является предварительное сульфатирование препаратов с
последующим окрашиванием толуидиновым синим, который дает метахромати-
ческую окраску грибов в красный цвет.
746 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯМетодика окраски•	Препараты помещают в абсолютный спирт на 5 мин и высушивают на воз¬
духе в течение 5 мин.•	Помещают препараты в сульфатирующий реактив на 5 мин. Сульфатирующий
реактив получают при смешивании охлажденной концентрированной серной
кислоты с предварительно замороженным диэтиловым эфиром в соотноше¬
нии 1:1.•	Затем препараты кладут на 3 мин в 3% уксусную кислоту.•	Окрашивают 0,01% раствором толуидинового синего в 3% уксусной кислоте
в течение 1 мин.•	По окончании окраски промывают в 3% уксусной кислоте 1 мин, после чего
помещают на 1 мин в 95% этиловый спирт.Метод сульфатирования позволяет выявить очень молодые формы грибов,
которые далеко не всегда могут быть выявлены с помощью PAS-метода. Особенно
информативен этот метод при диагностике кокцидиоидоза.МЕТОД ИМПРЕГНАЦИИ СЕРЕБРОМСущность метода состоит в окислении нейтральных мукополисахаридов три-
оксидом хрома с последующей окраской продуктов окисления нитрата серебра
в щелочном растворе уротропина. Применение комбинации «уротропин-нитрат
серебра» вместо реактива Шиффа (PAS-реакции) вызывает более сильное окра¬
шивание клеточной стенки грибов, окружающие же компоненты препарата
окрашиваются значительно слабее. Стенки грибковых клеток окрашиваются в
коричнево-черные цвета. Высокая контрастность окраски позволяет выявлять
грибы в некротических и обызвествленных очагах.Методика окраски по Гомори-ГрокоттуФиксация препарата10% формалин.•	Депарафинированные срезы доводят до воды.•	Препараты опускают на 1 ч в 5% хромовую кислоту.•	Промывают 10 мин в воде,•	Помещают препараты в 1% водный раствор бисульфата натрия на 1 мин для
освобождения от остатков хромовой кислоты, затем вновь промывают в про¬
точной воде 5 мин.•	Трижды ополаскивают в дистиллированной воде.•	Погружают препараты в раствор уротропин-нитрата серебра на 1,5-2 ч при
температуре 45 ‘’С или на 30-60 мин при 58-60 °С (по 25 мл уротропин-
нитрата серебра и дистиллированной воды, 1 мл 5% раствора буры).
Препараты должны стать слегка коричневыми.•	Хорошо промывают срезы в дистиллированной воде.•	Тонируют в 0,1% растворе хлорного золота в течение 2-5 мин.•	Промывают в дистиллированной воде.•	Закрепляют окраску погружением препаратов на 1-2 мин в 2% водный рас¬
твор тиосульфата натрия.•	Докрашивают в рабочем растворе светлого зеленого 30-45 с.•	Дегидратируют и заключают препараты в бальзам.Приготовление уротропин-нитрата серебра: 5 мл 5% раствора нитрата серебра
смешивают со 100 мл 3% раствора уротропина. Вначале образуется беловатый
осадок, исчезающий при помешивании, и раствор становится прозрачным и бесц¬
ветным. При комнатной температуре раствор не теряет своих свойств до 14 дней, в
холодильнике может храниться свыше месяца.
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 747Грибы окрашиваются в черный цвет, контрастируя с общим фоном. Муцин
темно-серого цвета. Внутренние части гиф грибов — темно-розового цвета,
окружающие ткани — светло-зеленого. Хотя, по мнению многих исследователей,
метод Гомори-Грокотта является лучшим для выявления патогенных грибов, он
не лишен недостатков, основными из которых являются длительность процедуры
и потребность в дорогостоящих реактивах (хлорном золоте). Помимо этого из-за
бледности фона невозможно определить отношение гриба к окружаюхцим структу¬
рам. Эритроциты могут стать темно-коричневыми и симулировать клетки грибов.
Также возможны выпадение осадков серебра и слабое окрашивание фона. Важным
ограничением является высокая квалификация врача лабораторной диагностики
как в отношении техники выполнения окраски, так и просмотра препаратов из-за
опасности спутать элементы паразитирующего гриба с тканевыми структурами,
содержащими полисахариды.К числу несомненных достоинств относится высокая выявляемость с его помо¬
щью возбудителей мукороза, плохо окрашиваемых при других методиках. Хорошо
выявляются также омертвевшие элементы грибковых клеток, причем не только в
очагах воспаления, но и в старых обызвествленных очагах.ОКРАСКА АЛЬЦИАНОВЫМ СИНИМ ПО МОУРИ•	Депарафинируют срезы и доводят до воды.•	Помещают на 1-2 ч в 0,5-2% раствор альцианового синего на 3% уксусной
кислоте или на 0,1% буфере (натрия цитрат — HCl) с pH = 2,2^2,4.•	Промывают в 3% уксусной кислоте, затем в воде.•	Проводят через спирты и заключают в бальзам.Капсулы Cryptococcus neoformans и Cryptococcus albidus окрашиваются в ярко-
голубой цвет.ОКРАСКА МУЦИКАРМИНОМ ПО МЕЙЕРУПрименяют для дифференциации криптококков. Иногда при этом методе слабо
окрашиваются клетки бластомицетов, однако их без труда различают от интенсив¬
но окрашивающихся криптококков. Исследованию подлежат парафиновые срезы
тканей.Фиксация препаратаЛюбым способом.Методика окраски•	Препарат депарафинируют ксилолом, затем абсолютным и 95% этанолом.•	Ополаскивают дистиллированной водой.•	Окрашивают в течение 7 мин гематоксилином Вейгерта.•	Промывают водопроводной водой 5-10 мин.•	Помещают в разбавленный раствор муцикармина на 30-60 мин. Интенсивность
окраски проверяют при микроскопировании контрольного препарата.•	Окрашивают метаниловым желтым в течение 1 мин.•	Ополаскивают препарат дистиллированной водой, затем 95% этанолом.•	Препарат обезвоживают, просветляют, заключают в бальзам.Муцин капсулы криптококков окрашивается в темно-розовый или красный
цвет, ядра — в черный, а фон — в желтый цвет.Методы окраски с флюоресцирующими красителямиМетод основан на наблюдении микроскопических объектов с использованием
их способности к свечению. По сравнению с методами обычной микроскопии
исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ:•	цветовым свечением;
Шш '748МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ❖	ВЫСОКОЙ степенью контрастности светящихся объектов на темном фоне;
значительно большей площадью поля зрения.Суть люминесцентной микроскопии заключается в том, что объекты (гриб¬
ковые клетки), окрашенные флюорохромами, под действием облучения ультра¬
фиолетом испускают излучение в видимом спектре света. В случае, когда объект
не окрашен специальными красителями, ультрафиолетовый свет, проходя через
объектив и попадая на препарат, поглощается молекулярными структурами объ¬
екта и остается невидимым или почти невидимым для человеческого глаза. Если
же какие-либо объекты окрашены специальным красителем, молекулы красителя
под действием ультрафиолета возбуждаются и начинают испускать кванты света в
длинноволновой области, иначе говоря — светиться. В этом случае клетка стано¬
вится источником света определенного спектра и хорошо видна на общем темном
контрастном фоне препарата.Поскольку собственная флюоресценция грибов невелика, для ее усиления при¬
меняют красители — акридиновый желтый или акридиновый оранжевый.За счет свечения вокруг клетки образуется ореол, благодаря которому види¬
мые размеры светящейся клетки превышают ее физические размеры, В связи с
этим окрашенные флюорохромными красителями препараты обычно исследуют
при увеличении Х250-450, тогда как окрашенные обычными красителями — при
увеличении Х800-1000. Разница в увеличении позволяет микроскописту видеть
одновременно в 4-10 раз большее поле зрения, что существенно сокращает время,
необходимое для просмотра мазка. Наряду с этим при люминесцентной микроско¬
пии отмечается большая резкость и контрастность микроскопической картины,
что повышает комфортность микроскопического исследования. Это делает метод
люминесцентной микроскопии особенно ценным при исследовании материала с
малым содержанием грибковых клеток.При окраске флюорохромными красителями нельзя подогревать мазки и поль¬
зоваться фильтровальной бумагой. Промывание мазков в процессе окраски следу¬
ет проводить только дистиллированной водой, так как водопроводная вода содер¬
жит соединения хлора, которые могут изменять флюоресценцию. Микроскопию
проводят по возможности сразу же после окончания процедуры окраски люминес¬
центными красителями и высыхания мазков, В случае невозможности проведения
немедленной микроскопии окрашенные мазки рекомендуют сохранять, прикрыв
черной бумагой во избежание ослабления флюоресценции. При окраске не следует
делать толстых мазков, так как это затрудняет обесцвечивание и фиксацию мазка
на стекле.При окраске мазков не следует помещать на штатив («рельсы») и окрашивать
одновременно более 12 стекол. Соприкосновение стекол боковыми краями может
привести к переносу краски и контаминации микроорганизмами с одного стекла
на соседние.Окрашенные для исследования флюорохромными красителями мазки непри¬
годны, если при окраске:❖	в положительном контрольном мазке не обнаруживаются ярко окрашенные
бактериальные клетки или они имеют тусклую флюоресценцию;❖	отрицательные контрольные мазки содержат флюоресцирующие объекты;❖	фон недостаточно темный или имеет флюоресцентное свечение.ПРОСТАЯ ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ ОКРАСКАМетодика окраски❖	Окрашивают препараты гематоксилином в течение 5 мин.❖	Промывают в воде 3-4 мин.❖	Окрашивают водным раствором акридинового оранжевого (1:1000).
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 749•	Ополаскивают в дистиллированной воде в течение 30 мин.•	Обрабатывают в 95% этаноле и абсолютном спирте (2 раза по 2-3 мин).Раствор акридинового оранжевого готовят по следующей прописи:•	безводный двузамещенный натрия фосфат (NajHPO^) — 0,01 г;•	дистиллированная вода — 100 мл;•	акридиновый оранжевый — 0,01 г.Растворяют натрия фосфат в дистиллированной воде. Добавляют акридиновый
оранжевый.Препараты просматривают в обычном световом микроскопе с электроосве¬
тителем. В качестве входного используют на конденсере голубой, а в качестве
окулярного — желтый фильтры, которые подбирают таким образом, чтобы они
полностью перекрещивались. Лучшие результаты дает просмотр в люминесцент¬
ном микроскопе.При этом одной из важных особенностей работы с мазками, окрашенными
флюорохромами. является то, что они не подлежат длительному наблюдению
в выбранном поле зрения, так как интенсивность люминесценции окрашенного
объекта быстро снижается. Другой особенностью работы является необходимость
строгого соблюдения режима работы люминесцентного микроскопа.При нанесении иммерсионного масла капля должна свободно упасть на стек¬
ло (при этом желательно немного смазать иммерсионным маслом фронтальную
линзу объектива). Пипетка капельницы масла ни в коем слзгчае не должна сопри¬
коснуться с мазком. Это может привести к переносу материала с одного мазка на
другой, к загрязнению иммерсионного масла и получению ложноположительного
результата микроскопического исследования.При микроскопии хорошо выявляется свечение грибов на темном фоне, под¬
крашенном эозином. Аспергиллы дают свечение зеленого цвета, дрожжевые
грибы рода Candida — желто-зеленого, криптококки — красного, бластомице-
ты — желто-зеленого, гистоплазмы — красно-желтого, возбудитель риноспо-
ридиоза — красного цвета. Возбудители нокардиоза при использовании этого
метода не выявляются.ОКРАСКА АКРИДИНОВЫМ ОРАНЖЕВЫМ ПО ДАРТУ-ТЕРНЕРУМетодика окраски•	Мазки фиксируют в смеси равных частей диэтилового эфира и 95% этилово¬
го спирта Б течение 1 ч.•	Проводят через спирты нисходящей концентрации (80,70,50%) и дистилли¬
рованную воду, окуная мазок по 5 раз в каждую порцию.•	Окунают 4 раза в 1% уксусную кислоту.•	Переносят в дистиллированную воду на 2 мин.•	Помещают на 3 мин в ацетатный буфер (pH = 3,8).•	Переносят в 0,01% забуференный раствор акридинового оранжевого на 3 мин.•	Дифференцируют 4 мин в ацетатном буфере фН = 3,8).•	Протирают концы предметных стекол, а затем осторожно удаляют избыток
буферного раствора фильтровальной бумагой.•	Заключают под покровное стекло в буферный раствор и оставляют на 2 мин.
Препарат исследуют с помощью флюоресцентного микроскопа сразу либо,
если мазок оставляют надолго, держат в темноте и парафинируют края
покровного стекла. Флюоресценция сохраняется в течение 3 мес.Бактерии, дрожжи, грибы рода Candida окрашиваются в красный цвет, парази¬
ты — в красный с желтыми ядрами, лейкоциты — в ярко-зеленый.
750МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯМЕТОДИКА ОКРАСКИ С ФЛЮОРОХРОМОМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДЕРМАТОФИТОВФлюорохром в смеси с 2% раствором гидроксида натрия в диметилсульфоксиде
(1:9) с предварительным просветлением патологического материала.ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ДЕРМАТОФИТОВ С ФЛЮОРОХРОМАМИ
БЕЗ ПРОСВЕТЛЕНИЯ•	Препарат окрашивают буферным раствором акридинового оранжевого с экс¬
позицией 5 мин.•	0Д% бланкофор.♦	Окрашивают с калькофлюором белым.•	\%шйех2Ъ.Методика окраски калькофлюором белымПриготовление красителя:растворяют 0,1 г калькофлюора белого (М2К) и Эванса голубого 0,05 г в
100 мл дистиллированной воды;❖	тщательно перемешивают;хранят в темной посуде при комнатной температуре.Процедура окраски;❖	добавляют 1 каплю раствора калькофлюора белого и 1 каплю раствора КОН
к исследуемому образцу на предметном стекле;■=> накрывают образец покровным стеклом;просматривают в УФ-свете, используя К530 возбуждающий фильтр и В12
барьерный фильтр (или 0365 возбуждающий фильтр и ЪР барьерный
фильтр).Флюорохром поглощается структурами гриба, и при микроскопии под люминес¬
центным микроскопом элементы гриба флюоресцируют зеленым или голубовато¬
белым цветом (в зависимости от сочетания фильтров) на тусклом красноватом
фоне. Ошибки в диагностике могут быть связаны со свечением других полисаха¬
ридов препарата, не входящих в хитиновые структуры гриба.МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (РЕАКЦИЯ
ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ - РИФ)Наибольшее распространение в практике этот метод имеет при исследовании
биологических жидкостей, с его помощью можно обнаружить корпускулярные
грибные антигены, установить наличие и локализацию антигенов, высвободив¬
шихся при разрушении грибов в организме.К числу недостатков метода относится необходимость иметь для диагностики
каждого вида, а иногда и штамма гриба соответствзтощую меченую иммунную
сыворотку, сложную в получении. При диагностике микозов с неизвестным воз¬
будителем в лаборатории необходимо иметь набор готовых иммунных высоко¬
специфичных сывороток против различных наиболее распространенных пара¬
зитирующих грибов, что весьма дорого и возможно только в условиях крупных
профильных лечебных учреждений.в табл. 25-3 суммированы методы окраски, применяемые при микроскопиче¬
ской идентификации грибов.
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 751Таблица 25-3. Методы окраски, применяемые при микроскопической идентификации грибов
(Номенклатура лабораторных исследований, 2000 г.)МикроорганизмМетод окраскиразлич¬
ные РА8-
модификацииI»IIAspergillus родBlastomycesdermatitidisCandida родChrysosporium
parvum var.
crescensCoccidioidesimmitisСотз^осош/йродEpidermohpytonfloccosumFusariumGeotrichumHistoplasmacapsulatumLoboa loboiMaiasseziaMicrosporumParacoccidioidesbrasiliensisPenicilliummarnefferiPneumocystiscariniiPseudalleschriaboydiiRhinosporidiumseberiSporotrix schenckiTrichphyton родГиалогифомицетыДерматофитыЗигомицетыФеогифомицеты
ШМтШ41:щ
Шш752 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯПричины ошибок при микроскопических исследованиях.
Структуры, имитирующие патогенные грибыИМИТАТОРЫ ГРИБОВ В ПРЕПАРАТАХ КОЖИ И ЕЕ ПРИДАТКОВ (ВОЛОС, НОГТЕЙ),
СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК•	Волокна текстиля лежат отдельно от клеток биологического материала, круп¬
нее, чем гифы грибов, неравномерной толщины, не септированы.•	Кристаллы щелочи. Имеют вид тонких волокон с двойной стенкой, но, в
отличие от мицелия грибов, не имеют общей оболочки для всех элемен¬
тов нити, не ветвятся, имеют стекловидную прозрачность, мономорфны.
Добавление под покровное стекло капли дистиллированной воды приводит к
растворению кристаллов.•	Жировые капли — имитируют дрожжевые клетки, часто встречаются в плохо
просветленном материале.•	Зерна кератогиалина могут быть приняты за споры грибов, однако они мель¬
че по размерам и расположены внутри клеток кожи, что устанавливают при
вращении микровинта микроскопа,•	Мозаичный гриб — артефакт, образующийся при кристаллизации КОН при
чрезмерном нагревании препаратов. В нем нет четкого деления на клетки. Он
представлен в виде гомогенных светлых элементов, различных по форме и
размерам, имеющих сетчатое деление. При подогревании препарата или его
хранении в течение 1-3 дней «мозаичный гриб» исчезает.•	Пузырьки воздуха.ИМИТАТОРЫ ПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ В СРЕЗАХ ТКАНИ
Имитаторы нитчатой структуры•	Нити фибрина (при окраске по 1^аму-Вейгерту).•	Вытянутые и уплощенные волокнистые фиброциты.•	Нити полисахаридов стенок капилляров при РАЗ-методе окраски.•	Базальные мембраны, щеточная кайма эпителия (РА5-метод).•	Коллагеновые и эластические волокна при импрегнации серебром по Гомори-
Грокотту.•	Ретикулярные волокна,•	Вытянутые и уплощенные волокнистые фиброциты,•	Тонкие обызвествленные волокна интерстиция, имитирующие коккоподоб¬
ный мелкозернистый мицелий нокардий.Округлые и сферические внутри- и внеклеточные имитаторы грибов•	Русселевские тельца, амилоидные тельца,•	обесцвеченные, вспученные и видоизмененные эритроциты.•	Зерна гемосидерина при импрегнации серебром.•	Микроглобулярные преципитаты рибонуклеиновой кислоты,•	Скопления муцинозных веществ Б эпителиальных клетках, макрофагах, ино¬
гда расположенные внеклеточно, выявляемые при окраске на мукополисаха-
риды,•	Выпадающие осадки красителей,•	Жировые капли,•	Округлые образования, обнаруживаемые при гранулематозных образовани¬
ях и в гигантских клетках.
яМИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВЛНИЯ 753 1^Имитаторы патогенных грибов, напоминающие сферулы или спорангииЦитоплазматические вакуоли макрофагов, симулирующие сферулу с эндоспо¬
рами.Обеспечение качества микроскопических исследованийВажным элементом обеспечения качества выполняемых исследований является
регулярное осуществление контроля качества микроскопических исследований,
который достигается систематическим наблюдением за проводимой в лаборато¬
рии работой и оценкой ее эффективности. Контроль качества осуществляется на
всех технологических этапах микроскопического исследования и включает:❖	оценку качества поступающих биопроб;❖	контроль за соблюдением рецептуры и методики приготовления реагентов и
красителей;❖	наблюдение за соблюдением методических приемов:❖	при приготовлении мазков (включая качество предметных стекол);❖	окраске мазков;
проведении микроскопического исследования;❖	учете и регистрации результатов.Кроме того, элементами внутрилабораторного контроля качества являются:❖	проверка правильности организации рабочих мест (приема и регистрации
материала, приготовления и окраски мазков, микроскопирования);❖	соблюдение правил и сроков хранения реагентов и красителей;<0^ настройка оборудования;❖	микроскопирование положительных и отрицательных контрольных образ¬
цов;своевременность и точность передачи результатов в учреждение, направив¬
шее материал для исследования.Успех применения контроля качества обеспечивается:регулярным его применением в лабораторном подразделении;
правильно обученными, заинтересованными и ответственными работниками;❖	рациональным применением регламентированных методов;
регулярным анализом допущенных ошибок и немедленным их исправлением.Одной из форм обеспечения качества микроскопических исследований является
использование в ряду клинических мазков двух дополнительных неокрашенных
контрольных мазков, один из которых заведомо является положительным, а вто¬
рой — отрицательным. Просмотр начинают с контрольных, затем просматривают
клинические мазки.Заключение по результатам микроскопического
исследованияРезультат микроскопического исследования патологического материала фикси¬
руется в специальном лабораторном журнале.Заключение оформляется для выдачи врачу-клиницисту в виде бланка, в кото¬
ром должны быть отражены патологический процесс (количество лейкоцитов при
воспалении, пролиферация, фиброз и др.), количественный и качественный состав
микрофлоры, а также наличие специфических возбудителей микоза. Заключение
формулируется не в виде диагноза, а как развернутое описание микроскопической
картины препарата. Формулировка диагноза в заключении по результатам микро¬
скопического исследования недопустима, так как она является прерогативой леча¬
щего врача, а не лабораторного работника.
ж	Ш:Ш<уМШШ 754 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯКУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕКультуральное исследование является значительно более чувствительной мето-
дикой, чем микроскопия. Выделение чистой культуры гриба применяют для иден-
тификации рода и вида гриба, подтверждения диагноза микотического процесса
отрицательных данных микроскопии.Оптимальные значения pH среды для культивирования большинства видов гри-
находятся в диапазоне 5,8-6,5.Ддд получения чистой культуры и устранения контаминации сопутствующей
бактериальной флорой используют различные селективные добавки к средам.
