I/ПииииЕГ1ЛЛ fl
IV. J I ж I Л1 art jl С V* IV JMk <rl
П ARAP ATOPM ACI
JIADUrM I Vr ПМ71
АНАЛИТИКА
 I Иг  яг   яг I  лк
под ред. В.В.Меньшикова
Том II
Частные
аналитические
технологии
в клинической
лаборатории
Кмсе
л иническая
DXlfiMnDHD ЙОНЦОГ&ЧО^С(1 ITQ9pSH,KHMrDI
лабораторная аналитика
I.b'icj • ги ^ООЛ Н< >•-.!’•*». й<%>
в трех томах
Ч *	’	<**» ' Т - -^\) 1 t 111	« 0 N I I	w / \'I * * J ll -/
С* 4*ШИИЦ\д МО*1MOto О О HHHdrj tow ^UVXK ♦ • МП? Ки* ** <w
Под общей редакцией
В.В.Меныникова
Том I. Основы клинического лабораторного
анализа
Элементы лабораторной работы. Реагенты. Основные
аналитические технологии и оборудование. Оценка и
выбор методов. Обеспечение и контроль качества.
Ci атистические методы. Нормы расхода времени на
анализы. Техника безопасности.
Том П. Частные аналитические технологии
Гематология. Цитология. Иммунология.
Паразитология. Молекулярно-биологические методы в
микробиологии. Лабораторный контроль
лекарственной терапии.
Том III. Частные аналитические технологии
Биохимия. Клиническая микроскопия биожидкостей.
Коагулология. Микробиология Токсикология.
УДК 616
ББК 53.4
Клиническая лабораторная аналитика
Том II. Частные аналитические технологии
в клинической лаборатории
/Под редакцией В.В.Меньшикова;
М.: Лабипформ-РАМЛД, - 1999. - 352 с.
ISBN 5-89429-003-1
“Клиническая лабораторная аналитика” - трехтомное руководство, содержа-
щее как основополагающие сведения о современном клиническом лаборатор-
ном анализе (том I), так и детальные описания методов исследования в различ-
ных разделах лабораторной медицины (тг. II и III).
Том 11 охватывает не только традиционные сферы клинической лабораторной
диагностики - лабораторную гематологию, цитологию, паразитологию, но и
такие относительно новые и бурно развивающиеся сферы как иммунологию,
молекулярно-биологическую диагностику, лабораторный мониторинг ле-
карств. Во всех разделах представлены сведения о тех методах, которые соста-
вляют наиболее действенный аналитический арсенал клинических лаборато-
рий, включая применение автоматизированных анализаторов и тонких физи-
ко-химических и биологических технологий.
Издание рассчитано на работников клинико-диагностических лаборато-
рий, на студентов и курсантов, изучающих лабораторную медицину.
Под общей редакцией проф. В.В.МЕНЬШИКОВА
Редакция: к.м.н. Д.Ю.ОКУНЕВ, В.О.АВАКОВА
© 1999 Лабинформ-РАМЛД
Подготовпено к печати “ЛАБИНФОРМ”. Лицензия ЛР № 071210 от 18.08.1995 г.
Подписано в печать 20.02.1999 г.
Формат бумаги 60 х 84 1/16. Бумага офсетная Гарнитура “Латинская*.
Печаль офсетная Усл. печ л. 23.0. Тираж 3000 экз. Заказ № 651.
Отпечатано в Псковской областной типографии, г. Псков, Рижский пр-г, 17.
Все права защищены. Исключительное право на издание и распространение этой кни=
ги на территории России и стран СНГ принадлежит издательствам ‘Лабинформ’ и
Московского отпеления РАМЛД Перепечатка книги или се фрагментов в любой форме
и любыми способами, электронными или механическими, включая фотокопирование,
запись на пленку, или любыми воспроизводящими информацию системами только с
письменного разрешения издательств.
ISBN 5-89429-003-1
Клиническая
лабораторная аналитика
Том II
Частные аналитические технологии
в клинической лаборатории
-	Гематология
-	Цитология
-	Иммунология
-	Паразитология
-	Молекулярно-биологические методы в
микробиологии
-	Лабораторный контроль лекарственной
терапии
Москва - “Лабинформ” - РАМЛД
1999
От редактора
Развитие лабораторной медицины определяется прогрессом фундаменталь-
ных наук - физики, химии, биологии, генетики, и техническим прогрессом,
обусловленным успехами электроники и информатики. Клиническая лабора-
торная аналитика черпает из этих источников как новые методические иссле-
довательские принципы, так и более совершенное аналитическое оборудова-
ние. Вследствие этого арсенал аналитических возможностей клинических ла-
бораторий в конце XX века многократно превосходит уровень их возможно-
стей не только начала столетия, но даже и десятилетней давности.
Казалось бы традиционный раздел повседневной лабораторной работы -
гематологические исследования - а как изменились аналитические подходы со
все более широким внедрением автоматических гематологических анализато-
ров ’ Раздел иммунологических исследований представлен в гораздо более ши-
роком объеме, чем 10 лет назад в нашем справочнике “ Лабораторные иссле-
дования в клинике”, предлагая лабораториям гамму новых методов, сущест-
венно облегчающих и уточняющих раннюю диагностику тяжелых форм пато-
логии человека.
Вместе с тем, наряду с новинками аналитических технологий класса поли-
меразной цепной реакции лаборатории продолжают использовать такие тра-
диционные средства исследования биоматериалов, как, например, световые
микроскопы, история которых восходит еще к Левенгуку. Тому причиной и не-
обходимость проводить исследования в довольно скромных условиях неболь-
ших лабораторий в местах весьма отдаленных, и потребность порой поверить
надежным ручным методом и опытным глазом лабораторного врача правиль-
ность результата анализа, выполненного на автомате.
Это разнообразие ( и своеобразие ) современного методического и техни-
ческого оснащения клинических лабораторий отразилось и в содержании вто-
рого тома “ Клинической лабораторной аналитики”, где рядом с новейшими
молекулярно-биологическими методами исследования вирусов соседствуют
простейшие методы обнаружения простейших ...
Лабораторная медицина развивается и вширь, отвечая на запросы клиниче-
ской медицины. В представленном вниманию читателей томе это нашло отра-
жение в появлении нового для российских клинических лабораторий раздела
лекарственного мониторинга. Хотя сторонники ограничения работы лабора-
тории привычным кругом аналитов могут выражать недовольство появлением
новых аналитических обязанностей, однако мировые тенденции развития ла-
бораторной медицины носят объективный характер, да и нашим пациентам не
безразлично, адекватна ли задачам эффективного лечения вводимая доза ле-
карства.
Таким образом, по содержанию второго тома “Клинической лабораторной
аналитики”, представляющего лишь долю частных клинико-лабораторных
технологий, можно в какой-то степени судить о глубоких процессах, происхо-
дящих в лабораторной медицине. Редактор и авторы надеются, что материал
этой книги будет способствовать более прочному вхождению современных
эффективных технологий в повседневную работу российских клинико-диагно-
стических лабораторий. Все конструктивные замечания и предложения чита-
телей будут с благодарностью встречены и внимательно обдуманы.
проф. В.В.Меньшиков
5
Содержание
От редактора	4
В. В. Меньшиков
Методы гематологических исследований	7
С.АЛуговская
Взятие крови (7) Гемоглобин (9) Эритроциты (13) Анализ клеток крови на ге-
матологических анализа горах (34) Лейкоциты (41) Тромбоциты (64) Измене-
ния крови при лейкозах (67) Костный мозг (73) Лимфатические узлы (82)
Цитологические исследования в клинической
лабораторной диагностике	99
А. С. Петрова, Н. Ю. Полонская, В. Н. Богатырев
Использование морфологических методов исследования в клинической
цитологии	99
Исследования, осуществляемые с помощью цитологического метода (101)
Способы получения и характер материала для цитологического исследова-
ния (102) Доставка, регистрация и маркировка материала (104) Приготовле-
ние стекол (104) Фиксация (105) Техника приготовления мазков (107) Основ-
ные методы окрашивания цитологических препаратов (107) Специальные ме-
тоды окрашивания цитологических препаратов (112) Окрашивание микроор-
ганизмов в мазках (121) Методика микроскопического исследования материа-
ла (124) Общепатологические процессы в цитологии (127) Воспаление (127)
Регенерация (130) Признаки злокачественности (130) Термины, используе-
мые при описании и оценке цитологической картины (131) Типы цитологиче-
ских заключений (133) Цитологические исследования при заболеваниях раз-
личных органов и систем (134)
Использование количественных методов исследования (компьютерной
морфометрии и проточной цитометрии) в клинической цитологии 151
Введение в количественную морфологию (151) Использование метода компь-
ютерной морфометрии для цитологической диагностики опухолей и предопу-
холевых процессов (156) Возможности и методические основы проточной ци-
тофлуорометрии (161) Применение метода проточной цитофлуорометрии в
цитологических исследованиях (177) Возможности параллельного анализа
морфометрических и проточно-цитометрических параметров клеток опухо-
ли (181) Прогностическое значение отдельных количественных параметров
клеток опухоли (185)
Методы клинической иммунологии	197
ЕЛ. Насонов
Общая характеристика методов (197) Белки острой фазы воспаления (203)
Иммуноглобулины (206) Система комплемента (207) Иммунные комплексы
(212) Криоглобул ины (214) Аутоантитела (215) Методы изучения клеточного
иммунитета (240) Показатели активации/повреждения эндотелия (243)
Методы клинической паразитологии	247
АЯ Лысенко, А. А. Красильников
Общие замечания (247) Методы приготовления, обработки и исследования
препаратов (250) Кровь (250) Костный мозг (259) Спинномозговая жид-
кость (261) Лимфатические узлы (263) Фекалии (264) Дуоденальное содержи-
мое и желчь (287) Моча (289) Мокрота (291) Отделяемое мочеполовых пу-
тей (294) Биоптаты тканей (297) Иммунодиагностика (299)
6 Молекулярно-биологические методы выявления и
идентификации инфекционных агентов	301
В. М. Говорун
Выявление и идентификация Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis,
Ureaplasma urealyticum методом полимеразной цепной реакции (301) ПЦР-
диагностика вируса гепатита В (306) Выявление вируса гепатита С методом
полимеразной цепной реакции (311) Выявление микобактерий туберкулезного
комплекса методом полимеразной цепной реакции (317)
Лабораторный контроль лекарственной терапии.
Аналитические процедуры	323
В. Г Кукес, Г. В. Рам енекая
Определение лекарственных средств в биологических жидкостях методом
ВЭЖХ (325) Нестероидные противовоспалительные препараты (326)
Спазмолитические средства (328) Средства, стимулирующие ЦНС (330)
Средства, действующие на периферические адренергические процессы (330)
Антагонисты ионов кальция (332) Антигистаминные препараты (333) Диу-
ретические средства (334) Иммунокорректоры (335) Транквилизаторы (336)
Снотворные средства (337) Наркотические анальгетики (339) Химиотера-
певтические средства. Фторхинолоны (340) Антибиотики-макролиды (341)
Сердечные гликозиды (341) Антиаритмические препараты (342) Противосу-
дорожные средства (343) Нейролептики (344)
Участники издания
Богатырев В.Н, - доктор медицинских наук; Онкологический научный центр
РАМН, лаборатория клинической цитологии; заведующий
Говорун В,М, - кандидат медицинских наук; НИИ физико-химической меди-
цины М3 РФ. лаборатория генной инженерии и иммуногенетики, заведующий
Красильников А. А. - кандидат медицинских наук
Кукес ВЛ, - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент Рос-
сийской академии медицинских наук; ММ А им. И. М.Сеченова, кафедра кли-
нической фармакологии, заведующий
Луговская С.А. - кандидат медицинских наук: Российская медицинская акаде-
мия последипломною образования, кафедра клинической лабораторной диаг-
ностики, доцент
Лысенко А.Я. - доктор медицинских наук, профессор; Российская медицин-
ская академия последипломного образования, кафедра тропических и парази-
тарных болезней, заведующий
Меньшиков В.В, - доктор медицинских наук, профессор; ММ А им, И.М. Сече-
нова. лаборатория проблем кзинико-лаборачорной диагностики, заведующий
Насонов EJL - доктор медицинских наук, профессор; ММ А им. И.М. Сечено-
ва, кафедра ревматологии ФППО, заведующий
Петрова А.С. - доктор медицинских наук, профессор; Онкологический науч-
ный цен гр РАМН, лаборатория клинической цитологии, ведущий консультант
Полонская НЛО, - доктор медицинских наук, заведующая ЦММ КД Л поли-
клиники № 117
Раменская Г.В, - кандидат фармацевтических наук; НИИ традиционных мето-
дов лечения М3 РФ, старший научный сотрудник
МЕТОДЫ
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Анализ крови является одним из самых распространенных лабораторных
исследований. Наиболее широко применяется так называемый общий клини-
ческий анализ, включающий определение концентрации гемоглобина, подсчет
числа эритроцитов и лейкоцитов, цветового показателя, исследование лейко-
цитарной формулы (процентного соотношения различных лейкоцитов) и оп-
ределение скорости оседания эритроцитов (СОЭ).
ВЗЯТИЕ КРОВИ
Кровь для проведения общего клинического анализа берут у пациента из
пальца, вены или из мочки уха, а у новорожденных - из пятки. Взятие крови
рекомендуется проводить утром натощак или через час после легкого завтра-
ка, до физической нагрузки и различных диагностических процедур.
Реактивы. 1. 5% раствор трехзамещенного цитрата натрия; хранят 1-2
нед., при помутнении негоден. 2. Трансформирующий раствор. 3. 0.9% изото-
нический раствор натрия хлорида. 3% раствор уксусной кислоты. 5. Спирт. 6.
Йод.
Оборудование. 1. Стерильные копья для укола + одноразовые скарифика-
торы. 2. Пробирки. 3. Мерные пипетки объемом 20 мкл. 4. Капилляры от ап-
парата Панченкова. 5. Мерные пипетки объемом 5 и 1 мл, бюретки или доза-
торы. 6. Предметные стекла, шлифованное стекло для приготовления мазков
крови.
Способы взятия крови
Взятие крови следует проводить в резиновых перчатках, соблюдая правила
асептики, обрабатывая перчатки 70й спиртом перед каждым взятием. Перед
проколом кожа пальца обследуемого обрабатывается стерильным тампоном
(шариком из ваты), смоченным 70 спиртом. После взятия крови к раневой по-
верхности прикладывается новый стерильный тампон, смоченный 7 ' спиртом.
При многократном использовании скарификаторов их необходимо, после
дезинфекционной обработки, стерилизовать сухим жаром в течение I ч при
160°С или автоклавировать в течение 30 мин при 1,5 атм., или кипятить в те-
чение 30 мин. В последнем случае скарификаторы хранят в этиловом спирте,
извлечение их проводится с помощью пинцета, находящегося в растворе дез-
средства.
Взя тие крови для гематологических исследований может осуществляться 4
способами.
I.	После прокола пальца несколько капель крови (нс менее 3-4) спускают
на индивидуальное предметное (часовое) сп екло, перемешивают и используют
для работы.
8
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
II.	Кровь с поверхности пальца набирается последовательно индивидуаль-
ным, стерильным, предварительно выверенным капилляром объемом 20 мкл
и капилляром Панченкова.
III.	Использование крови, взятой для определения скорости оседания эрит-
роцитов (см. ниже). Полученные результаты умножают на коэффициент пе-
ресчета 1.25.
IV.	После прокола кожи пальца, 6-8 капель крови спускают в пластиковую
пробирку, в которую предварительно внесено небольшое количество трилона
Б (1,5-2.2 мг на 1 мл крови), либо в специальные пластиковые пробирки одно-
разового пользования, обработанных К2ЭДТА (фирмы «Sarstedt», «Becton
Dickinson» и др.).
Материал для исследования крови подготавливается следующим образом:
1.	Заранее наливают в пробирки соответствующие реактивы: для опреде-
ления СОЭ - в капилляр Панченкова набирают (до метки 50) реактив 1; для
определения концентрации гемоглобина - 5 мл реактива 2; для подсчета числа
эритроцитов - 4 мл реактива 3, для подсчета числа лейкоцитов - 0,4 мл реак-
тива 4.
2.	Тщательно протерев кожу мякоти пальца (лучше IV пальца) ватным ша-
риком, смоченным спиртом, делают укол стерильным копьем до упора (на глу-
бину 3-4 мм). Взятие крови осуществляется одним из выше перечисленных
способов.
3.	Для подсчета количества эритроцитов кровь объемом 20 мкл выдувают
на дно пробирки с реактивом 3 и промывают пипетку несколько раз в верхнем
слое жидкости ( разведение 1:200).
4.	Для подсчета лейкоцитов кровь объемом 20 мкл выдувают на дно про-
бирки с раствором 4 и промывают пипетку несколько раз в верхнем слое жид-
кости (разведение 1: 20).
5.	Для определения концентрации гемоглобина 20 мкл крови выдувают на
дно пробирки с раствором 2 и промывают несколько раз надосадочной жидко-
стью пипетку ( разведение 1:251).
6.	Для определения СОЭ в капилляр, промытый в реактиве 1, набирают
кровь два раза до метки 0 (100 делений) и тщательно выдувают ее в пробирку
с раствором цитрата натрия (соотношение при этом крови и реактива 4:1),
пробирку встряхивают.
7.	Для исследования лейкоцитарной формулы, морфологии эритроцитов,
лейкоцитов, тромбоцитов готовят мазки крови: вытирают место укола сухим
шариком ваты и наносят каплю крови на сухое обезжиренное предметное сте-
кло, затем быстро готовят тонкие мазки с помощью шлифованного стекла,
краем которого быстрым движением продвигают по предметному стеклу кап-
лю крови.
Примечание'. исследование крови необходимо строго начинать с разведе-
ния для эритроцитов, так как дальнейшая работа по определению количества
лейкоцитов и содержания гемоглобина связана с использованием реактивов,
лизирующих эритроциты.
В настоящее время в связи с применением гематологических анализаторов
в КД I стали использовать для общего клинического анализа венозную кровь
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 9
Кровь из вены беру г в специальные пластиковые пробирки или шприцы
одноразового пользования, обработанных антикоагулянтом КгЭДТА в кон-
центрации 1.5-2,2 мг на 1 мл крови. Необходимо тотчас после взятия крови за-
крыть пробирку и несколько раз, не взбалтывая, тщательно перемешать
кровь,, переворачивая се. Перемешивание крови позволяет избежать образо-
вания сгустков, наличие которых искажает результаты исследования.
Литература. Инструкция по мерам профилактики распространения ин-
фекционных заболевании при работе в клинико-диагностических лаборатори-
ях лечебно-профилактических учреждений. М, 1991, 10 с.
ГЕМОГЛОБИН
Гемоглобин - основной дыхательный пигмент эритроцитов, относящийся к
хромой рот сидам и обеспечивающий ткани кислородом; состоит из белка - гло-
бина и гема - соединения протопорфирина IX с железом. Последний придает
гемоглобину характерную окраску. Присоединение к гему различных химиче-
ских групп сопровождается изменением окраски, на этом основано и опреде-
ление концентрации гемоглобина в крови.
Содержание гемоглобина
Исследование содержания гемоглобина в крови (гсмоглобинометрия)
включае т определение гемоглобина и его дериватов, которые присутствуют в
крови здоровых людей или появляются при различных патологических состо-
яниях. У здоровых гемоглобин в крови находится главным образом в виде ок-
сигемоглобина, восстановленного гемоглобина и в небольшом количестве -
метгемоглобина, карбоксигемоглобина и вердоглобина.
В качестве метода определения гемоглобина используют гемиглобшщиа-
нидный метод с применением ацетонциангидрина
Принцип. Гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железоси-
неродистым калием (красная кровяная соль); образующийся с ацетонциангид-
рином окрашенный цианметгемоглобин (гем и глобин цианид) определяю'!’ ко-
лориметрически. Концентрация гем и глобин циан и да, равная 597.5 мг/л, соот-
ветствует’ 150 । гемоглобина r 1 л крови.
Реактивы 1 Трансформирующий раствор: ацетонциангидрин 0.5 мг; ка-
лий железосинеродистый - 0,2 г: натрия гидрокарбонат - 1 г; дистиллирован-
ная вода - до I л. Раствор желтого цвета, прозрачный. При обесцвечивании или
появлении осадка непригоден. Стабилен в течение нескольких месяцев при
хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре. 2 Калибро-
вочный раствор । емиглобинцианида. В настоящее время многие фирмы выпу
скают наборы реактивов для определения концентрации гемоглобина (НПО
«Ренам». ЗАО « Медлакор», «Лахема» и др.), используя растворы гемиглобин-
цианида разной концентрации. Точные значения концентрации гемиглобинци-
анида и гемоглобина для каждой конкретной серии указаны в паспорте набора.
Специальное оборудование. Фотоэлектроколориметр (КФК 2. КФК 2МП,
КФК-3). спектрофотометр или i смоглобинометр любой марки («Мини Гем
540» фирмы Гехномедика и др )
Ход определения. В пробирку к 5 мл трансформирующего раст вора добав-
ляют 20 мкл крови (разведение 1:251). Содержимое пробирки тщательно пе-
10
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ремешивают и оставляют стоять на 10 мин. Измеряют на фотоэлектроколори-
мстре при длине волны 540 нм (для СФ) или 520-560 нм (зеленый свето-
фильтр. для ФЭК) в кювете с длиной оптического пути 10 мм против холостой
пробы (трансформирующий раствор).
Расчет содержания гемоглобина производят по калибровочному графику,
построенному по 4 точкам; на миллиметровой бумаге по горизонтальной оси
абсцисс откладывают концентрации гемоглобина в г/л. указанные в паспорте
и соответствующие содержанию гемиглобинцианида в ампулах. На вертикаль-
ной оси ординат откладывают величины абсорбции или показания гемоглоби-
нометра. полученные при измерении соответствующего раствора гемиглобин-
цианида. Калибровочный график должен представлять собой прямую линию,
исходящую из начала координат. Получение кривой линии вместо прямой оз-
начает, что в работе были допущены ошибки или прибор неисправен. Из кали-
бровочного графика, построенном для данного прибора, рассчитывают фак-
тор. который используется для программируемого фотометра или при расче-
те таблицы. Если СФ позволяет выделить длину волны 540 нм. можно исполь-
зовать для измерения гемоглобина прямую спектрофотометрию реакционной
смеси (5 мл трансформирующего раствора + 20 мкл крови). Полученную ве-
личину абсорбции умножают на коэффициент 367,7 и получают концентрацию
гемоглобина в г/л. При исследовании гемоглобина на приборе с длиной волны 520-
540 нм расчет содержания гемоглобина проводят по калибровочному графику.
Таблица 1
Нормальные величины гемоглобина
Возраст		Гемоглобин (i/л)
Кровь из пуповины		135-205
1 день		180-195
5 день		175-213
15 дней		168-208
1 мес.		107-171
2 мес.		94-130
4 мес.		103-141
6 мес.		111-141
9 мес.		114-140
12 мес.		113-141
2-5 лет		110 140
5-9 лет		115-145
9-12 лет		120-150
12-14 лет	М:	120-160
	Ж:	115-150
15 17 лет	М:	117-166
	Ж.	117 153
18-44 года	М:	132-173
	Ж:	117-155
45-64 года	М:	131-172
	Ж:	117-160
65 74 года	М:	126-174
	Ж:	117-161
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
11
Клиническое значение. Снижение концентрации гемоглобина в крови яв-
ляется основным лабораторным симптомом анемии. При этом содержание ге-
моглобина варьирует в широких пределах в зависимости от формы анемии и
ее степени. Так. при жслезодефицитной анемии у большинства больных отме-
чается относительно умеренное снижение гемоглобина Значительное сниже-
ние концентрации гемоглобина в крови характерно для острой кровопотери,
гипопластической анемии, гемолитической анемии в стадии гемолитического
криза, рецидива В12-дефицитной анемии. Следует, однако, иметь в виду, что
диагностика анемии ни в коей мере не может быть проведена лишь на основа-
нии определения концентрации гемоглобина в крови. Это исследование уста-
навливает только факт наличия анемии. Для уточнения ее характера необхо-
димо исследование количества эритроцитов, цветового показателя, других
расчс тных индексов эри троцитов, морфологии эритроцитов.
Повышение концентрации гемоглобина в крови может наблюдаться при
миелопролиферативных заболеваниях и симптоматических эритроцитозах, со-
путствующих различным состояниям. Среди миелопролиферативных заболе-
ваний наиболее характерно повышение гемоглобина при эритремии, концент-
рация которого может быть в пределах 180- 210 г/л. Для диагностики эритре-
мии важно исследование и количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов
в крови, которые, как правило, при этом заболевании повышаются.
Симптоматические реактивные эритроцитозы могут быть абсолютными
(обусловлены пролиферацией элементов эритропоэза) и относительными (ге-
моконцентрационные). Физиологическое увеличение содержания гемоглоби-
на свойственно новорожденным.
Литература- Энциклопедия клинических лабораторных тестов под ред.
Н Типа, М., 1997. Исследование системы крови в клинической практике. Под
ред. Г.И.Козинца, В.А.Макарова. М., 1997.
Фракции гемоглобина
Молекула гемоглобина здорового взрослого человека неоднородна. Основ-
ная фракция гемоглобина гемоглобин А - составляет около 95% всего гемо-
глобина: 5% приходится на малые фракции; 3,5% составляет гемоглобин А? и
1 1,5% гемоглобин Е Гемоглобины отличаются друг от друга аминокислот-
ным составом. У новорожденных гемоглобин F составляет 20%, а к 4-5 мес.
достигает величин взрослого человека.
Гемоглобин Г отличается от гемоглобина А значительной устойчивостью к
действиям щелочи. Химическое различие состоит в структуре пол и пептидных
цепей глобина: в гемоглобине А имеются 2сх- и 2[3-цепи («2. Рг), в гемоглоби-
не F - Р~цепи заменены у-цепями (сх2. уз).
Метод Зингера (1951 г.)
Принцип. Определение основано на щслочсустойчивости i смоглобина F: с
помощью щелочи проводят денатурацию гемоглобина A. a F определяют
спектроскопически.
Реактивы. I . Раствор едкого натра 1/12 н. (pH 12,7); хранят в парафини-
рованном сосуде в холодильнике. 2. Раствор сульфата аммония; к 350 г аммо
пия (NH4)2SO4 добавляю!’ 500 мл дистиллированной воды, дают постоять и
12
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
смешивают 400 мл этого раствора с равным объемом дистиллированной воды.
Затем к 800 мл полунасыщенного раствора добавляют 2 мл 10 н HCL 3. 5%
раствор цитрата натрия.
Специальное оборудование. Спектрофотометр.
Ход определения. Приготовление гемоглобинового раствора - гемолизата-
та: 0.2-1мл исследуемой крови помещают в пробирку с 3 мл 5% раствора цит-
рата натрия, перемешивают и центрифугируют в течение 5 мин при 3000
об/мин. Верхний слой отсасывают и повторно 2- 3 раза отмывают эритроциты
с центрифугированием до полного обесцвечивания надосадочного слоя. Затем
добавляю! к осадку равный объем дистиллированной воды, хорошо перемеши-
вают. центрифугируют 15-20 мин. при 6000 об/мин. Отобранный верхний слой
исследуют. Гемолизат можно хранить в холодильнике несколько недель.
В 1 мл дистиллированной воды разводят 0,2 мл гемолизата с приблизитель-
ной концентрацией 10 г% (100 г/л) Определяют общее содержание гемогло-
бина (А+Е) на спектрофотометре при длине волны 541 нм в кювете с толщи-
ной слоя 1 см.
Для изоляции гемоглобина F в пробирку с 3,2 мл 1/12 н. раствора едкого на-
тра, предварительно помешенную в водяную баню на 10 мин при 20°С, быст-
ро вливают 0,2 мл гемолизата, сильно взбалтывают в водяной бане в течение
10 с, затем включают секундомер. Через I мин добавляют 6,8 мл раствора
сульфата аммония. Смесь хорошо перемешивают, переворачивая пробирку до
6 раз, и затем фильтруют через двойной слой обеззоленных фильтров. На
фильтре остается гемоглобин А, а фильтрат содержит гемоглобин F. который
определяют спектроскопически в тех же условиях, что и раствор общего ге-
моглобина.
Проводят также и «холостой» опыт - определяют экстинкцию смеси 3,2 мл
1/12 н. едкого натра, 6,8 мл раствора сульфата аммония и 0.2 мл воды.
Расчет проводяз’ по формуле:
£2 - Еу
--------х 100 -= % гемоглобина F
£i
где Ех --экстинкция общего раствора гемоглобина; Е2 - экстинкция рас-
твора гемоглобина F; - экстинкция «холостой» пробы.
Менее точное представление о содержании гемоглобина F дает цитохими-
ческое исследование (метод Ветке).
Клиническое значение. Повышение гемоглобина F является важным кри-
терием для диагностики р-таласссмии, при которой одновременно повышает-
ся и содержание гемоглобина Аг. Особенно высокие цифры гемоглобина F
могут быть при гомозиготной Р-таласссмии до 20-90%. При гетерозиготной
|3-талассемии содержание гемоглобина F может быть нормальным или уме-
ренно повышенным (2,5-7%).
Однако надо иметь в виду, что повышение гемоглобина F не является спе-
цифичным для р-талассемии. Оно встречается при различных формах мало-
кровия: других гемолитических анемиях, железодефицитной анемии, гипопла-
стической анемии, лейкозах и других состояниях, сопровождающихся гипокси-
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
13
ей. Возможно, что повышение гемоглобина F при этих заболеваниях развива-
ется компенсаторно.
Гемоглобин А2 отличается от гемоглобина А более медленной миграцией
при электрофорезе, на чем основаны методы его определения. Химическая
структура полипептидных цепей глобина у гемоглобина Аг характеризуется
наличием двух цепей ос и двух цепей 8 (аг, &). Исследование гемоглобина Аг
наиболее информативно при использовании электрофореза на ацетатцеллю-
лозе.
Клиническое значение. Повышение содержания гемоглобина Аг характер-
но для Р-таласесмии; при гетерозиготной форме болезни содержание Аг со-
ставляет 4.2-8.9%.
Литература. Энциклопедия клинических лабораторных тестов под ред.
П.Тица, М. 1997. Руководство по гематологии под ред. А.И.Воробьева, М. 1985.
Патологические формы гемоглобина
К настоящему времени известно более 200 форм патологических гемогло-
бинов, отличающихся от нормальных структурой пол и пептидной цепи глоби-
на. когда одна или несколько аминокислот заменены дру| ими или отсутствуют.
Наиболее частой наследственной патологией является гемоглобинопатия S
(серповидноклеточная анемия), которая может быть подтверждена пробами
на серповидность эритроцитов. Исследование патологических гемоглобинов
является трудоемким и проводится в специализированных лабораториях.
ЭРИТРОЦИТЫ
Эритроциты - наиболее многочисленная популяция клеток. В кровеносном
русле при нормальных физиологических условиях эритроцит имеет форму
двояковогнутого диска. Сухое вещество эритроцита содержит около 95% ге-
моглобина. остальные 5% приходится на долю других белков, липидов, фер-
ментов Основная функция эритроцитов - снабжение тканей кислородом и
транспорт углекислого газа. Они участвуют в поддержании буферного ионно-
водного равновесия, взаимодействуют с циркулирующими иммунными комп-
лексами за счст Fc-рецепторов клеточной мембраны, обладают антигенными
свойствами. Продолжительность жизни эритроцитов -100-120 дней, разруша-
ются макрофагами селезенки.
Подсчет количества
Подсчет эритроцитов в крови осуществляется двумя методами - в счетной
камере и гематологическом анализаторе.
Метод подсчета в счетной камере
Принцип. Подсчет эритроцитов поп микроскопом в определенном количе-
стве квадратов счетной сетки и пересчет на 1 мкл крови, исходя из объема
квадратов и разведения крови.
Реактивы. 0,9% раствор хлорида натрия.
Специальное оборудование. 1. Счетная камера Горяева. 2 Микроскоп.
Ход исследования Исследуемую кровь разводят в 200 раз. Для этого в
14 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
сухую пробирку отмеривают 4 мл реактива 1 или 2. Пипеткой набирают 20
мкл крови. Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей и
кровь выдувают на дно пробирки; пипетку тщательно промывают в верхнем
слое жидкости, повторно набирая ее и выдувая в пробирку, содержимое про-
бирки перемешивают и оставляют стоять до момента счета (рекомендуется
считать эритроциты в течение 2-3 часов после взятия крови, а при гемолити-
ческих и В 12-дефицитной анемии - сразу после взятия, так как эритроциты мо-
гут разрушиться).
Подготавливают счетную камеру: протирают насухо камеру с сеткой и по-
кровное стекло, затем покровное стекло притирают к камере, слегка надавли-
вая на стекло таким образом, чтобы по краям его появились радужные поло-
сы (это свидетельствует о требуемой высоте камеры - 0,1 мм).
Заполняют счетную камеру разведенной кровью: предварительно несколь-
ко раз тщательно встряхивают содержимое пробирки, затем пастеровской пи-
петкой или стеклянной палочкой отбирают каплю разведенной крови и подно-
сят ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы она равномерно без пу-
зырьков воздуха заполнила всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в бо-
роздки. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении 1 мин.
(для оседания эритроцитов).
Для подсчета эритроцитов, не меняя горизонтального положения камеры,
помещают ее на столик микроскопа и с помощью малого увеличения микро-
скопа (объектив 8х, окуляр 10х) находят верхний левый край сетки (для луч-
шего контрастирования следует опустить конденсор и прикрыть диафрагму).
Счет производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т.е. в 80 ма-
лых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах сетки, расположен-
ных по диагонали. Для того, чтобы одни и те же эритроциты, лежащие на ли-
ниях, не попали дважды в счет, принято для каждого квадрата, кроме элемен-
тов. лежащих внутри квадрата, считать расположенные на определенных двух
линиях (например, на левой и верхней).
Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят, исходя из разве-
дения крови (200), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квад-
рата (U4000 мкл), по следующей формуле:
а х 4000 х 200
где X - число эритроци гов в 1 мкл крови; Cl - число сосчитанных эритроцитов.
В результате сокращения X — а, х 10 000.
Подсчет эритроцитов в счетной камере является трудоемким методом. На
результате подсчета сказываются любые неточности, связанные с взятием
крови, неравномерным заполнением камеры, неудовлетворительной градуи-
ровкой пипеток.
Метод автоматического подсчета эритроцитов с помошью счетчиков кле-
ток крови облегчает выполнение этого исследования и делает его более про-
изводительным.
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
15
Нормальные величины. Количество эритроцитов в крови составляет
4 х 10 - 5,1 х 106 в 1 мкл (4 х 1012/л - 5,1 х 10‘7л) у мужчин и 3,7 х 10е - 4,7 х КГ
в 1 мкл (3,7 х 10,2/л - 4,7 х 1012/л) у женщин.
Клиническое значение. Снижение количества эритроцитов в крови являет-
ся одним из основных лабораторных критериев анемии. При отсутствии кро-
вопотери можно предполагать нарушение эффективности эритропоэза. Сте-
пень эритроцитопении широко варьирует. В начальной стадии железодефи-
цитной анемии количество эритроцитов может быть нормальным или нерез-
ко сниженным. При острой кровопотере, В12-дефицитной анемии, гемолити-
ческих анемиях (в период криза), гипопластической анемии число эритроци-
тов значительно снижается до 1 х 106 в 1 мкл и менее.
Повышение количества эритроцитов в крови - эритроцитоз - может на-
блюдаться при различных состояниях (табл. 2).
Таблица 2
Эритроцитозы
Виды	Заболевания (клинические ситуации)
Абсолютный эритроцитоз (повышенная продукция эритроцитов) -первичный эритроцитоз - вторичный эритроцитоз: а) вызванный гипоксией	Эритремия Заболевания легких, врожденные пороки сердца, пребывание на высоте, синдром Пиквика (ожирение)
б) вызванный повышенной продукцией эритропоэтина	Гипернефроидный рак, гидронефроз и поликистоз почки, стеноз почечной артерии, рак я и ч н и ков. А н гиобл астома мозжечка
в) связанный с избытком адренокортикостероидов или _катехоламинов	Синдром Кушинга, феохромоцитома, ги перальдостерон изм
Относительный эритроцитоз ( вследствие гемокон центрац и и)	Потеря жидкости организмом (потоотделение, рвота, понос, ожоги, прием диуретиков, алкоголизм), стресс
Смешанный эритроцитоз (вследств и е сгущен и я кров и и плацентарной трансфузии)	Физиологический эритроцитоз новорожденных
Исследование морфологии эритроцитов
В клинической практике морфологию эритроцитов обычно исследуют в
окрашенных мазках крови.
Приготовление мазков крови. Мазки крови готовят на чистых, обезжирен-
ных предметных стеклах.
Подготовка стекол. Реактивы. 1. Хозяйственное мыло - 2% раствор или
раствор стирального порошка: 20 г растворить в 975 мл воды и добавить 20 мл
10
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
пергидроля. 2. Смесь Никифорова: равные части этилового спирта 96% и ди-
этилового эфира.
Ход обработки стекол. Стекла (новые и бывшие в употреблении) поме-
щают в эмалированную посуду в 2% раствор хозяйственного мыла или сти-
рального порошка на 8-10 ч. Кипятят в указанном растворе 5-10 мин. старые
мазки предварительно стирают ветошью или ватным тампоном. Более дли-
тельное кипячение или использование алюминиевой посуды не рекомендуют,
так как стекла мутнеют. Промывают в проточной воде, вытирают и помеша-
ют в смесь Никифорова на 30-60 мин. Насухо вытирают чистым полотенцем
и хранят в чистой посуде с притертой пробкой. Стекла рекомендуется брать
либо пинцетом, либо за края (соприкосновение пальцев с поверхностью стек-
ла оставляет жирные следы).
Техника приготовления мазков. На сухое, подготовленное описанным вы-
ше способом, предметное стекло наносят мазок крови следующим образом. На
• стекло ближе к короткой стороне наносят стеклянной палочкой (или непо-
средственно из места укола пальца) небольшую каплю крови. Оставляют сте-
кло в горизонтальном положении и размазывают каплю крови по стеклу с по-
мощью чистого шлифованного стекла, помещая его под углом 45°; коротким
ребром, подождав, пока вся кровь расплывется по нему, быстро проводят по
предметному стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом
гравмируются форменные элементы крови.
Мазки высушивают на воздухе и маркируют (лучше простым карандашом).
Высохший мазок должен быть равномерно тонким, желтоватого цвета, доста-
точной величины (располагаться на 1-1,5 см от краев, занимать почти всю дли-
ну стекла) и оканчиваться метелочкой". Толстые (густо-розового цвета) маз-
ки не следует использовать, так как в них морфология клеток плохо различи-
ма. Более качественные мазки крови получаются при использовании цитоцен-
трифуги Cytospin 3 фирмы Shandon. Благодаря такому устройству мазки полу-
чаются равномерные и имеют стандартные размер и толщину.
Фиксация и окраска мазков
Реактивы для фиксации: метиловый спирт х. ч. или раствор эозин метиле-
нового синего по Маю - Грюнвальду.
Реактивы для окраски мазков по Нохту. 1. Основной раствор азура II: 1 г
краски растворяют в 1 л дистиллированной воды. Оставляют в посуде из тем-
ного стекла на 12-14 дней при комнатной температуре, после чего используют.
2. Основной раствор эозина калия: 1 г краски растворяют в 1л дистиллирован-
ной воды. Оставляют в посуде из темного стекла при комнатной температуре
на 12-14 дней, затем используют. 3. Фосфатный буфер (смесь Бейзе) pH 7,4-
7,5: смешивают 0,49 г калия фосфата однозамешенного безводного (КН2Р04)
и 0,909 г натрия фосфата двузам еще иного безводного (Na2HPO4) и дистилли-
рованной воды 1000 мл. 4. Рабочий раствор азур-эозина: перед употреблением
смешивают 25 мл основного раствора азура II, 20 мл основного раствора эози-
на калия и 55 мл буферного раствора (пропорции красителей могут варьиро-
вать. их устанавливают опытным путем при приготовлении свежих партий ос
новных растворов).
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
17
Реактивы для окраски мазков по Паппенгейму. 1. Раствор эозин-метиле-
нового синего по Май - Грюнвальду. При отсутствии готового раствора краси-
теля его можно приготовить, растворив 1 г сухого красителя в 1000 мл мети-
лового спирта. Раствор готов к употреблению через 4 дня. 2. Рабочий раствор
азур-эозина по Нохту.
Специальное оборудование. Кювета для фиксации и окраски мазков со
штативом-контейнером (при отсутствии используют эмалированные лотки с
установленными для стекол "рельсами" из пары стеклянных палочек, соеди-
ненных резиновыми трубками).
Фиксация мазков. Фиксатор мазков наливают либо в кювету, либо в широ-
когорлую посуду с притертой пробкой. Высушенные на воздухе мазки поме-
щают в контейнер, который опускают в кювету с фиксатором (или кладут по
одному в посуду) на 5-10 мин. Вынимают контейнер со стеклами из кюветы
(или вынимают пинцетом стекла и устанавливают в штативе), оставляют на
воздухе до полного высыхания.
Окраска по Нохту. Высохшие фиксированные мазки, не вынимая из кон-
тейнера. помещают в кювету с рабочим раствором краски на строго опреде-
ленное время, подобранное для каждой партии красителя (от 20 до 45 мин).
При отсутствии кюветы с кон гейнером стекла помещаю! горизонтально на
рельсы” (мазком кверху) и наливают высокий слой (3-4 мл на мазок) рабоче-
го раствора краски. Вынимают контейнер со стеклами из кюветы с красите-
лем и помещают его в кювету с водопроводной водой (при отсутствии кюветы
краску со стекол смывают, не снимая их с "рельсов , водопроводной водой).
Высушивают мазки на воздухе.
Окраска по Паппенгейму. Сухие нефиксированные мазки помещают в кю-
вету с раствором Мая-Грюн вальда на 3-5 мин (или наливают на мазок, поме-
щенный на "рельсы", высоким слоем). Контейнер с мазками ополаскивают в
кювете с дистиллированной водой (или на мазок, помещенный на "рельсы", не
сливая краситель, добавляют дистиллированную воду на 1 мин). Помещают
контейнер с мазками в кювету с азур-эозиновой краской по Нохту (или нали-
вают на мазок краску) на 8-15 мин. Смывают краску водопроводной водой.
Мазки высушивают на воздухе.
Окраска по Романовскому-Гимзе производится так же, как и по 11охту: в
качестве красителя используют готовый раствор Романовского-Гимзы, кото-
рый перед употреблением разводят из расчета 1 капля краски на 1 мл дистил-
лированной воды. Время окраски устанавливают опытным путем для каждой
новой партии красителя (25— 40 мин).
Автоматическая фиксация и окраска мазков может быть осуществлена с
помощью специальных усгройств: ”Гема-Тек фирмы (США), "ПОМ К-Г*
(Россия), в которые ручным способом загружают нефиксированные мазки.
Последующее автоматическое дозирование фиксатора красителя и буферных
растворов обеспечивает стандартную и равномерную окраску мазков.
Исследование морфологии эритроцитов. Принцип. Исследование окра-
шенных мазков крови с помощью иммерсионной системы микроскопа.
Специальное оборудование. Микроскоп.
Реактивы. 1 Иммерсионное масло 2. Диэтиловый эфир
18
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Ход исследования. Предметное стекло с окрашенным, высохшим на возду-
хе мазком крови помещают на столик микроскопа и с помощью малого увели-
чения (окуляр 7х, объектив 8х) находят край мазка. Не меняя положения сте-
кла, наносят каплю иммерсионного масла на край мазка на место, располо-
женное под объективом. Переводят иммерсионный объектив в положение,
вертикальное к мазку, при этом он погружается в каплю масла. Осторожно
слегка вращают макровинт до появления изображения в поле зрения микро-
скопа. Затем с помощью микровинта устанавливают четкую видимость препа-
рата (критерием правильно подобранного для каждого гл^за фокусного рас-
стояния будет ясное изображение клеток с четкими границами и внугрикле-
гочной структурой). После установки микроскопа приступают к исследова-
нию морфологии эритроцитов, обращая внимание на форму, размеры клеток,
интенсивность их окраски, наличие внузриклеточных включений. Поскольку
клетки имеют определенный объем, для лучшего их рассмотрения надо посто-
янно менять фокусное расстояние с помощью микровинта. Для получения
полного представления о морфологии эритроцитов необходимо просмотреть
несколько полей зрения, передвигая мазок либо рукой, либо с помощью кре-
стообразного устройства. Рассматривать морфологию эритроцитов следует в
центре, в тонком месте мазка, где эритроциты расположены одиночно, не об-
разуют "монетных столбиков . По окончании микроскопии с помощью макро-
винта поднимают тубус микроскопа, снимают стекло с предметного стекла,
стирают масло с иммерсионного объектива и предметного стекла марлей,
смоченной эфиром. У здоровых людей эритроциты имеют примерно одинако-
вый размер. Для более точного представления о размере клеток проводят эри-
троцитометрию - измерение диаметра эритроцитов. Эритроцит имеет форму
двояковогнутого диска с утолщением по краям. В окрашенных препаратах
эритроциты имеют форму диска с небольшим просветлением в центре (нор-
моцит). Оксифилия (способность воспринимать кислые красители) клетки
обусловлена присутствием гемоглобина, поэтому но интенсивности окраски
можно судить о степени насыщения эритроци тов гемоглобином. Эритроциты
здоровых людей имеют равномерную окраску (нормохромия).
Клиническое значение. Изменения морфологии эритроцитов в виде появ-
ления эритроцитов разного размера (анизоцитоз), разной формы (пойкило-
цитоз), разной окраски (анизохромия) являются важными морфологически-
ми симптомами различных форм анемии. Микроцитоз - преобладание в кро-
ви эритроцитов с уменьшенным объемом. Наиболее часто сочетается с гипо-
хромией эритроцитов - клеток, имеющих более широкую неокрашенную цен-
тральную часть за счет низкого насыщения эритроцита гемоглобином. Мик-
роанизоцитоз характерен для распрос траненных форм малокровия, связанных
с дефицитом железа (постгеморрагические анемии, анемии беременных, опу-
холи, сепсис и другие тяжелые инфекционные заболевания, некоторые гемо-
глобинопатии). Гипохромия эритроцитов сопутствует и более редким формам
малокровия, не связанным с дефицитом железа: свинцовому отравлению, та-
лассемии и другим наследственным повреждениям эритроцитов. Следует
иметь в виду, что гипохромия эритроцитов может наблюдаться нс только при
снижении концентрации гемоглобина и числа эритроцитов в крови, но и при
нормальных количественных показателях. Реже встречается усиленная окра-
ска эритроцитов с отсутствием просветления в центре - гиперхромия, связан-
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
19
ная с повышенным насыщением эритроцитов гемоглобином и сочетающаяся с
увеличенным их размером - микроцитозом, мегалоцитозом. Эти изменения
эритроцитов характерны для дефицита таких факторов кроветворения, как
витамин В12, фолиевая кислота, и наблюдаются при анемии Аддисона-Бирме-
ра, дифиллоботриозе, злокачественных опухолях, миелопролиферативных за-
болеваниях, миелодиспластическом синдроме, гипотиреозе, алкоголизме, бе-
ременности, заболеваниях печени. Изменение окраски в виде полихромато-
филии (эритроциты сероватого цвета) обусловлено окраской кислыми и ос-
новными красителями. В норме встречаются единичные полихроматофиль-
ные эритроциты. Их число повышается при усиленном эритропоэзе (постге-
моррагические анемии, гемолитические анемии и др.). При талассемии и дру-
гих гемоглобинопатиях, заболеваниях печени, сопровождающихся длительной
механической желтухой, свинцовой интоксикации встречаются так называе-
мые мишеневидные эритроциты - клетки, имеющие окрашенную периферию
и на фоне светлой центральной части небольшой более темный сферический
участок. Мишеневидные эритроциты имеют увеличенную площадь поверхно-
сти за счет избытка холестерина. Появление базофильной пунктации в эри-
троцитах связано с патологическим кроветворением и характерно для свинцо-
вого отравления, но может встречаться при других формах анемии. Эритроци-
ты с ядром - нормобласты, эритробласты встречаются в мазках крови при
различных анемиях, гемобластозах. Большое количество нормобластов хара-
ктерно для гемолитических анемий, метастазов опухоли в костный мозг. Ги-
гантские ядерные эритроциты - мегалобласты - свидетельствуют о патологи-
ческом кроветворении, связанном с дефицитом витамина В12, фолиевой кис-
лоты. При этих же состояниях наблюдаются и эритроциты с остатками ядер -
кольца Кебота, тельца Жолли. Последние формы постоянно обнаруживают в
мазках крови у больных после спленэктомии. Шаровидная форма эритроци-
тов, отличающаяся уменьшенным диаметром и интенсивной без просветлений
окраской, - микросфероциты - является патогномоничным морфологическим
признаком гемолитической анемии - наследственного микросфероцитоза. Из-
менение содержания спектрина приводит к нарушению устойчивости мембра-
ны этих эритроцитов. В небольшом количестве микросфероциты могут встре-
чаться и при других гемолитических анемиях. Большое диагностическое зна-
чение имеет обнаружение в мазках крови эритроцитов серповидной формы.
Этот симптом характерен для серповидноклеточной анемии, относящейся к
группе наследственных i емоглобинопатий. Гемоглобин S обладает способно-
стью полимеризоваться и деформировать мембрану, особенно при низком со-
держании кислорода в крови. На этом основана проба жгута", когда для уве-
личения содержания серповидных эритроцитов перед взятием крови на палец
пациента накладывают жгут, чтобы вызвать местную гипоксию. В сомнитель-
ных случаях, когда число серповидных эритроцитов в мазках невелико, следу-
ет проводить пробы на серповицность эритроцитов, основанные на использо-
вании веществ (метабисульфит натрия, янусовый зеленый, метиленовый си-
ний), понижающих содержание кислорода в препаратах. Для установления
точного диагноза требуется проведение электрофореза гемоглобина.
На стекле смешивают каплю крови и каплю одного из указанных веществ,
накрывают покровным стеклом. Просматривают под микроскопом через 10-
15 мин, затем 24-48 ч. В положительных случаях в препаратах количество эри-
20
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
троцитов серповидной формы увеличивается.
Литература. Справочник по клиническим лабораторным методам иссле-
дования / Под ред. Е. А. Кост. 2-е изд.- М.: Медицина, 1975, с.17. Исследова-
ние системы крови в клинической практике. Под ред. Г.И.Козинца, В.А.Мака-
рова. М., 1997.
Эритроцитометрия (измерение диаметра эритроцитов)
Измерение с помощью окуляр-микрометра
Принцип. Измерение диаметра эритроцитов в окрашенном мазке крови с
помощью окуляр-микрометра.
Специальное оборудование. 1 .Микроскоп. 2. Окуляр-микрометр - окуляр
насаживаемый на тубус микроскопа, с круглой стеклянной пластинкой и нане-
сенной на ней шкалой, разделенной на 50 делений. 3. Обьскт-микрометр -
предметное стекло со шкалой длиной 2 мм, разделенной на 200 делений (каж-
дое деление 10 мкм).
Ход определения. Перед началом работы определяют цену одного деления
шкалы окуляр-микрометра, которая зависит от длины тубуса микроскопа и
увеличения объектива. Определение проводят с помощью объект-микромет-
ра, который устанавливают на столик микроскопа таким образом, чтобы шка-
лы окуляр-микрометра и объект-микрометра совпали. Затем отсчитывают
число делений шкалы окуляр-микрометра, совпадающих с тем или иным коли-
чеством делений шкалы объект-микрометра, и определяют цену одного деле-
ния. Например:40 делений шкалы окуляр-микрометра совпали с 6 делениями
объект-микрометра, т.е. соответствуют 60 мкм; одно деление 60/40=1,5 мкм.
Это определение проводят один раз для определенного микроскопа, с помо-
щью которого в дальнейшем производят эритроцитометрию.
На сухой окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла, погру-
жают в нее иммерсионный объектив и миироскопируют с максимально осве-
щенным полем зрения. В тонком месте мазка (где эритроциты расположены
изолированно) измеряют диаметр не менее 100 эритроцитов, отмечая, какое
количество делений шкалы окуляр-микрометра укладывается в эритроцит.
Отмечают результат измерения каждого эритроцита (удобно пользоваться 11 -
клавишным счетчиком, условно используя разные клавиши для определенно-
го числа делений шкалы). Зная цену одного деления и количество эритроци-
тов с одинаковым числом делений, выражают результат в процентах.
Пример: эритроциты с диаметром 4,5 мкм - 5%, 6 мкм - 10%, 7,5 мкм
70%, 9 мкм - 11%, 10,5 мкм - 4%. Результат можно представить и в виде эри-
троцитометрической кривой (кривая Прайс-Джонса), при этом на оси абсцисс
откладывают диаметр в микронах, а на оси ординат - процент эритроцитов.
При необходимости результат выражают в виде среднего диаметра эритроцитов.
Нормальные величины. У здоровых лиц нормоциты (эритроциты диамет-
ром 7,5 мкм) - составляют 68 ± 0,4%, микроциты (диаметр 5-6,5 мкм) -
15.3±0.42% и макроциты (диаметр > 8 мкм) - 16,9±0.47%.
Клиническое значение. Результаты эритроцитомстрии являются важными
для уточнения характера анемии. При железодефицитной анемии, как прави-
ло, имеет место микроцитоз эритроцитов до 30-50% и, соответственно, сдвиг
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
21
эритроцитометрической кривой влево. Увеличение процента микроцитов на-
блюдается также при наследственном микросфероцитозе, талассемии, свинцо-
вом отравлении. Увеличение числа макроцитов является признаком макроци-
тарной анемии, наблюдающейся при В 12-дефицитных и фолиеводефицитных
состояниях. Количество макроцитов при этих анемиях может достигать 50% и
более, при этом в небольшом числе (1-3%) обнаруживают и мегалоциты (эри-
троциты с диаметром >12 мкм). Макроцитоз эритроцитов может наблюдаться
независимо от анемии при алкоголизме, диффузных поражениях печени.
Литература. Гольдберг Д. И., Гольдберг Е. Д. Справочник по гематологии,
6-е изд.- Томск, 1980. с.72. Исследование системы крови в клинической прак-
тике Под ред. Г.И.Козинца, В.А.Макарова. М., 1997.
Общий объем эритроцитов (гематокритная величина)
Гематокритная величина, или показатель гематокрита, дает представление
о соотношении между объемами плазмы и форменных элементов крови (i дан-
ным образом эритроцитов), полученном после центрифугирования крови.
Принято гематокритной величиной выражать объем эритроцитов.
Метод определения гематокрита с помощью микроцентрифуг.
Принцип. Центрифугирование крови определенное время при постоянном
числе оборотов центрифуги с последующим определением результата по спе-
циальной шкале.
Реактивы. Антикоагулянты: гепарин - 5000 ЕД/мл разводят дистиллиро-
ванной водой в соотношении 1: 5 или этилендиаминтетрауксусной кислоты ди-
натриевая соль (№2-ЭДТА, трилон Б), 40 Г/л.
Оборудование. 1. Микроцентрифуга гематокритная любой марки 2. Капил-
лярные трубки (в комплекте с центрифугой). Можно использовать капилляры
для определения С-рсактивного белка.
Ход определения. Предварительно обработанный антикоагулянтом и высу-
шенный капилляр заполняют кровью из пальца (или венозной) на 7/8 длины.
Укупоривают капилляр с одного конца специальной пастой (можно пластили-
ном). Помещают в ротор центрифуги так, чтобы укупоренные концы упира-
лись в резиновую прокладку, и центрифугируют 5 мин при 8000 об/мин. По от-
счетной шкале, приложенной к центрифуге, определяют гематокритную вели-
чину.
Микро метод определения гематокрита (модификация И. Тодорова)
Принцип. Центрифугирование крови определенное время при постоянном
числе оборотов центрифуги с последующим определением резупьтата по гра-
дуированным капиллярам.
Реактивы те же.
Оборудование. 1. Центрифуга. 2. Пипетки от аппарата Панченкова (с отре-
занным верхним концом и длиной 10-11 см).
Ход определения. В обработанную антикоагулянтом и высохшую пипетку
набирают кровь из пальца (или венозную) до верхней метки (100 делений).
Пипетку укупоривают, обтягивая ее резиновым кольцом, и центрифугируют
30-40 мин при 3000 об/мин. Результат отмечают по градуировке капилляра,
22
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
вычитая из 100 высоту столбика эритроцитов.
Нормальные величины. У здоровых гематокрит венозной и капиллярной
крови равен 40-48% (или 0,40-0.48) для мужчин и 36-42% (или 0,36-0,42) для
женщин. У детей 0,5 мес. гематокрит 41-65%, 1 мес. - 33-55%, 2 мес. - 28-
42%, 4 мес. - 32-44%, 6 мес. - 31-41%, 9 мсс. - 32-40%, 12 мес. - 33-41%, 1-2
года - 32-40%. 3-5 лет - 32-42%, 6-8 лет - 33-41%. 9-11 лет - 34-43%, 12-14
лет - 35-45%, 15-17 лет - 34-48%.
Клиническое значение. Показатель широко используют для суждения о
степени анемии, при которой, как правило, отмечается его снижение, иногда
до значительных цифр (20-25%). Выраженное повышение (55-65 % Характер-
но для эритремии, менее резкое увеличение (50-55%) наблюдается при сим-
птоматических эритроцитозах, сопутствующих врожденным порокам сердца,
легочной недостаточности, некоторым гемоглобинопатиям. Показатель гема-
токрита дает представление о гемоконцентрационных сдвигах, он снижается
при гемодилюции. Используют гематокрит для расчетных показателей, отра-
жающих различные характеристики эритроцитов: средний объем, средняя
концентрация гемоглобина, а также для ряда биохимических показателей.
Литература. Энциклопедия клинических лабораторных тестов под ред.
Н.Тица, М., 1997. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в пе-
диатрии, 3-е изд. -София, 1961. с.263.
Индексы эритроцитов
В клинической практике используют различные расчетные характеристи-
ки, отражающие физико-химические свойства эритроцитов. Наиболее широ-
ко применяют расчет цветового показателя.
Цветовой показатель. Индекс отражает относительное содержание ге-
моглобина в эритроцитах. Вычисляют цветовой .показатель определением от-
ношения двух частных, полученных отделения коли*гества гемоглобина на ко-
личество эритроцитов в норме и в исследуемой крови по следующей формуле:
^гем ^jp
^гем ^эр
где А’гем - найденное количество гемоглобина; Л/гем - нормальное количест-
во гемоглобина; Хэр - найденное количество эритроцитов; N3p нормальное ко-
личество эритроцитов.
Если принять, что в норме в 100 мл крови содержится 16,7 г гемоглобина
и 5000000 эритроцитов в 1 мкл крови, то рассчитывают по формуле:
^гем	^эр
16,7 ’ 5000000
Агем к 5000000
Цветовой показатель = ---------------,
А' х 16,7
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
23
при сокращении :	------------------
Первые 2 цифры Хэр
В практической работе удобно пользоваться для подсчета цветового пока-
зателя пересчетными таблицами, а также номограммами.
Нормальные величины. У здоровых цветовой показатель находится в пре-
делах 0,86-1,05.
Клиническое значение. По величине цветового показателя принято делить
анемии на гипохромные, нормохромные и гиперхромные. Гипохромные ане-
мии (с цветовым показателем менее 0,86) широко распространены и наблюда-
ются прежде всего при дефиците железа, вызванном различными причинами.
Особенно выраженной гипохромией (0.6-0.5 и ниже) характеризуются желе-
зодефицитиые анемии, обусловленные хроническими кровопотерями. Менее
выраженная гипохромия эритроцитов (0,7-0,8) наблюдается при железодефи-
цитной анемии беременных, при инфекциях, опухолях. Редко встречаются ги-
похромные анемии, не связанные с дефицитом железа и обусловленные нару-
шением синтеза гемоглобина в результате свинцового отравления или наслед-
ственного повреждения синтеза порфиринов и цепей глобина (Р-талассемии,
а-талассемии и др.). Повышение цветового показателя - гиперхромия - явля-
ется характерным лабораторным признаком различных В12-дефицитных и фо-
лиеводефицитных анемии. Особенно выражена гиперхромия эритроцитов
(1,2-1,3) при рецидиве анемии Аддисона-Бирмера. Нормохромные анемии на-
блюдаются при некоторых гемолитических формах малокровия, острых кро-
вопотерях, лейкозах, сопутствуют циррозу печени.
Среднее содержание гемоглобина в эритроците. Показатель отражает
абсолютное содержание гемоглобина в одном эритроците в пикограммах (пг).
Определяют путем деления концентрации Гемоглобина на число эритроцитов.
НЬ (г/дл) х 10
мен =-----------------
RBC (10 ’7л)
Расчет показателя можно произвести по номограмме (по Мазону).
Нормальные величины составляют 27-31 пг.
Клиническое значение. Снижение отражает гипохромию и наблюдается
при железодефицитных анемиях, повышение имеет место при макроцитарных
и особенно мегалоцитарных анемиях.
Литература. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педи-
атрии, 3-е изд., русск. -София, 1961, с.272. Исследование системы крови в кли-
нической практике Под ред. Г.И.Козинца. В.А.Макарова. М., 1997.
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците. Показатель отража-
ет степень насыщения эритроцита гемоглобином в процентах. Вычисляют пу-
тем деления концентрации гемоглобина на гематокритную величину и умно-
жения на 100.
НЬ (г/дл) х 100
мснс =------------------
Ht (%)
М Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Можно легко рассчитать, используя номограмму по Мазону. Показатель
включен в программу современных гематологических анализаторов.
Нормальные величины. МСНС колеблется в пределах 33-38 г/дл. Величи-
на наиболее константная, насыщения выше 38% не бывает.
Клиническое значение. Снижение показателя отражает абсолютную гипо-
хромию и является характерным для .железодефицитных анемий. Чувстви-
тельность этого индекса эритроцитов при железодефицитных анемиях соста-
вляет 85 %. Снижение показателя выявлено также при макроцитарных и осо-
бенно мегалоцитарных анемиях, когда объем эритроцитов увеличен непропор-
ционально более значительно по сравнению с увеличением насыщения эрит-
роцитов гемоглобином.
Литература. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педи-
атрии. - София, 1966. с.341. Исследование системы крови в клинической пра-
ктике. Под ред. Г.И.Козинца, В.А.Макарова. М., 1997.
Средний объем эритроцитов. Показатель является важным при диагно-
стике различных форм анемий. Вычисляют путем деления гематокритной ве-
личины на общее количество эритроцитов в крови. Средний объем эритроци-
тов (MCV) характеризует размер эритроцита, выражают в кубических микро-
метрах (мкм) или фемтолитрах (фл). В анализаторах измеряется по амплиту-
де импульсов, возникающих при прохождении клетки через апертуру, одновре-
менно с подсчетом эритроцитов. Можно расчет дести по номограмме.
Нормальные величины составляют 75- 95 мкм3 (фл).
Клиническое значение. Повышение показателя наблюдается при наследст-
венном микросфероцитозе, макроцитарных и мегалоцитарных анемиях, осо-
бенно высокое значение (более 130 мкм3) выявлено при В12-дефицитных ане-
миях. Объем эритроцитов часто увеличен при диффузных поражениях печени,
алкоголизме. Снижение наблюдается при микроцитарных анемиях, талассемии.
Литература. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педи-
атрии.- София, 1966, с.341. Исследование системы крови в клинической прак-
тике. Под ред. Г.И.Козинца, В.А.Макарова. М., 1997.
Средний диаметр эритроцитов. Вычисляют из результатов эритроцито-
мстрии путем умножения каждого процента клеток с определенным диамет-
ром на его значение в мкм, суммированием этих произведений и делением на 100.
Пример', при эритроцитометрии 100 эритроцитов выявлено 10% эритроци-
тов с диаметром 6 мкм, 70% - с диаметром 7,5 мкм и 20% - с диаметром 9 мкм.
Средний диаметр эритроцитов (СДЭ) вычисляют следующим образом:
(10 х 6) + (70 х 7,5) + (20 х 9)	60 + 525 + 180	765
СДЭ =--------------- -----------------=-----------------= — = 7,65 мкм
100	100	100
Нормальные величины СДЭ -7,55+ 0,009 мкм.
Клиническое значение. Показатель значительно менее информативен, чем
развернутые данные эритроцитометрии. Снижение СДЭ наблюдается при рез-
ко выраженных железодефицитных анемиях, повышение - при рецидиве ане-
мии Аддисона Бирмера и других В 12-фолиеводефицитных состояниях.
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
25
Ретикулоцит ы
Ретикулоциты - молодые эритроциты, образующиеся после потери нор-
мобластами ядер. Время созревания их составляет 4,5 дня, из них в течение
3 дней они созревают в периферической крови. В них обнаруживают внутри-
клеточные структуры, связанные с синтезом белков (митохондрии, рибосомы,
аппарат Гольджи). Многие ферменты (пируваткиназа, глюкозо-6-фосфатде-
гидрогеназа. каталаза и др.) присутствуют в ретикулоцитах в большей концен-
трации, чем в эритроцитах. Ретикулоциты способны адсорбировать молекулы
железа посредством рецепторов к трансферрину. Характерной особенностью
ретикулоцитов является наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции,
представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.Эта субстанция
выявляется при специальном методе окраски - суправитальном, т.е. без предва-
рительной фиксации клеток. Зернисто-нитчатая субстанция в различных рети-
кулоцитах отличается полиморфизмом; чем клетка моложе, тем субстанция бо-
лее обильная. У самых молодых ретикулоцитов она имеет форму густого клуб-
ка, у более зрелых клеток выявляется в виде сеточки, отдельных нитей и затем
отдельных зерен. В мазках, окрашенных обычными гематологическими мето-
дами, ретикулоци ты представлены полихроматофильными эритроцитами.
Определение количества ретикулоцитов производится при микроскопии
специально окрашенных мазков.
Метод подсчета количества ретикулоцитов после окраски их брил-
лиантовым крезиловым синим, азуром I или азуром II непосредственно
на стекле или в пробирке
Принцип. Суправитальная окраска красителями, выявляющими зернисто-
нитчатую субстанцию ретикулоцитов.
Реактивы. Можно использовать один из следующих красителей.
1.	Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном
спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать этанол 96% в
нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл аб-
солютного спирта берут 1.2 г краски.
2.	Раствор азура I, предложенный П. Н. Кориковым: азур I - 1 г, аммония
оксалат - 0,4 г, натрия хлорид - 0,8 г, этиловый спирт 96% -10 мл, дистиллиро-
ванная вода - 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помешают на 2-3 дня
в термостат при 37°С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаж-
дают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Рас-
твор сохраняют в посуде из темного стекла. 11ри появлении осадка краску сле-
дует снова профильтровать.
3.	Раствор азура II следующего состава: азур II - 1 г, натрия цитрат - 5 г, на-
трия хлорид - 0,4 г, дистиллированная вода - 45 мл. Раствор оставляют в тер-
мостате при 37°С на 2 сут, периодически помешивая. Для ускорения растворе-
ния краску можно прогреть на слабом огне в течение 15-20 мин, не доводя до
кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посу-
де из темного стекла.
Специальное оборудование. Микроскоп.
26
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Ход определения. Окраска на стекле. Хороню вымытое и обезжиренное
предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой
наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шли-
фованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок
краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить
в сухом темном месте. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее
тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3-4 мин (можно поль-
зоваться чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или
фильтровальной бумаги). Затем высушивают мазки на воздухе. В приготов-
ленных таким образом мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленова-
тый цвет, зернисто-нитчатая субстанция - в сини и цвет.
Окраска в пробирке. Метод 1: перед употреблением готовят в пробирке
рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1 %
раствора оксалата калия 4 капли раствора краски 1. В краску добавляют 0,04
мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно пере-
мешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.
Метод 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови.
Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20-30 мин. Перемешивают и
готовят тонкие мазки.
Метод 3: в пробирку помещают 0,3-0,5 мл раствора краски 2 и 5-6 капель
крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой
пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1,5 ч
(лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 1/2-3 ч) Перемешивают
и готовят тонкие мазки.
Подсчет ретикулоцитов. В мазках эритроциты окрашены в желтовато-
зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция - в синий или синевато-фио-
летовый цвет.
Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопиру-
ют с иммерсионным объективом. Необходимо подсчитать не менее 1000 эрит-
роцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-
нитчатую субстанцию. Практически для большей точности пользуются специ-
альным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых
размеров. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты располо-
жены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например,
50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения При отсутст-
вии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают
окуляр 7х, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадра-
тиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на<
1000 или на 100 эритроцитов.
Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной
микроскопии
Принцип. Использование способности субстанции ретикулоцитов флюо-
ресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым.
Реактивы. 1. Раствор акридинового оранжевого на изотоническом раство-
ре хлорида натрия и концентрации I : 5000. Для приготовления изотоническо
го раствора рекомендуют использовать дистиллированную воду pH 5,8-6.8. Ра-
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 27
створ акридинового оранжевого должен быть свежим; хранят его не более 3-
5 дней в темном флаконе с притертой пробкой. 2. Нефлюоресцирующее им-
мерсионное масло. Можно использовать афлуоль или обычное иммерсионное
масло с флюоресценцией, погашенной нитробензолом (0.3 мл нитробензола на
1 мл масла). Ю.Н.Зубжицкий в качестве нефлюоресцирующего масла предла-
гает использовать перегнанный анизол.
Специальное оборудование. Люминесцентный микроскоп.
X од определения. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробир-
ке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь мож-
но хранить не более 5 ч). Смесь перемешивают в течение 2 мин, каплю смеси
наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Микроско-
пируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты не флюо-
ресцируют. а в ретикулоцитах зернисто-нитчатая субстанция светится ярко-
красным цветом. Замечено, что r крови, стабилизированной гепарином или
цитратом нагрия, флюоресценции ретикулоцитов нс наблюдается. Метод от-
личается простотой и требует немного времени; благодаря яркому свечению
ретикулоциты легко подсчитать.
Для подсчета ретикулоцитов служат гематологические анализаторы, снаб-
женные дополнительным блоком, в котором их анализ производится по окра-
ске митохондриальной РНК флюоресцентным красителем тиазоловым оран-
жевым. Возбуждение флюоресценции осуществляется аргоновым лазером
(ABX-Vega Reticulocyte, фирмы Hoffrnaim-La Roche). У приборов фирмы ICN
Instruments таким анализатором является Sysmex R-3000/R-2000, Coulter
МАХМ, GEN-S. В анализаторах этих фирм помимо относительного и абсо-
лютного количества ретикулоцитов рассчитывается процент незрелых рети-
кулоцитов, 3 класса ретикулоцитов разной степени зрелости, индекс созрева-
ния ретикулоцитов.
Таблица 3
Нормальные величины ретикулоцитов
Возраст	Норма(%)
Новорожденные	3-7
1 сут.	3-7
3 сут.	1-3
7 сут.	0-1
1 мес.	0,2-2
1,5 мес.	0,3-3,5
2 мес.	0,4-4,8
2,5 мес.	0,3-4,2
3 мес.	0,3 3,6
4 12 мес.	0.2-2.8
Взрослые	0,5-1,5
Клиническое значение. Число ретикулоцитов в крови отражает регенера-
тивные процессы костного мозга, и оценка его широко используется при раз-
личных анемиях^ Повышение количества ретикулоцитов служит критерием
активации кроветворения и наблюдается после, кровопотери, при гемолитиче-
ских анемиях, особенно в период криза (количество ретикулоцитов может
28 Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
быть 20-30 %), а также на фоне лечения анемии Аддисона-Бирмера витами-
ном В 12 (ретикулоцитарный криз - подъем числа ретикулоцитов на 4 - 8-й
день лечения), в начале ремиссии при гипопластической анемии, при эффек-
тивной терапии анемий. Снижение количества ретикулоцитов - показатель
снижения интенсивности кроветворения. Наблюдается при апластической
анемии, редициве В 12 -фолиеводефицитной анемии, железодефицитной ане-
мии, при приеме цитостатических препаратов, лучевой терапии, заболеваниях
почек.
Литература. Исследование системы крови в клинической практике . Под
ред. Г И.Козинца, В.А.Макарова. М., 1997. Руководство по гематологии под
ред. А.И.Воробьева М., 1985. Энциклопедия клинических лабораторных тес-
тов под ред. Н.Тииа. М , 1997. Справочник по клиническим лабораторным ме-
тодам исследования /Под ред. Е. А. Кост. 2-е изд.- М.: Медицина, 1975.
Резистентность эритроцитов
Для оценки физико-химических свойств эритроцитов исследуют стойкость
(резистентность) эритроцитов к различным воздействиям. Наибольшее рас-
пространение в клинической практике получило исследование осмотической
резис гентности эритроцитов.
Метод определения осмотической резистентности эритроцитов в
модификации Л. И. Иделъсона (1974)
Принцип. Количественное определение степени гемолиза эритроцитов в
забуференных гипотонических растворах хлорида натрия.
Реактивы. Основной раствор (по своей осмотической концентрации соот-
ветствует 10% раствору хлорида натрия) имеет pH 7,4, состав раствора: дву-
замещенный фосфат натрия ’(Na2HP04)- 27.31 г (или Na2HP04 2Н20 - 34,23, г),
однозамещенный фосфат натрия (NaH2P04-2H20) - 4.86 г, хлорид натрия - 180
г, дистиллированная вода - до 2 л. Раствор можно хранить в закрытой посуде в
холодильнике в течение нескольких месяцев. Основной раствор разводят в 10
раз и получают раствор, соответствующий по своей осмотической концентра-
ции 1 % раствору хлорида натрия. Из этого раствора готовят рабочие раство-
ры хлорида натрия следующих концентраций: 0.85: 0,751 0,70: 0.65: 0.60; 0.55;
0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,20; 0,10%. Можно приготовить по 100 мл этих ра-
бочих растворов и сохранять их в холодильнике. Годны в течение 2 нед.
Специальное оборудование. 1 .Фотоэлектроколоримстр. 2. Термостат на 37°С.
Ход определения. В две стерильные пробирки с предварительно внесенны-
ми 2 каплями гепарина берут по 1,5 мл крови, перемешивают и одну использу-
ют для исследования, вторую - оставляют на сутки в термостате. В ряд пент
рифужных пробирок (14 штук) разливают по 5 мл рабочих растворов хлорида
натрия с концентрацией от 1 до 0.10%. В каждую центрифужную пробирку до-
бавляют по 0,02 мл перемешанной гепаринизированной крови и оставляют
при комнатной температуре на 30 мин. Центрифугируют смесь крови с рас-
творами хлорида натрия при 2000 об/мин в течение 5 мин. Из каждой пробир-
ки сливают надосадочную жидкость и измеряют на фотоэлектроколориметре
при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя
10 мм против холостой пробы.
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
29
Холостая проба - надосадочная жидкость в пробирке, содержащей 1 % рас-
твор хлорида натрия.
Расчет. За 100% гемолиз принимают гемолиз в пробирке, содержащей
0,1% раствор хлорида натрия. Вычисляют процент гемолиза в каждой пробир-
ке, сравнивая величины экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией,
принятой за 100%, по формуле:
Ек х 100
где £| - экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1% раствором
хлорида натрия; £к - экстинкция исследуемой пробы; 100 - процент гемолиза в
пробирке с 0,1% раствором хлорида натрия.
На следующий день повторяют исследование с кровью, инкубированной 24
ч при 37°С.
Нормальные величины. У здоровых в свежей крови начало гемолиза отме-
чают при концентрации хлорида натрия 0,50 - 0,45%. а полный гемолиз - при
0.40 - 0,35% растворе хлорида натрия.
Клиническое значение. Исследование проводят при подозрении на гемоли-
тическую анемию Понижение осмотической резистентности, т.е. появление
гемолиза эритроцитов при более высокой, чем в норме, концентрации хлори-
да натрия (0,70 - 0,75%), наблюдается при наследственном микросфероцитозе
и некоторых наследственных несфероцитарных гемолитических анемиях, а
также иногда при аутоиммунной гемолитической анемии. В ряде случаев пони-
жение осмотической резистентности выявляется только при исследовании ин-
кубированной крови. Повышение осмотической резистентности характерно
для талассемии, гемоглобинопатий.
Литература. Руководство по гематологии под ред. А.И.Воробьева, М.,
1985.
Пробы на ферментопатию эритроцитов
При несферодитарных гемолитических анемиях возникает необходимость
исследования активности ферментов в эритроцитах. В эритроцитах содержат-
ся ферменты гликолиза, пентозофосфатного цикла, системы глютатиона, аде-
ниловой системы и других реакций обмена, блокада которых может быть свя-
зана с дефицитом ферментов.
Наиболее распространенной наследственной ферментопатией эритроцитов
является дефицит глюкозо-6 фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД), относящейся к
ферменту пентозофосфатного никла. Для диагностики дефицита Г-6-ФД наи-
более достоверным является количественное определение активности фер-
ментов в эритроцитах. В условиях практической работы могут быть выполне-
ны качественные пробы, имеющие ориентировочное значение.
Тест на образование телец Пинца-Эрлиха по Дейчи
Принцип. Инкубация эритроцитов с метиловым фиолетовым и появлением
окрашенных телец в большом количестве в патологических эритроцитах.
Реактивы. 0,5% раствор метилового фиолетового в изотоническом рас-
30
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
творе хлорида натрия.
Специальное оборудование. Микроскоп.
Ход определения. Смешивают в пробирке равные количества крови и рас-
твора метилового фиолетового. Тщательно перемешивают и оставляют на 10
мин. Готовят мазки на предметном стекле, накрывают покровным и микроско-
пируют с иммерсионным объективом.
Нормальные величины. Тельца Гейнца не обнаруживают в нормальной
крови за исключением небольшого'количества клеток у новорожденных или
больных после спленэктомии.
Клиническое значение. Тельца Гейнца представляют собой преципитиро-
ванный гемоглобин, денатурированный при окислении или врожденно неста-
бильный. При дефиците Г-6-ФДГ, передозировке сульфаниламидов, отравле-
нии анилиновыми красителями, дефиците других ферментов гексозомонофос-
фатного шунта, у носителей нестабильных гемоглобинов в эритроцитах появ-
ляются тельца Гейнца. У лиц с этой патологией прием низких доз окисляющих
препаратов (аспирин, фенацетин, резорцин, сульфаниламиды, сульфоны и др.)
может вызывать внутрисосудистый гемолиз.
Качественный метод Мотулъского-Кемпбеля
Принцип. В присутствии Г-6-ФД образуется NADPH, который обесцвечи-
вает бриллиантовый крезиловый синий.
Реактивы. 1. Раствор натриевой сол игл юкозо-6-фосфата (825 мг в 100 мл
дистиллированной воды). 2. Раствор NADP (50 мг в100 мл дистиллированной
воды). 3. Раствор бриллиантового крезилового синего (32 мг в 100 мл дистил-
лированной воды). 4. Трис-буферная смесь pH 8,5 (8,96 г в 97 мл дистиллиро-
ванной воды-1-3 мл концентрированной ИС1) . 5. Парафин.
Ход определения. В пробирке смешивают: 0,1 мл реактива 1: 0.1 мл реак-
тива 2; 0,25 мл реактива 3; 0,2 мл реактива 4. В другую пробирку, куда заранее
внесен 1 мл дистиллированной воды, добавляют 0,02 мл крови из пальца. Сме-
шивают содержимое обеих пробирок, смесь покрывают 1-2 мл жидкого пара-
фина и ставят на водяную баню при 37°С. Отмечают время обесцвечивания
смеси.
Нормальные величины. У здоровых раствор обесцвечивается через 40-55 мин.
Клиническое значение. Замедление обесцвечивания более 90 мин свиде-
тельствует о дефиците Г-6-ФД. При гемолитической энзимодефицитной ане-
мии обесцвечивание наступает через 3-24 ч.
Качественный метод по Бернштейну
Принцип тот же. что и в методе Мотульского-Кемпбел я, но окраска брил-
лиантовым крезиловым синим заменена дихлорфен и л индофенол ом.
Реактивы. 1. Раствор 2,6-дихлорфенилиндофснола (14,5 мг на 100 мл бу-
ферного раствора трис НС1, pH 8,0). Буферный раствор состоит из следую-
щих компонентов: 1,48 М раствор трисоксиметиламинометана (43.27 г на 250
мл воды) и 1,48 М раствор HCI (2 ампулы фиксанала содержащего 0.1 г-экв,
доводят водой до 135 мл). К 230 мл раствора трис добавляют 110 мл раствора
НС! и доводят водой до 460 мл. 2. Раствор феназинметасульфата (2 мг на 100
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 31
мл воды). 3. Раствор NADP (2,3 мг в 1 мл воды). 4. Раствор глюкозо-6-фосфа-
та (15,2 мг натриевой соли Г-6-Ф в 1 мл воды). Из этих растворов готовят ре-
активную смесь следующего состава: реактив 1-8 частей, реактив 2-1 часть,
реактив 3 - 0.5 части и реактив 4 - 0,5 части.
Специальное оборудование. Нс требуется.
Ход определения: В пробирку с 1 мл дистиллированной воды вносят 0,02 мл
крови из пальца. После наступления гемолиза добавляют 0,5 мл реактивной
смеси. Оставляют на 15-20 мин при комнатной температуре. Через 15-20 мин
оценивают изменение цвета смеси.
Нормальные величины. Обесцвечивание смеси происходит через 15-20 мин.
Клиническое значение. Более позднее обесцвечивание смеси свидетельст-
вует о дефиците Г-6-ФД в эритроцитах. Неполное обесцвечивание через 30 мин
соответствует уменьшению активности Г-6-ФД, а отсутствие обесцвечивания к
этому времени свидетельствует о резком снижении активности фермента.
Литература. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педи-
атрии, 5-е изд. (русск.) - София, 1966.
Цитохимические исследовании эритроцитов
Цитохимические исследования отличаются простотой, не требуют специ-
ального оборудования и дают ориентировочное представление о количестве
исследуемого вещества. Исследования эритроцитов проводят с целью выявле-
ния различных внутриклеточных включений, наличия разных форм гемогло-
бина, ферментных нарушений.
Сидероциты и сидеробласты - эго эритроциты и эритробласты (нормобла-
сты), содержащие в цитоплазме не гемоглобиновое железо в виде гемосидери-
на и ферритина.
Сидеробласты и сидероциты
Принцип. Окраска с помощью реакции на берлинскую лазурь и образова-
ние внутриклеточных гранул синего цвета.
Реактивы. 1.2% раствор железисто-синеродистого калия 2.0,1 н. раствор НС1
(8,2 мл концентрированной НС1 и дистиллированной воды до 1 л). 3.0,1 % рас-
твор сафранина. 4. Метиловый спирт.
Специальное оборудование. Микроскоп.
Ход определения. Фиксируют мазки в метиловом спирте 10-20 мин и высу-
шивают на воздухе. Помещают в смесь равных частей растворов 1 и 2 при тем-
пературе 5О-56°С на 15 -20 мин. Промывают в проточной воде 10-15 мин и
ополаскивают дистиллированной водой. Докрашивают раствором сафранина
3-5 с.
Нормальные величины. В периферической крови число сидероцитов не
превышает 1.1.% и составляет в среднем 0,6±0,04% , в костном мозге их не-
сколько больше - 0,2-2,1 %, количество сидеробластов (ядерных эритроцитов
с железосодержащими гранулами) в костном мозге 23,7±2,4%.
Клиническое значение. Снижение сидероцитов и сидеробластов характер-
но для жслезодефицитных анемий. Повышение железосодержащих клеток на-
блюдается при гемолитических анемиях, после спленэктомии, при миелодис-
32
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
пластическом синдроме (рефрактерной сидеробластной анемии), эритромие-
лозе.
Литература. Ф.Г.Дж.Хейхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия.
М„ 1983.
Фетальный гемоглобин. Метод Ветке
Принцип. Элюция гемоглобина кислотой с докраской мазков дает возмож-
ность отличить эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин, по сохра-
ненной окраске в отличие от обесцвеченных эритроцитов, содержащих гемо-
глобин А. Этот метод позволяет определять HbF лишь в некоторых эритроци-
тах (менее 1%) цельной крови взрослых.
Реактивы. 1. Цитратно-фосфатный буфер (pH 3,2): 24.7 мл 0,2 М раство-
ра Na2HPO4 (35,6 г Na2HPO4 • 2Н?О и до 1 л дистиллированной воды) и 75,3 мл
0,1 М раствора лимонной кислоты (21,01 г лимонной кислоты и до I л дистил-
лированной воды). 2. 1 % раствор метилового фиолетового или 1 % раствор
эозина. Лучшие результаты дает докраска метиловым фиолетовым. 3. Этило-
вый спирт 80%.
Специальное оборудование. 1 .Микроскоп, 2. Термостат на 37°С.
Ход определения Фиксируют мазки крови в 80% этиловом спирте 5 мин.
Промывают дистиллированной водой и высушивают. Погружают мазки на 5
мин в прогретый при 37°С в течение 30 мин цитратно-фосфатный буфер (для
элюции гемоглобина), периодически помешивая раствор стеклянной палочкой
для удаления пузырьков воздуха. Ополаскивают мазки дистиллированной во-
дой, высушивают фильтровальной бумагой. Докрашивают реактивом 2 в тече-
ние 2-3 мин. Промывают дистиллированной водой и высушивают.
Нормальные величины. У взрослых встречаются единичные окрашенные
эритроциты (содержащие гемоглобин F); увеличение числа окрашенных эри-
троцитов наблюдается у новорожденных и детей до 5-месячного возраста.
Клиническое значение. Увеличение числа эритроцитов с HbF наблюдается
у больных гомозиготной р-талласемией (20-100% HbF), гетерозиготной р-
талласемией (до 5% в некоторых случаях), серповидноклеточной анемии (1-
30%) До 10% HbF можно обнаружить при пароксизмальной ночной гемогло-
бинурии, рефрактерной сидеробластной анемии, врожденном хроническом
миелолейкозе, парциальной красноклеточной аплазии, острых лейкозах. Сни-
жение HbF наблюдается при гемолитической анемии новорожденных.
Литература. Энциклопедия клинических лабораторных тестов под ред.
Тица Н., М., 1997.
Активность Г-6-ФДГ (К. Ф. 1.1.1.49}
Принцип- Окисление глюкозо-6-фосфата в присутствии Г-6 ФЦГ при уча-
стии NADP, который восстанавливается в NADP Н; под влиянием последнего
тетразолий выявляется в виде гранул формазана.
Реактивы. 1. 10% раствор формалина. 2. Инкубационная среда: глюкозо-
6-фосфат - 3 мг в 1 мл, NADP - 1 мг в 1 мл, магния хлорид - 0,1 М в 0,2 мл, ни-
тросиний тетразолий - 1 мг в 1 мл, трис-буфер 0,25 М (pH 7,6) - 2,3 мл, фена-
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 33
зин-метасульфат - 0.5 мл.
Специальное оборудование. 1. Термостат на 37”С. 2. Микроскоп.
Ход исследования. На нефиксированные мазки крови наносят 0,1-0,2 мл
инкубационной среды и помещают мазки в горизонтальном положении в тер-
мостат на 1 ч 15 мин. Фиксируют в 10% растворе формалина 10 мин при ком-
натной температуре. Высушивают на воздухе и микроскопируют.
Нормальные величины. В эритроцитах обнаруживают 10 20 гранул фор-
мазана.
Клиническое значение. Снижение числа гранул формазана в эритроцитах
или их отсутствие указывает на дефицит Г-6-ФДГ. Прием противомалярийных
препаратов, фенацетина, больших доз аскорбиновой кислоты, некоторых
сульфаниламидов и сульфонов у таких больных может вызвать гемолитиче-
скую анемию. Случаи гемолиза возможны при отравлении бобами, диабетиче-
ском ацидозе.
Скорость оседания эритроцитов (СОЭ)
Исследование СОЭ является одним из самых распространенных в лабора-
торной практике и входит в состав общею клинического анализа крови.
Микрометод Панченкова
Принцип. Смесь крови с цитратом при стоянии разделяется на два слоя
(нижний - эритроциты, верхний - плазма). При этом СОЭ, т.е. величина стол-
бика плазмы, бывает различной в зависимости от изменений физико-химиче-
ских свойств крови.
Реактивы. 5% раствор трехзамещенного цитрата натрия (C6H5O7Na3 -5Н2О).
Раствор фильтруют (pH должен быть нейтральным или слабощелочным). При
помутнении реактив не годен.
Специальное оборудование. Аппарат Панченкова, состоящий из штатива и
капилляров. Пробирки и капилляры должны быть химически чистыми, т. е.
необходимо их промыть хромовой смесью, многократно после этого вымыть
водопроводной водой и 2-3 раза - дистиллированной.
Ход определения. Перед использованием химически чистый капилляр про-
мывают цитратом натрия и заполняют им пробирку до метки 50.
Кровь из пальца или вены набирают дважды в капилляр до метки 0 и пе-
реносят в пробирку с цитратом (усиленно выдувая всю кровь). При этом по-
лучают соотношение крови и цитрата 4:1. Закрыв пальцем верхний конец ка-
пилляра, осторожно, чтобы кровь из капилляра нс вылилась, устанавливают
его в штатив строго вертикально, упирая нижний конец в резиновую проклад-
ку и прижимая верхний конец прокладкой или пробкой. Через час отмечают
скорость оседания эритроцитов по высоте отстоявшегося слоя плазмы в мил-
лиметрах.
Нормальные величины. У мужчин 1-10 мм/ч, у женщин 2 15 мм'ч, у детей
от 2.5 + 0.9 мм/ч в 1 день и до 4,0 ± 2,1 мм/ч на 2 неделе. На протяжении 1 го-
да жизни СОЭ колеблется между 5,0 ± 2,0 мм/ч и 8,0 ± 3,0 мм/ч, в дальнейшем
- между 7,0 ± 3,0 мм/ч и 9,0 ± 3,6 мм/ч.
34
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
При снижении температуры (<20°С) помещения, в котором проводится ис-
следование, СОЭ замедляется, при повышении - увеличивается.
Клиническое значение. Увеличение СОЭ наблюдается при различных вос-
палительных процессах, интоксикациях, острых и хронических инфекциях,
при инфаркте миокарда, опухолях, после кровопотери, оперативных вмеша-
тельств. Особенно выраженное ускорение СОЭ (60-80 мм/ч) характерно для
ларапротеинемических гемобластозов (множественная миелома, болезнь
Вальденстрема. острый плазмобластный лейкоз и др.) и симптоматических па-
рапротеинемий, сопутствующих злокачественным новообразованиям, хрони-
ческому активному гепатиту, циррозу печени, туберкулезу, амилоидозу, колла-
генозам. Замедление СОЭ наблюдается при эритремии и симптоматических
эритроцитозах.
Литература. Руководство по гематологии под ред. А.И Воробьева, М.,
1985. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии, 5-е
изд. (русск.) - София, 1966.
Анализ клеток крови на гематологических анализаторах
Преимуществами автоматического анализа крови являются: высокая про-
изводительность (до 100 и более проб в час), небольшой объем крови (12-150
мкл), оценка более 20 показателей, вместо 10-12 при обычном анализе крови,
графическое представление распределения клеток в виде гистограмм, скето-
грамм, высокая точность исследования.
Работа большинства гематологических анализаторов основана на кондук-
тометрическом методе, разработанном J.& WCoulter в 1947 году, который по-
зволяет не только подсчитать количество клеток, но и охарактеризовать объ-
ем каждой клетки, проходящей через апертуру. Принцип метода основан на
подсчете числа клеток, проходящих через апертуру, по обе стороны которой
расположены электроды, через которые проходит постоянный электрический
ток. При прохождении клетки через микроотверстие сопротивление в элект-
рической цепи возрастает и на приборе регистрируется импульс, количество
которых соответствует количеству клеток. Анализ амплитуды импульсов поз-
воляет измерить объем клеток (импульс пропорционален объему клетки), и
построить кривую распределения клеток по их объему (гистограмму). Конду-
ктометрический тип счетчиков приспособлен для точного подсчета эритроци-
тов, лейкоцитов и тромбоцитов.
На кондуктометрическом принципе основаны приборы фирмы Coulter (се-
рия МД-8, МД-10, МД-18), ACT-8. ACT-18, Sysmex (F-520, F-820, К-800, K-
1000, К-4500), Roche (ABX-Micros), Biochem. Immunosystems (System
9000/9020, System 190, Spirit) и др.
В анализаторах последующих поколений этот метод сочетается с использо-
ванием дифференцирующих лизатов, лазерного светорассеивания, радиочас-
тотного анализа, цитохимического метода (анализаторы фирм ICN
Instruments. Roche, Coulter, Bayer, Abbott).
Так, работа анализатора Sysmex SE-9000 основана на сочетании кондукто-
метрического метода и радиочастотного анализа. Нововведением в кондукто-
метрическом методе этого прибора является наличие «динамической фокуси-
ровки» канала, что обеспечивает прохождение потока частиц по центру апер-
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
35
туры и исключает их слипание. Тем самым достигается высокая точность и
воспроизводимость результатов ( Cv < 1 %). Подсчет и дифференцировка лей-
коцитов осуществляется после добавления лизирующих реагентов. Для выяв-
ления и счета эозинофилов и базофилов система снабжена отдельными детек-
торными каналами, работа которых основана на применении специфических
лизатов. Анализатор SE-9000 оснащен специальным каналом, предназначен-
ным для дифференциальной диагностики незрелых гранулоцитов.
Использование одновременно нескольких методов анализа дает возмож-
ность значительно улучшить качество дифференцировки клеток. Автомати-
ческий анализ крови позволяет полноценно охарактеризовать красную кровь
по следующим параметрам: RBC, HGB, НСТ, MCV, МСН, МСНС, RDW
Средний объем эритроцита (MCV) - показатель, характеризующий раз-
мер эритроцита в кубических микрометрах (мкм3) или фемтолитрах (фл). Из-
мерение MCV проводится одновременно с подсчетом эритроцитов по ампли-
туде импульсов, возникающих при прохождении клетки через апертуру, а ре-
зультаты отражаются в виде гистограммы распределения эритроцитов по их
объему. Большинство современных анализаторов позволяют охарактеризо-
вать эритроциты объемом от 30 до 250-300 фл.
Показатель MCV меняется в течение всей жизни: у новорожденных он до-
стигает 128 фл, в течение первой недели снижается до уровня 100-112 фл, к
шести месяцам параметр падает до 78 фл, к году составляет 77-79 фл, в воз-
расте 4-5 лет нижняя граница нормы (80 фл) стабилизируется. MCV ниже
80 фл оценивается как микроцитоз, выше 95 фл - как макроцитоз.
Существует ряд состояний, при которых оценка MCV затруднена. Так, при
микросфероцитарной гемолитической анемии микросфероциты имеет диа-
метр меньше нормы, в то время как средний объем его чаще остается в пре-
делах нормы. В связи с этим следует подчеркнуть необходимость параллель-
ного изучения мазка периферической крови с измерением диаметра эритроци-
тов и описанием морфологии клеток. При выраженном анизоцитозе эритро-
цитов, когда в крови присутствуют микро- и макроциты, MCV, являясь сред-
ним показателем объема всей популяции клеток, имеет значения в пределах
нормы. Поэтому он должен учитываться в комплексе с показателем анизоци-
тоза (RDW) и эритроцитарной гистограммой. При холодовой аутоягглютина-
ции показатель MCV может быть ложно завышен, что устраняется при нагре-
вании пробы. MCV может быть ложно завышенным при диабетическом кето-
ацидозе вследствие гиперосмолярности плазмы. Относительное снижение
MCV может быть следствием повышенного содержания фрагментов эритро-
цитов в крови (коагулопатии потребления, механический гемолиз и др )
Гематокрит рассчитывается в счетчиках по числу эритроцитов и MCV.
Среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН) является расчет-
ным показателем. Он характеризует среднее содержание гемоглобина в от-
дельном эритроците в абсолютных единицах. На основании М( 'Н основано
разделение анемий на нормо-, гипо- и гиперхромные. МСН - более объектив-
ный показатель, чем цветовой показатель, который не отражает синтез гемо-
глобина и его содержание в эритроците.
36
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Таблица 4
Нормальные показатели МСН в эритроците (пг	
Кровь плода	
18-20 нед.	43,14±2,71
21-22 нед.	41,39±3,32
23-25 нед.	40,48±2.88
26-30 нед.	37,94±3,67
Кровь из пуповины	31-37 (2 SD)
0,5 мес.	30-37
1 мес.	29-36
2 мес.	27-34
4 мес.	25-32
6 мес.	24-30
9 мес.	25-30
12 мес.	24-30
1-2 г.	22-30
3-5 лет	25-31
6-8 лет	25-31
9-11 лет	26-32
12-14 лет	26-32
15-17 лет	27-32
18-44 года	27-34
45-64 года	27-35
65-74 года	27-34
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) отражает
степень насыщения эритроцита гемоглобином и также рассчитывается прибором.
Снижение МСНС наблюдается при заболеваниях, сопровождающихся на-
рушением синтеза гемоглобина. Любая неточность, связанная с определением
гемоглобина, гематокрита. MCV приводит к увеличению МСНС, поэтому этот
параметр может быть использован как индикатор ошибки прибора, или ошиб-
ки, допущенной при подготовке пробы к исследованию. Анализаторы серии
« Гесбшсоп» (Н-1, Н-2, Н-3) непосредственно измеряют концентрацию гемо-
глобина в каждом эритроците и строят гистограмму распределения клеток не
только по объему, но и по концентрации гемоглобина, при этом вводится но-
вый показатель - ширина распределения эритроцитов по концентрации гемо-
глобина (HDW).
Показатель анизоцитоза эритроцитов (RDW) рассчитывается как коэф-
фициент вариации среднего объема эритроцитов: RDW = SD/MCV х 100 (%),
где SD - стандартное сред неквадратическое отклонение объема эритроцитов
от среднего значения (норма 11,5 - 14.5%).
Приборы фирмы Sysmex выдают результаты как в виде RDW-SD, так и
RDW-CV. т.е. коэффициента вариации о&ьема эритроцитов (%). Анизоцитоз
характеризует колебания объема эритроцитов и улавливается прибором зна-
чительно быстрее, чем при визуальном просмотре мазка крови. Оценка степе-
ни анизоцитоза под микроскопом сопровождается целым рядом ошибок. При
высыхании эритроцитов в мазке их диаметр уменьшается на 10-20%, в тол-
стых мазках он меньше, чем в тонких. Полностью избавиться от артефактов
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
37
позволяет только автоматизированный подсчет с использованием кондукто-
метрического метода, где сохраняется стабильность клеток и воспроизводи-
мость результатов. Гистограмма графически отражает частоту встречаемости
эритроцитов разного объема.	>
Квалифицированная интерпретация полученных результатов позволяет ди-
агностировать и определить характер анемии, ориентировать врача на прове-
дение дополнительных исследований, таких как определение сывороточного
железа, ферритина, витамина В12. В начальной стадии железодефицитной ане-
мии (ЖДА) количество эритроцитов находится в пределах нормы, содержание
гемоглобина может быть на нижней границе нормы или сниженным, что отра-
жает нормальную пролиферативную активность костного мозга. Это сопрово-
ждается незначительным уменьшением MCV при нормальном RDW, что сви-
детельствует о преобладании однородных клеток с малым объемом. Эритро-
цитарная гистограмма имеет обычную форму и лишь смещается влево. По ме-
ре дальнейшего нарушения процессов гемоглобинообразования происходит
еще большее снижение MCV, МСН, МСНС. увеличение RDW Эритроцитар-
ная гистограмма имеет одиночный пик, значительно сдвинутый влево (рис. 1).
У больных в гипорегенераторной стадии ЖДА отмечается снижение количе-
ства эритроцитов, MCV. значительно более выраженное снижение гемоглоби-
на и МСНС. Эритроцитарная гистограмма имеет вид уплощенной кривой, сме-
щенной в левую сторону, что является отражением присутствия в крови гете-
рогенной популяции эритроцитов (микроцитов и макроцитов) (рис. 2). На фо-
не лечения ЖДА препаратами железа эритроцитарная гистограмма характе-
ризуется широким основанием за счет разнородности эритроцитов по объему
и двумя пиками (рис. 3). У больных с эритремией на фоне частых кровопуска-
ний развивается ЖДА с аналогичными изменениями показателей красной
крови (рис. 4).
Помимо железодефицитной анемии, эритроцитарная гистограмма с двумя
пиками эритроцитов между 50 и 140 фл, указывающих на присутствие гетеро-
генной популяции клеток, может наблюдаться после гемотрансфузий.
При В12-дефицитной анемии в результате замедления процессов синтеза
ДНК и деления клеток образуется популяция эритроцитов с резко увеличен-
ным объемом. Эритроцитарная гистограмма растянута, смещена вправо в зо-
ну макроэритроцитов, что соответствует высоким показателям RDW. MCV
при низких показателях RBC. HGB, НСТ, высоком содержании МСН при нор-
мальной средней концентрации гемоглобина (МСНС) (рис. 5). Диагноз В12-де-
фицитной анемии подтверждается пункцией костного мозга, определением в
сыворотке крови концентрации витамина В12 или фолиевой кислоты, измене-
ниями в периферической крови (микроцитоз, гиперхромия. тельца Жолли, ба-
зофильная пунктация эритроцитов, полисегментированность нейтрофилов).
Оценка тромбоцитарного звена гемограммы осуществляется по количест-
ву тромбоцитов, тромбоцитарным индексам (среднему объему тромбоцитов -
MPV, показателю анизоцитоза тромбоцитов - PDW, тромбокриту - РСТ) и
тромбоцитарной гистограмме
38
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
RBC	RBC !	НЬ 1	4.58 (х 10"/1) 76 (g/1)
	i	MCV	60.9 (11)
I / v !=	:	1	МСН	16.6 (pg)
1 [ А	:	i	МСНС	272 (g/1)
	!	RDW 1	18.0 (%)
250fL
Рис. 1. Эритроцитарная гистограмма при железодефицитной анемии,регенера-
торная фаза.
Примечание', здесь и на других рисунках мелкими штрихами указана зона нормального
распределения эритроцитарной гистограммы (анализатор Sysmex SE-9000)
RBC
RBC 3.47 (х 10'71)
НЬ 67 (g/1)
MCV 74.1(A)
МСН 19.3 (pg)
МСНС 261 (g/0
RDW 28.1 (%)
Рис. 2. Эритроцитарная гистограмма при железодефицитнои анемии, гипореге
нераторная фаза.
RBC 4.63 (х 10'70
НЬ 107 (g/0
MCV 78.2 (fl)
МСН 23.1 (pg)
МСНС 296 (g/1)
RDW 22.1 (%)
250 fL
Рис. 3. Эритроцитарная гистограмма при лечении железодефицитной анемии
RBC
RBC 6-97 (х 10'2/0
НЬ 134 (g/1)
MCV 65.4(10
МСН 19.2 (pg)
МСНС 294 (g/1)
RDW 21.6 (%)
Рис. 4. Эритроцитарная гистограмма при эритремии, сопровождающейся же-
лезодефицитной анемией.
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
39
RBC 2.45 (х 1012/1)
НЬ 100 (g/1)
MCV 123.7 (fl)
МСН 40.8 (pg)
МСНС 330 (g/1)
250fL
Рис. 5. Эритроцитарная гистограмма при В 12-дефи цитной анемии.
Автоматический подсчет тромбоцитов проводится в одном канале с эри г-
роцитами. В связи с этим важным является дифференцирование прибором ма-
кротромбоцитов от микроаригроцитов и фрагментов эритроцитов. Для этого
в приборах, где используется кондуктометрический метод, существует систе-
ма дискриминаторов, определяющих высоту электрического сигнала, пропор-
циональную размеру частицы и ширину (длительность) импульсов. Все им-
пульсы, соответствующие размерам частиц от 1,8 до 30,0 кубических микрон
(фемтолитр) подсчи тываются как тромбоциты. Если амплитуда импульса пре-
вышает 30 фемтолитр, то выводится сообщение “Micro RBC”, либо “Macro
PLT”. При этом прибор автоматически проводит коррекцию количества тром-
боцитов и выдаст их истинное значение. Важную дополнительную информа-
цию в этих случаях дают гистограммы распределения тромбоцитов. В норме
тромбоцитарная кривая характеризуется унимодальностью и при выявлении
ненормального распределения тромбоцитов следует анализировать окрашен-
ный мазок крови.
Ложное снижение числа тромбоцитов может давать их агрегация при нали-
чии тромбоцитарных агглютининов. Агрегация тромбоцитов выражена при
взятии крови с гепарином в качестве анти коагулянта. Большинство исследова-
телей рекомендует использовать стандартный антикоагулянт - К2ЭДТА в кон-
центрации 1.5 - 2.2 мг на 1 мл крови. Однако при наличии аутоантител к тром-
боцитам ЭДТА индуцирует агрегацию тромбоцитов, что проявляется псевдо-
тромбоцитопенией.
Средний объем тромбоцитов (MPV) (норма -8,1 + 1,9 фемтолитр) - уве-
личивается с возрастом: с 8,6 - 8,9 П у детей 1-5 лет до 9.5 - 10,6 fl у людей
старте 70 лет. Этот показатель повышается у больных с идиопатической
тромбоцитопенической пурпурой, гипертиреозе, сахарном диабете, атероскле-
розе, у курильщиков и лиц, страдающих алкоголизмом, миелопролифератив-
ных заболеваниях. MPV снижается после спленэктомии, при синдроме Вис-
котта-Олдрича.
Остальные тромбоцитарные индексы, такие как PDW. РСТ мало изучены,
их диаг ностическое значение пока не определено. PDW - показатель анизоци-
тоза тромбоцитов (норма 16.3 ± 1.0), изменяется при миелопролиферативных
и других заболеваниях. РСТ- тромбокрит, характеризует долю объема крови,
занимаемую тромбоцитами (норма - 0,235 ± 0,085%). Он вычисляется, исходя
из общего количества тромбоцитов и MPV.
40
Том 11 - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Большинство современных гематологических анализаторов определяют
как минимум от 6 до 10 показателей лейкоцитарной формулы. Они включают
как относительное, так и абсолютное содержание нейтрофилов, лимфоцитов,
моноцитов, эозинофилов, базофилов. Гематологические анализаторы “Coulter
STKS” и “Coulter МАХМ”, Sysmex позволяют получить относительное и аб-
солютное содержание ретикулоцитов, их средний объем и коэффициент зре-
лости.
Автоматический анализ лейкоцитарной формулы может использоваться
для проведения скрининга нормы и патологии, динамическом контроле за со-
держанием нейтрофилов и лимфоцитов при различных патологических состо-
яниях (лимфопролиферативные заболевания, нейтропении). Любые сигналы
тревоги, демонстрируемые прибором, должны контролироваться микроскопи-
ей окрашенного мазка крови. Многие из гематологических анализаторов сиг-
нализируют о наличии незрелых форм гранулоцитов, но ни один из них не спо-
собен дать их количественную оценку. В связи с этим гематологический конт-
роль воспалительных заболеваний должен включать микроскопию мазков
крови.
Точный автоматизированный дифференциальный подсчет лейкоцитов тре-
бует полного лизиса эритроцитов. Однако при определенных состояниях по-
вышена осмотическая резистентность эритроцитов и их лизис происходит не-
полностью. что является причиной завышения содержания лейкоцитов, отно-
си тельного и абсолютного содержания лимфоцитов. В этих случаях важную
информацию дает лейкоцитарная гистограмма, где в зоне распределения лим-
фоцитов появляется небольшой пик. свидетельствующий о присутствии в кро-
ви фрагментов клеток.
Повышение осмотической резистентности наблюдается у новорожденных,
после спленэктомии, при гемоглобинопатиях, мегалобластмой анемии, миело-
диспластическом синдроме, заболеваниях печени. Показано, что в мембране
эритроцитов новорожденных и больных с удаленной селезенкой повышено со-
держание фосфолипидов и холестерина, что приводит к увеличению средней
площади поверхности эритроцитов и повышению их осмотической резистент-
ности. При миелодиспластическом синдроме в эритроцитарной мембране име-
ются изменения со стороны белков, таких как спектрин, гликофорин и др.
Автоматический анализ крови позволяет быстро, с высокой точностью,
минимальной трудоемкостью, в сочетании с широким спектром исследуемых
гематологических параметров провести качественное исследование крови, оп-
ределить дальнейшие исследования с целью установления диагноза заболевания.
Литература- Л.В.Байдун, А.В-Логинов // Значение автоматического ана-
лиза крови в клинической практике. Гематол. и трансфузиол.. 1996, т.41.	2,
с.36-41. Денуэм М.Дж.. Чанарин И. // Болезни крови у пожилых: Пер с англ -
М.. 1989. В.Н.Титов. И.Н.Наумова //Автоматизированный счет форменных
элементов крови. М.. 1995. Исследование системы крови в клинической прак-
тике. Под ред. Г.И.Козинца, В.А.Макарова. М., 1997,
________МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 41
ЛЕЙКОЦИТЫ
Лейкоциты - клетки крови, отличающиеся характерной структурой и
сложным внутриклеточным метаболизмом. Это высокоспециализированныс
клетки, обладающие различными фуициями: нейтрофилы осуществляют фа-
гоцитоз. базофилы и эозинофилы участвую!’ в аллергических реакциях, про-
тивотел ьминтном иммунитете, моноциты являются профессиональными фа-
гоцитами, участвуют в противоопухолевом иммунитете, иммунном ответе, ре-
гуляции кроветворения, гемостазе, метаболизме липидов и железа, осуществ-
ляют медиаторную функцию, лимфоциты участвуют в реакциях гуморального
и клеточного иммунитета, синтезе и секреции цитокинов.
Количество лейкоцитов в крови изменяется под влиянием сезонных, кли-
матических, метеорологических внешних факторов, а также при разных фи-
зиологических состояниях организма (возрастные изменения, беременность,
фазы менструального цикла и пр.) и разнообразной патологии. Поэтому ис-
следование числа лейкоцитов в крови является одним из самых распростра-
ненных в лабораторной практике.
Подсчет количества
Подсчет количества лейкоцитов входит в состав общего клинического ана-
лиза крови, а также "укороченного1 анализа (содержание гемоглобина, число
лейкоцитов. СОЭ), иногда в экстренных случаях исследуют только количест-
во лейкоцитов (при подозрении на острый воспалительный процесс и др.)
Метод подсчета в счетной камере
Принцип. Подсчет лейкоцитов под микроскопом в определенном количест-
ве квадратов счетной сетки и пересчет на 1 мкл крови (или 1 л по системе
СИ), исходя из объема квадратов и разведения крови.
Реактивы. 3-5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный несколькими
каплями раствора метиленового синего (для окраски ядер лейкоцитов). Рас-
твор голубого цвета, длительно годен к употреблению.
Специальное оборудование. 1. Микроскоп. 2. Счетная камера Горяева.
Ход определения. Разводят исследуемую кровь в 20 раз, для этого в сухую
пробирку наливают 0,4 мл уксусной кислоты. Набирают из пальца 20 мкл кро-
ви (можно использовать стабилизированную антикоагулянтом венозную
кровь). Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей, сле-
дя за тем, чтобы из пипетки кровь не вылилась. Выдувают кровь из пипетки
на дно пробирки, тщательно перемешивают (повторно набирая и выдувая
смесь крови с уксусной кислотой). Маркируют пробирку и оставляют до мо-
мента счета (допускается счет лейкоцитов не более чем через 2-4 ч после взя-
тия крови).
Подготавливают счетную камеру: протирают- насухо камеру с сеткой и по-
кровное стекло, затем притирают стекло к камере, слегка надавливая его та-
ким образом, чтобы по краям стекла появились радужные кольца или полосы
(это свидетельствует о высоте камеры - 0,1 мм). Заполняют счетную камеру
разведенной кровью: предварительно встряхивают несколько раз содержимое
пробирки, затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой отбирают
каплю разведенной крови и подносят се к краю покровного стекла, следя за
тем, чтобы кровь без пузырьков воздуха равномерно заполнила всю поверх-
42
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
нос гь сетки, нс затекая в бороздки. Заполненную камеру оставляют в горизон-
тальном положении на 1 мин (для оседания лейкоцитов). Не меняя горизон-
тального положения камеры, помещают ее на столик микроскопа и подсчиты-
вают лейкоциты в 100 больших квадратах с малым увеличением (окуляр 10х,
объектив 8х). Для большей точности счет лейкоцитов проводят по всей сетке
в больших квадратах (неразделенных на малые квадраты и полосы), начиная с
левого верхнего угла сетки. Для лучшего контрастирования затемняют поле
зрения, опуская конденсор и закрывая диафрагму. Считают клетки, располо-
женные внутри квадрата и лежащие на любых двух линиях (чтобы дважды не
подсчитать одну клетку).
Расчет числа лейкоцитов проводя т, исходя из разведения крови (20), числа
сосчитанных квадратов (100) и объема одного большого квадрата 1/250, так
как сторона квадра та 1/5 мм, высота 1/10 мм).
а х 250 х 20
-------------, т с X = а х 50,
100
где X - число лейкоцитов в 1 мкл крови; а - число лейкоцитов в 100 боль-
ших квадратах. Количество подсчитанных лейкоцитов умножают на 50.
Таблица 5
Возрастные нормы содержания лейкоцитов в крови
Возраст
При рождении
24 часа
1 мес.
1-3 года
4-7 лет
Взрослые
Лейкоциты (107л)
9.0-30,0
9,4-30,4
5,0-19,6
6,0-17.5
5,5-15,5
4,0 - 9,0
Клиническое значение. Число лейкоцитов в крови - наиболее вариабель-
ный лабораторный показатель. Повышение количества лейкоцитов - лейкоци-
тоз - наблюдается при различных воспалительных процессах, острых бактери-
альных и вирусных инфекциях, интоксикациях, шоке, после острого кровотс
чения, при коматозных состояниях, гемолитическом кризе, почечной колике,
аллергических реакциях, опухолях, острых и хронических лейкозах. Физиоло-
гический лейкоцитоз отмечается после физической, эмоциональной нагрузки,
под влиянием различных диагностических процедур, медикаментозных воздей-
ствий, солнечного света и ультрафиолетовых лучей, на фоне менструации.
Лейкоцитоз может быть вызван болью, рвотой и тошнотой. Небольшой лей
копитоз наблюдается во время беременности и нарастает по мере приближе-
ния родов.
Снижение количества лейкоцитов - лейкопения - наблюдается при вирус
пых инфекциях, некоторых хронических инфекциях, сепсисе, циррозе печени,
хроническом активном гепатите, аутоиммунных заболеваниях, после приема
цитостатических препаратов, антибиотиков, сульфаниламидов и других меди-
каментов, при апластической, В 12-дефицитной анемии, агранулоцитозе, воз-
действии ионизирующей радиации.
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
43
Литература. Грибова И. А. Гематологическая норма.- В кн.: Руководство
по гематологии /Под ред. А И. Воробьева. Ю. И. Лорис. -М.: Медицина, 1979.
с.53. Исследование системы крови в клинической практике. Под род. Г.И.Ко
зинца, В.А.Макарова. М., 1997.
Лейкоцитарная формула
Лейкоцитарную формулу (процентное соотношение различных видов лей-
коцитов) подсчитывают в окрашенных мазках крови.
Метод морфологического исследования (форменных элементов крови
с дифференциальным подсчетом лейкоцитарной формулы
Принцип. Микроскопия сухих фиксированных и окрашенных мазков крови
с дифференцированием различных форм лейкоцитов. Этапы исследования,
включающие приготовление мазков крови, подготовку предметных сгекол,
фиксацию мазков и их окраску, изложены выше.
Реактивы. 1 Иммерсионное масло. 2. Диэтиловый эфир.
Специальное оборудование. 1. Микроскоп. 2. 11-Клавишный счетчик для
подсчета лейкоцитарной формулы.
Ход исследования. С помощью объектива 10х (малого увеличения) нахо-
дят край мазка крови. Наносят каплю иммерсионного масла и, не меняя поло-
жения стекла, переводят иммерсионный объектив (90х) таким образом, чтобы
он погрузился в каплю масла. Подбирают с помощью микровинта соответст-
вующее фокусное расстояние, устанавливая четкую видимость клеток. 11ри-
ступают к дифференцированию лейкоцитов, отмечают клетки с помощью 11-
клавишного счетчика: необходимо просчитать не менее 100 лейкоцитов. Подс-
чет лейкоцитов проводят, соблюдая следующее правило: отступив 2-3 поля
зрения от края мазка, затем 3-5 полей зрения вдоль края мазка, затем 3-5 по-
лей зрения под прямым углом по направлению к середине мазка, снова 3-5 по-
лей зрения параллельно краю, затем под прямым углом по направлению к
краю и т.д.; таким образом, стекло двигают по зигзагу (линия "меандра').
Просчитав около половины клеток на одном крае мазка, меняют положение
стекла и другую половину клеток считают на противоположном крае.
I !ри исследовании лейкоцитарной формулы необходимо дифференциро-
вать неразрушенные лейкоциты. Если при подсчете 100 лейкоцитов отмеча-
ются какие-либо отклонения от нормы (например, увеличение числа палочко-
ядерных форм, эозинофилов, лимфоцитов или появление клеток, не обнару-
живаемых у здоровых людей), необходимо подсчитать еще 100 лейкоцитов и
вывести средний результат.
Нормальные величины. В табл. 6, 7 представлены процентные и абсолют-
ные значения различных лейкоцитов и их морфологические особенности у
здоровых людей.
44
Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Таблица 6
Лейкоцитарная формула крови в период новорожденного! (%)
Клетки	При	рождении	1 ДСНЬ	4 дня	1 неделя	2 педели
Нейтрофилы Миелоциты	0,5	0.5	0	0	0
Метамиелоциты	4,0	4,0	2.5	1.5	1.5
I Галочкоядерные	27,0	26,0	7,0	4,5	3,0
Сегментоядерные	34.0	34,0	39.0	22.0	25,0
Всего	65.5	64.5	48.5	28.0	29.5
Эозинофилы	3.0	2,0	3,5	3,5	3,0
Базофилы	0,75	0,25	0	0.5	0,5
Моноциты	8,0	9,5	11,0	11.0	11.5
Лимфоциты	22.5	24.0	36,5	49,0	55,0
Плазмоциты	0,25	0,25	0,5	0,5	0,5
Клиническое значение. Изменения лейкоцитарной формулы сопутствуют
многим заболеваниям и нередко являются неспецифическими. Тем не менее ди-
агностическое значение этого исследования велико, оно дает представление о
тяжести состояния, эффективности терапии. При гемобластозах исследование
лейкоцитарной формулы особенно диагностически значимо. Обнаружение в кро-
ви бластных клеток является опорным пунктом для диагноза острого лейкоза.
Повышение числа нейтрофилов - нейтрофилез, как правило, сочетается с
увеличением общего числа лейкоцитов в крови и наблюдается при острых вос-
палительных процессах, интоксикациях, шоковых состояниях, при кровотече-
ниях. инфаркте миокарда, гемолитическом кризе. При однократном или дли-
тельном приеме кортикостероидов наблюдается нейтрофилёз. Нередко этим
состояниям сопутствует и повышение числа палочкоядерных нейтрофилов, и
появление незрелых гранулоцитов (миелоциты, метамиелоциты) в небольшом
количестве (сдвиг формулы влево). Максимальной степени эти изменения до-
стигаю!' при миелопролиферативных заболеваниях, особенно хроническом
миелолейкозе. При этом резко увеличивавтся общее количество лейкоцитов
(более 100 х 107л). в лейкоцитарной формуле в хронической фазе заболевания
обнаруживают промиелоциты (3-5%). миелоциты (до 10%), метамиелоциты
(до 10-15%) и единичные бластные клетки, при этом число зрелых нейтрофи-
лов существенно уменьшается. Выраженный сдвиг влево может сопутство-
вать сепсису, метастазам злокачественных опухолей в костный мозг
Снижение числа нейтрофилов - нейтропения - обычно соче тается с лей-
копенией и наблюдается при бактериальных, вирусных (грипп, гепатит, корь,
краснуха. СПИД) инфекциях, малярии, клещевом возвратном тифе, после
приема различных медикаментов (особенно цитостатических), лучевой тера-
пии. наследственной патоло! ии. Максимальная степень нейтропении наблюда-
ется при аплас тической анемии, а гранул оци тозе.
Увеличение числа эозинофилов - эозинофилия - сопутствует аллергиче-
ским реакциям, гельмингозам. пузырчатке, некоторым детским инфекциям,
особенно скарлатине, иногда опухолям, лимфогранулематозу, коллагенозам,
наблюдается при хроническом миелолейкозе, истинной полицитемии, после
спленэктомии, некоторых вариантах острого лейкоза.
Таблица 7
Характеристика различных видов лейкоцитов здоровых лишен
Нейтрофилы палочкоядерные		сегментоядерные	Эозинофилы	Базофилы	Лимфоциты	Моноциты
Кол-во в %	1 - 6	47 - 72	0,5 - 5	0- 1	19 -37	3-1 1
в 1 мкл	40 - 300	2000 - 5500	20- 300	0-65	1200 - 3000	90 - 600
Размерклетки,						
мкм	10—15	10—15	12—15	8-12	8—10	15—20
Ядро: форма	Узкое,	Узкое, состоит	Несколько	Неопреде-	Округлая	Полиформное:
	вытянутое в виде палочки	из 3-5 сегментов	шире, чем у нейтрофила. состоит из 2-3 сегментов	ленная	ил и бобовидная	округлое, бобовидное, с вдавлениями
структура	Неравномер-	Неравномер-	Неравномер-	Неравномер-	Неравномер-	Равномерная
	ная крупно- глыбчатая	ная крупно- глыбчатая	ная крупно- гл ыбчатая	ная	ная крупно- глыбчатая	сетчатая
окраска	Темно- ф иоле товая	- Темно-фиоле- товая	Фиолетовая	Фиолетовая	Темно- фиолетовая	Светло- фиолетовая
Цитоплазма	Розоватая	Розоватая	Бледно- розовая	Бледно- розоватая	Голубая. В виде узкого , ободка, иногда широкая зона	Обильная бледно-голубая или сероватая
Зернистость,	Обильная,	Обильная,	Обильная,	Необильная	Изредка	Непостоянно,
ее окраска.	мелкая,	мелкая,	занимает всю	неравномер-	единичные	иногда мелкая
характер	бледно-	бледно-	цитоплазму.	ная,	фиолетовые	бледно-
	фиолетовая	фиоле говая	крупная, розовая	фиолетовая	гранулы	фиолетовая
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ TEXI ЮЛОГИИ
46
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Увеличение числа базофилов - базофилия - наблюдается при гипотиреозе,
стрессе, на протяжении беременности, во время овуляции, после введения чу-
жеродного белка. Часто базофилия появляется при хроническом миелолейко-
зе, истинной полицитемии, лимфогранулематозе, после спленэктомии, приеме
эстрогенов и антитиреоидных препаратов.
Увеличение числа лимфоцитов - лимфоцитоз - наблюдается при инфекци-
онном мононуклеозе, коклюше, туберкулезе, инфекционном лимфоцитозе, ге-
патите, некоторых хронических инфекциях (бруцеллез, туберкулез, сифилис),
после удаления селезенки. Наибольшей степени лимфоцитоз достигает при
хроническом лимфолейкозе (70-90%) и сочетается с высоким лейкоцитозом
(50 х 107 л и выше), волосатоклеточном лейкозе и некоторых вариантах лим-
фосарком. Уменьшение числа лимфоцитов - лимфопения - наблюдается при
острых инфекциях, некоторых иммунодефицитных состояниях, после введе-
ния кортикостероидов и некоторых химиопрепаратов.
Увеличение числа моноцитов - моноцитоз - обнаруживается при бактери-
альных инфекциях (туберкулез, подострый септический эндокардит, сепсис,
сифилис, бруцеллез), заболеваниях, вызванных простейшими, риккетсиями и
другими паразитами (малярия, сыпной тиф, трипаносомоз, лейшманиоз), опу-
холях, коллагенозах. хронических моноцитарных лейкозах, длительном прие-
ме высоких доз кортикостероидов.
Литература. Исследование системы крови в клинической практике. Под
ред. Г.И.Козинца, В.А.Макарова. М., 1997.
Лейкоконцентрат
Приготовление и исследование лейкоконцентрата проводят при выражен-
ной лейкопении, когда исследование лейкоцитарной формулы затруднено, а
также для обнаружения патологических элементов, не выявляемых в мазках
крови (например, при алейкемическом варианте острых лейкозов, лимфогра-
нулематозе, миеломной болезни и др.). Лейкоконцентрацию можно проводить
при неотчетливых результатах стернальной пункции. Все существующие ме-
тоды лейкоконцен грации основаны на следующем: 1) гемолиз, 2) центрифуги-
рование и 3) седиментация.
Наиболее физиологичны и распространены методы, основанные на седи-
ментации форменных элементов крови.
Метод с трилоном Б
Принцип. В связи с различным удельным весом эритроцитов и лейкоцитов
и добавлением трилона Б, ускоряющего осаждение эритроцитов, получают
плазму, содержащую большое количество лейкоцитов.
Реактивы. 1. 3% раствор трилона Б. 2. Краска Романовского-Гимзы и пи
азур-эозина. 3. Метанол для фиксации мазков.
Специальное оборудование. 1. Микроскоп. 2. Термостат на 37°С. 3. Цент-
рифуга
Ход определения. В пробирку с 1 мл 3% раствора трилона Б вносят 4 мл
венозной крови и осторожно перемешивают. Ставя т смесь крови с трилоном
в термостат (можно отстаивать и при комнатной температуре) на 30-45 мин
(за это время над эритроцитами образуется 2-3 мл прозрачной плазмы). С по-
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
47
мощью пастеровской пипетки отсасывают в центрифужную пробирку слой
плазмы, стараясь не захватывать эритроциты. Цен грифугируют при 1000
об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а из осадка гото-
вят мазки (помещают каплю осадка пастеровской пипеткой на предметное
стекло и готовят мазок). Мазки высушивают на воздухе, фиксирую! и окра-
шивают гематологическими красителями.
Метод с гепарином (может быть использован при необходимости
удаления тромбоцитов)
Принцип. При цен трифугировании плазмы, разведенной холодным изото-
ническим раствором хлорида натрия, тромбоциты оседают в осадок, а лейко-
циты остаются во взвешенном состоянии.
Реактивы. 1. Гепарин (500 ЕД/мл). 2. 0,85% раствор хлорида натрия.
Оборудование. То же, что и в методе с трилоном Б.
Ход определения. В пробирку с 1 мл гепарина добавляют 4 мл крови. От-
стаивают 40 45 мин. С помощью пастеровской пипетки отбирают плазму в
центрифужную пробирку, стараясь не захватить эритроциты Центрифугиру-
ют при 1500 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а к
осадку добавляют 5 мл холодного 0.85% раствора хлорида натрия. Центрифу-
гируют при 500-800 об/мин в течение 10-15 мин (если в осадке имеется при-
месь эри троцитов, то повторно цен грифугируют с холодным раствором хло-
рида натрия). Из осадка готовят мазки и окрашивают их гематологическими
красителями.
Нормальные величины. При исследовании лейкоконцентрата у 50 здоро-
вых людей Р. А. Поспелова получила следующую лейкограмму: нейтрофилы
палочкоядерные 1.2 ± 0,1%, сегментоядерные 58,8 ± 0.7%, эозинофилы 1,8 ±
0,05%. базофилы 0,7 ± 0,08%, лимфоциты 31,2 ± 1.0%, моноциты 7,1 ± 0,3%,
плазматические клетки 0,2 ± 0,03%. У одного человека обнаружено 0,2% ми-
елоцитов. у 2 - 0,2 и 0,4% метамиелоцитов, у 2 - единичные фрагменты ядер
мега кари областов.
Клиническое значение. Исследование мазков лейкоконцен грата имеет су-
щественные преимущества перед мазками периферической крови при острых
лейкозах, особенно при выраженной лейкопении. Это исследование дает воз-
можность выявить бластные клетки, оценить полноту ремиссии при остром
лейкозе, а также провести цитохимические исследования, имеющие важное
диагностическое значение при острых лейкозах .
Выявление в мазках лейкоконцентрата фрагментов ядер мегакариоцитов
наблюдается при миелопролиферативных заболеваниях, миелодиспластиче-
ском синдроме, а также при опухолях различной локализации Увеличение
плазматических клеток может быть при лимфогранулематозе, миеломной бо-
лезни и других опухолях. При лимфогранулематозе могут быть найдены клет-
ки Березовского Штернберга, Ходжкина.
Литература. Поспелова Р. А. Леикоконцентрация в клинической практи-
ке.- М., 1973. с.22.
48
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Исследование волчаночных клеток (LE-клетки)
Волчаночные клетки служат морфологическим проявлением иммунологи-
ческого феномена, характерного для системной красной волчанки. Они обра-
зуются в результате фагоцитоза нейтрофильными лейкоцитами (реже моно-
цитами) ядер клеток, содержащих деполимеризованную ДНК. Предполагают,
что фагоцитируемая субстанция представляет собой иммунный комплекс, со-
стоящий из волчаночного фактора (антинуклеарного фактора), остатков ядра
лейкоцитов и комплемента. Морфологически LE-клетки характеризуются на-
личием в цитоплазме ней трофильных лейкоцитов округлого бесструк турного
образования, напоминающего лизированное ядро светло-фиолетового цвета,
занимающего центральную часть клетки с оттесненным к периферии ядром.
Реже такое же образование выявляют в моноцитах, иногда оно расположе-
но внеклсточно. может образовывать фигуры "розеток" (образование, окру-
женное нейтрофилами). В отличие от LE-клеток обнаруживают нейтрофилы
с фагоцитированной субстанцией не гомогенного характера, а с сохраненной
структурой хроматина. Такие клетки относят к клеткам Гарта и рассматрива-
ют их как прсдстадию LE-клеток. Специфичными для системной красной вол-
чанки считают типичные LE-клетки.
Для исследования LE-феномена предложены многочисленные методы, в
основе которых лежит инкубация клеток больного в собственной плазме (ме-
тод, предложенный Hargraves, Zimmer, 1948). Рекомендуется дополнительное
механическое встряхивание для усиления травматизации клеток и увеличение
количества LE-клеток.
Метод Харгренеса - Циммера
Принцип. Механическое повреждение лейкоцитов для усиления LE-фсномена.
Реактивы. 1. Метиловый спирт. 2. Краска Романовского-Гимзы или другой
гем атол оги чес к и й к расител ь.
Специальное оборудование. I. Микроскоп. 2. Металлическое сито. 3. Фар-
форовый пестик. 4. Центрифуга.
Ход определения. В пробирку набираю! 10 мл венозной крови и оставляют
для свертывания на 2 ч. Свернувшуюся кровь выливают на металлическое си-
то, поставленное на чашку Петри, и пестиком протирают сгусток в чашку. Со-
держимое чашки Петри выливают в центрифужную пробирку и центрифуги-
руют при 2000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и
удаляют, а из осадка (верхнего слоя) готовят мазки. Высохшие мазки фикси-
руют и окрашивают гематологическим красителем.
Метод Цинкхама-Конли в модификации ЕММовоселовой
Принцип. Механическое воздействие на кровь, облегчающее образование
LE-феномена.
Реактивы. 1 Оксалат натрия 2. Метиловый спирт. 3. Краска Романовско-
го-Гимзы или азур-эозин.
Специальное оборудование. 1. Микроскоп. 2. Центрифуга 3. Стеклянные
бусинки диаметром 3-4 мм.
Ход исследования. В пробирку помещают К) мг оксалата натрия и 10 мл
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
49
венозной крови. Тщательно перемешивают и оставляют стоять на 1-1,5 ч.
Вносят в пробирку 6-8 бусинок, закрывают пробирку плотно пробкой и пере-
мешивают в течение 30 мин (опрокидывая пробирку пробкой вниз и вверх).
Затем отстаивают в течение 1 ч при комнатной температуре до разделения
слоев. Плазму отсасывают пастеровской пипеткой и переносят в центрифуж-
ную пробирку. Центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадоч-
ную жидкость сливают, из осадка готовят мазки. Фиксируют высохшие мазки
в метиловом спирте и окрашивают гематологическим красителем.
Нормальные величины. У здоровых людей волчаночные клетки в крови
отсутствуют.
Клиническое значение. Обнаружение LE-клеток - специфичный симптом
системной красной волчанки. Исследование необходимо производить до нача-
ла кортикостероидной терапии. Отрицательный результат исследования не ис-
ключает возможность данного заболевания, он бывает в раннем периоде бо-
лезни, а также при выраженном нефротическом синдроме и потере с мочой
большого количества белка. Большую диагностическую ценность имеет им-
мунологическое исследование антинуклсарных антител.
Литература. Л.Йегер. Клиническая иммунология и аллергология, М.,
1986, т.2, с.257-286.
Цитохимические исследования лейкоцитов
Цитохимические исследования проводят в мазках крови, лейкоконцентра-
та, костного мозга и других пунктатах. Они основаны на использовании специ-
фических химических реакций для определения в клетках различных веществ
Эти исследования позволяют изучать локализацию, и ориентировочно оцени-
вать количество определяемых веществ в различных клеточных элементах.
Цитохимические исследования относительно несложны, дают возможность
исследовать различные виды лейкоцитов, но уступают в точности количест-
венному анализу, проводимому с помощью биохимических методов.
При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной
оценкой результатов, используя принцип Астапьди, основанный на выявлении
различной степени интенсивности специфической окраски. В зависимости от
нее исследуемые элементы деля г на 4 группы: с отрицательной ( ), слабополо-
жительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++) реакцией.
Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток опре-
деленного вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число кле-
ток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее
данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные
единицы. Например, при исследовании активности щелочной фосфатазы в
нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60 клетках активность фермен-
та не выявлена (-), в 35 - специфическая окраска была слабой (+) и в 5 - более
интенсивной (++). Результат определения активности щелочной фосфатазы в
нейтрофилах в таком случае сос тавит (60 х 0) + (35 х 1) + (5 х 2)=0+35+10=45
ед. Можно выразить результат в виде среднего цитохимического показателя
по L. Kaplow (1955) или среднего цитохимического коэффициента (СЦК). (
этой целью также дифференцируют 100 исследуемых клеток по указанной вы-
ше системе. 11олученный процент клеток в каждой группе умножают на соот-
50
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
встсгвующее данной группе число плюсов. Сумма этих величин, деленная на
100, представляет собой СЦК для одной клетки. В указанном примере СЦК
щелочной фосфатазы нейтрофилов равен 0.45. В тех случаях, когда изучае-
мые вещес тва локализуются в клетках в виде единичных гранул, результат ци-
тохимической реакции целесообразно выражать в процентах клеток, дающих
пол ожитсльную реакцию.
Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позво-
ляет сравнивать распределение исследуемых веществ в разных клеточных эле-
ментах или в одних и тех же клетках при различных патологических состояни-
ях организма, а также в зависимости от течения заболевания, степени его тя-
жести и в связи с проводимой терапией. Цитохимические реакции проводят с
целью дифференциации различных вариантов острого лейкоза, хронических
миелопролиферативных заболеваний, диагност ики волосатоклеточного лейкоза.
Наиболее распрост ранены цнтоэнзиматические исследования, дающие воз-
можность выявить в клетках активность различных ферментов. Для этого ча-
ще используют методы азосочетания, в которых специфический субстрат, вза-
имодействуя с ферментом, образует продукт реакции, который окрашивается
солями диазония, по окраске судят о локализации фермента и его активности.
В настоящей главе приведены наиболее распространенные в клинической
практике цитохимические методы исследования.
ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА (К.Ф. 3.1.3.1) содержится преимуществен-
но в зрелых нейтрофильных лейкоцитах; активность фермента связывают со
вторичными (специфическими) гранулами цитоплазмы Относится к группе
гидролитических ферментов с оптимумом действия при pH 9,6. осуществляет
гидролиз однозамещенных эфиров ортофосфата. Наиболее распространено
определение активности фермента методами азосочетания.
Метод азосочетания по Кеплоу
Принцип. Расщепление щелочной фосфатазой ос-нафтил фосфаза с осво-
бождением ос-нафтола. образующего с солями диазония нерастворимый окра-
шенный в коричневый цвет осадок в местах локализации фермента.
Реактивы. 1. 10% раствор формалина в абсолютном метаноле. 2. 0.05 М
раствор пропандиолового буфера (pH 9,75), готовят основной 0,2 М раствор
(10.5 г 2-амино 2 мстил-1.3-пропандиола растворяют в 500 мл дистиллирован-
ной воды), хранят его в холодильнике Из основного раствора готовят 0.05 М
раствор (25 мл ochobhoi о раствора буфера смешивают с 5 мл 0,1 н. раствора
НС! и доводят дистиллированной водой до 100 мл), хранят в холодильнике. 3.
ос-нафтилфосфат. Можно использовать нафтол-AS-фосфат, нафтол- AS-TR-
фосфат или нафтол-А5-В1-фосфат. 4. Прочный синий RR; можно использо-
вать отечественные красители диазоль синий 2С и диазоль синий 0. 5. 2% рас-
твор метилового зеленого. 6. Инкубационная среда (готовят перед употребле-
нием): 35 мг а-нафтил фосфата, 35 мг прочного синего RR. 35 мл буферного
раствора.
Специальное оборудование. Холодильник.
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
51
Ход исследования. Высохшие на воздухе мазки фиксируют в 10% раство-
ре формалина в абсолютном метаноле при температуре 0-5°С в течение 30 с.
На высохшие мазки наносят инкубационную среду после фильтрования и ос-
тавляют мазки при комнатной температуре на 8-10 мин. Ополаскивают в про-
точной воде в течение 10 с. Докрашивают метиловым зеленым в течение
15 мин или гематоксилином Майера 3-4 мин.
Метод азосочетания (модификация М Г Шубина)
Принцип см. метод азосочетания по Кеплоу.
Реактивы. 1. 0,5% раствор целлоидина в смеси равных количеств абсо-
лютного спирта и эфира. Целлоидин можно готови ть из кино и фотопленок по
методике Меркулова: удалить слой эмульсии после вымачивания в горячей во-
де или щелочи, выдержать 5-10 дней в трех сменах хлороформа, промыть
спиртом, высушить, мелко нарезать и растворить в смеси абсолютного спирта
с эфиром. 2. 0.5 М раствор тетрабората pH 9,18 [19,1 г тетрабората натрия
(бура) растворить и довести дистиллированной водой до 1 л]. Раствор стойкий.
3. 0,1% раствор а-нафтилфосфата в растворе тетрабората (готовят перед
употреблением). 4.0,2% раствор диазоля синего 0 в растворе тетрабората (го-
товят перед употреблением и фильтруют в защищенном от света месте). 5. Ге-
маталь 8 Бейкера: один объем 0,1% гематеина, приготовленного на 50% вод-
ном растворе этиленгликоля, смешивают с одним объемом 1.6% водного рас-
твора сульфата алюминия. Вместо гематаля можно использовать гематокси-
лин: 1 г краски растворяют в 50 мл дистиллированной воды, доводят до кипе-
ния, доливают 50 мл дистиллированной воды, добавляют 0.02 г йодата натрия
и 5 г алюмокалиевых квасцов, встряхивают до растворения и охлаждают.
6. Инкубационная среда (готовят перед употреблением); равные количества
реактивов 3 и 4.
Специальное оборудование. Холодильник.
Ход определения. Мазки фиксируют в 0.5% растворе целлоидина в тече-
ние 3 5 с. После фиксации целлоидин с обратной стороны предметного стекла
удаляют салфеткой, стекла ставят в вертикальном положении на фильтро-
вальную бумагу и дают им высохнуть. Инкубируют в инкубационной среде при
комнатной температуре в защищенном от све та месте в течение 30 мин. Про-
мывают в проточной воде в течение 5-10 мин и ополаскивают в дистиллиро-
ванной воде. Докрашивают ядра краси телем (реактив 5). При использовании
гематаля 8 мазки окрашивают 18-24 ч. затем ополаскивают в дистиллирован-
ной и проточной воде и высушивают. При использовании гематоксилина маз-
ки окрашивают 30-60 мин. ополаскивают в тетраборатном буфере, разведен-
ном водопроводной водой, промывают водой и высушивают.
Нормальные величины. У здоровых людей большинство сегментоядерных
нейтрофилов являются фосфатазоотрицательными и только в 20-30% клеток
выявлена слабая активность фермента (+). Поданным М.Г.Шубича и Б.С.На-
гоева, активность фосфатазы для здоровых обоего пола составляет 26±0,6 ед.,
или СПК 0,26±0.006, Поданным других авторов колебания активности щелоч-
ной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови от 8 до 80 ед. Выявле-
но достоверное различие между показателями энзиматической активности у
мужчин и женщин (соответственно 21±0,7 и 31±0.8 ед.).
52
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Клиническое значение. Повышение активности щелочной фосфатазы в
нейтрофилах наблюдается при истинной полицитемии, идиопатическом мие-
лофиброзе, воспалительных процессах, интоксикациях, инфекционных забо-
леваниях. опухолях, коллагенозах. циррозе печени. Резкое понижение актив-
ности щелочной фосфатазы отмечается при хроническом миелолейкозе, поэ-
тому исследование данного фермента может быть использовано для диффе-
ренциальной диагностики указанных состояний. Определение динамики актив-
ности щелочной фосфатазы в гранулоцитах периферической крови применя-
ется для диагностики послеоперационных осложнений в хирургической практике.
Литература. Шубич М.Г., Нагоев Б.С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в
норме и патологии.- М.: Медицина, 1980. Ф.Г.Дж.Хейхоу. Д.Кваглино. Гемато-
логическая цитохимия. М., 1983.
КИСЛАЯ ФОСФАТАЗА (К.Ф. 3.1.3.2) Обнаруживают преимуществен-
но в нейтрофилах и лимфоцитах крови; локализацию связывают с лизосомами
цитоплазмы клеток. Кислая фосфатаза является гидролитическим ферментом
с оптимумом действия pH 5.2. Для цитохимического исследования чаще ис-
пользуют методы азосочетания.
Метод азосочетания Берстона (модификация Ю.Ф.Рудеиса,
И. М. Буйкиса)
Принцип см. Метод азосочетания по Кеплоу.
Реактивы. 1.0,1 М раствор нитратного буфера (pH 5,2). 2. 0,05 М раствор
хлорида магния. 3. Нафтол AS фосфат (можно использовать нафтол-AS-TR-
фосфат или нафтол-AS-В1-фосфат. 4. Диметилформамид. 5. Диазоль синий
2С или прочный синий ВВ. 6. Краситель Романовского-Гимзы. 7. Изотониче-
ский раствор хлорида натрия. 8. Инкубационная среда: 10 мг нафол-AS-
фосфата, растворенного в 5 мл диметилформамида: 15 мл 0.1 М цитратного
буфера pH 5,2, 45 мл дистиллированной воды, 5 мл раствора хлорида магния,
50 мг диазоля синего. Готовят перед употреблением и используют после
фильтрования.
Специальное оборудование. Термостат.
Ход исследования. Нефиксированные мазки инкубируют в инкубационной
среде при 37°С в 'течение 2 ч. I [ромывают изотоническим раствором хлорида
назрия. Докрашивают красителем Романовского-Гимзы. Промывают в про-
точной воде. Активность фермента выявляется в виде синей окраски.
Нормальные величины. В сегментоядерных нейтрофилах активность фер-
мента равна 38,6±2,82 ед. или СЦК 0,386:К),028, в лимфоцитах - 26.911.94 ед.,
или СЦК 0.26810.019. У истей активность кислой фосфатазы в нейтрофилах
выше, чем у взрослых.
Клиническое значение. Повышение активности наблюдается в нейтрофи-
лах при воспалительных процессах, при туберкулезе, инфарк те миокарда, ост-
рых хирургических заболеваниях, злокачественных опухолях. При этом следу-
ет учитывать что высокие цифры активности фермента могу г быть результа-
том повышения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах, так как ак-
тивность последней может выявляться и в кислой среде Поскольку при всех
указанных выше заболеваниях наблюдается повышение активности и щелоч-
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
53
ной фосфатазы, а при цитохимическом методе исследования обоих ферментов
используют единый субстрат, при получении высокой активности кислой фо-
сфатазы М.Г.Шубич и И.В Нестерова предлагают проводить повторное ис-
следование после ингибирования щелочной фосфатазы с помощью ЭДТА.
Повышение активности кислой фосфатазы в лимфоцитах отмечается при
иммунизации, различных аллергических заболеваниях.
В бластных клетках при острых лейкозах характер распределения продук-
та реакции различен в зависимости от варианта лейкоза. При Т-клеточном
остром лимфобластном лейкозе активность кислой фосфатазы выявляется в
виде 1-3 крупных гранул. Для диагностики волосатоклеточного лейкоза необ-
ходимо определять тартратрсзистентный изофермент кислой фосфатазы.
Литература. Берстон М. Гистохимия фсрмснтов.-М.: Мир. 1965, с.215;
Ф.Г.Дж.Хсйхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия, М.. 1983.
МИЕЛОПЕРОКСИДАЗА (К.Ф. 1.11.1.7) Фермент, локализующийся
преимущественно в азурофилыюй зернистости гранулоцитов и являющийся
маркером клеток миелоидной линии. Миелопероксидаза разрушает токсиче-
скую перекись водорода, образующуюся впуфиклсточно в процессе жизнеде-
ятельности клеток.
Метод Грэхема - Кнолля
Принцип. В присутствии пероксидазы бензидин окисляется перекисью во-
дорода в коричневый оксибензидин.
Реактивы. 1.4% формалиново-спиртовой раствор (10 частей 40% форма-
лина и 90 частей 96% спирта). 2. Инкубационный раствор: бензидин (на кон-
чике ножа) растворяют в 6 мл 96% спирта, прибавляют 4 мл воды и 0,02 мл
3% перекиси водорода. Реактив годен к употреблению в течение 5-6 дней. 3.
Краситель Романовского-Гимзы.
Специальное оборудование. Нс требуе тся.
Ход определения. Свежие мазки (1-2-дневной давности) фиксируют 4%
формалиново-спиртовым раствором в чеченце 30 с. Споласкивают в проточ-
ной воде и высушивают. Заливают инкубационным раствором на 5 мин. Тща-
тельно промывают в проточной воде и высушивают. Докрашивают красите-
лем Романовского-Гимзы. Пероксидаза выявляется в цитоплазме клеток в ви-
де коричневых гранул.
Модифицированный метод Р. П.Нарциссова
Принцип см. метод Грэхема - Кнолля. Для уменьшения инактивации фер-
мента использованы соответствующий фиксатор и небольшое количество пе-
рекиси водорода
Реактивы. 1. 60% водный раствор ацетона. 2. 0,1 М раствор бората натрия
(можно использовать фосфатный или мединаловый буферный раствор pH
7 6) 3. 5% водный раствор трилона Б. 4. Насыщенный водный раствор бензи-
дина. 5. 0,003% раствор перекиси водорода (разводят перед употреблением из
3% раствора в два этапа) 6. Инкубационная среда: 5 мл 5% водного раствора
трилона Б, 10 мл раствора бората начрия. 35 мл насыщенного раствора бензи-
дина и 2 мл раствора перекиси водорода. 7. 0,5% раствор метилового зелено-
54
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
го на буферном растворе (pH 5,0) или 0,1% водный раствор метиленового си-
него.
Специальное оборудование. Термостат.
Ход определения. Свежеприготовленные мазки фиксируют в 60% водном
растворе ацетона в течение 30 с. Промывают дистиллированной водой. Инку-
бируют в инкубационной среде и течение 1 ч в термостате при 37°С. Промы-
вают дистиллированной водой. Докрашивают мазки метиловым зеленым или
метиленовым синим в течение 10 мин. Можно исследовать недокрашенные мазки.
Нормальные величины. В кропи здоровых людей ак тивность пероксидазы
выявляется преимущественно в цитоплазме гранулоцитов и в меныпей степе-
ни - моноцитов. Фермент появляется в клоч ках на стадии промиелоцита, встре-
чается в некоторых миелобласчах, его активность растет по мере созревания
клеток гранулоцитарного ряда. Миелопероксидаза является маркером клеток
миелоидной линии. Резко положительная реакция на миелопероксидазу на-
блюдается в 3-16% нейтрофилов (+++), положительная в 60-90% (++) и сла-
бо положи тельная в остальных клетках (+). СЦК нейтрофилов перифериче-
ской крови здоровых людей равен 2,56+0,033. В эозинофилах выявляется рез-
ко положительная реакция на пероксидазу.
Клиническое значение. Активность фермента в нейтрофилах снижена при
инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, опухолях. У больных хрониче-
ским миелолейкозом, особенно в терминальной стадии, СЦК снижается до
1,63±0,19 ед. В бластных клетках активность фермента высокая при остром
миелобластном лейкозе, слабая - при остром монобластном и отсутствует
при остром лимфобластном лейкозе.
Литература. Ф.Г.Дж.Хейхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия,
М., 1983.
НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ЭСТЕРАЗЫ
Группа ферментов, гидролизующих эфиры карбоновых кислот. Локализу-
ются в цитоплазме клеток, главным образом в лизосомах. Наибольшая актив-
ность обнаружена в моноцитах криви. Для определения активности ферментов
используют различные субстраты (а нафтил ацетат, нафтол-AS-ацетат, наф-
тол-AS D- хлорацетат, р-нафтил-ацетат и др.).
а-НАФТИЛАЦЕТАТ-ЭСТЕРАЗА. Метод Леффлера
Принцип. Соединение а-нафтилацсч'ача при определенных pH и темпера-
туре под влиянием неспецифических эстераз гидролизуется с образованием
свободного нафтола, который с солями диазония даеч* цветное окрашивание.
Реактивы. 1. Формалин промышленного производства (40%). 2. а Наф-
тилацетат. 3. Ацетон х. ч. 4. 0,1 М раствор фосфатного буфера (pH 7,8-8,0). 5.
Прочный синий ВВ (или прочный красный ГР). 6. Ядерный краситель (гема-
токсилин. метиловый зеленый и пр.). 7. Инкубационная среда: 10 мг а-нафтил-
ацетата, растворенного в 0,2 мл ацетона; 40 мл буферного раствора (рсакч ив
№ 4). встряхивают до растворения; 50 мг соли диазония (реактив № 5), встря-
хивают до растворения и фильтруют.
Специальное оборудование. 1. Весы. 2. Эксикатор.
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ 55
Ход определения. Свежеприготовленные и высушенные на воздухе мазки
фиксируют в парах формалина 4 мин (фиксированные препараты можно со-
хранять в холодильнике несколько недель или при комнатной температуре).
Инкубируют в инкубационной среде при комнатной температуре 30 мин Про-
мывают в проточной воде (2-3 мин). Докрашивают раствором гематоксилина
в течение 8 мин. Прошивают дистиллированной водой 15 мин. Активность
фермента выявляется в виде коричнево-черных (при употреблении прочного
синего) или красно-коричневых (при употреблении прочного красного) гра-
нул в цитоплазме клеток.
Нормальные величины. В моноцитах периферической крови активноегь
фермента содержится в виде мелкой обильной зернистости. СЦК в моноцитах
составляет 0,95±0,01. Небольшое количество лимфоцитов (18,0±0,4%) содер-
жит активность фермента в виде единичных гранул в цитоплазме. В тромбо-
цитах периферической крови фермент’ выявляется в виде мелких гранул, в сег -
ментоядерных нейтрофилах его акт ивность ничтожна.
Среди костномоз! овых клеточных элементов наибольшую активность име-
ют промиелоциты, миелоциты, мегакариоциты, моноциты. В моноцитах пери-
ферической крови и костного мозга при добавлении фторида натрия (NaF) в
количест ве 1.5 мг/мл реакция ингибируется, что используется в дифференци-
ации клеток моноцитарной линии от других клеточных элементов.
Клиническое значение. Снижение активности фермента в моноцитах и уве-
личение в лимфоцитах обнаружено при диффузных поражениях печени. Зна-
чительная активность фермента выявлена в плазматических клетках при мие-
ломной болезни, бластных клетках при остром монобластном и миеломоноб-
ластном вариантах лейкоза, подавляющаяся фторидом натрия, в то время как
при остальных формах острых лейкозов активность фермента в бластных
клетках ничтожна При хроническом лимфолейкозс активность фермента в
лимфоцитах резко снижена. Ферментативная активность нейтрофилов при
острых лейкозах, особенно при остром мислобластном. снижена.
Литература. Ф.Г.Дж.Хейхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия,
М., 1983.
КИСЛАЯ а-НАФТИЛАЦЕТАТ-ЭСТЕРАЗА Фермент локализуется глав-
ным образом в лизосомах цитоплазмы клеток и участвует в гидролизе алифа-
тических эфиров.
Метод Куллепкампфа и соавт.
Принцип Из соединения а- нафтилацетата при кислом pH под влиянием
фермен та образуе гея свободный нафтол, дающий цве тное окрашивание с фу-
ксином.
Реактивы. 1. 2,5% раствор глутаральдегида (pH 7.2). 2. 4% раствор соля-
нокислого фуксина. 3. 4 % раствор нитрата натрия. 4.0,7 М фосфатный буфер
(pH 5,0). 5. а-Нафтилацетат. 6. 2% раствор метилового зеленого. 7. Инкуба-
ционная среда: 2 мл реактива № 2, 2 мл реактива № 3, 40 мл реактива № 4. 10
мг а-нафтил ацетата, растворенного в 0.4 мл ацетона. Инкубационная среда
должна иметь pH 5,8 и готовиться перед употреблением.
Специальное оборудование 1. Холодильник 2. Весы. 3. Эксикатор.
56 Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Ход определения. Высушенные на воздухе мазки фиксируют в глутараль-
дегиде. (реактив № 1) при температуре 4°С в течение 10 мин (нефиксирован-
ные мазки можно хранить в холодильнике 1-2 мес). Промывают дистиллиро-
ванной водой. Инкубируют в инкубационной среде в течение 1,5-6 ч. Промы-
вают дистиллированной водой. Докрашивают метиловым зеленым.
Нормальные величины. В цитоплазме лимфоцитов активность фермента
выявляется в виде темно-красных гранул, в нейтрофилах и моноцитах - в виде
диффузной окраски. СЦК лимфоцитов равен 0,57±0,04. Активность фермен-
та увеличивается при увеличении времени инкубации. Так, при инкубации в те-
чение 1,5 ч активность фермента выявлена в 49.83±2,75% лимфоцитов, при
удлинении срока инкубации до 6 ч эстеразоположительными становятся
79.7+1,52% лимфоцитов. Использование в качестве фиксатора формалина да-
ет более стабильные результаты.
Клиническое значение. Снижение активности фермента в лимфоцитах ха-
рактерно для хронического лимфолейкоза (В-клеточного варианта);при Т-
клсточных пролиферациях активность неспецифической кислой эстеразы в
лимфоцитах повышена. Продукт реакции представлен 1-3 крупными фокаль-
ными пятнами.
Литература. Потапова С.Г., Шахбазян Г.П., Демидова Н.В., Козинец Г.И
Лаб дело. 1981. Ф.Г.Дж.Хейхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия,
М.. 1983.
НАФТО Л-AS-АЦЕТАТ-ЭСТЕ РАЗ А. Метод Леффлера
Принцип и оборудование такие же, как для определения о-нафтил ацстат-
эстсразы.
Реактивы. 1. Формалин промышленного производства (40%). 2. 0,1 М фо-
сфатный буфер (pH 6,8-7,0). 3. Ацетон х. ч. 4. Нафтол-AS- ацетат (можно ис-
пользовать нафтол-AS-D-ацетат). 5. Прочный синий ВВ. 6. Ядерный краси-
тель. 7. Инкубационная среда: 4 мг нафтол-AS-ацетата, растворенного в 0,4 мл
ацетона, 40 мл буферного раствора (реактив № 2): встряхивают и добавляют
80 мг прочного синего ВВ, встряхивают и фильтруют.
Ход определения. Высушенные на воздухе (в течение 1-3 ч) мазки фикси-
руют в парах формалина несколько минут. 11омешают в инкубационную среду
на 60 мин при комнатной температуре. Промывают в проточной воде. Докра-
шивают ядерным красителем.
Нормальные величины. Так же. как и ot-нафтил ацетатэстераза. фермент
локализуется главным образом в моноцитах крови. По сравнению с активно-
стью а-нафтилацезатэсгеразы активность нафтол-AS апетатэстеразы в сег-
ментоядерных нейтрофилах несколько выше, а в лимфоцитах - слабее В клет-
ках костного мозга фермент обнаружен в мегакариоцитах, плазматических
клетках, а также незрелых гранулоцитах.
Клиническое значение. Значительная активность фермента характерна
для бластных клеток при остром монобластном лейкозе, при остром промие-
лоцитарном лейкозе; при других вариантах острого лейкоза активность фер-
мента в бластных клетках не выявляется.
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
57
Литература. Ф.Г.Дж.Хейхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия,
М., 1983.
НАФТОЛ-А5-0-ХЛОРАЦЕТАТ-ЭСТЕРАЗА. Метод Молони с соавт.
Принцип и оборудование такие же, как для определения а-нафтил ацетат-
эстеразьЕ
Реактивы. 1. 10% раствор формалина в метаноле (хранят в холодильнике).
2. Буферный раствор Михаэлиса (pH 7,4). 3. Нафтол-AS-D-хлорацетат. 4.
Ацетон х. ч. 5 Гранатовый прочный GBC или синий прочный ВВ. 6. Ядерный
краситель. 7. Инкубационная среда: 10 мг нафтол-AS D-хлорацстата, раство-
ренного в 0,5 мл ацетона, 10 мл буферного раствора (реактив № 2), разведен-
ного пополам дистиллированной водой (добавляют по каплям), 10 мг реактива
№ 5: быстро встряхивают во избежание образования осадка, смесь филь труют.
Специальное оборудование. Не требуется.
Ход определения. Свежеприготовленные и высушенные на воздухе мазки
фиксируют в холодном 10% растворе формалина в метаноле в течение 30 с и
затем высушивают. Фиксированные препараты можно сохранять несколько
месяцев. Помещают в инкубационную смесь при комнатной температуре на 30
мин. Промывают в проточной воде. Докрашиваю т ядерным красителем.
Нормальные величины. Фермент выявляется в виде синих или фиолетовых
гранул в цитоплазме сегментоядерных нейтрофилов, лимфоциты и молоциты
фермента не содержат. В мазках пунктата костного мозга здоровых людей
наибольшую активность фермента обнаруживают в промиелоцитах. По мере
созревания гранулоцитов активность нафтол-А5-В-хлорацстатэстеразы не-
сколько снижается, но остается довольно высокой. Наиболее высокая интен-
сивность реакции наблюдается при фиксации в парах формалина при комнат-
ной температуре. Время фиксации до 10 мин не оказывает влияния на уровень
активности ферме ига. лишь при фиксации в течение 30 мин и дольше актив-
ность фермента снижается.
Клиническое значение. Высокая активность фермента обнаружена в бла-
стных кле тках при промиелоцитарном остром лейкозе, ничтожная - при ост-
ром монобластном; при других вариантах острого лейкоза в бластных клетках
активнос ть нс выявлена.
Литература. Ф.Г.Дж.Хейхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия,
М„ 1983.
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ группа окислительно-восстановительных фермен-
тов, локализующихся в митохондриях цитоплазмы клеток. Для исследования
различных дегидрогеназ используют ме тод Нахласа с соавт. в модификациях,
основанный на реакции восстановления солей тетразол ия и выпадения осадка
диформазана в местах активности фермен тов.
СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗА (СДГ; К.Ф. 1.3.9.9.1)
Метод Нахласа с соавт. (модификация Кваглино, Хейхоу)
Принцип. Активность фермента оценивае тся по реакции восстановления
солей тстразолия в вице осадка лиформазана синего цвета.
58
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Реактивы, 1. 60% водный раствор ацетона. 2. 0.2 М фосфатный буфер (pH
7,4). 3. 0.2 М раствор сукцината натрия. 4. 0,6 М раствор бикарбоната натрия.
5. 0.03 М раствор хлорида алюминия. 6. 0.03 М раствор хлорида кальция. 7. Те-
тразолий нитро ВТ. 8. 0J % раствор прочного красного. 9, Инкубационная сре-
да: 10 мл реактива № 3. 2 мл реактива № 4. 0,2 мл реактива № 5, 0,2 мл реак-
тива № 6. 10 мгтетразояия в 10 мл дистиллированной воды, дистиллированной
воды до 40 мл.
Специальное оборудование. Термостат.
Ход определения. Свежеприготовленные и высушенные на воздухе мазки
фиксируют в ацетоне при комнатной температуре 30-60 с. Промывают в дис-
тилированной воде и высушивают на воздухе. Инкубируют в инкубационной
среде в течение 1 ч при 37°С. I [ромывают дистиллированной водой. Докраши-
вают 0,1 % раствором прочного красного 10 мин.
Метод Нахласа с совет. (модификация Р.П. Нарциссе в а)
Принцип го г же.
Реактивы. 1. 60% раствор ацетона, насыщенный трилоном Б. 2. 1/15 М
фосфатный буфер (pH 7,2). 3. Сукцинат натрия. 4. Паранитротетразол и й фи-
олетовый. 5. Трилон Б. 6. 0,5% раствор метилового зеленого на ацетатном бу-
фере (pH 5.0). 7. Инкубационная среда: 540 мг сукцината натрия растворяют
в 10 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл буферного раствора (реак-
тив № 2) и 10 мл раствора пара-нитрогетразолия в дистиллированной воде (1
мг/мл), 13 мг трилона Б (pH довести до 7.2) и дистиллированной воды до 40 мл.
Среда может быть пригодна 1-2 нед при хранении в холодильнике.
Специальное оборудование. 1. Термоста!' или водяная баня. 2. Холодильник.
Ход определения. Фиксируют мазки ацетоном (реактив № 1) при комнат-
ной температуре в течение 30 с. Ополаскивают дистиллированной водой 3-5 с
и высушивают. Инкубируют в инкубационной среде в течение 1 ч при 37°С.
Промывают проточной водой в течение 1 мин. Ополаскивают дистиллирован-
ной водой 3-5 с. Докрашивают метиловым зеленым 5-10 мин. Промывают в
проточной воде. Дополнительно фиксируют мазки парами формалина в тече-
ние 30 мин (для предотвращения растворения формазана нитротетразол и я фи-
олетового в иммерсионном масле).
а-ГЛИЦЕРОФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА (а-ГФДГ)
Метод Нахласа с соавт. (модификация Р.П.Нарциссова)
Принцип см. Сукцинатдегидрогена за.
Реактивы. 1. 60% раствор ацетона, насыщенный трилоном Б. 2. 1/15 М
фосфатный буфер (pH 7,2). 3. ос-Глицерофосфат натрия. 4 Пара-нитротетра-
золий фиолетовый 5. Трилон Б. 6. 0,5% раствор метилового зеленого на аце-
татном буфере (pH 5,0). 7. Инкубационная среда: 630 мг а-глицерофосфата
натрия растворяют в 10 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл буфер-
ного раствора (реактив № 2), 10 мл раствора пара-нитротетразол и я в дистил-
лированной воде (1 мг/мл), 13 мг трилона Б (pH доводят до 7,2) и дистиллиро-
ванной воды до 40 мл. Среда пригодна в течение 1-2 нед при хранении в холо
дильнике.
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
59
Оборудование и ход определения см. Сукцинатдегидрогеназа (модифика-
ция Р. II. Нарциссова).
Нормальные величины. У здоровых СДГ и а-ГФДГ выявляются в виде гра-
нул в нейтрофилах, лимфоцитах, тромбоцитах периферической крови и мие-
лобластах. гранулоцитах, мегакариоцитах, эритро- и нормобластах костного
мозга.
СЦК СДГ лимфоцитов составляет 1,1 ± 0,05; а-ГФДГ - 0,8 ± 0,08. У детей
активность фермента СДГ обнаружена в 46% лимфоцитов. У здоровых взрос-
лых в пунктате костного мозга около 88% недифференцированных клеток
имеют активность фермента (+), все ядерные элементы эритроидного ряда и
гранулоциты проявляют активность на (+) и (++).
Клиническое значение. Снижение активности ферментов в лимфоцитах
отмечено в период приступа бронхиальной астмы, при хроническом лимфо-
лейкозе. Повышение активности ферментов обнаружено у больных злокаче-
ственными опухолями в гранулоцитах, снижение активности при хроническом
миелолейкозе.
Литература. Нарциссов Р П. Арх. анат.. 1969, № 5, с.85-91. Дж.Хейхоу,
Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия, М., 1983.
ГЛИКОГЕН локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в
энергетическом метаболизме клеток. При цитохимическом исследовании гли-
когена используют главным образом PAS- или ШИК реакцию (по названию
реактивов - шифф-йодная кислота).
Метод IIIабидиша
Принцип. Под влиянием периодата калия гликоген окисляется с образова-
нием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фук-
син-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишне-
во- ф иол етовое о к pa i н и ва н и е.
Реактивы. 1. 0.03 М раствор перйодата калия или натрия: 230 мг периода-
та растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед употреблени-
ем. 2. 1 н. НО: 82.5 мл концентрированной НО отн. плотности 1,19 доливают
дистиллированной водой до 1 л. 3. Основной фуксин (для фуксин-сернистой
кислоты). 4. Метабисульфит калия. 5. Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина
растворяют в 200 мл кипяшей дистиллированной воды. По мере охлаждения в
раствор добавляют I г метабисульфита калия и 20 мл 1 н. HCI. Оставляют- на
сутки. Для полного обесцвечивания добавляют растолченную таблетку карбо-
лена, оставляют на сутки, затем фильтруют; Реактив сохраняют в темноте
(лучше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен к употреблению в течение
нескольких месяцев (легкая степень покраснения свидетельствует о непригод-
ности реактива). 6. Сернистая вода: к К) мл 10% раствора метабисульфита ка-
лия добавляют 200 мл дистиллированной воды и 10 мл 1 н. НС1. Готовят перед
употреблением 7. 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой краски (лихтгрюн)
или раствор гематоксилина.
Специальное оборудование. 1 Горелки. 2. Термостат. 3. Весы.
60
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Ход определения. Препараты фиксируют (тотчас после приготовления) в
абсолютном спирте в течение 30 мин. Промывают в двух сменах дистиллиро-
ванной воды. Погружают в раствор перйодата на 20 мин (в темноте). Промы-
вают в трех сменах дистиллированной воды. Ополаскивают в сернистой воде
(в течение 1-2 мин). Окрашивают реактивом Шиффа в течение 30-40 мин (в
темноте). Промыва юз в трех сменах сернистой воды по 3 мин. Промывают в
грех сменах дистиллированной воды по 3 мин. Окрашивают светло-зеленой
краской или раствором гематоксилина в течение 10-20 с. Промывают в дис-
тиллированной воде. Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на
зеленом фоне препарата. Кроме гликогена, положительную реакцию могут
давать такие ШИ К-положи тельные вещества, как кислые и нейтральные му-
кополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко отдиф-
ференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.
Проба со слюной. Препарат помещают в свежесобранную слюну и остав-
ляют на 30 мин в термостате. Затем производят окраску на гликоген приведен-
ным выше методом. Инкубация препаратов со слюной способствует расщеп-
лению гликогена, и при реакции с реактивом Шиффа не получается розовой
окраски.
Идентифицировать гликоген можно также путем предварительной инкуба-
ции мазков с диастазой (ос-амидаза: К.Ф.3.2.LI) (1 мл профильтрованной диа-
стазы растворить в 40 мл изотонического раствора хлорида натрия) в течение
30 мин в термостате.
Нормальные величины. В мазках периферической крови гликоген содер-
жится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), ци-
топлазме лимфоцитов (в виде небольшого количества гранул). В пунктате ко-
стного мозга гликоген выявляется в гранулоцитах разной степени зрелости,
лимфоцитах и мегакариоцитах. У здоровых людей количество интенсивно ок-
рашенных нейзрофилов крови (+++) колеблется в пределах 2-12%. средней
интенсивности окраски (++) - в пределах 72-90%, слабо окрашенных (+) - от
4 до 18%. СЦК равен 1,71-2,04.
В лимфоцитах крови здоровых людей гликоген содержится в виде неболь-
шого числа гранул в 10,4±2,3% клеток. В мегакариоцитах костного мозга гли-
коген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30-50), напоминая ско-
пления кровяных пластинок. У здоровых людей число гликогенположитель-
ных мегакариоцитов составляет 62,0+3.55%.
Клиническое значение. Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах
наблюдается при различных воспалительных процессах, эритремии, сахарном
диабете, уменьшение - при агранулоцитозах, лучевой болезни, при хрониче-
ском миелолейкозе, особенно при прогрессировании процесса. Повышение
числа гликогенположительных лимфоцитов (до 70-80%) характерно для лим-
фопролиферативных заболеваний, особенно хронического лимфолейкоза.
При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях
число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено,
после спленэктомии оно повышается до нормальных величин.
При острых лейкозах гликоген можно обнаружить в бластных клетках: при
остром мислобластном лейкозе - в виде мелкой зернистости в цитоплазме или
в виде диффузного ее окрашивания, при остром лимфобластном лейкозе - в
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
61
виде крупных гранул, расположенных в цитоплазме вокруг ядра, при остром
межобластном варианте бластные клетки содержат гликогена немного в виде
диффузной или диффузно-гранулярной окраски, при эритромиелозе гликоген
в виде гранул обнаруживается в значительном числе эритробластов.
Литература. Дж.Хейхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия, М.,
1983.
КАТИОННЫЙ БЕЛОК. Неферментный катионный белок локализуется в
лизосомах гранулоцитов и играет важную роль в реализации фагоцитарной
функции клеток. При цитохимическом исследовании катионных белков ис-
пользуют методы, основанные на применении диахромных анионных красителей.
Метод В.Е.Пигаревского (модифицированный).
Принцип. Избирательная окраска катионного белка гранулоцитов проч-
ным зеленым при pH 8,1-8,2.
Реактивы. 1. Спиртовой раствор формалина (1 мл формалина и 19 мл аб-
солютного этилового спир та). 2. 0.2 М раствор триса: 24,2 г триса (оксиметил)
аминомстана растворяют в 1 л дистиллированной воды. 3. 0,1 н. НС1. 4. Мета-
ноловый трис-буфер (25 мл реак тива № 2 смешивают с 22.5 мл реактива № 3
и 52,5 мл метанола). 5. Забуферснный спиртовой раствор прочного зеленого
(pH 8.1 8,2)* 100 мг прочного зеленого растворяют в 100 мл реактива № 4. Оп-
ределяют pH через сутки после приготовления реактива и выравнивают его
добавлением в раствор порошка сухого триса (при pH ниже 8Д) или слабого
раствора НС1 (pH выше 8,2). Установленная величина pH стабильна при ра-
боте в течение 4 мес. Раствор хранить в стеклянной посуде с притертой проб-
кой (можно при комнатной температуре). 6. 0,25% водный раствор азура А:
250 мг азура А растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Краситель стойкий.
Специальное оборудование. 1. pH-Метр. 2. Весы.
Ход определения. Высушенные на воздухе мазки фиксируют в спиртовом
растворе формалина 10-15 с. Во избежание фоновой окраски можно исполь-
зовать свежеприготовленные нефиксированные мазки (не позже чем через 48
ч после приго товления, препараты более дли тельного срока необходимо фик-
сировать). Мазки окрашивангт забуференным спиртовым раст вором прочно-
го зеленого (реактива № 5) в течение 20 мин. Быстро ополаскивают дистил-
лированной водой. Окрашивают водным раствором азура А в течение 15-20 с.
Смывают мазки дистиллированной водой и высушивают. При микроскопии с
желтым или оранжевым светофильтром катионный белок в цитоплазме кле-
ток имеет вид ярко-зеленых гранул.
Воспроизводимое гь метода: коэффициент вариации Cv=2.9% для нор-
мальных величин и 5,2% для патологических (не превышает допустимой вели-
чины).
Нормальные величины. У взрослых в возрасте 20-30 лет СЦК равен для
мужчин 1,58 ± 0,01 и для женщин 1,58 ± 0,03. Более высокие значения получе-
ны у детей в возрасте 1-12 мес (1,89 ± 0,03) и 1-3 лет (1.96 ± 0.03).
62 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Метод с бромфеиоловым синим (по М. Г. Шубину)
Принцип. Избирательная окраска катионного белка бромфеноловым синим.
Реактивы. 1. 5% раствор сульфосалициловой кислоты (5 г сульфосалици-
ловой кислоты растворяют в 95 мл дистиллированной воды). 2. 0,05 М раствор
буры pl I 9,55 (19,1 г буры растворяют в 1 л дистиллированной воды). 3. 0 1 М
раствор однозамещенного фосфата калия (13.6 г КН2Р04 рас творяют в 1 л ди-
стиллированной воды). 4. 0,05 М боратный буфер pl I 8.2 (6,13 мл реактива №
2 добавляют 3,87 мл реактива № 3, а затем доводят реактивом 3 до pH 8,2) 5.
0,1% раствор бромфенолового синего в 0,05 М боратном буфере (100 мг су-
хого бромфенолового синего растворяют в 100 мл реактива № 4). 6. 1% вод-
ный раствор сафранина или 0.05% раствор основного фуксина. Последний го-
товят перед употреблением: растворяют 50 мг основного фуксина в 100 мл ки-
пящей дистиллированной воды.
Специальное, оборудование. 1. pH-Метр. 2. Весы. 3. Газовая или электри-
ческая плитка.
Ход определения. Фиксируют мазки в 5% растворе сульфосалициловой
кислоты в течение 60-90 с. Тщательно промывают дистиллированной водой и
высушивают. Окрашивают 0,1 % раствором бром фенолового синего в борат-
ном буфере (реактив № 5) в течение 1-2 мин. Промывают в трех сменах 0.05
М боратного буфера (реактив № 4) по 1-3 мин. Высушивают и докрашивают
1% раствором сафранина в течение 30-60 с или 0,05% раствором основного
фуксина в течение 1-2 с. Промывают проточной водопроводной водой и высу-
шивают. Катионный белок выявляется в цитоплазме клеток в виде синих гранул.
Нормальные величины. У здоровых в нейтрофилах обнаружено 123 + 1,5
ед. или СЦК 1,23 ± 0,015, при этом нс отмечено различий у здоровых обоего
пола. Протеинположительные нейтрофилы составляют у мужчин 83 + 1.4%, у
женщин 86 ± 0,6%.
Клиническое значение. Снижение катионного белка в нейтрофилах харак-
терно для острого воспалительного процесса; наблюдается в разгаре различ-
ных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии. Пери-
од выздоровления сопровождается нормализацией показателя. Изменения со-
держания лизосомального катионного белка коррелируют со степенью тяже-
сти заболевания.
Литература. Мазинг Ю.А., Староссльская И.Я. Лаб. дело, 1981, № 10,
с.582-584; Нагоев Б.С. Катионный белок лейкоцитов и его значение: Методи-
ческие указания,- Нальчик. 1982.-67 с.; Пигарсвский В.Е., Мазинг Ю.А. Лаб
дело, 1981, № 10, с.579-582: Шубич М.Г. Цитология. 1974. № 10, с.1321-1322.	I
липиды локализуются в цитоплазме клеток главным образом в мембра-
нах органелл и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных грануле
питах. Играют важную роль в проницаемости мембран. Цитохимическое ис-
следование основано на применении красящих веществ, растворяющихся в
жирах (судан III, судан IV. черный судан и др.). Для выявления нейтрального
жира пользуются Суданом III. окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липои-
ды выявляются лучше Суданом черным (черное окрашивание).
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
63
Окраска Суданом III (метод Гольдмана)
Принцип. Растворение жиров и окраска судаком III в оранжевый цвет.
Реактивы. I. Формалиновый спирт (1 часть формалина и 4 части 96%
спирта). 2. 70% этиловый спирт (к 100 мл 96% спирта прибавить 39,18 мл ди-
стиллированной воды). 3. сх-Нафтол. 4 Раствор Судана (к 100 мл 70% спирта
добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1,2 г а-нафтола и в избытке Судан
III. Раствор кипятят в течение 10 мин и фильтруют). 5. Краситель Романовско-
го-1 ймзы.
Специальное оборудование не требуется.
Ход определения. Мазки крови фиксируют в формалиновом спирте в тече-
ние 1-3 мин. Красят в растворе Судана III в течение 10 мин. Помещают в 70%
этиловый спирт на 1 мин. Докрашивают красителем Романовского-Гимзы или
гематоксилином в течение 5-10 мин. Промывают дистиллированной водой.
Липиды выявляются в виде оранжевых зерен.
Нормальные величины. В мазках периферической крови липиды содер-
жатся в цитоплазме нейтрофилов в виде обильной зернистости. Большинство
нейтрофилов (69-80%) у здоровых людей крася тся интенсивно (+++), 18-36%
дают окраску средней интенсивности (++) и 10% слабо окрашены (+). СЦК
липидов в нейтрофилах 2,65 + 0.033. В мазках кос тного мозга в миелобластах
обнаружено небольшое содержание липидов, в промиелоцитах их больше и по
мере созревания нейтрофилов содержание липидов увеличивается.
Клиническое значение. Повышение содержания липидов в нейтрофилах
наблюдается при острых лейкозах и обострении хронических лейкозов. При
острых лейкозах липиды в бластных клетках обнаружены у больных при мие-
лобластном и монобластном вариантах и не выявлены при лимфобластном
остром лейкозе. При недифференцированном остром лейкозе бластные клет-
ки лишь в небольшом количес тве (2.2±0.82%) содержат липиды. Уменьшение
липидов в нейтрофилах выявлено при ревматизме, воспалительных процессах.
Литература. Дж.Хсихоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия, М.,
1983.
ТЕСТ ВОССТАНОВЛЕНИЯ НИТРОСИНЕГО ТЕТРАЗОЛИЯ (11СТ-тест)
дает возможность судить о фагоцитарной и ме таболической функции грануло-
цитов по образованию в цитоплазме гранул фор мазан а.
Метод Парка с соавт. а модификации Ю-ИБажоры и соавт.
Принцип. Поглощение гранулоцитами нитросинего тетразолия и восстано-
вление его в формазан, выявляемый в виде гранул синего цвета.
Реактивы. 1. Гепарин (20-25 ЕД/мл). 2. 0,15М фосфатный буфер pH 7,2.
3. 0,2% раствор нитросинего тстразолия. 4. Изотонический раствор хлорида
натрия 5. Метанол. 6. 2% раствор метилового зеленого.
Специальное оборудование. 1. Термостат. 2 Полистироловые пластинки
(применяемые для РТГА).
Ход определения. В лунку пластинки вносят 0.025 мл раствора гепарина и
0,1 мл крови. 0,05 мл фосфатного буфера и 0,05 мл раствора тетразолия. Со-
64
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
дсржимос лунки перемешивают с помощью пипетки. Пластинку накрывают
фильтровальной бумагой, смоченной изотоническим раствором хлорида на-
трия и стеклянной пластинкой соответствующих размеров. Для создания
влажной камеры стеклянную пластинку прижимают с помощью пружинных
зажимов. Инкубируют в термостате при 37°С в течение 15 мин, затем при ком-
натной температуре в течение 15 мин. После каждого этапа инкубации смесь
перемешивают пастеровской пипеткой (продувая воздух). Готовят мазки, вы-
сушивают, фиксируют метанолом и докрашивают метиловым зеленым.
Нормальные, величины. У здоровых лиц гранулы формазана обнаружива-
ют в 7,2 ± 1.2% нейтрофилов,
Метой Стюарта и соавт. в модификации Б. С. Нагоева
Принцип см. Метой Парка.
Реактивы. I. Гепарин -10 ЕД в 1 мл 0.9% раствора хлорида натрия. 2. 0,1%
водный раствор нитросинего гетразолия. 3. 50% раствор формалина в 0,9%
растворе хлорида натрия. 4. 3,4% раствор хлорида натрия. 5. 4% формалино-
во-спиртовой раствор. 6. 0,5% раствор сафранина в 0,9% растворе хлорида
натрия.
Специальное оборудование. I Центрифуга. 2. Термостат или водяная баня
на 37°С.
Ход определении. Смешивают 0.1 мл крови из пальца с 0,1 мл раствора ге-
парина. Добавляют 0,1 мл раствора нитросинего тетразолия. Инкубируют
смесь на водяной бане (или в термостате) при 37°С в течение 10 мин. Фикси-
руют смесь в растворе формалина 3 мин. Добавляют 3 мл дистиллирован ной
водь] на 20 с (для лизиса эритроцитов). Добавляют 1 мл 3,4% раствора хлори-
да натрия (для восстановления изотонии) и оставляют при комнатной темпе-
ратуре на 10 мин. Центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Удаляют пастеров-
ской пипеткой надосадочную жидкость, из осадка готовят мазки. Фиксируют
мазки в формалиново-спиртовом растворе 30 с и докрашивают сафранином.
Нормальные величины.У здоровых людей положительный НСТ-тест вы-
явлен в 9.34 ± 0.4% нейтрофилов. СЦК составляет 13.3 ± 0.6.
Клиническое значение. НСТ-тест повышен при острых бактериальных
инфекциях, обострении и генерализации очаговых воспалительных процессов,
туберкулезе легких, хронических гепатитах, аллергических заболеваниях, по-
сле вакцинации, ревматизме.
Литература. А.Н.Маянский. О.И.Пикуза. Клинические аспекты фагоци-
тоза. К., 1993.
ТРОМБОЦИТЫ
Тромбоциты - безъядерные клетки, размером от 1 до 5 мкм, являются
фрагментами цитоплазмы мегакариоцитов, имеют гиаломер и грануломср. Ги-
аломер тромбоцитов ограничен трехслойной мембраной, играющей большую
роль в процессах адгезии и агрегации тромбоцитов. В гранулах содержатся
фосфолипиды, АТФ, серотонин, ферменты, фибронектин, гистамин, катион-
ные белки, фактор, активирующий фибробласты, трансформирующий росто-
вой фактор. Популяция 'тромбоцитов неоднородна. В ней различают зрелые
Я/0 ЮНИМЕД 129301 Москва, ул. Касаткина, 3
Тел.: (095) 187 3978, 283-9781, 187-6209, 187-3184 Факс: (095) 187-3840
Internet: www.glasnetoru/'’unimed e-mail: unimed@glasnet.ru
Медоник СА530 - это новая инженерная концепция построения гемато-
логических автоанализа горов которая позволила создать прибор с пре-
восходными техническими характеристиками и уникально низкой ценой
* Гематологические автоанализаторы Медоник СА530 выпускаются
в двух исполнениях: модель «MIMER» позволяет определять 9
показателей; модель «ODEN» - 16 показателей.
6 Время исследования одной пробы крови - 60 сек.
Производительность - 50 проб крови в час.
* Требуемый объем крови - 20 мкл (режим предилюции), 125 мкл
(измерение из цельной крови). Обе модели анализатора измеряют
три 1истограммы распределения клеток по объему (кривые Прайс-
Джонса).
* Совершенная конструкция анализатора СА530 позволяет эксплу-
атировать прибор в суровых условиях российских лабораторий и
при этом практически не требуется инженерное обслуживание.
4 Новый метод автоматической очистки датчика кардинально решил
проблему засорения и позволил отказаться от дорогостоящего
промывающего раствора.
4 Реагенты A/О Юнимед для анализатора Медоник СА530 - это
гарантия что у Вас никогда не будет проблем с реагентами (срок
поставки реагентов 2 недели со дня оплаты).
МВДОНИК СА530 - ЭТО ЛУЧШЕЕ РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ
АВТОМАТИЗАЦИИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛВДОВАНИЙ
В ВАШЕЙ ЛАБОРАТОРИИ