С этой целью наиболее часто применяют различные антимикробные вещества и
антибактериальные антибиотики.При культуральном исследовании мазок и посев проводят обязательно из одной
и той же порции материала. Это основное требование правильного микробиологи¬
ческого исследования.ТРЕБОВАНИЯ К ДОСТАВКЕ ПРОБ БИОМАТЕРИАЛА В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ
ЛАБОРАТОРИЮВсе собранные пробы отправляют в микробиологическую лабораторию немед¬
ленно после получения, за исключением случаев использования емкостей с транс¬
портировочными средами, разрешенными к применению для этих целей в уста¬
новленном порядке.Это необходимо:для сохранения жизнеспособности возбудителей и возможности вьщеления
микроорганизмов, требующих особых условий культивирования:•0- предотвращения избыточного роста быстрорастущих и активных микроорга¬
низмов;❖	поддержания соотношения исходных концентраций изолятов при наличии в
пробе микробных ассоциаций;❖	сокращения времени контакта пробы с некоторыми антисептиками, исполь¬
зуемыми местно, которые могут обладать антифунгеальной активностью;о объективизации клинического диагноза заболевания и оценки результатов
терапии.Если отделяемого всего несколько капель, его переносят из шприца в небольшую
емкость или в пробирку с транспортной средой немедленно после получения.Получение у пациента любой пробы, требующей использования инвазивных
методов, должен проводить врач (исключение — проба крови, которую может
собирать процедурная медицинская сестра).Поступивший в лабораторию материал перед обработкой и посевом следует
зарегистрировать в лабораторном регистрационном журнале. Каждой пробе
материала необходимо присвоить порядковый регистрационный лабораторный
номер, который должен использоваться при всех последующих лабораторных
исследованиях.Этап пробоподготовкиПатологический материал делят на три части: для микроскопии, культураль¬
ного исследования и повторного изучения. Засеваемый материал предварительно
измельчают.ПРИНЦИПЫ ПРЕДПОСЕВНОЙ ОБРАБОТКИ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛАВсе процедуры по переносу материала из одной посуды в другую при обработке
и посеве проводят только стерильными пипетками. Запрещается перенос мате-
МИКОЛОГИНЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 755риала переливанием его через край флаконов, пробирок или иной лабораторной
посуды. Все реактивы, используемые при приготовлении растворов для обработки
диагностических материалов, должны иметь степень очистки не менее категории
«химически чистый».Выбор алгоритма культурального исследованияОсновной средой для получения чистой культуры грибов в медицинской мико¬
логии является среда Сабуро. В нее вводят различные селективные добавки в зави¬
симости от типа исследуемого образца.Для исследования мазков со слизистых оболочек носо- и ротоглотки, урогени¬
тального тракта, при исследовании кала на дисбактериоз используют среду Сабуро
с хлорамфениколом, гентамицином, реже используют среду, содержащую комби¬
нацию этих антибиотиков. При культуральном исследовании материалов кожи и
ее придатков в качестве добавки в среду Сабуро вводят актидион (циклогексимид),
который обеслечивает селективный рост дерматофитов. Дерматофиты относятся
к медленно растущим грибам, и формирование колоний для некоторых из них
может наблюдаться лишь к концу 5-7-дневного периода инкубации. В течение
этого периода необходимо обеспечить в инкубаторе достаточную влажность во
избежание пересыхания среды. На практике хорошо зарекомендовал себя метод
культивирования дерматофитов с использованием двухфазной среды (твердая
фаза ~ агаризованная среда Сабуро с актидионом, жидкая фаза — бульон Сабуро с
цитратом или сердечно-мозговой бульон) во флаконе для гемкультуры. Актидион
из твердой фазы диффундирует в жидкую среду и препятствует росту бактериаль¬
ной флоры, а жидкая фаза препятствует пересыханию агара и обогащает агаризо-
ваннз^ю среду в зонах роста.При симптоматике иммунодефицитных состояний и подозрении на поражение
ЦНС образцы спинномозговой жидкости и сыворотки или плазмы крови высевают
в гемфлакон и одновременно проводят их исследование на наличие растворимого
ксиломаннанового антигена методом латекс-агглютинации или иммунофермент¬
ного анализа. При получении положительного результата в качестве подтверж¬
дающего метода осуществляют пересев обогащенной культуры из гемфлакона на
специализированные агаризованные среды для выявления криптококка (среда
L-DOPA). Оценивают оксидазную активность полученных колоний.Оценка результатов посеваПри оценке результатов культурального исследования необходимо соблюдать
следующие правила:посевы, выполненные в течение одного дня, помещают в отдельные ящики
или штативы с указанием даты посева и размещают их в термостате в порядке
номеров регистрации в хронологическом порядке, не нарушая его при еже¬
дневных просмотрах;❖	наблюдение за посевами и просмотр засеянных пробирок проводят ежедневно;❖	при оценке результатов регистрируют следующие параметры:-	появление роста — срок появления, начиная со дня посева;-	интенсивность роста — количество колоний;-	загрязнение посева посторонней микрофлорой;-	отсутствие роста.Соблюдение этих правил позволяет, во-первых, своевременно выявлять макро¬
скопически видимый рост грибов или загрязняющей микрофлоры, а во-вторых, на
основании регистрации сроков появления роста и его особенностей осуществлять
первичную идентификацию грибов.
¿Mlш
'MM■¿ШШ'ШШШ1756 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯИдентификация выделенных культур грибовВ лабораторно-диагностической практике используют культурально¬
морфологические критерии идентификации:вначале оценивают макроморфологические характеристики роста культуры
гриба на агаровых средах, а затем микроморфологию гриба;❖	в затруднительных случаях проводят изучение ферментативной активности
культуры гриба.В изучение макроморфологии входят:❖	оценка скорости роста и созревания;^ структуры колонии (пушистая, шерстистая, войлочная, бархатистая, паути¬
нистая, клочковатая, мучнистая);поверхности (плоская, складчатая, бугристая, куполообразная, зональная);❖	пигментации;❖	наличие экссудата на поверхности колонии.Микроморфологию грибной культуры изучают по препаратам, приготовлен¬
ным следующим способом:❖	на предметное стекло наносят каплю жидкости для приготовления препара¬
тов (спирта, глицерина, дистиллированной воды в равных частях);❖	в нее помещают кусочек грибницы, вырезанный микологической лопаточкой
из колонии в виде треугольного сектора от центральной части к периферии;❖	двумя препаровальными иглами расправляют вырезанный кусочек во избе¬
жание образования воздушных пузырьков;❖	накрывают покровным стеклом.АспергиллезВОЗБУДИТЕЛИAspergillusfumigatu, A.flavus, А. niger, А. terreus; А. nldulans и др.ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРЫ❖	Aspergillus fumigatus — колонии гладкие, бархатистые или шерстисто¬
клочковатые, цвет от различных оттенков зеленого до темно-бурого.
Обратная сторона колоний бесцветная или желтая.❖	Микроскопия:-	конидиеносцы гладкие, зеленоватые;-	септированные или несептированные;-	размеры 2-8 мкм в ширину и 300-500 мкм в длину;-	конечное вздутие (везикул) обратно-фляжковидное;-	в верхней половине находятся стеригмы, расположенные в один ряд,
размером 2-6x3-6 мкм, пригнуты кверху;-	каждая стеригма отчленяет цепочку конидий;-	гриб термофильный, хорошо растет при 37 ^С, некоторые штаммы —
при 52 °С.❖	A.flavus — колонии клочковатые, зеленовато-желтого цвета. Обратная сторо¬
на колоний желтоватая.❖	Микроскопия:-	конидиеносцы неокрашенные, шероховатые, везикул округлый;-	стеригмы однорядные, в малых головках, старые — двухрядные, с ко¬
лонками конидиальных цепочек;-	конидии грушевидные или круглые, 3-6 мкм в диаметре, склероции
обильные, вначале белые, затем бурые;-	рост культуры — при 25-37 °С.
■МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 757А, niger — колонии отличаются быстрым ростом, цвет вначале белый, со
временем становятся желтыми, с мелкими черными головками; через 4-
5 дней вся поверхность колоний становится черного цвета. Обратная сторона
колоний светло-желтая. Стеригмы расположены в два ряда друг над другом
и заканчиваются цепочками конидий с гладкой или бородавчатой поверхно¬
стью, 4-5 мкм в диаметре. Культура растет при 37 °С.А. terreus — культура растет при 2S-2>1 °С, колонии имеют клочковатую (до
вельветовой) поверхность, иногда пушистые, с радиальными полосками от
желтовато-бурого до шоколадно-коричневого цвета.❖	Микроскопия:-	конидиеносцы длинные и тонкие, гладкие, одинаковой ширины по всей
длине, размером 5-6x100-250 мкм;-	стеригмы расположены в два ряда на споровых головках;-	конидии гладкие, эллипсоидные;-	культура растет при 25-37 “С.А. nidulans — колонии темно-зеленого цвета с участками от оранжевого до
желтого в местах образования плодовых тел. Обратная сторона колоний пур¬
пурная.Микроскопия:-	конидиеносцы гладкие, короткие, коричневого цвета, размером 60-
150 мкм;-	конидии размером 3-4 мкм, шаровидные, шероховатые;-	плодовые тела коричневые, сферические, окружены большим количе¬
ством крупных стекловидных клеток;-	аскоспоры красновато-коричневые, чечевицеобразные, размером 4-
5 мкм.КандидозВОЗБУДИТЕЛИОсновными возбудителями являются С. albicans, С. tropicalis, С. parapsilosis,
С. glabrata и С. crusei. Значительно реже выявляются С. lusitaniae, С. guillermondii,
С. rugosae и др.ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРЫ<>• С. albicans на среде Сабуро имеет вид блестящих кремово-белых колоний.❖	При микроскопии колония состоит из округлых, овальных почкующихся
клеток 3-10 мкм в диаметре.^ По периферии колоний могуг встречаться нити псевдомицелия.❖	На обедненных средах формирует толстостенные хламидоспоры.❖	Биохимические характеристики С. albicans представлены в табл. 25-4.Mycotorula — шаровидный тип роста. Круглые бластоконидии образуют шаро¬
видные верти циллы.Mycocandida — ветви псевдомицелия образуют фигуру в виде елки, появление
бластоконидий запаздывает (рудиментарный тип роста).Mycotoruloides — крыловидный тип роста. Крыловидные вертициллы, состоя¬
щие из бластоконидий, расположены на перетяжках псевдомицелия с обеих сто¬
рон поочередно.Candida — цепочечный тип роста. Ветви псевдомицелия оканчиваются цепочка¬
ми бластоконидий.Blastodendrion — древовидный тип роста. Псевдомицелий, состоящий из поли¬
морфных клеток, в виде деревца. Шаровидные вертициллы могут отсутствовать.
758 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯТаблица 25-4. Биохимические характеристики наиболее часто встречаемых видов CandidaШ		Вид CandidaS
ё ^S а
S £о.1117 ла^ оX оÄ ^ Ä
S S £ifФерменгацияАссимиляцияТип ростаSSSЕ«!«П1«оа,пXсоUяежясояtv«ОгЕсопо>—лБЛSgо<9иЛSЁSтоeiаБ«QСпвоX(0ISС. albicans++++_++++-+Mycotoruloides/HycotoriJlaС. parapsilosis--+---++-++MycocandidaС. tropicalis-+++-+++-+MycotorulaMycocandidaMycotoruloidesCandidaС. glabrataС. crusei__++-__+MycotorulafJiycocandidaMycotoruloidesС. kefir--+-++++-t++MycocandidaС. guillermondii--+-+-++++-++BJastodencfriof)С. lusita-niaeКриптококкозВозбудителиCryptococcíis neoformans [var. neoformans = серотип D; var. ^ubii ~ серотип A; var
gattii = серотипы В, С; var.gmbií/var. neoformans (диплоид) = серотипы А, D].Характеристика культуры•	С. neoformans — колонии на сусло-агаре или агаре Сабуро при 37 °С белые,
желтоватые; на среде Штайба или агаризованной среде с L-DOPA ~ темно-
коричневые, гладкие, блестящие, слизисто-тягучие. Чувствительность куль¬
турального метода диагностики — 70%, Преобладают дрожжевые клетки с
одной почкой. Размеры капсулы различаются в зависимости от штамма и
состояния иммунной системы организма человека. У ВИЧ-иифицированных
в стадии СПИД встречаются бескапсульные формы или клетки с истончен¬
ной каггсулой, которые при пересеве вновь приобретают капсулу. У тканевых
форм всех видов криптококков капсула хорошо выявляется в препаратах,
окрашенных индийской тушью (чувствительность 40-70%), альциановьш
синим или основным коричневым.•	С. alhidus — колонии блестящие, гладкие, тонкие, кремового цвета.❖	Микроскопия:-	почкующиеся сферические или овальные клетки со стенками различной
толщины, размером 3-5x8-10 мкм;' гифы и псевдомицелий отсутствуют.•	С. laurentii — колонии влажные, слизистые, кремового цвета, по мере старе¬
ния приобретают палевый охристый оттенок.'í“ Микроскопия:почкующиеся сферические или эллипсоидные клетки, размером2-Зх5,5'7,0 мкм;-	гифы и псевдомицелий отсутствуют.Биохимическая характеристика культур возбудителей криптококкоза, используе¬
мая при дифференциальной диагностике методом пестрого ряда, представлена в
табл. 25-5.
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 759Таблица 25-5. Дифференциальная диагностика различных видов криптококка по ферментатив¬
ным свойствамВозбуцитепьс. neoformansС. albidusС. (aurenü'iФерментагивкые свойстваассимиляция сахаровлактозамелибиозамелицитозанитратуреазацикло-гексемидрост при 37 °СтЗигомикозыВОЗБУДИТЕЛИНизшие грибы, относящиеся к классу Zygomycetes: Rhizopus spp. (J?. arrhizus,
R. microsporus van rhizopodiformis, J?. microsporus var. oligosporus, R. stolon^er), Absidia
spp. (A. corimbifera, A. coerulea), Mucor spp. (M. drcineUoides, M. hiemalis, M. indicus,
M. racemosus, M. ramosissibus). Rkyzomucor pussibilis.•	Rhizopus spp. — колонки быстро растут при 37 “C. Воздушный мицелий обиль¬
ный, серовато-белый, шерстистый, затем по мере старения меняет цвет от
желтовато-коричневого до коричневого. Субстратный мицелий несептиро-
ванный, бесцветный, спороносцы неветвящиеся, одиночные или группами
с хорошо развитыми ризоидами. Спорангии с коричневыми или черными
стенками, содержат округлые или угловатые спорангиоспоры.•	R. arrhizus — наиболее частый возбудитель зигомикоза. Колонии войлочные,
неокрашенные или (при спороношении) пестрые, темно-серого цвета, с хоро¬
шо развитым мицелием, высотой 0,8'1,5 см.Дерматомикозы (дерматофитии)Повсеместно распространены, встречаются во всех возрастных группах населения.
ВОЗБУДИТЕЛИНаибольл1ее эпидемиологическое значение имеют 10 видов дерматомицетов:
Trichophyton rubrum, Т. mentagrophytes, Т. ajelloi, Г. tonsurans, Т. violaceum, Microsporum
canis, M. audouinii, M.femtgineum, M. gypseum, Epidermophyton floccosum.ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРЫ•	Trichophyton rubrum — культуры полиморфны, вначале белые, бархатистые,
позже могут быть пурпурно-красными, мучнистыми или кожистыми с кон¬
центрическими зонами красно-коричневого или фиолетового оттенка, пуши¬
стыми белыми с розовыми бороздками, белыми мучнистыми, окруженными
пурпурной полосой, кожистыми розовато-коричневого или коричневого
цвета, обратная сторона культ>’р красного или малинового цвета. Мицелий
ровный, септированный, диаметром 2-3 мкм. Микроконидии обильные,
каплевидные, удлиненные, грушевидные, размером 3-5 мкм, расположены
по бокам мицелия. Макроконидии состоят из 5-6 клеток, образуются на кон¬
цевых нитях, тупоконечные, встречаются не у всех штаммов. Хламидоспоры
интеркалярные и концевые.•	Г. mentagrophytes; по морфологическим особенностям выделяют два варианта:
Т. mentagrophytes var. gypseum и Т. mentagrophytes var. interdigitale.•	Т. mentagrophytes var. gypseum — колонии гипсовидно-мучнистые. Мицелий ров¬
ный, ветвистый, септированный. Микроконидии округлые или грушевидные,
расположены гроздьями по бокам мицелия. В зрелых культурах нередко обра¬
ш
II760МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯзуются спирали из 10-12 завитков. Макроконидии веретенообразные, состоят
из 3-5 клеток, свободный конец закруглен.•	Т. mentagrophytes var. interdigitale — зрелые колонии белые, бархатистые, цвет
от розового до коричневого, с ровной, реже радиально исчерченной поверхно¬
стью, с углублением в центре. Мицелий длинный, ветвистый, септированный,
с тонкими завитками и спиралями. Микроконидии округлые, расположены по
бокам мицелия. Макроконидии встречаются редко. Часто наблюдается плео-
морфизм культур.Идентификация грибов чистой культуры
по ферментативной активностиДля этой цели разработаны коммерческие наборы. В частности, набор
«Ауксаколор 2» — система идентификации, основанная на принципе утилизации
сахаров, позволяющая идентифицировать 31 вид дрожжей и один вид одно¬
клеточных водорослей Protothea wickerhamii. Рост грибов становится видимым в
результате изменения цвета рН-индикатора. Набор включает 16 биохимических
характеристик, распределенных в лунках; в 33 лунках находятся метаболиче¬
ские тесты, содержащие сахара (глюкозу, мальтозу, сахарозу, галактозу, лактозу,
раффинозу, инозитол, целлобиозу, трегаллозу, адонитол, мелезитозу, ксилозу,
арабинозу), имеется 3 ферментных теста, включая тест на обнаружение фенолок-
сидазной активности Cryptococcus neoformans. Для исследования используют 24-
или 48-часовую чистую культуру, выращенную на среде Сабуро или хромогенной
среде. Большинство дрожжей могут быть идентифицированы в пределах 24 ч, но
иногда результаты необходимо считывать через 48-72 ч. Рост дрожжеподобных
микроорганизмов регистрируется по изменению цвета индикатора от голубого до
желтого и помутнению раствора в лунке.ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИФУНГЕАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
Методики определения чувствительности
к антифунгеальным препаратамВ настоящее время разработан ряд объективных методик для определения in
vitro чувствительности широкого спектра дрожжевых и плесневых грибов к анти¬
фунгеальной терапии. В настоящее время сделан целый ряд шагов по увеличению
стандартизации и улучшению клинической интерпретации данных методов. Это
нашло отражение в стандартах NCCLS, описывающих референсные методы для
определения чувствительности дрожжевых и плесневых грибов. NCCLS постоянно
развивает референсную методологию определения антифунгеальной чувствитель¬
ности, используя многочисленные воспроизводимые исследования. Разработка и
практическое внедрение новых методов определения антифунгеальной чувстви¬
тельности осуществляются с использованием контрольных штаммов грибов при
сопоставлении с результатами референсных методов NCCLS.СТАНДАРТ NCCLS М27 А2
Референсный метод для определения антифунгеальной чувствительности
дрожжевых грибов методом последовательных разведений в жидкой средеСтандарт NCCLS М27 А2 распространяется на исследования дрожжевых гри¬
бов, включая грибы рода Candida, Cryptococcus (C. neoformans и C. gattii) с
использованием макро- или микропоследовательных разведений в жидкой среде.
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 7$-|В качестве среды рекомендуют использовать RPMI-1640 (сложную многокомпо¬
нентную среду с добавками 0,2% глюкозы, pH = 7,0). Инокулят стандартизуется
по мутности. Инкубацию осуществляют при 35 “С в течение 24 ч для грибов рода
Candida или 48-72 ч — для требовательных грибов, таких как криптококк. Метод
микроразведений осуществляют в лунках стандартного 96-луночного микроплан¬
шета, при этом сопоставляют рост фибов в лунках с различной концентрацией
препарата и контрольной лункой. Ингибирование оценивают в баллах от О до 4 по
следующей шкале:❖	О — содержимое лунки оптически прозрачно;❖	1 — легкая «дымка»;^ 2 — существенное снижение мутности суспензии по сравнению с лункой, не
содержащей антифунгеального препарата;❖	3 — слабое снижение мутности по сравнению с лункой, не содержащей анти-
фунгеального препарата;❖	4 — мутность совпадает с мутностью в лунке, не содержащей антифунгеаль¬
ного препарата.Минимальной ингибирующей концентрацией (МИК) для амфотерицина В*
считается наименьшая концентрация, при которой результат оценивается как
О (содержимое лунки оптически прозрачно). МИК для азольных препаратов и
5-флюороцитозина^^ является минимальная концентрация, при которой результат
оценивается как 2 (существенное снижение мутности).Разработаны коммерческие тест-системы для определения чувствительности
дрожжевых грибов, основанные на модификации метода последовательных раз-
ведений, описанного в стандарте NCCLS М27 А2. Исследование выполняют, как
правило, в микропланшетном варианте.Интерпретация результатовДля большинства штаммов грибов рода Candida МИК амфотерицина В‘ коле¬
блется от 0,25 до 1,0 мкг/мл, однако следует отметить, что метод NCCLS М27 не
позволяет определить разницу между резистентными штаммами и штаммами,
для которых минимальная ингибирующая концентрация больше 1 мкг/мл. И те
и другие предлагают считать резистентными по отношению к амфотерицину В*.
В настоящее время существуют жидкие среды, которые позволяют определить
МИК амфотерицина В*, в том числе и для устойчивых штаммов, но, к сожалению,
состав таких сред не поддается стандартизации, результаты с использованием раз¬
ных партий этих сред могут различаться.Имеются критерии интерпретации результатов определения чувствительно¬
сти для грибов рода Candida по отношению к флюконазолу^, итраконазолу*,
5-флюороцитозину^. Эти критерии также могут быть использованы для крипто¬
кокков.Ошибки в определении МИКНекоторые азольные препараты, в особенности флюконазол^’, демонстрируют
следующий феномен: мутность среды снижается при увеличении концентрации
препарата, но суспензия не становится прозрачной (частичное ингибирование
роста в широком спектре концентраций антимикотика). Для большинства изоля¬
тов различия между результатами, зафиксированными после 24 ч и 48 ч инкуба¬
ции, минимальны, однако некоторые штаммы демонстрируют резкое увеличение
МИК в зависимости от времени инкубации. В общем случае результаты для грибов
рода Candida фиксируют через 24 ч инкубации. Попытка разрешить эту ситуацию
отражена в описании процедуры контроля качества NCCLS М27 А2, которая
в настоящее время является референсным по отношению ко всем остальным
методам, в том числе по отношению к нескольким коммерческим тест-системам.
762 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯкоторые в настоящее время широко применяются в лабораторно-диагностической
практике для определения чувствительности к антифунгеальным препаратам.NCCLS М44-Р
Определение антифунгеальной чувствительности дрожжевых грибов с помощью
диско-диффузионного методав стандарте М44-Р описана методология для исследования чувствительности
фибов рода Cant/ííífl: диско-диффузионным методом. Документ включает значения
диаметров зон ингибирования роста для флюконазола*^’ и рекомендации по про¬
цедуре контроля качества для флюконазола^ и вориконазола*’. В качестве твердой
среды для постановки диско-диффузионного метода в документе рекомендуется
использовать агаризованную среду Мюллера-Хинтона, обогащенную 0,2% глю¬
козы и содержащую краситель метиленовый синий в концентрации 0,5 мкг/мл.
Среда Мюллера-Хинтона отличается высокой степенью стандартизации состава
и высокой воспроизводимостью результатов. Добавка глюкозы обеспечивает
условия роста большинства дрожжевых грибов, наличие метиленового синего в
составе среды контрастирует границу зоны ингибирования роста. Готовую среду
разливают в чашки Петри, pH готовой среды — 7,2-7,4. Посев осуществляют
методом сплошного газона, плотность инокулята стандартизована по мутности.
На поверхность среды апплицируются бумажные диски стандартного диаметра,
содержащие антифунгеальные препараты. Чашку с культурой инкубируют в тече¬
ние 24 ч при 35 "С. Если по истечении 24 ч наблюдается скудный рост культуры,
необходимо продолжить инкубацию в течение дополнительных 24 ч. в течение
инкубации происходит диффузия антифунгеального препарата от диска в толщу
среды с образованием концентрационного градиента. Критерием определения
чувствительности служит диаметр зоны ингибирования poeta.Метод является простым и недорогим средством для скрининговых исследо¬
ваний. Однако рекомендуют все культуры, зарегистрированные как устойчивые,
дополнительно исследовать методом последовательных разведений М27 А2 в
качестве подтверждающего.Имеются коммерческие тест-системы, основанные на методах, схожих с диско¬
диффузионным. в частности, вместо диска используют бумагу, содержащую гради¬
ент концентрации антимикробного препарата. Этот градиент позволяет осущест¬
влять непосредственное определение МИК. Выпущены наборы для исследования
антифунгеальных агентов, включая амфотерицин В*, кетоконазол*, итракозол*,
вориконазол *\ 5-флюороцитозин^^ флюконазол«".В перспективе диско-диффузионный метод может быть адаптирован для иссле¬
дования других грибов, включая плесневые, но получаемые результаты нуждаются
в стандартизации с точки зрения интерпретации с использованием референсных
методов NCCLS.NCCLSM38-A
Референсный метод последовательных разведений в жидкой среде
для определения чувствительности к антифунгеальным препаратам
мицелиеобразующих грибовв стандарте описан метод исследования чувствительности к антимикотикам
плесневых грибов, которые способны вызывать системные инфекции, включая
Aspergillus spp., Fusarium spp., Pseudallescheria (Scedosporium) spp., зигомицеты и
другие патогенные плесени. Рекомендуют использовать жидкую среду RPMI-1640
с той же формулой, что и в стандарте NCCLS М27 А2 для дрожжевых грибов.
Однако, в отличие от дрожжей, приготовление инокулята плесневых грибов сле¬
дует осуществлять с помощью спектрофотометра. Необходимая концентрация.
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 703обеспечивающая воспроизводимость значений МИК, колеблется в пределах
0,4x10^-0,5x10'^ КОЕ/мл, при этом оптическая плотность (ОП), измеренная на
530 нм, будет зависеть от морфологии исследуемого вида грибов. Необходимая
концентрация Aspergillus spp. и Sporothrix spp. при 0,09-0,11 ЕД ОП для Fusarium,
Pseudallescheria (Scedosporium) и Rhizopus spp. ОП должна составлять 0,15-0,17 ЕД,
а для гистиоплазмы — 0,2 ЕД ОП. Допускается использование малого количества
твин-20 в качестве осушающего агента, облегчающего приготовление инокулята
Aspergillus. Культуру инкубируют при 35 ®С. Чтение результатов проводят через 24ч	для Rhizopus spp., через 48 ч — для Aspergillus spp,, Fusarium, Sporothrix spp. и боль¬
шинства других, и через 72 ч — для медленно растущих плесневых грибов, таких
как Pseudallescheria (Scedosporium) spp.При оценке результатов используют условную шкалу баллов от О до 4, при этом
мутность каждого образца оценивают относительно контроля, не содержащего
антифунгеальный препарат:<0^ О — образец оптически прозрачный, рост отсутствует;❖	1 — слабый рост, 25% мутности контрольного образца;❖	2 — существеное ингибирование роста, 50% мутности контроля;^ Ъ — слабое ингибирование роста, 75% мутности контроля;❖	4 — нет ингибирования.МИК амфотерицина В*, итраконазола*, вориконазола^^ и позаконазола^^' явля¬
ется минимальная концентрация, при которой результат оценивается как О (среда
оптически прозрачна). МИК флюкoнaзoлa*^ кетоконазола и 5-флюороцитозина^
является минимальная концентрация, при которой наблюдается 50% снижение
мутности по сравнению с контрольным образцом (результат оценивается как 2).Интерпретация результатовМинимальная ингибирующая концентрация амфотерицина В* обычно опреде¬
ляется в пределах 0,5-2,0 мкг/мл, однако некоторые виды плесневых грибов,
такие как Aspergillus terreus, Acremonium strictum, Pseudallescheria boydii и Scedosporium
proUßcans, демонстрируют более высокие значения МИК — от 2 до 16 мкг/мл.
МИК флюконазола^ для большинства плесневых грибов превышает 64 мкг/мл.
Исключение составляют некоторые плесневые грибы, обладающие диморфизмом,
и дерматофиты. Значение МИК итраконазола*, вориконазола*® и позаконазола*^"
обычно колеблется в широких пределах — от 0,03 до 16 мкг/мл.Основными проблемами при исследованиях плесеней являются затруднения
стандартизации инокулята, низкая скорость роста, отсутствие спорообразования,
характерное для некоторых видов, которое не дает возможности получения стан¬
дартизованного инокулята.Проблема интерпретации результатов: методика исследования антифунгеаль¬
ной чувствительности плесневых грибов технологически более капризна, чем
дрожжевых. Коммерческие тест-системы отсутствуют.ПРОФИЛЬ АНТИФУНГЕАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИРезультаты определения чувствительности грибов к антимикотическим препа¬
ратам представлены в табл, 25-6-25-8.
Таблица 25-6. Профиль антифунгеальной чувствительности патогенных для человека грибов01Вид грибаАмф. В, мг/млФлю, мг/млВори, мг/млИтра, иг/млКето, мг/млТербии, мг/мл5-флю, мг/млКаспоCandida albicans4 0,54 0,5-1,04 0,064 0.254 0,25В0,03->12841чCandida famata4 0,5ЧДЗ 4-84 0,ое4 0,254 0,25Нет данных^ 41чCandida glabrata4 0,5ЧДЗ 2-324 1-2ЧДЗ 0,5-1,0В МУ >1284 0,54Candida guiltiermondii4 0,5ЧДЗ 4-8Ч 0,25-0,54 0,54 0,5-18 6,25-100Ч 0,125-0,2ЧCandida kefyr4 0,54 0,5-1,04 0,034 0,25-0,54 0,25У 0,5-50В 0,03-164Candida krusei4 0.5-1У 32-644 0,5-14ДЗ 0,511,0У50->100В 8-324Candida lusitaniaeВ 0,5-24 0,5-1,04 0,064 0,254 0,25Нбг данных4 0,125ЧCandida parapsilosisЧ 0.5-14 1-24 0,06Ч 0,125-0,54 0,54 0,25-241ЧCandida tropicalis4 0,54ДЗ 1-84 0,254 0,258 0,5-1,0В 10-12841ЧCryptococcus neoformans4 0.&-1ЧДЗ 2-84 0,25ЧДЗ 0,54 0.254 0,25Ч2-8УMalassezia urfurЧЧЧ444*ЧНет данныхSaccharomyces cerevis/ae4 0,5Ч2~84 0,034 0,5-1,04 0,5Нет данныхГ Ч 0,125Нет данныхTrict}osporon beigellii41,0Ч2-84 0,125Ч 0,1254 0,56 0,05-12818-16Нет данныхпmПримечания: Ч — чувствительный; ЧДЗ - чувствительный или дозозависимый; У - устойчивый; Б - - вариабельный; Г7 — промежуточный.Амф. В — амфотерицин В*; Флю - флюконазол*'-'; Вори - вориконазол*“; Итра - - итраконазол*; Кето — кетоконазол*: Тербин — тербинафин* (только для топи¬
ческой формы): 5-флк> — 5-флюцитозин»'; Каспо — касиофунгин.Таблица 25*7. Профиль антифунгеальной чувствительности для дерматофитовВид грибаТербинафинФлюконазолИтраконазолКетоконазолГризеофульвинВориконазолfricfiopftyton spp.4Ч44ч4Epidermophyton floccosumЧ44444Microsporum spp.4ЧЧЧЧЧ
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 705
Таблица 25-8. Профиль антифунгеальной чувствительности для патогенных плесневых грибовВид грибаАмф. В,
мг/млФлю,мг/млБори, мг/
млИгра, мг/
млКето, МГУ
млТербии, мг/МЛ5-флЮ,мг/млКаспоAspergillusfumigatusЧ 1,0У >100Ч0.5ЧДЗ 0.5У8Ч0.5У >64AspergillusflavusЧ 1-2У >100Ч 0,5-1ЧДЗ
0,5-1,0У84 0,5У >64Pseudalle¬
scheria boydii
[=Scedospo-
rimapiospermun]В 1-16В 8-644 0,5В 0.540ВМУ 10-100У >64НетданныхScedosporiumprolificar)sУ >16У >64Ч 0,5-1У >8У >16У >100У >64НетданныхFusarium sp.114У >64Ч1-4У >8У >16У 0,5-128У >64НетданныхBipolaris Sp.4 0,25У >64Ч0,2&-0,5Ч0.54 0,54 0.5-1,0У >64НетданныхCladophialo-
phora sp.41,0В 4-6441,04 0,1254 0.25-14 0,25НетданныхExophiala spp.4 0,25У 644 0,254 0,5В 0,5-24 0,06-2.0В 4-64НетданныхPhialophoraspp.4 0,5-1У16-644 0,254 0,5В 0,541НетданныхНетданныхPaecilomycesspp.8 0,5-16У644 0,5-1,0В0.5-8,0Нетданных81-64В 0.5-64,0НетданныхPenicilliumspp.4 0,5-1,0В 4-644 0,54 0,5414 0,5400,5НетданныхВЫВОДЫ•	Основные практические затруднения при определении чувствительности гри¬
бов к антифунгеальным препаратам связаны со стандартизацией приготовле¬
ния инокулята и определением конечной концентрации. Проверку плотности
и стерильности инокулята следует осуществлять при каждом исследовании,
то есть параллельно с тестированием высевают стандартный объем готового
инокулята. Через 24 ч инкубации подсчитывают количество колоний. Если
их слишком мало или слишком много, рекомендуют повторить тест.•	в настояш;ее время существуют модификации метода определения МИК, в
которых на стадии регистрации результатов применяют цветовые индика¬
торы или регистрация автоматизирована, с использованием микропланшет-
ного ридера или автоматического анализатора зон ингибирования роста, что
позволяет избежать субъективных ошибок при получении количественных
данных. Для увеличения клинической эффективности исследования часто
полученный результат антифунгеальной чувствительности подтверждают
другим методом, особенно в тех случаях, когда имеются сомнения в досто¬
верности полученного результата.•	Современная стадия развития лабораторных методов определения антифун¬
геальной чувствительности позволяет лаборатории осуществлять эти иссле¬
дования в рутинной практике. Однако для определения чувствительности
необходима культура, получить которую не всегда возможно. Видовая иденти¬
фикация часто дает возможность предсказать чувствительность вида 1п уг^о.•	Вопрос, какие клинические образцы должны быть исследованы, остается
открытым. Надо ли исследовать только образцы, в которых грибы являются
клинически значимыми, или осуществлять лабораторный скрининг всех изо-
//'^/.,'ЬЛ^''} 766 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯлятов? Ответ на этот вопрос может быть получен для каждого отдельного
ЛПУ с учетом анализа накопленных данных о превалирующих возбудителях,
их видовом составе и антифунгеальной чувствительности при участии спе¬
циалистов по химиотерапии, клинических микробиологов и клиницистов.		щщшТест-системы ДЛЯ серологической диагностики
микотических инфекцийСерологическая диагностика важна тем, что позволяет определить высокие титры
антител или циркулирующие антигены у пациентов с иммунодепрессией, которые
относятся к одной из групп риска по развитию системных микозов. Классическая
микробиологическая диагностика системных микозов, вызванных Candida,
подтверждается повторным выделением грибов из биологических образцов,
которые в норме стерильны (крови, мочи и т.д.). Однако интерпретировать
результаты, получаемые при выращивании культур грибов, трудно, так как грибы
часто выделяются в виде единичных колоний, а при распространенной инфекции
гемокультура может оставаться отрицательной.Обнаружение маннанового антигена, циркулирующего в сыворотке крови,
позволяет усовершенствовать диагностику кандидозной инфекции, особенно у
иммуносупрессивных пациентов.Коммерческий тест «Pastorex® Candidas позволяет определить в сыворотке
полисахарид Candida (маннан), используя простой метод агглютинации латекс¬
ных частиц. Маннан — основной компонент стенки грибов и основной циркули¬
рующий антиген. В тесте используются латексные частицы, сенсибилизированные
моноклональными антителами к маннану. Порог чувствительности теста 2,5 нг/мл.
В случае если сыворотка положительная, можно провести полуколичественный
анализ путем серийных ра.'^ведений супернатанта в глициновом буфере.Тест «Pastorex® Aspergillus»- предназначен для качественного и полуколиче-
ственного определения полисахарида Aspergillus (галактоманнана) в сыворотке,
основан на методе агглютинации латексных частиц. В тесте используются латекс¬
ные частицы, сенсибилизированные моноклональными антителами к галактоман-
нану. Порог чувствительности — 15 нг/мл.Качественный и полз^количественный тест «Pastorex® Cryptococcus» основан на
определении капсульного полисахарида Cryptococcus neoformans (гликуронокси-
ломаннан) в биологических жидкостях (сыворотке, спинномозговой жидкости,
бронхоальвеолярном лаваже, моче) с помощью реакции агглютинации. В тесте
используются латексные частички, покрытые моноклональными антителами
к глюкуроноксиломаннану, который является главным компонентом капсулы
Cryptococcus neoformans.Тест «Platelia Aspergillus ИФА» — одноэтапный И ФА-анализ в «сэндвич >>-
формате для определения галактоманнанового антигена грибов рода Aspergillus в
сыворотке крови. Иммунологическая диагностика, основанная на определении
антител, не адаптирована для случаев иммунодефицита. Аспергиллы крайне редко
изолируются из гемокультуры, часто отсутствуют в образцах мокроты. Диагностика
аспергиллеза часто основывается на неспецифических критериях или на признаках,
соответствующих поздним клиническим проявлениям (клинических симптомах,
радиологических методах исследования и т.д.). Внедрение серологического
анализа растворимых антигенов в сыворотке пациента дает возможность улучшить
диагностическую ситуацию, добиваясь высокой специфичности на самых ранних
стадиях заболевания.Одноэтапный «сэндвич»-иммуноферментный тест «Platelia Candida Ar» в
микропланшетном формате позволяет качественно или количественно определить
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 7ß7уровень циркулирующего в сыворотке маннанового антигена. Чувствительность
теста сильно зависит от вида изолированного микроорганизма.Двухэтапный непрямой иммуноферментный тест «Platelia Candida Ат» в микро¬
планшетном формате позволяет обнаружить антитела к маннановому антигену
дрожжевых грибов рода Candida, главному компоненту стенки грибов этого рода.
Маннан является маркером кандидоза и представляет собой высокоиммуноген-
ный полисахарид. Тест позволяет количественно оценить уровень антиманна-
новых антител в сыворотке человека. Уровень чувствительности различается в
зависимости от вида изолированного гриба.Диагностика инвазивного кандидоза должна быть основана на сочетании тестов
на определение как антител в маннану, так и самого циркулирующего в крови ман¬
нанового антигена в тесте «Platelia Candida Ат». Сочетание этих двух тестов позво¬
ляет поставить ранний лабораторный диагноз, повысить чувствительность мето¬
дов лабораторной диагностики. В целом сочетание клинических и лабораторных
результатов позволяет снизить риск ятрогенных факторов риска. Комбинация этих
двух тестов может стать важной составляющей системы клинико-лабораторного
мониторинга в ходе лечения.ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПОВЕРХНОСТНЫХ МИКОЗОВ
Микозы кожиМикоз гладкой кожи:❖	микроскопия чешуек, соскобов из очагов поражения;
культуральное исследование материала из очага поражения;^ видовая идентификация и определение антифунгеальной чувствительности
(при рецидивирующем течении и/или резистентности к стандартной анти¬
фунгеальной терапии).Микоз кистей, стоп. Онихомикоз:❖	микроскопия чешуек, соскобов из очагов поражения, соскобов и срезов пора¬
женной ногтевой пластинки;❖	культуральное исследование материала из очага поражения;O' видовая идентификация и определение антифунгеальной чувствительности
(при рецидивирующем течении и/или резистентности к стандартной анти¬
фунгеальной терапии).Микоз волосистой части головы:^ люминесцентное исследование с помощью лампы Вуда;❖	микроскопия чешуек, волос из очагов поражения;❖	культуральное исследование материала из очага поражения;<!► видовая идентификация и определение антифунгеальной чувствительности
(при рецидивирующем течении и/или резистентности к стандартной анти¬
фунгеальной терапии).Микозы слизистых оболочек:«> микроскопия соскобов из очагов поражения;видовая идентификация и определение антифунгеальной чувствительности
(при рецидивирующем течении и/или резистентности к стандартной анти¬
фунгеальной терапии).КРИТЕРИИ ДИАГНОСТИКИ СИСТЕМНЫХ МИКОЗОВМикотический бронхит:❖	рентгенография или компьютерная томография легких;^ бронхоскопия, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ);
768 МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ❖	микроскопия БАЛ, мокроты с окраской флюорохромами, материала биоп¬
сии;❖	культуральное исследование БАЛ, мокроты с окраской флюорохромами,
материала биопсии;❖	патоморфологическое исследование материала биопсии.Инвазивный микоз легких;❖	рентгенография или компьютерная томография легких;❖	бронхоскопия, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ);❖	биопсия очагов поражения (чрезбронхиальная, открьггая, трансторакальная);❖	микроскопия БАЛ, мокроты, биоптата с окраской флюорохромами;❖	культуральное исследование БАЛ, мокроты, биоптата с окраской флюорох¬
ромами;❖	патоморфологическое исследование биоптата;❖	видовая идентификация выявленного возбудителя;❖	определение антигена Aspergillus в сыворотке крови («Pastorex» или «Platelia
Aspergillus BioRad»);^ определение специфических антител к Aspergillus (при хроническом некроти-
зирующем аспергиллезе).Синусит:❖	клинические и рентгенологические признаки острого синусита;
микроскопия аспирата или биоптата с окраской люминесцентными красите¬
лями;о культуральное исследование аспирата или биоптата;❖	патоморфологическое исследование аспирата или биоптата;■0^ определение антигена Aspergillus в сыворотке крови (тест латекс-агглютина¬
ции «Pastorex» или «Platella Aspergillus BioRad»).Эзофагит:❖	нахождение бляшек на стенках пищевода при эзофагоскопии;❖	нахождение грибов в окрашенных микроскопических препаратах;❖	рост грибов при культуральном исследовании биопсийного материала.Микотическая инфекция мочевыводящих путей;❖	микроскопическое и культуральное исследование мочи с ростом грибов,
выявление более 1x10^ КОЕ/мл правильно собранной мочи;❖	компьютерная томография и ультразвуковое исследование почек;
цистоскопия (по показаниям);❖	видовая идентификация и определение антифунгеальной чувствительности
(при рецидивирующем течении и/или резистентности к стандартной анти-
микотической терапии).Фунгемия:❖	однократное выявление грибов в культуре крови в период подъема темпера¬
туры тела.Острый диссеминированный кандидоз:❖	фунгемия в сочетании с культуральными или патоморфологическими при¬
знаками поражения глубоких тканей, включая подкожную клетчатку.Эндофтальмит;микроскопическое, культуральное, патоморфологическое исследование биоп¬
сийного материала (пробы жидкости стекловидного тела в объеме 1-2 мл),
собранной путем тонкоигольной аспирации);❖	повторное культуральное исследование крови 2 раза в день в течение не
менее 2 дней;❖	видовая идентификация и определение антифунгеальной чувствительности;❖	повторное определение антигена в сыворотке крови (тест латекс¬
агглютинации).
МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ769Абсцесс или остеомиелит:❖	рентгенологические (компьютерно-томографические/магнитно-резонансные)
признаки остеомиелита;❖	выявление грибов при микроскопическом, культуральном, патоморфологи¬
ческом исследовании аспирата или биопсийного материала;повторное культуральное исследование крови 2 раза в день в течение не
менее 2 дней;❖	видовая идентификация и определение антифунгеальной чувствительности;❖	повторное определение антигена в сыворотке крови (тест латекс-
агглютинации).Менингит:о- люмбальная пункция с определением давления спинномозговой жидкости;
микроскопия ликвора;❖	культуральное исследование ликвора;^ микроскопическое и культуральное исследование крови, материала из пред¬
полагаемых очагов инфекции, мазков из носоглотки, среднего уха, собран¬
ных в день проведения люмбальной пункции;❖	видовая идентификация и определение антифунгеальной чувствительности
выявленного возбудителя;❖	определение антигена Crypticoccus neoformans в спинномозговой жидкости или
крови с помощью теста латекс-агглютинации («Pastorex Crypticoccus BioRadí^;
«Imniuno-Mycologics Inc»; «Meridian Diagnostic Inc»; «Murex Diagnostic») или
теста ELISA («Meridian Diagnostic Ine»),Хронический диссеминированный гепатолиенальный кандидоз,❖	Возможный:❖	персистирующая или интермиттирующая лихорадка после завершения
периода нейтропении в сочетании с клинической симптоматикой пораже¬
ния печени, селезенки, почек и характерными ультразвуковыми
(компьютерно-томографическими или магнитно-резонансно-томографи¬
ческими) признаками поражения этих органов,❖	Доказанный:вышеуказанные симптомы;^ положительный результат культурального исследования крови (до появ¬
ления признаков поражения печени, селезенки или почек);
о патоморофологические признаки кандидоза в биопсийном материале из
очагов поражения.Аспергиллез:❖	микроскопическое и культуральное исследование мокроты, бронхоальвео¬
лярного лаважа, биопсийного материала;❖	определение антител методом количественного электрофореза;❖	определение антигена (тестом латекс-агглютинации «Pastorex BioRad»);❖	определение антигена методом ИФА («Platelia Aspergillus BioRad»);■0^ определение ß-l,3-D («Fungitec G-test»).Бластомикоз:микроскопия гноя, мокроты, БАЛ, мочи;
культуральное исследование гноя, мокроты, БАЛ, мочи;
о- определение антител методом иммунодиффузии.Кокци д иоидомикоз :микроскопия и культуральное исследование мокроты, синовиальной жидко¬
сти, гноя и центрифугата спинномозговой жидкости;❖	кожная проба с кокцидиоидином или сферулином;определение IgM в сыворотке крови методом латекс-агглютинации, преципи¬
тации или иммунодиффузии;ж#щы
770МИКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯО- определение IgG в сыворотке крови методом фиксации комплемента или
иммунодиффузии;❖	определение антител в ликворе при подозрении на менингит.Криптококкоз:❖	микроскопия и культуральное исследование центрифугата спинномозговой
жидкости, крови, мочи, секрета предстательной железы и биопсийного мате¬
риала:определение антигена Crypticoccus neoformans в спинномозговой жидкости,
крови, моче с помощью теста латекс-агглютинации («Pastorex Crypticoccus
BioRad»; «Immuno-Mycologics Inc.»; «Meridian Diagnostic Inc.»; «Murex
Diagnostic») или теста ELISA («Meridian Diagnostic Inc.»).Гистоплазмоз:микроскопия окрашенных мазков крови, мокроты, БАЛ, гноя;❖	культуральное исследование крови, мокроты, костного мозга, гноя, биопсий¬
ного материала;определение антигена в крови, моче, спинномозговой жидкости, БАЛ радио-
иммунным методом или тестом ELISA;❖	определение антител методом фиксации комплемента или иммунодиффу¬
зии.Му кор микоз:микроскопия отделяемого из участков некроза, мокроты, БАЛ, биопсийного
материала;-0^ культуральное исследование материала с очагов на твердом небе, отделяемо¬
го придаточных пазух носа, мокроты, БАЛ.Паракокцидиоидомикоз:микроскопия и кульпфальное исследование гноя, мокроты, материала из
гранулематозных поражений;❖	определение антител методом фиксации комплемента или тестом ELISA.
Пенициллиоз (возбудитель — Penicilîiüm mam^erí):❖	микроскопия окрашенных по Райту мазков костного мозга, материала кож¬
ных элементов, биоптатов лимфатических узлов.Споротрихоз:❖	микроскопия и культуральное исследование гнойного отделяемого, биопсий¬
ного материала.Гиалогифомикозы❖	Фузариоз:культуральное исследование крови, биопсийного материала, материала
пораженных ноггей.❖	Феогифомикозы,о-	Синусит — поражение придаточных пазух носа {Altemaria, Bipolaris,
Curvularia, Exserohiluim):-	микроскопия отделяемого из носа, биопсийного материала, аспирата;-	культуральное исследование отделяемого из носа, биопсийного мате¬
риала, аспирата.о Поражение головного мозга (Cladophiaïophora):“ культуральное исследование биопсийного материала придаточных па¬
зух носа, аспирата, мокроты, БАЛ.
о Системный микоз, вызванный Maiassezia furfur {Pityrosporum)'.-	микроскопия мазков крови;-	культуральное исследование крови на средах, обогащенных липидами;-	культуральное исследование дистального фрагмента венозного катетера
на средах, обогащенных липидами.
Глава 26
Лабораторная диагностика
паразитарных болезнейПаразитарные болезни развиваются в результате проникновения
в организм гельминтов, простейших, членистоногих, использующих
его как место обитания и источник питания. Паразитарные болезни
часто протекают без выраженных и специфических клинических
симптомов и признаков, однако при снижении иммунитета, в част¬
ности при СПИДе, токсоплазмоз, пневмоцистоз, криптоспоридиоз,
акантамебиаз и другие паразитарные болезни являются причинами
летальных исходов. Пациенты жалуются на утомляемость, слабость,
повышенную температуру. При кишечных паразитозах часто разви¬
ваются нарушения пищеварения; диарея, метеоризм, гиперсалива¬
ция, тошнота, рвота, боли в животе. При пневмоцистозе поражения
легких протекают в виде пневмонии, бронхопневмонии вплоть до
развития пневмоторакса. При висцеральном лейшманиозе пора¬
жаются клетки ретикулоэндотелиальной системы, наблюдается
гепатоспленомегалия. Для ряда паразитарных болезней характерны
поражения кожи и слизистых оболочек: кожный лейшманиоз, неко¬
торые филяриидозы (онхоцеркоз, дирофиляриоз).Некоторые паразитарные болезни при поздней диагностике и
отсутствии адекватного лечения представляют серьезную опасность
для здоровья и жизни пациентов: тропическая малярия, висце¬
ральный лейшманиоз, трихинеллез, цистицеркоз, диссеминирован¬
ные формы стронгилоидоза, эхинококкозы, диоктофимоз, амебные
абсцессы.Основой диагностики паразитарных болезней являются результа¬
ты лабораторных исследований, которые позволяют выявить непо¬
средственно возбудителей, антигены возбудителей болезней или
антитела к ним. Возбудители паразитарных болезней могут быть
обнаружены при исследовании крови, фекалий, мочи, мокроты,
спинномозговой жидкости, пунктатов органов и тканей. Лечащий
врач, включающий в диагностический алгоритм паразитологиче¬
ские исследования, должен учитывать следующие обстоятельства:
заболеваемость паразитарными болезнями продолжает оста¬
ваться высокой, вероятность обнаружения возбудителей также
высока;❖	паразитарные болезни, такие как аскаридоз, трихоцефа-
лез, энтеробиоз, токсоплазмоз, лямблиоз, криптоспоридиоз,
пневмоцистоз, встречаются почти во всех регионах мира.
Лейшманиозы, филяриидозы, трипаносомозы, щистосомозы
шш772 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙимеют зональное или региональное распространение. Это связано с осо¬
бенностями жизненных циклов паразитов, в которых участвуют животные,
поэтому для установления предварительного диагноза следует учитывать,
не выезжал ли пациент в регионы, эндемичные в отношении того или иного
паразитоза;❖	некоторые паразитарные болезни намного чаще встречаются у детей, чем у
взрослых (аскаридоз, трихоцефалез, токсокароз, энтеробиоз);❖	существуют паразитарные болезни, которые чаще встречаются у пациентов
со сниженным иммунитетом (диссеминированные формы стронгилоидоза,
криптоспоридиоз, пневмоцистоз, энцефалиты, вызванные сапрофитными
амебами). У пациентов со сниженным иммунитетом могут развиваться тяже¬
лые формы тех инвазий, которь[е обычно протекают в виде легких и бессим¬
птомных случаев (лямблиоз, гименолепидоз);❖	следует учитывать, что период, когда при инвазии возбудитель не может быть
выявлен паразитологическими методами (паразитологической инкубацией),
может быть весьма долгим. При аскаридозе, описторхозе, дифиллоботриозе
этот период может продолжаться несколько недель;❖	ряд паразитарных болезней вообще не может быть выявлен прямыми
паразитологическими методами, в этих случаях применяют молекулярные
методы диагностики для обнаружения антигенов, антител, ДНК и РНК воз¬
будителей.Таким образом, подходы к диагностике паразитарных болезней весьма разно-
плановы.Для обнаружения разных видов возбудителей требуется применение разных
методов паразитологических исследований, поэтому в направлении на исследо¬
вание необходимо указать, какой паразитоз подозревается у пациента. Например,
в случае указания в направлении «кал на яйца гельминтов» лабораторией будет
проведено именно это исследование, в то время как возбудитель стронгилоидоза
может быть обнаружен только специальным методом исследования фекалий. Для
выявления ооцист криптоспоридий требуется специальная окраска фиксирован¬
ных препаратов. Кровь для поиска возбудителей малярии в виде толстой капли
или тонкого мазка на стекле и мазки костного мозга для поиска лейшманий окра¬
шивают по Романовскому-Гимзе. У пациентов возможно одновременное наличие
нескольких паразитарных инвазий, например гельминтов и простейших, малярии
и лейшмании. По этой причине иногда приходится проводить исследование раз¬
ных материалов от одного пациента.Диагноз паразитарной болезни ставят на основании обнаружения в исследуе¬
мом материале особей паразитов, фрагментов особей, разнообразных стадий их
развития. В ряде случаев при получении сомнительных результатов требуется
повторное исследование, при подозрении на некоторые паразитарные болезни
(лямблиоз, криптоспоридиоз и др.) однократное исследование не дает уверен¬
ности в отсутствии возбудителя и, следовательно, в предоставлении клиницисту
заключения об его отсутствии.Следует иметь в виду, что большинство гельминтозов не передаются непосред¬
ственно от одного человека к другому, поэтому пациенты неопасны в качестве
источника возбудителя для окружающих. Из этого общего правила есть несколь¬
ко исключений: энтеробиоз, гименолепидоз, вызываемый карликовым цепнем,
стронгилоидоз и свиной цепень, при котором серьезную опасность представляет
заражение онкосферами с последующим развитием цистицеркоза. Следует пом¬
нить, что инвазированные кишечными простейшими являются источниками
возбудителей и могут передавать инфекцию окружающим. Малярия может пере¬
даваться от человека к человеку не только через комаров, но и с кровью (при
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 773переливании крови, эритроцитарной массы, при использовании инструментария,
контаминированного кровью).Возбудители паразитарных болезней относятся к патогенным биологическим
агентам (ПБА) III и IV группы патогенности, чем определяется соответствующий
режим работы паразитологических лабораторий (подразделений), выполняющих
диагностические исследования.КРОВЕПАРАЗИТЫКровь является местом обитания на определенной стадии развития следующих
паразитов: простейших — малярийных плазмодий (Р. vivax, Р. falciparum, Р. ovale,
Р, malariae), бабезий (Babesia spp.); гельминтов — личинок филяриид (Wuchereria
hancrofti, Brugia malayi). В некоторых случаях в крови могут быть обнаружены
висцеротропные лейшмании {Leishmania donovani подвид infantum, Leishmania
donovant), однако исследование крови не является основным методом их диагно¬
стики.Неспецифические изменения крови при паразитарных
болезняхЭозинофилия. Многие паразитарные болезни сопровождаются повышением
количества эозинофилов в периферической крови (анизакидоз, анкилостомидозы,
описторхоз, стронгилоидоз, токсокароз, трихинеллез, фасциолез, филяриидозы,
цистицеркоз, шистосомозы, эхинококкозы и др.).Анемия встречается при многих паразитарных болезнях: анкилостомидо-
зах, дифиллоботриозе, трихоцефалезе, фасциолопсидозе, малярии, висцеральном
лейшманиозе, трипаносомозе, бабезиозе. При малярии в начальной стадии анемия
нормохромная и нормоцитарная; между приступами лихорадки и после лечения
отмечается ретикулоцитоз. В дальнейшем наблюдается повышенное количество
полихроматофилов, имеют место анизоцитоз, пойкилоцитоз. При висцеральном
лейшманиозе анемия резко выражена, содержание гемоглобина прогрессивно
снижается и может доходить до 30 г/л, увеличивается количество ретикулоци-
тов. при анкилостомидозах развивается железодефицитная анемия. Содержание
гемоглобина падает, развиваются анизоцитоз, пойкилоцитоз, отмечается низкое
среднее содержание гемоглобина в эритроците. У некоторых больных при тяже¬
лой анемии уровень гемоглобина падает до 30-50 г/л, количество эритроцитов
ниже 1,5х101ул.При дифиллоботриозе анемия протекает по типу пернициозной, характерен
мегалобластический тип кроветворения. В периферической крови появляют¬
ся мегалобласты, изредка нормобласты, встречаются эритроциты с тельцами
Жолли и кольцами Кебота. Отмечаются анизопойкилоцитоз, полихроматофилия.
Количество эритроцитов может быть от l,5xlO^V^ ДО 0,5х10^Ул, а концентрация
гемоглобина — 70-110 г/л. Лейкоцитоз с последующей лейкопенией и относи¬
тельным моноцитозом характерен для многих протозоозов и гельминтозов. На
ранних стадиях трихинеллеза, токсокароза и стронгилоидоза, при анизакидозе
лейкоцитоз может достигать ЗОхЮул. При амебном гепатите и амебном абсцессе
описан длительный лейкоцитоз до 25-30х10Ул со сдвигом лейкоцитарной фор¬
мулы (до 70-80% сегментоядерных лейкоцитов). У больных с тяжелым течением
тропической малярии встречается нейтрофильный лейкоцитоз, в периферической
крови отмечаются анэозинофилия и моноцитоз.Лейкопения до 0,2-0,6х10ул вплоть до агранулоцитоза может развиться в
терминальной стадии висцерального лейшманиоза. При висцеральном лейшма-
№774 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙниозе лейкопения сочетается с анемией, гранулоцитопенией, тромбоцитопенией,
имеют место относительный моноцитоз, лимфоцитоз (70-90%), анэозинофилия.
Лейкопения также наблюдается при кишечных шистосомозах, анкилостомидозах.
При малярии может наблюдаться лейкопения с относительным моноцитозом, в
лихорадочный период характерен лейкоцитоз с палочкоядерным сдвигом.Биохимические изменения крови. При поражениях печени при описторхозе
отмечают повышение уровня прямого и непрямого билирубина, Диспротеинемию
обнаруживают при малярии, висцеральном лейшманиозе, токсокарозе, шисто¬
сомозах, многокамерном эхинококкозе. Гипопротеинемию со снижением уровня
альбуминов выявляют при анкилостомидозах.Малярийные плазмодииМалярию у человека вызывают 4 вида возбудителей, относящихся к роду
Plasmodium: Р. falciparum, Р. vivax, Р. malariae и Р. ovale. Первый вызывает тропиче¬
скую малярию, которая может протекать злокачественно и без лечения закончить¬
ся летально. Трех-, четырехдневная и овале-малярия отличаются относительно
доброкачественным течением. Б последнее десятилетие в России около 99%
слу^1аев малярии вызваны либо Р. falciparum (завозится из-за рубежа, в основном
из тропической Африки), либо Р. vivax (завозится в основном из Азии, временами
передается в пределах России),Биология возбудителейМалярийные плазмодии паразитируют поочередно в двух хозяевах: в самке
комара рода Anopheles и в человеке. Во время укуса комар вводит в кровяное русло
человека спорозоиты, которые уже через несколько минут попадают в печень. В
гепатоцитах происходит экзоэритроцитарная шизогония, длящаяся не менее 7 сут.
При трехдневной и овале-малярии часто спорозоиты превращаются в гипнозоиты.
которые пребывают в неактивном состоянии; эта фаза обычно продолжается 6-
12 мес. Во время пребывания в печени малярийные паразиты никак себя не про¬
являют. Из печени продукты экзоэритроцитарной шизогонии выходят в кровь и
внедряются в эритроциты — так начинается фаза эритроцитарной шизогонии. Все
патологические проявления малярии (лихорадочные приступы, анемия, спленоме-
галия, полиорганные поражения при тропической малярии) связаны только с эри¬
троцитарной шизогонией. В этом процессе сменяются бесполые стадии мерозоита,
трофозоита и шизонта, из которых опять обра.зуются мерозоиты. Единичный цикл
эритроцитарной шизогонии от мерозоита до мерозоита продолжается 3 сут при
черырехдневной малярии и 2 сут — при других видах. В результате одного выхода
паразитов из печени таких последовательных циклов обычно бывает от одного до
нескольких десятков, пока эритроцитарная шизогония не будет прервана иммун¬
ным процессом. Однако в силу нестойкости иммунитета пациент может вновь
заболеть либо в результате нового заражения, либо за счет активации гипнозоитов
в печени. Из некоторых мерозоитов образуются и половые клетки — гаметоциты,
которые в организме человека не делятся и, следовательно, не оказывают патоген¬
ного воздействия.Дифференциальная диагностикаДиагностика малярии основывается на обнаружении в препарате крови боль¬
ного любых стадий плазмодиев. При этом следует учитывать важные отличия
эритроцитарной шизогонии и гаметоцитогонии у различных видов малярийных
плазмодиев.При Р. falciparum оболочка эритроцита вскоре после вторжения в него паразита
приобретает способность прилипать к эндотелию сосудов. Вследствие этого эри-
шшЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 775троциты с паразитами, кроме самых молодых (на стадии кольца), задерживаются
в венулах внутренних органов (секвестрируются), поэтому в капиллярной крови
из бесполых форм обнаруживаются только самые молодые трофозоиты (кольца).
Гаметоциты созревают в венулах внутренних органов и впервые выплывают в
периферическое русло только с 10-12-го дня болезни. Гаметоциты Р. falciparum
отличаются большой продолжительностью индивидуальной жизни (до 6 нед),
отчего их продолжают обнаруживать и после прекращения эритроцитарной шизо¬
гонии в результате лечения. Именно поэтому при тропической малярии крайне
важно указывать, обнаружены ли в препарате только кольца, кольца вместе с
гаметоцитами (указание, что болезнь имеет давность 12 дней и более) либо только
гаметоциты (указание, что образование новых бесполых паразитов прекратилось,
но пациент остается заразен для комаров). Обнаружение гаметоцитов Р. falciparum
после излечения больного — обычное явление, оно не является показателем
неэффективности лечения. При других видах малярии с самого начала болезни
в периферической крови обнаруживают гаметоциты и бесполые паразиты всех
возрастов. Гаметоциты после созревания живут лишь в течение нескольких часов,
поэтому нет нужды специально отмечать их присутствие или отсутствие.Методы исследованияОсновным методом диагностики малярии является исследование толстой капли
крови, окрашенной по Романовскому-Гимзе. Исследование тонкого мазка явля¬
ется вспомогательным методом и проводится, как правило, для уточнения вида
малярийных паразитов. Используют иммерсионный объектив х90 и окуляр х7.Принцип метода. Объем исследуемой крови в толстой капле в 20-40 раз боль¬
ше, чем в тонком мазке. По этой причине положительный ответ можно дать после
исследования мазка или толстой капли, а отрицательный — только после иссле¬
дования толстой капли. При подозрении на малярию необходимо просмотреть
не менее 200 полей зрения толстой капли. Это позволяет выявить паразитемию
порядка 5-10 паразитов в 1 мкл крови. В препаратах крови обнаруживают внутри-
эритроцитарные стадии развития паразитов: трофозоиты, шизонты и гаметоциты.
Внеэритроцитарные стадии — мерозоиты, существуют короткое время, поэтому
они обнаруживают редко.Трофозоиты (от греч. trophe — «питание») — питающиеся гемоглобином, расту¬
щие стадии с одним ядром. Шизонты (от греч. schizo — «делюсь») — делящиеся
стадии, имеющие 2 ядра и более. Трофозоиты подразделяются на 5 возрастных
классов, границы между которыми достаточно условны: самый ранний класс
(1) - кольца, затем (2) юные, (3) полувзрослые, (4) взрослые и (5) трофозоиты,
готовящиеся к делению, или прешизонты. Шизонты подразделяются на незрелые
и зрелые, иногда называемые также морулами.Обнаружение плазмодиев. Доказательством наличия малярийного плазмо¬
дия служит обнаружение даже одного паразита на любой стадии развития. Однако
следует с осторожностью относиться к находке единственного образования,
похожего на кольцевидный трофозоит в толстой капле, так как эта находка может
быть результатом сочетания посторонних элементов, случайно попавших в иссле¬
дуемый материал, например кокков, частиц краски и пр. В сомнительных случаях
кровь пациента должна быть взята и исследована повторно.Видовая идентификация плазмодиев обязательна для формулирования клини¬
ческого и эпидемиологического прогноза, выбора лечения. Морфология плазмоди¬
ев различных видов в тонком мазке практически полностью сохранена, в толстой
капле форма изменяется в процессе дегемоглобинизации при окраске нефиксиро¬
ванной пробы крови. В практической работе можно использовать определитель,
разработанный А.Е. Беляевым (табл, 26-1). Для постановки диагноза сначала
решают, является ли данное образование малярийным паразитом (пункт ]).
'Шш:
жí^0fШМЖ|‘'ШШ^тШ:776 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙПри положительном решении переходят к пункту 2 и выбирают одно из двух
утверждений. Если в конце выбранного утверждения стоит название вида — это и
есть искомый диагаоз, если цифра — это указание, к какому пункту определителя
следует перейти. Процесс повторяют, пока не дойдут до названия вида.При обнаружении возбудителей малярии обязательно определение интенсив¬
ности паразитемии. Это дает информацию для прогноза заболевания и оценки
его эффективности. Достаточно точный метод сводится к подсчету среднего числа
паразитов на одно поле зрения толстой капли.Таблица 26-1. Определитель возбудителей малярии (по А.Е. Беляеву)в тонком мазке1. Образование, лежащее на фоне эритроцита, с одним или несколькими ядрами розового,
вишневого или рубинового цвета, с цитоплазмой голубого или синего цветаPlasmodiumspp.2, Имеются только кольцевидные трофозоиты (кольца) и/или полулунные гаметоцитыP. falciparumИмеются также более крупные трофозоиты и/или шизонты33. Пораженные эритроциты такого же или меньшего диаметра, чем непораженные.