Иммунофенотипирование опухолей
 Л I J \ Диагностика лимфом , лейкемий
[ П I I  ДНК/РНК анализ
I Ж *	* И ндекс костного мозга
Определение иммунных комплексов
Полный спектр продукции для
ПРОТОЧНОЙ Цитометрии
•	Моно-, поликлональные антитела
•	М I ( , гЬ hi { < \Л . м г а
Двух- й трехцветные реаген гы
Контроли для всех комбинаций
флюоресцентных красителей
Калибраторы
DAKO Uti-Lyse

Ф для полно1 о и мягко о лизиса
эритроцитов в образцах цельной
крови или костного мозга
• набор реагентов для определения цитоплазматических маркеров
методом Проточной L (итометрии. Позволяет одновременно
работать с антителами к поверхностным и внутриклеточным антигенам.
Система для гомогенизации солидных
тканей и опухолей для последующего
цитометрического анализа
DAKO Medimachine System
Различный биологический материал:
свежая ткань, замороженный материал,
образны в парафиновых блоках
Полноценное выделение клеток и ядер
•	Экстракция ДНК
•	Безопасная работа с инфекционным
•материалом

АО "ФинБио" Санкт-Петербург, 197376,
ул. просЬ. Попова, д.23
Tei. (812) 327-53-27 Факс (812) 327-53-23
Филиал в Москве: Тел. (095) 214 95-50
ФинБио
•механические и электронные дозаторы,
• расходные материалы из пластика,
•приборы для ИФА,
• диагностические реагенты,
• ламинарные и вытяжные шкафы,
•ультразвуковые мойки,
• лабораторная мебель
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
65
тромбоциты ( 87.0+0.19%). юные (3.2±0ЛЗ%), старые (4,5+0,21%) и формы
раздражения (2,5±0.1%). Время циркуляции тромбоцитов 10-12 суток. Разру-
шение тромбоцитов происходит в селезенке. Тромбоциты выполняют ангио-
трофическую, адгезивно-агрегационную функции, играют ключевую роль в
гемостазе, обеспечивают ретракцию кровяного сгустка, переносят на своей
поверхности циркулирующие иммунные комплексы, участвуют в патогенезе
атеросклероза, способны поддерживать спазм сосудов.
Подсчет количества тромбоцитов
В практике ври подсчете тромбоцитов используют методы, основанные на
двух принципах: 1) непосредственный подсчет в крови (с помощью счетной ка-
меры или счетчика) и 2) подсчет в мазках крови на определенное количество
эритроцитов с пересчетом на 1 мкл или 1 л с учетом общего количества эрит-
роцитов в крови. Каждая группа методов имеет преимущества и недостатки.
Существенным преимуществом первой группы методов является их большая
точность. Непосредственный подсчет тромбоцитов в крови удобен еще и пото-
му. что не требует для расчета сведений о количестве эритроцитов, но подсчет
в камере более грудоемкий, поскольку тромбоциты в нативном виде предста-
влены мелкими и плохо кон грае гированны ми элементами. Недостатком этих
методов являе тся необходимость подсчета тромбоци тов в ближайшие часы по-
сле взя тия крови. Подсчет тромбоцитов в мазках крови значительно уступает
по своей точности методам непосредственного подсчета в камере или с помо-
щью счетчиков и автоматов. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть
обусловлены несколькими причинами: плохое качество мазка и связанное с
jthm неравномерное распределение тромбоцитов, неточный подсчет эритро-
цитов в крови. Сущеетвенное неудобство метода - необходимость одновремен-
ного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови. Преимущество его - воз-
можность подсче та тромбоци тов в любое время независимо от момента взятия
крови В качестве унифицированных были утверждены два метода, основан-
ных на обоих принципах.
Метод подсчета в камере
Принцип. Подсчет тромбоцитов в 1 мкл (или 1 л) с учетом разведения кро-
ви и объема квадра та счетной сетки с применением фазово-контрастного уст-
ройства для контрастирования тромбоцитов.
Реактивы. Применяют реактив 1 или 2. 1. Кокаина гидрохлорид - 3 г, на-
трия хлорид - 0,25 г, фурацилин 0.025 г, дистиллированная вода - 100 мл.
2. 1% раствор оксалата аммония Рас твор кипятят и филь труют. Хранят в хо
лодильнике. Сравнительный анализ разных разводящих жидкостей позволил
считать лучшим 1% раствор оксалата аммония, гак как он дает быстрый и
полный лизис эритроцитов.
Специальное оборудование. 1. Микроскоп 2. Фазово контрастное устрой-
ство. 3. (‘четная камера Горяева. 4. Осветитель к микроскопу (ОН -7. ОИ 48)
Ход определения Разводя г исследуемую кровь в 200 раз; для этого в cyxvjo
пробирку набирают 4 мл реактива 1 или 2 и 0.02 мл крови. Перемешиваю'! и
оставляют на 25-30 мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают счетную
камеру (см. подсчет лейкоцитов). Перемешивают разведенную кровь и запоя
няют камеру; подносят каплю се с помощью стеклянной палочки или пасте-
66 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ровской пипетки к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равно-
мерно без пузырьков воздуха заполняла всю поверхность сетки, не затекая в
бороздки. Помещают счетную камеру во влажную камеру на 5 мин для оседа-
ния тромбоцитов (чашка Петри с уложенной по краям смоченной водой
фильтровальной бумагой). Подготавливают фазово-контрастное устройство в
соответствии с инструкцией, приложенной к нему. Производят подсчет тром-
боцитов в 25 больших квадратах.
Тромбоциты выглядят в счетной камере в виде мелких, хорошо преломля-
ющих свет образований.
Расчет числа тромбоцитов проводят, исходя из разведения крови (200), чис-
ла сосчитанных квадратов (25) и объема одного большого квадрата (1/250
мкл, так как сторона квадрата 1/5 мм, высота 1/10 мм).
а х 250 х 200
X =-------------- = а х 2000,
25
X - число тромбоцитов в 1 мкл крови; а - число тромбоцитов, сосчитанных
в 25 больших квадратах. Практически число сосчитанных тромбоцитов умно-
жают на 2000.
Воспроизводимость. По данным Т. А. Одесской и соавт., ошибка метода
составляет 6,5%.
Метод подсчета в мазках крови (по Фонио)
Принцип. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных
мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исхо-
дя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.
Реактивы. Применяют реактив 1 или 2. 14% раствор сульфата магния. 2.
6% раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).
Специальное оборудование. Не требуется.
Ход определения. Смешивают кровь с реактивом 1 или 2, для этого взятый
капилляром Панченкова реактив до метки 75 вносят в пробирку, затем доба-
вляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки ”О . Содержимое пробир-
ки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Рома-
новскому - Гимзе в течение 2-3 ч (при использовании реактива 1) и в течение
30-45 мин (при использовании реактива 2). Высохшие мазки микроскопируют
с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких
местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолированно).
Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения микроско-
па считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор.
пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов. Для удобства счета и большей
точности следует пользоваться специальным окуляром с уменьшенным полем
зрения: при отсутствии окуляра можно уменьшить поле зрения простым приемом.
Расчет: количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А°/оо.
Зная число эритроцитов в 1 мкл (в 1 л) крови, легко подсчитать количество
тромбоцитов в 1 мкл крови (в 1 л).
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 67
Например. А=60°/о«; число эритроцитов 5()(ХМ)ОО в 1 мкл (5 х 107м к л или 5
х 10,2/л).
Составляют пропорцию:	60	-	1000:
X -	5 000 000, откуда
60 х 5 х 1000000
X-----------------= 300 X 1000 мкл (300 х 107мкл или 300 х 107л)
1000
Нормальные величины. Поданным В. В.Соколова и И А.Грибовой, количе-
ство тромбоцитов у здоровых людей составляет 180 х 10ч - 320 х 107л.
Клиническое значение. Снижение количества тромбоцитов в крови - тром-
боцитопения - может развиваться в результате снижения продукции тромбо-
цитов (опухолевые заболевания - острые лейкозы, миелодиспластичсский син-
дром, миелофиброз, метастазы рака в костный мозг; мегалобластные анемии,
ночная пароксизмальная гемоглобинурия, после вирусных инфекции, интокси-
кации, наследственные аномалии); в результате повышения деструкции тром-
боцитов (идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, системная красная
волчанка, хронический лимфолейкоз. хронический активный гепатит, по-
сттрансфузионная тромбоцитопения); разрушение в селезенке (гиперспле-
низм при болезнях накопления, лимфомах, волосатоклеточном лейкозе, мие-
лопролиферативных заболеваниях, портальной гипертензии): в результате по-
требления.
Повышение количества тромбоцитов в крови -тромбоцитоз - характерно
для миелопролиферативных заболеваний, наблюдается при злокачественных
новообразованиях, после операций, при воспалительных заболеваниях (ост-
рый ревматизм, ревматоидный артрит, туберкулез, остеомиелит), после спле-
нэктомии.
Литература. Соколов В.В., Грибова И.А, Гематологические показатели
здорового человека.- М.: Медицина, 1972 - 104 с. Исследование системы кро-
ви в клинической практике Под ред. Г.И.Козинца, В.А.Макарова. М., 1997.
ИЗМЕНЕНИЯ КРОВИ ПРИ ЛЕЙКОЗАХ
Исследование крови имеет особенно важное диагностическое значение в
диагностике гемобластозов. При появлении лихорадки неясного генеза, гемор-
рагического синдрома, увеличении печени, селезенки, лимфатических узлов,
кожных поражений, слабости, боли в костях необходимо проведение общего
клинического анализа крови.
Показатели красной крови. Нормохромная и нормоцитарная анемия - ча-
стый лабораторный симптом острых лейкозов При выраженном геморраги-
ческом синдроме развивается гипохромная микроцитарная анемия. Появление
в периферической крови иормобластов наблюдается при эритромиелозе. При
хронических лейкозах анемия развивается в хронической стадии, а в начале
заболевания показатели красной крови обычно не изменены. Эритроцитоз яв-
ляется ранним и основным лабораторным симптомом истинной полицитемии
(эритремии), который сопровождается повышением содержания гемоглобина,
гематокрита и вязкости крови. Умеренный эритроцитоз может быть в начале
доброкачественного сублейкемического миелоза (первичного или идиопаги-
68
Лом И - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ческого миелофиброза), который затем снижается до нормальных цифр, а в
терминальной стадии развивается анемия.
При лимфопролиферативных заболеваниях в начальной стадии показатели
красной крови не изменены, по мере прогрессирования процесса развивается
анемия, которая носит нормохромный, нормоцитарный или макроцитарный
характер, с небольшим повышением числа ретикулоцитов, иногда умеренным
нормобластозом. При хроническом лимфолейкозе у 15-20% больных заболе-
вание может сопровождаться аутоиммунной гемолитической анемией. В этих
случаях выявляется высокий рстикулоцитоз, появление нормобластов в маз-
ках периферической крови.
Лейкоциты и лейкоцитарная формула. Общее количество лейкоцитов в
крови резко изменяется при лейкозах. Особенно выраженные изменения в ви-
де гиперлейкоцитоза (>100 х 107л) наблюдаются при хроническом миелолей-
козе, хроническом лимфолейкозе, реже при остром лейкозе. Умеренный лей-
коцитоз может быть при миелопролиферативных заболеваниях, остром лейко-
зе, хроническом моноцитарном лейкозе. При парапротеинемичсских гемобла-
стозах чаще число лейкоцитов в крови нормальное, но может быть и лейкопе-
ния. Изменения числа лейкоцитов при острых лейкозах весьма варьируют; на-
ряду с нормальным количеством может наблюдаться лейкопения и умеренный
лейкоцитоз. Наибольшее значение и лабораторной диагностике лейкозов име-
ет исследование лейкоцитарной формулы. Важнейший признак острых лейко-
зов появление в мазках крови бластных клеток - бластемия. Количество бла-
стных клеток может варьировать от единичных (5-10%) до значительного
числа (70-80%). Соответственно резко сокращается число зрелых гранулоци-
тов. Количество незрелых гранулоцитов чаще небольшое или они вовсе отсут-
ствуют. К последним случаям применим термин «hiatus leukemicus».
Значительно реже встречается так называемый алейкемический вариант
острых лейкозов, когда в периферической крови бластные клетки отсутству-
ют: Диагноз в этих случаях может быть установлен после исследования пунк-
тата костного мозга. Во всех случаях панцитопенической картины крови необ-
ходимо проведение стернальной пункции.
Помимо количественных сдвигов лейкоцитарной формулы, важное диагно-
стическое значение имеет изменение морфологических особенностей клеток.
При разных формах острых лейкозов морфология бластных клеток различна.
При остром мие л областном и миеломон областном лейкозе ядра клеток круг-
лые, иногда неправильной формы, в цитоплазме содержат азурофильную зер-
нистость и нередко тельца (палочки) Ауэра. При остром промислоцйтарном
лейкозе отмечается выраженный полиморфизм бластных клеток, характерна
крупная фиолетовая зернистость, обильно заполняющая цитоплазму клеток,
часто встречаются пучки палочек Ауэра. При остром монобластном лейкозе
бластные клетки крупные с бобовидным ядром и скудной мелкой зернисто-
стью в цитоплазме. При остром лимфобластном лейкозе бласты меньших раз-
меров. ядро округлое с 1-2 нуклеолами, цитоплазма обычно не содержит зер
нистости Морфологические черты бласт ных клеток не всегда надежны для
дифференциации различных форм острых лейкозов, в связи с чем установле-
ние варианта острого лейкоза требует проведения цитохимических исследова-
ний Для практических целей может быть достаточным небольшой набор ци-
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
69
тохимических реакций (PAS - реакция, исследование активности миелоперок-
сидазы, липидов, неспецифической эстеразы, кислой фосфатазы). В 1976 г.
группа французских, американских и английских гематологов (ФАБ-группа)
разработала классификацию острых лейкозов и миелодиспластического син-
дрома, основанную на морфологических и цитохимических признаках бласт-
ных клеток и их количестве в костном мозге, последний пересмотр ее произ-
веден в 1985 г. (табл. 8. 9). Морфологическая ФАБ классификация острого
лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) учитывает размер бластных клеток, особен-
ности структуры ядерного хроматина, степень базофилии и наличие вакуоли-
зации в цитоплазме. Согласно этим признакам выделяют LI. L2, L3 варианты
ОЛЛ. При наличии в костном мозге менее 30% бластов устанавливается ди-
агноз миелодиспластического синдрома (малопроцентный лейкоз). Следует
отметить, что ФАБ классификация ОЛЛ имеет меньшее прогностическое зна-
чение, чем существующая иммунологическая классификация ОЛЛ (табл. 10).
Таблица 8
ФАБ классификация миелодиспластического синдрома
Вариант	Процент бласгов в крови	Процент бластов в костном мозге	Процент кольцевидных сидеробластов	Содерж. моноцитов в крови (107л)
Рефрактерная анемия (РА)	< 1	<5	<15	< 1
РА с кольце- видными сидеробластами	< 1	< 5	> 15	< 1
РА с избытком бластов	<5	5- 20	варьирует	<1
РА с избытком бластов в трансформации	> 5	21-30	варьирует	<1
Хронический миеломоноцитарный лейкоз	< 5		5-20	варьирует	> 1
Таблица 9
	ФАБ-	классификация острых нелимфобластных (миелоидных ) лейкозов				
Вариант лейкоза	Морфологические признаки форма ядра	включения в цитоплазме		Цитохимические признаки Иммунологи- миелограмма	МПО PaS	НЭ (NaF) чес кие и/или	маркеры липиды			Цитогене тические маркеры
МО Низкодиффе- ренцированный миелобластный	округлая	-	не отражено в классифи- кации	диффузная	не	CD34, CD33, подавля- CD13(± ется	t (9:22)
Ml Острый миелобластный лейкоз без созревания	округлая	-	бласты> 90% НЭК, созревающие	+ гранулоциты и моноциты <10%	диффузная	не	CD34,CD33, подавля- CD 13, ется	HLA-DR	t (9;22)
М2 Острый миелобластный лейкоз с созреванием	округлая	азурофильная зернистость, палочки Ауэра	бласты -	++ 30-89 % НЭК, созревающие гранулоциты > 10%, моноциты < 20%	диффузная	не	CD15.CD11, подавля- CD13, CD33, ется HLA-DR	t (8:21)
М3 Острый промиелоцита- рный лейкоз	скрученная, выраженный полиморфизм	гиперграну- лярность, пучки палочек Ауэра	преобладают	+++ атипичные промиелоциты	диффузная	не	CD11,CD13, подавля- CD33 ется	1(15:17)
M3v Острый промиелоцитар- ный, гипограну лярный вариант	скрученная, выраженный полиморфизм	скудное коли- чество азуро- фильных гранул	преобладают	+++ атипичные промиелоциты	диффузная	не	CD13, подавля- CD33 ется	i (15;17)
М4 Острый миеломонобла- стный лейкоз	округлая и моноцитоидная	пылевидная азурофильная зернистость	бласты >30%НЭК, + диффузная/ созревающие	диф.-гранул. гранулоциты >20%, моноциты >20%, в п/кр.- моноцитарный компонент > 5x109/л		подав- CD11,CD15, ляется CD33, CD13, NaF CD14. HLA-DR	del (llq), t(9;11)
М5а Острый монобластный без созревания М5Ь Острый монобластный с созреванием	округлая и бобовидная моноцитоидная	пылевидная азурофильная зернистость	бласты >30%НЭК, +/- диф./ моноц. комп. >80%, диф./гран. монобласты >80% МК бласты £30%НЭК, +/- диф./ моноц. комп. >80%, диф./гран. монобласты >80%МК	подав- CD15, ляется CD33,CD13, CD14, HLA-DR подав- CD15, ляется CD33, CD13, NaF CD14	del (1 lq), del (1 lq)
Мб Острый эритромиелоз	округлая	могут быть азурофильные гранулы	бласты >30%НЭК, +/- бласты -диф. нс Gly А эритрокариоциты	нормобл.» подавля- >50%, дизэритропоэз	гран.	ется NaF		7
М7 Острый мегакариобла- стный лейкоз	округлая, гиперхромные	резкая базофилия цитоплазмы	бласты >30%НЭК - диф.	не	CDW4L подавля- CDW42b, ется NaF CD61	7 
Примечание', НЭК - неэритроидные клетки, МПО - миелопероксидаза, НЭ - неспецифическая эстераза. PAS - гликоген
Таблица 10
Иммунологический фенотип острого лимфобластного лейкоза ; экспрессия дифференцировочных маркеров
Вариант ОЛТ	Антигены
В-клеточный	HLA-DR	TdT	CD10	CD19	CD20	CD22	с1в	sig
Ранний пре-В-ОЛЛ	+	+	-	+	-	-	-	ж
Пре-В-ОЛЛ	+	+	+*	+	+		+*	V
Промежуточный В-ОЛЛ	+	+		+	+	+	+	+П1
Зрелый В-ОЛЛ	+	_*	-	+	+		-	+
1 -клеточный	CD7	CD2	CD5	CD1	CD4	CD8	CD3	
Ранний Т-ОЛЛ	+	+	+		-	-	-	
Промежуточный Т-ОЛЛ	+	+	+	+		4-/-	-	
Зрелый Т-ОЛЛ	+	4-	+		+	+	+	
Примечание. TdT терминальная дезокси нуклеотид ил трансфераза, cig - цитоплазматический иммуноглобулин, sig - поверхностный
иммуноглобулин. Звездочкой отмечены антигены, значение которых принципиально в дифференциации вариантов ОЛЛ
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
72
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Для миелодиспласти чес кого синдрома характерно присутствие выражен-
ных признаков дизгемопоэза (табл.И).
Таблица 11
Признаки миелодисплазии при миелодиспластическом синдроме
Признаки дизгемопоэза Костный мозг и/или периферическая кровь
Дизэритропоэз	Костный мозг: многоядерность кариорексис метал областоидность кольцевидные сидеробласты межьядерные мостики асинхронизм созревания ядра и цитоплазмы Периферическая кровь: анизоцитоз пойкилоцитоз нормобласты
Дизгранулопоэз	Изменения ядер нейтрофилов: гиперсегментация гипосегментация кольцевидные ядра отсутствие или снижение числа гранул в цитоплазме
Дизмсгакариопоэз	Микромегакариоциты: одноядерные формы множество мелких ядер
Для миелопролиферативных заболеваний ( хронический миелолейкоз, иди-
опатический миелофиброз, истинная полицитемия) характерно наличие боль-
шого числа гранулоцитов (до 80-90%) в мазках крови при уменьшении лимфо-
цитарных и моноцитарных элементов. При хроническом миелолейкозе в лей-
коцитарной формуле находят все переходные формы от бластных клеток до
зрелых нейтрофилов. Часто отмечают увеличение числа эозинофилов и базо-
филов. В развернутой кл ин ико-гематологической стадии хронического миело
лейкоза обнаруживают следующую лейкоцитарную формулу: миелоблаегы 1-
3%, промиелоциты 3-8%, нейтрофильные миелоциты 5-10%, нейгрофильные
метамиелоциты 10-15%, нейтрофильные палочкоядерные 12-15%. нейтро-
фильные сегментоядерныс 25-35%, эозинофилы незрелые 1-3%. эозинофилы
зрелые 2-6%, базофилы 1-3%. лимфоциты 5-10%. моноци гы 2-3%. Про! но-
стически неблагоприятным признаком является увеличение миелоцитов . ба-
зофилов, эозинофилов, бластных клеток, моноцитов и уменьшение зрелых
нейтрофилов. В герминальной стадии заболевания (бластный криз) резко уве-
личивается число бластных клеток, цитохимическая характеристика которых
может различна. При эритремии отмечается нейтрофилсз обычно с палочко-
ядерным сдвигом. Картина крови при идиопатическом миелофиброзе характе
ризуется сдвигом влево в лейкоцитарной формуле до миелоцитов
Хронический лимфолейкоз имеет типичные изменения лейкоцитарной
формулы в виде выраженного лимфоцитоза, достиг ающего 80-90%. При этом
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 73
лимфобласты не превышают 0,5-2%. пролимфоциты - 3-5%. Остальные лим-
фоидные элементы представлены зрелыми лимфоцитами. Число зрелых ней-
трофилов резко уменьшено (8-15%), незрелые гранулоциты, как правило, от-
сутствуют или единичные (0,5-1%). Характерным морфологическим призна-
ком является наличие в мазках крови теней Боткина-Гумпрехта (клетки цито-
лиза). Лейкемические лимфоциты нередко морфологически не отличаются от
нормальных, обычно узкоплазменные, иногда голоядерные формы, реже с би-
полярно вытянутой цитоплазмой. Значительный полиморфизм клеток выяв-
ляется при волосатоклеточном лейкозе, когда цитоплазма клетки имеет не-
ровный отросчатый или фестончатый контур. Лейкемическая стадия грибо-
видного микоза ( синдром Сезари) характеризуется появлением в перифериче-
ской крови крупных клеток с мозговидной, складчатой структурой ядра, гру-
бым распределением хроматина, умеренной цитоплазмой базофильного или
слабо базофильного цвета. По своему иммунологическому фенотипу клетки
относят к CD4+ (Т-хелперы).
При плазмоцитоме и макроглобулинемии Вальдснстрема изменения лейко-
цитарной формулы не столь постоянны, как при хроническом лимфолейкозе.
Они могуч’ либо отсутствовать, либо характеризоваться умеренным лимфоци-
тозом. моноцитрзом. При плазмоцитоме в мазках крови может быть неболь-
шое количество плазматических клеток, значительное увеличение их наблю-
дается при трансформации миеломы в острый плазмобластный лейкоз, что на-
блюдается редко. Хронический моноцитарный лейкоз отличается значитель-
ным моноцитозом. в лейкоцитарной формуле могут быть единичные монобла-
сты и прЬмоноци гы.
Тромбоциты Тромбоцитопения наблюдается обычно при острых лейко-
зах, в развернутой, терминальной с тадиях хронических лейкозов. При миело-
пролиферативных заболеваниях в начальной стадии часто встречается тром-
боцитоз. М.С.Дульцин отметил этот симптом у 75% больных в начальной ста-
дии хронического миелолейкоза. Тромбоцитоз, иногда значительный, являет-
ся постоянным симптомом эритремии
Скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Небольшое увеличение СОЭ
может быть при острых и хронических лейкозах, хотя это далеко не обязатель-
ный гематологический признак При выраженной интоксикации СОЭ увели-
чена, при гнойно-воспалительных осложнениях резко увеличена. Характерно
резкое увеличение СОЭ (50-70 мм/ч) при парапротеинемических гемобласто-
зах. Этим симптомом часто манифестирует заболевание и требует обследова-
ния больных для исключения миеломной болезни, болезни Вальденстрема.
Литература. Руководство по гематологии под ред. А.И.Воробьева М..
1985. Морозова В.Т. Лабораторная диагностика лейкозов,- Л.: Медицина, 1977.
КОСТНЫЙ мозг
Исследование костного мозга проводят с диагностической целью для под-
тверждения или установления диагноза, главным образом различных форм ге-
мобластозов и анемий. Диагностическое значение имеет исследование костно-
го мозга при поражении его лимфогранулематозом, туберкулезом, болезнью
Гоше, I Ьиманна-Пика, метастазами рака Широко проводят исследование кост-
ного мозга при острых лейкозах с прогностической целью, для контроля за
74
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
терапией.
Для исследования костного мозга производят пункцию грудины или под-
вздошной кости с последующим цитологическим анализом мазков пунктата, а
также трепанобиопсию подвздошной кости с последующим гистологическим
исследованием срезов костного мозга.
Пункция костного мозга
Пункцию грудины или подвздошной кости проводят в процедурном кабине-
те с соблюдением правил асептики. Техника пункции подробно описана. Для
проведения качественного исследования необходимо обратить внимание на
тщательное обезвоживание иглы Кассирского и шприца, так как примесь во-
ды повреждает клеточные элементы. Учитывая быструю свертываемость со-
держимого пунктата, необходимо его по получении тотчас развести (для под-
счета кариоцитов) и быстро приготовить мазки. Дальнейшую обработку маз-
ков пунктата производят так же. как и мазков крови. При необходимости клет-
ки костномозгового пунктата могут быть окрашены цитохимическими методами
Подсчет миелокариоцитов
Принцип. Разведение пунктата. подсчет клеток в счетной камере в опреде-
ленном количестве квадратов с последующим пересчетом на 1 мкл пунктата.
Реактивы. 3-5% раствор уксусной кислоты.
Специальное оборудование. 1. Счетная камера Горяева. 2. Микроскоп.
Ход определения. Пунктат костного мозга разводят в 200 раз, для чего в
пробирку с 4 мл слабого раствора уксусной кислоты вносят пипеткой 20 мкл
пунктата (в таком виде пробирка должна быть для дальнейшего исследования
доставлена в лабораторию). Содержимое пробирки тщательно перемешива-
ют и заполняют счетную камеру. После оседания форменных элементов (че-
рез 1-2 мин) подсчитывают миелокариоциты, т. е. все ядерные элементы в 100
больших квадратах (аналогично подсчету числа лейкоцитов в крови).
Рассчитывают количество миелокариоцитов на 1 мкл пунктата по следую-
щей формуле:
п х 200 х 250
X =--------------- п х 500.
100
где X - число миелокариоцитов в 1 мкл пунктата; п - количество мислока-
риоцитов в 100 больших квадратах; 200 - разведение; 250 - множитель для при-
ведения к 1 мкл, так как объем одного большого квадрата равен 1/250 мкл.
Практически число подсчитанных в 100 больших квадратах миелокариоцитов
умножают на 500.
Нормальные величины. Количество миелокариоцитов колеблется в широ-
ких пределах (41600 -195 000; отклонения 1,5 S) и в большой степени зависит
от разведения пунктата кровью.
Клиническое значение. Количество миелокариоцитов дает ориентировоч-
ное представление о клеточности костного мозга. Увеличение количества ми-
елокариоцитов характерно главным образом для миелопролиферативных за-
болеваний, особенно выражено оно при хроническом миелолейкозе. Умерен-
ное увеличение наблюдается после кровопотери, при гемолитических анеми-
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
75
ях Уменьшение количества ядерных клеток свидетельствует об аплазии кро-
ветворения, может быть при агранулоцитозе, после лучевой и цитостатиче-
ской терапии.
Литература. Руководство по гематологии под ред. А.И.Воробьева М=. 1985.
Подсчет мегакариоцитов
Количество мегакариоцитов можно оценить ориентировочно, просмачри-
вая под малым увеличением микроскопа мазки пунктата костного мозга или
срезы чрепаната костного мозга, или подсчитывать число клеток в счетной камере.
Подсчет в счетной камере
Принцип. Разведение пунктата и подсчет гигантских клеток костного моз-
га в счетной камере в определенном количестве квадратов с последующим пе-
ресчетом на 1 мкл пунктата.
Реактивы. 3-5% раствор уксусной кислоты.
Специальное оборудование. 1. Счетная камера Фукса-Розенталя. 2. Микроскоп.
Ход определения. Разводят пунктат костного мозга в 20 раз, для этого
предварительно вносят’ в пробирку 0,4 мл раствора уксусной кислоты и затем
0,02 мл пунктата (в таком виде пробирку доставляют в лабораторию).
Подсчет мегакариоцитов (гигантских клеток) производят во всей сетке;
при окончательном расчете на 1 мкл пунктата умножают на разведение пунк-
тата (20) и деля г на объем камеры (3,2).
Нормальные величины. У здоровых взрослых людей количество мегакари-
оцитов составляет 63±10 или 83± 13,86 в 1 мкл пунктата. У детей в возрасте
5 мес - 3,5 года количество мегакариоцитов выше, чем у взрослых (116±10,8 в
1 мкл пунктата).
Клиническое значение. Увеличение количества мегакариоцитов является
ранним симптомом хронических лейкозов миелопролиферативной природы,
особенно эритремии. Мегакариоцитоз костного мозга характерен также для
геморрагической тромбоците ми и, может наблюдаться после кровопотери, при
раке, циррозах печени с гиперспленизмом, тромбоцитопенической пурпуре,
некоторых вариантах мислодиспластического синдрома. Уменьшение числа
мегакариоцитов характерно для острых лейкозов, лимфопролиферативных за-
болеваний и особенно в резкой степени - при апластических анемиях.
Литература. Руководство по гематологии под ред. А.И.Воробьева М.,
1985.
Морфологическое исследование форменных элементов с подсчетом
миелограммы
Проведению морфологического исследования пунктата костного мозга
должны предшествовать подготовка предметных стекол, приготовление и ок-
раска препаратов аналогично приготовлению и окраске препаратов перифе-
рической крови.
В табл. 12,13,14 приведены характеристики и основные морфологические
признаки лейкоцитов, незрелых миеломоноцитарных элементов и их пред-
шественников, незрелых лимфоидных элементов и их предшественников.
______________________________Морфологические характеристики лейкоцитов
Таблица 12
Вид клетки	Размер (мкм)	Положение	ЯДРО Форма Цвет Хроматин	Нуклеолы		Ц и т Цвет	о п л а з м а Перинукле- Гранулы	
						арная;	юна
ГРАНУЛОЦИТЫ Миелобласт	15-20		Эксцентрично или в центре	Круглая Светло- Нежный или	фиолет. мелко- овальная	сетчатый	2-5	Синий	Нет	Нет
Промиелоцит	18-25	Эксцентрично или в центре	Круглая Светло- Мелкосетчатый, или	фиолет, иногда с утол* овальная	щенными нитями	2-5	Синий	Нет	Первичные эозино- фильные или базофильные
Миелоцит	12-18	Эксцентрично	Круглое, Фиолет. Глыбчатый овальное или с вдавлением	Редко	Голубо- вато- розовый	Нет	Нейтрофильные, эозинофильные или базофильные
Мета миелоцит	10-16	Эксцентрично	Подково- Фиолет Неравномерный, образное,	глыбчатый бобовидное	Нет	Розовый	Нет	Нейтрофильные, эозинофильные или базофильные
Палочкоядер- ный нейтрофил	10-16	Центральное	Узкое, Темно- Неравномерная вытяну- фиолет. крупноглыбчатая тое в виде палочки	Нет	Розовый	Нет	Нейтрофильные, эозинофильные или базофильные
Сегментоядерный 10-15 нейтрофил		Центральное	Узкое, Темно- Неравномерный состоит фиолет. крупноглыбчатый из 3-5 сегментов	Нет 9	Светло- розовый	Нет	Нежные, розовые, фиолетово-розовые
Эозинофил	10 15	Центральное	2-3	Фиолет. Неравномерный сегмента	крупноглыбчатый	Нет	Розовый Нет		Много, крупные, грубые, одинаковые по размеру и форме, оранжевые
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Таблица 12 (продолжение)
Вид клетки	Размер (мкм)	Положение	ЯДРО Форма Цвет Хроматин	Нук леолы		Ц и т Цвет	о п л Перинукле арная зона	а з м а Гранулы
Базофил	10-15	Центральное	2-3	Фиолет. Грубый, сегмента	закрытый гранулами	Нет	Светло- розовый	Нет	Большие, грубые, неодинаковые по размеру и форме, синевато-черные
ЛИМФОЦИТЫ Лимфобласт	12-20	Центральное	Круглая Светло- Нежный, или	фиолет. мелкозернистый овальная	1-2	Светло- синий, узкая	И меется	Нет
Пролимфоцит	10-15	Центральное	Круглая Светло- Крупноглыб- или	фиолет. чатый овальная	1-2 неотче- тливые	Светло- синий относит, широкая	Имеется	Нет
Зрелый лимфоцит	7-12	Центральное или эксцентричное	Круглая Темно- Неравномерный, или	фиолет. крупноглыбчатый бобовидная	Нет	Небесно- Имеется голубой, темно- синий		Нет или азурофильные гранулы
Монобласт	15-20	Центральное	Круглая Светло- Нежный, или с фиолет. мелкосетчатый волнистыми контурами	2-3	Светло- синий, узкая	11ет	Непостоянны, иногда одиночные мелкие гранулы
Промоноцит	15-18	Центральное или эксцентричное	Бобови- Светло- Нежный, дная фиолет. крупнозернистый	1-2	Серо-	Нет ватый или голубой		Непостоянны, ино- гда мелкая пыле- видная зернистость
Моноцит	12-20	Центральное	Поли-	Светло- Нежный, морф-	фиолет. сетчатый, в виде ная	паутинки или кружева	Нет	Серова- тый или бледно- голубой	Нет	Непостоянны, ино- гда мелкая пыле- видная зернистость
Признаки
Таблица 13
Характеристика эрнтрокариоцитов костного мозга
Эритробласт Пронормобласт Нормобласт	Нормобласт	Нормобласт
базофильный	полихроматофильный	оксифильный
Размер, мкм Ядро: структура хроматина	12—20 Сетчатая или зернистая с нуклеолами	10—20 Комковатая без нуклеол 1	9—18 Крупные нити с тенденцией к колесовидности	8-12	8—11	
				Колесовидная	Пикнотичная
окраска	Светло- фиолетовая	Светло- фиолетовая	Фиолетовая	Темно- фиолетовая	Темно- фиолетовая
рас положе ние Цитоплазма:	Центральное	Центральное	Центральное	Центральное или эксцентричное	Эксцентричное
размер	Узкая	Узкая	Относительно широкая	Широкая	Широкая
окраска	Интенсивно синяя со светлой пери-	Синяя с более светлой перинуклеарной	Светло-синяя	Серовато-голубая или серовато- розовая	Бледно-розовая
нуклеарной зоной
зоной
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Примечание: единой унифицированной классификации эритрокариоцитов иет. Согласно классификации ВОЗ выделяют
эритробласт, базофильный, полихроматофильный и оксифильный эритробласты
Таблица 14
Характеристика мегакариоцитов костного мозга
Признаки
Размер, мкм
Ядро:
форма
структура
окраска
Цитоплазма
размер
окраска
зернистость
Мегакариобласт	Промегакариоцит Мегакариоцит базофильный		Мегакариоцит полихроматофильный	Мегакариоцит оксифильный
18—20	20—25	30-^0	40-50	60-70
Округлое	С бухтообраз- ными вдавлен иями	Лопастное,с бухтообразными вдавлениями	Многолопастное, гиперсегментиро- ванное	Миоголопастное гиперсегментиро- ванное
Мелкосетчатая, в виде клубка с видными чуклеолами	В виде клубка	В виде клубка	В виде клубка или шаров	Плотная, пикнотичная
* Бледно- фиолетовая	Фиолетовая	Фиолетовая	Темно- фиолетовая	Темно- фиолетовая
Узкая, иногда
с отростками
Синяя,
светло-синяя
Обычно
отсутствует
Узкая, иногда
с отростками
Синяя
Обычно
отсутствует
Неширокая
Голубая,
светло-синяя
Азурофил ьная,
необильная
Широкая
Светло-голубая
Обильная, неравно-
мерная, местами
скопления напоми-
нают тромбоциты,
иногда последние
располагаются вне
клеток
Широкая
Розоватая
Мелкая,
обильная,
светло-
фиолетовая
МЕТОДЫГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
80 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
эритрокариоцитов и мегакариоцитарных элементов. Зрелые гранулоциты,
лимфоциты, моноциты в мазках пунктата костного мозга не отличаются от та-
ковых периферической крови.
Метод М.И Аринкина
Принцип. Дифференцировка форменных элементов в окрашенных мазках
пунктата с выведением миелограммы, т.е. процентного содержания различных
м нелокариоцитов.
Реактивы. 1. Иммерсионное масло. 2. Диэтиловый эфир.
Специальное оборудование. 1. Микроскоп. 2. 11-Клавишный счетчик для
подсчета лейкоцитарной формулы.
Ход определения. Просматривают препараты под малым увеличением для
ориентировочного представления о клеточности костного мозга, наличии и
числе мегакариоцитов, для исключения патологических элементов (комплек-
сы атипических клеток или одиночные атипические клетки, клетки Березов-
ского-Штернберга, клетки Гоше и др.). В случае выявления таких патологиче-
ских элементов необходимо нанести каплю масла на препарат, перевести на
иммерсионный объектив и рассмотреть их морфологию .
После просмотра мазков под малым увеличением наносят каплю иммерси-
онного масла на мазок, погружают в него иммерсионный объектив и присту-
пают к дифференцированию форменных элементов. Для подсчста миелограм-
мы необходимо дифференцировать не менее 500 миелокариоцитов в разных
участках препарата. Подсчитывают все встречающиеся в поле зрения элемен-
ты. откладывая их количество с помощью 11-клавишного счетчика, недоста-
ющие обозначения (например, все формы эритрокариоцитов, плазмоцитов и
др.) отмечают отдельно на бумаге. При большом содержании мислокариоци-
тов в мазках в поле зрения обнаруживают много элементов и для облегчения
подсчета можно использовать окуляр с уменьшенным полем зрения. После
подсчета 500 клеток делят число клеток каждого вида на 5 (при подсчете 1000
клеток делят на 10) и выдают ответ в процентах.
Нормальные величины. В соответствии с обобщенными данными пределы
нормальных значений (X+I,5S%) миелограммы следующие (табл. 15).
Клиническое значение. Увеличение бластных клеток с появлением поли-
морфных, уродливых форм с атипией ядер, укрупненными нуклеолами наблю-
дается при острых лейкозах. В миелограмме при этом снижено число зрелых
нейтрофилов и эритрокариоцитов. Увеличение миелоидных элементов глав-
ным образом за счет незрелых форм, сочетающееся с небольшим увеличени-
ем миелобластов, промислоци гов, повышением лейкоэритробластического
соотношения и уменьшением эритрокариоцитов, является признаком миело-
пролиферации и особенно выражено при хроническом миелолейкозе.
Увеличение миелоидных элементов и их незрелых форм нередко сопутст
вует интоксикациям, острым воспалительным процессам, гнойным инфекци-
ям, может быть при шоке, острой кровопотере, гематосаркомах, туберкулезе,
раке.
АНАЛИЗАТОРЫ, КОТОРЫЕ
ПОЗВОЛЯТ СЭКОНОМИТЬ НЕ ТОЛЬКО МЕСТО
В ВАШЕЙ ЛАБОРАТОРИИ, НО И ВАШЕ ВРЕМЯ
Зарегистрированы в Минздраве России
Сертификаты качества

BIS-305
$2,900
; $14,200
БИОХИМИЧЕСКИЕ
АНАЛИЗАТОРЫ
Цены указаны при получении
со склодо в Москве.
Выгодные условия для оптовых
покупателей и дилеров
гел. 237-4653, фокс 238-7951
СИСТЕМА
ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
BTS-235.H
включая годовой
комплект расходных
материалов и реактивов
ПОСТАВКА ЛАБОРАТОРНОГО ОБОРУДОВАНИЯ,
РАСХОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ И ПРОГРАММНОГО
ОБЕСПЕЧЕНИЯ
ПОЛНОСТЬЮ
АВТОМАТИЧЕСКИЙ
БИОХИМИЧЕСКИЙ
АНАЛИЗАТОР
lBTS-370
БИОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКТИВЫ
Рекомендуемый набор
23 параметра включая контрол и и калибраторы
/BtoSystems/
BTS-3J0JH
г~<
BT5-32Q
; $5,995 ;
$6,829
$8,785
БИОХИМИЯ
ИММУНОЛОГИЯ
АЛЛЕРГОЛОГИЯ
ИНФЕКЦИИ
ОНКОМАРКЕРЫ
ГОРМОНЫ
ГЕМОСТАЗ
ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА
ГЕНОДИАГНОСТИКА
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
119899, г Москва
Ленинские горы, МГУ
ЗАО Лабораторная Диагностика0
тел (095) 932 92 15 939 21 60.
факс (095) 938 24 57
Е Mail: labdia@corbina.ru


МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
81
Таблице! 15
Пределы нормальных значении миелограммы
Недифференцированные бласты
Мислобласты
Нейтрофильные промиелоциты	1,0-4,1
«	миелоциты	7,0-12,2
«	мегам иелоциты	8,0-15,0
«	нал очкоядерные	12,8-23,7
«	сегментоядерные	13,1-24,1
Эозинофилы (всех генераций)
Базофилы
Эритробласты	0,2-1.1
Про нор моб ласты	0,1 -1,2
Нормобласты базофильные	1,4-4,6
«	полихроматофильные	8,9-16,9
«	оксифильные	0,8-5,6
Лимфоциты
Моноциты
0,1-1.1
0,2-1.7
52.7-68,9
0,5-5,8
0-0,5
14,5-26,5
Плазматические клетки
Ле йкоэритробласти  юс кое отноше н ие
4,3-13,7
0,7 ЗЛ
0,1-1,8
2,1-4,5
Увеличение лимфоидных элементов в основном за счет зрелых, появление
голоядерных форм при значительной редукции эритрокариоцитов являются
признаками лимфопролиферативных заболеваний (хронический лимфолей-
коз, макроглобулинемия Вальденстрсма). Увеличение плазматических клеток
с изменением их морфологических черт (полиморфизм, двухъядерные формы,
изменение окраски цитоплазмы и пр.) характерно для миеломной болезни.
Изменение эритрокариоцитов с резким увеличением их числа и уменьше-
ние лейкоэритробластического соотношения наблюдаются при анемиях (по-
стгеморрагические, гемолитические). Изменение морфологических черт эри-
троидных элементов, появление мегалобластов разных генераций , крупных
форм ней профильных миелоцитов, мстамиелоцитов. гиперсегментированных
нейтрофилов свидетельствуют о В12- или фол ново-дефицитных анемиях.
Уменьшение эритроидных форм на фоне снижения общего числа миелока-
риоцитов с небольшим увеличением бластных клеток, лимфоцитов, плазмати-
ческих клеток часто может быть проявлением гипопластической анемии Эти
формы малокровия могут протекать и с увеличением эритроидных клеток, по-
явлением атипичных эритробластов (мегалобластоидных форм).
Обнаружение в миелограммс повышенного количества эозинофилов сви-
детельствует об аллергии, может бы гь при глистной инвазии, эозинофильных
инфильтратах, злокачественных новообразованиях, эозинофильной гранулеме
и др Увеличение моноцитоидных клеток набчюдается при хроническом моно-
цитарном лейкозе, хроническом миеломоноцитарном лейкозе, инфекционном
мононуклеозе, при хронических инфекциях. Тучные клетки могут обнаружи-
ваться в миелограммс при пигментной крапивнице и в редких случаях тучно-
клеточного лейкоза (мастоцитома).
Для оценки каждого из ростков костного мозга предложено пользоваться
парциальными миелограммами, т.е. соотношением незрелых и зрелых элемен-
82
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
тов одного ряда (эритроцитограмма, мегакариоцитограмма и пр.).
Литература. Руководство по гематологии под ред. А.И.Воробьева.- М.,
1985. Аринкин М.И. Методика исследования при жизни костного мозга.-. В
кн.: Клиника болезней крови и кроветворных органов. Л., 1928, с.34. Соколов
В.В., Грибова И.А. Гематологические показатели здорового человека,- М..
1972.
Трепанобиопсия костного мозга
Трепанобиопсию костного мозга проводят для диагностики алейкемиче-
ских форм лейкозов, эритремии, миелофиброза и других миелопролифератив-
ных и лимфопролиферативных заболеваний, при подозрении на гипопластиче-
ские анемии, метастазы рака в костный мозг и при неясных изменениях пунк-
тата костного мозга.
Трепанобиопсию костного мозга проводят по методу Мачульского. Приго-
товление срезов костного мозга, их окраску осуществляют в гистологической
лаборатории по правилам гистологической обработки костных тканей.
Метод гистологической обработки трепаната
Трепанат фиксируют в ценкерформоле (9 частей жидкости Ценкера и
1 часть 40% формалина) в течение 10-16 ч. Промывают водопроводной водой.
Помещают в смесь, состоящую из равных частей 85% муравьиной кислоты и
20% цитрата натрия на 18-20 ч. Помещают в 5% раствор алюмо-калисвых
квасцов на 3-4 ч. Проводят через спирты: 70% - 24 ч, 96% - 2 сут. Погружа-
ют в жидкий целлоидин с гвоздичным маслом на 2-3 сут. Помещают в хлоро-
форм на 2-3 ч, а затем в хлороформ с парафином при 37°С на 18 ч. Парафин
I, парафин П - по 1 - 1 ч. парафин 111-1,5-1 ч, заливают в парафин. Готовят
среды и окрашивают их азур П-эозином. Для выявления ретикулиновых воло-
кон проводят импрегнацию серебром по Гомори.
Гистологическое исследование срезов костного мозга дает возможность
изучить архитектонику органа, соотношение кроветворной и жировой ткани и
выявить атипичные клетки.
ЛИМФАТИЧЕСКИЕ УЗЛЫ
Исследование лимфатических узлов широко применяется для диагностики
гемобластозов, особенно злокачественных лимфом (лимфогранулематоз, лим-
фосаркомы), метастазов рака, туберкулеза, саркоидоза. Информативным явля-
ется исследование лимфатических узлов при инфекционном мононуклеозе, не-
специфических лимфаденитах. Для морфологического исследования произво-
дят пункцию узла с последующим цитологическим анализом мазков пунктата, а
также биопсию лимфатического узла с гистологическим исследованием срезов.
Хотя пункция лимфатического узла является чрезвычайно простой проце-
дурой и может проводиться повторно с одновременной пункцией узлов различ-
ной локализации, более информативным, однако, является сочетанное иссле-
дование - биопсия лимфатического узла, приготовление отпечатков из поверх-
ности разреза с цитологическим исследованием отпечатков и дальнейшее при-
готовление срезов с гистологическим их анализом. Такое сочетанное исследо-
вание позволяет изучить морфологию отдельных клеточных элементов и гис-
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ
83
тологическую структуру узла, что особенно важно при лимфогранулематозе,
различных лимфомах и других злокачественных опухолях.
Цитологическое исследование
Материалом для цитологического исследования лимфатических узлов слу-
жат мазки, полученные при пункции, отпечатки (соскобы) биопсированных
ПУ. Для цитологического исследования готовят мазки из пунктата или отпе-
чатки узлов, полученных при биопсии. Пункция лимфатического узла прово-
дится с соблюдением правил асептики. Техника пункции несложная; для этого
необходимы высушенные обезвоженные шприц и игла. Подготовку предмет-
ных стекол, их обработку, окраску препаратов проводят аналогично обработ-
ке препаратов периферической крови.
Исследование лимфаденограммы
Принцип. Подсчет клеток в мазках пунктата и выведение их процен тного
соотношения
Реактивы. 1. Иммерсионное масло 2. Диэтиловый эфир.
Специальное оборудование. 1. Микроскоп. 2. 11-Клавишный счетчик для
подсчета лейкоцитарной формулы.
Ход определения. Просматривают препараты под малым увеличением для
выявления патологических элементов (комплексы атипических клеток, оди-
ночные крупные атипические клетки, клетки Березовского-Штернберга, Пи-
рогова-Лангханса и др.). В случае нахождения таких (или других) патологиче-
ских элементов наносят каплю иммерсионного масла на данное место препа-
рата. переводят на иммерсионный объектив и рассматривают морфологию па-
тологических элементов (см. ниже).
11осле просмотра мазков под малым увеличением приступают к микроско-
пии с помощью иммерсионного объектива I [аносят каплю иммерсионного
масла на край препарата, погружают в него иммерсионный объектив и диффе-
ренцируют форменные элементы. Для выведения лимфаденограммы диффе-
ренцируют нс менее 500 клеток, отмечая их с помощью 11-клавишного счет-
чика. и выдают ответ в процентах.
Нормальные величины. Данные о нормальных величинах весьма ориенти-
ровочны. так как они получены у людей с увеличенными лимфатическими уз-
лами (в норме увеличения лимфатических узлов не наблюдается).
Преобладающими элементами (до 98%) нормального лимфатического уз-
да являются лимфоциты и пролимфоциты. Морфология лимфоцитов не отли-
чается от таковой периферической крови . Пролимфоциты отличаются от
лимфоци тов несколько большими размерами, более светлоокрашенным и ме-
нее компактным ядром. Единичные клетки (не более 1%) относят к лимфоб-
ластам крупные клетки с округлым большим ядром, имеющим нежную стру-
ктуру хроматина и отчетливо видимые 1-2 нуклеолы; цитоплазма базофильная
в виде узкой зоны с перинуклеарным просветлением. В нормальной ли.мфадс-
нограмме встречаются единичные тучные клетки, макрофаги, плазматические
клетки, синусовые клетки (табл. 16).
84
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Таблица 16
Лимфаценограмма при неспецифических лимфаденитах
Содержание, % Нормальные
M±S	значения
Клеточные элементы
Лимфобласты
Пролимфоциты
Лимфоциты
Недифференцированные
бласты
Макрофаги
Иммунобласты
-г
Плазматические клетки
Нейтрофилы
Эозинофилы
Тучные клетки
3.0 ± 0.2	2.0
15.2 + 0.5	3.4
75,1 ± 0.7	91.0
1.6 + 0,3
0.6 + 0.12	0,2
1,3 + 0,3
0.7 ± 0.1	0.1
0,3 ± 0,05	0.3
0,4+ 0,1	0.1
0,1 + 0.07	0.2
Клиническое значение. При острых лимфаденитах в лимфаденограмме в
фазе лимфоидной гиперплазии наблюдаются лимфоидные элементы разной
степени зрелости, синусовые клетки, макрофаги, плазмоциты, в фазе специ-
фического воспаления - инфильтрация нейтрофилами, макрофагами. Фаза
острого нагноения характеризуется преобладанием нейтрофилов в состоянии
дегенерации. Иногда лимфаденит осложняется некрозом и вовлечением в
процесс прилежащих тканей и кожи с образованием свища, при этом в цито-
грамме отмечается нейтрофильный детрит. При развитии хронического вос-
палительного процесса в цитограмме лимфатического узла на фоне лимфоид-
ных элементов обнаруживают плазмоциты, тучные клетки, нейтрофилы, гис-
тиоциты. фибробласты, гигантские клетки инородного тела Исходом хрониче-
ского процесса может быть склероз, либо обратное развитие процесса.
Обнаружение в пунктате лимфатического узла иммунобластов - крупных
клеток с резко базофильной цитоплазмой, большим округлым ядром гомоген-
ной структуры с отчетливыми нукл солями - является морфологическим при-
знаком антигенной стимуляции и наблюдается при различных воспалительных
процессах, инфекциях (инфекционный мононуклеоз, краснуха, корь, инфекци-
онный лимфоцитоз и др.), аллергических реакциях, после вакцинации.
При туберкулезном лимфадените, в основе которого лежит гранулема-
тозное воспаление, в лимфатическом узле развивается ряд последовательных
стадий, которым соответствуют определенные цитограммы. Цитограмма
лимфоидной гиперплазии характеризуется увеличением количества лимфо-
цитов разной с гепени зрелости, плазмоцитов, синусовых клеток и макрофа-
гов. Цитограмма фазы специфической гранулемы представлена лимфоцита-
ми. разрозненных или в виде скоплений эпителиоидных клеток, синусовыми
клетками и плазмоцитами. Клетки Пирогова-Лангханса обнаруживаются при-
близительно в 25% случаев. Развитие туберкулезного процесса может сопро-
вождаться некрозом ткани, дегенеративными изменениями клеток и их распа
дом. В цитограмме распад лимфоцитов (казеозный детрит) представлен в
виде бесструктурных аморфных масс, окрашенных в темно-фиолетовый цвет
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
85
На их фоне могут сохраняться лимфоциты или их тени, иногда полуразрушен-
ные эпителиоидные клетки и клетки Пирогова-Лангханса. При отложении в
казеозные массы солей кальция (обызвествление) в цитограмме на фоне ка-
зеоза обнаруживаются кристаллы, преломляющие свет. Присоединение вто-
ричной инфекции приводит к развитию нагноения, что сопровождается ин-
фильтрацией ткани лимфатического узла нейтрофилами. В цитологических
препаратах присутствуют распавшиеся и дегенеративные нейтрофилы, дет-
рит. микробная флора. В редких случаях туберкулезный лимфаденит заверша-
ется фиброзом. В цитограмме - скудное количество лимфоцитов, встречают-
ся фибробласты и фиброциты. Казеозные, гнойно-творожистые и обызвеств-
ленные массы дополнительно исследуют на микобактерии туберкулеза с помо-
щью реакции иммунофлюоресценции, окрашивания по Цилю-Нильссну и ба-
ктериологического исследования.
Саркоидоз. Клеточный субстрат заболевания - элементы эпителиоидной
। ранулемы. По преобладающему виду клеток выделяют три типа цитограмм.
1.	Цитограмма с преобладанием эпителиоидных клеток. В препаратах
эпителиоидные клетки беспорядочно наслаиваются, располагаются в структу-
рах и разрозненно. Нередко обнаруживаются многоядерные гигантские клет-
ки. фибробласты, гистиоциты и лимфоциты, значительное количество клеток
эндотелия синусов.
2.	Цитограмма с преобладанием лимфоидных элементов. Выявляются
лимфоциты разной степени зрелости, немного разрозненных эпителиоидных
элементов, местами однослойные пласты и единичные гигантские многоядер-
ные клетки.
3.	Цитограмма с преобладанием фибробластов. Последние расположены
в виде пучков, тяжей и разрозненно, редкие лимфоциты, эпителиоидные и ги-
гантские клетки. Отличительными признаками ци roi рамм саркоидоза от ту-
беркулеза считаются отсутствие при саркоидозе нейтрофилов и казеозных
масс. Цитоплазма гигантских и эпителиоидных клеток не содержит оксифиль-
ной зернистости и вакуолей, но имеет волокнистую субстанцию, окрашенную
в розоватые тона.
Ли ш/юграиулематоз. Диагностическими клетками при лимфогранулема-
тозе являются клетки Березовского-Штернберга (КБШ). Выделяют несколь
ко типов КБШ - одноядерные с лопастным ядром, двухядерные “зеркальные”,
многоядерные, лакунарные. КЫН имеют размер от 30 до 120 мкм. Ядра лопа-
стные, бобовидные, округлые, неправильной формы. Хроматин ядер разре-
жен. Нуклеолы варьируют по форме, размеру, количеству. Характерны круп-
ные нуклсолы (размером с малый лимфоцит) или множество разной величи-
ны. Некоторые ядра содержат компактный хроматин, в них ядрышки плохо
просматриваются Цитоплазма клеток обильная или скудная, разной степени
базофилии, негомогенная, иногда вакуолизированная. Изредка встречаются
митозы в ядрах КБШ Клетки Ходжкина - крупные, с большими светлыми яд-
рами, нежно-петлистой структурой хроматина, с четкими увеличенными яд-
рышками. Они считаются предшественниками КБШ.
Реактивный компонен т, который нередко составляет основную массу опу-
холи. включает в себя лимфоидные элементы разной степени зрелости, плаз-
моциты, эозинофилы, нейтрофилы, макрофаги, клетки эндотелия синусов,
эпителиоидные клетки, фибробласты.
86
Гом П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
При лимфогранулематозе выделяют 4 варианта: лимфогистиоцитарный
(лимфоидное преобладание), нодулярный склероз, смешанноклеточный, лим-
фоцитарное истощение. Вариант лимфогранулематоза устанавливают при ги-
стологическом исследовании биоптатов лимфатических узлов.
Лимфосаркомы (неходжкинские злокачественные лимфомы. ЛСА) - сис-
темные злокачественные опухоли иммунной системы, субстратом которых яв-
ляются клетки внскостмомозговой лимфоидной ткани, что отличает их от лей-
козов. Развитие опухоли может сопровождаться инфильтрацией КМ и лейке-
мизацией. Все современные классификации ЛСА являются морфологически-
ми и основываются на морфологическом соответствии опухолевых клеток
своим нормальным аналогам - родоначальникам опухолевых клонов. В насто-
ящее время в разных странах используются различные классификации: клас-
сификация Lukes и Collins (США), Кильская (страны Европы), ВОЗ (Россия),
Рабочая формулировка (США). REAL (псрссмочр Европейско-Американской
классификации лимфоидных опухолей, 1994). Классификация (ВОЗ. 1981)
ЛСА основана на преобладании клеточного типа с учетом клинических и гис-
тологических признаков. Все ЛСА делятся в зависимости от характера пора-
жения на нодулярные (узловые), диффузные, нодулярно-диффузные. Клеточ-
ным субстратом могут быть В, Т-лимфоциты на разных стадиях их дифферен-
цировки. Морфология опухолевых клеток отражает определенную стадию им-
мунологической зрелости лимфоидных элементов, на уровне которой произо-
шел блок их дифференцировки. Клетки при всех формах ЛСА различны по
размерам (мелко-, крупноклеточные и смешанные типы).
Лимфоцитарная лимфосаркома (лимфоцитома). Преобладают опухоле-
вые клетки с морфологическими чертами, свойственными зрелым лимфоци-
там - мелкие клетки с плотным темноокрашенным ядром без видимых нуклеол
и с базофильной цитоплазмой. Морфологическая анаплазия выражена уме-
ренно. Много голоядерных форм. На малых лимфоцитах экспрессируются
преимущественно В-клеточные антигены: CD19, CD20, CD23, CD79a. слабая
экспрессия slgM, цитоплазматические ИГ могут отсутствовать. Опухолевые
В-лимфоциты проявляют высокую активность А ГФ-азы, которая считается
лучшим маркером В лимфоцитов. Этот вариант ЛСА как по морфологическо-
му субстрату, гак и по цитохимическим характеристикам не отличается от
ХЛЛ. Необходимо проведение иммуноцитохимических реакций с панелью мо-
ноклональных антител для подтверждения моноклональности опухолевого
процесса.
Пролимфоцшпарная ЛСА. Субстратом опухоли являются пролимфоциты
с округлыми или расщепленными ядрами, гомогенной структурой хроматина,
1-2 нуклеолами, встречаются лимфоциты и лимфобласты. Иммунологический
фенотип опухолевых клеток соответствует чаще В-лимфоцитам (выраженная
экспрессия sig, наличие CD22). реже - Т-лимфоцитам.
Лимфобластная ЛСА. Лимфобластная ЛСА может быть как В-. так и Т-
клеточной природы В цитологических препаратах отмечается мономорфная
пролиферация лимфобластов - клеток с крупными округлыми или полиморф-
ными (скрученные, мозговидныс) ядрами, нежной структурой хроматина, еди-
ничными крупными нуклеолами, базофильной цитоплазмой. Выделяют макро
и микроформы бластных клеток В микролимфобластах отмечается распре-
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
87
деление гликогена в виде мелких, пылевидных гранул по периферии цитоплаз-
мы, высокая или умеренная активность КФ. В макролимфобластах ШИК-по-
ложитсльное вещество представлено в виде 1 гранулы в небольшом проценте
клеток, отмечается низкая или умеренная активность КФ. Иммунологический
фенотип В-лимфобластной ЛСА - sig * , cig , CD19. CD20, CD22, CD79a. CD45*.
Лимфоплазмоцитарная ЛСА - представлена смешанной популяцией кле-
ток. состоящей из лимфоцитов и плазмоцитов разной степени зрелости. Клет-
ки экспрессируют sig и cig. обычно IgM при отсутствии IgD, имеют В-клеточ-
ные антигены (CD19, CD20, CD22, CD79a), CD5-. CD10-. В клетках при этом
варианте ЛСА определяется j-цепь, причем процент клеток, содержащих ее.
выше, чем при других вариантах ЛСА. Часто встречается моноклоновая гаммапа-
тия с секрецией IgM, либо IgG. В моче отмечается протеинурия Бенс-Джонса.
Иммунобластная ЛСА - субстрат опухоли представлен крупными клетка-
ми с интенсивно базофильной цитоплазмой, нередко содержащей вакуоли. Яд-
ра большие, округлой или неправильной формы, часто содержат нуклеолы.
Наряду с ними присутствуют лимфоциты, пролимфоциты, плазмоциты. Опу-
холевые клетки несут маркеры чаше В-клеток (CD19. CD20, CD22, CD79a),
реже Т-лимфоцитов .
Лимфосаркома Беркитта - представлена крупными лимфоидными эле-
ментами В-клеточной природы, малыми лимфоцитами с интенсивной базофи-
лией и вакуолизацией цитоплазмы и обильными суданофильными включени-
ями. Ядра содержат по 2-3 некрупные нуклеолы. размер клеток варьирует.
Опухолевые клетки сходны с иммунобластами, среди них встречаются боль-
шое количество МФ. В нашей стране берки ггоподобная лимфома встречается
преимущественно у детей. Излюбленная локализация опухоли - органы желу-
дочно-кишечного тракта. Опухолевые клетки при лимфоме Беркитта цитохи-
мически характ еризуются слабой активностью КФ. отсутствием эстераз и ще-
лочной фосфатазы. В отдельных клетках могут отмечаться гранулы гликоге-
на. МФ богаты липидами, имеют высокую активность КФ и неспсцифической
эстеразы. В основном лимфома Беркитта относится к В-клеточным опухо-
лям, на клетках обнаруживают экспрессию В-клеточных антигенов. Однако
описаны редкие 1 -клеточные варианты лимфомы Беркитта.
Гистиоцитоз из клеток Лангерганса (КЛ) или гистиоцитоз X объединя-
ет три заболевания - эозинофильную гранулему, болезнь Хонда-Шюллера -
Крисчена и болезнь Леттерера-Зивс. Субстрат заболевания - клетки Лангер-
ганса (антигенпредставляющие МФ), имеющие маркер гранулы Бирбска, оп-
ределяемые при электронной микроскопии клеток. Л У вовлекаются в процесс
в 30% случаев. Пролиферация КЛ отмечается в паракортикальной зоне, где в
норме расположены эти клетки. КЛ выделяют простагландин F. который уси-
ливает син гез фактора роста эозинофилов, в результате чего наблюдается эо-
зинофилия. Фагоцитоз приводит к патологическому накоплению липидов, что
вызывает вакуолизацию цитоплазмы. Иммунологические маркеры КЛ - CDla,
S-100-протеин. Цитограмма Л У при эозинофильной гранулеме может соот
ве гствовать некрозу, нагноению при обилии эозинофилов. В цитограммс Л У
при болезни Хен да-Шюллера- Крисчена - лимфоидные элементы и гистиоци-
ты с цитоплазматическими вакуолями различной величины и числа, придаю-
щих цитоплазме пенистый вид, эозинофилы, нейтрофилы, плазмоциты. Цито-
88
Том II - ЧАСТ НЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
грамма ЛУ при болезни Легтерера-Зиве - значительное количество гистиоци-
тов (макрофагов), лимфоцитов, лимфобластов, встречаются плазмоциты, эо-
зинофилы, нейтрофилы.
Метастазы рака в ЛУ (плоскоклеточного, железистого, недифференци-
рованного, мелкоклеточного) по мере роста опухоли, вытесняют нормальную
ткань лимфоузла. В цитограммс можно обнаружить группы клеток новообра-
зования на фоне лимфоидных элементов. Опухолевые клетки располагаются
группами, скоплениями, комплексами; характерен полиформизм клеток и
ядер, анизохромия ядер. Иногда клеточные элементы метастазов сохраняют
особенности клеток органа, из которого они происходят, что помогает устано-
вить первичную локализацию. Клетки плоскоклеточного рака отличаются
большим полиморфизмом, располагаются нередко на фоне детрита, дегенера-
тивно измененных клеток, чешуек плоского эпителия и значительного коли-
чество нейтрофилов и МФ, Метастазы железистого рака располагаются пла-
стами. жслезистоподобными структурами. Выявляются клетки с признаками
секреции. Метастазы недифференцированного рака представлены плотными
скоплениями, состоящими из крупных и мелких клеток, небольшими группами
и разрозненно. Отмечаются полиморфизм и анизохромия ядер. Клеточные
элементы в скоплениях, плотно прилегая друг к другу, образуют вдавления,
"фасетки" на прилегающих поверхностях. При метастазе меланомы в клетках
опухоли и внеклеточно обнаруживается черно-бурый пигмент - меланин. Воз-
можны труднодиагностируемые беспигментные меланомы.
Па основании цитологической картины пунктата можно высказать предпо-
ложение и о локализации первичного очага опухоли. Однако с уверенностью
определить локализацию первичной опухоли удается в тех случаях, когда опу-
холь имеет морфологические черты, свойственные тому органу, где образова-
лась опухоль.Это в первую очередь относится к гипернефроидному раку, раку
щитовидной железы, яичка.
При хроническом миелолейкозе в цитограммс ЛУ на фоне лимфоцитов
обнаруживаются элементы миелоидной ткани (промиелоциты, миелоциты,
мета миелоциты, палочкоядерныс и сегментоядерные нейтрофилы), количест-
во и состав которых может значительно варьировать. Цитограмма Л У при
хроническом лимфолейкозе характеризуется однородным клеточным соста-
вом, представленным обычно малыми лимфоцитами с округлыми ядрами, кон-
денсированным хроматином, без нуклеол, узкой цитоплазмой. В препаратах
встречается различное количество пролимфоцитов, лимфобластов. Возможен
исход в иммунобластную ЛСА (синдром Рихтера). Интерпретация результатов
цитологического исследования лимфатических узлов должна проводиться с
учетом изменений гемограммы. В неясных случаях прибегают к биопсии лим-
фатического узла с последующим гистологическим анализом.
В цитограмме ЛУ при острых лейкозах отмечается тотальная бластная ин-
фильтрация Бластные клетки отличаются полиморфизмом, их идентифика-
цию проводят с помощью цитохимических реакций. Первичная плазмоцито-
ма ЛУ - редкое заболевание, при котором субстрат представлен плазматиче-
скими клетками разной степени зрелости. При остром плазмоклеточном лей-
козе могут вовлекаться в процесс ЛУ. В этом случае в пунктате помимо лим-
фоцитов будут ирису гствовать опухолевые плазмобласты.
МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
89
Литература. Вылков И. Патология лимфатических узлов.- София, 1980,
с.156; Абрамов М.Г. Клиническая цитология. М., Медицина, 1974. Воспале-
ние. Под ред. В.В.Серова, В.С.Паукова. М., Медицина, 1995. Гистологическая
и цитологическая классификация опухолевых болезней кроветворной и лим-
фоидной тканей. ВОЗ, Женева, 1981. Лимфогранулематоз. Под ред. Симбир-
цевой Л.П., Холсти Л.М., Медицина, 1985. Маянский Д.Н. Хроническое воспа-
ление. М., Медицина, 1991. Патологическая диагностика опухолей человека.
Под ред. Н.А.Краевского, М., Медицина, т.2, 1993., Морозова В.Т., Луговская
С.А. Цитологическое исследование лимфатических узлов. Метод, пособие М.,
1997,20 с.
ПЕРВЫЙ в РОССИИ
ГЕМОГЛОБИНОМЕТР С АВТОКАЛИБРОВКОЙ
Портативный гемоглобинометр “Мини! ем” разработан московским
научно-производственным предприятием “ТЕХН О МЕДИ КА” и
производится с 1994 года.
По своим параметрам гемоглобинометр “Мини-
Гем п заметно отличается от аналогов. Это вы-
сокоточный микропроцессорный прибор, в кото-
ром калибровка полностью автоматизирована.
При его эксплуатации не нужны никакие регули-
ровки и калибровка, нет необходимости исполь-
зовать калибровочные растворы, не требуется
никакое сервисное обслуживание.
Прибор выпускается в двух модификациях:
“МиниГем-540” - с пробоподготовкой по
гем и гл об и н ци ан ид ному м етоду;
“МиниГем-523” - с пробоподготовкой в
слабом растворе аммиака. В первом случае
время реакции 20 минут, во втором - I секунда.
Прибор имеет размеры 160x70x34 мм и вес ме-
нее 300 г, возможность питания от сети и внутренних батарей, и может ис-
пользоваться как в стационарных, так и в мобильных лабораториях. По про-
изводительности прибор пригоден для лабораторий с небольшим потоком
исследований (до 100 вдень) - экспресс-лаборатории, малые и средние лабо-
ратории, а также крупные лаборатории для контроля и дублирования иссле-
лований патологий, выявленных на гематологических автоматах.’’МиниГем-
523” используется станциями переливания крови, в медицине катастроф.
Учитывая низкую стоимость раствора аммиака, исследования на нем эконо-
мичны.
Гемоглобинометр изготавливается на основе новейшей импортной элементной
базы, обеспечивающей высокую точность и надежность измерений.
ГАРАНТИЙНЫЙ СРОК - 2 ГОДА.
ИПП “Техномедика”. 129081. Москва, а/я 132. Т/ф 403 86 -66, 181-45-18,
404-93 55 E-mail: tmr®technomedica.ru;.http*//wwrw.technoniedica.ni/win/tm.htm
СДЕЛАНО В РОССИИ ~
В 1999 году fl/O ЮНН мед представляет оборудование для клинике-
д иагностических лабораторий российского производства.
Приборы, предлагаемые нашей фирмой, полностью соответствуют мировому уровню
и удовлетворяют практически всем требованиям отечесвенных лабораторий.
Приобретая российские приборы Вы оснащаете лабораторию современным,
надежным оборудованием и вносите свой вклад в развитие отечественного
производства лабораторной техники.
ИОНОСЕЛЕКТИВНЫЙ
МИКРОАНАЛИЗАТОР
СЧЕТЧИК
ЛАБОРАТОРНЫЙ
СТИМУЛ
плюс
АНАЛИЗАТОР КИСЛОТНО
ОСНОВНОГО РАВНОВЕСИЯ
КРОВИ
ЭЦ-60
ЭЦ-59
КОАГУЛОМЕТР
ЭМКО-02
ПОРТАТИВНЫЙ
ГЕМОГЛОБИНОМЕТР
МиниГем-540
АНАЛИЗАТОР БИЛИРУБИНА НЕОНАТАЛЬНЫЙ
БИЛИМЕГ
ЛАБОРАТОРНЫЙ МИКРОСКОП
МИКМЕД-1
АНАЛИЗАТОР
ГИПЕРБИЛИРУБИНЕМИИ
ТРАНСКУТАННЫЙ
БИЛИТЕСТ-М
fl/O ЮННМЕД 129301 Москва, ул. Касаткина, 3 Тел.: (095) 187-3978,
283-9781, 187-6209, 187-3184 Факс: (095) 187-3840
Internet: www.glasnet.ru/_unhned «ыпэП: u'4T-&d@glasnet.ru
РЕАГЕНТЫ МАРКИ “ЮНМ-ГЕМ” ДЛЯ ВАШЕГО
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОГО АВТОАНАЛИЗАТОРА
fl/О ЮНИМЕД - ПЕРВАЯ РОССИЙСКАЯ ФИРМА, ШЕСТЬ ЛЕТ НАЗАД НАЧАВШАЯ
РАЗРАБОТКУ И ПРОИЗВОДСТВО РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ
АВТОАНАЛИЗАТОРОВ.
ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ПОСТОЯННО РАСТУЩЕЙ ПОТРЕБНОСТИ В РЕАГЕНТАХ БЫЛО
СОЗДАНО ПРЕДПРИЯТИЕ РЕАМВД, ПОСТРОЕНО СОВРЕМЕННОЕ ПРОИЗВОДСТВО,
СПОСОБНОЕ ОБЕСПЕЧИТЬ ВЫСОКОЕ КАЧЕСТВО РЕАГЕНТОВ, СТАБИЛЬНОСТЬ
ПОСТАВОК И НИЗКУЮ СТОИМОСТЬ ПРОДУКЦИИ.
КАЧЕСТВО РЕАГЕНТОВ - КАЧЕСТВО РЕЗУЛЬТАТОВ
РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ПРИБОРОВ
С РАЗДЕЛЕНИЕМ
СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛЕЙКОЦИТОВ
Архангельск
/ Вологда
Ярославль
Л“.АЛИЗДТРРЫ
АВЛ-816
Бейкер 9000
Бейкер 9020
Кобас Минос СТХ11 ♦
Кобас Микрос ОТ 16/18
КультерМД-16
Медоник СА 530
Медоник СА 610
Свелаб920
Селл-Дин 1500-2000
Сисмекс К-1000
"I Саратов
J Самара
’олгоград
мень
\ Сургут
Хабаровск
РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ПРИБОРОВ БЕЗ РАЗДЕЛЕНИЯ
СУГПОПУЛЯЦИЙ ЛЕЙКОЦИТОВ
АНАЛИЗАТОРЫ
Алкон 871
Алкон 903
Гемоскрин 5,8
Диджисел 500
Диджисел 800
Кобас Минос СТЕ 6,8
Кульгер МД 8
Кобас Микрос 8
Медоник СА 470, СА 490
Саелаб 900
Селл-Дин 300,500,900
Селл-Дин 610
Сисмекс F500, F520, F800, F820
Хайселл 520,680
Хайселл 1020
:ссов
Я/О ЮНИМЕД 129301 Москва, ул. Касаткина, 3 Тел,: (095) 187-3978,
283-9781, 187-6209, 187-3184 Факс: (095) 187-3840
Internet: www.glasnet.ru/~unimed e-mail: unimed@glasnet.ru
Фирма	АН предлагает
продукцию собственного производства
для клинической биохимии:
КОНТРОЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
БИОКОНТ С" набор сухих контрольных
сывороток 5 флаконов по 5 мл.
Контрольные растворы гемоглобина:
БИОКОНТ ГД: 3 флакона
ГД-1 60-80 г/л,
ГД-2 110-130 г/л,
ГД-3 150-170 г/л.
БИОКОНТ ГД-Н: 3 флакона
ГД-2 110-130 г/л.
КАЛИБРОВОЧНЫЕ-РАСТВОРЫ
АЛЬБУМИН 1000 мг/л набор из 3 флаконов
АЛЬБУМИН 50 г/л
БИЛИРУБИН ЭТАЛОН
ГЕМОГЛОБИН 120 г/л
ЖЕЛЕЗО 179 мкмоль/л
КРЕАТИНИН 177 мкмоль/л
КАЛЬЦИЙ 2,5 ммоль/л
ОБЩИЙ БЕЛОК 60 г/л
ФОСФОР 3 ммоль/л
МОЧЕВИНА 10 ммоль/л
ГЛЮКОЗА 10 ммоль/л
ГЛЮКОЗА 10 ммоль/л & МОЧЕВИНА 10 ммоль/л
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ НАБОРЫ
Для определения гемоглобина:
Биоконт ГЕМОГЛОБИН (с калибратором 120 г/л)
Биоконт ГЕМ (без калибратора)
Биоконт ОБЩИЙ БЕЛОК
Биоконт АЛЬБУМИН
Биоконт МОЧЕВИНА
Биоконт МОЧЕВАЯ КИСЛОТА
Биоконт ТИМОЛОВАЯ ПРОБА
Биоконт ЖЕЛЕЗО
Биоконт ЖСС
Биоконт ГЛЮКОЗА
Биоконт ФОСФОР
Биоконт ТБК
Биоконт БЕЛОК В МОЧЕ
Биоконт БЕЛОК В СМЖ
РЕАКТИВ ЭРЛИХА (для качественного определения
порфобилиногена в моче)
ФОСФАТНЫЙ БУФЕР для анализатора "Эксан"
РАСТВОР КАЛЬЦИЯ ХЛОРИДА 0,277%
а также:
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПОЛОСКИ БИОСКАН:
глюкоза в моче, кетоны в моче, белок в моче,
pH, алкодиагностик
ЛАБОРАТОРНОЕ СТЕКЛО
ЛАБОРАТОРНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
РЕАКТИВЫ
КРАСИТЕЛИ
МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ИММУНОЛОГИИ
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
ДИСКИ С АНТИБИОТИКАМИ
СТАНДАРТ-ТИ ГРЫ
ТЕСТЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СТЕРИЛИЗАЦИИ
МЕДИЦИНСКАЯ ЛИТЕРАТУРА
105173, Москва. ул.Западная п.2. "Агат" Теп (095) 460-5048, 965-6657, 965-7575.
http //www.glasnet.ru/~agat, e-mail agat@glasnet.ru