Зернистость отсутствует. Трофозоиты компактныеP. malariaeПораженные эритроциты увеличены, имеется зернистость44. Зернистость мелкая и обильная. Трофозоиты обычно с ясно выраженными псевдопо¬
диями. Ядра относительно мелкиеP. vivaxЗернистость относительно крупная и редкая. Трофозоиты компактные. Ядра крупныеP. ovaleВ толстой капле1. Образование мельче сегментоядерного лейкоцита, имеет одно или несколько ядер
(обычно розового, вишневого или рубинового цвета) и цитоплазму (обычно голубого или
синего цвета)Plasmodiumspp.2. Имеются только кольцевидные трофозоиты (кольца) и/или полулунные гаметоцитыP. falciparumИмеются также более крупные трофозоиты и/или шизонты33. Трофозоиты неправильной формы, часто разорваны на мелкие фрагменты. Могут при¬
сутствовать остатки пораженных эритроцитов розового цветаP. vivaxТрофозоиты компактные и никогда не разрываются на мелкие фрагменты44. Обычно имеются остатки пораженных эритроцитов розового цвета. Ядра крупныеP. ovaleОстатков пораженных эритроцитов не наблюдается. Ядра мелкиеP. malariaeВыделяется 5 классов паразитемии, при этом численность паразитов в каждом
последующем классе в 10 раз выше, чем в предыдущем, образуя, таким образом,
логарифмическую шкалу:«+» — 1-10 в 100 полях зрения;^ «++» — 1-10 в 10 полях зрения;
v' «++-1-» — 1-10 в 1 поле зрения;•/ «++++» — 10-100 в 1 поле зрения;«+++++» — более 100 в 1 поле зрения.Если паразитов много, подсчет ведут в 10 полях зрения, если мало — в 100, а
при очень высокой численности достаточно и одного поля. В случае Р. falciparum
численность указьшают отдельно для бесполых форм и гаметоцитов, например,
кольца «+++», гаметоциты «+».Более точным является метод подсчета численности паразитов по отношению
к количеству лейкоцитов. Для этого необходимо параллельно определить числен¬
ность лейкоцитов. Например, в толстой капле на 100 лейкоцитов найдено 20 парази¬
тов, при этом известно, что у пациента 8000 лейкоцитов в 1 мкл крови. Составляют
пропорцию:8000x20/100 = 1600 паразитов.При очень высокой паразитемии ее интенсивность может бьггь охарактеризова¬
на количеством паразитов на 100 эритроцитов, подсчитанных в тонком мазке.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 777Оформление диагнозав ответе лаборатории указывают:какой препарат исследован (толстая капля или мазок);❖	количество исследованных полей зрения:❖	вид паразита;стадии паразита для Р. falciparum;
уровень паразитемии.Разработаны и применяются в некоторых случаях на практике экспресс-методы
диагностики малярии.МикрофилярииБольшой группой тропических гельминтов филярий вызываются у человека
8 нозоформ филяриидозов. Клинические проявления весьма разнообразны и в
зависимости от вида возбудителя включают поражение лимфатических сосудов,
кожи, подкожной клетчатки, органов брюшной полости, Филяриидозы характе¬
ризуются длительным инкубационным периодом, медленным развитием болезни
и продолжительным ее течением.Взрослые паразиты (4-10 см в длину) обитают в разных органах и тканях, где
отрождают личинки — микрофилярии. Отрождаемые личинки концентрируются
в крови (или в коже), где находятся длительно. Переносчиками филярий явля¬
ются кровососущие насекомые (мошки, слепни, комары, мокрецы). Численность
микрофилярий в крови связана с активностью переносчиков в разное время суток,
например, для микрофилярий Brugia malayi и Wuchereria bancrofti характерен ноч¬
ной пик численности, для Loa loa — дневной.Лабораторная диагностика основывается на обнаружении (в определенное
время суток) и идентификации микрофилярии в препаратах крови. Исследуют:❖	толстую каплю периферической крови;
мембранные фильтры после фильтрации крови;❖	осадок гемолизированной венозной крови.Идентификация микрофилярий. В нативных препаратах устанавливают
наличие микрофилярий змеевидной формы с характерной подвижностью, раз¬
меры в зависимости от вида возбудителя составляют 180-280 мкм в длину, 5-
10 мкм в ширину. Видовую идентификацию проводят при окраске препаратов по
Романовскому-Гимзе или, что предпочтительнее, по Гайденгайну. Основные мар¬
керы: наличие чехлика, расположение ядер в теле, форма хвостовой части,БабезииВозбудители бабезиоза — простейшие, представители рода Babesia, человек
заражается бабезидозом редко, в основном В. divergens. Этот вид паразитирует
обычно у крупного рогатого скота, овец и иногда передается человеку клещами.
Заболевание развивается только у лиц со сниженным иммунитетом, в частности
после спленэктомии. По характеру течения инфекции бабезиоз напоминает тропи¬
ческую малярию. Паразиты развиваются в эритроцитах и размножаются простым
делением. При поздней диагностике часты летальные исходы.Лабораторная диагностика основьшается на исследовании мазков и толстых
капель крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе.Идентификация бабезий. Бабезии расположены внутри эритроцитов в виде
одиночных кольцевидных образований, иногда по 2 или 4 особи в одном эритро¬
ците, и напоминают кольцевидные трофозоиты Р. falciparum. Однако они мельче,
не столь правильной кольцевидной формы, В цитоплазме паразитов отсутствует
пигмент. Шизонты и гаметоциты не встречаются.
t"Шщшт
ш^^Ш'тшш
шщШ'778 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙПАРАЗИТЫ В КОСТНОМ МОЗГЕобъекты исследования — возбудители висцеральных лейшманиозов — Leishma¬
nia infantum и Leishmania donovani.ЛейшманииЛейшмании — группа жгутиковых простейших, вызывающих различные виды
лейшманиозов, В крови обнаруживают только висцеротропные лейшмании —
Leishmania donovani подвида infantum Leishmania donovani — возбудители висце¬
ральных лейшманиозов. Наиболее часто завозимый в Россию паразит этой груп¬
пы, Leishmania donovani подвида infantum, встречается в странах Средиземноморья
(Греции, Тунисе, Турции, Франции, Испании, Португалии, Италии и др.), в
ряде стран - бывших республик СССР (Таджикистане, Туркмении, Узбекистане.
Казахстане, Грузии, Азербайджане), а также на южном берегу Крыма, в предгорьях
Кавказа. Средиземноморско-среднеазиатский (детский) висцеральный лейшмани¬
оз встречается очень редко. Это тяжелая протозойная инфекция, характеризуемая
хроническим течением, поражением лимфоидно-макрофагальной системы, спле-
номегалией, анемией и вторичной иммуносупрессией.Биология возбудителейПереносчиками возбудителей лейшманиоза являются москиты. Лейшмании в
организме человека (и некоторых животных — шакалов, лисиц) захватываются
моноцитами, где развиваются в амастиготы, вызывая генерализованный ретику-
логистиоцитоз. Амастигота — безжгутиковая стадия развития лейшманий оваль¬
ной или круглой формы, размером 3-5х1-3 мкм, с круглым ядром размером 0,7-
0,8 мкм. В цитоплазме можно видеть кинетопласт палочковидной формы.
Лейшмании являются внутриклеточными паразитами и размножаются простым
делением. На месте укуса москита формируется воспалительный бугорок, из кото¬
рого размножившиеся лейшмании разносятся по органам и тканям, локализуясь в
селезенке, костном мозге, крови, лимфатических узлах.Лабораторная диагностика основывается на обнаружении амастигот лейш¬
маний в аспирате костного мозга. Исследование крови не проводят из-за низкой
чувствительности этого метода. В некоторых случаях лейшмании могут быть
обнаружены в пунктате увеличенных лимфатических узлов.Сбор проб костного мозга проводят путем аспирации с помощью шприца из
грудины, гребня подвздошной кости или из эпифиза большеберцовой кости (у
детей до 3 лет). Аспират немедленно переносят на чистые обезжиренные предмет¬
ные стекла и готовят тонкие мазки, не разрушая клетки. Мазки быстро высушива¬
ют на воздухе или с помощью фена, красят по Романовскому-Гимзе аналогично
тонким мазкам крови.Идентификация лейшмании. Препараты исследуют в иммерсионной систе¬
ме, лейшмании в них расположены обычно вне клеток, но нередко их обнару¬
живают в цитоплазме мононуклеаров и нейтрофильных лейкоцитов; количество
лейшманий в одной клетке может достигать нескольких десятков. Они имеют
овальную или круглую форму размером 3-5х1-3 мкм. Цитоплазма окрашивается
в серовато-голубой, ядро — в красный или красно-фиолетовый, кинетопласт - в
темно-фиолетовый цвет.ПАРАЗИТЫ в ЛИКВОРЕв спинномозговой жидкости (СМЖ) можно обнаружить трипаносомы, ток-
соплазмы, сапрофитные амебы — Naegleria fowleri, Acanthamoeba spp., Balamuthia
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 779mandrillaris. Иногда в спинномозговой жидкости обнаруживают личинки трихи¬
нелл, Trichinellaspp., личинки кишечной угрицы — Strongyloides stercoraÜs, элементы
эхиноккоковой кисты (Echinococcus spp.). Однако исследование СМЖ не является
основным методом выявления указанных возбудителей.При паразитарных болезнях в спинномозговой жидкости формируется ком¬
плекс неспецифических признаков. При макроскопическом исследовании СМЖ
обращают внимание на ее цвет и прозрачность: нормальная жидкость бесцветна,
прозрачна, содержит 0,12-0,2 г/л белка и 1-2 клетки/мкл. Увеличение количества
клеток (цитоз) и изменение их состава могут свидетельствовать о заболеваниях, в
том числе паразитарной этиологии. Так, обнаружение в СМЖ лимфоидного плео-
цитоза с наличием гистиоцитов, макрофагов или эозинофильных гранулоцитов
может свидетельствовать о цистицеркозе головного мозга.Эозинофильный плеоцитоз может наблюдаться при цистицеркозе, ангиострон-
гилезе, гнатостомозе, парагонимозе, аскаридозе, трихинеллезе, эхинококкозе,
фасциолезе, шистосомозе, токсокарозе.Акантамебы, баламутии и неглерииЭто свободноживущие простейшие, амебы, способные при проникновении
в мозг (чаще всего при попадании с водой в носовые полости) вызвать нейтро¬
фильный и гранулематозный энцефалит и острый менингоэнцефалит, харак¬
теризуемый высокой летальностью. Возбудители живут в почве, воде, воздуш¬
ных фильтрах, экскрементах, разлагаюш[йхся тканях животных, промышленных
охлаждающих устройствах, воде бассейнов. Неглерии в виде цист проникают в
головной мозг через эпителий носовой полости, клетки которого способны к фаго¬
цитозу. Неглерии размножаются, вызывая кровоизлияния и некрозы, развивается
первичный амебный менингоэнцефалит. Болезнь поражает детей и молодых здо¬
ровых людей.Акантамебы и баламутии проникают в головной мозг через носоглотку и вызы¬
вают гранулематозный амебный энцефалит в основном у ослабленных людей,
получивших иммуносупрессивную терапию, в том числе у реципиентов органов и
тканей и ВИЧ-инфицированных. Акантамебы могут проникать через поврежден¬
ную роговицу с последующим развитием кератита, а также через кожу, на которой
появляются язвенно-некротические изменения. Б этих случаях их обнаруживают
при исследовании соскобов с конъюнктивы и жидкости из передней камеры глаза.
Встречаются диссеминированные формы акантамебиаза с поражением разных
органов, включая легкие.Лабораторная диагностика основывается на обнаружении трофозоитов диа¬
метром 10-35 мкм, с округлыми псевдоподиями и крупным ядром и цист диаме¬
тром 7-13 мкм в нативных или окрашенных препаратах СМЖ. Применяют также
культуральные методы, иммунодиагностику, гистологические исследования.Идентификация. Трофозоиты сапрофитных амеб в ликворе весьма схожи с
макрофагами. Трофозоиты неглерий концентрируются вокруг кровеносных сосу¬
дов в ЦНС, напоминают слизней с однонаправленным движением. При помеще¬
нии в воду они приобретают жгутиковую форму. При акантамебиазе и баламутиа-
зе, помимо трофозоитов, в СМЖ выявляются цисты.Трипаносомы в СМЖ появляются на поздней стадии болезни, когда возникают
симптомы поражения ЦНС. Исследуют нативный мазок из осадка СМЖ после
ее центрифугирования. Препарат просматривают под большим увеличением,
начиная с краев, поскольку трипаносомы часто концентрируются по самому
краю препарата. Можно также исследовать фиксированный и окрашенный по
Романовскому-Гимзе мазок.
780 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙщ	Токсоплазмы в СМЖ могут быть обнаружены у больных с острым токсоплаз¬мозом. Исследуют препарат из осадка СМЖ после центрифугирования. При окра¬
ске по Романовскому-Гимзе цитоплазма токсоплазмы приобретает синий цвет, а
ядро — темно-красный. Токсоплазма сохраняет полулунную форму, один конец ее
заострен, другой закруглен, размеры 3x7 мкм.Трихинеллы на стадии личинки иногда проникают в СМЖ, в частности у боль¬
ных с тяжелым течением трихинеллеза. Осадок СМЖ на наличие личинок трихи¬
нелл исследуют при малом увеличении микроскопа.Эхинококк в виде эхинококкового пузыря может развиваться в любых органах
и тканях, в ЦНС — редко.ПАРАЗИТЫ в ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛАХОбъектами исследования в увеличенных лимфатических узлах при трипаносо¬
мозе являются Trypanosoma spp.В некоторых случаях в аспирате лимфатических узлов при висцеральном лейш¬
маниозе можно обнаружить амастиготы лейшманий, однако основным методом
диагностики висцерального лейшманиоза является исследование аспиратов кост¬
ного мозга.ТрипаносомыВозбудителями трипаносомоза являются жгутиковые простейшие. В Африке
встречаются два вида трипаносомозов, их возбудргтели — Trypanosoma brucei
gambiense (гамбийский трипаносомоз) и Т. Ь. rhodesiense (родезийский трипа¬
носомоз), которые вызывают соответственно антропонозную и зоонозную
формы африканского трипаносомоза, или сонной болезни. Переносчиком воз¬
будителя африканского трипаносомоза является муха цеце. При африканском
трипаносомозе возбудители поражают лимфатические узлы, клетки ретикуло¬
эндотелиальной системы, в дальнейшем происходит диссеминация трипаносом
с поражением ЦНС. Б России трипаносомоз выявляется крайне редко, в виде
завозных случаев.Лабораторная диагностика африканского трипаносомоза основывается
на исследовании аспиратов лимфатических узлов (гамбийский трипаносомоз).
Возможно выявление возбудителей африканского (родезийского) трипаносомоза
в крови, СМЖ, пунктате костного мозга.Сбор проб проводят путем биопсии лимфатического узла. Пунктат лимфатиче¬
ского узла переносят из иглы на середину предметного стекла в каплю физраство¬
ра, накрывают покровным стеклом и исследуют при увеличении х400. В препарате
должны быть эритроциты и лейкоциты. Препарат просматривают, начиная с
периферических участков, поскольку трипаносомы стремятся проникнуть к краю
покровного стекла.Тонкий мазок из биоптата фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гймзе.
Трипаносомы обнаруживают в виде изогнутых образований, цитоплазма окра¬
шивается в синий цвет, ядро и кинетопласт, расположенный вблизи от одного
из концов трипаносомы, — в красный или фиолетовый. Рядом с кинетопласгом
начинается жгут, прикрепленный к клеточной стенке на всем протяжении, кроме
передней части, которая заканчивается свободно.В нативном препарате трипаносомы обращают на себя внимание энергичными
движениями, их размер превышает размер клеток в биоптате.Идентификация трипаносом до вида невозможна. В окрашенных препаратах
среди эритроцитов видны характерные по форме и по размеру кинетопласты и
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 781жгутиковые образования. Размеры колеблются в пределах 14-33x1,5-3,5 мкм.
Основные элементы строения:❖	тело удлиненное;•<^ ядро расположено в центре;<}■ на одном из полюсов находится кинетопласт;вдоль клетки расположена ундулирующая мембрана, заканчивающаяся жгу¬
тиком.Чувствительность метода составляет 70-75%.ИССЛЕДОВАНИЯ ПАРАЗИТОВ В КАЛЕ
Паразиты пищеварительного трактаФекалии — сложный по составу экскрет. В них могут быть обнаружены пропа-
гативные стадии множества паразитов и других симбионтов, обитающих в пище¬
варительном тракте.Фауну пищеварительного тракта обычно объединяют в две группы: простейшие
кишечника и кишечные гельминты. В группу простейших кишечника включают
не только патогенные виды, но и непатогенные, морфологически иногда трудно¬
отличимые от патогенных. С фекалиями вьщеляются яйца гельминтов, взрослые
особи которых обитают в кишечнике, а также вне кишечника, например пара-
гонима, обитающего в респираторном тракте, кишечной и японской шистосом,
локализующихся в мезентериальных венах, В фекалиях могут бьггь обнаружены
вегетативные стадии и цисты более 20 видов простейших, яйца и личинки многих
видов гельминтов, основные из которых представлены в табл. 26-2.Стеаторею с повышенным содержанием нейтрофильного жира, жирных кис¬
лот или мыла наблюдают чаще всего при инфекциях, протекающих с синдромом
мальабсорбции, — лямблиозе, стронгилоидозе, криптоспоридиозе, циклоспорозе,
изоспорозе. Часто обнаруживают непереваренные мышечные волокна, кристаллы
Шарко-Лейдена, Примесь крови и слизи в фекалиях выявляется при амебиазе и
балантидиазе. При амебной дизентерии эритроциты, как правило, склеены в кучки
разной величины, лишь небольшая их часть встречается в свободном состоянии.
При амебиазе в фекалиях среди небольшого количества нейтрофилов обнаружи¬
вают большое количество эозинофилов.!І!IМетоды исследованияСбор, доставка и консервирование пробНа результаты исследования влияет срок поступления и хранения материала
в лаборатории. При подозрении на амебную дизентерию фекалии должны быть
исследованы немедленно (не позже получаса) после дефекации. В пробе сохраня¬
ются и обнаруживаются вегетативные стадии и других амеб и жгутиковых. Пробы
оформленных фекалий можно до исследования хранить в течение 3-4 ч в холо¬
дильнике или поместить в консервирующую жидкость.Собирают пробы фекалий в сухие водонепроницаемые емкости из стекла или
полимеров, в них не должно быть следов химических веществ, губительно дей¬
ствующих на вегетативные стадии простейших и личинки гельминтов. Пробы
фекалий не должны содержать мочу. Взятие проб фекалий нежелательно прово¬
дить у пациентов, принимающих противопаразитарные лекарственные препараты,
подвергаемых незадолго до обследования рентгеноскопии с применением бария
или после масляных клизм. Доставка проб фекалий в лабораторию должна быть по
Таблица 26-2. Клинико-лабораторные характеристики паразитов пищеварительного трактаВозбудитель/инвазияПатогенная /инфитивная
стадия и ее размерыЛокализацияСимптомы, признаки, показателиЛабораторная диагностика (метод, диа¬
гностическая стадия)Anisakidae spp.Личинка 1,5-3,0 смРазные участки ЖКТБоль на месте проникновения личинки,
рвота, лихорадка, эозинофилияГистологическое исследование извлечен¬
ной личинки, иммуноферментный анализ
(ИФА)Ancytostoma duodenale!
АнкилостомозВзрослая особь 1-2 смТонкий кишечникАстения, микроцитарная гипохромная
анемияКопроовоскопияNecator amerícanus/некгторозВзрослая особь 1-2 смТонкий кишечникАстения, микроцитарная гипохромная
анемияКопроовоскопияAscaris lumbricoides/zcKíp^ozВзрослая особь 20-40 смТонкий кишечникБоли в животе, метеоризм, интоксикация,
непроходимость кишечникаКопроовоскопияHymenolepis /?аш/гименоле-
пидозВзрослая особь 4 смТонкий кишечникБоль в животе, диарея, астенияКопроовоскопияHymenolepis diminuta/шшно-
лепидоз крысиныйВзрослая особь до 60 смТонкий кишечникБоль в животе, диспепсияКопроовоскопияDicrocoelium lanceatum/Ampo-
целиоз*[Примечание:
перенесено в трематоды)Взрослая особь 1 смЖелчные протокиБоль в животе, диспепсияКопроовоскопияDipylidium canißum/ß,mmvt-
диоз*Взрослая особь до 70 смТонкий кишечникЭнтерит, боли в животеКопроовоскопияDiphyllobothriidae д. spp.
ДифиллоботриозыВзрослая особь до 12 мТонкий кишечникБоль в животе, метеоризм, макроцитарная
анемияКопроовоскопия,
идентификация члениковMetagonimus yokogawaüMeu-
гонимоз*Взрослая особь 1 ммТонкий кишечникЭнтерит, диспепсияКопроовоскопияNanophyetus schictiobalowü
нанофиегозВзрослая особь 1 ммТонкий кишечникЭнтерит, диспепсияКопроовоскопияOpisthorchis felineus/omaop-
X03ClonorchisSíWm/s/клонорхозВзрослая особь 8-13 мм
Взрослая особь 10-20 ммЖелчныеи панкреатическиепротокиЖелчныеи панкреатические
протокиЛихорадка, эозинофилия, боль в правом
подреберье, дискинезия желчных путей
Лихорадка, эозинофилия, боль в правом
подреберье, дискинезия желчных путейКопроовоскопия, исследование дуоде¬
нального содержимого, ИФА
Копроовоскопия, исследование дуоде¬
нального содержимого, ИФА■ыоогоо*0ЇІО"Ол:>
Продолжение табл. 26-2Возбудитель/инвазияПатогенная /инфитивная
стадия и ее размерыЛокализацияСимптомы, признаки, показателиЛабораторная диагностика (метод, диа¬
гностическая стадия)Strongyloiäes stercora//s/CTpo н-
гилоидозВзрослая особь 2 мм.
Личинка до 250 мкмЖКТ, другие органы и
ткани при диссеминиро¬
ванной формеЛинейная крапивница, кашель, диарея,
мальабсорбцияКопроларвоскопия.Специальные методы (Бермана и его
модификации). Обнаружение личинокTaeniarhynchus saginatus /
тениаринхозВзрослая особь до 12 мТонкий кишечникМетеоризм, боль в животе,
отхождение чл в ни ковКопроовоскопия.Яйца в фекалиях и перианальном соскобе
или отпечатке, идентификация члениковTaenia 5о/ш/77/тениозВзрослая особь до 7 мТонкий кишечникМетеоризм, боль в животе,
отхождение члеников.
ЦистицеркозКопроовоскопия.Яйца в фекалиях и перианальном соскобе
или отпечатке, идентификация члениковTricliosfrongylidae 5рр,/трихон-
стронгилидоз*Взрослая особь до 6 ммТонкий кишечникЭнтерит, боли в животеКопроовоскопия>Tríchocephalus trichiurus /три¬
хоцефалезВзрослая особь до 5 смТолстая кишкаБоли в животв, нарушения функции ЖКТ,
астенияКопроовоскопия ^Fasciola ЛераГ/са/фасциолезВзрослая особь 2-3 смЖелчные протокиЛихорадка, крапивница, эозинофилия,
гепатомегалия, желтухаКопроовоскопия, исследованив дуоде- X
нального содержимого, ИФА 5Schistosoma mansoni,S. japonícum, S. mekongi,S. intercalatum/mcTocoMos
кишечный**Взрослая особь 0,2-2,5 смВены, разные органыЗуд, эритема, эозинофилия,кровь в фекалиях, гепатоспленомегалия,портальная гипертензияКопроовоскопия. ИФА 3XоEnterobius vermicularis/
энтеробиозВзрослая особь до 1,3 смТонкий и толстый кишеч¬
никПерианальный зуд, боль в животе, астенияОбнаружение яиц в перианальном соско- ^
бе или отпечатке ^Протозоозы ^Entamoeba М$іоІуИса/те6\лгз15-50 мкмТолстый кишечник, реже
другие органы и тканиКолит, диарея, примесь слизи и крови в
фекалиях, тенезмы, лихорадкаТрофозоиты и цисты в фекалиях, ИФА ^X0"Balantidium со///6алантидиазТрофозоит 30-150 мкм
Циста 40-65 мкмТолстый кишечникДиарея, примесь слизи и крови в фекалиях,
боли в животеТрофозоиты в фекалиях .л§Blastocystis Лот/Л(5/6ласто-ЦИСТ03Трофозоит 5-30 мкмКишечникДиарея, боли в животеТрофозоиты в фекалиях хтDienthamoeba fragilis/fi,v\dma-
мебиазТрофозоит 5-15 мкмТолстый кишечникДиарея, боли в животеТрофозоиты 8 фекалиях
	 00
Окончание табл. 26-2Возбудктель/инвазияПатогенная /инфитивная
стадия и ее размерыЛокализацияСимптомы, признаки, показателиЛабораторная диагностика (метод, диа¬
гностическая стадия)Cn/ptospor\d)m рап/ит/кч>т-
тоспоридиозТрофозоит 10-15 мкмТонкий кишечникДиарея, анорексия, потеря массы телаОоцисты в фекалияхCyclospora caetanensis/m^o-
спорозТрофозоит 8-10 мкмТонкий кишечникДиарэя, анорексия, потеря массы телаОоцисты в фекалияхIsospora 0е////изоспорозТрофозоит 20--30х10-
20 мкмТонкий кишечникДиарея, анорексия, потеря массы телаОоцисты в фекалияхLamblia intestirjalis (Giardia
1атЬИа)/пшбтозТрофозоит 10-20 мкмДвенадцатиперстнаякишкаДиарея, диспепсия, боли в животеТрофозоиты в дуоденальном содержи¬
мом, трофозоиты и цисты в фекалиях3=1S3>■ Встречаются редко.“ Возможны только завозные случаи из тропических стран.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 785ВОЗМОЖНОСТИ немедленной после взятия, то есть в теплом виде, в случае задержки
доставки проб в лабораторию или невозможности исследования в короткрш сроки
пробы должны быть помещены в химические консерванты или храниться при тем¬
пературе 0-4“С не более 1 сут. В качестве консервантов можно использовать 4%
раствор формалина, 3-10% раствор уксусной кислоты, 1,0-1,5% раствор детерген¬
тов (моющие порошки без биоактивных добавок), а также жидкость Барбагалло
(3 мл формалина 40% + 97 мл физраствора или 1 л дистиллированной воды +
30 мл 40% формалина + 8,5 г поваренной соли). Для сохранения простейших
кишечника применяют консервант Турдыева (80 мл 0,2% раствора NaN02 + 2 мл
глицерина + 10 мл концентрированного формалина + 8 мл концентрированного
раствора Люголя). Соотношение проб фекалий и консерванта составляет 1:3, Для
сохранения взрослых особей гельминтов и их фрагментов используют жидкость
Барбагалло, 10% формалин, 70% спирт, глицерин.Длительное сохранение вегетативных стадий и цист простейших, яиц гельмин¬
тов в консервантах позволяет в затруднительных случаях переслать законсерви¬
рованный материал на консультацию в специализированную лабораторию. Такой
материал, содержащий точно идентифицированные простейшие или гельминты,
можно использовать в учебных целях, а также для контроля знаний врачей клини¬
ческой лабораторной диагностики.Вероятность наличия и обнаружения паразитарных объектов в пробах фекалий
в значительной степени определяется консистенцией стула. Вегетативные стадии
простейших обнаруживают обычно в жидких фекалиях и редко в оформленных.
Наоборот, цисты простейших в неоформленном стуле присутствуют редко, за
исключением тех случаев, когда жидкие фекалии получены после очистительной
клизмы; при этом в пробе могут быть обнаружены как вегетативные стадии, так и
цисты. Обычно цисты обнаруживают только в оформленном стуле.Макроскопические методы исследованияМакроскопические методы исследования направлены на поиск взрослых особей
гельминтов (например, остриц, аскарид) или их фрагментов (сколексов, члеников
и частей стробилы цестод). Применяют два метода: отмз^ивания и отстаивания.Метод отмучиванияПростым и эффективным является просмотр разжиженных водой фекалий
в чашках Петри. Фекалии размешивают с водой до образования равномерной
суспензии, после чего исследуют небольшими порциями на темном фоне в кюветах
или чашках Петри. Пинцетом или препаровальными иглами извлекают все подо¬
зрительные частицы белого цвета, помещают на предметное стекло в каплю 50%
раствора глицерина или воды, накрывают другим предметным стеклом и исследу¬
ют под лупой, а в случае необходимости ~ под микроскопом.Ленточные гельминты определяют по строению членика. Узкий длинный чле¬
ник характерен для бычьего и свиного цепня, короткий, плоский — для лентеца
широкого. Вид ленточного гельминта устанавливают по строению матки:
если она имеет форму розетки — это лентец широкий;^ если она имеет 20-30 боковых ответвлений — это цепень бычий;
если 8-12 — цепень свиной.Установить факт полного отхождения крупных цестод после дегельминтизации
можно, исследуя при малом увеличении узкий головной конец:❖	наличие четырех присосок с крючьями — свиной;❖	без крючьев — бычий;с двумя щелями (ботриями) — лентец широкий.Метод отстаиванияФекалии помещают в цилиндр и заливают 3-4 объемами воды, перемешивают
до образования гомогенной суспензии и дают отстояться 10-15 мин, надосадоч-
ный слой жидкости сливают. Процедуру повторяют трижды и исследуют осадок.
786 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙМетод флотацииИспользуют для выявления яиц гельминтов. Метод основан на том, что яйца
гельминтов всплывают на поверхность растворов с высоким удельным весом
(нитрата аммония, нитрата натрия, сульфата натрия, хлорида натрия). Метод
эффективен только для вь[явления яиц нематод и цестод, неэффективен для выяв¬
ления яиц трематод.Метод осажденияДля одновременного поиска возбудителей гельминтозов и протозоозов целе¬
сообразно применять наиболее простой, универсальный и эффективный метод —
формалин-эфирное осаждение. В качестве основных реактивов используют 10%
формалин, этиловый эфир, препараты докрашивают раствором Люголя. Метод
осаждения эффективно выявляет инвазии разной степени интенсивности. Его
применяют для выявления яиц и личинок гельминтов кишечника и печени, цист
и ооцист простейших. Трофозоиты простейших в используемых реактивах быстро
погибают и деформируются, поэтому не выявляются методам осаждения.Микроскопические методыМикроскопические методы исследования направлены в основном на обнару¬
жение пропагативных стадий возбудителей (яиц, личинок, цист, ооцист). В связи
с низкой интенсивностью инвазии целесообразно применять для диагностики
методы обогащения. Отрицательные результаты исследований методом нативного
мазка не считаются достоверными.Нативный (свежий неокрашенный) мазок. Он представляет собой взвесь
фекалий в капле воды, физраствора либо 50% раствора глицерина (последний
обеспечивает просветление материала, облегчая обнаружение яиц гельминтов, и
предохраняет препарат от высыхания). Достоинство метода - возможность обна¬
ружения, помимо яиц гельминтов, вегетативных стадий простейших (иногда и их
идентификацию по характеру движения).В нативном мазке простейшие кишечника и цисты бесцветны, отличаются от
фона лишь светопреломлением. Однако очень существенно, что вегетативные
стадии проявляют в препарате, приготовленном на физрастворе, характерную для
данного вида подвижность, чем способствуют их обнаружению, В нативном мазке
могут быть распознаны гематофаги Е. histolytica, цисты амеб и лямблий, яйца и
личинки гельминтов.При низкой интенсивности инвазии чувствительность метода недостаточная,
поэтому исследование материала с применением методов обогащения следует про¬
водить в обязательном порядке.Нативный мазок, обработанный раствором Люголя, предназначен для
обнаружения и идентификации цист простейших.На предметном стекле готовят два нативных мазка: один на физрастворе, дру¬
гой с раствором Люголя. Если мазок один, его исследуют вначале в неокрашенном
виде для выявления подвижных вегетативных стадий простейших, а затем добав¬
ляют каплю раствора Люголя. При двух мазках один исследуют на наличие веге¬
тативных стадий простейших и яиц гельминтов, другой обрабатывают раствором
Люголя. В последнем случае каплю раствора наносят у края покровного стекла,
йод при этом диффундирует в мазок, окрашивая его с разной интенсивностью по
мере проникновения в разные участки мазка.Достоинство мазка, обработанного раствором Люголя, — возможность обна¬
ружения в цистах простейших важных морфологических деталей, невидимых в
нативном (неокрашенном) мазке.Метод толстого мазка фекалий по Като и МиуриПринцип метода — исследование на яйца гельминтов большего объема фекалий
за счет просветления мазка смесью Като. На предметное стекло наносят комочек
фекалий величиной с горошину, покрывают замоченной в смеси Като целлофано-
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 787ВОЙ пластинкой, придавливают резиновой пробкой для получения равномерной
толщины мазка. Препарат оставляют для просветления на 40-50 мин при ком¬
натной температуре. Просветленный мазок микроскопируют через целлофановую
пленку. В толстом мазке по Като обнаруживают яйца аскарид, власоглава, анкило-
стоматид, лентецов (D. Шит и др.), трематод (O.felineus, Е hepatica, D. lanceatum
и др.). Эффективность метода для выявления яиц гельминтов достигает 84%.Методы обогащенияИсследование проб фекалий в мазках любого типа не всегда достаточно эффек¬
тивно из-за низкой численности цист или яиц в исследуемом материале, непосто¬
янства их выделения из кишечника и других причин. Отрицательный результат
анализа фекалий на простейшие и гельминты методом нативного мазка не может
считаться достоверным. Это обстоятельство вынуждает проводить обследование
пациента повторно и применять методы обогащения. Методы основаны на кон¬
центрации яиц и личинок гельминтов или цист простейших в пробе благодаря
отделению собственно фекальных частиц и накоплению паразитарных объектов
в препаратах. Процедуре обогащения могут подвергаться как свежие фекалии, так
и материал из консервирующих жидкостей. Стандартными методами являются
следующие:❖	толстый мазок фекалий на предметном стекле под гигроскопическим цел¬
лофаном, пропитанным раствором глицерина и фенола, — метод Като и
Миури, эффективность которого выше, чем исследование нативного мазка,
за счет большего объема исследуемых фекалий, однако при этом все-таки
не выявляются случаи гельминтозов с низкой интенсивностью, простейшие
кишечника;<> формалин-эфирное осаждение;❖	уксусно-эфирный метод осаждения;❖	химико-седиментационный метод (редко применяется из-за трудоемкости).СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫОбнаружение яиц остриц на перианальных складкахПринцип метода основан на взятии яиц остриц с перианальной области, отло¬
женных там самкой в период ее гибели. Помимо яиц остриц, этим методом мог>т
быть выявлены онкосферы бычьего цепня, редко личинки кишечной угрицы.Перианальный отпечаток на клейкую ленту (по Грэхему)Взятие материала проводят путем прикосновения кусочком ленты к перианаль-
ным складкам, яйца гельминтов прилипают к ней. Ленту приклеивают к пред¬
метному стеклу и просматривают под микроскопом. Перед исследованием под
микроскопом приподнимают ленту и наносят каплю иммерсионного масла под ее
середину — это улучшит прозрачность ленты.Перианальный отпечаток на липкую поверхность глазных лопаток
(метод Б.Е. Рабиновича)Набор для исследования состоит из стеклянных глазных лопаток со стержнем,
уложенных в пенал; специального клея из клеола, касторового масла, эфира и
спирта. Взятие материала проводят стеклянной глазной лопаточкой, покрытой
клеем, которую исследуют с обеих сторон при малом увеличении после установки
в кассете-держателе.Метод в 2 раза чувствительнее, менее трудоемок и значительно дешевле, чем
метод липкой ленты. Преимуществом метода является удобство для персонала и
пациентов.Перианальный соскоб по КеворковойПо Кеворковой используют шпатель с ватным тампоном, по Торгушину — шпа¬
тель с ватным тампоном, смоченным в глицерине. Эти методы менее эффективны■
шШ
788 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙПО сравнению с методами исследования по Грэхему и Рабиновичу, в последние
годы их применяют редко.Обнаружение личинок Strongyloides stercoralis — кишечной угрицыВыделяемые с фекалиями личинки обнаруживают, используя термотропизм
личинок — выход их из остывающих фекалий в среду (воду) с более высокой тем¬
пературой. Применяют метод исследования фекалий по Берману. Для проведения
этого исследования лечащий врач в направлении в лабораторию должен указать,
какой именно гельминтоз подозревается у пациента. Эффективность однократно¬
го исследования этим методом составляет 20-30% и возрастает при повторных (не
менее трех) исследованиях.ПростейшиеСтандартным методом выявления цист (ооцист) простейших в пробах фекалий
является формалин-эфирное осаждение. При этом трофозоиты погибают и не
выявляются. Временное хранение проб в стандартных консервантах не снижает
эффективности выявления цист. Трофозоиты могут быть обнаружены в нативном
мазке, в основном в пробах, исследование которых проводят немедленно после
взятия, В отношении цист лямблий чувствительность однократного обследова¬
ния методом формалин-эфирного осаждения составляет около 65%, троекратное
исследование повышает чувствительность метода до 80-90%. Для выявления
простейших кишечника требуется проведение, по крайней мере, 3 исследований с
интервалом несколько дней.Некоторые виды простейших выявляются с помощью специальных окрасок,
например по Цилю-Нильсену, сафранином (криптоспоридии, циклоспоры).Обитатели кишечника относятся к одной из 4 групп: амебам, жгутиковым, рес¬
нитчатым и кокцидиям.Амеба дизентерийнаяEntamoeba histolytica является возбудителем важнейшей кишечной инфекции
амебной дизентерии (амебиаза). Локализуется в толстом кишечнике, выделяет¬
ся в форме трофозоита (с жидкими фекалиями) и/или цисты (в оформленных
фекалиях). Поскольку большинство видов амеб, обитающих в кишечнике, непа¬
тогенны, следует быть очень осмотрительными при лабораторной диагностике,
Трофозоиты дизентерийных амеб в нативном препарате имеют зеленоватый цвет,
благодаря преломлению света они поблескивают, их диаметр может быть раз¬
личным — от 15 до 60 мкм. Важнейшим диагностическим признаком амебиаза
(амебной дизентерии) является обнаружение трофозоитов с поглощенными ими
эритроцитами — гематофагов, а также характерное однонаправленное движение
трофозоитов в нативном препарате. Во всех остальных случаях обнаружение
Е. histolytica-иодобных трофозоитов, не содержащих эритроцитов, не является
основанием для диагноза амебиаза как болезни. В равной степени это относится
и к случаям обнаружения только цист Е. histolytica, что характерно для цистоноси-
телей или реконвалесцентов. В связи с этим особую важность приобретает диф¬
ференциация трофозоитов и цист Е. histolytica от других видов амеб, обитающих
в юішечнике. Трофозоиты амеб различаются по наличию или отсутствию пери¬
ферического хроматина в ядре. Трофозоиты Е. hislolytica имеют периферический
ядерный хроматин, маленькую кариосому в ядре, мелкозернистую цитоплазму, в
которой отсутствуют бактерии, могут находиться (или отсутствовать) эритроци¬
ты. Трофозоиты непатогенных амеб Entamoeba coli и Entamoeba hartmanni, так же
как и дизентерийная амеба, имеют периферический ядерный хроматин, однако
у Е. coli цитоплазма имеет грубую зернистость, в ней обнаруживают бактерии и
дрожжи, которые никогда не обнаруживают в цитоплазме дизентерийной амебы,
В цитоплазме трофозоита Е. hartmanni могут находиться поглощенные эритроци-
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 789ТЫ. однако размер трофозоитов составляет 8-15 мкм, тогда как у дизентерийной
амебы — 15-60 мкм. У непатогенных амеб Endolimax папа, lodamoeba butschlii
и Dientamoeba fragiîis периферического хроматина в ядре трофозоитов нет, они
имеют меньший диаметр (до 15 мкм) и большую кариосому в ядре. Более 50% тро¬
фозоитов D.fragiUs имеют 2 ядра. Дифференциацию и идентификацию трофозои¬
тов Е. histolytica осуществляют по влажным (нативным) препаратам, ориентируясь
на характер их движения (однонаправленное), наличие в цитоплазме трофозоитов
эритроцитов. Для более точной идентификации трофозоитов и цист проводят
экспресс-окраску препаратов буферным метиленовым синим, а также окраску
постоянных препаратов трихромовым красителем или железным гематоксилином
по Гайден^'айну.Лямблия(Синоним Lamblia intestinalis — Giardia lambliä) — единственная среди остальных5	видов, обитающих в кишечнике жгутиковых, вызывающая у людей симпто¬
мы заболевания ЖКТ, в основном диарею, диспепсию, боли в животе, особенно
у первично зараженных детей. Это распространенный кишечный протозооз,
которым в некоторых регионах заражено до 30% детей, обратившихся за меди¬
цинской помощью с симптомами заболевания желудочно-кишечного тракта.
У трофозоитов лямблий имеется 4 пары жгутиков, дифференцировать их необхо¬
димо от Pentatrichomonas {Trichomonas) hominis. Цисты лямблии имеют овальную
форму с 2-4 ядрами и несколькими аксонемами, расположенными продольно.
Размеры цист — 8-12x7-10 мкм. Трофозоиты лямблий выявляются в нативном
мазке и отличаются характерным движением (подобно падающему листу, коле¬
блясь то вперед, то назад), наличием жгутиков. Размеры трофозоита составляют
10-20 мкм. Для изучения структуры цист нативный препарат обрабатывают
раствором Люголя. Для детальной дифференциации мазки в некоторых случаях
окрашивают трихромом.БалантидииBalantidium coli — единственный патогенный представитель из группы рес¬
ничных. Люди заболевают балантидиозом редко, заражаясь главным образом от
свиней. Возбудитель обнаруживают в фекалиях в форме трофозоитов или цист.
Трофозоиты крупные, 50-200x40-70 мкм, очень подвижные, хорошо заметны
в препаратах с физраствором при малом увеличении. Они покрыты короткими
волосками (ресничками), имеют макро- и микронуклеус. В окружающей феде
неустойчивы, исследовать фекалии необходимо как можно быстрее. Диаметр
цист — 45-75 мкм.КриптоспоридииCryptosporidium spp. — важнейший представитель кокцидий кишечника.
Cryptosporidium parvum вызывает диарею у детей младше 5-летнего возраста, одна¬
ко его значение многократно возросло как возбудителя СПИД-ассоциируемой
инфекции криптоспоридиоза. Криптоспоридий развивается в ворсинках эпителия
кишечника, располагаясь в особой вакуоле.Метод исследования — обнаружение окрашенных ооцист в фиксированном
мазке фекалий. Мазок фекалий высушивают на воздухе, фиксируют в смеси
Никифорова 10-15 мин или над пламенем горелки и красят по Цилю-Нильсену.