НОВОЕ ПОКОЛЕНИЕ РОССИЙСКИХ
КРАСИТЕЛЕЙ АЛЯ ГЕМАТОЛОГИИ
Растворы красителей	изготовлены
из импортного сырья и по современной технологии,
пластиковая герметичная упаковка позволяет
осуществить доставку в
любой регион России и СНГ
Высокую оценку качества растворов дали
авторитетные специалисты:
кафедра клинической лабораторной диагностики РМАПО, Москва
гематологический научный центр РАМН, Москва
ЦКДЛ СПбГМУ им. И.П.Павлова, Санкт-Петербург
НПФ “АбрИС+” производит также:
Наборы реагентов для гематологии и клинической
биохимии. Наборы с маркой ©ЙШИЙ? могут быть
использованы как для ручных методик, так и при
работе на биохимических анализаторах.
Вы можете найти в нашем каталоге широкий перечень
химических реактивов,расходных материалов,
лабораторной посуды,субстанций лекарственных средств,
готовых лекарственных средств
НПФ "Абрис+":
196135, С.-Петербург, а/я 355 пр. Ю. Гагарина, 65
Телефоны:
отдел диагностики и реактивов (812) 327-6473,127-8818 .
факс:	(812) 127-8818, 327-6475^
представитель в Москве:	(095) 144-1566 лЛ
<<Ro

ме
ЗАО "Алкор Био" производит и продает тест-
системы на основе ИФА для диагностики
•	репродуктивной функции
прогестерона
тестостерона
пролактина
ЛГ (лютеинизирующего гормона)
ФСГ (фолликулостимулирующего гормона)
ХГЧ (хорионического гормона)
•	заболеваний щитовидной железы
ттг
трийодтиронина
тироксина
антител к тиреоглобулину
•	обмена веществ
кортизола
•	онкомаркеров
АФП
•	гепатита В
HBsAg
HBs ^-подтверждающий тест
Вся продукция сертшфицирована в М3 РФ,
прошла испытания и используется в ведущих клиниках
Москвы и С.-Петербурга.
С нами можно связаться по телефонам:
(812) 437-5331,437-5371. 437-5214
телефон/факс: (812) 437-5353
Представительство в Москве: телефон/факс: (095) 322-4816
E-mail: alkorbio@infopro.spb.su
Почтовый адрес: 197110, С.-Петербург-110, а/я 243
Диагностические наборы серии Слайд
для выявления урогенитальных инфекций
методом прямой иммунофлюоресценции
ХламиСлайд "-1 - для выявления Chlamydia trachomatis
ХламиСлайд' -2 - для выявления Chlamydia pneumoniae
ХламиСлайд '-3 - для выявления Chlamydia psittaci
УреаСлайд”"* - для выявления Ureaplasma Urealiticum
МикоСлаид ' - для выявления Mycoplasma Hominis
методом непрямой иммунофлюоресценции
ТрихоСлайд " - для выявления Trichomonas Vaginalis
ВагиСлайд -для выявления Gardncrlla Vaginalis
ГерпесСлайд - для выявления Herpes simplex virus 2 type
ГоноСлайО - для выявления Neisseria Gonorrhoeae
ХламиСлайд'"1^ - для выявления Chlamydia Trachomatis
Основные достоинства
•	Высокая чувствительность и специфичность подтверждается
многочисленными отзывами из различных организаций Минздрава.
•	Время постановки анализа -15-30 минут -это в 2 раза быстрее, чем у
существующих отечественных аналогов.
•	Усилена яркость объектов -Вы точнее и быстрее поставите диагноз.
•	Докрашивающий компонент препарата позволяет увидеть
локализацию инфекционного агента и структуру клеток.
•	Удобная упаковка сохранит набор при транспортировке , а также
послужи^' Вам прекрасным штативом.
•	1 Триемлемая цена - стоимость наборов на 30-40 % ниже,чем у всех
производимых отечественных и зарубежных аналогов - объясняется
применением новейших запатентованных технологий.
•	Торговые марки препаратов зарегистрированы.
•	Пять лет в продаже.
•	Доставка препаратов: почтой, авиапочтой и курьером по Москве.
Авторский коллектив
Галарт-Диагностикум
Тел/фака 975-36-87, 975-36-37
NEW LAV BLOT 1
СПЕКТР ПРОДУКЦИИ^
ВЫПУСК 4 ЕМОЙ САНОФИ
ДИАГНОСТИКС ПА (ГЕР:
-	БАКТЕРИОЛОГИЯ И ПАРАЗИТОЛОГИЯ-
•	питательные и селективные‘среды, предназначенные для выявления
самых разнообразных инфекционных агентов
•	системы быстрой идентификации - для урогенитальных Микоплазм,
Стрептококкоков, Стафилококков, грибов и т.д.
•	тесты для проведения подбора чувствительности к антибиотикам
- МИКОЛОГИЯ - среды для выявления различных грибов, системы
быстрой идентификации и тесты для проведения антибиограмм
- ВИРУСОЛОГИЯ - диагностика ВИЧ- инфекции, т епатитов^ герпеса,
ЦМВ, вируса Эпштейн-Барр, краснухи, РСВ, гриппа, парагриппа,
аденовируса/ротавируса и т.д.	J
-	ДРУГИЕ ИНФЕКЦИИ - хламидии, сифилис, токсоплазмоз и т.д
-	ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ
-	ИММУНОХИМИЯ
АЛЛЕРГОЛОГИЯ
-	АУТОИММУННАЯ ПАТОЛОГИЯ
-	ДИАГНОСТИКА СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
-	ДИАГНОСТИКА ЭНДОКРИННЫХ НАРУШЕНИЙ
-	ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОНКОМАРКЕРОВ
Как Вы видите, спектр тестов весьма разнообразен, но особое внимание
компания уделяет лабораторной диагностике различных инфекций, в том
числе инфекций, передаваемых половым путем - это именно та область в
которой САНОФИ ДИАГНОСТИКС ПАСТЕР пользуется заслуженным
авторитетом среди мировых лидеров.
САНОФИ ДИАГНОСТИКС ПАСТЕР
CAI ЮФИ AO
103045, МОСКВА. ПОСЛЕДНИЙ пер., 23/3
ТЕЛ: (095) 721 14 04,721 14 00
ФАКС: (095) 721 14 12,721 14 10
sanofi
PASTEUR
Московский офис
113105,Москва,Варшавское ш.,19а,9 этаж,к. 3
Тел.: (095) 954-48-38; факс: (095) 952-51-43
Фирма SY-LAB (Австрия) предлагает Вашему вниманию оборудова-
ние для клинических лабораторий - МикроТакс -систему идентификации
микроорганизмов и определения их чувствительности к антибиотикам и
микробиологический анализатор БакТрак 4100. МикроТакс позволяет
идентифицировать более 500 видов бактерий и дрожжей. Принцип
идентификации основан на фотометрической регистрации результатов
биохимических реакций с последующей компьютерной обработкой
данных. Программное обеспечение включает специальную экспертную
программу для оценки результатов идентификации и антибиотико-
чувствительности. Тестирование проводится в стандартных 96-луночных
тест-планшетах с внесенными компонентами. Срок хранения тест-план-
шет составляет 1,5-2 года при комнатной температуре. Выбор антиби-
отиков на тест-планшете осуществляется по желанию пользователя.
Система МикроТакс - это открытая система, которая может быть испо-
льзована также для иммуноферментных исследований.
Микробиологический анализатор БакТрак 4100 - автоматизированная
система, которая позволяет осуществлять контроль стерильности, опре-
делять общее количество микроорганизмов, а также избирательно выяв-
лять колиформы, сальмонеллы, стафилококк, дрожжи/плесени, сульфит-
редуцирующие клостридии, листерии, лактобациллы в объектах окружа-
ющей среды.
г микродозаторы “Ленпипет”
фильтры обеззоленные
реагенты для хроматографии
предлагает
ДЛЯ МЕДИЦИНСКИХ
ЛА БОРА ГОРНИ
/Д ЛАВЕРНА
А МОСКОВСКАЯ ХИМИЧЕСКАЯ КОМПАНИЯ
. лабораторные аппараты и посуда
из стекла и фарфора, ареометры,
термометры
наборы химических реактивов для клинической диа/ пестики, тест-полоски
( Лахема", Чехия)
химические реактивы (соли, растворители, кислоты,
индикаторы, красители, стандарт титры)
- индивидуальные средства защиты
> лабораторная мебель и оборудование

3000
«сего свыше
паи. мепоианий .
I2723fi г.Москм. 51та/.ыжгшшый црое:М, <>.2/. “Яанерна'1
1 езефан/факс (095) W 200] (многоканальный)
К-тай' сатрап \ (cLchcmi. mxfc. hi
/тегнеЧ: и и и iaharaiarv.tfasnef ru
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
В КЛИНИЧЕСКОЙ
ЛАБОРАТОРНОЙ
ДИАГНОСТИКЕ
Использование морфологических методов
исследования в клинической цитологии
Клиническая цитология - признанный полноценный метод морфологиче-
ского анализа, основанный на изучении и оценке клеточного материала, полу-
ченного различными способами из патологического очага.
В нашей стране клиническая цитология является разделом лабораторной
диагностики и это находит свое объяснение в том, что традиционно исследова-
ние клеточного состава входит в комплекс клинических лабораторных анали-
зов крови, костного мозга, эксудатов, отделяемого различных органов.
Вместе с тем, в отличие от классических лабораторных методов, которые,
как правило, являются количественными, клиническая цитология носит по
преимуществу описательный характер. Последнее сближает цитологию с
другим морфологическим методом - гистологией.
Известно, что цитологическая картина отражает гистологическое строе-
ние, и во многом гистологические критерии подходят для оценки цитологиче-
ских препаратов. При этом следует напомнить, что при описании результатов
цитологического исследования используются диагностические, а не количест-
венные термины. Таким образом, методологически цитологическое исследо-
вание существенно отличается от других лабораторных методов.
Диагностическая цитология - наиболее быстро развивающийся раздел па-
томорфологии. Основным диагностическим направлением клинической цито-
логии является онкоцитология. Цитологический анализ производится в пер-
вую очередь для того, чтобы получить ответ на вопрос о наличии злокачест-
венного новообразования. "Цитологическая диагностика новообразований
уже сейчас достигла большого совершенства и имеет все основания, особенно
в сочетании с патологоанатомической, для дальнейшего успешного развития"
(Н.А. Краевский). В процессе дифференциальной диагностики определяется
характер патологического процесса и устанавливаются воспалительные, реа-
ктивные пролиферативные или предраковые поражения, а также доброкаче-
ственные опухоли.
100 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
В цитологических методах привлекает простота, быстрота, легкая повто-
ряемость, что позволяет использовать цитологическим анализ для изучения
динамики морфологических изменений в течение заболевания и процессе ле-
чения. Кроме того, классическое цитологическое исследование не требует
больших материальных затрат, недороги реактивы и оборудование.
Цитологическое исследование является одним из эффективных методов
диагностики на любом этапе прогрессии опухоли. Оно даст возможность: по-
казать харак тер и степень выраженности пролиферации клеток; диагностиро-
вать злокачественные опухоли при любой локализации в любой стадии про-
цесса. Цитологическое исследование позволяет с достаточно высокой досто-
верностью не только констатировать наличие злокачес твенного образования,
но и в большинстве случаев определить гистогенез (происхождение, ткане-
вую принадлежность) и степень дифференцировки опухоли. Последнее весь-
ма важно для клиники, так как известно, что чувствительность к различным
химио- и лучевым воздействиям во многом определяется степенью дифферен-
цировки новообразования. Кроме того, уровень дифференцировки опухоли
может быть использован в качестве довольно значимого прогностического по-
казателя.
Мощным стимулом к развитию клинической цитологии послужили разра-
ботка и совершенствование установок, приборов и инструментов для диагно-
стического обследования. Развитие эндоскопической техники, ультразвуковых
методов исследования в немалой степени способствовало широкому внедре-
нию цитологического анализа в диагностике новообразований практически из
всех тканей организма, в том числе и из внутренних органов, ранее нс доступ-
ных внеоперационному морфологическому анализу.
Необходимость морфологической верификации способствовала быстрому
и значительному росту числа биопсий. И если ранее клиническая цитология
была представлена преимущественно эксфолиативной цитологией: исследова-
нием жидкостей - эксудатов, промывных вод; выделений - мокроты, мочи; маз-
ков с шейки матки, с поверхности опухоли, то в настоящее время преобладает
пункционная цитология. В основном, материал для исследования получают по-
средством пункции опухолевых образований тонкой иглой, пункции под конт-
ролем ультразвука, рентгена, компьютерной томографии. Значительную до-
лю исследований в современной клинической цитологии составляют исследо-
вания мазков с кусочков, полученных при трепанбиопсии, мазков - отпечатков
с операционного и биопсийного материала, мазков щеточкой и соскобы при
эндоскопических исследованиях.
Цитологический анализ позволяет оценить характер и степень выраженно-
сти пролиферации эпителия, выделяя группу дисплазий, и на этой основе фор-
мировать группы "повышенного риска1'. Цитологическое исследование позво-
ляет осуществлять наблюдение непосредственно за характером клеточных из
мснений эпителия улиц группы "повышенного риска’, что фактически невоз-
можно с помощью других морфологических методов.
Все вышеизложенное позволяет широко использовать метод как для мор-
фологической верификации в условиях поликлиники, так и для проведения
массовых профилактических осмотров, выбора групп риска с последующим
систематическим наблюдением за лицами, входящими в группы риска.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
101
Ранняя и своевременная диагностика опухолей организационно складывает-
ся из двух этапов:
1	Массовое обследование (скрининг всей популяции или только групп по-
вышенного риска) для выявления опухолей или признаков, не позволяющих
исключить опухоль.
2	. Уточняющая диагностика в отобранных во время скрининга сравнитель-
но небольших группах. На обоих этапах клинической диагностической цитоло-
гии принадлежит важная роль, причем исследование этим методом характери-
зуется рядом особенностей.
На первом этапе к цитологическому исследованию как к скрининг-тесту
предъявляются особые требования и прежде всего высокая чувствительность
( г. е. высокая частота обнаружения клеток опухоли у больных со злокачест-
венными новообразованиями и низкое число так называемых «ложноотрица-
тельных" результатов) при однократном исследовании материала.
На втором этапе ранней диагностики опухолей, наряду с необходимостью
высокой чувствительности, к цитологическому методу предъявляется требо-
вание высокой специфичности. Для цитологического исследования на первом
этапе высокая специфичность является менее важным показателем, посколь-
ку результаты скрининга всегда проверяются на втором этапе диагностики.
При распознавании так называемых "ранних раков "цитологический метод
имеет нередко преимущества перед другими способами исследования. Свиде-
тельством этому является цитологическая диагностика случаев рака желудка,
легкого, мочевого пузыря и других органов при отсутствии клинических, рент-
генологических и эндоскопических проявлений, еще до появления обнаружи-
ваемых этими методами признаков. Цитологическое исследование мазков с
шейки матки является высокоэффективным скрининг-тсстом по раку этой
локализации, ибо примерно в десять раз повышает ныявляемость опухолей, по
сравнению с визуальной выявляемостью; при этом значительно увеличивает-
ся относительная частота обнаружения рака в ранних и доклинических стади-
ях процесса.
ИССЛЕДОВАНИЯ, ОСУЩЕСТВЛЯЕМЫЕ С ПОМОЩЬЮ
ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА
1.	Цитологическое исследование пункционного материала.
Цитологическое исследование пунктатов, полученных тонкой иглой (тон-
кой! ольная биопсия) из опухолей, опухолеподобных образований, уплотнений
любой локализации: головы, шеи, молочной, щитовидной железы, лимфатиче-
ских узлов, костей, мя! к их тканей конечностей, кожи, легких, средостения, ор-
ганов брюшной полости и забрил пи иного пространства.
2.	Цитологическое исследование эксфолиативного материала.
Цитологическое исследование секретов, экскретов, отделяемого и соско-
бов с поверхности эрозий, язв, ран, свищей, мокроты, промывных вод, эксуда-
тов, трансудатов.
3.	Цитологическое исследование эндоскопического материала.
Исследование материала, полученного при бронхоскопии, катетеризации
бронхов, эзофаго-, гастро-, дуодено-. лапаро-. ректоромано-, колоно-, цисто-
скопии и других видах эндоскопического обследования при любой локализации
патологического процесса.
102
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
4.	Цитологическое исследование биопсийного и операционного материала.
Цитологическое исследование мазков-отпечатков, соскобов с биопсийных
кусочков и операционного материала.
5.	Цитохимическое исследование материала.
Гликоген, липиды, ДНК, РНК. ферменты и др.
6.	Определение полового хроматина в клетках опухоли.
7.	Особое место занимает цитологическое исследование материала, по-
лученного при профилактических осмотрах населения.
8.	Исследования вагинального эпителия и уроцитограмм с целью опре-
деления экстрогенной насыщенности организма с подсчетом формулы созре-
вания, КП И. ЭИ и др.
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ХАРАКТЕР МАТЕРИАЛА ДЛЯ
ЦИТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал для цитологического исследования может быть получен различ-
ными способами.
А. Эксфолиативная цитология, где анализу подвергаются:
-	отделяемое различных органов ( молочная железа, бронхи и др. ).
Для приготовления препарата капля отделяемого наносится на стекло и го-
товится мазок. Можно также делать отпечатки с места выделения (сосок мо-
лочной железы, выходное отверстие свища). Отделяемое бронхов обычно в
виде мокроты собирается в сосуд, приготовление препаратов подробно описа-
но в разделе исследования органов дыхания:
-	> идкости и содержимое кист получают путем пункции полостей (брюш-
ной, плевральной и др.) и кист. Если материала мало, то он наносится на сте-
кла и распределяется в виде тонкого мазка. Значительные количества жидко-
сти предварительно центрифугируются и затем мазки готовят из осадка. Та-
ким же образом обрабатывается материал промывных вод;
-	отпечатки со слизистых и кожных покровов, если это доступно, можно
делать непосредственно на стекло. В других случаях мазки готовят из соско-
бов шпателем, с тампонов.
Для исследования эксфолиативного материала в гинекологии существуют
отработанные методики, описание которых - в соответствующем разделе.
Б. Пункционная цитология - один из наиболее частых видов исследования
в клинической цитологии.
Пункция опухолевых образований производится, как правило, тонкой иг-
лой. Для проведения аспирационной биопсии необходим определенный навык.
Кроме того, для получения полноценного материала необходимо соблюдать
ряд условий. В частности, игла и шприц для пункции должны быть сухими. Нс
следует проводить предварительную анестезию (введение новокаина). Для
пункции богато васкулизированных образований (щитовидная железа, сосуди-
стые опухоли, кость и др.), необходимо использовать иглу с манцреном, пос-
ледний извлекается после введения иглы в место, из которых предполагается
получить материал. Таким же образом, соблюдая вышеописанные правила и
используя специальные приспособления, осуществляют пункции под контро-
лем рентгена, ультразвука или компьютерной томог рафии.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
103
В. Использование для цитологического исследования мазков - отпе-
чатков с биопсийного и операционного материала значительно повышает эф-
фективность цитологической диагностики. Кроме того, морфологическое за-
ключение можс! быть получено значительно раньше, чем гистологическое.
Следует отмстить исключительную ценность таких параллельных исследова-
ний (цитологических и гистологических) в возможности проведения цитоги-
стологи ческих сопоставлений, что в свою очередь существенно обогащает как
один, так и другой метод. Для приготовления препарата необходимо соскоб со
среза биоптата или операционного материала распределить тонким мазком на
стекле. Отпечатки со среза биоптата или кусочка оперативно удаленной тка-
ни наносятся прикосновением поверхности среза к стеклу. Если отпечатки де-
лают с ткани богатой кровью (печень, селезенка и др.), с поверхности среза
необходимо снять кровь на фильтровальную бумагу и лишь за гем производи ть
отпечатки на стекло.
Г. С развитием эндоскопической техники обязательное цитологическое
исследование стало более доступным. В современных эндоскопических прибо-
рах имеются специальные приспособления для взятия материала на морфоло-
ги ческое исследование. При эндоскопии могут быть получены в частности:
-	мазки щеточкой.
-	промывные воды,
- мазки тампоном.
-	мазки-отпечатки щипковых биопсий.
Эндоскопические процедуры:
а)	бронхоскопия - мазки шс точкой, трансбронхиальные пунктаты, мазки
из материала щипковых биопсии, промывные воды.
б)	гастроскопия - мазки щеточкой, отпечатки с щипковых биопсий,
в) колоноскопия, ректороманоскопия - мазки с ватным тампоном, щеточ-
ные мазки, отпечатки с биопсий,
г)	цистоскопия - нативная моча, спиртовый смыв, отпечатки с биопсийных
кусочков,
д)	ларингоскопия - мазки с участков поражения и отпечатки с кусочков,
е)	кожа и слизистые оболочки - мазки соскобов с участков поражения,
при опухоли - пункция тонкой иглой.
ж)	мягкие ткани, молочная железа, лимфатические узлы, щитовидная же-
леза- пункция тонкой иглой,
з)	пункция под контролем ультразвука(щитовидная железа, опухоли шеи,
печень, селезенка, почки, матка, яичники, предстательная железа, забрюшин-
ные опухоли).
и)	цитологическому исследованию обязательно должны подвергаться пун-
ктаты серозных полостей, кист, отделяемое молочной железы и др. Стекла
для препаратов должны быть чистые, обезжиренные и сухие.
Выбор способа взятия ма териала определяется характером поражения, ло-
кализацией, возможностью проведения инструментальных исследований.
Желательно исследование в комплексе всех доступных методов взятия ма-
териала. В частности, при поражениях мочевого пузыря для цитологического
исследования може т быть использована нативная моча (эффек тивность цито-
логической диа! ностики 40-50%), спиртовой смыв (эффективность цитологи-
104 Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ческой диагностики 60-65%), мазки-отпечатки с кусочков опухоли, взятых
при цистоскопии (эффективность цитологической диагностики около 90%).
При комплексном обследовании эффективность цитологической диагностики
составляет около 100%.
ДОСТАВКА. РЕГИСТРАЦИЯ И МАРКИРОВКА МАТЕРИАЛА
Материал для цитологического исследования должен быть доставлен в ла-
бораторию в ближайшие сроки после получения (жидкость, моча, содержимое
кист, промывные воды, экссудаты, мокрота). Мазки, высушенные на воздухе,
могут храниться.
Флаконы с материалом и стекла-мазки должны быть маркированы указана
фамилия больного).
В сопровождающем материал направлении должно быть:
-	фамилия, имя, отчество, пол и возраст больного;
-	каким образом и откуда получен материал;
-	в каком виде направляется (жидкость, стекла-мазки), количество;
-	краткий анамнез с обязательным указанием на наличие и характер вред-
ных воздействий, предшествующего лечения (в особенности гормонального,
лучевого, хи м иотерап и и );
-	данные других методов исследования (рентген, эндоскопия и др.), при по-
дозрении на системное заболевание (гемобластозы) - анализ крови;
-	описание status local is;
-	клинический диагноз.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ СТЕКОЛ
Эффек тивность цитологической диагностики, помимо квалификации вра-
ча, в значительной мере определяется качеством приготовления препаратов.
Для приготовления цитологических препаратов необходимы чистые и сухие
предметные стекла.
1	Стекла тщательно промывают щеткой в теплой мыльной (или с моющим
средством) воде.
2.	Основательно промывают в проточной теплой воде.
3.	Затем кипятят 1-2 часа в воде с добавлением соды (2-3%) или моющего
средства.
4.	После хорошо ополаскивают в чистой горячей воде и промывают в про-
точной (1-2 часа).
Обработанные и промытые в воде стекла протирают мягком тряпкой, дер-
жа стекла за края и хранят в смеси Никифорова (равные части 96-градусного
спирта и эфира).
По мере надобности пинцетом извлекают стекла из смеси 11икифоройа и
протирают сухой тряпкой
Обработанные таким образом стекла могут быть использованы для приго-
товления цитологических препаратов.
Для проведения цитохимических исследований очень хорошие результаты
дает обработка предметных стекол и других стеклянных предметов в смеси
следующего состава:
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
105
Двухромовокислый калий - 100 г.
Вода горячая - 1000 мл.
Неочищенная серная кислота - 100 мл.
Для приготовления этой смеси растворяю т в горячей воде двухромовокис-
лый калий, затем охлаждают раствор и после этого добавляют серную кисло-
ту. Кислоту льют осторожно (обязательно в вытяжном шкафу), при этом
смесь весьма сильно нагревается и приобретает темно-коричневый цвет. В
этом составе предметные стекла и другую стеклянную посуду выдерживают
2-3 дня, а после промывают в проточной воде в течение 1-2 часов.
На хорошо обезжиренном предметном стекле вода должна растекаться
тонким слоем, а не собираться в капли.
Для обеспечения надежной маркировки стекол существуют два способа ма-
тирования края поверхности стекла: механический и химический. Первый осу-
ществляется с помощью заточного станка, снабженного абразивным камнем.
При втором способе, который может быть применен в любой цитологи ческой
лаборатории, используется пластмассовый сосуд емкостью около 300 мл. В
не! о помещают 50 г фторита - бифтор ита аммония и 50 г концентрированной
соляной кислоты (HCI). Смесь тщательно перемешивают предметным стек-
лом до кашицеобразной консистенции (в вытяжном шкафу). Высота слоя сме-
си в сосуде не должна превышать 1.5 см. Чистые предметные стекла устанав-
ливают вдоль стенок сосуда таким образом, чтобы один конец стекла был по-
гружен в смесь. Всего в сосуде последовательно размещают 20-25 предметных
стекол. Через 1 минуту стекла извлекают и сразу опускают на 10-15 минут в
пластмассовое ведро с большим количеством воды. Затем воду сливают и сте-
кла обрабатывают слабым раствором серной кислоты (5 мл H2SO4 на 8-10 ли-
гров воды) для их обезжиривания. Затем стекла тщательно промывают водой
и просушивают (можно с помощью вентилятора). Всю работу по подготовке
предметных стекол препаратор-лаборант выполняет в резиновых перчатках.
Смесь фтористого аммония и концентрированной соляной кислоты можно ис-
пользовать многократно, добавляя небольшое количество кислоты Маркиро-
вать стекла можно также подписывая один край стекла тушью (используя
перьевую ручку).
ФИКСАЦИЯ
Фиксация - один из важных этапов приготовления ци тологического препа-
рата. Если это специально не оговорено методикой. то, как правило, фикси
руют высушенные мазки. В качестве фиксаторов, ес ли другого нс требует ме-
тодика, лучше всего использовать метиловый спирт (время фиксации от трех
до десяти минут). Может быть использован для фиксации 100° спирт (время
фиксации - 10-30 минут).
Для приготовления абсолютного спирта в лабораторных условиях исполь-
зуется прокаленный (безводный) медный купорос.
Приготовление безводного купороса. Берут химически чистый синий купо-
рос (если он крупнокристаллический, то его предварительно толкут в фарфо-
ровой ступке) и прокаливают в фарфоровой чашке. В результате прокалива-
ния происходит удаление кристаллизационной воды из молекулы медного ку-
порпса(СпО4 • 5112О) и получается безводный купорос белого цвета (СиО4).
106
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
При соприкосновении с водой такой безводный купорос вновь жадно поглоща-
ет воду и дает первоначальное соединение синего цвета, на чем и основано его
применение для обезвоживания спирта.
Прокаливание ведут с соблюдением известных предосторожностей, а
именно: мелко размельченный купорос небольшими порциями прокаливают
на малом огне через асбестовую сетку в фарфоровой чашке(или медной посу-
де) при постоянном помешивании фарфоровой или стеклянной лопаткой.
Нельзя пользоваться металлическим шпателем и вести прокаливание в желез-
ной и никелированной посуде. Несоблюдение указанных правил может повес-
ти к пережиганию, точнее, к разложению медного купороса с образованием
окислов меди (СиО). Последнее обстоятельство весьма неблагоприятно ска-
зывается на способности купороса поглощать воду.
Хорошо и осторожно прокаленный медный купорос должен быть совер-
шенно белым или слегка голубоватым: при перекаливании он приобретает се-
рый цвет. Пережженный купорос при соединении с водой дает грязно-зеленые
гона, что является не желательным, ибо затрудняет контроль за ходом обез-
воживания спирта. Очень хорошо вести прокаливание купороса на электриче-
ской плитке малой мощности или даже в термостате при температуре 60-70°С;
в этом последнем случае мелко растолченный купорос рассыпают тонким
слоем на картоне. Прокаливание в термостате при 60-70°С идет медленно,
около 3-х недель (при ежедневном перемешивании), а при температуре 100°С
- в течение 1-2 дней (в фарфоровой чашке).
При прокаливании медный купорос начинает отдавать кристаллизацион-
ную воду уже при температуре 60°С, а при 100°С частично разлагается и ста-
новится серым.
Прокаленный купорос хранят в банке с притертой пробкой.
Приготовление абсолютного спирта. Для приготовления абсолютного
спирта прокаленный белый купорос насыпают в большую широкогорловую
банку и заливают 96е спиртом из такого расчета. чтобы столб спирта над ку-
поросом превышал толщину слоя последнего не больше чем в 4-5 раз. Содер-
жимое банки ежедневно взбалтывают в течение 4-5 дней, добиваясь посинения
всей гол щи оседающего купороса. После этого в банку подсыпают еще пор-
цию белого купороса, но уже в меньшем количестве, примерно в 2-3 раза, и
оставляют на 1-2 дня. Подсыпание купороса повторяют до тех пор, пока пос-
ледняя порция его не перестанет синеть, тогда абсолютный спирт считается
готовым. Такой абсолютный спирт хранится постоянно на медном купоросе и
используется по мере надобности для различных целей.
Если обезвоживанию подвергается 95-96° спирт, то купорос, (прокален-
ный) приходится добавлять не больше 1-2 раз, и выход абсолютного спирта в
этом случае будет составлять около 60-70%. Относительно небольшой выход
абсолютного спирта объясняется гем, что значительная часть его остается на
купоросе.
В качестве фиксатора может использоваться смесь Никифорова (время
фиксации минимум 15 минут, максимум 1 2 часа).
Некоторые красители (Лсйшман, Май-Грюнвальц) являются одновремен-
но фиксаторами.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
107
ТЕХНИКА ПРИГОТОВЛЕНИЯ МАЗКОВ
Полученное количество материала не всегда определяет возможности ди-
агностики, иногда очень малое количество материала является достаточным
для постановки диагноза.
Наличие большого количества крови часто является помехой. При се нали-
чии мазки необходимо делать как можно скорее, иначе наступает свертывание
и из свернувшегося сгустка очень трудно сделать мазки и провести исследова-
ние. Материал наносят на стекло и очень аккуратно делают мазки, т.к. клетки
очень ранимы, а наличие большого количества разрушенных клеток мешает
правильной диагностике.
Из жидких пунктатов мазки готовят подобно мазкам крови: если получен-
ная масса плотная или комковатая, то помимо мазков можно приготовить и от-
печатки на стекле. Метод отпечатков имеет определенные преимущества:
-	во-первых, клетки подвергаются гораздо меньшему травматизму;
-	во-вторых, есть возможность расположения клеток пластами, что помо-
гает при описании цитологического препарата характеризовать и соотноше-
ние клеток между собой:
-	в-третьих, если материал богат кровью, его необходимо нанести на стек-
ло и тогда выбирать оттуда беленькие крупинки и ими делать мазки.
При использовании цитологического исследования во время операционно-
го вмешательства, а также при получении биопсии этот метод может быть ис-
пользован как самостоятельно, так и параллельно с гистологическим анали-
зом.
В этих случаях помимо пункций проводят получение отпечатков с удален-
ных или обнаженных органов, с помощью прикосновения предметного стекла
к исследуемой ткани. Также можно готовить препараты при получении мате-
риала способом соскоба.
Жидкости, полученные при пункции, тут же центрифугируют, далее слива-
ют верхний слой центрифугата, а из осадка делают мазки, которые и подвер-
гают цитологическому исследованию. В некоторых случаях приг отовленные
препараты можно просмотреть под микроскопом, однако диагностику патоло-
гии необходимо проводить только по окрашенному препарату.
ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ
ПРЕПАРАТОВ
С целью окрашивания цитологических препаратов наиболее часто приме-
няют красители, используемые для гематологических исследований, в частно-
сти краски Романовского Гимза, Лейшмана, Майя-Г рюнвальда. Кроме того,
широко используются методики окраски, где основным красителем является
гематоксилин, а также цитохимические методы.
Качество окрашивания зависит от вида и состава краси теля - его концен-
трации, которая не всегда определяет красящую способность; продолжитель-
ности окрашивания; времени изготовления препарата (большинство препара-
тов, от момента приготовления которых до окрашивания прошло от 6 часов до
нескольких дней, утрачивают мелкие структурные детали); pH среды: темпе-
ратуры воздуха в процессе'окрашивания, что связано с испарением красящего
раствора.
108 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Окраска по Гимзе и ее модификации
Стандартный раствор Гимзы:
Азур 1 - 3,772 г
Эозин -2.165 г
Метиленовый синий - 1,563 г
Метиловый спирт - 750 мл
Глицерин - 256 мл
Методика окраски. Препарат, полученный 6ч- 2-3 дня назад, фиксируют
3 минуты в метиловом спирте и переносят на 30 минут в красящую жидкость,
состоящую из 5 мл стандартного раствора Гимзы и 20 мл дистиллированной
воды (pH 6,8-7,2). После этого ополаскивают водопроводной водой и высуши-
вают на воздухе.
Окраска по Романовскому-Гимзе
Сухие мазки фиксируют в метиловом спирте (5 минут) или смеси Никифо-
рова (15 минут). Затем погружают в рабочий раствор (разведение 1:4) готово-
го красителя Романовского-Гимзы на 5-7 минут, после чего промывают дис-
тиллированной водой и высушивают.
Окраска по Паппенгейму
Предварительная фиксация мазков нс требуется.На подсохшие на воздухе
мазки наливают краску-фиксатор Мая-Грюнвальда на 3 минуты. Не сливая
краску, к ней добавляют такое же количество дистиллированной воды. Через
1 минуту краску с мазка сливают и, не ополаскивая его, наливают профильт-
рованный рабочий раствор (разведение 1:4) готовой краски Романовского-
Гимзы (при pH 6,8) на 5 минут. После окрашивания препараты промывают ди-
стиллированной водой и высушивают на воздухе, устанавливая вертикально в
специальной сушке.
Для приготовления краски-фиксатора Мая-Грюнвальда 250 мг порошка
Мая-Грюнвальда растворяют в 100 мл метилового спирта. Раствор подогрева-
ют при 70°С на водяной бане до полного растворения порошка, фильтруют и
хранят в бутылке с притер'той пробкой.
Модификация метода Паппенгейма
Готовят 0,3% раствор красителя Мая-Грюнвальда (300 мг порошка краси-
теля растворяют в 100 мл метилового спирта; раствор созревает 3 дня); рас-
твор азура (I (1 г растворяют в 1000 мл кипящей воды): раствор эозина калия
или натрия (1 г эозина калия или 0,5 г эозина натрия растворяют в 1000 мл ки-
пящей воды).
Методика окраски
1.	Высушенные мазки фиксируют в метилоном спирте 3 минуты.
2.	Окрашивают 0,3% раствором Мая-Грюнвальда, на 1 часть которого до-
бавлено 4 части фосфатного буфера (pH 6,8 - 7,2) 10 минут.
3.	Докрашивают азур-эозином (1 часть раствора азура 4- 1 часть раствора
эозина + 5 частей фосфатного буфера при pH 6,8-7,2) 20 минут.
4.	Смывают краситель проточной водой.
5.	Высушивают мазки на воздухе.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
109
Окраска мазков по Лейшмаиу
Готовят краску Лейшмана (2.5 г сухого красителя на I литр метилового
спирта; краситель созревает 3-4 дня); азур (1г сухого красителя азур на 1 л ди-
стиллированной воды, краситель созревает 3-4 недели); эозин (1 г сухого кра-
сителя эозин на 1 литр дистиллированной воды; краситель созревает 3-4 неде-
ли).
Методика окраски
1.	Высушенный на воздухе мазок переносят на 3 минуты в краситель
Лейшмана.
2.	Промывают в водопроводной воде.
3.	Удаляют (стряхивают) избыток воды и заливают красителем, в состав
которого входят 40 мл азура, 30 мл эозина и 70 мл дистиллированной воды.
Краситель готовят перед работой. Мазки окрашивают 30-40 минут.
4.	Промываю! водопроводной водой.
5.	Высушивают на воздухе или промокают фильтровальной бумагой.
Срочная окраска по Алексееву
1.	Тонкие мазки фиксируют в подогретом до 35-40 градусов С растворе
Мая-Грюнвальда 30 сек.
2.	Ополаскивают в воде.
3.	Окрашивают в 0,1% растворе азур-эозина (2:1) 2 минуты.
4.	Ополаскивают в воде.
5.	Высушивают, промокая.
Окраска по Папаииколау и ее модификации
1.	Влажный препарат фиксируют в смеси Никифорова в течение 30 минут.
Если после фиксации его залить глицерином на 2 часа, то потом препарат
можно хранить до 14 дней.
2.	Перед окрашиванием препарат проводят через спирты нисходящей кон-
центрации (100%, 95%. 80%. 50%) и дистиллированную воду (в каждом ста-
канчике держат по 2 минуты).
3.	Окрашивают гематоксилином в течение 10 мину!’ (перед использовани-
ем раствор красителя необходимо фильтровать).
4.	Промывают в 3-х сменах дистиллированной воды.
5.	Переносят в смесь из 97 мл 70 % спирта и 3 мл концентрированного рас-
твора аммиака( препарат станови тся синим). В этой смеси препарат необхо-
димо ополоснуть несколько раз.
6.	Опускают в 70% спирт и затем промывают в проточной воде.
7.	Опускают в раствор карбоната лития на 1 минуту ( 3 капли насыщенно-
го водного раствора на 100 мл дистиллированной воды).
8.	Промывают в проточной воде 5 минут.
9.	Обезвоживают(дистиллированная вода и спирты восходящей концент-
рации - 50%, 70%. 80%. 100%).
10.	Докрашивают в течение 4 минут в оранжевом Г (готовый раствор).
11.	Ополаскивают в двух сменах 95% спирта.
12.	Опускают в краситель Папаниколау на 1-2 минуты.
13.	Ополаскивают в 3 сменах 95% и 2-х сменах 100% спирта (в последней
смене держат 5 минут).
по
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
14.	Просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.
Приготовление красителей. Раствор 1:1г кристаллического гематокси-
лина растворяют в 10 мл 100% спирта.
Раствор II: 20 г алюмокалиевых квасцов при нагревании растворить в 200
мл дистиллированной воды.
Через 24 часа растворы I и II смешивают и добавляют 0,5 г оксида ртути
(красного), нагревают до кипения и охлаждают на водяной бане. Через 24 ча-
са отфильтрованный раствор может быть использован. Каждый раз перед
применением его следует фильтровать.
Краситель Папаниколау. Смешивают 45 мл 1,5% раствора светлого зеле-
ного (лихтгрюн) в 95% спирте, 10 мл 0,5% раствора основного коричневого
(бисмаркбраун) 95% спирте, 45 мл 0,5% раствора эозина в 85% спирте, 0,2 г
фосфорномолибденовой кислоты и добавляют 1 каплю насыщенного водного
раствора карбоната лития (1 г на 100 мл дистиллированной воды).
Отечественными цитологами предложена модификация метода, в которой
светлый зеленый заменен на более доступный бриллиантовый зеленый.
Окраска по Папаниколау в модификации Куницы
I. Оранжевый Г: смешивают раствор 0,5 г Оранжа G на 100 мл 96% спирта
и 0,015 г фосфорно-молибденовой кислоты. Полученный раствор оставляют
на 1 сутки, после чего он годен для использования.
С целью приготовления промежуточного красителя и бриллиантового зе-
леного необходимо за 1 сутки приготовить следующие водные растворы:
1)	основного коричневого - 0,1 г на 1 л дистиллированной воды;
2)	эозина (желтый или обычный) - 0,1 г на 1 мл дистиллированной воды;
3)	бриллиантового зеленого - 0,05 г на 1 мл дистиллированной воды + 1 мл
96% спирта. Эти растворы необходимо плотно закрыть на I сутки в термоста-
те при 37°С. Далее на них готовят спиртовые растворы красителей.
(I. Промежуточные красители: основной коричневый - 1 мл водного рас-
твора на 200 мл 96% спирта (если эозин обычный - 1 мл водного раствора на
260 мл 96% спирта).
Для получения промежуточного красителя, представляющего собой смесь,
берут следующие количества вещества на 100 мл смеси: 16 мл спиртового рас-
твора основного коричневого, 84 мл спиртового раствора эозина (желтовато-
го или обычного), 0,17 г фосфорно молибденовой кислоты и добавляют 1 ка-
плю насыщенного раствора карбоната лития. Красители фильтруют перед
смешиванием, остаток хранят нспрофильтрованным.
III. Бриллиантовый зеленый - 0,5 мл водно-спиртового раствора на 180 мл
96% спирта.
Методика окраски
1.	Препарат фиксируют в смеси Никифорова (минимальная продолжи-
тельность фиксации 30 мин).
2.	Промывают в 96% спирте, а затем дистиллированной воде.
3.	Окрашивают гематоксилином 2-3 минуты, промывают в воде.
4.	Дифференцируют 0,5% раствором соляной кислоты до покраснения в
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ш
течение 2-3 минут, сливают, промывают в воде. Контролируют под микро-
скопом окраску ядер.
5.	Опускают на 1 минуту в слабый раствор карбоната лития (3 капли насы-
щенного водного раствора лития на 100 мл дистиллированной воды), промы-
вают в воде.
6.	Тщательно обезвоживают мазок 96% спиртом.
7.	Окрашивают оранжем G в течение 1 минуты, наливая краситель на сте-
кло. Сливают краситель и хорошо промывают спиртом до удаления его избытка.
8.	Красят промежуточным красителем 1 минуту, сливают, промывают в
спирте.
9.	Окрашивают бриллиантовым зеленым 1-2 минуты, сливают, промыва-
ют спиртом, промокают.
10.	Проводят через ксилол, заключают в бальзам.
Окраска по Папаниколау в модификации Руденко
Вначале готовят водные растворы цитоплазматических красок: по 0,1 г
светлого зеленого, эозина желтоватого водорастворимого и основного корич-
невого растворяют отдельно в 1 мл воды. Водные растворы, хорошо закрыв,
оставляют на 1 сутки в термостате при 37°С. Затем из водных растворов гото-
вят спиртовые растворы красителей:
1)	светлый зеленый - 1 мл водного раствора на 200 мл 96% спирта;
2)	эозин желтоватый водорастворимый - 1 мл водного рас твора на 200 мл
96% спирта;
3)	основной коричневый - 0.25 мл водного раствора на 200 мл 96 % спирта.
После этого готовят смесь, которую Г. Папаниколау назвал ЕА-36. Она со-
стоит из смеси спиртовых растворов красителей: 200 мл светлого зеленого,
168 мл эозина желтоватого и 32 мл основного коричневого, которые перед
смешиванием фильтруют. К смеси добавляют 0,68 -0,8 г фосфорно-молибде-
ноной кислоты и 4 капли насыщенного водного раствора карбоната лития. В
растворе краси теля образуется небольшое количество устойчивого осадка, не
мешающего работе. Полной готовности краска достигает через 3-12 дней при
комнатной температуре. Для приготовления оранжа G 0,5 г сухого вещества
растворяют в 100 мл 96% спирта и добавляют 0,02-0,05 г фосфорно-молибде-
новой кислоты. Полученный насыщенный раствор готов к применению на
следующий день После того как использован весь раствор красителя, в эту же
посуду с осадком можно добавить 100 мл 96% спирта и указанное количество
фосфорно-молибденовой кислоты. Оставшиеся количества спиртовых рас-
творов эозина желтоватого и основного коричневого храня т и используют для
приготовления краси теля 3 6 месяцев.
Методика окрас ки
1.	Мазки фиксируют в жидкости Никифорова 30 минут.
2.	Промывают 96% спиртом 1 минуту.
3.	11ромывают в дистиллированной воде 2-3 минуты.
4.	Окрашивают в растворе гематоксилина 3-8 минут.
5.	Ополаскивают в проточной воде 3-5 мину г.
6.	Проводят через 0,5% раствор соляной кислоты 1 минуту.
7.	Промывают 2-3 минуты в дистиллированной воде и 3-5 минут - в про-
точной, контролируя процесс под микроскопом.
112
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
8.	Переносят в 0,1% раствор карбоната лития 1 минуту.
9.	Ополаскивают в дистиллированной иоде и 96% спирте.
10.	Переносят в 100% спирт на 1 минуту.
11.	Окрашивают в растворе оранж G 1-3 минуты.
12.	Проводят через 96% спирт в течение 2 минут, контролируя процесс под
микроскопом.
13.	Окрашивают в светлом зеленом (смесь ЕА-36) 2-5 минут.
14.	Проводят через 96% спирт 1-3 минуты.
15.	Промокают фильтровальной бумагой® проводят через ксилол и заклю-
чают в бальзам.
Вариант окраски гематоксилином и эозином для мазков
Для приготовления красителя 50 г алюмокалиевых квасцов растворяют в
500 мл дистиллированной воды, доводят до кипения и высыпают в горячий
раствор 1 г гематоксилина. Затем добавляют 500 мл дистиллированной воды и
доводят до кипения (но не кипятят). Раствор остужают до комнатной темпера-
туры и добавляют йодат калия. Горло сосуда завязывают марлей и оставляют
созревать на свету 5 недель. Затем сосуд с красителем закупоривают и убира-
ют в темное место. Перед использованием краситель фильтруют.
Методика окраски
1.	Мазки фиксируют в смеси равных частей эфира и 96% спирта или в 96%
спирте 7-10 минут.
2.	Окрашивают в гематоксилине 5 минут.
3.	Промывают в проточной воде 1-2 минуты.
4.	Окрашивают в 0,3% спиртовом растворе желтоватого эозина 1 минуту.
5.	Промывают в проточной воде 1-2 минуты.
6.	Высушивают.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ
ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Окраска на гемосидерин Перлса
Реактивы:
1.	Желтая кровяная соль.
2.	1 N раствор ИО.
3.	Метиловый спирт.
4.	Сол я но-кислый спирт.
Ход реакции:
1.2% раствор желтой кровяной соли:
желтая кровяная соль - 2 гр.;
дистиллированная вода - 100 мл.
Раствор должен быть бесцветным.
2.	Обесцвечивание препарата метанолом или соляно-кислым спиртом.
3.	Дистиллированная вода.
4	Залить 1 N НС1 - 30 сек.
5.	Добавить в кислоту равное количество раствора желтой кровяной соли.
6.	Перемешать и красить - 10 мин
7.	Дистиллированная вода
8.	Высушить.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
113
ДНК по Фельгену
Реактивы:
1.	Метиловый спирт.
2.	3 N HCL
3.	Реактив Шиффа.
4.	1 N НС1.
Приготовление реактивов
1. 3 N НС1.
26	6,4 мл - конц. НО.
до 1 литра - дистиллированная вода.
Готовить в мерной колбе, хранить в холодильнике.
2. Реактив Шиффа (см. гликоген).
3. Сернистая вода.
1,5 г ~ Sa2S2O5.
15 мл - 1 N HCI.
300 мл - дистиллированной воды.
Ход реакции
1.	Фиксация - метанол - 15 мин.
2.	Подогреть 3 N НС1 до 37°С - 10 мин.
3.	В подогретый раствор 3 N НС1 опустить стекло и поставить в термостат
при 37°С - 20-25 мин.
4.	Промыть стекло в отработанном растворе Шиффа из холодильника.
5.	Поместить в раствор Шиффа чистый, при 37°С - 45-60 минут.
6.	Промыть сернистой водой 3 раза по 9 мин.
7.	Промыть дистиллированной водой.
8.	Высушит на воздухе.
9.	Бальзам.
Слизь
Реактивы:
1.	Сухой немецкий муцикармин фирмы «Керес».
2.	Метиловый спирт.
3.	Гематоксилин (этиловый спирт, глицерин, калийные квасцы, ледяная ук-
сусная кислота).
Приготовление реактивов
1. Однопроц. раствор муцикармина:
муцикармин 1.0 г + 50% С2Н5ОН - 100 мл.
Хранить в холодильнике.
Перед употреблением краску разводят 10 раз;
краска - 1 часть, дистиллированная вода 9 частей.
2. Гематоксилин Эрлиха:
гематоксилин - 2 г
96°C2HSOH - 100 мл
дистиллированная вода - 100 мл
глицерин - 100 мл
калийные квасны - 3 г
педяная уксусная кислота - 10 мл.
114 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
При смешивании раствор имеет светло-красный цвет. Созревает 14 дней в
сосуде с широким горлом, на дно которого насыпают в избытке толченые ка-
лийные квасцы. Горло сосуда обвязывают марлей и ставят на свет. Перед упо-
треблением краску фильтруют. Раствор должен иметь ароматический запах и
хромовато-фиолетовый цвет.
Ход реакции
1.	Фиксация - метанол - 3 мин.
2.	Опустить в эфир на несколько сек.
3.	Залить муцикармином мазки - 10 мин.
4	Смыть дистиллированной водой.
5.	Докрасить гематоксилином Эрлиха - 5 мин.
6.	Смыть водопроводной водой.
7.	Высушить.
РНК по Браше
Реактивы:
I.	Метиленовый спирт.
2.	Метиленовый зеленый.
3.	Пирон ин У.
4.	Уксус но-кислый натрий.
5.	Уксусная кислота.
Приготовление реактивов
1.	Метиленовый зеленый 2% раствор.
а)	омыть сухую краску хлороформом.
б)	2% раствор мелиленового зеленого:
2 г - метиленовый зеленый;
100 мл - дистиллированной воды.
2.	5% пиронин:
5	г - пирон и на У.
100	мл дистиллированной воды.
3.	Ацетатный буфер pH - 4,8:
a)	CI-hCOONa - 16,4 гр;
дистиллированная иода - до 1 литра.
Готовить в мерной колбе.
б)	CH3COONa -13.02 мл;
дистиллированная вода - до 1 литра;
59 мл «а» + 41 мл «б».
1.	Фиксация - метанол - 20 мин.
2.	Дистиллированная вода несколько сек.
3.	Окрасить метил, зелен. - пиронином - 2 часа при комнатной температу-
ре. Инкубационная среда готовится перед работой.
Р-ор «А»	- 0,35 мл 4 капли - 5 проц, пиронин;
0,2 мл 2 капли - 2 проц, мстил, зеленый;
5 мл дистил. воды.
Р-ор «Б»	- 5 мл р ор «А» 4* 2 мл ацетатного буфера.
4.	3 раза в дистил. воде по 5 сек.
5.	Высушить.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
115
Нуклеолы
Реактивы:
1.	Метиловый спирт - фиксатор.
2.	0,1% р-ор метиленового синего.
3.	Лимонная кислота.
4.	1 N р-ор NaOH
Приготовление реактивов
1.	0,1% р-ор метиленового синего:
метиленовый синий - 100 мг;
цистил, вода - 100 мл.
Профильтровать. Хранить в холодильнике.
2.	Цитратный буфер pH - 4,96.
Лимонная кислота - 21,01 г
1 N р-ор NaOH - 200 мл;
диет, вода - до 1 литра.
Готовить в мерной колбе, хранить в холодильнике.
3.	1 N р-ор NaOH,
NaOH - 40 г;
дистил. вода - до 1 литра.
Готовить в мерной колбе, хранить в холодильнике.
Ход реакции
1.	Фиксация - метанол - 5 мин
2.	Опустить в эфир на несколько секунд.
3.	Окрасить 0,1 % р-ром метиленового синего с кратковременным подогре-
ванием до легкого парообразования - 5-10 мин.
4.	Смыть краску.
5.	Высушить мазок.
6.	Поместить в цитратный буфер - 30-60 сек.
7.	Высушить.
Гликоген
Реактивы:
1.	Метиловый спирт - СН3ОН, пары 10% формалина - 3 мин.
2.	Иодная кислота.
3.	Фуксин основной для фуксинсернистой кислоты.
4.1 N раствор НС1.
5.	Сернокислый Na-Na2S2Os.
6.	Активированный уголь.
7.	Гематоксилин.
8.	Йодноватокислый Na или К - NalO3, КЮ3.
9	Калийные квасцы.
10.	Лимонная кислота.
Приготовление реактивов
1.	1 N р-ор HCI.
конц. НС! - 88,8 мл;
диет, вода - до 1 литра.
116 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Готовить в мерной колбе, хранить в холодильнике.
2.	Реактив Шиффа:
а)	фуксин - 1 г;
диет, вода - 2(Х) мл.
Прокипятить несколько мин.
б)	остудить р-ор до 50°С;
в)	профильтровать;
г)	добавить 20 мл 1 N НС1;
д)	остудить;
е)	добавить 1 г Na2S2O5;
ж)	добавить активированный уголь.
Через сутки р-ор обесцвечивается, хранить в холодильнике.
3.	Сернистая вода.
1 г - Na2S2Os;
200 мл - диет, воды;
10 мл - 1 N HCL
Готовить перед работой.
4.	Иодная кислота.
200 мг - иодная кислота;
40 мл - диет, вода.
Готовить перед работой.
Приготовление гематоксилина Эрлиха
Гематоксилин - 1 г;
NaIO3 - 0,2 г;
калийные квасцы - 50 г;
лимонная кислота - I г;
диет, вода - 1 литр.
Краска созревает 15 дней в сосуде, прикрытом бумажным колпачком, при
частом взбалтывании. При хранении в хорошо закрытом сосуде, р-ор остает-
ся в течение длительного времени.
Соляно-кислый спирт
99 мл - 70° C2H«jOH;
1	мл - конц. НС1
Ход реакции
1.	Фиксация - метанол - 20 мин.
2.	Промыть проточной водой - 15 мин.
3.	Опустить в эфир на несколько секунд.
4.	0,1 % р-ор амилазы pH - 7,0.
1 мг - амилазы, I мл - диет. вода.
Инкубировать 15-30 мин при t° - 37°С.
5.	Промыть диет, водой - 20 мин.
6.	Иодная кислота 3 мин.
7.	Диет, вода - 3 мин. по 3 раза.
8	Опустить в реактив Шиффа - 40 мин., в темном месте.
9.	Промыть сернистой водой - 3 мин. 3 раза.
10.	Диет вода - 3 мин.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
117
11.	Докрасить гематоксилином - 20 мин.
12.	Промыть водопроводной водой.
13.	Высушить.
Липиды
Реактивы:
1.	10% пары формалина: фиксация.
2.	Судан черный Б.
3.	96° этиловый спирт.
4.	Кармин.
Приготовление реактивов
1.	10% пары формалина.
2.	Краска Судан черный Б.
70° С2Н5ОН - 100 мг;
Судан черный Б - избыток.
При нагревании растворяют краску в этиловом спирте до состояния
перенасыщения. На дне колбы должны выпасть кристаллы Судана. Профильт-
ровать, хранить в сухом темном месте.
3.	70° QHsOH.
96° С2Н5ОН - 100 мл;
диет, вода - 391 мл.
4.	50° С2Н5ОН.
96° QHsOH - 100 мл;
цист, вода - 96 мл.
5.	40° QHsOH.
96° СгЩОН - 100 мл;
диет, вода - 144.4 мл.
Спирты хранить в холодильнике.
Ход реакции
1.	Фиксация - пары формалина - 3 мин.
2.	Диет, вода - несколько секунд.
3.	Опустить краску судан черный Б на 1 час при t° - 37°С.
4.	Отмыть в 70е С2Н5ОН
5.	Отмыть в 50° СрН5ОН.
6.	Отмыть в 40° QH^OH
7.	Диет, вода.
8,	Докрасить кармином 1 сутки.
Пероксиоаза
Реактивы:
1. Спирт 96° этиловый - QH^OH.
2= 40% формалин.
3. 3% перекись водорода - Н2О2.
4. Бензидин.
Приготовление реактивов
1. Спирт - формалин; 9:1 - фиксатор;
118
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
96° QHsOH - 9 частей;
40% формалин - 1 часть.
Хранить в холодильнике.
2. 40% этиловый спирт.
96° QHsOH - 100 мл;
диет, вода - 144,4 мл.
Хранить в холодильнике.
Ход реакции
1.	Фиксация - спирт-формалин - 30 сек.
2.	Опустить мазок на несколько секунд в эфир.
3.	Инкубация - 15 мин. t°- 22°С в темном месте.
Инкубационная среда готовится перед работой.
40% С2Н5ОН - 5-7 мл;
3%	Н2О2 - 2 капли;
бензидин - несколько кристаллов.
Смешать, профильтровать.
4	Смыть водопроводной водой
5.	Высушить.
Неспецифическая эстераза по Хейхо
Реактивы:
1.	10% раствор пары формалина - фиксатор.
2.	а-нафтил ацетат.
3.	Химически чистый ацетон.
4	Синий прочный В или РЕ
5.	Трис.
6.	ОД N HCI.
7.	NaF - ингибитор.
Приготовление реактивов
1.	10 проц, пары формалина
2.	0.1 NHC1.
3.	ОД М трис - HCI - буфер pH -7,8.
трис -121 мг;
диет, вода - 34 мл;
ОД НС1 - 5 мл.
Хранить в холодильнике.
4.	NaF
NaF - 1,5 мг;
инкубац. среда - 1 мл.
добавлять перед фильтрацией.
Ход реакции
1	Фиксация в парах формалина - 3 мин.
2.	Опустить в эфир на несколько секунд.
3.	Инкубания - 2 часа t° - 22°С.
Инкубационная среда готовится перед работой,
а-нафтилацетат -5 мг;
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
119
ацетон - 2 капли растворить;
трис - буфер - 20 мл;
синий прочный В или РР или
прочный красный TR - 25 mi*.
Растворить, профильтровать.
4.	Промыть проточной водой.
5.	Высушить.
Ход реакции
1.	Фиксация - пары формалина - 3 мин.
2.	Опустить на несколько секунд в эфир.
3-	Инкубация - 3 часа, в темном месте, t° -22°С.
Инкубационная среда готовится перед работой.
а-нафтил фосфат - 1 мг;
трис - буфер pH -9,2-1 мл.
Смешать, профильтровать.
4.	Промы ть водопроводной водой.
5.	Промыть дистиллированной водой.
6.	Докрасить метиленовым зеленым несколько секунд.
7.	Промыть водопроводной водой.
8.	Высушить.
Кислая фосфатаза по Барку
Реактивы:
1.	10% пары формалина нейтрального - фиксатор.
2.	Азотистокислый натрий - NaNO2.
3.	Ацетон химически чистый.
4.	а-нафтил фосфат (нафтол - AS - BJ, AS TR, AS-MX - фосфата).
5.	Ледяная уксусная кислота - СНдСООН.
6.	Уксуснокислый натрий - CH3COONa.
7.	Фуксин основной для фуксинсернистой кислоты.
8=	Метиленовый зеленый - краситель.
9.	Концетрированная соляная кислота - HCL
10.	К, Na виннокислый - ингибитор.
Приготовление реактивов
1.	10% нейтральный формалин,
40% формалин - 1 часть;
дистиллир. вода - 3 части.
Налить в эксикатор. Образуются пары формалина.
2.	Ацетатный буфер pH 5,2-5,6 (5,5) из ледяной уксусной кислоты.
а)	0.2 Н раствор СН3СООН.
11,5 мл ледяной - до 1 литра,
или 12 г ледяной - до 1 литра.
Готовят в мерной колбе, хранить в холодильнике.
б)	0.2 Н раствор CH3COONa уксуснокислого натрия;
27,2 г CH3COONa. ЗН2О или 16,4 г CH3COONa;
до 1 лигра дистиллир, воды.
Готовят в мерной колбе, хранить в холодильнике.
120 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
в)	рабочий раствор ацетатного буфера pH - 5,5; 8,8 мл раствора «а»; 41,2
мл раствора «б» до 100 мл дистил. воды.
Буфер pH - 5,6.
4,8 мл «а»;	45,2 м «б».
До 100 мл дис гиллир. воды.
Готовят в мерной колбе, хранить в холодильнике.
3.	4% раствор NaNO2-
NaNO2 - 200 мг:
дисгил. вода - 5 мл.
Раствор должен быть белым. Хранить в холодильнике при 4°С.
Годен 1 неделю.
4.	Гексоазотированный парарозанилин 4% по Davis, Ozustcin 1959 г.;
фуксин основной;
для фуксинсернисгой кислоты - 1 гр;
2 NHC - 25 мл.
Растворить при нагревании, но не доводя до кипения.
Охладить, профильтровать. Хранить в холодильнике при 4°С.
Гексоазотированис встряхиванием до оранжево-желтого цвета.
5.	2 N раствор НС1;
конф. - НО - 164 мл;
диет. вода - до 1 литра.
Готовить в мерной колбе для парарозанилина.
6.	0,05 М К, Na виннокислый;
К, Na виннокислый 2 - 352 мг;
инкубационная среда - 25 мл.
7.	Метиленовый зеленый - 0,1%
Отмыть метиленовый зеленый от примесей хлороформом.
Для этого в стаканчик с сухой краской добавить хлороформ, затем переме-
шать и оставить на несколько минут. Профильтровать. К сухой краске, остав-
шейся на фильтре, добавить хлороформ и т.д. Отмывать до тех пор, пока рас-
твор не станет бесцветным.
метиленовый зеленый - 100 мл;
дистил. вода - 100 мл.
Краску хранить в холодильнике.
Ход реакции
1.	Фиксация - пары формалина 3 мин.
2.	Опустить мазок в эфир на несколько секунд (обезжиривание).
3.	Инкубация Г - 37°С. 4.5 5 часов.
Инкубационная среда готовится перед работой,
Раствор «А».
нафтол AS - В7 (или ASTP, AS - MX - фосфат).
В 10 мг - нафтилфосфата растворить 2 капли диметилформамида, смешать
с 25 мл 0.05 М раствора ацетатного буфера pH - 5.5.
Раствор «Б».
NaNO2 - 4 капли;
парарозанилин - 4 капли.
Встряхивать 30 сек. до оранжево-желтого цвета.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
121
Растворы слить и профильтровать. Инкубировать 4,5 -5 час. при t° - 37°С
в термостате.
4.	Промыть прогонной водой.
5.	Промыть диет, водой.
6.	Докрасить ядра метиленовым зеленым - несколько секунд.
7.	Промыть проточной водой.
8.	Высушить.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛОВОГО ХРОМАТИНА
Соскоб со слизистой оболочки ротовой полости получают с внутренней по-
верхности щеки. Сначала утром натощак шпателем снимают поверхностный
слой эпителия, непригодный для исследования, а затем другим краем шпателя
получают клетки из среднего слоя слизистой оболочки и аккуратно размазы-
вают материал на стекле.
Методика окраски
1.	Мазок фиксируют в смеси спирта и эфира (1:1) 24 часа.
2.	Проводят через 70% и 50% спирты по 1 минуте.
3.	Ополаскивают в дистиллированной воде.
4.	Переносят в 5 н. соляную кислоту.
5.	Промывают в дистиллированной воде - 2 смены по 10 с.
6.	Окрашивают 5-15 с, промывают в проточной воде, высушивают.
Для приготовления красителя смешивают 9,7 г ацетата натрия, 14,7 г веро-
нала, 500 .мл дистиллированной воды, 32 мл 1 н. раствора соляной кислоты. 40
мл 50% спирта, 1 г толуидинового синего. Полученный раствор фильтруют
(pH красителя 5,7).
ОКРАШИВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В МАЗКАХ
Окраска метиленовым синим по Леффлеру
Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового сине-
го со 100 мл 0,01% раствора гидроксида калия. В этом красителе мазки окра-
шивают в течение 3-5 минут, ополаскивают в проточной воде, дифференциру-
ют Зев 0,5% растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде.
Проводят через спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Пре-
параты можно изучать при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но
в этом случае они хранятся недолго.
Результат', бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.
Окраска генциановым или метиловым фиолетовым
Смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианового фиоле-
тового со 100 мл 2.5% раствора фенола (смесь хранится долго). Мазки окра-
шивают в течение 2-5 минут, промывают в проточной воде, сушат и исслсду-
ю'1 при масляной иммерсии.
Результат: Бактерии окрашиваются в густо-фиолетовый цвет.
Окраска основным фуксином по Пфейферу
1 г основного фуксина растворяют в 10 15 мл этилового спирта и смеши-
вают со Ш0 мл 5% раствора фенола. Затем 3 капли полученного раствора до-
бавляют к 10 мл дистиллированной воды и этой смесью окрашивают мазки в
122
Том II - ЧАСТНЫЕ АНА.ПИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
течение 30-40 минут. После этого ополаскивают водой, дифференцируют
0,1% раствором соляной кислоты в абсолютном спирте, ополаскивают в абсо-
лютном спирте и заключают в бальзам.
Результат: бактерии окрашиваются в малиново-красный цвет.
Окраска по Романовскому-Гимзе
Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазком разводят из рас-
чета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашива-
ют 20-25 минут при 37°С во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлаж-
ненным фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной
воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.
Красящую жидкость Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий
краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глице-
рина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется
плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на
100 мг, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной кон-
центрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно
в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и
глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового
спирта можно применять 100% этиловый спирт. Приготовленную красящую
смесь хранят в сухом прохладной месте в плотно закрытом сосуде.
Методика окраски
1	Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1
мл готовой жилкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дис-
тиллированной воды) в течение 40-120 минут (продолжительность окрашива-
ния подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но pH бу-
фера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга - 5,8-6,0, для мазка кро-
ви - 6,4-6,5, для выделения простейших - 6,8. малярийного плазмодия - 7,0-7,2.
2	. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при
иммерсии.
Окрашивание толстой капли, Нефиксированную толстую каплю сушат
в течение 1 часа на воздухе и окрашивают 2-10 минут смесью из 4 мл раство-
ра 1 имзы, 3 мл ацетона, 2 мл буферного раствора (pl I 6.5) и 31 мл дистилли-
рованной воды; Осторожно промывают в дистиллированной воде, высушива-
ют и исследуют при иммерсии. Для сохранения препаратов можно закры ть
толстую каплю покровным стеклом, которое кладут на водный раствор поли-
винилового спирта или раствор желатина.
Толстую каплю (например, для выявления плазмодиев малярии) не фикси-
руют. На высохшую каплю наливают краситель Гимзы, разведенный как опи-
сано выше, и окрашивают 30-50 минут. Осторожно ополаскивают в воде (луч-
ше в стакане), просушивают окрашенный мазок в вертикальном положении и
исследуют при иммерсии.
Результат’ бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цито-
плазма клеток - в голубой, ядра - в красный.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
123
Окраска карболовым тионином Николи
Смешивают 1 часть насыщенней о спиртового раствора тионина с 10 частя-
ми 1% водного раствора фенола, мазки окрашивают 3-5 минут, ополаскивают
в проточной воде, дифференцируют 30 с в 96% спирте, снова ополаскивают в
воде и высушивают. Препарат изучают при масляной иммерсии.
Результат-, бактерии окрашиваются в темно-синий цвет.
Окраска акридиновым оранжевым по Дарту-Тернеру
1.	Мазки фиксируют в смеси равных частей диэтилового эфира и 95% эти-
лового спирта в течение 1 часа.
2.	Проводят через спирты нисходящей концентрации (80%, 70%, 50%) и
дистиллированную воду, окуная мазок по 5 раз в каждую порцию.
3.	Окунают 4 раза в 1% уксусную кислоту.
4.	Переносят в дистиллированную воду на 2 минуты.
5.	Помещают на 3 минуты в ацетатный буфер (pH 3,8).
6.	Переносят в 0,01 % забуференный раствор акридинового оранжево! о на
3 минуты.
7.	Дифференцируют 4 минуты в ацетатном буфере (pH 3,8).
8.	Протирают концы предметных стекол, а затем осторожно удаляют избы-
ток буферного раствора фильтровальной бумагой
9.	Заключают под покровное стекло в буферный раствор и оставляют на
2 минуты. Препарат исследуют с помощью флюоресцентного микроскопа сра-
зу либо, если мазок оставляют надолго, держат в темноте и парафинируют
края покровного стекла. Флюоресценция сохраняется в течение 3 месяцев.
Результат', бактерии, дрожжи, грибы рода Candida окрашиваю тся в крас-
ный цвет, паразиты - в красный.с желтыми ядрами; лейкоциты - ярко-зеленые.
Окраска по Граму для мазков
1.	Мазки крови, церебраспинальной жидкости, экссудатов фиксируют над
пламенем горелки (быстро проводят 3 раза над пламенем мазком вниз)за-
тем высушивают. Кроме фиксации надогнем, для мазков применима фиксация
в метиловом спирте (5 мин) или в парах формалина (в сосуде Коллина) в те-
чение 15 минут.
2.	Мазки окрашивают кристаллическим фиолетовым в течение 1-2 минут
(иногда при этом предметное стекло прогревают 3-4 с над огнем или нагрева-
ют краситель до 60-80°С).
3.	Краситель сливают, стекло промывают водой, мазок заливают на 1 ми-
нуту раствором Люголя или другим йодистым раствором, например по Граму
(2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллированной воды, добавляют 1 г
кристаллического йода, доливают до 300 мл, а-по Вейгерту до 100 мл дистил-
лированной воды), раствор сливают, мазок промывают водой.
4.	Дифференцируют в 96% этиловом спирте 2-3 раза до тех пор. пока не
перестанет отходить краситель, а мазок не обесцветится. Если вместо спирта
использовать ацетон, то промывание продолжается 30 с. Можно дифферен-
цировать смесью спирта и ацетона (1:1) 30 с.
5.	Промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мину-
ты. Докрашивают растворами фуксина, сафранина (0,2-0,5% водный ратвор
124 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
или 0.25% раствор в 10% спирте) основного коричневого либо пиронина J или
В 2-5 минут. Промывают в проточной воде 5 с и высушивают.
Результат', грамоположитсльные микробы окрашиваются в несими-
нерный цвет, грамоотринательные - в красный или коричневый в зависимо-
сти от красителя; ядра клеток - ярко-красные, цитоплазма - розовая.
Красящие растворы. Раствор кристаллического фиолетового по Эрлиху:
1.2 г кристаллического фиолетового растворяют в 12 мл 96% спирта и до-
бавляют 100 мл свежеприготовленной анилиновой воды, полученной при сме-
шивании 2 мл анилина со 100 мл воды. Эта красящая смесь может храниться 2
недели. Вместо кристаллического фиолетового можно использовать метило-
вый фиолетовый.
Красящие смеси для грамоположительных бактерий:
1)	10 г кристаллического фиолетового + 100 мл спирта:
2)	10 г генцианового фиолетового + 100 мл спирта;
3)	Ю г метилового фиолетового + 100 мл спирта;
4)	1 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетово-
го + 10 мл дистиллированной воды:
5)	0,25 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолето-
вого + 100 мл 5% раствора уксусной кислоты;
6)	8-9 г метиленового синего + 100 мл спирта;
7)	30 мл насыщенного раствора метиленового синего в спирте + 1 г гидро-
ксида калия + 99 мл дистил лированной воды.
Красящие смеси для грим отрицательных бактерии :
1)	8-9 г основного фуксина + 100 мл 96% спирта;
2)	1 мл насыщенного спиртовог о раствора основного фуксина + 10 мл ди-
стиллированной воды;
3)	1 г основного фуксина + 1 г фенола + 0. 5 мл глицерина + 10 мл 96%
спирта + 100 мл дистиллированной воды;
4)	0,2-0,5% водный раствор сафранина либо 0,257О раствор сафранина в
10% спирте.
МЕТОДИКА МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
МАТЕРИАЛА
Цитологический анализ включает: обработку присланного материала, при-
готовление препарата, окраску, микроскопию, трактовку цитологической кар-
тины, заключение, в котором дается оценка полученного материала, опреде-
ляется характер процесса (доброкачественный или злокачественный) при
возможности устанавливается нозологическая единица согласно принятым
морфологическим классификациям.
Оценка цитологической картины, гак же, как и при гистологическом ис-
следовании, осуществляется с обязательным привлечением данных клиники и
других методов исследования (анамнез, клинические проявления, результаты
рентгенологического, эндоскопического и других методов исследования).
Основной задачей указанного метода при исследовании различных органов
является установление характера патологического процесса, а также доказа-
тельства существования рака при клиническом подозрении на патологию та-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
125
кого характера. Более того, задачей специалиста является достижение такого
уровня знаний, когда возможно диагностировать тип опухоли с высокой сте-
пенью точности. Отрицательный результат цитологического исследования не
исключает наличие рака.
Существенную роль для правильного заключения играют быстрота полу-
чения, хорошая фиксация и окраска исследуемого материала. При описании
результатов цитологического исследования препаратов необходимо использо-
вать диагностические, а не количественные термины. По возможности следу-
ет указать тип опухоли. Иногда данные цитологического исследования позво-
ляют только констатировать наличие злокачественного новообразования, а не
определить тип опухолевых клеток. Однако даже такое заключение оказыва-
ется ценным для правильного ведения больного.
Поскольку методы лечения онкологических заболеваний могут быть весь-
ма агрессивными, при отсутствии убедительных признаков опухоли необходим
контроль в целях предотвращения гипердиагностики. Некоторые сложные
спорные случаи требуют гистологического подтверждения диагноза Следует
изучать также и неудачные препараты, но отрицательное заключение нс
должно категорически отрицать наличие опухоли.
Ци тологическое исследование препаратов должно состоять из подробного
описания морфологической картины и заключения, по возможности с указа-
нием характера процесса (доброкачественный или злокачественный), при на-
личии опухоли, определении тканевой принадлежности, гистологической фор-
мы и степени дифференцировки опухоли. Описание цитологической картины
должно проводиться по одной схеме и включать в себя: осмотр при малом уве-
личении (обзор) и при иммерсии. Особое внимание следует обращать на сле-
дующее:
1.	Фон препарата, наличие и характер межуточного вещества.
2.	Количество и расположение клеток, образование комплексов или стру-
ктур, сохранность клеточных границ
3.	Размеры и формы клеток.
4.	Ядро  форма и размеры, расположение и окрашиваемость.
5.	Ядерно-цитоплазматическое соотношение.
6.	Характер строения хроматина.
7.	Ядрышки - количество, форма, размеры, четкость границ.
8.	Цитоплазма - объем, окраска, четкость границ, секреция, включения, ва-
куолизация.
9.	Наличие многоядерных клеток, фигур деления (атипичные митозы).
Фон препарата часто имеет большое диагностическое значение. Фоном
препарата могут быть элементы периферической крови или воспаления, со-
провождающего опухолевый процесс, клеточный детрит, межуточное вещест-
во. Фон препарата в виде межуточного вещества може т иметь диагностиче-
ское значение при определении тканевой принадлежности опухали( хрящеоб-
разушие опухоли) или гистологический формы (слизеобразующие аденокар-
циномы).
Количество клеток вмазке определяется прочностью межклеточной свя-
зи. обилием стромы Богатый клеточный состав бывает в низкодифференци
рованных опухолях, гематосаркомах и др. (низкодифференцированный рак,
126 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
лимфосаркома, опухоль Юинга и др.). Единичные опухолевые клетки встреча-
ются при остеопластической (склеротической) остеогенной саркоме, фибро-
зирующих раках и др.).
Расположение клеток, образование комплексов или структур является од-
ним из важных диагностических признаков. Так, для рака характерно образо-
вание самых разнообразных комплексов, наряду с разрозненно расположенны-
ми клетками. Наличие типичных железистоподобных, тубулярных, папилляр-
ных структур позволяет говорить-об аденокарциноме. В опухолях мезенхиаль-
ной природы клеточные элементы располагаются преимущественно разроз-
ненно, хотя могут быть синтициальные пласты и скопления без формирова-
ния определен пых структур, тяжи клеток. В саркомах клетки располагаются
иногда в виде пучков. Розеткоподобные структуры могу г определятся в самых
различных новообразованиях (опухоль Юинга, аденокарцинома, хемодектома,
синовильная саркома и др.).
Ядро - форма - округлая, овальная, полигональная(неправильная), вытяну-
тая (веретенообразная), бобовидная, в виде перекрученного жгута, булавовид-
ная и другие.
Размеры - мелкие (примерно размеры лимфоцита), средних размеров
крупное, гигантское.
Расположение - в центре, эксцентрично, занимает почти всю клетку, го-
лое" ядро, голоядерная клетка (цитоплазма почти не определяется). Необхо
димо обращать внимание на комплексы ядер, напластовывание ядер.
Окрашиваемость - гипохромия, гиперхромия.
Сдвиг' ядерно-цитоплазматического соотношения в пользу ядра, в пользу
цитоплазмы.
Строение хроматина - равномерное, регулярное, хроматин тонкодисперс-
ный, мелкозернистый, грубозернистый, глыбчатый (в виде грубых глыбок),
конденсация хроматина по краю ядерной мембраны, распределен неравномер-
но, равномерно, разряжен.
Строение ядерной мембраны - сохранена, четкие контуры, нечетко очер-
чена, имеются разрывы, не на всем протяжении прослеживается.
Ядрышки - просматриваются, определяются, не просматриваются, количе-
ство, форма - округлая, неправильная, разнообразные по форме и размерам,
четкость границ.
Цитоплазма - обильная, умеренная, скудная, цвет (голубой, серо-голубой,
розовый, розово-фиолетовый и др.), окрашена равномерно, неравномерно,
стекловидная, включсния(зерна. пылевидная зернистость, пенистая цитоплаз-
ма и др.) признаки секреции, четкость границ (четкие, неровные, сливается с
фоном), вакуолизация. Существенным признаком является характер цито-
плазмы, наличие включений в ней. Кератоз цитоплазмы значительного коли-
чества клеток позволяет думать о плоскоклеточном ороговевающем раке, на-
личие гранул меланина - о меланоме.
Многоядерные клетки, фрагментов и почкования ядер. Митозы, атипичные
митозы.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 127
Если материала достаточно, клетки сохранные, хорошо приготовлен и ок-
рашен препарат, то часто без описания препарата дается заключение о гисто-
логической форме опухоли с указанием степени дифференцировки (низкодиф-
ференцированная аденокарцинома, плоскоклеточный ороговевающий рак. ос-
теогенная саркома).
В тех случаях, когда материал и цитологическая карта недостаточно убе-
дительны для установления конкретного диагноза, дается описание препарата,
отдельных клеточных элементов и при возможности их оценка.
Многочисленными и очень детальными исследованиями установлено, что
клетка злокачественного новообразования не имеет строго специфических
морфологических и цитохимических признаков. Однако, основываясь на ком-
плексе цитологических критериев злокачественности, с достаточной степе-
нью достоверности можно установить принадлежность клетки к злокачест-
венному новообразованию.
ОБЩЕПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ЦИТОЛОГИИ
ВОСПАЛЕНИЕ
Воспаление складывается из тесносвязанных между собой и последова-
тельно развивающихся фаз:
1.	Альтерация - повреждение ткани, пусковой механизм воспаления;
2.	Экссудация - экссудация составных частей плазмы крови, миграция кле-
ток крови, фагоцитоз, образование экссудата и воспалительного клеточного
пролиферата. Эта фаза играет важную роль в развертывании всего комплек-
са тканевых изменений:
3.	Пролиферация - размножение клеток. В этот период формируется кле-
точный состав воспалительного инфильтрата.
Основными клеточными элементами воспаления являются:
Фибробласты - наиболее распространенные клетки соединительной тка-
ни. Форма клеток отростчатая. границы отчетливы. Цитоплазма иногда нерав-
номерно окрашена, в ней встречаются вакуоли. Ядра бледно окрашены, хро-
матин пылевидный. В дальнейшей дифференцировке клетки превращаются в
фиброциты, для которых характерно более гиперхромное с плотным хромати-
ном, небольших размеров, округлое ядро; цитоплазма светлая, в виде отростков.
Малые гистиоциты - клетки обычно имеют округлую форму, однако мо-
гут встречаться клеточные элементы неправильных очертаний. Ядро, округ-
лой или овальной формы, часто располагается эксцентрично, светло окраше-
но. Обычно среди групп малых гис тиоцитов имеются одна или более клеток с
типичными бобовидными или почковидными ядрами, которые являются хара
ктерными для этого вида клеток. Цитоплазма светлая, иногда нежно вакуоли-
зирована и может содержать фагированныс частицы.
Гигантские многоядерные гистиоциты - клетки инородных тел в 2-10 раз
крупнее обычных малых гистиоцитов. Ядра округлые с нежной сетью хро ма
тина, распределены в цитоплазме равномерно, но иногда могут бы гь сосредо-
точены в центральной части клеток. Клетка может содержать до 100 ядер, од-
нако чаще имеется 20-40 ядер. Цитоплазма обильная, эозинофильная. Грани-
цы клеток четкие. Гигантские клетки Лангханса отличаются от гигантских
128 Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
клеток инородных тел главным образом локализацией часто несколько вытя-
нутых и перекрывающих друг друга ядер по периферии клетки.
Эпителиоидные клетки являются мононуклеарными фагоцитами и распо-
лагаются вокруг очагов некроза в туберкулезных или других специфических
гранулемах. По строению они имеют некоторое сходство с эпителиальными
клетками. Эпителиоидные клетки обычно вытянутой формы. Эти клетки во
многом сходны с обычными гистиоцитами и обнаруживаются в комплексах
вместе с другими типами гистиоцитарных элементов. Часто встречаются пере-
ходные формы между вытянутыми и округлыми клетками. Эпителиоидные
клетки имеют плохо очерченную, нежно вакуолизированную эозинофильную
цитоплазму. Ядра вытянутые и часто перекрученные. Они могут иметь вере-
тенообразную, иногда видоизмененную почковидную или бобовидную форму,
часто встречаются ядра грушевидной формы.
Тучные клетки (лаброциты) - большей частью имеют округлую форму,
неровные края, ядра богаты хроматином, в цитоплазме содержится специфи-
ческая базофильная зернистость.
Плазматические клетки округло-овальной формы. Эксцентрично распо-
ложенное ядро гиперхромное, хроматин располагается радиально(ядро имеет
вид "колеса со спицами ). Цитоплазма резко базофильная, с зоной просветле-
ния вблизи ядра. Молодые формы более крупных размеров, хроматин ядра
равномерный, сетчатый. 1-2 ядрышка, цитоплазма резко базофильная неши-
роким ободком окружае т ядро.
Адвентициальные клетки - обычно имеют вытянутую форму, овальное
светлое ядро. Эти клетки прилегают к стенкам кровеносных капилляров, и
способны превращаться в другие клеточные формы, поэтому их называют ма-
лодифферснциальными или камбиальными. Из камбиальных клеток могут
развиваться фибробласты, макрофаги, клетки крови.
В процессе формирования клеточного инфильтрата воспаления камбиаль-
ные мезенхимальные клетки дифференцируются в фибробласты, В-лимфоци-
ты дают начало клеткам плазматического ряда, моноциты - дают начало гис-
тиоцитам и макрофагам. Макрофаги могут быть источником эпителиоидных
клеток, из которых строятся гигантские многоядерные клетки, клетки инород-
ных тел (Пирогова-Лагханса).
Острое воспаление - преобладают нейтрофильные лейкоциты, эозинофи-
лы. макрофаги.
Хроническое воспаление - преобладают лимфоидные элементы и клетки
плазматического ряда.
Продуктивное воспаление - пролиферативное воспаление - образуются
очаговые и диффузные инфильтраты, которые могут быть полиморфнокле-
точные или круглоклеточные (лимфоцитарно моноцитарные), макрофагаль-
ные, эпителиоидноклеточные. гигантоклеточные, плазмоклеточныс и др.
Продуктивное воспаление встречается в любом органе, любой ткани и ос-
новные его виды
1. Межуточное (интерстициальное) воспаление характеризуется образо-
ванием клеточного инфильтрата в строме органа Инфильтрат представлен
молодыми (камбиальными) мезенхимальными клетками, гистиоцитами, моно-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
129
цитами, лимфоцитами, спазматическими клетками, лаброцитами (тучными
клетками), единичными нейтрофильными и эозинофильными лейкоцитами.
Моноцитарные фагоциты становятся макрофагами; молодые мезенхимальные
клетки превращаются в фибробласты, а последние в фиброциты. При некото-
рых формах продуктивного межуточного воспаления, особенно если оно при-
нимает хронический характер, накапливаются плазматические клетки
2. Гранулематозное воепаление - характеризуется образованием гранулем
(узелков), возникающих в результате пролиферации и трансформации способ-
ных к фагоцитозу клеток. Образование гранулемы происходи г в три стадии:
а)	накопление в очаге повреждения ткани юных моноцитарных фагоцитов;
б)	созревание этих клеток в макрофаги и агрегация их с образование*! зре-
лой гранулемы;
в)	дальнейшее созревание моноцитарных фагоцитов и макрофагов в эпите-
лиоидные клетки и агрегация их с образованием эпителиодной гранулемы.
При этом происходит слияние эпителиоидных клеток (или макрофагов), что
ведет к образованию гигантских клеток инородных тел, которые при опреде-
ленных условиях могут превращаться в гигантские клетки Пирогова-Лангханса
Гранулемы встречаются при острых и некоторых хронических инфекцион-
ных и неинфекционных заболеваниях. Они очень характерны для инфекцион-
ных заболеваний, в основе которых лежит специфическое воспаление (тубер-
кулез и др.).
Примером гранулематозного воспаления могу г служить также гранулемы
при саркоидозе, являющиеся выражением тканевой аутоаллегории. т.е. имею-
щие отношение к иммунопатологическим процессам. Для саркоидных грану-
лем, которые образуются в лимфатических узлах и, реже, во внутренних орга-
нах, характерно наличие эпителиоидных клеток, образующих i ранул ему, и ги-
гантских многоядерных клеток с небольшой примесью лимфоцитов. От тубер-
кулезных бугорков саркоидные гранулемы отличаются отсутствием некрозов.
3. Продуктивное воспаление с образованием полипов и остроконечных
кондилом наблюдается на слизистых оболочках и в граничащем с ними плос-
ком эпителии. Разрастание железистого эпителия и стромы слизистой оболоч-
ки приводит к образованию множества мелких сосочков или более крупных
образований, называемых полипами Такие полипозные разрастания наблюда-
ется при длительном воспалении слизистой оболочки носа, желудка, прямой
кишки, матки, влагалища и др.
В участках плоского эпителия, который расположен вблизи призматиче-
ского, например в анусе, половых органах, при хроническом воспалении обра
зуются сосочковые образования, покрытые плоским эпителием - остроконеч-
ные кондиломы.
Основными клеточными компонентами клеточных реакций при иммунопа-
тологических процессах, развитие которых связано с нарушением функции
иммунокомпетентной ткани, являются лимфоциты и макрофаги.
Следует учесть, однако, что иммунные реакции присутствуют при воспале-
нии, гиперплазии лимфоидной ткани, сопровождают опухолевые процессы. В
цитологической картине это имеет отражение в виде наличия молодых форм
лимфоидного и и шзмати чес ко го ряда.
130 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИЗ ИЧЕСКИЕ TEXIЮЛОГИИ
РЕГЕНЕРАЦИЯ
Регенерация - восстановление структурных элементов ткани взамен погиб-
ших, самовоспроизведение живой материи, восстановление как структуры,
гак и функции.
Восстановление структуры и функции может осуществляться с помощью
клеточных и внутриклеточных гиперпластических процессов. На этом основа-
нии различают клеточную и внутриклеточную формы регенерации. Для кле-
точной формы регенерации характерно размножение клеток митотическим и
амитотическим путем. Для внутриклеточной формы регенерации - увеличение
числа (гиперплазия) и размеров (гипертрофия) ультраструктур (ядра, мито-
хондрий, рибосом и т. д.).
Преобладание той или иной формы регенерации в определенных органах и
тканях определяется их функциональным назначением, структурно-функцио-
нальной специализацией. Все ткани и органы обладают способностью к реге-
нерации, различны лишь се формы в зависимости от структурно-функцио-
нальной специализации ткани или органа.
Так, преимущественно клеточная регенерация характерна для кости, эпи-
дермиса, слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, дыхательных и
мочевыводящих путей, рыхлой соединительной ткани, эндотелия, мезотелия,
кроветворной системы, лимфоидной ткани. Цитологическая картина при этом
может отличаться значительным количеством молодых форм, что не должно
расцениваться как предопухолевая пролиферация.
Клеточная и внутриклеточная регенерация характерна для печени, почек,
поджелудочной железы, эндокринных желез, легкого, гладких мышц. При
этом может наблюдаться некоторое укрупнение клеток, ядер, появление неко-
торого полиморфизма клеточного и ядерного, что также должно получать со-
ответствующую оценку.
Внутриклеточная регенерация свойственна миокарду, скелетным мышцам,
что проявляется укрупнением отдельных клеток и ядер.
Морфогенез регенераторного процесса складывается из двух фаз: проли-
ферации и дифференцировки. В фазу пролиферации размножаются молодые,
недифференцированные клетки. Эти клетки называются камбиальными, ство-
ловыми клетками и клетками-предшественниками.
Для каждой ткани характерны свои камбиальные клетки, которые отлича-
ются степенью пролиферативной активности и специализации, однако, ство-
ловая клетка может быть родоначальником нескольких видов клеток (крове-
творная ткань, соединительная ткань).
В фазу дифференцировки молодые клетки созревают, происходит их стру-
ктурно-функциональная специализация. Та же смена гиперплазии ультрастру-
ктур их дифференцировкой ("созреванием ) лежит в основе внутриклеточной
регенерации.
ПРИЗНАКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ
/ Клетка:
а)	размер клеток превосходит размеры клеток гой ткани, которая явилась
источником опухолевого роста: клетки могут быть гигантских размеров. Из-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 131
менение размера не абсолютный показатель - размеры клеток могут быть не
изменены.
б)	изменение формы клеток -она не полностью или мало соответствует той
форме, которая свойственная клеткам нормальной ткани. Форма может быть
самая причудливая. Может определяться отчетливый клеточный полимор-
физм, г. е. клетки разных размеров и формы.
в)	изменяется ядерио-цитоплазматичсскос соотношение и. как правило, в
пользу ядра(за счет увеличения последнего).
г)	появление многоядерных клеток, с отчетливым ядерным полиморфиз-
мом.
д)	атипичное расположение ядра.
е)	диссоциация в созревании ядра и цитоплазмы (молодое ядро в зрелой
клетке, зрелое ядро в незрелой цитоплазме).
//. Ядро:
а)	увеличение размера ядра.
б)	изменение формы ядра, иногда ядра приобретают самую причудливую
форму, ядерный полиморфизм.
в)	контур ядра неправильный, неравномерно извилистый, иногда с глубоки-
ми вырезками, нередко грубо очерчен
г)	ядерная мембрана неравномерно утолщена, разрывы.
///. Строение хроматина:
а)	неравномерность, грубость, разряжен.
б)	в недифференцированных и низкодифференцированных опухолях может
быть тонкодисперсный, распределен равномерно.
в)	окрашиваемость, чаще всего - гиперхромия.
/Е Ядрышки:
а)	чаще всего определяются,
б)	размеры увеличены.
в)	форма неправильная, нередко полиморфизм.
г)	число увеличено.
Степень выраженности этих признаков может быть различна, у анаплази-
рованных опухолей она чрезвычайно велика. Вместе с тем в высокозлокачест-
венных низкодифференцированных новообразованиях признаки атипии (по-
лиморфизм в строении ядра и цигоплазмы, нарушении регулярности строения
хроматина и др.) могут быть минимальными.
Некоторые термины, широко используемые при описании и оценке
цитологической картины
Гипертрофия - увеличение объема органа, ткани, клеток,внутриклеточ-
ных структур.
Гиперплазия - увеличение числа структурных элементов ткани и клеток.
Оба процесса взаимосвязаны: при гипертрофии может увеличиваться кле-
точный объем за счет гиперплазии (увеличения числа) внутриклеточных ульт-
132 Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИ ГИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
раструктур. В то же время, при гиперплазии могу г появляться гипертрофиро-
ванные многоядерные клетки.
Пролиферация - размножение клеток.
Дифференцировка - "созревание", структурная и функциональная специа-
лизация. В норме эти процессы происходят одновременно.
Метаплазия - переход одного вида ткани в другой, родственный, вид. Ме-
таплазия возникает в связи с предшествующей пролиферацией недифферен-
цированных клеток и начинается с размножения камбиальных клеток, диффе-
ренцирующихся в направлении нс призматического эпителия, а многослойно-
го плоского эпителия. Наблюдается метаплазия в дыхательных путях, вывод-
ных протоках слюнных желез, в поджелудочной железе. Может наблюдать-
ся плоскоклеточная метаплазия цервикального эпителия. В переходном эпите-
лии может наблюдаться плоскоклеточная и железистая метаплазия.
Лтипия - отличие от нормальных клеток структуры, функции, дифферен-
цировки.
Анаплазия, катапяазия - приобретение клетками новых, не присущих нор-
мальным клеткам свойств структурных особенностей. Морфологическая ана-
плазия - изменение внутриклеточных структур, а также формы и размеров
клеток. При анаплазии происходит дедифференцировка клеток, приобретение
ими эмбриональных свойств.
Дистрофия - один из видов повреждения.
Некроз - необратимое прекращение жизнедеятельности клетки.
Некробиоз - изменения, предшествующие некрозу и представленные необ-
ратимыми дистрофическими процессами.
Некроз клеток характеризуется изменениями ядра и цитоплазмы, ядра при
омертвении подвергаются пикнозу, лизису, рексису.
Кариопикноз проявляется в сморщивании, уплотнении ядер, конденсации
хроматина и гиперхромии; определяется инвагинация ядерной оболочки, ее
разрывы и отслойка, гомогенизация кариоплазмы, агрегация хроматина, обра-
зование глыбок, выход их за пределы ядра.
Кариорексис - в начале образуются разной величины глыбки хроматина,
которые часто располагаются по периферии ядра а затем его фрагментация и
распад на глыбки.
Кариолизис - растворение, исчезновение хроматина, гипохромия, отек,
утолщение ядерной оболочки, отек и просветление нуклеоплазмы, перерас-
пределение хроматина и выход его в цитоплазму.
Один из признаков глубоких дис трофических изменений - вакуолизация ядра.
Дистрофические изменения цитоплазмы проявляются слабым окрашива-
нием. исчезновением цитоплазмы и появлением так называемых голых' ядер.
Дисплазия. Этим гермином следует обозначать только нарушения
дифференцировки эпителия (или неэпителиальной ткани) предракового хара-
ктера в результате пролиферации камбиальных элементов (недифференциро-
ванных клеток-предшественников, стволовых клеток) с развитием в них ати-
пии, утратой полярности и нарушением гистоструктуры, без инвазии базаль-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
133
ной мембраны и с возможностью обратного развития.
Для многослойного плоского эпителия - это базальноклеточная гиперпла-
зия явления гипср- и паракератоза, увеличение митотической активности с по-
явлением атипических митозов.
Для железистого эпителия - это полиморфизм и гиперхромия ядер, возрас-
тание ядсрно-цитоплазматического отношения, изменение функциональной
активности клеточных элементов (патологическое ороговение, слизеобразо-
вание. изменение секреции гормонов).
В соответствии со степенью пролиферации эпителия и выраженностью
атипии выделяют: слабую; умеренную и выраженную дисплазию. При этом от
степени к степени нарастают полиморфизм и гиперхромия ядер, увеличивает-
ся ядер но/цитоплазмати чес кое отношение, число митозов и соответственно
продукция клеток, сокращается продолжительност], их жизни, что ведет к бы-
строму обновлению клеточной популяции. Степень дисплазии определяется
гл у би нои и зм е пени й.
Рак "in situ'\ прсдынвазивный вну три эпителиальный - полное замещение
эпителиального пласта анаплазированными элементами. Единственное досто-
верное отличие предынвазивного рака от инвазивного видимая сохранность
базальной мембраны.
Дне плас тичел кие пролифераты отличаются значительно более пестрым
клеточным составом, чем раковые опухоли в начальных фазах роста. Так, в
оча1 ах микроинвазивного рака дифференцировка клеток значительно выше, а
число митозов, в том числе патологических, меньше, чем в предынвазивном
раке.
Типы цитологических заключений
I.	Картина воспаления - элементы воспаления (лейкоциты нейтрофильные
и эозинофильные, лимфоидные элементы, гистиоциты, клетки фибробласти-
ческого ряда, плазматичссике клетки).
2	Пролиферирующие клеточные элементы.
3.	Диагностическое заключение о доброкачественном процессе или опухо-
ли (цитологическая картина саркоидоза, цитограмма соответствует хондроме
и др.).
4.	Клетки с признаками атипии это. как правило, доброкачественные эле-
менты; признаки атипии могут быть обусловлены быстрым ростом, воспале-
нием (в таких случаях необходимо повторить исследование, лечи ть воспаление
или доброкачественный процесс с обследованием после лечения).
5.	Подозрение по принадлежности к элементам йпокачествеиного новооб-
разования - это клетки с выраженными признаками атипии, клетки с выражен-
ными дистрофическими изменениями - в таких случаях необходимо обязатель-
но повторное исследование, наблюдение. Чаще всего при этом заключении
есть серьезные основания подозревать злокачественный процесс.
6.	Диагностическое заключение о злокачественной опухоли (плоскокле-
точный ороговевающий рак. лимфогранулематоз, остеогенная саркома и др.).
7.	Описательный ответ - может быть дан при малом количестве материала,
или он представлен в основном элементами воспаления или периферической
134
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
крови, отдельными клеточными элементами с выраженными дистрофически-
ми изменениями, затрудняющими дифференцировку клеток. В описании мо-
жет быть указано, что послужило причиной отсутствия диагностического за-
ключения (малое количество материала, трудность трактовки обнаруженных
клеточных элементов и всей цитологической картины).
8.	Отрицательный отвез' - клеток злокачественного новообразования нс
обнаружено. В таких случаях можно указать какие элементы обнаружены (пе-
риферическая кровь, элементы воспаления и др.).
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ
РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ И СИСТЕМ
ЖЕНСКИЙ ПОЛОВОЙ ТРАКТ
Цитологические исследования в гинекологии занимают особое место.
Здесь разработана целая система цитологического анализа, позволяющая ус-
тановить ряд весьма ценных показателей: гормональный статус, степень чис-
тоты и характер флоры, наличие инфицирования трихомонадами, гарднерел-
лами, хламидиями и, что весьма важно возможность диагностирования предо-
лухолевых и опухолевых поражений.
В направлении на исследование должны быть отражены следующие данные:
1.	Фамилия, имя, отчество, возраст.
2.	Возраст начала месячных, количество абортов и родов.
3.	Жалобы больной.
4.	Характер менструального цикла и дата последнего.
5.	Применяемые противозачаточные средства, гормональное лечение.
6.	Дата исследования.
Правильная оценка цитологических данных в этих случаях зависит от пра-
вильной техники приготовления вагинальных мазков, в оценке которых необ-
ходимо придерживаться определенных структурных наименований и класси-
фикаций в соответствии с современными данными.
Цитология клеточных элементов в мазках с шеики матки
1.	Слизистая оболочка влагалищной части матки выстлана многослойным
плоским эпителием, состоящим из базального, парабазального промежуточ-
ного и функционального (поверхностного) слоев.
2.	Слизистая оболочка цервикального канала покрыта высоким призмати-
ческим эпителием с базальным расположением ядер, цитоплазма клеток со-
держит слизь. Под призматическим эпителием нередко обнаруживаются ре-
зервные (камбиальные) клеточные элементы. Два вида эпителия: многослой-
ный, плоский и призматический имеют стык в области наружного маточного
зева.
3.	Многослойный плоский эпителий влагалищной части меняется в зависи-
мости от фаз овариально-менструального никла: в климактерическом перио-
де в менопаузе наблюдается его атрофия. Эти изменения эпителия в зависимо-
сти от фаз овариально-менструального цикла отражаются и на цитограммах.
В мазках клетки функционального слоя имеют полигональную, реже ок-
руглую или овальную форму с четкими границами. Диаметр их от 40 до 50
мкм. Ядра маленькие, пикнотичные, интенсивно окрашены, диаметром до 6
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
135
мкм. Структура хроматина не определяется. Ядерно-цитоплазматическое со-
отношение равно 1:10. Цитоплазма широкая, светлая, содержит зерна глико-
гена. Клетки функционального слоя в мазках располагаются в виде пластов и
полей. Наличие их в большом количестве в мазках является отражением эст-
рогенной активности
Клетки промежуточного слоя многослойного плоского эпителия меньше
по размерам клеток функционального слоя. Диаметр их 25-30 мкм. Ядра пу-
зырьковидные, округлые или овальные с хорошо выраженным тонко петли-
стым хроматином. Цитоплазма базофильна, содержит гликоген.
Появление значительного числа промежуточных клеток в мазках отмеча-
ется в начале фолликул и но вой и во время лютеиновой фаз, в послеродовом
периоде, менопаузе, являясь отражением недостаточности эстрогенных гор-
монов.
Парабазальные клетки в мазках имеют округлую, овальную, иногда поли-
гональную форму с четкими границами. Размеры их разные и колеблются в
пределах 12-30 мкм. Ядра, как и в клетках промежуточного слоя, с нежным
тонкопетлистым или мелкозернистым хроматином, иногда видно ядрышко.
Цитоплазма резко базофильна, гликоген выявляется не всегда. Парабазаль-
ные клетки могут обнаруживаться в мазках из влагалища во время менструа-
ции в период менопаузы.
Базальные клетки многослойного плоского эпителия мелкие, ядерно-цито-
плазматическое соотношение равно 1:3. Ядра округлые, хроматин мелкозер-
нистый. содержит 1-2 ядрышка. Цитоплазма в виде узкого ободка, резко базо-
фильная. гликоген в клетках не содержи тся. В мазках здоровых женщин ба-
зальные клетки появляются только в период менопаузы.
Появление в мазках в значительном числе парабазальпых и базальных кле-
ток говорит о каком-либо патологическом процессе со стороны шейки матки.
В мазках из влагалища наряду с эпителиальными клетками могут быть и
другие элементы. в частности, эритроциты, лейкоциты. Особенно много лей-
коцитов выявляется пекле менструации. Они могу г появляться у женщин в пе-
риод менопаузы. В мазках на стадии менструации нередко обнаруживаются ги-
стиоциты.
Эпителиальные клетки слизистой оболочки цервикального канала разной
величины, расположены изолированно или в виде групп, железистоподобных
структур, форма призматическая. ядра овальной или округлой формы, хрома-
тин нежный мелкодисперсный, цитоплазма слабо базофильная, в апикальной
части содержач’ся зерна слизи. Наряду с секреторным призматическим эпите-
лием встречаются реснички, хорошо выраженные на апикальной поверхности.
В ряде случаев эпителиальные клетки в мазках располагаются не вдоль про-
дольной оси тела клетки, а поперечно, клетки при этом выглядят округлыми
или полигональными с центральным расположением ядра. В мазках могут об-
наруживаться и резервные клетки призматического эпителия Резервные
к’летки округлой формы, со скудной бледно-окрашивающейся цитоплазмой и
круглым, занимающим почти всю цитоплазму ядром. Хроматин ядра плохо
различим.
136	Том и - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
При исследовании мазков, взятых у женщин при секреторной фазе цикла,
во время беременности и при дисгормональных изменениях возможно обнару-
жение металлизированного многослойного плоского эпителия. Клеточные
элементы похожи на клетки многослойного плоского эпителия, но цитоплазма
их содержит либо слизь, либо и гликоген и слизь.
При беременности в мазках наряду с подобного рода эпителиальными эле-
ментами отмечаются нередко и децидуальные клетки.
Цитологические индексы в гормональной оценке вагинальных мазков
Подсчет клеточных элементов мазка и представление морфологического
состава его в виде соответствующих индексов позволяет дать более достовер-
ную опенку наблюдаемой картины для целей гормональной цитодианосi ики.
Техника приготовления вагинальных мазков
1.	Материал для исследования нужно брать из верхне-бокового свода вла-
галища.
2.	Материал наносится на стекла и размазывается.
3.	Перед окраской мазок должен быть подсушен и зафиксирован в жидко-
сти Никифорова.
4.	Подсчет' клеточных элементов должен проводиться в нескольких полях
зрения мазка.
Индекс созревания (ИС) - представляет собой численное соотношение
всех парабазальных, промежуточных и поверхностных клеток в вагинальном
мазке, выраженное в процентах.
ИС определяется при подсчете 100-200 клеток в мазке нс менее чем в 5-8
полях зрения, т.к. 1-2 поля зрения могут дать неправильную информацию.
ИС обозначается в виде формулы, где слева записывается количество па-
рабазальных клеток, посредине - промежуточных, справа - поверхностных.
В случае отсутствия какого-либо вида клеток на их месте ставится нуль.
Примеры ИС:
1.	Выраженная атрофия в мазках только парабазальные клетки ИС
100/0/0;
2.	Умеренная атрофия - есть только парабазальные и промежуточные
клетки ИС 70/30/0 или 50/50/0;
3.	Умеренная пролиферация - парабазальные отсутствуют, преобладаю'!’
промежуточные. ИС 0/80/20, усиление пролиферативной активности может
быть обозначено стрелкой ИС =0/50/50.
4.	Выраженная пролиферация парабазальные клетки отсутствуют, в маз
ке преобладают поверхностные клетки. ИС- 0/20/80 или ИС -0/0/100. если
есть уменьшение пролиферативной активности, может быть указана так: ИС
- 0/20/80. Следовательно, ИС в ответе, помимо цифр, может быть охаракте-
ризован как сдвиг вправо и влево. ИС очень часто характеризует состояние
эпителия при гормональном лечении. Однако, с помощью одного лишь ИС
нельзя раскрыть специфику действия каждого из гормонов, поскольку опреде-
ление И( основывается только на морфологических особенностях клеточно-
го состава вагинально! о мазка.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
137
Кариопикнотический индекс (КИ) - представляет собой процентное от-
ношение всех отслоившихся зрелых поверхностных клеток с пикнотичными
ядрами к клеткам, содержащим везикулярные ядра с диаметром более 6 мкм. В
процессе созревания клеток с ядром происходи'!' его сморщивание, т.е. карио-
пикноз.
При нормальной реакции вагины КИ изменяется в строгой зависимости от
силы гормонального влияния. Для подбора соответствующей дозы необходим
подсчет КИ.
У женщин репродуктивного возраста с помощью подсчета КИ можно оп-
ределить характер менструального цикла. Высокие степени КИ в детском воз-
расте и в менопаузе говорят о патологической пролиферации.
Эозинофильный индекс (ЭИ) - представляет собой процентное соотно-
шение всех зрелых отделившихся поверхностных клеток с эозинофильной ок-
раской цитоплазмы к зрелым поверхностным клеткам с базофильной окра-
ской цитоплазмы. Для дифференциальной окраски мазков вагинального эпи-
телия применяются различные методы.
Чем сильнее эстрогенная стимуляция, тем больше появляется в мазках по-
верхностных эозинофильно-окрашиваемых клеток.
Во время нормального менструального цикла наибольшее число эозино-
фильных поверхностных клеток в мазках наблюдается в среднюю фоликули-
новую фазу.
Эстрогены оказывают большое влияние на синтез РНК, поэтому он очень
колеблется в течение жизни у женщин.
Числовой индекс созревания (ЧИС) - представляет собой сумму число-
вых значений каждого вида клеток, имеющихся в мазке. Для этого каждый вид
клеток эпителия условно обозначается цифровой величиной.
Поверхностные клетки эозинофильные - 1,0
Базофильные - 0,8.
Большие промежуточные клетки - 0,6.
Малые промежуточные клетки - 0,5.
Парабазальныс - 0,0.
При подсчете ЧИС мазок должен включать только свободно отделившие-
ся клетки с нормальной морфологией. Подсчитывают в среднем 200 клеток и
число каждого вида клеток умножают на соответствующее числовое значе-
ние. I {слученная сумма характеризует мазок. Таким образом, мазок, содержа-
щий только парабазальные клетки, будет иметь показатель созревания, рав-
ный 0. Чем выше степень созревания эпителия, тем больше в мазках клеток с
высоким числовым индексом и тем выше будет общая сумма, полученная при
подсчете клеточного состава мазка.
Индекс складчатости - представляет отношение всех складчатых зрелых
поверхностных клеток к числу плоских зрелых поверхностных клеток. Скру-
чивание или свертывание клеток проявляется главным образом при протесте
ромовой стимуляции. Клетки выглядят в виде скрученного или сложенного в
виде конверта листа. Он может быть выражен в процентах^ Отношение обще-
го числа складчатых поверхностных клеток к числу плоских не свернутых кле-
ток.
138
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Индекс скученности или группировки клеток - это скопление зрелых
клеток от 4-х или больше в отношении к зрелым клеткам, расположенным
раздельно. Он также отображает прогестероновое действие на влагалищный
эпителий. Его описывают в 3-х бальной системе. Выраженная скученность -
III (+++). умеренная - II (++), слабая - I (+).
Индекс поверхностных клеток - представляет собой отношение всех зре-
лых поверхностных клеток к общему числу всех других отделившихся клеток.
Этот индекс мало показателен. Все эти индексы могут быть эффективны
только в свете клинических данных и при учете других тестов функциональ-
ной диагностики и только в этом случае может бы ть сделана правильная оцен-
ка мазка.
Ни один из перечисленных выше индексов не может дать исчерпывающую
информацию и ни один не может иметь преимущес тва перед другими. Каждый
индекс предназначен для определенной цели.
Так. ИС - отражает степень пролиферации или атрофии, с помощью ЭИ и
КИ обозначаются степень пролиферации. Если речь идет о гормональном ле-
чении или о нарушениях менструального цикла в репродуктивном периоде
ЭИ и КИ дополняют индекс созревания.
Индекс свертывания и складчатости информирует о наличии прогестеро-
нового влияния, но они дают представление о нем на фоне динамики индекса
созревания и динамики изменений ЭИ и КИ. Если речь идет об изолированном
действии эстрогенов, можно oi раничиться тремя индексами - созревания, эо-
зинофильным и кариопикнотическим.
Однако, иногда такое положение с гормонами, что следуе т отдавать пред-
почтение только одному индексу.
Так, при беременности ЭИ является более надежным, чем КИ, так как
повышение одного КИ при низких уровнях ЭИ еще не свидетельствуем о пло-
хом прогнозе беременности.
Тины клеточной реакции с учетом цитологических индексов
L Степень пролиферации (II-I)
В мазках преобладают промежуточные клетки (до 90%) и (10%) поверх-
ностные клетки с крупными ядрами базофильных тонов, немного лейкоцитов,
это характерно для первых дней цикла.
II Степень пролиферации (П-П)
В мазках одинаковое количество поверхностных и промежуточных клеток
КИ колеблется от 1 до 30%, ЭИ от 1 до 20%. Такие мазки встречаются в ран-
нюю фолликулиновую фазу при норме.
III.	Степень пролиферации (П-Ш)
В мазках преобладают поверхностные клетки ЭИ от 20 до 50%, КИ от 30
до 50% встречаются в среднюю фолликулиновую фазу.
IV.	Степень пролиферации (II-IV)
Преобладаю! поверхностные раздельно расположенные клетки, четкие, в
цитоплазме зернистость, ЭИ - от 50 до 70%; КИ от 50 до 80%. нет лейкоци-
тов, много палочек Дедерлейна. Чаще всего такие мазки в период овуляции
могут быть и в период 11 15 дня.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
139
V.	Степень пролиферации (II-V)
В мазках только поверхностные клерки больших размеров с четкими кон-
турами, разрозненно. ЭИ от 70% до 100%. КИ от 80 до 100%. Мазки типа II-
V в норме не встречаются. Они говорят о чрезмерной эстрогенной стимуляции
и могут быть у женщин с дисфункциональными маточными кровотечениями и
при гормонопродуцирующих опухолях яичников.
Цитологическая картина прогестероновой стимуляции
Одним из признаков прогестероновой стимуляции является закрученность
краев клеток, как поверхностного, так и промежуточного слоя.
I ст. лютеиновой или прогестероновой стимуляции (Л-1)
В мазках поверхностные и промежуточные клетки в равных количествах
расположены группами. Поверхностные клетки иногда имеют завернутые
края. Эти мазки встречаются от 16 до 20 дня при этом ЭИ и К И довольно вы-
сокие - 50-60%.
II ст* прогестероновой стимуляции (Л-П)
В основном промежуточные клетки четкие, встречаются поверхностные
клетки с закрученными краями, лейкоциты и цитология в N наблюдаются в пе-
риод от 20 до 25 для циклов.
III ст. прогестероновой стимуляции (Л-Ш)
Мелкие промежуточные клетки без четких контуров, ветре чаются лейко-
циты. Такие препараты свидетельствуют о массивной десквамации клеток
влагалищного эпителия и наблюдаются в период от 25 до 28 дня нормального
менструального цикла.
Цитологический характер атрофии вагинального эпителия - в норме у
молодых не встречается, степень атрофии зависит от наличия клеток из глу-
боких слоев.
I ст. атрофии (А-I). В основном промежуточные клетки отдельные
поверхностные, до 10% парабазальных и базальных. В первые годы менопау-
зы они чаще встречаются и при вторичной аменорее (мазки смешанного ти-
па).
II ст. атрофии (А-П). Преобладают парабазальные клетки, поверх-
ностных клеток нет. Промежуточные клетки от 0 до 50% лейкоциты.
Ill ст. атрофии (A-III) - парабазальные клетки и лейкоциты. Эти мазки
при первичной аменорее в глубокой менопаузе.
При профилактических осмотрах, где необходимо анализировать состоя-
ние эктоцервикса и эндоцервикса. забор материала для исследования произво-
дится различными способами, по наиболее удобным и эффективным, на наш
взгляд, является забор материала с помощью поролоновых кубиков одноразо-
вого пользования.
Методика получения материала из шейки матки с помощью
поролоновых кубиков
Используют кубики одноразового пользования размерами 0.4 х 0.4 см из
поролона - пенополиуретана (ГОСТ ППУ-ЭС-100, ТУ -6055 127-82) Еще до
вырезки кубиков относительно большой кусок поролона моют горячей водой
140 Том II - ЧАСТНЫЕ Al 1АЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХ1 ЮЛОГИИ
с мылом, тщательно промывают 5-6 раз, просушивают на воздухе. Затем нож-
ницами вырезают необходимое число кубиков указанного размера, помещают
их в чис тую стеклянную банку с притертом пробкой (объемом 0.5-1.0 л) или в
чашки 11етри; стерилизуют в сухожаровом шкафу при 180 градусах Цельсия в
течение одного часа. Этим достигается стерильность поролона, когда посев
производится в аэробных или анаэробных условиях (протокол № 3116 от
28.05.1986 года Городской СЭС г. Москвы). В таком виде возможно длитель-
ное хранение готовых для использования кубиков.
Во время профилактического осмотра для получения материала у каждой
женщины необходимо 2 кубика. 1 кубик захватывают корнцангом, в начале бе-
рут материал из эктоиервикса: производят энергичное круговое движение ша-
риком во влагалищной части шейки матки (материал получают в самом нача-
ле гинекологического осмотра до любых других манипуляций). Согласно за-
ключения Всесоюзного научно-исследовательского и испытательного инсти-
тута медицинской техники (34/6323 от 01.08.1986 года) ’’кубики из поролона
для получения биологического материала из шейки матки в условиях кратко-
временного контакта не оказывают на органы вредного действия и рекоменду-
ются к применению по назначению". Затем материал переносят на чистое
обезжиренное предметное стекло с помощью энергичного продольного дви-
жения. При этом большая часть материала переносится с кубика на предмет-
ное стекло, что связано с низкой дсгидратационнЪй способностью поролона.
Последнее обеспечивается структурой поролона, край которого под малым
увеличением микроскопа представлен несколькими сферообразными поверх-
ностями, диаметром 0,4 -1,0 мм, с острыми краями; стенки сфер стеклоподоб-
ные, совершенно гладкие, не позволяющие отторгнутому из шейки материала
всасываться внутрь кубика.
Второй кубик захватывают тем же корнцангом и получают материал из эн-
доцервикса. погружая его на максимально возможную без травмы глубину
Материал с кубика переносят аналогично на то же или другое предметное сте-
кло круговым движением. Кубики после использования выбрасывают.
Наиболее рациональным является размещение материала из экто- и эндо-
цервикальной порции шейки матки на одном предметном стекле.
При детальном соблюдении методики в преобладающем большинстве на-
блюдений с помощью поролоновых кубиков удастся получить из шейки мат-
ки информативный материал для цитологического исследования.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ЗАКЛЮЧЕНИЙ
Действия врача-гинеколога зависят о г результатов гинекологического ос-
мотра женщины и цитологического заключения.
Цитологическое заключение может быть представлено по следующим типам:
I. Без патологии. Цитограмма соответствует возрастной норме (цитограм-
ма без особенностей).
Мазки представлены клетками многослойного плоского и призматическо-
го эпителиев без признаков атипии. Такие пациентки подлежа!' осмотру один
раз в гр и года.
II. Воспалительный тип мазка. При неспецифическом воспалении в маз-
ках содержится значительное число лейкоцитов, гистиоциты и макрофаги, не-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
141
к роти ческ и й детрит.
При туберкулезе обнаруживают эпителиоидные клетки, клетки Пирогова-
Лангханса. некротические массы.
Трихомонадный колышт - клеточный состав воспалительного инфильтра-
та. грихомонады выявляют при иммерсионной микроскопии окрашенных пре-
паратов. Если воспалительный фон отсутствует, го констатируют наличие
трихомонад.
Грибковые поражения - обнаруживается мицелий, споры грибков, дрожже-
вые грибки, идентификация которых возможна при обычных окрасках.
Хламидиоз - при этом заболевании в мазках цервикального канала наблю-
дается плоскоклеточная метаплазия, эктопия, признаки дисплазии, воспали-
тельный фон со значительным количеством мононуклеаров (не менее 10%).
Отмечается включение эпителием нейтрофильных лейкоцитов, вакуолизация
цитоплазмы. Заподозрить хламидиоз позволяет наличие элементарных или ре-
тикулярных телец.
Элементарные тельца- мелкие светлорозовые точки, расположенные
внутри вакуолей.
Ретикулярные тельца - более крупные, форма округлая, овальная, эти об-
разования оттесняют ядро, образуя вдавления в метаплазированном или ци-
л и ।! др и1 (веком эпителии.
Окончательное заключение может быть дано после идентификации хлами-
дии серологическими и культуральными методами.
Гарднереллез - к основным диагностическим критериям относится наличие
"ключевых клеток" - клеток влагалищного эпителия, сплошь покрытых не-
большими грамвариабельными коккобактериями.
Для постановки диагноза необходимо наличие нс менее двух критериев с
обязательным выявлением "ключевых клеток".
Больные с воспалением подлежат противовоспалительному лечению с по-
следующим контрольным взятием мазков. При отрицательном ответе боль-
ная переводится в группу пациенток, подлежащих осмотру в следующем году.
В ряде случаев при воспалительном процессе со стороны клеток много-
слойного плоского эпителия могут обнаруживаться явления атипии, соответ-
ствующие умеренной или выраженной дисплазии. Таким пациенткам проводят
противовоспалительное лечение, после которого вновь берутся мазки для ци-
тологического исследования. При дважды отрицательном ответе женщины
включаются в обычный ритм профилактических осмотров. В случаях повтор-
ных цитологических заключение об атипии эпителия женщины подлежат уг-
лубленному обследованшо.
При изменениях эпителия, трактуемых как слабая или умеренная диспла-
зия, показана кольпоскопия и повторная цитологическое исследование не ре
же двух раз (если нет визуально патологии в шейке матки). При повторных
двукратных отрицательных исследованиях пациентка включается в обычный
ритм профосмотров. При наличии патологического очага на шейке - взятие
биопсии с последующим i истологическим исследованием материала. Если при
двукратных повторных исследованиях дисплазия сохраняется, больные напра-
142
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
вляются для углубленного обследования.
При выраженном дисплазии или подозрении на рак в ряде случаев цитоло-
гически трудно утвердительно высказаться, является ли это действительно
дисплазией, или уже это рак in citu, или начальная форма инвазивного рака;
больные должны сразу же направляться в соответствующие учреждения для
углубленного обследования.
В практической работе необходимо использован, современную цитологи-
ческую классификацию воспалительных, фоновых и предраковых заболева-
ний шейки матки.
ТЕЛО МАТКИ
Материалом для исследования могу г служить отпечатки диагностического
соскоба, аспират из полости матки, полученный шприцем Брауна, а также от-
печатки с поверхности разреза опухоли во время операции.
При получении отпечатков с тканевых кусочков предварительно необходи-
мо удалить кровь, так как обилие эритроцитов затрудняет микроскопию.
При получении аспирата, содержимое шприца переносится на соответству-
ющее количество сухих обезжиренных предметных стекол и ребром другого
шлифовального предметного стекла делают тонкий равномерный мазок, кото-
рый после высушивания подвергается обычной фиксации и окраске. Если при-
готовленные препараты - мазки, окрашивают гематоксилин-эозином, то их
предварительно погружают в смесь Никифорова (равные объемы спирта и
эфира) на 15 минут. Другие панхромные окраски (Лейшман, Паппенгейм и др.)
фиксации нс требуют. Окрашивание препаратов - в соответствующей главе.
ДЫХАТЕЛЬНЫЙ ТРАКТ
Наиболее частым объектом исследования при заболеваниях дыхательного
тракта является мокрота.
Цитологу необходимо иметь представление о месте образования мокроты
Входящие в нее элементы являются либо производными бронхиального дере-
ва, составными частями которой являются слизь, к которой примешиваются
макрофаги, лейкоциты, микробы, клетки бронхиального эпителия, метаплазм
рованный эпителий.
В зависимости от вида патологии, встречающейся в легких, может быть не-
сколько вариантов мокроты:
1.	Сл изисто-лейкоци гарная.
2.	Сл изисто- мак рофагал ь на я.
3.	Смешанная.
4.	Сл из исто- гнойная
5.	Гнойная.
6.	Гистиоцитарно-ле йкоцитарная.
7.	Гистиоцитарно-макрофагальная.
8.	Гис тиоцитарно-л и мфоцитарная.
9.	Серозная.
10	Бедная клеточными элементами.
От 1 до 5 варианта чаще встречаются в бронхогенной мокроте. От 5 до 10
чаще являются отделяемым, соответственно, легочной ткани.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
143
Для окрашивания цитологических препаратов пользуются методиками:
Романовского-Гимза, Май-Грюнвальд, гематоксилином и эозином, Папа-
николау и его модификациями Лучшие результаты при окраске слизистого
материала можно получить при окрашивании мазков по Папаниколау. Приме-
нение полихромной окраски Папаниколау, в состав которой входят крепкие
алкогольные растворы нескольких цитоплазменных красителей, имеет следу-
ющие преимущества:
1.	Хорошее прокрашивание всех клеточных элементов, расположенных в
тяжах слизи, благодаря уплотняющему действию спиртовых растворов красок.
2.	Хорошее прокрашивание деталей элементов, расположенных в группах.
3.	Четкое, контрастное выявление ацидо- и базофилии цитоплазмы.
4.	Отчетливое выявление особенностей структуры ядра клеток.
5.	Слабое окрашивание эритроцитов и микробной флоры.
Этот метод окраски не требует приготовления мазка растягиванием мате-
риала между двумя предметными стеклами, что нарушает расположение кле-
ток в группах, очень важное для оценки клеточных элементов. Достаточно
приготовить тонкий мазок препаровальными иглами, лучинками или пипеткои
перенести аспират на стекло. Окраска даст хорошие результаты при изучении
мокроты, вагинального секрета, отделяемого бронхов, пищевода, желудка.
Для получения полноценного материала очень важно правильно собрать
мокрому. 11оэтому персонал должен каждому больному подробно и терпеливо
объяснить, как это лучше сделать. Собирают утреннюю порцию мокроты, по-
лученную до еды, после тщательного полоскания рта водой и глубокого от-
кашливания, в чистую стеклянную посуду. От момента отхаркивания до иссле-
дования не должно пройти более 2-3 часов, т.к. клетки мокроты разрушаются
и их трудно оценить. На посуду с мокротой необходимо наклеить этике тку с
фамилией и инициалами больного. Кроме того, обязательно прилагается на-
правление. в котором лечащий врач четко указывает необходимые сведения о
больном.
Цитологическое исследование мокроты начинают с осмотра, изучения ее
физических свойств. Для этого мокрот}' выливают r чашки Петри так. чтобы
она располагалась тонким. 0.5 см слоем, и помещают чашки на черный и бе-
лый фон поочередно ( на стекло с подложенной под него черной и белой бума-
гой). Тщательно осматривают по участкам всю мокроту в чашках, учитывая
его характер, наличие примесей, видимых кусочков ткани и т.п. С помощью
препаровальных игл, ш надел я или заостренных лучинок, которые отделяют
от остальной массы подозрительные участки и переносят их в одно место
предметного стекла, пока еще не растягивая. Эта часть работы весьма суще-
ствен пая для получения правильного конечного результата.
Оз бира ть следует: беловато-серые уплотненные, в виде тонких, коротких
пленок или нитей частицы слизи, которые не исчезают при растягивании ок-
ружающих участков; беловато-серые частицы слизи, лежащие вблизи кровя-
нистых сгустков и прожилок: непрозрачные сероватые, белесоватые частицы,
заметные на черном фоне; беловато-желтоватые крупинки, которые могут
быть участками ткани опухоли, но могут быть и частицами пищи, что легко
проверить тут же по нативному препарату. При обнаружении макроскопиче
ских кусочков ткани опухоли, их выделяют, переносят в формалин и подверга-
144 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ют гистологическому исследованию. При вязкой мокроте рекомендуется доба-
влять в чашку Петри 2-3 мл физиологического раствора, что облегчает отбор
частиц.
Не следует отбирать: сгустки крови, слюну, зеленоватые комочки гноя,
грубые белесоватые пленки (эпителий верхних дыхательных путей); округлой
формы плотные полупрозрачные комочки, окрашенные из альвеолярных ма-
крофагов; остатки пищи.
Перенесенные на предметное стекло частицы быстро равномерно растяги-
вают иглами или лучинками так, чтобы верхний конец стекла оставался сво-
бодным. К этому концу канцелярской скрепкой прикрепляют небольшой лис-
ток бумаги с номером анализа, который пишут простым, грифельным (не хи-
мическим)карандашом. Затем, не допуская высыхания мазка, стекло погружа-
ют в фиксатор.
Для приобретения навыков по отбору нужных частиц, начинающему врачу-
цитологу необходимо контролировать себя, просматривая в нативных препа-
ратах отбираемый материал. С злой целью, приготовленный препарат нужно быстро
(до высыхания) просмотреть сухими системами при увеличениях: окуляр - 10х.
объективы - 8 или 10. при опущенном конденсоре без покровного стекла, по-
сле чего погрузить в фиксатор. При высыхании препарата клеточные элемен-
ты окрасятся слабо или совсем нс окрасятся рядом красителей. Из одной ис-
следуемой мокроты рекомендуется готовить 3-4 мазка для окрашивания.
СКЕЛЕТ
Объектами цитологического исследования являются пунктаты, отпечатки
с спонсированного кусочка и с разреза удаленного во время операции образо-
вания. Метод диагностической пункции распространен широко при костных
опухолях, но приобретает особое значение в тех случаях, когда приходи тся ди-
агностировать наличие патологического процесса в труднодоступных облас-
тях, таких, как позвоночник, крестцово-подвздошное сочленение, опухоль с
внутрисуставной л окал и зацией.
Однако, получить полноценный пунктат при опухолях костей значительно
сложнее, чем при опухолях многих других локализаций. Очаг поражения мо-
жет быть расположен на значительной глубине, иметь неоднородную конси-
стенцию: хрящевые участки, очаги обызвествления и распада, полости. Все
это затрудняет получение информативного материала для микроскопии и ог-
раничивает возможности цитологического метода при опухолях данной лока-
лизации.
При большом очаге поражения пункцию необходимо проводить под конт-
ролем рентгенографии для подтверждения попадания иглы в очаг. Выбор иг-
лы зависит от глубины расположения очага и плотности ткани, которую необ-
ходимо преодолеть. Для получения материала при пункции из разных участков
патологического очага можно осторожно менять глубину и направление иглы.
Обычно пунктат представляет собой несколько кровянистых капель с вклю-
чениями белесоватых кусочков ткани, из которых удается приготовить 2-4
мазка, распределяя материал по предметному стеклу боковой поверхностью
иглы, которой производили пункцию. Получить материал для цитологическо-
го исследования при костных опухолях с наличием мягкотканного компонента
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
145
и мягкотканных опухолях легче» чем при чисто костных. Однако, все условия,
необходимые для проведения пункции опухолей костей, следует соблюдать при
пункции опухолей мягких тканей.
ОРГАНЫ ПИЩЕВАРЕНИЯ
Полость рта. Материалом для цитологического исследования при опухо-
левых поражениях полости рта служат соскобы с изъявленной поверхности
опухоли, пунктаты опухолей, кистозных полостей, отпечатки с разреза удален-
ной во время операции опухоли. Материал для исследования берут после тща-
тельной обработки полости рта (полоскание, способствующее увлажнению и
очищению полости рта. обработка антисептическими средствами)
При язвен но-инфильтративных формах удаляют некротические массы с
изъявленного участка плотным ватным или марлевым тампоном; слой орого-
вения нз i целевидных учас тков поражения с гиперкератозом также осторожно
удаляют и делают соскоб скальпелем или тонкой кюреткой диаметром около
4 мм. Болес рационально производить соскоб, несколько отступая от краев яз-
вы, так как отмечено, ч то материал, полученный из краев язвенной поверхно-
сти. часто представлен гипертрофическими разрастаниями плоского эпителия
с элементами воспаления и микробной флорой, затрудняющими микроскопию.
Для изучения клеточного состава опухолей, покрытых неизмененной сли-
зистой оболочкой, применяют метод диагностической пункции, выбирая для
этого участки средней плотности. Следует отметин», что при поражении мин-
далин и при опухолях малых слюнных желез полости рта наиболее ценный
материал для цитологического анализа получают при пункции этих образова-
нии, так как в соскоб чаще всего попадает реактивно измененная или нек-
ротизированная ткань. Кроме того, клеточные элементы некоторых опухолей
малых и особенно больших слюнных желез обладают некоторым цнтоморфо-
логическими особенностями, поэтому их значительно легче обнаружить и ин-
трепретировать по материалу пунктатов.
Пищевод. Материал для цитологического исследования опухолей или из-
мененной слизистой оболочки пищевода получают при эзофагогастрофибро-
скопии.
Желудок. Материалом для исследования при поражении желудка служат
мазки отпечатки с кусочков слизистой оболочки, опухоли, язвы, полипы же-
лудка. полученные с помощью биопсийных щипцов гас грофиброскопа. Кусо-
чек ткани с помощью инъекционной иглы наносят на обезжиренное предмет-
ное стекло. С этого кусочка делают мазки-отпечатки.
Материал для цитологического исследования можно получить также путем
соскоба пораженной поверхности специальной нейлоновой щеточкой. Этот
метод дает возможность исследовать большие поверхности, однако, щеточки
обычно разрушают основную массу клеточных элементов, что значительно
затрудняет цитологическую диагностику. Получение материала методом со-
скоба можно рекомендовать при больших изъявленных поверхностях, когда
возникает необходимость исключить малигнизацию. а биопсия затруднена или
нс дает ожидаемых результатов! Для определения границ распространения
опухолевых клеток в стенке желудка во время операции имеется технически
простой метод срочного цитологического исследования - соскоб ткани скаль-
146
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
пелем по линии операционного разреза по дистальному и проксимальному
краям остающихся частей желудка (пищевода, кишечника). С каждого края
беру г 4-5 мазков. Соскоб делают по всей линии разреза или с наиболее подоз-
рительных участков и переносят полученный материал на предметные стекла.
Толстая кишка. При поражении различных отделов толстой кишки, вплоть
до подвздошной кишки, материалом для цитологического исследования чаще
всего являются мазки-отпечатки с Спонсированного кусочка опухоли или из-
мененной слизистой оболочки толстой кишки, полученные при помощи щип-
цов колонофиброскопа или сигмофиброскопа, а также мазки, полученные нейло-
новой щеточкой, с изьявленной поверхности кишки. Исследуют также мазки-
отпечатки, полученные тупфером при ректороманоскопии. Мазки можно при-
готовить из материала, оставшегося на ректоскопе, а также с резиновых пер-
чаток после пальцевого исследования прямой кишки. При расположении опу-
холи около ануса можно сделать соскоб с поверхнос ги опухоли или ее пункцию.
Поджелудочная железа. Диагност ическую пункцию поджелудочной желе-
зы производят во время операции. Однако, даже исследование поджелудочной
железы во время операции, дополняемое холангиографией или панкреатогра-
фией. не всегда позволяет дифференцировать рак от неопухолевых заболева-
ний этого органа. Поэтому, при осмотре и пальпации поджелудочной железы
иглу вводят в "подозрительный участок и производят пункцию. Направление
и глубину введения иглы можно осторожно менять. Из полученного материа-
ла делают мазки.
Печень. Пункцию опухоли печени необходимо производить после клини-
ческого обследования больного (определение протромбинового индекса, ска-
нирование печени). На сканограмме хорошо видна локализация опухоли, что
облегчает выбор места пункции. Больному натощак без предварительной под-
готовки и анестезии, на высоте вдоха производят чрескожный прокол печени
тонкой иглой (для внутривенных вливаний) и быстро насасывают пунктат.
Щитовидная железа. Материалом для исследования опухолей щитовидной
железы служат пунктаты и отпечатки с удаленной опухоли. Перед диагности-
ческой пункцией производят осмотр и пальпацию опухоли для определения ее
консистенции, границ, смещаемости по отношению к окружающим тканям и
сосудам. Для более четкого выведения опухоли под шею больного подклады-
вают небольшой валик так, чтобы голова была несколько запрокинута, при
повороте головы больного определяют наиболее удобное и доступное для
пункции положение патологического очага. Больному предлагают сделать
глотательные движения, в этот момент опухоль фиксируют пальцами в том
месте, где она больше всего выступает над окружающими тканями, и вводят
иглу в выбранный участок. При небольшом узле равномерной плотности пунк-
цию производят в центральный участок, при большом узле неравномерной
плотности делают не менее двух пункций в разные по плотности места опухоли.
Молочная железа. Объектом исследования может быть пунктат опухоли,
выделения соска, отпечатки или соскоб с эрозированной поверхности соска,
отделяемое из свищевых ходов, пунктат уплотнения в области послеопераци-
онного руби, а. отпечатки с разреза удачен ной опухоли.
При небольшом и однородном по консистенции очаге поражения (диамет-
ром до 4 см) обычно ограничиваются однократным получением пунктата из
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
147
центра опухоли. Если выражены кожные симптомы, иглу вводят в центр опре-
деляемого участка измененной кожи. При диаметре очага поражения более 4
см или неодинаковой его плотности в разных участках пункцию производят в
двух местах. При наличии кисты или полости распада полностью эвакуируют
их содержимое. Затем, не вынимая иглы, патологический очаг повторно паль-
пируют и, если выявляется оставшееся уплотнение, его пунктируют.
Выделения из соска получаю т путем легкого надавливания пальцами на об-
ласть соска, околососковую зону и очень осторожно на ткань молочной желе-
зы с последовательным переходом от одного ее сектора к другому. Капли вы-
деляющейся жидкости перенося т на предметные стекла. Во всех случаях маз-
ки готовят как из первой, так и из последующих капель. Если выделения
очень скудны, их собирают несколько раз (иногда с перерывом 1-2 дня), осо-
бенно, если в анамнезе были указания на появление в прошлом выделений су-
кровичного или кровянистого характера. Во время взятия выделений из соска
нередко удается правильно определить именно тот сектор (учас ток) ткани мо-
лочной железы, при надавливании на который появляется секрет. Обычно го-
товят 2-5 мазков-препаратов; при обильных выделениях готовят до 15 мазков.
Если в молочной железе имеется четко пальпируемое уплотнение, исследуют
также и пунктат из данного образования.
Материал с язвенной (эрозированной) поверхности соска (околососковой
зоны) может иметь характер отпечатков или соскобов. Отпечатки готовят,
прижимая предметные стекла к патологической поверхности. Если отпечаток
очень густой, ст о следует размазать и сделать еще несколько препаратов; ес-
ли отпечаток едва заметен, то берут соскоб путем легкого поскабливай и я па-
тологической поверхности. Следует избегать появления капель крови. При
свищевых ходах мазки готовят из отделяемого, а также из соскоба, взятого же-
лобоватым зондом, можно брать отделяемое пипеткой. Опухолевое образова-
ние в послеоперационном рубце, как правило, плотное. При пункции игла с
прудом входи г в очаг поражения и набирается мало материала для исследования.
Органы мочеполовой системы
Почки. Объектами исследования при опухолях и других заболеваниях поч-
ки могут быть: осадок мочи, пунктаты почки, отпечатки с бионсированного
материала, соскобы и отпечатки с разреза удаленного очага поражения. Соб-
ранную утреннюю мочу центрифугируют и из осадка готовят мазки.
Техника пункции опухоли почек 'гонкой иглой в нашей стране разработана
И.А.Кассирским и М.Г Абрамовым Пункцию опухоли производят либо одно-
временно с внутривенной пиелографией, либо после нее. отмечая под рентге-
нологическим контролем место, где необходимо сделать прокол. Для этой ма-
нипуляции нс требуется предварительно анестезии. Прокол делают сзади по
лопаточной или задней подмышечной линии в одиннадцатом межреберье или
под XII ребро при положении больного на здоровом боку. Если опухоль исхо-
дит из нижнего сегмента почки, то ее часто можно прощупать в подреберье.
Перед проколом больной должен сделать вдох и задержать дыхание. Иглу вво-
дят под некоторым углом, направляя ее вверх и медиально. После введения в
опухоль иглы к ней присоединяют шприц и производят несколько насасываю-
щих движений. Затем, разъединив шприц и иглу, последнюю быстро извлека-
ют из органа. Вся процедура занимает несколько секунд. Из полученного мате-
148
Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
риала готовят мазки. Отпечатки для цитологического исследования могут быть
получены с кусочка ткани почки, взятого для гистологического исследования.
Методика пункции почек у детей. Пункцию производят тонкой иглой и с
помощью 20-граммового шприца, изменения направления и глубины введения
иглы, при этом неоднократно аспирируя материал. Наиболее подходящей об-
ластью для проведения диагностической пункции опухоли почки у детей явля-
ется область костно-вертебрального угла (пункцию делают, отступая от по-
звоночника на ширину прямой мышцы). При очень больших опухолях, лучше
пунктировать в том месте, где опухоль располагается близко к поверхности
тела. Диагностическая пункция у детей производится по методике, разработан-
ной в ОНЦ РАМН.
Мочевой пузырь. При заболевании мочевого пузыря исследуют мочу, про-
мывные воды, спиртовой смыв, отпечатки с Спонсированных кусочков. Для
проведения цитологического исследования мочи при подозрении на опухоль
мочевого пузыря, необходимо соблюдать ряд условий.
1.	Исследуют утреннюю порцию мочи, которая должна быть доставлена в
лабораторию срочно, так как клеточные элементы опухоли, находясь в
необычной для них среде, быстро подвергаются разрушению
2.	Исследование мочи производят до цистоскопии и до каких-либо других
манипуляций, травмирующих стенку мочевого пузыря, а также до введения
контрастных веществ, так как все эти момен гы мешают цитологическому ис-
следованию и затрудняют оценку клеточных элементов.
3.	Исследуют окрашенные препараты.
4.	Исследование проводят не менее 3-5 раз подряд.
Результат цитологического исследования осадка мочи мало результативен.
Проценз обнаружения опухолевых элементов в моче невысокий. Более высо-
кий процентопухолевых клеток получен при исследовании промывных вод мо-
чевого пузыря и при применении метода спиртового смыва, разработанного
Т, В.Кузьминым в 1963 году. Для этого мочевой пузырь тщательно промыва-
ют теплой кипяченой водой через катетер, затем вводят 50 мл 15% этилового
спирта, приготовленного на 1% растворе новокаина. Через 10-15 мину г спир-
товой раствор удаляют, центрифугируют и из осадка готовят мазки. Получа-
ют, как правило, большое количество опухолевых клеток, что позволяет пра-
вильнее поставить диагноз. Наилучшие результаты выявления опухолевых
клеток при заболевании мочевого пузыря получают при приготовлении отпе-
чатков с Спонсированного кусочка опухоли.
Предстательная железа. Цитологическому исследованию при заболевани-
ях предстательной железы подвергают осадок мочи, секрет предстательной
железы, пунктаты опухолей и отпечатки с Спонсированного кусочка ткани, со-
скобы и отпечатки с разреза удаленного патологического очага. Методика ис-
следования осадка мочи такая же, как и при исследовании опухолевых почек.
Секрет предстательной железы (простатический сок) получают путем
прямого массажа железы. Независимо оттого, получен секрет или нет. после
массажа собирают и исследуют первую порцию мочи Для изучения железы
каплю простатического сока наносят на предметное стекло, покрывают ее
стеклом и исследуют секрет сначала в нативном виде. Одновременно из ос-
тальной части секрета готовят мазки, которые затем окрашивают и изучают.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
149
Цитологическое исследование секрета предстательной железы является
весьма ценным в диагностике простатитов. В то же время при подозрении на
рак этот способ получения материала не рекомендуется применять или следу-
ет применять очень осторожно и ограниченно, ввиду опасности распростране-
ния опухолевых клеток. Массаж производят только при запущенном или ле-
ченном раке, для морфологического подтверждения диагноза, а также при
склерозированной опухоли, если нельзя получить материал для гистологиче-
ского или цитологического исследования другими методами.
Пункцию предстательной железы осуществляют различными инструмен-
тами и способами. Аспирационную пункцию производя'1’ специальными тонки-
ми длинными иглами, приспособлениями, типа инструмента и его модифкаций.
Отпечатки для цитологического исследования и кусочки ткани для гистологи-
ческого исследования получают, используя троакары, толстые иглы и другие
устройства.
Пункцию простаты производят чрезпро меж постным или грансректабель-
ным доступом, предпочтительнее применять последний. Пункцию простаты
тонкой иглой можно проводить в амбулаторных условиях без предварительной
подготовки больного и без анестезии. Инструмент состоит из тонкой металли-
ческой трубки, имеющей на дистальном конце направляющие кольца, для
пальпирующего пальца. В средней части проводника имеется пластинка для
поддержания инструмента, которая опирается на возвышение большого паль-
ца руки во время прокола. Игла изготовлена из гибкой нержавеющей стали
(переход широкой части иглы в узкую служит маркером). Если специальной
иглы нет, пункцию можно производить следующим образом: больной находит-
ся в коленно-локтевом положении или на боку с приведенными к животу бед-
рами. Указательными пальцем нащупывают в предстательной железе участок,
подлежащий пункции. Другой рукой к этому участку подводят конец уретро-
скопического тубуса или любую другую трубку, по которой вводят длинную
иглу для аспирационной пункции. Из полученного материала делают мазки.
Яичко. Объектами исследования являются пунктаты новообразований
яичка, соскобы и отпечатки из очага поражения, полученные при оперативном
вмешательстве.
Пункцию производят по общепринятой методике. После тщательного
пальпаторного исследования опухоли выбирают наиболее подходящее место
для прокола. Это может быть самый плотный или. наоборот, мягкий участок
опухоли, в зависимое! и от ее консистенции. Анестезия для этой манипуляции
не требуется. Фиксируя яичко левой рукой, правой рукой производят прокол
опухоли, вводя иглу перпендикулярно в глубь опухоли. Материал желательно
получить из разных участков опухоли, для чего иглу несколько выдвигают из
опухоли и поворачивают в стороны, если при пункции получена жидкость (на-
пример, при водянке оболочек яичка), ее полностью отсасывают в пробирку,
а иглу продвигают глубже и производят пункцию. Жидкость центрифугируют
и из осадка делают мазки
Диагностическую пункцию метастазов опухолей мочевого пузыря, почки,
предстательной железы и яичка, а также отпечатки и соскобы с опухолей про-
изводят также по общепринятой методике.
150	Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.	Руководство по цитологической диагностике опухолей человека. А.С.Пет-
рова, М.П.Птохов, Москва, «Медицина», 1976. 304 с.
2.	Книга: «Цитологическая диагностика опухолей и предопухолевых процес-
сов». Под редакцией А.С.Петровой, Москва, «Медицина», 1985, 300 с.
3.	Руководство «Микроскопическая техника». Под редакцией Д.С. Саркисова,
Ю.Л. Перова, Москва, «Медицина», 1996 г.
4.	Koss L. Diagnostic cytology and its histopathologic bases. London, 1961, 380 p.
5.	Lopes Cardozo P Atlas of clinical cytology. The Netherlands. 1973, 719 p.
( И LabMetod Oy
ОПТИМАЛЬНЫЕ РЕШЕНИЯ В ЦИТОТЕХНОЛОГИИ
•	Техника и принадлежности для приготовления стандартных
монослойных цитологических препаратов:
цитоцентрифуги Cytospin 3 и Cytofuge, цитощеточки,
предметные стекла
•	Оборудование для окрашивания микропрепаратов в
автоматическом режиме:
Linistain GLX. Varistain 24 и Varistain XY
•	Красители для цитологии в виде наборов:
Папаниколау, Гимза, Май-Грюнвальд, Гематоксилин-эозин,
Циль-Нильсен, Грам
СОВРЕМЕННОЕ ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ
ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
•	Исследовательские микроскопы Nicon серии Eclipse 400, 600,
800,1000
•	Программно-аппаратный комплекс для анализа и
архивирования изображений цитологических объектов
•	Автоматический иммуноокрашиваз ель Cadenza и ручной
центр Sequenza, панели антител для иммуноморфологии
•	Проз очный цитометр Coulter
•	Автоматические системы для скрининга рака шейка матки
PAPNET, Neopath
151
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ МЕТОДОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ (КОМПЬЮТЕРНОЙ МОРФОМЕТРИИ И
ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ) В КЛИНИЧЕСКОЙ
ЦИТОЛОГИИ
L ВВЕДЕНИЕ В КОЛИЧЕСТВЕННУЮ МОРФОЛОГИЮ
Первые приборы для объективизации морфологических исследований соз-
даны несколько десятилетий назад; их совершенствование способствовало по-
явлению и развитию нового направления - количественной цитологии. В на-
стоящее время в связи с развитием компьютерной техники наибольшее приме-
нение получили два метода: морфометрия и проточная цитометрия. Первый,
особенно в англоязычной литературе, именуют как распознавание образа
клетки (Image analysis) с последующим количественным анализом ее структур.
Морфометрия по E.Wcibel [1979] - это количественная оценка макроскопи-
ческих и микроскопических структур. Сейчас термин морфометрия применя-
ется только в основном только для количественного описания морфологиче-
ских структур и параметров клеток. Вместе с ним до 70-х годов XX века ши-
роко использовался более узкий термин - карпом етрия. и большинство науч-
ных работ, проведенных в те годы, оперируют им. В 1764 году A.Van Leeuwen-
hoek сравнивал при микроскопии объем эритроцита с 1/25000 объема песчин-
ки диаметром 0,33 мм. Наблюдения за делением клетки привели к накоплению
важных кариометрических соотношений. В 1903 году исследования R.Hertwig
показали, что между величиной ядра и размерами клетки имеется тесная зави-
симость, при этом ядерно-цитоплазматическое соотношение остается посто-
янным и величина его неодинакова в покоящихся клетках разных типов.
Вариации функционального состояния клетки затрагивают клеточный ме-
таболизм. При этом объем цитоплазмы зависит от активности ядра и, следова-
тельно, от его объема и площади. Клетки с высоким содержанием важных для
метаболизма веществ (гормонов, ферментов, жиров) отличаются понижен-
ным ядер но-цитоплазматическим соотношением. Величина ядра зависит от
количества хромосом. Объем диплоидных ядер вдвое больше объема гаплоид-
ных. Однако, нередко встречаются клетки с тождественным числом хромосом,
но с неодинаковым объемом ядер. В частности, у полиплоидных клеток число
хромосом не пропорционально величине ядра. Объем ядра (соответственно,
его площадь) величина далеко нс постоянная. Наблюдаются его вариации в
связи с возрастом, половой принадлежностью, биологическими ритмами.
Ядерно-цитоплазматическое соотношение остается постоянным только в
известные возрастные периоды. В условиях патологии, ядерно-цитоплазмачи-
ческое соотношение коренным образом меняется, что особенно характерно
для злокачественных новообразований.
1.1.	Содержание ДНК, РНК- белка н объем ядра
Принято считать, что в покоящихся клетках ядра одного и того же типа и
одинаковой величины содержат одинаковое количество ДНК; объем ядер по-
коящихся клеток пропорционален содержанию в них ДНК, усилению или ос-
лаблению функциональной ак гивности ядра. В тканях, в которых преоблада-
ют амитотичсскис и эндоми готические деления, отмечается линейная зависи-
мость между содержанием ДНК и объемом ядра, а также между числом хро-
152
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
мосом и объемом ядра.
Изменчивость объема ядер зависит не только от количества ДНК. Четкие
соотношения, касающиеся клеточного метаболизма, были выявлены между
РНК и негистонными белками, с одной стороны, и объемом ядра, с другой. В
физиологических условиях количество негистоновых белков в клетке варьи-
руем прямо пропорционально объему ядра: повышение содержания белков со-
ответствует увеличению объема ядра вследствие усилившейся активности
клетки. Установлено возрастание объема ядра в процессе регенерации. Следу-
ет отмстить, однако, что в увеличении объема ядра играют роль, помимо по-
вышенной активности ядра, еще и многочисленные деления клс гок. Ускорен-
ные темпы деления, связаны с возрастанием количества ДНК. РНК и белка,
и иногда ведут к возникновению полиплоидности.
1.2.	Влияние способа фиксации на изменение параметрон клеток
Объем ядра и цитоплазмы изменяется при обработке материала для мор-
фологического исследования. 80% спирт вызывает ретракцию на 10-32%. при
использовании формалина ретракция составляет 45-71 %. Реальное значение
имеет не минимальная ретракция, а тождественно повторяющаяся степень ре-
тракции. Поэтому, предпочтительны фиксаторы, дающие однообразную рет-
ракцию, даже если ее интенсивность сравнительно велика. Степень ретракции
ядра и цитоплазмы неодинаковая. Ретракция цитоплазмы на 1.1 % превышает
ретракцию ядра. Ретракционный эффект спирта является преимущественно
цитоплазматическим; фиксаторы Буэна и Ценкера вызывают главным обра-
зом ядерную ретракцию. Материал для кариомстричсских исследований сле-
дует фиксировать сразу после получения. Аутолиз и подсыхание фрагмента
ткани приводят к значительным изменениям. 11ри фиксации через 4 часа пос-
ле получения образца, средний объем ядер показывает разность r 6%, по срав-
нению с немедленно фиксированным материалом; через 24 часа разность дос-
тигает 27%.
Окрашивание ядер делает их видимыми и способствует увеличению конт-
растности между ядром и окружающей тканью. При окрашивании азаном объ-
ем ядер увеличивается на 28.7%, железным i сматоксилин-эозином - на 41.1 %.
Поэтому, для сравнения результатов при морфометрии изучают ткани, обра-
ботанные и окрашенные одним и тем способом.
1.3.	Методы и приборы для морфометрических исследований
Различают прямое измерение (окуляр-микрометр, микропланиметр, панто-
граф) и проекционные методы, при последних получают проекцию микро-
скопического изображения на бумагу и затем по полученным очертаниям ядер
без затруднения вычисляют параметры ядер и клеточных структур. Использо-
вание специальных таблиц ускоряло определение объема ядра но данным ли-
нейных замеров. При определении относительных объемов структурных ком-
понентов нормальной и опухолевой ткани на кариометрию и морфометрию за-
трачивают больше времени, чем на выполнение методов точечного счета, с
помощью окулярной сетки [Автандилов Г.Г., 1984] Например, полученные
данные об удельной объемной доле ядер и об их количестве в опухоли на стан-
дарт ной площади сетки позволяют судить об их среднем объеме (в процентах),
а величина, обратная этому показателю (1/Vv.lOO), отражающая плотность
компоновки ядер (клеток), позволяет следить за объемными изменениями со-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
153
ставляющих элементов опухоли.
Оба метода имеют преимущества и недостатки. При проекционном методе
ядра можно зарисовать и поэтому расчеты могут быть выполнены повторно.
Способ отнимает много времени и чреват ошибками при зарисовке. Прямой
метод также требует времени и аппаратуры, но имеет важное преимущество в
связи с возможностью автоматизации.
Для облегчения морфометрических исследований еще в 60-е годы созданы
полуавтоматические измерительные приборы: регистратор Эйхнера, регист-
рирующий микропланиметр, прибор для полуавтоматической микропроекции,
которые ускорили проведение измерений. Окуляр-микрометр, сетки Г.Г.Ав-
дандилова и другие приспособления и приборы способствовали объективиза-
ции морфологического анализа, однако подобные исследования сдерживались
из-за трудоемкости и большой потери времени при сборе и обработке количе-
ственной информации. В 70-80 годах ценность морфометрического метода в
цитологических исследованиях возросла из-за широкого применения персо-
нальных компьютеров, что существенно облегчило проведение морфометри-
ческого анализа.
Для обработки изображения морфологических препаратов использовались
анализаторы планшетного типа Lcitz-ASM (Leilz/PPI), Mopphomat-10 (Opton,
ФРГ),Videoplan (Reichert-Jung, Австрия), VID II ( Analitical Measuring Systems,
Великобритания). На плоском экране в виде планшета устанавливают фото-
графии или проецируют изображения клеток. Планшет можно освещать сни-
зу, что позволяет исследовать фотонегативы цитологических препаратов. Ин-
формацию вводят вручную, обводя контур изображения курсором или специ-
альным электронным пером; разрешение планшетных систем, зависящее от
плотности расположения электродов и конструкции курсора, составляет
0,1...0.5 мм в приборах Videoplan. Leitz-ASM
В приборе MOP (Zeiss, ФРГ) параметры клеток измерялись одновременно,
что существенно сокращает время исследования. Клиническое применение та-
ких приборов ограничено рядом недостатков, среди которых следует отмстить
низкую производительность. Скорость ввода информации (Vidcoplan) состав-
ляет до 100 мм/с, следовательно, обвод с га клеток потребует в среднем от 5 до
10 мин. Причем при обводе сложных границ клеток субъективная ошибка опе-
ратора возрастает до 5... 10%, по сравнению с указанной в рекламе погрешно-
стью прибора (Vidcoplan) - менее 1%. Следует также отметить трудность из-
мерения абсолютных размеров микрооб ьектов по их фотографиям. Недостат-
ком приборов планшетного типа также является относительный характер про-
ведения денситомечричсских измерений.
Некоторые из указанных недостатков устранены в интерак тивной системе
анализа VID II ( AMS. Великобритания), служащей примером смешанного ва-
рианта построения анализатора с включением планшетного и телевизионно-
го каналов, что ускоряет процесс измерения клеток. Изображение передается
телевизионной камерой на монитор. В приборе для накопления и обработки
данных используют компьютер.
Среди зарубежных телевизионных морфометрических анализаторов боль-
шое распространение получили полуавтоматические и автоматические прибо-
ры: Artek 800; Magiscan 1, 2, TAS; IRAS 1.2: Zeiss Kontron; SAMBA 4000. Bo
154 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
всех приборах используются микроскопы соединенные с телевизионными ка-
мерами. Перемещение цитологических препаратов, последующая фокусиров-
ка (у части приборов автофокусировка) осущес гвлялись с помощью предмет-
ного столика микроскопа. Рассматриваемые приборы предназначались как для
измерения геоме грических параметров клеток - площади, периметра, ориен-
тации, коэффициента формы, так и для определения денситометрических па-
раметров (интегральной оптической плотности, гистограмм уровней кванто-
вания) или текстурных характеристик. Погрешность измерения геометриче-
ских параметров (площади и периметра) составляла 3%.
В конструктивном решении наблюдаются два пути. Либо это единые по
конструкции приборы (Magiscan, Artek), либо это комплекс, объединенный ра-
бочим столом (TAS, IB AS). Однако, следует отметить, что у всех анализаторов
микроскоп с телевизионной камерой был выполнен в виде самостоятельного
блока. Приборы имеют чаще всего два монитора, один из которых использу-
ется для визуализации исследуемых клеток, другой для отображения резуль-
татов статистической обработки и информации, относящейся к диалоговому
режиму. В этих системах обеспечивается несколько режимов ввода морфо-
метрических характеристик клетки в компьютер: световое перо (планшетная
система IB AS), стробирующая рамка в виде круга или прямоугольника. Систе-
мы светового пера и телеменю, позволяли с помощью информации, выведен-
ной на экран дисплея, решать ряд практических задач, среди которых можно
отметить выбор клеток и измерение внутриклеточных структур при наложе-
нии клеток друг на друга, исключение артефактов, возможное'! ь выбора пара-
метров и режима обрабоггки. Осуществляется это путем "прикосновения" све-
тового пера к определенным зонам экрана вне рабочего поля. С помощью
принтера документируются результаты обработки.
В приборах TAS и Magiscan-1 были использованы телеменю для обеспече-
ния оперативного управления обработкой изображения клеток. В анализато-
ре изображений Magiscan-2 (фирма Joyce-Locbl, Великобритания) телевизи-
онная камера использовалась в стандартном режиме. Персональная ЭВМ
контролировала работу процессора изображения и была связана с пользова-
телем. На процессор изображения возлагаются задачи сегментации, измере-
ния параметров клеток и их классификация. Языки SPEL (Simple picture eval-
uation language) и MAGIC (Image basic language) существенно упростили про-
граммы обработки. Разрешение системы Magiscan составляет 1 %. Ядро клет-
ки в поле зрения автоматически анализировалось в течении 55 мкс. Для при-
бора был разработан алгоритм распознавания клеток рака шейки матки, по-
зволяющий исследовать до 5(Х) клеток в сек.
Мощной компьютерной системой анализа изображений являлись анализа-
торы IBAS (Interactive image analysis system), созданные фирмой Opton. IBAS-
1, работает в полуавтоматическом режиме, a IB AS -2 в автоматическом с объ-
емом памяти - 16 Мбайт, что позволяет записать до 64 цитологических изобра-
жений (512 х 512 элементов на 256 уровнях квантования).
Парк отечественных морфометрических анализаторов значительно менее
представителен: полуавтоматические анализаторы "Интеграл-1" и "Интеграл-
2МТ", последний был рекомендован Министерством здравоохранения СССР в
1985 году к серийному производству и внедрению в медицинскую практику.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
155
Система программного обеспечения по измерению морфологических пара-
метров клеток рассчитана на интерактивный режим работы анализатора. Она
включает программу ' Монитор', ipynny подпрограмм графического отобра-
жения, ввода-вывода и расчета параметров.
В начале работы врач-цитолог после включения питания персональной
ЭВМ и тестовой настройки вводит дату измерения, коэффициент пересчета,
номер препарата, выбирает режим работы и измеряемые параметры. В прибо-
ре предусмотрены два режима: маркер и стробрамка (прямоугольная и круг-
лая). В режиме с пробирующей рамки осуществляется автоматическое измере-
ние площади клеток. Измеренные значения запоминаются в оперативной па-
мяти. В дальнейшем они умножаются автоматически на коэффициент пере-
счета, что обеспечивает измерение параметров в абсолютных значениях (ми-
кронах - мкм). В режиме маркера оператор обводит по контуру клетку и ее яд-
ро, визуально контролируя точность обводки по следу маркера на экране дис-
плея. Адреса точек контура записываются в оперативной памяти. После замы-
кания контура автоматически вычисляются значения (в мкм и мкм2), площади
и периметра клетки соответствен но S1 и Р1 ядра (S2 и Р2), отношения площа-
дей (S) и периметров (Р), коэффициенты формы клетки (F1) и ядра (F2), а
также статистические характеристики: математическое ожидание (М) и сред-
неквадратическое отклонение (и).Формул а расчета коэффициента формы
клетки или ядра была следующей F= Р rcS, где S - площадь клетки или ядра; Р
- периметр клетки или ядра.
Наименьшим коэффициентом формы обладает идеально круглая клетка
(или ядро). По мерс отклонения от формы круга значение этого коэффициен-
та растет. Таким образом, этот показатель может служить количественной ме-
рой полиморфизма клеток и ядер. Погрешность измерения геометрических
параметров клеток и ядер составляет ± 3%.
В каждом исследованном цитологическом препарате морфометрические
параметры определяли в 100 исследованных подряд верифицированных клет-
ках (объектив 90х, окуляр 8х). При таком увеличении, ошибки из-за тремора
руки при измерений морфометрических параметров клеток в режиме Мар-
кер" могут быть меньше 1 %. Для того, чтобы при измерении исключить эле-
мент субъективизма необходимо было для получения воспроизводимых ре-
зультатов анализировать все клетки подряд: большие, маленькие, перекрыва-
ющиеся (если это возможно) и изолированные. Следует особо подчеркнуть,
что при опухолях молочной железы не измерялись идентифицированные вра-
чом-цитологом по маленькому плотному ядру и обычно отсутствующей цито-
плазме миоэпителиальные клетки.
I Доведенное исследование показало, что автоматически выдаваемое при-
бором среднеквадратическое отклонение, свидетельствующее, как известно, о
величине вариации каждого морфометрического параметра клетки, дает воз-
можность утверждать, что 100 проанализированных подряд оператором кле-
ток достаточно, чтобы статистически объективно отразить морфометриче-
ские параметры всей клеточной популяции, представленной в каждом из ис-
следованных цитологических препаратов. При этом следует особо подчерк-
нуть, что введение режима обводки контуров микрообъекта маркером позво-
ляет решить ряд практических задач, среди которых можно отметить возмож-
156
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ность исключения артефактов и анализа клеток из края железистой структу-
ры при наложении друг на друга.
По команде оператора все измеренные парметры и статистические харак-
теристики в виде таблиц могут быть выведены на экран дисплея, где также мо-
жет быть пос троена гистограмма любого параметра, масш табы которой выби-
раются оператором или задаются микроЭВМ. В анализаторе предусмотрено
фотографирование с экрана дисплея, а также вывод на перфоленчу получен-
ных результатов обработки. Возможность ввода информации с перфоленты,
обеспеченная в анализаторе, позволяет при цитологических исследованиях
провести сравнение изменений гистограммы и контроль в ходе лечения боль-
ных. Модульный принцип построения прибора, интерактивный режим его ра-
боты позволяют в минимальные сроки обучи гь работе на анализаторе врачей-
цитологов, нс имеющих опыта-и знаний в области программирования и средств
вычислительной техники.
Современная система "Диаморф (г. Москва) - это новое поколение теле-
медицинских видеокомпьютерных систем для количественного анализа изо-
бражений морфологических структур клеток по более чем 200-м парамет рам,
с последующим первичным статистическим анализом полученнных данных, и
их сохранения, а если нужно, и передачи па расстояние цитологической карти-
ны для дальнейшего ее анализа в рамках пакета прикладных программ Диа-
Морф ИПСО. Оборудование сертифицировано Министерством здравоохране-
ния России и защищено патентами.
II. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА КОМПЬЮТЕРНОЙ
МОРФОМЕТРИИ ДЛЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
ОПУХОЛЕЙ И ПРЕДОПУХОЛЕВЫХ ПРОЦЕССОВ
Причина возросшего интереса к применению морфометрии в морфологи-
ческих исследованиях кроется не только в появлении новых приборов, суще-
ственно упростивших получение объективных результатов при измерении
клеток и внутриклеточных структур, но и так же в возможности воспроизве-
сти результаты, полученные другими авторами. В отличие от морфологии -
гематология, клиническая биохимия давно используют количественные пока-
затели. что существенно облегчает в последующем проведение статистиче-
ской обработки полученных данных.
Известно, что расхождение заключений, при пересмотре препаратов ново-
образований другими морфологами колеблется от 2 до 28% и выше. Поэтому,
необходима обьективизация морфологической диагностики.
Для признания того или иного явления патологическим, - подчеркивал
И.В.Давыдовский, - необходимо учесть структуру явления, время, место, про-
странствен ньге отношения, то есть как качественную, так и количественную
его сторону’’.
Некоторые из параметров, применяемых в морфометрии, тесно связаны с
морфологическими характеристиками, используемыми патологами в повсе-
дневной практике и отражающими биологическое поведение опухоли. В сов-
ременных руководствах ядра злокачественных клеток обычно описываются
как увеличенные, часто неправильные по форме, иногда с большими нуклеи-
нами. При .этом площадь ядра связана с его размером, периметр ядра, ядерные
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
157
горизонтальные и вертикальные оси - с размером и формой. Как правило пло-
щадь ядра используется в качестве главного дискриминантного диагностиче-
ского критерия. С формой ядер связаны также и более сложные коэффициен-
ты. такие, как индекс контура ядра и коэффициент формы ядер. В условиях
патологии, ядерно-цитоплазматическое отношение коренным образом меня-
ется. особенно это характерно для клеток злокачественных новообразований.
В 1851 году H.Lebert впервые попытался использовать диаметр ядер клеток
рака для диагностики опухоли. Heiberg К.А. [1907] отметил увеличение ядер
при раке, но обратил внимание и на наличие мелких неопластических ядер. Не-
сколько лет спустя Borst высказывает мнение, что вариабельность размеров
ядер представляет собой более избирательный критерий злокачественности,
чем только кариомегалия. Jacobj W. [1925. 1935] связывал объемные измене-
ния ядер с генетическими особенностями клеток. Kloos Л. и соавт. [1962] ус-
тановили. что характерной чертой злокачественных опухолей является не уд-
воение ядерного объема по сравнению с таковым в исходной ткани, а появле-
ние ядер, которые в норме не встречаются в исходной ткани.
В нормальной ткани около 70% ядер имеют примерно одинаковый диа-
метр В "норме отклонение от среднего показателя не должно быть более
0,67ст, в этот инт ервал входит 50% всех изучаемых вариантов: клетки можно
считать атипичными при изменении их параметров более чем на 0.67(5 со зна-
ком плюс (+) или минус (-). Отклонения параметров свыше 2(5 увеличивает их
вариабельност ь и соответствует термину - полиморфизм. Этот интервал вари-
абельности можно разделить на две части, отражающие умеренную - от 0.67
до 1,33о и выраженную атипию клеток - от 1.33 до 2(5.
Распределение размеров ядер при злокачественных опухолях часто нерав-
номерное, что отражает важную особенность опухолевой кариограммы, а
именно, прерывистость значений - "ядерный пробел". Кроме того, исследова-
ние Ташкэ К. [ 1980] показало: параметры опухолевой кариограммы. как пра-
вило. существенно выше и разнообразнее, по сравнению с нормальной исход-
ной тканью Значительные вариации можно наблюдать и в разных участках
одной и той же опухоли, особенно при формах рака с крайне выраженным по-
лиморфизмом. Для анизокарии характерна тенденция к преобладанию круп-
ных ядер, достигающих при полиморфной саркоме 3500 мкм3. Следовательно,
характерен четкий сдвиг вправо опухолевой кариограммы; однако, ни усиле-
ние анизокарии, ни кариомегалия, ни другие кариометрическис параметры,
взятые в отдельности, не являются признаками клеток рака. Схематически пе-
реход от чисто" микроскопического анализа к количественному можно пред-
став ить так:
|--------------------------1 |--------1 |------------------------1
I чисто субъективный дна! ноз1 I градации 1 количественный анализ
|--------------------------1 |--------1 |------------------------1
Изучение морфометрических показателей у 47 больных плоскоклеточным
раком полости рта (рак языка, слизистой оболочки дна полости рта, альвео-
лярного отростка) с помощью полуавтоматического анализатора Интеграл
выявило дос товерное изменение всех показателей по сравнению с нормой, а
также в зависимости от степени дифференцировки клеток опухоли Площадь
158 Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ядра составила в среднем по группе рака (высоко, умеренно и низкодифферен-
цированного) - соответственно, 200,2; 255,3 и 239,4 мкм2 с колебаниями от 138
до 342 мкм2. При высокодифференцированном раке ядерно-цитоплазматиче-
ское отношение в пять раз превышало норму, при низкодифференцированном
- в 10 раз, что выражалось как в увеличении площади ядра, так и в уменьше-
нии площади цитоплазмы.
При исследовании плоскоклеточного рака пищевода средняя площадь ядер
опухолевых клеток (482 ± 26,8 мкм2) значительно превышала эти показатели
для ядер нормального эпителия (175 ± 20,5 мкм2). Соответственно уменьша-
лась площадь цитоплазмы (с 5708 ± 82,2 до 1173 ± 59,5 мкм2) и увеличивались
значения ядерно-цитоплазматического отношения (я/ц): с 0,036 в норме до
0,275 у высокодифференцированного и 0,452 у низкодифференцированного
плоскоклеточного рака пищевода. Морфометрические исследования позволи-
ли дифференцировать доброкачественные и злокачественные опухоли моче-
вого пузыря. Так, площадь ядер клеток злокачественных новообразований
различной степени дифференцировки по сравнению с папилломами была зна-
чительно выше (293,6 ± 12,1 мкм; 469,4 ± 14,0 мкм; 542,8 ± 28,4 мкм и 261,4 ±
5,2 мкм, соответственно). Существующие различия между доброкачественны-
ми и злокачественными опухолями отражала и величина клетки в целом. Так,
при папилломах площадь клетки составляла 564,7 ± 9,0 мкм, а при злокачест-
венных опухолях она равнялась 659,3 ± 35,7 мкм; 795,8 ± 34,9 мкм; 905,6 ± 34,2
мкм. соответственно. Эго же отражалось и в величинах ядерно-цитоплазмати-
ческого отношения.
Трудности цитологической диагностики дисплазий, прсинвазивного рака
шейки матки в значительной мерс порождены не только субъективизмом в
оценке цитологических признаков, но и недостаточной унификацией и четко-
стью терминологии при описании цитологических картин. Предпринимые по-
пытки морфометрического анализа помогают преодолевать известный субъек-
тивизм и положительно отражаются на качестве цитологической диагностики.
Полученные многими авторами данные свидетельствуют об увеличении
ядерно-цитоплазматического соотношения по мере нарастания степени злока-
чественности. Кроме того, получены конкретные значения я/ц и площади ядер
при различных патологических состояниях эпителия шейки матки. Обнаруже-
ны более выраженные сдвиги вправо кариометрических кривых при плоско-
клеточной карциноме и интраэпителиальной карциноме шейки матки, по
сравнению с плоскоклеточной метаплазией. Атипическая гиперплазия шейки
матки занимает в кариометрическом отношении промежуточное положение
между метаплазией и карциномой. Анализ связи размеров площади ядер кле-
ток с морфологическими заключениями при патологии шейки матки по сред-
ним арифметическим, средним квадратичным и дисперсии показал, что сред-
няя площадь ядер в норме составляет 89,2 мкм, при воспалении - 106.3. при
дисплазии - 121,8, при плоскоклеточном и железистом раках 226,3 и 219,1 мкм.
Выявлено увеличение среднегрупповой площади ядер при раке по сравне-
нию с нормальным эпителием в два раза. При дисплазии наблюдается наруше-
ние нормального соотношения между ядром и цитоплазмой в целом, ядерно-
цитоплазматическое соотношение увеличивается в два раза, а в глубоком слое
плоского эпителия в пять раз. Ядерно-цитоплазматические отношения разли-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
159
чаются при всех формах дисплазий и при преинвазинном раке шейки матки и
дают более четкие различия между нормальным и патологически измененным
эпителием, при этом наиболее значительные изменения происходят в глубо-
ких слоях. Многопараметрический статистический анализ морфометрических
данных (площади и периметра ядер) дал возможность разработать алгоритм
распознавания доброкачественных предраковых и раковых процессов шейки
мазки. Установлена нецелсообразность разделения слабой и умеренной степе-
ней дисплазии. Выраженные диспллогические процессы и рак шейки матки
классифицируются с помощью предложенной системы с ошибкой менее 16 и
15% соответственно.
Ядра клеток нормальной молочной железы продолговаты и мономорфны,
кривая их распределения относится к гауссовскому типу. В сложных диагно-
стических случаях морфометрический анализ аспиратов клеток из опухолей
молочной железы имеет преимущество перед обычным цитологическим ис-
следованием. Этот вывод сделан на основании изучения площади, периметра
клеток и ядер, ядерно-цитоплазматического соотношения при доброкачест-
венных заболеваниях (ДЗМЖ) и раке молочной железы (РМЖ).
В наших наблюдениях при ДЗМЖ измерения периметра, площади клеток и
ядер позволили объективизировать и более четко разграничить, с помощью
полученных алгоритмов, при высоком коэффициенте эффективности (0,9-
1,0), степень пролиферативных изменений эпителия молочной железы.
Пролиферирующий эпителий выстилки кис гы по своим параметрам суще-
ственно отличался (р<0,05) от эпи гелия протоков и альвеол с различной сте-
пенью пролиферации. Морфометрический анализ клеток эпителия при плаз-
моклеточном мастите показал их умеренно выраженную степень пролифера-
ции.
Основные морфометрические показатели клеток РМЖ были достоверно
больше (р<0,05), чем параметры эпителия молочной железы при пролифера-
ции по типу предрака. На основе этих данных с помощью кластерного анали-
за разработаны 8 информативных алгоритмов распознавания клеток рака с ко-
эффициентом эффективности (КЭ) 91,6-97,5%, лучше работали алгоритмы
(КЭ=95,5-97,5%) пос троенные на параметрах ядер. Выделена "зоны риска”;
при попадании в нее морфометрических параметров клеток пролиферирую-
щего эпителия за больной должен устанавливаться регулярный цитологиче-
ский контроль.
Тот факт, что морфометрические параметры клеток при ДЗМЖ и РМЖ не
полностью отличаются друг от друга (еегь морфометрическая область, вклю-
чающая предраковую пролиферацию с клетками, имеющими признаки атипии,
и отдельные случаи высокодифференцированного РМЖ), показывает предел
диагностических возможностей морфометрии, и, с нашей точки зрения, отра-
жает трудности дифференциальной цитологической диагностики, которые ча-
стично могут быть преодолены с учетом анализа нс только морфометриче-
ских, но и проточноцитометрических параметров клеток.
Площадь клеток и ядер, их полиморфизм и периметр при дольковом раке
достоверно ниже, чем при протоковом. Различие морфометрических парамет-
ров дает дополнительные объективные критерии для распознавания клеток
долькового инфильтративного рака с высоким (0.95) коэффициентом эффек-
160 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
тивности и, соответственно, способствует уточнению гистогенеза опухоли. С
помощью дискриминантного анализа показано, что комбинацией значений пло-
щади ядер и числа митозов на препарат возможно в 87,5% случаев разграни-
чить высоко- и умереннодифференцированный рак молочной железы. Присо-
единив к двум названным морфометрическим признакам коэффициент формы
ядер, в 83,3% случаев удается выделить низкодифференцированные опухоли.
На рис. 1 показано достоверное различие площади клеток и ядер при высо-
ко-, умеренно- и низко дифференцированном раке молочной железы. Сочета-
ние морфометрических и ДНК нроточноцитомстричсских показателей имеет
достаточную дискриминантную силу, чтобы определить степень дифференци-
ровки опухоли, и. поэтому, количественный анализ клеток может быть полез-
ным для классификации грудных случаев.
Площадь клеток опухоли
Рис. 1. Площадь клеток и ядер при высоко-, умеренно- и низкодифференциро-
ванном раке молочной железы
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
161
Таким образом, широкое применение в клинической цитологии компью-
терной морфометрии способствует повышению достоверности цитологиче-
ской диагностики злокачественных новообразований.
III. ВОЗМОЖНОСТИ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ
ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРОМЕТРИИ
Исследования подобного рода сейчас выполняются на приборах: FACS,
EPICS и других, в основе которых лежит метод проточной цитометрии, впер-
вые описанный Кросландом-Тейлором и позволяющий получать ламинарный
поток образца. Это обеспечивает высокую точность измерений и дает возмож-
ность анализировать десятки тысяч клеток за считанные секунды. Названия
метода по-русски были разными: проточная цитофлуорометрия, импульсная
цитометрия, проточная цитомсзрия. Перший и последний термины, по нашему
мнению, более соответствуют английскому Flow cytometry.
В качестве источника излучения в анализаторах используются, как ртутно-
кварцевые лампы высокого давления (ICP-11, ICP-22, Phywe. ФРГ; FACS.
Becton Dickinson, США), так и лазеры (50-Н, Ortho Instruments, США;
FACScan, Becton Dickinson, США; EPICS-5 и EPICS Elite, США-Франция), ко-
торые более современны и обладают рядом уникальных свойств: монохрома-
тичностью, большой плотностью энергии и высокой коллимацией.
Эго дает возможность измерять на нужной длине волн флуоресценцию
красителей. количественно связанных с нуклеиновыми кислотами, белком и
другими компонентами клеток.
3.1.	Методика получения материала для исследования
Материал для исследования получаю т разными способами:
1)	посредством пункции опухолей толстыми иглами;
2)	методом трепанобиопсии;
3)	при операции;
4)	из парафиновых блоков удаленных опухолей.
На проточном анализаторе возможно изучать только клеточную суспен-
зию, которую как правило, получают механическим или ферментным спосо-
бом. Для этой цели Петрова А.С. и соавт. [1976]; Robinson LJ.P. и соавт. [1993]
используют измельчение бритвой свежей опухолевой ткани с последующей
фиксацией суспензии клеток этанолом (образцы при хранении в холодильнике
-4 С могут быть пригодными для исследования в течение нескольких месяцев).
Клеточную суспензию обрабатывают детер1 ентом "тритон Х-100', окрашива-
ют флуорохромами и через полчаса, с помошью проточных систем, получают
ДНК и РНК-гистограммы.
В 1983 г. Hedley D.W. показал возможность получения клеточной суспен-
зии из хранившихся годами парафиновых блоков.
Все перечисленные способы почти всегда дают возможность получить аде-
кватное количество материала для проточной цитофлуорометрии и поэтому,
существует возможность проводить исследование сразу после получения кле-
точной суспензии (с помощью тритона Х-100), через 2-3 дня или позднее (фи-
ксация клеток этанолом) и на материале из парафиновых блоков, хранивших-
ся годы, что дает возможность post factum установить плоидность и пролифе-
162
Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ративную активность опухолей.
Следует также отметить, что методика проточной цитометрии обладает од-
ной важной отрицательной стороной - не позволяет, одновременно с измере-
нием, морфологически идентифицировать клетки новообразований. Поэтому,
полученный материал (пункционный, биопсийный, операционный) режется на
два кусочка, один для гистологического анализа, второй - для цитологическо-
го и цитофлуорометричсского исследования.
При твердой консистенции опухоли делается соскоб с каждой стороны ку-
сочка и ци тологический материал со скальпеля наносится на предметное сте-
кло. Мазки окрашиваются азур-эозином по Лейшману. После цитологическо-
го заключения они используются для морфометрического анализа.
Если полученный опухолевый материал был в достаточном объеме, то для
проточной цитометрии берут три-четыре кусочка из разных участков опухоли
(делают с каждого мазки-отпечатки для цитологического контроля) и, затем,
каждый из них обрабатывали отдельно. Это делается для более объективного
изучения содержания ДНК, так как морфологическая картина и содержание
ДНК в клетках опухоли иногда отличаются в различных ее участках. Нами в 25
случаях рака легкого было проведено сравнительное изучение содержания
ДНК в разных участках одной опухоли (исследовали до 4-6 кусочков). В 9 слу-
чаях (53%) из 17 при анализе отдельных кусочков новообразования выявлено
отличие в ИДНК. В 5 (29%) наблюдениях различия были значительными и ка-
сались не только ИДНК, но и числа клеток в S-фазе. В 8 наблюдениях (47%)
анеуплоидных и 7 (100%) диплоидных опухолей не было выявлено различий по
ИДНК. в то время как число клеток в S-фазе незначительно колебалось.
Особо следует подчеркнуть, что при диплоидных опухолях (в мазках отпе-
чатках преобладают клетки рака ле| кого) ни в одном из исследованных кусоч-
ков не было обнаружено анеуплоилной линии клеток. В то время, как при ане-
уплоидном раке - два из трех образцов, а в другом случае - один из трех образ-
цов оказался диплоидным.
Полученные данные указывают на гетерогенность популяции клеток опу-
холи. Поэтому, для предотвращения возможных погрешностей при ДНК-ПЦ,
мы всегда готовили клеточную суспензию из нескольких, взятых в разных ме-
стах опухоли кусочков, или делали бритвой толстый срез через всю опухоль, и
из него готовили суспензию. Оба способа дают как бы усредненный клеточ -
ный состав опухоли, более обьективно отражающий, чем один маленький ку-
сочек, всю популяцию клеток новообразования.
Кроме того, можно острой бритвой сделать толстый срез по большему диа-
метру всей удаленной опухоли. Далее из такого среза готовится клеточная сус-
пензия, которая позволяет получить суммарные данные о плоидности и проли-
феративной активности клеток новообразования. Этот способ также объек-
тивно отражает распределение ДНК в клетках опухоли,
В случае получения скудного материала часть его обязательно отправляет-
ся на гистологическое исследование, из другой половины, после цитологиче -
ского контроля, готовится клеточная суспензия для проточной цитометрии.
Для уверенности в том, что после терапии морфологическому исследова-
нию и проточной цитометрии будет подвергнут именно тот участок опухоле-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
163
вой ткани, из которой до лечения был взят биоптат и сделана проточная цито-
метрия, необходимо как можно точнее определить место прокола иглой или
трепаном. Затем соответственно проколу сделать разрез по ходу трепана (или
иглы) и из участков опухоли рядом с бывшим "каналом1 трепана вырезать ку-
сочки ткани для исследования. Это дает возможность предположить, что изме-
нения, полученные на гистограммах, будут соответственно отражать те изме-
нения, которые произошли в результате проведенного лечения.
Кусочки необходимых для исследования тканей помещают в пропитанные
физиологическим раствором салфетки, которые затем укладывают в чашки
Петри. В таком виде материал транспортируется в лабораторию.
Для анализа материала из парафиновых блоков на микротоме делают тон-
кие (4 мкм) и толстые (40 мкм) срезы по следующей технологии. До и после
трех-четырех толстых срезов нарезают для гистологических препаратов
обычные 4 мкм срезы, которые затем верифицировались. При этом, кроме
стандартной морфологической характеристики картины, особое внимание об-
ращается на клсточность исследованного материала. Считается возможным в
дальнейшем провести качественный проточно-цитофлуорометрический ана-
лиз, если клетки рака (или эпителия) составляют более 50% площади гисто-
логического среза. После такой оценки можно с уверенностью исследовать
содержание ДНК в ядрах клеток 40 мкм срезов.
Последующая обработка полученного материала протекает в несколько
этапов: приготовление суспензии клеток; если необходимо по методике - фик-
сация; затем окрашивание флуорохромами.
3.2.	Приготовление клеточной суспензии
В зависимости от полученного материала (свежий или толстые срезы с па-
рафиновых блоков) используют два разных способа приготовления клеточной
суспензии.
В случае свежего материала применяется следующая методика:
1)	Кусочек ткани измельчают (режут бритвой) в чашке Петри в неболь-
шом объеме (0.5 мл) профильтрованного через 0,45 мкм миллипоровый
фильтр Трис-НС1-буфсра (pH-7,4) или физиологического раствора до получе-
ния клеточной суспензии.
2)	Клеточную суспензию тщательно перемешивают в течении 3 минут ав-
томатической пипеткой до получения однородной взвеси клеток, затем фильт-
руют в градуированную центрифужную пробирку, в начале через редкий
фильтр (поры 500-600 мкм), затем через стандартный нейлоновый фильтр с
диаметром пор 100-130 мкм.
3)	Далее суспензия фиксируется (если нужно отсрочить проведение иссле-
дований) или сразу после окрашивания по специальной методике исследуется
на проточном анализаторе.
Примечание'. если полученный кусочек опухолевой ткани очень мал (раз-
мер со спичечную головку и меньше), то он измельчается в меныпем объеме
буфера (0,15-0,2 мл). Полученная клеточная суспензия не фильтруется, а сра-
зу окрашивается по специальной методике. И только после окраски она про-
пускается через 100-130 мкм нейлоновый фильтр и затем исследуется на про-
точном анализаторе.
164
Том 11 - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Процедура приготовления клеточной суспензии из толстых парафиновых
срезов по методу Camplejonh и соавт. [1985] более сложная и трудоемкая:
1)	Два-три парафиновых среза помещают в специальный закрывающийся
контейнер из мелкой сетки.
2)	Готовится батарея реактивов (10 лабораторных стаканов с притертыми
крышками по 100 мл): 1-й стакан - ксилол; 2-й - ксилол; 3-й - 100% метило-
вый спирт; 4-й - 100% метиловый спирт; 5-й - 95% метиловый спирт; 6-й -
95% метиловый спирт: 7-й - 70% метиловый спирт; 8-й - 50% метиловый
спирт; 9-й - дистиллированная вода: 10-й - дистиллированная вода.
Примечание: можно использовать и этиловый спирт.
3)	Контейнер (или сразу несколько контейнеров) с парафиновыми срезами
помещают на 15 минут последовательно в каждый из первых 8 стаканов. В ди-
стиллированной воде оставляют на 15 мину г. Если проводка материала выпол-
няется в конце рабочего дня, то контейнеры со срезами можно оставить на
ночь в стакане с 50% спиртом.
4)	После полной проводки срезы аккуратно пинцетом переносят в пробир-
ки с 1 мл 0,5% пепсина (Sigma, Poole, Dorset), pH 1,5.
5)	Пробирки ставят на водяную баню (или в термостат) на 30 минут при
температуре 37 С.
6)	Затем пробирки быстро охлаждают и помещают в центрифугу. В тече-
нии 3 минут центрифугируют при 2000 оборотах в минуту при комнатной тем-
пературе.
7)	Пипеткой аккуратно забирают всю надосадочную жидкость.
8)	К осадку добавляют 2 мл изотонического раствора (Coulter Electronics,
llnton) или фосфатного буфера (pH 7,4) и тщательно разбивают оставите ча-
сти срезов на вибромешалке.
9)	Фильтруют полученную клеточную суспензию через 35 мкм нейлоно-
вый фильтр.
10)	Пропускают два раза кле точную суспензию через тонкую иньекцион-
ную иглу.
11)	Добавляют 5,0 мл флуоресцентного красителя DAPI (4,6-диамидино-2-
фенилиндол гидрохлорид, Serva).
Примечание: в 15% наблюдений не удастся получить для анализа адекват-
ную концентрацию клеточной суспензии.
3.3.	Фиксация клеток
Фиксацию клеток осуществляют двумя методами:
По методу Darzynkiewicz Z. и соавт [1975; 1977] к 1-1,5 мл кле точной сус-
пензии добавляют по капле 9 мл холодной (4"С) смеси этанол-ацетон (1:1), все
время тщательно пипетируют полученную клеточную взвесь, ’гем самым препят-
ствуя образованию конгломератов клеток, ибо две склеившиеся клетки регист-
рируются проточным анализатором как одна с удвоенным количеством ДПК.
Но другой методике [Steinkamp J. и соавт., 1974] к 0.5 1 мл клеточной сус -
пензии добавляют по капле 96% этанол; при этом суспензия постоянно (для
предотвращения слипания клеток) пипетирустся с помощью автоматической
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
165
пипетки объемом на 1,5 мл. Концентрация спирта в суспензии постепенно уве-
личивается до 70% (соотношение взвеси клеток и спирта 1:2,5). Такой способ
фиксации особенно хорош для последующего окрашивания флуоро^ромом-ак-
ридиновым оранжевым.
Пробирки плотно закрывают резиновыми пробками или пленкой Parafilm
М" (American Can. Corp., США) и после 48-часовой фиксации при -20°С клет-
ки могут быть подвергнуты исследованию с флуорохромами.
Примечание/, зафиксированная клеточная суспензия может хранится в хо-
лодильнике в течении нескольких месяцев.
3.4.	Обработка клеток детергентом тритон Х-100
Traganos Е и соавт. [1977] установили, что в нефиксированной клеточной
суспензии после обработки 0,1% раствором тритон Х-100 (при рН=4,0 и ни-
же), клетки сохраняли цитоплазматическую оболочку, и делались проницае-
мыми для окраски акридиновым оранжевым, этидиум бромидом и другими
флуорохромами. При этом не затрачивалось время на отмывание клеток от
фиксатора, что также позволяло сохранить большое их количество. Кроме то-
го, авторы подчеркивали, что при обработке по этой методике клетки, находя-
щиеся в митозе, не разрушаются даже при встряхивании и пипетировании, а
содержание в них нуклеиновых кислот остается без изменения.
Учитывая эти положительные особенност и методики, она может быть ис-
пользована для срочного исследования (через 25 минут готов ответ) содержа-
ния ДНК в клетках опухоли.
1)	К 0,4 мл клеточной суспензии добавляют 0,02 мл 10% телячьей сыво-
ротки. Аккуратно несколько раз эту смесь встряхивают и через 5 минут к ней
добавляю! 0,6 мл очень холодного (1-4‘С) 0,1 % раствора тритон Х-100 (Sigma
Chemical Со.), 0.1N НС1 и 0,15N NaCt (pH 1,5-2,0).
Обработка нефиксированных клеток 0,1 N соляной кислотой в присутствии
детергента, тритон Х-100, удаляет гисгоны и другие кислоторастворимые
белки и увеличивает в 2,4 раза максимальное количество интеркалирующих
мест, которые затем связывались с красителем.
2)	Несколько раз смесь встряхивают и после 15-30 секунд к ней добавляют-
1 мл флуорохрома. Через 10-15 минут окрашенный образец можно исследо
вать на проточном анализаторе.
Примечание', этот способ обработки особенно хорошо использовать при
исследовании пункционного и биопсийного материала, когда кусочек опухо-
левой ткани очень маленький и, следовательно, незначительно количество по-
лученной клеточной суспензии.
3.5.	Окрашивание нуклеиновых кислот флуорохромами
Флуоресцентные красители (флуорохромы) это вещества, взаимодейству-
ющие специфически и стехиометрически с внутриклеточными компонентами
и при возбуждении светом соответствующей длины волны, дают излучение
большей длины волны, интенсивность которого соответствует содержанию
исследуемых веществ в клетке.
Для этого используются различные флуорохромы: акридиновый оранже-
вый, этидиум бромид, митроминин. оливомииин, пропидиум йодид, диамино-
166
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
фенил-индол (DAPI). Zante J. и соавт. [1976] модифицировали способ окраски
клеток Crissmann Н.А. и Tobey R. этидиум бромидом (ethidum bromide), добав-
ляя к красителю флуоресцирующий противоопухолевый антибиотик митрами-
цин (mithramycin) или оливомицин, что существенно улучшило чувствитель-
ность метода. Выбор флуорохрома зависит от того, что нужно исследовать -
ДНК, РНК, белок и т.д. (отдельно или вместе), и от способа окрашивания кле-
ток.
3.5.1.	Одновременное дифференциальное окрашивание ДНК и РНК в
фиксированных клетках с помощью акридинового оранжевого
Известно, что часть клеточной РНК находится в двуспиральной конформа-
ции. Поэтому, чтобы получить дифференциальное окрашивание ДНК и РНК
этим красителем, необходимо избирательно перевести двуспиральную РНК в
односпиральную форму без изменения конформации ДНК. Это достигается
обработкой клеток до окрашивания хелатирующими агентами |Darzynkiewics
Z. и соавт., 1975]. Для этой цели используют динатриевую соль этилендиами-
нотетрауксусной кислоты (трилон Б).
Разные партии акридинового оранжевого (А.О.), даже произведенные од-
ной фирмой, возможно, имеют неодинаковую степень очистки препарата
Вследствие этого в каждом конкретном случае действительная концентрация
красителя в растворе может оказаться неодинаковой. Поэтому одновременно
готовят значительное количество (маточного) раствора А.О. ( Serva ) в кон-
центрации 1 мг на I мл дистиллированной воды, которым пользуются в тече-
ние Всей серии опытов. Маточный раствор красителя хранится в темноте при
2-4 'С и годен в течение многих месяцев.
А. Приготовление растворов А и Б.
Раствор А:
8,775 г хлористого натрия (NaCl) на 1 литр 0,1 N НС1 (pH 2,0-1,5).
Этот раствор можно хранить при 4 С до 2-х недель. Чтобы нс произошла
денатурация ДНК от соляной кислоты, температура при использовании рас-
твора должны быть 1-4°С.
Раствор Б:
1)	Фосфатно-цитратный буфер, pH 4,1-4,2.
2)	0,15 N хлористый натрий (NaCl).
3)	5 х 10 М динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты.
4)	Акридиновый оранжевый 6 мкг/мл (0,6 мл маточного раствора А.О. на
100 мл смеси).
Раст вор Б без А.О. можно хранить в течении нескольких месяцев в холо-
дильнике при 2-4 С. После добавления А.О. его необходимо использовать в те-
чении 24 часов.
Как маточный, так и растворы А и Б фильтруют через 0,45 мкм миллипо-
ровые фильтры.
Б. Непосредственная окраска образцов.
1.	После фиксации клетки дважды отмывают. 11ервый раз в фосфатном
буферном растворе (pH 7,4), второй - в 0,85% физиологическом растворе.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
167
Центрифугируют при 1000 оборотах в минуту в течение 5 минут. Каждый раз
клеточную взвесь тщательно пипстируют.
2.	Проводят контроль под микроскопом на наличие гомогенности. Доводят
концентрацию клеток до 12 х 10 в 1 мл.
3.	0,2 мл клеточной суспензии смешивают с 0,4 мл холодного (1-4°С) рас-
твора А. Аккуратно несколько раз эту смесь встряхивают и после 15-20 се-
кунд к ней добавляют 1,2 мл раствора Б.
4.	Специфичность окрашивания рибонуклеиновой кислоты определяют в
выборочных пробах с помощью рибонуклеазы (0,5 мг/мл суспензии клеток,
"Serva"). Выявленное при измерении уменьшение красной флуоресценции
(A, max > 600 нм), происшедшее в результате обработки рибонуклеазой являет-
ся показателем специфичности окрашивания РНК. После такой обработки
число клеток с повышенным содержанием РНК уменьшается в суспензии в
среднем на 60% и происходит смещение по оси абсцисс РНК гистограммы
влево в среднем на 35 каналов.
5.	Окрашенный образец помещают в контейнер для клеточной суспензии
цитофлуорографа, откуда клетки под давлением через сменный фильтр по со-
единительной трубке поступают в протоковую ячейку, где они гидродинамиче-
ски фокусируются обтекающей жидкостью (физиологическим раствором).
Это позволяет получить условия ламинарного потока. При таких условиях все
клетки попадают в центр потока и пересекают лазерный луч одна за другой.
Скорость движения клеток регулируется давлением оболочечной жидкости,
при этом установленное давление образца определяло его расход (мл/мин) и
диаметр потока. Флуоресценция измеряется от каждой клетки и вызывается
фокусированным до 5 мкм аргон-ионным лазерным пучком с длиной волны
488 нм. Принцип работы проточных анализаторов простой. Окрашенная флу-
орохромом клеточная суспензия помещается в контейнер для образца, откуда
клетки под давлением поступают в проточную камеру, где они гидродинамиче-
ски фокусируются, что позволяет вызывать флуоресценцию каждой клетки,
пересекающей луч от ртутно-кварцевой лампы или лазера. Возникшее флуо-
ресцентное излучение подводится к фотоумножительным трубкам, где свето-
вой сигнал преобразуется в электрический, усиливается, преобразовывается и
в зависимости от величины записывается в виде гистограммы на экране дисп-
лея по принципу: чем больше содержание Д1IK. РНК или белка, тем сильнее
импульс и гем дальше на оси абсцисс откладывается величина флуоресценции
клетки. На оси ординат регистрируется число импульсов на канал: чем выше
кривая в любой точке, тем больше сосредоточено клеток с одинаковым содер-
жанием ДНК, РНК или белка в данном канале.
Красное флуоресцентное излучение от комплекса АО. с РНК (> 600 нм, в
пределах 625-650 нм) и зеленая флуоресценция от интеркалированного в ДНК
А.О. (в пределах 515-575 нм) измеряется от каждой клетки и разделяется с по-
мощью системы фильтров, встроенных в цитофлуограф. Так, фильтр N300-
0281-001 пропускает красное излучение (от 625 мм до инфракрасного), а
фильтр N300-0281-001 - излучение с длиной волны от 515 до 555 нм, что соот-
ветствует зеленой флуоресценции Красное и зеленое флуоресцентные излу-
чения, собранные элементами волоконной оптики, подводятся к соответству-
ющим фотоумножительным трубкам, аналоговые сигналы которых преобра-
168
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
зовываются и записываются в виде гистограмм на экране дисплея (по оси абс-
цисс которого представлены каналы многоканального анализатора). Получен-
ные цито-, ДНК или PH К-гистограммы автоматически записываются на же-
сткий диск компьютера и затем анализируются специальными программами:
LYSIS I или II, CellFIT, Becton Dickinson, США; MultiCycle, Phoenix Flow
Systems, США и т.д.
3.5.2.	Исследование в клетках ДНК с помощью смеси красителей
Ethidium bromid и Mithramycin
Добавление к иптеркалирующему красителю флуоресцирующего противо-
опухолевого антибиотика Mithramicin [Zante J. и соавт., 1976] улучшило специ-
фичность окрашивания, так как Mithramycin, не являясь интеркалирующим
красителем (он связывается преимущественно с гуанино-цитозиновым азоти-
стыми основаниями ДНК), в смеси с Ethidium bromide отдает ему энергию и
этим увеличивает интенсивность флуоресценции комплекса ДНК-интеркали-
руюший краситель.
Этот способ окрашивания пригоден как для нативного материала, так и для
фиксированного этанолом. Так же, как и при приготовлении маточного рас-
твора акридинового оранжевого, одномоментно, отдельно готовят значитель-
ное количество раствора Ethidium bromid (раствор А) и Mithramycin (раствор
Б), которыми можно пользоваться в течение нескольких серий опытов.
а.	Приготовление растворов А и Б
Раствор А:
I)	12,0 г трис буфера растворить в 1 литре дистиллированной воды. 0,1 N
НС1 довести pH буфера до 7,4.
2)	в 250,0 мл полученного буфера растворить 6,25 мг Ethidium bromid
(Sigma Chemical Co.). Таким образом, раствор А: 25 мг/л Ethidium bromid в
трис-НС1-буфере, pH 7,4.
Раствор Б:
1)	в 250,0 мл полученного буфера растворить 12,5 мг Mithramycin (Scrva) и
381,0 мг MgCl2. Таким образом, раствор Б: 50 мг/л Mithramycin в Трис-НС1-бу-
фере, pH 7,4; 7,5 mM MgCl2.
После фильтрования через 0,45 мкм миллипоровые фильтры растворы А
и Б можно хранить в течении нескольких месяцев в холодильнике при 2-4°С.
Примерно за 2 часа до окраски клеточной суспензии в непрозрачной пробир-
ке готовится смесь двух красителей в отношении Т.1, которая затем до начала
окрашивания находится при комнатной температуре.
б.	Окрашивание фиксированной этанолом клеточной суспензии
1.	Микропипеткой забирают в среднем 0.2 мл фиксированной суспензии.
Клетки отмывают физиологическим раствором (или фосфатным буфером,
pH-7,4), центрифугируя в течение 10 минут при 1000 оборотах в минуту,
2.	К осадку добавляют 1,0 мл фосфатного буфера (pH 7,4). Клеточную
суспензию тщательно пипетируют автоматической пипеткой.
3.	В пробирку берут пипеткой 0,4 мл клеточной суспензии и добавляют 1.0
мл смеси краси телей.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
169
4.	Через 20 минут после начала окрашивания, клеточную суспензию
фильтруют через 70 мкм нейлоновый фильтр в пластиковые стаканчики от
проточного анализатора.
Примечание: практический опыт показал, что можно не отмывать клеточ-
ную суспензию от спирта, а просто аккуратно, микропиноткой собрать часть
материала со дна пробирки и перенести его в пробирку с 0,10 мл фосфатного
буфера (pH-7,4) и выполнять перечисленные этапы далее.
в.	Окрашивание нефиксированной клеточной суспензии
1.	К 0.4 мл обработанной 0,1% тритон Х-100 кле точной суспензии добав-
ляют 1,0 мл смеси красителей.
2.	Для окрашивания ядер клеток требуется 15 минут. Затем клеточную
суспензию фильтруют через 70 мкм нейлоновый фильтр в плас тиковые ста-
канчики от проточного анализатора.
3.5.3.	Анализ содержания ДНК в клетках опухоли, полученных из пара-
финовых срезов с помощью флуорохрома DAPI
Синтезированный в 1971 году флуоресцентный краситель DAPI (4.6-
diamidino-2-phenylindol-dihydrochloride) не является флуорохромом, интерка-
лирующим в молекулу ДНК (он связывается преимущественно с аденино-ти-
миновыми азотистыми основаниями), однако, обладает высокой специфично-
стью и интенсивностью окрашивания дезоксирибонуклеиновых кислот
[Shapiro Н М., 1983].
Исследования клеточной суспензии, полученной из парафиновых срезов в
основном выполняются с помощью этого красителя. В нашей совместной ра-
боте с доктором Camplejohn R.S. (отделение исследования рака им. Р.Димблся
при госпитале Святого Томаса, руководитель проф. Nias A.H.W., г.Лондон)
было изучено содержания ДНК по методике Hedley DAV. и соавт. 11983; 1985]
с незначительными изменениями доктора Camplejohn R.S. [1985]:
1)	полученная из толстых парафиновых срезов после регидрирования и об-
работки 0,5% рас твором пепсина клеточная суспензия была ресуспендирова-
на в 5,0 мл изотонического буфера (Coulter Electronics, Luton, England) содер-
жащего 1 мг/мл DAPI (Serva, Boehringer Mannheim, Germany).
2)	суспензия окрашивалась в течении 30 минут, затем фильтровалась через
нейлоновый филыр.
3)	образцы исследовались на проточном анализаторе FACS (Becton
Dickinson, США) с ртутно-кварцевой лампой. В каждом образце анализирова-
лось не менее 50000 клеток. С помощью встроенной в прибор ЭВМ получен-
ные данные записывались на дискеты.
3.6.	Использование стандартов для определения плоидности клеток опухоли
Наше исследование и литературные данные свидетельствуют, что многие
клеточные суспензии, полученные из опухоли, содержали примесь клеток нор-
мальной ткани, либо стромы или элементов воспаления, то есть, первый пик в
анеуплоидной ДНК гистограмме является результатом флуоресценции этих
клеток и своего рода диплоидным стандартом, а второй четкий пик характери-
зует анеуплоидную популяцию клеток опухоли.
170
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ДНК-гистограммы клеток опухоли с одним модальным пиком, располо-
женным в области диплоидных стандартов (клетки нормальных тканей, лим-
фоциты) мы расматривали как диплоидную опухоль, каждый раз проводя для
большей убедительности параллельное цитологическое исследование мазков-
отпечатков с кусочков опухоли, взятых для проточной цитометрии.
Для настройки приборов перед анализом партии образцов проводилось ис-
следование диплоидных стандартов: клеток визуально неизмененной ткани,
взятой из того же органа вдали от опухоли, или лимфоцитов доноров, выделен-
ных из периферической крови человека по нижеприведенной методике.
3.6.1.	Методики приготовления диплоидных стандартов для настройки и
регулировки проточных анализаторов
Если клетки указанных стандартов обрабатывались вместе с клетками опу-
холи, а затем вся смесь окрашивалась флуорохромом, то стандарт назывался
внутренним. Если же он вносился окрашенным в клеточную суспензию с флу-
орохромом. то он назывался внешним, что ведет к увеличению процента ане-
уплоидных опухолей, из-за раздельного окрашивания клеток опухоли и стан-
дарта.
Количество ДНК в ядрах большей части клеток нормальной ткани соот-
ветствует диплоидному набору хромосом (2с). Так, все изученные нами образ-
цы (49 больных) при слабой-умсренной гиперплазии клеток бронхиального
эпителия (превалировал цилиндрический эпителий, иногда с небольшой при-
месью бокаловидных и базальных клеток) были диплоидные с небольшим чис-
лом клеток в S (7,3 ± 0.5%) и G2+M (5,5 + 0.5%) фазах митотического цикла,
то есть с низкой-умеренной пролиферативной активностью (ИП=12,8 ±
0.5%). ДНК гистограммы клеток опухоли с одним пиком, расположенным в
области диплоидных стандартов, рассматривали как признак диплоидного ра-
ка легкого.
Известно, что больше 90% лимфоцитов периферической крови находятся
в Go/i фазе клеточного цикла, и все они образуют диплоидную популяцию
клеток; поэтому их удобно использовать в качестве эталона.
Материал для диплоидных стандартов забирался но следующей схеме:
А: Если проводилось радикальное удаление новообразования, то кроме ку-
сочков опухоли, обязательно вдали от нее, из операционного материала бра-
лись кусочки визуально неизмененной ткани этого же органа.
После цитологического контроля, убедившись, что взятая визуально неиз-
мененная ткань является действительно такой, из нее готовилась клеточная
суспензия, часть из которой по выше приведенной методике фиксировал и.и в
последующих исследованиях использовали для регулировки прибора в качест-
ве внешнего стандарта для определении на экране дисплея контрольного по
ложения пика диплоидных клеток. Часть нефиксированной суспензии служи-
ла диплоидным стандартом в день исследования.
Б: 1) 15,0 мл гепаринизированной крови 20-40 ед/мл доноров ставили на 30
минут в термостат при 37ПС (можно и центрифугировать при 1500 об/мин 10
минут).
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
171
2)	пипеткой забирали плазму, в которой сосредоточено 40*50% лимфоцитов.
3)	наслаивали плазму на градиент Ficoll-Hepaque.
4)	центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 минут.
5)	аккуратно пипеткой забирали лимфоидное кольцо.
6)	лимфоциты, выделенные в градиенте плотности, дважды отмывали забу-
ференным физиологическим раствором и ресуспендировали в среде 199. Кон-
центрацию их доводили до 2 х 10 в 1 мл и фиксировали этанолом.
7)	часть лимфоцитов оставляли нефиксированными и использовали в каче-
стве диплоидного стандарта в день исследования.
Был создан банк лимфоцитов от разных доноров; с его помощью проводи-
лась точная корректировка положения диплоидного пика. С лимфоцитами
удобно работать,так как их можно легко выделять из крови, они уже являют-
ся готовой к употреблению суспензией, и самое главное, это точный диплоид-
ный стандарт. Однако, такой эталон, как суспензия из визуально неизмененной
ткани, объективно характеризует фон, на котором развилась опухоль и, поэ-
тому, вероятно, когда его можно получить, является более подходящим крите-
рием для определения плоидносчи и пролиферативной активности клеток опухоли.
Для удобства определения плоидности опухоли, чтобы диплоидный стан-
дарт не мешал выявлению диплоидных новообразований, Tannenbaum Е. и со-
авт. 11978] предложили использовать исскуственные латексные частицы
(сфероциты), эритроциты птиц и форели, которые, как известно, являются
ядросодержащими клетками, имеющими почти в 2,5 раза более низкое содер-
жание ДНК, чем клетки человека и, поэтому, на гистограммах их Go/i пик все-
гда находится перед диплоидным.
В.	Методика приготовления суспензии куриных эритроцитов
1.	Забирают кровь курицы в пробирку с гепарином (20-40 ед/мл). Гепари-
низированную кровь ставят в термостат при 37°С на 30 минут (или центрифу-
гируют 10 минут при 1000 об/мин.
2.	Пипеткой забирают плазму. Оставшиеся эршроциты трижды отмывают
в физиологическом растворе, центрифугируя каждый раз по 5 минут при 1000
об/мин.
3.	К 1,5-2.0 мл суспензии эритроцитов добавляют по капле 50° этанол; при
этом для предотвращения слипания клеток суспензия постоянно пипетируется
с помощью автоматической пипетки. Концентрация спирта в суспензии увели-
чивалась до 25-30° при соотношении взвеси клеток и спирта 1:3. Пробирку
плотно закрывают резиновой пробкой, и после 72-часовой фиксации при 0-4°С
эритроциты могут быть использованы в качестве внутреннего стандарта.
4.	Куриные эритроциты вносят в исследуемую клеточную суспензию, при
этом они составляют около 10-15% от конечного количества анализируемых
клеток.
Примечание*, фиксированные эритроциты можно добавлять только в фик-
сированную клеточную суспензию, а, соответственно, нативный материал не-
обходимо исследовать вместе с нефиксированными эритроцитами. Соблюде-
ние этого условия нужно для предотвращения возникновения возможного раз-
личия в интенсивности флуоресценции при одновременном окрашивании фик-
172
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
сированного и нативного материала. Приготовленная фиксированная суспен-
зия эритроцитов пригодна для использования в течение месяца.
Таким образом, внутренний стандарт, в отличие от диплоидных эталонов,
можно всегда видеть на экране дисплея, и когда его пик в вышеуказанных ка-
налах симметричен и устойчив, регистрируют номер канала Go/i фазы клеточ-
ного цикла исследуемой популяции клеток.
3.7. Анализ гистограмм
Цито- и гистограммы автоматически записываются на жесткий диск ком-
пьютера и затем анализируются (рис. 2 и 3) специальными программа: LYSIS
I или II, CcIlFIT, Becton Dickinson, США; MultiCycle. Phoenix Flow Systems.
США и т.д.
Методом прогонной цитометрии с высокой достоверностью можно опреде-
лить степень плоидности клеток опухоли,с одновременной оценкой их пропор-
ции в различных фазах (Gi/o, S. G2+M) клеточного цикла.
В любой клеточной суспензии, исследуемой на проточном анализаторе,
есть доля клеток нормальной ткани, либо элементов воспаления или стромы.
Первый пик в анеуплоидной ДНК-гистограмме является результатом флуо-
ресценции этих клеток и своего рода диплоидным стандартом. Поэтому реко-
мендуют говорить о ансуилоидии клеток опухоли при наличии двух четких пи-
ков на ДНК гистограмме (рис 2 и 3), полученной без внесенного или с внесен-
ным диплоидным стандартом (первый пик относится к диплоидной популяции,
а второй - к ансуплоидным клеткам опухоли). Популяцию клеток опухоли с од-
ним модальным пиком, расположенным в области диплоидных стандартов
(клетки нормальных тканей, лимфоциты, гранулоциты), следует считать дип-
лоидной. Для большей убедительности, что это именно диплоидная опухоль,
необходимо проводить параллельное цитологическое исследование кусочков
опухоли.взятой в исследование.
Известно, что количество ДПК в ядре пропорционально общему содержа-
нию хромосомного материала. В постмитотических нормальных соматических
клетках человека с диплоидным набором хромосом (2п) оно составляет 6,3 ±
0,5 pq (10g) ДНК, а число хромосом равняется 46.
В количественных исследованиях “плоицность”, выражаемая в числе хро-
мосом (n - number), указывает и специфическую кратность набора хромосом;
го-ссть, диплоидная с диплоидным 2п. триплоидная (Зп), тетраплоидная (4п)
опухоль. При этом единица плоидности "с (content) обозначает количество
ДНК в ядре клетки. Таким образом, диплоидное (или эуплоиднос) содержание
ДНК (2с) соотве тствует диплоидному числу хромосом в клетке, находящейся
в Gi/o фазе клеточного цикла, соответственно, в S фазе клеточного цикла это
значение равняется Зс. а в G2+M фазе - 4с.
На рис.2 последовательно показаны: 1 - цитограммы по SSC (показатель
гранулярности хроматина) и FSC (объем клетки); параметрам клеток: 2 - ци-
тограммы по FLl-Area и FL2-Width параметрам позволяют разделить отдель-
ные клетки от слипшихся между собой; 3 - ДНК-гистограммы.
Нарушения кариотипа в злокачественных опухолях варьируют в широких
пределах и эти изменения касаются как числа хромосом, так и их структурных
трансформаций.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
173
I этап	II этап	III этап
Рис. 2. I, II и III этапы использования компьютерной программы LYSIS II для
анализа плоидности и числа клеток в Go/1, S и G2 + М фазах клеточно-
го цикла (А - диплоидный; Б анеуплоидный и В - многоклоновый ане-
уплоидный рак предстательной железы)
174
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Рис. 3, Возможности компьютерной программы MULTICYCLE для автомати-
ческого расчета индекса ДНК, процента анеушюидных клеток, их чис-
ла в Go/i, S (заштрихованная зона) и G2 + М фазах клеточного цикла в
анеуплоцдной опухоли
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
175
Для характеристики степени анеуплоидии клеток опухоли вычисляют ин-
декс ДНК (ИДИ К), который характеризует отношения интенсивности флуо-
ресценции пика анеуплоидных клеток (его номер канала) к диплоидному. Ди-
плоидными опухолями считают новообразования, у которых Go/i пик находит-
ся в пределах контрольного пика диплоидных стандартов и, соответственно, их
ИДНК всегда равен 1,0. В анеуплоидных новообразованиях он больше или
меньше 1,0.
Популяция однородных клеток должна быть на гистограмме в виде верти-
кальной линии. Однако, на практике приходится иметь дело с кривой распре-
деления, ширина которой зависит от следующих причин: технических, связан-
ных с приготовлением и обработкой клеток, и биологических - отражающих
структурные изменения хроматина и распределение нуклеиновых кислот в ядре.
Для статистической характеристики ДНК-гистограмм вычисляется (в про-
центах) коэффициент вариации (Cv) по следующей формуле:
Cv = В/A х 42.5.
где А - номер канала середины Go/i пика;
В - ширина (в каналах) Go/i пика на 1/2 его высоты;
42,5 - коэффициент пересчета для получения результата
в процентах [Melamed M.R. и соавт., 1979].
Теоретически, если исследуемая популяция клеток мономорфна, и с одина-
ковым содержанием в ядрах ДНК, то коэффициент вариации гистограммы
должен быть равен 0. Однако, практически гистограммы отражают Гауссов-
ское распределение ядер и, поэтому, даже для тщательно приготовленной сус-
пензии неактивированных лимфоцитов его значение при исследовании на при-
боре 50-Н было равно 2-3%, а на ICP-11 - 3-6%.
При исследовании опухолей Cv значения были больше, и мы приняли усло-
вие, общепринятое в статистике, согласно которому Cv до 10% указывает на
слабое, от 10% до 20% - на среднее и более 20% - на сильное разнообразие
признака. Больше 90% гистограмм при раке легкого, молочной и предста-
тельной желез были меньше 9%, но больше 3%. но даже с таким низким по-
казателем Cv есть вероятность, что ряд диплоидных образцов на самом деле
содержал две популяции опухолевых клеток: одну истинно диплоидную, дру-
гую слабо анеуплоидную. Так, согласно данным Koss L.Y. и соавт. [1989], сус-
пензия. содержащая диплоидную (ИДНК=1,0) и слабо анеуплоидную
(ИДНК=1,2) линии клеток, не может быть различима внутри пика, имевшего
коэффициент вариации 4% и выше То есть, технические возможности прибо-
ра, качество его настройки и методические погрешности при приготовлении
суспензии могут уменьшить возможности метода.
Однако, мы считаем, что значение Cv больше 4% свидетельствует,при
правильном приготовлении образца, о гетерогенноети ядер в исследуемой сус-
пензии опухолевых клеток. Кроме того, при таких значениях Cv всегда необ-
ходимо обращать внимание на форму гистограммы. Так, симметричность Go/i
пика указывает на однородность клеточной популяции, а небольшая пологость
правой или левой половины пика может свидетельствовать о присутствии
близкой к диплоидной популяции клеток опухоли (ИДНК=1,05-1,20).
176
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Степень конденсации хроматина в ядре клетки влияет на интенсивность
флуоресценции комплекса ДНК - интсркалирующий краситель, так как флу-
орохром соединяется с бслками-гистонами, составляющими вместе с молеку-
лой ДНК основу хроматина. Гепарин и декстран-сульфат оказывают заметное
влияние на хроматин и белки-гистоны. Гепарин повышает число сайтов для
интеркаляции красителя (Ethidium bromide с Mithramycin) с молекулой ДНК,
переводя конденсированный хроматин в более дисперсную, деконденсирован-
ную форму. Эго вызывает увеличение флуоресценции клеток, не меняя соот-
ношения их по фазам клеточного цикла; снижает артефакты, улучшая при
этом качество ДНК-гистограмм. После обработки клеточной суспензии рас-
твором гепарина (СПОФА,Чехия) в концентрации 10 МЕ/мл (в течении 15-20
минут) качество ДНК-гистограмм также улучшается.
З.Х. Методика анализа клеток в фазах клеточного цикла
В полученной ДНК гистограмме процент клеточных ядер с различным со-
держанием ДНК вычисляется по отношению к общему числу исследованных
клеток по принципиальной схеме обсчета кривых, предложенной Rabinovitch
P.S. и соавт. [1989, 1992] в программе MultiCycle (Phoenix Flow Systems,
США). При выявлении анэуплоидной линии клеток зона между диплоидными
(Go/i) и анеуплоидными клетками (Go/i) делится пополам и, далее, вычисля-
ется количество пролиферирующих клеток (S и G2+M) для ансунлоидной по-
пуляции по тому же принципу, что и при диплоидной опухоли (см. рис.З). Та-
кой расчет пролиферативной активности анеуплоидной опухоли проводился
лишь в том случае, если число анеуплоидных клеток по отношению к общему
числу исследованных клеток составляло 20% и более (Ан >20%).
С помощью РНК гистограмм определялось число клеток с повышенным
содержанием РНК по методу Stadler В.М., De Week A.L. [1978], что позволило
ориентировочно определить число клеток в G1 фазе клеточного цикла. Для
этого от процента клеток с повышенным содержанием РНК нужно было от-
нять процент клеток в S и Gz + М фазах клеточно! о цикла (то есть индекс
пролиферации).
3.9. Типы ДНК-гистограмм
В соответствии с плоидностью и пролиферативной активностью клеток
изученных опухолей выделено 5 основных типов ДНК-i истограмм, а в боль-
шинстве этих типов в зависимости от пролиферативной активности и числа
анеуплоидных клеток (в %) еще и подтипы (табл.1 и рис.4).
I тип образовали больные с диплоидным содержанием ДНК в клетках опу-
холи с низким (подтип 1), умеренным (подтип 2) и высоким (подтип 3) показа-
телями пролиферативной активности.
II тип составили больные с тётраплоидными опухолями, гистограммы ко-
торых указывали на наличие популяции анеуплоидных клеток (их число пре-
вышало 20%) с значением индекса ДНК от 1.85 до 2.15.
III тип составляли больные с анеуплоидными опухолями (ИДНК от 1.1 до
Е84), которые в зависимости оз показателей пролиферативной активности
числа анеуплоидных клеток еще подразделялись (таблица 1) и на 7 подтипов:
111(H); П1(У1); 11КУ2); Ш(УЗ); Ш(М1); ПЦМ2) и Ш(МЗ).
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
177
IV типом гистограмм обладали больные с резко анеуплоидными опухоля-
ми (ИДНК > 2,15), которые при детальной оценке составляли три подтипа:
1V(1); 1V(2); IV(3).
V тип гистограмм был характерен для немногочисленной группы больных
с многоклоновыми опухолями.
Таблица 1
Типы и подтипы ДНК гистограмм
Тип nicrorpt	Подтип 1ММЫ	Число клеток (%)			ИДНК (индекс ДНК)	Число про- лиферирую- щих клеток
		BS- | фазах кле	bG2 + M точного цикла	анеупло- идпых		
I ЛИПЛО-	1	до 6	<10	нет	10	низкое
идная	2	до!2	10-15	нет	1.0	умеренное
	3	> 12	>15	нет	1.0	высокое
II тетра-		НЕ ИМЕ]	БТ	>20	1.85-2,15	НЕ ИМЕЕТ
ллоидная		ЗНАЧЕНИЯ				ЗНАЧЕНИЯ
III аиеу-	II	не вычислялись		>20	1.1-1,84	не вычис-
ллоидная						лялось
HI	У1	ДО 6	<10	20-40	1.1-1,84	низкое
ансупло-	У2	до 12	10-15	п	ч	умеренное
цдная	УЗ	> 12	>15	II	ч	высокое
	Ml	до 6	<10	>40	1,1-1,84	низкое
	М2	ДО 12	10-15	II	11	умеренное
	М3	>12	>15	II	•1	высокое
IV резко	1	до 6	<10			низкое
анеупло-	2	до 12	10-15	>20	>2,15	умеренное
идная	3	> 12	>15		I	высокое
V много-	3 клона н более (для анализа использовать параметры клеточного цикла популяции					
клоновая			с наибольшим ИДНК)			
Таким образом, с помощью типов гистограммы при строгом цитологиче-
ском контроле выделены диплоидные и анеуплоидные новообразования, дана
характеристика степени ансуплоидии - по ИДНК и количеству анеуплоидных
популяций. Подтип гистограммы дал возможность при каждом ее типе учиты-
вать число анеуплоидных клеток в опухоли и их пролиферативную активность.
IV ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПРОТОЧНОЙ
ЦИТОФЛУОРОМЕТРИИ В ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЯХ
В 50-80-с годы Caspersson Т и другими авторами было сообщено, что зло-
качественные клетки содержат больше ДНК. чем нормальные клетки. Эти ис-
следования проведены как с помощью одной из наиболее тщательно изучен-
ных гистохимических реакций по Фельгену и ее модификаций, так и посредст-
вом окрашивания флуорохромом - акридиновым оранжевым. Метод проточ-
ной цитометрии значительно облегчил изучение содержания ДНК, РНК, бел
ка. рецепторов в клетках нормальных и опухолевых тканей. При этом пресле-
дуются три основные цели: 1) установить различие между клетками нормаль-
ных и измененных тканей; 2) найти коррелятивные связи между особенностя-
ми ДНК, РНК-гистограмм в клеточных популяциях и клиническими проявле-
ниями болезни; 3) изучить кинетику содержания ДНК в клетках опухоли при
различных терапевтических воздействиях.
178
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Рис. 4 Основные типы ДНК-гистограмм
С появлением первых проточных систем были предприняты попытки ис
пользовать их в клинической цитологии для диагностических целей. Предпо-
лагалось, что метод должен стать скрининговым,так как с его помощью
можно было бы быс гро и достаточно просто установить злокачественность
процесса (большинствоопухолей поданным Isaacs!. [1986], Harrison G. [1988],
Stewart C.C. [1989] имеют хромосомные нарушения, и, как следствие, измене-
ние содержания ДНК в ядре клетки). Для этой цели наиболее удобной моде
лью из-за обилия материала является рак шейки матки. Полученные данные
показали, что клеточная суспензия всегда состояла из смеси нормальных и
опухолевых клеток, причем соотношение их в исследуемом материале было
различным. Когда процент опухолевых клеток в исследуемой популяции был
незначителен- выявить их методом проточной цитометрии было чрезвычайно
трудно. При значительном их количестве и большем содержании в них ДНК,
чем в нормальных клетках, всегда на гистограммах была видна их доминирую-
щая стволовая линия, которая имела диагностическое значение.
Эти исследования, а также данные обобщенные в монографии Melamed
M.R. и соавт. [ 1979] и других работах псх:тавили под сомнение возможность ис-
пользования проточных систем в клинической цитологии для диагностики из
за существования диплоидных опухолей, то есть злокачественных новообразо-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
179
ваний с нормальным кариотипом.
По нашим данным, при доброкачественных заболеваниях молочной желе-
зы в 97,9% наблюдениях обнаружены только диплоидные клетки, и только в
2,1% случаях предраковой пролиферации эпителия и при слоистой фиброаде-
номе выявлены анеуплоидные ДНК-гистограммы.
Наличие часто встречаемого диплоидного рака и, пусть редко, но выявляе-
мой ансуплоидии при доброкачественных заболеваниях (2,1% всех наблюде-
ний) молочной железы ограничивает, диагностические возможности проточ-
ной цитофлуорометрии. Однако, следует отметить, что в настоящее время уже
существуют сложные методы проточной цитометрии по распознаванию зло-
качественных и нормальных диплоидных клеток [C.Stewart, 1992].
При раке молочной железы в 57-73% случаев методом проточной цитоме-
трии выявляются анеуплоидные опухоли. Проведенное нами исследование по-
казало, что при раке молочной железы (группа из 426 больных) 72,2% опухо-
лей - анеуплоидные и, соответственно, 27,8% новообразований - диплоидные.
Доля диплоидных опухолей снижалась с повышением степени местно-регио-
нарного распространения болезни: при раке TiNoMo доля диплоидных опухо-
лей составила41 %, при раке T2N0M0 - 34%, при раке Т1-2N1M0 - 25%, при ра-
ке T3-4N0-2M0 и T1-2N2M0 - 15% [Портной С.М., 1997].
Одним из основных генов, контролирующих клеточный цикл млекопитаю-
щих, является ген белка р53. Содержащийся в ядре клетки белок р53 являет-
ся фосфопротеидом с мол. массой 53000 Д. Он был открыт в конце 70-х годов
в клетках, трансформированных вирусом SV-40. В 1986 г. установлено, что
ген, кодирующий этот белок, расположен в коротком плече хромосомы 17
(17р13). Нами применена проточноцитометрическая методика для одновре-
менного анализа плоидности, числа клеток в G0/1, S, G2+M фазах клеточного
цикла и экспрессии гена р53 в клетках новообразований молочной железы. С
помощью данной методики можно проследить основную роль белка р53 в кон-
тролировании пролиферации клеток и ее регуляции в ответ на повреждение
ДНК. Предварительные результаты свидетельствуют, что мутации 1 ена р53
выявляются у 32% больных раком молочной железы.
У больных с диплоидными опухолями пролиферативная активность клеток
выше, чем при доброкачественных процессах и ниже, чем при ансуплоидном
раке молочной железы.
Наличие ансуплоидного рака молочной железы коррелирует с наличием
метастазов в аксиллярных лимфатических узлах. Отмечена корреляция инде-
кса ДНК (ИДНК) с pl и pN, а также количеством метастазов в лимфоузлах.
Портной С.М. [1997] показал, что для анеуплоидных опухолей характерна го-
раздо большая частота метастатического поражения регионарных лимфати-
ческих узлов У больных, имевших анеуплоидные нс тстраплоидные опухоли,
частота поражения лимфатических узлов в 1,5 раза выше (р < 0,05), а у боль-
ных с многоклоновыми опухолями - в 2,0 раза выше (р < 0,05) по сравнению
с больными, имевшими диплоидные опухоли.
В 86,7% случаях диплоидного и 78.9% ансуплоидного рака ИДНК метаста-
зов соответствуют показателям первичных новообразований В ряде случаев
(13,3%) диплоидные опухоли молочной железы метастазируют клетками с
180
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
околодиплоидным ИДНК. Клетки диплоидных метастазов меньше и. соответ-
ственно, в них выше, чем в первичной диплоидной опухоли ядерноклсточное
соотношение и соотношение периметров, а их пролиферативная активность
одинакова. Клетки метастазов анеуплоидного рака по основным морфометри-
ческим параметрам крупнее, полиморфное и обладают большей пролифера-
тивной активностью, чем клетки первичной анеуплоидной опухоли.
Анализ ДНК параметров клеток у 47 больных с эпидермоидным раком лег-
ких показал, что при плоскоклеточном раке с ороговением (ВДПЛ; 17 наблю-
дений) 79,4% опухолей - анеуплоидные, с невысоким средним значением
ИДНК (1,31 ± 0,04) и умеренным числом анеуплоидных клеток в опухоли
(39,7 ± 4,3%). Пролиферативная активность в среднем по группе умеренная, а
в 27,2% наблюдений высокая, за счет значительного числа клеток в S-фазе
клеточного цикла (в среднем по группе ИП=21,8 ± 1,0%).
При умереннодифференцированном плоскоклеточном раке (УДПЛ; 8 на-
блюдений) час тота встречаемое ги анеуплоидных опухолей (71,1%) сгатистчс-
ски значимо не отличались (р>(),05) от частоты анеуплоидии при ВДПЛ
(79,4%), при этом нс было достоверного различия и по значениям ИДНК и ИП.
При низкодифференцированном раке (НДПЛ) все изученные опухоли
анеуплоидные с достоверно (рсО.ОО!) более высоким средним значением
ИДНК (1.60 ± 0,07) и интенсивной (ИП=28,8 ± 1,6%) пролиферативной ак-
тивностью клеток. Частота диплоидных и анеуплоидных аденокарцином лег-
кого связана со степенью дифференцировки опухоли.
Таким образом, снижение степени дифференцировки опухоли при плоско-
клеточном раке аденокарциноме легкого сопровождае тся достоверным увели-
чением значений ИДНК и пролиферативной активности клеток рака.
Между ИДНК в первичной опухоли и концентрацией РЭА в сыворотке
крови у больных плоскоклеточным раком легкого имеется статистически до-
стоверная корреляция. Средние уровни РЭА при диплоидном раке легкого
(ИДНК=1,0) достоверно (р<0,05) ниже, чем у больных с анеуплоидными опу-
холями (ИДНК > 1.05). Представленные результаты показывают, что в зави-
симости от степени анаплазии опухоли (показатели ИДНК) наблюдаются ко-
личественные изменения РЭА.
Использование лазерной ДНК - проточной цитометрии позволило полу-
чить с помощью компьютерной программы Multicycle (Phoenix Flow Systems,
США) важную и объек тивную информацию у больных ссминомой. При ти-
пичной семиноме (23 больных) однотипные опухолевые клетки в 60% случа-
ев были диплоидные и, соответственно, в 40% случаев анеуплоидные. В дип-
лоидных опухолях число клеток в S фазе (5,1 ± 0,2%) достоверно меньше, чем
в анеуплоидных 9,3 ± 0,2% (р<0,05) новообразованиях. Процент клеток в
G2+M фазе статистически значимо не различался (8.7 ± 0.5 и 9.4 + 0,5%).
У 4 больных выявлена диплоидная сперматоцитная семинома, которая ха-
рактеризовалась наличием клеточного и ядерного полиморфизма, гиперхро-
мной ядер и достоверно (р<0,05) большим, чем при типичной семиноме, чис-
лом клеток в Ga+M фазе клеточного циклг! (15.3 + 0,3%).
Диплоидный набор хромосом и значительна? число делящихся клеток (в
G24 М фазе 17,8 ± 0,2%) были выявлены у 71 % больных (17 случаев) с устой
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
181
чивой к химио- и лучевой терапии анапластической формой семиномы. У 5
больных (29%) выявлены анеуплоидныс опухоли с большим числом клеток в
S (11,3 ± 0,2%) и G2+M (18,1 ± 0,3%) фазах.
В анеуплоидных серозных пограничных опухолях яичников пролифератив-
ный уровень ( 18.9 ± 1.2%) был выше, чем в диплоидных опухолях (7,1 ±
2,2%). Высокий пролиферативный уровень (16,6 ± 2,4%) выявлен и при ис-
следовании высокодифференцированного рака яичников, при статически зна-
чимо неотличимом процентном содержании клеток в S-фазе (7,2 ± 0,6%) по
сравнению с 3,5 ± 03% и 8.1 ± 13%. Анеуплоидный высокодифференциро-
ванный серозный рак яичников встречается в 87,5% случаев, в то время, как
диплоидный в 12,5% случаев.
V. ВОЗМОЖНОСТИ ПАРАЛЛЕЛЬНОГО АНАЛИЗА
МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ И ПРОТОЧНО-ЦИТОМЕТРИЧЕСКИХ
ПАРАМЕТРОВ КЛЕТОК ОПУХОЛИ
Для преодоления трудностей распознавания методом проточной цитомет-
рии диплоидных злокачественных опухолей считают перспективным подход
основанный на комбинации анализа ДНК с одновременным исследованием
других параметров клетки (РНК, белка, площади клетки и ядра и т.п.).
Больные при пролиферации эпи гелия по типу прсдрака, особенно при со-
четании ансуплоидии с большими, чем в среднем по группе, основными мор-
фометрическими параметрами клеток, должны быть дополнительно обследо-
ваны для исключения злокачественности процесса. В случае подтверждения
доброкачественного характера новообразования молочной железы за такой
больной необходимо устанавливать тщательный динамический контроль.
Параллельно выполненный морфометрический анализ клеток показал, что
полиморфизм клеток и ядер, размеры ядер, при диплоидном раке молочной
железы достоверно меньше, чем в анеуплоидных опухолях. Отмечают корре-
ляционную связь плоидности со средней ядерной площадью, указывая на то,
что площадь ядер и коэффициент вариации площади ядер анеуплоидных опу-
холей значительно выше, чем у диплоидных опухолей. При этом, как при ане-
уплоидных, так и диплоидных опухолях не выявлено корреляции между пло-
щадью ядер и количеством клеток в S фазе.
Сочетание морфометрического и проточно цитометрического методов
способствует обьек типизации и улучшению цитологи ческой диагностики вы-
сокодифференцированного рака молочной железы (табл.2). Не выявлено раз-
личия между параметрами клеток диплоидного ВЦ долькового рака и резко
выраженной пролиферативной формой мастопатии Объективизация основ-
ных параметров клеток и ядер с помошыо морфометрии и проточной цито-
метрии позволяет внести при различных вариантах высокодифференцирован-
ных опухолей молочной железы четкие количественные критерии: три диагно-
стических алгоритма с коэффициентом эффек тивности распознавания клеток
рака (84=90,5%), которые можно использовать в качестве дополнительных
при проведении дифференциальной цитологической диш ностики между БД
раком и резко выраженной пролиферацией эпителия молочной железы с ати-
пией ядер час ти клеток.
182
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Установлено, что в 87% наблюдений диплоидного и 79% ансуплоидного
рака ИДНК метастазов соответствуют показателям первичных новообразова-
ний. В ряде случаев (13%) диплоидные опухоли метастазируют клетками с
околодиплоидным ИДНК. Клетки диплоидных метастазов имеют одинаковую
с диплоидной опухолью пролиферативную активность. Метастазы ансуплоид-
ного рака по основным морфометрическим параметрам крупнее, полиморф-
ное и обладают большей пролиферативной активностью, чем клетки первич-
ной анеуплоидной опухоли.
Таблица 2
Количественные параметры, которые можно использовать в качестве
дополнительных для дифференциальном цитологической диагностики
высокодифференцированного рака и резко выраженной
пролиферативной формы мастопатии с атипией ядер части клеток
Характер процесса
Количественные параметры
Внутрипротоковый
рак с началом инвазии
Основные морфометрические параметры
и индекс пролиферации
Инфильтративный протоковый рак
1) диплоидный	Основные морфометрические параметры
2) ансуплоидный	Основные морфометрические параметры,
плоидность, индекс пролиферации
Инфильтративный дольковый рак
1) диплоидный	НЕТ ОТЛИЧИЙ
2) анеуплоидный	Ядерные морфометрические параметры,
плоидность
Папиллярный рак
Тубулярный рак
Ядерные морфометрические параметры,
плоидность
Периметр клеток, их полиморфизм,
ядерные морфометрические параметры,
плоидность
5.1. Использование количественных параметров клеток рака молочной
железы для ориентировочной оценки уровня рецепторов стероидных гор
МОНОВ
В последние годы при раке молочной железы для отбора групп больных,
которым показана гормональная терапия широко используется количествен-
ная оценка рецепторов эстрогенов (РЭ) и прогестерона (Pl I) в цитозолях опу-
холей молочной железы. Эстрогенная стимуляция перед химиотерапией осно-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
183
вывается на концепции, согласно которой эстрогены увеличивают процент
клеток в S-фазс клеточного цикла и, следовательно, химиочувствигсльность
опухоли. Выявлена существенная корреляция уровня РЭ с гистологическими
вариантами и степенью злокачественности рака молочной железы. Исследо-
вание корреляции возраста, значений площади ядер клеток рака, статуса реги-
онарных лимфатических узлов и уровня рецепторов эстрогенов показало, что
у пациентов с метастазами и без метастазов существует связь возраста и пло-
щади ядер с различиями в уровне РЭ. Низкие значения площади ядер опухоле-
вых клеток наблюдаются в большинстве случаев в опухолях при высокой кон-
цен (рацией РЭ. Эта зависимость слабее выражена в группе больных с мета-
стазами в регионарные лимфатические узлы.
Площадь цитоплазмы клеток рака молочной железы коррелирует с кон-
центрацией РЭ. При этом анеуплоидные опухоли более часто РЭ отрицатель-
ные, в то время, как среди диплоидных опухолей более высок процент рецеп-
тор-позитивных новообразований. Самые большие значения основных мор-
фометрических параметров клеток и ядер наблюдаются при РЭ-РП- раке мо-
лочной железы, а наименьшие в РЭ+ РП+ опухолях (рис. 5).
У больных моложе 50 лет, с сохраненной менструальной функцией и стар
ше 60 лет, в глубокой менопаузе клетки и ядра РЭ+РП ь новообразований име-
ют наименьшую площадь,периметр и полиморфизм, а в РЭ-РП- опухолях наи-
большие значения этих параметров. При анеуплоидном раке четкость этих
различий менее выражена, чем при диплоидном. Упациенток в возрасте от 50
до 60 лет в климак терическом периоде определить, даже ориентировочно, по
количественным показателям гормонозависимость опухоли трудно.
5.2. Использование количественных показателей клеток опухоли для
объективизации степени выраженности патоморфоза
I функция опухолей специальными толстыми иглами или трепаном дает воз-
можность получить до лечения необходимое количество материала. Взятие
его из новообразования после лечения, во время операции, позволяет изучать
в динамике количественные параметры клеток у больных при раке молочной
железы. Поданным Tanaka A.S. и соавт. [1987,1996] терапевтический эффект
предоперационной химиотерапии значительно связан с атипией ядер, степе-
нью дифференцировки и митотическим индексом опухоли.
Анализ количественных показателей клеток опухоли до и после предопе-
рационной лучевой терапии (7 Гр х 2=СОД 14 Гр и 5 Гр х 4—СОД 2ОГр) или ле-
карственной терапии с адриамицином позволяет объективизировать, в основ-
ном с помощью морфометрических параметров, степень выраженности по-
стлучевого и лекарственного патоморфоза. При резко выраженных изменени-
ях морфометрические параметры клеток и ядер достоверно (р<(),001) больше
параметров клеток при слабо и умеренно выраженном патоморфозе. Выявле-
но, что диплоидные опухоли хуже, чем анеуплоидные поддавались лучевой те-
рапии, Предварительные результаты свидетельствуют, что возрастание или
неизменение числа клеток опухоли в S или G2+M фазах клеточного цикла при
проведении предоперационной крупнофракционной лучевой терапии (СОД =
14 Гр или 20 Гр) с большой вероятностью (более 75%) указывают на клини-
ческую радиорезистентность клеток рака, и поэтому в начале лучевой терапии
целесобразно оценивать пролиферативную активность опухоли при выра-
Морфометрические показатели Проточно цитометрические параметры
РЭ+РП+
Рис. 5. Отличие количественных параметров клеток опухоли у больных при РЭ-РП- и РЭ+РП+ раке молочной железы
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
185
ботке подходов для индивидуализации тактики лучевой терапии.
Исследовалась прогностическая значимость количественных параметров
клеток при 1П стадии рака молочной железы с учетом резистентности опухо-
ли и схемы химиотерапии. При химиотерапии с адриамицином плоидность опу-
холи не влияла на степень выраженности патоморфоза, но как в диплоидных,
так и анеуплоидных новообразованиях лекарственные изменения были выше в
опухолях с низким числом клеток в S фазе митотического цикла (< 7%). То
есть, увеличение степени выраженности патоморфоза сопровождалось досто-
верным уменьшением пролиферативной активности клеток рака молочной
железы. После 1-2 курсов эффективной лекарственной терапии по схемам
VCAF и CMFA. при слабой и умеренной степени выраженноети патоморфоза,
уменьшается площадь клеток опухоли, периметр и площадь ядер, полимор-
физм этих показателей, что обьективно свидетельствует о возрастании степе-
ни дифференцировки новообразований. Плоидность опухоли не влияла на сте-
пень лекарственного патоморфоза.
Van Diest P.J. и соавт. [1989, 1992] положительно оценивают значение мор-
фометрии для прогноза ответа на адъювантную химиотерапию по схеме CMF
у больных раком молочной железы находящихся в премснопаузе с поражени-
ем регионарных лимфатических узлов.
Для подавления гиперэкспрессии Рч ликопротеина клетками опухоли до-
полнительно к химиотерапии у больных мелкоклеточным раком легкого и мо-
лочной железы применяются модификаторы множественной лекарственной
устойчивости опухолевых клеток (верапамил и циклоспорин А). Их использо-
вание часто не приводит к положительным результатам. С помощью многопа-
раметровой проточной цитометрии, MR К-16 моноклональных антител и Родо-
мина 123 можно получить объективную информацию о функциональной ак-
тивности и резистентности клеток опухоли к химиопрепаратам (экспресия Р-
гликопротеина и Родомина 123).
Таким образом, анализ количественных показателей клеток опухоли до и
после предоперационной крупнофракционной лучевой терапии или лекарст-
венной терапии с адриамицином позволил объективизировать, в основном с
помощью морфометрических параметров, степень выраженности постлучево-
। о и лекарственного патоморфоза и оценить резистентность клеток опухоли к
химиопрепаратам.
VI. ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ
КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПАРАМЕТРОВ КЛЕТОК ОПУХОЛИ
Риск умереть от рака молочной железы зависит, с одной стороны, от ста-
дии болезни в момент диагноза, а с другой стороны от ее биологической агрес-
сивности.
В настоящее время для предсказания прогноза, в частности при раке молоч-
ной железы, используются различные критерии: клиническая стадия, возраст
больных, морфологическая градация опухоли, ее рецепторный стаз ус, другие
биологические и иммунологические параметры. Ядерные морфометрические
признаки (средняя площадь ядер, средний периметр ядер, максимальный и ми-
нимальный диаметры ядер клеток и другие параметры) имеют прогностиче
ское значение в выявлении поражения аксилляриых лимфатических узлов.
186 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Определение плоидности опухолей методом цитоспектрофотометрии дает
возможность прогнозировать течение заболевания. Однако, данный метод не
получил широкого распространения, вероятно, из-за его трудоемкости.
Данные, полученные методом проточной цитометрии, можно использовать
в качестве отдельных прогностических критериев течения злокачественных
новообразований. Точность прогноза важна для отбора больных, которые
должны получать раннюю адъювантную химиотерапию, предназначенную для
предотвращения дальнейшего роста опухоли и отдаленного метастазирования.
Частота анеуплоидных опухолей зависит прямопропорционально от размера
опухоли. Кроме того, % клеток в S-фазе клеточного цикла также увеличи-
вается с размером опухоли. Отмечено увеличение недифференцированного
компонента опухоли с увеличением ее размера, чго отражает изменения био-
логических свойств новообразования в течение его роста в сторону гистопато-
логической дедифференцировки и увеличения пролиферирующей фракции.
Среди опухолей больших размеров значительно чаще РЭ- новообразования,
анеуплоидные опухоли, выше % клеток в S фазе клеточного цикла.
Морфологические особенности первичной опухоли содержат значитель-
ную прогностическую информацию и объективные количественные методы
могут существенно повысить значение гистологического и цитологического
исследования. По данным Zajdela А. и соавт. [1981], если значения диаметров
ядер клеток рака маленькие (9-12 мкм2),то 5-летняя выживаемость при любой
стадии процесса составляет 89%-94%. Однако, если они составляют 12-25
мкм, то 5-летняя выживаемость при Т1 (диаметр опухоли меньше или равен 2
см) - 73%, при Т2 (диаметр опухоли клинически больше 2 см, но меньше или
равен 5 см) - 61%; и при Тз-14 (все другие опухоли) - 35%.
Wallgren А. и соавт. [1976] также было отмечено, что более длительная
продолжительность жизни наблюдается у больных, диаметр клеток рака кото-
рых менее 9,5 мкм. При преобладании более крупных ядер (более 19 мкм в
диаметре) доля пациентов, проживших 10 лет, составляет около 50%. По мне-
нию авторов, незначительное количество цитоплазмы вокруг ядра указывает
на более длительный срок жизни больных, нежели ее обилие.
Современные ретроспективные и проспективные исследования показали,
что морфометрические признаки являются более прогностическими, чем
классические, такие как поражение лимфатических узлов, размер опухоли и
содержание стероидных рецепторов.
Сильченко С.А. [1990] выявила, что по мере увеличения клинической ста-
дии заболевания уменьшается количество однотипных ядерных групп с не-
большими (до 100 мкм2) ядрами, происходит сдвиг вправо, и увеличивается ко-
личество разнородных по размеру ядерных групп за счет увеличения площади
ядер, что свидетельствует при раке молочной железы о нарастании гетероген-
ности клеточных популяций и об усилении злокачественности.
С помошью кластерного анализа Komitowski D. и соавт. [1989] провели на
гистологических препаратах исследование морфометрических параметров
клеток протокового инфильтративного рака, и показали, чго существует раз-
личие в оценке степени злокачественности опухоли, определяемой визуально
и объективно. 11о мнению авторов, более точна объективная количес гвенная
оценка злокачественности процесса, так как при морфомезрически выделен-
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
187
ной III степени злокачественности в 71% случаев выявляются метастазы в ре-
гионарные лимфатические узлы, в то время как при визуальной оценке они
обнаруживаются только в 48%.
Watanabe Т. и соавт. [1995] на основании ядерно-морфометрической степе-
ни риска (NMRG), определяемой двумя морфометрическими параметрами -
средней площадью ядра и стандартным отклонением площади ядра - раздели-
ли больных ранним раком молочной железы на две группы, имеющие досто-
верно различающуюся общую и безрецидивную выживаемость. Авторы при-
ходят к выводу о том, что NMRG может иметь значение для решения о необ-
ходимости адьювантной химиотерапии.
Поведение злокачественной опухоли связано не только с ее морфометри-
ческими характеристиками клеток, но с их пролиферативной активностью и
плоидностью. Оценка этих двух критериев вместе, делает прогноз еще более
достоверным. При этом большинство диплоидных опухолей обладает более
низкими темпами деления, чем анеуплоидные, пролиферативная активность
которых бывает очень высокой. По данным Hupperts R и соавт. 11993] комби-
нация количества клеток в S-фазе и % анеуплоидных клеток в опухоли явля-
ются важными факторами прогноза как для общей, так и для безрецидивной
выживаемости у больных с 1 и 11 стадиями рака молочной железы. По мнению
авторов, определение числа S-фазных клеток, а также плоидности опухоли в
сочетании с данными рецепторов стероидных гормонов должно стать рутин-
ным методом обследования больных.
Для более точного определения прогноза заболевания Kallioniemi O.-R и
соавт. [1988] предложили оценивать ДНК-гистограммы в целом, выделяя сле-
дующие их три типа: 1 - диплоидные, с низкой пролиферативной активностью
клеток (число клеток в S фазе клеточного цикла меньше 7%); III - анеупло-
идные с индексом ДНК больше 2,2 и числом клеток в S-фазе более 12%, ко-
торые связаны с наиболее неблагопритным прогнозом. Диплоидные опухоли с
высокой пролиферативной активностью клеток и анеуплоидные новообразо-
вания с индексом ДНК в триплоидной-околотетраплоидной области и низкой
пролиферацией клеток образовали II - промежуточный тип. В эту же ipynny
отнесены анеуплоидные гистограммы больных,в которых невозможно рассчи-
тать число пролиферирующих клеток. Указанные типы ДНК-гисто1*рамм кор-
релируют с возрастом больных, степенью злокачественности опухоли и содер-
жанием рецепторов стероидных гормонов,и являются так же, как и степень
злокачественности опухоли, независимым фактором прогноза.
При ретроспективном изучении 409 случаен рака молочной железы
Fallcnius А. и соавт. [1986] показали отсутствие четкой корреляции между
уровнем рецепторов стероидных гормонов, содержанием ДНК в клетках опу-
холи и характером процесса в подмышечных лимфатических узлах. Эти пара-
метры являются независимыми прогностическими факторами. Пациенты с ди
плоидным раком и без метастазов в подмышечные лимфатические узлы име-
ют наилучший прогноз, 95% из них после проведенного лечения живут десять
и более лет, в то время как только 31 % больных с анеуплоицными опухолями
и метастазами в лимфатические узлы доживает до 10 лет. Авторы делают вы-
вод. что анализ плоидности опухоли вместе с оценкой состояния лимфатиче-
ских узлов (есть ли в них метастазы или нет) может обеспечить высокую точ-
188
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ность прогноза для значительной группы пациентов.
Данные Comelisse С. и соавт. [1987| свидетельствуют, что у больных при
анеу плои дном раке молочной железы частота рецидивов выше, а выживае-
мость ниже, чем при диплоидных опухолях. Эта зависимость более четко вы-
ражена при мес гнораспространном раке, в то время как при наличии отдален-
ных метастазов корреляция показателей более слабая. Основываясь на данных
многофакторного анализа, авторы показывают, что у больных в менопаузе
плоидность опухоли является независимым фак тором прогноза.
В 34 клиниках Нидерландов Ваак J.P.A. и соавт. [1989] на гистологических
препаратах 3000 больных исследовали прогностическую ценность и воспроиз-
водимость морфометрического мультивариантного индекса (MPI), индекса
ДНК, других количественных параметров в сравнении с известными прогно-
стическими критериями (размер опухоли, статус регионарных лимфатических
узлов и уровень рецепторов стероидных гормонов). Морфометрический мно-
говариантный прогностический индекс в комбинации с индексом митотиче-
ской активности, размером опухоли и статусом лимфатических узлов давал
приблизительно на 20% более точный прогноз, чем при рутинной гистологи-
ческой оценке опухоли и регионарных лимфатических узлов. Применение MPI
может способствовать лучшему лечению многих пациентов при раке молоч-
ной железы. Прогностически важен также индекс ДНК. определяемый мето-
дом проточной цитометрии.
По нашим данным, увеличение основных морфометрических параметров:
площади (Sl>255,3 мкм2), периметра (Р1>63.1 мкм) опухолевых клеток и ядер
(S2>17(),1 мкм2: Р2>49.2 мкм), их полиморфизма (F2> 1,155), свидетельствует
о менее благоприятном прогнозе рака молочной железы. Расчет кривых об-
щей выживаемости и безрецидивной выживаемости проводился методом по-
строения таблиц дожития по Kaplan E.L. и Meier Р. [1958] и сравнение досто-
верности различий этих показателей с помощью теста log rank проводилось в
программе Survival, предоставленной отделом статистики M.D. Anderson
Hospital (США). Многофакторный анализ проводился путем Баесовской про-
цедуры с помощью пакета программ для компьютерного анализа SAS Блия
ние плоидности опухолевых клеток на общую выживаемость больных без уче-
та стаций рака шгчетливое. У больных с диплоидными (1-я группа) и тетран-
лоидными опухолями (2-я группа) отмечалось относительно доброкачествен-
ное течение болезни, показатели общей выживаемости (ОБ) каждой из этих
двух групп статистически значимо отличались (р<(),()5) от соответствующих
показателей больных с анеуплоидными опухолями с ИДНК в интервале 1,1-
1.84 и < 1.0 (3-я группа) и с многоклоновыми анеуплоидными опухолями (4-я
группа). ОБ больных с многоклоновыми опухолями (4-я группа) была наихуд-
шей и отличалась не только от соответствующих показателей больных 1 и 2
группы, но также и от ОБ больных 3 группы (р<0,()5).
При РМЖ T1-2N0M0 у 41 (37%) больной наблюдались диплоидные и у 71
(63%) больной - анеуплоидные опухоли, в том числе у 8 (7%) больных - тет-
раплоидные опухоли. Течение болезни у больных с диплоидными опухолями
относительно доброкачественно, показатели БРВ и ОБ этой группы больных
статистически значимо выше, чем больных с анеуплоидными, не тетраплоид-
ными опухолями (р < 0.001 для БРВ и р < 0.02 для ОБ).
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
189
Т&к, анеуплоидные опухоли имели значительно более высокую (р<0,05)
пролиферативную активность, чем диплоидные, в том числе более высокую до-
лю клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла. Течение болезни у боль-
ных с диплоидными опухолями было значительно лучше, чем у больных с ане-
уплоидными опухолями. 5-ти и 10-летняя безрецидивная выживаемость боль-
ных с диплоидными опухолями составила 94 ± 4% и 85 ± 7%, а у больных с ане-
уплоидными - 67 ± 7% и 52 ± 10% соответственно (р < 0,01). 5- и 10-летняя об-
щая выживаемость больных с диплоидными опухолями были 100% и 96 ± 4%,
а у больных с анеуплоидными опухолями - 84 ± 5% и 68 ± 10% соответствен-
но. Различия безрецидивной выживаемости становились статистически значи-
мыми после 3-го года наблюдения. У больных с диплоидными опухолями на-
блюдался в 2,3 раза более низкий риск развития рецидива болезни по сравне-
нию со всей группой больных. Таким образом, показатели ДНК-проточной ци-
тометрии имеют прогностической значение при раннем раке молочной железы.
При многофакторном анализе прогностических признаков у больных
РМЖ без поражения регионарных лимфатических узлов (рис. 6) индекс пло-
идности (индекс ДНК) оказался самым сильным фактором прогноза (Портной
С.М., 1997).
Ад. терапия
Индекс плоидности
Гистол. форма
РЭ
РП
Рис. 6. Весовые коэффициенты (по Шеннону) прогностически значимых при-
знаков у больных РхМЖ T1-4N0M0 с изученной плоидностью опухоли
Возможно разделение больных РМЖ 11-2N0M0 с одновременным учетом
плоидности и индекса пролиферативной активности (ИПА) опухолевых кле-
ток на следующие группы: 1) с диплоидными опухолями и ИПА не более 30%;
2) с анеуплоидными. не тетраплоидными опухолями и ИПА не более 30%; 3)
с анеуплоидными, не тетраплоидными опухолями и ИПА более 30%. У боль-
ных 1-й группы наблюдается доброкачественное течение болезни, с высокими
показателями БРВ и ОВ. У больных 3-й группы процесс рсцидивирования бо-
лезни идет очень бурно, 3-летняя БРВ составляет лишь 61%. 5-летняя - 43%,
10-летняя - 29%. Показатели больных 2-й группы занимают промежуточное
положение между 1-й и 3-й группами. Достоверность различий БРВ: между 1
и 2 группами - р < 0.05; между 1 и 3 группами - р < 0,001; между 2 и 3 группа-
ми - р < 0,05. Достоверность различий ОВ: между 1 и 2 группами - р < 0.05; ме-
жду 1 и 3 группами - р < 0.001: между 2 и 3 группами - р < 0.05.
190	Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Таким образом, проведенный статистический анализ показал, что пациен-
ток с диплоидными опухолями умерло за годы наблюдения меньше (р<0,001),
чем с анеуплоидными новообразованиями. Диплоидные и анеуплоидные ново-
образования (1,4<ИДНК<1,84) с высокой пролиферативной активностью
(ИП>30%) являются прогностически неблагоприятными, а сочетание таких
цитометрических показателей с перечисленными морфометрическими пара-
метрами еще более отягощает прогноз [В.Н,Богатырев, 1991]. Следует также
отметить, что тстраплоидные опухоли (II тип ДНК-гистограмм) и карциномы
с ИДНК от 1,1 до 1,3 с низкой и умеренной пролиферативной активностью
клеток (III тип ДНК-гистограмм) являются более благоприятными в прогно-
стическом плане анеуплоидными новообразованиями, а редкие виды - много-
клоновый рак (V тип ДНК-гистограмм) и опухоли с резко выраженной анеуп-
лоидией, ИДНК > 2,15 (IV тип ДНК-гистограмм) самыми неблагоприятными
с точки зрения прогноза. Количество анеуплоидных клеток в новообразовании
нс влияло на скорость прогрессирования заболевания, в отличие от высокого
уровня пролиферации, которая наблюдалась у больных с ранним метастазиро-
ванием опухоли. Анализ данных показал, что индекс РНК (ИРНК) является
менее точным прогностическим параметром, чем ИДНК. Так, у больных без
прогрессирования и с прогрессированием заболевания одинаково часто встре-
чаются минимальные, средние и максимальные значения ИРНК, но при этом
отмечается тенденция к увеличению числа пациенток с худшим прогнозом
при ИРНК >1,1.
Количественные параметры клеток опухоли и ее макроскопический раз-
мер не связаны между собой прямо пропорционально. При прогнозе заболева-
ния необходимо учитывать, что уже опухоли до 1.0 см в диаметре бывают ане-
уплоидными, с увеличенными морфометрическими показателями клеток.
Отдаленные результаты также свидетельствовали, что в группе пациенток
с прогрессированием заболевания и у умерших больных, клетки регионарных
метастазов менее дифференцированы, чем первичная опухоль, а в анеуплоид-
ных метастазах, в большинстве наблюдений, кроме того с повышенной проли-
феративной активностью (р<0.05). В то время, как в группе больных без про-
грессирования заболевания количественные параметры клеток опухоли и ме-
тастазов практически идентичны (р >0,05) [В.Н.Богатырев, 1991]. При любой
стадии процесса, вне зависимости от морфологического варианта опухоли и
проведенного лечения выявлен комплекс параметров, свидетельствующий о
неблагоприятном прогнозе рака (табл.З).
Среди злокачественных опухолей рак легкого занимает особое место, что
связано, с одной стороны, с ростом заболеваемости, а с другой - с особенно-
стями развития и течения опухолевого процесса, часто с быстро возникающи-
ми лимфогенными и гематогенными метастазами. Для выработки рациональ-
ной тактики ведения больных раком легкого важно знать точный прогноз за-
болевания. Морфологическая структура и распространенность опухолевого
процесса не всегда являются достаточными факторами в определении прогно-
за рака легкого.
У 7Я больных плоскококлеточпым раком легкого параллельно исследова-
ны количественные характеристики клеток опухоли (плоидность) и уровень
ракового эмбрионального антигена (РЭА) в сыворотке крови для оценки их
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 191
прогностической значимости. У радикально оперированных больных раком
легкого с благоприятным течением заболевания, средние значения ИДНК в
опухоли и РЭА в крови достоверно (р<0,05) ниже, чем у больных с прогресси-
рованием заболевания. Не выявлено зависимости между двухлетней безреци-
дивной выживаемостью и ИДНК у радикально оперированных больных I ста-
дией плоскоклеточного рака: в течение всего периода наблюдения не умер ни
один больной от прогрессирования основного заболевания как в группе с дип-
лоидными, так и в группе с ансуплоидным раком.
Таблица 3
Прогностически неблагоприятные количественные параметры клеток
опухоти у больных при раке молочной железы
Стадия	Количественные параметры
T1 No Мо п=64	SI > 245мкм2; S2 > 160 мкм2; S > 0,653; анеупл., в S фазе > 8 %; ИДНК > 1,35
Г2 Nq м0 п=111	S1 > 260 мкм2; Sla > 120 мкм2; Р1 > 65 мкм; S2 > 200 мкм2; S2o > 70 мкм2; Р2 > 50 мкм; анеупл., ИДНК > 1,6 ;ИП > 23%
Т3 No Мо п=21	S1 >315мкм2; анеупл., ИДНК >1,4
Tj.2 Ni Мо п-106	анеупл., ИДНК >1,3
N2-3 Мо п=51	S2a > 51мкм2; Р2 > 42 мкм; Р2с > 8мкм; F2 > 1,185мкм; ИП > 18.5%; ИДНК > 1,5
Т3_4 Nt Мо п-44	Умеренно или низкодифференцированные по данным морфометрии опухоли с ИП > 21 %
Ъ 4 ^2-3 п=101	S1 > 285мкм2; Р1 > 54 мкм; S2 > 180 мкм2; Р2 > 50 мкм; анеупл., ИДНК > 1,3; ИП > 19%.
IV п=8	анеупл.
Отечно-инф. форма рака п=4	анеупл., ИП >21%
Условные обозначения: п - число наблюдений; анеупл - анеуплоидная опухоль; Sic.
S2o и т.д. среднеквадатические отклонения параметров (т.е. полиморфизм признака)
192 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Иная картина обнаружена у радикально оперированных больных плоско-
клеточным раком легкого с метастазами во внутригрудные лимфатические
узлы T1-3N1 2М0. Ни один из 10 больных с диплоидным раком не умер от реци-
дива и метастазов в течение двухлетнего периода наблюдения. В то же время
из 17 пациентов с анеуплоидным раком 11 (65%) больных умерло от прогрес-
сирования основного заболевания (р<0,05).
Таким образом, у больных с диплоидным раком легкого средний уровень
РЭА в крови достоверно (р<0.05) ниже, чем у больных с анеуплоидным раком
легкого. Прогрессирование опухолевого процесса в течение первых 2-лет по-
сле радикальной операции наблюдается чаще у больных с анеуплоидным ра-
ком. Низкий пооперационный уровень РЭА (ниже 10 мкг/л) при прочих рав-
ных условиях свидетельствует о более благоприятном прогнозе после ради-
кального хирургического лечения. Двухлетняя выживаемость у больных пло-
скоклеточным раком легкого в стадии T1-3N1-2M0 достоверно (р<0.05) выше с
диплоидными опухолями, чем с анеуплоидными.
Анализ данных об отдаленных результатах лечения 114 больных с остео-
генной саркомой и у 40 больных с саркомой Юинга свидетельствует, что ане-
уплоидные опухоли имеют (р<0,05) худший прогноз, чем диплоидные новооб-
разования.
Клеточная суспензия у больных с опухолью Юинга в 6 случаях была полу-
чена из свежего биопсийного материала, в 34 - материал получен из парафи-
новых блоков опухоли после стандартной проводки в спиртах. Анеуплоидные
опухоли составили 58%, диплоидные - 42% наблюдений. Оценка ближайших
результатов химиолучевой терапии показала (в среднем в течение 6 мес от на-
чала лечения), что отмечается тенденция к более позднему метастазированию
и рецидивированию у больных с диплоидным вариантом опухоли Юинга. Более
агрессивное течение анеуплоидного варианта саркомы Юинга может быть
обьяснено явлениями опухолевой прогрессии, что подтверждается более вы-
сокой пролиферативной активностью, чем при диплоидном варианте (р<0.05),
в том числе большим количеством клеток, находящихся в S-фазе клеточного
цикла, а также большой вариацией ИДНК.
Ограниченное число наблюдений не позволяет пока с высокой степенью
достоверности оценить чувствительность к химиолучевому лечению, однако в
материале наших наблюдений диплоидные опухоли кажутся менее чувстви-
тельными к противоопухолевой терапии. Полная регрессия опухоли, опреде-
ляемая рентгенологически и, в нескольких случаях - морфологически, наблю-
далась в 10% при диплоидном варианте и в 50% при анеуплоидном, что может
быть отчасти связано с их различной пролиферативной активностью
Серия исследований с помощью метода ЦИК- проточной цитометрии в це-
лом совпадает с данными, полученными ранее с помощью других методов ана-
лиза клеточной кинетики и количества ДНК: анеуплоидный вариант саркомы
Юинга кажется более агрессивным в прогностическом отношении, но одно-
временно. требует несколько отличающейся от диплоидной опухоли так гики
терапии. Диплоидный вариант саркомы Юинга, несмотря на некоторое более
’благоприятное" поведение, хуже поддается цитостатической терапии и хара-
ктеризуется несколько более поздним развитием рецидивов и метастазов. Воз-
можно, применение ДНК проточной цитометрии в перспективе может стать