Ооцисты криптоспоридий имеют круглую форму, диаметр 5-6 мкм и окрашива¬
ются в разные оттенки ярко-красного цвета. Сопутствующая микрофлора окраши¬
вается в зеленый цвет. Характерный признак ооцист криптоспоридий — наличие
внутри черных гранул.В красный цвет также могут окрашиваться капли жироподобных веществ, гра¬
нулы детрита. Даже при случайном сходстве по размерам эти образования можно
отличить от ооцист по отсутствию у них отчетливой оболочки и структурирован¬
ного содержимого, в сомнительных случаях применяют модификацию окраски по
W'<-шшШ 790 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙЦилю-Нильсену — уменьшают концентрацию малахитового зеленого, что облег¬
чает видовую идентификацию ооцист Cryptosporidium spp., Cyclospora caetanensis,
Isospora belli.В последние годы применяют окраску 1% водным раствором сафранина или
метиленовым синим. Эти способы более надежны, просты, требуют меньше
времени по сравнению с методом окраски по Цилю-Нильсену,ИзоспораИзоспора — возбудитель изоспороза, протозойной инфекции, значение которой
в патологии человека стало возрастать в связи с эпидемией ВИЧ/СПИДа,Ооцисты Isospora belli могут быть обнаружены в нативных препаратах или в
препаратах, приготовленных из осадка фекалий, полученных методом формалин-
эфирного осаждения. При обработке мазка раствором йода ядра ооцист хорошо
прокрашиваются. Ооцисты I. belli имеют овальную форму, размер 32x16 мкм, в
центре находится неразделенная масса цитоплазмы.ЦиклоспораЦиклоспора — возбудрггель циклоспороза, актуальность этой протозойной
инфекции возрастает в связи с эпидемией ВИЧ/СПИДа, В нативных препаратах
в ооцистах Cyclospora caetanensis при малом увеличении хорошо видны многочис¬
ленные сферические тельца, а при большом увеличении — 2 спороцисты с 2 споро-
зоитами в каждой. В окрашенных по Цилю-Нильсену препаратах ооцисты могут
быть бесцветными или окрашенными с разной интенсивностью. Это свойство, а
также их больший размер (8-10 мкм) служат отличительными признаками при
сравнении с ооцистами криптоспоридий.ГельминтыВ фекалиях могут бьггь обнаружены яйца и/или личинки многих видов гель¬
минтов, относящихся к трем классам; нематодам, цестодам и трематодам. Для
обнаружения чаще всего используют универсальный метод формалин-эфирного
осаждения, который позволяет одновременно выявить цисты и ооцисты простей¬
ших.НематодыНематоды, обитающие в кишечнике, относятся в большинстве своем к группе
геогельминтов, их пропагативные стадии (яйца, личинки) приобретают инва-
зивность лишь после пребывания в почве. Исключением является острица, яйца
которой становятся инвазивными через 3-4 ч после откладки их самкой на
перианальной области. Личинки кишечной угрицы инвазивны уже в кишечнике,
вследствие этого возможно развитие диссеминированных форм стронгилоидоза с
проникновением личинок в разные органы и ткани.Лабораторная диагностика нематод основана на обнаружении яиц и/или личи¬
нок в препаратах из фекалий или в перианальном соскобе (отпечатке) при энте¬
робиозе.Идентификация яиц аскарид, власоглава, анкилостоматид, трихостронгилид,
остриц и личинок кишечной угрицы проводят, ориентируясь на опыт, атласы и
справочники. Некоторые затруднения может представить идентификация опло¬
дотворенных и неоплодотворенных яиц Ascaris lumbricoides. Первые имеют оваль¬
ную или круглую форму, покрыты толстой наружной фестончатой многослойной
оболочкой, окрашенной пигментами фекалий в темно-желтый или коричневый
цвет; вторые — удлиненные по форме, покрьггы фубой оболочкой с неровными
фестонами, более прозрачны, чем оплодотворенные (видны крупные желточные
клетки). Наличие в препарате только неоплодотворенных яиц свидетельствует о
низкой интенсивности инвазии (отсутствии самцов). Следует иметь в виду, что
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 791яйца Ancylosloma duodenale и Necator americanus морфологически неразличимы,
поэтому при их выявлении следует писать: «Обнаружены яйца анкилостоматид
\\ш Ancylostomatideag.spp>.	^Нематодозы зоонозной природы — токсокароз, анизакидоз, трихинеллез, диро- Ш
филяриоз — диагностируют иммунологическими и гистологическими методами.ЦестодыЦестоды — биогельминты, в их жизненном цикле участвуют животные. Человек
для большинства цестод является окончательным хозяином (паразитируют взрос¬
лые особи), для эхинококков — промежуточным (паразитируют в личиночной
стадии). Взрослые стадии цестод продуцируют яйца (диагностические стадии), о
наличии личиночных стадий эхинококков судят по результатам иммунологиче¬
ского исследования.Выявляемость яиц Г. saginatus и Я. папа существенно повышается при комбина¬
ции методов обогащения по Калантаряну и толстого мазка по Като. D. latum выде¬
ляет яиц так много, что они надежно выявляются в нативном мазке.Идентификацию яиц цестод (цепней — Hymenolepis папа, Taenia solium,
Taeniarhynchus saginatus и лентеца широкого — Diphyllobothrium latum) проводят,
ориентируясь на морфологические признаки. Следует иметь в виду, что онкосферы
Г. solium и Г. saginatus морфологически неразличимы, при их обнаружении следует
писать: «Обнаружены онкосферы тениид или Taeniidae spp.^. При инвазии кар¬
ликовым цепнем возможно размножение гельминтов в кишечнике человека без
выхода в окружающую среду, особенно у лиц со сниженным иммунитетом.ТрематодыТрематоды — биогельминты, человек для них является единственным оконча¬
тельным хозяином (шистосомы) или одним из окончательных наряду с животны¬
ми (описторх, фасциола и др.). Все виды трематод, паразитирующие в организме
человека, продуцируют яйца, выделяемые с фекалиями (исключение составляет
Schistosoma haematobium, яйца которой выделяются с мочой).Вследствие слабой интенсивности трематодных инвазий рекомендуют всегда
применять метод формалин-эфирного обогащения или метод Като. Следует также
иметь в виду важную особенность диагностики трематодозов: в острой стадии
инвазии, которая может продолжаться в течение нескольких недель или месяцев,
яйца паразитами не продуцируются и копроовоскопия в это время бесполезна.Наличие возбудителя в острой стадии может быть установлено только косвенно,
иммунологическими методами.Морфологические признаки яиц трематод приведены в табл. 26-2, в которой
также представлены отличительные при.знаки морфологически сходных яиц опи-
сторха, метагонима и клонорха. Яйца Fasciola hepatica и Dicrocelium lanceatum могут
быть «транзитными» (находились в съеденной печени крупного рогатого скота
или овец), для исключения ложного диагноза исследование фекалий необходимо
повторить через несколько дней, исключив из рациона пациента сырую или тер¬
мически слабо обработанную печень.ПАРАЗИТЫ в ДУОДЕНАЛЬНОМ СОДЕРЖИМОМв дуоденальном содержимом можно обнаружить яйца гельминтов, паразити¬
рующих в печени, — O.felineus, D. lanceatum, C. sinensis, F. hepatica, личинки S. sterc¬
oralis, ооцисты — Isospora belli, Cryptosporidium spp., трофозоиты лямблий.Полученное при дуоденальном зондировании содержимое необходимо подвер¬
гать немедленному микроскопическому исследованию, так как через 30 мин состав
его меняется. Для исследования дуоденальное содержимое выливают в чашки
Петри и микроскопируют при малом увеличении. Затем каждую порцию дуоде¬
нального содержимого соединяют с равным количеством эфира, смесь взбалтыва-
792 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙЮТ и центрифугируют. Надосадочную жидкость выливают, а осадок помещают на
предметное стекло и просматривают под микроскопом. В нативных мазках можно
увидеть увеличенное количество эпителиальных клеток желчных протоков, лей¬
коцитов, а также обнаружить эозинофилы (свидетельство острого или хрониче¬
ского холангита или холецистита паразитарной этиологии), трофозоиты лямблий,
яйца и личинки гельминтов. Помимо нативных препаратов, можно исследовать
окрашенные мазки для выявления ооцист изоспоры и криптоспоридий. Чаще
всего применяют модифицированную окраску по Цилю-Нильсену.ПАРАЗИТЫ в МОЧЕв норме моча соломенно-желтого цвета, прозрачная. Для диагностики многих
паразитарных поражений мочевыделительной системы имеет значение изменение
цвета и прозрачности мочи.В моче могут быть обнаружены яйца шистосом {Schistosoma haematobium) и
диоктофим {Dioctophyme гепак), изредка — трофозоиты Trichomonas vaginalis, цисты
Entamoeba histolytica, микрофилярии Wuchcreria bancrofti и Onchocerca volvulus.Следует иметь в виду, что некоторые виды простейших, обнаруживаемые в про¬
бах мочи, могут быть следствием загрязнения ее фекалиями или влагалищными
выделениями, в емкостях из-под напитков с содержанием углекислоты, сахаров
часто развиваются свободноживущие личинки мочекислой угрицы, которые под¬
вижны и способны захватывать лейкоциты и эритроциты в моче. Эти объекты,
не имеющие отношения к паразитарным болезням, привлекают внимание специ¬
алистов лабораторий, чаще всего их ошибочно принимают за личинки кишечной
угрицы. Для того чтобы исключить их как причину поражений мочевыделитель¬
ной системы, следует сделать повторный анализ пробы мочи, взятой стерильно.Неспецифические признаки паразитарных болезней в осадке мочи наблюда¬
ются при следующих паразитозах: малярии, мочеполовом шистосомозе и лимфа¬
тических филяриидозах, диоктофимозе. При осложненной тропической малярии
(остром гемолизе и гемоглобинурийной лихорадке) могут быть обнаружены
повышенное содержание белка, неизмененные или выщелоченные эритроциты,
зернистые и гиалиновые цилиндры, выявляются также альбуминурия, уробилину-
рия, билирубинурия. в моче обнаруживают глыбки и желтые крошковатые массы
аморфного гемоглобина, оксигемоглобин, метгемоглобин.При мочеполовом шистосомозе часто наблюдается эозинофилурия, при кото¬
рой в осадке мочи можно обнаружить до 15-95% эозинофилов, причем их коли¬
чество в моче всегда выше, чем в крови.Лимфатические филяриидозы часто сопровождаются хилурией, моча стано¬
вится «жирной», мутной, опалесцирующей, напоминающей молоко. В сосуде
собранная моча разделяется на три слоя: верхний - молочный хилус, средний —
обесцвеченная моча со сгустками и детритом, нижний — клеточный осадок. Для
диоктофимоза характерны гематурия, олигурия. анурия, пиурия, резистентные к
общепринятым методам терапии.Для исследования на мочеполовой шистосомоз мочу собирают в период наи¬
большей активности обследуемого. В качестве пробы для исследования исполь¬
зуют последнюю порцию мочи объемом до 10 мл. Количество яиц 5. haematobium
в пробе мочи увеличивается после нагрузки на мышцы брюшного пресса, что
действует на стенку мочевого пузыря, стимулирует выход яиц S. haematobium в
просвет мочевого пузыря и повышает вероятность их обнаружения. Исследуют
только свежую порцию мочи, В тех случаях, когда это невозможно, в мочу реко¬
мендуют добавлять консерванты, способствующие длительному сохранению яиц
5. haematobium (несколько суток). Наиболее простым и доступным консервантом
является формалин, концентрация которого после добавления в мочу должна быть
ЩшшЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 793В пределах 5%. Сбор проб для обнаружения возбудителя диоктофимоза проводят
обычным способом.Для обнаружения в моче яиц или личинок гельминтов применяют два метода:
осаждение и фильтрацию.•	Метод осаждения менее чувствительный, но более дешевый и простой в
выполнении, пробы мочи центрифугируют и из осадка готовят препаратыШ
11^на покровных стеклах. Препараты исследуют в нативном или окрашенномвиде.	Щ•	Метод фильтрации благодаря его высокой чувствительности используют для
количественной оценки инвазии. При фильтрации мочи через фильтр не про¬
пускаются яйца и личинки.Мочеполовой шистосомозЗаражение происходит при проникновении через кожу и слизистые оболочки
находящихся в воде пресноводных водоемов личинок — церкарий. В организме
человека шистосомы паразитируют в венах мочевого пузыря, с мочой выделяются
яйца гельминтов, имеющие удлиненную овальную форму, длину до 150 мкм, на
одном из полюсов расположен большой шип.ДиоктофимозРедкая и тяжелая паразитарная болезнь. Заражение происходит при случайном
проглатывании промежуточных хозяев — червей-олигохет. В организме человека,
обычно в правой почке, развивается крупная особь гельминта (длиной до 1 м.
толщиной до 1 см), приводя к необратимым изменениям. В моче выявляются яйца
эллипсоидной формы, коричневого цвета, с толстой оболочкой, покрытой вдавле-
ниями, на полюсах имеются крышечки, размеры яиц — 60-80x40-44 мкм.ПАРАЗИТЫ МОКРОТЫМокрота — отделяемое дыхательных путей: легких, бронхов, трахеи, гортани,
она выделяется при кашле или отхаркивании. К мокроте, как правило, приме¬
шивается слизь из горла или слюна, поэтому мокроту очень важно правильно
собирать,В мокроте обнаруживают цисты пневмоцист (Pneumocystis caTinii), яйца пара-
гонима (Paragonimus westermani), личинки Strongyloides stercoralis (при диссеми¬
нированной форме стронгилоидоза). В некоторых случаях при образовании
эхинококковой кисты в легком можно обнаружить оболочку и содержимое кисты
(сколексы и крючья эхинококкового пузыря). Редкими находками при микро¬
скопическом исследовании мокроты и лаважной жидкости являются трофозоиты
амеб (Acanthamoeba spp., Entamoeba histolytica. Entamoeba pn^valis), трофозоиты
токсоплазмы (Т. gondiC), личинки аскарид (A. lumbricoides) при миграции в раннем
периоде инвазии, яйца Thominx aerophylus (напоминают яйца власоглава).При пневмоцистозе мокрота вязкая, с большим количеством слизи, серовато¬
стекловидная. При парагонимозе и в миграционной фазе аскаридоза мокрота
становится жидкой в связи с наличием серозной жидкости, В случаях длительного
течения парагонимоза мокрота приобретает темно-коричневый цвет и сливкоо¬
бразную консистенцию. При развитии амебного абсцесса легкого в мокроте может
быть гной. В некоторых случаях (при аскаридозе, токсокарозе, стронгилоидозе)
в мокроте обнаруживают эозинофилы, кристаллы Шарко-Лейдена, спирали
Куршмана.
794 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙСвежевыделенную мокроту собирают в чистую сухую посуду, чаще всего в
чашку Петри. Мокроту лучше собирать утром натощак, желательно еще до приема
пищи. Перед сбором мокроты необходимо тщательно прополоскать рот. В слу¬
чае затруднения получения мокроты используют паровые или ультразвуковые
ингаляции. Они особенно показаны при исследовании мокроты на наличие пнев¬
моцист. Пациента в этих случаях необходимо предупреждать о нежелательности
использования зубных паст, так как входящие в состав последних консерванты
препятствуют хорошему окрашиванию препаратов мокроты. В целях обнаружения
пневмоцист мокроту нужно просматривать немедленно, в крайнем случае через1-4 ч, поместив ее при этом в холодильник при 4 “С, так как в мокроте быстро раз¬
вивается бактериальная флора и разрушаются клеточные элементы. Материал для
исследования на наличие пневмоцист желательно получать методом бронхоальве¬
олярного лаважа. Во время бронхоскопии после установления бронхоскопа в устье
одного из субсегментарных бронхов осуществляют инстилляцию в дистальные
отделы бронхиального дерева теплого физиологического раствора с последующей
его аспирацией. Аспират может быть разделен на 3 порции: бронхиальный, брон¬
хоальвеолярный и альвеолярный. Полученный аспират (лаважную жидкость)
также рекомендуют исследовать немедленно. Описано два способа временного
сохранения материала:О' лаважную жидкость сливают в стоящую во льду посуду с 50 мл раствора
Хенкса (коммерческого; pH ^ 7,2-^7,4);❖	лаважную жидкость охлаждают до 4 '’С, после чего в течение некоторого вре¬
мени ее можно использовать для дополнительных исследований.Мокроту разливают в чашки Петри тонким слоем, рассматривают на светлом и
черном фоне. Отбирают частицы из «ржавых» образований, обрывки ткани и тому
подобное на предметное стекло, расправляют осторожно препаровальной иглой,
накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. При большом
содержании гноя и слизи мокроту смешивают с равным объемом 2% соды или
0,5% раствором КОН или NaOH, перемешивают, встряхивают в течение 5 мин,
помещают в термостат или на водяную баню на 3 мин, центрифугируют 2-3 мин
со скоростью 1000-1500 об./мин; из осадка приготавливают препарат и исследу¬
ют под микроскопом. Проводят макроскопические (в целях изучения физических
свойств мокроты) и микроскопические паразитологические исследования.Для микроскопического исследования необходимо просматривать мокроту
методом нативного мазка. Для выявления пневмоцист мокроту подвергают специ¬
фическим методам окраски.Обычно применяют скрининговые окраски, позволяющие увидеть содержимое
8-ядерной цисты (так называемые внутрицистные тельца), однако не выявляющие
клеточную стенку пневмоцист. К ним относят окраску по Романовскому-Гимзе,
гематоксилин-эозином, по Райту.Для окончательной верификации пневмоцист применяют сложные, многоэтап¬
ные, зачастую требующие дорогостоящих реактивов окраски: окраска толуидино¬
вым синим, методом серебрения по Гомори-Грокотту, крезиловым фиолетовым, с
их помощью четко визуализируется клеточная стенка цист Pneumocystis carinii.ПАРАЗИТЫ ОТДЕЛЯЕМОГО МОЧЕПОЛОВЫХ ПУТЕЙTrichomonas vaginaîis, трихомонада — единственное простейшее, обитающее в
мочеполовых путях.Trichomonas vaginaîis у части инфицированных им индивидов вызывает острый
или хронический трихомоноз. Г. vaginaîis — жгутиковое простейшее, характерной
овальной или грушевидной формы. Размеры трофозоита — 4-13x2-9 мкм, имеет3-5 жгутиков, по краю тела расположена ундулирующая мембрана, доходящая
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 795примерно до половины тела. Ядро одно, расположено в передней части тела.
Размножается паразит простым делением, цист не образует.Исследованию на наличие этого простейшего подлежат отделяемое из уретры,
цервикального канала, влагалища, простатический секрет, содержимое парауре-
тральных ходов, бартолиниевых желез.Лабораторная диагностика основана на микроскопии нативных влажных пре¬
паратов из экссудатов половых органов или осадка мочи на наличие подвижных
трофозоитов, а также окрашенных препаратов. В свежем материале хорошо видны
трофозоиты, передвигающиеся «нервными», дергающимися или прыгающими,
движениями. Чувствительность этого метода достигает 75-80%, специфичность
высокая — до 100%. На эффективность выявления трихомонад влияют техниче¬
ски правильное взятие материала и своевременный его просмотр.Выделения, собранные из уретры, влагалища, шейки матки, переносят в каплю
теплого физиологического раствора или помещают в пробирку, содержащую 3 мл
такого раствора. Центрифугаруют пробирку в течение 2 мин. Удаляют пипеткой
надосадочную жидкость, из осадка готовят нативные или окрашенные мазки.Просмотр нативных препаратов чаще всего проводят методом раздавленной
капли-суспензии и реже методом висячей капли.В дополнение к препаратам, приготовленным из свежего материала, готовят
фиксированные и окрашенные постоянные препараты. Мазки фиксируют в смеси
Никифорова в течение 3-5 мин и окрашивают различными методами. В препара¬
тах, окрашенных железным гематоксилином, по Романовскому-Гимзе, акридином
оранжевым или трихромовым красителем, трофозоиты легко распознаются благо¬
даря наличию жгутиков и короткой ундулирующей мембраны.Микроскопия окрашенных препаратов является простым и дешевым методом,
не требующим немедленного проведения исследования, специального оборудова¬
ния, однако его специфичность и чувствительность низкие. Полезны повторные
исследования.в нативных препаратах трихомонады следует дифференцировать от свободно-
живущих жгутиковых, попадающих в препарат из воды или контаминированной
посуды. Эти сапрофитные жгутиковые имеют лишь 2 жгутика и двигаются прямо¬
линейно. В окрашенных препаратах у влагалищных трихомонад отчетливо видны
оболочка, ядро, цитоплазма, блефаропласт, жгутики.Культуральный метод является наиболее чувствительным, специфичным, одна¬
ко и наиболее дорогим методом. Влагалищные трихомонады дают хороший рост
на искусственных питательных средах, содержащих антибиотики для подавления
роста сопутствующей микрофлоры. Материал обязательно следует забирать сте¬
рильным зондом или бактериальной петлей. Микроскопическое исследование
культур и идентификацию Г. va^nalis следует проводить на 3-5-й день. Поскольку
длительность развития трихомонад в культуре зависит от величины посевной дозы,
отрицательный результат выставляют после исследования на 7-9-й и 11-17-й день
посева. Из придонного осадка готовят нативный препарат для микроскопии.ПАРАЗИТЫ В БИОПТАТАХ ТКАНЕЙБиоптаты берут из здоровых или патологически измененных тканей в целях
обнаружения в них паразитических простейших и яиц или личинок гельминтов.СРЕЗ КОЖИ НА НАЛИЧИЕ МИКРОФИЛЯРИЙOnchocerca vobulm и другие получают с помощью иглы и скальпеля или брит¬
венного лезвия.Принцип метода — обнаружение микрофилярий, вышедших из биоптата, поме¬
щенного в физраствор.
796 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙШИсследуемый участок кожи обрабатывают спиртом или эфиром, после их
испарения вводят стерильную тонкую иглу строго поверхностно-горизонтально и
приподнимают кожу над иглой. Срезают кусочек кожи, приподнятый с помощью
иглы, острым глазным скальпелем, удерживая его горизонтально и двигая против
иглы. При правильно выполненной процедуре получают кусочек размером около
2 мм, без следов крови. Затем помещают биоптат в каплю физиологического рас-
Щ твора на предметное стекло. Исследуют препарат под микроскопом (малое увели¬
чение) на наличие живых подвижных микрофилярий сразу после приготовления
препарата.Микрофилярии начинают выходить из биоптата в раствор немедленно, через
30 мин его покидают около 70% и через час практически все, находившиеся в
биоптате. Если биоптат фазу после его получения взвесить на торсионных весах,
через час можно определить интенсивность инвазии (количество микрофилярий
в 1 мг кожи). При очень большом числе микрофилярий для облегчения подсчета
препарат обезвоживают, добавляя каплю формалина.БИОПТАТ ИЗ КОЖНОГО ИНФИЛЬТРАТА, ЛЕЙШМАНИОМЫ НА НАЛИЧИЕ АМАСТИГОТ
ДЕРМАТОТРОПНЫХ ЛЕЙШМАНИЙВозбудителями являются Leishmania tropica (антропонозная форма кожного
лейшманиоза) и Leishmania major (зоонозная форма кожного лейшманиоза).