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
193
одним из элементов индивидульного прогнозирования реакции опухоли Юинга
на химиолучевое лечение.
Опыт работы, накопленный в лаборатории клинической цитологии ОНЦ
им. Н.Н.Блохина РАМН, дает основание полагать, что с помощью количест-
венных методов анализа можно: объективизировать цитологические крите-
рии, улучшить диагностику и дифференциальную диагностику опухолей и не-
опухолевых поражений, провести количественную оценку изменений в клет-
ках, происходящих в результате лечения, изучить содержание ДНК, РНК. экс-
прессию Р-гликопротеина и гена р53 в клетках опухоли, и получить надежные
прогностические количественные показатели.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.	Автандилов Г.Г. Введение в количественную патологическую морфоло-
гию.-М.:Медицина,1980.-216 с.
2.	Автандилов Г.Г. Проблема патогенеза и патологоанатомической диагности-
ки болезни в аспектах морфометрии.-М.: Медицина, 1984. -285 с.
3.	Богатырев В.Н. Значение количественных методов исследования (морфо-
метрии,проточной цитофлуорометрии,сканирующей микрофотометрии ) в
клинической онкоцитологии.-Автореф.дисс. ...доктора мед.наук.-Моск-
ва,1991,42 с.
4.	Богатырев В.Н.. Петрова А.С., Летягин В.П., Кушлинский Н.Е., Ермилова
В.Д., Чхиквадзе Н.В. Использование количественных параметров клеток
опухоли для оценки уровня рецепторов гормонов и прогноза при раке мо-
лочной железы.-Труды I сьезда Российского общества патологоанатомов,
21-24 января 1997, Москва, стр. 31-32.
5.	Богатырев В.Н., Портной С М., Лактионов КП., Летягин ВЛ. Проточная
цитоме грия при раке молочной железы Tl-2 NO МО : анализ 10-летних на-
блюдений,- Материалы I сьезда онкологов стран СНГ, 3-6 декабря 1996,
Москва, т.2, стр. 482-483.
6.	Брамберга В.М.. Канен В.В., Хесин А.Я. Принципы и аппаратура автомати-
зированной цитологической диагностики злокачественных опухолей /Ав-
томатизация анализа цитологических препаратов/.-Ри1 а:3инатне, 1975,
стр.5-12. ч
7.	Петрова А.С., Казанова Л.И., Зубрихина Г.Н. Исследование ДНК клеточ-
ных элементов лимфатических узлов при лимфо- и ретикулосаркоме с по-
мощью импульсного цитофотометра.- В кц.:Автоматизация цитологиче-
ской диагностики опухолей.- Рига:3инатне,1976,с.157-161.
8.	Петрова А.С., Читириди Н.Г., Исаков В.Л. Морфометрическая характери-
стика различных вариантов злокачественных лимфом.-Соврсмснные мето-
ды лабораторных исследований,-1 Республиканская конф.врачей-лаборан-
тов Латв.ССР,г.Рига,1984,20-21 декабря,стр.54-57.
9.	Петрова А.С., Зубрихина Г.Н., Зубриян Н.И. Опыт применения автомати-
ческих систем в онкологии.-В сб.: Автоматизация цитологических исследо-
ваний.-Киев:Наукова думка,1985,с.105=1 К).
10.	I lop гной С.М. Рак молочной железы ( факторы прогноза и лечение).- Ав-
тореф.дисс. доктора мед.наук -Москва,1997,40 с. *
194
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
11.	Сильченко С.А. Морфометрическая характерист ика рака молочной желе-
зы с помощью анализатора ”Интеграл-2МТ".-В сб.:Автоматизация цито-
логических исследований.-Киев.:Наукова думка,1990,с.139-141.
12.	Ташкэ К. Введение в количественную цито-гистологическую морфоло-
гию.-Изд-во Акад.Соц.Республики Румынии,1980.-192 с.
13.	Ваак J.P.A., Oort J. A manual of Morphometry in diagnostic pathology-
Heidelberg-Berlin-New-York:Springer,1983,205 p.
14.	Baak J.P.A., Noteboom E., Koevooes J.IM. The influence of fixatives and orther
variations in tissue processing on nuclear morphometric features.-
Analy t.Quant.Cy tol. Histol.,1989.
15.	Bogatyrev V.N., Petrova A.S., Tchkhikvadze N., Ermilova V.D., Letaygm V.P
ITie using of breast cancer' cell quantitative parameters for objectivization of
pathomorphosis expression grade and prognosis.- XII International Congress of
cytology, 21-25 May, 1995.- Acta Cytol., 1995, v.39, N2, p.276.
16.	Comclisse C.J.,.Van de velde C., Caspers R.G., Moolenar A.S., Hermans J. DNA
ploidy and survival in breast cancer patient.-Cytometry,l987,V.8.N2,p.225-234.
17.	Crissmann H.A., Tobey R.A. Cell cycle analysis in 20 minutes.-Science, 1974,
v.184, p.1297-1298.'
18.	Darzynkiewicz Z., Traganos E, Sharpless T., Melamed M.R. Interphase and
metaphase chromatin.Different stainability of DNA with acridine orange after
treatment at low pH.-Exp.Cell.Res., 1977, v. 110,N1,p.201-214.
19.	Fallenius A. DNA content and prognosis in breast cancer. - A methodological and
clinical study.-Stockholm,1986,210 p.
20.	Harrison G. The role of clinical cytogenetics in medicine with special emphasis
on oncology.-Med.Lab.Sci.,l988,v.45, N4.p.333-348.
21.	Hedley D.W., Friedlander M.L., Taylor I.W., Rugg C.A., Musgrove E.A. Method
for analysis of cellular DNA content of paraffin-embedded pathological material
using flow cytometry.-J.Histochem. Cytochcm J 983,v.31,v.31.p.1333-1335.
22.	Hedley D.W., Fiedlander M.L., Taylor I.W. Application of DNA flow cytometry
to paraffin-embedded archival material for the study of aneuploidy and its clini-
cal significance. - Cytometry,!985, v.6.p.327-333.
23.	Hertwig R. Wechselverhaltnisse von Kam und Protoplasma-Munchen: Lehman,
1903.
24,	Jacobj W. Uber das rhythmische wachstum der zellcn durch.- -Roux's
Arch.Entw.Mech.,1925,bd.l()6,S.124-192.
25.	Jacobj W. Die Zellkemgrosse bcim menschen.Ein beitrag zur quatitativen cytolo-
gie.-Z.mikr.anat.Forsch.J 935,bd.38,H.2,S.l61-240.
26.	Jsaacs J.T. Clonal heterogeneity and its implications - -ImBrcast cancer treatment
and prognosis /Ed:Stoll B.A/.-Oxford—London-Edinburgh:BIackwell scientific
publications,1986,p.45-56.
27.	Kallioniemi O.-P. Comparison of fresh and paraffm-embedded tissue as a start-
ing material for DNA-flow cytometry and evaluation of intratumor hetcrogene-
ity.-Cytometry, 1988, v.9,N2,p.164-169.
28.	Kloos A., Steffen J., Graffi A., Bielka H. Problema de oncologie cxperimentala.-
Edil.Acad R.P.R., Bucuresti, 1962.
29,	Komitowski D., Kett P. Janson C., Jarasch E-D. Quantitative aspects in defining
prognostic factors of breast cancer.- -Path.Res.Pract.,1989,v.l85,p.62L624.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 195
30.	Koss L.G., Czemiak В., Herz Е, Wersto R.T. Flow cytometric measurements of
DNA and other cell components in human tumors: A critical appraisal.-Human
Pathol.,1989,v.20,N6,p.528-548.
31.	Laerum O.D., Farsund T Clinical application of flow cytometry:A review.-
Cytometry, 1981, v.2,p. 1-13.ч
32.	Melamed M.R., Mullaney P.F., Mendelsohn M.R. Flow cytometry and sorting.-
/Ed.: Willey J./.-New-York, 1979,716 p.
33.	Stewart C.C. Flow cytometric analysis of oncogene expression in human neo-
plasies.-Arch.Pathol.Lab Med., 1989, v. 113, N6,p.634-640.
34.	Tanaka K., Testa J.R. Assessment of methods for the cytogcnitic analysis of
human solid tumors.-J.Nat.Cancer Ints.,1987, v.79,N6,p.1287-1293.
35.	Tannenbaum E., Cassidy M., Alabaster O., Herman C. Messarement of cellular
DNA content by flow microfluorimctry with use of a biological internal standart.-
J.Histoch.Cytochem.,1978,v.26, p.145-148.
36.	Van Dicst P.J., Risse E.K.J., Schipper N.W., Baak J.P.A. Comparison of light
microscopic grading and morphometric features in cytological breast cancer
spccimcns.-Path.Res.Pract.,1989, v.l85,p.612-616.
37.	Vindelov L.L., Christensen kJ., Keiding N., Spang-Thomson M„ Nissen N.I.
Long-term storage of sample for flow cytometric DNA analysis.-Cytometry,
1983, v.3, N5, p.317-322.
38.	Wallgrcn A., Silfvcrward C., Eklund G. Prognostic factors in breast cancer.- Acta
Radiol. (Then), 1976, v.15,p.1-16.
39.	Wcibel E.R. Stereological methods.-Vo 1.1.-Practical methods for biological mor-
phometry. - London:Academic press,1979.
40.	Zajdela A.,.de Maublane M.A. Aspiration cytology and cytoprognosis of breast
lesions.- ln:New Frontiers in mammary /Ed.J.de Brux J.N./-New York-London:
Verby Plenum Press, 1981. p.79-97.
41.	Zante J., Schumann J., Barlogie B., Goehde W., Buchner Th. Procedures for spe-
cific and rapid analysis of DNA distribution.- -ln:Pulse-Cytophotomctry, Second
International Symposium.-Belgium: European Press, Ghent, 1976, p.97-106.
42.	Zhukotsky A., Bogatyrev V., Kopylov V, Jakubova N., Kogan E. The using in
cytopathology DI A MORPH image analysis TV-system.- XII International
Congress of Cytology, 21-25 May, 1995, Abstr. 470.- - Acta Cytol., 1995, v.39,
N 2, p.376.

О1 LabMetod Оу

11	1	.	, . , .. jj 
Адрес: Московского представительства ij
й^ЖЙ59 ,г. Москва ул. Маршала Тимбшейкб: М &
®±	721-0558, 415-0975 Т\ф 14Т-9875


ОПТИМАЛЬНЫЕ РЕШЕНИЯ В ЦИТОТЕХНОЛОГИИ
•	Техника и принадлежности для
приготовления стандартных моно-
слойных цитологических препаратов:
цитоцснгрифуги Cytospin 3 и Cytofuge,
цитощеточки, предметные стекла
•	Оборудование для окрашивания
микронренаратов в
автоматическом режиме:
Linistain GLX, Varistain 24 и Varistain XY
• Красители для цитологии в виде наборов:
Папаниколау, Гимза, Май-Грюнвальд,
Гематоксилин-эозин, Циль Нильсен, Грамм
СОВРЕМЕННОЕ ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ НИТОЛОГИЧЕСКОЙ
ДИАГНОСТИКИ
•	Исследовательские микроскопы Nicon серии Ес! ipse 400. 600, 800. 1000
•	Программно-аппаратный комплекс для анализа и архивирования
изображений цитологических объектов
•	Автоматический нммуноокрашнватель
Cadenza и ручной центр Scqucnza. панели
антител для иммуноморфологии
•	Проточный цитометр Coulter
•	Автоматические системы для
скрининга рака шейка матки
PAPNET, Neo path
МЕТОДЫ
КЛИНИЧЕСКОЙ
ИММУНОЛОГИИ
Клиническая иммунология - самостоятельная научная дисциплина, охваты-
вающая болезни, характеризующиеся первичным нарушением функции лим-
фоидных органов и болезни, основное значение в патогенезе которых играют
иммунные реакции (Серия техн. доки. ВОЗ, 1973, № 496). К основным облас-
тям исследовании в клинической иммунологии относятся болезни иммунологи-
ческой недостаточности, аутоиммунные, лимфопролиферативные, инфекци-
онные и гематологические болезни, аллергия, пересадка органов и тканей,
злокачественные новообразования. В настоящее время в клиническую прак-
тику внедрен чрезвычайно широкий спек гр стандартизованных методов имму-
нологического обследования больных, которые позволяют оценить в количе-
ственном и качественном плане состояние клеточных и гуморальных звеньев
иммунитета и динамику различных сывороточных компонентов, отражающих
развитие воспаления (белки острой фазы, компоненты комплемента, и др=).
Центральное место среди методов клинической иммунологии занимают имму-
нодиагностические тесты, связанные с определением циркулирующих аутоан-
тител, имеющие исключительно важное значение для раннего распознавания
аутоиммунных заболеваний человека. Особенно большое внимание в послед-
ние годы уделяется исследованию цитокинов и растворимых форм цитокино-
вых рецепторов (ИЛ-2 рецепторы, рецепторы ФНО-сс и др.), а также раство-
римых форм молекул адгезии, определение которых имеет важное значение
для изучения роли активации клеточного иммунитета и сосудистого эндотелия
в развитии заболеваний человека.
1. Общая характеристика методов
/. Метод непрямой иммунофлюоресценции (НИФ)
До настоящего времени метод НИФ является самым распространенным
методом определения циркулирующих аутоантител, который применяется в
качестве скринингового, до применения других методом лабораторной диагно-
стики аутоиммунных заболеваний человека, характеризуется высокой чувст-
вительностью, воспроизводимостью и сравнительной простотой. С помощью
метода НИФ можно определять чрезвычайно широкий спектр аутоантител,
имеющих значение для диагностики ревматических болезней, заболеваний щи-
товидной и поджелудочной железы, системных васкулитов и др. В качестве
субстрата для выявления антител с помощью НИФ используют криостатные
срезы различных органов, полученных при аутопсии или от лабораторных жи-
вотных (обычно обезьян-макак, мышей), культивируемые клеточные линии
(НЕр-2 клетки) и нейтрофилы человека и др.
Реактивы. Фосфатно-солевой буфер (PBS. pH 7,2). Антисыворотка (кро-
личья или морской свинки) к иммуноглобулинами человека, конъюгированная
198
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
с флюоресцеинизотиоци анатом (ФИТЦ). Забуфсренный глицерин (смешать 9
объемов глицерина и 1 объем PBS). Криостатные срезы соответствующих
тканей (толщина 4 мкм) или культуры клеток, фиксированные на предметных
стеклах, покровные стекла.
Ход исследования. 1) Позитивную и негативную контрольные сыворотки и
исследуемые сыворотки разводят 1/10 PBS (при необходимости исследуемые
сыворотки титруют). 2) На срезы наносят по 20 мкл разведенных сывороток
и инкубируют во влажной камере в течении 30 мин при комнатной температу-
ре. 3) Промывают стекла в течении 30 мин при комнатной температуре PBS
(нс менее трех смен буфера) в камере с использованием магнитной мешалки.
4) На подсушенные срезы наносят по 20 мкл ФИТЦ-меченных антител к им-
муноглобулинам человека-и стекла инкубируют во влажной камере в течении
30 мин. 5) Повторяют промывку (см.пункт 3). 6) Помещают срезы в забуфе-
ренный глицерин, покрывают покровным стеклом и анализируют с использо-
ванием люминисцентного микроскопа.
Клиническое значение. Метод НПФ используется для определения антину-
клеарных факторов, антител к щитовидной железе (срезы щитовидной желе-
зы человека или обезьяны), надпочечнику (срезы надпочечника человека или
обезьяны), митохондриям, гладкой мускулатуре, париетальным клеткам же-
лудка (нефиксированные срезы желудка крысы) и др.
2. Иммуноферментный метод (ИФМ)
ИФМ относится к числу наиболее важных методов, используемых в клини-
ческой иммунологии для диагностики и оценки характера иммунологических
нарушений при заболеваниях человека. Особенно большое распространение
ИФМ получил в последние годы, благодаря широкому внедрению монокло-
нальных антител, и рекомбинантных (или синтетических) антигенов, позволя-
ющих повысить чувствительность и специфичность метода и расширить
спек гр выявляемых (ауто)антител (и антигенов) при воспалительных, аутоим-
мунных и инфекционных болезнях человека. 11рактически ИФМ почти полно-
стью заменил РИМ, поскольку оба метода имеют сходную чувствительность и
специфичность, но ИФМ не требует работы с радиоактивными короткоживу-
щими изотопами. Кроме того, благодаря более высокой точности, воспроизво-
димости, стандартизации и возможности автоматизации, ИФМ постепенно вы-
тесняет и другие методы, такие как иммунофлюоресценция, агглютинация, ре-
акция связывания комплемента.
Реактивы для исследования.
1.	Буферы для иммобилизации антигена (coating).
а)	0,01 М Фосфатный буфер, содержащий 0,145 М NaCl pH 7,2.
Na2HPO4, 12Н2О 2,680 г
NaH2PO4 Н20 0,345 г
NaCl 8,474 г
Н20 1 литр, довести pH, хранить при 4°С
б)	0,05 М Карбонатный буфер pH 9,6
Na2C03 1,59 г
NaHC03 2,93 г
NaN3
Н20 до 1 литра, хранить при 4еС
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОМ ИММУНОЛОГИИ 199
в)	Глициновый буфер pH 10,4
Глицин 7,50 г
MgCl2 0,203 г
Zn(S04)2 0,288 г
Н20 до 1 литра, довести pH до 10,4
2.	Буфер для отмывки/разведения
0,01 М Фосфатный буфер, содержащий 0,145 М хлористого натрия pH 7,2
Готовится также, как и буфер для иммобилизации, затем в большинстве слу-
чаев добавляют 1% Tween 20.
3.	Хромогенные субстраты
a)	р-Нитрофенил фосфат.
5 мг р-Нитрофенил фосфата растворяют в 5 мл глицинового буфера
б)	ортофс ни лен-диамин (ОФД)
8 мг ОФД растворяют в 12 мл 0,1 М цитратного буфера pH 5,0. После рас-
творения добавляют 5 мкл 30% перекиси водорода. Раствор сохраняет ста-
бильность в течении 1 ч в темноте. Избегать попадания на кожу и слизистые.
в)	3,3\5,5 тетраметилбензидин (ТМБ)
Растворить 10мг ТМБ в 1 мл диметилсульфоксида. Медленно смешать в
100 мл 0,1М ацстатно-цитратного буфера pH 6,0. Добавить 20 мкл 30% пере-
киси водорода. Использовать в течении 30 мин.
г)	2,2ч-азино-ди-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS)
Растворить 5 мг ABTS в 50 мл 0,1М цитрат-фосфатного буфера pH 5,0. До-
бавить 20 мкл 30% перекиси водорода. Использовать в течении 30 мин.
д)	орто-Нитрофенил-p-D-галактозидаза (ONPG).
Растворить 90 мг ONPG в 10 мл фосфатного буфера pH 7,2 (Прогреть при
50°С для растворения). Маточный раствор стабилен в течении нескольких
дней при комнатной температуре в темноте. Перед использованием маточный
раствор разводят 1:10 PBS, содержащим 10 мМ MgCl2 и 0,1 М 2-Меркаптоэта-
нола.
3.	Останавливающие растворы
а)	1 М Серная кислота.
55 мл 95% H2SO4
900 мл дистиллированной воды
Добавлять кислоту очень медленно к большому объему дистиллированной
воды. Охладить, довести до объема 1 литр дистиллированной водой.
б)	2М Серная кислота
в)	IM Na2CO3
г)	2,5 М Гидрохлорная кислота
Твердая фаза. Твердая фаза, которая используется для иммобилизации ан-
тигена (обычно белковой природы) или антител, состоит из полистирола или
поливинилхлорида. Наиболее распространенной формой твердой фазы явля-
ются U-образныс лунки микроплат, реже применяются пробирки или шарики.
В целом полистирол обладает меньшей белок-связывающей способностью и
следовательно даст низкое фоновое неспецифическое связывание. Поливи-
нилхлорид напротив отличается высокой адсорбционной способностью, но это
может приводи гь к высокому неспсцифическому связыванию белков, присут-
ствующих в используемых растворах. Поливинилхлорид предпочтительней ис-
200
Том [I - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
пользовать в том случае, когда для иммобилизации в наличии имеется неболь-
шое количество антигена, адсорбция которого должна быть максимально вы-
сокой. Кроме того, при использовании поливинилхлорида для посадки антиге-
на требуется очень непродолжительное время (обычно около 60 мин при ком-
натной темпертурс).
Конъюгаты и хромогенные субстраты (таблица 1). Конъюгаты, исполь-
зующиеся в ИФМ, обычно представляют собой иммуноглобулины, соединен-
ные посредством химической реакции с ферментом, способным реагировать с
хромогенным субстратом. Реже используется белок А, который позволяет вы-
являть антитела только определенного изотипа (IgG). В последнее время, осо-
бенно для изучения культуральных жидкостей, применяют белок Н, который
не реагирует с бычьим 1g (присутствует в фетальной сыворотке) и связывает-
ся только с IgG человека.
Таблица 1
Общая характеристика конъюгатов и хромогенных субстратов,
использующихся в ИФМ
Фермент	Субстрат
1. Щелочная
фосфатаза
2. Пероксидаза
3.	р-галакто-
зидаза
4.	Глюкоза
оксидаза
5.	Уреаза
р-ни трофеи и л
фосфат
Ортофенилендиамин
(ОФД)
Тетраметил бензидин
ABTS
Ортонитрофенил-
галактозидаза
Глюкозо-ОФД
Бромкрезол
Останавливающий Абсорбция,
раствор	длина волны
Не требуется	405 нм
1	М серная кислота	492 нм
2	М серная кислота	450 нм
Не требуется	405	нм
1 М Na2CO3	410	нм
2,5 М гидрохлорная	490 нм
кислота
Не требуется	Визуальная
оценка
К хромогенным субстратам относят вещества, которые нс имеют цвета в
нативной форме, а приобретают окраску в процессе расщепления под влияни-
ем фермента. В большинстве случаев развитие окраски хромогенных субстра-
тов требует определенного времени, а затем ферментная реакция останавли-
вается путем добавления соответствующих реагентов. Последнее затрудняет
стандартизацию метода. Это делает предпочтительным применение щелочно-
го р-нитрофенил фосфата, который используются в большинстве комерче
ских тест-систем.
Блокирующие агенты. Для блокирования неспецифического связывания
сывороточных антител с твердой фазой после сорбции антигена следует ис-
пользовать растворы, содержащие белки, к которым антитела в сыворотках
людей, как правило, отсутствуют: 1) 2% казеин; 2) 3% BSA; 3) 1 % Tween 20;
4) 2% FCS; 5) 2% глицерин; 6) 1 % желатина. Белки растворяют в том же рас-
творе. который используется для иммобилизации антигена. Для уменьшения
вероятности ложноположительных результатов, блокирующие растворы нс
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
201
должны содержать субстанций, с которыми потенциально могут взаимодейст-
вовать сывороточные антитела.
Твердофазный ИФМ, Используется для определения уровня антител (или
антигенов) в биологических жидкостях. Ход исследования. 1) В лунки микро-
плат вносят антиген (или антитела) в буфере для иммобилизации в объеме 50-
100 мкл. (стандартная концентрация белковых антигенов варьирует от 1 до 10
мкг/мл). Микроплаты должны быть плотно прикрыты крышкой для избежа-
ния испарения реагентов (за исключением тех случаев, когда антиген содер-
жится в органических растворителях, например кардиолипин). В некоторых
случаях иммобилизацию антигена можно проводить при 37°С в течении 1 ч, но
этот способ неприемлем для многих антигенов. В качестве буфера для иммо-
билизации обычно используют 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0.145
М хлористый натрий (pH 7,2) или 0.05 М карбонатный буфер (pH 9,6), реже
глициновый буфер (pH 10,4). 2) Микроплаты инкубируют в течении 16 ч при
4°С для связывания антигена с твердой фазой. 3) Удаляют избыток буфера, со-
держащего антиген, путем переворачивания микроплат и интенсивного встря-
хивания. Затем в каждую лунку добавляют по 200 мкл промывающего буфера
и вновь переворачивают и интенсивно встряхивают микроплаты (эту процеду-
ру повторяют 3-6 раз) и после финальной промывки удаляют остатки буфера,
помещая микроплаты в перевернутом состоянии на лист фильтровальной бу-
маги. Для промывки и разведения проб обычно используют 0,01 М фосфатный
буфер, содержащий 0,145 М хлористого натрия (pH 7,2). Для уменьшения не-
си сци фи чес кого связывания добавляют 1 % Tween 20. 4) Оставшиеся свобод-
ные участки связывания, присутствующие на твердой фазе, блокируют путем
добавления избытка иммунологически инертного белка. Обычно объем бло-
кирующего раствора в 2 раза больше, чем объем вносимого антигена. Для
полной блокировки микроплаты инкубируют при комнатной температуре
(примерно 22°С) в течении 2 ч. При необходимости все этапы инкубапии (см.
пункты 6 и 9) проводят в термостате. 5) Удаляют остатки блокирующего бу-
фера (см. пункт 3). 6) Готовят серийное разведение положительной и отрица-
тельной сывороток, вносят в лунки микроплат в объеме, равном объему рас-
твора антигена- Исследования стандартов и сывороток следует проводить в
дубликатах. Микроплаты инкубируют при комнатной температуре в течении 2
ч. 7) Удаляют остатки несвязавшихся белков (см. пункт 3). 8) В каждую лун-
ку микроплат вносят раствор антител к иммуноглобулинам, конъюгированных
с соответствующим хромогенным ферментом (см. табл.1), в таком же объеме,
как и объем внесенной сыворотки. Микроплаты инкубируют при комнатной
температуре в течении 2 ч. 9) Удаляют остатки несвязавшегося конъюгата
(см. пункт 3). 10) В каждую лунку микроплат вносят соответствующий суб-
страт (табл.1) в объеме, равном объему раствора конъюгата и через опреде-
ленное время при необходимости останавливают реакцию. 11) Определяют
оптическую плотность на многоканальном фотометре при соответствующей
длине волны (см. табл.1).
'Sandwich1' ИФМ. Этот метод используется для определения уровня анти-
гена в биологических жидкостях. Ход исследования. 1) В лунки микроплат
вносят раствор антител в буфере для иммобилизации в концентрации 5-15
мкг/мл и инкубируют в течении 16 ч при 4°С. 2)-И) Все остальные этапы по-
становки реакции такие же как и в твердофазном ИФМ.
202
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Рекомендации
Увеличить число отмывок
Некоторые общие рекомендации, касающиеся улучшения качества резуль-
татов ИФМ, суммированы ниже:
Проблемы
ОП в контрольных лунках
с PBS >0,1 ед.опт.пл.
ОП в лунках с отрицательным
контролем > 0,2 ед.опт.пл.
ОП в лунках с позитивным
контролем <0.5 ед.опт.пл.
Изменить блокировку твердой фазы.
Увеличить разведение конъюгата.
Использовать афинно-очищенные антитела.
Добавить 1-5% нормальную сыворотку в
буфер для разведения коньюгата.
Проверить эффективность иммобилизации
антигена или антител.
Увеличить чистоту иммобилизованных
реагентов.
Увеличить время инкубации позитивного
контроля с твердой фазой.
Увеличить время инкубации и изменить
температуру
Более тщательно прикрыть микроплаты
Краевой эффект
3.	Блоттинг белков
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПАГЭ) очень эффективный ме-
тод разделения сложной смеси различных белков. Аналитические возможно-
сти метода Существенно увеличились благодаря применению техники блот-
тинга, при котором белки, разделенные с помощью ПАГЭ, затем переносятся
на синтетическую мембрану. После этого интересующие белки изучаются с
помощью специфических антител или других лигандов Существенным преи-
муществом блоттинга белков по сравнению с методами, основанными на ис-
пользовании гелей, является то, что белки становятся доступными для взаимо-
действия с соответствующими антителами и остаются на мембране на всех по-
следующих этапах исследования. Кроме того, метод иммуноблоттинга требует
очень небольшого количества реагентов, его постановка занимает мало вре-
мени и отличается достаточной простотой. В стандартных случаях метод им-
муноблоттинга включает следующие этапы:
1.	Иммобилизация белков на мембране или с помощью электрофоретическо-
го переноса с геля, или за счет пассивного переноса при инкубации с бел-
ковым раствором.
2.	Блокирование свободных мест связывания на мембране для предотвращения
нсспецифического связывания антител с мембраной.
3.	Определение интсресущих белков с помошью соответствующих первичных
антител.
4.	Специфическая метка комплекса антиген-антитело вторыми антителами
или лигандами, специфичными для первичных антител.
5.	Визуализация меченных белковых полос в процессе инкубации с соответст-
вующими субстратами, образующими нерастворимый окрашенный про-
дукт в месте локализации соответствующего белка.
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
203
Более подробно описание метода иммуноблоттинга для определения цирку-
лирующих ауготоантител к ядерным и цитоплазматическим антигенам приво-
дится в обзоре RVerheijen и соавт. (1993).
4.	Иммунопреципитация меченных белков
Большинство аутоантител к ядерным и другим внутриклеточным аутоанти-
генам. реагируют со специфическими молекулами, которые в нативной форме
являются компонентами субклеточных частиц. Эти субклеточные частицы ча-
сто представляют собой аггрегаты нескольких различных белков, часть из ко-
торых связаны с молекулой РНК. Специфическая иммунопреципитация с ис-
пользованием определенных антител является результатом преципитации нс
только мишеневого антигена, реагирующего с соответствующими антитела-
ми, но и других молекул, образующих комплексы с антигеном-мишенью. Та-
ким образом, хотя аутоантитела реагируют только с одним компонентом час-
тиц, с помощью иммунопреципитации можно составить представление о пол-
ной структуре определенных внутри клеточных частиц. При проведении имму-
нопреципитации обычно используют биосинтетическую метку клеточных
компонентов природной аминокислотой [358]-метионином. После разрушения
клеток, интересующий антиген изолируется с использованием имунопреиипи-
тации антителами. 1 Треимуществом иммунопреципитации является очень вы-
сокая чувствительность и специфичность, существенно превосходящая стан-
дартный метод иммунодиффузии. Метод позволяет исследовать антигены, на-
ходящиеся в нативной конформации, и другие молекулы, связанные со специ-
фическим антигеном.
Более подробно методика проведения иммунопреципитации представлена в
обзоре Е.М.Тап и C.L.Peebles (1993).
Литература. Charles P.J., Maini R.N. Enzyme-linkes immunosorbent assay in the
rheumatological laboratory. In: Manual of Biological Markers of Disease. Ed.
W.J.van Venrooij, R.N.Maini. Kluwer Academic Publisher. Dordrecht, Boston,
London, 1993: A5/1-A/519. Tan E.M., Peebles C.L. Immunoprecipitation of labelled
proteins. In: Manual of Biological Markers of Disease. Ed. W.J.van Venrooij,
R.N Maini. Kluwer Academic Publisher. Dordrecht, Boston, London. 1993; A6/1-
A6/13. Verheijen R., Salden M., van Venrooij W.L. Protein blotting. In: Manual of
Biological Markers of Disease. Rd. WJ.Van Venrooij, R.N.Maini. Kluwer Academic
Publisher. Dordrecht, Boston, London, 1993:A4/l-A4/25
2.	Белки острой фазы воспаления
л
Острофазовый ответ рассматривается как i енерализованная реакций орга-
низма, направленная на ослабление нежелательных последствии стрессорных
воздействий и тканевого повреждения (инфекция, перелом костей, ожог, трав-
ма, тромбоз, воспаление и др). Основные проявления острофазового ответа
включают лихорадку, лейкоцитоз, увеличение синтеза горМонов (АКТ Г, кор-
тизол, инсулин, глюкагон, гормон роста и тиреотропный гормон и др.) и бел-
ков плазмы, которые получили название белков острой фазы воспаления. К
ним относятся такие белки плазмы, концентрация которых под влиянием про-
воспалительных стимулов увеличивается более, чем на 25%. Другим харак-
терным признаком острофазового ответа является подавление продукции аль-
204 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
бумина, трансферина и сс2-гликопротеина, аполипопротеинов A-I и A-IL
"Острофазовые" белки подразделяются на 3 основные группы (таблица 2).
Таблица 2
Основные острофазовые белки
Группы белков	Молекулярная Концентрация в	
	масса, Da	плазме в норме, мг/л
Группа 1 (1,5 раза) церулоплазмин	32000	150-600
СЗ-компонснт комплемента	185000	800-17000
С4-компонент комплемента		15-65
Группа 2 (2-4 раза) а-1 кислый гликопротеин	40000	55-140
а-1 -антитрипсин	54000	2000-4000
а-1 -анти х и мотри пси н	68000	300-600
гаптоглобин	86000	400-18000
фибриноген	340000	2000-45000
Группа 3 (100-1000 раз) С-реактивный белок	115000	<3
Сывороточный амилоидный белок А	12000	с5
Примечание: В скобках указана кратность повышения концентрации показателей дан-
ной группы в плазме на фоне острофазового ответа.
Синтез острофазовых белков регулируется цитокинами, контролирующи-
ми рост, дифференцировку и функциональную активность различных клеток,
принимающих участие в острофазовом ответе. К ним относятся интерлейкин-
6 (ИЛ-6), интерлейкин 1 (ИЛ-1), фактор некроза опухоли (ФНО), онкостатин
М, интерлейкин 11, интерлейкин 8 и лейкемический ингибиторный фактор
(ЛИФ) (рис 1).
агантитрипсин
с^-антихемотрипсин
Фибриноген
Гаптоглобин
Церулопл азми н
Печень
С-реак гивный белок
Сывороточный амилоид А
СЗ компонент комплемента
(Хркислый гликопротеин
Рис.1. Регуляция синтеза острофазовых белков провоспалительными цитоки-
нами
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
205
Наиболее важным острофазовым белком является С-реактивный белок
(СРВ), определение которого в сыворотке рассматривается как наиболее чув-
ствительный метод оценки активности (выраженности) острого и хроническо-
го воспаления. При хроническом воспалении уровень СРВ коррелирует с
СОЭ, вязкостью плазмы и, в большинстве случаев, с концентрацией провоспа-
лительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-1, ФНО-ot). По структуре СРВ относится к
семейству пентраксинов и состоит из 5 идентичных негликозилированных по-
липептидных субъединиц с молекулярной массой 23027 Da, которые за счет
нековалентных связей образуют образуют циклическую дискообразную пен-
тамерную структуру. Синтез СРВ кодируется одним геном, локализующимся
на хромосоме 1. В норме в сыворотке СРВ присутствует в следовых количест-
вах (около 0,8 мкг/мл). У 90% здоровых доноров конце» грация СРВ нс превы-
шает 3 мкг/мл, а у 99% - менее 10 мкг/мл. На фоне воспаления его концентра-
ция может увеличиваться в 100 и более раз, удваиваясь каждые 6 часов после
ак гивации его синтеза. Повышение концентрации СРВ наблюдается уже через
4-6 часов после повреждения ткани, а максимальная концентрация достигает-
ся через 24-72 часа. Период полужизни СРВ составляет примерно 19 ч и не за-
висит от его уровня в плазме.
Методы определения. Для определения СРВ следует использовать коли-
чественные методы: радиальная иммунодиффузия, нефелометрия и ИФМ.
Иммуноноферментный метод. Ход определения. В лунки полистироло-
вых микроплат вносят по 50 мкл кроличьих ан тител к СРВ человека (DAKO
А/S), разведенных 1:800 в 0.05 М карбонатном буфере (pH 9,6) и инкубируют
при 4°С в течении 18 ч. Затем лунки промывают 3 раза 0,15 М PBS (pH 7,2),
содержащем 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) и вносят по 50 мкл тестируемых
сывороток, контрольных сывороток (стандарты с высоким и низким содержа-
нием СРВ, DAKO), калибратора (сыворотка с известной концентрацией СРВ,
равной 160 мг/л в серийных двойных разведениях от 1:10000 до 1:2560000,
DAKO) в разведении 1.1000 в PBS-Tween, с добавлением 10% FCS (PBS-
Tween-FSC). После инкубации r течении 2 часов при 37е С лунки микроплат
промывают 3 раза PBS-Tween и вносят по 50 мкл кроличьх антител к СРВ че-
ловека, меченных пероксидазой (DAKO) в разведении 1:1000. После 2-часовой
инкубации при 37°С микроплаты отмывают 3 раза PBS Tween, после чего в
лунки вносят по КМ) мкл субстратной смеси (ОФД и перекись водорода в 0,1
М цитратно фосфатном буфере, pH 5,0). После появления желтой окраски
реакцию останавливают серной кислотой и определяют оптическую плот-
ность при длине волна 492 нм. Чувствительность метода не менее 2.5 мкг/мл.
Верхняя граница нормы 10 мкг/мл.
Клиническое значение. При бактериальных инфекциях наблюдается более
существенное увеличение концентрации СРВ, чем при вирусной инфекции.
Увеличение концентрации СРВ ассоциируется с повышением риска развития
инфаркта миокарда и смерти в общей популяции больных ишемической болез-
нью сердца. Отмечено более частое увеличение концентрации СРВ у больных
с нестабильной стенокардией, чем стабильной стенокардией. При хронических
воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит (РА), сероне-
гативные спондилоартропатии, системные васкулиты, но нс при системной
красной волчанке (СКВ) и идиопатических воспалительных миопатиях, уро-
206
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
вень СРВ очень хорошо коррелирует с клиническими проявлениями активно-
сти заболевания. У больных РА стойкое увеличение СРВ ассоциируется с не-
благоприятным прогнозом, а снижение концентрации отражает эффектив-
ность лечения. При остеоартрите увеличение СРВ ассоциируется с прогресси-
рованием поражения суставов. При НЕА-В27-позитивном анкилозирующем
спондилоартрите увеличение СРВ и гаптоглобина коррелирует с активностью
болезни. При СКВ увеличение концентрации СРВ более 6 мг/мл обладает 39%
чувствительностью и 93% специфичностью в отношении диагностики инфек-
ционных осложнений, особенно в отсутствие серозита. Кроме того, при СКВ
увеличение концентрации СРВ ассоциируется с развитием артериальных
тромбозов в рамках антифосфолипидного синдрома.
Литература. Brahn Е., Scoville C.D. Biochemical markers of disease activity.
Balliere's Clin. Rheumatol. 1988;2:153-158.
3.	Иммуноглобулины
Иммуноглобулины - белки с антительной активностью, мигрирующие при
электрофорезе как гамма -глобулины, подразделяются на 5 основных классов:
IgG, IgA, IgM, IgE, IgD. Все иммуноглобулины состоят из 2 разновидностей по-
липептидных цепей с различной молекулярной массой: 5 типов тяжелых цепей
(ос, 8, е, у, ц),определяющих класс иммуноглобулина и 2 типов легких пеней (к
и су), общих для всех иммуноглобулинов. Иммуноглобулины имеют сходную
базовую структуру, Y-образной формы, состоят из 2 тяжелых и 2 легких це-
пей. Амййотерминальные участки легких и тяжелых цепей (Fab-фрагмент)
образуют ан гиген-связывающую (вариабильную) область молекулы иммуног-
лобулина. С-терминальные участки тяжелых цепей (Fc-фрагмент) формиру-
ют константную область молекулы иммуноглобулинов, определяющую их
биологические свойства (способное гь активировать систему комплемента и
связываться со специфическими клеточными рецепторами). IgG. IgE и IgD
имеют мономерную структуру, IgA является мономером или димером, a IgM-
пентамсром.
IgG присутствует в сыворотке в наиболее высокой концентрации (8,0 1.8
г/л), на его долю приходится 80% антительной активности. Он включает в се-
бя 4 субкласса: IgGl (60-70%), lgG2 (20-30%), IgG3 (5-8%). IgG4 (1-3%). IgA
присутствует в сыворотке в концентрации 0,9-4,5 г/л и является основным се-
креторным иммуноглобулином, обнаруживаемым в слюне, слезах, кишечных
и бронхиальных секретах и материнском молоке. В секретах IgA находится в
виде димера, содержащего J цепь" и еще один пептид, называющийся секре-
торным компонентом. IgM состоит из 5 мономерных субъединиц, связанных
дисульфидными мостиками и J цепью, образующих пентамер (концентрация в
сыворотке 0.7-2.8 г/л). IgD находится в сыворотке в следовых количествах, но
является основным типом иммуноглобулинов, присутствующим на мембране
В лимфоцитов. Концентрация IgE не превышает 100 мкг/л, однако он играет
важную роль в реакциях гиперчувствительности немедленного типа.
Методы определения. Для определения концентрации и характеристики
основных классов иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA) используется метод бел-
кового электрофореза, иммуноэлсктрофорез, электрофорез с имунофиксаци-
ей, метод радиальной иммунодиффузии, нефелометрическая техника. Пос-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
207
кольку IgE присутствует в сыворотке в низких концентрациях, для его опреде-
ления используют РИМ или ИФМ. Субклассы IgG определяют с помощью ра-
диальной имунодиффузии или иммуноферментного метода.
Клиническое значение. Увеличение концентрации IgM отражает острый
воспалительный процесс и защитную реакцию организма на инфекцию. Уве-
личение концентрации IgG отражает развитие хронического воспалительного
процесса, a IgA -реакцию на токсическое повреждение или аутоиммунную па-
тологию. Для воспалительных ревматических заболеваний характерно разви-
тие поликлональной гипериммуноглобулинемии, часто коррелирующей с ак-
тивностью болезни. Кроме того увеличение концентрации IgA наблюдается
при поражениях печени, IgA-нефропатии, глютеновой энтеропатии; реже при
реактивных артритах, хронических гнойных заболеваниях легких, СПИДе;
увеличение концентрации IgM характерно для первичного билиарного цир-
роза, острой ревматической лихорадки. В целом, определение сывороточной
концентрации основных классов иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM) целесооб-
разно проводить в следующих случаях. 1. При подозрении на первичный или
вторичный иммунодефициты, при которых может наблюдаться снижение кон-
центрации основных классов иммуноглобулинов. Наиболее частой формой яв-
ляется IgA дефицит. 2. Для диагностики моноклональных гаммапатий (в соче-
тании с иммуноэлектрофорезом сыворотки и мочи) и дифференциальной ди-
агностики ’'доброкачественной идиопатической моноклональной гаммапатии
от парапротсинемии, связанной с миеломой (при миеломе наблюдается увели-
чение концентрации одного класса иммуноглобулинов и снижение концентра-
ции других классов им ммуногл обул инов, чтх) нс характерно для "доброкачест-
венной" моноклональной гаммапатии). 3. Для исследовательских целей у
больных аутоиммунными, лимфопролиферативными и воспалительными за-
болеваниями. Определение концентрации IgE позволяет диагностировать ги-
пер-IgE синдром и IgE миелому, реже атопические заболевания, некоторые
иммунодефициты (синдром Вискота-Олдрича) и гиперэозинофильные синдро-
мы. Определение субклассов IgG целесообразно при подозрении на иммуноде-
фицит, несмотря на нормальный уровень IgG в сыворотке. Иммунодефицит по
одному или нескольким субклассам IgG ассоциируется с развитием синуситов,
рецидивирующего среднего отита, бронхиальной астмы, рецидивирующей ин-
фекции верхних дыхательных путей, менингококцемии.
Литература. UIIS/WHO Working Group. Use and Abuse of Laboratory Tests
in Clinical Immunology: Critical Considerations of Eight Widely Used Diagnostic
Procedures. Clin.Immunol, ImmunopathoL 1982;24:122-138; A Second IUIS/WHO
Report. Laboratory Investigations in Clinical Immunology: Methods, Pit falls and
Clinical Indications.Chn. Exp. Immunol.1988; 74: 494 503.
4,	Система комплемента
Система комплемента, состоящая из более, чем 20 белков, играет важную
роль в развитии воспаления и иммунного ответа. Компоненты комплемента
присутствуют в кровяном русле в виде неактивных предшественников (зимо-
генов). При воздействии различных иммунологических и неиммунологических
стимулов, отдельные компоненты комплемента вступаю! в серию взаимодей-
ствий с активирующими субстанциями и Друг с другом, что приводит к образо-
208
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХ! ЮЛ ОГИ И
ванию биологически активных форм, обладающих мощной провоспалигель-
ной и литической активностью. Существует 2 основных пути активации комп-
лемента: классический и альтернативный, которые функционируют независи-
мым друг от друга образом. К белкам классического пути активации компле-
мента относятся Clq, Cis, Cl г, С4, С2, СЗ; белки альтернативного пути вклю-
чают пропердин, факторы В, D и СЗ. СЗ компонент, являясь одним из основ-
ных гликопротеинов плазмы (присутствует в сыворотке в концентрации 1,3
мг/мл), занимает центральное место в обоих путях активации комплемента.
Белки С5-С9 обозначаются как терминальные компоненты (мембраноатаку-
ющий комплекс), также являются общими для обоих путей и осущес гвляют
лизис и повреждение клеток-мишеней. Контроль за активацией комплемента
осуществляется 7 контролирующими белками, основными из которых явля-
ются C1INH, I (C3bINA), Н (BIH), С4ВР. а также мембранными белками и
клеточными рецепторами. Активация классического пути происходит при вза-
имодействии Clq с иммунными комплексами, содержащими антитела IgGl,
IgG2, IgG3, IgM. Активация Cl может происходит в отсутствие антител под
воздействием различных полианионов, некоторых полисахаридов, вирусных
мембран и других субстанции, однако физиологическое значение этого типа
активации не ясно. Активация альтернативного пути может происходить в От-
сутствие антител за счет воздействия липополисахаридов бактерий, вирусов и
вирус-инфицированных клеток.
Методы определения. Для оценки состояния системы комплемента ис-
пользуют различные методы, основанные на определении функциональной ак-
тивности всей системы комплемента, её отдельных компонентов или концент-
рации последних в биологических жидкостях с помощью различных иммуно-
химических методов (радиальная иммунодиффузия, нефелометрия, РИМ и
ИФМ). Существует ряд факторов, затрудняющих интерпретацию результатов
исследования системы комплемента. Уровень компонентов комплемента в
крови является статическим показателем динамического процесса их синтеза,
деградации и утилизации, поэтому концентрация компонентов комплемента
может существенно не меняться, даже несмотря на явное потребление. В нор-
ме концентрация компонентов комплемента варьируется в широких пределах,
что затрудняет выявление активации комплемента. Компоненты комплемента
могут вести себя как острофазовые белки, что ведет к увеличению их концен-
трации, несмотря на активное потребление.
1.	Общая гемолитическая активность комплемента классического пу-
ти (СН50)
Метод определения. Общая гемолитическая активность комплемента оп-
ределяется с помощью СН50 метода и выражается в условных единицах, ко-
торые представляют собой количество сыворотки, требуемой для лизиса 50%
суспензии эритроцитов барана, сенсибилизированных кроличьими антитела-
ми. Нормальные результаты СН50 отражаю г присутствие; функционально ак-
тивных С1-С9 в тестируемых пробах. Однако при этом абсолютное количест-
во компонентов комплемента (особенно СЗ и С4) может быть существенно
ниже нормы, так как эти компоненты присутствуют в сыворотке в большом
избытке. Таким образом. СН50 можно интерпретировать как показатель це-
лостности классического пути активации комплемента, но не как чувствитель-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОМ ИММУНОЛОГИИ
209
ный показатель активации комплемента в организме человека.
Клиническое значение. Определение СН50 рекомендуется при подозрении
на генетический дефицит комплемента. Исследование СН50 полезно прово-
дить у больных иммунокомплексными заболеваниями (особенно в динамике)
для оценки эффективности лечения. Например снижение концентрации СН50
ассоциируется с плохим прогнозом у больных волчаночным нефритом и часто
коррелирует с активностью почечного процесса.
2.	Общая гемолитическая активность комплемента альтернативно-
го пути (АН50)
Метод определения. Гемолитическую активность альтернативного пути
активации комплемента измеряют с помощью АН50.
Клиническое значение. Определение АН50 используют для выявления го-
мозиготною дефицита компонентов альтернативного пути, включая СЗ, фак-
тор I (вызывающий вторичный дефицит СЗ) и вероятно фактор Н. Дефицит
фактора D ассоциируется с рецидивирующей гонококковой инфекцией. Гомо-
зиготный дефицит фактора Н ассоциируется с развитием гломерулонефрита,
рецидивирующего менингококкового менингита, гемолитикоуремического
синдрома и СКВ.
3.	Отдельные компоненты комплемента
Методы определения. Для определения компонентов комплемента ис-
пользуют метод радиальной иммунодиффузии и нефелометрическую технику.
Клинической значение. Для более полной характеристики выраженности
активации комплемента рекомендуется определение отдельных компонентов
(в первую очередь СЗ и С4) с помощью иммунохимических методов. Сниже-
ние концентрации СЗ коррелирует с активностью процесса у больных СКВ и
особенно часто наблюдается у больных волчаночным нефритом. Устойчивое
снижение концентрации С4 также характерно для СКВ, но может отражать не
только потребление комплемента, но и присутствие нулевого аллеля С4, час-
тота встречаемости которого при СКВ выше, чем в популяции. Поскольку пе-
чень - основное место синтеза СЗ, С4, С2, факторов В и D, тяжелое пораже-
ние печени ассоциируется со снижением концентрации СЗ и С4. При мембра-
нознопролиферативном гломерулонефрите наблюдается снижение уровня СЗ,
фактора В и пропердина при нормальной концентрации С4, что связывают с
синтезом аутоантител (нефритического фактора), вызывающих активацию
компонентов альтернативного пути. Снижение, концентрации компонентов
комплемента наблюдается в плевральном, перикардиальном эксудатах и сино-
виальной жидкости при РА и СКВ
4.	Продукты расщепления компонентов комплемента
Метод определения. ИФМ
Клиническое значение. Уровень в плазме продуктов расщепления компле-
мента (C4d, Ba. C3dg) является чувствительным показателем активации ком-
племента. Прогрессирующее снижение концентрации продуктов расщепления
C4d коррелирует с активностью СКВ. Концентрация продуктов активации
фактора В (Ва и ВЬ) лучше коррелирует с активностью СКВ, чем концентра-
ция С4 и СЗ. Присутствие Ва в сыворотке ассоциируется с плохим прогнозом
при СКВ, а соотношение СН50/Ва снижается у больных СКВ с преэклампси
210
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ей. Уровень в плазме iC3b-NEO коррелируете клинической активностью СКВ
и поражением почек. Уровень C3dg повышается у больных системной склеро-
дермией с диффузным поражением кожи. У больных сепсисом выраженное
увеличение концентрации C3dg коррелирует с летальным исходом.
5.	Анафилотоксины (С3а} С4а, С5а) и мембраноатакующий комплекс
Анафилотоксины - биологически активные фрагменты компонентов ком-
племента (соответственно СЗ, С4. С5), принимающие участие в развитие вос-
паления и вазоспазма. Связываясь со специфическими рецепторами, экспрес-
сирующимися на мембране различных клеток, они индуцируют клеточную ак-
тивацию (хемотаксис и активация фагоцитов, синтез цитокинов и др.).
Методы определения. Поскольку анафилотоксины присутствуют в сыво-
ротке в очень низких концов [рация, для их определения используют чувстви-
тельные РИМ или ИФМ. Короткий период полужизни анафилотксинов и бы-
строе связывание с рецепторами затрудняет их определение в биологических
жидкостях.
Клиническое значение. В целом увеличение концентрации анафилотокси-
нов коррелирует с активностью воспаления. Увеличение уровня С5а обнару-
живается в синовиальной жидкости у больных РА. Высокий уровень СЗа об-
наружен у большинства больных СКВ с высокой активностью процесса. При
этом повышение концентрации СЗа отмечается в среднем за 2 мсс до начала
обострения СКВ, проявляющегося развитием нефрита, перикардита или кож-
ного васкулита. Наиболее существенное увеличение концентрации СЗа наблю-
дается у больных СКВ с поражением ЦНС. При СКВ увеличение концентра-
ции С4а коррелирует с уровнем антител к ДНК. Кроме того, увеличение уров-
ня СЗа и С4а наблюдается у больных шоковым легким, сепсисом, дилатацион-
ной кардиомиопатией, на фоне некоторых вирусных инфекций, у больных, на-
ходящихся на гемодиализе. Определение анафилотокеннов используют для
оценки биосовместимости иммуносорбентов, применяемых при проведении
процедур экстракорпорального очищения крови. Увеличение концентрации в
сыворотке SC5b-9 отражает образование С5И-9 мембраноатакующего комп-
лекса (МАК), связанного с белком S (ингиби гор МАК). Уровень SC5b-9 луч-
ше коррелирует с активностью СКВ, чем СН50, С4 и СЗ.
6.	С4 аллотипы
У человека описано 2 полиморфных тесно связанных структурных локуса
С4, которые называются С4А и С4В, расположенных на коротком плече
6 хромосомы. Каждый из этих локусов имеет несколько экспрессирующихся
аллелей (в настоящее время выявлено 13 аллельных продуктов С4 локуса и
21 аллельный продукт С4В локуса), а также неэкспрессирующихся (нулевых)
аллелей. Наличие неэкспрессирующихся аллелей С4А и С4В определяет ши-
рокие колебания концентрации С4 в сыворотке. Поэтому нормальная концен-
трация С4 в сыворотке (15 - 45 мг%) не отражает факт наличия нулевых ал-
лелей. При отсутствии нулевых аллелей концентрация С4 в норме составляет
22-50 мг%, при наличии одного нулевого аллеля - 13-38 мг%, а при 2х нуле-
вых аллелях - 10-16 мг%. Таким образом, снижение концентрации С4 до
10-20 мг% не может свидетельствовать о потреблении комплемента в отсут-
ствие информации о аллотипах С4 (так называемый С4 аллотип коррегиро-
ванный референсный уровень).
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
211
Клиническое значение. Наличие нулевых аллелей предрасполагает к раз-
витию аутоиммунных заболеваний, включая СКВ, лекарственную волчанку,
ССД, РА, синдром Шегрена, склерозирующий панэнцефалит, IgA имммуноде-
фицит. Полагают, что нулевой аллель С4А создает предпосылки для наруше-
ния клиренса иммунных комплексов и, таким образом, играет важную роль в
развитии аутоиммунных и иммунокомплексных заболеваний человека. Подав-
ление С4 гидралазином и изониазидом может иметь значение в развитии ле-
карственной волчанки.
7,	Дефицит C1INH
Существует 2 формы ангионевротического отека, которые наследуются по
аутосомно-доминантному типу. При типе I (85%) отмечается снижение уров-
ня C1INH в плазме и уменьшение его функциональной активности. При типе
II отмечен нормальный или повышенный уровень C1INH с нарушением его
биологической активности. Приобретенный дефицит C1INH, который связан
не столько со снижением синтеза, сколько с повышением потребления, часто
ассоциируется с доброкачественными или злокачественными лимфопролифе-
ративными опухолями В типа. Иногда он связан с продукцией антител к
CUNH Снижение концентрации Clq позволяет отличить приобретенный де-
фицит C1INH от врожденного дефицита.
8.	Рецепторы оля комплемента
СЗ и особенно СЗЬ и iC3b являются основными опсонизирующими белка-
ми комплементарного каскада. Их взаимодействие с клетками осуществляет-
ся посредством семейства рецепторов для комплемента, включающих CR1.
CR2, CR3 и CR4. Экспрессия рецепторов для комплемента снижается при
СКВ, аутоиммунной гемолитической анемии и парксизмальной ночной гемо-
глобинурии, СПИДе и проказе.
9.	Антитела к нефритическому ф)актору
При гломерулонефритах выявляются нс менее 4 типов антител, реагирую-
щих с компонентами системы комплемента. Наиболее часто встречаются ан-
титела к активированному фактору В, являющемуся частью СЗЬВЬ (амплифи-
кационная конвертаза альтернативного пути). Эти антитела, известные также
как C3NeF, чаще всего обнаруживаются у больных с типом II мембранозно-
пролиферативного нефрита (с интрамембранозными плотными депозитами), а
также при частичной липодистрофии, постстрептококковом гломерулонефри-
те, СКВ, идиопатическом быстропрогрессирующсм нефрите и очень редко
при мембранознопрппиферативном нефрите типа I и II, Реагируя с антигеном,
C3NeF вызывают существенное удлинение времени расщепления СЗ и поэто-
му ассоциируются со снижением концентрации СЗ в сыворотке. Определение
этих антител имеет значение для дифференциальной диагностики типов мем-
бранознопролиферативного гломерулонефрита и оценке эффективности те-
рапии. Другим типом антител являются антитела к NFt (конвертаза альтерна-
тивного пути, известная как NFI или СЗЬВЬ-Р стабилизирующий фактор), ко-
торые обнаруживаются у больных типами I (субэндотелиальные депозиты) и
III (субэпителиальные и субэндотелиальные депозиты с разрушением и дупли-
кацией базальной мембраны) мембранознопролиферативного нефрита. Обна-
ружение антител коррелирует со снижением уровня СЗ в сыворотке. Антите-
ла к NFc (нефритический фактор классического пути) обнаруживаются у
212
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
больных типом I мебранознопролиферативного гломерулонефрита, пост-
стрептококковым гломерулонефритом, СКВ и хроническим гломерулонефри-
том. Антитела к неоантигену белков системы комплемента обнаруживаются у
50% больных СКВ, изредка при синдроме Шегрена, а также при гломеруло-
нефригах типа I (74%), типа II (38%) и типа III (48%), только после фикса-
ции Clq на твердой фазе или при связывании с иммунными комплексами и ве-
роятно направлены к неоэпитопу коллагеноподобного участка Clq.
Литература. Law S.K. A, Reid K.B.V. Complement. IRL Press.Oxford.
Washington DC 1988, 73 p. Whaley K. Measurement of complement activation in
clinical practice. Complement. Inflamm.1989; 6: 96-103.
5. Иммунные комплексы
Образование комплексов антиген-антитело или иммунных комплексов
(ИК) является нормальным физиологическим процессом, направленным на
защиту организма от потенциально патогенных воздействий. Однако, при оп-
ределенных условиях ИК могут играть важную роль в развитии ревматиче-
ских болезней. Классическими проявлениями иммунокомплексного процесса,
связанными с нарушением клиренса и отложением ИК в тканях, являклея ва-
скулит, нефрит и арчрит, которые относятся к числу ведущих форм органной
патологии при многих ревматических заболеваниях. При ревматических забо-
леваниях развитие иммунокомплексной патологии связывают со следующими
факторами: 1) Нарушением механизмов нормального клиренса иммунных
комплексов из кровяного русла, а именно генетически детерминированной или
приобретенной патологией системы комплемента, ведущей к нарушению про-
цесса ингибиции иммунной преципитации и солюбилизации комплексов анти-
ген-антитело, что способствует циркуляции комплексов с более выраженным
воспалительным потенциалом и возможности их отложения в органах-мише-
нях. 2) Врожденным или приобретенным нарушением эритроцитарного кли-
ренса иммунных комплексов в связи с патологией CR1 рецепторов эритроци-
тов. 3) Блокадой функциональной активности Fc рецепторов мононулеарных
фагоцитирующих клеток, локализованных в печени и селезенке. 4) Гиперпро-
дукцией циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) с определенной стру-
ктурой и зарядом, обладающих способностью связываться с заряженными
биомолекулами органов-мишеней.
Методы определения. Для определения ЦИК целесообразно использовать
несколько методов, основанных на разных принципах.
1.	Твердофазный Clq-ИФМ Ход исследования. В качестве стандарта для
определения ЦИК используют агрегированный гамкш-глобулин (АГГ), кото
рый готовят следующим образом: гамма-глобулин (фракция IV, по Кону) рас-
творяют в 0,01 М PBS, содержащем 0,15 М хлористого натрия (pl I 7}2), в кон-
центрации 20 mi /мл. агрегируют нагреванием при 63°С в течении 20 минут,
моментально охлаждают и центрифугирую т (2000g) в течении 20 мин при 4°С
для удаления нерастворимых агрегатов. Определяют концентрацию белка на
спектрофотометре при длине волны 280 нм. В лунки микроплат из полистиро-
ла вносят по 100 мкл Clq в концентрации 10 мкг/мл в карбонатном буфере (pH
9.6) и инкубируют во влажной камере в течении 16 часов при 4°С. Несвязав-
шийся материал удаляют, лунки промывают 3 раза в 0,05 М PBS, содержащем
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОМ ИММУНОЛОГИИ
213
0,05% Twccn-20 и 1% BSA (PBS-BSA-Tween), и блокируют несвязавшиеся
участки, добавляя по 100 мкл PBS-BSA в течении 2 ч при комнатной темпера-
туре. После удаления блокирующего раствора в лунки вносят АГГ в концент-
рации от 2 до 50 мкл/мл и исследуемые сыворотки (перед разведением сыво-
ротки инактивируют нагреванием при 56°С в течении 30 мин) в разведении
1:50 в PBS-BSA-Tween в объеме 100 мкл и инкубируют в течении 1 ч при 37°С.
После 3-кратной промывки в лунки вносят по 100 мкл F(ap" )2-антител к IgG
человека, меченных пероксидазой ( в разведении 1:2(МХ)) в PBS-BSA-Tween и
инкубируют в течении 1 ч при 37°С. После финальной отмывки в лунки доба-
вляют субстратную смесь (ОФД с перекисью водорода). После отстановки ре-
акции измеряют ОП на автоматическом фотометре при длине волны 492 нм.
Чувствительность метода в отношении АГГ составляет 3 мкг/мл.
Клиническое значение. Изменение концентрации ЦИК. определяющихся
Clq-ИФМ, коррелирует с суставным индексом при РА и в ряде случаев с ак-
тивностью патологического процесса при СКВ. Однако этот метод может да-
вать ложноположительные результаты в связи с продукцией антител к Clq.
2.	Метод с использованием клеток Raji. Этот метод до последнего вре-
мени рассматривался как наиболее чувствительный способ выявления ПИК.
К недостаткам этого метода следует отнести возможность ложноположитель-
ных результатов из-за связывания с клетками антилимфоцитарных антител,
часто присутствующих в сыворотках больных СКВ. Этот метод иногда ис-
пользуют для оценки активности болезни при системных некротизирующих
васкулитах и саркоидозе.
3.	Метод осаждения иммунных комплексов полиэтиленгликолем
(ПЭГ-метод). Для определения ЦИК используют ПЭГ (Мв 6000 Da). В высо-
ких концентрациях (более 7,5%) ПЭГ почти полностью осаждает иммуногло-
булины и другие сывороточные белки, в то время как в низкой концентрации
он пренииитируег преимущественно растворимые комплексы антиген-антите-
ло с различной молекулярной массой. Предполагается, что растворимость
белков в ПЭГ зависит о г степени их агрегации и гидрофобности, которые вы-
ражены в большей степени у комплексов антиген-антитело, чем у белков, на-
ходящихся в растворе в нативной форме. На основе использования ПЭГ раз-
работано большое число методов определения ЦИК, которые условно подраз-
деляются на 3 основные группы: турбидиметрический и нефелометрический
методы, основанные на прямой регистрации погори проходящего свела или
интенсивности светорассеяния при добавлении 11ЭГ с помощью спектрофото-
метра или нефелометра; преципитационные методы, суть которых заключа-
ется в осаждении ИК-подобного материала ПЭГ с последующим анализом со-
держания белка или иммунохимического состава преципитата; комбинирован-
ные методы, при которых в реакционную смесь вводится какой-либо мечен-
ный изотопами или ферментами лиганд, специфически peai ирующий с комп-
лексом антиген-антитело (например Clq и РФ). Наиболее широко используе-
мым является турбидиметрический метод (V Haskova и соавт.), при котором
анализируется прирост мутности сыворотки в присутствии ПЭГ в конечной
концентрации 3,75% по отношению к бланку", включающему сыворотку,
разведенную буфером, на спектрофотометре при длине волны 450 нм. При
этом на получаемые результаты не влияет концентрация белков, дающих мак-
214 Том (I - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
симальное поглощение при длине волны 280 нм. Наиболее популярным преци-
питационным методом является метод, предложенный М.Digeon и соавт., ко-
торый основан на спектрофотометрическом определении концентрации белка
преципитата, полученного осаждением ПЭГ в конечной концентрации 3,5%.
Клиническое значение. Увеличение концентрации ЦИК по данным ПЭГ-
методов коррелирует с воспалительной и иммунологической активностью
процесса при СКВ, РА, серонегативных артропатиях. К недостаткам методов
следует отнести их недостаточно высокую чувствительность, трудности коли-
чественной оценки содержания ЦИК в пересчете на агрегированный гаммаг-
лобулин, зависимость результатов от концентрации IgG в сыворотке.
4.	IgA-содержащие ЦИК Обнаружение IgA-содержащих иммунных ком-
плексов коррелирует с гематурией при анкилозирующем спондилоартрите,
при котором может развиваться IgA-нефропатия. Комплексы IgA-фибронек-
тин наиболее характерны для IgA-нефропатии, в то время как при анкилози-
рующем спондилите они не обнаруживаются. Образование Clq-связывающих
иммунных комплексов и IgA-содержащих иммунных комплексов коррелирует
с серопозитивностью, активностью болезни и развитием васкулита при РА.
6. Криоглобулины
Криоглобулины - группа сывороточных белков, обладающих аномальной
способностью к обратимой преципитации или образованию геля при низкой
температуре. Криоглобулины могут обнаруживаться при широком спектре за-
болеваний внутренних органов, включая заболевания крови, вирусные инфек-
ции (гепатиты А, В, С, инфекционный мононуклеоз, цитомегаловирус), бакте-
риальные инфекции (бактериальный эндокардит, постстрептококовый гломе-
рулонефрит, проказа, сифилис, болезнь Лайма), паразитарные инфекции (ши-
стозоматоз, токсоплазмоз, малярия), диффузные болезни соединительной тка-
ни (СКВ, РА, узелковый полиартериит, синдром Шегрена, системная склеро-
дермия), при хронических заболеваниях печени и саркоидозе. В небольших ко-
личествах криоглобулины обнаруживаются у здоровых людей, чаще в возрас-
те старше 60 лет. В зависимости от состава криоглобулины разделяются на 3
основных типа: 1) тип 1 состоит из моноклональных иммуноглобулинов IgA,
IgA или IgM, реже моноклональных легких цепей (белок Бенс-Джонса). 2) тип
II (смешанная криоглобулинемия) состоит из моноклональных иммуноглобу-
линов (обычно IgM, реже IgA или IgG), обладающих антиглобулиновой актив-
ностью против поликлонального IgG. 3) тип III (смешанная криоглобулине-
мия). состоит из одного или нескольких классов поликлональных иммуногло-
булинов, иногда неиммуноглобулиновых молекул (фибронектин, липопротеи-
ды, СЗ компонент комплемента). Наиболее часто встречается III тип криогло-
булинемии (60-75%). При этом у 30% больных развитие криоглобулинемии
наблюдается в отсутствие ведущего заболевания. Этот синдром, получил на-
звание эссенциальная смешанная криоглобулинемия (ЭСК).
Ход исследования. 1. Стандартный метод определения критлобули-
нов, Инкубацию и центрифугирование крови для получения сыворотки следу-
ет проводить при 37°С. Затем в центрифужную пробирку помешают 3 мл сы-
воротки, добавляют азид натрия (0,01%) и инкубируют в течении 5 дней при
4°С. Пробирку центрифугируют (1500 об/мин в течении 15 мин) для пллуче-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
215
ния преципитата, преципитат отмывают центрифугированием 3 раза по 15 мин
в 10 мл 0,01 М PBS (pH 7,0) при 4°С, добавляют 0,5 мл подогретого до 37°С
0,15 М PBS (pH 7,2) и инкубируют в течении 2 ч при 37°С до полного раство-
рения. Полученный материал центрифугируют в течении 15 мин при 37°С
(1500 об/мин), собирают супернатант и определяют концентрацию белка по
Лоури и иммунохимический состав методом иммунодиффузии в агарозе с ис-
пользованием антисывороток к IgG, IgA, IgM, СЗ и С4.
2. Быстрым спектрофотометрический метод определения криоглобули-
нов. 2 мл сыворотки смешивают с равным объемом 0,9% хлористого натрия
и помещают в 2 пробирки, одну из которых инкубируют при 37°С, а другую
при 4°С в течении 60 мин. После окончания инкубации измеряют оптическую
плотность на спектрофотометре при длине волны 500 нм. В качестве бланка
используют 0,9% раствор хлористого натрия. О содержании криоглобул инов
судят по разнице ОП (дельта ОП500 нм) проб, инкубированных при 37°С и
4°С. Норма 0,016 ед.опт.пл.
Криоглобулинемию следует отличать от криофибриногенемии, которая
связана с присутствием преципитирующего на холоду фибриногена. Криофи-
бриногенемия может быть первичной и вторичной, связанной с опухолями, не-
крозом, острым или хроническим воспалением, аутоиммунными заболевания-
ми. Криофибриногенемия часто развивается у больных IgA-нефропатией. В
составе криопрсципитирующего материала обнаруживаются IgA-антитела,
реагирующие с фибронектином, IgA-ревматоидный фактор, полимерный IgA.
Клиническое значение. Определение криоглобулинов целесообразно про
водить при подозрении на ЭСК, которая характеризуется развитием кожной
васкулитной пурпуры, нефрита, нейропатии и др. системных проявлений и ча-
сто связана с инфекцией вирусом гепатита С. Кроме того, увеличение уровня
криоглобулинов коррелируете высокой активностью и поражением почек при
СКВ (маркер неблагоприятного прогноза), разви тием системных проявлений
при синдроме Шегрена и РА.
Литература. Алешкин В.А., Насонов Е.Л., Еремеева М.В., Кобылянский
А.Г. Использование твердофазного Clq-иммуноферментного метода для оп-
ределения циркулирующих иммунных комплексов при заболеваниях человека.
Терапевт, архив. 1989, № 6, с.113-116. Насонов Е.Л. Иммунные комплексы при
ревматических заболеваниях. Итоги науки и техники. Серия Иммунология,
том II, 1984, с. 104-158, Насонов Е.Л. Методические аспекты определения цир-
кулирующих иммунных комплексов с использованием полиэтиленгликоля. Те-
рапевт.архив, 1987, № 4. с.38- 45. Насонов Е.Л., Тимофеева Е.Б., Сура В.В.
Клинико-иммунологическая оценка спектрофотометрического метода опре-
деления криоглобулинов при ревматических заболеваниях. Ревматология.
1988, № 2, с.39-43. Насонов Е.Л., Баранаускайте А.А., Соловьев С.К. Криог-
лобулинемия при ревматических заболеваниях. Клин.медицина. 1991, N° 6,
с.23- 32.
7. Аутоантитела
Аутоантитела определяются как антитела, направленные против антиге-
нов, присутствующих на собственных клетках, внутри клеток или во внекле-
216 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
точном пространстве. Аутоантитела могут быть направлены в отношении
чрезвычайно широкого спектра антигенов, являющихся компонентами ядра,
цитоплазмы, клеточных мембран, белками плазмы, гормонами, ферментами,
клеточными рецепторами. В качестве аутоантигенов могут выступать молеку-
лы с различными биохимическими свойствами, включая белки, нуклеиновые
кислоты, фосфолипиды, сахара, стероиды др. В зависимости оттого, связыва-
ются ли аутоантитела с органоспецифическими, клеточноспецифическими ан-
тигенами или органонеспецифическими (широко распространенными) антиге-
нами, они подразделяются на 3 основных группы. Органоспецифические ауто-
антитела реагируют с пептидными гормонами (инсулин и др.), гормональными
рецепторами (ацетилхолин и др.), тиреоглобулином; клеточноспецифические
аутоантитела направлены против мембран различных клеток - эритроцитов,
лимфоцитов, тромбоцитов; органонеспецифические аутоантитела реагируют
с нуклеиновыми кислотами, нуклеопротеидами, белками цитоскелета, и други-
ми компонентами, участвующими в клеточной активации и метаболизме, а
также белками плазмы (иммуноглобулины, компоненты комплемента и др.)
Важным свойством некоторых типов аутоантител является их способность
к перекрестной реактивности (полиспецифичность) с различными антигенны-
ми детерминантами. Синтез аутоантител с определенной специфичнос тью мо-
жет наблюдаться в отсутствие патологии (естественные аутоантитела), и рас-
сматривается как защитная реакция организма, принимающая участие в регу-
ляции иммунного ответа к экзогенным антигенам (микробы, вирусы) и элими-
нации поврежденных и стареющих клеток.
При аутоиммунных заболеваниях аутоантитела играют важную роль в па-
тогенезе болезней, а их определение в биологических жидкостях имеет суще-
ственное диагностическое значение. Аутоантитела способны вызывать повре-
ждение органов посредством нескольких тесно связанных между собой меха-
низмов: 1) Комплементзависимый цитолиз и опсонизации клеток-мишеней
(антитела к форменным элементам крови); 2) Образование циркулирующих и
фиксированных иммунных комплексов (антитела к ДНК, ревматоидный фак-
тор). 3) Индукция антителозависимой клеточной цитотоксичности. 4) Взаимо-
действие с клеточными рецепторами для естественных лигандов (ингибиция
взаимодействия активного центра рецепторной молекулы с естественным ли-
гандом, имитация эффекта естественного лиганда, интернализация и ускоре-
ние деградации рецепторов) или кальциевыми каналами. 5) Модификация ак-
тивности сывороточных молекул (антитела к фосфолипидам). 6) Активация
клеток, принимающих участие в развитии воспаления (антитела к нейтрофи-
лам). 7) Изменения функциональной активности клеток различных органов и
тканей (антитела к клеткам миокарда, эндотелию и др.). 8) Регуляция апопто-
за различных клеток.
Циркулирующие аутоантитела - основной диагностический маркер аутоим-
мунных заболеваний. Однако только обнаружение аутоантител не является
достаточным для постановки диагноза аутоиммунного заболевания. Отмечено
нарастание частоты обнаружения аутоантител у лиц пожилого и старческого
возраста, на фоне приема некоторых лекарственных препаратов, при вирус-
ных и бактериальных инфекциях, у здоровых родственников больных аутоим-
мунными заболеваниями В то же время стойкое повышение уровня аутоанти-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
217
тел даже является фактором риска развития не только аутоиммунных заболе-
ваний, но и других широко распространенных заболеваний человека (болезни
сердечно-сосудистой системы, злокачественные новообразования и др.). При
оценке клинического значения аутоантител необходимо учитывать стойкость
и выраженность их продукции. Например, на фоне инфекций наблюдается
умеренное, 1*ранзиторное образование аутоантител, а при аутоиммунных забо-
леваниях стойкая выраженная гиперпродукция, в ряде случаев коррелирую-
щая с активностью иммунопатологического процесса и определенным спект-
ром клинических проявлений и лабораторных нарушений (подтипы аутоим-
мунных ревматических заболеваний).
Методы определения. Для определения циркулирующих аутоантител при-
меняют практически все существующие иммунологические методы, включая
метод непрямой иммунофлюоресценции (НИФ). методы гемагглютинации
(ГА), иммунодиффузии (ИД), встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ),
ЙФМ и РИМ, иммуноблоттинг (ИБ), иммунопреципитацию (ИП), некоторые
функциональные тесты (таблица 3).
Таблица 3
Методы определения аутоантител
'Din аутоантител
АНФ
Нативная ДНК
Дезоксирибонуклсопротеин
Гистон (Hl, Н2А, Н2В, НЗ,Н4)
Sm антиген
РНП
Scl-70
Центромера
Ro/SS-A
La/SS-B
PM/Scl
Jo-1
Другие амноаци л синтетазы тРНК
Протеиназа-3
Миелопероксидаза
Кардиолипин
IgG -Fc
Тироглобулин
Микросомы (пероксидаза)
щитовидной железы
Митохондрии
Гладкая мускулатура
Методы определения
НИФ
НИФ, РИМ, ИД. ВИЭФ, ГА, ИФМ
РИМ, ИД, ИФМ, латекс-тест,
флокуляция с бентонитом,
LE-клеточный феномен
ИБ, РИМ, ИФМ
ИД. ГА, ИФМ, ИБ. ИП
ИД, ГА, ИФМ. ИБ, ИП
ИД, ИБ
НИФ, ИБ
ИД, ИФМ, ИБ, ИП
ИД, ИФМ, ИБ, ИП
ИД, ИБ
ИД, ИБ, ИФМ
ИП
ИФМ
ИФМ
ИФМ '
Лазе кс-агглютинация,
нефелометрия, ИФМ
НИФ, ГА, ИФМ
НИФ, ИФМ
НИФ, ИФМ
НИФ
218 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
/. Ревматоидные факторы (РФ)
РФ - аутоантитела IgG, IgM или IgA изотипов, реагирующих с Fc-фрагмен-
том IgG.
Клиническое значение. Наибольшее клиническое значение имеет опреде-
ление IgM-РФ (таблица 4).
Таблица 4
Частота обнаружения IgM РФ при заболеваниях человека
Заболевания	Частота, %
Ревматоидный артрит	50-90
Системная красная волчанка	15-35
Синдром Шегрена	75-95
Системная склеродермия	20-30
Полимиозит/дсрматомиозит	<10
Криоглобулинемия	40-100
Смешанное заболевание соединительной ткани	50-60
Инфекции	
бактериальный эндокардит	25-50
туберкулез	<10
сифилис	<13
паразитарные инфекции	20-90
проказа	5-58
вирусные инфекции (краснуха, корь, грипп)	15-65
Болезни легких:	
саркоидоз	3-33
интерстициальный легочный фиброз	10-50
силикоз	30-50
асбестоз	30
Первичный билиарный цирроз	45-70
Злокачественные новообразования	5-25
солидные	
лимфопролиферативные	до 50
Здоровые люди	
моложе 70 лет	
старше 70 лет	до 25*
Примечание: имеются данные о том, что частота и титры РФ не увеличиваются с воз-
растом.
Обнаружение IgM-РФ у женщин среднего возраста с персистирующим по-
лиартритом при 15% вероятности РА на основании клинических данных, уве-
личивает вероятность этой патологии до 74%. Однако, у лиц пожилого возрас-
та, у которых наблюдается повышение частоты IgM-РФ, специфичность это-
го теста для диагностики РА снижается. При интерпретации результатов оп-
ределения IgM-РФ для диагностики РА, необходимо иметь в виду существова-
ние сероне! ативных вариантов РА. Последние чаще встречаются у женщин и
у больных, у которых РА начался в пожилом возрасте, чем у мужчин и у лиц,
у которых РА начался в среднем возрасте. Серопозитивность и высокие тит-
ры IgM-РФ коррелируют с тяжестью, быстротой прогрессирования патологи-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ 219
чсского процесса и развитием системных проявлений при РА. В то же время
динамика титров IgM-РФ не всегда является достаточно чувствительным и
специфичным показателем для оценки эффективности лечения РА.
IgA-РФ часто обнаруживается при IgA-нефропатии и при РА с полиарти-
кулярным вариантом начала заболевания и внесуставными (системными про-
явлениями), а также при синдроме Шегрена, пурпуре Шенлейна-Гсноха и ин-
фекционном эндокардите. Обнаружение IgA-РФ и IgA-содержаших иммунных
комплексов коррелирует с прогрессированием суставного процесса при РА.
IgG-РФ обнаруживается при различных заболевааниях, но метод его определе-
ния требует дальнейшего совершенствования, а клиническое значение до кон-
ца не ясно. РФ как правило не обнаруживается при других заболеваниях, про-
являющихся артритом или артральгиями, с которыми проводят дифференци-
альную диагностику системных ревматических заболеваний, такими как ос-
теоартрит, ревматическая полимиальгия, серонегативные спондиолартропа-
тии, микрокристаллические артропатии, лаймовский боррелиоз, метаболиче-
ские и эндокринные заболевания (акромегалия, сахарный диабет, гемохромаг
тоз, гиперпаратиреоз, охроноз, заболевания щитовидной железы, болезнь
Вильсона, амилоидоз, парвовирусная инфекция, тендиниты, бурситы.
Методы определения. IgM-РФ определяют с помощью реакции латекс-аг-
глютинации (частицы латекса, нагруженные IgG человека) или реакции Ваа-
лер-Розс (эритроциты барана, нагруженные IgG кролика). Реакция Ваалер-Ро-
зе менее чувствительный, но более специфичный метод определения РФ при
РА. Для определения IgM-РФ разработаны методы лазерной нефелометрии,
турбидиметрии, РИМ и ИФМ (последний позволяет определять РФ. относя-
щийся к различным изотипам иммуноглобулинов, IgG. IgA, IgE). Предполага-
ется, что использование в ИФМ смеси IgG человека и IgG кролика позволяет
повысить чувствительность и специфичность определения IgM РФ для диагно-
стики РА. (таблица 5).
Таблица 5
Чувствительность и специфичность различных методов определения
IgM-РФ
Методы	Чувствительность, %		Специфичность, %
Латекс тест (IgG человека)	75	75
Ваалер-Розе тест (IgG кролика)	50	90
Нефелометрия (IgG человека)	82	70
ИФМ (IgG человека+IgG кролика)	85	94
Латекс -тест Ход определения. Реагенты поставляются многими компа-
ниями. В состав большинства наборов входят частицы латекса, нагруженные
IgG человека, соответствующий буфер и специальное предметное стекло.
1) Инактивировать сыворотку нагреванием при 56°С в течении 30 мин, а затем
охладить до комнатной темпратуры; 2) Смешать 20 мкл суспензии лактекса и
20 мкл сыворотки (разведенной 1.20). 3) Аккуратно встряхивать с течении
1 мин. 4) Оценить наличие агглютинации. Для оценки пира РФ приготовить
серийные разведения сыворотки и провести исследование как описано в пунк-
тах 2-4.
220 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Иммуноферментный метод (no Faith и соавт., 1982). Ход определения.
1) В лунки микроплат из полистирола внести по 100 мкл IgG человека
(5 мкг/мл) в 0,01 М PBS (pH 6,3); 2) Инкубировать в течении 16 ч при комнат-
ной температуре; 3) Отмыть лунки микроплат 3 раза 0,01 М PBS (содержащим
0,05% Tween-20) (PBS-Т) и в каждую лунку добавить по 100 мкл тестируемой
сыворотки, разведенной 1:100 в PBS-T. 4) Инкубировать в течении 16 часов
при комнатной температуре; 5) Повторить промывку (пункт 3); 6) В каждую
лунку добавить по 100 мкл антител к IgM человека, меченных щелочной фос-
фатазой (разведение 1:500 в PBS-Т) и инкубировать в течении 2 ч при комнат-
ной температуре; 7) После 2х кратной промывки PBS-Т и однократной отмыв-
ки дистиллированной водой, добавить субстратную смесь и после остановки
реакции измерить ОП на многоканальном фотометре при длине волны 405 нм.
2. Антиядерные антитела (антинуклеарные факторы)
Антиядерные антитела или антинуклеарные факторы (АНФ) -гетероген-
ная группа аутоантител, реагирующих с различными компонентами ядра.
Методы определения. АНФ определяют методом непрямой иммунофлюо-
ресценции (НИФ) с использованием в качестве субстрата криостатных сре-
зов мышиной или крысиной печени или НЕр-2 клеток (эпителиальные клетки
рака гортани человека). Использование последнего субстрата предпочтитель-
ней, так как позволяет повысить чувствительность метода (таблица 6).
Таблица 6
Частота обнаружения (%) АНФ
при системных ревматических заболеваниях в зависимости от субстрата
Заболевание	Криостатный срез	НЕр-=2 клетки
СКВ	96	99
Синдром Шегрена	72	85
Системная склеродермия	40	88
Ревматоидный артрит	25	55
Ювенильный артрит	22	40
Ход исследования. 1. Культивирование НЕр-2 клеток. НЕр-2 клетки поме-
щают на предметное стекло (1x105 клеток) в 5 мл DMFM, содержащем
10% FCS и выращивают при 37°С в течении 40-48 часов в 5% СО2. При дос-
тижении 80-90% конфлюснтности, клетки фиксируют смесью метанола с аце-
тоном и хранят при -20°С. 2. Конъюгированные антитела. Используют поли-
валентные антитела (кроличьи или морской свинки) против IgG человека,
конъюгированные с флюоресце ин изотиоцианатом (соотношение флюоресце-
ин/белок около 3). Этапы определения АНФ- На клетки, фиксированные на
предметном стекле, наслаивают 10-20 мкл разведенной сыворотки и инкуби-
руют во влажной камере в течении 30 мин при комнатной температуре. Тща-
тельно отмывают препарат в растворе PBS-Tween. Затем наносят I каплю
(10-20 мкл) ФИТЦ-конъюгата и вновь инкубируют в течении 30 мин при ком-
натной температуре. Тщательно отмывают препарат в растворе PBS-Tween.
Наслаивают 2-3 капли раствора, состоящего из 70% глицерина в PBS (pH 8,3)
и анализируют препарат с использованием люминисцентного микроскопа.
Следует оценить титр антител (титр > 1:40 при использовании криостатных
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОМ ИММУНОЛОГИИ
221
срезов и >1:80 при использовании НЕр-2 клеток расценивается как положи-
тельный результат), а также интенсивность и тип флюоресценции (таблица 7).
Таблица 7
Зависимость характера иммунофлюоресценции от типов АИФ
Тип иммунофлюоресценции
Гомогенная
Периферическая (краевая)
Крапчатая
Сетчатая крапчатая
Дискретная крапчатая
Нуклеолярная
Тип аутоантител
Антитела к ДНК (двух и односпиральной),
дезоксирибонуклеопротеину, гистонам (Н1,
Н2В, НЗ, Н4)
Антитела к двухслиральной ДНК
Антитела Sm, РНП, Ro/SS-A, La/SS-B, Jo-1
Антитела Scl-70 (топоизомераза 1)
Антитела к центромере
Антитела к PH К-полимеразе 1, PM/Scl, другие?
Клиническое значение. АНФ рассматриваются как серологических маркер
аутоиммунных ревматических заболеваний (таблица 8).
Таблица 8
Частота обнаружения АНФ при заболеваниях человека
Заболевание	Частин
Системная красная волчанка активная форма	95
ремиссия	95
Дискоидная красная волчанка	-40
Лекарственная волчанка	100
Системная склеродермия	-70
Синдром Шегрена	-60
Смешанное заболевание соединительной ткани	100
Ревматоидный артрит	-40
Ювенильный хронический артрит	20
Пол и миозит/дерматомиозит	-40
Узелковый полиартериит	<20
Здоровые липа до 40	<5
после 40	до 25
Титры
+ или ++
++1 или +++
++ или +++
+ или ++
+ или ++
Примечание: + низкий титр; ++ средний титр; +++ высокий титр.
Частота обнаружения АНФ у здоровых людей зависит от пола и возраста.
У лиц моложе 40 лет АНФ выявляются в 1-3% случаев, а у лиц старше 60 лет-
в 16-25% случаев. У женщин АНФ выявляются в среднем в 5 раз чаше, чем у
мужчин. Частота выявления АНФ существенно повышена у родственников
больных аутоиммунными заболеваниями, особенно ревматическими: у родст-
венников больных СКВ АНФ обнаруживаются в 13-57%, у родственников
больных синдромом Шегрена - в 9%, системной склеродермией - в 17-27%,
аутоиммунной тромбоцитопений и гемолитической анемией в 18%. Увеличе-
ние частоты АНФ зарегистрировано на фоне приема некоторых лекарствен-
222	Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ных препаратов, особенно гидралазина и новокаинамида (50-75%). К неревма-
тическим заболеваниям, ассоциирующимся с АНФ, относятся следующие:
хронический активный ("аутоиммунный" или люпоидный) гепатит, первичный
билиарный цирроз, HBsAg-позитивный хронический активный гепатит, реже
алкогольный гепатит (при гепатите С АНФ не обнаруживаются), идиопатиче-
ский легочный фиброз (35%), чаще обнаруживаются у женщин с длительным
течением заболевания, экстрапульмональными проявлениями (феномен Рей-
но, артрит, серопозитивность по РФ. дигитальный васкулит), асбестоз (25%),
первичная легочная гипертензия (40%) (обнаружение АНФ не характерно для
аллергического альвеолита и вторичной легочной гипертензии), инфекцион-
ные заболевания (паразитарная инфекция, малярия, трипанозомоз, шистозо-
матоз, туберкулез, грамм-положительная и граммотрицатсльные бактерии),
злокачественные новообразования, такие как лимфопролиферативные и мие-
лопролиферативные опухоли (17-58%), меланома (30%), рак молочной желе-
зы (около 40%), яичников, простаты и легких, гематологические заболевания,
а именно идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (20%), аутоиммун-
ная гемолитическая анемия (30%). Иногда АНФ выявляются у больных с эн-
докринной патологией (полиэндокринопатии, инсулинзависимый сахарный ди-
абет, тиреоидит, тиреотоксикоз), дерматологические болезни (псориаз, пузыр-
чатка), на фоне беременнности. после трансплантации (коррелирует с оттор-
жением трансплантата) и у больных, находящихся на програмном гемодиализе.
3. Антитела к отдельным ядерным и цитоплазматическим антигенам
Наряду с АНФ, большое значение для диатостики аутоиммунных ревмати-
ческих заболеваний имеет определение антител к определенным клеточным
аутоантигенам (таблица 9).
Таблица 9
Частота обнаружения наиболее часто встречающихся аутоантител
(по данным ИФМ) при ревматических заболеваниях
Тип антител	СКВ	сзст	сед	CREST- Синдром ПМ/ДМ РА			
				синдром	[ Шегрена		
АНФ* 95%	100%	70-90% 60-90		70%	30-50% 40%		
Анти-нДНК	60%	отр	отр.	отр.	отр	Оф	отр
Анти-Sm	30%	отр	отр	отр	отр	отр	ОТр
Анти- РНП Анти-	30%	100% (выс. титр)	часто (низк. тигр)	отр	редко (низк. титр)	редко (низк. титр)	отр
центромерные	нет	нет	-15%	60-90% отр		отр	отр
Анти-Ro/SS-A	30%	редко	редко	отр	70%	О’ф	отр
Анти-La/SS-B Анти- нуклео-	15%	редко	редко	огр	60%	отр	отр
лярные	часто	отр	час го	отр	часто	ОТр	редко
Ahth-Sc1-70	огр	отр	10-20%	отр	отр	огр	отр
Анти-Jo-l	отр	отр	отр	отр	отр	30-40%	отр
аФЛ	-40%	огр	отр	отр	отр	огр	отр
Примечание: АНФ определяли методом НИФ с использованием НЕр-2 клеток
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
223
3.Z. Антитела к дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК)
Антитела к ДНК подразделяются на 2 основных типа: антитела, реагирую-
щие преимущественно с односпиральной (денатурированной) ДНК, и антите-
ла, реагирующие преимущественно с двухспиральной (нативной) ДНК. Пер-
вые распознают пуриновые и пиримидиновые основания ДНК, а вторые - са-
харно-фосфатный ос гов ДНК.
Методы определения. Для определения антител к ДНК используют раз-
личные методы, которые выявляют различные типы антител, присутствую-
щих в сыворотках больных СКВ. Наиболее часто используются 4 метода:
ИФМ, метод НИФ с использованием Crithidia lucilia, ПЭГ- метод и метод Fair,
В целом при СКВ наблюдается высокая корреляция между результатами раз-
личных методов. ИФМ метод определения антител к нативной ДНК обладает
наиболее высокой чувствительностью, а метод Farr наиболее специфичен для
диагностики СКВ (таблица 10). При использовании ИФМ возникают методи-
ческие проблемы, связанные с иммобилизацией нативной ДНК на твердой фа-
зе. Для увеличения сорбции ДНК полистирол предварительно обрабатывают
заряженными молекулами: поли-L-лизин, протаминсульфат или используют
конъюгаты молекулы ДНК с метилированным бычьим сывороточным альбу-
мином. Однако, в этом случае корректная оценка уровня антител к ДНК мо-
жет быть затруднена, поскольку связывание с полистиролом через заряжен-
ные молекулы может вызывать конформационные изменения молекулы Д1 (К
и давать ложноположительные результаты, обусловленные неспецифическим
связыванием антител с другой специфичностью. Имеются данные о том, что
облучение полистироловых микроплат ультрафиолетом приводит к увеличе-
нию их абсорбционной способности в отношении нативной ДНК.
Таблица 10
Сравнение специфичности различных методов
определения антител к ДНК
Заболевание Частота Метод Farr		положительных		результатов с Critidia ИФМ
		ПЭГ-метод	Тест	
Активная СКВ Ревматоидный	98	96	96	100
артрит	1	5	0	3
Синдром Шегрена	0	7	0	20
Склеродермия Аутоиммунный	0	0	0	30
гепатит	0	20	0	15
Миастения гравис А утои мму нны й	0	32	0	20
тиреоидит	0	7	0	13
Болезнь Аддисона Аутоиммунная ге-	0	0	0	0
молитическая анемия	0	10	0	0
Доноры	0	0	0	0
224
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
7.	Метод Farr (РИМ). В основе метода лежит использование сульфата
аммония для разделения комплексов ДНК-анти ДНК от свободной (меченной)
ДНК. Ход определения. В пробирке (16 х 100 мм) смешать 50 мкл сыворотки,
50 мкл раствора, содержащего 16 мг/мл IgG человека, 50 мкл PBS и 50 мкл
раствора, содержащего 2 мкг/мл [ЗН]-ДНК. (в качестве источника меченной
ДНК используют ДНК, выделенную из тимуса теленка или плазмидную
ДНК). Инкубировать 1 ч при 37°С. Добавить 5 мл холодного 50% насыщенно-
го раствора сульфата аммония (в PBS) и инкубировать 3 мин при 4°С до обра-
зования преципитата. Центрифугировать пробирки в течении 15 мин 3000g
при 4°С. Отмыть преципитат 2 раза 50% насыщенным раствором сульфата
аммония при 4°С (5 мл на каждую отмывку) цен трифугированием в течении
15 мин при 3000g. Растворить осадок в 1 мл раствора Solucne-100. Добавить
10 мл сцитиляционной жидкости. В качестве контроля всегда включать 2 про-
бирки, содержащие 50 мкл раствора ДНК в Soluene и сцинтиляционной жид-
кости. Уровень ДНК связывания рассчитать по формуле: [(pm образца)/(срт
ДНК контроля)] х 100. Уровень антител выражается в Ш/мл, который устана-
вливается по международному стандарту антител к нативной ДНК (Wo/80).	|
2.	НИФ с использованием Crithidia luciliae (гсмофлагелла, имеющая ги-
гантскую митохондрию, которая содержит большое количество двуспираль-
ной ДНК). Ход определения. Предметное стекло, содержащее каплю Crithidia
luciliae хранят при -20°С и размораживают непосредственно перед исследова-
нием. Готовят двойные разведения сывороток в PBS, начиная с 1:10. 50 мкл ка-
ждого разведения инкубируют с Crithidia lucilia в течении 30 мин при комнат-
ной температуре. Затем стекло отмывают один раз дистиллированной водой и
тремя сменами PBS в течении 30 мин. I [аслаивают 20 мкл ФИТЦ-мсчсйпых
антител и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Затем стекла вновь
отмывают дистиллированной водой и PBS и покрывают 65% сахарозой в PBS
(pH 8,2), содержащей 0,5 мкг/мл пропидиум иодида и анализируют с использо-
ванием люминисцентного микроскопа.
3.	Иммуноферментный метод (по M.Zouali и B.D.Stollar, 1986). Микро-
платы из полистирола облучают ультрафиолетом в течении 18 ч в ламинарном
шкафу с использованием 30 w ультрафиолетовой лампы. Затем в лунки мик-
роплат вносят по 100 мкл раствора нативной ДНК из тимуса теленка в Грис-
буфере (pH 7,4) в концентрации 5 мкг/мл. и инкубируют в течении 18 ч при
4°С, Затем микроплаты трижды отмывают Трис-буфером (по 200 мкл/лунка)
и блокируют неспецифическое связывание 100 мкл 1% раствора BSA в PBS
(pH 7,4) в течении 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной отмыв-
ки PBS, в лунки вносят по 100 мкл сыворотки (разведение 1 100) в PBS-BSA и
инкубируют в течении 1 ч при комнатной температуре. После удаления сыво-
ротки и трехкратной отмывки PBS, содержащем 0,1 % Tween, добавляют по
100 мкл антител к IgG человека, меченных пероксидазой (разведение 1:1000)
и инкубируют в течении 1 ч при 37°С. Затем микроплаты трижды отмывают
PBS TWcen, вносят рйетвор ОФД с перекисью водорода и после остановки ре-
акции определяют О11 на многоканальном фотометре при длине волны 492 нм.
Клиническое значение. Антитела к нативной ДНК (особенно высокоавид-
ныс антитела, выявляемые методом Farr), высокоспецифичны для СКВ У 2/3
больных без клинических признаков СКВ, но положительных по антителам к
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
225
нативной ДНК (метод Farr), в дальнейшем развивается СКВ. Уровень антител
к нативной ДНК коррелирует с активностью СКВ, а повышение уровня поз-
воляет предсказать обострение болезни. Низкоавидные антитела, выявляемые
ИМФ или ПЕГ-методом, менее специфичны для СКВ, но выявляются чаше,
чем высокоавидные антитела. В частности, увеличение титров низкоавидных
антител чаще наблюдается при СКВ с поражением нервной системы, чем вы-
сокоавидных антител. Антитела к денатурированной ДНК менее специфичны
для СКВ и выявляются при других ревматических заболеваниях.
3.2.	Антитела к гистонам
Гистоны - компоненты ядра, состоящие из 3 субъединиц: 2х Н2А-Н2В ди-
меров, которые фланкированы НЗ-Н4 тетрамером и ассоциированы с третьей
субъединицей, состоящей из 2 витков молекулы ДНК. Соединение этой стру-
ктуры (нуклеосомы) с другими нуклеосомами осуществляется линкерной
ДНК, которая ассоциируется с Н1 гистоном.
Методы определения, см. табл. 3.
Клиническое значение. Антитела к Н2А-Н2В гистонам обнаруживаются
почти у всех больных волчанкой, индуцированной новокаинамидом, у 19%
больных, получающих новокаинамид, но не имеющих симптомов волчанки и у
20% больных СКВ. При СКВ антитела реагируют с интактным гистоном, а
при лекарственной волчанке антитела реагируют с трипсин-резистентными
фрагментами. При лекарственной волчанке, связанной с приемой гидралазина,
антитела связываются с Y3 b Y4 и их трипсин-резистентными фрагментами.
Имеются данные о корреляции между активностью СКВ и уровнем антител к
гистону по данным ИФМ.
3.3.	Антитела к РНП
К антителам к РНП относятся антитела к белковым компонентам (70 ксЕ
А и С) U1 малого ядерного рибонуклеопротеина (Ы мяРНП).
Методы определения, см табл. 3.
Клиническое значение. Антитела к U1 РНП обнаруживаются при смешан-
ном заболевании соединительной ткани (СЗСТ), реже при СКВ и других ауто-
иммунных ревматических заболеваниях. Сыворотки больных СКВ и СЗСТ.
реагирующие с белковым компонентом U1 РНП, в 40% случаях связываются
и с РНК мяРНП. Уровень антител не коррелирует с активностью и развитием
обострения. В 60% случаев сыворотки, реагирующие с U1 мяР11П. содержат
антитела к Sm-антигену, как правило, в низких титрах, и рассматриваются как
РНП/Sm положительные. В сыворотках, содержащих антитела к Sm (СКВ),
антитела к Ш мяРНП не обнаруживаются. У больных перекрестным синдро-
мом с чертами миозита, наряду с антителами к U1 мяРНП, выявляются анти-
тела к U2 мяРНП, который состоит из U2 мяРНП и X полипептидов. Два из них
А и В встречаются только в U2, а 6 (В, D, Е, F, G) являются общими для U1 и
других мяРНП.
3.4	Sm (Smith) антитела
Sm антиген состоит из 5 малых ядерных (мя) РНК (Ul, U2, 1’4, U5, U6),
связанных с не менее 11 полипептидами (70 kd, А , В /В , С, С\ D, Е. F. G) Ан-
титела, специфичные для СКВ, реагируют с В7В и D полипептидами, общими
для U1,U2 и U4/6 мя РНП частиц, принимающих участие в сплайсинге пре-
226
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
мРНК. Антитела Sm распознают богатый пролином доминантный эпитоп В7В
р N белка (мя РНП - ассоциированный белок, распределение пептидов в кото-
ром соответствует распределению пептидов, кодирующихся геном кальцито-
нина).
Методы определения, см. табл. 3.
Клиническое значение. Антитела Sm обнаруживаются при СКВ с частотой
30% при использовании ИФМ и около 20% по данным метода гемагглютина-
ции и не выявляются при других ревматических заболеваниях. Они рассматри-
ваются как маркерные антитела для СКВ и их выявление входит в число диаг-
ностических критериев СКВ. Однако, уровень антител Sm не коррелирует с
активностью и определенными клиническими субтипами СКВ.
3.5.	SS-A/Ro (Robert) антитела
SS-A/Ro антиген - полипептиды 60 kD и 52 kD. образующие комплекс с Ro
РНК (hYl, ЬУЗ и hY5).
Методы определения, см. табл. 3.
Клиническое значение. Антитела SS-A/Ro обнаруживаются у 60-80%
больных вторичным синдромом Шегрена, у 96% больных первичным синдро-
мом Шегрена и у 35-60% больных СКВ в зависимости от чувствительности
использованных методов. В низких титрах антитела выявляются у здоровых
людей (1%). У 50% больных синдромом Шегрена и СКВ анти гола реагируют
с 60 kD и 52 kD компонентами SS-A/Ro частиц, которые состоят по крайней
мере из 3-х белков и РНК. У 40% больных синдромом Шегрена антитела ре-
агируют только с белком с молекулярной массой 52 kD, а 20% сывороток
больных СКВ реагируют только с белком с молекулярной массой 60 kD. Ан-
титела к 52 kD SS A/Ro и 48 kD SS-B/La белку (см. ниже) обнаруживаются в
большинстве сывороток больных с полной поперечной блокадой сердца (этот
антиген в большом количестве присутствует в проводящей системе сердца у
плода через 18-28 нед после оплодотворения). Наличие стабильной структур-
ной ассоциации Ro/РНП и La/полипептида позволяет объяснить, почему оба
типа антител часто выявляются в одних и тех же сыворотках. Предполагает-
ся, что SS A/Ro антиген имеет отношение к кальретикулину (кальпий-связы-
вающий белок). При СКВ продукция антител ассоциируется с определенным
набором клинических проявлений и лабораторных нарушений, фотосенсиби-
лизация, синдром Шегрена, гиперпродукция IgM-РФ. Повышение концентра-
ции антител SS-A/Ro в сочетании с гиперпродукцией IgM-РФ часто наблюда-
ется при А НФ-отри нательном подтипе заболевания (2-5% больных СКВ) с
клиническими проявлениями подострой кожной красной волчанки. Присутст-
вии этих антител в сыворотках беременных женщин увеличивает риск разви-
тия неонатального волчаночноподобного синдрома у новорожденных. При
этом у матерей детей с неонатальным волчаночноподобным синдромом могут
отсутствовать признаки СКВ или других аутоиммунных заболеваний (син-
дром Шегрена или тиреоидит). Имеется связь между обнаружением антител и
генетическими дефектами системы комплемента. Антитела обладают способ-
ностью передаваться от матери к плоду через плаценту и имеют патогенети-
ческое значении в развитии патологии проводящей системы сердца (полная
поперечная блокада). Уровень антител выше при первичном синдроме Шегре-
на, чем при вторичном синдроме Шегрена, и коррелирует с развитием васку-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
227
лита. При поражении ЦНС антитела выявляются в спиномозговой жидкости.
3.6.	SS-B/La (Lane) антитела
SS-B/La антиген - 48kd нуклеоцитоплазматический фосфопротеиновый
комплекс с Ro малым РНК (Ro hYl-hY5), являющийся транскриптом РНК по-
лимеразы II. Иммунодоминантный эпитоп (аминокислоты 88-101) SS-B/La
имеют структурную гомологию с gag белком ретровирусов; сходные амино-
кислотные последовательности и перекрестная реактивное гь обнаружены ме-
жду 70kd U1 мя РНП и ретровирусным p30gag, эпитопом ДНК-полимеразы 1
и различными регионами рЗО gag.
Методы определения. см. табл. 3.
Клиническое значение. Антитела SS-A/La обнаруживаются у больных пер-
вичным и вторичным синдромом Шегрена, сочетающимся с РА и СКВ, но не
с системной склеродермией и первичным билиарном циррозом. Как и SS-A/Ro
антитела, антитела SS-B/La являются фактором риска врожденной полной по-
перечной блокады. При СКВ антитела SS-B/La чаще встречаются при начале
болезни в пожилом возрасте и ассоциируются с низкой частотой развития
нефрита.
3.7.	Миозит-специфические антитела
Антитела, реагирующие с различными ядерными и/или цитоплазматиче-
скими антигенами выявляются у 80-90% больных идиопатическими воспали-
тельными миопатиями (ИВМ), к которым относится полимиозит (ПМ) и дер-
матомиозит (ДМ). К миозит-специфическим антителам относятся следующие:
1)	Антитела к аминоацилсинтетазам транспортной РНК (антисинтетазные
антитела): антитела к гистидин (Jo-1), треонил (PL-7), глицин (EJ), лизин, изо-
лейцин (OJ) и аланин (PL-12) тРНК-синтетезам. 2) Антитела к частицам сиг-
нального распознавания. 3) Антитела Mi-2 (5-10%) реагируют с ядерным бел-
ком с молекулярной массой 220kd (функция не известна). 4) Антитела Fe спе-
цифичны в отношении белков, участвующих в трансляции, включая фактор
элонгации (1а). 5) Антитела MAS реагируют с 4SPHK с неизвестной функци-
ей. 6) Антитела KJ реагируют с белком с молекулярной массой 34kd. 7) Анти-
тела MAS реагируют с 4S РНК с неизвестной функцией. 8) Антитела PM-Scl
(РМ-1), направленные против нуклеолярных и цитоплазматических белков,
реагируют по крайней мере с 16 различными белками.
Методы определения, см. табл. 3.
Клиническое значение. Антитела Jo-1 выявляются у 20-40% больных
ИВМ у взрослых, включая ПМ/ЦМ и перекрестный синдром и особенно час-
то (60%) при сочетании полимиозита с интерстициальным поражением лег-
ких. Частота обнаружения других антисинтетазных антител не превышает 5%.
В целом, антитела к синтетазам выявляются у 40% больных ПМ, у 54% боль-
ных ДМ и только у 6% больных миозитом в сочетании с ДБСТ, при опухоле
вом миозите эти антитела не обнаруживаются. Продукция антисинтетазных
антител ассоциируется с развитием так называемого антисинтетазного син-
дрома, который характеризуется острым началом, интерстициальным пора-
жением легких, лихорадкой, симметричным артритом, феноменом Рейно, из-
менение кожи кистей по типу руки механика". Антитела к частицам сигналь
кого распознавания обнаруживаются только при ПМ (4%) и также ассоции-
228
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
руются с определенным набором клинических проявлений, а именно острым
началом заболевания, тяжелым течением миозита, поражением сердца, пло-
хим ответом на глюкокортикоиды. Mi-2 антитела обычно выявляются у боль-
ных с классическим стероидчувствитсльным ДМ, благоприятным в прогно-
стическом отношении; очень редко у больных опухолевым миозитом. Антите-
ла KJ ассоциируются с развитием миозита, синдрома Рейно и интерстициаль-
ного поражения легких. Антитела PM/Scl (РМ-1) обнаруживаются у 8%
ПМ/ДМ. 3% больных системной склеродермией и у 11% больных ПМ/ССД.
Полагаю!, что эти антитела ассоциируются с особым субтипом диффузных за-
болеваний соединительной ткани, включающим признаки классической сис-
темной склеродермии, полимиозита и поражение почек.
3.8.	Склеродермические антитела
Группа аутоантител, с высокой частотой выявляемых при различных вари-
ан гах системной склеродермии (ССД). К ним относятся следующие: 1. Анти-
тела Scl-70 реагируют с топоизомеразой I (белок с молекулярной массой 100
kD и его фрагментом (67 kD) и относятся к изотипам IgG и IgM. 2. Антитела
к центромере (центромера-снециализированный домен хромосом эукариоти-
ческих клеток; кинетохор-область центромеры, с которой ассоциируются фи-
бриллы веретена). 3. Нуклсолярные антитела включают следующие специ-
фичности: 1) антитела к нуклеолярной Th РНП (2-7 РНК-белковым части-
цам). 2) Антитела к PH К-пол и меразе I (дают крапчатую нуклеолярную имму-
нофлюоресценцию). 3) Антитела к фибрилларину (34 kD белковый компо-
нент 113РНП). 4) Ки-антитела. 5) Антитела к центриоле (реагируют с митоти-
ческим веретеном, связываются с гликолитическим ферментом энолазой).
Методы определения, см. табл. 3.
Клиническое значение. Антитела Scl 70 чаще выявляются при диффузной
(40%), чем при лимитированной (20%) форме ССД (диффузная форма на-
блюдается у 2/3 больных с анти телами Scl-70). Присутствие антител в сочета-
нии с носительством HLA-DR3/DRw52 в 17 раз увеливает риск развития ле-
гочного фиброза при системной склеродермии, ассоциируется с плохим про-
гнозом у больных с феноменом Рейно. Обнаружение антител Scl-70 у больных
с феноменом Рейно коррелирует с развитием ССД. Антитела к центромере
обнаруживаются у 20% больных ССД, у большинства из которых имеются
признаки CREST-синдрома (кальциноз, феномен Рейно, поражение пищевода,
склеродактилия, телеангиэктазии), у 12% больных первичным билиарным
циррозом, у половины из которых имеются признаки склеродермии, очень
редко при хроническом активном гепатите и первичной легочной гипертензии.
Антитела к центромере рассматриваются как прогностический маркер разви-
тия ССД у больных синдромом Рейно. 11ри ССД в одних и тех же сыворотках
редко одномоментно обнаруживается оба типа склеродермических антител.
Больные с анти голами к центромере чаще погибают от легочной гипертензии,
поражения ЖКТ, а больные с антителами Scl-70 - от поражения сердца, лег
ких, почек. Антитела у нуклеолярной Th РНП обнаруживаются у 11% ССД, с
ограниченным поражением кожи и при первичном синдроме Рейно. Антитела
к РНК полимеразе 1 обнаруживаются у 4% больных ССД, чаще при диффуз-
ной форме с поражением сердца и легких. Антитела к фибрилларину встреча-
ются у 8% больных ССД, чаще у мужчин без поражения суставов. Кроме то-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ 229
го нуклеолярные анти тела обнаруживаются при хронической реакции транс-
плантат против хозяина после пересадки костного мозга. Антитела Кп ассоци-
ируются с перекрестным синдромом ССД/ПМ. Антитела к центриоле описа-
ны у больных с склероцермоподобным заболеванием соединительной ткани.
4.	Антитела к фосфолипидам
Антитела к фосфолипидам (аФЛ) представляют собой семейство аутоан-
тител, распознающих антигенные детерминанты анионных и нейтральных фо-
сфолипидов и комплексные эпитопы, образующиеся в процессе взаимодейст-
вия фосфолипидов и фосфолип ид-с вязывающих белков. Синтез аФЛ иногда
наблюдается на фоне инфекционых заболеваний, но чаще связан с аутоиммун-
ными нарушениями, ведущими к развитию своеобразного симптомокомплек-
са, включающего венозные и/или артериальные тромбозы, различные формы
акушерской патологии (в первую очередь привычное невынашивание бере-
менности), тромбоцитопению, а также другие разнообразные неврологиче-
ские, кожные, сердечно-сосудстые, гематологические нарушения. Этот сим-
птомокомплекс обозначается как анти фосфолипидный синдром (АФС), кото
рый может быть вторичным (связанным с основным заболеванием, обычно
СКВ) и первичным. К аФЛ относятся следующие типы антител: I) Волчаноч-
ный антикоагулянт (ВА) - антитела, способные in vitro удлинять фосфолипид-
зависимые коагуляционные реакции (каолиновое время свертывания, время
свертывания, определяемой с помощью яда гадюки Рассела, активированное
частичное тромбопластиновое время). 2) Антитела, реагирующие с иммоби-
лизованными на твердой фазе кардиолипином (аКЛ) и другими отрицательно
заряженными фосфолипидами, для определения которых используют иммуно-
ферментный метод. 3) Ложноположительная реакция Вассермана - антитела,
реагирующие со смесью кардиолипина, холестерина и фосфатидил холина, оп-
ределяемые с помощью реакции агглютинации (ЛПРВ). В сыворотках боль-
ных АФС могут обнаруживаться антитела к VDRL антигену, но, как правило,
в низком титре, несмотря на очень высокий уровень аКЛ. В свою очередь сы-
воротки больных с сифилисом, имеющие высокий титр антител к VDRL анти-
гену, часто не реагируют с чистым" КЛ. иммобилизованным на твердой фа-
зе. 4) Антитела к р2-гликопротеину (гликопротеин с молекулярной массой
50000 kD, с высоким содержанием углеводов (около 20%), состоящий из 326
аминокислот, соединенных несколькими дисульфидными мостиками). Р2-ГП1
активно связывается с различными биомолскулами, включая анионные фос-
фолипиды, гепарин, ДНК, а также мембраной тромбоцитов и митохондриями
и рассматривается как важный естественный антикоагулянт (подавляет внут-
ренний путь коагуляционного каскада и агрегацию тромбоцитов).
Методы определения. Для определения аКЛ применяется ИФМ, который
позволяет дать изотипическую характеристику ан тител, а также исследовать
силу взаимодействия антигена и антитела (авидность). Ход исследования. В
лунки полистироловых микроплат вносят по 0.05 мл кардиолипина в спирте
(Sigma) в конечной концентрации 50 мкг/мл и инкубируют при 4°С в течении
18 ч. Затем лунки микроплат с иммобилизованным на твердой фазе кардиоли-
пином промывают 3 раза 200 мкл 0,15 М PBS. Затем для блокирования неспе-
цифического связывания и r качестве аФЛ-кофактора (p2-GPl) в лунки вно-
сят по 100 мкл 10% PCS в PBS и инкубируют в течении 1 ч при комнатной тем-
230 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
пературе. Лунки микроплат промывают 3 раза PBS и в каждую лунку вносят
по 50 мкл исследуемой сыворотки в разведении 1:50 в 10% растворе FCS в
PBS и инкубируют 3 ч при комнатной температуры. Затем лунки микроплат
промывают 5 раз PBS для удаления несвязавшихся антител и вносят по 50 мкл
кроличьих антител к IgG и IgM человека, меченных пероксидазой. Инкубиру-
ют в течении 90 мин при комнатной температуре. Несвязавшийся конъюгат
отмывают 5 раз PBS, после чего в лунки вносят субстратный раствор (ОПД с
перекисью водорода). После остановки реакции измеряют ОП на многока-
нальном фотометре при длине волны 492 нм. При учете результатов реакции
из средних арифметических значений ОП позитивного с гандарта, отрицатель-
ного контроля и тестируемых сывороток вычитают среднее арифметическое
значение ОП разводящего раствора (10% раствор FCS в PBS). Полученные
показатели ОП переводят в единицы концентрации GPL и MPL. При этом 1 ед.
GPL соответствует кардиолипинсвязывающей активности 1 мкг/мл IgG аКЛ, а
1 ед. MPL - 1 мкг/мл IgM аКЛ, выделенных с помощью афинной хроматогра-
ции. Используют калибровочную кривую зависимости логарифма ОП стан-
дартов от логарифма концентрации аКЛ, описанной уравнением линейной ре-
грессии: logc(On) ~ а + Ъ х loge(aKJI), где значение коэффициента "Ь", выра-
жающего наклон кривой регрессии, в пределах чувстви гсльности метода для
каждой постановки должно быть не менее 0,4. Согласно международным ре-
комендациям при интерпретации результатов следует использовать нс только
абсолютные значения уровня аКЛ в GPL/MPL, но и уровень позитивности (табли-
ца 11).
Таблице! 11
Границы степеней позитивности при оценке результатов определения
аКЛ
Степень позитивности Изотип аКЛ
	IgG аКЛ (в GPL)	IgM аКЛ (в MPL)
Высоко позитивные	более 65	более 45
Умеренно позитивные	30-65	35-45
Низко позитивные	23-30	26-35
Негативные	менее 23	менее 26
II. Определение ВА основано на его способности удлинять in vitro фосфо-
липид-зависимыс коагуляционные реакции, воздействуя на Са^-зависимое
связывание протромбина и факторв Ха, Va с поверхностью фосфолипидов, в
процессе сборки протромбин активаторного комплекса (протромбиназы). Для
определения В А используют панель функциональных тестов. Для скрининга
сывороток рекомендуется использовать тест активированного частичного
тромбопластинового времени (АЧТВ) и тест с ядом гадюки Рассела. На вто-
ром этапе для дифференциации между присутствием в плазме ингибитора и де-
фицитом коагуляционных факторов используют подтверждающие тесты, ос-
нованные на опенке коррекции нарушений при смешивании (1:1 или 4:1) сыво-
ротки, содержащей ВА, и нормальной сыворотки. На третьем этапе исследо-
вания используется метод ингибиции тканевого тромбопластина, который по-
зволяет подтвердить взаимодействие сывороточного ингибитора с фосфоли-
пидами. В некоторых случаях обнаружение В А лучше коррелирует с развита-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
231
ем тромботических осложнений, чем уровень аКЛ, выявляемых с помощью
ИФМ. К недостаткам определения В А следует отнести невозможность его
идентификации у больных, получающих гепаринотерапию, возможное гь ложно-
положительных и ложноотрицательных результатов, трудность стандартизации.
Клиническое значение. В целом, В А обладают более высокой специфично-
стью, а аКЛ - большей чувствительностью для диагностики АФС. С развити-
ем клинических проявлений АФС лучше всего коррелируют IgG аКЛ, особен-
но если они выявляются в высоких титрах, но иногда в сыворотках больных
АФС обнаруживаются только IgM или IgA аКЛ. Установлено, что синтез
именно Р2-ГП [-зависимых аФЛ ассоциируется с развитием тромботических
нарушений в рамках АФС, в то время как стандартный метод определения
аКЛ с иммобилизованным на твердой фазе кардиолипином выявляет как
р2-ГП1-зависимые, так и р2-ГП1-независимые антитела, что снижает специ-
фичность результатов. Обнаружение антител к р2-ГП1 лучше коррелирует с
развитием тромбозов, чем обнаружение аКЛ. Определение аФЛ следует про-
водить в следующих клинических ситуациях: 1) При СКВ для прогнозирования
возможности развития АФС. 2) При тромбозе периферических сосудов у
больных молодого возраста, развившемся в отсутствие очевидных провоциру-
ющих факторов. 3) При аутоимунных и лимфопролиферативных заболева-
ниях при наличии признаков АФС. 4) У беременных женщины при наличии
2 спонтанных выкидышей в анамнезе. 5) В случае поражение ЦНС (ишемиче-
ский инсульт, хорея, приходящие нарушения мозгового кровообращения) у
больных молодого возраста при наличии других проявлений АФС, таких как
сетчатое ливедо, поражение клапанов сердца, тромбофлебит. 6) При заболе-
ваниях коронарных артерий у больных молодого возраста. 7) У больных с по-
роками сердца при отсутствии ревматического анамнеза. 8) При мультиорган-
ном тромбозе для дифференциальной диагностики с Д ВС-синдромом и тром
ботической тромбоцитопенической пурпурой. 9) У больных с тромбоцитопе-
нией и гемолитической анемией для диагностики гематологических проявле-
ний АФС. 10) Для дифференциальной диагностики внутрисердечного тромбо-
за с миксомой.
5.	Антинейтрофильные цитоплазматические антитела (АНЦА)
АНЦА - гетерогенная популяция аутоантител, реагирующих с фермента-
ми, локализованными в цитоплазме нейтрофилов. Основным методом опреде-
ления АНЦА является метод непрямой иммунофлюоресценции с использова-
нием фиксированных спиртом нейтрофилов, с помощью которого выявляют
ся 2 основных типа аутоантител: цитоплазматические АННА (цАНЦА). и пе-
ринуклеарные (пАНЦА). В некоторых случаях обнаруживается атипичное
диффузное свечение нейтрофилов (аАНПА) (таблицы 12 и 13). цАНЦА
обычно специфичны в отношении протеиназы (ПР)-3, а пАНЦА наиболее ча-
сто реагируют с миелопероксидазой.
Метод определения. Основным методом определения Al III А является ме-
тод непрямой иммунофлюоресценции. В последнее время для определения
АНЦА рекомендуется использовать проточную цитофлюори метрик) и ИФМ.
232
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Таблица 12
Частота АНЦА при заболеваниях человека (%)
Заболевание	Тип антител	
	цАНЦА	пАНЦА
	(или анти-ПР-3)	(или анти-
		м ие лоперокс идаза)
Гранулематоз Вегенера	80	20
Классический УП	10	20
МПА	50	50
Синдром Чарга-Страуса	10	70
Болезнь Кавасаки	0	6-91
Полиангиитный перекрестный синдром	40	20
СКВ	0	4
Смешанное заболевание соединительной ткани 0		0
Системная склеродермия	0	0
Полимиозит/дерматомиозит	0	10
Ревматоидный артрит	0	3-40
Ревматоидный васкулит	0	50-75
Синдром Фелти	0	21-100
Болезнь Стилла	0	23
Синдром Шегрена	0	27
Синдром Рейтера	0	0
Реактивный артрит	0	0
Анкилоизирующий спондилоартрит	0	0
Псориатический артрит	0	0
Метод НИФ. Ход исследования. Гранулоциты доноров выделяют из гепа-
ринизированной венозной крови с использованием 6% раствора декстрана Т-
500 (Sigma) с последующим центрифугированием клеток в градиенте плотно-
сти Histopaque-1077 (Sigma). Осадок лейкоцитов отмывают 3 раза PBS, разво-
дят PBS, содержащим 5% BSA до концентрации клеток 2x106 в 1 мл и наносят
по 25 мкл на предметное стекло. После высушивания препарат фиксируют
99% спиртом в течении 5 мин. при 4°С и дважды отмывают PBS. Затем нано-
сят 20 мкл исследуемой сыворотки в разведении от 1:16 до 1:512. После инку-
бации при комнатной температуре в течении 30 мин препарат дважды отмыва-
ют PBS. Затем наносят 25 мкл кроличьей антисыворотки к иммуноглобулинам
человека (IgG+IgA+IgM), меченной ФИТЦ, и инкубируют в течении 30 мин
при комнатой температуре. Препарат дважды отмывают PBS, просушивают
и анализируют с помощью люминисцентного микроскопа. Интерпретация ре-
зультатов. цАНЦА обычно дают гранулярную цитоплазматическую флюорес-
ценцию с большей интенсивностью по направлению к ядру нейтрофилов, чем
к периферии пАНЦА дают перинуклеарное свечение нейтрофилов и некото-
рых моноцитов. Этот тип свечения часто является как бы артефактом, обсу-
ловленным спиртовой фиксацией нейтрофилов, Обработка спиртом позволя-
ет зафисиксировать клетки на поверхности стекла и увеличивает проницае-
мость клеточной мембраны для молекул иммуноглобулинов, но растворяет ли-
пидную мембрану, что позволяет содержимому цитоплазмы нейтрофилов рас-
пределяться вокруг клеток или вступать в контакт с близлежащими клетками.
Таблица 13
Ъш АНЦА при заболеваниях человека
 — 
Заболевание Тип ПР-3 МПО >ЛФ h- Кат-G ББП ЛЗ р-ГН ’ Эла- Неиз-
свечеиия	amp-2	стаза вестей
МПА	Ц	+
Гранулематоз
.-Вегенера	Ц	+++
Геморрагический
васкулит	Ц
Синдром Чарта -
Страуса	Ц и П	+
. "Т .	-
Болезнь
Кавасаки Ц и П +
ь
ГКА	П
кУП	ЦиП	+
Лекарственный
васкулит	П
Быстропрогрес-
сирующий ГН	П и	X
Синдром ГУдпас-
чера	LT и	П	+
РА	X
Синдром Фелти	X
Ревматоидный
васкулит	П
СКВ i X
ВЗК, ВИЧ	X
Примечание: ц = цктоплазма-ичеекое свечение п - перинуклеарной свечек», к - атипичное свечение; ЛФ лактоферии; Кат отелей»
234
Том [I - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Катионные молекулы (лизоцим, миелопероксидаза, эластаза, катепсин G и ла-
ктоферин) могу г связываться с отрицательно заряженными компонентами яд-
ра собственных и близлежащих клеток и давать свечение, напоминающее
АНФ. Поэтому при определении пАНЦА необходима постановка соответст-
вующих контролен с лимфоцитами донора или НЕр-2 клетками. О наличии
пАНЦА можно судить только в том случае, если сыворотки реагируют толь-
ко с нейтрофилами (или моноцитами), или титр антител, реагирующих с ней-
трофилами, в 2 раза выше, чем титр антител, реагирующих с лимфоцитами
(таблица 14). Для исключения перераспределения катионных антигенов пред-
лагалось фиксировать клетки формальдегидом, но это приводит к увеличению
аутофлюоресценции и потере некоторых антигенных детерминант.
Таблица 14
Характеристика свечения при определении АНЦА
Тип антител Фиксация спиртом
Фиксация формаль- НЕр2 клетки
дегидом
ц-АНЦА
п-АНЦА
АНФ
Цитоплазматическое
Нуклеарное/псринук-
лсарной
Нуклсарное/перинук-
лсарное
Гранулоцитар- Нуклеарное/перинук-
ный АНФ леарное
п- А Н Ц А+А Н Ф 11у к л еарное/i i с ри нукл е-
Цитоплазматическое Нет
Цитоплазматическое Нет
Her	Нуклеарное
Нет	Нет
Цитоплазматическое Нуклеарное
арнос
Иммуноферментный метод. Разработан ИФМ, с использованием иммо-
билизованных на твердой фазе кислых экстрактов цитоплазмы нейтрофилов,
а-гранул или “чистых" нейтрофильных ферментов (ПР-3, миелопероксидаза и
др.) В целом, примерно у 85% больных с цАНЦА обнаруживаются антитела
к ПР-3 и 85% больных с антителами к ПР-3 - пАНЦА. У 90% больных с
пАНЦА выявляются антитела к миелопероксидазе. Однако, хотя результаты
определения АНЦА методом непрямой иммунофлюоресценции и ИФМ не-
редко дают совпадающие результаты, ИФМ требует стандартизации. У части
больных с цАНЦА по данным иммунофлюоресценции в сыворотках обнару-
живаются антитела к миелопероксидазе и наоборот, в сыворотках, в которых
выявляются только антитела к миелопероксидазе, иногда идентифицируются
не пАНЦА, а цАНЦА. Ход исследования. 1. Приготовление антигена. 50 мл
свежей гепаринизированной крови здорового донора смешивают с равным
объемом 3% декстрана Т-500 в 0,9% NaCI и выдерживают 45 мин при комнат-
ной температуре. Суспензию центрифугируют (200g, 5 мин), затем дважды от-
мывают PBS. Обогащенный лейкоцитами супернатант наносят на Ficoll-
Hcpaque в соотношении 1:3 и центрифугируют при комнатной температуре
(400g, 40 мин). Зону, содержащую лейкоциты, отбирают стеклянной пипет-
кой, трижды отмывают PBS (200g, 5 мин). Для разрушения эритроцитов клет-
ки суспендируют в буфере (0.15М NH4CL 0.01 М NaHCO3, 0,5 mM трилона Б),
выдерживают 5 мин и дважды центрифугируют (400g, 5 мин) при комнатной
температуре. Клеточный осадок замораживают при -20°С. После оттаивания
клетки суспендируют в 1 мл 0.2М NaCH3COO (pH 4.2) и подвергают обработ-
ке в ультразвуковой бане в течении 2 ч несколькими циклами продолжитель-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
235
ностью по 15 мин. Суспензию центрифугируют (6000g, 15 мин). Осадок по-
вторно суспендируют в том же буфере и обрабатывают в тех же условиях. От-
бирают супернатант. 2. Постановка ИФМ. Экстракт разбавляют 0,025М на-
трий-фосфатным буфером (pH 11,5) до концентрации белка 20 мкг/мл, вносят
в лунки микроплат из поливинилхлорида по 50 мкл экстракта и инкубируют
течении ночи при 4°С. Микроплаты однократно отмывают PBS. Для блокиро-
вания нсспецифического связывания в лунки вносят но 100 мкл PBS, содержа-
щего 1 % BSA и инкубируют в течении 60 мин при комнатной температуре. В
лунки вносят исследуемые пробы (сыворотка, разведенная 1:100 PBS, содер-
жащим 1 % BSA) в объеме 50 мкл. Инкубируют в течении часа при комнатной
температуре и трижды отмывают PBS, содержащим 1% BSA. В лунки вносят
по 50 мкл кроличьих антител к IgG человека, меченных пероксидазой (или
белка А) в соответствующих разведениях в 1% BSA и инкубируют в течении
1 ч при комнатной температуре. После отмывки вносят субстратную смесь
(ОФД с перекисью водорода) и после остановки реакции определяют ОП на
многоканальном фотометре при длине волны 492 нм.
Клиническое значение. цАНЦА (антитела к ПР-3) с наиболее высокой ча-
стотой обнаруживаются при гранулематозе Вегенера, реже - у больных с дру-
гими формами системных васкулитов, которые по характеру клинико-лабора-
торных проявлений напоминают гранулематоз Вегенера (микроскопический
полиартериит и синдром Черга-Страуса), и практически не встречаются при
других системных васкулитах. Использование определения цАНЦА в качест-
ве скринингового теста позволяет увеличить выявляемость гранулематоза Ве-
генера, особенно на ранней стадии болезни, у больных с лимитированной и
атипичной формами заболевания или перекрестными ангиитными синдрома-
ми, а также помогает верифицировать диагноз у некоторых больных с почеч-
ной недостаточностью, находящихся на гемодиализе. Специфичность цАНЦА
при гранулематозе Вегенера приближается к 100%. Чувствительность цАН-
ЦА при гранулематозе Вегенера зависит от активности и распространенности
патологического процесса и формы заболевания и варьирует от 28-50% в ’’на-
чальную» фазу болезни (поражение только верхних и нижних дыхательных
путей в отсутствие признаков васкулита) и до 100% у больных с генерализо-
ванным васкулитом мелких артерий. Повышение уровня цАНЦА у больных в
стадии ремиссии является фактором риска развития обострения, а динамика
титров цАНЦА на фоне цитотоксической терапии позволяет дифференциро-
вать обострение самого заболевания от интеркурентной инфекции. пАНЦА (и
антитела к миелопероксидазе IgG изотипа) наиболее часто обнаруживаются
при микроскопическом полиартериите, реже при классическом узелковом по-
лиартериите, синдроме Чарга-Страуса и гранулематозе Вегенера и практиче-
ски не выявляются при других системных васкулитах. Однако, пАНЦА не яв-
ляются специфическим маркером только системных некротизирующих васку-
литов, а обнаруживаются при других заболеваниях, в том числе системных
ревматических болезнях, воспалительных заболеваний кишечника, а также
при некоторых инфекциях. АНЦА, реагирующие с миелопероксидазой, иден-
тифицированы у больных с идиопатическим альвеолярным геморрагическим
синдромом, у трети больных с синдромом Гудпасчера, у больных с гломеруло-
нефритом и волчаночно-подобным синдромом, индуцированным гидралази-
ном, при системной склеродермии с почечной недостаточностью или легочны-
236
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИ ГИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ми геморагиями. Определение пАНЦА имеет существенное значение для ран-
ней диагностики микроскопического полиартериита, и быстро прогрессирую-
щего гломерулонефрита, развитие которого может наблюдаться в рамках ши-
рокого спектра заболевании, начиная от идиопатических форм пауси-иммун-
ного некротизирующего гломерулонефрита, гломерулонефрита, сочетающе-
гося с паси-им мутным некротизирующим геморрагическом альвеолярным ка-
пилляритом и до идиопатического иммунного альвеолярного геморрагическо-
го синдрома (без сопутствующего гломерулонефрита). Перинуклеарные АН-
ЦА, связанные с антителами к гранулярным белкам: катепсину G, эластазе,
лизосомам, выявляются при МПА, но также при заболеваниях, не осложнен-
ных васкулитом, включая РА, СКВ, воспалительные заболевания кишечника.
АНЦА, дающие гомогенное свечение цитоплазмы (атипичные АНЦА) ино-
гда обнаруживаются при различных инфекционных заболеваниях: ВИЧ-ин-
фекция, эндокардит, поликистоз легких, связанный с хронической легочной
инфекцией, туберкулез.
6.	Антиэндотелиалъные клеточные антитела (АЖА)
АЭКА - гетерогенная группа аутоантител, реагирующих с различными
эпитопами мембраны эндотелия. Цитотоксические антитела к сосудистому эн-
дотелию (иногда перекрестно реагирующие с моноцитами) обнаруживаются
при отторжения трансплантата, гсмолиго-уремическом синдроме, болезни Ка-
васаки. Обсуждается возможность перекрестной реактивности АЭКА и аФЛ.
При некоторых заболеваниях АЭКА активно реагируют только с эндотели-
альными клетками, активированными in vitro цитокинами (ИЛ-1 и ИФН).
Метод определения. Для определения АЭКА применяют ИФМ. Субстра-
том для АЭКА является монослой обработанных коллагеназой ЭК пупочной
вены или клеточные линии (EAhy.926), полученные путем гибридизации ЭК
пупочной вены и линии опухолевых эпителиальных клеток. Ход исследования.
1. Приготовление ЭК. Эндотелиальную гибридомную клеточную линию
EAhy.926 получают путем слияния ЭК пупочной вены с иммортализованными
клетками линии А549 человека, полученными из карциномы легкого (клон
А549/8, дефицитный по ферменту гипоксантин фосфорибозилтрансфсразе), и
последующим клонированием и селекцией клеток гибридомы в среде НАГ
(100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина и 16 мкМ тимидина). Клетки
линий EAhy.925 и А549 культивируют в среде Игла, модифицированной Дюзь-
бекко (Gibco), в присутствии 10% термальноинактивированной фетальной
бычьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина и гентамицина в концентрации 50
мкг/мл. Поддержание гомогенности гибридомной линии и элиминация ревер-
тантных клеток (постоянное селективное культивирование) достигается кон-
диционированием среды HAT. При культивировании клеток линии А549 в
культуральную среду кондиционируют 0.1 мкМ 6-тиогуанина (Sigma) для уст-
ранения ревер гантных клеток с нормальной активностью гипоксантин фос-
форибозилтрансферазы. Субкультивирование клеток осуществляется диссо-
циацией клеток монослоя в среде, содержащей 0.05% трипсина и 1 мМ ЭДТА,
и рассевом в разведении 1:3. 2. Адсорбция сывороток. Адсорбцию сывороток
на клетках линии А549 проводят следующим образом. Образцы сывороток
(400 мкл в разведении V800 в PBS) инкубируют сначала 1 ч при 37°С и посто-
янно перемешивают с 5 х 105 клеток линии А549. После этого клетки осаж-
дают центрифугированием при 900g и супернатант реинкубируют в течении 18
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
237
часов с тем же количеством клеток линии А549 при 4°С. Полученные после
осаждения клеток центрифугированием супернатанты использовали для опре-
деления АЭКА. Клетки разносят в лунки плоскодонных 96-луночных панелей
для культивирования клеток (Costar) в концентрации 2 х 104 клеток/лунка. Че-
рез 2-3 дня, после достижения монослоем конфлюентности. клетки фиксиру-
ют в течении 10 мин при 4°С с помощью 1,1% глютаральдегида (100 мкл/лун-
ка). После 3-кратной отмывки фиксированного монослоя в отмывочном рас-
творе (PBS. содержащий 1% BSA и 5мМ ЭД'1 А), клетки инкубируют 2 ч при
37°С и 100% влажности с 3% раствором BSA в PBS (200 мкл/лунка) для бло-
кирования участков неспецифического связывания антител. После этого мо-
нослой клеток отмывают 2 раза и инкубируют 2 ч при 37°С и 100% влажно-
сти со 100 мкл исследуемых сывороток, разведенных PBS, содержащим 0,5%
BSA. (разведение 1:800). После 4-кратной отмывки монослоя для удаления не-
связавшихся ан тител клетки инкубируют 1 ч при 37°С и 100% влажности со
100 мкл меченных пероксидазой Г(ар')2 фрагментов кроличьих антител к им-
муноглобулинам человека (IgG+IgA+IgM). в соответствующем разведении.
После 4-кратной отмывки монослоя клеток в лунки вносят субстрат (ОФД
с перекисью водорода). После остановки реакции определяют ОП на много-
кональном фотометре при длине волны 492 нм. Результаты выражают в
индексах связывания, которые расчитывают по следующей формуле:
100 х (О-Н)/(П-Н), где О - ОП образца; Н - ОП стандартного негативного
контроля; П - ОП стандартного позитивного контроля.
Клиническое значение. При системных васкулитах частота обнаружения и
титры АЭКА коррелировали с общей активностью заболеваний, но не с опре-
деленными клиническими проявлениями, включая поражение кожи, суставов,
легких, почек, Ц1IC. По нашим данным АЭКА выявляются у 20-70% больных
системными васкулитами, чаще при васкулитах, поражающих сосуды крупного
и среднего, чем мелкого калибра. Примечательно, что у больных с васкулита-
ми крупных сосудов уровень АЕКА практически не менялся после абсорбции
сывороток фибробластами. Э го свидетельствует о том, что антитела специфи-
чески распознают антигенные детерминанты самих ЭК. У больных гранулема-
тозом Вегенера, отрицательных по АНЦА, повышение титров АЭКА в пери-
од ремиссии ассоциируется с риском обострения заболевания. С особенно вы-
сокой частотой (58-88%) АЭКА обнаруживаются при СКВ, при которой ги-
перпродукция АЭКА ассоциируется с клинико-лабораторными показателями
активности болезни, поражением почек, сосудистой патологией, в том числе
легочной гипертензией, дигитальным васкулитом, феноменом Рейно, а также
ссрозитом, лейкоцитокластическим васкулитом. Увеличение уровня АЭКА
коррелируст с 'тяжестью поражения сосудов при ССД и синдромом Шегрена, а
при первичном синдроме Шегрена - с феноменом Рейно. При дерматомиозитс
АЭКА выявляются у больных с сопутствующим интерстициальным пораже-
нием легких), а при ревматоидном васкулите коррелируют с выраженностью
сосудистого повреждения. АЭКА IgM встречаются при аутоиммунном гипер-
паратиреозе, IgA нефропатии (перекрестно реагируют с HLA класса I).
7,	Гладкомышечные антитела (ГМА)
ГМ А - семейство аутоантител, реагирующих с различными компонентами
гладкой мускулатуры.
238
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Метод определения. Метод НИФ с использованием в качестве субстрата
криостатных срезов желудка крысы.
Клиническое значение. Увеличение титров антител, специфичных в отно-
шении актина наблюдается у 98% больных хроническим активным гепатитом.
ГМ А обнаруживаются при увеите, лекарственном гепатите, алкогольном по-
ражении печени, легочной гипертензии, у 3% здоровых доноров; гранзиторное
увеличение их уровня наблюдается при остром гепатите и других вирусных ин-
фекциях, особенно часто при инфекционном мононуклеозе. При этом антите-
ла к актину более характерны для ХАГ, а антитела к промежуточным фила-
ментам - чаще встречаются при вирусных поражениях печени.
8.	Митохондриальные антитела (МА)
МА направлены против нескольких компонентов мембраны митохондрий и
представляют весьма гетерогенную популяцию аутоанти гел.
Метод определения. Для определения МА используют метод НИФ с ис-
пользованием криостатных срезов почек крысы или НЕр-2 клеток, а в послед-
нее время ИФМ с иммобилизованным на твердой фазе пируватдегидрогеназой.
Клиническое значение. Выявлены следующие антигенные специфичности
(таблица 15).
Таблица 15
Типы и характеристика митохондриальных антител
Заболевание	Тип МА	Антиген Частота %	Клиническое значение
Первичный билиарный цирроз	М2	2-оксикислый 97 дегидрогеназный	Специфический маркер
комплекс (иммуно-
доминантный эпитоп
Е2 субъединица
пируватдегидрогеназы)
	М4	Сульфит	10	Обнаруживается в
		оксидаза		сочетании с М2
	М8	?	40	Маркер прогрессирования
	М9	Гликоген	39	Обнаруживается
		фосфорилаза		в дебюте болезни; маркер благоприят- ного прогноза
СКВ	М5	9 •	9 •	Гематологические проявления
Сифилис	Ml	Кардиолипин	?	?
Острый миокардит	М7	Саркозин	?	?
И дк МТ		дегидрогеназа		
Гепатит,	Мб	9 •	?	?
индуцированный
ипрониазидом и др.
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
239
Обнаружение МА обладает 90% чувствительностью и специфичностью
для диагностики первичного билиарного цирроза. Титр МА более 1:40 позво-
ляет заподозрить первичный билиарный цирроз даже в отсутствие клиниче-
ских проявлений и увеличения концентрации щелочной фосфатазы. Титр МА
имеет тенденцию к корреляции с прогрессированием заболевания. Антитела
М2 выявляются у больных CREST синдромом даже в отсутствие признаков
ПБЦ, однако в дальнейшем у этих больных нередко развивается холестатиче-
ское поражение печени. Описано несколько больных со своеобразным сим-
птомокомплексом, включающим печеночную гранулему, поражение легких,
синдром Шегрена, глютеновую энтеропатию, смешанное заболевание соеди-
нительной ткани, в сыворотках которых были обнаружены высокие тигры МА.
9.	Тиреоидные антитела
В сыворотках больных иммуноретинопатиями, к которым относится ти-
реоидит Хашимото, диффузный токсический зоб и первичная микседема, об-
наруживается широкий спектр аутоантител к антигенам щитовидной железы.
К ним относятся типы аутоантител: 1. Антитела к тиреоглобулину (белок с
молекулярной массой 600 kD, который синтезируется в клетках щитовидной
железы). 2. Антитела к микросомам, которые распознают пероксидазу щито-
видной железы (мембрано-ассоциированный гликопротеин, состоящий из 943
аминокислотных остатков, который экспрессируется только на тирсоцитах и
принимает участие в синтезе гормонов щитовидной железы). 3. Антитела к
тиреотропным рецепторам.
Метод определения. Для определения тиреоидных антител используют ме-
тод НИФ (в качестве субстрата срезы щитовидной железы человека или
обезьяны), реакцию гемагглютинации и ИФМ.
Иммуноферментный метод. Ход исследования. Выделение тиреоглобу-
лина. В 50 мл пробирке смешивают 0,1 мл экстракта щитовидной железы (по-
лучают путем гомогенизирования ткани шитовидной железы в PBS, инкубиро-
вания в течении ночи на холоду, центрифугирования 64000g в течении 50 мин)
с 5 мл раствора хлористого натрия. Тиреоглобулин разводят до концентрации
1 мкг/мл в карбонатно-бикарбонагном буфере (pH 9,6), вносят по 200 мкл в
лунки микроплат из поливинилхлорида и инкубируют в течении ночи при 4°С.
Трижды отмывают раствором PBS-Tween. Сыворотки, разведенные 1:100,
вносят в лунки микропланшет в объеме 200 мкл и инкубируют в течении 4 ч
при 37°С. Трижды отмывают раствором PBS-Tween. Затем в каждую лунку
добавляют антииммуноглобул и новые конъюгаты (по 200 мкл) и инкубируют в
течении ночи при 4°С. Трижды отмывают рас твором PBS-Tween. Затем в ка-
ждую лунку добавляю! соответствующий субстрат и после остановки реакции
определяют О] I с помощью автоматического фотометра.
Клиническое значение. Антитела к тиреоглобулину и микросомам (перок-
сидазе) щитовидной железы обнаруживаются у подавляющего большинства
больных тиреоидитом Хашимото (76-100%), атрофическим тиреоидитом и у
70-90% больных тиреотоксикозом. Антитела к микросомам в популяции об-
наруживаются у 7% и их частота увеличивается с возрастом, что ассоцииру-
ется с более частым развитием гипотиреоза у лиц пожилого возраста. Опреде-
ление антител к микросомам является адекватным методом для выявления па-
тологии щитовидной железы в послеродовый период. У больных тиреотокси-
240 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
козом, не имеющих тиреоидных антител до лечения, на фоне терапии более
высока вероятность развития гипотиреоза, чем у больных с высоким уровнем
антител. Титр тиреоидных антител не изменяется в процессе лечения тиреои-
дита Хашимото тироксином. У больных с высокими титрами антител может
развиться энцефалопатия (энцефалопатия Хашимото) в отсутствие микседе-
мы, которая купируется назначением глюкокортикоидов.
Литература. Насонов Е.Л., Сура В.В. Современные подходы к иммуноло-
гической диагностике аутоиммунных и иммунокомплексных болезней. Тер. ар-
хив, 1988, № 6, с.144-150. Титценко В.А., Бекетова Т.В., Семенкова Е.Н., Куз-
нецова Т.В., Насонов Е.Л. Антинейтрофильные цитоплазматические антитела
при гранулематозе Вегенера: анализ с помощью иммуноферментного и имму-
нофлюоресцентного методов. Тер. архив, 1994, № 5, с.48-50. Саложин К.В.,
Щербаков А.Б., Насонов Е.Л. и соавт. Антиэндотслиальные антитела при си-
стемной склеродермии и болезни Рейно. Тер. архив, 1995, № 5, с.54-57. Алек-
сандрова Е.Н., Насонов ЕЛ., Ковалев В.Ю. Количественный иммунофер-
ментный метод определения антител к кардиолипину в сыворотке крови.
Клин, ревматология 1996, № 4. с.35-39. Faith A., Pontestilli О., Unger A., ct al.
ELISA assay for IgG Rheumatoid factors. J.Immunol.Methods. 1982; 55: 169-177.
Manual of Clin. Labor. Immunol. Ed. N.R.Ross, E.C. de Macario, J.L.Fahcy,
H.Feldman, G.M.Penn. Amer. Soc. Microbiol. Washington, 1995, Schwartz R.S.,
Datta S.K. Autoimmunity and autoimmune diseases. Fundamental Immunology.
Second Edition, ed. by W.E.PauI, Raven Press Ltd., New York, 1989: 819-866; Barna
L.K., Triplet D.A.: A report on the First International Workshop for Lupus
Anticoagulant Identification. Clin. Exp. Rheumatol. 1991; 9: 557-567. Shmeling
R.H., Delbanco T.L. The Rheumatoid Factor: an analysis of clinical utility. Amer. J.
Med., 1991; 91: 528-534. Smeenk R. Measurement of antibodies to DNA. in Manual
of Biological Markers of Disease. Ed. WJ. van Vcnrooij, R.N.Maini. Kluwer
Academic Publisher. Dordrecht, Boston, London, 1993; A8/1-A8/12.
8. Методы изучения клеточного иммунитета
1	. Изучение лимфоцитов
Методы определения. Стандартным является метод проточной цитофлю-
ориметрии с использованием моноклональных антител к поверхностным анти-
генам различных субпопуляций лимфоцитов. Поскольку с помощью проточ-
ной цитофлюориметрии можно проводить одномоментную определение 2 и
более поверхностных (или внутриклеточных) молекул на каждой из исследуе-
мых клеток, это позволяет получить информацию о субклассс лимфоцитов,
стадии их дифференцировки и активации. И мм у нофеноти пирование проводит-
ся или в образцах цельной крови (после лизирования эритроцитов) или после
выделения очищенной популяции лимфоцитов в градиенте плотности Фиколл-
Гепака. Т-клетки составляют 65%-8О% периферических лимфоцитов, обыч-
но определяются с использованием антител к CD3 (рецептор, ассоциирован-
ный с Т-клеточным рецептором). Другими реагентами, позволяющими уста-
новить количество Т- клеток являются антитела к CD2, CD5 и '’D7. Однако,
антитела к CD2 реагируют с естественными киллерными (ЕК)-клстками, ан-
титела к CD5 - с В-клетками, а антитела к CD7 - с ЕК-клетками и клетками
миелолейкоза. Для более полной характеристики субпопуляций Т-лимфоцитов
применяют антитела к CD4 (составляют 45%-70% Т-лимфоцитов и часто оп-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
241
ределяются как хелперная/индукторная субпопуляция) и антитела к CD8 (20-
40% Т-лимфоцитов, обладающих супрсссорной/цитотокси ческой активно-
стью). Кроме того, CD4 клетки могут экспрессировать специфические CD45
изоформы, характерные для т.н. 'наивных" клеток (CD45RA) и клеток-памя-
ти (CD45RO). К маркерам, характеризующим активацию Т-клеток, относятся
CD69, CD71 (трансфсриновый рецептор), HLA-DR (главный комплекс гисто-
совместмости класса II), CD25 (рецептор для ИЛ-2 (X цепи), которые выявля-
ются с помощью соответствующих антител. Определение этих и других акти-
вационных антигенов может иметь значение для оценки выраженности акти-
вации клеток в периферической крови или в ткани при воспалительных забо-
леваниях или развитии злокачественной лимфопролиферации, С другой сто-
роны, отсутствие активационых маркеров на клеточных мембранах может
свидетельствовать о иммунодефиците. Для определения количества В-лимфо-
цитов используют определение поверхностных иммуноглобулинов, антител к
CD21 (рецепторы для комплемента), а также антитела к CR2 (рецепторторы
для C3d и вируса Эпштейна-Барр), CD40, CD23 (низкоаффинные рецепторы
для IgE). Для определения количества ЕК-клеток используют антитела к
CD16 и CD56.
Клиническое значение. Изучение периферических и тканевых лимфоцитов
наиболее полезно для диагностики лимфопролиферативных и иммунодефи-
цитных заболеваний и прогнозирования исходов ВЙЧ-инфекции. Например,
определение субпопуляций лимфоцитов имеет очень важное клиническое зна-
чение для диагностики и оценки заболеваний крови, в частности для характе-
ристики Т-клеточно! о острого лимфоцитарного лейкоза, для идентификации
злокачественных клеток при синдроме Sezary, В-клсточных опухолей (В-клс-
точного хронического лимфолейкоза). Определение CD4 - очень хороший
прогностический показатель при ВИЧ-инфекции, поскольку снижение числа
этих клеток свидетельствует о прогрессировании и плохом прогнозе. Иммуно-
фенотипиронанис лимфоцитов используют для диагностики иммунодефицит-
ных заболеваний, таких как X-тяжелого комбинированного иммунодефицита
(отсутствие Г-клсток и ЕК-клеток), ZAP-70- дефицитный тяжелый комбини-
рованный иммунодефицит (отсутствие CD8 -клеток), Х-агаммаглобулинемия
(отсутствие В-лимфоцитов).
2	Растворимые рецепторы интерлеикина~2 (рИЛ-2)
Актвированные Т-лимфоциты синтезируют интерлейкин-2 (ИЛ-2) и спе-
цифические мембранные рецепторы для этого цитокина. ИЛ 2 рецептор со-
стоит из Зх полипептидных цепей: ос-цепи (р55-65, Час), которая связывает
ИЛ-2 с низкой аффинностью (Kd=10-8 М), (3-цепи (р70-75), связывающей
ИЛ-2 с промежуточной аффинностью (Kd=10-9 М), и g-цепи (р64). Ассоциа-
ция трех цепей приводит к увеличению плотности гетеродимерного ИЛ-2Р на
клеточной мембране, который связывает ИЛ-2 с высокой аффинностью
(Kd=10-12 М)= В отличии от [3-цепи, которая постоянно присутствует на кле-
точной мембране, сс-цспь(Тас- белок) экспрессируется только в процессе кле-
точной активации и высвобождается в кровяное русло в виде растворимой
формы, которая получила название растворимый (р) ИЛ-2Р и на 10 Kd мень-
шей, чем мембранная форма. Установлено, что уровень рИЛ-2Р в биологиче-
ских жидкостях пропорционален выраженности экспрессии этой молекулы на
242
Том (I - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
мембранах активированных иммунокомпетентных клеток. Основными клетка-
ми, секретирующими рИЛ-2Р являются активированные Т-лимфоциты, в
меньшей степени В-лимфоциты и макрофаги.
Метод определения. Твердофазный ИФМ (Genzyme, США; Т cell Science,
США; Boehringer Ingelheim Bioproducts).
Клиническое значение. Увеличение концентрации рИЛ-2Р в сыворотке об-
наружено при многих воспалительных (РА, СКВ, системная склеродермия,
дерматомиозит/полимиозит, острая ревматическая лихорадка, системные вас-
кулиты, анкилозирующий спондилоартрит, диффузный токсический зоб, вос-
палительные заболевания кишечника, миастения гравис, рассеяный склероз,
бронхиальная астма, дилатационная кардиомиопатия и миокардит, синдром
Гийсна-Барре) и инфекционных (паразитарные инфекциия, ВИЧ-инфекция)
заболеваниях, лимфопролиферативных опухолях, кожной Г-клеточной лим-
фоме, при отторжении ’трансплантата. При РА гиперпродукция рИЛ-2Р кор-
релирует с активностью заболевания, а при СКВ с активностью процесса и
уровнем антител к ДНК. Сывороточный уровень рИЛ-2Р возрастает по мерс
прогрессирования IgA-нефропатии от стадии 1-П к стадии IU-IV. Увеличение
уровня рИЛ-2Р коррелирует с отторжением трансплантата при пересадке
сердца, почек и печени. Персистирующее повышение рИЛ-2Р в посттранс-
плантационный период после пересадки сердца коррелирует с неблагоприя т-
ным прогнозом, обусловленным поражением коронарных артерий. После пе-
ресадки почек повышение уровня рИЛ-2Р является более ранним и чувстви-
тельным прогностическим показателем последующего развития реакции от-
торжения трансплантата, чем увеличение уровня креатинина. Увеличение
уровня рИЛ-2Р коррелирует с прогрессированием ВИЧ-инфекции. В целом,
определение рИЛ-2Р рассматривается как весьма полезный метод оценки ак-
тивации клеточного иммунитета при заболеваниях человека, хотя и не позво-
ляет дифференцировать активность собственно иммунопатологического про-
цесса от иммунной активации, связанной с интеркурентной инфекцией.
3	Растворимые реиепторы фактора некроза опухоли (рФНО-Р)
ФИО ос и ФНО-Р связываются с 2 высокоаффинными клеточными поверх-
ностными рецепторами с молекулярной массой соответственно 55kd и 75 kd,
экспрессирующимися на мембранах многих клеток (Т-лимфоциты, макрофа-
ги, нейтрофилы и др). рФИО-Р представляют собой белки (30kd), которые
высвобождаются в биологические жидкости в процессе активации мононуклс-
арных клеток.
Метод определения. Твердофазный ИФМ (Genzyme, США; Т Cell Science,
США; Boehringer Ingelhaim Bioproducts).
Клиническое значение. Увеличение уровня рФ1 IO-Р обнаружено в сыво-
ротке и синовиальной жидкости больных РА и коррелирует с воевал тельной
активностью заболевания. При остеоартрозе также отмечено увеличение
уровня рФНО Р в сыворотке, но не синовиальной жидкости. Предполагается,
что определение концентрации рФНО-P может иметь значение для оценки ак-
тивности процесса и диагностики РА.
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
243
4	Неоптерин
Неоптерин (2-амино-4-гидрокси-(Г,2’3,'-тригидроксипропил)-птеридин)
является пиразино-пиримидиновым дериватом, образующимся из гуанозинт-
рифосфата в процессе биохимической трансформации. Промежуточный про-
дукт мстаболизма-тетрагидробиоптсрин, является естественым кофактором
для моноаминооксидаз ароматических аминокислот, окисления липидов и при-
нимает участие в образовании радикалов азота из аргинина. Нарушение био-
синтеза тетрагидробиоптерина вызывает серьезное неврологическое заболе-
вание (атипичная фенилкетонурия). Основным продуцентом неоптерина в ор-
ганизме являются моноциты/макрофаги; индуктором синтеза неоптерина в
этих клетках яадяется интерферон-g, синтезирующийся Т-лимфоцитами в
процессе иммунного ответа.
Метод определения. Для определения неоптерина в сыворотке использу-
ют радиоиммунологический метод (IMMUtest Neopterin, Henning-Berlin, Гер-
мания). Для определения концентрации неоптерина в моче используют высо-
коэффективную хроматографию высокого давления.
Клиническое значение. Увеличение концентрации неоптерина в сыворотке
и в моче наблюдается при многих заболеваниях или состояниях, характеризу-
ющихся активацией системы иммунитета: отторжение трансплантата, аутоим-
мунные заболевания (РА, СКВ. хронические воспалительные заболевания пе-
чени, инсулин-зависимый сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит, саркои-
доз, миокардит, дилатационная кардиомиопатия), злокачественные новообра-
зования, инфекционные заболевания (туберкулез легких, лаймовский борре-
лиоз, сепсис и др.), при ВИЧ-инфекции. Определение неоптерина имеет важ-
ное прогностическое значение для оценки исходов инфекционных и иммунопа-
тологических процессов (например прогрессирования ВИЧ инфекции), ак-
тивности заболеваний и скрыто протекающей иммунной и/или инфекционной
патологии.
Литература. Фукс Д., Самсонов М.Ю., Рейбнигер Ж, Насонов Е.Л., Вах-
тер X. Клиническое значение неоптерина при завоеваниях человека. Тера-
певт. архив 1993; № 5, с.80-87. Fuchs D., Werner E.R., Wachter Н. Soluble
Products of immune activation: neopterin. In: Manual of Clinical Laboratory
Immunology. Ed. Rose N.R., De Macarion E.C., Fahey J.L., Friedman H., Penn G.M.
Amer. Soc.Microb 1994; 251-255.
9. Показатели активации/ повреждения эндотелия
Сосудистый эндотелий является высокоспециализированным мегаболиче
ски активным монослоем клеток, выстилающих все сосуды организма челове-
ка. Эндотелиальные клетки (ЭК), специфически реагируя на различные моле-
кулярные сигналы, генерирующиеся как локально, гак и дистантно, выполня-
ют многообразные функции, в том числе селективные, транспортные и барь-
ерные, участвуют в метаболизме внеклеточного матрикса, биосинтезе разно-
образных цитокинов, ангиогенезе, регулируют процессы свертывания и агре-
гации тромбоцитов, сосудистый тонус и иммуновоспалительные реакции. ЭК
участвует во всех фазах острого и хронического воспаления, таких как началь-
ная вазодилатация, увеличение сосудистой проницаемости, прилипание, транс-
миграция и активация лейкоцитов, ангиогенез и фиброплазия. Активация
244
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
и/или повреждение ЭК имеет фундаментальное значение в развитии широко-
го спектра патологических процессов, в первую очередь тромботических на-
рушений, лежащих в основе сосудистой патологии при заболеваниях человека.
Очевидно, что оценка состояния эндотелия может иметь очень важное клини-
ческое значение для расширения возможностей лабораторной диагностики ак-
тивности иммуновоспалительного процесса и прогнозирования развития ос-
ложнений.
J. Тромбомодулин (ТМ)
ТМ - гликопротеин, экспрессирующийся на мембране ЭК и выполняющий
роль клеточного рецептора для тромбина. Кроме того, ТМ является кофакто-
ром тромбин-зависимой активации белка С, предотвращает опосредуемое
тромбином расщепление фибриногена, активацию тромбоцитов, фактора V
или фактора XIII и инактивацию белка S. ТМ существует как в мембран-свя-
занной, так и растворимой формах (рТМ), присутствующей в биологических
жидкостях. Полагают, что рТМ является расщепленной формой нативного
ТМ, лишенного серин-треониного участка молекулы и цитоплазматического
хвоста. Поскольку рТМ не секретируется ЭК в физиологических условиях,
полагают, что увеличение уровня циркулирующего рТМ отражает поврежде-
ние ЭК.
Метод определения. Твердофазный иммуноферментный метод (Stago,
Asniercs, France).
Клиническое значение. Увеличение уровня рТМ в сыворотке обнаружено
при тромботической тромбоцитопенической пурпуре, ДВС-синдроме, респи-
раторном дистресс синдроме у взрослых и легочной тромбоэмболии, диабети-
ческой ангиопатии, преэклампсии, атеросклеротическом поражении коронар-
ных артерий, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, системной
склеродермии, гранулематозе Вегенера, болезни Бехчета, полимиозите/дерма-
томиозитс и ювенильном РА. В целом, уровень рТМ связан с активностью за-
болеваний и чаще наблюдается у больных с сопутствующим интерстициаль-
ным легочным фиброзом. При системной склеродермии повышение рТМ ас-
социируется с тяжестью капилляроскопических нарушений и обнаружением
антител к топоизомеразе L При интерпретации результатов определения рТМ
необходимо иметь в виду, что рТМ фильтруется в почках и выводится из орга-
низма печенью. Поэтому у больных с острым гепатитом и тяжелым пораже-
нием почек также наблюдается увеличение концентрации рТМ. Особенно хо-
рошая корреляция между уровнем рТМ и активностью заболевания отмечена
у больных СКВ. При СКВ повышение рТМ отражает повреждение микросо-
судов, характерное для этого заболевания, ассоциируется с различ ием антифо-
сфолипидного синдрома. Исследование рТМ позволяло дифференцировать
активность СКВ от сопутствующей инфекции, на фоне которой изменения
уровня рТМ не отмечено. При гранулематозе Вегенера уровень рТМ коррели-
рует с активностью заболевания и тяжестью поражения внутренних органов.
По нашим данным наиболее существенное увеличение уровня рТМ наблюда-
ется при гигантоклеточном артериите, классическом узелковом полиартерии-
те?, артериите Такаясу, в то время как при системных некротизирующих васку-
литах и геморрагическом васкулите существенное увеличение уровня рТМ на-
блюдается редко.
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ
245
2. Фактор Виллебранда (ФВ)
ФВ - мультимерный гликопротеин с молекулярной массой 220 kDa, присут-
ствующий в плазме, мегакариоцитах, в сс-гранулах тромбоцитов и в тельцах
Weibcl-Palade ЭК. иРНК ФВ вначале транслирует синтез пре-про-ФВ, кото-
рый затем подвергается расщеплению в про-ФВ. Про-ФВ за счет дисульфид-
ных связей образует мультимерные формы различного размера. В дальней-
шем эти молекулы в процессе посттрансляционной модификации превраща-
ются в нативные молекулы, которые и секретируются в плазму и субэндоте-
лий. Наличие субэндотелиального депо ФВ является одним из важнейших ус-
ловий, обеспечивающих эффективную адгезию тромбоцитов и гемостаз в слу-
чае повреждения эндотелиального слоя сосудов. Увеличение высвобождения
ФВ in vitro отмечается в ответ на воздействия различных стимулов, включая
механическую травму, карболовый эфир, тромбин, фибрин, эндотоксин, гиста-
мин, ИЛ-1, ИФ-g, мембраноатакующий комплекс комплемента, окислитель-
ный стресс, аФЛ, антитела к ДНК. По данным экспериментальных исследова-
ний в куль гуре ЭК in vitro, в начальных стадиях пролиферации ЭК синтез ФВ
в пределах нормы. Повреждение эндотелия сопровождается зависимым от до-
зы угнетением выработки ФВАг. В последующем, при постановлении струк-
тур клетки, синтез ФВ вновь возрастает. По-видимому, сходные механизмы, а
также высвобождение ФВ из депо в тромбоцитах в процессе их активации и
агрегации, наблюдаются при васкулитах и васкулопатиях. ФВ участвует в ад-
гезии тромбоцитов к субэндогелию в зоне сосудистого повреждения. Он обес-
печивает связь между тромбоцитарным мембранным гликопротеином
GPIIb/IIla и субэндотелиальными молекулами (коллаген типа I и III и гепаран-
сульфат), способствует активации фактора VIII тромбином и вызывает агре-
гацию тромбоцитов. Основываясь на характере гистологических изменений,
выявляемых при некротизирующих васкулитах, предполагается, что одной из
основных причин повышения уровня ФВ в плазме является деструкция ЭК и,
вероятно, субэндотелия и/или регенерация ЭК.
Метод определения. Для определение антигенного компонента (ФВ Аг)
используют ИФМ. Ход исследования. В лунки микроплат из полистирола до-
бавляют по 100 мкл кроличьей моноспецифической антисыворотки к ВФАг в
концентрации 1 мкг/мл (разведение 1:1000) в карбонат-бикарбонатном буфе-
ре и инкубируют в течении 16 ч при 4°С. Затем отмывают 3 раза PBS (0Д5М.
pH 7,2), содержащим 0,05% Twccn-20 (PBS-Tween). Исследуемые сыворотки
разводят 1:400 в PBS-Tween и добавляю'!’ в лунки по 100 мкл. Затем микропла-
ты инкубируют в течении 1 ч при 37°С, отмывают 3 раза PBS-Tween и добав-
ляют по 100 мкл кроличьих антител к ФВАг, меченных пероксидазой (разве-
дение 1:1000). После часовой инкубации микроплаты отмывают 3 раза PBS-
Twccn. добавляют субстратную смесь (ОФД с перекисью водорода). После ос-
тановки реакции определяют ОП на автоматическом фотометре. Для количе-
ственного определения ФВАг используют стандарт ФВАг в концентрации от
0,0625 до 4,0 Ш/мл. Чувствительность метода 0,01 IU/мл. Верхняя граница
нормы 2,0 IU/мл.
Клиническое значение. 1 Товышенис уровня ФВАг в сыворотке обнаруже-
но у больных с различными заболеваниями сосудов как воспалительной, так и
невоспалительной природы, таких как преэклампсия, инфаркт миокарда, ин-
*46 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
сульт, сахарный диабет, первичная легочная гипертензия, на фоне некоторых
инфекций (включая ВИЧ инфекцию). Наиболее существенное увеличение ча-
стоты повышения и уровня ФВАг наблюдается при системных некротизирую-
щих васкулитах, в меньшей степени при гигантоклеточном артериите, артери-
те Такаясу и облитерирующем тромбоангиите. При кожных васкулитах увели-
чения уровня ФВАг наблюдается редко. При узелковом полиартериите увели-
чение уровня ФВАг ассоциируется с патологией почек. Увеличение концент-
рации ФВАг при болезни Бехчета ассоциируются с развитием сосудистых ос-
ложнений, в основном венозными тромбозами. При гигантоклеточном артери-
те концентрация ФВАг (в отличии от СОЭ и СРБ) не коррелирует с актив-
ностью и практически нс меняется на фоне эффективной противовоспали-
тельной терапии. Полагают, что увеличение уровня ФВАг у больных аутоим-
мунными заболеваниями в период ремиссии может быть связано или с субкли-
нически текущим сосудистым воспалением, которое наблюдается при этом за-
болевании в течении нескольких лет в отсутствие клинических симптомов или
отражает неоваскуляризацию в зоне воспалительной инфильтрации сосуди-
стой стенки. При РА уровень ФВАг коррелирует с системными проявления-
ми, в первую очередь кожным васкулитом и риском тромботических осложне-
ний. При болезни Шегрена увеличение ФВАг ассоциируется с синдромом Рей-
но и криоглобулинемическим васкулитом. Увеличение концентрации ФВАг
при РА может отражать повреждение ЭК, связанное с ишемией-реперфузией
на фоне физической активности. У больных СКВ увеличение ФВАг ассоции-
руется с васкулитом, поражением почек и тромботическими нарушениями в
рамках АФС. При ДМ/ПМ увеличение концентрации ФВАг чаще наблюдает-
ся у больных с системными проявлениями (феномен Рейно, ИЗЛ). Кроме то-
го, уровень ФВАг коррелирует (в отличии от СОЭ и СРБ) с выраженностью
мышечной слабости. Результаты динамического определения свидетельству-
ют о том. что увеличение ФВАг наблюдается на фоне обострения болезни.
При ССД увеличение уровня ФВАг отражает тяжесть и распространенность
поражения висцеральных органов, и выраженность периферического вазос-
пазма при первичном феномене Рейно. Увеличение уровня ФВАг отмечено у
больных, имеющих факторы риска атеросклероза, включая гиперхолестери-
немию, артериальную гипертензию (АГ) и избыточный вес и ассоциируется с
неблагоприятным прогнозом (повторный ИМ) у больных ишемической болез-
нью сердца. Определение ФВАг имеет значение для оценки тяжести и распро-
страненности повреждения сосудов. Персистирующее увеличение уровня
ФВАг является прогностически неблагоприятным фактором, ассоциирую-
щимся с увеличением риска смерти как у больных с атеросклеротическим по-
ражением сосудов, так и системными васкулитами.
Литература. Баранов А.А., Насонов Е.Л., Шилкина Н.П. и соавт. Антиген
фак гора Виллебранда у больных ревматоидным васкулитом: метод определе-
ния и клиническое значение. Терапевт, архив 1993; 4. 69-72. Насонов Е.Л., Са-
ложин К.В., Штутман В.З., и соавт. Антитела к эндотелию, тромбомодулин и
антиген фактора Виллебранда при полимиозите и дерматомиозите. Клин.ме-
дицина 1996; 74 (6), 32-34.
МЕТОДЫ
КЛИНИЧЕСКОЙ
ПАРАЗИТОЛОГИИ
ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Протозойные инфекции и глистные инвазии в большинстве случаев проте-
кают без патогномоничных симптомов и признаков и не могут быть диагнос ти-
рованы только на основе их клиники. Клинические данные в совокупности с
данными географического и эпидемиологического анамнеза позволяют леча-
щему врачу поставить предположительный диагноз, но только результаты ла-
бораторных исследований подтверждают или отвергаю'!’ этот диагноз.
Паразитологическая диагностика основывается на прямом обнаружении
и идентификации возбудителей. Иногда прибегают к иммунологическим ис-
следованиям, культивированию паразитов или заражению ими лабораторных
животных (метод биопроб). Использование любых методов паразитологиче-
ской диагностики должно преследовать также цель выявления смешанных
(двойных и более) инфскций/инвазий, что обозначается как полипаразитизм.
При обследовании студентов-иностранцев, выходцев из стран Юго Восточной
Азии, у них удавалось выявить одновременно до 6-8 и более видов паразитов.
Не меньшую ценность представляет умение выяви ть и идентифицировать па-
разита у пациентов-паразитоносителей, способствуя вторичной профилактике
паразитарного заболевания. Методы паразитологической диагностики неоце-
нимы при осуществлении лекарственного мониторинга и контроля за эффек-
тивностью хи м иотерапи и.
В материале, направляемом на исследование в лабораторию, паразит быва-
ет представлен в тех стадиях, с помощью которых он передается (непосредст-
венно или через переносчика) от инфицированного индивида окружающим
людям. Обычно это пропагативные стадии паразита цисты простейших, яйца
или личинки гельминтов. Эти, а у простейших и другие (трофозоиты, гамето-
циты) стадии, являются одновременно и диагностическими. Продуктивность
работы лаборанта зависит от качества микроскопа. Последний должен быть
по возможности, бинокулярным и находиться в личном пользовании лаборан-
та. Микроскоп должен быть снабжен микрометром, важным вспомогатель-
ным инструментом при идентификации патогенов.
Эффективность паразитологических исследований не является абсолют-
ной и зависит от ряда условий: а) правильности взятия пробы и приготовления
из нее препарата для микроскопии, бережности транспортировки и хранения;
б) компетентности исследования лаборантом препаратов, приготовленных из
проб; в) своевременности передачи результатов исследования лечащему вра-
чу; г) грамотной интерпретации этих результатов лечащим врачом и адекват-
ным использованием их для выбора тактики лечения. При несоблюдении лю-
бого из этих условий эффективность паразитологического исследования сни-
жается или полностью сводится на нет. Более того, ложноотрицательный ре-
246 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
сульт, сахарный диабет, первичная легочная гипертензия, на фоне некоторых
инфекций (включая ВИ1! инфекцию). Наиболее существенное увеличение ча-
стоты повышения и уровня ФВАг наблюдается при системных некротизирую-
щих васкулитах, в меньшей степени при гигантоклеточном артериите, артери-
те Такаясу и облитерирующем тромбоангиите. При кожных васкулитах увели-
чения уровня ФВАг наблюдается редко. При узелковом полиартериите увели-
чение уровня ФВАг ассоциируется с патологией почек. Увеличение концент-
рации ФВАг при болезни Бехчета ассоциируются с развитием сосудистых ос-
ложнений, в основном венозными тромбозами. При гигантоклеточном артери-
ите концентрация ФВАг (в отличии от СОЭ и СРБ) не коррелирует с актив-
ностью и практически не меняется на фоне эффективной противовоспали-
тельном терапии. Полагают, что увеличение уровня ФВАг у больных аутоим-
мунными заболеваниями в период ремиссии может быть связано или с субкли-
нически текущим сосудистым воспалением, которое наблюдается при этом за-
болевании в течении нескольких лет в отсутствие клинических симптомов или
отражает неоваскуляризацию в зоне воспалительной инфильтрации сосуди-
стой стенки. При РА уровень ФВАг коррелирует с системными проявления-
ми, в первую очередь кожным васкулитом и риском тромботических осложне-
ний. При болезни Шегрена увеличение ФВАг ассоциируется с синдромом Рей-
но и криоглобулинемическим васкулитом. Увеличение концентрации ФВАг
при РА может отражать повреждение ЭК, связанное с ишемией-реперфузией
на фоне физической активности. У больных СКВ увеличение ФВАг ассоции-
руется с васкулитом, поражением почек и тромботическими нарушениями в
рамках АФС. При ДМ/ПМ увеличение концентрации ФВАг чаще наблюдает-
ся у больных с системными проявлениями (феномен Рейно, ИЗ Л). Кроме то-
го, уровень ФВАг коррелирует (в отличии от СОЭ и СРБ) с выраженностью
мышечной слабости. Результаты динамического определения свидетельству-
ют о том, что увеличение ФВАг наблюдается на фоне обострения болезни.
При ССД увеличение уровня ФВАг отражает тяжесть и распространенность
поражения висцеральных органов, и выраженность периферического вазос-
лазма при первичном феномене Рейно. Увеличение уровня ФВАг отмечено у
больных, имеющих факторы риска атеросклероза, включая гиперхолестери-
немию, артериальную гипертензию (АГ) и избыточный вес и ассоциируется с
неблагоприятным прогнозом (повторный ИМ) у больных ишемической болез-
нью сердца. Определение ФВАг имеет значение для оценки тяжести и распро-
страненности повреждения сосудов. Персистирующее увеличение уровня
ФВАг является прогностически неблагоприятным фактором, ассоциирую-
щимся с увеличением риска смерти как у больных с атеросклеротическим по-
ражением сосудов, так и системными васкулитами.
Литература. Баранов А.А., Насонов Е.Л., Шилкина Н.П. и соавт. Антиген
фактора Виллебранда у больных ревматоидным васкулитом: метод определе-
ния и клиническое значение. Терапевт, архив 1993; 4, 69-72. Насонов Е.Л., Са-
ложин К.В., Штутман В.З.. и соавт. Антитела к эндотелию, тромбомодулин и
антиген фактора Виллебранда при поли миозите и дерматомиозите. Клин.ме-
дицина 1996; 74 (6), 32-34.
248
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
зультат исследования или неоправданная задержка с передачей положительно-
го результата лечащему врачу нередко становились причиной фатальных ис-
ходов болезни (например, при тропической малярии, трихинеллезе).
Паразитологическая диагностика требует от лаборанта и лечащего врача
базисных знаний о паразитах: их жизненных циклов, географического распро-
странения, характерных проявлений инфицированности или болезни. Эффек-
тивность клинической лабораторной диагностики в огромной степени опреде-
ляется наличием тесных профессиональных контактов между врачом-лабо-
рантом и лечащим врачом.
Только отсутствием таких контактов и взаимопонимания можно объяснить
распространенную форму направления в лабораторию: «анализ кала на гли-
сты» по поводу наличия у пациента эозинофилии. Высокая эозинофилия мо-
жет быть следствием не столько обитания взрослых гельминтов в кишечнике,
сколько миграцией по органам и тканям организма личинок некоторых видов
гельминтов (аскариды, токсокары и др,), что устанавливается не копроовоско-
пией, а серологическими методами.
Следует также помнить, что паразиты могу г вызывать различные другие
патологические реакции еще в тот период, когда их диагностические стадии
недоступны для прямого обнаружения лаборантом. Так, мигрирующие личин-
ки Ascaris lunibricoidcs и юные описторхи вызывают симптомы заболевания за
много недель до возможности диагноза этих инвазий путем обнаружения яиц
паразита в фекалиях. В этом смысл применения иммунологических методов
диагностики при инвазиях с длительным препатентным периодом (описторхоз,
фасциолез, парагонимоз и др.).
Другой тип показаний к иммунодиагностике паразитарных болезней - те
инфекции/инвазии при которых невозможно добыть материал для исследова-
ния неинвазивными способами на протяжении всего периода заболевания (то-
ксоплазмоз, токсокароз, эхинококкоз и др.).
Лечащим врачам и лаборантам нашей страны одинаково необходим мини-
мум знаний по тропическим завозным паразитарным болезням. В их диагно-
стике роль лабораторной диагностики незаменима.
Методы паразитологических исследований относительно простые, нс тре-
буют сложного и дорогостоящего оборудования, однако, это не снижает их ди-
агностической ценности и необходимости профессиональной подготовки ла-
боранта.
Очень важно правильно интерпретировать результаты лабораторных ис-
следований. Достоверное обнаружение и уверенная идентификация пато> сна
позволяют считать результат лабораторного исследования как достоверно по-
ложительный. Аналогично, надежно установленное отсутствие патогена в ис-
следуемом материале считается достоверно негативным. Ложные результаты
определяются иногда непрофессионализмом лаборанта-исследователя или его
недостаточной внимательностью. Однако, значительно чаше эффективность
исследования определяется чувствительностью метода исследования и его
специфичностью. Эти понятия получили широкое распространение в сероло-
гических исследованиях, при которых они отражают качество применяемых
тес г-систем. В тоже время, эти понятия вполне применимы (хотя на практике
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
249
не всегда учитываются) также к микроскопическим исследованиям. Напри-
мер, хорошо известно, что при диагностике малярии чувствительность иссле-
дования методом толстой капли в 20-40 раз больше, чем исследования мето-
дом тонкого мазка. Несмотря на это, чувствительность метода толстой капли,
проводимого по стандартам ВОЗ (исследование минимум 100 полей зрения в
течение минимум 5 минут) все же не превышает 95% из-за неравномерности
распределения малярийных паразитов в крови, особенно при низкой паразите-
мии. Специфичность методов микроскопического исследования также не аб-
солютна по другим причинам, в частности, из-за возможности ошибочной
идентификации паразита из-за симулирующих его артефактов.
Частой причиной недостаточной эффективности метода микроскопии на
наличие цист простейших или яиц гельминтов является непостоянство их вы-
хода с фекалиями. Этим объясняется требование повторных (обычно, трех-
кратных, с перерывом 1-3 дня) обследований пациента при кишечных инвази-
ях и инфекциях.
Важным путем повышения чувствительности многих методов исследова-
ния бесспорно являются способы концентрации патогенов с помощью различ-
ных процедур с исследуемой пробой (осаждение или флотация при исследова-
нии кала и фильтрация через миллипоровые фильтры (кровь, моча. СМЖ)).
В общем, следует считаться с тем, что в действительности не существует
методов лабораторной паразитологической диагностики со 100% чувстви-
тельностью или 100% специфичностью.
Из опыта известно, что методы с высокой чувствительное гыо могут быть
полезными при скрининговых обследованиях (например, внутрибольничные
вспышки). Отрицательные результаты обследования при этом будут с надеж-
ностью исключать инфицированное!!» данным патогеном, а положительные
надо будет исследовать более специфичным методом дабы исключить ложно-
положительные результаты.
В любом случае, доверие к положительному результату паразитологиче-
ского исследования возрастет, если лаборант помимо вида обнаруженного па-
тогена укажет также его стадии и количество в поле зрения или объеме иссле-
дуемого материала (в мкл крови, в г фекалий и т.д.).
При анализе и интерпретации результатов серологической диагностики
следует считаться с явлением «иммунологической» инкубации, т.е. появлени-
ем антител или формированием кожной реакции на антигены паразита лишь
через определенный латентный период, в течение которого антитела применя-
емым методом еще нс определяются, а кожная проба еще не стала положи-
тельной. Иллюстрацией важности грамотной интерпретации результатов им-
мунологического обследования пациента ня токсоплазмоз может служить таб-
лица 1.
250
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ TEXI ЮЛОГИИ
Таблица I
Интерпретация результатов иммунологического обследования пациен-
та на токсоплазменную инфекцию (по Лысенко А. Я., 1995)
Метод исследования
Кожная проба с
токсопл азм и ном
Результат
Серологическое
исследование на
антитоксоплазмен-
ныс IgG
Серологическое
исследование на
антитоксоплаз-
менные IgM
низкие титры
(низкая концен-
трация в МЕ/мкл)
высокие титры
(высокие пока-
затели в МЕ/мкл)
положительный
у новорожденного
положительный у
детей и взрослых
Интерпретация
пациент инфицирован
(указаний на сроки
заражения и характер
течения инфекции
КП не дает)
инфекция отсутствует или
заражение произошло лишь
4-6 нед. назад
токсоплазмоноси тель-
ство или субклиническая
хроническая инфекция
острая инфекция,
клинические проявления
обусловлены
токсоплазмозом
врожденный токсоппазмоз
свежая токсоплазменная
инфекция или рецидив
Следует помнить также о возможности перекрестных серологических ре-
акции при некоторых паразитарных заболеваниях (токсокароз, описторхоз и др.).
МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ, ОБРАБОТКИ И
ИССЛЕДОВАНИЯ ПРЕПАРАТОВ
1.	Кровь
Кровь - жидкая ткань организма, в компонентах которой могут паразити-
ровать простейшие (малярийные плазмодии, трипаносомы, лейшмании, бабе-
зии) и гельминты (филярии, шистосомы). Для некоторых из них кровь явля-
ется основным местом обитания и они составляют группу кровепаразитов.
Гаковы малярийные плазмодии, бабезии, паразитирующие в эритроцитах и
трипаносомы, возбудители сонной болезни, оби тающие в плазме крови. Лейш-
мании - возбудители висцерального лейшманиоза и токсоплазмы обитают
главным образом в тканевых макрофа! ах и в кровеносном русле появляются
редко. Что касается гельминтов, то одни из них, взрослые шистосомы, посто-
янно живут в венозных сосудах, отрождая здесь яйца. Но эти последние сразу
же покидают русло крови и концентрируются в кишечнике или мочевом пузы-
ре. Для их обнаружения исследуется не кровь, а фекалии или моча (см. разде-
лы 5 и 7). Своеобразна связь с кровью и другой группы гельминтов - филяри-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОМ ПАРАЗИТОЛОГИИ
251

ид. Взрослые филярии живут в лимфатических сосудах, а отрождаемые ими
личинки (микрофилярии) проникают в кровеносное русло и длительно пере-
живают в плазме.
Для обнаружения «кровепаразитов» исследуют цельную кровь, приготав-
ливая из нее «тонкий мазок» или «толстую каплю», реже подвергая ее центри-
фугированию или фильтрации. Эти препараты исследуют в нативном (на три-
паносомы и микрофилярии) или в окрашенном виде.
Препараты из крови для микроскопии готовят обычно на предметных сте-
клах, от их качества и чистоты в огромной степени зависит эффективность об-
наружения и идентификации кровепаразитов.
Сыворотка и плазма крови исследуется также в серологических реакциях с
целью обнаружения противопаразитарных специфических антител.
1.1* Малярийные плазмодии
Малярийные плазмодии - наиболее широко распространенные и неизменно
патогенные представители кровепаразитов-простейших. Малярийную инфек-
цию у человека вызывают 4 вида рода Plasmodium: P.falciparum, P.vivax,
P.malariac и P.ovale. Первый вызывает злокачественно протекающую тропиче-
скую малярию, нередко заканчивающуюся летально, остальные, соответст-
венно, грехдневную, четырехдневную и овалс-малярию, отличающиеся отно-
сительно доброкачественным течением.
/./.I. Биология малярийных паразитов. Малярийные плазмодии парази-
тируют поочередно в двух хозяевах: в организме самки комара рода Anopheles,
в котором осуществляется половое размножение, спорогония, и в организме
человека - бесполое размножение, шизогония. Начальная фаза шизогонии
происходит в печеночных клетках, гепатоцитах (экзоэритроцитарная шизого-
ния), последующая - в кровяном русле, в эри троцитах (эритроцитарная шизо-
гония). Развиваясь в эритроцитах, плазмодии питаются гемоглобином и разру-
шают пораженные эритроциты. Все патологические проявления малярии (ли-
хорадочные приступы, анемия, спленомегалия, поражение ЦНС при 'тропиче-
ской форме малярии) целиком связаны с эритроцитарной шизогонией (ЭШ).
1,	1.2. Лабораторный диагноз малярии основывается на обнаружении в
препарате крови больного любых стадий плазмодиев, развивающихся в эрит-
роцитах: трофозоитов (молодых и взрослых), шизонтов (незрелых и зре-
лых), а также половых форм, гаметоцитов (мужских и женских). При этом
следует учитывать важные отличия ЭШ у различных видов плазмодиев.
1)	У P.falciparum цикл ЭШ начинается в периферическом русле крови, за-
канчивается в центральном русле, вследствие задержки пораженных эритро-
цитов в узких капиллярах внутренних органов (мозг, плацента и др.). По этой
причине в начале инфекции лаборант в препаратах крови видит только моло-
дые трофозоиты («кольца»). Гаметоциты также созревают в капиллярах вну-
тренних органов и впервые выплывают в периферическое русло только с ГО-
12 дня болезни. Обнаружение в периферической крови взрослых трофозоитов
или любого возраста шизонтов свидетельствует о начале злокачественного
течения тропической малярии и близком летальном исходе, если лечащим вра-
чом не будут приняты неотложные меры. При других видовых формах мал я-
252 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
рии ЭШ протекает целиком в периферическом русле.
2)	Неоценимое дифференциально-диагностическое значение имеет форма
гаметоцитов у P.falciparum (рис.1 А) - они не круглые, как у других видов плаз-
модиев, а продолговатые («полулунные», «банано-, сосискообразные»), Они
отличаются также выраженным долгожитием: отмирают в течение 2-4-6 не-
дель (у других видов плазмодиев - в течение 1-3 суток). Поэтому обнаружение
гаметоцитов P.falciparum в течение многих дней после излечения больного
(т.е. прекращения ЭШ) благодаря действию шизонтицидных препаратов - яв-
ление обычное, оно не является показателем неэффективности лечения.
3)	Пикл ЭШ повторяется у P.falciparum, P.vivax и P.ovale каждые 48 часов,
у P.malariae - 72 часа (3 суток). Малярийные приступы наступают на той фазе
цикла ЭШ. когда основная масса пораженных эритроцитов разрушается и вы-
шедшие из них дочерние особи плазмодиев (мерозоиты) инвазируют свежие
красные кровяные клетки, т.е. через два дня на третий или через три дня на
четвертый. В межприступном (безлихорадочном) периоде в крови при всех
формах малярии кроме тропической преобладают взрослые трофозоиты и
шизонты, так что тс или иные стадии плазмодиев присутствуют в крови по-
стоянно, вплоть до полного прекращения ЭШ. Поэтому расхожая рекоменда-
ция «взять кровь на высоте приступа» отражает лишь профессиональную не-
грамотность медработника.
LL3. Методы исследования. Ведущим, а часто единственным методом
диагностики малярии является паразитологический. В особых случаях (напри-
мер, при необходимости выявить донора, заразившего малярией реципиента)
применяются серологические методы (РИФ, ИФА).
Принцип паразитологического метода заключается в микроскопии препа-
ратов крови - тонкого мазка и толстой капли. Объем исследуемой крови в тол-
стой капле в 20-40 раз больше, чем в тонком мазке, в связи с чем положитель-
ный ответ можно дать после исследования мазка, а отрицательный - только
после исследования толстой капли с иммерсионным объективом в течение ми-
нимум 5 минут, с просмотром не менее 100 полей зрения (стандарт ВОЗ).
Реактивы и оборудование', смесь Никифорова, коммерческий маточный и
рабочий раствор краски Романовского-Гимза, чистые предметные стекла мос-
тик или контейнер для окраски с гекол, микроскоп.
Приготовление препаратов крови - важная процедура, предопределяющая
эффективность микроскопической диагностики малярии.
Тонкий мазок готовят также, как для исследования морфологии эритроци-
тов (см. стр. 16).
Толстая капля готовится двумя способами: 1) к капле крови на месте про-
кола (на пальце, мочке уха) прикасаются предметным стеклом и круговыми
движениями его распределяют каплю до диаметра 15-20 мм; целесообразно
нанести на предметное стекло 2 капли, а также штрих крови между ними для
маркировки; 2) на предметном стекле готовят вначале мазок несколько толще
обычного, затем, пока он еще не высох, на него наносят 1 или 2 капли крови,
которые спонтанно растекаются равномерными дисками. Маркируют препа-
рат на свободном участке мазка. Высыхать толстые капли должны постепен-
но. без подогрева, в условиях зашиты их от повреждения насекомыми.
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОМ ПАРАЗИТОЛОГИИ
253
Окраска препаратов крови проводится 3-5% рабочим раствором краски
Романовского-Гимза. Разные серии коммерческих маточных растворов краски
могут значительно различаться по содержанию азура. Используют 2 способа
проверки содержания азура: 1) пробная окраска мазков и толстых капель на
яркость вишнево-красного цвета в ядрах лейкоцитов или ядрах малярийных
паразитов; 2)эксгракция азура хлороформом или эфиром: в пробирку с 10 мл
рабочего раствора краски добавляют 3 мл хлороформа или эфира, содержи-
мое встряхивают и отмечают изменение цвета экстрагирующего вещества.
При недостаточной концентрации азура, хлороформ (или эфир) приобретают
слабый фиолетово-розовый цвет. К такой краске рекомендуется добавить зре-
лую краску Мэнсона из расчета 1-2 капли на 10 мл. Рабочий раствор краски
Романовского-Гимза следует готовить на буферной воде с pH 7,2. Для этого
смешивают два основных раствора фосфатных солей:
1) Na2HPO4 безводный - 9,5 г на 1 л дистиллированной воды (или Na2HPO4
кристаллический - 23,7 г на 1 л воды); 2) КН2РО4 - 9,07 г на 1 л дистиллиро-
ванной воды. Растворы хранят отдельно и готовят из них буферную воду, сме-
шивая 73 мл Na2HPO4 и 27 мл КН2РО4 с 900 мл дистиллированной воды. Рас-
творы фосфатных солей и буферную воду хранят в посуде с притертой проб-
кой в бытовом холодильнике.
Процедуру окраски проводят в стеклянных кюветах (бачках) с вертикаль-
ными гнездами для предметных стекол, а при их отсутствие - на мостиках из
двух параллельных стеклянных палочек, соединенных попарно резиновыми
трубочками. Толстые капли окрашивают в течение 15-30 мин, тонкие мазки -
40-45 мин. После окраски препараты тщательно промываются под слабой
струей воды. Нужно соблюдать осторожность при промывке толстых капель,
так как при попадании сильной струи воды капли могут оторваться от стекла
и препарат придет в негодность.
1.1.4. Порядок и цели исследования препаратов крови. При первом об-
следовании больного, подозрительного на малярию, готовят тонкий мазок и
толстую каплю (лучше 2 капли на основе мазка). Вначале исследуют тонкий
мазок, а затем толстую каплю. Имеется 2 единые цели и 1 особая, касающая-
ся тропической формы малярии. Первая цель - установить наличие малярий-
ных плазмодиев в препаратах, вторая - идентификация их до вида; особая цель
- определение интенсивности паразитсмии.
Обнаружение плазмодиев. При высокой паразитемии наличие возбудителя
малярии достаточно достоверно устанавливается при исследовании тонкого
мазка. Однако и в этом случае целесообразно исследовать также толстую ка-
плю, что может помочь обнаружить микст-инфекцию (случаи ее нередки у
африканцев). Установлено, что исследование 2 капель в течение 2,5 мин на ка-
ждую более продуктивно, чем исследование одной в течение 5 мин. При отри-
цательном результате просмотра тонкого мазка, исследование толстой капли
становится абсолютно обязательным. Профессионализм лаборанта-микро-
скописта в диагностике малярии определяется его умением исследовать не
тонкий мазок, а именно толстую каплю. Доказательством наличия малярийно-
го плазмодия служит находка даже одного паразита на любой стадии развития.
Однако, следует с осторожностью относиться к находке единственного обра
зования. похожего на кольцевидного трофозоита в толстой капле, гак как
внешний вид этой стадии паразита может быть симулирован случайным соче-
254 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
танисм постороннего азур- и эозинофильного материала. При малейшем со-
мнении кровь пациента должна быть взята и исследована повторно.
Видовая идентификация плазмодиев обязательна, а в случае P.falciparum
абсолютно необходима. Морфология плазмодиев различных видов в тонком
мазке (в таком препарате их естественная форма практически полностью со-
хранена) и в толстой капле (форма резко изменена в процессе дегемоглобини-
зации при окраске нефиксированной пробы крови) представлена на рис.1 А, Б,
В, Г. В практической работе можно пользовать также определителем, разра-
ботанным А. Е. Беляевым.
Определитель возбудителей малярии*
а)	в тонком мазке;
1.	Образование, лежащее на фоне эритроцита, с одним или несколькими
ядрами розового, вишневого или рубинового цвета, с цитоплазмой голубого
или синего цвета	Plasmodium spp.
2.	Имеются только кольцевидные трофозоиты (кольца) и (или) полулун-
ные гаметоциты	P.falciparum
Имеются также более крупные трофозоиты и (или) шизонты 3
3.	Пораженные эритроциты такого же или меньшего диаметра, чем непо-
раженные. Зернистость отсутствует. Трофозоиты компактные
P.malariae
— Пораженные эритроциты увеличены, имеется зернистость	4
4.	Зернистость мелкая и очень обильная. Трофозоиты обычно с ясновыра-
женными псевдоподиями. Ядра относительно мелкие	P.vivax
— Зернистосч ь относительно крупная и редкая. Трофозоиты компактные.
Ядра крупные	P.ovale
б)	в толстой капле:
1.	Образование мельче сегментоядерного лейкоцита, имеющее одно или
несколько ядер (обычно розового, вишневого или рубинового цвета) и цито-
плазму (обычно голубого или синего цвета)	Plasmodium spp.
2.	Имеются только кольцевидные трофозоиты (кольца) и (или) полулун-
ные гаметоциты	P.falciparum
— Имеются также более крупные трофозоиты и (или) шизонты 3
3.	Трофозоиты неправильной формы и часто разорваны на мелкие фраг-
менты. Часто присутствуют остатки пораженных эритроцитов розового цвета
P.vivax
— Трофозоиты компактные и никогда не разрываются на мелкие фраг-
менты	4
4.	Обычно имеются остатки пораженных эритроцитов розового цвета. Яд-
ра крупные	P.ovale
Остатков пораженных эритроцитов нс наблюдается. Ядра мелкие
P.malariae
* Определитель построен по принципу обычных биологических определителей. Два
утверждения, объединенные в одном пункте, взаимно исключают друг друга. Для по-
становки диагноза сначала решают, является ли данное образование малярийным пара-
зитом (пункт 1). При положительном решении переходят к пункту 2 и выбирают одно
из двух утверждений. Если в конце выбранного утверждения стоит название видя — это
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
255
и есть искомый диагноз, если цифра — это указание, к какому пункту определителя
следует перейти. Процесс повторяют, пока не дойдут до названия вида.
Примечание: при редко встречающейся у людей в России протозойной инфекции
зоонозного происхождения, бабезиозе, в препаратах крови обнаруживаются внутри-
эритронитарныс паразиты сходные по своей форме с кольцевидными трофозоитами
P.falciparum. Важная отличительная черта бабезиоза - заболевание развивается только
у лиц с удаленной селезенкой.
Определение интенсивности паразитемии при обнаружении P.falciparum
- чрезвычайно важная информация для лечащего врача при выборе им такти-
ки лечения, оценке его эффективности, а также прогноза заболевания. Доста-
точно точный метод сводиться к подсче ту среднего числа паразитов на одно
поле зрения толстой капли. Если паразитов много, то подсче т ведут в 10 п.зр.,
если мало в 100. Численность указывают отдельно для обнаруженных стадий
паразита, например, P.falciparum кольца +++, гаметоциты +. Применительно к
численности колец ВОЗ рекомендованы следующие символы:
1-10 в 100 п.зр. =	+
1-10 в 10 п.зр. =	++
1-10 в п.зр. =	+++
более 10 в п.зр. =	++++
более 100 в п.зр. =	-Н--Н-+
Лаборанты с высоким уровнем подготовки применяют более точный ме-
тод, а именно, подсчитывают численность паразитов по отношению к числу
лейкоцитов. Например, в толстой капле на 100 лейкоцитов найдено 20 парази-
тов. Допуская, что у больного 4000 лейкоцитов в 1 мкл крови, легко установить:
в исследованных полях зрения - 100 лейкоцитов и 20 паразитов
в 1 мкл	имеется 4000 лейкоцитов и X паразитов
Следовательно, в 1 мкл: 4000x20/100=800 паразитов. Подсчет будет еще
более точным, если в формулу ввести конкретное, а не предположительное
число лейкоцитов у данного пациента. При очень высокой паразитемии ее ин-
тенсивность может быть охарактеризована числом паразитов на 100 эритро-
цитов, подсчитанных в тонком мазке.
1.1.5. Дефекты приготовления и окраски препаратов крови и способы
их устранения:
1)	Отрыв толстой капли от предметного стекла может произойти до окра-
ски (капля была слишком толстой) или во время промывки стекла после ок-
раски (струя воды была очень сильной). Дефект неустраним, обследование па-
циента надлежит повторить.
2)	Толстая капля зафиксировалась из-за близости паров спирта или огня.
Дефект неустраним, препарат следует приготовить заново.
3)	Окрашенные мазок и толстая капля имеют бледно голубой или зелено-
ватый цвет. Причина: некачественная краска или раствор ее готовился на ще-
лочной воде (рис.2). Дефект исправим: препараты погружают в 96° спирт до
полного обесцвечивания и затем окрашивают качественной краской как фик-
сированные тонкие мазки
4)	В препарате обнаруживаются бактерии, i рибы, рас тигельные клетки.
Они могут попасть на препарат из загрязненной воды или из воздуха и симули-
256 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ровать различные сталии развития плазмодиев (рис.З). Иногда приходится ис-
следовать другой препарат, используя для разведения краски чистую воду.
Примечание: положительные препараты необходимо хранить для возможного кон-
троля экспертом правильности диагностики, а также в целях использования их в даль-
нейшем для учебных целей.
1.2.	Трипаносомы
Trypanosoma gambiense и T.rhodesiense вызывают, соответственно, антро-
понозную и зоонозную формы африканского трипаносомоза или сонной бо-
лезни. Методы их лабораторной диагностики весьма непростые, но чрезвы-
чайно важны, так как вызываемые ими инфекции потенциально детальны.
1.2.1.	Биология паразитов. Трипаносомы - жгутиковые простейшие, раз-
виваются поочередно в двух хозяевах: мухе це-це (переносчик) и организме
человека или диких животных, обитающих в Африке. По форме они крайне
полиморфны, размеры колеблются в пределах 14-33 х 1,5-3,5 мкм. T.gambiensc
и T.rhodesiense микроскопически не различимы. Основные элементы с трое-
ния: тело удлиненное, ядро по середине, в задней части находится небольшой
кинетопласт, вдоль клетки расположена ундулирующая мембрана, передняя
часть которой заканчивается жгутиком.
На месте укуса мухи цс-це трипаносомы размножаются, образуется трипа-
носомный шанкр, отсюда по лимфатическим и кровеносным сосудам паразит
разносится по органам и тканям, поражая в основном РЭС и ЦНС.
Трипаносомы обитают в плазме крови (и других биологических жидко-
стях), в клетки не проникают.
1.2.2.	Лабораторный диагноз основывается на микроскопии крови, а так-
же аспиратов лимфатических узлов (см. раздел 4), костного мозга (см. раздел
2), СМЖ (см. раздел 3). В специализированных лабораториях проводятся био-
пробы на животных и применяются иммунологические методы.
1.2.3.	Методы исследования крови основываются на обнаружении в ок-
рашенных по Романовскому препаратах крови трипаносом. Паразиты находят-
ся в крови на ранней стадии инфекции. Из-за обычно низкой паразитемии эф-
фективность исследования тонкого мазка или толстой капли недостаточно вы-
сока и потому рекомендуются методы концентрации паразитов.
Микрогематокритный метод концентрации трипаносом несложен и дос-
тупен в исполнении Необходимо иметь капиллярную трубку, микрогематок-
ритную центрифугу, 2% раствор натрия лимоннокислою, клейкую лонгу' и
пластилин Из пальца после прокола наносят 2 капли крови на предметное сте-
кло и прибавляют в каждую по 1 капле раствора лимоннокислого натрия. Пе-
ремешивают и наполняют на 3/4 капиллярную трубку. Откры тый конец труб-
ки закрывают пластилином, центрифугируют в микрогематокритной центри-
фуге в течение 4 мин. Кладут трубку на предметное стекло и закрепляют ее
липкой лентой. Под малым увеличением микроскопа (10х) исследуют участок
между эритроцитами и плазмой. Для лучшего распознавания мелких извиваю
щихся объектов используют длиннофокусный объектив 25х.
1.2.4.	Идентификация трипаносом до вида не возможна, достаточно убе-
диться в том, что в окрашенных препаратах среди эритроцитов видны харак-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
257
терные по форме и длине, а также по размеру кинетопласта жгутиковые обра-
зования - трипаносомы (рис.4).
1.3.	Лейшмании
Лейшмании - группа жгутиковых простейших. вызывающих различные
формы лейшманиозов. В крови могу г обнаруживаться только висцеротроп-
ные лейшмании, возбудители висцеральных лейшманиозов. Наиболее часто
завозимый в РФ паразит этой группы - Leishmania infantum, распространен не
только в странах дальнего зарубежья (Франция. Испания, 1 Тортугалия, Ита-
лия). но также в южных республиках СНГ (Таджикистан, Туркмения, Узбеки-
стан, Казахстан, Грузия, Азербайджан). Средиземноморско-среднеазиатский
(детский) висцеральный лейшманиоз - тяжелая протозойная инфекция, закан-
чивающаяся без лечения смертельным исходом.
1.3.1.	Биология возбудителя. L.infanlum паразитирует поочередно в двух
хозяевах - моските-переносчике, в котором происходит бесполое размноже-
ние. и в организме шакала, лисицы или человека, вызывая генерализованный
ретикулогистиоцитоз. В моските лейшмании представлена жгутиковой фор-
мой (промастигота), в клетках РЭС она безжгутиковая (амастигота). Амасти-
гота имеет овальную или круглую форму размером 3-5 х 1-3 мкм с круглым
ядром размером 0,7-0,8 мкм. В цитоплазме можно видеть кинетотаст округ-
лой или палочковидной формы. Лейшмании - внутриклеточные паразиты, раз-
множаются простым делением.
На месте укуса москита формируется воспалительный бугорок, из которо-
го размножившиеся лейшмании разносятся затем по органам и тканям, лока-
лизуясь в селезенке, костном мозге и крови. У большинства инфицированных
взрослых лейшманийная инфекция протекает бессимптомно. Висцеральный
лейшманиоз (ВЛ) как болезнь развивается у детей младшего возраста с недо-
статочно сформировавшимся или супрессированным иммунитетом.
1.3.2.	Лабораторный диагноз основывается на обнаружении амастигот в
пунктате лимфатических узлов (см. раздел 4). селезенки или чаше - аспирате
костного мозга (см, раздел 2). Из-за слабой паразитемии Leishmania infantum
в крови обнаружить трудно: с большим постоянством они выявляются в кро-
ки ВИЧ-инфицированных, на фоне иммунодефицита. Применяются также
культуральный и иммунологический методы диагностики.
1.3.3.	Методы исследования крови. 1Три невозможности получить аспи-
рат костного мозга, альтернативный метод обнаружения лейшмании - иссле-
дование препаратов крови.
Готовят и окрашивают гонкий мазок и толстую каплю крови также, как
описано в разделе 1.1.3. Исследование этих препаратов позволяет выявить
лейшмании в 50% случаев ко-инфекпии ВЛ/СПИД.
Примечание: Буферная вода для приготовления рабочего раствора краски Рома
невского-Гимза должна иметь pH 6,8 (не 7.2, как при окраске малярийных плазмодиев).
Проводят процедуру лейкоцитоконцентрации (см. раздел 2.3.1.) и исследу-
ют окрашенный препарат из лейкоцитной пленки. Эффективность по ко-ин-
фскпии ВЛ/СПИД - 70-75%. Метод доступен и позволяет получить ответ до-
статочно быстро.
258 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
1.3.4.	Идентификация лейшмании. Препараты исследуют под иммерси-
ей, лейшмании в них располагаются обычно вне клеток, но нередко они обна-
руживаются в цитоплазме мононуклеаров и нейтрофильных лейкоцитов; чис-
ло лейшмании в одной клетке может достигать нескольких десятков. Они име-
ют форму мелких овальных или круглых телец размером от 2,5 до 5 мкм. Ци-
топлазма окрашивается в серовато-голубой, ядро в красный или красно-фио-
летовый, кинетопласт - в темно-фиолетовый цвет. Наличие ядре) и кинетопла-
ста - главный признак, отличающий лейшманию от тромбоцитов, кокков,
дрожжевых клеток (см. рис.6).
1.4.	Микрофилярии
Большая группа тропических гельминтов - филярии вызывают у человека
8 нозоформ филяриидозов. Взрослые паразиты обитают в различных органах
и тканях и недоступны для идентификации. Объектом паразитологической ди-
агностики являются отрождаемые филяриями личинки - микрофилярии, кон-
центрирующиеся в крови (6 видов) или коже (2 вида). Переносчиками филя-
рий являются различные виды насекомых, заражающиеся микрофиляриями
при кровососании.
1.4.1.	Биология микрофилярии. На вид достаточно примитивные, змее-
видные по форме организмы, тело которых заполнено множеством клеток с
ядрами. Многие виды личинок находятся в оболочке, называемой чехлик. У
некоторых видов чехлик выступает над головной и хвостовой частью тела.
Микрофилярии, попав в кровь (или кожу) пребывают в ней длительно, до за-
хвата их насекомым или до отмирания. Микрофилярии взрослых паразитов,
обитающих в лимфатических сосудах, выходят в периферическое русло крови
только в ночное время, переходя на дневное время в центральное русло.
1	4.2. Лабораторный диагноз основывается на обнаружении (в опреде-
ленное время суток) и идентификации микрофилярий в препаратах крови.
1.4.3.	Методы исследования. Микрофилярии, появляющихся в перифе-
рической крови, обнаруживают одним из 3 методов: исследованием толстой
капли, фильтрацией крови через мембранный фильтр, концентрацией гемоли-
зированной венозной крови.
Толстая капля готовится из крови, получаемой из пальца, объем ее должен
составлять 20, а лучше 60 мкл. Дать препарату высохнуть в течение 12 или 48
часов. Провести дегемоглобинизацию. поместив препарат на 3-5 мин в водо-
проводную или дистиллированную воду. Тщательно высушить на воздухе, по-
местить в этиловый спирт на 30-60 с и вновь высушить. Поместить зафикси-
рованный препарат в раствор краски Романовского-Гимза с pH 6,8-7.2 на 20-
45 мин в зависимости от концентрации рабочего раствора. Промыть препарат
в течение 3-5 мин в буферной воде, высушить стекло в вертикальном положе-
нии Дезали строения микрофилярий более четко просматриваются при окра-
ске по Гайденгайну.
Концентрация микрофилярий путем фильтрации крови через мембран-
ный фильтр проводится для определения обилия микрофилярии в крови, ре-
же с целью обнаружения и идентификации (при слабой интенсивности микро-
филярисмии). Используют миллипоровый (целлюлозный) или нуклсопоро-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
259
вый (поликарбонатный) фильтр. Необходимое оборудование и реагенты: 20-
мл шприц, держатель фильтра, набор фильтров (25 мм в диаметре, пористое гь
3-5 мкм), 3,8% раствор цитрата натрия. 1 мл свежей цельной крови с антико-
агулянтом пропускают под давлением поршня шприца через держатель с
фильтром. Наполнить шприц водой или физраствором и промыть фильтр от
остатков крови. С помощью шприца продуть камеру воздухом. Вынуть
фильтр, помес тить его на предметное стекло, нанести каплю физраствора, на-
крыть покровным стеклом и исследовать в нативном виде; можно зафиксиро-
вать фильтр в спирте, высушить и окрасить по Романовском у-Гимза (см. так-
же раздел 1.1.3).
Концентрация микрофилярий по методу Knott. Метод очень чувствителен
и недорог. Беру г из вены 1 мл крови и помещают се в центрифужную пробир-
ку с 10 мл 2% формалина. Энергично встряхивают, эритроциты лизируются.
Центрифугируют пробирку при 300 об/мин в течение 2 мин. Удаляют суперна-
тант, осадок исследуют под покровным стеклом при малом увеличении микро-
скопа. Из оставшейся порции осадка готовят толстую каплю на предметном
стекле, тщательно высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимза.
1.4.4.	Идентификация микрофилярий. В нативных препаратах устанав-
ливается наличие микрофилярий по их характерной подвижности. Видовая
идентификация проводи гея по препаратам, окрашенным по Романовскому-
Гимза или, предпочтительнее, по Гайденгайну. Основные маркеры: наличие
чехлика, расположение ядер, форма хвостовой части, размер (рис.5).
2.	Костный мозг
Костный мозг поражает единственный вид паразитов - простейшее
Lcishmania infanturn (см раздел 1.3). Как и в других органах (селезенке, пече-
ни) лейиимании паразитируют внутриклеточно, в клетках РЭС. Исследование
КМ - основной метод паразитологической диагностики висцерального лейш-
маниоза.
2.1.	Сбор пробы КМ проводится путем аспирации его с помощью шприца
из грудины, передне-верхнего гребня подвздошной кости или из эпифиза боль-
шеберцовой кости (у детей до 3 лет).
2.2.	Приготовление и окраска препаратов. Полученный аспират немед-
ленно переносят на чистые обезжиренные предметные стекла и аккуратно го-
товят тонкие мазки, нс разрушая клетки. Мазки быстро высушивают на возду-
хе или с помощью фена. На высохшем мазке хорошо видны жировые пустоты
и это свидетельствует, что мазок сделан из КМ, а не из крови. Мазки красят
ся по Романовскому-Гимза, аналогично тонким мазкам крови (см. раздел
1.1.3).
2.3.	Идентификация леишмании требует определенных знаний Амасгп
гот лейшманий в препарате, как правило, мало, находятся чаще вне клеток.
Они мелкие, имеют округлую и удлиненную форму длиной 3-5 мкм, шириной
1-3 мкм. Цитоплазма окрашена в голубой цвет, ядро в красно-фиолетовый. Ря-
дом с ядром находится кинетопласт - палочковидное образование, окрашенное
более интенсивно, чем ядро (рис.6). Исследование КМ даст положительный
результат в 90-92% случаев (несколько менее эффективно, чем исследование
ядра
без чехлика
I
в крови
в коже
с чехликом
ядра расположены
до кончика
хвостовой части
без чехлика
без чехлика
хвостовая часть хвостовая часть
утолщена с 2 четко без утолщений,
видимыми ядрами, длина головной
длина головной части части равна
в 2 раза больше ее ширине
 I
ядра не доходят
до кончика
хвостовой части,
длина головной
части равна
ее ширине
ядра расположены
до кончика
хвостовой части,
хвостовая часть
закруглена
—II--------
ядра не доходят
до кончика
хвостовой части,
личинка мелкая,
тонкая
ядра расположены
до кончика
хвостовой части,
личинка мелкая,
тонкая,
с хвостовой частью
в виде крючка
Brugia
malayi
Loa loa
Wuchoreria
bancrofti
Manscnolla
penmans
Mansoneta
ozzardr
Mansonaila
stiaptocerca
“"I
ядра не доходят
до кончика
хвостовой части,
личинка толстая
Onchocerca
volvulus
260	Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Рис. 5. Морфология и отличительные признаки микрофилярий, обнаруживаемых у человека
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
261
аспирата селезенки, но более - чем биоптата лимфатических узлов).
3.	Спинномозговая жидкость
Спинномозговая жидкость (СМЖ) - жидкая среда, циркулирующая в желу-
дочках мозга и между мягкой и паутинной мозговыми оболочками. СМЖ по-
лучают путем поясничной, субокципитальной или желудочковой пункции. Ко-
личество жидкости, извлекаемой без вреда для больного составляет 8-10 мл. В
связи с содержанием в СМЖ цитотоксических веществ, разрушающе действу-
ющих на клеточный состав, СМЖ должна доставляться в лабораторию немед-
ленно после ее получения!
При макроскопическом исследовании СМЖ обращают внимание на ее цвет
и прозрачность: нормальная жидкость бесцветна, не отличаясь от водопровод-
ной воды, прозрачна. В нормальной СМЖ содержится небольшое количество
белка (0.12-0,2 г/л) и клеток (1-2 кл/мкл). Увеличение количества клеток (ци-
тоз) и изменение их состава может свидетельствовать об определенных забо-
леваниях, в том числе паразитарной этиологии. Так, обнаружение в СМЖ лим-
фоидного плеоцитоза с наличием гистиоцитов, макрофагов или эозинофиль-
ных гранулоцитов с большой долей вероятности может свидетельствовать о
цистицеркозе головного мозга. Еще более очевидным для постановки диагно-
за паразитарного заболевания ЦНС является непосредственное обнаружение
возбудителя в СМЖ. Наиболее постоянно в СМЖ обнаруживаются трипано-
сомы (см. раздел 3), редко - токсоплазма. акантамсба. неглерия, а гак же гель-
минты трихинелла, стронгилоид и эхинококк.
3.1.	Трипаносомы в СМЖ появляются на поздней стадии инфекции, когда
возникают симптомы поражения ЦНС. С целью их обнаружения готовят на-
тивный мазок из осадка СМЖ после ее центрифугирования. 1 Толученную по-
средством поясничного прокола СМЖ центрифугируют в течение 10 мин при
900 об/мин. Переливают надосадочную жидкость и сохраняют ее для других
анализов. Ресуспсндируют осадок в небольшом количестве СМЖ. оставшейся
на дне пробирки, постукивая по последней пальцем. Наносят каплю ресуспсн-
дированного осадка СМЖ на чистое, сухое предметное стекло. Сразу же на-
крывают ее покровным стеклом Ждут несколько минут до прекращения кон-
векционных потоков. Исследуют препарат под малым и большим увеличени-
ем, для подтверждения наличия живых трипаносом просматривают весь пре-
парат, начиная с краев, поскольку трипаносомы часто концен грируются по са-
мому краю препарата. Из осадка может быть приготовлен мазок, который фи
ксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза (см. раздел 1.2).
3.2.	Токсоплазма в СМЖ может быть иногда обнаружена у больных с ост-
рым токсоплазмозом. Исследуют препарат из осадка СМЖ после центрифуги-
рования. 11ри окраске по Романовскому-Гимза цитоплазма приобретает синий
цвет, ядро - темно-красный. Токсоплазма сохраняет полулунную форму, один
конец ее заострен, другой закруглен. Размеры небольшие, 3x7 мкм.
3.3.	Трихинелла на стадии личинки иногда проникает в СМЖ, в частности
у больных с тяжелым течением трихинеллеза. 5-15 мл СМЖ ценз рифугируют
в течение 5 мин при 1000 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость и исследу-
ют осадок непосредственно на наличие трихинелл под малым увеличением ми-
кроскопа.
262
Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
3.4.	Акантамеба и неглерия - свободноживущис простейшие, способные
при проникновении их в мозг (чаще всего при попадании их вместе с водой в
носовые полости) вызвать гранулематозный энцефалит и острый менингоэн-
цефалит.
3.4.1.	Лабораторная диагностика достаточно сложная, однако значение ее
трудно переоценить, учитывая, что поражение ЦНС акантамебой и неглсрией
заканчивается в большинстве случаев летально. Диагностика основывается на
обнаружении этих сапрофитичсских амеб в нативных или окрашенных препа-
ратах СМЖ. Применяются также культуральные методы.
3.4.2.	Окраска препаратов по ГимЬа-Райшу. Готовят тонкий мазок, фикси-
руют в метиловом спирте 1 мин, высушивают, погружают 6 раз в забуферен-
ный раствор эозина, снимают остаток краски фильтровальной бумагой, погру-
жают 6 раз в забуференный раствор триазина, снимают' остаток краски, спо-
ласкивают 6 раз, погружая в водопроводную воду. Высушивают промоканием
и исследуют под иммерсионным объективом. Результат: трофозоиты и цисты
пурпурного цвета.
3.4.3.	Окраска трихромовым красителем - см. раздел 8.
3.4.4.	Культивирование. Акантамебы культивируют на среде Culberston, на
которой они хорошо размножаются. Подготовительная процедура:
1)	Готовят раствор неомицина сульфата - 0,56% на стерильной дистилли-
рованной воде.
2)	Готовят суспензию нистатина в дистиллированной воде, содержащую
1500 ЕД/мл.
3)	Отдельно готовят агар: 3 гбакто-агара на 100 мл 1,7% NaCl.
4)	Применяют суспензию Aerobacter aerogenes в трипсинизированном со-
евом бульоне, при этом могут быть использованы как живые, так и убитые ба-
ктерии (5 мл суспензии живых бактерии помещают в закрывающуюся колбу,
нагревают на водяной бане до 65°С в течение 30 мин, затем хранят в заморо-
женном виде до использования).
Приготовление среды: смешивают 5 мл каждого антибактериального рас-
твора, добавляют 5 мл суспензии с убитыми бактериями и 85 мл стерильной
дистиллированной воды. Прибавляют 100 мл расплавленного и остуженного
3% агара, все ингредиенты смешивают при 56°С на водяной бане. Приготов-
ленную смесь разливают по чашкам Петри по 8 мл в каждую чашку. На центр
чашки опускают 0,05 мл суспензии живых Aerobacter aerogenes и распределя-
ют их в виде зоны 25-40 мм в диаметре. Поверхность чашки высушивают при
комнатной температуре или 4°С в течение ночи.
Внесение исследуемого материала: капельку СМЖ бережно наносят на
поверхность среды в центре Засевают 2 чашки, одну из них инкубируют при
37°С, другую при 22°С. Во избежание высыхания среды, чашки герметизиру-
ют липкой лентой. Стедят за ростом амеб вокруг местонахождения исследуе-
мого материала в течение 2-3 дней. Для идентификации амеб наблюдают за од-
ним из трофозоитов, выясняя наличие мгновенно появляющейся и исчезаю-
щей сократи тельной вакуоли. Наличием вакуоли акантамеба отличается от ар-
тефактов. Через 2-3 дня начинается цистообразован ие. Когда все трофозоиты
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
263
(из-за исчерпания питательных вещее ги) инцистируются. цисты группируют-
ся кучками: для неопытного исследователя они представляются кристаллами.
Из культуры также можно приготовить препараты для микроскопирования.
Для этого на поверхность среды накладывается стерильное предметное стек-
ло и прилипшие к нему амебы фиксируются и окрашиваются (см.выше).
При подозрении на неглериоз также применяется культуральное исследо-
вание с применением модифицированной среды Нельсона.
Она готовится добавлением следующих ингредиентов в солевой раствор
Пейджа:
а)	0,1 % печеночного экстракта;
б)	ОД % раствора глюкозы.
Автоклавируют оба компонента. К этой смеси добавляют 0,5 мл 5% бычь-
ей сыворотки, инактивированной при 56°С в течение 30 мин.
Раствор Пейджа:
0,016 мМ MgSO4 х 7 Н2О........... 0,4	мг%
0,027м М СаС12 х 2 Н2О................ 0,4	мг%
1,00 мМ Na2HPO4................. 14,2	мг%
1,00 мМ КН2РО4........................13,6	мг%
2,00 мМ NaCl.................... 12,0	мг%
99,0 мл дистиллированной воды
Каждую соль растворяют отдельно в 10 мл дистиллированной воды. Рабо-
чий раствор готовят смешением 1 мл каждого солевого раствора с дистилли-
рованной водой, доводя общий объем до 10 мл.
Инкубируют пробирку при 35-37°С. Осматривают через 24 часа с целью
обнаружения цист амеб и трофозоитов.
3.4.5.	Идентификация: существует довольно простой метод дифференци-
ации акантамебы от неглсрии. При добавлении в культуру дистиллированной
волы в случае нахождения в культуре неглерий, появляются жгутиковые амебы.
4.	Лимфатические узлы
В увеличенных лимфатических узлах могут быть обнаружены лейшмании
и трипаносомы. Наличие в Л У токсоплазм может быть подтверждено только
биопробами на мышах.
4.1.	Сбор проб проводится путем биопсии ЛУ инъекционной мглой Во-
шедшие в отверстие иглы клетки и жидкость выдавливают пустым шприцем
непосредственно на предметное стекло или в каплю физраствора на нем.
4.2.	Приготовление и анализ препаратов. В целью обнаружения лейшма-
ний готовят тонкий мазок, подвергаемый фиксации и окраске по Романовско
му-Гимза. Наличие трипаносом можно определить по их подвижности но
влажном препарате и поэтому бион таг из Л У вносят в каплю физраствора на
предметном стекле, покрывают ее покровным стеклом и внимательно иссле-
дуют под большим увеличением, памятуя, что трипаносомы на некоторое вре-
мя могут исчезать из поля зрения, укрываясь под слоями клеток.
4.3.	Результат: эффективность исследования аспирата лимфоузла на пали
чие лейшмании существенно ниже, чем КМ (70-75%). Трипаносомы в увели
264
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ченных шейных лимфоузлах на ранней стадии инфекции выявляются чаще,
чем в крови.
4.4.	Идентификация лейшмании - см. раздел 2.3. Трипаносомы обращают
на себя внимание энергичными движениями, их размер (20 мкм в длину) пре-
вышает размер клеток в биоптате.
5.	Фекалии
Фекалии - самый обильный и сложный по составу экскрет человеческого
организма. В нем при исследовании обнаруживаются пропагативные стадии
практически всего множества паразитов и других симбионтов, обитающих в
пищеварительном тракте. Обитателей пищеварительного тракта обычно объ-
единяют в две группы: "простейшие кишечника и кишечные гельминты". В
группу простейших кишечника включают не только патогенные виды, но так-
же нспатогенныс. морфологически иногда трудно отличимые от патогенных.
Знание их необходимо для дифференциальной диагностики паразитарных ин-
фекций. С фекалиями выделяются также яйца ряда гельминтов, взрослые осо-
би которых обитают вне кишечника, например, парагонима, обитающего в
респираторном трак тс и кишечной и японской шистосомы, локализующихся в
мезентериальной венозной системе. В итоге, в фекалиях могут быть обнару-
жены вегетативные стадии и цисты более 20 видов простейших и яйца и личин-
ки многих видов гельмин тов, наиболее часто обнаруживаемые из них на тер-
ритории РФ представлены в таблице 2.
Вероятность наличия и обнаружения паразитологических объектов в про-
бах фекалий в значительной степени определяется консистенцией стула. Веге-
тативные стадии простейших обнаруживаются обычно в жидких или мягких
фекалиях и практически никогда - в оформленном стуле. Наоборот, цисты
простейших в неоформленном стуле присутствуют крайне редко, за исключе-
нием тех случаев, когда жидкие фекалии получены после очистительной клиз-
мы: при этом в пробе могут быть обнаружены как вегетативные стадии, так и
цисты. Обычно же цисты обнаруживаются только в оформленном стуле. Яй-
ца гельминтов могут быть найдены как в жидком, так и в оформленном стуле,
однако в сильно разведенных фекалиях они обнаруживаются нс всегда из-за
малого их числа в пробе.
I (а результаты исследования стула сильно влияет срок поступления и хра-
нения материала в лаборатории. При подозрении на амебную дизентерию фе-
калии на исследование должны поступить немедленно (нс позже получаса) по-
сле дефекации, в теплом виде. В пробе из теплых фекалий сохраняются и об-
наруживаются вегетативные стадии и других амеб и жгутиковых. Вероятность
обнаружения вегетативных стадий простейших достаточно велика и в том слу-
чае, если пробы свежих фекалий после их взятия или поступления в лаборато-
рию помещаются в консервирующую жидкость (см. ниже). Пробы оформлен-
ных фека лий возможно по исследования хранить в течение 3-4 часов в холо-
дильнике при 4°С или поместить в консервирующую жидкость.
5.1.	Макроскопические методы исследования
Макроскопические методы исследования направлены на поиск взрослых
особей гельминтов (например, остриц, аскарид) или их фрагментов (сколек-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
265
сов, члеников и части стробилы цестод). Применяются два метода: метод от-
мучивания и метод отстаивания.
Таблица 2
Паразиты и другие симбионты пищеварительного тракта
Простейшие
Диагностические Гельминты
стадии
Диагностические
стадии
А. Патогенные
Balantidium coli - балантидий Т, Ц* Ancylostoma duodcnale - Я
анкилостома
Blastocystis hominis - бластоциста	Т, Ц
Cryptosporidium parvum -	О
криптоспоридий
Cyclospora caetanensis - циклоспора О
Dientamocba fragilis - диэнтамсба	Т
Entamoeba histolytica -	Т, Ц
энтамеба дизентерийная
Isospora belli - кокцидия кишечная О
Lamblia intcstinalis - лямблия	Т, Ц
Sacrocystis bovihominis -	О
саркоциста бычья
Sacrocystis suihominis -	О
саркоциста свиная
Б. Непатогенные
Chilomastix mesnili	Т,	Ц
Endoliinax папа	Т,	Ц,
Entamoeba coli	Т,	Ц
Entamoeba dispar	Т,	Ц
Entamoeba gingivalis	Т
Entamoeba hartmani	Т,	Ц
Fntamocba polecki	Т,	Ц
Enteromonas hominis	Т,	Ц
lodamocba butschlei	Т,	Ц
Retortamonas iniestinalis	Т,	Ц
Trichomonas hominis	Т
Trichomonas tenax	Г
Ascans lumbricoides -
аскарида
Clonorchis sinensis -
клонорх
Dicrocoelium lanceatum -
двуустка ланцетовидная
Diphillobothrium latum -
лентец широкий
Enterobius vennicularis -
острица
Fasciola hepatica -
двуустка печеночная
Fasciolopsis buski
Hymenolepis папа -
цепень карликовый
Necator americanus -
некатор
Opisthorchis felincus -
двуустка кошачья
Paragonimus westermani -
парагоним
Schistosoma japonicum -
шистосома японская
Schistosoma mansoni -
шистосома Мэнсона
Strongyloides stercoralis -
угрица кишечная
Taenia solium -
цепень свиной
Taeniarhynchus saginatus
цепень бычий
Trichocephalus trichiurus -
власоглав
Trichostrongylus spp.
Я
Я
Я
я
я
я
я
я
я
я
я
я
я
(Я), л
я,
членики
Я,
членики
Я
Я
* Т - трофозоиты (вегетативные формы): Ц - нисты: О - ооцисты; Я - яйца; Л - ли-
чинки
266
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
5.1.1.	Метод отмучивания
Простым и достаточно эффек тивным являе тся просмотр разжиженных во-
дой фекалий в фотографических кюветах или чашках Петри.
Ход исследования. Фекалии размешивают с водой до образования равно-
мерной суспензии, после чего суспензию исследуют небольшими порциями на
темном фоне в фотографических кюветах или чашках Петри. Пинцетом или
препаровальными иглами извлекают все подозрительные час тицы белого цве-
та. Образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, помещают на
предметное стекло в каплю 50% раствора глицерина или воды, покрываю!
другим предметным стеклом и исследуют подлупой, а в случае необходимости
- под микроскопом.
Идентификация обнаруженных нематод несложна: гельминты рассматри-
вают визуально (аскарида, власоглав) или под лупой (острица). Ленточных
гельминтов определяют по строению членика. Узкий длинный членик харак-
терен для бычьего и свиного цепней, короткий, плоский - для лентсна широ-
кого. Вид ленточного гельминта устанавливают по строению матки: если она
имеет форму розетки - это лентец широкий, если она имеет 20-30 боковых от-
ветвлений - это цепень бычий, если 8-12 - цепень свиной. Установить факт
полного отхождения крупных цестод после дегсльминтизации можно, исследуя
под малым увеличением узкий головной конец: наличие четырех присосок с
крючьями - свиной, без крючьев - бычий, с двумя щелями (бозриями) - лентец
широкий.
5.1.2.	Метод отстаивания
I)	Фекалии помещают в цилиндр и заливают 3-4 объемами воды.
2)	I (ерсмешивают до образования гомогенной суспензии и дают отстоять-
ся 10-15 минут.
3)	Надосадочный слой жидкости сливают.
4)	К осадку вновь добавляют 3-4 объема воды, перемешивают, дают отсто-
яться.
5)	К осадку вновь добавляют 3-4 объема воды.
6)	Перемешивают до образования гомогенной суспензии и дают отстоять-
ся 10-15 минут.
7)	Затем вновь повторяют операции, указанные в пп 3-5.
8)	Дальнейшее исследование трехкратно отмытого осадка проводиться по
методу отмучивания.
11ри макроскопическом исследовании могут быть обнаружены гельминты,
перечисленные в разделе 5.1,1, а также кровянисто-слизистые массы - важное
указание на вероятное наличие у больного амебного язвенного колита. В
этих случаях материал подлежит первоочередному микроскопическому ис-
следованию.
5.2.	Микроскопические методы исследования
Диагностические стадии паразитологических объектов могут быть обнару-
жены микроскопически в нативном мазке, приготовленном из фекалий per
se, однако чаще пробы фекалий предварительно "обрабатываются 1 с целью
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ 267
окраски или концентрации в них паразитологических объектов и приготовле-
ния препаратов для микроскопии из обогащенной части проб. Способы приго-
товления препаратов для паразитологического исследования существенно раз-
личаются в зависимости от целей анализа, некоторые из них применяются для
обнаружения лишь определенного вида паразита, другие являются одинаково
пригодными для обнаружения разных стадий и видов паразитов. Современная
паразитологическая ситуация в РФ характеризуется рядом особенностей, на-
кладывающих заметный отпечаток на работу диагностических лабораторий.
Первая - при все еще широком распространении кишечных паразитозов про-
изошло повсеместное снижение интенсивности инфекций/инвазий. Эго обсто-
ятельство требует применения максимально эффективных методов исследо-
вания проб фекалий. Вторая особенность - возрастающая частота завоза пара-
зитов кишечника из развивающихся стран Азии и Африки как иностранцами,
так и россиянами. Третья особенность - возрастающее значение в патологии
многих людей СПИД-ассоциирусмых паразитозов. Эти особенности паразито-
логической ситуации в нашей стране предопределяют необходимость измене-
ния тактики диагностической работы: любая проба фекалий, направленная в
лабораторию для паразитологического исследования, должна подвергаться
комплексному (одновременному или параллельному) исследованию на всю
группу обитателей кишечника - простейших и гельминтов, Выявление слу-
чаев смешанных инфекций/инвазий, особенно в группах риска по ВИЧ-инфек-
ции и СПИДу, становиться задачей, имеющей непосредственное отношение к
здоровью и качеству жизни людей, находящихся в группах риска. С учетом
этих положений, все методы, ранее предложенные для обнаружения отдельно
простейших или гельминтов, рассматриваются ниже объединение, с примеча-
ниями в отношении тех из них, которые предназначаются специфически для
выявления только определенных видов простейших или гельминтов.
5.2.	L Сбор, доставка и консервирование проб
Сбор проб фекалий проводи тся в сухие водонепроницаемые емкости - ба-
ночки из стекла или полимеров, парафинированные стаканчики. В них не
должно быть следов химических веществ, губительно действующих на нежные
вегетативные стадии простейших и личинки гельминтов. Пробы фекалий
должны быть свободны от мочи, поэтому их берут из подкладного судна или
горшка. Взятие проб фекалий нежелательно проводить у пациентов, прини-
мающих противопаразитарные лекарственные препараты, подвергавшихся
незадолго до обследования рентгеноскопии с применением бария или после
масляных клизм.
Доставка проб фекалий в лабораторию должна быть по возможности не-
медленной после из взятия, т.е. в теплом виде (см. выше).
Оформленные фекалии. подлежащие исследованию на яйца гельминтов и
цисты простейших могут в течение рабочего дня храниться в вытяжном шка-
фу при комнатной температуре или, предпочтительней, в холодильнике при
4°С. В случае неизбежной задержки с доставкой проб в лабораторию или не-
возможности исследования их в день дос тавки, пробы должны быть помеще-
ны в консервирующую жидкость. Применение консервантов обеспечивает по-
лучение достаточно надежных результатов при исследовании материала, дос-
тавленного с задержкой, а также возможность более равномерного распреде-
268
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
лсния нагрузки лабораторного персонала. Длительность сохранения вегета-
тивных стадий и цист простейших и яиц гельминтов в консервантах позволяет
в затруднительных для диагностики случаях переслать законсервированный
материал на консультацию в специализированную лабораторию. Такой мате-
риал, содержащий точно идентифицированные простейшие или гельминты,
может использоваться в учебных целях, а также для контроля знаний лабора-
торных работников.
Предложено много прописей консервантов, предназначенных отдельно для
яиц и личинок гельминтов, для трофозоитов и цист простейших, или тех и дру-
гих вместе. Некоторые консерванты отличаются широкой, некоторые очень
узкой избирательностью, но эта особенность их действия не всегда коррелиру-
ет с их эффективностью. Наиболее известные консерванты с различной изби-
рательностью действия приведены в таблице 3.
Таблица 3
Прописи консервантов различной избирательности действия
Название	Реагенты	Соотно- шение фекалии/ консервант	Объект и длительность сохранения
Консервант Щуренковой	-	азотнокислый натрий 0.2% раствор - 1900 мл -	раствор Люголя водный - 250 мл -	формалин 30% - 300 мл -	глицерин -	25 мл	1:1	Яйца аскариды, власоглава, анкилостоматид, лентеца широкого, цепня карликового, двуусток кошачьей, печеноч- ной. ланцетовидной, шистосомы Мснсони. онкосфер тениид, до 1 года
Жидкость Барбагалло	- поваренная соль - 8 г - формалин 30% - 30 мл - вода дистил. -	1000 ня	1:4, 1:6	То же (заливка горячим раствором)
Детергенты (моющие порошки)	коммерческие, различных фирм	1:5, 1:10	То же + яйца остриц и трихостронгилид, до б мес. + личинки строигилонда и анкилостом ид - до 10 суток
Консервант Сафаралиева	-	метиленовая синь - 0,5 г -	сернокислый цинк. 2% водный раствор - 82,5 мл -	формалин продажный - 10 мл - уксусная к-та. конц. - 5 мл енол кристал. - 2,5 г	1:3	Вегетативные и цистные формы простейших, до 1 года
Жидкость Брука и Гольмана (консервант с PVA)	-глицерин-	1.5 мл -	уксусная кислота, ледяная -	5 мл жидкость Шаудина - 93,5 мл -	поливиниловый алкоголь (порошок)	1:3	Вегетативные и цистные формы простейших, длительно
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
269
5.2.2. Способы приготовления препаратов
5.2.2.1. Нативныи (свежий неокрашенный) мазок. Он представляет со-
бой взвесь фекалий в капле воды, физраствора, либо 50% раствора глицери-
на (последний обеспечивает просветление материала, облегчая обнаружение
яиц гельминтов, и предохраняет препарат от высыхания). Важное достоинст-
во нативного мазка - возможность обнаружения помимо яиц гельминтов, так-
же вегетативных стадий простейших (иногда и их идентификация по характе-
ру движения).
Процедура приготовления. На предметное стекло наносят по 2 капли физ-
раствора. Стеклянной (деревянной) палочкой берут частички исследуемого
материала, чуть больше спичечной головки (3-5 мг) и тщательно размешива-
ют в капле жидкости. Смесь накрывают покровным стеклом так, чтобы не об-
разовывалось пузырьков воздуха. Для этого вначале касаются смеси одним
концом покровного стекла, а затем осторожно опускают его на всю каплю.
Мазок должен быть средней толщины, не слитком прозрачный, но мугность
его должна быть такой, чтобы сквозь него можно было свободно прочесть га-
зетный текст.
Микроскопическое исследование свежего мазка должно проводиться с со-
блюдением следующих правил:
1) Освещение препарата не должно быть ярким. Правильное освещение
достигается соответствующим положением конденсора, который должен быть
опущен тем больше, чем сильнее источник света. Необходимо проверить на-
личие светофильтра.
2) Препарат должен просматриваться сначала с малым увеличением мик-
роскопа, а затем с сухой системой большого увеличения. Иммерсионной сис-
темой при просмотре свежих препаратов пользуются крайне редко.
Диагностическая ценность. В нативном мазке простейшие кишечника и
их цисты бесцветны, отличаясь от фона лишь своей светопреломляемостью.
Однако очень существенно, что вегетативные стадии проявляют в препарате,
приготовленном на физрастворе, характерную для данного вида подвижность,
чем способствуют их обнаружению. В нативном мазке могут быть распознаны
гематофаги E.histolytica, цисты амеб и лямблий и яйца и личинки гельминтов
(если число их превышает 1000 в 1 г фекалий). При слабой интенсивности ин-
вазии чувствительность нативного мазка в отношении яиц гельминтов недос-
таточно высокая. В современных лабораториях диагностику простейших про-
водят параллельно по нативному мазку и мазку, обработанному раствором
Люголя, диагностику яиц гельминтов - по 6 8 нативным мазкам или по толсто-
му мазку Като (см. ниже).
5.2.2.2. Нативныи мазок, обработанный раствором Люголя предназна-
чен для обнаружения и идентификации цист простейших.
Необходимы: раствор Люголя. предметные и покровные стекла, дсревян
ные (стеклянные) палочки. Раствор Люголя готовят по различным рецептам
(таблица 4).
270	Том И - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХ! ЮЛОГИИ
Таблица 4
Рецепты приготовления раствора Люголя
Реагенты	Количество в разных рецептах		
	№1	№2	№3
Кристаллический йод	1 г	2 г	5 г
Йодистый калий	2 г	5 г	Юг
Дистиллированная вода	100 мл	100 мл	100 мл
Приготовление: сначала растворяют йодистый калий, потом добавляю!
кристаллический йод. Раствор следует хранить во флаконе из темного стекла
с притертой пробкой. Срок пригодности для работы - не более 3 недель с мо-
мента приготовления.
На предметном стекле готовят один или два нативных мазка на физраство-
ре как описано выше. Если мазок один, то его исследуют вначале в неокра-
шенном виде для выявления подвижных вегетативных стадий простейших, а
затем добавляют каплю раствора Люголя. При наличии двух мазков один ис-
следуют на наличие вегетативных стадий простейших и яиц гельминтов, дру-
гой обрабатывают раствором Люголя. В последнем случае каплю раствора на-
носят у края покровного стекла, йод при этом диффундирует в мазок, окраши-
вая его с разной интенсивностью по мере проникновения в разные участки
мазка.
Достоинство мазка, обработанного раствором Люголя - возможность обна-
ружения в цистах простейших важных морфологических деталей, невидимых
в нативном неокрашенном мазке. Вегетативные стадии простейших под влия-
нием йода быстро погибают, поэтому обработку раствором Люголя следует
всегда проводи ть после предварительного просмотра свежего нативного мазка.
Исследование препаратов, обработанных раствором Люголя производят
так же, как и свежих неокрашенных препаратов. Окрашивание цист йодом
происходит через 1-2 мин пекле приготовления Сначала весь препарат осма-
тривают с малым увеличением, при котором цисты видны в виде круг дых или
овальных резко очерченных желтовато-коричневых образований. В них изби-
рательно окрашены ядерные структуры, гликогеновые вакуоли и другие
включения. После осмотра препарата с малым увеличением его тщательно
просматривают с сухой системой большого увеличения; в редких случаях при-
ходится пользоваться иммерсионной системой.
Сопоставление всех признаков, выявляющихся после окраски йодом, поз-
воляет в значительной части случаев с достоверностью определить видовую
принадлежность обнаруженных цист.
5.2.23,	Метод толстого мазка фекалий по Като
Принцип метода - исследование на яйца гельминтов большего объема на-
вески фекалии за счет просветления мазка смесью Като.
Ход исследования. Готовят необходимые ингредиенты: целлофановые по-
кровные пластинки, 3% водный раствор малахитовой зелени, 6% водный рас-
твор фенола. Из перечисленных реагентов готовят заблаговременно смесь
Като, которую можно хранить длительно при комнатной температуре в буты-
ли с притертой пробкой. Процедура приготовления смеси: 500 мл 6% ряство-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
271
Рис. 7. Приготовление толстого мазка под
целлофановым покрытием по Като
1 - пробка резиновая; 2 - целлофановая
пленка; 3 - проба фекалий; 4 - предметное
сгекло; 5 - препарат в готовм виде
ра фенола смешивают с
50 мл глицерина и 6 мл 3%
водного раствора малахито-
вой зелени. Кусочки гидро-
фильного целлофана разме-
ром 2 х 4 см замачивают в
смеси Като на 24 часа (запас
их может храниться в посуде
со смесью длительно). На
предметное стекло наносят
комочек фекалий величиной
с горошину, покрывают за-
моченной в смеси Като цел-
лофановой пластинкой, при-
давливают резиновой проб-
кой для получения равномер-
ной толщины мазка (рис.7).
Препарат оставляют для
просветления на 1 час при
комнатной температуре.
Просветленный мазок мик-
роскопируют через целло-
фановую пленку. В толстом мазке по Като обнаруживаются яйца аскариды.
власоглава, анкилостомид, лентецов. трематод.
Одним из основных требований, обеспечивающих высокую эффективность
исследования методом толстого мазка, является строгое соблюдение опти-
мальных сроков экспозиции толстого мазка в зависимости от консистенции и
массы фекалий и температуры при которой производится просветление пре-
парата. Иногда нужно выждать 24-48 ч прежде чем препарат просветлеет.
При нарушении оптимальных сроков выдерживания толстого мазка возни-
кают явления, которые напоминают нарушения в процессе проявления фото-
пленки. При «недопроявлении» толстого мазка световой поток микроскопа
будет недостаточен для просмотра препарата - видна лишь темная масса фека-
лий; при «перепроявлении» толстый мазок будет чрезмерно прозрачен, при
этом обесцвечиваются и яйца гельминтов, что весьма затруднит, а в ряде слу-
чаен сделает невозможным их выявление.
Исследование проб фекалий в мазках любого типа не всегда достаточно
эффективно из-за низкой численности цист или яиц в исследуемом материале,
непостоянства их выделения из кишечника и других причин. Это обстоятель-
ство вынуждает проводить обследование пациента повторно и применять ме-
тоды обогащения. Без соблюдения этих условий негативный результат одно-
го анализа фекалий на простейшие и гельминты методом нативного мазка не
может считаться валидным.
Примечание: при исследовании нативного мазка под малым увеличением
очень часто можно обнаружить мелкие круглые, обычно бесцветные тельца,
которые напоминают писты энтамеб. Если при исследовании под большим
увеличением (40х) эти тельца выглядят коричневыми или желтыми - это не
272
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
цисты и их можно игнорировать. Небольшие капли жира под малым увеличе-
нием также могут напоминать цисты, однако они крайне разнообразны по раз-
меру, а под большим увеличением видна их бесе груктурность. Особо следует
подчеркнуть, что малое увеличение позволяет выявить лишь объекты, напо-
минающие трофозоиты или цисты энтамеб, идентификация их уже невозмож-
на. Подозрительные объекты должны быть центрированы и исследованы с
большим увеличением (40х).
5.3.	Методы обогащения
Эти методы основаны на концентрации яиц и личинок гельминтов или цист
простейших в пробе благодаря от делению собственно фекальных частиц и на-
коплению паразитологических объектов в препаратах. Процедуре обогащения
могут подвергаться как свежие фекалии, так и материал из консервирующих
жидкостей. Используются два способа обогащения: осаждения и флотации.
5.3.1.	Методы осаждения
Метод формалин-эфирного осаждения
Оборудование и реагенты: цент рифуга, пробирки центрифужные на 15 мл,
бутылки на 250 или 500 мл, деревянные шпатели 145 х 2;0 мм, химический ста-
кан на 25, 50 или 100 мл, 400-мкм пластиковый или металлический фильтр или
хирургическая марля, предметные с текла, покровные стекла, Пастеровские
пипетки с резиновой грушей, резиновые пробки для центрифужных пробирок,
штатив для пробирок; формалин, 10%; эфир, этилацетат или бензин; изотони-
ческий солевой раствор (0,85%, 8,5 г/л); раствор Люголя.
Ход исследования:
1.	В центрифужную пробирку с 10 мл формалина добавьте с помощью де-
ревянного шпателя 1,0-1,5 г фекалий и перемешайте до образования гомоген-
ной суспензии.
2.	Процедите суспензию через 400-мкм фильтр или два слоя влажной хи-
рургической марли прямо в другую центрифужную пробирку или в маленький
химический стакан. Марлю после использования выбросить.
3.	Добавьте к суспензии необходимое количество 10% формалина так,
чтобы общий объем составил 10 мл.
4.	Добавьте к суспензии 3 мл эфира (или этилацстата, или бензина) и тща-
тельно перемешайте, заткнув пробирку пробкой и энергично встряхивая в те-
чение 10 секунд.
5.	Удалите пробку и поместите пробирку в центрифугу; уравновесьте про-
бирки и центрифугируйте со скоростью 400-500 об/мин в течение 2-3 мин.
6.	Достаньте пробирку из центрифуги; содержимое распределилось в 4
слоя: верхний слой эфира (или этилацетата или бензина), слой жирных остат-
ков, прилипших к стенке пробирки, слой формалина и (кадок (рис.8А).
7.	Спиральным движением с помощью деревянного шпателя мягко раз-
рыхлите слой жирных остатков; выпейте верхние три слоя в одно движение и
дайте надосадочной жидкости стекать из перевернутой пробирки как минимум
в течение 5 секунд. Если операции проделаны тщательно небольшое количе-
ство остаточной жидкости со стенок пробирки стечет вниз на осадок (рис.8 Б, В).
8.	Перемешайте жидкость с осадком (иногда необходимо добавить каплю
изотонического раствора, чтобы иметь достаточно жидкости для суспендиро
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
273
вания осадка) одноразовой стеклянной пинеткой. Нанесите каплю суспензии
на предметное стекло, накройте покровным стеклом. Препарат, окрашенный
раствором Люголя, также может быть сделан (рис.8Г).
9.	Йсследуйте препарат с объективом 10х или, если необходима идентифи-
кация, с более сильным объективом микроскопа, в систематическом порядке,
так чтобы вся площадь покровного стекла была просмотрена. Когда организ-
мы или подозрительные объекты найдены, используйте большее увеличение,
чтобы детальнее изучить морфологию исследуемого объекта.
Рис. 8. Формалин-эфирный метод концентрации яиц гельминтов
А. Распределение слоев
Б. Разрыхление слоя жирных остатков
В. Пробирка с осадком и остаточной жидкостью (три верхних слоя удалены)
Г. Нанесение осадка на предметное спекло
Метод МИФ-концентрации
Готовят смесь мертиолата с формалином и глицерином:
Раствор тиомерсаля (мертиолата № 99) 1:1000	200	мл
Раствор формалина 40%	25	мл
Глицерин	5	мл
Вода дистиллированная	250	мл
274
Том И - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Смесь хранят в темной, плотно закрытой стеклянной посуде. Срок ее хра-
нения нс более 3 мес. Готовят также 5% раствор Люголя (см. рецепт № 3 таб-
лицы 4), срок его хранения не более 3-4 пед. В день исследования смешивают
смесь реактивов с раствором Люголя в пропорции 9,4 мл и 0,6 мл. соответст-
венно. В полученную смесь вносят около 2 г фекалий, тщательно их размеши-
вают. фильтруют через марлю в центрифужную пробирку, добавляют 3 мл
эфира, закрывают пробкой, энергично встряхивают в течение 30 секунд. За-
тем пробку вынимают, а пробирку центрифугируют в течение 1 мин при 1500
об/мин. Надосадочную жидкость сливают, часть осадка переносят на предмет-
ное стекло, накрывают покровным стеклом и ми крое копируют. В осадке от-
четливо видны вегетативные стадии и цисты простейших и яйца разных видов
гельминтов. Следует отметить, что данный метод (каждения является одно-
временно и методом консервации (за счет формалина) и окрашивания за счет
йода и мертиолата.
Метод Красильникова. Используется способность поверхностно-актив-
ного вещества - сульфанола, входящего в состав детергентов (стиральных по-
рошков, моющих растворов) эмульгировать фекалии до дисперсного состоя-
ния и высвобождать из фекальных масс яйца гельминтов, которые затем, не-
зависимо от удельного веса, концентрируются в осадке в процессе отстаивания
или центрифугирования.
Оборудование и реагенты: микроскоп, центрифуга, предметные стекла,
стеклянные или деревянные палочки, центрифужные пробирки или стеклян-
ные флаконы (емкостью не менее 20-30 мл) с пробкой или плотно прилегаю-
щей крышкой, пастеровские пипетки с высоко отломленным концом или сте-
клянные трубочки, покровные стекла или кусочки целлофана (см. метод тол-
стого мазка по Като, раздел 5.2.2 3), детергент. Для работы можно использо-
вать любой стиральный порошок (или жидкоегь) отечественного или зару-
бежного производства (за исключением биологически активных стиральных
порошков или паст).
Ход исследования. Фекалии (не менее 1 г) заливают раствором детерген-
та (1-4%) в соотношении 1:10. Содержимое перемешивают вручную стеклян-
ной или деревянной палочкой или механически с использованием шуттель-ап
парата (в последнем случае флаконы должны быть плотно закрыты пробкой
или крышкой) до образования гомогенной суспензии. Смесь фекалий с детер-
гентом выдерживают не менее 24 часов. Отстаивание может длиться до не-
скольких суток без ущерба для качества исследования. За это время образует-
ся слой осадка и надосадочной жидкости. Пастеровскую пипетку или стеклян-
ную трубочку, зажав сверху пальнем, вводят до дна флакона (пробирки), затем
несколько приподнимают (на 2-3 мм) и отпускают палец, зажимавший конец
пипетки (трубочки). Порция осадка заполняет часть пипетки (трубочки). За-
жимают пипетку (трубочку) сверху пальцем, извлекают из флакона (пробир-
ки) и переносят часть осадка на предметное стекло. Каплю осадка накрывают
покровным стеклом или кусочком целлофана и приготовленный препарат ис-
следуют под микроскопом Из пробы на одном стекле рекомендуется готовить
два препарата.
Анализ материала можно провести срочно, для этого фекалии смешивают
в центрифужной пробирке с раствором детергента в соотношении 1: 10 до об-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОМ ПАРАЗИТОЛО1 ИИ
275
разевания гомогенной суспензии. Смесь отстаивают в течение 30 минут. Про-
бирку плотно закрывают пробкой и встряхивают энергичными движениями
20-30 секунд. Пробирку без пробки центрифугируют в течение 5 минут при
10()0-15(М) об/мин. Из образовавшегося осадка готовят нативные препараты,
так же как из осадка, образовавшегося при отстаивании.
Результат: в осадке обнаруживаются, кроме яиц прак тически всех видов
гельминтов, также личинки стронгилоида и цисты простейших (после обра-
ботки мазка по Люголю или другими методами окрашивания).
Эффективность метода зависит от соблюдения следующих условий: 1. со-
отношение «фекалии : детергент» допускается изменять только в сторону уве-
личения количества детергента; 2. фекалии должны быть тщательно переме-
шаны в растворе детергента до образования гомогенной суспензии; 3 сбор ма-
териала должен производится непосредственно в раствор детергента; 4. препа-
раты должны готовиться только из придонного слоя осадка.
5.3,2.	Флотационные методы
Принцип: фекалии суспензируются во флотационном растворе, имеющем
больший удельный вес, чем яйца гельминтов. Последние, всплывая в поверх-
ностную пленку, могут быть обнаружены при исследовании под микроскопом.
Оборудование и реагенты: стеклянные или фарфоровые баночки объемом
50-100 мл с вертикальными стенками, предметные с текла (тщательно обезжи-
ренные), деревянные шпатели, стеклянные или деревянные палочки, флотаци-
онный раствор. 50% раствор глицерина.
Наиболее часто применяемыми флотационными жидкостями являются на-
сыщенные растворы поваренной слои по Фюллсборну (0.4 кг NaCl на 1 л во-
ды, уд.вес 1,2) или селитры по Калантарян ( I кг NaNO3 на 1 л воды, уд. вес
1,38).
Ход исследования: 2,5-5 i фекалий суспендируют в баночке с солевым рас-
твором (в соотношении 1:20). На баночку с суспензией кладут предметное сте-
кло и доливают раствор так. чтобы он коснулся его нижней поверхности.
Всплывшие яйца концентрируются на предметном стекле. Через 45 мин при
использовании раствора NaCl и через 25 мин при использовании NaNO? пред-
метное стерло снимают, быстро переворачивая от себя. Оставшуюся на нем
пленку, нанеся каплю глицерина, исследуют под микроскопом.
Результат: время экспозиции зависит от флотационной жидкости В пер-
вые 10 мин всплывают яйца анкилос тома гид и карликового цепня, до 40 50%
яиц власоглава и до 50-80% яиц аскарид. Максимальное число их выявляется
после экспозиции в 2-3 часа. Для обнаружения «тяжелых», не всплывающих
яиц трематод и пистод можно из осадка (после удаления жидкости из баночки)
приготовить дополнительно нативные мазки.
5.4.	Специальные методы
5.4.1.	Обнаружение яиц острицы на периана тьных складках
5.4.1	Л. Перианальныи соскоб
Принцип метода. Яйца гельминтов, находящиеся в перианальных кожных
складках, счищают деревянным шпателем и исследуют под микроскопом.
276
Том П - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Оборудование и реагенты. 50% раствор глицерина или 1 % раствор двууг-
лекислого натрия (NaHCO3), микроскоп, предметные и покровные стекла, де-
ревянные шпатели (можно использовать отточенные и виде шпателя спички).
Ход исследования. Соскоб с перианальных складок делают поздно вечером
или утром, до дефекации, без проведения мероприятий по личной гигиене, а у
женщин и до мочеиспускания. Соскабливание проводят осторожно, с поверх-
ности складок в окружности ануса деревянным шпателем, смоченным в 50%
растворе глицерина. На предметное стекло наносят каплю этого же раствора.
Полученный материал тщательно счищают со шпателя краем покровного сте-
кла гак, чтобы он попадал непосредственно в каплю раствора на предметном
стекле. Затем каплю накрывают тем же покровным стеклом и исследуют под
микроскопом.
Результат. В материале, помимо яиц остриц, могут быть обнаружены он-
косферы гениид и личинки Strongyloides stercoralis.
5,4.1.2.	Перианальныи отпечаток на клейкую ленту
Принцип метода. При прикосновении кусочком ленты к перианальным
складкам яйца гельминтов прилипают к ней. Лента приклеивается к предмет-
ному стеклу и просматривается под микроскопом.
Оборудование: прозрачная клейкая лента шириной нс более 20 мм, пред-
метные стекла, деревянный или металлический шпатель, ножницы, ватный
тампон, 50% раствор глицерина.
Ход исследования. Полоска липкой лепты фиксируется на конце пластико-
вой ложки или шпателя. Прижимают покрытый лептой конец ложки (шпате-
ля) к участкам кожи в нескольких местах вокруг ануса. Переносят ленту лип-
кой стороной на предметное стекло. Перед исследованием под микроскопом
приподнимают ленту и нанося т каплю иммерсионного масла под ее середину -
это улучшит прозрачность ленты.
Примечание: сбор материала следует проводить поздним вечером или рано у гром
до посещения туалета и душа
Идентификация, На липкой ленте обнаруживаются яйца остриц, иногда
также онкосферы тениид. Яйпа остриц бесцветные, оболочка 4-слойная, раз-
мер 50-60 х 20-32 мкм. В них могут быть видны личинки. Онкосферы T.solium
и T.saginatus (неразличимы) бледно-желтого или коричневого цвета.
5.4.1.З.	Периаиальный отпечаток на липкую поверхность глазных лопа-
ток (метод Б.Е.Рабиновича)
Принцип метода аналогичен методу с клейкой лентой.
Коммерческий набор для исследования состоит из стеклянных глазных ло-
паток со стержнем 3,5-5 мм, длиной 75-80 мм и диаметром плоской части 8-10
мм, уложенных в пенал; специального клея (клеол -10 г, касторовое масло
2,5 г, этиловый эфир - 5 г, этиловый спирт 96,5% - 2.5 г). Клей расфасован в
закупоренные флаконы по 20 г. Лопатки можно помещать в пенициллиновые
флаконы, закрепив их в пробке с отверстием ( удобно выдавать роди гелям для
обследования детей и родственников на дому).
Ход исследования. Лопатки стерилизуются кипячением, затем их обмаки-
вают в клей, высушивают последний на воздухе до получения прозрачной
МЕТОДЫ КЛИ11ИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ 277
клейкой пленки. Лопаткой прикасаются к перианальным складкам и затем ис-
следуют ее с обеих сторон под малым увеличением (10 х 8), уложив на кассе-
ту-держатель. Использованные лопатки кипятят в мыльном растворе и они
могут использоваться повторно.
Результат. Метод в 2-2,5 раза чувствительнее, 3-5 раз менее трудоемок и
значительно дешевле, чем метод липкой ленты.
Примечание. Методические рекомендации утверждены М3 РФ 19.09.91 г.
5.4.2.	Обнаружение личинок Strongyloides stercoral is
Выделяющиеся с фекалиями личинки стронгилоида обнаруживают, ис-
пользуя термотропизм личинок - выход их из остывающих фекалий в среду
(иоду) с более высокой температурой, чем фекалии.
5,4.2.1.	Метод Бермана. Собирают установку Бермана - на узкий конец во-
ронки надевают резиновую трубку с зажимом на конце. Воронку наливают
почти доверху теплой (45-50°С) водой и ставят в штатив. 5-10 г свежевыделен-
ных фекалий на металлический сетке помешают в воронку так, чтобы нижняя
поверхность сетки соприкасалась с жидкостью. Оставляют на 3-4 ч при ком-
натной температуре. Открывают зажим и выпускают- в центрифужную про-
бирку 10-15 мл нижнего слоя жидкости из узкого конца воронки. Центрифу-
гируют в течение 1-2 мин при 1000 об/мин. Осадок микроскопируют с целью
обнаружения подвижных личинок стронгилоида.
S.4.2.2.	Модификация метода Бермана по В.Н.Супряге (1976) позволяет
обнаруживать личинки стронгилоида не только в свежевыделенных, но и ох
лажденных фекалиях.
Ход исследования. Порцию фекалий заливают 10-15 мл воды в той же по-
суде. в которой материал доставлен в лабораторию. Через 20-30 мин эту жид-
кость сливают в пробирку. Отстаивают в течение 10-15 мин или центрифуги-
руют 1 мин при 1500 об/мин. Осадок микроскопируют. отмечая наличие под-
вижных. слабоподвижных и совсем неподвижных личинок. Последние должны
быть исследованы под большим увеличением микроскопа.
Результат. Модифицированный метод более прост в применении, не усту-
пает в эффективности оригинальному методу Бермана, не требует никакого
дополнительного оборудования. Морфология личинки S.stercoralis представле-
на на рис. 17.
5.4.2.3.	Метод Харади-Мора для видовой идентификации апкилосгомати i
Принцип метода - культивирование яиц анкилостома гид на влажной
фильтровальной бумаге с целью получения из них личинок, позволяющих
дифференцировать анкилостому от нскатора.
Ход исследования. Около 0.5 г фекалий намазывают на полоску фильтро-
вальной бумаги (размером 15 х 150 мм), составляя свободными по 20 мм с ка-
ждого конца. Полоску вставляют в пробирку, наполненную на 1/4 водой, за-
крывают ее пробкой (свободный конец полоски выходит наружу) и оставляют
на 5-6 дней при температуре 28-30°С. Затем полоску удаляют, жидкость цен-
трифугируют, осадок исследуют на наличие личинок.
Результат. По обнаруженным рабдитовидным или филяриевидным шчин-
кам определяют их видовую принадлежность. У филяриевидных личинок
278
Том Н - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
*
N.amcricanus диаметр начального отдела кишечной трубки и диаметр бульбуса
равны, у A.duodenale первый значительно меньше второго.
Примечание. Филярисвидныс личинки инвазионны и потому работать надо в рези-
новых перчатках. Полезно также перед микроскопированием прогреть воду с личинка-
ми до 60°С, ч тобы они погибли.
5.5.	Дифференциация и идентификация паразитологических объектов,
обнаруживаемых в фекалиях
В фекалиях могут быть обнаружены 20 видов Protozoa (8 патогенных и ус-
ловно-патогенных и 12 комменсалов) и 25 видов гельминтов (15 эндемичных и
10 редких или завозных).
5.5.1.	Protozoa
Простейшие кишечника обитаю! в гонких или толстых кишках в стадии
трофозоита и/или цисты (ооцисты). Многие из них комменсалы, морфологи-
чески сходные с па тогенными видами, что затрудняет дифференциацию пос-
ледних. Обитатели кишечника относятся к одной из 4-х групп: амеб, жгутико-
вых, реснитчатых и кокцидий.
5.5.1.1.	Амеба дизентерийная является возбудителем важнейшей кишеч-
ной инфекции, амебной дизентерии (амебиаза). Локализуется в толстом ки-
шечнике, выделяется в форме трофозоита (с жидкими фекалиями) и/или цис-
ты (в оформленном стуле). Так как большинство видон амеб, обитающих в ки-
шечнике, являются комменсалами, следует быть очень осмотрительными при
формулировке лабораторного диагноза. Только обнаружение трофозоитов-
гематофагов может служить свидетельством наличия у пациента
амебной дизентерии и/или амебного язвенного колита. Во всех остальных
случаях обнаружение E.histolytica-подобных трофозоитов, не содержащих
эритроцитов не является основанием для диагноза амебиаза как болезни. В
равной степени это относится и к случаям обнаружения только цист E.his-
tolytica, что характерно для здоровых цистоносителсй или реконвалесцентов.
В связи с этим, особую важность приобретает дифференциация трофозоитов
и цист E.hixlolylica от 5 других видов амеб, обитающих в кишечнике, и одного,
обитающего в ротовой полости (рис.9, 10). Как видно на рисунке 9, трофозо-
иты всех 7 видов амеб имеют 1 ядро, но различаются по наличию или отсутст-
вию периферического ядерного хроматина. Среди 5 видов с наличием перифе-
рического хрома тина в ядре у трех видов, в том числе Ehistolytica, он нежный
и равномерный, а не i рубыи и неравномерный, как у E.coli и E.polecki. Для
трофозои тов E.histolylica характерны также мелкий размер кариосомы и неж-
но гранулированная цитоплазма и, главное, наличие в ней заглоченных эрит-
роцитов. Она отличается также своим большим размером (трофозоиты-гема-
тофа! и превышают20 мкм) Обычно дифференциацию и идентификацию тро
фозоитов E.histoiytica осуществляют по влажным (нативным) препаратам,
ориентируясь на характер их движения (однонаправленное), а цист - в препа-
ратах, обработанных раствором Люголя. В таких препаратах трофозоиты по-
гибают, а окрашенные ядра и гликогеновые тельца цист хорошо видны. Для
более точной идентификации трофозоитов и цист применяют экспресс окра-
шивание препаратов буферным метиленовым синим (ВМС) или готовят по-
стоянно окрашенные препараты железным iематоксилином по Гайденгайну
либо, предпочтительнее, трихромовым красителем (рис.11, 12).
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
279
Трофозоит с 1 ядром
I---------------------------------------1
с периферическим	без периферического
ядерным хроматином	ядерного хроматина
крупные глыбки
периферического хроматине
неправильной формы;
большая кариосома;
крупнозернистая, "грязная ’
цитоплазма; фагоцитированные
бактерии и грибы,
но не эритроциты
Периферический хроматин
расположен равномерными глыбками
в виде тонкого ободка;
меленькая кариосоме;
мелкозернистая цитоплазме
размер: 10 - 25 мкм
обычно: 15 - 20 мхм
размер 15-50 мкм
обычно* 20 - 25 мкм
ядро с крупной
кариосомой
неправильной формы
I
размер: 6 - 12 мкм
обычно В 10 мкм
ядро с крупной кариосомой;
возможно наличие
ахроматичных зерен
I
размер: 8-20 мкм
обычно 12 -15 мкм
Entamoeba	Entamoeba
Endoiimax lodamoeba
polecki
coli
папа	biitschlii
содержит бактерии и
лейкоциты,
но не эритроциты
размер: 6-40 мкм
обычно: 10- 20 мкм
не содержит	эритроциты могут
эритроцитов присутствовать или отсутствовать
I	неинвазивные формы
могут содержать бактерии
I
размер: 5 -12 мкм размер; 15 - 60 мкм (комменсал)
обычно: 8-10 мкм обычно: 15 - 20 мкм
размер >20 мкм (инвазивная форма)
Entamoeba
gingivalis
Entamoeba
histolytica
Рис. 9. Алгоритм идентификации трофозоитов амеб в окрашенных
препаратах (оригинал ВОЗ)
Цисты
I-------------------------------------------------------------------1
жгутиковые;	амеба;
с фибриллами или жгутиком внутри цисты	без фибрилл или жгутиков внутри цисты
Г--------------1--------------1	I--------------------1---------------1
-рушевидной формы; в форме лимона; овальная циста;
1 ядро	1 ядро толстая стенка
I
размер 4-9 мкм
обычно 4-7 мкм
размер: 6-10 мкм
обычно: 7-9 мкм
периферический ядерный
хроматин отсутствует
имеется периферический
ядерный хроматин
Retortamonas
intestinalis
Chilomastix
mesnili
1-4 ядра
(обычно 2);
срединного тельца
нет
4 ядра;	1 ядро;
крупные кариосомы; крупная кариосома;
диффузно расположенный большая гликогеновая
гликоген	вакуоль
।
размер: 5-20 мкм
обычно: 10-12 мкм
размер: 5-10 мкм
обычно: 6-8 мкм
1,2 или
размер: 4-10 мкм
обычно: 6-8 мкм
размер: 8-19 мкм
обычно: 10-12 мкм
(незрелые цисты)
Enteromonas
hominis
Lamblia
intestinalis
размер <10 мкм размер 10-15 мкм размер 15-30 мкм
1, 2 или 4 ядра;
часто присутствует
гликоген;
хроматоидные тела
в форме винограда
размер; 5-10 мкм
обычно 6-8 мкм
2 или 4 ядра;
часто присутствуют
зерна гликогена;
хроматоидные тела
с расщепленными концами
।
незрелые цисты
размер: 10-35 мкм
обычно: 15-25 мкм
5 или более ядер;
хроматоидные тела
с расщепленными
концами
2-4 ядра
на одном конце;
имеется
срединное тельце
Entamoeba coli
lodamoeba
butschlli
Endoiimax
папа
зрелые цисты
размер: 10-35 мкм
обычно: 15-25 мкм
(незрелые цисты)
Entamoeba hartmanni
4 ядра;	4 ядра;
часто имеются зерна гликогена, хроматоидные тела
„ •ЛЕ?ма1.?ИАН|?1е тел? с закругленными концами
с закругленными концами ~ г	‘
размер: 10-20 мкм
бычно: 12-15 мк
1 ядро;
много хроматоидных тел
и/или включений
размер: 9-18 мкм
обычно: 11-15 мкм
(зрелая циста)
л •.
Entamoeba polecki
Entamoeba histolytica
1