Проводят микроскопию клеток краевого инфильтрата вокруг язвы на наличие
лейшманий в макрофагах или вне их. Биоптат необходимо получить с минималь¬
ным количеством крови и максимальным количеством макрофагов. Для этого уча¬
сток инфильтративного валика анемизируют, сжимая его двумя пальцами левой
руки или пинцетом, делают надрез острым скальпелем и соскабливают кусочек
ткани. Биоптат можно получить, откусив кусочек ткани пинцетом, или ввести
в инфильтрат стерильную зубоврачебную иглу с насечкой и вращать ее в ткани
инфильтрата, а затем извлечь вместе с захваченным материалом. Биоптат вместе с
сукровичной жидкостью переносят на предметное стекло, размазывают получен¬
ный мазок, фиксируют, красят по Романовскому-Гимзе и исследуют с иммерсион¬
ной системой, как при исследовании мазка костного мозга.БИОПТАТ МЫШЦ НА НАЛИЧИЕ ТРИХИНЕЛЛ (ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ МЕТОД)Обнаружение инкапсулированных или живых личинок трихинелл в мышцах
проводят компрессионным методом или методом переваривания.Порядок приготовления и исследования препаратов. Для исследования
компрессионным методом берут небольшой биоптат дельтовидной, двуглавой или
икроножной мышцы, делают не менее 24 срезов вдоль мышечных волокон, сдав¬
ливают срез между двумя стеклянными пластинами и исследуют под микроскопом
при малом увеличении. При интенсивной инвазии в препарате обнаруживают
личинки трихинелл; при слабой интенсивности инвазии требуется исследование
большого количества срезов (70-100). Размеры личинок — 0,2-0,6 мм.БИОПСИЯ ТКАНЕЙ НА ЦИСТИЦЕРКИПри тениозе у пациента может развиться цистицеркоз — паразитирование в
органах и тканях (глазу, конъюнктиве, мозгу, подкожной клетчатке, мышцах)
личиночной стадии свиного цепня — Taenia soUum. Биоптат ткани (например,
подкожного узла) раздвигают препаровальными иглами в целях выделения бело¬
ватого пузырька 0,5-2,0 см в диаметре — цистицерка. Его раздавливают между
двумя предметными стеклами и исследуют под микроскопом. Наличие в пузырьке
сколекса с 4 присосками и венчиком крючьев подтверждает диагноз цистицеркоза.
Если цистицерк пропитан известью, для обнаружения головки его необходимо
предварительно декальцинировать в 4% растворе азотной Ю1СЛ0ты в течение 1 ч.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 797БИОПТАТЫ ИЗ ВЕРХНЕГО ОТДЕЛА ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТАВ них можно обнаружить личинки Anisakidae spp., которые проникают в сли¬
зистые и более глубокие ткани полости рта, пищевода, желудка (иногда и в более
дистальные отделы ЖКТ). Размеры личинок — 0,3x1-3 см. Вокруг личинки быстро
формируется гранулема, в некоторых случаях инвазия осложняется флегмоной.ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖИМОГО КИСТЫМатериал получают во время оперативных вмешательств и исследуют при подо¬
зрении на эхинококкоз. Диагностическими признаками эхинококкоза являются
слоистая структура стенки кисты, обнаружение в жидкости кисты сколексов и
крючьев эхинококка.ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖИМОГО АБСЦЕССАОсложнением кишечного амебиаза является развитие внекишечных поражений
и в частности амебного абсцесса (чаще печени, легких). В содержимом амебного
абсцесса возбудители амебиаза не выявляются. Содержимое представляет собой
клеточный детрит сливкообразной консистенции, темно-коричневого или серого
цвета.Осложнением фасциолеза является развитие фасциолезного абсцесса, В содер¬
жимом абсцесса можно обнаружить яйца F. hepatica, кристаллы Шарко-Лейдена.ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕЛЬМИНТОВ, ИЗВЛЕЧЕННЫХ ИЗ-ПОД КОЖИ И СЛИЗИСТЫХ
ОБОЛОЧЕК, ВКЛЮЧАЯ ОРГАН ЗРЕНИЯВозбудитель — нематода Dirofilaria repens, основными хозяевами которой явля¬
ются собаки, переносчиком — комары. В России регистрируются местные случаи
заражения дирофиляриозом. Под кожей и слизистыми оболочками (часто в орга¬
не зрения) развиваются единичные незрелые особи. Характерными признаками
гельминтов являются белый цвет, жесткая структура, напоминающая леску или
скрипичную струну, длина до 30 см, толщина 1-2 мм. При микроскопическом
исследовании выявляют продольную исчерченность тела гельминта и кутикуляр-
ные шипы.МЕТОДЫ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ПАРАЗИТАРНЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙМетоды иммунологической диагностики относятся к непрямым методам и
основаны на выявлении антигенов возбудителей или антител, вырабатываемых
против антигенов возбудителей. Эти методы в клинической паразитологии при¬
обретают все большее значение. Необходимость применения иммунологических
методов возникает при невозможности получения материала для микроскопии
неинвазивными способами на протяжении всего течения инфекции/инвазии (ток¬
соплазмоза. внекишечного амебиаза, трихинеллеза, токсокароза, эхинококкоза,
цистицеркоза, ларвального парагонимоза) или в острой фазе, когда диагностиче¬
ские стадии возбудителей еще не появились (описторхоза, легочного парагони¬
моза, фасциолеза). Иногда иммунологические методы применяют в дополнение
к паразитологическим, если чувствительность последних в хронической фазе
недостаточна из-за слабой интенсивности инфекции/инвазии (трипаносомозы,
криптоспоридиоз, стронгилоидоз, шистосомозы).при анализе и интерпретации результатов серологической диагностики следует
считаться с явлением иммунологической инкубации, то есть появлением антител
или формированием кожной реакции на антигены паразита лишь через опреде¬
ленный латентный период, в течение которого антитела применяемым методом
еще не определяются, а кожная проба еще не стала положительной. Следует пом¬
798 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙнить также о возможности перекрестных серологических реакций при некоторых
паразитарных заболеваниях (токсокарозе, описторхозе и др.),ТОКСОПЛАЗМОЗВ целях лабораторной диагностики этой широко распространенной протозой¬
ной инфекции применяют очень широкий набор иммунологических методов;
кожную пробу с токсоплазмином, РСК, РНГА, НРИФ, ИФА, а также оригинальную
реакцию с красителем (реакцию Сэбина-Фельдмана). В последние годы ведущее
место в иммунодиагностике токсоплазмоза занимают НРИФ в полуколичествен-
ном варианте (титр IgG) и ИФА в количественном варианте (IgG и IgM, в МЕ/мл).
Интерпретация результатов представлена в табл. 26-3.Таблица 26-3. Интерпретация результатов иммунологического обследования пациента на токсо-
плазменную инфекцию (по Лысенко А.Я., 1995)Метод исследованияСерологическое исследование
на антитоксоплазменные IgGСерологическое исследование
на антитоксоплазменные !дМРезультатНизкие титры (низкая кон¬
центрация, в МЕ/мкл)Высокие титры (высокие
показатели, в МЕ/мкл)Положительный у ново¬
рожденногоПоложительный у детей и
взрослыхИнтерпретацияТоксоплазмоносительство или субклиниче-
ская хроническая инфекцияОстрая инфекция, клинические проявления
обусловлены токсоплазмозомВрожденный токсоплазмозСвежая токсоплазменная инфекция или
рецидив	АМЕБИАЗ ВНЕКИШЕЧНЫЙПрименяют тест-системы НРИФ и ИФА.ЛЯМБЛИОЗПрименяют тест-систему ИФА для определения антител против лямблий. Имеет
вспомогательное значение при массовых противоэпидемических мероприятиях. В
последние годы применяют иммунохроматографический метод для определения
антигена лямблий в фекалиях. Чувствительность этого метода высокая, однако
снижается при исследовании проб фекалий, хранившихся до исследования в кон¬
серванте.ТОКСОКАРОЗПрименяют тест-систему ИФА для определения антител против личинок токсо-
кар. Является основным методом диагностики токсокароза.ТРИХИНЕЛЛЕЗПрименяют тест-систему ИФА для определения антител против личинок трихи¬
нелл. Является основным методом диагностики трихинеллеза.ОПИСТОРХОЗПрименяют иммуноферментные тест-системы для определения антител против
возбудителей описторхоза. Является методом диагностики острой фазы инва¬
зии, продолжающейся до 1,5 мес. В дальнейшем диагноз можно поставить путем
копроовоскопического исследования.ЭХИНОКОККОЗЫПрименяют тест-системы ИФА для выявления антител к Echinococcus
multilocularis, а также ИЭФ и РСК с лиофилизированным антигеном В, granulosus.
Является основным методом диагностики, необходимо сопоставление его резуль¬
татов с инструментальными методами исследования новообразования, а также
паразитологического исследования содержимого эхинококковой кисты, полу¬
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ 799ченной при оперативном вмешательстве. Пунктировать кисту в диагностических
целях нельзя ввиду риска анафилактического шока и диссеминирования возбуди¬
теля.ТРИХОМОНОЗПрименяют НРИФ. Отпечатки материала из различных очагов поражения
наносят на предметное стекло со специальными лунками одноразовыми зондами с
хорошо сорбирующим ватным тампоном. Трихомонады видны в виде полиморф¬
ных образований с характерным ярко-зеленым свечением. Бактериальная флора
окрашивается в оранжевый цвет, лейкоциты, эпителиальные клетки, сперматозои-
ты — в красно-бурый. Результат считается отрицательным при отсутствии клеточ¬
ных элементов со специфическим свечением.Чувствительность и специфичность иммунологического метода сравнимы с
таковыми при культуральном методе. Он сравнительно дешев, прост в выполне¬
нии, позволяет получить ответ в течение 40-60 мин.ЛЕЙШМАНИОЗ ВИСЦЕРАЛЬНЫЙПрименяют ИФА и непрямую реакцию флюоресцирующих антител — НРИФ.ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА МАЛЯРИИПозволяют поставить диагноз без микроскопа. Применение экспресс-методов
допускается в особых случаях по специальному решению органов здравоохране¬
ния, ответственных за противомалярийные программы.Экспресс-методы основаны на выявлении биохимических субстанций паразита
в крови пациента. Разработаны и применяются на практике следующие тест-
системы, содержащие антитела:-о- к богатому гистидином белку HRP2, специфичному для трофозоитов
Р. falciparum (выявляют бесполую паразитемию при тропической малярии);
лактатдегидрогеназе pLDH, специфичной для Р. falciparum (выявляют тропи¬
ческую малярию, не делая различий между бесполыми паразитами и гамето¬
цитами);о лактатдегидрогеназе, специфичной для Р. vivax (выявляют трехдневную
малярию);■0^ панспецифичной лактатдегидрогеназе или альдолазе (выявляют малярию
без указания вида).Чувствительность и специфичность этих тестов достаточно высоки (более
90%), если численность паразитов превышает 100 в 1 мкл, однако ниже, чем чув¬
ствительность стандартного исследования толстой капли крови. Преимущества
быстрых методов перед микроскопией заключаются в том, что они просты, зани¬
мают меньше времени, в меньшей степени зависят от субъективных факторов, не
требуют специального оборудования. Недостатками экспресс-методов являются;❖	невозможность выявить гаметоциты р. falciparum (методами, основанными
на выявлении HRP2) или отличить выявленные гаметоциты от бесполых
форм (при использовании pLDH);•0^ невозможность оценить уровень паразитемии;❖	невозможность использования их для оценки эффективности лечения,
поскольку тесты остаются положительными (в течение до 2 нед при HRP2)
после прекращения шизогонии.ПРОЧИЕ ПАРАЗИТАРНЫЕ БОЛЕЗНИМетоды иммунологической диагностики паразитарных болезней постоянно рас¬
ширяются и совершенствуются. Активно развиваются молекулярно-биологические
методы с выявлением нуклеиновых кислот возбудителей паразитарных болезней.
Однако еще не накоплен достаточный материал для широких рекомендаций этих
800ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙметодов к использованию в клинико-диагностических лабораториях при диагно¬
стике паразитарных заболеваний.СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫАвдюхина Т.И., Константинова Т.Н., Горбунова ГО.П. Лабораторная диагностика гель¬
минтозов. Ч. I. Нематодозы; Учебное пособие, — М.; РМАПО, 2007. — 51 с,Авдюхина Т.И., Константинова Т.Н., Горбунова Ю.П. Лабораторная диагностика гель¬
минтозов. Ч. II. Цестодозы и трематодозы; Учебное пособие. - М.: РМАПО, 2007, - 48 с.Беляев А.Е., Званцов А.Б., Авдюхина Т.И. Практическое руководство по эпидемиологи¬
ческому надзору за малярией для стран Европейского региона, столкнувшихся с возвратом
малярии. - Копенгаген: ВОЗ, 2006. - 119 с.Лысенко А.Я., Владимова М.Г., Кондрашин А.В., Майори Дж. Клиническая паразитоло¬
гия. - Женева: ВОЗ, 2002. - С. 15-78.Лысенко А.Я., Горбунова Ю.П., Константинова Т.Н., Авдюхина Т.И. Лабораторная диа¬
гностика кишечных протозоозов; Учебное пособие. — М.: РМАПО, 2007. — 42 с,Основные методы лабораторной диагностики паразитарных болезней. — Женева: ВОЗ,
1994. - 131 с.Bench Aids for the diagnosis of filarial infections. - Geneva: WHO, 1997.Bench Aids for the diagnosis of intestinal parasites. — Geneva: WHO, 1994.
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬАденовирусы 641
Акантамебы 779
Амеба дизентерийная 788
Амебиаз 798
Анализ-	имм)т10ферментный 288-	иммунофлюоресцентный 287-	иммунохромотографический 290
Анемия иммунная гемолитическая 188
Антигены эритроцитов 177
Антитела-	антинуклеарные 81-	антифосфолипидные 96-	антицитруллиновые 102-	Доната-Ландштейнера 189
-kRA-33 106-	к ацетилхолиновому рецептору 140-	к базальной мембране клубочка 111-	к гладким мышцам 117-	к глиадину 122-	к гликопротеину-1 99-	к глутамат-декарбоксилазе 130-	к кардиолипину 97-	к микросомам печени-почек 118-	к митохондриям 119-	к островковым клеткам 128-	к пероксидазе 124-	к скелетным мышцам и миокарду 142-	к тиреоглобулину 126-	к фактору Кастла 120
-кэндомизию 121
Апробация крови доноров 180
Аспергиллез 756, 769
Астровирусы 644
Аутоантитела-	при пемфигоиде 144-	при пузырчатке 143Бабезии 777
Бактерии-	гемофильные 375-	грамположительные 406-	неферментирующие 380
Баламутии 779
Балантидиоз 789Бластомикоз 769
Болезнь-	Аддисона 67,125,131-	Аддисонова 38-	Ауески 572-	Баттона 130-	Бехчета 107, 108-	Бюргера 108-	гемолитическая плода
и новорожденного 185-	Грейвса 67, 92,127-	Дюринга 145-	Иценко-Кушинга 18-	Кавасаки 107
-Крона 67-	Лайма 659-	Такаясу 107-	Чагаса 143
Бордетеллы 323ВВальденстремамакроглобулинемия 113
Вассермана реакция 96
Вирус-	бешенства 645-	гепатита-	А 673-	В 674-	С 676-	D 678-	Е 679-	гриппа 649-	H1N1 652-	иммунодефицита 653-	клещевого энцефалита 656-	кори 659-	краснухи 663-	парагриппа 665-	респираторно-синцитиальный 699-	эпидемического паротита 667-	Эпштейна-Барр 25, 55,139, 542
Вирусология 542-	методы исследования вирусов 561-	вирусоскопия 571-	гемагглютинация 575-	гемадсорбция 575-	иммуноферментный анализ 607
s'" С/6(05í: .у s} syswA>;o^ns>802 ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ—	иммунофлуоресценция 582—	клеточные культуры 562—	молекулярно-биологические 613
	амплификационные 619	гибридизационные 615—	обеспечение качества
исследований 633—	преаналитический этап 627—	прямая микроскопия 571—	развивающиеся куриные
эмбрионы 561—	реакция	гемагглютинации 590,599	нейтрализации 591	связывания комплемента 601	торможения гемагглютинации 596—	серодиагностика 589
—цитология 571—	электронная микроскопия 578—	общие сведения о вирусах 548—	организация работы
лабораторий 545—	таксономия вирусов 550
Возбудители микозов 728
Волчанка системная красная 23, 67Гемолиз 24
Герпесвирусы 680
Гиалогифомикоз 770
Гистоплазмоз 770
Гонококк 519Гранулематоз Вегенера 67,106
ДДерматит Дюринга 115
Дерматомиозит 67,76
Дерматофитии 759
Диагностика-	антифосфолипидного синдрома 150-	аутоиммунных васкулитов 157-	аутоиммунных заболеваний 66-	бактериологическая 230-	TORCH-комплекс 233-	исследование	 желчи 257	крови 239	материала 269, 272, 273,281	 мокроты 247	отделяемого из мочеполовыхорганов 265	промывных вод 281	рвотных масс 281	спинномозговой жидкости 242	 фекалий 277—лабораторная 230
	мокроты 252-	методы исследования 283-	раневые инфекции 244-	этиологическая 234-	заболеваний кожи 172-	полиэндокринопатий 170-	ревматических заболеваний 146-	ревматоидного артрита 154-	сахарного диабета 169-	системной красной волчанки 149
Диоктофимоз 793Заболевания-	аутоиммунные 66-	антитела 70-	лабораторные показатели 74
Зигомикозы 759Зоб Хашимото 67, 94,127ИИерсинии 365
Изоспора 790
Иммунитет-	алгоритм лабораторного
исследования 61-	антиген-неспецифические
факторы 48-	антиген-специфические факторы 51
-врожденный 17-	гуморальные факторы 21-	нарушения 36	гуморального иммунитета 39	дефекты Т-лимфоцитов 36	комбинированные 40-	и воспаление 48-	приобретенный 25-	Рс-рецепторы 31-	иммуноглобулины 31-	система	В-лимфоцитов 30	Т-лимфоцитов 25Иммуногематология 176-	лабораторные исследования 189-	терапия концентратом
тромбоцитов 190
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ 803Иммунодефицит-	вторичный 47-	первичный 35
Иммунология лабораторная 17
Индикация-	антигенов возбудителей 287-	молекулярно-генетическаябактерий 291-	специфических антител 295
Интерлейкины 221
Интерферон 226ККалицивирусы 691
Кампилобактеры 388
Кандидоз 757
Клетки-	врожденного иммунитета 17-	НК-клетки 20-	моноциты и макрофаги 20-	полиморфноядерные лейкоциты 17-	эозинофилы 19-	Лангерганса 20
Клостридии 451
Коксиеллы 335
Кокцидиоидомикоз 769
Комплексы-	иммунные-	циркулирзтощие 112
	криоглобулины 113-	мембрано-атакующий 22
Коринебактерии 468
Коронавирусы 694
Криптококкоз 758, 770
Криптоспоридии 789
Кровепаразиты 773
Культуры клеток-	диплоидные 565-	первично-трипсинизированные 564-	перевиваемые 569ЛЛаваж бронхоальвеолярный 731
Легионеллы 329
Лейшмании 778
Лептоспиры 460
Лимфома Ходжкина 19
Листерии 445Лихорадка геморрагическая 669
Лямблиоз 789,798ММалярия 774
Менингококк 438
Микобактерии 484
Микозы-	кистей и стоп 767-	кожи 767-	легких 768-	слизистых оболочек 767
Микология 726-	культуральное исследование 754-	лабораторная диагностика 729-	лампа Вуда 735-	макроскопические исследования 735
Микрофилярии 777Микрочипы биологические 625
Мукормикоз 770ННеглерии 779
Нематоды 790ООписторхоз 798Определение чувствительности к
антимикробным препаратам 300ППапилломавирусы 708
Паразиты-	в биоптатах тканей 795-	в дуоденальном содержимом 791-	в мокроте 793-	в моче 792-	отделяемого мочеполовых
путей 794Паракокцидиоидомикоз 770
Парвовирус 706
Пенициллиоз 770
Полиовирусы 714
Проба Кумбса 184Реакции посттрансфузионные 184
Реакция-	агглютинации 290
Риновирусы 700
Ротавирусы 702
804 ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬСиндром-аллергический 36-	антифосфолипидный 150-	Бехчета 116-	Вискотта-Олдрича 43-	Гийена-Барре 67,138-	голых лимфоцитов 44-	Гуда 43-	ГУдпасчера 67,107,111-	Ди Джорджи 37
-Дресслера 142-	инфекционный 36
-Карпентера 170-	Костманна 19
-Ламберта-Итона 137-	Леттерера-Зиве 45-	Луи Барр 45-	Миллера-Фишера 138-	Незелофа 45-	Оменна 45-	пролиферативный 36-	Рейно 87, 93-	Рейтера 55-	системного воспалительного
ответа 216-	Фелти 18-	Чедиака-Хигаси 37-	Черджа-Стросс 106-	Шарпа 87,148-	Шегрена 75-	Шмидта 170-	Ядассона-Левандовского 38
Система-ABO 177-	определение группы
крови 179-	резус 177-	определение резус-
принадлежности 179Склеродермия 67
Склероз-	рассеянный 133
-системный 75
Споротрихоз 770
Среда-	BCYE-a 330
-HTM 305-	MRSA 307-	Борде-Жангу 327-	Игла 563-	Кауфмана 346, 362-	Китта-Тароцци 454-	Клиглера 347
-Кэри-Блеер 278-	Левина 344-	Мак-Конки 344-	Мюллера 345, 362-	Олькеницкого 371-	Плоскирева 345-	Раппопорта 346-	Ресселя 347-	Симмонса 349-	СКС 278-	Стюарта 343, 389-	Хоттингера 371-	Хью-Лейфсона 346-	Цейсслера 455-	Эймса 343, 389-	Эндо 344
Стафилококки 406
Стрептококки 417-	пневмококковый 435Тельца-	Бабеша-Негри 572
-Боллингера 572-	Донована 268Терапия трансфузионная 179
Тест Ваалера-Розе 100
Токсокароз 798
Трематоды 791
Т^епонемы 496
Трипаносомы 780
Трихинеллез 798
Трихомоноз 799
Тромбопоэтин 228ФФактор-	антинуклеарный 74,75-	Виллебранда 116-	Касла 70-	Кастла 120-	колониестимулирующий 227-	ревматоидный 74, 100
Феогифомикозы 770
Физиология грибов 727
Франсиселлы 530
Фузариоз 770
Фунгемия 768
Хеликобактеры 394
Хламидии 312цЦестоды 791
Циклоспора 790
Цитокины 193-	диагностическое значение 220-	методы оценки 198-	биологический 198-	иммуногистохимический 212-	иммуноферментный 201-	иммунохимический 200-	определение продукции
клетками 207-	при аллергии 219-	при аутоиммунной патологии 217-	при сепсисе 216-	роль в патогенезе заболеваний 213ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ 805шШенлейна-Геноха пурпура 107
Шистосомоз 793Энтеробактерии 342
Энтеровирусы 720
Эритропоэтин 227
Эхинококкоз 798AbcBartonella (Rochalimaea) spp. 242
Borrelia spp. 242
Brucella spp. 242
Cardiobacterium hominis 242
Legionella spp. 242
Leptospira spp. 242
Mycobacterium spp. 242
Streptobacillus moniliformis 242ШmО'Л'II