Рис. I’). Алгоритм идентификации цист кишечных амеб и жгутиковых в окрашенных препаратах (оригинал ВОЗ)
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
281
Окраска нативных препаратов буферным метиленовым синим
Приготовление раствора БМС. 1. Раствор А (уксусная кислота): 98,8 мл
дистиллированной воды наливают в чистый флакон, прибавляют 1,2 мл ледя-
ной уксусной кислоты и хорошо перемешивают. Хранят в чистой бутыли. 2.
Раствор Б: в небольшую колбу наливают 100 мл дистиллированной воды и рас-
творяют в ней 1,6 г уксуснокислого натрия (CH3COONa). Хранят в чистой бу-
тылке. 3. Рабочий раствор (для окраски): 46,3 мл раствора А + 3,7 мл раство-
ра Б + 0,5 г метиленового синего + 50 мл дистиллированной воды. Раствор
фильтруют в чистую бутылку, закрывают пробкой и приклеивают этикетку:
«буферный метиленовый синий». Оптимальный pH - 3,6. Срок хранения не ог-
раничен.
Результат. После 5-10 минутного окрашивания мазка трофозоиты в нем
иногда сморщиваются, ядро и включения окрашиваются в темно-синий цвет,
цитоплазма в голубой. В окрашенных трофозоитах определяются перифери-
ческий ядерный хроматин, что свидетельствует о том, что обнаруженные тро-
фозоиты относятся к роду энтамеб.
Окраска трихромовым красителем облегчает идентификацию трофозо-
итов и цис т простейших кишечника, а также свободно живущих амеб (аканта-
мебы и неглерии) до вида.
Ингредиенты: ледяная уксусная кислота - 1 мл, хромотроп 2R - 0,6 г. свет-
ло-зеленый SF - 0,3 г, фосфорновольфрамовая кислота - 0,7 г.
Приготовление краски. Навеску каждой краски всыпать в 100 мл колбу,
внести в нее дополнительно кристаллы фосфорновольфрамовой кислоты,
влить ледяную уксусную кислоту, взболтать гак, чтобы кислота увлажнила
краски. Оставить на 30 мин. Влить 100 мл дистиллированной воды, тщательно
взболтать. Краска приобретает темно-пурпурный цвет. Сохранять в закрыва-
ющейся стеклянной бутыли. Краска стойкая, применяется в неразведенном виде.
Окраска препаратов. Поместить препараты, фиксированные в фиксаторе
Шаудина (лучше в PVA средней или низкой вязкости), в 70г спирт на 2 мин. До-
бавить раствор Люголя в спирт до появления цвета крепко заваренного чая.
Опустить мазки в этот раствор на 5 мин. Дважды на 1 мин погрузить в 70'
спирт. Поместить мазки на 10 мин в неразделенную зрихромовую краску. Вы-
нуть препараты, стряхнуть жидкость и опустить их в 90° подкисленный спирт
(4,5 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л 90° спирта) на 2-3 сек. Прополоскать
мазки в 95° спирте, дегидрировать в 100° спирте и ксилиле (или в смеси кар-
бол-ксилол). Нанести на предметное стекло 1-2 капли канадского бальзама и
накрыть покровным стеклом. Исследовать с иммерсионным объективом.
Результат: цитоплазма трофозоитов зеленая, ядро с кариосомой красно-
фиолетовое; оболочка цист зеленая, цитоплазма - пурпурно-зеленая (рис.11,12).
5.5.1.2.	Лямблия - единственная среди остальных 5 видов, обитающих в ки-
шечнике жгутиковых, способная при определенных условиях проявить свой
патогенный потенциал, вызывая лямблиоз.
Лабораторная диагностика лямблий не представляет больших трудно-
стей, если пользоваться определителем трофозоитов и цист жгутиковых ки-
шечника (рис. 13 и 10). У трофозоитов Lamblia intestinal is имеется 5 или более
Трофозоит
без внешнего
жгутика
с 2 или более жгутиками
2 ядра в более чем
50% трофозоитов
2 жгутика,
1 ядро
4 жгутика,
1 ядро
5 или более жгутиков,
1 или 2 ядра
размер: 5-15 мкм
обычно: 9-12 мкм
размер: 4-9 мкм
обычно: 5-7 мкм
цитостома нет
I
размер: 4-10 мкм
обычно: 7-9 мкм
с цитостомом
I
размер: 6-24 мкм
обычно-10-12 мкм
Dientamoeba
fraguis
Retortamonas
intestlnalis
Enteromonas
homlnis
5 жгутиков;
1 ядро;
с индулирующей
мембраной и
аксостилем; нет
срединных телец

4 пары жгутиков;
2 ядра;
нет индулирующей
мембраны или
аксостиля
размер: 10-20 мкм
обычно: 12-15 мкм
Chilomastix
mesnili
размер: 8-20 мкм
обычно: 10-12 мкм
Pentatrichomonas
Lamblia
282 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
homlnis
intestlnalis
Рис. 13. Алгоритм идентификации трофозоитов клишечных жгутиковых в окрашенных препаратах (оригинал ВОЗ)
Примечание: Dientamoeba fragilis и Pcntatrichomonas hominis не имеют стадии цисты
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОМ ПАРАЗИТОЛОГИИ
283
жгутиков, гак что дифференцировать их необходимо с Pentatrichomonas (син.
Trichomonas) hominis. Цисты лямблий имеют овальную форму с 2-4 ядрами,
они самые крупные среди других жгутиковых и это отличает их от наиболее
морфологически сходных цист Enteromonas hominis. Трофозоиты лямблий в
нативном мазке отличаются харак герным движением (подобно падающему ли-
сту, колеблясь то вперед, то назад). Для изучения структуры цист жгутиковых
нативный препарат обрабатывают раствором Люголя. Для детальной диффе-
ренциации мазки окрашивают трихромом (рис. 14).
Примечание: ВМС не пригоден!
5.5.1.З.	Balantidium coli - единственный патогенный представитель из
группы ресничных. Люди заболевают балантидиозом редко, заражаясь глав-
ным образом от свиней. Возбудитель обнаруживается в фекалиях в форме
трофозоитов или цист. Трофозоиты крупные, 50-200 х 40-70 мкм, очень под-
вижные. хорошо заметны в препаратах с физраствором под малым увеличени-
ем (рпс.14). Их тело покрыто короткими волосками (ресничками). Во внеш-
ней среде нс устойчивы, исследовать стул надо не позже часа после дефекации.
Диаме тр цист колеблется от 45 до 75 мкм. Как и трофозоиты, они плохо под-
даются обработке йодом, поэтому особое внимание должно быть уделено ис-
следованию нативного препарата.
5.5.1.4.	Криптоспоридий - важнейший представи тель кокцидий кишечни-
ка. Он вызывает диарею у детей младше 5-летнего возраста, однако его значе-
ние многократно возросло, как возбудителя СПИД-ассоциируемой инфекции
- криптоспоридиоза. Криптоспоридий развивается между ворсинками энтеро-
цита, проходя последовательно бесполое и половое размножение. Образовав-
шиеся ооцисты выделяются с фекалиями. Они мелкие (5-6 мкм r диаметре),
могут быть легко приняты за круглые дрожжи.
Лабораторная диагностика основана на обнаружении ооцист паразита в
фиксированном мазке фекалии. Препарат может готовиться из фекалий, пред-
варительно помешенных в консервант (Турдысва, 10% формалин, 2,5% рас-
твор бихромата калия, жидкость Барбагалло) и сохранявшихся при 4°С.
Приготовлении препарата: готовят мазок фекалий, высушивают на возду-
хе, фиксируют в смеси Никифорова 10-15 мин. Над пламенем горелки и кра-
сят по Цилю-I (ильсену.
Окраска карбол-фуксином по Цилю-Нилъсену:
Приготовление рабочего раствора карбол-фуксина: 10 г основного фукси-
на растворяют в 100 мл абсолютного спирта; 50 г фенола нагревают и раство-
ряют в небольшом количестве дистиллированной воды. После этого спирто-
вой раствор фуксина смешивают с фенолом и доводят до 1 л дистиллирован-
ной водой.
Окраска. Помещают мазки фекалий в приготовленный раствор на 5-10
мин; промывают мазки водопроводной водой и обесцвечивают в подкисленном
спирте (100 мл 95% этилового спирта + 1 мл концентрированной соляной ки
слоты) - 20-30 сек; промывают в проточной воде; докрашивают мазки в рас-
творе малахитового зеленого - 30 сек. Маточный 3% водный раствор малахи-
тового зеленого можно хранить долго, охраняя от света. Для окраски берут
1 мл маточного раствора + 100 мл глицерина + 100 мл дистиллированной во-
284
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
ды. Промывают мазки проточной водой и высушивают на воздухе.
Результат: ооцисты простейших (криптоспоридия, изоспоры, циклоспо-
ры) окрашиваются в разные оттенки ярко-красного цвета и имеют вид округ-
лых образований. Сопутствующая микрофлора окрашивается в зеленый цвет
(рис. 15). Отличительный признак ооцист криптоспоридия - наличие внутри
черных гранул.
Примечание: в красным цвет также могут окрашиваться капли жироподобных ве-
ществ, гранулы детрита. Даже при случайном сходстве по размерам эти образования
легко отличить от ооцист по отсутствию у них отчетливой оболочки и какого-либо
структурированного содержимого внутри. В сомнительных случаях применяют моди-
фикацию окраски Циля-Нильсена - уменьшают концентрацию малахитового зеленого,
что облегчает видовую идент ификацию ооцист Cryptosporidium sp., Cyclospora cacta-
nensis, Isospora belli.
В качестве альтернативного методу Циля-Нильссна применяется окраска
сафранином по Кестнеру.
Окраска сафранином по Кестнеру: 1. приготовленные мазки фекалий
фиксируют 4 мин в реагенте: 100 мл абсолютного метанола + 3 мл концентри-
рованной соляной кислоты; 2. промывают в проточной воде, 3. окрашивают 1
мин 1% водным раствором сафранина. Приготовление маточного раствора:
2,5 г сафранина О + 100 мл 95% этанола; рабочий раствор: 10 мл маточного
раствора + 90 мл дистиллированной воды. На мазок наливается краска, после
чего стекла нагревают над пламенем горелки до отхождения паров; 4. мазки
промывают проточной водой; 5. докрашивают 30 сек раствором метиленового
синего (1 г сухой краски метиленового синего соединяют с 3 г Na2HPO4 и 1 г
КН2РО4. Пестиком порошки перемешиваю!, сухую смесь можно долго хра-
нить в маркированной бутылке с плотно притертой пробкой. Для приготовле-
ния рабочего раствора 1 г смеси добавляют к 300 мл дистиллированной воды,
перемешивают на магнитной мешалке, фильтруют через фильтр и сохраняют
в стеклянной посуде в течение 2-х лет, оберегая от света); 6. промывают маз-
ки проточной водой и высушивают на воздухе.
Результат: определяются овально-круглые тельца оранжево-розового
цвета, внутри ооцисты видны 4 спорозоита, окрашенных в более темные тона.
Окраска трихромовым красителем (см. раздел 5.5.1.1) не всегда дает хо-
рошие результаты, но если ооцисты его восприняли, то в спорулированной
ооцисте легко различаются 4 спорозоита (важный дифференциально-диагно-
стический признак).
При слабой интенсивности инфекции с успехом применяют методы обога-
щения ооцист - флотацию с насыщенным раствором сахарозы (метод Scathcr),
NaCl или Zn2SO4 (331 г в 1 л воды) или форм ал ин-эфирное осаждение.
Результат: выявляемость ооцист криптоспоридия при осаждении форма-
лин-эфиром возрастала в 1,75 раз по сравнению с нативным мазком [Лысенко
А.Я., Лавдовская МВ.].
5.5.1.5-	Изоспора возбудитель изоспороза, протозойной инфекции, значе-
ние которой в патологии человека стало возрастать в связи с эпидемией
ВИЧ/СПИД.
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
285
Ооцисты Isospora belli могут быть обнаружены в нативных препаратах или
в препаратах, приготовленных из осадка фекалий, полученного методом фор-
мал ин-эфирного осаждения При обработке мазка раствором йода ядра ооцист
хорошо прокрашиваются.
Примечание. Раствор йода готовят, смешивая 10 мл раствора Люголя с 10 мл 25%
уксусной кислоты.
Результат: обнаруживаются ооцисты [.belli овальной формы, размером
32 х 16 мкм, в их центре находится неразделенная масса цитоплазмы (рис.15).
5.5.1.6.	Цик.тоспора - возбудитель циклоспороза, актуальность этой про-
тозойной инфекции возрастает в связи эпидемией ВИЧ/СПИД. В нативных
препаратах в ооцистах Cyclospora caelanensis при малом увеличении хорошо
видны многочисленные сферические тельца, а при большом увеличении -
2 спороцисты с 2 спорозоитами в каждой В окрашенных по Цилю-Нильсену
препаратах часть ооцист этого паразита может быть полностью бесцветной
или окрашенными с разной интенсивностью (рис.15). Это свойство, а также их
больший размер (8-10 мкм) служат отличительными признаками при сравне-
нии с ооцист ами криптоспоридия.
5.5.2-	Гельминты
В фекалиях могут быть обнаружены яйца и/или личинки многих видов
гельминтов, относящихся к трем классам: нематодам (круглые гельминты),
цсс годам и трематодам.
5.5.2.1.	Нематоды, обитающие в кишечнике, относятся в большинстве сво-
ем к группе геогельминтов, их пропагативные стадии (яйца, личинки) приоб-
ретают инвазивность лишь после пребывания в почве. Исключением является
острица, яйца которой инвазивны практически сразу после дефекации.
Лабораторная диагностика нематод основана на обнаружении яиц и/или
личинок в препаратах из фекалий методами, рассмотренными в разделе 5.2.
Идентификация яиц аскариды, власоглава, анкилостоматид, трихострон-
гилид, острицы и личинок кишечной угрицы проводят, ориентируясь на рис.16
и 17. Некоторую трудность может представить идентификация оплодотворен-
ных и неоплодотворенных яиц Ascaris lumbricoidcs. I [ервые имеют овальную
или круглую форму, покрыты толстой многослойной оболочкой, окрашенной
пигментами фекалий в темно желтый или коричневый цвет; вторые - удлинен-
ные по форме, покрыты грубой оболочкой с неровными зубцами, более про-
зрачны, чем оплодотворенные (видны крупные желточные клетки). Наличие
в препарате только неоплодотворенных яиц свидетельствует о низкой интен-
сивности инвазии (отсутствии самцов). Следует иметь в виду, что яйца
Ancylostoma duodenale и Nccator americanus морфологически неразличимы.
Два вида нематод-биогельминтов, возбудителей токсокароза и анизакидоза,
диагностируются иммунологическими (см. раздел 11) и гистологическими ме-
тодами (не рассматриваются).
5.S.2.2.	Цестоды - биогельминты, в их жизненном цикле участвуют живот
ные. Человек для большинства цестод является окончательным хозяином (па-
разитируют взрослые особи), для эхинококков - промежуточным (паразитиру-
ют в личиночной стадии). Взрослые стадии цестод продуцируют яйца (диагно-
стические стадии I, о наличии личиночных стадий эхинококков судят по ре-
Paragownus
wc^errvini
TnrhosJrongy.ns Asc/Vis i'jfnbftcooes
неолпсдотворвн ное
Scftisrosona
JhpOn'CU'"
Sci'jSfoSJATM
fiiaisrHtebium
Sc/.wjoscww
manjm1
Fascato
ларвйсв
Fasc&ops's
buski
Pnc. 16. Относительные размеры чиц гельминтов (оригинал ВОЗ)
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОМ ПАРАЗИТОЛОГИИ
287
зультатам иммунологического обследования (см. раздел 11). Препараты фека-
лий на наличие в них яиц цсстод исследуют методами, описанными в разделе 5.3.2.
Выявляемость яиц T.saginatus и Н.папа существенно повышается при ком-
бинации методов обогащения по Калаш арян и толстого мазка по Като.
DJatum выделяет яиц так много, что они надежно выявляются в нативном мазке.
Идентификацию яиц цестод (цепней - Hymcnolcpis папа, Taenia solium,
Taeniarhynchus saginatus и лентеца широкого - Diphylobothrium latum) прово-
дят, ориентируясь на рис.16 и 18. Следует иметь в виду, что яйца T.solium и
T.saginatus морфологически неразличимы и при их обнаружении следует пи-
сать. что «найдены яйца Tacniidac spp.».
5.5.2.3.	Трематоды - биогельминты, человек для них является единствен-
ным окончательным хозяином (шистосомы) или одним из окончательных, на-
ряду с рыбами (онисторх и другие гельминты рыб) или млекопитающими (фа-
сциола, Fasciolopsis buski). Все виды трематод, паразитирующие в организме
человека, продуцируют яйца, выделяемые с фекалиями (исключение -
Schistosoma haematobium, яйца которой выделяются с мочой, см. раздел 7).
Лабораторная диагностика. Вследствие слабой интенсивности трсматод-
ных инвазий рекомендуется всегда применять метод формалин-эфирного обо-
гащения или метод Като. Следует также иметь в виду важную особенность ди-
агностики трематодозов: в острой стадии инвазии, которая может продолжать-
ся в течение нескольких недель или месяцев, яйца паразитами не продуциру-
ются и koi 1роовоскопия н это время бесполезна. Наличие возбудителя вострой
стадии может быть установлено только косвенно, иммунологическими метода-
ми (см. раздел 11).
Идентификацию яиц трематод проводят, ориентируясь Hit рис. 16 и 18, а
также таблицу 5, в которой приведены отличительные признаки морфологи-
чески сходных яиц описторха, метагонима и клонорха. Яйца Fasciola hepatica
могут быть «транзитными» (находились в съеденной печени крупного рогато-
го скота или овец) и для исключения ложного диагноза анализ фекалий необ-
ходимо повторить, исключив из рациона пациента сырую или термически сла-
бо обработанную печень.
6, Дуоденальное содержимое и желчь
б./. Сбор проб и приготовление препаратов. Полученную при дуоде-
нальном зондировании желчь необходимо подвергать немедленному микро-
скопическому исследованию, так как через 30 мин состав ее меняется. Для
приготовления препаратов желчь выливают в чашки Петри и исследуют под
малым и большим увеличением микроскопа. Из дуоденального содержимого
отбирают хлопьевидную слизь и просматривают под микроскопом. Затем сме-
шивают все порции желчи, соединяют се с равным количеством эфира, смесь
взбалтывают и центрифугируют Надосадочную жидкость выливают, а осадок
помещают под покровное стекло и просматривают под микроскопом. В натив-
ных мазках обращают внимание на увеличение числа эпителиальных клеток
желчных протоков, лейкоцитов, могут обнаруживаться эозинофилы (свиде-
тельство острого или хронического холангита или холецистита паразитарной
этиологии), трофозоиты простейших, яйца и личинки гельминтов.
288
Гом II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Таблица 5
Отличительные признаки яиц O.felineus, M.yokogawai и C.sinensLs
Отличитель- ные морфо- логические признаки	Характеристика яиц		
	O.felineus	M.yokogawai	Csinensis
Размеры в мкм	23-34 х 10-19	26-28 х 15-17	27-35 х 12-19
Форма	напоминает семя подсолнечника; асимметричная	напоминает лимон, симметричная	грушевидная, асимметричность не всегда выражена
Оболочка	Гладкая, выступы перед крышечкой плохо выражены. Крышечка невысо- кая. слабо отличи- мая. Бугорок на противоположном крышечке полюсе заметен хорошо.	Гладкая, выступы перед крышечкой не выражены. Края крышечки выступа- ют. Крышечка плос- кая. слабо отличимая. Бугорок на противо- положном крышечке полюсе выражен.	Шершавая, толстая. Выступы оболочки перед крышечкой хорошо выражены. Граница крышечки в виде грубой извилистой линии. Крышечка высокая. Бугорок на противоположном крышечке полюсе заметен плохо из-за шероховатости оболочки.
6.2. Принцип метода паразитологического исследования: яйца гель-
минтов, паразитирующих в печени, желчных ходах, 12 -перстной кишке, могут
быть обнаружены не только в фекалиях, но также желчи и осадке дуоденаль-
ного содержимого после центрифугирования.
В работе используют: микроскоп, стандартные центрифужные пробирки,
покровные и предметные стекла, пастеровские пипетки, серный эфир.
6.3. Ход исследования. Дуоденальное содержимое и желчь (порции А, В и
С) смешивают с равным объемом серного эфира и центрифугируют в течение
5 минут со скоростью 1000-1500 об/мин. Из придонного слоя осадка готовят и
исследуют нативный препарат. В случае, если желчь густая, вязкая, при цент-
рифугировании может возникнуть так называемый эффект градиентного цен-
грифугирования: последовательное, послойное образование осадка в зависи-
мости от удельного веса составных компонентов желчи: придонный слой осад-
ка может иметь плотность большую, чем яйца гельминтов, которые концент-
рируются в верхних, менее плотных слоях осадка. Поэтому с целью изменения
плотности желчи ее смешивают с равным объемом 0,5% раствора едкой ше-
лочи, встряхивают и только после этого проводят центрифугирование с после-
дующим исследованием препаратов из придонного слоя осадка.
Помимо исследования нативных препаратов могут изучаться окрашенные
мазки для выявления ооцист изоспоры и криптоспоридия. Чаще всего приме-
няется модифицированная окраска по Цилю-Нильсену. Идентификация объе-
ктов, обнаруживаемых в содержимом двенадцатиперстной кишки, в том числе
лямблий, описана в разделе 5 «Фекалии».
ТРОФОЗОИТЫ
шизонты
ГАМЕТОЦИТЫ
Тонкий мазок	Толстая капля
Рис. 1А. Plasmodium falciparum
ТРОЪОЗОИТЫ
шизонты
• * к
ГАМЕТОЦИТЫ
Толстая капля
Тонкий мазок
*
Рис. 1 Б. Plasmodium vivax
I
I
ТРОФОЗОИТЫ
ШИЗОН1Ы
I \М1 ЮНИТЫ
Iонкии мн И IK
Т|».1сгая кии «я
Рис. IB. Plasmodium malariac
ТРОФОЗОИI ы
IIH1 ИНН ы
ГАМЕТОЦИТЫ
Тонкий мазок
Толстя капля
Рис. 11. Plasmodium ovale
pH 6-4
П~'~...
6-8
72
76
Рис. 2. Окраска малярийных паразитов в зависимости от pH
раствора краски
Рис. 4. Trypanosoma gambiense
в мазке крови
Рис. 6. Амастиготы
Leishmania infantum / Leish-
mania donovani в мазке
костного мозга
‘Облака' и хроматогиныс остатки,
происходящие ш незрелых ЗрИфОЦНГОВ.
при тяжелой анемии
Изолиропаиныс группы
хминофильпых гранул
Громбошпы.
Сравните с размерами
лимфоцита
ЭЛЕМЕНТЫ КРОВИ
БАКТЕРИИ
Ml
СПОРЫ
РАСТИТЕЛЬНЫЕ KJ1IТКИ
Гифы и споры
ГРИБОВ
Чистины грязи
Кристаллы
краски Гимза
Царапины на
лредметтюм стекле
Криста,lilt возникшие
при расстекловании
предметного стекла
ДРУ1 НЕ
Рис. 3. Артефакты, способные симулировать малярийные паразиты
Обрати re внимание: все масштабные линейки (—) = 10 мкм
А Слева: двуядерная циста E.histolytica ио влажном
препарате, метод МИФ концен грации: между
двумя ядрами видна большая гликогеновая ваку-
оль. Справа: (релин цисча E-hisiolytica во влаж-
ном препарате, обработанном раствором Люго-
ля: видны 3 из 4 ядер.
Б Подвижный трофозоит E.histolytica. содержащий
множество эритроцитов: нативный препарат.
В Трофозоит E.histolytica с заглоченными эритро-
цитами. окрашенными в красный цвет: вдоль
нижнего края микроорганизма можно увидеть
ядра: окраска трихромом
Г Одноядерная циста E.harUnanni. Слева: видны
гликогеновая вакуоль и хроматоидные тела: ок-
раска трихромом. Справа: видны хроматоидные
тела: окраска железным гема токси н ином.
Д Слева. зрелая циста E.hartniamii с 4 ядрами; окра-
ска грихромом. Справа: двуядерная циста с од-
ним ядром в фокусе и хроматовдными телами:
окраска железным гематоксилином
Е Трофозои гы E.harUnanni Сзева окраска три хро-
мом. Справа: окраска железным гематоксили-
ном.
Рис. 11. Entamoeba histolytica и Entamoeba hartmanni (оригинал ВОЗ)
Обратите внимание: нее масштабные линейки (—) = К) мкм
Л Зрелая циста Entamoeba coli- Слева: нсокрашен- Б Трофозои г E.coli. окраска трихромом. Обратите
ный препарат с формалином. Справа: нативный внимание на периферический хрома  ин на ядер-
препарат. обработанный раствором Люголя ной мембране.
В Цисз ы lodamoeba butschlff в нативном препарате,
обработанном раствором Люголя. Обратите
внимание на наличие в каждой цисте гликогено-
вой вакуоли, окрашенной в коричневый цвет; яд-
ро в подобных препаратах обычно не видно.
Г Цисты Lbutschlii- Слева, на препарате, окрашен-
ном трихромом, вакуоль видна нс гак ясно, как
справа, на препараie, окрашенном железным ге-
матоксилином; при данных окрасках хорошо за-
метно одиночное ядро с крупней кариосомой
Д Цисты Fndolimax папа в нативном преяйряге.
Слева: циста, окрашенная раствором Люголя;
видны 3 из 4 ядер. Справа 3 цис ни, в верхней
випны 3 из 4 ядер; метод МИФ-концеш рации.
Трофозоит е папа- окраска трихромом. Малень
кий размер организма, крупная кариосома, за
полняюшая практически все ядро, и незначи
тельное количество периферического хрома in
на диагностические критерии, позволяющие
идентифнцироваз ь Е.папа.
Рис. 12. Амебы-комменсалы (оригинал ВОЗ)
Обратите внимание: все масппабные линейки (—) - К) мкм
А Цисты Lumhiia intesiinalis: нативный препарат. Б Трофо*м>иг L.intcstmalts: окраска трихромом,
обработанный раствором Люголя.
В Цисты Chilomastix mcsnili: нативный препарат,
обработанный раствором Люголя. Две цис гы
слева под малым увеличением, хорошо видна
типичная форма лимона; справа под большим
увеличением едва видны ядро и цитостом.
Г Двуядерный трофозоит Dientamoeba fragilix.
окрашенный более мягко, виден между
трофозоитом Е histolytica (сверху справа)
и меньшей одноядерной цистой Е.histolytica,
содержащей хроматоидные тела. Обратите
внимание на разницу в размерах. Окраска
три хромом.
Д Циста Bakiniidiuin coli в naiинном препарате
Крупный макронук ieyc виден как чистое
прос гранство в правой части цисты
Е Трофозоит B-Coli. метод МИФ-концсн грации.
Видны цитостом на верхушке организма и
большое чистое пространство в задней части -
макронуклеус На поверхности микроорганизма
видны реснички.
Рис. 14. Кишечные жгутиковые и Balantidium coli в окрашенных
препаратах (оригинал ВОЗ)
Обратите внимание: вес масштабные линейки (—) =10 мкм
А Осипе гы Cryptosporidium parvum, влажный
препарат с формалином. Маленький размер
(4-6 мкм) и наличие внутри ооцист черных
I ранул диагностические признаки данного
организма.
Б Ооцисгы C.parvum. кислотоустойчивые. При
различных модификациях окраски на
кислотоустойчивые микроорганизмы ооцисты
могут окрашиваться от красного до розового
(как здесь) цвета, видны также черные гранулы.
В Hecnopvлированные ооцисты Cyclospora cayeta-
nensis. влажный препарат с формалином
(слева), содержат многочисленные сферические
тела. Справа, при большем увеличении, випна
спорулированная циста с 2 спороцистами.
Г Неспорулированные ооцисгы C.cayetanensis.
кислотоустойчивые. При данной окраске
ооцисты окрашиваются различно в красным
цвет, голубоватый или совсем не окрашиваются.
Э1 а черта и их более крупный размер (8-10 мкм)
помогают дифференцировать их с ооцистами
криптоспоридия.
Рис. 15 (А-Г). Кишечные кокцидии и микроспоридии (оригинал ВОЗ)
Обратите внимание: все масштабные линейки (—) = Ю мкм
Д Ооциста Isospoia belli, влажный препарат с К
формалином. Ооцисиа вы чел л юге я с фекалиями
неслорулированными и значительно больших
размеров, чем ооцисты крип гесперидия или
циклоспоры.
Спорулиронанные ооциегы и спороцисты
S rcoeystis species. влажный препарат с
формалином. Тонкостенная оонисга содержит 2
спороцисты, она легко разрушается. нош ому
в фекалиях часто обнаруживанием свободные
спороцита (как здесь). Размеры ооцист всех
видов Sarcucysti' приблизительно одинаковые.
Ж Споры Encephalito/oon helicin, окраска по Граму.
Обри in те внимание на их маленькие размеры,
хорошо иродсмонс!рировакныс на примере
данных спор микроспоридий в осадке мочи.
3 Споры типичны* микроспоридий Enlcrocytozimn
bienuiisi или Septala inlcsihialis в препарате
обработанном калькофлуором беяым-КОН под
ультрафнолс тоны мп лучами. Маленький размер
обоих видон препятствует их специфической
идет ификации в данном препарате.
Рис. 15 (Д-З). Кишечные кокцидии и микроспоридии (орш иная ВОЗ)
Обратите внимание: все масштабные линейки (—) = 25 мкм
А Нормальные оплодотворенные яйца Ascarid lum- Б Оплодотворенное (сверху слева) и неоплодотво-
biivoidcs имеют размеры 55-75 мкм на 35-50 мкм. репное яйца Ascaiis, окраска по Като,
окрашены в золотисто-жел i ый до коричневого
цвет, в фекалиях находя гея на стадии одной клет-
ки. Яйцо нмес I хороню заметные бугорки на сво-
ей повсрхност и.
окраска по Като.	Ancylostoma (справа) в одном поле зрения,
сравните их размеры.
Д Яйца Trichoxtrong\1uv похожи на яйца Ancylos-
lonia. но крупнее (75-95 мкм на 40-50 мкм) и име
ют более вытянутую форму. Яйцо находится в
поздней стадии дробления при прохождении в фе
калкях.
Е Инфекция Sirongyloidcs stercoral^ обычно диаг-
ностируется по присутствую в фекалиях рябин
товидном личинки размерами 180-380 мкм на 14
20 мкм. Личинки имеют короткую ротовую кап
супу, уменьшающийся хвостовой конец и высту
лающий полоном зачаток (показан стрелкой)
Рис. 17. Яйца нематод (оригинал ВОЗ)
Обратите внимание: все масштабные линейки (—) = 25 мкм
A Diphy llobothrium latum. Яйца этих цестод
с крышечкой, размеры 58-75 мкм на 40-50 мкм,
в фекалиях неоплодотворсны. могут иметь
бугорок или небольшое возвышение на полюсе
с крышечкой.
Ь Все яйца Taenia spp. идентичны 31-43 мкм
в диамс1рс. годсгая оболочка, содержат эмбри-
он с 6 крючьями - онкосферу. Иногда гонкая,
гиалиновая, первичная эмбриональная мембрана
может сохраняться вокруг этих яиц.
В Яйца llyinenolupis пака обычно сферической
формы. 30-47 мкм в диаметре, имеют гонкую
гиалиновую оболочку и содержат онкосферу
с 6 крючьями. На мембране вокруг онкосферы
имеются два полярных утолщения от которых
отходят 4-8 филаментов, проникающих
в пространство между онкосферой и наружной
оболочкой.
Г Яйца Clonorchis sinensis размерами 27-35 мкм
на 12-19 мкм, имеют крышечку i обычно
небольшой бугорок на противоположном
полюсе. Оболочка может иметь мельчайшие
прилипшие остатки фекалии. Яйца в фекалиях
содержат мирацнднй. Яйиа Opisthorchis сходны
с яйцами клонорха.
Д Яйца Paragonimus wcslcrinani обычно имеют
размеры 80 120 мкм на 45 70 мкм. золотисто
коричневого цвета, с толстой стенкой,
в фекалиях и мокроте не содержат зародыша,
имеют выступающую крышечку. Оболочка
утолщается на полюсе с крышечкой.
Е Яйца Fasciola hcpatica размерами 130-150 мкм
на 63-90 мкм. со слабозаметной крышечкой,
не содержат эмбриона, на стенке противо-
положного крышечке полюса имеется
неровность (последняя не видна в похожем яйце
Fasciolopsis buski)
Рис. 18 (А-Е) Яйца цестод и трематод (оригинал ВОЗ)
Образ ите внимание все масштабные линейки (—) = 25 мкм
Ж Яйца Schistosoma inansoni крупные, размерами
114-175 мкч на 45-70 мкм, имеют гонкую
прозрачную оболочку и выступающий
латеральный шип. содержат мирацпдий. Если
шип не заметен, слегка коснитесь покровного
стекла, что можс г провернуть яйцо, так что шип
станет виден.
3 Яйца Schistosoma japonicum меньше яиц
S.manxoni и S.haematobium. Их размеры
70-ИЮ мкм на 55-65 мкм. форма от округлой
до овальной, стенка тонкая, имется маленький,
плохо заметный латера пшый шип. Яйца
содержат мираииций. Часто фекальные остатки
прилипают к поверхносш яйца или шип не виден
из-за положения яйца.
И Яйца S.hacmatobium имеют терминальный шип
и содержат мирацидий. Их размеры — 112-
170 мкм ня 50-70 мкм. Эти яйца обычно
обнаруживаются в моче, но случайно мсиут
быть найдены и в фекалиях.
Рис. 18 (Ж И). Яйца цестод и трематод (оригинал ВОЗ)
Рис. 19. Цисты Pneumocystis carinii в альвеолярном экссудате
(окраска по Грохотту)
Рис. 20. Трофозоиты Trichomonas vaginalis
KJ2 1 '
DAKO
• широкий спектр моно- и поликлональных
антител и их конъюгатов
• уникальные системы визуализации
•	>• •. 'нг рсаге»п буферы,
растворители, ферменты и пр.
• автоматизированные системы обработки
материала
нстемы визу а. । и за ци и
/\ /\ тканевой антиген
tkvVision Новинка 1998 года!
DAKO Еп Vision
DAKO CSA
DAKO LSAB
•	для работы с моно- и
поликлональными
антителами
•	высокая чувствительность
специфичность
•	упрощение процедуры и
сокращение времени анал
•	уменьшение фонового
окрашивания
• основа системы: уникальная декстрановая
молекула, с которой связаны молекулы
вторых антител и фермент
• чувствительность выше других
известных методик (РАР, АРААР, авидин-
биотин и другие)
•	вся процедура всего за 40 минут!
.Автоматизированные системы
для иммуногистохимии
•	Приборы DAKO Tech Ма1е™и реагенты
DAKO ChemMate™
-	полная автоматизация процесса
-	быстрое получение качественных,
воспроизводимых результатов
использование: иммуногистохимия,
депарафинизация, гистологическое
ТМК-О ГьсКгНл+ъ ,м S00
окрашивание
АО "ФинБио" Санкг-Петербур!, 19737Б, •механические и электронные дозаторы,
ул. прош. Попова, д.23 • расходные материалы из пластика,
Тел. (812) 327-53-27 Факс (812) 327-53-23 «приборы для ИФА,
Филиал в Москве: Тел. (095) 214 <* *5-50 «диагностические реагенты,
ФинБио
• ламинарные и вытяжные шкафы,
•ультразвуковые мойки,
• лабораторная мебель
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
289
7.	Моча
Для исследования мочу собирают в чистую стеклянную посуду после туа-
лета половых органов. Анализ мочи включает в себя определение ее физиче-
ских свойств (цвет, прозрачность, плотность и т.д.); химических свойств и ми-
кроскопическое исследование. В норме моча соломенно-желтого цвета, про-
зрачна. Для диагностики многих паразитарных поражений мочевыделитель-
ной системы имеет значение изменение цвета и прозрачнос ти мочи: при моче-
половом трихомонозе моча мутная, при филяриидозах в результате хилурии -
мутная, молочная, при мочеполовом шистосомозе - красная вследствие гема-
турии.
7.1.	Лабораторный диагноз. Паразитологическое исследование мочи на-
правлено на выявление яиц Schistosoma haematobium и Dioctophyme renale. Из-
редка в ней могут быть обнаружены трофозоиты Trichomonas vaginalis, цисты
Entamoeba histolytica и микрофилярии Wuchereria bancrofti и Onchocerca volvulus.
Следует иметь в виду, что некоторые виды простейших, обнаруживаемые в
моче, могут быть следствием загрязнения ее фекалиями или влагалищными
выделениями. Чтобы исключить их как причину поражений мочевыделитель-
ной системы следует сделать повторный анализ пробы мочи, взя гой стерильно.
7.2.	Сбор проб. Для исследования пробы мочи центрифугируют и из осад-
ка готовят препараты на покровных стеклах. Препараты исследуют в наив-
ном или окрашенном виде.
7.3.	Методы исследования. Для обнаружения яиц или личинок гельмин-
тов применяют два метода: осаждение и фильтрацию. Метод осаждения менее
чувствительный, но более дешевый и простой в выполнении. Метод фильтра-
ции, благодаря его высокой чувствительности также используется для количе-
ственной оценки инвазии.
7.3.1.	Принцип метода осаждения - центрифугирование порции мочи и ис-
следование осадка. Для исследования необходимы: центрифуга, центрифуж-
ные пробирки, пастеровские пипетки, предметные и покровные стекла, стек-
лянные палочки, штатив для пробирок, дистиллированная вода, 10% раствор
едкого натра.
7.3.2.	Ход исследования. Мочу собирают в период наибольшей активности
обследуемого - с 11 до 17 часов дня. В качестве пробы для исследования ис-
пользуется терминальная порция мочи объемом до 10 мл. Количество яиц
S haematobium в пробе мочи увеличивается после определенном nai ручки на
мышцы брюшного пресса. Поэтому перед взятием мочи обследуемому реко
мендуют сделать 20-25 приседаний или совершить пробежку на 100-150 м.
При этом усиливается воздействие мышц брюшного пресса на стенку мочево-
го пузыря, что стимулирует выход яиц S.haematobium в просвет мочевого пу-
зыря и повышает вероятность их обнаружения. Исследуют только свежую
порцию мочи. В тех случаях, когда это невозможно, в мочу рекомендуют доба-
влять консерванты, способствующие длительному сохранению яиц S.hacmato
bium (несколько суток). Наиболее простым и доступным консервантом явля-
ется формалин, рабочая концентрация которого после добавления в мочу
должна бызъ в пределах 5%. Процедуры в лаборатории:
1)	Достав ленную пробу мочи взбалтывают в течение 30 сек и тут же нали-
вают по 10 мл в маркированные конические центрифужные пробирки.
290
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
2)	Оставляют пробы на 1 час для образования осадка. Сливают надосадоч-
ную жидкость, осадок центрифугируют в течение 2-5 мин при 1(ММ)-2(ХХ)
об/мин. После центрифугирования, в случае интенсивной гематурии, образует-
ся осадок красного цвета, видимый невооруженным глазом. Надосадочную
жидкость осторожно сливают. Пастеровской пипеткой берут каплю осадка,
переносят ее на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.
3)	Готовый препарат исследуют под микроскопом. Яйца S.haematobium
трудно различить на фоне большого количества эритроцитов. Для улучшения
качества препаратов исследуемый материал просветляют. С этой целью к
осадку добавляют дистиллированную воду, для стимуляции процесса лизиса
эритроцитов добавляют также 5 капель 10% водного раствора едкого натра и
перемешивают осадок с помощью стеклянной палочки. После того, как эрит-
роциты полностью гемолизируются (контролируется по изменению цвета мо-
чи), пробирку вновь помешают в центрифугу. Пипеткой берут каплю осадка,
переносят ее на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Гото-
вый препарат исследуют под микроскопом. Качество препарата значительно
улучшается за счет просветления фона и яйца S.haematobium более заметны.
Обнаружение яиц облегчается добавлением к препарату 1-2 капель любого
красителя, который имеется в лаборатории (раствор Люголя, метиленовой
синьки и т.д.), благодаря чему создается определенный цветовой фон и облег-
чается выявление яиц гельминтов.
7.3.3.	Принцип метода фильтрации - концентрация яиц S.haematobium
(или микрофилярий Wuchereria и Onchocerca) путем фильтрации мочи через
фильтр, не пропускающий яйца и личинки.
7.3.4.	Ход исследования для обнаружения яиц шистосом:
1)	Помещают в держатель фильтра пол и карбонатный или нейлоновый
фильтр (размеры ячеек по 12-20 мкм). Могут быть использованы бумажные
фильтры (Ватман N 541 или N 1). Перемешивают пробу мочи.
2)	Набирают в шприц 10 мл мочи и прикрепляют к основанию шприца дер-
жатель фильтра.
3)	Держат получившуюся конструкцию над лотком и фильтруют мочу из
шприца через держатель фильтра.
4)	Отвинчивают держатель фильтра, вынимают пинцетом фильтр и кла-
дут его верхней поверхностью вверх на предметное стекло.
5)	Наносят на предметное стекло каплю раствора Люголя и ждут 15 сек
для окрашивания яиц.
6)	При малом увеличении (объектив х 40) исследуют весь фильтр. Яйца
шистосом окрашиваются в оранжевый цвет и их легко обнаружить. Интенсив-
ность инвазии определяют по числу яиц на 10 мл мочи. Для этого общее чис-
ло обнаруженных яиц делят на 10. Если объем исследуемой мочи был меньше
10 мл, применяют следующее уравнение:
а - (п : у) х 10, где
а - число яиц на 10 мл мочи,
п - число обнаруженных яиц,
у - объем исследованной профильтрованной мочи.
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
291
В соответствии с числом обнаруженных яиц можно определить степень ин-
вазии: слабая инвазия - 1-49 яиц на 10 мл мочи, тяжелая инвазия - 50 яиц на 10
мл мочи
7.3.5.	Идентификация яиц S.haematobium проводят, ориентируясь на их
маркеры, видимые на рис. 16 и 18.
Ход исследования на микрофилярии аналогичен, за исключением типа
фильтра: он должен быть нейлоновым с размерами пор 3-5 мкм Осадок мочи
на все объекты можно просматривать как в нативном мазке, так и в окрашен-
ных препаратах.
8.	Мокрота
Мокрота - патологическое отделяемое дыхательных путей - легких, брон-
хов, трахеи, гортани, выделяется при кашле или отхаркивании. К мокроте, как
правило, примешивается слизь из горла или слюна. Поэтому мокроту очень
важно правильно собирать. Целенаправленно мокроту исследуют на наличие
в ней цист пневмоцист и яиц парагонима.
8.1.	Сбор и обеззараживание. Свежевыделенную мокроту собирают в чи-
стую. сухую посуду, чаще всего в чашку Петри. Мокроту лучше собирать ут-
ром, натощак, желательно еще до приема пищи. Перед сбором мокроты необ-
ходимо тщательно прополоскать рот. В случае затруднения получения мокро-
ты используют паровые или ультразвуковые ингаляции Они особенно показа-
ны при исследовании мокроты на наличие пневмоцист. Больного в этих случа-
ях необходимо предупреждать о нежелательности использования зубных паст,
так как входящие в состав последних консерванты препятствуют хорошему
окрашиванию препаратов мокроты. С целью обнаружения пневмоцист мокро-
ту нужно просматривать немедленно, в крайнем случае через 1-4 часа, помес-
тив ее при этом в холодильник при -И°С, так как при долгом стоянии мокроты
развивается бактериальная флора и разрушаются клеточные элементы, что
весьма затрудняет микроскопирование. Материал для исследования на нали-
чие пневмоцист желательно получать методом бронхоальвеолярного лаважа.
Во время проведения бронхоскопии, после установления бронхоскопа в устье
одного из субсегментарных бронхов, осуществляется инстилляция в дисталь-
ные отделы бронхиального дерева теплого физиологического раствора с пос-
ледующей его аспирацией. Аспират может быть разделен на 3 порции: бронхи-
альный, бронхоальвеолярный и альвеолярный. Полученный аспират (лаваж-
ную жидкость) также рекомендуют исследовать немедленно. Описано два спо-
соба временного сохранения материала: а) лаважную жидкость сливают в сто-
ящую во льду посуду с 50 мл раствора Хенкса (коммерческого, pH-7,2-7,4); б)
лаважную жидкость охлаждают до +4°С, после чего в течение некоторого вре-
мени се можно использовать для дополнительных исследований. Обсззаражи
вание мокроты, лаважной жидкости и посуды, в которой они находились, про
изводят кипячением и автоклавированием или с помощью дезинфицирующих
растворов (5% хлорамин и др).
8.2.	Порядок исследования мокроты. Мокроту разливают в чашки Петри
тонким слоем, рассматривают на светлом и черном фоне. Отбирают частицы
из «ржавых» образований, обрывки ткани и др на предметное стекло, распра-
вляют осторожно препаровальной иглой, накрывают покровным стеклом и
292
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
просматривают под микроскопом. При большом содержании гноя и слизи мок-
роту лучше смешивать с равным объемом 2% соды или 0,5% раствором КОН
или NaOH, перемешивать, встряхивать в течение 5 минут, помещать в термо-
стат или в водяную баню на 3 минуты, центрифугировать 2-3 минуты со ско-
ростью 1000-1500 об/мин; из осадка приготовить препарат и исследовать под
микроскопом. Проводят макроскопические (с целью изучения физических
свойств мокроты) и микроскопические парази ^логические исследования.
При макроскопическом исследовании мокроты обращают внимание на ее
запах, прозрачность, цвет, консистенцию, составные части. По консистенции
мокрота бывает: а) слизистой; б) слизисто-гнойной; в) гнойной; г) кровяни-
стой; д) кровянисто-слизистой. При описании консистенции мокроты принято
преобладающий субстрат ставить на второе место. Консистенция мокроты за-
висит от ее состава: при наличии слизи мокрота, как правило, вязкая (чаще
всего наблюдается при пневмоцистозе); жидкая - при наличии серозной жид-
кости (при парагонимозе, аскаридозе и др.), слизисто-гнойная при наличии
гноя (при амебном абсцессе легкого и др.). Цвет мокроты зависит от се хара-
ктера, т.е. от преобладания того или иного субстрата, что придает ей тот или
иной оттенок (серовато-стекловидный за счет слизи при пневмоцистозе, ян-
тарно-желтая при наличии примеси жидкости из эхинококковой кисты, кро-
вянистая при парагонимозе) и от вдыхаемых частиц, окрашивающих мокроту.
Объекты, обнаруживаемые при микроскопическом исследовании мокроты
и лаважной жидкости, представлены в таблице 6.
Таблица 6
Объекты, обнаруживаемые при микроскопическом исследовании
мокроты и лаважной жидкости
Простейшие
Pneumocystis carinii
Entamoeba histolytica (редко)
Entamoeba gingival is (редко)
Trichomonas lenax (редко)
Toxoplasma gondii (редко)
Гельминты
Paragoninius westermani
Echinococcus granulosus
Strongyloides stercoralis
Ascaris luinbricoides (редко)
Toxocara canis (редко)
Ancylostoma duodenalc (редко)
Цисты
Трофозоит ы
Трофозоиты
Трофозоиты
Трофозоиты
Яйца
Сколексы, крючья, обрывки
наружной оболочки
Личинки
Личинки
Личинки
Личинки
Для микроскопического исследования объектов, представленных в табли-
це (в том числе и яиц парагонима) необходимо просматривать мокроту мето-
дом нативного мазка, в отличие от этого для выявления пнсвмоцист исследуе-
мый материал подвергают специфическим методам окраски, рассматривае-
мым ниже.
Для обнаружения пневмоцист мокроту помещают в центрифужную про-
бирку с равным количеством какого либо муколитика (0,3% дитиотреитол в
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
293
0,02 М ЭДТА, рН=7,0; 1-2% NaOH или КОН; ацетил цисте ин; 2% димексид и
др.). Полученную смесь перемешивают стеклянной палочкой и инкубируют
при 37°С в течение 5-15 минут. Гомогенизированную смесь разводят равным
количеством формалина и цснгрифугируют в течение 10 минут при скорости
1500 об/мин. Из супернатанта готовят мазки на нескольких предметных стек-
лах, окрашиваемых различными красками.
8.3.	Окраска препаратов. Обычно применяют скрининговые окраски, по-
зволяющие увидеть содержимое 8-ядсрной цисты (так называемые внутрипи-
стные тельца), однако не выявляющие клеточную стенку пнсвмоцист. К ним
относят окраску по Романовскому-Гимза, Граму, гематоксилином-эозином, по
Райту. Для окончательной верификации пнсвмоцист применяют сложные,
многоэтапные, зачастую требующие для своего проведения дорогостоящих
реактивов, окраски: окраска толуидиновым синим, методом серебрения по Го-
мори-Грохотту, крезиловым фиолетовым. С их помощью четко визуализиру-
ется клеточная стенка цист Pneumocystis carinii.
Основные методы окраски
8.3.1.	Модифицированная окраска по Романовскому-Гимза (Walker et aL,
1989): 1. после фиксации в смеси Никифорова мазки опускают на 10 минут в
сульфатно-уксусный реагент (45 мл ледяной уксусной кислоты и 15 мл кон-
центрированной серной кислоты); 2. промывают мазки 5 минут в проточной
воде; З.окрашивают мазки 10% красной Романовского-Гимза в фосфатном бу-
фере, pH =7,2 в течение 30 минут.
Результат: оболочка цист окрашивается в красно-фиолетовый цвет, кле-
точное содержимое при этом не визуализируется. Процесс окраски занимает
30 мин.
8.3.2.	Окраска кристаллическим фиолетовым (Лавдовская М.В.. 1994):
1. мазки, зафиксированные в смеси Никифорова, помещают в раствор концен-
трированной серной кислоты (93,6-96,5%) на 10 минут; 2. промывают мазки в
проточной воде 10 минут, высушивают на воздухе; 3. стекла погружаю! в 1%
водный раствор кристаллического фиолетового; 4. избыток краски удаляют,
прополаскивая окрашенные мазки в 20% водном растворе CuSO4 в течение
10-20 секунд; 5. промывают мазки в проточной воде 1 минуту; 6. окрашенные
мазки высушивают на воздухе.
Результат: оболочка цист окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Про-
цесс окрашивания занимает нс более 10 мин.
8.3.3.	Окраска толуидиновым синим (Witebsky ЕС. et al., 1988): 1. препа-
раты фиксируют в 10% формалине, смывают дистиллированной водой; 2. маз-
ки опускают в сульфатно-уксусный реагент (см. выше) на 5 минут, затем пос
ле перемешивания реагента стеклянной палочкой оставляют в нем еще на 10
минут; 3. подготовленные таким образом мазки окрашивают 0,15% толуиди-
новым синим (75 мг толуидинового синего ч 15 мл дистиллированной воды +
0,5 мл концентрированной соляной кислоты + 35 мл абсолютного спирта) в те-
чение 3-х минут; 4. смыть в проточной воде; 5. докрасить 0.25% водным раство-
ром метанилово! о желтого в течение 2-х минут; 6. смыть избыток краски водой.
Результат: цисты сине- фиолетовые, тканевые элементы и фон - зелено-
желтые.
294
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Примечание: краска может использоваться в течение года, сульфатно-уксусный ре-
агент не более чем в течение недели!
83.4. Окраска ио Гомори-Грохотту: 1. препараты фиксируют в 10% фор-
малине - 5-10 минут; 2. промывают дистиллированной водой; 3. готовят 5%
раствор СгОз. который подогревается в стакане до 65°С, в подогретый раствор
быстро not ружают мазки на 1 минуту, смывают дистиллированной водой;
4. мазки опускают в 1% раствор метабисульфита калия или натрия на 1 мину-
ту; 5, наливают рабочий раствор серебра (25 мл раствора метснамина серебра,
который состоит из 100 мл 3% водного метенамина или уротропина и 5 мл 5%
водного нитрата серебра) + 25 мл дистиллированной воды -г 2 мл 5% водного
тетрабората натрия (буры) + 15 мл диметилсульфоксида). Рабочий раствор го-
товится непосрсдс! венно перед употреблением! В нею опускают мазки, рас-
твор подогревается до 90-95°С, пока мазки не станут темно-коричневыми, а
раствор - светло-серым; 6. прополаскивают препараты в 3-х сменах дистилли-
рованной воды; 7. опускают мазки в 0,2% водный раствор хлорного золота на
1 минуту, смывают дистиллированной водой; 8. опускают мазки в 2% водный
раствор тиосульфата натрия на 1 минуту, смывают дистиллированной водой; 9.
окрашивают светлым зеленым (0,02 г лихтгрюна зеленого и 100 мл дистилли-
рованной воды и 5 капель ледяной уксусной кислоты ) в течение 5 минут, смы-
вают дистиллированной водой.
Результат: цисты светло- или темно-коричневые (зависит от толщины
мазка), округлой или блюдцеобразной формы; окружающий фон и тканевые
элементы - зелено-желтые (рис. 19),
Для выявления полисахаридного компонента в стенке пневмоиисты недав-
но была предложена методика применения реакции Бауэра для индикации
P.carinii в патогенном материале (Аравийский Р.А.. 1991): 1. помещают маз-
ки r 5% раствор СгОз при 37°С на 30 минут в темноте; 2. промывают мазки в
проточной воде (не менее 10 минут); З.окрашивают мазки в течение 45 минут
реактивом Шиффа. Приготовление реактива Шиффа: 10 г парозанилина рас-
творяют в 200 мл IN НС1, добавляют 21 мл дис тиллированной воды и 10 г ме-
табисульфита калия. Полученный раствор хранят в темноте до полного обес-
цвечивания (соломенный оттенок), что достигается в течение 10-15 часов; 4.
промывают мазки в проточной воде 5 минут; 5. докрашивают мазки 0,2% вод-
ным раствором светлого зеленого (время подбирается опытным путем).
Результат: цисты P.carinii окрашиваются в розово-пурпурный цвет
9.	Отделяемое мочеполовых путем
В мочеполовых путях обитает единственный представитель Protozoa - ус-
ловно патогенный Trichomonas vaginalis. Два других вида трихомонац, обитаю-
щих в организме человека, - T.intestinalis (hominis) и T.tenax (buccalis) являют-
ся комменсалами.
9.1,	Trichomonas vaginalis у части инфицированных им индивидов вызыва-
ет острый или хронический трихомоноз.
9.1.1»	Биология. Т. vaginalis жгутиковое простейшее характерной овоиц-
ной или грушевидной формы, 4-13 мкм в длину и 2-9 мкм в ширину, имеет 3-5
жгутиков, по краю тела располагается ундулирующая мембрана, доходящая
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
295
примерно до половины тела. Ядро одно, располагается в передней части тела.
Размножается паразит простым делением, цист не образует, представлен толь-
ко трофозоитами.
Распространение повсеместное, пораженность Тvaginalis женщин состав-
ляет в среднем 15-40%; мужчин - существенно ниже.
Передача возбудителя осуществляется половым путем, дети иногда зара-
жаются от матери во время родов или через руки, белье и во время туалета по-
ловых органов.
Исследованию на наличие этого простейшего подлежит отделяемое из уре-
тры, цервикального канала, влагалища, простатический секрет, содержимое
парауретральных ходов, бартолинисвых и скеневских желез.
9.1.2.	Лабораторная диагностика основана на микроскопии нативных
влажных препаратов из экссудатов половых органов или осадка мочи на нали-
чие подвижных трофозоитов, а также окрашенных препаратов. В свежем ма-
териале хорошо видны трофозоиты, передвигающиеся «нервными», дергаю
щимися или прыгающими движениями. Чувствительность этого метода дости-
гает 75-80%, специфичность (в руках опытного микроскописта) - 100%. На
эффективность выявления трихомонад влияет технически правильное взятие
материала и своевременный его просмотр.
9.1.3.	Сбор проб. Выделения у женщин берут во время гинекологических
осмотров желобоватым зондом, фолькмановской ложечкой или путем отсасы-
вания через стеклянную трубочку с резиновым балончиком на конце (у дево-
чек с сохраненной девственной плевой). Если отделяемое очень скудное, то во
влагалище предвари тельно вводят при помощи указанных выше инструментов
2-3 мл стерильного физиологического раствора, который затем отсасывают
вместе с выделениями.
Из шейки матки материал собирают с помощью стерильного ватного там-
пона и переносят его в каплю теплого физиологического раствора или поме-
щают в пробирку, содержащую 3 мл такого раствора, если материал доставля-
ют в лабораторию из учреждения здравоохранения. Центрифугируют пробир-
ку в течение 2 мин. Удаляют пипеткой надосадочную жидкость, из осадка го-
товят нативные или окрашенные мазки.
У мужчин исследуют выделения или соскобы после массажа из переднего
отдела уретры, простатический сок (после массажа предстательной железы),
центрифугируют мочу, сперму. Для набора выделений из уретры в нее вводят
стерильный зонд (бактериологическая петля, желобоватый зонд, ушная ло-
жечка и т.п.).
При хроническом и вялотекущем заболевании материал из мочеполовых
путей целесообразнее собирать после предварительной провокации: алимен-
тарной (упот ребление соленой, острой пищи, алкоголя), биологической (вве-
дение гоновакцины), термической, механической (массаж уретры или шейки
матки).
9.1.4.	Методы исследования. Просмотр нативных препаратов чаше всего
производят методом раздавленной «капли-суспензии» и реже - методом «вися-
чей» капли.
296 Том IJ - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Для приготовления препарата «капля-суспензия» на сухое, обезжиренное,
прогретое до 37°С предметное стекло наносят каплю теплого физиологиче-
ского раствора и смешивают се с каплей исследуемого материала. Взвесь на-
крываю!’ покровным стеклом, избегая образования воздушных пузырьков в
препарате. Смывы со слизистой уретры, негустые осадки из цснтрифугатов,
полученных на физиологическом растворе исследуются в нативных препара-
тах без дополнительного разведения.
При приготовлении «висячей» капли точно на середину покровного стекла,
края которого предвари гель но смазываю! вазелином, наносят подогретый до
37°С физиологический раствор, к которому добавляют исследуемый материал
и осторожно перемешивают. Покровное стекло осторожно переворачивают и
накладывают каплей вниз над лункой специального предметного стекла для
просмотра «висячей» капли. Капля должна свободно свисать в углублении
предметного стекла, не соприкасаясь с его краями и дном.
Препараты просматривают вначале при объективе 10х, затем, для подтвер-
ждения, 40х. Количество трофозоитов может быть огромным, так что все по-
ля зрения находятся в движении, или настолько мизерным, что парази т с тру-
дом обнаруживается среди неподвижных малых лейкоцитов и клеточного дет-
рита, отличаясь от них волнистыми движениями.
В дополнении к препаратам, приготовленным из свежего материала, при-
готовляют фиксированные и окрашенные постоянные препараты. Мазки
фиксируют в смеси Никифорова в течение 3-5 мин и окрашивают различны-
ми методами. В препаратах, окрашенных железным гематоксилином, по Рома-
новскому-Гимза, акридином оранжевым или трихромовым красителем (см.
раздел 8) трофозоиты легко распознаются благодаря наличию жгутиков и ко-
роткой ундулирующей мембраны.
Для окрашивания 0.5% раствором бриллиантового зеленого 0,5 г краски
растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды, фильтруют в горячем
виде через бумажный фильтр. На препарат наносят водный раствор краски на
1 мин, затем краску смывают под проточной водой, препарат высушивают и
микроскопируют. При данной окраске ядра Т. vaginal is окрашиваются в интен-
сивно-зеленый цвет, сетчатая цитоплазма в светло-зеленый, четко просматри-
вается оболочка. Бактериальная флора окрашивается в зеленый цвет разной
интенсивности.
Микроскопия окрашенных препаратов является простым и дешевым ме-
тодом, не требующим немедленного проведения исследования, специального
оборудования, однако его специфичность и чувствительность низкая. Полезны
повторные обследования.
9,1.5.	Идентификация Т. vaginalis серьезных трудностей не вызывает. В
нативных препаратах их следуе т дифференцировать отсвободноживущих жгу-
тиковых семейства бодонидов, попадающих в препарат из воды или загрязнен-
ной посуды. Эти сапрофитные жгутиковые имеют лишь 2 жгутика и двигают-
ся прямолинейно. В окрашенных препаратах у влагалищных трихомонад от
четливо видных оболочка, ядро, цитоплазма, блефаропласт. жгутики (рис.20).
Культуральный метод является наиболее чувствительным и специфич-
ным методом. Влагал ищи ые трихомонацы дают хороший рост на искусствен-
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
297
ных питательных средах, содержащих антибиотики для подавления роста со-
путствующей микрофлоры. Материал обязательно должен забираться сте-
рильным зондом или бактериальной петлей. Материал сеют на среду СКДС,
среду из смеси жидких стандартных кровезаменителей, среду СГДС. Для вы-
ращивания трихомонад широко используется среда «Vagicult» фирмы Orion
Diagnostica (Финляндия). Микроскопическое исследование культур и иденти-
фикацию T.vaginalis следует производить на 3-5 день (положительный резуль-
тат - придонный рост в виде плотного беловатого осадка). Так как длитель-
ность развития трихомонад в культуре зависит от величины посевной дозы, от-
рицательный результат выставляют после исследования на 7-9 и 11-17 день
посева. Из придонного осадка готовят нативный препарат для микроскопии.
Куль гуральный метод дорогой из-за применяемых питательных сред. В на-
стоящее время появился коммерческий культуральный диагностикум «Трихо-
монаСкрин» компании Биоссрвис (Москва) в который входят стерильные зон-
ды, сухая питательная среда в капсулах, тест-пакет, мерная пипетка. Результат
исследования - максимум через 5 дней.
Иммунологический метод позволяет определить Тvaginalis в НРИФ с по-
мощью набора «ТрихоСлайд» (АО «ЛАБдиагностика», Россия). Отпечатки
материала из различных очагов поражения наносят на предметное стекло со
специальными лунками одноразовыми зондами с хорошо сорбирующим ват-
ным тампоном. Трихомонады видны в виде полиморфных образований с хара-
ктерным ярко-зеленым свечением. Бактериальная флора окрашивается в
оранжевый цвет, лейкоциты, эпителиальные клетки, сперматозоиты - в крас-
но-бурый. Результат считается отрицательным при отсутствии клеточных эле-
ментов со специфическим свечением.
Чувствительность и специфичность иммунологического метода сравнима с
таковой при культуральном методе. Он сравнительно дешев, прост в выполне-
нии, позволяет получить ответ в течение 40-60 мин.
10.	Биоптаты тканей
Биоптаты берут из здоровых или патологически измененных тканей с це-
лью обнаружения в них паразитических простейших и яиц или личинок гель-
минтов.
10J, Срез кожи на наличие микрофилярий Onchocerca volvulus получают с
помощью иглы и скальпеля или бритвенного лезвия.
Принцип метода - обнаружение микрофилярий, вышедших из биопта га,
помещенного в физраствор.
Ход приготовления и исследования препарата:
1)	Обработка участка кожи спиртом или эфиром.
2)	После испарения дезинфектанта вводят стерильную тонкую иглу в кожу
строго поверхностно-горизонталь но и приподнимают кожу над ш лой.
3)	Срезают кусочек кожи, приподнятый с помощью иглы, бритвенным лез-
вием (или острым скальпелем), удерживая его горизонтально и двигая против
иглы. При правильно выполненной процедуре получают кусочек размером
около 2 мм, без следов крови.
4)	Помешают биоптат кожи в каплю физиологического раствора на пред-
298
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
метном с текло или в микротитровальный планшет. Оставляют на 30 мин при
комнатной температуре, предохраняя препарат от высыхания.
5)	Исследуют препарат под микроскопом на наличие живых подвижных
микрофилярий.
Результат: Микрофилярии начинают выходить из биоптата в раствор не-
медленно, через 30 мин его покидают около 70% и через час практически все,
находившиеся в биоптате. Если биоптат сразу после его получения взвесить на
торсионных весах, то через час можно определить интенсивность инвазии
(число микрофилярий в мг кожи). При очень большом числе микрофилярий в
препарате, их для облегчения подсчета обезвоживают, добавляя каплю форма-
лина.
Идентификация микрофилярий проводится по признакам, указанным на
рис.5 (см. раздел 1).
10	.2. Биоптат нз кожном язвы на наличие амастигот дерматотронных
лейшмании
Принцип метода: микроскопия клеток краевого инфильтрата вокруг язвы
на наличие лейшмании в макрофагах или вне их.
Ход приготовления и исследования препарата. Биоптат надлежит взять с
минимальным количеством крови и максимальным числом макрофагов. Для
этого участок инфильтративного валика анемизируют, сжимая его двумя
пальцами левой руки или пинцетом, делают надрез острым скальпелем и со-
скабливают кусочек ткани. Биоптат можно получить, откусив кусочек ткани
пинцетом или введя в инфильтрат стерильно зубоврачебную иглу с насечкой
(применяется для удаления нерва из зуба) и, повращав ее в ткани инфильтра-
та, извлекают вместе с захваченным материалом. Биоптат вместе с сукрович-
ной жидкостью переносят на предметное стекло, размазывают полученный
мазок, фиксируют, красят по Романовскому-Гимза и исследуют с иммерсионной
системой, как при исследовании мазка костного мозга (см. разделы 2.2 и 2.3).
10	.3. Биоптат мышц на наличие трихинелл
Принцип метода: обнаружение инкапсулированных или живых личинок
трихинелл в мышцах путем компрессии биоптата или его переваривания.
Ход приготовления и исследования препаратов. Для исследования ком-
прессионным методом берут небольшой биоптат дельтовидной, двухглавой
или икроножной мышцы, сдавливают его между двумя стеклянными плас тина-
ми и исследуют под микроскопом при малом увеличении. При интенсивной ин-
вазии в препарате без труда обнаруживают инкапсулированные личинки три-
хинелл; при слабой инвазии они обычно просматриваются. Для обнаружения
живых личинок трихинелл проводят следующие манипуляции: 1. готовят пере-
варивающую жидкость: 5 мг пепсина растворяю! в 1 л дистиллированной во-
ды, в которую добавляют 7 мл концентрированной соляной кислоты, 2. берут
I г биоптата мышцы (см. выше), тщательно его размельчают и помешают в 20
мл переваривающей жидкости; 3. инкубируют пробу в течение 24 час при тем-
пературе 37°С, периодически се встряхивая: 4. добавляют 60-80 мл подогретой
до 37 С воды и вливают разведенную переваривающую жидкость в воронку
Бермана (см. раздел 5.42.1). Оставляют жидкость в воронке на час или доль-
ше с тем. чтобы личинки перешли в носик воронки; 5. выпустить жидкость из
МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ
299
носика воронки и исследовать под микроскопом на наличие живых личинок; 6.
в случае видимого отсутствия личинок подвергнуть всю имеющуюся в ворон-
ке жидкость центрифугированию в течение 2 мин при 2000 об/мин, и исследо-
вать осадок.
Результат. Обнаружение личинок трихинелл - абсолютный критерий три-
хинеллеза у обследуемого больного.
10	,4- Биопсия тканей на цистицерки. I 1ри тениозе у пациента может раз-
виться цистицеркоз - паразитирование в его тканях (глазу, конъюнктиве, моз-
ге, подкожной клетчатке, мышцах) личиночной стадии Taenia solium. Биоптат
ткани (например, подкожного узла) раздвигают препаровальными иглами с
целью выделения видимого невооруженным глазом беловатого пузырька ве-
личиной с горошину - собственно цистицерка. Его раздавливают между двумя
предметными стеклами и исследуют под микроскопом. Наличие в пузырьке
сколекса с 4 присосками и венчиком крючьев подтверждает диагноз цистицер-
коза. Если цистицерк пропитан взвесило, то для обнаружения головки его не-
обходимо предварительно декальцинировать в 4% растворе азотной кислоты
в течение 1 часа.
11.	Иммунодиагностика
Методы иммунологической диагностики в клинической паразитологии при-
обретают все большее значение, несмотря на то, что они не могут и не долж-
ны подменять точные, обычно доступные и недорогие паразитологические ме-
тоды. Однако в ряде случаев необходимость применения иммунологических
методов является императивной. Такая необходимость возникает при невоз-
можности получения материала для микроскопии неинвазивными способами
на протяжении всего течения инфекции/инвазии (токсоплазмоз, внекишеч-
ный амебиаз, трихинеллез, гоксокароз, эхинококкоз, цистицеркоз, ларвальный
парагонимоз) или в острой фазе, когда диагностические стадии отсутствуют
(описторхоз, легочный парагонимоз, фасциолез). Иногда иммунологические
методы применяют в дополнение к паразитологическим, если чувствитель-
ность последних в хронической фазе недостаточна из-за слабой интенсивности
инфекции/инвазии (трИпаносомозы, криптоспоридиоз, стропгилоидоз, шистосо-
мозы).
11	Л. Токсоплазмоз- С целью лабораторной диагностики этой широко рас-
пространенной протозойной инфекции применяется очень широкий набор им-
мунологических методов: кожная проба с токсоплазмином. РСК. РИГА,
НРИФ, ИФА, а также оригинальная реакция с красителем (реакция Себина-
Фельдмана). В последние годы ведущее место в иммунодиагностике токсо-
плазменной инфекции занимают ПРИФ в полуколичественном варианте (титр
IgG) и ИФА в количественном варианте (IgG и IgM в МЕ/мл).
Им му коферментные тест-системы для определения антитоксоплазменных
антител производят ЗАО «Вектор-Бест» и «Эко-Лаб» (РФ). Используются
также импортные тест-системы фирмы Санофи Диагностике Пастер.
“Labsystems ’ (Финляндия) и др. Постановку гой или иной тест-системы прово-
дят в соответствие с фирменной инструкцией.
300 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
11.2.	Амебиаз внекишечный. Применяются тест-системы НРИФ и ИФА,
производимые в США.
11.3.	Токсокароз. Применяется тест-система «Тиас кар-стрип» ЗАО «Век-
тор-Бест» (РФ).
11.4.	Трихинеллез. Применяется тест-система «Тиатрис-стрип» ЗАО «Ве-
ктор-Бест» (РФ).
11.5.	Описторхоз. Применяются иммуноферментные тест-системы, произ-
водства ЗАО «Вектор-Бест» и «Эко-Лаб» (РФ).
11.6.	Эхинококкозы. Тест-система для выявления антител к Echinococcus
multilocularis выпускает фирма «Эко-Лаб» (РФ), лиофилизированный Аг
E.granulosis для ИЭФ и РСК - фирма Санофи Диагностике Пастер (Франция).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1	Авдюхина ТИ., Константинова Т.Н., Горбунова Ю.П. Лабораторная диаг-
ностика гельминтозов. Часть I. Нематодозы: Учеб, пособие; М., 1993.
2.	Беляев А.Е., Авдюхина Т.Н., Горбунова Ю.П., Филиппов А.М. Лаборатор-
ная диагностика малярии: Учеб, пособие; М., 1995.
3.	Березанцсв Ю.А., Автушенко Е.Г. Гельминтологическая копрологическая
диагностика., Л., Медицина, 1976.
4.	Горбунова Ю.П. Лабораторная диагностика кишечных нротозоозов, М.,
1989.
5.	Дайгср А.Б.. Тумка А.Ф. Паразитарные болезни, Л., Медицина, 1980.
6.	Лавдовская М.В., Лысенко А.Я,, Авдюхина Т.И., Горбунова Ю,П. Амебиаз:
Учеб, пособие; М., 1998.
7.	Лысенко А.Я. (ред.) Руководство по тропическим болезням, М., Медицина,
1985.
8.	Лысенко А.Я., Павлова Е.А. Методические разработки по лабораторной
диагностике малярии; М., 1985.
9.	Методические разработки к практическим занятиям по лабораторной диаг-
ностике малярии / Сост. Лысенко А.Я., Беляев А.Е, М.: ЦОЛИУВ, 1989.
10.	Основные методы лабораторной диагностики паразитарных болезней,
ВОЗ, Женева, 1994.
11.	Павлова Е.А. Лабораторная диагностика паразитарных болезней. Часть 1.
Кишечные протозоозы, М., 1977.
12.	Т^мка А.Ф. Паразитология, эпидемиология и лабораторная диагностика
кишечных протозойных инфекций, Л., Медицина, 1967.
13.	Bench Aids for the diagnosis of intestinal parasites, WHO, Geneva, 1994
14.	Bench Aids for the diagnosis of filarial infections, WHO, Geneva, 1997.
15.	Bench Aids for the diagnosis of malaria, WHO, Geneva, 1995.
МОЛЕКУЛЯРНО-
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ВЫЯВЛЕНИЯ И
ИДЕНТИФИКАЦИИ
ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ
1.	Выявление и идентификация Chlamydia trachomatis,
Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum методом
полимеразной цепной реакции
Введение
Chlamydia trachomatis - внутриклеточный паразит, инфицирующий эпите-
лий слизистых поверхностей генитального тракта, прямого кишечника, носо-
глотки и конъюктивы. Хламидии являются причиной воспалительных заболе-
ваний вышеперечисленных органов и тканей, при осложненном или хрониче-
ском течении которых возникают бесплодие, простатиты, ксратоконыоктиви-
ты и др. Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealiticum часто являются сопутст-
вующими мембранными паразитами эпителиальных слизистых покровов, обу-
славливающими воспалительные изменения, приводящие к перечисленным
выше последствиям. Независимые исследования, проведенные в клиниках
разных стран показали, что в 50-90% нарушения репродуктивной функции че
ловека вызваны смешанными инфекциями мочеполовых путей, среди которых
в свою очередь часто встречаются хламидии, микоплазмы и уреаплазмы. Дли-
тельное бессимптомное течение и множественные клинические неспецифиче-
ские проявления затрудняют симптоматическую диагностику этих заболева-
ний. Не всегда эффективны и традиционные, иммунохимическис или сероло-
гические методы анализа, так как эти инфекции протекают в латентной фор-
ме, часто вызывая стертый ответ организма человека. Дороговизна, длитель-
ность и трудоемкость микробиологического выделения данных возбудителей в
культуре существенно затрудняют использование этой процедуры в лабора-
торной диагностике. В литературе накоплен обширный клинико-лаборатор-
ный опыт по использованию метода ПЦР для выявления перечисленных мик-
роорганизмов. Основными мишенями для амплификации при выявлении хла-
мидии трахоматис являются; нуклеотидная последовательность видоспецифи-
ческой критической плазмиды, последовательность главного белка внутрен-
ней мембраны, рибосомальные гены. Для выявления M.honnnis используются
фрагменты генов-адгезинов, или рибосомальной РНК. Для уреаплазм - i ены
уреазы. 11иже приведена методика, лежащая в основе работы набора реаген-
тов для определения хламидии трахоматис, микоплазмы гоминис и уреаплазмы
уреалитикум методом полимеразной цепной реакции, утвержденная Минздра-
вом России под (ТУ-9398-405-17253567 96).
302
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Специфичностъ анализа
В положительном контрольном образце должна выявляться одна полоса
оранжево-красного цвета после разделения реакционной смеси в агарозном
геле, соответствующая по подвижности фрагменту генома хламидии трахома-
тис или уреаплазмы уреалитикум или микоплазмы гоминис.
В отрицательном контрольном образце - полоса, соответствующая фраг-
менту генома хламидии трахоматис, уреаплазмы уреалитикум или микоплазмы
гоминис, должна отсутствовать.
Оборудование и реактивы
1)	Микропипетки полуавтоматические на 1-10, 5-40, 40-200, 200-1000 мкл;
2)	Наконечники к микропипеткам;
3)	Микропробирки пластиковые на 1,5 мл и 0,5 мл;
4)	Штативы для микропробирок;
5)	Микроцентрифуга на 8-12 тыс.об/мин для 1,5 и 0,5 мл пробирок;
6)	Прибор для горизонтального электрофореза;
7)	Программируемый термостат (ДНК амплификатор);
8)	Термостат на 45-55°С под 1,5 мл пробирки;
9)	Ультрафиолетовый трансиллюминатор;
10)	Водоструйный или вакуумный насос с колбой ловушкой;
11)	СВЧ-печь или водяная баня на 95-100°С;
12)	Встряхиватель для микропробирои типа “Вортекс”;
13)	Колба коническая термостойкая вмесгимостью 250 мл;
14)	Колба коническая вместимостью 1 л;
15)	Стерильные наконечники 1-200 мкл;
16)	Стерильные пластиковые пробирки объемом 1,5 мл;
17)	Стерильные пластиковые пробирки объемом 0,5 мл для амплификации;
18)	Стерильный физиологический р-р;
19)	Универсальные зонды для забора клинического материала.
Реактивы
1)	Раствор I - 6М раствор гуанидин тиоционата, 50 мМ трис НС1, pH 7.0
2)	Раствор II - 4М раствор гуанидин тиоцианата
3)	Раствор III - 50% этанол 50мМ NaCI, 25 трис НС1 pH 7.4
4)	Сорбент - суспензия диатомовой земли
5)	ТЕ буфер- 10мМ трис HCI, 1мМ ЭДТА, pH 8.0
6)	Taq-полимераза (5 ед/мл)
7)	Вода деионизованная
8)	Минеральное масло
9)	10х ПЦР буфер - 666мМ трис HCL 166 мМ (NH4)SO4, 0.1% твин-20, 25мМ
MgCI2, 0,1% желатина pH 8.8 при 25°С
10)	праймеры следующего состава:
5' CACGAGCTGACGACAACCATGCA 3* - R1
5’ GGTTAGCAATAACCTAGCGGCGA 3’ - Н
5* AAAGGGCGTGTAGGCGGAAAG 3' -Chi
5* CGTTTGCGACGCTTTTGGATG 3' -U
в концентрации 5 рмоль/мкл каждого.
ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ МЕТОДОМ ПЦР ЗОГ
И) раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (НТФ) 25мМ каждого из АТФ,
ТТФ, ЦТФ, ГТФ.
12) Агароза
13) 50- кратный ГАЕ-буфер (50хТАЕ) 2М Трис-ацетат pH 8,2, 0,05М ЭДТА
14) 6- кратный буфер для нанесения образца, (40% сахароза, 0,25% бромфе-
ноловый синий)
15) Раствор бромистого этидия, 1%
16) Положительные контрольные образцы- препараты ДНК M.hominis, U.urc-
aliticum, С trachomatis с концентрацией 100 фг/мкл
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Выделение ДНК из образца. Забор клинического материала
Исследуемый материал (соскоб эпителиальных клеток из цервикального
канала, уретры, зева) переносят в физиологический раствор, находящийся в
полипропиленовой 1,5 мл пробирке, с помощью одноразовых стерильных зон-
дов для соскоба эпителия. Для этого, взятый у пациента материал на зонде опу-
скают в 100 мкл физиологического раствора, перемешивают, зонд извлекают
(выбрасывают), а приготовленную таким образом пробу используют для вы-
деления ДНК или хранят при температуре - 20°С не более 2 недель.
Обработка клинических проб перед проведением амплификации (выде-
ление ДНК)
1)	К 100 мкл физиологического раствора, содержащего клинический мате-
риал в пробирке 1,5 мл (типа Eppendorf). добавляют 300 мкл раствора 1 и 10
мкл суспензии сорбента. Пробы инкубируют в течение 10 минут при комнат-
ной температуре, 1-2 раза перемешивая на вортсксс.
2)	Пробы центрифугируют 15 сек на микроцентрифуге при 12000-16000g
(8-12 тыс. об/мин), супернатант отбрасывают.
3)	К осадку добавляют 100 мкл раствора II и встряхивают его на вортсксс.
Сорбент осаждают центрифугированием при 12000-16000g (8-12 тыс. об/мин),
в течение 15 сек. Супернатант отбрасывают.
4)	Процедуру отмывки повторяют еще два раза с использованием 1,0 мл
раствора III так. как это описано в п.З.
5)	Дополнительным центрифугированием при 12000~16000g (8-12 тыс.
об/мин), с последующим отбрасыванием супернатанта убирают остатки рас-
твора III. Пробы подсушивают 5 минут при температуре 45 -55°С, оставляя
пробирки открытыми.
ВНИМАНИЕ! 11а всех стадиях обработки клинического материала удаление су-
пернатанта производят одноразовыми пластиковыми наконечниками при помоши водо-
ст руйного насоса в колбу ловушку, содержащую дезинфицирующий раствор (3% хло-
рамин или 5% перекись водорода и т.п.).
6)	В пробирки с сорбентом добавляют 50 мкл ГЕ буфера, закрывают их.
перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 5 минут при температуре
45-55°С.
7)	Пробирки центрифугируют 15 сек при 12000-16000g (8-12 тыс. об/мин),
водную фазу (супернатант) используют в качестве исследуемого образца ДНК
для постановки реакции амплификации.
304	Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Обработанные таким образом пробы можно хранить при температуре 4°С
в течение недели или при температуре минус 20°С в течение 6 месяцев.
Проведение полимеразной цепной реакции
1)	Приготовить пробирки для проведения амплификации, пронумеровав их
и расположив соответствующим образом в штативе. Подготовить также про-
бирки для положительного и отрицательного контролен.
2)	Перенести 5 мкл образца из обработанной клинической пробы в соот-
ветствующую пробирку для проведения амплификации.
3)	Добавить в соответствующие пробирки по 5 мкл ДНК положительных
контролем, а в пробирки, помеченные как отрицательные контроли, по 5 мкл
воды.
4)	Извлечь растворы 10х ПЦР- буфера, НТФ, Taq-полимеразы. праймеров
из морозильника, разморозить содержимое и перенести их в ледяную баню.
5)	Приготовить смесь реактивов согласно приведенной таблице:
Количество	Вода,	10х ПЦР	Taq,	раствор*	НТФ, мкл
пробирок	мкл	буфер, мкл	мкл	праймеров,	мкл
4	52	10	0.8	8	10
8	104	20	1.6	16	20
16	208	40	3.2	32	40
24	312	60	4.8	48	60
32	416	80	6.4	64	80
42	546	105	8.2	84	105
ВНИМАНИЕ! При приготовлении смеси реактивов необходимо все ком-
поненты добавлять отдельными наконечниками.
*Для выявления хламидии трахоматис используется пара праймеров R1 и Chi, ми-
коплазмы гоминис- R1 и Н, уреаплазмы уреалитикум - R1 и U.
6)	После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю
очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.
7)	Добавить по 20 мкл амплификационной смеси в каждую пробирку, со-
держащую 5 мкл анализируемого образца.
8)	Добавить по одной капле (около 25 мкл) минерального масла, используя
пипетку объемом 1 мл.
9)	Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 сек при 12000-
16000g (8-12 тыс. об/мин).
10)	Перенести пробирки в программируемый термостат (амплификатор) и
провести амплификацию по следующей программе:
94°С - 40 сек
58°С - 30 сек
72°С ЗОсек
количество циклов 30
ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ МЕТОДОМ ГЩР 305
РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
1)	Залить в аппарат для электрофореза lxTAE буфер, приготовленный на
дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ в 50 раз.
2)	К 1,5 г агарозы добавить 2 мл 50хТАЕ буфера и 100 мл дистиллирован-
ной воды.
3)	Расплавить агарозу на электрической плите или в СВЧ-печи. Добавить
к 100 мл расплавленной агарозы 10 мкл раствора бромистого этидия. Переме-
шать.
4)	Залить агарозный гель согласно инструкции к аппарату для горизон-
тального электрофореза.
Для заливки агарозного геля удобно использовать крышки для иммуноло-
гических планшетов подходящих размеров. Для получения карманов в агароз-
ном геле установить гребенку на планшет, используя зажим типа "бульдог".
Охладить агарозу до температуры 50-60°С и налить на планшет.
После застывания агарозы осторожно вынуть гребенку из геля и перене-
сти его в аппарат для проведения электрофореза.
5)	Добавить в каждую амплификационную пробирку по 5 мкл 6-кратного
буфера для нанесения образца.
6)	Нанести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата. предварительно
смешанного с буфером для образца (см. выше), в последовательности, соот-
ветствующей нумерации проб. Нанести положительные и отрицательные кон-
трол и.
7)	Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и за-
дать напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-
15 B/См. Провести электрофоретическое разделение продуктов амплифика-
ции в направлении от катода (-) к аноду (+) в течение 30-45 мин.
8)	Вынуть гель из формы и перенести его на стекло трансиллюминатора.
ВНИМАНИЕ! Г гелем агарозы следует работать в перчатках, тж. бромистый
этидий является сильным мутагеном.
9)	Включить трансиллюминатор и проанализировать результаты анализа.
Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-
красных полос.
АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДИАГНОСТИКИ
1)	Отрицательный контроль - отсутствие каких-либо фрагментов ДНК
2)	Положительный контроль - для хламидий выявляется полоса размером
501 н.п., для уреаплазм - 856 н.п., для микоплазм - 977 н.п.
3)	Анализируемые пробы: отсутствие полосы строго на уровне соответст-
вующего контроля свидетельствует об отрицательном ответе на присутствие
данного возбудителя. Наличие полосы, соответствующей по электрофоре™
ческой подвижности положительному контролю - наличие данного возбудите
ля в клинической пробе.
5)	Полученные результаты можно документировать фотографированием
гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) свето-
фильтра.
306
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
2. ПЦР- диагностика вируса гепатита В
Вирус гепатита В (HBV), открытый в 1965 г. В.S.Blumberg, в настоящее
время считается главным этиологическим агентом заболеваний печени и гепа-
токлеточной карциномы. HBV - самый мелкий из известных вирусов челове-
ка - представляет собой частицы размером 42 пт, состоящие из внешней обо-
лочки, представленной поверхностными антигенами пре-Sl, npe-S2, S, и нук-
лсокапсида, представленного нуклеиновой кислотой, окруженной белком
сердцевины - Core. Геном вируса представлен кольцевой частично двухцепо-
чечной молекулой ДНК размером около 3200 п.о. и имеет следующие гены:
pol- кодирует вирусную полимеразу, S- кодирует белки внешней оболочки
(HBsAg, npeSl, npeS2) С - кодирует белок нуклеокапсида (HBcAg) и секрети-
руемый белок ( HBcAg), X- кодирует белок, участвующий в регуляции вирус-
ной репликации и экспрессии вирусных белков. Предполагается существова-
ние дополнительных рамок считывания, роль которых в настоящее время ак-
тивно изучается. Кодирование значительного количества вирусных белков и
регуляторных элементов при незначительных размерах вирусного генома
обеспечивается полным или частичным перекрыванием генов (рис. 1).
Н Вс-Ад
НВеАд(-) || core Р21
'ТТТГТТТ'ТТТТТТТТ
:: CORE Р23
Thr->Stop
TGG— TAG I^XXXXXXXXXXXXXX1
PRE-CORE
::::::: core
ti
S (HBsAg)
НВеАд
ДНК 3200 н.п.
I » I I I У » I  I 1~
х-ген


Рис. 1. Организация генома вируса гепатита В
Серологическая диагностика включает в себя определение основных ви-
русных антигенов и антител к ним методом ИФА, а также определение вирус-
ной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). К основным иммуно-
логическим маркерам относят HBsAg, HBcAg, анти-НВс IgM, анти-IIBs. анти-
НВс. Развитие методов генодиагностики, в первую очередь ПНР. позволило
значительно увеличить информативность лабораторной диагностики. Нали-
чие HBV-Д! IK в сыворотке пациента свидетельствует о репликативной актив
ности вируса. Метод 11ЦР обладает черезвычайной чувствительностью (100 -
1000 копий/мл), что очень важно при низких титрах вируса. В настоящее вре-
мя ПЦР совместно с другими лабораторными тестами используется при поста-
новке диагноза вирусного гепатита и при проведении антивирусной терапии. В
ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ МЕТОДОМ ПЦР 307
приводимой ниже методике использованы праймеры к консервативным участ-
кам гена s. Приводимая ниже процедура пробоподготовки и постановки ПЦР
лежит в основе инструкции к набору ПОЛИГЕП-В для обнаружения вируса
гепатита В в сыворотке или плазме крови ТУ -9398-408-17253567-97.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Специфичность анализа
В положительном контрольном образце (ДНК вируса гепатита В) должна
выявляться одна полоса оранжево-красно! о цвета после электрофоретиче-
ского разделения продуктов амплификации в агарозном геле, соответствую-
щая по подвижности фрагменту генома вируса гепатита В размером 307 пар
нуклеотидов.
В отрицательном контрольном образце полоса оранжево-красного цвета,
соответствующая фрагменту генома вируса гепатита В, должна отсутствовать.
Необходимое оборудование
1.	) Пипс7ки полуавтоматические одноканальные на 1-20, 5-40, 40-200, 200-
1000 мкл
2)	Наконечники с фильтрами к пипеткам (ART-tips)
3)	Микропробирки пластиковые на 1,5 мл и 0,5 мл
4)	Штативы для микропробирок
5)	Микроцен грифу га на 12 тыс. об/мин для 1,5 и 0,5 мл пробирок
6)	Прибор для горизонтального электрофореза
7)	Программируемый термостат (ДНК амплификатор)
8)	Ультрафиолетовый трансиллюминатор
9)	Водоструйный или вакуумный насос с колбой-ловушкой
10)	СВЧ-печь, электрическая плитка или водяная баня на 95-1000 С
11)	Встряхиватель для микропробирок (типа ь‘Вортекс”)
12)	Одноразовые резиновые или пластиковые перчатки
Реактивы
1)	денатурирующий раствор (3 М гуанидинтиоцианат; 50 мМ трис-HCL;
50% фенол; 0.3 М ацетат натрия, pH 7,5);
2)	изопропиловый спирт;
3)	промывочный раствор (70% этиловый спирт );
4)	раствор носителя ( транспортная РНК; 1 мг/мл) ;
5)	вода деионизованная;
6)	10-кратный буфер для проведения ПЦР (0,1 М трис-НС1, pH 8,8; 25 мМ
MgCl; 0,5 М КС1; 0,1% раствор желатина, 0,5% - раствор твин-20),
7)	раствор праймеров HBV следующего состава:
HBV" 1 5'-GAT ТСС TAG GAC ССС TGC TCG TGT ТАС-3'
HBV_2 5' -A AT TAG AGG АСА А AC GGG С A A CAT АСС-3'
в концентрации 10 рмоль/мкл каждого;
8)	раствор дНТФ (2,5 мМ каждого);
9)	Taq полимераза ( НПФ “Литех”), 5 ед/мкл;
10)	масло вазелиновое;
11)	агароза;
12)	50-кратный ТАЕ-буфер (2М Трис-ацетат. pl I 8.2. 0,05М ЭДТА);
13)	6-кратный буфер для нанесения образца (40% сахароза, 0,25% бром-
308
Том И - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
феноловый синий);
14)	раствор бромистого этидия, 1%;
15)	контрольный образец НВ V-ДНК, с концентрацией не менее 10 фг\мкл.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Выделение ДНК из сыворотки или плазмы крови
Забор клинического материала
Для получения сыворотки венозную кровь в количестве 500 мкл собирают
в полипропиленовую 1,5 мл пробирку и дают свернуться. Пробирку центрифу-
гируют, полученную сыворотку переносят в стерильную полипропиленовую
1,5 мл пробирку, используя наконечник с фильтром. Сыворотку крови можно
хранить при температуре -20°С в течение 1 месяца.
Для получения плазмы венозную кровь в количестве 500 мкл собирают в
стерильную полипропиленовую 1,5 мл пробирку с 50 мкл 0,5 М раствора ЭД-
ТА. Тщательно перемешивают, пробирку центрифугируют, полученную плаз-
му переносят в стерильную полипропиленовую 1.5 мл пробирку, используя на-
конечник с фильтром. Плазму крови можно хранить при температуре -20°С в
течение 1 месяца.
Обработка сыворотки или плазмы крови перед проведением ампли-
фикации (выделение ДНК).
1)	В чистую 1,5 мл полипропиленовую пробирку внести 3 мкл раствора но-
сителя и 450 мкл денатурирующего раствора.
2)	Добавить 50 мкл исследуемой сыворотки или плазмы крови. Во избежа-
ние контаминации образцов сыворотку или плазму крови следует переносить
в пробирку с денатурирующим раствором, используя наконечники с фильтрами.
3)	Тщательно перемешать на вортексе в течение 10 сек. Инкубировать при
комнатной температуре (+18-25‘С) в течение 10 мин.
4)	Центрифугировать в течение 5 сек при 12 тыс. об/мин. при комнатной
температуре.
5)	Добавить 100 мкл хлороформа, перемешать на вортексе в течение 5 сек.
6)	Центрифугироват ь в течение 5 мин при 12 тыс. об/мин. при комнатной
температуре.
7)	Перенести 300 мкл верхней фазы в чистую полипропиленовую пробир-
ку, содержащую 300 мкл изопропилового спирта. Перемешать на вортексе в
течение 5 сек. Во избежание контаминации данную процедуру следует прово-
дить, используя наконечники с фильтрами.
8)	Центрифугировать с течение 15 мин при 12 тыс. об/мин. при комнатной
температуре.
9)	Отбросить супернатант, используя вакуумный аспиратор, в колбу-ло-
вушку. Данную манипуляцию проводить с особой осторожностью, нс допуская
захвата осадка.
10)	Добавить 1 мл промывочного раствора, перемешать.
11)	Центрифугировать в течение 5 мин при 12 тыс *ин. при комнатной
температуре.
ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ МЕТОДОМ ПЦР 309
12)	Удалить супернатант как можно полнее, нс захватив при этом осадок.
Осадок подсушить в течение 10-20 мин.
13)	Добавить 30 мкл деион изованной воды, пробирки закрыть, инкубиро-
вать в течение 10 мин при комнатной температуре, затем перемешать встря-
хиванием. Раствор очищенной ДНК можно хранить при температуре -20'С в
течение двух недель .
Проведение полимеразнои цепной реакции
Перед проведением ПЦР необходимо комплект реактивов для проведения
реакции, хранящийся при температуре -20°С. разморозить, оставив его при
комнатной температуре на 15-20 мин.
1)	Приготовить 0,5 мл пробирки для проведения амплификации в количе-
стве, соответствующем количеству исследуемых образцов, пронумеровав их и
расположив соответствующим образом в штативе. Приготовизъ также по 1
пробирке для положительного и 1 пробирке для отрицательного контроля на
каждые 20 исследуемых образцов.
2)	Приготовить смесь компонентов для амплификации из расчета на одну
пробу:
10х ПЦР буфер	3 мкл
Праймеры HBV	3 мкл
Вода деионизованная 23 мкл
Taq-полимераза	0,2 мкл
3)	Смесь перемешать пипетированием и внести по 27 мкл в каждую про-
бирку для амплификации.
4)	Внести по одной капле (около 25 мкл) вазелинового масла в каждую
пробирку, используя пипетку с наконечником вместимостью 1 мл.
5)	Внести по 3 мкл раствора анализируемого образца в соотвстсгвующие
пробирки индивидуальным наконечником с фильтром. Внести 3 мкл деионизо-
ванной воды в 1 пробирку, помеченную как отрицательный контроль, и 3 мкл
HBV ДНК в I пробирку, помеченную как положительный контроль.
6)	Пробирки закрыть, центрифугировать в течение 5 сек при 3 тыс. об/мин.
при комнатной температуре, поместить в программируемый термостат (амп-
лификатор), нагретый заранее до 94°С, и провеет реакцию по следующей
программе:
94ПС....40 сек
60°С.....60 сек	количество циклов	5
72ПС....15 сек
92”С.........30	сек
6О°С.....30 сек	количество циклов	35
72“С.........45	сек
РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
1)	Залить в аппарат для электрофореза 500 мл 1x3 АЕ-буфера, приготов-
ленного на дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ-буфера в 50 раз.
2)	К 2,5 г агарозы добавить 2 мл 50хТАЕ-буфера и 100 мл дистилл ировай-
ной воды.
3)	Расплавить агарозу на электрической плите или в СВЧ печи. Добавить
310 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
к 100 мл расплавленной агарозы 5 мкл раствора бромистого этидия. Перемешать.
4)	Залить агарозный гель согласно инструкции к аппарату для горизон-
тального электрофореза.
Для заливки агарозного геля удобно использовать крышки для иммуноло-
гических планшетов подходящих размеров. Для получения карманов в агароз-
ном геле установить гребенку на планшет, используя зажим типа бульдог
Охладить агарозу до температуры 50-60 С и налить на планшет.
После застывания агарозы осторожно вынуть гребенку из геля и перене-
сти его в аппарат для проведения электрофореза.
5)	Добавить в каждую амплификационную пробирку по 5 мкл 6-кратного
буфера для нанесения образца.
6)	Нанести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата, предварительно
смешанного с буфером для нанесения образца (см. выше), в последовательно-
сти, соответствующей нумерации проб. Нанести в карманы геля по 10-15 мкл
положительного и отрицательного контроля, предварительно смешанных с
буфером для нанесения образца.
7)	Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и за-
дать напряже ние, соответствующее напряженности электрического поля 10-
15 B/См. Провести электрофоретическое разделение продуктов амплифика-
ции в направлении от катода (-) к анод}' (+) в течение 30-45 мин.
8)	Вынуть гель из формы и перенести его на стекло трансиллюминатора.
ВНИМАНИЕ! С гелем агарозы следует работать в перчатках, гак как броми-
стый этидий является сильным мутагеном.
9)	Включить трансиллюминатор и проанализировать результаты анализа.
Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-
красных полос.
АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ
1)	Отрицательный контроль - полоса оранжево-красного цвета должна от-
сутствовать.
2)	Положительный контроль - выявляется полоса оранжево-красного цве-
та размером 307 пар нуклеотидов.
3)	Анализируемые пробы: отсутствие полосы оран же во-красного цвета
строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отрицатель-
ном ответе на присутствие данного возбудителя. 1Наличие полосы оранжево-
красного цвета, соответствующей по электрофоретической подвижности по-
ложительному контролю - наличие данного возбудителя в пробе сыворотки
или плазмы крови.
4)	Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о конта-
минации компонентов набора.
5)	Полученные результаты можно документировать фотографированием
гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) свето-
фильтра.
ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ МЕТОДОМ ПЦР
311
3. Выявление вируса гепатита С методом
полимеразной цепной реакции
Начиная с 1973 года, когда были разработаны иммуноферментные тес г-си-
стемы для диагностики вирусов гепатита А и В, большую часть посттрансфу-
зионных гепатитов (около 2/3 случаев) стали относить к классу ни А. ни В.
Интенсивные исследования гепатитов вирусной этиологии позволили выявить
в 1989 году новый РНК-содержащий гепатотропный вирус, в дальнейшем по-
лучивший название вируса гепатита С. По своим биологическим и молекуляр-
ным характеристикам этот вирус был отнесен к семейству Flaviviridac и выде-
лен в отдельный вид Hepacivirus наряду с уже известными видами Flavivirus и
Pestivirus. Вирион вируса гепатита С имеет сферическую форму и окружен ли-
пидной оболочкой. По последним данным эта липидная оболочка состоит из
липопротеинов низкой плотности организма хозяина (человека) и облегчает
вирусу проникновение через цитоплазматическую мембрану гепатоцита.
Геном вируса гепати-
та С представлен ли-
нейной молекулой
РНК. с ко горой в хо-
де размножения ви-
руса синтезируют-
ся вирусные белки
(пл юс-цепь РНК).
Размер вирусного ге-
3‘ NCR
5* NCR С Е1 Е2 NS2 NS3 NS4 NS5
1 раунд амплификации
262 п.н.
2 раунд амплификации
нома составляет око-
ло 9,5 kb и подразде-
ляется на несколько
Рис. 2. Схема генома вируса гепатита С с указанием
области, используемой для обнаружения РНК ви-
руса гепатита С в сыворотке или плазме крови ме-
тодом полимеразной цепной реакции набором
ПОЛИГЕП-С ТУ-9398-409-17253567-97.
функциональн ых
зон: 5 нетрансли-
ру емый регион (5'
NCR), Core область
(С), участки, кодиру
ющис белки оболоч-
ки вируса (Е1/Е2).
протеазу/геликазу (NS3), РНК зависимую РНК полимеразу (NS5) и 3' нс-
транслируемую область (рис.2).
С момента открытия вируса гепатита С и клонирования участков его гено-
ма активно разиваются методы тестирования его присутствия в организме хо-
зяина. Традиционно - эго иммуноферментные методы выявления ан тител, вы-
рабатываемых организмом хозяина в период контакта с вирусом, и генодиаг-
ностика, позволяющая непосредственно установить наличие РНК вируса гепа-
тита С в биопробе. На сегодняшний день алгоритм лабораторной диагностики
и мониторинга вирусного гепатита С включает обязательные стадии опреде-
ления в сыворотке больного суммарных ан ти тел к вирусным белкам и выявле
ния у больного HCV РНК, являющуюся показателем активности вирусного
процесса. Для выявления РНК вируса гепатита С широко используют метод
РТ ПЦР, состоящий в проведении обратной трансприпции матрицы РНК ви-
руса и амплификации специфических участков полученной кДНК. Особенно-
стью вируса гепатита С является его крайняя изменчивость. Исходя из срав-
312
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
нительного анализа различных штаммов и изолятов вируса, выявлено 11 ти-
пов, в свою очередь подразделяющихся на 70 субтипов вируса гепатита С.
Очень немногие участки вирусного генома являются консервативными. К ним
относятся 5' нетранслируемая и Core области, обычно используемые для под-
бора специфичных праймеров при детекции РНК вируса гепатита С. Для диаг-
ностики вируса гепатита С подобрана “гнездная” система праймеров, компле-
ментарных 5 -нетранслируемой области вирусного генома. В этом случае про-
дукт амплификации с внешней парой праймеров служит матрицей для ампли-
фикации с внутренней парой праймеров (рис. 2).
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
С и ецифи чност ъ анализа
В положительном контрольном образце (РНК вируса гепатита С) должна
выявляться одна полоса оранжево-красного цвета после электрофоретиче-
ского разделения продуктов амплификации в агарозном геле, соответствую-
щая по подвижности фрагменту генома вируса гепатита С размером 217 пар
нуклеотидов.
В отрицательном контрольном образце полоса оранжево-красного цвета,
соответствующая фрагменту генома вируса гепатита С, должна отсутствовать.
Оборудование
1)	Пипетки полуавтоматические одноканальныс на 1-20, 5-40, 40-200,200-
1000 мкл
2)	Наконечники с фильтрами к пипеткам
3)	Микропробирки пластиковые на 1,5 мл и 0,5 мл
4)	Штативы для микропробирок
5)	Микроцентрифуга на 12 тыс. об/мин для 1,5 и 0,5 мл пробирок
6)	Прибор для горизонтального электрофореза
7)	Программируемый термостат (ДНК амплификатор)
8)	Термостат на 45-55°С под 1,5 мл пробирки
9)	Ультрафиолетовый трансиллюминатрр
10)	Водоструйный или вакуумный насос с колбой - ловушкой
11)	Элек трическая плитка, СВЧ-печь или водяная баня на 95-100"С
12)	Встряхиватель для микропробирок (типа “Вортекс”)
13)	Одноразовые резиновые или пластиковые перчатки.
Реактивы
1.	Денатурирующий раствор (3 М гуанидин тиоцианат; 50 мМ трис-HCL;
50% фенол; 0.3 М ацетат натрия, pH 7,5)
2,	Изопропиловый спирт
3.	Промывочный раствор (70% этиловый спир т )
4.	Раствор носителя ( транспортная РНК; 1 мг/мл)
5.	Воду деионизованную, обработанная DEPC
6.	10-кратный буфер для проведения РТ ПЦР (0,1 М трис-НС1, pH 8,8; 25
мМ MgC|; 0,5 М КС1; 0.1% раствор желатина, 0,5% - раствор гвин-20)
7.	Раствор праймеров HCV1 следующего состава:
HCV1-1 AGA AAG CGT СТА GCC ATG GCG ТТА GT
HCV1_2 AGA ССТ ССС GGG GCA СТС GCA AGC А
в концентрации 10 рмоль/мкл каждого
ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ МЕТОДОМ ПЦР 313
8.	Раствор праймеров HCV2 следующего состава:
НСV2_l GTG TCG TGC AGC СТС CAG GAC С;
HCV2_2 GGG CAG TCG CAA GCA CCCTATC,
в концентрации 10 рмоль/мкл каждого
9.	Раствор дНТФ (2,5 мМ каждого)
10.	Обратная транскриптаза (фирма Promega, США), 200 ед/мкл
11.	Ингибитор рибонуклеаз (фирма Promega, США), 30 ед/мкл
12.	Taq-пол и мераза (фирма Promega, США), 5 ед/мкл
13.	Масло вазелиновое
14.	Агароза
15.	50- кратный ТАЕ-буфер (2М Трис-ацетат, pH 8,2, 0,05М ЭДТА)
17.	6- кратный буфер для нанесения образца (40% сахароза, 0.25% бром-
феноловый синий)
18.	Раствор бромистого этидия, 1%
19.	Контрольная положительная сыворотка, содержащая вирус гепатита С.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Выделение РНК из сыворотки или плазмы крови
Забор клинического материала
Для получения сыворотки венозную кровь в количестве 500 мкл собирают
в полипропиленовую 1,5 мл пробирку и дают крови свернуться. Пробирку цен-
трифугируют, полученную сыворотку переносят в стерильную полипропиле-
новую 1.5 мл пробирку, используя наконечник с фильтром. Сыворотку крови
можно хранить при температуре -20f,C в течение 1 месяца.
Для получения плазмы венозную кровь в количестве 500 мкл собирают в
стерильную полипропиленовую 1,5 мл пробирку с 50 мкл 0,5 М раствора
ЭДТА. Тщательно перемешивают, пробирку центрифугируют, полученную
плазму переносят в стерильную полипропиленовую 1,5 мл пробирку, исполь-
зуя наконечник с фильтром. Плазму крови можно хранить при температуре -
20иС в течение I месяца.
Обработка сыворотки или плазмы крови перед проведением ампли-
фикации (выделение РНК}
1)	В чистую 1,5 мл полипропиленовую пробирку внести 3 мкл раствора но-
сителя и 450 мкл денатурирующего раствора.
2)	Добавить 50 мкл исследуемой сыворотки или плазмы крови. Во избежа-
ние контаминации образцов сыворотку или плазму крови следует перено-
сить в пробирку с денатурирующим раствором, используя наконечники с
фильтрами. Тщательно перемешать на вортексс в течение 10 сек. Инкубиро-
вать при комнатной температуре (+18-25°С) в течение 10 мин.
3)	Центрифугировать в течение 5 сек при 12 тыс. об/мин при комнатной
температуре.
4)	Добавить 100 мкл хлороформа, перемешать на вортексс в течение 5 сек.
5)	Центрифугировать в течение 5 мин при 12 тыс. об/мин при комнатной
температуре.
6)	Перенести 300 мкл верхней фазы в чистую полипропиленовую пробир-
ку, содержащую 300 мкл изопропилового спирта. Перемешать на вортсксе в
314 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
течение 5 сек. Во избежание контаминации данную процедуру следует про-
водить, используя наконечники с фильтрами.
7)	Центрифугировать в течение 15 мин при 12 тыс. об/мин при комнатной
температуре.
8)	Отбросить супернатант, используя вакуумным аспиратор, в колбу-ло-
вушку. Данную манипуляцию проводить с особой осторожностью, не допуская
захвата осадка.
9)	Добавить 1 мл промывочного раствора, перемешать, центрифугировать
в течение 5 мин при 12 тыс. об/мин при комнатной температуре.
10)	Удалить супернатант как можно полнее, нс захватив при этом осадок.
Осадок подсушить в течение 10-20 мин.
11)	Добавить 30 мкл деионизованной воды, пробирки закрыть, инкубиро-
вать в течение 10 мин при комнатной температуре, затем перемешать встря-
хиванием. Раствор очищенной РНК можно хранить при минус 20(1С в течение
двух недель.
Проведение реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции
Перед проведением ПЦР необходимо комплект реактивов для проведения
ПЦР, хранящийся при температуре -20'С, разморозить, оставив его при ком-
натной температуре на 15-20 мин.
1)	Приготовить 0,5 мл пробирки для проведения амплификации в количе-
стве, соответствующем количеству исследуемых образцов, пронумеровав их и
расположив соответствующим образом в штативе. Приготовить также по 1
пробирке для положительного и 1 пробирке для отрицательного контроля на
каждые 20 исследуемых образцов.
2)	Приготовить смесь компонен тов для амплификации из расчета на одну
пробу:
10х ПЦР буферЕ	3 мкл
Праймеры НСVI	3 мкл
Раствор дНТФ	3 мкл
Вода деионизованная	18 мкл
Taq - пол и м е раза	Е.1 ед
Обратная транскриптаза	10 ед
Ингибитор рибонуклеаз	5 ед
3)	Смесь перемешать пилотированием и внести по 27 мкл в каждую про-
бирку для амплификации.
4)	Внести по одной капле (около 25/мкл) вазелинового масла в каждую
пробирку, используя пипетку с наконечником вместимостью 1 мл.
5)	Внести по 3 мкл раствора анализируемого образца в соответствующие
пробирки индивидуальным наконечником с фильтром. Внести 3 мкл деиони
зованной воды в 1 пробирку, помеченную как отрицательный контроль, и 3
мкл HCV РНК в 1 пробирку, помеченную как положительный контроль.
6)	Пробирки закрыть, центрифугировать в течение 5 сек при 3 тыс. об/мин
при комнатной температуре, поместить в программируемый термостат (амп-
нификатор), нагретый заранее до 42ПС, и провести реакцию по следующей
программе:
ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ МЕТОДОМ ПЦР	315
42°С........ 1	час
94°С........40	сек
60°С........60	сек
72°С........15	сек
92°С........30	сек
60пС...30 сек
72"С........45	сек
количество циклов 1
количество циклов 5
количество циклов 30
Проведение “гнездной'' реакции амплификации с внутренней парой
праймеров
1)	Приготовить 0,5 мл пробирки для проведения амплификации, пронуме-
ровав их и расположив соответствующим образом в штативе.
2)	Приготовить смесь компонентов для амплификации из расчета на одну
пробу:
10х ПЦР буферЕ	3 мкл
Праймеры HCV2	3 мкл
Раствор дНТФ	3 мкл
Вода деионизованная	18 мкл
Taq -пол и мераза	Е.1 ед
3)	Смесь перемешать пипетированием и внести по 27 мкл в каждую про-
бирку для амплификации.
4)	Внести по одной капле (около 25 мкл) вазелинового масла в каждую
пробирку, используя пипетку с наконечником вместимостью 1 мл.
5)	Внести по 3 мкл продукта амплификации с внешней парой праймеров в
реакционную смесь.
6)	Пробирки закрыть центрифугировать в течение 5 сек при 3 тыс. об/мин
при комнатной температуре, поместить в программируемый термостат (амп-
лификатор), нагретый заранее до 92'С, и провести реакцию по следующей
программе:
92°С........20	сек
60"С....20 сек	количество циклов 15
72°С........30	сек
РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
1)	Залить в аппарат для электрофореза 500 мл lxTAE-буфера, приготов-
ленного на дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ-буфера в 50 раз.
2)	К 2,5 г агарозы добавить 2 мл 50хТАЕ-буфера и 100 мл дистиллирован-
ной воды.
3)	Расплавить агарозу на электрической плите или в СВЧ печи. Добавить
к 100 мл расплавленной агарозы 5 мкл раствора бромистого этидия. Переме-
шать.
4)	Залить агарозный гель согласно инструкции к аппарату для горизон-
тального электрофореза.
Для заливки агарозного i еля удобно использовать крышки для иммуноло-
гических планшетов подходящих размеров. Для получения карманов в агароз-
ном геле установить гребенку на планшет, используя зажим типа бульдог .
И6 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Охладить агарозу до температуры 50-60°С и налить на планшет.
После застывания агарозы осторожно вынуть гребенку из геля и перене-
сти его в аппарат для проведения электрофореза.
5)	Добавить в каждую амплификационную пробирку по 5 мкл 6-кратного
буфера для нанесения образца.
6)	Нанести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата, предварительно
смешанного с буфером для нанесения образца (см. выше), в последовательно-
сти, соответствующей нумерации проб. Нанести в карманы геля по 10 15 мкл
положительного и отрицательного контроля, предварительно смешанных с
буфером для нанесения образца.
7)	Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и за-
дать напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10
15 B/См. Провести электрофоретическое разделение продуктов амплифика-
ции в направлении от катода (-) к аноду (+) в течение 30-45 мин.
8)	Вынуть гель из формы и перенести его на стекло трансиллюминатора.
ВНИМАНИЕ! С гелем агарозы следует работать в перчатках, так как броми-
стый этидий является сильным мутагеном.
9)	Включить трансиллюминатор и проанализировать результаты анализа.
Фрагменты анализируемой ДИК проявляются в виде светящихся оранжево-
красных полос.
АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ
1)	Отрицательный контроль - полоса оранжево-красного цвета должна
отсутствовать.
2)	Положительный контроль - выявляется полоса оранжево-красного
цвета размером 217 пар нуклеотидов.
3)	Анализируемые пробы: отсутствие полосы оранжево-красного цвета
строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отрицатель-
ном ответе на присутствие данного возбудителя. Наличие полосы оранжево-
красного цвета, соответствующей по электрофоретической подвижности по-
ложительному контролю - наличие данного возбудителя в сыворотке или
плазме крови.
4)	Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о конта-
минации компонентов набора.
5)	I [слученные результаты можно документировать фотографированием
гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) свето
фильтра.
I
ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ МЕТОДОМ ПЦР 317
4. Выявление микобактерий туберкулезного комплекса
методом полимеразной цепной реакции
В последние годы проблема туберкулеза приобретает приорите гное значе-
ние в группе инфекционных легочных заболеваний человека. Об этом свиде-
тельствует статистика заболевания и смертности от туберкулеза как в странах
Зап. Европы, так и в Российской Федерации. В 1994 г. заболеваемость тубер-
кулезом в России достигла в среднем 50 человек на 100 тыс. населения. В на-
стоящее время тенденция к ухудшению эпидемиологической ситуации по ту-
беркулезу в мире продолжает сохраняться.
Туберкулез относится к числу плохо диагностируемых и трудноизлечивае-
мых заболеваний, поэтому большинство усилий последних лет направлено на
разработку методов ДНК-диагностики, позволяющих решить следующие воп-
росы:
-	разработка эффективной диагностики заболевания, особенно на ранних
стадиях развития болезни:
определение штаммовой принадлежности возбудителя туберкулеза и, как
следствие, прогнозирование течения заболевания и эпидемиологический про-
гноз его распространения;
-	изучение генетической природы и механизмов устойчивости микобакте-
рий к традиционному спектру противотуберкулезных антибиотиков для успеш-
ного проведения терапии.
Диагностика туберкулеза основана на сочетании клинических, рентгеноло-
гических и лабораторных методов исследования. Основным критерием поста-
новки диагноза туберкулез в нашей стране является выявление возбудителя
туберкулеза с помощью традиционных лабораторных методов, к которым от-
носятся бактериоскопия (микроскопия мазков, окрашенных по Циль-Нильсе-
ну), люминесцентная микроскопия, культуральный метод (посевы на пита-
тельные среды Левснштейна-Йснсена) и биологический метод исследования
(заражение лабораторных животных).
Чувствительность указанных методов исследования следующая:
-	бактериоскопия окрашенных мазков - 10000-1000000 кл/мл;
-	люминесцентная микроскопия - 10000 кл/мл.
Подобная концентрация микроорганизмов встречается в клиническом ма-
териале от больных на поздних стадиях заболевания.
Исследование биологическим методом (биопроба на чувствительность ла-
бораторных животных ) является;
1) Дорогостоящим и длительным до 3 мес. с момен та заражения;
2) Не всегда успешным, что касается штаммов, устойчивых к антибактери-
альным препаратам или обладающих ослабленной вирулентностью.
Основное место в диагностике туберкулеза в настоящее время занимает
микробиологическая диагностика возбудителя (посев на дифференциальные
питательные среды) и получение морфологически регистрируемых колоний.
Чувствительность данного метода составляет не менее 100 кл/мл. Однако, сле-
дует отметить, что микобактерии туберкулезного комплекса относятся к мед-
ленно растущим микроорганизмам и выявление их. а. следовательно, и поста-
новка диагноза, требует времени от 6 недель до 3 месяцев, необходимого для
318
Том II - ЧАСТ НЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
формирования колоний. Кроме того, следует отметить, что формирование ко-
лоний затруднено в случае выделения пациентом ослабленных, маложизнеспо-
собных или мертвых микобактерий туберкулеза.
Следует отметить также, что микробиологические посевы являются ин-
формативными и адекватными только в 52-65% случаев активного туберкуле-
за легких. При внелегочных формах заболевания процент выявления микоба-
ктерий еще ниже. При туберкулезных менингитах рост микобактерии на пита-
тельных средах обнаруживается лишь в 3% случаев. I {езначительным являет-
ся процент выссвасмости у больных туберкулезом мочеполовой системы.
Учитывая все вышеизложенное, можно сделать вывод, что основным недо-
статком всех методов диагностики туберкулеза на сегодняшний день является
длительность лабораторных исследований и недостаточная чувствительность.
13 связи с этим разработка эффективной диагностики, использующей сов-
ременные достижения молекулярной биологии, позволила создать новые по-
коления диагностических систем, основанные на распознавании и селективной
амплификации фрагмента генома возбудителя туберкулеза^ В последние годы
предложено значительное количество ПЦР-диагностических систем (в нашей
стране и за рубежом), позволяющих с высокой чувствительностью проводить
эк с п ресс -ди агности к у ту берк ул е за.
Преимущества ДНК диагностики, по сравнению с традиционными метода-
ми, следующие:
1)	Прямое определение инфекционного агента, сочетающееся с высокой
специфичностью;
2)	Высокая чувствительность метода и лабильность, позволяющая в зави-
симости от задачи выявлять единичные микобактерии в исследуемой пробе;
3)	Быс грота проведения анализа (4-5 ч) с момента взятия пробы отбельного;
4)	Универсальность метода диагностики для всех видов клинического мате-
риала.
Для диагностики микобактерий туберкулеза подобрана сис тема праймеров,
следующего состава, комплементарных участку гена МРВ 64, позволяющая
амплифицировать фрагмент, специфичный только для микобактерий туберку-
лезного комплекса, и не выявляющая атипичные виды микобактерий.
Специфичность анализа
В положительном контрольном образце должна выявляться одна полоска
оран же во-красного цвета после электрофоретического разделения продуктов
амплификации в агарозном геле, соответствующая по подвижности фра! мен-
ту генома Mycobacterium tuberculosis или Mycobacterium bovis размером 357
пар нуклеотидов.
Необходимое оборудование
1.	Пипе тки полуавтоматические одноканальные на 1-20, 5-40, 40-200, 200-
1000 мкл
2.	Наконечники с фильтрами к пипеткам (ART-lips)
3.	Микропробирки пластиковые на 1,5 мл и 0,5 мл
4.	Штативы для микропробирок
5.	Микроцентрифуга на 12 тыс. об/мин для 1,5 и 0,5 мл пробирок
ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ МЕТОДОМ ПЦР 319
6.	Прибор для горизонтального электрофореза
7.	Программируемый термостат (ДНК амплификатор)
8.	Термостат на45-551'С под 1,5 мл пробирки
9.	Ультрафиолетовый трансиллюминатор
10.	Водоструйный или вакуумный насос с колбой - ловушкой
11.	СВЧ-печь, электрическая плитка или водяная баня на 95-100°С
12.	Встряхиватель для микропробирок (типа “Вортекс”)
13.	Одноразовые резиновые или пластиковые перчатки
14.	Колба коническая термостойкая вместимостью 250 мл
Реактивы
1)	Раствор I- 6М раствор гуанидин тиоционата, 50 мМ трис НС1, pH 7.0
2)	Раст вор II- 4М раствор гуанидин тиоцианата
3)	Раствор III- 50% этанол 50мМ NaCl, 25 трис НО pH 7.4
4)	Сорбент суспензия диатомовой земли
5)	ТЕ буфер- Юм М трис HCI, 1мМ ЭДТА, pH 8.0,
6)	Taq-полимераза (5 ед/мл)
7)	Вода деионизованная
8)	Минеральное масло
9)	10х ПЦР буфер - бббмМ трис HCI, I 66 мМ (NH4)SO4, 0,1% твин-20,
25мМ MgCl2, 0,1% желатина pH 8.8 при 25°С
10)	праймеры следующего состава:
5’ TGTCCGACCCCGCCTACAACATCAACA 3'
5’ CTTGCACAATGGGGAAGACGACTGGCA 3'
в концентрации 5рмоль/мкл каждого.
11)	раствор дезоксинуклеотидтрифосфатов (НТФ) 25мМ каждого из АТФ.
ГТФ, ЦТФ. ГТФ.
12)	Агароза
13)	50- кратный ТАЕ-буфер (50хТАЕ) (2М Трис-ацетат pH 8,2,0,05М ЭДТА)
14)	6- кратный буфер нанесения образца, (40% сахароза, 0,25% бромфе-
ноловый синий)
15)	Раствор бромистого этидия, 1%
16)	Положительный контрольный образец (ДНК из микобактерий тубер-
кулезного комлплекса в концентрации 100 фг/мкл)
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Выделение ДНК из образца
Подготовка клинических проб
Исследуемый материал (мокрота после разжижения, моча, плевральная и
спинномозговая жидкость и различные экссудаты) центрифугируют в течение
10 мин при 5000 об/мин при комнатной температуре (+18-25°С), осадок полно-
стью переносят в 100 мкл физиологического раствора, находящегося в поли-
пропиленовой 1,5 мл пробирке. Приготовленную таким образом пробу ис-
пользуют для выделения ДНК или хранят при температуре -20°С не более 2
недель.
320
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Обработка клинических проб перед проведением амплификации (выде-
ление ДНК)
1.	Анализируемые пробы прогревают в течение 20 мин при темпера гуре
+95°С.
2.	К прогретым анализируемым пробам добавляют 300 мкл раствора 1 и
10 мкл суспензии сорбента. Пробы инкубируют в течение 10 мин при комнат-
ной температуре, 1-2 раза перемешивая на вортексе.
3.	Пробы центрифугируют в течение 15 сек на микроцентрифуге при
12000 об/мин, супернатант отбрасывают.
4.	К осадку добавляют 100 мкл раствора II и встряхивают его на вортексе.
Сорбент осаждаю!' центрифугированием при 12000 об/мин, в течение 15 сек.
Супернатант отбрасывают.
5.	К осадку добавляют 1 мл раствора Ill и встряхивают его на вортексе
Сорбент осаждают центрифугированием при 12000 об/мин, в течение 15 сек.
Супернатант отбрасывают.
6.	Процедуру отмывки повторяют два раза с использованием 1,0 мл раство-
ра III, так, как это описано в п. 5.
7.	Дополнительным центрифугированием при 12(Х)0 об/мин, с последую-
щим отбрасыванием супернатанта, убирают остатки раствора III. Пробы под-
сушивают в течение 5 мин при температуре 45-55"С, оставляя пробирки от-
крытыми.
8.	В пробирки с сорбентом добавляют 50 мкл ТЕ буфера, закрывают их, пе-
ремешивают на вортексе и инкубируют в течение 5 мин при 45 55L,C.
9.	Пробирки центрифугируют в течение 15 сек при 12000 об/мин при ком-
натной температуре, водную фазу (супернатант) используют в качестве иссле-
дуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации.
Обработанные таким образом пробы можно хранить при температуре
2-8°С в течение недели или при температуре - 20"С в течение 6 месяцев.
Проведение полимеразной цепной реакции
1.	Приготовить 0,5 мл пробирки для проведения амплификации в количест-
ве, соответствующем количеству исследуемых образцов, пронумеровав их и
расположив соответствующим образом в штативе. Подготовить также по
1 пробирке для положительного и отрицательного контрольных образцов.
2.	Перенести 5 мкл раствора анализируемого образца из обработанной кли-
нической пробы в соответствующую пробирку для проведения амплификации
индивидуальным наконечником с фильтром.
3.	Внести 5 мкл положительного контрольного образца в пробирку, поме-
ченную как положительный контроль, а в пробирку, помеченную как отрица-
тельный контрольный образец, внести 5 мкл деионизованной воды,
4.	Извлечь набор для проведения полимеразной цепной реакции из моро
зильника, разморозить содержимое и перенести его в ледяную баню.
5.	Приготовить смесь реагентов согласно приведенной таблице:
ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ МЕТОДОМ ПЦР 321
Количество пробирок	Вода деионизо- 10х		10хПЦР буфер, МКЛ	Праймеры, Taq-поли-	
	ванная, мкл	дНТФ, мкл		мкл	мераза, мкл
4	54	10	10	8	0,8
8	108	20	20	16	1,6
10	135	25	25	20	2,0
16	216	40	40	32	3,2
6.	После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю
очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.
7.	Внести по 20 мкл амплификационной смеси в каждую пробирку для ам-
плификации. содержащую 5 мкл анализируемого образца.
8.	Добавить по одной капле (около 25 мкл) минерального масла в каждую
пробирку.
9.	Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 сек при комнатной
температуре (18-25 С при 12000 об/мин).
10.	Перенести пробирки в программируемый термостат (амплификатор),
нагретый заранее до +94°С, и провести амплификацию по следующей про-
грамме:
94°С - 40 сек
63“С - 30 сек количество циклов 35
72°С - 30 сек
После проведения амплификации результаты учитываются с помощью
электрофореза в 2% агарозном геле.
Отрицательный контроль - полоса оранжево-красного цвета должна отсут-
ствовать.
Положительный контроль - выявляется полоса оранжево-красного цвета.
Анализируемые пробы: отсутствие полосы оранжево-красного цвета стро-
го на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отрицательном
ответе на присутствие данного возбудителя. Наличие полосы оранжево-крас-
ного цвета, соответствующей по электрофоретической подвижности положи-
тельному контролю - наличие данного возбудителя в пробе.
Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контами-
нации компонентов набора.
322
CE LabMetod Оу
ОПТИМАЛЬНЫЕ РЕШЕНИЯ В МОЛЕКУЛЯРНО-
БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
•	Оборудование для выделения РНК и ДНК:
прибор Риболайзер с наборами реагентов
•	Оборудование для амплификации:
термоциклер ПЦР-экспресс со сменными блоками для
пробирок, планшет, предметных стекол, с градиентом
температур;
термоциклер ПЦР-спринт - компактный вариант
термоциклер Омнислайд для работы с микропрспаратами,
включая промывочные модули и рамки (методики in Situ)
•	Гибридизационные печи
•	Высушиватели гелей и
вакуумные установки
•	Секвенаторы
•	Электрофоретические
системы и транслюминаторы,
оборудование для
документации
• Криосистемы для хранения »в
биологических образцов
Общелабораторное
оборудование:
•	Микроцентрифуги серии MicroMax
•	Термостаты
•	Инкубаторы
•	Шкафы биологической защиты (ламинары) I, II и III
классов
•	Микродозаторы
НОВИНКА! • Наборы реагентов для получения
результатов ПЦР в течение одного часа!
ЛАБОРАТОРНЫЙ
КОНТРОЛЬ
ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ
ПРОЦЕДУРЫ
СОКРАЩЕНИЯ
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ГЖХ - газо-жидкостная хроматография
ГХ/МС - газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектирова-
нием
ИФА - иммуноферме нтный анализ
СФ - спектрофотометрия
ТСХ - тонкослойная хроматография
.ПС - лекарственное средство
Ж КТ - желудочно-кишечный тракт
РИА - радио-иммунологический анализ
ФИА - флюоресцентный иммуноанализ
ПФ - подвижная фаза
Л - аналитическая длина волны
С1Т - общий клиренс лекарственного средства
Стах " максимальная концентрация лекарственного средства
' шлх " время достижения макс, концентрации лекарственного средства
4/2 “ период полувыведения лекарственного средства
Vd - кажущийся объем распределения лекарственного средства
F - биодоступность лекарственного средства
РВ степень связывания лекарственного средства с белками крови
Т- увеличение
X - уменьшение
> - больше
< - меньше
ВВЕДЕНИЕ
Фармакологический эффект .ПС во многом зависит от его дозы. Однако,
эта связь не является прямой и однозначной, а зависит от многих факторов.
Зависимость эффекта от дозы реализуется через ряд последовательных ступе
ней или фаз, в числе которых всасывание и распределение ЛС составляют
фармакокинетический этап, а цепочка включения биологических реакций ха-
рактеризует все фармакодинамические этапы. Если имеется возможнос ть ко-
личественно оценить величину фармакологических эффектов, можно иссле-
довать зависимость этих эффектов от концентрации ЛС в крови. Интервал
324
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
концентраций от минимальной терапевтической до появления первых призна-
ков побочного действия называется терапевтическим диапазоном, а отноше-
ние верхней границы терапевтического диапазона к его нижней границе пред-
ставляет собой терапевтическую широту ЛС.
Задачей фармакокинетики и фармакодинамики являются обоснованные
рекомендации в отношении режимов назначения препаратов, величин поддер-
живающих доз и периодичности приема, которые обеспечивали бы быстрое
достижение и длительное поддержание концентрации ЛС в пределах терапев-
тического диапазона.
Определение границ терапевтического диапазона ЛС и оценка средних зна-
чений фармакокинетических параметров дают возможность рассчитать ре-
жим дозирования, который обеспечит поддержание средней концентрации J1C
в пределах терапевтического диапазона. Проблема индивидуализации терапии
сведется при этом к расчету режима дозирования в соответствии со значения-
ми фармакокинетических параметров ЛС у конкретных больных.
При ритмированном назначении ЛС устанавливается равновесная концен-
трация через 5-7 периодов пол у выведения. Она определяется утром натощак
через 12 ч после последнего приема препаратов. Регулярный контроль за рав-
новесной концентрацией получил название “терапевтический лекарствен-
ный мониторинг” (ТЛМ). При значительном отклонении этой концентрации
от терапевтического уровня производится индивидуальная коррекция дозиро-
вок препарата. Применение ТЛМ особенно эффективно в случае назначения
ЛС с узким терапевтическим диапазоном [ IJ. Так, например, на протяжении
многих лет теофиллин широко применяется как эффективный бронходилата-
тор в лечении бронхиальном астмы. Узкий терапевтический интервал (5-20
мкг/мл), широкая интер- и интраиндивидуальная вариабельность скорости
элиминации, обусловленная генетическими и средовыми факторами, диктуют
необходимость мониторинга уровней этого лекарства в ходе терапии.
Таким образом, исходя из выше сказанного понятно, что определение кон-
центраций ЛС в биологических жидкостях является важной задачей при под-
боре оптимальной схемы дозирования.
Для лабораторий, занятых определением концентраций ЛС в процессе
ТЛМ, особенно важны правильный сбор проб и их хранение, аналитическая
техника лабораторного анализа, расчет и интерпретация результатов.
Целью нашей работы является предоставление практической информации
по возможным методам определения некоторых известных ЛС в биологиче-
ских жидкостях.
Среди различных методов, применяемых для обнаружения ЛС в биологиче-
ских жидкостях наибольшее распространение получили иммунохимические
(ИФА, РИА и др.) и хроматофафические (ГЖХ, ВЭЖХ, ГХ/МС) методы.
Каждый из методов имеет свои преимущества и недостатки при определении
конкретных Л С.
Для удобства выполнения анализов в пределах одной лаборатории, приво-
дятся возможные условия для определения ЛС в биологических жидкостях мс
тодом ВЭЖХ.
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ 325
В качестве ориентировочных величин для каждого препарата представлен
терапевтический диапазон, приведены значения некоторых фармакокинетиче-
ских параметров. Однако, следует иметь ввиду, что все эти величины могут су-
щественно изменяться под воздействием физиологических, внешних и других
факторов (возраст, сопутствующие патологии, взаимодействие ЛС и др.).
Определение ЛС в биологических жидкостях методом ВЭЖХ
Определение ЛС в биожидкостях включает в себя следующие стадии:
-	взятие проб и их хранение;
-	изолирование Л С из биологической жидкости;
-	собственно хроматографическое разделение;
-	количественный анализ, обработку результатов, расчет параметров.
Взятие проб и их хранение. Во время исследования желательно отменить
прием других Л С. Методика взятия может изменяться в зависимости от осо-
бенностей Л С. Обычно прием исследуемого препарата проводя г в 8 часов ут-
ра натощак в известной дозе. Через 1,5-2 часа после приема препарата боль-
ные получают стандартный завтрак. Взятие проб проводят “до” и через опре-
деленные промежутки времени после приема препарата (время взятия опреде-
ляется исходя из фармакокинетических параметров ЛС - Cmax, Ттах,
Взятие проб крови для анализа проводят в количестве 5-7 мл в гепаринизиро-
ванные пробирки, плазму крови отделяют центрифугированием. Хранят про-
бы для анализа при -20°С.
Следует отметить, что это общие рекомендации. В каждом случае могут
быть свои особенности в зависимости от физико-химических свойств ЛС и его
фармакокинетических характеристик.
Изолирование ЛС из биологической жидкости. Извлечение ЛС из биоло-
гической жидкости будет описано на конкретных примерах, так как носит ин-
дивидуальный характер и зависит от физико-химических свойств определяе-
мых веществ.
Подбор условий хроматографического разделения методом ВЭЖХ включа-
ет в себя выбор типа детектора (спектрофотометрический или флюорометри-
ческий детектор) и условий детектирования (аналитическая длина волны), опти-
мального состава подвижной фазы и скорости подачи элюента. Условия также
определяются физико-химическими свойствами исследуемого соединения.
При подборе состава элюента исходят из соображений наилучшего отделе-
ния пика Л С от пиков соэкстрактивных веществ, а также доступности раство
рителей для анализа, простоты приготовления подвижной фазы.
Полученный элюент фильтруют, дегазируют под вакуумом в течение 1-2
минут, после чего используют для хроматографирования
Количественный анализ проводят методом абсолютной калибровки по
площади (при наличии интегратора) или высоте пиков, а также методом внут-
реннего стандарта.
Цостоверность результатов количественного определения оценивают, рас-
считывая точность и воспроизводимость метода Истинное содержание препа-
рата в пробе должно находиться к рассчитанных доверительных границах.
326
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Расчет фармакокинетических параметров проводят с помощью различных
программ для персонального компьютера (например программы M-IND) [2]
Статистическую обработку проводят с помощью программ STATGRAF,
EXCEL и др.
Материалы и оборудование. Для проведения исследований необходимы:
посуда для отбора проб (центрифужные пробирки, гепаринизированные про-
бирки), иглы для забора крови, пробирки с герметичными крышками, мерные
пипетки, конические колбы для упаривания, колба для дегазирования подвиж-
ной фазы., микрошприц для хроматографического анализа на 100 мкл, бумаж-
ные фильтры, мембранный фильтр IIVLP 0,45 мкм Millipor (Франция) или по-
добный, роторный испаритель (упаривание обычно проводят при температуре
37-40°С), центрифуга, vortex, жидкостной хроматограф (Shimadzu (Япония),
Hewlett Packard (США). Милихром (Россия) и др.), включающий спектрофо-
тометрический и флюориметрический детектор, интегратор или самописец,
колонка с обратно-фазным сорбентом, основным из которых является сор-
бент на основе силикагеля с привитой фазой С18 (например это готовые
стальные колонки “Lichrosoib Cl 8” размером 250 х 4,6 мм, “Nuclcosil 120-3
Cl 8” размером 125 х 4 мм, “Zorbax ODS” размером 150 х 4,6 мм и др.).
Примечание'. Следует иметь ввиду, что в зависимости от используемой ко-
лонки время удерживания исследуемого вещества может колебаться. Это мо-
жет быть скорректировано изменением соотношения водной и органической
фаз в элюенте.
Нестероидные противовоспалительные препараты
Диклофенак натрия (вольтарен, ортофен) [3, 5, 6]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Ацетонитрил для жидкостной хромато-
графии. Кислота орто-фосфорная, ч.д.а. Хлороформ. 0,1 М ацетатный буфер
(pH 4,5). Вода бидистиллированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещаю! 1
мл биологической жидкости, добавляют 200 мкл 1М раствора орто фосфор-
ной кислоты и 4 мл хлороформа, тщательно перемешивают и экстрагируют в
течение 10 минуг; затем центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Органи-
ческий слои перенося г в колбу для упаривания и упаривают досуха. Сухой ос-
таток растворяют в 150 мкл элюента. Аликвоту (100 мкл) используют для
хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с не
ременной длиной волны. X - 280 нм. ПФ - смесь ацетонитрила с 0.1 М ацетат-
ным буфером (pl I 4,5) в объемном соотношении 35:65. Скорость элюирования
1.5 мл/мин Время выхода пика ортофена 6 мин.
Количественное определение. Метод - внутренне! о стандарта. Внутренний
стандарт индометацин (время выхода - 8 мин). Предел обнаружения 5 нг/мл .
Терапевтический диапазон - общепризнанных терапевтических границ нет.
Фармакокинетика - TmdX 1 -3 ч: 11/2 1-2 ч; РВ>99%; Е 60%; С|Пах после одно-
кратного перорального приема 50 мг составляет в среднем 1134 нг/мл. Фарма-
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ 327
кокинетика ортофсна характеризуется быстрым всасыванием и выделением, а
также очень интенсивным распределением препарата по органам и тканям.
При приеме ортофена вместе с пищей резко увеличивается время достижения
максимальной концентрации и снижается клиренс, а период полувыведения и
площадь под фармакокинетической кривой практически не меняются. Заболе-
вания печени и почек значительно увеличивают период полувыведения, слабо
влияют на время достижения максимальной концентрации и клиренс. У пожи-
лых людей значительно увеличиваются площадь под фармакокинетической
кривой и время достижения максимальной концентрации и снижается клиренс,
в то время как период полувыведения практически нс меняется.
Другие методы исследования. ГЖХ, ТСХ. колориметрический метод. СФ
(феррицианидный и пироксидазный способы).
Индометацин (метиндол) [1, 4]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. См. статью Диклофенак натрия. В качестве внут-
реннего стандарта используется диклофенак натрия.
Терапевтический диапазон - 0,5-3,0 мкг/мл.
Фармакокинетика - Ттах 1-2 ч; t1/2 1-16 ч; С1т 76'140 мл/мин; Vd 0,12 л/кг;
РВ>90%. Индометацин почти полностью абсобируется при приеме внутрь. Он
подвергается энтерогс пати ческой рециркуляции, что может влиять на изме-
нение t /2. Биодоступность 96-98% при оральном приеме и 85% при ректаль-
ном. Через почки элиминирует 70% (20% в неизменном виде) и 30% - через
ЖКТ в виде метаболитов.
Другие методы исследования, ГЖХ, ТСХ, ГХ/МС, РИА.ФИ А.
Напроксен (напросин) [1, 16]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Метанол для жидкостной хроматогра-
фии. Кислота орто-фосфорная, ч.д.а. Эфир медицинский. 0.05 М фосфатный
буфер (pH 3,7). Вода бидистиллированная.
Приготовление образца В пробирку с герметичной крышкой помещают 1
мл биологической жидкости, добавляют 200 мкл 1М раствора орто-фосфор -
ной кислоты и 5 мл эфира медицинского, тщательно перемешивают и экстра-
гируют в течение 10 минут; затем центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин.
Органический слой переносят в колбу для упаривания и упаривают досуха.
Сухой остаток растворяют в 150 мкл элюента. Аликвоту (100 мкл) использу-
ют для хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 240 нм. ПФ - смесь метанола с 0,05 М фосфатным
буфером (pH 3,7) в объемном соотношении 60:40 Скорос ть элюирования 1
мл/мин. Время выхода пика напроксена 7 мин.
Количественное определение. Метод - абсолютной калибровки. Предел
обнаружения 5 нг/мл.
328
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Терапевтический диапазон - 30-50 мкг/мл.
Фармакокинетика - TI11W 1-2 ч; tl/2 12-15 ч; Vd 0,1 л/кг; С1т 5 мл/мин;
РВ>99%; F 100%; Cnwx после однократного перорального приема 250 мг со-
ставляет в среднем 34 мкг/мл. Напроксен быстро всасывается в системный
кровоток из ЖКТ. Препарат на 90% метаболизируется в печени. 98 % выво-
дится через почки (10 % в неизменном виде) и 2 % - через ЖКТ. При почеч-
ной недостаточности Vd и С1т Т. Концентрация напроксена в синовиальной
жидкости составляет примерно 50 % от плазменных концентраций.
Другие методы исследования. ГЖХ, флуориметрия.
Парацетамол (ацетаминофен) [1, 13 14, 15]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма,слюна.
Методика определения. Реактивы: Метанол для жидкостной хроматогра-
фии. 0,3 н сульфат цинка. 0,3 н гидроксид бария. Вода ойдис^иллированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают
200 мкл биологической жидкости, добавляют 800 мкл дистиллированной воды,
перемешивают на vortex в течение 2 минут и оставляют на 10 минут при ком-
натной температуре. Добавляют 1 мл 0,3 н гидроксида бария и перемешивают
на vortex 2 мин; затем добавляют 1 мл 0,3 н сульфата цинка и снова переме-
шивают на vortex 1 мин, после чего ценгрифугируют 10 минут при 3000
об/мин. Надосадочную жидкость фильтруют через фильтр типа Mil Прог. Али-
квоту (50 мкл) используют для хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 254 нм. ПФ - смесь метанола с водой в объемном
соотношении 80:20. Скорость элюирования 1,5 мл/мин. Время выхода пика
ацетаминофена 5 мин
Количественное определение. Метод - внутреннего стандарта. Внутренний
стандарт - 2-ацетамидофснол (время выхода 8 мин). Предел обнаружения 5 нг/мл.
Терапевтический диапазон - 10 30 мкг/мл; Токе.конп.>200 мкг/мл.
Фармакокинетика - 0/2	*; 41 0.95 л/кг; С1т 5,0 мл/мин/кг; ЕВ 20-50%.
Парацетамол всасывается в верхних отделах кишечника, метаболизируется в
печени и выделяется в основном почками. Заболевания печени и почек могут
вызывать Т периода полувыведения и X клиренса. При ? t1/? > 4 ч возможно
повреждение печени. 11еченочная и почечная токсичность может также воз-
никать у алкоголиков и в терапевтических дозах. У новорожденных период по-
лувыведсния ?.
Другие методы исследования. ГЖХ. ГХ/МС, ИФА.
Спазмолитические средства
Теофиллин [1, 7, 8, 9, К), 11, 12,13]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.слюна.
Методика определения. Реактивы. 1 н раствор соляной кислоты. Хлоро-
форм. Изопропанол. Ацетонитрил для жидкостной хроматографии. Хлорид
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ 329
натрия (порошок). Ледяная уксусная кислота. Вода бидистиллированная.
Приготовление образца. 1. Сыворотка, плазма. В пробирку с герметичной
крышкой помещают 1 мл биологической жидкости, добавляют 0,8 мл 1 н рас-
твора соляной кислоты и 10 мл смеси хлороформ - изопропанол (95:5), тща-
тельно перемешивают и экстрагируют в течение 20 мину г; затем центрифуги-
руют 10 минут при 3000 об/мин. Органический слой перенося т в колбу для упа-
ривания и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл элюента. Али-
квоту (50 мкл) используют для хроматографирования.
2. Слюна. В пробирку с герметичной крышкой помещают 1 мл слюны, до-
бавляют 5 мл ацетонитрила, встряхивают в течение 10 минут, затем центри-
фугируют 10 минут при 3000 об/мин. Раствор над осадком переносят в кониче-
ские колбы и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл элюента.
Аликвоту (50 мкл) используют для хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 255 нм. ПФ - смесь ацетонитрила и воды в объем-
ном соотношении 40:460 с добавлением 14,5 г хлорида натрия и ледяной уксус-
ной кислоты до pH 3,0. Скорость элюирования 1,5 мл/мин. Время выхода пи-
ка теофиллина - 6 мин.
Количественное определение. Метод - абсолютной калибровки. Предел
обнаружения 100 нг/мл .
Терапевтический диапазон - 10-20 мкг/мл; Токе. конц. >20 мкг/мл.
Фармакокинетика - ТП1ах 0,5-2 ч (6-12 ч для пролонгированных форм); t1/2
4-16 ч (в среднем 8,7 ч у нс курящих и 4,4 ч у курящих) - при циррозе и серд.
нсд.Т до 20-30 ч; РВ 40-65% (резко 1 при циррозах печени - 29-37%); 1 70-
100%; Vd 0,5л/кг; С1т 0,65 мл/мин/кг (взрослые некурящие), 1,05 мл/мин/кг
(взрослые курящие), 14 мл/мин/кг (дети 4-17 лет). 17 мл/мин/кг (дети 1-4 го-
да). При приеме внутрь в дозе 0,3 г хорошо всасывается; Сгп;1Х в плазме 4-5
мкг/мл отмечается через 60-90 мин и сохраняется на протяжении 4-5 ч. При
внузривенном введении 0,3 г через 15 мин отмечается концентрация 7 мкг/мл.
Препарат не обнаруживается в крови через 7 ч. Начало бронхолитического
эффекта отмечается при концентрации 5 мкг/мл. 85-90% препарата метаболи-
зируется в печени. С мочой выводится 90% в вице метаболитов и 10% в неиз-
менном виде. У больных с почечной недостаточностью возможна кумуляция
теофиллина в плазме крови. Фармакокинетика теофиллина характеризуется
циркадными ритмами (пик дневной концентрации приходится на 10 ч утра,
ночной - на 2 ч - при 2-кратном приеме пролонгированных препаратов). Тео-
филлин проникает через плацентарный барьер, в грудное молоко и слюну; в
слюне концентрация препарата приблизительно наполовину меньше, чем в
плазме. ЛС Т конц. теофиллина в сыворотке крови: аллопуринол, циметидин,
эритромицин, олеандомицин, оральные козрацептивы. ЛС 1 конц. теофилли-
на в сыворотке крови: фенобарбитал, карбамазепин, рифампицин, дифенин.
Другие методы исследования. ГЖХ. РИА, ФИ А.
Примечание. I. По данной ВЭЖХ методике можно одновременно с тео-
филлином определять теобромин (время выхода 4 мин) и кофеин (время вы-
хода 13 мин ).
330 Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
2. Сбор проб проводят через 2 часа после перорального приема или через
30 мин после внутривенного приема. Пробы обычно собирают при устойчивом
состоянии.
Средства, стимулирующие ЦНС
Кофеин [1,13]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма,слюна.
Методика определения. См. статью Теофиллин.
Терапевтическим диапазон - 3-15 мкг/мл; Токе. конц. >50 мкг/мл.
Фармакокинетика - t1/2 2,5-12 ч (зависит от дозы и активности ферментов
печени); С1т 1,5 мл/мин/кг; РВ 15-35%: С|пах 1,58 - 1,76 мг/мл. Быстро и полно
всасывается в ЖКТ (при Т pH содержимого желудка -? абсорбция). Распреде-
ляется в организме равномерно. В высокой концентрации обнаруживается в
слюне. Легко проникает через ГЭБ. 90% метаболизируется в печени (барби-
тураты Т метаболизм, а циметидин, эритромицин X). Через 24 ч полностью
элиминирует. У новорожденных клиренс -I, a tI/2 ?.
Другие методы исследования. ГЖХ, РИА, ИФА.
Средства, действующие на
периферические адренергические процессы
Атенолол [1, И, 13, 44]
Биологическая жидкое гь. Сыворотка, плазма.
Ме тодика определения. См. статью на пропранолол.
Терапевтический диапазон - 200-500 нг/мл.
Фармакокинетика - t1/2 6,3 ч; Vd 0.55 л/кг; РВ <5%; F 40-50%. Всасыва-
ние - 46-62%. Метаболизируется 10%, активных метаболитов нет. С мочой
выводится 90-100%. Нет хорошей корреляции между сывороточными концен-
трациями и терапевтическими эффектами. С1Т коррелирует с клиренсом кре-
атинина.
Лабетолол [1, 45]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. См. статью Пропранолол.
Терапевтический диапазон не достаточно определен.
Фармакокинетика - t1/2 5,2 ч; С1т 22 мл/мин/кг; Vd 10 л/кг; РВ 50%: F 25-
40%. Всасывание - 90-100%. Метаболизируется 70 75%. Фенотиазины и ци-
метидин могут повышать плазменную концентрацию лабетолола, возможно ,
благодаря их влиянию на печеночный метаболизм.
Другие методы исследования. Флуор иметрия.
Пропранолол (обзидсн, индерал, анаприлин) [1, И, 19. 20, 21]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ 331
Методика определения. Реактивы. Ацетонитрил для жидкостной хромато-
графии. Кислота ортофосфорная, ч.д.а. Хлороформ. Эфир медицинский. 0,1 N
гидроксид натрия. Разбавленная серная кислота. Триэтилам ин. Вода бидистил-
лированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают 1
мл биологической жидкости, добавляют 100 мкл 0,1 н раствора гидроксида на-
трия, 4 мл эфира и 1 мл хлороформа, тщательно перемешивают и экстрагиру-
ют в течение 10 минут; затем центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Про-
бирки помещают в морозильную камеру на 20 минут. Органический слой ко-
личественно переносят в пробирки с герметичными крышками, добавляют 150
мкл разбавленной серной кислоты, откручиваю! 2 минуты на voilex и центри-
фугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин. Аликвоту (100 мкл) отбирают
из нижнего слоя и используют для хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - флуори метрический. Хвозб - 265
нм, Хэмис - 340 нм. ПФ - смесь ацетонитрила, орто-фосфор ной кислоты, три-
этил амина и воды в объемном соотношении 83:2:1:214. Скорость элюирования
1.5 мл/мин. Время выхода пика ортофена 8 мин.
Количественное определение. Метод - внутреннего стандарта. Внутренний
стандарт - празозин (время выхода - 10 мин).Предел обнаружения 10 нг/мл.
Терапевтический диапазон - 50-100 нг/мл..
Фармакокинетика - Т1пах 1-2 ч; tl/2 3-6 ч (у детей X); Vd 3,6 л/кг; С1Т 11,4
мл/мин/кг С ПРИ курении); РВ 90-95% (Г при беременности, воспалении и
ожирении); Ь'30%; Стлх после однократного перорального приема 80 мг нато-
щак составляет в среднем 63,1 нг/мл, после еды -102,4 нг/мл. Всасывание пре-
парата - 95-100%. Пропранолол подвергается биотрансформации в печени,
причем пресистемный метаболизм ( при первом прохождении через печень)
составляет 60-75%. Имеется активный метаболит - гидроксипропанол, обла-
дающий такой же P-блокирующей активностью. Печеночная экскреция и ме-
таболизм препаратов с эффектом первого прохождения через печень могут
изменяться даже при нормальной функциональной активности гепатоцитов,
что связано с насыщением гепатоцита препаратом и выражается в непропор-
циональном росте концентрации пропранолола в плазме по отношению к при-
нимаемой дозе препарата. Снижение биотрансформации особенно заметно у
больных с циррозом печени, застойной недостаточностью кровообращения и
в пожилом возрасте. I [оэтому у этих групп больных доза пропранолола долж-
на быть снижена, а их концентрация в плазме крови регулярно контролиро-
ваться
Другие методы исследования. ГЖХ, РИА.
Эфедрин [1,311
Биологическая жидкость. Моча.
Методика определения. Реактивы. Метанол для жидкостной хроматогра-
фии, Кислота орто фосфорная, ч.д.а Бензол. Диэтиламин. 5% раствор гидро-
ксида натрия. Вода бидистиллированная.
332
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают
10 мл биологической жидкости, добавляют 5% раствор гидроксида натрия до
pH 11 и 10 мл бензола; откручивают на vortex 3 минуты. Затем центрифугиру-
ют 10 минут при 3000 об/мин. Органический слои переносят в колбу для упа-
ривания и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 150 мкл элюента.
Аликвоту (100 мкл) используют для хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 210 нм. ПФ - орто-фосфорная кислота-метанол-
диэтиламин (75:20:1). Скорость элюирования 50 мкл/мин. Время выхода пика
эфедрина 7 мин.
Количественное определение. Метод - внутреннего стандарта. Внутренний
стандарт - амфетамин (время выхода - 10 мин). Предел обнаружения 6 нг/мл .
Терапевтический диапазон - 0,035-0,08 мкг/мл; Токе. конц. > 0,15 мкг/мл.
Фармакокинетика - TmdX 2-3 ч; tI/2 3-11 ч (зависит от дозы и pH мочи, так,
при pH 5 он составляет 3 ч, при pH 6-6 ч). Хорошо всасывается после ораль-
ного и в/м введения. Всасываемость Т после приема нищи. Медленно метабо-
лизируется в печени, выделяется в основном почками в неизменном виде (при
кислой моче - до 90% за 24 ч, при щелочной - до 30%), Т действие эфедрина;
адреналин, ингибиторы МАО, резерпин. Образует нерастворимые соли с суль-
фаниламидами, амидопирином, йодом, отваром корня солодки
Другие методы исследования. ГХ/МС.
Примечание. Данная методика может быть использована для определения
и других производных фенилал килам ина (внутренний стандарт - эфедрин).
Антагонисты ионов кальция
Верапамил (изоптин) [1, 17, 43, 47, 48]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Кислота орто-фосфорная, ч.д.а. MeCN.
Вода бидистиллированная
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают
100 мкл биологической жидкости, добавляют 375 мкл MeCN и 25 мкл раство-
ра внутреннего стандарта (1 мг/мл) в ПФ и откручивают на vortex 13 минут; за-
тем центрифугируют 5 минут при 5000 об/мин. Аликвоту (5 мкл) используют
для хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - флуори метрический (Хвозб - 280
нм, Аэмис - 320 нм). 11Ф -смесь MeCN с 0,07% раствором о-фосфорной кис-
лоты в объемном соотношении 33:67. Скорость элюирования 1 мл/мин Время
выхода пика 10 мин.
Количественное определение. Метод - внутреннего стандарта. Внутренний
стандарт - 5,6-бснзохинолин (время выхода - 13 мину г).
Терапевтический диапазон - 100-500 нг/мл.
Фармакокинетика - tl/2 при в/в: быстрая фаза - 4 мин, медленная - 2-5 ч; при
приеме внутрь: 2,8-7,4 ч; при курсовом лечении; 4,5-12 ч; Vd 4,0 л/кг; С1т - од-
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ 333
нократный прием 11,8 мл/мин/кг, многократный прием > 2 кратное увеличе-
ние; РВ 90%; F 25%. Абсорбция высокая - > 90%. Биодоступность низкая из-
за эффекта первого прохождения через печень. Интенсивный метаболизм в
печени Выявлен активный метаболит - норверапамил. Выводится преимуще-
ственно почками. У пожилых С1т X. При циррозе t1/2 и Vd Т, а С1т i.
Другие методы исследования. ГХ/МС, ГЖХ, флуоримстрия.
Нифедипин (коринфар, адалат, фенигидин, кордипин) [1, 17.18]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Ацетонитрил для жидкостной хромато-
графии. Хлороформ. Гексан. 2 н раствор гидроксида натрия. 0,15 н раствор
натрия дигидрофосфата. Вода бидистиллированная.
Приготовление образца. Анализ проводится в темноте (при неярком свете
красной лампы)! Все пробирки должны быть обернуты фольгой. В пробирку
с герметичной крышкой помещают 1 мл биологической жидкости, добавляют
200 мкл 2 н раствора гидроксида натрия и 4 мл смеси хлороформ - гексан (3:7),
тщательно перемешивают и экстрагируют в течение 10 минут; затем центри-
фугируют 10 минут при 3000 об/мин. Пробирки помещают в морозильную ка-
меру на 20 минут. Затем органический слой переносят в колбу для упаривания
и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 150 мкл элюента. Аликвоту
(100 мкл) используют для хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 238 нм. ПФ - смесь ацетонитрила с 0,15 н раство-
ром натрия ди гидрофосфата в объемном соотношении 45:55. Скорость элюи-
рования 1 мл/мин. Время выхода пика нифедипина 8 мин.
Количественное определение. Метод - внутреннего стандарта. Внутренний
стандарт - низрендипин (время выхода - 10 мин). Предел обнаружения 10 нг/мл.
Терапевтический диапазон - общепризнанных терапевтических границ нет.
Фармакокинетика - Ттлх 0,5-2 ч; tl/2 2-5 ч; Vd 1,5 л/кг; С1т около 10
мл/мин/кг; РВ>90%; F 50%. Абсорбция - высокая - более 90%. Скорость вса-
сывания нифедипина из таблеток меньше, чем из капсул. Метаболизм - интен-
сивный - в печени. Активных метаболитов не выявлено. Выведение - преиму-
щественно почками (неактивные метаболиты). При циррозе и болезнях почек
' Ч/2> Т ГТГ
Другие методы исследования. ГЖХ.
Примечание. Препарат очень быстро разлагается на свету.
Антигистаминные препараты
Циметидин [1, 11, 22. 23, 24]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма, моча.
Методика определения. Реактивы. Ацетонитрил для жидкостной хромато-
графии. Хлороформ. Эфир медицинский. Пентанол. Разбавленная орто-фос
форная кислота. 0.05 М дигидрофосфат калия (pH 4,0) 0,02 М дигидрофосфат
334
Том [I - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
аммония (pH 4,8). 2 н раствор гидроксида натрия. Вода бидистиллированная.
Приготовление образца. 1. Сыворотка, плазма. В пробирку с гермет ичной
крышкой помещают 0,3 мл биологическом жидкости, добавляют 100 мкл 2 и
раствора гидроксида натрия и 2 мл смеси эфир-хлороформ-пентанол (2:1:1),
тщательно перемешивают и экстрагируют в течение 10 минут; затем центри-
фугируют 10 минут при 3000 об/мин. Органический слой количественно пере-
носят в пробирки с герметичными крышками, добавляют 100 мкл разбавлен-
ной орто-фосфорной кислоты, откручиваю т на vortex 2 минуты и центрифуги-
руют в течение 10 минут при 3000 об/мин. Аликвоту (25 мкл) используют для
хроматографирования.
2. Моча. В пробирку помещают 0,05 мл мочи, добавляют 2 мл 10% ацето-
нитрила (в дистиллированной воде), тщательно перемешивают. Аликвоту (25
мкл) используют для хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. ПФ - смесь ацетонитрила с 0,05 М раствором дигид-
рофосфата калия pH 4,0 (для плазмы) или с 0,02 М раствором дигидрофосфа-
та аммония pH 4,8 (для мочи) в объемном соотношении 10:90. Скорость элю-
ирования 1,5 мл/мин. Время выхода пика циметидина мин.
Количественное определение. Метод - абсолютной калибровки. Предел
обнаружения 10 нг/мл .
Терапевтический диапазон - 0,5-1,2 мкг/мл.
Фармакокинетика - Т1ПЯХ 1-2 ч; t1/2 1,9 ч; Vd 2,1 л/кг; С1Т 12 мл/мин/кг РВ 15-
20%; F 70%; Стах после однократного перорального приема 400 мг составля-
ет 1200 1800 нг/мл. При курсовой монотерапии остаточная концентрация ци-
метидина утром после вечернего приема практически не определяется. Прием
циметидина после еды заметно изменяет его фармакокинетику, приводя к дву-
горбой кривой “концентрация-время”. Препарат выводится с мочой (80% в
неизменном виде). Заболевания почек Т t1/2 и X С1т. У пожилых людей зна-
чительно ? tj/2, a Vd и С1т X.
Диуретические средства
Триамтерен [1, 22, 25, 26]
Биоло! ическая жидкость. Сыворотка, плазма, моча.
Методика определения. Реактивы. Ацетонитрил для жидкостной хромато-
графии Кислота орто фосфорная, ч.д.а. 2 М раствор гидроксида натрия. Хло-
роформ. Эфир медицинский. Пен ганол. Триэч иламин Вода бидис гиллированная.
Приготовление образца. 1. Сыворотка, плазма. В пробирку с герме тичной
крышкой помещают 0,2 мл биологической жидкости, добавляют 100 мкл 2 М
раствора гидроксида натрия и 2 мл смеси эфир-хлороформ-пентанол (2:1:1),
тщательно перемешивают и экстрагируют в течение 10 минут; откручивают
на vortex 1 минуту и центрифугируют 5 минут при 3000 об/мин. 1,5 мл органи-
ческого слоя переносят в пробирку с герметичной крышкой, добавляют 100
мкл орто-фосфорной кислоты (pl I 2,0), откручивают на vortex 2 минуты. Али-
квоту (25 мкл) отбирают из нижнего слоя и используют для хроматографиро-
вания.
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ 335
2. Моча. Непосредственный ввод.
Хроматографический анализ. Детектор - флуори метрический. Хвозб - 365
нм, Хэмис - 470 нм. ПФ - ацетонитрил-вода-триэтиламин (10:90:0,1). Скорость
элюирования 1,5 мл/мин. Время выхода пика триамтерена 5 мин.
Количественное определение. Метод - внутреннего стандарта. Внутренний
стандарт - гидрокси-Зч-хинидин (время выхода - 4 мин). 11редсл обнаружения
I нг/мл .
Терапевтический диапазон - общепризнанных терапевтических границ нет
Фармакокинетика - Ттах 2-3 ч; t1/2 1,5-3 ч; С1Т 71 мл/мин; РВ 50-80%; Стах
после однократного перорального приема 100 мг составляет 0,21+0,10 мкг/мл.
Триамтерен быстро и полно всасывается в тонком кишечнике. Более 90% ме-
таболизируется в печени. Метаболиты выводятся с желчью и мочой (в неиз-
менном виде 5-10%).
Фуросемид (лазикс) [1, 47]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. См. статью на дигоксин.
Фармакокинетика -11/2 0,5-0,85 ч; 1 мах 20-60 мин (в/в) и 1-2 ч (внутрь); С1т
166 мл/мин/кг; РВ 95-97%. Всасывание - из кишечника 63-65%. около 75%
выводится в виде глюкуронидов. Экскретируется почками путем фильтрации.
Болезни почек изменяют фармакокинетику препарата (при почечной недоста-
точности - С1 т >1, при нефротоксическом синдроме РВ ^).
Иммунокорректоры
Циклоспорин [11, 27,28, 29]
Биопогическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Ацетонитрил для жидкостной хромато-
графии. Кислота орто-фосфорная, ч.д.а. Вода бидистиллированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают
0,66 мл биологической жидкости, добавляют 0,8 мл раствора орто-фосфорной
кислоты в ацетонитриле (15 ммоль/л), тщательно перемешивают и центрифу-
гируют 10 минут при 3000 об/мин. Аликвоту (0.85 мл) используют для хрома-
тографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 214 нм. ПФ - аце тонитрил-вода в объемном соот-
ношении 55:45 со скоростью элюирования 1,5 мл/мин; в конце элюирования
ацетонитрил-вода (80:20) со скоростью 0,9 мл/мин. Время выхода пика цик-
лоспорина 9 мин.
Количественное определение. Метод - абсолютной калибровки. I [редел
обнаружения 20 нг/мл .
Терапевтический диапазон - При пересадке почек - 12 ч после дозы 100 400
нг/мл, 24 ч после дозы 100 200 нг/мл; при пересадке сердца -12 ч после дозы
100-300 нг/ мл, 24 ч после дозы 100-200 нг/мл; при пересадке костного мозга
336
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
12 ч после дозы 100-250 нг/мл. Токе.конц. > 400 нг/мл.
Фармакокинетика -	3-5 ч; tl/2 16+8 ч; Vd 3,5+2,7 л/кг; С1т 9,3+1,0
мл/мин/кг (болезни печени iCiT, у детей С1т *) ; РВ 96%; F 34+11%. Препа-
рат подвержен энтсропеченочной рециркуляции. Выведение - печень. ? С1П Р -
андрогены, циметидин, дилтиазем, эритромицин, эстрогены, ми кон азол. ? С1т
- Ко-тримаксозол. фенобарбитал, длительная стероидная терапия.
Другие методы исследования. ИФА (менее специфичен).
Т ра нкв и л изаторы
Оксазепам (тазепам, нозепам) [1, 30, 31, 32, 33, 34]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Метанол для жидкостной хроматогра-
фии. Насыщенный раствор фосфата натрия. Хлороформ. Вода бидистиллиро-
ванная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают 1
мл биологической жидкости, добавляют насыщенный раствор фосфата натрия
до pH 13, 10 мл хлороформа, тщательно перемешивают и экстрагируют в те-
чение 10 минут; затем центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Органиче-
ский слой переносят в колбу для упаривания и упаривают досуха. Сухой оста-
ток растворяют в 150 мкл элюента. Аликвоту (100 мкл) используют для хро-
матографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 230 нм. ПФ - метанол-вода в объемном соотноше-
нии 35:65. Скорость элюирования 1,5 мл/мин. Время выхода пика ночепама 5
мин.
Количественное определение. Метод - внутреннего стандарта. Вну1ренний
стандарт - феназепам (время выхода - 7 мин).Предел обнаружения 4 нг/мл .
Терапевтический диапазон - 0.2 - 1.4 мкг/мл.
Фармакокинетика - Ттах 2ч; t1/2 7-14 ч; Vd 0,6-2.0 л/кг; С1т 0,9-2.0 мл/мин/кг;
РВ 90%. Оксазепам хорошо всасывается при оральном приеме. Метаболизи-
руется в печени путем глюкуронирования. Большая часть принятой дозы вы-
деляется почками. мало зависит от функционального состояния печени и
возраста. В сравнении с другими производными бензодиазепина время его дей-
ствия значительно короче. Болезни почек ? tI/2, Vd, С1Т, РВ.
Другие методы исследования. ГЖХ, ГХ/МС, ИФА.
Примечание, Оксазепам является общим метаболитом диазепама, празепа-
ма, медазепама, темазепама. Применение этих бензодиазепинов можно мони-
торировать с помощью тестирования мочи иммуноисследованием; тест под-
тверждения - ГХ/МС. Данная ВЭЖХ методика подходит для определения фе-
назепама (в качестве внутреннего стандарта - оксазепам).
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ 337
Производные 1,4-бензодиазепина
Препараты. - Нитразепам, Хлордиазепоксид (X) и его метаболиты.
Подготовка пробы - К 1мл плазмы добавляют 0.1 н НС! до pH 9 и 5мл во-
ды. Перемешивают, добавляют по 5мл диэтилового эфира и воды. Смесь цен-
трифугируют (5мин), эфирный слой переносят в колбы и упаривают. Сухой
остаток растворяют в 100 мкл элюента. Аликвоту (100 мкл) используют для
хроматографирования.
Условия анализа - УФ-детектор (Л. - 260 нм). ПФ: ацетонитрил-0,1 М кар-
бонат аммония (35:65). Скорость потока - 2мл/мин. Время выхода X. - 8 минут,
его метаболиты - 4,5,11 минут.
Количественное определение - Метод внутреннего стандарта. Внут.сган-
дарт - нитразепам (время выхода - 6,5 мин).
Препараты. - Диазепам и его метаболиты.
Подготовка пробы - К 1мл сыворотки крови добавляют насыщенный р-р
Na3PO4 до pH 13, 10 мл хлороформа. Встряхивают 15 мин и центрифугируют
5 мин. Орган, слой переносят и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют
в 100 мкл хлороформа и вводят в хроматограф.
Условия анализа - УФ-детектор (X - 242 нм) ПФ: метанол-вода-уксусная
кислота (56:42:2). Скорость потока - 1 мл/мин.
Количественное определение - Метод абсолютной калибровки.
Препараты. - 19 бензодиазепинов (в том числе оксазепам, нитразепам,
хлордиазепоксид, медазепам).
Подготовка пробы - К 50 мкл добавляют 300 мкл смеси: ацетонитрил - 0,1
М КН2РО4 (10:90), pH 9. Смесь пропускают через предколонку, которую по-
том промывают 1 мл этой смеси.
Условия анализа - Фотодиодный сканирующий спектрофотометрический
детектор. ПФ-градиент: ацетонитрил-фосфатный буфер pH 5,4 (38:62-15мин,
70:30-40 мин).
Количественное определение - Внутренний с тандарт - празепам.
Снотворные средства
Фенобарбитал (люминал) 11. 31]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы Метанол для жидкостной хроматогра-
фии. Хлороформ. Изопропанол. Кислота орто-фосфорная, ч.д.а.. Двузаме-
щенный фосфат аммония (0.05 М) Вода бидистиллированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают 1
мл биологической жидкости, добавляют орто-фосфорную кислоту дез pH 1 -2 и
4 мл смеси хлороформ-изопропанол (9:1), тщательно перемешивают и экстра-
гируют в течение 10 минут; затем центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин.
Органический слой переносят в колбу для упаривания и упаривают досуха.
Сухой остаток растворяют в 150 мкл элюента. Аликвоту (100 мкл.) использу-
ют для хроматографирования.
338
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 240 нм. ПФ - 0,05 М двузамещенный фосфат ам-
мония-метанол в объемном соотношении 60:40. Скорость элюирования 100
мкл/мин. Время выхода пика препарата 8 мин.
Количественное определение. Метод - абсолютной калибровки.. Предел
обнаружения 15 нг/мл.
Терапевтический диапазон - 15-40 мкг/мл; токе. конц. > 40 мкг/мл.
Фармакокинетика - Ттах 2-8 ч после орального приема и 1,5 ч после в/м; t1/2
3-4 дня у взрослых и 60-180 ч у новорожденных; Vd 0,7 л/кг; С1Т 0,093
мл/мин/кг; РВ 45-50%; F 80-100%. Всасывание при приеме внутрь - 80%. Раз-
рушается микросомальными ферментами печени, в последующем выделяется
преимущественно с мочой (10-25% в неизменном виде и 2,5% в виде свобод-
ного метаболита). При циррозе печени t1/2 и i С1Т, при беременности С1т Т,
у пожилых людей tl/2 Т. Фенобарбитал - индуктор ферментной системы пече-
ни; вызывает повышение метаболизма других лекарственных препаратов пос-
ле одной-двух недель лечения. Снотворное действие X: амидопирин, атропин,
глюкоза, тиамин, никотоновая кислота, аналептики. Противосудорожное дей-
ствие : амитриптилин, ниаламид, диазепам; X: резерпин.
Другие методы исследования. ГЖХ, ИФА, ФИА, ГХ/МС
Примечание. Данная методика пригодна для определения и других барбиту-
ратов.
Барбитал-натри и (веронал-натрий) [Е 31]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. См. статью Фенобарбитал.
Фармакокинетика - Хорошо всасывается в ЖКТ, частично связывается
альбуминами. Мало метаболизируется в печени. Быстро экскретируется из
организма с желчью в основном в неизменном виде. tV2 X с возрастом (2,5-3,5
дня). При регулярном введении кумулирует ( кумулятивные свойства Т при на-
рушении функции почек и печени).
Этаминал-натрий (нембутал) [1, 31]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. См. статью Фенобарбитал
Фармакокинетика - Тт1х 0.5-2 ч (? после приема пищи) ; t1/2 20 ч (Т при
циррозе); РВ 45-70% (X при почечной недостаточности). Абсорбируется в
ЖК Г на 90-100%, хорошо всасывается при ректальном и в/м введении. Пре-
парат и его метаболиты элиминируются в основном почками (около 20% в не-
изменном виде). Накапливается в жировой ткани, из которой может повторно
поступать в кровь. При повторных введениях наступает привыкание.
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ 339
Наркотические анальгетики
Морфин [31]
Биологическая жидкость. Моча.
Методика определения. Реактивы. Ацетонитрил для жидкостной хромато-
графии. 0,01 М раствор ацетата аммония. Хлороформ. Изопропанол.Твердый
бикарбонат натрия. Концентрированная НС1. Вода бидистиллированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают
20 мл биологической жидкости, добавляют 4 мл концентрированной соляной
кислоты (35-39%) и выдерживают в течение 15 минут на кипящей водяной ба-
не в сосуде с завинчивающейся крышкой. После охлаждения добавляют твер-
дый бикарбонат натрия до pH 9,0, после оседания пены раствор переливаю! в
делительную воронку и дважды по 10 мл экстрагируют смесью хлороформ-
изопропанол (9:1). Органические фазы объединяют, фильтруют через без-
водный Na2SO4 и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 150 мкл элю-
ента. Аликвоту (100 мкл) используют для хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 230 нм. ПФ - смесь ацетонитрила с 0.01 М ацета-
том аммония в объемном соотношении 35:65. Скорость элюирования 100
мкл/мин. Время выхода пика препарата 4 мин.
Количественное определение. Метод - абсолютной калибровки. Предел
обнаружения 10 нг/мл.
Терапевтический диапазон - 10-80 нг/мл; Токе. конц. > 200 нг/мл.
Фармакокинетика - t1/2 2-3 ч; Vd 3-5 л/кг; С1Т 15-20 мл/мин/кг; РВ 35%; Ь
20 -33%. При в/в введении морфина максимальный фармакологический эф-
фект достигается через несколько мину г, при л/к и в/м введении - через 15 ми-
нус. В дальнейшем содержание морфина в крови резко падает.Около 80%
морфина от введенной дозы выделяется с мочой в течение 8 часов. Однако
следы морфина можно обнаружить в моче спустя 72-100 часов. С желчью вы-
деляется до 10% введенной дозы. При многократном приеме морфина он на-
капливается в волосах и hoi тях.
Другие методы исследования. IЖХ, РИА, ИФА, ГХ/МС. флуори метрик.
Примечание. Данная методика пригодна для совместного определения мор-
фина, кодеина и папаверина (время выхода 4,7 и 18 минут соответственно)
Кодеин [31, 35]
Биологическая жидкость. Моча.
Методика определения. См. статью Морфин. Время выхода кодеина - 7 минут.
Терапевтический диапазон - 10-100 нг/мл; Токе. конц. > 200 нг/мл.
Фармакокинетика - Tmax 1 ч (после перорального приема); 11/2 3-4 ч; С1Т10-
15 мл/мин/кг; Vd 3,5 л/кг; РВ 7 25%. Кодеин всасывается довольно быстро по-
сле парентерального введения. Метаболизм протекает главным образом в пе-
чени. после орального приема около 86 % дозы выделяется с мочой за 24 ча-
са, r том числе свободного кодеина 40-70%. При в/м введении количество с во-
340 Том И - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
бедного кодеина, выделяемого с мочой спустя 24 часа, составляет 15-20%.
Другие методы исследования. ГЖХ, ГХ/МС, РИА,ИФА.
Химиотерапевтические средства. Фторхинолоны
Офлоксацин (таривид) [38. 39]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Метанол для жидкостной хроматогра-
фии. Фосфатный буфер (pH 5). 0,1 н раствор гидроксида натрия. Хлороформ.
Вода бидистиллированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают 1
мл биологической жидкости, добавляют 200 мкл 0,1 н раствора гидроксида на-
трия и 4 мл хлороформа, тщательно перемешивают и экстрагируют в течение
10 минут; затем центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Органический
слой переносят в колбу для упаривания и упаривают досуха. Сухой остаток
растворяют в 150 мкл элюента. Аликвоту (100 мкл) используют для хромато-
графирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 313 нм. ПФ - смесь метанола с ацетатным буфе-
ром (pH 5) в объемном соотношении 35:65. Скорость элюирования 1,5 мл/мин.
Время выхода пика препарата 10 мин.
Количественное определение. Метод - абсолютной калибровки. Предел
обнаружения 10 нг/мл.
Черапсвтический диапазон - Тер. конц. зависят от микроорганизма, по по-
воду которого ведется лечение.
Фармакокинетика -t1/2 5-8 ч; Vd 1-1,5 л/кг; С1т 230-280 мл/мин; РВ 25%; F
95-100%. СП1ах после однократного перорального приема 200 мкг, 400 мкг, 600
мкг составляет 1,6-2,2 мкг/мл. 3,2-4,3 мкг/мл,6,7-8,1 мкг/мл соответственно.
Всасываемость и биодоступность таривида высокие (более 90%). Таривид хо-
рошо проникает практически во все ткани и физиологические жидкости.Тари-
вид обнаруживается в моче в высоких концентрациях. Более 90% однократной
пероральной дозы выделяется с мочой в течение 24 ч. Выделяется главным
образом через почки. Болезни почек ? t1/2 и i С1Т. С возрастом t1/2 Т.
Другие методы исследования. ВЭЖХ с флуоримстрическим детек1ч)ром.
Примечание. Данная методика подходит для определения и других произ-
водных фторхинолона.
Ломефлоксацин [1]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. См. статью Офлоксацин.
Фармакокинетика - Т1пах 1,33 ч; t1/2 7-8 ч; С1Т 199 мл/мин; Vd 2,54 л/кг; Спых
3,47 мкг/мл.
Другие методы исследования. ВЭЖХ с флуоримстрическим детек тором.
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ
341
Антибиотики-макролиды
Эритромицин [1, 47. 50]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Кислота орто-фосфорная. ч.д.а. MeCN.
Вода бидистиллированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают
200 мкл биологической жидкости, добавляют 10 мкл раствора внутреннего
стандарта (10 мкг/мл), 20 мкл насыщенного раствора карбоната натрия и 1 мл
диэтилового эфира, откручивают на vortex 30 секунд; затем центрифугируют
2 минуты при 6000 об/мин. Органический слой упаривают досуха. Сухой оста-
ток растворяют в 50 мкл ПФ. Аликвоту (20 мкл) используют для хроматогра-
фирования.
Хроматографический анализ. Детектор - Е, Shimadzu L-ECD-6A. ПФ
смесь MeCN с 50 мМ раствора дигидрофосфата калия (pH 10,5) в объемном
соотношении 37:63. Скорость элюирования 1 мл/мин. Время выхода пика пре-
парата 12 мин.
Количественное определение. Метод - внутреннего стандарта. Внутрен-
ний стандарт — олеандомицин (время выхода - 5 минут).
Терапевтический диапазон - Конц, очень вариабельна.
Фармакокинетика - Препарат кислотоустойчив; в щелочной среде превра-
щается в антибиогик широкого спектра действия. Хорошо проникает в пе-
чень, легкие, костную ткань, мышцы. РВ 60-80%. Выводится с желчью в не-
изменном виде (20-30%). Тмах 1,5-2 ч. t1/2 1,2-2,6 ч (у новорожденных Г). Уг-
нетает активность цитохрома Р-450, при этом нарушая биотрансформацию од-
новременно назначаемых ЯП (повышает концентрацию в плазме крови карба-
мазепина, теофиллина и усиливает их токсический эффект).
Сердечные гликозиды
Дигоксин [1.13, 40, 46, 47]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Ацетон Изооктан. Дихлорметан. п-
Пропанол. Метанол. Этанол. Пероксид водорода. L-аскорбиновая кислота. Во-
да бидистиллированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают 3
мл биологической жидкости, добавляют 20 мкл 8 мкг/мл раствора внутренне-
го стандарта в этаноле и 3 мл ацетона, тщательно перемешивают и экстра! и-
руют в течение 10 минут; затем центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин. К
органическому слою добавляют 2 мл смеси изооктан-дихлорметан (80 20). от
кручивают на vortex 1 минуту и центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин.
Удаляю!’ ацетоновый слой и упаривают под током азота при 370С, добавляют
10 мл смеси дихлорметан — п-пропанол (98:2), экстрагируют в течение 10 ми-
нут, центрифугируют 5 минут при 1000 об/мин; экстракцию повторяют, opi а-
нические слои сливают и выпаривают под током азота при 370С. Сухой оста-
ток растворяют в 100 мкл смеси метанол-вода (50:50). Аликвоту (100 мкл) ис-
пользуют для хроматографирования.
342
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Хроматографический анализ. Детектор - флуориметрический (Хвозб -
360 нм. Хэм - 425нм). ПФ - метанол : этанол : изопропанол : буфер (52:3:1:45)
(буфер готовится путем смешивания 12.5 мл 0,15% раствора пероксида водо-
рода с 500 мл 5()()мкг/мл раствора L-аскорбиновой кислоты; перемешивается
в течение 2 часов). Скорость элюирования 0,4 мл/мин. Время выхода пика пре-
парата 18,5 мин.
Количественное определение. Метод - внутреннего стандарта. Внутрен-
ний стандарт - дигитоксигенин (время выхода 22,5 минут). Предел обнаруже-
ния 0,5 нг/мл.
Терапевтический диапазон - 0,8-2,0 нг/мл; Токе. конц. >2,5 нг/мл..
Фармакокинетика - Ттах 4-6 ч; tl/2 30-40 ч; С1т 2,29 мл/мин/кг; Vd 7,3 л/кг;
РВ 20-40%; F 70-85%. С1т i при болезнях почек и у новорожденных и детей.
Плазменные концентрации препарата ? - мсксилитин, прокаинамид, ибупро-
фен. хинин.
Другие методы исследования. ГЖХ, РИА, ИФА.
Примечание. Одновременно можно определять дигоксигенин, дигидродиго-
ксигенин, дигидродигоксин, фуросемид, спиронолактон.
Антиаритмические препараты
Этмозин [1, 411
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Метанол для жидкостной хроматогра-
фии. Спирт этиловый. 0,01% раствор кислоты орто-фосфорной. Вода биди-
с гиллированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают 1
мл биологической жидкости, добавляют спирт этиловый для осаждения бел-
ков, тщательно перемешивают и экстрагируют в течение 10 минут; затем цен-
трифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Органический слой переносят в кол-
бу для упаривания и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 150 мкл
элюента. Аликвоту (100 мкл) используют для хроматографирования.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. ПФ - смесь метанола с 0,01% раствором фосфорной
кислоты в объемном соотношении 40:60. Скорость элюирования 1 мл/мин.
Время выхода пика 10 мин
Количественное определение. Метод - абсолютной калибровки Предел
обнаружения 12 нг/мл.
Терапевтический диапазон - Тсрап. конц.: вариабельна.
Фармакокинетика - ttnO,7-4.1 4;Vd 185-225 л; Cl г 0,92 1,31 л/мин; РВ 12%;
F 38 50%. Элиминация осуществляется главным образом за счет биотранс-
формации в печени Препарат об падает низкой биодоступностью в связи с вы-
раженным эффектом первого прохождения, поэтому доза значительно увели-
чивается при приеме внутрь по сравнению с парентерально вводимой дозой.
При сердечной недостаточности С1Т 1, а концентрация его в крови Т. Пре па-
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ 343
рат хорошо проникает в сердце, печень, почки. Недопустимо одновременное
назначение с ингибиторами МАО,
Другие методы исследования. ТСХ.
Этацизин [1]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. См. статью Этмозин.
Терапевтический диапазон - Тсрап. конц.:вариабельна.
Фармакокинетика - t1/2 2,5 ч; F 40%.
Другие методы исследования. ТСХ.
Противосудорожные средства
Карбамазепин (тегретол) [И. 42. 47, 49]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Хлороформ. Эти л ацетат, [оксан.
MeCN. 1,5 М раствор гидроксида натрия. Вода бидистиллированная.
Приготовление образца. В пробирку с герметичной крышкой помещают
200 мкл биологической жидкости, добавляют 750 иг внутреннего стандарта ,
200 мкл 1,5 М раствора гидроксида натрия и 2 мл смеси этил ацетат - хлоро-
форм (50:50), тщательно перемешивают и экстрагируют в течение 10 минут;
затем центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Органический слой перено-
сят в колбу для упаривания и упаривают досуха. К сухому остатку добавляют
100 мкл элюента и 100 мкл гексана. Аликвоту (20 мкл) используют для хрома-
тографиро ва н и я.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X - 220 нм. ПФ - смесь MeCN с водой в объемном со-
отношении 30:70. Скорость элюирования 1 мл/мин. Время выхода пика препа-
рата 11 мин.
Количественное определение. Метод — внутреннего стандарта. Внутрен-
ний стандарт - карбамазепин-10-гидроксид.
Терапевтический диапазон - 4-12 мкг/мл; Токе. конц. >15 мкг/мл.
Фармакокинетика - t 2 24-26 ч однократ. дозы и 8-20 ч многократ. дозы; Vd
1,0-1,5 л/кг у детей и 0,79-1.86 л/кг у взрослых; С1Т 0,39 мл/мин/кг; РВ 60-80%;
F >70%. С1Т Т при беременности и X при патологии печени. Есть активный ме-
таболит, который может аккумулировать при почечной недостаточности и из-
менять терапевтические и токсические концентрации карбамазепина. кон-
центрацию карбамазепина: циметидин, эритромицин, изониазид, верапамил.
Примечание. По данной методике можно определять и метаболиты
карбамазепина.
344
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Нейролептики
Аминазин [41]
Биологическая жидкость. Сыворотка, плазма.
Методика определения. Реактивы. Метанол для жидкостной хроматогра-
фии. Хлороформ. Триэтил амин. Вода бидистиллированная.
Хроматографический анализ. Детектор - спектрофотометрический с пе-
ременной длиной волны. X, - 254 нм. ПФ - хлороформ-метанол-триэтиламин
(420:80:0,5). Скорость элюирования 1 мл/мин. Время выхода пика 9 мин.
Количественное определение. Метод - абсолютной калибровки Предел
обнаружения 10 нг/мл.
Терапевтический диапазон - Терап. конц: вариабельна.
Фармакокинетика - ТП1;1Х 2-4 ч; t1/2 16 ч; Vd 21-150 л/кг; РВ 95-98%; F 25-
35%. Препарат подвергается биотрансформации при первом прохождении че-
рез печень (известно около 60 метаболитов). Легко проникает в гкани. Менее
1 % выводи гея с мочой в неизменном виде. Для препарата характерна резко вы-
раженная вариабельность создаваемого в крови уровня его при введении одной
и той же дозы разным больным. У одного и того же больного в течение суток
концентрация аминазина в крови может колебаться в 5-10 раз, что не сказыва-
ется на лечебном эффекте препарата, но влияет на выраженность побочных.
Список литературы
I.	Клиническая фармакология /В.Г.Куксс. А.С. Румянцев, Б.Р.Альперович,
И.Л.Блинков и др. // М.: Медицина, 1991. - С.292.
2.	Агафонов А.А.. Пиотровский В.К. Программа М-IND оценки системных
параметров фармакокинетики модельно-независимым методом статисти-
ческих моментов И Хим.фарм.журн. - 1991. - № 10. - С.16.
3.	Станиславчук И.А., Пентюк А.А., Луцкж Н.Б. Методы определения вольта-
рсна в биологическом материале // Хим.фарм.журн. - 1989. - № 9. - С 1131.
4.	Гулаганов А.А., Волчснок В.И., Кукес В.Г.. Арзамасцев А.П. Клиническая
фармакокинетика ортофсна // Хим.фарм.журн. - 1991. №12. - С.71 -75.
5.	Lansdorp D. High-performance liquid chromatographic method for the determi-
nation of diclofenac and its hydroxy metabolites in human plasma and urine.
J.Chromalogr.. 528:487-494.1990.
6.	Small R.E. Diclofenac sodium. Clin.Pharm., 8:545 558.1989.
7.	Определение теофиллина в плазме крови методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии. / Б.Е.Кушкенбасва, Е.Т.Гнеушев, А.П.Арза-
масцев // Тез.докл. II Съезда фармацевтов МССР, Кишинев. 1^85. - С. 102.
8.	Применение метода высокОэффекгицой жидкостной хроматографии для оп-
ределения теофиллина в слюне человека. / А.П. Арзамасцев, Б.Е.Кушкенба-
ева. Е.Т.Гнеушев. Э.М.Казьмина, A.IГЦой И Тез.док;ь IV Всесоюз. симпоз.
по молекулярной жидкостной хроматографии, Алма-Ата, - 1987. - С. 117-118.
9.	Кушкснбаева Б.Е. Хроматографический анализ и фармакокинетика лекар-
ственных форм теофиллина. Дисс. канд. фарм. наук. - 1988. - 238 с.
10.	Blouin R.A., Elgerl J.E, Bauer L.A. Theophylline clearance: Effect of marked
ЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ТЕРАПИИ 345
obesity. Clin. Pharmacol. and Then, 28:619-623,1980.
11.	Evans W.E., Schentag J.J., Jusko W.J. (Eds.): Applied Pharmacokinetics -
Principles of Therapeutic Drug Monitoring, 3rd ed. Vancouver. WA, Applied
Therapeutics, Inc., 1992.
12.	Haley, T.J.: Metabolism and pharmacokinetics of theophylline in human
neonates, children and adults. Drug Metab. Rev., 14; 295-335, 1983.
13.	Gilman A.G., Rail T.W., Nies A.S. and Taylor P. (Eds.): The Pharmacological
Basis of Therapeutics, 8th cd., New york, Pergamon Press, Inc., 1990.
14.	Forrest J.A.H., Clements J.A. and Prescott L.F.: Clinical pharmacokinetics of
paracetamol. Clin. Pharmacokinet., 7: 93-107,1982.
15.	Kaysen G.A., Pond S.M., Roper M.H. el al.: Combined hepatic and renal injury
in alcoholics during therapeutic use of acetaminophen. Arch. Intern. Med., 145:
2019-2023, 1985.
16.	Pharmacokinetics of naproxen after oral administration of two tablet formula-
tions in healthy volunteers /Aarbakkc J., ct al. // Ini. J. Clin. Pharmacol., Then,
Toxicol. 1983. Jun, 21(6), 281-283.
17.	Echizen H. and Eichelbaum M.: Clinical pharmacokinetк ' l verapamil, nifedip-
ine, and diitiazem. Clin.Pharmacokinet., 11: 425-449, 1986.
18.	Kleinblocscm C.H., Van Brummelen P. van Harten T.,et al: Nifedipine: Influence
of renal function on pharmacokinetic / hemodynamic relationship. Clin.
Pharmacol. Then, 37: 563-574, 1985.
19.	Hansten P.D. and Horn J.R. (Eds.): Drug Interactions, 6th ed. Philadelphia.
Febiger, 1989.
20.	Lawrence S. Olanoff, Wallc T., Cowart D. et al. Food effects on propranolol sys-
temic and oral clearance: Support for a blood flow hypothesis / Clin/ Pharm. and
Therap. Octoberl986, V.40. N 4. p.408.
21.	Me. Lean AJ.Jsbistcr C.,Bobik A., Dudley FJ, Reduction of first-pass hepatic
clearance of propranolol by food. Clin. Pharmacol Ther 1981;30:31-4.
22.	Effect of cimetidine on renal and hepatic drug elimination: Studies with tri-
amterene / Murray R. Muirhead, B. Sc. (Hons.), Andrew A. Somogyi, Ph. D.,
Paul E. Rolan, M. В.. B. S.. and Felix Bochner. M. D. // Clin. Pharm and Therap.
October 1986 p. 400 V 40 № 4.
23.	Somogyi A., and Gugler R.: Clinical pharmacokinetics of cimetidine. Clin.
Pharmacokinet., 8: 463-495. 1983.
24.	Somogyi., and Gugler R.: Drug interaction with cimetidine. J .Clin. Pharmacol.,
7:23-41, 1982.
25.	Hasegawa J., Lin E.T., Williams R.L. ct al. Pharmacokinetics of triamterene mid its
metabolites in man. J. Pharmacokinet. Biopharm. 1982; 10: 507-23.
26.	Gilfrich H.J., Kremer G., Mohrkc W. el al. Pharmacokine-tics of triamterene after
i.v. administration of bioavailability. Eur. J. Clin. Pharma-col. 1983; 25: 237-41.
27.	Ptachcinski R.J., Vcnkataramanan R. and Burchkart GJ.: Clinical pharmacoki-
netics of cyclosporin. Clin. Pharmacokinet., 11: 107 132,1986
28.	Age dependent cyclosporine: Pharmacokinetics in marrow transplant recipients /
• Gary C.Yee, Pharm D.. Thomas P. ct al.// < 'lin. Pharm. and Then October 1986
V 40, N 4, p.438-443.
29,	Gmur D.J., Yec G.C., Kennedy M.S. Modified column-switching high- perfor
mance liquid chromatographic method for the measurement of cyclosporine in
serum. J.Chromatogn 1985; 344: 422-7.
346
Том II - ЧАСТНЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
30.	Арыстанова Т.П. Комплексное использование оптических и хроматогра-
фических методов в анализе препаратов производных 1,4-бензодиазепина.
Автореф. канд.фарм.наук. М.-1985 - с.17.
31.	С.К.Еремин, Б.Н.Изотов, Н.В.Веселовская. Анализ наркотических
средств. М - 1993 - с.270.
32.	Langner J.C., Gan В.К., Liu R.H. et al.: Enzymatic digestion, solid-phase extrac-
tion, and gas chromatography/mass spectrometry of derivatized intact oxazepam
in urine. Clin. Chem., 37: 1595-1601,1991.
33.	Basel! R.C. Analytic Monitoring and Emergency Toxicology, 2nd cd. Davis, CA,
Biomedical Publications, 1987.
34.	Greenblatt D.J. Clinical pharmacokinetics of oxazepam and lorazepam. Clin.
Pharmacokinet., 6: 89-105, 1981.
35.	Clarke E.G.C.: Clarke s Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceuticals,
Body Fluids and Post-Mortem Material. London, The Pharmaceutical Press, 1986.
36.	Sadee W., and Bcelen G.C.M.: Drug Level Monitoring. New York, John Wiley
and Sons, 1980.
37.	Stanski D.R., Paalzow 1. and Edlund P.O.: Morphine pharmacokinetics: GLC
assay versus radioimmunoassay. J.Pharm. sci., 71:314-317, 1982.
38.	Guay D.R.P., Opsahl J.a., McMahon EG. et. al.: Safety and pharmacokinetics of
multiple doses of intravenous ofloxacin in healthy volunteers. Antimicrob. agents
Chemother., 36:308-312,1992.
39.	Lamp K.C., Bailey E.M., and Rybak M.J.: Ofloxacin clinical pharmacokinetics.
Clin. Pharmacokinet., 22: 32-46, 1992.
40.	Tietz N.W. (Ed.): Fundamentals of Clinical Chemistry, 3rd ed. Philadelphia,
W.B.Saundcrs Co., 1987.
41.	Гусель В. А., Маркова И.В. Справочник педиатра по клинической фармако-
логии. Ленинград, -Медицина, 1989.
42.	Bertilsson L. Clinical pharmacokinetics of carbamazepine. Clm. Pharmacokinet.,
3: 128-143, 1978.
43.	Hamann S.R., Blouin R.A., McAllister R.G. Clinical pharmacokinetics of vera-
pamil. Clin.Pharmacokinet., 9: 26-41,1984.
44.	Johnsson G., Regardh C.G. Clinical pharmacokinetics of P-adrcnoreceptor
blocking drugs. Clin. Pharmacokinet., 1: 233-263.1976.
45.	McNeil J.J., Louis WJ. Clinical pharmacokinetics of Iabctalol. 9:157-167,1984.
46.	Ernbrcc, L.; McErlane, K.M. Development of a high-performance liquid chro-
matographic-post-column fluorogcnic assay for digoxin in serum. J.Chromatogr.,
1989,496, 321-334.
47.	George Lunn and Norman R Schmuff. HPLC Methods for pharmaceutical analy-
sis, 1997.
48.	Yazan, Y,; Bozan, B. Rapid analysis of verapamil in plasma by reversed phase
HPLC. Pharmazie, 1995, 50, 117-119.
49.	Lanchote, V.L.; Bonato, P.S.; Campos, G.M.; Rodrigues. I. Factors influencing
plasma concen-trations of carbamazepine and carbamazepinc-10,11-epoxide in
epileptic children and adults. Thor.Drug.Moult., 1995, 17, 47-52.
50.	Kato, Y.; Yokoyama, T; Shimokawa, M.; Kudo, K.; Kabo. J.; Mohri, K.
Determination of erythromycin in human plasma and whole blood by high-per-
formance liquid chromatography. J. Liq. Chromatogr., 1993, 16, 661-680.
Указатель аналитов
Адвентициальные клетки 128
Ахантамеба 262
Аминазин 344
Анафилотоксины (СЗа, С4а, С5а) 210
Анкилостома 265, 292
Антинейтрофильные цитоплазмати-
ческие антитела (АНЦА) 231
Антитела антинуклеолярные
- к гистонам 221, 225
- к ДНК 22/, 221
- к дезоксирибонуклеопротеину 221
к нефритическому фактору 211
- к риоонуклеопротеину 221, 225
- к гНК-полимеразе 1 221
- к фосфолипидам 229
- к цент^юмере 221
- ' I/SS-B 222, 227
222
-	Scl-70 (топоизомераза 1) 222
-	Sm 222, 225
Антиэндотелиальные клеточные ан-
титела 236
а-1-Антитрипсин 204
а-1-Антихимотрипсин 204
Антиядерные антитела (антинуклеар-
ные факторы) 220
Аскарида 26э
Атенолол 330
Аутоантитела циркулирующие 216
Базофилы 43, 45, 47 77, 81
балантидий 265, 283
Зарбитал-натрий 338
Зелки негистонные» содержание в
ядре клетки 152
Березовского-Штернберга клетки 47,
85
Бластоциста 265
Бласты, недифференцированные 81, 84
Верапамил 332
Виллебранда фактор 245
Вирус гепатита В (HBV) 306
Вирус гепатита С < HCV) 311
Власоглав 265
Волчаночные клетки (LE-клетки) 48
Гаметоциты плазмодиев малярии 251
Гаптоглобин 204
Гистиоциты, малые 127
- гигантские многоядерные 127
Гейнца-Эрлиха тельца 29
Гемоглобин, концентрация в крови 9
-	среднее содержание в эритроците
(МСН) 23, 35
-	средняя концентрация в эритроци-
те (МТНС) 23, 36
емоглобин фетальный 32
^емоглобинА2 11
ем о глобин F 11
падкомышечные антитела 237
Двуустка кошачья 265
- ланцетовидная 265
- печеночная 265
Дигоксин 341
Диклофенак натрия 326
Диэнтамеба 265
ДНК индекс (ИДНК) 175
ДНК, содержание в ядре >
клетки 162
Изоспора 265
Иммунобласты 84
Иммуноглобулины 206
Иммунные комплексы циркулирую-
щие (ЦИК) 212
Индометацин 327
Карбамазепин 343
Кариопикнотический индекс 137
а-1-Кислый гликопротеин 204
Слетка, размеры 151-156
Слонорх 265
Содеин 339
Сокцидия кишечная 265
Сомплемент, C1INH 210
-С\^212
-	СЗ-компонент 204. 209
-	С4-компонент 204, 209
Кофеин 330
Криоглобулины 214
Криптоспоридий 265, 283
Лабеталол 330
Ланхганса-Пирогова гигантские
клетки 141
Лангерганса клетки 87
Лейкоцитарная формула 43
Лейкоциты, гликоген 59
-	а-глицерофосфатдегидрогеназа 58
-	дегидрогеназы 57
-	катионный белок 61
-	кислая фосфатаза 52
-	кислая а-нафтилацетатэстераза 55
-	липиды 62
-	миелопероксидаза 53
-	нафтол-AS ацетат-эстераза 56
-	нафтол-AS-D-хлорацетат-эстераза 57
-	неспецифические эстеразы 54
СИГ 57
-	средний цитохимический коэффи-
циент для отдельных ферментов
(СЦК) 49
-	средний цитохимический показа-
тель 49
-	число в крови 41
-	щелочная фосфатаза 50
Лейшмании 257, 298
Лентец широким 265
Лимфобласты 77, 84
Лимфоциты 43, 47 77, 81, 84
фосфатаза 50
257,298
TJ У" /Г
В-лимфоциты 86
Т-лимфоциты 86
- субпопуляции 240
Ломефлоканин 340
Лямблия 265, 281
Макрофаги 84
Малярийные плазмодии 251, 254
Мегакариобласты 79
Мегакариоциты 47, 75, 79
Мембраноатакующий комплекс
(SC5b-9) 210
Метагон им 288
Метамиелоциты 44, 76
Миелобласть! 76,81
Миелоциты 44, 76, 81
Миелокариоциты 74
Микобактерии туберкулеза 317
‘ 'икоплазма гоминис 301
икрофилярии 258, 260, 289, 297
иозит-специфические антитела 227
итохондриальные антитела 238
Многовариантный морфометриче-
ский прогностический индекс 188
Монооласты 77
Моноциты 44, 47, 77
Морфин 339
м
м
м
м
Напроксен 327
Чеглерия 262
кйтрофилы 44, 47, 76, 84
Чекатор 265. 285
Чематоды 285
Чеоптсрин 243
Чифедипин 333
ЕЧормобласты, базофильные 78, 81
-	полихроматофильные 81
-	оксифильные 78, 81
Общая гемолитическая активность
комплемента
-	классического пути (СН50) 208
-	альтернативного пути (АН 50) 209
Оксазепам 336
Острица 265
Офлокацин 340
Ревматоидные факторы 218
Ретикулоциты 25
Рецепторы для комплемента 211
РНК индекс 190
РНК, содержание в ядре клетки 152,
Саркоциста бычья 265
- свиная 265
Сегмен гоядерные нейтрофилы 44,
45, 47, 76
Сидеробласты 31
Сидероциты 31
Складчатости индекс 137
Склеродерм и веские антитела 228
Скученности или группировки ин-
декс 138
Созревания индекс (ИС) 136
-	- числовой (ЧИС) 13/
С-реактивный белок 204
Сывороточный амилоидный белок А
С4 аллотипы 210
Теофиллин 328
Тиреоидные антитела 239
Токсокара 292
Токсоплазма 261, 292
Трематод яйца в фекалиях 287
Триамтерен 334
Трипаносомы 256
Трихинелла 261, 298
Тромбомодулин 244
Тромбоциты, общий объем (тромбо-
крит, РСТ) 37
-	показатель анизоцитоза (PDW) 37
-	средний объем (MPV) 37
-	число в крови 65
Трофозоиты плазмодиев малярии 251
Палочкоядерные нейтрофилы 81
Парагоним 265, 292
Парацетамол 328
Плазматические клетки (плазмоци
ты) 44, 81, 83, 128
Пневмоциста 292
Поверхностных клеток индекс 138
Половой хроматин 121
Прогестерона рецепторы 182
Продукты расщепления компонен-
тов комплемента 209
Производные 1,4-бензодиазепина
Пролиферативной активности ин-
декс (ИЛА) 172, 176
11 рол и м фоциты 77. 84
Промегакариоциты 79
Промиелоциты 76
Промоноциты 77
Пронормобласты 78, 81
Пропранолол 330
Растворимые рецепторы
-	интерлеикина- 2 241
фактора некроза опухоли 242
Угрица кишечная 265, 292
Уреаплазма уреалитикум 301
Фазы клеточного цикла, число кле-
ток в Go/i, S G2+M фазах 176
Фенобарбитал 337
Фибриноген 204
Фибробласты 85, 127
Фиброциты 85
Фуросемид 335
Хламидия трахоматис 301
Ходжкина клетки 47, 85
Хроматин половой 121, 131
Хромосомы, число, набор 172
Цветовой показатель 22
Церулоплазмин 204
Цепень бычий 265
-	карликовый 265
-	свиной 265
Циклоспора 265 285
Циклоспорин 335
Циметидин 333
Шизонты плазмодиев малярии 251
Шистосома Мэнсона 265
-	японская 265
Энтамеба 265, 289, 292
Эпителиоидные клетки 128
Эозинофилы 43, 45, 47, 76, 81
Эритробласты 78, 81
Эритрокариоциты 78
Эритромицин 341
Эритроциты, дефицит глюкозо-6-
фосфатдегидрогеназы 29
- диаметр 20
морфология 15
-	общий объем (гематокритная вели-
чина) 21
-	осмотическая резистентность 28
-	показатель анизоцитоза (RDW) 36
-	скорость оседания 33
-	средний диаметр (СДЭ) 24
средний объем 24
-	число в крови 13
Эстрогенов рецепторы 182
Этаминал-натрий 338
Эта ци зин 343
Этмозин 342
Эфедрин 331
Эхинококк 292
Ядро клетки, диаметр 157, 185
-	объем 152
-	площадь 155, 157
-	периметр 155
Ядерно- цитоплазматическое соотно-
шение 131, 157, 158
Ядерно-морфометрическая степень
риска (NMRG) 187
Dioctophyme renale 289
Fasciolopsis buski 265
Schistosoma haematobium 289
Taenia sob urn 299
Trichomonas tenax 292
Trichomonas vaginalis 289, 294
Trichostrongylusspp. 265
Указатель аналитических
технологий
Акантамебы в СМЖ, методы обнару-
жения 262
Амебиаза внекишечного иммуно-
диагностика 300
Анкилостоматид яиц культивирова-
ние 277
Антител к ДНК определения методы
224
Антител к кардиолипину определе-
ния ИФА-метод 229
AHLIA определения И ФА- метод 234
АНЦА определения НИФ-метод 252
Антиэндртелиальных клеточных ан-
тител ИФА-метод 236
Базофилов в костном мозге подсчет
Базофилов в крови подсчет 44
Балантидия трофозоитов обнаруже-
ние 283
Бластов недифференцированных в
костном мозге подсчет (миелограм-
ма) 81
-	в пунктате лимфатических узлов
подсчет (лимфаденограмма) 84
Блоттинг белков 202
Ваалер-Розе тест 219
Вирус гепатита В выявление, ПЦР-
метод 307
Вирус гепатита С выявление, ПЦР
метод 311
Волчаночный антикоагулянт, опре-
деление 230
Волчаночные клетки, методы иссле-
дования 48
Встречный иммуноэлектрофорез
(ВИЭФ) 217
Гейнца-Эрлиха телец образования
тест по Дейчи 29
Гельминтов обнаружение, макроско-
пические методы 266
Гельминтов и простейших диагно-
стических стадий микроскопические
методы обнаружения
- вдуоденальном содержимом и
желчи 288
-	в мокроте 291-294
в моче 289
-	в фекалиях 270
Гемагглютинации метопы 217
Гемоглобин, содержания в крови
определение 9
в эритроците, средняя концентра-
ция расчет 23
-	- среднее содержание расчет 23
Гемоглобина фракций (А2 ,F) опре-
деления метод //
Геометрических параметров клеток
анализ 152
Гладкомышечных антител НИФ-ме-
тод238
Гликогена в лейкоцитах определения
метод 59
а-Глицерофосфатдегидрогеназы в
лейкоцитах определения метод 58
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в
эритроцитах дефици та методы обна-
ружения 30, 32
ДНК окрашивание
-	дифференциальное в фиксирован-
ных клетках (акридиновый оранже-
вый) 166
-	смесью красителей Ethidium bromid
и Mithramycin	. 168
-	флюорохром DA Pl	' 169
Изоспоры ооцист методы обнаруже-
ния 284
Иммунных комплексов осаждение
(ПЭГ метод) 213
Иммунобластов в пунктатс лимфати-
ческих узлов подсчет (лимфадено-
грамма) 84
Йммуноблоттинг 217
Иммунодиффузия радиальная 209, 217
Иммунопреципитация меченных
белков 203
Иммуноферментный анализ 198, 219,
-	твердофазный метод 201
-	“сендвич"-метод 201
Иммунофлюоресценция 217
Иммуноэлектрофорез 206, 217
Индекса ДНК (ИДНК) расчет /75
Индекса поверхностных клеток под-
счет 138
Индекса пролиферации подсчет 172,
176
Индекса складчатости подсчет 137
Индекса скученности или группи-
ровки клеток подсчет 138
Индекса созревания подсчет 136
^A-содержащих ПИК обнаружение
IgM- ревматоидного фактора опреде-
ления ИФА метод 220
Кт.риометрия 151, 157
Кариопикнотического индекса (КИ)
подсчет 137
Катионного белка в лейкоцитах оп-
^еделения методы 61, 62
.ислой а-нафтилацетатэстеразы оп-
ределения метод 55
Кислой фосфатазы определения ме-
тод 52
Клеток крови анализ на гематологи
ческих анализаторах 34
Клеточных элементов воспаления
поиск в мазках материала 127
Консервантов для проб фекалий
прописи 265
Криоглобулинов определения ме-
тоды 214, 215
Криптоспоридия оопист обнаруже-
ния методы 283
Лате кс-тест 219
Лейкоконценграции методы 46, 47
Лейкоцитарной формулы подсчет 43
Лейкоцитов количества в крови под-
счет 41
Лейкоэритробластического отноше-
ния в миелограмме расчет 81
Лейшманий амастигот обнаружения
методы 257, 259, 263
Лейшманий дерма готропных амасз и-
гот в биоптате из кожной язвы обна-
ружение 298
Лекарственных средств определения
ВЭЖХ-метод
Лимфаденограммы исследование 83
Лимфобластов и лимфоцитов в крови
подсчет (лейкоцитарная формула) 44
Лимфобластов и лимфоцитов в пунк
тате лимфатических узлов подсчет
(лимфаденограмма) 83, 84
Лимфоцитов в костном мозге содер-
жания подсчет (миелограмма) 81
Лимфоцитов суоклассов иммунофе-
нотипирование 240
Липидов в лейкоцитах определения
метод 63
Лямблий трофозоитов обнаружения
методы 281
Макрофагов в пунктате лимфатиче-
ских узлов подсчет (лимфаденограм-
ма) 83, 84
Малярийных плазмодиев обнаружс
ния методы 252-254
Мегакариоцитов в костном мозге
подсчет 75
Метамиелоцитов в крови подсчет
(лейкоцитарная формула) 44
Метамислоцигов нейтрофильных со-
держания в костном мозге подсчет
(миелограмма) 81
Миелобластов и миелоцитов в кост-
ном мозге содержания подсчет (мис-
лограмма) 81
Миелобластов и миелоцитов в крови
подсчет (лейкоцитарная формула) 44,
45
Миелограмма, метод Аринкина 80
Миелокариоцитов в костном мозге
подсчет 74
Миелопероксидазы в лейкоцитах оп-
ределения методы 53
Микобактерий тубгткулеза выявле-
ния ПЦР-метод 317
Микоплазмы выявление ПЦР-метод
301
Микрофилярий обнаружение в крови
Микрофилярий обнаружение в срезе
кожи 297
Митохондриазьных антител опреде-
ления методы определения 238
Монобластов и моноцитов в крови
подсчет (лейкоцитарная формула) 45
Моноцитов содержания в костном
мозге подсчет (миелограмма) 81
Морфометрические методы исследо-
вания клеток 152
4
а-Нафтилацетатэстеразы в лейкоци-
тах определения метоп 54
Нафтол-AS-ацстатэстеразы в лейко-
цитах определения метод 56
Нафтол-AS-D-хлорацетатэстеразы в
лейкоцитах определения метод 57
Неглерии вСМЖ обнаружения ме-
тод 263
Нейтрофилов в пунктате лимфатиче-
ских узлов подсчет (лимфаденограм-
ма) 83, 84
Нематод яиц и личинок в препаратах
Йекалии методы обнаружения 285
еоптерина определения в сыворот
ке РИА-метод 243
I (еоптерина определения в моче
ВЭЖХ метод 243
Непрямой флюоресценции метод
(НИФ) 197,217
Нефелометрия 205, 208, 213, 219
Нитросинего тетразолия восстанов-
ления тест (НСТ-тест) 63, 64
Нормобластов в костном мозге
подсчет (миелограмма) 81
Общей гемолитической активности
комплемента классического пути оп-
ееделение, метод СН50 208
)бшей гемолитической активности
комплемента альтернативного пути
определение, метод АН50 209
Окрашивание микроорганизмов в
мазках 121
- акридиновым оранжевым 123
генциановым или метиловым фио-
летовым 121
-	карболовым тионином Николя 123
- метиленовым синим по Леффлеру
121
^основным фуксином по Пфейферу
-	по Граму для мазков 123
-	по Романовскому-Гимзе 122
-	толстой капли /22
Окрашивание цитологических пре-
паратов, методы 107
гематоксилином и эозином 112
по Алексееву 109
по Гимзе 108
по Лейшману 109
по Папаниколау 109
-	по Папаниколау-Кунице 110
-	по Папаниколау-Руденко ///
-	по Паппенгейму 108
по Романовскому- Гимзе 108
Окрашивание цитологических пре-
паратов, специальные методы 112
- гематоксилин Эрлиха 116
- на гемосидерин 11ерлса //2
- на едикоген 115
-	на ДНК поФельгену 113
-	на кислую фосфатазу по Барку' 119
- на липиды 117
-	на неспецифическую эстеразу по
Хейхо 118
на нуклеолы 115
-	на пероксидазу 117
-	на РНК по Ьраше 114
-	на слизь ИЗ
-	соляно-кислый спирт 116
Описторхоза диагностики иммуно-
ферментные методы 300
Острицы яиц обнаружения методы
Палочкоядерных нейтрофилов в
крови подсчет (лейкоцитарная фор-
мула) 44. 45
Плазматических клеток в костном
мозге подсчет (миелограмма) 81
Плазматических клеток в пунктате
лимфатических узлов подсчет (лим-
фаденограммй) 84
Плазмоцитов в крови подсчет (лей-
коцитарная формула) 44
Плошали и периметра клетки изме-
рения методы 152
Полового хроматина определение в
клетках опухоли 121
Преципитационные методы опреде-
ления ЦИК 213
Пролимфоцитов в пунктате лимфа-
тических узлов подсчет (лимфадено-
грамма) 84
Промиелоцитов нейтрофильных в
костном мозге содержания подсчет
(миелограмма) 81
Промиелоцитов в крови подсчет
(лейкоцитарная формула) 44
Пронормобластов в костном мозге
содержания подсчет (миелограмма)
Простейших кишечника вегетатив-
ных форм обнаружения методы 269
Простейших кишечника
трофозоитов и цист окраска трихро-
мовым красителем 281
Простейших кишечника цист в на-
тивном мазке обнаружения методы
269
Проточная цитофлюорометрия 161
Прозочнопитометрическая методика
для одновременного анализа плоид-
ности, числа клеток в различных фа-
зах клеточного цикла и экспрессии
гена р53 в клетках опухолей 172
Радиоиммунологический анализ 208
Растворимых рецепторов интерлей-
кина-2 определения метод 242
Растворимых рецепторов фактора не-
кроза опухоли определения метол 242
Реакция связывания комплемента 299
Ретикулоцитов количества подсчет,
25,26
Рецепторов прогестерона в цитозо-
лях опухолей молочной железы коли-
чественная оценка 182
a
Рецепторов эстрогенов в цитозолях
опухолей молочной железы количе-
ственная оценка 182
Се ментоядерных нейтрофилов в
крови подсчет (лейкоцитарная фор-
мула) 44
Сидеробластов обнаружение 31
Сидероцитов обнаружение 31
С реактивного белка определения
методы 205
Стронгилоида личинок обнаружения
методы 277
Сукцинатдегидро,'еназы в лейкоци
тах определение, метод 57
Тиреоидных антител определения
ИФА-метод 2.39
Токсокароза диагностики иммуноло-
гический метод 300
Тс ксоплазмоза диагностики иммуно-
логический метод 299
Токсоплазмы в СМЖ обнаружения
метод 261
Г нематод яиц обнаружения методы
Трепаната клетного мозга гистологи-
ческое исследование 82
Трипаносом обнаружения методы
-	в крови 256
-	в лимфатических узлах 263
- в спинномозговой жидкости 261
Трихинелл обнаружения методы
- в биотате мыл  298
-ьС5ЛЖ.261
Трихинеллеза ИФА-диагностика 300
Т^ихомонад обнаружения методы
Трихомонад культуральное исследо-
вание 296
Тромбокритз расчет (РСТ) 3/
1 ргмбомодулина (растворимой фор-
мы) определение 244
Тромбоцитов количества в кроьи
подсчет 39, 65, 66
Тромбоцитов средний объем (MPV)
1 урбидимезоический метол опреде-
ления ЦИК 213
Тучных клеток в пунктате лимфати-
ческих узлов подсчет (лимфа депо-
грамма) 4’4
Уреаплазмы уреалитикум выявления
ПНР метол 301
фактора Виллебранда антигенного
компонента определима ИФА-метод
245
Фекалий отмучивания метол 266
Фекалии отстаивания метод 266
Фезального гсмог побина обнаруже
ние, м< то i Ветке ?2
фпг куляции с бентонитом мс год 217
Хшмидии трахоматис выявления
ПЦР- метод 301
Цветового показателя расчез 22
Цестод яиц методы обнаружения 28/
Циклоспоры ооцисз методы обнару-
жения 285
ЦИК, методы определения 212, 213
Цистицерков личинок в биоптатах
таканей обнаружение 299
Цитологическое исследование био-
псийного и операционного материа-
ла 102
пункционного материала 101
- эндоскопического материала 101
Цитохимические исследования 102
Числа хромосом в ядре клетки под-
счет 172
Числового индекса созревания
(ЧИС) подсчет 137
Щелочной фосфатазы в лейкоцитах
определения методы 50, 51
Электрофорез белков 202, 206
Электрофорез с иммунофиксацией
Энтамебы трофозоитовобнаружения
метод 281
Эозинофилов в крови подсчет (лей-
коцитарная формула) 45
Эозинефилов в костном мозге под-
счет (миелограмма) 81
Эозинофилов в пунктате лимфатиче-
ских узлов подсчет (лимфаденограм-
ма) 84
Эритробластов в костном мозге со-
держания подсчет (мие ioi рамма) 81
Эритроцитов анизоцитоза показателя
расчет (RDW) 36
Эризроцитов количества в крови
подсчет 13, 14
Эритроцитов морфологии исследова-
ние ( микроскопия мазков крови) 15
Эритроиити.мегрич 20
Эритроцитов общего объема (гемато-
критной величины) определе ние 21
Эритроцитов осмотической рези-
стентности определение 28
Воцитов скорость оседания
определение 33
□низов средний диаметр (СДЭ)
расчё. 24
Эритроцитов. среднего объем » расчет
i )хинококкоч, иммунологические ме-
тоды диагностики 300
<T RocheJ>
Новые высоты
в лабораторной
диагностике
ттмтттп
Отделение Диагностики компании
“Ф. Хоффманн-Ла РошЛтд. ’’предлагает широкий
спектр оборудования для лаборатории:
•	оборудование и реагенты для клинической химии -
биохимические анализаторы различной производительное!и
COBAS INTEGRA
HITACHI 902/912. 917
COBAS MIRA PLUS
•	оборудование и реагенты для иммуноферментного и элек-
трохемилюминесцентного анализа - тест-системы и автомати-
ческие анализаторы	ELEC.SYS 1010
ELECSYS20I0
COBAS CORE
Diagnostics
COBAS CORE II
•	оборудование и реагенты для исследований
гемостаза - автоматический и полуавтоматический
анализаторы	STA Compact
START 4
•	оборудование и тест-системы для ПЦР* анализа -
автомат ический анали затор СOBAS Amplicor
полуавтоматические анализаторы фирмы “Перкин Элмер”
Gene Amp 2400 РЕ и 9600 РЕ
•	экспресс  диагностика портативные анализаторы и
тсст-полоски для анализа крови и мочи
REELOTRON
MIDITRON Junior
MIDITRON М
• сродства самоконтроля при сахарном диабете
компактные приборы и тест-полоски для определения
уровня глюкозы и холестерина в крови, визуальные
тест-системы для определения глюкозы, кетоновых тел,
a/ibbvM ина в моче GL UCО TREND
ACCUTREND GC
Diabur-Test. Kefur-Test. Micro!-Test
Представительство аФ.Хофф.чанн-Ла РошЛтд."в Москве
Отд. “Рош Диагностика” “Хоффманн-Ла Рош” ЗАО
“ Рош-Москва”	125445 Москва. Смольная, д. 24 Д
Коммерческая башня Меридиан
Гел (095) 258-2790, 258-2777, факс (095)258-2798